CN110167576A - 靶向成纤维细胞活化蛋白的优化的合成共有免疫原性组合物 - Google Patents

Abstract

本文提供了一种包含合成的共有FAP抗原的免疫原性组合物。本文还公开了一种治疗或预防有需要的受试者中的肿瘤相关病理的方法，其通过向所述受试者施用免疫原性组合物来进行。

Description

靶向成纤维细胞活化蛋白的优化的合成共有免疫原性组合物

相关申请的交叉引用

本申请有权享有2016年9月21日提交的美国临时申请号62/397,469的优先权，所述临时申请以引用的方式整体并入本文中。

关于联邦资助的研究或开发的声明

本发明是在政府支持下在美国国家卫生研究院(National Institutes ofHealth)授予的授权号P50 CA 174523、U19 AI109646和F32 CA213795以及由美国国防部(U.S.Department of Defense)授予的授权号W31P4Q-15-1-0003下进行的。政府享有本发明的某些权利。

技术领域

本发明涉及靶向成纤维细胞活化蛋白的免疫原性组合物以及施用所述免疫原性组合物的方法。

背景技术

实体肿瘤病理生理学的特征在于指导肿瘤进展并且对癌症疗法的功效构成障碍的异常微环境。若干种蛋白质在肿瘤微环境中过表达，所述蛋白质包括成纤维细胞活化蛋白(FAP)。FAP是具有明胶酶和肽酶活性的膜结合酶，所述活性在超过90％的人类癌症的癌症相关成纤维细胞中上调。

破坏身体对肿瘤微环境的耐受性有可能改进癌症疗法。以前的研究已显示，从转基因小鼠中消除表达FAP的细胞会减弱肿瘤生长，并且与其他免疫疗法诸如免疫检查点阻断协同作用。各组还另外显示，表达靶向FAP的嵌合抗原受体的T细胞减慢了肿瘤进展；然而，在一些小鼠品系中，这些CAR引起致死毒性。

因此，本领域需要开发旨在破坏对肿瘤微环境的耐受性的更安全的疗法。本发明满足这种尚未满足的需求。

发明内容

在一个实施方案中，本发明涉及一种包含核酸分子的免疫原性组合物，其中所述核酸分子编码包含以下氨基酸序列的肽：a)在氨基酸序列SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:6的整体长度上具有至少约90％同一性的氨基酸序列，b)在氨基酸序列SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:6的至少60％上包含至少约90％同一性的免疫原性片段，c)氨基酸序列SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:6，或d)包含氨基酸序列SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:6的至少60％的免疫原性片段。

在一个实施方案中，核酸分子为DNA分子。在一个实施方案中，核酸分子为RNA分子。

在一个实施方案中，核酸分子包含以下核苷酸序列：a)在核苷酸序列SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5的整体长度上具有至少约90％同一性的核苷酸序列，b)在核苷酸序列SEQID NO:1或SEQ ID NO:5的至少60％上具有至少约90％同一性的核苷酸序列的免疫原性片段，c)核苷酸序列SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5，或d)核苷酸序列SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5的免疫原性片段。

在一个实施方案中，编码肽的核苷酸序列可操作地连接到至少一个调控序列。在一个实施方案中，调控序列是起始密码子、IgE前导序列、终止密码子或其组合。

在一个实施方案中，核酸分子编码包含以下氨基酸序列的肽：a)在氨基酸序列SEQID NO:4或SEQ ID NO:8的整体长度上具有至少约90％同一性的氨基酸序列，b)在氨基酸序列SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:8的至少60％上包含至少约90％同一性的免疫原性片段，c)氨基酸序列SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:8，或d)包含氨基酸序列SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:8的至少60％的免疫原性片段。

在一个实施方案中，核酸分子包含以下核苷酸序列：a)在核苷酸序列SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:7的整体长度上具有至少约90％同一性的核苷酸序列，b)在核苷酸序列SEQID NO:3或SEQ ID NO:7的至少60％上具有至少约90％同一性的核苷酸序列的免疫原性片段，c)核苷酸序列SEQ D NO:3或SEQ ID NO:7，或d)核苷酸序列SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:7的免疫原性片段。

在一个实施方案中，核酸分子是表达载体。

在一个实施方案中，核酸分子掺入到病毒颗粒中。

在一个实施方案中，免疫原性组合物包含药学上可接受的赋形剂。

在一个实施方案中，免疫原性组合物包含佐剂。

在一个实施方案中，本发明涉及一种编码包含以下氨基酸序列的肽的核酸分子：a)在氨基酸序列SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:6的整体长度上具有至少约90％同一性的氨基酸序列，b)在氨基酸序列SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:6的至少60％上包含至少约90％同一性的片段，c)氨基酸序列SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:6，或d)包含氨基酸序列SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:6的至少60％的片段。

在一个实施方案中，核酸分子为DNA分子或RNA分子。

在一个实施方案中，核酸分子为DNA分子。在一个实施方案中，核酸分子为RNA分子。

在一个实施方案中，核酸分子包含以下核苷酸序列：a)在核苷酸序列SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5的整体长度上具有至少约90％同一性的核苷酸序列，b)在核苷酸序列SEQID NO:1或SEQ ID NO:5的至少60％上具有至少约90％同一性的核苷酸序列的免疫原性片段，c)核苷酸序列SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5，或d)核苷酸序列SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5的免疫原性片段。

在一个实施方案中，编码肽的核苷酸序列可操作地连接到至少一个调控序列。在一个实施方案中，调控序列是起始密码子、IgE前导序列、终止密码子或其组合。

在一个实施方案中，核酸分子编码包含以下氨基酸序列的肽：a)在氨基酸序列SEQID NO:4或SEQ ID NO:8的整体长度上具有至少约90％同一性的氨基酸序列，b)在氨基酸序列SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:8的至少60％上包含至少约90％同一性的免疫原性片段，c)氨基酸序列SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:8，或d)包含氨基酸序列SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:8的至少60％的免疫原性片段。

在一个实施方案中，核酸分子包含以下核苷酸序列：a)在核苷酸序列SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:7的整体长度上具有至少约90％同一性的核苷酸序列，b)在核苷酸序列SEQID NO:3或SEQ ID NO:7的至少60％上具有至少约90％同一性的核苷酸序列的免疫原性片段，c)核苷酸序列SEQ D NO:3或SEQ ID NO:7，或d)核苷酸序列SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:7的免疫原性片段。

在一个实施方案中，核酸分子是表达载体。

在一个实施方案中，核酸分子掺入到病毒颗粒中。

在一个实施方案中，本发明涉及一种包含肽的免疫原性组合物，其中所述肽包含以下氨基酸序列：a)在氨基酸序列SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8的整体长度上具有至少约90％同一性的氨基酸序列，b)在氨基酸序列SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8的至少60％上包含至少约90％同一性的免疫原性片段，c)氨基酸序列SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8，或d)包含氨基酸序列SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8的至少60％的免疫原性片段。

在一个实施方案中，本发明涉及一种包含以下氨基酸序列的肽：a)在氨基酸序列SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8的整体长度上具有至少约90％同一性的氨基酸序列，b)在氨基酸序列SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6或SEQ IDNO:8的至少60％上包含至少约90％同一性的免疫原性片段，c)氨基酸序列SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8，或d)包含氨基酸序列SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8的至少60％的免疫原性片段。

在一个实施方案中，本发明涉及一种诱导有需要的受试者中针对成纤维细胞活化蛋白(FAP)的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含核酸分子的免疫原性组合物，其中所述核酸分子编码包含以下氨基酸序列的肽：a)在氨基酸序列SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:6的整体长度上具有至少约90％同一性的氨基酸序列，b)在氨基酸序列SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:6的至少60％上包含至少约90％同一性的免疫原性片段，c)氨基酸序列SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:6，或d)包含氨基酸序列SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:6的至少60％的免疫原性片段。

在一个实施方案中，施用包括电穿孔或注射中的至少一种。

在一个实施方案中，本发明涉及一种治疗或预防有需要的受试者中的肿瘤相关病理的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含核酸分子的免疫原性组合物，其中所述核酸分子编码包含以下氨基酸序列的肽：a)在氨基酸序列SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:6的整体长度上具有至少约90％同一性的氨基酸序列，b)在氨基酸序列SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:6的至少60％上包含至少约90％同一性的免疫原性片段，c)氨基酸序列SEQ ID NO:2或SEQID NO:6，或d)包含氨基酸序列SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:6的至少60％的免疫原性片段。

在一个实施方案中，施用包括电穿孔或注射中的至少一种。

在一个实施方案中，肿瘤相关病理是肿瘤生长、肿瘤转移或血管生成中的至少一种。

在一个实施方案中，受试者已被诊断为患有癌症。

在一个实施方案中，癌症为前列腺癌。

在一个实施方案中，方法包括向受试者施用包含一种或多种前列腺癌抗原的免疫原性组合物。在一个实施方案中，方法包括向受试者施用包含PSMA的免疫原性组合物。

在一个实施方案中，癌症为肺癌。在一个实施方案中，方法包括向受试者施用包含一种或多种肺癌抗原的免疫原性组合物。在一个实施方案中，方法包括向受试者施用包含TERT的免疫原性组合物。

附图说明

结合附图阅读时，将更好地理解本发明的优选实施方案的以下详细描述。出于说明本发明的目的，附图示出了当前优选的实施方案。然而，应理解，本发明不限于附图中所示实施方案的精确的布置和仪器。

图1，包括图1A至图1D，示出了使用与基于肿瘤抗原特异性DNA的免疫原性组合物构建体组合使用的合成共有技术的FAP免疫原性组合物的设计。图1A示出了描述本发明的优化的共有序列与天然人类和小鼠FAP序列之间的遗传关系的系统发育树。图1B示出了可操作地连接到IgE前导序列(IgELS)并具有S624A突变以阻断二肽基肽酶和明胶分解活性的小鼠FAP的示意图。图1C示出了以cpk形式示出的呈天然同源二聚体形式的成熟鼠类FAP的图。在该设计中不存在完全野生型FAP中的内源性膜丝。相对于代表性野生型序列的μCon变化以红色示出。两个消融的活性丝氨酸残基之一以位于单体活性位点袋中的黄色可见。图1D示出了示例性蛋白质印迹，其示出了转染到293T细胞中的天然小鼠FAP和μCon小鼠FAP质粒的表达。将未转染的细胞和用表达GFP的质粒转染的细胞用作阴性对照。

图2，包括图2A至图2E，示出了证明μCon小鼠FAP疫苗在C57Bl/6小鼠中的免疫原性的实验结果。图2A示出了实验设计。以两周的间隔对小鼠进行三次免疫，并在最后一次疫苗接种后一周处死。分析脾细胞以检查T细胞应答。图2B和图2C示出了证明对天然小鼠FAP肽(图2B)或与疫苗序列匹配的μCon肽(图2C)的IFN-γELISpot应答的示例性结果。图2D和图2E示出了证明用天然小鼠FAP肽刺激5小时后CD8+(图2D)和CD4+(图2E)T细胞的细胞内细胞因子染色的示例性结果。将10μg剂量的FAP疫苗用于此研究。通过学生t检验确定图2D和图2E的显著性。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。N＝5只小鼠/组，示出了两个独立实验的代表。

图3，包括图3A至图3C，示出了证明CD-1远交小鼠中天然和μCon FAP疫苗的比较的实验结果。图3A示出了在空白对照组(顶部图)、天然小鼠FAP疫苗组(中间图)或μCon小鼠FAP疫苗组(底部图)中证明对来自个体CD-1远交小鼠的天然小鼠FAP肽的IFN-γELISpot应答的示例性结果。免疫小鼠接受10μg DNA质粒。这些小鼠的免疫计划表与图2中相同。图3B示出了证明来自图3A中免疫的小鼠的、未被库分开的总IFN-γELISpot应答的示例性结果。图3C示出了证明来自图3A中的小鼠的针对天然FAP蛋白(细胞外结构域)的终点结合滴度的示例性结果。通过双向ANOVA，随后通过Tukey氏HSD检验确定图3B的显著性。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。在空白组中使用10只小鼠，并且在天然FAP和μCon FAP组中各使用15只小鼠。

图4，包括图4A至图4E，示出了证明C57Bl/6小鼠中天然和μCon FAP疫苗的比较的实验结果。图4A示出了显示实验设置的图。以两周的间隔对C57Bl/6小鼠进行三次免疫，并在最后一次疫苗接种后一周处死。分析脾细胞以检查T细胞应答，并收集血清以检查抗体应答。图4B示出了证明对天然小鼠FAP肽的IFN-γELISpot应答的示例性结果。图4C和图4D示出了证明在用天然小鼠FAP肽刺激5小时后CD8+(图4C)和CD4+(图4D)T细胞的细胞内细胞因子染色的示例性结果。将10μg剂量的天然小鼠FAP或μCon小鼠FAP疫苗用于此研究。图4E示出了证明来自图4A中的小鼠的针对天然FAP蛋白(细胞外结构域)的终点结合滴度的示例性结果。通过单向ANOVA，随后通过Tukey氏HSD检验确定显著性。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。N＝4-10只小鼠/组。

图5，包括图5A至图5E，示出了证明Balb/c小鼠中天然和μCon FAP疫苗的比较的实验结果。图5A示出了显示实验设置的图。以两周的间隔对Balb/c小鼠进行三次免疫，并在最后一次疫苗接种后一周处死。分析脾细胞以检查T细胞应答，并收集血清以检查抗体应答。图5B示出了证明对天然小鼠FAP肽的IFN-γELISpot应答的示例性结果。图5C和图5D示出了证明在用天然小鼠FAP肽刺激5小时后CD8+(图5C)和CD4+(图5D)T细胞的细胞内细胞因子染色的示例性结果。将10μg剂量的天然小鼠FAP或μCon小鼠FAP疫苗用于此研究。图5E示出了证明来自图5A中的小鼠的针对天然FAP蛋白(细胞外结构域)的终点结合滴度的示例性结果。通过单向ANOVA，随后通过Tukey氏HSD检验确定显著性。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。N＝4-10只小鼠/组。

图6，包括图6A至图6C，示出了在治疗性肺肿瘤模型中证明FAP疫苗和组合疗法的功效的实验结果。图6A示出了显示实验设置的图。在第0天向小鼠植入TC-1细胞，在第7天随机化并每周免疫一次，共进行4次免疫。使用10μg μCon FAP DNA和25μg μCon小鼠TERTDNA。图6B示出了证明植入TC-1的小鼠的指定疫苗接种方案随时间的肿瘤体积测量的示例性结果。图6C示出了证明植入TC-1的小鼠的指定疫苗接种方案随时间的小鼠存活的示例性结果。通过双向ANOVA，随后通过Tukey氏HSD检验确定肿瘤体积测量的显著性。通过Gehan-Breslow-Wilcoxon检验确定小鼠存活的显著性。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。对于TC-1研究，N＝10只小鼠/组。示出了两个独立实验的代表。

图7，包括图7A至图7C，示出了证明FAP疫苗和组合疗法在治疗性前列腺肿瘤模型中的功效的示例性实验结果。图7A示出了显示实验设置的图。在第0天向小鼠植入TRAMP-C2细胞，在第4天随机化并每周免疫一次，共进行4次免疫。使用10μg μCon FAP DNA和20μg μCon PSMA。图7B示出了证明植入TRAMP-C2的小鼠的指定疫苗接种方案随时间的肿瘤体积测量的示例性结果。图7C示出了证明植入TRAMP-C2的小鼠的指定疫苗接种方案随时间的小鼠存活的示例性结果。通过双向ANOVA，随后通过Tukey氏HSD检验确定肿瘤体积测量的显著性。通过Gehan-Breslow-Wilcoxon检验确定小鼠存活的显著性。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。对于TRAMP-C2研究，N＝15只小鼠/组。示出了每种肿瘤类型的两个独立实验的代表。

图8示出了证明FAP在肿瘤细胞系中的表达的示例性实验结果。在小鼠肿瘤细胞系TC-1和TRAMP-C2中小鼠FAP的蛋白质印迹表达。将用天然小鼠FAP质粒转染的293T细胞用作阳性对照。

图9，包括图9A至图9D，示出了证明FAP疫苗诱导FAP特异性TIL的示例性实验结果。图9A示出了显示实验设置的图。在第0天向小鼠植入TC-1肿瘤细胞，在第7天随机化并每周免疫一次，共进行2次免疫。使用10μg μCon FAP DNA。在第21天处死小鼠，并且收获脾细胞和TIL。图9B示出了证明在用天然小鼠FAP肽刺激5小时后脾脏中CD8+ T细胞的细胞内细胞因子染色的示例性结果。图9C示出了证明用天然小鼠FAP肽刺激5小时的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的细胞内细胞因子染色的示例性结果。图9D示出了证明通过流式细胞术评定的每种肿瘤中CD8+ T细胞和CD4+/CD25+/FoxP3+ Treg作为CD45+/CD3+淋巴细胞百分比的出现率的示例性结果。通过学生t检验确定图B-D的显著性。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。N＝9-10只小鼠/组，示出了两个独立实验的代表。

图10，包括图10A至图10D，示出了证明来自接受组合mTERT+FAP疫苗接种的小鼠的免疫应答的示例性实验结果。在第0天向小鼠植入TC-1肿瘤细胞，在第7天随机化并每周免疫一次，共进行2次免疫。使用10μg μCon FAP DNA或25μg mTERT DNA。在第21天处死小鼠，并且收获脾细胞和TIL。图10A和图10B示出了证明在用天然小鼠FAP肽(图10A)或天然小鼠TERT肽(图10B)刺激5小时后CD8+ TIL的细胞内细胞因子染色的示例性结果。图10C和图10D示出了证明在用天然小鼠FAP肽(图10C)或天然小鼠TERT肽(图10D)刺激5小时后CD8+脾细胞的细胞内细胞因子染色的示例性结果。使用单向ANOVA，随后使用Tukey氏HSD检验确定显著性。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。N＝8-10只小鼠/组。

图11，包括图11A至图11H，示出了证明FAP疫苗改变肿瘤微环境的示例性实验结果。图11A示出了来自对照小鼠或μCon小鼠FAP免疫小鼠的组织的针对FAP表达的代表性免疫组织化学染色。图11B示出了肿瘤中由表达FAP的细胞所覆盖的面积百分比的定量。图11C示出了来自对照小鼠或μCon小鼠FAP免疫小鼠的组织的针对透明质素表达的代表性免疫荧光图像。图11D示出了肿瘤中由透明质素所覆盖的面积百分比的定量。图11E示出了来自对照小鼠或μCon小鼠FAP免疫小鼠的组织的针对F4/80和EpCAM表达的代表性免疫荧光图像。图11F示出了肿瘤中由表达F4/80的细胞所覆盖的面积百分比的定量。图11G示出了来自对照小鼠或μCon小鼠FAP免疫小鼠的组织的针对CD8α和EpCAM表达的代表性免疫荧光图像。图11H示出了肿瘤中由表达CD8α的细胞所覆盖的面积百分比的定量。N＝6-8只小鼠/组。进行图像定量，每只小鼠至少5张图像。通过学生t检验确定图11B至图11D的显著性。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。比例尺＝100μm。

图12，包括图12A至图12D，示出了通过流式细胞术证明μCon FAP疫苗对免疫细胞亚群的影响的示例性实验结果。向小鼠植入TC-1肿瘤细胞并根据图9A中的计划表进行免疫。根据图例中指示的标记物，收获肿瘤以用于对先天免疫细胞群进行表面染色。图12A至图12D示出了证明每个肿瘤的巨噬细胞(图12A)、B细胞(图12B)、自然杀伤细胞(图12C)和树突细胞(图12D)的总数量的定量的示例性实验结果。通过学生t检验来确定显著性。N＝9-10只小鼠/组，示出了两个独立实验的代表。

图13，包括图13A至图13E，示出了证明μCon FAP疫苗对肿瘤浸润性巨噬细胞的性质的影响的实验结果。向小鼠植入TC-1肿瘤细胞并根据图9A中的计划表进行免疫。根据图例中指示的标记物，收获肿瘤以用于对先天免疫细胞群进行表面染色。图13A至图13D示出了证明Arg1+(图13A)、MHCII+(图13B)、CD68+(图13C)、CD80+(图13D)和CD86+(图13E)巨噬细胞的分数得到定量的示例性实验结果。通过学生t检验来确定显著性。N＝9-10只小鼠/组，示出了两个独立实验的代表。

图14，包括图14A至图14C，示出了优化的共有小鼠FAP疫苗的显性表位的表征。图14A示出了以23个库的矩阵排列的天然小鼠FAP中的122种肽的矩阵图。图14B示出了用每个合成共有FAP肽库刺激C57Bl/6小鼠。图14C示出了用每个合成共有FAP肽库刺激Balb/c小鼠。

图15示出了天然和合成共有小鼠FAP的显性免疫原性表位的列表。天然FAP的显性免疫原性表位被提供为SEQ ID NO:13至SEQ ID NO:21。优化的共有FAP的显性免疫原性表位被提供为SEQ ID NO:15至SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:20至SEQ ID NO:24。

具体实施方式

在一个方面中，本发明提供一种靶向FAP的免疫原性组合物。本发明的其他方面是单独使用所公开的免疫原性组合物或使用所述免疫原性组合物与另外的癌症疫苗或治疗剂的组合来治疗和/或预防癌症生长或转移。

编码本发明抗原的序列在遗传上不同于其天然蛋白质的序列，并且因此，本发明的优化的共有抗原是独特的。本发明的免疫原性组合物可广泛适用于破坏对肿瘤微环境的耐受性，并且由于所编码抗原的独特序列而减少或预防肿瘤生长或转移。这些独特的序列允许免疫原性组合物普遍预防多种类型的癌症。

免疫原性组合物可用于预防和治疗任何数目的癌症。免疫原性组合物可引发靶向肿瘤微环境抗原的体液和细胞免疫应答。免疫原性组合物可引发与肿瘤微环境抗原反应的中和抗体和免疫球蛋白G(IgG)抗体。免疫原性组合物还可引发与肿瘤微环境抗原反应并产生干扰素-γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)中的一种或多种的CD8⁺ T细胞应答。在一个实施方案中，免疫原性组合物还可引发与肿瘤微环境抗原反应并产生IFN-γ和TNF-α中的一种或多种的CD4⁺ T细胞应答。

定义

除非另外定义，否则本文所用的全部技术和科学术语都具有与本领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。当发生冲突时，以本文件(包括定义)为准。虽然在本发明的实践或测试中可使用与本文所描述的那些方法和材料类似或等效的方法和材料，但以下描述了优选的方法和材料。本文提及的所有公布、专利申请、专利以及其他参考文献以引用的方式整体并入。本文公开的材料、方法和实施例仅是示例性的，并且不意图为限制性的。

如本文所用，术语“包含(comprise)”、“包括(include)”、“具有(having)”、“具有(has)”、“可以(can)”、“含有(contain)”以及其变化形式意图是不排除另外行为或结构的可能性的开放式连接词、术语或词语。除非上下文另外清楚地说明，否则单数形式“一个/种(a)”、“一个/种(an)”以及“所述(the)”包括复数引用。本公开还涵盖“包括本文所呈现的实施方案或要素”、“由本文所呈现的实施方案或要素组成”以及“基本由本文所呈现的实施方案或要素组成”的其他实施方案，无论是否明确地提出。

如本文所用的“佐剂”意指添加至本文所描述的免疫原性组合物中以增强抗原的免疫原性的任何分子。

如本文所用的“抗体”意指类型IgG、IgM、IgA、IgD或IgE的抗体，或片段、其片段或衍生物，包括Fab、F(ab')₂、Fd以及单链抗体、双链抗体、双特异性抗体、双功能抗体及其衍生物。所述抗体可以是从哺乳动物的血清样本中分离出的抗体、多克隆抗体、亲和纯化抗体或其混合物，所述混合物对所需的表位或从其衍生的序列表现足够的结合特异性。

如本文所用的“编码序列”或“编码核酸”意指包含编码蛋白质的核苷酸序列的核酸(RNA或DNA分子)。所述编码序列可还包括可操作地连接至调控元件的起始信号和终止信号，所述调控元件包括能够在施用核酸的个体或哺乳动物的细胞中指导表达的启动子和多聚腺苷酸化信号。

如本文所用的“互补序列”或“互补的”意指核酸分子的核苷酸或核苷酸类似物之间的沃森-克里克(Watson-Crick)(例如，A-T/U和C-G)或Hoogsteen碱基配对。

如本文所用的“共有”或“共有序列”可指基于对特定抗原的多个亚型的比对的分析而构建的合成核酸序列或相应多肽序列。序列可用于诱导针对特定抗原的多个亚型、血清型或菌株的广泛免疫性。合成抗原，如融合蛋白，可被操纵以生成共有序列(或共有抗原)。

如本文可互换使用的“电穿孔”、“电-透化作用”或“电动增强”(“EP”)意指使用跨膜电场脉冲来诱导在生物膜中的微观途径(孔隙)；它们的存在允许生物分子诸如质粒、寡核苷酸、siRNA、药物、离子以及水从细胞膜的一侧流动到另一侧。

如本文所用的术语“可表达形式”是指基因构建体，其含有可操作地连接至编码靶蛋白或免疫调节蛋白的编码序列的必要调控元件，以在存在于所述个体的细胞中时，使得所述编码序列可得以表达。

如本文所用的“片段”意指编码能够在哺乳动物中引发免疫应答的多肽的核苷酸序列或其部分。所述片段可以是选自编码下文所述的蛋白质片段的各种核苷酸序列的至少一种的DNA片段。

就多肽序列来说，“片段”或“免疫原性片段”意指能够在与全长内源性抗原交叉反应的哺乳动物中引发免疫应答的多肽。共有蛋白的片段可以包含共有蛋白的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％。在一些实施方案中，共有蛋白的片段可以包含共有蛋白的至少20个氨基酸或更多、至少30个氨基酸或更多、至少40个氨基酸或更多、至少50个氨基酸或更多、至少60个氨基酸或更多、至少70个氨基酸或更多、至少80个氨基酸或更多、至少90个氨基酸或更多、至少100个氨基酸或更多、至少110个氨基酸或更多、至少120个氨基酸或更多、至少130个氨基酸或更多、至少140个氨基酸或更多、至少150个氨基酸或更多、至少160个氨基酸或更多、至少170个氨基酸或更多、至少180个氨基酸或更多、至少190个氨基酸或更多、至少200个氨基酸或更多、至少210个氨基酸或更多、至少220个氨基酸或更多、至少230个氨基酸或更多或至少240个氨基酸或更多。

如本文所用的术语“遗传构建体”是指包含编码蛋白质的核苷酸序列的DNA或RNA分子。所述编码序列包含可操作地连接至调控元件的起始信号和终止信号，所述调控元件包括能够在施用核酸分子的个体的细胞中指导表达的启动子和多聚腺苷酸化信号。如本文所用的术语“可表达的形式”是指含有可操作地连接至编码蛋白质的编码序列的必需调控元件的基因构建体，以使得当存在于个体的细胞中时，编码序列将被表达。

如本文在两种或更多种核酸或多肽序列的背景下所使用的术语“相同的”或“同一性”意指序列具有指定百分比的在指定区上相同的残基。可以通过以下来计算所述百分比：最佳地比对两个序列、在指定区域比较两个序列、确定在两个序列中相同的残基的位置的数量以产生匹配位置的数量、以匹配位置的数量除以在指定区域内的位置的总数量，并且将结果乘以100以产生序列同一性的百分比。在两个序列具有不同的长度或者比对产生一个或多个交错的末端并且比较的指定区域仅包括单一序列的情况下，单一序列的残基被包括在计算的分母中而不是分子中。当比较DNA和RNA时，胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)可以被认为是等同的。同一性可以手动地或者通过使用计算机序列算法诸如BLAST或者BLAST 2.0来执行。

如本文所用的“免疫应答”意指响应于抗原的引入而产生的宿主的免疫系统(例如，哺乳动物的免疫系统)的活化。所述免疫应答可以是细胞应答或体液应答或两者的形式。

如本文所用的“核酸”或“寡核苷酸”或“多核苷酸”意指共价连接在一起的至少两个核苷酸。单链的描述还定义了互补链的序列。因此，核酸还涵盖了所描述的单链的互补链。核酸的很多变体可以被用于与给定的核酸相同的目的。因此，核酸还涵盖了基本上相同的核酸和其互补体。单链提供可以与靶序列在严格的杂交条件下杂交的探针。因此，核酸还涵盖了在严格杂交条件下杂交的探针。

核酸可以是单链的或者双链的或可以含有双链或者单链序列两者的部分。所述核酸可以是DNA、基因组和cDNA两者、RNA或杂合体，其中所述核酸可以含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的组合，以及包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌啉、肌苷、黄嘌呤次黄嘌呤、异胞嘧啶以及异鸟嘌呤的碱基的组合。核酸可以通过化学合成方法或者通过重组方法来获得。

如本文所用的“可操作地连接”意指基因的表达是在空间上与之连接的启动子的控制下进行的。在其控制下，启动子可以被定位在基因的5'(上游)或者3'(下游)。所述启动子和基因之间的距离可以大约与所述启动子和其在启动子从中衍化的基因中所控制的基因之间的距离相同。如本领域所已知，这个距离的变化可以在没有丧失启动子功能的情况下进行调整。

如本文所用的“肽”、“蛋白质”或“多肽”可以意指氨基酸的连接序列，并且可以是天然的、合成的或天然与合成的修饰或组合。

如本文所用的“启动子”意指合成的或自然来源的分子，所述分子能够赋予、活化或增强细胞中的核酸的表达。启动子可包含一个或多个特定的转录调控序列以便进一步增强表达和/或改变其空间的表达和/或时间的表达。启动子还可以包含远端增强子或阻遏元件，它们可以位于从转录的起始点开始的差不多几千对碱基对处。启动子可以从包括病毒、细菌、真菌、植物、昆虫以及动物的来源中获得。启动子可以调控基因组分相对于其中发生表达的细胞、组织或器官或相对于发生表达所处的发育阶段或响应于外部刺激(诸如生理应激、病原体、金属离子或诱导剂)而组成型地或差异性地表达。启动子的代表性实例包括噬菌体T7启动子、噬菌体T3启动子、SP6启动子、乳糖操纵子-启动子、tac启动子、SV40后期启动子、SV40早期启动子、RSV-LTR启动子、CMV IE启动子、SV40早期启动子或者SV40后期启动子以及CMV IE启动子。

“信号肽”和“前导序列”在本文可互换使用并且是指可以被连接在本文所述的肿瘤微环境蛋白的氨基端的氨基酸序列。信号肽/前导序列通常指示蛋白质的位置。本文所用的信号肽/前导序列优选地促进蛋白质从产生其的细胞中分泌。信号肽/前导序列常常从蛋白质的剩余部分裂解，所述蛋白质在从细胞分泌后经常被称为成熟蛋白质。信号肽/前导序列连接在所述蛋白质的N端。

如本文所用的“受试者”可以意指能够施用本文所述的免疫原性组合物的哺乳动物。哺乳动物可以例如是人类、黑猩猩、狗、猫、马、牛、小鼠或大鼠。

如本文所用的“大致上相同的”可以意指第一氨基酸序列和第二氨基酸序列在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100或更多个氨基酸的区域上至少60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。大致上相同的还可以意指第一核苷酸序列和第二核苷酸序列在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100或更多个核苷酸的区域上至少60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。

如本文所用的“治疗(Treatment)”或“治疗(Treating)”可以意指通过预防、抑制、阻遏的手段保护受试者免于疾病或完全消除疾病。在一个实施方案中，预防疾病涉及在疾病发作之前向受试者施用本发明的免疫原性组合物。在一个实施方案中，预防疾病涉及在治疗之后向受试者施用本发明的免疫原性组合物以便预防所述疾病复发或进一步进展。抑制疾病涉及在疾病诱发之后但在其临床出现之前向受试者施用本发明的免疫原性组合物。阻遏疾病涉及在疾病的临床出现之后向受试者施用本发明的免疫原性组合物。

本文就核酸而言所用的“变体”意指(i)参考核苷酸序列的一部分或片段；(ii)参考核苷酸序列或其部分的互补体；(iii)与参考核酸或其互补体基本上相同的核酸；或者(iv)在严格的条件下与参考核酸、其互补体或与其基本上相同的序列杂交的核酸。

变体可以进一步定义为通过氨基酸的插入、缺失或保守性取代而在氨基酸序列上有所不同、但保留至少一种生物活性的肽或多肽。“生物活性”的代表性实例包括被特异性抗体结合或促进免疫应答的能力。变体还意指具有与参考蛋白质基本上相同的氨基酸序列的蛋白质，所述参考蛋白质具有保留至少一种生物活性的氨基酸序列。氨基酸的保守性取代，即以相似特性(例如，亲水性、带电区域的程度和分布)的不同氨基酸来替换氨基酸，在本领域中被认为通常涉及微小变化。这些微小变化可部分地通过考虑氨基酸的亲水指数来鉴定，如本领域中所理解的。Kyte等人,1982,J.Mol.Biol.157:105-132。氨基酸的亲疏水性指数是基于其疏水性和电荷的考虑。本领域已知的是相似的亲疏水性指数的氨基酸可以被取代并仍然保留蛋白质功能。在一方面，亲疏水性指数为±2的氨基酸被取代。氨基酸的亲水性还可以被用来揭示会产生保留生物功能的蛋白质的取代。在肽的情形下考虑氨基酸的亲水性允许计算所述肽最大的局部平均亲水性，这是已经被报道来与抗原性和免疫原性良好关联的有用测量。如本领域中所理解，用亲水性值相似的氨基酸进行取代可产生保留生物活性(例如免疫原性)的肽。可用亲水性值处在±2范围内的氨基酸进行取代。氨基酸的亲疏水性指数和亲水性值两者都受所述氨基酸的特定侧链影响。与所述观察一致的是，与生物功能相容的氨基酸取代被理解为取决于这些氨基酸相对的相似性，并且特别是那些氨基酸的侧链，如通过疏水性、亲水性、电荷、大小以及其他特性所揭示的。

变体可以是在全基因序列或其片段的全长上大致相同的核苷酸序列。核苷酸序列可在基因序列或其片段的全长上80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。变体可以是在氨基酸序列或其片段的全长上大致相同的氨基酸序列。氨基酸序列可在氨基酸序列或其片段的全长上80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。

如本文所用的“载体”意指含有复制起点的核酸序列。载体可以是病毒载体、噬菌体、细菌人工染色体或酵母人工染色体。载体可以是DNA或RNA载体。载体可以是自我复制的染色体外载体，并优选地是DNA质粒。

对于本文数值范围的叙述来说，明确地涵盖具有相同精确度的介于其间的每个中间数字。例如，对于6-9的范围，除了6和9外还涵盖数字7和8，并且对于6.0-7.0的范围，明确涵盖了数字6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9以及7.0。

描述

本发明提供了一种肿瘤微环境抗原的优化的共有序列。在一个实施方案中，由优化的共有序列编码的抗原能够在哺乳动物中引发免疫应答。在一个实施方案中，由优化的共有序列编码的抗原可包含使其作为可诱导免疫应答的免疫原尤其有效的表位。

优化的共有序列可以是衍生自两种或更多种天然FAP蛋白的共有序列。优化的共有序列可包含共有序列和/或用于改进表达的修饰。修饰可包括密码子优化、RNA优化、添加kozak序列以便增加翻译起始和/或添加免疫球蛋白前导序列以增加免疫原性。由优化的共有序列编码的FAP抗原可包含信号肽诸如免疫球蛋白信号肽，例如但不限于免疫球蛋白E(IgE)或免疫球蛋白(IgG)信号肽。在一些实施方案中，由优化的共有序列编码的抗原可包含血凝素(HA)标签。由优化的共有序列编码的FAP抗原可被设计为引发比对应天然抗原更强的细胞和/或体液免疫应答。由优化的共有序列编码的FAP抗原可被设计为破坏耐受性并与抗癌免疫疗法协同作用。

在一个实施方案中，优化的共有FAP被设计为破坏对天然人类FAP的耐受性。在一个实施方案中，人类优化的共有FAP编码序列为如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3所列出。在一个实施方案中，人类优化的共有FAP编码的抗原具有SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所列出的氨基酸序列。

在一个实施方案中，优化的共有FAP被设计为破坏对天然小鼠FAP的耐受性。在一个实施方案中，小鼠优化的共有FAP编码序列为如SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7所列出。在一个实施方案中，小鼠优化的共有FAP编码的抗原具有如SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8所列出的氨基酸序列。

在一个实施方案中，优化的共有编码的FAP抗原可操作地连接至一种或多种调控元件。在一个实施方案中，调控元件是前导序列。在一个实施方案中，可操作地连接至IgE前导序列编码序列的优化的共有DNA序列在SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:7中列出。在一个实施方案中，可操作地连接至IgE前导序列的优化的共有编码的FAP抗原为如SEQ ID NO:4或SEQID NO:8所列出。

在一个实施方案中，调控元件是起始密码子。因此，在一个实施方案中，本发明涉及一种如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5所列出的核酸序列或其片段或同源物，其可操作地连接至在5’端处包含起始密码子的核苷酸序列。在一个实施方案中，本发明涉及一种如SEQID NO:2或SEQ ID NO:6所列出的氨基酸序列或其片段或同源物，其可操作地连接至由N端处的起始密码子编码的氨基酸(例如甲硫氨酸)。

在一个实施方案中，调控元件是至少一个终止密码子。因此，在一个实施方案中，本发明涉及一种如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7所列出的核酸序列或其片段或同源物，其可操作地连接至在3’端处包含至少一个起始密码子的核苷酸序列。在一个实施方案中，核苷酸序列可操作地连接两个终止密码子，以增加翻译终止的效率。

在一个实施方案中，编码FAP抗原的优化的共有序列可以编码具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8所列出的氨基酸序列的肽。在一个实施方案中，优化的共有序列可以具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7所列出的核苷酸序列。在一些实施方案中，序列可以是在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7中所列出的核苷酸序列的全长上具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列。在其他实施方案中，序列可以是编码在SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6或SEQ ID No:8所列出的氨基酸序列的整体长度上具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的核苷酸序列。

在一些实施方案中，优化的共有FAP抗原可以由RNA编码，所述RNA是来自在SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7中所列出的核酸序列的整体长度上具有至少约96％、97％、98％、99％或100％同一性的DNA序列的转录物。在一些实施方案中，优化的共有FAP抗原可以由RNA编码，所述RNA编码在SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8中所列出的氨基酸序列的整体长度上具有至少约96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

优化的共有编码的FAP抗原可以是具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8所列出的氨基酸序列的肽。在一些实施方案中，抗原可以具有在SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8中所列出的氨基酸序列的整体长度上具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列。

可以提供氨基酸序列与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8的免疫原性片段同源的蛋白质的免疫原性片段。此类免疫原性片段可以包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6和/或SEQ ID NO:8 95％同源的蛋白质。一些实施方案涉及与本文共有蛋白质序列的免疫原性片段具有96％同源性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文共有蛋白质序列的免疫原性片段具有97％同源性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文共有蛋白质序列的免疫原性片段具有98％同源性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文共有蛋白质序列的免疫原性片段具有99％同源性的免疫原性片段。在一些实施方案中，免疫原性片段包括前导序列，例如像免疫球蛋白前导物，诸如IgE前导物。在一些实施方案中，免疫原性片段不含前导序列。

在一个实施方案中，优化的共有FAP抗原的免疫原性片段编码全长优化的共有FAP抗原的至少一种免疫显性或亚免疫显性表位。SEQ ID NO:6中所列出的全长优化的共有FAP抗原的示例性免疫显性和亚免疫显性表位包括但不限于具有如SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:23以及SEQ ID NO:24中所列出的氨基酸序列的肽。

一些实施方案涉及SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7的免疫原性片段，所述免疫原性片段包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5或SEQ IDNO:7的全长的至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。免疫原性片段可与SEQ ID NO:1、SEQID NO:3、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7的片段至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同源。在一些实施方案中，免疫原性片段包括编码前导序列的序列，例如像免疫球蛋白前导物，诸如IgE前导物。在一些实施方案中，片段不含编码前导序列的编码序列。

免疫原性组合物

本文提供了免疫原性组合物，诸如疫苗，其包含优化的共有序列、优化的共有编码的抗原、其片段、其变体或其组合。免疫原性组合物可用于减少肿瘤生长或转移或防止肿瘤发展，从而治疗、预防和/或防御基于癌症的病理。免疫原性组合物可显著地诱导施用所述免疫原性组合物的受试者的免疫应答，由此在受试者中防御基于癌症的病理并治疗所述病理。

免疫原性组合物可以是DNA疫苗、肽疫苗、或DNA与肽疫苗的组合。DNA疫苗可包括编码抗原的优化的共有核苷酸序列。所述核苷酸序列可以是DNA、RNA、cDNA、其变体、其片段或其组合。核苷酸序列还可以包含编码通过肽键连接至抗原的接头序列、前导序列或标签序列的另外序列。肽疫苗可以包括抗原、其变体、其片段或其组合。DNA与肽疫苗的组合可包括以上所述的优化的共有核苷酸序列和编码的抗原。

在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物可用于引发针对特征在于表达FAP的肿瘤细胞(例如癌细胞)和转移性肿瘤病变的癌症的保护性抗肿瘤免疫力并预防所述癌症复发。

在一个实施方案中，本文所述的组合物和方法适用于治疗癌症和肿瘤细胞，即恶性和良性肿瘤，只要待治疗的细胞表达FAP即可。因此，在本文所述的方法和组合物的各种实施方案中，癌症可包括但不限于前列腺癌、肺癌、非小细胞肺癌、恶性肉瘤、乳腺癌、胰腺癌、黑素瘤、血癌(例如，白血病、淋巴瘤、骨髓瘤)、食管鳞状细胞癌、膀胱癌、结肠直肠癌、食道癌、胃癌、肝癌、头颈癌、脑癌、肛门癌、滑膜癌、睾丸癌、肝癌、宫颈癌、复发性呼吸道乳头状瘤病、皮肤癌和胃癌。

在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含FAP抗原。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含FAP抗原和一种或多种另外的癌症抗原。

在一个实施方案中，免疫原性组合物可为疫苗。疫苗可以是减毒活疫苗、使用重组载体递送抗原的疫苗、亚单位疫苗和糖蛋白疫苗，例如但不限于以下美国专利号中描述的疫苗：4,510,245；4,797,368；4,722,848；4,790,987；4,920,209；5,017,487；5,077,044；5,110,587；5,112,749；5,174,993；5,223,424；5,225,336；5,240,703；5,242,829；5,294,441；5,294,548；5,310,668；5,387,744；5,389,368；5,424,065；5,451,499；5,453,364；5,462,734；5,470,734；5,474,935；5,482,713；5,591,439；5,643,579；5,650,309；5,698,202；5,955,088；6,034,298；6,042,836；6,156,319以及6,589,529，所述专利各自以引用的方式并入本文。

本发明的疫苗可以具有有效疫苗所要求的特征，诸如为安全的，以使得疫苗本身不会引起疾病或死亡；防御疾病；诱导中和抗体；诱导保护性T细胞应答；以及提供施用容易性、很少副作用、生物稳定性以及每剂量的低成本。

用于治疗特定癌症的组合免疫原性组合物

免疫原性组合物可以是呈如上所述的抗原与一种或多种治疗特定癌症或肿瘤的癌症抗原的各种组合的形式。根据一种或多种癌症抗原的组合，可以用免疫原性组合物靶向各种癌症或其他肿瘤类型。这些癌症可包括但不限于前列腺癌、肺癌、非小细胞肺癌、恶性肉瘤、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、黑素瘤、血癌(例如，白血病、淋巴瘤、骨髓瘤)、食道癌鳞状细胞癌、膀胱癌、结肠直肠癌、食道癌、胃癌、肝癌、头颈癌、脑癌、肛门癌、滑膜癌、睾丸癌、肝癌、宫颈癌、复发性呼吸道乳头状瘤病、皮肤癌和胃癌。图6和图7提供了可用于治疗特定癌症的优化的共有抗原和肿瘤抗原的特定组合的实例。

癌症抗原

免疫原性组合物可包含一种或多种癌症抗原，诸如WT1、MUC1、LMP2、HPV E6 E7、EGFRvIII、HER-2/neu、个体基因型、MAGE A3、p53(非突变型)、NY-ESO-1、PSMA、GD2、CEA、MelanA/MART1、Ras-突变体、gp100、p53突变体、蛋白酶3(PR1)、Bcr-abl、酪氨酸酶、存活素、PSA、hTERT、EphA2、PAP、ML-IAP、AFP、EpCAM、ERG、NA17、PAX3、ALK、雄激素受体、细胞周期蛋白B1、聚唾液酸、MYCN、TRP-2、RhoC、GD3、岩藻糖基GM1、间皮素、PSCA、MAGE A1、sLe(a)、CYP1B1、PLAC1、GM3神经节苷脂、BORIS、Tn、GloboH、ETV6-AML、NY-BR-1、RGS5、SART3、STn、碳酸酐酶IX、PAX5、OY-TES1、精子蛋白17、LCK、HMWMAA、精子纤维鞘蛋白、AKAP-4、SSX2、XAGE1、B7H3、豆荚蛋白、Tie 2、Page4、VEGFR2、MAD-CT-1(鱼精蛋白2)、MAD-CT-2和FOS相关抗原1，以治疗或预防肿瘤相关病理。免疫原性组合物可进一步将一种或多种癌症抗原WT1、MUC1、LMP2、HPV E6 E7、EGFRvIII、HER-2/neu、独特型、MAGE A3、p53(非突变型)、NY-ESO-1、PSMA、GD2、CEA、MelanA/MART1、Ras-突变体、gp100、p53突变体、蛋白酶3(PR1)、Bcr-abl、酪氨酸酶、存活素、PSA、hTERT、EphA2、PAP、ML-IAP、AFP、EpCAM、ERG、NA17、PAX3、ALK、雄激素受体、细胞周期蛋白B1、聚唾液酸、MYCN、TRP-2、RhoC、GD3、岩藻糖基GM1、间皮素、PSCA、MAGEA1、sLe(a)、CYP1B1、PLAC1、GM3神经节苷脂、BORIS、Tn、GloboH、ETV6-AML、NY-BR-1、RGS5、SART3、STn、碳酸酐酶IX、PAX5、OY-TES1、精子蛋白17、LCK、HMWMAA、精子纤维鞘蛋白、AKAP-4、SSX2、XAGE 1、B7H3、豆荚蛋白、Tie 2、Page4、VEGFR2、MAD-CT-1(鱼精蛋白2)、MAD-CT-2和FOS相关抗原1与优化的共有FAP抗原组合，以用于治疗或预防肿瘤相关病理。癌症抗原的其他组合也可适用于治疗或预防肿瘤相关病理。

前列腺癌抗原

免疫原性组合物可包含一种或多种癌症抗原，诸如PSA、PSMA或STEAP，以治疗或预防前列腺癌(参见图12)。免疫原性组合物可以进一步将一种或多种癌症抗原PSA、PSMA或STEAP与FAP抗原组合，以用于治疗或预防前列腺癌。癌症抗原的其他组合也可适用于治疗或预防前列腺癌。示例性PSA、PSMA和STEP抗原以及编码此类抗原的核酸分子公开于PCT申请号PCT/US11/60592和对应的美国专利号8,927,692中，所述专利以引用的方式并入本文中。

肺癌抗原

免疫原性组合物可包含一种或多种癌症抗原，诸如TERT、CD22、MAGE-3和NY-ESO-1，以治疗或预防肺癌(参见图13)。免疫原性组合物可以进一步将一种或多种癌症抗原TERT、CD22、MAGE-3和NY-ESO-1与FAP抗原组合，以用于治疗或预防肺癌。癌症抗原的其他组合也可适用于治疗或预防肺癌。

乳腺癌抗原

免疫原性组合物可包含一种或多种癌症抗原，诸如HER2、MUC-1、CEA、MAGE-3和NY-ESO-1，以治疗或预防乳腺癌。免疫原性组合物可以进一步将一种或多种癌症抗原HER2、MUC-1、CEA、MAGE-3和NY-ESO-1与FAP抗原组合，以用于治疗或预防乳腺癌。癌症抗原的其他组合也可适用于治疗或预防乳腺癌。

胰腺癌抗原

免疫原性组合物可包含一种或多种癌症抗原，诸如MUC-1、CEA、HER2、间皮素、存活素和VEGFR2，以治疗或预防胰腺癌。免疫原性组合物可进一步将一种或多种癌症抗原MUC-1、CEA、HER2、间皮素、存活素和VEGFR2与FAP抗原组合，以用于治疗或预防胰腺癌。癌症抗原的其他组合也可适用于治疗或预防胰腺癌。

黑素瘤抗原

免疫原性组合物可包含一种或多种癌症抗原，诸如酪氨酸酶、PRAME或GP100-Trp2，以治疗或预防黑素瘤。免疫原性组合物可以进一步将一种或多种癌症抗原酪氨酸酶、PRAME或GP100-Trp2与FAP抗原组合，以用于治疗或预防黑素瘤。癌症抗原的其他组合也可适用于治疗或预防黑素瘤。

肝癌症抗原

免疫原性组合物可包含一种或多种癌症抗原，诸如HBV核心抗原、HBV表面抗原、HCVNS34A、HCVNS5A、HCV NS5B或HCVNS4B，以治疗或预防肝癌。免疫原性组合物可以进一步将一种或多种癌症抗原HBV核心抗原、HBV表面抗原、HCVNS34A、HCVNS5A、HCV NS5B或HCVNS4B与FAP抗原组合，以用于治疗或预防肝癌。癌症抗原的其他组合也可适用于治疗或预防肝癌。

胶质母细胞瘤抗原

免疫原性组合物可包含CMV，以治疗或预防胶质母细胞瘤。免疫原性组合物可进一步将CMV与FAP抗原组合，以用于治疗或预防胶质母细胞瘤。癌症抗原的其他组合也可适用于治疗或预防胶质母细胞瘤。

血癌症抗原(诸如白血病、淋巴瘤、骨髓瘤)

免疫原性组合物可包含一种或多种癌症抗原，诸如PRAME、WT-1、hTERT，以治疗或预防血癌，诸如白血病、淋巴瘤和骨髓瘤。免疫原性组合物可以进一步将一种或多种癌症抗原PRAME、WT-1、hTERT与血癌诸如白血病、淋巴瘤和骨髓瘤的FAP抗原组合。癌症抗原的其他组合也可适用于治疗或预防血癌，诸如白血病、淋巴瘤和骨髓瘤癌。

免疫应答

免疫原性组合物可在施用所述组合物的受试者中诱导免疫应答。所诱导的免疫应答可对天然抗原具有特异性。所诱导的免疫应答可以与和优化的共有编码的抗原相关的天然抗原反应。在各种实施方案中，相关抗原包括与优化的共有编码的抗原的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同源性的氨基酸序列的抗原。在各种实施方案中，相关抗原包括由与本文所公开的优化的共有核苷酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同源性的核苷酸序列编码的抗原。

免疫原性组合物可在施用所述免疫原性组合物的受试者中诱导体液免疫应答。所诱导的体液免疫应答可对天然抗原具有特异性。所诱导的体液免疫应答可以与和优化的共有编码的抗原相关的天然抗原反应。体液免疫应答可在施用免疫原性组合物的受试者中被诱导约1.5倍至约16倍、约2倍至约12倍、或约3倍至约10倍。体液免疫应答可在施用免疫原性组合物的受试者中与未施用免疫原性组合物的受试者或施用未优化的FAP抗原的受试者相比被诱导至少约1.5倍、至少约2.0倍、至少约2.5倍、至少约3.0倍、至少约3.5倍、至少约4.0倍、至少约4.5倍、至少约5.0倍、至少约5.5倍、至少约6.0倍、至少约6.5倍、至少约7.0倍、至少约7.5倍、至少约8.0倍、至少约8.5倍、至少约9.0倍、至少约9.5倍、至少约10.0倍、至少约10.5倍、至少约11.0倍、至少约11.5倍、至少约12.0倍、至少约12.5倍、至少约13.0倍、至少约13.5倍、至少约14.0倍、至少约14.5倍、至少约15.0倍、至少约15.5倍、或至少约16.0倍。

由免疫原性组合物诱导的体液免疫应答可包括与未施用免疫原性组合物的受试者相比增加的与施用免疫原性组合物的受试者有关的中和抗体水平。中和抗体可以对与优化的共有编码的抗原相关的天然抗原具有特异性。中和抗体可以与在遗传上和优化的共有抗原相关的天然抗原反应。中和抗体可在施用免疫原性组合物的受试者中提供针对肿瘤生长、转移或肿瘤相关病理的保护和/或治疗。

由免疫原性组合物诱导的体液免疫应答可包括与未施用免疫原性组合物的受试者相比增加的与施用免疫原性组合物的受试者有关的IgG抗体水平。这些IgG抗体可对与优化的共有抗原遗传相关的天然抗原具有特异性。这些IgG抗体可以与在遗传上和优化的共有抗原相关的天然抗原反应。与施用免疫原性组合物的受试者有关的IgG抗体水平与未施用免疫原性组合物的受试者相比可增加约1.5倍至约16倍、约2倍至约12倍、或约3倍至约10倍。与施用免疫原性组合物的受试者有关的IgG抗体水平与未施用免疫原性组合物的受试者或施用未优化的FAP抗原的受试者相比可增加了至少约1.5倍、至少约2.0倍、至少约2.5倍、至少约3.0倍、至少约3.5倍、至少约4.0倍、至少约4.5倍、至少约5.0倍、至少约5.5倍、至少约6.0倍、至少约6.5倍、至少约7.0倍、至少约7.5倍、至少约8.0倍、至少约8.5倍、至少约9.0倍、至少约9.5倍、至少约10.0倍、至少约10.5倍、至少约11.0倍、至少约11.5倍、至少约12.0倍、至少约12.5倍、至少约13.0倍、至少约13.5倍、至少约14.0倍、至少约14.5倍、至少约15.0倍、至少约15.5倍、或至少约16.0倍。

免疫原性组合物可在施用所述免疫原性组合物的受试者中诱导细胞免疫应答。所诱导的细胞免疫应答可以对与优化的共有编码的抗原相关的天然抗原具有特异性。所诱导的细胞免疫应答可以与和优化的共有编码的抗原相关的天然抗原反应。所诱导的细胞免疫应答可包括引发CD8⁺ T细胞应答。引发的CD8⁺ T细胞应答可以与在遗传上和优化的共有抗原相关的天然抗原反应。所引发的CD8⁺ T细胞应答可以是多功能的。所诱导的细胞免疫应答可包括引发CD8⁺ T细胞应答，其中CD8⁺ T细胞产生干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素-2(IL-2)、或IFN-γ与TNF-α的组合。

所诱导的细胞免疫应答可包括与未施用免疫原性组合物的受试者相比增强的与施用免疫原性组合物的受试者有关的CD8⁺ T细胞应答。与施用免疫原性组合物的受试者有关的CD8⁺ T细胞应答与未施用免疫原性组合物的受试者相比可增强了约2倍至约30倍、约3倍至约25倍、或约4倍至约20倍。与施用免疫原性组合物的受试者有关的CD8⁺ T细胞应答与未施用免疫原性组合物的受试者或施用未优化的FAP抗原的受试者相比可增强了至少约1.5倍、至少约2.0倍、至少约3.0倍、至少约4.0倍、至少约5.0倍、至少约6.0倍、至少约6.5倍、至少约7.0倍、至少约7.5倍、至少约8.0倍、至少约8.5倍、至少约9.0倍、至少约9.5倍、至少约10.0倍、至少约10.5倍、至少约11.0倍、至少约11.5倍、至少约12.0倍、至少约12.5倍、至少约13.0倍、至少约13.5倍、至少约14.0倍、至少约14.5倍、至少约15.0倍、至少约16.0倍、至少约17.0倍、至少约18.0倍、至少约19.0倍、至少约20.0倍、至少约21.0倍、至少约22.0倍、至少约23.0倍、至少约24.0倍、至少约25.0倍、至少约26.0倍、至少约27.0倍、至少约28.0倍、至少约29.0倍、或至少约30.0倍。

所诱导的细胞免疫应答可包括增加的对天然抗原反应的CD107a/IFNγ/T-bet三阳性CD8 T细胞的出现率。与施用免疫原性组合物的受试者有关的CD107a/IFNγ/T-bet三阳性CD8 T细胞的出现率与未施用免疫原性组合物的受试者或施用未优化的FAP抗原的受试者相比可增加了至少约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、或20倍。

所诱导的细胞免疫应答可包括增加的对天然抗原反应的CD107a/IFNγ双阳性CD8T细胞的出现率。与施用免疫原性组合物的受试者有关的CD107a/IFNγ双阳性CD8 T细胞的出现率与未施用免疫原性组合物的受试者或施用未优化的FAP抗原的受试者相比可增加了至少约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、或14倍。

由免疫原性组合物诱导的细胞免疫应答可包括引发CD4⁺ T细胞应答。所引发的CD4⁺ T细胞应答可以与在遗传上和优化的共有抗原相关的天然抗原反应。所引发的CD4⁺ T细胞应答可以是多功能的。所诱导的细胞免疫应答可包括引发CD4⁺ T细胞应答，其中CD4⁺ T细胞产生IFN-γ、TNF-α、IL-2、或IFN-γ与TNF-α的组合。

所诱导的细胞免疫应答可包括增加的产生IFN-γ的CD4⁺ T细胞的出现率。与施用免疫原性组合物的受试者有关的CD4⁺IFN-γ⁺ T细胞的出现率与未施用免疫原性组合物的受试者或施用未优化的FAP抗原的受试者相比可增加了至少约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、或20倍。

所诱导的细胞免疫应答可包括增加的产生TNF-α的CD4⁺ T细胞的出现率。与施用免疫原性组合物的受试者有关的CD4⁺TNF-α⁺ T细胞的出现率与未施用免疫原性组合物的受试者或施用未优化的FAP抗原的受试者相比可增加了至少约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、21倍、或22倍。

所诱导的细胞免疫应答可包括增加的产生IFN-γ和TNF-α的CD4⁺ T细胞的出现率。与施用免疫原性组合物的受试者有关的CD4⁺IFN-γ⁺TNF-α⁺的出现率与未施用免疫原性组合物的受试者或施用未优化的FAP抗原的受试者相比可增加了至少约2倍、2.5倍、3.0倍、3.5倍、4.0倍、4.5倍、5.0倍、5.5倍、6.0倍、6.5倍、7.0倍、7.5倍、8.0倍、8.5倍、9.0倍、9.5倍、10.0倍、10.5倍、11.0倍、11.5倍、12.0倍、12.5倍、13.0倍、13.5倍、14.0倍、14.5倍、15.0倍、15.5倍、16.0倍、16.5倍、17.0倍、17.5倍、18.0倍、18.5倍、19.0倍、19.5倍、20.0倍、21倍、22倍、23倍、24倍、25倍、26倍、27倍、28倍、29倍、30倍、31倍、32倍、33倍、34倍、或35倍。

本发明的免疫原性组合物可以具有有效疫苗所要求的特征，诸如为安全的，以使得疫苗本身不会引起疾病或死亡；防御由暴露于活的病原体(诸如病毒或细菌)引起的疾病；诱导中和抗体来预防细胞的感染；诱导针对细胞内病原体的保护性T细胞；以及提供施用容易性、很少副作用、生物稳定性以及每剂量的低成本。

当施用至不同组织(诸如肌肉或皮肤)时，免疫原性组合物可以进一步诱导免疫应答。当通过电穿孔或注射施用或者皮下或肌内施用时，免疫原性组合物可进一步诱导免疫应答。

片段

在一个实施方案中，免疫原性片段是本发明的全长抗原的免疫原性片段。如本文所用，免疫原性片段是全长核酸或氨基酸序列的片段，其可以诱导与全长序列的免疫应答显着类似的免疫应答。在一个实施方案中，免疫原性片段包含全长序列的免疫原性表位。在一个实施方案中，免疫原性片段诱导与全长序列相比至少约0.7倍、至少约0.8倍、至少约0.9倍、至少约1.0倍、至少约1.1倍、至少约1.2倍、至少约1.3倍、至少约1.4倍、至少约1.5倍、至少约2.0倍或大于2.0倍的免疫应答。

免疫原性片段可在施用所述免疫原性片段的受试者中诱导体液免疫应答。体液免疫应答可在施用免疫原性片段的受试者中被诱导约1.5倍至约16倍、约2倍至约12倍、或约3倍至约10倍。体液免疫应答可在施用免疫原性片段的受试者中与未施用免疫原性片段的受试者相比被诱导至少约1.5倍、至少约2.0倍、至少约2.5倍、至少约3.0倍、至少约3.5倍、至少约4.0倍、至少约4.5倍、至少约5.0倍、至少约5.5倍、至少约6.0倍、至少约6.5倍、至少约7.0倍、至少约7.5倍、至少约8.0倍、至少约8.5倍、至少约9.0倍、至少约9.5倍、至少约10.0倍、至少约10.5倍、至少约11.0倍、至少约11.5倍、至少约12.0倍、至少约12.5倍、至少约13.0倍、至少约13.5倍、至少约14.0倍、至少约14.5倍、至少约15.0倍、至少约15.5倍、或至少约16.0倍。

由免疫原性片段诱导的体液免疫应答可包括与未施用免疫原性片段的受试者相比增加的与施用免疫原性片段的受试者有关的IgG抗体水平。与施用免疫原性片段的受试者有关的IgG抗体水平与未施用免疫原性片段的受试者相比可增加了约1.5倍至约16倍、约2倍至约12倍、或约3倍至约10倍。与施用免疫原性片段的受试者有关的IgG抗体水平与未施用免疫原性片段的受试者相比可增加了至少约1.5倍、至少约2.0倍、至少约2.5倍、至少约3.0倍、至少约3.5倍、至少约4.0倍、至少约4.5倍、至少约5.0倍、至少约5.5倍、至少约6.0倍、至少约6.5倍、至少约7.0倍、至少约7.5倍、至少约8.0倍、至少约8.5倍、至少约9.0倍、至少约9.5倍、至少约10.0倍、至少约10.5倍、至少约11.0倍、至少约11.5倍、至少约12.0倍、至少约12.5倍、至少约13.0倍、至少约13.5倍、至少约14.0倍、至少约14.5倍、至少约15.0倍、至少约15.5倍、或至少约16.0倍。

免疫原性片段可在施用所述免疫原性片段的受试者中诱导细胞免疫应答。所诱导的细胞免疫应答可以对与优化的共有编码的抗原相关的天然抗原具有特异性。所诱导的细胞免疫应答可以与和优化的共有编码的抗原相关的天然抗原反应。所诱导的细胞免疫应答可包括引发CD8⁺ T细胞应答。引发的CD8⁺ T细胞应答可以与在遗传上和优化的共有抗原相关的天然抗原反应。所引发的CD8⁺ T细胞应答可以是多功能的。所诱导的细胞免疫应答可包括引发CD8⁺ T细胞应答，其中CD8⁺ T细胞产生干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素-2(IL-2)、或IFN-γ与TNF-α的组合。

所诱导的细胞免疫应答可包括与未施用免疫原性片段的受试者相比增强的与施用免疫原性片段的受试者有关的CD8⁺ T细胞应答。与施用免疫原性片段的受试者有关的CD8⁺ T细胞应答与未施用免疫原性片段的受试者相比可增强了约2倍至约30倍、约3倍至约25倍、或约4倍至约20倍。与施用免疫原性片段的受试者有关的CD8⁺ T细胞应答与未施用免疫原性片段的受试者相比可增强了至少约1.5倍、至少约2.0倍、至少约3.0倍、至少约4.0倍、至少约5.0倍、至少约6.0倍、至少约6.5倍、至少约7.0倍、至少约7.5倍、至少约8.0倍、至少约8.5倍、至少约9.0倍、至少约9.5倍、至少约10.0倍、至少约10.5倍、至少约11.0倍、至少约11.5倍、至少约12.0倍、至少约12.5倍、至少约13.0倍、至少约13.5倍、至少约14.0倍、至少约14.5倍、至少约15.0倍、至少约16.0倍、至少约17.0倍、至少约18.0倍、至少约19.0倍、至少约20.0倍、至少约21.0倍、至少约22.0倍、至少约23.0倍、至少约24.0倍、至少约25.0倍、至少约26.0倍、至少约27.0倍、至少约28.0倍、至少约29.0倍、或至少约30.0倍。

所诱导的细胞免疫应答可包括增加的对天然抗原反应的CD107a/IFNγ/T-bet三阳性CD8 T细胞的出现率。与施用免疫原性片段的受试者有关的CD107a/IFNγ/T-bet三阳性CD8 T细胞的出现率与未施用免疫原性片段的受试者相比可增加了至少约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、或20倍。

所诱导的细胞免疫应答可包括增加的对天然抗原反应的CD107a/IFNγ双阳性CD8T细胞的出现率。与施用免疫原性片段的受试者有关的CD107a/IFNγ双阳性CD8 T细胞的出现率与未施用免疫原性片段的受试者相比可增加了至少约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、或14倍。

由免疫原性片段诱导的细胞免疫应答可包括引发CD4⁺ T细胞应答。所引发的CD4⁺T细胞应答可以与在遗传上和优化的共有抗原相关的天然抗原反应。所引发的CD4⁺ T细胞应答可以是多功能的。所诱导的细胞免疫应答可包括引发CD4⁺ T细胞应答，其中CD4⁺ T细胞产生IFN-γ、TNF-α、IL-2、或IFN-γ与TNF-α的组合。

所诱导的细胞免疫应答可包括增加的产生IFN-γ的CD4⁺ T细胞的出现率。与施用免疫原性片段的受试者有关的CD4⁺IFN-γ⁺ T细胞的出现率与未施用免疫原性片段的受试者相比可增加了至少约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、或20倍。

所诱导的细胞免疫应答可包括增加的产生TNF-α的CD4⁺ T细胞的出现率。与施用免疫原性片段的受试者有关的CD4⁺TNF-α⁺ T细胞的出现率与未施用免疫原性片段的受试者相比可增加了至少约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、21倍、或22倍。

所诱导的细胞免疫应答可包括增加的产生IFN-γ和TNF-α的CD4⁺ T细胞的出现率。与施用免疫原性片段的受试者有关的CD4⁺IFN-γ⁺TNF-α⁺的出现率与未施用免疫原性片段的受试者相比可增加了至少约2倍、2.5倍、3.0倍、3.5倍、4.0倍、4.5倍、5.0倍、5.5倍、6.0倍、6.5倍、7.0倍、7.5倍、8.0倍、8.5倍、9.0倍、9.5倍、10.0倍、10.5倍、11.0倍、11.5倍、12.0倍、12.5倍、13.0倍、13.5倍、14.0倍、14.5倍、15.0倍、15.5倍、16.0倍、16.5倍、17.0倍、17.5倍、18.0倍、18.5倍、19.0倍、19.5倍、20.0倍、21倍、22倍、23倍、24倍、25倍、26倍、27倍、28倍、29倍、30倍、31倍、32倍、33倍、34倍、或35倍。

本发明的免疫原性片段可以具有有效疫苗所要求的特征，诸如为安全的，以使得疫苗本身不会引起疾病或死亡；防御由暴露于活的病原体(诸如病毒或细菌)引起的疾病；诱导中和抗体来预防细胞的感染；诱导针对细胞内病原体的保护性T细胞；以及提供施用容易性、很少副作用、生物稳定性以及每剂量的低成本。

当施用至不同组织(诸如肌肉或皮肤)时，免疫原性片段可以进一步诱导免疫应答。当通过电穿孔或注射施用或者皮下或肌内施用时，免疫原性片段可进一步诱导免疫应答。

载体

所述免疫原性组合物可包含一种或多种包括编码抗原的优化的共有核苷酸的载体。所述一种或多种载体能够表达抗原。载体可以具有含有复制起点的核苷酸序列。载体可以是质粒、噬菌体、细菌人工染色体或酵母人工染色体。载体可以是自主复制的染色体外载体，或整合到宿主基因组中的载体。

一种或多种载体可以是表达构建体，所述表达构建体通常是用于将特定基因引入靶细胞中的质粒。一旦表达载体位于细胞内部，那么通过细胞转录和翻译机器核糖体复合物产生由基因编码的蛋白质。质粒经常经过工程改造以含有调控序列，所述调控序列充当增强子和启动子区域，并且导致表达载体上携带的基因的有效转录。本发明的载体表达大量稳定的信使RNA，和因此形成的蛋白质。

载体可具有表达信号(诸如强启动子、强终止密码子)、启动子与克隆基因之间的距离的调节以及转录终止序列和PTIS(可移动翻译起始序列)的插入。

(1)表达载体

载体可以是环状质粒或线性核酸。环状质粒和线性核酸能够指导适当的受试者细胞中的特定核苷酸序列的表达。载体可以具有可操作地连接至编码抗原的核苷酸序列的启动子，所述核苷酸序列可以可操作地连接至终止信号。载体还可以含有核苷酸序列的正确翻译所需的序列。包含目标核苷酸序列的载体可以是嵌合的，这意味着至少一种其组分相对于至少一种它的其他组分是异源的。表达盒中的核苷酸序列的表达可在组成型启动子或诱导型启动子的控制下，所述启动子仅在宿主细胞暴露于一些特定外部刺激时起始转录。在多细胞有机体的情况下，启动子还可以是对特定组织或器官或发育阶段特异性的。

(2)RNA载体

在一个实施方案中，核酸为RNA分子。因此，在一个实施方案中，本发明提供了一种编码一种或多种MAYV抗原的RNA分子。RNA可以是正链的。因此，在一些实施方案中，RNA分子可被细胞翻译而无需任何插入的复制步骤诸如逆转录。适用于本发明的RNA分子可具有5'帽(例如7-甲基鸟苷)。该帽可以增强RNA的体内翻译。适用于本发明的RNA分子的5'核苷酸可具有5'三磷酸基团。在加帽的RNA中，这可通过5'-至-5'桥连接至7-甲基鸟苷。RNA分子可具有3'聚-A(多聚腺苷酸)尾。所述分子还可在其3'端附近包含聚-A聚合酶识别序列(例如AAUAAA)。适用于本发明的RNA分子可以是单链的。在一些实施方案中，RNA分子为裸RNA分子。在一个实施方案中，RNA分子包含在载体内。

在一个实施方案中，RNA具有5'和3'UTR。在一个实施方案中，5'UTR的长度是零与3000个核苷酸之间。待添加到编码区的5'和3'UTR序列的长度可通过不同的方法来改变，包括但不限于设计用于进行PCR的退火到不同的UTR区域的引物。使用这种方法，本领域的普通技术人员可在转染转录的RNA之后修改实现最佳翻译效率所需要的5'和3'UTR长度。

5'和3'UTR可以是感兴趣的基因的天然存在的内源性5'和3'UTR。可替代地，对于感兴趣的基因不是内源性的UTR序列可通过将UTR序列并入到正向和反向引物中或通过对模板的任何其他修饰来添加。使用对于感兴趣的基因不是内源性的UTR序列可用于修改RNA的稳定性和/或翻译效率。例如，已知3'UTR序列中的富含AU的元件可降低RNA的稳定性。因此，基于本领域中熟知的UTR的特性，3'UTR可被选择或设计来增加转录的RNA的稳定性。

在一个实施方案中，5'UTR可包含内源性基因的Kozak序列。可替代地，当对于感兴趣的基因不是内源性的5'UTR通过如上所述的PCR进行添加时，共有Kozak序列可通过添加5'UTR序列来重新设计。Kozak序列可增加一些RNA转录物的翻译效率，但是似乎对于实现高效翻译并非对于所有RNA均是需要的。对于许多RNA而言需要Kozak序列是本领域中已知的。在其他实施方案中，5'UTR可来源于其RNA基因组在细胞中是稳定的RNA病毒。在其他实施方案中，各种核苷酸类似物可用于3'或5'UTR中来阻止RNA的外切核酸酶降解。

在一个实施方案中，RNA具有在5'端上的帽和3'聚(A)尾，其决定核蛋白体结合、翻译的启动和细胞中RNA的稳定性。

在一个实施方案中，RNA是核苷修饰的RNA。核苷修饰的RNA相对于未修饰的RNA具有特别的优点，包括例如增加的稳定性、较低或不存在的先天免疫原性和增强的翻译。

(3)环状载体和线性载体

载体可以是环状质粒，所述环状质粒可通过整合至细胞基因组中来转化靶细胞或存在于染色体外(例如，具有复制起点的自主复制质粒)。

载体可以是pVAX、pcDNA3.0或provax，或能够表达编码抗原的DNA并且使细胞能将序列翻译成由免疫系统识别的抗原的任何其他表达载体。

本文也提供一种能够通过电穿孔高效递送至受试者中且表达一种或多种所需抗原的线性核酸免疫原性组合物或线性表达盒(“LEC”)。LEC可以是没有任何磷酸主链的任何线性DNA。DNA可编码一种或多种抗原。LEC可包含启动子、内含子、终止密码子和/或多腺苷酸化信号。抗原的表达可受启动子控制。LEC可不包含任何抗生素抗性基因和/或磷酸主链。LEC可不含有与所需抗原基因表达无关的其他核苷酸序列。

LEC可源自能够线性化的任何质粒。质粒可能够表达抗原。质粒可以是pNP(PuertoRico/34)或pM2(New Caledonia/99)。质粒可以是WLV009、pVAX、pcDNA3.0或provax，或能够表达编码抗原的DNA并且使细胞能将序列翻译成由免疫系统识别的抗原的任何其他表达载体。

LEC可以是pcrM2。LEC可以是pcrNP。pcrNP和pcrMR可以分别源自pNP(PuertoRico/34)和pM2(New Caledonia/99)。

(4)启动子、内含子、终止密码子和多腺苷酸化信号

载体可具有启动子。启动子可以是能够驱动基因表达并且调控所分离核酸的表达的任何启动子。所述启动子是为通过DNA依赖性RNA聚合酶进行转录所需的顺式作用序列元件，所述RNA聚合酶转录本文所述的抗原序列。用于指导异源核酸表达的启动子的选择取决于具体应用。在载体中，启动子可定位在距离转录起始点与其天然环境中距离转录起始位点大约相同的位置上。然而，可容许所述距离的变化而不丧失启动子功能。

启动子可以可操作地连接至编码抗原以及转录物的有效多腺苷酸化、核糖体结合位点和翻译终止所需的信号的核苷酸序列。启动子可以是CMV启动子、SV40早期启动子、SV40晚期启动子、金属硫蛋白启动子、鼠乳腺肿瘤病毒启动子、劳斯(Rous)肉瘤病毒启动子、多角体蛋白启动子，或对于真核细胞中的表达显示有效的另一种启动子。

载体可包含增强子和具有功能性剪接供体和受体位点的内含子。载体可含有位于结构基因下游的转录终止区来提供有效终止。可从与启动子序列相同的基因获得或可从不同的基因获得终止区。

多种载体

免疫原性组合物可包含单个核酸分子诸如单个质粒的多个拷贝或两个或更多个不同的核酸分子诸如两个或更多个不同的质粒的多个拷贝。例如，免疫原性组合物可包含两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种或十种或更多种不同的核酸分子中的多种。此类组合物可包含两种、三种、四种、五种、六种或更多种不同的质粒中的多种。

免疫原性组合物可包含共同含有单一抗原的编码序列的核酸分子，诸如质粒。在一个实施方案中，抗原为FAP。免疫原性组合物可包含共同含有多种抗原的编码序列的核酸分子，诸如质粒。在一个实施方案中，抗原是选自FAP和另外的癌症抗原的多种抗原。在一个示例性实施方案中，抗原是FAP和TERT。在另一个示例性实施方案中，抗原是FAP和PSMA。免疫原性组合物可包含共同含有一种或多种抗原和一种或多种癌症抗原的编码序列的核酸分子，诸如质粒。

免疫原性组合物的赋形剂和其他组分

免疫原性组合物可还包含药学上可接受的赋形剂。药学上可接受的赋形剂可为作为媒介物、佐剂、载体或稀释剂的功能分子。药学上可接受的赋形剂可为转染促进剂，其可包括表面活性剂，诸如免疫刺激复合物(ISCOMS)、弗氏(Freunds)不完全佐剂、LPS类似物(包括单磷酰脂质A)、胞壁酰肽、醌类似物、囊泡(如角鲨烯(squalene)和角鲨烯(squalene))、透明质酸、脂质、脂质体、钙离子、病毒蛋白、聚阴离子、聚阳离子或纳米颗粒，或其他已知的转染促进剂。

所述转染促进剂是聚阴离子、聚阳离子(包括聚-L-谷氨酸(LGS))或脂质。所述转染促进剂是聚-L-谷氨酸，并且更优选地，所述聚-L-谷氨酸以小于6mg/ml的浓度存在于免疫原性组合物中。转染促进剂还可包括表面活性剂，诸如免疫刺激复合物(ISCOMS)、弗氏不完全佐剂、LPS类似物(包括单磷酰脂质A)、胞壁酰肽、醌类似物以及囊泡(诸如角鲨烯和角鲨烯)，并且透明质酸还可结合基因构建体施用而使用。在一些实施方案中，基于DNA质粒的免疫原性组合物还可以包括转染促进剂，诸如脂质；脂质体，包括卵磷脂脂质体或本领域已知的其他脂质体，为DNA脂质体混合物(参见例如W09324640)；钙离子；病毒蛋白；聚阴离子；聚阳离子或纳米颗粒；或者其他已知的转染促进剂。优选地，所述转染促进剂是聚阴离子、聚阳离子(包括聚-L-谷氨酸(LGS))或脂质。免疫原性组合物中的转染剂的浓度小于4mg/ml、小于2mg/ml、小于1mg/ml、小于0.750mg/ml、小于0.500mg/ml、小于0.250mg/ml、小于0.100mg/ml、小于0.050mg/ml或小于0.010mg/ml。

药学上可接受的赋形剂可为一种或多种佐剂。佐剂可以是由相同质粒或由替代性质粒表达的或在免疫原性组合物中作为蛋白质与以上质粒的组合递送的其他基因。一种或多种佐剂可以是蛋白质和/或编码选自由以下组成的组的蛋白质的核酸分子：CCL20、α-干扰素(IFN-α)、β-干扰素(IFN-β)、γ-干扰素、血小板衍生性生长因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、皮肤T细胞虏获趋化因子(CTACK)、上皮胸腺表达趋化因子(TECK)、粘膜相关上皮趋化因子(MEC)、IL-12、IL-15、IL-18、IL-23、IL-28、MHC、CD80、CD86、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-18、MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、IL-8、L-选择素、P-选择素、E-选择素、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac-1、pl50.95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-18的突变形式、CD40、CD40L、血管生长因子、成纤维细胞生长因子、IL-7、神经生长因子、血管内皮生长因子、Fas、TNF受体、Flt、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、半胱天冬酶ICE、Fos、c-jun、Sp-1、Ap-1、Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、无活性NIK、SAP K、SAP-1、JNK、干扰素应答基因、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK配体、Ox40、Ox40配体、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAP1、TAP2、及其功能片段、或其组合。在一些实施方案中，佐剂可以是一种或多种蛋白质和/或编码选自由以下组成的组的蛋白质的核酸分子：RANTES、IL-12、IL-15、IL-23、IL-28、CTACK、TECK、MEC、OX40和DR5。IL-12构建体和序列的实例公开于PCT申请号PCT/US12/69017和对应的美国专利号9,272,024，所述专利以引用的方式并入本文中。IL-15构建体和序列的实例公开于PCT申请号PCT/US04/18962和对应的美国专利号8,173,786，所述专利各自以引用的方式并入本文中。IL-23构建体和序列的实例公开于PCT申请号PCT/US14/25348和对应的美国申请序列号14/775,087，所述专利各自以引用的方式并入本文中。IL-28构建体和序列的实例公开于PCT申请号PCT/US09/039648和对应的美国申请序列号12/936,192，所述专利各自以引用的方式并入本文中。IL-28构建体和序列的实例公开于PCT申请号PCT/US09/039648和对应的美国申请序列号12/936,192，所述专利各自以引用的方式并入本文中。RANTES和其他构建体和序列的实例公开于PCT申请号PCT/US1999/004332和对应的美国专利号8,119,395，所述专利各自以引用的方式并入本文中。RANTES构建体和序列的其他实例公开于PCT申请号PCT/US11/024098和对应的美国专利号9.034,313，所述专利以引用的方式并入本文中。趋化因子CTACK、TECK和MEC构建体和序列的实例公开于PCT申请号PCT/US2005/042231和对应的美国申请序列号11/719,646，所述专利各自以引用的方式并入本文中。OX40和其他免疫调节剂的实例公开于美国申请序列号10/560,653中，所述申请以引用的方式并入本文中。DR5和其他免疫调节剂的实例公开于美国申请序列号09/622,452中，所述申请以引用的方式并入本文中。

免疫原性组合物可以包含的共有抗原和质粒的量为约1纳克到100毫克；约1微克到约10毫克；或者优选地约0.1微克到约10毫克；或者更优选地约1毫克到约2毫克。在一些优选实施方案中，根据本发明的药物组合物包含约5纳克至约1000微克DNA。在一些优选实施方案中，药物组合物含有约10纳克至约800微克DNA。在一些优选的实施方案中，所述药物组合物含有约0.1微克至约500微克的DNA。在一些优选的实施方案中，所述药物组合物含有约1微克至约350微克的DNA。在一些优选的实施方案中，药物组合物含有约25至约250微克、约100至约200微克、约1纳克至100毫克；约1微克到约10毫克；约0.1微克到约10毫克；约1毫克至约2毫克、约5纳克至约1000微克、约10纳克至约800微克、约0.1至约500微克、约1至约350微克、约25至约250微克、约100至约200微克的共有抗原或其质粒。

在一些实施方案中，根据本发明的药物组合物包含至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100纳克疫苗核酸。在一些实施方案中，药物组合物可包含至少1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95,100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、405、410、415、420、425、430、435、440、445、450、455、460、465、470、475、480、485、490、495、500、605、610、615、620、625、630、635、640、645、650、655、660、665、670、675、680、685、690、695、700、705、710、715、720、725、730、735、740、745、750、755、760、765、770、775、780、785、790、795、800、805、810、815、820、825、830、835、840、845、850、855、860、865、870、875、880、885、890、895.900、905、910、915、920、925、930、935、940、945、950、955、960、965、970、975、980、985、990、995或1000微克疫苗核酸。在一些实施方案中，药物组合物可包含至少1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10mg或更多的疫苗核酸。

在其他实施方案中，药物组合物可包含多达并包括15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100纳克疫苗核酸。在一些实施方案中，药物组合物可包含多达并包括1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95,100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、405、410、415、420、425、430、435、440、445、450、455、460、465、470、475、480、485、490、495、500、605、610、615、620、625、630、635、640、645、650、655、660、665、670、675、680、685、690、695、700、705、710、715、720、725、730、735、740、745、750、755、760、765、770、775、780、785、790、795、800、805、810、815、820、825、830、835、840、845、850、855、860、865、870、875、880、885、890、895.900、905、910、915、920、925、930、935、940、945、950、955、960、965、970、975、980、985、990、995或1000微克疫苗核酸。在一些实施方案中，药物组合物可包含多达并包括1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10mg疫苗核酸。

可以根据待使用的施用方式来配制免疫原性组合物。可注射的疫苗药物组合物可以是无菌、不含热原并且不含微粒的。可使用等渗制剂或溶液。用于等渗性的添加剂可包括氯化钠、右旋糖、甘露糖醇、山梨糖醇和乳糖。疫苗可包含血管收缩剂。等渗溶液可包括磷酸盐缓冲盐水。免疫原性组合物可还包含稳定剂，其包括明胶和白蛋白。稳定化可允许制剂在室温下或环境温度下稳定延长的时间段，诸如向疫苗制剂中加入LGS或聚阳离子或聚阴离子。

免疫原性组合物可以是稳定的，在室温(25℃)下稳定超过1周，在一些实施方案中超过2周，在一些实施方案中超过3周，在一些实施方案中超过4周，在一些实施方案中超过5周，并且在一些实施方案中超过6周。在一些实施方案中，疫苗稳定超过一个月、超过2个月、超过3个月、超过4个月、超过5个月、超过6个月、超过7个月、超过8个月、超过9个月、超过10个月、超过11个月、或超过12个月。在一些实施方案中，疫苗稳定超过1年、超过2年、超过数年、或超过5年。在一个实施方案中，免疫原性组合物在冷藏(2℃-8℃)下是稳定的。因此，在一个实施方案中，免疫原性组合物不需要冷冻冷藏链。如果免疫原性组合物保持其生物活性足够的时间段以允许其预期用途(例如，在受试者中生成免疫应答)，则所述免疫原性组合物是稳定的。例如，对于待储存、运输等的免疫原性组合物，可能需要免疫原性组合物保持稳定数月至数年。

疫苗接种的方法

本文还提供了一种治疗、防御和/或预防有需要的受试者中的疾病的方法，其通过向所述受试者施用免疫原性组合物来进行。向受试者施用免疫原性组合物可在所述受试者中诱导或引发免疫应答。所诱导的免疫应答可用于治疗、预防和/或防御疾病，例如一种或多种肿瘤相关病理。

所诱导的免疫应答可包括诱导的体液免疫应答和/或诱导的细胞免疫应答。体液免疫应答可被诱导了约1.5倍至约16倍、约2倍至约12倍、或约3倍至约10倍。所诱导的体液免疫应答可包括对抗原有反应性的IgG抗体和/或中和抗体。所诱导的细胞免疫应答可包括CD8⁺ T细胞应答，其被诱导了约2倍至约30倍、约3倍至约25倍、或约4倍至约20倍。

免疫原性组合物剂量可以是在1μg至10mg之间的活性组分/kg体重/时间，并且可以是20μg至10mg组分/kg体重/时间。可以每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、或31天施用免疫原性组合物。用于有效治疗的免疫原性组合物剂量的数目可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10。

可以根据制药领域技术人员所熟知的标准技术来配制免疫原性组合物。这类组合物可通过医学领域技术人员熟知的技术以考虑到诸如具体受试者中的年龄、性别、体重和病状以及施用途径的剂量来施用。

可以预防性地或治疗性地施用免疫原性组合物。在预防性施用中，可以足以诱导免疫应答的量施用免疫原性组合物。在治疗性应用中，以足以引发治疗效果的量向有需要的受试者施用免疫原性组合物。将足够实现此目标的量定义为“治疗有效剂量”。对于这种用途有效的量取决于例如所施用的免疫原性组合物方案的具体组成、施用方式、疾病的阶段和严重程度、患者的总体健康状况以及处方医师的判断。

免疫原性组合物可以通过本领域已熟知的方法施用，如Donnelly等人(1997,Ann.Rev.Immunol.15:617-648)；Felgner等人(1996年12月3日发布的美国专利号5,580,859)；Felgner(1997年12月30日发布的美国专利号5,703,055)；以及Carson等人(1997年10月21日发布的美国专利号5,679,647)所述。可以例如使用疫苗枪将免疫原性组合物的DNA与可以施用至个体的颗粒或珠粒进行复合。本领域的技术人员将知道药学上可接受的载体(包括生理学上可接受的化合物)的选择取决于(例如)表达载体的施用途径。

可以通过多种途径来递送免疫原性组合物。典型的递送途径包括肠胃外施用，例如，皮内、肌内或皮下递送。其他途径包括口服施用、鼻内和阴道内途径。特别是对于免疫原性组合物的DNA，可以将免疫原性组合物递送到个体组织的间隙空间中(Felgner等人，美国专利号5,580,859和5,703,055，所有所述专利的内容均以引用的方式整体并入本文中)。还可以将免疫原性组合物施用至肌肉，或可以通过皮内或皮下注射或经皮(诸如通过离子电渗疗法)施用。还可以采用免疫原性组合物的表皮施用。表皮施用可以涉及机械地或化学地刺激表皮的最外层，以刺激对刺激物的免疫应答(Carson等，美国专利号5,679,647，所述专利的内容以引用的方式整体并入本文)。

还可以配制免疫原性组合物，以用于通过鼻通道施用。适合用于经鼻施用的制剂(其中载体是固体)可以包括具有(例如)在约10微米至约500微米范围中的颗粒大小的粗糙粉末，所述粗糙粉末以其中采用鼻吸的方式来施用，即，通过鼻道从靠近鼻子的粉末的容器中快速吸入。制剂可以是鼻用喷雾剂、滴鼻剂或通过喷雾器进行气雾剂施用。制剂可以包含免疫原性组合物的水性溶液或油性溶液。

免疫原性组合物可以是液体制剂，诸如混悬剂、糖浆或酏剂。免疫原性组合物还可以是用于肠胃外、皮下、皮内、肌肉内或静脉内施用(例如，可注射施用)的制剂，诸如无菌混悬剂或乳剂。

免疫原性组合物可以掺入脂质体、微球体或其他聚合物基质中(Felgner等人，美国专利号5,703,055；Gregoriadis,Liposome Technology,第I至III卷(第2版，1993)，所述专利的内容以引用的方式整体并入本文中)。脂质体可以由磷脂或其他脂质组成，并且可以是制造和施用相对简单的无毒的、生理学上可接受的和可代谢的载体。

可以通过电穿孔，诸如通过美国专利号7,664,545中所描述的方法来施用免疫原性组合物，所述专利的内容以引用的方式并入本文。电穿孔可以通过美国专利号6,302,874、5,676,646、6,241,701、6,233,482、6,216,034、6,208,893、6,192,270、6,181,964、6,150,148、6,120,493、6,096,020、6,068,650和5,702,359中所描述的方法和/或装置来进行，所述专利的内容以引用的方式整体并入本文。可通过微创设备来进行电穿孔。

微创电穿孔设备(“MID”)可以是用于将以上所描述的免疫原性组合物和相关流体注射至身体组织中的装置。所述设备可包括中空针、DNA盒和流体递送部件，其中所述设备适于在使用中致动流体递送部件，以便在将针插入身体组织中的过程中同时(例如，自动地)将DNA注射至所述身体组织中。这具有以下优点：在插入针的同时逐渐注射DNA和相关流体的能力导致通过身体组织的流体的更均匀分布。由于注射的DNA分布在较大面积上，可减少注射过程中经受的疼痛。

MID可在不使用针的情况下将免疫原性组合物注射至组织中。MID可将免疫原性组合物作为小的流或射流以使免疫原性组合物穿透组织表面并进入下层组织和/或肌肉的力进行注射。小的流或射流之后的力可由压缩气体(诸如在几分之一秒内通过微小孔的二氧化碳)的膨胀提供。微创电穿孔装置的实例及其使用方法描述于公布的美国专利申请号20080234655；美国专利号6,520,950；美国专利号7,171,264；美国专利号6,208,893；美国专利号6,009,347；美国专利号6,120,493；美国专利号7,245,963；美国专利号7,328,064；以及美国专利号6,763,264，所述专利各自的内容以引用的方式并入本文中。

MID可包括产生无痛地穿透组织的液体的高速射流的注射器。这类无针注射器可商购获得。可在本文中利用的无针注射器的实例包括美国专利号3,805,783；4,447,223；5,505,697；及4,342,310中所述的那些，这些专利的内容各自以引用的方式并入本文。

可以使用无针注射器将呈适用于直接或间接电转运形式的所需的免疫原性组合物引入(例如注射)至待治疗的组织中，通常通过将组织表面与注射器接触，以便以足以导致免疫原性组合物渗透至组织中的力致动药剂射流的递送。例如，如果待治疗的组织是粘膜、皮肤或肌肉，那么将药剂朝向粘膜或皮肤表面以足以导致药剂渗透穿过角质层并且进入真皮层中或分别进入下层组织和肌肉中的力进行喷射。

无针注射器非常适合于将免疫原性组合物递送至所有类型的组织，特别是递送至皮肤和粘膜。在一些实施方案中，无针注射器可以用于将含有免疫原性组合物的液体推送至表面并且进入受试者的皮肤或粘膜中。可以使用本发明的方法治疗的各种类型的组织的代表性实例包括胰腺、喉、鼻咽、下咽部、口咽、唇、咽、肺、心脏、肾、肌肉、乳房、结肠、前列腺、胸腺、睾丸、皮肤、粘膜组织、卵巢、血管或其任何组合。

MID可具有将组织电穿孔的针电极。通过在多电极阵列(例如设置成矩形或正方形图案)中的多对电极之间脉冲来提供优于在一对电极之间脉冲的结果的改进的结果。例如于题为“Needle Electrodes for Mediated Delivery of Drugs and Genes”的美国专利号5,702,359中公开针阵列，其中可在治疗性处理过程中对多对针产生脉冲。在所述应用中(其以引用的方式并入本文，如同其全文陈述一样)，针安置在环形阵列中，但具有连接器和转换装置，从而实现相对对的针电极之间的脉冲。可使用用于将重组表达载体递送至细胞的一对针电极。这种设备和系统在美国专利号6,763,264中进行描述，所述专利的内容以引用的方式并入本文。另选地，可使用单针设备，所述设备允许DNA注射和使用类似于正常注射针的单针电穿孔并且施加比通过目前所使用设备递送的电压低的电压的脉冲，从而减少患者经受的电感觉。

MID可包括一个或多个电极阵列。阵列可包括具有相同直径或不同直径的两个或多个针。针可均匀或不均匀地间隔开。针可介于0.005英寸与0.03英寸之间、0.01英寸与0.025英寸之间，或0.015英寸与0.020英寸之间。针的直径可以是0.0175英寸。针可间隔开0.5mm、1.0mm、1.5mm、2.0mm、2.5mm、3.0mm、3.5mm、4.0mm或更多。

MID可由脉冲发生器和在单个步骤中递送免疫原性组合物和电穿孔脉冲的两个或更多个针免疫原性组合物注射器组成。脉冲发生器可允许通过闪存卡操作的个人计算机灵活地编程脉冲和注射参数，以及电穿孔和患者数据的全面记录和储存。脉冲发生器可在短的时间段期间递送多种伏特脉冲。例如，脉冲发生器可递送100ms持续时间的三个15伏特脉冲。所述MID的实例是Inovio Biomedical Corporation的Elgen 1000系统，所述系统在美国专利号7,328,064中进行描述，所述专利的内容以引用的方式并入本文。

MID可以是CELLECTRA(Inovio Pharmaceuticals，Blue Bell PA)设备和系统，其是便于将大分子(诸如DNA)引入身体或植物中选定组织的细胞中的模块化电极系统。模块化电极系统可包括多个针电极、皮下针、提供从可编程恒流脉冲控制器至多个针电极的导电链路的电连接器，以及电源。操作者可以抓住固定在支撑结构上的多个针电极并将它们坚固地插入到身体或植物中所选定的组织中。然后通过皮下针将大分子递送到选定组织中。启动可编程的恒定电流脉冲控制器，并将恒定电流电脉冲施加到多个针电极中。所施加的恒流电脉冲促进将大分子引入多个电极之间的细胞中。由于细胞的过度加热造成的细胞死亡通过借助于恒流脉冲限制组织中的功率消耗而得以最小化。Cellectra设备和系统在美国专利号7,245,963中进行描述，所述专利的内容以引用的方式并入本文。

MID可以是Elgen 1000系统(Inovio Pharmaceuticals)。Elgen 1000系统可包括提供中空针的设备；和流体递送部件，其中装置适于在使用中致动流体递送部件，以便在将针插入身体组织中的过程中同时(例如，自动地)将流体(本文所描述的免疫原性组合物)注射至所述身体组织中。优点是：在插入针的同时逐渐注射流体的能力导致通过身体组织的流体的更均匀分布。还据信，由于注射的流体的体积分布在较大面积上，减少了在注射过程中经受的疼痛。

此外，流体的自动注射有助于所注射流体的实际剂量的自动监测和配准。可以根据需要出于文件编制目的通过控制单元来储存这一数据。

应理解，注射速率可以是线性或非线性的，并且可在已经将针插入穿过待治疗的受试者中的皮肤之后并且在将所述针进一步插入身体组织中时进行注射。

可通过本发明的装置将流体注射至其中的适合组织包括肿瘤组织、皮肤或肝组织，但也可以是肌肉组织。

装置还包括用于引导针插入身体组织中的针插入部件。通过针插入的速率来控制流体注射的速率。这具有以下优点：既可以控制针插入，又可以控制流体的注射，以使得可以根据需要使插入速率与注射速率相匹配。它还使装置更易于用户操作。如果需要，可以提供用于将针自动地插入身体组织中的部件。

用户可以选择何时开始流体的注射。然而，理想地，在针的尖端到达肌肉组织时开始注射，并且装置可包括用于感测针何时插入至足以开始注射流体的深度的部件。这意味着当针达到所需深度(其将通常是肌肉组织开始处的深度)时，可以提示以自动地开始流体的注射。肌肉组织开始处的深度可以(例如)采用为预设针插入深度(诸如4mm的值)，所述深度将被认为是对于针穿过皮肤层来说是足够的。

感测部件可包括超声探针。感测部件可包括用于感测阻抗或电阻的变化的部件。在这种情况下，部件可不如此记录针在身体组织中的深度，而将相反适于随着针从不同类型的身体组织移动至肌肉中来感测阻抗或电阻的变化。这些替代方案中的任一个提供相对准确和简单地操作的感测可开始注射的部件。还可根据需要记录针的插入深度，并且所述深度可以用于控制流体的注射，以使得根据正被记录的针的插入深度来确定待注射的流体的体积。

装置可还包括：用于支撑针的底座和用于在其中接纳底座的壳体，其中底座可相对于壳体移动，以使得当底座相对于壳体处于第一后方位置时，针缩回壳体内，并且当底座在壳体内处于第二前方位置时，针延伸出壳体外。由于壳体可以在患者的皮肤上对准，并且然后可以通过相对于底座移动壳体来将针插入患者的皮肤中，所以这对于用户来说是有利的。

如上所述，希望实现流体注射的受控速率，以使得在将针插入皮肤中时，流体在针的长度上均匀分布。流体递送部件可包括适于以受控速率注射流体的活塞驱动部件。可以(例如)通过伺服马达来激活活塞驱动部件。然而，可通过在轴向方向上相对于壳体移动的底座来致动活塞驱动部件。应理解，可以提供用于流体递送的替代装置。因此，(例如)可以提供可以被挤压用于以受控或非受控速率流体递送的封闭容器来代替注射管和活塞系统。

以上所描述的装置可以用于任何类型的注射。然而，设想到它在电穿孔的领域中尤其有用，并且因此它可还包括用于向针施加电压的部件。这允许针不仅用于注射，而且还用作电穿孔过程中的电极。这一点是尤其有利的，因为它意味着电场被施加至与所注射的流体相同的面积上。电穿孔在传统上存在的问题在于很难使电极与先前注射的流体准确对准，且因此使用者已倾向于在较大区域注射体积大于所需的流体且在较大区域施加电场以试图保证注射物质与电场之间重叠。使用本发明，可减少所注射流体的体积和所施加电场的大小，同时实现电场与流体之间的良好配合。

制备核酸质粒的方法

本文提供了用于制备核酸质粒的方法，所述核酸质粒包含本文中讨论的基于核酸的免疫原性组合物。所述核酸质粒在最终亚克隆步骤进入哺乳动物表达质粒之后，可用于在大型发酵罐中使用本领域已知的方法接种细胞培养物。

可以使用已知装置和技术的组合来配制或制造用于本发明的EP装置的核酸质粒。在一些实例中，在这些研究中使用的核酸质粒可以按大于或等于10mg/mL的浓度来配制。制造技术还包括或并入本领域普通技术人员普遍已知的各种设备和方案，除在美国序列号60/939792中所述的那些外，还包括2007年7月3日公告的许可专利、美国专利号7,238,522中所述的那些。上文引用的申请和专利、美国序列号60/939,792和美国专利号7,238,522的全部内容地分别并入本文。

治疗方法

免疫原性组合物可用于在哺乳动物中生成或引发免疫应答，所述免疫应答与有需要的受试者的FAP反应或针对所述FAP。在一个实施方案中，免疫原性组合物可用于预防或治疗受试者中的癌症。在一个实施方案中，癌症表达FAP。因此，免疫原性组合物可用于在施用免疫原性组合物的受试者中治疗和/或预防表达FAP的癌症的方法中。在一个实施方案中，免疫原性组合物可用于预防受试者中表达FAP的癌症的原发性或初始发生。在一个实施方案中，免疫原性组合物可用于预防受试者中表达FAP的癌症的复发。

在一些实施方案中，免疫应答可以生成体液免疫应答和/或抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答，其在施用免疫原性组合物的受试者中不会引起各种组织或系统(例如，脑或神经系统等)的损伤或炎症。

在一些实施方案中，所施用的免疫原性组合物可以在受试者中增加癌症的存活，减小肿瘤尺寸或其组合。所施用的免疫原性组合物可在受试者中使癌症存活增加5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、以及60％或更多。所施用的免疫原性组合物可在免疫之后在受试者中使肿瘤尺寸减小了5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、以及70％或更多。

所施用的免疫原性组合物可使受试者中的细胞免疫应答增强约5倍至约6000倍、约50倍至约5500倍、约50倍至约5000倍、约50倍至约4500倍、约100倍至约6000倍、约150倍至约6000倍、约200倍至约6000倍、约250倍至约6000倍、或约300倍至约6000倍。在一些实施方案中，所施用的免疫原性组合物可使受试者中的细胞免疫应答增强约5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、100倍、150倍、200倍、250倍、300倍、350倍、400倍、450倍、500倍、550倍、600倍、650倍、700倍、750倍、800倍、850倍、900倍、950倍、1000倍、1100倍、1200倍、1300倍、1400倍、1500倍、1600倍、1700倍、1800倍、1900倍、2000倍、2100倍、2200倍、2300倍、2400倍、2500倍、2600倍、2700倍、2800倍、2900倍、3000倍、3100倍、3200倍、3300倍、3400倍、3500倍、3600倍、3700倍、3800倍、3900倍、4000倍、4100倍、4200倍、4300倍、4400倍、4500倍、4600倍、4700倍、4800倍、4900倍、5000倍、5100倍、5200倍、5300倍、5400倍、5500倍、5600倍、5700倍、5800倍、5900倍、或6000倍。

所施用的免疫原性组合物可使受试者中的干扰素γ(IFN-γ)水平增加约5倍至约6000倍、约50倍至约5500倍、约50倍至约5000倍、约50倍至约4500倍、约100倍至约6000倍、约150倍至约6000倍、约200倍至约6000倍、约250倍至约6000倍、或约300倍至约6000倍。在一些实施方案中，所施用的疫苗可使受试者中的IFN-γ水平增加约50倍、100倍、150倍、200倍、250倍、300倍、350倍、400倍、450倍、500倍、550倍、600倍、650倍、700倍、750倍、800倍、850倍、900倍、950倍、1000倍、1100倍、1200倍、1300倍、1400倍、1500倍、1600倍、1700倍、1800倍、1900倍、2000倍、2100倍、2200倍、2300倍、2400倍、2500倍、2600倍、2700倍、2800倍、2900倍、3000倍、3100倍、3200倍、3300倍、3400倍、3500倍、3600倍、3700倍、3800倍、3900倍、4000倍、4100倍、4200倍、4300倍、4400倍、4500倍、4600倍、4700倍、4800倍、4900倍、5000倍、5100倍、5200倍、5300倍、5400倍、5500倍、5600倍、5700倍、5800倍、5900倍、或6000倍。

疫苗剂量可以是在1μg至10mg之间的活性组分/kg体重/时间，并且可以是20μg至10mg组分/kg体重/时间。可以每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、或31天施用疫苗。用于有效治疗的疫苗剂量的数目可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10。

施用途径

所述免疫原性组合物或药物组合物可以通过不同的途径来施用，所述途径包括口服、胃肠外、舌下、经皮、经直肠、粘膜、局部地、通过吸入、通过颊施用、胸腔内、静脉内、动脉内、腹膜内、皮下、肌肉内、鼻囊内以及关节内或其组合。对于兽医使用，所述组合可以根据标准的兽医规范而作为适当可接受制剂来施用。兽医可以轻易地确定最适合于特定动物的给药方案和施用途径。所述免疫原性组合物可以通过传统的注射器、无针注射设备、“微粒轰击枪”或其他物理方法如电穿孔(“EP”)、“流体动力学方法”或超声波来施用。

疫苗的载体可以通过若干熟知的技术来施用至哺乳动物，所述技术包括在有和没有体内电穿孔、脂质体介导的纳米颗粒促进的重组载体情况下的DNA注射(也被称为DNA疫苗接种)，所述重组载体如重组腺病毒、重组腺病毒伴随病毒以及重组牛痘。本发明的优化的共有FAP抗原可以通过DNA注射连同体内电穿孔来施用。

试剂盒

本文提供了一种试剂盒，其可用于使用如上所述的接种方法治疗受试者。试剂盒可以包括免疫原性组合物。

试剂盒还可包含用于进行如上所述的接种方法和/或如何使用试剂盒的说明书。试剂盒中所容纳的说明书可附于包装材料上或可作为包装插入物包括在内。虽然说明书通常是书写或印刷的材料，但它们不限于此类。本公开涵盖能够储存说明书并且将它们传达给最终用户的任何介质。所述媒介包括但不限于电子存储媒介(例如，磁盘、磁带、磁片盒)、光学媒介(例如，CD ROM)等。本文所用，术语“说明书”可以包括提供说明书的网站(internet site)的地址。

本发明具有多个方面，所述方面通过以下非限制性实施例说明。

实验实施例

可参考以下实验实施例对本发明进行进一步详述。这些实施例仅出于说明目的而提供且并非旨在进行限制，除非另外指明。因此，本发明不应以任何方式被解释为限于以下实施例，而是应被解释为涵盖因本文提供的教导而变得显而易见的任何和所有变化。

无需进一步描述，据信本领域的普通技术人员可使用先前的描述和以下说明性实施例，制备和利用本发明并实践所要求保护的方法。因此，以下工作实施例特别指出本发明的优选实施方案，并且不应被解释为以任何方式限制本公开的其余部分。

实施例1：合成的共有FAP免疫原性组合物

FAP蛋白是在活化的成纤维细胞上表达的蛋白酶和明胶酶。FAP在人类癌症中(包括在前列腺癌和胰腺癌中)的>90％癌症相关成纤维细胞中表达。FAP也在与伤口愈合有关的成纤维细胞以及骨和软组织肉瘤的恶性细胞中表达。针对FAP的抗体(例如西布珠单抗)和FAP的小分子抑制剂(例如talabostat)是安全的，但在临床试验中显示功效最小。

在过去十年中，对开发靶向表达FAP的细胞的免疫疗法的兴趣激增(Fang等人,2016,Mol Ther Oncolytics,3:16007；Gottschalk等人,2013,PLoS One,8:e82658；Zhang和Ertl,2016,Oncotarget,7:23282–99；Xia等人,2016,Cancer Immunol Immunother,65:613–624；Wen等人,2010,Cancer Sci,101:2325–2332；Xia等人,2016,34:4526-4535；Chen等人,2015,Sci Rep,5:14421；Loeffler等人,2006,J Clin Invest,116:1955–1962)。在此，已开发出一种靶向FAP的DNA疫苗，所述疫苗将新颖改进结合到DNA疫苗设计策略中。结合的最新重要改进是使用合成微共有(μCon)序列来帮助破坏耐受性。对于不同的肿瘤相关抗原威尔姆氏瘤1(WT1)，先前已证实，与天然小鼠WT1共享约95％同源性的合成的共有疫苗在破坏耐受性并在C57Bl/6小鼠中生成抗肿瘤免疫力方面为优越的(Walters等人,2017,Mol Ther,25:976-988)。在此，使用遗传多样性的远交小鼠扩展了这一概念，以证明这种针对FAP的共有疫苗设计优于天然小鼠FAP疫苗序列。虽然用天然FAP疫苗免疫的个体小鼠确实显示出应答并且能够破坏耐受性，但是在μCon FAP免疫的小鼠组中应答总体上更广泛且更高。

重要的是，开发的μCon FAP DNA疫苗与TERT和PSMA肿瘤靶向疫苗协同作用，生成比单独的每种疫苗更强大的抗肿瘤免疫力。μCon FAP疫苗可改变肿瘤微环境的环境，以使PSMA疫苗具有更强大的抗肿瘤效果(Yadav等人,2014,Nature,515:572–576)。

该研究表明FAP是用于癌症免疫疗法的可行的治疗性疫苗靶标，并且当与肿瘤抗原疫苗疗法组合使用时显示出特别的功效。用于靶向FAP的其他基因治疗方法(诸如嵌合抗原受体疗法)具有一些毒性问题(Wang等人,2014,Cancer Immunol Res,2:154–166)。因此，基于DNA的疫苗方法可能是更安全且更容易获得的替代方案。

现在描述所述方法。

DNA质粒

通过比对来自与小鼠和人类相关的动物(诸如大鼠、猕猴和仓鼠)的20个FAP序列来生成合成的微共有(μCon)FAP序列。使用ClustalX2比对这些序列。在质粒中仅编码细胞外结构域序列(氨基酸26-761)，并且将其因此用于比对(图1A)。引入另外的突变S624A以阻断FAP的二肽基肽酶和明胶分解活性。所有序列均为RNA，并且在N端用Kozak序列进行密码子优化并在N端用IgE前导序列进行密码子优化。将所使用的所有质粒均克隆到修饰的pVax1载体(GenScript)中。最终的μCon小鼠FAP序列与天然小鼠FAP共享95.1％的序列同一性，这使用Mega6计算。

细胞培养和转染

将293T细胞(ATCC)和TC-1细胞(来自Yvonne Paterson博士的礼物)保持在补充有10％胎牛血清(FBS)的杜氏改良伊格尔培养基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium，DMEM)中。将TRAMP-C2肿瘤细胞系(ATCC)保持在补充有5％FBS、5％NuSerum IV、10nM脱氢异雄甾酮和0.005mg/mL牛胰岛素的DMEM(具有Glutamax+4.5g/L D-葡萄糖)中。常规测试所有细胞系的支原体污染，并保持在低传代下(对于细胞培养<20代，对于小鼠植入<5代)。为了证实FAP疫苗构建体的表达，根据制造商的指导使用lipofectamine 3000用每种质粒转染293T细胞。在转染后48小时收获细胞裂解液。用补充有不含EDTA的蛋白酶抑制剂(Roche)的RIPA裂解缓冲液(Cell Signaling Technology)裂解细胞。

动物免疫

57Bl/6、Balb/c和CD-1远交小鼠购自Jackson Laboratory。通过向胫骨内侧(TA)肌肉注射30μL DNA(DNA的μg量在图例中指示)来免疫小鼠，然后使用-3P装置(Inovio Pharmaceuticals)使用电穿孔(EP)递送两个0.1安培电恒定电流方波脉冲。所使用的疫苗计划表在每张图或图例中指出。

肿瘤攻击研究

对于肿瘤攻击研究，将50,000个TC-1细胞或1,000,000个TRAMP-C2细胞分别皮下植入到雌性C57Bl/6小鼠或雄性C57Bl/6小鼠的右翼中。在植入后一周(用于TC-1植入)或四天(用于TRAMP-C2植入)，将小鼠随机分入治疗组。然后每周一次免疫小鼠，共进行四次免疫。每周两次监测肿瘤，并且使用电子卡尺测量。使用以下公式计算肿瘤体积：体积＝(π/6)*(高度)*(宽度2)。当肿瘤直径达到1.5cm时，对小鼠实施安乐死。

脾细胞和肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)分离

在补充有10％FBS的RPMI培养基中收获来自免疫小鼠的脾脏。使用匀质器解离脾细胞，过滤并使用ACK裂解缓冲液(LifeTechnologies)裂解红细胞。通过40μm过滤器过滤细胞，并且计数并铺板以用于染色或用于ELISpot。使用解剖刀机械解离肿瘤，并且然后在胶原酶I、II和IV(170mg/L，ThermoFisher)、DNA酶I(12.5mg/L，Roche)、弹性蛋白酶(25mg/L，Worthington)于Hyclone L-15 Leibowitz培养基(ThermoFisher)和RPMI+10％FBS+1％青霉素/链霉素50/50混合物的混合物中温育。然后通过40μm过滤器将解离的细胞过滤两次，并铺板以用于刺激和染色。

ELISpot测定

使用MABTECH小鼠IFN-γ ELISpotPLUS板进行ELISpot测定。简言之，每孔铺板200,000个脾细胞，并在肽(重叠9个氨基酸的15-聚体肽)存在下刺激24小时。在RPMI+10％FBS培养基中用5μg/mL每种肽刺激细胞。根据制造商的说明书对斑点进行显色和定量。将单独的培养基和伴刀豆球蛋白A刺激的细胞分别用作阴性对照和阳性对照。通过从肽刺激的孔中减去单独培养基孔来计算每百万个细胞的斑点形成单位(SFU)。使用ImmunoSpot CTL读取器读取斑点。

细胞内细胞因子染色和流式细胞术

用蛋白质转运抑制剂混合物(eBioscience)用天然小鼠FAP肽刺激脾细胞或TIL 5小时。将细胞刺激混合物(加上蛋白质转运抑制剂)和完全培养基(R10)分别用作阳性对照和阴性对照。在刺激期间，将细胞与FITCα-小鼠CD107a(克隆1D4B，Biolegend)一起温育以检测脱粒。在刺激后，将细胞与LIVE/DEAD紫试剂(LIVE/DEAD violet)一起温育以检测活力。然后在室温下将细胞与表面染色剂一起温育30分钟。然后使用FoxP3/转录因子固定/透化试剂盒(eBioscience)固定细胞并透化。然后在4℃下在细胞内染色剂中将细胞温育1小时。所使用的抗体列表包含在补充方法中。在14-或18-色LSRII流式细胞分析仪(BDBioscience)上运行所有样品，并使用FlowJo软件分析。

流式细胞术染色抗体

以下抗体用于此研究中：PECy5αCD3(克隆145-2C11，BD Pharmingen)、BV510αCD4+(克隆RM4-5，Biolegend)、BV605αTNFα(克隆MP6-XT22)、PEαT-bet(克隆4B10，Biolegend)、APCαFoxP3(克隆FJK-16s，eBioscience)、APCCy7αCD8+(克隆53-6.7，Biolegend)、AF700αCD44(克隆IM7，Biolegend)、APCαIFNγ(克隆XMG1.2，Biolegend)、BV510αCD11b(M1/70，Biolegend)、BV605αCD11c(N418，Biolegend)、PE/Cy7αCD68(FA-11，Biolegend)、AF700αCD86(GL-1，Biolegend)、PEαArg1(IC5868P，R&D)、PE/Cy7αCD86(GL-1，Biolegend)、PE/Cy7αCD83(Michel-19，Biolegend)、BV650αCD80(16-10A1，Biolegend)、APCαF4/80(BM8，Biolegend)、AF700αF4/80(BM8，Biolegend)、PEαB220(RA3-6B2，Biolegend)、FITCαCD45(30-F11，Biolegend)、BV510αNK1.1(PK136，Biolegend)、APC/Cy7αMHCII(M5/114.15.2，Biolegend)、以及PE/Cy7αCD25(PC61.5，eBioscience)。

蛋白质印迹

在4-12％Bis-Tris NuPAGE凝胶(ThermoFisher Scientific)上运行细胞裂解物，并且随后转移至PVDF膜(Millipore)。将膜用Odyssey封闭缓冲液在室温下封闭1小时，并与第一抗体(抗-FAP ABT11，Millipore，1:1000，或者抗肌动蛋白AC-15，Sigma，1:10,000)在4℃下温育过夜。用PBS中的0.1％Tween-20洗涤膜，并与第二抗体IRDye 680RD山羊抗小鼠和IRDye 800CW山羊抗兔(LiCor)的1:10,000稀释液一起温育。使用LiCor Odyssey CLx成像系统对膜进行显色和分析。

ELISA

在处死前从小鼠收集血清以通过酶联免疫吸附测定(ELISA)确定抗体应答。在4℃下将Maxisorp 96孔板用PBS中的1μg/mL小鼠FAP蛋白(分离酶重组蛋白，MyBiosource，26-761个氨基酸片段)包被过夜。在室温下将板用PBS中的10％胎牛血清(FCS)封闭1小时。所有洗涤均在PBS中的0.2％Tween-20(PBST)中进行。对于终点结合滴度，在PBST中的1％FCS中使用血清的1:50稀释液，然后使用4-四个稀释液，以用于稀释曲线。在室温下使用抗小鼠IgG HRP(1:5000)作为第二抗体1小时。在室温下使用Sigma Fast OPD片将板显色10分钟。使用1M H2SO4终止显色。使用微板读取器读取450nm处的吸光度。

免疫荧光/免疫组织化学染色

对于免疫荧光或免疫组织化学染色，将组织包埋并在O.C.T.(Tissue-Tek)中在干冰上冷冻并且储存在-80℃，或固定在10％中性缓冲福尔马林中，并且随后进行石蜡包埋。对于透明质素染色，将冷冻组织切片到PermaFrost载玻片上，并且然后在室温下在3.7％多聚甲醛-PBS、70％乙醇、5％冰醋酸的混合物中固定15分钟。然后将载玻片在PBS中冲洗并在室温下用PBS中的1％牛血清白蛋白(BSA)封闭30分钟。在4℃下将生物素化的透明质素结合蛋白(HABP，Millipore)添加到以1:1000稀释的封闭剂中过夜。将载玻片在PBS中洗涤，并且然后在室温下在黑暗中在1:500的封闭溶液中加入链霉抗生物素蛋白AF488缀合物，持续1小时。用PBS洗涤载玻片并用具有DAPI的ProLong Gold防褪色剂固定。对于F4/80和CD8+染色，在室温下将冷冻切片在4％多聚甲醛-PBS中固定15分钟。将载玻片在PBS中洗涤并在室温下用0.5％Triton X-100透化15分钟。然后用PBS中的2.5％BSA和5％山羊血清封闭载玻片1小时，并且然后用抗生物素蛋白/生物素封闭试剂盒(Vector Labs)封闭。将第一F4/80(F4/80-生物素，BM8 1:2000)和CD8+α(CD8+α-生物素，53-6.7，1:2000)抗体在封闭缓冲液中在4℃下温育过夜。在用PBS洗涤后，将载玻片与TSA-生物素(PerkinElmer)一起在室温下温育8分钟以进行信号放大，并且然后与链霉抗生物素蛋白AF488(1:500)一起在室温下温育30分钟。随后洗涤载玻片并用具有DAPI的ProLong Gold防褪色剂固定。对于FAP染色，将石蜡包埋的组织切片到PermaFrost载玻片上。将切片脱石蜡，再水合并且与第一抗体(FAP-生物素，R&D BAF3715，1:40)在4℃下温育过夜。然后将载玻片与第二抗体(链霉抗生物素蛋白-HRP，1:1000)在室温下温育1小时，并用苏木精复染。石蜡包埋的组织的染色由宾夕法尼亚大学癌症组织学中心进行。

使用Zeiss LSM共聚焦显微镜(免疫荧光图像，宾夕法尼亚大学细胞和发育生物学显微镜中心)或用于明视场图像的Nikon 80i直立显微镜对所有载玻片进行成像。对每个肿瘤样品获取至少5张图像以用于定量。使用Fiji/ImageJ软件进行图像分析。

统计学分析

对于动物实验，误差条表示平均值±平均值标准误差(SEM)。对于具有多于两个实验组的实验，通过单向或双向ANOVA，然后进行Tukey氏事后HSD检验来确定统计学显着性。对于仅具有两个组的动物实验，使用双尾学生t检验确定显着性。对于小鼠肿瘤存活研究，通过Gehan-Breslow-Wilcoxon检验确定显着性。

现在描述结果

微共有(μCon)FAP DNA疫苗的设计和体外表达

FAP是具有大的细胞外结构域和小的细胞质尾部和跨膜结构域的膜结合酶。对于疫苗设计，构建了一种质粒，所述质粒仅含有在N端融合至免疫球蛋白E(IgE)前导序列的FAP的细胞外结构域(氨基酸26-761)，以提高蛋白质产生效率并促进分泌(图1B)。为了便于破坏对天然小鼠FAP(mFAP)序列的耐受性，使用来自NCBI数据库中的各种相关物种并提供一些序列多样性但结构保守的序列比对来设计微共有(μCon)序列。该μCon序列与天然蛋白质序列共享95.1％同源性(图1A)。此外，优化的共有FAP在催化结构域中含有S624A取代，以阻断可溶性FAP酶的二肽基肽酶和明胶分解活性(图1B和图1C)。类似地，出于比较目的生成mFAP质粒，所述质粒与mFAP序列共享100％同源性，并且另外含有相同的序列优化，包括IgE前导序列的添加和RNA/密码子优化。在转染的293T细胞的裂解物中体外检测天然和μConFAP质粒二者的表达(图1D)。

μCon FAP DNA疫苗在C57Bl/6小鼠中的免疫原性

为了确定μCon FAP DNA疫苗是否具有免疫原性并能够破坏小鼠中的耐受性，通过用EP肌内注射来用不同剂量的μCon FAP DNA疫苗(5μg、10μg、25μg和50μg)免疫C57Bl/6小鼠(图2A)。以两周的间隔对小鼠进行三次免疫，并在最后一次免疫后一周收集脾细胞以用于分析(图2A)。使用与疫苗序列精确匹配的肽(μCon肽)或与mFAP序列匹配的肽(天然肽)进行干扰素γ(IFN-γ)ELISpot。C57Bl/6小鼠对天然FAP和μCon FAP肽生成稳健的IFN-γELISpot，这表明μCon FAP疫苗能够破坏小鼠中的耐受性(图2B和图2C)。疫苗对μCon肽具有剂量依赖性作用；然而，天然肽的剂量依赖性在10μg剂量下达到最大应答(图2B和图2C)。因此，10μg剂量用于其余实验，并且仅显示对mFAP肽(其匹配小鼠FAP 100％)的应答。

为了进一步评估针对天然FAP肽生成的CD8+和CD4+细胞因子应答，对受刺激的脾细胞进行细胞内细胞因子染色(图2D和图2E)。与空白对照小鼠相比，在μCon FAP免疫小鼠中观察到CD8+ T细胞中的IFN-γ和TNF-α产生显着增加(图2D)。接下来，使用脱粒标记物CD107a和转录因子T-bet评估由μCon FAP疫苗生成的CD8+ T细胞的细胞溶解潜力，所述转录因子在活化的T细胞中表达(图2D)。与空白对照小鼠相比，在μCon FAP疫苗接种小鼠中对IFN-γ、CD107a和T-bet同时呈阳性的CD8+ T细胞显着增加，这表明此疫苗诱导具有细胞溶解杀伤潜力的效应T细胞的产生(图2D)。与空白对照小鼠相比，在μCon FAP免疫小鼠中也观察到CD4+ T细胞中的TNF-α产生的显着增加(图2E)。在CD4+ T细胞中也存在IFN-γ产生增加的趋势；然而，这种趋势不是统计学上显著的(图2E)。

微共有DNA疫苗设计在破坏耐受性并遗传多样性小鼠群体中生成CD8+ T细胞应答 方面优于天然FAP DNA

与mFAP DNA疫苗相比，评估了μCon FAP DNA疫苗在远交小鼠(CD-1ICR“Swiss”小鼠)中生成免疫应答的能力(图3)。将这些遗传上不同的小鼠用作更相关的耐受模型中免疫效力的重要指示，以用于外推到远交群体诸如人类。根据图2A中的计划表，用10μg mFAPDNA疫苗或μCon FAP DNA疫苗免疫小鼠，并通过IFN-γELISpot评估免疫应答(图3A)。虽然在小鼠之间观察到可变性，但由于这些小鼠的远交性质，与天然FAP免疫组相比，μCon FAP免疫组的总体免疫应答更高(图3A和图3B)。总体而言，与天然FAP组中的9/15只小鼠相比，μCon FAP组中的14/15只小鼠生成高于100SFU/百万个脾细胞的免疫应答(图3A)。在远交小鼠中观察到的应答(平均值为407SFU)更加多样化并且高于在C57Bl/6小鼠中观察到的应答(平均值为195SFU)(图2B、图3B)。

还通过ELISA使用对应于细胞外结构域(氨基酸26-761)的mFAP蛋白在这些小鼠中评估抗体应答(图3C)。有趣的是，用天然FAP疫苗或μCon FAP疫苗免疫的大多数小鼠生成了激烈的抗体应答(图3C)。与天然FAP组相比，在μCon FAP组中生成抗体应答的小鼠百分比更高(与9/15只小鼠相比的11/15只小鼠)。但是，差异不是统计学上显著的。

在C57Bl/6和Balb/c小鼠中微共有FAP DNA疫苗与天然FAP DNA疫苗的比较

接下来，将由μCon FAP疫苗生成的免疫应答的差异与常用小鼠品系C57Bl/6和Balb/c小鼠中的天然FAP疫苗进行比较。在具有相同的免疫计划表和疫苗剂量的这些小鼠中进行相同的比较(图4A、图5A)。

在倾向于生成比Th2应答更好的Th1应答的C57Bl/6品系中，发现与天然FAP疫苗相比，μCon FAP疫苗生成类似的IFN-γELISpot应答(图4B)。这些小鼠对于天然和μCon FAP疫苗生成类似的IFN-γ、TNF-α和IFN-γ/T-bet/CD107a三阳性CD8+ T细胞应答(图4C)。然而，与天然疫苗相比，C57Bl/6小鼠对于μCon疫苗生成改进的IFN-γ和TNF-αCD4+ T细胞应答(图4D)。在C57Bl/6小鼠中，与天然FAP疫苗相比，μCon FAP疫苗未改进抗体应答(图4E)。事实上，天然FAP趋向于更好的抗体应答；然而，这种趋势不是统计学上显著的。

在倾向于生成比Th1应答更好的Th2应答的Balb/c品系中，发现与天然FAP疫苗相比，μCon FAP疫苗生成优异的IFN-γELISpot应答(图5B)。Balb/c小鼠在CD8+和CD4+ T细胞中生成更好的IFN-γ和TNF-α应答(然而，这仅对于CD8+ T细胞中的IFN-γ产生为统计学上显著的)(图5C和图5D)。此外，与天然FAP DNA疫苗相比，在用μCon FAP DNA疫苗免疫后Balb/c小鼠生成更强大的IFN-γ/T-bet/CD107a三阳性CD8+ T细胞(图5C)。引人注目的是，在Balb/c小鼠中，天然FAP疫苗不生成任何可检测的抗体滴度，而μCon FAP疫苗在4/5只小鼠中生成强大的抗体水平(图5E)。

这些结果表明，常用的小鼠品系可能会扭曲基于免疫的研究结果，并且使用遗传多样性群体对于免疫疗法的临床应用将是重要的。总体而言，在更免疫耐受的Balb/c模型和免疫应答的C57Bl/6模型中，与天然FAP疫苗相比，μCon疫苗显示出破坏对天然FAP抗原的耐受性的一些免疫方面的改进。

在多种肿瘤模型中微共有FAP DNA疫苗与肿瘤抗原DNA疫苗协同作用

在确定在出现率增加的情况下对于μCon FAP DNA疫苗生成针对天然抗原的激烈的IFN-γ和TNF-α免疫应答后，在肿瘤攻击模型中评估与肿瘤相关抗原疫苗结合的μConFAP的治疗功效。用先前研究过的靶向肿瘤抗原PSMA或TERT的两种疫苗测试组合疗法(图6、图7)(Yan等人,2013,Cancer Immunol Res,1:179–189；Ferraro等人,2011,7增补版:120-7)。向雌性C57Bl/6小鼠植入肺肿瘤细胞系TC-1(图6A)，并在肿瘤植入后第7天开始免疫。用单独的μCon FAP DNA疫苗、单独的mTERT(小鼠TERT)疫苗或注射到同一条腿中的μCon FAP和mTERT肿瘤抗原疫苗的组合免疫小鼠。每周一次免疫小鼠，共进行四次免疫。对于TC-1肿瘤模型，FAP和mTERT的组合与单独的任一疫苗相比生成了最激烈的抗肿瘤活性和小鼠存活的改进(图6B和图6C)。为了在不同的肿瘤模型中验证这些结果，在TRAMPC2前列腺肿瘤模型中使用μCon FAP疫苗与PSMA疫苗的组合进行类似的实验(图7)。向雄性C57Bl/6小鼠植入TRAMPC2肿瘤细胞，并在肿瘤植入后第4天开始免疫(图7A)。对于TRAMPC2肿瘤模型，单独的μCon FAP DNA疫苗对肿瘤生长没有影响，而单独的PSMA疫苗减小了肿瘤体积(图7B)。然而，PSMA和FAP的组合比单独的PSMA疫苗更多地减小肿瘤体积并改进肿瘤存活，这表明两种疫苗之间的协同作用(图7B图7C)。

通过探测在不表达FAP的两种细胞系TC-1和TRAMP-C2细胞系(图8)中的FAP表达，确认μCon FAP疫苗仅靶向癌症相关成纤维细胞。

微共有FAP DNA疫苗诱导FAP特异性肿瘤浸润性淋巴细胞

全身性地和在FAP免疫的荷瘤小鼠的肿瘤中的免疫应答。向小鼠植入TC-1肿瘤，并在肿瘤植入后7天开始免疫(图9A)。以一周的间隔对小鼠进行两次免疫，并且然后在最后一次免疫后一周(第21天)处死小鼠。在来自这些小鼠的脾细胞和肿瘤浸润性淋巴细胞中评估抗原特异性免疫应答。尽管在较短时间段内使小鼠免疫较少，但小鼠表现出优异的CD8+IFN-γ和TNF-α产生，以及CD107a和IFN-γ的激烈共表达(图9B)。此外，在肿瘤浸润性淋巴细胞中也观察到激烈的FAP特异性T细胞应答，其中肿瘤内的CD8+ T细胞中的IFN-γ、TNF-α和IFN-γ/CD107a共同产生显着增加(图9C)。此外，当检查CD8+T细胞和调控性T细胞(CD3+/CD4+/CD25+/FoxP3+细胞)的相对比例时，在FAP免疫后观察到CD8+ T细胞的增加和Treg的减少(图9D)。

在接受使用单独的FAP疫苗、单独的mTERT疫苗或组合疗法进行的治疗的携带TC-1肿瘤的小鼠中比较免疫应答(图10A至图10D)。正如预期，接受单独的FAP疫苗或单独的mTERT疫苗的小鼠分别在脾和肿瘤中诱导对FAP肽或mTERT肽的激烈的CD8+IFN-γ和TNF-α应答(图10A至图10D)。有趣的是，在同时接受mTERT与FAP的组合治疗的小鼠中，与仅接受每种疫苗的小鼠相比，应答减弱，这表明抗原干扰(图10A至图10D)。尽管存在这种抗原干扰，但与单独的每种疫苗相比，组合疗法组的抗肿瘤应答仍有改进，这表明成纤维细胞和肿瘤细胞的双重靶向是癌症免疫疗法的重要策略。

合成的共有FAP DNA疫苗改变了TC-1肿瘤的免疫微环境，从而增加CD8+ T细胞的 比例并降低肿瘤中巨噬细胞的比例

其他研究报告了在用基于载体、基于细胞或DNA疫苗免疫后免疫微环境的改变(Zhang和Ertl，2016,Oncotarget,7:23282–99；Xia等人,2016,Cancer ImmunolImmunother,65:613–624；Chen等人,2015,Sci Rep,5:14421)。因此，使用免疫组织化学方法以及流式细胞术评估在用μCon FAP免疫后TC-1肿瘤的肿瘤微环境(图11、图12)。在用μCon FAP DNA疫苗接种后观察到由FAP表达细胞覆盖的肿瘤切片的面积减少和由成纤维细胞和肿瘤细胞分泌的细胞外基质糖胺聚糖透明质素的量(图11A至图11D)。在FAP疫苗接种后也观察到F4/80+巨噬细胞浸润的减少和CD8+ T细胞浸润的增加(图11E至图11H)。在FAP疫苗接种后通过流式细胞术也观察到每个肿瘤的F4/80+/CD11b+巨噬细胞的出现率降低，但是在FAP疫苗接种后未观察到B细胞、NK细胞或树突细胞的出现率变化(图12A至图12D)。为了区分在FAP疫苗接种后M1极化和M2极化巨噬细胞的相对比例，检查在肿瘤浸润性巨噬细胞上的表面标志物表达，包括检测Arg1、MHCII、CD68、CD80和CD86的表达。在这些浸润性巨噬细胞上没有观察到标记物表达的差异，这表明在用μCon FAP疫苗接种后巨噬细胞极化没有偏斜(图13A至图13E)。

实施例2：FAP的免疫原性片段

为了表征小鼠品系对天然FAP肽所具有的应答并确定显性表位，为优化的共有FAP生成代表FAP的不同表位的122种肽(图14A)。当用每个库刺激细胞时，存在多种应答(图14B和图14C)，得出结论：不存在一个显性表位，而是存在多个亚显性表位(图15)。若干亚显性表位(例如SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24)包含优化的共有FAP中相对于天然FAP的突变(图15)。

实施例3：序列信息

应理解先前详细描述和随附实施例仅是说明性的，并且不应视为对本发明的范围的限制，所述范围仅由随附权利要求和它们的等效物限定。

所公开的实施方案的各种变化和修改对本领域技术人员将是显而易见的。在不偏离其本质和范围的前提下，可进行与包括但不限于本发明的化学结构、取代基、衍生物、中间体、合成、组合物、制剂和/或使用方法有关的此类改变和改进。

序列表

<110> 大卫·韦纳

伊丽莎白·迪佩雷

<120> 靶向成纤维细胞活化蛋白的优化的合成共有免疫原性组合物

<130> 206108-0068-00-WO.606652

<150> US 62/397,469

<151> 2016-09-21

<160> 24

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 2202

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 人类FAP的合成共有核苷酸序列

<400> 1

ctgaggcctt ctagagtgca caactccgag ggcccaacca gagccctgac actgaaggac 60

atcctgaatg gcaccttttc ttacaagaca ttctttccca actggatctc tggccaggag 120

tatctgcacc agagcgccga taacaacatc atcctgtaca acatcgagac aggcgagagc 180

tacacaatcc tgtccaactc taccatgaag agcgtgaacg cctccaatta cggcctgagc 240

cctgacaggc agttcgccta cctggagtct gattatagca agctgtggag atactcctat 300

accgccacat accacatcta tgatctgatc aatggcgagt ttgtgcggga gaacgagctg 360

ccccgcccta tccagtacct gtgctggagc cccgtgggca gcaagctggc atacgtgtat 420

cagaacaata tctatctgaa gcagaggccc agggaccctc ccttccagat cacatccaac 480

ggcaaggaga ataagatctt taacggcatc cccgattggg tgtacgagga ggagatgctg 540

gccaccaagt atgccctgtg gtggagccct aatggcaagt tcctggccta cgccgagttt 600

aacgacacag atatcccagt gatcgcctat tcctactatg gcgacgagca gtacccccgg 660

accatcaata tcccatatcc caaggcagga gcaaagaacc caacagtgcg cgtgttcatc 720

atcgatacca catacccaga gcacgtggga ccaaaggagg tgcctgtgcc agccatgatc 780

gccagctccg actactactt cagctggctg acctgggtga cagatgagag gatctgtctg 840

cagtggctga agagaatcca gaacgtgagc gtgctgtcta tctgcgactt cagggaggat 900

tggaacacct gggactgtcc taagacacag gagcacatcg aggagagcag aaccggatgg 960

gccggcggct tcttcgtgag cacaccagtg ttctctagcg acgccatcag ctactataag 1020

atcttttccg acaaggatgg ctacaagcac atccactata tcaaggatac cgtggagaat 1080

gccatccaga tcacatctgg caagtgggag gccatcaaca tcttcagggt gacccaggac 1140

agcctgttct actcctctaa tgagtttgag ggctacccag gcaggagaaa catctataga 1200

atcagcatcg gctcctaccc acccagcaag aagtgcgtga cctgtcacct gcggaaggag 1260

aggtgccagt actatacagc cagcttttcc gattacgcca agtactatgc cctgatctgt 1320

tatggccccg gcatccctat ctccaccctg cacgacggcc ggacagatca ggagatcaag 1380

atcctggagg agaataagga gctggagaat gccctgaaga acatccagct gcctaaggag 1440

gagatcaaga agctggaggt ggacggcatc accctgtggt acaagatgat cctgcctcca 1500

cagttcgatc ggtctaagaa gtatcccctg ctgatccagg tgtacggcgg accttgctct 1560

cagagcgtgc gcagcgtgtt ttccatctct tggatctcct acctggcctc taaggagggc 1620

atcgtggtgg ccctggtgga cggaagggga accgccttcc agggcgataa gctgctgtac 1680

gccgtgtatc gcaagctggg cgtgtacgag gtggaggacc agatcacagc cgtgcggaag 1740

ttcatcgaga tgggctttat cgatgagaag aggatcgcaa tctggggatg ggcatacggc 1800

ggatatgtga gctccctggc cctggcatct ggaaccggcc tgttcaagtg tggcatcgcc 1860

gtggccccag tgtctagctg ggagtactat gcctccatct acaccgagag gttcatgggc 1920

ctgcccacaa agtccgacaa tctggagcac tataagaact ctaccgtgat ggccagggcc 1980

gagtacttca gaaacgtgga ttatctgctg atccacggca cagccgacga taatgtgcac 2040

ttccagaact ccgcccagat cgccaaggcc ctggtgaatg cccaggtgga ctttcaggcc 2100

atgtggtact ctgatcagaa ccacggcatc tctggcctga gcaccaagca cctgtatacc 2160

cacatgacac acttcctgaa gcagtgcttt agcctgtccg ac 2202

<210> 2

<211> 734

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 人类FAP的合成共有氨基酸序列

<400> 2

Leu Arg Pro Ser Arg Val His Asn Ser Glu Gly Pro Thr Arg Ala Leu

1 5 10 15

Thr Leu Lys Asp Ile Leu Asn Gly Thr Phe Ser Tyr Lys Thr Phe Phe

20 25 30

Pro Asn Trp Ile Ser Gly Gln Glu Tyr Leu His Gln Ser Ala Asp Asn

35 40 45

Asn Ile Ile Leu Tyr Asn Ile Glu Thr Gly Glu Ser Tyr Thr Ile Leu

50 55 60

Ser Asn Ser Thr Met Lys Ser Val Asn Ala Ser Asn Tyr Gly Leu Ser

65 70 75 80

Pro Asp Arg Gln Phe Ala Tyr Leu Glu Ser Asp Tyr Ser Lys Leu Trp

85 90 95

Arg Tyr Ser Tyr Thr Ala Thr Tyr His Ile Tyr Asp Leu Ile Asn Gly

100 105 110

Glu Phe Val Arg Glu Asn Glu Leu Pro Arg Pro Ile Gln Tyr Leu Cys

115 120 125

Trp Ser Pro Val Gly Ser Lys Leu Ala Tyr Val Tyr Gln Asn Asn Ile

130 135 140

Tyr Leu Lys Gln Arg Pro Arg Asp Pro Pro Phe Gln Ile Thr Ser Asn

145 150 155 160

Gly Lys Glu Asn Lys Ile Phe Asn Gly Ile Pro Asp Trp Val Tyr Glu

165 170 175

Glu Glu Met Leu Ala Thr Lys Tyr Ala Leu Trp Trp Ser Pro Asn Gly

180 185 190

Lys Phe Leu Ala Tyr Ala Glu Phe Asn Asp Thr Asp Ile Pro Val Ile

195 200 205

Ala Tyr Ser Tyr Tyr Gly Asp Glu Gln Tyr Pro Arg Thr Ile Asn Ile

210 215 220

Pro Tyr Pro Lys Ala Gly Ala Lys Asn Pro Thr Val Arg Val Phe Ile

225 230 235 240

Ile Asp Thr Thr Tyr Pro Glu His Val Gly Pro Lys Glu Val Pro Val

245 250 255

Pro Ala Met Ile Ala Ser Ser Asp Tyr Tyr Phe Ser Trp Leu Thr Trp

260 265 270

Val Thr Asp Glu Arg Ile Cys Leu Gln Trp Leu Lys Arg Ile Gln Asn

275 280 285

Val Ser Val Leu Ser Ile Cys Asp Phe Arg Glu Asp Trp Asn Thr Trp

290 295 300

Asp Cys Pro Lys Thr Gln Glu His Ile Glu Glu Ser Arg Thr Gly Trp

305 310 315 320

Ala Gly Gly Phe Phe Val Ser Thr Pro Val Phe Ser Ser Asp Ala Ile

325 330 335

Ser Tyr Tyr Lys Ile Phe Ser Asp Lys Asp Gly Tyr Lys His Ile His

340 345 350

Tyr Ile Lys Asp Thr Val Glu Asn Ala Ile Gln Ile Thr Ser Gly Lys

355 360 365

Trp Glu Ala Ile Asn Ile Phe Arg Val Thr Gln Asp Ser Leu Phe Tyr

370 375 380

Ser Ser Asn Glu Phe Glu Gly Tyr Pro Gly Arg Arg Asn Ile Tyr Arg

385 390 395 400

Ile Ser Ile Gly Ser Tyr Pro Pro Ser Lys Lys Cys Val Thr Cys His

405 410 415

Leu Arg Lys Glu Arg Cys Gln Tyr Tyr Thr Ala Ser Phe Ser Asp Tyr

420 425 430

Ala Lys Tyr Tyr Ala Leu Ile Cys Tyr Gly Pro Gly Ile Pro Ile Ser

435 440 445

Thr Leu His Asp Gly Arg Thr Asp Gln Glu Ile Lys Ile Leu Glu Glu

450 455 460

Asn Lys Glu Leu Glu Asn Ala Leu Lys Asn Ile Gln Leu Pro Lys Glu

465 470 475 480

Glu Ile Lys Lys Leu Glu Val Asp Gly Ile Thr Leu Trp Tyr Lys Met

485 490 495

Ile Leu Pro Pro Gln Phe Asp Arg Ser Lys Lys Tyr Pro Leu Leu Ile

500 505 510

Gln Val Tyr Gly Gly Pro Cys Ser Gln Ser Val Arg Ser Val Phe Ser

515 520 525

Ile Ser Trp Ile Ser Tyr Leu Ala Ser Lys Glu Gly Ile Val Val Ala

530 535 540

Leu Val Asp Gly Arg Gly Thr Ala Phe Gln Gly Asp Lys Leu Leu Tyr

545 550 555 560

Ala Val Tyr Arg Lys Leu Gly Val Tyr Glu Val Glu Asp Gln Ile Thr

565 570 575

Ala Val Arg Lys Phe Ile Glu Met Gly Phe Ile Asp Glu Lys Arg Ile

580 585 590

Ala Ile Trp Gly Trp Ala Tyr Gly Gly Tyr Val Ser Ser Leu Ala Leu

595 600 605

Ala Ser Gly Thr Gly Leu Phe Lys Cys Gly Ile Ala Val Ala Pro Val

610 615 620

Ser Ser Trp Glu Tyr Tyr Ala Ser Ile Tyr Thr Glu Arg Phe Met Gly

625 630 635 640

Leu Pro Thr Lys Ser Asp Asn Leu Glu His Tyr Lys Asn Ser Thr Val

645 650 655

Met Ala Arg Ala Glu Tyr Phe Arg Asn Val Asp Tyr Leu Leu Ile His

660 665 670

Gly Thr Ala Asp Asp Asn Val His Phe Gln Asn Ser Ala Gln Ile Ala

675 680 685

Lys Ala Leu Val Asn Ala Gln Val Asp Phe Gln Ala Met Trp Tyr Ser

690 695 700

Asp Gln Asn His Gly Ile Ser Gly Leu Ser Thr Lys His Leu Tyr Thr

705 710 715 720

His Met Thr His Phe Leu Lys Gln Cys Phe Ser Leu Ser Asp

725 730

<210> 3

<211> 2256

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 可操作地连接至编码IgE前导序列的序列的人类FAP的合成共有核苷酸序列

<400> 3

atggactgga cctggattct gttcctggtg gcagcagcaa caagggtgca ctccctgagg 60

ccttctagag tgcacaactc cgagggccca accagagccc tgacactgaa ggacatcctg 120

aatggcacct tttcttacaa gacattcttt cccaactgga tctctggcca ggagtatctg 180

caccagagcg ccgataacaa catcatcctg tacaacatcg agacaggcga gagctacaca 240

atcctgtcca actctaccat gaagagcgtg aacgcctcca attacggcct gagccctgac 300

aggcagttcg cctacctgga gtctgattat agcaagctgt ggagatactc ctataccgcc 360

acataccaca tctatgatct gatcaatggc gagtttgtgc gggagaacga gctgccccgc 420

cctatccagt acctgtgctg gagccccgtg ggcagcaagc tggcatacgt gtatcagaac 480

aatatctatc tgaagcagag gcccagggac cctcccttcc agatcacatc caacggcaag 540

gagaataaga tctttaacgg catccccgat tgggtgtacg aggaggagat gctggccacc 600

aagtatgccc tgtggtggag ccctaatggc aagttcctgg cctacgccga gtttaacgac 660

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aatatcccat atcccaaggc aggagcaaag aacccaacag tgcgcgtgtt catcatcgat 780

accacatacc cagagcacgt gggaccaaag gaggtgcctg tgccagccat gatcgccagc 840

tccgactact acttcagctg gctgacctgg gtgacagatg agaggatctg tctgcagtgg 900

ctgaagagaa tccagaacgt gagcgtgctg tctatctgcg acttcaggga ggattggaac 960

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cagatcacat ctggcaagtg ggaggccatc aacatcttca gggtgaccca ggacagcctg 1200

ttctactcct ctaatgagtt tgagggctac ccaggcagga gaaacatcta tagaatcagc 1260

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cagtactata cagccagctt ttccgattac gccaagtact atgccctgat ctgttatggc 1380

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<210> 4

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 可操作地连接至IgE前导序列的人类FAP的合成共有氨基酸序列

<400> 4

Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val

1 5 10 15

His Ser Leu Arg Pro Ser Arg Val His Asn Ser Glu Gly Pro Thr Arg

20 25 30

Ala Leu Thr Leu Lys Asp Ile Leu Asn Gly Thr Phe Ser Tyr Lys Thr

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Phe Phe Pro Asn Trp Ile Ser Gly Gln Glu Tyr Leu His Gln Ser Ala

50 55 60

Asp Asn Asn Ile Ile Leu Tyr Asn Ile Glu Thr Gly Glu Ser Tyr Thr

65 70 75 80

Ile Leu Ser Asn Ser Thr Met Lys Ser Val Asn Ala Ser Asn Tyr Gly

85 90 95

Leu Ser Pro Asp Arg Gln Phe Ala Tyr Leu Glu Ser Asp Tyr Ser Lys

100 105 110

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145 150 155 160

Asn Ile Tyr Leu Lys Gln Arg Pro Arg Asp Pro Pro Phe Gln Ile Thr

165 170 175

Ser Asn Gly Lys Glu Asn Lys Ile Phe Asn Gly Ile Pro Asp Trp Val

180 185 190

Tyr Glu Glu Glu Met Leu Ala Thr Lys Tyr Ala Leu Trp Trp Ser Pro

195 200 205

Asn Gly Lys Phe Leu Ala Tyr Ala Glu Phe Asn Asp Thr Asp Ile Pro

210 215 220

Val Ile Ala Tyr Ser Tyr Tyr Gly Asp Glu Gln Tyr Pro Arg Thr Ile

225 230 235 240

Asn Ile Pro Tyr Pro Lys Ala Gly Ala Lys Asn Pro Thr Val Arg Val

245 250 255

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260 265 270

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275 280 285

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290 295 300

Gln Asn Val Ser Val Leu Ser Ile Cys Asp Phe Arg Glu Asp Trp Asn

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Thr Trp Asp Cys Pro Lys Thr Gln Glu His Ile Glu Glu Ser Arg Thr

325 330 335

Gly Trp Ala Gly Gly Phe Phe Val Ser Thr Pro Val Phe Ser Ser Asp

340 345 350

Ala Ile Ser Tyr Tyr Lys Ile Phe Ser Asp Lys Asp Gly Tyr Lys His

355 360 365

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370 375 380

Gly Lys Trp Glu Ala Ile Asn Ile Phe Arg Val Thr Gln Asp Ser Leu

385 390 395 400

Phe Tyr Ser Ser Asn Glu Phe Glu Gly Tyr Pro Gly Arg Arg Asn Ile

405 410 415

Tyr Arg Ile Ser Ile Gly Ser Tyr Pro Pro Ser Lys Lys Cys Val Thr

420 425 430

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435 440 445

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Glu Glu Asn Lys Glu Leu Glu Asn Ala Leu Lys Asn Ile Gln Leu Pro

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Val Ala Leu Val Asp Gly Arg Gly Thr Ala Phe Gln Gly Asp Lys Leu

565 570 575

Leu Tyr Ala Val Tyr Arg Lys Leu Gly Val Tyr Glu Val Glu Asp Gln

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<220>

<223> 小鼠FAP的合成共有核苷酸序列

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tttaacgaca ccgatatccc agtgatcgcc tacagctact acggcgacgg acagtacccc 660

aggacaatca acatcccata ccccaaggct ggagccaaga accccgtggt gagagtgttc 720

atcgtggata ccacataccc acaccacgtg ggaccaatgg aggtgcctgt gccagagatg 780

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<211> 735

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 小鼠FAP的合成共有氨基酸序列

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His Gly Thr Ala Asp Asp Asn Val His Phe Gln Asn Ser Ala Gln Ile

675 680 685

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 可操作地连接至编码IgE前导序列的序列的小鼠FAP的合成共有核苷酸序列

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cgcgagaaca agatctttaa cggaatcccc gattgggtgt acgaggagga gatgctggct 600

acaaagtacg ccctgtggtg gagccccaac ggcaagttcc tggcttacgc cgagtttaac 660

gacaccgata tcccagtgat cgcctacagc tactacggcg acggacagta ccccaggaca 720

atcaacatcc cataccccaa ggctggagcc aagaaccccg tggtgagagt gttcatcgtg 780

gataccacat acccacacca cgtgggacca atggaggtgc ctgtgccaga gatgatcgct 840

agctccgact actactttag ctggctgacc tgggtgacag atgagagggt gtgcctgcag 900

tggctgaagc gcgtgcagaa cgtgtctgtg ctgagcatct gcgacttcag ggaggattgg 960

cacgcctggg agtgtcctaa gaaccaggag cacgtggagg agtccagaac cggatgggcc 1020

ggcggcttct tcgtgagcac accagtgttc agccaggacg ccatctccta ctacaagatc 1080

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atccagatca caagcggcaa gtgggaggcc atctacatct tccgggtgac ccaggactcc 1200

ctgttctact ctagcaacga gtttgagggc tacccaggaa ggagaaacat ctaccgcatc 1260

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 可操作地连接至IgE前导序列的小鼠FAP的合成共有氨基酸序列

<400> 8

Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val

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545 550 555 560

Val Ile Ala Leu Val Asp Gly Arg Gly Thr Ala Phe Gln Gly Asp Lys

565 570 575

Phe Leu Tyr Ala Val Tyr Arg Lys Leu Gly Val Tyr Glu Val Glu Asp

580 585 590

Gln Ile Thr Ala Val Arg Lys Phe Ile Glu Met Gly Phe Ile Asp Glu

595 600 605

Lys Arg Ile Ala Ile Trp Gly Trp Ala Tyr Gly Gly Tyr Val Ser Ser

610 615 620

Leu Ala Leu Ala Ser Gly Thr Gly Leu Phe Lys Cys Gly Ile Ala Val

625 630 635 640

Ala Pro Val Ser Ser Trp Glu Tyr Tyr Ala Ser Ile Tyr Thr Glu Arg

645 650 655

Phe Met Gly Leu Pro Thr Lys Asp Asp Asn Leu Glu His Tyr Lys Asn

660 665 670

Ser Thr Val Met Ala Arg Ala Glu Tyr Phe Arg Asn Val Asp Tyr Leu

675 680 685

Leu Ile His Gly Thr Ala Asp Asp Asn Val His Phe Gln Asn Ser Ala

690 695 700

Gln Ile Ala Lys Ala Leu Val Asn Ala Gln Val Asp Phe Gln Ala Met

705 710 715 720

Trp Tyr Ser Asp Gln Asn His Gly Ile Ser Gly Gly Ser Thr Asn His

725 730 735

Leu Tyr Thr His Met Thr His Phe Leu Lys Gln Cys Phe Ser Leu Ser

740 745 750

Asp

<210> 9

<211> 2208

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 小鼠FAP的天然核苷酸序列

<400> 9

ctgcggcctt ctcgcgtgta caagccagag ggcaacacca agcgcgctct gacactgaag 60

gatatcctga acggaacctt ctcttacaag acatactttc ccaactggat ctctgagcag 120

gagtacctgc accagagcga ggacgataac atcgtgtttt acaacatcga gacaagggag 180

agctacatca tcctgagcaa ctccaccatg aagagcgtga acgctacaga ctacggcctg 240

tcccctgata ggcagttcgt gtacctggag tctgactaca gcaagctgtg gagatactcc 300

tacaccgcca catactacat ctacgatctg cagaacggcg agtttgtgcg gggatacgag 360

ctgccccgcc ctatccagta cctgtgctgg agccctgtgg gctccaagct ggcctacgtg 420

taccagaaca acatctacct gaagcagagg cccggcgacc ctcccttcca gatcacctac 480

acaggcaggg agaacagaat ctttaacgga atccccgact gggtgtacga ggaggagatg 540

ctggctacca agtacgccct gtggtggtcc cctgatggca agttcctggc ttacgtggag 600

tttaacgact ccgatatccc aatcatcgcc tactcttact acggcgatgg acagtacccc 660

aggacaatca acatcccata ccccaaggct ggcgccaaga accccgtggt gagagtgttc 720

atcgtggaca ccacataccc acaccacgtg ggacccatgg aggtgcctgt gccagagatg 780

atcgccagct ccgattacta cttttcttgg ctgacctggg tgtctagcga gagggtgtgc 840

ctgcagtggc tgaagagagt gcagaacgtg tccgtgctgt ctatctgcga cttcagggag 900

gattggcacg cttgggagtg tcctaagaac caggagcacg tggaggagtc cagaacagga 960

tgggccggcg gcttcttcgt gagcacccca gctttcagcc aggacgccac atcctactac 1020

aagatctttt ctgacaagga tggctacaag cacatccact acatcaagga taccgtggag 1080

aacgctatcc agatcacaag cggaaagtgg gaggccatct acatcttcag ggtgacccag 1140

gactccctgt tctactcctc taacgagttt gagggctacc caggaaggag aaacatctac 1200

agaatctcca tcggcaacag cccaccctcc aagaagtgcg tgacctgtca cctgcggaag 1260

gagaggtgcc agtactacac agcctctttt agctacaagg ctaagtacta cgctctggtg 1320

tgctacggac caggactgcc tatctctacc ctgcacgacg gacggacaga tcaggagatc 1380

caggtgctgg aggagaacaa ggagctggag aacagcctgc gcaacatcca gctgcccaag 1440

gtggagatca agaagctgaa ggacggcgga ctgacattct ggtacaagat gatcctgcct 1500

ccacagtttg ataggagcaa gaagtacccc ctgctgatcc aggtgtacgg cggaccttgc 1560

tcccagtctg tgaagtccgt gttcgctgtg aactggatca cctacctggc ctctaaggag 1620

ggcatcgtga tcgctctggt ggacggaagg ggaacagctt tccagggcga taagtttctg 1680

cacgccgtgt accgcaagct gggagtgtac gaggtggagg accagctgac cgccgtgcgg 1740

aagttcatcg agatgggctt tatcgatgag gagcgcatcg ctatctgggg atgggcctac 1800

ggcggatacg tgagctccct ggctctggct agcggaacag gactgttcaa gtgtggcatc 1860

gctgtggccc cagtgtctag ctgggagtac tacgcctcta tctacagcga gcggtttatg 1920

ggactgccca ccaaggacga taacctggag cactacaaga acagcacagt gatggctagg 1980

gccgagtact tcagaaacgt ggactacctg ctgatccacg gcaccgctga cgataacgtg 2040

cacttccaga actccgccca gatcgctaag gccctggtga acgctcaggt ggactttcag 2100

gccatgtggt actctgatca gaaccacggc atctcctctg gacgcagcca gaaccacctg 2160

tacacccaca tgacacactt cctgaagcag tgctttagcc tgtccgac 2208

<210> 10

<211> 736

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 小鼠FAP的天然氨基酸序列

<400> 10

Leu Arg Pro Ser Arg Val Tyr Lys Pro Glu Gly Asn Thr Lys Arg Ala

1 5 10 15

Leu Thr Leu Lys Asp Ile Leu Asn Gly Thr Phe Ser Tyr Lys Thr Tyr

20 25 30

Phe Pro Asn Trp Ile Ser Glu Gln Glu Tyr Leu His Gln Ser Glu Asp

35 40 45

Asp Asn Ile Val Phe Tyr Asn Ile Glu Thr Arg Glu Ser Tyr Ile Ile

50 55 60

Leu Ser Asn Ser Thr Met Lys Ser Val Asn Ala Thr Asp Tyr Gly Leu

65 70 75 80

Ser Pro Asp Arg Gln Phe Val Tyr Leu Glu Ser Asp Tyr Ser Lys Leu

85 90 95

Trp Arg Tyr Ser Tyr Thr Ala Thr Tyr Tyr Ile Tyr Asp Leu Gln Asn

100 105 110

Gly Glu Phe Val Arg Gly Tyr Glu Leu Pro Arg Pro Ile Gln Tyr Leu

115 120 125

Cys Trp Ser Pro Val Gly Ser Lys Leu Ala Tyr Val Tyr Gln Asn Asn

130 135 140

Ile Tyr Leu Lys Gln Arg Pro Gly Asp Pro Pro Phe Gln Ile Thr Tyr

145 150 155 160

Thr Gly Arg Glu Asn Arg Ile Phe Asn Gly Ile Pro Asp Trp Val Tyr

165 170 175

Glu Glu Glu Met Leu Ala Thr Lys Tyr Ala Leu Trp Trp Ser Pro Asp

180 185 190

Gly Lys Phe Leu Ala Tyr Val Glu Phe Asn Asp Ser Asp Ile Pro Ile

195 200 205

Ile Ala Tyr Ser Tyr Tyr Gly Asp Gly Gln Tyr Pro Arg Thr Ile Asn

210 215 220

Ile Pro Tyr Pro Lys Ala Gly Ala Lys Asn Pro Val Val Arg Val Phe

225 230 235 240

Ile Val Asp Thr Thr Tyr Pro His His Val Gly Pro Met Glu Val Pro

245 250 255

Val Pro Glu Met Ile Ala Ser Ser Asp Tyr Tyr Phe Ser Trp Leu Thr

260 265 270

Trp Val Ser Ser Glu Arg Val Cys Leu Gln Trp Leu Lys Arg Val Gln

275 280 285

Asn Val Ser Val Leu Ser Ile Cys Asp Phe Arg Glu Asp Trp His Ala

290 295 300

Trp Glu Cys Pro Lys Asn Gln Glu His Val Glu Glu Ser Arg Thr Gly

305 310 315 320

Trp Ala Gly Gly Phe Phe Val Ser Thr Pro Ala Phe Ser Gln Asp Ala

325 330 335

Thr Ser Tyr Tyr Lys Ile Phe Ser Asp Lys Asp Gly Tyr Lys His Ile

340 345 350

His Tyr Ile Lys Asp Thr Val Glu Asn Ala Ile Gln Ile Thr Ser Gly

355 360 365

Lys Trp Glu Ala Ile Tyr Ile Phe Arg Val Thr Gln Asp Ser Leu Phe

370 375 380

Tyr Ser Ser Asn Glu Phe Glu Gly Tyr Pro Gly Arg Arg Asn Ile Tyr

385 390 395 400

Arg Ile Ser Ile Gly Asn Ser Pro Pro Ser Lys Lys Cys Val Thr Cys

405 410 415

His Leu Arg Lys Glu Arg Cys Gln Tyr Tyr Thr Ala Ser Phe Ser Tyr

420 425 430

Lys Ala Lys Tyr Tyr Ala Leu Val Cys Tyr Gly Pro Gly Leu Pro Ile

435 440 445

Ser Thr Leu His Asp Gly Arg Thr Asp Gln Glu Ile Gln Val Leu Glu

450 455 460

Glu Asn Lys Glu Leu Glu Asn Ser Leu Arg Asn Ile Gln Leu Pro Lys

465 470 475 480

Val Glu Ile Lys Lys Leu Lys Asp Gly Gly Leu Thr Phe Trp Tyr Lys

485 490 495

Met Ile Leu Pro Pro Gln Phe Asp Arg Ser Lys Lys Tyr Pro Leu Leu

500 505 510

Ile Gln Val Tyr Gly Gly Pro Cys Ser Gln Ser Val Lys Ser Val Phe

515 520 525

Ala Val Asn Trp Ile Thr Tyr Leu Ala Ser Lys Glu Gly Ile Val Ile

530 535 540

Ala Leu Val Asp Gly Arg Gly Thr Ala Phe Gln Gly Asp Lys Phe Leu

545 550 555 560

His Ala Val Tyr Arg Lys Leu Gly Val Tyr Glu Val Glu Asp Gln Leu

565 570 575

Thr Ala Val Arg Lys Phe Ile Glu Met Gly Phe Ile Asp Glu Glu Arg

580 585 590

Ile Ala Ile Trp Gly Trp Ala Tyr Gly Gly Tyr Val Ser Ser Leu Ala

595 600 605

Leu Ala Ser Gly Thr Gly Leu Phe Lys Cys Gly Ile Ala Val Ala Pro

610 615 620

Val Ser Ser Trp Glu Tyr Tyr Ala Ser Ile Tyr Ser Glu Arg Phe Met

625 630 635 640

Gly Leu Pro Thr Lys Asp Asp Asn Leu Glu His Tyr Lys Asn Ser Thr

645 650 655

Val Met Ala Arg Ala Glu Tyr Phe Arg Asn Val Asp Tyr Leu Leu Ile

660 665 670

His Gly Thr Ala Asp Asp Asn Val His Phe Gln Asn Ser Ala Gln Ile

675 680 685

Ala Lys Ala Leu Val Asn Ala Gln Val Asp Phe Gln Ala Met Trp Tyr

690 695 700

Ser Asp Gln Asn His Gly Ile Ser Ser Gly Arg Ser Gln Asn His Leu

705 710 715 720

Tyr Thr His Met Thr His Phe Leu Lys Gln Cys Phe Ser Leu Ser Asp

725 730 735

<210> 11

<211> 2262

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 可操作地连接至IgE前导序列的天然小鼠FAP的核苷酸序列

<400> 11

atggactgga cctggattct gttcctggtg gctgctgcta cacgggtgca ctccctgcgg 60

ccttctcgcg tgtacaagcc agagggcaac accaagcgcg ctctgacact gaaggatatc 120

ctgaacggaa ccttctctta caagacatac tttcccaact ggatctctga gcaggagtac 180

ctgcaccaga gcgaggacga taacatcgtg ttttacaaca tcgagacaag ggagagctac 240

atcatcctga gcaactccac catgaagagc gtgaacgcta cagactacgg cctgtcccct 300

gataggcagt tcgtgtacct ggagtctgac tacagcaagc tgtggagata ctcctacacc 360

gccacatact acatctacga tctgcagaac ggcgagtttg tgcggggata cgagctgccc 420

cgccctatcc agtacctgtg ctggagccct gtgggctcca agctggccta cgtgtaccag 480

aacaacatct acctgaagca gaggcccggc gaccctccct tccagatcac ctacacaggc 540

agggagaaca gaatctttaa cggaatcccc gactgggtgt acgaggagga gatgctggct 600

accaagtacg ccctgtggtg gtcccctgat ggcaagttcc tggcttacgt ggagtttaac 660

gactccgata tcccaatcat cgcctactct tactacggcg atggacagta ccccaggaca 720

atcaacatcc cataccccaa ggctggcgcc aagaaccccg tggtgagagt gttcatcgtg 780

gacaccacat acccacacca cgtgggaccc atggaggtgc ctgtgccaga gatgatcgcc 840

agctccgatt actacttttc ttggctgacc tgggtgtcta gcgagagggt gtgcctgcag 900

tggctgaaga gagtgcagaa cgtgtccgtg ctgtctatct gcgacttcag ggaggattgg 960

cacgcttggg agtgtcctaa gaaccaggag cacgtggagg agtccagaac aggatgggcc 1020

ggcggcttct tcgtgagcac cccagctttc agccaggacg ccacatccta ctacaagatc 1080

ttttctgaca aggatggcta caagcacatc cactacatca aggataccgt ggagaacgct 1140

atccagatca caagcggaaa gtgggaggcc atctacatct tcagggtgac ccaggactcc 1200

ctgttctact cctctaacga gtttgagggc tacccaggaa ggagaaacat ctacagaatc 1260

tccatcggca acagcccacc ctccaagaag tgcgtgacct gtcacctgcg gaaggagagg 1320

tgccagtact acacagcctc ttttagctac aaggctaagt actacgctct ggtgtgctac 1380

ggaccaggac tgcctatctc taccctgcac gacggacgga cagatcagga gatccaggtg 1440

ctggaggaga acaaggagct ggagaacagc ctgcgcaaca tccagctgcc caaggtggag 1500

atcaagaagc tgaaggacgg cggactgaca ttctggtaca agatgatcct gcctccacag 1560

tttgatagga gcaagaagta ccccctgctg atccaggtgt acggcggacc ttgctcccag 1620

tctgtgaagt ccgtgttcgc tgtgaactgg atcacctacc tggcctctaa ggagggcatc 1680

gtgatcgctc tggtggacgg aaggggaaca gctttccagg gcgataagtt tctgcacgcc 1740

gtgtaccgca agctgggagt gtacgaggtg gaggaccagc tgaccgccgt gcggaagttc 1800

atcgagatgg gctttatcga tgaggagcgc atcgctatct ggggatgggc ctacggcgga 1860

tacgtgagct ccctggctct ggctagcgga acaggactgt tcaagtgtgg catcgctgtg 1920

gccccagtgt ctagctggga gtactacgcc tctatctaca gcgagcggtt tatgggactg 1980

cccaccaagg acgataacct ggagcactac aagaacagca cagtgatggc tagggccgag 2040

tacttcagaa acgtggacta cctgctgatc cacggcaccg ctgacgataa cgtgcacttc 2100

cagaactccg cccagatcgc taaggccctg gtgaacgctc aggtggactt tcaggccatg 2160

tggtactctg atcagaacca cggcatctcc tctggacgca gccagaacca cctgtacacc 2220

cacatgacac acttcctgaa gcagtgcttt agcctgtccg ac 2262

<210> 12

<211> 754

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 可操作地连接至IgE前导序列的天然小鼠FAP的氨基酸序列

<400> 12

Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val

1 5 10 15

His Ser Leu Arg Pro Ser Arg Val Tyr Lys Pro Glu Gly Asn Thr Lys

20 25 30

Arg Ala Leu Thr Leu Lys Asp Ile Leu Asn Gly Thr Phe Ser Tyr Lys

35 40 45

Thr Tyr Phe Pro Asn Trp Ile Ser Glu Gln Glu Tyr Leu His Gln Ser

50 55 60

Glu Asp Asp Asn Ile Val Phe Tyr Asn Ile Glu Thr Arg Glu Ser Tyr

65 70 75 80

Ile Ile Leu Ser Asn Ser Thr Met Lys Ser Val Asn Ala Thr Asp Tyr

85 90 95

Gly Leu Ser Pro Asp Arg Gln Phe Val Tyr Leu Glu Ser Asp Tyr Ser

100 105 110

Lys Leu Trp Arg Tyr Ser Tyr Thr Ala Thr Tyr Tyr Ile Tyr Asp Leu

115 120 125

Gln Asn Gly Glu Phe Val Arg Gly Tyr Glu Leu Pro Arg Pro Ile Gln

130 135 140

Tyr Leu Cys Trp Ser Pro Val Gly Ser Lys Leu Ala Tyr Val Tyr Gln

145 150 155 160

Asn Asn Ile Tyr Leu Lys Gln Arg Pro Gly Asp Pro Pro Phe Gln Ile

165 170 175

Thr Tyr Thr Gly Arg Glu Asn Arg Ile Phe Asn Gly Ile Pro Asp Trp

180 185 190

Val Tyr Glu Glu Glu Met Leu Ala Thr Lys Tyr Ala Leu Trp Trp Ser

195 200 205

Pro Asp Gly Lys Phe Leu Ala Tyr Val Glu Phe Asn Asp Ser Asp Ile

210 215 220

Pro Ile Ile Ala Tyr Ser Tyr Tyr Gly Asp Gly Gln Tyr Pro Arg Thr

225 230 235 240

Ile Asn Ile Pro Tyr Pro Lys Ala Gly Ala Lys Asn Pro Val Val Arg

245 250 255

Val Phe Ile Val Asp Thr Thr Tyr Pro His His Val Gly Pro Met Glu

260 265 270

Val Pro Val Pro Glu Met Ile Ala Ser Ser Asp Tyr Tyr Phe Ser Trp

275 280 285

Leu Thr Trp Val Ser Ser Glu Arg Val Cys Leu Gln Trp Leu Lys Arg

290 295 300

Val Gln Asn Val Ser Val Leu Ser Ile Cys Asp Phe Arg Glu Asp Trp

305 310 315 320

His Ala Trp Glu Cys Pro Lys Asn Gln Glu His Val Glu Glu Ser Arg

325 330 335

Thr Gly Trp Ala Gly Gly Phe Phe Val Ser Thr Pro Ala Phe Ser Gln

340 345 350

Asp Ala Thr Ser Tyr Tyr Lys Ile Phe Ser Asp Lys Asp Gly Tyr Lys

355 360 365

His Ile His Tyr Ile Lys Asp Thr Val Glu Asn Ala Ile Gln Ile Thr

370 375 380

Ser Gly Lys Trp Glu Ala Ile Tyr Ile Phe Arg Val Thr Gln Asp Ser

385 390 395 400

Leu Phe Tyr Ser Ser Asn Glu Phe Glu Gly Tyr Pro Gly Arg Arg Asn

405 410 415

Ile Tyr Arg Ile Ser Ile Gly Asn Ser Pro Pro Ser Lys Lys Cys Val

420 425 430

Thr Cys His Leu Arg Lys Glu Arg Cys Gln Tyr Tyr Thr Ala Ser Phe

435 440 445

Ser Tyr Lys Ala Lys Tyr Tyr Ala Leu Val Cys Tyr Gly Pro Gly Leu

450 455 460

Pro Ile Ser Thr Leu His Asp Gly Arg Thr Asp Gln Glu Ile Gln Val

465 470 475 480

Leu Glu Glu Asn Lys Glu Leu Glu Asn Ser Leu Arg Asn Ile Gln Leu

485 490 495

Pro Lys Val Glu Ile Lys Lys Leu Lys Asp Gly Gly Leu Thr Phe Trp

500 505 510

Tyr Lys Met Ile Leu Pro Pro Gln Phe Asp Arg Ser Lys Lys Tyr Pro

515 520 525

Leu Leu Ile Gln Val Tyr Gly Gly Pro Cys Ser Gln Ser Val Lys Ser

530 535 540

Val Phe Ala Val Asn Trp Ile Thr Tyr Leu Ala Ser Lys Glu Gly Ile

545 550 555 560

Val Ile Ala Leu Val Asp Gly Arg Gly Thr Ala Phe Gln Gly Asp Lys

565 570 575

Phe Leu His Ala Val Tyr Arg Lys Leu Gly Val Tyr Glu Val Glu Asp

580 585 590

Gln Leu Thr Ala Val Arg Lys Phe Ile Glu Met Gly Phe Ile Asp Glu

595 600 605

Glu Arg Ile Ala Ile Trp Gly Trp Ala Tyr Gly Gly Tyr Val Ser Ser

610 615 620

Leu Ala Leu Ala Ser Gly Thr Gly Leu Phe Lys Cys Gly Ile Ala Val

625 630 635 640

Ala Pro Val Ser Ser Trp Glu Tyr Tyr Ala Ser Ile Tyr Ser Glu Arg

645 650 655

Phe Met Gly Leu Pro Thr Lys Asp Asp Asn Leu Glu His Tyr Lys Asn

660 665 670

Ser Thr Val Met Ala Arg Ala Glu Tyr Phe Arg Asn Val Asp Tyr Leu

675 680 685

Leu Ile His Gly Thr Ala Asp Asp Asn Val His Phe Gln Asn Ser Ala

690 695 700

Gln Ile Ala Lys Ala Leu Val Asn Ala Gln Val Asp Phe Gln Ala Met

705 710 715 720

Trp Tyr Ser Asp Gln Asn His Gly Ile Ser Ser Gly Arg Ser Gln Asn

725 730 735

His Leu Tyr Thr His Met Thr His Phe Leu Lys Gln Cys Phe Ser Leu

740 745 750

Ser Asp

<210> 13

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> FAP的免疫原性片段

<400> 13

Lys Asp Gly Gly Leu Thr Phe Trp Tyr Lys Met Ile Leu Pro Pro

1 5 10 15

<210> 14

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> FAP的免疫原性片段

<400> 14

Ala Val Asn Trp Ile Thr Tyr Leu Ala Ser Lys Glu Gly Ile Val

1 5 10 15

<210> 15

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> FAP的免疫原性片段

<400> 15

Tyr Leu Ala Ser Lys Glu Gly Ile Val Ile Ala Leu Val Asp Gly

1 5 10 15

<210> 16

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> FAP的免疫原性片段

<400> 16

Leu Glu His Tyr Lys Asn Ser Thr Val Met Ala Arg Ala Glu Tyr

1 5 10 15

<210> 17

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> FAP的免疫原性片段

<400> 17

His Gly Thr Ala Asp Asp Asn Val His Phe Gln Asn Ser Ala Gln

1 5 10 15

<210> 18

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> FAP的免疫原性片段

<400> 18

Val Asp Phe Gln Ala Met Trp Tyr Ser Asp Gln Asn His Gly Ile

1 5 10 15

<210> 19

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> FAP的免疫原性片段

<400> 19

Asn Ile Glu Thr Arg Glu Ser Tyr Ile Ile Leu Ser Asn Ser Thr

1 5 10 15

<210> 20

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> FAP的免疫原性片段

<400> 20

Gly Leu Ser Pro Asp Arg Gln Phe Val Tyr Leu Glu Ser Asp Tyr

1 5 10 15

<210> 21

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> FAP的免疫原性片段

<400> 21

Ala Thr Tyr Tyr Ile Tyr Asp Leu Gln Asn Gly Glu Phe Val Arg

1 5 10 15

<210> 22

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> FAP的免疫原性片段

<400> 22

Glu Val Asp Gly Ile Thr Leu Trp Tyr Lys Met Ile Leu Pro Pro

1 5 10 15

<210> 23

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> FAP的免疫原性片段

<400> 23

Ala Val Asn Trp Ile Ser Tyr Leu Ala Ser Lys Glu Gly Ile Val

1 5 10 15

<210> 24

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> FAP的免疫原性片段

<400> 24

Asn Ile Glu Thr Gly Glu Ser Tyr Ile Ile Leu Ser Asn Ser Thr

1 5 10 15

Claims (27)

1.一种包含核酸分子的免疫原性组合物，其中所述核酸分子编码包含选自由以下组成的组的氨基酸序列的肽

a)在选自由SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:6组成的组的氨基酸序列的整体长度上具有至少约90％同一性的氨基酸序列，

b)在选自由SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:6组成的组的氨基酸序列的至少60％上包含至少约90％同一性的免疫原性片段，

c)选自由SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:6组成的组的氨基酸序列，以及

d)包含选自由SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:6组成的组的氨基酸序列的至少60％的免疫原性片段。

2.如权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述核酸分子选自由DNA分子和RNA分子组成的组。

3.如权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述核酸分子包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：

a)在选自由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:5组成的组的核苷酸序列的整体长度上具有至少约90％同一性的核苷酸序列，

b)在选自由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:5组成的组的核苷酸序列的至少60％上具有至少约90％同一性的核苷酸序列的免疫原性片段，

c)选自由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:5组成的组的核苷酸序列，以及

d)选自由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:5组成的组的核苷酸序列的免疫原性片段。

4.如权利要求1所述的免疫原性组合物，其中编码所述肽的核苷酸序列可操作地连接到至少一个选自由以下组成的组的调控序列：起始密码子、IgE前导序列和终止密码子。

5.如权利要求4所述的免疫原性组合物，其中所述核酸分子编码包含选自由以下组成的组的氨基酸序列的肽

a)在选自由SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:8组成的组的氨基酸序列的整体长度上具有至少约90％同一性的氨基酸序列，

b)在选自由SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:8组成的组的氨基酸序列的至少60％上包含至少约90％同一性的免疫原性片段，

c)选自由SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:8组成的组的氨基酸序列，以及

d)包含选自由SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:8组成的组的氨基酸序列的至少60％的免疫原性片段。

6.如权利要求5所述的免疫原性组合物，其中所述核酸分子包含选自由以下组成的组的核苷酸序列

a)在选自由SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:7组成的组的核苷酸序列的整体长度上具有至少约90％同一性的核苷酸序列，

b)在选自由SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:7组成的组的核苷酸序列的至少60％上具有至少约90％同一性的核苷酸序列的免疫原性片段，

c)选自由SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:7组成的组的核苷酸序列，以及

d)选自由SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:7组成的组的核苷酸序列的免疫原性片段。

7.如权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述核酸分子包含表达载体。

8.如权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述核酸分子掺入到病毒颗粒中。

9.如权利要求1所述的免疫原性组合物，还包含药学上可接受的赋形剂。

10.如权利要求1所述的免疫原性组合物，还包含佐剂。

11.一种编码包含选自由以下组成的组的氨基酸序列的肽的核酸分子

a)在选自由SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:6组成的组的氨基酸序列的整体长度上具有至少约90％同一性的氨基酸序列，

b)在选自由SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:6组成的组的氨基酸序列的至少60％上包含至少约90％同一性的片段，

c)选自由SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:6组成的组的氨基酸序列，以及

d)包含选自由SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:6组成的组的氨基酸序列的至少60％的片段。

12.如权利要求11所述的核酸分子，其中所述核酸分子选自由DNA分子和RNA分子组成的组。

13.如权利要求11所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含选自由以下组成的组的核苷酸序列

a)在选自由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:5组成的组的核苷酸序列的整体长度上具有至少约90％同一性的核苷酸序列，

b)在选自由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:5组成的组的核苷酸序列的至少60％上具有至少约90％同一性的核苷酸序列的片段，

c)选自由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:5组成的组的核苷酸序列，以及

d)选自由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:5组成的组的核苷酸序列的片段。

14.如权利要求11所述的核酸分子，其中所编码的肽可操作地连接到至少一个选自由以下组成的组的调控序列：起始密码子、IgE前导序列和终止密码子。

15.如权利要求14所述的核酸分子，其中所述核酸分子编码包含选自由以下组成的组的氨基酸序列的肽

a)在选自由SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:8组成的组的氨基酸序列的整体长度上具有至少约90％同一性的氨基酸序列，

b)在选自由SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:8组成的组的氨基酸序列的至少60％上包含至少约90％同一性的片段，

c)选自由SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:8组成的组的氨基酸序列，以及

d)包含选自由SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:8组成的组的氨基酸序列的至少60％的片段。

16.如权利要求15所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含选自由以下组成的组的核苷酸序列

a)在选自由SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:7组成的组的核苷酸序列的整体长度上具有至少约90％同一性的核苷酸序列，

b)在选自由SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:7组成的组的核苷酸序列的至少60％上具有至少约90％同一性的核苷酸序列的片段，

c)选自由SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:7组成的组的核苷酸序列，以及

d)选自由SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:7组成的组的核苷酸序列的片段。

17.如权利要求11所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含表达载体。

18.如权利要求11所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含病毒颗粒。

19.一种包含肽的免疫原性组合物，其中所述肽包含选自由以下组成的组的氨基酸序列

a)在选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8组成的组的氨基酸序列的整体长度上具有至少约90％同一性的氨基酸序列，

b)在选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8组成的组的氨基酸序列的至少60％上包含至少约90％同一性的免疫原性片段，

c)选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8组成的组的氨基酸序列，以及

d)包含选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8组成的组的氨基酸序列的至少60％的免疫原性片段。

20.一种包含选自由以下组成的组的氨基酸序列的肽

a)在选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8组成的组的氨基酸序列的整体长度上具有至少约90％同一性的氨基酸序列，

b)在选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8组成的组的氨基酸序列的至少60％上包含至少约90％同一性的免疫原性片段，

c)选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8组成的组的氨基酸序列，以及

d)包含选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8组成的组的氨基酸序列的至少60％的免疫原性片段。

21.一种诱导有需要的受试者中针对成纤维细胞活化蛋白(FAP)的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用如权利要求1所述的免疫原性组合物。

22.如权利要求21所述的方法，其中施用包括电穿孔和注射中的至少一种。

23.一种治疗或预防有需要的受试者中的肿瘤相关病理的方法，所述方法包括向所述受试者施用如权利要求1所述的免疫原性组合物。

24.如权利要求23所述的方法，其中施用包括电穿孔和注射中的至少一种。

25.如权利要求23所述的方法，其中所述肿瘤相关病理是肿瘤生长、肿瘤转移和血管生成中的至少一种。

26.如权利要求23所述的方法，其中所述受试者已诊断为患有癌症。

27.如权利要求23所述的方法，其中所述方法还包括向所述受试者施用一种或多种癌症抗原。