JP2019532935A - 線維芽細胞活性化タンパク質を標的にする最適化された合成コンセンサス免疫原性組成物 - Google Patents

線維芽細胞活性化タンパク質を標的にする最適化された合成コンセンサス免疫原性組成物 Download PDF

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Abstract

合成コンセンサスＦＡＰ抗原を含む免疫原性組成物が本明細書で提供される。免疫原性組成物を対象に投与することによって、それらを必要とする対象において腫瘍関連病態を治療または予防する方法も本明細書に開示される。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２０１６年９月２１日に出願された米国特許仮出願第６２／３９７，４６９号に対して優先権を有する。
連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
本発明は、米国国立衛生研究所により与えられた助成金番号Ｐ５０ＣＡ１７４５２３、Ｕ１９ＡＩ１０９６４６及びＦ３２ＣＡ２１３７９５ならびに米国国防総省により与えられた助成金番号Ｗ３１Ｐ４Ｑ−１５−１−０００３の下で政府の支援により実施された。政府は本発明に関して一定の権利を有する。
本発明は、線維芽細胞活性化タンパク質を標的にする免疫原性組成物及びその免疫原性組成物を投与する方法に関する。
固形腫瘍の病態生理は、腫瘍の進行を導き、がん療法の有効性に対して障害を招く、異常な微小環境を特徴とする。線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）を含めたいくつかのタンパク質は、腫瘍微小環境中で過剰発現している。ＦＡＰは、９０％を超えるヒト癌腫において、がん関連線維芽細胞でアップレギュレートされている、ゼラチナーゼ及びペプチダーゼ活性を有する膜結合酵素である。
腫瘍微小環境に対する身体の寛容性の破壊は、がん療法を向上させる可能性がある。以前の研究によって、トランスジェニックマウスからのＦＡＰ発現細胞の除去は、腫瘍増殖を弱め、免疫チェックポイント阻害などの他の免疫療法と相乗的に作用することが示された。グループは、ＦＡＰを標的にするキメラ抗原受容体を発現するＴ細胞が腫瘍の進行を遅らすことをさらに示した。しかし、いくつかのマウス系統では、これらのＣＡＲは致死毒性を引き起こす。
したがって、腫瘍微小環境に対する寛容性を破壊することを目的とするより安全な療法の開発に対する必要性が当技術分野に存在する。本発明は、この未だ対処されていない必要性を満たす。
一実施形態では、本発明は、核酸分子を含む免疫原性組成物に関し、核酸分子は、ａ）配列番号２もしくは配列番号６のアミノ酸配列の全長にわたって、少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列、ｂ）配列番号２もしくは配列番号６のアミノ酸配列の少なくとも６０％にわたって、少なくとも約９０％の同一性を含む免疫原性断片、ｃ）配列番号２もしくは配列番号６のアミノ酸配列、またはｄ）配列番号２もしくは配列番号６のアミノ酸配列の少なくとも６０％を含む免疫原性断片のアミノ酸配列を含むペプチドをコードする。
一実施形態では、核酸分子はＤＮＡ分子である。一実施形態では、核酸分子はＲＮＡ分子である。
一実施形態では、核酸分子は、ａ）配列番号１もしくは配列番号５のヌクレオチド配列の全長にわたって、少なくとも約９０％の同一性を有するヌクレオチド配列、ｂ）配列番号１もしくは配列番号５のヌクレオチド配列の少なくとも６０％にわたって、少なくとも約９０％の同一性を有するヌクレオチド配列の免疫原性断片、ｃ）配列番号１もしくは配列番号５のヌクレオチド配列、またはｄ）配列番号１もしくは配列番号５のヌクレオチド配列の免疫原性断片のヌクレオチド配列を含む。
一実施形態では、ペプチドをコードするヌクレオチド配列は、少なくとも１つの調節配列に作動可能に連結している。一実施形態では、制御配列は、開始コドン、ＩｇＥリーダー配列、終止コドンまたはそれらの組み合わせである。
一実施形態では、核酸分子は、ａ）配列番号４もしくは配列番号８のアミノ酸配列の全長にわたって、少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列、ｂ）配列番号４もしくは配列番号８のアミノ酸配列の少なくとも６０％にわたって、少なくとも約９０％の同一性を含む免疫原性断片、ｃ）配列番号４もしくは配列番号８のアミノ酸配列、またはｄ）配列番号４もしくは配列番号８のアミノ酸配列の少なくとも６０％を含む免疫原性断片のアミノ酸配列を含むペプチドをコードする。
一実施形態では、核酸分子は、ａ）配列番号３もしくは配列番号７のヌクレオチド配列の全長にわたって、少なくとも約９０％の同一性を有するヌクレオチド配列、ｂ）配列番号３もしくは配列番号７のヌクレオチド配列の少なくとも６０％にわたって、少なくとも約９０％の同一性を有するヌクレオチド配列の免疫原性断片、ｃ）ヌクレオチド配列、配列番号３もしくは配列番号７、またはｄ）配列番号３もしくは配列番号７のヌクレオチド配列の免疫原性断片のヌクレオチド配列を含む。
一実施形態では、核酸分子は発現ベクターである。
一実施形態では、核酸分子はウイルス粒子中に組み込まれている。
一実施形態では、免疫原性組成物は医薬的に許容可能な賦形剤を含む。
一実施形態では、免疫原性組成物はアジュバントを含む。
一実施形態では、本発明は、ａ）配列番号２もしくは配列番号６のアミノ酸配列の全長にわたって、少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列、ｂ）配列番号２もしくは配列番号６のアミノ酸配列の少なくとも６０％にわたって、少なくとも約９０％の同一性を含む断片、ｃ）配列番号２もしくは配列番号６のアミノ酸配列、またはｄ）配列番号２もしくは配列番号６のアミノ酸配列の少なくとも６０％を含む断片のアミノ酸配列を含むペプチドをコードする核酸分子に関する。
一実施形態では、核酸分子はＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子である。
一実施形態では、核酸分子はＤＮＡ分子である。一実施形態では、核酸分子はＲＮＡ分子である。
一実施形態では、核酸分子は、ａ）配列番号１もしくは配列番号５のヌクレオチド配列の全長にわたって、少なくとも約９０％の同一性を有するヌクレオチド配列、ｂ）配列番号１もしくは配列番号５のヌクレオチド配列の少なくとも６０％にわたって、少なくとも約９０％の同一性を有するヌクレオチド配列の免疫原性断片、ｃ）配列番号１もしくは配列番号５のヌクレオチド配列、またはｄ）配列番号１もしくは配列番号５のヌクレオチド配列の免疫原性断片のヌクレオチド配列を含む。
一実施形態では、ペプチドをコードするヌクレオチド配列は、少なくとも１つの調節配列に作動可能に連結している。一実施形態では、制御配列は、開始コドン、ＩｇＥリーダー配列、終止コドンまたはそれらの組み合わせである。
一実施形態では、核酸分子は、ａ）配列番号４もしくは配列番号８のアミノ酸配列の全長にわたって、少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列、ｂ）配列番号４もしくは配列番号８のアミノ酸配列の少なくとも６０％にわたって、少なくとも約９０％の同一性を含む免疫原性断片、ｃ）配列番号４もしくは配列番号８のアミノ酸配列、またはｄ）配列番号４もしくは配列番号８のアミノ酸配列の少なくとも６０％を含む免疫原性断片のアミノ酸配列を含むペプチドをコードする。
一実施形態では、核酸分子は、ａ）配列番号３もしくは配列番号７のヌクレオチド配列の全長にわたって、少なくとも約９０％の同一性を有するヌクレオチド配列、ｂ）配列番号３もしくは配列番号７のヌクレオチド配列の少なくとも６０％にわたって、少なくとも約９０％の同一性を有するヌクレオチド配列の免疫原性断片、ｃ）ヌクレオチド配列、配列番号３もしくは配列番号７、またはｄ）配列番号３もしくは配列番号７のヌクレオチド配列の免疫原性断片のヌクレオチド配列を含む。
一実施形態では、核酸分子は発現ベクターである。
一実施形態では、核酸分子はウイルス粒子中に組み込まれている。
一実施形態では、本発明はペプチドを含む免疫原性組成物に関し、ペプチドは、ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６もしくは配列番号８のアミノ酸配列の全長にわたって、少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列、ｂ）配列番号２、配列番号４、配列番号６もしくは配列番号８のアミノ酸配列の少なくとも６０％にわたって、少なくとも約９０％の同一性を含む免疫原性断片、ｃ）配列番号２、配列番号４、配列番号６もしくは配列番号８のアミノ酸配列、またはｄ）アミノ酸配列、配列番号２、配列番号４、配列番号６もしくは配列番号８の少なくとも６０％を含む免疫原性断片のアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、本発明は、ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６もしくは配列番号８のアミノ酸配列の全長にわたって、少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列、ｂ）配列番号２、配列番号４、配列番号６もしくは配列番号８のアミノ酸配列の少なくとも６０％にわたって、少なくとも約９０％の同一性を含む免疫原性断片、ｃ）配列番号２、配列番号４、配列番号６もしくは配列番号８のアミノ酸配列、またはｄ）配列番号２、配列番号４、配列番号６もしくは配列番号８のアミノ酸配列の少なくとも６０％を含む免疫原性断片のアミノ酸配列を含むペプチドに関する。
一実施形態では、本発明は、それらを必要とする対象において線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に対して免疫応答を誘導する方法に関し、この方法は、核酸分子を含む免疫原性組成物を対象に投与することを含み、ここで、核酸分子は、ａ）配列番号２もしくは配列番号６のアミノ酸配列の全長にわたって、少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列、ｂ）配列番号２もしくは配列番号６のアミノ酸配列の少なくとも６０％にわたって、少なくとも約９０％の同一性を含む免疫原性断片、ｃ）配列番号２もしくは配列番号６のアミノ酸配列、またはｄ）配列番号２もしくは配列番号６のアミノ酸配列の少なくとも６０％を含む免疫原性断片のアミノ酸配列を含むペプチドをコードする。
一実施形態では、投与は、電気穿孔または注入のうちの少なくとも１つを含む。
一実施形態では、本発明は、それらを必要とする対象において腫瘍関連病態を治療または予防する方法に関し、この方法は、核酸分子を含む免疫原性組成物を対象に投与することを含み、ここで、核酸分子は、ａ）配列番号２もしくは配列番号６のアミノ酸配列の全長にわたって、少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列、ｂ）配列番号２もしくは配列番号６のアミノ酸配列の少なくとも６０％にわたって、少なくとも約９０％の同一性を含む免疫原性断片、ｃ）配列番号２もしくは配列番号６のアミノ酸配列、またはｄ）配列番号２もしくは配列番号６のアミノ酸配列の少なくとも６０％を含む免疫原性断片のアミノ酸配列を含むペプチドをコードする。
一実施形態では、投与は、電気穿孔または注入のうちの少なくとも１つを含む。
一実施形態では、腫瘍関連病態は、腫瘍増殖、腫瘍転移または血管新生のうちの少なくとも１つである。
一実施形態では、対象はがんと診断されている。
一実施形態では、がんは前立腺癌である。
一実施形態では、方法は、１種または複数の前立腺癌抗原を含む免疫原性組成物を対象に投与することを含む。一実施形態では、方法は、ＰＳＭＡを含む免疫原性組成物を対象に投与することを含む。
一実施形態では、がんは肺癌である。一実施形態では、方法は、１種または複数の肺癌抗原を含む疫原性組成物を対象に投与することを含む。一実施形態では、方法は、ＴＥＲＴを含む免疫原性組成物を対象に投与することを含む。
本発明の好ましい実施形態の以下の詳細な説明は、添付の図面と併せて読めば、より良く理解されるであろう。本発明を例示する目的で、現在好ましい実施形態が図面に示される。しかし、本発明は図面に示される実施形態の正確な配置及び手段に限定されないことを理解されたい。
腫瘍抗原特異的ＤＮＡベースの免疫原性組成物コンストラクトと組み合わせて使用するための、合成コンセンサス技術を使用するＦＡＰ免疫原性組成物の設計を示す図である。図１Ａは、本発明の最適化コンセンサス配列とネイティブなヒト及びマウスＦＡＰ配列の間の遺伝的関連性を説明する系統樹を示す。図１Ｂは、ＩｇＥリーダー配列（ＩｇＥＬＳ）に作動可能に連結しており、ジペプチジルペプチダーゼ及びゼラチン分解活性をブロックするためのＳ６２４Ａ突然変異を有するマウスＦＡＰの概略図を示す。図１Ｃは、ｃｐｋ型式で示される、天然のホモダイマー形態の成熟型マウスＦＡＰの図解を示す。完全に野生型のＦＡＰの内在性の膜テザーは、この設計中に存在しない。代表的な野生型配列に対するμＣｏｎの変化を赤色で示す。２つの除去された活性セリン残基のうちの１つは、モノマー活性部位ポケット中に位置する黄色で見ることができる。図１Ｄは、２９３Ｔ細胞中にトランスフェクトされた、ネイティブマウスＦＡＰとμＣｏｎマウスＦＡＰの両方のプラスミドの発現を示す、例示的ウエスタンブロットを示す。トランスフェクトされていない細胞及びＧＦＰ発現プラスミドでトランスフェクトされた細胞を陰性対照として使用した。 Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおいてμＣｏｎマウスＦＡＰワクチンの免疫原性を示す実験結果を示す図である。図２Ａは実験計画を示す。マウスを２週間隔で３回免疫化し、最終的なワクチン接種から１週後に屠殺した。脾細胞を解析して、Ｔ細胞応答を調べた。図２Ｂ及び図２Ｃは、ネイティブマウスＦＡＰペプチド（図２Ｂ）またはワクチン配列と一致したμＣｏｎペプチド（図２Ｃ）に対するＩＦＮ−γ ＥＬＩＳｐｏｔ応答を示す例示的結果を示す。図２Ｄ及び図２Ｅは、ネイティブマウスＦＡＰペプチドで５時間刺激した後のＣＤ８＋（図２Ｄ）及びＣＤ４＋（図２Ｅ）Ｔ細胞の細胞内サイトカイン染色を示す例示的結果を示す。１０μｇ用量のＦＡＰワクチンを本研究に使用した。図２Ｄ及び図２Ｅについて、スチューデントのｔ検定によって有意性を決定した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。群当たりＮ＝５マウスであり、２つの独立した実験の代表を示す。 ＣＤ−１非近交系マウスにおけるネイティブＦＡＰワクチンとμＣｏｎ ＦＡＰワクチンの比較を示す実験結果を示す図である。図３Ａは、未処置対照群（上）、ネイティブマウスＦＡＰワクチン群（中央）またはμＣｏｎマウスＦＡＰワクチン群（下）における個々のＣＤ−１非近交系マウスからの、ネイティブマウスＦＡＰペプチドに対するＩＦＮ−γ ＥＬＩＳｐｏｔ応答を示す例示的結果を示す。免疫化されたマウスは１０μｇのＤＮＡプラスミドが与えられた。これらのマウスの免疫化スケジュールは図２と同じである。図３Ｂは、プールによって分離されていない、図３Ａで免疫化されたマウスからの全ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳｐｏｔ応答を示す例示的結果を示す。図３Ｃは、ネイティブＦＡＰタンパク質（細胞外ドメイン）に対する、図３Ａのマウスからの終点結合力価を示す例示的結果を示す。図３Ｂについて、二元配置ＡＮＯＶＡ、続いてチューキーのＨＳＤ検定によって、有意性を決定した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。未処置群で１０匹のマウスを使用し、それぞれ１５匹のマウスをネイティブＦＡＰ群及びμＣｏｎ ＦＡＰ群で使用した。 Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおけるネイティブＦＡＰワクチンとμＣｏｎ ＦＡＰワクチンの比較を示す実験結果を示す図である。図４Ａは、実験設定を示す図解を示す。Ｃ５７Ｂｌ／６マウスを２週間隔で３回免疫化し、最終的なワクチン接種から１週後に屠殺した。脾細胞を解析して、Ｔ細胞応答を調べ、血清を収集して、抗体応答を調べた。図４Ｂは、ネイティブマウスＦＡＰペプチドに対するＩＦＮ−γ ＥＬＩＳｐｏｔ応答を示す例示的結果を示す。図４Ｃ及び図４Ｄは、ネイティブマウスＦＡＰペプチドで５時間刺激した後のＣＤ８＋（図４Ｃ）及びＣＤ４＋（図４Ｄ）Ｔ細胞の細胞内サイトカイン染色を示す例示的結果を示す。１０μｇ用量のネイティブマウスＦＡＰワクチンまたはμＣｏｎマウスＦＡＰワクチンを本研究に使用した。図４Ｅは、ネイティブＦＡＰタンパク質（細胞外ドメイン）に対する、図４Ａのマウスからの終点結合力価を示す例示的結果を示す。一元配置ＡＮＯＶＡ、続いてチューキーのＨＳＤ検定によって、有意性を決定した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。群当たりＮ＝４〜１０匹のマウス。 Ｂａｌｂ／ｃマウスにおけるネイティブＦＡＰワクチンとμＣｏｎ ＦＡＰワクチンの比較を示す実験結果を示す図である。図５Ａは、実験設定を示す図解を示す。Ｂａｌｂ／ｃマウスを２週間隔で３回免疫化し、最終的なワクチン接種から１週後に屠殺した。脾細胞を解析して、Ｔ細胞応答を調べ、血清を収集して、抗体応答を調べた。図５Ｂは、ネイティブマウスＦＡＰペプチドに対するＩＦＮ−γ ＥＬＩＳｐｏｔ応答を示す例示的結果を示す。図５Ｃ及び図５Ｄは、ネイティブマウスＦＡＰペプチドで５時間刺激した後のＣＤ８＋（図５Ｃ）及びＣＤ４＋（図５Ｄ）Ｔ細胞の細胞内サイトカイン染色を示す例示的結果を示す。１０μｇ用量のネイティブマウスＦＡＰワクチンまたはμＣｏｎマウスＦＡＰワクチンを本研究に使用した。図５Ｅは、ネイティブＦＡＰタンパク質（細胞外ドメイン）に対する、図５Ａのマウスからの終点結合力価を示す例示的結果を示す。一元配置ＡＮＯＶＡ、続いてチューキーのＨＳＤ検定によって、有意性を決定した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。群当たりＮ＝４〜１０匹のマウス。 治療的肺腫瘍モデルにおけるＦＡＰワクチン及び併用療法の有効性を示す実験結果を示す図である。図６Ａは、実験設定を示す図解を示す。マウスにＴＣ−１細胞を０日目に移植し、マウスを７日目に無作為化し、合計で４回の免疫化について週１回免疫化した。１０μｇのμＣｏｎ ＦＡＰ ＤＮＡ及び２５μｇのμＣｏｎマウスＴＥＲＴ ＤＮＡを使用した。図６Ｂは、ＴＣ−１を移植されたマウスに対する示されるワクチン接種レジメンについての経時的な腫瘍体積の測定値を示す例示的結果を示す。図６Ｃは、ＴＣ−１を移植されたマウスに対する示されるワクチン接種レジメンについての経時的なマウスの生存を示す例示的結果を示す。二元配置ＡＮＯＶＡ、続いてチューキーのＨＳＤ検定によって、腫瘍体積の測定値の有意性を決定した。ゲーハン−ブレスロウ−ウィルコクソン検定によって、マウスの生存の有意性を決定した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。ＴＣ−１研究について群当たりＮ＝１０匹のマウス。２つの独立した実験の代表を示す。 治療的前立腺腫瘍モデルにおけるＦＡＰワクチン及び併用療法の有効性を示す例示的実験結果を示す図である。図７Ａは実験設定を示す図解を示す。マウスにＴＲＡＭＰ−Ｃ２細胞を０日目に移植し、マウスを４日目に無作為化し、合計で４回の免疫化について週１回免疫化した。１０μｇのμＣｏｎ ＦＡＰ ＤＮＡ及び２０μｇのμＣｏｎ ＰＳＭＡを使用した。図７Ｂは、ＴＲＡＭＰ−Ｃ２を移植されたマウスに対する、示されるワクチン接種レジメンについての経時的な腫瘍体積の測定値を示す例示的結果を示す。図７Ｃは、ＴＲＡＭＰ−Ｃ２を移植されたマウスに対する、示されるワクチン接種レジメンについての経時的なマウスの生存を示す例示的結果を示す。二元配置ＡＮＯＶＡ、続いてチューキーのＨＳＤ検定によって、腫瘍体積の測定値の有意性を決定した。ゲーハン−ブレスロウ−ウィルコクソン検定によって、マウスの生存の有意性を決定した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。ＴＲＡＭＰ−Ｃ２研究について群当たりＮ＝１５匹のマウス。各腫瘍タイプについて２つの独立した実験の代表を示す。 腫瘍細胞株におけるＦＡＰの発現を示す例示的実験結果を示す図である。マウス腫瘍細胞株ＴＣ−１及びＴＲＡＭＰ−Ｃ２におけるマウスＦＡＰのウエスタンブロット発現。ネイティブマウスＦＡＰプラスミドでトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞を陽性対照として使用した。 ＦＡＰワクチンがＦＡＰ特異的ＴＩＬを誘導することを示す例示的実験結果を示す図である。図９Ａは実験設定を示す図解を示す。マウスにＴＣ−１腫瘍細胞を０日目に移植し、マウスを７日目に無作為化し、合計で２回の免疫化について週１回免疫化した。１０μｇのμＣｏｎ ＦＡＰ ＤＮＡを使用した。マウスを２１日目に屠殺し、脾細胞及びＴＩＬを回収した。図９Ｂは、ネイティブマウスＦＡＰペプチドで５時間刺激した後の脾臓中のＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞内サイトカイン染色を示す例示的結果を示す。図９Ｃは、ネイティブマウスＦＡＰペプチドで５時間刺激した腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の細胞内サイトカイン染色を示す例示的結果を示す。図９Ｄは、フローサイトメトリー染色によって評価した、各腫瘍におけるＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ４＋／ＣＤ２５＋／ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇｓの頻度を、ＣＤ４５＋／ＣＤ３＋リンパ球のパーセンテージとして示す例示的結果を示す。パネルＢ〜Ｄについて、スチューデントのｔ検定によって有意性を決定した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。群当たりＮ＝９〜１０マウスであり、２つの独立した実験の代表を示す。 ｍＴＥＲＴ＋ＦＡＰワクチンの併用接種を受けているマウスからの免疫応答を示す例示的実験結果を示す図である。マウスにＴＣ−１腫瘍細胞を０日目に移植し、マウスを７日目に無作為化し、合計で２回の免疫化について週１回免疫化した。１０μｇのμＣｏｎ ＦＡＰ ＤＮＡまたは２５μｇのｍＴＥＲＴ ＤＮＡを使用した。マウスを２１日目に屠殺し、脾細胞及びＴＩＬを回収した。図１０Ａ及び図１０Ｂは、ネイティブマウスＦＡＰペプチド（図１０Ａ）またはネイティブマウスＴＥＲＴペプチド（図１０Ｂ）で５時間刺激した後のＣＤ８＋ＴＩＬの細胞内サイトカイン染色を示す例示的結果を示す。図１０Ｃ及び図１０Ｄは、ネイティブマウスＦＡＰペプチド（図１０Ｃ）またはネイティブマウスＴＥＲＴペプチド（図１０Ｄ）で５時間刺激した後のＣＤ８＋脾細胞の細胞内サイトカイン染色を示す例示的結果を示す。一元配置ＡＮＯＶＡ、続いてチューキーのＨＳＤ検定を使用して、有意性を決定した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。群当たりＮ＝８〜１０匹のマウス。 ＦＡＰワクチンが腫瘍微小環境を変えることを示す例示的実験結果を示す図である。図１１Ａは、ＦＡＰ発現に対する、対照マウスまたはμＣｏｎマウスＦＡＰで免疫化されたマウス由来の組織の代表的な免疫組織化学染色を示す。図１１Ｂは、ＦＡＰ発現細胞によってカバーされる腫瘍内領域のパーセンテージの定量化を示す。図１１Ｃは、ヒアルロナン発現に対する、対照マウスまたはμＣｏｎマウスＦＡＰで免疫化されたマウス由来の組織の代表的な免疫蛍光画像を示す。図１１Ｄは、ヒアルロナンによってカバーされる腫瘍内領域のパーセンテージの定量化を示す。図１１Ｅは、Ｆ４／８０及びＥｐＣＡＭ発現に対する、対照マウスまたはμＣｏｎマウスＦＡＰで免疫化されたマウス由来の組織の代表的な免疫蛍光画像を示す。図１１Ｆは、Ｆ４／８０発現細胞によってカバーされる腫瘍内領域のパーセンテージの定量化を示す。図１１Ｇは、ＣＤ８α及びＥｐＣＡＭ発現に対する、対照マウスまたはμＣｏｎマウスＦＡＰで免疫化されたマウス由来の組織の代表的な免疫蛍光画像を示す。図１１Ｈは、ＣＤ８α発現細胞によってカバーされる腫瘍内領域のパーセンテージの定量化を示す。群当たりＮ＝６〜８匹のマウス。マウスあたり少なくとも５つ画像について画像の定量化を行った。図１１Ｂ〜図１１Ｄについて、スチューデントのｔ検定によって有意性を決定した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。スケールバー＝１００μｍ。 フローサイトメトリーによる免疫細胞のサブセットに対するμＣｏｎ ＦＡＰワクチンの影響を示す例示的実験結果を示す図である。マウスにＴＣ−１腫瘍細胞を移植し、図９Ａのスケジュールに従ってマウスを免疫化した。図の説明文に示されるマーカーによる先天免疫細胞集団の表面染色のために、腫瘍を回収した。図１２Ａ〜図１２Ｄは、腫瘍あたりのマクロファージ（図１２Ａ）、Ｂ細胞（図１２Ｂ）、ナチュラルキラー細胞（図１２Ｃ）及び樹状細胞（図１２Ｄ）の総数の定量化を示す例示的実験結果を示す。スチューデントのｔ検定によって、有意性を決定した。群当たりＮ＝９〜１０匹のマウスであり、２つの独立した実験の代表を示す。 腫瘍浸潤マクロファージの性質に対するμＣｏｎ ＦＡＰワクチンの影響を示す実験結果を示す図である。マウスにＴＣ−１腫瘍細胞を移植し、図９Ａのスケジュールに従ってマウスを免疫化した。図の説明文に示されるマーカーによる先天免疫細胞集団の表面染色のために、腫瘍を回収した。図１３Ａ〜図１３Ｄは、Ａｒｇ１＋（図１３Ａ）、ＭＨＣＩＩ＋（図１３Ｂ）、ＣＤ６８＋（図１３Ｃ）、ＣＤ８０＋（図１３Ｄ）及びＣＤ８６＋（図１３Ｅ）マクロファージの画分を定量化したことを示す例示的実験結果を示す。スチューデントのｔ検定によって、有意性を決定した。群当たりＮ＝９〜１０匹のマウスであり、２つの独立した実験の代表を示す。 最適化コンセンサスマウスＦＡＰワクチンに対する優性エピトープの特徴づけを示す図である。図１４Ａは、２３プールのマトリックスに配置された、ネイティブマウスＦＡＰにおける１２２種のペプチドのマトリックスマップを示す。図１４Ｂは、合成コンセンサスＦＡＰペプチドの各プールによるＣ５７Ｂｌ／６マウスの刺激を示す。図１４Ｃは、合成コンセンサスＦＡＰペプチドの各プールによるＢａｌｂ／ｃマウスの刺激を示す。 ネイティブ及び合成コンセンサスマウスＦＡＰに対する優性免疫原性エピトープのリストを示す。ネイティブＦＡＰの優性免疫原性エピトープは、配列番号１３〜配列番号２１として提供される。最適化コンセンサスＦＡＰの優性免疫原性エピトープは、配列番号１５〜配列番号１８及び配列番号２０〜配列番号２４として提供される。
一態様では、本発明はＦＡＰを標的にする免疫原性組成物を提供する。本発明のさらなる態様は、開示される免疫原性組成物を単独でまたはさらなるがんワクチンもしくは治療剤と組み合わせて使用する、がんの増殖または転移の治療及び／または予防である。
本発明の抗原をコードする配列は、それらのネイティブタンパク質の配列と遺伝的に異なっており、したがって、本発明の最適化コンセンサス抗原はユニークである。本発明の免疫原性組成物は、コードされる抗原のユニーク配列により、腫瘍微小環境に対する寛容性を破壊するのに、及び腫瘍の増殖または転移を低減させるまたは予防するのに広く適用可能であり得る。これらのユニーク配列により、免疫原性組成物は複数のタイプのがんに対して普遍的に保護的になる。
免疫原性組成物は、任意の数のがんを防ぐ及び治療するのに使用することができる。免疫原性組成物は、腫瘍微小環境抗原を標的にする液性と細胞性の両方の免疫応答を誘発することができる。免疫原性組成物は、腫瘍微小環境抗原と反応する、中和抗体及び免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体を誘発することができる。免疫原性組成物は、腫瘍微小環境抗原に反応し、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）及び腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）の１つまたは複数を生成するＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘発することもできる。一実施形態では、免疫原性組成物は、腫瘍微小環境抗原に反応し、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αの１つまたは複数を生成するＣＤ４＋Ｔ細胞応答を誘発することもできる。
定義
別段定義しない限り、本明細書で使用するすべての技術用語及び科学用語は当業者が通常理解するものと同じ意味を有する。矛盾がある場合には、定義を含めて、本明細書が優先する。本発明の実施または試験において、本明細書に記載のものと同様または均等な方法及び材料を使用することができるが、好ましい方法及び材料を以下に記載する。本明細書で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許及び他の参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に開示される材料、方法及び実施例は例示にすぎず、限定を意図したものではない。
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ））」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ（ｓ））」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「できる」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎ（ｓ））」及びそれらの変形は、本明細書で使用する場合、さらなる作用または構造の可能性を妨げない非限定的な移行句、用語または単語であることが意図される。文脈において別段明記しない限り、単数形「ａ」、「ａｎｄ」及び「ｔｈｅ」は複数の意味を含む。本開示は、明確に記載されているかどうかを問わず、本明細書で提示される実施形態または要素を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、それら「からなる」及びそれら「から本質的になる」他の実施形態も企図する。
本明細書で使用する場合、「アジュバント」は、抗原の免疫原性を増強するために本明細書に記載の免疫原性組成物に加えられる任意の分子を意味する。
本明細書で使用する場合、「抗体」は、クラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤもしくはＩｇＥの抗体、またはこれらの断片、断片もしくは誘導体、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ及び単鎖抗体、ダイアボディ、二重特異性抗体、二機能性抗体ならびにそれらの誘導体を意味する。抗体は、所望のエピトープまたはそれに由来する配列に十分な結合特異性を示す、哺乳動物の血清試料から単離された抗体、ポリクローナル抗体、親和性精製された抗体、またはこれらの混合物でもよい。
本明細書で使用する場合、「コード配列」または「コード核酸」は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ分子）を意味する。コード配列は、核酸が投与される個体または哺乳動物の細胞において発現を指示することができるプロモーター及びポリアデニル化シグナルを含めた調節エレメントに作動可能に連結している、開始及び終結シグナルをさらに含むことができる。
本明細書で使用する場合、「相補体」または「相補的」は、核酸分子のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体間のワトソン−クリック（例えば、Ａ−Ｔ／Ｕ及びＣ−Ｇ）またはフーグスティーン塩基対形成を意味する。
本明細書で使用する場合「コンセンサス」または「コンセンサス配列」は、特定の抗原の複数のサブタイプのアライメントの解析に基づいて構築される、合成核酸配列または対応するポリペプチド配列を意味することができる。この配列は、特定の抗原の複数のサブタイプ、血清型または系統に対して広範な免疫を誘導するのに使用することができる。コンセンサス配列（またはコンセンサス抗原）を生成するように、融合タンパク質などの合成抗原を操作することができる。
本明細書で互換的に使用される「電気穿孔」、「電気透過処理」または「動電学的エンハンスメント（ｅｌｅｃｔｒｏ−ｋｉｎｅｔｉｃ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ）」（「ＥＰ」）は、生体膜中に微視的経路（細孔）を誘導するための膜貫通電界パルスの使用を意味し、その存在によって、プラスミド、オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、薬物、イオン及び水などの生体分子が細胞膜の一方の側から他方の側に通過するのが可能になる。
本明細書で使用する場合、用語「発現可能な形態」は、個体の細胞中に存在する場合にコード配列を発現するように標的タンパク質または免疫調節性タンパク質をコードするコード配列に作動可能に連結している、必要な調節エレメントを含む、遺伝子コンストラクトを指す。
本明細書で使用する場合、「断片」は、哺乳動物において免疫応答を誘発することができるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列またはその一部を意味する。断片は、以下に記載されるタンパク断片をコードする様々なヌクレオチド配列の少なくとも１つから選択されるＤＮＡ断片でもよい。
ポリペプチド配列に関する「断片」または「免疫原性断片」は、全長の内在性抗原と交差反応する、哺乳動物において免疫応答を誘発することができるポリペプチドを意味する。コンセンサスタンパク質の断片は、コンセンサスタンパク質の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％を含むことができる。いくつかの実施形態では、コンセンサスタンパク質の断片は、コンセンサスタンパク質の少なくとも２０アミノ酸もしくはそれ以上、少なくとも３０アミノ酸もしくはそれ以上、少なくとも４０アミノ酸もしくはそれ以上、少なくとも５０アミノ酸もしくはそれ以上、少なくとも６０アミノ酸もしくはそれ以上、少なくとも７０アミノ酸もしくはそれ以上、少なくとも８０アミノ酸もしくはそれ以上、少なくとも９０アミノ酸もしくはそれ以上、少なくとも１００アミノ酸もしくはそれ以上、少なくとも１１０アミノ酸もしくはそれ以上、少なくとも１２０アミノ酸もしくはそれ以上、少なくとも１３０アミノ酸もしくはそれ以上、少なくとも１４０アミノ酸もしくはそれ以上、少なくとも１５０アミノ酸もしくはそれ以上、少なくとも１６０アミノ酸もしくはそれ以上、少なくとも１７０アミノ酸もしくはそれ以上、少なくとも１８０アミノ酸もしくはそれ以上、少なくとも１９０アミノ酸もしくはそれ以上、少なくとも２００アミノ酸もしくはそれ以上、少なくとも２１０アミノ酸もしくはそれ以上、少なくとも２２０アミノ酸もしくはそれ以上、少なくとも２３０アミノ酸もしくはそれ以上、または少なくとも２４０アミノ酸もしくはそれ以上を含むことができる。
本明細書で使用する場合、用語「遺伝的コンストラクト」は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡ分子を指す。コード配列は、核酸分子が投与される個体の細胞において発現を指示することができるプロモーター及びポリアデニル化シグナルを含めた調節エレメントに作動可能に連結している、開始及び終結シグナルを含む。本明細書で使用する場合、用語「発現可能な形態」は、個体の細胞中に存在する場合にコード配列を発現するように、タンパク質をコードするコード配列に作動可能に連結している必要な調節エレメントを含む遺伝子コンストラクトを指す。
２つ以上の核酸またはポリペプチド配列に関して本明細書で使用する場合、「同一の」または「同一性」は、配列が特定の領域にわたって同じである特定のパーセンテージの残基を有することを意味する。パーセンテージは、２つの配列を最適に整列させ、特定の領域にわたって２つの配列を比較し、両方の配列に同一の残基が存在する位置の数を決定して一致した位置の数を得、一致した位置の数を特定の領域における位置の総数で割り、その結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを得ることによって、計算することができる。２つの配列の長さが異なる場合、またはアライメントが１つまたは複数の付着末端をもたらし、比較の特定の領域が単一の配列のみを含む場合には、単一の配列の残基は、計算の分母に含まれるが、分子には含まれない。ＤＮＡとＲＮＡを比較する場合は、チミン（Ｔ）とウラシル（Ｕ）は、同等であると考えることができる。同一性は、手動で、またはＢＬＡＳＴまたはＢＬＡＳＴ２．０などのコンピューター配列アルゴリズムを使用することによって、行うことができる。
本明細書で使用する場合、「免疫応答」は、抗原の導入に応答した、宿主の免疫系の、例えば、哺乳動物の免疫系の活性化を意味する。免疫応答は、細胞性応答または体液性応答または両方の形態でもよい。
本明細書で使用する場合、「核酸」または「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」は、一緒に共有結合している少なくとも２つのヌクレオチドを意味する。一本鎖の記述は相補鎖の配列も規定する。したがって、核酸は記述される一本鎖の相補鎖も包含する。核酸の多くの変異体を所与の核酸と同じ目的のために使用することができる。したがって、核酸は、実質的に同一の核酸及びその相補体も包含する。一本鎖は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的配列にハイブリダイズすることができるプローブを提供する。したがって、核酸は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするプローブも包含する。
核酸は一本鎖でも二本鎖でもよく、または二本鎖と一本鎖の両方の配列の部分を含むことができる。核酸は、ＤＮＡ、ゲノム及びｃＤＮＡの両方、ＲＮＡ、またはハイブリッドでもよく、ここでは、核酸は、デオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドの組み合わせ、及びウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン及びイソグアニンを含めた塩基の組み合わせを含むことができる。核酸は、化学合成方法によって、または組換え方法によって得ることができる。
本明細書で使用する場合「作動可能に連結している」は、空間的に結びついているプロモーターの制御下にある遺伝子の発現を意味する。プロモーターは、その制御下にある遺伝子の５’（上流）または３’（下流）に位置し得る。プロモーターと遺伝子の間の距離は、そのプロモーターとそのプロモーターが由来する遺伝子内でそれが制御する遺伝子との間の距離とほぼ同じであり得る。当該技術分野において知られているように、この距離の変動は、プロモーターの機能を失うことなしに調節され得る。
本明細書で使用する場合、「ペプチド」、「タンパク質」または「ポリペプチド」は、アミノ酸が連結した配列を意味することができ、天然、合成、または天然及び合成の修飾もしくは組み合わせでもよい。
本明細書で使用する場合、「プロモーター」は、細胞において核酸の発現を与える、活性化または増強することができる、合成または天然由来の分子を意味する。プロモーターは、発現をさらに増強するために、及び／または空間的発現及び／またはその時間的発現を変化させるために、１つまたは複数の特定の転写調節配列を含むことができる。プロモーターは、遠位のエンハンサーまたはリプレッサーエレメントを含むこともでき、これらは、転写開始部位から数千塩基対程度の位置にあり得る。プロモーターは、ウイルス、細菌、真菌、植物、昆虫及び動物を含めた供給源に由来し得る。プロモーターは、発現が生じる細胞、組織もしくは器官に対して、または発現が生じる発生段階に対して、または外部刺激、例えば、生理的ストレス、病原体、金属イオンもしくは誘導剤に応答して、遺伝子成分の発現を構成的にまたは差次的に調節することができる。プロモーターの代表的な例としては、バクテリオファージＴ７プロモーター、バクテリオファージＴ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｌａｃオペレータープロモーター、ｔａｃプロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ ＩＥプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーターまたはＳＶ４０後期プロモーター及びＣＭＶ ＩＥプロモーターが挙げられる。
「シグナルペプチド」及び「リーダー配列」は本明細書で互換的に使用され、本明細書に記載される腫瘍微小環境タンパク質のアミノ末端に連結され得るアミノ酸配列を指す。シグナルペプチド／リーダー配列は、典型的には、タンパク質の局在を指示する。本明細書で使用されるシグナルペプチド／リーダー配列は、好ましくは、それが生成される細胞からのタンパク質の分泌を促進する。シグナルペプチド／リーダー配列は、細胞からの分泌の際に、成熟タンパク質と称されることが多いタンパク質残部から切断されることが多い。シグナルペプチド／リーダー配列は、タンパク質のＮ末端に連結される。
本明細書で使用する場合、「対象」は、本明細書に記載の免疫原性組成物を投与することができる哺乳動物を意味することができる。哺乳動物は、例えば、ヒト、チンパンジー、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、マウスまたはラットでもよい。
本明細書で使用する場合、「実質的に同一」は、第１及び第２のアミノ酸配列が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００個またはそれ以上のアミノ酸の領域にわたって、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％であることを意味することができる。実質的に同一は、第１のヌクレオチド配列及び第２のヌクレオチド配列が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００個またはそれ以上のヌクレオチドの領域にわたって、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％であることを意味することもできる。
本明細書で使用する場合、「治療」または「治療すること」は、疾患を予防する、抑制する、阻止するまたは完全に排除する手段を介して、対象を疾患から保護することを意味することができる。一実施形態では、疾患を予防することは、疾患の発症より前に本発明の免疫原性組成物を対象に投与することを含む。一実施形態では、疾患を予防することは、疾患の再発またはさらなる進行を予防するために、治療後に本発明の免疫原性組成物を対象に投与することを含む。疾患を抑制することは、疾患の誘発後であるが、その臨床的出現の前に、本発明の免疫原性組成物を対象に投与することを含む。疾患を阻止することは、疾患の臨床的出現の後に本発明の免疫原性組成物を対象に投与することを含む。
核酸に関して本明細書で使用される「変異体」は、（ｉ）参照されるヌクレオチド配列の一部もしくは断片、（ｉｉ）参照されるヌクレオチド配列の相補体もしくはその一部、（ｉｉｉ）参照される核酸と実質的に同一の核酸もしくはその相補体、または（ｉｖ）ストリンジェント条件下で参照される核酸にハイブリダイズする核酸、その相補体もしくはそれらに実質的に同一の配列を意味する。
変異体は、アミノ酸の挿入、欠失または保存的置換によってアミノ酸配列が異なるが、少なくとも１つの生物活性を保持する、ペプチドまたはポリペプチドとさらに定義することができる。「生物活性」の代表的な例としては、特異的な抗体が結合する能力、または免疫応答を促進する能力が挙げられる。変異体は、少なくとも１つの生物活性を保持するアミノ酸配列を有する参照されるタンパク質と実質的に同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質も意味することができる。アミノ酸の保存的置換、すなわち、同様の性質（例えば、親水性、荷電領域の程度及び分布）の異なるアミノ酸とのアミノ酸の置き換えは、典型的には軽微な変化を伴うと当技術分野で認識されている。こうした軽微な変化は、当技術分野で理解されているように、アミノ酸のヒドロパシー指数を考慮することによって、ある程度特定することができる。Ｋｙｔｅ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３２。アミノ酸のヒドロパシー指数は、その疎水性及び電荷の考慮に基づく。類似のヒドロパシー指数のアミノ酸は置換することができ、且つタンパク質の機能を依然として保持できることが当技術分野で既知である。一態様では、±２のヒドロパシー指数を有するアミノ酸が置換される。アミノ酸の親水性は、生物学的機能を保持するタンパク質をもたらすであろう置換を明らかにするのに使用することもできる。ペプチドにおけるアミノ酸の親水性の考慮は、抗原性及び免疫原性とよく相関すると報告されている有用な尺度であるペプチドの最大局所平均親水性の計算を可能にする。当技術分野で理解されているように、同様の親水性値を有するアミノ酸の置換は、生物活性、例えば免疫原性を保持するペプチドをもたらすことができる。互いに±２内の親水性値を有するアミノ酸で置換を行うことができる。アミノ酸の疎水性指数及び親水性値の両方とも、そのアミノ酸の特定の側鎖の影響を受ける。その知見と一致して、生物学的機能と両立し得るアミノ酸置換は、疎水性、親水性、電荷、サイズ及び他の性質によって明らかにされるような、アミノ酸、特にそれらのアミノ酸の側鎖の相対的な類似性に依存すると理解される。
変異体は、完全遺伝子配列またはその断片の全長にわたって実質的に同一のヌクレオチド配列でもよい。ヌクレオチド配列は、完全遺伝子配列またはその断片の全長にわたって、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一でもよい。変異体は、アミノ酸配列またはその断片の全長にわたって実質的に同一のアミノ酸配列でもよい。アミノ酸配列は、アミノ酸配列またはその断片の全長にわたって、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一でもよい。
本明細書で使用する場合「ベクター」は、複製開始点を含む核酸配列を意味する。ベクターは、ウイルスベクター、バクテリオファージ、細菌人工染色体または酵母人工染色体でもよい。ベクターは、ＤＮＡベクターまたはＲＮＡベクターでもよい。ベクターは、自己複製染色体外ベクターでもよく、好ましくは、ＤＮＡプラスミドである。
本明細書における数値範囲の記載については、同程度の正確さ有する、その間に介在する各数が、明確に意図される。例えば、６〜９の範囲については、６及び９に加えて、数７及び８が意図され、６．０〜７．０の範囲については、数６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９及び７．０が明確に意図される。
説明
本発明は、腫瘍微小環境抗原の最適化コンセンサス配列を提供する。一実施形態では、最適化コンセンサス配列にコードされる抗原は、哺乳動物において免疫応答を誘発することができる。一実施形態では、最適化コンセンサス配列にコードされる抗原は、免疫応答を誘導することができる免疫原としてその抗原を特に有効にするエピトープ（複数可）を含むことができる。
最適化コンセンサス配列は、２つ以上のネイティブＦＡＰタンパク質に由来するコンセンサス配列でもよい。最適化コンセンサス配列は、発現を向上させるために、コンセンサス配列及び／または改変（複数可）を含むことができる。改変としては、コドン最適化、ＲＮＡ最適化、翻訳開始を増進させるためのコザック配列の付加、及び／または免疫原性を増大させるための免疫グロブリンリーダー配列の付加を挙げることができる。最適化コンセンサス配列にコードされるＦＡＰ抗原は、免疫グロブリンシグナルペプチドなどのシグナルペプチド、例えば、限定されないが、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）または免疫グロブリン（ＩｇＧ）シグナルペプチドを含むことができる。いくつかの実施形態では、最適化コンセンサス配列にコードされる抗原は、ヘマグルチニン（ＨＡ）タグを含むことができる。最適化コンセンサス配列にコードされるＦＡＰ抗原は、対応するネイティブ抗原よりも強い細胞性及び／または液性免疫応答を誘発するように設計することができる。最適化コンセンサス配列にコードされるＦＡＰ抗原は、寛容性を破壊し、抗がん免疫療法と相乗的に作用するように設計することができる。
一実施形態では、最適化コンセンサスＦＡＰは、ネイティブヒトＦＡＰに対する寛容性を破壊するように設計される。一実施形態では、ヒトの最適化コンセンサスＦＡＰをコードする配列は、配列番号１または配列番号３に記載の通りである。一実施形態では、ヒトの最適化コンセンサスＦＡＰにコードされる抗原は、配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する。
一実施形態では、最適化コンセンサスＦＡＰは、ネイティブマウスＦＡＰに対する寛容性を破壊するように設計される。一実施形態では、マウスの最適化コンセンサスＦＡＰをコードする配列は、配列番号５または配列番号７に記載の通りである。一実施形態では、マウスの最適化コンセンサスＦＡＰにコードされる抗原は、配列番号６または配列番号８に記載のアミノ酸配列を有する。
一実施形態では、最適化コンセンサスにコードされるＦＡＰ抗原は、１つまたは複数の調節エレメントに作動可能に連結している。一実施形態では、調節エレメントはリーダー配列である。一実施形態では、ＩｇＥリーダーをコードする配列に作動可能に連結している最適化コンセンサスＤＮＡ配列は、配列番号３または配列番号７に記載される。一実施形態では、ＩｇＥリーダー配列に作動可能に連結している最適化コンセンサスにコードされるＦＡＰ抗原は、配列番号４または配列番号８に記載の通りである。
一実施形態では、調節エレメントは開始コドンである。したがって、一実施形態では、本発明は、５’末端に開始コドンを含むヌクレオチド配列に作動可能に連結している、配列番号１もしくは配列番号５に記載の核酸配列またはそれらの断片もしくは相同体に関する。一実施形態では、本発明は、Ｎ末端で開始コドン（例えば、メチオニン）にコードされるアミノ酸に作動可能に連結している、配列番号２もしくは配列番号６に記載のアミノ酸配列またはそれらの断片もしくは相同体に関する。
一実施形態では、調節エレメントは少なくとも１つの終止コドンである。したがって、一実施形態では、本発明は、３’末端に少なくとも１つの終止コドンを含むヌクレオチド配列に作動可能に連結している、配列番号１、配列番号３、配列番号５もしくは配列番号７に記載の核酸配列またはそれらの断片もしくは相同体に関する。一実施形態では、ヌクレオチド配列は、翻訳終結の効率を高めるために２つの終止コドンに作動可能に連結している。
一実施形態では、ＦＡＰ抗原をコードする最適化コンセンサス配列は、配列番号２、配列番号４、配列番号６もしくは配列番号８に記載されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードすることができる。一実施形態では、最適化コンセンサス配列は、配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号７に記載されるヌクレオチド配列を有することができる。いくつかの実施形態では、配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号７に記載されるヌクレオチド配列の全長にわたって、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一性を有するヌクレオチド配列でもよい。他の実施形態では、配列は、配列番号２、配列番号４、配列番号６もしくは配列番号８に記載されるアミノ酸配列の全長にわたって、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列でもよい。
いくつかの実施形態では、最適化コンセンサスＦＡＰ抗原は、配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号７に記載される核酸配列の全長にわたって、少なくとも約９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一性を有するＤＮＡ配列からの転写産物であるＲＮＡにコードされ得る。いくつかの実施形態では、最適化コンセンサスＦＡＰ抗原は、配列番号２、配列番号４、配列番号６もしくは配列番号８に記載されるアミノ酸配列の全長にわたって、少なくとも約９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一性を有するアミノ酸配列をコードするＲＮＡにコードされ得る。
最適化コンセンサスにコードされるＦＡＰ抗原は、配列番号２、配列番号４、配列番号６もしくは配列番号８に記載されるアミノ酸配列を有するペプチドでもよい。いくつかの実施形態では、抗原は、配列番号２、配列番号４、配列番号６もしくは配列番号８に記載されるアミノ酸配列の全長にわたって、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一性を有するアミノ酸配列を有することができる。
配列番号２、配列番号４、配列番号６もしくは配列番号８の免疫原性断片に相同なアミノ酸配列を有するタンパク質の免疫原性断片を提供することができる。そのような免疫原性断片は、配列番号２、配列番号４、配列番号６もしくは配列番号８に９５％相同なタンパク質の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％を含むことができる。いくつかの実施形態は、本明細書のコンセンサスタンパク質配列の免疫原性断片に９６％の相同性を有する免疫原性断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書のコンセンサスタンパク質配列の免疫原性断片に９７％の相同性を有する免疫原性断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書のコンセンサスタンパク質配列の免疫原性断片に９８％の相同性を有する免疫原性断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書のコンセンサスタンパク質配列の免疫原性断片に９９％の相同性を有する免疫原性断片に関する。いくつかの実施形態では、免疫原性断片は、リーダー配列、例えば免疫グロブリンリーダーなど、例えばＩｇＥリーダーを含む。いくつかの実施形態では、免疫原性断片はリーダー配列がない。
一実施形態では、最適化コンセンサスＦＡＰ抗原の免疫原性断片は、少なくとも１つの、全長の最適化コンセンサスＦＡＰ抗原の免疫優性または亜免疫優性エピトープをコードする。配列番号６に記載される全長の最適化コンセンサスＦＡＰ抗原の例示的免疫優性及び亜免疫優性エピトープとしては、限定されないが、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３及び配列番号２４に記載のアミノ酸配列を有するペプチドが挙げられる。
いくつかの実施形態は、配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号７の全長の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％を含む、配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号７の免疫原性断片に関する。免疫原性断片は、配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号７の断片に少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％相同であってもよい。いくつかの実施形態では、免疫原性断片は、リーダー配列、例えば免疫グロブリンリーダーなど、例えば、ＩｇＥリーダーをコードする配列を含む。いくつかの実施形態では、断片は、リーダー配列をコードするコード配列がない。
免疫原性組成物
最適化コンセンサス配列、最適化コンセンサスにコードされる抗原、それらの断片、それらの変異体、またはそれらの組み合わせを含む、ワクチンなどの免疫原性組成物が本明細書で提供される。免疫原性組成物は、腫瘍の増殖もしくは転移を低減する、または腫瘍の発生を防ぎ、それによって、がんに基づく病態を治療する、予防する及び／または防ぐのに使用することができる。免疫原性組成物は、免疫原性組成物が投与される対象の免疫応答を有意に誘導し、それによって、対象において、がんに基づく病態を防ぐこと及び治療することができる。
免疫原性組成物は、ＤＮＡワクチン、ペプチドワクチン、またはＤＮＡワクチン及びペプチドの配合ワクチンでもよい。ＤＮＡワクチンは、抗原をコードする最適化コンセンサスヌクレオチド配列を含むことができる。ヌクレオチド配列は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、それらの変異体、それらの断片、またはそれらの組み合わせでもよい。ヌクレオチド配列は、ペプチド結合によって抗原に連結しているリンカー、リーダーまたはタグ配列をコードするさらなる配列を含むこともできる。ペプチドワクチンは、抗原、その変異体、その断片、またはそれらの組み合わせを含むことができる。ＤＮＡワクチン及びペプチドの配合ワクチンは、上記の最適化コンセンサスヌクレオチド配列及びコードされる抗原を含むことができる。
一実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、ＦＡＰを発現する腫瘍細胞を特徴とするがん、例えば、がん細胞及び転移性腫瘍病変に対する防御的抗腫瘍免疫を誘発する、ならびにＦＡＰを発現する腫瘍細胞を特徴とするがん、例えば、がん細胞及び転移性腫瘍病変の再発を予防するのに使用することができる。
一実施形態では、本明細書に記載の組成物及び方法は、治療される細胞がＦＡＰを発現する限り、がん及び腫瘍細胞、すなわち、悪性及び良性の腫瘍の両方の治療に有用である。したがって、本明細書に記載の方法及び組成物の様々な実施形態では、がんとしては、限定されないが、前立腺癌、肺癌、非小細胞肺癌、悪性肉腫、乳癌、膵臓癌、黒色腫、血液癌（例えば、白血病、リンパ腫、骨髄腫）、食道扁平上皮癌、膀胱癌、結腸直腸癌、食道、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、肝細胞癌、頭頸部癌、脳腫瘍、肛門癌、滑膜癌、精巣癌、肝臓癌、子宮頸癌、再発性呼吸器乳頭腫症、皮膚癌及び胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）を挙げることができる。
一実施形態では、本発明の免疫原性組成物はＦＡＰ抗原を含む。一実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、ＦＡＰ抗原及び１種または複数のさらなるがん抗原を含む。
一実施形態では、免疫原性組成物はワクチンでもよい。ワクチンは、弱毒生ワクチン、抗原を送達するために組換えベクターを使用するワクチン、サブユニットワクチン及び糖タンパク質ワクチン、例えば、限定されないが、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第４，５１０，２４５号、第４，７９７，３６８号、第４，７２２，８４８号、第４，７９０，９８７号、第４，９２０，２０９号、第５，０１７，４８７号、第５，０７７，０４４号、第５，１１０，５８７号、第５，１１２，７４９号、第５，１７４，９９３号、第５，２２３，４２４号、第５，２２５，３３６号、第５，２４０，７０３号、第５，２４２，８２９号、第５，２９４，４４１号、第５，２９４，５４８号、第５，３１０，６６８号、第５，３８７，７４４号、第５，３８９，３６８号、第５，４２４，０６５号、第５，４５１，４９９号、第５，４５３，３６４号、第５，４６２，７３４号、第５，４７０，７３４号、第５，４７４，９３５号、第５，４８２，７１３号、第５，５９１，４３９号、第５，６４３，５７９号、第５，６５０，３０９号、第５，６９８，２０２号、第５，９５５，０８８号、第６，０３４，２９８号、第６，０４２，８３６号、第６，１５６，３１９及び第６，５８９，５２９号に記載されているワクチンでもよい。
本発明のワクチンは、例えば、安全であり、その結果ワクチンそれ自体が疾病または死亡を引き起こさない；疾病に対して防御的である；中和抗体を誘導する；防御的Ｔ細胞応答を誘導する；ならびに投与の容易さ、副作用がほとんどないこと、生物学的安定性、及び用量あたりの低コストをもたらす、などの有効なワクチンに求められる特色を有することができる。
特定のがんを治療するための組み合わせ免疫原性組成物
免疫原性組成物は、上記の抗原と、特定のがんまたは腫瘍を治療するための１種または複数のがん抗原との様々な組み合わせの形態でもよい。１種または複数のがん抗原の組み合わせに応じて、様々ながんまたは他の腫瘍タイプを免疫原性組成物で標的にすることができる。これらのがんとしては、限定されないが、前立腺癌、肺癌、非小細胞肺癌、悪性肉腫、乳癌、卵巣癌、膵臓癌、黒色腫、血液癌（例えば、白血病、リンパ腫、骨髄腫）、食道扁平上皮癌、膀胱癌、結腸直腸癌、食道、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、肝細胞癌、頭頸部癌、脳腫瘍、肛門癌、滑膜癌、精巣癌、肝臓癌、子宮頸癌、再発性呼吸器乳頭腫症、皮膚癌及び胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）を挙げることができる。図６及び図７は、特定のがんを治療するのに使用することができる、最適化コンセンサス抗原と腫瘍抗原の特定の組み合わせの例を提供する。
がん抗原
免疫原性組成物は、腫瘍関連病態を治療または予防するために、１種または複数のがん抗原、例えば、ＷＴ１、ＭＵＣ１、ＬＭＰ２、ＨＰＶ Ｅ６ Ｅ７、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、イディオタイプ、ＭＡＧＥ Ａ３、ｐ５３（非突然変異体）、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＳＭＡ、ＧＤ２、ＣＥＡ、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴ１、Ｒａｓ−突然変異体、ｇｐ１００、ｐ５３突然変異体、プロテイナーゼ３（ＰＲ１）、Ｂｃｒ−ａｂｌ、チロシナーゼ、サバイビン、ＰＳＡ、ｈＴＥＲＴ、ＥｐｈＡ２、ＰＡＰ、ＭＬ−ＩＡＰ、ＡＦＰ、ＥｐＣＡＭ、ＥＲＧ、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、ＡＬＫ、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ポリシアル酸、ＭＹＣＮ、ＴＲＰ−２、ＲｈｏＣ、ＧＤ３、フコシルＧＭ１、メソテリン、ＰＳＣＡ、ＭＡＧＥ Ａ１、ｓＬｅ（ａ）、ＣＹＰ１Ｂ１、ＰＬＡＣ１、ＧＭ３ガングリオシド、ＢＯＲＩＳ、Ｔｎ、ＧｌｏｂｏＨ、ＥＴＶ６−ＡＭＬ、ＮＹ−ＢＲ−１、ＲＧＳ５、ＳＡＲＴ３、ＳＴｎ、炭酸脱水酵素ＩＸ、ＰＡＸ５、ＯＹ−ＴＥＳ１、精子タンパク質１７、ＬＣＫ、ＨＭＷＭＡＡ、精子線維鞘タンパク質、ＡＫＡＰ−４、ＳＳＸ２、ＸＡＧＥ１、Ｂ７Ｈ３、レグマイン、Ｔｉｅ２、Ｐａｇｅ４、ＶＥＧＦＲ２、ＭＡＤ−ＣＴ−１（プロタミン２）、ＭＡＤ−ＣＴ−２、及びＦＯＳ関連抗原１を含むことができる。免疫原性組成物は、腫瘍関連病態を治療または予防するために、１種または複数のがん抗原、ＷＴ１、ＭＵＣ１、ＬＭＰ２、ＨＰＶ Ｅ６ Ｅ７、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、イディオタイプ、ＭＡＧＥ Ａ３、ｐ５３（非突然変異体）、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＳＭＡ、ＧＤ２、ＣＥＡ、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴ１、Ｒａｓ−突然変異体、ｇｐ１００、ｐ５３突然変異体、プロテイナーゼ３（ＰＲ１）、Ｂｃｒ−ａｂｌ、チロシナーゼ、サバイビン、ＰＳＡ、ｈＴＥＲＴ、ＥｐｈＡ２、ＰＡＰ、ＭＬ−ＩＡＰ、ＡＦＰ、ＥｐＣＡＭ、ＥＲＧ、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、ＡＬＫ、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ポリシアル酸、ＭＹＣＮ、ＴＲＰ−２、ＲｈｏＣ、ＧＤ３、フコシルＧＭ１、メソテリン、ＰＳＣＡ、ＭＡＧＥ Ａ１、ｓＬｅ（ａ）、ＣＹＰ１Ｂ１、ＰＬＡＣ１、ＧＭ３ガングリオシド、ＢＯＲＩＳ、Ｔｎ、ＧｌｏｂｏＨ、ＥＴＶ６−ＡＭＬ、ＮＹ−ＢＲ−１、ＲＧＳ５、ＳＡＲＴ３、ＳＴｎ、炭酸脱水酵素ＩＸ、ＰＡＸ５、ＯＹ−ＴＥＳ１、精子タンパク質１７、ＬＣＫ、ＨＭＷＭＡＡ、精子線維鞘タンパク質、ＡＫＡＰ−４、ＳＳＸ２、ＸＡＧＥ１、Ｂ７Ｈ３、レグマイン、Ｔｉｅ２、Ｐａｇｅ４、ＶＥＧＦＲ２、ＭＡＤ−ＣＴ−１（プロタミン２）、ＭＡＤ−ＣＴ−２、及びＦＯＳ関連抗原１を最適化コンセンサスＦＡＰ抗原とさらに組み合わせることができる。腫瘍関連病態を治療または予防するために、がん抗原の他の組み合わせも適用することができる。
前立腺癌抗原
免疫原性組成物は、前立腺癌を治療または予防するために、１種または複数のがん抗原、例えば、ＰＳＡ、ＰＳＭＡまたはＳＴＥＡＰを含むことができる（図１２を参照されたい）。免疫原性組成物は、前立腺癌を治療または予防するために、１種または複数のがん抗原、ＰＳＡ、ＰＳＭＡまたはＳＴＥＡＰをＦＡＰ抗原とさらに組み合わせることができる。前立腺癌を治療または予防するために、がん抗原の他の組み合わせも適用することができる。例示的なＰＳＡ、ＰＳＭＡ及びＳＴＥＰ抗原、ならびにそのような抗原をコードする核酸分子は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１１／６０５９２号及び対応する米国特許第８，９２７，６９２号に開示されており、それらは、参照により本明細書に組み込まれる。
肺癌抗原
免疫原性組成物は、肺癌を治療または予防するために、１種または複数のがん抗原、例えば、ＴＥＲＴ、ＣＤ２２、ＭＡＧＥ−３及びＮＹ−ＥＳＯ−１を含むことができる（図１３を参照されたい）。免疫原性組成物は、肺癌を治療または予防するために、１種または複数のがん抗原、ＴＥＲＴ、ＣＤ２２、ＭＡＧＥ−３及びＮＹ−ＥＳＯ−１をＦＡＰ抗原とさらに組み合わせることができる。肺癌を治療または予防するために、がん抗原の他の組み合わせも適用することができる。
乳癌抗原
免疫原性組成物は、乳癌を治療または予防するために、１種または複数のがん抗原、例えば、ＨＥＲ２、ＭＵＣ−１、ＣＥＡ、ＭＡＧＥ−３及びＮＹ−ＥＳＯ−１を含むことができる。免疫原性組成物は、乳癌を治療または予防するために、１種または複数のがん抗原、ＨＥＲ２、ＭＵＣ−１、ＣＥＡ、ＭＡＧＥ−３及びＮＹ−ＥＳＯ−１をＦＡＰ抗原とさらに組み合わせることができる。乳癌を治療または予防するために、がん抗原の他の組み合わせも適用することができる。
膵臓癌抗原
免疫原性組成物は、膵臓癌を治療または予防するために、１種または複数のがん抗原、例えば、ＭＵＣ−１、ＣＥＡ、ＨＥＲ２、メソテリン、サバイビン及びＶＥＧＦＲ２を含むことができる。免疫原性組成物は、膵臓癌を治療または予防するために、１種または複数のがん抗原、ＭＵＣ−１、ＣＥＡ、ＨＥＲ２、メソテリン、サバイビン及びＶＥＧＦＲ２をＦＡＰ抗原とさらに組み合わせることができる。膵臓癌を治療または予防するために、がん抗原の他の組み合わせも適用することができる。
黒色腫抗原
免疫原性組成物は、黒色腫を治療または予防するために、１種または複数のがん抗原、例えば、チロシナーゼ、ＰＲＡＭＥまたはＧＰ１００−Ｔｒｐ２を含むことができる。免疫原性組成物は、黒色腫を治療または予防するために、１種または複数のがん抗原、チロシナーゼ、ＰＲＡＭＥまたはＧＰ１００−Ｔｒｐ２をＦＡＰ抗原とさらに組み合わせることができる。黒色腫を治療または予防するために、がん抗原の他の組み合わせも適用することができる。
肝臓癌抗原
免疫原性組成物は、肝臓癌を治療または予防するために、１種または複数のがん抗原、例えば、ＨＢＶコア抗原、ＨＢＶ表面抗原、ＨＣＶＮＳ３４Ａ、ＨＣＶＮＳ５Ａ、ＨＣＶ ＮＳ５ＢまたはＨＣＶＮＳ４Ｂを含むことができる。免疫原性組成物は、肝臓癌を治療または予防するために、１種または複数のがん抗原、ＨＢＶコア抗原、ＨＢＶ表面抗原、ＨＣＶＮＳ３４Ａ、ＨＣＶＮＳ５Ａ、ＨＣＶ ＮＳ５ＢまたはＨＣＶＮＳ４ＢをＦＡＰ抗原とさらに組み合わせることができる。肝臓癌を治療または予防するために、がん抗原の他の組み合わせも適用することができる。
膠芽腫抗原
免疫原性組成物は、膠芽腫を治療または予防するために、ＣＭＶを含むことができる。免疫原性組成物は、膠芽腫を治療または予防するために、ＣＭＶをＦＡＰ抗原とさらに組み合わせることができる。膠芽腫を治療または予防するために、がん抗原の他の組み合わせも適用することができる。
血液癌抗原（例えば、白血病、リンパ腫、骨髄腫）
免疫原性組成物は、血液癌、例えば、白血病、リンパ腫及び骨髄腫を治療または予防するために、１種または複数のがん抗原、例えば、ＰＲＡＭＥ、ＷＴ−１、ｈＴＥＲＴを含むことができる。免疫原性組成物は、１種または複数のがん抗原、ＰＲＡＭＥ、ＷＴ−１、ｈＴＥＲＴをＦＡＰ抗原、血液癌、例えば、白血病、リンパ腫及び骨髄腫とさらに組み合わせることができる。血液癌、例えば、白血病、リンパ腫及び骨髄腫癌を治療または予防するために、がん抗原の他の組み合わせも適用することができる。
免疫応答
免疫原性組成物は、組成物が投与される対象において免疫応答を誘導することができる。誘導される免疫応答は、ネイティブ抗原に対して特異的であり得る。誘導される免疫応答は、最適化コンセンサスにコードされる抗原に関連するネイティブ抗原と反応することができる。様々な実施形態では、関連した抗原は、最適化コンセンサスにコードされる抗原のアミノ酸配列に少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の相同性を有するアミノ酸配列を有する抗原を含む。様々な実施形態では、関連した抗原は、本明細書に開示される最適化コンセンサスヌクレオチド配列に少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の相同性を有するヌクレオチド配列にコードされる抗原を含む。
免疫原性組成物は、免疫原性組成物が投与される対象において液性免疫応答を誘導することができる。誘導される液性免疫応答は、ネイティブ抗原に対して特異的であり得る。誘導される液性免疫応答は、最適化コンセンサスにコードされる抗原に関連するネイティブ抗原と反応することができる。液性免疫応答は、免疫原性組成物が投与される対象において、約１．５倍〜約１６倍、約２倍〜約１２倍、または約３倍〜約１０倍誘導され得る。液性免疫応答は、免疫原性組成物が投与される対象において、免疫原性組成物が投与されない対象または非最適化ＦＡＰ抗原が投与される対象と比べて、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２．０倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３．０倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４．０倍、少なくとも約４．５倍、少なくとも約５．０倍、少なくとも約５．５倍、少なくとも約６．０倍、少なくとも約６．５倍、少なくとも約７．０倍、少なくとも約７．５倍、少なくとも約８．０倍、少なくとも約８．５倍、少なくとも約９．０倍、少なくとも約９．５倍、少なくとも約１０．０倍、少なくとも約１０．５倍、少なくとも約１１．０倍、少なくとも約１１．５倍、少なくとも約１２．０倍、少なくとも約１２．５倍、少なくとも約１３．０倍、少なくとも約１３．５倍、少なくとも約１４．０倍、少なくとも約１４．５倍、少なくとも約１５．０倍、少なくとも約１５．５倍、または少なくとも約１６．０倍誘導され得る。
免疫原性組成物によって誘導される液性免疫応答は、免疫原性組成物が投与されない対象と比べて、免疫原性組成物が投与される対象と関連する増大したレベルの中和抗体を含むことができる。中和抗体は最適化コンセンサスにコードされる抗原に関連するネイティブ抗原に対して特異的であり得る。中和抗体は、最適化コンセンサス抗原に遺伝的に関係があるネイティブ抗原と反応することができる。中和抗体は、免疫原性組成物が投与される対象において、腫瘍増殖、転移または腫瘍関連病態を防ぐ及び／または治療することができる。
免疫原性組成物によって誘導される液性免疫応答は、免疫原性組成物が投与されない対象と比べて、免疫原性組成物が投与される対象と関連する増大したレベルのＩｇＧ抗体を含むことができる。これらのＩｇＧ抗体は、最適化コンセンサス抗原に遺伝的に関係があるネイティブ抗原に対して特異的であり得る。これらのＩｇＧ抗体は、最適化コンセンサス抗原に遺伝的に関係があるネイティブ抗原と反応することができる。免疫原性組成物が投与される対象と関連するＩｇＧ抗体のレベルは、免疫原性組成物が投与されない対象と比べて、約１．５倍〜約１６倍、約２倍〜約１２倍、または約３倍〜約１０倍増大し得る。免疫原性組成物が投与される対象と関連するＩｇＧ抗体のレベルは、免疫原性組成物が投与されない対象または非最適化ＦＡＰ抗原が投与される対象と比べて、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２．０倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３．０倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４．０倍、少なくとも約４．５倍、少なくとも約５．０倍、少なくとも約５．５倍、少なくとも約６．０倍、少なくとも約６．５倍、少なくとも約７．０倍、少なくとも約７．５倍、少なくとも約８．０倍、少なくとも約８．５倍、少なくとも約９．０倍、少なくとも約９．５倍、少なくとも約１０．０倍、少なくとも約１０．５倍、少なくとも約１１．０倍、少なくとも約１１．５倍、少なくとも約１２．０倍、少なくとも約１２．５倍、少なくとも約１３．０倍、少なくとも約１３．５倍、少なくとも約１４．０倍、少なくとも約１４．５倍、少なくとも約１５．０倍、少なくとも約１５．５倍、または少なくとも約１６．０倍増大し得る。
免疫原性組成物は、免疫原性組成物が投与される対象において、細胞性免疫応答を誘導することができる。誘導される細胞性免疫応答は、最適化コンセンサスにコードされる抗原に関連するネイティブ抗原に対して特異的であり得る。誘導される細胞性免疫応答は、最適化コンセンサスにコードされる抗原に関連するネイティブ抗原に反応することができる。誘導される細胞性免疫応答は、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘発することを含むことができる。誘発されるＣＤ８＋Ｔ細胞応答は、最適化コンセンサス抗原に遺伝的に関係があるネイティブ抗原と反応することができる。誘発されるＣＤ８＋Ｔ細胞応答は多機能性であり得る。誘導される細胞性免疫応答は、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘発することを含むことができ、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、またはＩＦＮ−γとＴＮＦ−αの組み合わせを生成する。
誘導される細胞性免疫応答は、免疫原性組成物が投与されない対象と比べて、免疫原性組成物が投与される対象と関連するＣＤ８＋Ｔ細胞応答の増大を含むことができる。免疫原性組成物が投与される対象と関連するＣＤ８＋Ｔ細胞応答は、免疫原性組成物が投与されない対象と比べて、約２倍〜約３０倍、約３倍〜約２５倍、または約４倍〜約２０倍増大し得る。免疫原性組成物が投与される対象と関連するＣＤ８＋Ｔ細胞応答は、免疫原性組成物が投与されない対象または非最適化ＦＡＰ抗原が投与される対象と比べて、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２．０倍、少なくとも約３．０倍、少なくとも約４．０倍、少なくとも約５．０倍、少なくとも約６．０倍、少なくとも約６．５倍、少なくとも約７．０倍、少なくとも約７．５倍、少なくとも約８．０倍、少なくとも約８．５倍、少なくとも約９．０倍、少なくとも約９．５倍、少なくとも約１０．０倍、少なくとも約１０．５倍、少なくとも約１１．０倍、少なくとも約１１．５倍、少なくとも約１２．０倍、少なくとも約１２．５倍、少なくとも約１３．０倍、少なくとも約１３．５倍、少なくとも約１４．０倍、少なくとも約１４．５倍、少なくとも約１５．０倍、少なくとも約１６．０倍、少なくとも約１７．０倍、少なくとも約１８．０倍、少なくとも約１９．０倍、少なくとも約２０．０倍、少なくとも約２１．０倍、少なくとも約２２．０倍、少なくとも約２３．０倍、少なくとも約２４．０倍、少なくとも約２５．０倍、少なくとも約２６．０倍、少なくとも約２７．０倍、少なくとも約２８．０倍、少なくとも約２９．０倍、または少なくとも約３０．０倍増大し得る。
誘導される細胞性免疫応答は、ネイティブ抗原に対して反応性であるＣＤ１０７ａ／ＩＦＮγ／Ｔ−ｂｅｔ三重陽性ＣＤ８Ｔ細胞の頻度の増加を含むことができる。免疫原性組成物が投与される対象と関連するＣＤ１０７ａ／ＩＦＮγ／Ｔ−ｂｅｔ三重陽性ＣＤ８Ｔ細胞の頻度は、免疫原性組成物が投与されない対象または非最適化ＦＡＰ抗原が投与される対象と比べて、少なくとも約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、または２０倍増加し得る。
誘導される細胞性免疫応答は、ネイティブ抗原に対して反応性であるＣＤ１０７ａ／ＩＦＮγ二重陽性ＣＤ８Ｔ細胞の頻度の増加を含むことができる。免疫原性組成物が投与される対象と関連するＣＤ１０７ａ／ＩＦＮγ二重陽性ＣＤ８Ｔ細胞の頻度は、免疫原性組成物が投与されない対象または非最適化ＦＡＰ抗原が投与される対象と比べて、少なくとも約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、または１４倍増加し得る。
免疫原性組成物によって誘導される細胞性免疫応答は、ＣＤ４＋Ｔ細胞応答を誘発することを含むことができる。誘発されるＣＤ４＋Ｔ細胞応答は、最適化コンセンサス抗原に遺伝的に関係があるネイティブ抗原と反応することができる。誘発されるＣＤ４＋Ｔ細胞応答は多機能性であり得る。誘導される細胞性免疫応答は、ＣＤ４＋Ｔ細胞応答を誘発することを含むことができ、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２、またはＩＦＮ−γとＴＮＦ−αの組み合わせを生成する。
誘導される細胞性免疫応答は、ＩＦＮ−γを生成するＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度の増加を含むことができる。免疫原性組成物が投与される対象と関連するＣＤ４＋ＩＦＮ−γ＋Ｔ細胞の頻度は、免疫原性組成物が投与されない対象または非最適化ＦＡＰ抗原が投与される対象と比べて、少なくとも約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、または２０倍増加し得る。
誘導される細胞性免疫応答は、ＴＮＦ−αを生成するＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度の増加を含むことができる。免疫原性組成物が投与される対象と関連するＣＤ４＋ＴＮＦ−α＋Ｔ細胞の頻度は、免疫原性組成物が投与されない対象または非最適化ＦＡＰ抗原が投与される対象と比べて、少なくとも約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、２０倍、２１倍、または２２倍増加し得る。
誘導される細胞性免疫応答は、ＩＦＮ−γとＴＮＦ−αの両方を生成するＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度の増加を含むことができる。免疫原性組成物が投与される対象と関連するＣＤ４＋ＩＦＮ−γ＋ＴＮＦ−α＋の頻度は、免疫原性組成物が投与されない対象または非最適化ＦＡＰ抗原が投与される対象と比べて、少なくとも約２倍、２．５倍、３．０倍、３．５倍、４．０倍、４．５倍、５．０倍、５．５倍、６．０倍、６．５倍、７．０倍、７．５倍、８．０倍、８．５倍、９．０倍、９．５倍、１０．０倍、１０．５倍、１１．０倍、１１．５倍、１２．０倍、１２．５倍、１３．０倍、１３．５倍、１４．０倍、１４．５倍、１５．０倍、１５．５倍、１６．０倍、１６．５倍、１７．０倍、１７．５倍、１８．０倍、１８．５倍、１９．０倍、１９．５倍、２０．０倍、２１倍、２２倍、２３倍、２４倍、２５倍、２６倍、２７倍、２８倍、２９倍、３０倍、３１倍、３２倍、３３倍、３４倍、または３５倍増大し得る。
本発明の免疫原性組成物は、安全であり、そのため、ワクチンそれ自体が疾病または死亡を引き起こさないなどの有効なワクチンに求められる特色を有することができ；ウイルスまたは細菌などの生きている病原体への暴露に起因する疾病に対して防御的であり；細胞のインベンションを予防するために中和抗体を誘導し；細胞内病原体に対して防御的Ｔ細胞を誘導し；ならびに投与の容易さ、副作用がほとんどないこと、生物学的安定性、及び用量あたりの低コストをもたらす。
免疫原性組成物は、さらに、筋肉または皮膚などの様々な組織に投与される場合、免疫応答を誘導することができる。免疫原性組成物は、さらに、電気穿孔もしくは注入を介して、または皮下もしくは筋肉内に投与される場合、免疫応答を誘導することができる。
断片
一実施形態では、免疫原性断片は本発明の全長抗原の免疫原性断片である。本明細書で使用する場合、免疫原性断片は、全長配列のものと同様に免疫応答を有意に誘導することができる、全長の核酸またはアミノ酸配列の断片である。一実施形態では、免疫原性断片は全長配列の免疫原性エピトープを含む。一実施形態では、免疫原性断片は、全長配列と比べて、少なくとも約０．７倍、少なくとも約０．８倍、少なくとも約０．９倍、少なくとも約１．０倍、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２．０倍また２．０倍を越えて、免疫応答を誘導する。
免疫原性断片は、免疫原性断片が投与される対象において、液性免疫応答を誘導することができる。液性免疫応答は、免疫原性断片が投与される対象において、約１．５倍〜約１６倍、約２倍〜約１２倍、または約３倍〜約１０倍誘導され得る。液性免疫応答は、免疫原性断片が投与される対象において、免疫原性断片が投与されない対象と比べて、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２．０倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３．０倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４．０倍、少なくとも約４．５倍、少なくとも約５．０倍、少なくとも約５．５倍、少なくとも約６．０倍、少なくとも約６．５倍、少なくとも約７．０倍、少なくとも約７．５倍、少なくとも約８．０倍、少なくとも約８．５倍、少なくとも約９．０倍、少なくとも約９．５倍、少なくとも約１０．０倍、少なくとも約１０．５倍、少なくとも約１１．０倍、少なくとも約１１．５倍、少なくとも約１２．０倍、少なくとも約１２．５倍、少なくとも約１３．０倍、少なくとも約１３．５倍、少なくとも約１４．０倍、少なくとも約１４．５倍、少なくとも約１５．０倍、少なくとも約１５．５倍、または少なくとも約１６．０倍誘導され得る。
免疫原性断片によって誘導される液性免疫応答は、免疫原性断片が投与されない対象と比べて、免疫原性断片が投与される対象と関連する増大したレベルのＩｇＧ抗体を含むことができる。免疫原性断片が投与される対象と関連するＩｇＧ抗体のレベルは、免疫原性断片が投与されない対象と比べて、約１．５倍〜約１６倍、約２倍〜約１２倍、または約３倍〜約１０倍増大し得る。免疫原性断片が投与される対象と関連するＩｇＧ抗体のレベルは、免疫原性断片が投与されない対象と比べて、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２．０倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３．０倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４．０倍、少なくとも約４．５倍、少なくとも約５．０倍、少なくとも約５．５倍、少なくとも約６．０倍、少なくとも約６．５倍、少なくとも約７．０倍、少なくとも約７．５倍、少なくとも約８．０倍、少なくとも約８．５倍、少なくとも約９．０倍、少なくとも約９．５倍、少なくとも約１０．０倍、少なくとも約１０．５倍、少なくとも約１１．０倍、少なくとも約１１．５倍、少なくとも約１２．０倍、少なくとも約１２．５倍、少なくとも約１３．０倍、少なくとも約１３．５倍、少なくとも約１４．０倍、少なくとも約１４．５倍、少なくとも約１５．０倍、少なくとも約１５．５倍、または少なくとも約１６．０倍増大し得る。
免疫原性断片は、免疫原性断片が投与される対象において、細胞性免疫応答を誘導することができる。誘導される細胞性免疫応答は、最適化コンセンサスにコードされる抗原に関連するネイティブ抗原に対して特異的であり得る。誘導される細胞性免疫応答は、最適化コンセンサスにコードされる抗原に関連するネイティブ抗原に反応することができる。誘導される細胞性免疫応答は、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘発することを含むことができる。誘発されるＣＤ８＋Ｔ細胞応答は、最適化コンセンサス抗原に遺伝的に関係があるネイティブ抗原と反応することができる。誘発されるＣＤ８＋Ｔ細胞応答は多機能性であり得る。誘導される細胞性免疫応答は、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘発することを含むことができ、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、またはＩＦＮ−γとＴＮＦ−αの組み合わせを生成する。
誘導される細胞性免疫応答は、免疫原性断片が投与されない対象と比べて、免疫原性断片が投与される対象と関連するＣＤ８＋Ｔ細胞応答の増大を含むことができる。免疫原性断片が投与される対象と関連するＣＤ８＋Ｔ細胞応答は、免疫原性断片が投与されない対象と比べて、約２倍〜約３０倍、約３倍〜約２５倍、または約４倍〜約２０倍増大し得る。免疫原性断片が投与される対象と関連するＣＤ８＋Ｔ細胞応答は、免疫原性断片が投与されない対象と比べて、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２．０倍、少なくとも約３．０倍、少なくとも約４．０倍、少なくとも約５．０倍、少なくとも約６．０倍、少なくとも約６．５倍、少なくとも約７．０倍、少なくとも約７．５倍、少なくとも約８．０倍、少なくとも約８．５倍、少なくとも約９．０倍、少なくとも約９．５倍、少なくとも約１０．０倍、少なくとも約１０．５倍、少なくとも約１１．０倍、少なくとも約１１．５倍、少なくとも約１２．０倍、少なくとも約１２．５倍、少なくとも約１３．０倍、少なくとも約１３．５倍、少なくとも約１４．０倍、少なくとも約１４．５倍、少なくとも約１５．０倍、少なくとも約１６．０倍、少なくとも約１７．０倍、少なくとも約１８．０倍、少なくとも約１９．０倍、少なくとも約２０．０倍、少なくとも約２１．０倍、少なくとも約２２．０倍、少なくとも約２３．０倍、少なくとも約２４．０倍、少なくとも約２５．０倍、少なくとも約２６．０倍、少なくとも約２７．０倍、少なくとも約２８．０倍、少なくとも約２９．０倍、または少なくとも約３０．０倍増大し得る。
誘導される細胞性免疫応答は、ネイティブ抗原に対して反応性であるＣＤ１０７ａ／ＩＦＮγ／Ｔ−ｂｅｔ三重陽性ＣＤ８Ｔ細胞の頻度の増加を含むことができる。免疫原性断片が投与される対象と関連するＣＤ１０７ａ／ＩＦＮγ／Ｔ−ｂｅｔ三重陽性ＣＤ８Ｔ細胞の頻度は、免疫原性断片が投与されない対象と比べて、少なくとも約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、または２０倍増大し得る。
誘導される細胞性免疫応答は、ネイティブ抗原に対して反応性であるＣＤ１０７ａ／ＩＦＮγ二重陽性ＣＤ８Ｔ細胞の頻度の増加を含むことができる。免疫原性断片が投与される対象と関連するＣＤ１０７ａ／ＩＦＮγ二重陽性ＣＤ８Ｔ細胞の頻度は、該免疫原が投与されない対象と比べて、少なくとも約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、または１４倍増大し得る。
免疫原性断片によって誘導される細胞性免疫応答は、ＣＤ４＋Ｔ細胞応答を誘発することを含むことができる。誘発されるＣＤ４＋Ｔ細胞応答は、最適化コンセンサス抗原に遺伝的に関係があるネイティブ抗原と反応することができる。誘発されるＣＤ４＋Ｔ細胞応答は多機能性であり得る。誘導される細胞性免疫応答は、ＣＤ４＋Ｔ細胞応答を誘発することを含むことができ、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２、またはＩＦＮ−γとＴＮＦ−αの組み合わせを生成する。
誘導される細胞性免疫応答は、ＩＦＮ−γを生成するＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度の増加を含むことができる。免疫原性断片が投与される対象と関連するＣＤ４＋ＩＦＮ−γ＋Ｔ細胞の頻度は、免疫原性断片が投与されない対象と比べて、少なくとも約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、または２０倍増大し得る。
誘導される細胞性免疫応答は、ＴＮＦ−αを生成するＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度の増加を含むことができる。免疫原性断片が投与される対象と関連するＣＤ４＋ＴＮＦ−α＋Ｔ細胞の頻度は、免疫原性断片が投与されない対象と比べて、少なくとも約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、２０倍、２１倍、または２２倍増大し得る。
誘導される細胞性免疫応答は、ＩＦＮ−γとＴＮＦ−αの両方を生成するＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度の増加を含むことができる。免疫原性断片が投与される対象と関連するＣＤ４＋ＩＦＮ−γ＋ＴＮＦ−α＋の頻度は、免疫原性断片が投与されない対象と比べて、少なくとも約２倍、２．５倍、３．０倍、３．５倍、４．０倍、４．５倍、５．０倍、５．５倍、６．０倍、６．５倍、７．０倍、７．５倍、８．０倍、８．５倍、９．０倍、９．５倍、１０．０倍、１０．５倍、１１．０倍、１１．５倍、１２．０倍、１２．５倍、１３．０倍、１３．５倍、１４．０倍、１４．５倍、１５．０倍、１５．５倍、１６．０倍、１６．５倍、１７．０倍、１７．５倍、１８．０倍、１８．５倍、１９．０倍、１９．５倍、２０．０倍、２１倍、２２倍、２３倍、２４倍、２５倍、２６倍、２７倍、２８倍、２９倍、３０倍、３１倍、３２倍、３３倍、３４倍、または３５倍増大し得る。
本発明の免疫原性断片は、安全であり、そのため、ワクチンそれ自体が疾病または死亡を引き起こさないなどの有効なワクチンに求められる特色を有することができ；ウイルスまたは細菌などの生きている病原体への暴露に起因する疾病に対して防御的であり；細胞のインベンションを予防するために中和抗体を誘導し；細胞内病原体に対して防御的Ｔ細胞を誘導し；ならびに投与の容易さ、副作用がほとんどないこと、生物学的安定性、及び用量あたりの低コストをもたらす。
免疫原性断片は、さらに、筋肉または皮膚などの様々な組織に投与される場合、免疫応答を誘導することができる。免疫原性断片は、さらに、電気穿孔もしくは注入を介して、または皮下もしくは筋肉内に投与される場合、免疫応答を誘導することができる。
ベクター
免疫原性組成物は、抗原をコードする最適化コンセンサスヌクレオチドを含む１種または複数のベクターを含むことができる。１種または複数のベクターは抗原を発現することができる。ベクターは、複製開始点を含むヌクレオチド配列を有することができる。ベクターは、プラスミド、バクテリオファージ、細菌人工染色体または酵母人工染色体でもよい。ベクターは、自己複製染色体外ベクターまたは宿主ゲノムに組み込まれるベクターのいずれかでもよい。
１種または複数のベクターは、一般に、特定の遺伝子を標的細胞に導入するのに使用されるプラスミドである、発現コンストラクトでもよい。発現ベクターが一旦細胞の内部に存在すれば、細胞の転写及び翻訳機構のリボソーム複合体によって遺伝子にコードされるタンパク質が生成される。プラスミドは、エンハンサー及びプロモーター領域として作用し、発現ベクター上に担持される遺伝子の効率的な転写を導く調節配列を含むように操作されることが多い。本発明のベクターは、多量の安定的な伝令ＲＮＡ、したがってタンパク質を発現する。
ベクターは、発現シグナル、例えば、強力なプロモーター、強力な終止コドン、プロモーターとクローニングした遺伝子の間の距離の調節、ならびに転写終結配列及びＰＴＩＳ（ポータブル翻訳開始配列）の挿入を有することができる。
（１）発現ベクター
該ベクターは、環状プラスミドまたは直鎖状核酸でもよい。環状プラスミド及び直鎖状核酸は、適切な対象細胞において、特定のヌクレオチド配列の発現を指示することができる。該ベクターは、終結シグナルに作動可能に連結していてもよい抗原をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結しているプロモーターを有することができる。該ベクターは、ヌクレオチド配列の適切な翻訳に必要とされる配列も含むことができる。目的のヌクレオチド配列を含む該ベクターはキメラでもよく、これは、その成分の少なくとも１つが、その他の成分の少なくとも１つに対して異種性であることを意味する。発現カセット中のヌクレオチド配列の発現は、構成的プロモーター、またはある特定の外部刺激に曝露された場合にのみ転写を開始する誘導性プロモーターの制御下にあってもよい。多細胞生物の場合には、プロモーターはまた、特定の組織または器官または発生段階に特異的であってもよい。
（２）ＲＮＡベクター
一実施形態では、核酸はＲＮＡ分子である。したがって、一実施形態では、本発明は、１つまたは複数のＭＡＹＶ抗原をコードするＲＮＡ分子を提供する。ＲＮＡはプラス鎖でもよい。したがって、いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子は、逆転写などのいかなる介在性複製ステップも必要とすることなしに、細胞によって翻訳され得る。本発明で有用なＲＮＡ分子は、５’キャップ（例えば、７−メチルグアノシン）を有することができる。このキャップは、ＲＮＡのインビボ翻訳を増強することができる。本発明で有用なＲＮＡ分子の５’ヌクレオチドは、５’三リン酸基を有することができる。キャップ化ＲＮＡでは、これは、５’−５’架橋を介して７−メチルグアノシンに連結していてもよい。ＲＮＡ分子は、３’ポリ−Ａテールを有することができる。これは、その３’末端近くにポリ−Ａポリメラーゼ認識配列（例えば、ＡＡＵＡＡＡ）を含むこともできる。本発明で有用なＲＮＡ分子は一本鎖でもよい。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子はネイキッドＲＮＡ分子である。一実施形態では、ＲＮＡ分子はベクター中に含まれる。
一実施形態では、ＲＮＡは５’及び３’ＵＴＲを有する。一実施形態では、５’ＵＴＲは０〜３０００ヌクレオチドの間の長さである。コード領域に加えられる５’及び３’ＵＴＲ配列の長さを、限定されないが、ＵＴＲの異なる領域にアニールするＰＣＲプライマーの設計を含めた様々な方法によって変えることができる。このアプローチを使用して、当業者は、転写されるＲＮＡのトランスフェクション後に最適な翻訳効率を達成するのに必要とされる５’及び３’ＵＴＲの長さを改変することができる。
５’及び３’ＵＴＲは、目的の遺伝子についての、天然に存在する内在性の５’及び３’ＵＴＲでもよい。あるいは、フォワード及びリバースプライマー中にＵＴＲ配列を組み込むことによって、または鋳型の任意の他の改変によって、目的の遺伝子にとって内在性ではないＵＴＲ配列を加えることができる。目的の遺伝子にとって内在性ではないＵＴＲ配列の使用は、ＲＮＡの安定性及び／または翻訳効率を改変するのに有用であり得る。例えば、３’ＵＴＲ配列中のＡＵリッチエレメントは、ＲＮＡの安定性を低下させることができることが知られている。したがって、当技術分野で周知であるＵＴＲの性質に基づいて、転写されるＲＮＡの安定性を高めるように３’ＵＴＲを選択または設計することができる。
一実施形態では、５’ＵＴＲは内在性遺伝子のコザック配列を含むことができる。あるいは、上記のようにＰＣＲによって目的の遺伝子にとって内在性ではない５’ＵＴＲが加えられる場合、５’ＵＴＲ配列を加えることによってコンセンサスコザック配列を再設計することができる。コザック配列は、いくつかのＲＮＡ転写産物の翻訳の効率を高めることができるが、効率的な翻訳を可能にするために、すべてのＲＮＡに必要とされるとは思われない。多くのＲＮＡに対するコザック配列の必要性は当該技術分野において既知である。他の実施形態では、５’ＵＴＲは、ＲＮＡゲノムが細胞中で安定であるＲＮＡウイルスに由来し得る。他の実施形態では、ＲＮＡのエキソヌクレアーゼ分解を妨害するために、様々なヌクレオチド類似体を３’または５’ＵＴＲ中で使用することができる。
一実施形態では、ＲＮＡは、細胞中でリボソームの結合、翻訳の開始及びＲＮＡの安定性を決定する、５’末端のキャップと３’ポリ（Ａ）テールの両方を有する。
一実施形態では、ＲＮＡはヌクレオシド修飾ＲＮＡである。ヌクレオシド修飾ＲＮＡは、非修飾ＲＮＡと比較して、例えば、安定性の増大、先天免疫原性が低いまたはないこと、及び翻訳の増強を含めた、特定の利点を有する。
（３）環状及び直鎖状ベクター
ベクターは環状プラスミドでもよく、これは、細胞ゲノム中に組み込まれることによって標的細胞を形質転換することができ、または染色体外に存在する（例えば、複製開始点を有する自己複製プラスミド）ことができる。
ベクターは、ｐＶＡＸ、ｐｃＤＮＡ３．０もしくはｐｒｏｖａｘ、または抗原をコードするＤＮＡを発現すること、及び細胞が、免疫系によって認識される抗原に配列を翻訳することを可能にする、任意の他の発現ベクターでもよい。
電気穿孔を介して効率的に対象に送達され得る、及び１種または複数の所望の抗原を発現することができる、直鎖状核酸免疫原性組成物または直鎖状発現カセット（「ＬＥＣ」）も本明細書で提供される。ＬＥＣは、いかなるリン酸骨格もない任意の直鎖状ＤＮＡでもよい。ＤＮＡは、１種または複数の抗原をコードすることができる。ＬＥＣは、プロモーター、イントロン、終止コドン、及び／またはポリアデニル化シグナルを含んでもよい。抗原の発現は、プロモーターによって制御され得る。ＬＥＣは、いかなる抗生物質耐性遺伝子及び／またはリン酸骨格を含まなくてもよい。ＬＥＣは、所望の抗原の遺伝子発現と関係がない他のヌクレオチド配列を含まなくてもよい。
ＬＥＣは、直鎖状にすることができる任意のプラスミドに由来し得る。プラスミドは抗原を発現することができ得る。プラスミドは、ｐＮＰ（Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／３４）またはｐＭ２（Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／９９）でもよい。プラスミドは、ＷＬＶ００９、ｐＶＡＸ、ｐｃＤＮＡ３．０もしくはｐｒｏｖａｘ、または抗原をコードするＤＮＡを発現すること、及び細胞が、免疫系によって認識される抗原に配列を翻訳することを可能にする、任意の他の発現ベクターでもよい。
ＬＥＣはｐｃｒＭ２でもよい。ＬＥＣはｐｃｒＮＰでもよい。ｐｃｒＮＰ及びｐｃｒＭＲはそれぞれ、ｐＮＰ（Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／３４）及びｐＭ２（Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／９９）に由来し得る。
（４）プロモーター、イントロン、終止コドン及びポリアデニル化シグナル
ベクターはプロモーターを有することができる。プロモーターは、単離核酸の遺伝子発現を駆動すること、及び単離核酸の発現を調節することができる任意のプロモーターでもよい。そのようなプロモーターは、本明細書に記載の抗原配列を転写するＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを介する転写に必要とされるシス作用配列エレメントである。異種核酸の発現を指示するのに使用されるプロモーターの選択は、特定の用途に依存する。プロモーターは、その天然の状況において転写開始点からであるのと同様に、ベクター中の転写開始からほぼ同じ距離に位置することができる。しかし、この距離の変動は、プロモーター機能を失うことなしに適応させることができる。
プロモーターは、抗原ならびに転写産物の効率的なポリアデニル化、リボソーム結合部位及び翻訳終結に必要とされるシグナルをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結し得る。プロモーターは、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳癌ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、または真核細胞における発現に有効であることが示されている別のプロモーターでもよい。
ベクターは、機能的なスプライスドナー部位及びアクセプター部位を有するエンハンサー及びイントロンを含むことができる。ベクターは、効率的な終結をもたらすために、構造遺伝子の下流に転写終結領域を含むことができる。終結領域は、プロモーター配列と同じ遺伝子から得ることができ、または異なる遺伝子から得ることができる。
多重ベクター
免疫原性組成物は、単一のプラスミドなど、単一核酸分子の複数のコピーを、または２種以上の異なるプラスミドなど、２種以上の異なる核酸分子の複数のコピーを含むことができる。例えば、免疫原性組成物は、複数の２、３、４、５、６、７、８、９または１０種おまたはそれ以上の異なる核酸分子を含むことができる。そのような組成物は、複数の２、３、４、５、６種またはそれ以上の異なるプラスミドを含むことができる。
免疫原性組成物は、単一の抗原に対するコード配列を集団的に含む核酸分子、例えばプラスミドを含むことができる。一実施形態では、抗原はＦＡＰである。免疫原性組成物は、複数の抗原に対するコード配列を集団的に含む核酸分子、例えばプラスミドを含むことができる。一実施形態では、抗原は、ＦＡＰ及びさらなるがん抗原から選択される複数の抗原である。例示的一実施形態では、抗原はＦＡＰ及びＴＥＲＴである。別の例示的実施形態では、抗原はＦＡＰ及びＰＳＭＡである。免疫原性組成物は、１種または複数の抗原及び１種または複数のがん抗原に対するコード配列を集団的に含む、核酸分子、例えばプラスミドを含むことができる。
免疫原性組成物の賦形剤及び他の成分
免疫原性組成物は、医薬的に許容可能な賦形剤をさらに含むことができる。医薬的に許容可能な賦形剤は、ビヒクル、アジュバント、担体または希釈剤として機能的な分子でもよい。医薬的に許容可能な賦形剤はトランスフェクション促進剤でもよく、トランスフェクション促進剤としては、表面活性剤、例えば、免免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）、フロイント不完全アジュバント、ＬＰＳ類似体、例えば、モノホスホリルリピドＡ、ムラミルペプチド、キノン類似体、小胞、例えばスクアレン及びスクアレン、ヒアルロン酸、脂質、リポソーム、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、またはナノ粒子、または他の既知のトランスフェクション促進剤を挙げることができる。
トランスフェクション促進剤はポリアニオン、ポリカチオン、例えば、ポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＬＧＳ）、または脂質である。トランスフェクション促進剤はポリ−Ｌ−グルタミン酸であり、より好ましくは、ポリ−Ｌ−グルタミン酸は６ｍｇ／ｍｌ未満の濃度で免疫原性組成物中に存在する。トランスフェクション促進剤としては、表面活性剤、例えば、免免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）、フロイント不完全アジュバント、ＬＰＳ類似体、例えば、モノホスホリルリピドＡ、ムラミルペプチド、キノン類似体及び小胞、例えばスクアレン及びスクアレンを挙げることもでき、ヒアルロン酸を使用して、遺伝的コンストラクトとともに投与することもできる。いくつかの実施形態では、ＤＮＡプラスミドベースの免疫原性組成物は、トランスフェクション促進剤、例えば、脂質、リポソーム、例えば、レシチンリポソームまたはＤＮＡリポソーム混合物として当技術分野で既知の他のリポソーム（例えば、Ｗ０９３２４６４０を参照されたい）、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、またはナノ粒子、または他の既知のトランスフェクション促進剤を含むこともできる。好ましくは、トランスフェクション促進剤はポリアニオン、ポリカチオン、例えば、ポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＬＧＳ）、または脂質である。免疫原性組成物中のトランスフェクション剤の濃度は、４ｍｇ／ｍｌ未満、２ｍｇ／ｍｌ未満、１ｍｇ／ｍｌ未満、０．７５０ｍｇ／ｍｌ未満、０．５００ｍｇ／ｍｌ未満、０．２５０ｍｇ／ｍｌ未満、０．１００ｍｇ／ｍｌ未満、０．０５０ｍｇ／ｍｌ未満、または０．０１０ｍｇ／ｍｌ未満である。
医薬的に許容可能な賦形剤は１種または複数のアジュバントでもよい。アジュバントは、同じもしくは別のプラスミドから発現される他の遺伝子でもよく、または免疫原性組成物中で上記のプラスミドと組み合わせて、タンパク質として送達されてもよい。１種または複数のアジュバントは、以下からなる群から選択されるタンパク質及び／またはそのタンパク質をコードする核酸分子でもよい：ＣＣＬ２０、α−インターフェロン（ＩＦＮ−α）、β−インターフェロン（ＩＦＮ−β）、γ−インターフェロン、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＧＭ−ＣＳＦ、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、皮膚Ｔ細胞誘引性ケモカイン（ＣＴＡＣＫ）、上皮胸腺発現ケモカイン（ＴＥＣＫ）、粘膜関連上皮ケモカイン（ＭＥＣ）、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２３、ＩＬ−２８、ＭＨＣ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１８、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＩＬ−８、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１、ＭａｄＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−１、Ｍａｃ−１、ｐｌ５０．９５、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＣＤ２、ＬＦＡ−３、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−１８の突然変異型、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、血管増殖因子、線維芽細胞増殖因子、ＩＬ−７、神経成長因子、血管内皮増殖因子、Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｌｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６、カスパーゼＩＣＥ、Ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、Ｓｐ−１、Ａｐ−１、Ａｐ−２、ｐ３８、ｐ６５Ｒｅｌ、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩｋＢ、不活性ＮＩＫ、ＳＡＰ Ｋ、ＳＡＰ−１、ＪＮＫ、インターフェロン応答遺伝子、ＮＦｋＢ、Ｂａｘ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬｒｅｃ、ＴＲＡＩＬｒｅｃＤＲＣ５、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫリガンド、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０リガンド、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２及びこれらの機能的断片またはこれらの組み合わせ。いくつかの実施形態では、アジュバントは、以下からなる群から選択される１種または複数のタンパク質及び／またはそのタンパク質をコードする核酸分子でもよい：ＲＡＮＴＥＳ、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２３、ＩＬ−２８、ＣＴＡＣＫ、ＴＥＣＫ、ＭＥＣ、ＯＸ４０及びＤＲ５。ＩＬ−１２のコンストラクト及び配列の例は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１２／６９０１７号及び対応する米国特許第９，２７２，０２４号開示されており、これらは、参照により本明細書に組み込まれる。ＩＬ−１５のコンストラクト及び配列の例は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ０４／１８９６２号及び対応する米国特許第８，１７３，７８６号に開示されており、これらは、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる。ＩＬ−２３コンストラクト及び配列の例はＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１４／２５３４８号及び対応する米国出願第１４／７７５，０８７号に開示されており、これらは、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる。ＩＬ−２８のコンストラクト及び配列の例はＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ０９／０３９６４８号及び対応する米国出願第１２／９３６，１９２号に開示されており、これらは、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる。ＩＬ−２８のコンストラクト及び配列の例はＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ０９／０３９６４８号及び対応する米国出願第１２／９３６，１９２号に開示されており、これらは、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる。ＲＡＮＴＥＳ及び他のコンストラクト及び配列の例は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１９９９／００４３３２号及び対応する米国特許第８，１１９，３９５号に開示されており、これらは、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる。ＲＡＮＴＥＳのコンストラクト及び配列の他の例は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１１／０２４０９８号及び対応する米国特許第９．０３４，３１３号に開示されており、これらは、参照により本明細書に組み込まれる。ケモカインのＣＴＡＣＫ、ＴＥＣＫ及びＭＥＣのコンストラクト及び配列の例は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０４２２３１号及び対応する米国出願第１１／７１９，６４６号に開示されており、これらは、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる。ＯＸ４０及び他の免疫調節物質の例は米国出願第１０／５６０，６５３号に開示されており、これは、参照によって本明細書に組み込まれる。ＤＲ５及び他の免疫調節物質の例は米国出願第０９／６２２，４５２号に開示されており、これは、参照によって本明細書に組み込まれる。
免疫原性組成物は、コンセンサス抗原及びプラスミドを、約１ナノグラム〜１００ミリグラム、約１マイクログラム〜約１０ミリグラム、または好ましくは、約０．１マイクログラム〜約１０ミリグラム、またはより好ましくは、約１ミリグラム〜約２ミリグラムの量で含むことができる。いくつかの好ましい実施形態では、本発明による医薬組成物は、約５ナノグラム〜約１０００マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの好ましい実施形態では、医薬組成物は約１０ナノグラム〜約８００マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの好ましい実施形態では、医薬組成物は約０．１〜約５００マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの好ましい実施形態では、医薬組成物は約１〜約３５０マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの好ましい実施形態では、医薬組成物は、約２５〜約２５０マイクログラム、約１００〜約２００マイクログラム、約１ナノグラム〜１００ミリグラム、約１マイクログラム〜約１０ミリグラム、約０．１マイクログラム〜約１０ミリグラム、約１ミリグラム〜約２ミリグラム、約５ナノグラム〜約１０００マイクログラム、約１０ナノグラム〜約８００マイクログラム、約０．１〜約５００マイクログラム、約１〜約３５０マイクログラム、約２５〜約２５０マイクログラム、約１００〜約２００マイクログラムのコンセンサス抗原またはそれらのプラスミドを含む。
いくつかの実施形態では、本発明による医薬組成物は、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００ナノグラムの核酸のワクチンを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、少なくとも１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、３０５、３１０、３１５、３２０、３２５、３３０、３３５、３４０、３４５、３５０、３５５、３６０、３６５、３７０、３７５、３８０、３８５、３９０、３９５、４００、４０５、４１０、４１５、４２０、４２５、４３０、４３５、４４０、４４５、４５０、４５５、４６０、４６５、４７０、４７５、４８０、４８５、４９０、４９５、５００、６０５、６１０、６１５、６２０、６２５、６３０、６３５、６４０、６４５、６５０、６５５、６６０、６６５、６７０、６７５、６８０、６８５、６９０、６９５、７００、７０５、７１０、７１５、７２０、７２５、７３０、７３５、７４０、７４５、７５０、７５５、７６０、７６５、７７０、７７５、７８０、７８５、７９０、７９５、８００、８０５、８１０、８１５、８２０、８２５、８３０、８３５、８４０、８４５、８５０、８５５、８６０、８６５、８７０、８７５、８８０、８８５、８９０、８９５、９００、９０５、９１０、９１５、９２０、９２５、９３０、９３５、９４０、９４５、９５０、９５５、９６０、９６５、９７０、９７５、９８０、９８５、９９０、９９５または１０００マイクログラムの核酸のワクチンを含むことができる。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、少なくとも１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５または１０ｍｇまたはそれ以上の核酸のワクチンを含むことができる。
他の実施形態では、医薬組成物は、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００ナノグラムまで（その数値を含む）の核酸のワクチンを含むことができる。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、３０５、３１０、３１５、３２０、３２５、３３０、３３５、３４０、３４５、３５０、３５５、３６０、３６５、３７０、３７５、３８０、３８５、３９０、３９５、４００、４０５、４１０、４１５、４２０、４２５、４３０、４３５、４４０、４４５、４５０、４５５、４６０、４６５、４７０、４７５、４８０、４８５、４９０、４９５、５００、６０５、６１０、６１５、６２０、６２５、６３０、６３５、６４０、６４５、６５０、６５５、６６０、６６５、６７０、６７５、６８０、６８５、６９０、６９５、７００、７０５、７１０、７１５、７２０、７２５、７３０、７３５、７４０、７４５、７５０、７５５、７６０、７６５、７７０、７７５、７８０、７８５、７９０、７９５、８００、８０５、８１０、８１５、８２０、８２５、８３０、８３５、８４０、８４５、８５０、８５５、８６０、８６５、８７０、８７５、８８０、８８５、８９０、８９５、９００、９０５、９１０、９１５、９２０、９２５、９３０、９３５、９４０、９４５、９５０、９５５、９６０、９６５、９７０、９７５、９８０、９８５、９９０、９９５、または１０００マイクログラムまで（その数値を含む）の核酸のワクチンを含むことができる。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５または１０ｍｇまで（その数値を含む）の核酸のワクチンを含むことができる。
免疫原性組成物は、使用される投与様式に従って製剤化することができる。注入用ワクチン医薬組成物は、無菌、発熱物質フリー及び微粒子フリーでもよい。等張性の製剤または溶液を使用することができる。等張性のための添加剤としては、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール及びラクトースを挙げることができる。ワクチンは血管収縮剤を含むことができる。等張液はリン酸緩衝食塩水を含むことができる。免疫原性組成物は、ゼラチン及びアルブミンを含む安定化剤をさらに含むことができる。ワクチン製剤に対するＬＧＳまたはポリカチオンまたはポリアニオンなど、安定化は、製剤が長期間にわたって室温または周囲温度で安定であることを可能にする。
免疫原性組成物は、１週間を超えて、いくつかの実施形態では２週間を超えて、いくつかの実施形態では３週間を超えて、いくつかの実施形態では４週間を超えて、いくつかの実施形態では５週間を超えて、及びいくつかの実施形態では、６週間を超えて、室温（２５℃）で安定であり得る。いくつかの実施形態では、ワクチンは、１か月間を超えて、２か月を超えて、３か月を超えて、４か月間を超えて、５か月間を超えて、６か月間を超えて、７か月間を超えて、８か月間を超えて、９か月間を超えて、１０か月間を超えて、１１か月間を超えて、または１２か月間を超えて安定である。いくつかの実施形態では、ワクチンは、１年間を超えて、２年間を超えて、数年間を超えて、または５年間を超えて安定である。一実施形態では、免疫原性組成物は、冷蔵（２〜８℃）下で安定である。したがって、一実施形態では、免疫原性組成物は冷凍コールドチェーンを必要としない。免疫原性組成物は、それが、その所期の用途を可能にする（例えば、対象において免疫応答を発生させる）のに十分な期間にわたってその生物活性を保持する場合、安定である。例えば、保存される、出荷されるなどの免疫原性組成物に対して、免疫原性組成物が数か月から数年にわたって安定なままであることが所望され得る。
ワクチン接種の方法
免疫原性組成物を対象に投与することによって、それらを必要とする対象において疾患を治療する、防ぐ、及び／または予防する方法も本明細書で提供される。対象への免疫原性組成物の投与は、対象において免疫応答を誘導または誘発することができる。誘導される免疫応答は、疾患、例えば、１つまたは複数の腫瘍関連病態を治療する、予防する、及び／または防ぐのに使用することができる。
誘導される免疫応答は、誘導される液性免疫応答及び／または誘導される細胞性免疫応答を含むことができる。液性免疫応答は、約１．５倍〜約１６倍、約２倍〜約１２倍、または約３倍〜約１０倍誘導され得る。誘導される液性免疫応答は、抗原に反応するＩｇＧ抗体及び／または中和抗体を含むことができる。誘導される細胞性免疫応答は、約２倍〜約３０倍、約３倍〜約２５倍、または約４倍〜約２０倍誘導されるＣＤ８＋Ｔ細胞応答を含むことができる。
免疫原性組成物の用量は、１μｇ〜１０ｍｇ活性成分／ｋｇ体重／回でもよく、２０μｇ〜１０ｍｇ成分／ｋｇ体重／回でもよい。免疫原性組成物は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、または３１日毎に投与することができる。有効な治療のための免疫原性組成物の用量の数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０でもよい。
免疫原性組成物は、医薬分野の当業者に周知の標準的な技法に従って製剤化することができる。そのような組成物は、特定の対象の年齢、性別、体重及び状態ならびに投与経路などを考慮して、医学分野の当業者に周知の投薬量及び技法で投与することができる。
免疫原性組成物は、予防的または治療的に投与することができる。予防的投与では、免疫原性組成物は、免疫応答を誘導するのに十分である量で投与することができる。治療用途では、免疫原性組成物は、治療効果を誘発するのに十分である量で、それらを必要とする対象に投与される。これを達成するのに適切な量は、「治療有効量」と定義される。この使用に有効な量は、例えば、投与される免疫原性組成物レジメンの特定の組成物、投与様式、疾患のステージ及び重症度、対象の一般的健康状態ならびに処方する医師の判断に依存する。
免疫原性組成物は、Ｄｏｎｎｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ．（１９９７，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：６１７−６４８）、Ｆｅｌｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９６年１２月３日に発行された、米国特許第５，５８０，８５９号）、Ｆｅｌｇｎｅｒ（１９９７年１２月３０日に発行された、米国特許第５，７０３，０５５号）、及びＣａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９７年１０月２１日に発行された、米国特許第５，６７９，６４７号）（これらのすべての内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されているような当技術分野で周知の方法によって、投与することができる。免疫原性組成物のＤＮＡは、例えばワクチン銃を使用して個体に投与することができる粒子またはビーズに複合体化することができる。生理学的に許容可能な化合物を含めた医薬的に許容可能な担体の選択は、例えば、発現ベクターの投与経路に依存することを当業者なら知っているであろう。
免疫原性組成物は、様々な経路を介して送達することができる。典型的な送達経路としては、非経口投与、例えば、皮内、筋肉内または皮下送達が挙げられる。他の経路としては、経口投与、鼻腔内経路及び腟内経路が挙げられる。特に免疫原性組成物のＤＮＡについては、免疫原性組成物は、個体の組織の間質腔に送達することができる（Ｆｅｌｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．、米国特許第５，５８０，８５９号及び第５，７０３，０５５号（これらのすべての内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））。免疫原性組成物は、筋肉に投与することもでき、あるいは皮内もしくは皮下注入を介して、または例えばイオン導入法によって、経皮的に投与することができる。免疫原性組成物の上皮投与を用いることもできる。上皮投与は、刺激物に対する免疫応答を促すために、表皮の最も外側の層を機械的または化学的に刺激することを含むことができる（その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｃａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、米国特許第５，６７９，６４７号）。
免疫原性組成物は、鼻孔を介する投与のために製剤化することもできる。担体が固形物である、経鼻投与に適した製剤は、例えば、約１０〜約５００ミクロンの範囲の粒径を有する粗粉末を含むことができ、これは、鼻吸入がとられる方法で、すなわち、鼻の近くに保持された粉末の容器から鼻孔を通る急速吸入によって投与される。製剤は、鼻腔用スプレー、点鼻剤でもよく、またはネブライザーによるエアロゾル投与によってもよい。製剤は、免疫原性組成物の水性または油性溶液を含むことができる。
免疫原性組成物は、液体調製物、例えば、懸濁剤、シロップ剤またはエリキシル剤でもよい。免疫原性組成物は、非経口、皮下、皮内、筋肉内または静脈内投与（例えば、注入可能な投与）のための調製物、例えば、無菌の懸濁剤または乳濁液でもよい。
免疫原性組成物をリポソーム、ミクロスフェアまたは他のポリマーマトリックスに組み込むことができる（Ｆｅｌｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ、米国特許第５，７０３，０５５号、Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．Ｉｔｏ ＩＩＩ（２ｎｄ ｅｄ．１９９３）（これらの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））。リポソームはリン脂質または他の脂質から構成されてもよく、作製及び投与するのが比較的簡単な、無毒の、生理学的に許容可能な、代謝可能な担体でもよい。
免疫原性組成物は、電気穿孔を介して、例えば、その内容が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，６６４，５４５号に記載されている方法によって、投与することができる。電気穿孔は、米国特許第６，３０２，８７４号、第５，６７６，６４６号、第６，２４１，７０１号、第６，２３３，４８２号、第６，２１６，０３４号、第６，２０８，８９３号、第６，１９２，２７０号、第６，１８１，９６４号、第６，１５０，１４８号、第６，１２０，４９３号、第６，０９６，０２０号、第６，０６８，６５０及び第５，７０２，３５９（これらの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている方法及び／または装置によってもよい。電気穿孔は、低侵襲デバイスによって行ってもよい。
低侵襲電気穿孔デバイス（「ＭＩＤ」）は、上記の免疫原性組成物及び付随する流体を体組織中に注入するための装置でもよい。該デバイスは、中空針、ＤＮＡカセット及び流体送達手段を含むことができ、デバイスは、体組織中に針を挿入している間に、同時に（例えば、自動的に）ＤＮＡを体組織中に注入するために、使用されている流体送達手段を作動させるように適合される。これは、針が挿入されている間にＤＮＡ及び付随する流体を徐々に注入する能力が、体組織中に流体のより均一な分布をもたらすという利点がある。より広い領域にわたって注入されるＤＮＡの分布の結果、注入の間に経験する痛みが低減し得る。
ＭＩＤは、針の使用なしで、免疫原性組成物を組織中に注入することができる。ＭＩＤは、免疫原性組成物が組織の表面に穴をあけ、下層組織及び／または筋肉に進入するような力を有する小さな流れまたは噴流として、免疫原性組成物を注入することができる。小さな流れまたは噴流を支持する力は、ほんの一瞬のうちに、微小開口部を通して、圧縮ガス、例えば二酸化炭素の膨張によって与えることができる。低侵襲電気穿孔デバイスの例及びそれらの使用方法は、公開米国特許出願第２００８０２３４６５５号、米国特許第６，５２０，９５０号、米国特許第７，１７１，２６４号、米国特許第６，２０８，８９３号、米国特許第６，００９，３４７号、米国特許第６，１２０，４９３号、米国特許第７，２４５，９６３号、米国特許第７，３２８，０６４号及び米国特許第６，７６３，２６４号（これらのそれぞれの内容は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
ＭＩＤは、無痛で組織に穴をあける高速液体噴流をもたらす注入器を含むことができる。そのような針がない注入器は市販されている。本明細書で利用可能な針がない注入器の例としては、米国特許第３，８０５，７８３号、第４，４４７，２２３号、第５，５０５，６９７号及び第４，３４２，３１０号（これらのそれぞれの内容は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているものが挙げられる。
直接的または間接的電気的輸送に適した形態の所望の免疫原性組成物を、通常、組織中へ免疫原性組成物を浸透させるのに十分な力を有する薬剤噴流送達を作動させるために、組織の表面を注入器と接触させることによって、針がない注入器を使用して治療される組織中に導入する（例えば、注入する）ことができる。例えば、治療される組織が粘膜、皮膚または筋肉である場合、薬剤は、角質層を通して、それぞれ皮層中に、または下層組織及び筋肉中に薬剤を浸透させるのに十分な力で、粘膜または皮膚の表面に向けて発射される。
針がない注入器は、すべてのタイプの組織に、特に皮膚及び粘膜に免疫原性組成物を送達するのによく適している。いくつかの実施形態では、針がない注入器は、表面に、及び対象の皮膚または粘膜中に、免疫原性組成物を含む液体を推進させるのに使用することができる。本発明の方法を使用して治療することができる様々なタイプの組織の代表的な例としては、膵臓、喉頭、上咽頭、下咽頭、中咽頭、唇、咽喉、肺、心臓、腎臓、筋肉、乳房、結腸、前立腺、胸腺、精巣、皮膚、粘膜組織、卵巣、血管またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。
ＭＩＤは、組織を電気穿孔する針電極を有することができる。例えば、長方形または正方形のパターンで設定された複数の電極アレイにおける複数の対の電極の間でパルスをかけることによって、１対の電極の間でパルスをかけるものと比較して、結果が向上する。治療的処置の間に複数の対の針にパルスをかけることができる針のアレイが、例えば、「Ｎｅｅｄｌｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｄｅｓ ｆｏｒ Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｄｒｕｇｓ ａｎｄ Ｇｅｎｅｓ」と題する米国特許第５，７０２，３５９号で開示されている。完全に記載されるかのように参照によって本明細書に組み込まれるその出願では、針は環状アレイで配置されたが、反対の対の針電極の間でパルスをかけることを可能にするコネクター及びスイッチング装置を有する。組換え発現ベクターを細胞に送達ための１対の針電極を使用することができる。そのようなデバイス及びシステムは、その内容が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，７６３，２６４号に記載されている。あるいは、通常の注入針に似ている単一針を用いてＤＮＡの注入及び電気穿孔を可能にし、現在使用されているデバイスによって加えられるものよりも低い電圧のパルスを印加し、したがって、患者が経験する電気の感覚を低減させる、単一針デバイスを使用することができる。
ＭＩＤは、１つまたは複数の電極アレイを含むことができる。アレイは、同じ直径または異なる直径の２つ以上の針を含むことができる。針は、均等に、または不均等に間隔があいていてもよい。針は、０．００５インチ〜０．０３インチの間、０．０１インチ〜０．０２５インチの間、または０．０１５インチ〜０．０２０インチの間でもよい。針は、直径が０．０１７５インチでもよい。針は、０．５ｍｍ、１．０ｍｍ、１．５ｍｍ、２．０ｍｍ、２．５ｍｍ、３．０ｍｍ、３．５ｍｍ、４．０ｍｍまたはそれ以上の間隔があいていてもよい。
ＭＩＤは、単一ステップで免疫原性組成物を送達し、電気穿孔パルスを加える、パルス発生器及び２つ以上の針の免疫原性組成物注入器から構成され得る。パルス発生器は、フラッシュカード操作パーソナルコンピューターを介するパルス及び注入のパラメーターの柔軟なプログラミングを、ならびに電気穿孔及び患者データの包括的な記録及び記憶を可能にし得る。パルス発生器は、短期間の間に、様々なボルトのパルスを加えることができる。例えば、パルス発生器は、１００ｍｓの持続時間の３回の１５ボルトのパルスを加えることができる。そのようなＭＩＤの例は、Ｉｎｏｖｉｏ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによるＥｌｇｅｎ１０００システムであり、これは、その内容が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，３２８，０６４号に記載されている。
ＭＩＤはＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（Ｉｎｏｖｉｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｂｌｕｅ Ｂｅｌｌ ＰＡ）デバイス及びシステムでもよく、これは、モジュール式の電極システムであり、体内または植物内の選択された組織の細胞中へのＤＮＡなどの巨大分子の導入を促進する。モジュール式の電極システムは、複数の針電極、皮下針、プログラム可能な定電流パルスコントローラーから複数の針電極への導電性リンクをもたらす電気的コネクター、及び電源を含むことができる。操作者は、支持構造物上にマウントされた複数の針電極を握り、体内または植物内の選択された組織中にしっかりとそれを挿入することができる。次いで、巨大分子が、皮下針を介して選択された組織中に送達される。プログラム可能な定電流パルスコントローラーを活性化し、定電流電気パルスを複数の針電極に印加する。印加した定電流電気パルスは、複数の電極の間の細胞中への巨大分子の導入を促進する。定電流パルスによって組織中の電力散逸を制限することによって、細胞の過熱による細胞死が最小限になる。Ｃｅｌｌｅｃｔｒａデバイス及びシステムは、その内容が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，２４５，９６３号に記載されている。
ＭＩＤはＥｌｇｅｎ１０００システム（Ｉｎｏｖｉｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）でもよい。Ｅｌｇｅｎ１０００システムは、中空針及び流体送達手段を提供するデバイスを含むことができ、装置は、体組織中に針を挿入している間に、同時に（例えば、自動的に）流体、本明細書で記載の免疫原性組成物を体組織中に注入するために、使用されている流体送達手段を作動させるように適合される。利点は、針が体組織中に挿入されている間に流体を徐々に注入する能力が、流体のより均一な分布をもたらすことである。より広い領域にわたって注入される流体量の分布の結果、注入の間に経験する痛みが低減することも考えられる。
さらに、流体の自動注入は、注入された流体の実際の用量の自動のモニタリング及び登録を促進する。このデータは、必要に応じて文書化目的のために、制御ユニットによって記憶することができる。
注入速度は直線的または非直線的のいずれかであり得ること、及び注入は、治療される対象の皮膚を通して針が挿入された後、且つ針がさらに体組織中に挿入されている間に行うことができることが理解されよう。
本発明の装置によって流体を注入することができる適切な組織としては、腫瘍組織、皮膚または肝組織が挙げられるが、筋組織でもよい。
装置は、体組織中への針の挿入をガイドするための針挿入手段をさらに含む。流体注入速度は、針挿入速度によって制御される。これは、挿入速度が所望の注入速度と一致し得るように針の挿入と流体の注入の両方を制御することができるという利点がある。これまた、使用者にとって装置をより操作しやすくする。必要に応じて、体組織中に針を自動的に挿入するための手段が提供され得る。
使用者は、いつ流体の注入を開始するかを選択することができる。しかし、理想的には、針の先端が筋組織に達したときに注入が開始され、装置は、流体の注入を開始するのに十分な深度にいつ針が挿入されたかを感知するための手段を含むことができる。これは、針が所望の深度（通常は、筋組織が始まる深度である）に達したときに流体の注入が自動的に開始するように促されることを意味する。筋組織が始まる深度は、例えば、針が皮膚層を通り抜けるのに十分であるとみなされるであろう４ｍｍの値などのあらかじめ設定した針挿入深度であると解釈することができる。
感知手段は、超音波プローブを含むことができる。感知手段は、インピーダンスまたは抵抗の変化を感知するための手段を含むことができる。この場合、手段は、それ自体は、体組織中の針の深度を記録しなくてもよく、むしろ、針が異なるタイプの体組織から筋肉中移動したときにインピーダンスまたは抵抗の変化を感知するように適合される。これらの選択肢のいずれも、比較的正確で操作するのが簡単な、注入を開始することができる感知手段を提供する。針の挿入深度を必要に応じてさらに記録することができ、針挿入深度が記録されるときに注入される流体量が決定されるように、流体の注入を制御するために針の挿入深度を使用することができる。
装置は、針を支持する基部、及び中に基部を受容するためのハウジングをさらに含むことができ、基部がハウジングに対して第１の後方位置にある場合に針がハウジング内に引っ込められ、基部がハウジング内の第２の前方位置にある場合に針がハウジングから外へ伸びるように、基部はハウジングに対して移動可能である。これは、ハウジングが患者の皮膚に並べられ、次いで、基部に対してハウジングを移動させることによって、針を患者の皮膚に挿入することができるので、使用者にとって有利である。
上で述べたように、針が皮膚中に挿入されるときに針の長さにわたって流体が均等に分布するように、制御された流体注入速度を達成することが望ましい。流体送達手段は、制御された速度で流体を注入するように適合されたピストン駆動手段を含むことができる。ピストン駆動手段は、例えば、サーボモーターによって稼働させることができる。しかし、ピストン駆動手段は、ハウジングに対して軸方位に基部を移動させることにより作動させることができる。流体送達のための代替手段を提供できることが理解されよう。したがって、例えば、シリンジ及びピストンシステムの代わりに、制御された、または制御されていない速度で流体を送達するために圧搾することができる密閉容器を提供することができる。
上記の装置は、いかなるタイプの注入にも使用することができる。しかし、電気穿孔の分野で特に有用であることが想定され、そのため、これは、針に電圧を印加するための手段をさらに含むことができる。これは、針が注入のためだけでなく、電気穿孔の間の電極としても使用されることを可能にする。これは、注入される流体と同じ領域に電界が印加されることを意味するので、特に有利である。電極を以前に注入された流体と正確に整合させることが非常に難しいという電気穿孔に関連する問題が伝統的に存在し、そのため、使用者が、注入された物質と電界の間の重なりを保証しようと試みるために、より大きな領域にわたって必要とされるよりもたくさんの量の流体を注入する、及びより高い領域にわたって電界を印加する傾向があった。本発明を使用すれば、電界と流体の間の良好な適合度を達成しながら、注入される流体の量と印加される電界の大きさの両方を低減させることができる。
核酸プラスミドを調製する方法
本明細書に論じる核酸ベースの免疫原性組成物を含む核酸プラスミドを調製するための方法が本明細書で提供される。哺乳類発現プラスミドへの最終的なサブクローニングステップの後、核酸プラスミドは、当技術分野で既知の方法を使用して、大規模な発酵タンク中に細胞培養物を播種するのに使用することができる。
本発明のＥＰデバイスで使用するための核酸プラスミドは、既知のデバイスと技法の組み合わせを使用して、製剤化または製造することができる。いくつかの例では、これらの研究で使用される核酸プラスミドは、１０ｍｇ／ｍＬ以上の濃度で製剤化することができる。製造技法は、２００７年７月３日に発行された、ライセンスを受けた特許である米国特許第７，２３８，５２２号に記載されているものを含めて、米国第６０／９３９７９２号に記載されているものに加えて、当業者に一般に知られている様々なデバイス及びプロトコールも含むか組み込む。上記で参照した出願及び特許、米国第６０／９３９，７９２号及び米国特許第７，２３８，５２２号は、それぞれ、その全体が本明細書に組み込まれる。
治療方法
免疫原性組成物は、それらを必要とする対象のＦＡＰに反応性であるか、それに向けられる、哺乳動物における免疫応答を発生させるまたは誘発するのに使用することができる。一実施形態では、免疫原性組成物は、対象においてがんを予防するまたは治療するのに使用することができる。一実施形態では、がんはＦＡＰを発現する。したがって、免疫原性組成物は、免疫原性組成物が投与される対象においてＦＡＰを発現するがんを治療する及び／または予防する方法で使用することができる。一実施形態では、免疫原性組成物は、対象において、ＦＡＰを発現するがんの原発性または初発性の発生を予防するのに使用することができる。一実施形態では、免疫原性組成物は、対象において、ＦＡＰを発現するがんの再発を予防するのに使用することができる。
いくつかの実施形態では、免疫応答は、免疫原性組成物が投与される対象において、様々な組織またはシステム（例えば、脳または神経システムなど）に損傷を引き起こさない、またはそうした組織またはシステムの炎症を引き起こさない、液性免疫応答及び／または抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を発生させることができる。
いくつかの実施形態では、投与される免疫原性組成物は、対象において、がんの生存を延ばすこと、腫瘍の大きさ縮小すること、またはそれらの組み合わせを行うことができる。投与される免疫原性組成物は、対象において、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、及び６０％またはそれ以上、がんの生存を延ばすことができる。投与される免疫原性組成物は、免疫化後の対象において、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、及び７０％またはそれ以上、腫瘍の大きさ縮小することができる。
投与される免疫原性組成物は、対象において、約５倍〜約６０００倍、約５０倍〜約５５００倍、約５０倍〜約５０００倍、約５０倍〜約４５００倍、約１００倍〜約６０００倍、約１５０倍〜約６０００倍、約２００倍〜約６０００倍、約２５０倍〜約６０００倍、または約３００倍〜約６０００倍、細胞性免疫応答を高めることができる。いくつかの実施形態では、投与される免疫原性組成物は、対象において、約５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、１５０倍、２００倍、２５０倍、３００倍、３５０倍、４００倍、４５０倍、５００倍、５５０倍、６００倍、６５０倍、７００倍、７５０倍、８００倍、８５０倍、９００倍、９５０倍、１０００倍、１１００倍、１２００倍、１３００倍、１４００倍、１５００倍、１６００倍、１７００倍、１８００倍、１９００倍、２０００倍、２１００倍、２２００倍、２３００倍、２４００倍、２５００倍、２６００倍、２７００倍、２８００倍、２９００倍、３０００倍、３１００倍、３２００倍、３３００倍、３４００倍、３５００倍、３６００倍、３７００倍、３８００倍、３９００倍、４０００倍、４１００倍、４２００倍、４３００倍、４４００倍、４５００倍、４６００倍、４７００倍、４８００倍、４９００倍、５０００倍、５１００倍、５２００倍、５３００倍、５４００倍、５５００倍、５６００倍、５７００倍、５８００倍、５９００倍、または６０００倍、細胞性免疫応答を高めることができる。
投与されるワクチンは、対象において、約５倍〜約６０００倍、約５０倍〜約５５００倍、約５０倍〜約５０００倍、約５０倍〜約４５００倍、約１００倍〜約６０００倍、約１５０倍〜約６０００倍、約２００倍〜約６０００倍、約２５０倍〜約６０００倍、または約３００倍〜約６０００倍、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）レベルを高めることができる。いくつかの実施形態では、投与されるワクチンは、対象において、約５０倍、１００倍、１５０倍、２００倍、２５０倍、３００倍、３５０倍、４００倍、４５０倍、５００倍、５５０倍、６００倍、６５０倍、７００倍、７５０倍、８００倍、８５０倍、９００倍、９５０倍、１０００倍、１１００倍、１２００倍、１３００倍、１４００倍、１５００倍、１６００倍、１７００倍、１８００倍、１９００倍、２０００倍、２１００倍、２２００倍、２３００倍、２４００倍、２５００倍、２６００倍、２７００倍、２８００倍、２９００倍、３０００倍、３１００倍、３２００倍、３３００倍、３４００倍、３５００倍、３６００倍、３７００倍、３８００倍、３９００倍、４０００倍、４１００倍、４２００倍、４３００倍、４４００倍、４５００倍、４６００倍、４７００倍、４８００倍、４９００倍、５０００倍、５１００倍、５２００倍、５３００倍、５４００倍、５５００倍、５６００倍、５７００倍、５８００倍、５９００倍、または６０００倍、ＩＦＮ−γレベルを高めることができる。
ワクチン用量は、１μｇ〜１０ｍｇ活性成分／ｋｇ体重／回の間でもよく、２０μｇ〜１０ｍｇ成分／ｋｇ体重／回でもよい。ワクチンは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０または３１日毎に投与することができる。有効な治療のためのワクチン用量の数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０でもよい。
投与経路
免疫原性組成物または医薬組成物は、経口、非経口、舌下、経皮、経直腸、経粘膜、局所、吸入によるもの、口腔内投与によるもの、胸膜内、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、鼻腔内、髄腔内及び関節内またはそれらの組み合わせを含めた様々な経路によって投与することができる。獣医学用途については、組成物は、通常の獣医学的実施に従って適切に許容される製剤として投与することができる。獣医師は、特定の動物に最も適している投与レジメン及び投与経路を容易に決定することができる。免疫原性組成物は、従来のシリンジ、針なし注入デバイス、「微粒子衝撃遺伝子銃（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ ｇｅｎｅ ｇｕｎｓ）」または他の物理的方法、例えば、電気穿孔法（「ＥＰ」）、「流体力学的方法」もしくは超音波によって投与することができる。
ワクチンのベクターは、インビボ電気穿孔、リポソーム媒介法、ナノ粒子促進法、組換えベクター、例えば、組換えアデノウイルス、組換えアデノウイルス随伴ウイルス及び組換えワクシニアを用いる、及び用いないＤＮＡ注入（ＤＮＡワクチン接種とも称される）を含めた、いくつかの周知の技術によって哺乳動物へ投与することができる。本発明の最適化コンセンサスＦＡＰ抗原は、インビボ電気穿孔を伴うＤＮＡ注入によって投与することができる。
キット
上記のワクチン接種の方法を使用して対象を治療するのに使用することができるキットが本明細書で提供される。キットは免疫原性組成物を含むことができる。
キットは、上記のワクチン接種方法の実施及び／またはキットの使用方法に関する指示書を含むこともできる。キットに含まれる指示書は、包装材料に貼り付けることができ、または添付文書として含めることができる。指示書は、典型的には文書または印刷物であるが、それらに限定されない。指示書を記憶すること、及びそれを最終使用者に伝えることができる任意の媒体が本開示で企図される。そのような媒体としては、限定されないが、電子記憶媒体（例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ）、光学式媒体（例えば、ＣＤ ＲＯＭ）などが挙げられる。本明細書で使用する場合、用語「指示書」は、指示書を提供するインターネットサイトのアドレスを含むことができる。
本発明は、以下の非限定的実施例によって例示される複数の態様を有する。
本発明を、以下の実験実施例を参照することによりさらに詳細に記載する。これらの実施例は、例示の目的のみで提供され、別段の指定がない限り限定を意図したものではない。したがって、本発明は、以下の実施例に限定されるとして決して解釈されるべきでなく、むしろ、本明細書で提供される教示の結果として明らかになるありとあらゆる変形形態を包含すると解釈されるべきである。
さらなる説明がなくても、当業者は、前述の説明及び以下の例示的な実施例を使用して、本発明を作製及び利用することができ、請求される方法を実施することができると考えられる。したがって、以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を具体的に示し、決して本開示の残りの部分を限定すると解釈されるべきでない。
実施例１：合成コンセンサスＦＡＰ免疫原性組成物
ＦＡＰタンパク質は、活性化した線維芽細胞で発現するプロテアーゼ及びゼラチナーゼである。ＦＡＰは、前立腺癌及び膵臓癌を含めたヒト癌腫中のがん関連線維芽細胞の＞９０％で発現している。ＦＡＰは、創傷治癒ならびに骨及び軟部組織肉腫の悪性細胞と関係がある線維芽細胞でも発現している。ＦＡＰに対する抗体（例えば、シブロツズマブ（ｓｉｂｒｏｔｕｚｕｍａｂ））及びＦＡＰの小分子阻害剤（例えば、タラボスタット）は、臨床試験において、安全であるが、最少の有効性しか示さない。
過去１０年間で、ＦＡＰ発現細胞を標的にする免疫療法の開発への関心が急増している（Ｆａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃｓ，３：１６００７、Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ ｅｔ ａｌ．，２０１３，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，８：ｅ８２６５８、Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｅｒｔｌ，２０１６，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ，７：２３２８２−９９、Ｘｉａ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ，６５：６１３−６２４、Ｗｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ，１０１：２３２５−２３３２、Ｘｉａ ｅｔ ａｌ．，２０１６，３４：４５２６−４５３５、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｓｃｉ Ｒｅｐ，５：１４４２１、Ｌｏｅｆｆｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ，１１６：１９５５−１９６２）。本明細書では、ＤＮＡワクチン設計ストラテジーに新規な改良を組み込む、ＦＡＰを標的にするＤＮＡワクチンを開発した。組み込まれる重要な最近の改良は、寛容性を破壊するのを助けるための合成マイクロコンセンサス（μＣｏｎ）配列の使用である。異なる腫瘍関連抗原、ウィルムス腫瘍１（ＷＴ１）について、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおいて、ネイティブなマウスＷＴ１とおよそ９５％の相同性を有する合成コンセンサスワクチンが、寛容性の破壊及び抗腫瘍免疫の発生で優れていることが以前に示された（Ｗａｌｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ，２５：９７６−９８８）。本明細書では、遺伝的に多様な非近交系マウスを使用してこの概念を発展させて、ＦＡＰに対するこのコンセンサスワクチン設計がネイティブマウスＦＡＰワクチン配列より優れていることを示した。ネイティブＦＡＰワクチンで免疫化された個々のマウスは応答を示し、寛容性を破壊することができたが、応答は、μＣｏｎ ＦＡＰで免疫化されたマウス群において、全体的に見て、より広範で高かった。
重要なことに、開発したμＣｏｎ ＦＡＰ ＤＮＡワクチンは、各ワクチン単独と比べてより強い抗腫瘍免疫の発生において、ＴＥＲＴとＰＳＭＡの両方の腫瘍標的ワクチンと相乗的に作用した。μＣｏｎ ＦＡＰワクチンは、ＰＳＭＡワクチンがより強い抗腫瘍効果を有することができるように腫瘍微小環境の環境を変えることができる（Ｙａｄａｖ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｎａｔｕｒｅ，５１５：５７２−５７６）。
本研究は、ＦＡＰが、がん免疫療法に対する実行可能な治療的ワクチン標的であり、腫瘍抗原ワクチン療法と組み合わせて使用する場合に特定の有効性を示すことを示す。ＦＡＰを標的にするための他の遺伝子療法アプローチ、例えば、キメラ抗原受容体療法は、いくらかの毒性の懸念がある（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ，２：１５４−１６６）。したがって、ＤＮＡベースのワクチンアプローチは、より安全で、より容易に利用可能な代替法であり得る。
方法を次に記載する。
ＤＮＡプラスミド
合成マイクロコンセンサス（μＣｏｎ）ＦＡＰ配列は、マウス及びヒトに関連する動物、例えば、ラット、マカク及びハムスター由来の２０個を超えるＦＡＰ配列を整列させることによって生成した。これらの配列は、ＣｌｕｓｔａｌＸ２を使用して整列させた。細胞外ドメイン配列（アミノ酸２６〜７６１）だけが、プラスミド中にコードされており、したがって、これをアライメントに使用した（図１Ａ）。ＦＡＰのジペプチジルペプチダーゼ及びゼラチン分解活性をブロックするために、追加的な突然変異、Ｓ６２４Ａを導入した。すべての配列は、Ｎ末端のコザック配列及びＮ末端のＩｇＥリーダー配列を用いて、ＲＮＡ及びコドン最適化した。使用したすべてのプラスミドは、改変ｐＶａｘ１ベクター（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）にクローニングした。最終的なμＣｏｎマウスＦＡＰ配列は、Ｍｅｇａ６を使用して計算した場合、ネイティブマウスＦＡＰと９５．１％の配列同一性を有する。
細胞培養及びトランスフェクション
２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ）及びＴＣ−１細胞（Ｄｒ．Ｙｖｏｎｎｅ Ｐａｔｅｒｓｏｎからの寄贈品）は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で維持した。ＴＲＡＭＰ−Ｃ２腫瘍細胞株（ＡＴＣＣ）は、５％ＦＢＳ、５％ＮｕＳｅｒｕｍ ＩＶ、１０ｎＭデヒドロイソアンドロステロン及び０．００５ｍｇ／ｍＬのウシインスリンを補充したＤＭＥＭ（Ｇｌｕｔａｍａｘ＋４．５ｇ／ＬのＤ−グルコースを含む）中で維持した。すべての細胞株は、マイコプラズマの混入について日常的に試験し、少ない継代（細胞培養については＜２０継代、マウスへの移植については＜５継代）で維持した。ＦＡＰワクチンコンストラクトの発現を確認するために、製造業者のガイドラインに従ってリポフェクタミン３０００を使用して、２９３Ｔ細胞を各プラスミドでトランスフェクトした。細胞可溶化物をトランスフェクションしてから４８時間後に収集した。ＥＤＴＡフリープロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）を補充したＲＩＰＡ溶解バッファー（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で細胞を溶解した。
動物の免疫化
Ｃ５７Ｂｌ／６、Ｂａｌｂ／ｃ及びＣＤ−１非近交系マウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。マウスは、脛骨内側（ＴＡ）筋に３０μＬのＤＮＡ（ＤＮＡのμｇ量を図の説明文に示す）注入し、続いて、ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）−３Ｐデバイス（Ｉｎｏｖｉｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）を使用する電気穿孔（ＥＰ）を使用して、０．１アンペアの電気的定電流方形波パルスを２回加えることによって、免疫化した。使用されるワクチンスケジュールを各図または図の説明文に示す。
腫瘍チャレンジ研究
腫瘍チャレンジ研究のために、５０，０００個のＴＣ−１細胞または１，０００，０００個のＴＲＡＭＰ−Ｃ２細胞を、それぞれ、雌のＣ５７Ｂｌ／６マウスまたは雄のＣ５７Ｂｌ／６マウスの右脇腹に皮下移植した。移植してから１週後（ＴＣ−１移植について）または４日後（ＴＲＡＭＰ−Ｃ２移植について）、マウスを処置群に無作為化した。次いで、合計で４回の免疫化について週１回マウスを免疫化した。腫瘍を週２回モニターし、電子キャリパーを使用して測定した。式：体積＝（π／６）＊（高さ）＊（幅２）を使用して腫瘍体積を計算した。腫瘍の直径が１．５ｃｍを超えたときに、マウスを安楽死させた。
脾細胞及び腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の単離
免疫化されたマウスからの脾臓を、１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ培地中に回収した。脾細胞をストマッカーを使用して分離し、濾過し、ＡＣＫ溶解バッファー（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して赤血球を溶解した。細胞を４０μｍのフィルターを通して濾過し、数え、染色用に、またはＥＬＩＳｐｏｔ用にプレーティングした。メスを使用して腫瘍を機械的に分離し、次いで、Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｌ−１５ライボビッツ培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）及びＲＰＭＩの５０／５０混合物＋１０％ＦＢＳ＋１％ペニシリン／ストレプトマイシンに入れたコラゲナーゼＩ、ＩＩ及びＩＶ（１７０ｍｇ／Ｌ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、ＤＮＡｓｅＩ（１２．５ｍｇ／Ｌ、Ｒｏｃｈｅ）、エラスターゼ（２５ｍｇ／Ｌ、Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）の混合物中でインキュベートした。次いで、分離した細胞を４０μｍのフィルターを通して２回濾過し、刺激及び染色用にプレーティングした。
ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ
ＭＡＢＴＥＣＨマウスＩＦＮ−γ ＥＬＩＳｐｏｔＰＬＵＳプレートを使用して、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを行った。手短に言えば、ウェルあたり２００，０００個の脾細胞をプレーティングし、ペプチド（９アミノ酸が重複する１５アミノ酸長のペプチド）の存在下で２４時間刺激した。ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ培地中の５μｇ／ｍＬの各ペプチドで細胞を刺激した。製造者の指示書に従ってスポットを発色させ、定量化した。培地単独及びコンカナバリンＡ刺激した細胞を、それぞれ陰性対照及び陽性対照として使用した。ペプチド刺激したウェルから培地単独ウェルを引くことによって、１００万細胞あたりのスポット形成単位（ＳＦＵ）を計算した。スポットは、ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ ＣＴＬリーダーを使用して読み取った。
細胞内サイトカイン染色及びフローサイトメトリー
脾細胞またはＴＩＬを、タンパク質輸送阻害剤カクテル（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）とともにネイティブマウスＦＡＰペプチドで５時間刺激した。細胞刺激カクテル（＋タンパク質輸送阻害剤）及び完全培地（Ｒ１０）をそれぞれ陽性対照及び陰性対照として使用した。刺激中、ＦＩＴＣα−マウスＣＤ１０７ａ（クローン１Ｄ４Ｂ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）とともに細胞をインキュベートして、脱顆粒を検出した。刺激後、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤバイオレットとともに細胞をインキュベートして、生存率を検出した。次いで、表面染色剤とともに細胞を室温で３０分間インキュベートした。次いで、ＦｏｘＰ３／転写因子固定／透過処理キット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して、細胞を固定し、透過処理した。次いで、細胞を細胞内染色剤中で４℃で１時間インキュベートした。使用する抗体のリストは補足方法に含まれる。すべての試料を１４または１８色ＬＳＲＩＩフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）にかけて、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して解析した。
フローサイトメトリー染色抗体
以下の抗体を本研究で使用した：ＰＥＣｙ５ αＣＤ３（クローン１４５−２Ｃ１１、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＢＶ５１０ αＣＤ４＋（クローンＲＭ４−５、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＢＶ６０５ αＴＮＦα（クローンＭＰ６−ＸＴ２２）、ＰＥ αＴ−ｂｅｔ（クローン４Ｂ１０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＡＰＣ αＦｏｘＰ３（クローンＦＪＫ−１６ｓ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＡＰＣＣｙ７ αＣＤ８＋（クローン５３−６．７、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＡＦ７００ αＣＤ４４（クローンＩＭ７、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＡＰＣ αＩＦＮγ（クローンＸＭＧ１．２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＢＶ５１０ αＣＤ１１ｂ（Ｍ１／７０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＢＶ６０５ αＣＤ１１ｃ（Ｎ４１８、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＰＥ／Ｃｙ７ αＣＤ６８（ＦＡ−１１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＡＦ７００ αＣＤ８６（ＧＬ−１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＰＥ αＡｒｇ１（ＩＣ５８６８Ｐ、Ｒ＆Ｄ）、ＰＥ／Ｃｙ７ αＣＤ８６（ＧＬ−１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＰＥ／Ｃｙ７ αＣＤ８３（Ｍｉｃｈｅｌ−１９、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＢＶ６５０ αＣＤ８０（１６−１０Ａ１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＡＰＣ αＦ４／８０（ＢＭ８、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＡＦ７００ αＦ４／８０（ＢＭ８、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＰＥ αＢ２２０（ＲＡ３−６Ｂ２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＦＩＴＣ αＣＤ４５（３０−Ｆ１１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＢＶ５１０ αＮＫ１．１（ＰＫ１３６、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＡＰＣ／Ｃｙ７ αＭＨＣＩＩ（Ｍ５／１１４．１５．２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、及びＰＥ／Ｃｙ７ αＣＤ２５（ＰＣ６１．５、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）。
ウエスタンブロット
細胞可溶化物を４〜１２％のＢｉｓ−Ｔｒｉｓ ＮｕＰＡＧＥゲル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で流し、続いて、ＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）にトランスファーした。この膜をＯｄｙｓｓｅｙブロッキングバッファーで室温で１時間ブロッキングし、一次抗体（抗ＦＡＰ ＡＢＴ１１、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、１：１０００、または抗アクチンＡＣ−１、Ｓｉｇｍａ、１：１０，０００）とともに４℃で一晩インキュベートした。膜を０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０のＰＢＳで洗浄し、１：１０，０００希釈の二次抗体のＩＲＤｙｅ６８０ＲＤヤギ抗マウス及びＩＲＤｙｅ８００ＣＷヤギ抗ウサギ（ＬｉＣｏｒ）とともにインキュベートした。膜を発色させて、ＬｉＣｏｒ Ｏｄｙｓｓｅｙ ＣＬｘイメージングシステムを使用して解析した。
ＥＬＩＳＡ
酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によって抗体応答を測定するために、屠殺する前のマウスから血清を収集した。Ｍａｘｉｓｏｒｐ９６ウェルプレートを、１μｇ／ｍＬのマウスＦＡＰタンパク質（セパラーゼ組換えタンパク質、ＭｙＢｉｏｓｏｕｒｃｅ、２６〜７６１アミノ酸断片）のＰＢＳで、４℃で一晩コーティングした。このプレートを１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）のＰＢＳで室温で１時間ブロッキングした。すべての洗浄は、０．２％Ｔｗｅｅｎ−２０のＰＢＳ（ＰＢＳＴ）中で行った。終点結合力価については、１％ＦＣＳのＰＢＳＴ中で１：５０希釈の血清を使用し、続いて、希釈曲線のために４−４希釈した。抗マウスＩｇＧ ＨＲＰ（１：５０００）を二次抗体として室温で１時間使用した。Ｓｉｇｍａ Ｆａｓｔ ＯＰＤ錠剤を使用して、プレートを室温で１０分間発色させた。１Ｍ Ｈ２ＳＯ４を使用して発色を止めた。マイクロプレートリーダーを使用して、４５０ｎｍの吸光度を読み取った。
免疫蛍光／免疫組織化学染色
免疫蛍光または免疫組織化学染色については、組織をドライアイス上でＯ．Ｃ．Ｔ．（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ）中で包埋し、凍結し、−８０℃で保存したか、１０％中性緩衝ホルマリン中で固定し、続いて、パラフィン包埋した。ヒアルロナン染色については、凍結した組織をＰｅｒｍａＦｒｏｓｔスライド上に切片化し、次いで、３．７％パラホルムアルデヒド−ＰＢＳ、７０％エタノール、５％氷酢酸の混合液中で、室温で１５分間固定した。次いで、スライドをＰＢＳ中ですすぎ、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のＰＢＳで室温で３０分間ブロッキングした。ビオチン化ヒアルロナン結合タンパク質（ＨＡＢＰ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を、１：１０００の希釈で、ブロッキング剤に４℃で一晩加えた。スライドをＰＢＳ中で洗浄し、次いで、ストレプトアビジンＡＦ４８８コンジュゲートを、１：５００で、ブロッキング溶液中に、暗所において室温で１時間加えた。スライドをＰＢＳで洗浄し、ＤＡＰＩを含むＰｒｏＬｏｎｇ Ｇｏｌｄ Ａｎｔｉｆａｄｅでマウントした。Ｆ４／８０及びＣＤ８＋染色については、凍結した切片を４％パラホルムアルデヒド−ＰＢＳ中で室温で１５分間固定した。スライドをＰＢＳ中ですすぎ、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で室温で１５分間透過処理した。次いで、スライドを２．５％ＢＳＡ及び５％ヤギ血清のＰＢＳで１時間ブロッキングし、次いで、アビジン／ビオチンブロッキングキット（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ）でブロッキングした。一次Ｆ４／８０（Ｆ４／８０−ビオチン、ＢＭ８ １：２０００）及びＣＤ８＋α（ＣＤ８＋α−ビオチン、５３−６．７、１：２０００）抗体をブロッキングバッファー中で４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳで洗浄後、シグナルの増幅のために、スライドをＴＳＡ−ビオチン（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）とともに室温で８分間インキュベートし、次いで、ストレプトアビジンＡＦ４８８（１：５００）とともに室温で３０分間インキュベートした。続いて、スライドを洗浄し、ＤＡＰＩを含むＰｒｏＬｏｎｇ Ｇｏｌｄ Ａｎｔｉｆａｄｅでマウントした。ＦＡＰ染色については、パラフィン包埋した組織をＰｅｒｍａＦｒｏｓｔスライド上に切片化した。切片を脱パラフィンし、再水和し、一次抗体（ＦＡＰ−ビオチン、Ｒ＆Ｄ ＢＡＦ３７１５、１：４０）とともに４℃で一晩インキュベートした。次いで、スライドを二次抗体（ストレプトアビジン−ＨＲＰ、１：１０００）とともに室温で１時間インキュベートし、ヘマトキシリンで対比染色した。パラフィン包埋した組織の染色は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ Ｃａｎｃｅｒ Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｅによって行われた。
Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ共焦点顕微鏡（免疫蛍光画像、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｃｏｒｅ）または明視野画像用のＮｉｋｏｎ８０ｉ正立顕微鏡のいずれかを使用して、すべてのスライドを画像化した。定量化のために、腫瘍試料あたり少なくとも５つの画像を得た。Ｆｉｊｉ／ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して、画像解析を行った。
統計解析
動物実験については、エラーバーは、平均±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。２つを超える実験群を有する実験については、一元または二元配置ＡＮＯＶＡ、続いてチューキーの事後ＨＳＤ検定によって、統計的有意性を決定した。２つの群しか有さない動物実験については、スチューデントの両側ｔ検定を使用して有意性を決定した。マウスの腫瘍生存研究については、ゲーハン−ブレスロウ−ウィルコクソン検定によって、有意性を決定した。
結果を次に記載する
マイクロコンセンサス（μＣｏｎ）ＦＡＰ ＤＮＡワクチンの設計及びインビトロ発現
ＦＡＰは、大きな細胞外ドメイン及び小さな細胞質尾部及び膜貫通ドメインを有する膜結合酵素である。ワクチン設計については、タンパク質産生の効率のために、及び分泌を促進するために、Ｎ末端で免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）リーダー配列に融合したＦＡＰの細胞外ドメイン（アミノ酸２６〜７６１）のみを含むプラスミドを構築した（図１Ｂ）。ネイティブマウスＦＡＰ（ｍＦＡＰ）配列に対する寛容性の破壊を促進するために、いくらかの配列多様性を提供するが、構造を保存する、ＮＣＢＩデータベース中の様々な近縁種からの配列アラインメントを使用して、マイクロコンセンサス（μＣｏｎ）配列を設計した。このμＣｏｎ配列は、ネイティブタンパク質配列に対して９５．１％の相同性を有する（図１Ａ）。さらに、最適化コンセンサスＦＡＰは、可溶性ＦＡＰ酵素のジペプチジルペプチダーゼ活性とゼラチン分解活性の両方をブロックするために、触媒ドメインにＳ６２４Ａ置換を含む（図１Ｂ及び図１Ｃ）。同様に、比較目的でｍＦＡＰプラスミドを生成し、これは、ｍＦＡＰ配列に対して１００％の相同性を有し、他の点では、ＩｇＥリーダー配列の付加及びＲＮＡ／コドン最適化を含めて、同じ配列最適化を含む。ネイティブＦＡＰプラスミドとμＣｏｎＦＡＰプラスミドの両方の発現を、トランスフェクトされた２９３Ｔ細胞の可溶化液において、インビトロで検出した（図１Ｄ）。
Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおけるμＣｏｎ ＦＡＰ ＤＮＡワクチンの免疫原性
マウスにおいて、μＣｏｎ ＦＡＰ ＤＮＡワクチンが免疫原性であり、寛容性を破壊することができたかどうかを決定するために、ＥＰを用いる筋肉内注入によって、様々な用量のμＣｏｎ ＦＡＰ ＤＮＡワクチン（５μｇ、１０μｇ、２５μｇ及び５０μｇ）でＣ５７Ｂｌ／６マウスを免疫化した（図２Ａ）。２週間隔で３回マウスを免疫化し、最終的な免疫化から１週後に、解析のために脾細胞を回収した（図２Ａ）。ワクチン配列に正確に一致したペプチド（μＣｏｎペプチド）またはｍＦＡＰ配列に一致したペプチド（ネイティブペプチド）を使用してインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）のＥＬＩＳｐｏｔを行った。Ｃ５７Ｂｌ／６マウスは、ネイティブＦＡＰ及びμＣｏｎ ＦＡＰペプチドの両方に対して強いＩＦＮ−γ ＥＬＩＳｐｏｔを生成し、これは、μＣｏｎ ＦＡＰワクチンが、マウスにおいて寛容性を破壊することができることを示す（図２Ｂ及び図２Ｃ）。μＣｏｎペプチドに対してワクチンの用量依存的効果があったが、ネイティブペプチドに対する用量依存は、１０μｇ用量で最大応答に達した（図２Ｂ及び図２Ｃ）。したがって、残りの実験については１０μｇ用量を使用し、（マウスＦＡＰと１００％一致する）ｍＦＡＰペプチドに対する応答のみを示す。
ネイティブＦＡＰペプチドに対して生じるＣＤ８＋及びＣＤ４＋サイトカイン応答をさらに評価するために、刺激した脾細胞に対して細胞内サイトカイン染色を行った（図２Ｄ及び図２Ｅ）。未処置の対照マウスと比較して、μＣｏｎ ＦＡＰで免疫化されたマウスのＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−α産生の有意な増大が観察された（図２Ｄ）。次に、μＣｏｎ ＦＡＰワクチンによってもたらされるＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞溶解能力を、脱顆粒マーカーＣＤ１０７ａ及び転写因子Ｔ−ｂｅｔ（これは、活性化Ｔ細胞で発現している）を使用して評価した（図２Ｄ）。未処置の対照マウスと比べて、μＣｏｎ ＦＡＰワクチン接種マウスにおいて、ＩＦＮ−γ、ＣＤ１０７ａ及びＴ−ｂｅｔに同時に陽性であったＣＤ８＋Ｔ細胞の有意な増大が見られ、これは、このワクチンが細胞溶解性死滅能力を有するエフェクターＴ細胞の産生を誘導することを示す（図２Ｄ）。未処置の対照マウスと比較して、μＣｏｎ ＦＡＰで免疫化されたマウスにおいて、ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＴＮＦ−α産生の有意な増大も観察された（図２Ｅ）。ＣＤ４＋Ｔ細胞においてＩＦＮ−γ産生の増加傾向もあったが、この傾向は、統計学的に有意ではなかった（図２Ｅ）。
マイクロコンセンサスＤＮＡワクチン設計は、遺伝的に多様なマウス集団において、寛容性の破壊及びＣＤ８＋Ｔ細胞応答の発生がネイティブＦＡＰ ＤＮＡより優れている
非近交系マウス（ＣＤ−１ ＩＣＲ「スイス」マウス）においてμＣｏｎ ＦＡＰ ＤＮＡワクチンが免疫応答を発生させる能力を、ｍＦＡＰ ＤＮＡワクチンと比較して評価した（図３）。これらの遺伝的に多様なマウスは、ヒトなどの非近交系集団に対する外挿のためのより適切な寛容性モデルにおける免疫効力の重要な指標として使用した。図２Ａのスケジュールに従って、１０μｇのｍＦＡＰ ＤＮＡワクチンまたはμＣｏｎ ＦＡＰ ＤＮＡワクチンでマウスを免疫化し、ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳｐｏｔによって免疫応答を評価した（図３Ａ）。これらのマウスの非近交系の性質が原因で、マウス間で変動性が観察されたが、ネイティブＦＡＰで免疫化された群と比較して、μＣｏｎ ＦＡＰで免疫化された群について、全体的な免疫応答は高かった（図３Ａ及び図３Ｂ）。全体的に見て、ネイティブＦＡＰ群の９／１５マウスと比較して、μＣｏｎ ＦＡＰ群の１４／１５マウスが、１００ＳＦＵ／１００万脾細胞を超える免疫応答を発生させた（図３Ａ）。非近交系マウスで観察された応答（平均４０７ＳＦＵ）は、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおいて観察されたもの（平均１９５ＳＦＵ）よりも多様であり、高かった（図２Ｂ、図３Ｂ）。
抗体応答も、ＥＬＩＳＡによって、細胞外ドメイン（アミノ酸２６〜７６１）に対応するｍＦＡＰタンパク質を使用して、これらのマウスにおいて評価した（図３Ｃ）。興味深いことに、ネイティブＦＡＰワクチンまたはμＣｏｎ ＦＡＰワクチンのいずれかで免疫化されたマウスの大部分は、強い抗体応答を発生させた（図３Ｃ）。抗体応答を発生させた、μＣｏｎ ＦＡＰ群のマウスのパーセンテージは、ネイティブＦＡＰ群と比較して高かった（９／１５マウスと比較して１１／１５マウス）。しかし、差異は統計学的に有意でなかった。
Ｃ５７Ｂｌ／６及びＢａｌｂ／ｃマウスにおける、ネイティブＦＡＰ ＤＮＡワクチンとのマイクロコンセンサスＦＡＰ ＤＮＡワクチンの比較
次に、一般に使用されているマウス系統Ｃ５７Ｂｌ／６及びＢａｌｂ／ｃマウスにおいて、μＣｏｎ ＦＡＰワクチンから発生される免疫応答の差異をネイティブＦＡＰワクチンと比較した。同じ免疫化スケジュール及びワクチン用量を用いて、これらのマウスにおいて同じ比較を行った（図４Ａ、５Ａ）。
Ｔｈ２応答よりも良いＴｈ１応答を発生する傾向があるＣ５７Ｂｌ／６系統では、μＣｏｎ ＦＡＰワクチンが、ネイティブＦＡＰワクチンと比較して、同様のＩＦＮ−γ ＥＬＩＳｐｏｔ応答を発生させることが見出された（図４Ｂ）。これらのマウスは、ネイティブＦＡＰワクチンとμＣｏｎ ＦＡＰワクチンの両方に対して、同様のＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α及びＩＦＮ−γ／Ｔ−ｂｅｔ／ＣＤ１０７ａ三重陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を発生した（図４Ｃ）。しかし、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスは、ネイティブワクチンと比較して、μＣｏｎワクチンに対して向上したＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αＣＤ４＋Ｔ細胞応答を発生した（図４Ｄ）。Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおいて、μＣｏｎ ＦＡＰワクチンは、ネイティブＦＡＰワクチンと比較して、抗体応答を向上させなかった（図４Ｅ）。実際に、ネイティブＦＡＰは、より良い抗体応答への傾向を示したが、この傾向は統計学的に有意でなかった。
Ｔｈ１応答よりも良いＴｈ２応答を発生する傾向があるＢａｌｂ／ｃ系統では、μＣｏｎ ＦＡＰワクチンは、ネイティブＦＡＰワクチンと比較して、優れたＩＦＮ−γ ＥＬＩＳｐｏｔ応答を発生させた（図５Ｂ）。Ｂａｌｂ／ｃマウスは、ＣＤ８＋細胞とＣＤ４＋Ｔ細胞の両方において、より良いＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−α応答を発生した（しかし、これは、ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＩＦＮ−γ産生について統計学的に有意であるだけであった）（図５Ｃ及び図５Ｄ）。さらに、Ｂａｌｂ／ｃマウスは、μＣｏｎ ＦＡＰ ＤＮＡワクチンによる免疫化の際に、ネイティブＦＡＰ ＤＮＡワクチンと比較して、より強いＩＦＮ−γ／Ｔ−ｂｅｔ／ＣＤ１０７ａ三重陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞を発生した（図５Ｃ）。際だったことに、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおいて、ネイティブＦＡＰワクチンはいかなる検出可能な抗体価も発生させなかったが、μＣｏｎ ＦＡＰワクチンは、４／５マウスにおいて強い抗体レベルを発生させた（図５Ｅ）。
これらの結果は、一般に使用されているマウス系統は免疫ベースの研究の結果を歪める可能性があること、及び遺伝的に多様な集団の使用は免疫療法の臨床応用に重要であろうことを示す。全体的に見て、μＣｏｎワクチンは、より免疫寛容性があるＢａｌｂ／ｃモデルと免疫応答性のＣ５７Ｂｌ／６モデルの両方において、ネイティブＦＡＰワクチンと比較して、ネイティブＦＡＰ抗原に対する寛容性を破壊するといういくらかのいくらかの免疫態様の改善を示した。
マイクロコンセンサスＦＡＰ ＤＮＡワクチンは、複数の腫瘍モデルにおいて、腫瘍抗原ＤＮＡワクチンと相乗的に作用する
μＣｏｎ ＦＡＰ ＤＮＡワクチンに対するネイティブ抗原に対して、強いＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−α免疫応答が頻度を増して発生することを確証した後、腫瘍チャレンジモデルにおいて、腫瘍関連抗原ワクチンと併用して、μＣｏｎ ＦＡＰの治療効果を評価した。腫瘍抗原ＰＳＭＡまたはＴＥＲＴを標的にする以前に研究された２つのワクチンを用いて、併用療法を試験した（図６、図７）（Ｙａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ，１：１７９−１８９、Ｆｅｒｒａｒｏ ｅｔ ａｌ．，２０１１，７ Ｓｕｐｐｌ：１２０−７）。雌のＣ５７Ｂｌ／６マウスに肺腫瘍細胞株ＴＣ−１を移植し（図６Ａ）、腫瘍移植してから７日目に免疫化を開始した。同じ脚に注入した、μＣｏｎ ＦＡＰ ＤＮＡワクチン単独、ｍＴＥＲＴ（マウスＴＥＲＴ）ワクチン単独またはμＣｏｎ ＦＡＰとｍＴＥＲＴ腫瘍抗原ワクチンの組み合わせのいずれかで、マウスを免疫化した。合計で４回の免疫化について週１回マウスを免疫化した。ＴＣ−１腫瘍モデルについては、ＦＡＰとｍＴＥＲＴの組み合わせは、いずれのワクチン単独と比較しても、最も強い抗腫瘍活性及びマウスの生存の改善をもたらした（図６Ｂ及び図６Ｃ）。異なる腫瘍モデルでこれらの結果を検証するために、ＴＲＡＭＰＣ２前立腺腫瘍モデルにおいて、ＰＳＭＡワクチンと組み合わせてμＣｏｎ ＦＡＰワクチンを使用して、同様の実験を行った（図７）。雄のＣ５７Ｂｌ／６マウスにＴＲＡＭＰＣ２腫瘍細胞を移植し、腫瘍移植から４日目に免疫化を開始した（図７Ａ）。ＴＲＡＭＰＣ２腫瘍モデルについては、μＣｏｎ ＦＡＰ ＤＮＡワクチン単独は、腫瘍増殖に対する影響がなかったが、ＰＳＭＡワクチン単独は腫瘍体積を減少させた（図７Ｂ）。しかし、ＰＳＭＡとＦＡＰの組み合わせは、ＰＳＭＡワクチン単独よりも、腫瘍体積を減少させ、腫瘍の生存を向上させ、これは、２つのワクチン間の相乗作用を示す（図７Ｂ、図７Ｃ）。
ＦＡＰを発現しない２つの細胞株であるＴＣ−１とＴＲＡＭＰ−Ｃ２細胞株の両方においてＦＡＰの発現を探ることによって、μＣｏｎ ＦＡＰワクチンは、がん関連線維芽細胞のみを標的にするであろうことが確認された（図８）。
マイクロコンセンサスＦＡＰ ＤＮＡワクチンはＦＡＰ特異的腫瘍浸潤リンパ球を誘導する
免疫は、全身的に及びＦＡＰで免疫化された腫瘍担持マウスの腫瘍において応答する。マウスにＴＣ−１腫瘍を移植し、腫瘍移植から７日後に免疫化を開始した（図９Ａ）。１週間隔で２回マウスを免疫化し、次いで、最終的な免疫化から１週後（２１日目）にマウスを屠殺した。これらのマウス由来の脾細胞及び腫瘍浸潤リンパ球の両方で、抗原特異的免疫応答を評価した。より短い期間にわたって、より少ない免疫化をマウスに与えたのにもかかわらず、マウスは優れたＣＤ８＋ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−α産生、ならびにＣＤ１０７ａとＩＦＮ−γの強い共発現を示した（図９Ｂ）。さらに、腫瘍中のＣＤ８＋Ｔ細胞においてＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α及びＩＦＮ−γ／ＣＤ１０７ａ共産生の有意な増大を伴って、腫瘍浸潤リンパ球において強いＦＡＰ特異的Ｔ細胞応答も観察された（図９Ｃ）。さらに、ＣＤ８＋Ｔ細胞と調節性Ｔ細胞（ＣＤ３＋／ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋／ＦｏｘＰ３＋細胞）の相対的な比率を調べると、ＦＡＰ免疫化の際に、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増加及びＴｒｅｇｓの減少が観察された（図９Ｄ）。
ＦＡＰワクチン単独、ｍＴＥＲＴワクチン単独または併用療法で処置を受けているＴＣ−１腫瘍担持マウスにおいて、免疫応答を比較した（図１０Ａ〜図１０Ｄ）。予想通り、ＦＡＰワクチン単独またはｍＴＥＲＴワクチン単独を受けているマウスは、それぞれ、ＦＡＰペプチドまたはｍＴＥＲＴペプチドに対して、脾臓と腫瘍の両方において強いＣＤ８＋ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−α応答を誘導する（図１０Ａ〜図１０Ｄ）。興味深いことに、同時にｍＴＥＲＴとＦＡＰの併用療法を受けているマウスでは、各ワクチン単独を受けているマウスと比較して応答が少なくなり、これは、抗原干渉を示唆する（図１０Ａ〜図１０Ｄ）。この抗原干渉にもかかわらず、各ワクチン単独と比較して、併用療法群において抗腫瘍応答の改善が依然としてあり、これは、線維芽細胞及び腫瘍細胞の二重標的化が、がん免疫療法にとって重要なストラテジーであることを示唆する。
合成コンセンサスＦＡＰ ＤＮＡワクチンは、ＴＣ−１腫瘍の免疫微小環境を変化させ、腫瘍において、ＣＤ８＋Ｔ細胞の比率を増大させ、マクロファージの比率を低下させる
他の研究によって、ベクターベースのワクチン、細胞ベースのワクチンまたはＤＮＡワクチンによる免疫化の際の免疫微小環境の変化が報告された（Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｅｒｔｌ，２０１６，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ，７：２３２８２−９９、Ｘｉａ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ，６５：６１３−６２４、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｓｃｉ Ｒｅｐ，５：１４４２１）。したがって、免疫組織化学的アプローチとフローサイトメトリーの両方を使用して、μＣｏｎ ＦＡＰによる免疫化の際に、ＴＣ−１腫瘍の腫瘍微小環境を評価した（図１１、図１２）。μＣｏｎ ＦＡＰ ＤＮＡによるワクチン接種の際に、ＦＡＰ発現細胞によってカバーされる腫瘍切片の領域及び線維芽細胞と腫瘍細胞の両方によって分泌される細胞外基質グリコサミノグリカンであるヒアルロナンの量の低下が観察された（図１１Ａ〜図１１Ｄ）。ＦＡＰワクチン接種の際に、Ｆ４／８０＋マクロファージ浸潤の低下及びＣＤ８＋Ｔ細胞浸潤の増加も観察された（図１１Ｅ〜図１１Ｈ）。フローサイトメトリーによって、ＦＡＰワクチン接種の際に、腫瘍あたりのＦ４／８０＋／ＣＤ１１ｂ＋マクロファージの頻度の低下も観察されたが、ＦＡＰワクチン接種の際に、Ｂ細胞、ＮＫ細胞または樹状細胞の頻度は変化しないことが観察された（図１２Ａ〜図１２Ｄ）。ＦＡＰワクチン接種の際のＭ１極性マクロファージとＭ２極性マクロファージの相対的な比率を区別するために、Ａｒｇ１、ＭＨＣＩＩ、ＣＤ６８、ＣＤ８０及びＣＤ８６の発現の検査を含めて、腫瘍浸潤マクロファージに対して表面マーカーの発現を調べた。これらの浸潤マクロファージに対してマーカー発現の差異は観察されず、これは、μＣｏｎ ＦＡＰワクチンによるワクチン接種の際に、マクロファージ極性化の歪みがないことを示唆する（図１３Ａ〜図１３Ｅ）。
実施例２：ＦＡＰの免疫原性断片
マウス系統がネイティブＦＡＰペプチドに対して有していた応答を特徴づけるために、及び優性エピトープ決定するために、最適化コンセンサスＦＡＰについて、ＦＡＰの様々なエピトープを代表する１２２種のペプチドを生成した（図１４Ａ）。各プールで細胞を刺激した場合、多種多様な応答があり（図１４Ｂ及び図１４Ｃ）、これは、１つの優性エピトープではなく、むしろ複数の亜優性エピトープが存在するという結論をもたらした（図１５）。亜優性エピトープのいくつか（例えば、配列番号２２、配列番号２３及び配列番号２４）は、ネイティブＦＡＰに対して、最適化コンセンサスＦＡＰ中に突然変異を含む（図１５）。
実施例３：配列情報
前述の詳細な説明及び添付の実施例は例示にすぎず、本発明の範囲に対する限定として解釈されるべきでなく、本発明の範囲は、添付の請求項及びそれらの均等物によってのみ定義されることが理解されよう。
開示される実施形態に対する様々な変更及び修正は当業者には明白である。限定されないが、本発明の化学構造、置換基、誘導体、中間体、合成物、組成物、製剤、または使用方法に関するものを含めた、そのような変更及び修正を、それらの趣旨及び範囲を逸脱することなく行うことができる。

Claims (27)

  1. 核酸分子を含む免疫原性組成物であって、前記核酸分子が、
    ａ）配列番号２及び配列番号６からなる群から選択されるアミノ酸配列の全長にわたって、少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列、
    ｂ）配列番号２及び配列番号６からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも６０％にわたって、少なくとも約９０％の同一性を含む免疫原性断片、
    ｃ）配列番号２及び配列番号６からなる群から選択されるアミノ酸配列、及び
    ｄ）配列番号２及び配列番号６からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも６０％を含む免疫原性断片
    からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドをコードする、前記免疫原性組成物。
  2. 前記核酸分子がＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子からなる群から選択される、請求項１に記載の免疫原性組成物。
  3. 前記核酸分子が、
    ａ）配列番号１及び配列番号５からなる群から選択されるヌクレオチド配列の全長にわたって、少なくとも約９０％の同一性を有するヌクレオチド配列、
    ｂ）配列番号１及び配列番号５からなる群から選択される前記ヌクレオチド配列の少なくとも６０％にわたって、少なくとも約９０％の同一性を有するヌクレオチド配列の免疫原性断片、
    ｃ）配列番号１及び配列番号５からなる群から選択されるヌクレオチド配列、ならびに
    ｄ）配列番号１及び配列番号５からなる群から選択されるヌクレオチド配列の免疫原性断片
    からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。
  4. 前記ペプチドをコードするヌクレオチド配列が、開始コドン、ＩｇＥリーダー配列及び終止コドンからなる群から選択される少なくとも１つの制御配列に作動可能に連結している、請求項１に記載の免疫原性組成物。
  5. 前記核酸分子が、
    ａ）配列番号４及び配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列の全長にわたって、少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列、
    ｂ）配列番号４及び配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも６０％にわたって、少なくとも約９０％の同一性を含む免疫原性断片、
    ｃ）配列番号４及び配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列、ならびに
    ｄ）配列番号４及び配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも６０％を含む免疫原性断片
    からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドをコードする、請求項４に記載の免疫原性組成物。
  6. 前記核酸分子が、
    ａ）配列番号３及び配列番号７からなる群から選択されるヌクレオチド配列の全長にわたって、少なくとも約９０％の同一性を有するヌクレオチド配列、
    ｂ）配列番号３及び配列番号７からなる群から選択される前記ヌクレオチド配列の少なくとも６０％にわたって、少なくとも約９０％の同一性を有するヌクレオチド配列の免疫原性断片、
    ｃ）配列番号３及び配列番号７からなる群から選択されるヌクレオチド配列、ならびに
    ｄ）配列番号３及び配列番号７からなる群から選択されるヌクレオチド配列の免疫原性断片
    からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項５に記載の免疫原性組成物。
  7. 前記核酸分子が発現ベクターを含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。
  8. 前記核酸分子がウイルス粒子中に組み込まれている、請求項１に記載の免疫原性組成物。
  9. 医薬的に許容可能な賦形剤をさらに含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。
  10. アジュバントをさらに含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。
  11. ａ）配列番号２及び配列番号６からなる群から選択されるアミノ酸配列の全長にわたって、少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列、
    ｂ）配列番号２及び配列番号６からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも６０％にわたって、少なくとも約９０％の同一性を含む断片、
    ｃ）配列番号２及び配列番号６からなる群から選択されるアミノ酸配列、ならびに
    ｄ）配列番号２及び配列番号６からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも６０％を含む断片
    からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドをコードする核酸分子。
  12. 前記核酸分子がＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子からなる群から選択される、請求項１１に記載の核酸分子。
  13. 前記核酸分子が、
    ａ）配列番号１及び配列番号５からなる群から選択されるヌクレオチド配列の全長にわたって、少なくとも約９０％の同一性を有するヌクレオチド配列、
    ｂ）配列番号１及び配列番号５からなる群から選択される前記ヌクレオチド配列の少なくとも６０％にわたって、少なくとも約９０％の同一性を有するヌクレオチド配列の断片、
    ｃ）配列番号１及び配列番号５からなる群から選択されるヌクレオチド配列、ならびに
    ｄ）配列番号１及び配列番号５からなる群から選択されるヌクレオチド配列の断片
    からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１１に記載の核酸分子。
  14. 前記コードされるペプチドが、開始コドン、ＩｇＥリーダー配列及び終止コドンからなる群から選択される少なくとも１つの制御配列に作動可能に連結している、請求項１１に記載の核酸分子。
  15. 前記核酸分子が、
    ａ）配列番号４及び配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列の全長にわたって、少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列、
    ｂ）配列番号４及び配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも６０％にわたって、少なくとも約９０％の同一性を含む断片、
    ｃ）配列番号４及び配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列、ならびに
    ｄ）配列番号４及び配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも６０％を含む断片
    からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドをコードする、請求項１４に記載の核酸分子。
  16. 前記核酸分子が、
    ａ）配列番号３及び配列番号７からなる群から選択されるヌクレオチド配列の全長にわたって、少なくとも約９０％の同一性を有するヌクレオチド配列、
    ｂ）配列番号３及び配列番号７からなる群から選択される前記ヌクレオチド配列の少なくとも６０％にわたって、少なくとも約９０％の同一性を有するヌクレオチド配列の断片、
    ｃ）配列番号３及び配列番号７からなる群から選択されるヌクレオチド配列、ならびに
    ｄ）配列番号３及び配列番号７からなる群から選択されるヌクレオチド配列の断片
    からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１５に記載の核酸分子。
  17. 前記核酸分子が発現ベクターを含む、請求項１１に記載の核酸分子。
  18. 前記核酸分子がウイルス粒子を含む、請求項１１に記載の核酸分子。
  19. ペプチドを含む免疫原性組成物であって、前記ペプチドが、
    ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６及び配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列の全長にわたって、少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列、
    ｂ）配列番号２、配列番号４、配列番号６及び配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも６０％にわたって、少なくとも約９０％の同一性を含む免疫原性断片、
    ｃ）配列番号２、配列番号４、配列番号６及び配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列、ならびに
    ｄ）配列番号２、配列番号４、配列番号６及び配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも６０％を含む免疫原性断片
    からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、前記免疫原性組成物。
  20. ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６及び配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列の全長にわたって、少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列、
    ｂ）配列番号２、配列番号４、配列番号６及び配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも６０％にわたって、少なくとも約９０％の同一性を含む免疫原性断片、
    ｃ）配列番号２、配列番号４、配列番号６及び配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列、ならびに
    ｄ）配列番号２、配列番号４、配列番号６及び配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも６０％を含む免疫原性断片
    からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチド。
  21. 請求項１に記載の免疫原性組成物を対象に投与することを含む、それらを必要とする前記対象において線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に対して免疫応答を誘導する方法。
  22. 投与が電気穿孔及び注入の少なくとも１つを含む、請求項２１に記載の方法。
  23. 請求項１に記載の免疫原性組成物を対象に投与することを含む、それらを必要とする前記対象において腫瘍関連病態を治療または予防する方法。
  24. 投与が電気穿孔及び注入の少なくとも１つを含む、請求項２３に記載の方法。
  25. 前記腫瘍関連病態が腫瘍増殖、腫瘍転移及び血管新生の少なくとも１つである、請求項２３に記載の方法。
  26. 前記対象ががんと診断されている、請求項２３に記載の方法。
  27. １種または複数のがん抗原を前記対象に投与することをさらに含む、請求項２３に記載の方法。
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3038889A1 (en) * 2016-09-30 2018-04-05 Jian Yan Tert immunogenic compositions and methods of treatment using the same
CN111118063B (zh) * 2019-12-05 2023-04-18 吉林大学 以FAPα和survivin为基础的DNA及其在制备肿瘤疫苗中的应用
CN112402597B (zh) * 2020-11-26 2022-04-01 四川大学 一种fap修饰的类外泌体纳米囊泡肿瘤疫苗

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6472375B1 (en) * 1998-04-16 2002-10-29 John Wayne Cancer Institute DNA vaccine and methods for its use
WO2007149518A2 (en) * 2006-06-21 2007-12-27 The Scripps Research Institute Dna composition against tumor stromal antigen fap and methods of use thereof
CN102573922B (zh) * 2009-08-17 2015-08-05 罗切格利卡特公司 靶向性免疫缀合物
US9238679B2 (en) * 2011-02-11 2016-01-19 The Trustees Of The University Of Pennslyvania Nucleic acid molecule encoding hepatitis B virus core protein and surface antigen protein and vaccine comprising the same
WO2013151667A1 (en) * 2012-04-02 2013-10-10 modeRNA Therapeutics Modified polynucleotides
US9303079B2 (en) * 2012-04-02 2016-04-05 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
US9402888B2 (en) * 2013-03-14 2016-08-02 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Methods and compositions for treating cancer
CA3038889A1 (en) * 2016-09-30 2018-04-05 Jian Yan Tert immunogenic compositions and methods of treatment using the same

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