KR20190092371A - 섬유아세포 활성화 단백질을 표적화하는 최적화된 합성 컨센서스 면역원성 조성물 - Google Patents

Abstract

합성 컨센서스 FAP 항원을 포함하는 면역원성 조성물이 본원에 제공된다. 이를 필요로 하는 대상체에게 면역원성 조성물을 투여함으로써 상기 대상체에서 종양 관련 병리학을 치료하거나 예방하는 방법도 또한 본원에 개시된다.

Description

섬유아세포 활성화 단백질을 표적화하는 최적화된 합성 컨센서스 면역원성 조성물

관련 출원에 대한 교차 참조

본원은 다음에 대한 우선권을 갖는다: 미국 가출원 제62/397,469호(2016년 9월 21일 출원됨), 이는 본원에 그 전체가 참고로 도입된다.

연방 지원 연구 또는 개발에 관한 진술

본 발명은 국립 보건원에 의해 수여된 허가 번호 P50 CA174523, U19 AI109646 및 F32 CA213795 및 미국에 의해 수여된 허가 번호 W31P4Q-15-1-0003하에 정부 지원으로 수행되었다. 국방부. 정부는 본 발명에 대해 특정 권리를 갖는다.

기술 분야

본 발명은 섬유아세포 활성 단백질을 표적화하는 면역원성 조성물, 및 면역원성 조성물을 투여하는 방법에 관한 것이다.

고형 종양 병리생리학은 종양 진행을 안내하고 암 요법의 효능에 대한 장벽을 부과하는 비정상적인 미세환경을 특징으로 한다. 섬유아세포 활성화 단백질 (FAP)을 포함하여 몇 개의 단백질이 종양 미세환경에서 과발현된다. FAP는 인간 암종의 90% 이상에서 암 관련 섬유아세포에서 상향조절되는 젤라티나제 및 펩티다제 활성을 갖는 막-결합 효소이다.

종양 미세환경에 대한 신체의 내성을 파괴하면 암 요법을 개선할 가능성이 있다. 이전의 연구는 유전자 도입 마우스의 FAP -발현 세포의 절제가 종양 성장을 약화시키고, 면역 체크포인트 차단과 같은 다른 면역 요법과 상승작용한다는 것을 나타냈다. 그룹은 추가로 FAP를 표적화하는 키메라 항원 수용체를 발현하는 T 세포가 종양 진행을 늦추지만, 일부 마우스 균주에서 이들 CAR가 치명적인 독성을 일으킨다는 것을 나타내었다.

따라서, 당업계에서 종양 미세환경에 대한 내성을 파괴하는데 지향된 더 안전한 요법을 개발할 필요가 있다. 본 발명은 이러한 미충족 요구를 만족시킨다.

일 구현예에서, 본 발명은 핵산 분자를 포함하는 면역원성 조성물로서, 상기 핵산 분자가 a) 서열번호: 2 또는 서열번호: 6의 아미노산 서열의 전장에 대해 적어도 약 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열, b) 서열번호: 2 또는 서열번호: 6의 아미노산 서열의 적어도 60%에 대해 적어도 약 90% 동일성을 갖는 면역원성 단편, c) 서열번호: 2 또는 서열번호: 6의 아미노산 서열, 또는 d) 서열번호: 2 또는 서열번호: 6의 아미노산 서열을 적어도 60% 포함하는 면역원성 단편의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 코딩하는, 면역원성 조성물에 관한 것이다.

일 구현예에서, 핵산 분자는 DNA 분자이다. 일 구현예에서, 핵산 분자는 RNA 분자이다.

일 구현예에서, 핵산 분자는 a) 서열번호: 1 또는 서열번호: 5의 뉴클레오타이드 서열의 전장에 대해 적어도 약 90% 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열, b) 서열번호: 1 또는 서열번호: 5의 뉴클레오타이드 서열의 적어도 60%에 대해 적어도 약 90% 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열의 면역원성 단편, c) 서열번호: 1 또는 서열번호: 5의 뉴클레오타이드 서열, 또는 d) 서열번호: 1 또는 서열번호: 5의 뉴클레오타이드 서열의 면역원성 단편의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

일 구현예에서, 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 적어도 하나의 조절 서열에 작동가능하게 연결된다. 일 구현예에서, 조절 서열은 시작 코돈, IgE 선도 서열, 정지 코돈 또는 이들의 조합이다.

일 구현예에서, 핵산 분자는 a) 서열번호: 4 또는 서열번호: 8의 아미노산 서열의 전장에 대해 적어도 약 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열, b) 서열번호: 4 또는 서열번호: 8의 아미노산 서열의 적어도 60%에 대해 적어도 약 90% 동일성을 포함하는 면역원성 단편, c) 서열번호: 4 또는 서열번호: 8의 아미노산 서열, 또는 d) 서열번호: 4 또는 서열번호: 8의 아미노산 서열을 적어도 60% 포함하는 면역원성 단편의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 코딩한다.

일 구현예에서, 핵산 분자는 a) 서열번호: 3 또는 서열번호: 7의 뉴클레오타이드 서열의 전장에 대해 적어도 약 90% 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열, b) 서열번호: 3 또는 서열번호: 7의 뉴클레오타이드 서열의 적어도 60%에 대해 적어도 약 90% 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열의 면역원성 단편, c) 서열번호: 3 또는 서열번호: 7의 뉴클레오타이드 서열, 또는 d) 서열번호: 3 또는 서열번호: 7의 뉴클레오타이드 서열의 면역원성 단편의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

일 구현예에서, 핵산 분자는 발현 벡터이다.

일 구현예에서, 핵산 분자는 바이러스 입자에 도입된다.

일 구현예에서, 면역원성 조성물은 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함한다.

일 구현예에서, 면역원성 조성물은 아쥬반트를 포함한다.

일 구현예에서, 본 발명은 a) 서열번호: 2 또는 서열번호: 6의 아미노산 서열의 전장에 대해 적어도 약 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열, b) 서열번호: 2 또는 서열번호: 6의 아미노산 서열의 적어도 60%에 대해 적어도 약 90% 동일성을 갖는 단편, c) 서열번호: 2 또는 서열번호: 6의 아미노산 서열, 또는 d) 서열번호: 2 또는 서열번호: 6의 아미노산 서열을 적어도 60% 포함하는 단편의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다.

일 구현예에서, 핵산 분자는 DNA 분자 또는 RNA 분자이다.

일 구현예에서, 핵산 분자는 DNA 분자이다. 일 구현예에서, 핵산 분자는 RNA 분자이다.

일 구현예에서, 핵산 분자는 a) 서열번호: 1 또는 서열번호: 5의 뉴클레오타이드 서열의 전장에 대해 적어도 약 90% 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열, b) 서열번호: 1 또는 서열번호: 5의 뉴클레오타이드 서열의 적어도 60%에 대해 적어도 약 90% 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열의 면역원성 단편, c) 서열번호: 1 또는 서열번호: 5의 뉴클레오타이드 서열, 또는 d) 서열번호: 1 또는 서열번호: 5의 뉴클레오타이드 서열의 면역원성 단편의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

일 구현예에서, 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 적어도 하나의 조절 서열에 작동가능하게 연결된다. 일 구현예에서, 조절 서열은 시작 코돈, IgE 선도 서열, 정지 코돈 또는 이들의 조합이다.

일 구현예에서, 핵산 분자는 a) 서열번호: 4 또는 서열번호: 8의 아미노산 서열의 전장에 대해 적어도 약 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열, b) 서열번호: 4 또는 서열번호: 8의 아미노산 서열의 적어도 60%에 대해 적어도 약 90% 동일성을 포함하는 면역원성 단편, c) 서열번호: 4 또는 서열번호: 8의 아미노산 서열, 또는 d) 서열번호: 4 또는 서열번호: 8의 아미노산 서열을 적어도 60% 포함하는 면역원성 단편의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 코딩한다.

일 구현예에서, 핵산 분자는 a) 서열번호: 3 또는 서열번호: 7의 뉴클레오타이드 서열의 전장에 대해 적어도 약 90% 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열, b) 서열번호: 3 또는 서열번호: 7의 뉴클레오타이드 서열의 적어도 60%에 대해 적어도 약 90% 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열의 면역원성 단편, c) 서열번호: 3 또는 서열번호: 7의 뉴클레오타이드 서열, 또는 d) 서열번호: 3 또는 서열번호: 7의 뉴클레오타이드 서열의 면역원성 단편의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

일 구현예에서, 핵산 분자는 발현 벡터이다.

일 구현예에서, 핵산 분자는 바이러스 입자에 도입된다.

일 구현예에서, 본 발명은 펩타이드를 포함하는 면역원성 조성물로서, 상기 펩타이드가 a) 서열번호: 2, 서열번호: 4, 서열번호: 6 또는 서열번호: 8의 아미노산 서열의 전장에 대해 적어도 약 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열, b) 서열번호: 2, 서열번호: 4, 서열번호: 6 또는 서열번호: 8의 아미노산 서열의 적어도 60%에 대해 적어도 약 90% 동일성을 포함하는 면역원성 단편, c) 서열번호: 2, 서열번호: 4, 서열번호: 6 또는 서열번호: 8의 아미노산 서열, 또는 d) 서열번호: 2, 서열번호: 4, 서열번호: 6 또는 서열번호: 8의 아미노산 서열을 적어도 60% 포함하는 면역원성 단편의 아미노산 서열을 포함하는, 면역원성 조성물에 관한 것이다.

일 구현예에서, 본 발명은 a) 서열번호: 2, 서열번호: 4, 서열번호: 6 또는 서열번호: 8의 아미노산 서열의 전장에 대해 적어도 약 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열, b) 서열번호: 2, 서열번호: 4, 서열번호: 6 또는 서열번호: 8의 아미노산 서열의 적어도 60%에 대해 적어도 약 90% 동일성을 포함하는 면역원성 단편, c) 서열번호: 2, 서열번호: 4, 서열번호: 6 또는 서열번호: 8의 아미노산 서열, 또는 d) 서열번호: 2, 서열번호: 4, 서열번호: 6 또는 서열번호: 8의 아미노산 서열을 적어도 60% 포함하는 면역원성 단편의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드에 관한 것이다.

일 구현예에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 대상체에서 섬유아세포 활성화 단백질 (FAP)에 대한 면역 반응을 유도하는 방법으로서, 상기 방법이 핵산 분자를 포함하는 면역원성 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 핵산 분자가 a) 서열번호: 2 또는 서열번호: 6의 아미노산 서열의 전장에 대해 적어도 약 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열, b) 서열번호: 2 또는 서열번호: 6의 아미노산 서열의 적어도 60%에 대해 적어도 약 90% 동일성을 포함하는 면역원성 단편, c) 서열번호: 2 또는 서열번호: 6의 아미노산 서열, 또는 d) 서열번호: 2 또는 서열번호: 6의 아미노산 서열을 적어도 60% 포함하는 면역원성 단편의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 코딩하는, 방법에 관한 것이다.

일 구현예에서, 투여 단계는 전기천공 또는 주사 중 적어도 하나를 포함한다.

일 구현예에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 대상체에서 종양 관련 병리학을 치료하거나 예방하는 방법으로서, 상기 방법이 핵산 분자를 포함하는 면역원성 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 핵산 분자가 a) 서열번호: 2 또는 서열번호: 6의 아미노산 서열의 전장에 대해 적어도 약 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열, b) 서열번호: 2 또는 서열번호: 6의 아미노산 서열의 적어도 60%에 대해 적어도 약 90% 동일성을 포함하는 면역원성 단편, c) 서열번호: 2 또는 서열번호: 6의 아미노산 서열, 또는 d) 서열번호: 2 또는 서열번호: 6의 아미노산 서열을 적어도 60% 포함하는 면역원성 단편의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 코딩하는, 방법에 관한 것이다.

일 구현예에서, 투여 단계는 전기천공 또는 주사 중 적어도 하나를 포함한다.

일 구현예에서, 종양 관련 병리학은 종양 성장, 종양 전이 또는 혈관신생 중 적어도 하나이다.

일 구현예에서, 상기 대상체는 암으로 진단되었다.

일 구현예에서, 암은 전립선암이다.

일 구현예에서, 상기 방법은 1개 이상의 전립선암 항원을 포함하는 면역원성 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 상기 방법은 PSMA를 포함하는 면역원성 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.

일 구현예에서, 상기 암은 폐암이다. 일 구현예에서, 상기 방법은 1개 이상의 폐암 항원을 포함하는 면역원성 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 상기 방법은 TERT를 포함하는 면역원성 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예의 하기 상세한 설명은 첨부된 도면과 함께 판독할 때 더 잘 이해될 것이다. 본 발명을 설명할 목적으로, 현재 바람직한 구현예가 도면에 도시되어 있다. 그러나, 본 발명은 도면에 제시된 구현예의 정확한 배열 및 수단에 제한되지 않는다는 것이 이해되어야 한다.
도 1a 내지 도 1d를 포함하는 도 1은 종양 항원 특이적 DNA 기반 면역원성 조성물 작제물과 조합하여 사용하기 위한 합성 컨센서스 기술을 사용하는 FAP 면역원성 조성물의 설계를 도시한다. 도 1a는 본 발명의 최적화된 컨센서스 서열과 천연 인간 및 마우스 FAP 서열 사이의 유전적 관계를 설명하는 계통발생적 나무를 도시한다. 도 1b는 IgE 선도 서열(IgELS)에 작동가능하게 연결되고 디펩티딜 펩티다제 및 젤라틴 분해 활성을 차단하기 위한 S624A 돌연변이를 갖는 마우스 FAP의 개략도를 도시한다. 도 1c는 cpk 형식으로 도시된, 천연 동종이량체 형태의 성숙한 뮤린 FAP의 다이아그램을 도시한다. 완전 야생형 FAP 중 내인성 막 테터는 이 설계에 제시되지 않는다. 대표적인 야생형 서열에 대한 μCon 변화는 적색으로 나타낸다. 2개의 제거된 활성 세린 잔기 중 하나는 단량체 활성 부위 포켓에 위치된 황색으로 가시화된다. 도 1d는 293T 세포로 형질감염된 천연 마우스 FAP 및 μCon 마우스 FAP 플라스미드 둘 다의 발현을 보여주는 예시적인 웨스턴 블랏을 도시한다. 비형질감염된 세포, 및 GFP-발현 플라스미드로 형질감염된 세포를 음성 대조군으로서 사용했다.
도 2a 내지 도 2e를 포함하는 도 2는 C57Bl/6 마우스의 μCon 마우스 FAP 백신의 면역원성을 입증하는 실험 결과를 도시한다. 도 2a는 실험 설계를 도시한다. 마우스를 2주 간격으로 3회 면역화시키고, 최종 백신 접종 1주일 후에 희생시켰다. 비장세포를 분석하여 T 세포 반응을 조사했다. 도 2b 및 도 2c는 천연 마우스 FAP 펩타이드(도 2b) 또는 백신 서열에 매칭된 μCon 펩타이드(도 2c)에 대한 IFN-γ ELISpot 반응을 입증하는 예시적인 결과를 도시한다. 도 2d 및 도 2e는 5시간 동안 천연 마우스 FAP 펩타이드로 자극 후 CD8+ (도 2d) 및 CD4+ (도 2e) T 세포의 세포내 사이토카인 염색을 입증하는 예시적인 결과를 도시한다. 10μg 용량의 FAP 백신을 이 연구에 사용했다. 유의성은 도 2d 및 도 2e에 대한 스튜던트 t-테스트에 의해 결정되었다. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001. 도시된 그룹당 N=5 마우스는 2개의 독립적인 실험의 대표이다.
도 3a 내지 도 3c를 포함하는 도 3은 CD-1 이계 교배된 마우스에서 천연 및 μCon FAP 백신의 비교를 입증하는 실험 결과를 도시한다. 도 3a는 천연 대조군 (상단부), 천연 마우스 FAP 백신 그룹 (중간부) 또는 μCon 마우스 FAP 백신 그룹 (하단부)에서 개별적 CD-1 이계교배된 마우스로부터의 천연 마우스 FAP 펩타이드에 대한 IFN-γ ELISpot 반응을 입증하는 예시적인 결과를 도시한다. 면역화된 마우스는 10μg의 DNA 플라스미드를 투여했다. 이들 마우스의 면역화 스케줄은 도 2에서와 동일했다. 도 3b는 풀에 의해 분리되지 않고 도 3a에서 면역화된 마우스로부터 총 IFN-γ ELISpot 반응을 입증하는 예시적인 결과를 도시한다. 도 3c는 천연 FAP 단백질 (세포외 도메인)에 대한 도 3a의 마우스로부터 종점 결합 역가를 입증하는 예시적인 결과를 도시한다. 유의성은 도 3b에 대한 터키의 HSD 테스트가 이어지는 2원 ANOVA에 의해 결정되었다. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001.10마리의 마우스를 천연 그룹에 사용했고, 15마리의 마우스를 각각 천연 FAP 및 μCon FAP 그룹에 사용했다.
도 4a 내지 도 4e를 포함하는 도 4는 C57Bl/6 마우스에서 천연 및 μCon FAP 백신의 비교를 입증하는 실험적 결과를 도시한다. 도 4a는 실험 설정을 보여주는 다이어그램을 도시한다. C57Bl/6 마우스는 2주 간격으로 3회 면역화하였고, 최종 백신접종 1주 후에 희생시켰다. 비장세포를 분석하여 T 세포 반응을 검사하고, 혈청을 수집하여 항체 반응을 검사했다. 도 4b는 천연 마우스 FAP 펩타이드에 대한 IFN-γ ELISpot 반응을 입증하는 예시적인 결과를 도시한다. 도 4c 및 도 4d는 천연 마우스 FAP 펩타이드에 의한 5시간 자극 후 CD8+ (도 4c) 및 CD4+ (도 4d) T 세포의 세포내 사이토카인 염색을 입증하는 예시적인 결과를 도시한다. 10μg 용량의 천연 마우스 FAP 또는 μCon 마우스 FAP 백신을 이 연구에 사용했다. 도 4e는 천연 FAP 단백질 (세포외 도메인)에 대한 도 4a의 마우스로부터 종점 결합 역가를 입증하는 예시적인 결과를 도시한다. 유의성은 터키 HSD 테스트가 이어지는 1원 ANOVA에 의해 결정했다. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001. 그룹당 N=4-10 마우스.
도 5a 내지 도 5e를 포함하는 도 5는 Balb/c 마우스에서 천연 및 μCon FAP 백신의 비교를 입증하는 실험 결과를 도시한다. 도 5a는 실험 설정을 나타내는 다이어그램을 도시한다. Balb/c 마우스는 2주 간격으로 3회 면역화하고, 최종 백신접종 1주 후에 희생시켰다. 비장세포를 분석하여 T 세포 반응을 검사하고, 혈청을 수집하여 항체 반응을 검사했다. 도 5b는 천연 마우스 FAP 펩타이드에 대한 IFN-γ ELISpot 반응을 입증하는 예시적인 결과를 도시한다. 도 5c 및 도 5d는 천연 마우스 FAP 펩타이드에 의한 5시간 동안 자극 후 CD8+ (도 5c) 및 CD4+ (도 5d) T 세포의 세포내 사이토카인 염색을 입증하는 예시적인 결과를 도시한다. 10μg 용량의 천연 마우스 FAP 또는 μCon 마우스 FAP 백신을 이 연구에 사용했다. 도 5e는 천연 FAP 단백질 (세포외 도메인)에 대한 도 5a의 마우스로부터 종점 결합 역가를 입증하는 예시적인 결과를 도시한다. 유의성은 터키 HSD 테스트가 이어지는 1원 ANOVA에 의해 결정했다. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001. 그룹당 N=4-10 마우스.
도 6a 내지 도 6c를 포함하는 도 6은 치료적 폐 종양 모델에서 FAP 백신 및 병용 요법의 효능을 입증하는 실험 결과를 도시한다. 도 6a는 실험 설정을 나타내는 다이어그램을 도시한다. 마우스는 0일째에 TC-1 세포를 이식하고, 7일째에 무작위화하고, 총 4회 면역화 동안 매주 1회 면역화했다. 10μg의 μCon FAP DNA 및 25μg의 μCon 마우스 TERT DNA가 사용되었다. 도 6b는 TC-1이 이식된 마우스에 대해 지시된 백신접종 섭생에 대한 경시적인 종양 용적 측정을 입증하는 예시적인 결과를 도시한다. 도 6c는 TC-1이 이식된 마우스에 대해 지시된 백신접종 섭생에 대한 경시적인 마우스 생존율을 입증하는 예시적인 결과를 도시한다. 유의성은 터키 HSD 테스트가 이어지는 2원 ANOVA에 의해 결정되었다. 마우스 생존에 대한 유의성은 게한-브레슬로우-윌콕슨 테스트에 의해 결정되었다. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001.TC-1 연구를 위해 그룹당 N=10 마우스. 2개의 독립적인 실험의 대표가 도시된다.
도 7a 내지 도 7c를 포함하는 도 7은 치료적 전립선 종양 모델에서 FAP 백신 및 병용 요법의 효능을 입증하는 예시적인 실험 결과를 도시한다. 도 7a는 실험 설정을 나타내는 다이어그램을 도시한다. 마우스는 0일째에 TRAMP-C2 세포를 이식하고, 4일째에 무작위화하고, 총 4회 면역화에 대해 매주 1회 면역화했다. 10μg의 μCon FAP DNA 및 20μg의 μCon PSMA가 사용되었다. 도 7b는 TRAMP-C2가 이식된 마우스에 지시된 백신접종 섭생에 대한 경시적인 종양 용적 측정을 입증하는 예시적인 결과를 도시한다. 도 7c는 TRAMP-C2가 이식된 마우스에 지시된 백신접종 섭생에 대한 경시적인 마우스 생존율을 입증하는 예시적인 결과를 도시한다. 유의성은 터키 HSD 테스트가 이어지는 2원 ANOVA에 의해 결정되었다. 마우스 생존에 대한 유의성은 게한-브레슬로우-윌콕슨 테스트에 의해 결정되었다. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001.TRAMP-C2 연구를 위해 그룹당 N=15 마우스. 각 종양 유형에 대한 2개의 독립적인 실험의 대표가 도시된다.
도 8은 종양 세포주에서 FAP의 발현을 입증하는 예시적인 실험 결과를 도시한다. 마우스 종양 세포주 TC-1 및 TRAMP-C2에서 마우스 FAP의 웨스턴 블랏 발현. 천연 마우스 FAP 플라스미드로 형질감염된 293T 세포를 양성 대조군으로 사용했다.
도 9a 내지 도 9d를 포함하는 도 9는 FAP 백신이 FAP-특이적 TIL을 유도한다는 것을 입증하는 예시적인 실험 결과를 도시한다. 도 9a는 실험 설정을 나타내는 다이어그램을 도시한다. 마우스는 0일째에 TC-1 종양 세포를 이식하고, 7일째에 무작위화하고, 총 2회 면역화에 대해 매주 1회 면역화했다. 10μg의 μCon FAP DNA가 사용되었다. 마우스를 21일째에 희생시키고, 비장세포 및 TIL을 수확했다. 도 9b는 천연 마우스 FAP 펩타이드에 의한 5시간 동안 자극 후 비장에서 CD8+ T 세포의 세포내 사이토카인 염색을 입증하는 예시적인 결과를 도시한다. 도 9c는 5시간 동안 천연 마우스 FAP 펩타이드로 자극된 종양 침윤성 림프구 (TIL)의 세포내 사이토카인 염색을 입증하는 예시적인 결과를 도시한다. 도 9d는 CD45+/CD3+ 림프구의 백분율로서, 유동 세포 계측법 염색에 의해 평가된 각 종양에서의 CD8+ T 세포 및 CD4+/CD25+/FoxP3+ Treg의 빈도를 입증하는 예시적인 결과를 도시한다. 유의성은 패널 B-D에 대한 스튜던트 t-테스트에 의해 결정되었다. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001. 도시된 그룹당 N=9-10 마우스가 2개의 독립적인 실험의 대표이다.
도 10a 내지 도 10d를 포함하는 도 10은 조합 mTERT + FAP 백신접종을 받은 마우스로부터의 면역 반응을 입증하는 예시적인 실험 결과를 도시한다. 마우스는 0일째에 TC-1 종양 세포를 이식하고, 7일째에 무작위화하고, 총 2회 면역화에 대해 매주 1회 면역화했다. 10μg의 μCon FAP DNA 또는 25μg의 mTERT DNA가 사용되었다. 마우스를 21일째에 희생시키고, 비장세포 및 TIL을 수확했다. 도 10a 및 도 10b는 5시간 동안 천연 마우스 FAP 펩타이드 (도 10a) 또는 천연 마우스 TERT 펩타이드 (도 10b)에 의한 자극 후 CD8+ TIL의 세포내 사이토카인 염색을 입증하는 예시적인 결과를 도시한다. 도 10c 및 도 10d는 5시간 동안 천연 마우스 FAP 펩타이드 (도 10c) 또는 천연 마우스 TERT 펩타이드 (도 10d)에 의한 자극 후 CD8+ 비장세포의 세포내 사이토카인 염색을 입증하는 예시적인 결과를 도시한다. 유의성은 터키 HSD 테스트가 이어지는 1원 ANOVA를 사용하여 결정되었다. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001. 그룹당 N=8-10 마우스.
도 11a 내지 도 11h를 포함하는 도 11은 FAP 백신이 종양 미세환경을 변경한다는 것을 입증하는 예시적인 실험 결과를 도시한다. 도 11a는 FAP 발현을 위한 대조군 마우스 또는 μCon 마우스 FAP 면역화된 마우스로부터의 조직의 대표적인 면역조직화학적 염색을 도시한다. 도 11b는 FAP-발현 세포에 의해 커버되는 종양 내 영역의 백분율의 정량화를 도시한다. 도 11c는 히알루로난 발현을 위한 대조군 마우스 또는 μCon 마우스 FAP 면역화된 마우스로부터의 조직의 대표적인 면역형광성 이미지를 도시한다. 도 11d는 히알루로난에 의해 커버되는 종양 내 영역의 백분율의 정량화를 도시한다. 도 11e는 F4/80 및 EpCAM 발현을 위한 대조군 마우스 또는 μCon 마우스 FAP 면역화된 마우스로부터의 조직의 대표적인 면역형광성 이미지를 도시한다. 도 11f는 F4/80 발현 세포에 의해 커버되는 종양 내 영역의 백분율의 정량화를 도시한다. 도 11g는 CD8α 및 EpCAM 발현을 위한 대조군 마우스 또는 μCon 마우스 FAP 면역화된 마우스로부터의 조직의 대표적인 면역형광성 이미지를 도시한다. 도 11h는 CD8α 발현 세포에 의해 커버되는 종양 내 영역의 백분율의 정량화를 도시한다. 그룹당 N=6-8 마우스. 이미지 정량화는 마우스당 적어도 5개의 이미지에 대해 수행했다. 유의성은 도 11b 내지 도 11d에 대해 스튜던트 t-테스트에 의해 결정되었다. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001. 기준자 = 100μm.
도 12a 내지 도 12d를 포함하는 도 12는 유동 세포 계측법에 의한 면역 세포 서브세트에 대한 μCon FAP 백신의 영향을 입증하는 예시적인 실험 결과를 도시한다. 마우스는 TC-1 종양 세포를 이식하고, 도 9a의 스케줄에 따라 면역화했다. 종양은 도면 범례에 표시된 마커에 따라 선천적인 면역 세포 집단의 표면 염색을 위해 수확했다. 도 12a 내지 도 12d는 종양당 대식세포 (도 12a), B 세포 (도 12b), 천연 살해 세포 (도 12c) 및 수지상 세포 (도 12d)의 총 수의 정량화를 입증하는 예시적인 실험 결과를 도시한다. 유의성은 스튜던트 t-테스트에 의해 결정되었다. 도시된 그룹당 N=9-10 마우스가 2개의 독립적인 실험의 대표이다.
도 13a 내지 도 13e를 포함하는 도 13은 종양 침윤성 대식세포의 특성에 대한 μCon FAP 백신의 영향을 입증하는 실험 결과를 도시한다. 마우스는 TC-1 종양 세포를 이식하고, 도 9a의 스케줄에 따라 면역화했다. 종양은 도면 범례에 표시된 마커에 따라 선천적인 면역 세포 집단의 표면 염색을 위해 수확했다. 도 13a 내지 도 13d는 Arg1+ (도 13a), MHCII+ (도 13b), CD68+ (도 13c), CD80+ (도 13d) 및 CD86+ (도 13e) 대식세포의 분획이 정량화되었음을 입증하는 예시적인 실험 결과를 도시한다. 유의성은 스튜던트 t-테스트에 의해 결정되었다. 도시된 그룹당 N=9-10 마우스가 2개의 독립적인 실험의 대표이다.
도 14a 내지 도 14c를 포함하는 도 14는 최적화된 컨센서스 마우스 FAP 백신에 대한 우세한 에피토프의 특성화를 도시한다. 도 14a는 23개의 풀의 매트릭스로 배열된 천연 마우스 FAP 중 122개 펩타이드의 매트릭스 맵을 도시한다. 도 14b는 합성 컨센서스 FAP 펩타이드의 각 풀에 의한 C57Bl/6 마우스의 자극을 도시한다. 도 14c는 합성 컨센서스 FAP 펩타이드의 각 풀에 의한 Balb/c 마우스의 자극을 도시한다.
도 15는 천연 및 합성 컨센서스 마우스 FAP에 대한 우세한 면역원성 에피토프의 목록을 도시한다. 천연 FAP의 우세한 면역원성 에피토프는 다음과 같이 제공된다: 서열번호: 13 내지 서열번호: 21. 최적화된 컨센서스 FAP의 우세한 면역원성 에피토프는 다음과 같이 제공된다: 서열번호: 15 내지 서열번호: 18, 및 서열번호: 20 내지 서열번호: 24.

일 양태에서, 본 발명은 FAP를 표적화하는 면역원성 조성물을 제공한다. 본 발명의 추가 양태는 개시된 면역원성 조성물을 단독으로 또는 추가의 암 백신 또는 치료제와 함께 사용하는 암 성장 또는 전이의 치료 및/또는 예방이다.

본 발명의 항원을 코딩하는 서열은 천연 단백질의 서열로부터 유전적으로 분열되고, 따라서 본 발명의 최적화된 컨센서스 항원은 독특하다. 본 발명의 면역원성 조성물은 코딩된 항원의 독특한 서열 때문에 종양 미세환경에 대한 내성을 파괴하고 종양 성장 또는 전이를 감소시키거나 예방하는 데 광범위하게 적용가능할 수 있다. 이들 독특한 서열은 면역원성 조성물이 다중 유형의 암에 대해 보편적으로 보호성이도록 한다.

면역원성 조성물은 임의의 수의 암에 대해 보호하고 치료하는 데 사용될 수 있다. 면역원성 조성물은 종양 미세환경 항원을 표적으로 하는 체액성 및 세포 면역 반응 둘 다를 유도할 수 있다. 면역원성 조성물은 종양 미세환경 항원과 반응성인 중화 항체 및 면역글로불린 G (IgG) 항체를 유도할 수 있다. 면역원성 조성물은 종양 미세환경 항원과 반응성이고 하나 이상의 인터페론-감마(IFN-γ) 및 종양 괴사 인자 알파 (TNF-α)를 생성하는 CD8⁺ T 세포 반응을 또한 유도할 수 있다. 일 구현예에서, 면역원성 조성물은 또한 종양 미세환경 항원과 반응성이고 하나 이상의 IFN-γ 및 TNF-α를 생성하는 CD4⁺ T 세포 반응을 유도할 수 있다.

정의

달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어들은 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 모순될 경우에, 정의를 포함하는 본 문서가 제어할 것이다. 바람직한 방법 및 물질이 아래에 기재되어 있지만, 본원에 기재된 것들과 유사하거나 동등한 방법 및 물질이 본 발명을 실시 또는 시험하는 데 사용될 수 있다. 본원에 언급된 모든 공보, 특허 출원, 특허 및 다른 참조문헌은 그 전문이 본원에참조로 인용된다. 본원에 개시된 물질, 방법 및 실시예는 단지 예시적이고 제한하려는 것은 아니다.

본원에 사용된 용어들 "포함한다", "포함한다", "갖는", "갖는다", "할 수 있다", "함유한다" 및 이의 변이체는 추가의 작용 또는 구조의 가능성을 배제하지 않는 개방형 접속구, 용어들 또는 단어들인 것으로 의도된다. 단수 형태 "a," "and" 및 "the"는 문맥이 명확하게 달리 지시하지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다. 본 개시내용은 또한 명백하게 제시되는 지의 여부와 상관없이 본원에 제시된 구현예 또는 요소를 "포함하는", "로 이루어지는" 및 "로 본질적으로 이루어지는"의 다른 구현예를 고려한다.

본원에 사용된 "아쥬반트"는 항원의 면역원성을 향상시키기 위해 본원에 기재된 면역원성 조성물에 첨가된 임의의 분자를 의미한다.

본원에 사용된 "항체"는 Fab, F(ab')₂, Fd, 및 단일 쇄 항체, 디아바디, 이중특이적 항체, 이작용성 항체 및 이의 유도체를 포함하는 부류 IgG, IgM, IgA, IgD 또는 IgE, 또는 이의 단편, 단편 또는 유도체의 항체를 의미한다. 항체는 목적하는 에피토프 또는 이로부터 유래된 서열에 대한 충분한 결합 특이성을 나타내는 포유동물, 폴리클로날 항체, 친화성 정제된 항체 또는 이들의 혼합물의 혈청 샘플로부터 단리된 항체일 수 있다.

본원에 사용된 "코딩 서열" 또는 "코딩 핵산"은 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 (RNA 또는 DNA 분자)을 의미한다. 코딩 서열은 추가로 핵산이 투여되는 개체 또는 포유동물의 세포에서 발현을 지시할 수 있는 프로모터 및 폴리아데닐화 신호를 포함하는 조절 요소에 작동가능하게 연결된 개시 및 종결 신호를 포함할 수 있다.

본원에 사용된 "보체" 또는 "상보성"은 핵산 분자의 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체 사이의 왓슨-크릭(Watson-Crick)(예: A-T/U 및 C-G) 또는 후그스틴(Hoogsteen) 염기 쌍을 의미한다.

본원에 사용된 "컨센서스" 또는 "컨센서스 서열"은 특정 항원의 다중 하위유형의 정렬 분석에 기초하여 작제된 합성 핵산 서열, 또는 상응하는 폴리펩타이드 서열을 의미할 수 있다. 서열은 다중 하위유형, 혈청형, 또는 특정 항원의 균주에 대한 광범위한 면역을 유도하는 데 사용될 수 있다. 합성 항원, 예를 들어, 융합 단백질은 컨센서스 서열 (또는 컨센서스 항원)을 생성하도록 조작될 수 있다.

본원에서 상호교환적으로 사용된 "전기천공", "전기-침투" 또는 "전기-동력학 강화"("EP")는 생체막에서 현미경적 통로 (기공)를 유도하기 위한 막관통 전기장 펄스의 사용을 의미하고; 그들의 존재는 생체분자, 예를 들어, 플라스미드, 올리고뉴클레오타이드, siRNA, 약물, 이온, 및 물이 세포막의 한면으로부터 다른 면으로 통과하도록 할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "발현가능한 형태"는 개체의 세포에 존재할 때 코딩 서열이 발현되도록 표적 단백질 또는 면역조절 단백질을 코딩하는 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 필요한 조절 요소를 함유하는 유전자 작제물을 지칭한다.

본원에 사용된 "단편"은 포유동물에서 면역 반응을 유도할 수 있는 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 부분을 의미한다. 단편은 아래에 제시된 단백질 단편을 코딩하는 다양한 뉴클레오타이드 서열 중 적어도 하나로부터 선택된 DNA 단편일 수 있다.

폴리펩타이드 서열에 관한 "단편" 또는 "면역원성 단편"은 전장 내인성 항원과 교차 반응하는 포유동물에서 면역 반응을 유도할 수 있는 폴리펩타이드를 의미한다. 컨센서스 단백질의 단편은 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%의 컨센서스 단백질을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 컨센서스 단백질의 단편은 적어도 20개 이상의 아미노산, 적어도 30개 이상의 아미노산, 적어도 40개 이상의 아미노산, 적어도 50개 이상의 아미노산, 적어도 60개 이상의 아미노산, 적어도 70개 이상의 아미노산, 적어도 80개 이상의 아미노산, 적어도 90개 이상의 아미노산, 적어도 100개 이상의 아미노산, 적어도 110개 이상의 아미노산, 적어도 120개 이상의 아미노산, 적어도 130개 이상의 아미노산, 적어도 140개 이상의 아미노산, 적어도 150개 이상의 아미노산, 적어도 160개 이상의 아미노산, 적어도 170개 이상의 아미노산, 적어도 180개 이상의 아미노산, 적어도 190개 이상의 아미노산, 적어도 200개 이상의 아미노산, 적어도 210개 이상의 아미노산, 적어도 220개 이상의 아미노산, 적어도 230개 이상의 아미노산 또는 적어도 240개 이상의 아미노산의 컨센서스 단백질을 포함할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "유전적 작제물"은 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 또는 RNA 분자를 지칭한다. 코딩 서열은 핵산 분자가 투여되는 개체의 세포에서 발현을 지시할 수 있는 프로모터 및 폴리아데닐화 신호를 포함하는 조절 요소에 작동가능하게 연결된 개시 및 종결 신호를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "발현가능한 형태"는 개체의 세포에 존재할 경우, 코딩 서열이 발현되도록 단백질을 코딩하는 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 필요한 조절 요소를 함유하는 유전자 작제물을 지칭한다.

2개 이상의 핵산 또는 폴리펩타이드 서열의 맥락에서 본원에 사용된 "동일한" 또는 "동일성"은 서열이 특정 영역에 걸쳐 동일한 명시된 백분율의 잔기를 갖는다는 것을 의미한다. 백분율은 두 서열을 최적으로 정렬하고, 특정 영역에 걸쳐 두 서열을 비교하고, 두 서열에서 동일한 잔기가 발생하는 위치의 수를 결정하여 매칭된 위치의 수를 산출하고, 매칭된 위치의 수를 특정 영역에서 총 위치 수로 나누고, 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 산출함으로써 계산될 수 있다. 두 서열의 길이가 다르거나 정렬이 하나 이상의 엇갈린 단부를 생성하고, 특정 비교 영역이 단일 서열만을 포함하는 경우에, 단일 서열의 잔기는 계산의 분자가 아니라 분모에 포함된다. DNA와 RNA를 비교할 경우, 티민 (T) 및 우라실 (U)은 동등한 것으로 간주될 수있다. 동일성은 수동으로 또는 BLAST 또는 BLAST 2.0과 같은 컴퓨터 서열 알고리즘을 사용하여 수행될 수 있다.

본원에 사용된 "면역 반응"은 항원의 도입에 반응하여 숙주 면역계의 활성화, 예를 들어, 포유동물의 활성화를 의미한다. 면역 반응은 세포성 또는 체액성 반응, 또는 둘 다의 형태일 수 있다.

본원에 사용된 "핵산" 또는 "올리고뉴클레오타이드" 또는 "폴리뉴클레오타이드"는 함께 공유결합된 적어도 2개의 뉴클레오타이드를 의미한다. 단일 가닥의 묘사는 또한 상보성 가닥의 서열을 정의한다. 따라서, 핵산은 또한 도시된 단일 가닥의 상보성 가닥을 포함한다. 핵산의 많은 변이체는 소정의 핵산과 동일한 목적으로 사용될 수 있다. 따라서, 핵산은 또한 실질적으로 동일한 핵산 및 이의 보체를 포함한다. 단일 가닥은 엄격한 하이브리드화 조건하에 표적 서열로 하이브리드화될 수 있는 프로브를 제공한다. 따라서, 핵산은 또한 엄격한 하이브리드화 조건하에 하이브리드화되는 프로브를 포함한다.

핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있거나, 이중 가닥 또는 단일 가닥 서열 둘 다의 일부를 함유할 수 있다. 핵산은 DNA, 게놈 및 cDNA 둘 다, RNA, 또는 하이브리드일 수 있고, 여기서 핵산은 데옥시리보- 및 리보-뉴클레오타이드의 조합, 및 우라실, 아데닌, 티민, 시토신, 구아닌, 이노신, 크산틴 하이포크산틴, 이소시토신 및 이소구아닌을 포함하는 염기의 조합을 함유할 수 있다. 핵산은 화학적 합성 방법 또는 재조합 방법으로 수득될 수 있다.

본원에 사용된 "작동가능하게 연결된"은 유전자의 발현이 그것이 공간적으로 연결된 프로모터의 조절하에 있음을 의미한다. 프로모터는 이의 조절하에 유전자의 5' (업스트림) 또는 3' (다운스트림)에 배치될 수 있다. 프로모터와 유전자 사이의 거리는 프로모터가 유래된 유전자에서 조절하는 유전자와 프로모터 사이의 거리와 거의 동일할 수 있다. 당업계에서 공지된 바와 같이, 이 거리의 변형은 프로모터 기능의 손실 없이 수용될 수 있다.

본원에 사용된 "펩타이드", "단백질" 또는 "폴리펩타이드"는 아미노산의 연결된 서열을 의미할 수 있고, 천연, 합성, 또는 천연 및 합성의 변형 또는 조합일 수 있다.

본원에 사용된 "프로모터"는 세포에서 핵산의 발현을 부여하고, 활성화하거나 증강시킬 수 있는 합성 또는 천연 유도 분자를 의미한다. 프로모터는 발현을 추가로 증강시키고/시키거나 공간 발현 및/또는 이의 일시적 발현을 변경하기 위해 하나 이상의 특정 전사 조절 서열을 포함할 수 있다. 프로모터는 또한 원위 인핸서 또는 억제인자 요소를 포함할 수 있고, 이는 전사 개시 부위로부터 수천 개의 염기쌍으로 배치될 수 있다. 프로모터는 바이러스, 박테리아, 진균, 식물, 곤충 및 동물을 포함하는 공급원으로부터 유래될 수 있다. 프로모터는 발현이 일어나는 세포, 조직 또는 장기와 관련하여 또는 발현이 일어나는 발달 단계와 관련하여 또는 생리학적 스트레스, 병원체, 금속 이온 또는 유도제와 같은 외부 자극에 반응하여 유전자 성분의 발현을 구성적으로 또는 차별적으로 조절할 수 있다. 프로모터의 대표적인 예는 박테리오파아지 T7 프로모터, 박테리오파아지 T3 프로모터, SP6 프로모터, lac 오퍼레이터-프로모터, tac 프로모터, SV40 후기 프로모터, SV40 초기 프로모터, RSV-LTR 프로모터, CMV IE 프로모터, SV40 초기 프로모터 또는 SV40 후기 프로모터 및 CMV IE 프로모터를 포함한다.

"신호 펩타이드" 및 "선도 서열"은 본원에서 상호교환적으로 사용되고, 본원에 제시된 종양 미세환경 단백질의 아미노산 말단에 연결될 수 있는 아미노산 서열을 지칭한다. 신호 펩타이드/선도 서열은 전형적으로 단백질의 국재화를 지시한다. 본원에 사용된 신호 펩타이드/선도 서열은 바람직하게는 그것이 생산되는 세포로부터 단백질의 분비를 촉진시킨다. 신호 펩타이드/선도 서열은 세포로부터의 분비시 종종 성숙한 단백질로서 지칭되는 단백질의 나머지로부터 종종 절단된다. 신호 펩타이드/선도 서열은 단백질의 N 말단에 연결된다.

본원에 사용된 "대상체"는 본원에 기재된 면역원성 조성물이 투여될 수 있는 포유동물을 의미할 수 있다. 포유동물은, 예를 들어, 인간, 침팬지, 개, 고양이, 말, 소, 마우스 또는 랫트일 수있다.

본원에 사용된 "실질적으로 동일한"은 제1 및 제2 아미노산 서열은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100개 이상의 아미노산의 영역에서 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%임을 의미할 수 있다. 실질적으로 동일한은 또한 제1 뉴클레오타이드 서열 및 제2 뉴클레오타이드 서열이 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100개 이상의 뉴클레오타이드의 영역에서 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%임을 의미할 수 있다.

본원에 사용된 "치료" 또는 "치료하는"은 질환을 예방하고, 억압하고, 억제하거나완전히 제거하는 수단을 통해 질환으로부터 대상체를 보호함을 의미할 수 있다. 일 구현예에서, 질환을 예방하는 단계는 본 발명의 면역원성 조성물을 질환의 개시 전에 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 질환을 예방하는 단계는 질환의 재발 또는 추가 진행을 예방하기 위해 치료 후 대상체에게 본 발명의 면역원성 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 질환을 억압하는 단계는 질환 유도 후, 이의 임상적 출현 이전에 본 발명의 면역원성 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 질환을 억제하는 단계는 질환의 임상적 출현 후 본 발명의 면역원성 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.

핵산과 관련하여 본원에 사용된 "변이체"는 (i) 참조된 뉴클레오타이드 서열의 부분 또는 단편; (ii) 참조된 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 부분의 보체; (iii) 참조된 핵산 또는 이의 보체와 실질적으로 동일한 핵산; 또는 (iv) 엄격한 조건하에 참조된 핵산, 이의 보체 또는 이와 실질적으로 동일한 서열로 하이브리드화되는 핵산을 의미한다.

변이체는 아미노산의 삽입, 결실 또는 보존적 치환에 의해 아미노산 서열이 상이하지만 적어도 하나의 생물학적 활성을 유지하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드로서 추가로 정의될 수 있다. "생물학적 활성"의 대표적인 예는 특정 항체에 의해 결합되거나 면역 반응을 촉진시키는 능력을 포함한다. 변이체는 또한 적어도 하나의 생물학적 활성을 보유하는 아미노산 서열을 갖는 참조된 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질을 의미할 수 있다. 아미노산의 보존적 치환, 즉 아미노산을 유사한 특성(예: 하전된 영역의 친수성, 정도 및 분포)의 상이한 아미노산으로 대체하는 것은 당업계에서 전형적으로 최소의 변화를 포함하는 것으로 인식된다. 이들 최소의 변화는 당업계에서 이해되는 바와 같이, 아미노산의 수치 요법 지수를 고려함으로써 부분적으로 확인될 수 있다(참조: Kyte 등, 1982, J. Mol. Biol. 157: 105-132).아미노산의 수치 요법 지수는 이의 소수성 및 전하의 고려에 기초한다. 유사한 수치 요법 지수의 아미노산이 치환될 수 있고, 단백질 기능을 여전히 보유한다는 것이 당업계에 공지되어 있다. 일 양태에서, ±2의 수치 요법 지수를 갖는 아미노산이 치환된다. 아미노산의 친수성은 또한 생물학적 기능을 유지하는 단백질을 초래하는 치환을 밝히는데 사용될 수 있다. 펩타이드와 관련하여 아미노산의 친수성을 고려하면 항원성 및 면역원성과 충분히 상관되는 것으로 보고된 유용한 척도인 그 펩타이드의 가장 큰 국소 평균 친수성의 계산을 허용한다. 유사한 친수성 값을 갖는 아미노산의 치환은 당업계에서 이해되는 바와 같이 생물학적 활성, 예를 들어, 면역원성을 유지하는 펩타이드를 초래할 수 있다. 치환은 서로 ±2 내의 친수성 값을 갖는 아미노산으로 수행될 수 있다. 아미노산의 소수성 지수 및 친수성 값은 모두 그 아미노산의 특정 측쇄에 의해 영향을 받는다. 그 관찰과 일치하여, 생물학적 기능과 양립가능한 아미노산 치환은 소수성, 친수성, 전하, 크기 및 다른 특성에 의해 나타낸 바와 같이 아미노산의 상대적 유사성, 특히 그러한 아미노산의 측쇄에 의존하는 것으로 이해된다.

변이체는 완전 유전자 서열 또는 이의 단편의 전장에 걸쳐 실질적으로 동일한 뉴클레오타이드 서열일 수 있다. 뉴클레오타이드 서열은 유전자 서열 또는 이의 단편의 전장에 걸쳐 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일할 수 있다. 변이체는 아미노산 서열 또는 이의 단편의 전장에 걸쳐 실질적으로 동일한 아미노산 서열일 수 있다. 아미노산 서열은 아미노산 서열 또는 이의 단편의 전장에 걸쳐 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일할 수 있다.

본원에 사용된 "벡터"는 복제의 기원을 함유하는 핵산 서열을 의미한다. 벡터는 바이러스 벡터, 박테리오파아지, 박테리아 인공 염색체 또는 효모 인공 염색체일 수 있다. 벡터는 DNA 또는 RNA 벡터일 수 있다. 벡터는 자가-복제 염색체외 벡터일 수 있고, 바람직하게는 DNA 플라스미드이다.

본원에서 수치 범위의 인용을 위해, 동일한 정도의 정확도로 사이에 있는 각각의 중재 번호가 명확하게 고려된다. 예를 들어, 6 내지 9의 범위의 경우, 6 및 9 이외에 숫자 7 및 8이 고려되고, 범위 6.0 내지 7.0의 경우, 숫자 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9 및 7.0이 명백하게 고려된다.

설명

본 발명은 종양 미세환경 항원의 최적화된 컨센서스 서열을 제공한다. 일 구현예에서, 최적화된 컨센서스 서열에 의해 코딩된 항원은 포유동물에서 면역 반응을 유도할 수 있다. 일 구현예에서, 최적화된 컨센서스 서열에 의해 코딩된 항원은 면역 반응이 유도될 수 있는 면역원으로서 특히 효과적이도록 하는 에피토프(들)를 포함할 수 있다.

최적화된 컨센서스 서열은 둘 이상의 천연 FAP 단백질로부터 유래된 컨센서스 서열일 수 있다. 최적화된 컨센서스 서열은 개선된 발현을 위한 컨센서스 서열 및/또는 변형(들)을 포함할 수 있다. 변형은 코돈 최적화, RNA 최적화, 번역 개시 증가를 위한 코작 서열의 첨가 및/또는 면역원성을 증가시키기 위한 면역글로불린 선도 서열의 첨가를 포함할 수 있다. 최적화된 컨센서스 서열에 의해 코딩된 FAP 항원은 신호 펩타이드, 예를 들어, 면역글로불린 신호 펩타이드, 예를 들어, 비제한적으로, 면역글로불린 E (IgE) 또는 면역글로불린 (IgG) 신호 펩타이드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 최적화된 컨센서스 서열에 의해 코딩된 항원은 혈구응집소 (HA) 태그를 포함할 수 있다. 최적화된 컨센서스 서열에 의해 코딩된 FAP 항원은 상응하는 천연 항원보다 더 강한 세포성 및/또는 체액성 면역 반응을 유도하도록 설계될 수 있다. 최적화된 컨센서스 서열에 의해 코딩된 FAP 항원은 내성을 파괴하고 항암 면역 요법과 상승작용하도록 설계될 수 있다.

일 구현예에서, 최적화된 컨센서스 FAP는 천연 인간 FAP에 대한 내성을 파괴하도록 설계된다. 일 구현예에서, 인간 최적화된 컨센서스 FAP 코딩 서열은 서열번호: 1 또는 서열번호: 3에 제시된 바와 같다. 일 구현예에서, 인간 최적화된 컨센서스 FAP 코딩된 항원은 서열번호: 2 또는 서열번호: 4에 제시된 아미노산 서열을 갖는다.

일 구현예에서, 최적화된 컨센서스 FAP는 천연 마우스 FAP에 대한 내성을 파괴하도록 설계된다. 일 구현예에서, 마우스 최적화된 컨센서스 FAP 코딩 서열은 서열번호: 5 또는 서열번호: 7에 제시된 바와 같다. 일 구현예에서, 마우스 최적화된 컨센서스 FAP 코딩된 항원은 서열번호: 6 또는 서열번호: 8에 제시된 아미노산 서열을 갖는다.

일 구현예에서, 최적화된 컨센서스 코딩된 FAP 항원은 하나 이상의 조절 요소에 작동가능하게 연결된다. 일 구현예에서, 조절 요소는 선도 서열이다. 일 구현예에서, IgE 리더 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 최적화된 컨센서스 DNA 서열은 서열번호: 3 또는 서열번호: 7에 제시된다. 일 구현예에서, IgE 선도 서열에 작동가능하게 연결된 최적화된 컨센서스-코딩된 FAP 항원은 서열번호: 4 또는 서열번호: 8에 제시된 바와 같다.

일 구현예에서, 조절 요소는 시작 코돈이다. 따라서, 일 구현예에서, 본 발명은 5' 말단에 시작 코돈을 포함하는 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 연결된, 서열번호: 1 또는 서열번호: 5에 제시된 바와 같은 핵산 서열 또는 이의 단편 또는 동족체에 관한 것이다. 일 구현예에서, 본 발명은 N-말단에서 시작 코돈(예: 메티오닌)에 의해 코딩된 아미노산에 작동가능하게 연결된, 서열번호: 2 또는 서열번호: 6에 제시된 바와 같은 아미노산 서열 또는 이의 단편 또는 동족체에 관한 것이다.

일 구현예에서, 조절 요소는 적어도 하나의 정지 코돈이다. 따라서, 일 구현예에서, 본 발명은 3' 말단에 적어도 하나의 정지 코돈을 포함하는 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 연결된, 서열번호: 1, 서열번호: 3, 서열번호: 5 또는 서열번호: 7에 제시된 바와 같은 핵산 서열 또는 이의 단편 또는 동족체에 관한 것이다. 일 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열은 2개의 정지 코돈에 작동가능하게 연결되어 번역 종결 효율을 증가시킨다.

일 구현예에서, FAP 항원을 코딩하는 최적화된 컨센서스 서열은 서열번호: 2, 서열번호: 4, 서열번호: 6 또는 서열번호: 8에 제시된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 코딩할 수 있다. 일 구현예에서, 최적화된 컨센서스 서열은 서열번호: 1, 서열번호: 3, 서열번호: 5 또는 서열번호: 7에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 서열은 서열번호: 1, 서열번호: 3, 서열번호: 5 또는 서열번호: 7에 제시된 뉴클레오타이드 서열의 전장에 대해 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열일 수 있다. 다른 구현예에서, 서열은 서열번호: 2, 서열번호: 4, 서열번호: 6 또는 서열번호: 8에 제시된 아미노산 서열의 전장에 대해 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.

일부 구현예에서, 최적화된 컨센서스 FAP 항원은 서열번호: 1, 서열번호: 3, 서열번호: 5 또는 서열번호: 7에 제시된 핵산 서열의 전장에 대해 적어도 약 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 DNA 서열로부터의 전사체인 RNA에 의해 코딩될 수 있다. 일부 구현예에서, 최적화된 컨센서스 FAP 항원은 서열번호: 2, 서열번호: 4, 서열번호: 6 또는 서열번호: 8에 제시된 아미노산 서열의 전장에 대해 적어도 약 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 RNA에 의해 코딩될 수 있다.

최적화된 컨센서스-코딩된 FAP 항원은 서열번호: 2, 서열번호: 4, 서열번호: 6 또는 서열번호: 8에 제시된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드일 수 있다. 일부 구현예에서, 항원은 서열번호: 2, 서열번호: 4, 서열번호: 6 또는 서열번호: 8에 제시된 아미노산 서열의 전장에 대해 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.

서열번호: 2, 서열번호: 4, 서열번호: 6 또는 서열번호: 8의 면역원성 단편에 상동성인 아미노산 서열을 갖는 단백질의 면역원성 단편이 제공될 수 있다. 이러한 면역원성 단편은 서열번호: 2, 서열번호: 4, 서열번호: 6 또는 서열번호: 8에 95% 상동성인 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 단백질을 포함할 수 있다. 일부 구현예는 본원의 컨센서스 단백질 서열의 면역원성 단편과 96% 상동성을 갖는 면역원성 단편에 관한 것이다. 일부 구현예는 본원의 컨센서스 단백질 서열의 면역원성 단편과 97% 상동성을 갖는 면역원성 단편에 관한 것이다. 일부 구현예는 본원의 컨센서스 단백질 서열의 면역원성 단편과 98% 상동성을 갖는 면역원성 단편에 관한 것이다. 일부 구현예는 본원의 컨센서스 단백질 서열의 면역원성 단편과 99% 상동성을 갖는 면역원성 단편에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 면역원성 단편은, 예를 들어, 면역글로불린 리더, 예를 들어, IgE 리더와 같은 선도 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 면역원성 단편은 선도 서열을 함유하지 않는다.

일 구현예에서, 최적화된 컨센서스 FAP 항원의 면역원성 단편은 전장 최적화된 컨센서스 FAP 항원의 적어도 하나의 면역우성 또는 하위-면역우성 에피토프를 코딩한다. 서열번호: 6에 제시된 전장 최적화된 컨센서스 FAP 항원의 예시적인 면역우성 및 하위-면역우성 에피토프는, 비제한적으로, 서열번호: 15, 서열번호: 16, 서열번호: 17, 서열번호: 18, 서열번호: 20, 서열번호: 21, 서열번호: 22, 서열번호: 23 및 서열번호: 24에 제시된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 포함한다.

일부 구현예는 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열번호: 1, 서열번호: 3, 서열번호: 5 또는 서열번호: 7의 전장을 포함하는 서열번호: 1, 서열번호: 3, 서열번호: 5 또는 서열번호: 7의 면역원성 단편에 관한 것이다. 면역원성 단편은 서열번호: 1, 서열번호: 3, 서열번호: 5 또는 서열번호: 7의 단편과 적어도 96%, 적어도 97% 적어도 98% 또는 적어도 99% 상동성일 수 있다. 일부 구현예에서, 면역원성 단편은, 예를 들어, 면역글로불린 리더, 예를 들어, IgE 리더와 같은 선도 서열을 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 단편은 선도 서열을 코딩하는 코딩 서열을 함유하지 않는다.

면역원성 조성물

최적화된 컨센서스 서열, 최적화된 컨센서스-코딩된 항원, 이의 단편, 이의 변이체 또는 이들의 조합을 포함하는 면역원성 조성물, 예를 들어, 백신이 본원에 제공된다. 면역원성 조성물은 종양 성장 또는 전이를 감소시키거나 종양 발달로부터 보호하여 암 기반 병리학을 치료, 예방 및/또는 보호하는 데 사용될 수 있다. 면역원성 조성물은 면역원성 조성물이 투여된 대상체의 면역 반응을 상당히 유도하여 대상체의 암 기반 병리학으로부터 보호하고 치료할 수 있다.

면역원성 조성물은 DNA 백신, 펩타이드 백신, 또는 DNA 및 펩타이드 백신의 조합일 수 있다. DNA 백신은 항원을 코딩하는 최적화된 컨센서스 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 뉴클레오타이드 서열은 DNA, RNA, cDNA, 이의 변이체, 이의 단편 또는 이들의 조합일 수 있다. 뉴클레오타이드 서열은 또한 펩타이드 결합에 의해 항원에 연결된 링커, 리더 또는 태그 서열을 코딩하는 추가의 서열을 포함할 수 있다. 펩타이드 백신은 항원, 이의 변이체, 이의 단편 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. DNA 및 펩타이드 백신의 조합은 상기한 최적화된 컨센서스 뉴클레오타이드 서열 및 코딩된 항원을 포함할 수 있다.

일 구현예에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 FAP를 발현하는 종양 세포, 예를 들어, 암 세포 및 전이성 종양 병변을 특징으로 하는 암에 대한 보호성 항종양 면역력을 유도하고, 재발을 예방하는 데 사용될 수 있다.

일 구현예에서, 본원에 기재된 조성물 및 방법은 치료될 세포가 FAP를 발현하는한 암 및 종양 세포, 즉 악성 및 양성 종양 둘 다의 치료에 유용하다. 따라서, 본원에 기재된 방법 및 조성물의 다양한 구현예에서, 암은, 비제한적으로, 전립선암, 폐 암종, 비-소세포 폐 암종, 악성 육종, 유방암, 췌장암, 흑색종, 혈액 암(예: 백혈병, 림프종, 골수종), 식도 편평 세포 암종, 방광암, 결장직장암, 식도, 위암, 간암종, 두경부암, 뇌암, 항문암, 활막 암종, 고환암, 간암, 자궁경부암, 재발성 호흡 유두종증, 피부암 및 위암을 포함할 수 있다.

일 구현예에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 FAP 항원을 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 FAP 항원 및 1개 이상의 추가의 암 항원을 포함한다.

일 구현예에서, 면역원성 조성물은 백신일 수 있다. 백신은 약독화 생백신, 항원을 전달하기 위해 재조합 벡터를 사용하는 백신, 서브유닛 백신 및 당단백질 백신, 예를 들어, 비제한적으로, 하기에 기재된 백신일 수 있다: 미국특허 번호: 4,510,245; 4,797,368; 4,722,848; 4,790,987; 4,920,209; 5,017,487; 5,077,044; 5,110,587; 5,112,749; 5,174,993; 5,223,424; 5,225,336; 5,240,703; 5,242,829; 5,294,441; 5,294,548; 5,310,668; 5,387,744; 5,389,368; 5,424,065; 5,451,499; 5,453,3 64; 5,462,734; 5,470,734; 5,474,935; 5,482,713; 5,591,439; 5,643,579; 5,650,309; 5,698,202; 5,955,088; 6,034,298; 6,042,836; 6,156,319 및 6,589,529, 이들은 각각 본원에 참고로 도입된다.

본 발명의 백신은 백신 자체가 질병 또는 사망을 일으키지 않도록 안전하고, 질병에 대해 보호성이고, 중화 항체를 유도하고, 보호성 T 세포 반응을 유도하고, 투여의 용이성, 적은 부작용, 생물학적 안정성 및 용량당 저비용을 제공하는 효과적인 백신에 요구되는 특징을 가질 수 있다.

특정 암을 치료하기 위한 조합적 면역원성 조성물

면역원성 조성물은 특정 암 또는 종양을 치료하기 위한 하나 이상의 암 항원과 상기한 항원의 다양한 조합 형태일 수 있다. 하나 이상의 암 항원의 조합에 따라, 다양한 암 또는 다른 종양 유형은 면역원성조성물로 표적화될 수 있다. 이들 암은, 비제한적으로, 전립선암, 폐 암종, 비-소세포 폐 암종, 악성 육종, 유방암, 난소암, 췌장암, 흑색종, 혈액 암(예: 백혈병, 림프종, 골수종), 식도 편평 세포 암종, 방광암, 결장직장암, 식도, 위암, 간암종, 두경부암, 뇌암, 항문암, 활막 암종, 고환암, 간암, 자궁경부암, 재발성 호흡 유두종증, 피부암 및 위암을 포함할 수 있다. 도 6 및 도 7은 특정 암을 치료하는 데 사용될 수 있는 최적화된 컨센서스 항원 및 종양 항원의 특정 조합의 예를 제공한다.

암 항원

면역원성 조성물은 1개 이상의 암 항원, 예를 들어, WT1, MUC1, LMP2, HPV E6 E7, EGFRvIII, HER-2/neu, 개별특이형, MAGE A3, p53 (비-돌연변이체), NY-ESO-1, PSMA, GD2, CEA, MelanA/MART1, Ras-돌연변이체, gp100, p53 돌연변이체, 프로테이나제 3 (PR1), Bcr-abl, 티로시나제, 서바이빈, PSA, hTERT, EphA2, PAP, ML-IAP, AFP, EpCAM, ERG, NA17, PAX3, ALK, 안드로겐 수용체, 사이클린 B1, 폴리시알산, MYCN, TRP-2, RhoC, GD3, 푸코실 GM1, 메소텔린, PSCA, MAGE A1, sLe(a), CYP1B1, PLAC1, GM3 강글리오사이드, BORIS, Tn, GloboH, ETV6-AML, NY-BR-1, RGS5, SART3, STn, 탄산 탈수 효소 IX, PAX5, OY-TES1, 정자 단백질 17, LCK, HMWMAA, 정자 섬유질 외피 단백질, AKAP-4, SSX2, XAGE 1, B7H3, 레구마인, Tie 2, Page4, VEGFR2, MAD-CT-1 (프로타민 2), MAD-CT-2, 및 종양 관련 병리학을 치료하거나 예방하기 위한 FOS-관련 항원을 포함할 수 있다. 면역원성 조성물은 1개 이상의 암 항원 WT1, MUC1, LMP2, HPV E6 E7, EGFRvIII, HER-2/neu, 개별특이형, MAGE A3, p53 (비-돌연변이체), NY-ESO-1, PSMA, GD2, CEA, MelanA/MART1, Ras-돌연변이체, gp100, p53 돌연변이체, 프로테이나제 3 (PR1), Bcr-abl, 티로시나제, 서바이빈, PSA, hTERT, EphA2, PAP, ML-IAP, AFP, EpCAM, ERG, NA17, PAX3, ALK, 안드로겐 수용체, 사이클린 B1, 폴리시알산, MYCN, TRP-2, RhoC, GD3, 푸코실 GM1, 메소텔린, PSCA, MAGE A1, sLe(a), CYP1B1, PLAC1, GM3 강글리오사이드, BORIS, Tn, GloboH, ETV6-AML, NY-BR-1, RGS5, SART3, STn, 탄산 탈수 효소 IX, PAX5, OY-TES1, 정자 단백질 17, LCK, HMWMAA, 정자 섬유질 외피 단백질, AKAP-4, SSX2, XAGE 1, B7H3, 레구마인, Tie 2, Page4, VEGFR2, MAD-CT-1 (프로타민 2), MAD-CT-2, 및 FOS-관련 항원 1을 종양 관련 병리학을 치료하거나 예방하기 위한 최적화된 컨센서스 FAP 항원과 추가로 조합할 수 있다. 암 항원의 다른 조합은 또한 종양 관련 병리학을 치료하거나 예방하기 위해 적용될 수 있다.

전립선암 항원

면역원성 조성물은 전립선암을 치료하거나 예방하기 위해 하나 이상의 암 항원, 예를 들어, PSA, PSMA, 또는 STEAP를 포함할 수 있다(참조: 도 12).면역원성 조성물은 전립선암을 치료하거나 예방하기 위한 FAP 항원을 하나 이상의 암 항원 PSA, PSMA 또는 STEAP와 추가로 조합할 수 있다. 암 항원의 다른 조합은 또한 전립선암을 치료하거나 예방하기 위해 적용될 수 있다. 예시적인 PSA, PSMA 및 STEP 항원뿐만 아니라 이러한 항원을 코딩하는 핵산 분자는 본원에 참조로 인용된 PCT 출원 번호 PCT/US11/60592 및 상응하는 미국 특허 번호 8,927,692에 개시된다.

폐암 항원

면역원성 조성물은 폐암을 치료하거나 예방하기 위해 하나 이상의 암 항원, 예를 들어, TERT, CD22, MAGE-3 및 NY-ESO-1을 포함할 수 있다(참조: 도 13).면역원성 조성물은 폐암을 치료하거나 예방하기 위한 FAP 항원을 하나 이상의 암 항원 TERT, CD22, MAGE-3 및 NY-ESO-1과 추가로 조합할 수 있다. 암 항원의 다른 조합은 또한 폐암을 치료하거나 예방하기 위해 적용될 수 있다.

유방암 항원

면역원성 조성물은 유방암을 치료하거나 예방하기 위해 하나 이상의 암 항원, 예를 들어, HER2, MUC-1, CEA, MAGE-3 및 NY-ESO-1을 포함할 수 있다. 면역원성 조성물은 유방암을 치료하거나 예방하기 위한 FAP 항원과 하나 이상의 암 항원 HER2, MUC-1, CEA, MAGE-3 및 NY-ESO-1과 추가로 조합할 수 있다. 암 항원의 다른 조합은 또한 유방암을 치료하거나 예방하기 위해 적용될 수 있다.

췌장암 항원

면역원성 조성물은 췌장암을 치료하거나 예방하기 위해 하나 이상의 암 항원, 예를 들어, MUC-1, CEA, HER2, 메소텔린, 서바이빈 및 VEGFR2 를 포함할 수 있다. 면역원성 조성물은 췌장암을 치료하거나 예방하기 위한 FAP 항원과 하나 이상의 암 항원 MUC-1, CEA, HER2, 메소텔린, 서바이빈 및 VEGFR2를 추가로 조합할 수 있다. 암 항원의 다른 조합은 또한 췌장암을 치료하거나 예방하기 위해 적용될 수 있다.

흑색종 항원

면역원성 조성물은 흑색종을 치료하거나 예방하기 위해 하나 이상의 암 항원, 예를 들어, 티로시나제, PRAME 또는 GP100-Trp2를 포함할 수 있다. 면역원성 조성물은 흑색종을 치료하거나 예방하기 위한 FAP 항원과 하나 이상의 암 항원 티로시나제, PRAME 또는 GP100-Trp2를 추가로 조합할 수 있다. 암 항원의 다른 조합은 또한 흑색종을 치료하거나 예방하기 위해 적용될 수 있다.

간암 항원

면역원성 조성물은 간암을 치료하거나 예방하기 위해 하나 이상의 암 항원, 예를 들어, HBV 코어 항원, HBV 표면 항원, HCVNS34A, HCVNS5A, HCV NS5B 또는 HCVNS4B를 포함할 수 있다. 면역원성 조성물은 간암을 치료하거나 예방하기 위한 FAP 항원과 하나 이상의 암 항원 HBV 코어 항원, HBV 표면 항원, HCVNS34A, HCVNS5A, HCV NS5B 또는 HCVNS4B를 추가로 조합할 수 있다. 암 항원의 다른 조합은 또한 간암을 치료하거나 예방하기 위해 적용될 수 있다.

교모세포종 항원

면역원성 조성물은 교모세포종을 치료하거나 예방하기 위해 CMV를 포함할 수 있다. 면역원성 조성물은 교모세포종을 치료하거나 예방하기 위한 FAP 항원과 CMV를 추가로 조합할 수 있다. 암 항원의 다른 조합은 또한 교모세포종을 치료하거나 예방하기 위해 적용될 수 있다.

혈액 암 항원 (예: 백혈병, 림프종, 골수종)

면역원성 조성물은 혈액 암, 예를 들어, 백혈병, 림프종 및 골수종을 치료하거나예방하기 위해 하나 이상의 암 항원, 예를 들어, PRAME, WT-1, hTERT를 포함할 수 있다. 면역원성 조성물은 하나 이상의 암 항원 PRAME, WT-1, hTERT를 혈액 암, 예를 들어, 백혈병, 림프종 및 골수종의 FAP 항원과 추가로 조합할 수 있다. 암 항원의 다른 조합은 또한 혈액 암, 예를 들어, 백혈병, 림프종 및 골수종 암을 치료하거나 예방하기 위해 적용될 수 있다.

면역 반응

면역원성 조성물은 조성물이 투여된 대상체에서 면역 반응을 유도할 수 있다. 유도된 면역 반응은 천연 항원에 특이적일 수 있다. 유도된 면역 반응은 최적화된 컨센서스-코딩된 항원과 관련된 천연 항원과 반응성일 수 있다. 다양한 구현예에서, 관련된 항원은 최적화된 컨센서스-코딩된 항원의 아미노산 서열과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 항원을 포함한다. 다양한 구현예에서, 관련된 항원은 본원에 개시된 최적화된 컨센서스 뉴클레오타이드 서열과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 상동성을 갖는 뉴클레오타이드 서열로 코딩된 항원을 포함한다.

면역원성 조성물은 면역원성 조성물이 투여된 대상체에서 체액성 면역 반응을 유도할 수 있다. 유도된 체액성 면역 반응은 천연 항원에 특이적일 수 있다. 유도된 체액성 면역 반응은 최적화된 컨센서스-코딩된 항원에 관련된 천연 항원과 반응성일 수 있다. 체액성 면역 반응은 면역원성 조성물이 투여된 대상체에서 약 1.5배 내지 약 16배, 약 2배 내지 약 12배, 또는 약 3배 내지 약 10배로 유도될 수 있다. 체액성 면역 반응은 면역원성 조성물이 투여되지 않은 대상체 또는 비최적화된 FAP 항원이 투여된 대상체와 비교하여 면역원성 조성물이 투여된 대상체에서 적어도 약 1.5배, 적어도 약 2.0배, 적어도 약 2.5배, 적어도 약 3.0배, 적어도 약 3.5배, 적어도 약 4.0배, 적어도 약 4.5배, 적어도 약 5.0배, 적어도 약 5.5배, 적어도 약 6.0배, 적어도 약 6.5배, 적어도 약 7.0배, 적어도 약 7.5배, 적어도 약 8.0배, 적어도 약 8.5배, 적어도 약 9.0배, 적어도 약 9.5배, 적어도 약 10.0배, 적어도 약 10.5배, 적어도 약 11.0배, 적어도 약 11.5배, 적어도 약 12.0배, 적어도 약 12.5배, 적어도 약 13.0배, 적어도 약 13.5배, 적어도 약 14.0배, 적어도 약 14.5배, 적어도 약 15.0배, 적어도 약 15.5배, 또는 적어도 약 16.0배로 유도될 수 있다.

면역원성 조성물에 의해 유도된 체액성 면역 반응은 면역원성 조성물이 투여되지 않은 대상체와 비교하여 면역원성 조성물이 투여된 대상체와 관련된 중화 항체의 증가된 수준을 포함할 수 있다. 중화 항체는 최적화된 컨센서스-코딩된 항원에 관련된 천연 항원에 특이적일 수 있다. 중화 항체는 최적화된 컨센서스 항원에 유전적으로 관련된 천연 항원과 반응성일 수 있다. 중화 항체는 면역원성 조성물이 투여된 대상체에서 종양 성장, 전이 또는 종양 관련 병리학에 대한 보호 및/또는 치료를 제공할 수 있다.

면역원성 조성물에 의해 유도된 체액성 면역 반응은 면역원성 조성물이 투여되지 않은 대상체와 비교하여 면역원성 조성물이 투여된 대상체와 관련된 IgG 항체의 증가된 수준을 포함할 수 있다. 이들 IgG 항체는 최적화된 컨센서스 항원에 유전적으로 관련된 천연 항원에 특이적일 수 있다. 이들 IgG 항체는 최적화된 컨센서스 항원에 유전적으로 관련된 천연 항원과 반응성일 수 있다. 면역원성 조성물이 투여된 대상체와 관련된 IgG 항체의 수준은 면역원성 조성물이 투여되지 않은 대상체와 비교하여 약 1.5배 내지 약 16배, 약 2배 내지 약 12배, 또는 약 3배 내지 약 10배로 증가될 수 있다. 면역원성 조성물이 투여된 대상체와 관련된 IgG 항체의 수준은 면역원성 조성물이 투여되지 않은 대상체 또는 비최적화된 FAP 항원이 투여된 대상체와 비교하여 적어도 약 1.5배, 적어도 약 2.0배, 적어도 약 2.5배, 적어도 약 3.0배, 적어도 약 3.5배, 적어도 약 4.0배, 적어도 약 4.5배, 적어도 약 5.0배, 적어도 약 5.5배, 적어도 약 6.0배, 적어도 약 6.5배, 적어도 약 7.0배, 적어도 약 7.5배, 적어도 약 8.0배, 적어도 약 8.5배, 적어도 약 9.0배, 적어도 약 9.5배, 적어도 약 10.0배, 적어도 약 10.5배, 적어도 약 11.0배, 적어도 약 11.5배, 적어도 약 12.0배, 적어도 약 12.5배, 적어도 약 13.0배, 적어도 약 13.5배, 적어도 약 14.0배, 적어도 약 14.5배, 적어도 약 15.0배, 적어도 약 15.5배, 또는 적어도 약 16.0배로 증가될 수 있다.

면역원성 조성물은 면역원성 조성물이 투여된 대상체에서 세포 면역 반응을 유도할 수 있다. 유도된 세포 면역 반응은 최적화된 컨센서스-코딩된 항원에 관련된 천연 항원에 특이적일 수 있다. 유도된 세포 면역 반응은 최적화된 컨센서스-코딩된 항원에 관련된 천연 항원에 반응성일 수 있다. 유도된 세포 면역 반응은 CD8⁺ T 세포 반응을 유도하는 단계를 포함할 수 있다. 유도된 CD8⁺ T 세포 반응은 최적화된 컨센서스 항원에 유전적으로 관련된 천연 항원과 반응성일 수 있다. 유도된 CD8⁺ T 세포 반응은 다작용성일 수 있다. 유도된 세포 면역 반응은 CD8⁺ T 세포 반응을 유도하는 단계를 포함할 수 있고, 여기서 상기 CD8⁺ T 세포는 인터페론-감마 (IFN-γ), 종양 괴사 인자 알파 (TNF-α), 인터류킨-2 (IL-2), 또는 IFN-γ 및 TNF-α의 조합을 생산한다.

유도된 세포 면역 반응은 면역원성 조성물이 투여되지 않은 대상체와 비교하여 면역원성 조성물이 투여된 대상체와 관련된 증가된 CD8⁺ T 세포 반응을 포함할 수 있다. 면역원성 조성물이 투여된 대상체와 관련된 CD8⁺ T 세포 반응은 면역원성 조성물이 투여되지 않은 대상체와 비교하여 약 2배 내지 약 30배, 약 3배 내지 약 25배, 또는 약 4배 내지 약 20배로 증가될 수 있다. 면역원성 조성물이 투여된 대상체와 관련된 CD8⁺ T 세포 반응은 면역원성 조성물이 투여되지 않은 대상체 또는 비최적화된 FAP 항원이 투여된 대상체와 비교하여 적어도 약 1.5배, 적어도 약 2.0배, 적어도 약 3.0배, 적어도 약 4.0배, 적어도 약 5.0배, 적어도 약 6.0배, 적어도 약 6.5배, 적어도 약 7.0배, 적어도 약 7.5배, 적어도 약 8.0배, 적어도 약 8.5배, 적어도 약 9.0배, 적어도 약 9.5배, 적어도 약 10.0배, 적어도 약 10.5배, 적어도 약 11.0배, 적어도 약 11.5배, 적어도 약 12.0배, 적어도 약 12.5배, 적어도 약 13.0배, 적어도 약 13.5배, 적어도 약 14.0배, 적어도 약 14.5배, 적어도 약 15.0배, 적어도 약 16.0배, 적어도 약 17.0배, 적어도 약 18.0배, 적어도 약 19.0배, 적어도 약 20.0배, 적어도 약 21.0배, 적어도 약 22.0배, 적어도 약 23.0배, 적어도 약 24.0배, 적어도 약 25.0배, 적어도 약 26.0배, 적어도 약 27.0배, 적어도 약 28.0배, 적어도 약 29.0배, 또는 적어도 약 30.0배로 증가될 수 있다.

유도된 세포 면역 반응은 천연 항원에 대해 반응성인 CD107a/IFNγ/T-bet 삼중-양성 CD8 T 세포의 증가된 빈도를 포함할 수 있다. 면역원성 조성물이 투여된 대상체와 관련된 CD107a/IFNγ/T-bet 삼중-양성 CD8 T 세포의 빈도는 면역원성 조성물이 투여되지 않은 대상체 또는 비최적화된 FAP 항원이 투여된 대상체와 비교하여 적어도 약 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 11배, 12배, 13배, 14배, 15배, 16배, 17배, 18배, 19배, 또는 20배로 증가될 수 있다.

유도된 세포 면역 반응은 천연 항원에 대해 반응성인 CD107a/IFNγ 이중-양성 CD8 T 세포의 증가된 빈도를 포함할 수 있다. 면역원성 조성물이 투여된 대상체와 관련된 CD107a/IFNγ 이중-양성 CD8 T 세포의 빈도는 면역원성 조성물이 투여되지 않은 대상체 또는 비최적화된 FAP 항원이 투여된 대상체와 비교하여 적어도 약 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 11배, 12배, 13배, 또는 14배로 증가될 수 있다.

면역원성 조성물에 의해 유도된 세포 면역 반응은 CD4⁺ T 세포 반응을 유도하는 단계를 포함할 수 있다. 유도된 CD4⁺ T 세포 반응은 최적화된 컨센서스 항원에 유전적으로 관련된 천연 항원과 반응성일 수 있다. 유도된 CD4⁺ T 세포 반응은 다작용성일 수 있다. 유도된 세포 면역 반응은 CD4⁺ T 세포 반응을 유도하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 CD4⁺ T 세포는 IFN-γ, TNF-α, IL-2, 또는 IFN-γ 및 TNF-α의 조합을 생산한다.

유도된 세포 면역 반응은 IFN-γ를 생산하는 CD4⁺ T 세포의 증가된 빈도를 포함할 수 있다. 면역원성 조성물이 투여된 대상체와 관련된 CD4⁺IFN-γ⁺ T 세포의 빈도는 면역원성 조성물이 투여되지 않은 대상체 또는 비최적화된 FAP 항원이 투여된 대상체와 비교하여 적어도 약 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 11배, 12배, 13배, 14배, 15배, 16배, 17배, 18배, 19배, 또는 20배로 증가될 수 있다.

유도된 세포 면역 반응은 TNF-α를 생산하는 CD4⁺ T 세포의 증가된 빈도를 포함할 수 있다. 면역원성 조성물이 투여된 대상체와 관련된 CD4⁺TNF-α⁺ T 세포의 빈도는 면역원성 조성물이 투여되지 않은 대상체 또는 비최적화된 FAP 항원이 투여된 대상체와 비교하여 적어도 약 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 11배, 12배, 13배, 14배, 15배, 16배, 17배, 18배, 19배, 20배, 21배, 또는 22배로 증가될 수 있다.

유도된 세포 면역 반응은 IFN-γ 및 TNF-α 둘 다를 생산하는 CD4⁺ T 세포의 증가된 빈도를 포함할 수 있다. 면역원성 조성물이 투여된 대상체와 관련된 CD4⁺IFN-γ⁺TNF-α⁺의 빈도는 면역원성 조성물이 투여되지 않은 대상체 또는 비최적화된 FAP 항원이 투여된 대상체와 비교하여 적어도 약 2배, 2.5배, 3.0배, 3.5배, 4.0배, 4.5배, 5.0배, 5.5배, 6.0배, 6.5배, 7.0배, 7.5배, 8.0배, 8.5배, 9.0배, 9.5배, 10.0배, 10.5배, 11.0배, 11.5배, 12.0배, 12.5배, 13.0배, 13.5배, 14.0배, 14.5배, 15.0배, 15.5배, 16.0배, 16.5배, 17.0배, 17.5배, 18.0배, 18.5배, 19.0배, 19.5배, 20.0배, 21배, 22배, 23배 24배, 25배, 26배, 27배, 28배, 29배, 30배, 31배, 32배, 33배, 34배, 또는 35배로 증가될 수 있다.

본 발명의 면역원성 조성물은 백신 자체가 질병 또는 사망을 일으키지 않도록 안전하고, 간 병원체, 예를 들어, 바이러스 또는 박테리아에의 노출로 인해 생성되는 질병에 대해 보호성이고, 세포의 발명을 예방하기 위해 중화 항체를 유도하고, 세포내 병원체에 대한 보호성 T 세포를 유도하고, 투여의 용이성, 적은 부작용, 생물학적 안정성 및 용량당 적은 비용을 제공하는 효과적인 백신에 요구되는 특징을 가질 수 있다.

면역원성 조성물은 근육 또는 피부와 같은 상이한 조직에 투여될 때 면역 반응을 추가로 유도할 수 있다. 면역원성 조성물은 전기천공을 통해 또는 주사 또는 피하로 또는 근육내로 투여될 때 면역 반응을 추가로 유도할 수 있다.

단편

일 구현예에서, 면역원성 단편은 본 발명의 전장 항원의 면역원성 단편이다. 본원에 사용된 바와 같이, 면역원성 단편은 전장 서열의 면역 반응과 상당히 유사한 면역 반응을 유도할 수 있는 전장 핵산 또는 아미노산 서열의 단편이다. 일 구현예에서, 면역원성 단편은 전장 서열의 면역원성 에피토프를 포함한다. 일 구현예에서, 면역원성 단편은 전장 서열과 비교하여 면역 반응을 적어도 약 0.7배, 적어도 약 0.8배, 적어도 약 0.9배, 적어도 약 1.0배, 적어도 약 1.1배, 적어도 약 1.2배, 적어도 약 1.3배, 적어도 약 1.4배, 적어도 약 1.5배, 적어도 약 2.0배 또는 2.0배 초과로 유도한다.

면역원성 단편은 면역원성 단편이 투여된 대상체에서 체액성 면역 반응을 유도할 수 있다. 체액성 면역 반응은 면역원성 단편이 투여된 대상체에서 약 1.5배 내지 약 16배, 약 2배 내지 약 12배, 또는 약 3배 내지 약 10배로 유도될 수 있다. 체액성 면역 반응은 면역원성 단편이 투여되지 않은 대상체와 비교하여 면역원성 단편이 투여된 대상체에서 적어도 약 1.5배, 적어도 약 2.0배, 적어도 약 2.5배, 적어도 약 3.0배, 적어도 약 3.5배, 적어도 약 4.0배, 적어도 약 4.5배, 적어도 약 5.0배, 적어도 약 5.5배, 적어도 약 6.0배, 적어도 약 6.5배, 적어도 약 7.0배, 적어도 약 7.5배, 적어도 약 8.0배, 적어도 약 8.5배, 적어도 약 9.0배, 적어도 약 9.5배, 적어도 약 10.0배, 적어도 약 10.5배, 적어도 약 11.0배, 적어도 약 11.5배, 적어도 약 12.0배, 적어도 약 12.5배, 적어도 약 13.0배, 적어도 약 13.5배, 적어도 약 14.0배, 적어도 약 14.5배, 적어도 약 15.0배, 적어도 약 15.5배, 또는 적어도 약 16.0배로 유도될 수 있다.

면역원성 단편에 의해 유도된 체액성 면역 반응은 면역원성 단편이 투여되지 않은 대상체와 비교하여 면역원성 단편이 투여된 대상체와 관련된 IgG 항체의 증가된 수준을 포함할 수 있다. 면역원성 단편이 투여된 대상체와 관련된 IgG 항체의 수준은 면역원성 단편이 투여되지 않은 대상체와 비교하여 약 1.5배 내지 약 16배, 약 2배 내지 약 12배, 또는 약 3배 내로 약 10배로 증가될 수 있다. 면역원성 단편이 투여된 대상체와 관련된 IgG 항체의 수준은 면역원성 단편이 투여되지 않은 대상체와 비교하여 적어도 약 1.5배, 적어도 약 2.0배, 적어도 약 2.5배, 적어도 약 3.0배, 적어도 약 3.5배, 적어도 약 4.0배, 적어도 약 4.5배, 적어도 약 5.0배, 적어도 약 5.5배, 적어도 약 6.0배, 적어도 약 6.5배, 적어도 약 7.0배, 적어도 약 7.5배, 적어도 약 8.0배, 적어도 약 8.5배, 적어도 약 9.0배, 적어도 약 9.5배, 적어도 약 10.0배, 적어도 약 10.5배, 적어도 약 11.0배, 적어도 약 11.5배, 적어도 약 12.0배, 적어도 약 12.5배, 적어도 약 13.0배, 적어도 약 13.5배, 적어도 약 14.0배, 적어도 약 14.5배, 적어도 약 15.0배, 적어도 약 15.5배, 또는 적어도 약 16.0배로 증가될 수 있다.

면역원성 단편은 면역원성 단편이 투여된 대상체에서 세포 면역 반응을 유도할 수 있다. 유도된 세포 면역 반응은 최적화된 컨센서스-코딩된 항원에 관련된 천연 항원에 특이적일 수 있다. 유도된 세포 면역 반응은 최적화된 컨센서스-코딩된 항원에 관련된 천연 항원에 반응성일 수 있다. 유도된 세포 면역 반응은 CD8⁺ T 세포 반응을 유도하는 단계를 포함할 수 있다. 유도된 CD8⁺ T 세포 반응은 최적화된 컨센서스 항원에 유전적으로 관련된 천연 항원과 반응성일 수 있다. 유도된 CD8⁺ T 세포 반응은 다작용성일 수 있다. 유도된 세포 면역 반응은 CD8⁺ T 세포 반응을 유도하는 단계를 포함할 수 있고, 여기서 상기 CD8⁺ T 세포는 인터페론-감마 (IFN-γ), 종양 괴사 인자 알파 (TNF-α), 인터류킨-2 (IL-2), 또는 IFN-γ 및 TNF-α의 조합을 생산한다.

유도된 세포 면역 반응은 면역원성 단편이 투여되지 않은 대상체와 비교하여 면역원성 단편이 투여된 대상체와 관련된 증가된 CD8⁺ T 세포 반응을 포함할 수 있다. 면역원성 단편이 투여된 대상체와 관련된 CD8⁺ T 세포 반응은 면역원성 단편이 투여되지 않은 대상체와 비교하여 약 2배 내지 약 30배, 약 3배 내지 약 25배, 또는 약 4배 내지 약 20배로 증가될 수 있다. 면역원성 단편이 투여된 대상체와 관련된 CD8⁺ T 세포 반응은 면역원성 단편이 투여되지 않은 대상체와 비교하여 적어도 약 1.5배, 적어도 약 2.0배, 적어도 약 3.0배, 적어도 약 4.0배, 적어도 약 5.0배, 적어도 약 6.0배, 적어도 약 6.5배, 적어도 약 7.0배, 적어도 약 7.5배, 적어도 약 8.0배, 적어도 약 8.5배, 적어도 약 9.0배, 적어도 약 9.5배, 적어도 약 10.0배, 적어도 약 10.5배, 적어도 약 11.0배, 적어도 약 11.5배, 적어도 약 12.0배, 적어도 약 12.5배, 적어도 약 13.0배, 적어도 약 13.5배, 적어도 약 14.0배, 적어도 약 14.5배, 적어도 약 15.0배, 적어도 약 16.0배, 적어도 약 17.0배, 적어도 약 18.0배, 적어도 약 19.0배, 적어도 약 20.0배, 적어도 약 21.0배, 적어도 약 22.0배, 적어도 약 23.0배, 적어도 약 24.0배, 적어도 약 25.0배, 적어도 약 26.0배, 적어도 약 27.0배, 적어도 약 28.0배, 적어도 약 29.0배, 또는 적어도 약 30.0배로 증가될 수 있다.

유도된 세포 면역 반응은 천연 항원에 대해 반응성인 CD107a/IFNγ/T-bet 삼중-양성 CD8 T 세포의 증가된 빈도를 포함할 수 있다. 면역원성 단편이 투여된 대상체와 관련된 CD107a/IFNγ/T-bet 삼중-양성 CD8 T 세포의 빈도는 면역원성 단편이 투여되지 않은 대상체와 비교하여 적어도 약 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 11배, 12배, 13배, 14배, 15배, 16배, 17배, 18배, 19배, 또는 20배로 증가될 수 있다.

유도된 세포 면역 반응은 천연 항원에 대해 반응성인 CD107a/IFNγ 이중-양성 CD8 T 세포의 증가된 빈도를 포함할 수 있다. 면역원성 단편이 투여된 대상체와 관련된 CD107a/IFNγ 이중-양성 CD8 T 세포의 빈도는 면역원성이 투여되지 않은 대상체와 비교하여 적어도 약 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 11배, 12배, 13배, 또는 14배로 증가될 수 있다.

면역원성 단편에 의해 유도된 세포 면역 반응은 CD4⁺ T 세포 반응을 유도하는 단계를 포함할 수 있다. 유도된 CD4⁺ T 세포 반응은 최적화된 컨센서스 항원에 유전적으로 관련된 천연 항원과 반응성일 수 있다. 유도된 CD4⁺ T 세포 반응은 다작용성일 수 있다. 유도된 세포 면역 반응은 CD4⁺ T 세포 반응을 유도하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 CD4⁺ T 세포는 IFN-γ, TNF-α, IL-2, 또는 IFN-γ 및 TNF-α의 조합을 생산한다.

유도된 세포 면역 반응은 IFN-γ를 생산하는 CD4⁺ T 세포의 증가된 빈도를 포함할 수 있다. 면역원성 단편이 투여된 대상체와 관련된 CD4⁺IFN-γ⁺ T 세포의 빈도는 면역원성 단편이 투여되지 않은 대상체와 비교하여 적어도 약 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 11배, 12배, 13배, 14배, 15배, 16배, 17배, 18배, 19배, 또는 20배로 증가될 수 있다.

유도된 세포 면역 반응은 TNF-α를 생산하는 CD4⁺ T 세포의 증가된 빈도를 포함할 수 있다. 면역원성 단편이 투여된 대상체와 관련된 CD4⁺TNF-α⁺ T 세포의 빈도는 면역원성 단편이 투여되지 않은 대상체와 비교하여 적어도 약 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 11배, 12배, 13배, 14배, 15배, 16배, 17배, 18배, 19배, 20배, 21배, 또는 22배로 증가될 수 있다.

유도된 세포 면역 반응은 IFN-γ 및 TNF-α 둘 다를 생산하는 CD4⁺ T 세포의 증가된 빈도를 포함할 수 있다. 면역원성 단편이 투여된 대상체와 관련된 CD4⁺IFN-γ⁺TNF-α⁺의 빈도는 면역원성 단편이 투여되지 않은 대상체와 비교하여 적어도 약 2배, 2.5배, 3.0배, 3.5배, 4.0배, 4.5배, 5.0배, 5.5배, 6.0배, 6.5배, 7.0배, 7.5배, 8.0배, 8.5배, 9.0배, 9.5배, 10.0배, 10.5배, 11.0배, 11.5배, 12.0배, 12.5배, 13.0배, 13.5배, 14.0배, 14.5배, 15.0배, 15.5배, 16.0배, 16.5배, 17.0배, 17.5배, 18.0배, 18.5배, 19.0배, 19.5배, 20.0배, 21배, 22배, 23배 24배, 25배, 26배, 27배, 28배, 29배, 30배, 31배, 32배, 33배, 34배, 또는 35배로 증가될 수 있다.

본 발명의 면역원성 단편은, 예를 들어, 백신 자체가 질병 또는 사망을 일으키지 않도록 안전하고, 바이러스 또는 박테리아와 같은 생병원체에의 노출로 인한 질병에 대해 보호성이고, 세포의 발명을 예방하기 위해 중화 항체를 유도하고, 세포내 병원체에 대한 보호성 T 세포를 유도하고, 투여의 용이성, 적은 부작용, 생물학적 안정성 및 용량당 낮은 비용을 제공하는 효과적인 백신에 필요한 특징을 가질 수 있다.

면역원성 단편은 근육 또는 피부와 같은 상이한 조직에 투여될 때 면역 반응을 추가로 유도할 수 있다. 면역원성 단편은 전기천공을 통해, 또는 주사, 또는 피하로 또는 근육내로 투여될 때 면역 반응을 추가로 유도할 수 있다.

벡터

면역원성 조성물은 항원을 코딩하는 최적화된 컨센서스 뉴클레오타이드를 포함하는 하나 이상의 벡터를 포함할 수 있다. 하나 이상의 벡터는 항원을 발현시킬 수 있다. 벡터는 복제의 기원을 함유하는 뉴클레오타이드 서열을 가질 수 있다. 벡터는 플라스미드, 박테리오파아지, 박테리아 인공 염색체 또는 효모 인공 염색체일 수 있다. 벡터는 자가-복제 염색체외 벡터 또는 숙주 게놈에 통합되는 벡터일 수 있다.

하나 이상의 벡터는 일반적으로 특정 유전자를 표적 세포로 도입하는데 사용되는 플라스미드인 발현 작제물일 수 있다. 발현 벡터가 세포 내부에 있으면, 유전자에 의해 코딩되는 단백질은 세포-전사 및 번역 기계 리보솜 복합체에 의해 생산된다. 플라스미드는 인핸서 및 프로모터 영역으로 작용하고 발현 벡터 상에 운반된 유전자의 효율적인 전사를 유도하는 조절 서열을 함유하도록 빈번하게 조작된다. 본 발명의 벡터는 다량의 안정한 메신저 RNA를 발현하고, 따라서 단백질을 발현한다.

벡터는 강한 프로모터, 강한 종결 코돈, 프로모터와 클로닝된 유전자 사이의 거리 조정, 및 전사 종결 서열 및 PTIS (휴대용 번역 개시 서열)의 삽입과 같은 발현 신호를 가질 수 있다.

(1) 발현 벡터

벡터는 원형 플라스미드 또는 선형 핵산일 수 있다. 원형 플라스미드 및 선형 핵산은 적합한 대상체 세포에서 특정 뉴클레오타이드 서열의 발현을 지시할 수 있다. 벡터는 종결 신호에 작동가능하게 연결될 수 있는 항원-코딩 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 가질 수 있다. 벡터는 또한 뉴클레오타이드 서열의 적절한 번역에 필요한 서열을 함유할 수 있다. 관심 있는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터는 키메라일 수 있고, 이의 성분 중 적어도 하나가 이의 다른 성분 중 적어도 하나에 대해 이종성임을 의미한다. 발현 카세트에서 뉴클레오타이드 서열의 발현은 숙주 세포가 일부 특정 외부 자극에 노출될 때만 전사를 개시하는 구성적 프로모터 또는 유도성 프로모터의 조절하에 있을 수 있다. 다중세포 유기체의 경우, 프로모터는 또한 특정 조직 또는 장기 또는 발달 단계에 특이적일 수 있다.

(2) RNA 벡터

일 구현예에서, 핵산은 RNA 분자이다. 따라서, 일 구현예에서, 본 발명은 하나 이상의 MAYV 항원을 코딩하는 RNA 분자를 제공한다. RNA는 플러스-가닥일 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, RNA 분자는 역전사와 같은 임의의 중재 복제 단계를 필요로 하지 않고 세포로 번역될 수 있다. 본 발명에 유용한 RNA 분자는 5′ 캡(예: 7-메틸구아노신)을 가질 수 있다. 이 캡은 RNA의 생체내 번역을 향상시킬 수 있다. 본 발명에 유용한 RNA 분자의 5′ 뉴클레오타이드는 5′ 트리포스페이트 그룹을 가질 수 있다. 캡핑된 RNA에서, 이는 5′'-대-5′ 브릿지를 통해 7-메틸구아노신에 연결될 수 있다. RNA 분자는 3′ 폴리-A 테일을 가질 수 있다. 그것은 또한 이의 3' 말단 근처에 폴리-A 중합효소 인식 서열(예: AAUAAA)을 포함할 수 있다. 본 발명에 유용한 RNA 분자는 단일-가닥일 수 있다. 일부 구현예에서, RNA 분자는 네이키드 RNA 분자이다. 일 구현예에서, RNA 분자는 벡터 내에 포함된다.

일 구현예에서, RNA는 5' 및 3' UTR을 갖는다. 일 구현예에서, 5' UTR은 길이가 0 내지 3000개의 뉴클레오타이드이다. 코딩 영역에 첨가되는 5' 및 3' UTR 서열의 길이는, 비제한적으로, UTR의 상이한 영역에 어닐링되는 PCR을 위한 프라이머를 설계하는 단계를 포함하는 상이한 방법에 의해 변경될 수 있다. 이 접근법을 사용하여, 당업자는 전사된 RNA의 형질감염 후 최적의 번역 효율을달성하는 데 필요한 5' 및 3' UTR 길이를 변형할 수 있다.

5' 및 3' UTR은 관심 있는 유전자에 대해 자연 발생적 내인성 5' 및 3' UTR일 수 있다. 대안적으로, 관심 있는 유전자에 내인성이 아닌 UTR 서열은 UTR 서열을 전방 및 역방향 프라이머에 도입하거나 템플레이트의 임의의 다른 변형에 의해 첨가될 수 있다. 관심 있는 유전자에 내인성이 아닌 UTR 서열의 사용은 RNA의 안정성 및/또는 번역 효율을 변형하는데 유용할 수 있다. 예를 들어, 3' UTR 서열 중 AU-풍부 요소는 RNA의 안정성을 감소시킬 수 있음이 공지되어 있다. 따라서, 3' UTR은 당업계에 익히 공지된 UTR의 특성에 기초하여 전사된 RNA의안정성을 증가시키도록 선택되거나 설계될 수 있다.

일 구현예에서, 5' UTR은 내인성 유전자의 코작 서열을 함유할 수 있다. 대안적으로, 관심 있는 유전자에 내인성이 아닌 5' UTR이 상기한 바와 같이 PCR에 의해 첨가될 때, 컨센서스 코작 서열은 5' UTR 서열을 첨가하여 재설계될 수 있다. 코작 서열은 일부 RNA 전사체의 번역 효율을 증가시킬 수 있지만, 모든 RNA가효율적인 번역을 가능하게 하는데 필요한 것으로 나타나지 않는다. 많은 RNA를 위한 코작 서열에 대한 요건은 당업계에 공지되어 있다. 다른 구현예에서, 5' UTR은 RNA 게놈이 세포에서 안정한 RNA 바이러스로부터 유래될 수 있다. 다른 구현예에서, 다양한 뉴클레오타이드 유사체는 3' 또는 5' UTR에 사용되어 RNA의 엑소뉴클레아제 분해를 방해할 수 있다.

일 구현예에서, RNA는 리보솜 결합, 번역의 개시 및 세포내 RNA의 안정성을 결정하는 5' 말단 상의 캡 및 3' 폴리(A) 테일 모두를 갖는다.

일 구현예에서, RNA는 뉴클레오사이드-변형된 RNA이다. 뉴클레오사이드-변형된 RNA는, 예를 들어, 증가된 안정성, 낮거나 부재하는 선천적인 면역원성 및 향상된 번역을 포함하여 비변형된 RNA에 비해 특별한 이점을 갖는다.

(3) 원형 및 선형 벡터

벡터는 세포 게놈 내로의 통합에 의해 표적 세포를 형질전환시키거나 염색체외로 존재할 수 있는 원형 플라스미드(예: 복제의 기원을 갖는 자율적 복제 플라스미드)일 수 있다.

벡터는 pVAX, pcDNA3.0, 또는 provax, 또는 항원을 코딩하는 DNA를 발현할 수 있고 세포가 서열을 면역계에 의해 인식되는 항원으로 번역할 수 있게 하는 임의의 다른 발현 벡터일 수 있다.

또한, 선형 핵산 면역원성 조성물, 또는 전기천공을 통해 대상체에게 효율적으로전달될 수 있고 하나 이상의 목적하는 항원을 발현할 수 있는 선형 발현 카세트 ("LEC")가 본원에 제공된다. LEC는 임의의 포스페이트 골격이 결여된 임의의 선형 DNA일 수 있다. DNA는 하나 이상의 항원을 코딩할 수 있다. LEC는 프로모터, 인트론, 정지 코돈 및/또는 폴리아데닐화 신호를 함유할 수 있다. 항원의 발현은 프로모터에 의해 조절될 수 있다. LEC는 임의의 항생제 내성 유전자 및/또는 포스페이트 골격을 함유하지 않을 수있다. LEC는 목적하는 항원 유전자 발현에 관련되지 않는 다른 뉴클레오타이드 서열을 함유하지 않을 수 있다.

LEC는 선형화될 수 있는 임의의 플라스미드로부터 유래될 수 있다. 플라스미드는 항원을 발현할 수 있다. 플라스미드는 pNP (Puerto Rico/34) 또는 pM2 (New Caledonia/99)일 수 있다. 플라스미드는 WLV009, pVAX, pcDNA3.0, 또는 provax, 또는 항원을 코딩하는 DNA를 발현할 수 있고 세포가 서열을 면역계에 의해 인식되는 항원으로 번역할 수 있게 하는 임의의 다른 발현 벡터일 수 있다.

LEC는 pcrM2일 수 있다. LEC는 pcrNP일 수 있다. pcrNP 및 pcrMR은 각각 pNP (Puerto Rico/34) 및 pM2 (New Caledonia/99)로부터 유래될 수 있다.

(4) 프로모터, 인트론, 정지 코돈, 및 폴리아데닐화 신호

벡터는 프로모터를 가질 수 있다. 프로모터는 유전자 발현을 구동하고, 단리된 핵산의 발현을 조절할 수 있는 임의의 프로모터일 수 있다. 이러한 프로모터는 본원에 기재된 항원 서열을 전사하는 DNA 의존적 RNA 중합효소를 통해 전사에 필요한 시스-작용 서열 요소이다. 이종 핵산의 발현을 지시하는데 사용되는 프로모터의 선택은 특정 용도에 좌우된다. 프로모터는 이의 자연 환경에서의 전사 개시 부위로부터 그대로 벡터에서의 전사 개시로부터 대략 동일한 거리에 위치될 수 있다. 그러나, 이 거리의 변화는 프로모터 기능의 손실 없이 수용될 수 있다.

프로모터는 전사체의 효율적인 폴리아데닐화, 리보솜 결합 부위 및 번역 종결에필요한 항원 및 신호를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 프로모터는 CMV 프로모터, SV40 초기 프로모터, SV40 후기 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터, 뮤린 유선 종양 바이러스 프로모터, 라우스 육종 바이러스 프로모터, 폴리헤드린 프로모터, 또는 진핵 세포에서 발현에 효과적인 것으로 나타난 또 다른 프로모터일 수 있다.

벡터는 기능적 스플라이스 공여체 및 수용체 부위를 갖는 인핸서 및 인트론을 포함할 수 있다. 벡터는 효율적인 종결을 제공하기 위해 구조 유전자의 전사 종결 영역 다운스트림을 함유할 수 있다. 종결 영역은 프로모터 서열과 동일한 유전자로부터 수득될 수 있거나 상이한 유전자로부터 수득될 수 있다.

다중 벡터

면역원성 조성물은 단일 플라스미드와 같은 단일 핵산 분자의 복수의 카피, 또는 둘 이상의 상이한 플라스미드와 같은 둘 이상의 상이한 핵산 분자의 복수의 카피를 포함할 수 있다. 예를 들어, 면역원성 조성물은 복수의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 이상의 상이한 핵산 분자를 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 복수의 2, 3, 4, 5, 6개 이상의 상이한 플라스미드를 포함할 수 있다.

면역원성 조성물은 단일 항원에 대한 코딩 서열을 집합적으로 함유하는 플라스미드와 같은 핵산 분자를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 항원은 FAP이다. 면역원성 조성물은 다중 항원에 대한 코딩 서열을 집합적으로 함유하는 플라스미드와 같은 핵산 분자를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 항원은 FAP 및 추가의 암 항원으로부터 선택된 다중 항원이다. 하나의 예시적인 구현예에서, 항원은 FAP 및 TERT이다. 또 다른 예시적인 구현예에서, 항원은 FAP 및 PSMA이다. 면역원성 조성물은 하나 이상의 항원 및 하나 이상의 암 항원에 대한 코딩 서열을 집합적으로 함유하는 플라스미드와 같은 핵산 분자를 포함할 수 있다.

부형제 및 면역원성 조성물의 다른 성분

면역원성 조성물은 약제학적으로 허용되는 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 부형제는 비히클, 아쥬반트, 담체 또는 희석제로서의 기능적 분자일 수 있다. 약제학적으로 허용되는 부형제는 표면 활성제, 예를 들어, 면역-자극성 복합체 (ISCOMS), 프로인트 불완전 아쥬반트, 모노포스포릴 지질 A를 포함하는 LPS 유사체, 뮤라밀 펩타이드, 퀴논 유사체, 스쿠알렌 및 스쿠알렌과 같은 소포, 히알루론산, 지질, 리포좀, 칼슘 이온, 바이러스성 단백질, 다중 음이온, 다중 양이온 또는 나노입자를 포함할 수 있는 형질감염 촉진제, 또는 다른 공지된 형질감염 촉진제일 수 있다.

형질감염 촉진제는 다중 음이온, 폴리-L-글루타메이트 (LGS)를 포함하는 다중 양이온, 또는 지질이다. 형질감염 촉진제는 폴리-L-글루타메이트이고, 더 바람직하게는, 폴리-L-글루타메이트는 6 mg/ml 미만의 농도로 면역원성 조성물에 존재한다. 형질감염 촉진제는 또한 표면 활성제, 예를 들어, 면역-자극성 복합체 (ISCOMS), 프로인트 불완전 아쥬반트, 모노포스포릴 지질 A를 포함하는 LPS 유사체, 뮤라밀 펩타이드, 퀴논 유사체 및 소포, 예를 들어, 스쿠알렌 및 스쿠알렌을 포함할 수 있고, 히알루론산은 또한 사용되어 유전적 작제물과 함께 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, DNA 플라스미드-기반 면역원성 조성물은 또한 형질감염 촉진제, 예를 들어, 지질, 레시틴 리포좀 또는 DNA-리포좀 혼합물 (참조: 예를 들어 W09324640)로서 당업계에 공지된 다른 리포좀을 포함하는 리포좀, 칼슘 이온, 바이러스성 단백질, 다중 음이온, 다중 양이온, 또는 나노입자, 또는 다른 공지된 형질감염 촉진제를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 형질감염 촉진제는 다중 음이온, 폴리-L-글루타메이트 (LGS)를 포함하는 다중 양이온, 또는 지질이다. 면역원성 조성물 중 형질감염제의 농도는 4 mg/ml 미만, 2 mg/ml 미만, 1 mg/ml 미만, 0.750 mg/ml 미만, 0.500 mg/ml 미만, 0.250 mg/ml 미만, 0.100 mg/ml 미만, 0.050 mg/ml 미만 또는 0.010 mg/ml 미만이다.

약제학적으로 허용되는 부형제는 하나 이상의 아쥬반트일 수 있다. 아쥬반트는 동일한 플라스미드 또는 대안의 플라스미드로부터 발현되거나 면역원성 조성물에서 상기 플라스미드와 함께 단백질로서 전달되는 다른 유전자일 수 있다. 하나 이상의 아쥬반트는 단백질 및/또는 하기로 구성된 군으로부터 선택된 단백질을 코딩하는 핵산 분자일 수 있다: CCL20, α-인터페론 (IFN- α), β-인터페론 (IFN-β), γ-인터페론, 혈소판 유래된 성장 인자 (PDGF), TNFα, TNFβ, GM-CSF, 표피 성장 인자 (EGF), 피부 T 세포-유인 케모카인 (CTACK), 상피 흉선-발현된 케모카인 (TECK), 점막-관련 상피 케모카인 (MEC), IL-12, IL-15, IL-18, IL-23, IL-28, MHC, CD80, CD86, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-18, MCP-1, MIP-lα, MIP-1β, IL-8, L-셀렉틴, P-셀렉틴, E-셀렉틴, CD34, GlyCAM-1, MadCAM-1, LFA-1, VLA-1, Mac-1, pl50.95, PECAM, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, CD2, LFA-3, M-CSF, G-CSF, IL-18의 돌연변이체 형태, CD40, CD40L, 혈관 성장 인자, 섬유아세포 성장 인자, IL-7, 신경 성장 인자, 혈관 내피 성장 인자, Fas, TNF 수용체, Flt, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6, 카스파제 ICE, Fos, c-jun, Sp-1, Ap-1, Ap-2, p38, p65Rel, MyD88, IRAK, TRAF6, IkB, 불활성 NIK, SAP K, SAP-1, JNK, 인터페론 반응 유전자, NFkB, Bax, TRAIL, TRAILrec, TRAILrecDRC5, TRAIL-R3, TRAIL-R4, RANK, RANK LIGAND, Ox40, Ox40 LIGAND, NKG2D, MICA, MICB, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2F, TAP1, TAP2 및 이들의 기능적 단편 또는 이들의 조합.일부 구현예에서, 아쥬반트는 하나 이상의 단백질 및/또는 하기로 구성된 군으로부터 선택된 단백질을 코딩하는 핵산 분자일 수 있다: RANTES, IL-12, IL-15, IL-23, IL-28, CTACK, TECK, MEC, OX40 및 DR5.IL-12 작제물 및 서열의 예는 하기에 개시되어 있다: PCT 출원 번호 PCT/US12/69017 및 상응하는 미국 특허 번호9,272,024, 이는 본원에 참고로 도입된다. IL-15 작제물 및 서열의 예는 PCT 출원 번호 PCT/US04/18962 및 상응하는 미국 특허 번호 8,173,786에 개시되어 있고, 이들은 각각 본원에 참고로 도입된다. IL-23 작제물 및 서열의 예는 이하에 개시되어 있다: PCT 출원 번호 PCT/US14/25348 및 상응하는 미국출원 일련 번호 14/775,087, 이들은 각각 본원에 참고로 도입된다. IL-28 작제물 및 서열의 예는 하기에 개시되어 있다: PCT 출원 번호 PCT/US09/039648 및 상응하는 미국출원 일련 번호 12/936,192, 이들은 각각 참고로 본원에 도입된다. IL-28 작제물 및 서열의 예는 하기에 개시되어 있다: PCT 출원 번호 PCT/US09/039648 및 상응하는 미국출원 일련 번호 12/936,192, 이들은 각각 참고로 본원에 도입된다. RANTES 및 다른 작제물 및 서열의 예는 이하에 개시되어 있다: PCT 출원 번호 PCT/US1999/004332 및 상응하는 미국특허 번호 8,119,395, 이들은 각각 참고로 본원에 도입된다. RANTES 작제물 및 서열의 예는 이하에 개시되어 있다: PCT 출원 번호 PCT/US11/024098 및 상응하는 미국특허 번호 9.034,313, 이들은 각각 본원에 참고로 도입된다. 케모카인 CTACK, TECK 및 MEC 작제물 및 서열의 예는 이하에 개시되어 있다: PCT 출원 번호 PCT/US2005/042231 및 상응하는 미국 출원 일련 번호 11/719,646, 이들 각각은 본원에 참고로 도입된다. OX40 및 다른 면역조절제의 예는 하기에 개시되어 있다: 미국출원 일련 번호 10/560,653, 이는 본원에 참고로 도입된다. DR5 및 다른 면역조절제의 예는 하기에 개시되어 있다: 미국출원 일련 번호 09/622,452, 이는 본원에 참고로 도입된다.

면역원성 조성물은 컨센서스 항원 및 플라스미드를 약 1 나노그램 내지 100 밀리그램; 약 1 마이크로그램 내지 약 10 밀리그램; 또는 바람직하게는 약 0.1 마이크로그램 내지 약 10 밀리그램; 또는 더 바람직하게는 약 1 밀리그램 내지 약 2 밀리그램의 양으로 포함할 수 있다. 일부 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따르는 약제학적 조성물은 약 5 나노그램 내지 약 1000 마이크로그램의 DNA를 포함한다. 일부 바람직한 구현예에서, 약제학적 조성물은 약 10 나노그램 내지 약 800 마이크로그램의 DNA를 함유한다. 일부 바람직한 구현예에서, 약제학적 조성물은 약 0.1 내지 약 500 마이크로그램의 DNA를 함유한다. 일부 바람직한 구현예에서, 약제학적 조성물은 약 1 내지 약 350 마이크로그램의 DNA를 함유한다. 일부 바람직한 구현예에서, 약제학적 조성물은 약 25 내지 약 250 마이크로그램, 약 100 내지 약 200 마이크로그램, 약 1 나노그램 내지 100 밀리그램; 약 1 마이크로그램 내지 약 10 밀리그램; 약 0.1 마이크로그램 내지 약 10 밀리그램; 약 1 밀리그램 내지 약 2 밀리그램, 약 5 나노그램 내지 약 1000 마이크로그램, 약 10 나노그램 내지 약 800 마이크로그램, 약 0.1 내지 약 500 마이크로그램, 약 1 내지 약 350 마이크로그램, 약 25 내지 약 250 마이크로그램, 약 100 내지 약 200 마이크로그램의 컨센서스 항원 또는 이의 플라스미드를 함유한다.

일부 구현예에서, 본 발명에 따르는 약제학적 조성물은 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100 나노그램의 백신의 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 다음을 포함할 수 있다: 적어도 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95,100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355, 360, 365, 370, 375, 380, 385, 390, 395, 400, 405, 410, 415, 420, 425, 430, 435, 440, 445, 450, 455, 460, 465, 470, 475, 480, 485, 490, 495, 500, 605, 610, 615, 620, 625, 630, 635, 640, 645, 650, 655, 660, 665, 670, 675, 680, 685, 690, 695, 700, 705, 710, 715, 720, 725, 730, 735, 740, 745, 750, 755, 760, 765, 770, 775, 780, 785, 790, 795, 800, 805, 810, 815, 820, 825, 830, 835, 840, 845, 850, 855, 860, 865, 870, 875, 880, 885, 890, 895.900, 905, 910, 915, 920, 925, 930, 935, 940, 945, 950, 955, 960, 965, 970, 975, 980, 985, 990, 995 또는 1000 마이크로그램의 백신의 핵산.일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 적어도 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5 또는 10 mg 이상의 백신의 핵산을 포함할 수 있다.

다른 구현예에서, 약제학적 조성물은 최대 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100 나노그램의 백신의 핵산을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 다음을 포함할 수 있다: 최대 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95,100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355, 360, 365, 370, 375, 380, 385, 390, 395, 400, 405, 410, 415, 420, 425, 430, 435, 440, 445, 450, 455, 460, 465, 470, 475, 480, 485, 490, 495, 500, 605, 610, 615, 620, 625, 630, 635, 640, 645, 650, 655, 660, 665, 670, 675, 680, 685, 690, 695, 700, 705, 710, 715, 720, 725, 730, 735, 740, 745, 750, 755, 760, 765, 770, 775, 780, 785, 790, 795, 800, 805, 810, 815, 820, 825, 830, 835, 840, 845, 850, 855, 860, 865, 870, 875, 880, 885, 890, 895.900, 905, 910, 915, 920, 925, 930, 935, 940, 945, 950, 955, 960, 965, 970, 975, 980, 985, 990, 995, 또는 1000 마이크로그램의 백신의 핵산.일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 최대 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5 또는 10 mg의 백신의 핵산을 포함할 수 있다.

면역원성 조성물은 사용되는 투여 방식에 따라 제형화될 수 있다. 주사가능한 백신 약제학적 조성물은 멸균, 발열원 부재 및 미립자 부재일 수 있다. 등장성 제형 또는 용액이 사용될 수 있다. 등장성 첨가제는 염화나트륨, 덱스트로스, 만니톨, 소르비톨 및 락토스를 포함할 수 있다. 백신은 혈관 수축제를 포함할 수 있다. 등장성 용액은 포스페이트 완충 식염수를 포함할 수 있다. 면역원성 조성물은 젤라틴 및 알부민을 포함하는 안정화제를 추가로 포함할 수 있다. 안정화는 백신 제형에 대한 LGS 또는 다중 양이온 또는 다중 음이온과 같은 제형이 장시간 동안 실온 내지 주위 온도에서 안정하도록 할 수 있다.

면역원성 조성물은 실온(25 ℃)에서 1주일 이상 동안, 일부 구현예에서 2주 이상동안, 일부 구현예에서 3주 이상 동안, 일부 구현예에서 4주 이상 동안, 일부 구현예에서 5주 이상 동안, 일부 구현예에서 6주 이상 동안 안정할 수 있다. 일부 구현예에서, 백신은 1개월 이상, 2개월 이상, 3개월 이상, 4개월 이상, 5개월 이상, 6개월 이상, 7개월 이상, 8개월 이상, 9개월 이상, 10개월 이상, 11개월 이상 또는 12개월 이상 동안 안정하다. 일부 구현예에서, 백신은 1년 이상, 2년 이상, 수년 이상 또는 5년 이상 동안 안정하다. 일 구현예에서, 면역원성 조성물은 냉동하(2-8°C)에 안정하다. 따라서, 일 구현예에서, 면역원성 조성물은 동결된 냉동-쇄를 필요로 하지 않는다. 면역원성 조성물은 이의 의도된 사용을 허용하기에 (예: 대상체에서 면역 반응을 생성하기에) 충분한 시간 동안 이의 생물학적 활성을 보유하는 경우 안정하다. 예를 들어, 저장되고, 출하되어야 하는 등의 면역원성 조성물의 경우, 면역원성 조성물이 수개월 내지 수년 동안 안정하게 보유되는 것이 바람직할 수 있다.

백신접종 방법

또한, 대상체에게 면역원성 조성물을 투여함으로써 이를 필요로 하는 대상체에서질환을 치료하고, 보호하고/하거나 예방하는 방법이 본원에 제공된다. 면역원성 조성물을 대상체에게 투여하면 대상체에서 면역 반응을 유도하거나 도출할 수 있다. 유도된 면역 반응은 질환, 예를 들어, 하나 이상의 종양 관련 병리학을 치료, 예방 및/또는 보호하는데 사용될 수 있다.

유도된 면역 반응은 유도된 체액성 면역 반응 및/또는 유도된 세포 면역 반응을 포함할 수 있다. 체액성 면역 반응은 약 1.5배 내지 약 16배, 약 2배 내지 약 12배, 또는 약 3배 내지 약 10배로 유도될 수 있다. 유도된 체액성 면역 반응은 항원에 반응성인 IgG 항체 및/또는 중화 항체를 포함할 수 있다. 유도된 세포 면역 반응은 CD8⁺ T 세포 반응을 포함할 수 있고, 이는 약 2배 내지 약 30배, 약 3배 내지 약 25배, 또는 약 4배 내지 약 20배로 유도된다.

면역원성 조성물 용량은 1 μg 내지 10 mg 활성 성분/kg 체중/시간일 수 있고, 20 μg 내지 10 mg 성분/kg 체중/시간일 수 있다. 면역원성 조성물은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 또는 31일 마다 투여될 수 있다. 효과적인 치료를 위한 면역원성 조성물 용량의 수는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10일 수 있다.

면역원성 조성물은 약학 분야의 당업자에게 익히 공지된 표준 기술에 따라 제형화될 수 있다. 이러한 조성물은 연령, 성별, 체중 및 특정 대상체의 상태 및 투여 경로와 같은 인자를 고려하여 의학 분야의 당업자에게 익히 공지된 투여량 및 기술에 의해 투여될 수 있다.

면역원성 조성물은 예방적으로 또는 치료적으로 투여될 수 있다. 예방적 투여에서, 면역원성 조성물은 면역 반응을 유도하기에 충분한 양으로 투여될 수 있다. 치료적 적용에서, 면역원성 조성물은 치료적 효과를 유도하기에 충분한 양으로 이를 필요로 하는 대상체에게 투여된다. 이를 달성하기에 적합한 양은 "치료적 유효량"으로 정의된다. 이 용도에 효과적인 양은, 예를 들어, 투여되는 면역원성 조성물 섭생의 특정 조성, 투여 방식, 질환의 단계 및 중증도, 대상체의 일반적인 건강 상태, 및 처방 의사의 판단에 의존할 것이다.

면역원성 조성물은 다음에 기재된 바와 같이 당업계에 익히 공지된 방법에 의해 투여될 수 있다: Donnelly 등 (1997, Ann.Rev. Immunol. 15: 617-648); Felgner 등 (U.S.특허 번호 5,580,859, 1996년 12월 3일 허여됨); Felgner (U.S.특허 번호 5,703,055, 1997년 12월 30일 허여됨); 및 Carson 등 (U.S.특허 번호 5,679,647, 1997년 10월 21일 허여됨), 이들 모두의 내용은 그 전체가본원에 참고로 도입된다. 면역원성 조성물의 DNA는, 예를 들어, 백신 건을 사용하여 개체에 투여될 수 있는 입자 또는 비드와 복합체화될 수 있다. 당업자는 생리적으로 허용되는 화합물을 포함하는 약제학적으로 허용되는 담체의 선택이, 예를 들어, 발현 벡터의 투여 경로에 의존한다는 것을 알 것이다.

면역원성 조성물은 다양한 경로를 통해 전달될 수 있다. 전형적인 전달 경로는 비경구 투여, 예를 들어, 피내, 근육내 또는 피하 전달을 포함한다. 다른 경로는 경구 투여, 비강내, 및 질내 경로를 포함한다. 특히, 면역원성 조성물의 DNA의 경우, 면역원성 조성물은 개체의 조직의 간질 공간에 전달될 수 있다 (Felgner 등, 미국 특허 번호 5,580,859 및 5,703,055, 이들 모두의 내용은 그 전체가 본원에 참고로 도입된다). 면역원성 조성물은 또한 근육에 투여될 수 있거나, 피내 또는 피하 주사, 또는 경피로, 예를 들어, 이온침투요법을 통해 투여될 수 있다. 면역원성 조성물의 표피 투여가 또한 사용될 수 있다. 표피 투여는 표피의 최외층을 기계적으로 또는 화학적으로 자극하여 자극제에 대한 면역 반응을 자극함을 포함할 수 있다 (Carson 등, 미국 특허 번호 5,679,647, 이들의 내용은 그 전체가 본원에 참고로 도입된다).

면역원성 조성물은 또한 비강을 통한 투여용으로 제형화될 수 있다. 담체가 고체인 비강 투여에 적합한 제형은, 예를 들어, 코담배를 흡입하는 방식으로, 즉 코에 가깝게 유지된 분말의 용기로부터 비강 통로를 통한 급속 흡입에 의해 투여되는 약 10 내지 약 500 마이크론 범위의 입자 크기를 갖는 조악한 분말을 포함할 수 있다. 제형은 비강 스프레이, 비강 점적제, 또는 분무기에 의한 에어로졸 투여일 수 있다. 제형은 면역원성 조성물의 수성 또는 유성 용액을 포함할 수 있다.

면역원성 조성물은 액상 제제, 예를 들어, 현탁액, 시럽 또는 엘릭서일 수 있다. 면역원성 조성물은 또한 멸균 현탁액 또는 에멀젼과 같은 비경구, 피하, 피내, 근육내 또는 정맥내 투여(예: 주사가능한 투여)용 제제일 수 있다.

면역원성 조성물은 리포좀, 미소구 또는 다른 중합체 매트릭스로 도입될 수 있다 (Felgner 등, 미국특허 번호 5,703,055; Gregoriadis, Liposome Technology, Vols. Ito III (2nd ed. 1993), 이들의 내용은 그 전체가 본원에 참고로 도입된다). 리포좀은 인지질 또는 다른 지질로 이루어질 수 있고, 제조 및 투여하기가 비교적 간단한 무독성의 생리학적으로 허용가능하고 대사가능한 담체일 수 있다.

면역원성 조성물은 전기천공을 통해, 예를 들어, 다음에 기재된 방법으로 투여될 수 있다: 미국특허 번호 7,664,545, 이의 내용은 본원에 참고로 도입된다. 전기천공은 다음에 기재된 방법 및/또는 장치에 의해서일 수 있다: 미국특허 번호 6,302,874; 5,676,646; 6,241,701; 6,233,482; 6,216,034; 6,208,893; 6,192,270; 6,181,964; 6,150,148; 6,120,493; 6,096,020; 6,068,650; 및 5,702,359, 이들의 내용은 그 전체가 본원에 참고로 도입된다. 전기천공은 최소 침습 장치를 통해 수행될 수 있다.

최소 침습 전기천공 장치 ("MID")는 상기한 면역원성 조성물 및 관련 유체를 신체 조직으로 주입하기 위한 장치일 수 있다. 상기 장치는 중공 바늘, DNA 카셋트, 및 유체 전달 수단을 포함할 수 있고, 여기서 상기 장치는 상기 신체 조직에 바늘을 삽입하는 동안 신체 조직에 DNA를 동시에(예: 자동으로) 주입하기 위해 사용시 유체 전달 수단을 작동시키도록 조정된다. 이것은 바늘이 삽입되는 동안 DNA 및 관련 유체를 점차적으로 주입하는 능력이신체 조직을 통해 유체의 보다 균일한 분포를 유도한다는 이점을 갖는다. 주사 동안 경험하는 통증은 더 넓은 영역에 대해 주사되는 DNA의 분포로 인해 감소될 수 있다.

MID는 면역원성 조성물을 바늘을 사용하지 않고 조직에 주사할 수 있다. MID는 면역원성 조성물이 조직의 표면을 관통하여 기본적인 조직 및/또는 근육에 들어가는 힘으로 작은 스트림 또는 제트로서 면역원성 조성물을 주사할 수 있다. 작은 스트림 또는 제트 뒤의 힘은 마이크로-오리피스를 통해 이산화탄소와 같은 압축된 가스의 팽창에 의해 순식간에 제공될 수 있다. 최소 침습 전기천공 장치의 예 및 이들을 사용하는 방법은 하기에 기재되어 있다: 공개된 미국특허 출원 번호 20080234655; 미국특허 번호 6,520,950; 미국특허 번호 7,171,264; 미국특허 번호 6,208,893; 미국특허 번호6,009,347; 미국특허 번호 6,120,493; 미국특허 번호 7,245,963; 미국특허 번호 7,328,064; 및 미국특허 번호 6,763,264, 이들 각각의 내용은 본원에 참고로 도입된다.

MID는 통증없이 조직을 관통하는 액체의 고속 제트를 생성하는 주사기를 포함할 수 있다. 이러한 무바늘 주사기는 시판되고 있다. 본원에서 이용될 수 있는 무바늘 주사기의 예는 다음에 기재된 것들을 포함한다: 미국 특허 번호 3,805,783; 4,447,223; 5,505,697; 및 4,342,310, 이들 각각의 내용은 본원에 참고로 도입된다.

직접 또는 간접 전기수송에 적합한 형태의 목적하는 면역원성 조성물은 일반적으로 면역원성 조성물의 조직으로의 침투를 유발하기에 충분한 힘으로 제제의 제트의 전달을 작동시키기 위해 조직 표면을 주사기와 접촉시켜 치료할 조직 내로 무바늘 주사기를 사용하여 도입(예: 주사)될 수 있다. 예를 들어, 치료할 조직이 점막, 피부 또는 근육인 경우, 제제는 제제가 각질층을 통해 각각 진피층 또는 기본적인 조직 및 근육으로 침투하게 하는 충분한 힘으로 점막 또는 피부 표면을 향해 투사된다.

무바늘 주사기는 모든 유형의 조직, 특히 피부 및 점막으로 면역원성 조성물을 전달하는데 매우 적합하다. 일부 구현예에서, 무바늘 주사기는 면역원성 조성물을 함유하는 액체를 표면 및대상체의 피부 또는 점막으로 추진시키는데 사용될 수 있다. 본 발명의 방법을 사용하여 치료될 수 있는 다양한 유형의 조직의 대표적인 예는 췌장, 후두, 비인두, 하인두, 구인두, 입술, 목, 폐, 심장, 신장, 근육, 유방, 결장, 전립선, 흉선, 고환, 피부, 점막 조직, 난소, 혈관, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.

MID는 조직을 전기천공하는 바늘 전극을 가질 수 있다. 예를 들어, 직사각형 또는 정사각형 패턴으로 설정된 다중 전극 어레이에서 다수의 전극 쌍 사이를 펄싱함으로써 한 쌍의 전극 사이에서 펄싱하는 것보다 개선된 결과를 제공한다. 예를 들어, 다음에 개시된다: 미국"약물 및 유전자의 중재 전달을 위한 바늘 전극"이란 명칭의 특허 번호 5,702,359는 복수의 바늘 쌍이 치료적 치료 동안 펄스화될 수 있는 바늘의 어레이이다. 완전히 제시된 것처럼 본원에 참고로 도입된 그 출원에서, 바늘은 원형 어레이로배치되었지만, 대향하는 쌍의 바늘 전극 사이에서 펄싱을 가능하게 하는 커넥터 및 스위칭 장치를 갖는다. 재조합 발현 벡터를 세포에 전달하기 위한 한 쌍의 바늘 전극이 사용될 수 있다. 이러한 장치 및 시스템은 하기에 기재되어 있다: 미국 특허 번호 6,763,264, 이의 내용은 본원에 참고로 도입된다. 대안적으로, 정상적인 주사 바늘과 유사한 단일 바늘로 DNA 및 전기천공의 주사를 가능하게 하고, 현재 사용되는 장치에 의해 전달되는 것들보다 낮은 전압의 펄스를 인가하여 환자가 경험하는 전기적 감각을 감소시키는 단일 바늘 장치가 사용될 수 있다.

MID는 하나 이상의 전극 어레이를 포함할 수 있다. 어레이는 동일한 직경 또는 상이한 직경의 2개 이상의 바늘을 포함할 수 있다. 바늘은 균일하게 또는 불균일하게 이격되어 있을 수 있다. 바늘은 0.005in 내지 0.03in, 0.01in 내지 0.025in; 또는 0.015in 내지 0.020in일 수 있다. 바늘은 직경이 0.0175 in일 수 있다. 바늘은 0.5 mm, 1.0 mm, 1.5 mm, 2.0 mm, 2.5 mm, 3.0 mm, 3.5 mm, 4.0 mm 이상 이격될 수 있다.

MID는 펄스 발생기 및 면역원성 조성물 및 전기천공 펄스를 단일 단계로 전달하는 2개 이상의 바늘 면역원성 조성물 주사기로 구성될 수 있다. 펄스 발생기는 플래시 카드 작동된 퍼스널 컴퓨터를 통한 펄스 및 주사 파라미터의 가요성 프로그래밍 뿐만 아니라 전기천공 및 환자 데이터의 포괄적인 기록 및 저장을 허용할 수 있다. 펄스 발생기는 짧은 기간 동안 다양한 볼트 펄스를 전달할 수 있다. 예를 들어, 펄스 발생기는 100ms의 지속 기간 동안 3개의 15볼트 펄스를 전달할수 있다. 이러한 MID의 예는 다음에 기재된 Inovio Biomedical Corporation의 Elgen 1000 시스템이다: 미국특허 번호 7,328,064, 이의 내용은 본원에 참고로 도입된다.

MID는 신체 또는 식물의 선택된 조직의 세포로 DNA와 같은 거대분자의 도입을 촉진시키는 모듈형 전극 시스템인 CELLECTRA (Inovio Pharmaceuticals, Blue Bell PA) 장치 및 시스템일 수 있다. 모듈형 전극 시스템은 복수의 바늘 전극; 피하 주사 바늘; 프로그래밍가능한 정전류 펄스 제어기로부터 복수의 바늘 전극으로 전도성 링크를 제공하는 전기 커넥터; 및 전원을 포함할 수 있다. 작동자는 지지체 구조에 실장된 복수의 바늘 전극을 움켜잡고, 그들을 신체 또는 식물의 선택된 조직에 견고하게 삽입할 수 있다. 이어서, 거대분자는 피하 주사 바늘을 통해 선택된 조직으로 전달된다. 프로그래밍가능한 정전류 펄스 제어기는 활성화되고, 정전류 전기 펄스는 복수의바늘 전극에 인가된다. 인가된 정전류 전기 펄스는 복수의 전극 사이의 세포로 거대분자의 도입을 촉진한다. 세포의 과열로 인한 세포사는 정전류 펄스에 의해 조직에서 전력 소산을 제한함으로써 최소화된다. Cellectra 장치 및 시스템은 다음에 기재되어 있다: 미국특허 번호 7,245,963, 이의 내용은 본원에 참고로 도입된다.

MID는 Elgen 1000 시스템 (Inovio Pharmaceuticals)일 수 있다. Elgen 1000 시스템은 중공 바늘을 제공하는 장치; 및 유체 전달 수단을 포함할 수 있고, 여기서 상기 장치는 바늘을 상기 신체 조직에 삽입하는 동안 본원에 기재된 면역원성 조성물인 유체를 신체 조직으로 동시에(예: 자동으로) 주입하기 위해 사용시 유체 전달 수단을 작동시키도록 적응된다. 이점은 바늘이 삽입되는 동안 유체를 점차적으로 주입하여 신체 조직을 통해 유체의 더 균일한 분포를 유도하는 능력이다. 또한, 주사 동안 겪게 되는 통증은 더 큰 영역에 주사되는 유체의 용적의 분포로 인해 감소되는 것으로 믿어진다.

또한, 유체의 자동 주사는 주사된 유체의 실제 용량의 자동 모니터링 및 등록을촉진시킨다. 이 데이터는 경우에 따라 문서화 목적을 위해 제어 장치에 의해 저장될 수 있다.

주사 속도는 선형 또는 비선형일 수 있고, 주사는 바늘이 치료될 대상체의 피부를 통해 삽입된 후에 그들이 신체 조직으로 추가로 삽입되는 동안 수행될 수 있음이 이해될 것이다.

본 발명의 장치에 의해 유체가 주사될 수 있는 적합한 조직은 종양 조직, 피부 또는 간 조직을 포함하지만, 근육 조직일 수 있다.

장치는 추가로 바늘의 신체 조직으로의 삽입을 안내하는 바늘 삽입 수단을 포함한다. 유체 주사 속도는 바늘 삽입 속도로 제어된다. 이것은 삽입 속도가 목적하는 바와 같은 주사 속도와 일치할 수 있도록 바늘 삽입 및 유체 주사 모두가 제어될 수 있다는 이점을 갖는다. 그것은 또한 사용자가 장치를 더 쉽게 조작하도록 한다. 목적하는 경우, 바늘을 신체 조직에 자동으로 삽입하기 위한 수단이 제공될 수 있다.

사용자는 언제 유체의 주사를 시작할 지를 선택할 수 있다. 그러나, 이상적으로, 주사는 바늘 끝이 근육 조직에 도달될 때 시작하고, 장치는 바늘이 유체 주사가 개시되기에 충분한 깊이까지 삽입되었을 때를 감지하는 수단을 포함할 수 있다. 이것은, 유체의 주사가 바늘이 (일반적으로 근육 조직이 시작되는 깊이인) 목적하는 깊이에 도달될 때 자동으로 개시되도록 할 수 있음을 의미한다. 근육 조직이 시작되는 깊이는, 예를 들어, 바늘이 피부층을 통과하기에 충분한 것으로 간주되는 4mm의 값과 같은 사전 설정된 바늘 삽입 깊이로 취할 수 있다.

감지 수단은 초음파 프로브를 포함할 수 있다. 감지 수단은 임피던스 또는 저항의 변화를 감지할 수단을 포함할 수 있다. 이 경우에, 수단은 신체 조직에서 바늘의 깊이를 그 자체로 기록할 수 없지만, 오히려 바늘이 상이한 유형의 신체 조직으로부터 근육으로 이동할 때 임피던스 또는 저항의 변화를 감지하도록 적응될 것이다. 이들 대안 중 어느 하나는 주사를 개시할 수 있음을 감지하는 비교적 정확하고 간단하게 조작하는 수단을 제공한다. 바늘 삽입 깊이는 목적하는 경우 추가로 기록될 수 있고, 바늘 삽입 깊이가 기록될 때 주사되는 유체의 용적이 결정되도록 유체의 주사를 제어하는데 사용될 수 있다.

장치는 바늘을 지지하기 위한 기재; 및 상기 기재를 내부에 수용하기 위한 하우징을 추가로 포함할 수 있고, 여기서 상기 기재는 상기 기재가 하우징에 대해 제1 후방 위치에 있을 때 바늘이 하우징 내에서 후퇴되고, 상기 기재가 하우징 내의 제2 전방 위치에 있을 때 바늘이 하우징으로부터 연장되도록 하우징에 대해 이동 가능하다. 이것은 하우징이 환자의 피부 상에 정렬될 수 있고, 이어서 하우징을 기재에 대해 이동시킴으로써 바늘이 환자의 피부에 삽입될 수 있기 때문에 사용자에게 유리하다.

상기 언급된 바와 같이, 유체가 피부에 삽입된 그대로 바늘의 길이에 걸쳐 균일하게 분포되도록 유체 주사의 제어된 속도를 달성하는 것이 바람직하다. 유체 전달 수단은 제어된 속도로 유체를 주사하도록 적응된 피스톤 구동 수단을포함할 수 있다. 피스톤 구동 수단은, 예를 들어, 서보 모터에 의해 활성화될 수 있다. 그러나, 피스톤 구동 수단은 기재가 하우징에 대해 축 방향으로 이동됨으로써 작동될 수 있다. 유체 전달을 위한 대안적인 수단이 제공될 수 있다는 것이 이해될 것이다. 따라서, 예를 들어, 제어되거나 제어되지 않은 속도에서 유체 전달을 위해 압착될 수 있는 밀폐된 용기가 주사기 및 피스톤 시스템 대신에 제공될 수 있다.

상기한 장치가 임의의 유형의 주사에 사용될 수 있다. 그러나, 그것은 전기천공 분야에서 특히 유용할 것으로 예상되고, 따라서 그것은 바늘에 전압을 인가하기 위한 수단을 추가로 포함할 수 있다. 이것은 바늘이 주사를 위해서 뿐만 아니라 전기천공 동안 전극으로서 사용될 수있도록 한다. 이것은 전기장이 주사된 유체와 동일한 영역에 인가된다는 것을 의미하기 때문에특히 유리하다. 전통적으로, 이전에 주사된 유체와 전극을 정확하게 정렬하는 것이 매우 어렵다는 점에서 전기천공과 관련된 문제가 있었고, 따라서 사용자는 넓은 영역에서 필요한 것보다 더 큰 용적의 유체를 주사하고, 주사된 물질과 전기장 사이의 중첩을 보장하기 위해 더 큰 영역에 전기장을 인가하는 경향이 있다. 본 발명을 사용하면, 주사된 유체의 용적 및 인가된 전기장의 크기 모두가 전기장과 유체 사이의 양호한 맞춤을 달성하면서 감소될 수 있다.

핵산 플라스미드의 제조 방법

본원에서 논의된 핵산 기반 면역원성 조성물을 포함하는 핵산 플라스미드를 제조하는 방법이 본원에 제공된다. 포유동물 발현 플라스미드로 최종 서브클로닝 단계 후, 핵산 플라스미드는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 대규모 발효 탱크에서 세포 배양물을 접종하는데 사용될 수 있다.

본 발명의 EP 장치와 함께 사용하기 위한 핵산 플라스미드는 공지된 장치와 기술의 조합을 사용하여 제형화되거나 제조될 수 있다. 일부 예에서, 이들 연구에 사용된 핵산 플라스미드는 10 mg/mL 이상의 농도로 제형화될 수 있다. 제조 기술은 또한 하기에 기재된 것들 이외에 당업자에게 통상적으로 공지된 다양한 장치 및 프로토콜을 포함하거나 통합한다: 미국특허원 번호 60/939792, 2007년 7월 3일에 발행된 허가 받은 특허인, 미국 특허 번호 7,238,522에 기재된 것들을 포함한다. 상기-언급된 출원 및 특허, 미국 특허원 번호 60/939,792 및 미국 특허 번호 7,238,522는 각각 그 전체가 본원에 도입된다.

치료 방법

면역원성 조성물은 이를 필요로 하는 대상체의 FAP에 반응성이거나 지시되는 포유동물에서 면역 반응을 생성하거나 유도하는데 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 면역원성 조성물은 대상체에서 암을 예방하거나 치료하는데 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 암은 FAP를 발현한다. 따라서, 면역원성 조성물은 면역원성 조성물이 투여된 대상체에서 FAP 발현 암을 치료하고/하거나 예방하는 방법에 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 면역원성 조성물은 대상체에서 FAP 발현 암의 1차 또는 초기 발생을 예방하는데 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 면역원성 조성물은 대상체에서 FAP 발현 암의 재발을 예방하는데 사용될 수 있다.

일부 구현예에서, 면역 반응은 면역원성 조성물이 투여된 대상체에서 다양한 조직 또는 시스템(예: 뇌 또는 신경계 등)에 손상 또는 염증을 일으키지 않는 체액성 면역 반응 및/또는 항원-특이적 세포독성 T 림프구 (CTL) 반응을 생성할 수 있다.

일부 구현예에서, 투여된 면역원성 조성물은 대상체에서 암의 생존을 증가시키거나 종양의 크기를 감소시키거나 이들의 조합일 수 있다. 투여된 면역원성 조성물은 대상체에서 암의 생존을 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 및 60% 이상으로 증가시킬 수 있다. 투여된 면역원성 조성물은 면역화 후 대상체에서 종양 크기를 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 및 70% 이상 감소시킬 수 있다.

투여된 면역원성 조성물은 대상체에서 세포 면역 반응을 약 5배 내지 약 6000배, 약 50배 내지 약 5500배, 약 50배 내지 약 5000배, 약 50배 내지 약 4500배, 약 100배 내지 약 6000배, 약 150배 내지 약 6000배, 약 200배 내지 약 6000배, 약 250배 내지 약 6000배, 또는 약 300배 내지 약 6000배로 증가시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 투여된 면역원성 조성물은 대상체에서 세포 면역 반응을 약 5배, 10배, 20배, 30배, 40배, 50배, 100배, 150배, 200배, 250배, 300배, 350배, 400배, 450배, 500배, 550배, 600배, 650배, 700배, 750배, 800배, 850배, 900배, 950배, 1000배, 1100배, 1200배, 1300배, 1400배, 1500배, 1600배, 1700배, 1800배, 1900배, 2000배, 2100배, 2200배, 2300배, 2400배, 2500배, 2600배, 2700배, 2800배, 2900배, 3000배, 3100배, 3200배, 3300배, 3400배, 3500배, 3600배, 3700배, 3800배, 3900배, 4000배, 4100배, 4200배, 4300배, 4400배, 4500배, 4600배, 4700배, 4800배, 4900배, 5000배, 5100배, 5200배, 5300배, 5400배, 5500배, 5600배, 5700배, 5800배, 5900배, 또는 6000배로 증가시킬 수 있다.

투여된 백신은 대상체에서 인터페론 감마 (IFN-γ) 수준을 약 5배 내지 약 6000배, 약 50배 내지 약 5500배, 약 50배 내지 약 5000배, 약 50배 내지 약 4500배, 약 100배 내지 약 6000배, 약 150배 내지 약 6000배, 약 200배 내지 약 6000배, 약 250배 내지 약 6000배, 또는 약 300배 내지 약 6000배로 증가시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 투여된 백신은 대상체에서 IFN-γ 수준을 약 50배, 100배, 150배, 200배, 250배, 300배, 350배, 400배, 450배, 500배, 550배, 600배, 650배, 700배, 750배, 800배, 850배, 900배, 950배, 1000배, 1100배, 1200배, 1300배, 1400배, 1500배, 1600배, 1700배, 1800배, 1900배, 2000배, 2100배, 2200배, 2300배, 2400배, 2500배, 2600배, 2700배, 2800배, 2900배, 3000배, 3100배, 3200배, 3300배, 3400배, 3500배, 3600배, 3700배, 3800배, 3900배, 4000배, 4100배, 4200배, 4300배, 4400배, 4500배, 4600배, 4700배, 4800배, 4900배, 5000배, 5100배, 5200배, 5300배, 5400배, 5500배, 5600배, 5700배, 5800배, 5900배, 또는 6000배로 증가시킬 수 있다.

백신 용량은 1 μg 내지 10 mg 활성 성분/kg 체중/시간일 수 있고, 20 μg 내지 10 mg 성분/kg 체중/시간일 수 있다. 백신은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 또는 31일마다 투여될 수 있다. 효과적인 치료를 위한 백신 용량의 수는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10일 수 있다.

투여 경로

면역원성 또는 약제학적 조성물은 경구, 비경구, 설하, 경피, 직장, 경점막, 국소, 흡입, 구강 투여, 늑막내, 정맥내, 동맥내, 복강내, 피하, 근육내, 비강내, 척추강내, 및 관절내 또는 이들의 조합을 포함하는 상이한 경로에 의해 투여될 수 있다. 수의학적 사용을 위해, 조성물은 통상적인 수의학적 실시에 따라 적합하게 허용되는 제형으로 투여될 수 있다. 수의사는 특정 동물에 가장 적절한 투여 섭생 및 투여 경로를 쉽게 결정할 수 있다. 면역원성 조성물은 전통적인 주사기, 무바늘 주사 장치, "미세발사 폭격 유전자 건", 또는 다른 물리적 방법, 예를 들어, 전기천공 ("EP"), "유체역학적 방법", 또는 초음파에 의해 투여될 수 있다.

백신의 벡터는 생체내 전기천공, 리포좀 매개된, 나노입자 촉진된, 재조합 벡터, 예를 들어, 재조합 아데노바이러스, 재조합 아데노바이러스 관련 바이러스 및 재조합 백시니아를 포함하거나 포함하지 않는 DNA 주사(DNA 백신접종으로 지칭되기도 함)를 포함하는 몇 가지 익히 공지된 기술에 의해 포유동물에게 투여될 수 있다. 본 발명의 최적화된 컨센서스 FAP 항원은 생체내 전기천공과 함께 DNA 주사를 통해 투여될 수 있다.

키트

상기한 백신접종 방법을 사용하여 대상체를 치료하는데 사용될 수 있는 키트가 본원에 제공된다. 키트는 면역원성 조성물을 포함할 수 있다.

키트는 또한 상기한 백신접종 방법을 수행하기 위한 지침 및/또는 키트를 사용하는 방법을 포함할 수 있다. 키트에 포함된 지침은 포장재에 부착될 수 있거나 포장 삽입물로서 포함될 수 있다. 지침은 전형적으로 서면 자료 또는 인쇄물이지만, 그들은 이에 제한되지 않는다. 지침을 저장하고 그들을 최종 사용자에게 전달할 수 있는 임의의 매체가 본 개시내용에 의해 고려된다. 이러한 매체는, 비제한적으로, 전자 저장 매체 (예: 자기 디스크, 테이프, 카트리지), 광학 매체(예: CD ROM) 등을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "지침"은 지침을 제공하는 인터넷 사이트의 주소를 포함할 수 있다.

본 발명은 하기 비제한적인 실시예에 의해 예시된 다중 양태를 갖는다.

실험예

본 발명은 하기 실험예를 참조로 보다 상세히 기재된다. 이들 예는 예시 목적으로만 제공되고, 달리 구체화되지 않는 한 제한되는 것을 의도하지 않는다. 따라서, 본 발명은 이하 실시예에 제한되는 것으로 해석되어서는 안되고, 오히려본원에 제공된 교시의 결과로서 명백해지는 임의의 및 모든 변형을 포함하는 것으로 해석되어야 한다.

추가의 설명 없이, 당업자는 선행 설명 및 하기 예시적인 실시예를 사용하여 본발명을 실시하고 이용하고 청구된 방법을 실시할 수 있는 것으로 믿어진다. 따라서, 하기 실시예는 본 발명의 바람직한 구현예를 구체적으로 지적하며, 어떤 식으로든 본 개시내용의 나머지를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.

실시예 1: 합성 컨센서스 FAP 면역원성 조성물

FAP 단백질은 활성화된 섬유아세포 상에서 발현된 프로테아제 및 젤라티나제이다. FAP는 전립선암 및 췌장암을 포함하여 인간 암종에서 암 관련 섬유아세포의 >90%로 발현된다. FAP는 또한 상처 치유 및 뼈 및 연조직 육종의 악성 세포와 관련된 섬유아세포에서 발현된다. FAP (예: 시브로투주맙) 및 FAP의 소분자 억제제(예: 탈라보스타트)에 지시된 항체는 안전하지만, 임상 시험에서 최소 효능을 나타낸다.

지난 10년 동안, FAP 발현 세포를 표적화하는 면역 요법을 개발하는데 관심이 급증했다(참조: Fang 등, 2016, Mol Ther Oncolytics, 3: 16007; Gottschalk 등, 2013, PLoS One, 8: e82658; Zhang and Ertl, 2016, Oncotarget, 7: 23282-99; Xia 등, 2016, Cancer Immunol Immunother, 65: 613-624; Wen 등, 2010, Cancer Sci, 101: 2325-2332; Xia 등, 2016, 34: 4526-4535; Chen 등, 2015, Sci Rep, 5: 14421; Loeffler 등, 2006, J Clin Invest, 116: 1955-1962). 여기서, DNA 백신 설계 전략에 새로운 개선을 도입한 FAP를 표적화하는 DNA 백신이 개발되었다. 도입된 최근의 중요한 개선은 파단 내성을 돕기 위해 합성 마이크로-컨센서스(μCon) 서열의 사용이다. 이전에 상이한 종양 관련된 항원인 윌름스 종양 1(WT1)에 대해, 천연 마우스 WT1와 약 95% 상동성을 공유하는 합성 컨센서스 백신이 내성을 파괴하고 C57Bl/6 마우스에서 항종양 면역력을 생성하는데 우수하다는 것이 입증되었다(참조: Walters 등, 2017, Mol Ther, 25: 976-988). 여기서, 이 개념은 유전적으로 다양한 이계 교배 마우스를 사용하여 확대되어 FAP에 대한 이 컨센서스 백신 설계가 천연 마우스 FAP 백신 서열보다 우수하다는 것을 입증한다. 천연 FAP 백신으로 면역화된 개별 마우스는 반응을 나타냈고, 내성을 파괴할 수 있었지만, 반응은 μCon FAP 면역화된 마우스 그룹에서 전반적으로 더 넓고 더 높았다.

중요하게는, 개발된 μCon FAP DNA 백신은 각각의 백신 단독보다 더 강력한 항종양 면역력을 생성하는데 있어서 TERT 및 PSMA 종양-표적화 백신 둘 다와 상승작용되었다. μCon FAP 백신은 종양 미세환경의 환경을 변경하여 PSMA 백신이 보다 강력한 항종양 효과를 갖도록 할 수 있다(참조: Yadav 등, 2014, Nature, 515: 572-576).

이 연구는 FAP가 암 면역요법을 위한 생존가능한 치료적 백신 표적이고, 종양 항원 백신 요법과 함께 사용될 때 특정 효능을 나타낸다는 것을 입증한다. FAP를 표적화하는 다른 유전자 요법 접근법, 예를 들어, 키메라 항원 수용체 요법은 일부 독성 문제를 갖는다(참조: Wang 등, 2014, Cancer Immunol Res, 2: 154-166). 따라서, DNA 기반 백신 접근법은 더 안전하고 보다 쉽게 이용할 수 있는 대안일 수 있다.

방법이 이하 기재된다.

DNA 플라스미드

합성 마이크로-컨센서스(μCon) FAP 서열은 랫트, 마카크 및 햄스터와 같은 마우스 및 인간에 관련된 동물로부터 20개 이상의 FAP 서열을 정렬시킴으로써 생성되었다. 이들 서열은 ClustalX2를 사용하여 정렬되었다. 세포외 도메인 서열 (아미노산 26-761)만이 플라스미드에서 코딩되고, 따라서 정렬을 위해 사용되었다(도 1a). 추가의 돌연변이 S624A는 도입되어 FAP의 디펩티딜 펩티다제 및 젤라틴분해 활성을 차단했다. 모든 서열은 N 말단의 코작 서열 및 N 말단의 IgE 선도 서열로 최적화된 RNA 및 코돈이었다. 사용된 모든 플라스미드는 변형된 pVax1 벡터 (GenScript)로 클로닝되었다. 최종 μCon 마우스 FAP 서열은 Mega6을 사용하여 계산된, 천연 마우스 FAP와 95.1% 서열 동일성을 공유한다.

세포 배양 및 형질감염

293T 세포 (ATCC) 및 TC-1 세포 (Dr. Yvonne Paterson의 선물)를 10% 태아 소혈청(FBS)이 보충된 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM)에 유지시켰다. TRAMP-C2 종양 세포주 (ATCC)는 5% FBS, 5% NuSerum IV, 10nM 데하이드로이소안드로스테론 및 0.005mg/mL의 소 인슐린이 보충된 DMEM (Glutamax + 4.5g/L D-글루코스 포함)에 유지시켰다. 모든 세포주는 마이코플라스마 오염에 대해 일상적으로 시험되었고, 낮은 계대로 유지되었다(세포 배양을 위해 <20 계대, 마우스에서의 이식을 위해 <5 계대). FAP 백신 작제물의 발현을 확인하기 위해, 293T 세포를 제조업자의 지침에 따라 리포펙타민 3000을 사용하여 각 플라스미드로 형질감염시켰다. 세포 용해물을 형질감염 48시간 후에 수집했다. 세포는 EDTA 비함유 프로테아제 억제제 (Roche)가 보충된 RIPA 용해 완충액 (Cell Signaling Technology)으로 용해시켰다.

동물 면역화

C57Bl/6, Balb/c 및 CD-1 이계 교배된 마우스는 Jackson Laboratory로부터 구입했다. 마우스는 30μL의 DNA (DNA의 μg 양은 도면 범례에 나타낸다)를 경골 내부(TA) 근육에 주사한 다음, CELLECTRA®-3P 장치 (Inovio Pharmaceuticals)를 사용하는 전기천공 (EP)을 사용하여 2개의 0.1 Amp 전기 정전류 구형파 펄스를 전달하여 면역화했다. 사용된 백신 스케줄은 각각의 도면 또는 도면 범례에 표시된다.

종양 도전 연구

종양 도전 연구를 위해, 50,000개의 TC-1 세포 또는 1,000,000개의 TRAMP-C2 세포를 각각 암컷 C57Bl/6 마우스 또는 수컷 C57Bl/6 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하 이식했다. 이식 1주 (TC-1 이식의 경우) 또는 4일 (TRAMP-C2 이식의 경우) 후, 마우스를 처리 그룹으로 무작위화했다. 이어서, 마우스를 총 4회 면역화 동안 매주 1회 면역화했다. 종양은 매주 2회 모니터링하고, 전자 캘리퍼스를 사용하여 측정했다. 종양 용적은 하기 식을 사용하여 계산했다: 용적=(π/6)*(높이)*(폭2). 마우스는 종양 직경이 1.5cm를 초과할 때 안락사시켰다.

비장세포 및 종양 침윤성 림프구 (TIL) 단리

면역화된 마우스의 비장은 10% FBS가 보충된 RPMI 배지에서 수확했다. 비장세포는 스토마커를 사용하여 해리시키고, 여과하고, 적혈구를 ACK 용해 완충액 (LifeTechnologies)을 사용하여 용해시켰다. 세포를 40μm 필터를 통해 여과하고, 염색 또는 ELISpots을 위해 계수하고 플레이팅했다. 종양을 메스를 사용하여 기계적으로 해리시킨 다음, 하이클론 L-15 Leibowitz 배지 (ThermoFisher) 및 RPMI + 10% FBS + 1% 페니실린/스트렙토마이신의 50/50 혼합물 중 콜라게나제 I, II 및 IV (170mg/L, ThermoFisher), DNAseI (12.5mg/L, Roche), 엘라스타제 (25mg/L, Worthington)의 혼합물에서 배양했다. 이어서, 해리된 세포를 40μm 필터를 통해 2회 여과한 다음, 자극 및 염색을 위해 플레이팅했다.

ELISpot 검정

ELISpot 검정은 MABTECH 마우스 IFN-γ ELISpotPLUS 플레이트를 사용하여 수행했다. 간단히, 웰당 200,000개의 비장세포를 플레이팅하고, 펩타이드(9개의 아미노산으로 중첩되는 15-mer 펩타이드)의 존재하에 24시간 동안 자극했다. 세포를 RPMI + 10% FBS 배지에서 5μg/mL의 각각의 펩타이드로 자극했다. 스폿을 제조업자의 지침에 따라 개발하고 정량화했다. 배지 단독 및 콘카나발린 A 자극된 세포는 각각 음성 및 양성 대조군으로 사용했다. 백만개의 세포당 스폿 형성 단위 (SFU)는 펩타이드 자극된 웰로부터 배지 단독 웰을 빼서 계산했다. 스폿은 ImmunoSpot CTL 판독기를 사용하여 판독했다.

세포내 사이토카인 염색 및 유동 세포 계측법

비장세포 또는 TIL은 단백질 수송 억제제 칵테일 (eBioscience)을 사용하여 5시간 동안 천연 마우스 FAP 펩타이드로 자극했다. 세포 자극 칵테일 (플러스 단백질 수송 억제제) 및 완전 배지 (R10)를 각각 양성 및 음성 대조군으로 사용했다. 자극 동안, 세포를 FITC α-마우스 CD107a (클론 1D4B, Biolegend)와 함께 배양하여 탈과립화를 검출했다. 자극 후, 세포를 LIVE/DEAD 바이올렛과 함께 배양하여 생존력을 검출했다. 이어서, 세포를 실온에서 30분 동안 표면 염색으로 배양했다. 이어서, 세포를 고정시키고, FoxP3/전사 인자 고정/침투 키트 (eBioscience)를 사용하여 침투시켰다. 이어서, 세포를 1시간 동안 4 ℃에서 세포내 염색으로 배양했다. 사용된 항체의 목록은 보충 방법에 포함된다. 모든 샘플을 14색 또는 18색 LSRII 유동 세포 계측기 (BD Bioscience)에서 실행하고, FlowJo 소프트웨어를 사용하여 분석했다.

유동 세포 계측법 염색 항체

하기 항체를 이 연구에 사용했다: PECy5 αCD3 (클론 145-2C11, BD Pharmingen), BV510 αCD4+ (클론 RM4-5, Biolegend), BV605 αTNFα (클론 MP6-XT22), PE αT-bet (클론 4B10, Biolegend), APC αFoxP3 (클론 FJK-16s, eBioscience), APCCy7 αCD8+ (클론 53-6.7, Biolegend), AF700 αCD44 (클론 IM7, Biolegend), APC αIFNγ (클론 XMG1.2, Biolegend), BV510 αCD11b (M1/70, Biolegend), BV605 αCD11c (N418, Biolegend), PE/Cy7 αCD68 (FA-11, Biolegend), AF700 αCD86 (GL-1, Biolegend), PE αArg1 (IC5868P, R&D), PE/Cy7 αCD86 (GL-1, Biolegend), PE/Cy7 αCD83 (Michel-19, Biolegend), BV650 αCD80 (16-10A1, Biolegend), APC αF4/80 (BM8, Biolegend), AF700 αF4/80 (BM8, Biolegend), PE αB220 (RA3-6B2, Biolegend), FITC αCD45 (30-F11, Biolegend), BV510 αNK1.1 (PK136, Biolegend), APC/Cy7 αMHCII (M5/114.15.2, Biolegend), 및 PE/Cy7 αCD25 (PC61.5, eBioscience).

웨스턴 블랏

세포 용해물은 4-12% 비스-트리스 NuPAGE 겔 (ThermoFisher Scientific) 상에서 수행한 후, PVDF 막 (Millipore)으로 옮겼다. 막을 실온에서 1시간 동안 오디세이 차단 완충액으로 차단하고, 4 ℃에서 밤새 1차 항체 (항-FAP ABT11, Millipore, 1: 1000 또는 항-액틴 AC-15, Sigma, 1: 10,000)와 함께 배양했다. 막을 PBS 중 0.1% Tween-20으로 세척하고, 2차 항체 IRDye 680RD 염소 항-마우스 및 IRDye 800CW 염소 항-토끼 (LiCor)의 1: 10,000 희석액과 함께 배양했다. 막을 개발하고 LiCor Odyssey CLx 이미징 시스템을 사용하여 분석했다.

ELISA

혈청은 효소-결합 면역흡착 검정 (ELISA)에 의한 항체 반응을 결정하기 위해 희생시키기 전에 마우스로부터 수집했다. Maxisorp 96 well 플레이트를 4 ℃에서 밤새 PBS에서 1μg/mL의 마우스 FAP 단백질 (세파라제 재조합 단백질, MyBiosource, 26-761 아미노산 단편)로 코팅시켰다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 PBS에서 10% 태아 소 혈청 (FCS)으로 차단시켰다. 모든 세척은 PBS 중 0.2% Tween-20 (PBST)으로 수행했다. 종점 결합 역가를 위해, 혈청의 1: 50 희석액을 PBST 중 1% FCS에 사용한 후, 희석 곡선을 위해 4배 희석시켰다. 항-마우스 IgG HRP (1: 5000)를 실온에서 1시간 동안 2차 항체로서 사용했다. 플레이트를 Sigma 신속 OPD 정제를 사용하여 실온에서 10분 동안 개발했다. 개발은 1M H2SO4를 사용하여 정지시켰다. 450nm에서 흡광도는 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 판독했다.

면역형광/면역조직화학 염색

면역형광 또는 면역조직화학 염색을 위해, 조직을 매립시키고, 드라이 아이스 상의 O.C.T. (Tissue-Tek)에서 동결시키고, -80°C에서 저장하거나, 10% 중성-완충된 포르말린으로 고정시킨 다음, 파라핀 매립시켰다. 히알루로난 염색을 위해, 동결된 조직을 PermaFrost 슬라이드 상에서 절단한 다음, 실온에서 15분 동안 3.7% 파라포름알데하이드-PBS, 70% 에탄올, 5% 빙초산의 혼합물로 고정시켰다. 이어서, 슬라이드를 PBS로 세정하고, 실온에서 30분 동안 PBS 중 1% 소 혈청 알부민 (BSA)으로 차단했다. 바이오티닐화된 히알루로난 결합 단백질 (HABP, Millipore)을 4 ℃에서 밤새 1: 1000의 희석으로 차단제에 첨가했다. 슬라이드를 PBS로 세척한 다음, 스트렙타비딘 AF488 접합체를 실온의 암실에서 1시간 동안 1: 500으로 차단 용액에 첨가했다. 슬라이드를 PBS로 세척하고, DAPI와 함께 ProLong Gold Antifade를 장착했다. F4/80 및 CD8+ 염색을 위해, 동결된 섹션을 실온에서 15분 동안 4% 파라포름알데하이드-PBS로 고정시켰다. 슬라이드를 PBS로 세정하고, 실온에서 15분 동안 0.5% 트리톤 X-100으로 침투시켰다. 이어서, 슬라이드를 1시간 동안 PBS 중 2.5% BSA 및 5% 염소 혈청으로 차단한 다음, 아비딘/바이오틴 차단 키트 (Vector Labs)로 차단시켰다. 1차 F4/80 (F4/80-바이오틴, BM8 1: 2000) 및 CD8+α (CD8+α-바이오틴, 53-6.7, 1: 2000) 항체를 4 ℃에서 밤새 차단 완충액에서 배양했다. PBS로 세척 후, 슬라이드를 신호 증폭을 위해 실온에서 8분 동안 TSA-바이오틴 (PerkinElmer)과 함께 배양한 다음, 실온에서 30분 동안 스트렙타비딘 AF488 (1: 500)과 함께 배양했다. 후속적으로, 슬라이드를 세척하고, DAPI와 함께 ProLong Gold Antifade를 장착시켰다. FAP 염색을 위해, 파라핀 매립된 조직을 PermaFrost 슬라이드 상에서 절단했다. 섹션을 탈파라핀화하고, 재수화시키고 4 ℃에서 밤새 1차 항체 (FAP-바이오틴, R&D BAF3715, 1: 40)와 함께 배양했다. 이어서, 슬라이드를 실온에서 1시간 동안 2차 항체 (스트렙타비딘-HRP, 1: 1000)와 함께 배양한 다음, 헤마톡실린으로 대조염색했다. 파라핀-매립된 조직의 염색은 펜실베니아 대학 암 조직학 코어에 의해 수행되었다.

모든 슬라이드는 Zeiss LSM 공초점 현미경 (면역형광 이미지, 펜실베니아 대학 세포 및 발달 생물학 현미경검사 코어) 또는 명시야 이미지를 위한 Nikon 80i 직립 현미경을 사용하여 이미지화했다. 정량화를 위해 종양 샘플 당 적어도 5개의 이미지를 촬영했다. 이미지 분석은 Fiji/ImageJ 소프트웨어를 사용하여 수행했다.

통계 분석

동물 실험의 경우, 오차 막대는 평균 ± 평균의 표준 오차 (SEM)를 나타낸다. 둘 이상의 실험군에 의한 실험의 경우, 통계적 유의성은 1원 또는 2원 ANOVA에 이어, 터키 사후 HSD 테스트에 의해 결정했다. 단지 2개 그룹에 의한 동물 실험의 경우, 유의성은 양측 스튜던트 t-테스트를 사용하여 결정했다. 마우스 종양 생존 연구의 경우, 유의성은 게한-브레슬로우-윌콕슨 테스트에 의해 결정했다.

결과는 이제 기재된다

마이크로-컨센서스(μCon) FAP DNA 백신의 설계 및 시험관내 발현

FAP는 거대한 세포외 도메인과 작은 세포질 꼬리 및 막관통 도메인을 갖는 막-결합 효소이다. 백신 설계의 경우, 단백질 생산의 효율 및 분비를 촉진시키기 위해 N 말단에서 면역글로불린 E(IgE) 선도 서열에 융합된 FAP(아미노산 26-761)의 세포외 도메인만을 함유하는 플라스미드를 작제했다(도 1b). 천연 마우스 FAP (mFAP) 서열에 대한 파단 내성을 촉진시키기 위해, 마이크로-컨센서스(μCon) 서열은 일부 서열 다양성을 제공하지만 구조를 보존하는 NCBI 데이터베이스 중 다양한 관련 종으로부터의 서열 정렬을 사용하여 설계했다. 이 μCon 서열은 천연 단백질 서열과 95.1% 상동성을 공유한다(도 1a). 또한, 최적화된 컨센서스 FAP는 가용성 FAP 효소의 디펩티딜 펩티다제 및 젤라틴분해 활성 둘 다를 차단하기 위해 촉매 도메인에서 S624A 치환을 함유한다 (도 1b 및 도 1c). 유사하게, mFAP 서열과 100% 상동성을 공유하고, 그렇지 않으면 IgE 선도 서열 및 RNA/코돈 최적화의 첨가를 포함하는 동일한 서열 최적화를 함유하는 mFAP 플라스미드가 비교 목적으로 생성되었다. 천연 및 μCon FAP 플라스미드 둘 다의 발현은 형질감염된 293T 세포의 용해물에서 시험관내로 검출시켰다(도 1d).

C57Bl/6 마우스에서 μCon FAP DNA 백신의 면역원성 면역원성

μCon FAP DNA 백신이 면역원성이고 마우스에서 내성을 파괴할 수 있는지를 결정하기 위해, C57Bl/6 마우스를 EP를 근육내 주사하여 상이한 용량의 μCon FAP DNA 백신 (5μg, 10μg, 25μg 및 50μg)으로 면역화했다(도 2a). 마우스는 2주 간격으로 3회 면역화하고, 비장세포는 최종 면역화 1주 후에 분석을 위해 수확했다(도 2a). 인터페론 γ (IFN-γ) ELISpot은 백신 서열에 정확하게 매칭된 펩타이드 (μCon 펩타이드), 또는 mFAP 서열에 매칭된 펩타이드 (천연 펩타이드)를 사용하여 수행했다. C57Bl/6 마우스는 천연 FAP 및 μCon FAP 펩타이드 둘 다에 대한 강력한 IFN-γ ELISpot을 생성하여 μCon FAP 백신이 마우스에서 내성을 파괴할 수 있음을 나타낸다(도 2b 및 도 2c). μCon 펩타이드에 대한 백신의 용량- 의존적 효과가 있었지만; 천연 펩타이드에 대한 용량-의존성은 10μg 용량에서 최대 반응에 도달했다(도 2b 및 도 2c). 따라서, 10μg 용량을 나머지 실험에 사용하였고, 단지 (마우스 FAP 100%에 매칭하는) mFAP 펩타이드에 대한 반응만이 제시된다.

천연 FAP 펩타이드에 대해 생성된 CD8+ 및 CD4+ 사이토카인 반응을 추가로 평가하기 위해, 세포내 사이토카인 염색은 자극된 비장세포에서 수행했다(도 2d 및 도 2e). 유의한 증가는 천연 대조군 마우스와 비교하여 μCon FAP 면역화된 마우스에서 CD8+ T 세포의 IFN-γ 및 TNF-α 생산에서 관찰되었다(도 2d). 이어서, μCon FAP 백신에 의해 생성된 CD8+ T 세포의 세포용해 가능성은 활성화된 T 세포에서 발현되는 탈과립화 마커 CD107a 및 전사 인자 T-bet를 사용하여 평가했다(도 2d). μCon FAP 백신접종된 마우스에서 IFN-γ, CD107a 및 T-bet에 대해 동시에 양성인 CD8+ T 세포에서의 유의한 증가가 천연 대조군 마우스와 비교하여 관찰되어 이 백신이 세포용해 사멸 가능성을 갖는 이펙터 T 세포의 생산을 유도한다는 것을 나타낸다(도 2d). CD4+ T 세포에서 TNF-α 생산의 유의한 증가가 또한 천연 대조군 마우스와 비교하여 μCon FAP 면역화된 마우스에서 관찰되었다(도 2e). CD4+ T 세포에서 또한 IFN-γ 생산이 증가하는 경향이 있었지만, 이 경향은 통계적으로 유의하지 않았다(도 2e).

마이크로-컨센서스 DNA 백신 설계는 마우스의 유전적으로 다양한 집단에서 내성을 파괴하고 CD8+ T 세포 반응을 생성하는데 있어서 천연 FAP DNA보다 우수하다

이계 교배된 마우스(CD-1 ICR "스위스" 마우스)에서 면역 반응을 생성하는 μCon FAP DNA 백신의 용량을 mFAP DNA 백신과 비교하여 평가했다(도 3). 이들 유전적으로 다양한 마우스는 이계 교배된 집단, 예를 들어, 인간에의 외삽을 위한 보다 관련된 내성 모델에서 면역 효능의 중요한 지표로서 사용되었다. 마우스는 도 2a의 스케줄에 따라 10μg의 mFAP DNA 백신 또는 μCon FAP DNA 백신으로 면역화하고, IFN-γ ELISpot에 의해 면역 반응을 평가했다(도 3a). 마우스 사이에서 가변성이 관찰되었지만, 이들 마우스의 이계 교배 특성으로 인해, 전체 면역 반응은 천연 FAP 면역화 그룹과 비교하여 μCon FAP 면역화된 그룹에 대해 더 높았다(도 3a 및 도 3b). 전반적으로, 천연 FAP 그룹에서 9/15 마우스와 비교하여 μCon FAP 그룹에서 14/15 마우스는 백만 개의 비장세포 당 100 SFU 이상의 면역 반응을 생성했다(도 3a). 이계 교배 마우스에서 관찰된 반응 (평균 407 SFU)은 C57Bl/6 마우스 (평균 195 SFU)에서 관찰된 것들보다 더 다양하고 더 높았다(도 2b, 도 3b).

항체 반응은 또한 세포외 도메인(아미노산 26-761)에 상응하는 mFAP 단백질을 사용하여 이들 마우스에서 ELISA에 의해 평가했다(도 3c). 흥미롭게도, 천연 FAP 백신 또는 μCon FAP 백신으로 면역화된 대부분의 마우스는 강력한 항체 반응을 생성했다(도 3c). μCon FAP 그룹에서 항체 반응을 생성하는 마우스의 비율은 천연 FAP 그룹과 비교하여 더 높았다(9/15 마우스와 비교하여 11/15 마우스). 그러나, 차이는 통계적으로 유의하지 않았다.

C57Bl/6 및 Balb/c 마우스에서 천연 FAP DNA 백신과 마이크로-컨센서스 FAP DNA 백신 비교

다음으로, μCon FAP 백신으로부터 생성된 면역 반응의 차이는 통상적으로 사용된 마우스 균주 C57Bl/6 및 Balb/c 마우스에서 천연 FAP 백신과 비교했다. 동일한 면역화 스케줄과 백신 용량을 사용하여 이들 마우스에서 동일한 비교를 수행했다(도 4a, 5a).

Th2 반응에 비해 우수한 Th1 반응을 생성하는 경향이 있는 C57Bl/6 균주에서, μCon FAP 백신이 천연 FAP 백신과 비교하여 유사한 IFN-γ ELISpot 반응을 생성했다는 것이 발견되었다(도 4b). 이들 마우스는 천연 및 μCon FAP 백신 둘 다에 대해 유사한 IFN-γ, TNF-α 및 IFN-γ/T-bet/CD107a 삼중-양성 CD8+ T 세포 반응을 생성했다(도 4c). 그러나, C57Bl/6 마우스는 천연 백신과 비교하여 μCon 백신에 대한 개선된 IFN-γ 및 TNF-α CD4+ T 세포 반응을 생성했다(도 4d). C57Bl/6 마우스에서, μCon FAP 백신은 천연 FAP 백신과 비교하여 항체 반응을 개선시키지 않았다(도 4e). 사실상, 천연 FAP는 더 나은 항체 반응을 향하는 경향이 있지만, 이 경향은 통계적으로 유의하지 않았다.

Th1 반응에 비해 우수한 Th2 반응을 생성하는 경향이 있는 Balb/c 균주에서, μCon FAP 백신은 천연 FAP 백신과 비교하여 우수한 IFN-γ ELISpot 반응을 생성했다(도 5b). Balb/c 마우스는 CD8+ 및 CD4+ T 세포 둘 다에서 우수한 IFN-γ 및 TNF-α 반응을 생성했다(그러나, 이는 CD8+ T 세포에서 IFN-γ 생산에 대해 단지 통계적으로 유의했다)(도 5c 및 도 5d). 또한, Balb/c 마우스는 천연 FAP DNA 백신과 비교하여 μCon FAP DNA 백신으로 면역화시 더욱 강력한 IFN-γ/T-bet/CD107a 삼중-양성 CD8+ T 세포를 생성했다(도 5c). 현저하게, Balb/c 마우스에서, 천연 FAP 백신은 임의의 검출가능한 항체 역가를 생성하지 않은 반면, μCon FAP 백신은 4/5 마우스에서 강력한 항체 수준을 생성했다(도 5e).

이 결과는, 통상적으로 사용되는 마우스의 균주가 면역 기반 연구의 결과를 왜곡시킬 수 있고, 유전적으로 다양한 집단의 사용이 면역 요법의 임상 적용에 중요할 것임을 나타낸다. 전반적으로, μCon 백신은 더욱 면역 내성 Balb/c 모델 및 면역 반응성 C57Bl/6 모델 모두에서 천연 FAP 백신과 비교하여 천연 FAP 항원에 대한 내성을 파괴하는 일부 면역 측면에서 개선을 나타냈다.

마이크로-컨센서스 FAP DNA 백신은 다중 종양 모델에서 종양 항원 DNA 백신과 상승작용한다

강력한 IFN-γ 및 TNF-α 면역 반응이 μCon FAP DNA 백신에 대한 천연 항원에 대해 증가된 빈도로 생성되는 것을 확립한 후, μCon FAP의 치료적 효능은 종양 도전 모델에서 종양 관련 항원 백신과 함께 평가될 수 있다. 병용 요법은 종양 항원 PSMA 또는 TERT를 표적화하는 이전에 연구된 두 개의 백신으로 시험했다(도 6, 도 7)(참조: Yan 등, 2013, Cancer Immunol Res, 1: 179-189; Ferraro 등, 2011, 7 Suppl: 120-7). 암컷 C57Bl/6 마우스는 폐 종양 세포주 TC-1을 이식했고(도 6a), 종양 이식 후 7일째에 면역화를 시작했다. 마우스는 동일한 다리에 주사된 μCon FAP DNA 백신 단독, mTERT (마우스 TERT) 백신 단독, 또는 μCon FAP 및 mTERT 종양 항원 백신의 조합으로 면역화했다. 마우스는 총 4회 면역화 동안 매주 1회 면역화했다. TC-1 종양 모델의 경우, FAP 및 mTERT의 조합은 백신 단독 중 어느 하나와 비교하여 가장 강력한 항종양 활성 및 마우스 생존율의 향상을 생성했다(도 6b 및 도 6c). 상이한 종양 모델에서 이들 결과를 확인하기 위해, TRAMPC2 전립선 종양 모델에서 PSMA 백신과 함께 μCon FAP 백신을 사용하여 유사한 실험을 수행했다(도 7). 수컷 C57Bl/6 마우스는 TRAMPC2 종양 세포를 이식하고, 종양 이식 후 4일째에 면역화를 시작했다(도 7a). TRAMPC2 종양 모델의 경우, μCon FAP DNA 백신 단독은 종양 성장에 영향을 미치지 않았지만, PSMA 백신 단독은 종양 용적을 감소시켰다(도 7b). 그러나, PSMA 및 FAP의 조합은 PSMA 백신 단독보다 종양 용적을 감소시키고, 종양 생존율을 향상시켜 두 백신 사이의 상승작용을 나타냈다(도 7b 도 7c).

μCon FAP 백신이 FAP를 발현시키지 않는 두 세포주 TC-1 및 TRAMP-C2 세포주 둘 다(도 8)에서 FAP의 발현을 프로빙함으로써 단지 암 관련 섬유아세포를 표적화한다는 것이 확인되었다.

마이크로-컨센서스 FAP DNA 백신은 FAP-특이적 종양 침윤성 림프구를 유도한다

FAP-면역화된 종양 보유 마우스의 종양에서 전신 면역 반응.마우스는 TC-1 종양을 이식하고, 종양 이식 후 7일째 면역화를 시작했다(도 9a). 마우스는 1주일 간격으로 2회 면역화한 다음, 마우스를 최종 면역화 1주일 후(21일째)에 희생시켰다. 항원-특이적 면역 반응은 이들 마우스의 비장세포 및 종양-침윤성 림프구 둘 다에서 평가했다. 마우스에게 짧은 기간 동안 더 적은 면역화를 제공함에도 불구하고, 마우스는 우수한 CD8+ IFN-γ 및 TNF-α 생산뿐만 아니라 CD107a 및 IFN-γ의 강력한 공-발현(도 9b)을 나타냈다. 게다가, 강력한 FAP-특이적 T 세포 반응은 종양 내의 CD8+ T 세포에서 IFN-γ, TNF-α 및 IFN-γ/CD107a 공-생산의 유의한 증가와 함께 종양 침윤성 림프구에서 또한 관찰되었다(도 9c). 게다가, CD8+ T 세포 및 조절 T 세포 (CD3+/CD4+/CD25+/FoxP3+ 세포)의 상대적 비율이 검사되었을 때, CD8+ T 세포의 증가 및 Treg의 감소가 FAP 면역화시 관찰되었다(도 9d).

면역 반응은 FAP 백신 단독, mTERT 백신 단독, 또는 병용 요법에 의한 치료를 받은 TC-1 종양 보유 마우스에서 비교했다(도 10a 내지 도 10d). 기대된 바와 같이, FAP 백신 단독 또는 mTERT 백신 단독을 수용한 마우스는 비장 및 종양 둘 다에서 각각 FAP 펩타이드 또는 mTERT 펩타이드에 대한 강력한 CD8+ IFN-γ 및 TNF-α 반응을 유도한다(도 10a 내지 도 10d). 흥미롭게도, mTERT 및 FAP를 동시에 사용하는 병용 요법을 수용한 마우스에서, 반응은 각각 백신 단독을 수용한 마우스와 비교하여 감소되어 항원 간섭성을 시사한다(도 10a 내지 도 10d). 이러한 항원 간섭성에도 불구하고, 각각 백신 단독과 비교하여 병용 요법에서 항종양 반응의 개선이 여전히 존재하여 섬유아세포 및 종양 세포의 이중 표적화가 암 면역 요법에 중요한 전략임을 시사한다.

합성 컨센서스 FAP DNA 백신은 TC-1 종양의 면역 미세환경을 변경하여 CD8+ T 세포의 비율을 증가시키고 종양 중 대식세포의 비율을 감소시킨다

다른 연구은 벡터 기반, 세포 기반 또는 DNA 백신으로 면역화시 면역 미세환경의 변경을 보고했다(참조: Zhang and Ertl, 2016, Oncotarget, 7: 23282-99; Xia 등, 2016, Cancer Immunol Immunother, 65: 613-624; Chen 등, 2015, Sci Rep, 5: 14421). 따라서, TC-1 종양의 종양 미세환경은 면역조직화학 접근법뿐만 아니라 유동 세포 계측법 둘 다를 사용하여 μCon FAP로 면역화시 평가했다(도 11, 도 12). FAP-발현 세포에 의해 커버되는 종양 섹션의 영역 및 섬유아세포 및 종양 세포 둘 다에 의해 분비된 세포외 매트릭스 글리코사미노글리칸인 히알루로난의 양의 감소는 μCon FAP DNA에 의한 백신접종시 관찰되었다(도 11a 내지 도 11d). F4/80+ 대식세포 침윤의 감소 및 CD8+ T 세포 침윤의 증가도 또한 FAP 백신접종시 관찰되었다(도 11e 내지 도 11h). 종양당 F4/80+/CD11b+ 대식세포의 빈도의 감소는 또한 유동 세포 계측법에 의한 FAP 백신접종시 관찰되었지만, B 세포, NK 세포 또는 수지상 세포의 빈도의 변화는 FAP 백신접종시 관찰되지 않았다(도 12a 내지 도 12d). FAP 백신접종시 M1 분극된 및 M2 분극된 대식세포의 상대적 비율을 구별하기 위해, 표면 마커 발현을 Arg1, MHCII, CD68, CD80 및 CD86의 발현 검사를 포함하는 종양 침윤성 대식세포 상에서 조사했다. 이러한 침윤성 대식세포에서 마커 발현의 차이가 관찰되지 않았고, μCon FAP 백신에 의한 백신접종시 대식세포 분극화가 왜곡되지 않았음을 시사한다(도 13a 내지 도 13e).

실시예 2: FAP의 면역원성 단편

마우스 균주가 천연 FAP 펩타이드에 대해 갖는 반응을 특성화하고 우성 에피토프를 결정하기 위해, FAP의 상이한 에피토프를 나타내는 122개의 펩타이드가 최적화된 컨센서스 FAP에 대해 생성되었다(도 14a). 세포가 각각의 풀로 자극되었을 때, 다양한 반응(도 14b 및 도 14c)이 존재하여 하나의 우성 에피토프가 아니라 오히려 다중 하위-우성 에피토프가 존재한다는 결론을 도출한다(도 15). 몇 개의 하위-우성 에피토프 (예: 서열번호: 22, 서열번호: 23 및 서열번호: 24)는 천연 FAP에 대하여 최적화된 컨센서스 FAP에 돌연변이를 포함한다(도 15).

실시예 3: 서열 정보

전술한 상세한 설명 및 동반되는 실시예는 단지 예시적인 것이고, 첨부된 청구범위 및 그들의 등가물에 의해서만 정의되는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다.

개시된 구현예에 대한 다양한 변화 및 변형은 당업자에게 자명할 것이다. 본 발명의 화학 구조, 치환체, 유도체, 중간체, 합성, 조성물, 제형, 또는 사용 방법에 관한 것들을 제한 없이 포함하는 이러한 변화 및 변경은 이의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 이루어질 수 있다.

<110> Weiner, David Duperret, Elizabeth <120> OPTIMIZED SYNTHETIC CONSENSUS IMMUNOGENIC COMPOSITIONS TARGETING FIBROBLAST ACTIVATION PROTEIN <130> 206108-0068-00-WO.606652 <150> US 62/397,469 <151> 2016-09-21 <160> 24 <170> KoPatentIn version 3.0 <210> 1 <211> 2202 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic consensus nucleotide sequence for human FAP <400> 1 ctgaggcctt ctagagtgca caactccgag ggcccaacca gagccctgac actgaaggac 60 atcctgaatg gcaccttttc ttacaagaca ttctttccca actggatctc tggccaggag 120 tatctgcacc agagcgccga taacaacatc atcctgtaca acatcgagac aggcgagagc 180 tacacaatcc tgtccaactc taccatgaag agcgtgaacg cctccaatta cggcctgagc 240 cctgacaggc agttcgccta cctggagtct gattatagca agctgtggag atactcctat 300 accgccacat accacatcta tgatctgatc aatggcgagt ttgtgcggga gaacgagctg 360 ccccgcccta tccagtacct gtgctggagc cccgtgggca gcaagctggc atacgtgtat 420 cagaacaata tctatctgaa gcagaggccc agggaccctc ccttccagat cacatccaac 480 ggcaaggaga ataagatctt taacggcatc cccgattggg tgtacgagga ggagatgctg 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taacatcgtg ttttacaaca tcgagacagg agagtcctac 240 atcatcctgt ccaactctac aatgaagtct gtgaacgcta gcgactacgg cctgtctcct 300 gataggcagt tcgtgtacct ggagagcgac tactccaagc tgtggagata cagctacacc 360 gccacatact acatctacga tctgcagaac ggcgagtttg tgaggggata cgagctgccc 420 agacctatcc agtacctgtg ctggtcccct gtgggatcta agctggccta cgtgtaccag 480 aacaacatct acctgaagca gcggccaggc gaccctccct tccagatcac ctacaacggc 540 cgcgagaaca agatctttaa cggaatcccc gattgggtgt acgaggagga gatgctggct 600 acaaagtacg ccctgtggtg gagccccaac ggcaagttcc tggcttacgc cgagtttaac 660 gacaccgata tcccagtgat cgcctacagc tactacggcg acggacagta ccccaggaca 720 atcaacatcc cataccccaa ggctggagcc aagaaccccg tggtgagagt gttcatcgtg 780 gataccacat acccacacca cgtgggacca atggaggtgc ctgtgccaga gatgatcgct 840 agctccgact actactttag ctggctgacc tgggtgacag atgagagggt gtgcctgcag 900 tggctgaagc gcgtgcagaa cgtgtctgtg ctgagcatct gcgacttcag ggaggattgg 960 cacgcctggg agtgtcctaa gaaccaggag cacgtggagg agtccagaac cggatgggcc 1020 ggcggcttct tcgtgagcac accagtgttc 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amino acid sequence for mouse FAP <400> 10 Leu Arg Pro Ser Arg Val Tyr Lys Pro Glu Gly Asn Thr Lys Arg Ala 1 5 10 15 Leu Thr Leu Lys Asp Ile Leu Asn Gly Thr Phe Ser Tyr Lys Thr Tyr 20 25 30 Phe Pro Asn Trp Ile Ser Glu Gln Glu Tyr Leu His Gln Ser Glu Asp 35 40 45 Asp Asn Ile Val Phe Tyr Asn Ile Glu Thr Arg Glu Ser Tyr Ile Ile 50 55 60 Leu Ser Asn Ser Thr Met Lys Ser Val Asn Ala Thr Asp Tyr Gly Leu 65 70 75 80 Ser Pro Asp Arg Gln Phe Val Tyr Leu Glu Ser Asp Tyr Ser Lys Leu 85 90 95 Trp Arg Tyr Ser Tyr Thr Ala Thr Tyr Tyr Ile Tyr Asp Leu Gln Asn 100 105 110 Gly Glu Phe Val Arg Gly Tyr Glu Leu Pro Arg Pro Ile Gln Tyr Leu 115 120 125 Cys Trp Ser Pro Val Gly Ser Lys Leu Ala Tyr Val Tyr Gln Asn Asn 130 135 140 Ile Tyr Leu Lys Gln Arg Pro Gly Asp Pro Pro Phe Gln Ile Thr Tyr 145 150 155 160 Thr Gly Arg Glu Asn Arg Ile Phe Asn Gly Ile Pro Asp Trp Val Tyr 165 170 175 Glu Glu Glu Met Leu Ala Thr Lys Tyr Ala Leu Trp Trp Ser Pro Asp 180 185 190 Gly Lys Phe Leu Ala Tyr Val Glu Phe Asn Asp Ser Asp Ile 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Thr Cys 405 410 415 His Leu Arg Lys Glu Arg Cys Gln Tyr Tyr Thr Ala Ser Phe Ser Tyr 420 425 430 Lys Ala Lys Tyr Tyr Ala Leu Val Cys Tyr Gly Pro Gly Leu Pro Ile 435 440 445 Ser Thr Leu His Asp Gly Arg Thr Asp Gln Glu Ile Gln Val Leu Glu 450 455 460 Glu Asn Lys Glu Leu Glu Asn Ser Leu Arg Asn Ile Gln Leu Pro Lys 465 470 475 480 Val Glu Ile Lys Lys Leu Lys Asp Gly Gly Leu Thr Phe Trp Tyr Lys 485 490 495 Met Ile Leu Pro Pro Gln Phe Asp Arg Ser Lys Lys Tyr Pro Leu Leu 500 505 510 Ile Gln Val Tyr Gly Gly Pro Cys Ser Gln Ser Val Lys Ser Val Phe 515 520 525 Ala Val Asn Trp Ile Thr Tyr Leu Ala Ser Lys Glu Gly Ile Val Ile 530 535 540 Ala Leu Val Asp Gly Arg Gly Thr Ala Phe Gln Gly Asp Lys Phe Leu 545 550 555 560 His Ala Val Tyr Arg Lys Leu Gly Val Tyr Glu Val Glu Asp Gln Leu 565 570 575 Thr Ala Val Arg Lys Phe Ile Glu Met Gly Phe Ile Asp Glu Glu Arg 580 585 590 Ile Ala Ile Trp Gly Trp Ala Tyr Gly Gly Tyr Val Ser Ser Leu Ala 595 600 605 Leu Ala Ser Gly Thr Gly Leu Phe Lys Cys Gly Ile Ala Val Ala Pro 610 615 620 Val Ser Ser Trp Glu Tyr Tyr Ala Ser Ile Tyr Ser Glu Arg Phe Met 625 630 635 640 Gly Leu Pro Thr Lys Asp Asp Asn Leu Glu His Tyr Lys Asn Ser Thr 645 650 655 Val Met Ala Arg Ala Glu Tyr Phe Arg Asn Val Asp Tyr Leu Leu Ile 660 665 670 His Gly Thr Ala Asp Asp Asn Val His Phe Gln Asn Ser Ala Gln Ile 675 680 685 Ala Lys Ala Leu Val Asn Ala Gln Val Asp Phe Gln Ala Met Trp Tyr 690 695 700 Ser Asp Gln Asn His Gly Ile Ser Ser Gly Arg Ser Gln Asn His Leu 705 710 715 720 Tyr Thr His Met Thr His Phe Leu Lys Gln Cys Phe Ser Leu Ser Asp 725 730 735 <210> 11 <211> 2262 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence for native mouse FAP operably linked to an IgE leader sequence <400> 11 atggactgga cctggattct gttcctggtg gctgctgcta cacgggtgca ctccctgcgg 60 ccttctcgcg tgtacaagcc agagggcaac accaagcgcg ctctgacact gaaggatatc 120 ctgaacggaa ccttctctta caagacatac tttcccaact ggatctctga gcaggagtac 180 ctgcaccaga gcgaggacga taacatcgtg ttttacaaca tcgagacaag ggagagctac 240 atcatcctga gcaactccac catgaagagc gtgaacgcta cagactacgg cctgtcccct 300 gataggcagt tcgtgtacct ggagtctgac tacagcaagc tgtggagata ctcctacacc 360 gccacatact acatctacga tctgcagaac ggcgagtttg tgcggggata cgagctgccc 420 cgccctatcc agtacctgtg ctggagccct gtgggctcca agctggccta cgtgtaccag 480 aacaacatct acctgaagca gaggcccggc gaccctccct tccagatcac ctacacaggc 540 agggagaaca gaatctttaa cggaatcccc gactgggtgt acgaggagga gatgctggct 600 accaagtacg ccctgtggtg gtcccctgat ggcaagttcc tggcttacgt ggagtttaac 660 gactccgata tcccaatcat cgcctactct tactacggcg atggacagta ccccaggaca 720 atcaacatcc cataccccaa ggctggcgcc aagaaccccg tggtgagagt gttcatcgtg 780 gacaccacat acccacacca cgtgggaccc atggaggtgc ctgtgccaga gatgatcgcc 840 agctccgatt actacttttc ttggctgacc tgggtgtcta gcgagagggt gtgcctgcag 900 tggctgaaga gagtgcagaa cgtgtccgtg ctgtctatct gcgacttcag ggaggattgg 960 cacgcttggg agtgtcctaa gaaccaggag cacgtggagg agtccagaac aggatgggcc 1020 ggcggcttct tcgtgagcac cccagctttc agccaggacg ccacatccta ctacaagatc 1080 ttttctgaca aggatggcta caagcacatc cactacatca aggataccgt ggagaacgct 1140 atccagatca caagcggaaa gtgggaggcc atctacatct tcagggtgac ccaggactcc 1200 ctgttctact cctctaacga gtttgagggc tacccaggaa ggagaaacat ctacagaatc 1260 tccatcggca acagcccacc ctccaagaag tgcgtgacct gtcacctgcg gaaggagagg 1320 tgccagtact acacagcctc ttttagctac aaggctaagt actacgctct ggtgtgctac 1380 ggaccaggac tgcctatctc taccctgcac gacggacgga cagatcagga gatccaggtg 1440 ctggaggaga acaaggagct ggagaacagc ctgcgcaaca tccagctgcc caaggtggag 1500 atcaagaagc tgaaggacgg cggactgaca ttctggtaca agatgatcct gcctccacag 1560 tttgatagga gcaagaagta ccccctgctg atccaggtgt acggcggacc ttgctcccag 1620 tctgtgaagt ccgtgttcgc tgtgaactgg atcacctacc tggcctctaa ggagggcatc 1680 gtgatcgctc tggtggacgg aaggggaaca gctttccagg gcgataagtt tctgcacgcc 1740 gtgtaccgca agctgggagt gtacgaggtg gaggaccagc tgaccgccgt gcggaagttc 1800 atcgagatgg gctttatcga tgaggagcgc atcgctatct ggggatgggc ctacggcgga 1860 tacgtgagct ccctggctct ggctagcgga acaggactgt tcaagtgtgg catcgctgtg 1920 gccccagtgt ctagctggga gtactacgcc tctatctaca gcgagcggtt tatgggactg 1980 cccaccaagg acgataacct ggagcactac aagaacagca cagtgatggc tagggccgag 2040 tacttcagaa acgtggacta cctgctgatc cacggcaccg ctgacgataa cgtgcacttc 2100 cagaactccg cccagatcgc taaggccctg gtgaacgctc aggtggactt tcaggccatg 2160 tggtactctg atcagaacca cggcatctcc tctggacgca gccagaacca cctgtacacc 2220 cacatgacac acttcctgaa gcagtgcttt agcctgtccg ac 2262 <210> 12 <211> 754 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence for native mouse FAP operably linked to an IgE leader sequence <400> 12 Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val 1 5 10 15 His Ser Leu Arg Pro Ser Arg Val Tyr Lys Pro Glu Gly Asn Thr Lys 20 25 30 Arg Ala Leu Thr Leu Lys Asp Ile Leu Asn Gly Thr Phe Ser Tyr Lys 35 40 45 Thr Tyr Phe Pro Asn Trp Ile Ser Glu Gln Glu Tyr Leu His Gln Ser 50 55 60 Glu Asp Asp Asn Ile Val Phe Tyr Asn Ile Glu Thr Arg Glu Ser Tyr 65 70 75 80 Ile Ile Leu Ser Asn Ser Thr Met Lys Ser Val Asn Ala Thr Asp Tyr 85 90 95 Gly Leu Ser Pro Asp Arg Gln Phe Val Tyr Leu Glu Ser Asp Tyr Ser 100 105 110 Lys Leu Trp Arg Tyr Ser Tyr Thr Ala Thr Tyr Tyr Ile Tyr Asp Leu 115 120 125 Gln Asn Gly Glu Phe Val Arg Gly Tyr Glu Leu Pro Arg Pro Ile Gln 130 135 140 Tyr Leu Cys Trp Ser Pro Val Gly Ser Lys Leu Ala Tyr Val Tyr Gln 145 150 155 160 Asn Asn Ile Tyr Leu Lys Gln Arg Pro Gly Asp Pro Pro Phe Gln Ile 165 170 175 Thr Tyr Thr Gly Arg Glu Asn Arg Ile Phe Asn Gly Ile Pro Asp Trp 180 185 190 Val Tyr Glu Glu Glu Met Leu Ala Thr Lys Tyr Ala Leu Trp Trp Ser 195 200 205 Pro Asp Gly Lys Phe Leu Ala Tyr Val Glu Phe Asn Asp Ser Asp Ile 210 215 220 Pro Ile Ile Ala Tyr Ser Tyr Tyr Gly Asp Gly Gln Tyr Pro Arg Thr 225 230 235 240 Ile Asn Ile Pro Tyr Pro Lys Ala Gly Ala Lys Asn Pro Val Val Arg 245 250 255 Val Phe Ile Val Asp Thr Thr Tyr Pro His His Val Gly Pro Met Glu 260 265 270 Val Pro Val Pro Glu Met Ile Ala Ser Ser Asp Tyr Tyr Phe Ser Trp 275 280 285 Leu Thr Trp Val Ser Ser Glu Arg Val Cys Leu Gln Trp Leu Lys Arg 290 295 300 Val Gln Asn Val Ser Val Leu Ser Ile Cys Asp Phe Arg Glu Asp Trp 305 310 315 320 His Ala Trp Glu Cys Pro Lys Asn Gln Glu His Val Glu Glu Ser Arg 325 330 335 Thr Gly Trp Ala Gly Gly Phe Phe Val Ser Thr Pro Ala Phe Ser Gln 340 345 350 Asp Ala Thr Ser Tyr Tyr Lys Ile Phe Ser Asp Lys Asp Gly Tyr Lys 355 360 365 His Ile His Tyr Ile Lys Asp Thr Val Glu Asn Ala Ile Gln Ile Thr 370 375 380 Ser Gly Lys Trp Glu Ala Ile Tyr Ile Phe Arg Val Thr Gln Asp Ser 385 390 395 400 Leu Phe Tyr Ser Ser Asn Glu Phe Glu Gly Tyr Pro Gly Arg Arg Asn 405 410 415 Ile Tyr Arg Ile Ser Ile Gly Asn Ser Pro Pro Ser Lys Lys Cys Val 420 425 430 Thr Cys His Leu Arg Lys Glu Arg Cys Gln Tyr Tyr Thr Ala Ser Phe 435 440 445 Ser Tyr Lys Ala Lys Tyr Tyr Ala Leu Val Cys Tyr Gly Pro Gly Leu 450 455 460 Pro Ile Ser Thr Leu His Asp Gly Arg Thr Asp Gln Glu Ile Gln Val 465 470 475 480 Leu Glu Glu Asn Lys Glu Leu Glu Asn Ser Leu Arg Asn Ile Gln Leu 485 490 495 Pro Lys Val Glu Ile Lys Lys Leu Lys Asp Gly Gly Leu Thr Phe Trp 500 505 510 Tyr Lys Met Ile Leu Pro Pro Gln Phe Asp Arg Ser Lys Lys Tyr Pro 515 520 525 Leu Leu Ile Gln Val Tyr Gly Gly Pro Cys Ser Gln Ser Val Lys Ser 530 535 540 Val Phe Ala Val Asn Trp Ile Thr Tyr Leu Ala Ser Lys Glu Gly Ile 545 550 555 560 Val Ile Ala Leu Val Asp Gly Arg Gly Thr Ala Phe Gln Gly Asp Lys 565 570 575 Phe Leu His Ala Val Tyr Arg Lys Leu Gly Val Tyr Glu Val Glu Asp 580 585 590 Gln Leu Thr Ala Val Arg Lys Phe Ile Glu Met Gly Phe Ile Asp Glu 595 600 605 Glu Arg Ile Ala Ile Trp Gly Trp Ala Tyr Gly Gly Tyr Val Ser Ser 610 615 620 Leu Ala Leu Ala Ser Gly Thr Gly Leu Phe Lys Cys Gly Ile Ala Val 625 630 635 640 Ala Pro Val Ser Ser Trp Glu Tyr Tyr Ala Ser Ile Tyr Ser Glu Arg 645 650 655 Phe Met Gly Leu Pro Thr Lys Asp Asp Asn Leu Glu His Tyr Lys Asn 660 665 670 Ser Thr Val Met Ala Arg Ala Glu Tyr Phe Arg Asn Val Asp Tyr Leu 675 680 685 Leu Ile His Gly Thr Ala Asp Asp Asn Val His Phe Gln Asn Ser Ala 690 695 700 Gln Ile Ala Lys Ala Leu Val Asn Ala Gln Val Asp Phe Gln Ala Met 705 710 715 720 Trp Tyr Ser Asp Gln Asn His Gly Ile Ser Ser Gly Arg Ser Gln Asn 725 730 735 His Leu Tyr Thr His Met Thr His Phe Leu Lys Gln Cys Phe Ser Leu 740 745 750 Ser Asp <210> 13 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Immunogenic Fragment of FAP <400> 13 Lys Asp Gly Gly Leu Thr Phe Trp Tyr Lys Met Ile Leu Pro Pro 1 5 10 15 <210> 14 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Immunogenic Fragment of FAP <400> 14 Ala Val Asn Trp Ile Thr Tyr Leu Ala Ser Lys Glu Gly Ile Val 1 5 10 15 <210> 15 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Immunogenic Fragment of FAP <400> 15 Tyr Leu Ala Ser Lys Glu Gly Ile Val Ile Ala Leu Val Asp Gly 1 5 10 15 <210> 16 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Immunogenic Fragment of FAP <400> 16 Leu Glu His Tyr Lys Asn Ser Thr Val Met Ala Arg Ala Glu Tyr 1 5 10 15 <210> 17 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Immunogenic Fragment of FAP <400> 17 His Gly Thr Ala Asp Asp Asn Val His Phe Gln Asn Ser Ala Gln 1 5 10 15 <210> 18 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Immunogenic Fragment of FAP <400> 18 Val Asp Phe Gln Ala Met Trp Tyr Ser Asp Gln Asn His Gly Ile 1 5 10 15 <210> 19 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Immunogenic Fragment of FAP <400> 19 Asn Ile Glu Thr Arg Glu Ser Tyr Ile Ile Leu Ser Asn Ser Thr 1 5 10 15 <210> 20 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Immunogenic Fragment of FAP <400> 20 Gly Leu Ser Pro Asp Arg Gln Phe Val Tyr Leu Glu Ser Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 21 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Immunogenic Fragment of FAP <400> 21 Ala Thr Tyr Tyr Ile Tyr Asp Leu Gln Asn Gly Glu Phe Val Arg 1 5 10 15 <210> 22 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Immunogenic Fragment of FAP <400> 22 Glu Val Asp Gly Ile Thr Leu Trp Tyr Lys Met Ile Leu Pro Pro 1 5 10 15 <210> 23 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Immunogenic Fragment of FAP <400> 23 Ala Val Asn Trp Ile Ser Tyr Leu Ala Ser Lys Glu Gly Ile Val 1 5 10 15 <210> 24 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Immunogenic Fragment of FAP <400> 24 Asn Ile Glu Thr Gly Glu Ser Tyr Ile Ile Leu Ser Asn Ser Thr 1 5 10 15

Claims (27)

1. 핵산 분자를 포함하는 면역원성 조성물로서, 상기 핵산 분자가 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 코딩하는, 면역원성 조성물: a) 서열번호: 2 및 서열번호: 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 전장에 대해 적어도 약 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열, b) 서열번호: 2 및 서열번호: 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 적어도 60%에 대해 적어도 약 90% 동일성을 갖는 면역원성 단편, c) 서열번호: 2 및 서열번호: 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 및 d) 서열번호: 2 및 서열번호: 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 적어도 60% 포함하는 면역원성 단편.
2. 청구항 1에 있어서, 상기 핵산 분자가 DNA 분자 및 RNA 분자로 구성된 군으로부터 선택되는, 면역원성 조성물.
3. 청구항 1에 있어서, 상기 핵산 분자가 다음으로 구성된 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 면역원성 조성물: a) 서열번호: 1 및 서열번호: 5로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열의 전장에 대해 적어도 약 90% 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열, b) 서열번호: 1 및 서열번호: 5로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열의 적어도 60%에 대해 적어도 약 90% 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열의 면역원성 단편, c) 서열번호: 1 및 서열번호: 5로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열, 및 d) 서열번호: 1 및 서열번호: 5로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열의 면역원성 단편.
4. 청구항 1에 있어서, 상기 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 시작 코돈, IgE 선도 서열 및 정지 코돈으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 조절 서열에 작동가능하게 연결된, 면역원성 조성물.
5. 청구항 4에 있어서, 상기 핵산 분자가 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 코딩하는, 면역원성 조성물: a) 서열번호: 4 및 서열번호: 8로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 전장에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열, b) 서열번호: 4 및 서열번호: 8로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 적어도 60%에 대해 적어도 약 90% 동일성을 포함하는 면역원성 단편, c) 서열번호: 4 및 서열번호: 8로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 및 d) 서열번호: 4 및 서열번호: 8로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 적어도 60% 포함하는 면역원성 단편.
6. 청구항 5에 있어서, 상기 핵산 분자가 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 면역원성 조성물: a) 서열번호: 3 및 서열번호: 7로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열의 전장에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열, b) 서열번호: 3 및 서열번호: 7로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열의 적어도 60%에 대해 적어도 약 90% 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열의 면역원성 단편, c) 서열번호: 3 및 서열번호: 7로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열, 및 d) 서열번호: 3 및 서열번호: 7로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열의 면역원성 단편.
7. 청구항 1에 있어서, 상기 핵산 분자가 발현 벡터를 포함하는, 면역원성 조성물.
8. 청구항 1에 있어서, 상기 핵산 분자가 바이러스 입자에 도입되는, 면역원성 조성물.
9. 청구항 1에 있어서, 약제학적으로 허용되는 부형제를 추가로 포함하는, 면역원성 조성물.
10. 청구항 1에 있어서, 아쥬반트를 추가로 포함하는, 면역원성 조성물.
11. 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 코딩하는 핵산 분자: a) 서열번호: 2 및 서열번호: 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 전장에 대해 적어도 약 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열, b) 서열번호: 2 및 서열번호: 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 적어도 60%에 대해 적어도 약 90% 동일성을 포함하는 단편, c) 서열번호: 2 및 서열번호: 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 및 d) 서열번호: 2 및 서열번호: 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 적어도 60% 포함하는 단편.
12. 청구항 11에 있어서, 상기 핵산 분자가 DNA 분자 및 RNA 분자로 구성된 군으로부터 선택되는, 핵산 분자.
13. 청구항 11에 있어서, 상기 핵산 분자가 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 핵산 분자: a) 서열번호: 1 및 서열번호: 5로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열의 전장에 대해 적어도 약 90% 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열, b) 서열번호: 1 및 서열번호: 5로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열의 적어도 60%에 대해 적어도 약 90% 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열의 단편, c) 서열번호: 1 및 서열번호: 5로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열, 및 d) 서열번호: 1 및 서열번호: 5로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열의 단편.
14. 청구항 11에 있어서, 상기 코딩된 펩타이드가 시작 코돈, IgE 선도 서열 및 정지 코돈으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 조절 서열에 작동가능하게 연결된, 핵산 분자.
15. 청구항 14에 있어서, 상기 핵산 분자가 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 코딩하는, 핵산 분자: a) 서열번호: 4 및 서열번호: 8로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 전장에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열, b) 서열번호: 4 및 서열번호: 8로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 적어도 60%에 대해 적어도 90% 동일성을 포함하는 단편, c) 서열번호: 4 및 서열번호: 8로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 및 d) 서열번호: 4 및 서열번호: 8로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 적어도 60% 포함하는 단편.
16. 청구항 15에 있어서, 상기 핵산 분자가 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 핵산 분자: a) 서열번호: 3 및 서열번호: 7로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열의 전장에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열, b) 서열번호: 3 및 서열번호: 7로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열의 적어도 60%에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열의 단편, c) 서열번호: 3 및 서열번호: 7로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열, 및 d) 서열번호: 3 및 서열번호: 7로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열의 단편.
17. 청구항 11에 있어서, 상기 핵산 분자가 발현 벡터를 포함하는, 핵산 분자.
18. 청구항 11에 있어서, 상기 핵산 분자가 바이러스 입자를 포함하는, 핵산 분자.
19. 펩타이드를 포함하는 면역원성 조성물로서, 상기 펩타이드가 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 면역원성 조성물: a) 서열번호: 2, 서열번호: 4, 서열번호: 6 및 서열번호: 8로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 전장에 대해 적어도 약 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열, b) 서열번호: 2, 서열번호: 4, 서열번호: 6 및 서열번호: 8로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 적어도 60%에 대해 적어도 약 90% 동일성을 포함하는 면역원성 단편, c) 서열번호: 2, 서열번호: 4, 서열번호: 6 및 서열번호: 8로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열 및 d) 서열번호: 2, 서열번호: 4, 서열번호: 6 및 서열번호: 8로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 적어도 60% 포함하는 면역원성 단편.
20. 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드: a) 서열번호: 2, 서열번호: 4, 서열번호: 6 및 서열번호: 8로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 전장에 대해 적어도 약 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열, b) 서열번호: 2, 서열번호: 4, 서열번호: 6 및 서열번호: 8로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 적어도 60%에 대해 적어도 약 90% 동일성을 포함하는 면역원성 단편, c) 서열번호: 2, 서열번호: 4, 서열번호: 6 및 서열번호: 8로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열 및 d) 서열번호: 2, 서열번호: 4, 서열번호: 6 및 서열번호: 8로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 적어도 60% 포함하는 면역원성 단편.
21. 필요로 하는 대상체에서 섬유아세포 활성화 단백질 (FAP)에 대한 면역 반응을 유도하는 방법으로서, 상기 방법이 상기 대상체에게 청구항 1의 면역원성 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
22. 청구항 21에 있어서, 투여 단계가 전기천공 및 주사 중 적어도 하나를 포함하는, 방법.
23. 필요로 하는 대상체에서 종양 관련 병리학을 치료하거나 예방하는 방법으로서, 상기 방법이 상기 대상체에게 청구항 1의 면역원성 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
24. 청구항 23에 있어서, 투여 단계가 전기천공 및 주사 중 적어도 하나를 포함하는, 방법.
25. 청구항 23에 있어서, 상기 종양 관련 병리학이 종양 성장, 종양 전이 및 혈관신생 중 적어도 하나인, 방법.
26. 청구항 23에 있어서, 상기 대상체가 암을 진단받은, 방법.
27. 청구항 23에 있어서, 상기 방법이 상기 대상체에게 하나 이상의 암 항원을 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
    

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