CN108770343A - 用于治疗癌症的使用MICA/Bα3结构域的疫苗接种 - Google Patents

Abstract

本发明提供了通过引起针对MICα3‑结构域多肽的免疫应答来治疗个体中的癌症的组合物和方法。

Description

用于治疗癌症的使用MICA/Bα3结构域的疫苗接种

相关申请

本申请要求2015年12月4日提交的美国临时申请号62/263,377和2016年11月15日提交的美国临时申请号62/422,454的优先权和权益，它们中的每一篇的内容特此通过引用以其整体并入本文。

序列表的通过引用并入

名称为“DFCI-126-001WO-Sequence Listing.txt”的文本文件（其创建于2016年12月2日且是30.9 KB大小）的内容特此通过引用以其整体并入本文。

技术领域

本发明一般地涉及用于诱导个体中的抗肿瘤免疫应答的组合物和方法。

政府利益

本发明在美国国立卫生研究院颁布的R01CA173750下在政府支持下完成。政府具有本发明的某些权利。

发明背景

癌症免疫疗法领域中的新近进展已经证实了我们的免疫系统根除甚至晚期癌症的能力。这些疗法正在迅速地改变癌症治疗的面貌。不同于需要重复施用抗体来预防肿瘤复发的单克隆抗体疗法，疫苗可以诱导内源性免疫记忆并因而具有提供长期保护的潜力。

用于疫苗疗法的抗原的选择要求综合理解候选抗原在肿瘤生长中的生物学作用和与正常组织相比肿瘤细胞对它们的表达水平。MICA和密切相关的MICB蛋白(缩写为MIC)是正常细胞缺少或以非常低的水平表达的抗原，但是被由基因组损伤继发的多种不同癌症广泛地上调。MIC是在细胞毒性淋巴细胞（具体地，NK细胞、CD8 T细胞和γ-δT细胞）上的NKG2D受体的重要配体。MIC的表达靶向这样的细胞以被免疫系统消除。但是，发现许多肿瘤会通过从细胞表面脱落MIC而逃脱该重要的免疫监视途径，在该过程中，MICα3结构域被二硫键异构酶ERp5展开，从而使它对基质金属蛋白酶诸如ADAM 10和ADAM 17的切割敏感。脱落的MIC造成NK细胞和CD8 T细胞上的NKG2D受体的下调。蛋白水解性裂解因而将免疫刺激蛋白转化成免疫抑制物质。

因而，需要化合物来抑制MICA脱落。

发明概述

在不同的方面，本发明提供了疫苗组合物，其包括有效量的包含MICα3-结构域的肽作为免疫原性组分。有效量是指有效地引起针对MICα3-结构域的免疫应答的量。

所述MICα3-结构域是MICA或MICBα3-结构域。任选地，所述MICα3-结构域是非糖基化的。优选地，所述肽包括SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 4的氨基酸序列。在不同的方面，所述疫苗组合物包含多种肽。在某些方面，所述肽缀合至载体蛋白。

在另一个方面，本发明提供了一种融合蛋白，其具有与MICα3-结构域蛋白连接的单体铁蛋白亚基蛋白。所述单体铁蛋白亚基蛋白具有允许所述融合蛋白自装配成纳米颗粒的结构域。在一个优选的实施方案中，所述单体亚基是幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）铁蛋白蛋白。任选地，所述融合蛋白进一步缀合至CpG寡核苷酸。

在另一个方面，本发明提供了一种纳米颗粒，其包括根据本发明的融合蛋白。所述纳米颗粒包括多种‘MICα3-结构域肽。

在另一个方面，本发明提供了一种疫苗组合物，其包含根据本发明的纳米颗粒。所述疫苗组合物可以进一步包含GM-CSF。

在另一个方面，本发明提供了通过给个体施用根据本发明的疫苗组合物来治疗个体中的癌症的方法。任选地，所述疫苗组合物含有GM-CSF。所述个体已经在他们的血清中被测试为MIC脱落阳性的。所述疫苗组合物作为治疗方案的部分来施用。治疗方案包括，例如，辐射疗法、靶向疗法、免疫疗法或化学疗法。任选地，给所述个体进一步施用一种或多种对MICα3-结构域抗原以外的抗原特异性的疫苗。

在另一个方面，本发明提供了一种通过给所述个体施用疫苗来治疗癌症的方法，所述疫苗包含表达MICα-3结构域的细胞。在另一个方面，本发明提供了一种治疗癌症的方法，其中通过使用复制型或非复制型病毒来诱导针对MIC的免疫应答。

除非另外定义，否则在本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解相同的含义。尽管与本文描述的那些类似或等同的方法和材料可以用于实践本发明，但是在下面描述了合适的方法和材料。在本文中提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献都明确地通过引用以其整体并入本文。在冲突的情况下，以本说明书（包括定义）为准。另外，本文描述的材料、方法和实施例仅仅是示例性的，且不意图是限制性的。

本发明的其它特征和优点将从下述详细描述和权利要求中明白且被下述详细描述和权利要求包括。

附图简述

图1A是表示NKG2D同源二聚体和MICA之间的相互作用的示意图。为了参考指出了MICA-α3结构域。来自：Nat Immunol. 2001 May;2(5):443-51. Complex structure of theactivating immunoreceptor NKG2D and its MHC class I-like ligand MICA。

图1B是表示一种机制的示意图，通过该机制，肿瘤通过从肿瘤细胞的表面脱落MIC而逃脱免疫监视。

图1C是描绘一种铁蛋白颗粒的示意图。

图1D是描绘一种图谱的示意图，所述图谱表明针对人和小鼠铁蛋白的细胞和体液免疫应答。

图2A是MICAα3铁蛋白融合基因构建体的示意图。

图2B是(左)使用XK16/60 Superdex200柱(流速: 2ml/min；运行缓冲液: 50mMTris, 150mM NaCl pH 7.5)的MICAα3-铁蛋白的尺寸排阻色谱图。图2B进一步描绘了(右)在还原条件下的SDS凝胶，其含有在蛋白峰处在22-27分钟之间收集的样品。

图2C是去糖基化的MICAα3构建体的示意图。

图2D是(左)使用Superdex200柱(流速: 1ml/min；运行缓冲液: 50mM Tris,150mM NaCl pH 7.5)的MICAα3的尺寸排阻色谱图。图2D进一步描绘了(右)在还原条件下的SDS凝胶，其含有在蛋白峰处在16-20分钟之间收集的样品。

图3是描绘介孔二氧化硅杆(Mesoporous silica杆，MSR)疫苗用于皮下注射的应用和得到的有效免疫应答的诱导的示意图。参见Kim, J & Aileen, W.L. 等人. Nature Biotech. 2015。

图4A和4B的一系列图描绘了MICα3结构域疫苗在肺转移模型中的效力。如下得到呈现在图4A中的数据。将B6小鼠用200 μg MICα3蛋白、1 μg GM-CSF和100 μg CpG-ODN免疫，作为没有支架的推注(推注)或在介孔二氧化硅杆(MSR)支架内(MSR疫苗)。小鼠在第28天接受一次加强注射。3周以后，通过5X10⁵ B16-MIC肿瘤细胞的静脉内注射来攻击小鼠。在肿瘤细胞注射后第14天定量肺转移灶的数目。如下得到在图4B中得到的数据。在肿瘤细胞注射后第0、5和13天通过ELISA定量脱落的MIC。先前的实验已经表明，MICα3结构域特异性抗体不会干扰用于检测脱落的MIC的ELISA。

图5A和5B的一系列小图和图证实，使用MICA-铁蛋白融合蛋白的疫苗接种会诱导高滴度的MICA特异性抗体。图5A描绘了免疫的小鼠的血清中针对在B16F10小鼠黑素瘤细胞的表面上表达的全长MICA的MICAα3特异性抗体的FACS图。将B16F10黑素瘤细胞用人MICAcDNA (等位基因009)转染，并然后用同种型对照抗体(阴性对照)或饱和浓度的对MICA特异性的鼠mAb (6D4, 阳性对照)标记。然后使用该系统测试来自用MICAα3 - 铁蛋白或对照抗原(OVA)接种疫苗的小鼠的血清。使用PE-标记的第二抗-小鼠IgG抗体检测结合至细胞表面的抗体。通过FACS定量荧光。在疫苗接种后第14-42天甚至用1 μl来自小鼠的血清检测到强烈染色。图5B描绘的平均荧光强度(MFI)的条形图代表了免疫的小鼠的血清中的MICAα3特异性抗体与在B16F10小鼠黑素瘤细胞的表面上表达的全长MICA的结合的3个重复的±SD。

图6的一系列图描绘了来自MICA-铁蛋白免疫的小鼠的测试血清，其通过ELISA进行测定以确定在疫苗接种后诱导的IgG的不同亚类。

图7的图表明，MICA-铁蛋白免疫组中的血清抗体会阻止MICA从肿瘤细胞表面脱落。

图8A和8B的一系列图描绘了MICA-铁蛋白疫苗的治疗活性。将C57BL/6小鼠用MICAα3 - 铁蛋白或卵白蛋白免疫并在第28天接受加强注射。通过5x10⁵个形成肺转移灶的B16-MICA肿瘤细胞的静脉内注射，攻击小鼠。在第14天计数肺转移灶的数目(图8A)，并定量血清中的脱落的MICA (图8B)。MICAα3结构域疫苗实质上减少肺转移灶的数目，而对照疫苗没有影响。并且，脱落的MICA在已经接受MICAα3 - 铁蛋白疫苗的小鼠的血清中变得不可检测，而脱落的MICA水平在两个对照组中非常高。图8A证实，相对于原初对照或接受OVA-蛋白注射的动物，使用MICAα3-铁蛋白的免疫接种会阻止转移。图8B的图证实了通过ELISA得到的结果，其指示，接种疫苗的小鼠在血清中具有不可检测的sMICA (脱落的MICA)水平。

图9A-9C的一系列图描绘了通过MICA-铁蛋白疫苗诱导的抗体的滴度(图9A)以及疫苗剂量对肺小结节的数目(图9B)和sMICA的量(图9C)的影响。

图10A和10B是描绘通过流式细胞计量术测试的MICAα3疫苗的去糖基化形式(没有连接至铁蛋白纳米颗粒)对免疫的小鼠的血清中的MICAα3特异性抗体与在B16F10小鼠黑素瘤细胞的表面上表达的全长MICA的结合的影响的一系列图(图10A)，以及描绘来自ELISA测定的结果的图，所述ELISA测定用于确定在疫苗接种后诱导的IgG的不同亚类(图10B)。

图11A和11B的一系列图描绘了单独的MICAα3疫苗(没有铁蛋白融合)具有显著的体内治疗益处。图11A的图描绘了接种单独的MICAα疫苗以后肺转移灶的数目。图11B的图描绘了在接种单独的MICAα疫苗后第0天、第5天和第13天血清中的sMICA的量。

图12A和12B表明，MICA-铁蛋白疫苗在B16F10皮下黑素瘤模型中延迟肿瘤生长。在图12A中，将7周龄C57BL/6雌性小鼠(n=8)用MICA-铁蛋白疫苗免疫并在第12天强化。在初次疫苗接种以后第25天通过皮下注射0.5x10⁶个表达MICA的B16F10细胞来攻击小鼠，并每隔一天测量肿瘤体积。发现与原初的、未治疗的年龄匹配的对照组(实心圆)相比，MICA-铁蛋白免疫组(空心正方形)中的肿瘤生长显著更低。在图12B中，在用MICA-铁蛋白疫苗免疫的小鼠的血清中的sMICA水平是不可检测的(空心三角形)，而在肿瘤攻击以后2周内在未免疫的对照组的血清中检测到高水平的sMICA (实心三角形)。

图13A和13B表明，CD8 T细胞的除去在接种MICA-铁蛋白的B16F10皮下黑素瘤模型中会加速肿瘤生长。在图13A中，将7周龄C57BL/6雌性小鼠用MICA-铁蛋白疫苗(n=16)或用OV对照疫苗(n=8)免疫，并在第14天强化。在初次疫苗接种以后第21天通过皮下注射0.5x10⁶个表达MICA的B16F10细胞来攻击小鼠。小鼠在肿瘤攻击前2天接受200 μg抗-CD8抗体(n=8)或同种型对照抗体(n=8)的静脉内注射，并在此后每周2次接受每只小鼠100 μg的剂量直到研究端点。每隔一天测量肿瘤体积。当肿瘤达到≥250mm²时，将小鼠安乐死。肿瘤在用CD8抗体治疗的、接种OVA蛋白的对照小鼠中在第12天之前(空心三角形)和在原初的、未治疗的、未除去的对照组中在第14天之前(实心圆)达到它们的最大体积。与接受同种型抗体的MICA-接种组(空心正方形)相比，CD8除去在MICA-接种组(实心三角形)中加速肿瘤生长。在图13B中，CD8除去实验的存活率分析，以粗实线显示了年龄匹配的原初的、未治疗的、未除去的对照组，以细短划线显示了OVA蛋白接种组，以粗短划线显示了接种MICA-铁蛋白的、除去CD8的组，且以细实线显示了接种MICA-铁蛋白的、注射同种型抗体的小鼠。

图14A和14B表明，NK细胞为MICA-铁蛋白疫苗在B16F10皮下黑素瘤模型中的治疗效果做出贡献。在图14A中，将7周龄C57BL/6雌性小鼠用MICA-铁蛋白疫苗(n=16)免疫，并在第14天强化。在初次疫苗接种以后第21天通过皮下注射0.5x10⁶个表达MICA的B16F10细胞来攻击小鼠。小鼠在肿瘤攻击前2天接受200 μg抗-NK1.1抗体(n=8)或同种型对照抗体(n=8)的静脉内注射，并在此后每周2次接受每只小鼠100 μg的剂量直到研究端点。每隔一天测量肿瘤体积。当肿瘤达到≥250mm²时，将小鼠安乐死。肿瘤在原初的、未治疗的、未除去的对照组中在第14天之前达到它们的最大体积(实心圆)。与接受同种型抗体的MICA-接种组(实心正方形)相比，NK细胞除去加速MICA-接种组(空心三角形)中的肿瘤生长。在图14B中，NK细胞除去实验的存活率分析，其以粗实线显示了年龄匹配的原初的、未治疗的、未除去的对照组；以短划线显示了接种MICA-铁蛋白的、除去NK细胞的组，且以细实线显示了接种MICA-铁蛋白的、注射同种型抗体的小鼠。

图15A和15B表明，响应于MICA-铁蛋白疫苗产生的血清多克隆抗体会阻止B16F10-MICA肿瘤细胞的肺转移。在图15A中，通过静脉内注射0.5x10⁶个表达MICA的B16F10黑素瘤细胞攻击8周龄Ighmtm1Cgn/J雌性小鼠(n=12)。将小鼠随机分入3个组群，每个4只小鼠。在肿瘤攻击以后第1、2、4和6天，给小鼠注射(腹膜内途径) 100 μl来自原初的、OVA-蛋白或MICA-铁蛋白免疫的C57BL/6小鼠的终点血清。在肿瘤攻击以后14天将小鼠安乐死；将肺收获并在10%中性缓冲的福尔马林中固定，并定量肺转移灶的数目。与注射了来自未治疗的、年龄匹配的对照组(实心圆)和OVA-蛋白免疫组的血清的小鼠相比，注射了来自MICA-铁蛋白接种组(空心正方形)的血清的小鼠具有显著更少的肺转移灶。在图15B中，与接受来自原初或OVA-蛋白免疫组的血清的小鼠相比，sMICA水平在接受来自MICA-铁蛋白接种组(空心正方形)的血清的小鼠中更低。

图16A和16B表明，MICA-铁蛋白疫苗也控制B16F10-MICB005皮下肿瘤生长。在图16A中，将7周龄C57BL/6雌性小鼠(n=4)用MICA-铁蛋白疫苗免疫并在第14天强化。在初次疫苗接种以后第21天通过皮下注射0.5x10⁶个表达MICB的B16F10细胞来攻击小鼠，并每隔一天测量肿瘤体积。发现与OVA-蛋白免疫的对照组(实心圆)相比，MICA-铁蛋白免疫组中的B16F10-MICB肿瘤生长显著更低(空心正方形)。在图16B中，sMICB水平在用MICA-铁蛋白疫苗免疫的小鼠(空心正方形)的血清中是几乎不可检测的，而在肿瘤攻击以后2周内在OVA-蛋白免疫的对照组(实心圆)的血清中检测到高水平的sMICB。

图17的一系列图显示了用血清对表达MICA的B16细胞系的染色，所述血清来自用与介孔二氧化硅杆(MSR)一起配制的MICA-铁蛋白疫苗(短划线)或CpG与MICA-铁蛋白的直接缀合(没有MSR) (细实线)免疫的小鼠。这些数据表明，与用MSR支架配制的疫苗相比，使用与MICA-铁蛋白肽直接缀合的CpG的疫苗接种会诱导更强烈的对MICAα3结构域的免疫应答。对于MSR疫苗，5mg MSR+200ug蛋白+100ug CpG+1ug GM-CSF在第0天免疫；在第14天强化；血清来自第28天。对于直接缀合，200ug蛋白缀合至~5ug CpG (初次免疫接种)；强化(100ug蛋白缀合至~5ug CpG + addavax (100ul) + GM-CSF (1ug)；在第0天免疫；在第21天强化；血清来自第28天。

图18A是纯化的MICAα3 - 铁蛋白纳米颗粒的电子显微照片。

图18B是亲和力和凝胶过滤色谱法以后疫苗蛋白的SDS-PAGE的照片。

图19的图表明，由MICAα3结构域疫苗诱导的多克隆抗体抑制人肿瘤细胞的MICA脱落。使用夹心ELISA定量人A375黑素瘤细胞系的MICA脱落。小量来自接种了MICAα3 - 铁蛋白的小鼠的血清(1-10 μl)的添加强烈地抑制脱落，而来自对照小鼠的血清的添加影响很小。

图20A-20C的一系列图表明，MICA-铁蛋白疫苗诱导对新抗原的二次T细胞应答。我们检查了MICBα3结构域疫苗是否诱导对肿瘤新抗原的二次应答。将淋巴结T细胞用CFSE标记，并与4种不同的新抗原肽（以前针对B16F10肿瘤鉴别为CD4 T细胞表位）一起培养3天。基于繁殖细胞中的细胞内IFNγ染色(CFSE^低)，为4种肽中的3种鉴别出CD4 T细胞应答。我们假定，MICA抗体触发Fc受体介导的树突细胞对细胞凋亡肿瘤片段的摄取并由此促进对新抗原的T细胞应答。在图20A- 20B中，将B6小鼠用MICBα3 - 铁蛋白或OVA (n=5/组)免疫并注射B16F10-MICB肿瘤细胞。在肿瘤植入以后10天从肿瘤-引流淋巴结分离T细胞并用CFSE标记。在有4种不同的CD4新抗原肽(10 μg/ml)（以前针对B16F10肿瘤鉴别处）存在下，将T细胞与CD11c+脾细胞一起培养3天。执行细胞内IFNγ染色，并定量就细胞内IFNγ而言为阳性的繁殖T细胞(CFSE-低)。在用OV对照抗原(图20A)或MICBα3结构域(图20B)免疫的小鼠之间对比对新抗原肽的T细胞应答。将两种T细胞群体与M30新抗原一起在体外温育。在图20C中，对3种新抗原(M30、M44和M48)的T细胞应答的总结，所述新抗原在MICB免疫的小鼠中观察到增强的T细胞应答。

图21A-21B的图表明，使用与CpG缀合的MICA-铁蛋白纳米颗粒的免疫接种会诱导高滴度抗体。在图21A中，通过点击化学(蛋白-寡物缀合试剂盒, Solulink)将猕猴MICA/B-铁蛋白缀合至CpG ODN 1826。简而言之，将S-HyNic (琥珀酰亚胺基-6-肼基-烟酰胺)接头通过赖氨酸上的伯胺缀合至所述蛋白，并将S-4B (琥珀酰亚胺基-4-甲酰基苯甲酰胺)接头添加至CpG寡物。将经修饰的蛋白和寡物在催化的缀合反应中温育。在该反应以后，通过尺寸排阻色谱法除去多余的未缀合的CpG。形成的蛋白-寡物缀合键(稳定的二芳基腙键)是在350nm紫外可追踪的(参见图)。在图21B中，使用CpG缀合的蛋白来免疫C57BL/6小鼠。在第14天通过B16-MICA细胞的标记分析在血清中的MICA/B特异性抗体。相对于与支架一起配制的MICA-铁蛋白蛋白(短划线；粗实线表明背景染色水平)，CpG连接的蛋白诱导更高滴度抗体(细实线)。

发明详述

本发明提供了一种癌症疫苗。更具体地，本发明提供了一种MICα3-结构域疫苗，其可以引起针对MICα3-结构域的免疫应答。重要的是，所述疫苗引起针对MICα3结构域的抗体，但是不引起针对MIC的α1-α2结构域的抗体，也不会干扰α1-α2结构域与NK细胞上的NKG2D受体的结合。

所述疫苗的目的是诱导多克隆抗体，其结合MICA的膜近侧Ig结构域并抑制该蛋白从肿瘤细胞的蛋白水解性脱落。MICAα3结构域在纳米颗粒的表面上表达。具体地，鉴于铁蛋白自发地形成纳米颗粒，将MICAα3结构域编码序列与铁蛋白序列(来自幽门螺杆菌)融合。使用CpG（作为佐剂）和GM-CSF（以将树突细胞募集至注射部位）与免疫接种支架(介孔二氧化硅杆)一起配制疫苗，或直接地将CpG缀合至MICAα3结构域-铁蛋白融合蛋白和GM-CSF。发现这些疫苗的注射诱导了针对MICAα3结构域的高滴度抗体。令人惊讶地，具有直接缀合的CpG的MICAα3结构域-铁蛋白融合蛋白实现了更高的抗体滴度。

由本发明的疫苗组合物诱导的这些抗体结合多个MICA等位基因并将MICA阳性的肿瘤细胞染色。重要的是，这些多克隆抗体抑制肿瘤细胞对MICA的脱落。在黑素瘤的转移性小鼠模型中测试了所述疫苗的体内效力。将B16F10黑素瘤细胞遗传修饰成表达MICA，并在小鼠已经接种疫苗2次以后静脉内地注射。所述疫苗提供高保护水平，而对照小鼠具有大肺转移灶数目(~150-200)。

本发明的疫苗在概念上不同于常规癌症疫苗，后者尝试诱导消除所有表达特定抗原的癌细胞的免疫应答。相反，本发明的疫苗的目的是防止肿瘤逃脱重要的免疫监视途径。基于使用MICA抗体的患者研究和MIC表达会标记细胞用于被细胞毒性的淋巴细胞消除的事实，该疫苗将是安全的。所述疫苗方案的益处是：疫苗的低成本，长期保护免于逃脱免疫监视，诱导多克隆抗体，其抑制脱落并通过免疫复合物的形成迅速地清除脱落的MIC，和诱导针对其它肿瘤抗原的T细胞应答（通过增强的树突细胞对细胞凋亡肿瘤片段的摄取）。

本发明还提供了自组装的基于铁蛋白的纳米颗粒，其在它们的表面上展示MICAα3结构域的免疫原性部分。任选地，所述纳米颗粒还包括CpG寡核苷酸。例如，CpG寡核苷酸共价地偶联至MICAα3结构域-铁蛋白融合蛋白。这样的纳米颗粒可用于接种个体。因此，本发明也涉及用于生产这样的纳米颗粒的融合蛋白和编码这样的蛋白的核酸分子。另外，本发明涉及生产本发明的纳米颗粒的方法和使用这样的纳米颗粒接种个体的方法。

本发明还提供了疫苗组合物，其包含与CpG寡核苷酸连接的MICα3-结构域肽。

针对MICα3结构域蛋白的疫苗

本发明提供了一种适合用于施用给人的疫苗组合物，其包含至少一种MICα3-结构域肽作为免疫原性组分。所述MICα3-结构域肽包含MICA或MICB的全长α3结构域或由其组成，所述结构域对应于SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2的氨基酸181-274。任选地，所述肽包括一个或多个侧接氨基酸。在该背景下，术语“侧接氨基酸”表示在全长参照序列[对于MICA而言为SEQ ID NO: 1，或对于MICB而言为SEQ ID NO: 2]中与MICα3-结构域序列邻近的氨基酸。在某些实施方案中，所述肽包含在它的N-或C-端末端或二者上的2、4、6、8或10个侧接氨基酸。在某些实施方案中，所述疫苗肽是非糖基化的。

在一个优选的实施方案中，所述疫苗包含具有以下氨基酸序列的肽：

。

在另一个实施方案中，所述疫苗组合物包含编码MICα3-结构域序列的核酸。所述核酸可以呈表达载体的形式，例如质粒或病毒载体，或所述核酸可以被包装进纳米颗粒中。在一个实施方案中，通过注射将所述核酸递送给个体。在一个实施方案中，所述核酸作为经纯化的DNA或以纳米颗粒的形式注射。在一个实施方案中，注射经修饰的免疫细胞，其已经被修饰成表达所述核酸。在一个实施方案中，经由体外转染或感染用包含所述核酸的载体修饰所述免疫细胞。

形成或掺入本发明的疫苗组合物中的肽优选地从污染性化学前体（如果化学合成的话）纯化，或基本上不含有来自衍生出它们的细胞或组织来源的细胞物质。在一个具体实施方案中，所述肽60%、优选地65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%不含污染性化学前体、蛋白、脂质或核酸。在一个优选的实施方案中，所述肽基本上不含有污染性病毒。优选地，用于施用给个体的每种组合物至少95%、至少97%或至少99%不含污染性病毒。

在一个实施方案中，本发明的疫苗组合物的MICα3-结构域肽包含一种或多种肽或由其组成，所述一种或多种肽与包括SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2的氨基酸181-274的肽具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性。在该背景下，术语“类似”表示氨基酸序列相似性，其根据查询序列相对于参照序列的保守和非保守氨基酸变化的数目来定义。保守和非保守氨基酸变化是本领域已知的。参见，例如，W. R. Taylor, The Classificationof Amino Acid Conservation, J. Theor. Biol. 1986 119:205-218, 以及D. Bordo和P. Argos, Suggestions for“Safe”Residue Substitutions in Site-DirectedMutagensis, 1991 J. Mol. Biol. 217:721-729。通常，保守氨基酸变化表示一个氨基酸对具有基本上类似化学性质（特别是参考氨基酸侧链）的另一个氨基酸的置换。非保守变化表示一个氨基酸对具有实质不同化学性质的另一个氨基酸的置换。通常，保守置换是本领域中公认为不可能影响多肽的总结构或生物学功能的那些，而非保守变化被公认为更可能影响结构和功能。

保守氨基酸变化的非限制性例子包括在下述组内的氨基酸的置换：脂族的、芳族的、极性的、非极性的、酸性的、碱性的、可磷酸化的、疏水的、亲水的、小非极性的、小极性的、大非极性的和大极性的。非保守氨基酸变化的非限制性例子包括前述组之间的氨基酸的置换。

在一个实施方案中，保守氨基酸变化是这样的置换：其中所述残基对的置换矩阵具有正值。氨基酸置换矩阵的例子是本领域已知的，例如BLOSUM50矩阵或PAM250矩阵(参见W. A. Pearson, Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA,Meth. Enzymology, 1990 183:63-98, R. Doolittle编, Academic Press, San Diego)。关于评分矩阵的其它例子和它们之间的对比，参见M. S. Johnson和J. P. Overington,1993, A Structural Basis for Sequence Comparisons: An Evaluation of ScoringMethodologies, J. Mol. Biol. 233:716-738。

在一个优选的实施方案中，保守氨基酸变化是一个氨基酸对相同化学组内的另一个氨基酸的置换，其中所述组选自中性的和极性的氨基酸(Ser、Thr、Pro、Ala、Gly、Asn、Gln)、带负电荷的和极性的氨基酸(Asp、Glu)、带正电荷的和极性的氨基酸(His、Arg、Lys)、非极性的缺乏环结构的氨基酸(Met、Ile、Leu、Val)、非极性的具有环结构的氨基酸(Phe、Tyr、Trp)和半胱氨酸。

在不同的实施方案中，所述肽缀合至CpG寡核苷酸序列。

在其它实施方案中，所述肽缀合至载体蛋白。术语“载体蛋白”意图涵盖小肽和大多肽(>10 kDa)。所述载体蛋白可以是任何肽或蛋白。它可以包含一个或多个T-辅助表位。所述载体蛋白可以是破伤风类毒素(TT)、破伤风类毒素片段C、破伤风毒素的无毒突变体[注：TT的所有这样的变体被认为是用于本发明的目的的相同类型的载体蛋白]、包含破伤风毒素T-细胞表位诸如N19的多肽(WO2006/067632)、白喉类毒素(DT)、CRM197、白喉毒素的其它无毒突变体诸如CRM176、CRM 197、CRM228、CRM 45 (Uchida等人J. Biol. Chem. 218;3838-3844, 1973)；由Nicholls和Youle在Genetically Engineered Toxins, Frankel编,Maecel Dekker Inc, 1992中描述的CRM 9、CRM 45、CRM102、CRM 103和CRM107和其它突变；Glu-148至Asp、Gln或Ser和/或Ala 158至Gly的缺失或突变和在美国专利号4,709,017或4,950,740中公开的其它突变；至少一个或多个残基Lys 516、Lys 526、Phe 530和/或Lys 534的突变和在美国专利号5,917,017或6,455,673中公开的其它突变；或在美国专利号5,843,711中公开的片段] (注：DT的所有这样的变体被认为是用于本发明的目的的相同类型的载体蛋白)、肺炎球菌的肺炎链球菌溶血素(Kuo等人(1995) Infect Immun 63; 2706-13)、OMPC (脑膜炎球菌的外膜蛋白—经常提取自脑膜炎奈瑟氏菌（N. meningitidis）血清群B—EP0372501)、合成的肽(EP0378881、EP0427347)、热激蛋白(WO 93/17712、WO 94/03208)、百日咳蛋白(WO 98/58668、EP0471177)、细胞因子、淋巴因子、生长因子或激素(WO91/01146)、包含来自不同病原体衍生的抗原的多个人CD4+ T细胞表位的人工蛋白(Falugi等人(2001) Eur J Immunol 31; 3816-3824)诸如N19蛋白(Baraldoi等人(2004) InfectImmun 72; 4884-7)、肺炎球菌的表面蛋白PspA (WO 02/091998)、铁摄取蛋白(WO 01/72337)、艰难梭菌的毒素A或B(WO 00/61761)、流感嗜血杆菌蛋白D (EP594610和WO 00/56360)、肺炎球菌的PhtA (WO 98/18930，也称作Sp36)、肺炎球菌的PhtD (公开在WO 00/37105中，且也称作Sp036D)、肺炎球菌的PhtB (公开在WO 00/37105中，且也称作Sp036B)或PhtE (公开在WO00/30299中，且被称作BVH-3)。

在一个实施方案中，所述载体蛋白可以选自：破伤风类毒素(TT)、破伤风类毒素的片段C、白喉类毒素(DT)、CRM197、肺炎链球菌溶血素(Ply)、蛋白D、PhtD、PhtDE和N19。在一个实施方案中，所述载体蛋白是CRM197。

包含HA-铁蛋白融合蛋白的疫苗

发明人还已经发现，MICα3-结构域肽与铁蛋白蛋白的融合（MICα3-铁蛋白融合蛋白）产生引起对癌症的稳健免疫应答的疫苗。这样的MICα3-铁蛋白融合蛋白自装配成纳米颗粒，其在它们的表面上展示MICα3-结构域肽的免疫原性部分。这些纳米颗粒可用于针对MICα3-结构域接种个体。因而，本发明的一个实施方案是MICα3-铁蛋白融合蛋白，其包含与本文中公开的MICα3-结构域肽连接的本文中公开的单体铁蛋白亚基。所述MICα3-铁蛋白融合蛋白能够自组装成纳米颗粒。在不同的方面，所述融合蛋白还包含CpG寡核苷酸序列。所述CpG寡核苷酸序列可以共价地连接至MICα3-铁蛋白融合蛋白。

铁蛋白是存在于所有动物、细菌和植物中的球状蛋白，其主要起作用以通过水合铁离子和质子向/从矿化核心的运输来控制多核Fe(III)₂O₃形成的速率和定位。铁蛋白的球形形式由单体亚基蛋白(也被称作单体铁蛋白亚基)构成，所述单体亚基蛋白是具有大约17-20 kDa的分子量的多肽。每个单体铁蛋白亚基具有螺旋束的拓扑学，所述螺旋束包括4个反平行的螺旋基序，第5个更短的螺旋(c-端螺旋)定位成大致垂直于4螺旋束的长轴。根据惯例，所述螺旋分别从N-端标记`A、B、C和D以及E`。N-端序列位于衣壳3倍轴附近并延伸至表面，而E螺旋在4倍轴处包装在一起，C-端延伸进颗粒核心中。该包装的后果在衣壳表面上产生两个孔。预见到，这些孔中的一个或两个代表水合的铁扩散进出衣壳的点。生产后，这些单体铁蛋白亚基蛋白自装配成球形铁蛋白蛋白。因而，铁蛋白的球形形式包含24个单体铁蛋白亚基蛋白，且具有含432个对称性的衣壳-样结构。

根据本发明，本发明的单体铁蛋白亚基是铁蛋白蛋白的全长单个多肽或其任意部分，其能够指导单体铁蛋白亚基自装配成所述蛋白的球形形式。来自任何已知铁蛋白蛋白的单体铁蛋白亚基的氨基酸序列可以用于生产本发明的融合蛋白，只要所述单体铁蛋白亚基能够自组装成在其表面上展示MICα3-结构域的纳米颗粒。在一个实施方案中，所述单体亚基是来自选自细菌铁蛋白蛋白、植物铁蛋白蛋白、藻铁蛋白蛋白、昆虫铁蛋白蛋白、真菌铁蛋白蛋白和哺乳动物铁蛋白蛋白的铁蛋白蛋白。在一个实施方案中，所述铁蛋白蛋白是来自幽门螺杆菌。

本发明的MICα3-铁蛋白融合蛋白不需要包含铁蛋白蛋白的单体亚基多肽的全长序列。可以利用所述单体铁蛋白亚基蛋白的部分或区域，只要所述部分包含指导单体铁蛋白亚基自装配成所述蛋白的球形形式的氨基酸序列。这样的区域的一个例子位于幽门螺杆菌铁蛋白蛋白的氨基酸5和167之间。更具体的区域描述在Zhang, Y. Self-Assembly inthe Ferritin Nano-Cage Protein Super Family. 2011, Int. J. Mol. Sci., 12,5406-5421中，其通过引用以其整体并入本文本文。

本发明的一个实施方案是MICα3-铁蛋白融合蛋白，其包含与来自单体铁蛋白亚基的至少25个连续氨基酸、至少50个连续氨基酸、至少75个连续氨基酸、至少100个连续氨基酸或至少150个连续氨基酸连接的本发明的MICα3-结构域蛋白，其中所述MICα3-铁蛋白融合蛋白能够自组装成纳米颗粒。本发明的一个实施方案是MICα3-铁蛋白融合蛋白，其包含与来自铁蛋白蛋白的特定区域的至少25个连续氨基酸、至少50个连续氨基酸、至少75个连续氨基酸、至少100个连续氨基酸或至少150个连续氨基酸连接的本发明的MICα3-结构域蛋白，所述特定区域对应于幽门螺杆菌铁蛋白单体亚基的指导所述单体亚基自装配成铁蛋白蛋白的球形形式的氨基酸序列，其中所述MICα3-铁蛋白融合蛋白能够自组装成纳米颗粒。

本领域众所周知，可以在蛋白的氨基酸序列中做出一些变化，而不影响所述蛋白的活性。这样的变化包括氨基酸残基的插入、氨基酸残基的缺失和氨基酸残基的置换。因而，在一个实施方案中，所述单体铁蛋白亚基的序列与在哺乳动物中天然地发现的铁蛋白亚基的序列足够不同，使得当将变体单体铁蛋白亚基引入哺乳动物中时，它不会导致与哺乳动物的天然铁蛋白蛋白反应的抗体的产生。根据本发明，这样的单体亚基被称作免疫原性地中性的。本发明的一个实施方案是MICα3-铁蛋白融合蛋白，其包含连接至特定氨基酸序列的本发明的MICα3-结构域蛋白，所述特定氨基酸序列与负责指导单体铁蛋白亚基自装配成所述蛋白的球形形式的单体铁蛋白亚基的氨基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%和至少97%同一性，其中所述MICα3-铁蛋白融合蛋白能够自组装成纳米颗粒。在一个实施方案中，所述HA-铁蛋白融合蛋白包含在序列上与单体铁蛋白亚基相同的多肽序列。本发明的一个实施方案是MICα3-铁蛋白融合蛋白，其包含连接至特定氨基酸序列的本发明的MICα3-结构域蛋白，所述特定氨基酸序列与来自幽门螺杆菌的单体铁蛋白亚基的氨基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%和至少97%同一性，其中所述MICα3-铁蛋白融合蛋白能够自组装成纳米颗粒。

在某些实施方案中，可能有用的是，将突变工程改造至本发明的蛋白的氨基酸序列中。例如，可能有用的是，改变单体铁蛋白亚基、三聚化结构域或接头序列中的位点诸如酶识别位点或糖基化位点，以便给融合蛋白提供有益的性质(例如，可溶性，半衰期，掩蔽所述蛋白的部分免于免疫监视)。在这点上，已知的是，铁蛋白的单体亚基没有天然地糖基化。但是，如果将它在哺乳动物或酵母细胞中表达为分泌蛋白，它可以被糖基化。因而，在一个实施方案中，将来自单体铁蛋白亚基的氨基酸序列中的潜在的N-连接的糖基化位点突变，使得突变的铁蛋白亚基序列不再在突变位点处被糖基化。

本发明的蛋白由本发明的核酸分子编码。另外，它们由本发明的核酸构建体表达。本文中使用的核酸构建体是重组表达载体，即，与编码蛋白的核酸分子连接的载体，使得当将所述核酸构建体施用给例如个体或器官、组织或细胞时，所述核酸分子可以实现所述蛋白的表达。所述载体也能够将核酸分子运输至环境（例如，但不限于，生物体、组织或细胞培养物）内的细胞。本公开内容的核酸构建体通过人工干预产生。所述核酸构建体可以是DNA、RNA或其变体。所述载体可以是DNA质粒、病毒载体或其它载体。在一个实施方案中，载体可以是巨细胞病毒(CMV)、逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒、痘苗病毒、脊髓灰质炎病毒、辛德毕斯病毒或任意其它DNA或RNA病毒载体。在一个实施方案中，载体可以是假型慢病毒或逆转录病毒载体。在一个实施方案中，载体可以是DNA质粒。在一个实施方案中，载体可以是DNA质粒，其包含病毒组分和质粒组分以实现核酸分子递送和表达。用于构建本公开内容的核酸构建体的方法是众所周知的。参见，例如，Molecular Cloning: a LaboratoryManual, 第3版, Sambrook等人. 2001 Cold Spring Harbor Laboratory Press, 和Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel等人编, John Wiley & Sons,1994。在一个实施方案中，所述载体是DNA质粒，诸如CMV/R质粒诸如CMV/R或CMV/R 8 KB(在本文中也被称作CMV/R 8 kb)。在本文中提供了CMV/R和CMV/R 8 kb的例子。CMV/R也描述在2006年8月22日授权的美国专利号7,094,598 B2中。

本文中使用的核酸分子包含编码本发明的MICα3-结构域肽免疫原、铁蛋白单体亚基和/或MICα3-铁蛋白融合蛋白的核酸序列。可以重组地、合成地或通过重组和合成程序的组合生产核酸分子。本公开内容的核酸分子可以具有野生型核酸序列或修饰过密码子的核酸序列，例如，以掺入被人翻译系统更好地识别的密码子。在一个实施方案中，可以将核酸分子遗传工程改造以引入或消除编码不同氨基酸的密码子，诸如以引入编码N-连接的糖基化位点的密码子。生产本公开内容的核酸分子的方法是本领域已知的，特别是在已知核酸序列后。应当明白，核酸构建体可以包含一个核酸分子或超过一个核酸分子。还应当理解，核酸分子可以编码一种蛋白或超过一种蛋白。

在一个实施方案中，所述铁蛋白的单体亚基来自幽门螺杆菌的铁蛋白蛋白。

在本发明中还包括核酸序列，其为编码本发明的蛋白的核酸序列的变体。这样的变体包括核苷酸插入、缺失和置换，只要它们不会影响本发明的融合蛋白自装配成纳米颗粒的能力或显著地影响融合蛋白的MICα3-结构域部分的引起针对MICα3-结构域蛋白的免疫应答的能力。

本发明还包括用于生产本发明的融合蛋白的表达系统。在一个实施方案中，本发明的核酸分子可操作地连接至启动子。本文中使用的可操作地连接是指，当连接的启动子被活化时，可以表达由连接的核酸分子编码的蛋白。可用于实践本发明的启动子是本领域技术人员已知的。本发明的一个实施方案是包含本发明的核酸分子的重组细胞。本发明的一个实施方案是包含本发明的核酸分子的重组病毒。

如上面指出的，本发明的铁蛋白融合蛋白的重组生产可以使用本领域中当前已知的任意合适的常规重组技术进行。例如，分子克隆融合蛋白，诸如铁蛋白和合适蛋白诸如重组MICα3-结构域蛋白，可以通过在大肠杆菌中表达合适的单体亚基蛋白（诸如幽门螺杆菌铁蛋白单体亚基）而实现。然后可以将所述构建体转化进蛋白表达细胞中，培养至合适大小，并诱导以生产所述融合蛋白。

如已经描述的，因为本发明的MICα3-铁蛋白融合蛋白包含铁蛋白的单体亚基，它们可以自装配。根据本发明，由这样的自装配产生的超分子被称作表达基于铁蛋白的纳米颗粒的MICα3。为了容易讨论，表达基于铁蛋白的纳米颗粒的MICα3将被简称作纳米颗粒(np)。本发明的纳米颗粒具有与早前描述的铁蛋白蛋白相同的结构特征。也就是说，它们含有24个亚基且具有432个对称性。在本发明的纳米颗粒的情况下，所述亚基是包含与MICα3-结构域蛋白连接的铁蛋白单体亚基的融合蛋白。这样的纳米颗粒在它们的表面上展示MICα3-结构域蛋白的至少一部分。因而，本发明的一个实施方案是包含MICα3 -铁蛋白融合蛋白的纳米颗粒，其中所述融合蛋白包含与MICα3-结构域蛋白连接的单体铁蛋白亚基。在一个实施方案中，所述纳米颗粒是八面体。

因为本发明的MICα3-铁蛋白融合蛋白和纳米颗粒可以引起针对MICα3-结构域蛋白的免疫应答，它们可以用作疫苗来治疗癌症。根据本发明，疫苗可以是本发明的MICα3-结构域肽免疫原、MICα3-铁蛋白融合蛋白或纳米颗粒。本发明的疫苗也可以含有其它组分诸如佐剂、缓冲剂等。尽管可以使用任何佐剂，优选的实施方案可以含有：化学佐剂诸如磷酸铝、苯扎氯铵（benzyalkonium chloride）、乌苯美司和QS21；遗传佐剂诸如IL-2基因或其片段、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)基因或其片段、IL-18基因或其片段、趋化因子(C--C基序)配体21 (CCL21)基因或其片段、IL-6基因或其片段、CpG、LPS、TLR激动剂和其它免疫刺激基因；蛋白佐剂诸如IL-2或其片段、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)或其片段、IL-18或其片段、趋化因子(C--C基序)配体21 (CCL21)或其片段、IL-6或其片段、CpG、LPS、TLR激动剂和其它免疫刺激性细胞因子或其片段；脂质佐剂诸如阳离子脂质体、N3 (阳离子脂质)、单磷酰脂质A (MPL1)；其它佐剂，包括霍乱毒素、肠毒素、Fms-样酪氨酸激酶-3配体(Flt-3L)、布比卡因、麻卡因和左旋咪唑。

介孔二氧化硅

根据本发明的疫苗组合物还可以包含免疫接种支架。在一个实施方案中，所述免疫接种支架是介孔二氧化硅纳米颗粒(MSR)。MSR可以呈任何形状或形式，诸如杆、球、丝、立方体或多角体。MSR的形状或形式通常是特定反应条件的结果。例如，通过本领域已知的任意方法可以合成介孔二氧化硅纳米颗粒，诸如使正硅酸四乙酯与由胶束杆制成的模板反应。结果是被孔的规则排列填充的纳米大小的球或杆的集合。然后可以通过用调至适当pH的溶剂洗涤来除去模板。在另一种技术中，使用简单的溶胶-凝胶方法或喷雾干燥方法可以合成中孔颗粒。正硅酸四乙酯也与另外的聚合物单体(作为模板)一起使用。其它方法包括在美国专利公开20150072009、20120264599和20120256336（特此通过引用并入）中描述的那些。

粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)

粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)是由巨噬细胞、T细胞、肥大细胞、内皮细胞和成纤维细胞分泌的蛋白。具体地，GM-CSF是作为白细胞生长因子起作用的细胞因子。GM-CSF刺激干细胞以产生粒细胞和单核细胞。单核细胞离开血流，迁移进组织中，并随后成熟为巨噬细胞。

本文描述的支架装置包含并释放GM-CSF多肽以将宿主DC吸引至所述装置。预见到的GM-CSF多肽分离自内源性来源或在体内或在体外合成。内源性GM-CSF多肽分离自健康的人组织。在将模板DNA转染或转化进宿主生物或细胞（例如哺乳动物或培养的人细胞系）中以后，合成的GM-CSF多肽在体内合成。可替换地，合成的GM-CSF多肽通过聚合酶链式反应(PCR)或其它本领域公知的方法在体外合成(例如，Sambrook, J., Fritsch, E. F., 和Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring HarborLaboratory Press, NY, 第1、2、3卷(1989)，通过引用并入本文)。

将GM-CSF多肽修饰以增加体内蛋白稳定性。可替换地，将GM-CSF多肽工程改造以成为大致上免疫原性的。内源性的成熟的人GM-CSF多肽被糖基化，据报道在氨基酸残基23(亮氨酸)、27 (天冬酰胺)和39 (谷氨酸)处(参见美国专利号5,073,627)。就糖基化状态而言，本发明的GM-CSF多肽在这些氨基酸残基中的一个或多个处被修饰。

GM-CSF多肽是重组的。可替换地，GM-CSF多肽是哺乳动物GM-CSF多肽的人源化衍生物。衍生出GM-CSF多肽的示例性哺乳动物物种包括、但不限于小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、雪貂、猫、狗、猴或灵长类动物。在一个优选的实施方案中，GM-CSF是重组人蛋白(PeproTech,目录号300-03)。可替换地，GM-CSF是重组鼠(小鼠)蛋白(PeproTech, 目录号315-03)。最后，GM-CSF是重组小鼠蛋白的人源化衍生物。

人重组GM-CSF (PeproTech, 目录号300-03)由下述多肽序列编码：

鼠重组GM-CSF (PeproTech, 目录号315-03)由下述多肽序列编码：

人内源性GM-CSF由下述mRNA序列(NCBI登记号NM 000758和SEQ ID NO: 28)编码：

人内源性GM-CSF由下述氨基酸序列(NCBI登记号NP000749.2和SEQ ID NO: 29)编码：

胞嘧啶-鸟苷(CpG)寡核苷酸(CpG-ODN)序列

CpG位点是脱氧核糖核酸(DNA)的区域，其中半胱氨酸核苷酸在直链碱基序列中沿着它的长度出现在鸟嘌呤核苷酸后面(“p”代表它们之间的磷酸酯键，并将它们从胞嘧啶-鸟嘌呤互补碱基配对区分开)。CpG位点在DNA甲基化中起关键作用，这是细胞用于沉默基因表达的几个内源机制之一。在启动子元件内的CpG位点的甲基化可以导致基因沉默。在癌症的情况下，已知的是，肿瘤抑制基因经常被沉默，而癌基因或癌症诱导基因被表达。已经证实在肿瘤抑制基因(其阻止癌症形成)的启动子区域中的CpG位点被甲基化，而在癌基因的启动子区域中的CpG位点在某些癌症中被低甲基化或未甲基化。TLR-9受体结合DNA中的未甲基化的CpG位点。

本文描述的疫苗组合物包含CpG寡核苷酸。CpG寡核苷酸分离自内源性来源或者在体内或在体外合成。内源性CpG寡核苷酸的示例性来源包括、但不限于微生物、细菌、真菌、原生动物、病毒、霉菌或寄生虫。可替换地，内源性CpG寡核苷酸分离自哺乳动物良性或恶性肿瘤。在将模板DNA转染或转化进宿主生物体中以后，合成的CpG寡核苷酸在体内合成。可替换地，合成的CpG寡核苷酸通过聚合酶链式反应(PCR)或其它本领域公知的方法在体外合成(Sambrook, J., Fritsch, E. F., 和Maniatis, T., Molecular Cloning: ALaboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 第1、2、3卷(1989)，通过引用并入本文)。

CpG寡核苷酸被呈递以供树突细胞的细胞摄取。例如，使用裸CpG寡核苷酸。术语“裸”用于描述分离的内源性的或合成的不具有另外取代基的多核苷酸（或寡核苷酸）。在另一个实施方案中，CpG寡核苷酸结合至一个或多个化合物以增加细胞摄取的效率。可替换地或另外，CpG寡核苷酸结合至一个或多个化合物以增加在支架和/或树突细胞内的寡核苷酸的稳定性。任选地在细胞摄取之前使CpG寡核苷酸凝聚。例如，使用聚乙烯亚胺（PEI）（一种增加树突细胞的细胞摄取效率的阳离子聚合物）使CpG寡核苷酸凝聚。

CpG寡核苷酸可以分成多个类别。例如，本发明的组合物、方法和装置包括的示例性CpG-ODN是刺激性的、中性的或抑制性的。术语“刺激性的”描述了活化TLR9的CpG-ODN序列类别。术语“中性的”描述了不会活化TLR9的CpG-ODN序列类别。术语“抑制性的”描述了抑制TLR9的CpG-ODN序列类别。术语“活化TLR9”描述了TLR9开始细胞内信号传递的过程。

刺激性的CpG-ODN可以进一步分成三种类型A、B和C，它们在它们的免疫刺激活性上存在差异。A型刺激性CpG ODN以磷酸二酯中央含CpG的回文基序和硫代磷酸酯3' 聚-G串为特征。在TLR9的活化以后，这些CpG ODN诱导从浆细胞样树突细胞(pDC)产生高IFN-α。A型CpG ODN较弱地刺激TLR9依赖性的NF-κB信号传递。

B型刺激性CpG ODN含有具有一个或多个CpG二核苷酸的完整硫代磷酸酯主链。在TLR9活化以后，这些CpG-ODN强烈地活化B细胞。不同于A型CpG-ODN，B型CpG-ODNS较弱地刺激IFN-α分泌。

C型刺激性CpG ODN包含A和B型的特征。C型CpG-ODN含有完全硫代磷酸酯主链和含CpG的回文基序。类似于A型CpG ODN，C型CpG ODN诱导从pDC的强烈IFN-α产生。类似于B型CpG ODN，C型CpG ODN诱导强烈B细胞刺激。

示例性的刺激性CpG ODN包含、但不限于ODN 1585、ODN 1668、ODN 1826、ODN2006、ODN 2006-G5、ODN 2216、ODN 2336、ODN 2395、ODN M362 (都来自InvivoGen)。本发明也包括上述CpG ODN的任何人源化形式。在一个优选的实施方案中，本发明的组合物、方法和装置包含ODN 1826 (其序列从5' 至3'为tccatgacgttcctgacgtt，其中CpG元件为粗体，SEQ ID NO: 30)。

本发明包括不会刺激TLR9的中性或对照CpG ODN。这些ODN包含与它们的刺激性相应物相同的序列，但是含有GpC二核苷酸而不是CpG二核苷酸。

本发明所包括的示例性的中性或对照CpG ODN包含、但不限于ODN 1585对照、ODN1668对照、ODN 1826对照、ODN 2006对照、ODN 2216对照、ODN 2336对照、ODN 2395对照、ODNM362对照(都来自InvivoGen)。本发明也包括上述CpG ODN的任何人源化形式。

治疗和施用方法

本发明的疫苗组合物可用于预防和治疗癌症。因此，本发明提供了预防处于发生癌症的风险中的个体中的癌症的方法和治疗需要这种治疗的个体中的癌症的方法。在一个实施方案中，所述癌症选自前列腺癌、多发性骨髓瘤、多形性成胶质细胞瘤和黑素瘤。在一个实施方案中，所述癌症是黑素瘤。

在一个实施方案中，将本发明的疫苗组合物施用给具有与MICA的过表达有关的癌症的个体。使用本领域中已知的用于测量蛋白或相应核酸的表达水平的任何方法，可以确定MICA的过表达。这样的方法包括、但不限于蛋白质印迹、RNA印迹、DNA印迹、ELISA、免疫沉淀、免疫荧光、流式细胞计量术、免疫细胞化学、核酸杂交技术、核酸反转录方法和核酸扩增方法。在一个实施方案中，所述癌症选自黑素瘤、肺癌、乳癌、肾癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌和结肠癌、淋巴瘤或白血病。在一个实施方案中，所述癌症是黑素瘤。在一个实施方案中，所述癌症是浆细胞恶性肿瘤，例如，多发性骨髓瘤(MM)或浆细胞的恶化前病症。在某些实施方案中，所述个体已经被诊断为具有癌症或易发癌症。

本发明的疫苗组合物可以单独地或作为治疗方案或联合治疗的部分施用，如下所述。本发明的疫苗组合物还可以单次施用，或多次施用，例如在激发-强化策略中。在该背景下，术语“激发-强化”表示接连地使用两种不同的免疫原。所述两种不同的免疫原通常在诸如10-30天或10-60天的时间段以后接连地施用。在一个实施方案中，所述时间段是2-4周。因而，例如，在一个实施方案中，在时间零点施用本发明的疫苗组合物，并在时间段（例如10-30天，10-60天，或2-4周）以后施用本发明的第二种疫苗组合物(其包含不同的免疫原)。

所述第一种和第二种疫苗组合物可以是、但不需要是相同的组合物。因而，在本发明的一个实施方案中，施用疫苗的步骤包括施用第一种疫苗组合物，然后在以后的时间，施用第二种疫苗组合物。

在一个实施方案中，如在US 8,110,196中所述将本发明的一种或多种不同疫苗组合物在多个部位施用给个体。优选地，每个部位排液至淋巴结或淋巴结组。在一个实施方案中，将本发明的疫苗组合物施用至排液至两个或多个淋巴结的多个部位，所述淋巴结选自头和颈淋巴结、腋窝淋巴结、气管支气管淋巴结、腔壁（parietal）淋巴结、胃淋巴结、回结肠淋巴结以及腹股沟和腹股沟下淋巴结。在另一个实施方案中，所述部位选自右臂、左臂、右大腿、左大腿、右肩、左肩、右乳房、左乳房、腹部、右臀和左臀。在一个实施方案中，所述部位是或排液至无包膜的淋巴组织簇，其选自扁桃体、腺样体、盲肠和派伊尔斑。在一个实施方案中，将本发明的疫苗组合物施用至向脾排液的部位。

在一个实施方案中，通过独立地选自真皮内地、皮下地、透皮地、肌肉内地、口服地、直肠地、阴道地、吸入和它们的组合的途径，施用每种疫苗组合物。在一个实施方案中，将至少一种组合物直接注射进解剖学上独特的淋巴结、淋巴结簇或无包膜的淋巴组织簇。

本发明的方法包括任何合适的施用途径，例如真皮内、皮下、静脉内、肌肉内或粘膜。粘膜施用途径包括、但不限于口服、直肠、阴道和鼻施用。在一个优选的实施方案中，透皮地、真皮内地、皮下地、口服地、直肠地、阴道地或通过吸入施用至少一种组合物。被食品和药品管理局(FDA)批准的任何途径可以用于本发明的疫苗组合物。示例性的施用方法描述在FDA’s CDER Data Standards Manual，版本编号004 (其可在fda.give/cder/dsm/DRG/drg00301.htm得到)。

优选地，选择施用途径以将组合物靶向至特定部位，例如，通过直接注射进淋巴结或淋巴结簇，通过口服施用以靶向胃的淋巴结，通过鼻施用以靶向直肠的淋巴结，通过吸入气溶胶以靶向肺的淋巴结，或通过任意其它合适的施用途径。

在本发明的方法包括将疫苗组合物施用至多个部位的情况下，优选地在基本上相同的时间施用每种组合物，例如，在1-8小时内或在同一次医生就诊过程中。在一个实施方案中，在1-2小时内、在1-3小时内、在1-4小时内或在1-5小时内施用每种组合物。

在所述疫苗组合物呈支架形式的情况下，给个体接种疫苗的方法包括将支架组合物植入个体中，优选皮下植入。在某些实施方案中，所述给个体接种疫苗的方法可以包括将支架疫苗组合物植入或注射进个体的解剖学的两个或多个区域。

在一个实施方案中，本发明的方法还包括给所述个体施用抗原呈递细胞，其已经用至少一种MIC肽敏化。在一个优选的实施方案中，所述抗原呈递细胞是树突细胞。

在一个实施方案中，所述方法还包括给所述个体施用一种或多种佐剂。在一个实施方案中，所述一种或多种佐剂选自基于油的佐剂、CpG DNA佐剂、聚肌苷酸:聚胞苷酸(经常缩写聚(I:C))、矿物盐佐剂、矿物盐凝胶佐剂、微粒佐剂、微小微粒佐剂、粘膜佐剂和细胞因子。这样的佐剂可以用本发明的组合物配制或与所述组合物分开施用，例如，在将所述组合物施用给个体之前、并行地或之后。所述一种或多种佐剂可以共价地连接至本发明的肽或融合蛋白。例如，将CpG DNA佐剂共价地连接至本发明的肽或融合蛋白。

本文中公开的方法可以适用于广范围的物种，例如，人类、非人灵长类动物(例如，猴)、马、牛、猪、绵羊、鹿、麋鹿、山羊、狗、猫、鼬鼠、兔、豚鼠、仓鼠、大鼠和小鼠。

本文中使用的术语“治疗”或“处理”表示部分地或完全地减轻、抑制、改善和/或减轻所述个体正在遭受的疾病或病症。在某些情况下，治疗可以导致所述个体正在遭受的疾病或病症的持续缺失。

一般而言，方法包括选择处于病症或疾病的风险中或具有病症或疾病的个体。在某些情况下，可以用本文中公开的药物组合物治疗个体的病症或疾病。例如，在某些情况下，方法包括选择具有癌症的个体，例如，其中所述个体的癌症可以通过靶向一种或两种MICA来治疗。

在某些情况下，治疗方法可以包括单次施用、多次施用和在需要时重复施用，以预防或治疗所述个体正在遭受的疾病或病症。在某些情况下，治疗方法可以包括在治疗之前、在治疗过程中和/或在治疗之后评估所述个体中的疾病水平。在某些情况下，治疗可以持续直到检测到所述个体中的疾病水平的下降。

本文中使用的术语“施用”表示植入、吸收、摄入、注射或吸入本发明的肽，不论形式。在某些情况下，可以局部地(例如，鼻地)和/或口服地将一种或多种本文中公开的肽施用给个体。例如，本文中的方法包括施用有效量的化合物或化合物组合物以实现期望的或所述的效果。用于任何特定患者的具体剂量和治疗方案将取决于多种因素，包括使用的具体化合物的活性、年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、施用时间、排泄速率、药物组合、疾病、病症或征状的严重程度和进程、患者对所述疾病的倾向和治疗医师的判断。

在施用后，可以评价个体以检测、评估或确定他们的疾病水平。在某些情况下，治疗可以持续直到检测到个体的疾病水平的变化(例如，下降)。

在患者的状况改善(例如，个体的疾病水平的变化(例如，下降))后，如果必要的话，可以施用维持剂量的本发明的化合物、组合物或组合。随后，可以减小施用的剂量或频率或二者（作为征状的函数）至保持改善的状况的水平。但是，患者可以在疾病征状的任何复发后要求在长期基础上的间歇治疗。

在某些情况下，本发明提供了用于检测来自人个体的免疫细胞（例如，B细胞和/或记忆B细胞）的方法。这样的方法可以用于，例如，监测人个体中的免疫细胞（例如，B细胞和/或记忆B细胞）的水平，例如，在一个事件以后。示例性的事件可以包括、但不限于：检测疾病、感染；施用本文中公开的治疗组合物，施用治疗剂或治疗方案，施用疫苗，诱导免疫应答。这样的方法可以在临床上使用和/或用于研究。

有效量和剂量

在一个实施方案中，本发明的疫苗组合物的有效量是足以减轻具有癌症的个体中的癌症的严重程度的量，或足以减轻或改善其一种或多种征状的严重程度的量，足以阻止所述癌症的进展的量，足以阻止所述癌症的进一步转移的量，足以造成所述癌症的临床消退的量，或足以增强或改善与本发明的疫苗组合物并行地、在其之前或之后施用的另一种疗法或治疗剂的治疗效果的量。

癌症的征状是本领域技术人员众所周知的，且包括、但不限于，异常痣特征、痣的外观（包括不对称、边缘、颜色和/或直径）的变化、新色素沉着的皮肤区域、异常痣、在指甲下的深色区域、乳腺肿块、乳头变化、乳腺囊肿、乳房痛、死亡、重量减轻、虚弱、过度疲劳、进食困难、食欲缺乏、慢性咳嗽、恶化气绝、咳血、尿中带血、粪便中带血、恶心、呕吐、肝转移灶、肺转移灶、骨转移灶、腹满、胃气胀、腹腔积液、阴道出血、便秘、腹胀、结肠穿孔、急性腹膜炎(感染、发热、疼痛)、疼痛、呕血、重度出汗、发热、高血压、贫血、腹泻、黄疸、头晕、恶寒、肌肉痉挛、结肠转移灶、肺转移灶、膀胱转移灶、肝转移灶、骨转移灶、肾转移灶和胰腺转移灶、吞咽困难等。

在一个实施方案中，本发明的疫苗组合物的有效量是足以产生分泌抗体的B细胞或细胞毒性的T细胞介导的免疫应答（针对本发明的疫苗组合物的一种或多种肽）的量。在一个实施方案中，本发明的疫苗组合物的有效量是足以产生分泌抗体的B细胞或细胞毒性的T细胞介导的免疫应答（针对癌细胞）的量。使用本领域技术人员可得到的任何常规方法可以确定本发明的疫苗组合物的引起免疫应答的能力。在一个实施方案中，每种组合物的有效量是足以在个体中产生细胞毒性的T细胞应答的量，如通过例如混合的淋巴细胞T细胞测定所测量的。

在一个实施方案中，施用给个体或在个体的特定部位施用的疫苗组合物的有效量是递送1-1000微克的所述组合物的一种或多种肽的量。在一个实施方案中，所述肽的量是1-100微克、1-200微克、1-300微克、1-400微克、1-500微克、1-600微克、1-700微克、1-800微克或1-900微克。在另一个实施方案中，所述肽的量是1-10微克、1-20微克、1-30微克、1-40微克、1-50微克、1-60微克、1-70微克、1-80微克或1-90微克。在一个实施方案中，施用给个体的肽的总量不超过5毫克。在一个实施方案中，施用给个体的肽的总量不超过2毫克。

联合治疗

本发明也提供了用于治疗或预防癌症的方法，所述方法包括将本发明的疫苗组合物与一种或多种另外的治疗剂或治疗方案一起施用给有此需要的个体。在一个实施方案中，将本发明的疫苗组合物作为治疗方案的部分施用，所述治疗方案包括外科手术、化学治疗剂或辐射疗法、免疫疗法、或前述的任意组合。

在一个实施方案中，所述治疗方案包含或进一步包含一种或多种免疫刺激剂。在一个实施方案中，所述一种或多种免疫刺激剂选自抗-CTLA-4抗体或肽、抗-PD-1抗体或肽、抗-PDL-1抗体或肽、抗-OX40 (也被称作CD134、TNFRSF4、ACT35和/或TXGP1L)抗体或肽、抗-GITR (也被称作TNFRSF18、AITR和/或CD357)抗体或肽、抗-LAG-3抗体或肽和/或抗-TIM-3抗体或肽。

在一个实施方案中，所述一种或多种免疫刺激剂选自在WO 2013/049517或WO2008/036981中描述的抗-MICA抗体。在一个实施方案中，所述一种或多种免疫刺激剂选自CM33322 Ab4、CM33322 Ab28和CM33322 Ab29，它们描述在美国临时申请号61/792,034和61/913,198和美国申请号14/025,573中。

在一个实施方案中，所述治疗方案包含或进一步包含一种或多种细胞因子。在一个实施方案中，本发明的疫苗组合物包含一种或多种细胞因子。在一个实施方案中，至少一种细胞因子是白介素或干扰素。在一个实施方案中，至少一种细胞因子是选自IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15和IL-18的白介素。在另一个实施方案中，至少一种细胞因子是选自IFNα、IFNβ和IFNγ的干扰素。

在一个实施方案中，将本发明的疫苗组合物作为治疗方案的部分施用，所述治疗方案包括给所述个体施用至少一种选自组蛋白脱乙酰基酶抑制剂(“HDAC”)抑制剂、蛋白酶体抑制剂、烷化剂和拓扑异构酶抑制剂的化学治疗剂。

在一个实施方案中，所述化学治疗剂是选自氧肟酸、伏林司他(Zolinza)、辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)(Merck)、曲古抑菌素A (TSA)、LAQ824 (Novartis)、帕比司他(LBH589) (Novartis)、贝林司他(PXD101)(CuraGen)、ITF2357 Italfarmaco SpA(Cinisello)、环状四肽、缩肽(罗米地新，FK228) (Gloucester Pharmaceuticals)、苯甲酰胺、恩替司他(SNDX-275/MS-275)(Syndax Pharmaceuticals)、MGCD0103 (Celgene)、短链脂肪族酸、丙戊酸、丁酸苯酯、AN-9、pivanex (Titan Pharmaceutical)、CHR-3996 (ChromaTherapeutics)和CHR-2845 (Chroma Therapeutics)的HDAC抑制剂。

在一个实施方案中，所述化学治疗剂是选自硼替佐米(MillenniumPharmaceuticals)、NPI-0052 (Nereus Pharmaceuticals)、卡非佐米(PR-171) (OnyxPharmaceuticals)、CEP 18770和MLN9708的蛋白酶体抑制剂。

在一个实施方案中，所述化学治疗剂是烷化剂诸如美法仑。

在一个实施方案中，所述化学治疗剂是拓扑异构酶抑制剂诸如阿霉素(多柔比星)。

在一个实施方案中，所述治疗方案包含或进一步包含以下一种或多种：化学疗法、辐射疗法、细胞因子、趋化因子和其它生物信号传递分子、肿瘤特异性疫苗、细胞癌症疫苗(例如，GM-CSF转导的癌细胞)、肿瘤特异性的单克隆抗体、自体和同种异体干细胞挽救(例如，以增加移植物抗肿瘤效应)、其它治疗性抗体、分子靶向疗法、抗血管生成疗法、具有治疗意图的传染性病原体(诸如定位于肿瘤的细菌)和基因治疗。

试剂盒

本发明提供了用于实现本发明的方法或治疗方案的药物包或试剂盒。在一个实施方案中，所述试剂盒包含冻干形式的本发明的疫苗组合物。在一个实施方案中，所述试剂盒包含蛋白支架形式的本发明的疫苗组合物。

在另一个实施方案中，所述试剂盒进一步包含在一个或多个另外容器中的细胞因子或佐剂。

在每个容器中的组合物可以呈药学上可接受的溶液的形式，例如，与无菌的盐水、右旋糖溶液或缓冲溶液、或其它药学上可接受的无菌流体组合。可替换地，可以将所述组合物冻干或干燥；在该情况下，所述试剂盒任选地进一步包含在单独容器中的药学上可接受的溶液(例如，盐水、右旋糖溶液等)，优选地是无菌的，以重构所述组合物以形成用于注射目的的溶液。

在另一个实施方案中，所述试剂盒进一步包含一个或多个可重复使用的或一次用弃的施用装置(例如，注射器、针头、分配笔)，优选地以无菌形式包装，和/或包装的酒精垫。任选地包括关于临床医师或患者施用所述组合物的说明书。所述试剂盒还可以包含其它材料，例如，金属或塑料箔，诸如泡罩包装。

在某些实施方案中，本公开内容提供了在下述方法中使用本文中公开的任意一种或多种疫苗组合物(在下面指示为‘X’)的方法。

物质X用于在本文中公开的一种或多种疾病或病症(例如，癌症，在下述实施例中称作‘Y’)的治疗中用作药物。物质X用于制备药物的用途，所述药物用于治疗Y；和用于治疗Y的物质X。

在某些情况下，本文中公开的治疗组合物可以配制成用于在美国销售、进口到美国和/或从美国输出。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员所通常理解的相同含义。本文描述了用于用在本发明中的方法和材料；还可以使用本领域已知的其它合适的方法和材料。所述材料、方法和实施例仅仅是示例性的，且无意成为限制性的。在本文中提及的所有出版物、专利申请、专利、序列、数据库条目和其它参考文献通过引用以其整体并入本文。在冲突的情况下，以本说明书（包括定义）为准。

实施例

实施例1: 一般方法

载体构建

多价疫苗诱导比单价蛋白实质上更高滴度的抗体应答。在本文中使用多价展示，其中将MICAα3结构域融合至幽门螺杆菌(H. pylori)铁蛋白。最近证实基于铁蛋白的纳米颗粒会诱导针对流感和EBV疫苗的高滴度抗体。铁蛋白在大多数生物体中作为铁贮存蛋白存在。铁蛋白是形成具有八面体对称性的球形颗粒（由24个亚基组成）的自组装颗粒。关于铁蛋白颗粒的示意图以及表明针对人和小鼠铁蛋白的细胞和体液免疫应答的图谱，参见图1C和1D。通过使用Gly-Ser-Gly接头将编码MICA的α3结构域的基因与幽门螺杆菌铁蛋白融合，产生MICAα3铁蛋白融合基因(缩写为MICA-铁蛋白)(图2A)。将点突变(Asn19Gln)引入幽门螺杆菌铁蛋白中以消除潜在的N-糖基化位点。为了确定单独的MICAα3 (没有铁蛋白)的抗体应答，通过将8个潜在N-糖基化位点中的7个突变成Asp或Gln，产生MICAα3基因的去糖基化形式。为了下游蛋白纯化目的，包括C-端HA标签。使用GeneArt®Gene Synthesis平台合成所述基因，并针对昆虫细胞表达进行密码子优化。将合成的基因克隆进pAcDB3杆状病毒表达载体中(参见图2C)。

证实MICα3结构域疫苗的产生和去糖基化的MICAα3疫苗的产生的测定分别呈现在图2B和2D中。

蛋白生物合成和纯化

如下在Sf9 (草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）)昆虫细胞中表达MICAα3和MICA-铁蛋白融合蛋白：以10的感染复数，用重组杆状病毒感染这些细胞。使细胞在Sf900无血清表达培养基(Life Technologies)中生长，并在转染后3 天收集培养的上清液。将上清液浓缩，并然后交换进Tris缓冲液(50mM Tris, 150mM NaCl, pH 7.5缓冲液)。将蛋白通过HA亲和色谱法纯化，并通过使用Superose 6柱(GE Healthcare)执行尺寸排阻色谱法除去聚集体。使用PD-10脱盐柱(GE)将纯化的蛋白缓冲液交换进PBS中，并使用Amicon Ultra 4ml离心过滤器浓缩至1mg/ml。通过SDS-PAGE证实蛋白纯度和大小。

MPS疫苗的制备和免疫接种

最近报道了这里描述的支架疫苗(Kim等人 Nat. Biotechnol. 2015, 33, 64-72)。用针注射介孔二氧化硅杆(MSR)，所述针在体内自发地组装以形成类似于草堆的大孔结构，其给树突细胞提供3D细胞微环境。该可生物降解的支架募集并训练树突细胞，所述树突细胞然后迁移至淋巴结，它们在此处诱导免疫应答。给5mg MSR加载1µg GM-CSF (以募集树突细胞)、100µg CpG寡核苷酸(以诱导树突细胞活化)和200µg MICA-铁蛋白融合体或对照蛋白(卵白蛋白)在室温保持12小时。将所述颗粒冻干，重新悬浮在PBS中，并皮下地注射进C57BL/6小鼠的胁腹中。小鼠在初次免疫接种以后第14或21天接受强化。年龄匹配的未免疫的小鼠(原初)和用卵白蛋白免疫的小鼠用作MICA-铁蛋白免疫接种实验的对照组。作为MICAα3实验中的另一个对照，将小鼠用不含MSR支架的所有疫苗组分免疫(推注)。

在MICAα3和MICA-铁蛋白免疫小鼠中的肺转移实验

将C57Bl/6J小鼠用MICAα3或MICAα-铁蛋白疫苗免疫。强化以后3周，用0.5x10⁶个表达MICA的B16F10黑素瘤细胞的静脉内(i.v)注射攻击小鼠。在肿瘤攻击之前和在每周间隔收集血清以分析脱落的MICA水平。在肿瘤攻击以后14天将小鼠安乐死；将肺收获并在10%中性缓冲的福尔马林中固定，并定量肺转移灶的数目。

流式细胞计数分析和ELISA以确定免疫小鼠中的MICA抗体滴度

通过ELISA使用MICA的全长细胞外结构域测试MICA特异性抗体滴度。在4℃将全长MICA蛋白(0.2µg)包被在96孔ELISA板上过夜。将平板用PBS/2%BSA在室温封闭1小时。将平板洗涤，并与在每周间隔从每个实验组收集的血清的系列稀释物一起温育。将山羊抗-小鼠HRP用作检测抗体。使用流式细胞计数分析来评估血清抗体与在肿瘤细胞的表面上表达的全长物的结合。简而言之，将1x10⁵肿瘤细胞与1µl血清一起在4℃温育2小时。将1 x10⁵细胞用在100µl PBS中的1µl血清染色2小时，所述血清来自未免疫的小鼠(原初)、用不含MSR支架的疫苗组分(推注)或MICA-铁蛋白疫苗(接种疫苗)免疫的小鼠。商购可得的结合MICA的α1-α2结构域的单克隆抗体6D4用作阳性对照(10µg)。PE缀合的抗-小鼠IgG用作第二抗体。

实施例2：用于诱导有效免疫应答的支架疫苗

将MICα3结构域在杆状病毒系统中表达为重组蛋白；所述蛋白以多价形式展示在幽门螺杆菌铁蛋白（具有24个相同亚基的铁贮存蛋白）上。使用在Kim等人 Nat. Biotechnol.2015, 33, 64-72（在本文中使用并特此通过引用以其整体并入本文）中最初描述的介孔二氧化硅杆(MSR)实现的疫苗接种(参见图3)。用针皮下地注射的MSR在体内自发地组装成大孔结构，其为宿主免疫细胞提供3D细胞微环境。该系统募集大量免疫细胞，将它们暴露于有关抗原，并且也为有效免疫应答的诱导提供适当的分子线索。MICα3结构域蛋白与GM-CSF(用于募集树突细胞)和CpG寡核苷酸(活化树突细胞的佐剂)一起被吸附至MSR。该疫苗接种方案实现了对MICα3结构域特异性的高滴度抗体的诱导。这些抗体将表达MIC的肿瘤细胞染色，并抑制肿瘤细胞对MIC的脱落。

为了测试该疫苗的抗肿瘤活性，我们利用了用人MIC转染的B16黑素瘤细胞。当将这些肿瘤细胞静脉内地注射进未免疫小鼠中时，它们形成大量肺转移灶(~200个转移灶/小鼠)。MSR支架疫苗提供有效的保护免于这样的转移灶的生长晕。当将所述疫苗组分作为不含MSR支架的推注来注射时，观察到部分保护，但是生物学效应显著地更弱。该结果表明，免疫细胞向MSR支架的局部募集极大地增强该疫苗的活性(参见图4)。

实施例3: 使用MICA-铁蛋白融合蛋白的疫苗接种诱导高滴度的MICA特异性抗体

通过流式细胞计量术测试了免疫的小鼠的血清中的MICAα3特异性抗体与在B16F10小鼠黑素瘤细胞的表面上表达的全长MICA的结合。简而言之，将1 x10⁵细胞用在100µl PBS中的1µl血清染色2小时，所述血清来自未免疫的小鼠(原初)、用对照疫苗(OVA-蛋白)或MICA-铁蛋白疫苗（从第14、28和42天）(接种疫苗)免疫的小鼠。将商购可得的结合MICA的α1-α2结构域的单克隆抗体6D4用作阳性对照(10µg)。将PE缀合的抗-小鼠IgG用作第二抗体。在接种疫苗的小鼠的血清中的MICAα3特异性抗体(直方图–绿色(d14), 蓝色(d28), 红色(d42))表明与在肿瘤细胞表面上表达的MICA的显著结合(图5A和5B)。这些测定的结果证实，MICA-铁蛋白融合蛋白接种会诱导高滴度的MICA特异性抗体。

实施例4: 使用MICA-铁蛋白融合蛋白的疫苗接种会产生高水平的IGG1、IGG2a和IGG3 MICAA3特异性的多克隆抗体应答

在ELISA中测试了来自MICA-铁蛋白免疫的小鼠的血清，以确定在疫苗接种后诱导的IgG的不同亚类。将来自用OVA-蛋白免疫的小鼠(推注)或未免疫的小鼠(原初)的血清用作对照组。将全长MICA用作捕获抗原，并在每个孔中使用1/1000的血清稀释度。将HRP缀合的抗-小鼠IgG1、IgG2a、IgG2b或IgG3用于检测。发现使用MICA-铁蛋白的免疫接种(接种疫苗)诱导高水平的所有测试的IgG亚类(参见图6)。

实施例5: 响应于MICA-铁蛋白疫苗而产生的多克隆抗体阻止来自人转移性黑素瘤细胞系的表面的MICA脱落

用自体肿瘤疫苗(GVAX) + 伊匹木单抗治疗的黑素瘤患者中的MICA抗体的诱导与降低的血清可溶性MICA (sMICA)水平有关。MICA/B的细胞外部分含有两个MHC I类-样结构域(α1和α2)和一个膜近侧免疫球蛋白结构域(α3)。已经证实，二硫键异构酶ERp5切割MICAα3结构域中的结构性二硫键，且得到的该结构域的解折叠允许ADAM 10、ADAM 17和MMP-14的蛋白水解性裂解。该测定的目的是确定响应于MICA-铁蛋白疫苗而产生的多克隆抗体是否阻止来自人黑素瘤肿瘤细胞系A375的MICA脱落。

关于这些测定，将4x10⁵个A375恶性黑素瘤细胞铺板在含有200µl培养基的96孔板中。将所述细胞与无血清一起或与来自原初的、OVA-蛋白免疫的或MICA-铁蛋白接种疫苗的小鼠(图7具有反转三角形的条)的血清一起温育24小时。使用MICA ELISA试剂盒分析上清液中的sMICA，其利用MICAα1-α2结构域抗体进行捕获和检测。相对于没有血清、与来自原初(图7具有圆圈和正方形的条)或OVA-蛋白免疫的小鼠(图7具有三角形的条)的血清一起温育的细胞，在与来自MICA-铁蛋白接种疫苗的小鼠(图7具有反转三角形的条)的血清一起温育的细胞的上清液中检测到更低水平的sMICA，从而指示MICAα3特异性抗体可以抑制MICA从肿瘤细胞表面的脱落。

实施例6：MICA-铁蛋白疫苗的治疗活性

使用高侵袭性的B16F10黑素瘤肿瘤模型测试了MICA-铁蛋白疫苗的治疗活性。将B16F10黑素瘤肿瘤细胞遗传修饰成表达人MICA。MICA被鼠NKG2D受体结合，使这成为合适的模型系统。通过静脉内注射B16F10-MICA肿瘤细胞，攻击用MICA-铁蛋白疫苗、OVA-蛋白疫苗(对照抗原)免疫的C57BL/6小鼠和未免疫的对照小鼠(年龄和性别匹配)。在肿瘤攻击之前、在第7天和第13天，收集血清。在肿瘤攻击以后14天将小鼠安乐死，并定量肺转移灶的数目(参见图8A)。

关于这些测定，将8周龄C57BL/6雌性小鼠用MICAα3-铁蛋白或ova-蛋白免疫，随后在第28天强化。3周以后，通过静脉内注射5x10⁵个表达MICA的B16F10黑素瘤细胞，攻击小鼠。在肿瘤攻击以后14天将小鼠安乐死，并定量肺转移灶的数目。通过ELISA监测血清中的脱落的MICA (sMICA)水平。这些实验证实，MICA-铁蛋白接种疫苗的小鼠是几乎无肿瘤的。相反，未免疫的年龄匹配的对照组(原初)和用对照抗原（卵白蛋白）接种疫苗的小鼠具有大数目的肺转移灶(~150肺转移灶/小鼠的平均值) (图8A)。重要的是，sMICA在用MICA-铁蛋白疫苗(三角形)免疫的小鼠的血清中是不可检测的，而在肿瘤攻击以后2周内在用卵白蛋白免疫的小鼠(正方形)和未免疫的对照组(圆形)的血清中检测到高水平的sMICA (图8B)。

实施例7: 确定MICA-铁蛋白疫苗的有效剂量和体内多克隆抗体应答的动力学

关于这些研究，小鼠在肿瘤细胞攻击之前接受2次疫苗注射。但是，在初次免疫接种以后2周已经实现了接近最大抗体水平。为了确定最佳疫苗接种剂量和在不同剂量时多克隆抗体应答的动力学，用不同剂量的吸附至MSR的MICA-铁蛋白蛋白(50-200µg)免疫C57Bl/6J小鼠。小鼠在第17天接受强化。在每周间隔通过眶后抽血收集血清以通过ELISA确定MICA抗体滴度。在初次免疫接种以后第25天，通过静脉内注射表达MICA的B16F10黑素瘤细胞攻击小鼠。在肿瘤攻击之前和在每周间隔收集血清以分析脱落的MICA水平。在肿瘤攻击以后14天将小鼠安乐死；将肺收获并在10%中性缓冲的福尔马林中固定，并定量肺转移灶的数目。

关于这些研究，将8周龄C57BL/6雌性小鼠用不同剂量(50µg、100µg或200µg)的MICAα3-铁蛋白疫苗免疫，并在第17天强化。如下确定终点抗体滴度：将所述血清连续稀释，并通过ELISA测试它与全长MICA蛋白的结合。MICA-铁蛋白免疫的小鼠在所有测试的剂量在第14天之前引起高水平的抗体滴度(10⁵的ELISA端点滴度)，且所述滴度在第17天强化以后增加了约1000倍。原初的、未治疗的年龄匹配的小鼠用作对照组(参见图9A)。

在初次免疫接种以后第25天，通过静脉内注射0.5x10⁶个表达MICA的B16F10黑素瘤细胞，攻击小鼠。在肿瘤攻击之前和在每周间隔收集血清以分析脱落的MICA水平。在肿瘤攻击以后14天将小鼠安乐死；将肺收获并在10%中性缓冲的福尔马林中固定，并定量肺转移灶的数目。与用50µg疫苗免疫的小鼠(~2-12个肺遇到)相比，用100µg和200µg免疫的小鼠是几乎无肿瘤的。sMICA在用不同剂量的MICA-铁蛋白疫苗(50µg -正方形，100µg - 向上三角形，200µg - 向下三角形)免疫的小鼠的血清中是不可检测的，而在肿瘤攻击以后2周内在未免疫的对照组(空心圆)的血清中检测到高水平的sMICA (参见图9B和9C)。

实施例8：单独的MICAA3疫苗诱导高滴度的MICA特异性抗体

为了确定单独的MICAα3疫苗(没有铁蛋白)在产生MICA特异性的多克隆抗体应答中的作用，通过将8个潜在N-糖基化位点中的7个突变成Asp或Gln，产生MICAα3基因的去糖基化形式。在方法部分所述的蛋白生产和纯化以后，通过给5mg MSR加载1µg GM-CSF、100µgCpG-ODN和150µg去糖基化的MICAα3蛋白，制备MICAα3疫苗(缩写MICAα3疫苗)。然后将所述颗粒冻干，再悬浮于冷PBS (150µl)中并皮下地注射进雌性C57Bl/6J小鼠的胁腹中。将用不含MSR支架的所有疫苗组分(推注)免疫的小鼠和未治疗的、年龄匹配的小鼠用作对照组。在每周间隔通过眶后抽血来收集血清。小鼠在初次免疫接种后第28天接受强化。

关于这些研究，将1x10⁵个表达MICA009的B16F10黑素瘤细胞用在100µl PBS中的1µl血清染色2小时，所述血清来自未免疫的小鼠(原初)、用不含MSR的MICAα3 (推注)或MICAα3疫苗(接种疫苗)免疫的小鼠。商购可得的结合MICA的α1-α2结构域的单克隆抗体6D4用作阳性对照(10µg)。PE缀合的抗-小鼠IgG用作第二抗体。在接种疫苗的小鼠和推注组的血清中的MICAα3特异性抗体表明与在肿瘤细胞表面上表达的MICA的显著结合，具有与强化后的阳性对照组类似的水平(参见图10A)。

在ELISA中测试了来自MICAα3免疫的小鼠的血清以确定在疫苗接种后诱导的IgG的不同亚类。将来自未免疫的小鼠的血清用作对照组。将全长MICA用作捕获抗原，并在每个孔中使用1/1000的血清稀释度。将HRP缀合的抗-小鼠IgG1、IgG2a、IgG2b或IgG3用于检测。发现使用MICAα3疫苗和推注疫苗的免疫接种会诱导所有测试的IgG亚类的产生，具有高于MICA-铁蛋白疫苗的IgG1水平(参见图10B)。

实施例8: 单独的MICAA3疫苗(没有铁蛋白融合)显示出显著的体内治疗益处

关于这些研究，将8周龄C57Bl/6J雌性小鼠用MICAα3疫苗或由不含MSR支架的所有疫苗组分组成的推注免疫。将未治疗的、年龄匹配的C57Bl/6J雌性小鼠用作对照组。强化以后3周，通过静脉内注射0.5x10⁶个表达MICA的B16F10黑素瘤细胞攻击小鼠。在肿瘤攻击以后14天将小鼠安乐死；将肺收获并在10%中性缓冲的福尔马林中固定，并定量肺转移灶的数目。与未治疗的、年龄匹配的对照组相比，MICAα3接种疫苗的小鼠是几乎无肿瘤的。与未免疫组(~200-250)相比，肺转移灶的数目在推注组中显著更低(~100-125) (参见图11A)。

sMICA在用MICAα3疫苗免疫的小鼠(三角形)的血清中是不可检测的，而在未治疗的对照组中在肿瘤攻击以后2周内发现了高水平的sMICA (圆形)。与对照组相比，推注组在血清中具有相对更低水平的sMICA (正方形) (参见图11B)。与接种组相比在用MICAα3推注免疫的小鼠中增加的肺转移灶数目和sMICA水平最可能是由于与接种组相比在初次免疫接种以后第62天之前观察到的MICA特异性抗体滴度的下降水平(数据未显示)。

实施例9：确定疫苗效力所需的细胞毒性淋巴细胞群体

通过用mAb除去CD8 T细胞或NK细胞，发现CD8 T细胞和NK细胞为所述疫苗的治疗效果做出贡献(图13A-13B和14A-14B)。

实施例10：用于定量MIC抗体的ELISA测定

使用ELISA测定，其用于定量由所述疫苗诱导的MIC抗体(图6)。

实施例11：将来研究

以下是有待执行以进一步评估疫苗性能的将来研究。

1. 将通过测试抗原的最佳量和对比两种佐剂CpG寡核苷酸和聚(I:C)来优化疫苗制剂。

2. 将在多个肿瘤模型中测试疫苗的效力，具体地是B16-MIC黑素瘤模型(皮下和转移模型)和前列腺癌的正位TRAMP-MIC模型。这些研究包括通过评估肿瘤生长的抑制和血清中脱落的MIC的减少来测量疫苗效力。

3. 将血清从免疫的小鼠转移至未免疫的接受者，以检查诱导的MIC-特异性抗体对于由所述疫苗提供的保护而言是否足够。

4. 确定所述疫苗是否提供保护以对抗由缺乏MIC表达的肿瘤细胞引起的二次攻击，其归因于针对其它肿瘤抗原的CD8 T细胞应答的诱导。通过静脉内注射高剂量的表达或不表达MIC的B16肿瘤细胞，攻击B16-MIC转移模型存活的小鼠。

将执行反映诱导的抗体的机理活性的生物标志物的进一步研究。这些将包括以下方案。

1. 关于血清中脱落的MIC的ELISA测定；一种测定是可得到的，并且将用来自晚期癌症患者的血清样品严格地测试。

2. 诱导的MICα3结构域抗体的功能活性测试. 将研究哪些人肿瘤细胞系对于评估抗体介导的MIC脱落的抑制的测定而言是最佳的(一组细胞系是可得到的)。

3. 在外周血和肿瘤活组织检查中的免疫细胞的流式细胞计量术分析. 特别重要的是定量CD8 T细胞和NK细胞的表面NKG2D水平；抗体是可得到的，并将对该组进行优化。

实施例12: 与铁蛋白融合的MICA002α3的杆状病毒表达(幽门螺杆菌)

目的：与铁蛋白纳米颗粒融合的MICA (002)α3的昆虫细胞表达

一般设计：

信号肽, 6 his标签, 接头, N-端HA肽, MICAα3结构域(*002:01)，

GSG接头, 幽门螺杆菌铁蛋白, 终止密码子

策略: 在SmaI和BamHI位点之间克隆进pacDB3载体中

策略: 克隆进pacDB3载体中

DNAMAN18(1-945)的翻译

通用密码

总氨基酸数目: 314, MW=35668

Max ORF: 1-942, 314 AA, MW=35668

SEQ DNAMAN: 945碱基对；

组成254 A; 252 C; 241 G; 198 T; 0其它

百分比:26.9%A; 26.7%C; 25.5%G; 21.0%T; 0.0%其它

分子量(kDa): ssDNA: 291.81 dsDNA: 582.6

起源

步骤1. 使用以下引物从C1347构建体扩增用于PCR 1的模板(信号肽, 6 his, 接头,HA, MICAα3)

正向引物# 铁蛋白_baculo_SmaIfor

内部反向引物: # 铁蛋白baculo_IRev

步骤2. 使用以下引物从C1347扩增用于PCR 2 (铁蛋白)的模板

内部正向引物: # 铁蛋白baculo_IF

反向引物: # 铁蛋白baculo_BamHIRev

步骤3: 使用以下引物的融合PCR

# 铁蛋白_baculo_SmaIfor

和

# 铁蛋白baculo_BamHIRev

在DNAMAN18上的限制性分析

甲基化: dam-No dcm-No

用117种酶筛选，发现了18个位点

按位点次序列出

非切割酶

来自幽门螺杆菌的铁蛋白

位置N19变成Q (以消除N-连接的糖基化位点)，开始于位置5 (带有下划线)

铁蛋白[幽门螺杆菌]

NCBI参照序列: WP_000949190.1

FASTA图

转至：

基因座WP_000949190 167氨基酸直链BCT 16-MAY-2013

定义：铁蛋白[幽门螺杆菌]。

登录：WP_000949190

版本：WP_000949190.1 GI:446871934

关键词：RefSeq.

来源：幽门螺杆菌

生物：幽门螺杆菌

细菌；变形杆菌门；ε变形杆菌；弯曲菌目；

螺杆菌科；螺杆菌属。

评论REFSEQ: 该记录代表单一非冗余蛋白序列，其可以注解在来自相同或不同物种的许多不同RefSeq基因组上。

完整性: 全长。

特征：位置/限定词

来源1..167

/生物体=“幽门螺杆菌”

/db_xref=“分类单元:210”

蛋白1..167

/产物=“铁蛋白”

/计算分子量=19183

区域3..158

/区域名=“非血红素_铁蛋白”

/注解=“含有非血红素的铁蛋白; cd01055”

/db_xref=“CDD:153113”

区域7..144

/区域名=“铁蛋白”

/注解=“铁蛋白-样结构域; pfam00210”

/db_xref=“CDD:249681”

位点次序(17,49..50,53,94,126,129..130)

/位点类型=“其它”

/注解=“亚铁氧化酶二铁中心[离子结合]”

/db_xref=“CDD:153113”

起源

实施例11: 在昆虫细胞中的去糖基化的MICA 002蛋白表达

目的：去糖基化的MICAα3 (*002:01)的杆状病毒表达

一般设计：

信号肽, N-端HA肽, MICAα3结构域(*002:01), 终止密码子

策略: 克隆进pAcDB3 BglII-EcoRI位点

SEQ DNAMAN1: 432碱基对；

组合物96 A; 125 C; 122 G; 89 T; 0其它

百分比: 22.2%A; 28.9%C; 28.2%G; 20.6%T; 0.0%其它

分子量(kDa): ssDNA: 133.37 dsDNA: 266.4

起源

DNAMAN1(1-432)的翻译

通用密码

总氨基酸数目: 143, MW=15928

Max ORF: 1-429, 143个氨基酸, MW=15928

在DNAMAN1上的限制性分析

甲基化: dam-No dcm-No

用117种酶筛选，发现了5个位点

按位点次序列出

非切割酶

其它实施方案

尽管已经结合其详细说明描述了本发明，但是前述说明书意在只是说明性的，并且不限制本发明的范围，本发明的范围由随后的权利要求的范围限定。其它方面、优点和改变是在下述权利要求的范围内。

Claims (22)

1.一种疫苗组合物，其包含有效量的含有MICα3-结构域或者由MICα3-结构域组成的肽作为免疫原性组分，所述有效量是有效地引起针对MICα3-结构域的免疫应答的量。

2.权利要求1的疫苗组合物，其中所述MICα3-结构域是MICA或MICBα3-结构域。

3.权利要求1或2的疫苗组合物，其中所述MICα3-结构域是非糖基化的。

4.权利要求1-3中的任一项的疫苗组合物，其中所述肽包含SEQ ID NO: 3或SEQ IDNO: 4的氨基酸序列或由其组成。

5.权利要求1-4中的任一项的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物包含多种肽。

6.权利要求1-5中的任一项的疫苗组合物，其中所述肽缀合至载体蛋白。

7.权利要求1的疫苗组合物，其进一步包含GM-CSF。

8.一种融合蛋白，其包含与MICα3-结构域蛋白连接的单体铁蛋白亚基蛋白，其中所述单体铁蛋白亚基蛋白包含允许所述融合蛋白自装配成纳米颗粒的结构域。

9.权利要求8的融合蛋白，其中所述单体亚基是幽门螺杆菌铁蛋白蛋白的单体亚基。

10.权利要求8或9的融合蛋白，所述融合蛋白进一步包含胞嘧啶-鸟苷(CpG)寡核苷酸序列。

11.一种纳米颗粒，其包含权利要求8-10中的任一项的融合蛋白。

12.一种纳米颗粒，其包含多种MICα3-结构域肽。

13.一种疫苗组合物，其包含权利要求11或12的纳米颗粒。

14.权利要求13的疫苗组合物，所述疫苗组合物进一步包含GM-CSF。

15.一种治疗个体中的癌症的方法，所述方法包括给个体施用权利要求1-7或13-14中的任一项的疫苗组合物。

16.根据权利要求15所述的方法，所述方法进一步包括施用GM-CSF。

17.根据权利要求15或16所述的方法，其中所述疫苗组合物作为治疗方案的部分来施用。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述治疗方案是辐射疗法、靶向疗法、免疫疗法或化学疗法。

19.根据权利要求15-18中的任一项所述的方法，其中所述个体就他们的血清中脱落的MIC而言已经测试为阳性的。

20.根据权利要求15-19中的任一项所述的方法，所述方法包括给所述个体施用一种或多种对除了MICα3-结构域抗原以外的抗原特异性的疫苗。

21.一种用于治疗癌症的方法，所述方法包括给所述个体施用包含表达MICα-3结构域的细胞的疫苗。

22.一种用于治疗癌症的方法，其中通过使用复制型或非复制型病毒来诱导针对MIC的免疫应答。