CN105899217A - 癌症疗法中的番木瓜花叶病毒和病毒样颗粒 - Google Patents
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Abstract
用于抑制癌症生长和转移的番木瓜花叶病毒和包含ssRNA的病毒样颗粒(VLP)。PapMV和PapMV VLP可单独使用或与另一种癌症疗法如化学治疗剂、免疫治疗剂或放射疗法组合使用。
Description
技术领域
本发明涉及癌症治疗学领域，具体地涉及番木瓜花叶病毒(PapMV)和病毒样颗粒(VLP)在癌症疗法中的用途。
背景技术
已知免疫系统在癌症中和肿瘤对常规治疗方式的应答中起重要作用。已经开发出并且仍正在开发用于治疗癌症的免疫治疗方法。利用单克隆抗体的被动免疫疗法是一种重要方法，然而，经受被动免疫疗法的患者经常复发并且显示对治疗的应答逐渐减少。因此，正在开发刺激患者自身的免疫系统以对抗所述疾病的替代方法，包括癌症疫苗(如)和非特异性免疫疗法(如小分子化合物咪喹莫特(imiquimod))。
咪喹莫特是Toll样受体7(TLR7)激动剂和已被批准以5％乳霜制剂形式用于局部治疗恶化前和早期皮肤癌症的强力免疫调节剂。已证明，全身施用也是TLR7激动剂的类似咪唑并喹啉小分子852A在一些患有IV期转移性黑素瘤的患者中导致长期疾病稳定(Dudek等人，2007，Clin Cancer Res，13(23)：7119-7125)。已显示，全身施用另一种咪唑并喹啉TLR7激动剂R848(瑞喹莫德(Resquimod))与放射疗法组合在T细胞和B细胞淋巴瘤携带小鼠中导致肿瘤的长时间清除(Dovedi等人，2012，Blood，121(2)：251-259)。已显示，局部施用咪喹莫特与局部放射疗法的组合和全身施用环磷酰胺协同作用以在皮肤乳腺癌的小鼠模型中减少肿瘤生长和复发(Dewan等人，2012，Clin Cancer Res，18(24)：6668-6678)。
已描述番木瓜花叶病毒(PapMV)和PapMV病毒样颗粒(VLP)增强抗原的免疫原性的能力(美国专利第7,641,896号和第8,101,189号、加拿大专利申请第2,434,000号和国际专利申请第PCT/CA03/00985号(WO2004/004761))。
另外，国际专利申请公开第WO 2012/155261号描述包含PapMV或PapMV VLP的组合物刺激先天性免疫应答的用途。PapMV组合物可用于针对随后的病原体攻击提供保护或治疗已建立的感染。还描述了使用PapMV组合物保护受试者免于病原体的潜在感染和通过鼻内或肺部途径施用所述组合物以在粘膜内和/或呼吸系统中引发作用。
国际专利申请公开第WO 2012/155262号描述从重组番木瓜花叶病毒外壳蛋白和ssRNA制备VLP的体外过程。VLP可以用作佐剂且在与抗原融合时用作疫苗。还描述了使用VLP刺激先天性免疫应答。
提供这一背景信息的目的在于公开申请人认为可能与本发明相关的信息。先前的任何信息均不应认为或理解为对抗本发明的现有技术。
发明概述
本发明涉及癌症疗法中的番木瓜花叶病毒和病毒样颗粒。在第一方面，本发明涉及包含番木瓜花叶病毒(PapMV)或含有ssRNA的PapMV病毒样颗粒(VLP)的组合物，其用于治疗有此需要的受试者的癌症。
在另一方面，本发明涉及包含番木瓜花叶病毒(PapMV)或含有ssRNA的PapMV病毒样颗粒(VLP)的组合物，其用于在有此需要的受试者的癌症的治疗中改善癌症免疫疗法。
在另一方面，本发明涉及治疗受试者的癌症的方法，其包括向受试者施用有效量的包含番木瓜花叶病毒(PapMV)或含有ssRNA的PapMV病毒样颗粒(VLP)的组合物。
在另一方面，本发明涉及在治疗受试者的癌症中改善癌症免疫疗法的方法，其包括向受试者施用有效量的包含番木瓜花叶病毒(PapMV)或含有ssRNA的PapMV病毒样颗粒(VLP)的组合物。
在某些实施方案中，所述组合物包含含有ssRNA的PapMV VLP。
在另一方面，本发明涉及包含含有ssRNA的番木瓜花叶病毒(PapMV)病毒样颗粒(VLP)的组合物，其用于治疗有此需要的受试者的癌症，其中所述组合物是用于肿瘤内施用且其中所述组合物抑制癌症生长。
在另一方面，本发明涉及包含含有ssRNA的番木瓜花叶病毒(PapMV)病毒样颗粒(VLP)的组合物，其用于在有此需要的受试者的癌症的治疗中改善基于树突细胞的免疫疗法。
在另一方面，本发明涉及治疗受试者的癌症的方法，其包括向受试者施用有效量的包含含有ssRNA的番木瓜花叶病毒(PapMV)病毒样颗粒(VLP)的组合物，其中肿瘤内施用所述组合物且其中所述组合物抑制癌症生长。
在另一方面，本发明涉及在治疗受试者的癌症中改善基于树突细胞的免疫疗法的方法，其包括向受试者施用有效量的包含含有ssRNA的番木瓜花叶病毒(PapMV)病毒样颗粒(VLP)的组合物。
在某些实施方案中，所述癌症疗法包括放射疗法、化学疗法和免疫疗法中的一种或多种。在一些实施方案中，所述癌症疗法包括免疫治疗剂，如基于细胞的癌症免疫治疗剂。在一些实施方案中，所述癌症疗法包括基于树突细胞的免疫治疗剂。
附图简述
本发明的这些和其它特征在参照附图的以下详细说明中将变得更加显而易见。
图1呈现(A)可用于在本发明的一个实施方案中制备PapMV VLP的合成RNA模板(SRT)的序列(SEQ ID NO：1)，和(B)可用于本发明的另一个实施方案中的另一合成RNA模板(SRT)的序列(SEQ ID NO：6)；所有ATG密码子均已突变为TAA终止密码子(粗体)，前16个核苷酸是从T7转录起始位点起位于pBluescript表达载体内且所述序列包含用于rVLP组装的PapMV成核位点(在(A)中方框内)。
图2呈现(A)野生型PapMV外壳蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)和(B)野生型PapMV外壳蛋白的核苷酸序列(SEQ ID NO：3)。
图3呈现(A)修饰的PapMV外壳蛋白CPΔAN5的氨基酸序列(SEQID NO：4)，和(B)修饰的PapMV外壳蛋白PapMV CPsm的氨基酸序列(SEQ ID NO：5)。
图4A和4B呈现显示用PapMV ssRNA-VLP进行肿瘤内免疫导致在免疫后6h产生IFN-α的图。通过ELISA测量肿瘤(A)和脾(B)中的IFN-α的动力学。
图4C和4D呈现显示用PapMV ssRNA-VLP免疫诱导免疫细胞浸润到肿瘤中的图：免疫后24h肿瘤中的(C)CD45+细胞的比例和(D)CD8+和CD4+T细胞、B淋巴细胞和浆细胞样树突细胞的比例的流式细胞术分析。
图5呈现显示皮下(s.c.)和静脉内(i.v.)注射负载OVA的BMDC(BMDC-OVA)主要在脾和血清中诱导OVA特异性CD8+T细胞的产生的图：BMDC-OVA免疫后7天脾(A)、血清(B)和淋巴(C)中的CD8+T细胞中的Kb-OVA+细胞的流式细胞术分析。
图6A、6B和6C呈现显示肿瘤内注射PapMV ssRNA-VLP增加BMDC-OVA免疫的治疗作用的图：显示(A)B16-OVA-ofl和(B)B16-OVA的生长动力学。使用卡钳测量肿瘤并在肿瘤细胞接种后的第7天和第12天施用治疗。(C)在接种后第16天脾中的CD44+Kb-OVA+CD8+T细胞的比例。
图6D呈现显示小鼠中的补体耗竭并不改善利用PapMV ssRNA-VLP的肿瘤内治疗对皮下黑素瘤B16-OVA的生长动力学(在第7天和第12天在治疗后通过卡钳测量)的治疗作用的图。
图7呈现显示补体耗竭并不诱导在B16-OVA i.v.接种小鼠的肺中大量生成OVA特异性CD8+T细胞的图：免疫后第7天肺中的Kb-OVA特异性CD8+T细胞(A)和产生IL-2的CD8+T细胞(B)的流式细胞术分析。
图8呈现显示用PapMV ssRNA-VLP进行预治疗增加BMDC-OVA免疫对B16-OVA转移治疗作用的图。对小鼠i.v.接种B16-OVA-ofl并在接种后第7天注射PapMV ssRNA-VLP+BMDC-OVA。在第12天处死小鼠并收获肺。(A)将荧光素添加到肺匀浆上清液中并使用发光计测量发光。肺(B)和脾(C)中的CD44+Kb-OVA+CD8+T细胞的比例。在体外用OVA肽SIINFEKL(SEQ ID NO：7)再刺激后产生IFN-γ(D)或TNF-α(E)的脾CD8+T细胞的比例。
图9呈现显示用PapMV ssRNA-VLP治疗降低B16-OVA黑素瘤的生长速率并增加免疫细胞浸润的结果：(A)使用卡钳量测肿瘤直径并计算肿瘤面积来跟踪肿瘤生长。(B)通过肿瘤中的CD45+细胞的比例的流式细胞术测定免疫细胞浸润。(C)肿瘤匀浆的CD45+群体中的CD44+Kb-OVA+CD8+T细胞的比例。(D)在体外用OVA肽SIINFEKL(SEQ ID NO：7)再刺激后肿瘤中产生IFN-γ的CD8+T细胞的比例。＊：P＜0.05
图10显示表明在用一种或两种PapMV ssRNA-VLP(60μg)治疗或用对照缓冲液(Tris HCL 10mM pH 8)鼻内治疗的Balb/C小鼠的气管肺泡灌洗中(A)MIP-1α、(B)MIP-1β、(C)MIP-2、(D)KC、(E)TNF-α、(F)RANTES，(G)VEGF、(H)MCP-1、(I)IP-10、(J)IL-17、(K)IL-13、(L)IL-12(p70)、(M)IL-9、(N)IL-6、(O)IL-1α、(P)IL-1β、(Q)GM-CSF和(R)G-CSF的存在的图。各个点对应于各小鼠中检测到的细胞因子水平。
图11显示描绘通过在用100μg PapMV ssRNA-VLP进行静脉内免疫后C57BL/6小鼠的血清(A)和脾(B)中的IFN-α的产生的动力学的ELISA；和(C)用100μg PapMV ssRNA-VLP或PBS进行免疫(i.v.)后6h C57BL/6和不同敲除小鼠中的血清IFN-α的ELISA量化进行的评估的图。
图12呈现显示腹膜内施用PapMV ssRNA-VLP诱导在小鼠的脾中产生细胞因子和趋化因子的结果：(A)IFN-γ(IFN-g)、(B)IL-6、(C)TNF-α(TNF-a)、(D)KC和(E)趋化因子MIP-1α(MIP-1a)。
图13呈现显示腹膜内施用PapMV ssRNA-VLP诱导在小鼠的血清中产生细胞因子和趋化因子的结果：(A)KC、(B)IFN-γ(IFN-g)、(C)IL-6、(D)趋化因子MIP-1α(MIP-1a)和(E)TNF-α(TNF-a)。
图14呈现显示腹膜内施用PapMV ssRNA-VLP诱导在小鼠的脾(A)和血清(B)中产生IFN-α(IFN-a)，并且还诱导治疗后5小时在小鼠的血清中分泌KC(C)和MIPl-a(D)的结果(聚C＝用聚C DNA自组装的PapMVVLP；PapMV和ENG＝PapMV ssRNA-VLP；Dénat＝变性PapMVssRNA-VLP；5715＝具有弱佐剂活性的PapMV VLP批次)。
图15呈现显示PapMV ssRNA-VLP治疗降低B16-OVA黑素瘤的生长速率并增加免疫细胞浸润的结果。(A)通过用卡钳测量肿瘤直径并计算肿瘤面积(mm2)来跟踪肿瘤生长。(B)小鼠的存活百分比。当肿瘤达到17mm的直径时，对小鼠实施安乐死。在PapMV ssRNA-VLP注射后6h肿瘤中的(C)IP-10、(D)MCP-1和(E)IL-6的Luminex量化。(F)通过肿瘤中的CD45+细胞的比例的流式细胞术测定免疫细胞浸润。接种后第15天肿瘤匀浆的CD45+群体中的(G)CD8+T细胞、(H)源自骨髓的抑制性细胞(MDSC，CDllbhiGrl+)、(I)Kb-OVA+CD8+T细胞、(J)Db-gpl00+CD8+T细胞和(K)Kb-TRP2+CD8+T细胞的比例。＊：P＜0.05，＊＊＊：P＜0.001。
图16呈现显示用PapMV ssRNA-VLP预治疗增加DC-OVA免疫对B16-OVA黑素瘤肿瘤的治疗作用的结果。(A)随着时间的过去使用卡钳监测肿瘤生长。(B)小鼠的存活百分比。当肿瘤达到17mm的直径时，对小鼠实施安乐死。＊：p＜0.05。
图17呈现显示PapMV ssRNA-VLP与高剂量环磷酰胺(CTX；100mg/kg)的组合对肿瘤生长的作用的结果。(A)静脉内施用的PapMVssRNA-VLP，和(B)肿瘤内施用的PapMV ssRNA-VLP。
发明详述
本发明大体上涉及番木瓜花叶病毒(PapMV)和包含ssRNA的PapMV病毒样颗粒(VLP)(ssRNA-VLP)在癌症疗法中的用途，并且是基于如下发现：除了其在增强新触发的对抗原的免疫应答中充当佐剂的能力以外，PapMV和PapMV ssRNA-VLP能够将患有癌症的受试者的现有免疫应答加强到足以提供抗癌作用的水平。
如本文中所显示，PapMV ssRNA-VLP在单独施用时能够抑制肿瘤生长，且还能够增强其它癌症疗法、且具体地说癌症免疫疗法的肿瘤生长减少作用和/或抗转移作用。不希望受任何特定理论的限制，据信PapMV和PapMV ssRNA-VLP激活toll样受体TLR7，从而使它们能够充当免疫调节剂并加强患者的免疫细胞针对肿瘤的活性。由于PapMV还含有内源性ssRNA，所以预计展现针对肿瘤的类似免疫调节作用。
因此，在某些实施方案中，本发明涉及在癌症疗法中使用PapMV和PapMV ssRNA-VLP作为免疫调节剂的方法。一些实施方案涉及单独使用PapMV或PapMV ssRNA-VLP以抑制肿瘤生长的方法。
使用PapMV和PapMV ssRNA-VLP来加强经受另一种癌症疗法的患者中的抗癌免疫应答并从而改善所述疗法的有效性也涵盖于某些实施方案中。因此，本发明的一些实施方案涉及使用PapMV或PapMVssRNA-VLP作为组合疗法的一部分来治疗癌症、例如抑制肿瘤生长和/或抑制肿瘤转移的方法。本发明的各个实施方案中所涵盖的组合疗法包括例如PapMV或PapMV ssRNA-VLP与免疫治疗剂、化学治疗剂、放射疗法或病毒疗法中的一种或多种的组合。
因此，本发明的一些实施方案涉及包括PapMV或PapMVssRNA-VLP和另一种癌症治疗剂(例如免疫治疗剂或化学治疗剂)的治疗组合。
在一些实施方案中，预期PapMV或PapMV ssRNA-VLP可与治疗性癌症疫苗或其它癌症免疫治疗剂组合施用来抑制肿瘤生长或转移。在一些实施方案中，预期PapMV或PapMV ssRNA-VLP可与癌症免疫治疗剂组合施用来抑制肿瘤生长或转移。在某些实施方案中，PapMV或PapMV ssRNA-VLP可与基于细胞的癌症免疫治疗剂、如基于树突细胞(DC)的癌症免疫治疗剂组合施用。本发明的某些实施方案涉及与一种或多种治疗性癌症疫苗或其它癌症免疫治疗剂组合使用PapMV或PapMVssRNA-VLP来抑制肿瘤转移的方法。
本发明的某些实施方案涉及使用PapMV或PapMV ssRNA-VLP改善包含负载有癌症特异性抗原的树突细胞的免疫疗法的方法。在本上下文中，PapMV或PapMV ssRNA-VLP可在施用负载抗原的树突细胞之前用作例如预治疗，以通过在施用被负载的树突细胞之前刺激患者的先天性免疫来改善树突细胞治疗的功效，或者PapMV或PapMV ssRNA-VLP可与负载抗原的树突细胞同时或在其之后施用。
定义
除非另有定义，否则本文中所用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域技术人员所通常了解的含义相同的含义。
本文中所用的术语“约”是指自给定值的大约+/-10％变化。应理解，此变化总是包括在本文所提供的任何指定值内，无论是否明确提及。
PapMV或ssRNA-VLP的“注射”或“施用”意在涵盖有效地将PapMV或ssRNA-VLP引入到受试者体内的任何技术。在某些实施方案中，通过皮下、肿瘤内、腹膜内、静脉内、鼻内或肌肉内施用将PapMV或ssRNA-VLP引入到受试者体内。
与一种或多种其它治疗剂“组合”施用PapMV或ssRNA-VLP意在包括同时(并行)施用和连续施用。同时施用在某些情形下可涉及预混合PapMV或ssRNA-VLP和治疗剂。在一些情形下，同时施用可涉及在不进行预混合的情况下并行施用PapMV或ssRNA-VLP和治疗剂。连续施用意在涵盖以不同顺序将PapMV或ssRNA-VLP和治疗剂施用给受试者，其中将PapMV或ssRNA-VLP和治疗剂的施用隔开所界定时期，所述所界定时期可较短(如大约几分钟或甚至几秒钟)或较长(如大约几小时、几天或几周)。
本文中所用的术语“抑制”和其语法变化形式是指给定参数或事件的可测量降低。
本文所互换使用的术语“疗法”和“治疗”是指以缓解与疾病相关的症状、预防或延迟其或相关症状的发展或改变其或相关症状的病理学的目的实施的干预。因此，术语疗法和治疗广泛地使用，且在各个实施方案中包括疾病或相关症状在不同阶段的预防(prevention、prophylaxis)、缓和、减少和/或治愈中的一种或多种。
本文中所用的术语“受试者”和“患者”是指需要治疗的动物。
本文中所用的术语“动物”是指人和非人动物，包括但不限于哺乳动物、鸟和鱼，并且涵盖家畜、农畜、动物园动物、实验室动物和野生动物，如牛、猪、马、山羊、绵羊和其它有蹄类动物；狗；猫；鸡；鸭；非人灵长类动物；豚鼠；兔；白鼬；大鼠；仓鼠和小鼠。
词语“一个(a/an)”在本文中与术语“包含”连用时使用可意指“一个”，但其也与“一个或多个”、“至少一个”和“一个或多于一个”的含义一致。
本文中所用的术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”和其语法变化形式是包含性的或开放性的，且不排除另外的未列举的要素和/或方法步骤。术语“基本上由……组成”在本文中与组合物、用途或方法连用时表示可存在另外的要素和/或方法步骤，但这些另外的要素和/或方法步骤不会实质上影响所列举组合物、方法或用途起作用的方式。术语“由……组成”在本文中与组合物、用途或方法连用时排除另外的要素和/或方法步骤的存在。本文中描述为包含某些要素和/或步骤的组合物、用途或方法在某些实施方案中也可基本上由那些要素和/或步骤组成，且在其它实施方案中由那些要素和/或步骤组成，无论是否明确提及这些实施方案。
预期可参照本发明的任何方法或组合物执行本文中所论述的任何实施方案，且反之亦然。此外，可使用本发明的组合物和试剂盒来实现本发明的方法。
番木瓜花叶病毒和病毒样颗粒
PapMV
PapMV是本领域内已知的，并且可例如以ATCC编号PV-204TM从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)获得。可遵循标准方案(参见例如Erickson，J.W.和Bancroft，J.B.，1978，Virology 90：36-46)将所述病毒维持在宿主植物如番木瓜(Carica papaya)和金鱼草(Antirrhinum majus)上，并从所述宿主植物将其纯化。
PapMV ssRNA-VLP
PapMV ssRNA-VLP包含多个围绕ssRNA分子组装以形成病毒样颗粒的PapMV外壳蛋白。
PapMV外壳蛋白
用于制备VLP的PapMV外壳蛋白可以是整个PapMV外壳蛋白，或其一部分，或者它可以是野生型PapMV外壳蛋白的基因修饰形式，例如包含一个或多个氨基酸缺失、插入、置换等，条件是外壳蛋白保留自组装成VLP的能力。野生型PapMV外壳(或衣壳)蛋白的氨基酸序列是本领域内已知的(参见Sit等人，1989，J.Gen.Virol.，70：2325-2331和GenBank登记号NP_044334.1)且在本文中被作为SEQ ID NO：2(参见图2A)提供。该序列的变体是已知的，例如，由Noa-Carrazana和Silva-Rosales(2001，Plant Science，85：558)描述的PapMV的墨西哥分离物的外壳蛋白的序列与SEQ ID NO：2具有88％同一性且可从GenBank获得。PapMV外壳蛋白的核苷酸序列也是本领域内已知的(参见Sit等人，见上文和GenBank登记号NC_001748(核苷酸5889-6536))(参见图2B；SEQ ID NO：3)。
如上文所述，PapMV外壳蛋白的氨基酸序列不必与亲代(野生型)序列精确对应，即它可以是“变体序列”。例如，PapMV外壳蛋白可通过一个或多个氨基酸残基的取代、插入或缺失而被诱变，使得该位点处的残基并不与亲代(参照)序列相对应。然而，本领域技术人员将认识到此类突变将不是广泛的，并且将不会显著影响重组PapMV CP组装成VLP的能力。
因此，本发明还涵盖使用保留多聚体化并组装成VLP的能力的野生型外壳蛋白片段(即为“功能性”片段)制备的重组PapMV CP用于制备ssRNA-VLP。例如，片段可包含从蛋白质的N端、C端或内部或其组合缺失一个或多个氨基酸。通常，功能性片段长至少100个氨基酸，例如长至少150个氨基酸、至少160个氨基酸、至少170个氨基酸、至少180个氨基酸或至少190个氨基酸。野生型蛋白的N端进行的缺失通常应缺失少于13个氨基酸，例如12个、11个、10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个氨基酸，以保留所述蛋白质自组装的能力。
在某些实施方案中，当重组外壳蛋白包含变体序列时，变体序列与参照序列至少约70％同一，例如与参照序列至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％同一、至少约98％同一或至少约99％同一，或其间的任何量。在某些实施方案中，参照氨基酸序列为SEQ ID NO：2。
在某些实施方案中，用于制备重组PapMV VLP的PapMV外壳蛋白是PapMV外壳蛋白的基因修饰(即变体)形式。在一些实施方案中，PapMV外壳蛋白已被基因修饰以从蛋白质的N端或C端缺失氨基酸和/或包含一个或多个氨基酸取代。在一些实施方案中，PapMV外壳蛋白已被基因修饰以从蛋白质的N端或C端缺失约1个到约10个氨基酸，例如约1个到约5个氨基酸。
在某些实施方案中，PapMV外壳蛋白已被基因修饰以去除邻近野生型蛋白质的N端(即SEQ ID NO：2的1位和6位处)存在的两个甲硫氨酸密码子中的一个且可起始翻译。去除翻译起始密码子中的一个使得产生均一的蛋白质群体。所选甲硫氨酸密码子可例如通过以下方式被去除：取代所述密码子的核苷酸中的一个或多个，使得所述密码子编码除甲硫氨酸以外的氨基酸，或变成无义密码子。或者，可缺失所述密码子的全部或一部分或编码所述蛋白质的包含所选密码子的核酸的5′区域。在本发明的一些实施方案中，PapMV外壳蛋白已被基因修饰以从蛋白质的N端缺失1个到5个氨基酸。在一些实施方案中，基因修饰PapMV外壳蛋白具有与SEQ ID NO：4(图3A)基本上同一的氨基酸序列并且可任选地包含具有多达6个组氨酸残基的组氨酸标签。在一些实施方案中，PapMV外壳蛋白已被基因修饰以在C端包含另外的氨基酸(例如约1个到约8个氨基酸)，所述另外的氨基酸由将一个或多个特异性限制性酶切位点纳入编码核苷酸序列中而产生。在一些实施方案中，PapMV外壳蛋白具有与SEQ IDNO：5(图3B)基本上同一的氨基酸序列且具有或不具有组氨酸标签。
当PapMV VLP是使用含有一个或多个氨基酸取代的变体PapMV外壳蛋白序列制备时，这些氨基酸取代可以是“保守”取代或“非保守”取代。保守取代涉及一个氨基酸残基被具有相似侧链性质的另一个残基置换。如本领域内所已知，20种天然存在的氨基酸可根据它们侧链的物理化学性质来分组。适宜分组包括丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸和色氨酸(疏水性侧链)；甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺(极性的不带电荷的侧链)；天冬氨酸和谷氨酸(酸性侧链)和赖氨酸、精氨酸和组氨酸(碱性侧链)。氨基酸的另一分组是苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸(芳香族侧链)。保守取代涉及一个氨基酸被来自同一组的另一个氨基酸取代。非保守取代涉及一个氨基酸残基被具有不同侧链性质的另一个残基置换，例如酸性残基被中性或碱性残基置换、中性残基被酸性或碱性残基置换、疏水性残基被亲水性残基置换等。
在某些实施方案中，PapMV外壳蛋白变体序列包含一个或多个非保守取代。一个氨基酸被具有不同性质的另一个氨基酸置换可改善外壳蛋白的性质。例如，如先前所描述，外壳蛋白的残基128的突变改善所述蛋白质到VLP的组装(Tremblay等人2006，FEBS J.，273：14-25)。在本发明的一些实施方案中，因此，外壳蛋白包含外壳蛋白的残基128处的突变，其中该位置处的谷氨酸残基被中性残基取代。在一些实施方案中，128位的谷氨酸残基被丙氨酸残基取代。
已证明，野生型PapMV外壳蛋白的F13位的苯丙氨酸残基被另一个疏水性残基取代导致在表达重组蛋白时所形成的VLP比例高于在使用野生型蛋白序列时所形成的VLP(Laliberté-Gagné等人，2008，FEBS J.，275：1474-1484)。在本发明的上下文中，以下氨基酸残基被认为是适于F13位的取代的疏水性残基：Ile、Trp、Leu、Val、Met和Tyr。在本发明的一些实施方案中，外壳蛋白包含13位Phe被Ile、Trp、Leu、Val、Met或Tyr取代。在一些实施方案中，外壳蛋白包含13位的Phe被Leu或Tyr取代。
在某些实施方案中，可将外壳蛋白的F13位的突变与E128位的突变、N端处的缺失或其组合相组合。
同样，编码用于制备重组PapMV外壳蛋白的PapMV外壳蛋白的核酸序列不必与亲代参照序列精确对应，而是可因遗传密码的简并性而变化和/或使得其编码上文所描述的变体氨基酸序列。因此，在本发明的某些实施方案中，编码变体外壳蛋白的核酸序列与参照序列至少约70％同一，例如与参照序列至少约75％、至少约80％、至少约85％或至少约90％同一，或其间的任何量。在某些实施方案中，参照核酸序列为SEQ ID NO：3(图10B)。
重组外壳蛋白的制备
用于制备PapMV VLP的重组PapMV外壳蛋白可由本领域技术人员通过标准的遗传工程改造技术容易地制备。遗传工程改造蛋白的方法为本领域内众所周知(参见例如Ausubel等人(1994年及更新)Current Protocolsin Molecular Biology，John Wiley&Sons，New York)，野生型PapMV外壳蛋白的序列(参见例如SEQ ID NO：2和3)也是如此。
例如，编码野生型蛋白的核酸序列的分离和克隆可使用标准技术(参见例如Ausubel等人，见上文)来实现。例如，所述核酸序列可通过标准技术提取RNA且然后从RNA模板合成cDNA(例如，通过RT-PCR)来直接从PapMV获得。可通过标准技术从显示花叶症状的受感染植物叶片来纯化PapMV。
然后将编码外壳蛋白的核酸序列直接地或在一个或多个亚克隆步骤后插入到适宜表达载体中。本领域技术人员将认识到所用的确切载体对于本发明来说并不关键。适宜载体的实例包括但不限于质粒、噬菌粒、粘粒、噬菌体、杆状病毒、反转录病毒或DNA病毒。然后可如先前所述(参见例如Tremblay等人，2006，见上文)表达并纯化外壳蛋白。通常，对载体和相应的宿主细胞进行选择，以使得重组外壳蛋白在细胞中作为低分子量物质而不是作为VLP表达。在这一点上，适当载体和宿主细胞组合的选择是本领域普通技术人员所熟知的。
或者，可通过本领域内所熟知的标准体外定点诱变技术进一步工程改造编码外壳蛋白的核酸序列以引入一个或多个突变，如上文所描述的那些。可通过构成编码序列的适当核苷酸中的一个或多个的缺失、插入、取代、倒位或其组合来引入突变。这可以通过例如基于PCR的技术来实现，设计用于所述技术的合并一个或多个核苷酸错配、插入或缺失的引物。突变的存在可通过许多标准技术，例如通过限制性分析或通过DNA测序来验证。
本领域技术人员将认识到编码外壳蛋白的DNA可在不影响被编码蛋白质的活性的情况下以各种方式被改变。例如，DNA序列的变化形式可用于优化用于表达所述蛋白质的宿主细胞中的密码子优先性，或可含有促进表达的其它序列变化。
本领域技术人员应了解，表达载体可进一步包含有效转录编码外壳蛋白的DNA序列所需的调控元件，如转录元件。可合并到载体中的调控元件的实例包括但不限于启动子、增强子、终止子和多腺苷酸化信号。本领域技术人员将认识到适宜调控元件的选择取决于被选择用于表达遗传改造的外壳蛋白的宿主细胞，并且此类调控元件可源自于各种来源，包括细菌、真菌、病毒、哺乳动物或昆虫基因。
在某些实施方案中，表达载体可另外含有促进表达的蛋白的纯化的异源核酸序列。此类异源核酸序列的实例包括但不限于亲和性标签如金属-亲和性标签、组氨酸标签、抗生物素蛋白/链酶抗生素蛋白编码序列、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)编码序列和生物素编码序列。被表达的外壳蛋白在使用之前，可根据本领域内已知的方法从其中去除由异源核酸序列编码的氨基酸。或者，如果与异源核酸序列的表达相对应的氨基酸不干扰外壳蛋白随后组装成VLP，那么它们可被保留在该外壳蛋白上。
在本发明的一个实施方案中，外壳蛋白被表达为带组氨酸标签的蛋白。组氨酸标签可位于外壳蛋白的羧基端或氨基端。在某些实施方案中，外壳蛋白在C端包含组氨酸标签或相似标签。
可通过本领域内已知的各种方法中的一种将表达载体引入到适宜宿主细胞或组织中。此类方法可被发现通常描述于Ausubel等人(见上文)中，且包括例如稳定或瞬时转染、脂转染、电穿孔和被重组病毒载体感染。本领域技术人员应了解用于表达外壳蛋白的适当宿主细胞的选择将取决于所选载体。宿主细胞的实例包括但不限于细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞和哺乳动物细胞。所用的确切宿主细胞对于本发明来说并不关键。外壳蛋白可在原核宿主(例如大肠杆菌(E.coli)、杀鲑气单胞菌(A.salmonicida)或枯草芽孢杆菌(B.subtilis))中或在真核宿主(例如酵母属(Saccharomyces)或毕赤酵母属(Pichia)；哺乳动物细胞，例如COS细胞、NIH 3T3细胞、CHO细胞、BHK细胞、293细胞或HeLa细胞；昆虫细胞或植物细胞)中产生。在某些实施方案中，外壳蛋白在大肠杆菌和巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)中表达。
如果期望的话，可通过本领域内已知的标准技术(参见例如CurrentProtocols in Protein Science，Coligan，J.E.等人编辑，Wiley&Sons，NewYork，NY)将从宿主细胞纯化外壳蛋白，并且通过标准的肽测序技术使用完整蛋白或其蛋白水解片段进行测序以确认该蛋白质的同一性。
ssRNA模板
用于制备ssRNA-VLP的ssRNA模板可以是例如合成的ssRNA、天然存在的ssRNA、被修饰的天然存在的ssRNA、天然存在的或合成的ssRNA的片段等。
通常，用于体外组装的ssRNA至少长约50个核苷酸且最多长约5000个核苷酸，例如至少长约100个、250个、300个、350个、400个、450个或500个核苷酸且最多长约5000个、4500个、4000个或3500个核苷酸或其间的任何量。在某些实施方案中，用于体外组装的ssRNA长约500个到约3000个核苷酸，例如长约800个到约3000个核苷酸，长约1000个到约3000个核苷酸，长约1200个到约3000个核苷酸或长约1200个到约2800个核苷酸。
在某些实施方案中，对ssRNA模板设计进行，以使得其不包含任何ATG(AUG)起始密码子，以使序列的体内转录的可能性降到最低。然而，不排除使用包含ATG起始密码子的ssRNA模板，因为如果ssRNA未被封端，则体内转录不可能保持。
在某些实施方案中，用于体外组装的ssRNA包含来自天然PapMVRNA的5’末端的约38个到约100个核苷酸，这些核苷酸含有至少一部分推定的包装信号。在某些实施方案中还可使用不包含推定的包装信号的ssRNA模板。可用于产生ssRNA模板的基于PapMV基因组的序列的非限制性实例提供于图1(SEQ ID NO：1和6)中。在本发明的某些实施方案中，预期这些序列的片段以及多达约5000个核苷酸的延长形式也用于产生ssRNA模板。在某些实施方案中，用于体外组装的ssRNA包含与SEQID NO：1的核苷酸17至54相对应的RNA序列。在某些实施方案中，用于体外组装的ssRNA包含与SEQ ID NO：1的核苷酸17至63相对应的RNA序列。在某些实施方案中，用于体外组装的ssRNA包含与SEQ IDNO：1相对应的RNA序列。
已知富含A和C核苷酸的ssRNA序列也与PapMV外壳蛋白一起组装(Sit等人，1994，Virology，199：238-242)。因此，在某些实施方案中，ssRNA模板为富含A和/或C的序列，包括聚-A和聚-C ssRNA模板。在一些实施方案中，预期基于其它马铃薯X病毒组如马铃薯病毒X(PVX)、黄色花叶病毒(CYMV)、马铃薯奥古巴花叶病毒(potato aucuba mosaic virus，PAMV)和锦葵花叶病毒(MaMV)的序列的全部或一部分的ssRNA模板也用于该过程。
ssRNA模板的制备
可通过本领域内已知的标准技术(参见例如Ausubel等人(1994年及更新)Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，New York)分离和/或制备ssRNA模板。
例如，对于合成ssRNA来说，可将编码ssRNA模板的序列插入到可用于转化适当宿主细胞的适宜质粒中。在适当的细胞培养条件下培养被转化的宿主细胞后，可通过标准的分子生物学技术从所述细胞培养物纯化质粒DNA并通过限制性酶消化将其线性化。
然后使用适宜的RNA聚合酶转录ssRNA并通过标准方案纯化转录产物。
本领域技术人员将认识所用的确切质粒对于本发明来说并不关键，条件是它能够实现其期望的目的。同样，所用的具体宿主细胞也不关键，只要它能够繁殖所选质粒即可。
也可使用标准技术化学合成较短的ssRNA模板。还可利用许多商业RNA合成服务。
最终ssRNA模板可任选地在使用前被灭菌。
VLP的体外组装
使用制备的重组外壳蛋白和ssRNA模板在体外进行组装反应。虽然重组外壳蛋白和ssRNA模板两者通常在组装之前被纯化，但预期在一些实施方案中还使用粗制剂或部分纯化的外壳蛋白和/或ssRNA模板。
通常，在组装反应中采用具有同一的氨基酸序列的重组外壳蛋白的制剂，以使得最终VLP在组装时包含同一的外壳蛋白亚单位。预期在一些实施方案中还使用包含多个具有不同氨基酸序列的重组外壳蛋白的制剂，以使得最终VLP在被组装时包含其外壳蛋白亚单位的变化形式。
组装反应中所用的重组外壳蛋白主要呈低分子量物质的形式，所述低分子量物质主要由单体和二聚体组成，但也包括小于20聚体的其它低分子量物质。在本发明的上下文中，当重组外壳蛋白制剂所包含的外壳蛋白的至少约70％作为低分子量物质存在时，认为所述制剂主要呈低分子量物质的形式。在某些实施方案中，组装反应中所用的重组外壳蛋白制剂中的外壳蛋白的至少约75％、80％、85％、90％或95％或其间的任何量作为低分子量物质存在。在本发明的某些实施方案中，重组外壳蛋白制剂包含至少约50％的单体和二聚体，例如约60％、70％、75％或80％的单体和二聚体或其间的任何量。
在中性水溶液中进行组装反应，且不需要任何其它特定离子。通常，使用缓冲溶液。pH应当在约pH6.0到约pH9.0，例如约pH6.5到约pH9.0、约pH7.0到约pH9.0、约pH6.0到约pH8.5、约pH6.5到约pH8.5或约pH7.0到约pH8.5的范围内。缓冲液的性质对于本发明来说并不关键，条件是其可将pH维持在上述范围内。在上述pH范围内使用的缓冲液的实例包括但不限于Tris缓冲液、磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液等。
高浓度的氯化钠(NaCl)的存在可影响PapMV外壳蛋白的组装。在某些实施方案中，因此，组装反应在基本上不含NaCl(例如含有少于约0.05M NaCl)的溶液中进行。
可使用各种蛋白质∶ssRNA比率进行组装反应。通常，可使用以重量计约1∶1到约50∶1的蛋白质∶ssRNA比率，例如以重量计至少约1∶1、2∶1、3∶1、4∶1或5∶1到以重量计不超过约50∶1、40∶1或30∶1的蛋白质∶ssRNA比率。在某些实施方案中，组装反应中所用的蛋白质∶ssRNA比率为以重量计约5∶1到约40∶1或约10∶1到约40∶1或其间的任何范围。
可在约2℃到约37℃(例如至少约3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃或10℃到约37℃、35℃、30℃或28℃)变化的温度下进行组装反应。在某些实施方案中，在约15℃到约37℃(例如约20℃到约37℃或约22℃到约37℃或其间的任何范围)的温度下进行组装反应。
使组装反应进行足够时期以使VLP形成。所述时期将根据所用的重组外壳蛋白和ssRNA的浓度以及所述反应的温度而变化，且可由本领域技术人员容易地确定。通常，采用至少约60分钟的时期。如果标准技术如动态光散射或电子显微术所要求，可监测外壳蛋白向VLP的组装。
在已使组装反应进行适当长的时间后，可使VLP经受“钝化”步骤以去除从颗粒突出的RNA。使用能够切割RNA的核酸酶实现所述钝化反应。各种核酸酶可商购且它们的使用条件是本领域内已知的。
VLP一旦被组装即可通过标准技术如透析、渗滤或色谱从其它反应组分纯化。
可在纯化步骤之前或之后任选地通过例如离心或渗滤浓缩(或富集)ssRNA-VLP制剂。如果期望的话，可使用标准技术如电子显微术使ssRNA-VLP显现。
药物组合物
在某些实施方案中，本发明提供包含有效量的PapMV或PapMVssRNA-VLP和一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂的药物组合物。如果期望的话，所述组合物中可包含其它活性成分，例如另外的免疫治疗剂、化学治疗剂、治疗性癌症疫苗等。本发明的一些实施方案涉及包含PapMV或PapMV ssRNA-VLP和另一种癌症治疗剂(如本文所述的免疫治疗剂或化学治疗剂)的治疗组合，其中将PapMV或PapMVssRNA-VLP和另一种癌症治疗剂配制成单独组合物，但组合使用。
可将药物组合物配制以供通过各种途径施用。例如，可将所述组合物配制以供口服、局部、直肠、鼻部肠胃外施用或以供通过吸入或喷雾施用。本文中所用的术语肠胃外包括皮下、静脉内、肌肉内、鞘内、胸骨内注射或输注技术。向受试者鼻内施用包括将所述组合物施用到受试者的鼻通道或鼻腔的粘膜。在一些实施方案中还预期肿瘤内施用。
配制为水性悬浮液形式的组合物可含有PapMV或PapMVssRNA-VLP与一种或多种适宜赋形剂的混合物，例如悬浮剂，如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基-β-环糊精、黄蓍胶和阿拉伯胶；分散剂或湿润剂，如天然存在的磷脂，例如卵磷脂，或环氧烷与脂肪酸的缩合产物，例如聚氧乙烯硬脂酸酯，或环氧乙烷与长链脂肪族醇的缩合产物，例如十七乙烯氧基鲸蜡醇，或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物，例如聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯，或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物，例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯。水性悬浮液还可含有一种或多种防腐剂例如对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸正丙酯、一种或多种着色剂、一种或多种调味剂或一种或多种甜味剂如蔗糖或糖精。
在某些实施方案中，可将药物组合物配制为可分散粉末或粒剂形式，随后可用于通过添加水来制备水性悬浮液。此类可分散粉末或粒剂提供PapMV或PapMV ssRNA-VLP与一种或多种分散剂或湿润剂、悬浮剂和/或防腐剂的混合物。适宜分散剂或湿润剂和悬浮剂以上文已经提及的那些为例。另外的赋形剂例如着色剂也可包含在这些组合物内。
在一些实施方案中还可将药物组合物配制为水包油乳液形式。油相可以是植物油例如橄榄油或花生油，或矿物油例如液体石蜡，或者其可以是这些油的混合物。以供含于这些组合物中的适宜乳化剂包括天然存在的胶，例如阿拉伯胶或黄蓍胶；天然存在的磷脂，例如大豆、卵磷脂；或衍生自脂肪酸和己糖醇、酸酐的酯或偏酯，例如山梨糖醇单油酸酯，和所述偏酯与环氧乙烷的缩合产物，例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯。
在某些实施方案中，可根据本领域内已知的方法并使用适宜的一种或多种分散剂或湿润剂和/或悬浮剂(如上文所提及的那些将药物组合物)配制为无菌的可注射的水性或油质悬浮液。无菌的可注射的制剂可以是无毒性肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，例如作为1，3-丁二醇中的溶液。可采用的可接受的媒介物和溶剂包括但不限于水、林格氏溶液(Ringer’s solution)、乳酸化林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。其它实例包括无菌的固定油，其按惯例用作溶剂或悬浮介质，和各种温和的固定油，包括例如合成的甘油单酯或甘油二酯。脂肪酸如油酸也可用于制备可注射剂。
任选地，药物组合物可含有防腐剂如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体，和/或稳定剂如碳水化合物(例如山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、蔗糖、葡萄糖或右旋糖酐)、蛋白质(例如白蛋白或酪蛋白)或含蛋白质的试剂(例如牛血清或脱脂乳)以及适宜缓冲液(例如磷酸盐缓冲液)。可根据熟知参数调节所述组合物的各组分的pH和准确浓度。
无菌组合物可例如通过将PapMV或PapMV ssRNA-VLP以所需量根据需要与上文所列举的各种其它成分一起合并适当溶剂中，接着进行过滤灭菌来制备。通常，通过将各种灭菌的活性成分合并含有碱性分散介质和来自上文所列举的那些的所需其它成分的无菌媒介物中来制备分散液。在用于制备无菌组合物的无菌粉末的情况下，一些示例性的制备方法为真空干燥和冷冻干燥技术，所述技术从预先无菌过滤的溶液产生活性成分加上任何另外的期望成分的粉末。
预期在本发明的某些实施方案中使用经过设计以供肺部或鼻内递送治疗性产品的各种机械装置，包括但不限于喷雾器、计量剂量吸入器、粉末吸入器和鼻用喷雾装置，其全部为本领域技术人员所熟知。
所有此类装置均要求使用适于分散PapMV或PapMV ssRNA-VLP的制剂。通常，各制剂针对于所用装置类型且可涉及除了如本领域技术人员所了解可用于疗法的常用稀释剂、佐剂和/或载体以外还使用适当推进剂材料。而且，预期在某些实施方案中使用脂质体、微胶囊或微球体、包合复合物或其它类型的载体。
其它药物组合物和制备药物组合物的方法为本领域内所已知且描述于例如“Remington：The Science and Practice of Pharmacy”(以前是“Remingtons Pharmaceutical Sciences”)；Gennaro，A.，Lippincott，Williams和Wilkins，Philadelphia，PA(2000)中。
在本发明的某些实施方案中还涵盖包含PapMV或PapMVssRNA-VLP与一种或多种市售化学治疗剂或免疫治疗剂的组合的药物组合物。
用途
本发明大体上涉及PapMV和PapMV ssRNA-VLP单独地或与一种或多种其它癌症疗法组合治疗癌症的方法和用途。在本上下文中，癌症治疗可导致例如以下结果的一个或多个：减小肿瘤大小、减缓或预防肿瘤大小的增加、增加肿瘤消失或去除与其再现之间的无疾病生存期、预防肿瘤的初始或随后发生(例如转移)、增加进展前时间、减少与肿瘤相关的一个或多个不良症状或增加患有癌症的受试者的总生存期中。
不希望受任何特定理论或机制的限制，据信向患有癌症的患者施用PapMV ssRNA-VLP增加对抗癌症所涉及的免疫细胞的库。虽然已知癌症患增加了抗癌免疫应答，但此应答通常不足以影响癌症生长或进展。因此，施用PapMV ssRNA-VLP以增加免疫细胞的现有库和/或刺激抗癌免疫应答应当增加此应答针对癌症的功效。出于相似原因，PapMV ssRNA-VLP应当还具有改善已知抗癌疗法的作用的功效。当所选抗癌疗法(例如化学治疗剂)对于免疫细胞来说无毒或相反导致免疫细胞减少时，可能需要与PapMV ssRNA-VLP组合使用降低剂量的此药物以避免化学治疗剂抵消PapMV ssRNA-VLP的免疫调节作用的可能性。
在组合疗法中，预期在大部分实施方案中，PapMV或PapMVssRNA-VLP将增强所述组合中的另一种或多种疗法的作用。在取决于具体组合的各种实施方案中，PapMV或PapMV ssRNA-VLP与另一种或多种疗法的作用可以是加性的、大于加性的或协同性的。
可依照本发明的某些实施方案治疗或稳定的癌症的实例包括但不限于血液性肿瘤(包括白血病、骨髓瘤和淋巴瘤)；癌瘤(包括腺癌和鳞状细胞癌)；黑素瘤和肉瘤。癌瘤和肉瘤也常称作“实体瘤”。常见的实体瘤的实例包括但不限于脑癌、乳腺癌、子宫颈癌、结肠癌、头颈癌、肾癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、胃癌和子宫癌、非小细胞肺癌和结肠直肠癌。各种形式的淋巴瘤也可导致形成实体瘤，因此在某些背景下也可被认为是实体瘤。
在某些实施方案中，PapMV或PapMV ssRNA-VLP可用于治疗实体瘤。在某些实施方案中，PapMV或PapMV ssRNA-VLP可用于治疗已知免疫疗法特别有效的癌症，例如膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、肾癌、肺癌、前列腺癌、白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤和黑素瘤。在某些实施方案中，本发明涉及PapMV或PapMV ssRNA-VLP治疗除肺癌以外的癌症的用途。
待治疗的癌症可以是生长缓慢的，或者它可以是侵袭性的。在各种实施方案中，本发明涵盖使用PapMV或PapMV ssRNA-VLP治疗顽固性癌症、晚期癌症、复发癌或转移性癌症。本领域技术人员将认识到这些类别中的许多类别可能重叠，例如侵袭性癌症通常也是转移性的。
预期PapMV或PapMV ssRNA-VLP的各种施用模式取决于待治疗的癌症，包括全身施用和局部施用。本领域技术人员可根据待治疗的癌症容易地确定适当施用途径。一些实施方案包括全身施用PapMV或PapMVssRNA-VLP来治疗癌症，例如皮下、静脉内、肌肉内或鼻内施用。在某些实施方案中，本发明涉及局部施用PapMV或PapMV ssRNA-VLP来治疗癌症，例如肿瘤内或肿瘤周施用。在某些实施方案中，本发明涉及通过除肺部途径以外的途径局部施用PapMV或PapMV ssRNA-VLP。
在某些实施方案中，本发明涉及使用PapMV或PapMV ssRNA-VLP作为单一药剂治疗癌症的方法。一些实施方案涉及单独使用PapMV或PapMV ssRNA-VLP抑制肿瘤生长。一些实施方案涉及抑制肿瘤生长的方法，其包括肿瘤内施用PapMV或PapMV ssRNA-VLP。
在一些实施方案中，本发明涉及PapMV或PapMV ssRNA-VLP与一种或多种其它癌症疗法组合使用以治疗癌症的方法。一些实施方案涉及PapMV或PapMV ssRNA-VLPs VLP与一种或多种其它癌症疗法组合使用以抑制肿瘤生长和/或转移。其它癌症疗法可包括例如免疫治疗剂、化学治疗剂、放射疗法和病毒疗法。
当作为组合疗法的一部分使用时，预期PapMV或PapMVssRNA-VLP和另一种或多种癌症疗法的各种施用顺序。本发明的某些实施方案涉及在施用另一种或多种疗法之前或与其相伴施用PapMV或PapMV ssRNA-VLP。相伴施用在本上下文中包括同时施用PapMV或PapMV ssRNA-VLP和另一种疗法，以及在施用另一种或多种疗法的短时期内(在其之前或之后)施用PapMV或PapMV ssRNA-VLP，例如在施用另一种或多种疗法的2小时或更短、90分钟或更短、60分钟或更短或30分钟或更短内施用PapMV或PapMV ssRNA-VLP。
一些实施方案涉及在另一种或多种疗法之后施用PapMV或PapMVssRNA-VLP。
不管用哪种施用顺序，在一些实施方案中还预期在施用另一种或多种疗法之后进一步施用一次或多次PapMV或PapMV ssRNA-VLP“加强剂”。
本发明的一些实施方案涉及在施用一种或多种其它抗癌疗法之前施用PapMV或PapMV ssRNA-VLP。在另一种疗法之前施用PapMV或PapMV ssRNA-VLP可例如使免疫系统“初免”，以使得增强随后施用的治疗剂的作用。在本上下文中，将PapMV或PapMV ssRNA-VLP和治疗剂的施用隔开所界定时期，所述所界定时期可较短(例如大约几分钟)或较长(例如大约几小时、几天或几周)。
通常，当在另一种疗法之前或之后施用PapMV或PapMVssRNA-VLP时，施用PapMV或PapMV ssRNA-VLP与另一种疗法之间的时期将为至少30分钟，例如至少60分钟、至少90分钟或120分钟。在一些实施方案中，施用PapMV或PapMV ssRNA-VLP与另一种疗法之间的时期可以是至少3小时、至少4小时、至少5小时或至少6小时。在一些实施方案中，施用PapMV或PapMV ssRNA-VLP与另一种疗法之间的时期可约2小时到约48小时，例如约2小时到约36小时、约2小时到约24小时或约2小时到约18小时。在一些实施方案中，在一些实施方案中，施用PapMV或PapMV ssRNA-VLP与另一种疗法之间的时期可以是约3小时到约24小时、约4小时到约24小时或约5小时到约24小时。
一些实施方案涉及使用PapMV或PapMV ssRNA-VLP作为辅助疗法，例如作为放射疗法或外科手术的辅助疗法。在本上下文中，预期通过PapMV或PapMV ssRNA-VLP刺激先天性免疫系统可有助于消除在放射疗法或外科手术后仍存在的任何肿瘤细胞，或者其可在放射疗法之前使肿瘤细胞变弱。此类辅助疗法可有助于增加放射疗法和外科手术干预的成功率。
在某些实施方案中，本发明涉及PapMV或20PapMV ssRNA-VLP与一种或多种癌症免疫治疗剂组合使用以抑制肿瘤生长的方法。本发明的一些实施方案涉及PapMV或PapMV ssRNA-VLP与一种或多种癌症免疫治疗剂组合使用以抑制肿瘤转移的方法。各种癌症免疫治疗剂是本领域内已知的，且包括例如单克隆抗体(如阿仑单抗(alemtuzumab)西妥昔单抗(cetuximab)帕尼单抗(panitumumab)(VectibixTM)、利妥昔单抗(rituximab)(例如)、曲妥珠单抗(trastuzumab)和易普利单抗(ipilimumab)(YervoyTM))、癌症疫苗(如斯普流塞-T(sipuleucel-T)和其它树突细胞疫苗、肿瘤细胞疫苗、PBMC疫苗和基于病毒载体的疫苗)和非特异性免疫治疗剂(如白介素-2(例如)、干扰素(IFN)-α和其它细胞因子；沙利度胺(thalidomide)、咪喹莫和来那度胺(lenalidomide))。在一些实施方案中预期PapMV或PapMV ssRNA-VLP与其它免疫疗法如过继性细胞疗法(ACT)组合使用。在某些实施方案中，本发明涉及PapMV或PapMV ssRNA-VLP与一种或多种基于细胞的癌症免疫治疗剂如树突细胞、PBMC、肿瘤细胞等组合使用的方法。在某些实施方案中，PapMV或PapMV ssRNA-VLP可与基于树突细胞的癌症疗法组合施用。
如本领域内所已知，基于树突细胞的癌症疗法通常基于源自从患者获得且随后负载有一种或多种肿瘤相关抗原的源自单细胞的祖细胞的体外扩增的树突细胞。将所述抗原以各种形式与树突细胞一起孵育，所述形式包括例如肽、重组蛋白、质粒DNA、配制的RNA或重组病毒。还正在开发基于纯真树突细胞的癌症疫苗用于肿瘤内施用并与其它治疗方式如放射疗法组合使用。
本发明的某些实施方案涉及PapMV或PapMV ssRNA-VLP在受试者中改善癌症免疫疗法的用途，所述改善是通过在施用癌症免疫疗法之前、与其相伴或在其之后向受试者施用有效量的PapMV或PapMVssRNA-VLP来实现的。在一些实施方案中，使用PapMV或PapMVssRNA-VLP改善包括负载有癌症特异性抗原的树突细胞的癌症免疫疗法。在一些实施方案中，向患者施用PapMV或PapMV ssRNA-VLP作为预治疗以通过在施用负载抗原的树突细胞之前刺激患者的先天性免疫来改善树突细胞治疗的功效。在替代实施方案中还预期相伴和随后施用PapMV或PapMV ssRNA-VLP。
某些实施方案涉及PapMV或PapMV ssRNA-VLP与一种或多种癌症化学治疗剂组合使用以抑制癌症的生长和/或转移的方法。本领域内已知各种化学治疗剂且包括特定用于治疗具体类型的癌症的那些以及可应用于一系列癌症的光谱化学治疗剂。化学治疗剂的实例包括但不限于氨磷汀(amifostine)(例如)、L-天冬酰胺酶、卡培他滨(capecitabine)(例如)、卡铂(carboplatin)、顺铂(cisplatin)、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪(dacarbazine)、多西他赛(docetaxel)(例如)、多沙唑嗪(doxazosin)(例如)、多柔比星(doxorubicin)(例如)、依达曲沙(edatrexate)(10-乙基-10-脱氮-氨基蝶呤)、表多柔比星(表柔比星(epirubicin))、雌莫司汀(estramustine)、依托泊苷(etoposide)、非那雄胺(finasteride)(例如)、氟脱氧尿苷(FUdR)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、氟他米特(flutamide)(例如)、吉西他滨(gemcitabine)(例如)、乙酸戈舍瑞林(goserelin acetate)(例如)、伊达比星(idarubicin)、异环磷酰胺(ifosfamide)、伊立替康(irinotecan)(CPT-11，例如)、左旋咪唑(levamisole)、亚叶酸、利阿唑(liarozole)、洛哌丁胺(loperamide)(例如)、美法仑(melphalan)、甲氨蝶呤(methotrexate)、甲基-氯乙基-环己基-亚硝基脲、米托蒽醌(mitoxantrone)(例如)、尼鲁米特(nilutamide)(例如)、亚硝基脲、奥沙利铂(oxaliplatin)、紫杉醇(paclitaxel)(例如)、培门冬酶(例如)、铂类似物、强的松(prednisone)(例如)、丙卡巴肼(procarbazine)(例如)、卟吩姆钠(porfimer sodium)(例如)、他莫西芬(tamoxifen)、替莫唑胺(temozolomide)、特拉唑嗪(terazosin)(例如)、拓扑替康(topotecan)(例如)、维甲酸(tretinoin)(例如)、长春新碱(vincristine)和酒石酸长春瑞滨(vinorelbine tartrate)(例如)。
在某些实施方案中，PapMV或PapMV ssRNA-VLP可与也具有免疫调节作用的化学治疗剂组合施用。在一些实施方案中，PapMV或PapMVssRNA-VLP可与也具有免疫调节作用的化学治疗剂组合施用，其中施用的化学治疗剂的剂量相比于通常在不存在PapMV或PapMV ssRNA-VLP的情况下会施用的剂量减少。例如，已知环磷酰胺展现取决于施用的剂量的免疫调节作用(Motoyoshi等人，2006，Oncology Reports，16：141-146)。因此，在某些实施方案中，预期PapMV或PapMV ssRNA-VLP与低剂量环磷酰胺组合使用以治疗癌症。在一些实施方案中也预期PapMV或PapMV ssRNA-VLP与低剂量的其它化学治疗剂组合使用。
本发明的某些实施方案涉及PapMV或PapMV ssRNA-VLP与放射疗法组合治疗癌症的方法和用途。在本上下文中，预期通过PapMV或PapMV ssRNA-VLP刺激先天性免疫系统可增强放射疗法的作用和/或有助于消除疗法后仍存在的任何肿瘤细胞。
本发明的某些实施方案涵盖使用PapMV或PapMV ssRNA-VLP增强已知组合疗法，例如化学治疗剂的组合、化学治疗剂和免疫治疗剂的组合、放射疗法与化学治疗剂的组合或放射疗法与免疫治疗剂的组合。在本领域内众所周知此类组合用于治疗不同阶段的特异性癌症。
本发明的一些实施方案涉及PapMV或PapMV ssRNA-VLP与放射疗法和另一种癌症治疗剂如化学治疗剂或免疫治疗剂组合的方法和用途。例如，已发现放射疗法和低剂量环磷酰胺的组合可用于治疗某些癌症，包括淋巴瘤，且可进一步与PapMV或PapMV ssRNA-VLP组合来增强此组合疗法的作用。
在某些实施方案中，涵盖PapMV或PapMV ssRNA-VLP与病毒疗法组合使用。溶瘤病毒疗法目前正发展为用于治疗癌症的靶向方法。若干基于溶瘤病毒的疗法正在进行临床试验且包括基于单纯疱疹病毒(HSV)、呼肠孤病毒、牛痘病毒(VV)、腺病毒、麻疹病毒和水泡性口炎病毒(VSV)的疗法。涵盖PapMV或PapMV ssRNA-VLP与病毒疗法的组合作为改善病毒疗法在减少肿瘤生长和/或转移方面的功效的方式。
首先可例如在动物模型中、通常在啮齿类动物、兔、狗、猪或灵长类动物中估计待施用的PapMV或PapMV ssRNA-VLP的量。还可使用动物模型确定适当浓度范围和施用途径。然后可使用此类信息确定在待治疗的患者中施用的有用剂量和途径。PapMV或PapMV ssRNA-VLP的示例性剂量包括约10μg到约10mg的蛋白质的剂量，例如约10μg到约5mg的蛋白质、约40μg到约5mg的蛋白质、约80μg到约5mg的蛋白质、约40μg到约2mg的蛋白质或约80μg到约2mg的蛋白质。
药物包和试剂盒
本发明的某些实施方案提供包含用于癌症疗法的PapMV或PapMVssRNA-VLP的药物包和试剂盒。当PapMV或PapMV ssRNA-VLP与另一种癌症治疗剂(例如化学治疗剂或免疫治疗剂)组合使用时，药物包或试剂盒可含有用于治疗癌症的包含PapMV或PapMV ssRNA-VLP和癌症治疗剂的治疗组合。
所述包或试剂盒的单个组分将被包装在单独容器中，并且此类容器附有通知，所述通知呈监管药物或生物产品的制造、使用或销售的政府机构规定的形式，该通知反映了该机构对制造、使用或销售的批准。试剂盒可任选地含有概括PapMV或PapMV ssRNA-VLP和另一种癌症治疗剂(当存在时)的使用方法或施用方案的说明书或指南。
所述包或试剂盒的组分中的一种或多种可任选地以干燥或冻干形式提供，且所述试剂盒可另外含有用于重构冻干组分的适宜溶剂。
在其中一种或多种组分是以溶液例如水溶液或无菌水溶液形式提供的那些实施方案中，所述容器器具本身可以是吸入器、注射器、移液器、滴眼器或其它此类装置，可将溶液从容器施用给受试者或施用到试剂盒中并与试剂盒的其它组分混合。
不管容器的数量或类型如何，本发明的试剂盒还可包括用于向患者辅助施用PapMV或PapMV ssRNA-VLP的仪器。该仪器可以是吸入器、鼻用喷雾装置、喷雾器、注射器、移液器、滴眼器或经医学批准的相似递送媒介物。
为了获得对本文所述的本发明的更好理解，陈述以下实施例。应理解，这些实施例意在描述本发明的说明性实施方案，而非意在以任何方式限制本发明的范围。
实施例
实施例1：PapMV ssRNA-VLP抑制肿瘤生长并加强树突细胞的体内抗癌作用
如国际专利申请公开第WO2012/155262号中所述制备该实施例中所用的包含ssRNA的PapMV VLP(PapMV ssRNA-VLP)(同样参见实施例2)。VLP的外壳蛋白为修饰的PapMV外壳蛋白PapMV CPsm(SEQ IDNO：5；参见图3)。
概述
疫苗接种是有前景的癌症疗法，尤其在此涉及负责将抗原呈递到淋巴细胞的树突细胞时更是如此(Banchereau和Palucka 2005，Nat RevImmunol，5(4)：296-306)。然而，该方法对于治疗肿瘤不完全有效。添加TLR7配体导致产生IFN-α，可有助于改善此类型疫苗产生的抗肿瘤应答。为TLR7的配体并且诱导产生IFN-α的PapMV ssRNA-VLP可充当免疫调节剂。已知PapMV ssRNA-VLP被树突细胞摄取并诱导细胞毒素细胞免疫应答。本研究的目的是表征在皮下模型以及肺转移模型中PapMVssRNA-VLP对针对鼠科动物黑素瘤B16-OVA的抗肿瘤应答的作用。作为本研究的结果，已确定用PapMV ssRNA-VLP进行肿瘤内免疫增加了因树突细胞免疫所致的肿瘤生长的延迟，且另外，在使树突细胞负载OVA之前注射时，PapMV ssRNA-VLP增加了肺部转移的减少。因此，PapMVssRNA-VLP具有在抗肿瘤应答中充当免疫调节剂的有前景的能力。
介绍
目前正在开发用于癌症疗法的疫苗是基于激活抗原呈递细胞、生成炎性环境以及增加肿瘤细胞的免疫原性。用树突细胞进行免疫导致一些、但不完全有效的肿瘤消退。诱导产生IFN-α的TLR7配体可用于增强树突细胞的作用。IFN-α参与树突细胞的成熟以及细胞毒素抗肿瘤应答的激活(Diamond等人，2011，J Exp Med，208(10)：1989-2003)。
PapMV ssRNA-VLP被树突细胞吞噬，在树突细胞中ssRNA被TLR7识别，从而导致产生IFN-α。然后这诱导保护性细胞毒素细胞介导的免疫。
材料和方法
表达OVA的B16小鼠黑素瘤细胞系(B16-OVA)和此细胞系的另一种表达荧光素酶的变体(B16-OVA-ofl)用于这些实验。
源自骨髓的树突细胞(BMDC)是在存在GM-CSF和IL-4的情况下孵育6天后由雄性小鼠的骨髓生成。然后用LPS刺激BMDC并使其负载OVA肽。
通过磷酸钙方法将含有oFL基因的质粒SRα转染到B16-OVA肿瘤细胞中。在可以目视检测B16-OVA-ofL肿瘤之前，可通过发光进行检测，从而允许跟踪肿瘤的皮下生长.
通过卡钳并通过腹膜内(i.p.)注射20ug荧光素测量体内肿瘤生长的动力学，随后使用体内成像系统(IVIS；PerkinElmer，Waltham，MA)进行分析。
通过输注PBS-2mM EDTA且然后通过FACS进行分析来实施肺中的免疫应答的分析。通过i.p.施用20μg眼镜蛇毒因子来实现小鼠中的补体耗竭。
使用BD LSRFortessaTM(BD Biosciences，San Jose，CA)实施流式细胞术，并使用FlowJo软件(FlowJo，LLC，Ashland，OR)分析数据。
皮下肿瘤模型
对于局部肿瘤生长模型来说，对1x105个或5x105个B16-OVA细胞进行皮下(s.c.)注射。注射后约7天，肿瘤开始可见。在肿瘤细胞接种后的第7天和/或第12天施用治疗。在接种后的第16天通过流式细胞术分析免疫应答。
所测试的治疗为：
-100μg PapMV ssRNA-VLP静脉内(i.v.)
-100μg PapMV ssRNA-VLP肿瘤内(i.t.)
-100μg PapMV ssRNA-VLP i.t.与6h后在相对侧中1.25x 106个负载有OVA的源自骨髓的树突细胞(BMDC-OVA)s.c.。
将这些治疗与以下对照相比较：
-100μl PBS i.v.
-100μl PBS i.t.
-100μl PBS+6h后1.25x 106个BMDC-OVA。
转移模型
对于肺中的转移的诱导来说，i.v.注射5x 105个B16-OVA或B16-OVA-ofl。在肿瘤细胞接种后的第7天施用治疗。在接种后的第14天通过流式细胞术分析免疫应答。
所测试的治疗为：
-100μg PapMV ssRNA-VLPs i.v.
-100μg PapMV ssRNA-VLPs i.v.与6h后1.25x 106个BMDC-OVA i.v.
将这些治疗与对照相比较：
-100μl PBS i.v.
-100μl PBS i.v.+6h后1.25x 106个BMDC-OVA i.v.
结果和讨论
PapMV ssRNA-VLP在针对皮下黑素瘤的抗肿瘤应答中的作用
结果示于图4-8中。
在免疫后(p.i.)6h用PapMV ssRNA-VLP进行的肿瘤内(i.t.)免疫诱导产生IFN-α(图4A、B)。Luminex验证另外的细胞因子的产生。
当在肿瘤细胞接种后的第12天注射i.t.PapMV ssRNA-VLP时，24h后观察到免疫细胞(CD45+)浸润到肿瘤中的量增加(图4C、D)。不同类型的免疫细胞的比例似乎并不随治疗而改变。
在第7天和第12天静脉内注射PapMV ssRNA-VLP对肿瘤生长动力学没有明显作用。然而，i.t.注射PapMV ssRNA-VLP降低B16-OVA的生长速率并增加OVA特异性CD8+T细胞的比例(图8)。
用负载有OVA的树突细胞进行的皮下(s.c.)免疫生成CD8+OVA特异性T淋巴细胞，从而导致抑制肿瘤生长(图5)。PapMV ssRNA-VLP还增加了BMDC-OVA治疗的治疗作用(减缓生长动力学并增加OVA特异性CD8+T细胞的比例)(图6A-C)。最后，这些状况中的补体耗竭并没有增加PapMV治疗的有益作用(图6D)。
PapMV在针对肺部转移的抗肿瘤应答中的作用
结果示于图7和8中。
在第7天静脉内注射PapMV ssRNA-VLP并没有诱导在肺、淋巴节或脾中产生OVA特异性CD8+T细胞(图7)。补体耗竭没有改变这个结果。然而，在BMDC-OVA免疫前6h i.v.注射PapMV ssRNA-VLP增加了肺和脾中的OVA特异性CD8+T细胞的比例，并且在添加荧光素后减少肺匀浆产生的发光，由此表明活肿瘤细胞数减少(图8)。
总结
本研究证明单独的PapMV ssRNA-VLP对皮肤黑素瘤肿瘤的肿瘤生长有作用。当与用负载有OVA的树突细胞进行的免疫组合时，PapMVssRNA-VLP改善抗肿瘤应答优于单独的树突细胞。虽然在肺部转移的模型中，单独的PapMV ssRNA-VLP没有显示任何作用，但用负载有OVA的树突细胞进行的免疫的抗肿瘤作用因施用PapMV ssRNA-VLP而得到显著改善。PapMV ssRNA-VLP的鼻内免疫可通过促进PapMVssRNA-VLP分配到肺中而有助于进一步改善这些结果。
实施例2：用于制备PapMV ssRNA-VLP的示例性方法
重组外壳蛋白(rCP)的产生
简单地说，将携有6x His标签的PapMV CP(SEQ ID NO：5；参见图3(B))克隆到侧接有限制性酶NcoI和BamHI并在T5启动子的控制下的pQE80载体(QIAGEN)中。用质粒转化大肠杆菌BD-792并使其在标准培养基中生长。通过将IPTG(0.7-1mM IPTG，持续6-9h，在22-25℃下)添加到培养基中来诱导蛋白质表达。在诱导期结束时，收获细胞，将其悬浮于裂解缓冲液(10mM Tris pH 8.0，500mM NaCl)中，并使用弗氏压碎器(French press)、匀化器或超声仪进行机械破裂。通过标准DNA酶处理去除基因组DNA并通过离心或切向流过滤(300kDa至0.45μm MWCO膜)去除大细胞片段和膜来使细胞裂解物澄清。将rCP捕获在离子基质亲和树脂上并使用标准程序用咪唑进行洗脱。可用250mM到1M咪唑洗脱PapMV外壳蛋白。还可以使用pH梯度来实现洗脱。随后通过阳离子交换色谱/过滤从内毒素并通过切向流过滤(0至30kDa MWCO膜)从小的低MW分子纯化rCP。通过透析或切向流过滤(5至30kDa MWCO膜)去除rCP溶液中存在的任何污染性咪唑。通过过滤对最终的rCP蛋白质溶液进行灭菌。
ssRNA模板(SRT)的产生
编码SRT的DNA的序列提供于图1中[SEQ ID NO：1]。SRT是基于PapMV的基因组并且在5′末端携有PapMV外壳蛋白成核信号(在图1中方框内)。其余核苷酸序列是多突变的，这是因为所有ATG密码子已经突变为TAA终止密码子。所述序列的前16个核苷酸(在图1中加下划线)包含位于pBluescript表达载体内的T7转录起始位点并且存在于RNA转录物内。五聚体重复序列在图1中加下划线。整个转录物为1522个核苷酸长。
使用标准程序将与SRT相对应的DNA插入到包含原核RNA聚合酶启动子的DNA质粒中。使用重组质粒转化大肠杆菌细胞，且随后使转化的细菌在标准培养基中生长。回收质粒DNA并通过标准技术从细胞培养物进行纯化，然后通过在DNA序列中紧接着SRT序列的最后一个核苷酸的点处用限制性酶MluI切割来线性化。
使用RiboMAXTM试剂盒(Promega，USA)遵循制造商的推荐方案用T7RNA聚合酶实施SRT的转录。设计表达载体，以使得自RNA聚合酶启动子起的转录物在DNA切割点处从DNA模板释放。纯化SRT以通过使用100kDa MWCO膜的切向流过滤去除DNA、蛋白质和游离核苷酸。通过过滤对最终的RNA溶液进行灭菌。
rVLP的产生
通过组合rCP和SRT来体外组装rVLP。在中性缓冲溶液(10mMTris-HCl pH 8)中并使用15-30mg的蛋白质对应1mg RNA的蛋白质∶RNA比率实施组装反应。将新组装的rVLP与少量RNA酶(0.0001μgRNA酶/μg RNA)一起孵育以去除从rVLP产生的任何RNA。然后通过渗滤使用10-100kDa MWCO膜从污染物和游离rCP(未组装的单体rCP)纯化钝化的rVLP。通过过滤对最终的rVLP液体悬浮液进行灭菌。
实施例3：通过各种途径施用PapMV ssRNA-VLP来刺激先天性免疫系统
鼻内施用
用60μg PapMV ssRNA-VLP或用对照缓冲液(10mM Tris HCl pH 8)对小鼠(每组5只)进行鼻内治疗一次或两次(间隔7天)。在治疗后6小时实施气管肺泡灌洗(BAL)并使用Luminex技术(Milliplex小鼠细胞因子预混合32重免疫测定试剂盒(Milliplex Mouse cytokine premixed 32-pleximmunoassay kit)；Millipore)筛选是否存在细胞因子。
结果示于图10(A)-(R)中。两种治疗方案均诱导细胞因子和趋化因子产生，其中2种治疗比一种更有效。
静脉内施用
用100μg PapMV ssRNA-VLP或100μg PBS对两组C57BL/6小鼠以及TLR-7敲除(KO)和MYD88KO小鼠(每组4只小鼠)进行i.v.免疫。一组C57BL/6小鼠在PapMV ssRNA-VLP免疫之前48h和24h时先通过i.p.注射500μg的抗BST2抗体(mAb 927)来治疗。在免疫后6h、12h、24h和48h时(图11A)或在免疫后6h时(图11B)通过ELISA(VeriKineTM小鼠干扰素αELISA试剂盒(VerilkineTM Mouse Interferon Alpha ELISAKit)；PBL InterferonSource)监测血清和脾中的IFN-α产生。
结果示于图11中，并且说明当静脉内施用时PapMV ssRNA-VLP可有效刺激IFN-α产生且此刺激依赖于MYD88、TLR7和BST2+细胞。
腹膜内施用
实验1：向Balb/C小鼠i.p.注射含有Tris-HCl缓冲液10mM pH 8.0、15μg咪喹莫特或100μg的PapMV ssRNA-VLP的200μL的体积。注射后6小时，通过外科手术收集动物的脾并进行裂解。对裂解物进行过滤并离心。通过LUMINEX分析上清液中是否存在(i)细胞因子：IFN-γ(IFN-g)、IL-6、TNF-α(TNF-a)、(ii)角化细胞化学引诱物(KC)和(iii)趋化因子MIP-1α(MIP-1a)。结果示于图12中。
还在外科手术期间从各动物提取脾时收集血液，并且还通过LUMINEX分析血清中是否存在细胞因子和趋化因子。结果示于图13中。
实验2：向Balb/C小鼠(每组2只)i.p.注射含有Tris-HCl缓冲液10mMpH 8.0、15μg咪喹莫特或100μg的PapMV ssRNA-VLP的200μL的体积。注射后4小时、5小时或6小时，通过外科手术收集动物的脾并进行裂解。对裂解物进行过滤并离心。通过LUMINEX分析上清液中是否存在干扰素-α(IFN-a)。结果示于图14(A)中。
使用针对实验1所述的相似方案，i.p.注射Tris-HCl pH8 10mM、15μg咪喹莫特或100μg PapMV ssRNA-VLP后6小时收集血清并分析是否存在干扰素-α(IFN-a)。结果示于图14(B)中。
实验3：为验证以上实验1和2的结果，使用在“工程改造过程(engineering run)”中产生的PapMV ssRNA-VLP(命名为“ENG”)、与聚CRNA而非ssRNA自组装的PapMV VLP、“lot 5715PapMV VLP”、CpG(50μg)和通过在60℃下加热30min进行变性的PapMVssRNA-VLP(“Dénat”)实施第三个实验。聚C RNA-VLP、“lot 5715PapMVVLP”和变性的ssRNA-VLP是归为阴性对照。已知聚C RNA-VLP只有较弱的佐剂性质。“Lot 5715PapMV VLP”是在产生期间被氧化而导致异常自组装的VLP，其中所得VLP极短并展现非常差的免疫原性和佐剂活性。已知ssRNA-VLP的热处理破坏了颗粒的结构，颗粒结构对于其免疫调节作用很重要。结果示于图14(C)和(D)中。
总之，该实施例中的实验证明可通过i.n、i.v.和i.p.注射PapMVssRNA-VLP有效触发先天性免疫。图10显示通过PapMV ssRNA-VLP的鼻内免疫可早在注射后6小时时就在肺中触发先天性免疫，并且诱导若干细胞因子和趋化因子，包括MIP-1a、TNF-a、IL-6和KC。图11显示PapMV ssRNA-VLP能够通过i.v.注射触发先天性免疫。使用该免疫途径，在注射后6小时可在免疫动物的脾和血清中检测到IFN-a的分泌。图12-14显示i.p.施用的PapMV ssRNA-VLP早在注射后5小时时就有效地触发先天性免疫应答。
预测PapMV ssRNA-VLP的抗癌活性归因于其触发先天性免疫的能力。基于以上结果，预期可使用i.n.、i.p.和i.v.免疫途径诱导罹患癌症的患者中的先天性免疫。这进而将改善针对癌症细胞的免疫应答并使患者的疾病状态得以改善。
实施例4：PapMV ssRNA-VLP在体内抑制肿瘤生长并加强树突细胞的抗癌作用#2
重复实施例1中所述的研究PapMV ssRNA-VLP在针对皮下黑素瘤的抗肿瘤应答中的作用的实验，其中具有以下修改。将5x 105个B16-OVA细胞皮下(s.c.)注射到小鼠中。在肿瘤细胞接种后的第7天、第12天和第17天施用治疗。在第二次PapMV ssRNA-VLP注射后6h对一些小鼠实施安乐死用于细胞因子和趋化因子分析。在肿瘤接种后的第15天或第16天对其它小鼠实施安乐死用于通过流式细胞术进行免疫应答分析。最后，为了监测肿瘤生长和存活，在肿瘤达到17mm的直径时，对小鼠实施安乐死。
结果示于图15和16中并证实单独的PapMV ssRNA-VLP的肿瘤内施用降低了B16-OVA的生长速率(图15A)。另外，观测到该治疗增加了小鼠的存活率(图15B)。当在肿瘤细胞接种后的第7天和第12天i.t.注射PapMV ssRNA-VLP时，观测到在第15天免疫细胞(CD45+)浸润到肿瘤中的量增加(图15F)。另外，不同类型的免疫细胞的比例似乎因治疗而变化。具体地说，观测到CD8+T细胞的比例增加且源自骨髓的抑制性细胞(MDSC)的比例降低(图15G、H)。也观测到肿瘤特异性CD8+T细胞的比例更高(图15I-K)。
PapMV ssRNA-VLP还增加了BMDC-OVA治疗的治疗作用以及小鼠的存活率(图16)。这些状况中的补体耗竭(20μg眼镜蛇毒因子，i.p.)并没有增加PapMV ssRNA-VLP治疗的有益作用。
实施例5：PapMV ssRNA-VLP与高剂量环磷酰胺组合对肿瘤生长的作用
使用PapMV ssRNA-VLP(i.v.施用)与250mg/mL环磷酰胺(CTX)的组合实施的初步实验证明所述组合与单独的CTX之间作用没有任何差异。使用较低剂量的CTX(100mg/kg)实施随后的两个实验。该剂量仍普遍被认为是高剂量CTX(参见例如Veltman等人，2010，J.BiomedicineBiotechnol.，文章编号798467)。
实验1
设计：在第0天向4组10只雌性C57BL6小鼠(6-8周龄)注射6x 105个于PBS中的B16黑素瘤细胞。在第9天，向一半小鼠IV注射100μgPapMV ssRNA-VLP并向另一半小鼠注射200μL Tris-HCL 10mM。在第11天，测量肿瘤，并且向一半小鼠腹膜内注射2mg(100mg/kg)的环磷酰胺(CTX)并向另一半小鼠注射200μL的磷酸盐缓冲盐水。此后每隔一天测量肿瘤。在肿瘤注射后的第14天和第18天，向接受CTX的一组和接受PBS的一组静脉内施用100μg PapMV ssRNA-VLP。其它小鼠接受Tris-HCL 10mM作为对照。在第25天终止该方案。
结果：结果示于图17A中。正如预期的，单独的PapMV ssRNA-VLP的静脉内施用相比于缓冲液对照并未减缓或加速肿瘤生长。与CTX组合IV施用的PapMV ssRNA-VLP的有效性低于单独的CTX。
实验2
设计：在第9天向4组10只雌性C57BL6小鼠(6-8周龄)注射6x 105个于PBS中的B16黑素瘤细胞。在第0天，测量肿瘤，并且向一半小鼠腹膜内注射2mg(100mg/kg)的环磷酰胺(CTX)并向另一半小鼠注射200μL的磷酸盐缓冲盐水(PBS)。此后每隔一天测量肿瘤。在CTX治疗后的第2天、第7天和第12天，向接受CTX的一组和接受PBS的一组肿瘤内(IT)注射100μg PapMV ssRNA-VLP。其它小鼠接受Tris-HCL 10mM作为对照。
结果：结果示于图17B中。IT施用的PapMV ssRNA-VLP显示相比于缓冲液对照肿瘤生长更缓慢的趋势。高剂量CTX与PapMVssRNA-VLP的组合进一步改善这一作用。另一方面，用单独的CTX治疗的组显示非常缓慢的肿瘤生长。这可能部分地归因于在治疗开始时CTX组中的肿瘤相比于CTX+PapMV ssRNA-VLP组的肿瘤更小的事实。本实验证实在肿瘤内部递送的PapMV ssRNA-VLP具有一些作用并且该作用可通过与化学疗法组合得到改善。
以上两个实验均说明PapMV ssRNA-VLP与高剂量CTX的组合没有引起优于单独的CTX的抗肿瘤作用的改善。这个结果并不意外，这是因为高剂量CTX对治疗动物中的T细胞亚群的已知作用(参见例如Motoyoshi等人，2006，见上文)通常会损害免疫系统的功效，从而影响PapMV ssRNA-VLP在增加抗肿瘤应答方面的功效。
预期PapMV ssRNA-VLP与低剂量CTX(即小于100mg/kg)的组合将显示在低剂量CTX的抗肿瘤作用方面的改善，低剂量CTX对T细胞群体的影响小得多。具体地说，已证明小鼠中10mg/kg的剂量的CTX有效地刺激细胞介导的免疫(Otterness和Chang，1976，Clin.Exp.Immunol.，26：346-354)且因此可能有用。也预期PapMV ssRNA-VLP与具有不同于环磷酰胺的作用机制的其它化学治疗剂的组合与PapMV IT更好地协同作用来阻抑肿瘤生长。
本说明书中所引用的所有专利、专利申请、出版物和数据库条目的公开内容在此通过引用整体明确地并入，其程度如同明确地且单独地指出将每一此类专利、专利申请、出版物和数据库条目通过引用并入一般。
虽然已参照某些特定的实施方案描述了本发明，但其各种修改将为本领域技术人员显而易见且并不背离本发明的精神和范围。如本领域技术人员将显而易见的所有此类修改意在包括在所附权利要求的范围内。
Claims (54)
1.一种组合物，其包含番木瓜花叶病毒(PapMV)或含有ssRNA的PapMV病毒样颗粒(VLP)，其用于治疗有此需要的受试者的癌症。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物用于肿瘤内施用。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述组合物用于与另一种癌症疗法组合使用。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中所述治疗包括抑制所述癌症的生长。
5.根据权利要求3所述的组合物，其中所述治疗包括抑制所述癌症的转移。
6.根据权利要求3或5所述的组合物，其中所述癌症疗法包括放射疗法、化学疗法和免疫疗法中的一种或多种。
7.根据权利要求3或5所述的组合物，其中所述组合物用于与免疫治疗剂组合使用。
8.根据权利要求7所述的组合物，其中所述免疫治疗剂是基于细胞的癌症免疫治疗剂。
9.根据权利要求8所述的组合物，其中所述基于细胞的癌症免疫治疗剂是基于树突细胞的免疫治疗剂。
10.一种组合物，其包含番木瓜花叶病毒(PapMV)或含有ssRNA的PapMV病毒样颗粒(VLP)，其用于在有此需要的受试者的癌症的治疗中改善癌症免疫疗法。
11.根据权利要求10所述的组合物，其中所述组合物用于在施用所述癌症免疫疗法之前向所述受试者施用。
12.根据权利要求10或11所述的组合物，其中所述癌症免疫疗法包括负载有癌症特异性抗原的树突细胞。
13.根据权利要求10至12中任一项所述的组合物，其中所述治疗包括抑制所述癌症的生长。
14.根据权利要求10至13中任一项所述的组合物，其中所述治疗包括抑制所述癌症的转移。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含所述PapMV VLP。
16.一种组合物，其包含含有ssRNA的番木瓜花叶病毒(PapMV)病毒样颗粒(VLP)，其用于治疗有此需要的受试者的癌症，其中所述组合物用于肿瘤内施用且其中所述组合物抑制所述癌症的生长。
17.一种组合物，其包含含有ssRNA的番木瓜花叶病毒(PapMV)病毒样颗粒(VLP)，其用于在有此需要的受试者的癌症的治疗中改善基于树突细胞的免疫疗法。
18.根据权利要求17所述的组合物，其中所述组合物用于在施用所述基于树突细胞的免疫疗法之前向所述受试者施用。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的组合物，其中所述癌症是实体瘤。
20.根据权利要求1至15中任一项所述的组合物，其中所述癌症是膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、肾癌、肺癌、前列腺癌、白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤或黑素瘤。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的组合物，其中所述PapMVVLP所包含的所述ssRNA长约50个核苷酸到约5000个核苷酸。
22.根据权利要求1至20中任一项所述的组合物，其中所述PapMVVLP所包含的所述ssRNA长约1000个到约3000个核苷酸。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的组合物，其中所述PapMVVLP所包含的所述ssRNA是合成的ssRNA。
24.根据权利要求23所述的组合物，其中所述合成的ssRNA不包含任何AUG密码子。
25.根据权利要求23或24所述的组合物，其中所述合成的ssRNA包含对应于SEQ ID NO：1的核苷酸17至54的序列。
26.根据权利要求23或24所述的组合物，其中所述合成的ssRNA包含对应于SEQ ID NO：1或6中所示的核酸序列的序列或其片段。
27.根据权利要求1至26中任一项所述的组合物，其中所述受试者是人。
28.一种治疗受试者的癌症的方法，其包括向所述受试者施用有效量的包含番木瓜花叶病毒(PapMV)或含有ssRNA的PapMV病毒样颗粒(VLP)的组合物。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述组合物经肿瘤内施用。
30.根据权利要求28或29所述的方法，其中所述组合物与另一种癌症疗法组合施用。
31.根据权利要求28至30中任一项所述的方法，其中所述治疗包括抑制所述癌症的生长。
32.根据权利要求30所述的方法，其中所述治疗包括抑制所述癌症的转移。
33.根据权利要求30或32所述的方法，其中所述癌症疗法包括放射疗法、化学疗法和免疫疗法中的一种或多种。
34.根据权利要求30或32所述的组合物，其中所述组合物与免疫治疗剂组合施用。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述免疫治疗剂是基于细胞的癌症免疫治疗剂。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述基于细胞的癌症免疫治疗剂是基于树突细胞的免疫治疗剂。
37.一种在治疗受试者的癌症中改善癌症免疫疗法的方法，其包括向所述受试者施用有效量的包含番木瓜花叶病毒(PapMV)或含有ssRNA的PapMV病毒样颗粒(VLP)的组合物。
38.根据权利要求37所述的方法，其中在施用所述癌症免疫疗法之前向所述受试者施用所述组合物。
39.根据权利要求37或38所述的方法，其中所述癌症免疫疗法包括负载有癌症特异性抗原的树突细胞。
40.根据权利要求37至39中任一项所述的方法，其中所述治疗包括抑制所述癌症的生长。
41.根据权利要求37至39中任一项所述的方法，其中所述治疗包括抑制所述癌症的转移。
42.根据权利要求28至41中任一项所述的方法，其中所述组合物包含所述PapMV VLP。
43.一种治疗受试者的癌症的方法，其包括向所述受试者施用有效量的包含含有ssRNA的番木瓜花叶病毒(PapMV)病毒样颗粒(VLP)的组合物，其中经肿瘤内施用所述组合物且其中所述组合物抑制所述癌症的生长。
44.一种在治疗受试者的癌症中改善基于树突细胞的免疫疗法的方法，其包括向所述受试者施用有效量的包含含有ssRNA的番木瓜花叶病毒(PapMV)病毒样颗粒(VLP)的组合物。
45.根据权利要求44所述的方法，其中在施用所述基于树突细胞的免疫疗法之前向所述受试者施用所述组合物。
46.根据权利要求28至45中任一项所述的方法，其中所述癌症是实体瘤。
47.根据权利要求28至45中任一项所述的方法，其中所述癌症是膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、肾癌、肺癌、前列腺癌、白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤或黑素瘤。
48.根据权利要求28至47中任一项所述的方法，其中所述PapMVVLP所包含的所述ssRNA长约50个核苷酸到约5000个核苷酸。
49.根据权利要求28至47中任一项所述的方法，其中所述PapMVVLP所包含的所述ssRNA长约1000个到约3000个核苷酸。
50.根据权利要求28至49中任一项所述的方法，其中所述PapMVVLP所包含的所述ssRNA是合成的ssRNA。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述合成的ssRNA不包含任何AUG密码子。
52.根据权利要求50或51所述的方法，其中所述合成的ssRNA包含对应于SEQ ID NO：1的核苷酸17至54的序列。
53.根据权利要求50或51所述的方法，其中所述合成的ssRNA包含对应于SEQ ID NO：1或6中所示的核酸序列的序列或其片段。
54.根据权利要求29至53中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
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