ES2877160T3

ES2877160T3 - Formulación para administración de ARN

Info

Publication number: ES2877160T3
Application number: ES17743293T
Authority: ES
Inventors: Ugur Sahin; Heinrich Haas; Annette Vogel; Daniel Zucker; Stephanie Erbar; Kerstin Reuter; Anne Schlegel; Sebastian Hörner; Sebastian Kreiter; Mustafa Diken; Herrero Jorge Moreno
Original assignee: TRON Translationale Onkologie an der Universitaetsmedizin der Johannes Gutenberg Universitaet Mainz gGmbH; Biontech SE
Current assignee: TRON Translationale Onkologie an der Universitaetsmedizin der Johannes Gutenberg Universitaet Mainz gGmbH; Biontech SE
Priority date: 2016-07-15
Filing date: 2017-07-14
Publication date: 2021-11-16
Anticipated expiration: 2037-07-14
Also published as: BR112018077163A2; BR112018077163A8; US20190321458A1; MX2019000381A; JP2022174191A; US11318195B2; JP7139307B2; EP3881827A1; AU2017297822B2; EP3484445A1; WO2018010815A1; WO2018011406A1; AU2017297822A1; CN109562059A; JP2019527685A; EP3484445B1; CA3027148A1; KR102432434B1; RU2019103434A3; RU2019103434A

Abstract

Una composición que comprende: (a) ARN monocatenario; y (b) polietilenimina, en la que el ARN monocatenario y la polietilenimina están presentes en partículas de poliplex y en la que la proporción molar del número de átomos de nitrógeno (N) en la polietilenimina con respecto al número de átomos de fósforo (P) en el ARN monocatenario (Proporción de N:P) es de 2.0 a 15.0; para su uso como una composición farmacéutica y en la que el uso comprende la administración de la composición a células musculares o tejido muscular, preferiblemente mediante inyección intramuscular en el tejido muscular.

Description

DESCRIPCIÓN

Formulación para administración de ARN

Campo técnico

La presente enseñanza se refiere a composiciones que comprenden formulaciones de poliplex para el suministro de ARN a un órgano diana o una célula diana después de la administración parenteral, en particular después de la administración intramuscular. Más precisamente, la presente enseñanza se refiere a formulaciones para la administración de ARN tales como ARN autorreplicante, en particular mediante inyección intramuscular. Más detalladamente, las partículas de poliplex comprenden ARN monocatenario, preferiblemente ARN autorreplicante o autoamplificador, y una polialquilenimina. El ARN puede codificar una proteína de interés, tal como una proteína farmacéuticamente activa. El ARN es absorbido por la célula y el ARN se traduce preferiblemente en un péptido o proteína, que puede exhibir su actividad fisiológica. Las composiciones de la enseñanza son aplicables para inducir o potenciar una respuesta inmune. También son útiles en un tratamiento profiláctico y/o terapéutico de una enfermedad que implica un antígeno tal como una proteína. Además, la presente enseñanza se refiere a métodos para producir composiciones estables que comprenden formulaciones de poliplex de ARN, comprendiendo dichas formulaciones de poliplex de ARN, ARN monocatenario y una polialquilenimina. Las formulaciones de partículas de poliplex de ARN divulgadas en el presente documento pueden congelarse y descongelarse o deshidratarse y rehidratarse sin pérdida de la calidad del producto y, en particular, sin pérdida sustancial de la actividad del ARN. En particular, las formulaciones de partículas de poliplex de ARN divulgadas en el presente documento pueden congelarse o deshidratarse mediante liofilización, secado por aspersión o métodos relacionados, lo que permite obtener una vida útil prolongada de los productos con respecto al almacenamiento de líquidos. Además, las formulaciones de partículas de poliplex de ARN divulgadas en este documento pueden cumplir con los requisitos para productos farmacéuticos, refiriéndose más específicamente a los requisitos para la fabricación GMP y los requisitos para la calidad de los productos farmacéuticos para aplicación parenteral. Las formulaciones de poliplex de ARN divulgadas en el presente documento son particularmente útiles para la vacunación de seres humanos o animales, por ejemplo, contra enfermedades infecciosas.

Cualquier materia o enseñanza divulgada no forma parte de la invención. La invención está definida únicamente por las reivindicaciones.

Antecedentes

La introducción de ácidos nucleicos extraños que codifican uno o más polipéptidos con fines profilácticos y terapéuticos ha sido un objetivo de la investigación biomédica durante muchos años. Los enfoques de la técnica anterior comparten la administración de una molécula de ácido nucleico a una célula u organismo diana, pero difieren en el tipo de molécula de ácido nucleico y/o sistema de administración: influenciado por preocupaciones de seguridad asociadas con el uso de moléculas de ácido desoxirribonucleico (ADN), las moléculas de ácido ribonucleico (ARN) han recibido una atención creciente en los últimos años. Se han propuesto varios enfoques, incluida la administración de ARN monocatenario o bicatenario, en forma de ARN desnudo o en forma complejada o empaquetada, por ejemplo, en vehículos de administración no virales o virales. En virus y en vehículos de administración viral, el ácido nucleico está típicamente encapsulado por proteínas y/o lípidos (partículas de virus). Por ejemplo, se han propuesto partículas de virus de ARN modificadas derivadas de virus de ARN como vehículo de administración para el tratamiento de plantas (documento WO 2000/053780 A2) o para la vacunación de mamíferos (Tubulekas et al., 1997, Gene, vol. 190, páginas 191-195). En vista de las preocupaciones de seguridad, la comunidad médica y veterinaria es reacia a administrar partículas de virus de ARN a humanos o animales. Los vehículos de administración no virales que podrían ser aplicables al ARN se han investigado extensamente para el desarrollo de terapias basadas en la administración de genes. Sin embargo, por diversas razones, la traducción de enfoques de administración de genes no virales a la práctica clínica no ha tenido mucho éxito. Las razones pueden estar asociadas con niveles insatisfactorios de expresión génica, problemas tecnológicos y regulatorios relacionados con el desarrollo farmacéutico de productos tan complejos y razones de seguridad.

Por lo tanto, existe la necesidad de productos farmacéuticos para el suministro seguro y eficaz de ARN que codifica una proteína con un valor terapéutico, tal como una vacuna, en pacientes y animales. Como se divulga en el presente documento, los aspectos y realizaciones de la presente enseñanza abordan esta necesidad.

Resumen

Las estrategias inmunoterapéuticas representan opciones prometedoras para la prevención y terapia de por ejemplo, enfermedades infecciosas y enfermedades cancerosas. La identificación de un número creciente de antígenos asociados a patógenos y tumores condujo a una amplia colección de dianas adecuadas para la inmunoterapia. La presente enseñanza abarca agentes y métodos mejorados adecuados para la expresión eficaz de antígenos, adecuados para el tratamiento inmunoterapéutico para la prevención y terapia de enfermedades.

El alcance de la protección está definido únicamente por las reivindicaciones. Las enseñanzas o el material divulgado no forman parte de la invención.

En un aspecto, la enseñanza se refiere a una composición que comprende:

(a) ARN monocatenario; y

(b) polialquilenimina

para uso como producto farmacéutico.

Se divulga en este documento, pero no es parte de la invención, la relación molar del número de átomos de nitrógeno (N) en la polialquilenimina con respecto al número de átomos de fósforo (P) en el ARN monocatenario (relación N: P) es 1.0 a 30, preferiblemente 2.0 a 15.0, más preferiblemente 6.0 a 12.0.

La divulgación se refiere a una composición que comprende:

(a) ARN monocatenario; y

(b) polialquilenimina

en la que la relación molar del número de átomos de nitrógeno (N) en la polialquilenimina con respecto al número de átomos de fósforo (P) en el ARN monocatenario (relación N: P) es de 1.0 a 30.0, preferiblemente de 2.0 a 15.0, más preferiblemente 6.0 a 12.0.

Se divulga en este documento, pero no forma parte de la invención, que la fuerza iónica de la composición es 50 mM o menos, preferiblemente en la que la concentración de iones monovalentes cargados positivamente es 25 mM o menos y la concentración de iones catiónicos divalentes libre cargados positivamente es de 20 pM o menos.

La divulgación adicional se refiere a una composición que comprende:

(a) ARN monocatenario; y

(b) polialquilenimina

en la que la fuerza iónica es 50 mM o menos.

En una realización, la concentración de iones monovalentes cargados positivamente es 25 mM o menos y la concentración de iones catiónicos divalentes cargados positivamente es 20 pM o menos.

En una realización de todos los aspectos de la enseñanza, la composición es para administración intramuscular tal como por inyección intramuscular.

En una realización de todos los aspectos de la enseñanza, el ARN monocatenario y la polialquilenimina están presentes en partículas de poliplex.

La polialquilenimina de la divulgación comprende la siguiente fórmula general (I):

en la que

R es H, un grupo acilo o un grupo que comprende la siguiente fórmula general (II):

en la que R1 es H o un grupo que comprende la siguiente fórmula general (111):

n, m y I se seleccionan independientemente de números enteros de 2 a 10; y

p, q y r son números enteros, en los que la suma de p, q y r es tal que el peso molecular promedio del polímero es de 1.5 x 102 a 107 Da, preferiblemente de 5000 a 105 Da, más preferiblemente 10000 a 40000 Da, más preferiblemente 15000 a 30000 Da, incluso más preferiblemente 20000 a 25000 Da.

Se divulga que n, m y I se seleccionan independientemente de 2, 3, 4 y 5, preferiblemente de 2 y 3. En una realización, R1 es H. En una realización, R es H o un grupo acilo.

Se divulga que la polialquilenimina comprende polietilenimina y/o polipropilenimina, preferiblemente polietilenimina.

Se divulga adicionalmente en el presente documento que al menos el 92% de los átomos de N en la polialquilenimina son protonables.

La composición de la enseñanza comprende uno o más aditivos. En una realización, el uno o más aditivos se seleccionan del grupo que consiste en sustancias tamponantes, sacáridos, estabilizadores, crioprotectores, lioprotectores y agentes quelantes. En una realización de todos los aspectos de la enseñanza, la composición de la enseñanza comprende uno o más polímeros. En una realización, las sustancias tampón comprenden al menos una seleccionada del grupo que consiste en ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetanosulfónico (HEPES), ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES), ácido 3-morfolino- 2-hidroxipropanosulfónico (MOPSO), sistemas de tamponamiento de ácido acético y análogos, sistemas de tamponamiento de ácido fosfático o sistemas de tamponamiento de ácido cítrico. La composición de la divulgación comprende tampones para tamponar en el intervalo de pH entre 4 y 8, preferiblemente entre 5 y 7.5. Ejemplos de tales sistemas tampón son tampones de acetato o tampones HEPES o tampones de fosfato o tampones de ácido acético. En una realización, los sacáridos comprenden al menos uno seleccionado del grupo que consiste en monosacáridos, disacáridos, trisacáridos, oligosacáridos y polisacáridos, preferiblemente de glucosa, trehalosa, sacarosa y dextrano. El aditivo de la divulgación es un dextrano con una masa molar media entre 1 kDa y 100 kDa. Los crioprotectores comprenden al menos uno seleccionado del grupo que consiste en glicoles, tales como etilenglicol, propilenglicol y glicerol. El agente quelante comprende EDTA. En una realización, los lípidos comprenden al menos uno seleccionado del grupo que consiste en lípidos catiónicos, lípidos neutros y lípidos aniónicos. La divulgación comprende uno o más copolímeros de bloques que comprenden bloques de construcción de óxido de etileno y óxido de propileno. La composición de la divulgación comprende copolímeros que comprenden grupos etilendiamina. En una realización, la composición de la divulgación comprende un copolímero de bloques anfifílicos, preferiblemente que comprende bloques de construcción de óxido de etileno y óxido de propileno, que opcionalmente también comprenden grupos etilendiamina.

La composición comprende glucosa tamponada con HEPES (HBG o HBGx1), glucosa tamponada con MES (MBG o MBGx1) o trehalosa tamponada con HEPES (HBT o HBTx1). Se divulga que la composición comprende glucosa o trehalosa o sacarosa en un tampón de ácido acético con una concentración en el intervalo de 0.1 mM a 10 mM. En una realización de todos los aspectos de la enseñanza, la composición comprende glucosa o trehalosa o sacarosa en un tampón de fosfato con una concentración en el intervalo de 0.1 mM a 10 mM.

El tamaño promedio z de las partículas es menor de 200 nm, preferiblemente menor de 150 nm y más preferiblemente menor de 100 nm. En una realización, el tamaño promedio z de las partículas está entre 50 nm y 200 nm. El potencial zeta de las partículas es de 20 mV o más, preferiblemente de 25 a 40 mV. La movilidad (|j) de las partículas está entre 1 y 1.6 jm*cm/V*S. En una realización de todos los aspectos de la enseñanza, el tamaño promedio z de las partículas y/o el potencial zeta y/o la movilidad electroforética se determinan en una suspensión que comprende las partículas de poliplex y glucosa tamponada con HEPES (HBG) o trehalosa tamponada con HEPES (HBT). En una realización, el HBG comprende glucosa al 5% (p/v) y HEPES 10 mM, pH 7.1 o la HBT comprende trehalosa al 10% (p/v) y HEPES 10 mM, pH 7.1. En una realización, el tamaño promedio z de las partículas se determina mediante dispersión dinámica de luz y análisis de datos mediante algoritmo acumulativo. En una realización, el coeficiente de difusión de traslación se mide mediante dispersión de luz dinámica. Luego, se usa la ecuación de Stock-Einstein para calcular el promedio Z. En una realización, la movilidad electroforética se mide mediante electroforesis láser-Doppler. Luego, se usa la ecuación de Henry o la ecuación de Smoluchowski para calcular el potencial Zeta.

Las partículas divulgadas son neutras o cargadas positivamente, preferiblemente a pH fisiológico o a un pH entre 4.5 y 7.5.

El ARN monocatenario divulgado es una molécula de 6000 a 15000 bases, preferiblemente de 9000 a 12000 bases. En una realización de todos los aspectos de la enseñanza, el ARN monocatenario codifica al menos una proteína de interés. En una realización de todos los aspectos de la enseñanza, el ARN monocatenario es un replicón, preferiblemente ARN autorreplicante o autoamplificador. En una realización, el replicón puede ser replicado por una replicasa de un alfavirus, y en el que el replicón preferiblemente comprende una secuencia de reconocimiento de replicación 5' de un alfavirus, o una variante del mismo, y una secuencia de reconocimiento de replicación 3' de un alfavirus, o una variante del mismo. En una realización de todos los aspectos de la enseñanza, el a Rn monocatenario comprende un marco de lectura abierto que codifica un péptido o proteína de interés tal como un péptido o proteína farmacéuticamente activo.

La composición divulgada en el presente documento es para uso en terapia. En una realización de todos los aspectos de la enseñanza, la composición divulgada en este documento es una composición de vacuna.

La divulgación se refiere al uso de una composición descrita en el presente documento para introducir ARN en una célula, en particular para expresar ARN en una célula. En una realización, la célula es una célula muscular.

La divulgación se refiere al uso de una composición descrita en el presente documento para la administración intramuscular de ARN.

La divulgación se refiere a un método de administración intramuscular de ARN que comprende la etapa de administrar intramuscularmente la composición descrita en el presente documento.

La divulgación se refiere a una composición congelada, liofilizada o secada por aspersión que comprende:

(a) ARN monocatenario; y

(b) polialquilenimina

en la que la composición comprende un crioprotector y/o lioprotector, preferiblemente un disacárido tal como trehalosa, o un polisacárido tal como dextrano.

En una realización, la composición comprende además un agente quelante tal como EDTA.

La composición se prepara a partir de una composición acuosa que comprende un disacárido al 5-20% (p/v) y opcionalmente el agente quelante de 20 pM a 10 mM tal como de 80 pM a 5 mM. En una realización, la composición acuosa comprende trehalosa, HEPES y Ed TA tal como trehalosa al l0% (p/v), HEPES 2.8 mM, EDTA 80 pM, pH 7.1. La divulgación se refiere a una composición acuosa que se puede obtener descongelando la composición congelada descrita en el presente documento o reconstituyendo la composición liofilizada o secada por aspersión divulgada en el presente documento.

La divulgación se refiere a un método para preparar una composición congelada, liofilizada o secada por aspersión que comprende:

(i) preparar una composición acuosa que comprende ARN monocatenario, polialquilenimina y un crioprotector y/o lioprotector, preferiblemente un disacárido tal como trehalosa, o un polisacárido tal como dextrano y

(ii) congelar, liofilizar o secar por aspersión la composición.

La composición acuosa comprende además un agente quelante tal como EDTA. En una realización, la composición acuosa comprende el disacárido al 5-20% (p/v) y opcionalmente el agente quelante de 20 pM a 10 mM tal como de 80 pM a 5 mM. En una realización, la composición acuosa comprende trehalosa, HEPES y EDTA tal como trehalosa al 10% (p/v), HEPES 2.8 mM, EDTA 80 pM, pH 7.1.

La divulgación se refiere al uso de un crioprotector y/o lioprotector, preferiblemente un disacárido tal como la trehalosa o un polisacárido tal como el dextrano para preparar una composición congelada, liofilizada o secada por aspersión que comprende:

(a) ARN monocatenario; y

(b) polialquilenimina.

El disacárido se usa en combinación con un agente quelante tal como EDTA.

La composición congelada o liofilizada o secada por aspersión o la composición acuosa para preparar la composición congelada o liofilizada o secada por aspersión puede comprender uno o más de los siguientes:

(i) Disolventes no acuosos tales como etilenglicol, glicerol, dimetilsulfóxido y dimetilformamida.

(ii) Tensioactivos tales como Tween 80, Brij 35, Brij 30, Lubrol-px, Triton X-10; Pluronic F127 (copolímero de polioxietileno-polioxipropileno) también conocido como poloxámero, poloxamina y dodecilsulfato de sodio.

(iii) Disacáridos tales como trehalosa, sacarosa, lactosa y maltosa.

(iv) Polímeros (que pueden tener diferentes PM) tales como polietilenglicol, dextrano, poli(alcohol vinílico), hidroxipropilmetilcelulosa, gelatina, polivinilpirrolidona, hidroxietilcelulosa, Ficoll y albúmina.

(v) Aminoácidos tales como glicina, prolina, 4-hidroxiprolina, L-serina, glutamato, alanina, lisina, sarcosina y ácido gamma-aminobutírico.

La divulgación se refiere a un método para la fabricación de flujo continuo de formulaciones de poliplex de ARN mediante el uso de bombas de flujo continuo y un dispositivo de mezcla, en el que dos fluidos acuosos se mezclan mediante canales de tamaño mm o pm.

Breve descripción de los dibujos

Fig. 1. A. Toxicidad de PEI pura libre en células HEK-293 in vitro. IC50 = 77 pM de nitrógenos (libres). B. Toxicidad de los poliplexos de PEI/replicón-ARN en células HEK-293 in vitro. IC50 = 542 pM de nitrógenos (formulación de poliplex). Fig. 2. Luminiscencia relativa de células musculares C2C12 después de la incubación con poliplexos de PEI/replicón-ARN con una N/P 11.6 de diferentes condiciones de almacenamiento después de 1 semana de almacenamiento. Fig. 3. Integridad relativa del ARN de poliplexos de PEI/replicón-ARN con una N/P 11.6 en diferentes condiciones de almacenamiento después de 2 semanas de almacenamiento.

Fig. 4. Se obtiene poli(2-etil-2-oxazolina) mediante una polimerización por isomerización con apertura de anillo de 2-etil-2-oxazolina en presencia de iniciadores.

Fig. 5. Síntesis de PEI22, PEI87 y PEI217 lineales completamente desacilados por hidrólisis ácida de PEOZ. Condiciones: (i) HCl al 24% (peso/volumen), 110 °C, 96 h; n = 504 para PEOZ de 50 kDa, 2018 para PEOZ de 200 kDa y 5044 para PEOZ de 500 kDa.

Fig. 6. Cinética de agregación de poliplexos IVT (A) y replicón (B) a concentraciones crecientes de sal.

Fig. 7. Parámetros fisicoquímicos de los poliplex antes (inicial) y después (final) de la filtración. A y B. El diámetro y la polidispersidad de los poliplex se midieron mediante DLS. C. Se liberó ARN de los poliplexos mediante heparina y se midió mediante absorción de UV a 260 nm. D. La concentración de PEI se midió mediante un ensayo de CuSCO4. Fig. 8. Comparación de las estructuras químicas de PEI de alta pureza y PEI de pureza regular. n = 58 para PEI de 25 kDa. El número promedio de monómeros -CH2CH2NH- en PEI de 25 kD es 581, que es también la longitud del tramo contiguo de nitrógenos potencialmente protonables. Suponiendo una distribución uniforme de las fracciones de N-propionilo en el PEI25 regular, su tramo contiguo de nitrógenos protonables es de solo 64.

Fig. 9. Transfección de células musculares C2C12 in vitro mediante poliplexos de replicón-ARN que se prepararon usando PEI de diferente nivel de pureza a diferentes proporciones de N/P.

Fig. 10. Se prepararon poliplexos de replicón-ARN con proporciones de N/P de 1 (-) y 11.6 (+) con PEI de alta pureza (jetPEI) y PEI de pureza regular (25 kDa). Se usó ARN libre como control. Las formulaciones se inyectaron en forma im a las extremidades posteriores de los ratones (n = 3). Se registraron señales de luminiscencia de los músculos de los ratones.

Fig. 11. Se prepararon poliplexos de replicón-ARN en proporciones de N/P de 7.7 y 11.6 con PEI de alta pureza: jetPEI (de Polyplus), PEI-Max 40000 (de Polyscience) y Exgen 500 (de Eurodamex). Todas las formulaciones se prepararon en tampón HBGx1 excepto la formulación liofilizada, que se preparó en tampón HBTx1. Las formulaciones se inyectaron en forma im a las extremidades posteriores de los ratones (n = 3). Se registraron señales de luminiscencia de los músculos de los ratones.

Fig. 12. Tortas liofilizadas de poliplexos de JetPEI/replicón-ARN a una N/P 11.6 preparadas con diferentes tampones. Fig. 13. Se transfectaron células musculares C2C12 in vitro mediante IVT-ARN que codifica la luciferasa. El ARN formaba complejos con JetPEI a diferentes proporciones de N/P en tampón HBGx1. La señal de luminiscencia se midió 24 h después de la transfección.

Fig. 14. Se prepararon poliplexos de IVT-ARN en proporciones de N/P de 5.8 y 11.6 con PEI pura en tampón HBGx1. Se utilizó como control IVT-ARN libre en tampón HBGx1. Las formulaciones se inyectaron en forma i.m. a las extremidades posteriores de los ratones (n = 3) a dosis de ARN de 2-8 pg por inyección. Las señales de luminiscencia se registraron en los músculos de los ratones 6 h después de la inyección.

Fig. 15. Se prepararon poliplexos de replicón-ARN y jetPEI a diferentes concentraciones de ARN en una proporción de N/P de 11.6 en tampón HBGx1. Para las medidas de tamaño mediante DLS, los poliplexos se diluyeron hasta una concentración de ARN de 10 mg/l.

Fig. 16. Las células musculares C2C12 se transfectaron in vitro mediante los poliplexos de la Fig. 16. La señal de luminiscencia se midió 24 h después de la transfección.

Fig. 17. Se prepararon poliplexos de Rep-ARN en una proporción de N/P de 11.6 con PEI pura en tampón HBGx1 a diferentes concentraciones de ARN como en la Fig. 16. Las formulaciones se inyectaron en forma i.m. a las extremidades posteriores de los ratones (n = 3) con dosis de ARN de 2-8 pg por inyección. Se registraron las señales de luminiscencia de los músculos de los ratones.

Fig. 18. Estudios in vitro con poliplexos de PEI/replicón-ARN en células dendríticas (DC) humanas y células musculares de ratón (C2C12) A. Toxicidad (expresada como % de células viables después del tratamiento con poliplexos) B. Transfección (expresada como emisión de luminiscencia después del tratamiento con poliplexos). Los resultados de la transfección se muestran solo para las células C2C12.

Fig. 19. Se prepararon de Rep-RNA poliplexos con proporciones de N/P de 11.6 o 15.8 con PEI de Polyplus o Polytheragene en tampones HBGx1 o Hepes 10 mM. Antes de la inyección a los ratones, los poliplexos se diluyeron en tampones HBGx1 u Opti-MEM. Las formulaciones se inyectaron en forma im a las extremidades posteriores de los ratones (n = 3) con dosis de ARN de 2 |jg por inyección. Se registraron señales de luminiscencia de los músculos de los ratones.

Fig. 20. A) Cuatro, siete y once días después de la aplicación intramuscular (i.m.) de 2 jg no formulado (solución tampón) o replicón-ARN formulado que codifica Luciferasa a ambos musculus tibialis posterior de ratones Balb/c, los animales se sometieron a imágenes de bioluminiscencia in vivo no invasivas. Los fotones derivados de la proteína luciferasa se recogieron durante un minuto y se muestran superpuestos con la fotografía de los ratones fotografiados. B) Visualización gráfica de fotones medidos/segundo (p/s) en el sitio de la inyección.

Fig. 21. A) Siete días después de la aplicación intradérmica (i.d.) de 2 jg no formulado (solución tampón) o replicón-ARN formulado que codifica luciferasa en dos sitios de inyección en la piel dorsal de ratones Balb/c, los animales se sometieron a obtención de imágenes de bioluminiscencia in vivo no invasiva. Los fotones derivados de la proteína luciferasa se recogieron durante un minuto y se muestran superpuestos con la fotografía de los ratones fotografiados. Las flechas negras indican el lugar de la inyección. B) Visualización gráfica de fotones medidos/segundo (p/s) en el sitio de la inyección.

Fig. 22. Efecto beneficioso de la formulación de replicón-ARN como vacuna.

Fig. 23. Efecto beneficioso de la formulación de replicón-ARN como vacuna.

Fig. 24. Resultados del secado por aspersión de replicón-ARN formulado con PEI en trehalosa al 10% (p:v).

Fig. 25. Luminiscencia normalizada de las células musculares C2C12 después de la incubación con poliplexos de PEI/replicón-ARN a diferentes proporciones de N/P, antes (preparada) y después (esterilizada) de la filtración estéril.

Fig. 26: Efecto de la combinación de PEI corta y larga sobre la eficacia de transfección in vitro de acuerdo con el ejemplo 16. Fig. 26 A): eficacia de transfección de poliplexos de PEI lineal corta y PEI larga a 250 ng de ARN/pocillo. Fig. 26 B): eficacia de transfección de poliplexos de PEI de ramificación corta y de PEI largas a 250 ng de ARN/pocillo. En comparación con el índice de referencia Jet PEI in vivo y para la misma proporción de NP total, se lograron niveles de expresión más altos en diferentes marcos de tiempo con combinaciones de PEI corto (Fig.26 A: lineal; Fig. 26 B: ramificado) y PEI larga (por ejemplo, jetPEI in vivo).

Fig.27: Eficacia de transfección de replicón-ARN de poliplexos Jet PEI largas PEI cortos frente al punto de referencia (es decir, JetPEI NP12 in vivo) de acuerdo con el ejemplo 17: PEI corto (ramificada 1.8 kDa) y PEI larga en diferentes combinaciones (NP4 NP8 o NP1, 15 NP11) para un NP total de 12.

Fig. 28: Efecto de las variaciones de sal (por ejemplo, NaCl) en la eficacia de transfección de replicón (ARNsa)-ARN in vivo de acuerdo con el ejemplo 18. Se detectaron señales de bioluminiscencia en el día 3 (Fig. 28A), 6 (Fig. 28B), 9 (Fig. 28C) y 13 (Fig. 28D). La intensidad de la señal se comparó en la Fig. 28E. La señal más intensa en la región muscular de los ratones pudo detectarse el día 6 después de la inyección im en ratones que recibieron poliplexos de PEI-replicón-ARN (por ejemplo, PEI larga N/P 12) y adición de sal en concentraciones bajas (5 a 10 mM).

Fig. 29: Efecto de los ajustes de pH sobre la eficacia de transfección de formulaciones de replicón (ARNsa)-PEI de acuerdo con el ejemplo 18. Se obtuvieron buenos resultados con formulaciones de poliplex de ARNsa-PEI que tenían valores de pH entre 6.5 y 7.1. La señal más intensa podría detectarse con una formulación de ARNsa-PEI larga NP12 ajustada a pH 6.5. Como puntos de referencia, se utilizaron poliplexos de ARNsa-Jet PEI NP12 con pH no ajustado (BM) o HBG (Hepes 20 mM, pH 7.4, glucosa al 5% en peso).

Fig.30: Movilidad electroforética de poliplexos de jetPEI/replicón-ARN in vivo (N/P 4) ajustados a diferentes valores de pH de acuerdo con el ejemplo 19.

Figura 31: Luminiscencia normalizada de las células musculares C2C12 después de la incubación con diferentes dosis de poliplexos de jetPEI/replicón-ARN in vivo en una proporción de N/P de 4 y diferentes valores de pH (pH 6.5 - pH 8.5) de acuerdo con el ejemplo 19.

Fig.32: Expresión de luciferasa después de la transfección con diferentes cantidades de PEI/exceso de cargas positivas en formulaciones de PEI de acuerdo con el ejemplo 20.

Fig.33: Optimización de la transfección de poliplex mediante el uso de complejación de 2 etapas de acuerdo con el ejemplo 21.

Fig. 34: Experimento de inmunización de acuerdo con el ejemplo 22 que muestra el efecto superior de poliplexos de ARNsa formulados con glucosa tamponada con MES (MBG) en comparación con glucosa tamponada con HEPES (HBG).

Descripción detallada

Preferiblemente, los términos usados en este documento se definen como se describe en "A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", H.G.W. Leuenberger, B. Nagel y H. Kolbl, Eds., Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basilea, Suiza, (1995).

La práctica de la presente enseñanza empleará, a menos que se indique lo contrario, métodos convencionales de química, bioquímica, biología celular, inmunología y técnicas de ADN recombinante que se explican en la literatura en este campo (véase, por ejemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Edición, J. Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989).

El término "aproximadamente" significa aproximadamente o casi, y en el contexto de un valor numérico o intervalo establecido en el presente documento preferiblemente significa /-10% del valor numérico o intervalo mencionado o reivindicado.

Los términos "un" y "uno, una" y "el, la" y referencias similares utilizadas en el contexto de la descripción de la enseñanza deben interpretarse para cubrir tanto el singular como el plural, a menos que se indique lo contrario en el presente documento o que el contexto lo contradiga claramente. La mención de intervalos de valores en el presente documento está destinada simplemente a servir como un método abreviado para hacer referencia individualmente a cada valor separado que se encuentre dentro del intervalo. A menos que se indique lo contrario en el presente documento, cada valor individual se incorpora en la especificación como si se mencionara individualmente en el presente documento. Todos los métodos descritos en este documento se pueden realizar en cualquier orden adecuado a menos que se indique lo contrario en el presente documento o que el contexto lo contradiga claramente. El uso de todos y cada uno de los ejemplos, o ejemplo de expresión (por ejemplo, "tal como"), proporcionado en el presente documento, está destinado simplemente a ilustrar mejor la invención. Ninguna expresión en la memoria descriptiva en debe interpretarse como que indica algún elemento no reivindicado esencial para la práctica de la enseñanza.

A menos que se especifique expresamente lo contrario, el término "que comprende" se usa en el contexto del presente documento para indicar que otros miembros pueden estar presentes opcionalmente además de los miembros de la lista introducida por "que comprende". Sin embargo, se contempla como una realización específica de la presente enseñanza que el término "que comprende" abarca la posibilidad de que no estén presentes más miembros, es decir, para el propósito de esta realización "que comprende" debe entenderse que tiene el significado de "que consiste en".

Términos tales como "reducir" o "inhibir" como se usan en este documento significan la capacidad de causar una disminución general, preferiblemente del 5% o más, del 10% o más, del 20% o más, más preferiblemente del 50% o más, y lo más preferiblemente 75% o más, en el nivel. El término "inhibir" o frases similares incluye una inhibición completa o esencialmente completa, es decir, una reducción a cero o esencialmente a cero.

Términos tales como "aumentar" o "mejorar" se refieren preferiblemente a un aumento o mejora en aproximadamente al menos 10%, preferiblemente al menos 20%, preferiblemente al menos 30%, más preferiblemente al menos 40%, más preferiblemente al menos 50%, incluso más preferiblemente al menos 80% y lo más preferiblemente al menos 100%.

"Fragmento", con referencia a una secuencia de ácido nucleico, se refiere a una parte de una secuencia de ácido nucleico, es decir, una secuencia que representa la secuencia de ácido nucleico acortada en el o los extremos 5' y/o 3'. Preferiblemente, un fragmento de una secuencia de ácido nucleico comprende al menos 80%, preferiblemente al menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de los residuos de nucleótidos de dicha secuencia de ácido nucleico. En la presente enseñanza, se prefieren aquellos fragmentos de moléculas de ARN que conservan la estabilidad del ARN y/o la eficacia de la traducción.

"Fragmento", con referencia a una secuencia de aminoácidos (péptido o proteína), se refiere a una parte de una secuencia de aminoácidos, es decir, una secuencia que representa la secuencia de aminoácidos acortada en el termina N y/o el terminal C. Se puede obtener un fragmento acortado en el terminal C (fragmento del terminal N), por ejemplo, por traducción de un marco de lectura abierto truncado que carece del extremo 3' del marco de lectura abierto. Se puede obtener un fragmento acortado en el terminal N (fragmento del terminal C), por ejemplo, por traducción de un marco de lectura abierto truncado que carece del extremo 5' del marco de lectura abierto, siempre que el marco de lectura abierto truncado comprenda un codón de inicio que sirve para iniciar la traducción. Un fragmento de una secuencia de aminoácidos comprende, por ejemplo, al menos 1%, al menos 2%, al menos 3%, al menos 4%, al menos 5%, al menos 10%, al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90% de los residuos de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos.

El término "fuerza iónica" se refiere a la relación matemática entre el número de diferentes tipos de especies iónicas en una solución particular y sus respectivas cargas. Por lo tanto, la fuerza iónica I está representada matemáticamente por la fórmula

en la que c es la concentración molar de una especie iónica particular y z el valor absoluto de su carga. La suma I se toma sobre todos los diferentes tipos de iones (i) en solución.

Se prefiere que la fuerza iónica de las composiciones descritas en este documento sea 50 mM o menos, preferiblemente 25 mM o menos, preferiblemente 20 mM o menos, 19 mM o menos, 18 mM o menos, 17 mM o menos, 16 mM o menos, 15 mM o menos, 10 mM o menos, o 5 mM o menos. Preferiblemente, la fuerza iónica de las composiciones descritas en este documento es lo suficientemente baja como para evitar la agregación de partículas de poliplex.

De acuerdo con la enseñanza, el término "fuerza iónica" se refiere preferiblemente a la presencia de iones monovalentes. Con respecto a la presencia de iones divalentes, en particular cationes divalentes, su concentración o concentración efectiva (presencia de iones libres) debido a la presencia de agentes quelantes es preferiblemente suficientemente baja para evitar la degradación del ARN. En una realización particularmente preferida, la concentración o concentración efectiva de iones divalentes está por debajo del nivel catalítico para la hidrólisis de los enlaces fosfodiéster entre nucleótidos de ARN. En una realización particularmente preferida, la concentración de iones divalentes libres es 20 ^M o menos, preferiblemente no hay o esencialmente no hay iones divalentes libres.

Se prefiere que el pH de las composiciones descritas en este documento esté entre 4 y 8; más preferiblemente entre 5.5 y 8, por ejemplo, entre 6 y 7.5, por ejemplo, entre 6.5 y 7.1, entre 6.5 y 7, o entre 6.5 y 6.9.

El término "disacárido" se refiere a carbohidratos compuestos por dos residuos de monosacárido unidos por enlaces glicosídicos. Ejemplos representativos de disacáridos incluyen trehalosa, maltosa, sacarosa, lactosa, lactulosa, celobiosa, isomaltosa, gentibiosa, disacárido de laminarina (laminarabiosa), quitobiosa, xilobiosa (xilobiosa), disacárido de inulina y azúcar manobiosa. Un contenido preferido del disacárido en las composiciones descritas en el presente documento es 5-20% (p/v) tal como 5-15% (p/v), 7-15% (p/v) u 8-12% (p/v). De acuerdo con las enseñanzas, se prefieren los disacáridos que tienen altas temperaturas de transición vítrea.

El término "agente quelante" significa un compuesto que forma un quelato con iones metálicos, preferiblemente iones metálicos divalentes o multivalentes. Un agente quelante tiene una pluralidad de grupos, por ejemplo, OH, -COOH, capaces de formar una estructura de anillo con iones metálicos. Ejemplos de agentes quelantes son: agentes quelantes de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA), ácido trans-1,2-diamino-ciclohexano tetraacético monohidrato, ácido N-hidroxietiletilendiaminotriacético (He Dt A), ácido cítrico y ácido fosfórico (por ejemplo, Dequest 2000). Se prefiere el ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) de acuerdo con las enseñanzas. Se prefiere que el agente quelante esté presente en las composiciones descritas en el presente documento en una concentración de al menos 20 ^M, al menos 40 ^M, al menos 60 ^M o al menos 80 ^M. Se prefiere que el agente quelante esté presente en las composiciones descritas en el presente documento en una concentración de hasta 10 mM, hasta 5 mM, hasta 2 mM, hasta 1 mM, hasta 0.5 mM, hasta 0.2 mM o hasta a 0.1 mM.

El término "congelación" se refiere a la solidificación de un líquido, normalmente con la eliminación del calor.

El término "liofilizar" o "liofilización" se refiere al secado por congelación de una sustancia congelándola y luego reduciendo la presión circundante para permitir que el medio congelado en la sustancia se sublime directamente de la fase sólida a la fase gaseosa.

El término "secado por aspersión" se refiere a secado por aspersión de una sustancia mezclando gas (calentado) con un fluido que se atomiza (asperja) dentro de un recipiente (secador por aspersión), en el que el disolvente de las gotitas formadas se evapora, dando lugar a una polvo seco.

El término "crioprotector" se refiere a una sustancia que se agrega a una formulación para proteger los ingredientes activos durante las etapas de congelación.

El término "lioprotector" se refiere a una sustancia que se agrega a una formulación para proteger los ingredientes activos durante las etapas de secado.

El término "reconstituir" se refiere a la adición de un disolvente tal como agua a un producto seco para devolverlo a un estado líquido tal como su estado líquido original.

El término "autólogo" se usa para describir cualquier cosa que se derive del mismo sujeto. Por ejemplo, "célula autóloga" se refiere a una célula derivada del mismo sujeto. La introducción de células autólogas en un sujeto es ventajosa porque estas células superan la barrera inmunológica que de otro modo da como resultado el rechazo.

El término "alogénico" se usa para describir cualquier cosa que se derive de diferentes individuos de la misma especie. Se dice que dos o más individuos son alogénicos entre sí cuando los genes en uno o más loci no son idénticos.

El término "singénico" se usa para describir cualquier cosa que se derive de individuos o tejidos que tienen genotipos idénticos, es decir, gemelos idénticos o animales de la misma cepa consanguínea, o sus tejidos o células.

El término "heterólogo" se usa para describir algo que consta de múltiples elementos diferentes. Como ejemplo, la introducción de la célula de un individuo en un individuo diferente constituye un trasplante heterólogo. Un gen heterólogo es un gen derivado de una fuente distinta al sujeto.

De acuerdo con las enseñanzas, debido a la inestabilidad del ARN no protegido, es ventajoso proporcionar las moléculas de ARN en forma complejada. En particular, en algunas realizaciones, las composiciones de la presente enseñanza comprenden partículas que comprenden ARN y polialquilenimina.

Cuando el sistema de acuerdo con las presentes enseñanzas se formula como una formulación en partículas, es posible que cada especie de ARN (por ejemplo, replicón, constructo de replicasa y especies de ARN adicionales opcionales tales como un ARN que codifica una proteína adecuada para inhibir IFN) sea formulado por separado como una formulación de partículas individuales. En ese caso, cada formulación en partículas individuales comprenderá una especie de ARN. Las formulaciones de partículas individuales pueden estar presentes como entidades separadas, por ejemplo, en contenedores separados. Dichas formulaciones se pueden obtener proporcionando cada especie de ARN por separado (típicamente cada una en forma de una solución que contiene ARN) junto con un agente formador de partículas, lo que permite la formación de partículas. Las partículas respectivas contendrán exclusivamente la especie de ARN específica que se proporciona cuando se forman las partículas (formulaciones de partículas individuales).

En una realización, una composición de acuerdo con las enseñanzas comprende más de una formulación de partículas individuales. Las respectivas composiciones se denominan formulaciones mixtas de partículas. Las formulaciones de partículas mixtas de acuerdo con las enseñanzas se pueden obtener formando, por separado, formulaciones de partículas individuales, como se describió anteriormente, seguido de una etapa de mezcla de las formulaciones de partículas individuales. Mediante la etapa de mezcla, se obtiene una formulación que comprende una población mixta de partículas que contienen ARN (a modo de ilustración: por ejemplo, una primera población de partículas puede contener replicón y una segunda formulación de partículas puede contener un constructo de replicasa). Las poblaciones de partículas individuales pueden estar juntas en un recipiente, que comprende una población mixta de formulaciones de partículas individuales.

Alternativamente, es posible que todas las especies de ARN de la composición (por ejemplo, replicón, constructo de replicasa y especies adicionales opcionales tales como ARN que codifica una proteína adecuada para inhibir IFN) se formulen juntas como una formulación combinada de partículas. Dichas formulaciones se pueden obtener proporcionando una formulación combinada (típicamente solución combinada) de todas las especies de ARN junto con un agente formador de partículas, lo que permite la formación de partículas. A diferencia de una formulación de partículas mixtas, una formulación de partículas combinadas comprenderá típicamente partículas que comprenden más de una especie de ARN. En una composición de partículas combinada, diferentes especies de ARN están típicamente presentes juntas en una sola partícula.

En una realización, la formulación de partículas de la presente enseñanza es una formulación de nanopartículas. En esa realización, la composición de acuerdo con las presentes enseñanzas comprende ARN en forma de nanopartículas.

En una definición general, el término "nanopartícula" se refiere a cualquier partícula que tenga un diámetro de entre 1 nm y 1000 nanómetros (nm).

En el contexto de la presente enseñanza, el término "partícula" se refiere a una entidad estructurada formada por moléculas o complejos de moléculas. En una realización, el término "partícula" se refiere a una estructura de tamaño micro o nano, tal como una estructura compacta de tamaño micro o nano.

Los términos "In vivo-jetPEIMR", "in vivo jetPEIMR", "in vivo jetPEI", "jetPEI", "jet PEI" y "JetPEI" se refieren todos al reactivo In vivo-jetPEIMR comercialmente disponible, cat. # 201-50G de Polyplus-Transfection SA (Illkirch, Francia).

El término "poliplex" como se usa en este documento se refiere a un complejo de un polímero y un ácido nucleico tal como ARN formado a través de interacciones electrostáticas. En los casos en los que el poliplex comprende ARN, también puede denominarse "complejo de ARN" o "poliplex de ARN".

La presente enseñanza se refiere a partículas poliplex formadas a partir de al menos un ARN monocatenario y al menos una polialquilenimina.

En una realización, las partículas descritas en el presente documento tienen un diámetro promedio inferior a aproximadamente 200 nm, preferiblemente inferior a aproximadamente 150 nm y más preferiblemente inferior a aproximadamente 100 nm. En una realización, las partículas descritas en el presente documento tienen un diámetro promedio de al menos aproximadamente 30 nm, al menos aproximadamente 40 nm, al menos aproximadamente 50 nm, al menos aproximadamente 60 nm, al menos aproximadamente 70 nm, al menos aproximadamente 80 nm, a al menos aproximadamente 90 nm, o al menos aproximadamente 100 nm.

El término "diámetro promedio" se refiere al diámetro hidrodinámico promedio de las partículas medido por dispersión dinámica de luz con análisis de datos utilizando el denominado algoritmo acumulativo, que proporciona como resultado el denominado Zpromedio con la dimensión de una longitud y el índice de polidispersidad (PI), que es adimensional (Koppel, D., J. Chem. Phys. 57, 1972, páginas 4814-4820, ISO 13321). En el presente documento, "diámetro promedio", "diámetro" o "tamaño" de partículas se utiliza como sinónimo de este valor de Zpromedio.

El término "carga neta" se refiere a la suma total de cargas, tales como cargas positivas y negativas. Por ejemplo, si una partícula comprende un mayor número de cargas negativas que de cargas positivas, la carga neta de la partícula es negativa. Si la partícula comprende un mayor número de cargas positivas que negativas, la carga neta de la partícula es positiva. Si la partícula comprende un número igual de cargas positivas y negativas, la carga neta de la partícula es neutra, particularmente eléctricamente neutra. Por lo tanto, la carga neta de la partícula de acuerdo con las presentes enseñanzas puede ser negativa, positiva o neutra. En una realización, la carga neta de la partícula es positiva. En una realización, la carga neta de la partícula es negativa.

Los términos como "cargado", "carga neta", "cargado negativamente" o "cargado positivamente" se refieren a la carga eléctrica neta del compuesto o partícula dados cuando se disuelve o suspende en tampón acuoso al pH relevante (por ejemplo, 7.1).

De acuerdo con las presentes enseñanzas, los términos "proporción de N/P", "proporción de NP", "proporción de N:P", "N/P" y "NP" se refieren a la relación molar de átomos de nitrógeno (N) en la polietilenimina con respecto a los átomos de fósforo (P) en el ARN.

De acuerdo con la enseñanza, la relación molar del número de átomos de nitrógeno (N) en la polialquilenimina al número de átomos de fósforo (P) en el ARN (proporción de N/P) es preferiblemente de 2.0 a 15.0, preferiblemente de 8.0 a 12.0, 6.0 a 14.0 o 6.0 a 12.0.

De acuerdo con las enseñanzas, se prefiere ajustar las composiciones descritas en el presente documento a la proporción final de N/P en más de 1 etapa, tal como en 2, 3, 4 o más etapas. Por ejemplo, la composición puede ajustarse a una primera proporción de N/P que es menor que la proporción final de N/P en una primer etapa, por ejemplo, usando una polialquilenimina larga. Añadiendo más polialquilenimina, por ejemplo, polialquilenimina corta o polialquilenimina larga tal como la polialquilenimina larga usada en la primera etapa, la proporción de N/P puede ajustarse a la proporción de N/P final. En una realización, la proporción de N/P final está entre 8 y 16, por ejemplo, entre 9 y 14, por ejemplo, entre 10 y 12. En una realización, la proporción de N/P resultante en la primera etapa está entre 1 y 6, por ejemplo, tal como entre 2 y 5 tal como 3 o 4.

Polialquileniminas

El alcance de la protección está definido únicamente por las reivindicaciones. Cualquier otro asunto de la enseñanza o divulgación no forma parte de la invención. La polialquilenimina como se usa en este documento preferiblemente comprende la siguiente fórmula general (I):

en la que

en la que R1 es H o un grupo que comprende la siguiente fórmula general (III):

n, m y I se seleccionan independientemente de números enteros de 2 a 10; y

n, m y I se seleccionan independientemente de 2, 3, 4 y 5, preferiblemente de 2 y 3, y más preferiblemente son 2. En una realización, R1 es H. En una realización, R es H o un grupo acilo.

En una realización, la polialquilenimina comprende polietilenimina y/o polipropilenimina, preferiblemente polietilenimina. Una polialquilenimina preferida es la polietilenimina (PEI). El peso molecular promedio de PEI es preferiblemente de 1.5 x 102 a 107 Da, preferiblemente de 5.000 a 105 Da, más preferiblemente de 10000 a 40000 Da, más preferiblemente de 15000 a 30000 Da, incluso más preferiblemente de 20000 a 25000 Da.

Se prefiere de acuerdo con la divulgación la polialquilenimina lineal, tal como la polietilenimina lineal (PEI). En una realización, la PEI lineal se obtiene mediante una polimerización por isomerización con apertura de anillo de 2-etil-2-oxazolina para obtener poli(2-etil-2-oxazolina) (PEOX; N-propionil-PEI), que luego es hidrolizado con ácido para escindir los grupos N-propionilo para producir PEI.

Se prefiere de acuerdo con la divulgación que la PEI lineal se obtenga por desacilación completa o esencialmente completa de PEOX. Por ejemplo, la PEOX con un peso molecular de 50 kDa produce una PEI lineal con un peso molecular de 22 kDa. Se prefiere que al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% o esencialmente el 100% de la los sustituyentes de los átomos de nitrógeno en la polialquilenimina tales como polietilenimina son hidrógeno (es decir, R en la fórmula anterior es H). Por tanto, se prefiere que al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% o esencialmente el 100% de los átomos de nitrógeno de la polialquilenimina, tal como la polietilenimina, son protonables.

Una polialquilenimina preferida de acuerdo con la divulgación, polietilenimina (PEI), en particular polietilenimina lineal. Tal polietilenimina lineal tiene preferiblemente una masa molar entre 15 kDa y 30 kDa, y se usa preferiblemente en combinación con ARN autorreplicante o autoamplificador, en la que la proporción de N/P está preferiblemente entre 6 y 15, y la polietilenimina lineal y los ARN autorreplicantes o autoamplificadores están presentes preferiblemente en partículas poliplex que tienen un tamaño de menos de 200 nm, preferiblemente menos de 150 nm, e incluso más preferiblemente menos de 100 nm.

Se divulga que la polialquilenimina es una combinación de polialquilenimina corta, tal como polietilenimina corta, de entre 0.6 y 11 kDa, preferiblemente de entre 1 y 6 kDa o entre 1 y 4 kDa tal como entre 1 y 3 kDa (ya sea lineal y/o ramificada) y polialquilenimina larga, tal como polietilenimina larga, de entre 20 y 40 kDa (lineal y/o ramificada), en la que la proporción de N/P total está preferiblemente entre 8 y 16, tal como entre 9 y 14, por ejemplo, entre 10 y 12. En una realización, la proporción de N/P entre polialquilenimina larga y ARN está entre 1 y 6, tal como entre 2 y 5, tal como 3 o 4.

La polietilenimina (PEI) es una macromolécula orgánica con una alta densidad de carga catiónica. PEI puede compactar los ácidos nucleicos en partículas cargadas positivamente capaces de interactuar con proteoglicanos aniónicos en la superficie celular y facilitar la entrada de las partículas por endocitosis.

Existen varios métodos de fabricación para PEI. De acuerdo con la divulgación, la polietilenimina lineal se sintetiza y prepara preferiblemente mediante un método que comprende las etapas de, a partir de una cantidad determinada de monómero 2-etil-2-oxazolina con una pureza superior al 99%, secar completamente dicha cantidad de monómero y polimerizar dicha cantidad de monómero para la obtención de poli(2-etil-2-oxazolina) (PEOX) mediante:

- después de secar a fondo una cantidad predeterminada de acetonitrilo, usando dicho acetonitrilo como disolvente en dicha cantidad de monómero seco, mientras se agrega una cantidad predeterminada de iniciador de la reacción de polimerización completamente seco, y mezclándolos por completo,

- purificar dicha PEOX obtenida por evaporación para eliminar dicho disolvente, mientras se realizan al menos tres etapas sucesivas de lavado/precipitación con metanol y éter dietílico y las filtraciones correspondientes,

- estando dispuestas dichas operaciones de secado, polimerización y purificación para obtener (i), mediante la realización de pruebas de RMN de 1H, identificación correcta de dicho polímero PEOX, confirmación de ausencia de monómero a un nivel <1.0% y confirmación de ausencia de disolvente a un nivel <5.0% y (ii), mediante la realización de cromatografía de permeación en gel, una media de peso molecular (Mw)> 23000 Da y polidispersidad (Mw/Mn) de dicha PEOX <1.5,

- hidrolizar dicha PEOX con ácido clorhídrico para obtener dicha PEI de manera suficientemente eficiente para tener, realizando pruebas de RMN de 1H, una cantidad de cadenas laterales residuales o ácido propiónico <5% y para identificar la PEI como un solo pico.

Secando a fondo una determinada cantidad de monómero, acetonitrilo o iniciador, se debe entender obtener, justo antes de su uso, una reducción de la humedad por debajo de 10 ppm de agua, que se puede obtener secando sobre hidruro de calcio durante 48h y luego por destilación y recogida del monómero por encima de la temperatura de 129 °C.

Se prefieren una o más de las siguientes características de acuerdo con las enseñanzas:

(i) la media del peso molecular (Mw) de la PEOX es tal como 40000 Da <Mw <60000 Da;

(ii) la relación monómero/iniciador es de aproximadamente 500 (por aproximadamente se debería entender ± 5%); (iii) la relación monómero/iniciador es 480;

(iv) el monómero tiene una pureza superior al 99.95%;

(v) el iniciador se mezcla con el acetonitrilo antes de la adición al monómero;

(vi) la polimerización se realiza durante más de 20 horas a una temperatura superior a 85 °C;

(vii) la temperatura de polimerización es superior o igual a 105 °C;

(viii) después de la primera filtración, el residuo se lava libremente con un solvente tal como MeOH, y después de la adición de éter dietílico, la poli(2-etil-2-oxazolina) se separa naturalmente como aceite de la solución, el solvente total se decanta y dicho lavado y separación se repite al menos cuatro veces antes de secar al vacío;

(ix) la etapa de hidrolización comprende eliminar de la mezcla de reacción el ácido propiónico descargado obtenido por destilación azeotrópica de forma regular y durante al menos un día, mientras se monitoriza el proceso de reacción mediante espectroscopía de RMN de 1H;

(x) el residuo obtenido al final del proceso de reacción se diluye en agua y se evapora al menos tres veces para eliminar las trazas de ácido propiónico, luego el residuo se disuelve nuevamente en agua y se filtra antes de la liofilización;

(xi) la filtración se realiza a través de una membrana estéril con una dimensión de malla entre 0.20 pm y 0.25 pm, particularmente una membrana de acetato celular estéril.

Ventajosamente, una PEI lineal para su uso de acuerdo con las enseñanzas se caracteriza porque la PEOX intermedia tiene un peso molecular Mw tal como 40000 <Mw <60000 Da. El grado de polimerización está controlado por la relación monómero/iniciador y por el rendimiento de síntesis. La determinación del peso molecular se puede realizar mediante cromatografía de permeación en gel (GPC).

El término "ácido nucleico" de acuerdo con la divulgación comprende ácido desoxirribonucleico (ADN), ácido ribonucleico (ARN) y ácido nucleico bloqueado (LNA). De acuerdo con la enseñanza, los ácidos nucleicos comprenden ADN genómico, ADNc, ARNm, ARN viral, moléculas preparadas de forma recombinante y sintetizadas químicamente. De acuerdo con la enseñanza, un ácido nucleico puede estar en forma de una molécula circular monocatenaria o bicatenaria y lineal o covalentemente cerrada. El término "ácido nucleico" de acuerdo con las enseñanzas también comprende una derivatización química de un ácido nucleico sobre una base de nucleótidos, sobre el azúcar o sobre el fosfato, y ácidos nucleicos que contienen nucleótidos y análogos de nucleótidos no naturales. Los ácidos nucleicos divulgados pueden ser ácidos nucleicos aislados y/o recombinantes.

El término "aislado", como se usa en el presente documento, pretende hacer referencia a una molécula que está sustancialmente libre de otras moléculas, tal como otro material celular. El término "ácido nucleico aislado" significa de acuerdo con las enseñanzas que el ácido nucleico ha sido (i) amplificado in vitro, por ejemplo mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR), (ii) producido recombinantemente mediante clonación, (iii) purificado, por ejemplo por escisión y fraccionamiento electroforético en gel, o (iv) sintetizado, por ejemplo, mediante síntesis química. Un ácido nucleico aislado es un ácido nucleico disponible para manipulación mediante técnicas recombinantes.

El término "recombinante" en el contexto de la presente enseñanza significa "elaborado mediante ingeniería genética". Preferiblemente, un "objeto recombinante" en el contexto de la presente enseñanza no se produce de forma natural.

El término "de origen natural", como se usa en el presente documento, se refiere al hecho de que un objeto se puede encontrar en la naturaleza. Por ejemplo, un péptido o ácido nucleico que está presente en un organismo (incluidos los virus) y que puede aislarse de una fuente en la naturaleza y que no ha sido modificado intencionalmente por el hombre en el laboratorio es de origen natural. El término "encontrado en la naturaleza" significa "presente en la naturaleza" e incluye objetos conocidos, así como objetos que aún no han sido descubiertos y/o aislados de la naturaleza, pero que pueden ser descubiertos y/o aislados en el futuro de una fuente natural.

De acuerdo con la enseñanza, "secuencia de ácido nucleico" se refiere a la secuencia de nucleótidos en un ácido nucleico, por ejemplo, un ácido ribonucleico (ARN) o un ácido desoxirribonucleico (ADN). El término puede referirse a una molécula de ácido nucleico completa (tal como la cadena única de una molécula de ácido nucleico completa) o una parte (por ejemplo, un fragmento) de la misma.

El "extremo 3' de un ácido nucleico" se refiere de acuerdo con las enseñanzas para ese extremo que tiene un grupo hidroxilo libre. En una representación esquemática de ácidos nucleicos bicatenarios, en particular ADN, el extremo 3' está siempre en el lado derecho. "El extremo 5' de un ácido nucleico" se refiere de acuerdo con las enseñanzas para ese extremo que tiene un grupo fosfato libre. En una representación esquemática de ácidos nucleicos bicatenarios, en particular ADN, el extremo 5' está siempre en el lado izquierdo.

Extremo 5' 5'--P-NNNNNNN-OH-3' extremo 3' y

3'-HO-NNNNNNN-P--5'

"Secuencia arriba" describe el posicionamiento relativo de un primer elemento de una molécula de ácido nucleico con respecto a un segundo elemento de esa molécula de ácido nucleico, en la que ambos elementos están comprendidos en la misma molécula de ácido nucleico, y en la que se localiza el primer elemento más cerca del extremo 5' de la molécula de ácido nucleico que el segundo elemento de esa molécula de ácido nucleico. Se dice entonces que el segundo elemento está "secuencia abajo" del primer elemento de esa molécula de ácido nucleico. Un elemento que está ubicado "secuencia arriba" de un segundo elemento puede denominarse como sinónimo ubicado "5'" de ese segundo elemento. Para una molécula de ácido nucleico de doble cadena, se dan indicaciones como "secuencia arriba" y "secuencia abajo" con respecto a la cadena (+).

De acuerdo con la enseñanza, el término "gen" se refiere a una secuencia de ácido nucleico particular que es responsable de producir uno o más productos celulares y/o de lograr una o más funciones intercelulares o intracelulares. Más específicamente, dicho término se refiere a una sección de ácido nucleico (ADN o ARN) que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína específica o una molécula de ARN funcional o estructural.

El término "vector" se utiliza en el presente documento en su significado más general y comprende cualquier vehículo intermedio para un ácido nucleico que, por ejemplo, permita que dicho ácido nucleico se introduzca en células huésped procariotas y/o eucariotas y, en su caso, para integrarse en un genoma. Preferiblemente, dichos vectores se replican y/o expresan en la célula. Los vectores comprenden plásmidos, fagémidos, genomas de virus y fracciones de los mismos.

En el contexto de la presente enseñanza, el término "ARN" se refiere a una molécula que comprende residuos de ribonucleótidos y que preferiblemente está compuesta total o sustancialmente por residuos de ribonucleótidos y comprende todos los tipos de ARN descritos en el presente documento. El término "ribonucleótido" se refiere a un nucleótido con un grupo hidroxilo en la posición 2' de un grupo p-D-ribofuranosilo. El término "ARN" comprende ARN bicatenario, ARN monocatenario, ARN aislado, tal como ARN parcial o completamente purificado, ARN esencialmente puro, ARN sintético y ARN generado de forma recombinante, tal como a Rn modificado, que se diferencia del ARN natural por adición, eliminación, sustitución y/o alteración de uno o más nucleótidos. Tales alteraciones pueden incluir la adición de material no nucleotídico, tal como en el extremo o extremos de un ARN o internamente, por ejemplo en uno o más nucleótidos del ARN. Los nucleótidos en las moléculas de ARN también pueden comprender nucleótidos no estándar, tales como nucleótidos de origen no natural o nucleótidos o desoxinucleótidos sintetizados químicamente. Estos ARN alterados pueden denominarse análogos, particularmente análogos de ARN de origen natural. El ARN usado de acuerdo con las presentes enseñanzas puede tener una composición conocida, o la composición del ARN puede ser total o parcialmente desconocida.

El término "estabilidad" del ARN se refiere a la "vida media" del ARN. La "vida media" se refiere al período de tiempo que se necesita para eliminar la mitad de la actividad, cantidad o número de moléculas. En el contexto de la presente enseñanza, la vida media de un ARN es indicativa de la estabilidad de dicho ARN. La vida media del ARN puede influir en la "duración de la expresión" del ARN. Se puede esperar que el ARN que tenga una vida media larga se exprese durante un período de tiempo prolongado.

El término "eficacia de traducción" se refiere a la cantidad de producto de traducción proporcionado por una molécula de ARN dentro de un período de tiempo particular.

De acuerdo con la enseñanza, "ARN bicatenario" o "ARNbc" significa ARN con dos cadenas parcial o completamente complementarias.

De acuerdo con las enseñanzas, el ARN es preferiblemente ARN monocatenario (ARNmc). El término "ARN monocatenario" generalmente se refiere a una molécula de ARN a la que no está asociada ninguna molécula de ácido nucleico complementaria (típicamente, ninguna molécula de ARN complementaria). El ARN monocatenario puede contener secuencias autocomplementarias que permiten que partes del ARN se replieguen y formen motivos de estructura secundaria que incluyen, sin limitación, pares de bases, tallos, bucles de tallo y protuberancias. El ARN monocatenario puede existir como cadena menos [cadena (-)] o como cadena más [cadena (+)]. La cadena (+) es la cadena que comprende o codifica información genética. La información genética puede ser, por ejemplo, una secuencia de polinucleótidos que codifica una proteína. Cuando el ARN de cadena (+) codifica una proteína, la cadena (+) puede servir directamente como plantilla para la traducción (síntesis de proteínas). La cadena (-) es el complemento de la cadena (+). En el caso del a Rn bicatenario, cadena (+) y cadena (-) son dos moléculas de ARN separadas, y ambas moléculas de ARN se asocian entre sí para formar un ARN bicatenario ("ARN dúplex").

El ARN monocatenario particularmente preferido de acuerdo con las enseñanzas es ARNm y ARN replicón tal como ARN autorreplicante. De acuerdo con las presentes enseñanzas, el ARN puede ser ARN codificante, es decir, ARN que codifica un péptido o proteína. Preferiblemente, el ARN es ARN farmacéuticamente activo.

Un "ARN farmacéuticamente activo" es un ARN que codifica un péptido o proteína farmacéuticamente activo tal como un antígeno o un compuesto inmunológicamente activo (que no codifica un antígeno) o es farmacéuticamente activo por sí mismo, por ejemplo, tiene una o más actividades farmacéuticas tal como aquellas descritas para proteínas farmacéuticamente activas.

De acuerdo con la divulgación, el término "ARN que codifica un péptido o proteína" significa que el ARN, si está presente en el entorno apropiado, preferiblemente dentro de una célula, puede dirigir el ensamblaje de aminoácidos para producir el péptido o proteína durante el proceso de traducción. Preferiblemente, el ARN codificante de acuerdo con las enseñanzas puede interactuar con la maquinaria de traducción celular permitiendo la traducción del ARN codificante para producir un péptido o proteína.

De acuerdo con la divulgación, el término "ARNm" significa "ARN mensajero" y se refiere a un transcripto que se genera típicamente usando una plantilla de ADN y codifica un péptido o proteína. Normalmente, el ARNm comprende una secuencia 5'-UTR, una región codificante de proteína, una secuencia 3'-UTR y una secuencia poli(A). El ARNm puede generarse mediante transcripción in vitro a partir de una plantilla de ADN. El experto en la materia conoce la metodología de transcripción in vitro. Por ejemplo, existe una variedad de kits de transcripción in vitro disponibles comercialmente. De acuerdo con las enseñanzas, el ARNm puede modificarse estabilizando modificaciones y protegiendo.

El término "región no traducida" o "UTR" se refiere a una región en una molécula de ADN que se transcribe pero no se traduce en una secuencia de aminoácidos, o a la región correspondiente en una molécula de ARN, tal como una molécula de ARNm. Una región no traducida (UTR) puede estar presente 5' (secuencia arriba) de un marco de lectura abierto (5'-UTR) y/o 3' (secuencia abajo) de un marco de lectura abierto (3'-UTR).

Una 3'-UTR, si está presente, está ubicada en el extremo 3' de un gen, secuencia abajo del codón de terminación de una región que codifica una proteína, pero el término "3'-UTR" preferiblemente no incluye la cola de poli(A). Por lo tanto, la 3'-UTR está secuencia arriba de la cola de poli(A) (si está presente), por ejemplo directamente adyacente a la cola de poli(A). Una 5'-UTR, si está presente, está ubicada en el extremo 5' de un gen, secuencia arriba del codón de inicio de una región que codifica una proteína. Una 5'-UTR está secuencia abajo de la protección de 5' (si está presente), por ejemplo, directamente adyacente a la protección de 5'. Las regiones 5' y/o 3' no traducidas pueden, de acuerdo con las enseñanzas, estar funcionalmente vinculadas a un marco de lectura abierto, de modo que estas regiones se asocien con el marco de lectura abierto de tal manera que la estabilidad y/o la eficiencia de traducción del ARN que comprende dicho marco de lectura abierto aumenta.

De acuerdo con la divulgación, los términos "secuencia de poli(A)" o "cola de poli(A)" se refieren a una secuencia ininterrumpida o interrumpida de residuos de adenilato que se localiza típicamente en el extremo 3' de una molécula de ARN. Una secuencia ininterrumpida se caracteriza por residuos de adenilato consecutivos. En la naturaleza, una secuencia poli(A) ininterrumpida es típica. Si bien una secuencia de poli(A) normalmente no está codificada en el ADN eucariota, pero se une durante la transcripción eucariota en el núcleo celular al extremo 3' libre del ARN por una ARN polimerasa independiente de la plantilla después de la transcripción, la presente enseñanza abarca secuencias de poli (A) codificadas por ADN.

Términos tales como "protección de 5'", "protección", "estructura de protección 5'" o "estructura de protección" se utilizan como sinónimos para referirse a un dinucleótido que se encuentra en el extremo 5' de algunos transcriptos primarios eucariotas tal como el ARN mensajero precursor. Una protección de 5' es una estructura en la que una guanosina (opcionalmente modificada) está unida al primer nucleótido de una molécula de ARNm mediante un enlace trifosfato 5' a 5' (o enlace trifosfato modificado en el caso de ciertos análogos de protección). Los términos pueden referirse a una protección convencional o a un análogo de protección.

Las moléculas de ARN de acuerdo con las enseñanzas pueden caracterizarse por una protección de 5', una 5'-UTR, una 3'-UTR, una secuencia de poli(A) y/o una adaptación del uso del codón.

Las moléculas de ARN para su uso de acuerdo con las enseñanzas tienen preferiblemente un tamaño de más de 2000 bases, preferiblemente más de 3000 bases, más de 4000 bases, más de 5000 bases, más de 6000 bases, más de 7000 bases, más de 8000 bases, más de 9000 bases o más de 10000 bases Las moléculas de ARN para usar de acuerdo con las enseñanzas tienen preferiblemente un tamaño de 6000 a 20000 bases, preferiblemente de 6000 a 15000 bases, preferiblemente de 9000 a 12000 bases

De acuerdo con la divulgación, el término "expresión" se usa en su significado más general y comprende la producción de ARN y/o proteína. También comprende la expresión parcial de ácidos nucleicos. Además, la expresión puede ser transitoria o estable. Con respecto al ARN, el término "expresión" o "traducción" se refiere al proceso en los ribosomas de una célula mediante el cual una cadena de ARN codificante (por ejemplo, ARN mensajero) dirige el ensamblaje de una secuencia de aminoácidos para producir un péptido o proteína.

Los términos "transcripción" y "que se transcribe" se refieren a un proceso durante el cual una molécula de ácido nucleico con una secuencia de ácido nucleico particular (la "plantilla de ácido nucleico") es leída por una ARN polimerasa de modo que la ARN polimerasa produce una molécula de ARN monocatenaria. Durante la transcripción, se transcribe la información genética en una plantilla de ácido nucleico. El plantilla de ácido nucleico puede ser ADN; sin embargo, por ejemplo en el caso de la transcripción a partir de una plantilla de ácido nucleico alfaviral, la plantilla es típicamente ARN. Posteriormente, el ARN transcrito puede traducirse en proteína. De acuerdo con la presente enseñanza, el término "transcripción" comprende "transcripción in vitro", en la que el término "transcripción in vitro" se refiere a un proceso en el que el ARN, en particular el ARNm, se sintetiza in vitro en un sistema libre de células. Preferiblemente, los vectores de clonación se aplican para la generación de transcriptos. Estos vectores de clonación se designan generalmente como vectores de transcripción y, de acuerdo con la presente enseñanza, están abarcados por el término "vector". Los vectores de clonación son preferiblemente plásmidos. De acuerdo con las presentes enseñanzas, el ARN es preferiblemente ARN transcrito in vitro (IVT-ARN) y puede obtenerse mediante la transcripción in vitro de una plantilla de ADN apropiado. El promotor para controlar la transcripción puede ser cualquier promotor de cualquier ARN polimerasa. Puede obtenerse una plantilla de ADN para la transcripción in vitro clonando un ácido nucleico, en particular ADNc, e introduciéndolo en un vector apropiado para la transcripción in vitro. El ADNc puede obtenerse mediante transcripción inversa de ARN.

La molécula de ácido nucleico monocatenario producida durante la transcripción normalmente tiene una secuencia de ácido nucleico que es la secuencia complementaria de la plantilla.

De acuerdo con la divulgación, los términos "plantilla" o "plantilla de ácido nucleico" o "ácido nucleico plantilla" generalmente se refieren a una secuencia de ácido nucleico que puede replicarse o transcribirse.

El término "secuencia de control de la expresión" comprende, de acuerdo con los promotores de la enseñanza, secuencias de unión a ribosomas y otros elementos de control que controlan la transcripción de un gen o la traducción del ARN derivado. En realizaciones particulares de la enseñanza, se pueden regular las secuencias de control de la expresión. La estructura precisa de las secuencias de control de la expresión puede variar según la especie o el tipo de célula, pero normalmente incluye secuencias 5' no transcritas y 5' y 3' no traducidas implicadas en el inicio de la transcripción y traducción, respectivamente. Más específicamente, las secuencias de control de la expresión no transcritas en 5' incluyen una región promotora que abarca una secuencia promotora para el control de la transcripción del gen unido funcionalmente. Las secuencias de control de la expresión también pueden incluir secuencias potenciadoras o secuencias activadoras secuencia arriba. Una secuencia de control de la expresión de una molécula de ADN incluye habitualmente secuencias 5' no transcritas y 5' y 3' no traducidas tales como la caja TATA, secuencia de protección, secuencia CAAT y similares. Una secuencia de control de la expresión de ARN alfaviral puede incluir un promotor subgenómico y/o uno o más elementos de secuencia conservados. Una secuencia de control de expresión específica de acuerdo con la presente enseñanza es un promotor subgenómico de un alfavirus, como se describe en el presente documento.

El término "promotor" o "región promotora" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que controla la síntesis de una transcripción, por ejemplo, un transcrito que comprende una secuencia codificante, proporcionando un sitio de reconocimiento y unión para la ARN polimerasa. La región promotora puede incluir sitios de reconocimiento o unión adicionales para factores adicionales implicados en la regulación de la transcripción de dicho gen. Un promotor puede controlar la transcripción de un gen procariota o eucariota. Un promotor puede ser "inducible" e iniciar la transcripción en respuesta a un inductor, o puede ser "constitutivo" si la transcripción no está controlada por un inductor. Un promotor inducible se expresa solo en una extensión muy pequeña o no se expresa en absoluto, si no hay un inductor. En presencia del inductor, el gen se "enciende" o aumenta el nivel de transcripción. Esto suele estar mediado por la unión de un factor de transcripción específico. Un promotor específico de acuerdo con la presente enseñanza es un promotor subgenómico de un alfavirus, como se describe en el presente documento. Otros promotores específicos son los promotores genómicos de cadena positiva o de cadena negativa de un alfavirus.

El término "promotor central" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que está comprendida por el promotor. El promotor central es típicamente la porción mínima del promotor requerida para iniciar apropiadamente la transcripción. El promotor central incluye típicamente el sitio de inicio de la transcripción y un sitio de unión para la ARN polimerasa.

Las secuencias de ácido nucleico especificadas en el presente documento, en particular las secuencias de ácido nucleico codificables y transcribibles, pueden combinarse con cualquier secuencia de control de la expresión que pueda ser homóloga o heteróloga a dichas secuencias de ácido nucleico, refiriéndose el término "homólogo" al hecho de que una secuencia de ácido nucleico también está funcionalmente ligada de forma natural a la secuencia de control de expresión, y el término "heterólogo" se refiere al hecho de que una secuencia de ácido nucleico no está naturalmente ligada funcionalmente a la secuencia de control de expresión.

Una secuencia de ácido nucleico, en particular una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido o proteína, y una secuencia de control de expresión están "funcionalmente" unidas entre sí, si están unidas covalentemente entre sí de tal manera que la transcripción o la expresión de la secuencia de ácido nucleico transcribible y/o codificante está bajo el control o bajo la influencia de la secuencia de control de la expresión.

De acuerdo con la divulgación, "enlace funcional" o "enlazado funcionalmente" se refiere a una conexión dentro de una relación funcional. Un ácido nucleico está "funcionalmente unido" si está funcionalmente relacionado con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor está funcionalmente unido a una secuencia codificante si influye en la transcripción de dicha secuencia codificante. Los ácidos nucleicos unidos funcionalmente son típicamente adyacentes entre sí, cuando sea apropiado separados por secuencias de ácidos nucleicos adicionales.

En divulgaciones particulares, un ácido nucleico está unido funcionalmente de acuerdo con las enseñanzas a secuencias de control de la expresión que pueden ser homólogas o heterólogas con respecto al ácido nucleico.

Una "polimerasa" generalmente se refiere a una entidad molecular capaz de catalizar la síntesis de una molécula polimérica a partir de bloques de construcción monoméricos. Una "ARN polimerasa" es una entidad molecular capaz de catalizar la síntesis de una molécula de ARN a partir de bloques de construcción de ribonucleótidos. Una "ADN polimerasa" es una entidad molecular capaz de catalizar la síntesis de una molécula de ADN a partir de bloques de construcción de desoxirribonucleótidos. Para el caso de las ADN polimerasas y las ARN polimerasas, la entidad molecular es típicamente una proteína o un ensamblaje o complejo de múltiples proteínas. Normalmente, una ADN polimerasa sintetiza una molécula de ADN basada en un ácido nucleico plantilla, que normalmente es una molécula de ADN. Por lo general, una ARN polimerasa sintetiza una molécula de ARN basada en un ácido nucleico plantilla, que es una molécula de ADN (en ese caso, la ARN polimerasa es una ARN polimerasa dependiente de ADN, DdRP), o es una molécula de ARN (en ese caso, la ARN polimerasa es una ARN polimerasa dependiente de ARN, RdRP).

Una "ARN polimerasa dependiente de ARN" o "RdRP" es una enzima que cataliza la transcripción de ARN a partir de una plantilla de ARN. En el caso de la ARN polimerasa dependiente de ARN alfaviral, la síntesis secuencial del complemento de la cadena (-) del ARN genómico y del ARN genómico de cadena (+) conduce a la replicación del ARN. Por lo tanto, la ARN polimerasa alfaviral dependiente de ARN se denomina sinónimamente "ARN replicasa". En la naturaleza, las ARN polimerasas dependientes de ARN están codificadas típicamente por todos los virus de ARN excepto los retrovirus. Los representantes típicos de virus que codifican una ARN polimerasa dependiente de ARN son alfavirus.

De acuerdo con la presente divulgación, "replicación de ARN" generalmente se refiere a una molécula de ARN sintetizada con base en la secuencia de nucleótidos de una molécula de ARN dada (molécula de ARN plantilla). La molécula de ARN que se sintetiza puede ser, por ejemplo, idéntica o complementaria a la molécula de ARN plantilla. En general, la replicación del ARN puede ocurrir mediante la síntesis de un compuesto intermedio de ADN, o puede ocurrir directamente por la replicación del ARN dependiente del ARN mediada por una ARN polimerasa dependiente del ARN (RdRP). En el caso de los alfavirus, la replicación del ARN no se produce a través de un compuesto intermedio de ADN, sino que está mediada por una ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRP): una cadena de ARN plantilla (primera cadena de ARN), o una parte de la misma, sirve como plantilla para la síntesis de una segunda cadena de ARN que es complementaria de la primera cadena de ARN o de una parte de la misma. La segunda cadena de ARN, o una parte de la misma, puede a su vez servir opcionalmente como plantilla para la síntesis de una tercera cadena de ARN que es complementaria de la segunda cadena de ARN o de una parte de la misma. Por lo tanto, la tercera cadena de ARN es idéntica a la primera cadena de ARN o a una parte de la misma. Por lo tanto, la ARN polimerasa dependiente de ARN es capaz de sintetizar directamente una cadena de ARN complementaria de un plantilla y de sintetizar indirectamente una cadena de ARN idéntica (a través de una cadena intermedia complementaria).

De acuerdo con la divulgación, el término "ARN plantilla" se refiere a ARN que puede ser transcrito o replicado por una ARN polimerasa dependiente de ARN.

El ARN utilizado de acuerdo con la divulgación es el ARN replicón o simplemente "un replicón", en particular el ARN autorreplicante. En una realización particularmente preferida, el replicón o ARN autorreplicante se deriva de o comprende elementos derivados de un virus de ARNmc, en particular un virus de ARNmc de cadena positiva tal como un alfavirus.

En general, los virus de ARN son un grupo diverso de partículas infecciosas con un genoma de ARN. Los virus de ARN se pueden subdividir en virus de ARN monocatenario (ARNmc) y ARN bicatenario (ARNbc), y los virus de ARNmc se pueden dividir en general en virus de cadena positiva [cadena (+)] y/o de cadena negativa [cadena (-)]. Los virus de ARN de cadena positiva son en principio atractivos como sistema de administración en biomedicina porque su ARN puede servir directamente como plantilla para la traducción en la célula huésped.

Los alfavirus son representantes típicos de virus de ARN de cadena positiva. Los huéspedes de alfavirus incluyen una amplia gama de organismos, que comprenden insectos, peces y mamíferos, tales como animales domésticos y humanos. Los alfavirus se replican en el citoplasma de las células infectadas (para una revisión del ciclo de vida de los alfavirus, véase Jose et al., Future Microbiol., 2009, vol. 4, páginas 837-856). La longitud total del genoma de muchos alfavirus varía típicamente entre 11000 y 12000 nucleótidos, y el ARN genómico típicamente tiene una protección de 5' y una cola poli(A) de 3'. El genoma de los alfavirus codifica proteínas no estructurales (involucradas en la transcripción, modificación y replicación del ARN viral y en la modificación de proteínas) y proteínas estructurales (que forman la partícula viral). Por lo general, hay dos marcos de lectura abiertos (ORF) en el genoma. Las cuatro proteínas no estructurales (nsP1-nsP4) generalmente se codifican juntas por un primer ORF que comienza cerca del extremo 5' del genoma, mientras que las proteínas estructurales de alfavirus están codificadas juntas por un segundo ORF que se encuentra secuencia abajo del primer ORF y se extiende cerca del extremo 3' del genoma. Normalmente, el primer ORF es más grande que el segundo ORF, la relación es aproximadamente 2:1.

En las células infectadas por un alfavirus, solo la secuencia de ácido nucleico que codifica proteínas no estructurales se traduce del ARN genómico, mientras que la información genética que codifica proteínas estructurales es traducible a partir de una transcripto subgenómico, que es una molécula de ARN que se asemeja a un ARN mensajero eucariota (ARNm; Gould et al., 2010, Antiviral Res., Vol. 87 páginas 111-124). Después de la infección, es decir, en las primeras etapas del ciclo de vida viral, el ARN genómico de cadena (+) actúa directamente como un ARN mensajero para la traducción del marco de lectura abierto que codifica la poliproteína no estructural (nsP1234). En algunos alfavirus, hay un codón de parada de ópalo entre las secuencias codificantes de nsP3 y nsP4: la poliproteína P123, que contiene nsP1, nsP2 y nsP3, se produce cuando la traducción termina en el codón de parada de ópalo, y la poliproteína P1234, que contiene además nsP4, se produce tras la lectura de este codón de ópalo (Strauss & Strauss, Microbiol. Rev., 1994, vol. 58, páginas 491-562; Rupp et al., 2015, J. Gen. Virology, vol. 96, páginas 2483-2500). nsP1234 se escinde autoproteolíticamente en los fragmentos nsP123 y nsP4. Los polipéptidos nsP123 y nsP4 se asocian para formar el complejo de replicasa de cadena (-) que transcribe ARN de cadena (-), utilizando el ARN genómico de cadena (+) como plantilla. Típicamente, en etapas posteriores, el fragmento nsP123 se escinde completamente en proteínas individuales nsP1, nsP2 y nsP3 (Shirako & Strauss, 1994, J. Virol., Vol. 68, páginas 1874-1885). Las cuatro proteínas forman el complejo de replicasa de cadena (+) que sintetiza nuevos genomas de cadena (+), utilizando el complemento de cadena (-) de ARN genómico como plantilla (Kim et al., 2004, Virology, vol. 323, páginas 153- 163, Vasiljeva et al., 2003, J. Biol. Chem. Vol. 278, páginas 41636-41645).

En las células infectadas, el ARN subgenómico, así como el ARN genómico nuevo, se proporciona con una protección de 5' por nsP1 (Pettersson et al. 1980, Eur. J. Biochem. 105, 435-443; Rozanov et al., 1992 , J. Gen. Virology, vol. 73, páginas 2129-2134), y provista de una cola de poliadenilato [poli(A)] por nsP4 (Rubach et al., Virology, 2009, vol. 384, páginas 201-208). Por lo tanto, tanto el ARN subgenómico como el ARN genómico se parecen al ARN mensajero (ARNm).

Las proteínas estructurales de alfavirus están codificadas típicamente por un único marco de lectura abierto bajo el control de un promotor subgenómico (Strauss & Strauss, Microbiol. Rev., 1994, vol. 58, páginas 491-562). El promotor subgenómico es reconocido por proteínas no estructurales alfavirales que actúan en cis. En particular, la replicasa del alfavirus sintetiza un transcrito subgenómico de cadena (+) usando el complemento de cadena (-) de ARN genómico como plantilla. El transcrito subgenómico de cadena (+) codifica las proteínas estructurales del alfavirus (Kim et al., 2004, Virology, vol. 323, páginas 153-163, Vasiljeva et al., 2003, J. Biol. Chem. Vol. 278, páginas .41636-41645). El transcrito de ARN subgenómico sirve como plantilla para la traducción del marco de lectura abierto que codifica las proteínas estructurales como una poliproteína, y la poliproteína se escinde para producir las proteínas estructurales. En una etapa tardía de la infección por alfavirus en una célula huésped, una señal de empaquetamiento que se encuentra dentro de la secuencia codificante de nsP2 asegura el empaquetamiento selectivo de ARN genómico en viriones en gemación, empaquetados por proteínas estructurales (White et al., 1998, J. Virol. , vol. 72, páginas 4320 4326).

En las células infectadas, la síntesis de ARN de la cadena (-) se observa típicamente solo en las primeras 3-4 h después de la infección, y es indetectable en las etapas tardías, momento en el que se observa únicamente la síntesis de ARN de la cadena (+) (tanto genómica como subgenómico). De acuerdo con Frolov et al., 2001, RNA, vol. 7, páginas 1638-1651, el modelo predominante para la regulación de la síntesis de ARN sugiere una dependencia del procesamiento de la poliproteína no estructural: la escisión inicial de la poliproteína no estructural nsP1234 produce nsP123 y nsP4; nsP4 actúa como ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRp) que es activa para la síntesis de cadena (-), pero ineficaz para la generación de ARN de cadena (+). El procesamiento adicional de la poliproteína nsP123, incluida la escisión en la unión nsP2/nsP3, cambia la especificidad de la plantilla de la replicasa para aumentar la síntesis de ARN de cadena (+) y disminuir o terminar la síntesis de ARN de cadena (-).

La síntesis de ARN alfaviral también está regulada por elementos de ARN que actúan en cis, incluidos cuatro elementos de secuencia conservados (CSE; Strauss & Strauss, Microbiol. Rev., 1994, vol. 58, páginas 491-562; y Frolov, 2001, RNA, vol. 7, páginas 1638-1651).

En general, la secuencia de reconocimiento de replicación 5' del genoma del alfavirus se caracteriza por una baja homología global entre diferentes alfavirus, pero tiene una estructura secundaria predicha conservada. La secuencia de reconocimiento de la replicación 5' del genoma del alfavirus no solo está involucrada en el inicio de la traducción, sino que también comprende la secuencia de reconocimiento de la replicación 5' que comprende dos elementos de secuencia conservados involucrados en la síntesis de ARN viral, CSE 1 y CSE 2. Para la función de CSE 1 y 2, se cree que la estructura secundaria es más importante que la secuencia lineal (Strauss & Strauss, Microbiol. Rev., 1994, vol. 58, páginas 491-562).

Por el contrario, la secuencia terminal 3' del genoma del alfavirus, es decir, la secuencia inmediatamente secuencia arriba de la secuencia de poli(A), se caracteriza por una estructura primaria conservada, particularmente por el elemento de secuencia conservado 4 (CSE 4), también denominado "secuencia conservada de 19 nt", que es importante para el inicio de la síntesis de la cadena (-).

El CSE 3, también denominado "secuencia de unión" es un elemento de secuencia conservada en la cadena (+) del ARN genómico alfaviral, y el complemento de CSE 3 en la cadena (-) actúa como promotor de la transcripción del ARN subgenómico (Strauss & Strauss, Microbiol. Rev., 1994, vol. 58, páginas 491-562; Frolov et al., 2001, RNA, vol.

7, páginas 1638-1651). CSE 3 típicamente se superpone con la región que codifica el fragmento del terminal C de nsP4.

Además de las proteínas de alfavirus, también los factores de la célula huésped, presumiblemente proteínas, pueden unirse a elementos de secuencia conservados (Strauss & Strauss, citado anteriormente).

Se han propuesto vectores derivados de alfavirus para el suministro de información genética extraña en células diana u organismos diana. En enfoques simples, el marco de lectura abierto que codifica proteínas estructurales alfavirales se reemplaza por un marco de lectura abierto que codifica una proteína de interés. Los sistemas de replicación trans basados en alfavirus se basan en elementos de secuencia de nucleótidos de alfavirus en dos moléculas de ácido nucleico separadas: una molécula de ácido nucleico codifica una replicasa viral (típicamente como poliproteína nsP1234), y la otra molécula de ácido nucleico es capaz de ser replicada por dicha replicasa en trans (de ahí la designación de sistema de transreplicación). La transreplicación requiere la presencia de estas dos moléculas de ácido nucleico en una célula huésped determinada. La molécula de ácido nucleico capaz de ser replicada por la replicasa en trans debe comprender ciertos elementos de la secuencia alfaviral para permitir el reconocimiento y la síntesis de ARN por la replicasa alfaviral.

De acuerdo con las enseñanzas, el término "alfavirus" debe entenderse ampliamente e incluye cualquier partícula de virus que tenga características de alfavirus. Las características del alfavirus incluyen la presencia de un ARN de cadena (+) que codifica información genética adecuada para la replicación en una célula huésped, incluida la actividad de la ARN polimerasa. Se divulgan características adicionales de muchos alfavirus, por ejemplo, en Strauss & Strauss, Microbiol. Rev., 1994, vol. 58, páginas 491-562. El término "alfavirus" incluye alfavirus que se encuentran en la naturaleza, así como cualquier variante o derivado del mismo. En algunas realizaciones, no se encuentra una variante o derivado en la naturaleza.

En una realización, el alfavirus es un alfavirus que se encuentra en la naturaleza. Normalmente, un alfavirus que se encuentra en la naturaleza es infeccioso para uno o más organismos eucariotas, tal como un animal (incluyendo un vertebrado tal como un ser humano y un artrópodo tal como un insecto).

Un alfavirus que se encuentra en la naturaleza se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en lo siguiente: complejo de virus del bosque de Barmah (que comprende el virus del bosque de Barmah); complejo de encefalitis equina del este (que comprende siete tipos antigénicos del virus de la encefalitis equina del este); complejo del virus de Middelburg (que comprende el virus de Middelburg); complejo del virus Ndumu (que comprende el virus de Ndumu); complejo del virus del bosque Semliki (que comprende el virus de Bebaru, el virus de Chikungunya, el virus de Mayaro y su subtipo el virus de Una, el virus de O'Nyong Nyong y su subtipo el virus de Igbo-Ora, virus del rio Rose y sus subtipos virus de Bebaru, virus de Getah, virus de Sagiyama, virus del bosque de Semliki y su subtipo virus de Me Tri); complejo de encefalitis equina venezolana (que comprende virus de Cabassou, virus de los Everglades, virus Mosso das Pedras, virus de Mucambo, virus de Paramana, virus de Pixuna, virus del Río Negro, virus de Trocara y su subtipo el virus del Puente Bijou, virus de encefalitis equina venezolana); complejo de encefalitis equina occidental (que comprende el virus de Aura, virus de Babanki, virus de Kyzylagach, virusde Sindbis, virus de Ockelbo, virus de Whataroa, virus de la ensenada Buggy, virus de Fort Morgan, virus de Highlands J, virus de encefalitis equina occidental); y algunos virus no clasificados, incluido el virus de la enfermedad pancreática del salmón; virus de la enfermedad del sueño; virus del elefante marino del sur; virus de Tonate. Más preferiblemente, el alfavirus se selecciona del grupo que consiste en el complejo de virus del bosque de Semliki (que comprende los tipos de virus como se indicó anteriormente, incluido el virus del bosque de Semliki), el complejo de encefalitis equina occidental (que comprende los tipos de virus como se indicó anteriormente, incluido el virus Sindbis), virus de la encefalitis equina oriental (que comprende los tipos de virus indicados anteriormente), complejo de encefalitis equina venezolana (que comprende los tipos de virus indicados anteriormente, incluido el virus de la encefalitis equina venezolana).

En una realización preferida adicional, el alfavirus es el virus del bosque de Semliki. En una realización alternativa adicional preferida, el alfavirus es el virus Sindbis. En una realización alternativa adicional preferida, el alfavirus es el virus de la encefalitis equina venezolana.

En algunas realizaciones de la presente enseñanza, el alfavirus no es un alfavirus que se encuentre en la naturaleza. Normalmente, un alfavirus que no se encuentra en la naturaleza es una variante o derivado de un alfavirus que se encuentra en la naturaleza, que se distingue de un alfavirus que se encuentra en la naturaleza por al menos una mutación en la secuencia de nucleótidos, es decir, el ARN genómico. La mutación en la secuencia de nucleótidos puede seleccionarse de una inserción, una sustitución o una eliminación de uno o más nucleótidos, en comparación con un alfavirus que se encuentra en la naturaleza. Una mutación en la secuencia de nucleótidos puede o no estar asociada con una mutación en un polipéptido o proteína codificada por la secuencia de nucleótidos. Por ejemplo, un alfavirus que no se encuentra en la naturaleza puede ser un alfavirus atenuado. Un alfavirus atenuado que no se encuentra en la naturaleza es un alfavirus que típicamente tiene al menos una mutación en su secuencia de nucleótidos por lo cual se distingue de un alfavirus que se encuentra en la naturaleza, y que no es infeccioso en absoluto, o que es infeccioso pero tiene una menor capacidad para producir enfermedades o ninguna capacidad para producir enfermedades. Como ejemplo ilustrativo, TC83 es un alfavirus atenuado que se distingue del virus de la encefalitis equina venezolana (VEEV) que se encuentra en la naturaleza (McKinney et al., 1963, Am. J. Trop. Med. Hyg., 1963, vol. 12; páginas 597-603).

Los miembros del género alfavirus también pueden clasificarse basándose en sus características clínicas relativas en humanos: alfavirus asociados principalmente con encefalitis y alfavirus asociados principalmente con fiebre, erupción cutánea y poliartritis.

El término "alfavirus" significa que se encuentra en un alfavirus, o que se origina a partir de un alfavirus o se deriva de un alfavirus, por ejemplo, por ingeniería genética.

"SFV" significa virus del bosque de Semliki. De acuerdo con la enseñanza, "SIN" o "SINV" significa virus Sindbis. De acuerdo con la enseñanza, "VEE" o "VEEV" significa virus de la encefalitis equina venezolana.

El término "de un alfavirus" o "derivado de un alfavirus" se refiere a una entidad que se origina en un alfavirus. A modo de ilustración, una proteína de un alfavirus puede referirse a una proteína que se encuentra en un alfavirus y/o una proteína que está codificada por un alfavirus; y una secuencia de ácido nucleico de un alfavirus puede referirse a una secuencia de ácido nucleico que se encuentra en alfavirus y/o a una secuencia de ácido nucleico que está codificada por alfavirus. Preferiblemente, una secuencia de ácido nucleico "de un alfavirus" se refiere a una secuencia de ácido nucleico "del genoma de un alfavirus" y/o "de ARN genómico de un alfavirus".

De acuerdo con la divulgación, el término "ARN alfaviral" se refiere a uno o más ARN genómico alfaviral (es decir, cadena (+)), complemento de ARN genómico alfaviral (es decir, cadena (-)) y la transcripto subgenómico (es decir cadena (+)), o un fragmento de cualquiera de los mismos.

De acuerdo con la divulgación, "genoma de alfavirus" se refiere a ARN de cadena genómica (+) de un alfavirus.

De acuerdo con la divulgación, el término "secuencia de alfavirus nativa" y términos similares se refieren típicamente a una secuencia (por ejemplo, de ácido nucleico) de un alfavirus de origen natural (alfavirus que se encuentra en la naturaleza). En algunas realizaciones, el término "secuencia de alfavirus nativa" también incluye una secuencia de un alfavirus atenuado.

De acuerdo con la divulgación, el término "secuencia de reconocimiento de replicación 5'" se refiere preferiblemente a una secuencia de ácido nucleico continua, preferiblemente una secuencia de ácido ribonucleico, que es idéntica u homóloga a un fragmento 5' del genoma del alfavirus. La "secuencia de reconocimiento de replicación 5'" es una secuencia de ácido nucleico que puede ser reconocida por una replicasa alfaviral. El término secuencia de reconocimiento de replicación 5' incluye secuencias de reconocimiento de replicación de 5' nativas así como equivalentes funcionales de las mismas, tales como, por ejemplo, variantes funcionales de una secuencia de reconocimiento de replicación 5' de alfavirus que se encuentra en la naturaleza. La secuencia de reconocimiento de la replicación de 5' es necesaria para la síntesis del complemento de cadena (-) del ARN genómico de alfavirus, y es necesaria para la síntesis de ARN genómico viral de cadena (+) con base en una plantilla de cadena (-). Una secuencia de reconocimiento de replicación 5' nativa típicamente codifica al menos el fragmento del terminal N de nsP1; pero no comprende todo el marco de lectura abierto que codifica nsP1234. En vista del hecho de que una secuencia de reconocimiento de replicación 5' nativa típicamente codifica al menos el fragmento del terminal N de nsP1, una secuencia de reconocimiento de replicación 5' nativa típicamente comprende al menos un codón de iniciación, típicamente AUG. En una realización, la secuencia de reconocimiento de replicación 5' comprende el elemento 1 de secuencia conservada de un genoma de alfavirus (CSE 1) o una variante del mismo y el elemento 2 de secuencia conservada de un genoma de alfavirus (CSE 2) o una variante del mismo. La secuencia de reconocimiento de replicación 5' típicamente es capaz de formar cuatro bucles de tallo (SL), es decir, SL1, SL2, SL3, SL4. La numeración de estos bucles de tallo comienza en el extremo 5' de la secuencia de reconocimiento de replicación 5'.

De acuerdo con la divulgación, el término "secuencia de reconocimiento de replicación 3'" se refiere preferiblemente a una secuencia de ácido nucleico continua, preferiblemente una secuencia de ácido ribonucleico, que es idéntica u homóloga a un fragmento 3' del genoma del alfavirus. La "secuencia de reconocimiento de replicación 3'" es una secuencia de ácido nucleico que puede ser reconocida por una replicasa alfaviral. El término secuencia de reconocimiento de replicación 3' incluye secuencias de reconocimiento de replicación 3' nativas así como equivalentes funcionales de las mismas, tales como, por ejemplo, variantes funcionales de una secuencia de reconocimiento de replicación 3' de alfavirus que se encuentra en la naturaleza. La secuencia de reconocimiento de la replicación 3' es necesaria para la síntesis del complemento de cadena (-) del ARN genómico del alfavirus. En una realización, la secuencia de reconocimiento de replicación 3' comprende el elemento 4 de secuencia conservada de un genoma de alfavirus (CSE 4) o una variante del mismo y, opcionalmente, la cola de poli(A) de un genoma de alfavirus.

El término "elemento de secuencia conservada" o "CSE" se refiere a una secuencia de nucleótidos que se encuentra en el ARN de alfavirus. Estos elementos de secuencia se denominan "conservados" porque los ortólogos están presentes en el genoma de diferentes alfavirus, y los CSE ortólogos de diferentes alfavirus comparten preferiblemente un alto porcentaje de identidad de secuencia y/o una estructura secundaria o terciaria similar. El término CSE incluye CSE 1, CSE 2, CSE 3 y CSE 4.

De acuerdo con la divulgación, los términos "CSE 1" o "CSE de 44 nt" se refieren como sinónimos a una secuencia de nucleótidos que se requiere para la síntesis de la cadena (+) a partir de un plantilla de la cadena (-). El término "CSE 1" se refiere a una secuencia en la cadena (+); y la secuencia complementaria de CSE 1 (en la cadena (-)) funciona como un promotor para la síntesis de la cadena (+). Preferiblemente, el término CSE 1 incluye la mayoría de nucleótidos 5' del genoma del alfavirus. El CSE 1 forma típicamente una estructura de tallo-bucle conservada. Sin desear estar ligado a una teoría particular, se cree que, para CSE 1, la estructura secundaria es más importante que la estructura primaria, es decir, la secuencia lineal. En el ARN genómico del modelo de alfavirus del virus Sindbis, CSE 1 consta de una secuencia consecutiva de 44 nucleótidos, que está formado por la mayoría de los 44 nucleótidos 5' del ARN genómico (Strauss & Strauss, Microbiol. Rev., 1994, vol. 58, páginas 491-562).

De acuerdo con la divulgación, los términos "CSE 2" o "CSE de 51 nt" se refieren como sinónimos a una secuencia de nucleótidos que se requiere para la síntesis de la cadena (-) a partir de un plantilla de la cadena (+). La plantilla de la cadena (+) es típicamente a Rn genómico de alfavirus o un replicón de ARN (téngase en cuenta que la transcripto subgenómico de ARN, que no comprende CSE 2, no funciona como una plantilla para la síntesis de la cadena (-)). En el ARN genómico de alfavirus, CSE 2 se localiza típicamente dentro de la secuencia codificante de nsP1. En el ARN genómico del modelo de alfavirus del virus Sindbis, el CSE de 51 nt se localiza en las posiciones de nucleótidos 155 205 del ARN genómico (Frolov et al., 2001, RNA, vol. 7, páginas 1638-1651). CSE 2 forma típicamente dos estructuras de bucle de tallo conservadas. Estas estructuras de bucle de tallo se designan como bucle de tallo 3 (SL3) y bucle de tallo 4 (SL4) porque son el tercer y cuarto bucle de tallo conservado, respectivamente, del ARN genómico del alfavirus, contado desde el extremo 5' del ARN genómico del alfavirus. Sin desear estar ligado a una teoría particular, se cree que, para CSE 2, la estructura secundaria es más importante que la estructura primaria, es decir, la secuencia lineal.

De acuerdo con la divulgación, los términos "CSE 3" o "secuencia de unión" se refieren como sinónimos a una secuencia de nucleótidos que se deriva del ARN genómico alfaviral y que comprende el sitio de inicio del ARN subgenómico. El complemento de esta secuencia en la cadena (-) actúa para promover la transcripción del ARN subgenómico. En el a Rn genómico de alfavirus, CSE 3 se solapa típicamente con la región que codifica el fragmento del terminal C de nsP4 y se extiende a una región corta no codificante ubicada secuencia arriba del marco de lectura abierto que codifica las proteínas estructurales.

De acuerdo con la divulgación, los términos "CSE 4" o "secuencia conservada de 19 nt" o "CSE de 19 nt" se refieren como sinónimos a una secuencia de nucleótidos del ARN genómico alfaviral, inmediatamente secuencia arriba de la secuencia de poli(A) en la región 3' no traducida del genoma del alfavirus. El CSE 4 normalmente consta de 19 nucleótidos consecutivos. Sin desear estar ligado a una teoría en particular, se entiende que el CSE 4 funciona como un promotor central para el inicio de la síntesis de la cadena (-) (Jose et al., Future Microbiol., 2009, vol. 4, páginas 837-856) ; y/o CSE 4 y la cola de poli(A) del ARN genómico del alfavirus se entiende que funcionan juntos para una síntesis eficiente de la cadena (-) (Hardy & Rice, J. Virol., 2005, vol. 79, páginas 4630-4639 ).

De acuerdo con la divulgación, el término "promotor subgenómico" o "SGP" se refiere a una secuencia de ácido nucleico secuencia arriba (5') de una secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, secuencia codificante), que controla la transcripción de dicha secuencia de ácido nucleico proporcionando un sitio de reconocimiento y unión para la ARN polimerasa, típicamente ARN polimerasa dependiente de ARN, en particular proteína funcional no estructural de alfavirus. El SGP puede incluir más sitios de reconocimiento o unión para factores adicionales. Un promotor subgenómico es típicamente un elemento genético de un virus de ARN de cadena positiva, tal como un alfavirus. Un promotor subgenómico de alfavirus es una secuencia de ácido nucleico comprendida en el ARN genómico viral. El promotor subgenómico se caracteriza generalmente porque permite el inicio de la transcripción (síntesis de ARN) en presencia de una ARN polimerasa dependiente de ARN, por ejemplo, proteína no estructural funcional del alfavirus. Una cadena de ARN (-), es decir, el complemento del ARN genómico alfaviral, sirve como plantilla para la síntesis de un transcripto subgenómico de cadena (+), y la síntesis del transcripto subgenómico de cadena (+) se inicia típicamente en o cerca del promotor subgenómico. El término "promotor subgenómico", como se usa en este documento, no se limita a ninguna localización particular en un ácido nucleico que comprende tal promotor subgenómico. En algunas realizaciones, el SGP es idéntico al CSE 3 o se solapa con el CSE 3 o comprende el CSE 3.

Los términos "transcripto subgenómico" o "ARN subgenómico" se refieren como sinónimos a una molécula de ARN que se puede obtener como resultado de la transcripción usando una molécula de ARN como plantilla ("ARN plantilla"), en el que el ARN plantilla comprende un promotor subgenómico que controla la transcripción del transcripto subgenómico. El transcripto subgenómico se puede obtener en presencia de una ARN polimerasa dependiente de ARN, en particular una proteína funcional no estructural de alfavirus. Por ejemplo, el término "transcripto subgenómico" puede referirse al transcripto de ARN que se prepara en una célula infectada por un alfavirus, utilizando el complemento de cadena (-) del ARN genómico de alfavirus como plantilla. Sin embargo, el término "transcripto subgenómico", como se usa en el presente documento, no se limita al mismo y también incluye transcriptos que se pueden obtener usando ARN heterólogo como plantilla. Por ejemplo, los transcriptos subgenómicos también se pueden obtener usando el complemento de cadena (-) de replicones que contienen SGP de acuerdo con las presentes enseñanzas como plantilla. Por lo tanto, el término "transcripto subgenómico" puede referirse a una molécula de ARN que se puede obtener transcribiendo un fragmento de ARN genómico de alfavirus, así como a una molécula de ARN que se puede obtener transcribiendo un fragmento de un replicón de acuerdo con la presente enseñanza.

De acuerdo con la enseñanza, un constructo de ácido nucleico que es capaz de ser replicada por una replicasa, preferiblemente una replicasa alfaviral, se denomina replicón. De acuerdo con la enseñanza, el término "replicón" define una molécula de ARN que puede ser replicada por la ARN polimerasa dependiente de ARN, produciendo, sin compuesto intermedio de ADN, una o múltiples copias idénticas o esencialmente idénticas del replicón de ARN. "Sin compuesto intermedio de ADN" significa que no se forma una copia o complemento de ácido desoxirribonucleico (ADN) del replicón en el proceso de formación de las copias del replicón de ARN, y/o que no se usa ninguna molécula de ácido desoxirribonucleico (ADN) como plantilla en el proceso de formación de las copias del replicón de ARN, o complemento del mismo. La función replicasa la proporciona típicamente la proteína no estructural funcional del alfavirus.

De acuerdo con la divulgación, los términos "puede replicarse" y "capaz de replicarse" divulgan generalmente que se pueden preparar una o más copias idénticas o esencialmente idénticas de un ácido nucleico. Cuando se usa junto con el término "replicasa", tal como en "capaz de ser replicado por una replicasa", los términos "puede replicarse" y "capaz de replicarse" describen características funcionales de una molécula de ácido nucleico, por ejemplo, un replicón de ARN, con respecto a una replicasa. Estas características funcionales comprenden al menos una de (i) la replicasa es capaz de reconocer el replicón y (ii) la replicasa es capaz de actuar como ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRP). Preferiblemente, la replicasa es capaz de (i) reconocer el replicón y (ii) actuar como ARN polimerasa dependiente de ARN.

La expresión "capaz de reconocer" describe que la replicasa es capaz de asociarse físicamente con el replicón y, preferiblemente, que la replicasa es capaz de unirse al replicón, típicamente de forma no covalente. El término "unión" puede significar que la replicasa tiene la capacidad de unirse a uno o más de un elemento de secuencia conservada 1 (CSE 1) o secuencia complementaria del mismo (si está comprendido por el replicón), elemento de secuencia conservada 2 (CSE 2) o secuencia complementaria del mismo (si está comprendido por el replicón), elemento de secuencia conservada 3 (CSE 3) o secuencia complementaria del mismo (si está comprendido por el replicón), elemento de secuencia conservado 4 (CSE 4) o secuencia complementaria del mismo (si está comprendido por el replicón). Preferiblemente, la replicasa es capaz de unirse a CSE 2 [es decir a la cadena (+)] y/o al c Se 4 [es decir a la cadena (+)], o de unión al complemento de CSE 1 [es decir a la cadena (-)] y/o al complemento de CSE 3 [es decir a la cadena (-)].

La expresión "capaz de actuar como RdRP" significa que la replicasa es capaz de catalizar la síntesis del complemento de cadena (-) de ARN genómico alfaviral de cadena (+), en el que el ARN de cadena (+) tiene función de plantilla, y/o que la replicasa es capaz de catalizar la síntesis de ARN genómico alfaviral de cadena (+), en el que el ARN de cadena (-) tiene función de plantilla. En general, la expresión "capaz de actuar como RdRP" también puede incluir que la replicasa es capaz de catalizar la síntesis de un transcripto subgenómico de cadena (+) en el que un ARN de cadena (-) tiene una función de plantilla, y en el que la síntesis del transcripto subgenómico de cadena (+) se inicia típicamente en un promotor subgenómico de alfavirus.

Las expresiones "capaz de unirse" y "capaz de actuar como RdRP" se refieren a la capacidad en condiciones fisiológicas normales. En particular, se refieren a las condiciones dentro de una célula, que expresa una proteína no estructural funcional del alfavirus o que ha sido transfectada con un ácido nucleico que codifica una proteína no estructural funcional del alfavirus. La célula es preferiblemente una célula eucariota. La capacidad de unión y/o la capacidad de actuar como RdRP se pueden probar experimentalmente, por ejemplo, en un sistema in vitro sin células o en una célula eucariota. Opcionalmente, dicha célula eucariota es una célula de una especie para la que el alfavirus particular que representa el origen de la replicasa es infeccioso. Por ejemplo, cuando se usa la replicasa de alfavirus de un alfavirus particular que es infeccioso para los seres humanos, las condiciones fisiológicas normales son las condiciones en una célula humana. Más preferiblemente, la célula eucariota (en un ejemplo, célula humana) es del mismo tejido u órgano para el que el alfavirus particular que representa el origen de la replicasa es infeccioso.

De acuerdo con la divulgación, "comparado con una secuencia de alfavirus nativa" y términos similares se refieren a una secuencia que es una variante de una secuencia de alfavirus nativa. Típicamente, la variante no es en sí misma una secuencia de alfavirus nativa.

El replicón de ARN comprende una secuencia de reconocimiento de replicación tal como una secuencia de reconocimiento de replicación 5' y una secuencia de reconocimiento de replicación 3'. Una secuencia de reconocimiento de replicación es una secuencia de ácido nucleico que puede ser reconocida por una proteína no estructural funcional de alfavirus. En otras palabras, la proteína no estructural funcional del alfavirus es capaz de reconocer la secuencia de reconocimiento de replicación. Preferiblemente, la secuencia de reconocimiento de replicación 5' está ubicada en el extremo 5' del replicón. En una realización, la secuencia de reconocimiento de replicación 5' consiste en o comprende CSE 1 y 2. Preferiblemente, la secuencia de reconocimiento de replicación 3' está ubicada en el extremo 3' del replicón (si el replicón no comprende una cola de poli(A)), o inmediatamente secuencia arriba de la cola de poli(A) (si el replicón comprende una cola de poli(A)). En una realización, la secuencia de reconocimiento de replicación 3' consiste en o comprende CSE 4.

La secuencia de reconocimiento de replicación 5' y la secuencia de reconocimiento de replicación 3' son capaces de dirigir la replicación del replicón de a Rn en presencia de una proteína no estructural funcional del alfavirus. Por lo tanto, cuando están presentes solas o preferiblemente juntas, estas secuencias de reconocimiento dirigen la replicación del replicón de ARN en presencia de proteína no estructural funcional del alfavirus.

Se divulga preferiblemente que una proteína funcional no estructural del alfavirus se proporciona en cis (codificada como proteína de interés por un marco de lectura abierto en el replicón) o en trans (codificada como proteína de interés por un marco de lectura abierto en un constructo de replicasa separado, que es capaz de reconocer tanto la secuencia de reconocimiento de replicación 5' como la secuencia de reconocimiento de replicación 3' del replicón. Esto se logra cuando las secuencias de reconocimiento de replicación 5' y 3' son nativas del alfavirus del cual se deriva la proteína no estructural funcional del alfavirus. Nativa significa que el origen natural de estas secuencias es el mismo alfavirus. En una divulgación alternativa, la secuencia de reconocimiento de replicación 5' y/o la secuencia de reconocimiento de replicación 3' no son nativas del alfavirus del cual se deriva la proteína no estructural funcional del alfavirus, siempre que la proteína no estructural funcional del alfavirus sea capaz de reconocer tanto la secuencia de reconocimiento de la replicación 5' como la secuencia de reconocimiento de replicación 3' del replicón. En otras palabras, la proteína no estructural funcional del alfavirus es compatible con la secuencia de reconocimiento de replicación 5' y la secuencia de reconocimiento de replicación 3'. Cuando una proteína no estructural funcional no nativa del alfavirus es capaz de reconocer una secuencia o elemento de secuencia respectivo, se dice que la proteína no estructural funcional del alfavirus es compatible (compatibilidad entre virus). Cualquier combinación de secuencias de reconocimiento de replicación (3'/5') y CSE, respectivamente, con proteína no estructural funcional del alfavirus es posible siempre que exista compatibilidad entre virus. La compatibilidad entre virus puede ser probada fácilmente por el experto en la presente enseñanza incubando una proteína no estructural funcional de alfavirus que se probará junto con un ARN, en el que el ARN tiene secuencias de reconocimiento de replicación 3' y 5' que se probarán en condiciones adecuadas para la replicación del ARN, por ejemplo en una célula huésped adecuada. Si se produce la replicación, se determina que las secuencias de reconocimiento de replicación (3'/5') y la proteína no estructural funcional del alfavirus son compatibles.

En una realización de la divulgación, el replicón es parte de un sistema de replicación trans y, por lo tanto, el replicón es un replicón trans. En esta realización, se prefiere que el replicón de ARN no comprenda un marco de lectura abierto que codifique una proteína no estructural funcional del alfavirus. Por lo tanto, la divulgación proporciona un sistema que comprende dos moléculas de ácido nucleico: un primer constructo de ARN para expresar una proteína no estructural funcional del alfavirus (es decir, que codifica una proteína no estructural funcional del alfavirus); y una segunda molécula de ARN, el replicón de ARN. El constructo de ARN para expresar proteína no estructural funcional del alfavirus se denomina de manera sinónima en el presente documento como "constructo de ARN para expresar proteína no estructural funcional del alfavirus" o como "constructo de replicasa". La proteína no estructural funcional del alfavirus es como se definió anteriormente y típicamente está codificada por un marco de lectura abierto compuesto por el constructo de replicasa. La proteína no estructural funcional del alfavirus codificada por el constructo de replicasa puede ser cualquier proteína no estructural funcional del alfavirus que sea capaz de replicar el replicón. De acuerdo con las enseñanzas, el constructo de replicasa puede estar presente con el replicón o replicones dentro de la misma composición, por ejemplo, como formulación de partículas mixtas o formulación de partículas combinadas, o en composiciones separadas, por ejemplo, como formulaciones de partículas individuales. Cuando el sistema de la presente enseñanza se introduce en una célula, preferiblemente una célula eucariota, se puede traducir el marco de lectura abierto que codifica la proteína no estructural funcional del alfavirus. Después de la traducción, la proteína no estructural funcional del alfavirus es capaz de replicar una molécula de ARN separada (replicón de ARN) en trans.

En este documento, trans (por ejemplo, en el contexto de actuar en forma trans, regulador en forma trans), en general, significa "actuar a partir de una molécula diferente" (es decir, intermolecular). Es lo opuesto a cis (por ejemplo, en el contexto de actuar en forma cis, regulador en forma cis), que, en general, significa "actuar a partir de la misma molécula" (es decir, intramolecular). En el contexto de la síntesis de ARN (incluidas la transcripción y la replicación de ARN), un elemento que actúa en forma trans incluye una secuencia de ácido nucleico que contiene un gen que codifica una enzima capaz de síntesis de ARN (ARN polimerasa). La ARN polimerasa utiliza una segunda molécula de ácido nucleico, es decir, una molécula de ácido nucleico distinta de la que la codifica, como plantilla para la síntesis de ARN. Se dice que tanto la ARN polimerasa como la secuencia de ácido nucleico que contiene un gen que codifica la ARN polimerasa "actúan en forma trans" sobre la segunda molécula de ácido nucleico. En el contexto de la presente enseñanza, la ARN polimerasa codificada por el ARN que actúa en forma trans puede ser una proteína no estructural funcional del alfavirus. La proteína no estructural funcional del alfavirus es capaz de utilizar una segunda molécula de ácido nucleico, que es un replicón de ARN, como plantilla para la síntesis o ARN, incluida la replicación del replicón de ARN. El replicón de ARN que puede ser replicado por la replicasa en forma trans de acuerdo con las presentes enseñanzas se denomina como sinónimo en el presente documento como "replicón trans".

De acuerdo con la presente enseñanza, el papel de la proteína no estructural funcional del alfavirus es amplificar el replicón y preparar un transcripto subgenómico, si un promotor subgenómico está presente en el replicón. Si el replicón codifica un gen de interés para la expresión, los niveles de expresión del gen de interés y/o la duración de la expresión pueden regularse en forma trans modificando los niveles de la proteína no estructural funcional del alfavirus.

El sistema de replicación trans de la presente enseñanza comprende al menos dos moléculas de ácido nucleico. En una realización preferida, el sistema consta de exactamente dos moléculas de ARN, el replicón y el constructo de replicasa. En realizaciones preferidas alternativas, el sistema comprende más de un replicón, cada uno de los cuales preferiblemente codifica al menos una proteína de interés, y también comprende el constructo de replicasa. En estas realizaciones, la proteína no estructural funcional del alfavirus codificada por el constructo de replicasa puede actuar sobre cada replicón para impulsar la replicación y opcionalmente la producción de transcriptos subgenómicos, respectivamente. Por ejemplo, cada replicón puede codificar un péptido o proteína farmacéuticamente activo. Esto es ventajoso, por ejemplo, si se desea la vacunación de un sujeto contra varios antígenos diferentes.

Preferiblemente, el constructo de replicasa carece de al menos un elemento de secuencia conservada (CSE) que se requiere para la síntesis de la cadena (-) con base en un plantilla de cadena (+) y/o para la síntesis de la cadena (+) con base en una plantilla de cadena (-). Más preferiblemente, el constructo de replicasa no comprende ningún elemento de secuencia conservada (CSE) alfaviral. En particular, entre los cuatro CSE de alfavirus (Strauss & Strauss, Microbiol. Rev., 1994, vol. 58, páginas 491-562; Jose et al., Future Microbiol., 2009, vol. 4, páginas 837- 856), cualquiera o más de los siguientes CSE preferiblemente no están presentes en el constructo de replicasa: CSE 1; CSE 2; CSE 3; CSE 4. Particularmente en ausencia de uno o más CSE alfavirales, el constructo de replicasa de la presente enseñanza se parece mucho más al ARNm eucariota típico que al ARN genómico alfaviral.

El constructo de replicasa de la presente divulgación se distingue preferiblemente del ARN genómico alfaviral al menos en que no es capaz de autorreplicarse y/o que no comprende un marco de lectura abierto bajo el control de un promotor subgenómico. Cuando no se puede autorreplicar, el constructo de replicasa también puede denominarse "constructo suicida".

El constructo de replicasa de acuerdo con la presente divulgación es preferiblemente una molécula de ARN monocatenaria. El constructo de replicasa de acuerdo con las presentes enseñanzas es típicamente una molécula de ARN de cadena (+). En una realización, el constructo de replicasa de la presente enseñanza es una molécula de ácido nucleico aislada.

El ARN, tal como el replicón, comprende al menos un marco de lectura abierto que codifica un péptido de interés o una proteína de interés. El péptido o proteína de interés está codificado por una secuencia de ácido nucleico heteróloga. De acuerdo con la presente divulgación, el término "heterólogo" se refiere al hecho de que una secuencia de ácido nucleico no está naturalmente unida funcional o estructuralmente a una secuencia nucleica tal como una secuencia de ácido nucleico de alfavirus.

El ARN de acuerdo con la presente divulgación puede codificar un solo polipéptido o múltiples polipéptidos. Pueden codificarse múltiples polipéptidos como un único polipéptido (polipéptido de fusión) o como polipéptidos separados. De acuerdo con esto el ARN puede comprender más de un marco de lectura abierto, cada uno de los cuales, en el caso de un replicón, puede seleccionarse independientemente para estar o no bajo el control de un promotor subgenómico. Alternativamente, una poliproteína o polipéptido de fusión comprende polipéptidos individuales separados por un sitio de escisión de proteasa opcionalmente autocatalítica (por ejemplo, proteína 2A del virus de la fiebre aftosa), o una inteína. Las proteínas de interés pueden, por ejemplo, seleccionarse del grupo que consiste en proteínas indicadoras, péptidos o proteínas farmacéuticamente activos, inhibidores de la señalización del interferón intracelular (IFN) y proteína no estructural funcional del alfavirus.

De acuerdo con la divulgación, el término "péptido" comprende oligo y polipéptidos y se refiere a sustancias que comprenden dos o más, preferiblemente 3 o más, preferiblemente 4 o más, preferiblemente 6 o más, preferiblemente 8 o más, preferiblemente 10 o más, preferiblemente 13 o más, preferiblemente 16 o más, preferiblemente 20 o más, y hasta preferiblemente 50, preferiblemente 100 o preferiblemente 150, aminoácidos consecutivos unidos entre sí mediante enlaces peptídicos. El término "proteína" se refiere a péptidos grandes, preferiblemente péptidos que tienen al menos 151 aminoácidos, pero los términos "péptido" y "proteína" se usan en el presente documento normalmente como sinónimos.

Los términos "péptido" y "proteína" comprenden sustancias que contienen no solo componentes de aminoácidos sino también componentes no aminoácidos tales como azúcares y estructuras de fosfato, y también comprenden sustancias que contienen enlaces tales como enlaces éster, tioéter o disulfuro.

El término "variante" con respecto a, por ejemplo, secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos, incluye cualquier variante, en particular mutantes, variantes de cepas virales, variantes de corte y empalme, conformaciones, isoformas, variantes alélicas, variantes de especies y homólogos de especies, en particular aquellas que están presentes de forma natural. Una variante alélica se relaciona con una alteración en la secuencia normal de un gen, cuyo significado a menudo no está claro. La secuenciación completa de genes a menudo identifica numerosas variantes alélicas para un gen determinado. Con respecto a las moléculas de ácido nucleico, el término "variante" incluye secuencias de ácido nucleico degeneradas, en las que un ácido nucleico degenerado de acuerdo con la enseñanza es un ácido nucleico que difiere de un ácido nucleico de referencia en la secuencia de codones debido a la degeneración del código genético (por ejemplo, debido a la adaptación del uso del codón). Un homólogo de especie es un ácido nucleico o una secuencia de aminoácidos con una especie de origen diferente a la de un ácido nucleico o una secuencia de aminoácidos dada. Un homólogo de virus es un ácido nucleico o una secuencia de aminoácidos con un virus de origen diferente al de un ácido nucleico o una secuencia de aminoácidos determinada.

De acuerdo con la divulgación, las variantes de ácido nucleico incluyen eliminaciones, adiciones, mutaciones, sustituciones y/o inserciones de nucleótidos únicos o múltiples en comparación con el ácido nucleico de referencia. Las eliminaciones incluyen la eliminación de uno o más nucleótidos del ácido nucleico de referencia. Las variantes de adición comprenden fusiones terminales 5' y/o 3' de uno o más nucleótidos, tales como 1,2, 3, 5, 10, 20, 30, 50 o más nucleótidos. En el caso de sustituciones, se elimina al menos un nucleótido de la secuencia y se inserta al menos otro nucleótido en su lugar (tal como transversiones y transiciones). Las mutaciones incluyen sitios abásicos, sitios entrecruzados y bases modificadas o alteradas químicamente. Las inserciones incluyen la adición de al menos un nucleótido en el ácido nucleico de referencia.

De acuerdo con la divulgación, "cambio de nucleótidos" puede referirse a eliminaciones, adiciones, mutaciones, sustituciones y/o inserciones de nucleótidos únicos o múltiples en comparación con el ácido nucleico de referencia. Un "cambio de nucleótido" se selecciona del grupo que consiste en una eliminación de un solo nucleótido, la adición de un solo nucleótido, la mutación de un solo nucleótido, la sustitución de un solo nucleótido y/o la inserción de un solo nucleótido, en comparación con el ácido nucleico de referencia. De acuerdo con la enseñanza, una variante de ácido nucleico puede comprender uno o más cambios de nucleótidos en comparación con el ácido nucleico de referencia.

Las variantes de secuencias de ácido nucleico específicas tienen preferiblemente al menos una propiedad funcional de dichas secuencias específicas y preferiblemente son funcionalmente equivalentes a dichas secuencias específicas, por ejemplo, secuencias de ácidos nucleicos que presentan propiedades idénticas o similares a las de las secuencias de ácidos nucleicos específicas.

Preferiblemente, el grado de identidad entre una secuencia de ácido nucleico dada y una secuencia de ácido nucleico que es una variante de dicha secuencia de ácido nucleico dada será al menos 70%, preferiblemente al menos 75%, preferiblemente al menos 80%, más preferiblemente al menos el 85%, incluso más preferiblemente al menos el 90% o lo más preferiblemente al menos el 95%, 96%, 97%, 98% o 99%. El grado de identidad se da preferiblemente para una región de al menos aproximadamente 30, al menos aproximadamente 50, al menos aproximadamente 70, al menos aproximadamente 90, al menos aproximadamente 100, al menos aproximadamente 150, al menos aproximadamente 200, al menos aproximadamente 250, al menos aproximadamente 300, o al menos aproximadamente 400 nucleótidos. En realizaciones preferidas, el grado de identidad se da para toda la longitud de la secuencia de ácido nucleico de referencia.

La "similitud de secuencia" indica el porcentaje de aminoácidos que son idénticos o que representan sustituciones conservadoras de aminoácidos. La "identidad de secuencia" entre dos secuencias de polipéptidos o ácidos nucleicos indica el porcentaje de aminoácidos o nucleótidos que son idénticos entre las secuencias.

El término "% idénticos" pretende hacer referencia, en particular, a un porcentaje de nucleótidos idénticos en un alineamiento óptimo entre dos secuencias a comparar, siendo dicho porcentaje puramente estadístico, y las diferencias entre las dos secuencias puede distribuirse aleatoriamente en toda la longitud de la secuencia y la secuencia a comparar puede comprender adiciones o eliminaciones en comparación con la secuencia de referencia, con el fin de obtener un alineamiento óptimo entre dos secuencias. Las comparaciones de dos secuencias se realizan habitualmente comparando dichas secuencias, después de un alineamiento óptimo, con respecto a un segmento o "ventana de comparación", con el fin de identificar regiones locales de secuencias correspondientes. La alineación óptima para una comparación puede llevarse a cabo manualmente o con la ayuda del algoritmo de homología local de Smith y Waterman, 1981, Ads App. Math. 2, 482, con la ayuda del algoritmo de homología local de Needleman y Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443, y con la ayuda del algoritmo de búsqueda de similitudes de Pearson y Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA 85, 2444 o con la ayuda de programas informáticos que utilicen dichos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N y TFASTA en Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.).

El porcentaje de identidad se obtiene determinando el número de posiciones idénticas en las que se corresponden las secuencias a comparar, dividiendo este número por el número de posiciones comparadas y multiplicando este resultado por 100.

Por ejemplo, se puede utilizar el programa BLAST "secuencias de BLAST 2" que está disponible en el sitio web http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/wblast2.cgi.

Un ácido nucleico es "capaz de hibridar" o "hibrida" con otro ácido nucleico si las dos secuencias son complementarias entre sí. Un ácido nucleico es "complementario" a otro ácido nucleico si las dos secuencias son capaces de formar un dúplex estable entre sí. De acuerdo con la enseñanza, la hibridación se lleva a cabo preferiblemente en condiciones que permitan la hibridación específica entre polinucleótidos (condiciones rigurosas). Las condiciones rigurosas se describen, por ejemplo, en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook et al., Editores, 2a Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989 o Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., Editors, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York y se refieren, por ejemplo, a la hibridación a 65 °C en tampón de hibridación (3.5 x SSC, Ficoll, al 0.02% de polivinilpirrolidona al 0.02%, albúmina de suero bovino al 0.02%, NaH2PO42.5 mM (pH 7), SDS al 0.5%, EDTA 2 mM). El Ss C es cloruro de sodio 0.15 M/citrato de sodio 0.15 M, pH 7. Después de la hibridación, la membrana a la que se ha transferido el ADN se lava, por ejemplo, en 2 * SSC a temperatura ambiente y luego en 0.1-0.5 * SSC/0.1 * SDS a temperaturas de hasta 68 °C.

Un porcentaje de complementariedad indica el porcentaje de residuos contiguos en una molécula de ácido nucleico que puede formar enlaces de hidrógeno (por ejemplo, emparejamiento de bases de Watson-Crick) con una segunda secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, 5, 6, 7, 8, 9, 10 de cada 10 son 50%, 60%, 70%, 80%, 90% y 100% complementarios). "Perfectamente complementario" o "completamente complementario" significa que todos los residuos contiguos de una secuencia de ácido nucleico formarán un enlace de hidrógeno con el mismo número de residuos contiguos en una segunda secuencia de ácido nucleico. Preferiblemente, el grado de complementariedad de acuerdo con la enseñanza es al menos 70%, preferiblemente al menos 75%, preferiblemente al menos 80%, más preferiblemente al menos 85%, incluso más preferiblemente al menos 90% o lo más preferiblemente al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99%. Lo más preferiblemente, el grado de complementariedad de acuerdo con la enseñanza es del 100%.

El término "derivado" comprende cualquier derivatización química de un ácido nucleico sobre una base de nucleótidos, sobre el azúcar o sobre el fosfato. El término "derivado" también comprende ácidos nucleicos que contienen nucleótidos y análogos de nucleótidos que no se encuentran naturalmente. Preferiblemente, una derivatización de un ácido nucleico aumenta su estabilidad.

De acuerdo con la divulgación, una "secuencia de ácido nucleico que se deriva de una secuencia de ácido nucleico" se refiere a un ácido nucleico que puede ser una variante del ácido nucleico del que se deriva.

Un marco de lectura abierto codifica una proteína informadora. El marco de lectura abierto comprende un gen indicador. Ciertos genes pueden elegirse como indicadores porque las características que confieren a las células u organismos que los expresan pueden identificarse y medirse fácilmente, o porque son marcadores seleccionables. Los genes informadores se utilizan a menudo como una indicación de si un determinado gen ha sido incorporado o expresado en la población de células u organismos.

Preferiblemente, el producto de expresión del gen indicador es detectable visualmente. Las proteínas informadoras comunes detectables visualmente poseen típicamente proteínas fluorescentes o luminiscentes. Ejemplos de genes informadores específicos incluyen el gen que codifica la proteína fluorescente verde de medusa (g Fp ), que hace que las células que la expresan brillen en verde bajo luz azul, la enzima luciferasa, que cataliza una reacción con luciferina para producir luz, y la proteína roja fluorescente (RFP). Son posibles variantes de cualquiera de estos genes indicadores específicos, siempre que las variantes posean propiedades detectables visualmente. Por ejemplo, eGFP es una variante mutante puntual de GFP.

El ARN de la divulgación comprende o consiste en ARN farmacéuticamente activo. Un "ARN farmacéuticamente activo" puede ser ARN que codifica un péptido o proteína farmacéuticamente activo. Preferiblemente, el ARN de acuerdo con la presente enseñanza codifica un péptido o proteína farmacéuticamente activo. Preferiblemente, un marco de lectura abierto de la divulgación codifica un péptido o proteína farmacéuticamente activo. Preferiblemente, el ARN comprende un marco de lectura abierto que codifica un péptido o proteína farmacéuticamente activo, opcionalmente en el caso de un replicón de ARN bajo el control de un promotor subgenómico.

Un "péptido o proteína farmacéuticamente activo" de la divulgación tiene un efecto positivo o ventajoso sobre la condición o estado de enfermedad de un sujeto cuando se administra al sujeto en una cantidad terapéuticamente eficaz. Preferiblemente, un péptido o proteína farmacéuticamente activo tiene propiedades curativas o paliativas y se puede administrar para mejorar, disminuir, aliviar, revertir, retrasar el inicio o disminuir la gravedad de uno o más síntomas de una enfermedad o trastorno. Un péptido o proteína farmacéuticamente activo puede tener propiedades profilácticas y puede usarse para retrasar la aparición de una enfermedad o para disminuir la gravedad de dicha enfermedad o condición patológica. El término "péptido o proteína farmacéuticamente activo" incluye proteínas o polipéptidos completos, y también puede referirse a fragmentos farmacéuticamente activos de los mismos. También puede incluir análogos farmacéuticamente activos de un péptido o proteína. El término "péptido o proteína farmacéuticamente activo" incluye péptidos y proteínas que son antígenos, es decir, el péptido o proteína provoca una respuesta inmune en un sujeto que puede ser terapéutica o parcial o totalmente protectora.

En una realización, el péptido o proteína farmacéuticamente activo es o comprende un compuesto inmunológicamente activo o un antígeno o un epítopo.

De acuerdo con la divulgación, el término "compuesto inmunológicamente activo" se refiere a cualquier compuesto que altere una respuesta inmune, preferiblemente induciendo y/o suprimiendo la maduración de las células inmunes, induciendo y/o suprimiendo la biosíntesis de citocinas y/o alterando la inmunidad humoral estimulando la producción de anticuerpos por las células B. En una realización, la respuesta inmune implica la estimulación de una respuesta de anticuerpo (normalmente que incluye inmunoglobulina G (IgG)) y/o una respuesta celular tal como una respuesta de células T. Los compuestos inmunológicamente activos pueden poseer una potente actividad inmunoestimulante que incluye, pero no se limita a, actividad antiviral y antitumoral, y también pueden subregular otros aspectos de la respuesta inmune, por ejemplo, alejando la respuesta inmune de una respuesta inmune TH2, que es útil para tratar una amplia gama de enfermedades mediadas por TH2.

De acuerdo con la divulgación, el término "antígeno" o "inmunógeno" cubre cualquier sustancia que provoque una respuesta inmune. En particular, un "antígeno" se refiere a cualquier sustancia que reacciona específicamente con anticuerpos o linfocitos T (células T). De acuerdo con la presente divulgación, el término "antígeno" comprende cualquier molécula que comprenda al menos un epítopo. Preferiblemente, un antígeno en el contexto de la presente enseñanza es una molécula que, opcionalmente después del procesamiento, induce una reacción inmune, que preferiblemente es específica para el antígeno. De acuerdo con la presente divulgación se puede usar cualquier antígeno adecuado, que sea candidato para una reacción inmune, en la que la reacción inmune puede ser tanto una reacción inmune humoral como celular. En el contexto de las realizaciones de la presente enseñanza, el antígeno es presentado preferiblemente por una célula, preferiblemente por una célula presentadora de antígeno, en el contexto de moléculas del MHC, lo que da como resultado una reacción inmune contra el antígeno. Un antígeno es preferiblemente un producto que corresponde o se deriva de un antígeno de origen natural. Dichos antígenos de origen natural pueden incluir o pueden derivarse de alérgenos, virus, bacterias, hongos, parásitos y otros agentes infecciosos y patógenos o un antígeno también puede ser un antígeno tumoral. De acuerdo con la presente enseñanza, un antígeno puede corresponder a un producto de origen natural, por ejemplo, una proteína viral, o una parte de la misma. En realizaciones preferidas, el antígeno es un polipéptido de superficie, es decir, un polipéptido que se presenta de forma natural en la superficie de una célula, un patógeno, una bacteria, un virus, un hongo, un parásito, un alérgeno o un tumor. El antígeno puede provocar una respuesta inmunitaria contra una célula, un patógeno, una bacteria, un virus, un hongo, un parásito, un alérgeno o un tumor.

El término "antígeno asociado a una enfermedad" se usa en su sentido más amplio para referirse a cualquier antígeno asociado con una enfermedad. Un antígeno asociado a una enfermedad es una molécula que contiene epítopos que estimularán el sistema inmunológico del huésped para producir una respuesta inmunitaria específica del antígeno celular y/o una respuesta de anticuerpos humorales contra la enfermedad. Por lo tanto, el antígeno asociado a la enfermedad se puede utilizar con fines terapéuticos. Los antígenos asociados a enfermedades se asocian preferiblemente con infección por microbios, típicamente antígenos microbianos, o asociados con cáncer, típicamente tumores.

El término "patógeno" se refiere a material biológico patógeno capaz de causar una enfermedad en un organismo, preferiblemente un organismo vertebrado. Los patógenos incluyen microorganismos tales como bacterias, organismos eucariotas unicelulares (protozoos), hongos así como virus.

Los términos "epítopo", "péptido antigénico", "epítopo antigénico", "péptido inmunogénico" y "péptido de unión al MHC" se usan indistintamente en el presente documento y se refieren a un determinante antigénico en una molécula tal como un antígeno, es decir, a una parte o un fragmento de un compuesto inmunológicamente activo que es reconocido por el sistema inmunológico, por ejemplo, que es reconocido por una célula T, en particular cuando se presenta en el contexto de moléculas del MHC. Un epítopo de una proteína comprende preferiblemente una porción continua o discontinua de dicha proteína y tiene preferiblemente entre 5 y 100, preferiblemente entre 5 y 50, más preferiblemente entre 8 y 30, lo más preferiblemente entre 10 y 25 aminoácidos de longitud, por ejemplo, el epítopo puede tener preferiblemente 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 aminoácidos de longitud. De acuerdo con la enseñanza, un epítopo puede unirse a moléculas del MHC tales como moléculas del MHC en la superficie de una célula y, por lo tanto, puede ser un "péptido de unión al MHC" o "péptido antigénico". El término "complejo mayor de histocompatibilidad" y la abreviatura "MHC" incluyen moléculas del MHC de clase I y MHC de clase II y se refieren a un complejo de genes que está presente en todos los vertebrados. Las proteínas o moléculas del MHC son importantes para la señalización entre linfocitos y células presentadoras de antígenos o células enfermas en reacciones inmunes, en las que las proteínas o moléculas del MHC se unen a péptidos y los presentan para su reconocimiento por receptores de células T. Las proteínas codificadas por el MHC se expresan en la superficie de las células y presentan tanto autoantígenos (fragmentos de péptidos de la propia célula) como antígenos no propios (por ejemplo, fragmentos de microorganismos invasores) a una célula T. Las porciones inmunogénicas preferidas se unen a una molécula del MHC de clase I o clase II. Como se usa en el presente documento, se dice que una porción inmunogénica se "une a" una molécula del MHC de clase I o clase II si dicha unión es detectable usando cualquier ensayo conocido en la técnica. El término "péptido de unión al MHC" se refiere a un péptido que se une a una molécula del MHC de clase I y/o del MHC de clase II. En el caso de complejos de MHC clase I/péptido, los péptidos de unión tienen típicamente de 8 a 10 aminoácidos de longitud, aunque los péptidos más largos o más cortos pueden ser eficaces. En el caso de complejos de MHC clase II/péptido, los péptidos de unión tienen típicamente una longitud de 10-25 aminoácidos y, en particular, una longitud de 13-18 aminoácidos, mientras que los péptidos más largos y más cortos pueden ser eficaces.

La proteína de interés de acuerdo con la presente divulgación comprende un epítopo adecuado para la vacunación de un organismo diana. Un experto en la materia sabrá que uno de los principios de inmunobiología y vacunación se basa en el hecho de que se produce una reacción inmunoprotectora frente a una enfermedad inmunizando un organismo con un antígeno, que es inmunológicamente relevante con respecto a la enfermedad a ser tratada. De acuerdo con la presente divulgación, un antígeno se selecciona del grupo que comprende antígeno propio y un antígeno no propio. Un antígeno no propio es preferiblemente un antígeno bacteriano, un antígeno de virus, un antígeno de hongos, un alérgeno o un antígeno de parásito. Se prefiere que el antígeno comprenda un epítopo que sea capaz de provocar una respuesta inmune en un organismo diana. Por ejemplo, el epítopo puede provocar una respuesta inmune contra una bacteria, un virus, un hongo, un parásito, un alérgeno o un tumor.

El antígeno no propio es un antígeno bacteriano. En algunas realizaciones, el antígeno provoca una respuesta inmune contra una bacteria que infecta a animales, incluidos aves, peces y mamíferos, incluidos animales domesticados. Preferiblemente, la bacteria contra la que se desencadena la respuesta inmune es una bacteria patógena.

El antígeno no propio es un antígeno de virus. Un antígeno de virus puede ser, por ejemplo, una proteína, polipéptido o péptido de una proteína de la superficie del virus, por ejemplo, una glicoproteína unida a la membrana, una proteína o polipéptido de la cápside o una proteína o polipéptido de espiga. En algunas realizaciones, el antígeno provoca una respuesta inmune contra un virus que infecta a animales, incluidos aves, peces y mamíferos, incluidos animales domesticados. Preferiblemente, el virus contra el que se desencadena la respuesta inmune es un virus patógeno.

El antígeno no propio es un polipéptido o una proteína de un hongo. En algunas realizaciones, el antígeno provoca una respuesta inmune contra un hongo que infecta a animales, incluidos aves, peces y mamíferos, incluidos animales domesticados. Preferiblemente, el hongo contra el que se desencadena la respuesta inmune es un hongo patógeno.

El antígeno no propio es un polipéptido o proteína de un parásito eucariota unicelular. El antígeno provoca una respuesta inmune contra un parásito eucariota unicelular, preferiblemente un parásito eucariota unicelular patógeno. Los parásitos eucariotas unicelulares patógenos pueden ser por ejemplo, del género Plasmodium, por ejemplo, P. falciparum, P. vivax, P. malariae o P. ovale, del género Leishmania, o del género Trypanosoma, por ejemplo, T. cruzi o T. brucei.

El antígeno no propio es un polipéptido alergénico o una proteína alergénica. Una proteína alergénica o un polipéptido alergénico son adecuados para la inmunoterapia con alérgenos, también conocida como hiposensibilización.

En algunas realizaciones, el antígeno es un antígeno propio, particularmente un antígeno tumoral. Los expertos en la materia conocen los antígenos tumorales y su determinación.

En el contexto de la presente enseñanza, el término "antígeno tumoral" o "antígeno asociado a tumor" se refiere a proteínas que se encuentran en condiciones normales expresadas específicamente en un número limitado de tejidos y/u órganos o en etapas específicas de desarrollo, por ejemplo, el antígeno tumoral puede expresarse en condiciones normales específicamente en el tejido del estómago, preferiblemente en la mucosa gástrica, en los órganos reproductores, por ejemplo, en los testículos, en el tejido trofoblástico, por ejemplo, en la placenta, o en las células de la línea germinal, y se expresan o expresado de forma aberrante en uno o más tejidos tumorales o cancerosos. En este contexto, "un número limitado" significa preferiblemente no más de 3, más preferiblemente no más de 2. Los antígenos tumorales en el contexto de la presente enseñanza incluyen, por ejemplo, antígenos de diferenciación, preferiblemente antígenos de diferenciación específicos del tipo celular, es decir, proteínas que están en condiciones normales expresadas específicamente en un determinado tipo de células en una determinada etapa de diferenciación, antígenos de cáncer/testículo, es decir, proteínas que están en condiciones normales expresadas específicamente en testículos y, a veces, en placenta, y antígenos específicos de la línea germinal. En el contexto de la presente enseñanza, el antígeno tumoral se asocia preferiblemente con la superficie celular de una célula cancerosa y preferiblemente no se expresa o solo rara vez se expresa en tejidos normales. Preferiblemente, el antígeno tumoral o la expresión aberrante del antígeno tumoral identifica células cancerosas. En el contexto de la presente enseñanza, el antígeno tumoral que es expresado por una célula cancerosa en un sujeto, por ejemplo, un paciente que padece una enfermedad cancerosa, es preferiblemente una proteína propia en dicho sujeto. En realizaciones preferidas, el antígeno tumoral en el contexto de la presente enseñanza se expresa en condiciones normales específicamente en un tejido u órgano que no es esencial, es decir, tejidos u órganos que cuando son dañados por el sistema inmunológico no conducen a la muerte del sujeto, o en órganos o estructuras del cuerpo que no son o sólo difícilmente accesibles por el sistema inmunológico. Preferiblemente, la secuencia de aminoácidos del antígeno tumoral es idéntica entre el antígeno tumoral que se expresa en tejidos normales y el antígeno tumoral que se expresa en tejidos cancerosos.

Los ejemplos de antígenos tumorales que pueden ser útiles en la presente enseñanza son p53, ART-4, BAGE, betacatenina/m, Bcr-abL CAMEL, CAP-1, Ca SP-8, CDC27/m, CDK4/m, CEA, las proteínas de la superficie celular de la familia de las claudinas, tales como CLAUDINA-6, CLAUDINA-18.2 y CLAUDINA-12, c-MYC, CT, Cyp-B, DAM, ELF2M, ETV6-AML1, G250, GAGE, GnT-V, Gap100, HAGE, HER-2/neu, HPV-E7, HPV-E6, HAST-2, hTERT (o hTRT), LAGE, LDLR/FUT, MAGE-A, preferiblemente MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE -A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11 o MAGE-A12, MAGE-B, MAGE-C, MART-1/Melan-A, MC1R, Miosina/m, MUC1, MUM-1, MUM-2, MUM-3, NA88-A, NF1, NY-ESO-1, NY-BR-1, p190 menor BCR-abL, Pm1/RARa, PRAME, proteinasa 3, PSA, PSM, RAGE, RU1 o RU2, SAGE, SART-1 o SART-3, SCGB3A2, SCP1, SCP2, SCP3, SSX, SURVIVINA, TEL/AML1, TPI/m, TRP-1 , TRP-2, TRP-2/INT2, TPTE y WT. Los antígenos tumorales particularmente preferidos incluyen CLAUDINA-18.2 (CLDN18.2) y CLAUDINA-6 (CLDN6). En algunas realizaciones, no se requiere que el péptido o proteína farmacéuticamente activo sea un antígeno que provoque una respuesta inmune. Las proteínas o péptidos farmacéuticamente activos adecuados se pueden seleccionar del grupo que consiste en citocinas y proteínas del sistema inmunológico tales como compuestos inmunológicamente activos (por ejemplo, interleucinas, factor estimulante de colonias (CSF), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF), eritropoyetina, factor de necrosis tumoral (TNF), interferones, integrinas, adresinas, seletinas, receptores homing, receptores de células T, inmunoglobulinas), hormonas (insulina, hormona tiroidea, catecolaminas, gonadotrofinas, hormonas tróficas, prolactina, oxitocina, dopamina, somatotropina bovina, leptinas y similares), hormonas de crecimiento (por ejemplo, hormona de crecimiento humano), factores de crecimiento (por ejemplo, factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento similar a la insulina y similares), receptores del factor de crecimiento, enzimas (activador del plasminógeno tisular, estreptoquinasa, colesterol biosintético o degradativo, enzimas esteroidogénicas, quinasas, fosfodiesterasas, metilasas, desmetilasas, deshidrogenasas, celulasas, proteasas, lipasas, fosfolipasas, aromatasas, citocromos, adenilato o guanilasto ciclasas, neuramidasas y similares), receptores (receptores de hormonas esteroides, receptores de péptidos), proteínas de unión (proteínas de unión a la hormona del crecimiento o factor de crecimiento y similares) factores de transcripción y traducción, proteínas supresoras del crecimiento tumoral (por ejemplo, proteínas que inhiben la angiogénesis), proteínas estructurales (tales como colágeno, fibroína, fibrinógeno, elastina, tubulina, actina y miosina), proteínas sanguíneas (trombina, albúmina sérica, Factor VII, Factor VIII, insulina, Factor IX, Factor X, activador del plasminógeno tisular, proteína C, Factor de von Wilebrand, antitrombina III, glucocerebrosidasa, factor estimulante de colonias de granulocitos de eritropoyetina (GCSF) o factor VIII modificado, anticoagulantes y similares. En una realización, la proteína farmacéuticamente activa de acuerdo con las enseñanzas es una citocina que participa en la regulación de la homeostasis linfoide, preferiblemente una citocina que está involucrada y preferiblemente induce o mejora el desarrollo, cebado, expansión, diferenciación y/o supervivencia de las células T. En una realización, la citocina es una interleucina, por ejemplo, IL-2, IL-7, IL-12, IL-15 o IL-21.

Una proteína de interés adecuada adicional codificada por un marco de lectura abierto es un inhibidor de la señalización del interferón (IFN). Si bien se ha informado que la viabilidad de las células en las que se ha introducido ARN para la expresión puede reducirse, en particular, si las células se transfectan varias veces con ARN, se encontró que los agentes inhibidores de IFN mejoran la viabilidad de las células en las que se va a expresar ARN (documento W o 2014/071963 A1). Preferiblemente, el inhibidor es un inhibidor de la señalización de IFN tipo I. La prevención de la participación del receptor de IFN por el IFN extracelular y la inhibición de la señalización del IFN intracelular en las células permite una expresión estable de ARN en las células. Alternativa o adicionalmente, la prevención del acoplamiento del receptor de IFN por el IFN extracelular y la inhibición de la señalización del IFN intracelular mejora la supervivencia de las células, en particular, si las células se transfectan repetidamente con ARN. Sin pretender imponer ninguna teoría, se prevé que la señalización de IFN intracelular puede dar como resultado la inhibición de la traducción y/o la degradación del ARN. Esto se puede abordar inhibiendo una o más proteínas efectoras antiviralmente activas inducibles por IFN. La proteína efectora antiviralmente activa inducible por IFN se puede seleccionar del grupo que consiste en proteína quinasa dependiente de ARN (PKR), 2',5'-oligoadenilato sintetasa (OAS) y RNasaL. La inhibición de la señalización de IFN intracelular puede comprender inhibir la vía dependiente de PKR y/o la vía dependiente de OAS. Una proteína de interés adecuada es una proteína que es capaz de inhibir la vía dependiente de PKR y/o la vía dependiente de OAS. La inhibición de la vía dependiente de PKR puede comprender inhibir la fosforilación de eIF2-alfa. La inhibición de PKR puede comprender tratar la célula con al menos un inhibidor de PKR. El inhibidor de PKR puede ser un inhibidor viral de PKR. El inhibidor viral preferido de PKR es el virus vaccinia E3. Si un péptido o proteína (por ejemplo, E3, K3) va a inhibir la señalización de IFN intracelular, se prefiere la expresión intracelular del péptido o proteína. El virus vaccinia E3 es una proteína de unión a ARNbc de 25 kDa (codificada por el gen E3L) que se une y secuestra ARNbc para prevenir la activación de PKR y OAS. E3 se puede unir directamente a PKR e inhibe su actividad, lo que reduce la fosforilación de eIF2-alfa. Otros inhibidores adecuados de la señalización de IFN son ICP34.5 del virus del herpes simple, NS del virus Toscana, PK2 del virus nucleopoliédrico de Bombyx mori y NS34A del VHC.

En una realización, el inhibidor de la señalización de IFN intracelular o extracelular está codificado por un replicón. El replicón comprende elementos de la secuencia de ácido nucleico que permiten la replicación por la replicasa del alfavirus, típicamente CSE 1, CSE 2 y CSE 4; y preferiblemente también elementos de secuencia de ácido nucleico que permiten la producción de un transcrito subgenómico, es decir, un promotor subgenómico, que típicamente comprende CSE 3. El replicón puede comprender adicionalmente una o más modificaciones de la secuencia no polipeptídica como se describe en el presente documento, por ejemplo, secuencia de protección de poli(A), adaptación del uso del codón. Si están presentes múltiples marcos de lectura abiertos en el replicón, entonces un inhibidor de la señalización de IFN intracelular puede ser codificado por cualquiera de ellos, opcionalmente bajo el control de un promotor subgenómico o no. En una realización preferida, el inhibidor de la señalización de IFN intracelular está codificado por el marco de lectura abierto más secuencia arriba del replicón de ARN. Cuando un inhibidor de la señalización de IFN intracelular está codificado por el marco de lectura abierto más secuencia arriba del replicón de ARN, la información genética que codifica el inhibidor de la señalización de IFN intracelular se traducirá pronto después de la introducción del replicón de ARN en una célula huésped, y la proteína resultante posteriormente puede inhibir la señalización intracelular de IFN.

Una proteína de interés adecuada adicional codificada por un marco de lectura abierto es la proteína no estructural funcional del alfavirus. El término "proteína no estructural de alfavirus" incluye todas y cada una de las formas co o postraduccionalmente modificadas, incluidas las formas modificadas con carbohidratos (tales como glicosiladas) y modificadas con lípidos de proteína no estructural de alfavirus.

En algunas realizaciones, el término "proteína no estructural de alfavirus" se refiere a una o más de las proteínas no estructurales individuales de origen de alfavirus (nsP1, nsP2, nsP3, nsP4), o a una poliproteína que comprende la secuencia del polipéptido de más de una proteína no estructural de origen alfavirus. En algunas realizaciones, "proteína no estructural de alfavirus" se refiere a nsP123 y/o nsP4. En otras realizaciones, "proteína no estructural de alfavirus" se refiere a nsP1234. En una realización, la proteína de interés codificada por un marco de lectura abierto consta de todo nsP1, nsP2, nsP3 y nsP4 como una sola poliproteína, opcionalmente escindible: nsP1234. En una realización, la proteína de interés codificada por un marco de lectura abierto consta de nsP1, nsP2 y nsP3 como una sola poliproteína, opcionalmente escindible: nsP123. En esa realización, nsP4 puede ser una proteína adicional de interés y puede estar codificada por un marco de lectura abierto adicional.

En algunas realizaciones, la proteína no estructural de alfavirus es capaz de formar un complejo o asociación, por ejemplo, en una célula huésped. En algunas realizaciones, "proteína no estructural de alfavirus" se refiere a un complejo o asociación de nsP123 (sinónimo de P123) y nsP4. En algunas realizaciones, "proteína no estructural de alfavirus" se refiere a un complejo o asociación de nsP1, nsP2 y nsP3. En algunas realizaciones, "proteína no estructural de alfavirus" se refiere a un complejo o asociación de nsP1, nsP2, nsP3 y nsP4. En algunas realizaciones, "proteína no estructural de alfavirus" se refiere a un complejo o asociación de uno cualquiera o más seleccionados del grupo que consiste en nsP1, nsP2, nsP3 y nsP4. En algunas realizaciones, la proteína no estructural del alfavirus comprende al menos nsP4.

Los términos "complejo" o "asociación" se refieren a dos o más moléculas de proteína iguales o diferentes que están en proximidad espacial. Las proteínas de un complejo están preferiblemente en contacto físico o fisicoquímico directo o indirecto entre sí. Un complejo o asociación puede constar de múltiples proteínas diferentes (heteromultímero) y/o de múltiples copias de una proteína particular (homomultímero). En el contexto de la proteína no estructural de alfavirus, el término "complejo o asociación" describe una multitud de al menos dos moléculas de proteína, de las cuales al menos una es una proteína no estructural de alfavirus. El complejo o asociación puede consistir en múltiples copias de una proteína particular (homomultímero) y/o de múltiples proteínas diferentes (heteromultímero). En el contexto de un multímero, "multi" significa más de uno, tal como dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más de diez.

El término "proteína no estructural funcional de alfavirus" incluye proteína no estructural de alfavirus que tiene función de replicasa. Por lo tanto, la "proteína no estructural funcional del alfavirus" incluye la replicasa del alfavirus. La "función replicasa" comprende la función de una ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRp), es decir, una enzima que es capaz de catalizar la síntesis de ARN de cadena (-) basada en una plantilla de ARN de cadena (+), y/o que es capaz de catalizar la síntesis de ARN de cadena (+) con base en una plantilla de ARN de cadena (-). Por lo tanto, el término "proteína no estructural funcional del alfavirus" puede referirse a una proteína o complejo que sintetiza ARN de cadena (-), usando el ARN de cadena (+) (por ejemplo, genómico) como plantilla, a una proteína o complejo que sintetiza nuevo ARN de cadena (+), usando el complemento de cadena (-) de ARN genómico como plantilla, y/o una proteína o complejo que sintetiza un transcripto subgenómico, usando un fragmento del complemento de cadena (-) de ARN genómico como plantilla. La proteína no estructural funcional del alfavirus puede tener adicionalmente una o más funciones adicionales, como por ejemplo, una proteasa (para la auto-escisión), helicasa, adenililtransferasa terminal (para la adición de la cola de poli(A)), metiltransferasa y guanililtransferasa (para proporcionar un ácido nucleico con una protección de 5'), sitios de localización nuclear, trifosfatasa (Gould et al., 2010, Antiviral Res., Vol. 87 páginas 111-124; Rupp et al., 2015, J. Gen. Virol., Vol. 96, páginas 2483-500).

De acuerdo con la divulgación, el término "replicasa de alfavirus" se refiere a la ARN polimerasa dependiente de ARN alfaviral, que incluye una ARN polimerasa dependiente de ARN de un alfavirus de origen natural (alfavirus que se encuentra en la naturaleza) y una ARN polimerasa dependiente de ARN de una variante o derivado de un alfavirus, tal como de un alfavirus atenuado. En el contexto de la presente enseñanza, los términos "replicasa" y "replicasa de alfavirus" se usan indistintamente, a menos que el contexto indique que cualquier replicasa en particular no es una replicasa de alfavirus.

El término "replicasa" comprende todas las variantes, en particular variantes modificadas postraduccionalmente, conformaciones, isoformas y homólogos de replicasa de alfavirus, que se expresan por células infectadas por alfavirus o que se expresan por células que han sido transfectadas con un ácido nucleico que codifica la replicasa del alfavirus. Además, el término "replicasa" comprende todas las formas de replicasa que se han producido y pueden producirse mediante métodos recombinantes. Por ejemplo, una replicasa que comprende una etiqueta que facilita la detección y/o purificación de la replicasa en el laboratorio, por ejemplo, se puede producir una etiqueta myc, una etiqueta HA o una etiqueta de oligohistidina (etiqueta His) mediante métodos recombinantes.

Opcionalmente, la replicasa del alfavirus se define funcionalmente adicionalmente por la capacidad de unirse a uno o más de los elementos 1 de la secuencia conservada del alfavirus (CSE 1) o la secuencia complementaria del mismo, el elemento 2 de la secuencia conservada (CSE 2) o la secuencia complementaria del mismo, elemento 3 de secuencia conservada (CSE 3) o secuencia complementaria del mismo, elemento 4 de secuencia conservada (CSE 4) o secuencia complementaria del mismo. Preferiblemente, la replicasa es capaz de unirse a CSE 2 [es decir a la cadena (+)] y/o al CSE 4 [es decir a la cadena (+)], o de unión al complemento de CSE 1 [es decir a la cadena (-)] y/o al complemento de CSE 3 [es decir a la cadena (-)].

El origen de la replicasa no se limita a ningún alfavirus particular. La replicasa del alfavirus comprende una proteína no estructural del virus del bosque de Semliki, que incluye un virus del bosque de Semliki que se produce de forma natural y una variante o derivado del virus del bosque de Semliki, tal como un virus del bosque de Semliki atenuado. En una realización alternativa preferida, la replicasa del alfavirus comprende una proteína no estructural del virus Sindbis, que incluye un virus Sindbis de origen natural y una variante o derivado del virus Sindbis, tal como un virus Sindbis atenuado. En una realización alternativa preferida, el alfavirus replicasa comprende una proteína no estructural del virus de la encefalitis equina venezolana (VEEV), que incluye un VEEV de origen natural y una variante o derivado de VEEV, tal como un VEEV atenuado. En una realización alternativa preferida, el alfavirus replicasa comprende una proteína no estructural del virus Chikungunya (CHIKV), que incluye un CHIKV natural y una variante o derivado de CHIKV, tal como un CHIKV atenuado.

Una replicasa también puede comprender proteínas no estructurales de más de un alfavirus. Por lo tanto, los complejos o asociaciones heterólogas que comprenden una proteína no estructural de alfavirus y que tienen función de replicasa están igualmente comprendidos por la presente enseñanza. Meramente con fines ilustrativos, la replicasa puede comprender una o más proteínas no estructurales (por ejemplo, nsP1, nsP2) de un primer alfavirus y una o más proteínas no estructurales (nsP3, nsP4) de un segundo alfavirus. Las proteínas no estructurales de más de un alfavirus diferente pueden codificarse mediante marcos de lectura abiertos separados, o pueden codificarse mediante un solo marco de lectura abierto como poliproteína, por ejemplo, nsP1234.

En la divulgación, la proteína no estructural funcional del alfavirus es capaz de formar complejos de replicación membranosa y/o vacuolas en células en las que se expresa la proteína no estructural funcional del alfavirus.

Si la proteína no estructural funcional del alfavirus, es decir, la proteína no estructural de alfavirus con función replicasa, está codificada por una molécula de ácido nucleico de acuerdo con las presentes enseñanzas, es preferible que el promotor subgenómico del replicón, si está presente, sea compatible con dicha replicasa. Compatible en este contexto significa que la replicasa del alfavirus es capaz de reconocer el promotor subgenómico, si está presente. En un elemento de la divulgación, esto se logra cuando el promotor subgenómico es nativo del alfavirus del que se deriva la replicasa, es decir, el origen natural de estas secuencias es el mismo alfavirus. En un elemento alternativo de la divulgación, el promotor subgenómico no es nativo del alfavirus del que se deriva la replicasa del alfavirus, siempre que la replicasa del alfavirus sea capaz de reconocer el promotor subgenómico. En otras palabras, la replicasa es compatible con el promotor subgenómico (compatibilidad entre virus). Se conocen en la técnica ejemplos de compatibilidad entre virus relacionados con el promotor subgenómico y la replicasa que se originan a partir de diferentes alfavirus. Es posible cualquier combinación de promotor subgenómico y replicasa siempre que exista compatibilidad entre virus. La compatibilidad entre virus puede ser probada fácilmente por el experto en la presente enseñanza incubando una replicasa para ser probada junto con un ARN, en la que el ARN tiene un promotor subgenómico para ser probado, en condiciones adecuadas para la síntesis de ARN a partir de un promotor subgenómico. Si se prepara un transcripto subgenómico, se determina que el promotor subgenómico y la replicasa son compatibles. Se conocen varios ejemplos de compatibilidad entre virus (revisados por Strauss & Strauss, Microbiol. Rev., 1994, vol. 58, páginas 491-562).

En la divulgación, se puede proporcionar un marco de lectura abierto que codifica la proteína no estructural funcional del alfavirus en el replicón de ARN, o alternativamente, se puede proporcionar como molécula de ácido nucleico separada, por ejemplo, molécula de ARNm. Una molécula de ARNm separada puede comprender opcionalmente por ejemplo, una secuencia de protección, 5'-UTR, 3'-UTR, poli(A) y/o adaptación del uso del codón. La molécula de ARNm separada puede proporcionarse en forma trans, como se describe en el presente documento.

Cuando se proporciona un marco de lectura abierto que codifica la proteína no estructural funcional del alfavirus en el replicón de a Rn , el replicón se puede replicar preferiblemente mediante la proteína no estructural funcional del alfavirus. En particular, el replicón de ARN que codifica la proteína no estructural funcional del alfavirus puede ser replicado por la proteína no estructural funcional del alfavirus codificada por el replicón. Esta realización es muy preferida cuando no se proporciona en forma trans ninguna molécula de ácido nucleico que codifique una proteína no estructural funcional del alfavirus. En esta realización, se pretende la replicación en forma cis del replicón. En una realización preferida, el replicón de ARN comprende un marco de lectura abierto que codifica una proteína no estructural funcional del alfavirus así como al menos un marco de lectura abierto adicional que codifica una proteína de interés, y puede ser replicado por la proteína no estructural funcional del alfavirus.

Si están presentes múltiples marcos de lectura abiertos en el replicón, entonces la proteína no estructural funcional del alfavirus puede ser codificada por cualquiera de ellos, opcionalmente bajo el control de un promotor subgenómico o no, preferiblemente no bajo el control de un promotor subgenómico. En una realización preferida, la proteína no estructural funcional del alfavirus está codificada por el marco de lectura abierto más secuencia arriba del replicón de ARN. Cuando la proteína no estructural funcional del alfavirus está codificada por el marco de lectura abierto más secuencia arriba del replicón de ARN, la información genética que codifica la proteína no estructural funcional del alfavirus se traducirá pronto después de la introducción del replicón de ARN en una célula huésped, y la proteína resultante puede conducir posteriormente la replicación y, opcionalmente, la producción de una transcripto subgenómico, en la célula huésped.

La presencia de un marco de lectura abierto que codifica la proteína no estructural funcional del alfavirus, ya sea comprendida por el replicón o por una molécula de ácido nucleico separada que se proporciona en forma trans, permite que el replicón se replique y, en consecuencia, que un gen de interés codificado por el replicón, opcionalmente bajo el control de un promotor subgenómico, se exprese a niveles elevados.

El replicón de ARN es adecuado para la expresión de uno o más genes que codifican un péptido de interés o una proteína de interés, opcionalmente bajo el control de un promotor subgenómico. Son posibles varias formas de realización. En el replicón de ARN pueden estar presentes uno o más marcos de lectura abiertos, cada uno de los cuales codifica un péptido de interés o una proteína de interés. El marco de lectura abierto más secuencia arriba del replicón de ARN se denomina "primer marco de lectura abierto". En algunas realizaciones, el "primer marco de lectura abierto" es el único marco de lectura abierto del replicón de ARN. Opcionalmente, pueden estar presentes uno o más marcos de lectura abiertos adicionales secuencia abajo del primer marco de lectura abierto. Uno o más marcos de lectura abiertos adicionales secuencia abajo del primer marco de lectura abierto pueden denominarse "segundo marco de lectura abierto", "tercer marco de lectura abierto" y así sucesivamente, en el orden (5' a 3') en el que están presentes secuencia abajo del primer marco de lectura abierto. Preferiblemente, cada marco de lectura abierto comprende un codón de inicio (triplete de bases), típicamente AUG (en la molécula de ARN), correspondiente a ATG (en una molécula de ADN respectiva).

Si el replicón comprende una secuencia de reconocimiento de replicación 3', se prefiere que todos los marcos de lectura abiertos estén localizados secuencia arriba de la secuencia de reconocimiento de replicación 3'. Cuando el replicón de ARN que comprende uno o más marcos de lectura abiertos se introduce en una célula huésped, el replicón puede servir directamente como plantilla para la traducción del primer marco de lectura abierto. Preferiblemente, el replicón comprende una protección de 5'. Esto es útil para la expresión del gen codificado por el primer marco de lectura abierto directamente del replicón.

Al menos un marco de lectura abierto del replicón está bajo el control de un promotor subgenómico, preferiblemente un promotor subgenómico de alfavirus. El promotor subgenómico de alfavirus es muy eficaz y, por lo tanto, es adecuado para la expresión de genes heterólogos a niveles elevados. Preferiblemente, el promotor subgenómico es un promotor de un transcripto subgenómico en un alfavirus. Esto significa que el promotor subgenómico es uno que es nativo de un alfavirus y que preferiblemente controla la transcripción del marco de lectura abierto que codifica una o más proteínas estructurales en dicho alfavirus. Alternativamente, el promotor subgenómico es una variante de un promotor subgenómico de un alfavirus; es adecuada cualquier variante que funcione como promotor de la transcripción de ARN subgenómico en una célula huésped. Si el replicón comprende un promotor subgenómico, se prefiere que el replicón comprenda un elemento 3 de secuencia conservada (c Se 3) o una variante del mismo.

Preferiblemente, al menos un marco de lectura abierto bajo el control de un promotor subgenómico se localiza secuencia abajo del promotor subgenómico. Preferiblemente, el promotor subgenómico controla la producción de ARN subgenómico que comprende un transcripto del marco de lectura abierto.

En algunas realizaciones, el primer marco de lectura abierto está bajo el control de un promotor subgenómico. Cuando el primer marco de lectura abierto está bajo el control de un promotor subgenómico, su localización se asemeja a la localización del marco de lectura abierto que codifica proteínas estructurales en el genoma de un alfavirus. Cuando el primer marco de lectura abierto está bajo el control del promotor subgenómico, se prefiere que el gen codificado por el primer marco de lectura abierto pueda expresarse tanto a partir del replicón como a partir de una transcripto subgenómico del mismo (este último en presencia de proteína no estructural del alfavirus). Uno o más marcos de lectura abiertos adicionales, cada uno bajo el control de un promotor subgenómico, pueden estar presentes secuencia abajo del primer marco de lectura abierto que está bajo el control de un promotor subgenómico. Los genes codificados por uno o más marcos de lectura abiertos adicionales, por ejemplo, por el segundo marco de lectura abierto, puede traducirse a partir de uno o más transcriptos subgenómicos, cada uno bajo el control de un promotor subgenómico. Por ejemplo, el replicón de ARN puede comprender un promotor subgenómico que controla la producción de un transcripto que codifica una segunda proteína de interés.

El primer marco de lectura abierto no está bajo el control de un promotor subgenómico. Cuando el primer marco de lectura abierto no está bajo el control de un promotor subgenómico, el gen codificado por el primer marco de lectura abierto puede expresarse a partir del replicón. Uno o más marcos de lectura abiertos adicionales, cada uno bajo el control de un promotor subgenómico, pueden estar presentes secuencia abajo del primer marco de lectura abierto. Los genes codificados por uno o más marcos de lectura abiertos adicionales pueden expresarse a partir de transcriptos subgenómicos.

En una célula que comprende el replicón, el replicón puede amplificarse mediante una proteína funcional no estructural de alfavirus. Además, si el replicón comprende uno o más marcos de lectura abiertos bajo el control de un promotor subgenómico, se espera que se preparen uno o más transcriptos subgenómicos mediante la proteína no estructural funcional del alfavirus. La proteína no estructural funcional del alfavirus puede proporcionarse en forma trans, o puede estar codificada por un marco de lectura abierto del replicón.

Si un replicón comprende más de un marco de lectura abierto que codifica una proteína de interés, es preferible que cada marco de lectura abierto codifique una proteína diferente, por ejemplo, un péptido o proteína diferente farmacéuticamente activo. Por ejemplo, la proteína codificada por el segundo marco de lectura abierto es diferente de la proteína codificada por el primer marco de lectura abierto.

La proteína de interés de la divulgación codificada por el primer y/o un marco de lectura abierto adicional, preferiblemente por el primer marco de lectura abierto, es una proteína funcional no estructural de alfavirus o un inhibidor de la señalización de IFN, por ejemplo, E3. La proteína de interés codificada por el primer y/o un marco de lectura abierto adicional, por ejemplo, por el segundo marco de lectura abierto, es un péptido o proteína farmacéuticamente activo, o una proteína informadora.

La proteína de interés codificada por el primer marco de lectura abierto es una proteína no estructural funcional de alfavirus. En esa realización, el replicón comprende preferiblemente una protección de 5' . Particularmente cuando la proteína de interés codificada por el primer marco de lectura abierto es una proteína no estructural funcional del alfavirus, y preferiblemente cuando el replicón comprende una protección de 5', la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína no estructural funcional del alfavirus puede traducirse eficazmente a partir del replicón, y la proteína resultante puede conducir posteriormente la replicación del replicón y conducir la síntesis de transcripto o transcriptos subgenómicos. Esta realización puede ser preferida cuando no se usa o está presente junto con el replicón una molécula de ácido nucleico adicional que codifica la proteína no estructural funcional del alfavirus. En esta realización, se pretende la replicación en forma cis del replicón.

Las composiciones descritas en el presente documento se pueden administrar para tratar enfermedades como las descritas en el presente documento, por ejemplo, una enfermedad asociada con un antígeno codificado por el ARN que se administra.

El término "enfermedad" se refiere a una condición anormal que afecta el cuerpo de un individuo. Una enfermedad se suele interpretar como una afección médica asociada con signos y síntomas específicos. Una enfermedad puede ser causada por factores originalmente de una fuente externa, tal como una enfermedad infecciosa, o puede ser causada por disfunciones internas, tales como enfermedades autoinmunes. En los seres humanos, "enfermedad" se usa a menudo de manera más amplia para referirse a cualquier condición que cause dolor, disfunción, angustia, problemas sociales o la muerte del individuo afectado, o problemas similares para quienes están en contacto con el individuo. En este sentido más amplio, a veces incluye lesiones, discapacidades, trastornos, síndromes, infecciones, síntomas aislados, conductas desviadas y variaciones atípicas de estructura y función, mientras que en otros contextos y para otros fines pueden considerarse categorías distinguibles. Las enfermedades generalmente afectan a las personas no solo físicamente, sino también emocionalmente, ya que contraer y vivir con muchas enfermedades puede alterar la perspectiva de la vida y la personalidad de uno.

El término "enfermedad asociada con un antígeno" o "enfermedad que implica un antígeno" se refiere a cualquier enfermedad que implica un antígeno, por ejemplo, una enfermedad que se caracteriza por la presencia de un antígeno. La enfermedad que involucra un antígeno puede ser una enfermedad infecciosa, una enfermedad autoinmune o una enfermedad cancerosa o simplemente cáncer. Como se mencionó anteriormente, el antígeno puede ser un antígeno asociado a una enfermedad, tal como un antígeno asociado a un tumor, un antígeno viral o un antígeno bacteriano.

El término "enfermedad infecciosa" se refiere a cualquier enfermedad que puede transmitirse de un individuo a otro o de un organismo a otro, y está causada por un agente microbiano (por ejemplo, un resfriado común). Las enfermedades infecciosas son conocidas en la técnica e incluyen, por ejemplo, una enfermedad viral, una enfermedad bacteriana o una enfermedad parasitaria, enfermedades que son causadas por un virus, una bacteria y un parásito, respectivamente. En este sentido, la enfermedad infecciosa puede ser, por ejemplo, hepatitis, enfermedades de transmisión sexual (por ejemplo, clamidia o gonorrea), tuberculosis, VIH/síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), difteria, hepatitis B, hepatitis C, cólera, síndrome respiratorio agudo grave (SARS), la gripe aviar, influenza, enfermedades animales tales como fiebre aftosa, peste de pequeños rumiantes, virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino o enfermedades parasitarias tales como Chagas, malaria y otras.

El término "enfermedad autoinmune" se refiere a cualquier enfermedad en la que el cuerpo produce una respuesta inmunogénica (es decir, sistema inmunológico) a algún constituyente de su propio tejido. En otras palabras, el sistema inmunológico pierde su capacidad para reconocer algún tejido o sistema dentro del cuerpo como si fuera propio y lo ataca como si fuera extraño. Las enfermedades autoinmunes se pueden clasificar en aquellas en las que predomina un órgano afectado (por ejemplo, anemia hemolítica y tiroiditis antiinmunitaria) y aquellas en las que el proceso de la enfermedad autoinmunitaria se difunde a través de muchos tejidos (por ejemplo, Lupus eritematoso sistémico). Por ejemplo, se cree que la esclerosis múltiple es causada por células T que atacan las vainas que rodean las fibras nerviosas del cerebro y la médula espinal. Esto resulta en pérdida de coordinación, debilidad y visión borrosa. Las enfermedades autoinmunes son conocidas en la técnica e incluyen, por ejemplo, tiroiditis de Hashimoto, enfermedad de Grave, lupus, esclerosis múltiple, artritis reumática, anemia hemolítica, tiroiditis antiinmunitaria, lupus eritematoso sistémico, enfermedad celíaca, enfermedad de Crohn, colitis, diabetes, esclerodermia, psoriasis y similares.

Los términos "enfermedad cancerosa" o "cáncer" se refieren o describen la condición fisiológica en un individuo que se caracteriza típicamente por un crecimiento celular no regulado. Los ejemplos de cánceres incluyen, pero no se limitan a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia. Más particularmente, los ejemplos de dichos cánceres incluyen cáncer de hueso, cáncer de sangre, cáncer de pulmón, cáncer de hígado, cáncer de páncreas, cáncer de piel, cáncer de cabeza o cuello, melanoma cutáneo o intraocular, cáncer de útero, cáncer de ovario, cáncer de recto, cáncer de la región anal, cáncer de estómago, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de útero, carcinoma de los órganos sexuales y reproductivos, enfermedad de Hodgkin, cáncer de esófago, cáncer de intestino delgado, cáncer del sistema endocrino, cáncer de la glándula tiroides, cáncer de glándula paratiroidea, cáncer de glándula suprarrenal, sarcoma de tejido blando, cáncer de vejiga, cáncer de riñón, carcinoma de células renales, carcinoma de pelvis renal, neoplasias del sistema nervioso central (SNC), cáncer neuroectodérmico, tumores del eje espinal, glioma, meningioma y adenoma hipofisario. El término "cáncer" de acuerdo con la enseñanza también comprende metástasis de cáncer.

El término "respuesta inmune" se refiere a una reacción del sistema inmune tal como a organismos inmunogénicos, tales como bacterias o virus, células o sustancias. El término "respuesta inmune" incluye la respuesta inmune innata y la respuesta inmune adaptativa. Preferiblemente, la respuesta inmune está relacionada con una activación de células inmunes, una inducción de la biosíntesis de citocinas y/o la producción de anticuerpos.

Se prefiere que la respuesta inmune inducida por las composiciones de la presente enseñanza comprenda las etapas de activación de células presentadoras de antígeno, tales como células dendríticas y/o macrófagos, presentación de un antígeno o fragmento del mismo por dichas células presentadoras de antígeno y activación de células T citotóxicas debido a esta presentación.

El término "células inmunes" se refiere a las células del sistema inmunológico implicadas en la defensa del cuerpo de un individuo. El término "células inmunes" abarca tipos específicos de células inmunes y sus precursores, incluidos leucocitos que comprenden macrófagos, monocitos (precursores de macrófagos), granulocitos tales como neutrófilos, eosinófilos y basófilos, células dendríticas, mastocitos y linfocitos tales como células B, células T y células asesinas naturales (NK). Los macrófagos, monocitos (precursores de macrófagos), neutrófilos, células dendríticas y mastocitos son células fagocíticas.

El término "inmunoterapia" se refiere al tratamiento de una enfermedad o afección induciendo, mejorando o suprimiendo una respuesta inmune. Las inmunoterapias diseñadas para provocar o amplificar una respuesta inmune se clasifican como inmunoterapias de activación, mientras que las inmunoterapias que reducen o suprimen una respuesta inmune se clasifican como inmunoterapias de supresión. El término "inmunoterapia" incluye inmunización con antígenos o vacunación con antígenos, o inmunización con tumores o vacunación con tumores. El término "inmunoterapia" también se refiere a la manipulación de respuestas inmunes de manera que las respuestas inmunes inapropiadas se modulan en otras más apropiadas en el contexto de enfermedades autoinmunes tales como artritis reumática, alergias, diabetes o esclerosis múltiple.

Los términos "inmunización" o "vacunación" describen el proceso de administrar un antígeno a un individuo con el propósito de inducir una respuesta inmune, por ejemplo, por razones terapéuticas o profilácticas.

El término "tratamiento terapéutico" o simplemente "tratamiento" se refiere a cualquier tratamiento que mejora el estado de salud y/o prolonga (aumenta) la vida útil de un individuo. Dicho tratamiento puede eliminar la enfermedad en un individuo, detener o retardar el desarrollo de una enfermedad en un individuo, inhibir o retardar el desarrollo de una enfermedad en un individuo, disminuir la frecuencia o severidad de los síntomas en un individuo y/o disminuir la recurrencia en un individuo que actualmente tiene o que previamente ha tenido una enfermedad.

El término "tratamiento profiláctico" o "tratamiento preventivo" se refiere a cualquier tratamiento destinado a prevenir la aparición de una enfermedad en un individuo. Los términos "tratamiento profiláctico" o "tratamiento preventivo" se utilizan en est documento indistintamente.

Los términos "proteger", "prevenir", "profiláctico", "preventivo" o "protector" se refieren a la prevención y/o tratamiento de la aparición y/o propagación de una enfermedad, por ejemplo, tumor, en un individuo. Por ejemplo, una administración profiláctica de una inmunoterapia, por ejemplo, al administrar la composición de la presente enseñanza, puede proteger al individuo receptor del desarrollo de un tumor. Por ejemplo, una administración terapéutica de una inmunoterapia, por ejemplo, administrando la composición de la presente enseñanza, puede detener el desarrollo de una enfermedad, por ejemplo conducir a la inhibición del progreso/crecimiento de un tumor. Esto comprende la desaceleración del progreso/crecimiento del tumor, en particular una interrupción del progreso del tumor, que preferiblemente conduce a la eliminación del tumor. Una administración terapéutica de una inmunoterapia puede proteger al individuo, por ejemplo, de la diseminación o metástasis de tumores existentes.

El término "individuo" o "sujeto" se refiere a vertebrados, particularmente mamíferos. Por ejemplo, los mamíferos en el contexto de la presente enseñanza son humanos, primates no humanos, mamíferos domesticados tales como perros, gatos, ovejas, vacas, cabras, cerdos, caballos, etc., animales de laboratorio tales como ratones, ratas, conejos, conejillos de indias, etc., así como animales en cautiverio tal como animales de zoológicos. El término "sujeto" también se refiere a vertebrados no mamíferos tales como aves (particularmente aves domesticadas tales como pollos, patos, gansos, pavos) y peces (particularmente peces de cultivo, por ejemplo, salmón o bagre). El término "animal" como se usa en este documento también incluye humanos.

Los agentes tales como las partículas poliplex descritas en el presente documento pueden administrarse en forma de cualquier composición farmacéutica adecuada. El término "composición farmacéutica" se refiere a una formulación que comprende un agente terapéuticamente eficaz o una sal del mismo, preferiblemente junto con excipientes farmacéuticos tales como tampones, conservantes y modificadores de tonicidad. Dicha composición farmacéutica es útil para tratar, prevenir o reducir la gravedad de una enfermedad o trastorno mediante la administración de dicha composición farmacéutica a un individuo. Una composición farmacéutica también se conoce en la técnica como formulación farmacéutica. La composición farmacéutica se puede administrar de forma local o sistémica. En el contexto de la presente enseñanza, la composición farmacéutica comprende las partículas descritas en este documento. El término "administración sistémica" se refiere a la administración de un agente terapéuticamente eficaz de manera que el agente se distribuya ampliamente en el cuerpo de un individuo en cantidades significativas y desarrolle un efecto biológico. De acuerdo con las presentes enseñanzas, se prefiere que la administración sea por vía parenteral. El término "administración parenteral" se refiere a la administración de un agente terapéuticamente eficaz de manera que el agente no pase por el intestino. El término "administración parenteral" incluye la administración intravenosa, la administración subcutánea, la administración intradérmica o la administración intraarterial, pero no se limita a las mismas.

En una realización particularmente preferida, la composición de acuerdo con las presentes enseñanzas se administra a tejido muscular, tal como músculo esquelético. La administración intramuscular tal como mediante inyección intramuscular es, por lo tanto, la vía de administración preferida.

La administración se puede lograr de varias formas. En una realización, la composición de acuerdo con la presente enseñanza es para uso en un método de tratamiento y se administra mediante inyección. En una realización preferida, la inyección se realiza mediante una aguja. La inyección sin aguja se puede utilizar como alternativa.

Las composiciones farmacéuticas de la presente enseñanza pueden comprender al menos un adyuvante. El término "adyuvante" se refiere a compuestos que, cuando se administran en combinación con un antígeno o péptido de antígeno a un individuo, prolongan, potencian o aceleran una respuesta inmunitaria. Se supone que los adyuvantes ejercen su actividad biológica por uno o más mecanismos, incluido un aumento de la superficie del antígeno, una prolongación de la retención del antígeno en el cuerpo, un retraso en la liberación del antígeno, el direccionamiento del antígeno a los macrófagos, aumento de la captación del antígeno, mejora del procesamiento del antígeno, estimulación de la liberación de citocinas, estimulación y activación de células inmunes tales como células B, macrófagos, células dendríticas, células T y activación inespecífica de células inmunes. Los adyuvantes comprenden un grupo heterogéneo de compuestos tales como emulsiones oleosas (por ejemplo, adyuvantes de Freund), compuestos minerales (tales como alumbre), productos bacterianos (tales como la toxina de Bordetella pertussis) o complejos inmunoestimulantes. Los ejemplos de adyuvantes incluyen saponinas, adyuvantes de Freund incompletos, adyuvantes de Freund completos, tocoferol o alumbre, pero no se limitan a ellos.

La composición farmacéutica de acuerdo con la presente divulgación se aplica generalmente en una "cantidad farmacéuticamente eficaz" y en "una preparación farmacéuticamente aceptable".

El término "cantidad farmacéuticamente eficaz" se refiere a la cantidad que logra una reacción deseada o un efecto deseado solo o junto con dosis adicionales. En el caso del tratamiento de una enfermedad particular, la reacción deseada se refiere preferiblemente a la inhibición del curso de la enfermedad. Esto comprende ralentizar el progreso de la enfermedad y, en particular, interrumpir o revertir el progreso de la enfermedad. La reacción deseada en un tratamiento de una enfermedad también puede ser un retraso del inicio o una prevención del inicio de dicha enfermedad o dicha condición. Una cantidad eficaz de las composiciones descritas en el presente documento dependerá de la afección a tratar, la gravedad de la enfermedad, los parámetros individuales del paciente, incluida la edad, la afección fisiológica, el tamaño y el peso, la duración del tratamiento, el tipo de terapia acompañante (si está presente), la vía específica de administración y factores similares. Por consiguiente, las dosis administradas de las composiciones descritas en este documento pueden depender de varios de dichos parámetros. En el caso de que una reacción en un paciente sea insuficiente con una dosis inicial, se pueden usar dosis más altas (o dosis efectivamente más altas logradas por una vía de administración diferente, más localizada).

El término "farmacéuticamente aceptable" se refiere a la no toxicidad de un material que no interactúa con la acción del componente activo de la composición farmacéutica.

Las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación pueden contener sales, tampones, agentes conservantes, vehículos y opcionalmente otros agentes terapéuticos. Preferiblemente, las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación comprenden uno o más vehículos, diluyentes y/o excipientes farmacéuticamente aceptables.

El término "excipiente" pretende indicar todas las sustancias en una composición farmacéutica que no son ingredientes activos tales como aglutinantes, lubricantes, espesantes, agentes tensioactivos, conservantes, emulsionantes, tampones, agentes saborizantes o colorantes.

El término "diluyente" se refiere a un agente adelgazante y/o diluyente. Además, el término "diluyente" incluye uno cualquiera o más de suspensiones y/o medios de mezcla fluidos, líquidos o sólidos.

El término "vehículo" se refiere a una o más rellenos o diluyentes sólidos o líquidos compatibles, que son adecuados para una administración a un ser humano. El término "vehículo" se refiere a un componente orgánico o inorgánico natural o sintético que se combina con un componente activo para facilitar la aplicación del componente activo. Preferiblemente, los componentes del vehículo son líquidos estériles tales como agua o aceites, incluidos los que se derivan de aceite mineral, animales o plantas, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite de sésamo, aceite de girasol, etc. Las soluciones salinas y las soluciones acuosa de dextrosa y glicerina también se pueden usar como compuestos portadores acuosos.

Los vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables para uso terapéutico son bien conocidos en la técnica farmacéutica y se describen, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R Gennaro edit. 1985). Los ejemplos de vehículos adecuados incluyen, por ejemplo, carbonato de magnesio, estearato de magnesio, talco, azúcar, lactosa, pectina, dextrina, almidón, gelatina, tragacanto, metilcelulosa, carboximetilcelulosa de sodio, una cera de bajo punto de fusión, manteca de cacao y similares. Los ejemplos de diluyentes adecuados incluyen etanol, glicerol y agua.

Los vehículos, excipientes o diluyentes farmacéuticos se pueden seleccionar con respecto a la vía de administración pretendida y la práctica farmacéutica estándar. Las composiciones farmacéuticas de la presente enseñanza pueden comprender como, o además de, el vehículo o vehículos, excipiente o excipientes o diluyente o diluyentes cualquier aglutinante o aglutinantes, lubricante o lubricantes, agente o agentes de suspensión, agente o agentes de recubrimiento, y/o agente o agentes solubilizantes adecuados. Ejemplos de aglutinantes adecuados incluyen almidón, gelatina, azúcares naturales tales como glucosa, lactosa anhidra, lactosa de flujo libre, beta-lactosa, edulcorantes de maíz, gomas naturales y sintéticas, tales como goma arábiga, tragacanto o alginato de sodio, carboximetilcelulosa y polietilenglicol. Los ejemplos de lubricantes adecuados incluyen oleato de sodio, estearato de sodio, estearato de magnesio, benzoato de sodio, acetato de sodio, cloruro de sodio y similares. En la composición farmacéutica se pueden proporcionar conservantes, estabilizadores, colorantes e incluso agentes saborizantes. Los ejemplos de conservantes incluyen benzoato de sodio, ácido sórbico y ésteres de ácido p-hidroxibenzoico. También se pueden usar antioxidantes y agentes de suspensión.

La composición de la divulgación es una composición acuosa. La composición acuosa puede comprender opcionalmente solutos, por ejemplo, sales. En una realización, la composición está en forma de composición liofilizada. Una composición liofilizada se puede obtener liofilizando una composición acuosa respectiva.

Los agentes y composiciones divulgados en este documento pueden usarse solos o en combinación con otros regímenes terapéuticos tales como cirugía, irradiación, quimioterapia y/o trasplante de médula ósea (autólogo, singénico, alogénico o no relacionado).

Cualquier característica divulgada anteriormente no forma parte de la invención. La invención está definida únicamente por las reivindicaciones.

Ejemplos

Ejemplo 1: Toxicidad in vitro de poliplexos

Materiales y métodos

Reactivo in vivo-jetPEIMR, cat. # 201-50G, se adquirió a través de e Polyplus-Transfection (IIIkirch, Francia). In vivo-jetPEIMR se proporciona a razón de150 mM (expresado como la concentración de residuos de nitrógeno) en agua estéril libre de pirógenos. JetPEI se diluyó en tampón HEPES 10 mM, pH 7.1, glucosa al 5% (HBGx1) hasta las concentraciones deseadas (expresadas como la concentración de residuos de nitrógeno).

Ensayo de citotoxicidad in vitro

Se sembraron células HEK-293 en una placa de 96 pocillos (fondo plano) a una concentración de 2x104 células por pocillo. Las células se mantuvieron a 37 °C y CO2 al 7.5%. Después de 24 h, el sobrenadante se descartó y se reemplazó con 50 pl de medio DMEM (FCS a del 10%). Se diluyó PEI (1:5) en medio RPMI con FCS al 10% y se preincubó durante 15 min. Luego se añadieron 50 pl de la solución de PEI a las células hasta un volumen final de medio de 100 pl. Después de 18 h adicionales, se realizó el ensayo XTT (XTT Cell Viability Kit # 9095, New England Biolabs GmbH, Frankfurt, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del manual. Los datos de muerte celular en función de la concentración de PEI se ajustaron usando la ecuación sigmoidea:

La Figura 1A muestra la toxicidad de PEI pura libre en células HEK-293 in vitro. IC50 = 77 pM de nitrógenos (libres). La Fig. 1B muestra la toxicidad de los poliplexos de PEI/replicón-ARN en células HEK-293 in vitro. IC50 = 542 pM de nitrógenos (formulación de poliplex).

Resultados y Conclusiones

La PEI libre conduce a la muerte celular a una concentración de nitrógeno por encima de 18 pM (Fig. 1A). La concentración final de PEI libre en el medio celular debe estar por debajo del límite antes mencionado para evitar problemas de toxicidad.

Los poliplexos causan menos muerte celular que la PEI libre, pero su toxicidad también aumenta cuando aumenta la concentración de PEI (Fig. 1B). La muerte celular después de la adición de poliplexos podría calcularse usando la ecuación:

% de muerte celular = 21.13 78.59/(1 10((-0.27-log(concentración))*3.13)) Para poliplexos de N/P 11.6 (concentración de ARN de 10 mg/l, PEI = 348 pM), la muerte celular es de 36.8%, mientras que para poliplexos de N/P 15.8 la muerte celular es de 52.3%.

Ejemplo 2: Estudios de estabilidad de poliplexos

Materiales y métodos

Se utilizó el reactivo in vivo-jetPEIMR del ejemplo 1. El ARN que codifica luciferasa, Constructo del replicón D1-824, ID R076 1, fue proporcionado por la unidad de bioquímica de ARN (BioNTech RNA Pharmaceuticals GmbH, Mainz, Alemania).

Preparación de poliplexos

Antes de la preparación, el in vivo-jetPEIMR y la solución de azúcar se equilibraron a temperatura ambiente. La preparación de los complejos in vivo-jetPEIMR/ARN se realizó en una campana de flujo laminar utilizando soluciones de azúcar estériles (Tabla 1). La concentración final del azúcar en la formulación fue del 5 al 10% p/v.

Todas las formulaciones se prepararon a una concentración de ARN de 250 mg/l y una proporción de 11.6. Las etapas de preparación fueron:

1. El ARN se diluyó utilizando un tampón de azúcar concentrado (HBGx2, MBGx2 o HBTx2) para preparar una solución de la mitad del volumen final. Se aplicó un vórtice suave.

2. El reactivo in vivo-jetPEIMR se diluyó usando el mismo tampón de azúcar y agua estéril para preparar una solución de 3/5 del volumen final. Se aplicó un vórtice suave.

3. La mitad del volumen del in vivo-jetPEIMR diluido se añadió rápidamente al ARN diluido de una vez y se aplicó un vórtice suave.

4. Los poliplex se incubaron durante 15 a 20 minutos a temperatura ambiente y luego se transfirieron a las condiciones de almacenamiento apropiadas.

T l 1. M i r l r r i n lm n mi n li l x

Liofilización de poliplexos

Las formulaciones se colocaron en un liofilizador con colector de sobremesa Epsilon 2-4 LSCplus (Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Osterode, Alemania).

Las muestras se congelaron a -40 °C (~ 2 °C/min) a 1 ATM. Tomó de 60 a 90 minutos.

La presión se redujo a 0.2 ATM durante 10 min a -40 °C.

Las muestras se secaron durante 4 ha 0.2 ATM y -40 °C.

Las muestras se calentaron a -16 °C a 0.2 ATM durante 2 h (rampa).

Se continuaron secando las muestras durante 4 ha -16 °C y 0.2 ATM.

La presión se redujo a 0.01 ATM durante 10 min a -16 °C.

Se continuaron secando las muestras durante 4 ha -16 °C y 0.01 ATM.

Las muestras se calentaron a 20 °C a 0.01 ATM durante 2 h (rampa).

Se continuaron secando las muestras durante 8 ha 20 °C y 0.01 ATM.

Liberación de ARN de poliplexos

Se prepararon doce tubos de ensayo con 90 j l de muestra de acuerdo con la Tabla 2.

Tabla 2. Pre aración de muestras ara mediciones de concentración e inte ridad de ARN

Se añadieron a cada tubo 10 j l de heparina 50 g/l en NaCl 500 mM. La mezcla se incubó durante 20 min a 30 °C en una máquina de vórtice con una velocidad de agitación de 300 rpm.

Integridad del ARN

Se utilizaron 5 j l del ARN liberado para la medición en el Bioanalyzer. El ARN se mezcló con 5 j l de formamida. La cuantificación de la integridad del ARN se realizó con el instrumento Agilent 2100 Bioanalyzer. El Nano Kit Agilent RNA 6000 se equilibró a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se centrifugaron 400 j l de “Matriz de Nano Gel” a 1500 g durante 10 minutos. Se mezclaron 65 j l del sobrenadante con 1 j l de “Concentrado de Nano colorante” bien agitado en vórtex y se centrifugaron a 15000 g durante 10 minutos para obtener la “Mezcla Gel-Colorante”. Las muestras preparadas se desnaturalizaron calentando durante 10 minutos a 70 °C, y la "Nano Escalera" también se calentó durante 2 minutos a la misma temperatura. El chip se imprimó usando la "Estación de cebado", agregando 9 j l de "Mezcla de Gel-Colorante" en la posición marcada G y presurizando el chip durante 30 segundos. A continuación, se añadieron 9 j l de “Mezcla de Gel-Colorante” en las otras posiciones G. Se agregaron 7 j l y medio de "Marcador" en la posición de escalera y 5 j l en cada posición de muestra. La "Nano escalera" desnaturalizada (1.5 j l ) se añadió a la posición de la escalera y luego se añadió 1 j l de muestra en los 12 pocillos de muestra (se añade 1 j l de H2O a los pocillos no usados). El Chip se colocó en una máquina de vórtex IKA y se aplicó un vórtex durante 1 minuto a 2000 rpm. Este chip se midió en el instrumento y se detectó el pico de ARN del replicón a los 47-57 segundos. La integridad del ARN se calculó en el software Expert 2100 usando análisis Smear seleccionando la región de ARN del replicón. El % de integridad relativa del ARN se calculó usando la siguiente ecuación:

In te g r id a d del ARN después de 2 semanas de alm acenam iento % In te g r id a re la t iv a de ARN = 100 x----------——, , , , _ ,-------- -------- ;— -—------------------ - — -------- — —

In te g r id a d del ARN 1 hora después de la p reap rac ion de po lip lex Ensayo de transfección in vitro

Se sembraron células C2C12 en una placa de 96 pocilios (fondo plano) a una concentración de 2x104 células por pocilio. Las células se mantuvieron a 37 °C y CO2 al 7.5%. Después de 24 h, el sobrenadante se descartó y se reemplazó con 50 pl de medio DMEM (FCS 10%). Los poliplexos se diluyeron (1:5) en medio DMEM con FCS al 10% y se preincubaron durante 15 min. Luego se añadieron 50 pl de la solución de poliplex a las células hasta un volumen medio final de 100 pl. Después de 48 h adicionales, el ensayo Bright-GloMR Luciferase Cat. # E2610, Promega GmbH, Mannheim, Alemania) se realizó de acuerdo con las instrucciones del manual.

El % de luminiscencia relativa se calculó usando la siguiente ecuación:

Lum iniscencia abso lu ta después de 8 días de alm acenam iento % de lum in iscencia re la t iv a = 100x ---------------------------— -------- ---------;— -------- ------------------------------------------Lum iniscencia abso lu ta después de 16 horas de alm acenam iento

La Figura 2 muestra la luminiscencia relativa de las células musculares C2C12 después de la incubación con poliplexos de PEI/replicón-ARN a N/P 11.6 de diferentes condiciones de almacenamiento después de 1 semana de almacenamiento.

La Figura 3 muestra la integridad relativa del ARN de los poliplexos de PEI/replicón-ARN a N/P 11.6 en diferentes condiciones de almacenamiento después de 2 semanas de almacenamiento.

Resultados y Conclusiones

Los poliplexos tienen poca estabilidad al almacenamiento en estado líquido (4 y 25 °C). La estabilidad de los poliplexos es significativamente mejor en estado sólido (congelado o liofilizado) que en estado líquido. La estabilidad de almacenamiento de poliplexos en tampón HBT EDTA en estado sólido es significativamente mejor que la estabilidad de almacenamiento en tampón HBGx1.

Para poliplexos en HBT EDTA, es posible una estabilidad de almacenamiento prolongada en estado sólido, mientras que para poliplexos en HBGx1, la estabilidad de almacenamiento prolongada en estado líquido es muy improbable.

Las formulaciones de Poliplex con replicón-ARN podrían estabilizarse mediante la adición de: trehalosa al 5-20% (p/v), EDTA 80 pM - 5 mM.

Ejemplo 3: Descripción del cálculo de Mw de PEI lineales

La PEI lineal se sintetiza a partir de 2-etil-2-oxazolina en dos etapas: Primero, se obtiene poli(2-etil-2-oxazolina) mediante una polimerización por isomerización de apertura de anillo de 2-etil-2-oxazolina en presencia de iniciadores (Fig. 4). Luego, PEOX (N-propionil-PEI) se hidroliza con ácido para escindir los grupos N-propionilo para producir PEI (Fig. 5).

La desacilación completa de PEOX (N-propionil-PEI) con un peso molecular de 50 kDa produce una PEI lineal con un peso molecular de 22 kDa. La determinación del peso molecular del producto intermedio (PEOX) se realiza mediante cromatografía de permeación en gel con un detector de índice de refracción o un detector de dispersión de luz de múltiples ángulos. Los detalles técnicos completos se describen en: Adib, Abdennaji, Fabrice Stock y Patrick Erbacher. "Method for Manufacturing Linear Polyethylenimine (PEI) for Transfection Purpose and Linear PEI Obtained with Such Method." Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 12/671,312.

De acuerdo con esta enseñanza, las PEI, que se sintetizaron a partir de PEOX con el intervalo de Mw de 40-60 kDa, son los potentes reactivos de transfección para replicón-ARN.

El PEI para su uso de acuerdo con las enseñanzas se puede adquirir en Polyplus-Transfection SA (IIIkirch-Graffenstaden, Francia): In vivo-JetPEI, Polysciences Europe GmbH (Eppelheim, Alemania): PEI MAX 40.000 y Euromedex (Souffelweyersheim, Francia ): Exgen 500.

Ejemplo 4: Cinética de agregación de poliplexos

Materiales y métodos

Los poliplexos se prepararon en HBGx1 a una concentración de ARN de 200 mg/l, como se describió previamente en el Ejemplo 2. Se diluyeron en HBGx1 y solución salina tamponada con fosfato pH 7.4 (PBS) hasta una concentración de ARN de 10 mg/l. Se utilizó PBS para aumentar la fuerza iónica de la solución. Se limpió una placa de 96 pocillos con aire filtrado antes de añadir los poliplexos diluidos a la placa. Los tamaños se midieron con el instrumento DynaPro plate reader II de WYATT Technology GmbH (Dernbach, Alemania). El ajuste acumulativo se utilizó para el cálculo del tamaño de muestras monomodales, mientras que el ajuste de regularización se utilizó para muestras multimodales.

La Figura 6 muestra la cinética de agregación de los poliplexos IVT (A) y replicón (B) con JetPEI a concentraciones crecientes de sal.

Resultados y Conclusiones

La alta fuerza iónica conduce a un aumento del tamaño de los poliplexos (Fig. 6). La fuerza iónica de la formulación del poliplex debe ser <20 mM para evitar la agregación de los poliplexos.

Ejemplo 5: Esterilización de poliplexos por filtración

Materiales y métodos

Se prepararon poliplexos a una concentración de ARN de 100 mg/l y proporciones de N/P de 11.5, 13.5 y 15.5, como se describió previamente en la sección "Estudios de estabilidad de poliplexos".

Integridad y concentración de ARN

El ARN se liberó de los poliplexos mediante incubación con heparina. Se mezclaron noventa pl de ARN libre (100 mg/l) o poliplexos con 10 pl de heparina 20 g/l en Hepes 10 mM, pH 7.4, EDTA 1 mM. La mezcla se incubó durante 20 min a 30 °C en la máquina de vórtice. Se mezclaron 5 pl de esta mezcla con 5 pl de formamida. A continuación, se midió la integridad del a Rn mediante Bioanalyzer con pico-chips. La integridad del ARN se calculó, como se describe en el ejemplo 2. La concentración de ARN se midió mediante el ensayo Ribogreen con reactivo y kit de ARN "QuantiT RiboGreen" (Cat. # R11490, Thermo Fischer Scientific), de acuerdo con las instrucciones del fabricante para el método de alta sensibilidad. Brevemente, la mezcla de poliplexos con heparina se incubó con fluoróforo Ribogreen en tampón Tris 10 mM, pH 7.5, EDTA 1 mM. La fluorescencia de Ribogreen se midió a una longitud de onda de excitación de 485 nm y una emisión de 535 nm.

Concentración de PEI

Se preparó una solución de CuSO423 mg (anhidro) en 100 ml de acetato de Na 0.1 M, pH 5.4 (reactivo CSS). Se mezclaron 600 pl de reactivo CSS con los poliplexos y se incubaron durante 5 min a temperatura ambiente. La absorción de cada solución se midió a 285 nm en un espectrofotómetro UV contra el blanco usando una cubeta de 1 cm. Se preparó una curva de calibración con concentraciones conocidas de PEI (0-1.55 mM) y se usó para calcular la concentración de PEI en las muestras desconocidas. Se restó una absorción de fondo del ARN libre de todas las muestras.

Medida de la movilidad electroforética (p)

Los poliplexos se diluyeron hasta una concentración de ARN de 20 mg/l en HBGx1 en 3.1 ml. A continuación, se centrifugaron a 600 g durante 2 min. Se prepararon tres muestras de 1.05 ml para cada formulación en cubetas de plástico. La movilidad electroforética de los poliplexos se midió mediante electroforesis láser Dopler con el instrumento Z-Wallis (Corduan Technologies, Francia). Se utilizó una medición de resolución media con 1 secuencia de 10 pruebas para cada muestra. Las mediciones con relaciones de señal a ruido bajas, o con p extrema (> 3 o <-3 pm * cm/V * S) se excluyeron del análisis final. Todas las formulaciones se midieron por triplicado.

Filtración de poliplexos

Se prepararon tres tubos con 2.68 ml de poliplexos en tres proporciones de N/P diferentes. Los poliplexos (1.34 ml) se filtraron a través de unidades de filtro de jeringa Millex-GP Med estériles con poros de 220 nm (cat. No. SLMPL25SS, Merck Millipore). Las propiedades fisicoquímicas se midieron antes y después de la filtración.

La Figura 7 muestra los parámetros fisicoquímicos de los poliplexos antes (preparados) y después (filtrados) de la filtración. A y B. La heparina liberó ARN de los poliplexos. Luego se midió la integridad replicón-ARN (A) mediante electroforesis capilar con el instrumento Bioanalyzer. La concentración de replicón-ARN (B) se midió mediante fluorescencia Ribogreen. C. La concentración de PEI se midió mediante un ensayo de CuSO4. D. La movilidad electroforética (p) se midió mediante electroforesis láser-Doppler.

Resultados y Conclusiones

Las unidades de filtro de jeringa son un método adecuado para la esterilización de poliplexos. Los poliplexos deben ser pequeños <120 nm para esterilizarlos por filtración. Con una proporción de N/P de 11.6, las propiedades fisicoquímicas de los poliplexos no se modifican por la filtración. Cuando la proporción de N/P aumenta por encima de 11.6, hay pérdida de ARN durante la filtración.

Ejemplo 6: Efecto de la pureza de PEI sobre la transfección de formulaciones de replicón-ARN/PEI

Materiales y métodos

Los siguientes PEI de alta pureza se adquirieron de Polyplus-Transfection SA (IlIkirch-Graffenstaden, Francia): in vivo-JetPEI y de Polysciences Europe GmbH (Eppelheim, Alemania): PEI MAX 40000.

Se adquirió el siguiente PEI de pureza regular de Polysciences Europe GmbH (Eppelheim, Alemania): PEI 25000. Los poliplexos se prepararon en HBGx1 a una concentración de ARN de 100 mg/l, como se describió previamente en el Ejemplo 2.

Transfección in vivo

Los ratones se anestesiaron con isoflurano y el lado posterior de las patas traseras se afeitó y desinfectó con una solución de EtOH al 70%. Se inyectaron 20 pl de las formulaciones investigadas en el músculo tibial posterior del músculo con una jeringa de insulina preinstalada con una cánula de tamaño 30G. Se observó al ratón hasta que recobró la conciencia en busca de signos de dolor, sufrimiento y angustia.

El día de la medición, los ratones se inyectaron en forma ip con solución de luciferina. Posteriormente, los ratones se anestesiaron con isoflurano y se colocaron sobre una estera térmica (37 °C) dentro de la cámara de imágenes IVIS® Spectrum (Perkin Elmer) con suministro constante de isoflurano/oxígeno a través de máscaras de anestesia individuales. Cinco minutos después de la inyección de luciferina, se realizó la detección de luz de bioluminiscencia durante un minuto a través de una cámara. Las imágenes resultantes se analizaron utilizando el software "LivingImage" (Perkin Elmer).

La Figura 8 muestra una comparación de las estructuras químicas de PEI de alta pureza y PEI de pureza regular. n = 58 para PEI de 25 kDa. El número promedio de monómeros CH2CH2NH en PEI 25 kD es 581, que también es la longitud del tramo contiguo de nitrógenos potencialmente protonables. Suponiendo una distribución uniforme de las fracciones de N-propionilo en el PEI25 regular, su tramo contiguo de nitrógenos protonables es de solo 64.

La Figura 9 muestra la transfección de células musculares C2C12 in vitro mediante poliplexos de replicón-ARN que se prepararon usando PEI de diferente nivel de pureza a diferentes proporciones de N/P.

De acuerdo con la Figura 10, se prepararon poliplexos de replicón-ARN en proporciones de N/P de 1 (-) y 11.6 (+) con PEI de alta pureza (jetPEI) y PEI de pureza regular (25 kDa). Se usó ARN libre como control. Las formulaciones se inyectaron en forma im a las extremidades posteriores de los ratones (n = 3). Se registraron señales de luminiscencia de los músculos de los ratones.

Resultados y Conclusiones

Los poliplexos, que se prepararon usando PEI de alta pureza, transfectan células musculares in vitro mejor que la PEI de pureza regular. Los poliplexos tienen la mayor eficacia de transfección in vivo a N/P 11.6 después de la inyección im.

Los poliplexos catiónicos con PEI de alta pureza a N/P 11.6 pueden transfectar el tejido muscular in vivo significativamente mejor (diferencia de 4-5 veces) que el replicón-ARN libre.

Los poliplexos aniónicos con PEI altamente puro a N/P 1, poliplexos con PEI de pureza regular a N/P 1, y poliplexos catiónicos con PEI regular puro a N/P 11.6 transfectan el tejido muscular peor que el replicón-ARN libre.

Ejemplo 7: Alta eficacia de transfección de replicón-ARN por PEI puras de diferentes proveedores y poliplexos liofilizados

Materiales y métodos

Las siguientes PEI de alta pureza se adquirieron de Polyplus-Transfection SA (IIIkirch-Graffenstaden, Francia): in vivo -JetPEI y Euromedex (Souffelweyersheim, Francia): Exgen 500 y de Polysciences Europe GmbH (Eppelheim, Alemania): PEI MAX 40000.

Los poliplexos se prepararon en HBGx1 a una concentración de ARN de 100 mg/l, como se describió previamente en el Ejemplo 2. Todas las formulaciones se prepararon en tampón HBGx1 excepto la formulación liofilizada, que se preparó en tampón HBTx1. Se realizó la liofilización de los poliplexos en tampón HBTx1, como se describió previamente en el Ejemplo 2. Las formulaciones se inyectaron en forma im a las extremidades posteriores de los ratones (n = 3), y se registraron las señales de luminiscencia de los músculos de los ratones, como se describió previamente en el Ejemplo 6.

Para el experimento de la Figura 11, se prepararon poliplexos de replicón-ARN en proporciones de N/P de 7.7 y 11.6 con PEI de alta pureza: jetPEI (de Polyplus), PEI-Max 40000 (de Polyscience) y Exgen 500 ( de Eurodamex).

Tabla 3. Prueba de Mann Whitney, de dos colas, para la significancia estadística (valor P) de la diferencia entre las formulaciones de la Fig. 11.

La Fig. 12 muestra tortas liofilizadas de poliplexos de JetPEI/replicón-ARN a N/P 11.6 preparadas con diferentes tampones.

Resultados y Conclusiones

Los poliplexos de replicón-ARN transfectan el tejido muscular de manera eficiente después de inyección im (Fig. 11). Las PEI de alta pureza: jetPEI (de Polyplus), PEI-Max 40000 (de Polyscience) y Exgen 500 (de Eurodamex) podrían usarse para la preparación de los poliplexos. Los poliplexos Exgen-500 se transfectan mejor a N/P 7.7 que a 11.6. El liofilizado de poliplexos en trehalosa tiene una morfología similar a una torta, mientras que en la glucosa el liofilizado colapsa y es difícil disolverlo en agua (Fig. 12).

La trehalosa es preferible a la glucosa para la liofilización de poliplexos. Los poliplexos liofilizados se comportan in vivo de forma similar a los poliplexos líquidos recién preparados.

Ejemplo 8: Transfección de IVT-ARN a células musculares mediante poliplexos de PEI puros

Materiales y métodos

Reactivo in vivo-jetPEIMR, cat. # 201-50G, se adquirió de Polyplus-Transfection (IIIkirch, Francia). El ARNm transcrito in vitro (IVT) que codifica la luciferasa, Constructo pST1-475, fue proporcionado por la RNA Biochemistry Unit (Biontech RNA Pharmaceuticals, Mainz, Alemania).

Se prepararon poliplexos de IVT-ARN y PEI como se describió previamente en el Ejemplo 2. Se prepararon diferentes proporciones de n /p manteniendo constante la concentración de ARN y aumentando la concentración de PEI. La transfección de células musculares in vitro se realizó como se describió previamente en el Ejemplo 2.

Se realizaron estudios de transfección in vivo como se describió previamente en el Ejemplo 6.

De acuerdo con la Fig. 13, las células musculares C2C12 se transfectaron in vitro mediante IVT-RNA que codifica la luciferasa. El ARN formaba complejos con JetPEI a diferentes proporciones de N/P en tampón HBGx1. La señal de luminiscencia se midió 24 h después de la transfección.

De acuerdo con la Fig. 14, se prepararon poliplexos de IVT-ARN en proporciones de N/P de 5.8 y 11.6 con PEI pura en tampón HBGx1. Se utilizó como control IVT-ARN libre en tampón HBGx1. Las formulaciones se inyectaron en forma im a las extremidades posteriores de los ratones (n = 3) a dosis de ARN de 2-8 |jg por inyección. Se registraron señales de luminiscencia de los músculos de los ratones 6 h después de la inyección.

Resultados y Conclusiones

Los poliplexos de IVT-ARN y PEI de alta pureza pueden transfectar células musculares de forma eficaz in vitro. Existe una correlación positiva entre la eficiencia de transfección y la proporción de N/P (Fig. 13). El IVT-ARN libre no transfecta las células in vitro.

Los poliplexos con PEI de alta pureza en proporciones de N/P de 5.8 y 11.6 transfectan el tejido muscular in vivo significativamente peor que el IVT-ARN libre (Fig. 14).

Ejemplo 9: Efecto del tamaño de partícula y las condiciones de preparación sobre la transfección por poliplexos de replicón-ARN

Materiales y métodos

Se prepararon poliplexos de replicón-ARN y PEI como se describió previamente en el Ejemplo 2. Los poliplexos se prepararon a 5 Ar N diferentes: 100, 250, 500, 750, 1000 mg/l. La concentración de PEI se incrementó apropiadamente para mantener la proporción de N/P en 11.6 para todas las formulaciones.

Se midió el tamaño de los poliplexos como se describió previamente en el Ejemplo 4. Se realizó la transfección de células musculares in vitro como se describió previamente en el Ejemplo 2.

De acuerdo con la Fig. 15, se prepararon poliplexos de replicón-ARN y jetPEI a diferentes concentraciones de ARN a una proporción de 11.6 en tampón HBGx1. Para las medidas de tamaño mediante DLS, los poliplexos se diluyeron hasta una concentración de ARN de 10 mg/l.

De acuerdo con la Fig. 16, las células musculares C2C12 fueron transfectadas in vitro por los poliplexos de la Fig. 16. La señal de luminiscencia se midió 24 h después de la transfección.

De acuerdo con la Fig. 17, se prepararon poliplexos de Rep-ARN en una proporción de N/P de 11.6 con PEI pura en tampón HBGx1 a diferentes concentraciones de ARN como en la Fig. 16. Las formulaciones se inyectaron en forma im a las extremidades posteriores de los ratones (n = 3) con dosis de ARN de 2-8 |jg por inyección. Se registraron señales de luminiscencia de los músculos de los ratones.

Resultados y Conclusiones

- Los poliplexos son buenos agentes de transfección para replicón-ARN. La bioactividad de los poliplexos en términos de eficiencia de la traducción de ARN en el tejido muscular no está influenciada por la concentración de ARN (0.1-1 g/l) en el momento de la formación del poliplex.

- El tamaño de los poliplexos en el intervalo de 60-200 nm no tiene un efecto de la eficacia de transfección de los poliplexos in vitro e in vivo (inyección im).

Ejemplo 10: diferentes poliplexos se comportan de manera diferente después de inyecciones sc o im en ratones Materiales y métodos

Reactivo in vivo-jetPEIMR, cat. # 201-50G, se adquirió de Polyplus-Transfection SA (IIIkirch, Francia). La PEI lineal de 22 kDa fue proporcionada por el Prof. Cheradame (Polytheragene, EVRY cedex, Francia). El ARN que codifica la luciferasa, Constructo replicón D1-824, ID 1600801, fue proporcionado por RNA Biochemistry Unit (Biontech RNA Pharmaceuticals, Mainz, Alemania).

Se prepararon poliplexos con JetPEI en HBGx1 a una concentración de ARN de 500 mg/l, como se describió previamente en el Ejemplo 2.

Los poliplexos con Polytheragene-PEI se prepararon de manera similar al procedimiento con JetPEI pero con dos modificaciones:

1. Se utilizó tampón HEPES 10 mM, pH 7.4 en lugar de HBGx1 para la preparación de los poliplexos.

2. Se utilizó una proporción de N/P de 15.8 en lugar de 11.6.

La preparación de los poliplexos con Polytheragene-PEI se realizó de acuerdo con el siguiente artículo: Démoulins, Thomas, et al., "Polyethylenimine-based polyplex delivery of self-replicating RNA vaccines." Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine (2015).

Se diluyeron los poliplexos en tampones HBGx1 u Opti-MEM (Cat. # 31985062, Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Alemania) hasta concentraciones finales de ARN de 5 mg/l para estudios in vitro y 100 mg/l para estudios in vivo. Se realizaron estudios in vitro como se describió previamente en los Ejemplos 1 y 2.

Los estudios in vivo se realizaron como se describió previamente en el Ejemplo 6.

Resultados y Conclusiones

La Fig. 18 muestra estudios in vitro con poliplexos de PEI/replicón-ARN en células dendríticas (DC) humanas y células musculares de ratón (C2C12) A. Toxicidad (expresada como % de células viables después del tratamiento con poliplexos) B. Transfección (expresada como emisión de luminiscencia después del tratamiento con poliplexos). Los resultados de la transfección se muestran solo para las células C2C12.

Para los resultados de la Fig. 19, se prepararon poliplexos de replicón-ARN en proporciones de N/P de 11.6 o 15.8 con PEI de Polyplus o Polytheragene en tampones HBGx1 o Hepes 10 mM. Antes de la inyección a los ratones, los poliplexos se diluyeron en tampones HBGx1 u Opti-MEM. Las formulaciones se inyectaron en forma im a las extremidades posteriores de los ratones (n = 3) a dosis de ARN de 2 |jg por inyección. Se registraron señales de luminiscencia de los músculos de los ratones.

Resultados y Conclusiones

Tabla 4. Com aración entre tamaños de los diferentes oli lexos

Opti-MEM tiene una fuerza iónica superior a 20 mM. En Opti-MEM, los poliplexos se agregan rápidamente (Tabla 4), por lo tanto, esta formulación no es adecuada para el desarrollo farmacéutico.

Los poliplexos descritos en el presente documento (PEI de Polyplus, N/P 11.6, HBGx1) tienen características muy diferentes a los poliplexos descritos anteriormente (PEI de Polytheragene, N/P 15.8, Opti-MEM). En Opti-MEM, los poliplexos tienen un diámetro > 1000 nm y una distribución de tamaño multimodal. Los poliplexos descritos en el presente documento tienen un diámetro de 100 nm y una baja polidispersidad.

In vitro, todos los poliplexos son más tóxicos para las células dendríticas que las células musculares. Probablemente, las células dendríticas absorben los poliplexos después de inyección sc, mientras que las células musculares son transfectadas por los poliplexos después de inyección im.

La transfección de células musculares in vitro por el poliplexo descrito en el presente documento y los poliplexos descritos anteriormente es similar.

La transfección in vivo por los poliplexos descritos en este documento y los poliplexos descritos previamente es diferente y depende de la vía de aplicación. Los poliplexos descritos en el presente documento se transfectan mucho después de la inyección im y peor después de la inyección sc. Los poliplexos descritos anteriormente no se transfectan en absoluto después de la inyección im, mientras que se observó una señal débil después de la inyección sc.

Ejemplo 11: Administración de replicón-ARN por inyecciones i.m. frente a i.d. en ratones

Se disolvió replicón-ARN, que codifica la enzima luciferasa, en tampón HBGx1 o se complejó en poliplexos, como se describe en el ejemplo 2. Estas formulaciones se inyectaron en forma im en los músculos tibialis posteriores de ratones Balb/c a dosis de 2 jg de ARN. Los ratones se anestesiaron mediante isoflurano 4, 7 y 10 días después de las inyecciones. Luego, se les inyectó sustrato de luciferina y se registró la emisión de luminiscencia de los músculos mediante una cámara CCD.

Los fotones derivados de la proteína luciferasa se recogieron durante un minuto y se muestran como una superposición con la fotografía de los ratones fotografiados (Fig. 20A). La Fig. 20B muestra una representación gráfica de fotones medidos/segundo (p/s) en el sitio de inyección.

Siete días después de la aplicación intradérmica (i.d.) de 2 jg de HBGx1) no formulado o replicón-ARN formulado que codifica Luciferasa en dos sitios de inyección en la piel dorsal de ratones Balb/c, los animales se sometieron a toma de imágenes no invasivas de bioluminiscencia in vivo. Los fotones derivados de la proteína luciferasa se recogieron durante un minuto y se muestran superpuestos con la fotografía de los ratones fotografiados. Las flechas negras indican el lugar de la inyección (Fig. 21A). La Fig. 21B muestra una representación gráfica de fotones medidos/segundo (p/s) en el sitio de inyección.

Ejemplo 12: Efecto beneficioso de la formulación de ARN como vacuna

Los ratones se inmunizaron dos veces en el día de prueba 0 y 21 con una composición de replicón-ARN monocatenario que codifica la hemaglutinina (HA) de la cepa del virus de la influenza H1N1 A/PuertoRico/8/1934 (H1N1/PR8) formulada con PEI con una proporción de N/P de 11.6 y/o ARN monocatenario no formulado. Todos los animales recibieron una dosis de 1.25 |jg de ARN. Un tercer grupo recibió solo solución salina como grupo de control de tampón. Como se muestra en la Fig. 22A, 19 días después de la primera inmunización y poco antes de la segunda inmunización, todos los animales que recibieron el ARN formulado desarrollaron una respuesta inmune contra e1HA analizado mediante el ensayo de neutralización del virus (VNT, límite de detección 1280). Por el contrario, sólo 5 de los 8 animales que recibieron el ARN no formulado se seroconvirtieron contra HA. Como se muestra en la Fig. 22B, 35 días después de la primera inmunización, todos los animales que recibieron ARN fueron positivos para anticuerpos específicos de HA y aumentaron los títulos de anticuerpos contra HA. Los títulos de animales del grupo de ARN formulado, pero no del grupo de ARN no formulado, se volvieron significativamente más altos en comparación con el grupo de control de solución salina. Como se muestra en la Fig. 22C, 54 días después de la inmunización, los ratones que recibieron 1.25 jg de ARN formulado que codifica el H1N1/PR8-HA desarrollaron un título de anticuerpos significativamente mayor en comparación con los animales que recibieron 1.25 jg del ARN no formulado que codifica el H1N1/PR8-HA (la significancia se calculó mediante ANOVA de una vía; * p<0.001).

Los ratones se inmunizaron una vez en el día de prueba 0 con una composición de replicón-ARN monocatenario que codifica la hemaglutinina (HA) de la cepa del virus de la influenza H1N1 A/PuertoRico/8/1934 (H1N1/PR8) formulada con PEI con una proporción específica de N/P de 11.6 y/o el ARN monocatenario no formulado. Todos los animales recibieron 0.25 jg de ARN. Un tercer grupo recibió solo solución salina como grupo de control de tampón. Como se muestra en la Fig. 23A, 54 días después de la inmunización, todos los animales que recibieron ARN fueron positivos para anticuerpos específicos de HA, los títulos del grupo de ARN formulado se volvieron significativamente más altos en comparación con el grupo de control con solución salina y con los animales que recibieron 0.25 jg de ARN no formulado que codifica el H1N1/PR8-HA (la significancia se calculó mediante ANOVA de una vía; ** p<0.001; * p<0.05). Cincuenta y cinco días después de la inmunización, todos los ratones se infectaron con una dosis letal media de 10 veces (MLD50) de H1N1/PR8. Se observó supervivencia. Como se muestra en la Fig. 23B, todos los animales de control murieron en 8 días. Cuatro de cada 5 animales que recibieron el ARN no formulado que codifica e1H1N1/PR8-HA sobrevivieron a la infección de provocación. Por el contrario, todos los ratones que recibieron el ARN formulado que codifica el H1N1/PR8-HA sobrevivieron a la infección provocada, lo que demuestra el efecto beneficioso de la composición de ARN/polialquilenimina.

Ejemplo 13: Secado por aspersión de replicón-ARN formulado con PEI

La formulación se preparó con una proporción de N:P de 12 siguiendo el esquema de pipeta proporcionado en la Tabla 1 dos veces y la combinación posterior del material obtenido. De ese modo, se obtuvieron 5.0 ml de poliplexos de replicón-ARN con una concentración de ARN de 0.1 mg/ml de ARN.

Se secaron por aspersión 3.5 ml de esta formulación y se recogieron 533 mg de material (rendimiento: 76.1%). No se determinó el tamaño de partícula de los poliplexos de replicón-ARN recién preparados, ya que el material se descargó en el laboratorio de demostración de Büchi. El tamaño de partícula (promedio z) después de la reconstitución con agua (mezcla: 20 mg de poliplexos secados por aspersión y 200 j l de wfi; dando como resultado trehalosa 10 mM y una concentración de a Rn de 0.1 mg/ml) fue de 289 nm y el p D i fue de 0.238 (Nicomp, 15 minutos). La Fig. 24A muestra una investigación in vitro de la expresión de luciferasa de poliplexos de ARNsa después y antes del secado por aspersión. La actividad luciferasa del ARNsa no se pierde debido al proceso de secado por aspersión. Las diferencias en la altura absoluta de las señales se deben a las variaciones del ensayo.

En un experimento adicional, se secó por aspersión ARNm no complejado en trehalosa al 10% (p:v) y se investigó la integridad del ARNm después del secado por aspersión mediante mediciones de electroforesis capilar.

Se mezclaron 2.50 ml de ARN mensajero (R36-05.2-DP; c (ARN) = 0.5 mg/ml; Hepes 10 mM; EDTA 0.1 mM; pH 7.0) con 2.50 ml de solución de trehalosa al 20% (p:v) (relación de volumen de 1:1) dando como resultado la siguiente composición: c (ARN) = 0.25 mg/ml; Trehalosa al 10% (p/v); Hepes 5 mM; EDTA 0.05 mM. Durante el secado por aspersión, el material de muestra se mantuvo en hielo. En total, se secaron por aspersión 2.5 ml de esta solución. Durante el secado por aspersión, la temperatura de salida aumentó de 33 a 37 °C en diez minutos. Para reducir el aumento de temperatura, se aumentó el flujo de gas de 98 a 101 l/min. Durante el secado por aspersión, la temperatura aumentó aún más a 41 °C en los siguientes 60 minutos. Después de la aspersión completa, se recogieron 165 mg de material seco (rendimiento: 66.0%). Para el análisis de la integridad del ARN, el material se disolvió en wfi (mezcla: 20 mg de ARN secado por aspersión y 200 j l de wfi; dando como resultado un contenido de trehalosa del 10% y una concentración de a Rn de 0.25 mg/ml). El ARN disuelto se analizó utilizando el Bioanalyzer Agilent 2100. Los resultados de estos análisis se representan como electroferograma de ARN secado por aspersión en la Figura 24B.

Se demostró que se mantuvo la integridad del ARN no complejado, y que el secado por aspersión no condujo a una degradación mensurable del ARN.

Los experimentos de secado por aspersión se realizaron como sigue:

Se utilizó el secador de Nano aspersión B-90 de Büchi para el secado por aspersión de formulaciones que contienen ARN. Para la preparación de estas formulaciones se utilizaron los siguientes compuestos:

• ARN mensajero (R36-05.2-DP, c (ARN) = 0.5 mg/ml; Hepes 10 mM; EDTA 0.1 mM; pH 7.0)

• Replicón-ARN que codifica Luciferasa (D2 ARN-A1310 29-01 pST1-SFV4-TRON-I2m2-A30L70, wfi, c(ARN) = 1 mg/ml)

• Agua para inyección (wfi)

• NaCl (1.5 M en wfi)

• Trehalosa 20% (p:v) en wfi (Pfanstiehl. Lote No: 35261A)

• Trehalosa al 20% (p:v) tamponada con Hepes 2X en wfi (Pfanstiehl. Número de lote: 35261A, Hepes 20 mM) • JetPEI (Polyplus; Lote No.: 13081A1S; nitrógeno 150 mM)

Para el secado por aspersión, se eligieron los siguientes parámetros de proceso:

• Boquilla: 4 pm

• Temperatura de entrada: 80 °C

• Temperatura de salida: 30 °C

• Flujo de gas: 98 ml/min

• Corriente aplicada: 15000 V; 350 pA

Antes de todos los experimentos, el dispositivo se limpia con RNasa Zapp y se limpia con etanol, y la tapa se limpia en un baño ultrasónico.

Ejemplo 14: Microfluidos para la fabricación de Poliplex

Se utilizó el NanoAssemblrMR (Precision Nanosystems, BC, Vancouver, Canadá) con el chip de microfluidos proporcionado por el fabricante (1029-036). Para el ARN, se usó un replicón-ARN fabricado internamente (Lote No. R071_1_2). La polietilenimina (Max PEI 40) era de Polysciences (Eppelheim, Alemania). Se usaron como jeringas BD Plastipak 1 ml; 1508006, BD Biosciences (Heidelberg, Alemania). Los dos componentes se mezclaron en una proporción de 1:1, usando un caudal de 12 ml/minuto. Las muestras se prepararon a dos concentraciones diferentes, a saber, 50 mg/l y 250 mg/l. Para las mediciones del tamaño de partícula usando dispersión de luz dinámica, se usó un analizador de potencial zeta/partícula submicrométrica 380 ZLS de Nicomp (PSS Nicomp, Santa Barbara, CA).

Para cada condición, se fabricaron 1.5 ml. Las muestras se diluyeron con tampón HBG para medir el tamaño.

El esquema de pipeteo fue el siguiente:

Se realizaron experimentos de mezcla de microfluidos usando un dispositivo que comprende un mezclador de microfluidos de tipo Y en el que se mezclan dos componentes, que se proporcionan en jeringas estándar. Los dos componentes se mezclaron en una proporción de 1:1, usando un caudal constante de 12 ml/minuto. Se prepararon muestras a dos concentraciones diferentes, a saber, 50 mg/l y 250 mg/l y se midieron los tamaños de partícula de los poliplexos obtenidos.

Los poliplexos se fabricaron con dispositivos de microfluidos, lo que demuestra la viabilidad de la fabricación de flujo continuo para escalado y fabricación GMP. La formación de partículas fue posible sin problemas y no se observó ninguna indicación de formación de agregados u obstrucción. El tamaño de partícula se midió mediante dispersión dinámica de luz. Para los poliplexos fabricados a 0.05 mg/l, el tamaño fue de aproximadamente 123 nm, y para las partículas fabricadas a razón de 0.25 mg/ml, el tamaño fue de aproximadamente 314 nm. Los detalles de los resultados obtenidos se presentan en la siguiente tabla.

Se demostró la viabilidad de la fabricación de poliplex mediante microfluidos. La fabricación se realizó con un mezclador simple tipo Y, y no fue necesario ningún procedimiento particular, tal como el enfoque hidrodinámico, para permitir una fabricación sin problemas. En condiciones adecuadas, se pueden fabricar partículas con un tamaño muy por debajo de 200 nm, lo que permite una filtración estéril terminal con filtros estériles establecidos y que cumplen con las normas GMP. Como no se observaron indicios de agregación u obstrucción, se concluye que el escalado a lotes de fabricación más grandes será posible sin problemas. Otras opciones para escalar incluyen la paralelización de varios dispositivos idénticos. Resumiendo, los resultados pueden tomarse como una indicación de la viabilidad general de la fabricación de microfluidos que cumplen con las g Mp de poliplexos de PEI/ARN.

Ejemplo 15: Esterilización de poliplexos por filtración

Se prepararon poliplexos a una concentración de replicón-ARN de 100 mg/l y proporciones de N/P de 11.5, 13.5 y 15.5, como se describió previamente en la sección "Estudios de estabilidad de poliplexos".

Se prepararon tres tubos con 2.68 ml de poliplexos en tres proporciones diferentes de N/P. Los poliplexos (1.34 ml) se filtraron a través de unidades de filtro de jeringa Millex-GP Med estériles con poros de 220 nm (cat. No. SLMPL25SS, Merck Millipore).

Se diluyeron los poliplexos hasta una concentración de ARN de 10 mg/l en HBGx1. A continuación, se diluyeron a una concentración de a Rn de 5 mg/l en NaCl al 0.9% 30 min antes de la adición a las células.

Se sembraron células C2C12 en una placa de 96 pocillos (fondo plano) a una concentración de 2x104 células por pocillo. Las células se mantuvieron a 37 °C y CO2 al 7.5%. Después de 24 h, el sobrenadante se descartó y se reemplazó con 50 pl de medio DMEM (FCS a más del 10%). Los poliplexos se diluyeron (1:5) en medio DMEM con FCS al 10% y se preincubaron durante 15 min. Luego se añadieron 50 pl de la solución de poliplex a las células hasta un volumen medio final de 100 pl. Después de 48 h adicionales, se realizó el ensayo de luciferasa Bright-GloMR (Cat. No. E2610, Promega GmbH, Mannheim, Alemania) de acuerdo con el manual de instrucciones.

Paralelamente a la transfección, también se midió el número de células usando el kit II de proliferación celular (XTT. Roche, No. 11465015001). En ambos ensayos, cada muestra de poliplex se analizó por triplicado biológico. Como control negativo, las células se sembraron sin tratamiento ("sin tratar"). Para el ensayo XTT también se sembró por triplicado medio sin células, equivalente al fondo (BG). Finalmente, se midieron la luminiscencia (Bright-GloMR) así como la absorbancia (XTT) con un lector "Infinite 200pro" (Tecan). La luminiscencia normalizada se calculó dividiendo la señal de luminiscencia por la absorbancia (proporcional al número de células).

La Fig. 25 muestra la luminiscencia normalizada de las células musculares C2C12 después de la incubación con poliplexos de PEI/replicón-ARN a diferentes proporciones de N/P, antes de la filtración estéril (preparada) y después (esterilizada).

Se puede concluir que las unidades de filtro de jeringa son adecuadas para la esterilización de poliplexos. La eficacia de transfección de los poliplexos no cambia debido al proceso de esterilización.

Ejemplo 16: Optimización de la transfección de poliplex mediante combinaciones de PEI corta y larga

Se complejó el replicón-ARN que codifica luciferasa con una combinación genuina de PEI corta entre 0.6 y 11 kDa (por ejemplo, PEI corta lineal 2.5 kDa o PEI corta ramificada 1.8 kDa) y PEI larga entre 20 y 40 kDa (por ejemplo, 22 kDa in vivo/Jet PEI) a diferentes combinaciones para un NP total de 10 o 12 en tampón MBG (concentración final 5% p/v de glucosa, MES 10 mM, pH 6.1). In vivo/Jet PEI NP12 solo se utilizó como referencia. La complejación de los poliplexos de PEI corta y larga tuvo lugar en dos etapas: En la primera etapa, se ajustó la complejación de replicón-ARN para el NP deseado con in vivo/JetPEI. En la segunda etapa, se añadió un exceso de PEI corta a la formulación para alcanzar la proporción de NP total deseada; es decir, el primer número define el PEI larga NP y el segundo número el PEI corto (por ejemplo, NP4 8 = NP4 PEI larga y NP8 PEI corto). El ensayo de luciferasa se realizó como se describió previamente en el Ejemplo 15.

Los resultados se muestran en la Fig. 26. La Fig. 26 A) indica la eficacia de transfección de poliplexos de PEI lineal corta e in vivo JetPEI larga a razón de 250 ng de ARN/pocillo. La Fig. 27 B) indica la eficacia de la transfección de poliplexos de PEI ramificada corta e in vivo JetPEI larga a razón de 250 ng de ARN/pocillo.

Conclusión: en comparación con los resultados de referencia con PEI larga (por ejemplo, in vivo Jet solamente, la eficacia de la transfección se puede mejorar significativamente usando combinaciones de PEI larga y PEI corta).

Curiosamente, con respecto a las combinaciones con PEI corta lineal, la señal de expresión de luciferasa alcanzó su punto máximo en las primeras 24 horas después de la transfección, mientras que con respecto a las combinaciones con PEI corta ramificada, la señal de expresión de luciferasa alcanzó su punto máximo en las primeras 48 horas después de la transfección. Por lo tanto, en situaciones en las que se desea la expresión en un marco de tiempo particular, es razonable una selección cuidadosa de la combinación correcta de PEI corta/PEI larga.

Ejemplo 17: Optimización de la transfección de poliplex reduciendo la cantidad de PEI larga

El replicón-ARN que codifica la nano-luciferasa secretada se complejó con una combinación genuina de PEI corta (por ejemplo, 1.8 kDa ramificada) y PEI larga (por ejemplo, in vivo/Jet en diferentes combinaciones para un NP total de 12 en tampón MBG (concentración final de glucosa al 5% p/v, MES 10 mM, pH 6.1). Se usó como referencia in vivo/Jet PEI NP12. La complejación de poliplexos de PEI corta larga se llevó a cabo en dos etapas: En la primera etapa, se realizó la complejación del replicón-ARN ajustado para el NP deseado con in vivo/JetPEI. En la segunda etapa, se añadió un exceso de PEI corta a la formulación para alcanzar la proporción de NP total deseada; es decir, el primer número define el NP de PEI larga y el segundo número la PEI corta ( Por ejemplo, NP4 8 = NP4 PEI Larga y NP8 PEI corta). La luciferasa secretada se midió de acuerdo con el protocolo del fabricante (Nano-GLO, Promega, e E.UU.) a razón de 125 ng o ARN/pocillo. Los ensayos de viabilidad celular se realizaron como se describió previamente en el Ejemplo 15.

Los resultados se muestran en la Fig. 27. En comparación con el punto de referencia y para la misma proporción de NP total, se lograron niveles de expresión más altos con combinaciones, por ejemplo, NP4 8 y NP1.15 11. Por lo tanto, la eficacia de la transfección puede aumentarse significativamente reduciendo la concentración de PEI larga en la formulación y aumentando la concentración de PEI corta menos tóxica (por ejemplo, 1.8 kDa ramificada).

Ejemplo 18: Efecto de las variaciones de sal y/o pH sobre la eficacia de la transfección in vivo

Se adquirieron ratones BALB/c de Janvier Laboratories y se implementaron en el experimento a una edad de ocho semanas. Antes de la inyección de los elementos de prueba indicados, se sometió a los ratones a anestesia con isoflurano y se les quitó el pelo de las patas traseras usando una maquinilla de afeitar eléctrica. Posteriormente, se aplicaron por vía intramuscular poliplexos de replicón-ARN (ARNsa)-PEI (por ejemplo, poliplexos de ARNsa-in vivo JetPEI NP12) a una dosis de a Rn de 2 |jg en volumen total de 20 j l en cada músculo tibial posterior de tres ratones por grupo. Las formulaciones variaron con respecto al pH y/o las concentraciones de sal (por ejemplo, NaCl). En los puntos de tiempo indicados, se inyectó intraperitonealmente a los ratones una solución de D-Luciferina (100 mg/kg de peso corporal) y se capturó la bioluminiscencia de forma no invasiva en ratones anestesiados con isoflurano durante 1 minuto a través del dispositivo IVIS® Spectrum (Perkin Elmer). Los gráficos muestran fotones por segundo [p/s] de la señal de bioluminiscencia determinada a través del software Living Image® (Perkin Elmer) en una región de interés (ROI) definida manualmente con respecto al músculo de los ratones (sitios de inyección) en estas imágenes con un total de seis valores/grupo.

El efecto de las variaciones de sal (por ejemplo, NaCl) sobre la eficacia de la transfección se muestra en la Fig. 28. Las inyecciones intramusculares de poliplexos replicón-ARN-PEI en diferentes proporciones de N/P condujeron a señales de bioluminiscencia duraderas en la región muscular de los ratones después de la medición en los días 3, 6, 9 y 13. La intensidad de la señal detectada aumentó desde el día 3 hasta el día 6 (pico) después de la aplicación, pero fue detectable incluso en el día 13. La señal más intensa en la región muscular de los ratones se pudo detectar el día 6 después de la inyección im en ratones que recibieron poliplexos de replicón-RNA-PEI (por ejemplo, PEI larga N/P 12) y adición de sal en concentraciones bajas (5 a 10 mM).

El efecto de las variaciones de pH sobre la eficacia de la transfección se muestra en la Fig. 29. Se obtuvieron buenos resultados con formulaciones de poliplex de replicón-ARN (ARNsa)-PEI que tenían valores de pH entre 6.5 y 7.1, preferiblemente entre 6.5 y 6.9. La señal más intensa se pudo detectar con una formulación de replicón-ARN-PEI larga NP12 ajustada a pH 6.5. Como puntos de referencia, se utilizaron poliplexos de replicón-ARN-Jet PEI NP12 con pH no ajustado (BM) o HBG (HEPe S 20 mM, pH 7.4, 5% en peso de glucosa).

Ejemplo 19: Efectos dependientes del pH sobre la movilidad electroforética y la eficacia de transfección de poliplexos de p E i in vitro

Se complejó el replicón-ARN que codifica luciferasa con PEI larga (por ejemplo,, in vivo Jet a una proporción de N/P de 4 en tampón HBG (concentración final de glucosa al 4.5% p/v, HEp Es 10 mM, pH 7.1) a temperatura ambiente durante 15 minutos y se dividieron en 11 muestras alícuotas. El pH de las muestras se ajustó mediante la adición de HCl o NaOH dependiendo del pH a granel final a ensayar. La medición de la movilidad electroforética ( j) se realizó como se describe en el Ejemplo 5. Se realizaron ensayos de transfección in vitro de células de músculo de ratón C2C12, luciferasa y viabilidad celular como se describió previamente en el Ejemplo 15.

Los efectos dependientes del pH sobre la movilidad electroforética y la eficacia de transfección de los poliplexos de PEI in vitro se muestran en las Figs. 30 y 31. La Fig. 30 indica la movilidad electroforética de poliplexos de in vivo jetPEI/replicón-ARN (N/P 4) ajustados a diferentes valores de pH. La Fig. 31 muestra la luminiscencia normalizada de las células musculares C2C12 después de la incubación con diferentes dosis de poliplexos de in vivo jetPEI/replicón-ARN en una proporción de N/P de 4 y diferentes valores de pH (pH 6.5 - pH 8.5).

La movilidad electroforética de los poliplexos se correlacionó negativamente con el pH. Los poliplexos neutros se obtienen a aprox. pH 8.9. El aumento de la densidad de carga positiva en los poliplexos de PEI reduciendo el pH total del poliplex, preferiblemente a valores de pH entre 6.5 y 7.1, dio como resultado una mayor eficiencia de transfección de las células C2C12 sin afectar la viabilidad celular. Los polímeros de PEI contienen aminas primarias y secundarias, cuyo estado de protonación depende del pH global. Por lo tanto, los resultados sugieren una forma eficiente de controlar la carga de los poliplexos y su eficiencia de transfección ajustando y optimizando el pH global.

Ejemplo 20: Influencia del exceso de carga positiva en formulaciones de PEI larga

Se complejó replicón-ARN que codifica nano luciferasa secretada en diferentes proporciones de NP entre 2-12 en tampón MBG (concentración final de glucosa al 5% p/v, MES 10 mM, pH 6.1). La luciferasa secretada se mide de acuerdo con el protocolo del fabricante (Nano-GLO, Promega, EE. UU.) a razón de 125 ng o ARN/pocillo. El exceso de cargas positivas se calcula con base en la relación de NP de PEI larga (es decir, in vivo/JetPEI)-replicón-ARN y la proporción exacta de NP a la que tiene lugar la complejación total para este replicón de ARN e in vivo JetPEI. La diferencia entre la proporción de NP usada y la proporción de NP conocida para la complejación total permite calcular el exceso de cargas positivas en la formulación.

Como ejemplo, los resultados relacionados con la transfección con poliplexos in vivo Jet PEI a razón de 250 ng de ARN se muestran en la Fig. 32. En general, aumentar la concentración de cargas positivas en la formulación es exponencialmente proporcional al nivel de expresión de luciferasa. Se ha demostrado que el exceso de cargas positivas hasta 30 nM al aumentar la cantidad de PEI es beneficioso.

Ejemplo 21: Optimización de la transfección de poliplex de PEI de un componente mediante el uso de complejación de 2 etapas

Si solo se usa una variante de PEI (tal como, por ejemplo, larga, se puede mejorar la eficiencia de la transfección mediante el uso de un método de complejación de 2 etapas. Se complejó replicón-ARN que codifica nano-luciferasa secretada en dos etapas para un NP total de 12 en tampón MBG (concentración final de glucosa al 5% p/v, MES 10 mM, pH 6.1). Se utilizó complejación en 1 una etapa in vivo/Jet PEI NP12 como punto de referencia. Por ejemplo, la complejación en 2 etapas usando in vivo Jet PEI in vivo se llevó a cabo como sigue: en la primera etapa, la complejación del replicón-ARN se ajustó para el NP inicial deseado. En la segunda etapa, se añadió un exceso de in vivo/Jet PEI a la formulación para alcanzar la proporción de NP total deseada; es decir, el primer número define el PEI NP inicial y el segundo número el exceso de in vivo Jet PEI administrado en la segunda etapa (por ejemplo, NP4 8: NP4 Jet PEI en la primera etapa y NP8 Jet PEI en la segundo etapa). La luciferasa secretada se midió de acuerdo con el protocolo del fabricante (Nano -GLO, Promega, EE. UU.) a razón de 125 ng o ARN/pocillo. El ensayo de viabilidad celular se realizó como se describió previamente en el Ejemplo 15.

Los resultados de la complejación en 2 etapas se muestran en la Fig. 33. En comparación con el punto de referencia de complejación de 1 etapa in vivo/Jet p Ei NP12 y para la misma proporción de NP total, se lograron niveles de expresión más altos con la complejación de dos etapas.

Ejemplo 22: Efecto del tampón de formulación de poliplex sobre la eficacia de la inmunización

Se formuló ARNsa en poliplexos usando In vivo-jetPEI. Los poliplexos se produjeron usando glucosa tamponada con Hepes (HBG) o glucosa tamponada con MES (MBG) (D-Glucosa al 5%, m Es 10 mM, pH 6.1). Los ratones se inmunizaron im en d0 en un experimento de una sola vez. Se recogió suero a los 45 días después de la inmunización y se analizó la cantidad de anticuerpos específicos de Cf07-HA en el suero usando ELISA específico de HA. Se realizó la titulación de punto final de las diluciones de suero y se determinó el área bajo la curva (AUC). El aumento porcentual en el área bajo la curva de los poliplexos producidos por MBG se representa en comparación con los poliplexos producidos por HBG establecidos como 100%.

Los resultados se muestran en la Fig. 34. En comparación con los poliplexos formulados con HBG, los poliplexos producidos mediante el uso de glucosa tamponada con MES generan una señal de ELISA mucho más alta después de la vacunación de ratones con una sola inyección.

Lista de abreviaturas y definiciones

ATM: presión atmosférica

C: concentración

CSS: una solución de CuSO423 mg en 100 ml de acetato de sodio 0.1 M, pH 5.4

DLS: dispersión dinámica de luz

EDTA: ácido etilendiaminotetraacético

FCS: suero de ternero fetal

h: horas

HBGx1: glucosa al 5% tamponada con HEPES 10 mM (pH 7.1)

HBGx2: glucosa al 10% tamponada con HEPES 20 mM (pH 7.1)

HBTx1: trehalosa al 10% tamponada con HEPES 10 mM (pH 7.1)

HBTx2: trehalosa al 20% tamponada con HEPES 200 mM (pH 7.1)

HBTx1 EDTA: trehalosa al 10% tamponada con HEPES 2.8 mM (pH 7.1) con EDTA 80 pM

HEPES: ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetanosulfónico

IVI: Instituto de Virología e Inmunología, Mittelhausern, Suiza

IVT: ARNm transcrito in vitro

kDa: 1000 daltons

Lyo: liofilización

min: minutos

MBGxl: D-glucosa al 5%, MES 10 mM, pH 6.1

MES: ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico

N/P: la proporción entre el número de grupos amina en PEI y grupos fosfato en ARN. PEI: polietilenimina

ARN: ácido ribonucleico

UV: ultravioleta

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición que comprende:

(a) ARN monocatenario; y

(b) polietilenimina,

en la que el ARN monocatenario y la polietilenimina están presentes en partículas de poliplex y en la que la proporción molar del número de átomos de nitrógeno (N) en la polietilenimina con respecto al número de átomos de fósforo (P) en el ARN monocatenario (Proporción de N:P) es de 2.0 a 15.0;

para su uso como una composición farmacéutica y en la que el uso comprende la administración de la composición a células musculares o tejido muscular, preferiblemente mediante inyección intramuscular en el tejido muscular.

2. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la fuerza iónica es 50 mM o menos, preferiblemente en la que la concentración de iones catiónicos monovalentes es 25 mM o menos y la concentración de iones catiónicos divalentes es 20 ^M o menos.

3. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en la que la polietilenimina comprende la siguiente fórmula general (I):

en la que

R es H

n es 2; y

p es un número entero y el peso molecular promedio del polímero es 1.5 x 102 a 107 Da, preferiblemente de 5000 a 105 Da, más preferiblemente de 10000 a 40000 Da, más preferiblemente de 15000 a 30000 Da, incluso más preferiblemente de 20000 a 25000 Da

4 La composición para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la composición comprende uno o más aditivos seleccionados del grupo que consiste en sustancias tamponantes, sacáridos, estabilizadores, crioprotectores, lioprotectores y agentes quelantes.

5. La composición para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que las sustancias tampón comprenden al menos una seleccionada del grupo que consiste en ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetanosulfónico (HEPES), ácido 3-morfolino-2-hidroxipropanosulfónico (MOPSO), ácido 2-(N-morfolino) etanosulfónico (MES), ácido acético, tampones de acetato y análogos, tampones de ácido fosfórico y fosfato, y tampones de ácido cítrico y citrato.

6. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 4 o 5, en la que los sacáridos comprenden al menos uno seleccionado del grupo que consiste en monosacáridos, disacáridos, trisacáridos, oligosacáridos y polisacáridos preferiblemente de glucosa, trehalosa y sacarosa.

7. La composición para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en la que los crioprotectores comprenden al menos uno seleccionado del grupo que consiste en glicoles, tales como etilenglicol, propilenglicol y glicerol.

8. La composición para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que la composición comprende glucosa tamponada con HEPES (HBG), glucosa tamponada con MES o trehalosa tamponada con HEPES (HBT).

9. La composición para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que el promedio z derivado de las mediciones de dispersión dinámica de la luz de las partículas es menor que 200 nm, preferiblemente menor que 150 nm y más preferiblemente menor que 100 nm y/o el índice de polidispersidad derivado de las medidas de dispersión dinámica de la luz de las partículas es menor que 0.5, preferiblemente menor que 0.3 y más preferiblemente menor que 0.2.

10. La composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la que el ARN monocatenario codifica al menos una proteína de interés.

11. La composición para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la que el ARN monocatenario es un replicón, preferiblemente ARN autorreplicante o autoamplificador, en el que el replicón puede replicarse preferiblemente mediante una replicasa de un alfavirus, y en el que el replicón comprende preferiblemente una secuencia de reconocimiento de replicación 5’ de un alfavirus, o una variante del mismo, y una secuencia de reconocimiento de replicación 3' de un alfavirus, o una variante del mismo.

12. La composición para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en la que el ARN monocatenario comprende un marco de lectura abierto que codifica un péptido o proteína de interés tal como un péptido o proteína farmacéuticamente activa.

13. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 12, en la que el uso es una vacuna.