ES2747762T3 - Vacuna contra el virus respiratorio sincitial (RSV) - Google Patents

Vacuna contra el virus respiratorio sincitial (RSV) Download PDF

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Abstract

Secuencia de ARNm que comprende una región codificante que codifica un mutante de la proteína de fusión F del virus respiratorio sincitial (RSV), donde los residuos aminoácido 554-574 de la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión F se han eliminado en el mutante de la proteína de fusión F, donde el contenido en G/C de la región codificante se ha aumentado sustituyendo al menos el 70% de los codones sustituibles en la región codificante en comparación con el contenido en G/C de la región codificante del ARNm de tipo salvaje y donde la secuencia de aminoácidos codificada de dicho ARNm enriquecido en GC no se ha modificado en comparación con la secuencia de aminoácidos codificada del ARNm de tipo salvaje.

Description

DESCRIPCIÓN
Vacuna contra el virus respiratorio sincitial (RSV).
La presente invención se define en sus reivindicaciones adjuntas y se refiere a una secuencia de ARNm que comprende una región codificante que codifica un mutante de la proteína de fusión F del virus respiratorio sincitial (RSV), donde los residuos aminoácido 554-574 de la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión F se han eliminado en el mutante de la proteína de fusión F, donde el contenido en G/C de la región codificante se ha aumentado sustituyendo al menos el 70% de los codones sustituibles en la región codificante en comparación con el contenido en G/C de la región codificante del ARNm de tipo salvaje y donde la secuencia de aminoácidos codificada de dicho ARNm enriquecido en GC no se ha modificado en comparación con la secuencia de aminoácidos codificada del ARNm de tipo salvaje. Además, la presente invención se refiere a una composición que comprende una pluralidad de secuencias de ARNm tal como se han definido anteriormente. Además, también se describe el uso de la secuencia de ARNm o de la composición que comprende una pluralidad de secuencias de ARNm para la preparación de una composición farmacéutica, especialmente de una vacuna, por ejemplo para su uso en la profilaxis o el tratamiento de infecciones por RSV. La invención se refiere además a un kit o kit de partes que comprende la secuencia de ARNm o la composición (farmacéutica) aquí descrita. Igualmente, la presente invención además proporciona la secuencia de ARNm, la composición (farmacéutica) o el kit o kit de partes aquí descritos para su uso como un medicamento, en particular para su uso en el tratamiento o la profilaxis de infecciones por RSV.
La necesidad médica global y el impacto económico del RSV es muy alto. Es la causa más importante de infecciones agudas del tracto respiratorio inferior (ALRI) que resultan en visitas al hospital durante la lactancia y la primera infancia. Por ejemplo, en Estados Unidos, más del 60% de lactantes están infectados por RSV durante en la primera temporada del RSV y casi todos se han infectado a los 2-3 años de edad. Aproximadamente 2,1 millones de niños estadounidenses menores de 5 años son tratados para la enfermedad del RSV al año: 3% como pacientes hospitalizados, 25% en servicios de urgencias y 73% en consultas pediátricas. A nivel mundial, entre los niños menores de cinco años, el RSV se estima que provoca 33,8 millones de ALRI cada año (más del 22% de todos las ALRI), resultando en 66.000-199.000 muertes, el 99% de las mismas en países en vías de desarrollo. El RSV también es una causa común de enfermedades respiratorias entre los ancianos, provocando muchas hospitalizaciones por gripe en una población fuertemente inmunizada contra la gripe. El RSV se propaga por gotitas respiratorias y por contacto cercano con personas infectadas o con objetos contaminados. En climas templados, hay una epidemia invernal anual. Los lactantes tienen un mayor riesgo de padecer una enfermedad severa por RSV en sus primeros 6 meses y picos de hospitalización a los 2-3 meses de edad. El nacimiento prematuro y la enfermedad cardiopulmonar son factores de riesgo para la enfermedad por RSV severa. La infección por RSV en lactantes produce una inmunidad parcialmente protectora, que parece decaer más rápidamente que la inmunidad contra la mayoría de otros virus respiratorios. La mayoría de los niños infectados con RSV durante su primer año se vuelven a infectar al año siguiente, en general de forma menos severa. Las re­ infecciones continúan a lo largo de la vida, a menudo con síntomas del tracto respiratorio superior y a veces con implicación del tracto respiratorio inferior o nasal. El tratamiento recomendado de la bronquiolitis por RSV consiste principalmente en la asistencia respiratoria y la hidratación. No se recomienda una terapia antiviral específica. Se utiliza el anticuerpo monoclonal neutralizante Palivizumab para la profilaxis de aquellos lactantes de mayor riesgo de infección severa, pero es demasiado costoso y poco práctico para un uso universal. Actualmente, no existe una vacuna autorizada contra el RSV y el desarrollo de una vacuna contra el RSV segura y efectiva es una prioridad de en la salud pública global.
En un ensayo de vacunas en los años 60', se inmunizaron lactantes y niños pequeños con una preparación del virión completo de RSV inactivado en formalina (FIRSV) o con una preparación equivalente de paramixovirus (FIPIV). El cinco por ciento de los sujetos inmunizados con FI-PIV y luego infectados de forma natural con RSV durante la siguiente temporada del RSV fueron hospitalizados; el 80% de aquellos inmunizados con FI-RSV y luego infectados por RSV fueron hospitalizados y murieron dos niños. Este aumento de infección por RSV debido a la vacunación es un problema específico del desarrollo de vacunas frente a infecciones por RSV (revisado en Shaw et al. Curr Opin Virol. junio 2013; 3(3):332-42. doi: 10.1016/j.coviro.2013.05.003. Epub 30 de mayo de 2013).
Por tanto, las infecciones por el virus respiratorio sincitial (RSV) constituyen la mayor necesidad de vacunación en lactantes no satisfecha en los países desarrollados y una importante necesidad insatisfecha de vacunación en lactantes a nivel mundial. Más de 40 años de esfuerzos todavía no han dado como resultado una vacuna autorizada del RSV para seres humanos.
En resumen, el RSV, perteneciente a la familia de virus Paramyxoviridae, es uno de los patógenos más contagiosos y contribuye de forma sustancial a las infecciones severas del tracto respiratorio en lactantes, ancianos y pacientes inmunodeprimidos.
Como se mencionó anteriormente, actualmente el único producto profiláctico en el mercado es un anticuerpo monoclonal humanizado contra la proteína de superficie F viral recomendado para lactantes considerados de alto riesgo, incluyendo lactantes prematuros y lactantes con enfermedad pulmonar crónica (The IMpact-RSV Study Group. 1998. Palivizumab, a Humanized Respiratory Syncytial Virus Monoclonal Antibody, Reduces Hospitalization From Respiratory Syncytial Virus Infection in High-risk Infants. Pediatrics, 102(3), pp.531-537, Tablan et al. 2003. Guidelines for preventing health-care-associated pneumonia, 2003: recommendations of CDC and the Healthcare Infection Control Practices Advisory Committee. MMWR. Recommendations and Reports: Morbidity and Mortality Weekly Report. Recommendations and Reports/Centers for Disease Control, 53(RR-3), pp.1-36).
Las proteínas F y G del RSV son necesarias para la infectividad del virus y se ha encontrado que la cola citoplásmica de la proteína F juega un papel crucial en la localización celular de la proteína F y en la generación de la progenie del virus infeccioso (Oomens et al. 2006. J. Virol. 80(21):10465-77). Estudios recientes con modelos animales ha demostrado que una cantidad suficiente de anticuerpos neutralizantes dirigidos a la proteína F del RSV limitan la replicación viral, conduciendo a un curso menos severo de la enfermedad (Singh, S.R. et al., 2007. Immunogenicity and efficacy of recombinant RSV-F vaccine in a mouse model. Vaccine, 25(33), S.6211-6223., Zhan, X. et al., 2007. Respiratory syncytial virus (RSV) F protein expressed by recombinant Sendai virus elicits B-cell and T-cell responses in cotton rats and confers protection against RSV subtypes A and B. Vaccine, 25(52), pp. 8782-8793., Vaughan, K., et al., 2005. DNA immunization against respiratory syncytial virus (RSV) in infant rhesus monkeys. Vaccine, 23(22), pp. 2928­ 2942).
Además, se podría demostrar que es necesaria una función equilibrada de las células T reguladoras y efectoras para el aclaramiento viral y mitigar la gravedad de la enfermedad (Liu, J. et al., 2010. Epitopespecific regulatory CD4 T cells reduce virus-induced illness while preserving CD8 T-cell effector function at the site of infection. Journal of Virology, 84(20), pp. 10501-10509).
Además del anticuerpo monoclonal humanizado mencionado anteriormente, se ha desarrollado virus atenuados vivos en vacunas que producen una fuerte respuesta inmunitaria, pero que no se recomiendan para su uso en grupos objetivo específicos (lactantes, niños, ancianos y pacientes inmunodeprimidos). También se han utilizado vectores de ADN que expresa la proteína F del RSV que porta los epítopos de células B para inducir la producción de anticuerpos neutralizantes. En este contexto, la WO 2008/077527 y la WO 96/040945 describen vectores que comprenden secuencias de ADN que codifican la proteína F del RSV para su uso como vacunas. Sin embargo, el uso de un ADN como vacuna puede ser peligroso debido a una inserción no deseada en el genoma, que potencialmente conduce a la interrupción de genes funcionales y a cáncer o a la formación de anticuerpos anti-ADN. La WO 2012/116714 describe vacunas que comprenden un ARNm codificador de antígeno para su uso en pacientes ancianos.
Por tanto, el objetivo que subyace en la invención es proporcionar una secuencia de ARNm que codifica para péptidos o proteínas antigénicos del virus respiratorio sincitial (RSV) para su uso como vacunas en la profilaxis o el tratamiento de infecciones por RSV, en particular en lactantes, ancianos y pacientes inmunodeprimidos.
Estos objetivos se resuelven mediante el contenido de las reivindicaciones anexas. En particular, los objetivos que fundamentan la presente invención se resuelven, de acuerdo con un primer aspecto, mediante una secuencia de ARNm de la invención tal como se define en las reivindicaciones.
Por claridad y legibilidad, se proporciona la siguiente información científica y definiciones de la técnica. En el contexto de esta descripción, se pueden proporcionar definiciones y explicaciones adicionales.
Sistema inmunitario: El sistema inmunitario puede proteger a los organismos de infecciones. Cuando un patógeno penetra una barrera física de un organismo y se introduce en él, el sistema inmunitario innato proporciona una respuesta inmediata, aunque no específica. Cuando los patógenos evaden esta respuesta innata, los vertebrados tienen una segunda barrera de protección, el sistema inmunitario adaptativo. Aquí, el sistema inmunitario adapta su respuesta durante una infección para mejorar su reconocimiento del patógeno. Esta respuesta mejorada luego es retenida, después de que el patógeno se haya eliminado, en forma de una memoria inmunológica y permite que el sistema inmunitario adaptativo organice ataques más rápidos y fuertes cada vez que se encuentra con este patógeno. Así, el sistema inmunitario comprende el sistema inmunitario innato y el adaptativo. Cada una de estas dos partes contiene los denominados componentes humorales y celulares.
Respuesta inmunitaria: Una respuesta inmunitaria típicamente puede ser una reacción específica del sistema inmunitario adaptativo a un antígeno particular (denominada respuesta inmunitaria específica y adaptativa) o una reacción no específica del sistema inmunitario innato (denominada respuesta inmunitaria no específica o innata). La invención se refiere esencialmente a reacciones específicas (respuestas inmunitarias adaptativas) del sistema inmunitario adaptativo. En particular, se refiere a respuestas inmunitarias adaptativas a infecciones virales, como por ejemplo a infecciones por RSV. Sin embargo, esta respuesta específica puede estar apoyada por una reacción no específica adicional (respuesta inmunitaria innata). Por tanto, la invención también se refiere a un compuesto para una estimulación simultánea del sistema inmunitario innato y el adaptativo con el fin de provocar una respuesta inmunitaria adaptativa eficiente.
Sistema inmunitario adaptativo: El sistema inmunitario adaptativo está compuesto por células sistémicas altamente especializadas y por procesos que eliminan o evitan el crecimiento de patógenos. La respuesta inmunitaria adaptativa proporciona al sistema inmunitario del vertebrado la capacidad de reconocer y recordar patógenos específicos (para generar inmunidad) y de organizar ataques más fuertes cada vez que se encuentra el patógeno. El sistema es altamente adaptable debido a una hipermutación somática (un proceso que aumenta la frecuencia de las mutaciones somáticas) y la recombinación V(D)J (recombinación genética irreversible de segmentos de genes receptores antigénicos). Este mecanismo permite que un pequeño número de genes genere un vasto número de diferentes receptores antigénicos, que luego se expresan únicamente en cada linfocito individual. Debido a que la redisposición genética conduce a un cambio irreversible en el ADN de cada célula, toda la progenie (descendencia) de esa célula heredará entonces los genes que codifican para la misma especificidad del receptor, incluyendo células B de memoria y células T de memoria, que son las claves para una inmunidad específica duradera. La teoría de la red inmunitaria es una teoría de cómo funciona el sistema inmunitario adaptativo basada en las interacciones entre las regiones variables de los receptores de las células T, las células B y las moléculas producidas por las células T y las células B que tienen regiones variables.
Respuesta inmunitaria adaptativa: La respuesta inmunitaria adaptativa típicamente se entiende como específica de antígeno. La especificidad antigénica permite generar respuestas que se adaptan a antígenos, patógenos o células infectadas por patógenos específicos. La capacidad de organizar estas respuestas adaptadas es retenida en el cuerpo mediante las “células de memoria”. Si un patógeno infecta el cuerpo más de una vez, estas células de memoria específicas se utilizan para eliminarlo rápidamente. En este contexto, el primer paso de una respuesta inmunitaria adaptativa es la activación de células T naive específicas de antígeno o de diferentes células inmunitarias capaces de inducir una respuesta inmunitaria específica de antígeno mediante células presentadoras de antígenos. Esto sucede en los tejidos linfoides y en los órganos por los que las células T naives están pasando constantemente. Los tipos celulares que pueden servir como células presentadoras de antígeno son, entre otras, células dendríticas, macrófagos y células B. Cada una de estas células tiene una función distinta para producir respuestas inmunitarias. Las células dendríticas capturan antígenos mediante fagocitosis y macropinocitosis y se estimulan mediante el contacto con, por ejemplo un antígeno extraño para migrar al tejido linfoide local, donde se diferencian en células dendríticas maduras. Los macrófagos ingieren antígenos particulados, tales como bacterias, y son inducidos por agentes infecciosos u otros estímulos adecuados para expresar moléculas MHC. La capacidad única de las células B de unirse e internalizar antígenos de proteína solubles vía sus receptores también puede ser importante para inducir células T. La presentación del antígeno sobre moléculas MHC conduce a la activación de las células T, lo cual provoca su proliferación y diferenciación en células T efectoras armadas. La función más importante de las células T efectoras es la eliminación de las células infectadas mediante células T citotóxicas CD8+ y la activación de macrófagos mediante células Th1, que conjuntamente constituyen la inmunidad mediada por células, y la activación de las células B mediante células tanto Th2 como Th1 para producir diferentes clases de anticuerpos, dirigiendo así la respuesta inmunitaria humoral. Las células T reconocen un antígeno mediante sus receptores de células T, que no reconocen ni se unen directamente al antígeno, sino que, en su lugar, reconocen fragmentos peptídicos cortos, por ejemplo de antígenos proteínicos derivados de patógenos, que se unen a las moléculas MHC sobre la superficie de otras células.
Inmunidad celular/respuesta inmunitaria celular: La inmunidad celular se refiere típicamente a la activación de macrófagos, células asesinas naturales (NK), linfocitos T citotóxicos específicos de antígeno y a la liberación de diversas citoquinas en respuesta a un antígeno. De forma más general, la inmunidad celular no se relaciona con anticuerpos, sino con la activación de las células del sistema inmunitario. Una respuesta inmunitaria celular se caracteriza, por ejemplo, por activar los linfocitos T citotóxicos específicos de antígeno que son capaces de inducir la apoptosis en las células corporales que tienen epítopos de un antígeno en su superficie, tales como células infectadas por virus, células con bacterias intracelulares y células cancerosas que presentan antígenos tumorales; activar macrófagos y células asesinas naturales, que les permiten destruir patógenos; y estimular células para secretar diversas citoquinas que influyen en la función de otras células implicadas en las respuestas inmunitarias adaptativa e innata.
Inmunidad humoral/respuesta inmunitaria humoral: La inmunidad humoral se refiere típicamente a la producción de anticuerpos y a los procesos adicionales que puedan acompañarla. Una respuesta inmunitaria humoral típicamente se puede caracterizar, por ejemplo, por la activación de Th2 y la producción de citoquinas, la formación de centros germinales y la conmutación de isotipos, la maduración de afinidad y la generación de células de memoria. La inmunidad humoral típicamente también puede se refiere a las funciones efectoras de los anticuerpos, incluyendo la neutralización de patógenos y toxinas, la activación complementaria clásica y la promoción de la fagocitosis por opsonina y la eliminación de patógenos.
Sistema inmunitario innato: El sistema inmunitario innato, también conocido como sistema inmunitario no específico, comprende las células y los mecanismos de defienden al huésped de una infección por otros organismos de forma no específica. Esto significa que las células del sistema innato reconocen y responden a patógenos de forma genérica, pero a diferencia del sistema inmunitario adaptativo, no confiere inmunidad o protección a largo plazo al huésped. El sistema inmunitario innato se puede activar, por ejemplo, mediante ligandos de efectores de patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP), por ejemplo receptores tipo Toll (TLR) u otras sustancias auxiliares, como lipopolisacáridos, TNF-alfa, ligando c D40, o citoquinas, monoquinas, linfoquinas, interleuquinas o quimioquinas, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, 1L-10, IL-12 , IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, IFN-alfa, IFN-beta, IFN-gamma, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, LT-beta, TNF-alfa, factores de crecimiento y hGH, un ligando del receptor tipo Toll humano TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, un ligando del receptor tipo Toll murino TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, TLR11, TLR12 o TLR13, un ligando del receptor tipo NOD, un ligando de un receptor tipo RIG-1, un ácido nucleico inmunoestimulador, un ARN inmunoestimulador (ARNis), un CpG-ADN, un agente antibacteriano o un agente antiviral. Típicamente, una respuesta del sistema inmunitario innato incluye reclutar células inmunitarias hacia los sitios de infección mediante la producción de factores químicos, incluyendo mediadores químicos especializados, denominados citoquinas; activar la cascada complementaria; identificar y eliminar sustancias extrañas presentes en órganos, tejidos, sangre y linfa mediante glóbulos blancos especializados; activar el sistema inmunitario adaptativo mediante un proceso conocido como presentación de antígenos y/o actuar como una barrera física y química frente a agentes infecciosos.
Adyuvante/componente adyuvante: Un adyuvante o un componente adyuvante en el sentido más amplio es típicamente un agente (por ejemplo, farmacológico o inmunológico) o una composición que pueda modificar, por ejemplo mejorar, la eficacia de otros agentes, tales como un fármaco o una vacuna. Convencionalmente, el término se refiere, en el contexto de la invención, a un compuesto o composición que sirve como vehículo o sustancia auxiliar para inmunógenos y/u otros compuestos farmacéuticamente activos. Se debe interpretar en un amplio sentido y se refiere a un amplio espectro de sustancias que son capaces de aumentar la inmunogenicidad de los antígenos incorporados en o co-administrados con el adyuvante en cuestión. En el contexto de la presente invención, un adyuvante preferentemente mejorará el efecto inmunogénico específico de los agentes activos de la presente invención. Típicamente, “adyuvante” o “componente adyuvante” tienen el mismo significado y se puede utilizar indistintamente. Los adyuvantes se pueden dividir, por ejemplo, en inmuno-potenciadores, sistemas de suministro antigénico o combinaciones de los mismos.
El término “adyuvante” se entiende típicamente como sin comprender agentes que confieren inmunidad por sí mismos. Un adyuvante ayuda al sistema inmunitario de forma no específica a mejorar la respuesta inmunitaria específica de antígeno, por ejemplo estimulando la presentación de un antígeno al sistema inmunitario o induciendo una respuesta inmunitaria innata no específica. Además, un adyuvante preferentemente puede, por ejemplo, modular la respuesta inmunitaria específica de antígeno mediante, por ejemplo, un desplazamiento de la respuesta específica de antígeno basada en Th2 dominante a una respuesta específica de antígeno más basada en Th1 o viceversa. Así, un adyuvante puede modular favorablemente la expresión/secreción de citoquinas, la presentación de antígenos, el tipo de respuesta inmunitaria, etc.
ARN inmunoestimulador: Un ARN inmunoestimulador (ARNis) en el contexto de la invención típicamente puede ser un ARN capaz de inducir una respuesta inmunitaria innata por sí mismo. Normalmente no tiene un marco de lectura abierto y, así, no proporciona un antígeno peptídico o un inmunógeno, pero produce una respuesta inmunitaria innata, por ejemplo al unirse a un tipo específico de receptor tipo Toll (TLR) o a otros receptores adecuados. Sin embargo, por supuesto, también los ARNm que tienen un marco de lectura abierto y que codifican para un/a péptido/proteína (por ejemplo con una función antigénica) pueden inducir una respuesta inmunitaria innata.
Antígeno: De acuerdo con la presente invención, el término “antígeno” se refiere típicamente a una sustancia que pueda ser reconocida por el sistema inmunitario y que es capaz de activar una respuesta inmunitaria específica de antígeno, por ejemplo mediante la formación de anticuerpos o células T específicas de antígeno, como parte de una respuesta inmunitaria adaptativa. Un antígeno puede ser una proteína o un péptido. En este contexto, el primer paso de la respuesta inmunitaria adaptativa es la activación de las células T específicas de antígeno mediante células presentadoras de antígeno. Esto sucede en los tejidos linfoides y en los órganos a través de los cuales las células T naive están pasando constantemente. Los tres tipos celulares que pueden servir como células presentadoras de antígeno son células dendríticas, macrófagos y células B. Cada una de estas células tiene una función distinta en la producción de respuestas inmunitarias. Las células dendríticas tisulares capturan antígenos mediante fagocitosis y macropinocitos y son estimuladas por la infección a migrar hacia el tejido linfoide local, donde se diferencian en células dendríticas maduras. Los macrófagos ingieren antígenos particulados, tales como bacterias, y son inducidos por los agentes infecciosos para expresar moléculas MHC clase II. La capacidad única de las células B de unirse e internalizar antígenos de proteínas solubles vía sus receptores puede ser importante para inducir células T. La presentación del antígeno en moléculas MHC conduce a la activación de las células T, lo que induce su proliferación y diferenciación en células T efectoras armadas. La función más importante de las células T efectoras es la eliminación de las células infectadas mediante las células T citotóxicas CD8+ y la activación de macrófagos mediante las células Th1, que conjuntamente constituyen la inmunidad mediada por células, y la activación de células B mediante células tanto Th2 como Th1 para producir diferentes clases de anticuerpos, dirigiendo así la respuesta inmunitaria humoral. Las células T reconocen un antígeno mediante sus receptores de células T, que no reconocen ni se unen al antígeno directamente, sino que, en su lugar, reconocen fragmentos peptídicos cortos, por ejemplo de antígenos proteínicos de patógenos, que se unen a las moléculas MHC en la superficie de otras células.
Las células T se dividen en dos clases principales que tienen diferentes funciones efectoras. Las dos clases se distinguen por la expresión de las proteínas de superficie celular CD4 y CD8. Estos dos tipos de células T difieren en la clase de molécula m Hc que reconocen. Existen dos clases de moléculas m Hc , moléculas MHC clase I y clase II, que difieren en su estructura y patrón de expresión sobre los tejidos del cuerpo. Las células T CD4+ se unen a las moléculas MHC de clase II y las células T CD8+ a las molécula MHC de clase I. Las moléculas MHC de clase I y clase II tienen distinta distribución entre las células, que refleja las diferentes funciones efectoras de las células T que las reconocen. Las moléculas MHC de clase I presentan péptidos de origen citosólico y nuclear, por ejemplo, a partir de patógenos, comúnmente virus, a las células T CD8+, que se diferencian en células T citotóxicas especializadas en eliminar cualquier célula que reconozcan específicamente. Casi todas las células expresan moléculas MHC de clase I, aunque el nivel de expresión constitutiva varía de un tipo de célula a otro. Pero no sólo los péptidos patogénicos procedentes de virus son presentados mediante moléculas MHC de clase I, también son presentados por éstas antígenos tumorales de tipo auto-antígenos. Las moléculas MHC de clase I se unen a péptidos procedentes de proteínas degradadas en el citosol y transportas al retículo endoplásmico. Las células T CD8+ que reconocen los complejos MHC de clase I:péptido en la superficie de las células infectadas están especializadas en eliminar cualesquiera células que tengan péptidos extraños y libran así al cuerpo de las células infectadas con virus y otros patógenos citosólicos. La función principal de las células T CD4+ (células T auxiliares CD4+) que reconocen las moléculas MHC de clase II es activar otras células efectoras del sistema inmunitario. De esta forma, las moléculas MHC de clase II normalmente se encuentran en los linfocitos B, células dendríticas y macrófagos, células que participan en las respuestas inmunitarias, pero no en otras células tisulares. Los macrófagos, por ejemplo, son activados para eliminar los patógenos intravesiculares que albergan y las células B secretan inmunoglobulinas contra moléculas extrañas. Se evita que las moléculas MHC de clase II se unan a péptidos en el retículo endoplásmico y de esta forma las moléculas MHC de clase II se unen a péptidos provenientes de proteínas que se degradan en los endosomas. Capturan péptidos a partir de patógenos que han ingresado al sistema vesicular de macrófagos o a partir de antígenos internalizados mediante células dendríticas inmaduras o los receptores de inmunoglobulina de células B. Los patógenos que se acumulan en grandes cantidades dentro de los macrófagos y las vesículas de células dendríticas tienden a estimular la diferenciación de las células TH1, mientras que los antígenos extracelulares tienden a estimular la producción de las células TH2. Las células TH1 activan las propiedades microbiocidas de los macrófagos e inducen las células B para que los anticuerpos IgG sean muy eficaces opsonizando los patógenos extracelulares por la ingesta mediante células fagocíticas, mientras que las células TH2 inician la respuesta humoral activando las células B naive para secretar IgM e inducen la producción de anticuerpos débilmente opsonizantes, tales como IgG1 e IgG3 (ratón) e IgG2 y IgG4 (humano), así como IgA e IgE (ratón y humano).
Epítopo (también denominado “determinante de antígeno”): Los epítopos de células T o partes de las proteínas en el contexto de la presente invención pueden comprender preferentemente fragmentos con una longitud de entre aproximadamente 6 hasta aproximadamente 20 o incluso más aminoácidos, por ejemplo fragmentos según se procesan y presentan mediante las moléculas MHC de clase I, preferentemente con una longitud entre aproximadamente 8 hasta aproximadamente 10 aminoácidos, por ejemplo 8, 9 o 10, (o incluso 11 o 12 aminoácidos), o fragmentos tal como son procesados y presentados mediante las moléculas MHC de clase II, preferentemente con una longitud de aproximadamente 13 o más aminoácidos, por ejemplo 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o incluso más aminoácidos, pudiendo seleccionarse los fragmentos de cualquier parte de la secuencia de aminoácidos. Estos fragmentos típicamente son reconocidos por las células T y forman un complejo consistente en el fragmento peptídico y una molécula MHC.
Los epítopos de células B típicamente son fragmentos localizados en la superficie externa de antígenos proteínicos o peptídicos (nativos) como se definen aquí, preferentemente con 5 a 15 aminoácidos, con mayor preferencia de 5 a 12 aminoácidos, incluso con mayor preferencia de 6 a 9 aminoácidos, que pueden ser reconocidos por los anticuerpos, es decir, en su forma nativa.
Estos epítopos de proteínas o péptidos además se pueden seleccionar de cualquiera de las variantes aquí mencionadas de estas proteínas o péptidos. En este contexto, los determinantes antigénicos pueden ser epítopos conformacionales o discontinuos compuestos por segmentos de las proteínas o péptidos como se definen aquí, que son discontinuos en la secuencia de aminoácidos de las proteínas o péptidos como se define aquí, pero que se agrupan en la estructura tridimensional, o son epítopos continuos o lineales, compuestos por una sola cadena polipeptídica.
Vacuna: Una vacuna típicamente se entiende como un material profiláctico o terapéutico que proporciona al menos un antígeno o una función antigénica. El antígeno o la función antigénica puede estimular el sistema inmunitario adaptativo del cuerpo para proporcionar una respuesta inmunitaria adaptativa.
ARNm proporcionador de antígeno: Un ARNm proporcionador de antígeno en el contexto de la invención típicamente puede ser un ARNm con al menos un marco de lectura abierto que se puede traducir mediante una célula u organismo al que se ha proporcionado ese ARNm. El producto de esta traducción es un péptido o proteína que puede actuar como un antígeno, de preferencia como un inmunógeno. El producto también puede ser una proteína de fusión compuesta por más de un inmunógeno, por ejemplo una proteína de fusión que consiste en dos o más epítopos, péptidos o proteínas derivados de las mismas o diferentes proteínas virales, donde los epítopos, péptidos o proteínas pueden estar unidos mediante secuencias enlazantes.
ARNm Bi-/multi-c¡strón¡co: El ARNm típicamente puede tener dos (bicistrónico) o más (multicistrónico) marcos de lectura abiertos (ORF). Un marco de lectura abierto en este contexto es una secuencia de varios tripletes (codones) de nucleótidos que se pueden traducir en un péptido o proteína. La traducción de este ARNm proporciona dos (bicistrónico) o más (multicistrónico) productos de traducción distintos (siempre que los ORF no sean idénticos). Para la expresión en eucariotas, estos ARNm pueden comprender, por ejemplo, una secuencia de sitio de entrada ribosómico interno (IRES).
Estructura 5'-CAP: Una 5'-CAP típicamente es un nucleótido modificado, en particular un nucleótido guanina, añadido en el extremo 5' de una molécula de ARNm. Preferentemente, la 5'-CAP se añade utilizando un enlace 5'-5'-trifosfato (también denominado m7GpppN). Otros ejemplos de estructuras 5'-CAP incluyen glicerilo, residuo (parte) desoxi abásico invertido, 4',5'-metilen-nucleótido, 1-(beta-D-eritrofuranosil)nucleótido, 4'-tionucleótido, nucleótido carbocíclico, 1,5-anhidrohexitol-nucleótido, L-nucleótidos, alfa-nucleótidos, nucleótidos base modificados, treo-pentofuranosil-nucleótido, 3',4'-seconucleótido acíclico, 3,4-dihidroxibutil-nucleótido acíclico, 3,5-dihidroxipentil-nucleótido acíclico, residuo 3'-3'-invertido de nucleótido, residuo 3'-3'-invertido abásico, residuo 3'-2'-invertido de nucleótido, residuo 3'-2'-invertido abásico, 1,4-butandiol-fosfato, 3'-fosforamidato, hexilfosfato, aminohexilfosfato, 3'-fosfato, 3'-fosfotioato, fosfoditioato, o un residuo metilfosfonato puente o no puente. En el contexto de la presente invención, estas estructuras 5'-CAP modificadas pueden utilizarse para modificar la secuencia de ARNm inventiva. Otras estructuras 5'-CAP modificadas que se pueden utilizar en el contexto de la presente invención son CAP1 (metilación de la ribosa del nucleótido adyacente a m7GpppN), CAP2 (metilación de la ribosa del 2o nucleótido en la dirección 3' del m7GpppN), CAP3 (metilación de la ribosa en el 3er nucleótido en la dirección 3' del m7GpppN), CAP4 (metilación de la ribosa del 4o nucleótido en la dirección 3' del m7GpppN), ARCA (análogo CAP anti-inverso), ARCA modificado (por ejemplo ARCA modificado con fosfotioato), inosina, N1-metilguanosina, 2'-fluoroguanosina, 7-deazaguanosina, 8-oxoguanosina, 2­ aminoguanosina, LNA-guanosina y 2-azidoguanosina.
Fragmentos de proteínas: Los “fragmentos” de proteínas o péptidos en el contexto de la presente invención típicamente pueden comprender una secuencia de una proteína o péptido como se define aquí que, con respecto a su secuencia de aminoácidos (o a su molécula de ácido nucleico codificada), está truncado de forma N-terminal y/o C-terminal en comparación con la secuencia de aminoácidos de la proteína original (nativa) (o su molécula de ácido nucleico codificada). Tal truncamiento puede existir ya sea a nivel aminoácido o a nivel ácido nucleico. Una identidad de secuencia con respecto a tal fragmento como se define aquí, por tanto, preferentemente puede hacer referencia a la proteína o al péptido total como se define aquí o a la molécula de ácido nucleico completa (codificante) de esta proteína o péptido.
Los fragmentos de proteínas o péptidos en el contexto de la presente invención pueden comprender además una secuencia de proteína o péptido como se define aquí con una longitud de, por ejemplo, al menos 5 aminoácidos, de preferencia una longitud de al menos 6 aminoácidos, preferentemente al menos 7 aminoácidos, con mayor preferencia al menos 8 aminoácidos, incluso con mayor preferencia al menos 9 aminoácidos; incluso con mayor preferencia al menos 10 aminoácidos; incluso con mayor preferencia al menos 11 aminoácidos; incluso con mayor preferencia al menos 12 aminoácidos; incluso con mayor preferencia al menos 13 aminoácidos; incluso con mayor preferencia al menos 14 aminoácidos; incluso con mayor preferencia al menos 15 aminoácidos; incluso con mayor preferencia al menos 16 aminoácidos; incluso con mayor preferencia al menos 17 aminoácidos; incluso con mayor preferencia al menos 18 aminoácidos; incluso con mayor preferencia al menos 19 aminoácidos; incluso con mayor preferencia al menos 20 aminoácidos; incluso con mayor preferencia al menos 25 aminoácidos; incluso con mayor preferencia al menos 30 aminoácidos; incluso con mayor preferencia al menos 35 aminoácidos; incluso con mayor preferencia al menos 50 aminoácidos; o con total preferencia al menos 100 aminoácidos. Por ejemplo, tal fragmento puede tener una longitud entre aproximadamente 6 a aproximadamente 20 o incluso más aminoácidos, por ejemplo los fragmentos tal como son procesados y presentados por las moléculas MHC de clase I preferentemente tienen una longitud entre aproximadamente 8 y aproximadamente 10 aminoácidos, por ejemplo 8, 9 o 10 (o incluso 6, 7, 11 o 12 aminoácidos), o los fragmentos tal como son procesados y presentados por las moléculas MHC de clase II preferentemente tienen una longitud de aproximadamente 13 o más aminoácidos, por ejemplo 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o incluso más aminoácidos, pudiendo seleccionarse estos fragmentos de cualquier parte de la secuencia de aminoácidos. Estos fragmentos típicamente son reconocidos por las células T en forma de un complejo consistente en el fragmento peptídico y una molécula MHC, es decir, los fragmentos típicamente no son reconocidos en su forma natural. Los fragmentos de proteínas o péptidos pueden comprender al menos un epítopo de estas proteínas o péptidos. Además, también los dominios de una proteína, similares al dominio extracelular, el dominio intracelular o el dominio transmembrana y las versiones acortadas o truncadas de una proteína se puede entender comprendidos en un fragmento de una proteína.
Variantes de proteínas: Las “variantes” de proteínas o péptidos como se definen en el contexto de la presente invención se pueden generar con una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia original en una o más mutaciones, tal como uno o más aminoácidos sustituidos, insertados y/o suprimidos. De preferencia, estos fragmentos y/o variantes tienen la misma función biológica o actividad específica en comparación con la proteína natural de longitud total, por ejemplo su propiedad antigénica específica. Las “variantes” de proteínas o péptidos como se definen en el contexto de la presente invención pueden comprender sustituciones conservadoras de aminoácidos en comparación con su secuencia natural, es decir su secuencia fisiológica no mutada. Estas secuencias de aminoácidos, así como sus secuencias nucleotídicas codificantes, están en particular bajo el término de variantes como se define aquí. Las sustituciones donde los aminoácidos que se intercambian por otros de la misma clase se denominan sustituciones conservadoras. En particular, se trata de aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas, cadenas laterales cargadas positiva o negativamente, grupos aromáticos en las cadenas laterales o aminoácidos cuyas cadenas laterales pueden participar en puentes de hidrógeno, por ejemplo cadenas laterales con una función hidroxilo. Esto significa que, por ejemplo, un aminoácido con una cadena lateral polar es reemplazado por otro aminoácido que tiene asimismo una cadena lateral polar, o, por ejemplo, un aminoácido caracterizado por una cadena lateral hidrofóbica se sustituye por otro aminoácido que también tiene una cadena lateral hidrofóbica (por ejemplo serina (treonina) por treonina (serina) o leucina (isoleucina) por isoleucina (leucina)). Son posibles inserciones y sustituciones, en particular en esas posiciones de secuencia que no provocan una modificación de la estructura tridimensional o que no afectan la región de enlace. Las modificaciones de una estructura tridimensional mediante inserciones o deleciones se pueden determinar fácilmente por ejemplo utilizando espectroscopía CD (espectros de dicroísmo circular) (Urry, 1985, Absorption, Circular Dichroism and o Rd of Polypeptides, en: Modern Physical Methods in Biochemistry, Neuberger et al. (ed.), Elsevier, Amsterdam).
Una “variante” de una proteína o péptido puede tener al menos un 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de identidad de aminoácidos en un tramo de 10, 20, 30, 50, 75 o 100 aminoácidos de tal proteína o péptido.
Además, las variantes de proteínas o péptidos como se definen aquí que pueden ser codificadas por una molécula de ácido nucleico también pueden comprender aquellas secuencias donde los nucleótidos de la secuencia de ácido nucleico codificante se intercambian de acuerdo con la degeneración del código genético sin conducir a una alteración de la secuencia respectiva de aminoácidos de la proteína o péptido, es decir, la secuencia de aminoácidos o al menos parte de la misma pueden no diferir de la secuencia original en una o más mutaciones dentro del significado anterior.
Identidad de secuencia: Para determinar el porcentaje en que dos secuencias son idénticas, por ejemplo las secuencias de ácido nucleico o de aminoácidos como se definen aquí, preferentemente las secuencias de aminoácidos codificadas por una secuencia de ácido nucleico del vehículo polimérico como se define aquí o las secuencias de aminoácidos por sí mismas, dichas secuencias se pueden alinear para ser posteriormente comparadas entre sí. Así, por ejemplo, una posición de una primera secuencia se puede comparar con la posición correspondiente de la segunda secuencia. Si una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo componente (residuo) que en una posición en la segunda secuencia, las dos secuencias son idénticas en esa posición. Si este no es el caso, las secuencias difieren en esta posición. Si existen inserciones en la segunda secuencia en comparación con la primera secuencia, se pueden insertar espacios en la primera secuencia para permitir un alineamiento adicional. Si existen deleciones en la segunda secuencia en comparación con la primera secuencia, se pueden insertar espacios en la segunda secuencia para permitir una alineación adicional. El porcentaje en que dos secuencias son idénticas es entonces función del número de posiciones idénticas divididas entre el número total de posiciones, incluyendo aquellas posiciones que sólo están ocupadas en una secuencia. El porcentaje en que dos secuencias son idénticas se puede determinar utilizando un algoritmo matemático. Un ejemplo preferente, aunque pero no limitativo, de algoritmo matemático a utilizar es el algoritmo de Karlin et al. (1993), PNAS USA, 90:5873-5877 o Altschul et al. (1997), Nucleic Acids Res., 25:3389-3402. Este algoritmo está integrado en el programa BLAST. Las secuencias que son idénticas a las secuencias de la presente invención en cierto grado se pueden identificar mediante este programa.
Derivado de una proteína o péptido: Un derivado de un péptido o proteína típicamente se debe entender como una molécula que se deriva de otra molécula, tal como ese péptido o proteína. Un “derivado” de un péptido o proteína también abarca fusiones que comprenden un péptido o proteína utilizados en la presente invención. Por ejemplo, la fusión comprende una etiqueta, tal como, por ejemplo, un epítopo, por ejemplo un epítopo FLAG o V5. Por ejemplo, el epítopo es un epítopo FLAG. Tal etiqueta es útil, por ejemplo, para purificar la proteína de fusión.
ARNm monocistrónico: Un ARNm monocistrónico típicamente puede ser un ARNm que codifica sólo para un marco de lectura abierto. Un marco de lectura abierto en este contexto es una secuencia de varios tripletes (codones) de nucleótidos que se pueden traducir en un péptido o proteína.
Ácido nucleico: El término ácido nucleico significa cualquier molécula de ADN o ARN y se utiliza de manera sinónima a polinucleótidos. Donde quiera que se haga referencia aquí a un ácido nucleico o a una secuencia de ácido nucleico que codifica para una proteína y/o péptido particular, el ácido nucleico o la secuencia de ácido nucleico, respectivamente, preferentemente también comprende secuencias reguladoras que permiten su expresión en un huésped adecuado, por ejemplo un ser humano, es decir, la transcripción y/o traducción de la secuencia de ácido nucleico que codifica para la proteína o péptido particular.
Péptido: Un péptido es un polímero de monómeros aminoácidos. Normalmente, los monómeros están unidos por enlaces peptídicos. El término “péptido” no limita la longitud de la cadena polimérica de los aminoácidos. En algunas realizaciones de la presente invención, un péptido puede contener, por ejemplo, menos de 50 unidades monoméricas. Los péptidos más largos también se denominan polipéptidos, típicamente de 50 a 600 unidades monoméricas, más específicamente de 50 a 300 unidades monoméricas.
Cantidad farmacéuticamente efectiva: Una cantidad farmacéuticamente efectiva en el contexto de la invención típicamente se debe entender como una cantidad que es suficiente para inducir una respuesta inmunitaria.
Proteína: Una proteína típicamente consiste en uno o más péptidos y/o polipéptidos plegados en una forma tridimensional, facilitando una función biológica.
Secuencia poli(C): Una secuencia poli(C) es típicamente una secuencia larga de nucleótidos de citosina, típicamente de aproximadamente 10 a aproximadamente 200 nucleótidos de citosina, de preferencia de aproximadamente 10 a aproximadamente 100 nucleótidos de citosina, con mayor preferencia de aproximadamente 10 a aproximadamente 70 nucleótidos de citosina o incluso con mayor preferencia de aproximadamente 20 a aproximadamente 50 o incluso de aproximadamente 20 a aproximadamente 30 nucleótidos de citosina. Preferentemente, una secuencia poli(C) puede estar ubicada 3' de la región codificante comprendida en el ácido nucleico.
Cola poli-A: Una cola poli-A, también denominada “cola 3'-poli(A)” típicamente es una secuencia larga de nucleótidos de adenosina de hasta aproximadamente 400 nucleótidos de adenosina, por ejemplo entre aproximadamente 25 y aproximadamente 400, de preferencia de aproximadamente 50 a aproximadamente 400, con mayor preferencia de aproximadamente 50 a aproximadamente 300, incluso con mayor preferencia de aproximadamente 50 a aproximadamente 250, con total preferencia de aproximadamente 60 a aproximadamente 250 nucleótidos de adenosina, añadidos al extremo 3' de un ARN.
Ácido nucleico estabilizado: Un ácido nucleico estabilizado típicamente presenta una modificación que aumenta la resistencia a la degradación in vivo (por ejemplo degradación por una exo- o endo-nucleasa) y/o a la degradación ex vivo (por ejemplo por el proceso de fabricación antes de administrar la vacuna, por ejemplo durante la preparación de la solución de vacuna a administrar). La estabilización del ARN se puede alcanzar, por ejemplo, proporcionando una estructura 5'-CAP, una cola poli(A) o cualquier otra modificación de UTR. También se puede conseguir por una modificación estructural o modificando el contenido en G/C del ácido nucleico. En el contexto de la invención son concebibles otros diversos métodos conocidos en la técnica.
Portador/portador polimérico: Un portador en el contexto de la invención típicamente puede ser un compuesto que facilite el transporte y/o la complejación de otro compuesto. Dicho portador puede formar un complejo con dicho otro compuesto. Un portador polimérico es un portador formado por un polímero.
Componente catiónico: El término “componente catiónico” típicamente se refiere a una molécula cargada que está cargada positivamente (catión) a un valor pH típico de aproximadamente 1 a 9, de preferencia un pH de o inferior a 9 (por ejemplo 5 a 9), o inferior a 8 (por ejemplo 5 a 8), o inferior a 7 (por ejemplo 5 a 7), con mayor preferencia a valores pH fisiológicos, por ejemplo de aproximadamente 7,3 a 7,4. Así, un péptido, proteína o polímero catiónico de acuerdo con la presente invención está cargado positivamente en condiciones fisiológicas, en particular en las condiciones fisiológicas salinas de la célula in vivo. Preferentemente, un péptido o proteína catiónico contiene un gran número de aminoácidos catiónicos, por ejemplo un mayor número de Arg, His, Lys u Orn que otros residuos aminoácidos (en particular más aminoácidos catiónicos que residuos aminoácidos aniónicos similares a Asp o Glu), o contiene bloques formados predominantemente por residuos aminoácidos catiónicos. La definición “catiónico” puede hacer referencia a componentes “policatiónicos”.
Vehículo: Un agente, por ejemplo un portador, que típicamente se puede utilizar dentro de una composición farmacéutica o vacuna para facilitar la administración de los componentes de la composición farmacéutica o vacuna a un individuo.
Región no traducida 3’ (3’UTR): Una 3'UTR típicamente es la parte de un ARNm localizada entre la región codificante de proteínas (es decir, el marco de lectura abierto) y la secuencia poli(A) del ARNm. Una 3’UTR del ARNm no se traduce en una secuencia de aminoácidos. La secuencia 3’UTR en general está codificada por el gen que es transcrito en el ARNm respectivo durante el proceso de expresión génica. La secuencia genómica se transcribe primero en un ARNm pre-maduro, que comprende intrones opcionales. El ARNm pre-maduro luego se procesa adicionalmente en un ARNm maduro en un proceso de maduración. Este proceso de maduración comprende el paso de terminar en una estructura CAP-5’, eliminar los intrones del ARNm pre-maduro para eliminar los intrones opcionales y las modificaciones del extremo 3’, tal como la poliadenilación del extremo 3’ del ARNm pre-maduro y segmentaciones opcionales por endo- o exonucleasas, etc. En el contexto de la presente invención, una 3’UTR corresponde a una secuencia de un ARNm maduro que está localizada 3’ al codón de parada de la región codificante de proteínas, preferentemente inmediatamente 3’ al codón de parada de la región codificante de proteínas, y que se extiende al lado 5’ de la secuencia poli(A), preferentemente al nucleótido inmediatamente 5’ a la secuencia poli(A). El término “corresponde a” significa que la secuencia 3’UTR puede ser una secuencia de ARN, tal como en la secuencia de ARNm utilizada para definir la secuencia 3’UTR, o una secuencia de ADN que corresponda a dicha secuencia de ARN. En el contexto de la presente invención, el término “una 3’UTR de un gen”, tal como “una 3’UTR de un gen de albúmina”, es la secuencia que corresponde a la 3’UTR del ARNm maduro derivado de este gen, es decir, el ARNm obtenido mediante la transcripción del gen y la maduración del ARNm pre-maduro. El término “3’UTR de un gen” abarca la secuencia de ADN y la secuencia de ARN de la 3’UTR.
Región no traducida 5’ (5’UTR): Una 5’-UTR típicamente se entiende como una sección particular del ARN mensajero (ARNm). Está localizada 5’ del marco de lectura abierto del ARNm. Típicamente, la 5’UTR inicia con el sitio de inicio de la transcripción y termina un nucleótido antes del codón de inicio del marco de lectura abierto. La 5'-UTR puede comprender elementos de control de la expresión génica, también denominados elementos reguladores. Tales elementos reguladores pueden ser, por ejemplo, sitios de unión ribosómica o un tracto de oligopirimidina 5'-terminal. La 5'UTR se puede modificar pos-transcripcionalmente, por ejemplo por la adición de una 5'-CAP. En el contexto de la presente invención, una 5'UTR corresponde a la secuencia de un ARNm maduro localizada entre el extremo 5'-CAP y el codón de inicio. Preferentemente, la 5'UTR corresponde a la secuencia que se extiende desde un nucleótido ubicado 3' al extremo 5'-CAP, preferentemente del nucleótido ubicado inmediatamente 3' al extremo 5'-CAP a un nucleótido ubicado 5' al codón de inicio de la región codificante de proteínas, preferentemente al nucleótido ubicado inmediatamente 5' al codón de inicio de la región codificante de proteínas. El nucleótido ubicado inmediatamente 3' al extremo 5'-CAP de un ARNm maduro típicamente corresponde al sitio de inicio de la transcripción. El término “corresponde a” significa que la secuencia 5'UTR puede ser una secuencia de ARN, tal como en la secuencia de ARNm utilizado para definir la secuencia de 5'UTR, o una secuencia de ADN que corresponde a esta secuencia de ARN. En el contexto de la presente invención, el término “una 5'UTR de un gen”, tal como “una 5'UTR de un gen TOP”, es la secuencia que corresponde a la 5'UTR del ARNm maduro derivado de dicho gen, es decir, el ARNm obtenido mediante la transcripción del gen y la maduración del ARNm pre­ maduro. El término “5'UTR de un gen” abarca la secuencia de ADN y la secuencia de ARN de la 5'UTR.
Tracto de oligopirimidina 5' terminal (TOP): El tracto de oligopirimidina 5' terminal (TOP) típicamente es un tramo de nucleótidos de pirimidina locaizado en la región 5'-terminal de una molécula de ácido nucleico, tal como la región 5'-terminal de ciertas moléculas de ARNm o la región 5'-terminal de una entidad funcional, por ejemplo la región transcrita, de ciertos genes. La secuencia se inicia con una citidina, que normalmente corresponde al sitio de inicio de la transcripción, y está seguida por un tramo normalmente de aproximadamente 3 a 30 nucleótidos de pirimidina. Por ejemplo, la TOP puede comprender 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o incluso más nucleótidos. El tramo de pirimidinas y así la 5'TOP termina en un nucleótido 5' al primer nucleótido de purina aguas abajo de la TOP. El ARN mensajero que contiene un tracto de oligopirimidina 5' terminal con frecuencia se denomina ARNm TOP. Por ejemplo, los genes que proporcionan estos ARN mensajeros se denominan genes TOP. Se han encontrado secuencias TOP, por ejemplo, en genes y ARNm que codifican para factores de alargamiento peptídico y proteínas ribosómicas.
Motivo TOP: En el contexto de la presente invención, un motivo TOP es una secuencia de ácido nucleico que corresponde a una 5'TOP como se definió anteriormente. Así, un motivo TOP en el contexto de la presente invención preferentemente es un tramo de nucleótidos pirimidina con una longitud de 3-30 nucleótidos. De preferencia, el motivo TOP consiste en al menos 3 nucleótidos pirimidina, de preferencia al menos 4 nucleótidos pirimidina, de preferencia al menos 5 nucleótidos pirimidina, con mayor preferencia al menos 6 nucleótidos, con mayor preferencia al menos 7 nucleótidos, con total preferencia al menos 8 nucleótidos pirimidina, donde el tramo de nucleótidos de pirimidina preferentemente se inicia en su extremo 5' con un nucleótido citosina. En los genes TOP y los ARNm TOP, el motivo TOP preferentemente se inicia en el extremo 5' al sitio de inicio transcripcional y termina en un nucleótido 5' al primer residuo de purina del gen o del ARNm. Un motivo TOP en el sentido de la presente invención preferentemente se ubica en el extremo 5' de una secuencia que representa una 5'UTR o en el extremo 5' de una secuencia que codifica para una 5'UTR. Así, preferentemente, un tramo de 3 o más nucleótidos de pirimidina se denomina “motivo TOP” en el sentido de la presente invención si dicho tramo se localiza en el extremo 5' de una secuencia respectiva, tal como el ARNm inventivo, al elemento 5'UTR del ARNm inventivo, o la secuencia de ácido nucleico que se deriva de la 5'UTR de un gen TOP como se describe aquí. En otras palabras, un tramo de 3 o más nucleótidos de pirimidina que no esté ubicado en el extremo 5' de una 5'UTR o de un elemento 5'UTR, sino en cualquier sitio dentro de una 5'UTR o de un elemento 5'UTR preferentemente no se denomina “motivo TOP”.
Gen TOP: Los genes TOP típicamente se caracterizan por la presencia de un tracto de oligopirimidina 5' terminal. Además, la mayoría de los genes TOP se caracterizan por una regulación traduccional asociada el crecimiento. Sin embargo, también se conocen genes TOP con una regulación traduccional específica de tejido. Como se definió anteriormente, la 5'UTR de un gen TOP corresponde a la secuencia de una 5'UTR de un ARNm maduro derivado de un gen TOP, que preferentemente se extiende desde el nucleótido ubicado 3' al extremo 5'-CAP hasta el nucleótido ubicado 5' hacia el codón de inicio. Una 5'UTR de un gen TOP típicamente no comprende ningún codón de inicio, preferentemente no AUG aguas arriba (uAUG) o marcos de lectura abiertos aguas arriba (uORF). Aquí, los AUG aguas arriba y los marcos de lectura abiertos aguas arriba típicamente se entiende como los AUG y los marcos de lectura abiertos que existen 5' al codón de inicio (AUG) del marco de lectura abierto a traducir. Las 5'UTR de los genes TOP en general son bastante cortas. La longitud de las 5'UTR de genes TOP pueden variar de 20 nucleótidos a 500 nucleótidos y típicamente tienen menos de aproximadamente 200 nucleótidos, de preferencia menos de aproximadamente 150 nucleótidos, con mayor preferencia menos de aproximadamente 100 nucleótidos.
5'UTR ilustrativas de los genes TOP en el sentido de la presente invención son las secuencias de ácido nucleico que se extienden desde el nucleótido en la posición 5 hasta el nucleótido ubicado inmediatamente 5' al codón de inicio (por ejemplo ATG) en las secuencias de acuerdo con las SEQ ID NO: 1-1363, SEQ ID NO: 1395, SEQ ID NO: 1421 y SEQ ID NO: 14221-1363 de la solicitud de patente PCT/EP2012/002448, WO2013/143700, u homólogos o variantes de las mismas, cuya descripción se incorpora con la misma como referencia. En este contexto un fragmento particularmente preferente de una 5'UTR de un gen TOP es una 5'UTR de un gen TOP que carece del motivo 5'TOP. El término “5'UTR de un gen TOP” preferentemente se refiere a la 5'UTR de un gen TOP de origen natural.
Fragmento de una secuencia de ácido nucleico, en particular de ARNm: Un fragmento de una secuencia de ácido nucleico consiste en un tramo continuo de nucleótidos que corresponden a un tramo continuo de nucleótidos en la secuencia de ácido nucleico de longitud total que es la base de la secuencia de ácido nucleico del fragmento, que representa al menos el 20%, de preferencia al menos 30%, con mayor preferencia al menos 40%, de con preferencia al menos 50%, incluso con mayor preferencia al menos 60%, incluso con mayor preferencia al menos 70%, incluso con mayor preferencia al menos 80% y con la máxima preferencia al menos el 90% de la secuencia de ácido nucleico de longitud total. Tal fragmento, en el sentido de la presente invención, preferentemente es un fragmento funcional de la secuencia de ácido nucleico de longitud total.
Variante de una secuencia de ácido nucleico, en particular ARNm: Una variante de una secuencia de ácido nucleico se refiere a una variante de secuencias de ácido nucleico que forma la base de una secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico variante puede exhibir una o más deleciones, inserciones, adiciones y/o sustituciones de nucleótidos en comparación con la secuencia de ácido nucleico de la cual se deriva. De preferencia, una variante de una secuencia de ácido nucleico es al menos un 40%, de preferencia al menos 50%, con mayor preferencia al menos 60%, con mayor preferencia al menos 70%, incluso con mayor preferencia al menos 80%, incluso con mayor preferencia al menos 90%, con la máxima preferencia al menos un 95% idéntica a la secuencia de ácido nucleico de la se deriva la variante. Preferentemente, la variante es una variante funcional. Una “variante” de una secuencia de ácido nucleico puede tener al menos un 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de identidad de nucleótidos con respecto a un tramo de 10, 20, 30, 50, 75 o 100 nucleótidos de tal secuencia de ácido nucleico.
Homólogo de una secuencia de ácido nucleico: El término “homólogo” de una secuencia de ácido nucleico se refiere a las secuencias de otras especies distintas a la secuencia particular. Es particularmente preferente que la secuencia de ácido nucleico sea de origen humano y, por tanto, que el homólogo sea un homólogo de una secuencia de ácido nucleico humano.
Inyección por chorro: El término “inyección por chorro” como se utiliza aquí se refiere a un método de inyección sin aguja donde un fluido que contiene al menos una secuencia de ARNm inventivo y opcionalmente excipientes adecuados adicionales se hace pasar a través de un orificio, generando así una corriente ultra-fina de líquido a alta presión que es capaz de penetrar la piel de un mamífero y, dependiendo de los ajustes de la inyección, el tejido subcutáneo o el tejido muscular. En principio, la corriente de líquido provoca un agujero en la piel, a través del cual se impulsa la corriente de líquido al tejido diana. Preferentemente, la inyección por chorro se utiliza para la inyección intradérmica, subcutánea o intramuscular de la secuencia de ARNm de acuerdo con la invención. En una realización preferida, la inyección por chorro se utiliza para la inyección intramuscular del ARNm inventivo. En una realización preferida adicional, la inyección por chorro se utiliza para la inyección intradérmica del ARNm inventivo.
La presente invención se basa en el hallazgo sorprendente de los presentes inventores de que una secuencia de ARNm que comprende una región codificante que codifica para al menos un péptido o proteína antigénico del virus respiratorio sincitial (RSV), donde los residuos aminoácido 554-574 de la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión F se han eliminado en el mutante de la proteína de fusión F, donde el contenido en G/C de la región codificante se ha aumentado sustituyendo al menos el 70% de los codones sustituibles en la región codificante en comparación con el contenido en G/C de la región codificante del ARNm de tipo salvaje y donde la secuencia de aminoácidos codificada de dicho ARNm enriquecido en GC no se ha modificado en comparación con la secuencia de aminoácidos codificada del ARNm de tipo salvaje induce respuestas inmunes específicas de antígeno y, por tanto, evitan o al menos minimizan las infecciones por el virus respiratorio sincitial (RSV). Fue muy sorprendente para los inventores que la secuencia de ARNm inventiva indujera al menos las mismas respuestas inmunitarias que las vacunas basadas en RSV inactivado, que consiste en el virus completo. Incluso más sorprendentemente, la secuencia de ARNm inventiva como se define en las reivindicaciones inducía células T CD8+ específicas de antígeno, al contrario que una vacuna basada en RSV inactivado. Adicionalmente, en un modelo de inoculación de RSV en ratas algodoneras, los títulos virales en la nariz y en el pulmón de los animales vacunados con el ARNm fueron mucho más bajos en comparación con los de los animales vacunados con las vacunas basadas en un virus RSV inactivado. Con respecto a la seguridad, los inventores podrían demostrar que la vacuna del RSV basada en ARNm no sugería la mejora de la enfermedad mediada por la vacuna, en términos de patología pulmonar, en comparación con una vacuna basada en el virus inactivado con formalina. Además, los inventores han encontrado sorprendentemente que ya una única vacunación con la secuencia de ARNm inventivo era suficiente para producir una respuesta inmunitaria contra los antígenos administrados. Específicamente, se ha encontrado que una administración única, preferentemente por inyección intradérmica o intramuscular, del ARNm inventivo es muy eficiente reduciendo los títulos virales en el pulmón después de la inoculación con el virus RSV.
En resumen, la secuencia de ARNm de la invención definida por las reivindicaciones adjuntas podría proporcionar una vacuna efectiva y segura, en particular para lactantes, ancianos y pacientes inmunodeprimidos.
También se describe aquí una secuencia de ARNm que comprende una región codificante, que codifica para al menos un péptido o proteína antigénico derivado de la proteína de fusión F, de la glucoproteína G, de la proteína hidrofóbica corta SH, de la proteína matriz M, de la nucleoproteína N, de la polimerasa Long L, de la proteína M2-1, de la proteína M2-2, de la fosfoproteína P, de la proteína NS1 no estructural o de la proteína NS2 no estructural del virus respiratorio sincitial (RSV) o un fragmento, variante o derivado de la misma.
La región codificante de la secuencia de ARNm de acuerdo con el primer aspecto de la presente descripción se puede estar presente como un ARNm mono-, bi- o incluso multi-cistrónico, es decir, una secuencia de ARNm que porta las secuencias codificantes de una, dos o más proteínas o péptidos. Estas secuencias codificantes de los ARNm bi- o multi-cistrónicos pueden estar separadas por al menos una secuencia de sitio de entrada ribosomial interna (IRES), por ejemplo como se describe aquí, o por péptidos de señal que inducen la segmentación del polipéptido resultante que comprende diversas proteínas o péptidos.
De acuerdo con el primer aspecto de la presente descripción, la secuencia de ARNm comprende una región codificante que codifica para al menos un péptido o proteína antigénico derivado de la proteína de fusión F, la glucoproteína G, la proteína hidrofóbica corta SH, la proteína matriz M, la nucleoproteína N, la polimerasa Long L, la proteína m 2-1, la proteína M2-2, la fosfoproteína P, la proteína NS1 no estructural o la proteína NS2 no estructural del virus respiratorio sincitial (RSV), o de un fragmento, variante o derivado de los mismos. En una realización aquí descrita, la secuencia de ARNm comprende una región codificante que codifica para al menos un péptido o proteína antigénico derivado de la proteína de fusión F, la nucleoproteína N o la proteína M2-1 del virus respiratorio sincitial (RSV) o un fragmento, variante o derivado de los mismos.
En este contexto, la secuencia de aminoácidos del al menos un péptido o proteína antigénico se puede seleccionar de cualquier péptido o proteína derivado de la proteína de fusión F, la glucoproteína G, la proteína hidrofóbica corta SH, la proteína matriz M, la nucleoproteína N, la polimerasa Long L, la proteína M2-1, la proteína M2-2, la fosfoproteína P, la proteína NS1 no estructural o la proteína NS2 no estructural de cualquier aislado del RSV o de cualquier péptido proteína de RSV diseñados sintéticamente por ingeniería o a partir de un fragmento, variante o derivado de los mismos.
En una realización no reivindicada, la proteína de longitud total de la proteína de fusión F, la glucoproteína G, la proteína hidrofóbica corta de SH, la proteína matriz M, la nucleoproteína N, la polimerasa Long L, la proteína M2-1, la proteína M2-2, la fosfoproteína P, la proteína NS1 no estructural o la proteína NS2 no estructural del virus respiratorio sincitial (RSV) es codificada por la región codificante comprendida en el ARNm inventivo.
En esta realización no reivindicada, la proteína de longitud total de la proteína de fusión F y la nucleoproteína N son particularmente preferentes. Además, es particularmente preferente un mutante de proteína F con una deleción de la cola citoplasmática. Un ejemplo de este mutante de deleción es la proteína larga RSV-F 554-574 de acuerdo con Oomens et al., 2006, J. Virol. 80(21):10465-77.
En otra realización aquí descrita, un fragmento que comprende al menos un epítopo de la proteína de fusión F, la glucoproteína G, la proteína hidrofóbica corta de SH, la proteína matriz M, la nucleoproteína N, la polimerasa grande L, la proteína M2-1, la proteína M2-2, la fosfoproteína P, la proteína NS1 no estructural o la proteína NS2 no estructural del virus respiratorio sincitial (RSV) es codificado por la región codificante comprendida en el ARNm.
Se describen aquí las secuencias de aminoácidos de la cepa long del RSV (ATCC VR-26) de acuerdo con el No. de acceso NCBI AY911.262:
Proteína de fusión F de la cepa de RSV ATCC VR-26 long:
Secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO 1
MELPILKANA ITTXLAAVTF CFASSQNITE EFYQSTCSAV SKGYLSALRT GWYTSVITIE LSNIKElNKCN gtdakvklin qeldkyknav telqllmqst taannrarre lprfmnytln NTKKTNVTLS KKRKRRFLGF LLGVGSAIAS GIAVSKVLHL EGEVNKIKSA LLSTNKAVVS LSNGVSVLTS KVLDLKNYID KQLLPIVNKQ SCRISNIF.TV XEFQQKNNRL LEITREFSVN AGVTTPVSTY MLTNSELLSL INDMPITNDQ KKLMSNNVQI VRQQSYSIMS IIKEEVLAYV VQLPLYGVID TPCWKLHTSP LCTTNTKEGS NICLTRTDRG KYCDNAGSVS FFPQAETCKV QSNRVFCDTM NSLTLPSEVN LCNVDIFNPK YDCKIMTSKT DVSSSVITSL GAIVSCYGKT KCTASNKNRG IIKTFSNGCD YVSNKGVDTV SVGNTLYYVN KQEGKSLYVK GEPIINFYDP LVFPSDEFDA SISQVNEKIN QSLAFIRKSD ELLHHVNAGK STTNIMITTI IIVIIVILLS LIAVGLLLYC KARSTPVTLS KDQLSGINNI AFSN
Glucoproteína G de la cepa del RSV ATCC VR-26 long:
Secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO 2
MSKNKDQRTA KTLEKTWDTL NHLLFISSGL YKLNLKSIAQ ITESXLAMII STSLIITAII FIASANHKVT LTTAIIQDAT SQTKNTTPTY LTQDPQLGIS FSNLSEITSQ TTTILASTTP GVKSKLQPTT VKTKNTTTTQ TQPSKPTTKQ RQNKPPNKPN NDFHFEVFNF VPCSICSNNP TCWAICKRIP NKKPGKKTTT KPTKKPTFKT TKKDLKPQTT KPKEVPTTKP TEEPTINTTK TNITTTLLTN NTTGNPKLTS QMETFHSTSS EGNLSPSQVS TTSEHPSQPS SPPNTTRQ
Proteína hidrofóbica corta SH de la cepa del RSV ATCC VR-26 long:
Secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO 3
MENTSITIEF SSKFWPYFTL IHMITTIISL LIIISIMTAI LNKLCEYNVF HNKTFELPRA RVNT
Proteína matriz M de la cepa del RSV ATCC VR-26 long:
Secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO 4
METYVNKLHE GSTYTAAVQY NVLEKDDDPA SLTIWVPMFQ SSMPADLLIK ELANVNILVK QISTPKGPSL RVMTNSRSAL LAQMPSKFTI CANVSLDERS KLAYDVTTPC EIKACSLTCL KSKNMLTTVK DLTMKTLNPT HDIIALCEFE N1VTSKKVII PTYLRSISVR NKDLNTLF.NI TTTEFKNAIT NAKIIPYSGL LLVITVTDNK GAFKYIKPQS QFIVDLGAYL EKESIYYVTT NWKHTATRFA IKPMED
Nucleoproteína N de la cepa del RSV ATCC VR-26 long:
Secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO 5
MALSKVKLND TLNKDQLLSS SKYT1QRSTG DSIDTPNYDV QKHINKLCGM LLXTEDANHK FTGLIGMLYA MSRLGREDTT KILRDAGYHV KANGVDVTTH RQDINGKEMK FEVLTLASLT TEIQINIEIE SRKSYKKMLK EMGEVAPEYR HDSPDCGMII LCIAALVITK LAAGDRSGLT AVIRRANNVL KNEMKRYKGL LPKDIANSFY EVFEKHPHFI DVFVHFGIAQ SSTRGGSRVE GIFAGLFMNA YGAGQVMLRW GVLAKSVKNI MLGHASVQAE MEQVVEVYEY AQKLGGEAGF YHILNNPKAS LLSLTQFPHF SSWLGNAAG LGIMGEYRGT PRNQDLYDAA KAYAEQLKEN GVINYSVLDL TAEELEAIKH QLNPKDNDVE L
Polimerasa larga L de la cepa del RSV ATCC VR-26 long:
Secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO 6
MDPIINGNSA NVYLTDSYLK GVISFSECNA LGSYIFNGPY LKNDYTNLIS RQNPLIEHNN LKKLNITQSL ISKYHKGEIK LEEPTYFQ5L LMTYKSMTSL EQIATTNLLK KIIRRAIEIS DVKVYAILNK LGLKEKDKIK SNNGQDEDNS VITTIIKDDI LSAVKDKQSH LKñDKKHSTK QKDTIKTTLL KKLMCSMQHP PSWLIHWFWL YTKLNNI1TQ YRSNEVKNHG FILXDNQTLS GFQFILNQYG CIVYHKELKR ITVTTYNQFL TWKDISLSRL NVCLITWISN CLNTLNKSLG LRCGFNNVIL TQLFLYGDCI LKLFHNEGFY IIKEVEGFIM SLILNITEED QFRKRFYNSM LNNITDAANK AQKNLLSRVC HTLLDKTVSD NIINGRWIIL LSKFLKLIKL AGDNNLNNLS ELYFLFRIFG HPMVDERQAM DAVKVNCNET KFYLLSSLSM LRGAFIYRII KGFVNNYNRW PTLRNAIVLP LRWLTYYKLN TYPSLLELTE RDLIVLSGLR FYREFRLPKK VDLEMIINDK AISPPKNLIW TSFPRNYMPS HIQNYIEHEK LKFSESDKSR RVLEYYLRDN KFNECDLYNC VVNQSYLNNP KHVVSLTGKE RELSVGRMFA MQPGMFRQVQ ILAEKMIAEN ILQFFPESLT RYGDLELQKI LELKAGISNK SNRYNDNYNN YISKCSIITD LSKFNQAFRY ETSCICSDVL DELHGVQSLF SWLHLTIPHV TIICTYRHAP PYIRDHIVDL NNVDEQSGLY RYHMGGIEGW CQKLWTIEAI SLLDLI3LKG KFSITALING DNQSrDISKP VRLMEGQTHA QADYLLALNS LKLLYKEYAG IGHKLKGTET YISRDMQFMS KTIQHNGVYY PASIKKVLRV GPWINTILDD FKVSLESIGS LTQELEYRGE SLLCSLIFRN VWLYNQIALQ LKNHALCNNK LYLDILKVLK HLKTFFNLDN IDTALTLYMN LPMLFGGGDP NLLYRSFYRR TPDFLTEAIV HSVFIL3YYT NHDLKDKLQD LSDDRLNKFL TCIITFDKNP NAEFVTLMRD PQALGSERQA KITSEINRLA VTEVLSTAPN KIFSKSAQHY TTTEIDLNDI MQNIEPTYPH GLRVVYESIP FYKAEKIVML ISGTKSITNI LEKT3AIDLT DIDRATEMMR KNITLLIRIL PLDCNRDKRE ILSMENLSIT ELSKYVRERS WSLSNIVGVT SPSÍMYTMDI KYTTSTIASG IIIEKYNVNS LTRGERGPTK PWVGSSTQEK KTMPVYNRQV LTKKQRDQID LLAKLDWVYA SIDNKDEFME ELSIGTLGLT YEKAKKLFPQ YLSVNYLHRL TVSSRPCEFP ASIPAYRTTN YHFDTSPINR ILTEKYGDED IDIVFQNCIS FGLSLMSVVE QFTNVCPNRI ILIPKLNEIH LMKPPIFTGD VDIHKLKQVI QKQHMFLPDK ISLTQYVELF LSNKTLKSGS HVNSNLILAH KISDYFHNTY ILSTNLAGHW ILIIQLMKDS KGIFEKDWGE GYITDHMFIN LKVFFNAYKT YLLCFHKGYG KAKLECDMNT SDLLCVLELI DSSYWKSMSK VFLEQKVIKY ILSQDASLHR VKGCHSFKLW FLKRLNVAEF TVCPWVVNID YHPTHMKAIL TYIDLVRMGL INIDRIKIKN KHKFNDEFYT SNLFYINYNF SDNTHLLTKH IRIANSELEN NYNKLYHPTP ETLENILANP IKSNDKKTLN DYCIGKNVDS IMLPLLSNKK LVKSSAMIRT NYSKQDLYNL FPTVVIDRII DHSGNTAKSN QLYTTTSHQI SLVHNSTSLY CMLPWHHINR FNFVFSSTGC KISIEYILKD LKIKDPNCIA FIGEGAGNLL LRTVVELHPD IRYIYR3LKD CNDH3LPIEF LRLYNGHINI DYGENLTIPA TDATNNIHWS YLHIKFAEPI SLFVCDAELP VTVNWSKIII EWSKHVRKCK YCSSVNKCTL IVKYHAQDDI DFKLDNITIL KTYVCLGSKL KGSEVYLVLT IGPANIFPVF NVVQNAKLIL SRTKNFIMPK KADKESIDAN IKSLIPFLCY PITKKGINTA LSKLKSVVSG DILSYSIAGR NEVFSNKLIN HKHMNILKWF NHVLNFRSTE LNYNHLYMVE STYPYLSELL NSLTTNELKK LIKITGSLLY NFHNE
Proteína M2-1 de la cepa del RSV ATCC VR-26 long:
Secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO 7
MSRRNPCKFE IRGHCLNGKR CHFSHNYFEW PPHALLVRQN FMLNRILKSM DKSIDTLSEI SGAAELDRTE EYALGVVGVL ESYIGSINNI TKQSACVAMS KLLTELNSDD IKKLRDNEEL NSPKIRVYNT VISYIESNRK NNKQTIHLLK RLPADV1KKT IKNTLDIHKS ITINNPKELT VSDTNDHAKN KDTT
Proteína M2-2 de la cepa del RSV ATCC VR-26 long:
Secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO 8
MTMPKIMILP DKYPCSITSI LITSRCRVTM YNRKNTLYFN QNNPNNHMYS PNQTFNE1HW TSQDLIDTIQ NFLQHLGVIE DIYTIYILVS
Fosfoproteína P de la cepa del RSV ATCC VR-26 long:
Secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO 9
MF.KFfiPEFHG EDANNRATKF LESIKGKFTS PKDPKKKDSI ISVNSIDIEV TKESPITSNS
TIINPTNETD DNAGNKPNYQ RKPLVSFKED PIPSDNPFSK LYKETIETFD NNEEESSYSY EEINDQTNDN ITARLDRIDE KLSEILGMLH TLVVASAGPT SARDGIRDAM VGLREEMIEK IRTEALMTND RLEAMARLRN EESEKMAKDT SDEVSLNPTS EKLNNLLEGN DSDNDLSLF.D
F
Proteína no estructural NS1 de la cepa del RSV ATCC VR-26 long:
Secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO 10
MGSNSLSMIK VRLQNLFDND EVALLKITCY TDKLIHLTNA LAKAVIHTIK LNGIVFVHVI TSSDICPNNN IWKSNFTTM PVLQNGGYIW EMMELTHCSQ PNGLIDDNCE IKF5KKLSDS
TMTNYMNQLS ELLGFDLNP
Proteína no estructural NS2 de la cepa del RSV ATCC VR-26 long:
Secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO 11
MDTTHNDTTP QRLMITDMRP LSLETTITSL TRDIITHRFI YLINHECIVR KLDERQATFT FLVNYEMKLL HKVGSTKYKK YTEYNTKYGT FPMPIFINHD GFLECIGIKP TKHTPIIYKY DLNP
En el contexto de la presente descripción, además de las secuencias de aminoácidos aquí descritas según las SEQ ID NO: 1-11, también se pueden utilizar secuencias de aminoácidos de diferentes aislados del virus respiratorio sincitial (RSV). Estos aislados del virus respiratorio sincitial (RSV) preferentemente tiene una identidad de al menos un 70%, con mayor preferencia de al menos un 80% y con total preferencia de al menos un 90% con las secuencias de aminoácidos de acuerdo con las SEQ ID Nos: 1-11.
Además, en este contexto, la región codificante que codifica para al menos un péptido o proteína antigénico derivado de la proteína de fusión F, la glucoproteína G, la proteína hidrofóbica corta SH, la proteína matriz M, la nucleoproteína N, la polimerasa large L, la proteína M2-1, la proteína M2-2, la fosfoproteína P, la proteína NS1 no estructural o la proteína no estructural NS2 del virus respiratorio sincitial (RSV) o para un fragmento, variante o derivado de los mismos se puede seleccionar de cualquier secuencia de ácido nucleico que comprenda una región codificante derivada de cualquier aislado del virus respiratorio sincitial (RSV) o de un fragmento o variante del mismo.
SE describen aquí secuencias de ARNm de tipo salvaje de las regiones codificantes de la cepa long de RSV (ATCC VR-26) de acuerdo con el No. de acceso NCBI AY911262:
ARNm que codifica para la proteína de fusión F de la cepa de RSV ATCC VR-26 long:
Secuencia de ARNm de acuerdo con la SEQ ID NO 12:
auggaguugccaauccucaaagcaaaugcaauuaccacaauccucgcugcagucacauuuugcuuugciiucuaguca aaacaucacugaagaauuuuaucaaucaacaugcagugcaguuagcaaaggcuaucuuagugcucuaagaacugguu gguauacuaguguuauaacuauagaauuaaguaauaucaaggaaaauaaguguaauggaacagaugcuaagguaaaa uügauaaaccaagaauüagauaaauauaaaaaugcuguaacagaauugcaguugcucaugcaaagcacaacagcagc aaacaaucgagccagaagagaacuaccaagguuuaugaauuauacacucaacaauaccaaaaaaaccaauguaacauu aagcaagaaaaggaaaagaagauuucuugguuuuuuguuagguguuggaucugcaaucgccaguggcauugcuguau cuaagguccugcacuuagaaggagaagugaacaagaucaaaagugcucuacuauccacaaacaaggccguagucagcu uaucaaauggaguuagugucuuaaccagcaaagüguuagaccucaaaaacuauauagauaaacaauuguuaccuauu gugaauaagcaaagcugcagaauaucaaauauagaaacugugauagaguuccaacaaaagaacaacagacuacuagag auüaccagggaauuüaguguuaaugcaggüguaacuacaccuguaagcacuuacaugüuaacuaaLiagugaauuau ugucauuaaucaaugauaugccuauaacaaaugaucagaaaaaguuaauguccaacaauguucaaauaguuagacag caaaguuacucuaucauguccauaauaaaagaggaagucuuagcauauguaguacaaüuaccacuaüaüggugugau agauacaccuuguuggaaauuacacacauccccücuauguacaaccaacacaaaagaagggucaaacaucugüuuaa caagaacugacagaggaugguacugugacaaugcaggaucaguaucuuucuucccacaagcugaaacauguaaaguu caaucgaaucgaguauuuugugacacaaugaacaguuuaacauuaccaagugaaguaaaucucugcaauguugacau auucaaucccaaauaugauuguaaaauuaugacuucaaaaacagauguaagcagcuccguuaucacaucucuaggag ccauugugucaugcuaiiggcaaaacuaaauguacagcauccaauaaaaaucguggaaucauaaagacauuuucuaac 888u8u8auuau8uaucaaauaaa8888u88acacu8u8ucu8ua88uaacacauuauauuau8uaaauaa8caa8a aggcaaaagucucuauguaaaaggugaaccaauaauaaauuucuaugacccauuaguauuccccucugaugaauuug augcaucaauaucucaagucaaugagaagauuaaccagaguuuagcauuuauucguaaauccgaugaauuauuacau cauguaaaugcugguaaaucaaccacaaauaucaugauaacuacuauaauuauagugauuauaguaauauuguuau cauuaauugcuguuggacugcüccuauacuguaaggccagaagcacaccagucacacuaagcaaggaucaacugagu gguauaaauaauauugcauuuaguaacuga
ARNm que codifica para la glucoproteína G de la cepa del RSV ATCC VR-26 long:
Secuencia de ARNm de acuerdo con la SEQ ID NO 13: auguccaaaaacaaggaccaacgcaccgcuaagacacuagaaaagaccugggacacucucaaucauuuauuauucaua ucaucgggcuuauauaaguuaaaucuuaaaucuauagcacaaaucacauuauccauucuggcaaugauaaucucaac uucacuuauaauuacagccaucauauucauagccucggcaaaccacaaagucacacuaacaacugcaaucauacaag augcaacaagccagaucaagaacacaaccccaacauaccucacucaggauccucagcuuggaaucagcuucuccaauc ugucugaaauiiacaucacaaaccaccaccauacuagcuucaacaacaccaggagucaagucaaaccugcaacccacaa cagucaagacuaaaaacacaacaacaacccaaacacaacccagcaagcccacuacaaaacaacgccaaaacaaaccacc aaacaaacccaauaaugauuuucacuucgaaguguuuaacuuuguacccugcagcauaugcagcaacaauccaaccu gcugggcuaucugcaaaagaauaccaaacaaaaaaccaggaaagaaaaccaccaccaagccuacaaaaaaaccaaccu ucaagacaaccaaaaaagaucucaaaccucaaaccacuaaaccaaaggaaguacccaccaccaagcccacagaagagcc aaccaucaacaccaccaaaacaaacaucacaacuacacugcucaccaacaacaccacaggaaauccaaaacucacaag ucaaauggaaaccuuccacucaaccuccuccgaaggcaaucuaagcccuucucaagucuccacaacauccgagcaccc aucacaacccucaucuccacccaacacaacacgccaguag
ARNm que codifica para la proteína hidrofóbica corta SH de la cepa del RSV ATCC VR-26 long: Secuencia de ARNm de acuerdo con la SEQ ID NO 14: auggaaaauacauccauaacaauagaauucucaagcaaauucuggccuuacLiuuacacuaauacacaugaucacaac aauaaucucuuugcuaaucauaaucuccaucaugacugcaauacuaaacaaacuuugugaauauaacguauuccau aacaaaaccuuugaguuaccaagagcucgagucaacacauag
ARNm que codifica para la proteína de matriz M de la cepa del RSV ATCC VR-26 long:
Secuencia de ARNm de acuerdo con la SEQ ID NO: 15: auggaaacauacgugaacaagcuucacgaaggcuccacauacacagcugcuguucaauacaauguccuagaaaaagac gaugacccugcaucacuuacaauaugggugcccauguuccaaucaucuaugccagcagauuuacuuauaaaagaacu agcuaaugucaacauacuagugaaacaaauauccacacccaagggaccuucacuaagagucaugauaaacucaagaag ugcauugcuagcacaaaugcccagcaaauuuaccauaugugcuaauguguccuuggaugaaagaagcaaacuggcau augauguaaccacacccugugaaaucaaggcauguagucuaacaugccuaaaaucaaaaaauauguuaacuacaguu aaagaucucacuaugaagacacucaaccccacacaugauauuauugcuuuaugugaauuugaaaacauaguaacauc aaaaaaagucauaauaccaacauaccuaagauccaucagugucagaaauaaagaucugaacacacuugaaaauauaac aaccacugaauucaaaaaugccaucacaaaugcaaaaaucaucccuuacucaggauuacuauuagucaucacaguga cugacaacaaaggagcauucaaauacauaaagccgcaaagucaauucauaguagaucuuggagcuuaccuagaaaaag aaaguauauauuauguuaccacaaauuggaagcacacagcuacacgauuugcaaucaaacccauggaagauuaa ARNm que codifica para la nucleoproteína N de la cepa del RSV ATCC VR-26 long:
Secuencia de ARNm de acuerdo con la SEQ ID NO 16:
auggcucuuagcaaagucaaguugaaugauacacucaacaaagaucaacuucugucaucuagcaaauacaccaucca acggagcacaggagauaguauugauacuccuaauuaugaugugcagaaacacaucaauaaguuauguggcauguuau uaaucacagaagaugcuaaucauaaauucacuggguuaauagguauguuauaugcuaugucuagguuaggaagagaa gacaccauaaaaauacucagagaugcgggauaucauguaaaagcaaauggaguagauguaacaacacaucgucaagac aucaaugggaaagaaaugaaauuugaaguguuaacauuggcaagcuuaacaacugaaauucaaaucaacauugagau agaaucuagaaaauccuacaaaaaaaugcuaaaagaaaugggagagguagcuccagaauacaggcaugauucuccuga uugugggaugauaauauuauguauagcagcauuaguaauaaccaaauuggcagcaggggauagaucuggucuuacag ccgugauuaggagagcuaauaauguccuaaaaaaugaaaugaaacguuacaaaggcuuacuacccaaggauauagcc aacagcuucuaugaaguguuugaaaaacauccccacuuuauagauguuuuuguucauuuugguauagcacaaucuu ccaccagagguggcaguagaguugaagggauuuuugcaggauuguuuaugaaugccuauggugcagggcaaguaaug cuacgguggggagucuuagcaaaaucaguuaaaaauauuauguuaggacaugcuagugugcaagcagaaauggaaca aguuguugagguuuaugaauaugcccaaaaauuggguggagaagcaggauucuaccauauauugaacaacccaaaag caucauuauuaucuuugacucaauuuccucacuuuuccaguguaguauuaggcaaugcugcuggccuaggcauaau gggagaguacagagguacaccgaggaaucaagaucuauaugaugcagcaaaggcauaugcugaacaacucaaagaaaa uggugugauuaacuacaguguauuagacuugacagcagaagaacuagaggcuaucaaacaucagcuuaauccaaaag auaaugauguagagcuuuga
ARNm que codifica para la polimerasa long L de la cepa del RSV ATCC VR-26 long:
Secuencia de ARNm de acuerdo con la SEQ ID NO 17:
auggaucccauüauuaauggaaauucugcuaauguuuaucuaaccgauaguuauuuaaaagguguuaucucuuucu cagaguguaaugcuuuaggaaguuacauauucaaugguccuuaucucaaaaaugauuauaccaacuuaauuaguag acaaaauccauuaauagaacacaugaaucuaaagaaacuaaauauaacacaguccuuaauaucuaaguaucauaaag gugaaauaaaailuagaagagccuacuiiauuuucagucauuacuiiaugacauacaagaguaugacciicguLiggaacag auugcuaccacuaauuuacuuaaaaagauaauaagaagagcuauagaaauaagugaugucaaagucuaugcuauauu gaauaaacuagggcuuaaagaaaaggacaagauuaaauccaacaauggacaggaugaagacaacucaguuauuacgac cauaaucaaagaugauauacuuucagajguuaaggauaaucaaiicucaucuuaaagcagacaaaaaucacuciiacaa aacaaaaagacacaaucaaaacaacacucuugaagaaauuaauguguucaaugcagcauccuccaucauggüuaaua cauugguuuaauuuauacacaaaauuaaacaacauauuaacacaguaucgaucaaaugagguuaaaaaccauggguu uauauugauagauaaucaaacucuuaguggauuucaauuuauuuugaaucaauaugguuguauaguuuaucauaag gaacucaaaagaauuacugugacaaccuauaaucaauucuugacauggaaagauauuagccuuaguagauuaaaugu uuguuuaauuacauggauuaguaacugcüugaacacauuaaauaaaagcuuaggcuuaagaugcggauucaauaau guuaucuugacacaacuauuccuuuauggugauuguauacuaaagcuauuucacaaugagggguucuacauaauaa aagagguagagggauuuauuaugucucuaauuuuaaauauaacagaagaagaucaauucagaaaacgauuuuauaau aguaugcucaacaacaucacagaugcugcuaauaaagcucagaaaaaucugcuaucaagaguaugucauacauuauu agauaagacaguauccgauaauauaauaaauggcagauggauaauucuauuaaguaaguuccuuaaauuaauuaagc uugcaggi¡gacaauaaccuuaacaaucugagugaacuauauuuuuuguucagaauauuuggacacccaaugguaga ugaaagacaagccauggaugcuguuaaaguuaauugcaaugagaccaaauuuuacuuguuaagcaguuugaguaugu uaagaggugccuuuauauauagaauuauaaaaggguüuguaaauaauuacaacagauggccuacuuüaagaaaügcu auuguujuacccuuaagaugguuaacuuacuauaaacuaaacacuuauccuucuuugüuggaacuuacagaaagag auuugauuguguuaucaggacuacguuucuaucgugaguuucgguugccuaaaaaaguggaucüugaaaügauuau aaaugauaaagcuauaucacccccuaaaaauuugauauggacuaguuucccuagaaauuauaugccgucacacauac aaaacuauauagaacaugaaaaauuaaaauuuuccgagagugauaaaucaagaagaguauuagaguauuauuuaaga gauaacaaauucaaugaaugugauuuauacaacuguguaguuaaucaaaguuaucucaacaacccuaaucauguggu aucau ugacaggcaaagaaagagaacucaguguagguagaauguuugcaaugcaaccgggaauguucagacagguuc aaauauuggcagagaaaaugauagcugaaaacauiiuuacaauucuuuccugaaagucuuacaagauauggugaucua gaacuacaaaaaauauuagaauugaaagcaggaauaaguaacaaaucaaaucgcuacaaugauaauuacaacaauua cauuaguaagugcucuaucaucacagaucucagcaaauucaaucaagcaiiuucgauaugaaacgucauguauuugua gugaugugcuggaugaacugcaugguguacaaucucuauuuuccugguuacauuuaacuauuccucaugucacaau aauaugcacauauaggcaugcaccccccuauauaagagaucauauuguagaucuuaacaauguagaugaacaaagug gauuauauagauaucacaugggugguauugaaggguggugucaaaaacuauggaccauagaagcuauaucacuauug gaucuaauaucucucaaagggaaauucucaauuacugcuuuaauuaauggugacaaucaaucaauagauauaagcaa accagucagacucauggaaggucaaacucaugcucaagcagauuauuugcuagcauuaaauagccuuaaauuacugu auaaagaguaugcaggcauaggucacaaauuaaaaggaacugagacuuauauaucacgagauaugcaauuuaugagu aaaacaauucaacauaacgguguauauuacccugcuaguauaaagaaaguccuaagagugggaccguggauaaacac uauacuugaugauuucaaagugagucuagaaucuauagguagü uugacacaagaauuagaauauagaggugaaaguc uauuaugcaguuuaauauuuagaaauguaugguuauauaaucaaauugcucuacaauuaaaaaaucaugcguuau§ uaacaauaaauuauauuuggacauauuaaagguucugaaacacuuaaaaaccuuuuuuaaucuugauaauauugau acagcauuaacauuguauaugaauuuacccauguuauuuggugguggugaucccaacuuguuauaucgaaguuucu auagaagaacuccugauuuccucacagaggcuauaguucacucuguguucauacuuaguuauuauacaaaccaugac uuaaaagauaaacuucaagauuugucagaugauagauugaauaaguucuuaacaugcauaaucacguuugacaaaaa cccuaaugcugaauucguaacauugaugagagauccucaagcuuuaggguajgagagacaagcuaaaauuacuagug aaaucaauagacuggcaguuacagagguuuugaguacagcuccaaacaaaauauucuccaaaagugcacaacauuau accacuacagagauagaucuaaaugauauuaugcaaaauauagaaccuacauauccucacgggcuaagaguuguuua ugaaaguuuacccuuuuauaaagcagagaaaauaguaaaucuuauaucagguacaaaaucuauaacuaacauacugg aaaagacuucugccauagacuuaacagauauugauagagccacugagaugaugaggaaaaacaitaacuuugcuuaua aggauacuuccauuggauuguaacagagauaaaagagaaauauugaguauggaaaaccuaaguauuacijgaauuaag caaauauguuagggaaagaucuuggucuuuauccaauauaguugguguuacaucacccaguaucauguauacaaug gacaucaaauauacaacaagcacuauagcuaguggcauaauuauagagaaauauaauguuaacaguuuaacacgugg cuauaaccauuuauauaugguagaaucuacauauccuuaccuaagugaauuguuaaacagcuugacaacuaaugaac uuaaaaaacugauuaaaaucacagguagucuguuauacaacuuucauaaugaauaa
ARNm que codifica para la proteína M2-1 de la cepa del RSV ATCC VR-26 long:
Secuencia de ARNm de acuerdo con la SEQ ID NO 18:
Augucacgaaggaauccuugcaaauuugaaauucgaggucauugcuugaaugguaagagaugucauuuuagucaua auuauuuugaauggccaccccaugcacugcucguaagacaaaacuüuauguuaaacagaauacuuaagucuauggau aaaaguauagauaccuuaucagaaauaaguggagcugcagaguuggacagaacagaagaguaugcucuugguguagu uggagugcuagagaguuauauaggaucaauaaauaauauaacuaaacaaucagcauguguugccaugagcaaacucc ucacugaacucaauagugaugauaucaaaaaacugagagacaaugaagagcuaaauucacccaagauaagaguguaca auacugucauaucauauauugaaagcaacaggaaaaacaauaaacaaacuauccaucugu uaaaaagauugccagca gacguauugaagaaaaccaucaaaaacacauuggauauccacaagagcauaaccaucaacaacccaaaagaauuaacu guuagugauacaaaugaccaugccaaaaauaaugauacuaccuga
ARNm que codifica para la proteína M2-2 de la cepa del RSV ATCC VR-26 long:
Secuencia de ARNm de acuerdo con la SEQ ID NO 19: augaccaugccaaaaatiaaugauacuaccugacaaauauccuuguaguauaacuuccauacuaauaacaaguagaug uagagucacuauguauaaucgaaagaacacacuauauuucaaucaaaacaacccaaauaaccauauguacucaccga aucaaacauucaaugaaauccauuggaccucacaagacuugauugacacaauucaaaauuuucuacagcaucuaggu guuauugaggauauauauacaauauauauauuagugucauaa
ARNm que codifica para la fosfoproteína P de la cepa del RSV ATCC VR-26 long:
Secuencia de ARNm de acuerdo con la SEQ ID NO: 20: auggaaaaguuugcuccugaauuccauggagaagaugcaaacaacagggcuacuaaauuccuagaaucaauaaaggg caaauucacaiicaccuaaagaucccaagaaaaaagauaguaucauaucugucaacucaauagauauagaaguaacca aagaaagcccuauaacaucaaauucaaccauuauuaacccaacaaaugagacagaugauaaugcagggaacaagccca auuaucaaagaaaaccucuaguaaguuucaaagaagacccuauaccaagugauaaucccuuuucaaaacuauacaaa gaaaccauagagacauuugauaacaaugaagaagaaucuagcuauucauaugaagaaauaaaugaucagacgaacga uaauauaacugcaagauuagauaggauugaugaaaaauuaagugaaauacuaggaaugcuucacacauuaguaguag caagugcaggaccuacaucugcuagggaugguauaagagaugccaugguugguuuaagagaagaaaugauagaaaaa aucagaacugaagcauuaaugaccaaugacagauuagaagcuauggcaagacucaggaaugaggaaagugaaaagaug gcaaaagacacaucagaugaagugucucucaaucca.acaucagagaaauugaacaaccuguuggaagggaaugauagu gacaaugaucuaucacuugaagauuucuga
ARNm que codifica para la proteína NS1 no estructural de la cepa del RSV ATCC VR-26 long: Secuencia de ARNm de acuerdo con la SEQ ID NO 21: augggcagcaauucguugaguaugauaaaaguuagauuacaaaauuuguuugacaaugaugaaguagcauuguuaaa aauaacaugcu3uacugacaaauuaauacauuuaacuaaugcuuuggcuaaggcagugauacauacaaucaaauuga auggcauuguguuugugcauguuauiiacaaguagugauauuugcccuaauaauaauauuguaguaaaauccaauuu cacaacaaugccagugcuacaaaauggagguuauaiiaugggaaaugauggaauuaacacauugcucucaaccuaaug gucuaauagaugacaauugi;gaaauuaaauucuccaaaaaacuaagugauucaacaaugaccaauuaiiaugaaucaa uuaucugaauuacuuggauuugaucuuaauccauaa
ARNm que codifica para la proteína NS2 no estructural de la cepa del RSV ATCC VR-26 long: Secuencia de ARNm de acuerdo con la SEQ ID NO 22:
auggacacaacccacaaugauaccacaccacaaagacugaugaucacagacaugagaccguugucaajugagacuaca
auaacaucacuaaccagagacaucauaacacacagauuuauauacuuaauaaaucaugaaugcauagugagaaaacu
ugaugaaagacaggccacauuuacauuccuggucaacuaugaaaugaaacuauugcacaaaguaggaagcacuaaau
auaaaaaauauacugaauacaacaeaaaauauggcacuuucccuaugccgauauucaucaaucaugauggguucuua
gaaugcauuggcauuaagccuacaaagcaiiacucccauaauauacaaguaugaucucaauccauag
En el contexto de la presente descripción, además de las secuencias de ácido nucleico aquí descritas, también se incorporan aquí secuencias de ácido nucleico de diferentes aislados del virus respiratorio sincitial (RSV). Estos diferentes aislados del virus respiratorio sincitial (RSV) preferentemente tienen una identidad de al menos un 50%, 60%, 70%, con mayor preferencia de al menos un 80% y con total preferencia de al menos un 90% con las secuencias de ácido nucleico de acuerdo con las SEQ ID Nos: 12­ 22 o fragmentos de las mismas.
En una realización preferente, la secuencia de ARNm de acuerdo con la invención no comprende un gen reporter ni un gen marcador. Preferentemente, la secuencia de ARNm de acuerdo con la invención no codifica, por ejemplo, para la luciferasa, la proteína fluorescente verde (GFP) y sus variantes (tales como eGFP, RFP o BFP), la a-globina, la hipoxantina-guanina-fosforribosiltransferasa (HGPRT), la U-galactosidasa; la galactoquinasa, la fosfatasa alcalina, la fosfatasa alcalina embrionaria secretada (SEAP)) o para un gen de resistencia (tal como un gen de resistencia a neomicina, puromicina, higromicina y zeocina). En una realización preferente, la secuencia de ARNm de acuerdo con la invención no codifica para luciferasa. En otra realización, la secuencia de ARNm de acuerdo con la invención no codifica para GFP o para una variante de la misma.
En otra realización preferente, la secuencia de ARNm de acuerdo con la invención no codifica para una proteína (o para un fragmento de una proteína) derivada de un virus que pertenece a la familia Orthomyxoviridae. De preferencia, la secuencia de ARNm no codifica una proteína que se deriva de un virus de la influenza, con mayor preferencia de un virus de la influenza A. Preferentemente, la secuencia de ARNm de acuerdo con la invención no codifica una proteína de la influenza A seleccionada del grupo consistente en hemaglutinina (HA), neuraminidasa (nA), nucleoproteína (NP), M1, M2, NS1, NS2 (NEP: proteína de exportación nuclear), PA, PB1 (polimerasa básica 1), PB1-F2 y PB2. En otra realización preferente, el ARNm de acuerdo con la invención no codifica para ovoalbúmina (OVA) o para un fragmento de la misma. De preferencia, la secuencia de ARNm de acuerdo con la invención no codifica para una proteína de la influenza A u ovoalbúmina.
En una realización adicional, el ARNm inventivo preferentemente comprende al menos uno de los siguientes elementos estructurales: un elemento de la región no traducida (elemento UTR) 5' y/o 3', en particular un elemento 5'-UTR que comprende o que consiste en una secuencia de ácido nucleico que se deriva de la 5'-UTR de un gen TOP o de un fragmento, homólogo o variante del mismo, o un elemento 5' y/o 3'-UTR que se puede derivar de un gen que proporciona un ARNm estable o proveniente de un homólogo, fragmento o variante del mismo; una estructura tallo-bucle de histona, de preferencia un tallo-bucle de histona en su región no traducida 3'; una estructura 5'-CAP; una cola poli-A; o una secuencia poli(C).
En una realización preferente del primer aspecto de la presente invención, el ARNm inventivo comprende al menos un elemento 5'- o 3'-UTr . En este contexto, un elemento UTR comprende o consiste en una secuencia de ácido nucleico que se deriva de la 5'- o 3'-UTR de cualquier gen de origen natural o que se deriva de un fragmento, homólogo o variante de la 5'- o 3'-UTR de un gen. Preferentemente, el elemento 5'- o 3'-UTR utilizado de acuerdo con la presente invención es heterólogo a la región codificante de la secuencia de ARNm inventiva. Incluso si se prefieren los elementos 5'- o 3'-UTR derivados de genes de origen natural, también se pueden utilizar en el contexto de la presente invención elementos UTR sintéticos diseñados por ingeniería.
En una realización particularmente preferente del primer aspecto de la presente invención, la secuencia de ARNm inventiva comprende al menos un elemento de la región no traducida 5' (elemento 5'UTR) que comprende o consiste en una secuencia de ácido nucleico que se deriva de la 5'UTR de un gen TOP o que se deriva de un fragmento, homólogo o variante de la 5'UTR de un gen TOP.
Es particularmente preferente que el elemento 5'UTR no comprenda un motivo TOP ni un 5'TOP como se han definido anteriormente.
En algunas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico del elemento 5'UTR que se deriva de una 5'UTR de un gen TOP termina en su extremo 3' con un nucleótido ubicado en la posición 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aguas arriba del codón de inicio (por ejemplo A(U/T)G) del gen o del ARNm del que se deriva. Así, el elemento 5'UTR no comprende ninguna parte de la proteína que codifica para la región. De esta forma, preferentemente, la única parte codificante de la proteína del ARNm inventivo es proporcionada por la región codificante.
La secuencia de ácido nucleico que se deriva de la 5'UTR de un gen TOP se deriva de un gen TOP eucariota, preferentemente de un gen TOP vegetal o animal, con mayor preferencia de un gen TOP de cordado, incluso con mayor preferencia de un gen TOP de vertebrado, con total preferencia de un gen TOP de mamífero, tal como de un gen TOP de humano.
Por ejemplo, el elemento 5'UTR preferentemente se selecciona de los elementos 5'-UTR que comprenden o consisten en una secuencia de ácido nucleico que se deriva de una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo consistente en las SEQ ID NO: 1-1363, SEQ ID NO: 1395, SEQ ID NO: 1421 y SEQ ID NO: 1422 de la solicitud de patente WO2013/143700, a partir de homólogos de las SEQ ID NO: 1-1363, SEQ ID NO: 1395, SEQ ID NO: 1421 y SEQ ID NO: 1422 de la solicitud de patente WO2013/143700, de una variante de los mismos o, de preferencia, de una secuencia de ARN correspondiente. El término “homólogos de las SEQ ID NO: 1-1363, SEQ ID NO: 1395, SEQ ID NO: 1421 y SEQ ID NO: 1422 de la solicitud de patente WO2013/143700” se refiere a secuencias de otras especies distintas a Homo sapiens que son homólogas a las secuencias de acuerdo con las SEQ ID NO: 1-1363, SEQ ID NO: 1395, s Eq ID NO: 1421 y SEQ ID NO: 1422 de la solicitud de patente WO2013/143700.
En una realización preferente, el elemento 5'UTR comprende o consiste en una secuencia de ácido nucleico que se deriva de una secuencia de ácido nucleico que se extiende desde la posición de nucleótido 5 (es decir, el nucleótido en la posición 5 en la secuencia) hasta la posición de nucleótido inmediatamente 5' al codón de inicio (en el extremo 3' de las secuencias), por ejemplo la posición de nucleótido inmediatamente 5' a la secuencia ATG, de una secuencia de ácido nucleico seleccionada de las SEQ ID NO: 1-1363, SEQ ID NO: 1395, SEQ ID NO: 1421 y SEQ ID NO: 1422 de la solicitud de patente WO2013/143700, de los homólogos de las SEQ ID NO: 1-1363, SEQ ID NO: 1395, SEQ ID NO: 1421 y SEQ ID NO: 1422 de la solicitud de patente WO2013/143700, de una variante de los mismos, o de una secuencia de ARN correspondiente. Es particularmente preferente que el elemento 5'UTR se derive de una secuencia de ácido nucleico que se extiende desde la posición de nucleótido inmediatamente 3' a la 5'TOP hasta la posición de nucleótido inmediatamente 5' al codón de inicio (en el extremo 3' de la secuencia), por ejemplo la posición de nucleótido inmediatamente 5' a la secuencia ATG de una secuencia de ácido nucleico seleccionada de las SEQ ID NO: 1-1363, SEQ ID NO: 1395, SEQ ID NO: 1421 y SEQ ID NO: 1422 de la solicitud de patente WO2013/143700, de los homólogos de las SEQ ID NO: 1-1363, SEQ ID NO: 1395, SEQ ID NO: 1421 y SEQ ID NO: 1422 de la solicitud de patente WO2013/143700, de una variante de los mismos, o de una secuencia de ARN correspondiente.
En una realización particularmente preferente, el elemento 5'UTR comprende o consiste en una secuencia de ácido nucleico que se deriva de una 5'UTR de un gen TOP que codifica para una proteína ribosómica o de una variante de una 5'UTR de un gen TOP que codifica para una proteína ribosómica. Por ejemplo, el elemento 5'UTR comprende o consiste en una secuencia de ácido nucleico que se deriva de una 5'UTR de una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las SEQ ID NO: 67, 170, 193, 244, 259, 554, 650, 675, 700, 721, 913, 1016, 1063, 1120, 1138 y 1284-1360 de la solicitud de patente WO2013/143700, de una secuencia de ARN correspondiente, de un homólogo de la misma de o una variante de la misma como se describe aquí, preferentemente sin el motivo 5'TOP. Como se describió anteriormente, la secuencia que se extiende desde la posición 5 hasta el nucleótido inmediatamente 5' al ATG (que se ubica en el extremo 3' de las secuencias) corresponde a la 5'UTR de dichas secuencias.
Preferentemente, el elemento 5'UTR comprende o consiste en una secuencia de ácido nucleico que se deriva de una 5'UTR de un gen TOP que codifica para una proteína ribosómica Large (RPL) o de un homólogo o variante de una 5'UTR de un gen TOP que codifica para una proteína ribosómica Large (RPL). Por ejemplo, el elemento 5'UTR comprende o consiste en una secuencia de ácido nucleico que se deriva de una 5'UTR de una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las SEQ ID NO: 67, 259, 1284-1318, 1344, 1346, 1348-1354, 1357, 1358, 1421 y 1422 de la solicitud de patente WO2013/143700, una secuencia de ARN correspondiente, un homólogo de la misma, o una variante de la misma como se describe aquí, que preferentemente carece del motivo 5'TOP.
En una realización particularmente preferente, el elemento 5'UTR comprende o consiste en una secuencia de ácido nucleico que se deriva de la 5'UTR de un gen Large 32 de una proteína ribosómica, preferentemente de un gen Large 32 (L32) de una proteína ribosómica de vertebrado, con mayor preferencia de un gen Large 32 (L32) de una proteína ribosómica de mamífero, con mayor preferencia de un gen Large 32 (L32) de una proteína ribosómica humana, o a partir de una variante de la 5'UTR de un gen Large 32 de una proteína ribosómica, de preferencia a partir de un gen Large 32 (L32) de una proteína ribosómica de vertebrado, con mayor preferencia a partir de un gen Large 32 (L32) de una proteína ribosómica de mamífero, con mayor preferencia a partir de un gen Large 32 (L32) de una proteína ribosómica humana, donde preferentemente el elemento 5'UTR no comprende el 5'TOP de dicho gen.
Por consiguiente, en una realización particularmente preferente, el elemento 5'UTR comprende o consiste en una secuencia de ácido nucleico que tiene una identidad de al menos aproximadamente un 40%, de preferencia de al menos aproximadamente un 50%, de preferencia de al menos aproximadamente un 60%, de preferencia de al menos aproximadamente un 70%, con mayor preferencia de al menos aproximadamente un 80%, con mayor preferencia de al menos aproximadamente un 90%, incluso con mayor preferencia de al menos aproximadamente un 95%, incluso con mayor preferencia de al menos aproximadamente un 99% con la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 23 (5'-UTR de la proteína Large 32 ribosómica humana sin el tracto de oligopirimidina 5' terminal: GGCGCTGCCTACGGAGGTGGCAGCCATCTCCTTCTCGGCATC; correspondiente a la SEQ ID NO: 1368 de la solicitud de patente W02013/143700) o, de preferencia, con una secuencia de ARN correspondiente, o donde al menos un elemento 5'UTR comprende o consiste en un fragmento de una secuencia de ácido nucleico que tenga una identidad de al menos aproximadamente un 40%, de preferencia de al menos aproximadamente un 50%, de preferencia de al menos aproximadamente un 60%, de preferencia de al menos aproximadamente un 70%, con mayor preferencia de al menos aproximadamente un 80%, con mayor preferencia de al menos aproximadamente un 90%, incluso con mayor preferencia de al menos aproximadamente un 95%, incluso con mayor preferencia de al menos aproximadamente un 99% con la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 23 o, con total preferencia, con una secuencia de ARN correspondiente, donde, preferentemente, el fragmento es como se describió anteriormente, es decir un tramo continuo de nucleótidos que representa al menos un 20%, de preferencia al menos aproximadamente un 30%, con mayor preferencia al menos aproximadamente un 40%, con mayor preferencia al menos aproximadamente un 50%, incluso con mayor preferencia al menos aproximadamente un 60%, incluso con mayor preferencia al menos aproximadamente un 70%, incluso con mayor preferencia al menos aproximadamente un 80% y con total preferencia al menos aproximadamente un 90% de la 5'UTR de longitud total. Preferentemente, el fragmento tiene una longitud de al menos aproximadamente 20 nucleótidos o más, en especial al menos aproximadamente 30 nucleótidos o más, con mayor preferencia al menos aproximadamente 40 nucleótidos o más. Preferentemente, el fragmento es un fragmento funcional como se describe aquí.
En algunas realizaciones, el ARNm inventivo comprende un elemento 5'UTR que comprende o consiste en una secuencia de ácido nucleico que se deriva de la 5'UTR de un gen TOP de vertebrado, tal como un mamífero, por ejemplo un gen TOP humano seleccionado de RPSA, RPS2, RPS3, RPS3A, RPS4, RPS5, RPS6, RPS7, RPS8, RPS9, RPS10, RPS11, RPS12, RPS13, RPS14, RPS15, RPS15A, RPS16, RPS17, RPS18, RPS19, RPS20, RPS21, RPS23, RPS24, RPS25, RPS26, RPS27, RPS27A, RPS28, RPS29, RPS30, RPL3, RPL4, RPL5, RPL6, RPL7, RPL7A, RPL8, RPL9, RPL10, RPL10A, RPL11, RPL12, RPL13, RPL13A, RPL14, RPL15, RPL17, RPL18, RPL18A, RPL19, RPL21, RPL22, RPL23, RPL23A, RPL24, RPL26, RPL27, RPL27A, RPL28, RPL29, RPL30, RPL31, RPL32, RPL34, RPL35, RPL35A, RPL36, RPL36A, RPL37, RPL37A, RPL38, RPL39, RPL40, RPL41, RPLP0, RPLP1, RPLP2, RPLP3, RPLPO, RPLP1, RPLP2, EEF1A1, EEF1B2, EEF1D, EEF1G, EEF2, EIF3E, EIF3F, EIF3H, EIF2S3, EIF3C, EIF3K, EIF3EIP, EIF4A2, PABPC1, HNRNPA1, TPT1, TUBB1, UBA52, NPM1, ATP5G2, GNB2L1, NME2, UQCRB, 0 de un homólogo o variante de los mismos, donde preferentemente el elemento 5'UTR no comprende un motivo TOP o la 5'TOP de dichos genes y donde opcionalmente el elemento 5'UTR comienza en su extremo 5' con un nucleótido ubicado en la posición 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aguas abajo del tracto de oligopirimidina 5' terminal (TOP) y donde opcionalmente además el elemento 5'UTR, que se deriva de una 5'UTR de un gen TOP termina en su extremo 3' con un nucleótido ubicado en la posición 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aguas arriba del codón de inicio (A(U/T)G) del gen del cual se deriva.
En otra realización particularmente preferente, el elemento 5'UTR comprende o consiste en una secuencia de ácido nucleico que se deriva de la de la 5'-UTR de un gen de proteína ribosómica LARGE 32 (RPL32), un gen de proteína ribosómica LARGE 35 (RPL35), un gen de proteína ribosómica LARGE 21 (RPL21), una ATP sintasa, un transportador H+, un complejo F1 mitocondrial, una subunidad alfa 1, gen de músculo cardíaco (ATP5A1), gen hidroxiesteroide (17-beta) deshidrogenasa 4 (HSD17B4), un gen 1 inducido por andrógenos (AIG1), un gen Vic de la subunidad citocromo c oxidasa (COX6C) o un gen N-acilesfingosina amidohidrolasa (ceramidasa ácida) 1 (ASAH1) o de una variante de los mismos, preferiblemente de un gen de proteína ribosómica LARGE 32 (RPL32) de vertebrado, un gen de proteína ribosómica LARGE 35 (RPL35) de vertebrado, un gen de proteína ribosómica LARGE 21 (RPL21) de vertebrado, una ATP sintasa de vertebrado, un transportador H+, un complejo F1 mitocondrial, una subunidad alfa 1, un gen de músculo cardíaco (ATP5A1), un gen hidroxiesteroide (17-beta) deshidrogenasa 4 (HSD17B4) de vertebrado, un gen 1 inducido por andrógenos (AIG1) de vertebrado, un gen Vic de la subunidad citocromo c oxidasa (COX6C) de vertebrado o un gen N-acilesfingosina amidohidrolasa (ceramidasa ácida) 1 (ASAH1) de vertebrado, o de una variante de los mismos; más preferiblemente de un gen proteína ribosómica LARGE 32 (RPL32) de mamífero, un gen de proteína ribosómica LARGE 35 (RPL35) de mamífero, un gen de proteína ribosómica LARGE 21 (RPL21) de mamífero, una ATP sintasa de mamífero, un transportador H+, un complejo F1 mitocondrial, una subunidad alfa 1, gen de músculo cardíaco (ATP5A1), un gen hidroxiesteroide (17-beta) deshidrogenasa 4 (HSD17B4) de mamífero, un gen 1 inducido por andrógenos (AIG1) de mamífero, un gen Vic de la subunidad citocromo c oxidasa (COX6C) de mamífero, un gen N-acilesfingosina amidohidrolasa (ceramidasa ácida) 1 (ASAH1) de mamífero o de una variante de los mismos; con total preferencia de preferiblemente de un gen de proteína ribosómica LARGE 32 (RPL32) de vertebrado, un gen de proteína ribosómica LARGE 35 (RPL35) humana, un gen de proteína ribosómica LARGE 21 (RPL21) humana, una ATP sintasa humana, un transportador H+, un complejo F1 mitocondrial, una subunidad alfa 1, un gen de músculo cardíaco (ATP5A1), un gen hidroxiesteroide (17-beta) deshidrogenasa 4 (HSD17B4) humano, un gen 1 inducido por andrógenos (AIG1) humano, un gen Vic de la subunidad citocromo c oxidasa (COX6C) humano o un gen N-acilesfingosina amidohidrolasa (ceramidasa ácida) 1 (ASAH1) humano, o de una variante de los mismos; donde preferiblemente el elemento 5'-UTR no comprende la 5'-TOP de dicho gen.
Por consiguiente, en una realización particularmente preferente, el elemento 5'UTR comprende o consiste en una secuencia de ácido nucleico que tiene una identidad de al menos aproximadamente un 40%, de preferencia de al menos aproximadamente 50%, de preferencia de al menos aproximadamente 60%, de preferencia de al menos aproximadamente 70%, con mayor preferencia de al menos aproximadamente 80%, con mayor preferencia de al menos aproximadamente 90%, incluso con mayor preferencia de al menos aproximadamente 95%, incluso con mayor preferencia de al menos aproximadamente un 99% con la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con las SEQ ID NO: 1368 o SEQ ID NO: 1412-1420 de la solicitud de patente WO2013/143700, o una secuencia de ARN correspondiente, o donde al menos un elemento 5'UTR comprende o consiste en un fragmento de una secuencia de ácido nucleico que tiene una identidad de al menos aproximadamente un 40%, de preferencia de al menos aproximadamente 50%, de preferencia de al menos aproximadamente 60%, de preferencia de al menos aproximadamente 70%, con mayor preferencia de al menos aproximadamente 80%, con mayor preferencia de al menos aproximadamente 90%, incluso con mayor preferencia de al menos aproximadamente 95%, incluso con mayor preferencia de al menos aproximadamente un 99% con la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 1368 o las Se Q ID NO: 1412-1420 de la solicitud de patente WO2013/143700, donde, preferentemente, el fragmento es como se describió anteriormente, es decir, es un tramo continuo de nucleótidos que representa al menos el 20%, etc., de la 5'UTR de longitud total. De preferencia, el fragmento tiene una longitud de al menos aproximadamente 20 nucleótidos o más, preferentemente de al menos aproximadamente 30 nucleótidos o más, con mayor preferencia de al menos aproximadamente 40 nucleótidos o más. Preferentemente, el fragmento es un fragmento funcional tal como se describe aquí.
Así, en una realización particularmente preferente, el elemento 5'UTR comprende o consiste en una secuencia de ácido nucleico con una identidad de al menos aproximadamente un 40%, de preferencia de al menos aproximadamente 50%, de preferencia de al menos aproximadamente 60%, de preferencia de al menos aproximadamente 70%, con mayor preferencia de al menos aproximadamente 80%, con mayor preferencia de al menos aproximadamente 90%, incluso con mayor preferencia de al menos aproximadamente 95%, incluso con mayor preferencia de al menos aproximadamente un 99% con la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 36 (5'-UTR de ATP5A1 sin el tracto de oligopiridina 5' terminal: GCGGCTCGGCCATTTTGTCCCAGTCAGTCCGGAGGCTGCGGCTGCAGAAGTACCGCCT GCG-GAGTAACTGCAAAG; correspondiente a la SEQ ID NO: 1414 de la solicitud de patente WO2013/143700) o, preferentemente, con una secuencia de ARN correspondiente, o donde el al menos un elemento 5'UTR comprende o consiste en un fragmento de una secuencia de ácido nucleico con una identidad de al menos aproximadamente un 40%, de preferencia de al menos aproximadamente 50%, de preferencia de al menos aproximadamente 60%, de preferencia de al menos aproximadamente 70%, con mayor preferencia de al menos aproximadamente 80%, con mayor preferencia de al menos aproximadamente 90%, incluso con mayor preferencia de al menos aproximadamente 95%, incluso con mayor preferencia de al menos aproximadamente un 99% con la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 26 o, con especial preferencia, con una secuencia de ARN correspondiente, donde, preferentemente, el fragmento es como se describió anteriormente, es decir, es un tramo continuo de nucleótidos que representa al menos el 20%, etc., de la 5'UTR de longitud completa. Preferentemente, el fragmento tiene una longitud de al menos aproximadamente 20 nucleótidos o más, de preferencia de al menos aproximadamente 30 nucleótidos o más, con mayor preferencia de al menos aproximadamente 40 nucleótidos o más. De preferencia, el fragmento es un fragmento funcional tal como se describe aquí.
En una realización preferente adicional, el ARNm inventivo comprende además al menos un elemento 3'UTR, que comprende o consiste en una secuencia de ácido nucleico derivado de la 3'UTR de un gen de cordado, preferentemente de un gen de vertebrado, con mayor preferencia un gen de mamífero, con total preferencia de un gen humano, o de una variante de la 3'UTR de un gen de cordado, de preferencia de vertebrado, con mayor preferencia de mamífero, con total preferencia de un gen humano.
El término “elemento 3'UTR” se refiere a una secuencia de ácido nucleico que comprende o consiste en una secuencia de ácido nucleico que se deriva de una 3'UTR o de una variante de una 3'UTR. Un elemento 3'UTR en el sentido de la presente invención puede representar la 3'UTR de un ARNm. Así, en el sentido de la presente invención, preferentemente un elemento 3'UTR puede ser la 3'UTR de un ARNm, de preferencia de un ARNm artificial, o puede ser un molde de transcripción para la 3'UTR de un ARNm. De esta forma, un elemento 3'UTR preferentemente es una secuencia de ácido nucleico que corresponde a la 3'UTR de un ARNm, con preferencia a la 3'UTR de un ARNm artificial, tal como un ARNm obtenido por transcripción de una constructo vector diseñado por ingeniería genética. De preferencia, el elemento 3'UTR cumple con la función de una 3'UTR o codifica para una secuencia que cumple la función de una 3'UTR.
Preferentemente, el ARNm inventivo comprende un elemento 3'UTR que se puede derivar de un gen que se relaciona con un ARNm con una vida media mejorada (que proporciona un ARNm estable), por ejemplo un elemento 3'UTR como se define y describe más adelante.
En una realización particularmente preferente, el elemento 3'UTR comprende o consiste en una secuencia de ácido nucleico que se deriva de una 3'UTR de un gen seleccionado del grupo consistente en un gen de albúmina, un gen de a-globina, un gen de p-globina, un gen de tirosina-hidroxilasa, un gen de lipoxigenasa y un gen de colágeno alfa, tal como un gen de colágeno alfa 1 (I), o de una variante de una 3'UTR de un gen seleccionado del grupo consistente en un gen de albúmina, un gen a-globina, un gen p-globina, un gen de tirosina-hidroxilasa, un gen de lipoxigenasa y un gen de colágeno alfa, tal como un gen de colágeno alfa 1 (I) de acuerdo con las SEQ ID NO: 1369-1390 de la solicitud de patente W02013/143700. En una realización particularmente preferente, el elemento 3'UTR comprende o consiste en una secuencia de ácido nucleico que se deriva de una 3'UTR de un gen de albúmina, preferentemente de un gen de albúmina de vertebrado, con mayor preferencia de un gen de albúmina de mamífero, con total preferencia de un gen de albúmina humano de acuerdo con la SEQ ID NO: 24.
3'UTR albúmina humana SEC ID NO: 24:
CATCACATTT AAAAGCATCT CAGCCTACCA TGAGAATAAG AGAAAGAAAA TGAAGATCAA AAGCTTATTC ATCTGTTTTT CTTTTTCGTT GGTGTAAAGC CAACACCCTG TCTAAAAAAC ATAAATTTCT TTAATCATTT TGCCTCTTTT CTCTGTGCTT CAATTAATAA AAAATGGAAA GAATCT
(correspondiente a la SEQ ID NO: 1369 de la solicitud de patente WO2013/143700).
En este contexto, se prefiere particularmente que el ARNm inventivo comprenda un elemento 3'-UTR que comprende una secuencia de ARN correspondiente derivada de los ácidos nucleicos según las SEQ ID NO: 1369-1390 de la solicitud de patente WO2013/143700 o un fragmento, homólogo o variante de las mismas.
Con mayor preferencia, el elemento 3'-UTR comprende la secuencia de ácido nucleico derivada de un fragmento del gen de albúmina humana según la SEQ ID NO: 25:
3'UTR de albumina7
CATCACATTTAAAAGCATCTCAGCCTACCATGAGAATAAGAGAAAGAAAATGAAGATCAATAGCTTATT CATCTCTTTTTCTTTTTCGTTGGTGTAAAGCCAACACCCTGTCTAAAAAACATAAATTTCTTTAATCATT TTGCCTCTTTTCTCTGTGCTTCAATTAATAAAAAATGGAAAGAACCT (SEQ ID NO: 25 correspondiente a la SEQ ID NO: 1376 de la solicitud de patente WO2013/143700)
En este contexto, es particularmente preferente que el elemento 3'-UTR del ARNm inventivo comprenda o consista en una secuencia de ARN correspondiente con la secuencia de ácido nucleico según la SEQ ID NO: 25.
En otra realización particularmente preferente, el elemento 3'UTR comprende o consiste en una secuencia de ácido nucleico que se deriva de una 3'UTR de un gen de a-globina, preferentemente de un gen de a- o p-globina de vertebrado, con mayor preferencia de un gen de a- o p-globina de mamífero, con total preferencia de un gen de a- o p-globina humano, de acuerdo con las SEQ ID NO: 26-28:
3'-UTR de hemoglobina de Homo sapiens, alfa 1 (HBA1)
GCTGGAGCCTCGGTGGCCATGCTTCTTGCCCCTTGGGCCTCCCCCCAGCCCCTCCTCCCCTTCCTG CACCCGTACCCCCGTGGTCTTTGAATAAAGTCTGAGTGGGCGGC (SEQ ID NO:26 correspondiente a la SEQ ID NO: 1370 de la solicitud de patente WO2013/143700)
3'-UTR de hemoglobina de Homo sapiens, alfa 2 (HBA2)
GCTGGAGCCTCGGTAGCCGTTCCTCCTGCCCGCTGGGCCTCCCAACGGGCCCTCCTCCCCTCCTTG CACCGGCCCTTCCTGGTCTTTGAATAAAGTCTGAGTGGGCAG (SEQ ID NO: 27 correspondiente a la SEQ ID NO: 1371 de la solicitud de patente WO2013/143700)
3'-UTR de hemoglobina de Homo sapiens, beta (HBB)
GCTCGCTTTCTTGCTGTCCAATTTCTATTAAAGGTTCCTTTGTTCCCTAAGTCCAACTACTAAACTGGG GGATATTATGAAGGGCCTTGAGCATCTGGATTCTGCCTAATAAAAAACATTTATTTTCATTGC (SEQ ID NO: 28 correspondiente a la SEQ ID NO: 1372 de la solicitud de patente WO2013/143700)
Por ejemplo, el elemento 3'UTR puede comprender o consistir en la porción central de unión al complejo a de la 3'u Tr de un gen de a-globina, tal como un gen de a-globina humana, preferentemente según la SEQ ID NO: 29:
Porción central de unión al complejo a de la 3'UTR de un gen de a-globina (también denominado aquí “muag”)
GCCCGATGGGCCTCCCAACGGGCCCTCCTCCCCTCCTTGCACCG (SEQ ID NO: 29 correspondiente a la SEQ ID NO: 1393 de la solicitud de patente WO2013/143700).
En este contexto, es particularmente preferente que el elemento 3'-UTR del ARNm inventivo comprenda o consista en una secuencia de ARN correspondiente de la secuencia de ácido nucleico según la SEQ ID NO: 29 o un homólogo, fragmento o variante de la misma.
El término “una secuencia de ácido nucleico que se deriva de la 3'UTR de un gen [...]” preferentemente se refiere a una secuencia de ácido nucleico basada en la secuencia 3'UTR de un gen [...] o en una parte de la misma, tal como en la 3'UTR de un gen de albúmina, de a-globina, de p-globina, de tirosina-hidroxilasa, de lipoxigenasa o de colágeno alfa, tal como un gen de colágeno alfa 1 (I), preferentemente de un gen de albúmina o de una parte del mismo. Este término incluye secuencias que se corresponden con la secuencia 3'UTR completa, es decir, la secuencia 3'UTR de longitud total de un gen, y con secuencias correspondientes a un fragmento de la secuencia 3'UTR de un gen, tal como un gen de albúmina, de a -globina, de p-globina, de tirosina-hidroxilasa, de lipoxigenasa o de colágeno alfa, tal como un gen de colágeno alfa 1 (I), con preferencia de un gen de albúmina.
Preferentemente, el término “una secuencia de ácido nucleico que se deriva de una variante de la 3'UTR de un gen [...]” se refiere a una secuencia de ácido nucleico basada en una variante de la secuencia de 3'UTR de un gen, tal como una variante de la 3'UTR de un gen de albúmina, de a-globina, de p-globina, de tirosina-hidroxilasa, de lipoxigenasa o de colágeno alfa, tal como un gen de colágeno alfa 1 (I), o en una parte de los mismos como se describió anteriormente. Este término incluye secuencias correspondientes a la secuencia completa de la variante de la 3'UTR de un gen, es decir, la secuencia 3'UTR variante de longitud completa de un gen, y las secuencias correspondientes a un fragmento de la secuencia 3'UTR de la variante de un gen. Un fragmento en este contexto preferentemente consiste en un tramo continuo de nucleótidos correspondientes a un tramo continuo de nucleótidos de la variante 3'UTR de longitud completa que representa al menos el 20%, de preferencia al menos el 30%, con mayor preferencia al menos el 40%, con mayor preferencia al menos el 50%, incluso con mayor preferencia al menos el 60%, incluso con mayor preferencia al menos el 70%, incluso con mayor preferencia al menos el 80% y con total preferencia al menos el 90% de la variante 3'UTR de longitud completa. Este fragmento de una variante, en el sentido de la presente invención, preferentemente es un fragmento funcional de una variante como se describe aquí.
Preferentemente, el al menos un elemento 5'UTR y el al menos un elemento 3'UTR actúan sinérgicamente para aumentar la producción de proteínas a partir del ARNm como se describió anteriormente.
En una realización particularmente preferente, el ARNm inventivo tal como se define en las reivindicaciones adjuntas comprende una secuencia/estructura de tallo-bucle de histona. Estas secuencias tallo-bucle de histona preferentemente se seleccionan de las secuencias tallo-bucle de histona descritas en la WO 2012/019780.
Una secuencia tallo-bucle de histona adecuada para su uso en la presente invención preferentemente se selecciona de al menos una de las siguientes fórmulas (I) o (II):
fórm ula (I) (secuencia tallo-bucle sin elementos frontera de tallo):
[N0-2GN3-5] [No-4(U/T)No-4] [N3-5CN0-2] v---- v----- ' V----- ^ ---------Y" J
Tallo 1 Bucle 1^ Tallo 2
fórm ula (II) (secuencia tallo-bucle con elementos frontera del tallo):
N ,-6 [N0-2GN3-5] [No-4(U/T)N(m ] [N3-5CN0-2] N |-6 ^-----V----- V J K V " ------------Y ------------j ^ V^-Elemento Tallo1 Bucle Tallo2 Elemento frontera de frontera de Tallo1 Tallo2 donde:
elementos frontera del tallo1 o tallo2 N1-6: es una secuencia consecutiva de 1 a 6, preferiblemente de 2 a 6, más preferiblemente de 2 a 5, aún más preferiblemente de 3 a 5, más preferiblemente de 4 a 5 o de 5 N, donde cada N se selecciona independientemente de un nucleótido seleccionado de entre A, U, T, G y C, o un análogo de nucleótido del mismo;
tallo1 [N0-2GN3-5]: es complementaria inversa o complementaria parcialmente inversa con el elemento tallo2 y es una secuencia consecutiva de entre 5 a 7 nucleótidos; donde N0-2 es una secuencia consecutiva de 0 a 2, preferiblemente de 0 a 1, más preferiblemente de 1 N, donde cada N se selecciona independientemente de un nucleótido seleccionado de A, U, T, G y C o un análogo de nucleótido del mismo; donde N3-5 es una secuencia consecutiva de 3 a 5, preferiblemente de 4 a 5, más preferiblemente de 4 N, donde cada N se selecciona independientemente de un nucleótido seleccionado de A, U, T, G y C o un análogo de nucleótido del mismo, y donde G es guanosina o un análogo del mismo, y se puede reemplazar opcionalmente por una citidina o un análogo de la misma, siempre que su citidina de nucleótido complementario en tallo2 se reemplace por guanosina;
secuencia bucle [N0-4(U/T)N0-4]: se ubica entre los elementos tallo1 y tallo2 y es una secuencia consecutiva de 3 a 5 nucleótidos, más preferiblemente de 4 nucleótidos; donde cada N0-4 es independiente de otra secuencia consecutiva de 0 a 4, preferiblemente de 1 a 3, más preferiblemente de 1 a 2 N, donde cada N se selecciona de un nucleótido seleccionado de A, U, T, G y C o un análogo de nucleótido del mismo; donde U/T representa uridina, u opcionalmente timidina;
tallo2 [N3-5CN0-2]: es complementaria inversa o complementaria parcialmente inversa al elemento tallo1 y es una secuencia consecutiva de 5 a 7 nucleótidos; donde N3-5 es una secuencia consecutiva de 3 a 5, preferiblemente de 4 a 5, más preferiblemente de 4 N, donde cada N se selecciona independientemente de un nucleótido seleccionado de A, U, T, G y C o un análogo de nucleótido del mismo; siendo N0-2 una secuencia consecutiva de 0 a 2, preferiblemente de 0 a 1, más preferiblemente de 1 N, donde cada N se selecciona independientemente de un nucleótido seleccionado de A, U, T, G o C o un análogo de nucleótido del mismo; y donde C es citidina o un análogo de la misma, y se puede reemplazar opcionalmente por una guanosina o un análogo de la misma siempre que su guanosina de nucleósido complementario en tallo1 se reemplace por citidina;
donde tallo1 y tallo2 son capaces de apareamiento de bases entre sí formando una secuencia inversa complementaria, donde el apareamiento de bases puede ocurrir entre tallo1 y tallo2, por ejemplo por apareamiento de bases Watson-Crick de nucleótidos A y U/T o G y C o por apareamiento de bases no Watson-Crick, por ejemplo apareamiento de bases de tambaleo, apareamiento de bases Watson-Crick inverso, apareamiento de bases Hoogsteen, apareamiento de bases Hoogsteen inverso o son capaces de apareamiento de bases entre sí formando una secuencia complementaria parcialmente inversa, donde un apareamiento de bases incompleto puede ocurrir entre tallo1 y tallo2, en base a que una o más bases en un tallo no tienen una base complementaria en la secuencia complementaria inversa del otro tallo.
De acuerdo con una realización particularmente preferente adicional del primer aspecto de la invención, la secuencia de ARNm inventivo puede comprender al menos una secuencia tallo-bucle de histona de acuerdo con al menos una de las siguientes fórmulas específicas (Ia) o (IIa):
De acuerdo con una realización preferida adicional del primer de la presente descripción, la secuencia de ARNm puede comprender al menos una secuencia tallo-bucle de histona de acuerdo con al menos una de las siguientes fórmulas específicas (la) o ( IIa):
fórmula (la) (secuencia de tallo-bucle sin elementos frontera de tallo):
Figure imgf000029_0001
tallo 1 bucle tallo 2
fórmula (lia) (secuencia de tallo-bucle con elementos frontera de tallo):
Figure imgf000029_0002
Elemento frontera Tallo 1 T V Tallo 2 Elemento frontera de de tallo 1 bucle tallo 2
donde N, C, G, T y U son como se definen anteriormente.
De acuerdo con una realización adicional más particularmente preferida del primer aspecto, el al menos un ARN puede comprender al menos una secuencia tallo-bucle de histona de acuerdo con al menos una de las siguientes fórmulas específicas (lb) o (lIb):
fórmula (Ib) (secuencia tallo-bucle sin elementos frontera de tallo):
[N ,CN4 -] J [N2(U/T)N,] [N4CN,]
■~V ~Y--------
tallo 1 bucle tallo 2
fórmula (IIb) (secuencia tallo-bucle con elementos frontera de tallo):
N4,5 [N.GNJ [N ^u /D N J [N.CNJ n 4.s
------ Y " Y
Elemento frontera Tallo 1 Bucle Tallo 2 Elemento frontera de de tallo 1 tallo 2
donde N, C, G, T y U son como se definen anteriormente.
Una secuencia tallo-bucle de histona particularmente preferente es la secuencia según la SEQ ID NO: 30 CAAAGGCTCTTTTCAGAGCCACCA o, con mayor preferencia, la secuencia de ARN correspondiente a la secuencia de ácido nucleico según la SEQ ID NO: 30 (CAAAGGCUCUUUUCAGAGCCACCA SEQ ID NO: 37).
En una realización particularmente preferente del primer aspecto de la presente invención, el ARNm inventivo comprende además la región codificante como se define en las reivindicaciones adjuntas, una secuencia poli(A), también denominada cola poli(A), preferentemente en el terminal 3' del ARNm inventivo. Cuando está presente, esta secuencia poli(A) comprende una secuencia de entre aproximadamente 25 y aproximadamente 400 nucleótidos de adenosina, con preferencia una secuencia de aproximadamente 50 a aproximadamente 400 nucleótidos de adenosina, con mayor preferencia una secuencia de aproximadamente 50 a aproximadamente 300 nucleótidos de adenosina, incluso con mayor preferencia una secuencia de aproximadamente 50 a aproximadamente 250 nucleótidos de adenosina, con total preferencia una secuencia de aproximadamente 60 a aproximadamente 250 nucleótidos de adenosina. En este contexto, el término “aproximadamente” se refiere a una desviación de ± 10% de los valores a los que refiere. Esta secuencia poli(A) preferentemente se localiza 3' de la región codificante comprendida en el ARNm inventivo de acuerdo con el primer aspecto de la presente invención.
De acuerdo con una realización preferente adicional, el ARNm inventivo puede estar modificado con una secuencia de al menos 10 citosinas, preferentemente al menos 20 citosinas, con mayor preferencia al menos 30 citosinas (denominada “secuencia poli(C)”). En particular, el ARNm puede contener una secuencia poli(C) típica de aproximadamente 10 a 200 nucleótidos de citosina, de preferencia de aproximadamente 10 a 100 nucleótidos de citosina, con mayor preferencia de aproximadamente 10 a 70 nucleótidos de citosina o incluso con mayor preferencia de aproximadamente 20 a 50 o incluso de 20 a 30 nucleótidos de citosina. Esta secuencia poli(C) preferentemente se ubica 3' de la región codificante, con mayor preferencia 3' de una secuencia poli(A) opcional comprendida en el ARNm inventivo de acuerdo con el primer aspecto de la presente invención.
En este contexto, la secuencia de ARNm inventiva puede comprender, en una realización específica:
a) una estructura 5'-CAP, preferentemente m7GpppN;
b) una región codificante que codifica para al menos un mutante de la proteína de fusión F del virus respiratorio sincitial (RSV), donde los residuos aminoácido 554-574 de la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión F se han eliminado en el mutante de la proteína de fusión F, donde el contenido en G/C de la región codificante se ha aumentado sustituyendo al menos el 70% de los codones sustituibles en la región codificante en comparación con el contenido en G/C de la región codificante del ARNm de tipo salvaje y donde la secuencia de aminoácidos codificada de dicho ARNm enriquecido en GC no se ha modificado en comparación con la secuencia de aminoácidos codificada del ARNm de tipo salvaje;
c) una secuencia poli(A) que preferentemente comprende 64 adenosinas; y
d) opcionalmente, una secuencia poli(C), que preferentemente comprende 30 citosinas.
En una realización particularmente preferente del primer aspecto de la presente invención, el ARNm inventivo preferentemente comprende en la dirección 5'- a 3'-:
a) una estructura 5'-CAP, preferentemente m7GpppN;
b) una región codificante que codifica para al menos un mutante de la proteína de fusión F del virus respiratorio sincitial (RSV), donde los residuos aminoácido 554-574 de la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión F se han eliminado en el mutante de la proteína de fusión F, donde el contenido en G/C de la región codificante se ha aumentado sustituyendo al menos el 70% de los codones sustituibles en la región codificante en comparación con el contenido en G/C de la región codificante del ARNm de tipo salvaje y donde la secuencia de aminoácidos codificada de dicho ARNm enriquecido en GC no se ha modificado en comparación con la secuencia de aminoácidos codificada del ARNm de tipo salvaje;
c) una secuencia poli(A) que preferentemente comprende 64 adenosinas;
d) opcionalmente, una secuencia poli(C), que preferentemente comprende 30 citosinas; y e) un tallo-bucle de histona, preferentemente comprendiendo la secuencia de ARN correspondiente a la secuencia de ácido nucleico según la SEQ ID NO: 30.
En otra realización particularmente preferente del primer aspecto de la presente invención, el ARNm inventivo preferentemente comprende en la dirección 5'- a 3'-:
a) una estructura 5'-CAP, preferentemente m7GpppN;
b) una región codificante que codifica para al menos un mutante de la proteína de fusión F del virus respiratorio sincitial (RSV), donde los residuos aminoácido 554-574 de la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión F se han eliminado en el mutante de la proteína de fusión F, donde el contenido en G/C de la región codificante se ha aumentado sustituyendo al menos el 70% de los codones sustituibles en la región codificante en comparación con el contenido en G/C de la región codificante del ARNm de tipo salvaje y donde la secuencia de aminoácidos codificada de dicho ARNm enriquecido en GC no se ha modificado en comparación con la secuencia de aminoácidos codificada del ARNm de tipo salvaje;
c) opcionalmente un elemento 3'-UTR derivado de un gen de alfa-globina, preferentemente comprendiendo la secuencia de ARN correspondiente a la secuencia de ácido nucleico según la SEQ ID NO: 29, un homólogo, fragmento o variante de la misma;
d) una secuencia poli(A) que preferentemente comprende 64 adenosinas;
e) opcionalmente, una secuencia poli(C), que preferentemente comprende 30 citosinas; y f) un tallo-bucle de histona, preferentemente comprendiendo la secuencia de ARN correspondiente a la secuencia de ácido nucleico según la SEQ ID NO: 30.
En otra realización particularmente preferente, el ARNm inventivo preferentemente comprende en la dirección 5'- a 3'-:
a) una estructura 5'-CAP, preferentemente m7GpppN;
b) opcionalmente un elemento 5'-UTR derivado de un gen TOP, preferentemente derivado de la secuencia de ARN correspondiente a la secuencia de ácido nucleico según la SEQ ID NO: 23, un homólogo, fragmento o variante de la misma;
c) una región codificante que codifica para al menos un muíante de la proteína de fusión F del virus respiratorio sincitial (RSV), donde los residuos aminoácido 554-574 de la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión F se han eliminado en el mutante de la proteína de fusión F, donde el contenido en G/C de la región codificante se ha aumentado sustituyendo al menos el 70% de los codones sustituibles en la región codificante en comparación con el contenido en G/C de la región codificante del ARNm de tipo salvaje y donde la secuencia de aminoácidos codificada de dicho ARNm enriquecido en GC no se ha modificado en comparación con la secuencia de aminoácidos codificada del ARNm de tipo salvaje;
d) opcionalmente un elemento 3'UTR derivado de un gen que proporciona un ARNm estable, preferentemente derivado de la secuencia de ARN correspondiente a una secuencia de ácido nucleico según la SEQ ID NO: 25, un homólogo, fragmento o variante de la misma;
e) una secuencia poli(A) que preferentemente comprende 64 adenosinas;
f) opcionalmente, una secuencia poli(C), que preferentemente comprende 30 citosinas; y g) un tallo-bucle de histona, preferentemente comprendiendo la secuencia de ARN correspondiente a la secuencia de ácido nucleico según la SEQ ID NO: 30.
De acuerdo con la presente descripción, la región codificante podría codificar al menos parcialmente una de las secuencias de aminoácidos de acuerdo con las SEQ ID NO: 1-11 o fragmentos, variantes o derivados de las mismas. Además, la región codificante del ARNm puede codificar para una combinación de al menos dos de estas secuencias de aminoácidos o una combinación de fragmentos, variantes o derivados de las mismas. También se describe en este contexto una combinación de la proteína de fusión F con la nucleoproteína N y una combinación de la proteína de fusión F y la proteína M2-1.
Adicionalmente, la región codificante podría ser o podría comprender al menos una de las secuencias según la SEQ ID NO: 12 a la SEQ ID NO: 22, o fragmentos, homólogos o variantes de las mismas. Además, el ARNm podría comprender una combinación de al menos dos de estas secuencias o una combinación de fragmentos, homólogos o variantes de las mismas.
Para una mejora adicional de la resistencia a, por ejemplo, la degradación in vivo (por ejemplo por una exoo endo-nucleasa), el ARNm inventivo se puede proporcionar como un ácido nucleico estabilizado, por ejemplo en forma de un ácido nucleico modificado. De acuerdo con una realización adicional de la invención, es así preferente que el ARNm inventivo esté estabilizado, preferentemente mediante modificaciones de esqueleto, modificaciones de azúcar y/o modificaciones de bases, con mayor preferencia estabilizado por la modificación del contenido en G/C. Todas estas modificaciones se pueden introducir en el ARNm inventivo sin afectar a la función del ARNm a ser traducido en la función antigénica derivada del péptido o proteína del virus respiratorio sincitial (RSV).
Una modificación estructural en el contexto de la presente invención preferentemente es una modificación donde los fosfatos del esqueleto de nucleótidos contenido en el ARNm inventivo están químicamente modificados, por ejemplo el enlace intemudeosídico aniónico, modificaciones N3’^ P 5 ’, reemplazamiento de átomos de oxígeno no puenteados por boranos, enlaces internucleósidos neutros, enlace amida de los nucleósidos, enlaces metileno(metilimino), enlaces formacetal y tioformacetal, introducción de grupos sulfonilo o similares.
Una modificación de azucar en el contexto de la presente invención preferentemente es una modificación química del azúcar de los nucleótidos del ARNm inventivo, por ejemplo la metilación del residuo ribosa o similares.
Según la invención, el ARNm inventivo está modificado y así estabilizado por el aumento del contenido de G(guanosina)/C(citosina) de la región codificante del ARNm tal como se define en las reivindicaciones.
Aquí, el contenido de G/C de la región codificante del ARNm inventivo está en particular incrementado en comparación con el contenido de G/C de la región codificante de su secuencia codificante de tipo salvaje, es decir del ARNm no modificado. Sin embargo, la secuencia codificada de aminoácidos del ARNm inventivo no está modificada en comparación con la secuencia codificada de aminoácidos del ARNm tipo salvaje/no modificado particular.
La modificación del contenido G/C del ARNm inventivo se basa en el hecho de que las secuencias de ARN que tiene un contenido aumentado de G (guanosina)/C (citosina) son más estables que las secuencias de ARN que tienen un contenido aumentado de A (adenosina)/U (uracilo). Los codones de una secuencia codificante o de un ARN completo, por tanto podrían variar en comparación con la secuencia codificante o del ARNm de tipo salvaje de forma que incluyan una cantidad aumentada de nucleótidos de G/C, a la vez que se mantiene la secuencia de aminoácidos traducida. Con respecto al hecho de que diversos codones codifican para uno y el mismo aminoácido (la denominada degeneración del código genético), pueden determinarse los codones más favorables para la estabilidad (el denominado uso alternativo de codones). El contenido en G/C de la región codificante del ARNm inventivo según la invención se aumenta en al menos un 70%, preferentemente en al menos un 80%, y con particular en al menos un 90%, 95% o incluso 100% de los codones que se pueden sustituir en la región codificante para una proteína como se define en las reivindicaciones o están sustituidos en la secuencia completa de la región de codificación de la secuencia de ARNm tipo salvaje, aumentando así el contenido de G/C dicha la secuencia. En este contexto, es particularmente preferente aumentar el contenido en G/C del ARNm inventivo al máximo (es decir, el 100% de los codones sustituibles), en particular en la región codificante, en comparación con la secuencia de tipo salvaje.
De acuerdo con una realización preferente adicional de la invención, el ARNm inventivo se optimiza para la traducción, preferentemente se optimiza para la traducción reemplazando los codones para los ARNt menos frecuentes de un aminoácido determinado por codones para los ARNt que se presentan con mayor frecuencia del aminoácido respectivo. Esto se basa en el descubrimiento de que la eficacia de la traducción también está determinada por una frecuencia diferente en la presencia de los ARNt en las células. Así, si los denominados “codones menos frecuentes” están presentes en el ARNm inventivo en un grado aumentado, el ARN modificado correspondiente se traduce en un grado significativamente más deficiente que en caso de que estén presentes codones que codifican para los ARNt más frecuentes. Preferentemente, la región codificante del ARNm inventivo está modificada en comparación con la región codificante correspondiente de la secuencia de ARN de tipo salvaje de forma que al menos un codón de la secuencia de tipo salvaje que codifica para un ARNt que es relativamente raro o menos frecuente en la célula es intercambiado por un codón que codifica para un ARNt que es más o el más frecuente en la célula y porta el mismo aminoácido que el ARNt relativamente raro o menos frecuente. Mediante esta modificación, las secuencias del ARNm inventivo se pueden modificar de forma que se insertan codones para los cuales están disponibles los ARNt que se presentan con mayor frecuencia. En otras palabras, de acuerdo con la invención, mediante esta modificación todos los codones de la secuencia de tipo salvaje que codifican para un ARNt que es relativamente raro en la célula en cada caso se pueden intercambiar por un codón que codifica para un ARNt respectivo relativamente frecuente en la célula y que, en cada caso, porta el mismo aminoácido que el ARNt relativamente raro. Además, es particularmente preferente enlazar el contenido de G/C secuencial que se aumenta, en particular se maximiza, en el ARNm inventivo con los codones “frecuentes” sin modificar la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada por la región codificante del ARNm inventivo o de la región codificante. Esta realización preferente permite proporcionar un ARNm inventivo especialmente traducido y estabilizado eficiente (modificado).
Las sustituciones, adiciones o eliminaciones de las bases preferentemente se llevan a cabo utilizando una matriz de ADN para la preparación de la molécula de ácido nucleico por las técnicas bien conocidas de mutagénesis sitio-dirigida o por una unión de oligonucleótidos. En tales procesos, para la preparación del menos un ARN de la vacuna de la combinación inventiva como se define aquí, se puede transcribir in vitro una molécula de ADN correspondiente. Esta matriz de ADN preferentemente comprende un promotor adecuado, por ejemplo un promotor T7 o SP6, para la transcripción in vitro, que es seguida mediante la secuencia deseada de nucleótidos para el al menos un ARN a preparar y por una señal de terminación para la transcripción in vitro. La molécula de ADN que forma la matriz del al menos un ARN de interés puede prepararse mediante proliferación fermentativa y aislamiento posterior como parte de un plásmido que se pueda replicar en bacterias. Plásmidos que se pueden mencionar como adecuados para la presente invención son, por ejemplo, los plásmidos pT7T (número de acceso GenBank U26404; Lai et al., Development 1995, 121: 2349 a 2 3 6 0 ), pGEM® series, por ejemplo pGEM®-1 (número de acceso GenBank X65300; de Promega) y pSP64 (número de acceso GenBank X65327); véase también, Mezei and Storts, Purification of PCR Products, en: Griffin and Griffin (ed.), PCR Technology: Current Innovation, CRC Press, Boca Raton, FL, 2001.
En una realización particularmente preferente, la secuencia de ARNm inventivo de acuerdo con el primer aspecto de la presente invención preferentemente comprende en la dirección 5'- a 3'-:
a) una estructura 5'-CAP tal como se define aquí, preferentemente m7GpppN;
b) una región codificante que codifica para al menos un mutante de la proteína de fusión F del virus respiratorio sincitial (RSV), donde los residuos aminoácido 554-574 de la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión F se han eliminado en el mutante de la proteína de fusión F, donde el contenido en G/C de la región codificante se ha aumentado sustituyendo al menos el 70% de los codones sustituibles en la región codificante en comparación con el contenido en G/C de la región codificante del ARNm de tipo salvaje y donde la secuencia de aminoácidos codificada de dicho ARNm enriquecido en GC no se ha modificado en comparación con la secuencia de aminoácidos codificada del ARNm de tipo salvaje;
c) un elemento 3'-UTR como se define aquí, preferentemente derivado de un gen que proporciona un ARNm estable, en especial la secuencia de ARN correspondiente de la molécula de ácido nucleico según la SEQ ID NO: 29, o un homólogo, fragmento o variante de la misma;
d) una secuencia poli(A) que preferentemente comprende 64 adenosinas;
e) opcionalmente, una secuencia poli(C), que preferentemente comprende 30 citosinas; y f) al menos una secuencia tallo-bucle de histona, preferentemente la secuencia de ARN correspondiente a la secuencia de ácido nucleico según la SEQ ID NO: 30.
En una realización particularmente preferente adicional, la secuencia del ARNm inventivo de acuerdo con el primer aspecto de la presente invención preferentemente comprende en la dirección 5'- a 3'-:
a) una estructura 5'-CAP tal como se define aquí, preferentemente m7GpppN;
b) un elemento 5'-UTR como se define aquí, preferentemente un elemento 5'-UTR que comprende o consiste en una secuencia de ácido nucleico que se deriva de la 5'-UTR de un gen TOP, preferentemente de la 5'-UTR de la proteína ribosómica humana Large 32 sin el tracto oligopirimidina 5' terminal según la SEQ ID NO: 23 o la secuencia de ARN correspondiente; o un fragmento, homólogo o variante de la misma;
c) una región codificante que codifica para al menos un mutante de la proteína de fusión F del virus respiratorio sincitial (RSV), donde los residuos aminoácido 554-574 de la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión F se han eliminado en el mutante de la proteína de fusión F, donde el contenido en G/C de la región codificante se ha aumentado sustituyendo al menos el 70% de los codones sustituibles en la región codificante en comparación con el contenido en G/C de la región codificante del ARNm de tipo salvaje y donde la secuencia de aminoácidos codificada de dicho ARNm enriquecido en GC no se ha modificado en comparación con la secuencia de aminoácidos codificada del ARNm de tipo salvaje;
d) un elemento 3'-UTR, preferentemente el elemento 3'-UTR de albúmina humana de acuerdo con la SEQ ID NO: 24 o el ARN correspondiente, o un homólogo, fragmento o variante de los mismos; e) una secuencia poli(A), que preferentemente comprende 64 adenosinas;
f) opcionalmente, una secuencia poli(C), que preferentemente comprende 30 citosinas; y g) al menos una secuencia tallo-bucle de histona, preferentemente la secuencia de ARN correspondiente a la secuencia de ácido nucleico según la SEQ ID NO: 30.
En una realización especialmente preferente, la secuencia de ARNm inventiva comprende o consiste en las secuencias mostradas en la figura 3, de acuerdo con la SEQ ID NO: 33.
En realizaciones específicas adicionales, el ARNm de acuerdo con la invención puede comprender además una secuencia de sitio de entrada ribosómico interno (IRES) o un motivo IRES, que puede separar diversos marcos de lectura abiertos, por ejemplo si el ARNm inventivo codifica para dos o más péptidos o proteínas antigénicos. Una secuencia IRES puede ser particularmente útil cuando el ARNm es un ARNm bi- o multicistrónico.
Adicionalmente, el ARNm inventivo se puede preparar utilizando cualquier método conocido en la técnica, incluyendo métodos sintéticos, tales como síntesis en fase sólida, así como métodos in vitro, como reacciones de transcripción in vitro.
De acuerdo con una realización de la presente invención, el ARNm que comprende una región codificante como se define en las reivindicaciones se puede administrar desnudo, sin asociarse a ningún vehículo adicional, agente de transfección o complejación, para aumentar la eficiencia de transfección y/o las propiedades inmunoestimuladoras del ARNm inventivo o del ácido nucleico comprendido adicional.
En una realización preferente, el ARNm inventivo se puede formular junto con un compuesto catiónico o policatiónico y/o con un vehículo polimérico. Por consiguiente, en una realización adicional de la invención, es preferente que el ARNm inventivo o cualquier otro ácido nucleico comprendido en la composición farmacéutica o en la vacuna aquí descritas esté asociado o complejado con un compuesto catiónico o policatiónico o con un vehículo polimérico, opcionalmente en una proporción en peso seleccionada de un rango de aproximadamente 6:1 (p/p) a aproximadamente 0,25:1 (p/p), con mayor preferencia de aproximadamente 5:1 (p/p) a aproximadamente 0,5:1 (p/p), incluso con mayor preferencia de aproximadamente 4:1 (p/p) a aproximadamente 1:1 (p/p) o de aproximadamente 3:1 (p/p) a aproximadamente 1:1 (p/p), y con total preferencia en una proporción de aproximadamente 3:1 (p/p) a aproximadamente 2:1 (p/p) ARNm o ácido nucleico: compuesto catiónico o policatiónico y/o con un vehículo polimérico; u opcionalmente en una proporción nitrógeno/fosfato del ARNm o del ácido nucleico:compuesto catiónico o policatiónico y/o vehículo polimérico en el rango de aproximadamente 0,1-10, de preferencia en el rango de aproximadamente 0,3-4 o 0,3-1 y con total preferencia en un rango de aproximadamente 0,5-1 o 0,7-1, e incluso con mayor preferencia en el rango de aproximadamente 0,3-0,9 o 0,5-0,9.
Así, el ARNm inventivo o cualquier otro ácido nucleico comprendido en la composición farmacéutica o en la vacuna aquí descritas también puede estar asociado con un vehículo, con un agente de transfección o con un agente de complejación para aumentar la eficiencia de transfección y/o las propiedades inmunoestimuladoras del ARNm inventivo y de los ácidos nucleicos adicionales opcionales incluidos.
Compuestos catiónicos o policatiónicos que son agentes particularmente preferidos en este contexto incluyen protamina, nucleolina, espermina o espermidina u otros péptidos o proteínas catiónicos, como poli-L-lisina (PLL), poliarginina, polipéptidos básicos, péptidos penetrantes celulares (CPP), incluyendo péptidos que se unen a VIH, Tat-VIH (VIH), péptidos derivados de Tat, penetratina, péptidos derivados de VP22 o análogos, HSV VP22 (Herpes simplex), MAP, KALA o dominios de transducción de proteínas (PTD), PpT620, péptidos ricos en prolina, péptidos ricos en arginina, péptidos ricos en lisina, péptido(s) MPG, Pep-1, oligómeros L, péptido(s) de calcitonina, péptidos derivados de Antennapedia (particularmente de Drosophila antennapedia), pAntp, plsl , FGF, lactoferrina, transportano, Buforina-2, Bac715-24, SynB, SynB(1), pVEC, péptidos derivados de hCT, SAP o histonas.
En este contexto, se prefiere particularmente la protamina.
Además, las proteínas o péptidos catiónicos o policatiónicos preferentes pueden seleccionarse de las siguientes proteínas o péptidos de la siguiente fórmula total (III):
(Arg)i ;(Lys)m ;(His)n ;(Orn)o ;(Xaa)x , (formula (III))
donde l m n o x = 8-15, y l, m, n u o, independientemente, puede ser cualquier número seleccionado de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15, siempre que el contenido global de Arg, Lys, His y Orn representa al menos 50% de todos los aminoácidos del oligopéptido; y Xaa puede ser cualquier aminoácido seleccionado de aminoácidos nativos (= que se presentan naturalmente) o no nativos excepto Arg, Lys, His u Orn; y x puede ser cualquier número seleccionado de 0, 1,2, 3 o 4, siempre que el contenido total de Xaa no exceda el 50% de todos los aminoácidos del oligopéptido. Son particularmente preferentes en este contexto por ejemplo los péptidos catiónicos Arg7, Args, Arg9, H3R9 , R9H3 , H3R9H3 , YSSR9SSY, (RKH)4, Y(RKH)2R, etc. A este respecto, se incorpora aquí por referencia la descripción de la WO2009/030481.
Además, compuestos catiónicos o policatiónicos preferentes que pueden usarse como agentes de transfección o complejación pueden incluir polisacáridos catiónicos, por ejemplo quitosano, polibreno, polímeros catiónicos, por ejemplo polietilenimina (PEI), lípidos catiónicos, por ejemplo DOTMA: cloruro de [1-(2,3-sioleiloxi)propil)]-N,N,N-trimetilamonio, DMRIE, di-C14-amidina, DOTIM, SAINT, DC-Chol, BGTC, CTAP, DOPC, DODAP, DOPE: Dioleil fosfatidiletanol amina, DOSPA, DODAB, DOIC, DMEPC, DOGS: Dioctadecilamidoglicilespermina, DIMRI: bromuro de dimiristo-oxipropil-dimetilhidroxietil-amonio, DOTAP: dioleoiloxi-3-(trimetilamonio)-propano, DC-6-14: cloruro de O,O-ditetradecanoil-N-(a-trimetilamonioacetil)-dietanolamina, CLIP1: cloruro de rac-[(2,3-dioctadeciloxipropil)(2-hidroxietil)]-dimetilamonio, CLIP6: rac-[2(2,3-dihexadeciloxipropil-oximetiloxi)etil]-trimetilamonio, CLIP9: rac-[2(2,3-dihexadeciloxipropiloxisucciniloxi)etil]-trimetilamonio, oligofectamina, o polímeros catiónicos o policatiónicos, por ejemplo poliaminoácidos modificados, como p-aminoácido-polímeros o poliamidas invertidas, etc., polietilenos modificados, tal como PVP (poli(bromuro de N-etil-4-vinilpiridinio)), etc., acrilatos modificados, como pDMAEMA (poli(dimetilaminoetil metilacrilato)), etc., amidoaminas modificadas tal como pAMAM (poli(amidoamina)), etc., polibetaaminoéster modificado (PBAE), tal como diamina y polímeros 1,4-butanodiol-diacrilato-co-5-amino-1-pentanol modificados, etc., dendrímeros, como dendrímeros de polipropilamina o dendrímeros basados en pAMAM, etc., poliimina(s), tal como PEI: poli(etilenimina), poli(propilenimina), etc., polialilamina, polímeros basados en estructura de azúcar, tal como polímeros basados en ciclodextrina, polímeros basados en dextrano, quitosano, etc., polímeros basados en estructuras silano, tal como copolímeros PMOXA-PDMS, etc., polímeros en bloque que consisten en una combinación de uno o más bloques catiónicos (por ejemplo seleccionados de un polímero catiónico como se mencionó arriba) y de uno o más bloques hidrofílicos o hidrofóbicos (por ejemplo polietilenglicol); etc.
Un portador polimérico utilizado de acuerdo con la invención podría ser un portador polimérico formado mediante componentes catiónicos reticulados con disulfuro. Los componentes catiónicos reticulados con disulfuro pueden ser iguales o diferentes entre sí. El portador polimérico también puede contener componentes adicionales. También se prefiere particularmente que el portador polimérico utilizado de acuerdo con la presente invención comprenda mezclas de péptidos, proteínas o polímeros catiónicos y opcionalmente componentes adicionales como se define aquí, que se reticulan por enlaces disulfuro como se describe aquí. En este contexto, se hace referencia a la descripción de la WO 2012/013326.
En este contexto, los componentes catiónicos que forman la base para el portador polimérico por reticulación con disulfuro se seleccionan típicamente de cualquier péptido, proteína o polímero catiónico o policatiónico adecuado para este fin, en particular cualquier péptido, proteína o polímero catiónico o policatiónico, capaz de complejar un ARNm o un ácido nucleico como se define aquí, y, por ello, preferentemente condensar el ARNm o el ácido nucleico. El péptido, proteína o polímero catiónico o policatiónico preferentemente es una molécula lineal, sin embargo, también se pueden utilizar péptidos, proteínas o polímeros catiónicos o policatiónicos ramificados.
Cada proteína, péptido o polímero catiónico o policatiónico reticulado con disulfuro del portador polimérico que puede ser utilizado para complejar el ARNm inventivo o cualquier ácido nucleico adicional comprendido en la composición farmacéutica inventiva o en la vacuna aquí descrita contiene al menos un porción -SH, con mayor preferencia al menos un residuo cisteína o cualquier grupo químico adicional que presente una porción -SH capaz de formar un enlace disulfuro con la condensación con al menos una proteína péptido o polímero catiónico o policatiónico como un componente catiónico del portador polimérico como se menciona aquí.
Como se definió anteriormente, el portador polimérico que se puede utilizar para complejar el ARNm inventivo o cualquier ácido nucleico adicional comprendido en la composición farmacéutica inventiva o en la vacuna aquí descrita puede estar formado por componentes catiónicos (o policatiónicos) reticulados con disulfuro.
Preferentemente, estos péptidos o proteínas o polímeros catiónicos o policatiónicos del portador polimérico que comprenden o están modificados adicionalmente para comprender al menos una porción -SH se seleccionan de proteínas, péptidos y polímeros como se han definido anteriormente para los agentes de complejación.
En una realización particular adicional, el portador polimérico que se puede utilizar para complejar el ARNm inventivo o cualquier ácido nucleico adicional comprendido en la composición farmacéutica de la invención o en la vacuna aquí descrita se puede seleccionar de una molécula portadora polimérica de acuerdo con la fórmula genérica (IV):
L-P1 -S-[S-P2-S]n-S-P3-L fórmula (IV)
donde
P1 y P3 son diferentes o idénticos y representan una cadena de polímero hidrofílico lineal o ramificada, cada P1 y P3 tiene al menos una porción -SH- capaz de formar un enlace disulfuro sobre la condensación con el componente P2, o alternativamente con (AA), (AA)x, o [(AA)x]z si tales componentes se usan como enlazante entre P1 y P2 o P3 y P2 y/o con componentes adicionales (por ejemplo (AA), (AA)x, [(AA)x]z o L), la cadena de polímero hidrofílico lineal o ramificada se seleccionada independientemente de polietilenglicol (PEG), poli-W-(2-hidroxipropil)metacrilamida, poli-2-(metacriloiloxi)etil-fosforilcolinas, poli(hidroxialquil-L-asparagina), poli(2-(metacriloiloxi)etil-fosforilcolina), hidroxietil-almidón o poli(hidroxialquil-L-glutamina), donde la cadena de polímero hidrofílico tiene un peso molecular de alrededor de 1 kDa a alrededor de 100 kDa, preferiblemente de alrededor de 2 kDa a alrededor de 25 kDa; o más preferiblemente de alrededor de 2 kDa a alrededor de 10 kDa, por ejemplo alrededor de 5 kDa a alrededor de 25 kDa o 5 kDa a alrededor de 10 kDa;
P2 es una proteína o péptido catiónico o policatiónico, por ejemplo como se definió arriba para el portador polimérico formado por componentes catiónicos disulfuro-reticulados, y preferiblemente de una longitud de alrededor de 3 a alrededor de 100 aminoácidos, más preferiblemente una longitud de alrededor de 3 a alrededor de 50 aminoácidos, aún más preferiblemente de una longitud de alrededor de 3 a alrededor de 25 aminoácidos, por ejemplo una longitud de alrededor de 3 a 10, 5 a 15, 10 a 20 o 15 a 25 aminoácidos, más preferiblemente una longitud de alrededor de 5 a alrededor de 20 y aún más preferiblemente una longitud de alrededor de 10 a alrededor de 20; o es un polímero catiónico o policatiónico, por ejemplo como se definió arriba para el portador polimérico formado por componentes catiónicos disulfuro-reticulados, típicamente con un peso molecular de alrededor de 0,5 kDa a alrededor de 30 kDa, incluyendo un peso molecular de alrededor de 1 kDa a alrededor de 20 kDa, aún más preferiblemente de alrededor de 1,5 kDa a alrededor de 10 kDa, o con un peso molecular de alrededor de 0,5 kDa a alrededor de 100 kDa, incluyendo un peso molecular de alrededor de 10 kDa a alrededor de 50 kDa, aún más preferiblemente de alrededor de 10 kDa a alrededor de 30 kDa; teniendo cada P2 al menos dos porciones -SH, capaces de formar un enlace disulfuro sobre la condensación con componentes adicionales P2 o componente(s) P1 y/o P3 o alternativamente con componentes adicionales (por ejemplo (AA), (AA)x, o [(AA)x]z);
-S-S- es un enlace disulfuro (reversible) (los corchetes se omiten para una mejor legibilidad), donde S preferiblemente representa azufre o una porción que lleva -SH, que forma un enlace disulfuro (reversible). El enlace disulfuro (reversible) se forma preferiblemente por condensación de porciones -SH- de cualquiera de los componentes P1 y P2, P2 y P2, o P2 y P3, u opcionalmente de componentes adicionales como se definen aquí (por ejemplo L, (AA), (AA)x, [(AA)x]z, etc.); La porción -SH- puede ser parte de la estructura de estos componentes o agregarse por una modificación como se define abajo;
L es un ligando opcional, que puede estar o no presente, y se puede seleccionar independientemente de RGD, transferrina, folato, un péptido señal o secuencia señal, una secuencia o señal de localización, una secuencia o señal de localización nuclear (NLS), un anticuerpo, un péptido de penetración celular, (por ejemplo TAT o KALA), un ligando de un receptor (por ejemplo citoquinas, hormonas, factores de crecimiento etc.), moléculas pequeñas (por ejemplo carbohidratos como manosa o galactosa o ligandos sintéticos), agonistas de molécula pequeña, inhibidores o antagonistas de receptores (por ejemplo análogos peptidomiméticos RGD), o cualquier proteína adicional como se define aquí, etc.;
n es un entero, típicamente seleccionado de un intervalo de alrededor de 1 a 50, preferiblemente de un intervalo de alrededor de 1,2 o 3 a 30, más preferiblemente de un intervalo de alrededor de 1, 2, 3, 4 o 5 a 25, o un intervalo de alrededor de 1, 2, 3, 4 o 5 a 20, o un intervalo de alrededor de 1, 2, 3, 4 o 5 a 15, o un intervalo de alrededor de 1, 2, 3, 4 o 5 a 10, incluyendo por ejemplo un intervalo de alrededor de 4 a 9, 4 a 10, 3 a 20, 4 a 20, 5 a 20 o 10 a 20, o un intervalo de alrededor de 3 a 15, 4 a 15, 5 a 15 o 10 a 15, o un intervalo de alrededor de 6 a 11 o 7 a 10. Más preferiblemente, n está en el intervalo de alrededor de 1, 2, 3, 4 o 5 a 10, más preferiblemente en el intervalo de alrededor de 1, 2, 3 o 4 a 9, en el intervalo de alrededor de 1,2, 3 o 4 a 8, o en el intervalo de alrededor de 1, 2 o 3 a 7.
En este contexto, se hace referencia a la descripción de la WO 2011/026641. Cada uno de los polímeros hidrofílicos P1 y P3 típicamente tienen al menos una porción -SH-, donde la al menos una porción -SH- es capaz de formar un enlace disulfuro por reacción con el componente P2 o con componente el (AA) o (AA)x, si se usa como enlazante entre P1 y P2 o P3 y P2 como se define abajo y opcionalmente con un componente adicional, por ejemplo L y/o (AA) o (AA)x, por ejemplo si existen dos o más porciones -SH-. Las siguientes subfórmulas “P1-S-S-P2” y “P2-S-S-P3” dentro de la fórmula genérica (V) anterior (los corchetes se omiten para una mejor legibilidad), donde cualquiera de S, P1 y P3 son como se definen aquí, típicamente representan una situación donde una porción -SH- de los polímeros hidrofílicos P1 y P3 se condensa con una porción -SH- del componente P2 de la fórmula genérica (V) anterior, formando ambos azufres de estas porciones -SH- un enlace disulfuro -S-S- como se define aquí en la fórmula (V). Estas porciones -SH- son proporcionadas típicamente por cada uno de los polímeros hidrofílicos P1 y P3, por ejemplo mediante una cisteína interna o cualquier aminoácido adicional (modificado) o compuesto que tenga una porción -SH. En consecuencia, las subfórmulas “P1-S-S-P2” y “P2-S-S-P3” también pueden ser escritas como “P1-Cys-Cys-P2” y “P2-Cys-Cys-P3”, si la porción -SH- se proporciona por una cisteína, en donde el término Cys-Cys representa dos cisteínas acopladas por un enlace disulfuro, no por un enlace peptídico. En este caso, el término “-S-S-“ en estas fórmulas también puede escribirse como “-S-Cys”, como “-Cys-S” o como “-Cys-Cys-”. En este contexto, el término “-Cys-Cys-” no representa un enlace peptídico sino un enlace de dos cisteínas por sus porciones -SH- para formar un enlace disulfuro. En consecuencia, el término “-Cys-Cys-” también se puede entender generalmente como “-(Cys-S)-(S-Cys)-”, donde en este caso específico S indica el azufre de la porción -SH- de la cisteína. Igualmente, los términos “-S-Cys” y “-Cys-S” indican un enlace disulfuro entre una porción que contiene -SH y una cisteína, que también puede escribirse como “-S-(S-Cys)” y “-(Cys-S)-S”. Alternativamente, los polímeros hidrofílicos P1 y P3 se pueden modificar con una porción -SH, preferiblemente por una reacción química con un compuesto que lleva una porción -SH, de manera que cada uno de los polímeros hidrofílicos P1 y P3 lleva al menos una de tales porciones -SH. Tal compuesto que lleva una porción -SH puede ser por ejemplo una cisteína (adicional) o cualquier aminoácido adicional (modificado) que tenga una porción -S h . Tal compuesto también puede ser cualquier porción o compuesto no amino que contiene o permite introducir una porción -SH en los polímeros hidrofílicos P1 y P3 como se definen aquí. Tales compuestos no amino se pueden enlazar a los polímeros hidrofílicos P1 y P3 de fórmula (VI) del portador polimérico de acuerdo con la presente invención por reacciones químicas o enlace de compuestos, por ejemplo por enlace de un ácido 3-tiopropiónico o tioimolano, por formación de amida (por ejemplo ácidos carboxílicos, ácidos sulfúricos, aminas, etc.), por adición Michael (por ejemplo porciones de maleinimida, carbonilos a,p-insaturados, etc.), por química clic (por ejemplo azidas o alquinos), por metátesis de alqueno/alquino (por ejemplo alquenos o alquinos), formación de imina o hidrozona (aldehídos o cetonas, hidrazinas, hidroxilaminas, aminas), reacciones de formación de complejo (avidina, biotina, proteína G) o componentes que permiten reacciones de substitución tipo Sn (por ejemplo haloalcanos, tioles, alcoholes, aminas, hidrazinas, hidrazidas, ésteres de ácido sulfónico, sales de oxifosfonio) u otras porciones químicas que se pueden utilizar en el enlace de componentes adicionales. Un derivado PEG particularmente preferido en este contexto es alfa-metoxi-omega-mercaptopoli(etilenglicol). En cada caso, la porción SH, por ejemplo de una cisteína o de cualquier aminoácido adicional (modificado) o compuesto, puede estar presente en los extremos terminales o internamente en cualquier posición de los polímeros hidrofílicos P1 y P3. Como se define aquí, cada uno de los polímeros hidrofílicos P1 y P3 típicamente tiene al menos una porción -SH- preferiblemente en un extremo terminal, pero también pueden contener dos o aún más porciones -SH-, que se pueden usar para enlazar adicionalmente componentes adicionales como se definen aquí, preferiblemente péptidos o proteínas funcionales adicionales, por ejemplo un ligando, un componente aminoácido (AA) o (AA)x, anticuerpos, péptidos penetradores de la célula o péptidos potenciadores (por ejemplo TAT, KALA), etc.
En este contexto, se prefiere particularmente que el ARNm inventivo esté complejado al menos parcialmente con un compuesto catiónico o policatiónico y/o con un vehículo polimérico, preferiblemente proteínas o péptidos catiónicos. En este contexto, se hace referencia a la descripción de las WO 2010/037539 y WO 2012/113513. Parcialmente significa que solo una parte del ARN está complejada con un compuesto catiónico y que el resto del ARN está (comprendido en la composición) en forma no compleja ("libre"). Preferiblemente, la relación ARN complejado:ARN libre (en la composición) se selecciona de un intervalo de aproximadamente 5:1 (p/p) a aproximadamente 1:10 (p/p), más preferiblemente de un intervalo de aproximadamente 4:1 (p/p) a aproximadamente 1:8 (p/p), incluso más preferiblemente de un rango de aproximadamente 3:1 (p/p) a aproximadamente 1:5 (p/p) o 1:3 (p/p), y con total preferencia, la relación ARN complejado:ARN libre en la composición se selecciona de una relación de aproximadamente 1:1 (p/p).
El ARNm complejado en la composición farmacéutica inventiva o en la vacuna aquí descrita preferentemente se prepara de acuerdo con un primer paso de complejar el ARNm inventivo con un compuesto catiónico o policatiónico y/o con un portador polimérico, preferentemente como se define aquí, en una proporción específica, para formar un complejo estable. En este contexto, es especialmente preferente que ni el compuesto catiónico o policatiónico libre o el portador polimérico ni sólo una pequeña cantidad insignificante del mismo permanezca en el componente del ARNm complejado después de la complejación del ARNm. Por consiguiente, la proporción entre el ARNm y el compuesto catiónico o policatiónico y/o el portador polimérico en el componente ARNm complejado típicamente se selecciona en un rango tal que el ARNm esté completamente complejado y sin ningún compuesto catiónico o policatiónico libre o portador polimérico, sin que ni siquiera una cantidad insignificantemente pequeña del mismo permanezca en la composición.
De preferencia, la proporción entre el ARNm y el compuesto catiónico o policatiónico y/o el portador polimérico, de preferencia como se define aquí, se selecciona de un rango de aproximadamente 6:1 (p/p) a aproximadamente 0,25:1 (p/p), preferentemente de aproximadamente 5:1 (p/p) a aproximadamente 0,5:1 (p/p), con mayor preferencia de aproximadamente 4:1 (p/p) a aproximadamente 1:1 (p/p) o de aproximadamente 3:1 (p/p) a aproximadamente 1:1 (p/p), y con total preferencia en un rango de aproximadamente 3:1 (p/p) a aproximadamente 2:1 (p/p). Alternativamente, la proporción entre el ARNm y el compuesto catiónico o policatiónico y/o el portador polimérico, de preferencia como se define aquí, en el componente del ARNm complejado también se puede calcular en base a la proporción nitrógeno/fosfato (proporción N/P) del complejo completo. En el contexto de la presente invención, una proporción N/P preferente está en el intervalo de aproximadamente 0,1-10, de preferencia en de aproximadamente 0,3-4 y con total preferencia de aproximadamente 0,5-2 o 0,7-2 con respecto a la proporción ARNm:compuesto catiónico o policatiónico y/o portador polimérico, preferentemente como se define aquí, en el complejo, y con mayor preferencia en un intervalo de aproximadamente 0,7-1,5, 0,5-1 o 0,7-1, e incluso con la máxima preferencia de aproximadamente 0,3-0,9 o 0,5-0,9, preferentemente con la condición de que el compuesto catiónico o policatiónico en el complejo sea una proteína o péptido catiónico o policatiónico y/o el portador polimérico como se definió anteriormente. En esta realización específica, el ARNm complejado también está incluido en el término “componente adyuvante”.
En otro aspecto, la invención proporciona una composición que comprende una pluralidad o más de una, de preferencia de 2 a 10, con mayor preferencia de 2 a 5, con total preferencia de 2 a 4 de las secuencias de ARNm como se definen aquí. Estas composiciones inventivas comprenden más de una secuencia de ARNm que preferentemente codifican para diferentes péptidos o proteínas que comprenden preferentemente diferentes antígenos patógenos o fragmentos, variantes o derivados de los mismos. De éstos, al menos una secuencia de ARNm comprende una región codificante que codifica para un mutante de la proteína de fusión F del virus respiratorio sincitial (RSV), donde los residuos aminoácido 554-574 de la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión F se han eliminado en el mutante de la proteína de fusión F, donde el contenido en G/C de la región codificante se ha aumentado sustituyendo al menos el 70% de los codones sustituibles en la región codificante en comparación con el contenido en G/C de la región codificante del ARNm de tipo salvaje y donde la secuencia de aminoácidos codificada de dicho ARNm enriquecido en GC no se ha modificado en comparación con la secuencia de aminoácidos codificada del ARNm de tipo salvaje y al menos una secuencia de ARNm codifica para al menos un péptido o proteína antigénico derivado de otro antígeno del virus respiratorio sincitial (RSV), en particular de la nucleoproteína N o la proteína M2-1.
Combinaciones de antígenos descritas en este contexto son:
• F G (serotipo A) G (serotipo B)
• F G (serotipo A) G (serotipo B) M2-1
• F G (serotipo A) G (serotipo B) N
• F G (serotipo A) G (serotipo B) N M2-1
• F M2-1 N
• F M2-1
• F N
• F G (serotipo A) G (serotipo B) N M2-1 P M2-2 M L
• F G (serotipo A) G (serotipo B) N M2-1 P M2-2 M
• F G (serotipo A) G (serotipo B) N M2-1 P M2-2 L
• F G (serotipo A) G (serotipo B) N M2-1 P M L
• F G (serotipo A) G (serotipo B) N M2-1 M2-2 M L
• F G (serotipo A) G (serotipo B) N P M2-2 M L
• F G (serotipo A) G (serotipo B) M2-1 P M2-2 M L
Por consiguiente, en un aspecto adicional particularmente preferente, la presente invención también proporciona una composición farmacéutica como se define en las reivindicaciones adjuntas, que comprende al menos una secuencia de ARNm inventiva como se define aquí o una composición inventiva que comprende una pluralidad de secuencias de ARNm inventivo como se definen aquí y opcionalmente un portador y/o vehículo farmacéuticamente aceptable.
Como un primer ingrediente, la composición farmacéutica inventiva comprende al menos una secuencia de ARNm inventivo como se define aquí.
Como un segundo ingrediente, la composición farmacéutica inventiva opcionalmente puede comprender al menos un componente farmacéuticamente activo adicional. Un componente farmacéuticamente activo a este respecto es un compuesto con un efecto terapéutico para curar, mejorar o evitar una indicación o enfermedad particular como se menciona aquí, preferentemente infecciones por RSV. Estos compuestos incluyen, sin implicar ninguna limitación, péptidos o proteínas, preferentemente como se definen aquí, ácidos nucleicos, preferentemente como se definen aquí, compuestos orgánicos o inorgánicos de bajo peso molecular (terapéuticamente activos) (peso molecular inferior a 5000, de preferencia inferior a 1.000), azúcares, antígenos o anticuerpos, preferentemente como se definen aquí, agentes terapéuticos ya conocidos en la técnica anterior, células antigénicas, fragmentos celulares antigénicos, fracciones celulares, componentes de la pared celular (por ejemplo polisacáridos), patógenos (virus, bacterias, etc.) modificados, atenuados o desactivados (por ejemplo químicamente o por irradiación), adyuvantes, preferentemente como se definen aquí, etc. En este contexto se prefieren en particular las vacunas contra el RSV o inmunoglobulinas del RSV, por ejemplo Palivizumab (Synagis®).
La composición farmacéutica se puede administrar vía oral, parenteral, por aerosol de inhalación, vía tópica, rectal, nasal, bucal, vaginal o vía un depósito implantado. El término parenteral como se utiliza aquí incluye la inyección subcutánea, intravenosa, intramuscular, intra-articular, intra-sinovial, intraesternal, intratecal, intrahepática, intralesional, intracraneal, transdérmica, intradérmica, intrapulmonar, intraperitoneal, intracardiaca, intra-arterial y sublingual o técnicas de infusión.
En particular se prefiere la inyección intradérmica e intramuscular. Las formas inyectables estériles de las composiciones farmacéuticas inventivas pueden ser suspensiones acuosa u oleosas. Estas suspensiones se pueden formular de acuerdo con técnicas bien conocidas en la técnica, utilizando agentes dispersantes o humectantes y agentes de suspensión adecuados.
En una realización preferente, la composición farmacéutica inventiva se administra vía inyección intradérmica o intramuscular, preferentemente empleando técnicas de inyección basadas en agujas convencionales o sistemas sin agujas, por ejemplo inyección por chorro. En una realización preferente adicional, la composición farmacéutica inventiva se puede administrar mediante inyección por chorro como se define aquí. De preferencia, la composición farmacéutica inventiva se puede administrar vía intramuscular mediante inyección por chorro. De acuerdo con otra realización, la composición farmacéutica se administra vía intradérmica por inyección por chorro.
En una realización preferente, la composición farmacéutica se puede administrar una, dos o tres veces, preferentemente por inyección intradérmica o intramuscular, en especial inyección por chorro. De acuerdo con una determinada realización, una única administración de la composición farmacéutica inventiva, preferentemente por inyección intradérmica o intramuscular, en especial empleando inyección por chorro, es suficiente para producir una respuesta inmune frente al al menos un antígeno codificado por la secuencia de ARNm de acuerdo con la invención. En una realización preferente, la administración única de la composición farmacéutica produce una respuesta inmune que resulta en la neutralización del virus. En este contexto, una inyección intradérmica o intramuscular única de la composición farmacéutica es particularmente preferente. De preferencia, opcionalmente se pueden realizar administraciones adicionales de la composición farmacéutica para mejorar y/o prolongar la respuesta inmunitaria.
De acuerdo con una realización específica, la composición farmacéutica inventiva puede comprender un adyuvante. En este contexto, se debe entender un adyuvante como cualquier compuesto adecuado para iniciar o aumentar una respuesta inmune del sistema inmunitario innato, es decir, una respuesta inmune no específica. En otras palabras, cuando se administra, la composición farmacéutica inventiva preferentemente produce una respuesta inmunitaria innata debido al adyuvante opcionalmente contenido en la misma. Preferentemente, este adyuvante se puede seleccionar de un adyuvante conocido por un experto y adecuado para este caso, es decir, que de soporte a la inducción de una respuesta inmunitaria innata en un mamífero, por ejemplo una proteína adyuvante como se definió anteriormente o un adyuvante como se define a continuación.
Adyuvantes particularmente preferentes adecuados para el depósito y el suministro son compuestos catiónicos o policatiónicos como se han definido anteriormente para la secuencia de ARNm inventivo como vehículo, agente de transfección o agente de complejación.
Además, la composición farmacéutica inventiva puede comprender uno o más adyuvantes adicionales, que son adecuados para iniciar o aumentar una respuesta inmune del sistema inmunitario innato, es decir, una respuesta inmunitaria no específica, en particular mediante la unión a patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP). En otras palabras, cuando se administra, la composición farmacéutica o la vacuna preferentemente producen una respuesta inmunitaria innata debido al adyuvante opcionalmente contenido en la misma. De preferencia, este adyuvante se puede seleccionar de un adyuvante conocido por el experto y adecuado para este caso, es decir, que de soporte a la inducción de una respuesta inmune innata en un mamífero, por ejemplo una proteína adyuvante como se ha definido anteriormente o un adyuvante como se define a continuación. De acuerdo con una realización, este adyuvante se puede seleccionar de un adyuvante como se ha definido anteriormente.
Además, dicho adyuvante puede seleccionarse de cualquier adyuvante conocido por el experto y adecuado para el presente caso, es decir, apoyar la inducción de una respuesta inmune innata en un mamífero y/o adecuado para depósito y suministro de los componentes de la composición farmacéutica inventiva o de la vacuna aquí descrita. Son preferentes como adyuvantes adecuados para depósito y suministro los compuestos catiónicos o policatiónicos como se definieron anteriormente. Del mismo modo, el adyuvante puede seleccionarse del grupo consistente en, por ejemplo, compuestos catiónicos o policatiónicos como se definió anteriormente, de quitosano, TDM, m Dp , dipéptido de muramilo, pluronics, solución de alumbre, hidróxido de aluminio, ADJUMERTM (polifosfaceno); gel de fosfato de aluminio; glucanos de algas; algamulina; gel de hidróxido de aluminio (alumbre); gel de hidróxido de aluminio sumamente absorbente de proteínas; gel de hidróxido de aluminio de baja viscosidad; AF o SPT (emulsión de escualeno (5%), Tween 80 (0,2%), Pluronic L121 (1,25%), solución salina amortiguada con fosfato, pH 7,4); AVRIDINETM (propanodiamina); BAY R1005TM ((hidroacetato de N-(2-desoxi-2-L-leucilaminob-D-glucopiranosil)-N-octadecil-dodecanoilamida); CALCITRIOLTM (1-alfa,25-dihidroxi-vitamina D3); gel de fosfato de calcio; CAPTM (nanopartículas de fosfato de calcio); holotoxina de cólera, proteína de fusión de cólera toxina-A1-proteína-A-fragmento D, subunidad B de la toxina de cólera; CRL 1005 (copolímero de bloques P1205); liposomas que contienen citoquinas; DDA (bromuro de dimetildioctadeciamonio); DHEA (deshidroepiandrosterona); DMPC (dimiristoilfosfatidilcolina); DMPG (dimiristoilfosfatidilglicerol); complejo de DOC/alumbre (sal de sodio de ácido desoxicólico); adyuvante completo de Freund; adyuvante incompleto de Freund; inulina-gamma; adyuvante Gerbu (mezcla de: i) N-acetilglucosaminil-(P1-4)-N-acetilmuramil-L-alanil-D35 glutamina (GMDP), ii) cloruro de dimetildioctadecilamonio (DDA), iii) complejo de sal de zinc L-prolina (ZnPro-8); GM-CSF); g Md P (N-acetilglucosaminil-(b14)-N-acetilmuramil-L47-alanil-D-isoglutamina); imiquimod (1-(2-metipropil)-1H-imidazo[4,5-c]quinoline-4-amina); ImmTher™ (dipalmitato de N-acetilglucosaminil-N-acetilmuramil-L-Ala-D-isoGlu-L-Ala-glicerol); DRVs (inmunoliposomas preparados de vesículas de deshidratación-rehidratación); interferón gamma; interleucina-1beta; interleucina-2; interleucina-7; interleucina-12; ISCOMS™; ISCOPREP 7.0.3.TM; liposomas; LOXORIBINE™ (7-alil-8-oxoguanosina); adyuvante oral LT 5 (enterotoxina-protoxina lábil de E.coli); microesferas y micropartículas de cualquier composición; MF59TM; (emulsión de agua de escualeno); MONTANIDE™ ISA 51 (adyuvante de Freund incompleto purificado); m On TANIDE ISA 720TM (adyuvante de aceite metabolizable); MPLTM (lípido A de 3-Q-desacil-4'-monofosforilo); MTP-PE y liposomas MTP-PE ((N-acetil-L alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-(hidroxifosforiloxi))-etilamida, sal de monosodio); MURAMETIDE™ (Nac-Mur-L-Ala-D-Gln-OCH3); MURAPALMITINE™ y DMURAPALMITINE™ (Nac-Mur-L-Thr-D-isoGIn-sngliceroldipalmitoilo); NAGO (neuraminidasa-galactosa-oxidasa); nanoesferas o nanopartículas de cualquier composición; NISVs (vesículas de agentes tensioactivos no iónicos); PLEURANTM (p-glucano); PLGA, PGA y PLA (homo- y copolímeros de ácido láctico y ácido glicólico; microesferas/nanoesferas); PLURONIC L121TM; PMMA (polimetilmetacrilato); PODDSTM (microesferas proteinoides); derivados de polietilencarbamato; poli-rA: poli-rU (complejo de ácido poliadenílico-ácido poliuridílico); polisorbato 80 (Tween 80); cocleatos proteínicos (Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, AL); STIMULON™ (QS-21); Quil-A (saponina de QuilA); S-28463 (4-amino-otec-dimetil-2-etoximetil-1H-imidazo[4,5-c]quinolina-1-etanol); SAF-1TM (“formulación adyuvante Syntex”); proteoliposomas Sendai y matrices lipídicas que contienen Sendai; Span-85 (triolato de sorbitan); Specol (emulsión de Marcol 52, Span 85 y Tween 85); escualeno o Robane™ (2,6,10,15,19,23-hexametiltetracosan y 2,6,10,15,19,23-hexametil-2,6,10,14,18,22-tetracosahexano); esteariltirosina (clorhidrato de octadeciltirosina); Theramid™ (N-acetilglucosaminil-N-acetilmuramil-L-Ala-D-isoGlu-L-Aladipalmitoxipropilamida); Teronil-MDP (TermurtideTM o [thr 1]-MDP; N-acetilmuramil-treonil-D-isoglutamina); partículas de Ty (Ty-VLPs o partículas similares a virus); liposomas Walter-Reed (liposomas que contienen lípido A adsorbido en hidróxido de alumino), y lipopéptidos, incluyendo Pam3Cys, en particular sales de alumino, tales como Adju-phos, Alhydrogel, Rehydragel; emulsiones, incluyendo CFA, SAF, IFA, MF59, Provax, TiterMax, Montanida, Vaxfectina; copolímeros, incluyendo Optivax (CRL1005), L121, Poloaxmer4010), etc.; liposomas, incluyendo Stealth, cocleatos, incluyendo BIORAL; adyuvantes derivados de plantas, incluyendo QS21, Quil A, Iscomatrix, ISCOM; adyuvantes adecuados para la co­ estimulación incluyendo Tomatina, biopolímeros, incluyendo PLG, PMM, Inulina, adyuvantes derivados de microbios, incluyendo Romurtida, DETOX, MPL, c W s , Manosa, secuencia de ácido nucleicos CpG, CpG7909, ligandos de TLR 1-10 humanos, ligandos de TLR 1-13 de murino, ISS-1018, 35 IC31, Imidazoquinolinas, Ampligen, Ribi529, IMOxine, IRIVs, VLPs, toxina de cólera, toxina lábil térmica, Pam3Cys, Flagelina, anclaje GPI, LNFPIII/Lewis X, péptidos antimicrobianos, UC-1V150, proteína de fusión RSV, cdiGMP; y adyuvantes adecuados como antagonistas incluyendo neuropéptido de CGRP.
Con particular preferencia, un adyuvante puede seleccionarse de adyuvantes que apoyan la inducción de una respuesta inmune a Th1 o la maduración de células T naive, tales como GM-CSF, IL-12, IFNg, cualquier ácido nucleico inmunoestimulador como se definió anteriormente, preferiblemente un ARN inmunoestimulador, ADN CpG, etc.
En una realización preferente adicional, también es posible que la composición farmacéutica inventiva contenga, además del ARNm que proporciona antígenos, componentes adicionales que se seleccionan del grupo consistente en: antígenos adicionales o ácidos nucleicos adicionales que proporcionan antígenos; un agente inmunoterapéutico adicional; una o más sustancias auxiliares; o cualquier compuesto adicional que sea conocido como inmunoestimulador debido a su afinidad de unión (como ligandos) a receptores tipo Toll humanos; y o un ácido nucleico/adyuvante, de preferencia un ARN inmunoestimulador (ARNis).
La composición farmacéutica inventiva además puede contener una o más sustancias auxiliares para aumentar su inmunogenicidad o su capacidad inmunoestimuladora, si se desea. Preferentemente, con ello se consigue una acción sinérgica de la secuencia de ARNm inventiva como se define aquí y de una sustancia auxiliar que puede estar contenida opcionalmente en la composición farmacéutica inventiva. Dependiendo de los diversos tipos de sustancias auxiliares, se pueden tomar en consideración diversos mecanismos a este respecto. Por ejemplo, compuestos que permiten la maduración de células dendríticas (DC), por ejemplo lipopolisacáridos, TNF-alfa o un ligando CD40, forman una primera clase de sustancias auxiliares adecuadas. En general, es posible utilizar como sustancia auxiliar cualquier agente que influye en el sistema inmunitario en forma de una “señal de peligro” (LPS, GP96, etc.) o citoquinas, tales como GM-CFS, que permiten mejorar y/o influir una respuesta inmunitaria de manera dirigida. Sustancias auxiliares particularmente preferidas son citoquinas, como monoquinas, linfoquinas, interleuquinas o quimioquinas, que estimulan adicionalmente la respuesta inmunitaria innata, tales como IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, iL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19 , IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, IFN-alfa, IFN-beta, IFN-gamma, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, LT-beta o TNF-alfa, factores de crecimiento, tales como hGH.
Aditivos adicionales que se pueden incluir en la composición farmacéutica inventiva son emulsionantes, por ejemplo Tween®; agentes humectantes, por ejemplo laurilsulfato de sodio; agentes colorantes; agentes saborizantes, portadores farmacéuticos; agentes formadores de tabletas; estabilizantes; antioxidantes; conservantes.
La composición farmacéutica inventiva también puede contener adicionalmente cualquier compuesto adicional, conocido por ser inmunoestimulante debido a su afinidad de unión (como ligando) a los receptores tipo Toll humanos TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, o debido a su afinidad de unión (como ligando) a los receptores tipo Toll murinos TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, TLR11, TLR12 o TLR13.
En este contexto, se prefiere particularmente que el componente adyuvante comprendido opcionalmente comprenda el mismo ARNm inventivo tal como se incluye en la composición farmacéutica inventiva como un ARNm proporcionador de antígenos.
Además, la composición farmacéutica inventiva puede comprender otros componentes para facilitar la administración y la absorción de los componentes de la composición farmacéutica. Estos componentes adicionales pueden ser un portador o vehículo adecuado, adyuvantes adicionales para ayudar cualquier respuesta inmune, agentes antibacterianos y/o antivirales.
Así, en una realización adicional, la composición farmacéutica inventiva comprende además un portador y/o vehículo farmacéuticamente aceptable.
Este portador farmacéuticamente aceptable incluye típicamente una base líquida o no líquida de una composición que comprende los componentes de la composición farmacéutica inventiva. Si la composición se proporciona en forma líquida, el portador típicamente será agua libre de pirógenos, solución salina isotónica o soluciones tampón (acuosas), por ejemplo soluciones tampón fosfato, citrato, etc. El tampón de inyección puede ser hipertónico, isotónico o hipotónico con respecto al medio de referencia específico, es decir, el tampón puede tener un mayor, igual o menor contenido en sal con respecto al medio de referencia específico, donde preferentemente se pueden utilizar las concentraciones de sales mencionadas anteriormente que no producen daños celulares debidos a ósmosis u otros efectos de la concentración. Medios de referencia son, por ejemplo, líquidos que se emplean en métodos “in vivo”, como sangre, linfa, líquidos citosólicos u otros líquidos corporales, o, por ejemplo, líquidos que se pueden utilizar como medios de referencia en métodos “in vitro”, como tampones o líquidos habituales. Estos tampones o líquidos habituales son conocidos por el experto. Es particularmente preferente como base líquida una solución Ringer-Lactato.
Sin embargo, también pueden emplearse una o más cargas o diluyentes sólidos o líquidos compatibles o compuestos encapsulantes, que son adecuados para la administración a un paciente a tratar, para la composición farmacéutica de acuerdo con la invención. El término "compatible", tal como se usa aquí, significa que estos constituyentes de la composición farmacéutica inventiva pueden mezclarse con los componentes de la composición farmacéutica inventiva de manera que no se produce una interacción que reduzca esencialmente la eficacia farmacéutica de la composición farmacéutica bajo las condiciones típicas de uso.
Un componente adicional de la composición farmacéutica inventiva puede ser un agente inmunoterapéutico, que puede seleccionarse de inmunoglobulinas, preferiblemente IgG, anticuerpos monoclonales o policlonales, suero o sueros policlonales, etc, preferentemente inmunoglobulinas dirigidas contra el virus respiratorio sincitial (RSV), por ejemplo Palivizumab. Preferiblemente, dicho agente inmunoterapéutico adicional puede proporcionarse como un péptido/proteína o puede estar codificado por un ácido nucleico, preferiblemente por un ADN o un ARN, más preferiblemente un ARNm. Este agente inmunoterapéutico permite proporcionar una vacunación pasiva adicional a la vacunación activa activada por los ARNm proporcionadores de antígenos inventivos.
Además, en una realización específica, además del ARNm para proporcionar antígenos, se pueden incluir antígenos adicionales en la composición farmacéutica inventiva y son típicamente sustancias tales como células, lisados celulares, virus, virus atenuados, virus inactivados, proteínas, péptidos, ácidos nucleicos u otras bio- o macromoléculas o fragmentos de las mismas. Preferentemente, los antígenos pueden ser proteínas y péptidos o fragmentos de los mismos, tales como epítopos de esas proteínas o péptidos, preferentemente con 5 a 15, con preferencia de 6 a 9 aminoácidos. En particular, las proteínas, péptidos o epítopos se pueden derivar de la proteína de fusión F, la glucoproteína G, la proteína hidrofóbica corta SH, la proteína matriz M, la nucleoproteína N, la polimerasa Large L, la proteína M2-1, la proteína M2-2, la fosfoproteína P, la proteína NS1 no estructural o la proteína NS2 no estructural del virus respiratorio sincitial (RSV), o a partir de fragmentos, variantes o derivados de los mismos. Además, los antígenos también pueden comprender cualquier otra biomolécula, por ejemplo lípidos, carbohidratos, etc. De preferencia, el antígeno es una proteína o antígeno (poli-)peptídico, un ácido nucleico, un ácido nucleico que codifica para una proteína o antígeno (poli)peptídico, un antígeno polisacárido, un antígeno conjugado polisacárido, un antígeno lipídico, un antígeno glicolípido, un antígeno carbohidrato, una bacteria, una célula (vacuna) o virus muertos o atenuados.
La composición farmacéutica inventiva o la vacuna como se describe aquí presente puede comprender, además, aditivos o compuestos adicionales. Los aditivos adicionales que se pueden incluir en la composición farmacéutica son emulsionantes, por ejemplo, Tween®, agentes humectantes, por ejemplo laurilsulfato de sodio, agentes colorantes, agentes saborizantes, portadores farmacéuticos, agentes de formación de tabletas, estabilizantes, antioxidantes, conservantes, inhibidores de ARNasa y/o agentes antibacterianos o antivirales. Adicionalmente, la composición farmacéutica inventiva puede comprender un ARN interferente pequeño (ARNsi) dirigido contra los genes del virus respiratorio sincitial (RSV), por ejemplo ARNsi dirigido contra el gen que codifica para la proteína de fusión F, la glucoproteína G, la proteína hidrofóbica corta SH, la proteína matriz M, la nucleoproteína N, la polimerasa Large L, la proteína M2-1, la proteína M2-2, la fosfoproteína P, la proteína NS1 no estructural o la proteína NS2 no estructural del virus respiratorio sincitial (RSV). La composición farmacéutica inventiva comprende típicamente una “cantidad segura y efectiva” de los componentes de la composición farmacéutica inventiva, en particular de las secuencias de ARNm inventivas como se definen aquí. Tal como se usa aquí, una “cantidad segura y efectiva” significa una cantidad de las secuencias de ARNm inventivas como se definen aquí que, como tal, es suficiente para inducir significativamente una modificación positiva de una enfermedad o trastorno o para evitar una enfermedad, preferentemente las infecciones por RSV como se definen aquí. Al mismo tiempo, sin embargo, una “cantidad segura y efectiva” debe ser tan pequeña como para evitar efectos secundarios graves y permitir una relación adecuada entre ventaja y riesgo. La determinación de estos límites típicamente queda dentro del alcance de un juicio médico acertado.
La composición farmacéutica inventiva se puede utilizar para seres humanos y también para fines médicos veterinarios, de preferencia para fines médicos en humanos, como una composición farmacéutica en general o como una vacuna.
De acuerdo con otro aspecto particularmente preferente, la composición farmacéutica inventiva (o la secuencia de ARNm inventiva como se define aquí o la composición inventiva que comprende una pluralidad de secuencias de ARNm inventivas como se define aquí) se puede proporcionar o utilizar como una vacuna. Típicamente, esta vacuna es como se definió anteriormente para las composiciones farmacéuticas. Adicionalmente, esta vacuna contiene típicamente la secuencia de ARNm inventiva como se define aquí o la composición inventiva que comprende una pluralidad de secuencias de ARNm inventivas como se define aquí.
La vacuna aquí descrita también puede comprender un portador, un adyuvante y/o un vehículo farmacéuticamente aceptables como se define aquí para la composición farmacéutica inventiva. En el contexto específico de la vacuna aquí descrita, la selección de un portador farmacéuticamente aceptable se determina, en principio, por la forma en la cual se administra la vacuna aquí descrita. La vacuna aquí descrita se puede administrar, por ejemplo, sistémica o localmente. Las vías de administración sistémica en general incluyen, por ejemplo, las vías transdérmica, oral, parenteral, incluyendo inyección subcutánea, intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intradérmica e intraperitoneal, y/o vías de administración intranasal. Las vías de administración local en general incluyen, por ejemplo, las vías de administración tópica, aunque también inyecciones intradérmicas, transdérmicas, subcutáneas o inyecciones intramusculares o intralesionales, intracraneales, intrapulmonales, intracardiacas y sublinguales. Con mayor preferencia, las vacunas se pueden administrar vía intradérmica, subcutánea o intramuscular. Así, las vacunas aquí descritas preferentemente se formulan en forma líquida (o a veces en forma sólida).
En una realización preferente, la vacuna aquí descrita se administra vía inyección intradérmica o intramuscular, de preferencia empleando una técnica de inyección basada en aguja convencional o un sistema sin aguja, por ejemplo inyección por chorro. En una realización preferente adicional, la vacuna aquí descrita se puede administrar mediante inyección por chorro como se define aquí. De preferencia, la vacuna aquí descrita se administra vía intramuscular mediante inyección por chorro. De acuerdo con otra realización, la vacuna se administra vía intradérmica por inyección por chorro.
En una realización preferente, la vacuna se puede administrar una, dos o tres veces, preferentemente vía inyección intradérmica o intramuscular, de preferencia mediante inyección por chorro. De acuerdo con una determinada realización, una administración única de la vacuna, preferentemente vía inyección intradérmica o intramuscular, de preferencia por inyección por chorro, es suficiente para producir una respuesta inmunitaria frente a al menos un antígeno codificado por la secuencia de ARNm según la invención. En una realización preferente, la única administración de la vacuna produce una respuesta inmunitaria que resulta en la neutralización del virus. En este contexto, es particularmente preferente una sola inyección intradérmica o intramuscular de la vacuna. De preferencia, opcionalmente se pueden llevar a cabo administraciones adicionales de la vacuna para mejorar y/o prolongar la respuesta inmunitaria.
La vacuna aquí descrita puede contener además una o más sustancias auxiliares para aumentar su inmunogenicidad o su capacidad inmunoestimuladora, si se desea. Son particularmente preferentes los adyuvantes como sustancias auxiliares o aditivos como se han definido para la composición farmacéutica.
En un aspecto adicional, la invención se dirige a un kit o kit de partes que comprende la secuencia de ARNm inventiva, la composición inventiva que comprende una pluralidad de secuencias de ARNm como se definen aquí, la composición farmacéutica inventiva o la vacuna aquí descrita y opcionalmente las instrucciones técnicas con información sobre la administración y dosificación de los componentes.
Además de la secuencia de ARNm inventiva, la composición inventiva que comprende una pluralidad de secuencias de ARNm como se define aquí, la composición farmacéutica inventiva o la vacuna aquí descrita, el kit puede contener además un vehículo farmacéuticamente aceptable, un adyuvante y al menos un componente adicional como se define aquí, así como los medios para la administración e instrucciones técnicas. La secuencia de ARNm inventiva, la composición inventiva que comprende una pluralidad de secuencias de ARNm, la composición farmacéutica inventiva o la vacuna y, por ejemplo, el adyuvante, se pueden proporcionar en forma liofilizada. En una realización preferente, antes de utilizar el kit de vacunación, el vehículo proporcionado es entonces añadido a los componentes liofilizados en una cantidad predeterminada como se describe, por ejemplo, en las instrucciones técnicas proporcionadas. Al hacerlo así, se proporciona la secuencia de ARNm inventiva, la composición inventiva que comprende una pluralidad de secuencias de ARNm como se define aquí, la composición farmacéutica inventiva o la vacuna aquí descrita de acuerdo con los aspectos de la invención descritos anteriormente, que después se puede utilizar en un método como se ha descrito anteriormente.
La presente invención proporciona además diversas aplicaciones y usos de la secuencia de ARNm inventiva como se define aquí, de la composición inventiva que comprende una pluralidad de secuencias de ARNm como se define aquí, de la composición farmacéutica inventiva, de la vacuna aquí definida, comprendiendo todos la secuencia de ARNm inventiva como se define aquí, o de los kits que la comprenden.
En un aspecto adicional, la invención proporciona una secuencia de ARNm como se define en las reivindicaciones, una composición, una composición farmacéutica, una vacuna y un kit, comprendiendo todos la secuencia de ARNm, para su uso en un método de tratamiento profiláctico y/o terapéutico de infecciones por RSV. Por consiguiente, en un aspecto adicional, la presente invención se dirige al primer uso médico de la secuencia de ARNm inventiva, de la composición inventiva que comprende una pluralidad de secuencias de ARNm inventivas, de la composición farmacéutica inventiva, de la vacuna aquí descrita y del kit inventivo como se define aquí como un medicamento. En particular, la invención proporciona el uso de una secuencia de ARNm como se define en las reivindicaciones para la preparación de un medicamento.
De acuerdo con otro aspecto, la presente invención se dirige al segundo uso médico de la secuencia de ARNm como se define en las reivindicaciones, opcionalmente en forma de una composición que comprende una pluralidad de secuencias de ARNm como se definen aquí, de una composición farmacéutica o vacuna, o kit o kit de partes para el tratamiento de infecciones por RSV como se define aquí. En particular, la secuencia de ARNm a usar en un método como el anterior es una secuencia de ARNm como se define en las reivindicaciones formulada junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable y opcionalmente un adyuvante adicional y opcionalmente un componente adicional como se ha definido anteriormente, por ejemplo un antígeno adicional o una inmunoglobulina de RSV. En este contexto, es particularmente preferente el tratamiento (profiláctico) de lactantes, ancianos y pacientes inmunodeprimidos. Incluso es especialmente preferente el tratamiento (profiláctico) de lactantes prematuros y lactantes con enfermedad pulmonar crónica.
La secuencia de ARNm inventivo alternativamente se puede proporcionar de tal forma que es para su uso en la prevención o el tratamiento de infecciones por RSV mediante diversas dosis, cada dosis conteniendo la secuencia de ARNm inventiva como se define en las reivindicaciones, por ejemplo conteniendo la primera dosis al menos un ARNm que codifica un mutante de la proteína de fusión F del virus respiratorio sincitial (RSV), donde los residuos aminoácido 554-574 de la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión F se han eliminado en el mutante de la proteína de fusión F, y conteniendo la segunda dosis al menos una secuencia de ARNm que codifica para al menos un péptido o proteína antigénicos derivado de un antígeno diferente al del virus respiratorio sincitial (RSV), de preferencia de nucleoproteína N (o fragmentos, variantes o derivados de la misma), de proteína M2-1 o de glucoproteína G (o fragmentos, variantes o derivados de la misma). Mediante esta realización, ambas dosis se administran de forma escalonada, es decir, posteriormente, una poco después de la otra, por ejemplo en un intervalo inferior a 10 minutos, preferentemente inferior a 2 minutos, y en el mismo sitio del cuerpo, para alcanzar el mismo efecto inmunológico que el de la administración de una sola composición que contenga ambos, por ejemplo el ARNm que codifica para la proteína de fusión F y el ARNm que codifica para la nucleoproteína N.
De acuerdo con una realización específica, la secuencia de ARNm inventiva, o la composición farmacéutica inventiva o la vacuna aquí descrita, se pueden administrar al paciente como una dosis única. En ciertas realizaciones, la secuencia de ARNm inventiva o la composición farmacéutica inventiva o vacuna aquí descrita se pueden administrar a un paciente como una dosis única seguida de una segunda dosis más tarde y opcionalmente incluso una tercera, cuarta (o más) dosis posteriores a la misma, etc. De acuerdo con esta realización, se pueden administrar inoculaciones de refuerzo con la secuencia de ARNm inventivo o la composición farmacéutica inventiva o la vacuna aquí descrita a un paciente a intervalos de tiempo específicos, de preferencia como se definirá más adelante, después de la segunda (o tercera, cuarta, etc.) inoculación. En este contexto, se prefiere particularmente que las diversas dosis comprendan la misma secuencia de ARNm que codifica para el mismo péptido o proteína antigénicos del virus respiratorio sincitial (RSV), por ejemplo la proteína de fusión F. En esa realización, las dosis se proporcionan en un período de tiempo específico, por ejemplo 20-30 días. Por ejemplo, para una profilaxis posterior a la exposición se pueden administrar en 20-30 días al menos 5 dosis de la secuencia de ARNm inventiva o de la composición farmacéutica inventiva o de la vacuna aquí descrita.
En una realización preferente, la secuencia de ARNm inventiva, la composición farmacéutica inventiva o la vacuna aquí descrita se administra vía inyección intradérmica o intramuscular, de preferencia utilizando una técnica inyección basada en aguja convencional o un sistema sin aguja, por ejemplo inyección por chorro. En una realización preferente adicional, la secuencia de ARNm inventiva, la composición farmacéutica inventiva o la vacuna aquí descrita se pueden administrar mediante inyección por chorro como se define aquí. Preferentemente, la secuencia de ARNm inventiva, la composición farmacéutica inventiva o la vacuna aquí descrita se administran intramuscularmente mediante inyección por chorro. De acuerdo con otra realización, la secuencia de ARNm inventiva, la composición farmacéutica inventiva o la vacuna aquí descrita se administra intradérmicamente vía inyección por chorro.
En una realización preferente, la secuencia de ARNm inventiva, la composición farmacéutica inventiva o la vacuna aquí descrita se puede administrar una, dos o tres veces, de preferencia por inyección intradérmica o intramuscular, en especial mediante inyección por chorro. De acuerdo con una determinada realización, una administración única de la secuencia de ARNm inventiva, de la composición farmacéutica inventiva o de la vacuna aquí descrita, de preferencia vía inyección intradérmica o intramuscular, de preferencia empleando inyección por chorro, es suficiente para producir una respuesta inmunitaria contra el al menos un antígeno codificado por la secuencia de ARNm según la invención. En una realización preferente, la administración única de la secuencia de ARNm inventiva, de la composición farmacéutica inventiva o de la vacuna aquí descrita produce una respuesta inmunitaria que da como resultado la neutralización del virus. En este contexto, una sola inyección intradérmica o intramuscular de la secuencia del ARNm inventiva, de la composición farmacéutica inventiva o de la vacuna aquí descrita es particularmente preferente. De preferencia, se pueden llevar a cabo opcionalmente administraciones adicionales de la secuencia de ARNm inventiva, de la composición farmacéutica inventiva o de la vacuna aquí descrita para mejorar y/o prolongar la respuesta inmunitaria.
En ciertas realizaciones, estas inoculaciones de refuerzo con la secuencia de ARNm inventiva o con la composición farmacéutica inventiva o con la vacuna aquí descrita pueden utilizar un compuesto adicional o un componente como se define para la secuencia de ARNm inventiva o la composición farmacéutica inventiva o la vacuna aquí descrita como se define aquí.
De acuerdo con un aspecto adicional, se describe aquí un método no reivindicado para la expresión de un péptido o de una proteína antigénica codificada derivada de la proteína de fusión F, la glucoproteína G, la proteína hidrofóbica corta SH, la proteína matriz M, la nucleoproteína N, la polimerasa Large L, la proteína M2-1, la proteína M2-2, la fosfoproteína P, la proteína NS1 no estructural o la proteína NS2 no estructural del virus respiratorio sincitial (RSV) que comprende los pasos de, por ejemplo a) proporcionar la secuencia de ARNm inventiva como se define aquí o la composición inventiva que comprende una pluralidad de secuencias de ARNm inventivas como se definen aquí, b) aplicar o administrar la secuencia de ARNm inventiva como se define aquí o la composición inventiva que comprende una pluralidad de secuencias de ARNm inventivas como se define aquí a un sistema de expresión, por ejemplo a un sistema de expresión libre de células, a una célula (por ejemplo una célula huésped de expresión o una célula somática), un tejido o un organismo. El método se puede aplicar en laboratorio, para investigación, para el diagnóstico, para la producción comercial de péptidos o proteínas y/o con fines terapéuticos. En este contexto, típicamente, después de preparar la secuencia de ARNm inventiva como se define aquí o la composición inventiva que comprende una pluralidad de secuencias de ARNm inventivas como se define aquí, se aplica o administra a un sistema de expresión libre de células, a una célula (por ejemplo una célula huésped de expresión o una célula somática), un tejido o un organismo, por ejemplo, en forma desnuda o complejada o como una composición farmacéutica o vacuna como se describe aquí, preferentemente vía transfección o empleando cualquiera de los modos de administración tal como se describen aquí. El método se puede llevar a cabo in vitro, in vivo o ex vivo. Además, el método se puede llevar a cabo en el contexto del tratamiento de una enfermedad específica, en particular en el tratamiento de enfermedades infecciosas, preferentemente infecciones por RSV como se define aquí.
En este contexto, in vitro se define aquí como la transfección o transducción del ARNm inventivo como se define aquí o de la composición inventiva que comprende una pluralidad de secuencias de ARNm inventivas como se define aquí en células cultivadas fuera de un organismo; in vivo se define aquí como la transfección o transducción del ARNm inventivo o de la composición inventiva que comprende una pluralidad de secuencias de ARNm inventivas en células mediante la aplicación del ARNm inventivo o de la composición inventiva al organismo completo o individuo y ex vivo se define aquí como la transfección o transducción del ARNm inventivo o de la composición de la invención que comprende una pluralidad de secuencias de ARNm inventivas en células fuera de un organismo o individuo y la posterior aplicación de las células transfectadas al organismo o individuo.
Asimismo, de acuerdo con otro aspecto, la presente descripción también proporciona el uso no reivindicado de la secuencia de ARNm inventiva como se define aquí o de la composición inventiva que comprende una pluralidad de secuencias de ARNm inventivas como se define aquí, preferentemente con fines diagnósticos o terapéuticos, para la expresión de un péptido o proteína antigénico codificado, por ejemplo aplicando o administrando la secuencia de ARNm inventiva como se define aquí o la composición inventiva que comprende una pluralidad de secuencias de ARNm inventivas como se define aquí, por ejemplo, a un sistema de expresión libre de células, a una célula (por ejemplo una célula huésped de expresión o una célula somática), un tejido o un organismo. El uso se puede aplicar en laboratorio, para investigación, para diagnóstico, para la producción comercial de péptidos o proteínas y/o con fines terapéuticos. En este contexto, típicamente después de preparar la secuencia de ARNm inventiva como se define aquí o la composición de la invención que comprende una pluralidad de secuencias de ARNm inventivas como se define aquí, se aplica o administra a un sistema de expresión libre de células, a una célula (por ejemplo una célula huésped de expresión o una célula somática), a un tejido o un organismo, preferentemente en forma desnuda o complejada, o como una composición farmacéutica o vacuna como se describe aquí, preferentemente vía transfección o utilizando cualquiera de los modos de administración aquí descritos. El uso se puede llevar a cabo in vitro, in vivo o ex vivo. El uso además se puede llevar a cabo en el contexto del tratamiento de una enfermedad específica, en particular en el tratamiento de infecciones por RSV.
En un aspecto adicional, la invención proporciona la secuencia de ARNm inventiva, la composición que comprende una pluralidad de secuencias de ARNm, la composición farmacéutica o el kit o kit de partes que comprende la secuencia de ARNm inventiva para su uso en un método de tratamiento o profilaxis de infecciones por RSV que comprende los pasos de:
a) proporcionar la secuencia de ARNm inventiva, la composición que comprende una pluralidad de secuencias de ARNm como se define en las reivindicaciones, la composición farmacéutica o el kit o kit de partes que comprenden la secuencia de ARNm inventiva como se define en las reivindicaciones;
b) aplicar o administrar la secuencia de ARNm, la composición, la composición farmacéutica o el kit o kit de partes a un tejido o un organismo;
c) opcionalmente administrar una inmunoglobulina de RSV.
Tomada en conjunto, la presente descripción proporciona, en un cierto aspecto, una secuencia de ARNm que comprende una región codificante como se define en las reivindicaciones. La secuencia de ARNm inventiva es para su uso en un método de tratamiento profiláctico y/o terapéutico de infecciones provocadas por el virus sincitial (RSV). Por consiguiente, la invención se refiere a una secuencia de ARNm como se define aquí para su uso en un método de tratamiento profiláctico y/o terapéutico de infecciones por RSV.
Breve descripción de las figuras
Las figuras mostradas a continuación son meramente ilustrativas y describen la presente invención de forma adicional. Estas figuras no se deben interpretar como limitantes de la presente invención.
Figura 1: Secuencia de ARNm optimizada en G/C de R1691 que codifica para la proteína F cepa RSV long (RSV-F long) de RSV como está comprendida en la vacuna de ARNm RSV-F long (SEC ID n O: 31).
Figura 2: Secuencia de ARNm optimizada en G/C de R2510 que codifica para la proteína RSV-F de la cepa RSV long (RSV-F long) como está comprendida en la vacuna de ARNm de RSV-F long (SEC ID NO: 32).
Figura 3: Secuencia de ARNm optimizada de G/C de R2821 que codifica para la proteína mutante del554-574 RSV-F de la cepa RSV long (RSV-F log) (SEC ID NO: 33.).
Figura 4: Secuencia de ARNm optimizada en G/C de R2831 que codifica para la proteína RSV-N de la cepa RSV long (RSV-F long) (SEC ID NO: 34).
Figura 5: Secuencia de ARNm optimizada en G/C de R2833 que codifica para la proteína RSV-M2-1 de la cepa RSV long (RSV-F long) (SEC ID NO: 35).
Figura 6: Muestra que la vacuna de ARNm RSV-F long induce títulos de anticuerpos contra la proteína F de RSV comparable con aquella frente a RSV inactivado. Ratones hembra BALB/c fueron inyectados vía intradérmica (i.d.) con la vacuna ARNm RSV-F long (160 pg de R1691) o Ringer-Lactato (tampón RiLa) como tampón control. Un grupo se inyectó intramuscularmente (i.m.) con 10 pg de la vacuna de RSV long inactivado. Todos los animales recibieron inyecciones de refuerzo los días 21 y 35, se recogieron muestras sanguíneas el día 49 para determinar los títulos de anticuerpo en los sueros reunidos como se describe en el Ejemplo 2. Como se puede observar, la vacuna de ARNm del RSV-F long induce anticuerpos antiproteína-F de las subclases IgG1 y IgG2a. Los títulos de anticuerpos se muestran en la gráfica (n = 5 ratones/grupo).
Figura 7: Muestra que la vacuna ARNm de RSV-F long (R1691) induce una respuesta inmunitaria de larga duración en ratones. El experimento se realizó como se describe en el Ejemplo 3 y se determinaron mediante ELISA los títulos totales de anticuerpos IgG. Como se puede observar, los títulos de anticuerpos son estables durante al menos once meses después de la última vacunación de refuerzo.
Figuras 8: Muestra que la vacuna ARNm de RSV-F long (R1691) induce células T CD8+ multifuncionales específicas de proteínas de fusión (F) de RSV en ratones. El experimento se realizó como se describe en el Ejemplo 4 y se analizaron las células T mediante tinción con citoquina intracelular para la inducción antígeno-específica de citoquinas. Las células se estimularon con un péptido RSV-F (stim. F; KYKNAVTEL) o un péptido control de la influenza HA (stim. HA; IYSTVASSL). La línea en la gráfica representa el valor medio (n = 5 ratones/grupo). Como se puede observar, la vacuna ARNm-F de RSV long induce células T CD8+ multifuncionales específicas de proteínas de fusión (F) de RSV, al contrario que la vacuna basada en RSV inactivado, que no fue capaz de inducir células T CD8+ específicas de proteína F.
Figura 9: Muestra que la vacuna ARNm de RSV-N (R2831) induce células T CD8+ multifuncionales (N)-específicas de nucleoproteína en ratones. El experimento se realizó como se describe en el Ejemplo 5 y se analizaron células T mediante tinción con citosina intracelular para la inducción antígeno-específica de citoquinas después de la estimulación con ProMix RSV-N (péptidos 15mer). La línea en la gráfica representa el valor medio (n = 5 ratones/grupo). Como se puede observar, la vacuna de ARNm de RSV-N induce células T CD8+ multifuncionales (N)-específicas de la nucleoproteína del RSV, al contrario que la vacuna basada en RSV inactivado, que no fue capaz de inducir células T CD8+ específicas de proteínas N.
Figura 10: Muestra que la vacuna de ARNm de RSV-N (R2831) induce células T CD4+ multifuncionales (N)-específicas de la nucleoproteína en ratones. El experimento se realizó como se describe en el Ejemplo 5 y se analizaron células T mediante tinción con citosina intracelular para la inducción antígeno-específica de citoquinas después de la estimulación con ProMix RSV-N (péptidos 15mer). La línea en la gráfica representa el valor medio (n = 5 ratones/grupo). Como se puede observar, la vacuna de ARNm de RSV-N induce células T CD4+ multifuncionales (N)-específicas de la nucleoproteína del RSV, al contrario que la vacuna basada en RSV inactivado, que no es capaz de inducir células T CD4+ específicas de proteína N.
Figura 11: Muestra que la vacuna de ARNm de RSV-M2-1 (R2833) induce células T CD8+ multifuncionales M2-1-específicas en ratones. El experimento se realizó como se describe en el Ejemplo 5 y se analizaron células T mediante tinción con citocina intracelular para la inducción antígeno-específica de citoquinas después de la estimulación con péptido 9mero de un M2-1 específico. La línea de la gráfica representa el valor medio (n = 5 ratones/grupo). Como puede observar, la vacuna de ARNm de RSV-M2-1 induce células T CD8+ multifuncionales RSV-M2-1-específicas de RSV, al contrario que la vacuna basada en RSV inactivado, que no es capaz de inducir células T CD8+ específicas de proteínas M2-1.
Figura 12: Muestra que las vacunas de ARNm de RSV-F ya sea solas (RSV-F = R2510; RSV-Fdel554-574 mutante = R2821) o en combinación con ARNm que codifican para otras proteínas de RSV (RSV-N = R2831; RSV-M2-1 = R2833) inducen respuestas inmunitarias humorales en ratas algodoneras. El experimento se realizó como se describe en el Ejemplo 6 y se determinaron los títulos de anticuerpos IgG total específico de RSV-F mediante ELISA el día 49. El suero se analizó en dilución diferente, como se muestra abajo en el gráfico.
Figura 13: Muestra que las vacunas de ARNm de RSV-F ya sea solas (RSV-F, R2510; RSV-Fdel554-574 mutante, R2821) o en combinación con ARNm que codifican para otras proteínas de RSV (RSV-N = R2831; RSV-M2-1 = R2833) inducen la formación de anticuerpos funcionales en ratas algodoneras como se muestra en los títulos de anticuerpos de neutralización viral. El experimento se realizó como se describe en el Ejemplo 6 y se determinaron mediante análisis de reducción de placas, el día 49, los títulos de neutralización viral.
Figura 14: Muestra que las vacunas de ARNm de RSV-F ya sea solas ((RSV)-F = R2510; RSV-Fdel554-574 mutante = R2821) o en combinación con ARNm que codifican para otras proteínas de RSV (RSV-N = R2831; RSV-M2-1, = R2833) reducen los títulos pulmonares y nasales en ratas algodoneras inoculadas con el virus RSV. El experimento se realizó como se describe en el Ejemplo 6. (A) títulos en pulmón el día 5 después de la infección por inoculación de RSV. Todos los grupos de animales vacunados con las vacunas de ARNm mostraron títulos virales por debajo del nivel de detección de la titulación viral realizada, demostrando la protección de las ratas algodoneras vacunadas en términos de títulos pulmonares virales. En comparación con las vacunas de ARNm, la vacuna basada en el virus inactivado con formalina no fue capaz de prevenir los títulos virales en el pulmón. (B) títulos nasales el día 5 después de la infección de inoculación por RSV. El título viral en el tejido nasal no se redujo en gran medida en los grupos vacunados con el ARNm. En comparación con las vacunas de ARNm, la vacuna basada en el virus inactivado con formalina no fue capaz de reducir los títulos del virus nasal.
Figura 15: Muestra los resultados del análisis histopatológico pulmonar del estudio de inoculación de RSV en ratas algodoneras descrito en el Ejemplo 6.
Figura 16: Muestra los resultados de la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa cuantitativa (RT-PCR) de los números de copias de genomas virales (midiendo los números de copias del gen NS-1 de RSV) o las citoquinas expresadas a partir de tejido pulmonar de animales infectados con RSV (o controles) del estudio de inoculación de RSV en ratas algodoneras descrito en el Ejemplo 6.
Figura 17: Muestra que las vacunas de ARNm (RSV-F = R2510; RSV F* (RSV-Fdel554-574 mutante) = R2821) reducen los títulos pulmonares en ratas algodoneras inoculadas con el virus RSV. El experimento se realizó como se describe en el Ejemplo 7. (A) títulos en pulmón el día 5 después de la infección por inoculación del RSV. Todos los grupos animales vacunados intradérmicamente con las vacunas de ARNm mostraron títulos virales reducidos en comparación con el grupo control con tampón, que demostró protección de las ratas algodoneras vacunadas en términos de títulos pulmonares virales. Ya una sola dosis de las vacunas de ARNm de RSV-F redujo eficientemente los títulos virales en el pulmón. (B) títulos en pulmón el día 5 después de la infección por inoculación de RSV. El título viral en el pulmón también se redujo en gran medida en los grupos vacunados intramuscularmente con el ARNm.
Ejemplos
Los ejemplos mostrados a continuación son simplemente ilustrativos y describen la presente invención de forma adicional. Estos ejemplos no se deben interpretar como limitantes de la presente invención.
Ejemplo 1: Preparación de la vacuna de ARNm
1. Preparación de estructuras de ADN y ARNm
Para estos ejemplos, se prepararon secuencias de ADN que codifican para la proteína F de RSV (R1691 y R2510), la proteína mutante RSV-F del554-574 (R2821), la proteína N de RSV (R2831) y la proteína M2-1 de RSV (R2833) de la cepa RSV long y se utilizaron para posteriores reacciones de transcripción in vitro. La proteína mutante RSV-Fdel554-574 se había descrito con anterioridad (Oomens et al. 2006. J. Virol.
80(21):10465-77).
De acuerdo con una primera preparación, se prepararon las secuencias de ADN que codifican para los ARNm mencionados anteriormente. La estructura R1691 se preparó modificando la secuencia codificante de tipo silvestre introduciendo una secuencia optimizada en GC para la estabilización, seguida por una secuencia estabilizante derivada de la 3'-UTR de alfa-globina (muag (alfa-globina-3'-UTR mutada) de acuerdo con la SEQ ID NO: 29), un tramo de 64 adenosinas (secuencia poli(A)), un tramo de 30 citosinas (secuencia poli(c) y un tallo-bucle de histona de acuerdo con la SEQ ID NO: 30. En la SEQ ID NO: 31 (véase la figura 1) se muestra la secuencia de ARNm correspondiente. Las estructuras R2510, R2821, R2831 y R2833 se prepararon introduciendo una 5'-TOP-UTR derivada de la proteína ribosómica 32L de acuerdo con la SEQ ID NO: 23, modificando la secuencia codificante de tipo silvestre introduciendo una secuencia optimizada en GC para la estabilización, seguida por una secuencia estabilizante derivada de la 3'-UTR de albúmina (albumina7 de acuerdo con la SEQ ID NO: 25), un tramo de 64 adenosinas (secuencia poli(A)), un tramo de 30 citosinas (secuencia poli(C)) y un tallo-bucle de histona de acuerdo con la SEQ ID NO: 30. En las SEQ ID NO: 32-35 (véase la figura 2, 3, 4 y 5) se muestran las secuencias de los ARNm correspondientes.
Tabla 1: Estructuras de ARNm
Figure imgf000048_0001
2. Transcripción In vitro
Los plásmidos de ADN respectivos preparados de acuerdo con el párrafo 1 se transcribieron in vitro utilizando la polimerasa T7 en presencia de un análogo CAP (m7GpppG). Posteriormente, el ARNm se purificó utilizando PureMessenger® (CureVac, Tubingen, Alemania; WO2008/077592A1).
3. Reactivos:
Reactivo de complejación: protamina
4. Preparación de la vacuna:
El ARNm se complejó con protamina mediante la adición de protamina al ARNm en proporción (1:2) (p/p) (componente adyuvante). Después de incubar durante 10 minutos, se agregó la misma cantidad del ARNm libre utilizado como ARN para proporcionar antígenos.
Por ejemplo: La vacuna de RSV-F long (R1691): que comprende un componente adyuvante que consiste en el ARNm que codifica para la proteína F de RSV long (R1691) de acuerdo con la SEQ ID NO: 31 complejada con protamina en una proporción 2:1 (p/p) y el ARNm libre que proporciona antígenos que codifica para la proteína F de RSV long (R1691) de acuerdo con la SEQ iD NO: 31 (proporción 1:1; ARN complejado: ARN libre).
Ejemplo 2: Inducción de una respuesta inmunitaria humoral mediante la vacuna del ARNm de RSV-F long en ratones
Inmunización
El día cero, se inyectaron intradérmicamente (i.d.) ratones BALB/c con la vacuna de ARNm de RSV-F long (R1691 de acuerdo con el Ejemplo 1; 25 pg/ratón/día de vacunación) o Ringer-Lactato (RiLa) como tampón control, como se muestra en la Tabla 2. Un grupo control se inyectó intramuscularmente (i.m.) con 10 pg de la vacuna de RSV long inactivado. El “antígeno del virus respiratorio sincitial” inactivado (RSV long inactivado) se adquirió del INSTITUT VIRION/SERION GmbH-SERION IMMUNDIAGNOSTICA GmbH. El virus inactivado se diluyó en PBS estéril, de forma que se alcanzó una concentración final de 0,2 pg/pl. Todos los animales recibieron inyecciones de refuerzo el día 14 y el día 28. Se recolectaron muestras sanguíneas el día 42 para la determinación de los títulos de anticuerpos anti-RSV F.
Tabla 2: Gru os animales
Figure imgf000049_0001
Determinación de los anticuerpos de la proteína anti-RSVF mediante ELISA
Se recubrieron placas ELISA con la glucoproteína de fusión de RSV humano recombinante (rec.hu-proteína F, conc. final: 5 pg/ml) (Sino Biological Inc.). Las placas recubiertas se incubaron utilizando diluciones séricas determinadas y la unión de anticuerpos específicos a la proteína F se detectó utilizando anticuerpos anti-ratón isotipo específicos biotinilados en combinación con estreptavidina-HRP (peroxidasa de rábano picante) con sustrato ABTS.
Resultados
Como se puede observar en la figuras 6, la vacuna de ARNm de RSV-F long induce títulos de anticuerpos (IgG total, IgG1 IgG2a) contra la proteína del RSV F comparables con aquellos contra el RSV inactivado.
Ejemplo 3: Inducción de una respuesta inmunitaria humoral duradera mediante la vacuna de ARNm de RSV-F long en ratones
Inmunización
Ratones BALB/c se inyectaron intradérmicamente (i.d.) con 20 pg de la vacuna de ARNm de RSV-F long (R1691) o tampón RZinger-Lactato (RiLa) de acuerdo con el programa de vacunación mostrado en la Tabla 3. Se recolectó sangre 2 semanas, 4 meses y 11 meses después de la última inmunización.
Tabla 3: Gru os de animales
Figure imgf000049_0002
Resultados
Como se puede observar en la Figura 7, la vacuna de ARNm de RSV-F long induce una respuesta inmunitaria duradera como se demuestra por los títulos de anticuerpo estables durante al menos 11 meses después de la última vacunación de refuerzo.
Ejemplo 4: Inducción de una respuesta inmunitaria celular mediante la vacuna de ARNm del RSV-F long en ratones
Inmunización
El día cero, ratones BALB/c se inyectaron intradérmicamente (i.d.) con la vacuna de ARNm del RSV-F long R1691 (20 pg/ratón/día de vacunación) o Ringer-lactato (RiLa) como tampón control como se muestra en la Tabla 4. Un grupo control se inyectó intramuscularmente (i.m.) con l0 pg de la vacuna del RSV long inactivado. El “antígeno del virus respiratorio sincitial” inactivado (RSV long inactivado) se adquirió de INSTITUT VIRION/SERION GmbH-SERION IMMUNDIAGNOSTICA GmbH. El virus inactivado se diluyó en PBS estéril, de forma que se alcanzó una concentración final de 0,2 pg/pl. Todos los animales recibieron inyecciones de refuerzo en los días 14 y 28. Se recolectaron los bazos el día 34 para el análisis de las células T antígeno-específicas.
Tabla 4: Gru os animales
Figure imgf000050_0001
Tinción intracelular con citoquinas
Los esplenocitos procedentes de ratones vacunados y control se aislaron de acuerdo con un protocolo estándar. Brevemente, los bazos aislados se trituraron mediante un filtro celular y se lavaron en PBS/1%FBS, seguido por lisis de glóbulos rojos. Después de un paso de lavado a fondo con PBS/1%FBS, los esplenocitos se sembraron en placas de 96 pocillos (2 x 106 células/pocillo). Al siguiente día, las células se estimularon con un péptido RSV-F (KYKNAVTEL; 5 pg/ml; epítopo de células T H-2Kd-reestructuradas) o un péptido control irrelevante derivado de la proteína Ha de influenza (IYSTVASSL; 5 pg/ml; adquirido de las micro-colecciones EMC) y 2,5 pg/ml de un anticuerpo anti-CD28 (BD Biosciences) durante 6 horas a 37°C, en presencia de la mezcla GolgiPlugMR/GolgiStopMR (inhibidores de transporte de proteínas que contienen Brefeldina A y monensina, respectivamente; Bd Biosciences). Después de la estimulación, las células se lavaron y tiñeron para las citoquinas intracelulares utilizando el reactivo Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se utilizaron los siguientes anticuerpos para la tinción: CD8-PECy7 (1:200), CD3-FITC (1:200), IL2-PerCP-Cy5.5 (1:100), TNFa-PE (1:100), IFNy-APC (1:100) (eBioscience), CD4-BD Horizon V450 (1:200) (BD Biosciences) y se incubaron con bloque de Fcy diluido 1:100. Se utilizó Tinte Aqua para distinguir las células vivas/muertas (Invitrogen). Las células se recolectaron utilizando un citómetro de flujo Canto II (Beckton Dickinson). Los datos de la citometría de flujo se analizaron utilizando el software FlowJo (Tree Star, Inc.). Se realizó un análisis estadístico utilizando el software GraphPad Prism, versión 5.01. Las diferencias estadísticas entre grupos se evaluaron con el test Mann Whitney.
Resultados
Como se puede observar en la figura 8, la vacuna de ARNm de RSV-F long (R1691) induce células T CD8+ multifuncionales IFNy positivas, TNFa positivas y IFNY/TNFa doble positivas dirigidas contra la proteína del RSV-F. Sorprendentemente, la vacuna basada en el virus de RSV inactivado no fue capaz de inducir células T CD8+ antígeno-específicas.
Ejemplo 5: Inducción de respuestas inmunitarias celulares mediante las vacunas de ARNm de RSV-N y RSV-M2-1 en ratones
Inmunización
El día cero, ratones BALB/c se inyectaron intradérmicamente (i.d.) con diferentes dosis de la vacuna ARNm R2831 de RSV-N, la vacuna ARNm R2833 de RSV-M2-1 o Ringer-Lactato (RiLa) como tampón control como se muestra en la Tabla 5. Un grupo control se inyectó intramuscularmente (i.m.) con 10 pg de la vacuna del RSV long inactivado. El “Antígeno del virus respiratorio sincitial” inactivado (RSV long inactivado) se adquirió del INSTITUT VIRION/SERION GmbH-SERION IMMUNDIAGNOSTICA GmbH. El virus inactivado se diluyó en PBS estéril, de tal forma que se alcanzó una concentración final de 0,2 pg/pL. Todos los animales recibieron inyecciones de refuerzo en los días 7 y 21. Los bazos se recolectaron en el día 27 para el análisis de las células T antígeno-específicas.
Tabla^ 5: Gru os de animales
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Se realizó una tinción con citoquina intracelular como se describe en el Ejemplo 4, excepto que las células se trataron con los siguientes estimuladores: péptido M2-1 (5 pg/ml) Grupo 4 a 8; (SYIGSINNI de Prolmmune); ProMix N (1 pg/ml) 1-3, grupo 7 y 8; (PX39 de Prolmmune); Control: medio DMSO anti-CD28, el grupo 1-8 como se describió anteriormente.
Resultados
Como se puede observar en la figura 9, la vacuna de ARNm de RSV-N (R2831) induce células T CD8+ multifuncionales IFNy positivas, TNFa positivas e IFNY-TNFa doble positivas dirigidas contra la proteína del RSV-N en ratones. Sorprendentemente, la vacuna basada en el virus RSV inactivado no fue capaz de inducir células T CD8+ antígeno específicas.
Como se puede en la figura 10, la vacuna de ARNm de RSV-N (R2831) induce células T CD4+ multifuncionales IFNy positivas, TNFa positivas e IFNY-TNFa doble positivas dirigidas contra la proteína del RSV-N en ratones. Sorprendentemente, la vacuna basada en el virus RSV inactivado no fue capaz de inducir células T CD4+ antígeno específicas.
Como se puede observar en la figura 11, la vacuna ARNm del RSV-M2-1 (R2833) induce células T CD8+ multifuncionales IFNy positivas, TNFa positivas e IFNY-TNFa doble positivas dirigidas contra la proteína del RSV M2-1 en ratones. Sorprendentemente, la vacuna basada en el virus RSV inactivado no fue capaz de inducir células T CD8+ antígeno específicas.
Ejemplo 6: Estudio 1 de inoculación de RSV en ratas algodoneras
Para el desarrollo de las vacunas del RSV, la rata algodonera es un modelo animal aceptado, en especial para la infección por inoculación. Las ratas algodoneras responden a las preparaciones de la vacuna del virus del RSV inactivado con formalina con patología pulmonar mejorada. Esto permite evaluar la seguridad de una vacuna en los términos de un fenómeno de enfermedad mejorada.
Para ampliar y optimizar la respuesta inmunitaria RSV específica, se prepararon vacunas del ARNm que codifican para diferentes proteínas de RSV (RSV F, mutante RSV-Fdel554-574, N y M2-1) de acuerdo con el Ejemplo 1. Para evaluar el efecto de vacunas individuales o combinadas, estas vacunas se administraron ya sea solas o en combinación (cóctel de vacunas) como se muestra en la Tabla 5. Los volúmenes de vacuna de 2x50 pl se inyectaron intradérmicamente (i.d.) en la piel de la espalda de las ratas algodoneras. Grupos adicionales se inmunizaron intramuscularmente (i.m.) con RSV inactivado con p-propiolactona (INSTITUT VIRION/SERION GmbH-SERION IMMUNDIAGNOSTICA GmbH), RSV inactivado con formalina (Sigmovir) o RSV/A2 vivo (Sigmovir) (105 unidades formadoras de placa, ufp) para comparar su inmunogenicidad con las vacunas de ARNm. Otros grupo recibieron inyecciones i.m. del anticuerpo anti-RSV monoclonal SYNAGIS® (palivizumab) como inmunización pasiva. SYNAGIS® se administró con una dosis de 15 mg/kg en el día antes de la infección por inoculación de RSV. Así, los animales se pesaron y se calculó la cantidad adecuada de SYNAGIS® de acuerdo con el peso del animal. El volumen máximo para la inyección i.m. fue 200 pl por rata de 100 g. Después de la inmunización las ratas algodoneras se inocularon por infección intranasal (i.n.) con el virus de RSV/A2 (105 UFP en 100 pl; Sigmovir).
Tabla 5: Gru os animales
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Se realizaron los siguientes ensayos para analizar las respuestas inmunitarias: ELISA IgG en suero con la proteína del RSV F, títulos de anticuerpo neutralizante del virus RSV (VNT), titulaciones virales del RSV e histopatología pulmonar.
ELISA IgG en suero de RSV-F
La inducción de anticuerpos de la proteína anti-RSV F se determinaron mediante ELISA de acuerdo con el Ejemplo 2.
Títulos del anticuerpo neutralizante del virus RSV (VNT)
Se analizaron sueros mediante la prueba de neutralización del virus (VNT). Brevemente, las muestras de suero se diluyeron 1:10 con EMEM, se inactivaron con calor y además se diluyeron en series 1:4. Las muestras de suero diluido se incubaron con RSV (25-50 UFP) durante 1 hora a temperatura ambiente y se inocularon por duplicado en monocapas de HEp-2 confluentes en placas de 24 pocillos. Después de una hora de incubación a 37°C en una incubadora con CO2 al 5%, los pocillos se recubrieron con medio de metilcelulosa al 0,75%. Después de 4 días de incubación, el recubrimiento se retiró y las células se fijaron con tinción de cristal violeta al 0,1% durante una hora y luego se enjuagaron y secaron con aire. Los títulos del anticuerpo neutralizante recíproco correspondientes se determinaron al límite de reducción del 60% del control.
Titulaciones virales del RSVe histopatología pulmonar
El día 54, se recolectó el tejido nasal y se homogeneizó para las titulaciones virales. El pulmón se recolectó en bloque y se tri-seccionó para titulación viral (sección izquierda), histopatología (sección derecha) y análisis PCR (lóbulo Ungular). Además, se determinaron los números de copias del genoma viral del RSV (midiendo los números de copias del gen NS-1 del RSV) y los niveles de ARNm de citocina mediante reacción en cadena de la polimerasa-transcripción inversa cuantitativa (qRT-PCR).
Resultados
Como se puede observar en la figura 12, las vacunas de ARNm del RSV-F ya sea solas (RSV-F = R2510; RSV-Fdel554-574 mutante = R2821) o en combinación con los ARNm que codifican para otras proteínas del RSV (RSV-N = R2831; RSV M2-1 = R2833), inducen respuestas inmunitarias humorales específicas de RSV-F en ratas algodoneras como se demuestra por los títulos totales del anticuerpos IgG el día 49.
Como se puede observar en la figura 13, las vacunas de ARNm del RSV-F ya sea solas (RSV-F = R2510; RSV-Fdel554-574 mutante = R2821) o en combinación con los ARNm que codifican para otras proteínas de RSV (RSV-N, R2831 = RSV -M2-1 = R2833), inducen la formación de anticuerpos funcionales RSV específicos en ratas algodoneras como se demuestra por los títulos de anticuerpos neutralizantes del virus.
Como se puede observar en la figura 14, las vacunas de ARNm del RSV-F ya sea solas (RSV-F = R2510; RSV-Fdel554-574 mutante = R2821) o en combinación con los ARNm que codifican para otras proteínas del RSV (RSV-N = R2831; RSV M2-1 = R2833) reducen los títulos virales de pulmón y nasales en ratas algodoneras inoculadas con el virus RSV.
Como se puede observar en la figura 14A, todos los grupos animales vacunados con las vacunas de ARNm mostraron títulos de virus por debajo del nivel de detección de la titulación del virus realizada, demostrando la protección de las ratas algodoneras vacunadas en términos de títulos pulmonares virales. Por el contrario, la vacuna del virus inactivado con formalina redujo sólo al mínimo el título del virus pulmonar en comparación con el grupo control con tampón RiLa. El efecto de la vacuna del RSV inactivado con ppropiolactona fue más pronunciado, pero no redujo el título pulmonar del virus por debajo del nivel de detección en todos los animales de este grupo. Como se puede observar en la figura 14B, el título viral en el tejido nasal también se redujo en gran medida en los grupos vacunados con el ARNm. Los títulos virales nasales del virus inactivado con formalina fueron comparables con el título viral en el grupo vacunado con RiLa. La vacuna del virus inactivado con p-propiolactona fue más efectiva (al menos para dos de los cinco animales). Por el contrario, todos los grupos vacunados con el ARNm tuvieron un título reducido del virus nasal en comparación con el grupo vacunado con RiLa.
Como se puede observar en la Figura 15, el análisis de histopatología pulmonar a partir del estudio de inoculación de ratas algodoneras con el RSV revela diferentes marcas de patología para diversos grupos animales. A partir de la histopatología se puede concluir que ninguno de los grupos vacunados con el ARNm exhibieron una patología pulmonar mejorada, como es el caso para el grupo que se vacunó utilizando la vacuna de RSV inactivado con formalina. Las marcas de patología promedio para peribronquiolitis (PB), perivasculitis (PV), neumonía intersticial (IP) y alveolitis (A) son mucho menores para todos los grupos vacunados con el ARNm en comparación con el grupo H (RSV inactivado con formalina). Además, los grupos que serán vacunados con R2510 (grupo B; RSV F) o R2821 (grupo C; mutante del RSV F) parecen exhibir una patología pulmonar reducida en comparación con el grupo (G) vacunado con el tampón RiLa y el grupo infectado posteriormente con el RSV.
Como se puede observar en la figura 16, la RT-PCR cuantitativa revela diferentes patrones de expresión para los diversos grupos animales. La cuantificación de las copias del genoma del r Sv al medir el gen NS-1 del RSV se muestra en A. los número de copias del genoma se reduce por la vacunación utilizando las vacunas de ARNm en comparación con el control con tampón RiLa (grupo G). Este no es el caso para el grupo que se vacunó utilizando el RSV inactivado con formalina (grupo H). Como se observa en B, la vacunación utilizando la vacuna del RSV inactivado con formalina (grupo H) induce una expresión mejorada de la citoquina IL-4 de TH2 en comparación con el grupo control, que se vacunó con el tampón RiLa (grupo G). Por el contrario, la vacunación con el ARNm R2821 que codifica para el mutante RSV-F reduce significativamente la expresión de ARNm IL-4 en comparación con el grupo control con Rila en el pulmón después de la infección por inoculación del RSV. C. Expresión del ARNm de INF-y. D. Expresión de ARNm de IL-5. La expresión de IL-5 se reduce significativamente en los grupos vacunados utilizando R2510 o R2821 en comparación con los animales vacunados con el tampón RiLa. La expresión ARN de NS-1 viral o los ARNm de citocinas, que se aislaron del tejido pulmonar, se mide en el días 5 después de la inoculación. El análisis estadístico se realizó con la prueba T de Student (* p <0,05 en comparación con el grupo G (control RiLa)).
Ejemplo 7: Estudio II de inoculación de ratas algodoneras RSV
Las vacunas de ARNm que codifican para la proteína (F) de RSV F o la proteína (F*) de RSV-F muíante (RSV F del554-574) se prepararon de acuerdo con el Ejemplo 1. Para evaluar el efecto de una sola o varias vacunaciones (vacunaciones principal y de refuerzo), estas vacunas se administraron una, dos o 3 veces (como se muestra en la Tabla 6). Los volúmenes de vacunas de 2x50 pl se inyectaron intradérmicamente (i.d.) en la piel de la espalda de ratas de algodoneras. Se inmunizaron intramuscularmente (i.m.) grupos adicionales con volúmenes de vacuna de 1 x 100 pl en la pata trasera derecha. Como control, un grupo se inyectó intradérmicamente con tampón de Lactato de Ringer (tampón). Después de la inmunización, las ratas algodoneras se inocularon mediante infección intranasal (i.n.) con el virus RSV/A2 (105 UFP en 100 pl; Sigmovir). Como control, un grupo no se trató y permaneció sin inocular con el virus (no tratado).
Tabla 5: Grupos de animales
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Valoraciones virales del RSV
La determinación de los títulos virales del RSV se realizó como se describe en el Ejemplo 6.
Resultados
Como se muestra en la figura 17A, ya una sola vacunación intradérmica con las vacunas de ARNm que codifican para la proteína F del Rs V (F) o la proteína (F*) del RSV-F mutante (RSV F del554-574) fue bastante eficiente para reducir el título viral en el pulmón en comparación con el grupo con control de tampón. Una segunda y una tercera vacunación (vacunaciones de refuerzo) redujeron los títulos virales por debajo del nivel de detección.
Como se muestra en la figura 17B, dos vacunaciones intramusculares con las vacunas de ARNm que codifican para la proteína (F) del RSVF o la proteína (F*) del RSV-F mutante (RSV F del554-574) redujeron en gran medida el título viral en el pulmón en comparación con el grupo con control de tampón.

Claims (28)

REIVINDICACIONES
1. Secuencia de ARNm que comprende una región codificante que codifica un muíante de la proteína de fusión F del virus respiratorio sincitial (RSV), donde los residuos aminoácido 554-574 de la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión F se han eliminado en el mutante de la proteína de fusión F, donde el contenido en G/C de la región codificante se ha aumentado sustituyendo al menos el 70% de los codones sustituibles en la región codificante en comparación con el contenido en G/C de la región codificante del ARNm de tipo salvaje y donde la secuencia de aminoácidos codificada de dicho ARNm enriquecido en GC no se ha modificado en comparación con la secuencia de aminoácidos codificada del ARNm de tipo salvaje
2. Secuencia de ARNm según la reivindicación 1, donde la proteína de fusión F mutante se deriva de la cepa de RSV ATCC VR-26 long.
3. Secuencia de ARNm según las reivindicaciones 1 o 3, que adicionalmente comprende:
a) una estructura 5'-CAP,
b) una secuencia poli(A),
c) y, opcionalmente, una secuencia poli(C).
4. Secuencia de ARNm según la reivindicación 3, donde la secuencia poli(A) comprende una secuencia de 25 a 400 nucleótidos de adenosina
5. Secuencia de ARNm según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que además comprende al menos un tallo-bucle de histona.
6. Secuencia de ARNm según la reivindicación 5, donde el al menos un tallo-bucle de histona se selecciona de las siguientes fórmulas (I) o (II):
fórm ula (I) (secuencia tallo-bucle sin elementos frontera de tallo):
[N0-2GN3-5] [No-4(U/T)No-4] [N3-5CN0-2]
v V_______ _ ._______ 2 -------- V---------
V
Tallo 1 Bucl le stTallo 2
fórm ula (II) (secuencia tallo-bucle con elementos frontera del tallo):
Figure imgf000097_0001
Elemento Tallol Bucle Tallo2 Elemento frontera de frontera de Tallo1 Tallo2
donde:
elementos frontera del tallo1 o tallo2 N m es una secuencia consecutiva de 1 a 6, preferiblemente de 2 a 6, más preferiblemente de 2 a 5, aún más preferiblemente de 3 a 5, más preferiblemente de 4 a 5 o de 5 N, donde cada N se selecciona independientemente de un nucleótido seleccionado de entre A, U, T, G y C, o un análogo de nucleótido del mismo;
tallo1 [N0-2GN3-5]: es complementaria inversa o complementaria parcialmente inversa con el elemento tallo2 y es una secuencia consecutiva de entre 5 a 7 nucleótidos; donde N0-2 es una secuencia consecutiva de 0 a 2, preferiblemente de 0 a 1, más preferiblemente de 1 N, donde cada N se selecciona independientemente de un nucleótido seleccionado de A, U, T, G y C o un análogo de nucleótido del mismo; donde N3-5 es una secuencia consecutiva de 3 a 5, preferiblemente de 4 a 5, más preferiblemente de 4 N, donde cada N se selecciona independientemente de un nucleótido seleccionado de A, U, T, G y C o un análogo de nucleótido del mismo, y donde G es guanosina o un análogo del mismo, y se puede reemplazar opcionalmente por una citidina o un análogo de la misma, siempre que su citidina de nucleótido complementario en tallo2 se reemplace por guanosina; secuencia bucle [N0-4(U/T)N0-4]: se ubica entre los elementos tallo1 y tallo2 y es una secuencia consecutiva de 3 a 5 nucleótidos, más preferiblemente de 4 nucleótidos; donde cada N0-4 es independiente de otra secuencia consecutiva de 0 a 4, preferiblemente de 1 a 3, más preferiblemente de 1 a 2 N, donde cada N se selecciona de un nucleótido seleccionado de A, U, T, G y C o un análogo de nucleótido del mismo; donde U/T representa uridina, u opcionalmente timidina;
tallo2 [N3-5CN0-2]: es complementaria inversa o complementaria parcialmente inversa al elemento tallol y es una secuencia consecutiva de 5 a 7 nucleótidos; donde N3-5 es una secuencia consecutiva de 3 a 5, preferiblemente de 4 a 5, más preferiblemente de 4 N, donde cada N se selecciona independientemente de un nucleótido seleccionado de A, U, T, G y C o un análogo de nucleótido del mismo; siendo N0-2 una secuencia consecutiva de 0 a 2, preferiblemente de 0 a 1, más preferiblemente de 1 N, donde cada N se selecciona independientemente de un nucleótido seleccionado de A, U, T, G o C o un análogo de nucleótido del mismo; y donde C es citidina o un análogo de la misma, y se puede reemplazar opcionalmente por una guanosina o un análogo de la misma siempre que su guanosina de nucleósido complementario en tallo1 se reemplace por citidina;
donde tallo1 y tallo2 son capaces de apareamiento de bases entre sí formando una secuencia inversa complementaria, donde el apareamiento de bases puede ocurrir entre tallo1 y tallo2 o formando una secuencia complementaria parcialmente inversa, donde un apareamiento de bases incompleto puede ocurrir entre tallo1 y tallo2.
7. Secuencia de ARNm según la reivindicación 6, donde el al menos un tallo-bucle de histona se selecciona de al menos una de las siguientes fórmulas (Ia) o (I Ia):
Figure imgf000098_0001
tallo 1 bucle tallo 2
fórmula (Ia) (secuencia de tallo-bucle sin elementos frontera de tallo)
N2.5 [NwGIMjJ [N,.3(U/T)N0.2] [N3.5CNw ] n 2_s
s-----------------V---------' V.__________________J
Elemento frontera Tallo 1 Tallo 2 Elemento frontera de de tallo 1 bucle tallo 2
fórmula (IIa) (secuencia de tallo-bucle con elementos frontera de tallo)
8. Secuencia de ARNm según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que además comprende un elemento 3'-UTR.
9. Secuencia de ARNm según la reivindicación 8, donde el al menos un elemento 3'UTR comprende o consiste en una secuencia de ácido nucleico que se deriva de una 3'UTR de un gen que proporciona un ARNm estable, donde el elemento 3'UTR preferentemente comprende o consiste en una secuencia de ácido nucleico derivada de una 3'UTR de un gen seleccionado del grupo consistente en un gen de albúmina, un gen de a-globina, un gen de p-globina, un gen de tirosina-hidroxilasa, un gen de lipoxigenasa y un gen de colágeno alfa, donde, con especial preferencia, el elemento 3'-UTR comprende o consiste en una secuencia de ácido nucleico derivado de una 3'UTR de un gen de aglobina, preferentemente comprendiendo la secuencia de ARN correspondiente de la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 29.
10. Secuencia de ARNm según cualquiera de las reivindicaciones 8 o 9, donde la secuencia de ARNm comprende, preferentemente en la dirección 5' a 3':
a) una estructura 5'-CAP, preferentemente m7GpppN;
b) una región codificante que codifica para la proteína de fusión F mutante del virus respiratorio sincitial (RSV);
c) un elemento 3'-UTR que comprende o consiste en una secuencia de ácido nucleico que se deriva de un gen de alfa globina, preferentemente que comprende la secuencia de ARN correspondiente de la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 29,
d) una secuencia poli(A), que preferentemente comprende 64 adenosinas;
e) una secuencia poli(C), que preferentemente comprende 30 citosinas; y
f) un tallo-bucle de histona, que preferentemente comprende la secuencia de ARN correspondiente a la secuencia de ácido nucleico según la SEQ ID NO: 30.
11. Secuencia de ARNm según la reivindicación 8, donde el al menos un elemento 3'UTR comprende o consiste en una secuencia de ácido nucleico que se deriva de la 3'UTR de un gen de albúmina humano.
12. Secuencia de ARNm según la reivindicación 11, donde el elemento 3'UTR se deriva de una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 25, preferentemente de una secuencia de ARN correspondiente.
13. Secuencia de ARNm según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, que además comprende un elemento 5'-UTR que comprende o consiste en una secuencia de ácido nucleico que se deriva de la 5'UTR de un gen TOP, preferentemente de una secuencia de ARN correspondiente, preferentemente sin el motivo 5'TOP.
14. Secuencia de ARNm según la reivindicación 13, donde el elemento 5'UTR comprende o consiste en una secuencia de ácido nucleico que se deriva de una 5'UTR de un gen TOP que codifica una proteína ribosómica, preferentemente de una secuencia de ARN correspondiente, preferentemente sin el motivo 5'To P.
15. Secuencia de ARNm según la reivindicación 14, donde el elemento 5'UTR comprende o consiste en una secuencia de ácido nucleico que se deriva de una 5'UTR de un gen TOP que codifica una proteína ribosómica Large (RPL), preferentemente sin el motivo 5'TOP y con mayor preferencia que comprende o consiste en una secuencia de ARN correspondiente a la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 23.
16. Secuencia de ARNm según la reivindicación 15, donde la secuencia de ARNm comprende, preferentemente en la dirección 5' a 3':
a) una estructura 5'-CAP,
b) un elemento 5'-UTR que comprende o consiste en una secuencia de ácido nucleico que se deriva de la 5'-UTR de un gen TOP, preferentemente que comprende o consiste en la secuencia de ARN correspondiente a la secuencia de ácido nucleico según la SEQ ID NO: 23,
c) una región codificante que codifica el mutante de la proteína de fusión F del virus respiratorio sincitial (RSV),
d) un elemento 3'UTR que comprende o consiste en una secuencia de ácido nucleico que se deriva de un gen que proporciona un ARNm estable, preferentemente que comprende o consiste en la secuencia de ARN correspondiente a una secuencia de ácido nucleico según la SEQ ID NO: 18, e) una secuencia poli(A) que preferentemente comprende 64 adenosinas;
f) una secuencia poli(C), que preferentemente comprende 30 citosinas; y
g) un tallo-bucle de histona, que preferentemente comprende la secuencia de ARN correspondiente a la secuencia de ácido nucleico según la SEQ ID NO: 30.
17. Secuencia de ARNm según la reivindicación 16, donde la secuencia de ARNm comprende la secuencia de ARN de acuerdo con la SEQ ID NO: 33.
18. Secuencia de ARNm según las reivindicaciones 1 a 17, donde la secuencia de ARNm está asociada a o complejada con un compuesto catiónico o policatiónico o un portador polimérico, opcionalmente en una proporción en peso seleccionada de un intervalo de 6:1 (p/p) a 0,25:1 (p/p) ARNm:compuesto catiónico o policatiónico y/o con un portador polimérico; u opcionalmente en una proporción nitrógeno/fosfato entre el ARNm y el compuesto catiónico o policatiónico y/o un portador polimérico en el intervalo de 0,1-10.
19. Secuencia de ARNm según la reivindicación 18, donde la secuencia de ARNm está asociada a o complejada con una proteína o un péptido catiónico, preferentemente protamina, o con un lípido catiónico.
20. Composición que comprende una pluralidad o más de una de las secuencias de ARNm, en cada caso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19.
21. Composición farmacéutica que comprende una secuencia de ARNm como se define según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19 o una composición como se define según la reivindicación 20 y opcionalmente un portador farmacéuticamente aceptable.
22. Composición farmacéutica según la reivindicación 21, donde la secuencia de ARNm está complejada al menos parcialmente con un compuesto catiónico o policatiónico y/o con un portador polimérico, preferentemente proteínas o péptidos catiónicos y con total preferencia con protamina.
23. Composición farmacéutica según la reivindicación 22, donde la proporción entre el ARNm complejado y el ARNm libre se selecciona de un intervalo de 5:1 (p/p) a 1:10 (p/p).
24. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 23, para su uso como una vacuna.
25. Kit o kit de partes que comprende la secuencia de ARNm como se define según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, composición como se define según la reivindicación 20, composición farmacéutica como se define según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 24 y, opcionalmente, instrucciones técnicas con información sobre la administración y dosificación de los componentes.
26. Secuencia de ARNm como se define según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, composición como se define según la reivindicación 20, composición farmacéutica como se define según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 24 y kit o kit de partes como se define según la reivindicación 25, para su uso como un medicamento.
27. Secuencia de ARNm como se define según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, composición como se define según la reivindicación 20, composición farmacéutica como se define según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 24 y kit o kit de partes como se define según la reivindicación 25 para su uso en el tratamiento o la profilaxis de infecciones por RSV.
28. Secuencia de ARNm, composición, composición farmacéutica y kit o kit de partes para su uso según la reivindicación 27, donde el tratamiento se combina con la administración de inmuno-globulina de RSV, en particular Palivizumab.
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