ES2967701T3 - Mejora sinergística de la entrega de ácidos nucleicos mediante formulaciones mezcladas - Google Patents

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Abstract

En el presente documento se describen composiciones farmacéuticas que comprenden "mezclas" de nanopartículas lipídicas y métodos relacionados para usar dichas composiciones mezcladas para administrar polinucleótidos a una o más células, tejidos u órganos diana. Las composiciones mezcladas se caracterizan generalmente por ser capaces de administrar eficazmente polinucleótidos a las células diana y por su capacidad para mejorar la expresión de dichos polinucleótidos y la producción de proteínas funcionales por parte de las células diana. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCION
Mejora sinergística de la entrega de ácidos nucleicos mediante formulaciones mezcladas
ANTECEDENTES
[0001] La entrega eficiente de ácidos nucleicos a células y tejidos específicos, así como la posterior transfección de dichos ácidos nucleicos en dichas células y tejidos específicos sigue siendo un desafío técnico. Por ejemplo, como resultado del tamaño y la carga de los ácidos nucleicos tales como ADN y ARN, la capacidad de administrar eficaz y eficientemente dichos ácidos nucleicos y/o de transfectar dichas células y tejidos objetivo es a menudo limitada.
[0002] Un enfoque para mejorar el suministro de ácidos nucleicos y polinucleótidos a células y tejidos diana ha sido la encapsulación liposomal de ácido nucleico en lípidos, y en particular en lípidos catiónicos. La interacción electrostática del lípido catiónico con ácidos nucleicos facilita la formación de partículas de ácido nucleico encapsuladas en lípidos en intervalos de tamaño que pueden ser adecuados para la administración in vivo. El lípido catiónico cargado positivamente en las superficies externas de las partículas facilita la interacción del liposoma basado en lípidos catiónicos con las membranas celulares cargadas negativamente, promoviendo así la fusión del liposoma con la membrana celular y liberando el liposoma y/o vaciando el contenido de ácido nucleico. del liposoma intracelularmente. Aunque se han descrito previamente varias ventajas del uso de liposomas para facilitar la administración de agentes terapéuticos a células y tejidos diana, todavía existen muchos problemas en aplicaciones in vivo,ex vivoein vitro.Por ejemplo, muchos de los lípidos catiónicos son generalmente tóxicos para las células diana y, en consecuencia, pueden ser de uso limitado. Además, los vehículos liposomales pueden no ser el medio más eficaz para administrar ácidos nucleicos a las células diana o para transfectar posteriormente dichas células.
[0003] El documento US 2011/244026 describe composiciones farmacéuticas para la administración de ARNm que comprenden nanopartículas lipídicas.
[0004] El documento WO 2012/170930 describe composiciones y métodos para modular la producción de una proteína en una célula diana.
[0005] El documento US 2006/216343 describe composiciones farmacéuticas que comprenden un oligonucleótido como agente activo, estando adaptado el oligonucleótido para diana de ácidos nucleicos que codifican CD40, y un liposoma como excipiente.
[0006] Xingfang Su et al., 240a Reunión Nacional de la Sociedad Química Estadounidense, 25 y 26 de agosto de 2010, describen una nanopartícula biodegradable envuelta en lípidos.
[0007] Yuhua Wang y col., Mol Ther. 2013 Feb;21(2):358-6, propone una administración sistémica de ARN mensajero (ARNm) modificado químicamente como alternativa al ADN plasmídico (ADNp) en la terapia génica del cáncer.
[0008] Todavía se necesitan nuevos enfoques y terapias para mejorar las eficiencias de administración y/o transfección de polinucleótidos y ácidos nucleicos, particularmente aquellos administrados en vehículos de administración de liposomas, como las formulaciones liposomales encapsuladas. El desarrollo de vehículos de administración de liposomas y formulaciones liposomales nuevos y mejorados que demuestren eficiencias mejoradas de administración y/o transfección avanzaría aún más en las terapias basadas en ácidos nucleicos para el tratamiento de enfermedades, como las terapias de silenciamiento de genes y ARNm, que pueden beneficiarse de las terapias de reemplazo genético. Terapias de administración de ARNm y/u otras terapias que incluyen la administración intracelular de ácidos nucleicos para la modulación de la expresión de genes, proteínas y/o enzimas.
RESUMEN
[0009] La invención proporciona una composición farmacéutica para la administración mejorada sinérgicamente de uno o más polinucleótidos encapsulados a una o más células diana, para su uso en un método para tratar o prevenir una enfermedad o trastorno relacionado con la deficiencia de una o más proteínas y/o enzimas, dicha composición que comprende ARNm como un primer polinucleótido encapsulado y una mezcla de al menos una primera nanopartícula lipídica y una segunda nanopartícula lipídica, en la que la primera nanopartícula lipídica encapsula uno o más polinucleótidos; y en el que la primera nanopartícula lipídica comprende al menos un lípido distinto de la segunda nanopartícula lipídica.
[0010] La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento inesperado de que una mezcla de múltiples nanopartículas lipídicas no idénticas mejora sinérgicamente la expresión del ARN mensajero (ARNm) encapsulado dentro de al menos una de las nanopartículas lipídicas in vivo. Este efecto sinérgico se observa en una amplia variedad de diferentes nanopartículas lipídicas mezcladas en diversas proporciones y mediante diferentes modos de administración. Por ejemplo, en algunos casos, las mejoras en la expresión de proteínas (por ejemplo, evidenciadas por la emisión de luz de una luciferasa de luciérnaga) oscilaron entre aproximadamente 1,5 y 30 veces en comparación con el total aditivo basado en cada nanopartícula individual. La sinergia también se observa en la expresión sistémica y específica de tejido del ARNm. Más sorprendentemente, este efecto sinérgico no es específico del ácido nucleico. Por ejemplo, un ARNm no fluorescente puede mejorar sinérgicamente la producción de luz de un ARNm fluorescente. Se contempla que este descubrimiento inesperado de mejora sinérgica entre diferentes formulaciones de lípidos tiene implicaciones significativas en la terapia con<a>R<n>mensajero porque permite lograr una eficacia terapéutica equivalente mediante la administración de una dosis significativamente menor. La capacidad de crear una producción sinérgica de proteínas a través de la administración de ARNm en nanopartículas basadas en lípidos también permite una ventana terapéutica mucho mayor para el tratamiento de una serie de enfermedades y logra una eficacia igual o mayor al tiempo que minimiza cualquier evento adverso o tóxico. Por tanto, la presente invención proporciona una terapia de ARN mensajero más segura y potente para diversas enfermedades.
[0011] Entre otras cosas, en el presente documento se describen composiciones farmacéuticas que comprenden una mezcla de al menos dos nanopartículas lipídicas (por ejemplo, una mezcla de una primera nanopartícula lipídica y una segunda nanopartícula lipídica) y métodos relacionados para usar dichas composiciones de nanopartículas combinadas, como se define en las reivindicaciones. Al menos una de las nanopartículas lipídicas constituyentes que comprende la composición de nanopartículas lipídicas mezcladas encapsula ARNm. Las composiciones de nanopartículas lipídicas mezcladas descritas en el presente documento se caracterizan por ser capaces de administrar eficazmente los polinucleótidos encapsulados a las células diana, y también se caracterizan por su capacidad para mejorar la transfección posterior de dichos polinucleótidos encapsulados después de ponerse en contacto con una o más de dichas células diana. Las composiciones de nanopartículas lipídicas mezcladas también se caracterizan por su capacidad para modular o mejorar (por ejemplo, aumentar sinérgicamente) la expresión de los polinucleótidos encapsulados en ellas por las células diana. Las composiciones de nanopartículas lipídicas mezcladas también pueden caracterizarse por su capacidad para mejorar la producción de polipéptidos codificados por dichos polinucleótidos.
[0012] Tal como se utiliza en el presente documento, el término “mezcla”, “combinado” o equivalente gramatical se refiere a una combinación de dos o más formulaciones separadas no idénticas. Normalmente, las dos o más formulaciones separadas no idénticas se combinan o mezclan en una composición, tal como una suspensión, como se representa, por ejemplo, en la FIG. 1. Como se usa en este documento, formulaciones no idénticas se refieren a formulaciones que contienen al menos un componente lipídico distinto. Las formulaciones no idénticas adecuadas para mezclas pueden contener al menos un componente lipídico catiónico distinto. El término “mezcla” como se usa en el presente documento se distingue de los términos “mezcla” o “mezcla”, que se usan en el presente documento para definir una única formulación que contiene múltiples lípidos catiónicos/ionizables no idénticos, múltiples lípidos auxiliares no idénticos y/o múltiples lípidos pegilados no idénticos. Una formulación “mezclada” puede contener al menos dos o más lípidos catiónicos/ionizables no idénticos. Normalmente, una formulación “mezclada” contiene una única población homogénea de nanopartículas lipídicas.
[0013] Ciertos casos divulgados se relacionan con métodos de expresión de uno o más polinucleótidos en una o más células diana. Por ejemplo, cuando los polinucleótidos son ARNm que codifican una proteína funcional, en el presente documento se describen métodos para mejorar la producción y/o excreción de polipéptidos codificados por dichos polinucleótidos por una célula diana. Ciertos casos se refieren a métodos para modular la expresión de uno o más polinucleótidos o ácidos nucleicos (por ejemplo, un ácido nucleico diana) en una o más células diana, usando, por ejemplo, un oligonucleótido antisentido. Dichos métodos pueden comprender poner en contacto una o más células diana con una composición farmacéutica que comprende una mezcla de al menos dos nanopartículas lipídicas (por ejemplo, una primera nanopartícula lipídica y una segunda nanopartícula lipídica), en donde dichas primera y segunda nanopartículas lipídicas tienen diferentes composiciones lipídicas (por ejemplo, la primera composición lipídica comprende un lípido catiónico diferente que la segunda composición de nanopartículas lipídicas). En ciertos casos, al menos una de las dos o más nanopartículas lipídicas que comprenden la composición de nanopartículas lipídicas mezcladas comprende uno o más polinucleótidos. Por ejemplo, la primera nanopartícula lipídica puede encapsular uno o más polinucleótidos y la segunda nanopartícula lipídica puede encapsular opcionalmente uno o más polinucleótidos.
[0014] En ciertas formas de realización, la primera nanopartícula lipídica y la segunda nanopartícula lipídica mezcladas comprenden el mismo uno o más polinucleótidos, en donde la expresión de uno o más polinucleótidos por las células diana después de la administración (por ejemplo, por vía intravenosa) de la composición farmacéutica mezclada a un sujeto excede la suma relativa de la expresión de uno o más polinucleótidos conseguida por la primera nanopartícula lipídica y la expresión de uno o más polinucleótidos conseguida por la segunda nanopartícula lipídica cuando la primera nanopartícula lipídica y la segunda nanopartícula lipídica se administran al sujeto de forma independiente el uno del otro. Por ejemplo, en determinadas formas de realización, la expresión de uno o más polinucleótidos por las células diana después de la administración (por ejemplo, por vía intravenosa) de dicha composición farmacéutica combinada a un sujeto puede exceder la suma relativa de la expresión de uno o más polinucleótidos lograda por la primera nanopartícula lipídica y la expresión de uno o más polinucleótidos lograda por la segunda nanopartícula lipídica cuando la primera nanopartícula lipídica y la segunda nanopartícula lipídica se administran independientemente al sujeto por al menos aproximadamente dos, cinco, diez, doce, quince, veinte, veinticinco, treinta, cuarenta, cincuenta veces o más.
[0015] En ciertas formas de realización, la primera nanopartícula lipídica y la segunda nanopartícula lipídica mezcladas comprenden el mismo uno o más polinucleótidos (ARNm), en donde la producción de uno o más polipéptidos o proteínas (por ejemplo, una enzima) por las células diana después de la administración (por ejemplo, por vía intravenosa) de la composición farmacéutica mezclada a un sujeto excede la suma relativa de la producción de uno o más polipéptidos o proteínas (por ejemplo, una enzima) producida después de la administración de dichos uno o más polinucleótidos lograda por la primera nanopartícula lipídica y el uno o más polipéptidos producidos después de la administración de uno o más polinucleótidos logrados por la segunda nanopartícula lipídica cuando la primera nanopartícula lipídica y la segunda nanopartícula lipídica se administran al sujeto independientemente entre sí. Por ejemplo, en ciertas formas de realización en las que los polinucleótidos comprenden ARNm, los polipéptidos producidos después de la administración de dichos polinucleótidos a las células diana después de la administración (por ejemplo, por vía intravenosa) de dicha composición farmacéutica combinada a un sujeto pueden exceder la suma relativa de los polipéptidos producidos después de la administración de tales polinucleótidos lograda por la primera nanopartícula lipídica y los polipéptidos producidos después de la administración de tales polinucleótidos lograda por la segunda nanopartícula lipídica cuando la primera nanopartícula lipídica y la segunda nanopartícula lipídica se administran independientemente al sujeto por al menos aproximadamente dos, cinco, diez, doce, quince, veinte, veinticinco, treinta, cuarenta, cincuenta, sesenta, setenta, ochenta, noventa, cien, quinientos, mil veces o más.
[0016] En otra forma de realización, solo una de las dos o más nanopartículas lipídicas que comprenden la composición mezclada comprende o encapsula un polinucleótido. Por ejemplo, cuando las composiciones farmacéuticas comprenden dos nanopartículas lipídicas mezcladas, sólo la primera nanopartícula lipídica comprende uno o más polinucleótidos mientras que la segunda nanopartícula lipídica no comprende un polinucleótido (es decir, el segundo polinucleótido está vacío). En tal forma de realización, después de la administración (por ejemplo, por vía intravenosa) de las dos primera y segunda nanopartículas lipídicas mezcladas que comprenden la composición farmacéutica al sujeto, la producción de uno o más polipéptidos o proteínas codificadas por los polinucleótidos encapsulados por una célula diana es mejorada en relación con la producción de uno o más polipéptidos o proteínas observada cuando la primera nanopartícula lipídica se administra al sujeto independientemente de la segunda nanopartícula lipídica. Por ejemplo, en tal forma de realización, la producción de uno o más polipéptidos o proteínas por las células diana después de la administración de dicha composición farmacéutica mezclada a un sujeto excede la producción de uno o más polipéptidos o proteínas cuando la primera nanopartícula lipídica es administrada al sujeto independientemente de la segunda nanopartícula lipídica en al menos aproximadamente dos, cinco, diez, doce, quince o veinte veces, veinticinco, treinta, cuarenta, cincuenta, cien, quinientos, mil veces o más.
[0017] Al poner en contacto una o más células diana con las composiciones de nanopartículas lipídicas mezcladas descritas en el presente documento (por ejemplo, administrando por vía intravenosa la composición farmacéutica mezclada a un sujeto), una o más de dichas células diana se transfectan con y pueden expresar uno o más polinucleótidos y/o mejorar la producción de uno o más polipéptidos o proteínas funcionales codificados por dichos uno o más polinucleótidos. En determinadas formas de realización, poner en contacto dichas células diana con las nanopartículas lipídicas mezcladas y las composiciones farmacéuticas de manera que las células diana sean transfectadas por uno o más polinucleótidos encapsulados mejora (por ejemplo, aumenta sinérgicamente) la expresión de dichos polinucleótidos y/o aumenta la producción de un producto de proteína o polipéptido funcional que puede ser útil en el tratamiento de una enfermedad o condición patológica (por ejemplo, enfermedades resultantes de una deficiencia de proteína o enzima). En ciertas formas de realización, tras o después de la transfección mediante las composiciones de nanopartículas lipídicas mezcladas descritas en el presente documento, la expresión de los polinucleótidos encapsulados y/o la producción de un polipéptido o proteína funcional por una o más células diana aumenta sinérgicamente, y en particular aumenta sinérgicamente en relación con a la expresión de los polinucleótidos y/o producción de un polipéptido o proteína funcional que se observa cuando las nanopartículas lipídicas constituyentes que comprenden la composición mezclada (por ejemplo, la primera nanopartícula lipídica y la segunda nanopartícula lipídica) se administran independientemente una de otra. La expresión de los polinucleótidos encapsulados que comprenden la composición mezclada (y/o cuando dichos polinucleótidos comprenden ARNm, la producción de los polipéptidos codificados por dichos polinucleótidos encapsulados) se puede aumentar, por ejemplo, en al menos aproximadamente dos, tres, cuatro, cinco, seis, ocho, diez, doce, quince, veinte, veinticinco, treinta, cuarenta o cincuenta veces, o más en relación con la expresión del polinucleótido (y/o la producción de polipéptido donde dicho polinucleótido comprende ARNm) que se observa cuando las nanopartículas lipídicas constituyentes que comprenden la formulación combinada se administran de forma independiente.
[0018] También se describen en el presente documento métodos para modular o aumentar la expresión de uno o más polinucleótidos y métodos para aumentar la producción de uno o más polipéptidos o proteínas funcionales en una o más células diana (por ejemplo, células diana de un sujeto al que se le aplica las composiciones de nanopartícula lipídica mezclada). Dichos métodos pueden comprender la etapa de administrar o de otro modo poner en contacto células o tejidos específicos con una composición farmacéutica que comprende una mezcla de al menos una primera nanopartícula lipídica y una segunda nanopartícula lipídica, en donde la primera nanopartícula lipídica comprende uno o más polinucleótidos. Después de la administración o de poner en contacto de otro modo células o tejidos diana con las composiciones de nanopartículas lipídicas mezcladas, se transfectan una o más células diana con uno o más polinucleótidos encapsulados en una o más de las nanopartículas lipídicas constituyentes, de manera que la expresión de uno o más polinucleótidos y/o la producción de uno o más polipéptidos o proteínas funcionales se incrementa o aumenta sinérgicamente con respecto a la expresión de uno o más polinucleótidos o la producción de uno o más polipéptidos o proteínas funcionales cuando la primera nanopartícula lipídica se administra independientemente de la segunda nanopartícula lipídica. En ciertas formas de realización, la expresión de los polinucleótidos encapsulados que comprenden la composición mezclada puede aumentarse, por ejemplo, en al menos aproximadamente dos, cuatro, cinco, diez, doce, quince, veinte o veinticinco, cincuenta, setenta y cinco, cien, doscientas, quinientas, mil veces o más en relación con la expresión observada cuando las nanopartículas lipídicas constituyentes que comprenden la formulación combinada se administran de forma independiente.
[0019] También se describen en el presente documento composiciones farmacéuticas que comprenden una mezcla de una primera nanopartícula lipídica y una segunda nanopartícula lipídica, en las que la primera nanopartícula lipídica comprende uno o más polinucleótidos, como se define en las reivindicaciones. En determinadas formas de realización, tanto la primera como la segunda nanopartículas lipídicas comprenden o encapsulan el mismo polinucleótido o uno diferente. Al poner en contacto una o más células diana con la composición farmacéutica, uno o más polinucleótidos encapsulados por las nanopartículas lipídicas constituyentes transfectan las células diana y se expresan, y cuando dichos polinucleótidos comprenden ARNm, producen de ese modo un polipéptido o proteína funcional. En ciertas formas de realización, la expresión de uno o más polinucleótidos por las células diana excede la suma relativa de la expresión de uno o más polinucleótidos lograda por la primera nanopartícula lipídica y la segunda nanopartícula lipídica que comprenden la composición farmacéutica cuando las células diana son en contacto con la primera nanopartícula lipídica y la segunda nanopartícula lipídica independientemente de la otra. En otras formas de realización, la producción de uno o más polipéptidos funcionales por las células diana excede la suma relativa de la producción de uno o más polipéptidos funcionales lograda por la primera nanopartícula lipídica y la segunda nanopartícula lipídica que comprenden la composición farmacéutica cuando las células diana se ponen en contacto con la primera nanopartícula lipídica y la segunda nanopartícula lipídica independientemente de la otra.
[0020] En determinadas formas de realización, la primera nanopartícula lipídica o la segunda nanopartícula lipídica comprende uno o más lípidos catiónicos. Por ejemplo, una o ambas de la primera y segunda nanopartículas lipídicas pueden incluir una o más de C12-200, DOTAP (1,2-dioleil-3-trimetilamonio propano), DODAP (1,2-dioleil-3-dimetilamonio propano), DOTMA (propano de 1,2-di-O-octadecenil-3-trimetilamonio), DLinDMA, DLin-KC2-DMA, HGT4003 e ICE.
[0021] En determinadas formas de realización, la primera nanopartícula lipídica o la segunda nanopartícula lipídica comprenden uno o más lípidos auxiliares. Por ejemplo, una o ambas de la primera y segunda nanopartículas lipídicas que comprenden las composiciones farmacéuticas mezcladas pueden incluir uno o más lípidos auxiliares que se seleccionan del grupo que consiste en DSPC (1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfocolina), DPPC (1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina), DOPE (1,2-dioleil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina), DPPE (1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina), DMPE (1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina), DOPG (,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfo-(1'-rac-glicerol)) y colesterol.
[0022] De manera similar, en ciertas formas de realización, la primera nanopartícula lipídica o la segunda nanopartícula lipídica pueden comprender uno o más lípidos modificados con PEG. Por ejemplo, una o ambas de la primera y segunda nanopartículas lipídicas pueden comprender uno o más lípidos modificados con PEG que comprenden una cadena de poli(etilen)glicol de hasta 5 kDa de longitud unida covalentemente a un lípido que comprende una o más cadenas alquílicas de C<6>-C<20>de longitud.
[0023] En ciertas formas de realización, una o más de las al menos dos nanopartículas lipídicas que comprenden las composiciones mezcladas de la invención se preparan combinando o comprenden múltiples componentes lipídicos, no lipídicos y/o poliméricos. Por ejemplo, la primera nanopartícula lipídica o la segunda nanopartícula lipídica pueden comprender DLinDMA, CHOL, DOP<e>y<d>MG-PEG-2000. En algunas formas de realización, la primera nanopartícula lipídica o la segunda nanopartícula lipídica comprende C12-200, CHOL, DOPE y DMG-PEG-2000. En algunas formas de realización, la primera nanopartícula lipídica o la segunda nanopartícula lipídica comprende DLinKC2, CHOL, DOPE y DMG-PEG-2000. De manera similar, una o más de la primera nanopartícula lipídica y la segunda nanopartícula lipídica pueden comprender uno o más lípidos seleccionados del grupo que consiste en ICE, DSPC, CHOL, DODAP, DOT<a>P y C8-PEG-2000. En otra forma de realización, la primera nanopartícula lipídica o la segunda nanopartícula lipídica comprende ICE, DOPE y DMG-PEG-2000. Aún en otra forma de realización, la primera nanopartícula lipídica o la segunda nanopartícula lipídica comprende HGT4003, DOPE, CHOL y DMG-PEG-2000.
[0024] Las composiciones de lípidos de las dos o más nanopartículas de lípidos mezcladas proporcionadas en el presente documento son diferentes (por ejemplo, tienen diferentes composiciones de lípidos). Por ejemplo, en la presente se contemplan composiciones mezcladas en las que la primera nanopartícula lipídica comprende un lípido catiónico, y en las que la segunda nanopartícula lipídica comprende un lípido catiónico que es diferente del lípido catiónico que comprende la primera nanopartícula lipídica.
[0025] También se describen en el presente documento métodos para mejorar o aumentar de otro modo (por ejemplo, aumentar sinérgicamente) la entrega o la velocidad de entrega de uno o más polinucleótidos a una o más células diana, así como métodos para mejorar el tiempo de residencia de uno o más polinucleótidos dentro de una célula objetivo. Dichos métodos generalmente comprenden poner en contacto una o más células diana con una composición farmacéutica que comprende una mezcla de al menos dos nanopartículas lipídicas, teniendo cada una una composición lipídica diferente, de manera que la administración de los polinucleótidos (por ejemplo, a una o más células diana, tejidos u órganos) se mejora. Tras la administración de uno o más polinucleótidos (por ejemplo, uno o más oligonucleótidos antisentido) a o dentro de las células diana, dicho polinucleótido puede ejercer su función prevista (por ejemplo, modular la expresión de un ácido nucleico diana tal como ARNm). Por ejemplo, un oligonucleótido antisentido puede modular o disminuir (por ejemplo, disminuir sinérgicamente) la expresión de un gen o ácido nucleico diana. Como alternativa, tras la administración de los polinucleótidos a las células diana, la producción de un péptido o proteína funcional codificada por dicho polinucleótido se incrementa o aumenta sinérgicamente.
[0026] Las composiciones combinadas y los métodos de uso descritos en el presente documento pueden formularse para dirigirse específicamente y transfectar una o más células, tejidos y órganos diana. Por ejemplo, las células diana contempladas pueden comprender una o más células seleccionadas del grupo que consiste en hepatocitos, células epiteliales, células hematopoyéticas, células epiteliales, células endoteliales, células pulmonares, células óseas, células madre, células mesenquimales, células neurales, células cardíacas, adipocitos, células del músculo liso vascular, cardiomiocitos, células del músculo esquelético, células beta, células pituitarias, células del revestimiento sinovial, células ováricas, células testiculares, fibroblastos, células B, células T, reticulocitos, leucocitos, granulocitos y células tumorales.
[0027] Las composiciones de nanopartículas lipídicas mezcladas proporcionadas en el presente documento y los métodos para usar dichas composiciones mezcladas comprenden uno o más polinucleótidos (ARNm). Dichos polinucleótidos pueden codificar, por ejemplo, un polipéptido, proteína o enzima funcional, y al ser expresados (por ejemplo, traducidos) por una o más células diana se produce un producto polipeptídico funcional (por ejemplo, una proteína o enzima), y en algunos casos secretarse por la célula diana a la circulación periférica. En ciertas formas de realización, uno o más de los polinucleótidos que están encapsulados por una o más de las nanopartículas lipídicas constituyentes que comprenden las composiciones mezcladas codifican un polipéptido que el sujeto expresa de manera aberrante, como se define en las reivindicaciones. En ciertas formas de realización, uno o más de los polinucleótidos encapsulados que comprenden las formulaciones de nanopartículas lipídicas mezcladas codifican una enzima funcional tal como una enzima del ciclo de la urea (por ejemplo, omitina transcarbamilasa (OTC), carbamoil fosfato sintetasa 1 (CFS1), argininosuccinato sintetasa (ASS1), argininosuccinato liasa (ASL) o arginasa 1 (ARG1)). En determinadas formas de realización, uno o más de los polinucleótidos encapsulados comprende ARNm que codifica una enzima asociada con un trastorno de almacenamiento lisosomal (por ejemplo, el polinucleótido encapsulado es ARNm que codifica una o más de las enzimas agalsidasa alfa, alfa L-iduronidasa, iduronato-2-sulfatasa, N-acetilglucosamina-1-fosfato transferasa, N-acetilglucosaminidasa, alfa-glucosaminida acetiltransferasa, N-acetilglucosamina 6-sulfatasa, N-acetilgalactosamina-4-sulfatasa, beta-glucosidasa, galactosa-6-sulfato sulfatasa, beta-galactosidasa, beta-glucuronidasa, glucocerebrosidasa, heparán sulfamidasa, hialuronidasa y galactocerebrosidasa). Como alternativa, en algunas formas de realización, uno o más de los polinucleótidos encapsulados que comprenden las formulaciones de nanopartículas lipídicas mezcladas comprenden SEQ ID NO: 2 o Se Q ID NO: 3.
[0028] También se contempla en la presente el uso de ARNm que comprende una o más modificaciones químicas. En determinadas formas de realización, dichas modificaciones químicas hacen que el ARNm sea más estable y pueden comprender, por ejemplo, una modificación de bloqueo terminal de una región no traducida 5' o 3' del ARNm. En determinadas formas de realización, la modificación química comprende la inclusión de una secuencia parcial de un gen 1 temprano inmediato (IE1) de CMV en la región 5' no traducida del ARNm. En otras formas de realización, la modificación química comprende la inclusión de una cola poli A en la región 3' no traducida del ARNm. También se contemplan modificaciones químicas que comprenden la inclusión de una estructura Cap1 en la región 5' no traducida del ARNm. Aún en otras formas de realización, la modificación química comprende la inclusión de una secuencia que codifica la hormona del crecimiento humano (hGH) en la región 3' no traducida del ARNm.
[0029] También se describen en el presente documento métodos para manipular la expresión mejorada (por ejemplo, aumentada sinérgicamente) de uno o más polinucleótidos que están encapsulados en una o más de la primera o segunda nanopartículas lipídicas que comprenden las composiciones mezcladas y métodos para manipular la producción mejorada de los polipéptidos codificados por dichos uno o más polinucleótidos encapsulados. Por ejemplo, la proporción relativa de la primera y segunda nanopartículas lipídicas se puede ajustar (por ejemplo, basándose en la masa del polinucleótido encapsulado) para mejorar la expresión de uno o más de los polinucleótidos encapsulados y/o para mejorar la producción de uno o más de los polinucleótidos encapsulados por tales polinucleótidos encapsulados. La relación entre uno o más polinucleótidos que comprenden la primera nanopartícula lipídica y uno o más polinucleótidos que comprenden la segunda nanopartícula lipídica en la composición farmacéutica puede ser aproximadamente 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 11:1, 12:1, 15:1,20:1,25:1, 30:1, 40:1, 50 :1 ,60:1, 75:1, 100:1, 125:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:15, 1:20, 1:25, 1:30, 1:40, 1:50, 1:60, 1:75, 1:100, 1:125 o más. De manera similar, la expresión mejorada (por ejemplo, aumentada sinérgicamente) de uno o más polinucleótidos que están encapsulados en una o más de la primera o segunda nanopartículas lipídicas que comprenden las composiciones mezcladas se puede manipular variando el contenido y las concentraciones relativas de una o más lípidos, no lípidos, lípidos auxiliares y lípidos modificados con PEG que comprenden dichas nanopartículas lipídicas. Además, la producción mejorada (por ejemplo, aumentada sinérgicamente) por células diana de uno o más polipéptidos o proteínas funcionales codificadas por polinucleótidos encapsulados en la primera o segunda nanopartículas lipídicas que comprenden las composiciones mezcladas se puede manipular variando el contenido y las concentraciones relativas de uno o más de los lípidos, no lípidos, lípidos auxiliares y lípidos modificados con PEG que comprenden dichas nanopartículas lipídicas.
[0030] Las mejoras sinérgicas en la expresión de polinucleótidos encapsulados que caracterizan las formulaciones de nanopartículas lipídicas mezcladas de la presente invención y/o la producción sinérgica de polipéptidos codificados por las mismas por una o más células diana permiten concentraciones terapéuticamente efectivas de polinucleótidos producidos (por ejemplo, una proteína o enzima terapéutica) que se logrará en los tejidos diana (o suero si el producto polipeptídico es excretado por la célula diana) usando una dosis de polinucleótido significativamente menor de lo que se anticipó previamente. Por consiguiente, en determinadas formas de realización, la cantidad eficaz de un polinucleótido necesaria para lograr un efecto terapéutico deseado se puede reducir encapsulando dicho polinucleótido en una o más nanopartículas lipídicas y mezclando al menos dos nanopartículas lipídicas. Dichos métodos comprenden una etapa de administrar una composición farmacéutica al sujeto, en donde la composición farmacéutica comprende una primera nanopartícula lipídica mezclada con una segunda nanopartícula lipídica, y en donde una o ambas de la primera nanopartícula lipídica y la segunda nanopartícula lipídica comprenden el polinucleótido, seguido mediante la transfección de una o más células diana del sujeto con tales polinucleótidos, de manera que la cantidad del polinucleótido requerida para efectuar un efecto terapéutico se reduce (por ejemplo, reducida con respecto a la cantidad de polinucleótido requerida para efectuar un efecto terapéutico usando una composición mezclada u otras técnicas estándar). En determinadas formas de realización, la cantidad de un polinucleótido necesaria para efectuar un efecto terapéutico se reduce en al menos aproximadamente un 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 75 %, 80 %, 90 %, 95 % o 99 % con respecto a la cantidad de polinucleótido requerida para efectuar un efecto terapéutico usando una composición no mezclada u otras técnicas estándar. En determinadas formas de realización, la cantidad de un polinucleótido necesaria para efectuar un efecto terapéutico se reduce en al menos dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, diez, doce, quince, veinte, veinticinco, treinta, cuarenta o cincuenta veces o más con respecto a la cantidad de polinucleótido requerida para efectuar un efecto terapéutico usando una composición no mezclada u otras técnicas estándar.
[0031] Las características discutidas anteriormente y muchas otras características y ventajas inherentes de la presente invención se entenderán mejor con referencia a la siguiente descripción detallada de la invención cuando se toma en conjunto con los ejemplos adjuntos. Las diversas formas de realización descritas en el presente documento son complementarias y pueden combinarse o usarse juntas de una manera que entienda el experto en vista de las enseñanzas contenidas en el presente documento.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
[0032]
La Figura 1 es un esquema que representa una “mezcla” de formulación, que generalmente se define como una combinación de dos o más formulaciones separadas y no idénticas en una.
La Figura 2 ilustra la producción de luminiscencia de la proteína luciferasa de luciérnaga en hígados de ratones después del tratamiento con nanopartículas lipídicas encapsuladas en ARNm de luciferasa de luciérnaga (FFL) basadas en varios lípidos catiónicos. Las dosis de ARNm de FFL encapsulado evaluadas fueron C12-200 (30 |jg), DLin-KC2-DMA (90 |jg), HGT4003 (200 |jg), ICE (200 |jg) y DODAP (200 |jg). Los dos controles incluían una nanopartícula lipídica catiónica basada en C12-200 que encapsulaba un ARNm no fluorescente (dosis de 30 jig) y un vehículo de PBS. Los valores se representan como URL medianas/mg de proteína total en el hígado cuatro horas después de la administración.
La Figura 3 ilustra la producción de luminiscencia de la proteína luciferasa de luciérnaga en hígados de ratones cuatro horas después del tratamiento con nanopartículas lipídicas encapsuladas en ARNm de FFL. Las formulaciones comparadas fueron una formulación basada en C12-200 (dosis de 30 jig), una formulación basada en DLin-KC2-DMA (dosis de 90 jg), una formulación única mixta de C12-200/DLin-Kc2-DMA (dosis de 30 jg ) y una mezcla de dos formulaciones independientes basadas en C12-200 y DLin-KC2-DMA. Como se representa en la Figura 3, la formulación combinada (dosis de 120 jg , proporción 1:3 de ARNm de FFL encapsulado en C12-200:ARNm de FFL encapsulado en DLin-KC2-DMA, respectivamente) demostró una mejora sinérgica de la luminiscencia.
La Figura 4 ilustra una comparación de la producción de luminiscencia de la proteína luciferasa de luciérnaga en hígados de ratón basada en dos proporciones de formulaciones mezcladas. Las formulaciones individuales de HGT4003 e ICE se dosificaron a 100 jg de ARNm de luciferasa de luciérnaga (FFL) encapsulado cada una. Las dos formulaciones combinadas se administraron a una dosis total de 200 jg de ARNm de FFL encapsulado. Los valores se representan como URL medianas/mg de proteína total en el hígado cuatro horas después de la administración.
La Figura 5 ilustra la comparación de luminiscencia cuando se mezclan formulaciones que encapsulan ARNm fluorescente (FFL) y no fluorescente (GALT). Las formulaciones basadas en C12-200 evaluadas se dosificaron a 30 jg , mientras que las formulaciones basadas en DLin KC2-DMA se dosificaron a 90 jg de ARNm. Las formulaciones mezcladas se dosificaron a 120 jg de ARNm total. Los valores se representan como URL medianas/mg de proteína total en el hígado cuatro horas después de la administración.
La Figura 6 ilustra la comparación de luminiscencia de hígados tratados cuando se mezclan formulaciones que encapsulan fluorescentes (FFL) con nanopartículas lipídicas vacías (sin ARNm). Todas las nanopartículas lipídicas basadas en C12-200 se dosificaron con 30 jg de ARNm (o equivalente), mientras que las formulaciones basadas en DLin-KC2-DMA se dosificaron con 90 jg de ARNm (o equivalente). Las formulaciones mezcladas se dosificaron a 120 jg de equivalente de ARNm. Los valores se representan como URL medianas/mg de proteína total en el hígado cuatro horas después de la administración.
La Figura 7 ilustra la producción de luminiscencia de la proteína luciferasa de luciérnaga en los tejidos cerebrales de ratones después de la administración intracerebroventricular (ICV) de nanopartículas lipídicas encapsuladas en ARNm de luciferasa de luciérnaga (FFL). Las formulaciones comparadas fueron formulaciones basadas en C12-200 (dosis de 0,96 |jg) y formulaciones basadas en DLin-KC2-DMA (dosis de 2,87 |jg), tanto individualmente como en relación con una mezcla de estas dos formulaciones en una proporción de 1:3 (dosis de 3,83 jg ). Los valores se representan como URL medianas/mg de proteína total en el cerebro cuatro horas después de la administración.
La Figura 8 ilustra una comparación de la proteína eritropoyetina (EPO) humana secretada después de la administración intravenosa de nanopartículas lipídicas encapsuladas en ARNm de EPO. Se tomaron muestras de sangre cuatro horas después de la inyección. Como se ilustra en la FIG. 8, todas las formulaciones demostraron una secreción exitosa de EPO humana por parte de las células objetivo. Cada formulación combinada demostró una mejora sinérgica de la producción de proteínas. Las dosis se representan en la FIG. 8 (entre paréntesis) como microgramos de ARNm de EPO humana encapsulado.
La Figura 9 ilustra el aumento sinérgico de la producción de proteínas cuando se analiza mediante transferencia Western. Una mezcla de una nanopartícula lipídica basada en C12-200 cargada con ARNm de EPO humana con una nanopartícula lipídica análoga cargada con DLin-KC2-DMA muestra una banda fuerte (carril 4) significativa de la proteína EPO humana aislada del suero cuatro horas después de la administración. El carril correspondiente a una formulación individual de C12-200 (carril 2) produce una banda moderadamente detectada, mientras que la de la formulación basada en DLin KC2-DMA (carril 3) es indetectable.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
[0033] En el presente documento se divulgan composiciones farmacéuticas que comprenden una mezcla de al menos dos nanopartículas lipídicas, al menos una de las cuales comprende un polinucleótido como se define en las reivindicaciones, y métodos relacionados para usar tales composiciones farmacéuticas como un medio altamente eficaz para aumentar la expresión de dichos polinucleótidos. También se proporcionan composiciones farmacéuticas combinadas que comprenden uno o más polinucleótidos que codifican ARNm como se define en las reivindicaciones, y métodos relacionados para aumentar la producción del polipéptido o proteína funcional codificado por dicho polinucleótido. Tal como se utilizan en el presente documento, los términos “mezcla” y “combinado” se refieren a composiciones farmacéuticas que comprenden dos o más nanopartículas lipídicas heterogéneas y distintas. Normalmente, las dos o más nanopartículas lipídicas heterogéneas y distintas se combinan en una única composición o formulación farmacéutica. Por ejemplo, una composición farmacéutica mezclada puede comprender una primera nanopartícula lipídica que comprende el lípido catiónico DOTAP y una segunda nanopartícula lipídica que comprende el lípido catiónico<i>C<e>. En algunas formas de realización, una composición farmacéutica combinada puede comprender una primera nanopartícula lipídica que comprende el lípido catiónico C12-200 y una segunda nanopartícula lipídica que comprende el lípido catiónico DLinKC2DMA. En la FIG. 1 se muestra una ilustración de tal formulación combinada.
[0034] Cabe señalar que los términos “mezcla” y “combinado” tal como se usan en el presente documento para describir las composiciones y formulaciones farmacéuticas de la presente invención se distinguen de los términos “mezcla” o “combinación”, que se usan en el presente documento para describir una formulación farmacéutica o composición que incluye sólo una única nanopartícula lipídica en la formulación. Por ejemplo, los términos mezcla y combinación se usan en el presente documento para referirse a una composición farmacéutica que comprende solo una única población de nanopartículas lipídicas, todas las cuales generalmente tienen la misma o sustancialmente la misma composición lipídica. Esto contrasta con una formulación combinada que comprende dos o más nanopartículas lipídicas diferentes. En particular, los términos “mezcla” y “combinación” se usan generalmente para describir una composición o formulación farmacéutica que incluye una población única y homogénea de nanopartículas lipídicas, todas ellas sintetizadas a partir de una solución orgánica que contiene los mismos lípidos catiónicos y, por ejemplo, cualquier lípidos auxiliares adicionales o lípidos modificados con PEG.
[0035] Las composiciones de nanopartículas lipídicas mezcladas se caracterizan por ser capaces de administrar eficazmente los polinucleótidos encapsulados a las células diana, y también se caracterizan por su capacidad para mejorar la transfección posterior de dichos polinucleótidos encapsulados después del contacto con una o más células diana. Las composiciones de nanopartículas lipídicas mezcladas también se caracterizan por su capacidad para mejorar (por ejemplo, aumentar) la expresión de polinucleótidos encapsulados en ellas por células diana. Las composiciones de nanopartículas lipídicas mezcladas descritas en el presente documento también se caracterizan por su capacidad para mejorar (por ejemplo, aumentar) la producción de uno o más polipéptidos o proteínas (por ejemplo, por células diana) codificadas por uno o más polinucleótidos encapsulados en dichas composiciones de nanopartículas. Por consiguiente, dichas composiciones farmacéuticas de nanopartículas lipídicas mezcladas también son útiles para el tratamiento de enfermedades y, en particular, el tratamiento de enfermedades que resultan de la expresión aberrante de genes o productos genéticos (por ejemplo, enfermedades asociadas con la producción deficiente de una proteína). Las enfermedades para las que se pueden usar las nanopartículas lipídicas mezcladas y las composiciones farmacéuticas incluyen aquellas en las que una mutación genética de un gen particular hace que las células afectadas no expresen, tengan una expresión reducida o expresen un producto no funcional de ese gen. Poner en contacto dichas células diana con las nanopartículas lipídicas mezcladas y las composiciones farmacéuticas de manera que las células diana sean transfectadas por los polinucleótidos encapsulados aumenta la expresión de dichos polinucleótidos y aumenta la producción de una proteína funcional o un producto polipeptídico que puede ser útil en el tratamiento de enfermedades resultantes por una deficiencia de proteínas o enzimas.
[0036] En ciertas formas de realización, las nanopartículas lipídicas mezcladas y las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento exhiben una mayor capacidad para transfectar una o más células diana. Como se usa en el presente documento, los términos “transfectar” o “transfección” se refieren a la introducción intracelular de un polinucleótido en una célula, o preferiblemente en una célula diana. El polinucleótido introducido puede mantenerse estable o transitoriamente en la célula diana. El término “eficiencia de transfección” se refiere a la cantidad relativa de polinucleótido absorbido o introducido por la célula diana que está sujeta a transfección. En la práctica, la eficacia de la transfección se estima mediante la cantidad de un producto polinucleótido indicador expresado por las células diana después de la transfección. Las nanopartículas lipídicas mezcladas y las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento demuestran altas eficiencias de transfección y, en particular, tales mezclas demuestran altas eficiencias de transfección en relación con las eficiencias de transfección de las nanopartículas lipídicas constituyentes individuales que comprenden dichas composiciones mezcladas. Las altas eficiencias de transfección observadas por las nanopartículas lipídicas mezcladas y las composiciones farmacéuticas pueden minimizar los efectos adversos asociados tanto con los lípidos que comprenden las nanopartículas como con los polinucleótidos encapsulados por dichos lípidos. Por consiguiente, las nanopartículas lipídicas mezcladas de la presente invención demuestran altas eficacias de transfección, mejorando así la probabilidad de que se administren dosis apropiadas del polinucleótido al sitio de la patología, mientras que al mismo tiempo se minimizan los posibles efectos adversos sistémicos.
[0037] Como se usan en el presente documento, los términos “polinucleótido” y “ácido nucleico” se usan indistintamente para referirse a material genético (por ejemplo, ADN o ARN), y cuando dichos términos se usan con respecto a las nanopartículas lipídicas generalmente se refieren al material genético encapsulado por tales nanopartículas lipídicas. El primer polinucleótido encapsulado es ARNm. Otros ARN adecuados incluyen ARNm, ARNip, miARN, ARNsn y ARNsno. Los polinucleótidos contemplados también incluyen ARN intergénico no codificante de gran tamaño (lincARN), que generalmente no codifican proteínas, sino que funcionan, por ejemplo, en la señalización inmune, la biología de las células madre y el desarrollo de enfermedades. (Véase, por ejemplo, Guttman, et al., 458: 223-227 (2009); y Ng, et al., Nature Genetics 42: 1035-1036 (2010)). Los polinucleótidos para usar con la invención son ARN o ARN estabilizado que codifica una proteína o enzima (por ejemplo, ARNm que codifica eritropoyetina humana, como se representa por SEQ ID NO: 3) como se define en las reivindicaciones. La presente invención contempla el uso de tales polinucleótidos como un agente terapéutico que es capaz de ser expresado por células diana para facilitar de ese modo la producción (y en ciertos casos la excreción) de una enzima o proteína funcional por dichas células diana, como se describe, por ejemplo, en la Solicitud Internacional N° PCT/US2010/058457 y en la Solicitud Provisional de Estados Unidos N° PCT/US2012/041724 presentada el 8 de junio de 2012. Por ejemplo, en ciertas formas de realización, tras la expresión de uno o más polinucleótidos por células diana, la producción de se puede observar una enzima o proteína funcional en la que un sujeto tiene deficiencia (por ejemplo, una enzima del ciclo de la urea o una enzima asociada con un trastorno de almacenamiento lisosomal). El término “funcional”, como se usa en el presente documento para calificar una proteína o enzima, significa que la proteína o enzima tiene actividad biológica o, alternativamente, es capaz de realizar la misma función o una función similar que la proteína o enzima nativa o que funciona normalmente.
[0038] También se contemplan en el presente documento nanopartículas lipídicas mezcladas, composiciones farmacéuticas y métodos relacionados para modular la expresión de un polinucleótido y/o para modular (por ejemplo, aumentar) la producción de un polipéptido o proteína funcional (por ejemplo, una enzima) codificada por dicho polinucleótido en una o más células y tejidos diana. En el contexto de la presente invención, el término “expresión” se utiliza en su sentido más amplio para referirse a la transcripción de un gen o polinucleótido específico en al menos un transcrito de ARNm, o a la traducción de al menos un ARNm o polinucleótido en un polipéptido. (p. ej., una proteína o enzima funcional). Por ejemplo, en ciertas formas de realización las nanopartículas lipídicas mezcladas comprenden al menos una primera y una segunda nanopartícula lipídica, al menos una de las cuales comprende un polinucleótido (ARNm) que codifica una proteína o enzima funcional. El término expresión se refiere a la traducción de dicho ARNm (por ejemplo, por las células diana) para producir el polipéptido o proteína codificado por el mismo. En el contexto de un oligonucleótido antisentido encapsulado en una o más de las composiciones de nanopartículas lipídicas descritas en el presente documento, el término “expresión” puede usarse con referencia a uno o más genes o ácidos nucleicos diana (por ejemplo, ARNm). Por ejemplo, cuando se ha preparado un oligonucleótido antisentido encapsulado para que sea complementario a un fragmento de un ARNm endógeno diana expresado por una célula, el término “expresión” puede usarse con referencia a dicho ARNm endógeno (por ejemplo, el oligonucleótido antisentido encapsulado puede reducir la expresión de dicho ARNm dirigido).
[0039] También se describen nanopartículas lipídicas mezcladas y composiciones farmacéuticas para modular la expresión de ácidos nucleicos y polinucleótidos expresados de forma aberrante en una o más células y tejidos diana. Las nanopartículas lipídicas mezcladas pueden comprender al menos una primera nanopartícula lipídica y una segunda nanopartícula lipídica, una o ambas de las cuales pueden encapsular un polinucleótido. Las nanopartículas lipídicas mezcladas pueden comprender, por ejemplo, uno o más polinucleótidos encapsulados en una primera nanopartícula lipídica que se mezcla con una o más nanopartículas lipídicas diferentes (es decir, una segunda o tercera nanopartícula lipídica) que opcionalmente pueden encapsular uno o más polinucleótidos. Dichas formulaciones de nanopartículas lipídicas mezcladas demuestran una expresión mejorada de uno o más polinucleótidos encapsulados de ese modo en relación con la expresión de los mismos polinucleótidos observada después de la administración de una única nanopartícula lipídica (por ejemplo, la primera nanopartícula lipídica). De manera similar, tales formulaciones de nanopartículas lipídicas mezcladas pueden demostrar una producción mejorada de uno o más polipéptidos (por ejemplo, una enzima funcional) codificados por un polinucleótido encapsulado en relación con la producción de los mismos polipéptidos observados después de la administración de una única nanopartícula lipídica (por ejemplo, la primera nanopartícula lipídica). Por ejemplo, en determinadas formas de realización, las nanopartículas lipídicas mezcladas y las composiciones farmacéuticas son capaces de aumentar la expresión de polinucleótidos encapsulados, y/o la producción de los polipéptidos codificados por dichos polinucleótidos encapsulados, en una célula diana al menos aproximadamente diez veces, veinte veces, treinta, cuarenta, cincuenta, sesenta, setenta, cien, quinientas, mil o más en relación con la expresión del polinucleótido o la producción de polipéptidos observada cuando la célula diana se pone en contacto con dichos polinucleótidos encapsulados en una única nanopartícula lipídica.
[0040] También se describen métodos para potenciar (por ejemplo, aumentar) la expresión de un polinucleótido y métodos para aumentar la producción y secreción de un producto polipeptídico funcional en células y tejidos diana (por ejemplo, hepatocitos). Las células o tejidos diana pueden expresar de manera aberrante el polinucleótido encapsulado por una o más de las nanopartículas lipídicas que comprenden la composición farmacéutica mezclada. También se describen en el presente documento métodos para aumentar la expresión de uno o más polinucleótidos (por ejemplo, ARNm) y métodos para aumentar la producción y/o secreción de uno o más polipéptidos (por ejemplo, una enzima funcional) en una o más células, tejidos y órganos. Generalmente, tales métodos comprenden poner en contacto las células diana con una composición farmacéutica que comprende una mezcla de al menos dos nanopartículas a base de lípidos (por ejemplo, una primera y una segunda nanopartícula de lípidos), en donde al menos una de tales nanopartículas a base de lípidos comprende o encapsula de otro modo el uno o más polinucleótidos.
[0041] También se describen en el presente documento métodos y composiciones para mejorar (por ejemplo, aumentar) o modular de otro modo la expresión de uno o más polinucleótidos (por ejemplo, ARNm) y/o mejorar (por ejemplo, aumentar) o modular de otro modo la producción y secreción de los polipéptidos o proteínas codificados de este modo en las células diana de un sujeto. Dichos métodos generalmente comprenden la etapa de administrar (por ejemplo, administrar por vía intravenosa) una composición farmacéutica mezclada a un sujeto en donde dicha composición farmacéutica comprende al menos dos nanopartículas lipídicas mezcladas (por ejemplo, una primera y una segunda nanopartícula lipídica), al menos una de las cuales encapsula o de lo contrario comprende uno o más polinucleótidos. La etapa de administrar la composición farmacéutica mezclada a un sujeto puede facilitar el contacto de las nanopartículas lipídicas mezcladas con las células y tejidos diana, cuyo resultado es una expresión mejorada (por ejemplo, aumentada) de los polinucleótidos encapsulados y un producto mejorado (por ejemplo, aumentadp) de los polinucleótidos encapsulados del polipéptido codificado por dichos polinucleótidos encapsulados por las células y tejidos diana contactados. Como el término “mejorado” se utiliza en el presente documento para describir la actividad de las nanopartículas lipídicas mezcladas, cabe señalar que dicha mejora generalmente se determina en relación con la suma del efecto observado o producido por los miembros constituyentes que comprenden la formulación de nanopartículas lipídicas mezcladas. Por ejemplo, la expresión mejorada de un polinucleótido y/o la producción o secreción mejorada de un polipéptido que se observa después de la administración de una formulación de nanopartículas lipídicas mezcladas que comprende dos nanopartículas lipídicas diferentes denominadas “A” y “B”, en donde solo nanopartículas lipídicas “A” encapsula el polinucleótido, aumenta con respecto a la suma de la expresión del polinucleótido y/o la producción o secreción de polipéptido observada tanto por “A” como por “B” cuando se administran independientemente uno del otro.
[0042] Los presentes inventores han descubierto que en ciertas formas de realización la expresión de los polinucleótidos (y la correspondiente producción y/o secreción de un polipéptido codificado por polinucleótidos que comprenden ARNm) observada cuando dichos polinucleótidos se administran en una composición de nanopartículas mezclada a base de lípidos se mejora y en muchos casos excede (por ejemplo, en aproximadamente dos, tres, cuatro, cinco, diez, veinte, veinticinco, treinta, cuarenta, cincuenta, sesenta, setenta, ochenta, noventa, uno cien, doscientas veces o más) la expresión (y la correspondiente producción y/o secreción de un polipéptido donde dichos polinucleótidos comprenden ARNm) observada cuando dichos polinucleótidos se administran usando cada una de las dos o más nanopartículas lipídicas constituyentes independientes que comprenden las composiciones farmacéuticas de nanopartículas lipídicas mezcladas. Por consiguiente, las composiciones farmacéuticas mezcladas (por ejemplo, una única composición farmacéutica que comprende dos nanopartículas lipídicas no idénticas separadas) demuestran un aumento sinérgico (es decir, no aditivo) en la expresión de los polinucleótidos encapsulados en las dos o más nanopartículas lipídicas que comprenden la composición farmacéutica y un aumento sinérgico (es decir, no aditivo) en la producción y/o secreción de los polipéptidos codificados por tales polinucleótidos encapsulados donde dichos polinucleótidos comprenden ARNm. El aumento sinérgico es evidente con respecto a la expresión total aditiva de tales polinucleótidos (o la producción total aditiva de polipéptidos codificados por polinucleótidos que comprenden ARNm), que se observa cuando cada una de las nanopartículas lipídicas constituyentes que comprenden la composición farmacéutica mezclada se administran individualmente. Los aumentos sinérgicos observados en la expresión de polinucleótidos encapsulados (y/o producción de polipéptido codificado por polinucleótidos que comprenden ARNm) son evidentes en una variedad de nanopartículas lipídicas y en diversas proporciones de dichas nanopartículas lipídicas mezcladas. Además, la expresión mejorada observada de polinucleótidos encapsulados en al menos una de las nanopartículas lipídicas que comprenden las composiciones farmacéuticas mezcladas (y la producción correspondiente de los polipéptidos codificados por polinucleótidos encapsulados que comprenden ARNm) puede oscilar entre aumentos de aproximadamente 1,5 a 25 veces o más en comparación con la suma de la expresión (o, cuando corresponda, la producción y/o secreción) observada en las nanopartículas lipídicas constituyentes que comprenden dichas composiciones farmacéuticas mezcladas, demostrando así que la mezcla de dos o más nanopartículas lipídicas separadas (al menos una de las cuales encapsula un polinucleótido) permite mecánicamente la mayor expresión de dichos polinucleótidos, lo que a su vez corresponde a una mayor producción del producto codificado por los mismos, en comparación con las nanopartículas lipídicas separadas que comprenden dicha composición farmacéutica mezclada.
[0043] El mecanismo de este aumento sinérgico en la producción de proteínas aún no se ha dilucidado. Sin desear quedar vinculado a ninguna teoría particular, las posibles explicaciones incluyen, por ejemplo, vías o mecanismos no competitivos de entrada celular por cada una de las formulaciones de nanopartículas lipídicas que comprenden la composición farmacéutica mezclada, la combinación de diferentes mecanismos de tráfico intracelular (por ejemplo, esponja de protones versus fusogenicidad), la combinación de propiedades de liberación de fármacos con propiedades de liberación endosómica y/o la modulación de vías inhibidoras activas que permiten una mayor absorción de nanopartículas.
[0044] Las composiciones farmacéuticas mezcladas, y en particular las nanopartículas lipídicas constituyentes que comprenden tales composiciones mezcladas, son capaces de administrar polinucleótidos de diferentes tamaños a sus células o tejidos diana. En determinadas formas de realización, las nanopartículas lipídicas de la presente invención son capaces de administrar secuencias de polinucleótidos grandes (por ejemplo, polinucleótidos de al menos 1 kb, 1,5 kb, 2 kb, 2,5 kb, 3 kb, 3,5 kb, 4 kb, 4,5 kb, 5 kb, 6 kb, 7kb, 8kb, 9kb, 10kb, 12kb, 15kb, 20kb, 25kb, 30kb o más).
[0045] En determinadas formas de realización, las composiciones farmacéuticas mezcladas y los polinucleótidos encapsulados comprendidos en las mismas se pueden formular con uno o más excipientes o reactivos aceptables para facilitar la administración de dichos polinucleótidos a las células, tejidos y órganos previstos o diana. Los reactivos y excipientes apropiados pueden seleccionarse generalmente con respecto a una serie de factores, que incluyen, entre otras cosas, las propiedades biológicas o químicas de los polinucleótidos (por ejemplo, la carga), el modo de administración previsto, el entorno biológico previsto al que se expondrán dichos polinucleótidos y las propiedades específicas de las células y tejidos diana previstos. En algunas formas de realización, una o más de las nanopartículas lipídicas que comprenden la composición farmacéutica mezclada demuestran una unión preferencial y/o sustancial a una célula diana con respecto a células no diana. En algunas formas de realización, las nanopartículas lipídicas que comprenden la formulación farmacéutica combinada, y en particular las nanopartículas lipídicas que encapsulan uno o más polinucleótidos, entregan su contenido a la célula diana de manera que los polinucleótidos se entregan al compartimento subcelular apropiado, tal como el citoplasma. y puede expresarse en consecuencia, de manera que, en determinadas formas de realización, la célula diana produce y/o excreta uno o más polipéptidos funcionales (por ejemplo, una proteína funcional).
[0046] Las composiciones farmacéuticas mezcladas comprenden dos o más nanopartículas lipídicas separadas (por ejemplo, una primera nanopartícula lipídica que comprende HGT4003, DOPE, colesterol y DMG-PEG2K mezclada con una segunda nanopartícula lipídica que comprende ICE, DOPE y DMG-PEG2K). La primera nanopartícula lipídica y la segunda nanopartícula lipídica que comprenden la composición farmacéutica mezclada pueden encapsular cada una el mismo polinucleótido o más. Un aumento sinérgico en la expresión de uno o más polinucleótidos por las células diana después de la administración de la composición farmacéutica mezclada a un sujeto excede la suma relativa de la expresión de uno o más polinucleótidos lograda por la primera nanopartícula lipídica y la expresión del uno o más polinucleótidos conseguidos por la segunda nanopartícula lipídica cuando la primera nanopartícula lipídica y la segunda nanopartícula lipídica se administran al sujeto de forma independiente. De manera similar, en ciertas formas de realización un aumento sinérgico en la producción de uno o más polipéptidos funcionales codificados por uno o más polinucleótidos encapsulados por las células diana después de la administración de la composición farmacéutica mezclada a un sujeto excede la suma relativa de la producción de uno o más polipéptidos funcionales logrados por la primera nanopartícula lipídica y la producción de uno o más polipéptidos logrados por la segunda nanopartícula lipídica cuando la primera nanopartícula lipídica y la segunda nanopartícula lipídica se administran al sujeto de forma independiente. Alternativamente, en determinadas formas de realización, solo una de las nanopartículas lipídicas (por ejemplo, las primeras nanopartículas lipídicas) que comprenden la composición farmacéutica mezclada encapsula uno o más polinucleótidos.
[0047] En algunas formas de realización, las nanopartículas lipídicas mezcladas y las composiciones farmacéuticas mezcladas son capaces de mejorar la expresión de uno o más polinucleótidos independientemente de si algunas o todas las nanopartículas lipídicas que comprenden la composición farmacéutica mezclada encapsulan uno o más polinucleótidos. En particular, las nanopartículas lipídicas mezcladas que comprenden una primera nanopartícula lipídica que encapsula un polinucleótido y una segunda nanopartícula lipídica vacía (es decir, que no encapsula un polinucleótido) son capaces de mejorar sinérgicamente la expresión de tales polinucleótidos (por ejemplo, aumentar la expresión aproximadamente dos, cuatro, cinco, diez, veinte, veinticinco, treinta, cuarenta, cincuenta, cien, doscientas, quinientas, mil veces o más). Por consiguiente, en el contexto de la presente invención, al menos uno de los componentes de nanopartículas lipídicas liposomales de la formulación combinada sirve para transportar el polinucleótido a la célula diana. En algunas formas de realización, dos de los al menos dos componentes de nanopartículas lipídicas de la formulación combinada sirven para transportar uno o más polinucleótidos a la célula diana. Al ponerse en contacto con las células diana, tales composiciones farmacéuticas mezcladas demuestran un aumento en la expresión del polinucleótido encapsulado (por ejemplo, al menos aproximadamente dos, cinco, diez o veinte veces) y, en ciertas formas de realización, de ese modo aumenta la producción de un polipéptido funcional codificado por dicho polinucleótido encapsulado.
[0048] Como se usa en el presente documento, la frase “nanopartícula lipídica” se refiere a una vesícula o vehículo que comprende uno o más lípidos (por ejemplo, lípidos catiónicos y/o no catiónicos). Ejemplos de lípidos adecuados incluyen, por ejemplo, lípidos catiónicos tales como C12-200, ICE, DLin-KC2-DMA, DOpE, DMG-PEG-2000, HGT4003, lípidos no catiónicos, lípidos a base de colesterol, lípidos auxiliares, lípidos modificados por PEG, así como los compuestos de fosfatidilo (por ejemplo, fosfatidilglicerol, fosfatidilcolina, fosfatidilserina, fosfatidiletanolamina, esfingolípidos, cerebrósidos y gangliósidos) y combinaciones o mezclas de los anteriores. Las composiciones farmacéuticas combinadas descritas en el presente documento comprenden al menos dos o más nanopartículas lipídicas, cada una de las cuales tiene una composición lipídica diferente. Estas dos o más nanopartículas lipídicas que comprenden las composiciones mezcladas se denominan en el presente documento “primera nanopartícula lipídica”, “segunda nanopartícula lipídica”, “tercera nanopartícula lipídica”, etc. Las designaciones de, por ejemplo, primera y segunda nanopartículas lipídicas se realizan con el fin de distinguir las diferentes nanopartículas lipídicas que comprenden las composiciones farmacéuticas mezcladas y no pretenden limitar el número de nanopartículas lipídicas diferentes que comprenden dichas composiciones farmacéuticas mezcladas.
[0049] También se contempla el uso de composiciones farmacéuticas mezcladas que comprenden una o más nanopartículas lipídicas que comprenden uno o más lípidos catiónicos. Como se usa en el presente documento, la frase “ lípido catiónico” se refiere a cualquiera de varias especies de lípidos que llevan una carga positiva neta a un pH seleccionado, tal como un pH fisiológico. Las nanopartículas lipídicas contempladas se pueden preparar incluyendo mezclas de lípidos multicomponentes de proporciones variables empleando uno o más lípidos catiónicos, lípidos no catiónicos y lípidos modificados con PEG. En determinadas formas de realización, cada una de la primera y segunda nanopartículas lipídicas que comprenden las formulaciones farmacéuticas mezcladas comprende uno o más lípidos catiónicos. De manera similar, también se contemplan composiciones farmacéuticas mezcladas que comprenden dos o más nanopartículas lipídicas separadas, en donde dichas nanopartículas lipídicas comprenden lípidos catiónicos, cada uno de los cuales tiene diferentes composiciones lipídicas. Por ejemplo, en determinadas formas de realización, la primera y la segunda nanopartícula lipídica comprenden cada una un lípido catiónico diferente (por ejemplo, la primera nanopartícula lipídica comprende ICE y la segunda nanopartícula lipídica comprende DLin-KC2-DMA).
[0050] En la literatura se han descrito varios lípidos catiónicos, muchos de los cuales están disponibles comercialmente. Los lípidos catiónicos pueden incluir, entre otros, ALNY-100 ((3aR,5s,6aS)-N,N-dimetil-2,2-di((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dienil)tetrahidro- 3aH-ciclopenta[d] [1,3]dioxol-5-amina)), DOdAp (1,2-dioleil-3-dimetilamonio propano), HGT4003 (WO 2012/170889), HGT5000 (Solicitud de patente provisional de EE. UU. n° 61/617,468) o HGT500l(cis o trans) (Solicitud de Patente Provisional No. 61/617,468), lipidoides de aminoalcohol tales como los divulgados en WO2010/053572, DOTAP (1,2-dioleil-3-trimetilamonio propano), DOTMA (1,2-di -O-octadecenil-3-trimetilamonio propano), DLinDMA (1,2-dilinoleiloxi-N,N-dimetil-3-aminopropano) (Heyes, et al., J. Contr. Rel. 107:276-287(2005)), DLin-KC2-DMA (Semple, et al., Nature Biotech. 28:172-176 (2010)), C12-200 (Love, et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. 107:1864 -1869(2010)), cloruro de N-[1-(2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamonio. (Felgner et al. (Proc. Nat'l Acad. Sci. 84, 7413 (1987); patente estadounidense n° 4.897.355). DOTMA puede ser formulado solo o puede combinarse con dioleoilfosfatidiletanolamina o "DOPE" u otros lípidos catiónicos o no catiónicos en una nanopartícula lipídica. Otros lípidos catiónicos adecuados incluyen, por ejemplo, 5-carboxispermilglicinadioctadecilamida o "DOGS", 2,3-dioleiloxi-N-[2(espermina carboxamido)etil]-N,N-dimetil-1-propanaminio o "DOSPA" (Behr et al. al. Proc. Nat'l Acad. Sci. 86, 6982 (1989); patente estadounidense n° 5.171.678; patente estadounidense n° 5.334.761), 1,2-Dioleoil-3-Dimetilamonio-Propano o "DODAP", 1,2-Dioleoil-3-Trimetilamonio-Propano o "DOTAP". Los lípidos catiónicos contemplados también incluyen 1,2-diesteariloxi-N,N-dimetil-3-aminopropano o "DSDMA", 1,2-dioleiloxi-N,N-dimetil-3-aminopropano o "DODMA", 1,2-dilinoleiloxi-N,N-dimetil-3-aminopropano o "DLinDMA", 1,2-dilinoleniloxi-N,N-dimetil-3-aminopropano o "DLenDMA", cloruro de N-dioleil-N,N-dimetilamonio o "DODAC", bromuro de N,N-diestearil-N,N-dimetilamonio o "DDAB", bromuro de N-(1,2-dimiristiloxiprop-3-il)-N,N-dimetil-N-hidroxietilamonio o "DMRIE", 3-dimetilamino-2-(colest-5-en-3-beta-oxibutan-4-oxi)-1-(cis,cis-9,12-octadecadienoxi)propano o "CLinDMA", 2-[5'-(colest-5-en-3-beta-oxi)-3'-oxapentoxi)-3-dimetil 1-1-(cis,cis-9',1-2'-octadecadienoxi)propano o "CpLinDMA", N,N-dimetil-3,4-dioleiloxibencilamina o "DMOBA", 1,2-N,N'-dioleilcarbamil-3-dimetilaminopropano o "DOcarbDAP", 2,3-Dilinoleoiloxi N,N-dimetilpropilamina o "DLinDAP", 1,2-N,N'-Dilinoleilcarbamil-3-dimetilaminopropano o "DLincarbDAP", 1,2-Dilinoleoilcarbamil-3-dimetilaminopropano o "DLinCDAP", 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminometil-[1,3]-dioxolano o "DLin-K-DMA ", 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]dioxolano o "DLin-K-XTC2-DMA", o mezclas de los mismos. (Heyes, J., et al., J Controlled Release 107: 276-287 (2005); Morrissey, DV., et al., Nat. Biotechnol. 23(8): 1003-1007 (2005); Publicación PCT WO2005/121348Al).
[0051] También se contempla el uso de lípidos catiónicos a base de colesterol para formular las nanopartículas lipídicas mezcladas. Estos lípidos catiónicos a base de colesterol se pueden usar solos o en combinación con otros lípidos catiónicos o no catiónicos. Los lípidos catiónicos basados en colesterol adecuados incluyen, por ejemplo, DC-Chol (N,N-dimetil-N-etilcarboxamidocolesterol), 1,4-bis(3-N-oleilamino-propil)piperazina (Gao, et al. Biochem. Biophys. Res. Comm.
179.280 (1991); Wolf et al.. BioTechniques 23, 139 (1997); patente estadounidense n° 5.744.335).
[0052] Además, hay varios reactivos disponibles comercialmente para mejorar la eficacia de la transfección. Los ejemplos adecuados incluyen LIPOFECTIN (DOTMA:DOPE) (Invitrogen, Carlsbad, California), LIPOFECTAMINE (DOSPA:DOPE) (Invitrogen), LIPOFECTAMINE2000. (Invitrogen), FUGENE, TRANSFECTAM (DOGS) y EFFECTENE.
[0053] También se contemplan lípidos catiónicos tales como los lípidos basados en dialquilamino, basados en imidazol y basados en guanidinio. Por ejemplo, ciertas formas de realización se dirigen a una composición que comprende uno o más lípidos catiónicos a base de imidazol, por ejemplo, el éster de colesterol de imidazol o el lípido "ICE" (3S, 10R, 13R, 17R)-10,13-dimetil-17-((R)-6-metilheptan-2-il)-2, 3, 4, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17-tetradecahidro-1H-ciclopenta[a]fenantren-3-ilo 3-(1H-imidazol-4-il)propanoato, como se representa mediante la estructura (I) a continuación. En ciertas formas de realización, una nanopartícula lipídica para la administración de ARN (por ejemplo, ARNm) que codifica una proteína funcional puede comprender uno o más lípidos catiónicos basados en imidazol, por ejemplo, el éster de colesterol de imidazol o el lípido "ICE" (3S, 10R, 13R, 17R)-10,13-dimetil-17-((R)-6-metilheptan-2-il)-2, 3, 4, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17-tetradecahidro-1H ciclopenta[a]fenantren-3-ilo 3-(1H-imidazol-4-il)propanoato, como se representa por la estructura (I).
[0054] Sin desear estar ligado a una teoría particular, se cree que la fusogenicidad del lípido catiónico basado en imidazol ICE está relacionada con la alteración endosómica que es facilitada por el grupo imidazol, que tiene un pKa más bajo en relación con los lípidos catiónicos tradicionales. La alteración endosómica, a su vez, promueve la inflamación osmótica y la alteración de la membrana liposomal, seguida de la transfección o liberación intracelular de los contenidos de polinucleótidos cargados o encapsulados en la misma en la célula diana.
[0055] Los lípidos catiónicos a base de imidazol también se caracterizan por su toxicidad reducida en relación con otros lípidos catiónicos. En algunas formas de realización, una o más de las nanopartículas lipídicas que comprenden la composición farmacéutica mezclada comprenden un lípido catiónico a base de imidazol tal como ICE, para reducir la concentración relativa de otros lípidos catiónicos más tóxicos en dicha composición farmacéutica mezclada. Los lípidos catiónicos a base de imidazol (por ejemplo, ICE) se pueden usar como el único lípido catiónico en una o más de las nanopartículas lipídicas que comprenden las formulaciones mezcladas, o alternativamente se pueden combinar con lípidos catiónicos tradicionales (por ejemplo, DOPE, DC-Chol), lípidos no catiónicos, lípidos modificados con PEG y/o lípidos auxiliares. El lípido catiónico puede comprender una proporción molar de aproximadamente 1 % a aproximadamente 90 %, aproximadamente 2 % a aproximadamente 70 %, aproximadamente 5 % a aproximadamente 50%, aproximadamente 10% a aproximadamente 40% del lípido total presente en la nanopartícula lipídica o preferiblemente aproximadamente del 20 % a aproximadamente el 70 % del lípido total presente en la nanopartícula lipídica.
[0056] De manera similar, ciertas formas de realización se dirigen a nanopartículas lipídicas que comprenden el lípido catiónico HGT4003 2-((2,3-Bis((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-l iloxi)propil)disulfanil)-N,N-dimetiletanamina, como se representa por la estructura (II) a continuación, y como se describe con más detalle en la solicitud provisional de EE. UU. No: PCT/US2012/041663, presentada el 8 de junio de 2012:
[0057] En otras formas de realización, las composiciones y métodos descritos en el presente documento están dirigidos a nanopartículas lipídicas que comprenden uno o más lípidos escindibles, tales como, por ejemplo, uno o más lípidos catiónicos o compuestos que comprenden un grupo funcional disulfuro (S-S) escindible (por ejemplo, HGT4001, HGT4002, HGT4003, HGT4004 y h Gt 4005), como se describe con más detalle en la Solicitud Provisional de EE. UU. N.°: PCT/US2012/041663.
[0058] El uso y la inclusión de fosfolípidos modificados con polietilenglicol (PEG) y lípidos derivatizados tales como cerarmidas derivatizadas (PEG-CER), incluida la N-octanoil-esfingosina-1--[succinil(metoxipolietilenglicol)-2000] (ceramida C8 PEG-2000) también se contempla en las formulaciones de nanopartículas lipídicas mezcladas de la presente invención, ya sea sola o preferiblemente en combinación con otras formulaciones lipídicas que comprenden uno o más de los lípidos. nanopartículas que comprenden una composición farmacéutica mezclada. Los lípidos modificados con PEG contemplados incluyen, entre otros, una cadena de polietilenglicol de hasta 5 kDa de longitud unida covalentemente a un lípido con cadena(s) alquílica(s) de longitud C<6>-C<20>. La adición de tales componentes puede prevenir la agregación compleja y también puede proporcionar un medio para aumentar la vida útil en circulación y aumentar la entrega de la composición de lípidos y polinucleótidos a los tejidos diana (Klibanov et al. (1990) FEBS Letters, 268 (1): 235-237), o pueden seleccionarse para intercambiarse rápidamente fuera de la formulación in vivo (ver la patente de EE. UU. n° 5.885.613). Lípidos intercambiables particularmente útiles son las ceramidas de PEG que tienen cadenas de acilo más cortas (por ejemplo, C14 o C18). Los fosfolípidos modificados con PEG y los lípidos derivatizados de las composiciones de la presente invención pueden comprender una relación molar de aproximadamente 0 % a aproximadamente 20 %, aproximadamente 0,5 % a aproximadamente 20 %, aproximadamente 1 % a aproximadamente 15 %, aproximadamente 4 % a aproximadamente el 10%, o aproximadamente el 2% del lípido total presente en una nanopartícula lipídica liposomal.
[0059] Si bien los vehículos basados en lípidos y los lípidos que los componen presentan medios prometedores para administrar su contenido de polinucleótidos intracelularmente, la utilidad de muchos lípidos (y en particular de los lípidos catiónicos) puede estar limitada por su citotoxicidad asociada. Esto es particularmente cierto en el caso de la LIPOFECTINA, cuyo componente DOTMA no se degrada fácilmente in vivo y es tóxico para las células y los tejidos. Las composiciones de nanopartículas lipídicas mezcladas de la presente invención proporcionan medios para reducir las toxicidades asociadas con los lípidos y, en particular, la toxicidad asociada con los lípidos catiónicos. En ciertas formas de realización, la mejora sinérgica en la expresión de polinucleótidos encapsulados observada con el uso de las composiciones de nanopartículas lipídicas mezcladas de la presente invención puede corresponder a cantidades reducidas de lípidos (y en particular lípidos tóxicos) necesarios para efectuar la transfección de una cantidad eficaz de dichos polinucleótidos a una o más células diana. Por consiguiente, también se contemplan en el presente documento métodos para mediar, reducir o eliminar la toxicidad asociada con uno o más lípidos, y en particular uno o más lípidos catiónicos. Por ejemplo, la cantidad de lípido catiónico requerida para efectuar la transfección de una cantidad eficaz de uno o más polinucleótidos en una o más células diana se puede reducir incorporando dicho lípido catiónico en una primera composición de nanopartículas lipídicas y mezclando dicha primera composición de nanopartículas lipídicas con una segunda nanopartícula lipídica. La expresión mejorada del polinucleótido observada con el uso de dicha composición de nanopartículas lipídicas mezcladas puede permitir la reducción correspondiente en la cantidad de dicho lípido requerida para efectuar la transfección de una cantidad eficaz de uno o más polinucleótidos en una o más células diana. En determinadas cantidades, la toxicidad de uno o más lípidos se reduce al menos aproximadamente un 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o alternativamente se elimina.
[0060] La presente invención también contempla el uso de lípidos no catiónicos en una o más de las nanopartículas lipídicas que comprenden las formulaciones mezcladas. Tal como se utiliza en el presente documento, la frase “ lípido no catiónico” se refiere a cualquier lípido neutro o aniónico. Como se usa en el presente documento, la frase “ lípido aniónico” se refiere a cualquiera de varias especies de lípidos que llevan una carga negativa neta a un pH seleccionado, tal como un pH fisiológico. Los lípidos no catiónicos incluyen, entre otros, distearoilfosfatidilcolina (DSPC), dioleoilfosfatidilcolina (DOPC), dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), dioleoilfosfatidilglicerol (DOPG), dipalmitoilfosfatidilglicerol (DPPG), dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE), palmitoiloleoilfosfatidilcolina (POPC), palmitoiloleoil-fosfatidiletanolamina (POPE), carboxilato de 4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1-dioleoil-fosfatidiletanolamina (DOPE-mal), dipalmitoil fosfatidiletanolamina (DPPE), dimiristoilfosfoetanolamina (DMPE), distearoil fosfatidiletanolamina (DSPE), 16-O-monometil PE, 16-O-dimetil PE, 18-1-trans PE, 1-estearoil-2-oleoil-fosfatidietanolamina (SOPE), colesterol o una mezcla de los mismos. Dichos lípidos no catiónicos se pueden usar solos, pero se usan preferiblemente en combinación con otros excipientes, por ejemplo, lípidos catiónicos. Cuando se usa en combinación con un lípido catiónico, el lípido no catiónico puede comprender una proporción molar de 5 % a aproximadamente 90 %, o preferiblemente de aproximadamente 10 % a aproximadamente 70 % del lípido total presente en la nanopartícula lipídica.
[0061] También se contempla la inclusión de polímeros en las nanopartículas lipídicas que comprenden la formulación farmacéutica combinada. Los polímeros adecuados pueden incluir, por ejemplo, poliacrilatos, polialquilcianoacrilatos, polilactida, copolímeros de polilactida y poliglicolida, policaprolactonas, dextrano, albúmina, gelatina, alginato, colágeno, quitosano, ciclodextrinas y polietilenimina.
[0062] En determinadas formas de realización, las nanopartículas lipídicas se formulan basándose en parte en su capacidad para facilitar la transfección de un polinucleótido a una célula diana. En otra forma de realización, las nanopartículas lipídicas se pueden seleccionar y/o preparar para optimizar la administración de polinucleótidos a una célula, tejido u órgano diana. Por ejemplo, si la célula objetivo es un hepatocito, las propiedades de la nanopartícula lipídica (por ejemplo, tamaño, carga y/o pH) pueden optimizarse para administrar eficazmente dicha nanopartícula lipídica a la célula u órgano objetivo, reducir el aclaramiento inmunológico y/o promover retención en ese órgano diana. Alternativamente, si el tejido objetivo es el sistema nervioso central, la selección y preparación de la nanopartícula lipídica debe considerar la penetración y retención dentro de la barrera hematoencefálica y/o el uso de medios alternativos para administrar directamente dichas nanopartículas lipídicas a dicho tejido objetivo (p. ej., administración intracerebrovascular). En ciertas formas de realización, las composiciones mezcladas o sus nanopartículas lipídicas constituyentes se pueden combinar con agentes que facilitan la transferencia de polinucleótidos encapsulados (por ejemplo, agentes que alteran o mejoran la permeabilidad de la barrera hematoencefálica y de ese modo mejoran la transferencia de dichos polinucleótidos encapsulados a las células diana). Si bien las nanopartículas lipídicas pueden facilitar la introducción de polinucleótidos en las células diana, la adición de policationes (por ejemplo, poli L-lisina y protamina) a las nanopartículas lipídicas o a las composiciones farmacéuticas mezcladas como un copolímero también puede facilitar, y en algunos casos mejorar notablemente, la eficiencia de transfección de varios tipos de liposomas catiónicos entre 2 y 28 veces en varias líneas celulares tanto in vitro como in vivo. (Ver NJ Caplen, et al., Gene Ther.
1995; 2: 603; S. Li, et al., Gene Ther. 1997; 4, 891.)
[0063] Para los fines de la presente invención, al menos una de las nanopartículas lipídicas (por ejemplo, la primera nanopartícula lipídica) que comprenden la composición farmacéutica mezclada se prepara para encapsular uno o más polinucleótidos deseados. En algunas formas de realización, todas las nanopartículas lipídicas que comprenden una composición farmacéutica combinada se preparan para encapsular uno o más polinucleótidos. Por ejemplo, la primera y segunda nanopartículas lipídicas mezcladas que comprenden la composición mezclada pueden encapsular cada uno los mismos polinucleótidos (por ejemplo, ARNm que codifica una enzima deficiente) o, alternativamente, cada una puede encapsular un polinucleótido diferente. El proceso de incorporar un polinucleótido deseado (por ejemplo, ARNm) en un liposoma o una nanopartícula lipídica se denomina en el presente documento “cargar” o “encapsular” (Lasic, et al., FEBS Lett., 312: 255-258, 1992). Los polinucleótidos cargados o encapsulados en nanopartículas lipídicas pueden estar total o parcialmente ubicados en el espacio interior de la nanopartícula lipídica, dentro de la membrana bicapa de la nanopartícula lipídica, o asociados con la superficie exterior de la nanopartícula lipídica.
[0064] Cargar o encapsular un polinucleótido en una nanopartícula lipídica puede servir para proteger el polinucleótido de un entorno que puede contener enzimas o productos químicos (por ejemplo, suero) que degradan polinucleótidos y/o sistemas o receptores que provocan la rápida excreción de los polinucleótidos. Por consiguiente, en algunas formas de realización, las nanopartículas lipídicas seleccionadas que comprenden las composiciones farmacéuticas mezcladas son capaces de mejorar la estabilidad del polinucleótido encapsulado por las mismas, particularmente con respecto a los entornos a los que dichos polinucleótidos estarán expuestos. Encapsular los polinucleótidos en una o más de las nanopartículas lipídicas que comprenden las composiciones farmacéuticas mezcladas también facilita la administración de dichos polinucleótidos en las células y tejidos diana. Por ejemplo, las nanopartículas lipídicas pueden permitir que el polinucleótido encapsulado llegue a la célula diana o pueden permitir preferentemente que el polinucleótido encapsulado alcance las células u órganos diana de forma discriminatoria (por ejemplo, las nanopartículas lipídicas pueden concentrarse en el hígado o el bazo de un sujeto al que se administra la composición mezclada). Alternativamente, las nanopartículas lipídicas pueden limitar la administración de polinucleótidos encapsulados a otras células u órganos no diana donde la presencia de los polinucleótidos encapsulados puede ser indeseable o de utilidad limitada.
[0065] Preferiblemente, las nanopartículas lipídicas se preparan combinando múltiples componentes lipídicos y/o poliméricos. Por ejemplo, se puede preparar una nanopartícula lipídica usando ceramida DSPC/CHOL/DODAP/C8-PEG-5000 en una relación molar de aproximadamente 1 a 50:5 a 65:5 a 90:1 a 25, respectivamente. Una nanopartícula lipídica puede estar compuesta de combinaciones de lípidos adicionales en diversas proporciones, incluyendo, por ejemplo, DSPC/CHOL/DODAP/mPEG-5000 (por ejemplo, combinados en una proporción molar de aproximadamente 33:40:25:2), DSPC/CHOL/DODAP/C8 PEG-2000-Cer (por ejemplo, una relación molar combinada de aproximadamente 31:40:25:4), POPC/DODAP/C8-PEG-2000-Cer (por ejemplo, una relación molar combinada de aproximadamente 75-87:3-14:10) o DSPC/CHOL/DOTAP/C8 PEG-2000-Cer (por ejemplo, combinados en una relación molar de aproximadamente 31:40:25:4). La selección de lípidos catiónicos, lípidos no catiónicos y/o lípidos modificados con PEG que comprenden las nanopartículas lipídicas, así como la relación molar relativa de dichos lípidos entre sí, se basa en las características de los lípidos seleccionados, la naturaleza de las células o tejidos diana previstos y las características de los polinucleótidos que serán administrados por la nanopartícula lipídica. Consideraciones adicionales incluyen, por ejemplo, la saturación de la cadena alquílica, así como el tamaño, la carga, el pH, el pKa, la fusogenicidad y la toxicidad de los lípidos seleccionados.
[0066] Las nanopartículas lipídicas para uso en la presente invención se pueden preparar mediante diversas técnicas actualmente conocidas en la técnica. Las vesículas multilaminares (MLV) se pueden preparar con técnicas convencionales, por ejemplo, depositando un lípido seleccionado en la pared interior de un recipiente o recipiente adecuado disolviendo el lípido en un disolvente apropiado y luego evaporando el disolvente para dejar una película fina. en el interior del recipiente o mediante secado por aspersión. A continuación, se puede añadir una fase acuosa al recipiente con un movimiento de vórtice que da como resultado la formación de MLV. A continuación, se pueden formar vesículas unilaminares (ULV) mediante homogeneización, sonicación o extrusión de las vesículas multilaminares. Además, se pueden formar vesículas unilaminares mediante técnicas de eliminación de detergentes.
[0067] En ciertas formas de realización, las composiciones mezcladas de la presente invención comprenden una nanopartícula lipídica en la que el polinucleótido (por ejemplo, ARNm que codifica OTC) está asociado tanto en la superficie de la nanopartícula lipídica (por ejemplo, un liposoma) como encapsulado dentro de la misma nanopartícula lipídica. Por ejemplo, durante la preparación de las composiciones de la presente invención, los lípidos catiónicos que comprenden las nanopartículas lipídicas pueden asociarse con los polinucleótidos (por ejemplo, ARNm) a través de interacciones electrostáticas con dicho ARNm terapéutico.
[0068] En determinadas formas de realización, las composiciones mezcladas de la presente invención se pueden cargar con radionucleidos de diagnóstico, materiales fluorescentes u otros materiales que sean detectables en aplicaciones tanto in vitro como in vivo. Por ejemplo, los materiales de diagnóstico adecuados para su uso en la presente invención pueden incluir rodamina dioleoil fosfatidiletanolamina (Rh-PE), ARNm de proteína fluorescente verde (ARNm de GFP), ARNm de luciferasa de Renilla y ARNm de luciferasa de luciérnaga.
[0069] Durante la preparación de nanopartículas lipídicas liposomales, también se pueden encapsular agentes portadores solubles en agua en el interior acuoso incluyéndolos en la solución hidratante, y se pueden incorporar moléculas lipófilas en la bicapa lipídica mediante su inclusión en la formulación lipídica. En el caso de ciertas moléculas (por ejemplo, polinucleótidos lipófilos catiónicos o aniónicos), la carga del polinucleótido en nanopartículas lipídicas o liposomas preformados se puede lograr, por ejemplo, mediante los métodos descritos en las patentes de e E. UU. n° 4.946.683. Después de la encapsulación del polinucleótido, las nanopartículas lipídicas se pueden procesar para eliminar el ARNm no encapsulado mediante procesos como cromatografía en gel, diafiltración o ultrafiltración. Por ejemplo, si se desea eliminar el polinucleótido unido externamente de la superficie de las nanopartículas lipídicas que comprenden las composiciones farmacéuticas mezcladas, dichas nanopartículas lipídicas pueden someterse a una columna SEPHACEL de dietilaminoetil.
[0070] Además del polinucleótido encapsulado, se pueden incluir o encapsular uno o más agentes terapéuticos o de diagnóstico en la nanopartícula lipídica. Por ejemplo, dichos agentes terapéuticos adicionales pueden asociarse con la superficie de la nanopartícula lipídica, pueden incorporarse en la bicapa lipídica de la nanopartícula lipídica mediante inclusión en la formulación lipídica o cargándose en nanopartículas lipídicas preformadas (véanse las patentes estadounidenses n° 5.194.654 y 5.223.263).
[0071] Existen varios métodos para reducir el tamaño, o “tamaño”, de nanopartículas lipídicas, y cualquiera de estos métodos generalmente se puede emplear cuando se utiliza el tamaño. El método de extrusión es un método único de dimensionamiento de liposomas. (Hope, M J et al. Reduction of Liposome Size and Preparation of Unilamellar Vesicles by Extrusion Techniques. En: Liposome Technology (G. Gregoriadis, Ed.) Vol. l. p 123 (1993). El método consiste en extruir liposomas a través de una membrana de policarbonato de poros pequeños o una membrana cerámica asimétrica para reducir los tamaños de los liposomas a una distribución de tamaños relativamente bien definida. Normalmente, la suspensión se cicla a través de la membrana una o más veces hasta que se logra la distribución de tamaños de liposomas deseada. Los liposomas se pueden extruir a través de membranas de poros sucesivamente más pequeñas para lograr una reducción gradual del tamaño de los liposomas.
[0072] Está disponible una variedad de métodos alternativos conocidos en la técnica para dimensionar una población de nanopartículas lipídicas. Uno de dichos métodos de dimensionamiento se describe en la patente de<e>E. UU. n° 4.737.323. La sonicación de una suspensión de liposomas o nanopartículas lipídicas mediante sonicación con baño o sonda produce una reducción progresiva del tamaño hasta pequeños ULV de menos de aproximadamente 0,05 micrones de diámetro. La homogeneización es otro método que se basa en la energía de corte para fragmentar liposomas grandes en otros más pequeños. En un procedimiento de homogeneización típico, las MLV se recirculan a través de un homogeneizador de emulsión estándar hasta que se observan tamaños de liposomas seleccionados, típicamente entre aproximadamente 0,1 y 0,5 micrones. El tamaño de las nanopartículas lipídicas puede determinarse mediante dispersión de luz cuasi eléctrica (QELS) como se describe en Bloomfield, Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 10:421-450 (1981). El diámetro promedio de las nanopartículas lipídicas se puede reducir mediante sonicación de las nanopartículas lipídicas formadas. Los ciclos de sonicación intermitentes se pueden alternar con la evaluación QELS para guiar la síntesis eficiente de liposomas.
[0073] La selección del tamaño apropiado de una nanopartícula lipídica debe tener en cuenta el sitio de la célula o tejido objetivo y, en cierta medida, la aplicación para la que se fabrica la nanopartícula lipídica. Como se usa en el presente documento, la frase “célula diana” se refiere a células a las que se van a dirigir u orientar una o más de las nanopartículas lipídicas que comprenden la composición mezclada. En algunas formas de realización, las células diana comprenden un tejido u órgano particular. En algunas formas de realización, las células diana son deficientes en una proteína o enzima de interés. Por ejemplo, cuando se desea administrar un polinucleótido a un hepatocito, el hepatocito representa la célula diana. En algunas formas de realización, los polinucleótidos y las composiciones mezcladas de la presente invención transfectan las células diana de forma discriminatoria (es decir, no transfectan células no diana). Las composiciones de la presente invención se pueden preparar para dirigirse preferentemente a una variedad de células diana, que incluyen, entre otras, hepatocitos, células epiteliales, células hematopoyéticas, células epiteliales, células endoteliales, células pulmonares, células óseas, células madre, células mesenquimales, células neurales (p. ej., meninges, astrocitos, neuronas motoras, células de los ganglios de la raíz dorsal y neuronas motoras del asta anterior), células fotorreceptoras (p. ej., bastones y eones), células epiteliales pigmentadas de la retina, células secretoras, células cardíacas, adipocitos, células del músculo liso vascular, cardiomiocitos, células del músculo esquelético, células beta, células pituitarias, células del revestimiento sinovial, células ováricas, células testiculares, fibroblastos, células B, células T, reticulocitos, leucocitos, granulocitos y células tumorales.
[0074] Después de la transfección de una o más células diana mediante los polinucleótidos encapsulados en la una o más nanopartículas lipídicas que comprenden la composición mezclada, se puede estimular preferentemente la producción del producto (por ejemplo, un polipéptido o proteína funcional) codificado por dicho polinucleótido y se puede mejorar la capacidad de que dichas células diana expresen el polinucleótido y produzcan, por ejemplo, un polipéptido o proteína de interés. Por ejemplo, la transfección de una célula diana mediante las composiciones mezcladas que encapsulan ARNm de OTC mejorará (es decir, aumentará) la expresión del ARNm de OTC y producirá una enzima OTC funcional.
[0075] En algunas formas de realización, puede ser deseable limitar la transfección de los polinucleótidos a determinadas células o tejidos. Por ejemplo, el hígado representa un órgano diana importante para las composiciones de la presente invención en parte debido a su papel central en el metabolismo y la producción de proteínas y, en consecuencia, enfermedades que son causadas por defectos en productos genéticos específicos del hígado (por ejemplo, trastornos del ciclo de la urea) pueden beneficiarse de la focalización específica de las células (p. ej., hepatocitos). Por consiguiente, en determinadas formas de realización de la presente invención, se pueden aprovechar las características estructurales del tejido diana para dirigir la distribución de las nanopartículas lipídicas a dichos tejidos diana. Por ejemplo, para dirigirse a los hepatocitos, una o más de las nanopartículas lipídicas que comprenden la composición farmacéutica mezclada pueden tener un tamaño tal que sus dimensiones sean más pequeñas que las fenestraciones de la capa endotelial que recubre los sinusoides hepáticos en el hígado; en consecuencia, una o más de dichas nanopartículas lipídicas pueden penetrar fácilmente dichas fenestraciones endoteliales para alcanzar los hepatocitos diana. Alternativamente, una nanopartícula lipídica puede tener un tamaño tal que las dimensiones del liposoma tengan un diámetro suficiente para limitar o evitar expresamente la distribución en ciertas células o tejidos. Por ejemplo, una o ambas de la primera y segunda nanopartícula lipídica que comprenden la composición farmacéutica mezclada pueden tener un tamaño tal que sus dimensiones sean mayores que las fenestraciones de la capa endotelial que recubre los sinusoides hepáticos para limitar así la distribución de la nanopartícula lipídica liposomal a los hepatocitos. En tal forma de realización, las nanopartículas lipídicas liposomales grandes no penetrarán fácilmente las fenestraciones endoteliales y, en cambio, serían eliminadas por las células macrófagas de Kupffer que recubren los sinusoides hepáticos. Por lo tanto, el dimensionamiento de, por ejemplo, la primera y segunda nanopartículas lipídicas que comprenden la composición mezclada puede proporcionar una oportunidad para manipular adicionalmente y controlar con precisión el grado en el que se puede mejorar la expresión de los polinucleótidos encapsulados en una o más células diana. Generalmente, el tamaño de al menos una de las nanopartículas lipídicas que comprenden la composición farmacéutica mezclada está dentro del intervalo de aproximadamente 25 a 250 nm, preferiblemente menos de aproximadamente 250 nm, 175 nm, 150 nm, 125 nm, 100 nm, 75 nm, 50 nm, 25 nm o 10 nm.
[0076] De manera similar, las composiciones de la presente invención pueden prepararse para distribuirse preferentemente a otros tejidos, células u órganos diana, tales como el corazón, los pulmones, los riñones y el bazo. Por ejemplo, las nanopartículas lipídicas se pueden preparar para lograr una entrega mejorada a las células y tejidos diana. Por consiguiente, las composiciones de la presente invención pueden enriquecerse con lípidos catiónicos, no catiónicos y modificados con PEG adicionales para atacar más tejidos o células.
[0077] En algunas formas de realización, las nanopartículas lipídicas que comprenden las composiciones mezcladas se distribuyen a las células y tejidos del hígado para mejorar la administración, la transfección y la expresión posterior de los polinucleótidos (por ejemplo, ARNm) encapsulados en los mismos por las células y tejidos del hígado (por ejemplo, hepatocitos) para, en determinadas formas de realización, mejorar de este modo la producción de un polipéptido funcional codificado por dicho polinucleótido encapsulado. Si bien tales composiciones pueden distribuirse preferentemente en las células y tejidos del hígado, los efectos terapéuticos de los polinucleótidos expresados y/o los polipéptidos producidos no necesitan limitarse a las células y tejidos diana. Por ejemplo, los hepatocitos diana pueden funcionar como un “depósito” o “reserva” capaz de expresar y/o producir y excretar sistémica o periféricamente una proteína o enzima funcional. Por consiguiente, en ciertas formas de realización de la presente invención, una o más de las nanopartículas lipídicas que comprenden la composición mezclada pueden dirigirse a los hepatocitos y/o distribuirse preferentemente a las células y tejidos del hígado tras su administración. Después de la transfección de los hepatocitos diana por el polinucleótido encapsulado en una o más de las nanopartículas lipídicas que comprenden la composición mezclada, dichos polinucleótidos se expresan (por ejemplo, se traducen) y un producto funcional (por ejemplo, un polipéptido o proteína) se excreta y se distribuye sistémicamente, donde dicho producto funcional puede ejercer un efecto terapéutico deseado.
[0078] Los polinucleótidos encapsulados en una o más de las nanopartículas lipídicas que comprenden la composición mezclada pueden administrarse y/o transfectarse células o tejidos específicos. En algunas formas de realización, los polinucleótidos encapsulados son capaces de ser expresados y productos polipeptídicos funcionales producidos (y en algunos casos excretados) por la célula diana, confiriendo así una propiedad beneficiosa a, por ejemplo, las células o tejidos diana. Dichos polinucleótidos encapsulados pueden codificar, por ejemplo, una hormona, enzima, receptor, polipéptido, péptido u otra proteína de interés. En determinadas formas de realización, dichos polinucleótidos encapsulados también pueden codificar un pequeño ARN de interferencia (ARNip) o ARN antisentido con el fin de disminuir o eliminar la expresión de un ácido nucleico o gen endógeno. En determinadas formas de realización, dichos polinucleótidos encapsulados pueden ser de naturaleza natural o recombinante y pueden ejercer su actividad terapéutica utilizando mecanismos de acción sentido o antisentido.
[0079] Debe entenderse que si bien ciertas formas de realización descritas en el presente documento pueden causar una expresión mejorada o modulada de uno o más polinucleótidos encapsulados por una célula diana, la utilidad de las composiciones combinadas descritas en el presente documento no se limita a aumentos en la expresión de polinucleótidos encapsulados. Más bien, en determinadas formas de realización, las composiciones combinadas descritas en el presente documento pueden modular o provocar de otro modo una reducción sinérgica en la expresión de uno o más genes o ácidos nucleicos en una célula diana. Por ejemplo, en determinadas formas de realización en las que uno o más de los polinucleótidos encapsulados que comprenden las formulaciones combinadas de la presente son oligonucleótidos antisentido, dichas formulaciones combinadas pueden mejorar sinérgicamente (por ejemplo, aumentar) la administración de dichos oligonucleótidos antisentido encapsulados a una o más células diana, modulando de este modo o potenciando la interferencia o inhibición de la expresión o producción de un gen o ácido nucleico objetivo. Por consiguiente, cuando los polinucleótidos encapsulados son, por ejemplo, oligonucleótidos antisentido o ARNip, las formulaciones mezcladas que comprenden dichos polinucleótidos pueden mejorar sinérgicamente la entrega de polinucleótidos encapsulados a las células diana (por ejemplo, potenciada en aproximadamente uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, ocho, diez, doce, quince, veinte, veinticinco, cincuenta, cien, quinientas, mil veces o más). Dicha administración mejorada de, por ejemplo, los polinucleótidos antisentido o ARNip, utilizando las formulaciones combinadas descritas en el presente documento reduciría de ese modo de manera sinérgica la expresión de los ácidos nucleicos diana (por ejemplo, de manera que la producción de un ácido nucleico o proteína correspondiente a dichos ácidos nucleicos diana se reduce o se elimina de otro modo). En tal forma de realización, la entrega de los polinucleótidos encapsulados a las células diana puede mejorarse sinérgicamente (por ejemplo, aumentarse) y, en consecuencia, también mejorarse la función de los polinucleótidos encapsulados, causando de este modo una reducción correspondiente en la expresión de los genes o ácidos nucleicos diana.
[0080] De manera similar, en ciertas formas de realización, las invenciones descritas en el presente documento pueden provocar una producción mejorada sinérgicamente (por ejemplo, aumentada) de uno o más polipéptidos o proteínas que están codificados por los polinucleótidos encapsulados. En ciertas formas de realización en las que dichos polipéptidos o proteínas se excretan en la circulación periférica de un sujeto, se esperaría que dicha producción mejorada de polipéptidos o proteínas codificadas por, por ejemplo, un polinucleótido de ARNm encapsulado, usando las formulaciones combinadas descritas en el presente documento, provoque una correspondiente secreción mejorada (por ejemplo, aumentada) de tales polipéptidos periféricamente.
[0081] En algunas formas de realización, los polinucleótidos encapsulados (por ejemplo, ARNm que codifica una proteína deficiente) pueden incluir opcionalmente modificaciones químicas o biológicas que, por ejemplo, mejoran la estabilidad y/o la vida media de dicho polinucleótido o que mejoran o facilitan de otro modo la traducción de dicho polinucleótido.
[0082] La presente invención también contempla la administración conjunta de uno o más polinucleótidos únicos a las células diana mediante las nanopartículas lipídicas que comprenden las composiciones mezcladas, por ejemplo, combinando dos polinucleótidos únicos en una única nanopartícula lipídica. En ciertas formas de realización, un primer polinucleótido, tal como ARNm que codifica galactosa-1-fosfato uridiltransferasa (GALT) como se representa por SEQ ID NO: 2, y un segundo polinucleótido, tal como ARNm que codifica galatoquinasa (GALK), se puede encapsular en un único polinucleótido, tal como ARNm que codifica galatoquinasa (GALK), puede encapsularse en un único polinucleótido. nanopartícula lipídica (por ejemplo, una primera nanopartícula lipídica) y se mezcla con una segunda nanopartícula lipídica y se administra a un sujeto que lo necesita (por ejemplo, para el tratamiento de galactosemia). Alternativamente, en ciertas formas de realización, un primer polinucleótido, tal como ARNm que codifica galactosa-1-fosfato uridiltransferasa (GALT) como se representa por SEQ ID NO: 2, y un segundo polinucleótido, tal como ARNm que codifica galatoquinasa (GALK), se pueden encapsular respectivamente en una primera y una segunda nanopartícula lipídica, y dichas primera y segunda nanopartículas lipídicas se mezclan y administran a un sujeto que las necesita (por ejemplo, para el tratamiento de galactosemia). También se contempla la entrega conjunta y/o administración conjunta de un primer polinucleótido y un segundo polinucleótido en una composición farmacéutica mezclada. Por ejemplo, tales primer y segundo polinucleótidos (por ejemplo, ARNm exógeno o sintético) pueden encapsularse respectivamente en una primera y segunda nanopartícula lipídica y dichas primera y segunda nanopartículas lipídicas se pueden combinar en una única composición farmacéutica. En determinadas formas de realización, el segundo polinucleótido encapsulado por la segunda nanopartícula lipídica mejora la administración o mejora la expresión del primer polinucleótido. De manera similar, en ciertas formas de realización, el primer polinucleótido encapsulado por la primera nanopartícula lipídica facilita la administración o mejora sinérgicamente la expresión del segundo polinucleótido. Alternativamente, se puede encapsular un polinucleótido en una primera nanopartícula lipídica y posteriormente mezclarlo con una segunda nanopartícula lipídica vacía (es decir, una nanopartícula lipídica que no encapsula un polinucleótido). En tal forma de realización, la expresión del polinucleótido se puede potenciar (por ejemplo, aumentar) con respecto a la expresión de los polinucleótidos observada cuando la primera nanopartícula lipídica se administra independientemente de la segunda nanopartícula lipídica (por ejemplo, la expresión del polinucleótido se puede aumentar sinérgicamente en aproximadamente dos, cuatro, cinco, diez, doce, quince o veinte veces o más).
[0083] También se contempla la administración de uno o más polinucleótidos encapsulados a una o más células diana para tratar un único trastorno o deficiencia, en el que cada uno de dichos polinucleótidos funciona mediante un mecanismo de acción diferente. Por ejemplo, las composiciones farmacéuticas mezcladas de la presente invención pueden comprender un primer polinucleótido que, por ejemplo, está encapsulado en una primera nanopartícula lipídica y destinado a corregir una deficiencia de proteína o enzima endógena, y que está mezclado con un segundo polinucleótido encapsulado en una segunda nanopartícula lipídica y destinada a desactivar o “derribar” un polinucleótido endógeno que funciona mal y su proteína o producto enzimático. Dichos polinucleótidos encapsulados pueden encadenarse, por ejemplo, ARNm y ARNip. Alternativamente, dichos polinucleótidos pueden encapsularse en la misma nanopartícula lipídica y combinarse con una nanopartícula lipídica vacía. En cada una de estas formas de realización, la expresión de los polinucleótidos encapsulados se puede mejorar sinérgicamente (por ejemplo, aumentar) con respecto a la expresión de los polinucleótidos observada cuando dichas primeras nanopartículas lipídicas se administran independientemente de las segundas nanopartículas lipídicas. Por ejemplo, la expresión del polinucleótido encapsulado puede aumentarse sinérgicamente al menos aproximadamente dos, cuatro, cinco, diez, doce, quince o veinte veces o más, con respecto a la suma de la expresión de los polinucleótidos. Se observa cuando dichas primeras nanopartículas lipídicas se administran independientemente de las segundas nanopartículas lipídicas.
[0084] Aunque los polinucleótidos transcritos in vitro (por ejemplo, ARNm) pueden transfectarse en células diana, dichos polinucleótidos pueden ser degradados fácil y eficientemente por la célula in vivo, volviendo así ineficaces a dichos polinucleótidos. Además, algunos polinucleótidos son inestables en los fluidos corporales (particularmente el suero humano) y pueden degradarse o digerirse incluso antes de llegar a una célula diana. Además, dentro de una célula, un ARNm natural puede descomponerse con una vida media de entre 30 minutos y varios días. Por consiguiente, en ciertas formas de realización, los polinucleótidos encapsulados en nanopartículas lipídicas proporcionados en el presente documento, y los polinucleótidos de ARNm descritos en el presente documento, preferiblemente conservan al menos alguna capacidad para expresarse o traducirse, para producir de ese modo una proteína o enzima funcional dentro de una o más células diana.
[0085] En ciertas formas de realización, las composiciones farmacéuticas mezcladas comprenden una o más nanopartículas lipídicas que incluyen o encapsulan uno o más polinucleótidos estabilizados (por ejemplo, ARNm que se ha estabilizado contra la digestión o degradación con nucleasa in vivo) que modulan la expresión de un gen o que pueden ser expresados o traducidos para producir un polipéptido o proteína funcional dentro de una o más células diana. En determinadas formas de realización, la actividad de dichos polinucleótidos encapsulados (por ejemplo, ARNm que codifica una proteína o enzima funcional) se prolonga durante un período de tiempo prolongado. Por ejemplo, la actividad de los polinucleótidos puede prolongarse de manera que las composiciones farmacéuticas mezcladas puedan administrarse a un sujeto quincenalmente o quincenalmente, o más preferiblemente mensualmente, quincenalmente, trimestralmente o anualmente. La actividad extendida o prolongada de las composiciones farmacéuticas combinadas de la presente invención, y en particular del ARNm encapsulado, está directamente relacionada con la cantidad de proteína o enzima funcional traducida a partir de dicho ARNm. De manera similar, la actividad de las composiciones mezcladas de la presente invención se puede ampliar o prolongar aún más mediante modificaciones químicas realizadas para mejorar o potenciar aún más la traducción de los polinucleótidos de ARNm. Por ejemplo, la secuencia consenso de Kozac desempeña un papel en el inicio de la traducción de proteínas, y la inclusión de dicha secuencia consenso de Kozac en los polinucleótidos de ARNm encapsulados puede extender o prolongar aún más la actividad de los polinucleótidos de ARNm. Además, la cantidad de proteína o enzima funcional expresada y producida por la célula diana es función de la cantidad de polinucleótido (por ejemplo, ARNm) entregado a las células diana y de la estabilidad de dicho polinucleótido. En la medida en que se pueda mejorar o potenciar la estabilidad de los polinucleótidos para su uso en la presente invención, se puede ampliar aún más la vida media, la actividad de la proteína o enzima traducida y la frecuencia de dosificación de la composición.
[0086] Los polinucleótidos encapsulados en las composiciones farmacéuticas comprenden ARNm (por ejemplo, SEQ ID NO: 3 que codifica ARNm de eritropoyetina humana). En determinadas formas de realización, los polinucleótidos se pueden modificar químicamente, por ejemplo, para conferir estabilidad (por ejemplo, estabilidad relativa a la versión de tipo salvaje o natural del ARNm y/o la versión del ARNm naturalmente endógeno a las células diana). Por consiguiente, en algunas formas de realización, los polinucleótidos encapsulados proporcionados en el presente documento comprenden al menos una modificación química que confiere estabilidad aumentada o mejorada al polinucleótido, incluyendo, por ejemplo, resistencia mejorada a la digestión con nucleasas in vivo. Como se usan en el presente documento, las frases “modificaciones químicas” y “modificado químicamente”, tal como dichos términos se relacionan con los polinucleótidos proporcionados en el presente documento, incluyen al menos una alteración que preferiblemente mejora la estabilidad y hace que el polinucleótido sea más estable (por ejemplo, resistente a la digestión con nucleasa) que la versión de tipo salvaje o de origen natural de ese polinucleótido. Los términos “estable” y “estabilidad” tal como tales términos se relacionan con los polinucleótidos para uso en la presente invención, y particularmente con respecto al ARNm, se refieren a una resistencia aumentada o mejorada a la degradación por, por ejemplo, nucleasas (es decir, endonucleasas o exonucleasas) que normalmente son capaces de degradar dicho ARN. Una estabilidad aumentada puede incluir, por ejemplo, menos sensibilidad a la hidrólisis u otra destrucción por enzimas endógenas (por ejemplo, endonucleasas o exonucleasas) o condiciones dentro de la célula o tejido diana, aumentando o mejorando de este modo la residencia de tales polinucleótidos en la célula, tejido, diana. sujeto y/o citoplasma. Las moléculas de polinucleótidos estabilizadas proporcionadas en el presente documento demuestran vidas medias más largas en relación con sus homólogos no modificados de origen natural (por ejemplo, la versión natural del polinucleótido).
[0087] También se contemplan en las frases “modificación química” y “modificado químicamente” como términos relacionados con los polinucleótidos para su uso con la presente invención alteraciones que mejoran o potencian la traducción de polinucleótidos de ARNm, incluyendo, por ejemplo, la inclusión de secuencias que funcionan en el inicio de la traducción de proteínas (p. ej., la secuencia consenso de Kozac). (Kozak, M., Nucleic Acids Res 15(20):8125-48 (1987)). La frase “modificaciones químicas”, como se usa en el presente documento, también incluye modificaciones que introducen químicas que difieren de las observadas en los polinucleótidos naturales, por ejemplo, modificaciones covalentes tales como la introducción de nucleótidos modificados (por ejemplo, análogos de nucleótidos o la inclusión de grupos colgantes que no se encuentran naturalmente en tales moléculas de polinucleótidos). En algunas formas de realización, los polinucleótidos han sufrido una modificación química o biológica para hacerlos más estables antes de la encapsulación en una o más nanopartículas lipídicas. Las modificaciones químicas ejemplares de un polinucleótido incluyen el agotamiento de una base (por ejemplo, mediante eliminación o sustitución de un nucleótido por otro) o modificación química de una base.
[0088] Además, las modificaciones adecuadas incluyen alteraciones en uno o más nucleótidos de un codón de modo que el codón encadene el mismo aminoácido pero sea más estable que el codón encontrado en la versión natural del polinucleótido. Por ejemplo, se ha demostrado una relación inversa entre la estabilidad del ARN y un mayor número de residuos de citidinas (C) y/o uridinas (U), y se ha descubierto que el ARN desprovisto de residuos C y U es estable frente a la mayoría de las RNasas (Heidenreich, et al., J Biol Chem 269, 2131-8 (1994)). En algunas formas de realización, se reduce el número de residuos C y/o U en una secuencia de ARNm. En otra forma de realización, el número de residuos C y/o U se reduce mediante la sustitución de un codón que codifica un aminoácido particular por otro codón que codifica el mismo aminoácido o un aminoácido relacionado. Las modificaciones contempladas a los polinucleótidos de ARNm para su uso con la presente invención también incluyen la incorporación de pseudouridinas. La incorporación de pseudouridinas en los polinucleótidos de ARNm para su uso con la presente invención puede mejorar la estabilidad y la capacidad de traducción, así como disminuir la inmunogenicidad in vivo. (Véase, por ejemplo, Karikó, K., et al., Molecular Therapy 16(11): 1833-1840 (2008)). Las sustituciones y modificaciones de los polinucleótidos para su uso con la presente invención se pueden realizar mediante métodos fácilmente conocidos por un experto en la técnica.
[0089] Las limitaciones para reducir el número de residuos C y U en una secuencia probablemente serán mayores dentro de la región codificante de un ARNm, en comparación con una región no traducida (es decir, probablemente no será posible eliminar todos los residuos C y U presentes en el mensaje conservando al mismo tiempo la capacidad del mensaje de codificar la secuencia de aminoácidos deseada). La degeneración del código genético, sin embargo, presenta una oportunidad para permitir que se reduzca el número de residuos C y/o U que están presentes en la secuencia, manteniendo al mismo tiempo la misma capacidad de codificación (es decir, dependiendo de qué aminoácido está codificado por un codón, pueden ser posibles varias posibilidades diferentes para la modificación de secuencias de ARN). Por ejemplo, los codones de Gly se pueden alterar a GGA o GGG en lugar de GGU o GGC.
[0090] Los polinucleótidos encapsulados pueden incluir variantes tanto de origen natural como de origen no natural y, en consecuencia, dichos polinucleótidos pueden comprender no sólo los heterociclos de purina y pirimidina conocidos sino también análogos heterocíclicos y tautómeros de los mismos. Los ejemplos contemplados incluyen, entre otros, adenina, guanina, citosina, timidina, uracilo, xantina, hipoxantina, pseudouridina, 5-metilcitosina, isocitosina, pseudoisocitosina, 5-bromouracilo, 5-propiniluracilo, 6-aminopurina, 2-aminopurina, inosina, diaminopurina y 2-cloro-6-aminopurina. En algunas formas de realización, al menos uno de los nucleótidos presentes en el polinucleótido es una nucleobase modificada seleccionada del grupo que consiste en 5-metilcitosina, isocitosina, pseudoisocitosina, 5-bromouracilo, 5-propiniluracilo, 6-aminopurina, 2-aminopurina, inosina, diaminopurina y 2-cloro-6-aminopurina.
[0091] El término modificación química también incluye, por ejemplo, la incorporación de enlaces no nucleotídicos o nucleótidos modificados en las secuencias de polinucleótidos para su uso con la presente invención (por ejemplo, modificaciones de bloqueo de extremos en uno o ambos extremos 3' y 5' de una molécula de ARNm que codifica una proteína o enzima funcional). Dichas modificaciones pueden incluir la adición de bases a una secuencia de polinucleótidos (p. ej., la inclusión de una cola poli A o una cola poli A más larga), la alteración de la UTR 3' o la UTR 5', complejar el polinucleótido con un agente (p. ej., una proteína o una molécula de polinucleótido complementaria), e inclusión de elementos que cambian la estructura de una molécula de polinucleótido (por ejemplo, que forman estructuras secundarias).
[0092] Se cree que la cola poli A estabiliza los mensajeros naturales y el ARN sentido sintético. Por lo tanto, en ciertas formas de realización se puede agregar una cola larga de poli A a una molécula de ARNm, haciendo así que el ARN sea más estable. Las colas de poli A se pueden agregar utilizando una variedad de técnicas reconocidas en la técnica. Por ejemplo, se pueden añadir colas largas de poli A a ARN sintético o transcrito in vitro usando poli A polimerasa (Yokoe, et al. Nature Biotechnology. 1996; 14: 1252-1256). Un vector de transcripción también puede codificar colas largas de poli A. Además, se pueden añadir colas de poli A mediante transcripción directamente a partir de productos de PCR. Poli A también puede ligarse al extremo 3' de un ARN sentido con ARN ligasa (véase, por ejemplo, Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2a ed., ed. de Sambrook, Fritsch y Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: edición de 1991). En determinadas formas de realización, la longitud de la cola de poli A es de al menos aproximadamente 90, 200, 300, 400 y al menos 500 nucleótidos. En determinadas formas de realización, la longitud de la cola de poli A se ajusta para controlar la estabilidad de una molécula de ARNm con sentido modificado de las composiciones de la invención y, por tanto, la transcripción de la proteína. Por ejemplo, dado que la longitud de la cola de poli A puede influir en la vida media de una molécula de ARNm sentido, la longitud de la cola de poli A puede ajustarse para modificar el nivel de resistencia del ARNm a las nucleasas y controlar de este modo el transcurso del tiempo de expresión de polinucleótidos y/o producción de polipéptidos en una célula diana. En determinadas formas de realización, las moléculas de polinucleótidos estabilizadas son suficientemente resistentes a la degradación in vivo (por ejemplo, mediante nucleasas), de modo que pueden administrarse a la célula diana sin una nanopartícula lipídica.
[0093] En ciertas formas de realización, las modificaciones químicas son modificaciones de bloqueo terminal de uno o más polinucleótidos que comprenden las composiciones farmacéuticas combinadas de la invención. Por ejemplo, tales polinucleótidos pueden modificarse mediante la incorporación de secuencias no traducidas (UTR) 3' y/o 5' que no se encuentran naturalmente en el polinucleótido de tipo salvaje. En ciertas formas de realización, la secuencia flanqueante 3' y/o 5' que flanquea naturalmente un ARNm y codifica una segunda proteína no relacionada se puede incorporar en la secuencia de nucleótidos de una molécula de ARNm que codifica una proteína funcional para modificarla. Por ejemplo, pueden incorporarse secuencias 3' o 5' de moléculas de ARNm que son estables (p. ej., globina, actina, GAPDH, tubulina, histona o enzimas del ciclo del ácido cítrico) en la región 3' y/o 5' de una molécula de polinucleótido de ARNm sentido para aumentar la estabilidad de la molécula de ARNm sentido.
[0094] También se contemplan modificaciones a las secuencias de polinucleótidos realizadas en uno o ambos extremos 3' y 5' del polinucleótido. Por ejemplo, se contemplan modificaciones en el extremo 5' de los polinucleótidos (por ejemplo, ARNm) para incluir una secuencia parcial de un gen 1 inmediato-temprano (IE1) de CMV, o un fragmento del mismo para mejorar la resistencia a nucleasas y/o mejorar la vida media del polinucleótido. Además de aumentar la estabilidad de la secuencia de polinucleótidos del ARNm, se ha descubierto sorprendentemente que la inclusión de una secuencia parcial de un gen 1 inmediato-temprano (IEI) del CMV (por ejemplo, en la región 5' no traducida del ARNm) mejora aún más la traducción del ARNm. También se contempla la inclusión de una secuencia que codifica la hormona del crecimiento humano (hGH), o un fragmento de la misma, en el extremo 3' o región no traducida del polinucleótido (por ejemplo, ARNm) para estabilizar aún más el polinucleótido. Generalmente, las modificaciones químicas contempladas mejoran la estabilidad y/o las propiedades farmacocinéticas (por ejemplo, vida media) del polinucleótido en relación con sus homólogos no modificados, e incluyen, por ejemplo, modificaciones realizadas para mejorar la resistencia de dichos polinucleótidos a la digestión con nucleasas in vivo.
[0095] Las modificaciones químicas contempladas también incluyen, por ejemplo, modificar polinucleótidos encapsulados para incluir nucleótidos no naturales que comprenden, por ejemplo, restos de azúcar y/o bases modificados, que también se denominan en el presente documento “análogos de nucleótidos”. Los nucleótidos no naturales incluyen nucleótidos que tienen restos de azúcar modificados, tales como nucleótidos bicíclicos o nucleótidos modificados en 2', tales como nucleótidos sustituidos en 2'. En algunas formas de realización, los análogos de nucleótidos son variantes de nucleótidos naturales, tales como nucleótidos de ADN o ARN, en virtud de, por ejemplo, modificaciones en los restos de azúcar y/o base.
[0096] En determinadas formas de realización, los análogos de nucleótidos contemplados pueden ser funcionalmente equivalentes a los nucleótidos de origen natural en el contexto del polinucleótido. Por ejemplo, los análogos de nucleótidos pueden no tener ningún efecto funcional sobre la forma en que funciona el polinucleótido. No obstante, dichos análogos de nucleótidos funcionalmente equivalentes pueden ser útiles si, por ejemplo, son más fáciles o más baratos de fabricar, o son más estables en las condiciones de almacenamiento o fabricación, o representan una etiqueta o marcador.
[0097] En otras formas de realización, los análogos de nucleótidos pueden tener un efecto funcional sobre la forma en que funciona el polinucleótido (por ejemplo, aumentando la resistencia a las nucleasas intracelulares y/o aumentando la facilidad de transporte al interior de la célula diana). Ejemplos específicos de análogos de nucleótidos contemplados se describen, por ejemplo, en Freier y col., Nucl. Acid Res. (1997) 25: 4429-4443 y Uhlmann, et al., Curr. Opinion in Drug Development (2000) 3(2): 293-213.
[0098] Por lo tanto, los polinucleótidos divulgados en el presente documento pueden comprender o consistir en una secuencia de nucleótidos de origen natural (por ejemplo, ADN o ARNm) o, alternativamente, pueden comprender o consistir en una combinación de tales nucleótidos de origen natural y uno o más nucleótidos de origen no natural. (p. ej., análogos de nucleótidos). En determinadas formas de realización, por ejemplo, cuando los polinucleótidos encapsulados comprenden o consisten en oligonucleótidos antisentido, la inclusión de análogos de nucleótidos en dichos polinucleótidos puede mejorar adecuadamente la afinidad del polinucleótido por una o más secuencias diana. En la solicitud de patente internacional WO 2007/031091 se proporcionan ejemplos adicionales de análogos de nucleótidos adecuados y preferidos.
[0099] En algunas formas de realización, los análogos de nucleótidos se seleccionan independientemente entre, por ejemplo: unidades de 2'-O-alquil-ARN, unidades de 2'-amino-ADN, unidades de 2'-fluoro ADN, unidades de ácido nucleico bloqueadas, unidades de ácido arabinonucleico (ANA), unidades de 2'-fluoro ANA, unidades HNA, INA (unidades de ácido nucleico intercaladas como se analiza en Christensen, et al., Nucl. Acids. Res. (2002) 30: 4918-4925) y unidades 2'MOE. En determinadas formas de realización, solo uno de los tipos anteriores de análogos de nucleótidos está presente en los polinucleótidos para su uso con la invención.
[0100] En algunas formas de realización, los análogos de nucleótidos comprenden 2'-O-metoxietil-ARN (2'MOE), monómeros de 2'-fluoro-ADN o análogos de nucleótidos de ANB y, como tales, los polinucleótidos para usar con la invención pueden comprender análogos de nucleótidos que se seleccionan independientemente. de estos tres tipos de análogos, o alternativamente puede comprender sólo un tipo de análogo seleccionado de los tres tipos. En algunas formas de realización, al menos uno de los nucleótidos de un polinucleótido encapsulado es 2'-ARN-MOE, tal como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 unidades de nucleótidos de 2'-ARN-MOE. En algunas formas de realización, al menos uno de los nucleótidos de un polinucleótido encapsulado es 2'-fluoro-ADN, tal como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 unidades de 2'-fluoro-ADN.
[0101] En algunas formas de realización, los polinucleótidos encapsulados comprenden al menos una unidad de ácido nucleico bloqueado (ANB), tal como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 unidades de ANB, tal como aproximadamente 3-7 o 4-8 unidades ANB, o 3, 4, 5, 6 o 7 unidades ANB. En algunas formas de realización, todos los nucleótidos del polinucleótido son ANB. En algunas formas de realización, el polinucleótido puede comprender tanto beta-D-oxi-ANB como una o más de las siguientes unidades de ANB: tio-ANB, amino-ANB, oxi-ANB y/o ANE en beta-D o configuraciones alfa-L o combinaciones de las mismas. En algunas formas de realización, todas las unidades de citosina de ANB son 5'metilcitosina.
[0102] En algunas formas de realización, la composición farmacéutica mezclada, las dos o más nanopartículas lipídicas comprendidas en la misma o los polinucleótidos encapsulados por dichas nanopartículas lipídicas pueden comprender un reactivo estabilizante. Las composiciones pueden incluir uno o más reactivos de formulación que se unen directa o indirectamente al polinucleótido y lo estabilizan, mejorando así el tiempo de residencia en el citoplasma de una célula diana. Tales reactivos conducen preferiblemente a una vida media mejorada de un polinucleótido en las células diana. Por ejemplo, la estabilidad de un ARNm y la eficacia de la traducción se pueden aumentar mediante la incorporación de “reactivos estabilizantes” que forman complejos con los polinucleótidos (por ejemplo, ARNm) que se encuentran naturalmente dentro de una célula (ver, por ejemplo, la patente de EE. UU. n° 5.677.124). La incorporación de un reactivo estabilizante se puede lograr, por ejemplo, combinando la proteína poli A y una con el ARNm que se va a estabilizar in vitro antes de cargar o encapsular el ARNm dentro de una o más nanopartículas lipídicas que comprenden la composición farmacéutica mezclada. Los reactivos estabilizantes ejemplares incluyen una o más proteínas, péptidos, aptámeros, proteínas accesorias a la traducción, proteínas de unión a ARNm y/o factores de iniciación de la traducción.
[0103] La estabilización de las composiciones farmacéuticas combinadas descritas en el presente documento, y de las nanopartículas lipídicas constituyentes, también puede mejorarse mediante el uso de restos inhibidores de la opsonización, que normalmente son polímeros hidrófilos grandes que están unidos química o físicamente o incorporados de otro modo en la nanopartícula lipídica (p. ej., mediante la intercalación de un anclaje soluble en lípidos en la propia membrana, o mediante la unión directa a grupos activos de lípidos de la membrana). Estos polímeros hidrófilos inhibidores de la opsonización forman una capa superficial protectora que disminuye significativamente la absorción de los liposomas por el sistema macrófago-monocito y el sistema retículo-endotelial (por ejemplo, como se describe en la patente estadounidense 4.920.016). Por ejemplo, los retrasos en la absorción de nanopartículas lipídicas por el sistema reticuloendotelial pueden facilitarse mediante la adición de un recubrimiento superficial de polímero hidrófilo sobre o dentro de las nanopartículas lipídicas para enmascarar el reconocimiento y la absorción de la nanopartícula lipídica de base liposomal por el sistema reticuloendotelial. Por ejemplo, en determinadas formas de realización, una o más de las nanopartículas lipídicas que comprenden las formulaciones mezcladas comprenden un polímero de polietilenglicol (PEG) o un lípido modificado con PEG para mejorar aún más la entrega de dichas nanopartículas lipídicas a las células y tejidos diana.
[0104] Cuando el ARN se hibrida con una molécula de polinucleótido complementaria (por ejemplo, ADN o ARN), puede protegerse de las nucleasas. (Krieg, et al. Melton. Methods in Enzymology. 1987; 155, 397-415). La estabilidad del ARNm hibridado probablemente se deba a la especificidad inherente de cadena única de la mayoría de las ARNasas. En algunas formas de realización, el reactivo estabilizante seleccionado para formar complejo con un polinucleótido es una proteína eucariótica (por ejemplo, una proteína de mamífero). En aún otra forma de realización, el polinucleótido (por ejemplo, ARNm) para uso en terapia sensorial puede modificarse mediante hibridación con una segunda molécula de polinucleótido. Si una molécula de ARNm completa se hibridara con una molécula de polinucleótido complementaria, el inicio de la traducción puede reducirse. En algunas formas de realización, la región 5' no traducida y la región inicial AUG de la molécula de ARNm pueden opcionalmente dejarse sin hibridar. Después del inicio de la traducción, la actividad de desenrollado del complejo ribosomal puede funcionar incluso en dúplex de alta afinidad para que la traducción pueda continuar. (Liebhaber. J. Mol. Biol. 1992; 226: 2-13; Monia, et al. J Biol Chem. 1993; 268: 14514-22). Se entenderá que cualquiera de los métodos descritos anteriormente para mejorar la estabilidad de polinucleótidos se pueden usar solos o en combinación con uno o más de cualquiera de los otros métodos y/o composiciones descritos anteriormente.
[0105] En determinadas formas de realización, las composiciones farmacéuticas combinadas de la presente invención mejoran la administración de polinucleótidos encapsulados en nanopartículas lipídicas a una o más células, tejidos u órganos diana. En algunas formas de realización, la administración mejorada a una o más células diana comprende aumentar la cantidad de polinucleótido que entra en contacto o se administra de otro modo a las células diana. En algunas formas de realización, mejorar la administración a las células diana comprende reducir la cantidad de polinucleótido que entra en contacto con células no diana. En algunas formas de realización, mejorar la administración a las células diana comprende permitir la transfección de al menos algunas células diana con el polinucleótido encapsulado. En algunas formas de realización, el nivel de expresión del polinucleótido encapsulado por las nanopartículas lipídicas que comprenden las composiciones farmacéuticas mezcladas en cuestión aumenta en las células diana.
[0106] Los polinucleótidos para uso con la presente invención pueden combinarse opcionalmente con un gen indicador (por ejemplo, corriente arriba o corriente abajo de la región codificante del polinucleótido) que, por ejemplo, facilita la determinación del suministro de polinucleótidos a las células o tejidos diana. Los genes indicadores adecuados pueden incluir, por ejemplo, ARNm de proteína fluorescente verde (ARNm de GFP), ARNm de luciferasa de Renilla (ARNm de luciferasa), ARNm de luciferasa de luciérnaga (SEQ ID NO: 1) o cualquier combinación de los mismos. Por ejemplo, el ARNm de GFP puede fusionarse con un polinucleótido que codifica el ARNm de OTC para facilitar la confirmación de la localización del ARNm en las células, tejidos u órganos diana.
[0107] En algunas formas de realización, las composiciones mezcladas de la presente invención comprenden una o más moléculas adicionales (por ejemplo, proteínas, péptidos, aptámeros u oligogonucleótidos) que facilitan la transferencia de los polinucleótidos (por ejemplo, ARNm, miARN, ARNsn y ARNsn) desde la nanopartícula lipídica en un compartimento intracelular de la célula diana. En algunas formas de realización, la molécula adicional facilita la administración de los polinucleótidos en, por ejemplo, el citosol, el lisosoma, la mitocondria, el núcleo, las nucleolas o el proteosoma de una célula diana. También se incluyen agentes que facilitan el transporte de la proteína traducida de interés desde el citoplasma a su ubicación intercelular normal (p. ej., en la mitocondria) para tratar deficiencias en ese orgánulo. En algunas formas de realización, el agente se selecciona del grupo que consiste en una proteína, un péptido, un aptámero y un oligonucleótido.
[0108] En algunas formas de realización, las composiciones de la presente invención facilitan la producción endógena de un sujeto de una o más proteínas y/o enzimas funcionales, y en particular la producción de proteínas y/o enzimas que demuestran menos inmunogenicidad en relación con sus homólogos preparados de forma recombinante. En determinadas formas de realización de la presente invención, las nanopartículas lipídicas comprenden polinucleótidos que codifican ARNm de una proteína o enzima deficiente. Tras la distribución de dichas composiciones a los tejidos diana y la posterior transfección de dichas células diana, el ARNm exógeno cargado o encapsulado en las nanopartículas lipídicas que comprenden las composiciones mezcladas se puede traducir in vivo para producir una proteína o enzima funcional codificada por dicho ARNm encapsulado. (p. ej., una proteína o enzima en la que el sujeto tiene deficiencia). Por consiguiente, en determinadas formas de realización, las composiciones de la presente invención explotan la capacidad de un sujeto para traducir ARNm preparado de forma exógena o recombinante para producir una proteína o enzima traducida de forma endógena y, de ese modo, producir (y, cuando corresponda, excretar) una proteína o enzima funcional. El ARNm expresado y/o las proteínas o enzimas traducidas producidas a partir del mismo también pueden caracterizarse por la inclusión in vivo de modificaciones postraduccionales nativas que a menudo pueden estar ausentes en las proteínas o enzimas preparadas de forma recombinante, reduciendo así aún más la inmunogenicidad de la proteína traducida o enzima.
[0109] La encapsulación de ARNm en las nanopartículas lipídicas y la administración de composiciones farmacéuticas mezcladas que comprenden tales nanopartículas lipídicas evita la necesidad de administrar el ARNm a orgánulos específicos dentro de una célula diana (por ejemplo, mitocondrias). Más bien, tras la transfección de una célula diana y la entrega del ARNm encapsulado al citoplasma de la célula diana, el contenido de ARNm de las nanopartículas lipídicas puede traducirse y producirse y/o excretarse una proteína o enzima funcional.
[0110] También se contempla el direccionamiento discriminatorio de una o más células y tejidos diana mediante medios de direccionamiento tanto pasivos como activos. El fenómeno de la focalización pasiva explota los patrones de distribución natural de las nanopartículas lipídicas in vivo sin depender del uso de excipientes o medios adicionales para mejorar el reconocimiento de la nanopartícula lipídica por parte de una o más células diana. Por ejemplo, es probable que las nanopartículas lipídicas que están sujetas a fagocitosis por las células del sistema retículo-endotelial se acumulen en el hígado o el bazo y, en consecuencia, pueden proporcionar medios para dirigir pasivamente la administración de las composiciones a dichas células diana.
[0111] Alternativamente, se contempla el direccionamiento activo, que implica el uso de excipientes adicionales, denominados en el presente documento “ ligandos de direccionamiento” que pueden unirse (ya sea de forma covalente o no covalente) a la nanopartícula lipídica para fomentar la localización de dicha nanopartícula lipídica en ciertas células diana o tejidos diana. Por ejemplo, la dirección puede estar mediada por la inclusión de uno o más ligandos de dirección endógenos (por ejemplo, apolipoproteína E) en o sobre la nanopartícula lipídica para fomentar la distribución a las células o tejidos diana. El reconocimiento del ligando diana por los tejidos diana facilita activamente la distribución tisular y la absorción celular de las nanopartículas lipídicas y/o su contenido por las células y tejidos diana. Por ejemplo, en determinadas formas de realización, una o más de las nanopartículas lipídicas que comprenden la formulación farmacéutica combinada pueden comprender un ligando dirigido a apolipoproteína-E en o sobre dichas nanopartículas lipídicas para facilitar o fomentar el reconocimiento y la unión de dichos receptores de nanopartículas lipídicas a lipoproteínas endógenas de baja densidad expresados, por ejemplo, por hepatocitos. Como se proporciona en el presente documento, la composición puede comprender un ligando capaz de mejorar la afinidad de las composiciones mezcladas por una o más células diana. Los ligandos dirigidos pueden unirse a la bicapa externa de la nanopartícula lipídica durante la formulación o después de la formulación. Estos métodos son bien conocidos en la técnica. Además, algunas nanopartículas lipídicas pueden comprender polímeros fusogénicos tales como PEAA, hemaglutinina, otros lipopéptidos (véanse las solicitudes de patente de EE. UU. Nos 08/835.281 y 60/083.294) y otras características útiles para la administración in vivo y/o intracelular. En otras formas de realización, las composiciones mezcladas de la presente invención demuestran eficacias de transfección mejoradas y/o demuestran una selectividad mejorada hacia células o tejidos diana de interés. Por lo tanto, se contemplan composiciones mezcladas o nanopartículas lipídicas que comprenden uno o más ligandos (por ejemplo, péptidos, aptámeros, oligonucleótidos, una vitamina u otras moléculas) que son capaces de mejorar la afinidad de las composiciones mezcladas o sus nanopartículas lipídicas constituyentes y sus contenidos de polinucleótidos para una o más células o tejidos diana. Opcionalmente, los ligandos adecuados pueden unirse o enlazarse a la superficie de la nanopartícula lipídica. En algunas formas de realización, el ligando de direccionamiento puede abarcar la superficie de una nanopartícula lipídica o estar encapsulado dentro de la nanopartícula lipídica. Los ligandos adecuados se seleccionan basándose en sus propiedades físicas, químicas o biológicas (p. ej., afinidad selectiva y/o reconocimiento de marcadores o características de la superficie de la célula diana). Los sitios diana específicos de la célula y su ligando de direccionamiento correspondiente pueden variar ampliamente. Los ligandos diana adecuados se seleccionan de manera que se aprovechen las características únicas de una célula diana, permitiendo así que la composición discrimine entre células diana y no diana. Por ejemplo, las composiciones de la presente invención pueden contener marcadores de superficie (por ejemplo, apolipoproteína-B o apolipoproteína-E) que mejoran selectivamente el reconocimiento o la afinidad por los hepatocitos (por ejemplo, mediante el reconocimiento mediado por receptores y la unión a dichos marcadores de superficie). Además, se esperaría que el uso de galactosa como ligando dirigido dirigiera las composiciones de la presente invención a hepatocitos parenquimatosos, o alternativamente se esperaría que el uso de manosa que contiene residuos de azúcar como ligando dirigido dirigiera las composiciones de la presente invención a células endoteliales del hígado (p. ej., manosa que contienen residuos de azúcar que pueden unirse preferentemente al receptor de asialoglicoproteína presente en los hepatocitos). (Ver Hillery AM, et al. “Drug Delivery and Targeting: For Pharmacists and Pharmaceutical Scientists” (2002) Taylor & Francis, Inc.). La presentación de dichos ligandos de direccionamiento que se han conjugado con restos presentes en la nanopartícula lipídica facilita, por lo tanto, el reconocimiento y absorción de las composiciones mezcladas de la presente invención por una o más células y tejidos diana. Ejemplos de ligandos dirigidos adecuados incluyen uno o más péptidos, proteínas, aptámeros, vitaminas y oligonucleótidos.
[0112] Como se usa en el presente documento, el término “sujeto” se refiere a cualquier animal (por ejemplo, un mamífero), incluidos, entre otros, humanos, primates no humanos, roedores y similares, a los que se pueden aplicar las composiciones mezcladas de la presente invención. ser administrado. Normalmente, los términos “sujeto” y “paciente” se usan indistintamente en el presente documento en referencia a un sujeto humano.
[0113] La capacidad de las composiciones de nanopartículas lipídicas mezcladas para mejorar sinérgicamente la expresión de polinucleótidos encapsulados como la producción de un polipéptido o proteína proporciona medios novedosos y más eficientes para efectuar la producción in vivo de polipéptidos y proteínas para el tratamiento de una serie de enfermedades o afecciones patológicas. Dichas composiciones de nanopartículas lipídicas mezcladas son particularmente adecuadas para el tratamiento de enfermedades o afecciones patológicas asociadas con la expresión aberrante de una proteína o enzima. Por ejemplo, la administración exitosa de polinucleótidos tales como ARNm a órganos diana como el hígado y, en particular, a los hepatocitos, puede usarse para el tratamiento y la corrección de errores congénitos del metabolismo que se localizan en el hígado. Por consiguiente, las composiciones farmacéuticas combinadas y los métodos relacionados descritos en el presente documento se pueden emplear para tratar una amplia gama de enfermedades y afecciones patológicas, en particular aquellas enfermedades que se deben a deficiencias de proteínas o enzimas. Los polinucleótidos encapsulados por las nanopartículas lipídicas que comprenden las composiciones farmacéuticas mezcladas pueden codificar un producto funcional (por ejemplo, una proteína, enzima, polipéptido, péptido y/o ARN funcional) y pueden codificar un producto cuya producción in vivo se desea. Alternativamente, los polinucleótidos encapsulados por las nanopartículas lipídicas que comprenden las composiciones farmacéuticas mezcladas pueden comprender un oligonucleótido antisentido y, tras la administración de dicho oligonucleótido antisentido a una o más células diana, la expresión de genes o ácidos nucleicos diana modulada, reducida sinérgicamente o eliminada.
[0114] Los trastornos metabólicos del ciclo de la urea representan ejemplos de tales deficiencias de proteínas y enzimas que pueden tratarse utilizando los métodos descritos y las composiciones de nanopartículas lipídicas mezcladas proporcionadas en el presente documento. Dichos trastornos metabólicos del ciclo de la urea incluyen la deficiencia de ornitina transcarbamilasa (OTC), la deficiencia de arginosuccinato sintetasa (DAS) y la deficiencia de argininosuccinato liasa (DAL). Por lo tanto, en algunas formas de realización, los polinucleótidos encapsulados por las nanopartículas lipídicas proporcionadas en el presente documento codifican una enzima implicada en el ciclo de la urea, incluyendo, por ejemplo, ornitina transcarbamilasa (OTC), carbamil fosfato sintetasa (CFS), argininosuccinato sintetasa 1 (ASS1), argininosuccinato liasa (ASL) y arginasa (ARG).
[0115] Se han descrito cinco trastornos metabólicos que resultan de defectos en la biosíntesis de las enzimas implicadas en el ciclo de la urea, e incluyen la deficiencia de ornitina transcarbamilasa (OTC), la deficiencia de carbamil fosfato sintetasa (CFS), la deficiencia de argininosuccinato sintetasa 1 (ASS1) (citrulinemia), deficiencia de argininosuccinato liasa (ASL) y deficiencia de arginasa (ARG). De estos cinco trastornos metabólicos, la deficiencia de OTC representa el más común y se estima que ocurre en uno de cada 80.000 nacimientos.
[0116] OTC es una enzima mitocondrial homotrimérica que se expresa casi exclusivamente en el hígado y que codifica una proteína OTC precursora que se escinde en dos pasos tras su incorporación a la matriz mitocondrial (Horwich AL., et al. Cell 1986; 44: 451-459). La deficiencia de OTC es un trastorno genético que resulta en una forma mutada y biológicamente inactiva de la enzima ornitina transcarbamilasa. La deficiencia de<o>T<c>a menudo se hace evidente en los primeros días de vida, generalmente después de la ingestión de proteínas. En la forma grave clásica de deficiencia de OTC, durante los primeros días de vida los pacientes presentan letargo, convulsiones, coma e hiperamonemia grave, lo que rápidamente conduce a un deterioro y un desenlace fatal en ausencia de una intervención médica adecuada. (Monish S., et al., Genetics for Pediatricians; Remeda, Cold Spring Harbor Laboratory (2005)). Si se trata de forma inadecuada o no se trata, las complicaciones de la deficiencia de OTC pueden incluir retraso en el desarrollo y retraso mental. Los sujetos con deficiencia de OTC también pueden presentar daño hepático progresivo, lesiones cutáneas y cabello quebradizo. En algunas personas afectadas, los signos y síntomas de la deficiencia de OTC pueden ser menos graves y no aparecer hasta una etapa más avanzada de la vida.
[0117] El gen OTC, que se encuentra en el brazo corto del cromosoma X dentro de la banda Xp21.1, abarca más de 85 kb y está compuesto por 10 exones que codifican una proteína de 1062 aminoácidos. (Lindgren V., et al. Science 1984; 226: 698-7700; Horwich, AL., et al. Science 224: 1068-1074, 1984; Horwich, AL. et al., Cell 44: 451-459, 1986; Hata, A, y otros, J. Biochem. 100: 717-725, 1986). La enzima OTC cataliza la conversión de ornitina y carbamoil fosfato en citrulina. Dado que OTC está en el cromosoma X, las mujeres son principalmente portadoras, mientras que los hombres con mutaciones no conservadoras rara vez sobreviven más de 72 horas después del nacimiento.
[0118] En sujetos sanos, OTC se expresa casi exclusivamente en las mitocondrias hepatocelulares. Aunque no se expresa en el cerebro de sujetos sanos, la deficiencia de OTC puede provocar trastornos neurológicos. Por ejemplo, uno de los síntomas habituales de la deficiencia de OTC, que es heterogéneo en su presentación, es el coma hiperamonémico (Gordon, N., Eur J Paediatr Neurol 2003;7:115-121.).
[0119] La deficiencia de OTC es muy heterogénea, con más de 200 mutaciones únicas reportadas y grandes deleciones que representan aproximadamente el 10-15 % de todas las mutaciones, mientras que el resto generalmente comprende mutaciones puntuales sin sentido con números más pequeños de mutaciones sin sentido, de sitio de empalme y de deleciones pequeñas. (Monish A, et al.) El fenotipo de la deficiencia de OTC es extremadamente heterogéneo y puede variar desde un coma hiperamonémico neonatal agudo hasta adultos hemicigotos asintomáticos (Gordon N. Eur J Paediatr Neurol 2003; 7: 115-121). Aquellas mutaciones que resultan en enfermedades neonatales graves y potencialmente mortales se agrupan en importantes dominios estructurales y funcionales en el interior de la proteína en sitios de actividad enzimática o en la superficie entre cadenas, mientras que las mutaciones asociadas con la enfermedad de aparición tardía se localizan en la superficie de la proteína (Monish A, et al.). Los pacientes con formas más leves o parciales de deficiencia de OTC pueden tener la aparición de la enfermedad más adelante en la vida, que puede presentar vómitos recurrentes, cambios neuroconductuales o convulsiones asociadas con hiperamonemia.
[0120] Las composiciones de nanopartículas lipídicas mezcladas de la presente invención y los métodos relacionados aquí contemplados son ampliamente aplicables a la administración de polinucleótidos, y en particular de ARNm, para tratar una serie de trastornos. En particular, las composiciones mezcladas de nanopartículas lipídicas de la presente invención son adecuadas para el tratamiento de enfermedades o trastornos relacionados con la deficiencia de proteínas y/o enzimas. En determinadas formas de realización, los polinucleótidos encapsulados en nanopartículas lipídicas codifican proteínas o enzimas funcionales que son excretadas o secretadas por una o más células diana en el líquido extracelular circundante (por ejemplo, ARNm que codifica hormonas y neurotransmisores). Alternativamente, en otra forma de realización, los polinucleótidos para uso con la presente invención codifican proteínas o enzimas funcionales que permanecen en el citosol de una o más células diana (por ejemplo, ARNm que codifica enzimas asociadas con trastornos metabólicos del ciclo de la urea o una enzima asociada con un trastorno de almacenamiento lisosomal). Otros trastornos para los cuales son útiles las composiciones farmacéuticas de nanopartículas lipídicas mezcladas de la presente invención incluyen, entre otros, trastornos tales como atrofia muscular espinal (AME) relacionada con SMN1; esclerosis lateral amiotrófica (ELA); galactosemia relacionada con GALT; fibrosis quística (FQ); trastornos relacionados con SLC3Al, incluida cistinuria; trastornos relacionados con COL4A5, incluido el síndrome de Alport; deficiencias de galactocerebrosidasa; adrenoleucodistrofia y adrenomieloneuropatía ligadas al cromosoma X; ataxia de Friedreich; enfermedad de Pelizaeus Merzbacher; esclerosis tuberosa relacionada con TSCl y TSC2; síndrome de Sanfilippo B (MPS IIIB); cistinosis relacionada con CTNS; los trastornos relacionados con FMR1 que incluyen el síndrome de X frágil, el síndrome de ataxia/temblor asociado a X frágil y el síndrome de insuficiencia ovárica prematura de X frágil; síndrome de Prader-Willi; enfermedad de Fabry; telangiectasia hemorrágica hereditaria (AT); enfermedad de Niemann-Pick tipo Cl; las enfermedades relacionadas con las lipofuscinosis neuronales de los cérnidos, incluyendo la lipofuscinosis neuronal juvenil de los cérnidos (JNCL), la enfermedad de Batten juvenil, la enfermedad de Santavuori-Haltia, la enfermedad de Jansky-Bielschowsky y las deficiencias de PTT-1 y TPPI; Ataxia infantil relacionada con EIF2Bl, EIF2B2, EIF2B3, EIF2B4 y EIF2B5 con hipomielinización del sistema nervioso central/sustancia blanca en desaparición; Ataxia episódica tipo 2 relacionada con CACNAIA y CACNB4; los trastornos relacionados con MECP2, incluido el síndrome de Rett clásico, la encefalopatía neonatal grave relacionada con MECP2 y el síndrome PPM-X; síndrome de Rett atípico relacionado con CDKL5; enfermedad de Kennedy (SBMA); Arteriopatía cerebral autosómica dominante relacionada con Notch-3 con infartos subcorticales y leucoencefalopatía (CADASIL); trastornos convulsivos relacionados con SCNIA y SCNIB; los trastornos relacionados con la polimerasa G que incluyen síndrome de Alpers-Huttenlocher, neuropatía atáxica sensorial relacionada con POLG, disartria y oftalmoparesia, y oftalmoplejía externa progresiva autosómica dominante y recesiva con deleciones de ADN mitocondrial; hipoplasia suprarrenal ligada al cromosoma X; agammaglobulinemia ligada al cromosoma X; y la enfermedad de Wilson. En determinadas formas de realización, el ARNm para uso con la presente invención puede codificar proteínas o enzimas funcionales. Por ejemplo, las composiciones de la presente invención pueden incluir ARNm que codifica agalsidasa alfa, eritropoyetina, al-antitripsina, carboxipeptidasa N, alfa-L-iduronidasa, iduronato-2- sulfatasa, N acetilglucosamina-1-fosfato transferasa, N-acetilglucosaminidasa, alfa glucosaminida acetiltransferasa, N-acetilglucosamina 6-sulfatasa, N acetilgalactosamina-4-sulfatasa, beta-glucosidasa, galactosa-6-sulfato sulfatasa, beta galactosidasa, beta-glucuronidasa, glucocerebrosidasa, heparán sulfamidasa, hialuronidasa y galactocerebrosidasa u hormona del crecimiento humano.
[0121] Alternativamente, los polinucleótidos encapsulados pueden codificar anticuerpos de longitud completa o anticuerpos más pequeños (por ejemplo, cadenas pesadas y ligeras) para conferir inmunidad a un sujeto. Ciertas formas de realización de la presente invención se refieren a composiciones farmacéuticas de nanopartículas lipídicas mezcladas que pueden usarse en métodos para conferir inmunidad a un sujeto (por ejemplo, mediante la traducción de ácidos nucleicos de ARNm que codifican anticuerpos funcionales). En una forma de realización alternativa, las composiciones mezcladas de la presente invención codifican anticuerpos que pueden usarse para efectuar de forma transitoria o crónica una respuesta funcional en sujetos. Por ejemplo, el ARNm encapsulado puede codificar un anticuerpo monoclonal o policlonal funcional, que tras la traducción (y según corresponda, la excreción sistémica de las células diana) puede ser útil para dirigirse y/o inactivar una diana biológica (por ejemplo, una citocina estimuladora tal como factor de necrosis tumoral). De manera similar, el ARNm encapsulado puede codificar, por ejemplo, anticuerpos funcionales contra el factor antinefrítico útiles para el tratamiento de la glomerulonefritis membranoproliferativa tipo II o el síndrome urémico hemolítico agudo, o alternativamente puede codificar anticuerpos anti-factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) útiles para el tratamiento. de enfermedades mediadas por VEGF, como el cáncer.
[0122] Las composiciones farmacéuticas combinadas se pueden administrar a un sujeto. En algunas formas de realización, las composiciones mezcladas o las nanopartículas lipídicas constituyentes se formulan en combinación con uno o más polinucleótidos, vehículos, ligandos de dirección o reactivos estabilizantes adicionales, o en composiciones farmacológicas mezcladas donde dichas composiciones comprenden otros excipientes adecuados. Por ejemplo, en determinadas formas de realización, las nanopartículas lipídicas que comprenden las composiciones mezcladas se pueden preparar para administrar ácidos nucleicos (por ejemplo, ARNm) que codifican dos o más proteínas o enzimas distintas. Alternativamente, las composiciones de nanopartículas lipídicas mezcladas de la presente invención se pueden preparar para administrar un único polipéptido en dos o más nanopartículas lipídicas, teniendo cada una composiciones lipídicas distintas y que posteriormente se mezclan en una única formulación o forma de dosificación y se administran a un sujeto. Las técnicas para la formulación y administración de fármacos se pueden encontrar en “Remington's Pharmaceutical Sciences”, Mack Publishing Co., Easton, Pa., última edición.
[0123] Se puede administrar una amplia gama de moléculas que pueden ejercer efectos farmacéuticos o terapéuticos a las células diana utilizando las composiciones de nanopartículas lipídicas mezcladas de la presente invención. Las moléculas pueden ser orgánicas o inorgánicas. Las moléculas orgánicas pueden ser péptidos, proteínas, carbohidratos, lípidos, esteroles, ácidos nucleicos (incluidos ácidos peptídicos nucleicos) o cualquier combinación de los mismos. Una formulación para administración en células diana puede comprender más de un tipo de molécula, por ejemplo, dos secuencias de polinucleótidos diferentes que codifican una proteína, una enzima y/o un esteroide.
[0124] Las composiciones mezcladas de nanopartículas lipídicas de la presente invención se pueden administrar y dosificar de acuerdo con la práctica médica actual, teniendo en cuenta la condición clínica del sujeto, el sitio y método de administración, la programación de la administración, la edad, sexo y peso corporal del sujeto y otros factores relevantes para los médicos con experiencia habitual en la técnica. La “cantidad eficaz” para los fines del presente documento puede determinarse mediante consideraciones relevantes como las que conocen los expertos en investigación clínica experimental, artes farmacológicas, clínicas y médicas, reconociendo que las composiciones de nanopartículas lipídicas mezcladas son capaces de mejorar sinérgicamente la expresión de los polinucleótidos encapsulados y la producción de polipéptidos o proteínas codificados por ellos o modulando la expresión de un ácido nucleico o polinucleótido diana (por ejemplo, usando un oligonucleótido antisentido), y que en algunos casos puede estar justificado reducir las dosis de dichos polinucleótidos encapsulados con respecto a la formulación tradicional no mezclada. En algunas formas de realización, la cantidad administrada es eficaz para lograr al menos cierta estabilización, mejora o eliminación de los síntomas y otros indicadores que los expertos en la técnica seleccionan como medidas apropiadas del progreso, la regresión o la mejora de la enfermedad. Por ejemplo, una cantidad y un régimen de dosificación adecuados son aquellos que provocan al menos una expresión transitoria de uno o más polinucleótidos en las células diana.
[0125] Las mejoras sinérgicas en la expresión de polinucleótidos encapsulados que caracterizan las formulaciones de nanopartículas lipídicas mezcladas de la presente invención permiten que se alcancen concentraciones terapéuticamente efectivas de polipéptidos producidos tras la expresión de dichos polinucleótidos encapsulados (por ejemplo, una proteína o enzima terapéutica) en los tejidos diana (o suero si el producto es excretado por la célula diana) utilizando una dosis de polinucleótido significativamente menor que la prevista previamente. Por consiguiente, en determinadas formas de realización, la cantidad eficaz de un polinucleótido necesaria para lograr un efecto terapéutico deseado se puede reducir encapsulando dicho polinucleótido en una o más nanopartículas lipídicas y mezclando al menos dos nanopartículas lipídicas. También se contemplan métodos para reducir la cantidad de un polinucleótido necesaria para provocar un efecto terapéutico en un sujeto. Dichos métodos generalmente comprenden una etapa de administrar una composición farmacéutica al sujeto, en donde la composición farmacéutica comprende una primera nanopartícula lipídica mezclada con una segunda nanopartícula lipídica, y en donde una o ambas de la primera nanopartícula lipídica y la segunda nanopartícula lipídica comprenden el polinucleótido, seguido de la transfección de una o más células diana del sujeto con tales polinucleótidos, de modo que la cantidad del polinucleótido requerida para efectuar un efecto terapéutico se reduzca (por ejemplo, reducida con respecto a la cantidad de polinucleótido requerida para efectuar un efecto terapéutico usando un composición no mezclada u otras técnicas estándar). En determinadas formas de realización, la cantidad de un polinucleótido necesaria para efectuar un efecto terapéutico se reduce en al menos aproximadamente un 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 75 %, 80 %, 90 %, 95 % o 99 %. En ciertas formas de realización, la cantidad de un polinucleótido requerida para efectuar un efecto terapéutico se reduce en al menos dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, diez, doce, quince, veinte o veinticinco veces o más.
[0126] Las vías de administración adecuadas de las composiciones mezcladas de nanopartículas lipídicas incluyen, por ejemplo, administración oral, rectal, vaginal, transmucosa, sublingual, subdural, nasal o intestinal; administración parenteral, incluyendo inyecciones intramusculares, subcutáneas, intramedulares, así como inyecciones o infusiones intratecales, intraventriculares directas, intravenosas, intraperitoneales, intranasales, oftálmicas o intraoculares. En determinadas formas de realización, la administración de la composición de nanopartículas lipídicas mezcladas a un sujeto facilita el contacto de las nanopartículas lipídicas constituyentes con una o más células, tejidos u órganos diana.
[0127] Alternativamente, las composiciones de nanopartículas lipídicas mezcladas de la presente invención se pueden administrar de manera local en lugar de sistémica, por ejemplo, mediante inyección o infusión de la composición farmacéutica mezclada directamente en un tejido objetivo, preferiblemente en una formulación de depósito o de liberación sostenida, tal como que el contacto de las células objetivo con las nanopartículas lipídicas constituyentes puede facilitarse aún más. La entrega local puede verse afectada de varias maneras, dependiendo del tejido al que se dirige. Por ejemplo, los aerosoles que contienen composiciones de la presente invención se pueden inhalar (para administración nasal, traqueal o bronquial); las composiciones mezcladas de la presente invención se pueden inyectar en el sitio de la lesión, manifestación de la enfermedad o dolor, por ejemplo; las composiciones mezcladas se pueden proporcionar en forma de pastillas para aplicación oral, traqueal o esofágica; puede suministrarse en forma líquida, tableta o cápsula para administración en el estómago o los intestinos, puede suministrarse en forma de supositorio para aplicación rectal o vaginal; o incluso puede administrarse al ojo mediante el uso de cremas, gotas o incluso inyecciones. Las formulaciones que contienen composiciones mezcladas de la presente invención complejadas con moléculas o ligandos terapéuticos pueden incluso administrarse quirúrgicamente, por ejemplo en asociación con un polímero u otra estructura o sustancia que pueda permitir que las composiciones se difundan desde el sitio de implantación a las células circundantes. Como alternativa, dichas composiciones mezcladas se pueden aplicar quirúrgicamente sin el uso de polímeros o soportes.
[0128] En determinadas formas de realización, las composiciones mezcladas de la presente invención se formulan de manera que sean adecuadas para la liberación prolongada de los polinucleótidos o ácidos nucleicos encapsulados en las nanopartículas lipídicas constituyentes. Dichas composiciones combinadas de liberación prolongada se pueden administrar convenientemente a un sujeto en intervalos de dosificación prolongados. Por ejemplo, en determinadas formas de realización, las composiciones de la presente invención se administran a un sujeto dos veces al día, diariamente o cada dos días. En determinadas formas de realización, las composiciones de la presente invención se administran a un sujeto dos veces por semana, una vez por semana, cada diez días, cada dos semanas, cada tres semanas o más preferentemente cada cuatro semanas, una vez al mes, cada seis semanas, cada ocho semanas, cada dos meses, cada tres meses, cada cuatro meses, cada seis meses, cada ocho meses, cada nueve meses o anualmente. También se contemplan composiciones y nanopartículas lipídicas que se formulan para administración de depósito (por ejemplo, por vía intramuscular, subcutánea, intravítrea) para administrar o liberar un polinucleótido (por ejemplo, ARNm) durante períodos de tiempo prolongados. Preferiblemente, los medios de liberación prolongada empleados se combinan con modificaciones (por ejemplo, modificaciones químicas) introducidas en los polinucleótidos para mejorar la estabilidad.
[0129] También se contemplan en el presente documento composiciones farmacéuticas liofilizadas que comprenden uno o más de los compuestos descritos en el presente documento y métodos relacionados para el uso de dichas composiciones liofilizadas como se describe, por ejemplo, en la Solicitud Provisional de Estados Unidos N° PCT/US2012/041663, presentada el 8 de junio de 2011.
[0130] Si bien ciertas composiciones de la presente invención se han descrito con especificidad de acuerdo con ciertas formas de realización, los siguientes ejemplos sirven sólo para ilustrar las composiciones de la invención y no pretenden limitarlas.
[0131] Debe entenderse que los artículos “un” y “una” tal como se usan en la presente memoria descriptiva y en las reivindicaciones, a menos que se indique claramente lo contrario, incluyen los referentes en plural. Cuando los elementos se presentan en esta especificación como listas (por ejemplo, en el grupo Markush o formato similar), se debe entender que cada subgrupo de elementos también se divulga y cualquier elemento puede eliminarse del grupo. Debe entenderse que, en general, cuando se hace referencia a que la invención, o aspectos de la invención, comprenden elementos particulares, características, etc., ciertas formas de realización de la invención o aspectos de la invención consisten, o consisten esencialmente en, tales elementos, características, etc. Para fines de simplicidad, esas formas de realización no se han establecido específicamente en todos los casos con tantas palabras en el presente documento.
EJEMPLOS
[0132] Los siguientes ejemplos se refieren generalmente a composiciones y formulaciones farmacéuticas de nanopartículas lipídicas, y en particular a composiciones y formulaciones farmacéuticas que comprenden “mezclas” de tales nanopartículas lipídicas, así como a métodos altamente eficaces para usar las composiciones y formulaciones farmacéuticas anteriores para administrar construcciones de polinucleótidos a una o más células, tejidos y órganos diana.
Ejemplo l. Formulaciones y material de ARN mensajero
Materiales lipídicos
[0133] Las formulaciones descritas en el presente documento incluyen una mezcla de lípidos multicomponente de proporciones variables que emplean uno o más lípidos catiónicos, lípidos auxiliares y lípidos PEGilados diseñados para encapsular diversos materiales a base de ácidos nucleicos. Los lípidos catiónicos pueden incluir, entre otros, DOTAP (1,2-dioleil-3-trimetilamonio propano), DODAP (1,2-dioleil-3-dimetilamonio propano), DOTMA (1,2-di-O-octadecenil-3-trimetilamonio propano), DLinDMA (Heyes, J.; Palmer, L.; Bremner, K.; MacLachlan, l. “Cationic lipid saturation influences intracellular delivery of encapsulated nucleic acids” J Contr. Rel. 2005, 107, 276 - 287), DLin-KC2-DMA (Semple, SC et al. “Rational Design of Cationic Lipids for siRNA Delivery” Nature Biotech. 2010, 28, 172-176), C12-200 (Love, K.T. et al. “Lipid-like materials for low-dose in vivo gene silencing” PNAS 2010, 107, 1864-1869), HGT4003, ICE, a base de dialquilamino, a base de imidazol o a base de guanidinio. Otros componentes de nanopartículas pueden incluir, entre otros, DSPC (1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfocolina), DPPC (1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina), DOPE (1,2-dioleilsn-glicero-3-fosfoetanolamina), DPPE
[0134] (1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina), DMPE (1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina), DOPG (,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfo-(1'-rac-glicerol)), o colesterol. Los lípidos PEGilados pueden incluir, entre otros, una cadena de poli(etilen)glicol de hasta 5 kDa de longitud unida covalentemente a un lípido con cadena(s) alquílica(s) de longitud C6-C<20>.
Material de ARN mensajero
[0135] Se sintetizaron ARN mensajero de luciferasa de luciérnaga con codones optimizados (ARNm de CO-FFL), galactosa-1-fosfato uridil transferasa (GALT) y eritropoyetina humana (EPO) mediante transcripción in vitro a partir de una plantilla de ADN plásmido que codifica el gen, seguida de la adición de una estructura de tapa 5' (Cap1) (Fechter, P.; Brownlee, GG “Recognition of mRNA cap structures by viral and cellular proteins” J Gen. Virology 2005, 86, 1239-1249) y un poli(A) 3' cola de aproximadamente 200 nucleótidos de longitud según lo determinado por electroforesis en gel. Las regiones no traducidas 5' y 3' presentes en cada producto de ARNm se representan como X e Y, respectivamente, y se definen como se indica.
ARNm de luciferasa CO-FF:
XAUGGAAGAUGCCAAAAACAUUAAGAAGGGCCCAGCGCCAUUCUACCCACUCGAAGA
CGGGACCGCCGGCGAGCAGCUGCACAAAGCCAUGAAGCGCUACGCCCUGGUGCCCGG
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CCUGCUGGUGCCCACACUAUUUAGCUUCUUCGCUAAGAGCACUCUCAUCGACAAGUA
CGACCUAAGCAACUUGCACGAGAUCGCCAGCGGCGGGGCGCCGCUCAGCAAGGAGGU
AGGUGAGGCCGUGGCCAAACGCUUCCACCUACCAGGCAUCCGCCAGGGCUACGGCCU
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GACACUGGGUGUGAACCAGCGCGGCGAGCUGUGCGUCCGUGGCCCCAUGAUCAUGAG
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CGGUGGUGUUGUGUUCGUGGACGAGGUGCCUAAAGGACUGACCGGCAAGUUGGACGC
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AY (S E O ID N O 1)
ARNm de GALThumano:
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CGCAGCAGCAACCUUCCGGGCAAACGACCAUCAGCAUAUCCGCUACAACCCGCUGCA
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AY ( S E Q 1 D N 0 2 )
ARNm de EPO humana:
XAUGGGGGUGCACGAAUGUCCUGCCUGGCUGUGGCUUCUCCUGUCCCUGCUGUCGCU
CCCUCUGGGCCUCCCAGUCCUGGGCGCCCCACCACGCCUCAUCUGUGACAGCCGAGU
CCUGGAGAGGUACCUCUUGGAGGCCAAGGAGGCCGAGAAUAUCACGACGGGCUGUGC
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CUCAGCUGCUCCACUCCGAACAAUCACUGCUGACACUUUCCGCAAACUCUUCCGAGU
CUACUCCAAUUUCCUCCGGGGAAAGCUGAAGCUGUACACAGGGGAGGCCUGCAGGAC
AGGGGACAGAUGAY (SE Q ID NO: 3)
Secuencias UTR 5 y 3'
X = GGGAUCCUACC (SEQ ID NO: 4)
o
GGACAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUCCAUAGAAGACACCGG
GAC C GAUC CAG CCUCCGCGGCCGGGAACGGUGCAUUGGAACGCGGAUUCCCCGUGCC
AAGAGÜGACUCACCGUCCUUGACACG (S E Q ID N O : 5)
<Y - UUUGAAUU>(SEQ<ID>NO:<6)>
o
CGGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAGUUGCCAC
<UCCAGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUC>(SEQ<ID>NO:<7)>
Protocolo de formulación ejemplar
[0136] Las nanopartículas lipídicas (LNP) se formaron mediante métodos estándar de inyección de etanol (Ponsa, M.; Foradada, M.; Estelrich, J. “Liposomes obtained by the ethanol injection method” Int. J Pharm. 1993, 95, 51-56). Las soluciones madre etanólicas de los lípidos se prepararon con anticipación a 50 mg/mL y se almacenaron a -20 °C. El ARNm de FFL se almacenó en agua a una concentración final de 1 mg/mL a -80 °C hasta el momento de su uso. Todas las concentraciones de ARNm se determinaron mediante el ensayo Ribogreen (Invitrogen). La encapsulación del ARNm se calculó realizando el ensayo Ribogreen con y sin la presencia de Triton-X 100 al 0,1 %. Los tamaños de partículas (dispersión dinámica de la luz (DLS)) y los potenciales zeta se determinaron utilizando un instrumento Malvern Zetasizer en soluciones 1x de PBS y 1mM de KCl., respectivamente.
Ejemplo de formulación 1:
[0137] Se mezclaron alícuotas de soluciones etanólicas de 50 mg/ml del lípido catiónico a base de imidazol ICE, DOPE y DMG-PEG2K y se diluyeron con etanol hasta un volumen final de 3 ml. Por separado, se preparó una solución tamponada acuosa (citrato 10 mM/NaCl 150 mM, pH 4,5) de ARNm de FFL a partir de una solución madre de 1 mg/ml. La solución lipídica se inyectó rápidamente en la solución acuosa de ARNm y se agitó para producir una suspensión final en etanol al 20 %. La suspensión de nanopartículas resultante se filtró, se diafiltró con 1x PBS (pH 7,4), se concentró y se almacenó a 2-8 °C. Concentración final = 1,73 mg/ml de ARNm de CO-FF (encapsulado). Zave = 68,0 nm (Dvcso) = 41,8 nm; DV(90) = 78,0 nm). Potencial Zeta = 25,7 mV.
Ejemplo de formulación 2:
[0138] Se mezclaron alícuotas de soluciones etanólicas de 50 mg/ml de DLinKC2DMA, DOPE, colesterol y DMG-PEG2K y se diluyeron con etanol hasta un volumen final de 3 ml. Por separado, se preparó una solución tamponada acuosa (acetato 10 mM, pH 6,5) de ARNm de FFL a partir de una solución madre de 1 mg/ml. La solución lipídica se inyectó rápidamente en la solución acuosa de ARNm y se agitó para producir una suspensión final en etanol al 20 %. La suspensión de nanopartículas resultante se filtró, se diafiltró con 1x PBS (pH 7,4), se concentró y se almacenó a 2-8 °C. Concentración final = 3,47 mg/ml de ARNm de CO-FF (encapsulado). Zave = 74,3 nm (Dv(<50>) = 58,6 nm; DV(<90>) = 95,2 nm).
[0139] Todas las formulaciones se prepararon de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo de formulación 1, con la excepción de las formulaciones de DLinKC2DMA, que se formularon de acuerdo con el Ejemplo de formulación 2. En la Tabla 1 se describen varios ejemplos de formulaciones de nanopartículas lipídicas. Todas las proporciones de lípidos se calculan como porcentaje molar.
Tabla 1. Formulaciones ejemplares de nanopartículas lipídicas.
Formulaciones “mezcladas":
[0140] Se combinó una porción de una formulación de lípidos catiónicos con una alícuota separada de una formulación de lípidos catiónicos diferente en una proporción deseada, basada en las concentraciones de ARNm encapsulado y se dosificó en consecuencia.
Formulaciones “mixtas":
[0141] Una formulación única sintetizada a partir de una solución orgánica previamente combinada de lípidos auxiliares, lípidos pegilados y múltiples lípidos catiónicos/ionizables no idénticos.
[0142] Tal como se utiliza en el presente documento, el término “mezcla” se refiere a una combinación de dos o más formulaciones separadas no idénticas. Normalmente, las dos o más formulaciones separadas no idénticas se combinan o mezclan en una composición, tal como una suspensión, como se representa, por ejemplo, en la FIG. 1. Como se usa en este documento, formulaciones no idénticas se refieren a formulaciones que contienen al menos un componente lipídico distinto. En algunas formas de realización, las formulaciones no idénticas adecuadas para la mezcla contienen al menos un componente lipídico catiónico distinto. El término “mezcla” como se usa en el presente documento se distingue de los términos “mezcla” o “combinación”, que se usan en el presente documento para definir una única formulación que contiene múltiples lípidos catiónicos/ionizables no idénticos, múltiples lípidos auxiliares no idénticos y/o múltiples lípidos pegilados no idénticos. En algunas formas de realización, una formulación “mezclada” contiene al menos dos o más lípidos catiónicos/ionizables no idénticos. Normalmente, una formulación “mezclada” contiene una única población homogénea de nanopartículas lipídicas.
Ejemplo 2. Protocolo de inyección y ensayos de expresión y biodistribución in vivo.
Protocolo de inyección
[0143] Todos los estudios se realizaron utilizando ratones CD-1 machos o hembras de aproximadamente 6 a 8 semanas de edad al comienzo de cada experimento. Las muestras se introdujeron mediante una inyección en bolo único en la vena de la cola o la administración intracerebroventricular (ICV) de una dosis total equivalente de ARNm de FFL encapsulado hasta una dosis de 230 microgramos. Cuatro horas después de la inyección, los ratones fueron sacrificados y perfundidos con solución salina.
Aislamiento de tejidos de órganos para análisis
[0144] Se recogieron el hígado, el bazo y, cuando correspondía, el cerebro de cada ratón, se dividieron en dos partes y se almacenaron en: (1) - formalina tamponada neutra al 10 % o; (2) - congelado rápidamente y almacenado a -80 °C para análisis de bioluminiscencia.
Ensayo de bioluminiscencia
Homogeneización de tejidos
[0145] El ensayo de bioluminiscencia se realizó utilizando un sistema de ensayo de luciferasa Promega (Promega). La preparación del tejido se realizó de la siguiente manera: brevemente, se descongelaron porciones de la muestra de tejido deseada (congeladas instantáneamente), se lavaron con agua desionizada y se colocaron en un tubo de homogeneización de perlas de cerámica. El tejido se trató con tampón de lisis y se homogeneizó. Tras someterlo a cinco ciclos de congelación/descongelación seguidos de centrifugación a 4 °C, el sobrenadante se transfirió a un nuevo tubo de microcentrífuga y se almacenó a -80 °C.
Ensayo de luciferasa
[0146] El reactivo de ensayo de luciferasa se preparó añadiendo 10 ml de tampón de ensayo de luciferasa al sustrato de ensayo de luciferasa y se mezcló mediante vórtice. Se cargaron veinte microlitros de cada homogeneizado en una placa de 96 pocillos, junto con 20 microlitros de control de placa. Por separado, se cargaron 120 microlitros de reactivo de ensayo de luciferasa en cada pocillo de una placa de fondo plano de 96 pocillos y se analizaron utilizando un instrumento Biotek Synergy 2 para medir la luminiscencia (las mediciones se registraron en unidades relativas de luz (URL)).
Ensayo EPO
[0147] La proteína EPO humana se detectó mediante el sistema hEPO ELISA (R&D Systems). Los análisis de transferencia Western se realizaron utilizando un anticuerpo anti-hEPO MAB2871 (R&D Systems) y proteína EPO humana ultrapura (R&D Systems) como control.
Ejemplo 3. Entrega de ARNm de CO-FFL mediante nanopartículas derivadas de lípidos
[0148] Para el estudio, a los animales se les inyectó por vía intravenosa una dosis única de ARNm encapsulado y se sacrificaron después de cuatro horas. La actividad de la proteína luciferasa de luciérnaga expresada en hígados y bazos se determinó mediante un ensayo de bioluminiscencia. Se observó una señal detectable por encima del valor inicial en cada animal analizado para determinar la expresión de la proteína luciferasa de luciérnaga a partir del ARNm exógeno.
[0149] Como se ilustra en la Figura 2, todas las formulaciones probadas produjeron una producción de luminiscencia mejorada con respecto a diferentes controles (p. ej., nanopartículas lipídicas encapsuladas con ARNm no FFL, nanopartículas vacías y PBS). En la Tabla 2 a continuación se presenta una representación detallada de los valores brutos de la producción de luminiscencia (expresada como la mediana de URL/mg de proteína total) de la proteína luciferasa de luciérnaga detectada en el hígado de ratones 4 horas después de la administración de una dosis única de las formulaciones lipídicas. Los controles utilizados en el presente estudio incluyeron una nanopartícula lipídica catiónica basada en C12-200 que encapsula un ARNm no fluorescente (dosis de 30 |jg) y un vehículo de PBS.
Tabla 2. Producción de luminiscencia de la proteína CO-FFL en ratones
Ejemplo 4. La combinación de dos nanopartículas lipídicas separadas y no idénticas conduce a una mejora sinérgica de la expresión
[0150] Para evaluar la eficacia de la transfección de diversas formulaciones encapsulantes de lípidos de ARNm de CO-FFL, se prepararon y analizaron mezclas y combinaciones de diversas formulaciones de nanopartículas lipídicas, así como las nanopartículas lipídicas constituyentes individuales y se analizó su capacidad para transfectar y expresar ARNm en diversos células y tejidos diana (según lo determinado por la luminiscencia de la proteína luciferasa de luciérnaga) in vivo.
[0151] Específicamente, se prepararon dos formulaciones de nanopartículas lipídicas que encapsulan ARNm de FFL y que comprenden C12-200 o DLin-KC2-DMA como lípido catiónico de acuerdo con el protocolo de formulación descrito en el Ejemplo 1 (dichas formulaciones se denominan en el presente documento Formulaciones 1 y 2, respectivamente). Se preparó una tercera formulación de nanopartículas lipídicas que encapsula el ARNm de FFL y que comprendía una mezcla de los lípidos catiónicos C12-200 y DLin-KC2-DMA en una única nanopartícula lipídica (denominada en el presente documento Formulación 3). Finalmente, se preparó una cuarta formulación de nanopartículas lipídicas que comprendía una mezcla de las Formulaciones 1 y 2 en una proporción de 1:3 basada en la dosis de ARNm de<f>F<l>encapsulado (denominada en el presente documento Formulación 4). La Tabla 3 representa el componente lipídico catiónico de las Formulaciones 1, 2, 3 y 4, así como la dosis total de ARNm de FFL encapsulado.
Tabla 3. Intensidad de fluorescencia hepática para formulaciones de lípidos simples, mixtas y combinadas
[0152] A los animales se les inyectó por vía intravenosa (mediante una inyección en la vena de la cola) una dosis única de ARNm de FFL encapsulado en las Formulaciones 1, 2, 3 o 4 y se sacrificaron después de cuatro horas. La actividad del ARNm de luciferasa de luciérnaga expresado en el hígado y el bazo de los animales se determinó mediante un ensayo de bioluminiscencia. Se observó una señal detectable por encima del valor inicial en todos los animales analizados, lo que infiere la expresión del ARNm de FFL encapsulado administrado exógenamente y la correspondiente producción de la proteína luciferasa de luciérnaga.
[0153] Se evaluó una comparación de la producción de luminiscencia de la proteína FFL expresada en el hígado tras su administración a través de varias nanopartículas liposomales. La luminiscencia de una única formulación varió en intensidad según el lípido catiónico empleado. Dicha luminiscencia también puede depender (pero no exclusivamente) de la composición de lípidos, del contenido total de lípidos y de la dosis. Sin embargo, todas las formulaciones probadas produjeron una salida de luz mejorada con respecto a diferentes controles (nanopartículas cargadas con ARNm no FFL, nanopartículas vacías, PBS, etc.) (Figura 2). En la Tabla 3 se incluye una representación más detallada de la salida luminiscente (valores brutos) de estas formulaciones.
[0154] Como se muestra en la Tabla 3, mezclar diferentes lípidos catiónicos dentro de una única formulación (C12-200, DLin-KC2-DMA) aún permite la entrega exitosa del ARNm deseado al tejido objetivo con una producción general comparable de proteína (basada en la producción de URL medida). de proteína FFL) en comparación con la formulación basada en C12-200 o DLin-KC2-DMA. Sin embargo, al mezclar dos formulaciones separadas no idénticas, se observó una mejora sinérgica (no aditiva) en la producción de luz (Figura 3, Tabla 3). Específicamente, como se enumera en la Tabla 3, cuando se mezcla una nanopartícula lipídica basada en C12-200 que encapsula ARNm de FFL (Formulación n° 1) con una nanopartícula lipídica cargada con ARNm de FFL basada en DLin-KC2-DMA (Formulación n° 2) en un 1:3 (30 ug de ARNm de FFL: 90 ug de ARNm de FFL, respectivamente), se observa un valor medio de URL de 46,8 x 106 URL/mg de proteína (Formulación n° 4). Esto se compara con un valor aditivo esperado de 5,05 x 106 URL/mg de proteína, basado en la suma de cada formulación analizada individualmente (2,77 x 106 y 2,28 x 106 URL/mg de proteína para las Formulaciones n° 1 y n° 2, respectivamente (Figura 3, Tabla 3)). Al administrar una mezcla de las dos formulaciones, se logra una producción luminiscente 9 veces mayor (es decir, una producción más eficaz de la proteína deseada).
[0155] Por el contrario, simplemente mezclar dos lípidos dentro de una nanopartícula lipídica no dio como resultado ninguna mejora observable (Formulación n° 3, Tabla 3). Por ejemplo, una dosis de 30 ug de una nanopartícula lipídica cargada con ARNm C12-200/DLin-KC2-DMA FFL mixta produjo una producción luminiscente comparable, aunque menor, que nanopartícula sola de lípido cargada con ARNm de C12-200 o DLin-KC2-DMA FFL (1,53 x 106 URL/mg de proteína frente a 2,77 x 106 y 2,28 x 106 URL/mg de proteína, respectivamente) (Figura 3, Tabla 3). Cuando se dosificaba dicha “mezcla” a 120 ug, la formulación resultante era letal. Es de destacar que la combinación de dos formulaciones separadas a esta dosis (120 ug) fue bien tolerada en ratones después de 4 horas.
[0156] El efecto de la mezcla se evaluó adicionalmente utilizando dos mezclas de lípidos de ARNm de CO-FFL adicionales: C12-200/ICE FFL y DODAP/ICE FFL. Cuando la formulación mixta C12-200/|C<e>FFL se dosificó a 30 ug, la producción luminiscente media resultante detectada fue de 2,71 x 106 URL/mg de proteína, comparable a una formulación lipídica individual basada en C12-200 (2,77 x 106 URL/mg de proteína). La formulación mixta DODAP/ICE FFL dio como resultado una producción media de 7300 URL/mg de proteína en comparación con una formulación única basada en DODAP (~14.000 URL/mg de proteína). Como se indicó anteriormente, una formulación mixta ha producido resultados comparables a las formulaciones basadas en lípidos catiónicos individuales, pero no mejorados.
Ejemplo 5. Sinergia observada en una variedad de diferentes mezclas de nanopartículas lipídicas
[0157] Este ejemplo demuestra que la sinergia observada en el Ejemplo 4 no se limita a formulaciones específicas mezcladas. De hecho, esta sinergia se observa en una amplia variedad de nanopartículas lipídicas diferentes mezcladas en diversas proporciones. En la Tabla 4 se resumen resultados ejemplares de diversos experimentos.
[0158] Específicamente, se prepararon múltiples formulaciones de nanopartículas lipídicas que encapsulan ARNm de FFL y que comprenden C12-200, DLin-KC2-DMA, ICE, DODAP o HGT4003 como lípido catiónico de acuerdo con el protocolo de formulación descrito en el Ejemplo 1, y posteriormente se mezclaron en diversas proporciones para preparar la formulación de nanopartículas lipídicas mezcladas (Tabla 4). Además, las formulaciones lipídicas designadas como “(A)” comprenden una concentración del 5 % del lípido modificado con PEG DMG-PEG2000, mientras que las formulaciones lipídicas designadas como “(B)” comprenden un 10 % de DMG-PEG2000. A los animales se les inyectó por vía intravenosa (mediante una inyección en la vena de la cola) una única dosis en bolo de ARNm de FFL encapsulado en una formulación lipídica mezclada o en la formulación lipídica constituyente y se sacrificaron después de cuatro horas. La actividad del ARNm de luciferasa de luciérnaga expresado en el hígado se determinó mediante un ensayo de bioluminiscencia. Los aumentos varían de 1,1 a 10 veces la luminiscencia sobre la suma de cada formulación individual respectiva, lo que demuestra una mejora sinérgica.
[0159] Como se muestra en la Tabla 4, cada mezcla dio como resultado un aumento en la luminiscencia al administrar ARNm de FFL en comparación con la suma de la producción de sus formulaciones individuales. Los experimentos n° 1-4 (Tabla 4) fueron similares a los descritos anteriormente (Ejemplo 4). Los resultados mostrados en la Tabla 4 también indican que al variar los parámetros de formulación (porcentaje de PEG) para cada nanopartícula, se puede ajustar y controlar eficazmente la cantidad de mejora sinérgica. Además, esta mejora sinérgica en la producción de proteínas puede verse afectada/adaptada por la composición de los lípidos (distintos de los lípidos PEGilados) y el contenido total de lípidos.
[0160] Otro ejemplo de mejora sinérgica utilizando diferentes formulaciones de lípidos catiónicos está representado por el Experimento n° 8. Cuando se mezcla una nanopartícula lipídica basada en HGT4003 cargada con ARNm de FFL con una nanopartícula lipídica basada en ICE cargada con ARNm de FFL en una proporción de 1:1 (100 ug de ARNm encapsulado: 100 ug de ARNm encapsulado, respectivamente), se observa una URL media/mg. valor de proteína de 4,39 x 105. Esto se compara con un valor aditivo esperado de 2,77 x 105 URL/mg de proteína, basado en la suma de cada formulación analizada individualmente (2,53 x 105 y 2,40 x 104 URL/mg de proteína, respectivamente (Tabla 4, Figura 4)).
[0161] Otro factor es la proporción en la que se mezclan las formulaciones. Como se representa en la Figura 4, dos formulaciones que encapsulan ARNm de FFL se dosifican individualmente y como mezclas empleando dos proporciones de mezcla diferentes, 1:1 y 3:1 (HGT4003:ICE) (Tabla 4, Experimento n° 8 y n° 9, respectivamente). Si bien se observa un aumento sinérgico en la luminiscencia para ambas mezclas, se observa una mejora mucho mayor cuando las dos formulaciones se mezclan en una proporción de 3:1 (HGT4003:ICE). Las formulaciones mezcladas en una proporción de 1:1 produjeron una mejora de 1,59 veces con respecto a la suma de sus contrapartes individuales, mientras que las formulaciones mezcladas en una proporción de 3:1 produjeron una mejora aproximada de 4,4 veces.
[0162] Los resultados descritos en este documento demuestran que la combinación de dos nanopartículas lipídicas cargadas con ARNm de FFL separadas permite mecánicamente la producción de más proteína FFL dentro del hígado del ratón de forma sinérgica que en comparación con sus contrapartes separadas. Sin desear quedar vinculado a ninguna teoría, se contempla que las posibles explicaciones para la sinergia incluyen: a.) vías no competitivas de entrada celular, b.) combinación de diferentes mecanismos de tráfico intracelular (protón-esponja versus fusogenicidad, c.) “fusión endosómica” que combina propiedades de liberación de fármacos con propiedades de liberación endosómica (es decir, una célula puede absorber ambas nanopartículas separadas y, a medida que se procesan a través de la vía endosómica, los endosomas se fusionan y luego un conjunto de lípidos mejora al otro en términos de liberación de ARNm), d.) modulación de vías inhibidoras activas que permitan una mayor absorción de nanopartículas.
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Ejemplo 6. Efecto sinérgico es independiente del ácido nucleico incorporado.
[0163] Esta mejora sinérgica de la producción de luz es aún más evidente cuando se sustituyen nanopartículas lipídicas de ARNm “ficticias” (no FFL) no fluorescentes como componente de la mezcla. Específicamente, se realizaron experimentos representativos que incorporaron ARNm que codifica galactosa-1-fosfato uridil transferasa (GALT) como componente no fluorescente para demostrar que la noción de sinergia con respecto a la mezcla de formulaciones separadas es independiente del ácido nucleico incorporado (Figura 5).
[0164] La Figura 5 ilustra una comparación de la luminiscencia media observada al estudiar formulaciones combinadas que encapsulan ARNm fluorescente (FFL) y no fluorescente (GALT). Las formulaciones de nanopartículas lipídicas basadas en C12-200 se administraron en una dosis de 30 |jg de ARNm, mientras que las formulaciones de nanopartículas lipídicas basadas en DLin-KC2-DMA se administraron en una dosis de 90 jg de ARNm. Ambas formulaciones combinadas se administraron en dosis de 120 jg de ARNm total. Como se ilustra en la Figura 5, se observó una luminiscencia mediana mejorada en ambas formulaciones combinadas en relación con la luminiscencia observada cuando se administran individualmente las nanopartículas lipídicas constituyentes.
[0165] La Tabla 5 enumera algunos ejemplos representativos de diversos sistemas basados en lípidos catiónicos que demuestran una producción sinérgica de proteína FFL cuando incorporan un mensaje GALT no fluorescente en una de las formulaciones.
[0166] Como se puede observar en la Tabla 5, la sinergia es evidente en una variedad de lípidos catiónicos empleados (C12-200, DLin-KC2-DMA, HGT4003, ICE, DODAP, etc., Tabla 5). En algunos casos, se observan mejoras de más de 30 veces mayores que las formulaciones individuales administradas por separado (Tabla 5, Experimento n° 14). Esto fue evidente al mezclar una formulación del lípido HGT4003 a base de disulfuro que encapsula el ARNm de FFL con una formulación a base de C12-200 que encapsula el ARNm de GALT (Tabla 5, Experimento n° 17). Las URL medias observadas medidas en los hígados de ratones cuatro horas después de la administración fueron 8,38 x 106 URL para las blendas en comparación con 3,85 x 105 URL de la nanopartícula cargada con ARNm de FFL basada en HGT4003 de forma independiente. Se observó una fluorescencia de fondo insignificante para todos los grupos de nanopartículas lipídicas cargadas con ARNm de GALT no fluorescentes.
[0167] Otro ejemplo de mejora sinérgica observada al combinar una nanopartícula lipídica cargada con ARNm de FFL con una nanopartícula lipídica cargada con ARNm de GALT se representa en el Experimento n° 18 (Tabla 5). Una mezcla de una nanopartícula lipídica basada en ICE cargada con ARNm de FFL con una nanopartícula lipídica basada en DLin-KC2-DMA cargada con ARNm de GALT (relación 1:1 basada en la dosis de ARNm encapsulado) produjo una URL media observada/mg. valor de proteína de 1,84 x 105. Esto se compara con un valor de 3,76 x 104 URL/mg de proteína para la formulación basada en<i>C<e>cargada con ARNm de FFL administrada de forma independiente. Tal mezcla proporcionó una mejora de aproximadamente 4,85 veces en la salida luminiscente.
[0168] Por lo tanto, los experimentos mostrados en la Tabla 5 demuestran claramente que la mejora sinérgica con respecto a la producción de luz no depende de que ambas nanopartículas tengan un mensaje fluorescente incorporado, lo que sugiere que los efectos sinérgicos con respecto a la combinación de formulaciones lipídicas separadas son independientes del ácido nucleico incorporado.
[0169] A continuación probamos si el efecto sinérgico con respecto a la mezcla de diferentes formulaciones de lípidos depende de la presencia de ARN mensajero. Para ello, se probaron nanopartículas liposomales vacías (sin ningún ARNm encapsulado) como posibles agentes sinérgicos. Curiosamente, la combinación de una nanopartícula lipídica catiónica vacía basada en C12-200 con una nanopartícula lipídica catiónica basada en DLin-KC2-DMA cargada con ARNm de FFL dio como resultado una fuerte mejora sinérgica de la luminiscencia (aumento de 4 veces) (Figura 6, Tabla 6, Experimento n° 24), mientras que la mezcla inversa respectiva (nanopartículas C12-200 cargadas con ARNm de FFL con nanopartículas liposomales DLin-KC2-DMA vacías) no produjo ninguna mejora (Figura 6, Tabla 6 (Experimento n° 23)).
[0170] Estos resultados indican que el efecto sinérgico puede depender de la presencia del mensaje, al menos en algunos casos. Sin desear quedar ligado a ninguna teoría particular, se contempla que dos posibles mecanismos específicos de lípidos pueden conducir a un efecto sinérgico con o sin la presencia de ARNm.
Ejemplo 7. Efecto sinérgico de liposomas nanopartículas derivadas mediante entrega ICV
[0171] Como se muestra en los ejemplos anteriores, el aumento sinérgico en la producción de proteínas se ha observado en el hígado en múltiples sistemas cuando los artículos de prueba se administraron por vía intravenosa como se describe (vide supra). Se contempla que el efecto sinérgico se pueda aplicar adicionalmente, no sólo a enfermedades específicas del hígado sino a cualquier lugar donde se requiera tratamiento, es decir, pulmón, bazo, riñón, corazón, ojo, sistema nervioso central, cerebro, etc. El presente ejemplo demuestra una mejora sinérgica de la luminiscencia de la proteína FFL cuando se administra una mezcla de dos nanopartículas lipídicas cargadas con ARNm de FFL mediante administración intracerebroventricular (ICV).
[0172] Como se muestra en la Figura 7, las nanopartículas lipídicas encapsuladas en ARNm de FFL basadas en C12-200 mezcladas con nanopartículas lipídicas basadas en DLin-KC2-DMA cargadas con ARNm de FFL en una proporción de 1:3 (según la dosis de ARNm) dieron como resultado un aumento aproximado de 2,0 veces de la luminiscencia de la proteína FFL en comparación con la suma de la producción luminiscente de cada formulación individual (1,11 x 105 URL frente a 5,57 x 104 u Rl , respectivamente). Para evaluar si las formulaciones combinadas eran capaces de demostrar una mejora sinérgica de la luminiscencia observada en las células y tejidos del sistema nervioso central, se realizaron estudios adicionales en los que las formulaciones combinadas se administraron a animales a través del silenciador de administración intracerebroventricular (ICV). En particular, la mejora sinérgica en la expresión del ARNm exógeno administrado por ICV encapsulado en una formulación de nanopartículas lipídicas mezcladas y la producción correspondiente de la proteína luciferasa de luciérnaga codificada por la misma (como lo demuestra la producción luminiscente mediana mejorada) se evaluó comparando la producción luminiscente mediana observada después de la administración ICV de las formulaciones lipídicas mezcladas a la producción de luminiscencia media observada después de la administración ICV de las formulaciones de nanopartículas lipídicas constituyentes individuales.
Ejemplo 8. Mejora sinérgica de la expresión de proteínas secretadas.
[0173] Este ejemplo demuestra que el fenómeno sinérgico también se aplica a la idea de un efecto de “depósito” para la secreción de una proteína deseada en el torrente sanguíneo. Por ejemplo, la administración de ARNm que codifica la eritropoyetina humana (EPO) puede empaquetarse mediante una nanopartícula lipídica e inyectarse en un ratón. La formulación puede acumularse dentro del hígado y/u otros órganos y transcribir el ARNm a la proteína EPO deseada. Tras su expresión, la proteína puede secretarse desde el hígado (órgano) y funcionar según sea necesario.
[0174] Esta noción se probó utilizando una nanopartícula lipídica basada en C12-200 cargada con ARNm de EPO humana, una nanopartícula lipídica basada en DLin-KC2-DMA cargada con ARNm de EPO humana y una mezcla de las dos formulaciones en varias proporciones. La EPO humana completamente secretada se detectó mediante ELISA y análisis de inmunotransferencia (Figuras 8 y 9, respectivamente) cuatro horas después de la administración intravenosa de estas nanopartículas en ratones. Además, tras el tratamiento con una mezcla de las dos formulaciones individuales, se observó una mejora sinérgica de la proteína EPO humana secretada en el torrente sanguíneo en comparación con la suma de cada formulación homóloga individual (Figura 8). Esta mejora fue más pronunciada al mezclar en una proporción de 1:3 (~2 veces) en comparación con 1:1 (~1,4 veces) (formulación basada en C12-200:formulación basada en DLin-KC2-DMA).
[0175] Este aumento sinérgico de la producción de proteínas es más pronunciado cuando se analiza mediante transferencia Western. Como se representa en la Figura 9, una mezcla de una nanopartícula lipídica basada en C12-200 cargada con ARNm de EPO humana con una nanopartícula lipídica cargada con DLin-KC2-DMA análoga muestra una banda fuerte (carril 4) significativa de proteína EPO humana aislada del suero cuatro horas después de la administración. El carril correspondiente a una formulación individual de C12-200 (carril 2) produce una banda moderadamente detectada, mientras que la de la formulación basada en DLin-KC2-DMA (carril 3) es indetectable. Se puede observar cualitativamente una mejora en la producción de proteínas en comparación con el “total de aditivos” de cada formulación individual.
[0176] Estas observaciones confirman que este fenómeno sinérgico no es específico de un sistema de luciferasa, sino que puede ser aplicable a otras proteínas diana en general. Además, como se demuestra en el Ejemplo 7, el fenómeno sinérgico se observa no sólo mediante administración intravenosa al hígado, sino también mediante administración intracerebroventricular al cerebro. Además de administrarse a órganos diana específicos, la combinación de dos formulaciones puede mejorar de forma sinérgica la producción de proteínas secretadas, como se demuestra con nuestro sistema EPO humano.
[0177] La mejora sinérgica presentada en este documento sugiere que se puede lograr una eficacia terapéutica equivalente mediante la administración de una dosis significativamente más baja de lo previsto anteriormente. La capacidad de crear una producción sinérgica de proteínas a través de la administración de ARNm en nanopartículas basadas en lípidos permite una ventana terapéutica mucho mayor para el tratamiento de una serie de enfermedades. La entrega exitosa de dicho ARNm al hígado y, en particular, a los hepatocitos, puede usarse para el tratamiento y la corrección de errores congénitos del metabolismo que están localizados en el hígado. Enfermedades como el ASD y el OTC, entre otros trastornos del ciclo de la urea, pueden tratarse mediante terapia con ARNm del gen faltante. La zonación metabólica del ciclo de la urea en los hepatocitos significa que proporcionar la enzima faltante en estas células debería mejorar en gran medida el procesamiento bioquímico normal en personas con estos trastornos. Para lograr esto de manera sinérgica a través del proceso descrito anteriormente, se podría administrar una dosis mucho más baja (de ~2 a 30 veces menor) y lograr una eficacia igual o mayor al mediar cualquier evento adverso o tóxico.

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Una composición farmacéutica para la administración mejorada sinérgicamente de uno o más polinucleótidos encapsulados a una o más células diana, para uso en un método de tratamiento o prevención de una enfermedad o trastorno relacionado con la deficiencia de una o más proteínas y/o enzimas, comprendiendo dicha composición ARNm como un primer polinucleótido encapsulado y una mezcla de al menos una primera nanopartícula lipídica y una segunda nanopartícula lipídica, en la que la primera nanopartícula lipídica encapsula uno o más polinucleótidos; y en la que la primera nanopartícula lipídica comprende al menos un lípido distinto de la segunda nanopartícula lipídica.
2. La composición farmacéutica de la reivindicación 1, en la que la segunda nanopartícula lipídica comprende un segundo polinucleótido encapsulado que es (i) idéntico al ARNm de la primera nanopartícula lipídica o (ii) no idéntico al ARNm de la primera nanopartícula lipídica.
3. La composición farmacéutica de la reivindicación 2, en la que el primer y segundo polinucleótidos encapsulados funcionan mediante un mecanismo de acción diferente.
4. La composición farmacéutica de la reivindicación 3, en la que el segundo polinucleótido encapsulado es un ARNip.
5. La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que al menos un lípido distinto es un lípido catiónico, opcionalmente en la que el lípido catiónico se selecciona del grupo que consiste en C12-200, DOTAP (1,2-dioleil-3-trimetilamonio propano), DODAP (1,2-dioleil-3-dimetilamonio propano), DOTMA (1,2-di-O-octadecenil-3-trimetilamonio propano), DLinDMA, DLin-KC2-DMA, HGT4003 (2-((2,3-Bis((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi)propil)disulfanil)-N,N-dimetiletanamina) e ICE (éster de colesterol imidazol).
6. La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la primera nanopartícula lipídica y la segunda nanopartícula lipídica comprenden:
(i) uno o más lípidos auxiliares, opcionalmente en donde uno o más lípidos auxiliares se seleccionan del grupo que consiste en DSPC (1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfocolina), DPPC (1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina), DOPE (1,2-dioleil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina), DPPE (1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina), DMPE (1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina), DOPG (,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfo-(1'-racglicerol)) y colesterol, o
(ii) uno o más lípidos modificados con PEG, opcionalmente en donde el uno o más lípidos modificados con PEG comprende una cadena de poli(etilen)glicol de hasta 5 kDa de longitud unida covalentemente a un lípido que comprende una o más cadenas alquílicas de C<6>-C<20>de longitud.
7. La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la primera nanopartícula lipídica o la segunda nanopartícula lipídica comprende (i) DLinDMA, CHOL, DOPE y DMG-PEG-2000, (ii) C12-200, CHOL, DOPE y DMG-PEG-2000, (iii) DLinKC2, CHOL, DOPE y DMG-PEG-2000, (iv) uno o más lípidos seleccionados del grupo que consiste en ICE, DSPC, CHOL, DODAP, DOTAP y C8-PEG-2000, (v) DSPC, CHOL, DODAP y C8-PEG-2000, (vi) ICE, DOPE y DMG-PEG-2000, o (vii) HGT4003, DOPE, CHOL y DMG-PEG-2000.
8. La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el ARNm encadena:
(i) una enzima, opcionalmente en la que la enzima se secreta a partir de una o más células diana;
(ii) una proteína que se secreta desde la célula diana; o
(iii) un polipéptido que el sujeto expresa de manera aberrante, opcionalmente en el que el polipéptido se selecciona del grupo que consiste en agalsidasa alfa, alfa-L-iduronidasa, iduronato-2-sulfatasa, N-acetilglucosamina-1-fosfato transferasa, beta-glucosidasa, galactosa-6-sulfato sulfatasa, beta-galactosidasa, glucocerebrosidasa, heparán sulfamidasa, hialuronidasa, galactocerebrosidasa, omitino transcarbamilasa (OTC), carbamoil-fosfato sintetasa 1 (CFS1), argininosuccinato sintetasa (ASS1), argininosuccinato liasa (ASL), y arginasa 1 (ARGI);
opcionalmente en donde el ARNm se selecciona de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3.
9. La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el ARNm comprende una modificación química, opcionalmente en donde
(i) la modificación química produce el ARNm más estable;
(ii) la modificación química comprende una modificación de bloqueo terminal de una región 5' no traducida del ARNm;
(iii) la modificación química comprende una modificación de bloqueo terminal de una región 3' no traducida del ARNm;
(iv) la modificación química comprende la inclusión de una secuencia parcial de un gen 1 temprano inmediato (IE1) de CMV en la región 5' no traducida del ARNm;
(v) la modificación química comprende la inclusión de una cola poli A en la región 3' no traducida del ARNm; (vi) la modificación química comprende la inclusión de una estructura Capí en la región 5' no traducida del ARNm; o
(vii) la modificación química comprende la inclusión de una secuencia que codifica la hormona del crecimiento humano (hGH) en la región 3' no traducida del ARNm.
10. La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la relación de la primera nanopartícula lipídica a la segunda nanopartícula lipídica en la composición farmacéutica es aproximadamente 1:1, aproximadamente 2:1, aproximadamente 3:1 o aproximadamente 4:1.
11. La composición farmacéutica para su uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el ARNm se administra a células diana seleccionadas del grupo que consiste en hepatocitos, células epiteliales, células hematopoyéticas, células epiteliales, células endoteliales, células pulmonares, células óseas, células madre, células mesenquimales, células neurales, células cardíacas, adipocitos, células del músculo liso vascular, cardiomiocitos, células del músculo esquelético, células beta, células pituitarias, células del revestimiento sinovial, células ováricas, células testiculares, fibroblastos, células B, células T, reticulocitos, leucocitos, granulocitos y células tumorales, opcionalmente en donde la administración de la composición da como resultado la expresión del ARNm en las células diana.
12. La composición farmacéutica para su uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la expresión del ARNm después de la administración de la composición farmacéutica a un sujeto excede la expresión del ARNm administrado con la primera nanopartícula lipídica pero sin la segunda nanopartícula lipídica, opcionalmente en la que la expresión del ARNm después de la administración de la composición farmacéutica al sujeto excede la expresión del ARNm administrado con la primera nanopartícula lipídica pero sin la segunda nanopartícula lipídica en al menos aproximadamente dos veces, al menos aproximadamente cinco veces o al menos diez veces más.
13. La composición farmacéutica para el uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la composición farmacéutica se administra a un sujeto mediante una o más de las siguientes vías de administración: intravenosa, oral, rectal, vaginal, transmucosa, sublingual, subdural, por vía nasal, por vía intramuscular, por vía subcutánea, por inyección intramedular, por vía intratecal, por vía intraventricular, por vía intraperitoneal, por vía intranasal, por vía intracerebroventricular (ICV), por vía oftálmica e intraocular.
14. La composición farmacéutica para su uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la enfermedad o trastorno es atrofia muscular espinal (AME) relacionada con SMN1; esclerosis lateral amiotrófica (<e>L<a>); galactosemia relacionada con GALT; Fibrosis Quística (FQ); Trastornos relacionados con SLC3A1, incluida cistinuria; Trastornos relacionados con COL4A5, incluido el síndrome de Alport; deficiencias de galactocerebrosidasa; adrenoleucodistrofia y adrenomieloneuropatía ligadas al cromosoma X; ataxia de Friedreich; enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher; Esclerosis tuberosa relacionada con TSCl y TSC2; síndrome de Sanfilippo B (MPS IIIB); Cistinosis relacionada con CTNS; los trastornos relacionados con FMR1 que incluyen el síndrome de X frágil, el síndrome de ataxia/temblor asociado a X frágil y el síndrome de insuficiencia ovárica prematura de X frágil; síndrome de Prader-Willi; enfermedad de Fabry; telangiectasia hemorrágica hereditaria (AT); enfermedad de Niemann-Pick tipo C1; las enfermedades relacionadas con las lipofuscinosis neuronales de los cérnidos, incluyendo la lipofuscinosis neuronal juvenil de los cérnidos (JNCL), la enfermedad de Batten juvenil, la enfermedad de Santavuori-Haltia, la enfermedad de Jansky-Bielschowsky y las deficiencias de PTT-1 y TPP1; Ataxia infantil relacionada con EIF2B1, EIF2B2, EIF2B3, EIF2B4 y EIF2B5 con hipomielinización del sistema nervioso central/sustancia blanca en desaparición; ataxia episódica tipo 2 relacionada con CACNA1A y CACNB4; los trastornos relacionados con MECP2, incluido el síndrome de Rett clásico, la encefalopatía neonatal grave relacionada con MECP2 y el síndrome PPM-X; Síndrome de Rett atípico relacionado con CDKL5; enfermedad de Kennedy (SBMA); Arteriopatía cerebral autosómica dominante relacionada con Notch-3 con infartos subcorticales y leucoencefalopatía (CADASIL); trastornos convulsivos relacionados con SCNlA y SCNlB; los trastornos relacionados con la polimerasa G que incluyen síndrome de Alpers-Huttenlocher, neuropatía atáxica sensorial relacionada con POLG, disartria y oftalmoparesia, y oftalmoplejía externa progresiva autosómica dominante y recesiva con deleciones de ADN mitocondrial; hipoplasia suprarrenal ligada al cromosoma X; agammaglobulinemia ligada al cromosoma X; o la enfermedad de Wilson.
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