KR101366482B1 - 코팅된 지질 복합체 및 이들의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은,
적어도 제1 지질 성분,
적어도 제1 헬퍼(helper) 지질, 및
생체 내 조건하에서 지질 조성물로부터 제거될 수 있는 차폐(shielding) 화합물을 포함하는 지질 조성물에 관한 것이다.
Figure R1020077014611
지질, 헬퍼 지질, 차폐 화합물

Description

코팅된 지질 복합체 및 이들의 용도{COATED LIPID COMPLEXES AND THEIR USE}
본 발명은 양이온성 지질, 그를 함유하는 조성물 및 그의 용도뿐만 아니라 화학 화합물을 세포로 전달하는 방법에 관한 것이다.
분자 생물학뿐만 아니라 분자 의학은 생물학적 활성 화합물을 세포로 도입하는 것에 주로 의존한다. 이러한 생물학적 활성 화합물은, 전형적으로 다른 중에서도, DNA, RNA 뿐만 아니라 펩티드와 단백질을 포함한다. 극복해야 할 장벽은 전형적으로 음으로 하전된 외부 표면을 갖는 지질 이중층이다. 이 분야에서, 세포 막을 침투하여 생물학적 활성 화합물을 도입하기 위한 다수의 기술이 개발되어 왔다. 그러나 실험실용으로 개발된 일부 방법은 의료 분야에서는 이용될 수 없고 특히 약물 전달에는 적합하지 않다. 예컨대, 당해 분야에 공지된 엘렉트로포레이션 (electroporation) 및 벨라스틱(ballastic) 방법은 생물학적 활성 화합물의 국소적 전달만을 허용한다. 상술한 지질 이중층 이외에, 세포막은 또한 트랜스포터(transporter) 계를 포함한다. 따라서, 생물학적 활성 화합물이 세포막을 통과하여 전달되도록 상기 유형의 트랜스포터 계를 사용하는 것에 연구가 실시되었다. 그러나, 이러한 트랜스포터 계의 특이성 또는 교차반응성으로 인하여, 이들의 사용은 일반적으로 이용가능한 방법은 아니다.
생물학적 활성 화합물을 세포로 전달하기 위한, 당해 분야에 기재된, 보다 일반적으로 이용가능한 방법은 바이러스 벡터를 사용하는 것이다. 그러나, 바이러스 벡터는 유전자를 일부 세포 유형에만 효과적으로 전달하기 위해 사용될 수 있다; 그러나 이들은 화학적으로 합성된 분자를 세포로 전달하기 위해서는 사용될 수 없다.
다른 방법은 소위 리포좀을 사용하는 것이었다(Bangham, J. Mol. Biol. 13, 238-252). 리포좀은 물 중의 양친매성(amphiphilic) 지질과 결합될 때 생성되는 소포체(vesicle)이다. 리포좀은 전형적으로 동심적으로 배열된 인지질 이중층을 포함한다. 층의 갯수에 따라서, 리포좀은 소형 단일 라멜라 소포체, 다중 라멜라 소포체 및 대형 다중 라멜라 소포체로 구분될 수 있다. 리포좀은 친수성 화합물이 수성 중간층으로 혼입되게 하는 반면에 소수성 화합물은 지질층에 혼입되므로 효과적인 전달제인 것으로 밝혀졌다. 당해 분야에서 지질 제제의 조성물뿐만 아니라 그의 제조방법은 생성한 지질 응집물의 구조 및 크기에 영향을 주고 따라서 리포좀에 영향을 주는 것으로 알려져 있다. 리포좀은 양이온성 지질을 혼입하는 것으로 알려져 있다.
양이온성 지질은, 리포좀의 성분인 것 이외에, 상당한 관심을 유발하는데 이는 이들이 생중합체(biopolymer)의 세포 전달을 위해 사용될 수 있기 때문이다. 양이온성 지질을 사용하여 음이온성 화합물은 정전 상호작용으로 인하여 정량 방식으로 캡슐화될 수 있다. 또한, 양이온성 지질은 음으로 하전된 세포 막과 상호작용하여서 세포막 수송을 개시하는 것으로 믿어진다. 양이온성 지질을 함유하는 리포좀 제제의 사용 또는 생물학적 활성 화합물과 합쳐진 양이온성 지질의 사용은, 각 제제가 일부 세포 유형에는 플라스미드를 전달할 수 있지만 보통 혈청 부재하에서 일부 세포 유형에는 전달할 수 없기 때문에 그 사용이 제한되므로 발견적 접근방법(heuristic approach)을 필요로 함이 밝혀졌다.
이들에 의해 전달될 지질 및 생물학적 활성 화합물의 전하비 및/또는 중량비는 상이한 유형의 상기 생물학적 활성 화합물의 전달에 중요한 인자인 것으로 드러났다. 예컨대, 5,000 내지 10,000 개 염기를 포함하는 플라스미드 전달에 적합한 지질 제제는 일반적으로 약 10 내지 약 50개 염기를 포함하는 합성 리보자임 또는 안티센스 분자와 같은 올리고뉴클레오티드의 전달에는 효과적이지 않다는 것도 밝혀졌다. 또한, 최근에는 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 리보자임의 최적 전달 조건은 동일 세포 유형에서도 상이하다는 것이 밝혀졌다.
미국특허 6,395,713호는 친유성 기, 링커 및 헤드 기로 전형적으로 구성된 양이온성 지질 계 조성물 및 생물학적 활성 화합물을 세포로 전달하기 위한 이러한 조성물의 용도를 개시하고 있다.
본 발명의 문제는 생물학적 활성 화합물을 세포, 바람직하게는 동물 세포로 도입하기 위한 수단을 제공하는 것이었다. 본 발명의 다른 문제는 핵산, 특히 소형 핵산, 예컨대 siRNA, siNA 및 RNAi 또는 앱타머(aptmaer) 및 스피겔머(spiegelmer)의 전달제를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 문제는 생체 내에서 긴 순환 시간을 제공하면서도 양호한 형질감염(transfection) 및 전달 특징을 갖는 전달제를 제공하는 것이다.
상술한 문제는 본 명세서에 첨부한 독립항 특허청구범위의 주체에 의해 해결된다. 바람직한 구체예는 독립항의 종속항으로부터 취할 수 있다.
본 발명의 문제는, 제1 요지로서,
적어도 제1 지질 성분,
적어도 제1 헬퍼(helper) 지질, 및
생체 내 조건하에서 지질 조성물로부터 제거될 수 있는 차폐(shielding) 화합물을 포함하는 지질 조성물에 의해 해결된다.
제 1 요지의 구체예로서, 상기 차폐 화합물은 PEG, HEG, 폴리히드록시에틸 녹말(polyHES) 및 폴리프로필렌을 포함하는 군으로부터 선택된다.
제1 요지의 바람직한 구체예로서, 상기 차폐 화합물은 PEG2000 또는 PEG5000 이다.
제1 요지의 구체예로서, 상기 조성물은 다른 성분 및/또는 제2 헬퍼 지질을 포함한다.
제1 요지의 구체예로서, 상기 지질 조성물은 핵산을 포함하며, 이러한 핵산은 바람직하게는 다른 성분이다.
제1 요지의 구체예로서, 상기 핵산은 RNAi, siRNA, siNA, 안티센스 핵산, 리보자임, 앱타머 및 스피겔머를 포함하는 군으로부터 선택된다.
제1 요지의 구체예로서, 상기 차폐 화합물은 PEG와 세라미드의 콘쥬게이트이다.
제1 요지의 바람직한 구체예로서, 상기 세라미드는 6 내지 10개 탄소원자, 바람직하게는 8개 탄소원자의 적어도 1개의 짧은 탄소쇄 성분을 포함한다.
제1 요지의 구체예로서, 상기 세라미드는 제1 헬퍼 지질이다.
제1 요지의 다른 구체예로서, 상기 세라미드는 제2 헬퍼 지질이다.
제1 요지의 구체예로서, 상기 차폐 화합물은 핵산에 부착된다.
제1 요지의 구체예로서, 상기 차폐 화합물은 링커 잔기에 의해 핵산에 부착되며, 바람직하게는 링커 잔기에 의해 핵산에 공유결합된다.
제1 요지의 바람직한 구체예로서, 상기 링커 잔기는 ssRNA, ssDNA, dsRNA, dsDNA, 펩티드, S-S 링커 및 pH 감수성 링커를 포함하는 군으로부터 선택된다.
제1 요지의 바람직한 구체예로서, 상기 핵산은 RNAi, siRNA 및 siNA 를 포함하는 군으로부터 선택되며 또 상기 링커는 센스 스트랜드(strand)의 3' 말단에 부착된다.
제1 요지의 바람직한 구체예로서, 상기 차폐 화합물은 pH 감수성 링커 또는 pH 감수성 잔기이다.
제1 요지의 바람직한 구체예로서, 상기 링커 또는 잔기는 음이온성 링커 또는 음이온성 잔기이다.
제1 요지의 보다 바람직한 구체예로서, 상기 음이온성 링커 또는 음이온성 잔기는 산성 환경에서는 음이온성이 덜하거나 중성이고, 바람직하게는 이러한 산성 환경은 엔도좀(endosome)이다.
제1 요지의 구체예로서, 상기 pH 감수성 링커 또는 pH 감수성 잔기는 올리고(글루탐산), 올리고페놀레이트 및 디에틸렌 트리아민 펜타아세트산을 포함하는 군으로부터 선택된다.
제1 요지의 구체예로서, 상기 제1 지질 성분은 하기 화학식(I)에 따른 화합물이다:
Figure 112007046783852-pct00001
상기 식 중에서,
R1 및 R2는 각각 독립적으로 알킬을 포함하는 군으로부터 선택되며;
n은 1 내지 4의 정수이고;
R3은 리실, 오르니틸, 2,4-디아미노부티릴, 히스티딜 및 하기 화학식(II)의 아실 잔기를 포함하는 군으로부터 선택된 아실이며
Figure 112007046783852-pct00002
상기 식 중에서,
n은 1 내지 3의 정수이고,
NH3 + 는 경우에 따라 존재하지 않으며, 또
Y- 는 약학적으로 허용되는 음이온임.
제1 요지의 바람직한 구체예로서, R1 및 R2는 각각 독립적으로 라우릴, 미리스틸, 팔미틸 및 올레일을 포함하는 군으로부터 선택된다.
제1 요지의 바람직한 구체예로서, R1는 라우릴이고 또 R2는 미리스틸이거나; 또는 R1 은 팔미틸이고 또 R2는 올레일이다.
제1 요지의 더욱 바람직한 구체예로서, m은 1 또는 2이다.
제1 요지의 더욱 바람직한 구체예로서, 상기 화합물은 바람직하게는 음이온성 지질, 바람직하게는 Y- 과 결합된 양이온성 지질이다.
제1 요지의 더욱 바람직한 구체예로서, 상기 Y- 는 할로게나이드, 아세테이트 및 트리플루오로아세테이트를 포함하는 군으로부터 선택된다.
제1 요지의 더욱 바람직한 구체예로서, 상기 화합물은
- β-아르기닐-2,3-디아미노 프로피온산-N-팔미틸-N-올레일-아미드 트리히드로클로라이드
Figure 112007046783852-pct00003
- β-아르기닐-2,3-디아미노 프로피온산-N-라우릴-N-미리스틸-아미드 트리히드로클로라이드
Figure 112007046783852-pct00004
및
-ε-아르기닐-리신-N-라우릴-N-미리스틸-아미드 트리히드로클로라이드
Figure 112007046783852-pct00005
를 포함하는 군으로부터 선택된다.
제 1 요지의 보다 바람직한 구체예로서, 상기 조성물은 담체를 포함한다.
본 발명의 문제는, 제1 요지에 따른 조성물 및 약학적 활성 화합물 및 바람직하게는 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물에 의해 제2 요지로서 해결된다.
제2 요지의 구체예로서, 상기 약학적 활성 화합물 및/또는 다른 성분은 펩티드, 단백질, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드 및 핵산을 포함하는 군으로부터 선택된다.
제2 요지의 바람직한 구체예로서, 상기 단백질은 항체, 바람직하게는 모노클 로날 항체이다.
다른 바람직한 구체예로서, 상기 핵산은 DNA, RNA, PNA 및 LNA를 포함하는 군으로부터 선택된다.
제2 요지의 바람직한 구체예로서, 상기 핵산은 기능적 핵산이고, 바람직하게는 상기 기능적 핵산은 RNAi, siRNA, siNA, 안티센스 핵산, 리보자임, 앱타머 및 스피겔머를 포함하는 군으로부터 선택된다.
제1 및 제2 요지의 구체예로서, 제1 헬퍼 지질 및/또는 제2 헬퍼 지질은 인지질 및 스테로이드를 포함하는 군으로부터 선택되며, 단 바람직하게는 제1 및/또는 제2 헬퍼 지질은 세라미드와는 다르다.
제1 및 제2 요지의 바람직한 구체예로서, 제1 헬퍼 지질 및/또는 제2 헬퍼 지질 또는 헬퍼 지질 성분은 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 및 1,2-디올레일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민을 포함하는 군으로부터 선택된다.
제1 및 제2 요지의 더욱 바람직한 구체예로서, 헬퍼 지질 성분의 함량은 조성물의 전체 지질 함량의 약 20몰% 내지 약 80몰%이다.
제1 및 제2 요지의 더욱 바람직한 구체예로서, 헬퍼 지질 성분의 함량은 약 35몰% 내지 약 65몰%이다.
제1 및 제2 요지의 구체예로서, 상기 지질은 β-아르기닐-2,3-디아미노 프로피온산-N-팔미틸-N-올레일-아미드 트리히드로클로라이드이고 또 헬퍼 지질은 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민이다.
제1 및 제2 요지의 바람직한 구체예로서, 지질은 조성물의 전체 지질 함량의 50몰%이고 또 헬퍼 지질은 50몰%이다.
제1 및 제2 요지의 구체예로서, 상기 조성물은 제2 헬퍼 지질을 포함한다.
제1 및 제2 요지의 구체예로서, 제1 및/또는 제2 헬퍼 지질은 PEG 잔기, HEG 잔기, 폴리히드록시에틸 녹말 (polyHES) 잔기 및 폴리프로필렌 잔기를 포함하는 군으로부터 선택되는 기를 포함하며, 바람직하게는 이러한 잔기는 약 500 내지 10000 Da, 보다 바람직하게는 약 2000 내지 5000 Da의 분자량을 제공한다.
제1 및 제2 요지의 바람직한 구체예로서, PEG 잔기를 포함하는 상기 헬퍼 지질은 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 및 1,2-디알킬-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민을 포함하는 군으로부터 선택된다.
제1 및 제2 요지의 보다 바람직한 구체예로서, 헬퍼 지질의 PEG 잔기는 2,000 내지 5,000 Da, 바람직하게는 2,000Da의 분자량을 갖는다.
제1 및 제2 요지의 더욱 더 바람직한 구체예로서, 상기 조성물은 지질 성분으로서 β-아르기닐-2,3-디아미노 프로피온산-N-팔미틸-N-올레일-아미드 트리히드로클로라이드, 제1 헬퍼 지질로서 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 및 제2 헬퍼 지질로서 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-PEG2000을 포함한다.
제1 및 제2 요지의 구체예로서, 상기 제2 헬퍼 지질의 함량은 약 0.05 몰% 내지 4.9 몰%, 바람직하게는 약 1 내지 2 몰% 이다.
제1 및 제2 요지의 구체예로서, 상기 조성물은 약 1 내지 10몰%, 보다 바람직하게는 1 내지 7.5 몰%, 가장 바람직하게는 1 내지 5몰%의 PEG와 세라미드의 콘 쥬게이트(conjugate)를 함유한다.
제1 및 제2 요지의 바람직한 구체예로서, 세라미드는 C8m 이고 또 PEG는 PEG2000이며, PEG와 세라미드의 콘쥬게이트의 함량은 약 1 내지 7.5몰%이다.
제1 및 제2 요지의 다른 바람직한 구체예로서, 세라미드는 C8m 이고 또 PEG는 PEG5000이며 또 PEG와 세라미드의 콘쥬게이트의 함량은 약 1 내지 5몰%이다.
제1 및 제2 요지의 구체예로서, 제1 지질 성분의 함량은 약 42.5몰% 내지 50몰%이고, 제1 헬퍼 지질의 함량은 약 42.5 몰% 내지 50몰%이며, 제1 지질 성분, 제2 지질 성분 및 PEG와 세라미드의 콘쥬게이트의 함량의 합은 100몰% 이다.
제1 및 제2 요지의 구체예로서, 기능적 핵산은 이중 스트랜드의 리보핵산이며, 상기 조성물은 핵산, 바람직하게는 기능적 핵산, 보다 바람직하게는 이중 스트랜드 리보핵산 및 가장 바람직하게는 RNAi, siRNA, siNA, 안티센스 핵산 및 리보자임을 포함하는 군으로부터 선택되는 핵산을 더 포함하며, 상기 양이온성 지질에 대한 RNAi의 몰비는 약 0 내지 0.075, 바람직하게는 약 0.02 내지 0.05, 더욱 바람직하게는 0.037이다.
제1 및 제2 요지의 구체예로서, 상기 제1 지질 성분 및/또는 적어도 1개의 헬퍼 지질 및/또는 차폐 화합물은 수성 매질 중의 분산액으로 존재한다.
제1 및 제2 요지의 다른 구체예로서, 상기 제1 지질 성분 및/또는 적어도 1개의 헬퍼 지질 및/또는 차폐 화합물은 수혼화성 용매 중의 용액으로 존재하며, 바람직하게는 상기 용매는 에탄올 및 t-부탄올을 포함하는 군으로부터 선택된다.
본 발명의 문제는, 제3 요지로서, 의약 제조를 위해 제1 또는 제2 요지에 따 른 조성물을 사용하는 것에 의해 해결된다.
본 발명의 문제는 또한 제4 요지로서, 전달제로서 제1 또는 제 2요지에 따른 조성물을 사용하는 것에 의해 해결된다.
제4 요지의 구체예로서, 전달제는 약학적으로 활성인 성분 및/또는 기타 성분을 세포, 바람직하게는 포유동물 세포, 보다 바람직하게는 인간 세포로 전달한다.
본 발명의 다른 문제는, 제5 요지로서,
- 세포 또는 막을 제공하고;
- 약학적 활성 화합물 및/또는 다른 성분을 포함하는 제1 또는 제2 요지에 따른 조성물을 제공하며; 또
- 세포 또는 막을 제1 또는 제2 요지에 따른 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는, 약학적 활성 화합물 및/또는 다른 성분을 세포로, 또는 막을 통하여, 바람직하게는 세포막을 통하여 전달하는 방법에 의해 해결된다.
제5 요지의 구체예로서, 상기 방법은,
- 세포 중 및/또는 막을 통과한 약학적 활성 화합물 및/또는 다른 성분을 검출하는 단계를 더 포함한다.
본 발명자들은 놀랍게도 제1 지질 성분, 적어도 제1 헬퍼 지질 및 차폐 화합물을 포함하는 지질 조성물을 사용함으로써 생체 내 적용시 핵산, 특히 RNAi, siRNA 및 siNA와 같은 소형 핵산의 아주 효과적인 전달을 달성할 수 있다는 것을 밝혀내었다. 상기 차폐 화합물은 생체 내에서 더 긴 순환 시간을 제공하므로 핵산 함유 지질 조성물의 더 우수한 생체분산을 허용한다. 이러한 메카니즘에 의해, 지질 조성물은 주사 부위 근처의 조직에 의해서 즉각적으로 흡수되지 않으므로 지질 조성물을 투여한 부위로부터 비교적 떨어진 인체 또는 동물 체내의 부위, 통상 정맥 주사를 실시할 경우 혈관계의 내피 라이닝(lining)을 표적화할 수 있다. 본 명세서에 사용된 차폐 화합물은 지질 조성물과 혈청 화합물 또는 다른 체액의 화합물 또는 세포질 막, 바람직하게는 지질 조성물이 바람직하게는 투여되는 혈관계의 내피 라이닝(lining)의 세포질 막의 즉각적인 상호작용을 피하는 화합물이다. 용어 차폐는 면역계의 요소가 지질 조성물과 즉각적으로 상호작용하지 않아서 살아있는 생물에서 순환 시간을 증가시키는 것을 의미한다. 지금까지, 차폐 화합물은 항-옵신화(anti-opsinizing) 화합물로 작용한다. 어떠한 메카니즘 또는 이론에 얽매임 없이, 상기 차폐 화합물은 그 환경과 상호작용할 수 있는 지질 조성물의 표면 영역을 감소시키는 커버(cover) 또는 피막(coat)을 형성하는 것으로 보이며, 지질 조성물의 투여시 이러한 상호작용은 보통 전달을 제공하기 위하여 적어도 어느 정도 바람직하다. 차폐 화합물의 관찰된 효능이 기본으로 하는 것으로 보이는 다른 메카니즘은 지질 조성물의 전체 전하의 차폐, 특히 핵산, 바람직하게는 상기 정의된 기능적 핵산, 보다 바람직하게는 siRNA, siNA 및 RNAi를 함유하는 지질 조성물의 전체전하를 차폐하는 것이다. 다시, 지질 조성물의 상호작용이 영향을 받고, 그에 의해 지질 성분의 차폐보다는 전하의 차폐로부터 그 효과가 생긴다. 본 발명의 개시내용과 관련하여, 조성물은 1개 지질을 포함할 수 있다.
차폐 화합물은 바람직하게는 생물학적 불활성 화합물이다. 보다 바람직하게 는, 차폐 화합물 자체로는 그 표면 또는 분자 상에 어떤 전하를 갖지 않는다. 특히 바람직한 차폐 화합물은 폴리에틸렌 글리콜, 히드록시에틸글루코오스계 중합체, 폴리히드록시에틸 녹말(polyHES) 및 폴리프로필렌이며, 상술한 화합물은 바람직하게는 약 500 내지 10000 Da, 보다 바람직하게는 약 2000 내지 5000 Da의 분자량을 갖는다.
본 발명의 중요한 특징은 차폐 화합물이 생체 내 조건하에서 지질 조성물로부터 제거될 수 있는 것이다. 이러한 제거로 동물 체내 및 인체 내와 같은 환경에 지질 조성물의 다른 성분 또는 그의 일부를 노출시키며, 결국 지질 조성물에 함유된 핵산과 같은 화합물을 방출하고 전달한다. 상기 용어 생체 내 조건은 바람직하게는 동물 체내 또는 인체 내에 존재하는 환경, 바람직하게는 혈액, 사이질 및 세포내 액체와 같은 체액 및/또는 엔도좀 및/또는 리소좀에 존재하는 환경을 의미한다. 차폐 화합물의 디자인에 따라서, 상기 제거는 이하에 더욱 자세하게 기재한 바와 같이 다양한 방식으로 영향을 받을 수 있다.
특히 차폐제(shielding agent)가 PEG인 경우 차폐제의 손실로부터 생기는 다른 효과는 페길화(PEGylation)로도 불리는 PEG를 갖는 지질 제제의 제공이 이러한 지질 제제에 의해 세포질로 전달될 핵산 분자의 기능적 전달의 손상을 초래하는 사실에 기인한다. 지질 제제에서 PEG의 벌키(bulky)한 존재하는 지질 제제에 의해 전형적으로 형성되는 리포좀의 엔도좀 흡수에 손상을 주거나, 함유되거나 지질 조성물과 결합된 핵산의 필요한 엔도좀 탈출을 방해한다.
일 구체예로서, 차폐 화합물은 PEG, HEG, 폴리히드록시에틸 녹말(polyHES) 및 폴리프로필렌을 포함하는 군으로부터 선택되며, 이것은 세라미드에 부착되며, 바람직하게는 공유결합에 의해 세라미드에 부착된다. 세라미드는 지질 화합물과 상호작용하며, 또 헬퍼 지질이 존재하는 경우 헬퍼 지질과도 상호작용한다. 세라미드는 제1 헬퍼 지질 또는 제2 헬퍼 지질일 수 있다. PGE에 콘쥬게이트된 세라미드는 제1 헬퍼 지질과 상이한 것이 바람직하다. 세라미드는 제1 지질 성분 및 제1 헬퍼 지질에 의해 바람직하게 형성된 지질 조성물의 지질 분획에 끼워지며 비교적 짧은 탄화수소 사슬로 인하여 특정 속도로 방출된다. 세라미드가 지질 조성물로부터 방출되면, 그것은 차폐제이다. 따라서, 이 구체예에서, 생체 내 조건은 지질 제제의 붕해를 허용하며 따라서 지질 조성물의 생체 내의 수명 또는 순환 시간을 연장시킨다.
다른 구체예로서, 상기 차폐제는 지질 조성물 중에 함유된 핵산에 부착되거나 또는 그와 결합된다. 바람직하게는, 차폐제는 핵산에 공유 결합되며, 가장 바람직하게는 링커를 통하여 공유결합된다. 보다 바람직한 구체예로서, 상기 링커는 생리학적 조건 하, 즉 동물 체내 또는 인체 내에서 우세한 조건하에서 분해되도록 고안된다. 바람직한 구체예로서, 핵산의 일부 %는 링커를 통하여 중합체를 갖도록 제공된다. 특정 이론에 얽매임 없이, 지질 조성물의 일부를 형성하는 오직 특정 개수의 핵산 분자가 상술한 지질 조성물에 차폐 효과를 제공하도록 벌키한 잔기를 가지면 충분하다. 바람직하게는, 핵산 분자의 비율은 약 0 내지 20%, 보다 바람직하게는 3 내지 10%, 더욱 바람직하게는 6 내지 10% 이다. 차폐제(본 명세서에서 차폐 화합물로도 칭함)를 갖는 핵산의 바람직한 함량은 약 0 내지 3%, 3 내지 6%, 6 내 지 10% 및 10 내지 20%이며, 본 명세서에서 사용된 %는 다르게 정의하지 않는 한 몰%이다.
이러한 링커는 바람직하게는 1 내지 20개 뉴클레오티드를 포함하는 단일 스트랜드 RNA 링커일 수 있으며, 생체 내 조건 중 또는 조건 하에서 존재하는 RNA 엔도뉴클레아제(endonuclease) 활성에 의해 분해될 것이다. 다른 구체예로서, 링커는 생체 내 조건 중 또는 조건 하에서 존재하는 DNA 엔도뉴클레아제에 의해 분해되는 단일 스트랜드 DNA 링커에 의해 형성된다. 다른 구체예로서, 링커는 이중 스트랜드 RNA 또는 이중 스트랜드 DNA에 의해 형성될 수 있다. 핵산으로 구성된 링커의 안정성은 전형적으로 ssDNA<dsRNA, <ssDNA<<dsDNA이다. 이러한 안정성의 다양성은 핵산 및 그러한 링커를 포함하는 변형된 지질 조성물의 잔류 시간의 특이적 고안을 가능하게 한다.
다른 구체예로서, 상기 링커는 생체 내 조건 중 또는 조건 하에 존재하는 프로테아제에 의해 분해되는 올리고펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질에 의해 형성될 수 있다. 다른 구체예는 레독스 조건에 감수성인 S-S 결합을 포함하는 링커를 제공한다.
다른 구체예로서, 상기 링커는 pH 감수성 링커이다. pH 감수성 링커의 개념은 리포플렉스(lipoplex) 또는 리포좀일 수 있는 지질 조성물의 내부화시, 내부화 되기 전에 지질 조성물의 보호에 관하여 분명히 이로운 차폐제는 세포로 전달될 화합물의 사용에 제한을 부과할 수 있다는 관찰에 존재한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 차폐제는 바람직한 구체예로서 음이온성 잔기이거나 음이온성 잔기를 포함하는 pH 감수성 링커에 결합된다. 엔도좀과 같은 산성 환경에서, 이러한 음이온성 잔기의 전하는 변경된다. 이 때문에, pH 감수성 링커와 지질 제제 중에 함유된 양이온성 지질과의 정전을 기본으로 한 상호작용도 또한 변경되며, 흔히 환원되어 지질 제제를 포함하는 양이온성 지질로부터 pH 감수성 링커의 점진적 방출을 초래한다. 따라서, 리포좀은 차폐제를 피하게되므로 세포에서 그의 영향을 발휘할 수 있다. 이러한 종류의 링커는 당해 분야에 공지된 링커 및 상기 종류의 신규 링커, 즉 상기 종류의 특징을 갖는 링커를 포함한다. 바람직하게는, 이러한 링커는 링커가 상술한 바와 같이 반응하게 하는 전하 특징을 갖는 링커이다. 이러한 pH 감수성 링커의 대표는 비제한적으로 올리고(글루탐산), 올리고페놀레이트, 및 디에틸렌 트리아민 펜타 아세트산을 포함한다. 이러한 링커를 차폐제에 결합시키는 것 및 이러한 링커를 차폐제의 잔기로도 불리는 차폐제에 혼입하는 것은 당업자에게 공지되어 있다.
본 발명에 따른 지질 조성물에서 제1 지질 성분으로 사용되는, 본 발명에 따른 화합물로도 지칭되는 화합물은 도 1에 도시된 바와 같이 R1-N-R2 잔기에 의해 형성된 친유성 기, C(O)-CH(NH3)+(CH2)n-NH 잔기에 의해 형성된 링커기 및 R3 잔기에 의해 형성된 헤드 기를 포함하는 것으로 간주된다. 본 발명자들은 링커 기에서 양전하를 나타내는 상기 유형의 화합물은 생물학적 활성 화합물을 세포막으로, 바람직하게는 세포로, 더욱 바람직하게는 동물 세포로 전달하기에 특히 적합하다는 것을 놀랍게도 밝혀내었다. 또한 본 발명자들은 놀랍게도 본 발명에 따른 화합물에 의해 매개된 전달이 생물학적 활성 화합물이 핵산, 보다 바람직하게는 siRNA 및 siNA이면 특히 효과적일 것이라는 것을 발견하였다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 알킬은 8 내지 20개 탄소원자, 바람직하게는 12 내지 18개 탄소원자를 함유하는 포화 지방족 라디칼, 또는 적어도 1개의 이중 및 삼중 결합을 함유하는 8 내지 30개 탄소원자를 함유하는 일- 또는 다중불포화 지방족 탄화수소 라디칼을 의미한다. 따라서, 바람직한 구체예로서, 용어 알킬은 알케닐 및 알키닐을 포함한다. 알킬은 측쇄 및 비측쇄, 즉 비선형 또는 직쇄 알킬 기를 지칭한다. 바람직한 직쇄 알킬 기는 8 내지 30개 탄소원자를 함유한다. 보다 바람직한 직쇄 알킬 기는 12 내지 18개 탄소원자를 함유한다. 바람직한 분지쇄 알킬 기는 8 내지 30개 탄소원자를 함유하며, 8 내지 30개 탄소원자 수는 이러한 측쇄 알킬기의 주쇄를 형성하는 탄소원자의 수를 지칭한다. 분지쇄 알킬 기의 주쇄는 주쇄로부터 분지되는 적어도 1개의 알킬 기를 함유하며, 상기 알킬기는 본 명세서에 정의된 바와 같은 단쇄 알킬기, 보다 바람직하게는 1 내지 6개, 더욱 바람직하게는 1 내지 3개, 가장 바람직하게는 1개 C 원자를 갖는 알킬 기이다. 보다 바람직하게는, 상기 정의된 바와 같은 분지 알킬 기를 갖고 주쇄에 12 내지 18개 탄소원자를 함유하는 분지쇄 알킬 기이다. 특히 바람직한 알킬 기는 피타닐 기이다.
다른 구체예로서, 알킬은 상술한 바와 같이 불포화 분지쇄 또는 비분지쇄 알킬 기이다. 보다 바람직하게는, 이러한 불포화 지방족 탄화수소 라디칼은 1, 2 또는 3 또는 4개의 이중 결합을 함유하며, 1개의 이중 결합을 갖는 라디칼이 특히 바 람직하다. 가장 바람직한 것은 C18: 1델타9인 올레일, 즉 18개 탄소원자를 갖는 지방족 탄화수소 라디칼이며, 위치 9에서 9번 탄소원자를 10번 탄소원자에 연결하는 단일 결합보다는 시스 구조의 이중 결합이 존재한다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, n은 1 내지 4의 정수인데, 즉 n은 1, 2, 3 및 4일 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같이 m은 1 내지 3의 정수, 즉 m은 1, 2 및 3일 수 있다.
본 발명에 따른 화합물은 바람직하게는 양이온성 지질일 수 있다. 보다 바람직하게는, 본 발명에 따른 화합물에 존재하는 NH 또는 NH2 기는 양성자화된 형태로 존재한다. 전형적으로, 본 발명에 따른 화합물의 양전하는 음이온의 존재에 의해 상쇄된다. 이러한 음이온은 1가 또는 다가 음이온일 수 있다. 바람직한 음이온은 할라이드, 아세테이트 및 트리플루오로아세테이트이다. 본 명세서에 기재된 바와 같이 할라이드는 바람직하게는 플루오라이드, 클로라이드, 요오다이드 및 브로마이드이다. 가장 바람직한 것은 클로라이드이다. 양이온성 지질 및 세포에 전달될 생물학적 활성 화합물의 결합시, 할라이드 음이온은 1개 또는 몇 개의 음전하를 나타내는 생물학적 활성 화합물에 의해 치환되지만, 생물학적 활성 화합물의 전체 전하는 반드시 음성일 필요는 없다는 것이 알려져 있다.
화학식(I)의 화합물은 적어도 2개의 비대칭 C 원자를 포함하는 것이 알려져 있다. 본 발명에서 이러한 화합물의 가능한 에난티오머, 즉 특히 R-R; S-S; R-S 및 S-R 에난티오머가 기재되어 있다.
본 발명에 따른 화합물은 조성물을 형성하거나 또는 조성물의 일부일 수 있으며, 이러한 조성물은 담체를 포함한다. 본 명세서에서 지질 조성물로도 지칭되는 조성물에서, 본 발명에 따른 화합물은 지질 성분으로도 지칭된다. 이러한 담체는 바람직하게는 액체 담체이다. 바람직한 담체는 수성 담체 및 비-수성 담체이다. 바람직한 수성 담체는 물, 수성 완충액 계, 보다 바람직하게는 생리학적 완충액 강도 및 생리학적 염 농도를 갖는 완충액 계이다. 바람직한 비-수성 담체는 용매, 바람직하게는 에탄올 및 t-부탄올과 같은 유기 용매이다. 어떤 이론에 얽매임 없이, 원칙적으로 수혼화성 유기 용매가 사용될 수 있다. 상기 조성물, 보다 특히 지질 조성물은 리포좀으로 존재하거나 리포좀을 형성할 수 있음을 알 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 헬퍼 지질 성분으로 지칭되는 1 이상의 헬퍼 지질을 포함할 수 있다. 헬퍼 지질 성분은 바람직하게는 인지질 및 스테로이드를 포함하는 군으로부터 선택된다. 인지질은 바람직하게는 인산의 디에스테르 및 모노에스테르이다. 인지질의 바람직한 구성원은 포스포글리세리드 및 스핀고지질이다. 본 명세서에서 사용된 스테로이드는 부분적으로 수소화된 시클로펜타[a]페난트렌을 기본으로 한 천연 산출 및 합성 화합물이다. 바람직하게는, 상기 스테로이드는 21 내지 30개 탄소원자를 함유한다. 특히 바람직한 스테로이드는 콜레스테롤이다.
특히 바람직한 헬퍼 지질은 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DPhyPE) 및 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DOPE)이다.
특히 바람직한 본 발명에 따른 조성물은 DPhyPE와 조합된 β-아르기닐-2,3-디아미노프로피온산-N-팔미틸-N-올레일-아미드 트리히드로클로라이드 [#6], β-아 르기닐-2,3-디아미노프로피온산-N-라우릴-N-미리스틸-아미드 트리히드로클로라이드[#11] 또는 ε-아르기닐-리신-N-라우릴-N-미리스틸-아미드 트리히드로클로라이드 [#15]를 포함하며, DPhyPE의 함량은 약 90 내지 20몰%, 바람직하게는 80몰%, 65몰%, 50몰% 및 35몰%이며, 상기 용어 몰%는 조성물의 전체 지질 함량의 %를 지칭하며, 즉 본 발명에 따른 양이온성 지질 및 비제한적으로 헬퍼 지질을 비롯한 부가적인 지질을 포함하는 조성물의 지질 함량을 지칭한다.
본 발명에서 본 발명에 따른 조성물은 바람직하게는 본 발명에 따른 화합물 및/또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 1 또는 몇 개의 헬퍼 지질을 포함하며, 본 발명에 따른 화합물, 즉 양이온성 지질 및/또는 헬퍼 지질 성분은 수성 매질 중의 분산액으로 존재한다. 다르게는, 본 발명에 따른 화합물, 즉 양이온성 지질 및/또는 헬퍼 지질 성분은 수혼화성 용매 중의 용액으로 존재한다. 수성 매질로서, 바람직하게는 본 명세서에 기재된 바와 같은 수성 담체가 사용된다. 바람직한 수 혼화성 용매는 어떤 비율로 물과 균일 상을 형성하는 용매이다. 바람직한 용매는 에탄올 및 t-부탄올이다. 조성물, 보다 특히 지질 조성물은 리포좀으로 존재하거나 또는 리포좀을 형성할 수 있다.
다양한 구체예에서 본 발명에 따른 조성물은 약학적 조성물로 사용될 수 있음이 알려져 있다. 후자의 경우, 약학적 조성물은 약학적 활성 화합물 및 경우에 따라 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 이러한 약학적으로 허용되는 담체는 바람직하게는 본 발명에 따른 조성물과 관련하여 본 명세서에 정의된 바와 같은 담체 군으로부터 선택될 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 조성물은 그 성분 및 그의 조합이 약학적으로 허용되는 것인 한 약학적 조성물로서 사용될 수 있음은 당업자에게 잘 알려져 있다. 약학적 조성물은 약학적 활성 화합물을 포함한다. 이러한 약학적 활성 화합물은 생물학적 활성 화합물, 보다 바람직하게는 본 명세서에 기재한 바와 같은 생물학적 활성 화합물인 본 발명에 따른 조성물의 다른 성분과 동일할 수 있다. 다른 성분, 약학적 활성 화합물 및/또는 생물학적 활성 화합물은 바람직하게는 펩티드, 단백질, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드 및 핵산을 포함하는 군으로부터 선택된다.
바람직하게는, 이러한 생물학적 활성 화합물은 음으로 하전된 분자이다. 용어 음으로 하전된 분자는, 어떠한 이론에 한정하려는 것은 아니나, 본 발명에 따른 양이온성 지질의 양으로 하전된 기와 이온 쌍을 이룰 수 있는 적어도 1개의 음으로 하전된 기를 갖는 분자를 포함하는 것으로 의미한다. 원칙적으로, 링커 잔기에서 양전하는 지질 그 자체 또는 양이온성 지질과 음으로 하전된 분자 사이에 형성된 착물, 즉 생물학적 활성 화합물의 전체 구조에 어느 정도 영향을 줄 수 있다. 그와는 별도로, 본 발명에 따른 지질에 도입된 부가적 양전하는 미국특허 6,395,713호에 기재된 양이온성 지질과 비교되며, Xu Y, Szoka FC Jr.; Biochemistry; 1996 May 07, 35 (18): 5616-23에 의해 개시된 바와 같은 지질의 증가된 독성에 기여해야 한다. 당업자가 종래 기술의 상기 문헌으로부터 예상한 것과는 대조적으로, 본 발명에 따른 화합물은 본 명세서에 기재한 바와 같은 다양한 목적에 특히 적합하며 어떠한 독성 증가도 피할 수 있다.
본 명세서에서 바람직하게 사용되는 펩티드는 바람직하게는 펩티드 결합을 통하여 서로 공유결합되어 있는 2 이상의 아미노산으로 구성되는 중합체이다. 보다 바람직하게는, 펩티드는 2 내지 10개 아미노산으로 구성된다. 펩티드의 보다 바람직한 구체예는 약 10 내지 약 100개 아미노산을 포함하는 올리고펩티드이다. 본 명세서에서 바람직하게 사용되는 단백질은 서로 공유결합된 복수의 아미노산으로 구성된 중합체이다. 바람직하게는 이러한 단백질은 약 100개 이상의 아미노산 또는 아미노산 잔기를 포함한다.
본 발명에 따른 양이온성 지질 및 조성물과 조합되어 사용될 수 있는 바람직한 단백질은 항체, 바람직하게는 모노클로날 항체이다.
특히 바람직한 생물학적 활성 화합물, 즉 약학적 활성 화합물 및 본 발명에 따른 조성물과 관련하여 사용되는 다른 성분은 핵산이다. 이러한 핵산은 DNA, RNA, PNA 또는 그의 혼합물일 수 있다. 보다 바람직하게는, 핵산은 기능적 핵산이다. 본 명세서에서 바람직하게 사용되는 기능적 핵산은 헵티드 및 단백질을 코딩하는 핵산이 아닌 핵산이다. 바람직한 기능적 핵산은 당업자에게 공지된 siRNA, siNA, RNAi, 안티센스 핵산, 리보자임, 앱타머 및 스피겔머이다.
siRNA는 국제 특허출원 PCT/EP03/08666호에 기재된 바와 같은 소형 간섭 RNA이다. 이들 분자는 서로 염기 쌍을 이루는, 즉 서로에 대해 필수적으로 상보적인, 전형적으로 왓슨-크릭 염기쌍에 의해 매개되는, 전형적으로 15 내지 25개, 바람직하게는 18 내지 23개 뉴클레오티드 쌍을 포함하는 이중 스트랜드 RNA 구조로 구성된다. 이 이중 스트랜드 RNA 분자의 1개 스트랜드는 필수적으로 표적 핵산, 바람직하게는 mRNA에 상보적인 반면에, 상기 이중 스트랜드 RNA 분자의 두번째 스트랜드 는 상기 표적 핵산의 스트레치와 필수적으로 동일하다. siRNA 분자는 각 측면 및 각 스트레치 상에서 서로 반드시 염기 쌍을 이룰 필요는 없는 복수의 부가적 올리고뉴클레오티드와 인접할 수 있다.
RNAi는 siRNA와 실질적으로 동일한 디자인을 갖지만, 분자들은 siRNA에 비하여 훨씬 더 길다. RNAi 분자는 전형적으로 50개 이상의 뉴클레오티드 및 염기 쌍을 포함한다.
siRNA 및 RNAi와 동일 작용 모드를 기본으로 하여 활성인 다른 종류의 기능적 핵산은 siNA이다. siNA는 예컨대 국제 특허출원 PCT/EP03/074654호에 기재되어 있다. 보다 특히, siNA는 siRNA에 상응하며, siNA 분자는 리보뉴클레오티드를 포함하지 않는다.
본 명세서에서 바람직하게 사용되는 안티센스 핵산은 염기 상보성을 기본으로 하여 표적 RNA, 바람직하게는 mRNA와 혼성화되어 RNaseH를 활성화시키는 올리고뉴클레오티드이다. RNaseH는 포스포디에스테르 및 포스포티오에이트-커플링된 DNA에 의해 활성화된다. 그러나, 포스포디에스테르-커플링된 DNA는 포스포티오에이트-결합된 DNA를 제외하고는 세포 뉴클레아제에 의해 신속하게 분해된다. 안티센스 폴리뉴클레오티드는 DNA-RNA 하이브리드 복합체로서만 효과적이다. 안티센스 핵산의 바람직한 길이는 16 내지 23개 뉴클레오티드 범위이다. 상기 종류의 안티센스 올리고뉴클레오티드의 예는 미국특허 5,849,902호 및 미국특허 5,989,912호에 기재되어 있다.
기능적 핵산의 다른 군은 2개 성분(moiety)을 기본적으로 포함하는 RNA로 바 람직하게 구성된 촉매적 활성 핵산인 리보자임이다. 제1 성분은 촉매적 활성을 나타내는 반면에, 제2 성분은 표적 핵산과 특이적 상호작용에 관여한다. 전형적으로 2개 혼성화(hybridising) 스트랜드 상의 필수적으로 상보적인 염기 스트레치의 혼성화 및 왓슨-크릭 염기쌍에 의해 표적 핵산과 리보자임의 상기 성분 사이에 상호작용시, 촉매적 활성 성분은 활성으로 될 수 있는데, 이는 리보자임의 촉매 활성이 포스포디에스테라제 활성인 경우 분자내 또는 분자간이든 표적 핵산을 분해하는 것을 의미한다. 리보자임, 그의 용도 및 그의 디자인 원리는 당업자에게 공지되어 있으며 예컨대 Doherty 및 Doudna (Annu. Ref. Biophys. Biomolstruct. 2000; 30: 457-75)에 기재되어 있다.
기능적 핵산의 다른 군은 앱타머이다. 앱타머는 단일 스트랜드 또는 이중 스트랜드일 수 있고 또 표적 분자와 특이적으로 상호작용하는 D-핵산이다. 앱타머의 제조 또는 선택은 예컨대 유럽특허 EP 0 533 838호에 기재되어 있다. RNAi, siRNA, siNA, 안티센스 뉴클레오티드 및 리보자임과 대조적으로, 앱타머는 표적 mRNA를 전혀 분해하지 않지만, 단백질과 같은 표적 화합물의 2차 및 3차 구조와 특이적으로 상호작용한다. 표적과 상호작용시, 표적은 전형적으로 그의 생물학적 활성에서 변화를 나타낸다. 앱타머의 길이는 전형적으로 15 내지 80 뉴클레오티드 범위이고, 바람직하게는 약 20 내지 약 50 뉴클레오티드 범위이다.
기능적 핵산의 다른 군은 국제 특허출원 WO 98/08856호에 기재된 바와 같은 스피겔머이다. 스피겔머는 앱타머와 유사한 분자이다. 그러나, 스피겔머는 앱타머와 대조적으로 D-뉴클레오티드보다는 완전히 또는 대부분 L-뉴클레오티드로 구성된 다. 다르게는, 스피겔의 가능한 길이에 관하여는 앱타머와 관련하여 언급한 바와 동일한 내용이 스피겔머에도 적용된다.
앞서 말한 바와 같이, 본 발명자들은 놀랍게도 본 발명에 따른 화합물 및 이러한 화합물을 포함하는 각 조성물은 RNAi, 보다 특히 siRNA 및 siNA를 세포로 전달하는데 특히 효과적일 수 있다는 것을 밝혀내었다. 어떤 이론에 얽매이는 것은 아니지만, 헬퍼 지질이 PEG-유리 헬퍼 지질 또는 PEG-함유 헬퍼 지질일 수 있는 본 발명에 따른 지질 조성물에 함유된 헬퍼 지질의 특정 몰%로 인하여, 특히 상기 종류의 헬퍼 지질이 본 명세서에 특정된 농도 범위 내로 함유되면 놀라운 효과를 실현할 수 있는 것으로 본다. 이와 관련하여, 본 발명에 따른 조성물이 PEG 성분을 포함하는 헬퍼 지질을 함유하면, 이러한 PEG-유래 헬퍼 지질을 함유하는 조성물을 사용한 전달 또는 형질감염 작용은 핵산, 특히 RNAi 분자, 가장 특히 siRNA, siNA, 안티센스 뉴클레오티드 및 리보자임을 전달하는데 특히 효과적이다.
상기 이유는 본 발명자들이 약 4% 이상의 PEG-함유 헬퍼 지질을 함유하는 리포좀은 활성이 아닌 반면에, 4% 미만을 함유하는 리포좀(바람직하게는 3% 미만이지만 0% 이상임)은 기능적 전달을 매개한다는 것을 발견한 까닭이다. 기본적으로, 본 발명자들은 본 발명에 따른 지질 조성물에서 특정 양의 PEG는 효과적인 형질감염 및 전달에 적합하다는 것을 발견하였다.
다른 요지로서 본 발명자들은 바람직하게는 리포플렉스 또는 리포좀으로 존재하는 본 발명에 따른 지질 조성물이 전체적으로 양이온 전하, 따라서 1 이상의 양전하 과량을 나타낸다는 것을 놀랍게도 발견하였다. 보다 바람직하게는, 상기 지 질 조성물은 약 1:1.3 내지 1:5의 음전하: 양전하 비율을 나타낸다. 따라서 본 발명은 다른 요지로서 1 이상의 양이온성 지질 및 핵산, 바람직하게는 RNAi, siRNA 또는 siNA 또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 다른 기능적 핵산을 포함하는 지질 조성물에 관한 것이다. 양이온성 지질은 바람직하게는 본 명세서에 기재된 바와 같은 양이온성 지질이다. 지질 조성물은 바람직한 구체예로서 본 명세서에 기재된 바와 같은 헬퍼 지질 또는 헬퍼 지질 조합물을 포함한다.
본 발명자들은 또한 핵산 함유 지질 제제의 양이온성 전체 전하와 관련하여 상술한 내용의 측면에서 특히 siRNA와 양이온성 지질의 몰비가 본 발명에 따른 지질 조성물의 성공적인 적용에 중요할 수 있음을 발견하였다. 어떠한 이론에 얽매임없이, 특히 본 명세서에 기재된 바와 같은 1몰의 양이온 지질은 분자당 최대 3개의 양전하를 제공할 수 있는 반면에, 본 명세서에 기재된 바와 같은 핵산 및 보다 특히 siRNA 분자는 분자당 최대 40개의 음전하를 제공한다. 본 발명에 따른 siRNA 함유 지질 제제의 전체적 양전하에 도달하기 위하여, 상기 몰비는 0 내지 최대 0.075 범위일 수 있다. 바람직한 몰비 범위는 약 0.02 내지 0.05이고, 더욱 바람직하게는 약 0.037 몰비 범위이다.
본 발명에서 상기 조성물 및 보다 특히 약제학적 조성물은 본 발명에 따른 조성물에 약학적 활성 화합물 및 추가의 성분으로서 각각 함유될 수 있는 1 이상의 상술한 생물학적 활성 화합물을 포함할 수 있다. 상술한 화합물은 원칙적으로 약학적 활성 화합물로 사용될 수 있음은 당업자에게 공지되어 있다. 이러한 약학적 활성 화합물은 전형적으로 질병의 파토메카니즘(pathomechanism)에 관련된 표적 분자 에 관련된 것이다. 본 발명의 요지와 관련하여 사용되는 바와 같은 다양한 생물학적 활성 화합물 및 약학적 활성 화합물에 존재하는 일반적인 디자인 원리 및 작용 모드로 인하여, 실질적으로 어떠한 표적도 어드레스(addressed)될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 화합물 및 그를 함유하는 각 조성물은 상기 유형의 생물학적 활성 화합물을 사용하여 어드레스되고, 예방되며 및/또는 처리될 수 있는 질병 또는 질병 조건의 치료 또는 예방을 위해 사용될 수 있다. 이들 생물학적 활성 화합물과는 별도로, 기타 생물학적 활성 화합물도 본 발명의 구체예에 따른 조성물의 일부일 수 있음이 알려져 있다. 바람직하게는, 이러한 기타 생물학적 활성 화합물은 기타 생물학적 활성 화합물이 본 발명에 따른 화합물, 보다 바람직하게는 양이온성 지질로 존재하는 본 발명에 따른 화합물과 상호작용하거나 착화되는 조건하에서 1 이상의 음전하를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 생물학적 활성 화합물은 바람직하게는 생물학적 활성인 화합물이고, 바람직하게는 생물학적 계에 대하여 생물학적, 화학적 및/또는 물리적 효과를 나타낸다. 이러한 생물학적 계는 바람직하게는 생화학적 반응, 세포, 바람직하게는 포유 동물 세포, 보다 바람직하게는 척추동물 세포 및 가장 바람직하게는 비제한적으로 인간 세포, 조직, 기관 및 생물을 비롯한 포유동물 세포이다. 이러한 생물은 바람직하게는 마우스, 랫트, 기니아 피그, 토끼, 고양이, 개, 양, 돼지, 염소, 소, 말, 가금류, 원숭이 및 인간을 포함하는 군으로부터 선택된다.
본 발명에서 본 발명에 따른 조성물, 보다 특히 본 발명에 따른 약학적 조성 물은 추가의 약학적 활성 화합물을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 조성물, 특히 약학적 조성물은 다양한 투여 형태에 대해 사용될 수 있으며, 국소 투여 및 전신 투여가 특히 바람직하다. 근육내, 경피, 피하, 정맥내 및 폐 투여를 포함하는 군으로부터 선택되는 투여 경로가 더욱 바람직하다. 본 명세서에서 바람직하게 사용된 바와 같이, 국소 투여는 각 조성물을 세포, 조직 및 생물에 대하여 밀접한 공간적 관계로 상기 조성물 및 생물학적 활성 화합물이 투여되는 것을 의미한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 전신 투여는 국소 투여와는 상이한 투여를 의미하며, 보다 바람직하게는 혈액 및 액체와 같은 체액에 투여되며, 상기 체액은 상기 조성물 및 생물학적 활성 화합물이 전달될 세포, 조직 및 생물로 상기 조성물을 수송한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 세포는 생물학적 활성 화합물이 본 발명에 따른 화합물 및 조성물에 의하여 전달되는 세포 막, 바람직하게는 진핵세포, 보다 바람직하게는 척추생물 세포, 더욱 바람직하게는 포유동물 세포를 통과한다. 가장 바람직하게는 상기 세포는 인간 세포이다.
본 발명에 따른 화합물 및 조성물을 사용하여 제조될 수 있는 의약은 마우스, 랫트, 개, 고양이, 기니아 피그, 토끼, 양, 돼지, 염소, 소, 말, 가금류, 원숭이 및 인간을 포함하는 군으로부터 선택된다. 다른 요지로서, 본 발명에 따른 화합물 및 조성물은 전달제, 보다 바람직하게는 형질감염제로서 사용될 수 있다.
본 명세서에 바람직하게 사용되는 바와 같이, 전달제는 화합물, 보다 바람직하게는 약학적 활성 화합물과 같은 생물학적 활성 화합물이 막, 바람직하게는 세포 막을 거쳐서 더욱 바람직하게는 본 명세서에 기재된 바와 같은 세포로 상기와 같은 화합물을 전달한다. 더욱 더 바람직하게는, 이러한 전달은 엔도좀/리포좀으로부터 방출을 포함한다.
다른 요지로서, 본 발명은 세포에 생물학적 활성 화합물을 전달하는, 보다 특히 세포를 생물학적 활성 화합물로 형질감염시키는 방법에 관한 것이다. 제1 단계로서, 상기 단계의 순서는 반드시 제한되는 것이 아니며 이하에 기재된 상기 단계의 수순에 한정되지 않으며, 세포 및 막 및 세포를 제공한다. 제2 단계로서, 본 발명에 따른 화합물뿐만 아니라 약학적 활성 화합물과 같은 생물학적 활성 화합물도 제공한다. 상기 반응은 세포 및 막과 각각 접촉될 수 있으며, 또 본 발명에 따른 화합물 및 조성물의 생체물리적 특성으로 인하여, 생물학적 활성 화합물은 막의 한면에서부터 다른 면으로 전달되거나, 또는 막이 세포를 형성하는 경우, 세포 외부로부터 세포 내로 전달된다. 본 발명의 범위에서 세포 및 막이 접촉하기 전에, 생물학적 화성 화합물 및 본 발명에 따른 화합물, 즉 양이온성 지질은 바람직하게는 복합체가 형성되고 이러한 복합체가 세포 및 막과 접촉할 때 접촉된다.
본 발명의 다른 요지로서, 생물학적 활성 화합물 및 약학적 활성 화합물을 전달하는 방법은 세포 및 막을 제공하는 단계, 본 발명에 따른 조성물을 제공하는 단계 및 상기 조성물과 세포 및 막을 접촉시키는 단계를 포함한다. 본 발명에서 상기 조성물은 세포 및 막과 접촉하기 전에 또는 접촉하는 동안 형성된다.
본 명세서에 기재된 바와 같이 생물학적 활성 화합물을 전달하는 방법의 구체예로서, 상기 방법은 생물학적 활성 화합물이 전달되었는지 여부를 검출하는 단 계를 더 포함할 수 있다. 이러한 검출 반응은 상기 방법에 따라 전달되는 생물학적 활성 화합물의 종류에 따라 달라지며 당업자들이 쉽게 이해할 수 있다. 본 발명에서 이러한 방법은 본 명세서에 기재된 바와 같은 세포, 조직, 기관 및 생물 상에서 실시된다.
다른 구체예로서 차폐제는 본 명세서에 기재된 바와 같이 본 발명에 따른 지질 조성물의 지질 성분에, 바람직하게는 양이온성 지질에 부착됨을 알 수 있다.
본 발명은 이하의 도면 및 실시예를 참조하여 설명하며, 그로부터 본 발명의 추가의 특징, 구체예 및 이점을 알 수 있을 것이다.
도 1은 본 발명에 따른 양이온성 지질의 기본 디자인을 도시한다.
도 2는 본 발명에 따른 화합물을 합성하기 위한 출발물질인 N-올레일-팔미틸아민의 합성을 도시하며, 이러한 합성은 미국특허 6,395,713호에 기재된 바와 같은 종래 기술에 따른 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 중요한 출발 물질인 N-올레일-팔미틸아민의 합성을 도시한다.
도 4 내지 도 9는 β-아르기닐-2,3-아미노 프로피온산-N-팔미틸-N-올레일-아미드 트리히드로클로라이드, β-아르기닐-2,3-디아미노 프로피온산-N-라우릴-N-미리스틸-아미드 트리히드로클로라이드 및 ε-아르기닐-리신-N-라우일-N-미리스틸-아미드 트리클로라이드의 합성을 도시한다.
도 10은 본 발명에 따른 양이온성 지질을 합성하기 위한 대체 성분인 대체 양이온성 헤드 기의 합성을 도시한다.
도 11은 베타-아르기닐-2,3-디아미노프로피온산-N-팔미틸-N-올레일-아미드 트리히드로클로라이드를 합성하기 위한 대체 합성 경로를 도시한다.
도 12A 및 도 12B는 본 발명에 따른 지질 제제의 크기 분포 및 압출 및 고압 균질화의 영향을 각각 도시한다.
도 13A 및 도 13B는 웨스턴 블럿 분석 결과 및 상이한 농도의 PEG-치환된 지질의 영향을 도시한다.
실시예 1: 종래 기술에 따른 N- 올레일 - 팔미틸 아민의 합성
N-올레일-팔미틸 아민은 본 발명에 따른 화합물의 중요한 출발 물질이다. N-올레일-팔미틸 아민은 원칙적으로 미국특허 6,395,713호에 기재된 바와 같이 합성할 수 있다. 각 반응도는 도 2에 도시되어 있다. 그러나, 출발물질은 플루카에 의해 제공되는 공업용 올레일 아민이다. 가스 크로마토그래피에 의한 상기 출발 물질의 분석은 순도가 ≥70%이고, 이 물질의 30%는 상이한 사슬 길이를 갖는 아민으로 구성됨을 보여준다. 상기의 이유는 상기 물질이 식물 공급원으로부터 얻어지기 때문일 수 있다. 올레일 아민 및 1-브로모헥사데칸 (팔미틸브로마이드)를 조합하여 100 내지 120℃에서 30분간 반응시킨 후 N-올레일-팔미틸 아민을 얻는다. 수율은 약 83%이다.
실시예 2: 본 발명에 따른 N- 팔미틸 - 올레일 아민의 합성
신규 합성법은 본 발명에 따른 화합물과 관련하여 본 발명자들에 의해 밝혀 졌다(도 3). 이 신규 반응도는 다량의 불순물이 상기 출발물질을 기본으로 하여 제조된 전달제의 양에 영향을 준다는 본 발명자의 발견을 기초로 하고 있다. 따라서, 가스 크로마토그래피에 의해 도시된 바와 같이 ≥ 99% 의 순도를 갖는 올레산을 사용하고 이러한 올레산을 에틸클로로포르메이트, TEA 및 CH2Cl2 와 접촉시키며 이렇게 얻어진 혼합 카르복시-탄산 무수물을 가스 크로마토그래피에 의해 도시된 바와 같이 ≥ 99%의 순도를 갖는 헥사데실아민(팔미틸아민)과 혼합하여 반응이 개시된다. 이 반응 생성물 N-팔미틸-올레오일 아미드[#1]를 LiAlH4 (THF 중)와 반응시켜 85% N-팔미틸-올레일 아민 [#2]를 생성하며, 이것은 무색 결정성 고체로 존재한다.
보다 상세한 반응 조건은 다음에 개시된 바와 같다.
N- 팔미틸 - 올레오일 아미드 [#1]의 합성
아르곤 불활성 가스하의 슈렝크(Schlenk)에 따른 250 ml들이 질소 플라스크에 든 30 ml의 무수 디클로로메탄에 2.62 ml (27.5 밀리몰)의 클로로포름산 에틸 에스테르를 용해시키고 또 0℃로 냉각시킨다. 40 ml의 무수 디클로로메탄에 7.93 ml (25 밀리몰) 올레산 및 4.16 ml (30 밀리몰) 트리에틸아민이 용해된 용액을 교반하에서 20분 동안 적가한다. 얼음욕 상에서 30분간 교반한 후 50 ml CHCl3 중의 6.64 g (27.5 밀리몰) 팔미틸아민이 용해된 용액을 급속히 적가하고 그 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반한다. 이어, 이 용액을 40 ml 물을 사용하여 3회 세척하고, 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조시키고 또 회전 증발기를 이용하여 용매를 제거하였다. 잔류물을 100 ml 아세톤으로부터 재결정화하였다. 89%의 무색 고체 수율에 상응하는 11.25 g (22.3 밀리몰)를 얻었다.
N- 팔미틸 - 올레일아민 [#2]의 합성
적하 깔때기 및 환류 응축기를 구비한 250 ml 들이 3-목 플라스크에 들어있는 아르곤 불활성 가스하에 에테르 중의 20 ml 1M LiAlH4 를 제공한 다음 80 ml THF 중에 7.59 g (15 밀리몰) 팔미틸올레오일아미드가 용해된 용액을 20분 동안 적가하였다. 이 혼합물을 2.5 시간 동안 환류시킨 다음 에테르 중의 5 ml 1M LiAlH4 를 부가하고 약 2.5 시간 동안 환류시켰다. 얼음욕 냉각 하 6M NaOH를 사용하여 과량의 수소화물을 분해시키고 석출물은 여과제거하였다. 석출물을 40 ml 뜨거운 MtBE 로 2회 추출하고, 모아진 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조시키고 회전 증발기를 이용하여 용매를 제거하였다. 잔류물을 -20℃에서 100 ml MtBE로부터 결정화시켰다. 무색 결정성 고체에 상응하는 85% 수율에 상응하는 23 g(12.7 밀리몰)을 얻었다.
실시예 3: Boc - Dap ( Fmoc )-N- 팔미틸 -N- 올레일 -아미드 [#3]의 합성
10 ml 무수 디클로로메탄 중의 521 mg (1.06 밀리몰)의 N-올레일-팔미틸아민을 50 ml 원형 바닥 플라스크에서 용해시키고 289 g(1.17 밀리몰) EEDQ를 부가하였다. 이어, 500 mg(1.17 밀리몰)의 Boc-Dap(Fmoc)-OH를 교반하에 부가하고 그 혼합물을 실온에서 20시간 동안 교반하였다. 이 용액을 80 ml 디클로로메탄과 함께 분리 깔때기에 넣고 각각 20 ml 0.1N HCl를 사용하여 3회 세척하고 1번은 20 ml 포화 NaHCO3 용액을 사용하여 세척하였다. Na2SO4 상에서 건조시킨 후 회전 증발기를 이용하여 용매를 제거하였다(도 4). 황색을 띄는 점성 오일을 얻으며, 이것은 더 이상 정제하지 않는다. 헥산/에틸아세테이트 1:1을 사용한 박층 크로마토그래피에서 Rf 0.70이 관측되었다.
실시예 4: Boc - Dap -N- 팔미틸 -N- 올레일 -아미드 [#4]의 합성
1g의 Boc-Dap(Fmoc)-N-팔미틸-N-올레일-아미드 원료 물질을 50 ml 원형 바닥 플라스크에서 8 ml 무수 디클로로메탄에 용해시켰다. 3 ml 디에틸아민을 부가하고 실온에서 교반하였다(도 4). 반응의 박층 크로마토그래피 대조용은 4.5 시간 후 출발 물질의 반응이 완료되었음을 나타내었다. 휘발성 성분을 회전 증발기로 제거하고 그 잔류물을 헥산/에틸아세테이트 5:1을 사용하는 40 g 실리카겔 60 (Merck) 상에서 크로마토그래피 정제하였다. 에틸아세테이트, 에틸아세테이트/메탄올 4:1 및 디클로로메탄/메탄올 4:1로 구성된 단계 구배를 사용하여 생성물을 용출시켰다. 576 mg(0.85 밀리몰)의 Boc-Dap-N-팔미틸-N-올레일-아미드를 황색 점성 오일로 수득하였다.
실시예 5: 테트라 - Boc -[β- 아르기닐 -2,3- 디아미노프로피온산 -N- 팔미틸 -N- 올 레일-아미드 [#5]의 합성
576 mg (0.85 밀리몰)의 Boc-Dap-N-팔미틸-N-올레일-아미드를 100 ml 원형 바닥 플라스크에서 10 ml 무수 디클로로메탄에 용해시키고 또 210 mg (0.85 밀리몰)의 EEDQ 및 403 mg(0.85 밀리몰)의 Boc-Arg(Boc)2-OH를 교반하에서 부가하였다(도 5). 이 혼합물을 아르곤 분위기하, 실온에서 20 시간 동안 교반하였다. 이어, 디클로로메탄을 회전 증발기에 의해 제거하고 100 ml MtBE 중의 잔류물을 분리 깔 때기로 전달하였다. 유기 상을 0.1N HCl, 1N NaOH 및 포화 NaHCO3 용액으로 완전히 세척한 다음 Na2SO4 상에서 건조시키고 회전 증발기에 의해 용매를 제거하였다. 원료 물질을 헥산/에틸 아세테이트를 용리액으로 사용하는 플래쉬 크로마토그래피 (컴비플래쉬 리트리브; Isco Inc. 제조)에 의해 정제하였다. 수율 72%에 상응하는 694 mg (0.61 밀리몰)의 무색 점성 오일을 얻었다.
실시예 6: β- 아르기닐 -2,3- 디아미노프로피온산 -N- 팔미틸 -N- 올레일 -아미드 트리히드로클로라이드[ #6]의 합성
694 mg (0.61 밀리몰)의 잘 건조된 테트라-Boc-[β-아르기닐-2,3-디아미노프로피온산-N-팔미틸-N-올레일-아미드를 아르곤 분위기하에서 슈렝크에 따른 25 ml 질소 플라스크에 제공하고 또 디옥산 중의 8ml 4N HCl을 부가하였다(도 5). 이 혼합물을 실온의 아르곤 불활성 가스하에서 24시간 동안 교반한 다음 생성물을 약 6 내지 8시간 후 용액으로부터 무정형의 부분적으로 왁스상 고체로서 석출시켰다. 반응(CHCl3/MeOH/NH4OH 65:25:4를 이용한 박층 대조용) 완료후 휘발성 성분은 고 진공하에서 제거하였다. 489 mg(0.58 밀리몰)의 β-아르기닐-2,3-디아미노프로피온산-N-팔미틸-N-올레일-아미드를 트리히드로클로라이드로서 얻었다.
실시예 7: N- 라우릴 - 미리스틸 아민[#7]의 합성
18.54 g (100 밀리몰)의 도데실아민 (라우릴아민), 6.36 g (60 밀리몰)의 Na2CO3 및 50 mg의 테트라부틸 암모늄 요오다이드 (TBAI)를 환류 응축기 및 적하 깔때기를 구비한 500 ml 들이 3-목 플라스크 중 100 ml 무수 DMF에 현탁시켰다. 100 ml 무수 디옥산 중에 16.4 ml (60 밀리몰)의 1-브로모 테트라데칸이 용해된 용액을 100℃ 에서 3.5 시간 동안 교반하였다(도 6). 이 용액을 가능한한 고온에서 여과하였다. 9 g의 무색 잎 모양 결정을 얻으며, 이것을 100 ml MtBE로부터 재결정시켰다. -18℃에서 석출한 결정을 냉각 프릿(frit)으로부터 흡수하고 냉각 MtBE로 세척하였다. 7.94 g (21 밀리몰)의 무색 결정 고체를 얻으며, 이는 35% 수율에 상응한다.
실시예 8: Boc - Dap ( Fmoc )-N- 라우릴 -N- 미리스틸 아미드 [#8]의 합성
715 mg (1.68 밀리몰)의 Boc-Dap(Fmoc)-OH를 50 ml 원형 바닥 플라스크에서 15 ml 무수 디클로로메탄에 용해시키고 또 420 mg (1.7 밀리몰)의 EEDQ를 부가하였다. 이 혼합물을 실온에서 45분간 교반한 다음 25 ml 무수 디클로로메탄에 641 mg (1.68 밀리몰)의 N-라우릴-미리스틸 아민이 용해된 용액을 60분 동안 서서히 적가하였다(도 6). 20시간의 반응 시간 후, 회전 증발기에 의해 용매를 제거하고 그 잔류물을 100 ml MtBE와 함께 분리 깔때기로 전달하였다. 이 용액을 0.1N HCl 및 포화 NaHCO3 용액으로 완전히 세척하고, 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조시키고 용매는 회전 증발기에 의해 제거하였다. 1.02 g의 생성물을 얻으며, 이것은 헥산/에틸아세테이트를 사용한 플래쉬 크로마토그래피 (컴비플래쉬 리트리브; Isco Inc. 제조)에 의해 정제되었다. 607 mg의 순수한 생성물을 무색의 점성 오일로 수득하였다. 헥산/에틸아세테이트 1:1을 사용한 박층 크로마토그래피는 Rf 0.58을 제공하였다.
실시예 9: Boc - Dap -N- 라우릴 -N- 미리스틸 아미드 [#9]의 합성
607 mg의 Boc-Dap(Fmoc)-N-라우릴-N-리미스틸 아미드를 50 ml 원형 바닥 플라스크 중 8 ml 무수 디클로로메탄에 용해시켰다(도 6). 3 ml 디에틸아민을 부가하고 그 반응을 실온에서 4.5 시간 동안 교반하였다. 휘발성 성분을 회전 증발기를 이용하여 제거하고 그 잔류물을 40 g 실리카 겔 60 (머크 제조)과 헥산/에틸 아세테이트 5:1을 사용한 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 생성물을 에틸아세테이트, 디클로로메탄 및 디클로로메탄/메탄올 3:1로 구성된 단계 구배에 의해 용출시켰다. 372 mg (0.655 몰)의 Boc-Dap-N-라우리-미리스틸 아미드를 황색 점성 오일로 얻었다.
실시예 10: 테트라 - Boc -[β- 아르기닐 -2,3- 디아미노프로피온산 -N- 라우릴 -N- 미 리스틸 아미드 [#10]의 합성
372 mg (0.655 몰)의 Boc-Dap-N-라우리-미리스틸 아미드를 50 ml 원형 바닥 플라스크 중 8 ml 무수 디클로로메탄에 용해시키고 또 162 mg (0.655 밀리몰) EEDQ 및 311 mg (0.655 몰)의 Boc-Arg-(Boc)2-OH를 교반하에 부가하였다(도 7). 그 혼합물을 실온에서 20시간 동안 교반하였다. 이어, 디클로로메탄을 회전 증발기를 이용하여 제거하고 그 잔류물을 80 ml MtBE와 함께 분리 깔때기에 전달하였다. 유기 상을 0.1N HCl, 1N NaOH 및 포화 NaHCO3 용액으로 완전히 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고 용매를 회전 증발기에 의해 제거하였다. 조 생성물을 플래쉬 크로마토그래피 (컴비플래쉬 리트리브, Isco Inc. 제조)에 의해 헥산/에틸아세테이트 단계 구배를 이용하여 정제하였다. 500 mg(0.5 밀리몰)의 무색 점성 오일을 얻으며, 이는 76% 수율에 상응한다.
실시예 11: β- 아르기닐 -2,3- 디아미노프로피온산 -N- 라우릴 -N- 미리스틸 아미드 트리히드로클로라이드 [#11]의 합성
511 mg (0.5 밀리몰)의 잘 건조된 테트라-Boc-[β-아르기닐-2,3-디아미노프로피온산-N-라우릴-N-미리스틸 아미드를 아르곤하에서 슈렝크에 의한 25 ml 아르곤 플라스크에 제공하고 또 디옥산 중의 4N HCl 10 ml를 부가하였다(도 7). 그 혼합물을 아르곤 불활성 가스 하, 실온에서 24시간 동안 교반한 다음 그 생성물을 부분적으로 무정형, 부분적으로 왁스상 고체 상태로 상기 용액으로부터 6 내지 8시간 후에 석출시켰다. 반응 완료 후(CHCl3/MeOH/NH4OH 65:25:4를 사용한 박층 크로마토그래피 대조) 모든 휘발성 성분을 고압하에서 제거하였다. 트리히드로클로라이드 형태의 β-아르기닐-2,3-디아미노프로피온산-N-라우리-N-미리스틸 아미드 323 mg (0.5 밀리몰)을 얻었다.
실시예 12: Boc - Lys ( Fmoc )-N- 라우릴 -N- 미리스틸 아미드 [#12]의 합성
937 mg (2 밀리몰) Boc-Lys(Fmoc)-OH를 50 ml원형 바닥 플라스크 중 10 ml 무수 디클로로메탄에 용해시키고 495 mg (2 밀리몰) EEDQ를 부가하였다(도 8). 이 혼합물을 실온에서 60분간 교반한 다음 30 ml 무수 디클로로메탄 중의 764 mg (2 밀리몰)의 N-라우릴-미리스틸 아민을 서서히 120분간에 걸쳐 적가하였다. 20시간 후 반응 시간 후 용매를 회전 증발기를 이용하여 제거하고 그 잔류물은 100 ml MtBE와 함께 분리 깔대기로 전달하였다. 이 용액을 0.1 NHCl 및 포화 NaHCO3 으로 완전히 세척한 후 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 용매를 회전 증발기 상에서 제거하였다. 헥산/에틸 아세테이트 4:1을 용리액으로 사용한 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하여 1.757 g의 조 생성물을 얻었다. 1.377 g 순수한 생성물을 무색의 점성 오일로서 얻었다. 헥산/에틸아세테이트 1:1을 사용한 박층 크로마토그래피에 의해 Rf 0.57을 얻었다.
실시예 13: Boc - Lys -N- 라우릴 -N- 미리스틸 아미드 [#13]의 합성
1.377 g의 Boc-Lys(Fmoc)-N-라우릴-N-미리스틸 아미드를 50 ml원형 바닥 플라스크 중 16 ml 무수 디클로로메탄에 용해시켰다. 6 ml의 디에틸아민을 부가하고 그 혼합물을 실온에서 5시간 동안 교반하였다(도 8). 회전 증발기를 이용하여 휘발성 성분을 제거하고 그 잔류물을 헥산/에틸 아세테이트 5:1을 이용하는 40 g 실리카겔 60 (머크 제조)을 이용하여 크로마토그래피에 의해 잔류물을 정제하였다. 에틸아세이트, 디클로로메탄 및 디클로로메탄/메탄올 3:1로 구성된 단계 구배를 이용하여 생성물을 용출시켰다. 556 mg (0.911 밀리몰)의 Boc-Lys-N-리우릴-N-미리스틸 아미드를 황색 점성 오일로 수득하고 그와 함께 119 mg의 혼합 분획을 얻었다.
실시예 14: 테트라 - Boc -[ε- 아르기닐 -리신-N- 라우릴 -N- 미리스틸 아미드 [#14]의 합성
556 mg (0.911 밀리몰)의 Boc-Lys-N-리우릴-N-미리스틸 아미드를 40 ml 무수 디클로로메탄에 용해시키고 또 226 mg (0.911 밀리몰)의 EEDQ 및 433 mg (0.911 밀리몰)의 Boc-Arg(Boc)2-OH를 교반하에 부가하였다(도 9). 이 혼합물을 실온에서 20 시간 동안 교반하였다. 이어, 디클로로메탄을 회전 증발기를 사용하여 제거하고 그 잔류물을 80 ml MtBE와 함께 분리 깔때기로 전달하였다. 유기 상은 0.1 N HCl 및 포화 NaHCO3 용액으로 완전히 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고 용매는 회전 증발기를 이용하여 제거하였다. 헥산/에틸 아세테이트 단계 구배를 이용하여 플래쉬 크로마토그래피(컴비플래쉬 리트리브, Isco Inc. 제조)에 의해 정제시켰다. 무색의 점성 오일 730 mg (0.684 밀리몰)을 얻으며, 이는 75% 수율에 상응한다.
실시예 15: ε- 아르기닐 -리신-N- 라우릴 -N- 미리스틸 아미드 트리히드로클로라이드 [#15]의 합성
730 mg (0.684 밀리몰)의 잘 건조된 테트라-Boc-[ε-아르기닐-N-리우릴-N-미리스틸 아미드]를 슈렝크에 의한 25 ml 아르곤 플라스크 내 아르곤하에 제공하고 또 디옥산 중의 4N HCl 10 ml를 부가하였다(도 9). 이 혼합물을 아르곤 불활성 가스 하, 실온에서 24시간 동안 교반하면, 약 8시간 후 상기 용액으로 생성물이 무정형, 부분적으로 왁스상 고체로 석출된다. CHCl3/MeOH/NH4OH 65:25:4를 이용한 박층 크로마토그래피에 의해 제어하는 것과 같이 반응을 완료하면, 모든 휘발성 성분은 고압하에서 제거되었다. 491 mg (0.633 밀리몰)의 ε-아르기닐-리신-N-리우릴-N-미리스틸 아미드를 트리히드로클로라이드로서 얻었다.
실시예 16: 트리- Boc -γ- 카르보아미디노 -α,γ- 디아미노 부티르산 [#16]의 합성
1.31 g (6 밀리몰)의 Boc-Dab-OH를 100 ml 원형 바닥 플라스크 중 15 ml 아 세토니트릴에 제공하고 또 12 밀리몰의 디이소프로필에틸 아민(DIPEA)를 부가하였다(도10). 이어, Boc-Dab-OH의 일부가 용해될 때까지 물을 적가한 다음 1.96 g (5 밀리몰)의 1,3-디-Boc-2-(트리플루오로메틸술포닐)구아니딘을 부가하였다. 이 혼합물을 실온에서 12시간 동안 교반하고, 아세토니트릴을 회전 증발기를 이용하여 제거하였다. 수성 잔류물을 5 ml 물을 사용하여 희석시키고 50 ml 디클로로메탄을 부가하였다. 이 반응을 교반하에서 2N HCl을 부가함으로써 pH 2로 산성화시킨 다음 유기 상을 분리하였다. 수성 상을 50 ml 디클로로메탄으로 추출한 다음 모아진 유기 상을 희석된 HCl 및 포화 NaCl 용액으로 세척하였다. 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조시키고 용매는 회전 증발기를 이용하여 제거하였다. 헥산/에틸 아세테이트 2:1 단계 구배를 이용하는 실리카겔 60 상의 크로마토그래피에 의해 잔류물을 정제하였다. 50%의 수율에 상응하는 1.138 g (2.47 밀리몰)의 무색의 무정형 고체를 얻었다.
실시예 17: 베타- 아르기닐 -2,3- 디아미노프로피온산 -M- 팔미틸 -N- 올레일 아미드 트리히드로클로라이드 [##6]의 합성
15 ml 무수 CH2Cl2 중의 1.225 g (6 밀리몰)의 BOC-Dap-OH를 적하 깔때기를 구비한 250 ml 슈렝크 플라스크에서 아르곤 분위기하에서 현탁시키고 1.72 ml의 트리메틸아민을 부가하였다. 30 ml 무수 CH2Cl2 중에 1.52 ml (12 밀리몰) TMSCI가 용해된 용액을 급격하게 교반되는 실온에서 15 내지 20분간 적가하였다. 그 동안 100 ml 슈렝크 플라스크중, 아르곤 분위기하에서 941 mg (5.8 밀리몰)의 카르보닐 디이미다졸을 8 ml 무수 CH2Cl2에 용해시켰다. 25 ml 무수 CH2Cl2 중에 2.66 g (5.6 밀리몰)의 Boc-Arg(Boc)2-OH가 용해된 용액을 교반하 실온에서 15 내지 20분간 적가하였다. 반응 용액을 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 이어, 제1 용액에 832 ㎕ (6 밀리몰)의 트리에틸아민을 부가하고 또 아르곤 분위기하, 실온에서 적하 깔때기를 통하여 15 내지 20분간 제2 용액을 부가하였다. 15 내지 20분 후, 30 ml 물을 부가하고, 45분간 급격하게 교반한 다음 그 용액을 pH 2로 조정하였다. 유기 상을 분리하고 수성 상은 CH2Cl2를 사용하여 몇 회 추출하였다. 모아진 유기 상을 NaCl 포화 용액 및 황산 나트륨으로 건조시키고 용매는 회전 증발기를 이용하여 제거하였다. 유리 상 잔류물은 디클로로메탄을 용리액으로 사용하는 실리카겔 상에서 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 2.74 g (4.15 밀리몰; 74%)의 무색 , 무정형 고체를 얻었다.[화합물 17].
이 고체를 실시예 1의 조건과 비슷한 조건하에서 올레일 팔미틸 아민[#2]와 반응시키고 온도는 35 내지 40℃로 설정하였다(수율 72%). 실시예 11에 기재된 Boc 보호기가 분해되면, 목적한 최종 생성물 β-아르기닐-2,3-디아미노프로피온산-N-팔미틸-N-올레일-아미드 트리히드로클로라이드[#6]를 얻는다. 이렇게 얻은 생성물은 MeOH/물을 용리액으로 사용한 RP-18 실리카겔 상에서 플래쉬 크로마토그래피에 의해 더 정제될 수 있다.
실시예 18: 리포좀 및 siRNA 로 구성된 복합체 ( 리포플렉스 )의 제조
양이온성 리포좀 및 siRNA로 구성된 리포플렉스는 지질 막/케이크, 에탄올 주입 과정, 역상 증발 및 세제 투석 과정과 같은 당해 분야에 공지된 표준 수법을 이용하여 제조하였다[Liposomes as Tools in Basic Research and Industry; Jean R. Philippot and Francis SChuber; CRC Press January 1995 und Liposome Technology: Preparation of Liposomes: 001 Gregory Gregoriadis CRC Press 1 L1c. April 1984 참조].
본 명세서에서 리포플렉스로도 불리는 상기 얻은 리포좀은 지질로서 베타-아르기닐-2,3-디아미노프로피온산-N-팔미틸-N-올레일-아미드 트리히드로클로라이드 및 부가적으로 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 또는 1,2-디올레일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민을 포함하며, 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민의 사용이 바람직하다. 이러한 리포좀 및 리포플렉스의 지질 분획은 각각 50몰% 베타-아르기닐-2,3-디아미노프로피온산-N-팔미틸-N-올레일-아미드 트리히드로클로라이드 및 50몰%의 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 또는 50몰% 1,2-디올레일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민이었다.
50몰%의 β-아르기닐-2,3-디아미노프로피온산-N-팔미틸-N-올레일-아미드 트리히드로클로라이드 및 50몰% 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민의 조합을 atuFect로 칭한다.
원리적으로 본 명세서에 기재된 바와 같은 지질 및 지질 조성물은 이미 언급한 수법 뿐만 아니라 다른 가공 단계를 이용하여 제조될 수 있다.
리포좀 및 리포플렉스는 크기, 다분산성 및 층 디자인에 대하여 조절하도록 다른 가공 단계에 처리시켰다. 이들 특징은 초음파 처리, 다공성 막을 통한 압출, 및 균질화, 바람직하게는 고압 균질화에 의해 조정될 수 있다.
이렇게 형성된 리포좀은 베크만-쿨터 N5 서브마이크론 입자 분석기를 갖는 광자 관련 분광계에 의해 특징화하고 이러한 리포좀의 압출에 의한 크기분포 또는 고압 균질화에 의한 크기 분포 결과를 도 12A 및 도 12에 도시되어 있다.
도 12A로부터, 리포좀의 크기 분포는 상이한 크기 압출을 갖는 상이한 막을 사용하여 변성될 수 있고, 본 발명의 경우 1,000 nm 내지 400nm 일 수 있음을 알 수 있다. 양쪽의 경우, 압출 단계는 21회 반복하였다. 그러나, 본 발명에서 크기 분포는 약 50 내지 5000 nm 일 수 있고, 압출 단계는 10 내지 50회 반복할 수 있다.
도 12B로부터 알 수 있듯이, 고압 균질화는 리포좀의 크기 분포를 변성하기 위한 적합한 수단일 수 있으며, 이러한 고압 균질화를 적용할 때 리포좀의 크기는 리포좀이 거치는 균질화 주기의 수에 따라 다르다. 전형적인 압력 범위는 100 내지 2500 바아이고, 본 발명의 경우 적용된 압력은 1,500 바아이다.
실시예 19: 지질 조성물 및 PEG 함량
제1 지질 성분으로서, β-아르기닐-2,3-디아미노프로피온산-N-팔미틸-N-올레일-아미드 트리히드로클로라이드 (양이온성 지질) 및 제1 헬퍼 지질로서 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DPhyPE) 및 PEG2000에 콘쥬게이트된 세라미드(C8mPEG2000) 및 PEG5000에 콘쥬게이트된 세라미드(C8mPEG5000)를 포함하는 지질 조성물의 형질감염 및 전달에 대한 PEG의 영향을 시험하기 위하여, 본 명세서에 기재된 방법에 따라서 다음 제제를 생성하였다:
Figure 112007046783852-pct00006
상술한 어떤 제제에서든, 지질 농도는 1.445 mg/ml이고, siRNA 농도는 300 mM 수크로오스 중의 15μM이었다. 농축된 스톡-복합체를 희석하면 세포 배지에서 20, 10, 5 nM siRNA 최종 농도를 얻었다.
상기 제제에 함유된 RNAi 분자는 PTEN에 향한 것이고 그 서열은 다음과 같았 다: 하기 서열을 갖는 제1 스트랜드:
Figure 112007046783852-pct00007
; 다음 서열을 갖는 제2 스트랜드:
Figure 112007046783852-pct00008
이며, 변형 패턴은 진하게 인쇄된 뉴클레오티드가 2'-O-메틸 뉴클레오티드이도록 하는 것이며; 어떤 스트랜에서든, 포스페이트로 시작하는 3' 말단은 상술한 서열에서 P로 표시하였다.
상기 지질 제제를 40,000 세포/웰을 함유하는 6웰 플레이트 중에 함유된 HeLa 세포에 투여하였다. 이들 세포를 PTEN 발현에 대해 분석하였고 그 결과를 웨스턴 블럿으로 도 13에 도시한다. 도 13A 및 도 13B에 도시된 웨스턴 블럿으로부터, PEG 화합물의 함량, 즉 차폐 화합물이 5 내지 7.5몰%로 증가할 수 있고, 그 농도는 PEG5000이 사용된 경우에 비하여 PEG2000을 사용한 경우에 그 범위의 상한보다 더 높거나 그와 동일할 수 있다는 것을 알 수 있다.
이것은 PEG가 지질 조성물로부터 제거될 수 없는 PEG 함유 조성물에 비하여 분명히 유리하다. 세라미드 PEG 콘쥬게이트 보다는 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-폴리에틸렌-글리콜 (DSPE-PEG2000)을 1 내지 5몰% 포함하는 유사 조성의 지질 제제는 효과적인 녹다운(knockdown)을 제공하도록 1 내지 2몰%의 도입을 허용한다.
명세서, 특허청구범위 및/또는 도면에 개시된 본 발명의 특징은 개별적으로 또는 조합되어 다양한 형태로 본 발명을 실시하기 위한 재료일 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Atugen AG <120> Coated lipid complexes and their use <130> A 19026 PCT <160> 2 <170> Patentln version 3.1 <210> 1 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial <220> <221> misc_feature <223> Synthetic <400> 1 uaaguucuag cuguggugg 19 <210> 2 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial <220> <221> misc_feature <223> Synthetic <400> 2 ccaccacagc uagaacuua 19

Claims (56)

  1. 아래 화학식 I에 따른 화합물인 양이온성 지질 성분;
    인지질이나 스테로이드인 제1 헬퍼(helper) 지질, 및
    PEG, HEG, 폴리히드록시에틸 녹말(polyHES) 및 폴리프로필렌중 하나를 포함하며, 상기 지질 조성물의 생체 내에서 순환 시간을 연장시키는 차폐(shielding) 화합물을 포함하는 지질 조성물;
    화학식 I은,
    Figure 112013063198656-pct00030
    (I)
    상기 식 중에서,
    R1 및 R2는 각각 독립적으로 알킬 또는 알케닐이며;
    n은 1 내지 4의 정수이고;
    R3은 리실, 오르니틸, 2,4-디아미노부티릴, 히스티딜 및 하기 화학식(II)의 아실 잔기로 이루어지는 군으로부터 선택된 아실이며;
    Figure 112013063198656-pct00031
    II
    상기 식 중에서,
    n은 1 내지 3의 정수이고,
    NH3 + 는 경우에 따라 존재하지 않으며, 또
    Y- 는 약학적으로 허용되는 음이온임.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 차폐 화합물은 PEG2000 또는 PEG5000인 지질 조성물.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 지질, 펩티드, 단백질, 올리고뉴클레오티드핵산으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 성분을 포함하는 지질 조성물.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 성분은 핵산을 포함하는 지질 조성물.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 핵산은 RNAi, siRNA, siNA, 안티센스 핵산, 리보자임, 앱타머 및 스피겔머로 이루어지는 군으로부터 선택되는 지질 조성물.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 차폐 화합물이 PEG와 세라미드의 콘쥬게이트(a conjugate of PEG and ceramide)인 지질 조성물.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 세라미드는 6 내지 10개 탄소원자의 적어도 1개의 짧은 탄소쇄 성분을 포함하는 지질 조성물.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 세라미드는 8개 탄소원자 적어도 1개의 짧은 탄소쇄 성분을 포함하는 지질 조성물.
  9. 제 1항에 있어서, 상기 제1 헬퍼 지질은 세라미드인 지질 조성물.
  10. 제 3항에 있어서, 상기 지질은 세라미드인 지질 조성물.
  11. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 제2 헬퍼 지질을 포함하며, 상기 제2 헬퍼 지질은 세라미드이고 상기 세라미드는 PEG에 콘쥬게이트되어 있는 지질 조성물.
  12. 제 3항에 있어서, 상기 차폐 화합물은 핵산에 부착되는 지질 조성물.
  13. 제 12항에 있어서, 상기 차폐 화합물은 링커 잔기에 의해 핵산에 부착되는 지질 조성물.
  14. 제 13항에 있어서, 상기 링커 잔기는 ssRNA, ssDNA, dsRNA, dsDNA, 펩티드, S-S 링커 및 pH 감수성 링커로 이루어지는 군으로부터 선택되는 지질 조성물.
  15. 제 13항에 있어서, 상기 핵산은 RNAi, siRNA 및 siNA 로 이루어지는 군으로부터 선택되며 또 상기 링커는 센스 스트랜드(strand)의 3' 말단에 부착되는 지질 조성물.
  16. 제 1항에 있어서, 상기 차폐 화합물은 pH 감수성 링커 또는 pH 감수성 잔기인 지질 조성물.
  17. 제 16항에 있어서, 상기 pH 감수성 링커 또는 pH 감수성 잔기는 올리고(글루탐산), 올리고페놀레이트 및 디에틸렌 트리아민 펜타 아세트산으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 지질 조성물.
  18. 제 1항에 있어서, R1 및 R2는 각각 독립적으로 라우릴, 미리스틸, 팔미틸 및 올레일으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 지질 조성물.
  19. 제 18항에 있어서, R1은 라우릴이고 또 R2는 미리스틸이거나; 또는 R1은 팔미틸이고 또 R2는 올레일인 지질 조성물.
  20. 제 1항에 있어서, m은 1 또는 2인 지질 조성물.
  21. 제 1항에 있어서, Y- 는 할로게나이드, 아세테이트 및 트리플루오로아세테이트로 이루어지는 군으로부터 선택되는 지질 조성물.
  22. 제 1항에 있어서, 상기 화합물은
    - β-아르기닐-2,3-디아미노 프로피온산-N-팔미틸-N-올레일-아미드 트리히드로클로라이드
    Figure 112013063198656-pct00011
    - β-아르기닐-2,3-디아미노 프로피온산-N-라우릴-N-미리스틸-아미드 트리히드로클로라이드
    Figure 112013063198656-pct00012
    및
    -ε-아르기닐-리신-N-라우릴-N-미리스틸-아미드 트리히드로클로라이드
    Figure 112013063198656-pct00013
    로 이루어지는 군으로부터 선택되는 지질 조성물.
  23. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 약학적 활성 담체를 더 포함하는 지질 조성물.
  24. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 약학적 활성 화합물을 더 포함하는 지질 조성물.
  25. 제 24항에 있어서, 상기 약학적 활성 화합물은 펩티드, 단백질, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드 및 핵산으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 지질 조성물.
  26. 제 24항에 있어서, 상기 약학적 활성 화합물은 항체인 지질 조성물.
  27. 제 24항에 있어서, 상기 약학적 활성 화합물은 DNA, RNA, PNA 및 LNA로 이루어지는 군으로부터 선택되는 핵산인 지질 조성물.
  28. 제 24항에 있어서, 상기 핵산은 기능적 핵산이고, 따라서 상기 기능적 핵산은 RNAi, siRNA, siNA, 안티센스 핵산, 리보자임, 앱타머 및 스피겔머로 이루어지는 군으로부터 선택되는 지질 조성물.
  29. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 제2 헬퍼 지질을 포함하며, 상기 제2 헬퍼 지질은 세라미드인 지질 조성물.
  30. 제 29항에 있어서, 상기 제1 헬퍼 지질 및 제2 헬퍼 지질은 독립적으로 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 및 1,2-디올레일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 지질 조성물.
  31. 제 29항에 있어서, 상기 제1 헬퍼 지질 또는 상기 제2 헬퍼 지질의 함량은 조성물의 전체 지질 함량의 20몰% 내지 80몰%인 지질 조성물.
  32. 제 31항에 있어서, 상기 제1 헬퍼 지질 또는 상기 제2 헬퍼 지질의 함량은 35몰% 내지 65몰%인 지질 조성물.
  33. 제 30항에 있어서, 상기 양이온성 지질 성분은 β-아르기닐-2,3-디아미노 프로피온산-N-팔미틸-N-올레일-아미드트리히드로클로라이드이고, 또한 상기 제1 및 제2 헬퍼 지질은 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민인 지질 조성물.
  34. 제 33항에 있어서, 상기 양이온성 지질 성분은 조성물의 전체 지질 함량의 50몰%이고, 또한 상기 제1 및 제2 헬퍼 지질은 50몰%인 지질 조성물.
  35. 제 24항에 있어서, 적어도 상기 제1 또는 제2 헬퍼 지질은 PEG 잔기, HEG 잔기, 폴리히드록시에틸 녹말 (polyHES) 잔기 및 폴리프로필렌 잔기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 기를 포함하는 지질 조성물.
  36. 제 35항에 있어서, 상기 잔기는 500 내지 10000 Da의 분자량을 제공하는 지질 조성물.
  37. 제 36항에 있어서, 상기 잔기는 2000 내지 5000 Da의 분자량을 제공하는 지질 조성물.
  38. 제 35항에 있어서, PEG 잔기를 포함하는 적어도 상기 제1 또는 제2 헬퍼 지질은 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 및 1,2-디알킬-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 지질 조성물.
  39. 제 38항에 있어서, 상기 PEG 잔기는 2,000 내지 5,000 Da의 분자량을 갖는 지질 조성물.
  40. 제 39항에 있어서, 상기 PEG 잔기는 2,000Da의 분자량을 갖는 지질 조성물.
  41. 제 39항에 있어서, 상기 조성물은 상기 양이온성 지질 성분으로서 β-아르기닐-2,3-디아미노 프로피온산-N-팔미틸-N-올레일-아미드 트리히드로클로라이드; 상기 제1 헬퍼 지질로서 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민; 및 상기 제2 헬퍼 지질로서 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-PEG2000을 포함하는 지질 조성물.
  42. 제 24항에 있어서, 상기 조성물은 제2 헬퍼 지질을 더 포함하며, 상기 제2 헬퍼 지질의 함량은 상기 지질 조성물의 전체 지질 함량의 0.05몰% 내지 4.9몰%인 지질 조성물.
  43. 제 42항에 있어서, 상기 제2 헬퍼 지질의 함량은 상기 지질 조성물의 전체 지질 함량의 1 내지 2 몰%인 지질 조성물.
  44. 제 6항에 있어서, 상기 조성물은 1 내지 10몰%의 PEG와 세라미드의 콘쥬게이트(conjugate)를 함유하는 지질 조성물.
  45. 제 44항에 있어서, 상기 조성물은 1 내지 5몰%의 PEG와 세라미드의 콘쥬게이트(conjugate)를 함유하는 지질 조성물.
  46. 제 44항에 있어서, 상기 세라미드는 C8m 이고 또 PEG는 PEG2000이며, PEG와 세라미드의 콘쥬게이트의 함량은 1 내지 7.5몰%인 지질 조성물.
  47. 제 44항에 있어서, 상기 세라미드는 C8m 이고 또 PEG는 PEG5000이며 PEG 및 세라미드의 콘쥬게이트의 함량은 1 내지 5몰%인 지질 조성물.
  48. 제 42항에 있어서, 상기 양이온성 지질 성분의 함량은 42.5 몰% 내지 50 몰%이고, 상기 제1 헬퍼 지질의 함량은 42.5 내지 50몰%이며, 상기 양이온성 지질 성분, 상기 제1 헬퍼 지질 및 PEG와 세라미드의 콘쥬게이트 함량의 총합이 100몰%인 지질 조성물.
  49. 제 1항에 있어서, RNAi를 더 포함하며, 상기 양이온성 지질에 대한 RNAi의 몰비는 0 초과 0.075 이하인 지질 조성물.
  50. 제 49항에 있어서, 상기 양이온성 지질에 대한 RNAi의 몰비는 0.02 내지 0.05인 지질 조성물.
  51. 제 49항에 있어서, 상기 양이온성 지질에 대한 RNAi의 몰비는 0.037인 지질 조성물.
  52. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 전달제를 포함하는 지질 조성물.
  53. 제 52항에 있어서, 상기 전달제는 약학적 활성 성분을 세포로 전달하는 지질 조성물.
  54. 약학적 활성 화합물을 세포로 또는 막을 통하여 전달하는 생체외 방법(in vitro method)으로서,
    - 세포 또는 막을 제공하는 단계;
    - 제1 항에 따른 조성물로, 약학적 활성 화합물을 포함하는 조성물을 제공하는 단계 및;
    - 제1항에 따른 조성물과 상기 세포 또는 막을 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  55. 제 54항에 있어서, - 세포 중 또는 막을 통과한 약학적 활성 화합물을 검출하는 단계를 더 포함하는 방법.
  56. 제 1항에 따른 지질 조성물; 및 siRNA를 포함하는 리포플렉스.
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