TW202340461A

TW202340461A - 用於純化多核糖核苷酸之組成物和方法

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Publication number: TW202340461A
Application number: TW111149506A
Authority: TW
Inventors: 亞歷姍卓蘇菲德波爾; 尼可拉斯麥卡尼普拉吉斯; 羅傑斯凱薩琳希弗安提斯; 瓦迪姆達德金; 約書亞納森法伯; 艾麗莎莫德琳荷伯特; 白其永
Original assignee: 美商旗艦先鋒創新有限責任公司
Priority date: 2021-12-22
Filing date: 2022-12-22
Publication date: 2023-10-16
Also published as: WO2023122745A1; CA3241061A1

Abstract

本揭露關於用於分離和/或純化多核糖核苷酸之組成物和方法。該多核糖核苷酸可從多核糖核苷酸與寡核苷酸的混合物中分離出來，該寡核苷酸與多核糖核苷酸的靶區域雜交。

Description

用於純化多核糖核苷酸之組成物和方法

多核糖核苷酸可用於多種治療和工程應用。因此，需要用於分離和純化多核糖核苷酸之新型組成物和方法。

在一方面，本揭露之特徵在於從多種多核糖核苷酸中分離線性多核糖核苷酸之方法。多種多核糖核苷酸包括線性多核糖核苷酸和環狀多核糖核苷酸的混合物，該環狀多核糖核苷酸包含編碼多肽的開讀框（ORF）。該方法包括 (a) 提供具有該多種多核糖核苷酸的樣本，其中該多種多核糖核苷酸的子集包括該線性多核糖核苷酸；(b) 將靶區域附接至該線性多核糖核苷酸；以及 (c) 使該樣本與和該靶區域雜交的寡核苷酸接觸。該方法進一步包括 (d) 從該樣本中的多種多核糖核苷酸中分離具有與該寡核苷酸雜交的該靶區域的線性多核糖核苷酸。

在一些實施方式中，寡核苷酸與顆粒（例如，直接地或間接地）軛合。顆粒可為例如磁性珠。在一些實施方式中，寡核苷酸與包括多種顆粒的樹脂軛合。該樹脂可以包括，例如，交聯聚[苯乙烯-二乙烯基苯]、瓊脂糖或SEPHAROSE®瓊脂糖。在一些實施方式中，柱包括樹脂。

在一些實施方式中，將線性多核糖核苷酸分離包括將寡核苷酸固定。

在一些實施方式中，將線性多核糖核苷酸分離包括將未與寡核苷酸雜交的樣本部分收集。例如，該未與寡核苷酸雜交的樣本部分可以包括環狀多核糖核苷酸。

在一些實施方式中，來自純化後環狀多核糖核苷酸的ORF的表現水平相對於來自純化前的ORF的表現水平增加了至少10%。

在另一方面，本揭露之特徵在於從多種多核糖核苷酸中分離線性多核糖核苷酸之方法。多種多核糖核苷酸包括線性多核糖核苷酸和環狀多核糖核苷酸的混合物。該方法包括 (a) 提供具有該多種多核糖核苷酸的樣本，其中該多種多核糖核苷酸的子集包括該線性多核糖核苷酸；(b) 將靶區域附接至該線性多核糖核苷酸；以及 (c) 使該樣本與包括具有與和靶區域雜交的寡核苷酸軛合的多種顆粒的樹脂的柱接觸。該方法進一步包括 (d) 從該樣本中的多種多核糖核苷酸中收集包括未與該寡核苷酸雜交的樣本部分的洗脫液。

在一些實施方式中，未與該寡核苷酸雜交的樣本部分包括環狀多核糖核苷酸。

在一些實施方式中，該樹脂包括交聯聚[苯乙烯-二乙烯基苯]、瓊脂糖、或SEPHAROSE®瓊脂糖。

在以上任何方面的一些實施方式中，該方法在步驟 (a) 前包括從線性先質中將環狀多核糖核苷酸環化的步驟。例如，該線性先質可以包括5’自剪接內含子片段和3’自剪接內含子片段，並且該環狀多核糖核苷酸係藉由該線性先質的自剪接產生的。5’自剪接內含子片段和3’自剪接內含子片段可以各自是，例如，I型或II型自剪接內含子片段。

在另一方面，本揭露之特徵在於從多種多核糖核苷酸中分離線性多核糖核苷酸之方法。多種多核糖核苷酸包括線性多核糖核苷酸和環狀多核糖核苷酸的混合物。該方法包括 (a) 將線性先質環化以形成該環狀多核糖核苷酸；(b) 提供包括多種多核糖核苷酸的樣本，其中該多種多核糖核苷酸的子集包括該線性多核糖核苷酸；(c) 將靶區域附接至該線性多核糖核苷酸；以及 (d) 使該樣本與和該靶區域雜交的寡核苷酸接觸。該方法進一步包括 (e) 從該樣本中的多種多核糖核苷酸中分離具有與該寡核苷酸雜交的該靶區域的線性多核糖核苷酸。

在一些實施方式中，將環狀多核糖核苷酸環化係藉由線性先質的夾板連接產生的。

在一些實施方式中，該線性先質包括5’自剪接內含子片段和3’自剪接內含子片段，並且該環狀多核糖核苷酸係藉由該線性先質的自剪接產生的。

在一些實施方式中，5’自剪接內含子片段和3’自剪接內含子片段各自是I型或II型自剪接內含子片段。

在以上任何方面的一些實施方式中，該環狀多核糖核苷酸包括ORF。ORF可以編碼，例如，多肽。

在以上任何方面的一些實施方式中，該環狀多核糖核苷酸包括內部核糖體進入位址（IRES）。ORF可以與IRES可操作地連接。

在一些實施方式中，該方法包括將靶區域附接至該線性多核糖核苷酸的3’或5’端。例如，該方法可以包括將靶區域附接至該線性多核糖核苷酸的3’端。該附接步驟可以包括將該線性多核糖核苷酸的3’端聚腺苷酸化。聚腺苷酸化可以包括提供聚A聚合酶，例如，大腸桿菌（ E. coli）聚A聚合酶。在另一實施方式中，該附接步驟包括將靶區域連接至該線性多核糖核苷酸的3’端。

在一些實施方式中，步驟 (a) 的線性多核糖核苷酸包含靶區域（例如，在將步驟 (b) 中的靶區域附接前）。因此，此類實施方式提供了另外的純化方法，其中靶區域的第一拷貝在步驟 (b) 前存在於該線性多核糖核苷酸，並且將靶區域的第二拷貝在步驟 (b) 期間附接至該線性多核糖核苷酸。存在於步驟 (a) 的線性多核糖核苷酸的靶區域與附接至步驟 (b) 的線性多核糖核苷酸的靶區域可為相同的或不同的（例如，在序列和長度上）。在一些實施方式中，該線性先質包括在以下5’至3’順序中可操作地連接：靶區域、第一環化元件（例如，第一自剪接內含子片段）、多核糖核苷酸負載物（例如，視需要地包括間隔子、IRES、和開讀框中之一或多種）、和第二環化元件（例如，第二自剪接內含子片段）。

在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸不包括聚A序列（例如，至少10個，例如，至少11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、或25個，例如，至少15個、至少20個、至少25個或至少30個連續腺苷核苷酸的聚A序列）。

在一些實施方式中，靶區域包括聚A序列（例如，至少10個連續腺苷核苷酸的聚A序列）。

在一些實施方式中，與靶區域結合的寡核苷酸包括聚U或聚dT序列。聚U或聚dT序列可以包括至少10個（例如，至少11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、或25個，例如，至少15個、至少20個、至少25個或至少30個）尿苷或胸苷殘基。在一些實施方式中，聚dT包括 (dT) ₂₅。

在一些實施方式中，寡核苷酸與顆粒軛合。顆粒可為例如磁性珠。在一些實施方式中，寡核苷酸與包括多種顆粒的樹脂軛合。該樹脂可以包括，例如，交聯聚[苯乙烯-二乙烯基苯]、瓊脂糖、或SEPHAROSE®瓊脂糖。在一些實施方式中，柱包括樹脂。

在以上任何方面的一些實施方式中，該方法進一步包括將具有與該寡核苷酸雜交的該靶區域的線性多核糖核苷酸洗滌一次或多次。

在以上任何方面的一些實施方式中，該方法進一步包括從寡核苷酸中將具有該靶區域的線性多核糖核苷酸洗脫。

在一些實施方式中，該方法包括提供多種寡核苷酸，其中每種寡核苷酸都與不同的靶區域雜交。

在一些實施方式中，寡核苷酸的長度為至少5個核苷酸（例如，至少6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、70個、75個、80個、85個、90個、95個、100個或更多個核苷酸）。在一些實施方式中，寡核苷酸的長度為，例如5-100個、5-95個、10-90個、10-80個、12-60個、15-50個、15-40個、15-30個、18-30個、20-25個或20-22個核苷酸。在一些實施方式中，寡核苷酸的長度為23個核苷酸。在一些實施方式中，寡核苷酸與靶區域的等長部分具有至少80%（例如，至少85%、90%、95%、97%、99%或100%）互補性。

在一些實施方式中，該方法包括提供與具有該靶區域的線性多核糖核苷酸的莫耳比為10 : 1至1 : 10的寡核苷酸。

在以上任何方面的一些實施方式中，該方法分離至少500 µg（例如，至少600 µg、700 µg、800 µg、900 µg、1 mg、2 mg、3 mg、4 mg、5 mg、6 mg、7 mg、8 mg、9 mg、10 mg、20 mg、30 mg、40 mg、50 mg、60mg、70 mg、80 mg、90 mg、100 mg、200 mg、300 mg、400 mg、500 mg、600 mg、700 mg、800 mg、900 mg、1,000 mg或更多）的具有該靶區域的線性多核糖核苷酸。在一些實施方式中，該方法分離500 µg至1,000 mg的包括該靶區域的線性多核糖核苷酸。

在另一方面，本揭露之特徵在於藉由本文所述之（例如，任何方面的）方法產生的多核糖核苷酸群體。

在一些實施方式中，該群體包括缺乏靶區域的環狀多核糖核苷酸，並且該環狀多核糖核苷酸包括組成物中總多核糖核苷酸的至少40%（例如，至少50%、60%、70%、80%、855、90%、95%、97%、99%或100%）（mol/mol）。

在一些實施方式中，該群體包括組成物中總多核糖核苷酸的小於40%（例如，小於35%、30%、25%、20%、15%、10%、5%、4%、3%、2%或1%）（mol/mol）的線性多核糖核苷酸。

在一些實施方式中，在多核糖核苷酸群體中的多核糖核苷酸的總重量係至少500 µg（例如，至少600 µg、700 µg、800 µg、900 µg、1 mg、2 mg、3 mg、4 mg、5 mg、6 mg、7 mg、8 mg、9 mg、10 mg、20 mg、30 mg、40 mg、50 mg、60mg、70 mg、80 mg、90 mg、100 mg、200 mg、300 mg、400 mg、500 mg、600 mg、700 mg、800 mg、900 mg、1,000 mg或更多）。在一些實施方式中，在多核糖核苷酸群體中的多核糖核苷酸的總重量係500 µg至1000 mg。

在另一方面，本揭露之特徵在於包括上文任何實施方式的（例如，藉由本文所述之方法產生的）多核糖核苷酸群體以及稀釋劑、載劑、或賦形劑的藥物組成物。定義

為了促進對本揭露之理解，下面定義了多個術語。本文定義的術語具有如與本揭露相關的領域中的普通技術者通常理解的含義。術語例如「一個/種（a、an）」和「該」並不旨在僅指單個實體，而是包括可以使用特定實例來說明的一般類別。術語「或」用於意指「和/或」，除非明確指出僅指替代物或者替代物相互排斥，儘管本揭露支持僅指替代物以及「和/或」的定義。本文的術語用於描述特定實施方式，但它們的使用不應被視為限制，除非在申請專利範圍中列出。

如本文所用，在值的範圍內提供的任何值都包括上限和下限、以及該上限和下限內含有的任何值。

如本文所用，術語「約」係指列舉值的 ± 10%內的值。

如本文所用，術語「佐劑」係指增加免疫響應，例如增加針對免疫原的特異性免疫響應的組成物（例如化合物、多肽、核酸或脂質）。增加免疫響應包括強化或擴大抗體和細胞免疫響應中之任一者或兩者的特異性。

如本文所用，術語「載劑」係藉由對環狀多核糖核苷酸的共價修飾、經由部分或完全封裝劑或者它們的組合促進組成物（例如，環狀多核糖核苷酸）轉運或遞送到細胞中的化合物、組成物、試劑或分子。載劑的非限制性實例包括碳水化合物載劑（例如，酸酐修飾的植物糖原或糖原型材料）、奈米顆粒（例如，封裝或共價連接/結合到環狀多核糖核苷酸的奈米顆粒）、脂質體、融合體、離體分化的網狀紅血球、胞泌體、蛋白質載劑（例如，共價連接到環狀多核糖核苷酸的蛋白質）或陽離子載劑（例如，陽離子脂質聚合物或轉染試劑）。

如本文所用，術語「環狀多核糖核苷酸」、「環狀RNA」和「circRNA」可互換使用，並且意指具有無游離端（即，無游離3'或5'端）的結構的多核糖核苷酸分子，例如藉由共價或非共價鍵形成環狀或無端結構的多核糖核苷酸分子。環狀多核糖核苷酸可為例如共價閉合的多核糖核苷酸。

術語「稀釋劑」意指包含非活性溶劑的媒介物，本文所述之組成物（例如，包含環狀多核糖核苷酸之組成物）可以稀釋或溶解在其中。稀釋劑可為RNA助溶劑、緩衝液、等滲劑或其混合物。稀釋劑可為液體稀釋劑或固體稀釋劑。液體稀釋劑的非限制性實例包括水或其他溶劑、助溶劑和乳化劑（諸如乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲醯胺、油類（尤其是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄欖油、蓖麻油和芝麻油）、甘油、四氫糠醇、聚乙二醇和山梨糖醇酐的脂肪酸酯以及1,3-丁二醇）。固體稀釋劑的非限制性實例包括碳酸鈣、碳酸鈉、磷酸鈣、磷酸二鈣、硫酸鈣、磷酸氫鈣、磷酸鈉乳糖、蔗糖、纖維素、微晶纖維素、高嶺土、甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇、氯化鈉、乾澱粉、玉米澱粉或糖粉。

如本文所用，術語「疾病」、「病症」和「病狀」各自指亞健康狀態，例如，通常被或將會被醫療專業人員診斷或治療的狀態。

如本文所用，術語「表現序列」係編碼產物，例如肽或多肽的核酸序列。編碼肽或多肽的示例性表現序列可以包括多個核苷酸三聯體，其中每一個都可以編碼胺基酸，並被稱為「密碼子」。

如本文所用，術語「GC含量」係指核酸序列中鳥嘌呤（G）和胞嘧啶（C）的百分比。用於計算GC含量的公式為 (G+C)/(A+G+C+U) × 100%（對於RNA）或 (G+C)/(A+G+C+T) × 100%（對於DNA）。同樣地，術語「尿苷含量」係指核酸序列中尿苷（U）的百分比。用於計算尿苷含量的公式為U/(A+G+C+U) × 100%。同樣地，術語「胸苷含量」係指核酸序列中胸苷（T）的百分比。用於計算胸苷含量的公式為T/(A+G+C+T) × 100%。

「異源」意指發生在與天然存在的（天然的）背景不同的背景中。「異源」多核苷酸序列指示多核苷酸序列以在該序列的天然基因組中發現的方式不同的方式使用。例如，「異源啟動子」用於驅動序列的轉錄，該序列不是由該啟動子天然轉錄的序列；因此，「異源啟動子」序列通常藉由重組核酸技術包括在表現構建體中。術語「異源」也用於指被置於與另一序列的非天然存在的關係中的給定序列；例如，異源編碼或非編碼核苷酸序列通常藉由基因組轉化技術被插入基因組中，產生經基因修飾的基因組或重組基因組。

如本文所用，術語「內含子片段」係指內含子的部分，其中第一內含子片段和第二內含子片段一起形成內含子，例如催化內含子。內含子片段可為內含子的5’部分（例如，催化內含子的5’部分）或內含子的3’部分（例如，催化內含子的3’部分），這樣5’內含子片段和3’內含子片段一起形成功能性內含子，例如能夠催化自剪接的功能性內含子。術語內含子片段意指內含子分成的兩個部分。術語內含子片段並非意在指出、暗示或表明這兩個部分或兩半長度相等。術語內含子片段與術語斷裂內含子同義使用，並且可以代替術語「半內含子」使用。

如本文所用，術語「雜質」係存在於組成物中，例如如本文所述之藥物組成物中的不需要的物質。在一些實施方式中，雜質係與製程有關的雜質。在一些實施方式中，雜質係最終組成物中除期望產物之外，例如除如本文所述之活性藥物成分（例如，環狀多核糖核苷酸）之外的產品相關物質。如本文所用，術語「與製程有關的雜質」係在最終的組成物、製劑或產物中，除本文所述之線性多核糖核苷酸以外，在組成物、製劑或產物的製造中使用、存在或生成的不需要的物質。在一些實施方式中，與製程有關的雜質係在多核糖核苷酸之合成或環化中使用的酶。如本文所用，術語「與產物有關的物質」係在組成物、製劑或產物或其任何中間體的合成過程中產生的物質或副產物。在一些實施方式中，與產物有關的物質係去氧核糖核苷酸片段。在一些實施方式中，與產物有關的物質係去氧核糖核苷酸單體。在一些實施方式中，與產物有關的物質係以下的一或多種：本文所述之多核糖核苷酸的衍生物或片段，例如10、9、8、7、6、5或4個核糖核酸、單核糖核酸、二核糖核酸或三核糖核酸的片段。

如本文所用，「增加受試者的適應度」或「促進受試者的適應度」係指由於投與本文所述之肽或多肽而產生的生理學上或受試生物進行的任何活動的任何有利的改變，包括但不限於以下希望效果中之任何一或多種：(1) 對生物或非生物脅迫的耐受性提高；(2) 產率或生物量提高；(3) 開花時間調整；(4) 對有害生物或病原體的抗性提高；(4) 對除草劑的抗性提高；(5) 受試生物群體（例如，農業上重要的昆蟲）增加；(6) 受試生物（例如昆蟲，例如蜂或蠶）的繁殖速率提高；(7) 受試生物（例如昆蟲，例如蜂或蠶）的活動能力增強；(8) 受試生物（例如昆蟲，例如蜂或蠶）的體重增加；(9) 受試生物（例如昆蟲，例如蜂或蠶）的代謝速率或活性提高；(10) 授粉（例如，被授粉植物的數量）增加；(11) 受試生物（例如昆蟲，例如蜂或蠶）副產物（例如，來自蜜蜂的蜂蜜或來自蠶的蠶絲）的產量提高；(12) 受試生物（例如，昆蟲）的營養物（例如，蛋白質、脂肪酸或胺基酸）含量提高；(13) 受試生物對殺有害生物劑（例如，新煙鹼（例如，吡蟲啉）或有機磷殺蟲劑（例如硫代磷酸酯，例如殺螟松））的抗性提高；或 (14) 受試生物（例如，人或非人動物）的健康狀況改善或疾病減少。相比於未投與調節劑的受試生物，可以確定宿主適應度的提高。

相反地，「降低受試者的適應度」係指由於投與本文所述之肽或多肽而產生的生理學的或受試生物進行的任何活動的任何不利的改變，包括但不限於以下預期效果中之任何一或多種：(1) 對生物或非生物脅迫的耐受性降低；(2) 產率或生物量降低；(3) 開花時間調整；(4) 對有害生物或病原體的抗性降低；(4) 對除草劑的抗性降低；(5) 受試生物群體（例如，農業上重要的昆蟲）減少；(6) 受試生物（例如昆蟲，例如蜂或蠶）的繁殖速率降低；(7) 受試生物（例如昆蟲，例如蜂或蠶）的活動能力減弱；(8) 受試生物（例如昆蟲，例如蜂或蠶）的體重減輕；(9) 受試生物（例如昆蟲，例如蜂或蠶）的代謝速率或活性降低；(10) 藉由受試生物（例如昆蟲，例如蜂或蠶）進行的授粉（例如，在給定時間內被授粉的植物數量）減少；(11) 受試生物（例如昆蟲，例如蜂或蠶）副產物（例如，來自蜜蜂的蜂蜜或來自蠶的蠶絲）的產量降低；(12) 受試生物（例如，昆蟲）的營養物（例如，蛋白質、脂肪酸或胺基酸）含量降低；(13) 受試生物對殺有害生物劑（例如，新煙鹼（例如，吡蟲啉）或有機磷殺蟲劑（例如硫代磷酸酯，例如殺螟松））的抗性降低；或 (14) 受試生物（例如，人或非人動物）的健康狀況下降或疾病減少。相比於未投與調節劑的受試生物，可以確定宿主適應度的降低。對熟悉該項技術者而言將顯而易見的是，受試者的生理學、表現型、或活性的某些變化（例如，植物開花時間的調整）可以被認為提高該受試者的適應度或降低該受試者的適應度，這取決於背景（例如，以適應氣候或其他環境條件的變化）。例如，開花時間的延遲（例如，在給定日曆日期開花的群體中的植物減少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%、100%）可為對較晚或較涼的春季的有益適應，並因此被認為會提高植物的適應度；相反，在較早或較暖的春季背景下，相同的開花時間的延遲可以被認為會降低植物的適應度。

如本文中可互換使用的，術語「線性對應物」或「線性先質」係指具有與環狀多核糖核苷酸相同或相似的核苷酸序列（例如，100%、95%、90%、85%、80%、75%或之間的任何百分比的序列同一性）並且具有兩個游離末端（即，環狀多核糖核苷酸的未環化形式（及其片段））的多核糖核苷酸分子（及其片段）。在一些實施方式中，線性對應物（例如，環化前形式）係具有與環狀多核糖核苷酸相同或相似的核苷酸序列（例如，100%、95%、90%、85%、80%、75%或之間的任何百分比的序列相似性）和相同或相似的核酸修飾並且具有兩個游離末端（即，環狀多核糖核苷酸的未環化形式（及其片段））的多核糖核苷酸分子（及其片段）。在一些實施方式中，線性對應物係具有與環狀多核糖核苷酸相同或相似的核苷酸序列（例如，100%、95%、90%、85%、80%、75%或之間的任何百分比的序列同一性）和不同的核酸修飾或沒有核酸修飾並且具有兩個游離末端（即，環狀多核糖核苷酸的未環化形式（及其片段））的多核糖核苷酸分子（及其片段）。在一些實施方式中，作為線性對應物的多核糖核苷酸分子的片段係線性對應物多核糖核苷酸分子的比該線性對應物多核糖核苷酸分子短的任何部分。在一些實施方式中，線性對應物進一步包括5’帽。在一些實施方式中，線性對應物進一步包括聚腺苷尾。在一些實施方式中，線性對應物進一步包括3’ UTR。在一些實施方式中，線性對應物進一步包括5’ UTR。

如本文所用，術語「線性RNA」、「線性多核糖核苷酸」和「線性多核糖核苷酸分子」可互換使用並且意指具有5'末端和3’末端的多核糖核苷酸分子。5'末端和3’末端中之一或兩個可為游離末端或者可以與另一部分連接。線性RNA包括尚未經歷環化（例如，環化前）的RNA，並且可以用作起始材料藉由例如夾板連接或化學、酶促、核酶或剪接催化的環化方法進行環化。

如本文所用，術語「經修飾的寡核苷酸」意指含有具有針對糖、核鹼基或核苷酸間鍵的至少一種修飾的核苷酸的寡核苷酸。

如本文所用，術語「經修飾的核糖核苷酸」意指含有具有針對糖、核鹼基或核苷間鍵的至少一種修飾的核苷的核糖核苷酸。

如本文所用，術語「裸遞送」係用於遞送到細胞而無需載劑的幫助且無需對有助於遞送到細胞的部分的共價修飾的配製物。裸遞送配製物不含任何轉染試劑、陽離子載劑、碳水化合物載劑、奈米顆粒載劑或蛋白質載劑。例如，環狀多核糖核苷酸的裸遞送配製物係包括沒有共價修飾的環狀多核糖核苷酸並且不含載劑的配製物。

如本文所用，術語「帶切口的RNA」和「帶切口的線性多核糖核苷酸」和「帶切口的線性多核糖核苷酸分子」可以互換使用並且意指由於環狀RNA切口或降解而產生的具有5’末端和3’末端的多核糖核苷酸分子。「帶切口的環狀RNA」意指被切口的環狀RNA。

如本文所用，術語「非環狀RNA」意指總的帶切口的RNA和線性RNA。

如本文所用，術語「視需要地取代的X」旨在等同於「X，其中X被視需要地取代」（例如「烷基，其中所述烷基被視需要地取代」）。並不旨在意指特徵「X」（例如，烷基）本身係視需要的。如本文所用，術語「視需要地取代的」係指具有0個、1個或更多個取代基（例如，0-25個、0-20個、0-10個或0-5個取代基）。例如，C ₁烷基基團（即，甲基）可以被側氧基取代而形成甲醯基並且進一步被-OH或-NH ₂取代而形成羧基或醯胺基。

術語「藥物組成物」旨在還揭露包括在藥物組成物中的環狀多核糖核苷酸可用於藉由療法治療人體或動物體。因此，這意味著等同於「用於在療法中使用的環狀多核糖核苷酸」。

如本文所用，術語「多核苷酸」意指包括一或多個核酸亞基或核苷酸的分子，並且可以與「核酸」或「寡核苷酸」互換使用。多核苷酸可以包括一或多個選自腺苷（A）、胞嘧啶（C）、鳥嘌呤（G）、胸腺嘧啶（T）和尿嘧啶（U）或其變體的核苷酸。核苷酸可以包括核苷和至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個磷酸（PO ₃）基團。核苷酸可以包括核鹼基、五碳糖（核糖或去氧核糖）以及一或多個磷酸基團。核糖核苷酸係其中糖為核糖的核苷酸。多核糖核苷酸、核糖核酸或RNA可以指包括經由磷酸二酯鍵聚合的多個核糖核苷酸的大分子。去氧核糖核苷酸係其中糖係去氧核糖的核苷酸。

多去氧核糖核苷酸、去氧核糖核酸和DNA意指包括經由磷酸二酯鍵聚合的多個去氧核糖核苷酸的大分子。核苷酸可為核苷一磷酸或核苷多磷酸。核苷酸意指包括可檢測標籤（如發光標籤）或標誌物（例如，螢光團）的去氧核糖核苷多磷酸，如例如去氧核糖核苷三磷酸（dNTP），其可以選自去氧腺苷三磷酸（dATP）、去氧胞苷三磷酸（dCTP）、去氧鳥苷三磷酸（dGTP）、尿苷三磷酸（dUTP）和去氧胸苷三磷酸（dTTP）dNTP。核苷酸可以包括可以摻入正在生長的核酸鏈中之任何亞基。此類亞基可為A、C、G、T或U，或對一或多個互補A、C、G、T或U有特異性或與嘌呤（即，A或G或其變體）或嘧啶（即C、T或U或其變體）互補的任何其他亞基。在一些實例中，多核苷酸係去氧核糖核酸（DNA）、核糖核酸（RNA）或其衍生物或變體。在一些情況下，僅舉數例，多核苷酸係短干擾RNA（siRNA）、微小RNA（miRNA）、質體DNA（pDNA）、短髮夾RNA（shRNA）、小核RNA（snRNA）、傳訊者RNA（mRNA）、先質mRNA（pre-mRNA）、反義RNA（asRNA），並且涵蓋核苷酸序列及其任何結構實施方式，如單股、雙股、三股、螺旋、髮夾等。在一些情況下，多核苷酸分子係環狀的。多核苷酸可以具有各種長度。核酸分子可以具有至少約10個鹼基、20個鹼基、30個鹼基、40個鹼基、50個鹼基、100個鹼基、200個鹼基、300個鹼基、400個鹼基、500個鹼基、1千鹼基（kb）、2 kb、3 kb、4 kb、5 kb、10 kb、50 kb或更大的長度。可以從細胞或組織中分離多核苷酸。多核苷酸的實施方式包括分離和純化的DNA/RNA分子、合成的DNA/RNA分子以及合成的DNA/RNA類似物。

多核苷酸（例如，多核糖核苷酸或多去氧核糖核苷酸）的實施方式包括含有一或多個核苷酸變體（包括非標準核苷酸、非天然核苷酸、核苷酸類似物或修飾的核苷酸）的多核苷酸。經修飾的核苷酸的實例包括但不限於二胺基嘌呤、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、4-乙醯胞嘧啶、5-(羧基羥甲基)尿嘧啶、5-羧甲基胺基甲基-2-硫代尿苷、5-羧甲基胺基甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、β-D-半乳糖基辨苷（galactosylqueosine）、肌苷、N6-異戊烯腺嘌呤、1-甲基鳥嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鳥嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲基胺基甲基尿嘧啶、5-甲氧基胺基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基辮苷（mannosylqueosine）、5'-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-D46-異戊烯腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸（v）、懷丁苷（butoxosine）、假尿嘧啶、辮苷（queosine）、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸（v）、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-胺基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶、(acp3)w、2,6-二胺基嘌呤等。在一些情況下，核苷酸在其磷酸部分中包括修飾，這包括對三磷酸部分的修飾。此類修飾的非限制性實例包括長度更長的磷酸酯鏈（例如，具有4、5、6、7、8、9、10個或更多個磷酸酯部分的磷酸酯鏈）和帶有硫醇部分（例如，α-硫代三磷酸酯和β-硫代三磷酸酯）的修飾。在一些實施方式中，核酸分子在鹼基部分（例如，在典型地可用於與互補核苷酸形成氫鍵的一或多個原子處和/或在典型地不能與互補核苷酸形成氫鍵的一或多個原子處）、糖部分或磷酸骨架處被修飾。核酸分子還可含有胺修飾的基團，如胺基烯丙基1-dUTP（aa-dUTP）和胺基己基丙烯醯胺-dCTP（aha-dCTP），以允許胺反應性部分（如N-羥基琥珀醯亞胺酯（NHS））的共價附接。本揭露之寡核苷酸中標準DNA鹼基對或RNA鹼基對的替代物可以提供更高的密度（以位/立方毫米計）、更高的安全性（抗天然毒素的偶然或有目的合成）、更容易辨別光程式性聚合酶（photo-programmed polymerase）或較低的二級結構。與用於從頭或擴增合成的天然和突變聚合酶相容的此類替代性鹼基對在Betz K, Malyshev DA, Lavergne T, Welte W, Diederichs K, Dwyer TJ, Ordoukhanian P, Romesberg FE, Marx A. Nat. Chem. Biol. [自然化學生物學] 2012;8(7):612-4中描述，其藉由援引併入本文用於所有目的。

如本文所用，本文的術語「多核糖核苷酸負載物」包括包含至少一個多核糖核苷酸的任何序列。在實施方式中，多核糖核苷酸負載物包括一或多個表現（或編碼）序列，其中每個表現（或編碼）序列編碼多肽。在實施方式中，多核糖核苷酸負載物包括一或多個表現序列，其中每個表現序列編碼多肽。在實施方式中，多核糖核苷酸負載物包括一或多個非編碼序列，如具有調節或催化功能的多核糖核苷酸。在實施方式中，多核糖核苷酸負載物包括表現序列和非編碼序列的組合。在實施方式中，多核糖核苷酸負載物包括本文所述之一或多個多核糖核苷酸序列，諸如一或多個調節元件、內部核糖體進入位址（IRES）元件或間隔子序列。

如本文中可互換使用的，術語「聚A」和「聚A序列」係指至少5個核苷酸長並由腺苷殘基組成的核酸分子的非翻譯連續區域。在一些實施方式中，聚A序列的長度為至少10個、至少15個、至少20個、至少30個、至少40個或至少50個核苷酸。在一些實施方式中，聚A序列位於開讀框（例如編碼多肽的開讀框）的3'（例如下游），並且聚A序列位於終止元件（例如終止密碼子）的3'，使得聚A不被翻譯。在一些實施方式中，聚A序列位於終止元件的3’並且係3’非翻譯區。

如本文所用，如果核酸的元件位於載體上，使得它們可以被轉錄而形成線性多核糖核苷酸，然後可以使用本文提供的方法將該線性多核糖核苷酸環化成環狀多核糖核苷酸，則該等元件係「可操作地相連的（operably connected）」或「可操作地連接的（operably linked）」。

如本文所用，「多肽」意指最常藉由肽鍵連接在一起的胺基酸殘基（天然或非天然的）的聚合物。如本文所用，該術語係指任何大小、結構或功能的蛋白質、多肽和肽。多肽可以包括基因產物、天然存在的多肽、合成多肽、同系物、異種同源物、同種同源物、前述物質的片段和其他等同物、變體和類似物。多肽可為單分子或多分子複合物，如二聚物、三聚物或四聚物。它們還可以包括單鏈或多鏈多肽（如抗體或胰島素），並且可為締合的或連接的。最常見的二硫鍵存在於多鏈多肽中。術語多肽也可以適用於胺基酸聚合物，其中一或多個胺基酸殘基係相應的天然存在的胺基酸的人工化學類似物。

如本文所用，術語「植物修飾多肽」係指可以以使得植物生理學或表現型發生變化（例如，植物適應度增加或降低）的方式改變植物的遺傳特性（例如，增加基因表現、降低基因表現或者以其他方式改變DNA或RNA的核苷酸序列）、表觀遺傳特性或者生物化學或生理學特性的多肽。

如本文所用，術語「純化（purify、purifying和purification）」係指從含有環狀RNA和線性RNA以及其他物質的混合物的樣本中去除雜質（例如，製程相關雜質（例如，酶）、製程相關物質（例如，去氧核糖核苷酸片段、去氧核糖核苷酸單體））或副產物（例如，線性RNA）的一或多個步驟或過程，以產生含有增濃的環狀RNA群體之組成物，其中與原始混合物相比，雜質（例如製程相關雜質（例如，酶）、製程相關物質（例如，去氧核糖核苷酸片段、去氧核糖核苷酸單體））或副產物（例如，線性RNA）的水平降低，或相對於起始混合物，線性RNA或物質減少了按質量計的40%或更多（例如，50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、97%、或99%或更多）。

如本文所用，術語「純的」和「純度」係指分析物（例如，環狀RNA）被分離出並且不含其他組分的程度。在核酸（例如，多核糖核苷酸）的背景下，分離的核酸（例如，環狀RNA）的純度可以用不含任何污染物、雜質或副產物（例如，線性RNA和其他物質）的核酸群體來表示。例如，環狀RNA群體的純度表示按分離材料的總質量計，該群體中有多少係環狀RNA，可以使用例如純的環狀RNA作為參考進行確定。本揭露中發現的純度水平可以為5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、大於95%或大於99%（w/w）。在一些實施方式中，污染物或雜質或副產物的水平不超過約20%、15%、12%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%（w/w）。純度可以藉由以下方式確定：使用凝膠電泳、分光光度法（例如，賽默飛世爾科技公司（ThermoFisher Scientific）的NanoDrop）或適用於測量核酸群體的純度的其他技術檢測特定分析物（例如，環狀RNA）或特定雜質或副產物（例如，線性RNA）的水平，並計算分析物相對於總核酸含量（例如，如藉由本領域已知的測定確定的）的百分比（w/w）。

如本文所用，短語「基本上不含一或多種雜質或副產物」係指樣本（例如含有增濃的環狀RNA群體的樣本）不含一或多種雜質或副產物（例如，本文揭露的一或多種雜質或副產物）或含有最少量的一或多種雜質或副產物的特性。最少量的一或多種雜質或副產物可能不超過20%（w/w）（例如，不超過19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%（w/w）或更少）。在另一實例中，如果一或多種雜質或副產物以小於15%（w/w）（例如，不超過14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%（w/w）或更少）的量存在，則樣本或增濃的環狀RNA群體基本上不含該一或多種雜質或副產物。在另一實例中，如果一或多種雜質或副產物以小於10%（w/w）（例如，不超過9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%（w/w）或更少）的量存在，則樣本或增濃的環狀RNA群體基本上不含該一或多種雜質或副產物。在另一實例中，如果一或多種雜質或副產物以小於5%（w/w）（例如，不超過4%、3%、2%、1%（w/w）或更少）的量存在，則樣本或增濃的環狀RNA群體基本上不含該一或多種雜質或副產物。在又另一實例中，如果一或多種雜質或副產物以小於1%（不超過0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%（w/w）或更少）的量存在，則樣本或增濃的環狀RNA群體基本上不含該一或多種雜質或副產物。

如本文所用，「調節元件」係修飾環狀或線性多核糖核苷酸內表現序列的表現的部分，例如核酸序列。

如本文所用，術語「複製元件」係可用於複製或者起始環狀多核糖核苷酸轉錄的序列和/或模體。

如本文所用，「間隔子」係指在兩個相鄰多核苷酸區域之間提供距離或柔性的任何連續核苷酸序列（例如，一或多個核苷酸的連續核苷酸序列）。

如本文所用，術語「序列同一性」係藉由使用全域或局部比對演算法對兩個肽或兩個核苷酸序列進行比對來確定的。當序列在最佳比對時（例如，當藉由程式（如GAP或BESTFIT）使用默認參數進行比對時）共用至少某個最小百分比的序列同一性時，該等序列被稱為「基本上相同的」或「基本上相似的」。GAP使用Needleman和Wunsch全域比對演算法在兩個序列的整個長度上對其進行比對，從而最大程度地增加了匹配數目並最大程度地減少了空位數目。通常，使用GAP默認參數，空位產生罰分 = 50（核苷酸）/8（蛋白質），空位延伸罰分 = 3（核苷酸）/2（蛋白質）。對於核苷酸，使用的默認評分矩陣係nwsgapdna，而對於蛋白質，默認評分矩陣係Blosum62（Henikoff和Henikoff, 1992, PNAS [美國科學院院報] 89, 915-919）。序列比對和百分比序列同一性的評分例如使用電腦程式來確定，該等電腦程式如從美國92121-3752加州聖地牙哥斯克蘭頓路9685號的阿賽樂德公司（Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, CA 92121-3752 USA）獲得的GCG Wisconsin套裝軟體10.3版或EmbossWin 2.10.0版（使用程式「needle」）。替代性地或額外地，藉由例如使用如FASTA、BLAST等的演算法對數據庫進行搜索來確定同一性百分比。序列同一性係指在序列的整個長度上的序列同一性。

「訊息序列」係指長度例如介於10至45個胺基酸之間的多肽序列，其存在於初生蛋白質的多肽序列的N端，將多肽序列靶向分泌途徑。

如本文所用，「終止元件」係終止環狀或線性多核糖核苷酸中表現序列的翻譯的部分，例如核酸序列。

如本文所用，術語「總核糖核苷酸分子」意指藉由核糖核苷酸分子的總質量所測量的任何核糖核苷酸分子的總量，包括線性多核糖核苷酸分子、環狀多核糖核苷酸分子、單體核糖核苷酸、其他多核糖核苷酸分子、其片段及其經修飾的變體。

如本文所用，術語「翻譯起始序列」係在環狀多核糖核苷酸中起始表現序列的翻譯的核酸序列。

如本文所用，術語「產率」係指純化步驟或製程後獲得的分析物（例如，環狀多核糖核苷酸的群體）與起始材料（例如，多核糖核苷酸的混合群體，如例如，環狀和線性多核糖核苷酸）中分析物的量相比的相對量（w/w）。產率可以表示為百分比。在本揭露之背景下，可以使用測定（例如，凝膠電泳或分光光度法）對起始材料中分析物（例如，環狀多核糖核苷酸）和純化步驟後獲得的分析物的量進行測量。可以使用本揭露之方法產生相對於起始材料（例如，多核糖核苷酸的混合群體）中存在的量約20%（w/w）或更高的環狀多核糖核苷酸增濃群體的產率。例如，可以使用該等方法產生以下產率的純化的環狀多核糖核苷酸：約25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、65%、70%、75%、80%、85%、或90%（w/w）或更高。

本發明的其他特徵和優點從以下詳細說明、附圖、和申請專利範圍將是顯而易見的。

本揭露描述了用於加工（例如，純化）多核糖核苷酸之組成物和方法。多核糖核苷酸（例如線性或環狀多核糖核苷酸）可用於多種工程或治療目的。然而，當經由某些生物反應生成多核糖核苷酸時，可能存在多種雜質、副產物或不完全產物。本發明的特徵在於可用於從樣本中減少或去除該等雜質、副產物或不完全產物的方法，以便產生具有希望的多核糖核苷酸組成、量和/或純度的組成物，或含有多種具有希望的多核糖核苷酸組成、量和/或純度的多核糖核苷酸的群體。

在某些實施方式中，該等方法可用於純化已經經歷剪接反應的多核糖核苷酸。在這種實施方式中，該等方法可用於將剪接的多核糖核苷酸與非剪接的多核糖核苷酸分離，或將非剪接的多核糖核苷酸與剪接的多核糖核苷酸分離。在一些實施方式中，該等方法可用於將環狀多核糖核苷酸（例如，已被剪接的環狀多核糖核苷酸）與線性多核糖核苷酸分離，或將線性多核糖核苷酸與環狀多核糖核苷酸分離。此類含有所需多核糖核苷酸的純化的組成物可用於多種下游應用，例如將多核苷酸負載物（例如，編碼基因或蛋白質）遞送至靶細胞。以下更詳細地描述了該等組成物和方法。方法

本文所述之方法包括從多種多核糖核苷酸中分離具有靶區域的多核糖核苷酸。該方法包括提供包含該多種多核糖核苷酸的樣本。多種多核糖核苷酸包括線性多核糖核苷酸和環狀多核糖核苷酸的混合物。環狀多核糖核苷酸可包含編碼多肽的開讀框（ORF）。多種多核糖核苷酸的子集係線性多核糖核苷酸。該方法進一步包括將靶區域附接至該線性多核糖核苷酸。該方法還包括使樣本與和靶區域雜交的寡核苷酸接觸，並從樣本中的該多種多核糖核苷酸中分離具有與該寡核苷酸雜交的該靶區域的線性多核糖核苷酸（圖 1）。在一些實施方式中，附接包括聚腺苷酸化，並且寡核苷酸包括聚T序列（圖 2）。

在一些實施方式中，本文所述之方法包括從多種多核糖核苷酸中分離線性多核糖核苷酸。多種多核糖核苷酸包括線性多核糖核苷酸和環狀多核糖核苷酸的混合物。該方法包括提供具有該多種多核糖核苷酸的樣本，其中該多種多核糖核苷酸的子集包括該線性多核糖核苷酸；將靶區域附接至該線性多核糖核苷酸；以及使該樣本與包括具有與和靶區域雜交的寡核苷酸軛合的多種顆粒的樹脂的柱接觸。該方法進一步包括從該樣本中的多種多核糖核苷酸中收集包括未與該寡核苷酸雜交的樣本部分的洗脫液。

在一些實施方式中，本文所述之方法包括從多種多核糖核苷酸中分離線性多核糖核苷酸。多種多核糖核苷酸包括線性多核糖核苷酸和環狀多核糖核苷酸的混合物。該方法包括將線性先質環化以形成該環狀多核糖核苷酸；提供包括多種多核糖核苷酸的樣本，其中該多種多核糖核苷酸的子集包括該線性多核糖核苷酸；將靶區域附接至該線性多核糖核苷酸；以及使該樣本與和該靶區域雜交的寡核苷酸接觸。該方法進一步包括從該樣本中的多種多核糖核苷酸中分離具有與該寡核苷酸雜交的該靶區域的線性多核糖核苷酸。

在本文所述任何方法的一些實施方式中，靶區域位於該多核糖核苷酸（例如，線性或環狀多核糖核苷酸）的5’或3’端，並且靶區域不含聚A序列。在一些實施方式中，靶區域位於多核糖核苷酸的3’端並且不含聚A序列。

在一些實施方式中，寡核苷酸與顆粒（例如，直接地或間接地）軛合。顆粒可為例如磁性珠。在一些實施方式中，寡核苷酸與包括多種顆粒的樹脂軛合。該樹脂可以包括，例如，交聯聚[苯乙烯-二乙烯基苯]、瓊脂糖、或SEPHAROSE®瓊脂糖。在一些實施方式中，柱包括樹脂。

在本文所述任何方法的一些實施方式中，分離包括將寡核苷酸固定。該方法可以包括例如，將寡核苷酸、顆粒、或其組合固定。

在一些實施方式中，顆粒係磁性顆粒。該方法可以包括向磁性顆粒施加力，例如磁力。顆粒或珠可為例如交聯瓊脂糖，例如SEPHAROSE®珠。該方法可以包括向珠或顆粒施加力，例如機械力、光學力、離心力或聲學力。

如本文所述之，該等方法可用於將例如剪接的與非剪接的多核糖核苷酸分離。在一些實施方式中，本文所述之方法包括將剪接的多核糖核苷酸與非剪接或部分剪接的多核糖核苷酸分離。在一些實施方式中，剪接的多核糖核苷酸係環狀多核糖核苷酸。在一些實施方式中，剪接的多核糖核苷酸係線性多核糖核苷酸。在一些實施方式中，剪接的多核糖核苷酸缺乏內含子或其部分，例如在生成期間的剪接（例如，自剪接）事件後。在一些實施方式中，具有內含子或其部分的多核糖核苷酸係線性多核糖核苷酸。

在一些實施方式中，該方法進一步包括將具有靶區域的結合的多核糖核苷酸洗滌一次或多次（例如，兩次、三次、四次、五次或更多次）。洗滌可以在接觸後和/或分離步驟後進行。

在一些實施方式中，該方法進一步包括進行第一洗脫步驟，以從具有靶區域的多核糖核苷酸中釋放具有靶區域的結合的多核糖核苷酸。第一洗脫步驟可以包括添加第一緩衝劑和/或將樣本加熱至，例如至少50°C、55°C、60°C、65°C、70°C、75°C、80°C或更高。

在一些實施方式中，該方法進一步包括進行第二洗脫步驟。第二洗脫步驟可以包括添加第二緩衝劑和/或將樣本加熱至例如至少50°C、55°C、60°C、65°C、70°C、75°C、80°C或更高。在一些實施方式中，第二緩衝劑包括變性劑，例如甲醯胺或尿素。第二緩衝劑可以包括，例如約40%至約60%的甲醯胺（例如，約40%、45%、50%、55%或60%的甲醯胺）。

在一些實施方式中，該方法包括將樣本與寡核苷酸一起孵育至少十分鐘（例如，至少20分鐘、30分鐘、40分鐘、50分鐘、60分鐘、70分鐘、80分鐘、90分鐘、100分鐘、110分鐘、120分鐘或更長）。

在一些實施方式中，該方法包括收集未被寡核苷酸結合的樣本部分。

在一些實施方式中，該方法包括提供多種寡核苷酸，其中每種寡核苷酸都與不同的靶區域雜交。每種寡核苷酸都可以與例如顆粒（例如，磁性顆粒或珠）軛合。

在一些實施方式中，該方法包括提供與多核糖核苷酸（例如，含有靶區域的多核糖核苷酸）的莫耳比為10 : 1至1 : 10（例如，10 : 1、5 : 1、2 : 1、1 : 2、1 : 5或1 : 10）的寡核苷酸。

在一些實施方式中，該方法包括提供顆粒（例如珠，例如磁珠）的樣本。顆粒可以存在於容器（例如，微量離心管）中或填充於柱中。顆粒可以與寡核苷酸軛合。該方法可以包括使多核糖核苷酸的混合物流動通過含有顆粒的柱。因此，被寡核苷酸結合的多核糖核苷酸將與柱結合。在一些實施方式中，顆粒與寡核苷酸直接軛合，例如該寡核苷酸被配置為與多核糖核苷酸的靶區域雜交。

在一些實施方式中，例如當使用磁性顆粒時，該方法可以包括例如在容器（例如微量離心管）中藉由提供永磁體來粒化磁性顆粒。

在一些實施方式中，本文所述之方法增濃了樣本中一定量的所需多核糖核苷酸。例如，該方法可增濃相對於純化前樣本的至少10%（例如，至少20%、30%、40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%或更多）的量的所需（例如，剪接的，例如，環狀）多核糖核苷酸。

在一些實施方式中，純化方法產生了具有少於50%（mol/mol）（例如，少於40%、30%、20%、10%、5%、4%、3%、2%或1%（mol/mol））的線性多核糖核苷酸的環狀多核糖核苷酸。

在一些實施方式中，本文所述之方法將至少500 µg（例如，至少600 µg、700 µg、800 µg、900 µg、1 mg、2 mg、3 mg、4 mg、5 mg、6 mg、7 mg、8 mg、9 mg、10 mg、20 mg、30 mg、40 mg、50 mg、60 mg、70 mg、80 mg、90 mg、100 mg、200 mg、300 mg、400 mg、500 mg、600 mg、700 mg、800 mg、900 mg、1,000 mg、或更多）的具有該靶區域的線性多核糖核苷酸分離。在一些實施方式中，該方法分離500 µg至1,000 mg的包括該靶區域的線性多核糖核苷酸。 附接方法

本文所述之方法包括將靶區域附接至線性多核糖核苷酸。例如，該方法可以包括將靶區域附接至線性多核糖核苷酸的3’或5’末端。在一些實施方式中，該方法包括將區域附接至線性多核糖核苷酸的3’或5’末端，並且該靶區域不位於該線性多核糖核苷酸的3’或5’端。例如，含有靶區域的多核糖核苷酸可以附接至該端，並且將該靶區域連接至該線性多核糖核苷酸的該端，然而側翼區形成該線性多核糖核苷酸之新的5’或3’端，例如，在附接後。附接可以藉由將靶區域或其部分連接至線性多核糖核苷酸進行。在其他實施方式中，附接可以藉由聚腺苷酸化進行，其中將一或多種腺苷核糖核苷酸添加至線性多核糖核苷酸的該端（例如，3’端），例如，以產生聚A尾。此類方法包括提供聚A聚合酶，該聚A聚合酶將腺苷三磷酸中的腺苷單磷酸單元附接至RNA，同時裂解掉焦磷酸。在一些實施方式中，在附接步驟期間將靶區域的部分附接。例如，在一些實施方式中，該線性多核糖核苷酸含有靶區域的部分，並且該附接步驟包括將靶區域的其餘部分附接。

靶區域或含有靶區域的多核糖核苷酸可以根據任何可用技術（包括但不限於化學方法和酶促方法）附接。

此類酶促方法包括，例如，提供連接酶（例如，RNA連接酶），該連接酶附接線性RNA的游離末端，例如，該線性多核糖核苷酸的3’末端以及該靶區域的5’末端或該線性多核糖核苷酸的5’末端以及該靶區域的3’末端。

在一個實例中，線性多核糖核苷酸的5’或3’末端可以編碼連接酶核酶序列，使得在體外轉錄期間，所得線性多核糖核苷酸包括能夠將線性多核糖核苷酸的5’末端或線性多核糖核苷酸的3’末端連接至靶區域的活性核酶序列。連接酶核酶可以源自I型內含子、D型肝炎病毒、髮夾核酶，或者可以藉由SELEX（藉由指數增濃進行的配體系統進化）進行選擇。

在另一實例中，可以使用至少一個非核酸部分將靶區域附接至線性多核糖核苷酸。例如，至少一個非核酸部分可與線性多核糖核苷酸5’端附近或3’端附近的區域或特徵反應，以附接至線性多核糖核苷酸。在另一實例中，至少一個非核酸部分可以位於或連接至或靠近線性多核糖核苷酸的5’端或3’端。非核酸部分可為同源的或異源的。作為非限制性實例，非核酸部分可為鍵，如疏水鍵、離子鍵、可生物降解的鍵或可切割的鍵。作為另一非限制性實例，非核酸部分係連接部分。作為又另一非限制性實例，非核酸部分可為寡核苷酸或肽部分，例如，如本文所述之適體或非核酸連接子。

在另一實例中，可以將線性多核糖核苷酸剪接至靶區域。在一些實施方式中，線性多核糖核苷酸和靶區域一起可以包括連接的環E序列。在另一實施方式中，線性多核糖核苷酸和靶區域可以包括環化內含子（例如，5’和3’剪接連接）或環化催化內含子，如I型、II型或III型內含子。I型內含子自剪接序列的非限制性實例可以包含衍生自T4噬菌體基因td的自剪接置換內含子-外顯子序列以及眼原蟲屬的插入序列（IVS）rRNA。

在另一實例中，可以藉由非核酸部分將靶區域附接至線性多核糖核苷酸，該非核酸部分引起位於、鄰近或連接到線性環狀多核糖核苷酸的5’端和3’端的原子、分子表面之間的吸引力。可以藉由分子間作用力或分子內作用力將線性多核糖核苷酸附接至靶區域。分子間作用力的非限制性實例包括偶極-偶極力、偶極誘導偶極力、誘導偶極誘導偶極力、凡得瓦力和倫敦分散力。分子內作用力的非限制性實例包括共價鍵、金屬鍵、離子鍵、共振鍵、抓氫鍵（agnostic bond）、偶極鍵、軛合、超軛合和反向鍵。

在另一實例中，線性多核糖核苷酸可以包括5’端附近的核酶RNA序列，並且靶區域可以包括3’端附近的核酶RNA序列，或反之亦然。當序列暴露於核酶的其餘部分時，核酶RNA序列可以共價地連接至肽。共價連接至5’端和3’端附近的核酶RNA序列的肽可以相互締合，從而將靶區域附接至線性多核糖核苷酸。用於在本發明的線性初級構建體或線性多核糖核苷酸中使用的核酶的非限制性實例，或者摻入或共價地連接肽的方法的非窮舉列表在美國專利申請案號US 20030082768中描述，將該專利申請的內容藉由援引以其全文併入本文。

在又另一實例中，環化的化學方法可用於將靶區域附接至線性多核糖核苷酸。此類方法可以包括但不限於點擊化學（例如，基於炔烴和疊氮化物的方法，或可點擊的鹼基）、烯烴複分解、胺基磷酸酯連接、半胺縮醛-亞胺交聯、鹼基修飾、及其任何組合。 環化方法

環化可以使用包括例如重組技術或化學合成的方法進行。例如，用於產生RNA環的DNA分子可以包括天然存在的原始核酸序列的DNA序列、其修飾形式、或編碼通常在自然界中不存在的合成多肽的DNA序列（例如，嵌合分子或融合蛋白）。DNA和RNA分子可以使用多種技術修飾，該等技術包括但不限於經典誘變技術和重組技術，如定點誘變、化學處理核酸分子以誘導突變、限制性酶切割核酸片段、連接核酸片段、聚合酶鏈反應（PCR）擴增或誘變核酸序列的選定區域、合成寡核苷酸混合物以及連接混合物基團以「建造」核酸分子混合物及其組合。

在一些實施方式中，用於環化的線性多核糖核苷酸被環化或連環化。在一些實施方式中，用於環化的線性多核糖核苷酸在分離、配製和/或遞送之前在體外環化。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸係與線性多核糖核苷酸的混合物。在一些實施方式中，線性多核糖核苷酸具有與環狀多核糖核苷酸相同的核酸序列。

在一些實施方式中，使用化學方法環化或連環化用於環化的線性多核糖核苷酸以形成環狀多核糖核苷酸。在一些化學方法中，核酸（例如，用於環化的線性多核糖核苷酸）的5'末端和3'末端包括化學反應性基團，當基團彼此靠近時，可在分子的3'末端和5'末端之間形成新的共價鍵。5’末端可以含有NHS酯反應性基團，且3’末端可以含有3’胺基末端的核苷酸，使得在有機溶劑中，線性RNA分子3’末端上的3’胺基末端的核苷酸將在5’-NHS-酯部分上經歷親核攻擊，形成新的5’-/3’-醯胺鍵。

在一些實施方式中，使用DNA或RNA連接酶將5'-磷酸化的核酸分子（例如，用於環化的線性多核糖核苷酸）酶促連接至核酸（例如，線性核酸）的3'-羥基，形成新的磷酸二酯鍵。在示例性反應中，根據製造商的方案，將用於環化的線性多核糖核苷酸與1-10單位的T4 RNA連接酶（新英格蘭生物學實驗室公司（New England Biolabs），麻塞諸塞州伊普斯威奇（Ipswich, MA））在37°C下孵育1小時。連接反應可以在存在線性核酸時發生，該線性核酸能夠與並列的5'-和3'-區域鹼基配對，以輔助酶促連接反應。在一些實施方式中，連接係夾板連接。例如，夾板連接酶，如SplintR®連接酶，可用於夾板連接、RNA連接酶II、T4 RNA連接酶、或T4 DNA連接酶。對於夾板連接，單股多核苷酸（夾板），如單股RNA，可以被設計成與線性多核糖核苷酸的兩個末端雜交，使得在與單股夾板雜交時可以將兩個末端並列。因此，夾板連接酶可以催化線性多核糖核苷酸並列的兩個末端的連接，生成環狀多核糖核苷酸。

在一些實施方式中，DNA或RNA連接酶用於環狀多核苷酸之合成。在一些實施方式中，用於環化的線性多核糖核苷酸的5'末端或3'末端可編碼連接酶核酶序列，使得在體外轉錄期間，所得用於環化的線性多核糖核苷酸包括活性核酶序列，該活性核酶序列能夠連接用於環化的線性多核糖核苷酸的5'末端至用於環化的線性多核糖核苷酸的3'末端。連接酶核酶可以源自I型內含子、D型肝炎病毒、髮夾核酶，或者可以藉由SELEX（藉由指數增濃進行的配體系統進化）進行選擇。核酶連接酶反應在0°C與37°C之間的溫度下可能需要1小時至24小時。

在一些實施方式中，可藉由使用至少一個非核酸部分將用於環化的線性多核糖核苷酸環化或連環化。在一個實施方式中，該至少一個非核酸部分與用於環化的線性多核糖核苷酸的5'端附近和/或3'端附近的區域或特徵反應，以環化或連環化用於環化的線性多核糖核苷酸。在另一實施方式中，該至少一個非核酸部分位於或連接至或鄰近用於環化的線性多核糖核苷酸的5'端和/或3'端。設想的非核酸部分可為同源或異源的。作為一個非限制性實例，非核酸部分係鍵，如疏水鍵、離子鍵、可生物降解的鍵和/或可裂解的鍵。作為另一非限制性實例，非核酸部分係連接部分。作為又另一非限制性實例，非核酸部分係寡核苷酸或肽部分，例如，如本文所述之適體或非核酸連接子。

在一些實施方式中，使用IVT和RNA聚合酶合成用於環化的線性多核糖核苷酸，其中用於IVT的核苷酸混合物可以含有相對於鳥苷三磷酸過量的鳥苷單磷酸，以優先產生具有5’單磷酸的RNA；純化的IVT產物可以使用夾板DNA來環化。

在一些實施方式中，用於環化的線性多核糖核苷酸由於非核酸部分而被環化或連環化，引起位於、鄰近或連接至用於環化的線性多核糖核苷酸的5’末端和3'末端的原子、分子表面之間的吸引力。作為一個非限制性實例，可藉由分子間作用力或分子內作用力將一或多個用於環化的線性多核糖核苷酸環化或連環化。分子間作用力的非限制性實例包括偶極-偶極力、偶極誘導偶極力、誘導偶極誘導偶極力、凡得瓦力和倫敦分散力。分子內作用力的非限制性實例包括共價鍵、金屬鍵、離子鍵、共振鍵、抓氫鍵（agnostic bond）、偶極鍵、軛合、超軛合和反向鍵。

在一些實施方式中，用於環化的線性多核糖核苷酸在5'端附近和3'端附近包含核酶RNA序列。當序列暴露於核酶的其餘部分時，核酶RNA序列可以共價地連接至肽。在一個實施方式中，共價連接至5'端和3'端附近的核酶RNA序列的肽可以彼此締合，引起用於環化的線性多核糖核苷酸環化或連環化。在另一實施方式中，肽共價地連接至核酶RNA序列5'末端和3'末端附近可以引起線性初級構建體或線性mRNA在使用本領域已知的方法（諸如但不限於蛋白連接）進行連接後環化或連環化。用於本發明的線性初級構建體或線性RNA中的核酶的非限制性實例，或摻入和/或共價地連接肽的方法的非窮舉列表在美國專利申請案號US 20030082768中描述，該專利內容藉由援引以其全文併入本文。

在一些實施方式中，用於環化的線性多核糖核苷酸包括核酸的5'三磷酸，例如藉由使5'三磷酸與RNA 5'焦磷酸水解酶（RppH）或ATP二磷酸水解酶（脫磷酸酶）接觸使其轉化為5'單磷酸。在一些實施方式中，至少一部分的線性多核糖核苷酸的5’末端包括單磷酸部分。在一些實施方式中，在用5’外切核酸酶和/或3’外切核酸酶酶切至少一部分的線性多核糖核苷酸前使包括環狀和線性多核糖核苷酸的多核糖核苷酸群體與RppH接觸。替代性地，將用於環化的線性多核糖核苷酸的5'三磷酸轉化為5'單磷酸可藉由兩步反應完成，該兩步反應包括：(a) 使用於環化的線性多核糖核苷酸的5'核苷酸與磷酸酶（例如，熱敏磷酸酶、蝦鹼性磷酸酶或小牛腸磷酸酶）接觸以除去所有三個磷酸；以及 (b) 在步驟 (a) 之後，使5'核苷酸與添加單個磷酸酯的激酶（例如，多核苷酸激酶）接觸。

在一些實施方式中，線性多核糖核苷酸包括內部剪接元件，該內部剪接元件在被複製時，剪接端部被連接在一起。一些實例包含具有剪接位點序列及短反向重複序列（30-40 nt）的微型內含子（＜ 100 nt），例如AluSq2、AluJr及AluSz、側翼內含子中的反向序列、側翼內含子中的 Alu元件以及在接近反向剪接事件的（suptable4增濃模體）順式序列元件中發現的模體，例如帶有側翼外顯子的反向剪接位點（back splice site）之前（上游）或之後（下游）200 bp中的序列。在一些實施方式中，線性多核糖核苷酸包括至少一個本文其他處所述之重複核苷酸序列作為內部剪接元件。在此類實施方式中，重複核苷酸序列包括來自Alu家族內含子的重複序列。在一些實施方式中，剪接相關的核糖體結合蛋白質可調節環狀多核糖核苷酸的生物發生（例如盲肌蛋白和震動蛋白（QKI）剪接因子）。

在一些實施方式中，線性多核糖核苷酸包含側接環狀多核糖核苷酸的頭尾接合點處的規範的剪接位點。

在一些實施方式中，線性多核糖核苷酸包含隆起-螺旋-隆起模體，該模體包括側接兩個3-核苷酸隆起的4-鹼基對莖。裂解發生在隆起區域的一個位點處，生成具有端5'-羥基和2',3'-環狀磷酸酯的特徵片段。藉由將5'-OH基團親核攻擊到形成3',5'-磷酸二酯橋的同一分子的2',3'-環狀磷酸酯上來進行環化。

在一些實施方式中，線性多核糖核苷酸包含具有HPR元件的多聚重複RNA序列。HPR包含2',3'-環狀磷酸酯和5'-OH端。HPR元件自處理線性多核糖核苷酸的5’末端和3'末端，由此將末端連接在一起。

在實施方式中，線性多核糖核苷酸藉由自剪接環化或連接。在一些實施方式中，線性多核糖核苷酸包含介導自連接的序列。在一個實施方式中，線性多核糖核苷酸包括HDV序列，例如，HDV複製結構域保守序列，GGCUCAUCUCGACAAGAGGCGGCAGUCCUCAGUACUCUUACUCUUUUCUGUAAAGAGGAGACUGCUGGACUCGCCGCCCAAGUUCGAGCAUGAGCC（Beeharry等人 2004）（SEQ ID NO: 2）或GGCUAGAGGCGGCAGUCCUCAG UACUCUUACUCUUUUCUGUAAAGAGGAGACUGCUGGACUCGCCGCCCGAGCC（SEQ ID NO: 3），以進行自連接。在一個實施方式中，線性多核糖核苷酸包括環E序列（例如在PSTVd中）以進行自連接。在另一實施方式中，線性多核糖核苷酸包括自環化內含子（例如，5’和3’剪接連接）或自環化催化內含子，如I型、II型或III型內含子。I型內含子自剪接序列的非限制性實例包括源自T4噬菌體基因td的自剪接排列內含子-外顯子序列，和眼原蟲屬屬、魚腥藍細菌（cyanobacterium Anabaena）前tRNA基因或眼原蟲屬前rRNA的間插序列（IVS）rRNA。

在一些實施方式中，該線性多核糖核苷酸包括催化內含子片段，如I型催化內含子片段的3’一半和I型催化內含子片段的5’一半。第一和第二退火區可以位於催化內含子片段內。I型催化內含子係自剪接核酶，該等自剪接核酶藉由雙金屬離子磷醯基轉移機制催化其自身從mRNA、tRNA和rRNA先質上切除。重要的是，RNA本身自催化內含子的去除而不需要外源酶，如連接酶。

在一些實施方式中，I型催化內含子片段的3’一半和I型催化內含子片段的5’一半來自魚腥藍細菌前tRNA-Leu基因或眼原蟲屬前rRNA。

在一些實施方式中，I型催化內含子片段的3’一半和I型催化內含子片段的5’一半來自魚腥藍細菌前tRNA-Leu基因，並且3’外顯子片段包括第一退火區，並且5’外顯子片段包括第二退火區。第一退火區域可以包括例如5至50個、例如10至15個（例如10、11、12、13、14或15個）核糖核苷酸，並且第二退火區域可以包括例如5至50個、例如10至15個（例如10、11、12、13、14或15個）核糖核苷酸。

在一些實施方式中，I型催化內含子片段的3’一半和I型催化內含子片段的5’一半來自眼原蟲屬前rRNA，並且I型催化內含子片段的3’一半包括第一退火區，並且5’外顯子片段包括第二退火區。在一些實施方式中，3’外顯子包括第一退火區，並且I型催化內含子片段的5’一半包括第二退火區。第一退火區域可以包括例如6至50個、例如10至16個（例如10、11、12、13、14、15或16個）核糖核苷酸，並且第二退火區域可以包括例如6至50個、例如10至16個（例如10、11、12、13、14、15或16個）核糖核苷酸。

在一些實施方式中，I型催化內含子片段的3’一半和I型催化內含子片段的5’一半來自魚腥藍細菌前tRNA-Leu基因、眼原蟲屬前rRNA基因或T4噬菌體td基因。

在一些實施方式中，I型催化內含子片段的3’一半和I型催化內含子片段的5’一半來自T4噬菌體td基因。3’外顯子片段可包括第一退火區，並且I型催化內含子片段的5’部分可包括第二退火區。第一退火區域可以包括例如2至16個、例如10至16個（例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16個）核糖核苷酸，並且第二退火區域可以包括例如2至16個、例如10至16個（例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16個）核糖核苷酸。

在一些實施方式中，I型催化內含子片段的3’一半係線性多核苷酸的5’端。

在一些實施方式中，I型催化內含子片段的5’一半係線性多核糖核苷酸的3’端。

在一些實施方式中，用於環化的線性多核糖核苷酸包括互補序列，包括個體內含子內或側翼內含子內的重複或非重複核酸序列。

在一些實施方式中，環化化學方法可用於生成環狀多核糖核苷酸。此類方法可以包括但不限於點擊化學（例如，基於炔烴和疊氮化物的方法，或可點擊的鹼基）、烯烴複分解、胺基磷酸酯連接、半胺縮醛-亞胺交聯、鹼基修飾、及其任何組合。

在一些實施方式中，環化酶促方法可用於生成環狀多核糖核苷酸。在一些實施方式中，連接酶，例如DNA或RNA連接酶，可用於生成環狀多核糖核苷酸或互補物的模板、環狀多核糖核苷酸的互補鏈或環狀多核糖核苷酸。

在另一實施方式中，使用無細胞系統中（例如，藉由體外轉錄）轉錄的去氧核糖核苷酸模板產生線性多核糖核苷酸來產生環狀多核糖核苷酸。線性多核糖核苷酸產生剪接相容的多核糖核苷酸，該多核糖核苷酸可以自剪接以產生環狀多核糖核苷酸。

在一些實施方式中，藉由提供線性多核糖核苷酸產生環狀多核糖核苷酸（例如，在無細胞系統中）；以及在適用於剪接線性多核糖核苷酸的3’和5’剪接位點的條件下自剪接線性多核糖核苷酸，從而產生環狀多核糖核苷酸。

在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸係藉由提供編碼線性多核糖核苷酸的去氧核糖核苷酸產生的；在無細胞系統中轉錄去氧核糖核苷酸以產生線性多核糖核苷酸；視需要地純化剪接相容的線性多核糖核苷酸；以及在適用於剪接線性多核糖核苷酸的3’和5’剪接位點的條件下自剪接線性多核糖核苷酸，從而產生環狀多核糖核苷酸。

在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸係藉由提供編碼線性多核糖核苷酸的去氧核糖核苷酸產生的；在無細胞系統中轉錄去氧核糖核苷酸以產生線性多核糖核苷酸（其中該轉錄在適用於剪接線性多核糖核苷酸的3’和5’剪接位點的條件下在溶液中發生），從而產生環狀多核糖核苷酸。在一些實施方式中，線性多核糖核苷酸包含5'斷裂內含子和3'斷裂內含子（例如，用於產生circRNA的自剪接構建體）。在一些實施方式中，線性多核糖核苷酸包含5'退火區和3'退火區。

在一些實施方式中，線性多核糖核苷酸由去氧核糖核酸（例如，本文所述之去氧核糖核酸，例如DNA載體、線性化DNA載體或cDNA）產生。在一些實施方式中，線性多核糖核苷酸藉由在無細胞系統中轉錄（例如，體外轉錄）由去氧核糖核酸轉錄。

在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸在細胞，例如原核細胞或真核細胞中產生。在一些實施方式中，向細胞提供外源多核糖核苷酸（例如，本文所述之線性多核糖核苷酸或編碼本文所述之線性多核糖核苷酸的轉錄的DNA分子）。線性多核糖核苷酸可以在細胞中從向細胞提供的外源DNA分子轉錄。線性多核糖核苷酸可以在細胞中從向該細胞暫態提供的外源重組DNA分子轉錄。在一些實施方式中，外源DNA分子不整合到細胞的基因組中。在一些實施方式中，線性多核糖核苷酸在細胞中從整合到細胞基因組中的重組DNA分子轉錄。

製備本文所述之環狀多核糖核苷酸之方法描述於以下中，例如，Khudyakov & Fields, Artificial DNA: Methods and Applications [人工DNA：方法與應用], CRC Press [CRC出版社] (2002)；Zhao, Synthetic Biology: Tools and Applications [合成生物學：工具與應用] (第一版), Academic Press [學術出版社] (2013)；Muller和Appel, RNA Biol [RNA生物學], 2017, 14(8):1018-1027；以及Egli和Herdewijn, Chemistry and Biology of Artificial Nucleic Acids [人工核酸的化學與生物學], (第一版), Wiley-VCH [威利-VCH出版社] (2012)。製備環狀多核糖核苷酸的其他方法描述於以下中：例如，國際公開案號WO 2022/247943、美國專利案號US 11000547、國際公開案號2018/191722、國際公開案號WO 2019/236673、國際公開案號WO 2020/023595、國際公開案號WO 2022/204460、國際公開案號WO 2022/204464、和國際公開案號WO 2022/204466。

其他地方也描述了製備環狀多核糖核苷酸的各種方法（參見，例如，美國專利案號US 6210931、美國專利案號US 5773244、美國專利案號US 5766903、美國專利案號US 5712128、美國專利案號US 5426180、美國公開案號US 20100137407、國際公開案號WO 1992001813、國際公開案號WO 2010084371、和Petkovic等人, Nucleic Acids Res [核酸研究]. 43:2454-65 (2015)；將其各自內容藉由援引以其全文併入本文）。 寡核苷酸

本文所述之寡核苷酸被配置為與多核糖核苷酸的靶區域雜交。在一些實施方式中，寡核苷酸與靶區域的等長部分具有至少80%（例如，至少85%、90%、95%、97%、99%或100%）互補性。在一些實施方式中，寡核苷酸與多核糖核苷酸的靶區域的誤配至多為10個、9個、8個、7個、6個、5個、4個、3個、2個或1個。在一些實施方式中，寡核苷酸與靶區域沒有誤配。在一些實施方式中，寡核苷酸可為經修飾的寡核苷酸（例如，具有經修飾的磷酸鹽、糖或鹼基）。在一些實施方式中，寡核苷酸含有被配置為與靶區域雜交的部分和不與靶區域（例如，末端區域）雜交的部分。

寡核苷酸的長度可以為例如至少5個核苷酸（例如，至少6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、70個、75個、80個、85個、90個、95個、100個或更多個核苷酸）。在一些實施方式中，寡核苷酸的長度為，例如5-100個、5-95個、10-90個、10-80個、12-60個、15-50個、15-40個、15-30個、18-30個、20-25個或20-22個核苷酸。

寡核苷酸可以例如具有30%-70%（例如，30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%或70%）的GC含量。寡核苷酸可以具有例如約45°C至約75°C（例如，約46°C、47°C、48°C、49°C、50°C、51°C、52°C、53°C、54°C、55°C、56°C、57°C、58°C、59°C、60°C、61°C、62°C、63°C、64°C、65°C、66°C、67°C、68°C、69°C、70°C、71°C、72°C、73°C、74°C或75°C）的解鏈溫度（Tm）。

在一些實施方式中，寡核苷酸包括聚dT或聚U序列。這種序列對於結合（例如，雜交至）聚A或聚dA靶區域可為有用的。在一些實施方式中，寡核苷酸包括至少10個（例如，至少11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、或更多個，例如，至少25個）連續胸苷或尿苷。在一些實施方式中，寡核苷酸係聚 (dT) ₂₅。 靶區域

本文所述之多核糖核苷酸的靶區域被配置為與寡核苷酸雜交。在一些實施方式中，靶區域與寡核苷酸的等長部分具有至少80%（例如，至少85%、90%、95%、97%、99%或100%）互補性。在一些實施方式中，靶區域與寡核苷酸的誤配至多為10個、9個、8個、7個、6個、5個、4個、3個、2個或1個。在一些實施方式中，靶區域與寡核苷酸沒有誤配。在一些實施方式中，靶區域可以含有經修飾的核苷酸（例如，具有經修飾的磷酸鹽、糖或鹼基）。在一些實施方式中，靶區域含有被配置為與寡核苷酸雜交的部分和不與寡核苷酸（例如，末端區域）雜交的部分。

靶區域的長度可以為例如至少5個核苷酸（例如，至少6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、70個、75個、80個、85個、90個、95個、100個或更多個核苷酸）。在一些實施方式中，靶區域的長度為，例如5-100個、5-95個、10-90個、10-80個、12-60個、15-50個、15-40個、15-30個、18-30個、20-25個或20-22個核苷酸。

靶區域可以例如具有30%-70%（例如，30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%或70%）的GC含量。靶區域可以具有例如約45°C至約75°C（例如，約46°C、47°C、48°C、49°C、50°C、51°C、52°C、53°C、54°C、55°C、56°C、57°C、58°C、59°C、60°C、61°C、62°C、63°C、64°C、65°C、66°C、67°C、68°C、69°C、70°C、71°C、72°C、73°C、74°C或75°C）的解鏈溫度（Tm）。

在一些實施方式中，靶區域包括聚A或聚dA序列。這種序列對於結合（例如，雜交至）聚T或聚U寡核苷酸可為有用的。在一些實施方式中，靶區域包括至少10個（例如，至少11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、或更多個，例如，至少25個）連續腺嘌呤或去氧腺嘌呤。在一些實施方式中，靶區域含有聚(A) ₂₅。顆粒

本文所述之寡核苷酸可以與顆粒（例如，磁性顆粒或珠）（例如，直接地或間接地）軛合。在一些實施方式中，寡核苷酸與多種顆粒軛合。在一些實施方式中，顆粒與多種寡核苷酸軛合。

磁性顆粒包括至少一種響應於磁力的組分。磁性顆粒可以完全是磁性的或可以含有非磁性組分。磁性顆粒可為磁珠，例如，基本上呈球形的磁珠。磁性顆粒可以完全是磁性的或可以含有一或多個磁性核，該等磁性核被一或多種額外的材料（如例如，一或多種官能基和/或用於與一或多種靶分子結合的修飾）包圍。在一些實例中，磁性顆粒可以含有磁性組分和經一或多種矽醇基團修飾的表面。這種類型的磁性顆粒可用於結合靶核酸分子。

顆粒（例如，磁性顆粒或珠）可為有孔的、無孔的、中空的、固體的、半固體的、半流體的、流體的和/或其組合。在一些情況下，顆粒（例如，珠）可為可溶解的或可降解的。在一些情況下，顆粒（例如，珠）可能不是可降解的。在一些實施方式中，珠由交聯瓊脂糖（例如，SEPHAROSE®瓊脂糖）構成。

顆粒（例如，磁性顆粒或珠）可以包括天然和/或合成材料。例如，顆粒（例如，珠）可以包括天然聚合物、合成聚合物或天然及合成聚合物二者。天然聚合物的實例包括蛋白質和糖，例如去氧核糖核酸、橡膠、纖維素、澱粉（例如，直鏈澱粉、支鏈澱粉）、蛋白質、酶、多糖、絲、聚羥基鏈烷酸酯、殼聚糖、聚葡萄醣、膠原、角叉菜膠、車前草（ispaghula）、阿拉伯膠、瓊脂、明膠、蟲膠、梧桐膠、黃原膠、玉米糖膠、瓜爾膠、刺梧桐膠、瓊脂糖、海藻酸、海藻酸鹽或其天然聚合物。合成聚合物的實例包括丙烯酸樹脂、尼龍、矽酮、彈性纖維、黏液嫘縈、多元羧酸、聚乙酸乙烯酯、聚丙烯醯胺、聚丙烯酸酯、聚乙二醇、聚胺酯、聚乳酸、二氧化矽、聚苯乙烯、聚丙烯腈、聚丁二烯、聚碳酸酯、聚乙烯、聚對苯二甲酸乙二醇酯、聚（氯代三氟乙烯）、聚(環氧乙烷)、聚(對苯二甲酸乙二酯)、聚乙烯、聚異丁烯、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(氧亞甲基)、聚甲醛、聚丙烯、聚苯乙烯、聚(四氟乙烯)、聚(乙酸乙烯酯)、聚(乙烯醇)、聚(氯乙烯)、聚(偏二氯乙烯)、聚(偏二氟乙烯)、聚(氟乙烯)、和/或其組合（例如，共聚物）。珠也可以由除了聚合物之外的材料形成，該等材料包括脂質、膠束、陶瓷、玻璃-陶瓷、複合材料、金屬、其他無機材料等。

交聯可為永久的或可逆的，這取決於使用的特定交聯劑。可逆交聯在適當的條件下可以使得聚合物線性化或解離。在一些情況下，可逆交聯還可以使與珠表面結合的材料進行可逆附接。

顆粒（例如，珠或磁性顆粒）可為大小均勻的或大小不均一的。在一些情況下，顆粒（例如，珠）的直徑可以為至少約1 µm、5 µm、10 µm、20 µm、30 µm、40 µm、50 µm、60 µm、70 µm、80 µm、90 µm、100 µm、250 µm、500 µm、1 mm、2 mm、3 mm、4 mm、5 mm、6 mm、7 mm、8 mm、9 mm、10 mm或更大。在一些情況下，顆粒（例如，珠）的直徑可以為小於約1 µm、5 µm、10 µm、20 µm、30 µm、40 µm、50 µm、60 µm、70 µm、80 µm、90 µm、100 µm、250 µm、500 µm、1 mm、2 mm、3 mm、4 mm、5 mm、6 mm、7 mm、8 mm、9 mm、10 mm或更小。在一些情況下，顆粒（例如，珠）的直徑可以為在約40-75 µm、30-75 µm、20-75 µm、40-85 µm、40-95 µm、20-100 µm、10-100 µm、1-100 µm、20-250 µm、或20-500 µm、500 µm-1 mm、1 mm-2 mm、1-5 mm或1-10 mm的範圍內。

顆粒可以具有任何合適的形狀。顆粒（例如，磁性顆粒或珠）形狀的實例包括但不限於球形、非球形、卵形、橢圓形、無定形、環狀、圓柱形及其變體。 連接子

在一些實施方式中，連接子用於軛合本文所述之組成物或方法中使用的兩種或更多種組分。例如，連接子可用於將寡核苷酸與顆粒（例如，珠）、靶區域與線性多核糖核苷酸或其任何組合或其變體軛合。在一些實施方式中，靶區域藉由化學連接子與線性多核糖核苷酸軛合。在一些實施方式中，寡核苷酸藉由化學連接子與顆粒軛合。化學連接子可以與寡核苷酸的3’端或5’端軛合。替代性地，化學連接子可以與寡核苷酸的內部區域軛合。顆粒可為例如磁性顆粒或珠。珠可為例如交聯瓊脂糖，例如SEPHAROSE®珠。在一些實施方式中，寡核苷酸直接與顆粒（例如珠，例如磁珠或交聯瓊脂糖，例如SEPHAROSE®珠）軛合。

化學連接子提供例如，寡核苷酸與顆粒或靶區域與線性多核糖核苷酸之間的空間、剛性、和/或柔性。在一些實施方式中，連接子可為鍵，例如共價鍵（例如醯胺鍵、二硫鍵、C-O鍵、C-N鍵、N-N鍵、C-S鍵）或由化學反應（例如，化學軛合）產生的任何類型的鍵。在一些實施方式中，連接子包括不超過250個原子（例如，1-2個、1-4個、1-6個、1-8個、1-10個、1-12個、1-14個、1-16個、1-18個、1-20個、1-25個、1-30個、1-35個、1-40個、1-45個、1-50個、1-55個、1-60個、1-65個、1-70個、1-75個、1-80個、1-85個、1-90個、1-95個、1-100個、1-110個、1-120個、1-130個、1-140個、1-150個、1-160個、1-170個、1-180個、1-190個、1-200個、1-210個、1-220個、1-230個、1-240個或1-250個原子；250個、240個、230個、220個、210個、200個、190個、180個、170個、160個、150個、140個、130個、120個、110個、100個、95個、90個、85個、80個、75個、70個、65個、60個、55個、50個、45個、40個、35個、30個、28個、26個、24個、22個、20個、18個、16個、14個、12個、10個、9個、8個、7個、6個、5個、4個、3個、2個或1個原子）。在一些實施方式中，連接子包括不超過250個非氫原子（例如，1-2個、1-4個、1-6個、1-8個、1-10個、1-12個、1-14個、1-16個、1-18個、1-20個、1-25個、1-30個、1-35個、1-40個、1-45個、1-50個、1-55個、1-60個、1-65個、1-70個、1-75個、1-80個、1-85個、1-90個、1-95個、1-100個、1-110個、1-120個、1-130個、1-140個、1-150個、1-160個、1-170個、1-180個、1-190個、1-200個、1-210個、1-220個、1-230個、1-240個或1-250個非氫原子；250個、240個、230個、220個、210個、200個、190個、180個、170個、160個、150個、140個、130個、120個、110個、100個、95個、90個、85個、80個、75個、70個、65個、60個、55個、50個、45個、40個、35個、30個、28個、26個、24個、22個、20個、18個、16個、14個、12個、10個、9個、8個、7個、6個、5個、4個、3個、2個或1個非氫原子）。在一些實施方式中，連接子的主鏈包括不超過250個原子（例如，1-2個、1-4個、1-6個、1-8個、1-10個、1-12個、1-14個、1-16個、1-18個、1-20個、1-25個、1-30個、1-35個、1-40個、1-45個、1-50個、1-55個、1-60個、1-65個、1-70個、1-75個、1-80個、1-85個、1-90個、1-95個、1-100個、1-110個、1-120個、1-130個、1-140個、1-150個、1-160個、1-170個、1-180個、1-190個、1-200個、1-210個、1-220個、1-230個、1-240個或1-250個原子；250個、240個、230個、220個、210個、200個、190個、180個、170個、160個、150個、140個、130個、120個、110個、100個、95個、90個、85個、80個、75個、70個、65個、60個、55個、50個、45個、40個、35個、30個、28個、26個、24個、22個、20個、18個、16個、14個、12個、10個、9個、8個、7個、6個、5個、4個、3個、2個或1個原子）。連接子的「主鏈」係指連接子中一起形成軛合物的一部分至軛合物的另一部分的最短路徑的原子。連接子主鏈中的原子直接參與將軛合物的一部分與軛合物的另一部分連接。例如，連接子主鏈中與碳附接的氫原子不被視為直接參與軛合物的一部分與軛合物的另一部分的連接。

在一些實施方式中，連接子可以包括衍生自例如，合成聚合物（例如，聚乙二醇（PEG）聚合物）的合成基團。化學連接子可以包括，例如三乙二醇（TEG）。在一些實施方式中，連接子可以包括一或多個胺基酸殘基。在一些實施方式中，連接子可為胺基酸序列（例如，1-25個胺基酸、1-10個胺基酸、1-9個胺基酸、1-8個胺基酸、1-7個胺基酸、1-6個胺基酸、1-5個胺基酸、1-4個胺基酸、1-3個胺基酸、1-2個胺基酸或1個胺基酸序列）。在一些實施方式中，連接子可以包括一或多個視需要地取代的C ₁-C ₂₀伸烷基、視需要地取代的C ₁-C ₂₀雜伸烷基（例如，PEG單元）、視需要地取代的C ₂-C ₂₀亞烯基（例如，C ₂亞烯基）、視需要地取代的C ₂-C ₂₀雜亞烯基、視需要地取代的C ₂-C ₂₀亞炔基、視需要地取代的C ₂-C ₂₀雜亞炔基、視需要地取代的C ₃-C ₂₀環伸烷基（例如，環亞丙基、環亞丁基）、視需要地取代的C ₂-C ₂₀雜環伸烷基、視需要地取代的C4-C ₂₀環亞烯基、視需要地取代的C ₄-C ₂₀雜環亞烯基、視需要地取代的C ₈-C ₂₀環亞炔基、視需要地取代的C ₈-C ₂₀雜環亞炔基、視需要地取代的C ₅-C ₁₅亞芳基（例如，C ₆亞芳基）、視需要地取代的C ₃-C ₁₅雜亞芳基（例如，咪唑、吡啶）、O、S、NRi（Ri係H、視需要地取代的C ₁-C ₂₀烷基、視需要地取代的C ₁-C ₂₀雜烷基、視需要地取代的C ₂-C ₂₀烯基、視需要地取代的C ₂-C ₂₀雜烯基、視需要地取代的C ₂-C ₂₀炔基、視需要地取代的C ₂-C ₂₀雜炔基、視需要地取代的C3-C ₂₀環烷基、視需要地取代的C ₂-C ₂₀雜環烷基、視需要地取代的C ₄-C ₂₀環烯基、視需要地取代的C ₄-C ₂₀雜環烯基、視需要地取代的C ₈-C ₂₀環炔基、視需要地取代的C ₈-C ₂₀雜環炔基、視需要地取代的C ₅-C ₁₅芳基或視需要地取代的C ₃-C ₁₅雜芳基）、P、羰基、硫代羰基、磺醯基、磷酸、磷醯基或亞胺基。

使用連接子的軛合物中兩種或更多種組分的共價軛合可以使用熟知的有機化學合成技術和方法完成。兩種組分上的互補官能基可以彼此反應形成共價鍵。互補反應官能基的實例包括但不限於，例如順丁烯二醯亞胺和半胱胺酸、胺和活化的羧酸、硫醇和順丁烯二醯亞胺、活化的磺酸和胺、異氰酸酯和胺、疊氮化物和炔烴、以及烯烴和四𠯤。可以使用本領域已知的技術完成與多肽的位點特異性軛合。樹脂

在一些實施方式中，本文所述之方法包括使用具有與和靶區域雜交的寡核苷酸軛合的多種顆粒的樹脂。該等方法可以包括使用包括樹脂的柱。該方法可以包括從該樣本中的多種多核糖核苷酸中收集包括未與該寡核苷酸雜交的樣本部分（例如，未與樹脂結合）的洗脫液。在一些實施方式中，該樹脂包括交聯聚[苯乙烯-二乙烯基苯]、瓊脂糖、或SEPHAROSE®瓊脂糖。

本發明的組成物和方法可以使用與寡核苷酸相連的表面，該表面含有被配置為與靶區域雜交的序列。此類寡核苷酸可以包括，例如，聚T、聚U、或聚T/U。樹脂的表面係指可與一或多種試劑或寡核苷酸接觸的支撐結構（例如基底）的部分。樹脂的表面的形狀、形式、材料和修飾可以根據應用從一系列選項中進行選擇。在一個實施方式中，樹脂的表面係SEPHAROSE®瓊脂糖。在一個實施方式中，樹脂的表面係瓊脂糖。

樹脂的表面可以基本上是平坦的或平面的。可替代地，樹脂的表面可為圓形或輪廓狀的。可以包括在樹脂的表面上的示例性輪廓係孔、凹陷、柱子、脊、通道等。

可以用作樹脂的表面的示例性材料包括，但不限於丙烯酸樹脂、碳（例如，石墨、碳纖維）、纖維素（例如，乙酸纖維素）、陶瓷、控制孔徑玻璃、交聯多糖（例如，瓊脂糖或SEPHAROSE®瓊脂糖）、凝膠、玻璃（例如，經修飾的或官能化的玻璃）、金（例如，原子平滑Au（l 11））、石墨、無機玻璃、無機聚合物、乳膠、金屬氧化物（例如，Si02、Ti02、不銹鋼）、類金屬、金屬（例如，原子平滑Au（l 11））、雲母、硫化鉬、奈米材料（例如，高度定向熱解石墨（HOPG）奈米片）、硝基纖維素、NYLON™、光纖束、有機聚合物、紙、塑膠、聚丙烯醯𠰌啉（polacryloylmorpholide）、聚（4-甲基丁烯）、聚對苯二甲酸乙二酯）、聚（丁酸乙烯酯）、聚丁烯、聚二甲基矽氧烷（PDMS）、聚乙烯、聚甲醛、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯、多糖、聚苯乙烯、聚胺基甲酸酯、聚偏二氟乙烯（PVDF）、石英、人造絲、樹脂、橡膠、半導體材料、二氧化矽、矽（例如，表面氧化矽）、硫化物、和TEFLON™。單一材料或幾種不同材料的混合物可以形成可用於本發明的樹脂。

在一些實施方式中，樹脂的表面包括聚合物。

在一些實施方式中，樹脂的表面包括SEPHAROSE®瓊脂糖。實例如以下所示，其中n係任何正整數：

在一些實施方式中，樹脂的表面包括瓊脂糖。實例如以下所示，其中n係正整數：

瓊脂糖的結構：D-半乳糖和3,6-酐-a-L-哌喃半乳糖重複單元。

在一些實施方式中，樹脂的表面包括基於聚苯乙烯的聚合物。聚苯乙烯二乙烯基苯共聚物合成示意圖如以下所示：

在一些實施方式中，樹脂的表面包括基於丙烯酸樹脂的聚合物。聚(甲基丙烯酸甲酯)係以下所示的實例，其中n係任何正整數：

在一些實施方式中，樹脂的表面包括基於聚葡萄醣的聚合物。聚葡萄醣實例如以下所示：

在一些實施方式中，樹脂的表面包括二氧化矽。實例如以下所示：

在一些實施方式中，樹脂的表面包括聚丙烯醯胺。與N-N-亞甲基雙丙烯酸醯胺交聯的實例如以下所示：

在一些實施方式中，樹脂的表面包括基於觸手的相，例如基於甲基丙烯酸鹽的相。

本領域已知的許多表面適用於與本發明的方法一起使用。適合的表面可以包括（包括但不限於）以下材料：硼矽酸鹽玻璃、瓊脂糖、SEPHAROSE®瓊脂糖、磁性珠、聚苯乙烯、聚丙烯醯胺、膜、二氧化矽、半導體材料、矽、有機聚合物、陶瓷、玻璃、金屬、塑膠聚碳酸脂、聚碳酸脂、聚乙烯、聚對苯二酸乙二醇酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚丙烯、聚乙烯醋酸酯、聚氯乙烯、聚乙烯吡咯啶酮、和鈉鈣玻璃。

在一個實施方式中，樹脂的表面被修飾以含有通道、圖案、層、或其他組態（例如，圖案表面）。表面可為以如下的形式：珠、盒、柱、圓筒、圓盤、培養皿（例如，玻璃培養皿、PETRI培養皿）、纖維、薄膜劑、過濾器、微孔盤（例如，96孔微孔盤）、多刃棒、網、顆粒、板、環、桿、卷、片、載玻片、棒、托盤、管、或小瓶。表面可為單一離散體（例如，單一管、單一珠）、任何數量的多個表面體（例如，10個管的架子、若干珠）、或其組合（例如，包括多種微孔盤的托盤、填充有珠的柱、填充有珠的微孔盤）。

在一些實施方式中，表面可以包括基於膜的樹脂基質。在一些實施方式中，樹脂的表面包括有孔樹脂或無孔樹脂。有孔樹脂的實例可以包括另外的基於瓊脂糖的樹脂（例如，溴化氫活化的SEPHAROSE®瓊脂糖（GE）；WorkBeads™ 40 ACT和WorkBeads 40/10000 ACT（Bioworks公司））、甲基丙烯酸酯：（Tosoh 650M衍生物等）、聚苯乙烯二乙烯基苯（生命技術公司（Life Tech）Poros介質/GE Source介質）、壓裂凝膠、聚丙烯醯胺、二氧化矽、控制孔徑玻璃、聚葡萄醣衍生物、丙烯醯胺衍生物、另外的聚合物、及其組合。

在一些實施方式中，表面可以包括一或多個孔。在一些實施方式中，孔徑的大小可為300至8,000埃，例如，500至4,000埃。

如本文所述之樹脂包括多種顆粒。粒度的實例係5 µm -500 µm、20 µm -300 µm、和50 µm -200 µm。在一些實施方式中，粒度可為50 µm、60 µm、70 µm、80 µm、90 µm、100 µm、110 µm、120 µm、130 µm、140 µm、150 µm、160 µm、170 µm、180 µm、190 µm、或200 µm。

可以將寡核苷酸固定、塗覆、結合、黏住、黏附、或附接至本文所述之表面的任何形式（例如，珠、盒、柱、圓筒、圓盤、培養皿（例如，玻璃培養皿、PETRI培養皿）、纖維、薄膜劑、過濾器、微孔盤（例如，96孔微孔盤）、多刃棒、網、顆粒、板、環、桿、卷、片、載玻片、棒、托盤、管、或小瓶）。

在一個實施方式中，表面被修飾以含有化學修飾的位點，該等位點可以用於將寡核苷酸（例如，共價或非共價）附接至離散位點或表面上的位置。化學修飾的位點包括例如，添加包括以下的一種模式的化學官能基：胺基基團、羧基基團、側氧基基團和硫醇基團，該等官能基可以用於將寡核苷酸共價附接，該寡核苷酸總體上也含有相應反應性官能基。表面官能化的實例係胺基衍生物、硫醇衍生物、醛衍生物、甲醯基衍生物、疊氮化物衍生物（點擊化學）、生物素衍生物、炔烴衍生物、羥基衍生物、活化的羥基或衍生物、羧酸鹽衍生物、活化的羧酸鹽衍生物、活化的碳酸鹽、活化的酯、NHS酯（琥珀醯亞胺基）、NHS碳酸鹽（琥珀醯亞胺基）、亞胺酸酯或其衍生物、溴化氫衍生物、順丁烯二醯亞胺衍生物、鹵代醯衍生物、碘乙醯胺/碘乙醯基衍生物、環氧化物衍生物、卵白素衍生物、三甲磺醯衍生物、二烯/軛合的二烯衍生物（Diels-Alder類型反應）、鏈烯衍生物、經取代的磷酸鹽衍生物、溴醇/鹵代醇、經取代的二硫化物、吡啶基-二硫化物衍生物、芳基疊氮化物、醯基疊氮化物、吖內酯、醯肼衍生物、鹵代苯衍生物、核苷衍生物、分支/多功能連接子、樹突狀功能肌、核苷衍生物、或其任何組合。

在一些實施方式中，相連的表面的結合能力可為至少1 mg/mL、5 mg/mL、10 mg/mL、20 mg/mL、30 mg/mL、40 mg/mL、50 mg/mL、或更多。

在一些實施方式中，包括樹脂的柱被配置為將至少500 µg（例如，至少600 µg、700 µg、800 µg、900 µg、1 mg、2 mg、3 mg、4 mg、5 mg、6 mg、7 mg、8 mg、9 mg、10 mg、20 mg、30 mg、40 mg、50 mg、60mg、70 mg、80 mg、90 mg、100 mg、200 mg、300 mg、400 mg、500 mg、600 mg、700 mg、800 mg、900 mg、1,000 mg、或更多）的多核糖核苷酸與例如靶區域結合。在一些實施方式中，柱被配置以將500 µg至1,000 mg的多核糖核苷酸例如與靶區域結合。 組成物

如本文所述之，本發明的特徵在於包括藉由如本文所述之方法產生的多核糖核苷酸群體之組成物。該群體可以包括，例如缺乏靶區域的環狀多核糖核苷酸，並且該環狀多核糖核苷酸包括組成物中總多核糖核苷酸的至少1%（例如至少5%，例如至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、97%、99%或更多）（mol/mol）。在一些實施方式中，該群體具有組成物中小於50%（例如，小於40%、30%、20%、10%、5%、4%、3%、2%或1%）（mol/mol）的線性多核糖核苷酸。

在其他實施方式中，該群體包括例如具有靶區域的第一構象的多核糖核苷酸以及具有靶區域的第二構象的多核糖核苷酸，並且第一構象的多核糖核苷酸包括組成物中總多核糖核苷酸的至少1%，例如至少5%，例如至少10%、至少20%、至少30%或至少40%（例如，至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、97%、99%或更多）（mol/mol）。

在如本文所述之一些實施方式中，本發明的特徵在於包括多核糖核苷酸混合物的組成物。該混合物的第一子集包括缺乏靶區域的環狀多核糖核苷酸，並且該多種多核糖核苷酸的第二子集包括具有靶區域的線性多核糖核苷酸。第一子集包括組成物中總多核糖核苷酸的至少1%，例如，至少5%，例如至少10%、至少20%、至少30%、或至少40%（例如，至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、97%、99%或更多）（mol/mol）。在一些實施方式中，線性多核糖核苷酸包括多種不同的線性多核糖核苷酸物種，例如，各自含有靶區域。

在如本文所述之一些實施方式中，本發明的特徵在於包含具有靶區域的多核糖核苷酸和配置為與靶區域雜交的寡核苷酸之組成物，其中寡核苷酸與顆粒（例如，經由連接子）軛合。

在如本文所述之任何組成物的一些實施方式中，線性多核糖核苷酸包括內含子或其部分。靶區域可以位於內含子或其部分的5’或3’。

在一些實施方式中，多核糖核苷酸可為經修飾的多核糖核苷酸。

在一個實施方式中，環狀多核糖核苷酸製劑（例如，環狀多核糖核苷酸藥物製劑或組成物或環狀多核糖核苷酸製劑生產中的中間體）係基於質量至少30%（w/w）、40%（w/w）、50%（w/w）、60%（w/w）、70%（w/w）、80%（w/w）、85%（w/w）、90%（w/w）、91%（w/w）、92%（w/w）、93%（w/w）、94%（w/w）、95%（w/w）、96%（w/w）、97%（w/w）、98%（w/w）、99%（w/w）、或100%（w/w）純的。純度可以藉由熟悉該項技術者已知的多種分析技術中之任一種來測量，該等分析技術諸如但不限於使用分離技術，諸如層析法（使用柱、使用紙、使用凝膠、使用HPLC、使用UHPLC等，或藉由IC、藉由SEC、藉由逆相、藉由陰離子交換、藉由混合模式等）或使用或不使用分離前或分離後衍生化方法的電泳（尿素PAGE、基於晶片的、聚丙烯醯胺凝膠、RNA、毛細管、c-IEF等），使用基於質譜法、UV-Vis、螢光、光散射、折射率，或利用銀或染料染色或放射性衰變用於檢測的檢測技術。替代性地，純度可以在不使用分離技術的情況下藉由質譜法、顯微鏡法、圓二色性（CD）光譜法、UV或UV-Vis分光光度法、螢光法（例如，Qubit）、RNA酶H分析、表面電漿共振（SPR）、或利用銀或染料染色或放射性衰變用於檢測的方法。

在一些實施方式中，可以藉由生物學測試方法（例如，基於細胞的或基於受體的測試）來測量純度。在一些實施方式中，本文所述之製劑中總質量核糖核苷酸的至少30%（w/w）、40%（w/w）、50%（w/w）、60%（w/w）、70%（w/w）、80%（w/w）、85%（w/w）、90%（w/w）、91%（w/w）、92%（w/w）、93%（w/w）、94%（w/w）、95%（w/w）、96%（w/w）、97%（w/w）、98%（w/w）、99%（w/w）或100%（w/w）以環狀多核糖核苷酸分子包含。該百分比可以藉由熟悉該項技術者已知的多種分析技術中之任一種來測量，該等分析技術諸如但不限於使用分離技術，諸如層析法（使用柱、使用紙、使用凝膠、使用HPLC、使用UHPLC等，或藉由IC、藉由SEC、藉由逆相、藉由陰離子交換、藉由混合模式等）或使用或不使用分離前或分離後衍生化方法的電泳（尿素PAGE、基於晶片的、聚丙烯醯胺凝膠、RNA、毛細管、c-IEF等），使用基於質譜法、UV-Vis、螢光、光散射、折射率，或利用銀或染料染色或放射性衰變用於檢測的檢測技術。替代性地，純度可以在不使用分離技術的情況下藉由質譜法、顯微鏡法、圓二色性（CD）光譜法、UV或UV-Vis分光光度法、螢光法（例如，Qubit）、RNA酶H分析、表面電漿共振（SPR）、或利用銀或染料染色或放射性衰變用於檢測的方法。

在一個實施方式中，環狀多核糖核苷酸製劑（例如，環狀多核糖核苷酸藥物製劑或組成物或環狀多核糖核苷酸製劑生產中的中間體）具有至少0.1 ng/mL、0.5 ng/mL、1 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、50 ng/mL、0.1 µg/mL、0.5 µg/mL、1 µg/mL、2 µg/mL、5 µg/mL、10 µg/mL、20 µg/mL、30 µg/mL、40 µg/mL、50 µg/mL、60 µg/mL、70 µg/mL、80 µg/mL、100 µg/mL、200 µg/mL、300 µg/mL、500 µg/mL、1000 µg/mL、5000 µg/mL、10,000 µg/mL、100,000 µg/mL、200 mg/mL、300 mg/mL、400 mg/mL、500 mg/mL、600 mg/mL、650 mg/mL、700 mg/mL、或750 mg/mL的環狀多核糖核苷酸濃度。在一個實施方式中，環狀多核糖核苷酸製劑（例如，環狀多核糖核苷酸藥物製劑或組成物或環狀多核糖核苷酸製劑生產中的中間體）基本上不含單核苷酸或具有不超過1 pg/ml、10 pg/ml、0.1 ng/ml、1 ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml、15 ng/ml、20 ng/ml、25 ng/ml、30 ng/ml、35 ng/ml、40 ng/ml、50 ng/ml、60 ng/ml、70 ng/ml、80 ng/ml、90 ng/ml、100 ng/ml、200 ng/ml、300 ng/ml、400 ng/ml、500 ng/ml、1000 µg/mL、5000 µg/mL、10,000 µg/mL、或100,000 µg/mL的單核苷酸含量。在一個實施方式中，環狀多核糖核苷酸製劑（例如，環狀多核糖核苷酸藥物製劑或組成物或環狀多核糖核苷酸製劑生產中的中間體）具有從檢測限至1 pg/ml、10 pg/ml、0.1 ng/ml、1 ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml、15 ng/ml、20 ng/ml、25 ng/ml、30 ng/ml、35 ng/ml、40 ng/ml、50 ng/ml、60 ng/ml、70 ng/ml、80 ng/ml、90 ng/ml、100 ng/ml、200 ng/ml、300 ng/ml、400 ng/ml、500 ng/ml、1000 µg/mL、5000 µg/mL、10,000 µg/mL、或100,000 µg/mL的單核苷酸含量。

在一個實施方式中，環狀多核糖核苷酸製劑（例如，環狀多核糖核苷酸藥物製劑或組成物或環狀多核糖核苷酸製劑生產中的中間體）具有基於質量占總核苷酸不超過0.1%（w/w）、0.2%（w/w）、0.3%（w/w）、0.4%（w/w）、0.5%（w/w）、0.6%（w/w）、0.7%（w/w）、0.8%（w/w）、0.9%（w/w）、1%（w/w）、2%（w/w）、3%（w/w）、4%（w/w）、5%（w/w）、6%（w/w）、7%（w/w）、8%（w/w）、9%（w/w）、10%（w/w）、15%（w/w）、20%（w/w）、25%（w/w）、30%（w/w）、或其間的任何百分比的單核苷酸含量，其中總核苷酸含量係去氧核糖核苷酸分子和核糖核苷酸分子的總質量。

在一個實施方式中，環狀多核糖核苷酸製劑（例如，環狀多核糖核苷酸藥物製劑或組成物或環狀多核糖核苷酸製劑生產中的中間體）具有不超過1 ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml、15 ng/ml、20 ng/ml、25 ng/ml、30 ng/ml、35 ng/ml、40 ng/ml、50 ng/ml、60 ng/ml、70 ng/ml、80 ng/ml、90 ng/ml、100 ng/ml、200 ng/ml、300 ng/ml、400 ng/ml、500 ng/ml、600 ng/ml、1 µg/ml、10 µg/ml、50 µg/ml、100 µg/ml、200 g/ml、300 µg/ml、400 µg/ml、500 µg/ml、600 µg/ml、700 µg/ml、800 µg/ml、900 µg/ml、1 mg/ml、1.5 mg/ml、2 mg/ml、5 mg/mL、10 mg/mL、50 mg/mL、100 mg/mL、200 mg/mL、300 mg/mL、400 mg/mL、500 mg/mL、600 mg/mL、650 mg/mL、700 mg/mL、或750 mg/mL的線性RNA含量，例如線性RNA對應物或RNA片段。在一個實施方式中，環狀多核糖核苷酸製劑（例如，環狀多核糖核苷酸藥物製劑或組成物或環狀多核糖核苷酸製劑生產中的中間體）具有從檢測限至1 ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml、15 ng/ml、20 ng/ml、25 ng/ml、30 ng/ml、35 ng/ml、40 ng/ml、50 ng/ml、60 ng/ml、70 ng/ml、80 ng/ml、90 ng/ml、100 ng/ml、200 ng/ml、300 ng/ml、400 ng/ml、500 ng/ml、600 ng/ml、1 µg/ml、10 µg/ml、50 µg/ml、100 µg/ml、200 g/ml、300 µg/ml、400 µg/ml、500 µg/ml、600 µg/ml、700 µg/ml、800 µg/ml、900 µg/ml、1 mg/ml、1.5 mg/ml、2 mg/ml、5 mg/ml、10 mg/ml、50 mg/ml、100 mg/ml、200 mg/ml、300 mg/ml、400 mg/ml、500 mg/ml、600 mg/ml、650 mg/ml、700 mg/ml、或750 mg/ml的線性RNA含量，例如線性RNA對應物或RNA片段。

在一個實施方式中，環狀多核糖核苷酸製劑（例如，環狀多核糖核苷酸藥物製劑或組成物或環狀多核糖核苷酸製劑生產中的中間體）具有不超過10%（w/w）、9.9%（w/w）、9.8%（w/w）、9.7%（w/w）、9.6%（w/w）、9.5%（w/w）、9.4%（w/w）、9.3%（w/w）、9.2%（w/w）、9.1%（w/w）、9%（w/w）、8%（w/w）、7%（w/w）、6%（w/w）、5%（w/w）、4%（w/w）、3%（w/w）、2%（w/w）、1%（w/w）、0.5%（w/w）、或0.1%（w/w）、或其間的百分比的帶切口RNA含量。在一個實施方式中，環狀多核糖核苷酸製劑（例如，環狀多核糖核苷酸藥物製劑或組成物或環狀多核糖核苷酸製劑生產中的中間體）具有低至零的帶切口RNA含量或基本上不含帶切口RNA。

在一個實施方式中，環狀多核糖核苷酸製劑（例如，環狀多核糖核苷酸藥物製劑或組成物或環狀多核糖核苷酸製劑生產中的中間體）具有不超過30%（w/w）、25%（w/w）、20%（w/w）、15%（w/w）、10%（w/w）、9%（w/w）、8%（w/w）、7%（w/w）、6%（w/w）、5%（w/w）、4%（w/w）、3%（w/w）、2%（w/w）、1%（w/w）、0.5%（w/w）、或0.1%（w/w）、或其間的百分比的組合的線性RNA和帶切口RNA含量。在一個實施方式中，環狀多核糖核苷酸製劑（例如，環狀多核糖核苷酸藥物製劑或組成物或環狀多核糖核苷酸製劑生產中的中間體）具有低至零的組合的帶切口RNA和線性RNA含量或基本上不含帶切口和線性RNA。

在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸製劑（例如，環狀多核糖核苷酸藥物製劑或組成物或環狀多核糖核苷酸製劑生產中的中間體）具有不超過分析方法的檢測限的線性RNA含量，例如線性RNA對應物或RNA片段，該等分析方法諸如利用以下項的方法：質譜法、UV光譜或螢光檢測器、光散射技術、使用或不使用分離方法包括HPLC的表面電漿共振（SPR）、藉由HPLC、使用或不使用分離前或分離後衍生化方法的基於晶片或凝膠的電泳、使用銀或染料染色或放射性衰變的檢測方法、或顯微鏡、目測法或分光光度計。

在一個實施方式中，環狀多核糖核苷酸製劑（例如，環狀多核糖核苷酸藥物製劑或組成物或環狀多核糖核苷酸製劑生產中的中間體）具有例如如藉由實例2中的方法測量的不超過0.1%（w/w）、1%（w/w）、2%（w/w）、3%（w/w）、4%（w/w）、5%（w/w）、6%（w/w）、7%（w/w）、8%（w/w）、9%（w/w）、10%（w/w）、15%（w/w）、20%（w/w）、25%（w/w）、30%（w/w）、35%（w/w）、40%（w/w）、45%（w/w）、50%（w/w）的線性RNA。

在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸製劑的線性多核糖核苷酸分子包括環狀多核糖核苷酸分子的線性對應物或其片段。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸製劑的線性多核糖核苷酸分子包括線性對應物（例如，環化前形式）。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸製劑的線性多核糖核苷酸分子包括環狀多核糖核苷酸的非對應物或其片段。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸製劑的線性多核糖核苷酸分子包括環狀多核糖核苷酸的非對應物。在一些實施方式中，線性多核糖核苷酸分子包括環狀多核糖核苷酸的對應物和環狀多核糖核苷酸的非對應物或其片段的組合。在一些實施方式中，線性多核糖核苷酸分子包括環狀多核糖核苷酸的對應物和環狀多核糖核苷酸的非對應物的組合。在一些實施方式中，線性多核糖核苷酸分子片段係長度為至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、11000、12000個、或更多個核苷酸、或其間的任何核苷酸數的片段。

在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸製劑（例如，環狀多核糖核苷酸藥物製劑或組成物或環狀多核糖核苷酸製劑生產中的中間體）具有例如如藉由分光光度計測量的從約1.6至約2.3的A260/A280吸光度比。在一些實施方式中，A260/A280吸光度比係約1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、或其間的任何數。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸（例如，環狀多核糖核苷酸藥物製劑或組成物或環狀多核糖核苷酸生產中的中間體）具有例如如藉由分光光度計測量的大於約1.8的A260/A280吸光度比。在一些實施方式中，A260/A280吸光度比係約1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、或更大。

在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸製劑（例如，環狀多核糖核苷酸藥物製劑或組成物或環狀多核糖核苷酸製劑生產中的中間體）基本上不含雜質或副產物。在各種實施方式中，包含環狀多核糖核苷酸之組成物中至少一種雜質或副產物的水平與在去除雜質或副產物的純化或處理之前組成物的該水平相比降低至少30%（w/w）、至少40%（w/w）、至少50%（w/w）、至少60%（w/w）、至少70%（w/w）、至少80%（w/w）、至少90%（w/w）或至少95%（w/w）。在一些實施方式中，至少一種製程相關雜質或副產物的水平與在去除雜質或副產物的純化或處理之前組成物的該水平相比降低至少30%（w/w）、至少40%（w/w）、至少50%（w/w）、至少60%（w/w）、至少70%（w/w）、至少80%（w/w）、至少90%（w/w）或至少95%（w/w）。在一些實施方式中，至少一種產物相關物質的水平與在去除雜質或副產物的純化或處理之前組成物的該水平相比降低至少30%（w/w）、至少40%（w/w）、至少50%（w/w）、至少60%（w/w）、至少70%（w/w）、至少80%（w/w）、至少90%（w/w）、或至少95%（w/w）。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸製劑（例如，環狀多核糖核苷酸藥物製劑或組成物或環狀多核糖核苷酸製劑生產中的中間體）進一步基本上不含製程相關雜質或副產物。在一些實施方式中，製程相關雜質或副產物包括蛋白質（例如，細胞蛋白質，諸如宿主細胞蛋白質）、去氧核糖核酸（例如，細胞去氧核糖核酸，諸如宿主細胞去氧核糖核酸）、單去氧核糖核苷酸或雙去氧核糖核苷酸分子、酶（例如，核酸酶（諸如核酸內切酶或核酸外切酶）、或連接酶）、試劑組分、凝膠組分、或層析材料。在一些實施方式中，雜質或副產物選自：緩衝試劑、連接酶、核酸酶、RNA酶抑制劑、RNA酶R、去氧核糖核苷酸分子、丙烯醯胺凝膠碎片、和單去氧核糖核苷酸分子。在一些實施方式中，藥物製劑包含少於0.1 ng、1 ng、5 ng、10 ng、15 ng、20 ng、25 ng、30 ng、35 ng、40 ng、50 ng、60 ng、70 ng、80 ng、90 ng、100 ng、200 ng、300 ng、400 ng、或500 ng蛋白質污染物/毫克（mg）環狀多核糖核苷酸分子的蛋白質（例如，細胞蛋白質，諸如宿主細胞蛋白質）污染物。

在一個實施方式中，環狀多核糖核苷酸製劑（例如，環狀多核糖核苷酸藥物製劑或組成物或環狀多核糖核苷酸製劑生產中的中間體）基本上不含DNA含量，例如模板DNA或細胞DNA（例如，宿主細胞DNA），或具有低至零的DNA含量，或具有不超過1 pg/ml、10 pg/ml、0.1 ng/ml、1 ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml、15 ng/ml、20 ng/ml、25 ng/ml、30 ng/ml、35 ng/ml、40 ng/ml、50 ng/ml、60 ng/ml、70 ng/ml、80 ng/ml、90 ng/ml、100 ng/ml、200 ng/ml、300 ng/ml、400 ng/ml、500 ng/ml、1000 µg/mL、5000 µg/mL、10,000 µg/mL、或100,000 µg/mL的DNA含量。

在一個實施方式中，環狀多核糖核苷酸製劑（例如，環狀多核糖核苷酸藥物製劑或組成物或環狀多核糖核苷酸製劑生產中的中間體）基本上不含DNA含量，具有低至零的DNA含量，或具有基於質量占總核苷酸不超過0.001%（w/w）、0.01%（w/w）、0.1%（w/w）、1%（w/w）、2%（w/w）、3%（w/w）、4%（w/w）、5%（w/w）、6%（w/w）、7%（w/w）、8%（w/w）、9%（w/w）、10%（w/w）、15%（w/w）、20%（w/w）、25%（w/w）、30%（w/w）、35%（w/w）、40%（w/w）、45%（w/w）、50%（w/w）的DNA含量，其中總核苷酸分子係去氧核糖核苷酸含量和核糖核苷酸分子的總質量。在一個實施方式中，環狀多核糖核苷酸製劑（例如，環狀多核糖核苷酸藥物製劑或組成物或環狀多核糖核苷酸製劑生產中的中間體）基本上不含DNA含量，具有低至零的DNA含量，或具有基於質量占總核苷酸不超過0.001%（w/w）、0.01%（w/w）、0.1%（w/w）、1%（w/w）、2%（w/w）、3%（w/w）、4%（w/w）、5%（w/w）、6%（w/w）、7%（w/w）、8%（w/w）、9%（w/w）、10%（w/w）、15%（w/w）、20%（w/w）、25%（w/w）、30%（w/w）、35%（w/w）、40%（w/w）、45%（w/w）、50%（w/w）的DNA含量，如在藉由消化核苷的酶進行總DNA消化後藉由定量液體層析法-質譜法（LC-MS）測量的，其中DNA的含量從如藉由LC-MS測量的每種鹼基（即，A、C、G、T）的標準曲線反演計算出。

在實施方式中，環狀多核糖核苷酸製劑（例如，環狀多核糖核苷酸藥物製劑或組成物或環狀多核糖核苷酸製劑生產中的中間體）具有不超過0.1 ng/ml、1 ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml、15 ng/ml、20 ng/ml、25 ng/ml、30 ng/ml、35 ng/ml、40 ng/ml、50 ng/ml、60 ng/ml、70 ng/ml、80 ng/ml、90 ng/ml、100 ng/ml、200 ng/ml、300 ng/ml、400 ng/ml、或500 ng/ml的蛋白質（例如，細胞蛋白質（CP）（例如，酶）、生產相關蛋白（例如，載劑蛋白））污染物、雜質或副產物。在實施方式中，環狀多核糖核苷酸（例如，環狀多核糖核苷酸藥物製劑或組成物或環狀多核糖核苷酸生產中的中間體）具有從檢測限至0.1 ng/ml、1 ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml、15 ng/ml、20 ng/ml、25 ng/ml、30 ng/ml、35 ng/ml、40 ng/ml、50 ng/ml、60 ng/ml、70 ng/ml、80 ng/ml、90 ng/ml、100 ng/ml、200 ng/ml、300 ng/ml、400 ng/ml、或500 ng/ml的蛋白質（例如，生產相關蛋白諸如細胞蛋白質（CP），例如酶）污染物、雜質或副產物。

在實施方式中，環狀多核糖核苷酸製劑（例如，環狀多核糖核苷酸藥物製劑或組成物或環狀多核糖核苷酸製劑生產中的中間體）具有少於0.1 ng、1 ng、5 ng、10 ng、15 ng、20 ng、25 ng、30 ng、35 ng、40 ng、50 ng、60 ng、70 ng、80 ng、90 ng、100 ng、200 ng、300 ng、400 ng、或500 ng/毫克（mg）環狀多核糖核苷酸的蛋白質（例如，生產相關蛋白諸如細胞蛋白質（CP），例如酶）污染物、雜質或副產物。在實施方式中，環狀多核糖核苷酸（例如，環狀多核糖核苷酸藥物製劑或組成物或環狀多核糖核苷酸生產中的中間體）具有從檢測水平至0.1 ng、1 ng、5 ng、10 ng、15 ng、20 ng、25 ng、30 ng、35 ng、40 ng、50 ng、60 ng、70 ng、80 ng、90 ng、100 ng、200 ng、300 ng、400 ng、或500 ng/毫克（mg）環狀多核糖核苷酸的蛋白質（例如，生產相關蛋白諸如細胞蛋白質（CP），例如酶）污染物、雜質或副產物。

在一個實施方式中，環狀多核糖核苷酸製劑（例如，環狀多核糖核苷酸藥物製劑或組成物或環狀多核糖核苷酸製劑生產中的中間體）具有低水平的內毒素或基本上不存在內毒素，例如如藉由鱟變形細胞裂解物（LAL）測試測量的。在一些實施方式中，藥物製劑或組成物或環狀多核糖核苷酸生產中的中間體如藉由鱟變形細胞裂解物測試所測量包含少於20 EU/kg（重量）、10 EU/kg、5 EU/kg、1 EU/kg的內毒素，或缺乏內毒素。在實施方式中，環狀多核糖核苷酸組成物具有低水平或不存在的核酸酶或連接酶。

在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸製劑（例如，環狀多核糖核苷酸藥物製劑或組成物或環狀多核糖核苷酸製劑生產中的中間體）包含不大於約50%（w/w）、45%（w/w）、40%（w/w）、35%（w/w）、30%（w/w）、25%（w/w）、20%（w/w）、19%（w/w）、18%（w/w）、17%（w/w）、16%（w/w）、15%（w/w）、14%（w/w）、13%（w/w）、12%（w/w）、11%（w/w）、10%（w/w）、9%（w/w）、8%（w/w）、7%（w/w）、6%（w/w）、5%（w/w）、4%（w/w）、3%（w/w）、2%（w/w）、1%（w/w）的至少一種酶，例如聚合酶，例如RNA聚合酶。

在一個實施方式中，環狀多核糖核苷酸製劑（例如，環狀多核糖核苷酸藥物製劑或組成物或環狀多核糖核苷酸製劑生產中的中間體）係無菌的或基本上不含微生物，例如組成物或製劑如在無菌條件下所測試支持少於100個活微生物的生長，組成物或製劑滿足USP ＜71＞的標準，和/或組成物或製劑滿足USP ＜85＞的標準。在一些實施方式中，藥物製劑在滅菌之前包含少於100 CFU/100 ml、50 CFU/100 ml、40 CFU/100 ml、30 CFU/100 ml、200 CFU/100 ml、10 CFU/100 ml、或10 CFU/100 ml的生物負荷。

在一些實施方式中，可以使用本領域中已知的去除雜質或副產物的技術（例如柱層析法或pH/小瓶滅活）進一步純化環狀多核糖核苷酸製劑。

在一些實施方式中，在組成物中的多核糖核苷酸的總重量包括至少500 µg（例如，至少600 µg、700 µg、800 µg、900 µg、1 mg、2 mg、3 mg、4 mg、5 mg、6 mg、7 mg、8 mg、9 mg、10 mg、20 mg、30 mg、40 mg、50 mg、60mg、70 mg、80 mg、90 mg、100 mg、200 mg、300 mg、400 mg、500 mg、600 mg、700 mg、800 mg、900 mg、1,000 mg、或更多）。在一些實施方式中，在多核糖核苷酸群體中的多核糖核苷酸的總重量係500 µg至1000 mg。 多核苷酸

本發明的特徵在於在分離和/或純化方法中使用的以及存在於本文所述之組成物中的多核糖核苷酸。本文所述之多核糖核苷酸可為線性多核糖核苷酸、環狀多核糖核苷酸或其組合。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸由線性多核糖核苷酸產生（例如，藉由剪接線性多核糖核苷酸的相容端）。在一些實施方式中，線性多核糖核苷酸從去氧核糖核苷酸模板（例如，載體、線性化載體或cDNA）轉錄。因此，本發明的特徵在於可用於產生多核糖核苷酸的線性去氧核糖核苷酸、環狀去氧核糖核苷酸、線性多核糖核苷酸、和環狀多核糖核苷酸及其組成物。 線性多核糖核苷酸

本發明的特徵在於可以包括以下一或多種的線性多核糖核苷酸：3’內含子片段；3’剪接位點；3’外顯子；多核糖核苷酸負載物；5’外顯子；5’剪接位點；和5′內含子片段。在一些實施方式中，3’內含子片段對應於催化I型內含子（例如，來自魚腥藍細菌前tRNA-Leu基因、眼原蟲屬前rRNA、T4噬菌體td基因或其變體的催化I型內含子）的3’部分。在一些實施方式中，5’內含子片段對應於催化I型內含子（例如，來自藍細菌魚腥藻屬前tRNA-Leu基因、眼原蟲屬前rRNA、T4噬菌體td基因或其變體的催化I型內含子）的5’部分。

線性多核糖核苷酸可以包括例如在以上所述之元件中之任一者之外或之間的另外的元件。例如，如本文所述之，以上元件的任一者可以藉由間隔子序列隔開。如本文所述之靶區域可以存在於如本文所述之線性多核糖核苷酸的任何區域。在一些實施方式中，靶區域存在於內含子或其部分內。

在某些實施方式中，本文提供了一種藉由使用本文提供的去氧核糖核苷酸（例如，載體、線性化載體或cDNA）作為模板（例如，本文提供的載體、線性化載體或cDNA，它們具有位於編碼線性多核糖核苷酸的區域上游的RNA聚合酶啟動子）在無細胞系統中進行轉錄（例如，體外轉錄）來生成線性多核糖核苷酸之方法。

去氧核糖核苷酸模板可以被轉錄以產生含有本文所述組分的線性多核糖核苷酸。表現後，線性多核糖核苷酸可以產生剪接相容的多核糖核苷酸，該剪接相容的多核糖核苷酸可以被剪接以產生環狀多核糖核苷酸，例如，用於隨後使用。

在一些實施方式中，線性多核糖核苷酸的長度為50個至20,000個，例如300個至20,000個（例如，50個、60個、70個、80個、90個、100個、150個、200個、250個、300個、400個、500個、600個、700個、800個、900個、1,000個、1,100個、1,200個、1,300個、1,400個、1,500個、1,600個、1,700個、1,800個、1,900個、2,000個、2,500個、3,000個、3,500個、4,000個、5,000個、6,000個、7,000個、8,000個、9,000個、10,000個、11,000個、12,000個、13,000個、14,000個、15,000個、16,000個、17,000個、18,000個、19,000個或20,000個）核糖核苷酸。線性多核糖核苷酸的長度可以為，例如至少500個、至少1,000個、至少2,000個、至少3,000個、至少4,000個或至少5,000個核糖核苷酸。 環狀多核糖核苷酸

在一些實施方式中，本發明的特徵在於環狀多核糖核苷酸。環狀多核糖核苷酸可以包括連接5’外顯子和3’外顯子的剪接點。如本文所述之靶區域可以存在於如本文所述之環狀多核糖核苷酸的任何區域。環狀多核糖核苷酸可能例如在剪接之後缺乏內含子。

環狀多核苷酸可以進一步包含多核糖核苷酸負載物。多核糖核苷酸負載物可以包含表現序列、非編碼序列、或表現序列和非編碼序列的組合。多核糖核苷酸負載物可以包含編碼多肽的表現序列。多核糖核苷酸可以包含與編碼多肽的表現序列可操作地連接的IRES。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸進一步包括IRES與5'外顯子片段或3'外顯子片段之間的間隔子區域。間隔子區域的長度可以為例如至少5個（例如至少10個、至少15個、至少20個）核糖核苷酸。間隔子區域可以為例如5至500個（例如10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450或500個）核糖核苷酸。在一些實施方式中，間隔子區域包括聚A序列。在一些實施方式中，間隔子區域包括聚A-C、聚A-G、聚A-U或其他異源或隨機序列。

在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸為至少約20個核苷酸、至少約30個核苷酸、至少約40個核苷酸、至少約50個核苷酸、至少約75個核苷酸、至少約100個核苷酸、至少約200個核苷酸、至少約300個核苷酸、至少約400個核苷酸、至少約500個核苷酸、至少約1,000個核苷酸、至少約2,000個核苷酸、至少約5,000個核苷酸、至少約6,000個核苷酸、至少約7,000個核苷酸、至少約8,000個核苷酸、至少約9,000個核苷酸、至少約10,000個核苷酸、至少約12,000個核苷酸、至少約14,000個核苷酸、至少約15,000個核苷酸、至少約16,000個核苷酸、至少約17,000個核苷酸、至少約18,000個核苷酸、至少約19,000個核苷酸或至少約20,000個核苷酸。

在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸可以具有足夠的大小以容納核糖體的結合位點。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸的大小係足以編碼有用的多肽的長度，並且因此可以產生至少20,000個核苷酸、至少15,000個核苷酸、至少10,000個核苷酸、至少7,500個核苷酸或至少5,000個核苷酸、至少4,000個核苷酸、至少3,000個核苷酸、至少2,000個核苷酸、至少1,000個核苷酸、至少500個核苷酸、至少1400個核苷酸、至少300個核苷酸、至少200個核苷酸、至少100個核苷酸的長度。

在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包含一或多個本文所述之元件。在一些實施方式中，該等元件可以藉由間隔子序列彼此隔開。在一些實施方式中，該等元件可以被1個核糖核苷酸、2個核苷酸、約5個核苷酸、約10個核苷酸、約15個核苷酸、約20個核苷酸、約30個核苷酸、約40個核苷酸、約50個核苷酸、約60個核苷酸、約80個核苷酸、約100個核苷酸、約150個核苷酸、約200個核苷酸、約250個核苷酸、約300個核苷酸、約400個核苷酸、約500個核苷酸、約600個核苷酸、約700個核苷酸、約800個核苷酸、約900個核苷酸、約1000個核苷酸、最多約1 kb、至少約1000個核苷酸、或其間任意量的核苷酸彼此隔開。在一些實施方式中，一或多個元件彼此鄰接，例如缺少間隔子元件。

在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸可以包含一或多個重複元件。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包含一或多個本文所述之修飾。在一個實施方式中，環狀多核糖核苷酸含有至少一個核苷修飾。在一個實施方式中，高達100%的環狀多核糖核苷酸的核苷被修飾。在一個實施方式中，至少一個核苷修飾係尿苷修飾或腺苷修飾。

作為其環化的結果，環狀多核糖核苷酸可能包括某些使其差異於線性多核糖核苷酸的特徵。例如，環狀多核糖核苷酸可以含有比線性多核糖核苷酸更易接近或更難接近的靶區域。在一些實施方式中，與線性多核糖核苷酸相比，環狀多核糖核苷酸可能較不易被核酸外切酶降解。這樣，環狀多核糖核苷酸可以比線性多核糖核苷酸更穩定，尤其是在核酸外切酶存在下孵育時。環狀多核糖核苷酸與線性多核糖核苷酸相比增加的穩定性使得環狀多核糖核苷酸作為產生多肽的細胞轉化試劑更加有用，並且與線性多核糖核苷酸相比，存儲更容易且時間更長。可以使用本領域標準的方法測試用核酸外切酶處理的環狀多核糖核苷酸的穩定性，該方法確定是否已經發生RNA降解（例如，藉由凝膠電泳）。此外，與線性多核糖核苷酸不同，當環狀多核糖核苷酸與磷酸酶諸如小牛腸磷酸酶一起孵育時，環狀多核糖核苷酸可能不太容易去磷酸化。 多核糖核苷酸負載物

本文所述之多核糖核苷酸負載物包括包含至少一個多核糖核苷酸的任何序列。在一些實施方式中，多核糖核苷酸負載物包括表現序列、非編碼序列、或表現序列和非編碼序列。在一些實施方式中，多核糖核苷酸負載物包括編碼多肽的表現序列。在一些實施方式中，多核糖核苷酸負載物包括與編碼多肽的表現序列可操作地連接的IRES。在一些實施方式中，多核糖核苷酸負載物包括編碼對受試者具有生物學效應的多肽的表現序列。

例如，多核糖核苷酸負載物可以包括至少約40個核苷酸、至少約50個核苷酸、至少約75個核苷酸、至少約100個核苷酸、至少約200個核苷酸、至少約300個核苷酸、至少約400個核苷酸、至少約500個核苷酸、至少約1,000個核苷酸、至少約2,000個核苷酸、至少約5,000個核苷酸、至少約6,000個核苷酸、至少約7,000個核苷酸、至少約8,000個核苷酸、至少約9,000個核苷酸、至少約10,000個核苷酸、至少約12,000個核苷酸、至少約14,000個核苷酸、至少約15,000個核苷酸、至少約16,000個核苷酸、至少約17,000個核苷酸、至少約18,000個核苷酸、至少約19,000個核苷酸、或至少約20,000個核苷酸。在一些實施方式中，多核糖核苷酸負載物包括1-20,000個核苷酸、1-10,000個核苷酸、1-5,000個核苷酸、100-20,000個核苷酸、100-10,000個核苷酸、100-5,000個核苷酸、500-20,000個核苷酸、500-10,000個核苷酸、500-5,000個核苷酸、1,000-20,000個核苷酸、1,000-10,000個核苷酸或1,000-5,000個核苷酸。

在實施方式中，多核糖核苷酸負載物包括一或多個表現（或編碼）序列，其中每個表現（或編碼）序列編碼多肽。在實施方式中，多核糖核苷酸負載物包括一或多個非編碼序列。在實施方式中，多核糖核苷酸負載物完全由一或多個非編碼序列組成。在實施方式中，多核糖核苷酸負載物包括表現（或編碼）和非編碼序列的組合。

在一些實施方式中，如本文所述製備的多核糖核苷酸用作治療或農業中的效應子。例如，可以向受試者投與藉由本文所述之方法（例如，本文所述之無細胞的方法）製備的環狀多核糖核苷酸（例如，在藥物、獸用、或農業組成物中）。在另一實例中，可將藉由本文所述之方法（例如，本文所述之無細胞方法）製備的環狀多核糖核苷酸遞送到細胞。

在一些實施方式中，多核糖核苷酸包括如PCT公開案號WO 2019/118919中揭露的任何特徵或特徵的任何組合，該文獻特此藉由援引以其全文併入。

在一些實施方式中，多核糖核苷酸負載物包括開讀框。在一些實施方式中，開讀框與IRES可操作地連接。開讀框可以編碼RNA或多肽。在一些實施方式中，開讀框編碼多肽，並且例如與編碼多肽的線性多核糖核苷酸相比，多核糖核苷酸（例如，環狀多核糖核苷酸）提供增加的多肽表現（例如，增加至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%或更多）。在一些實施方式中，例如與環狀和線性多核糖核苷酸的群體相比，多核糖核苷酸（例如，環狀多核糖核苷酸）的純度增加促使多肽的表現增加（例如，增加至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%或更多）。 多肽表現序列

在一些實施方式中，本文所述之多核糖核苷酸（例如，環狀多核糖核苷酸的多核糖核苷酸負載物）包括一或多個表現（或編碼）序列，其中每個表現序列編碼多肽。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個表現（或編碼）序列。

每個編碼的多肽可為直鏈或支鏈的。在實施方式中，多肽具有約5至約40,000個胺基酸、約15至約35,000個胺基酸、約20至約30,000個胺基酸、約25至約25,000個胺基酸、約50至約20,000個胺基酸、約100至約15,000個胺基酸、約200至約10,000個胺基酸、約500至約5,000個胺基酸、約1,000至約2,500個胺基酸或它們之間的任何範圍的長度。在一些實施方式中，長度少於約40,000個胺基酸、少於約35,000個胺基酸、少於約30,000個胺基酸、少於約25,000個胺基酸、少於約20,000個胺基酸、少於約15,000個胺基酸、少於約10,000個胺基酸、少於約9,000個胺基酸、少於約8,000個胺基酸、少於約7,000個胺基酸、少於約6,000個胺基酸、少於約5,000個胺基酸、少於約4,000個胺基酸、少於約3,000個胺基酸、少於約2,500個胺基酸、少於約2,000個胺基酸、少於約1,500個胺基酸、少於約1,000個胺基酸、少於約900個胺基酸、少於約800個胺基酸、少於約700個胺基酸、少於約600個胺基酸、少於約500個胺基酸、少於約400個胺基酸、少於約300個胺基酸或更少的多肽可能是有用的。

本文包括的多肽可包括天然存在的多肽或非天然存在的多肽。在一些實施方式中，該多肽係或包括參考多肽的功能性片段或變體（例如，酶的酶活性片段或變體）。例如，該多肽可為本文所述之任一多肽的功能活性變體，例如在指定區域或整個序列上與本文所述之多肽或天然存在的多肽的序列具有至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一性。在一些情況下，多肽可以與目的蛋白具有至少50%（例如，至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、97%、99%、或更大）同一性。

多肽的一些實例包括但不限於螢光標籤或標誌物、抗原、治療性多肽、植物修飾多肽、或用於農業應用的多肽。

治療性多肽可為激素、神經傳遞質、生長因子、酶（例如，氧化還原酶、代謝酶、粒線體酶、加氧酶、脫氫酶、ATP非依賴性酶、溶酶體酶、去飽和酶）、細胞介素、抗原結合多肽（例如，抗原結合抗體或抗體樣片段，諸如單鏈抗體、奈米抗體或其他含有Ig重鏈或輕鏈的多肽）、Fc融合蛋白、抗凝劑、血液因子、骨成形性蛋白質、干擾素、白介素和血栓溶解劑。

用於農業應用的多肽可為細菌素、溶素、抗微生物多肽、抗真菌多肽、根瘤富含C的肽、細菌細胞調節肽、肽毒素、殺蟲多肽（例如，殺蟲多肽或殺線蟲多肽）、抗原結合多肽（例如，抗原結合抗體或抗體樣片段，諸如單鏈抗體、奈米抗體或其他含有Ig重鏈或輕鏈的多肽）、酶（例如，核酸酶、澱粉酶、纖維素酶、肽酶、脂酶、幾丁質酶）、肽傳訊素和轉錄因子。

在一些情況下，多核糖核苷酸表現非人蛋白。

在一些實施方式中，多核糖核苷酸表現抗體，例如抗體片段或其部分。在一些實施方式中，由環狀多核糖核苷酸表現的抗體可為任何同種型的，如IgA、IgD、IgE、IgG、IgM。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸表現抗體的一部分，如輕鏈、重鏈、Fc片段、CDR（互補決定區）、Fv片段、或Fab片段、其另外的部分。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸表現抗體的一或多個部分。例如，環狀多核糖核苷酸可以包括多於一個表現序列，其中每一個表現抗體的一部分，並且其總和可以構成該抗體。在一些情況下，環狀多核糖核苷酸包括一個編碼抗體重鏈的表現序列和另一個編碼抗體輕鏈的表現序列。在一些情況下，當環狀多核糖核苷酸在細胞或無細胞環境中表現時，輕鏈和重鏈可以經受適當的修飾、折疊或其他翻譯後修飾以形成功能性抗體。

在實施方式中，多肽包括多個多肽，例如，一個多肽序列的多個拷貝、或多個不同的多肽序列。在實施方式中，多個多肽藉由連接子胺基酸或間隔胺基酸連接。

在實施方式中，多核苷酸負載物包括編碼訊息肽的序列。已經描述了許多訊息肽序列，例如，Tat（雙精胺酸易位）訊息序列通常是含有共有SRRxFLK「雙精胺酸」模體的N末端肽序列，其用於將含有這種Tat訊息肽的折疊蛋白易位穿過脂質雙層。還參見例如，在www[dot]signalpeptide[dot]de上可公開獲得的訊息肽數據庫。訊息肽也可用於將蛋白質導向特定的細胞器；參見例如，Spdb訊息肽數據庫中揭露的實驗確定和計算預測的訊息肽，該數據庫可在proline.bic.nus.edu.sg/spdb公開獲得。

在實施方式中，多核苷酸負載物包括編碼細胞穿透肽（CPP）的序列。已經描述了數百個CPP序列；參見例如，細胞穿透肽數據庫CPPsite，可在crdd.osdd.net/raghava/cppsite/上公開獲得。常用的CPP序列的實例係聚精胺酸序列，例如八精胺酸或九精胺酸，其可以融合到CGI肽的C端。

在實施方式中，多核苷酸負載物包括編碼自組裝肽的序列；參見例如，Miki等人. (2021) Nature Communications [自然通訊], 21:3412, DOI: 10.1038/s41467-021-23794-6。

在一些實施方式中，表現序列包括聚A序列（例如，在表現序列的3’末端）。在一些實施方式中，聚A序列的長度大於10個核苷酸。在一個實施方式中，聚A序列的長度大於15個核苷酸（例如，至少或大於約10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1,000、1,100、1,200、1,300、1,400、1,500、1,600、1,700、1,800、1,900、2,000、2,500和3,000個核苷酸）。在一些實施方式中，根據國際專利公開案號WO 2019/118919 A1的[0202]-[0204]中對聚A序列的描述來設計聚A序列，將其藉由援引以其全文併入本文。在一些實施方式中，表現序列缺少聚A序列（例如，在表現序列的3’末端）。

在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括聚A、缺少聚A或具有經修飾的聚A以調節環狀多核糖核苷酸的一或多種特徵。在一些實施方式中，缺少聚A或具有修飾的聚A的環狀多核糖核苷酸改善一或多種功能特性，例如免疫原性（例如免疫或炎症響應的一或多種標記物的水平）、半衰期和/或表現效率。 治療性多肽

在一些實施方式中，本文所述之多核糖核苷酸（例如，環狀多核糖核苷酸的多核糖核苷酸負載物）包括至少一個編碼治療性多肽的表現序列。治療性多肽係當向受試者投與或在受試者中表現時提供一些治療性益處的多肽。向受試者投與或在受試者中表現治療性多肽可用於治療或預防疾病、障礙或病症或其症狀。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸編碼兩種、三種、四種、五種、六種、七種、八種、九種、十種或更多種治療性多肽。

在一些實施方式中，多核糖核苷酸包括編碼治療性蛋白的表現序列。該蛋白可治療有需要的受試者的疾病。在一些實施方式中，治療性蛋白可以補償有需要的受試者中突變的、表現不足的或缺少的蛋白。在一些實施方式中，治療性蛋白可以靶向有需要的受試者中的細胞、組織或病毒，與有需要的受試者中的細胞、組織或病毒相互作用或結合。

治療性多肽可為可以從細胞分泌或定位於細胞的細胞質、細胞核或膜區室的多肽。

治療性多肽可為激素、神經傳遞質、生長因子、酶（例如，氧化還原酶、代謝酶、粒線體酶、加氧酶、脫氫酶、ATP非依賴性酶、溶酶體酶、去飽和酶）、細胞介素、轉錄因子、抗原結合多肽（例如，抗原結合抗體或抗體樣片段，諸如單鏈抗體、奈米抗體或其他含有Ig重鏈或輕鏈的多肽）、Fc融合蛋白、抗凝劑、血液因子、骨成形性蛋白質、干擾素、白介素、血栓溶解劑、抗原（例如，腫瘤、病毒或細菌抗原）、核酸酶（例如，核酸內切酶，諸如Cas蛋白，例如Cas9）、膜蛋白（例如，嵌合抗原受體（CAR）、跨膜受體、G蛋白偶合受體（GPCR）、受體酪胺酸激酶（RTK）、抗原受體、離子通道或膜運輸蛋白）、分泌蛋白、基因編輯蛋白（例如，CRISPR-Cas、TALEN或鋅指）或基因書寫蛋白（參見例如，國際專利公開案號WO 2020/047124，該文獻藉由援引以其全文併入本文）。

在一些實施方式中，治療性多肽係抗體，例如，全長抗體、抗體片段、或其一部分。在一些實施方式中，由多核糖核苷酸（例如，環狀多核糖核苷酸）表現的抗體可為任何同種型的，例如IgA、IgD、IgE、IgG、IgM。在一些實施方式中，多核糖核苷酸表現抗體的一部分，如輕鏈、重鏈、Fc片段、CDR（互補決定區）、Fv片段、或Fab片段、其另外的部分。在一些實施方式中，多核糖核苷酸表現抗體的一或多個部分。例如，多核糖核苷酸可以包括多於一個表現序列，其中每一個表現抗體的一部分，並且其總和可以構成該抗體。在一些情況下，多核糖核苷酸包括一個編碼抗體重鏈的表現序列和另一個編碼抗體輕鏈的表現序列。當多核糖核苷酸在細胞中表現時，輕鏈和重鏈可以經受適當的修飾、折疊或其他翻譯後修飾以形成功能性抗體。

在一些實施方式中，如本文所述製備的多核糖核苷酸（例如，環狀多核糖核苷酸）在療法或農業中用作效應子。例如，可向受試者投與藉由本文所述之方法製備的多核糖核苷酸（例如，在藥物、獸用或農業組成物中）。在實施方式中，受試者係脊椎動物（例如哺乳動物、鳥、魚、爬蟲類或兩棲類）。在實施方式中，受試者係人。在實施方式中，方法受試者係非人哺乳動物。在實施方式中，受試者係非人哺乳動物，諸如非人靈長類動物（例如猴、猿類）、有蹄類動物（例如家牛、水牛、綿羊、山羊、豬、駱駝、駱馬、羊駝、鹿、馬、驢）、肉食動物（例如狗、貓）、齧齒動物（例如大鼠、小鼠）或兔類動物（例如兔）。在實施方式中，受試者係鳥，諸如鳥類類群雞形目（例如雞、火雞、野雞、鵪鶉）、雁形目（例如鴨、鵝）、古顎下綱（例如鴕鳥、鴯鶓）、鴿形目（例如鴿子、家鴿）或鸚形目（例如鸚鵡）的成員。在實施方式中，該受試者係無脊椎動物，如節肢動物（例如，昆蟲、蛛形綱、甲殼動物）、線蟲、環節動物、蠕蟲、或軟體動物。在實施方式中，受試者係無脊椎動物農業有害生物或者寄生在無脊椎動物或脊椎動物宿主上的無脊椎動物。在實施方式中，受試者係植物，諸如被子植物（其可為雙子葉植物或單子葉植物）或裸子植物（例如針葉樹、蘇鐵、買麻藤類植物、銀杏）、蕨類、木賊草、石松屬或苔蘚植物。在實施方式中，受試者係真核藻類（單細胞或多細胞）。在實施方式中，受試者係具有農業或園藝重要性的植物，諸如行間作物、生產水果的植物和樹木、蔬菜、樹木以及觀賞植物（包括觀賞花、灌木、樹木、地被植物和草皮草）。 植物修飾多肽

在一些實施方式中，本文所述之多核糖核苷酸（例如，多核糖核苷酸的多核糖核苷酸負載物）包括至少一個編碼植物修飾多肽的表現序列。植物修飾多肽係指可以以使得植物生理學或表現型發生變化（例如，植物的適應度增加或降低）的方式改變植物的遺傳特性（例如，增加基因表現、降低基因表現或者以其他方式改變DNA或RNA的核苷酸序列）、表觀遺傳特性或者生理學或生物化學特性的多肽。在一些實施方式中，多核糖核苷酸編碼兩種、三種、四種、五種、六種、七種、八種、九種、十種或更多種不同的植物修飾多肽，或者一或多種植物修飾多肽的多個拷貝。植物修飾多肽可改變多種植物的生理學或表現型或者增加或降低多種植物的適應度，或者可為在一或多種特定植物（例如，特定物種或屬的植物）中實現這種改變的多肽。

可以用於本文的多肽的實例可以包括酶（例如，代謝重組酶、解旋酶、整合酶、RNAse、DNAse或泛蛋白化蛋白）、成孔蛋白、傳訊配體、細胞穿透肽、轉錄因子、受體、抗體、奈米抗體、基因編輯蛋白（例如，CRISPR-Cas核酸內切酶、TALEN或鋅指）、核醣蛋白、蛋白質適體或伴護蛋白。 農業多肽

在一些實施方式中，本文所述之多核糖核苷酸（例如，多核糖核苷酸的多核糖核苷酸負載物）包括至少一個編碼農業多肽的表現序列。農業多肽係適合於農業用途的多肽。在實施方式中，將農業多肽投與於植物或種子（例如，藉由葉噴、撒粉、注射或種子包衣）或者植物環境（例如，藉由土壤澆灌或顆粒土壤投與），從而使得植物的生理學、表現型或適應度改變。農業多肽的實施方式包括改變寄宿於植物或非人動物宿主中或寄宿於其上的一或多種微生物的水平、活性或代謝的多肽，該改變導致該宿主的適應度提高。在一些實施方式中，農業多肽係植物多肽。在一些實施方式中，農業多肽係昆蟲多肽。在一些實施方式中，當與非人類脊椎動物、無脊椎動物、微生物或植物細胞接觸時，農業多肽具有生物學作用。

在一些實施方式中，多核糖核苷酸編碼兩種、三種、四種、五種、六種、七種、八種、九種、十種或更多種農業多肽，或者一或多種農業多肽的多個拷貝。

可用於農業應用的多肽的實施方式包括例如細菌素、溶素、抗微生物肽、根瘤富含C的肽和細菌細胞調節肽。此類多肽可以用於改變靶微生物的水平、活性或代謝以增加昆蟲（諸如蜜蜂和蠶）的適應度。農業上有用的多肽的實施方式包括肽毒素，諸如由昆蟲病原線蟲細菌（例如，蘇雲金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）、發光光桿狀菌（Photorhabdus luminescens）、嗜蟲沙雷氏菌（Serratia entomophila）或嗜線蟲致病桿菌（Xenorhabdus nematophila））天然產生的那些，如本領域已知的。農業上有用的多肽的實施方式包括用於控制農業上重要的有害生物或病原體的多肽（包括小肽，諸如環二肽或二酮哌𠯤），例如用於控制植物中的疾病的抗微生物多肽或抗真菌多肽，或用於控制無脊椎有害生物諸如昆蟲或線蟲的殺蟲多肽（例如，殺昆蟲多肽或殺線蟲多肽）。農業上有用的多肽的實施方式包括抗體、奈米抗體、及其片段，例如，保留完整抗體或奈米抗體的至少一些（例如，至少10%）特異性結合活性的抗體或奈米抗體片段。農業上有用的多肽的實施方式包括轉錄因子，例如，植物轉錄因子；參見例如，列出了在模式植物阿拉伯芥（Arabidopsis thaliana）中鑒定的轉錄因子家族的「AtTFDB」數據庫，其可在agris-knowledgebase[dot]org/AtTFDB/上公開獲得。農業上有用的多肽的實施方式包括核酸酶，例如核酸外切酶或核酸內切酶（例如，Cas核酸酶，諸如Cas9或Cas12a）。農業上有用的多肽的實施方式進一步包括細胞穿透肽、酶（例如，澱粉酶、纖維素酶、肽酶、脂酶、幾丁質酶）、肽傳訊素（例如，酵母交配傳訊素、無脊椎動物生殖和幼蟲傳訊傳訊素，參見例如Altstein (2004) Peptides [肽], 25:1373-1376）。

如本文所用，「增加受試者的適應度」或「促進受試者的適應度」係指由於投與本文所述之肽或多肽而產生的生理學上或受試生物進行的任何活動的任何有利的改變，包括但不限於以下希望效果中之任何一或多種：(1) 對生物或非生物脅迫的耐受性提高；(2) 產率或生物量提高；(3) 開花時間調整；(4) 對有害生物或病原體的抗性提高；(4) 對除草劑的抗性提高；(5) 受試生物群體增加；(6) 受試生物的繁殖速率提高；(7) 受試生物的活動能力增強；(8) 受試生物的體重增加；(9) 受試生物的代謝速率或活性提高；(10) 授粉增加；(11) 受試生物的產量提高；(12) 受試生物的營養物含量提高；(13) 受試生物對殺有害生物劑的抗性提高；或 (14) 受試生物（例如，人或非人動物）的健康狀況改善或疾病減少。相比於未投與調節劑的受試生物，可以確定宿主適應度的提高。相反地，「降低受試者的適應度」係指由於投與本文所述之肽或多肽而產生的生理學的或受試生物進行的任何活動的任何不利的改變，包括但不限於以上列出的效果中之任何一或多種的降低。 內部核糖體進入位址

在一些實施方式中，本文所述之多核糖核苷酸包括一或多個內部核糖體進入位址（IRES）元件。在一些實施方式中，IRES與一或多個表現序列可操作連接（例如，每個IRES與一或多個表現序列可操作連接）。在實施方式中，IRES位於異源啟動子與編碼序列的5'端之間。

包括在多核糖核苷酸中的合適的IRES元件包括能夠接合真核核糖體的RNA序列。在一些實施方式中，IRES元件係至少約5 nt、至少約8 nt、至少約9 nt、至少約10 nt、至少約15 nt、至少約20 nt、至少約25 nt、至少約30 nt、至少約40 nt、至少約50 nt、至少約100 nt、至少約200 nt、至少約250 nt、至少約350 nt或至少約500 nt。

在一些實施方式中，IRES元件源自生物體的DNA，該生物體包括但不限於病毒、哺乳動物和果蠅。此類病毒DNA可以衍生自但不限於小RNA病毒互補DNA（cDNA）、腦心肌炎病毒（EMCV）cDNA和脊髓灰白質炎病毒cDNA。在一個實施方式中，衍生IRES元件的果蠅DNA包括但不限於來自黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）的觸角足基因。

在一些實施方式中，如果存在，IRES序列係以下病毒的IRES序列：套拉症（Taura syndrome）病毒、錐鼻蟲屬（Triatoma）病毒、泰勒氏腦脊髓炎病毒（Theiler’s encephalomyelitis virus）、猿猴病毒40、入侵紅火蟻（Solenopsis invicta）病毒1、稻麥蚜（Rhopalosiphum padi）病毒、網狀內皮細胞增生症病毒、福爾曼脊髓灰白質炎病毒（fuman poliovirus）1、普勞提婭失速腸病毒（Plautia stall intestine virus）、喀什米爾蜜蜂病毒、人鼻病毒2（HRV-2）、假桃病毒葉蟬病毒（Homalodisca coagulata virus）-1、人類免疫缺乏病毒1型、假桃病毒葉蟬病毒-1、Himetobi P病毒、C型肝炎病毒、A型肝炎病毒、GB型肝炎病毒、口蹄疫病毒、人類腸道病毒71、馬鼻炎病毒、茶尺蠖小RNA病毒（Ectropis obliqua picorna-like virus）、腦心肌炎病毒（EMCV）、果蠅C病毒、十字組花科煙草病毒、蟋蟀麻痹病毒、牛病毒性腹瀉病毒1、黑皇后細胞病毒、蚜蟲致死性麻痹病毒、禽腦脊髓炎病毒（AEV）、急性蜜蜂毒引發之麻痺病毒、朱槿黃脈嵌紋病毒（Hibiscus chlorotic ringspot virus）、豬瘟病毒、人FGF2、人SFTPA1、人AML1/RUNX1、果蠅觸角足、人AQP4、人AT1R、人BAG-l、人BCL2、人BiP、人c-IAPl、人c-myc、人eIF4G、小鼠NDST4L、人LEF1、小鼠HIF1α、人n.myc、小鼠Gtx、人p27kipl、人PDGF2/c-sis、人p53、人Pim-l、小鼠Rbm3、果蠅reaper、犬Scamper、果蠅Ubx、人UNR、小鼠UtrA、人VEGF-A、人XIAP、薩里病毒（Salivirus）、科薩病毒（Cosavirus）、副腸孤病毒（Parechovirus）、果蠅無毛、釀酒酵母（S. cerevisiae）TFIID、釀酒酵母YAP1、人c-src、人FGF-l、猿猴小RNA病毒、蕪菁皺縮病毒（Turnip crinkle virus）、愛知病毒、克羅希病毒、腸道細胞病變性人類孤兒病毒11、eIF4G適體、柯沙奇病毒（Coxsackievirus）B3（CVB3）或柯沙奇病毒A（CVB1/2）。在又另一實施方式中，IRES係柯沙奇B3病毒（CVB3）的IRES序列。在另外的實施方式中，IRES係腦心肌炎病毒（EMCV）的IRES序列。在另外的實施方式中，IRES係蒂勒腦脊髓炎病毒的IRES序列。

在一些實施方式中，與野生型IRES序列相比，IRES序列具有經修飾的序列。在一些實施方式中，當野生型IRES的最後一個核苷酸不是胞嘧啶核酸殘基時，修飾野生型IRES序列的最後一個核苷酸，使得其係胞嘧啶殘基。例如，在一些實施方式中，IRES序列可為CVB3 IRES序列，其中將末端腺苷殘基修飾為胞嘧啶殘基。

在一些實施方式中，IRES序列係腸道病毒71（EV17）IRES，其中將EV17 IRES序列的末端鳥苷殘基修飾為胞嘧啶殘基。

在一些實施方式中，多核糖核苷酸包括側接至少一個（例如2、3、4、5個或更多個）表現序列的至少一個IRES。在一些實施方式中，IRES側接至少一個（例如2、3、4、5或更多個）表現序列的兩側。在一些實施方式中，多核糖核苷酸在每個表現序列的一側或兩側包括一或多個IRES序列，導致所得的一或多種肽和或一或多種多肽的隔開。

在一些實施方式中，本文所述之多核糖核苷酸包括IRES（例如，與編碼區可操作地連接的IRES）。例如，多核糖核苷酸可以包括如在以下中描述的任何IRES：Chen等人 Mol. Cell [分子細胞] 81(20):4300-18, 2021；Jopling等人 Oncogene [致癌基因] 20:2664-70, 2001；Baranick等人 PNAS [美國國家科學院院刊]105(12):4733-38, 2008；Lang等人 Molecular Biology of the Cell [細胞分子生物學] 13(5):1792-1801, 2002；Dorokhov等人 PNAS [美國國家科學院院刊] 99(8):5301-06, 2002；Wang等人 Nucleic Acids Research [核酸研究] 33(7):2248-58, 2005；Petz等人 Nucleic Acids Research [核酸研究] 35(8):2473-82, 2007；Chen等人 Science [科學] 268:415-417, 1995；Fan等人 Nature Communication [自然通訊]13(1):3751-3765, 2022，以及國際公開案號WO 2021/263124，其各自特此藉由援引以其全文併入。 調節元件

在一些實施方式中，本文所述之多核糖核苷酸（例如，多核糖核苷酸的多核糖核苷酸負載物）包括一或多個調節元件。在一些實施方式中，多核糖核苷酸包括調節元件，例如修飾多核糖核苷酸內表現序列的表現的序列。

調節元件可以包括位置與編碼表現產物的表現序列相鄰的序列。調節元件可與相鄰序列可操作連接。如與不存在調節元件時表現的產物的量相比，調節元件可以增加表現的產物的量。另外，一個調節元件可增加串聯附接的多個表現序列表現的產物的量或數目。因此，一種調節元件可以增強一或多個表現序列的表現。也可以使用多種調節元件，例如，差異性地調控不同表現序列的表現。

在一些實施方式中，調節元件係翻譯調節子。翻譯調節子可以調節多核糖核苷酸中表現序列的翻譯。翻譯調節子可為翻譯強化子或翻譯抑制子。在一些實施方式中，多核糖核苷酸包括與至少一個表現序列相鄰的至少一個翻譯調節子。在一些實施方式中，多核糖核苷酸包括與每個表現序列相鄰的翻譯調節子。在一些實施方式中，翻譯調節子存在於每個表現序列的一側或兩側，導致表現產物例如肽和/或多肽的分離。

在一些實施方式中，調節元件係微小RNA（miRNA）或miRNA結合位點。

調節元件的其他實例在例如國際專利公開案號WO 2019/118919的第[0154]-[0161]段中描述，該文獻特此藉由援引以其全文併入。 翻譯起始序列

在一些實施方式中，本文所述之多核糖核苷酸（例如，多核糖核苷酸的多核糖核苷酸負載物）包括至少一個翻譯起始序列。在一些實施方式中，多核糖核苷酸包括與表現序列可操作地連接的翻譯起始序列。

在一些實施方式中，多核糖核苷酸編碼多肽並且可包括翻譯起始序列，例如起始密碼子。在一些實施方式中，翻譯起始序列包括科札克（Kozak）序列或薩思-達爾加諾（Shine-Dalgamo）序列。在一些實施方式中，多核糖核苷酸包括與表現序列相鄰的翻譯起始序列，例如科札克序列。在一些實施方式中，翻譯起始序列係非編碼起始密碼子。在一些實施方式中，翻譯起始序列（例如科札克序列）存在於每個表現序列的一側或兩側，導致表現產物的隔開。在一些實施方式中，多核糖核苷酸包括與表現序列相鄰的至少一個翻譯起始序列。在一些實施方式中，翻譯起始序列為多核糖核苷酸提供構象柔性。在一些實施方式中，翻譯起始序列在多核糖核苷酸的基本上單股的區域內。在國際專利公開案號WO 2019/118919的段落[0163] - [0165]中描述了翻譯起始序列的其他實例，該專利特此藉由援引以其全文併入。

多核糖核苷酸可包括多於1個起始密碼子，諸如但不限於至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少11個、至少12個、至少13個、至少14個、至少15個、至少16個、至少17個、至少18個、至少19個、至少20個、至少25個、至少30個、至少35個、至少40個、至少50個、至少60個或多於60個起始密碼子。翻譯可以在第一個起始密碼子上起始或可以在第一個起始密碼子的下游起始。

在一些實施方式中，多核糖核苷酸可在不是第一個起始密碼子的密碼子（例如AUG）處起始。多核糖核苷酸的翻譯可以起始於替代的翻譯起始序列，如但不限於ACG、AGG、AAG、CTG/CUG、GTG/GUG、ATA/AUA、ATT/AUU、TTG/UUG。在一些實施方式中，翻譯在選擇性條件（例如，應激誘導條件）下在替代性翻譯起始序列處開始。作為非限制性實例，多核糖核苷酸的翻譯可在替代性翻譯起始序列（諸如ACG）處開始。作為另一非限制性實例，多核糖核苷酸翻譯可以在替代的翻譯起始序列CTG/CUG處開始。作為另一非限制性實例，多核糖核苷酸翻譯可以在替代的翻譯起始序列GTG/GUG處開始。作為另一非限制性實例，多核糖核苷酸可以在重複相關的非AUG（RAN）序列，如包括短段的重複RNA（例如CGG、GGGGCC、CAG、CTG）的替代的翻譯起始序列處開始翻譯。 終止元件

在一些實施方式中，本文所述之多核糖核苷酸（例如，多核糖核苷酸的多核糖核苷酸負載物）包括至少一個終止元件。在一些實施方式中，多核糖核苷酸包括與表現序列可操作地連接的終止元件。在一些實施方式中，多核苷酸缺少終止元件。

在一些實施方式中，多核糖核苷酸包括一或多個表現序列，並且每個表現序列可具有或可不具有終止元件。在一些實施方式中，多核糖核苷酸包括一或多個表現序列，並且表現序列缺少終止元件，使得多核糖核苷酸被連續翻譯。終止元件的排除可導致表現產物的滾環翻譯或連續表現。

在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括一或多個表現序列，並且每個表現序列可具有或可不具有終止元件。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括一或多個表現序列，並且表現序列缺少終止元件，使得環狀多核糖核苷酸被連續翻譯。由於缺少核糖體停滯或脫落，終止元件的排除可能導致表現產物例如肽或多肽的滾環翻譯或連續表現。在這樣的實施方式中，滾環翻譯藉由每個表現序列來表現連續表現產物。在一些其他實施方式中，表現序列的終止元件可為交錯元件的一部分。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸中之一或多個表現序列包括終止元件。然而，在環狀多核糖核苷酸中進行滾環翻譯或後繼（例如，第二、第三、第四、第五等）表現序列的表現。在此類情況下，當核糖體遇到終止元件（例如，終止密碼子）並終止翻譯時，表現產物可以從核糖體上脫落。在一些實施方式中，在核糖體例如核糖體的至少一個亞基與環狀多核糖核苷酸保持接觸時翻譯終止。

在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸在一或多個表現序列的末端包括終止元件。在一些實施方式中，一或多個表現序列包括兩個或更多個連續的終止元件。在此類實施方式中，翻譯終止並且滾環翻譯終止。在一些實施方式中，核糖體與環狀多核糖核苷酸完全脫離。在一些此類實施方式中，在環狀多核糖核苷酸中後繼（例如，第二、第三、第四、第五等）表現序列的產生可能需要核糖體在起始翻譯之前與環狀多核糖核苷酸重新接合。通常，終止元件包括發出翻譯終止訊息的框內核苷酸三聯體，例如UAA、UGA、UAG。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸中之一或多個終止元件係移碼終止元件，諸如但不限於可終止翻譯的框外或-1和+1移碼讀框（例如，隱藏終止子）。框移位的終止元件包括出現在表現序列的第二讀框和第三讀框中的核苷酸三聯體，TAA、TAG和TGA。框移位的終止元件可能對防止通常對細胞有害的mRNA誤讀很重要。在一些實施方式中，終止元件係終止密碼子。

在國際專利公開案號WO 2019/118919的段落[0169] - [0170]中描述了終止元件的其他實例，該國際專利公開特此藉由援引以其全文併入。 非翻譯區

在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括非翻譯區（UTR）。包括基因的基因組區域的UTR可以轉錄但不翻譯。在一些實施方式中，UTR可以被包括在本文所述之表現序列的翻譯起始序列的上游。在一些實施方式中，UTR可以被包括在本文所述之表現序列的下游。在一些情況下，第一表現序列的一個UTR與第二表現序列的另一個UTR相同或連續或重疊。

在國際專利公開案號WO 2019/118919的段落[0197] - [201]中描述了示例性非翻譯區，該專利公開特此藉由援引以其全文併入。

在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括聚A序列。在國際專利公開案號WO 2019/118919的段落[0202] - [0205]中描述了示例性聚A序列，該專利公開特此藉由援引以其全文併入。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸缺少聚A序列。

在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括內嵌有一段或多段的腺苷和尿苷的UTR。該等AU增濃簽名可能會增加表現產物的轉化率。

富含UTR AU的元件（ARE）的引入、去除或修飾可用於調節環狀多核糖核苷酸的穩定性或免疫原性（例如，免疫或炎性響應的一或多種標誌物的水平）。工程化特定的環狀多核糖核苷酸時，可以將ARE的一或多個拷貝引入環狀多核糖核苷酸中，並且ARE的該等拷貝可以調節表現產物的翻譯和/或產生。同樣，可以對ARE進行鑒別和去除或工程化至環狀多核糖核苷酸以調節細胞內穩定性，從而影響所得蛋白質的翻譯和產生。

應當理解，可以將來自任何基因的任何UTR摻入環狀多核糖核苷酸的相應側翼區中。

在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸缺少5'-UTR，並且能夠從其一或多個表現序列表現蛋白。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸缺少3'-UTR，並且能夠從其一或多個表現序列表現蛋白。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸缺少聚A序列，並且能夠從其一或多個表現序列表現蛋白。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸缺少終止元件，並且能夠從其一或多個表現序列表現蛋白。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸缺少內部核糖體進入位址，並且能夠從其一或多個表現序列表現蛋白。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸缺少帽，並且能夠從其一或多個表現序列表現蛋白。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸缺少5'-UTR、3'-UTR和IRES，並且能夠從其一或多個表現序列表現蛋白。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸進一步包括以下序列中之一或多個：編碼一或多個miRNA的序列、編碼一或多個複製蛋白的序列、編碼外源基因的序列、編碼治療劑的序列、調節元件（例如翻譯調節子，例如翻譯強化子或抑制子）、翻譯起始序列、靶向內源基因（例如，siRNA、lncRNA、shRNA）的一或多種調節核酸和編碼治療性mRNA或蛋白質的序列。

在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸缺少5'-UTR。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸缺少3'-UTR。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸缺少聚A序列。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸缺少終止元件。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸缺少內部核糖體進入位址。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸缺少核酸外切酶的降解易感性。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸缺少降解易感性的事實可能意味著環狀多核糖核苷酸不被核酸外切酶降解，或在僅存在核酸外切酶時被降解的有限程度例如與不存在核酸外切酶時相當或相似。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸不被核酸外切酶降解。在一些實施方式中，當暴露於核酸外切酶時，環狀多核糖核苷酸降解減少。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸缺少與帽結合蛋白的結合。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸缺少5’帽。 交錯元件

在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括與表現序列相鄰的至少一個交錯元件。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括與每個表現序列相鄰的交錯元件。在一些實施方式中，交錯元件存在於每個表現序列的一側或兩側，導致表現產物例如一或多種肽和/或一或多種多肽的分離。在一些實施方式中，交錯元件係一或多個表現序列的一部分。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包含一或多個表現序列，並且該一或多個表現序列中之每一個藉由環狀多核糖核苷酸上的交錯元件與後繼的表現序列隔開。在一些實施方式中，交錯元件阻止 (a) 單個表現序列的兩輪翻譯或 (b) 兩個或更多個表現序列的一輪或多輪翻譯生成單個多肽。在一些實施方式中，交錯元件係與該一或多個表現序列隔開的序列。在一些實施方式中，交錯元件包括該一或多個表現序列的表現序列的一部分。

在國際專利公開案號WO 2019/118919的段落[0172] - [0175]中描述了交錯元件的實例，該專利公開特此藉由援引以其全文併入。 非編碼序列

在一些實施方式中，本文所述之多核糖核苷酸（例如，多核糖核苷酸的多核糖核苷酸負載物）包括一或多個非編碼序列，例如不編碼多肽表現的序列。在一些實施方式中，多核糖核苷酸包括兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或多於十個非編碼序列。在一些實施方式中，多核糖核苷酸不編碼多肽表現序列。

非編碼序列可為天然的或合成的序列。在一些實施方式中，非編碼序列可以改變細胞行為，如例如淋巴球行為。在一些實施方式中，該非編碼序列對於細胞RNA序列係反義的。

在一些實施方式中，多核糖核苷酸包括調節核酸，該等調節核酸係通常約5-500鹼基對（bp）的RNA或RNA樣結構（取決於特定RNA結構，例如，miRNA 5-30 bp，lncRNA 200-500 bp）並且可具有與細胞內表現的靶基因中的編碼序列相同（互補）或幾乎相同（基本上互補）的核鹼基序列。在實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括編碼可以被加工成較小RNA的RNA先質（例如，可以被加工成較小miRNA中間體或成熟miRNA的約50至約1000 bp的miRNA先質）的調節核酸。

長非編碼RNA（lncRNA）被定義為長於100個核苷酸的非蛋白編碼轉錄物。許多lncRNA被表徵為具有組織特異性。在與附近的蛋白編碼基因相反的方向上轉錄的不同lncRNA占很大比例（例如，在哺乳動物基因組中占總lncRNA的約20%）並且可能調節附近的基因的轉錄。在一個實施方式中，本文提供的多核糖核苷酸包括lncRNA的有義鏈。在一個實施方式中，本文提供的多核糖核苷酸包括lncRNA的反義鏈。 蛋白質結合序列

在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括一或多個蛋白質結合位點，使得蛋白質例如核糖體能夠結合至RNA序列中的內部位點。藉由將蛋白質結合位點（例如核糖體結合位點）工程化至環狀多核糖核苷酸中，環狀多核糖核苷酸可以逃避或更少地被宿主的免疫系統檢測到，藉由掩蔽宿主免疫系統成分中的環狀多核糖核苷酸來調節降解或調節翻譯。

在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括至少一個免疫蛋白結合位點，例如用於逃避免疫響應，例如CTL（細胞毒性T淋巴球）響應。在一些實施方式中，免疫蛋白結合位點係結合至免疫蛋白並有助於將環狀多核糖核苷酸掩蔽為外源的核苷酸序列。在一些實施方式中，免疫蛋白結合位點係結合至免疫蛋白並有助於將環狀多核糖核苷酸隱藏為外源或外來的核苷酸序列。

核糖體與線性RNA接合的傳統機制包括核糖體與RNA的加帽5'端的結合。從5’端，核糖體遷移到起始密碼子，於是形成第一肽鍵。根據本揭露，環狀多核糖核苷酸的翻譯的內部起始（即，不依賴帽）不需要游離末端或加帽端。準確的說，核糖體結合至未加帽的內部位點，由此核糖體在起始密碼子處開始多肽延長。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸包括一或多個RNA序列，該RNA序列包括核糖體結合位點，例如起始密碼子。

天然5'UTR具有在翻譯起始中起作用的特徵。它們帶有類似科札克序列的簽名，該等序列眾所周知參與核糖體起始多種基因的翻譯的過程。科札克序列具有共有CCR(A/G)CCAUGG（SEQ ID NO: 1），其中R係起始密碼子（AUG）的三個鹼基上游的嘌呤（腺嘌呤或鳥嘌呤），後接另一個「G」。還已知5'UTR形成參與延長因子結合的二級結構。

在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸編碼與蛋白質結合的蛋白質結合序列。在一些實施方式中，蛋白質結合序列靶向環狀多核糖核苷酸或將其定位至特定靶標。在一些實施方式中，蛋白結合序列特異性結合蛋白的精胺酸增濃區。

在一些實施方式中，蛋白質結合位點包括但不限於與蛋白質的結合位點，如ACIN1、AGO、APOBEC3F、APOBEC3G、ATXN2、AUH、BCCIP、CAPRIN1、CELF2、CPSF1、CPSF2、CPSF6、CPSF7、CSTF2、CSTF2T、CTCF、DDX21、DDX3、DDX3X、DDX42、DGCR8、EIF3A、EIF4A3、EIF4G2、ELAVL1、ELAVL3、FAM120A、FBL、FIP1L1、FKBP4、FMR1、FUS、FXR1、FXR2、GNL3、GTF2F1、HNRNPA1、HNRNPA2B1、HNRNPC、HNRNPK、HNRNPL、HNRNPM、HNRNPU、HNRNPUL1、IGF2BP1、IGF2BP2、IGF2BP3、ILF3、KHDRBS1、LARP7、LIN28A、LIN28B、m6A、MBNL2、METTL3、MOV10、MSI1、MSI2、NONO、NONO-、NOP58、NPM1、NUDT21、PCBP2、POLR2A、PRPF8、PTBP1、RBFOX2、RBM10、RBM22、RBM27、RBM47、RNPS1、SAFB2、SBDS、SF3A3、SF3B4、SIRT7、SLBP、SLTM、SMNDC1、SND1、SRRM4、SRSF1、SRSF3、SRSF7、SRSF9、TAF15、TARDBP、TIA1、TNRC6A、TOP3B、TRA2A、TRA2B、U2AF1、U2AF2、UNK、UPF1、WDR33、XRN2、YBX1、YTHDC1、YTHDF1、YTHDF2、YWHAG、ZC3H7B、PDK1、AKT1和任何其他結合RNA的蛋白質。 間隔子序列

在一些實施方式中，本文所述之多核糖核苷酸包括一或多個間隔子序列。間隔子係指在兩個相鄰多核苷酸區域之間提供距離或柔性的任何連續核苷酸序列（例如，一或多個核苷酸的連續核苷酸序列）。間隔子可以存在於本文所述之任一核酸元件之間。間隔子還可以存在於本文所述核酸元件內。

間隔子的長度可以為例如至少5個（例如至少10個、至少15個、至少20個）核糖核苷酸。在一些實施方式中，每個間隔子區域的長度為至少5個（例如至少10個、至少15個、至少20個）核糖核苷酸。每個間隔子區域的長度可以為例如5至500個（例如10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450或500個）核糖核苷酸。第一間隔子區、第二間隔子區、或第一間隔子區和第二間隔子區可包括聚A序列。第一間隔子區、第二間隔子區、或第一間隔子區和第二間隔子區可包括聚A-C序列。在一些實施方式中，第一間隔子區、第二間隔子區、或第一間隔子區和第二間隔子區包括聚A-G序列。在一些實施方式中，第一間隔子區、第二間隔子區、或第一間隔子區和第二間隔子區包括聚A-T序列。在一些實施方式中，第一間隔子區、第二間隔子區、或第一間隔子區和第二間隔子區包括隨機序列。

間隔子也可存在於本文所述之核酸區域內。例如，多核苷酸負載物區可包括一或多個間隔子。間隔子可以隔開多核苷酸負載物內的區域。

在一些實施方式中，間隔子序列的長度可為，例如，至少10個核苷酸、至少15個核苷酸、或至少30個核苷酸。在一些實施方式中，間隔子序列的長度係至少7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25或30個核苷酸。在一些實施方式中，間隔子序列的長度係不多於100、90、80、70、60、50、45、40、35或30個核苷酸。在一些實施方式中，間隔子序列的長度係20至50個核苷酸。在某些實施方式中，間隔子序列的長度係10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個核苷酸。

間隔子序列可為聚A序列、聚A-C序列、聚C序列、或聚U序列。

在一些實施方式中，間隔子序列可為聚A-T、聚A-C、聚A-G或隨機序列。

間隔子序列可用於將IRES與相鄰結構元件隔開，以保證IRES或相鄰元件的結構和功能。可以根據IRES將間隔子特異性工程化。在一些實施方式中，可以利用RNA折疊電腦軟體（如RNAFold）指導載體的各種元件（包括間隔子）的設計。

在一些實施方式中，多核糖核苷酸包括5'間隔子序列（例如，在5'退火區域與多核糖核苷酸負載物之間）。在一些實施方式中，5'間隔子序列的長度係至少10個核苷酸。在另一實施方式中，5'間隔子序列的長度係至少15個核苷酸。在另外的實施方式中，5'間隔子序列的長度係至少30個核苷酸。在一些實施方式中，5'間隔子序列的長度係至少7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25或30個核苷酸。在一些實施方式中，5’間隔子序列的長度不超過100、90、80、70、60、50、45、40、35或30個核苷酸。在一些實施方式中，5'間隔子序列的長度係在20與50個核苷酸之間。在某些實施方式中，5'間隔子序列的長度係10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個核苷酸。在一個實施方式中，5'間隔子序列係聚A-C序列。在另一實施方式中，5'間隔子序列係聚A-C序列。在一些實施方式中，5'間隔子序列包括聚A-G序列。在一些實施方式中，5'間隔子序列包括聚A-T序列。在一些實施方式中，5'間隔子序列包括隨機序列。

在一些實施方式中，多核糖核苷酸包括3'間隔子序列（例如，在3'退火區域與多核糖核苷酸負載物之間）。在一些實施方式中，3'間隔子序列的長度係至少10個核苷酸。在另一實施方式中，3'間隔子序列的長度係至少15個核苷酸。在另一個實施方式中，3'間隔子序列的長度係至少30個核苷酸。在一些實施方式中，3'間隔子序列的長度係至少7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25或30個核苷酸。在一些實施方式中，3'間隔子序列的長度不超過100、90、80、70、60、50、45、40、35或30個核苷酸。在一些實施方式中，3'間隔子序列的長度係20至50個核苷酸。在某些實施方式中，3'間隔子序列的長度係10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個核苷酸。在一個實施方式中，3'間隔子序列係聚A序列。在另一實施方式中，5'間隔子序列係聚A-C序列。在一些實施方式中，5'間隔子序列包括聚A-G序列。在一些實施方式中，5'間隔子序列包括聚A-T序列。在一些實施方式中，5'間隔子序列包括隨機序列。

在一個實施方式中，多核糖核苷酸包括5'間隔子序列，但不包括3'間隔子序列。在另一實施方式中，多核糖核苷酸包括3'間隔子序列，但不包括5'間隔子序列。在另一實施方式中，多核糖核苷酸既不包括5'間隔子序列，也不包括3'間隔子序列。在另一實施方式中，多核糖核苷酸不包括IRES序列。在另外的實施方式中，多核糖核苷酸不包括IRES序列、5'間隔子序列或3'間隔子序列。

在一些實施方式中，間隔子序列包括至少3個核糖核苷酸、至少4個核糖核苷酸、至少5個核糖核苷酸、至少約8個核糖核苷酸、至少約10個核糖核苷酸、至少約12個核糖核苷酸、至少約15個核糖核苷酸、至少約20個核糖核苷酸、至少約25個核糖核苷酸、至少約30個核糖核苷酸、至少約40個核糖核苷酸、至少約50個核糖核苷酸、至少約60個核糖核苷酸、至少約70個核糖核苷酸、至少約80個核糖核苷酸、至少約90個核糖核苷酸、至少約100個核糖核苷酸、至少約120個核糖核苷酸、至少約150個核糖核苷酸、至少約200個核糖核苷酸、至少約250個核糖核苷酸、至少約300個核糖核苷酸、至少約400個核糖核苷酸、至少約500個核糖核苷酸、至少約600個核糖核苷酸、至少約700個核糖核苷酸、至少約800個核糖核苷酸、至少約900個核糖核苷酸或至少約100個核糖核苷酸。生物反應器

在一些實施方式中，本文所述之任何純化多核糖核苷酸（例如，環狀多核糖核苷酸）的方法都可以在生物反應器中進行。生物反應器係指在其中進行化學或生物學過程的任何容器，該過程涉及生物或衍生自此類生物的生物化學活性物質。生物反應器可以與本文所述之用於純化或產生環狀RNA的無細胞的方法相容。用於生物反應器的容器可包括培養瓶、培養皿或培養袋，它們可為一次性使用的（一次性的）、可高壓滅菌的或可滅菌的。生物反應器可以由玻璃製成，或者其也可為基於聚合物的，或者其也可以由其他材料製成。

生物反應器的實例包括但不限於攪拌罐（例如，充分混合的）生物反應器和管式（例如，活塞流）生物反應器、氣升式生物反應器、膜攪拌罐、旋轉過濾攪拌罐、振動混合器、流體化床反應器、和膜生物反應器。操作生物反應器的模式可為間歇的或連續的過程。當試劑和產物流連續地進出系統時，生物反應器係連續的。間歇式生物反應器可以具有連續的再循環流，但沒有連續的試劑進料或產物收穫。

本揭露之一些方法涉及大規模生產多核糖核苷酸。對於大規模產生方法，該方法可在1升（L）至50 L或更大（例如，5 L、10 L、15 L、20 L、25 L、30 L、35 L、40 L、45 L、50 L或更大）的體積中進行。在一些實施方式中，該方法可在5 L至10 L、5 L至15 L、5 L至20 L、5 L至25 L、5 L至30 L、5 L至35 L、5 L至40 L、5 L至45 L、10 L至15 L、10 L至20 L、10 L至25 L、20 L至30 L、10 L至35 L、10 L至40 L、10 L至45 L、10 L至50 L、15 L至20 L、15 L至25 L、15 L至30 L、15 L至35 L、15 L至40 L、15 L至45 L或15至50 L的體積中進行。

在一些實施方式中，生物反應器可生產至少1 g RNA。在一些實施方式中，生物反應器可生產1-200 g的RNA（例如，1-10 g、1-20 g、1-50 g、10-50 g、10-100 g、50-100 g或50-200 g的RNA）。在一些實施方式中，產生的量係每升（例如，每升1-200 g）、每批次或反應（例如，每批次或反應1-200 g）或每單位時間（例如，每小時或每天1-200 g）測量的。

在一些實施方式中，可串聯使用多於一個生物反應器以增加產生能力（例如，可串聯使用一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個或九個生物反應器）。 使用方法

在一些實施方式中，如本文所述製備的多核糖核苷酸（例如，環狀多核糖核苷酸）在療法或農業中用作效應子。

例如，可以向受試者投與藉由本文所述之方法純化的多核糖核苷酸（例如，在藥物、獸用、或農業組成物中）。在一些實施方式中，受試者係脊椎動物（例如哺乳動物、鳥、魚、爬蟲類或兩棲類）。在一些實施方式中，受試者係人。在一些實施方式中，受試者係非人哺乳動物。在實施方式中，受試者係非人哺乳動物，諸如非人靈長類動物（例如猴、猿類）、有蹄類動物（例如家牛、水牛、綿羊、山羊、豬、駱駝、駱馬、羊駝、鹿、馬、驢）、肉食動物（例如狗、貓）、齧齒動物（例如大鼠、小鼠）或兔類動物（例如兔）。在實施方式中，受試者係鳥，諸如鳥類類群雞形目（例如雞、火雞、野雞、鵪鶉）、雁形目（例如鴨、鵝）、古顎下綱（例如鴕鳥、鴯鶓）、鴿形目（例如鴿子、家鴿）或鸚形目（例如鸚鵡）的成員。在實施方式中，受試者係無脊椎動物，諸如節肢動物（例如昆蟲、蛛形類、甲殼類動物）、線蟲、環節動物、蠕蟲或軟體動物。在實施方式中，受試者係無脊椎動物農業有害生物或者寄生在無脊椎動物或脊椎動物宿主上的無脊椎動物。在實施方式中，受試者係植物，諸如被子植物（其可為雙子葉植物或單子葉植物）或裸子植物（例如針葉樹、蘇鐵、買麻藤類植物、銀杏）、蕨類、木賊草、石松屬或苔蘚植物。在實施方式中，受試者係真核藻類（單細胞或多細胞）。在實施方式中，受試者係具有農業或園藝重要性的植物，諸如行間作物、生產水果的植物和樹木、蔬菜、樹木以及觀賞植物（包括觀賞花、灌木、樹木、地被植物和草皮草）。

在一些實施方式中，本揭露提供了一種藉由向受試者提供本文所述之組成物或配製物來改變受試者的方法。在一些實施方式中，組成物或配製物係或包括核酸分子（例如，本文所述之DNA分子或RNA分子），並且向真核受試者提供多核苷酸。在一些實施方式中，組成物或配製物係或包括包含本文所述之核酸的真核或原核細胞。

在一些實施方式中，本揭露提供了一種藉由向有需要的受試者提供本文所述之組成物或配製物來治療受試者的病症之方法。在一些實施方式中，組成物或配製物係或包括核酸分子（例如，本文所述之DNA分子或多核糖核苷酸），並且向真核受試者提供多核苷酸。在一些實施方式中，組成物或配製物係或包括包含本文所述之核酸的真核或原核細胞。

在一些實施方式中，本揭露提供了一種藉由向受試者提供包含本文所述之多核苷酸的真核或原核細胞來向受試者提供多核糖核苷酸（例如，環狀多核糖核苷酸）的方法。 配製物

在本揭露之一些實施方式中，本文所述之多核糖核苷酸（例如，環狀多核糖核苷酸）可被配製在組成物中，例如用於遞送到細胞、植物、無脊椎動物、非人脊椎動物或人類受試者的組成物，例如農業、獸用或藥物組成物。在一些實施方式中，多核糖核苷酸被配製在藥物組成物中。在一些實施方式中，組成物包含多核糖核苷酸和稀釋劑、載劑、佐劑或它們的組合。在特定實施方式中，組成物包含本文所述之多核糖核苷酸和載劑或不含任何載劑的稀釋劑。在一些實施方式中，包括多核糖核苷酸和不含任何載劑的稀釋劑的組成物用於將多核糖核苷酸（例如，環狀多核糖核苷酸）裸遞送給受試者。

藥物組成物可視需要地包含一或多種額外活性物質，例如治療和/或預防活性物質。藥物組成物可以視需要地包含充當本文所述之組成物（例如，包含環狀多核糖核苷酸之組成物）的媒介物或介質的非活性物質，諸如由美國食品和藥品管理局（United States Food and Drug Administration）（FDA）批准並且在非活性成分數據中列出的任一種非活性成分。本發明之藥物組成物可為無菌的和/或無熱原的。可在以下文獻中找到藥劑的配製和/或生產中的總體考慮：例如，Remington: The Science and Practice of Pharmacy [雷明頓：藥學科學與實踐]第21版, Lippincott Williams & Wilkins, 2005（藉由援引併入本文）。非活性物質的非限制性實例包括溶劑、水溶劑、非水溶劑、分散介質、稀釋劑、分散體、懸浮助劑、界面活性劑、等滲劑、增稠劑、乳化劑、防腐劑、聚合物、肽、蛋白質、細胞、玻醣醛酸酶、分散劑、製粒劑、崩散劑、黏結劑、緩衝劑（例如，磷酸鹽緩衝液（PBS））、潤滑劑、油、及其混合物。

儘管本文提供的藥物組成物的描述主要針對適合於投與至人的藥物組成物，但是熟悉該項技術者應理解，此類組成物適合於投與至任何其他動物，例如非人動物，例如非人哺乳動物。為了使組成物適合於投與於各種動物而對適合於投與於人的藥物組成物的修飾係熟知的，並且普通獸醫藥理師可僅藉由普通實驗（如果有的話）來設計和/或進行此種修飾。我們設想向其投與藥物組成物的受試者包括但不限於人類和/或其他靈長類動物；哺乳動物，包括商業相關的哺乳動物，如牛、豬、馬、綿羊、貓、狗、小鼠和/或大鼠；和/或鳥類，包括商業相關的鳥類，如家禽、雞、鴨、鵝和/或火雞。

本文所述之藥物組成物的配製物可藉由藥理學領域中已知的或以後開發的任何方法來製備。通常，這樣的製備方法包括以下步驟：使活性成分與賦形劑和/或一或多種其他輔助成分結合，並且然後，如果必要和/或期望的話，將產品分開、成形和/或包裝。

在一些實施方式中，製劑中存在的線性多核糖核苷酸分子的量的參考標準係存在不多於1 ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml、15 ng/ml、20 ng/ml、25 ng/ml、30 ng/ml、35 ng/ml、40 ng/ml、50 ng/ml、60 ng/ml、70 ng/ml、80 ng/ml、90 ng/ml、100 ng/ml、200 ng/ml、300 ng/ml、400 ng/ml、500 ng/ml、600 ng/ml、1 µg/ ml、10 µg/ml、50 µg/ml、100 µg/ml、200 g/ml、300 µg/ml、400 µg/ml、500 µg/ml、600 µg/ml、700 µg/ml、800 µg/ml、900 µg/ml、1 mg/ml、1.5 mg/ml或2 mg/ml的線性多核糖核苷酸分子。

在一些實施方式中，關於製劑中存在的環狀多核糖核苷酸分子的量的參考標準係占藥物製劑中的總核糖核苷酸分子至少30%（w/w）、40%（w/w）、50%（w/w）、60%（w/w）、70%（w/w）、80%（w/w）、85%（w/w）、90%（w/w）、91%（w/w）、92%（w/w）、93%（w/w）、94%（w/w）、95%（w/w）、96%（w/w）、97%（w/w）、98%（w/w）、99%（w/w）、99.1%（w/w）、99.2%（w/w）、99.3%（w/w）、99.4%（w/w）、99.5%（w/w）、99.6%（w/w）、99.7%（w/w）、99.8%（w/w）、99.9%（w/w）、或100%（w/w）的分子。

在一些實施方式中，關於製劑中存在的線性多核糖核苷酸分子的量的參考標準係占藥物製劑中的總核糖核苷酸分子不超過0.5%（w/w）、1%（w/w）、2%（w/w）、5%（w/w）、10%（w/w）、15%（w/w）、20%（w/w）、25%（w/w）、30%（w/w）、40%（w/w）、50%（w/w）的線性多核糖核苷酸分子。

在一些實施方式中，關於製劑中存在的帶切口多核糖核苷酸分子的量的參考標準係占藥物製劑中的總核糖核苷酸分子不超過0.5%（w/w）、1%（w/w）、2%（w/w）、5%（w/w）、10%（w/w）、或15%（w/w）的帶切口多核糖核苷酸分子。

在一些實施方式中，關於製劑中存在的組合的帶切口和線性多核糖核苷酸分子的量的參考標準係占藥物製劑中的總核糖核苷酸分子不超過0.5%（w/w）、1%（w/w）、2%（w/w）、5%（w/w）、10%（w/w）、15%（w/w）、20%（w/w）、25%（w/w）、30%（w/w）、40%（w/w）、50%（w/w）的組合的帶切口和線性多核糖核苷酸分子。在一些實施方式中，藥物製劑係最終環狀多核糖核苷酸成品藥的中間體藥物製劑。在一些實施方式中，藥物製劑係原料藥或活性藥物成分（API）。在一些實施方式中，藥物製劑係用於投與於受試者的成品藥。

在一些實施方式中，對環狀多核糖核苷酸的製劑（在減少線性RNA之前、期間或之後）進一步處理以基本上去除DNA、蛋白質污染物、雜質或副產物（例如，細胞蛋白質（例如宿主細胞蛋白質）或蛋白質製程雜質）、內毒素、單核苷酸分子和/或製程相關雜質。 防腐劑

本文提供的組成物或藥物組成物可以包括用於單次投與的材料，或者可以包括用於多次投與的材料（例如，「多劑量」套組（kit））。多核糖核苷酸可以線性或環狀形式存在。該組成物或藥物組成物可以包含一或多種防腐劑，諸如硫柳汞或2-苯氧乙醇。防腐劑可用於防止使用過程中的微生物污染。合適的防腐劑包括：氯化苯二甲烴銨、硫柳汞、氯丁醇、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、苯乙醇、依地酸二鈉、山梨酸、Onamer M或熟悉該項技術者已知的其他試劑。在眼科產品中，例如，此類防腐劑可以以0.004%至0.02%的含量採用。在本文所述之組成物中，防腐劑（例如氯化苯二甲烴銨）可以按重量計以0.001%至小於0.01%，例如0.001%至0.008%，較佳的是約0.005%的含量採用。

多核糖核苷酸可易受周圍環境中可能豐富的RNA酶的影響。本文提供的組成物可以包含抑制RNA酶活性的試劑，從而防止多核糖核苷酸降解。在一些情況下，該組成物或藥物組成物包含熟悉該項技術者已知的任何RNA酶抑制劑。替代性地或另外，可以在無RNA酶的環境中製備本文提供的組成物中的多核糖核苷酸和細胞穿透劑和/或藥學上可接受的稀釋劑或載劑、媒介物、賦形劑或其他試劑。該組成物可以在無RNA酶的環境中配製。

在一些情況下，本文提供的組成物可為無菌的。可以在本領域已知的合適的媒介物中將組成物配製成無菌溶液或懸浮液。可以藉由常規的已知滅菌技術對組成物進行滅菌，例如，可以對組成物進行無菌過濾。鹽

在一些情況下，本文提供的組成物或藥物組成物包含一或多種鹽。為了控制張度，本文提供的組成物可以包含生理鹽諸如鈉鹽。其他鹽可以包括氯化鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉和/或氯化鎂等。在一些情況下，該組成物與一或多種藥學上可接受的鹽一起配製。該一或多種藥學上可接受的鹽可以包括無機離子，諸如鈉、鉀、鈣、鎂離子等的那些鹽。此類鹽可以包括與無機酸或有機酸的鹽，該無機酸或有機酸諸如鹽酸、氫溴酸、磷酸、硝酸、硫酸、甲磺酸、對甲苯磺酸、乙酸、反丁烯二酸、琥珀酸、乳酸、苦杏仁酸、蘋果酸、檸檬酸、酒石酸或順丁烯二酸。多核糖核苷酸可以線性或環狀形式存在。 緩衝劑 /pH

本文提供的組成物或藥物組成物可以包含一或多種緩衝劑，諸如Tris緩衝劑；硼酸鹽緩衝劑；琥珀酸鹽緩衝劑；組胺酸緩衝劑（例如，含氫氧化鋁佐劑）；或檸檬酸鹽緩衝劑。在一些情況下，包含5-20 mM範圍內的緩衝劑。

本文提供的組成物或藥物組成物可以具有約5.0至約8.5、約6.0至約8.0、約6.5至約7.5、或約7.0至約7.8的pH。該組成物或藥物組成物可以具有約7的pH。多核糖核苷酸可以線性或環狀形式存在。 洗滌劑 / 界面活性劑

根據預期的投與途徑，本文提供的組成物或藥物組成物可以包含一或多種洗滌劑和/或界面活性劑，例如聚氧乙烯山梨醇酯界面活性劑（通常稱為「吐溫（Tween）」），例如聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80；以DOWFAX™商標出售的環氧乙烷（EO）、環氧丙烷（PO）和/或環氧丁烷（BO）的共聚物，諸如線性EO/PO嵌段共聚物；重複的乙氧基(氧基-1,2-乙二基)基團的數目可以變化的辛基酚聚醚，例如辛基酚聚醚-9（Triton X-100或三級辛基苯氧基聚乙氧基乙醇）；(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇（IGEPAL CA-630/NP-40）；磷脂，諸如磷脂醯膽鹼（卵磷脂）；壬基酚聚氧乙烯醚，諸如Tergitol™ NP系列；衍生自月桂醇、鯨蠟醇、硬脂醇和油醇的聚氧乙烯脂肪醚（稱為Brij界面活性劑），諸如三乙二醇單月桂基醚（Brij 30）；和山梨醇酯（通常稱為「SPAN」），諸如山梨糖醇酐三油酸酯（Span 85）和山梨糖醇酐單月桂酸酯、辛基酚聚醚（諸如辛基酚聚醚9（Triton X-100）或三級辛基苯氧基聚乙氧基乙醇）、十六烷基三甲基溴化銨（「CTAB」）或去氧膽酸鈉。該一或多種洗滌劑和/或界面活性劑可僅以痕量存在。在一些情況下，該組成物可以包含小於各1 mg/ml的辛基酚聚醚-10和聚山梨醇酯80。在本文中可使用非離子界面活性劑。界面活性劑可以按其「HLB」（親水/親脂平衡值）進行分類。在一些情況下，界面活性劑的HLB為至少10、至少15和/或至少16。多核糖核苷酸可以線性或環狀形式存在。 稀釋劑

在一些實施方式中，本揭露之組成物包含多核糖核苷酸和稀釋劑。在一些實施方式中，本揭露之組成物包含線性多核糖核苷酸和稀釋劑。

稀釋劑可為非載劑賦形劑。非載劑賦形劑用作組成物（諸如，如本文所述之環狀多核糖核苷酸）的媒介物或介質。非載劑賦形劑用作組成物（諸如，如本文所述之線性多核糖核苷酸）的媒介物或介質。非載劑賦形劑的非限制性實例包括溶劑、水溶劑、非水溶劑、分散介質、稀釋劑、分散劑、助懸劑、界面活性劑、等滲劑、增稠劑、乳化劑、防腐劑、聚合物、肽、蛋白質、細胞、玻醣醛酸酶、分散劑、製粒劑、崩散劑、黏合劑、緩衝劑（例如，磷酸鹽緩衝液（PBS））、潤滑劑、油及其混合物。非載劑賦形劑可為經美國食品和藥物管理局（FDA）批准並列在非活性成分數據庫中的不表現出細胞穿透作用的任一種非活性成分。非載劑賦形劑可為適於投與於非人動物（例如，適合獸醫用途）的任何非活性成分。為了使組成物適於向各種動物投與，對適於向人投與的組成物的修飾得到很好的理解，並且普通技術的獸醫藥理師可以僅藉由普通的實驗（如果有）來設計和/或進行此類修飾。

在一些實施方式中，多核糖核苷酸（例如，環狀多核糖核苷酸）可以以裸遞送配製物的形式遞送，諸如包含稀釋劑。裸遞送配製物將多核糖核苷酸遞送至細胞，無需藉助於載劑並且無需對多核糖核苷酸、加帽的多核糖核苷酸或其複合物進行修飾或部分或完全封裝。

裸遞送配製物係不含載劑的配製物並且其中多核糖核苷酸（例如，環狀多核糖核苷酸）沒有結合有助於遞送至細胞的部分的共價修飾，或者沒有對多核糖核苷酸的部分或完全封裝。在一些實施方式中，沒有結合有助於遞送至細胞的部分的共價修飾的多核糖核苷酸係未與蛋白質、小分子、顆粒、聚合物或生物聚合物共價結合的多核糖核苷酸。沒有結合有助於遞送至細胞的部分的共價修飾的多核糖核苷酸不含經修飾的磷酸基團。例如，沒有結合有助於遞送至細胞的部分的共價修飾的多核糖核苷酸不含硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、硼代磷酸鹽、硼代磷酸酯、磷酸氫鹽、胺基磷酸酯、二胺基磷酸酯、烷基或芳基膦酸酯或磷酸三酯。

在一些實施方式中，裸遞送配製物不含任何或所有轉染試劑、陽離子載劑、碳水化合物載劑、奈米顆粒載劑或蛋白質載劑。在一些實施方式中，裸遞送配製物不含植物糖原辛烯基琥珀酸酯、植物糖原β-糊精、酸酐修飾的植物糖原β-糊精、lipofectamine、聚乙烯亞胺、聚(三甲基亞胺)、聚(四甲基亞胺)、聚丙烯亞胺、胺基糖苷-聚胺、雙去氧-二胺基-b-環糊精、精胺、亞精胺、聚甲基丙烯酸(2-二甲基胺基)乙酯、聚(離胺酸)、聚(組胺酸)、聚(精胺酸)、陽離子明膠、樹狀聚合物、殼聚糖、1,2-二油醯基-3-三甲基銨-丙烷（DOTAP）、N-[1-(2,3-二油醯氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化銨（DOTMA）、1-[2-(油醯氧基)乙基]-2-油基-3-(2-羥乙基)咪唑鎓氯化物（DOTIM）、2,3-二油醯氧基-N-[2(精胺甲醯胺基)乙基]-N,N-二甲基-1-三氟乙酸丙銨（DOSPA）、3B-[N-(N\N'-二甲胺基乙烷)-胺基甲醯基]膽固醇鹽酸鹽（DC-膽固醇鹽酸鹽）、二十七烷基胺基甘胺醯基亞精胺（DOGS）、N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化銨（DDAB）、N-(1,2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羥乙基溴化銨（DMRIE）、N,N-二油基-N,N-二甲基氯化銨（DODAC）、人血清白蛋白（HSA）、低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白（HDL）或球蛋白。

在某些實施方式中，裸遞送配製物包括非載劑賦形劑。在一些實施方式中，非載劑賦形劑包括不表現出細胞穿透作用的非活性成分。在一些實施方式中，非載劑賦形劑包括緩衝液，例如PBS。在一些實施方式中，非載劑賦形劑係溶劑、非水溶劑、稀釋劑、助懸劑、界面活性劑、等滲劑、增稠劑、乳化劑、防腐劑、聚合物、肽、蛋白質、細胞、玻醣醛酸酶、分散劑、製粒劑、崩散劑、黏合劑、緩衝劑、潤滑劑或油。

在一些實施方式中，裸遞送配製物包括稀釋劑。稀釋劑可為液體稀釋劑或固體稀釋劑。在一些實施方式中，稀釋劑係RNA助溶劑、緩衝液或等滲劑。RNA助溶劑的實例包括水、乙醇、甲醇、丙酮、甲醯胺和2-丙醇。緩衝劑的實例包括2-(N-𠰌啉代)乙磺酸（MES）、Bis-Tris、2-[(2-胺基-2-氧乙基)-(羧甲基)胺基]乙酸（ADA）、N-(2-乙醯胺基)-2-胺基乙磺酸（ACES）、哌𠯤-N,N'-雙(2-乙磺酸)（PIPES）、2-[[1,3-二羥基-2-(羥甲基)丙-2-基]胺基]乙磺酸（TES）、3-(N-𠰌啉代)丙磺酸（MOPS）、4-(2-羥乙基)-1-哌𠯤乙磺酸（HEPES）、Tris、Tricine、Gly-Gly、Bicine或磷酸鹽。等滲劑的實例包括甘油、甘露醇、聚乙二醇、丙二醇、海藻糖或蔗糖。載劑

在一些實施方式中，本揭露之組成物包含環狀多核糖核苷酸和載劑。在一些實施方式中，本揭露之組成物包含線性多核糖核苷酸和載劑。

在某些實施方式中，組成物在囊泡或其他基於膜的載劑中包括如本文所述之環狀多核糖核苷酸。在某些實施方式中，組成物在囊泡或其他基於膜的載劑中包括如本文所述之線性多核糖核苷酸。

在其他實施方式中，組成物在細胞、囊泡或其他基於膜的載劑中或經由細胞、囊泡或其他基於膜的載劑包括環狀多核糖核苷酸。在其他實施方式中，組成物在細胞、囊泡或其他基於膜的載劑中或經由細胞、囊泡或其他基於膜的載劑包括線性多核糖核苷酸。在一個實施方式中，組成物在脂質體或其他類似囊泡中包括環狀多核糖核苷酸。在一個實施方式中，組成物在脂質體或其他類似囊泡中包括線性多核糖核苷酸。脂質體係球形囊泡結構，該等球形囊泡結構由圍繞內部水性間室的單層或多層的脂質雙層和相對不可滲透的外部親脂性磷脂雙層構成。脂質體可為陰離子的、中性的或陽離子的。脂質體具有生物相容性，無毒，可以遞送親水性和親脂性藥物分子，保護其貨物免受血漿酶的降解，並將其負載運輸穿過生物膜和血腦屏障（BBB）（有關綜述，參見，例如，Spuch和Navarro, Journal of Drug Delivery [藥物遞送雜誌], 第2011卷, 文章ID 469679, 第12頁, 2011. doi:10.1155/2011/469679）。

囊泡可以由若干種不同類型的脂質製成；然而，磷脂最常用於生成作為藥物載劑的脂質體。用於製備多層囊泡脂質的方法係本領域已知的（參見，例如美國專利案號6,693,086，其中涉及多層囊泡脂質製備的教導藉由援引併入本文）。儘管當脂質膜與水溶液混合時，囊泡形成可為自發的，但也可以藉由經由使用均質器、超音波波儀或擠壓設備以振盪的形式施加力來加快囊泡形成（關於綜述，參見例如，Spuch和Navarro, Journal of Drug Delivery [藥物遞送雜誌], 第2011卷, 文章ID 469679, 第12頁, 2011. doi:10.1155/2011/469679）。可以藉由擠出通過具有減小尺寸的過濾器來製備擠出的脂質，如Templeton等人, Nature Biotechnol [自然生物技術], 15:647-52, 1997中所述，該文獻關於擠出脂質製備的教導內容藉由援引併入本文。

在某些實施方式中，本揭露之組成物包含多核糖核苷酸和脂質奈米顆粒，例如本文所述之脂質奈米顆粒。在某些實施方式中，本揭露之組成物包含線性多核糖核苷酸和脂質奈米顆粒。脂質奈米顆粒係為如本文所述之多核糖核苷酸分子提供生物相容性和生物可降解遞送系統的載劑的另一實例。脂質奈米顆粒係為如本文所述之線性多核糖核苷酸分子提供生物相容性和可生物降解的遞送系統的載劑的另一實例。奈米結構化的脂質載劑（NLC）係經修飾的固體脂質奈米顆粒（SLN），該等經修飾的固體脂質奈米顆粒保留了SLN的特徵、改善了藥物穩定性和負載能力、並且防止了藥物滲漏。聚合物奈米顆粒（PNP）係藥物遞送的重要部分。該等奈米顆粒可以有效地指導藥物遞送至特定靶標並且提高藥物穩定性和藥物可控釋放。也可以採用脂質-聚合物奈米顆粒（PLN），即一種組合了脂質體和聚合物的新型載劑。該等奈米顆粒具有PNP和脂質體的互補優勢。PLN由核殼結構構成；聚合物核提供了穩定的結構，而磷脂殼提供了良好的生物相容性。因此，這兩種組分增加了藥物封裝率、促進了表面修飾、並且防止了水溶性藥物的滲漏。對於綜述，參見，例如，Li等人 2017, Nanomaterials [奈米材料] 7, 122；doi:10.3390/nano7060122。

載劑的其他非限制性實例包括碳水化合物載劑（例如，酸酐修飾的植物糖原或糖原型材料）、蛋白質載劑（例如，與多核糖核苷酸共價連接的蛋白質或與線性多核糖核苷酸共價連接的蛋白質）或陽離子載劑（例如，陽離子脂質聚合物或轉染試劑）。碳水化合物載劑的非限制性實例包括植物糖原辛烯基琥珀酸酯、植物糖原β-糊精和酸酐修飾的植物糖原β-糊精。陽離子載劑的非限制性實例包括lipofectamine、聚乙烯亞胺、聚(三亞甲基亞胺)、聚(四乙烯亞胺)、聚丙烯亞胺、胺基糖苷-多胺、雙去氧-二胺基-b-環糊精、精胺、亞精胺、聚(2-二甲胺基)乙基甲基丙烯酸酯、聚(離胺酸)、聚(組胺酸)、聚(精胺酸)、陽離子化明膠、樹狀聚合物、殼聚糖、1,2-二油醯基-3-三甲基銨-丙烷（DOTAP）、N-[1-(2,3-二油醯基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化銨（DOTMA）、1-[2-(油醯基氧基)乙基]-2-油烯基-3-(2-羥乙基)咪唑啉鎓氯化物（DOTIM）、2,3-二油醯基氧基-N-[2(精胺甲醯胺基)乙基]-N,N-二甲基-1-丙烷銨三氟乙酸酯（DOSPA）、3B-[N—(N\N'-二甲基胺基乙烷)-胺基甲醯基]膽固醇鹽酸鹽（DC-膽固醇鹽酸鹽）、雙十七烷基醯胺基甘胺醯亞精胺（DOGS）、N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化銨（DDAB）、N-(1,2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羥乙基溴化銨（DMRIE）、和N,N-二油烯基-N,N-二甲基氯化銨（DODAC）。蛋白質載劑的非限制性實例包括人血清白蛋白（HSA）、低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白（HDL）或球蛋白。

胞泌體也可用作本文所述之組成物或製劑的藥物遞送媒介物。胞泌體可用作本文所述之線性多核糖核苷酸組成物或製劑的藥物遞送媒介物。對於綜述，參見Ha等人 2016年7月. Acta Pharmaceutica Sinica B [藥學學報英文版] 第6卷, 第4期, 第287-96頁；doi.org/10.1016/j.apsb.2016.02.001。

離體分化的紅血球也可用作本文所述組成物或製劑的載劑。離體分化的紅血球也可用作本文所述之線性多核糖核苷酸組成物或製劑的載劑。參見，例如，國際專利公開案號WO 2015/073587；WO 2017/123646；WO 2017/123644；WO 2018/102740；WO 2016/183482；WO 2015/153102；WO 2018/151829；WO 2018/009838；Shi等人 2014. Proc Natl Acad Sci USA [美國國家科學院院刊]. 111(28): 10131-10136；美國專利9,644,180；Huang等人 2017. Nature Communications [自然通訊] 8: 423；Shi等人 2014. Proc Natl Acad Sci USA [美國國家科學院院刊]. 111(28): 10131-10136。

例如國際專利公開案號WO 2018/208728中所述之融合體組成物也可以用作載劑遞送本文所述之多核糖核苷酸分子。例如WO 2018/208728中所述之融合體組成物也可以用作載劑遞送本文所述之線性多核糖核苷酸分子。

病毒體和病毒樣顆粒（VLP）也可用作載劑來將本文所述之多核糖核苷酸分子遞送至靶細胞。病毒體和病毒樣顆粒（VLP）也可用作載劑將本文所述之線性多核糖核苷酸分子遞送至靶向的細胞。

例如國際專利公開案號WO 2011/097480、WO 2013/070324、WO 2017/004526或WO 2020/041784中所述之植物奈米囊泡和植物傳訊者包（PMP）也可用作載劑遞送本文所述之組成物或製劑。植物奈米囊泡和植物傳訊者包（PMP）也可用作載劑遞送本文所述之線性多核糖核苷酸組成物或製劑。

微泡也可用作載劑來遞送本文所述之多核糖核苷酸分子。微泡也可用作載劑遞送本文所述之線性多核糖核苷酸分子。參見，例如，US 7115583；Beeri, R.等人，Circulation. [循環] 2002年10月1日; 106(14):1756-1759；Bez, M.等人，Nat Protoc. [自然實驗手冊] 2019年4月; 14(4):1015-1026；Hernot, S.等人，Adv Drug Deliv Rev. [高級藥物遞送綜述] 2008年6月30日; 60(10):1153-1166；Rychak, J.J.等人，Adv Drug Deliv Rev. [高級藥物遞送綜述] 2014年6月; 72:82-93。在一些實施方式中，微泡係白蛋白包被的全氟化碳微泡。

包括本文所述多核糖核苷酸的載劑可包括多個顆粒。該等顆粒可具有30至700奈米的中值粒度（例如30至50、50至100、100至200、200至300、300至400、400至500、500至600、600至700、100至500、50至500或200至700奈米）。可以優化顆粒的大小以有利於包括環狀多核糖核苷酸在內的有效載荷沈積到細胞中。將多核糖核苷酸沈積到某些細胞類型中可有利於不同的粒度。例如，可以優化粒度以使多核糖核苷酸沈積到抗原呈現細胞中。可以優化粒度以將多核糖核苷酸沈積到樹突細胞中。另外，可以優化粒度以將多核糖核苷酸沈積到引流淋巴結細胞中。 脂質奈米顆粒

本揭露提供的組成物、方法和遞送系統可以採用本文所述之任何合適的載劑或遞送形式，在某些實施方式中包括脂質奈米顆粒（LNP）。在一些實施方式中，脂質奈米顆粒包括一或多種離子脂質，如非陽離子脂質（例如，中性或陰離子或兩性離子脂質）；一或多種軛合脂質（諸如WO 2019217941的表5中描述的PEG軛合的脂質或軛合至聚合物的脂質；其藉由援引以其全文併入本文）；一或多種固醇（例如，膽固醇）。

可用於形成奈米顆粒（例如，脂質奈米顆粒）的脂質包括例如WO 2019217941的表4中描述的那些，其藉由引用併入 — 例如，含脂質的奈米顆粒可包含WO 2019217941的表4中之一或多種脂質。脂質奈米顆粒可以包括另外的要素，諸如聚合物，諸如藉由援引併入的WO 2019217941的表5中描述的聚合物。

在一些實施方式中，軛合脂質，當存在時，可以包括以下的一或多種：PEG-二醯基甘油（DAG）（諸如l-(單甲氧基-聚乙二醇)-2,3-二肉豆蔻醯甘油（PEG-DMG））、PEG-二烷氧基丙基（DAA）、PEG-磷脂、PEG-神經醯胺（Cer）、聚乙二醇化磷脂醯乙醇胺（PEG-PE）、PEG琥珀酸二醯基甘油（PEGS-DAG）（諸如4-0-(2',3'-二(十四烷醯氧基)丙基-l-0-(w-甲氧基(聚乙氧基)乙基)丁二酸酯（PEG-S-DMG））、PEG二烷氧基丙基胺基甲酸酯、N-(羰基-甲氧基聚乙二醇2000)-1,2-二硬脂醯-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺鈉鹽，以及在WO 2019051289的表2中描述的那些（藉由援引併入）和前述的組合。

在一些實施方式中，可摻入脂質奈米顆粒中的固醇包括膽固醇或膽固醇衍生物中之一或多種，諸如藉由援引併入的WO 2009/127060或US 2010/0130588中的那些。另外的示例性固醇包括植物固醇，包括藉由援引併入本文的Eygeris等人(2020)，dx.doi.org/10.1021/acs.nanolett.0c01386中描述的那些。

在一些實施方式中，脂質顆粒包括可電離脂質、非陽離子脂質、抑制顆粒聚集的軛合脂質和固醇。該等組分的量可以獨立地變化，以獲得所需特性。例如，在一些實施方式中，脂質奈米顆粒包括可電離脂質、非陽離子脂質、軛合脂質和甾醇，該可電離脂質的量為總脂質的約20 mol %至約90 mol %（在其他實施方式中，該可電離脂質可為脂質奈米顆粒中存在的總脂質的20%-70%（mol）、30%-60%（mol）或40%-50%（mol）；約50 mol %至約90 mol %）；該非陽離子脂質的量為總脂質的約5 mol %至約30 mol %；該軛合脂質的量為總脂質的約0.5 mol %至約20 mol %，該甾醇的量為總脂質的約20 mol %至約50 mol %。總脂質與核酸的比率可以根據需要變化。例如，總脂質與核酸（質量或重量）的比率可為約10 : 1至約30 : 1。

在一些實施方式中，脂質與核酸的比率（質量/質量比率；w/w比）可處於約1 : 1至約25 : 1、約10 : 1至約14 : 1、約3 : 1至約15 : 1、約4 : 1至約10 : 1、約5 : 1至約9 : 1或約6 : 1至約9 : 1的範圍內。可以調節脂質和核酸的量以提供所需的N/P比，例如3、4、5、6、7、8、9、10或更高的N/P比。通常，脂質奈米顆粒配製物的總脂質含量可在約5 mg/ml至約30 mg/mL的範圍內。

可用於（例如，與其他脂質組分組合）形成用於遞送本文所述之組成物，例如本文所述之核酸（例如，RNA（例如，環狀多核糖核苷酸、線性多核糖核苷酸））的脂質奈米顆粒的脂質化合物的一些非限制性實例包括： (i)

在一些實施方式中，包含式 (i) 的LNP用於將本文所述之多核糖核苷酸（例如，環狀多核糖核苷酸、線性多核糖核苷酸）組成物遞送至細胞。 (ii)

在一些實施方式中，包含式 (ii) 的LNP用於將本文所述之多核糖核苷酸（例如，環狀多核糖核苷酸、線性多核糖核苷酸）組成物遞送至細胞。 (iii)

在一些實施方式中，包含式 (iii) 的LNP用於將本文所述之多核糖核苷酸（例如，環狀多核糖核苷酸、線性多核糖核苷酸）組成物遞送至細胞。 (iv) (v)

在一些實施方式中，包括式 (v) 的LNP用於將本文所述之多核糖核苷酸（例如，環狀多核糖核苷酸、線性多核糖核苷酸）組成物遞送至細胞。 (vi)

在一些實施方式中，包括式 (vi) 的LNP用於將本文所述之多核糖核苷酸（例如，環狀多核糖核苷酸、線性多核糖核苷酸）組成物遞送至細胞。 (vii) (viii)

在一些實施方式中，包括式 (viii) 的LNP用於將本文所述之多核糖核苷酸（例如，環狀多核糖核苷酸、線性多核糖核苷酸）組成物遞送至細胞。 (ix)

在一些實施方式中，包含式 (ix) 的LNP用於將本文所述之多核糖核苷酸（例如，環狀多核糖核苷酸、線性多核糖核苷酸）組成物遞送至細胞。 (x) 其中 X ¹係O、NR ¹或直接鍵，X ²係C2-5伸烷基，X ³係C(=O)或直接鍵，R ¹係H或Me，R ³係C1-3烷基，R ²係C1-3烷基，或R ²與它所附接的氮原子和X ²的1-3個碳原子一起形成4-員、5-員或6-員環，或X ¹係NR ¹，R ¹和R ²與它們所附接的氮原子一起形成5-員或6-員環，或R ²與R ³和它們所附接的氮原子一起形成5-員、6-員或7-員環，Y ¹係C2-12伸烷基，Y ²選自（在任一取向上），（在任一取向上），（在任一取向上）， n為0至3，R ⁴為C1-15烷基，Z ¹為C1-6伸烷基或直接鍵，（在任一取向上）或不存在，條件係如果Z ¹係直接鍵，則Z ²不存在； R ⁵係C5-9烷基或C6-10烷氧基，R ⁶係C5-9烷基或C6-10烷氧基，W係亞甲基或直接鍵，並且R ⁷係H或Me，或其鹽，條件係如果R ³和R ²係C2烷基，X ¹係O，X ²係直鏈C3伸烷基，X ³係C(=0)，Y ¹係直鏈Ce伸烷基，(Y ²)n-R ⁴是，R ⁴係直鏈C5烷基，Z ¹係C2伸烷基，Z ²不存在，W係亞甲基，並且R ⁷係H，則R ⁵和R ⁶不是Cx烷氧基。

在一些實施方式中，包含式 (xii) 的LNP用於將本文所述之多核糖核苷酸（例如，環狀多核糖核苷酸、線性多核糖核苷酸）組成物遞送至細胞。 (xi)

在一些實施方式中，包含式 (xi) 的LNP用於將本文所述之多核糖核苷酸（例如，環狀多核糖核苷酸、線性多核糖核苷酸）組成物遞送至細胞。其中R = (xii) (xiii) (xiv)

在一些實施方式中，LNP包括具有式 (xiii) 的化合物和具有式 (xiv) 的化合物。 (xv)

在一些實施方式中，包含式 (xv) 的LNP用於將本文所述之多核糖核苷酸（例如，環狀多核糖核苷酸、線性多核糖核苷酸）組成物遞送至細胞。 (xvi)

在一些實施方式中，包括具有式 (xvi) 配製物的LNP用於將本文所述之多核糖核苷酸（例如，環狀多核糖核苷酸、線性多核糖核苷酸）組成物遞送至細胞。 (xvii) 其中X = (xviii)(a) (xviii)(b) (xix)

在一些實施方式中，用於形成用於遞送本文所述之組成物，例如本文所述之核酸（例如，RNA（例如，環狀多核糖核苷酸、線性多核糖核苷酸））的脂質奈米顆粒的脂質化合物藉由以下反應之一製成： (xx)(a) (xx)(b)。

在一些實施方式中，包含式 (xxi) 的LNP用於將本文所述之多核糖核苷酸（例如，環狀多核糖核苷酸、線性多核糖核苷酸）組成物遞送至細胞。在一些實施方式中，式 (xxi) 的LNP係WO 2021113777描述的LNP（例如，式 (1) 的脂質，諸如WO 2021113777的表1的脂質）。 (xxi) 其中每個n獨立地是2-15的整數；L ₁和L ₃各自獨立地是-OC(O)-*或-C(O)O-*，其中「*」表示與R ₁或R ₃的附接點； R ₁和R ₃各自獨立地是視需要地被一或多個選自由以下組成之群組的取代基取代的直鏈或支鏈C ₉-C ₂₀烷基或C ₉-C ₂₀烯基：側氧基、鹵基、羥基、氰基、烷基、烯基、醛、雜環基烷基、羥基烷基、二羥基烷基、羥基烷基胺基烷基、胺基烷基、烷基胺基烷基、二烷基胺基烷基、(雜環基)(烷基)胺基烷基、雜環基、雜芳基、烷基雜芳基、炔基、烷氧基、胺基、二烷基胺基、胺基烷基羰基胺基、胺基羰基烷基胺基、(胺基羰基烷基)(烷基)胺基、烯基羰基胺基、羥基羰基、烷氧基羰基、胺基羰基、胺基烷基胺基羰基、烷基胺基烷基胺基羰基、二烷基胺基烷基胺基羰基、雜環基烷基胺基羰基、(烷基胺基烷基)(烷基)胺基羰基、烷基胺基烷基羰基、二烷基胺基烷基羰基、雜環基羰基、烯基羰基、炔基羰基、烷基亞碸、烷基亞碸烷基、烷基磺醯基和烷基碸烷基；以及 R ₂選自由以下組成之群組：

在一些實施方式中，包括式 (xxii) 的LNP用於將本文所述之多核糖核苷酸（例如，環狀多核糖核苷酸、線性多核糖核苷酸）組成物遞送至細胞。在一些實施方式中，式 (xxii) 的LNP係WO 2021113777描述的LNP（例如，式 (2) 的脂質，諸如WO 2021113777的表2的脂質）。 (xxii) 其中每個n獨立地是1-15的整數； R ₁和R ₂各自獨立地選自由以下組成之群組： R ₃選自由以下組成之群組：

在一些實施方式中，包括式 (xxiii) 的LNP用於將本文所述之多核糖核苷酸（例如，環狀多核糖核苷酸、線性多核糖核苷酸）組成物遞送至細胞。在一些實施方式中，式 (xxiii) 的LNP係WO 2021113777描述的LNP（例如，式 (3) 的脂質，諸如WO 2021113777的表3的脂質）。 (xxiii) 其中 X選自-O-、-S-或-OC(O)-*，其中*表示與R ₁的附接點； R ₁選自由以下組成之群組：且R ₂選自由以下組成之群組：

在一些實施方式中，本文所述之組成物（例如，核酸（例如，環狀多核糖核苷酸、線性多核糖核苷酸）或蛋白質）在包括可電離脂質的LNP中提供。在一些實施方式中，可電離脂質係十七烷-9-基8-((2-羥乙基)(6-側氧基-6-(十一烷氧基)己基)胺基)辛酸酯（SM-102）；例如，如US9,867,888（藉由援引以其全文併入本文）的實例1中所述。在一些實施方式中，可電離脂質係9Z,12Z)-3-((4,4-雙(辛基氧基)丁醯基)氧基)-2-((((3-(二乙基胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙基十八碳-9,12-二烯酸酯（LP01），例如，如WO 2015/095340（將其藉由引用以其整體併入本文）的實例13中合成的。在一些實施方式中，可電離脂質係二((Z)-非-2-烯-1-基)9-((4-二甲胺基)丁醯基)氧基)十七烷二酸酯（L319），例如，如US 2012/0027803（藉由援引以其全文併入本文）的實例7、8和9中合成的。在一些實施方式中，可電離脂質係1,1’-((2-(4-(2-((2-(雙(2-羥基十二烷基)胺基)乙基)(2-羥基十二烷基)胺基)乙基)哌𠯤-1-基)乙基)氮烷二基)雙(十二烷-2-醇)（C12-200），例如，如WO 2010/053572（藉由援引以其全文併入本文）的實例14和實例16中合成的。在一些實施方式中，可電離脂質係咪唑膽固醇酯（ICE）脂質(3S,10R,13R,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氫-lH-環戊烯並[a]菲-3-基3-(1H-咪唑-4-基)丙酸酯，例如來自WO 2020/106946（藉由援引以其全文併入本文）的結構 (I)。

在一些實施方式中，可電離脂質可為陽離子脂質、可電離陽離子脂質，例如可以根據pH以帶正電荷的形式或中性形式存在的陽離子脂質，或可以容易地質子化的含胺脂質。在一些實施方式中，陽離子脂質係例如在生理條件下能夠帶正電的脂質。示例性的陽離子脂質包括一或多個帶有正電荷的胺基。在一些實施方式中，脂質顆粒包括與中性脂質、可電離含胺脂質、可生物降解的炔脂質、類固醇、包括多不飽和脂質的磷脂、結構脂質（例如固醇）、PEG、膽固醇和聚合物軛合脂質中之一或多種配製的陽離子脂質。在一些實施方式中，陽離子脂質可為可電離的陽離子脂質。如本文揭露的示例性陽離子脂質可具有超過6.0的有效pKa。在實施方式中，脂質奈米顆粒可包括具有與第一陽離子脂質不同的有效pKa（例如，大於第一有效pKa）的第二陽離子脂質。脂質奈米顆粒可包括40 mol%至60 mol%的封裝在脂質奈米顆粒內或與脂質奈米顆粒締合的陽離子脂質、中性脂質、類固醇、聚合物軛合的脂質和治療劑，例如本文所述之核酸（例如RNA（例如環狀多核糖核苷酸、線性多核糖核苷酸））。在一些實施方式中，核酸與陽離子脂質共同配製。核酸可以吸附到LNP（例如包括陽離子脂質的LNP）的表面。在一些實施方式中，核酸可以封裝在LNP（例如包括陽離子脂質的LNP）中。在一些實施方式中，脂質奈米顆粒可包括靶向部分，例如用靶向劑包被的靶向部分。在實施方式中，LNP配製物係生物可降解的。在一些實施方式中，包括一或多種本文所述之脂質（例如式 (i)、(ii)、(ii)、(vii) 和/或 (ix)）的脂質奈米顆粒封裝至少1%、至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少92%、至少95%、至少97%、至少98%或100%的RNA分子。

可用於脂質奈米顆粒配製物中的示例性可電離脂質包括但不限於藉由援引併入本文的WO 2019051289的表1中所列的那些。另外的示例性脂質包括但不限於下式中之一或多種：US 2016/0311759的X；US 20150376115或US 2016/0376224中的I；US 20160151284的I、II或III；US 20170210967的I、IA、II或IIA；US 20150140070的I-c；US 2013/0178541的A；US 2013/0303587或US 2013/0123338的I；US 2015/0141678的I；US 2015/0239926的II、III、IV或V；US 2017/0119904的I；WO 2017/117528的I或II；US 2012/0149894的A；US 2015/0057373的A；WO 2013/116126的A；US 2013/0090372的A；US 2013/0274523的A；US 2013/0274504的A；US 2013/0053572的A；WO 2013/016058的A；WO 2012/162210的A；US 2008/042973的I；US 2012/01287670的I、II、III或IV；US 2014/0200257的I或II；US 2015/0203446的I、II或III；US 2015/0005363的I或III；US 2014/0308304的I、IA、IB、IC、ID、II、IIA、IIB、IIC、IID或III-XXIV；US 2013/0338210；WO 2009/132131的I、II、III或IV；US 2012/01011478的A；US 2012/0027796的I或XXXV；US 2012/0058144的XIV或XVII；US 2013/0323269；US 2011/0117125的I；US 2011/0256175的I、II或III；US 2012/0202871的I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII；US 2011/0076335的I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、X、XII、XIII、XIV、XV或XVI；US 2006/008378的I或II；US 2013/0123338的I；US 2015/0064242的I或X-A-Y-Z；US 2013/0022649的XVI、XVII或XVIII；US 2013/0116307的I、II或III；US 2013/0116307的I、II或III；US 2010/0062967的I或II；US 2013/0189351的I-X；US 2014/0039032的I；US 2018/0028664的V；US 2016/0317458的I；US 2013/0195920的I；US 10,221,127的5、6或10；WO 2018/081480的III-3；WO 2020/081938的I-5或I-8；US 9,867,888的18或25；US 2019/0136231的A；WO 2020/219876的II；US 2012/0027803的1；US 2019/0240349的OF-02；US 10,086,013的23；Miao等人(2020)的cKK-E12/A6；WO 2010/053572的C12-200；Dahlman等人(2017)的7C1；Whitehead等人的304-O13或503-O13；US 9,708,628的TS-P4C2；WO 2020/106946的I；WO 2020/106946的I；和WO 2021/113777的 (1)、(2)、(3) 或 (4)。示例性脂質還包括WO 2021/113777的表1-16中任一個的脂質。

在一些實施方式中，可電離脂質係MC3 (6Z,9Z,28Z,3 lZ)-三十七烷-6,9,28,3 l-四烯-l9-基-4-(二甲基胺基)丁酸酯（DLin-MC3-DMA或MC3），例如，如WO 2019051289A9（藉由援引以其全文併入）的實例9中所述。在一些實施方式中，可電離脂質係脂質ATX-002，例如，如WO 2019051289 A9（藉由援引以其全文併入）的實例10中所述。在一些實施方式中，可電離脂質係(l3Z,l6Z)-A,A-二甲基-3-壬基二十二-l3,l6-二烯-l-胺（化合物32），例如，如WO 2019051289 A9（藉由援引以其全文併入）的實例11中所述。在一些實施方式中，可電離脂質係化合物6或化合物22，例如，如WO 2019051289 A9（藉由援引以其全文併入）的實例12中所述。

示例性非陽離子脂質包括但不限於二硬脂醯-sn-甘油基-磷酸乙醇胺、二硬脂醯磷脂醯膽鹼（DSPC）、二油醯磷脂醯膽鹼（DOPC）、二棕櫚醯磷脂醯膽鹼（DPPC）、二油醯磷脂醯膽鹼（DOPG）、二棕櫚醯磷脂醯甘油（DPPG）、二油醯磷脂醯乙醇胺（DOPE）、棕櫚醯油醯磷脂醯膽鹼（POPC）、棕櫚醯油醯磷脂醯乙醇胺（POPE）、二油醯-磷脂醯乙醇胺4-(N-順丁烯二醯亞胺甲基)-環己烷-1-羧酸酯（DOPE-mal）、二棕櫚醯磷脂醯乙醇胺（DPPE）、二肉豆蔻醯磷酸乙醇胺（DMPE）、二硬脂醯-磷脂醯-乙醇胺（DSPE）、單甲基-磷脂醯乙醇胺（諸如16-O-單甲基PE）、二甲基-磷脂醯乙醇胺（諸如16-O-二甲基PE）、l8-l-反式PE、l-硬脂醯-2-油醯-磷脂醯乙醇胺（SOPE）、氫化大豆磷脂醯膽鹼（HSPC）、卵磷脂醯膽鹼（EPC）、二油醯磷脂醯絲胺酸（DOPS）、神經鞘磷脂（SM）、二肉豆蔻醯磷脂醯膽鹼（DMPC）、二肉豆蔻醯磷脂醯甘油（DMPG）、二硬脂醯磷脂醯甘油（DSPG）、二芥醯基磷脂醯膽鹼（DEPC）、棕櫚醯油醯磷脂醯甘油（POPG）、二反油烯醯-磷脂醯乙醇胺（DEPE）、卵磷脂、磷脂醯乙醇胺、溶血卵磷脂、Lys磷脂醯乙醇胺、磷脂醯絲胺酸、磷脂酸肌醇、鞘磷脂、卵鞘磷脂（ESM）、腦磷脂、心磷脂、磷脂酸、腦苷脂、雙十六烷基磷酸、Lys磷脂醯膽鹼、二亞油醯基磷脂醯膽鹼或其混合物。應當理解，也可以使用其他二醯基磷脂醯膽鹼和二醯基磷脂醯乙醇胺磷脂。該等脂質中的醯基基團較佳的是為衍生自具有C10-C24碳鏈的脂肪酸的醯基基團，例如月桂醯基、肉豆蔻醯基、棕櫚醯基、硬脂醯基或油醯基。在某些實施方式中，另外的示例性脂質包括但不限於藉由援引併入本文的Kim等人(2020) dx.doi.org/10.1021/acs.nanolett.0c01386描述的那些。在一些實施方式中，此類脂質包括發現會改善用mRNA進行肝轉染的植物脂質（例如DGTS）。

適合用於脂質奈米顆粒中的非陽離子脂質的其他實例包括但不限於非磷脂質，例如硬脂胺、十二烷基胺、十六烷基胺、乙醯基棕櫚酸酯、蓖麻酸甘油酯、硬脂酸十六烷基酯、肉豆蔻酸異丙酯、兩性丙烯酸聚合物、三乙醇胺-月桂基硫酸酯、烷基-芳基硫酸酯、聚乙氧基化脂肪酸醯胺、雙十八烷基二甲基溴化銨、神經醯胺、鞘磷脂等。其他非陽離子脂質在WO 2017/099823或美國專利公開US2018/0028664中有描述，其內容藉由援引以其全文併入本文。

在一些實施方式中，非陽離子脂質係油酸或藉由援引以其全文併入的US 2018/0028664的式I、II或IV的化合物。非陽離子脂質可以占例如脂質奈米顆粒中存在的總脂質的0%-30%（莫耳）。在一些實施方式中，非陽離子脂質含量係脂質奈米顆粒中存在的總脂質的5%-20%（莫耳）或10%-15%（莫耳）。在實施方式中，可電離脂質與中性脂質的莫耳比為約2 : 1至約8 : 1（例如，約2 : 1、3 : 1、4 : 1、5 : 1、6 : 1、7 : 1或8 : 1）。

在一些實施方式中，脂質奈米顆粒不包括任何磷脂。

在一些方面，脂質奈米顆粒可進一步包括如固醇的組分以提供膜完整性。可用於脂質奈米顆粒中之一種示例性固醇係膽固醇及其衍生物。膽固醇衍生物的非限制性實例包括極性類似物，諸如5a-膽甾烷醇、53-糞甾烷醇、膽甾醇基-(2 ^,-羥基)-乙基醚、膽甾醇基-(4'-羥基)-丁基醚和6-酮膽甾烷醇；非極性類似物，諸如5a-膽甾烷、膽甾烯酮、5a-膽甾烷酮、5p-膽甾烷酮和膽甾醇癸酸酯；及其混合物。在一些實施方式中，膽固醇衍生物係極性類似物，例如，膽甾醇基-(4'-羥基)-丁基醚。示例性的膽固醇衍生物在PCT公開案號WO 2009/127060和美國專利公開US2010/0130588中有描述，其各自藉由援引以其全文併入本文。

在一些實施方式中，提供膜完整性的組分，諸如固醇，可以包括脂質奈米顆粒中存在的總脂質的0-50%（莫耳）（例如，0-10%、10%-20%、20%-30%、30%-40%或40%-50%）。在一些實施方式中，此類組分係脂質奈米顆粒的總脂質含量的20%-50%（莫耳）、30%-40%（莫耳）。

在一些實施方式中，脂質奈米顆粒可包括聚乙二醇（PEG）或軛合的脂質分子。通常，該等用於抑制脂質奈米顆粒的聚集和/或提供空間穩定。示例性的軛合脂質包括但不限於PEG-脂質軛合物、聚㗁唑啉（POZ）-脂質軛合物、聚醯胺-脂質軛合物（諸如ATTA-脂質軛合物）、陽離子聚合物脂質（CPL）軛合物及其混合物。在一些實施方式中，軛合脂質分子係PEG-脂質軛合物，例如(甲氧基聚乙二醇)軛合脂質。

示例性的PEG-脂質軛合物包括但不限於PEG-二醯基甘油（DAG）（諸如l-(單甲氧基-聚乙二醇)-2,3-二肉豆蔻醯甘油（PEG-DMG））、PEG-二烷氧基丙基（DAA）、PEG-磷脂、PEG-神經醯胺（Cer）、聚乙二醇化磷脂醯乙醇胺（PEG-PE）、PEG琥珀酸二醯基甘油（PEGS-DAG）（諸如4-0-(2',3'-二(十四烷醯氧基)丙基-l-0-(w-甲氧基(聚乙氧基)乙基)丁二酸酯（PEG-S-DMG））、PEG二烷氧基丙基胺基甲酸酯、N-(羰基-甲氧基聚乙二醇2000)-1,2-二硬脂醯-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺鈉鹽或其混合物。另外的示例性PEG-脂質軛合物描述於以下中：例如，US 5,885,6l3、US 6,287,59l、US 2003/0077829、US 2003/0077829、US 2005/0175682、US 2008/0020058、US 2011/0117125、US 2010/0130588、US 2016/0376224、US 2017/0119904、US 2018/0028664和WO 2017/099823，所有該等的內容藉由援引以其全文併入本文。在一些實施方式中，PEG-脂質係US 2018/0028664的式III、III-a-I、III-a-2、III-b-1、III-b-2或V的化合物，其內容藉由援引以其全文併入本文。在一些實施方式中，PEG-脂質具有US 20150376115或US 2016/0376224的式II，兩者的內容藉由援引以其全文併入本文。在一些實施方式中，PEG-DAA軛合物可為例如PEG-二月桂基氧基丙基、PEG-二肉豆蔻基氧基丙基、PEG-二棕櫚基氧基丙基或PEG-二硬脂基氧基丙基。PEG-脂質可為以下的一或多種：PEG-DMG、PEG-二月桂基甘油、PEG-二棕櫚醯甘油、PEG-二硬脂基甘油、PEG-二月桂基甘油脂醯胺、PEG-二肉豆蔻基甘油脂醯胺、PEG-二棕櫚醯甘油脂醯胺、PEG-二硬脂基甘油脂醯胺、PEG-膽固醇（l-[8'-(膽甾-5-烯-3[β]-氧基)甲醯胺基-3',6'-二氧雜辛基]胺基甲醯基-[ω]-甲基-聚(乙二醇)）、PEG-DMB（3,4-雙十四烷氧基苄基-[ω]-甲基-聚(乙二醇)醚）和1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]。在一些實施方式中，PEG-脂質包括PEG-DMG、1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]。在一些實施方式中，PEG-脂質包括選自以下的結構：

在一些實施方式中，與PEG以外的分子軛合的脂質也可用於代替PEG-脂質。例如，聚㗁唑啉（POZ）-脂質軛合物、聚醯胺-脂質軛合物（諸如ATTA-脂質軛合物）和陽離子聚合物脂質（GPL）軛合物可用於代替PEG-脂質或與PEG-脂質一起使用。

示例性的軛合脂質（即PEG-脂質、（POZ）-脂質軛合物、ATTA-脂質軛合物和陽離子聚合物-脂質）在WO 2019051289 A9的表2中列出的PCT和LIS專利申請（所有該等的內容藉由援引以其全文併入本文）中描述。

在一些實施方式中，PEG或軛合脂質可包括脂質奈米顆粒中存在的總脂質的0%-20%（莫耳）。在一些實施方式中，PEG或軛合脂質的含量為脂質奈米顆粒中存在的總脂質的0.5%-10%或2%-5%（莫耳）。可電離脂質、非陽離子脂質、固醇和PEG/軛合脂質的莫耳比可以根據需要變化。例如，脂質顆粒可包括按組成物的莫耳或總重量計30%-70%的可電離脂質，按組成物的莫耳或總重量計0%-60%的膽固醇，按組成物的莫耳或總重量計0%-30%的非陽離子脂質和按組成物的莫耳或總重量計1%-10%的軛合脂質。較佳的是，該組成物包括按組成物的莫耳或總重量計30%-40%的可電離脂質，按組成物的莫耳或總重量計40%-50%的膽固醇，以及按組成物的莫耳或總重量計10%-20%的非陽離子脂質。在一些其他實施方式中，組成物係按組成物的莫耳或總重量計50%-75%的可電離脂質，按組成物的莫耳或總重量計20%-40%的膽固醇，和按組成物的莫耳或總重量計5%-10%的非陽離子脂質，以及按組成物的莫耳或總重量計1%-10%的軛合脂質。該組成物可含有按組成物的莫耳或總重量計60%-70%的可電離脂質，按組成物的莫耳或總重量計25%-35%的膽固醇，以及按組成物的莫耳或總重量計5%-10%的非陽離子脂質。該組成物還可含有按組成物的莫耳或總重量計至多90%的可電離脂質和按組成物的莫耳或總重量計2%至15%的非陽離子脂質。該配製物也可為脂質奈米顆粒配製物，例如包括按組成物的莫耳或總重量計8%-30%的可電離脂質，按組成物的莫耳或總重量計5%-30%的非陽離子脂質，以及按組成物的莫耳或總重量計0%-20%的膽固醇；按組成物的莫耳或總重量計4%-25%的可電離脂質，按組成物的莫耳或總重量計4%-25%的非陽離子脂質，按組成物的莫耳或總重量計2%至25%的膽固醇，按組成物的莫耳或總重量計10%至35%的軛合脂質，以及按組成物的莫耳或總重量計5%的膽固醇；或按組成物的莫耳或總重量計2%-30%的可電離脂質，按組成物的莫耳或總重量計2%-30%的非陽離子脂質，按組成物的莫耳或總重量計1%至15%的膽固醇，按組成物的莫耳或總重量計2%至35%的軛合脂質，以及按組成物的莫耳或總重量計1%-20%的膽固醇；或按組成物的莫耳或總重量計甚至高達90%的可電離脂質和按組成物的莫耳或總重量計2%-10%的非陽離子脂質，或按組成物的莫耳或總重量計甚至100%的陽離子脂質。在一些實施方式中，脂質顆粒配製物包括莫耳比為50 : 10 : 38.5 : 1.5的可電離脂質、磷脂、膽固醇和聚乙二醇化脂質。在一些其他實施方式中，脂質顆粒配製物包括莫耳比為60 : 38.5 : 1.5的可電離脂質、膽固醇和聚乙二醇化脂質。

在一些實施方式中，脂質顆粒包括可電離脂質、非陽離子脂質（例如磷脂）、固醇（例如膽固醇）和聚乙二醇化脂質，其中可電離脂質的脂質莫耳比的範圍為20至70莫耳%，目標為40-60，非陽離子脂質的莫耳百分比的範圍為在0至30，目標為0至15，固醇的莫耳百分比的範圍為20至70，目標為30至50，並且聚乙二醇化脂質的莫耳百分比的範圍為1至6，目標為2至5。

在一些實施方式中，脂質顆粒包括莫耳比為50 : 10 : 38.5 : 1.5的可電離脂質/非陽離子脂質/固醇/軛合脂質。

在一方面，本揭露提供了包括磷脂、卵磷脂、磷脂醯膽鹼和磷脂醯乙醇胺的脂質奈米顆粒配製物。

在一些實施方式中，還可以包括一或多種另外的化合物。那些化合物可以單獨投與，或者另外的化合物可以包括在本發明的脂質奈米顆粒中。換言之，除核酸或至少第二核酸之外，脂質奈米顆粒可含有不同於第一核酸的其他化合物。非限制性地，其他另外的化合物可以選自由以下組成之群組：小的或大的有機分子或無機分子、單糖、二糖、三糖、寡糖、多糖、肽、蛋白質、其肽類似物和衍生物、肽類比物、核酸、核酸類似物和衍生物、由生物材料製成的提取物，或其任何組合。

在一些實施方式中，LNP包括可生物降解的、可電離的脂質。在一些實施方式中，LNP包括(9Z,l2Z)-3-((4,4-雙(辛氧基)丁醯基)氧基)-2-((((3-(二乙基胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙基十八碳-9,l2-二烯酸酯，也稱為3-((4,4-雙(辛氧基)丁醯基)氧基)-2-((((3-(二乙基胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙基 (9Z,l2Z)-十八碳-9,l2-二烯酸酯)或另一種可電離脂質。參見，例如WO 2019/067992、WO/2017/173054、WO 2015/095340、和WO 2014/136086，以及其中提供的參考文獻的脂質。在一些實施方式中，在LNP脂質的上下文中術語陽離子和可電離係可互換的，例如，其中可電離脂質根據pH係陽離子的。

在一些實施方式中，LNP配製物的平均LNP直徑可以在數十nm和數百nm之間，例如藉由動態光散射（DLS）測量的。在一些實施方式中，LNP配製物的平均LNP直徑可以為約40 nm至約150 nm，諸如約40 nm、45 nm、50 nm、55 nm、60 nm、65 nm、70 nm、75 nm、80 nm、85 nm、90 nm、95 nm、100 nm、105 nm、110 nm、115 nm、120 nm、125 nm、130 nm、135 nm、140 nm、145 nm或150 nm。在一些實施方式中，LNP配製物的平均LNP直徑可為約50 nm至約100 nm、約50 nm至約90 nm、約50 nm至約80 nm、約50 nm至約70 nm、約50 nm至約60 nm、約60 nm至約100 nm、約60 nm至約90 nm、約60 nm至約80 nm、約60 nm至約70 nm、約70 nm至約100 nm、約70 nm至約90 nm、約70 nm至約80 nm、約80 nm至約100 nm、約80 nm至約90 nm或約90 nm至約100 nm。在一些實施方式中，LNP配製物的平均LNP直徑可為約70 nm至約100 nm。在一個特定實施方式中，LNP配製物的平均LNP直徑可為約80 nm。在一些實施方式中，LNP配製物的平均LNP直徑可為約100 nm。在一些實施方式中，LNP配製物的平均LNP直徑範圍為約l mm至約500 mm、約5 mm至約200 mm、約10 mm至約100 mm、約20 mm至約80 mm、約25 mm至約60 mm、約30 mm至約55 mm、約35 mm至約50 mm，或約38 mm至約42 mm。

在一些情況下，LNP可為相對均質的。多分散性指數可用於指示LNP的均質性，例如脂質奈米顆粒的粒度分佈。小的（例如，小於0.3）多分散性指數通常指示窄的粒度分佈。LNP的多分散性指數可為約0至約0.25，諸如0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.20、0.21、0.22、0.23、0.24或0.25。在一些實施方式中，LNP的多分散性指數可為約0.10至約0.20。

LNP的ζ電位可用於指示組成物的電動位。在一些實施方式中，ζ電位可以描述LNP的表面電荷。具有相對低電荷（正電荷或負電荷）的脂質奈米顆粒通常是期望的，因為更高電荷的物質可能不理想地與體內的細胞、組織和其他元素相互作用。在一些實施方式中，LNP的ζ電位可為約-10 mV至約+20 mV、約-10 mV至約+15 mV、約-10 mV至約+10 mV、約-10 mV至約+5 mV、約-10 mV至約0 mV、約-10 mV至約-5 mV、約-5 mV至約+20 mV、約-5 mV至約+15 mV、約-5 mV至約+10 mV、約-5 mV至約+5 mV、約-5 mV至約0 mV、約0 mV至約+20 mV、約0 mV至約+15 mV、約0 mV至約+10 mV、約0 mV至約+5 mV、約+5 mV至約+20 mV、約+5 mV至約+15 mV或約+5 mV至約+10 mV。

蛋白質和/或核酸的封裝效率描述了相對於所提供的初始量，在製備後被封裝或以其他方式與LNP締合的蛋白質和/或核酸的量。封裝效率理想的是較高（例如，接近100%）。封裝效率可以例如藉由比較在用一或多種有機溶劑或洗滌劑破碎脂質奈米顆粒之前和之後含有脂質奈米顆粒的溶液中蛋白質或核酸的量來測量。陰離子交換樹脂可用於測量溶液中游離蛋白質或核酸（例如RNA）的量。螢光可用於測量溶液中游離蛋白質和/或核酸（例如RNA）的量。對於本文所述之脂質奈米顆粒，蛋白質和/或核酸的封裝效率可為至少50%，例如50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些實施方式中，封裝效率可為至少80%。在一些實施方式中，封裝效率可為至少90%。在一些實施方式中，封裝效率可為至少95%。

LNP可以視需要地包括一層或多層包衣。在一些實施方式中，LNP可以配製在具有包衣的膠囊、膜或片劑中。包含本文所述之組成物的膠囊、膜或片劑可具有任何可用的尺寸、拉伸強度、硬度或密度。

WO 2020/061457和WO 2021/113777（它們各自藉由援引以其全文併入本文）教導了LNP的另外的示例性脂質、配製物、方法和表徵。LNP的其他示例性的脂質、配製物、方法和表徵由Hou等人Lipid nanoparticles for mRNA delivery [用於mRNA遞送的脂質奈米顆粒]. Nat Rev Mater [自然評論材料] (2021). doi.org/10.1038/s41578-021-00358-0傳授，其藉由援引以其全文併入本文（參見例如Hou等人的圖2的示例性脂質和脂質衍生物）。

在一些實施方式中，使用LIPOFECTAMINE® MessengerMax（賽默飛世爾公司（Thermo Fisher））或TransIT-mRNA轉染試劑（米盧斯生物公司（Mirus Bio））進行體外或離體細胞脂質轉染。在某些實施方式中，使用GenVoy_ILM可電離脂質混合物（精密奈米系統（Precision NanoSystems））配製LNP。在某些實施方式中，使用2,2‐二亞油烯基‐4‐二甲基胺基乙基‐[1,3]‐二氧戊環（DLin‐KC2‐DMA）或二亞油烯基甲基‐4‐二甲基胺基丁酸酯（DLin-MC3-DMA或MC3）配製LNP，其配製和體內用途在Jayaraman等人Angew Chem Int Ed Engl [德國應用化學] 51(34):8529-8533 (2012)中傳授，藉由援引以其全文併入本文。

優化用於遞送CRISPR-Cas系統（例如Cas9-gRNA RNP、gRNA、Cas9 mRNA）的LNP配製物在兩者均藉由援引併入的WO 2019067992和WO 2019067910中有描述，並且可用於遞送本文所述之環狀多核糖核苷酸和線性多核糖核苷酸。

可用於遞送核酸（例如，環狀多核糖核苷酸、線性多核糖核苷酸）的另外的特定LNP配製物在兩者均藉由援引併入的US 8158601和US 8168775中有描述，其包括帕替西蘭（patisiran）中使用的以名稱ONPATTRO銷售的配製物。

在實施方式中，編碼本文所述之蛋白質或多肽的至少一部分（例如，抗原的部分）的多核糖核苷酸（例如，環狀多核糖核苷酸、線性多核糖核苷酸）在LNP中配製，其中：(a) LNP包括陽離子脂質、中性脂質、膽固醇和PEG脂質，(b) LNP的平均粒度為80 nm和160 nm之間，以及 (c) 多核糖核苷酸。在實施方式中，在LNP中配製的多核糖核苷酸（例如，環狀多核糖核苷酸、線性多核糖核苷酸）係疫苗。

多核糖核苷酸（例如，環狀多核糖核苷酸、線性多核糖核苷酸）LNP的示例性給藥可包括約0.1、0.25、0.3、0.5、1、2、3、4、5、6、8、10或100 mg/kg（RNA）。在一些實施方式中，本文所述之多核糖核苷酸（例如，環狀多核糖核苷酸、線性多核糖核苷酸）抗原的組成物的劑量為30-200 mcg之間，例如30 mcg、50 mcg、75 mcg、100 mcg、150 mcg或200 mcg。套組

在一些方面，本揭露提供了套組。在一些實施方式中，套組包括 (a) 本文所述之環狀多核糖核苷酸或藥物組成物，以及視需要地 (b) 資訊材料。在一些實施方式中，環狀多核糖核苷酸或藥物組成物可為所定義的給藥方案的一部分。資訊材料可為描述性的、指導性的、行銷性的或係與本文所述方法和/或用於本文所述方法的藥物組成物或環狀多核糖核苷酸之用途相關的其他材料。藥物組成物或環狀多核糖核苷酸可包含用於單次投與（例如，單劑量形式）的材料，或可包含用於多次投與（例如，「多劑量」套組）的材料。

套組的資訊材料的形式不受限制。在一個實施方式中，資訊材料可包括關於藥物組成物、製藥藥物物質或製藥藥物產品的生產的資訊，藥物組成物、製藥藥物物質或製藥藥物產品的分子量，濃度，有效期，批次或生產地點資訊等。在一個實施方式中，資訊材料涉及用於投與藥物組成物劑型之方法。在一個實施方式中，資訊材料涉及用於投與環狀多核糖核苷酸劑型之方法。

除了本文所述之藥物組成物和環狀多核糖核苷酸的劑型之外，該套組還可包括其他成分，如溶劑或緩衝液、穩定劑、防腐劑、調味劑（例如，苦味拮抗劑或增甜劑）、香料、染料或著色劑（例如用於將套組中之一或多種組分著色或染色）、或其他化妝品成分、和/或用於治療本文所述病症或障礙的第二藥劑。可替代地，套組中可包括其他成分，但在與本文所述藥物組成物或環狀多核糖核苷酸不同的組成物或容器中。在此類實施方式中，套組可包括將本文所述之藥物組成物或核酸分子（例如，環狀多核糖核苷酸）和其他成分混合，或者將本文所述之藥物組成物或核酸分子（例如，環狀多核糖核苷酸）與其他成分一起使用的說明書。

在一些實施方式中，將套組的組分儲存在惰性條件下（例如，在氮氣或另一種惰性氣體諸如氬氣下）。在一些實施方式中，將套組的組分儲存在無水條件下（例如，用乾燥劑）。在一些實施方式中，將組分儲存在遮光容器，如琥珀色小瓶中。

本文所述之藥物組成物或核酸分子（例如，環狀多核糖核苷酸）的劑型可以以任何形式，例如液體、乾燥或冷凍乾燥形式提供。較佳的是本文所述之藥物組成物或核酸分子（例如，環狀多核糖核苷酸）係基本上純的和/或無菌的。當在液體溶液中提供本文所述之藥物組成物或核酸分子（例如，環狀多核糖核苷酸）時，液體溶液較佳的為水溶液，其中較佳的是無菌水溶液。當本文所述之藥物組成物或核酸分子（例如，環狀多核糖核苷酸）以乾燥形式提供時，通常藉由添加合適的溶劑來重構。套組中可以視需要地提供溶劑，例如無菌水或緩衝液。

該套組可包括用於含有本文所述劑型的組成物的一或多個容器。在一些實施方式中，套組含有用於組成物和資訊材料的單獨容器、分隔物或間室。例如，藥物組成物或環狀多核糖核苷酸可以裝在瓶子、小瓶或注射器中，並且資訊材料可以裝在塑膠套管（plastic sleeve）或包中。在其他實施方式中，套組的單獨元件包含在單個未分開的容器中。例如，本文所述之藥物組成物或核酸分子（例如，環狀多核糖核苷酸）的劑型包含在瓶、小瓶或注射器中，其上附有標籤形式的資訊材料。在一些實施方式中，套組包括多個（例如，一包）單獨的容器，每個容器含有一或多個單位劑型的本文所述之藥物組成物或環狀多核糖核苷酸。例如，該套組包括多個注射器、安瓿、箔包或泡鼓包裝，每個含有單個單位劑量的本文所述之劑型。

套組的容器可為氣密的、防水的（例如，不受水分或蒸發變化的影響）和/或不透光的。

該套組視需要地包括適用於劑型的使用的裝置，例如注射器、移液管、鑷子、量勺、拭子（例如，棉簽或木簽）或任何這樣的裝置。

本發明的套組可包括不同強度的劑型，以向受試者提供適用於本文所述之起始期方案、誘導期方案或維持期方案中之一或多個的劑量。可替代地，套組可包括刻痕片劑，以允許使用者根據需要投與分劑量。實例

提出以下實例係為了向熟悉該項技術者提供可以如何使用、製備和評價本文所述之組成物和方法的描述，並且旨在純粹作為本揭露之示例，而不旨在限制諸位發明人認為是其發明的範圍。實例 1. 環狀多核糖核苷酸的純化

體外翻譯生成circRNA和線性RNA的混合物。使用RNA純化柱將混合物純化，並且使用10 K Amicon自旋濃縮裝置將緩衝劑交換為無核酸酶的水。然後根據製造商說明使用酵母聚A聚合酶將材料聚腺苷酸化。將樣本在10 mM Tris-HCl、1 mM EDTA（pH 7.4）調節至0.5 M NaCl，並且將0.18 mg樣本負載至柱上，用10 mM Tris-HCl、0.5 M NaCl、1 mM EDTA（pH 7.4）洗滌並平衡。該等結果顯示在圖 3A和 3B中。第一道係最初純化和聚腺苷酸化的IVT生成的circRNA和linRNA的樣本混合物；第二道係柱的流通峰（FT）的分析；第三道和第四道係洗脫峰E1（包括級分B7和B8）的分析；以及第五道和第六道係峰E2（包括級分C4和C5）的分析。用10 mM Tris-HCl、1 mM EDTA（pH 7.4）將樣本洗脫，並且在圖 3A中觀察到的峰表示為E1（包括級分B7和B8）。然後使用H ₂O將材料的剩餘部分洗脫，並且觀察第二洗脫峰（含有級分C4和C5的E2）。藉由SDS PAGE分析計算百分比純度，並且顯示在圖 3B中。負載含有11.4% circRNA和87.2線性RNA。FT池含有57.6% circRNA和40.3%線性RNA。洗脫峰E1和E2分別含有8-9% - 10.1%和2.9% - 3.7% circRNA以及82.7% - 87.0%和94.4% - 94.6%線性RNA。實例 2 ：線性 RNA 拉下特異性地捕獲線性 RNA 副產物並增濃環狀 RNA

此實例顯示藉由經由聚A-寡核苷酸dT相互作用捕獲線性副產物對環狀RNA的增濃。

在此實例中，構建體設計為具有催化內含子的3’一半、外顯子片段2（E2）、包括ORF的多核糖核苷酸負載物、外顯子片段1（E1）和催化內含子的5’一半。使用本文所述之方法藉由自剪接來生成環狀RNA。體外翻譯生成環狀RNA和線性RNA副產物的混合物（圖 4）。使用RNA純化柱將混合物純化，並且洗脫到無核酸酶的水中。然後，在進行第二柱純化步驟前，根據製造商說明使用大腸桿菌聚A聚合酶將所得材料聚腺苷酸化。

在第一實驗中，使用寡核苷酸 (dT)25 Dynabead磁性珠（賽默飛世爾公司）一式兩份（運行A和運行B）加工20 µg含有環狀RNA和線性RNA副產物的混合物的聚腺苷酸化的RNA樣本。簡而言之，將RNA樣本添加至結合緩衝劑（20 mM Tris-HCl、1.0 M LiCl、2.0 mM EDTA），並且在室溫下與寡核苷酸 (dT)25磁性珠一起孵育以選擇性結合聚腺苷酸化的線性物種。磁場的應用以及上清液的去除生成寡核苷酸流通峰（FT）柱。在用無核酸酶的水將結合RNA洗脫兩次前，用洗滌緩衝劑（10 mM Tris-HCl、0.15 M LiCl、1.0 mM EDTA）將保留的磁性珠洗滌兩次。

純度百分比藉由AEX-HPLC分析計算，並且結果顯示在表1和補充的SDS PAGE凝膠圖（圖 5）中。負載含有42.35% - 43.27% circRNA和56.73% - 57.65%線性RNA副產物。FT池含有68.25% - 68.78% circRNA和31.75% - 31.22%線性RNA副產物。洗脫峰E1和E2含有17.53% - 20.44% circRNA和79.56% - 82.47%線性RNA副產物。

洗脫的環狀RNA和線性RNA副產物的濃度使用分光光度計（NanoDrop™分光光度計A260，賽默飛世爾公司）來測量，並且顯示在表1中。 [ 表 1] ：質量平衡 - 回收率

	純度（ % ）	質量（ µg ）	回收率（ % ）
circRNA	RNA	circRNA	線性RNA副產物	circRNA	線性RNA副產物
負載	42.35 - 43.2	19800	8385.3	11414.7
流通峰（FT）	68.25 - 68.78	7120	4897.1	2222.9	58.40	19.47
洗脫1（E1）	17.53 - 20.44	6764	1382.6	5381.4	16.48	47.14
洗脫2（E2）	17.53 - 20.44	2340	468.0	1872	5.58	16.93
	總回收率	80.47	83.02

該第一實驗的結果顯示寡核苷酸 (dT)25珠與在洗脫柱中釋放的聚腺苷酸化的線性RNA副產物選擇性結合。

在第二實驗中，首先用20 mM Tris-HCl、0.5 M NaCl、10.0 mM EDTA（pH 7.4）將1 mL寡核苷酸 (dT) 柱洗滌且平衡。在20 mM Tris-HCl、10 mM EDTA（pH 7.4）中將樣本調節至0.5 M NaCl，並且以5 mL/min的流速將8.7 mg樣本負載至寡核苷酸柱。藉由運行將含有0.5 mL級分的RNA收集。在樣本應用階段期間觀察到兩個不同的峰並且在圖 6A中分別表示為流通峰（FT）和突破峰（BT）。

用10 mM Tris-HCl、1mM EDTA（pH 8）將樣本洗脫，並且觀察到峰且在圖 6A中表示為洗脫1（E1）。然後，使用水將材料的剩餘部分洗脫，並且觀察到第四洗脫峰（E2）（圖 6A）。

純度百分比藉由AEX-HPLC分析計算，並且結果顯示在表2和補充的SDS PAGE凝膠圖（圖 6B）中。負載含有44.55% circRNA和55.45%線性RNA副產物。FT池含有76.46% circRNA和23.54%線性RNA副產物。BT池含有59.0% circRNA和41.0%線性RNA副產物。洗脫峰E1和E2分別含有29.14%和15.52% circRNA以及70.86%和84.48%線性RNA副產物。

洗脫的環狀RNA和線性RNA副產物的濃度使用分光光度計（NanoDrop™分光光度計A260，賽默飛世爾公司）來測量，並且顯示在表2中。 [ 表 2] ：質量平衡 - 回收率

	純度（ % ）	質量（ µg ）	回收率（ % ）
circRNA	RNA	circRNA	線性RNA副產物	circRNA	線性RNA副產物
負載	44.55	9120	4063.0	5057.0
流通峰（FT）	76.48	2572.6	1967.0	605.6	48.41	11.98
突破峰（BT）	59.00	1867.5	1101.8	765.7	27.12	15.14
洗脫1（E1）	29.14	3546.25	1033.4	2512.9	25.43	49.69
洗脫2（E2）	15.52	142.7	22.1	120.6	0.54	2.38
	總回收率	101.51	79.19

其他實施方式

雖然已經結合本發明的特定實施方式描述了本發明，但是應當理解，能夠進行進一步的修改，並且本申請旨在涵蓋總體上遵循本發明的原理並且包括在本發明所屬領域內的已知或常規實踐內的與本發明的此類偏離的本發明的任何變化、使用或改編，並且可應用於在上文中闡述的基本特徵，並且遵循申請專利範圍的範圍。其他實施方式在申請專利範圍中。

無

[ 圖 1]係示出如本文所述方法的示意圖。左邊係線性多核糖核苷酸。該線性多核糖核苷酸係被環化的。將靶區域附接至未環化的線性多核糖核苷酸。將與顆粒軛合的寡核苷酸添加至混合物中。將寡核苷酸雜交至線性多核糖核苷酸的靶區域，然而環狀多核糖核苷酸未被寡核苷酸結合，從而從缺乏靶區域的環狀多核糖核苷酸中分離含有靶區域的線性多核糖核苷酸。另外的靶區域可以視需要地存在於線性先質的5’末端處，如圖所示。

[ 圖 2]係示出如本文所述方法的示意圖。左邊係線性多核糖核苷酸。該線性多核糖核苷酸係被環化的。未環化的線性多核糖核苷酸係被聚腺苷酸化的，從而產生3’聚A尾。將與顆粒軛合的聚DT寡核苷酸添加至混合物中。將寡核苷酸雜交至線性多核糖核苷酸上的聚A靶區域，然而環狀多核糖核苷酸未被寡核苷酸結合，從而從缺乏聚A尾的環狀多核糖核苷酸中分離含有聚A尾的線性多核糖核苷酸。另外的聚A區域可以視需要地存在於線性先質的5’末端處，如圖所示。

[ 圖 3A]示出了來自實例1的體外轉錄（IVT）生成的樣本的層析譜。層析譜用流通峰（FT）、洗脫峰1（E1）和洗脫峰2（E2）進行注釋，其特徵在於SDS PAGE，如實例1所述以及如圖3B所示。

[ 圖 3B]係顯示在純化和聚腺苷酸化後實例1中環狀和線性RNA的IVT生成的混合物的SDS PAGE分析（6% TBE凝膠）的凝膠。第一道係最初在柱上負載（L）的IVT生成的circRNA和linRNA的樣本混合物；第二道係柱的流通峰（FT）的分析；第三道和第四道係洗脫峰E1（包括級分B7和B8）的分析；以及第五道和第六道係峰E2（包括級分C4和C5）的分析。分析的級分對應於從示於圖3A的柱層析法中收集的級分（FT、E1和E2）。顯示了從PAGE分析中計算的百分比純度。

[ 圖 4]係示出IVT混合物中線性副產物的凝膠，其中環狀RNA藉由自剪接生成。該凝膠示出了需要的環狀RNA產物、非剪接的線性RNA、部分剪接的線性RNA、帶切口的環狀RNA和剪接的內含子。

[ 圖 5]係顯示來自實例2中寡核苷酸 (dT) 磁性珠純化運行（運行A和運行B）的環狀RNA和線性RNA副產物的IVT生成的混合物的SDS-PAGE分析（6% TBE凝膠）的凝膠。第二道和第五道係最初與寡核苷酸 (dT) 磁性珠（L）（分別係運行A和運行B）一起孵育的IVT生成的circRNA和linRNA副產物的樣本混合物；第三道和第六道係寡核苷酸流通峰（FT）（分別係運行A和運行B）的分析；以及第四道和第七道係洗脫（分別係運行A和運行B）的分析。

[ 圖 6A]示出了來自實例2的IVT生成的樣本的層析譜。層析譜用流通峰（FT）、突破峰（BT）、洗脫峰1（E1）和洗脫峰2（E2）進行注釋，其特徵在於SDS PAGE，如實例2所述以及如圖6B所示。

[ 圖 6B]係顯示來自實例2中寡核苷酸 (dT) 柱純化運行的環狀RNA和線性RNA副產物的IVT生成的混合物的SDS-PAGE分析（6% TBE凝膠）的凝膠。第二道係最初在柱上負載（L）的IVT生成的circRNA和linRNA副產物的樣本混合物；第三道係柱的流通峰（FT）的分析；第四道係突破峰（BT）的分析；第五道係洗脫峰E1的分析；以及第六道係峰E2的分析。分析的級分對應於從示於圖6A的柱層析法中收集的級分（FT、BT、E1和E2）。

無

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Claims

一種從包含線性多核糖核苷酸和環狀多核糖核苷酸的混合物的多種多核糖核苷酸中分離線性多核糖核苷酸之方法，該環狀多核糖核苷酸包含編碼多肽的開讀框（ORF），該方法包括： (a) 提供包含該多種多核糖核苷酸的樣本，其中該多種多核糖核苷酸的子集包含該線性多核糖核苷酸； (b) 將靶區域附接至該線性多核糖核苷酸； (c) 使該樣本與和該靶區域雜交的寡核苷酸接觸；以及 (d) 從該樣本中的該多種多核糖核苷酸中分離包含與該寡核苷酸雜交的靶區域的該線性多核糖核苷酸。
如請求項1所述之方法，其中該寡核苷酸與顆粒軛合。
如請求項2所述之方法，其中該顆粒包含磁性珠。
如請求項2所述之方法，其中該寡核苷酸與包含多種該等顆粒的樹脂軛合。
如請求項4所述之方法，其中該樹脂包含交聯聚[苯乙烯-二乙烯基苯]、瓊脂糖或SEPHAROSE®瓊脂糖。
如請求項4或5所述之方法，其中柱包含該樹脂。
如請求項1-6中任一項所述之方法，其中將該線性多核糖核苷酸分離包括將該寡核苷酸固定。
如請求項1-7中任一項所述之方法，其中將該線性多核糖核苷酸分離包括將該樣本中未與該寡核苷酸雜交的部分收集。
如請求項8所述之方法，其中該樣本中未與該寡核苷酸雜交的部分包含該環狀多核糖核苷酸。
如請求項1-9中任一項所述之方法，其中來自純化後該環狀多核糖核苷酸的該ORF的表現水平相對於來自純化前的該ORF的表現水平增加了至少10%。
一種從包含線性多核糖核苷酸和環狀多核糖核苷酸的混合物的多種多核糖核苷酸中分離線性多核糖核苷酸之方法，該方法包括： (a) 提供包含該多種多核糖核苷酸的樣本，其中該多種多核糖核苷酸的子集包含該線性多核糖核苷酸； (b) 將靶區域附接至該線性多核糖核苷酸； (c) 使該樣本與包含含有與和該靶區域雜交的寡核苷酸軛合的多種顆粒的樹脂的柱接觸；以及 (d) 從該樣本中的該多種多核糖核苷酸中收集包含該樣本中未與該寡核苷酸雜交的部分的洗脫液。
如請求項11所述之方法，其中該樣本中未與該寡核苷酸雜交的部分包含該環狀多核糖核苷酸。
如請求項11或12所述之方法，其中該樹脂包含交聯聚[苯乙烯-二乙烯基苯]、瓊脂糖或SEPHAROSE®瓊脂糖。
如請求項1-12中任一項所述之方法，其中該方法在步驟 (a) 前包括從線性先質中將該環狀多核糖核苷酸環化的步驟。
如請求項13所述之方法，其中該線性先質包括5’自剪接內含子片段和3’自剪接內含子片段，並且其中該環狀多核糖核苷酸係藉由該線性先質的自剪接產生的。
如請求項15所述之方法，其中該5’自剪接內含子片段和該3’自剪接內含子片段各自是I型或II型自剪接內含子片段。
一種從包含線性多核糖核苷酸和環狀多核糖核苷酸的混合物的多種多核糖核苷酸中分離線性多核糖核苷酸之方法，該方法包括： (a) 將線性先質環化以形成該環狀多核糖核苷酸； (b) 提供包含該多種多核糖核苷酸的樣本，其中該多種多核糖核苷酸的子集包含該線性多核糖核苷酸； (c) 將靶區域附接至該線性多核糖核苷酸； (d) 使該樣本與和該靶區域雜交的寡核苷酸接觸；以及 (e) 從該樣本中的該多種多核糖核苷酸中分離包含與該寡核苷酸雜交的該靶區域的線性多核糖核苷酸。
如請求項14-17中任一項所述之方法，其中將該環狀多核糖核苷酸環化係藉由該線性先質的夾板連接產生的。
如請求項18所述之方法，其中該線性先質包括5’自剪接內含子片段和3’自剪接內含子片段，並且其中該環狀多核糖核苷酸係藉由該線性先質的自剪接產生的。
如請求項19所述之方法，其中該5’自剪接內含子片段和該3’自剪接內含子片段各自是I型或II型自剪接內含子片段。
如請求項11-20中任一項所述之方法，其中該環狀多核糖核苷酸包含ORF。
如請求項21中任一項所述之方法，其中該ORF編碼多肽。
如請求項1-22中任一項所述之方法，其中該環狀多核糖核苷酸包含內部核糖體進入位址（IRES）。
如請求項23所述之方法，其中該ORF與該IRES可操作地連接。
如請求項1-24中任一項所述之方法，其中該方法包括將該靶區域附接至該線性多核糖核苷酸的3’或5’端。
如請求項25所述之方法，其中該方法包括將該靶區域附接至該線性多核糖核苷酸的3’端。
如請求項26所述之方法，其中該附接步驟包括將該線性多核糖核苷酸的3’端聚腺苷酸化。
如請求項27所述之方法，其中聚腺苷酸化包括提供聚A聚合酶。
如請求項26所述之方法，其中該附接步驟包括將該靶區域附接至該線性多核糖核苷酸的3’端。
如請求項1-29中任一項所述之方法，其中該環狀多核糖核苷酸不包含聚A序列。
如請求項25所述之方法，其中該環狀多核糖核苷酸不包含聚A序列，該聚A序列包含至少10個連續腺苷核苷酸。
如請求項1-31中任一項所述之方法，其中步驟 (a) 的該線性多核糖核苷酸包含該靶區域。
如請求項1-32中任一項所述之方法，其中該靶區域包含聚A序列。
如請求項33所述之方法，其中該聚A序列包含至少10個連續腺苷核苷酸。
如請求項33或34所述之方法，其中該寡核苷酸包含聚U或聚dT序列。
如請求項35所述之方法，其中該聚dT包含 (dT) ₂₅。
如請求項17-36中任一項所述之方法，其中該寡核苷酸與顆粒軛合。
如請求項37所述之方法，其中該顆粒包含磁性珠。
如請求項37所述之方法，其中該寡核苷酸與包含多種該等顆粒的樹脂軛合。
如請求項39所述之方法，其中柱包含該樹脂。
如請求項40所述之方法，其中該樹脂包含交聯聚[苯乙烯-二乙烯基苯]、瓊脂糖或SEPHAROSE®瓊脂糖。
如請求項17-41中任一項所述之方法，其中將該線性多核糖核苷酸分離包括將該寡核苷酸固定。
如請求項17-42中任一項所述之方法，其中將該線性多核糖核苷酸分離包括將該樣本中未與該寡核苷酸雜交的部分收集。
如請求項43所述之方法，其中該樣本中未與該寡核苷酸雜交的部分包含該環狀多核糖核苷酸。
如請求項1-44中任一項所述之方法，該方法進一步包括將包含與該寡核苷酸雜交的該靶區域的線性多核糖核苷酸洗滌一次或多次。
如請求項1-45中任一項所述之方法，該方法進一步包括將包含來自該寡核苷酸的該靶區域的線性多核糖核苷酸洗脫。
如請求項1-46中任一項所述之方法，其中該方法包括提供多種寡核苷酸，其中每種寡核苷酸都與不同的靶區域雜交。
如請求項1-47中任一項所述之方法，其中該寡核苷酸與該靶區域的等長部分具有至少80%互補性。
如請求項48所述之方法，其中該寡核苷酸與該靶區域的等長部分具有至少85%、90%、95%、97%、99%或100%互補性。
如請求項1-49中任一項所述之方法，其中該方法包括提供與包含該靶區域的該多核糖核苷酸的莫耳比為10 : 1至1 : 10的寡核苷酸。
如請求項11-50中任一項所述之方法，其中來自純化後該環狀多核糖核苷酸的該ORF的表現水平相對於來自純化前的該ORF的表現水平增加了至少10%。
如請求項1-51中任一項所述之方法，其中該方法分離至少500 µg的包含該靶區域的該線性多核糖核苷酸。
如請求項52所述之方法，其中該方法分離500 µg至1000 mg的包含該靶區域的線性多核糖核苷酸。
一種多核糖核苷酸群體，其藉由如請求項1-53中任一項所述之方法產生。
如請求項54所述之多核糖核苷酸群體，其中該群體包含缺乏該靶區域的環狀多核糖核苷酸，並且該環狀多核糖核苷酸包含該組成物中總多核糖核苷酸的至少40%（mol/mol）。
如請求項54或55所述之多核糖核苷酸群體，其中該群體包含該組成物中總多核糖核苷酸的小於40%（mol/mol）的線性多核糖核苷酸。
如請求項56所述之多核糖核苷酸群體，其中該群體包含該組成物中總多核糖核苷酸的小於30%、20%、10%、5%或1%（mol/mol）的線性多核糖核苷酸。
如請求項54-57中任一項所述之多核糖核苷酸群體，其中在該多核糖核苷酸群體中的多核糖核苷酸的總重量係至少500 µg。
如請求項58所述之多核糖核苷酸群體，其中在該多核糖核苷酸群體中的多核糖核苷酸的總重量係500 µg至1000 mg。
一種藥物組成物，其包含如請求項54-59中任一項所述之多核糖核苷酸群體，以及稀釋劑、載劑或賦形劑。