BR112020024292A2 - rna circular para translação em células eucarióticas - Google Patents

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Daniel G. Anderson
Robert Alexander Wesselhoeft
Piotr S. Kowalski
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Massachusetts Institute Of Technology
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Abstract

"RNA CIRCULAR PARA TRANSLAÇÃO EM CÉLULAS EUCARIÓTICAS". A presente invenção se refere a métodos e construções para a modificação do RNA circular. É revelado um vetor para produzir o RNA circular, o referido vetor compreendendo os seguintes elementos operativamente conectados uns aos outros e dispostos na seguinte sequência: a.) um braço de homologia 5, b.) um fragmento de íntron de Grupo I 3' contendo um dinucleotídeo do sítio de junção 3, c.) opcionalmente, uma sequência espaçadora 5', d.) uma região de codificação ou não codificação de proteína, e.) opcionalmente, uma sequência espaçadora 3, f.) um fragmento de íntron de Grupo I 5' contendo um dinucleotídeo do sítio de junção 5, e g.) um braço de homologia 3', o referido vetor permitindo a produção de um RNA circular que é transladável ou biologicamente ativo dentro de células eucarióticas. Em outra modalidade, o vetor pode compreender a sequência espaçadora 5, mas não a sequência espaçadora 3'. Em ainda outra modalidade, o vetor pode compreender a sequência espaçadora 3, mas não a sequência espaçadora 5'. Também é revelado um método para purificar o RNA circular produzido pelo vetor e o uso de modificações de nucleosídeos no RNA circular produzido pelo vetor.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "RNA CIRCULAR PARA TRANSLAÇÃO EM CÉLULAS EUCARIÓTICAS". PEDIDO(S) RELACIONADO(S)
[001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório Nor- te-americano No. 62/851.548, depositado em 22 de maio de 2019, do Pedido Provisório Norte-americano No. 62/791.028, depositado em 10 de janeiro de 2019 e do Pedido Provisório Norte-americano No. 62/681.617, depositado em 6 de junho de 2018. Todos os ensinamen- tos dos pedidos acima são aqui incorporados por referência.
INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA DO MATERIAL EM ARQUIVO DE TEXTO ASCII
[002] Este pedido incorpora por referência a Listagem de Se- quência contida no seguinte arquivo de texto ASCII sendo enviado si- multaneamente com este: a) Nome do arquivo: 00502311003_FinalSequenceListing.txt; criado em 4 de junho de 2019, 55 KB de tamanho.
SUPORTE GOVERNAMENTAL
[003] Esta invenção foi feita com o apoio do governo sob W32P4Q-13-1-0011 da Defense Advanced Research Projects Agency e sob 5R01HL125428 do National Institutes of Health. O governo tem certos direitos sobre a invenção.
ANTECEDENTES
[004] O RNA mensageiro (mRNA) tem amplo potencial para uma faixa de aplicações terapêuticas e modificadas. No entanto, uma limi- tação fundamental para seu uso é sua meia-vida relativamente curta em sistemas biológicos. Assim, há uma necessidade de estender a duração da expressão da proteína a partir de mensagens de RNA de tamanho natural.
SUMÁRIO
[005] Em certos aspectos, é fornecido aqui um vetor para produ- zir o RNA circular (circRNA).
[006] Em algumas modalidades, o vetor compreende os seguin- tes elementos operativamente conectados uns aos outros e, em algu- mas modalidades, dispostos na seguinte sequência: a.) um braço de homologia 5’, b.) um fragmento de íntron de Grupo I 3' contendo um dinucleotídeo do sítio de junção 3', c.) uma região de codificação ou não codificação de proteína, d.) um fragmento de íntron de Grupo I 5' contendo um dinucleotídeo do sítio de junção 5', e e.) um braço de homologia 3'. Em certas modalidades, o referido vetor permite a pro- dução de um RNA circular que é transladável e/ou biologicamente ati- vo dentro das células eucarióticas. Em algumas modalidades, o RNA biologicamente ativo é, por exemplo, uma esponja de miRNA ou RNA não codificador longo.
[007] Em algumas modalidades, o referido vetor compreende os seguintes elementos operativamente conectados uns aos outros e dis- postos na seguinte sequência: a.) um braço de homologia 5’, b.) um fragmento de íntron de Grupo I 3' contendo um dinucleotídeo do sítio de junção 3’, c.) opcionalmente, uma sequência espaçadora 5’, d.) op- cionalmente, um sítio de entrada do ribossomo interno (IRES), e.) uma região de codificação ou não codificação de proteína, f.) opcionalmen- te, uma sequência espaçadora 3', g.) um fragmento de íntron de Grupo I 5’ contendo um dinucleotídeo do sítio de junção 5’ e h.) um braço de homologia 3'. Em certas modalidades, o referido vetor permite a pro- dução de um RNA circular que é transladável e/ou biologicamente ati- vo dentro das células eucarióticas.
[008] Em algumas modalidades, o vetor compreende os seguin- tes elementos operativamente conectados uns aos outros e dispostos na seguinte sequência: a.) um braço de homologia 5’, b.) um fragmen- to de íntron de Grupo I 3' contendo um dinucleotídeo do sítio de junção
3’, c.) uma sequência espaçadora 5’, d.) um sítio de entrada do ribos- somo interno (IRES), e.) uma proteína de codificação ou não codifica- ção, f.) um fragmento de íntron de Grupo I 5' contendo um dinucleotí- deo do sítio de junção 5’ e g.) um braço de homologia 3’. Em algumas modalidades, o referido vetor permite a produção de um RNA circular que é transladável e/ou biologicamente ativo dentro das células euca- rióticas.
[009] Em algumas modalidades, o vetor compreende os seguin- tes elementos operativamente conectados uns aos outros e dispostos na seguinte sequência: a.) um braço de homologia 5’, b.) um fragmen- to de íntron de Grupo I 3' contendo um dinucleotídeo do sítio de junção 3’, c.) uma sequência espaçadora 5’, d.) uma região de codificação ou não codificação de proteína, e.) uma sequência espaçadora 3', f.) um fragmento de íntron de Grupo I 5’ contendo um dinucleotídeo do sítio de junção 5' e g.) a braço de homologia 3’. Em algumas modalidades, o referido vetor permite a produção de um RNA circular que é transla- dável e/ou biologicamente ativo dentro das células eucarióticas.
[0010] Em algumas modalidades, o referido vetor compreende os seguintes elementos operativamente conectados uns aos outros e dis- postos na seguinte sequência: a.) um braço de homologia 5’, b.) um fragmento de íntron de Grupo I 3' contendo um dinucleotídeo do sítio de junção 3’, c.) um sítio de entrada do ribossomo interno (IRES), d.) uma região de codificação ou não codificação de proteína, e.) uma se- quência espaçadora 3’, f.) um fragmento de íntron de Grupo I 5' con- tendo um dinucleotídeo do sítio de junção 5’ e g.) um braço de homo- logia 3’. Em algumas modalidades, o referido vetor permite a produção de um RNA circular que é transladável e/ou biologicamente ativo den- tro das células eucarióticas.
[0011] Em algumas modalidades, o referido vetor compreende os seguintes elementos operativamente conectados uns aos outros e dis-
postos na seguinte sequência: a.) um braço de homologia 5’, b.) um fragmento de íntron de Grupo I 3' contendo um dinucleotídeo do sítio de junção 3’, c.) uma região de codificação ou não codificação de pro- teína, d.) uma sequência espaçadora 3’, e.) um fragmento de íntron de Grupo I 5' contendo um dinucleotídeo do sítio de junção 5’ e f.) um braço de homologia 3'. Em algumas modalidades, o referido vetor permite a produção de um RNA circular que é transladável e/ou biolo- gicamente ativo dentro das células eucarióticas.
[0012] Em algumas modalidades, o referido vetor compreende os seguintes elementos operativamente conectados uns aos outros e dis- postos na seguinte sequência: a.) um braço de homologia 5’, b.) um fragmento de íntron de Grupo I 3' contendo um dinucleotídeo do sítio de junção 3’, c.) uma sequência espaçadora 5', d.) uma região codifi- cacora ou não codificadora de proteína, e.) um fragmento de íntron de Grupo I 5’ contendo um dinucleotídeo do sítio de junção 5' e f.) um braço de homologia 3’. Em algumas modalidades, o referido vetor permite a produção de um RNA circular que é transladável e/ou biolo- gicamente ativo dentro das células eucarióticas.
[0013] Em algumas modalidades, o referido vetor compreende os seguintes elementos operativamente conectados uns aos outros e dis- postos na seguinte sequência: a.) um braço de homologia 5’, b.) um fragmento de íntron de Grupo I 3' contendo um dinucleotídeo do sítio de junção 3’, c.) um sítio de entrada do ribossomo interno (IRES), d.) uma região de codificação ou não codificação de proteína, e.) um fra- gmento de íntron de Grupo I 5’ contendo um dinucleotídeo do sítio de junção 5', e f.) um braço de homologia 3’. Em algumas modalidades, o referido vetor permite a produção de um RNA circular que é transladá- vel e/ou biologicamente ativo dentro das células eucarióticas.
[0014] Em algumas modalidades, o vetor compreende os seguin- tes elementos operativamente conectados uns aos outros e dispostos na seguinte sequência: a.) um braço de homologia 5’, b.) um fragmen- to de íntron de Grupo I 3' contendo um dinucleotídeo do sítio de junção 3’, c.) uma sequência espaçadora 5’, d.) um sítio de entrada do ribos- somo interno (IRES), e.) uma região de codificação ou não codificação de proteína, f.) uma sequência espaçadora 3', g.) um fragmento de ín- tron de Grupo I 5’ contendo um dinucleotídeo do sítio de junção 5’, e g.) um braço de homologia 3'. Em algumas modalidades, o referido vetor permite a produção de um RNA circular que é transladável e/ou biologicamente ativo dentro das células eucarióticas.
[0015] Em uma modalidade, o fragmento de íntron de Grupo I 3’ e/ou o fragmento de íntron de Grupo I 5' é de um gene de Cyanobacte- rium Anabaena sp. pré-tRNA-Leu ou gene Td do fago T4.
[0016] Em uma modalidade, o fragmento de íntron de Grupo I 3’ e/ou o fragmento de íntron de Grupo I 5' é de um gene de Cyanobacte- rium Anabaena sp. pré-tRNA-Leu.
[0017] Em outra modalidade, se presente, a sequência de IRES é uma sequência de IRES do vírus da síndrome de Taura, vírus do Tria- toma, vírus da encefalomielite de Theiler, vírus Símio 40, vírus de So- lenopsis invicta 1, vírus de Rhopalosiphum padi, vírus da Reticuloen- doteliose, poliovírus humano 1, vírus do intestino de Plautia stali, vírus da abelha da Caxemira, rinovírus Humano 2, vírus-1 Homalodisca co- agulata, Vírus da Imunodeficiência Humana tipo 1, vírus-1 de Homalo- disca coagulata, vírus de Himetobi P, vírus da Hepatite C, Vírus da he- patite A, Vírus da hepatite GB, vírus da doença do pé e boca, Enteroví- rus humano 71, Vírus da rinite equina, Vírus tipo Ectropis obliqua pi- corna, Vírus da Encefalomiocardite (EMCV), Vírus de Drosophila C, Vírus de Crucifer tobamo, Vírus de Cricket paralysis, Vírus da diarreia viral bovina 1, Vírus da Célula Rainha Negra, Vírus da paralisia letal por afídeo, Vírus da encefalomielite aviária, Vírus da paralisia da abe- lha aguda, Vírus da mancha do anel clorótico de Hibiscus, Vírus da febre suína clássica, FGF2 Humano, SFTPAl Humano, AMLl/RUNXl Humano, Drosophila antennapedia, AQP4 Humano, AT1R Humano, BAG-1 Humano, BCL2 Humano, BiP Humano, c-IAPl Humano, c-myc Humano, eIF4G Humano, NDST4L de Camundongo, LEF1 Humano, HIF1 alfa de Camundongo, n.myc Humano, Gtx de Camundongo, P27kipl Humano, PDGF2/c-sis Humano, p53 Humano, Pim-1 Humano, Rbm3 de Camundongo, Drosophila reaper, Scamper Canino, Droso- phila Ubx, UNR Humano, UtrA de Camundongo, VEGF-A Humano, XIAP Humano, Salivirus, Cosavirus, Parechovirus, Drosophila hairless, TFIID de S. cerevisiae, YAP1 de S. cerevisiae, c-src Humano, FGF-1 Humano, Picomavirus de Símio, Vírus Turnip crinkle, um aptâmero pa- ra eIF4G, Coxsackievirus B3 (CVB3) ou Coxsackievirus A (CVB1/2). Em ainda outra modalidade, o IRES é uma sequência de IRES de Co- xsackievirus B3 (CVB3). Em uma outra modalidade, o IRES é uma se- quência de IRES do vírus da Encefalomiocardite.
[0018] Em uma modalidade, a região de codificação da proteína codifica uma proteína de origem eucariótica ou procariótica. Em outra modalidade, a região de codificação da proteína codifica a proteína humana ou proteína não humana. Em algumas modalidades, a região de codificação da proteína codifica um ou mais anticorpos. Por exem- plo, em algumas modalidades, a região de codificação da proteína co- difica anticorpos humanos. Em uma modalidade, a região de codifica- ção da proteína codifica uma proteína selecionada dentre hFIX, SP-B, VEGF-A, metilmalonil-CoA mutase humana (hMUT), CFTR, autoantí- genos de câncer e enzimas de edição de genes adicionais como Cpf1, nucleases de dedo de zinco ( ZFNs) e nucleases efetoras similares a ativadores de transcrição (TALENs). Em outra modalidade, a região de codificação da proteína codifica uma proteína para uso terapêutico. Em uma modalidade, o anticorpo humano codificado pela região de codificação da proteína é um anticorpo anti-HIV. Em uma modalidade,
o anticorpo codificado pela região de codificação da proteína é um an- ticorpo biespecífico. Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico é específico para CD19 e CD22. Em outra modalidade, o anticorpo bies- pecífico é específico para CD3 e CLDN6. Em uma modalidade, a regi- ão de codificação da proteína codifica uma proteína para uso em diag- nóstico. Em uma modalidade, a região de codificação da proteína codi- fica a Gaussia luciferase (Gluc), Vagalume luciferase (Fluc), proteína fluorescente verde realçada (eGFP), eritropoetina humana (hEPO) ou Cas9 endonuclease.
[0019] Em uma modalidade, o braço de homologia 5’ tem cerca de 5-50 nucleotídeos no comprimento. Em outra modalidade, o braço de homologia 5’ tem cerca de 9-19 nucleotídeos no comprimento. Em al- gumas modalidades, o braço de homologia 5’ tem pelo menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 ou 19 nucleotídeos no compri- mento. Em algumas modalidades, o braço de homologia 5’ não tem mais do que 50, 45, 40, 35, 30, 25 ou 20 nucleotídeos no comprimen- to. Em algumas modalidades, o braço de homologia 5’ tem 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 ou 19 nucleotídeos no comprimen- to.
[0020] Em uma modalidade, o braço de homologia 3’ tem cerca de 5-50 nucleotídeos no comprimento. Em outra modalidade, o braço de homologia 3’ tem cerca de 9-19 nucleotídeos no comprimento. Em al- gumas modalidades, o braço de homologia 3’ tem pelo menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 ou 19 nucleotídeos no compri- mento. Em algumas modalidades, o braço de homologia 3’ não tem mais do que 50, 45, 40, 35, 30, 25 ou 20 nucleotídeos no comprimen- to. Em algumas modalidades, o braço de homologia 3’ tem 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 ou 19 nucleotídeos no comprimen- to.
[0021] Em uma modalidade, a sequência espaçadora 5’ tem pelo menos 10 nucleotídeos no comprimento. Em outra modalidade, a se- quência espaçadora 5’ tem pelo menos 15 nucleotídeos no compri- mento. Em uma outra modalidade, a sequência espaçadora 5’ tem pe- lo menos 30 nucleotídeos no comprimento. Em algumas modalidades, a sequência espaçadora 5’ tem pelo menos 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25 ou 30 nucleotídeos no comprimento. Em al- gumas modalidades, a sequência espaçadora 5’ não tem mais do que 100, 90, 80, 70, 60, 50, 45, 40, 35 ou 30 nucleotídeos no comprimento. Em algumas modalidades, a sequência espaçadora 5’ tem entre 20 e 50 nucleotídeos no comprimento. Em certas modalidades, a sequência espaçadora 5’ tem 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 nucleotídeos no comprimento. Em uma modalidade, a sequência espaçadora 5’ é uma sequência polyA-C. Em outra modalidade, a sequência espaçadora 5’ é uma sequência polyA- C.
[0022] Em uma modalidade, a sequência espaçadora 3’ tem pelo menos 10 nucleotídeos no comprimento. Em outra modalidade, a se- quência espaçadora 3’ tem pelo menos 15 nucleotídeos no compri- mento. Em outra modalidade, a sequência espaçadora 3’ tem pelo menos 30 nucleotídeos no comprimento. Em algumas modalidades, a sequência espaçadora 3’ tem pelo menos 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25 ou 30 nucleotídeos no comprimento. Em al- gumas modalidades, a sequência espaçadora 3’ não tem mais do que 100, 90, 80, 70, 60, 50, 45, 40, 35 ou 30 nucleotídeos no comprimento. Em algumas modalidades, a sequência espaçadora 3’ tem entre 20 e 50 nucleotídeos no comprimento. Em certas modalidades, a sequência espaçadora 3’ tem 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 nucleotídeos no comprimento. Em uma modalidade, a sequência espaçadora 3’ tem uma sequência poly A-C. Em outra modalidade, a sequência espaçadora 5' tem uma sequência poly A-C.
[0023] Em uma modalidade, o vetor compreende ainda um promo- tor de RNA polimerase. Em outra modalidade, o promotor de RNA po- limerase é um promotor de RNA polimerase do vírus T7, promotor de RNA polimerase do vírus T6, promotor de RNA polimerase do vírus SP6, promotor de RNA polimerase do vírus T3 ou promotor de RNA polimerase do vírus T4.
[0024] Em uma modalidade, o vetor é usado para transcrever o RNA circular com a faixa de tamanho de cerca de 500 a cerca de
10.000 nucleotídeos. Em algumas modalidades, o RNA circular é de pelo menos 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1.000,
1.100, 1.200, 1.300, 1.400, 1.500, 1.600, 1.700, 1.800, 1.900, 2.000,
2.500, 3.000, 3.500, 4.000, 4.500 ou 5.000 nucleotídeos no tamanho. Em algumas modalidades, o RNA circular não tem mais do que
10.000, 9.000, 8.000, 7.000, 6.000, 5.000 ou 4.000 nucleotídeos no tamanho.
[0025] Em outra modalidade, o IRES é uma sequência de IRES de Coxsackievirus B3 (CVB3), a região de codificação da proteína codifi- ca a luciferase Guassia (Gluc) e as sequências espaçadoras são poly A-C.
[0026] Em algumas modalidades, o IRES, se presente, tem pelo menos cerca de 50 nucleotídeos no comprimento. Em uma modalida- de, o vetor compreende um IRES que compreende uma sequência na- tural. Em uma modalidade, o vetor compreende um IRES que compre- ende uma sequência sintética.
[0027] Em uma modalidade, a invenção é direcionada a um vetor para produzir o RNA circular, o referido vetor compreendendo os se- guintes elementos operativamente conectados uns aos outros e dis-
postos na seguinte sequência: a.) um braço de homologia 5’, b.) um fragmento de íntron de grupo I 3’ contendo um dinucleotídeo do sítio de junção 3’, c.) uma sequência espaçadora 5’, d.) um sítio de entrada do ribossomo interno (IRES), e.) uma região de codificação ou não co- dificação de proteína, f.) um fragmento de íntron de grupo I 5’ conten- do um dinucleotídeo do sítio de junção 5’ e g.) um braço de homologia 3'. Em algumas modalidades, o referido vetor permite a produção de um RNA circular que é transladável e/ou biologicamente ativo dentro das células eucarióticas.
[0028] Em uma modalidade, a invenção é direcionada a um vetor para produzir o RNA circular, o referido vetor compreendendo os se- guintes elementos operativamente conectados uns aos outros e dis- postos na seguinte sequência: a.) um braço de homologia 5’, b.) um fragmento de íntron de grupo I 3’ contendo um dinucleotídeo do sítio de junção 3’, c.) um sítio de entrada do ribossomo interno (IRES), d.) uma proteína de codificação ou região de não codificação, por exem- plo) e.) uma sequência espaçadora (por exemplo, segundo espaça- dor), f.) um fragmento de íntron de Grupo I 5’ contendo um dinucleotí- deo do sítio de junção 5’ e g.) um braço de homologia 3'. Em algumas modalidades, o referido vetor permite a produção de um RNA circular que é transladável e/ou biologicamente ativo dentro das células, por exemplo, células eucarióticas.
[0029] Em certas modalidades, os vetores fornecidos neste docu- mento não compreendem um sítio de clonagem múltipla (MCS).
[0030] Em uma modalidade, a invenção é direcionada a um RNA circular. Em certas modalidades, o RNA circular é um RNA circular produzido por um vetor aqui fornecido. Em algumas modalidades, o RNA circular compreende, na seguinte sequência: a.) uma sequência espaçadora 5’, b.) um sítio de entrada do ribossomo interno (IRES), c.) uma região de codificação ou não codificação de proteína e d.) uma sequência espaçadora 3’. Em algumas modalidades, o RNA circular compreende ainda a porção do fragmento de íntron de Grupo I 3’ que está 3’ do dinucleotídeo do sítio de junção 3’. Em algumas modalida- des, o RNA circular compreende ainda a porção do fragmento de ín- tron de Grupo I 5’ que está 5’ do dinucleotídeo do sítio de junção 5’. Em algumas modalidades, o RNA circular tem pelo menos 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000 ou 4500 nu- cleotídeos. Em uma modalidade, o RNA circular é de pelo menos cer- ca de 10 nt. Em uma modalidade, o RNA circular é de cerca de 500 nt ou menos do que 500 nt. Em uma modalidade, o RNA circular tem pe- lo menos cerca de 1 kb. O RNA circular pode ser não modificado, par- cialmente modificado ou completamente modificado. Em uma modali- dade, o RNA circular contém pelo menos uma modificação de nucleo- sídeo. Em uma modalidade, até 100% dos nucleosídeos do RNA circu- lar são modificados. Em uma modalidade, pelo menos uma modifica- ção de nucleosídeo é uma modificação de uridina ou uma modificação de adenosina. Em uma modalidade, pelo menos uma modificação de nucleosídeo é selecionada dentre N6-metiladenosina (m6A), pseudou- ridina (ψ), N1-metilpseudouridina (m1ψ) e 5-metoxiuridina (5moU). Em uma modalidade, o RNA precursor é modificado com metilpseudouri- dina (m1ψ).
[0031] Em outra modalidade, a invenção é direcionada a um mé- todo de expressão de proteína em uma célula, o referido método com- preendendo a transfecção do RNA circular na célula. Em uma modali- dade, o método compreende a transfecção usando lipofecção ou ele- troporação. Em outra modalidade, o RNA circular é transfectado para uma célula usando um nanotransportador. Em ainda outra modalidade, o nanotransportador é um lipídio, polímero ou um híbrido lipo- polimérico. Em uma modalidade, o RNA circular compreende IRES de coxsackievirus B3.
[0032] Em uma modalidade, a invenção é direcionada a um méto- do de purificação de RNA circular, compreendendo a execução do RNA através de uma coluna de exclusão por tamanho em tris-EDTA ou tampão de citrato em um sistema de cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC). Em outra modalidade, o RNA é executado atra- vés da coluna de exclusão por tamanho em tris-EDTA ou tampão de citrato a pH na faixa de cerca de 4-7 a uma taxa de fluxo de cerca de 0,01-5mL/minuto. Em uma modalidade, a HPLC remove um ou mais dos seguintes: fragmentos de íntron, RNA linear cortado, concatena- ções lineares e circulares e impurezas resultantes da transcrição in vitro e reações de junção.
[0033] Em uma modalidade, é fornecido aqui um RNA precursor. Em certas modalidades, o RNA precursor é um RNA circular produzido por transcrição in vitro de um vetor aqui fornecido. Em algumas moda- lidades, o RNA precursor compreende, na sequência a seguir, a.) um braço de homologia 5’, b.) um fragmento de íntron de Grupo I 3' con- tendo um dinucleotídeo do sítio de junção 3’, c.) uma sequência espa- çadora 5’, d.) um sítio de entrada do ribossomo interno (IRES), e.) uma região de codificação ou não codificação de proteína, f.) uma sequên- cia espaçadora 3’, f.) um fragmento de íntron de Grupo I 5' contendo um dinucleotídeo do sítio de junção 5’, e g.) um braço de homologia 3’. O RNA precursor pode ser não modificado, parcialmente modificado ou completamente modificado. Em uma modalidade, o RNA precursor contém pelo menos uma modificação de nucleosídeo. Em uma moda- lidade, até 100% dos nucleosídeos do RNA precursor são modificados. Em uma modalidade, pelo menos uma modificação de nucleosídeo é uma modificação de uridina ou uma modificação de adenosina. Em uma modalidade, pelo menos uma modificação de nucleosídeo é sele- cionada dentre N6-metiladenosina (m6A), pseudouridina (ψ), N1- metilpseudouridina (m1ψ) e 5-metoxiuridina (5moU). Em uma modali-
dade, o RNA precursor é modificado com metilpseudouridina (m1ψ).
[0034] Em outra modalidade, a invenção é direcionada a um mé- todo de purificação de RNA circular, o referido método compreenden- do: a execução de RNA circular (por exemplo, RNA circular fornecido neste documento) através de uma coluna de exclusão por tamanho em tris-EDTA ou tampão de citrato em um sistema de cromatografia líqui- da de alto desempenho (HPLC), e tratamento do RNA circular com fosfatase após a execução do RNA circular através da coluna de ex- clusão por tamanho, produzindo assim o RNA circular purificado. Em uma modalidade, o tratamento com fosfatase é seguido por tratamento com RNase R. Em uma modalidade, o RNA circular purificado é formu- lado em nanopartículas. Em uma modalidade, o RNA circular é execu- tado através da coluna de exclusão por tamanho a um pH na faixa de cerca de 4-8. Em uma modalidade, o RNA circular é executado através da coluna de exclusão por tamanho a uma taxa de fluxo de cerca de 0,01-5,0 mL/minuto.
[0035] Em algumas modalidades, a HPLC, conforme utilizada nos métodos aqui descritos, pode incluir um tampão aquoso que inclui um sal, tal como tampão de fosfato, tendo um pH entre cerca de 4 e cerca de 7,5.
[0036] Em ainda outra modalidade, a invenção é direcionada a um método de produção de RNA circular a partir de RNA precursor, o refe- rido método compreendendo o uso de um vetor aqui fornecido. Em al- gumas modalidades, o método compreende a.) síntetização do RNA precursor por transcrição in vitro do vetor, e b.) incubação do RNA precursor na presença de íons de magnésio e nucleotídeo ou nucleo- sídeo de quanosina a uma temperatura em que ocorre a circularização de RNA (por exemplo, entre 20 °C e 60 °C). Em algumas modalidades, o vetor compreende os seguintes elementos operativamente conecta- dos uns aos outros e dispostos na seguinte sequência: a) um braço de homologia 5’, b) um fragmento de íntron de Grupo I 3' contendo um dinucleotídeo do sítio de junção 3’, c) uma sequência espaçadora 5’, d) uma região de codificação ou não codificação de proteína, e) uma se- quência espaçadora 3', f) um fragmento de íntron de Grupo I 5’ con- tendo um dinucleotídeo do sítio de junção 5' e g) um braço de homolo- gia 3’, referido vetor permitindo a produção de um RNA circular que é transladável no interior das células eucarióticas. Em uma modalidade, o método compreende ainda um sítio de entrada do ribossomo interno (IRES) entre a sequência espaçadora 5' e a região de codificação da proteína.
[0037] Em uma modalidade, a invenção é direcionada a um méto- do para produzir o RNA circular a partir de RNA precursor gerado por transcrição in vitro de um vetor aqui fornecido. Em algumas modalida- des, o método inclui a incubação do RNA precursor na presença de íons de magnésio e nucleotídeo ou nucleosídeo de quanosina a uma temperatura na qual ocorre a circularização de RNA (por exemplo, en- tre 20 °C e 60 °C). Em algumas modalidades, os nucleosídeos do RNA precursor não são modificados. O RNA precursor pode ser não modifi- cado, parcialmente modificado ou completamente modificado. Em uma modalidade, o RNA precursor pode ocorrer naturalmente. Em uma modalidade, o RNA precursor contém pelo menos uma modificação de nucleosídeo. Em uma modalidade, até 100% dos nucleosídeos do RNA precursor são modificados. Em uma modalidade, pelo menos uma modificação de nucleosídeo é uma modificação de uridina ou uma modificação de adenosina. Em uma modalidade, pelo menos uma mo- dificação de nucleosídeo é selecionada dentre N6-metiladenosina (m6A), pseudouridina (ψ), N1-metilpseudouridina (m1ψ) e 5- metoxiuridina (5moU). Em uma modalidade, o RNA precursor é modifi- cado com metilpseudouridina (m1ψ).
[0038] Em uma modalidade, a invenção é direcionada a um RNA circular produzido por um vetor e/ou um método aqui descrito. Em uma modalidade, a invenção é direcionada a uma composição, por exem- plo, uma composição farmacêutica, compreendendo um RNA circular fornecido neste documento (por exemplo, um RNA circular produzido por um vetor, RNA precursor e/ou um método descrito neste documen- to).
[0039] Em uma modalidade, a invenção é direcionada a um méto- do de expressão de proteína em uma célula, o referido método com- preendendo a transfecção de um RNA circular fornecido neste docu- mento para a célula.
[0040] Quando aqui usado, "RNA precursor" refere-se a uma mo- lécula de RNA linear criada por transcrição in vitro (por exemplo, a par- tir de um vetor aqui fornecido). Esta molécula de RNA precursor con- tém a totalidade da sequência circRNA, mais sequências de junção (fragmentos de íntron e braços de homologia) necessárias para circu- larizar o RNA. Essas sequências de junção (fragmentos de íntron e braços de homologia) são removidos do RNA precursor durante a cir- cularização, produzindo circRNA mais dois fragmentos de RNA linear de braço de homologia/íntron. O RNA precursor pode ser não modifi- cado, parcialmente modificado ou completamente modificado. Em uma modalidade, o RNA precursor contém apenas nucleotídeos de ocor- rência natural.
[0041] Em uma modalidade, a invenção é direcionada a um méto- do de produção de RNA circular com eficiência de translação realçada, o referido método compreendendo a incorporação de nucleosídeos artificiais em um RNA precursor durante a transcrição de um vetor que codifica o RNA precursor e circularização do RNA precursor para for- mar o RNA circular.
[0042] Em outra modalidade, a invenção é direcionada a um mé- todo de produção de RNA circular com estabilidade de expressão de proteína realçada, o referido método compreendendo a incorporação de nucleosídeos artificiais em um RNA precursor durante a transcrição de um vetor que codifica o RNA precursor e circularização do RNA precursor para formar o RNA circular.
[0043] Em ainda outra modalidade, a invenção é direcionada a um método de fazer RNA circular com ascensão incorporando nucleosí- deos artificiais em um RNA precursor durante a transcrição de um ve- tor que codifica o RNA precursor e circularização do RNA precursor para formar o RNA circular.
[0044] Em algumas modalidades, um vetor fornecido neste docu- mento pode ser usado para transcrever um RNA precursor que se au- toligará em um circRNA sob as condições diretas (por exemplo, condi- ções fornecidas neste documento). Em uma modalidade, o compri- mento deste circRNA está entre cerca de 200 e cerca de 10.000 nu- cleotídeos longos.
[0045] Em uma modalidade, os vetores aqui fornecidos compreen- dem um promotor de RNA polimerase a montante da região que codi- fica o RNA precursor (por exemplo, a montante do braço de homologia 5’). Em algumas modalidades, o promotor pode ser reconhecido pela enzima T7 RNA polimerase do fago.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0046] O precedente ficará evidente a partir da seguinte descrição mais particular de modalidades exemplares, conforme ilustrado nos desenhos anexos, nos quais os caracteres de referência similares se referem às mesmas partes ao longo das diferentes vistas. Os dese- nhos não estão necessariamente em escala, em vez disso, a ênfase é colocada na ilustração de modalidades.
[0047] O arquivo de patente ou do pedido contém pelo menos um desenho executado em cores. Cópias desta publicação de patente ou do pedido de patente com desenho(s) colorido(s) serão fornecidas pe-
lo Instituto mediante solicitação e pagamento da taxa necessária.
[0048] A FIG.1A é um diagrama esquemático que mostra um exemplo de um projeto de construção de íntron-éxon permutado e me- canismo de junção. O íntron catalítico do grupo I do gene da Td do fa- go T4 é dividido ao meio de forma a preservar os elementos estrutu- rais críticos para o dobramento da ribozima. O fragmento de éxon 2 (E2) é ligado a montante do fragmento de éxon 1 (E1), e uma região de codificação de aproximadamente 1.1 kb de comprimento é inserida na junção éxon-éxon. Durante a junção, o grupo hidroxila 3’de um nu- cleotídeo de guanosina se envolve em uma reação de transesterifica- ção no sítio de junção 5'. O fragmento do íntron 5’ é excisado, e o gru- po hidroxila liberado no final do intermediário se envolve em uma se- gunda transesterificação no sítio de junção 3', resultando na circulari- zação da região interveniente e excisão do íntron 3’.
[0049] A FIG. 1B mostra previsões de RNAFold da estrutura se- cundária de RNA precursor para projeto de braço de homologia. As cores denotam a probabilidade do pareamento de base, com o verme- lho indicando maior probabilidade. Sem braços de homologia, nenhum pareamento de base está previsto para ocorrer entre as extremidades da molécula precursora. As setas apontam para os braços de homolo- gia adicionados.
[0050] A FIG.1C mostra um gel de agarose que demonstra o efeito dos braços de homologia na junção. O circRNA putativo funciona com um peso molecular mais alto do que o RNA precursor mais pesado, conforme indicado. (-): sem braços de homologia. Fraco: braços de homologia fracos, 9nt. Forte: braços de homologia fortes, 19nt.
[0051] A FIG.1D mostra a confirmação do gel de agarose da circu- larização do RNA precursor. C: RNA precursor (com braços de homo- logia forte) submetido a condições de circularização. C+R: Faixa C, digerido com RNase R. C+R+H: Faixa C+R, digerido com RNase H guiada por oligonucleotídeo U: RNA precursor não submetido a condi- ções de circularização. U+ H: Faixa U, digerido com RNase H. guiada por oligonucleotídeo
[0052] A FIG. 1E mostra a saída de sequenciamento Sanger de RT-PCR através da união da junção da amostra representada na faixa C+R da FIG. 1D.
[0053] FIG. 1F mostra previsões RNAFold da estrutura secundária do RNA precursor no contexto de espaçadores projetados. Estruturas secundárias potencialmente importantes para a função da ribozima são identificadas por setas pretas.
[0054] A FIG. 1G mostra um gel de agarose demonstrando o efeito dos espaçadores na junção. (-): sem espaçador. D: espaçador disrup- tivo. P1: espaçador permissivo 1. P2: espaçador permissivo 2.
[0055] A FIG. 1H mostra previsões de RNAFold da estrutura se- cundária do RNA precursor para o projeto da região de homologia in- terna. Falta de homologia interna significativa (Anabaena 1.0) e homo- logia interna introduzida (Anabaena 2.0) indicada por setas pretas. 'Bo- lha de junção' indicada como a região entre os braços de homologia e as regiões de homologia internas que contém a ribozima de junção.
[0056] A FIG. 1I mostra um gel de agarose demonstrando o efeito da homologia interna na junção.
[0057] A FIG. 1J mostra um gel de agarose comparando a reação de junção do fago T4 otimizada com a reação de junção de Anabaena otimizada. As metades do íntron de Anabaena são de comprimentos aproximadamente iguais e são menos propensos a permanecer asso- ciadas após a junção em comparação com as metades do intron do fago T4, apesar dos braços de homologia mais fortes.
[0058] A FIG. 2A é um diagrama esquemático que mostra os ele- mentos de um projeto de RNA precursor de autojunção de exemplo. Avaliação da eficácia de circularização e translação para uma faixa de circRNAs de codificação de proteínas gerados a partir do RNA precur- sor modificado por de novo.
[0059] A FIG. 2B mostra um gel de agarose de RNA precursor contendo um IRES de EMCV e uma inserção variável incluindo Gaus- sia luciferase (GLuc), eritropoetina humana (hEpo), EGFP, Vagalume luciferase (FLuc) ou regiões de codificação Cas9 após circularização e recircularização (R-). CircRNA foi enriquecido pela degradação de RNase R (R+).
[0060] A FIG. 2C é um gráfico de barras mostrando rendimentos do circRNA aproximados do tratamento de 20 µg de reação de junção com RNase R, conforme avaliado por espectrofotometria (dados apre- sentados como média+DP, n=3).
[0061] A FIG. 2D é um gráfico de barras que mostra a luminescên- cia no sobrenadante de células HEK293 24 horas após a transfecção com circRNA que codifica para GLuc (dados apresentados como mé- dia + SD, n = 4, *p <0,05).
[0062] A FIG. 2E é um gráfico de barras que mostra a expressão de eritropoetina humana no sobrenadante de células HEK293 24 horas após a transfecção com circRNA que codifica para hEpo (dados apre- sentados como média + SD, n = 4, *p<0,05).
[0063] A FIG. 2F mostra a fluorescência de GFP em células HEK293 24 horas após a transfecção com circRNA que codifica para EGFP.
[0064] A FIG. 2G é um gráfico de barras que mostra a lumines- cência no lisado de células HEK293 24 horas após a transfecção com circRNA que codifica para FLuc (dados apresentados como média + SD, n = 4, *p<0,05).
[0065] A FIG. 2H é um gráfico que mostra a análise por FACS que demonstra a ablação de GFP em células HEK293-EF1a-GFP 4 dias após a transfecção com sgGFP sozinho (circCas9-) indicado pelo apa-
recimento de uma população de células GFP-negativas.
[0066] A FIG. 2I é um gráfico que mostra a análise por FACS que demonstra a ablação de GFP em células HEK293-EF1a-GFP 4 dias após a transfecção com circRNA que codifica para Cas9 (circCas9+), indicado pelo aparecimento de uma população de células GFP- negativas.
[0067] A FIG. 3A é um gráfico de barras que mostra a luminescên- cia no sobrenadante de células HEK293 24 horas após a transfecção com circRNA contendo um painel de sequências de IRES de UTR 5' virais em contextos GLuc (barras à esquerda, pretas) e FLuc (barras à direita, cinzas) (dados apresentados como média + SD, n = 4).
[0068] A FIG. 3B é um gráfico de barras que mostra a luminescên- cia no sobrenadante de células HEK293 24 horas após a transfecção com circRNA contendo uma região de codificação de GLuc e um IRES funcional. O efeito da adição de uma sequência espaçadora polyA(30) ou polyAC(30) separando o IRES da união da junção é medido. (-): sem espaçador. pAC: espaçador de 30nt consistindo em adenosinas e citosinas. pA: espaçador de 30nt consistindo em adenosinas (dados apresentados como média + SD, n = 4, *p<0,05).
[0069] A FIG. 3C é um gráfico de barras que mostra a luminescên- cia no sobrenadante das células HEK293 (esquerda, pretas) e HeLa (direita, cinzas) 24 horas após a transfecção com os circRNAs mais eficazes por IRES em b) (dados apresentados como média + SD, n = 4).
[0070] A FIG. 3D é um gráfico que mostra o cromatograma de HPLC de RNA de GLuc linear (parte superior) e uma reação de junção de CVB3-GLuc-pAC (parte inferior).
[0071] A FIG. 3E mostra o gel de agarose de CVB3-GLuc-pAC pu- rificado por diferentes métodos. C: reação de junção. +R: reação de junção tratada com RNase R. +G,R: gel de reação de junção extraído e, em seguida, tratado com RNase R. +H,R: reação de junção purifica- da por HPLC e depois tratada com RNase R.
[0072] A FIG. 3F mostra a luminescência no sobrenadante de cé- lulas HEK293 24 horas após a transfecção com as reações de junção de CVB3-GLuc-pAC purificadas por diferentes métodos, conforme ob- servado na FIG. 3E (dados apresentados como média + SD, n = 4, *p<0,05).
[0073] A FIG. 3G mostra um gel de agarose de frações de HPLC para os dados da FIG. 3D. Da esquerda para a direita: Fração 1, 2, 3, 4, 5.
[0074] A FIG. 3H é um gráfico de barras que mostra a luminescên- cia no sobrenadante de células HEK293 (esquerda) e HeLa (direita) 24 horas após a transfecção com circRNA de CVB3-GLuc-pAC ou mRNA de GLuc linear modificado ou não modificado (dados apresentados como média + SD, n = 4 HEK293, n = 3 HeLa, *p<0,05).
[0075] A FIG. 3I é um gráfico que mostra a luminescência no so- brenadante de células HEK293 começando 24 horas após a transfec- ção com circRNA de CVB3-GLuc-pAC ou mRNA de GLuc linear modi- ficado ou não modificado e continuando por 6 dias (dados apresenta- dos como média + SD, n = 4 HEK293).
[0076] A FIG. 3J é um gráfico que mostra a luminescência cumula- tiva relativa produzida ao longo de 6 dias por células HEK293 (esquer- da) e HeLa (direita) transfectadas com circRNA de CVB3-GLuc-pAC ou mRNA de GLuc linear modificado ou não modificado (dados apre- sentados como média + SD, n = 4 HEK293 , n = 3 HeLa, *p<0,05).
[0077] A FIG. 3K é um gráfico que mostra a luminescência no so- brenadante de células HeLa começando 24 horas após a transfecção com circRNA de CVB3-GLuc-pAC ou mRNA de GLuc linear modifica- do ou não modificado e continuando por 6 dias (dados apresentados como média + SD, n = 3 HeLa).
[0078] A FIG. 4A mostra o efeito do comprimento da inserção na eficiência de circularização do RNA usando um íntron do grupo I per- mutado contendo espaçadores otimizados e braços de homologia. 1.2: circRNA de 1200nt. 2.4: circRNA de 2400 nt. 4,8: circRNA de 4800nt.
[0079] A FIG. 4B é um gráfico de barras que mostra a quantifica- ção em gel da eficiência de junção de moléculas precursoras contendo diferentes sequências projetadas. WHA: braços de homologia fracos. SHA: braços de homologia fortes. DS: espaçador disruptivo. PS: espa- çador permissivo. Ana: base de Anabaena. IH: homologia interna.
[0080] A FIG. 5A é um gráfico de barras que mostra a quantifica- ção de gel (ImageJ) de eficiência de junção e corte em circRNA con- tendo diferentes regiões de codificação intervenientes, dispostas por comprimento. Eficiência de junção apresentada como relação de RNA não precursor (circular, cortado) para RNA precursor. Corte apresen- tado como a relação de RNA cortado para RNA longo sem corte (pre- cursor, circular).
[0081] A FIG. 5B mostra gel de agarose demonstrando o efeito de pequenas deleções abrangendo os sítios de junção 5’ e 3' na junção.
[0082] A FIG. 5C é um gráfico de barras que mostra a luminescên- cia no sobrenadante de células HEK293 24 horas após a transfecção com circRNA que codifica para GLuc e que contém um IRES de EMCV ou o mesmo RNA precursor com sítios de junção deletados (dados apresentados como média + SD, n = 4).
[0083] A FIG. 6A é um gráfico de barras que mostra sequências de IRES adicionais e sequências de IRES putativas testadas quanto à funcionalidade no contexto de circRNA.
[0084] A FIG. 6B é um diagrama esquemático de uma previsão de RNAFold da estrutura secundária do RNA precursor na união da jun- ção. IRES, região de codificação e íntrons são excluídos.
[0085] A FIG. 6C é um gráfico de barras que mostra a luminescên-
cia no sobrenadante de células Min6 24 horas após a transfecção com os circRNAs mais eficazes por IRES na FIG. 3B (dados apresentados como média + SD, n = 4).
[0086] A FIG. 6D é um gráfico de barras que mostra a luminescên- cia no sobrenadante de células A549 24 horas após a transfecção com os circRNAs mais eficazes por IRES na FIG 3B (dados apresentados como média + SD, n = 4).
[0087] As FIGS. 7A-7J. FIGS. 7A-F mostram um exemplo do proje- to, síntese e purificação de circRNA. FIG. 7A) Projeto de RNA precur- sor e visão geral da autojunção. As cores denotam diferentes regiões dos RNAs usados. FIG. 7B) Esquemas de RNAs introduzidos e usa- dos nesta figura. Sítios ΔSplice (ΔS) são idênticos ao RNA precursor, exceto por pequenas deleções que abrangem ambos os sítios de jun- ção. FIG. 7C) Gel de agarose mostrando RNA precursor após a jun- ção, digestão com RNase R, purificação por HPLC e digestão com RNase H guiada por oligonucleotídeo. O RNA circular é digerido por RNase H em uma banda principal, enquanto ΔS é digerido em duas bandas principais, confirmando a circularidade. FIG. 7D) Gel de agaro- se mostrando métodos de purificação cumulativos aplicados a circR- NA. +RNase R: circRNA não purificado digerido com RNase R apenas. +HPLC: circRNA purificado por HPLC não purificado e depois digerido com RNase R. +Phos: circRNA purificado por HPLC não purificado, depois tratado com uma fosfatase e depois digerido com RNase R. FIG. 7E) Viabilidade celular, estabilidade de expressão de GLuc e libe- ração de citocinas de células 293 transfectadas com diferentes prepa- rações de circRNA, conforme descrito na FIG. 7D). A viabilidade celu- lar foi avaliada 3 dias após a transfecção. A liberação de citocinas foi avaliada 24 horas após a transfecção (dados apresentados como mé- dia + SD, n = 3, ns = não significativo p<0,05, ND = não detectado). FIG. 7F) Viabilidade celular, estabilidade de expressão de circRNA e liberação de citocinas de células A549 transfectadas com diferentes preparações de circRNA descritas na FIG. 7D). A viabilidade celular foi avaliada 3 dias após a transfecção. A liberação de citocinas foi avalia- da 24 horas após a transfecção (dados apresentados como média + SD, n = 3, ND = não detectado, *p<0,05). FIGS. 7G-J mostram carac- terização de Sítios ΔSplice (ΔS). FIG. 7G) Esquema do RNA introduzi- do e usado nesta figura. ΔS é o precursor de circRNA linear com sítios de junção deletados (marcados por x). ΔS é poliadenilado e tratado com fosfatase. FIG. 7H) Gel de agarose mostrando ladder usada para atribuir pesos moleculares e bandas. ΔS não circulariza de forma de- tectável. FIG. 7I) Expressão de GLuc 24 horas após a transfecção de células 293 com circRNA ou ΔS (dados apresentados como média + SD, n = 3). FIG. 7J) Estabilidade da produção da proteína GLuc ao longo de 3 dias após a transfecção de células 293 com circRNA ou ΔS (dados apresentados como média + SD, n = 3).
[0088] As FIGS. 8A-G. FIGS. 8A-F mostram o fracionamento da reação de junção e a avaliação da imunogenicidade. FIG. 8A) Esque- mas de RNAs introduzidos e usados nesta figura. HMW: Peso Molecu- lar Alto; esta fração contém concatenações lineares e circulares. FIG. 8B) Acima: Cromatograma de HPLC de uma reação de junção não pu- rificada. Abaixo: gel de agarose das frações purificadas. A separação adequada do RNA precursor foi difícil e, portanto, ΔS foi usado em seu lugar. FIG. 8C) Liberação de citocina 24 horas após a transfecção de células A549 com diferentes frações de HPLC, conforme descrito na FIG. 8B) (dados apresentados como média + SD, n = 3, *p<0,05). FIG. 8D) Viabilidade celular 36 horas após a transfecção de células A549 com diferentes frações de HPLC, conforme descrito em b) (dados apresentados como média + SD, n = 3, *p<0,05). FIG. 8E) Indução da transcrição de RIG-I e IFN-β1 18 horas após a transfecção de células A549 com os RNAs indicados. 3p-hpRNA é RNA em forma de grampo de cabelo de trifosfato 5' e um agonista específico de RIG-I (dados apresentados como média + SD, n = 3, *p<0,05). FIG. 8F) Indução da transcrição de RIG-I e IFN-β1 18 horas após a transfecção de células A549 com reações de junção digeridas por RNase R ou a fração de circRNA tardia (dados apresentados como média + SD, n = 3, *p<0,05). FIG. 8G mostra citocinas adicionais avaliadas em meios de cultura após a transfecção de células A549 (esquerda) e 293 (direita) com diferentes preparações de circRNA, conforme descrito na FIG. 7D (dados apresentados como média + SD, n = 3). Na maioria dos casos, esses analisados foram detectados em níveis extremamente baixos, impedindo a observação de diferenças significativas.
[0089] As FIGS. 9A-O. FIGS. 9A-F mostram a determinação da imunogenicidade de circRNA em relação ao RNA linear. FIG. 9A) Es- quemas de RNAs introduzidos e usados nesta figura. Os mRNAs line- ares não contêm um IRES ou outras características estruturadas que podem provocar uma resposta imune específica da estrutura. FIG. 9B) Gel de agarose mostrando modificação progressiva de precursor de circRNA com m1ψ. FIG. 9C) Gel de agarose mostrando RNAs modifi- cados e não modificados purificados. A modificação com m1ψ reduz o peso molecular aparente. FIG. 9D) Expressão de GLuc 24 horas após a transfecção de células 293 ou A549 com circRNA ou m1ψ-circRNA não modificado (dados apresentados como média + SD, n = 3). FIG. 9E) Viabilidade celular, estabilidade da expressão de GLuc e liberação de citocinas de células 293 transfectadas com circRNA ou mRNA line- ar m1ψ ou não modificado. A viabilidade celular foi avaliada 3 dias após a transfecção. A liberação de citocinas foi avaliada 24 horas após a transfecção (dados apresentados como média + SD, n = 3, ns = não significativo p<0,05, ND = não detectado). FIG. 9F) Viabilidade celular, estabilidade de expressão de GLuc e liberação de citocinas de células A549 transfectadas com circRNA ou mRNA linear m1ψ ou não modifi-
cado.
A viabilidade celular foi avaliada 3 dias após a transfecção.
A liberação de citocinas foi avaliada 24 horas após a transfecção (dados apresentados como média + SD, n = 3, ND = não detectado, *p<0,05). FIG. 9G) representa a atividade de GLuc (RLU). FIG. 9H) Citocinas adicionais avaliadas em meios de cultura após transfecção de células A549 com diferentes frações de HPLC, como mostrado na FIG. 9H (dados apresentados como média + SD, n = 3, *p<0,05). FIG. 9I Viabi- lidade celular 36 horas após a transfecção simulada ou nenhuma transfecção de células 293 (esquerda) e indução da transcrição 24 ho- ras após a transfecção simulada ou nenhuma transfecção de células 293 (direita; indução dobrada em relação às não transfectadas; dados apresentados como média + SD, n = 2 , ns = não significativo). FIG. 9J) Secreção de IL-6 e RANTES por células A549 24 horas após a transfecção simulada com MessengerMax, ou sem transfecção (dados apresentados como média + SD, n = 3). FIG. 9K) Indução de transcri- ção de RIG-I e IFN-β1 24 horas após a transfecção de células A549 com circRNA purificado contendo um ligante RIG-I sintético (3p- hpRNA) como uma porcentagem do RNA total transfectado (dados apresentados como média + SD, n = 3, *p<0,05). FIG. 9L) Indução da transcrição de RIG-I e IFN-β1 24 horas após a transfecção de células HeLa com os RNAs indicados (dados apresentados como média + SD, n = 3, *p<0,05). FIG. 9M) Decurso do tempo de indução da transcrição 2-8 horas após a transfecção de 150.000 células A549 com 20 ng dos RNAs indicados (dados apresentados como média + SD, n = 2). FIG. 9N) Expressão de GLuc 24 horas após a transfecção de células RAW264.7 em 80% de confluência com os RNAs indicados (esquer- da). Estabilidade da expressão de GLuc ao longo de 2 dias (direita; dados apresentados como média + SD, n = 3). Indução da transcrição 24 horas após a transfecção de células RAW264.7 com os RNAs indi- cados (dados apresentados como média + SD, n = 2). FIG. 9O) Análi-
se de um RNA circular contendo um IRES de EMCV e codificação pa- ra GFP (circGFP). Gel de agarose mostrando circularização de cir- cGFP e circGFP purificado (esquerda). Viabilidade das células A549 36 horas após a transfecção reversa de 20.000 células A549 com 40ng de circRNA (direita). Indução da transcrição 24 horas após a transfecção reversa de células A549 com os RNAs indicados (parte inferior; dados apresentados como média + SD, n = 2, ns = não signifi- cativo).
[0090] As FIGS. 10A-I. FIGS. 10A-F mostram evasão de CircRNA de TLRs. FIG. 10A) Esquemas de RNAs introduzidos e usados para experimentos de TLR. Os circRNAs linearizados contêm todos os mesmos elementos de sequência do circRNA unido devido a deleções que abrangem igualmente os íntrons e os braços de homologia. FIG. 10B) Expressão de SEAP 36 horas após a transfecção de células re- pórter de TLR com os RNAs indicados em relação aos controles nulos (dados apresentados como média + SD, n = 3, ns = não significativo, *p<0,05). FIG. 10C) Expressão de SEAP 36 horas após a transfecção de células repórter TLR8 com a fração de circRNA tardia em relação ao controle nulo. (-): meios não contêm nucleosídeo. C: meios contêm citidina (3,5 mM). U: meios contêm uridina (3,5 mM); (dados apresen- tados como média + SD, n = 3, ns = não significativo, *p<0,05). FIG. 10D) Esquema de RNAs introduzidos e usados para experimentos de RNA cortado de TLR. FIG. 10E) Gel de agarose mostrando estratégias alternativas de corte de circRNA. FIG. 10F) Expressão de SEAP 36 horas após a transfecção de células repórter de TLR com os RNAs indicados em relação aos controles nulos (dados apresentados como média + SD, n = 3, *p<0,05). FIGS. 10G-I mostram a otimização da ligação por splint. FIG. 10G) Projeto de RNA precursor de ligação por splint e visão geral da junção. FIG. 10H) Diferentes splints usados para ligação. Digno de nota, estas otimizações foram conduzidas com um plasmídeo contendo um sítio de corte de restrição NaeI para lineariza- ção, levando a indesejáveis produtos colaterais de RNA (vistos como bandas estranhas nas condições de Ligase(-) e Splint(-)) formando-se durante a transcrição in vitro. Este sítio foi alterado para XbaI para as ligações por splint de GLuc e hEpo usadas na FIG. 9A-F e FIG. 10A-F. OH: saliência (5’, 3’); Tm: temperatura de fusão. FIG. 10I) mostra a otimização das condições de circularização.
[0091] As FIGS. 11A-F. FIGS. 11A-D mostram a caracterização de hEpo circRNA in vivo. FIG. 11A) Expressão de hEpo sérica 6 horas após a injeção de 350ng de circRNA ou mRNA linear m1ψ ou não mo- dificado complexado com MessengerMax em tecido adiposo visceral (dados apresentados em relação ao peso molecular, média + SD, n = 3). FIG. 11B) Expressão relativa de hEpo no soro durante 42 horas (dados apresentados como média + SD, n = 3). FIG. 11C) Citocinas detectadas no soro 6 horas após a injeção de 350 ng dos RNAs indi- cados em adiposo visceral (dados apresentados como média + SD, n = 3, *p<0,05). FIG.11D) Sítio de injeção demonstrado por injeção de mRNA de vagalume luciferase modificado complexado com Messen- gerMax. FIG. 11E mostra a viabilidade celular, estabilidade de expres- são de GLuc e liberação de citocina a partir de células 293 transfecta- das com circRNA ou mRNA linear m1ψ ou não modificado. A viabilida- de celular foi avaliada 3 dias após a transfecção. A liberação de citoci- nas foi avaliada 24 horas após a transfecção (dados apresentados como média + SD, n = 3, ns = não significativo p<0,05, ND = não de- tectado). FIG. 11F mostra citocinas adicionais avaliadas em meios de cultura após a transfecção de células 293 e A549 com circRNA ou mRNA linear m1ψ ou não modificado (veja FIG. 9E, 9F; dados apre- sentados como média + SD, n = 3). Na maioria dos casos, esses ana- lisados foram detectados em níveis extremamente baixos, impedindo a observação de diferenças significativas.
[0092] As FIGS. 12A-I. FIGS. 12A-F nostram a caracterização de LNP-circRNA. FIG. 12A) Imagem Cryo-TEM de LNP-circRNA. FIG.12B) expressão de hEpo 24 horas após a transfecção de células 293 com quantidades equimolares de LNP-5moU-mRNA ou LNP- circRNA não modificado (esquerda) e estabilidade de expressão de proteína hEpo ao longo de 3 dias (direita; dados apresentados como média + SD, n = 3). FIG. 12C) Indução da transcrição de RIG-I e IFN- β1 24 horas após a transfecção de células A549 com LNP-5moU- mRNA ou LNP-circRNA não modificado. TR: reagente de transfecção mais 200ng de RNA (MessengerMax); LNP (1x): 200ng de LNP-RNA; LNP(2x): 400 ng de LNP-RNA; L: 5moU-mRNA; C: circRNA (dados apresentados como média + SD, n = 3, ns = não significativo, p<0,05). FIG. 12D) Expressão de SEAP 48 horas após a transfecção de células repórter de TLR com os RNAs indicados em c), em relação aos contro- les nulos (dados apresentados como média + SD, n = 3). FIG. 12E) Expressão de hEpo sérica 6 horas após a injeção de 1,5 picomoles de LNP-5moU-mRNA ou LNP-circRNA não modificado em adiposo visce- ral (dados apresentados como média + SD, n = 5 Linear 5moU, Circu- lar; n = 3 Simulação). FIG. 12F) Expressão relativa de hEpo no soro durante 42 horas após a injeção com LNP-RNAs (dados apresentados como média + SD, n = 5 Linear 5moU, Circular; n = 3 Imitação). FIG. 12G) Gel de agarose dos RNAs lineares representados na FIG. 9G. FIG. 12H) Expressão de SEAP 36 horas após a transfecção de células repórter TLR8 com o RNA linear com cauda mostrado em a) em rela- ção aos controles nulos na presença ou ausência de concentrações variáveis de uridina (dados apresentados como média + SD, n = 2). FIG. 12I) Dados completos da FIG. 10F incluindo um controle positivo adicional.
[0093] A FIG. 13 mostra um gráfico de cromatograma de HPLC de uma reação de junção de hEpo não purificada.
[0094] As FIGS. 14A-D mostram a caracterização de hEpo circR- NA in vitro. A FIG. 14A) Gel de agarose mostrando RNAs modificados e não modificados purificados. FIG. 14B) expressão de hEpo 24 horas após a transfecção de células 293 com quantidades equimolares de m1ψ-mRNA ou circRNA não modificado (dados apresentados como média + SD, n = 3). FIG. 14C) Viabilidade celular, estabilidade de pro- dução de proteína hEpo e expressão de proteína em 24 horas a partir de células 293 transfectadas com pesos iguais de circRNA ou mRNA linear m1ψ ou não modificado. A viabilidade celular foi avaliada 36 ho- ras após a transfecção (dados apresentados como média + SD, n = 3). FIG. 14D) Viabilidade celular, estabilidade de produção de proteína hEpo e expressão de proteína em 24 horas a partir de células A549 transfectadas com pesos iguais de circRNA ou mRNA linear m1ψ ou não modificado. A viabilidade celular foi avaliada 36 horas após a transfecção (dados apresentados como média + SD, n = 3).
[0095] A FIG. 15 mostra citocinas adicionais detectadas no soro 6 horas após a injeção intraperitoneal de pesos iguais dos RNAs indica- dos (veja FIG. 10F; dados apresentados como média + SD, n = 3). Na maioria dos casos, esses analisados foram detectados em níveis ex- tremamente baixos, impedindo a observação de diferenças significati- vas.
[0096] As FIGS. 16A-D mostram a caracterização de LNP-RNA in vivo. FIG. 16A) Propriedades físico-químicas de LNP-RNAs (dados apresentados como média ± DP, n = 3). FIG. 16B) Sítio de injeção demonstrado por injeção de mRNA de vagalume luciferase modificado formulado em LNPs de cKK-E12. A luminescência detectada em 6 e 24 horas mostra distribuição local ao adiposo visceral. FIG. 16C) Cito- cinas detectadas no soro 6 horas após a injeção intraperitoneal de 750 ng dos RNAs indicados formulados em LNPs de cKK-E12 (dados apresentados como média + SD, n = 3). FIG. 16D) Indução da trans-
crição no adiposo visceral 24 horas após a injeção intraperitoneal de 750 ng dos RNAs indicados formulados em LNPs de cKK-E12 (dados apresentados como média + SD, n = 3). FIG. 16E) Expressão de hEpo sérica do fígado 6 horas após a injeção intravenosa de 0,1 mg/kg de 5moU-mRNA ou circRNA não modificado (esquerda) e expressão rela- tiva de hEpo durante 42 horas (direita; dados apresentados em relação ao peso molecular, média + SD, n = 3)
[0097] A FIG. 17 mostra a circularização do RNA precursor con- tendo um íntron permutado por fago T4, IRES de EMCV, estrutura de leitura de GLuc e braços de homologia forte diretamente após a trans- crição in vitro. O RNA precursor foi aquecido às temperaturas indica- das, resfriado em gelo e, em seguida, unido a 55 graus Celsius.
[0098] As FIGS. 18A-18C mostram a circularização do RNA pre- cursor. FIG. 18A mostra a circularização do RNA precursor contendo um íntron permutado por T4 ou Anabaena, IRES de EMCV, estrutura de leitura de GLuc, braços de homologia forte e um espaçador 5' em diferentes concentrações de GTP. FIG. 18B mostra a circularização dos RNAs precursores descritos na FIG. 18A em diferentes concentra- ções de RNA. FIG. 18C mostra a extração de gel das principais ban- das superior e inferior resultantes da junção completa usando três pro- tocolos alternativos para descartar a interconversão de espécies.
[0099] A FIG. 19 mostra um gráfico de estabilidade e expressão de GLuc de EMCV-circRNA sem espaçadores ou mRNA linear durante 144h em células 293.
[00100] As FIGS. 20A-20D. FIG. 20A) Estabilidade e expressão de GLuc de EMCV-circRNA sem espaçadores e com ou sem UTRs du- rante 144h em células HeLa. FIG. 20B) Estabilidade e expressão de GLuc de EMCV-circRNA sem espaçadores e com ou sem UTRs du- rante 144h em células 293. FIG. 20C) Expressão de GLuc de CVB3- circRNA com um espaçador 5’ e com ou sem UTRs diferentes. Trilink:
5mC/mRNA linear pseudomodificado adquirido de Trilink. FIG. 20D) Circularização de RNA precursor contendo um íntron permutado por T4, IRES de EMCV, estrutura de leitura de GLuc, braços de homologia forte, um espaçador 5' com ou sem UTRs diferentes. R: digestão de RNase R.
[00101] As FIGS. 21A-21G. FIGS. 21A-21D) Expressão de GLuc de circRNA com um espaçador 5’ e com diferentes sequências de IRES em células 293 e HeLa. 21E-21F) Expressão de GLuc de circRNA com um espaçador 5’ e com diferentes sequências de IRES ou UTRs em células 293 e HeLa. CircRNAs contêm um IRES de CVB3, a menos que indicado de outra forma. Trilink: 5mC/mRNA linear pseudomodifi- cado adquirido de Trilink. 21G) Comparação do reagente de transfec- ção StemFect e distribuição de nanopartículas de lipídio (LNP) de dife- rentes espécies de RNA em células 293.
[00102] As FIGS. 22A-22B. FIGS. 22A-22B) Expressão de GLuc de CVB3-circRNA com um íntron permutado por Anabaena, um espaça- dor 5’ e com ou sem sequências polyN diferentes em células 293 e HeLa.
[00103] As FIGS. 23A-23B. FIG. 23A) Comparação dos efeitos do contexto de sequência de íntron permutado na expressão de GLuc de circRNA com um espaçador 5’ e o IRES indicado em células 293. FIG. 23B) Expressão sérica de GLuc de circRNA contendo um íntron per- mutado por T4, um espaçador 5’ e diferentes sequências de IRES, ou mRNA linear. O RNA foi formulado em LNPs de origem hepática e in- jetado por via intravenosa. O soro foi coletado 6 horas após a injeção.
[00104] A FIG. 24 mostra a expressão de GLuc a partir de um plasmídeo contendo circRNA com espaçadores 5’ e 3' e um IRES de CVB3 em células HeLa. O plasmídeo base não contém o IRES de CVB3. Sítios dSplice contém sítios de junção mutados para anular a circularização após a transcrição.
[00105] As FIGS. 25A-25B. FIG. 25A) Circularização do RNA pre- cursor contendo um íntron permutado por Anabaena, estrutura de lei- tura de GLuc, braços de homologia forte, espaçadores 5’ e 3' e o IRES indicado. FIG. 25B) Circularização do RNA precursor contendo um ín- tron permutado por Anabaena, estrutura de leitura de FLuc, braços de homologia forte, espaçadores 5’ e 3' e o IRES indicado.
[00106] As FIGS. 26A-26B. FIG. 26A) Células HeLa. FIG. 26B) Cé- lulas A594. Indução de dobramento de RIG-I e IFNB1 após a transfec- ção de preparações de circRNA indicadas. Todas as preparações con- têm circRNA com um intron permutado por Anabaena, estrutura de leitura de GLuc, braços de homologia forte, espaçadores 5’ e 3' e um IRES de CVB3. Não purificado: reação de junção total. GMP: precur- sores de CircRNA transcritos na presença de GMP 12,5 vezes maior que GTP. 3phpRNA: controle positivo do RNA em forma de grampo de vabelo de trifosfato.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[00107] Segue-se uma descrição de exemplos de modalidades.
[00108] Conforme descrito neste documento, circRNA exógeno foi desenvolvido para estender a duração da expressão da proteína a par- tir de mensagens de RNA de tamanho natural. Em primeiro lugar, um intron de autojunção foi projetado para circular de forma eficiente uma ampla faixa de RNAs in vitro, codificando para proteínas como Cas9, projetando racionalmente sequências acessórias ubíquas que auxiliam na junção. A proteína funcional foi produzida a partir desses circRNAs em células eucarióticas e a translação incorporando diferentes sítios de entrada do ribossomo interno (IRES) e tratos internos de poliade- nosina foi maximizada. CircRNA modificado purificado por cromatogra- fia líquida de alto desempenho exibiu qualidades excepcionais de pro- dução de proteína em termos de quantidade de proteína produzida e estabilidade de produção. São fornecidos aqui métodos e composi-
ções que facilitam o uso de circRNA exógeno para expressão de pro- teínas robustas e estáveis em células eucarióticas, tornando circRNA uma alternativa promissora ao mRNA linear.
[00109] Os RNAs circulares (circRNAs) endógenos às células euca- rióticas têm atraído interesse crescente devido à sua prevalência e fai- xa de funções biológicas potenciais (Barrett, S. P. & Salzman, J., "Cir- cular RNAs: analysis, expression and potential func- tions,"Development, 143(11):1838-1847 (2016)). A maioria dos circR- NAs são gerados por retrojunção e parecem cumprir funções de não codificação (Barrett, S. P. & Salzman, J., "Circular RNAs: analysis, ex- pression and potential functions," Development, 143(11):1838-1847 (2016); Chen, L. & Yang, L., "Regulation of circRNA biogenesis," RNA Biology, 12(4):381-388 (2015); Jeck, W. R. and Sharpless, N. E., "De- tecting and characterizing circular RNAs,"Nat. Biotechnol., 32:453–461 (2014); Wang, Y. & Wang, Z., "Efficient backsplicing produces transla- table circular mRNAs,"RNA, 21(2):172-179 (2014); Hansen, T. B. et al., "Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges," Nature, 495(7441):384-388 (2013); Li, Z. et al., "Exon-intron circular RNAs re- gulate transcription in the nucleus," Nature Structural & Molecular Bio- logy, 22(3):256-264 (2015)). No entanto, foi sugerido que alguns cir- cRNAs endógenos para Drosophila podem ser transladados em prote- ínas (Legnini, I. et al., "Circ-ZNF609 Is a Circular RNA that Can Be Translated and Functions in Myogenesis," Molecular Cell, 66(1):22-
37.e9 (2017); Pamudurti, N. R. et al., "Translation of CircR- NAs,"Molecular Cell, 66(1) (2017)).
[00110] Além de ter potencial de codificação de proteínas, os cir- cRNAs endógenos não possuem as extremidades livres necessárias para a degradação mediada por exonuclease, tornando-os resistentes a vários mecanismos de renovação de RNA e concedendo-lhes uma vida útil prolongada em comparação com suas contrapartes de mRNA lineares (Chen, L. & Yang, L., "Regulation of circRNA biogenesis,"RNA Biology, 12(4):381-388 (2015); Enuka, Y. et al., "Circular RNAs are long-lived and display only minimal early alterations in response to a growth factor," Nucleic Acids Research, 44(3):1370-1383 (2015)). Por esta razão, a circularização pode permitir a estabilização de mRNAs que geralmente sofrem de meia-vida curta e pode, portanto, melhorar a eficácia geral do mRNA exógeno em uma variedade de aplicações (Kaczmarek, J. C. et al., "Advances in the delivery of RNA therapeu- tics: from concept to clinical reality,"Genome Medicine, 9(1) (2017); Fink, M. et al., "Improved translation efficiency of injected mRNA during early embryonic development,"Developmental Dynamics, 235(12):3370-3378 (2006); Ferizi, M., et al., "Stability analysis of che- mically modified mRNA using micropattern-based single-cell ar- rays,"Lab Chip, 15(17):3561-3571 (2015)). No entanto, a circulariza- ção eficiente de RNA transcrito in vitro longo (IVT), a purificação do circRNA e a expressão adequada da proteína do circRNA são obstá- culos significativos que devem ser superados antes que seu potencial de codificação de proteína possa ser realizado. Conforme descrito aqui, em uma modalidade, uma abordagem de modificação é apresen- tada para gerar circRNAs exógenos para expressão de proteínas po- tentes e duráveis em células, por exemplo, células eucarióticas.
ABREVIATURAS GFP Proteína fluorescente verde ORF Estrutura de leitura aberta IRES Sítio de entrada do ribossomo interno UTR Região não transladada HEK Rim embrionário humano IRES Sítio de Entrada do Ribossomo Interno EMCV Vírus da encefalomiocardite, um picornavírus PIE Sítio de junção do íntron-exon permutado
[00111] Em uma modalidade, a presente invenção é direcionada a um vetor para produzir o RNA circular, o referido vetor compreendendo os seguintes elementos operativamente conectados uns aos outros e dispostos na seguinte sequência: a.) um braço de homologia 5’, b.) um fragmento de íntron de Grupo I 3’ contendo um dinucleotídeo do sítio de junção 3’, c.) opcionalmente, uma sequência espaçadora 5', d.) op- cionalmente, um sítio de entrada do ribossomo interno (IRES), e.) uma proteína de codificação ou não codificação, f.) opcionalmente, uma se- quência espaçadora 3’, g.) um fragmento de íntron de Grupo I 5' con- tendo um dinucleotídeo do sítio de junção 5’ e h.) um braço de homo- logia 3', o referido vetor permitindo a produção de um RNA circular que é transladável e/ou biologicamente ativo dentro das células eucarióti- cas.
[00112] Quando aqui usado, as letras dos elementos (por exemplo, "a.) - h.)") são usadas apenas para fins de clareza. Além disso, enten- de-se que em modalidades alternativas, é possível que os elementos possam ser dispostos em uma sequência diferente e/ou que um ou mais elementos possam ser omitidos.
[00113] Quando aqui usado, os elementos de um vetor são "opera- tivamente conectados" se eles estiverem posicionados no vetor de modo que possam ser transcritos para formar um RNA precursor que pode, então, ser circularizado em um RNA circular usando os métodos aqui fornecidos.
[00114] Em uma modalidade, a presente invenção é direcionada a um vetor (por exemplo, um plasmídeo) para produzir o circRNA, o refe- rido vetor compreendendo os seguintes elementos operativamente co- nectados uns aos outros e dispostos na seguinte sequência: a.) um braço de homologia 5’, b.) um fragmento de íntron de Grupo I 3’, c.) uma sequência espaçadora 5' opcional, d.) um sítio de entrada do ri- bossomo interno opcional (IRES), e.) uma região de codificação ou não codificação de proteína, f.) uma sequência espaçadora 3’ opcio- nal, g.) um fragmento de íntron de Grupo I 5’ contendo um dinucleotí- deo do sítio de junção 5' e h.) um braço de homologia 3’, o referido ve- tor permitindo a produção de um circRNA que é transladável ou biolo- gicamente ativo dentro das células eucarióticas.
[00115] Quando aqui usado, um "braço de homologia" é qualquer sequência contígua que é 1) prevista para formar pares de bases com pelo menos cerca de 75% (por exemplo, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, em pelo menos cerca de 95%, cerca de 100%) de outra sequência no RNA, tal como outro braço de homologia 2) pelo menos 7 nt no comprimento e não mais que 250 nt 3) localizada antes e adjacente a, ou incluída dentro, do fragmento de íntron 3’ e/ou após e adjacente a, ou incluída dentro do fragmento de íntron 5’ e, opcionalmente, 4) previsto ter menos de 50% (por exemplo, menos de 45%, menos de 40%, menos de 35%, menos de 30 %, menos de 25%) pareamento de bases com sequên- cias indesejadas no RNA (por exemplo, sequências de braço de não homologia). Um "braço de homologia forte" refere-se a um braço de homologia com uma Tm superior a 50 graus Celsius quando a base pareou com outro braço de homologia no RNA.
[00116] Quando aqui usado, um fragmento de íntron de Grupo I 3’ é uma sequência contígua que é pelo menos 75% (por exemplo, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, 100%) homóloga a um fragmento proximal 3’ de um íntron de grupo I natural, incluindo o dinucleotídeo do sítio de junção 3' e, opcionalmen- te, a sequência do éxon adjacente com pelo menos 1 nucleotídeo no comprimento (por exemplo, pelo menos 5 nucleotídeos no comprimen- to, pelo menos 10 nucleotídeos no comprimento, em pelo menos 15 nucleotídeos no comprimento, pelo menos 20 nucleotídeos no com- primento, pelo menos 25 nucleotídeos no comprimento, pelo menos 50 nucleotídeos no comprimento). Em uma modalidade, a sequência de éxon adjacente incluída tem aproximadamente o comprimento do éxon natural. Em algumas modalidades, um fragmento de íntron de Grupo I 5’ é uma sequência contígua que é pelo menos 75% (por exemplo, pe- lo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, 100%) homóloga a um fragmento proximal 5’ de um íntron de grupo I natural, incluindo o dinucleotídeo do sítio de junção 5' e, opcionalmen- te, a sequência do éxon adjacente com pelo menos 1 nucleotídeo no comprimento (por exemplo, pelo menos 5 nucleotídeos no comprimen- to, pelo menos 10 nucleotídeos no comprimento, em pelo menos 15 nucleotídeos no comprimento, pelo menos 20 nucleotídeos no com- primento, pelo menos 25 nucleotídeos no comprimento, pelo menos 50 nucleotídeos no comprimento). Em uma modalidade, a sequência de éxon adjacente incluída tem aproximadamente o comprimento do éxon natural.
[00117] Quando aqui usado, um "espaçador" refere-se a qualquer sequência de nucleotídeos contígua que é 1) prevista para evitar inter- ferir com estruturas proximais, por exemplo, do IRES, região de codifi- cação ou não codificação, ou íntron 2) pelo menos 7 nucleotídeos no comprimento (e opcionalmente não mais que 100 nucleotídeos) 3) lo- calizado a jusante e adjacente ao fragmento de íntron 3’ e/ou a mon- tante e adjacente ao fragmento de íntron 5' e/ou 4) contém um ou mais dos seguintes: a) uma região não estruturada com pelo menos 5 nt no comprimento b) uma região prevista pareamento de bases de pelo menos 5 nt no comprimento a uma sequência distal (ou seja, não ad- jacente), incluindo outro espaçador, e/ou c) uma região estruturada de pelo menos 7nt no comprimento limitada em escopo à sequência do espaçador.
[00118] Quando aqui usado, "interferir" em relação às sequências refere-se à(s) sequência(s) prevista(s) ou empiricamente determina-
da(s) para alterar o dobramento de outras estruturas no RNA, como o IRES ou sequências derivadas do intron do grupo I.
[00119] Quando aqui usado, "não estruturado" no que diz respeito ao RNA se refere a uma sequência de RNA que não é prevista pelo software RNAFold ou ferramentas preditivas similares para formar uma estrutura (por exemplo, uma alça em forma de grampo de cabelo) com ela mesma ou outras sequências na mesma molécula de RNA.
[00120] Quando aqui usado, "estruturado" em relação ao RNA se refere a uma sequência de RNA que é prevista pelo software RNAFold ou ferramentas preditivas similares para formar uma estrutura (por exemplo, uma alça em forma de grampo de cabelo) com ela mesma ou outras sequências na mesma molécula de RNA.
[00121] Em algumas modalidades, a sequência espaçadora pode ter, por exemplo, pelo menos 10 nucleotídeos no comprimento, pelo menos 15 nucleotídeos no comprimento ou pelo menos 30 nucleotí- deos no comprimento. Em algumas modalidades, a sequência espa- çadora tem pelo menos 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25 ou 30 nucleotídeos no comprimento. Em algumas modalidades, a sequência espaçadora não tem mais do que 100, 90, 80, 70, 60, 50, 45, 40, 35 ou 30 nucleotídeos no comprimento. Em algumas modali- dades, a sequência espaçadora tem entre 20 e 50 nucleotídeos no comprimento. Em certas modalidades, a sequência espaçadora é 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 nucleotídeos no comprimento.
[00122] As sequências espaçadoras podem ser sequências polyA, sequências polyA-C, sequências polyC ou sequências poly-U, ou as sequências espaçadoras podem ser especificamente modificadas de- pendendo do IRES. As sequências espaçadoras, conforme descrito neste documento, podem ter duas funções: (1) promover a circulariza-
ção e (2) promover a funcionalidade, permitindo que os íntrons e IRES se dobrem corretamente. Mais especificamente, as sequências espa- çadoras como aqui descritas foram modificadas com três prioridades: 1) para serem inertes em relação ao dobramento do íntron proximal e estruturas de IRES; 2) separar suficientemente o íntron e as estruturas secundárias do IRES; e 3) conter uma região de complementaridade espaçador-espaçador para promover a formação de uma "bolha de junção". Em uma modalidade, os vetores são compatíveis com muitos IRES possíveis e regiões de codificação ou não codificação e duas sequências espaçadoras.
[00123] Em algumas modalidades, um software de computador de dobramento de RNA, como RNAFold, pode ser utilizado para orientar os projetos dos vários elementos do vetor, incluindo os espaçadores.
[00124] Em algumas modalidades, um ou mais elementos no vetor para produzir o RNA circular compreendem pelo menos 75% de iden- tidade de sequência com sequências naturais, incluindo, por exemplo, o IRES e elementos de fragmento de íntron. Em algumas modalida- des, as regiões de codificação de proteínas ou regiões de não codifi- cação não são sequências de nucleotídeos de ocorrência natural. Em algumas modalidades, as regiões de codificação de proteínas codifi- cam proteínas naturais ou sintéticas.
[00125] Em algumas modalidades, as regiões de codificação ou não codificação podem ser sequências naturais ou sintéticas. Em algumas modalidades, as regiões de codificação podem codificar receptores de antígenos quiméricos, proteínas imunomoduladoras e/ou fatores de transcrição. Em algumas modalidades, as regiões de não codificação podem codificar sequências e podem alterar o comportamento celular, como, por exemplo, o comportamento dos linfócitos. Em algumas mo- dalidades, as sequências de não codificação são antissenso para se- quências de RNA celular.
[00126] Em uma modalidade, o vetor pode compreender uma se- quência espaçadora 5’, mas não uma sequência espaçadora 3'. Em outra modalidade, o vetor pode compreender uma sequência espaça- dora 3’, mas não uma sequência espaçadora 5'. Em outra modalidade, o vetor não pode compreender nem uma sequência espaçadora 5’, nem uma sequência espaçadora 3'. Em outra modalidade, o vetor não compreende uma sequência de IRES. Em uma outra modalidade, o vetor não compreende uma sequência de IRES, uma sequência espa- çadora 5’ ou uma sequência espaçadora 3'.
[00127] Quando aqui usado, um "vetor" significa um pedaço de DNA, que é sintetizado (por exemplo, usando PCR), ou que é retirado de um vírus, plasmídeo ou célula de um organismo superior no qual um fragmento de DNA estranho pode ser ou ter sido inserido para fins de clonagem e/ou expressão. Em algumas modalidades, um vetor po- de ser mantido de forma estável em um organismo. Um vetor pode compreender, por exemplo, uma origem de replicação, um marcador selecionável ou gene repórter, como resistência a antibióticos ou GFP e/ou um sítio de clonagem múl6tipla (MCS). O termo inclui fragmentos de DNA lineares (por exemplo, produtos de PCR, fragmentos de plas- mídeo linearizados), vetores de plasmídeo, vetores virais, cosmídeos, cromossomas artificiais bacterianos (BACs), cromossomas artificiais de levedura (YACs) e similares. Em uma modalidade, os vetores for- necidos neste documento compreendem um sítio de clonagem múltipla (MCS). Em outra modalidade, os vetores fornecidos neste documento não compreendem um MCS.
[00128] Exemplos de sequências de autojunção de íntron de Grupo I incluem, porém, não estão limitados a, sequências de íntron-exon permutadas de autojunção derivadas do gene do bacteriófago T4 td ou gene Cyanobacterium Anabaena sp. pré-tRNA-Leu.
[00129] A região de codificação da proteína pode codificar uma pro-
teína de origem eucariótica ou procariótica. Em algumas modalidades, a proteína pode ser qualquer proteína para uso terapêutico ou uso di- agnóstico. Por exemplo, a região de codificação da proteína pode codi- ficar proteínas ou anticorpos humanos. Em algumas modalidades, a proteína pode ser selecionada a partir de, porém, não limitada a, hFIX, SP-B, VEGF-A, metilmalonil-CoA mutase humana (hMUT), CFTR, au- toantígenos de câncer e enzimas adicionais de edição de genes como Cpf1, nucleases de dedo de zinco (ZFNs) e nucleases efetoras simila- res a ativadores de transcrição (TALENs). Em algumas modalidades, o vetor ou circRNA carece de uma sequência de codificação de proteína. Em algumas modalidades, o RNA precursor é um intermediário neces- sário entre o plasmídeo e o circRNA.
[00130] Os braços de homologia 5’ e 3' podem ser sequências sin- téticas e são distintos das regiões de homologia interna, porém, simila- res em função. Os braços de homologia podem ser, por exemplo, cer- ca de 5-50 nucleotídeos no comprimento, cerca de 9-19 nucleotídeos no comprimento, por exemplo, cerca de 5, cerca de 10 cerca de 20, cerca de 30, cerca de 40 ou cerca de 50 nucleotídeos no comprimento. Em outra modalidade, os braços de homologia podem ter 9 nucleotí- deos no comprimento. Em uma outra modalidade, os braços de homo- logia podem ter 19 nucleotídeos no comprimento. Em algumas modali- dades, os braços de homologia têm pelo menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 ou 19 nucleotídeos no comprimento. Em al- gumas modalidades, os braços de homologia não têm mais que 50, 45, 40, 35, 30, 25 ou 20 nucleotídeos no comprimento. Em algumas modalidades, os braços de homologia são 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 nucleotídeos no comprimento.
[00131] Em algumas modalidades, o vetor compreende uma se-
quência de IRES.
A sequência de IRES pode ser selecionada a partir de, porém, não limitada a, uma sequência de IRES de um vírus da síndrome de Taura, vírus do Triatoma, vírus da encefalomielite de Theiler, Vírus símio 40, vírus de Solenopsis invicta 1, vírus de Rhopa- losiphum padi, vírus da Reticuloendoteliose, poliovírus humano 1, vírus do intestino de Plautia stali, vírus da abelha da Caxemira, rinovírus Humano 2, vírus-1 Homalodisca coagulata, Vírus da Imunodeficiência Humana tipo 1, vírus-1 de Homalodisca coagulata, vírus de Himetobi P, vírus da Hepatite C, Vírus da hepatite A, Vírus da hepatite GB, vírus da doença do pé e boca, Enterovírus humano 71, Vírus da rinite equi- na, Vírus tipo Ectropis obliqua picorna, Vírus da Encefalomiocardite (EMCV), Vírus de Drosophila C, Vírus de Crucifer tobamo, Vírus de Cricket paralysis, Vírus da diarreia viral bovina 1, Vírus da Célula Rai- nha Negra, Vírus da paralisia letal por afídeo, Vírus da encefalomielite aviária, Vírus da paralisia da abelha aguda, Vírus da mancha do anel clorótico de Hibiscus, Vírus da febre suína clássica, FGF2 Humano, SFTPAl Humano, AMLl/RUNXl Humano, Drosophila antennapedia, AQP4 Humano, AT1R Humano, BAG-1 Humano, BCL2 Humano, BiP Humano, c-IAPl Humano, c-myc Humano, eIF4G Humano, NDST4L de Camundongo, LEF1 Humano, HIF1 alfa de Camundongo, n.myc Hu- mano, Gtx de Camundongo, P27kipl Humano, PDGF2/c-sis Humano, p53 Humano, Pim-1 Humano, Rbm3 de Camundongo, Drosophila rea- per, Scamper Canino, Drosophila Ubx, UNR Humano, UtrA de Ca- mundongo, VEGF-A Humano, XIAP Humano, Salivirus, Cosavirus, Pa- rechovirus, Drosophila hairless, TFIID de S. cerevisiae, YAP1 de S. cerevisiae, c-src Humano, FGF-1 Humano, Picomavirus de Símio, Ví- rus Turnip crinkle, um aptâmero para eIF4G, Coxsackievirus B3 (CVB3) ou Coxsackievirus A (CVB1/2). As sequências de IRES tipo selvagem também podem ser modificadas e ser eficazes na invenção.
Em algumas modalidades, a sequência de IRES tem cerca de 50 nu-
cleotídeos no comprimento.
[00132] Em algumas modalidades, a fim de expressar a proteína em uma célula, o RNA circular pode ser transfectado para a célula usando, por exemplo, lipofecção ou eletroporação. Em outra modali- dade, o RNA circular é transfectado para uma célula usando um nano- transportador. O nanotransportador pode ser, por exemplo, um lipídio, polímero ou um híbrido lipo-polimérico.
[00133] O RNA circular pode ser purificado pelo método de execu- ção do RNA através de uma coluna de exclusão por tamanho em tris- EDTA ou tampão de citrato em um sistema de cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC). Em uma modalidade, o RNA é executado através da coluna de exclusão por tamanho em tris-EDTA ou tampão de citrato em pH na faixa de cerca de 4-7 a uma taxa de fluxo de cerca de 0,01-5mL/minuto.
[00134] Em certas modalidades, é fornecido aqui um método de ge- ração de RNA precursor realizando a transcrição in vitro usando um vetor fornecido aqui como um padrão (por exemplo, um vetor fornecido aqui com um promotor de RNA polimerase posicionado a montante do braço de homologia 5’).
[00135] Em algumas modalidades, o uso de um nucleotídeo, nu- cleosídeo ou um nucleotídeo ou nucleosídeo quimicamente modificado nas reações de transcrição in vitro aqui descritas estão em uma con- centração em excesso em relação ao trifosfato de nucleotídeo análo- go. "Concentração em excesso" é definida como maior do que a con- centração do trifosfato de nucleotídeo análogo, com o objetivo de alte- rar o nucleotídeo da extremidade 5’, especificamente para reduzir a imunogenicidade de preparações de circRNA, evitando a inclusão de um motivo trifosfato 5' ou para permitir a circularização enzimática de moléculas precursoras, incluindo o motivo monofosfato 5' necessário.
[00136] Em algumas modalidades, o nucleotídeo usado em excesso é monofosfato de guanosina (GMP). Em outras modalidades, o nucleo- tídeo usado em excesso é GDP, ADP, CDP, UDP, AMP, CMP, UMP, guanosina, adenosina, citidina, uridina ou qualquer nucleotídeo ou nu- cleosídeo quimicamente modificado. Em algumas modalidades, o ex- cesso é cerca de um excesso de 10 vezes. Em algumas modalidades, o excesso é cerca de um excesso de 12,5 vezes.
[00137] Em uma modalidade, o nucleotídeo, nucleosídeo ou um nu- cleotídeo ou nucleosídeo quimicamente modificado é usado em con- centrações pelo menos cerca de 10x em excesso do trifosfato de nu- cleotídeo análogo na reação de transcrição in vitro.
[00138] Em algumas modalidades, o circRNA que resulta do RNA precursor sintetizado na presença de um nucleotídeo, nucleosídeo ou um nucleotídeo ou nucleosídeo quimicamente modificado pelo menos cerca de 10x em excesso do trifosfato de nucleotídeo análogo na rea- ção de transcrição in vitro é, então, purificado por HPLC para atingir a imunogenicidade mínima. Composições Farmacêuticas/Administração
[00139] Em modalidades da presente descrição, os produtos de cir- cRNA descritos neste documento e/ou produzidos usando os vetores e/ou métodos descritos neste documento, podem ser fornecidos em composições, por exemplo, composições farmacêuticas.
[00140] Portanto, em algumas modalidades, a invenção também se refere a composições, por exemplo, composições compreendendo um circRNA (produto circRNA) e um transportador farmaceuticamente aceitável. Em um aspecto, a presente descrição fornece composições farmacêuticas que compreendem uma quantidade eficaz de um circR- NA aqui descrito e um excipiente farmaceuticamente aceitável. As composições farmacêuticas da presente descrição podem compreen- der um circRNA como aqui descrito, em combinação com um ou mais transportadores, excipientes ou diluentes farmaceuticamente ou fisio-
logicamente aceitáveis. Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas da presente descrição podem compreender uma célula que expressa circRNA, por exemplo, uma pluralidade de células que expressam circRNA, como aqui descrito, em combinação com um ou mais transportadores, excipientes ou diluentes farmaceuticamente ou fisiologicamente aceitáveis.
[00141] Em algumas modalidades, um transportador farmaceutica- mente aceitável pode ser um ingrediente em uma composição farma- cêutica, diferente de um ingrediente ativo, que não é tóxico ao indiví- duo.
[00142] Um transportador farmaceuticamente aceitável pode incluir, porém, não está limitado a, um tampão, excipiente, estabilizador ou conservante. Exemplos de transportadores farmaceuticamente aceitá- veis são solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes anti- bacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e de retardo de absor- ção e similares que são fisiologicamente compatíveis, tais como sais, tampões, sacarídeos, antioxidantes, transportadores aquosos ou não aquosos, conservantes, agentes umectantes, tensoativos ou agentes emulsificantes, ou combinações dos mesmos. As quantidades de transportador(es) farmaceuticamente aceitável(eis) nas composições farmacêuticas podem ser determinadas experimentalmente com base nas atividades do(s) transportador(es) e nas características desejadas da formulação, tais como estabilidade e/ou oxidação mínima.
[00143] Em algumas modalidades, tais composições podem com- preender tampões, como ácido acético, ácido cítrico, histidina, ácido bórico, ácido fórmico, ácido succínico, ácido fosfórico, ácido carbônico, ácido málico, ácido aspártico, tampões Tris, HEPPSO, HEPES, solu- ção salina tamponada neutra, solução salina tamponada com fosfato e similares; carboidratos como glicose, sacarose, manose ou dextranos, manitol; proteínas; polipeptídeos ou aminoácidos, tais como glicina;
antioxidantes; agentes quelantes como EDTA ou glutationa; adjuvan- tes (por exemplo, hidróxido de alumínio); agentes antibacterianos e antifúngicos; e conservantes.
[00144] Em certas modalidades, as composições da presente des- crição podem ser formuladas para uma variedade de meios de admi- nistração parenteral ou não parenteral. Em uma modalidade, as com- posições podem ser formuladas para infusão ou administração intra- venosa. As composições aqui divulgadas podem ser fornecidas, por exemplo, como preparações líquidas estéreis, por exemplo, soluções aquosas isotônicas, emulsões, suspensões, dispersões ou composi- ções viscosas, que podem ser tamponadas a um pH desejável. As formulações adequadas para administração oral podem incluir solu- ções líquidas, cápsulas, sachês, comprimidos, pastilhas e trociscos, pós, suspensões líquidas em um líquido apropriado e emulsões.
[00145] Em um aspecto, a descrição se refere à administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição compre- endendo um circRNA aqui descrito para o tratamento de um indivíduo tendo, ou em risco de desenvolver uma doença ou distúrbio, por exemplo, câncer. Em outro aspecto, a descrição se refere à adminis- tração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composi- ção compreendendo um circRNA aqui descrito para o tratamento de um indivíduo tendo uma doença envolvendo a perda de um gene fun- cional.
[00146] Em algumas modalidades, o tratamento visa prolongar a translação do circRNA para uma proteína.
[00147] As composições farmacêuticas da presente descrição po- dem ser administradas de uma maneira apropriada para a doença a ser tratada (ou prevenida). A quantidade e a frequência da administra- ção serão determinadas por tais fatores como a condição do indivíduo e o tipo e gravidade da doença do indivíduo, embora as dosagens apropriadas possam ser determinadas por ensaios clínicos.
[00148] Os termos "tratar" ou "tratamento" referem-se ao tratamento terapêutico em que o objetivo é desacelerar (diminuir) uma alteração fisiológica ou doença indesejada ou fornecer um resultado clínico be- néfico ou desejado durante o tratamento. Os resultados clínicos bené- ficos ou desejados incluem o alívio dos sintomas, diminuição da exten- são da doença, estado da doença estabilizado (ou seja, sem agrava- mento), atraso ou desaceleração da progressão da doença, melhoria ou paliação do estado da doença e/ou remissão (seja parcial ou total), sejam detectáveis ou indetectáveis. "Tratamento" também pode signifi- car o prolongamento da sobrevida em comparação com a sobrevida esperada se um indivíduo não estivesse recebendo tratamento. Aque- les que precisam de tratamento incluem aqueles indivíduos já com a alteração fisiológica ou doença indesejável, bem como aqueles indiví- duos propensos a ter a alteração fisiológica ou doença.
[00149] Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" ou "quantidade eficaz", usada indistintamente aqui, refere-se a uma quantidade eficaz, em dosagens e por períodos de tempo necessários, para atingir um resultado terapêutico desejado. Uma quantidade terapeuticamente efi- caz pode variar de acordo com fatores como o estado de doença, ida- de, sexo e peso do indivíduo, e a capacidade de um agente terapêuti- co ou uma combinação de terapêuticos para induzir uma resposta de- sejada no indivíduo. Indicadores de exemplo de uma terapêutica eficaz ou combinação de terapêutica que incluem, por exemplo, bem-estar melhorado do paciente, redução da carga da doença, parada ou pro- gressão retardada da doença e/ou ausência de progressão da doença para outros locais no corpo.
[00150] Quando aqui usado, o termo "indivíduo" refere-se a um animal. Os termos "indivíduo" e "paciente" podem ser usados indistintamente aqui. Como tal, um "indivíduo" inclui um ser humano que está sendo tratado para uma doença ou prevenção de uma doen- ça, tal como um paciente.
[00151] Quando aqui usado, o termo "dinucleotídeo de sítio de jun- ção" refere-se aos dois nucleotídeos que fazem fronteira com um sítio de junção.
[00152] Em algumas modalidades, o método descrito neste docu- mento pode ser usado para tratar um indivíduo animal pertencente a qualquer classificação. Exemplos de tais animais incluem mamíferos, como camundongos, hamsters, coelhos, gatos, cães, vacas, porcos ou cavalos). Os mamíferos podem ser macacos, humanos e símios. Em uma modalidade, o mamífero é um humano.
[00153] Os sistemas de liberação úteis no contexto das modalida- des da invenção podem incluir sistemas de distribuição de liberação com o tempo, de liberação retardada e de liberação prolongada de modo que a distribuição das composições ocorra antes e com tempo suficiente para causar sensibilização do sítio a ser tratado. A composi- ção pode ser usada em conjunto com outros agentes terapêuticos ou terapias. Tais sistemas podem evitar administrações repetidas da composição, aumentando assim a conveniência para o indivíduo e o médico, e podem ser particularmente adequados para certas modali- dades de composição da invenção.
[00154] Os sistemas de distribuição de liberação incluem sistemas de base de poliméro, tais como poli(lactídeo-glicolídeo), copolioxala- tos, poliesteramidas, poliortoésteres, policaprolactonas, ácido poli- hidroxibutírico e polianidridos. As microcápsulas dos polímeros anterio- res contendo fármacos são descritas, por exemplo, na Patente Norte- americana No. 5.075.109. Os sistemas de distribuição também inclu- em sistemas não poliméricos que são lipídios, incluindo esteróis, tais como colesterol, ésteres de colesterol e ácidos graxos ou gorduras neutras, tais como mono-di- e tri-glicerídeos; sistemas silásticos; sis-
temas baseados em peptídeos; sistemas de liberação de hidrogel; re- vestimentos de cera; comprimidos prensados usando aglutinantes e excipientes convencionais; implantes parcialmente fundidos; e simila- res. Em algumas modalidades, nanopartículas de lipídios ou polímeros são usados como veículos de distribuição para circRNAs terapêuticos aqui descritos, incluindo a distribuição de RNA aos tecidos.
[00155] Em certas modalidades, a administração das composições pode ser realizada de qualquer maneira, por exemplo, por administra- ção parenteral ou não parenteral, incluindo por inalação de aerossol, injeção, infusões, ingestão, transfusão, implante ou transplante. Por exemplo, as composições aqui descritas podem ser administradas a um paciente por via transarterial, intradérmica, subcutânea, intratumo- ral, intramedular, intranodal, intramuscular, por injeção intravenosa (i.v.), intranasal, intratecal ou intraperitoneal. Em um aspecto, as com- posições da presente descrição são administradas por via intravenosa. Em um aspecto, as composições da presente descrição são adminis- tradas a um indivíduo por injeção intradérmica ou subcutânea. As composições podem ser injetadas, por exemplo, diretamente em um tumor, nódulo linfático, tecido, órgão ou sítio de infecção.
[00156] Em uma modalidade, a administração pode ser repetida após um dia, dois dias, três dias, quatro dias, cinco dias, seis dias, uma semana, duas semanas, três semanas, um mês, cinco semanas, seis semanas, sete semanas, dois meses, três meses, quatro meses, cinco meses, seis meses ou mais. Cursos repetidos de tratamento também são possíveis, assim como a administração crônica. A admi- nistração repetida pode ser na mesma dose ou em uma dose diferen- te.
[00157] Em algumas modalidades, as composições podem ser ad- ministradas nos métodos da invenção por terapia de manutenção, co- mo, por exemplo, uma vez por semana por um período de 6 meses ou mais.
[00158] Em uma modalidade, as células podem expressar transito- riamente o circRNA aqui descrito para 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 dias após a introdução. A expressão transitória do circRNA po- de ser afetada pelo método de distribuição. Em uma modalidade, o circRNA é transduzido na célula por eletroporação. Em uma modalida- de, o circRNA é introduzido na célula por métodos de transfecção de lipídios conhecidos na técnica.
[00159] Em algumas modalidades, um circRNA conforme descrito neste documento pode ser usado em combinação com outros agentes e terapias conhecidas. Administrado "em combinação", quando aqui usado, significa que dois (ou mais) tratamentos diferentes são distribu- ídos ao indivíduo durante o curso do tratamento do indivíduo, por exemplo, os dois ou mais tratamentos são administrados após o indi- víduo ter sido diagnosticado com a doença e antes que a doença te- nha sido curada ou eliminada ou o tratamento tenha cessado por ou- tras razões. Em algumas modalidades, a distribuição de um tratamento ainda está ocorrendo quando a distribuição do segundo começa, de modo que há sobreposição em termos de administração. Isso às vezes é referido neste documento como "simultâneo" ou "distribuição simul- tânea". Em outras modalidades, a distribuiçção de um tratamento ter- mina antes do início da distribuição do outro tratamento. Em algumas modalidades de ambos os casos, o tratamento é mais eficaz por causa da administração combinada. Por exemplo, o segundo tratamento é mais eficaz, por exemplo, um efeito equivalente é visto com menos do segundo tratamento, ou o segundo tratamento reduz os sintomas em maior extensão, do que seria visto se o segundo tratamento fosse ad- ministrado na ausência do primeiro tratamento, ou a situação análoga é observada com o primeiro tratamento. Em algumas modalidades, a distribuição é tal que a redução em um sintoma ou outro parâmetro relacionado ao distúrbio é maior do que o que seria observado com um tratamento distribuído na ausência do outro. O efeito dos dois trata- mentos pode ser parcialmente aditivo, totalmente aditivo ou maior que o aditivo. A distribuição pode ser tal que um efeito do primeiro trata- mento administrado ainda seja detectável quando o segundo é admi- nistrado.
[00160] Em outras modalidades, uma composição aqui descrita po- de ser usada em um regime de tratamento em combinação com cirur- gia, radiação, quimioterapia, anticorpos ou outros agentes.
EXEMPLOS EXEMPLO 1
[00161] Existem três estratégias gerais para circularização de RNA exógeno: métodos químicos usando brometo de cianogênio ou um agente de condensação similar, métodos enzimáticos usando RNA ou DNA ligases e métodos ribozimáticos usando íntrons de autojunção (Petkovic, S. & Muller, S., "RNA circularization strategies in vivo and in vitro, "Nucleic Acids Research, 43(4):2454-2465 (2015); Beadudry, D. & Perreault, J., "An efficient strategy for the synthesis of circular RNA molecules,"Nucleic Acids Research, 23(15):3064-3066 (1995); Micura, R., "Cyclic Oligoribonucleotides (RNA) by Solid-Phase Synthesis, "Chemistry - A European Journal, 5(7):2077-2082 (1999)). Foi relatado que um método ribozimático utilizando um íntron catalítico de grupo I permutado é mais aplicável à circularização de RNA longo e requer apenas a adição de GTP e Mg2+ como cofatores (Petkovic, S. & Mul- ler, S., "RNA circularization strategies in vivo and in vitro, "Nucleic Acids Research, 43(4):2454-2465 (2015)). Esta estratégia de junção de íntron-éxon permutado (PIE) consiste em éxons parciais fundidos flanqueados por sequências de meio-íntron (Puttaraju, M. & Been, M., "Group I permuted intron-exon (PIE)sequences self-splice to produce circular exons," Nucleic Acids Research, 20(20):5357-5364 (1992)). In vitro, esses construtos sofrem as reações de transesterificação dupla características dos íntrons catalíticos do grupo I, mas porque os éxons já estão fundidos, eles são excisados como círculos ligados covalen- temente de 5' a 3' (FIG. 1A) (Petkovic, S. & Muller, S., "RNA circulari- zation strategies in vivo and in vitro", Nucleic Acids Research, 43(4):2454-2465 (2015)). Usando esta estratégia como um ponto de partida para a criação de uma proteína que codifica RNA circular, uma sequência de 1.1 kb contendo um IRES do vírus da encefalomiocardite de tamanho natural (EMCV), uma mensagem de Gaussia luciferase (GLuc) e duas regiões curtas correspondentes a fragmentos de éxon (E1 e E2) do construto de PIE entre os íntrons 3’ e 5' do intron catalíti- co do grupo I permutado no gene da timidilato sintase (Td) do fago T4 foram inseridos (FIG. 1A, Tabela 1) (Ford, E. & Ares , M., "Synthesis of circular RNA in bacteria and yest using RNA cyclase ribozimas derive from a group I intron of phage T4," Proceedings of the National Aca- demy of Sciences, 91(8):3117-3121 (1994)). O RNA precursor foi sin- tetizado por transcrição de escoamento e, em seguida, aquecido na presença de íons de magnésio e GTP para promover a circularização, essencialmente conforme descrito anteriormente para a circularização de RNAs mais curtos (Ford, E. & Ares, M., "Synthesis of circular RNA in bacteria and yeast using RNA cyclase ribozymes derived from a group I intron of phage T4," Proceedings of the National Academy of Sciences, 91(8):3117-3121 (1994)). No entanto, produtos de junção não foram obtidos.
Especulou-se que longas regiões intervenientes entre os sítios de junção podem reduzir a capacidade dos sítios de junção de interagir uns com os outros e formar um complexo estável, reduzindo assim a eficiência de junção.
Na verdade, a região interve- niente entre os sítios de junção 5’ e 3' dos íntrons nativos do grupo I tem, em média, 300-500 nucleotídeos no comprimento, enquanto a região interveniente do RNA modificado que construímos era duas a quatro vezes maior (Vicens, Q ., et al., "Toward predicting self-splicing e protein-facilated splicing of group I introns", RNA, 14 (10): 2013-2029 (2008)). Portanto, "braços de homologia" perfeitamente complementa- res de 9 (fracos) ou 19 (fortes) nucleotídeos no comprimento foram projetados e colocados nas extremidades 5’ e 3' do RNA precursor com o objetivo de trazer os sítios de junção 5’ e 3' em proximidade um do outro (FIG. 1B, Tabela 1). A adição desses braços de homologia aumentou a eficiência da junção de 0% para 16% para braços de ho- mologia fraca e para 48% para braços de homologia forte, conforme avaliado pelo desaparecimento da banda de RNA precursor (FIG. 1C). Para garantir que o principal produto de junção era circular, a reação de junção foi tratada com RNase R (FIG. 1D). O sequenciamento atra- vés da união da junção putativa de reações de junção tratadas com RNase R revelou éxons ligados e a digestão da reação de junção tra- tada com RNase R com RNase H direcionada a oligonucleotídeo pro- duziu uma única banda em contraste com duas bandas produzidas por precursor linear digerido com RNase H (FIG. 1D e FIG. 1E). Esses da- dos mostram que circRNA é um produto principal dessas reações de junção e que a eletroforese em gel de agarose permite a separação simples e eficaz de produtos de junção circular de moléculas precurso- ras lineares, círculos cortados, intermediários de junção e íntrons exci- sados.
[00162] A fim de melhorar ainda mais a eficiência da geração de circRNA a partir do RNA precursor de autojunção, outros fatores que podem influenciar a circularização bem-sucedida foram considerados. O sítio de junção de PIE 3’ é proximal ao IRES, e porque ambas as sequências são altamente estruturadas, foi hipotetizado que as se- quências dentro do IRES podem interferir com o dobramento da ribo- zima de junção, proximalmente no sítio de junção 3' ou distalmente no sítio de junção 5' através de contatos de longa distância. A fim de per-
mitir que essas estruturas se dobrem independentemente, uma série de espaçadores entre o sítio de junção de PIE 3’ e o IRES foram proje- tados e previu-se que permitiria ou interromperia a junção (FIG. 1F, Tabela 1). Espaçadores permissivos foram projetados para conservar estruturas secundárias presentes nas sequências de íntron que podem ser importantes para a atividade da ribozima, enquanto o espaçador disruptivo foi projetado para interromper as sequências em ambas as metades do íntron, especialmente a metade de 5'. A adição de se- quências espaçadoras previstas para permitir a junção aumentou a eficiência da junção de 46% a 87% (P1 e P2), enquanto a adição de uma sequência espaçadora disruptiva aumentou completamente a junção (FIG. 1G). Este construto melhorado, contendo ambos os bra- ços de homologia e espaçadores racionalmente projetados, foi capaz de circular o RNA com aproximadamente 5kb no comprimento (FIG. 4). O uso de um intron catalítico do grupo I alternativo do pré-tRNA de Anabaena também foi explorado (Puttaraju, M. & Been, M., "Group I permuted intron-exon (PIE) sequences self-splice to produce circular exons," Nucleic Acids Research, 20(20):5357-5364 (1992)). As mes- mas técnicas de otimização usadas para aumentar a eficiência da rea- ção de junção do íntron do fago T4 permutado foram aplicadas.
Curio- samente, durante nossas otimizações, foi notado que a mudança do intron catalítico de T4 para o intron catalítico de Anabaena pode ter resultado no enfraquecimento de um pequeno trecho de homologia interna entre o IRES e a extremidade 3’ da região de codificação, o que pode ter ajudado na formação de uma 'bolha de junção' isolada (FIG. 1H). O fortalecimento desta homologia interna aumentou ainda mais a eficiência de junção de 84% a 95% usando o intron catalítico de Anabaena permutado (FIG. 1H e FIG. 1I, Tabela 1). O uso do intron catalítico de Anabaena resultou em uma redução de 37% no corte de circRNA em comparação com o intron catalítico de T4 (FIG. 1I e FIG.
1J). Devido à maior eficiência de junção e saída de circRNA intacta, o sistema de PIE de Anabaena modificado provou ser globalmente supe- rior ao sistema PIE de T4 modificado (FIG. 1J).
[00163] A homologia interna entre o éxon 2 e a sequência de codifi- cação de GLuc tornou o sistema de PIE de Anabaena otimizado in- compatível com regiões intervenientes não GLuc. Para adaptar o cons- truto de circRNA para circularização eficiente de uma variedade de longas sequências de RNA intervenientes, um par de sequências es- paçadoras foi projetado por de novo com base na compreensão dos parâmetros que afetam a eficácia de junção de íntron do grupo I catalí- tico permutado. Essas sequências espaçadoras foram modificadas com três prioridades: 1) ser inertes em relação ao dobramento do ín- tron proximal e estruturas de IRES; 2) separar suficientemente o íntron e as estruturas secundárias do IRES; e 3) conter uma região de com- plementaridade espaçador-espaçador para promover a formação de uma "bolha de junção" (FIG. 2A, Tabela 1). Braços de homologia nas extremidades 5’ e 3' da molécula precursora também foram incluídos. Entre essas sequências foi inserido um IRES de EMCV, bem como regiões de codificação para cinco proteínas diferentes, incluindo Gau- ssia luciferase, Vagalume luciferase, eGFP, eritropoetina humana e Cas9 endonuclease. A circularização de todas as cinco sequências de RNA foi alcançada (FIG. 2B, Tabela 1); a eficiência de circularização correspondeu à do construto projetado em etapas (FIG. 1J) e era al- tamente reproduzível entre as inserções, mas também era dependente do tamanho, com RNAs longos menos eficientemente circularizados (FIG. 5A). Além disso, verificou-se que circRNAs longos eram mais propensos a entalhar na presença de íons de magnésio, resultando no acúmulo de circRNA cortado durante e após a transcrição in vitro e digestão de RNase R, que reduziu os rendimentos gerais e a pureza da amostra tratada com RNase R (FIG. 2B e FIG. 2C, FIG. 5A). RNase
R não digeriu totalmente os íntrons de Anabaena resistentes (FIG. 2B, bandas inferiores) ou concatenações circulares (FIG. 2B, bandas su- periores).
[00164] Foi demonstrado que circRNA endógeno pode produzir pe- quenas quantidades de proteína (Legnini, I. et al., "Circ-ZNF609 Is a Circular RNA that Can Be Translated and Functions in Myogenesis", Molecular Cell, 66(1):22- 37.e9 (2017)). Como um meio de avaliar a capacidade de circRNAs modificados para produzir proteína, as rea- ções de junção digeridas por RNase R de cada construto foram trans- fectadas em células renais embrionárias humanas (HEK293). A trans- fecção de circRNA de Gaussia ou Vagalume luciferase resultou na produção robusta de proteína funcional medida por luminescência (FIG. 2D e FIG. 2G). Da mesma forma, eritropoetina humana foi detec- tada em meios de cultura de células a partir da transfecção de circRNA de eritropoetina e fluorescência de EGFP foi observada a partir da transfecção de circRNA de EGFP (FIG. 2E e FIG. 2F). A cotransfecção de circRNA de Cas9 com sgRNA direcionado contra GFP em células HEK293 que expressam GFP constitutivamente resultou em fluores- cência removida em até 97% das células em comparação com um controle apenas de sgRNA (FIG. 2H e FIG. 2I). Como a digestão de RNase R de reações de junção nem sempre é completa e o RNA pre- cursor contém um IRES funcional, um mutante de deleção do sítio de junção da construção de GLuc foi criado para medir a contribuição po- tencial de impurezas para a expressão de proteínas. Quando transfec- tado em quantidades iguais de peso para reações de junção digeridas com RNase-R, este mutante de deleção no sítio de junção produziu um nível quase imperceptível de proteína (FIG. 5B e FIG. 5C).
[00165] Para estabelecer circRNA exógeno como uma alternativa confiável para a tecnologia de mRNA linear existente, é desejável ma- ximizar a expressão da proteína. A translação independente de cap mediada por um IRES pode exibir vários níveis de eficiência depen- dendo do contexto da célula e é geralmente considerada menos efici- ente do que a translação dependente de cap quando incluída no mRNA linear bicistrônico (Borman, A. M. et al., "Comparison of Picor- naviral IRES-Driven Internal Initiation of Translation in Cultured Cells of Different Origins", Nucleic Acids Research, 25(5):925-932 (1997)). Da mesma forma, a cauda polyA estabiliza e melhora a eficiência de inici- ação da translação em mRNA linear por meio das ações de proteínas de ligação de poliadenilato (Imataka, H.,"A newly identified N-terminal amino acid sequence of human eIF4G binds poly(A)-binding protein and functions in poly(A)-dependent translation," The EMBO Journal,
17.24:7480-489 (1998); Kahvejian, A. et al., "Mammalian poly(A)- binding protein is a eukaryotic translation initiation factor, which acts via multiple mechanisms," Genes & Development, 19(1):104-113 (2005)). No entanto, a eficiência de diferentes sequências de IRES e a inclusão de um trato polyA no contexto de circRNA não foi investigada. O IRES de EMCV foi substituído por sequências 5' UTR de várias transcrições virais que contêm IRESs conhecidos ou putativos, bem como várias outras sequências de IRES putativas (Tabela 1, FIG. 6A) (Weingarten-Gabbay, S. et al., "Systematic discovery of cap- independent translation sequences in human and viral geno- mes,"Science, 351(6270) (2016)). Verificou-se que o IRES de Cox- sackievirus B3 (CVB3) foi 1,5 vezes mais eficaz do que o IRES de EMCV comumente adotado em células HEK293 (FIG. 3A). Como as estruturas secundárias proximais ao IRES, incluindo dentro da região de codificação que segue diretamente o IRES, têm o potencial de in- terromper o dobramento de IRES e a iniciação da translação, as se- quências de IRES virais selecionadas foram testadas no contexto da Vagalume luciferase. Embora o IRES de CVB3 ainda fosse superior a todos os outros, a eficácia de vários outros IRESs, mais notavelmente o Poliovírus IRES, foi dramaticamente alterada (FIG. 3B). A adição de uma sequência polyA interna ou um controle de espaçador polyAC às sequências de IRES foi testada e mostrou que a capacidade de con- duzir a produção de proteína acima dos níveis de base de circRNA modificado alteraria a expressão da proteína. Verificou-se que ambas as sequências melhoraram a expressão em todos os construtos, pos- sivelmente devido à maior separação não estruturada entre o início da sequência de IRES e a união da junção éxon-éxon, que se prevê man- ter a estrutura estável (FIG. 3B, FIG. 6B). Este maior grau de separa- ção não estruturada pode reduzir o impedimento estérico que obstrui a ligação do fator de iniciação às estruturas de IRES. No caso de EMCV e IRESs de Poliovírus, as sequências polyA melhoraram a expressão além da melhora observada com um espaçador polyAC não estrutura- do. Isso pode sugerir que a associação de proteínas de ligação de po- liadenilato pode realçar a eficiência do IRES. Depois de selecionar o construto polyA ou polyAC mais eficaz para cada IRES, a eficácia do IRES em diferentes tipos de células foi explorada, incluindo adenocar- cinoma cervical humano (HeLa), carcinoma de pulmão humano (A549) e células beta pancreáticas de camundongo imortalizadas (Min6). A eficácia do jIRES variou dependendo do tipo, mas o IRES de CVB3 foi superior em todos os tipos testados (FIG. 3C, FIG. 6C e FIG. 6D).
[00166] A pureza das preparações de circRNA é outro fator essen- cial para maximizar a produção de proteínas a partir de circRNA e para evitar respostas imunes celulares inatas. Foi demonstrado que a re- moção de dsRNA por HPLC elimina a ativação imune e melhora a translação de mRNA de IVT modificado com nucleosídeo linear (Kari- ko, K. et al., "Generating the optimal mRNA for therapy: HPLC purifica- tion eliminates immune activation and improves translation of nucleosi- de-modified, protein-encoding mRNA,"Nucleic Acids Research, 39(21):e142-e142 (2011)). No entanto, nenhum método escalável foi relatado para purificação de circRNA de subprodutos de IVT e reações de circularização, que incluem dsRNA e trifosfato-RNA que pode en- volver sensores de RNA e induzir uma resposta imune celular (Kariko, K. et al., "Generating the optimal mRNA for therapy: HPLC purification eliminates immune activation and improves translation of nucleoside- modified, protein-encoding mRNA,"Nucleic Acids Research, 39(21):e142-e142 (2011)). Embora a evitação completa de circRNA cortado fosse insustentável devido à degradação leve durante o pro- cessamento, circRNA substancialmente puro (90% circular, 10% cor- tado) foi obtido usando extração de gel para pequenas quantidades e HPLC de exclusão de tamanho para grandes quantidades de material de partida de reação de junção (FIG . 3D e FIG. 3E). Em ambos os casos, a purificação foi seguida com tratamento com RNase R para eliminar a maioria do RNA degradado. Ao comparar a expressão da proteína de gel extraído ou circRNA purificado por HPLC para reações de junção digeridas por RNase-R, a purificação por HPLC foi conside- rada um método superior de purificação que ultrapassou a digestão de RNAse-R sozinha (FIG. 3E e FIG. 3F).
[00167] Não se sabe se a eficiência de translação do circRNA exó- geno é comparável à do mRNA linear e se a produção da proteína de circRNA exibe diferenças na estabilidade. Usando circRNA modificado purificado por HPLC, a estabilidade e eficácia de circRNA de codifica- ção de Gaussia luciferase (CVB3-GLuc-pAC) foi comparada a quanti- dades equimolares de um mRNA de GLuc linear de cauda polyA 3’ e tamponado por metilguanosina 5' não modificado canônico bem como um mRNA de GLuc linear modificado de nucleosídeo disponível co- mercialmente (Trilink). A produção de proteína avaliada por lumines- cência 24 horas após a transfecção revelou que circRNA produziu 811,2% mais proteína do que o mRNA linear não modificado neste ponto de tempo inicial em células HEK293 (FIG. 3H). Curiosamente, o circRNA também produziu 54,5% mais proteína do que o mRNA modi- ficado, demonstrando que as modificações de nucleosídeos não são necessárias para a produção robusta de proteína a partir do circRNA. Resultados similares foram obtidos em células HeLa (FIG. 3H). Dados de luminescência coletados ao longo de seis dias mostraram que a produção de proteína de circRNA foi estendida em relação àquela de mRNA linear em células HEK293, com circRNA exibindo uma meia- vida de produção de proteína de 80 horas, enquanto a meia-vida de produção de proteína de mRNA linear não modificado e modificado foram aproximadamente 43 e 45 horas, respectivamente (FIG. 3I). De- vido ao aumento da expressão ou estabilidade, circRNA também pro- duziu substancialmente mais proteína do que mRNAs lineares não modificados e modificados ao longo de sua vida (FIG. 3J e FIG. 3K). Em células HeLa, circRNA exibiu uma meia-vida de produção de pro- teína de 116 horas, enquanto a meia-vida de produção de proteína de mRNA linear não modificado e modificado foi de aproximadamente 44 e 49 horas, respectivamente (FIG. 3I). Isso novamente resultou em substancialmente mais produção de proteína de circRNA ao longo de sua vida em comparação com mRNAs lineares não modificados e mo- dificados (FIG. 3J e FIG. 3K).
[00168] A obtenção de produção de proteína estável a partir de mRNA exógeno tem sido um objetivo de longa data da biotecnologia de mRNA. A possibilidade de adaptar o RNA circular para esse propó- sito foi sufocada pela baixa eficiência de produção de circRNA, dificul- dade de purificação e fraca expressão de proteínas. Na verdade, es- ses obstáculos devem ser superados antes que a estabilidade da pro- dução de proteínas de circRNA possa ser totalmente avaliada. O sis- tema baseado em íntron catalítico de grupo 1 permutado modular usando um vetor que incluiu braços de homologia e espaçadores, con- forme descrito neste documento, permite a circularização eficiente de uma ampla faixa de RNAs longos. Além disso, foi demonstrado que circRNA otimizado é capaz de produzir grandes quantidades de prote- ína e que pode ser efetivamente purificado por HPLC. Finalmente, foi demonstrado que circRNA pode produzir maiores quantidades de pro- teína por um período mais longo do que o RNA linear não modificado e modificado, fornecendo evidências de que circRNA possui potencial como uma alternativa ao mRNA para a expressão estável de proteínas terapêuticas.
[00169] Os resultados para FIG. 17 mostram que a circularização do RNA com um construto subideal pode ser promovida pelo aumento da temperatura, mas ao custo do aumento da degradação.
[00170] Os resultados para as FIGS. 18A-C mostram que a circula- rização é sensível à concentração de GTP, insensível à concentração de RNA, e as duas bandas no gel não trocam (A, B, C respectivamen- te); este é também um exemplo de circularização de espaçador de 5'/braço de homologia forte.
[00171] Os resultados para FIG. 19 mostram que a expressão de proteína baixa do construto de circRNA não otimizado - sem espaça- dores, braços de homologia forte; demonstração da importância da purificação na expressão/estabilidade de circRNA.
[00172] Os resultados para FIG. 20A e B mostram que UTRs po- dem melhorar a expressão de circRNA. Os resultados para FIG. 20C mostram que, quando usado em combinação com um espaçador 5’, os benefícios da expressão de adicionar UTRs desaparecem, sugerindo que UTRs podem atuar como espaçadores. Os resultados da FIG. 20D mostram essa circularização eficiente de construtos contendo UTR, todos usando os mesmos espaçadores/braços de homologia.
[00173] Os resultados para as FIGS. 21A-G mostram ensaios de expressão usando diferentes IRES ou sequências espaçadoras. As condições de pA/UTR nas FIGS. E e F usam o IRES de EMCV e são capazes de melhorar a expressão ao nível do IRES de CVB3 em al- guns casos. FIG. G mostra a comparação do reagente de transfecção e nanopartículas; não parece haver diferença aqui.
[00174] Os resultados para as FIGS. 22A e B mostram que a adição de diferentes espaçadores 5’ ou 3' (além de um espaçador projetado, existente) pode modular a expressão.
[00175] Os resultados para as FIGS. 23A e B mostram que os ín- trons podem interferir com a translação de diferentes sequências de IRES em diferentes graus; Anabaena interfere menos com IRESes de CVB3/polioV, enquanto o fago T4 interfere menos com EMCV. FIG. 23B mostra a avaliação in vivo de diferentes IRESes (fígado de ca- mundongo via LNP).
[00176] Os resultados da FIG. 24 mostram que plasmídeos que promovem a transcrição de moléculas precursoras de circRNA em cé- lulas de mamíferos não demonstram a translação de proteína realçada em comparação com plasmídeos que promovem a transcrição das mesmas moléculas precursoras de circRNA com sítios de junção dele- tados, sugerindo que a circularização não ocorre em células de mamí- feros.
[00177] Os resultados para as FIGS. 25A e 25B mostram que a efi- ciência de circularização de construtos contendo um painel de se- quências de IRES com uma região de codificação de gaussiana ou vagalume luciferase – a eficiência é consistente apesar das inserções variáveis. Todos construtos têm as mesmas sequências de junção (de- finidas como espaçadores, braços de homologia e homologia interna (que faz parte dos espaçadores).
[00178] Os resultados para as FIGS. 26A e 26B mostram que o aumento do monofosfato de guanosina na reação de transcrição in vi- tro (em excesso em relação ao trifosfato de guanosina) reduz a imu- nogenicidade das preparações de circRNA. Monofosfato de guanosina é melhor usado em combinação com HPLC para células sensíveis.
MATERIAIS E MÉTODOS Clonagem e Mutagênese
[00179] A codificação da proteína, o intron de autojunção do grupo I e as sequências de IRES foram sintetizados quimicamente (Integrated DNA Technologies) e clonadas em um vetor de plasmídeo linearizado por PCR contendo um promotor de T7 RNA polimerase por montagem Gibson usando um kit NEBuilder HiFi DNA Assembly (New England Biolabs). Regiões espaçadoras, braços de homologia e outras altera- ções menores foram introduzidos usando um kit Q5 Site Directed Mu- tagenesis (New England Biolabs). Projeto, Síntese e Purificação de circRNA
[00180] A estrutura do RNA foi prevista usando RNAFold (Vicens, Q. et al., "Toward predicting self-splicing e protein-facilated splicing of group I introns", RNA, 14(10):2013-2029 (2008)). O mRNA de GLuc linear modificado foi obtido de Trilink Biotechnologies. O mRNA linear não modificado ou precursores de circRNA foram sintetizados por transcrição in vitro a partir de um padrão de DNA de plasmídeo lineari- zado usando um Kit T7 High Yield RNA Synthesis (New England Bio- labs). Após a transcrição in vitro, as reações foram tratadas com DNase I (New England Biolabs) por 20 minutos. Após o tratamento com DNase, o mRNA linear não modificado foi purificado em coluna usando um kit MEGAclear Transcription Clean-up (Ambion). O RNA foi, então, aquecido a 70 °C por 5 minutos e imediatamente colocado em gelo por 3 minutos, após o que o RNA foi capeado usando mRNA cap-2'-O-metiltransferase (NEB) e enzima de capeamento de Vacínia (NEB) de acordo com as instruções do fabricante. Caudas de poliade- nosina foram adicionadas aos transcritos lineares capeados protegidos usando PolyA Polymerase de E. coli (NEB) de acordo com as instru- ções do fabricante, e o mRNA totalmente processado foi purificado em coluna.
Para circRNA, após o tratamento com DNase, GTP adicional foi adicionado a uma concentração final de 2 mM e, em seguida, as reações foram aquecidas a 55 °C por 15 minutos.
O RNA foi, então, purificado em coluna.
Em alguns casos, o RNA purificado foi recircula- rizado: o RNA foi aquecido a 70 °C por 5 minutos e, em seguida, ime- diatamente colocado em gelo por 3 minutos, após o que GTP foi adici- onado a uma concentração final de 2 mM junto com um tampão inclu- indo magnésio (Tris-HCl 50 mM, MgCl2 10 mM, DTT 1 mM, pH 7,5; New England Biolabs). O RNA foi, então, aquecido a 55 °C durante 8 minutos e depois purificado em coluna.
Para enriquecer para circRNA, 20 µg de RNA foram diluídos em água (volume final de 86 µL) e, en- tão, aquecidos a 65 °C por 3 minutos e resfriados em gelo por 3 minu- tos. 20U de RNase R e 10uL de tampão RNase R 10x (Epicenter) fo- ram adicionados, e a reação foi incubada a 37 °C por 15 minutos; um adicional de 10U de RNase R foi adicionado no meio da reação.
O RNA digerido com RNase R foi purificado em coluna.
O RNA foi sepa- rado em géis de agarose E-gel EX 2% pré-fundido (Invitrogen) no iBa- se E-gel (Invitrogen) usando o programa E-gel EX 1-2%. A separação de circRNA adequada usando outros sistemas de gel de agarose não foi obtida.
As bandas foram visualizadas usando transiluminação de luz azul e quantificadas usando ImageJ.
Para extrações de gel, as bandas correspondentes ao circRNA foram excisadas do gel e, em se- guida, extraídas usando um Kit de Extração Zymoclean Gel RNA (Zymogen). Para cromatografia líquida de alto desempenho, 30 µg de RNA foram aquecidos a 65 °C por 3 minutos e, em seguida, colocados em gelo por 3 minutos.
O RNA foi executado através de uma coluna de exclusão por tamanho de 4,6 x 300 mm com tamanho de partícula de 5 µm e tamanho de poro de 200Å (Sepax Technologies; número da parte: 215980P-4630) em uma HPLC Agilent 1100 Series (Agilent). O RNA foi executado em tampão TE sem RNase (Tris 10mM, EDTA
1mM, pH: 6) a uma taxa de fluxo de 0,3mL/minuto. O RNA foi detecta- do por absorvência UV em 260nm, porém, foi coletado sem detecção de UV. As frações de RNA resultantes foram precipitadas com acetato de amônio 5 M, ressuspensas em água e, em seguida, em alguns ca- sos tratadas com RNase R como descrito acima. Análise Corte de RNase H
[00181] As reações de junção enriquecidas para circRNA com RNase R e depois purificadas em coluna foram aquecidas a 65 °C por 5 minutos na presença de uma sonda de DNA (Tabela 1) em excesso molar de cinco vezes e, em seguida, aneladas à temperatura ambien- te. As reações foram tratadas com RNase H (New England Biolabs) no tampão de reação fornecido durante 15 minutos a 37 °C. O RNA foi purificado em coluna após digestão. Transcrição Reversa e Síntese de cDNA
[00182] Para sequenciamento de união de junção, as reações de junção enriquecidas para circRNA com RNase R e depois purificadas em coluna foram aquecidas a 65 °C por 5 minutos e resfriadas em gelo por 3 minutos para padronizar a estrutura secundária. As reações de transcrição reversa foram realizadas com Superscript IV (Invitrogen), conforme recomendado pelo fabricante, usando um iniciador específi- co para uma região interna do circRNA putativo. Produto de PCR para sequenciamento foi sintetizado usando Q5 polimerase (New England Biolabs) e um par de primers abrangendo a união da junção. Cultura de Tecidos e Transfecções
[00183] Células HEK293, HEK293-GFP, HeLa e A549 foram culti- vadas a 37 °C e 5% de CO2 em Meio de Eagle Modificado por Dul- becco (4500 mg/L de glicose) suplementado com 10% de soro bovino fetal inativado por calor (hiFBS, Gibco) e penicilina/estreptomicina. O meio Min6 foi adicionalmente suplementado com 5% de hiFBS, HEPES 20 mM (Gibco) e beta-mercaptoetanol 50 μM (BioRad). As cé-
lulas foram passadas a cada 2-3 dias. Para todos os conjuntos de da- dos de circRNA apresentados na FIG. 2, exceto Cas9, 40-100ng de reações de junção tratadas com RNase R ou circRNAs purificados por HPLC foram transfectados reversamente em 10.000 células HEK293/100uL por cavidade de uma placa de 96 cavidades usando Lipofectamine MessengerMax (Invitrogen) de acordo com as instru- ções do fabricante. Para Cas9, 100ng de sgRNA transcrito in vitro foi reversamente transfectado sozinho ou cotransfectado com 150ng de reação de junção de Cas9 tratada com RNase R em 50.000 células HEK293-GFP/500uL por cavidade de uma placa de 24 cavidades usando MessengerMax. Para todos os conjuntos de dados de RNA apresentados na FIG. 3, quantidades equimolares de cada RNA foram transfectadas de forma reversa em 10.000 células HEK293, HeLa ou A549/100uL por cavidade de uma placa de 96 cavidades usando Mes- sengerMax. As células Min6 foram transfectadas em formato de placa de 96 cavidades entre 60-80% de confluência. Análise de Expressão de Proteína
[00184] Para os ensaios de luminescência, as células e os meios foram colhidos 24 horas após a transfecção. Para detectar a lumines- cência da Gaussia luciferase, 10-20uL de meio de cultura de tecidos foram transferidos para uma placa de parede branca de fundo plano (Corning). 25uL de reagente BioLux Gaussia Luciferase incluindo es- tabilizador (New England Biolabs) foram adicionados a cada amostra e a luminescência foi medida em um Leitor de Microplaca Infinite 200Pro (Tecan) após 45 segundos. Para detectar a luminescência da Vagalu- me luciferase, 100uL do reagente Bright-Glo Luciferase (Promega) fo- ram adicionados a cada cavidade, misturados e incubados por 5 minu- tos. 100uL do meio de cultura e da mistura de reagentes de luciferase foram, então, transferidos para uma placa de parede branca de fundo plano e a luminescência foi detectada como descrito acima. A fluores-
cência de GFP foi detectada 24 horas após a transfecção e as ima- gens foram tiradas usando um imageador celular EVOS FL (Invitro- gen). A eritropoetina foi detectada por ELISA em sanduíche de fase sólida (R&D Systems) essencialmente de acordo com as instruções do fabricante, exceto sobrenadante de cultura de células 24 horas após a transfecção foi usado e as amostras foram diluídas 1:200 antes do uso. Citometria de fluxo
[00185] A ablação de GFP mediada por CRISPR-Cas9 foi detecta- da por citometria de fluxo 96 horas após a transfecção. As células de controle HEK293-GFP e HEK293 foram tripsinizadas e suspensas em Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (4500 mg/L de glicose) su- plementado com soro fetal bovino a 10% e penicilina/estreptomicina. As células foram, então, lavadas duas vezes em tampão FACS (PBS, 5% de soro fetal bovino inativado por calor) e ressuspensas em tam- pão FACS contendo Sytox Blue Dead Cell Stain (Thermo Fisher) de acordo com as instruções do fabricante, ou tampão FACS sozinho pa- ra GFP e controles em branco. A fluorescência foi detectada para
10.000 eventos em um citômetro de fluxo BD FACSCelesta (BD Bios- ciences). Os dados foram analisados em Flowjo (Flowjo LLC). Estatísticas
[00186] A análise estatística dos resultados foi realizada por um tes- te t de Welch não pareado bicaudal, assumindo variâncias desiguais. As diferenças foram consideradas significativas quando p <0,05. Deta- lhes estatísticos de experimentos individuais estão presentes nas le- gendas das figuras. EXEMPLO 2
[00187] Os RNAs circulares (circRNAs) são uma classe de RNAs de fita simples com uma estrutura contígua que tem estabilidade real- çada e uma falta de motivos finais necessários para a interação com várias proteínas celulares. Aqui, é mostrado que circRNA exógeno não modificado é capaz de contornar os sensores de RNA celular e, assim, evitar provocar uma resposta imune em células competentes RIG-I e receptor Toll-like (TLR) e em camundongos. A imunogenicidade e a estabilidade da expressão de proteínas de preparações de circRNA são dependentes da pureza, com pequenas quantidades de RNA line- ar contaminante levando a respostas imunes celulares robustas. O cir- cRNA não modificado é menos imunogênico do que o mRNA linear não modificado in vitro, em parte devido à evasão da percepção de TLR, e provoca uma resposta de citocina que é similar àquela induzi- da pelo mRNA linear modificado por uridina. Além disso, foi descober- to que a modificação da uridina do circRNA interrompe a translação mediada pelo sítio de entrada do ribossomo interno (IRES) e não tem um efeito significativo na resposta das citocinas. Finalmente, os dados mostram a primeira demonstração da distribuição e translação de cir- cRNA exógenos in vivo, e os dados mostram que a translação de cir- cRNA é estendida no tecido adiposo em comparação com mRNAs li- neares não modificados e modificados por uridina. Introdução
[00188] CircRNAs são uma classe de RNAs com uma variedade de funções de codificação e não codificação de proteínas (Legnini, I. et al. Circ-ZNF609 Is a Circular RNA that Can Be Translated and Functions in Myogenesis. Mol. Cell 66, 22–37.e9 (2017); Li, Z. et al. Exon-intron circular RNAs regulate transcription in the nucleus. Nat. Struct. Mol. Biol. 22, 256–264 (2015); Hansen, T. B. et al. Natural RNA circles func- tion as efficient microRNA sponges. Nature 495, 384–388 (2013); and Barrett, S. P. & Salzman, J. Circular RNAs: analysis, expression and potential functions. Development 143, 1838–1847 (2016). As células eucarióticas geram circRNAs por meio de retrojunção, enquanto os genomas de patógenos virais, como o vírus da hepatite D e viroides de plantas também podem ser circulares (Chen, L.-L. & Yang, L.
Regula- tion of circRNA biogenesis.
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Cell 67, 228–238.e5 (2017)). Recentemente, foi proposto que as células evoluíram um mecanismo dependente de junção para a discriminação de circRNA endógeno e exógeno, usando RIG-1 como um sensor citoplasmático de circRNA exógeno (Chen, Y.
G. et al.
Sen- sing Self and Foreign Circular RNAs by Íntron Identity.
Mol.
Cell 67, 228–238.e5 (2017)). Embora circRNA não contenha o motivo trifosfato canonicamente necessário para a ativação de RIG-I, foi sugerido que RIG-I pode interagir transitoriamente com circRNA desprovido de pro- teínas nucleares do hospedeiro, levando a uma resposta antiviral me- diada por RIG-I canônica (Chen, Y.
G. et al.
Sensing Self and Foreign Circular RNAs by Íntron Identity.
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Available at: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21616437. (Accessed: 7th May 2018)). No entanto, o mecanismo de reconhecimento de circRNA me- diado por RIG-I permanece obscuro.
Além de RIG-I, também é possí- vel que circRNA interaja com outros sensores de RNA, como os TLRs endossomais 3, 7 e 8, que mostraram ativar a sinalização em resposta a motivos de ssRNA e dsRNA lineares, bem como produtos de degra- dação de RNA como fragmentos ricos em uridina e guanosina-uridina (Tanji, H. et al.
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RNAs Containing Modified Nucleotides Fail To Trigger
RIG-I Conformational Changes for Innate Immune Signaling. MBio 7, (2016)). A modificação do RNA com N6-metiladenosina (m6A) de- monstrou mediar a translação independente de cap em endógenos lineares e circRNAs (Meyer et al. 2015; Yang et al. 2017). A contribui- ção dos TLRs para a imunogenicidade do circRNA, e os efeitos das modificações dos nucleosídeos na translação, estabilidade e imunoge- nicidade do circRNA exógeno ainda não foram relatados.
[00189] Recentemente, circRNA foi desenvolvido para a produção de proteína estável em células de mamíferos (Wesselhoeft, R. A., Kowalski, P. S. & Anderson, D. G. Engineering circular RNA for potent and stable translation in eukaryotic cells. Nat. Commun. 9, 2629 (2018)). Conforme descrito neste documento, a imunogenicidade e a capacidade de translação do circRNA exógeno in vitro e in vivo foram investigadas para determinar a utilidade potencial do circRNA para aplicações de produção de proteínas. Foi demonstrado aqui que cir- cRNA exógeno não estimula uma resposta imune celular em células competentes RIG-I e TLR. Além disso, é mostrado que, ao contrário do mRNA linear, circRNA dependente de IRES não se beneficia da modi- ficação com m1ψ em termos de expressão de proteína e imunogenici- dade ou modificação com m6A em termos de expressão de proteína. Verificou-se que o circRNA é compatível com a distribuição mediada por nanopartículas lipídicas e é efetivamente transladado in vivo sem provocar uma resposta imune inata mediada por RNA, enquanto a ex- pressão de proteína de circRNA exibe maior estabilidade que a do mRNA linear modificado por uridina no tecido adiposo. Resultados Purificação de circRNA exógeno elimina imunogenicidade
[00190] Usando o método de junção íntron-éxon permutado otimi- zado (PIE) relatado anteriormente, os precursores de circRNA foram sintetizados contendo um sítio de entrada do ribossomo interno de co-
xsackievirus B3 (IRES de CVB3), uma mensagem de Gaussia lucifera- se (GLuc), duas sequências espaçadoras projetadas, duas regiões curtas correspondentes a fragmentos de éxon do construto de PIE, e os segmentos de intron 3’e 5' do intron do grupo I pré-tRNA de Anaba- ena permutado por transcrição de escoamento (FIG. 7A-B) (Wesse- lhoeft, R.
A., Kowalski, P.
S. & Anderson, D.
G.
Engineering circular RNA for potent and stable translation in eukaryotic cells.
Nat.
Commun. 9, 2629 (2018); Puttaraju, M. & Been, M.
Group I permuted intron-exon (PIE) sequences self-splice to produce circular exons.
Nucleic Acids Res. 20, 5357–5364 (1992)). Na presença de GTP e Mg2+, essas mo- léculas de RNA precursor sofrem as reações de transesterificação du- pla características dos íntrons catalíticos do grupo I, porém, como os exons já estão fundidos, a região entre os dois segmentos de íntron é excisada como um círculo covalentemente ligado a 5' a 3' (FIG. 7A) (Puttaraju, M. & Been, M.
Group I permuted intron-exon (PIE) sequen- ces self-splice to produce circular exons.
Nucleic Acids Res. 20, 5357– 5364 (1992)). Para confirmar que os produtos circulares foram obtidos, a reação de junção foi tratada com RNase R, uma exonuclease de RNA de 3’a 5', e o enriquecimento observado da banda de circRNA putativa (FIG. 7C) (Suzuki, H. et al.
Characterization of RNase R- digested cellular RNA source that consists of lariat and circular RNAs from pre-mRNA splicing.
Nucleic Acids Res. 34, e63–e63 (2006)). A purificação subsequente da reação de junção tratada com RNase R por HPLC e, em seguida, a digestão com RNase H direcionada ao oli- gonucleotídeo produziu uma única banda principal em contraste com duas bandas principais produzidas por RNA precursor linear digerido por RNase H que contém todos os mesmos elementos de sequência que o precursor de circRNA com exceção dos nucleotídeos do sítio de junção (FIG. 7C, ΔS), confirmando a circularidade.
As reações de jun- ção contendo circRNA demonstraram produção de proteína melhorada e estabilidade de expressão da produção de proteína em comparação com o precursor linear tratado com fosfatase e poliadenilado após a transfecção em células 293 (FIG 7. G-I).
[00191] Para investigar a imunogenicidade do circRNA, duas linha- gens celulares (rim embrionário humano, 293; carcinoma de pulmão humano, A549) foram selecionadas, as quais foram observadas para eliciar a viabilidade celular diferencial e respostas de estabilidade de expressão de GLuc após a transfecção de reações de junção de cir- cRNA não purificadas (FIGS. 7 E e F). Após o protocolo de circulariza- ção, espera-se que essas reações de junção contenham circRNA, ín- trons trifosforilados excisados, concatenações lineares e circulares e produtos de degradação de RNA linear e circRNA, alguns dos quais trifosforilados. Embora a reação de junção prossiga quase até a con- clusão sob as condições de circularização aqui utilizadas, algum RNA precursor linear trifosforilado também está presente. Várias etapas fo- ram, então, aplicadas de purificação para as reações de junção não purificadas e enriquecimento de circRNA confirmado por eletroforese em gel: RNase R para enriquecer circRNA, HPLC para remover com- ponentes não circulares e fosfatase para remover trifosfatos residuais (Figura 7D). Para determinar a extensão da resposta imune celular inata ao RNA transfectado, a liberação de uma ampla faixa de citoci- nas e quimiocinas no meio de cultura foi monitorada, bem como a es- tabilidade de expressão da proteína a partir do circRNA e a viabilidade celular.
[00192] Verificou-se que a digestão com RNase R de reações de junção era insuficiente para eliminar a liberação de citocinas em célu- las A549 em comparação com controles não transfectados (FIG. 7F, FIG. 8G). A adição de purificação por HPLC foi, além disso, insuficien- te para eliminar a liberação de citocinas, embora tenhamos notado uma redução significativa em IL-6 e um aumento significativo em IFN-
α1 em comparação com a reação de junção não purificada, sugerindo que RNase R e HPLC combinados podem ter esgotado algumas es- pécies de RNA imunogênico enquanto enriquecendo outras (Figura 7F). A adição da purificação por HPLC foi além disso insuficiente para eliminar a liberação de citocinas, embora uma redução em IL-6 em comparação com a reação de junção não purificada (FIG. 7F) tenha sido observada.
Curiosamente, a adição de um tratamento de fosfa- tase após a purificação por HPLC e antes da digestão de RNase R re- duziu drasticamente a expressão de todas as citocinas super- reguladas que avaliamos em células A549, com MCP1, IL-6, IFN-α1, TNF-α e IP-10 secretados caindo para níveis de linha de base indetec- táveis ou não transfectados (FIG. 7F). A liberação substancial de cito- cinas em células 293 não foi observada, consistente com a observa- ção de que o fenótipo de estabilidade de expressão de proteína de 3 dias destas células é relativamente não afetado pelo grau de pureza de circRNA e relatórios anteriores indicando que as células 293 não expressam vários sensores principais de RNA ( FIG. 7E, FIG. 8G) (Hornung, V. et al.
Quantitative expression of toll-like receptor 1-10 mRNA in cellular subsets of human peripheral blood mononuclear cells and sensitivity to CpG oligodeoxynucleotides.
J.
Immunol. 168, 4531– 4537 (2002)). Em contraste, a pureza aumentada de circRNA melho- rou a estabilidade da expressão de GLuc em células A549 transfecta- das, com circRNA completamente purificado demonstrando um fenóti- po de estabilidade similar ao das células 293 transfectadas (FIGS. 7E e F). Da mesma forma, uma tendência de aumento da pureza do cir- cRNA melhorou a viabilidade das células A549 3 dias após a transfec- ção, enquanto as viabilidades das células 293 permaneceram pratica- mente não afetadas, consistente com uma falta de sinalização inflama- tória nas células 293 e diminuição da sinalização inflamatória nas célu- las A549 com aumento da pureza do circRNA (FIGS. 7E e F). Juntos,
estes resultados demonstram que a pureza do circRNA afeta forte- mente seu potencial imunogênico e que o circRNA totalmente purifica- do é significativamente menos imunogênico do que reações de junção não purificadas ou incompletamente purificadas. A estabilidade da produção de proteína a partir do circRNA também depende da pureza do circRNA e da sensibilidade dos tipos de células transfectadas a es- pécies de RNA contaminantes. Um experimento ao longo do tempo monitorando a indução da transcrição de RIG-I, IFN-β1, IL-6 e RAN- TES nas primeiras 8 horas após a transfecção de células A549 com reações de junção ou circRNA totalmente purificado não revelou uma resposta transitória ao circRNA (Figura S2F). O circRNA purificado si- milarmente não conseguiu induzir transcrições pró-inflamatórios em macrófagos murinos RAW264.7 (Figura S2G). Para generalizar esses resultados para outro construto de circRNA sintético, testamos a indu- ção de transcrições pró-inflamatórios em resposta à transfecção de células A549 com circRNA purificado contendo uma região de codifi- cação de IRES de EMCV e EGFP, e novamente falhou em observar a indução substancial (Figura S2H). Estes dados demonstram que os componentes não circulares da reação de junção são responsáveis pela imunogenicidade observada em estudos anteriores e que circRNA não é um ligante natural para RIG-I. Componentes não circulares da reação de junção contribuem para a imunogenicidade
[00193] Para explorar a fonte de imunogenicidade em reações de junção de circRNA, cada componente da reação de junção foi purifica- do por HPLC e avaliada a liberação de citocinas e a viabilidade celular após a transfecção de células A549 (FIGS. 8A e B). Como havia difi- culdade em obter RNA precursor linear adequadamente puro a partir da reação de junção, o RNA precursor na forma do mutante de dele- ção do sítio de junção (ΔS) (FIG. 8B, direita inferior) foi separadamente sintetizado e purificado. Além disso, o pico de circRNA foi dividido em duas frações para controlar a sobreposição de pico de RNA cortado (FIG. 8B). A liberação robusta de IL-6, RANTES e IP-10 foi observada em resposta à maioria das espécies presentes na reação de junção, bem como RNA precursor (FIG. 8C, FIG. 9G). As frações de circRNA iniciais eliciaram respostas de citocinas comparáveis a outras frações não circRNA, indicando que mesmo quantidades relativamente peque- nas de contaminantes de RNA linear são capazes de induzir uma res- posta imune celular substancial em células A549. As frações de circR- NA tardias não eliciaram nenhuma resposta de citocina além da dos controles não transfectados. Consistente com as observações de libe- ração de citocinas, a viabilidade das células A549 36 horas após a transfecção foi significativamente maior para frações de circRNA tardi- as em comparação com todas as outras frações (FIG. 8D).
[00194] Porque foi relatado anteriormente que circRNA pode induzir a transcrição de RIG-I em uma alça de realimentação autorregulador, a indução da transcrição de RIG-I e IFN-β1 foi analisada após a trans- fecção de células A549 com frações de HPLC de circRNA tardias (Chen, YG et al. Sensing Self and Foreign Circular RNAs by Intron Identity. Mol. Cell 67, 228-238.e5 (2017)). Uma indução significativa- mente mais fraca de ambas as transcrições RIG-I e IFN-β1 para fra- ções de circRNA tardias foi observada em comparação com o RNA precursor e reações de junção não purificadas (FIG. 8E). Além disso, verificou-se que o tratamento com RNase R de reações de junção por si só não foi suficiente para eliminar este efeito (FIG. 8F), enquanto a contaminação do circRNA purificado com quantidades muito pequenas do ligante de RIG-I 3p-hpRNA induziu transcrição substancial de RIG-I (FIG. 9I). Em células HeLa, a transfecção de reações de junção digeri- das por RNase R, porém, não circRNA purificado, induziu RIG-I e IFN- β1, embora tenha sido descoberto que células HeLa são menos sensí-
veis do que células A549 a espécies de RNA contaminantes (FIG. 9L). Esses dados sugerem que componentes não circulares da reação de junção são responsáveis pela imunogenicidade observada em estudos anteriores e que circRNA não é um ligante endógeno para RIG-I. Modificação do nucleosídeo do circRNA é disruptiva
[00195] Modificações de nucleosídeos como 5-metilcitidina (m5C), N6-metiladenosina (m6A) e pseudouridina (ψ) foram relatadas para diminuir a imunogenicidade do mRNA linear in vitro e em alguns con- textos in vivo, impedindo os ribonucleotídeos de interagir com senso- res de RNA celular como os TLRs endossômicos 3, 7 e 8 e RIG-I (Karikó, K., Buckstein, M., Ni, H. & Weissman, D. Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors: the impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA. Immunity 23, 165–175 (2005); Dur- bin, A. F., Wang, C., Marcotrigiano, J. & Gehrke, L. RNAs Containing Modified Nucleotides Fail To Trigger RIG-I Conformational Changes for Innate Immune Signaling. MBio 7, (2016)). Foi relatado que a N6- metiladenosina (m6A) media a entrada interna do ribossomo e a trans- lação em RNAs lineares e separadamente em circRNAs endógenos (Meyer et al. 2015; Yang et al. 2017). Os efeitos dessas modificações na utilidade do mRNA in vivo podem ser variáveis, no entanto, como ψ-mRNA distribuído ao fígado não reduz a imunogenicidade ou melho- ra a produção de proteínas (Kauffman, K. J. et al. Efficacy and immu- nogenicity of unmodified and pseudouridina-modified mRNA delivered systemically with lipid nanoparticles in vivo. Biomaterials 109, 78–87 (2016)). Recentemente, foi relatado que a incorporação de m1ψ dimi- nui a imunogenicidade do mRNA e melhora a expressão da proteína em um grau maior do que a incorporação de ψ (Svitkin, Y. V. et al. N1- metil-pseudouridine in mRNA enhances translation through eIF2α- dependent and independent mechanisms by increasing ribosome den- sity. Nucleic Acids Res. 45, 6023–6036 (2017) and Andries, O. et al.
N(1)-metilpseudouridina-incorporated mRNA outperforms pseudouridi- na-incorporated mRNA by providing enhanced protein expression and reduced immunogenicity in mammalian cell lines and mice. J. Control. Release 217, 337–344 (2015)). Os efeitos das modificações de nu- cleosídeos na eficiência da translação do circRNA e na imunogenici- dade não foram testados. Devido a dificuldades anteriores com a puri- ficação de circRNA, a imunogenicidade do circRNA purificado em rela- ção ao mRNA linear não modificado também não foi avaliada. Portan- to, procurou-se avaliar a estabilidade da expressão da proteína GLuc e o perfil de liberação de citocinas de circRNA purificado não modificado e modificado por m1ψ em comparação com mRNA linear não modifi- cado e modificado por m1ψ em células A549 e 293 (FIG. 9A).
[00196] As tentativas iniciais de circularizar m1ψ-circRNA usando o método PIE não tiveram sucesso, uma vez que a substituição comple- ta da uridina por m1ψ nos precursores de construto de PIE aboliu a atividade da ribozima enquanto a substituição parcial reduziu drasti- camente a eficiência da junção (FIG. 9B). Um método alternativo de preparação de circRNA usando T4 RNA ligase I e oligonucleotídeos splint projetados para trazer as extremidades do RNA precursor em proximidade para ligação (FIG. 10G) (Sonja Petkovic, S. M. RNA circu- larization strategies in vivo and in vitro. Nucleic Acids Res. 43, 2454 (2015)). Usando oligonucleotídeos splint otimizados e condições de anelamento, 40% de eficiência de circularização do RNA precursor de 1,5 kb foram obtidos (FIGS. 10H e I). A substituição completa da uridi- na com m1ψ não impediu a circularização usando este método e pro- dutos circulares totalmente modificados foram obtidos (FIG. 9C).
[00197] Após a transfecção de células 293 e A549 com m1ψ- circRNA, nenhuma expressão de proteína foi observada e, portanto, a estabilidade da expressão de proteína de circRNA modificado não foi determinada (FIG. 9D). CircRNA não modificado exibiu estabilidade de expressão de proteína realçada em células HEK293 e A549 em com- paração com mRNA linear não modificado e modificado (FIG. 9E e F). Curiosamente, foi descoberto que o mRNA linear não modificado pro- vocou uma maior resposta de citocinas do que circRNA não modifica- do em células A549 imunorresponsivas, apesar do capeamento, tra- tamento com fosfatase e purificação por HPLC para remover ligantes RIG-I. Em contraste, ambos m1ψ-circRNA e m1ψ-mRNA não altera- ram significativamente os perfis de liberação de citocinas (FIG. 9F, FIG 11E). A viabilidade das células A549 foi diminuída após a transfecção de mRNA linear não modificado, porém, não circRNA não modificado ou m1ψ-RNAs (FIG. 9F). Consistente com os dados das FIGS. 7A-F, não foram detectadas diferenças significativas na liberação de citoci- nas de 293 em 24 horas após a transfecção e na viabilidade celular em 3 dias após a transfecção (FIG. 9E, FIG. 11E). Esses experimentos indicam que circRNA é menos imunogênico do que mRNA linear ca- peado e poliadenilado e que a modificação de nucleosídeo de circRNA é desnecessária para proteção contra sensores imunes inatos. CircRNA evita a detecção por receptores toll-like
[00198] Como o mRNA linear capeado e poliadenilado foi capaz de desencadear a secreção de citocinas, enquanto o circRNA não, a ca- pacidade de diferentes RNAs para ativar TLRs em linhagens celulares repórteres foi investigada. TLRs 3, 7 e 8 são conhecidos por detectar RNA em endossomos e iniciar uma cascata inflamatória (Takumi Ka- wasaki, T. K. Toll-Like Receptor Signaling Pathways. Front. Immunol. 5, (2014)). TLR3 se liga a dsRNA e estruturas tronco em ssRNA viral, enquanto TLR7 e TLR8 humano se ligam a ssRNA e produtos de de- gradação de nucleosídeos (guanosina para TLR7 e uridina para TLR8), com ambos os ligantes necessários para ativação de TLR (Tanji, H. et al. Toll-like receptor 8 senses degradation products of sin- gle-stranded RNA. Nat. Struct. Mol. Biol. 22, 109–115 (2015); Zhang,
Z. et al. Structural Analysis Reveals that Toll-like Receptor 7 Is a Dual Receptor for Guanosine and Single-Stranded RNA. Immunity 45, 737– 748 (2016); Bell, J. K., Askins, J., Hall, P. R., Davies, D. R. & Segal, D. M. The dsRNA binding site of human Toll-like receptor 3. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 8792–8797 (2006); and Tatematsu, M., Nishi- kawa, F., Seya, T. & Matsumoto, M. Toll-like receptor 3 recognizes in- complete stem structures in single-stranded viral RNA. Nat. Commun. 4, 1833 (2013)). Para controlar as diferenças estruturais e de sequên- cia entre os RNAs lineares e circulares, uma versão linearizada do cir- cRNA foi construída. Este construto continha todos os componentes do circRNA juntado e foi criado pela deleção das sequências do intron e do braço de homologia (RNA linearizado, FIG. 10A, FIG. 12G). To- dos os RNAs linearizados foram adicionalmente tratados com fosfa- tase (no caso de RNAs capeados, após capeamento) e purificados por HPLC. Embora uma resposta ao RNA linearizado ou circular em célu- las repórter TLR7 não tenha sido encontrada, ambas as células repór- ter TLR3 e TLR8 foram ativadas por RNA linearizado capeado, RNA linearizado poliadenilado, a fração de circRNA cortada e a fração de circRNA inicial (FIG. 10B). Curiosamente, a fração de circRNA tardia não provocou uma resposta mediada por TLR em qualquer linhagem celular, de forma similar ao m1ψ-mRNA (FIG. 10B). No entanto, a adi- ção de uridina, porém, não de citidina, aos meios de células repórter TLR8 transfectadas com circRNA reverteu parcialmente esse efeito e resultou na secreção de SEAP, indicando que a trans-adição de um dos dois sinais de degradação de RNA necessários para a ativação de TLR8 pode compensar para a falta de detecção de circRNA por TLR8 (FIG. 10C, FIG. 12H).
[00199] Em seguida, circRNA purificado foi linearizado usando dois métodos: tratamento de circRNA com calor na presença de íons de magnésio e digestão de RNase H guiada por oligonucleotídeo de DNA
(FIG. 10D). Ambos os métodos produziram uma maioria de RNA linear de tamanho natural com pequenas quantidades de circRNA intacto, embora o tratamento térmico tenha resultado em uma proporção maior de produtos de degradação de RNA linear de peso molecular mais baixo (FIG. 10E). A transfecção de circRNA degradado igualmente por calor e RNase H estimulou a secreção de SEAP em células repórter TLR8 (FIG. 4F). Nenhuma ativação foi observada em células repórter TLR3 e TLR7 para condições degradadas ou intactas, apesar da ati- vação de TLR3 por RNA linearizado transcrito in vitro (FIG. 4F, FIG. 12I). Esses resultados indicam que circRNA é capaz de evitar a detec- ção por TLRs, e que a evasão de TLR8 é resultado de conformação circular. circRNA exógeno é transladável in vivo
[00200] A translação e a imunogenicidade de circRNAs e mRNAs lineares da eritropoetina humana (hEpo) não modificada e modificada por m1ψ foram examinadas primeiro, com mRNAs lineares idênticos aos representados na FIG. 9A com exceção da região de codificação (FIG. 13, FIG. 14A). A transfecção equimolar de m1ψ-mRNA e circR- NA não modificado resultou na expressão de proteína robusta em cé- lulas 293 (Fig.14B). O circRNA e mRNA linear de hEpo exibiram pa- drões de expressão de proteína relativa similares e viabilidades celula- res em comparação com o circRNA e mRNA linear de GLuc e após transfecção de peso igual de células 293 e A549 (FIGS. 14C e D). Em camundongos, a hEpo foi detectada no soro após a injeção de circR- NA de hEpo ou mRNA linear na adipose visceral (FIGS. 11A e D). A hEpo detectada após a injeção de circRNA não modificado decaiu mais lentamente do que a do não modificado ou m1ψ-mRNA e ainda estava presente 42 horas após a injeção (FIG. 11B). Foi observado um declínio rápido na hEpo sérico após a injeção de reações de junção de circRNA não purificado ou mRNA linear não modificado (FIG. 11B). A injeção de reações de junção não purificadas, além disso, produziu uma resposta de citocina detectável no soro que não foi observada para os outros RNAs, incluindo circRNA purificado (FIG. 11C, FIG. 15). CircRNA é compatível com nanopartículas lipídicas
[00201] Nanopartículas lipídicas têm mostrado potencial significati- vo para uso como veículos de distribuição para RNAs terapêuticos, incluindo a distribuição de mRNA aos tecidos (Oberli, M. A. et al. Lipid Nanoparticle Assisted mRNA Delivery for Potent Cancer Immunothe- rapy. Nano Lett. 17, 1326–1335 (2017); Yanez Arteta, M. et al. Suc- cessful reprogramming of cellular protein production through mRNA delivered by functionalized lipid nanoparticles. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 115, E3351–E3360 (2018); and Kaczmarek, J. C., Kowalski, P. S. & Anderson, D. G. Advances in the delivery of RNA therapeutics: from concept to clinical reality. Genome Med. 9, 60 (2017)). Para avaliar a eficácia de nanopartículas lipídicas para a distribuição de circRNA in vivo, circRNA purificado foi formulado em nanopartículas com o lipidoi- de ionizável cKK-E12 (Dong, Y. et al. Lipopeptide nanoparticles for po- tent and selective siRNA delivery in rodents and nonhuman primates. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 3955–3960 (2014); and Kauffman, K. J. et al. Optimization of Lipid Nanoparticle Formulations for mRNA Delivery in Vivo with Fractional Factorial and Definitive Screening De- signs. Nano Lett. 15, 7300–7306 (2015)). Estas partículas formaram estruturas multilamelares uniformes com um tamanho médio, índice de polidispersidade e eficiência de encapsulação similar àquela das partí- culas contendo mRNA linear de controle disponível comercialmente modificado com 5-metoxiuridina (5moU, FIG. 12A, Tabela 2). O circR- NA de hEpo purificado encapsulado em LNPs exibiu expressão robus- ta após adição a células 293 em comparação com 5moU-mRNA (FIG. 12B, à esquerda). Este mRNA disponível comercialmente teve desem- penho similar ao m1ψ-mRNA que foi usado anteriormente em relação ao circRNA (FIG. 14C). A estabilidade da expressão da proteína de LNP-RNA em células 293 foi similar à do RNA distribuído pelo rea- gente de transfecção, com a exceção de um ligeiro atraso no decai- mento tanto para 5moU-mRNA quanto para circRNA (FIG. 12B, à direi- ta). O encapsulamento em LNPs não alterou a indução de RIG-I/IFN- β1 ou ativação de TLR in vitro, com circRNA não modificado falhando em ativar sensores imunes de uma maneira similar a 5moU-mRNA (FIGS. 12C e D).
[00202] Em camundongos, o LNP-RNA foi injetado localmente no tecido adiposo visceral (FIG. 16B). A expressão de hEPo sérica do cir- cRNA foi menor, porém, comparável com a de 5moU-mRNA 6 horas após a injeção de LNP-RNAs na distribuição visceral adiposa ou intra- venosa ao fígado (FIG. 12E, FIG. 16E). A hEpo sérica detectada após a injeção adiposa de LNP-circRNA não modificado decaiu mais lenta- mente do que a de LNP-5moU-mRNA, com um retardo no declínio da expressão presente no soro similar ao observado in vitro (FIG. 12F); no entanto, a hEpo sérica detectada após a injeção intravenosa de LNP-circRNA decaiu na mesma taxa que a de LNP-5moU-mRNA (FIG. 16E). Não foi observado um aumento nas citocinas séricas, ou indução de transcrição local de RIG-I, TNF-α ou IL-6 após a injeção de LNP- 5moU-mRNA ou LNP-circRNA (FIGS. 16C e D). Tabela 2 Formulação de Polidispersi- Média da Intensidade Eficácia de En- cKK-E12 dade do Tamanho capsulação 5moU-mRNA 0,14±0,02 92±6 75±6 Não purificada 0,13±0,04 87±7 75±13 Circular 0,12±0,03 95±7 77±14 Propriedades fisicoquímicas de LNP-RNAs (dados apresentados como média±SD, n=3). Discussão
[00203] Neste trabalho foi demonstrado que circRNA exógeno eva-
de sensores de RNA e que a expressão é estendida em relação ao mRNA linear após injeção no tecido adiposo de camundongo.
Embora estudos anteriores que examinam a imunogenicidade do circRNA te- nham proposto que o circRNA exógeno provoca uma forte resposta imune celular inata mediada por RIG-I, devido a uma ausência de fato- res de junção do hospedeiro associados (Chen et al. 2017), foi desco- berto neste estudo que o circRNA faz não ativar vários sensores de RNA celulares conhecidos, incluindo TLRs e RIG-I (Chen, Y.
G. et al.
Sensing Self and Foreign Circular RNAs by Intron Identity.
Mol.
Cell 67, 228–238.e5 (2017)). É provável que esses resultados discordantes sejam o resultado de impurezas nas preparações de circRNA.
Estudos anteriores usaram circRNA purificado por RNase R (Chen, Y.
G. et al.
Sensing Self and Foreign Circular RNAs by Íntron Identity.
Mol.
Cell 67, 228–238.e5 (2017)). Este estudo descobriu que o tratamento com RNase R não é suficiente para obter o circRNA puro e enriquece vá- rias espécies de RNA resistentes, que incluem circRNA e RNAs linea- res com extremidades 3’ estruturadas.
Além disso, mesmo pequenas quantidades de RNA linear contaminante, alguns dos quais podem abrigar trifosfatos e podem estar presentes após a purificação por HPLC, são suficientes para provocar respostas imunes celulares ro- bustas (FIG. 9C). A purificação por HPLC de circRNA apresenta difi- culdades únicas, pois circRNA cortado e circRNA intacto são iguais em peso molecular e seus respectivos picos se sobrepõem parcialmente.
Os produtos de degradação do RNA precursor trifosforilado também se separam no pico do circRNA e, portanto, é necessária uma prepa- ração cuidadosa do circRNA.
O tratamento com fosfatase, minimizan- do a exposição ao calor na presença de cátions divalentes, e a sele- ção rigorosa de pico de HPLC podem reduzir esses riscos.
Usando o protocolo de purificação descrito aqui, verificou-se que circRNA não elicia respostas imunes inatas substanciais de células competentes de
TLR e RIG-I, em contraste com outros componentes da reação de jun- ção, ou do tecido adiposo de camundongo, apesar da ausência de fa- tores de junção do hospedeiro associados ao circRNA.
Usando o pro- tocolo de purificação descrito aqui, verificou-se que circRNA não elicia respostas imunes inatas substanciais de células competentes de TLR e RIG-I, em contraste com outros componentes da reação de junção ou do tecido adiposo de camundongo.
Além disso, a produção de pro- teínas a partir de circRNA purificado é significativamente mais estável do que a de circRNA não purificado e a transfecção de circRNA purifi- cado resulta na viabilidade celular muito melhorada (FIG. 7F, FIG. 8D), ambos os quais são indicadores de uma resposta antiviral resultante de contaminantes não circulares (Loo, Y.
M. & Gale, M., Jr.
Immune signaling by RIG-I-like receptors. - PubMed - NCBI.
Available at: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21616437. (Accessed: 7th May 2018)). Modificações de nucleosídeos, especialmente modificações de uridina, foram relatadas para reduzir a imunogenicidade do mRNA li- near, evitando a detecção por sensores de RNA, o que pode ser im- portante para a função do RNA em alguns tipos de tecido (Karikó, K., Buckstein, M., Ni, H. & Weissman, D.
Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors: the impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA.
Immunity 23, 165–175 (2005); Durbin, A.
F., Wang, C., Marcotrigiano, J. & Gehrke, L.
RNAs Containing Modified Nucleotides Fail To Trigger RIG-I Conformational Changes for Innate Immune Signaling.
MBio 7, (2016)). Com os construtos descritos aqui, foi observada estabilidade de expressão de proteína realçada de m1ψ- mRNA em comparação com mRNA não modificado in vitro e no tecido adiposo (Figuras 9E, 11B). Isso pode ser um resultado secundário de evasão imune ou um efeito primário não relacionado de modificação.
A modificação das moléculas precursoras de circRNA com m1ψ interferiu com a junção nos construtos de PIE e translação nos RNAs circulari-
zados enzimaticamente, sugerindo que m1ψ altera significativamente o dobramento de estruturas de ribozima e de IRES.
[00204] Foi demonstrado que a modificação do RNA com m6A promove a translação independente do cap de RNAs lineares e circu- lares endógenos em células vivas e RNAs lineares exógenos em lisa- dos celulares (Meyer et al. 2015; Yang et al. 2017). Descobrimos que a substituição parcial de adenosina por m6A não foi suficiente para con- duzir a translação de circRNA exógeno intacto ou linearizado em célu- las vivas, consistente com relatórios anteriores que indicam o envolvi- mento de proteínas de ligação de RNA nuclear no auxílio à translação dependente de m6A (Figuras 9F, G) ( Lin et al. 2016).
[00205] Ao contrário do mRNA linear, circRNA depende fortemente de estruturas de RNA dobradas, incluindo o íntron do grupo I permuta- do e IRES, para junção e translação. A modificação das moléculas precursoras de circRNA com m1ψ e m6A interferiu com a junção nos construtos de PIE e translação nos RNAs circularizados enzimatica- mente, sugerindo que as modificações alteram significativamente o dobramento destes elementos estruturais (Figuras 9B, D, F, G).
[00206] Foi demonstrado que a incorporação de ψ melhora as inte- rações de empilhamento de base, o que pode levar a alterações estru- turais; no entanto, é possível que outras modificações de nucleosídeos possam ser mais compatíveis com estruturas de ribozima e IRES e permitir o estudo da translação de circRNA modificada durante a esta- bilidade (Davis, DR Stabilization of RNA stacking by pseudouridine. Nucleic Acids Res. 23, 5020 (1995)). Embora seja conhecido que o mRNA linear modificado é capaz de evitar a detecção por TLRs, foi surpreendente descobrir que circRNA não modificado exibe a mesma propriedade. Recentemente, os ligantes de TLR7 e TLR8 foram relata- dos como produtos de degradação de RNA, incluindo trechos curtos de ssRNA e nucleosídeos (Tanji, H. et al. Toll-like receptor 8 senses degradation products of single-stranded RNA.
Nat.
Struct.
Mol.
Biol. 22, 109–115 (2015); Zhang, Z. et al.
Structural Analysis Reveals that Toll-like Receptor 7 Is a Dual Receptor for Guanosine and Single- Stranded RNA.
Immunity 45, 737–748 (2016)). Estes produtos de de- gradação são presumivelmente produzidos por nucleases no endos- soma logo após o RNA ser internalizado (Roers, A., Hiller, B. & Hornung, V.
Recognition of Endogenous Nucleic Acids by the Innate Immune System.
Immunity 44, 739–754 (2016)). A estrutura contígua do circRNA pode conferir-lhe resistência às nucleases endossômicas, resultando na evasão destes detectores.
Nesse caso, seria esperado que as nucleases endossômicas fossem compostas principalmente de exonucleases, uma vez que seria esperado que a presença de endo- nucleases levasse à degradação do circRNA.
Consistente com esta postulação, a adição de um dos dois ligantes TLR8 cooperativos, uri- dina, aos meios das células repórter TLR8 foi capaz de anular parcial- mente as propriedades imunoevasivas do circRNA, sugerindo que uma falta de produtos de degradação e, portanto, a resistência à nuclease pode de fato ser responsável pela evasão de TLR8 por circRNA.
No entanto, nenhum produto de degradação ainda não foi definido como um ligante para TLR3, que circRNA também parece evadir no contexto de células 293 de superexpressão de TLR3, apesar de conter os mesmos motivos de dsRNA que o circRNA linearizado de ativação de TLR3. Pode ser possível que os produtos de degradação de RNA se liguem a TLR3 na interface de dimerização de uma maneira similar a TLR8 (Roers, A., Hiller, B. & Hornung, V.
Recognition of Endogenous Nucleic Acids by the Innate Immune System.
Immunity 44, 739–754 (2016)). Diferenças na ativação de TLR3 por circRNA linearizado tam- bém foram observadas, com circRNA linearizado transcrito in vitro eli- ciando uma resposta mediada por TLR3, enquanto circRNA lineariza- do produzido por circRNA purificado degradante não o fez (FIGS. 10B e F). É possível que a degradação do circRNA por calor ou RNase H interrompa as estruturas de dsRNA necessárias para a ativação robus- ta de TLR3.
[00207] A injeção intra-adiposa de circRNA complexado com rea- gente de transfecção ou dentro de LNPs produziu expressão de hEpo que era mais estável do que a de m1ψ-mRNA ou 5moU-mRNA (FIG. 11B e FIG. 12F). No entanto, embora a produção de hEpo de circRNA tenha sido observada quase duas vezes mais do que a da transfecção equimolar de m1ψ-mRNA ou 5moU-mRNA em células 293 em 24 ho- ras, a expressão de hEpo de circRNA in vivo foi relativamente diminuí- da. Vários fatores podem ter levado a esse resultado. O IRES de CVB3 foi originalmente selecionado para uso em circRNA com base em sua capacidade de conduzir a translação em linhagens celulares humanas (Wesselhoeft, R. A., Kowalski, P. S. & Anderson, D. G. Engi- neering circular RNA for potent and stable translation in eukaryotic cells. Nat. Commun. 9, 2629 (2018)). Tecido adiposo ou hepático de camundongo pode, portanto, não ser o tipo de célula ideal para a translação mediada por IRES de CVB3. As sequências de IRES tam- bém devem competir por fatores de iniciação da translação com trans- crições endógenas portadoras de caps m7G. Consequentemente, cir- cRNA usando sequências de IRES virais para iniciar a translação po- deria ser mais eficaz em células com densidade de fator de iniciação mais alta em relação à densidade de transcrição. É necessária uma caracterização abrangente da capacidade de outras sequências de IRES para conduzir a translação de circRNA em diversos tecidos.
[00208] A estabilidade da expressão de proteína de circRNA distri- buído por via intravenosa por LNP ao fígado não foi realçada em com- paração com a de 5moU-mRNA, embora a magnitude relativa da ex- pressão de circRNA em 6 horas fosse comparável à obtida do tecido adiposo (FIG. 12E e FIG. 16E) . Este resultado destaca a estabilidade específica do tecido que pode ser dependente de vários fatores, inclu- indo taxa de renovação do RNA geral ou atividade da endonuclease, inibição ou degradação da translação específica da sequência e a pre- sença ou ausência de proteínas estabilizadoras do RNA. Avaliação e alteração de sítios de ligação de miRNA dentro de circRNA ou deple- ção de motivos de degradação específicos de sequência podem au- mentar ainda mais a estabilidade e expressão de circRNA em tecidos selecionados.
[00209] Um aumento nas citocinas séricas foi detectado em ca- mundongos injetados com reações de junção não purificadas, mas tal resposta em camundongos injetados com mRNA não modificado, m1ψ-mRNA/5moU-mRNA ou circRNA não foi detectada. Consistente com os resultados in vitro, uma rápida diminuição na expressão de hEpo após a injeção de mRNA não modificado e reações de junção não purificado foi observada, enquanto hEpo sérica após a injeção de m1ψ-mRNA/5moU-mRNA e circRNA permaneceu relativamente está- vel, indicando que m1ψ-mRNA/5moU-mRNA e circRNA não provoca- ram uma resposta imune substancial que levaria à degradação do RNA in vivo. A formulação de circRNA em LNPs não alterou as intera- ções do sensor imune, e a análise de citocinas séricas e níveis de transcrição pró-inflamatória local após injeções de LNP-RNA não reve- lou uma resposta imunológica contra circRNA distribuído por LNP.
[00210] Acredita-se que a estabilidade de expressão realçada de circRNA em alguns tecidos e a capacidade do circRNA de evitar sen- sores imunes sem a necessidade de modificações de nucleosídeos demonstram o potencial do circRNA como um vetor para a expressão de proteínas terapêuticas. Métodos: Projeto, Síntese e Purificação de RNA
[00211] Os precursores de mRNA ou circRNA lineares foram sinte-
tizados por transcrição in-vitro de escoamento a partir de um padrão de DNA de plasmídeo linearizado usando um Kit T7 High Yield RNA Synthesis (New England Biolabs (NEB)) com a substituição completa de uridina por N1-metilpseudouridina (Trilink Biotechnologies) para RNA linear ou circular modificado.
Após a transcrição in vitro, as rea- ções foram tratadas com DNase I (NEB) por 15 minutos.
Após o trata- mento com DNase, o RNA foi purificado em coluna usando um kit MEGAclear Transcription Clean-up (Ambion). O RNA foi, então, aque- cido a 70 °C por 3 minutos e imediatamente colocado em gelo por 2 minutos, após o que o RNA linear foi capeado usando mRNA cap-2'-O- metiltransferase (NEB) e enzima de capeamento de Vacínia (NEB) de acordo com as instruções do fabricante.
Caudas de poliadenosina fo- ram adicionadas às transcrições lineares capeadas usando PolyA Po- limerase de E. coli (NEB) de acordo com as instruções do fabricante, e o mRNA totalmente processado foi purificado em coluna.
Para circR- NA, GTP foi adicionado a uma concentração final de 2 mM juntamente com um tampão incluindo magnésio (Tris-HCl 50 mM, MgCl2 10 mM, DTT 1 mM, pH 7,5; NEB) e, em seguida, as reações foram aquecidas a 55 °C por 8 minutos.
O RNA foi, então, purificado em coluna.
Em al- guns casos, circRNA foi digerido com RNase R: 20 µg de RNA foram diluídos em água (volume final de 86uL) e, então, aquecidos a 70 °C por 3 minutos e resfriados em gelo por 2 minutos. 20U de RNase R e 10uL de tampão RNase R 10x (Applied Biological Materials) foram adi- cionados, e a reação foi incubada a 37 °C por 15 minutos; um adicio- nal de RNase R 10U foi adicionado no meio da reação.
O RNA digeri- do com RNase R foi purificado em coluna.
Em alguns casos, o RNA foi tratado com uma fosfatase (CIP, NEB): 20ug de RNA foram diluídos, aquecidos e resfriados conforme descrito acima e, em seguida, o tam- pão Cutsmart (NEB) foi adicionado a uma concentração final de 1X juntamente com 20U de CIP.
A reação foi incubada a 37 °C durante 15 minutos. O RNA tratado com a fosfatase foi purificado em coluna. O RNA foi diluído em formamida a 50%, desnaturado a 70 °C durante 3 minutos e, em seguida, resfriado à temperatura ambiente. O RNA foi, então, separado em géis de agarose EX 2% E-gel pré-fundido (Invitro- gen) no E-gel iBase (Invitrogen) usando o programa E-gel EX 1-2%; ssRNA Ladder (NEB) foi usado como um padrão. As bandas foram visualizadas usando transiluminação de luz azul e quantificadas usan- do ImageJ. Para cromatografia líquida de alto desempenho, 30 µg de RNA foram aquecidos a 65 °C por 3 minutos e, em seguida, colocados em gelo por 2 minutos. O RNA foi passado por uma coluna de exclu- são por tamanho de 4,6 x 300 mm com tamanho de partícula de 5 µm e tamanho de poro de 2000Å (Sepax Technologies; número de parte: 215980P-4630) em um Agilent 1100 Series HPLC (Agilent). O RNA foi executado em tampão TE sem RNase (Tris 10mM, EDTA 1mM, pH: 6) em uma taxa de fluxo de 0,3mL/minuto. O RNA foi detectado por ab- sorvência de UV em 260nm, porém, foi coletado sem detecção UV. As frações de RNA resultantes foram precipitadas com acetato de amônio 5M, ressuspensas em água e, em seguida, em alguns casos submeti- das a tratamento enzimático adicional, conforme descrito acima. A Va- galume luciferase modificada por 5moU e o mRNA de hEpo foram ob- tidos da Trilink Biotechnologies. Ligação por Splint
[00212] Os precursores lineares para ligação mediada por splint fo- ram projetados para ter todas as mesmas características de sequência que o circRNA circularizado de PIE, exceto para a adição de sequên- cias adaptadoras curtas nas extremidades 5’ e 3' do RNA precursor. Estas sequências adaptadoras compartilhavam homologia com os splints usados para circularização (Splint otimizado: 5'- GTTTGTGGTTCGTGCGTCTCCGTGCTGTTCTGTTGGTGTGGG-3' (SEQ ID NO: 33).
[00213] O RNA precursor de ligação por splint foi sintetizado como descrito anteriormente, exceto que um excesso de RNA de GMP de 10 vezes foi adicionado para reações de transcrição in vitro. 25ug de RNA precursor purificado foi aquecido a 70 °C por 5 minutos na presença de splint de DNA a uma concentração de 5uM em uma reação de 90uL. A reação foi deixada resfriar até a temperatura ambiente e, em seguida, Tampão de T4 RNA Ligase I (NEB) foi adicionado a uma concentração final de 1X. ATP foi adicionado a uma concentração final de 1 mM. 50U de T4 RNA Ligase I (NEB) foram adicionados. As rea- ções foram incubadas a 37 °C por 30 minutos e, em seguida, purifica- das por coluna. Corte de RNase H
[00214] As reações de junção enriquecidas para circRNA com RNase R e, em seguida, purificadas por coluna ou purificadas por HPLC, foram aquecidas a 70 °C por 5 minutos na presença de uma sonda de DNA (5'-TTGAACCCAGGAATCTCAGG-3' (SEQ ID NO: 34)) em excesso molar de cinco vezes, e então aneladas em temperatura ambiente. As reações foram tratadas com RNase H (New England Bio- labs) no tampão de reação fornecido durante 15 minutos a 37 °C. O RNA foi purificado em coluna após digestão. Cultura de Tecidos, Transfecções, e Viabilidade Celular
[00215] Células 293 e A549, células RAW264.7 (ATCC) e TLR3 de camundongo HEK-Blue, TLR7 de camundongo, TLR8 humana, células Null1 e Null2 (Invivogen) foram cultivadas a 37 °C e 5% de CO2 em Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (4500 mg/L de glicose) su- plementado com 10% de soro fetal bovino inativado por calor (hiFBS, Gibco) e penicilina/estreptomicina. As células HEK293 e HeLa deram resultado negativo para micoplasma. As células foram passadas a ca- da 2-3 dias. Para as células 293 e A549, 40 ng de RNA foram transfec- tados de forma reversa em 10.000 células/100uL por cavidade de uma placa de 96 cavidades usando Lipofectamine MessengerMax (Invitro- gen) de acordo com as instruções do fabricante. Para células HEK- Blue, 100 ng de RNA foram transfectados de forma reversa em 40.000 células/100uL por cavidade de uma placa de 96 cavidades usando Li- pofectamine MessengerMax. Para células A549 transfectadas antes da colheita de RNA e qPCR, 200 ng de RNA foram transfectados de forma reversa em 100.000 células por cavidade de uma placa de 24 cavidades usando Lipofectamine MessengerMax. Para experiências em que a expressão da proteína foi avaliada em vários pontos de tem- po, os meios foram totalmente removidos e substituídos em cada pon- to de tempo. Para experiências em que a atividade de SEAP ou citoci- nas foram analisadas, os meios não foram substituídos entre a trans- fecção e a avaliação. Para todas as experiências de transfecção, o RNA foi aquecido a 70 °C durante 3 minutos e imediatamente coloca- do em gelo durante 2 minutos antes da complexação com o reagente de transfecção. A viabilidade celular 36-72 horas após a transfecção foi avaliada usando um kit MultiTox (Promega). Para detectar a secre- ção de SEAP por repórter de TLR e células nulas, os meios foram co- lhidos 36-48 horas após a transfecção e combinados com reagente HEK-Blue Detection (Invivogen) para uma concentração final de 1X. Os meios e o reagente de detecção foram incubados durante a noite a 37 °C e, em seguida, a absorvência em 640 nm foi medida em um Lei- tor de Microplaca Infinite 200Pro (Tecan). R848, polyI:C e 3p-hpRNA foram obtidos de Invivogen. Análise de Expressão de Proteína
[00216] Para os ensaios de luminescência, os meios foram colhidos 24 horas após a transfecção. Para detectar a luminescência da Gaus- sia luciferase, 20uL de meio de cultura de tecidos foram transferidos para uma placa de parede branca de fundo plano (Corning). 25uL de reagente BioLux Gaussia Luciferase incluindo estabilizador (New En-
gland Biolabs) foram adicionados a cada amostra e a luminescência foi medida em um Leitor de Microplaca Infinite 200Pro (Tecan) após 45 segundos. A eritropoetina humana foi detectada por ELISA em sanduí- che de fase sólida (R&D Systems) essencialmente de acordo com as instruções do fabricante. As citocinas nas Figuras 1, 3 e 5 foram detec- tadas por imunoensaio Fireplex (Abcam). As citocinas nas Figuras 2 e 6 foram detectadas por imunoensaio individual ou multiplex (Eve Technologies). Transcrição Reversa e qPCR
[00217] As células foram lavadas e o RNA foi colhido e purificado 24 horas após a transfecção usando um kit RNeasy Mini Plus (Qiagen) ou Kit RNeasy Lipid (Qiagen) para RNA extraído de tecido adiposo de camundongo de acordo com as instruções do fabricante. A síntese de cDNA de primeira fita a partir do RNA total foi realizada com o Kit de Transcrição Reversa de cDNA de Alta Capacidade usando hexâmeros randomizados (Thermo Fisher Scientific). Os iniciadores TaqMan es- pecíficos do gene foram adquiridos como Assay-on-Demand (Thermo Fisher Scientific); iniciadores humanos: GAPDH (Hs99999905_m1), DDX58 (Hs01061436_m1), IFN-β1 (Hs01077958_s1); iniciadores de camundongo: Gapdh (Mm99999915_g1), Ddx58 (Mm01216853_m1), Il-6 (Mm00446190_m1), Tnf (Mm00443258_m1). A reação qPCR foi realizada usando o instrumento LightCycler 480 Probe Master Mix (Roche) e o instrumento LightCycler 480 (Roche). Para cada amostra, os valores do ciclo limite (Ct) foram processados de acordo com o mé- todo Ct comparativo. Os níveis de expressão gênica foram normaliza- dos para a expressão do gene de manutenção GAPDH. Experimentos Animais
[00218] Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com as diretrizes do Comitê de Uso e Cuidado de Animais do MIT. Camundongos fêmeas C57B1/6 de 30-35g designados randomi-
zadamente para grupos de tratamento ou controle foram injetados na gordura visceral através da almofada de gordura mamária inferior direi- ta e peritônio com 350ng de RNA complexado com MessengerMax ou 1,5 picomoles de LNP-RNA em um volume total de 50μL, ou intrave- nosamente por injeção na veia da cauda com 0,1 mg/kg de LNP-RNA. Amostras de sangue foram coletadas por sangramento da cauda ou punção cardíaca em tubos BD Microtainer nos pontos de tempo indi- cados. Para coletar o soro, o sangue foi permitido coagular por 15-30 min e foi subsequentemente centrifugado em 2.000xg por 5 min em temperatura ambiente. A eritropoetina humana em 2uL de soro foi de- tectada conforme descrito anteriormente. Para coletar o tecido adipo- so, os camundongos foram sacrificados e todo o tecido adiposo visce- ral inferior foi removido e congelado em nitrogênio líquido para subse- quente isolamento do RNA. Formulação de Nanopartículas Lipídicas
[00219] Os LNPs foram preparados pela mistura de etanol e fase aquosa em uma relação volumétrica de 1:3 em um dispositivo microflu- ídico, usando bombas de seringa conforme descrito anteriormente. Resumidamente, a fase de etanol foi preparada solubilizando uma mis- tura de lipidoide ionizável cKK-E12, 1,2-dioleoil-sn-glicero-3- fosfoetanolamina (DOPE, Avanti), colesterol (Sigma) e 1,2-dimiristoil- sn -glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metóxi-(polietilenoglicol)-2000] (sal de amônio) (C14-PEG 2000, Avanti) em uma relação molar de 35:16:46,5:2,5. A fase aquosa foi preparada em tampão de citrato 10 mM (pH 3) com circRNA ou mRNA linear. Os LNPs foram dialisados contra PBS em um Slide-A-Lyzer™ G2 Dialysis Cassettes, 20.000 MWCO (Thermo Fisher) por 2h em temperatura ambiente. A concen- tração de mRNA encapsulado em nanopartículas de LNPs foi analisa- da usando o ensaio Quant-iT RiboGreen (Thermo Fisher) de acordo com o protocolo do fabricante. A eficiência da encapsulação do mRNA em LNPs foi calculada comparando as medições na ausência e pre- sença de 1% (v/v) de Triton X-100. O tamanho das nanopartículas, a polidispersidade (PDI) e o potencial ζ foram analisados por dispersão de luz dinâmica (DLS) usando Zetasizer Nano ZS (Malvern Instru- ments, Worcestershire, UK). Os diâmetros hidrodinâmicos de LNP são relatados no modo de ponderação de volume e são uma média de três medições independentes. CRYO-TEM
[00220] Para Microscopia Eletrônica de Transmissão Criogênica (Cryo-TEM), as amostras foram preparadas em um Gatan Cryo Plunge III (Cp3). Resumidamente, 3 uL da amostra foram gotejados em uma grade de cobre Lacey revestida com um filme de carbono contínuo e congelados em etano líquido. Posteriormente, a grade congelada foi montada em um crio-suporte Gatan 626 de inclinação única. A imagem foi realizada usando o microscópio JEOL 2100 FEG operando a 200 kV com uma ampliação de 10.000-60.000. Todas as imagens foram registradas em condições de baixa dosagem com uma câmera Gatan 2kx2k UltraScan CCD. Análise de Dados e Estatísticas
[00221] Para os dados de TLR nas Figuras 10 e 12, a absorvência medida em células repórter TLR foi normalizada para a absorvência medida em células repórter nulas contendo apenas o plasmídeo com SEAP sob o controle do promotor mínimo IFN-β fundido a cinco sítios de ligação NF-κB e AP-1 para mTLR3 e hTLR8, ou células repórter nulas contendo apenas o plasmídeo com SEAP sob o controle do promotor mínimo IL-12p40 fundido a cinco sítios de ligação NF-κB e AP-1 para mTLR7 (Invivogen). Para todos os dados de GLuc e hEpo de vários dias, a expressão é apresentada em relação ao primeiro dia de expressão para cada condição. A análise estatística dos resultados foi realizada por um teste t de Welch não pareado bicaudal, assumindo variâncias desiguais.
As diferenças foram consideradas significativas quando p < 0,05. Para todos os estudos, os dados apresentados são representativos de um experimento independente.
Métodos STAR: REAGENTE ou RECURSO FONTE IDENTIFICADOR Substâncias Químicas, Peptídeos, e Proteínas Recombinantes RNase R Applied Biological Cat#E049 Materials 3p-hpRNA Invivogen Cat#tlrl-hprna polyI:C Invivogen Cat#tlrl-pic RNase H New England Cat#M0297S Biolabs T4 RNA Ligase 1 New England Cat#M0204S Biolabs Reagente de Transfecção Lipo- ThermoFisher Cat#LMRNA003 fectamine™ MessengerMAX™ Scientific N1-Metilpseudouridina-5'- Trilink Biotechno- Cat#N-1081 Trifosfato logies mRNA de EPO CleanCap™ Trilink Biotechno- Cat#L-7209 (5moU) logies mRNA de FLuc CleanCap™ Trilink Biotechno- Cat#L-7202 (5moU) logies Fosfatase Alcalina, Intestinal de New England Cat#M0290S Bezerro (CIP) Biolabs Sistema de Tamponamento de New England Cat#M2080S Vacínia Biolabs 2´-O-Metiltransferase de Tampão New England Cat#M0366S de mRNA Biolabs Poly(A) Polimerase de E. coli New England Cat#M0276S Biolabs Uridina Millipore Sigma Cat#U6381 Citidina Millipore Sigma Cat#C4654 1,2-dioleoil-sn-glicero-3- Avanti Polar Li- Cat#850725P fosfoetanolamina pids
REAGENTE ou RECURSO FONTE IDENTIFICADOR 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3- Avanti Polar Li- Cat#700100P fosfoetanolamina-N-[metóxi- pids (polietilenoglicol)-2000] N6-Metiladenosina-5'-Trifosfato Trilink Biotechno- Cat#N-1013 logies Ensaios Comerciais Críticos Géis de Agarose E-Gel™ EX, 2% ThermoFisher Cat#G401002 Scientific Kit de Síntese de RNA de Alto New England Cat#E2040S Rendimento HiScribe™ T7 Biolabs Múltiplos Ensaios de Citotoxici- Promega Cat#G9200 dade MultiTox-Flúor Mini Kit RNeasy Qiagen Cat#74104 Kit ELISA IVD Quantikine de Eri- R&D Systems Cat#DEP00 tropoetina Humana Kit de Ensaio Gaussia Luciferase New England Cat#E3300 BioLux® Biolabs Ensaio de Expressão de Gene ThermoFisher Cat#Hs00982282 hCCL5 TaqMan® Scientific m1 Ensaio de Expressão de Gene ThermoFisher Cat#Hs01077958 hIFNB1 TaqMan® Scientific s1 Ensaio de Expressão de Gene ThermoFisher Cat#Hs99999905 hGAPDH TaqMan® Scientific m1 Ensaio de Expressão de Gene ThermoFisher Cat#Hs01061436 hDDX58 TaqMan® Scientific m1 Ensaio de Expressão de Gene ThermoFisher Cat#Hs00714131 hIL6 TaqMan® Scientific m1 Ensaio de Expressão de Gene ThermoFisher Cat#Mm0130242 mCcl5 TaqMan® Scientific 7m1 Ensaio de Expressão de Gene ThermoFisher Cat#Mm0043955 mIfnB1 TaqMan® Scientific 2s1 Ensaio de Expressão de Gene ThermoFisher Cat#Mm9999991 mGapdh TaqMan® Scientific 5g1
REAGENTE ou RECURSO FONTE IDENTIFICADOR Ensaio de Expressão de Gene ThermoFisher Cat#Mm0121685 mDdx58 TaqMan® Scientific 3m1 Ensaio de Expressão de Gene ThermoFisher Cat#Mm0044619 mIl6 TaqMan® Scientific 0m1 Ensaio de Expressão de Gene ThermoFisher Cat#Mm0044325 Tnf TaqMan® Scientific 8_m1 Modelos Experimentais: Li- nhagens Célulares Células Null1 HEK-Blue™ Invivogen Cat#hkb-null1 Células Null2 HEK-Blue™ Invivogen Cat#hkb-null2 mTLR3 HEK-Blue™ Invivogen Cat#hkb-mtlr3 mTLR7HEK-Blue™ Invivogen Cat#hkb-mtlr7 hTLR8 HEK-Blue™ Invivogen Cat#hkb-htlr8 293 [HEK-293] ATCC Cat#CRL-1573 A549 ATCC Cat#CCL-185 RAW264,7 ATCC Cat#TIB-71 HeLa ATCC Cat#CCL-2 Modelos Experimentais: Orga- nismos/Cepas Camundongos C57BL/6 Charles River Cat#C57BL/6NCr l Oligonucleotídeos Sonda RNase H: TTGAACCCA- Descrito aqui N/A GGAATCTCAGG (SEQ ID NO. 34) Aparelho de Ligação: GTTTG- Descrito aqui N/A TGGTTCGTGCGTCTCCGTG-
CTGTTCTGTTGGTGTGGG (SEQ ID NO. 33) DNA Recombinante Plasmídeo: GLuc APIE CVB3 Wesselhoeft et N/A pAC al., 2017
REAGENTE ou RECURSO FONTE IDENTIFICADOR Plasmídeo: hEpo APIE CVB3 Wesselhoeft et N/A pAC al., 2017 Plasmídeo: EGFP APIE EMCV Wesselhoeft et N/A al., 2017 Plasmídeo: GLuc APIE ΔIRES Descrito aqui N/A Plasmídeo: GLuc APIE CVB3 Wesselhoeft et N/A pAC dS al., 2017 Plasmídeo: GLuc APIE CVB3 Wesselhoeft et N/A pAC dI al., 2017 Plasmídeo: splintGLuc CVB3 Descrito aqui N/A Plasmídeo: splinthEpo CVB3 Descrito aqui N/A Plasmídeo: GLuc L Descrito aqui N/A Plasmídeo: hEpo L Descrito aqui N/A Tabela 1 SEQ ID GLuc GGGAGACCCTCGAGCCTAACGACTATCCCT NO. 1 T4PIE TTGGGGAGTAGGGTCAAGTGACTCGAAAC
EMCV GATAGACAACTTGCTTTAACAAGTTGGAGAT (Total) ATAGTCTGCTCTGCATGGTGACATGCAGCT
GGATATAATTCCGGGGTAAGATTAACGACC TTATCTGAACATAATGCTACCGTTTAATATT GCGTCACCCCCCTCTCCCTCCCCCCCTAAC GTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGC CGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCA CCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGG CCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGA GCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCA AAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGA AGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAA GACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCA GGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGG TGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAA GATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCA GTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGA AAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATT CAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGG TACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGC CTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTC GAGGTTAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAAC CACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACA CGATGATAATATGGCCACAACCATGGGAGT CAAAGTTCTGTTTGCCCTGATCTGCATCGC TGTGGCCGAGGCCAAGCCCACCGAGAACA ACGAAGACTTCAACATCGTGGCCGTGGCCA GCAACTTCGCGACCACGGATCTCGATGCTG ACCGCGGGAAGTTGCCCGGCAAGAAGCTG CCGCTGGAGGTGCTCAAAGAGATGGAAGC CAATGCCCGGAAAGCTGGCTGCACCAGGG GCTGTCTGATCTGCCTGTCCCACATCAAGT GCACGCCCAAGATGAAGAAGTTCATCCCAG GACGCTGCCACACCTACGAAGGCGACAAA GAGTCCGCACAGGGCGGCATAGGCGAGGC GATCGTCGACATTCCTGAGATTCCTGGGTT CAAGGACTTGGAGCCCATGGAGCAGTTCAT CGCACAGGTCGATCTGTGTGTGGACTGCAC AACTGGCTGCCTCAAAGGGCTTGCCAACGT GCAGTGTTCTGACCTGCTCAAGAAGTGGCT GCCGCAACGCTGTGCGACCTTTGCCAGCA AGATCCAGGGCCAGGTGGACAAGATCAAG GGGGCCGGTGGTGACTAACAGAGATGTTTT CTTGGGTTAATTGAGGCCTGAGTATAAGGT GACTTATACTTGTAATCTATCTAAACGGGGA ACCTCTCTAGTAGACAATCCCGTGCTAAATT
GTAGGACTAATTCCATTTATCAGATTTCTAG SEQ ID Braços de GGGAGACCCTCGAGGTTCTACATAAATGCC NO. 2 homologia TAACGACTATCCCTTTGGGGAGTAGGGTCA fraca 3’ Ín- AGTGACTCGAAACGATAGACAACTTGCTTT tron AACAAGTTGGAGATATAGTCTGCTCTGCAT
GGTGACATGCAGCTGGATATAATTCCGGGG
TAAGATTAACGACCTTATCTGAACATAATG SEQ ID Braços de TAATTGAGGCCTGAGTATAAGGTGACTTATA
NO. 3 homologia CTTGTAATCTATCTAAACGGGGAACCTCTCT fraca 5' Ín- AGTAGACAATCCCGTGCTAAATTGTAGGAC tron TAATTCCATTTATCAGATTTCTAG SEQ ID Braços de GGGAGACCCTCGAATGGAATTGGTTCTACA NO. 4 homologia TAAATGCCTAACGACTATCCCTTTGGGGAG forte 3' Ín- TAGGGTCAAGTGACTCGAAACGATAGACAA tron CTTGCTTTAACAAGTTGGAGATATAGTCTGC
TCTGCATGGTGACATGCAGCTGGATATAAT TCCGGGGTAAGATTAACGACCTTATCTGAA
CATAATG SEQ ID Braços de TAATTGAGGCCTGAGTATAAGGTGACTTATA NO. 5 homologia CTTGTAATCTATCTAAACGGGGAACCTCTCT forte 5' Ín- AGTAGACAATCCCGTGCTAAATTGTAGGAC tron TAATTCCATTTATCAGATTTCTAG SEQ ID Espaçador ACTGCAAGTTGTCTATCGTTACGGTAAGTC NO. 6 disruptivo ACCTTATTTCA T4 SEQ ID Espaçador GGTAGTGGTGCTACTAACTTCAGCCTGCTG NO. 7 1 permis- AAGCA sivo T41 5’ SEQ ID Espaçador GGTAGTAAACTACTAACTACAACCTGCTGA NO. 8 2 permis- AGCA sivo T42 5’ SEQ ID 2400nt GGGAGACCCTCGAATGGAATTGGTTCTACA NO. 9 (Total) TAAATGCCTAACGACTATCCCTTTGGGGAG
TAGGGTCAAGTGACTCGAAACGATAGACAA CTTGCTTTAACAAGTTGGAGATATAGTCTGC TCTGCATGGTGACATGCAGCTGGATATAAT TCCGGGGTAAGATTAACGACCTTATCTGAA CATAATGCTACCGTTTAATATTGCGTCAGGT AGTAAACTACTAACTACAACCTGCTGAAGC ACCCCCCTCTCCCTCCCCCCCTAACGTTAC TGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGT GTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCAT ATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCG GAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCAT TCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGG AATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGA AGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACA AACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCA GCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCC TCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATA CACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGC CACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGA GTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAAC AAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACC CCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCG GTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAG GTTAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCAC GGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGA TGATAATATGGCCACAACCATGGAAGACGC CAAAAACATAAAGAAAGGCCCGGCGCCATT CTATCCGCTGGAAGATGGAACCGCTGGAG AGCAACTGCATAAGGCTATGAAGAGATACG CCCTGGTTCCTGGAACAATTGCTTTTACAG ATGCACATATCGAGGTGGACATCACTTACG CTGAGTACTTCGAAATGTCCGTTCGGTTGG CAGAAGCTATGAAACGATATGGGCTGAATA CAAATCACAGAATCGTCGTATGCAGTGAAA ACTCTCTTCAATTCTTTATGCCGGTGTTGGG CGCGTTATTTATCGGAGTTGCAGTTGCGCC CGCGAACGACATTTATAATGAACGTGAATT GCTCAACAGTATGGGCATTTCGCAGCCTAC CGTGGTGTTCGTTTCCAAAAAGGGGTTGCA AAAAATTTTGAACGTGCAAAAAAAGCTCCCA ATCATCCAAAAAATTATTATCATGGATTCTA AAACGGATTACCAGGGATTTCAGTCGATGT ACACGTTCGTCACATCTCATCTACCTCCCG GTTTTAATGAATACGATTTTGTGCCAGAGTC CTTCGATAGGGACAAGACAATTGCACTGAT CATGAACTCCTCTGGATCTACTGGTCTGCC TAAAGGTGTCGCTCTGCCTCATAGAACTGC CTGCGTGAGATTCTCGCATGCCAGAGATCC TATTTTTGGCAATCAAATCATTCCGGATACT GCGATTTTAAGTGTTGTTCCATTCCATCACG GTTTTGGAATGTTTACTACACTCGGATATTT GATATGTGGATTTCGAGTCGTCTTAATGTAT AGATTTGAAGAAGAGCTGTTTCTGAGGAGC CTTCAGGATTACAAGATTCAAAGTGCGCTG CTGGTGCCAACCCTATTCTCCTTCTTCGCC AAAAGCACTCTGATTGACAAATACGATTTAT CTAATTTACACGAAATTGCTTCTGGTGGCG CTCCCCTCTCTAAGGAAGTCGGGGAAGCG GTTGCCAAGAGGTTCCATCTGCCAGGTATC AGGCAAGGATATGGGCTCACTGAGACTACA TCAGCTATTCTGATTACACCCGAGGGGGAT GATAAACCGGGCGCGGTCGGTAAAGTTGTT CCATTTTTTGAAGCGAAGGTTGTGGATCTG GATACCGGGAAAACGCTGGGCGTTAATCAA AGAGGCGAACTGTGTGTGAGAGGTCCTATG ATTATGTCCGGTATGGGAGTCAAAGTTCTG TTTGCCCTGATCTGCATCGCTGTGGCCGAG GCCAAGCCCACCGAGAACAACGAAGACTTC AACATCGTGGCCGTGGCCAGCAACTTCGC GACCACGGATCTCGATGCTGACCGCGGGA AGTTGCCCGGCAAGAAGCTGCCGCTGGAG GTGCTCAAAGAGATGGAAGCCAATGCCCG GAAAGCTGGCTGCACCAGGGGCTGTCTGA TCTGCCTGTCCCACATCAAGTGCACGCCCA AGATGAAGAAGTTCATCCCAGGACGCTGCC ACACCTACGAAGGCGACAAAGAGTCCGCA CAGGGCGGCATAGGCGAGGCGATCGTCGA CATTCCTGAGATTCCTGGGTTCAAGGACTT GGAGCCCATGGAGCAGTTCATCGCACAGG TCGATCTGTGTGTGGACTGCACAACTGGCT GCCTCAAAGGGCTTGCCAACGTGCAGTGTT CTGACCTGCTCAAGAAGTGGCTGCCGCAAC GCTGTGCGACCTTTGCCAGCAAGATCCAGG GCCAGGTGGACAAGATCAAGGGGGCCGGT GGTGACTAACAGAGATGTTTTCTTGGGTTA ATTGAGGCCTGAGTATAAGGTGACTTATAC TTGTAATCTATCTAAACGGGGAACCTCTCTA GTAGACAATCCCGTGCTAAATTGTAGGACT
AATTCCATTTATCAGATTTCTAG SEQ ID 4800nt GGGAGACCCTCGAATGGAATTGGTTCTACA NO. 10 (Total) TAAATGCCTAACGACTATCCCTTTGGGGAG
TAGGGTCAAGTGACTCGAAACGATAGACAA CTTGCTTTAACAAGTTGGAGATATAGTCTGC TCTGCATGGTGACATGCAGCTGGATATAAT TCCGGGGTAAGATTAACGACCTTATCTGAA CATAATGCTACCGTTTAATATTGCGTCAGGT AGTAAACTACTAACTACAACCTGCTGAAGC ACCCCCCTCTCCCTCCCCCCCTAACGTTAC TGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGT GTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCAT ATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCG GAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCAT TCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGG AATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGA AGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACA AACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCA GCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCC TCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATA CACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGC CACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGA GTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAAC AAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACC CCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCG GTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAG GTTAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCAC GGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGA TGATAATATGGCCACAACCATGGAAGACGC CAAAAACATAAAGAAAGGCCCGGCGCCATT CTATCCGCTGGAAGATGGAACCGCTGGAG AGCAACTGCATAAGGCTATGAAGAGATACG CCCTGGTTCCTGGAACAATTGCTTTTACAG ATGCACATATCGAGGTGGACATCACTTACG CTGAGTACTTCGAAATGTCCGTTCGGTTGG CAGAAGCTATGAAACGATATGGGCTGAATA CAAATCACAGAATCGTCGTATGCAGTGAAA ACTCTCTTCAATTCTTTATGCCGGTGTTGGG CGCGTTATTTATCGGAGTTGCAGTTGCGCC CGCGAACGACATTTATAATGAACGTGAATT GCTCAACAGTATGGGCATTTCGCAGCCTAC CGTGGTGTTCGTTTCCAAAAAGGGGTTGCA AAAAATTTTGAACGTGCAAAAAAAGCTCCCA ATCATCCAAAAAATTATTATCATGGATTCTA AAACGGATTACCAGGGATTTCAGTCGATGT ACACGTTCGTCACATCTCATCTACCTCCCG GTTTTAATGAATACGATTTTGTGCCAGAGTC CTTCGATAGGGACAAGACAATTGCACTGAT CATGAACTCCTCTGGATCTACTGGTCTGCC TAAAGGTGTCGCTCTGCCTCATAGAACTGC CTGCGTGAGATTCTCGCATGCCAGAGATCC TATTTTTGGCAATCAAATCATTCCGGATACT GCGATTTTAAGTGTTGTTCCATTCCATCACG GTTTTGGAATGTTTACTACACTCGGATATTT GATATGTGGATTTCGAGTCGTCTTAATGTAT AGATTTGAAGAAGAGCTGTTTCTGAGGAGC CTTCAGGATTACAAGATTCAAAGTGCGCTG CTGGTGCCAACCCTATTCTCCTTCTTCGCC AAAAGCACTCTGATTGACAAATACGATTTAT CTAATTTACACGAAATTGCTTCTGGTGGCG CTCCCCTCTCTAAGGAAGTCGGGGAAGCG GTTGCCAAGAGGTTCCATCTGCCAGGTATC AGGCAAGGATATGGGCTCACTGAGACTACA TCAGCTATTCTGATTACACCCGAGGGGGAT GATAAACCGGGCGCGGTCGGTAAAGTTGTT CCATTTTTTGAAGCGAAGGTTGTGGATCTG GATACCGGGAAAACGCTGGGCGTTAATCAA AGAGGCGAACTGTGTGTGAGAGGTCCTATG ATTATGTCCGGTAGGTCTCATATCACCTTG GCTTTCGCCGTATTCACATGCTGGAACACA TCATGCTAGCTTTAACATCGGGGAGTTACG ATCCGTGAAAAGACGGATATATTGCCCTTG TATAGGACTATATTCCGGAGGGATTAGAATT TATAGTTGGAGAGCTTCATACCCCACTGAG CTTTTCACTGTATGCTAGTAATTATACTTCAT TTGCTCGTTGGGTAGATGCGTTCTTCTCGC ACAAGCCGATGATTTCCGAGTTTCTTTTCAG CGGCCGTAAAGCCTCGACACGTGACGCAC TGTGAACCGCACCCGTATACCTAATAGAGG CAGTTAACTTCATTCAGCCACATAAGGGGT GATAACACCGACTGCCCAAGTACGGAATTA AGAAAATGGATAATGAAGATTATGAGATCAC CGCTACATTAGCAACGCTTGGTGCTTTAATT GGCATGTATGACCAATCTACAACCTGGGGG GAGGGTACCTCTTTGAGATGTACGATGCAG CCTAAAGGGTAACGTTATGCAAGTGGTCAA GAGCCTAGCATGCTTATGCGGTTTATCAAA ATGTATCGCACTTTATGCTAGGTAATGTGTG TTCTCCACGGTATCCATAAGCTTGCCTAAAT ACTGAAGTCTACGAGAAAACTATGGGATAT TTGTGCATATATTACCCATAGTTATCCTGGA GCAGTCCGTTCCCACGTAGAATGTAGCGAA TTGCGTGGCTGGCTTCAAACATAGCACCGA ACAGTAGATCTAGTTGCGCCCCTTCCAAGT TTACAGTTAGGTAAACCTTCACGATAGAAAG TTGGGAACAAGGCCGCATTCAACCTTTACG ATCACTTCCAGAAAGGGATTGTGGGTAGGA GACACCACGCCCTCAGATCACGTCGATCAC TTGTTATAAGGTCAAATGTGAGAAACGCGT CAGAAGGGAGTTGGTGCTTGCTTATTTCTTT TCCAGACTCGTCGTTGGATCAACCTATCTC ATGACCCTAGCTCTAGTATGTCTGGTGGTA AAGGAGCTGCGCTGGATGCATTTATTCTGC TGGGAGAAATAATCGCGGATATTATCCTTTT TCAAAGAGACGCCGAACTAATGACTTGTCG AGAGGAATCGGCATGGTTTCGTACCTTGCC AGCATTCCCAATTTTTTTTTATTTGCTTGGG TCTTATAAAGGAAATCGACAATTTGGGTAAA ATGGTGCAAAGAATCTACCCGTTGGAATAT TTTACTGGAGTCACCGGGGGAGCTTCGAG GACACACCTACCTGGTCTAACCCAGCCTAC TTGTAAGATATGTTAACGTCGGCACCGTCA TTGTAGTTATCTTATTTAAGGCGACACGAGA CGTGAGAACTTTTGCATTGCATATGTAACG GTCAATGTCGTACATGCGACACCATTGGAT CGCTACCGTAAAAGTACACGTTACGGGGGT AGCTGGTGTACCTAAGCGCGACCCGGAAC ACCTACACCCGCTAGTTTAGCTTGTGAAAG TGCGGCGCTGCCTGTGATTCACGCGTTGTA TGGACAACGTTGTACCATTCGTAGCAGACT TTGATCAATGATGTAGTTATGCCATGCCCG AAACAAACTATAGACATTTTCGAAAACGTTC CACTGAGTTAATCCTTAAGCCATGCAATTTT ATGAAAATTTATTAGGCTAGCGGAAATTACG TTCCAAGTTCTGGAACCCTTATATCGATCAA GGCTGCAGACCTAATGGCTTGTGTTCCTGA AACATGTTACGTTGCCATTAACTCGGGAGT CGAGTACGTGCCATGTGTTGTGATGGGAG GTACTCGTTTGCGGAAAGGCATCTGCCCAA AAACACATTAGGTCATTAACGTCCCGTTAC GGTAGATATGGCCACGGTCCACATAAACCG CTCATGGGTAAAAAGGATTCCTATACCTAAC GGCTAGATGGCCAGGTATGTGCAATTTGGG CAGGATCCCGTTGGACGTGACATCTCAATG GCCTGAGAGGTCTGAGACCCCCGATGGAG ATAGTTTAATCAAACTTTTGAAATGCCAAGG CACAGCTAGATTTAGATAGTCAACGCCATC GACTTTGCATTTTCGACATATACTCTTGCCA TTATGAGAGTGACGCGGATAAGAGGTAGG GATGCATGAGTAAAAGAGAGCGGTTTTACG TTCAATATGTGGAAGGATGCTCTAGCCGGG AGTGAGGACACTAAACGCTTGTCATGCACA GTTACTGTGCGGCGTATTGTTAGGGATGCG GTTGTAGTAGTCAAACGGCCAGAAAATGTG TCTCATTTTGAATTCGCGATCTCAGATCTCC GTGAAATGATCTTCGGAATTCAACTCTCATC GGGACAGCAGGACGCGTGCTAACTTAGGG CGTTTCAACTGTGATCCGAATACGTATGGG AGTCAAAGTTCTGTTTGCCCTGATCTGCATC GCTGTGGCCGAGGCCAAGCCCACCGAGAA CAACGAAGACTTCAACATCGTGGCCGTGGC CAGCAACTTCGCGACCACGGATCTCGATGC TGACCGCGGGAAGTTGCCCGGCAAGAAGC TGCCGCTGGAGGTGCTCAAAGAGATGGAA GCCAATGCCCGGAAAGCTGGCTGCACCAG GGGCTGTCTGATCTGCCTGTCCCACATCAA GTGCACGCCCAAGATGAAGAAGTTCATCCC AGGACGCTGCCACACCTACGAAGGCGACA AAGAGTCCGCACAGGGCGGCATAGGCGAG GCGATCGTCGACATTCCTGAGATTCCTGGG TTCAAGGACTTGGAGCCCATGGAGCAGTTC ATCGCACAGGTCGATCTGTGTGTGGACTGC ACAACTGGCTGCCTCAAAGGGCTTGCCAAC GTGCAGTGTTCTGACCTGCTCAAGAAGTGG CTGCCGCAACGCTGTGCGACCTTTGCCAG CAAGATCCAGGGCCAGGTGGACAAGATCA AGGGGGCCGGTGGTGACTAACAGAGATGT TTTCTTGGGTTAATTGAGGCCTGAGTATAAG GTGACTTATACTTGTAATCTATCTAAACGGG GAACCTCTCTAGTAGACAATCCCGTGCTAA ATTGTAGGACTAATTCCATTTATCAGATTTC
TAG SEQ ID Ana1.0 GGGAGACCCTCGACCGTCGATTGTCCACT NO. 11 (Total) GGTCAACAATAGATGACTTACAACTAATCG
GAAGGTGCAGAGACTCGACGGGAGCTACC CTAACGTCAAGACGAGGGTAAAGAGAGAGT CCAATTCTCAAAGCCAATAGGCAGTAGCGA AAGCTGCAAGAGAATGAAAATCCGTTGACC TTAAACGGTCGTGTGGGTTCAAGTCCCTCC ACCCCCAGAAACCAACTTTATTACTATATTC CCCACAACCCCCCTCTCCCTCCCCCCCTAA CGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGG CCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCC ACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGG GCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACG AGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCC AAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTG AAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGA AGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGC AGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAG GTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATA AGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCA GTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGA AAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATT CAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGG TACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGC CTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTC GAGGTTAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAAC CACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACA CGATGATAATATGGCCACAACCATGGGAGT CAAAGTTCTGTTTGCCCTGATCTGCATCGC TGTGGCCGAGGCCAAGCCCACCGAGAACA ACGAAGACTTCAACATCGTGGCCGTGGCCA GCAACTTCGCGACCACGGATCTCGATGCTG ACCGCGGGAAGTTGCCCGGCAAGAAGCTG CCGCTGGAGGTGCTCAAAGAGATGGAAGC CAATGCCCGGAAAGCTGGCTGCACCAGGG GCTGTCTGATCTGCCTGTCCCACATCAAGT GCACGCCCAAGATGAAGAAGTTCATCCCAG GACGCTGCCACACCTACGAAGGCGACAAA GAGTCCGCACAGGGCGGCATAGGCGAGGC GATCGTCGACATTCCTGAGATTCCTGGGTT CAAGGACTTGGAGCCCATGGAGCAGTTCAT CGCACAGGTCGATCTGTGTGTGGACTGCAC AACTGGCTGCCTCAAAGGGCTTGCCAACGT GCAGTGTTCTGACCTGCTCAAGAAGTGGCT GCCGCAACGCTGTGCGACCTTTGCCAGCA AGATCCAGGGCCAGGTGGACAAGATCAAG GGGGCCGGTGGTGACTAAAGACGCTACGG ACTTAAATAATTGAGCCTTAAAGAAGAAATT CTTTAAGTGGATGCTCTCAAACTCAGGGAA ACCTAAATCTAGTTATAGACAAGGCAATCCT GAGCCAAGCCGAAGTAGTAATTAGTAAGAC CAGTGGACAATCGACGGATAACAGCATATC
TAG SEQ ID Ana2.0 GGGAGACCCTCGACCGTCGATTGTCCACT NO. 12 (Total) GGTCAACAATAGATGACTTACAACTAATCG
GAAGGTGCAGAGACTCGACGGGAGCTACC CTAACGTCAAGACGAGGGTAAAGAGAGAGT CCAATTCTCAAAGCCAATAGGCAGTAGCGA AAGCTGCAAGAGAATGAAAATCCGTTGACC TTAAACGGTCGTGTGGGTTCAAGTCCCTCC ACCCCCATGATCTGAAACCAACTTTATTACT ATATTCCCCACAACCCCCCTCTCCCTCCCC CCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGA ATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTT ATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAAT GTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTT CTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCC TCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAA TGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGC TTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGAC CCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTG GCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCA CGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCA CAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATA GTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCA AGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCC CAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGAT CTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGT GTTTAGTCGAGGTTAAAAAACGTCTAGGCC CCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTT GAAAAACACGATGATAATATGGCCACAACC ATGGGAGTCAAAGTTCTGTTTGCCCTGATC TGCATCGCTGTGGCCGAGGCCAAGCCCAC CGAGAACAACGAAGACTTCAACATCGTGGC CGTGGCCAGCAACTTCGCGACCACGGATC TCGATGCTGACCGCGGGAAGTTGCCCGGC AAGAAGCTGCCGCTGGAGGTGCTCAAAGA GATGGAAGCCAATGCCCGGAAAGCTGGCT GCACCAGGGGCTGTCTGATCTGCCTGTCC CACATCAAGTGCACGCCCAAGATGAAGAAG TTCATCCCAGGACGCTGCCACACCTACGAA GGCGACAAAGAGTCCGCACAGGGCGGCAT AGGCGAGGCGATCGTCGACATTCCTGAGAT TCCTGGGTTCAAGGACTTGGAGCCCATGGA GCAGTTCATCGCACAGGTCGATCTGTGTGT GGACTGCACAACTGGCTGCCTCAAAGGGC TTGCCAACGTGCAGTGTTCTGACCTGCTCA AGAAGTGGCTGCCGCAACGCTGTGCGACC TTTGCCAGCAAGATCCAGGGCCAGGTGGA CAAGATCAAGGGGGCCGGTGGTGACTAAA GACGCTACGGACTTAAATAATTGAGCCTTA AAGAAGAAATTCTTTAAGTGGATGCTCTCAA ACTCAGGGAAACCTAAATCTAGTTATAGACA AGGCAATCCTGAGCCAAGCCGAAGTAGTAA TTAGTAAGACCAGTGGACAATCGACGGATA
ACAGCATATCTAG SEQ ID Ana3.0 GGGAGACCCTCGACCGTCGATTGTCCACT NO. 13 (Total) GGTCAACAATAGATGACTTACAACTAATCG
GAAGGTGCAGAGACTCGACGGGAGCTACC CTAACGTCAAGACGAGGGTAAAGAGAGAGT CCAATTCTCAAAGCCAATAGGCAGTAGCGA AAGCTGCAAGAGAATGAAAATCCGTTGACC TTAAACGGTCGTGTGGGTTCAAGTCCCTCC ACCCCCACGCCGGAAACGCAATAGCCGAA AAACAAAAAACAAAAAAACCCCCCTCTCCCT CCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCT TGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATA TGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGG CAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTG TCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTT CCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGT TGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGG AAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAG CGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCA CCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAA GCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGC GGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTG GATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTC CTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGA TGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATC TGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTAC ATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAACGTCTAG GCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTC CTTTGAAAAACACGATGATAATATGGCCACA ACCATGGGAGTCAAAGTTCTGTTTGCCCTG ATCTGCATCGCTGTGGCCGAGGCCAAGCC CACCGAGAACAACGAAGACTTCAACATCGT GGCCGTGGCCAGCAACTTCGCGACCACGG ATCTCGATGCTGACCGCGGGAAGTTGCCC GGCAAGAAGCTGCCGCTGGAGGTGCTCAA AGAGATGGAAGCCAATGCCCGGAAAGCTG GCTGCACCAGGGGCTGTCTGATCTGCCTGT CCCACATCAAGTGCACGCCCAAGATGAAGA AGTTCATCCCAGGACGCTGCCACACCTACG AAGGCGACAAAGAGTCCGCACAGGGCGGC ATAGGCGAGGCGATCGTCGACATTCCTGAG ATTCCTGGGTTCAAGGACTTGGAGCCCATG GAGCAGTTCATCGCACAGGTCGATCTGTGT GTGGACTGCACAACTGGCTGCCTCAAAGG GCTTGCCAACGTGCAGTGTTCTGACCTGCT CAAGAAGTGGCTGCCGCAACGCTGTGCGA CCTTTGCCAGCAAGATCCAGGGCCAGGTG GACAAGATCAAGGGGGCCGGTGGTGACTA AAAAAAACAAAAAACAAAACGGCTATTATGC GTTACCGGCGAGACGCTACGGACTTAAATA ATTGAGCCTTAAAGAAGAAATTCTTTAAGTG GATGCTCTCAAACTCAGGGAAACCTAAATC TAGTTATAGACAAGGCAATCCTGAGCCAAG CCGAAGTAGTAATTAGTAAGACCAGTGGAC
AATCGACGGATAACAGCATATCTAG SEQ ID hEpo ATGGGAGTGCATGAATGTCCTGCCTGGCTG NO. 14 TGGCTTCTCCTGTCACTGCTGTCTCTCCCT
CTGGGCCTCCCAGTGCTGGGCGCACCACC AAGACTCATCTGTGACAGCAGAGTGCTGGA GAGGTATCTCTTGGAGGCCAAGGAGGCTG AGAACATTACCACAGGCTGTGCTGAACACT GCAGCTTGAATGAGAATATCACTGTCCCAG ACACCAAAGTTAATTTCTATGCCTGGAAGA GGATGGAGGTTGGGCAACAAGCAGTTGAA GTGTGGCAAGGCCTGGCCCTGCTGTCTGA AGCTGTCCTGAGGGGCCAGGCACTGTTGG TCAACTCTTCCCAGCCTTGGGAGCCCCTGC AACTGCATGTGGATAAAGCAGTGAGTGGCC TTAGAAGCCTCACCACTCTGCTTCGGGCTC TGGGAGCACAGAAGGAAGCCATCTCCCCT CCAGATGCAGCCTCAGCAGCTCCACTCAGA ACAATTACTGCTGACACTTTTAGAAAACTCT TTAGGGTGTACTCCAATTTCCTCCGGGGAA AGCTGAAGCTGTACACAGGTGAGGCATGTA GGACAGGGGACAGATAA
SEQ ID EGFP ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCAC NO. 15 CGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGG
ACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGC GTGTCTGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCAC CTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTG CACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGC CCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGC GTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCA CATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGC CATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCA CCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACA AGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGC GACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAA GGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACA TCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACA ACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACA AGCAGAAGAACGGCATCAAGGCGAACTTCA AGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGC GTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAA CACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGC TGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGT CCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAG CGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTG ACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGA
CGAGCTGTACAAGTAA SEQ ID FLuc ATGGAAGACGCCAAAAACATAAAGAAAGGC NO. 16 CCGGCGCCATTCTATCCGCTGGAAGATGGA
ACCGCTGGAGAGCAACTGCATAAGGCTATG AAGAGATACGCCCTGGTTCCTGGAACAATT GCTTTTACAGATGCACATATCGAGGTGGAC ATCACTTACGCTGAGTACTTCGAAATGTCC GTTCGGTTGGCAGAAGCTATGAAACGATAT GGGCTGAATACAAATCACAGAATCGTCGTA TGCAGTGAAAACTCTCTTCAATTCTTTATGC CGGTGTTGGGCGCGTTATTTATCGGAGTTG CAGTTGCGCCCGCGAACGACATTTATAATG AACGTGAATTGCTCAACAGTATGGGCATTT CGCAGCCTACCGTGGTGTTCGTTTCCAAAA AGGGGTTGCAAAAAATTTTGAACGTGCAAA AAAAGCTCCCAATCATCCAAAAAATTATTAT CATGGATTCTAAAACGGATTACCAGGGATT TCAGTCGATGTACACGTTCGTCACATCTCAT CTACCTCCCGGTTTTAATGAATACGATTTTG TGCCAGAGTCCTTCGATAGGGACAAGACAA TTGCACTGATCATGAACTCCTCTGGATCTAC TGGTCTGCCTAAAGGTGTCGCTCTGCCTCA TAGAACTGCCTGCGTGAGATTCTCGCATGC CAGAGATCCTATTTTTGGCAATCAAATCATT CCGGATACTGCGATTTTAAGTGTTGTTCCAT TCCATCACGGTTTTGGAATGTTTACTACACT CGGATATTTGATATGTGGATTTCGAGTCGT CTTAATGTATAGATTTGAAGAAGAGCTGTTT CTGAGGAGCCTTCAGGATTACAAGATTCAA AGTGCGCTGCTGGTGCCAACCCTATTCTCC TTCTTCGCCAAAAGCACTCTGATTGACAAAT ACGATTTATCTAATTTACACGAAATTGCTTC TGGTGGCGCTCCCCTCTCTAAGGAAGTCG GGGAAGCGGTTGCCAAGAGGTTCCATCTG CCAGGTATCAGGCAAGGATATGGGCTCACT GAGACTACATCAGCTATTCTGATTACACCC GAGGGGGATGATAAACCGGGCGCGGTCGG TAAAGTTGTTCCATTTTTTGAAGCGAAGGTT GTGGATCTGGATACCGGGAAAACGCTGGG CGTTAATCAAAGAGGCGAACTGTGTGTGAG AGGTCCTATGATTATGTCCGGTTATGTAAAC AATCCGGAAGCGACCAACGCCTTGATTGAC AAGGATGGATGGCTACATTCTGGAGACATA GCTTACTGGGACGAAGACGAACACTTCTTC ATCGTTGACCGCCTGAAGTCTCTGATTAAG TACAAAGGCTATCAGGTGGCTCCCGCTGAA TTGGAATCCATCTTGCTCCAACACCCCAAC ATCTTCGACGCAGGTGTCGCAGGTCTTCCC GACGATGACGCCGGTGAACTTCCCGCCGC CGTTGTTGTTTTGGAGCACGGAAAGACGAT GACGGAAAAAGAGATCGTGGATTACGTCGC CAGTCAAGTAACAACCGCGAAAAAGTTGCG CGGAGGAGTTGTGTTTGTGGACGAAGTACC GAAAGGTCTTACCGGAAAACTCGACGCAAG AAAAATCAGAGAGATCCTCATAAAGGCCAA
GAAGGGCGGAAAGATCGCCGTGTAA SEQ ID Cas9 ATGGCCCCAAAGAAGAAGCGGAAGGTCGG NO. 17 TATCCACGGAGTCCCAGCAGCCGACAAGAA
GTACAGCATCGGCCTGGACATCGGCACCA ACTCTGTGGGCTGGGCCGTGATCACCGAC GAGTACAAGGTGCCCAGCAAGAAATTCAAG GTGCTGGGCAACACCGACCGGCACAGCAT CAAGAAGAACCTGATCGGAGCCCTGCTGTT CGACAGCGGCGAAACAGCCGAGGCCACCC GGCTGAAGAGAACCGCCAGAAGAAGATAC ACCAGACGGAAGAACCGGATCTGCTATCTG CAAGAGATCTTCAGCAACGAGATGGCCAAG GTGGACGACAGCTTCTTCCACAGACTGGAA GAGTCCTTCCTGGTGGAAGAGGATAAGAAG CACGAGCGGCACCCCATCTTCGGCAACATC GTGGACGAGGTGGCCTACCACGAGAAGTA CCCCACCATCTACCACCTGAGAAAGAAACT GGTGGACAGCACCGACAAGGCCGACCTGC GGCTGATCTATCTGGCCCTGGCCCACATGA TCAAGTTCCGGGGCCACTTCCTGATCGAGG GCGACCTGAACCCCGACAACAGCGACGTG GACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTGCAGACC TACAACCAGCTGTTCGAGGAAAACCCCATC AACGCCAGCGGCGTGGACGCCAAGGCCAT CCTGTCTGCCAGACTGAGCAAGAGCAGAC GGCTGGAAAATCTGATCGCCCAGCTGCCC GGCGAGAAGAAGAATGGCCTGTTCGGAAA CCTGATTGCCCTGAGCCTGGGCCTGACCC CCAACTTCAAGAGCAACTTCGACCTGGCCG AGGATGCCAAACTGCAGCTGAGCAAGGAC ACCTACGACGACGACCTGGACAACCTGCTG GCCCAGATCGGCGACCAGTACGCCGACCT GTTTCTGGCCGCCAAGAACCTGTCCGACGC CATCCTGCTGAGCGACATCCTGAGAGTGAA CACCGAGATCACCAAGGCCCCCCTGAGCG CCTCTATGATCAAGAGATACGACGAGCACC ACCAGGACCTGACCCTGCTGAAAGCTCTCG TGCGGCAGCAGCTGCCTGAGAAGTACAAA GAGATTTTCTTCGACCAGAGCAAGAACGGC TACGCCGGCTACATTGACGGCGGAGCCAG CCAGGAAGAGTTCTACAAGTTCATCAAGCC CATCCTGGAAAAGATGGACGGCACCGAGG AACTGCTCGTGAAGCTGAACAGAGAGGACC TGCTGCGGAAGCAGCGGACCTTCGACAAC GGCAGCATCCCCCACCAGATCCACCTGGG AGAGCTGCACGCCATTCTGCGGCGGCAGG AAGATTTTTACCCATTCCTGAAGGACAACC GGGAAAAGATCGAGAAGATCCTGACCTTCC GCATCCCCTACTACGTGGGCCCTCTGGCCA GGGGAAACAGCAGATTCGCCTGGATGACC AGAAAGAGCGAGGAAACCATCACCCCCTG GAACTTCGAGGAAGTGGTGGACAAGGGCG CTTCCGCCCAGAGCTTCATCGAGCGGATGA CCAACTTCGATAAGAACCTGCCCAACGAGA AGGTGCTGCCCAAGCACAGCCTGCTGTAC GAGTACTTCACCGTGTATAACGAGCTGACC AAAGTGAAATACGTGACCGAGGGAATGAGA AAGCCCGCCTTCCTGAGCGGCGAGCAGAA AAAGGCCATCGTGGACCTGCTGTTCAAGAC CAACCGGAAAGTGACCGTGAAGCAGCTGA AAGAGGACTACTTCAAGAAAATCGAGTGCT TCGACTCCGTGGAAATCTCCGGCGTGGAA GATCGGTTCAACGCCTCCCTGGGCACATAC CACGATCTGCTGAAAATTATCAAGGACAAG GACTTCCTGGACAATGAGGAAAACGAGGAC ATTCTGGAAGATATCGTGCTGACCCTGACA CTGTTTGAGGACAGAGAGATGATCGAGGAA CGGCTGAAAACCTATGCCCACCTGTTCGAC GACAAAGTGATGAAGCAGCTGAAGCGGCG GAGATACACCGGCTGGGGCAGGCTGAGCC GGAAGCTGATCAACGGCATCCGGGACAAG CAGTCCGGCAAGACAATCCTGGATTTCCTG AAGTCCGACGGCTTCGCCAACAGAAACTTC ATGCAGCTGATCCACGACGACAGCCTGACC TTTAAAGAGGACATCCAGAAAGCCCAGGTG TCCGGCCAGGGCGATAGCCTGCACGAGCA CATTGCCAATCTGGCCGGCAGCCCCGCCA TTAAGAAGGGCATCCTGCAGACAGTGAAGG TGGTGGACGAGCTCGTGAAAGTGATGGGC CGGCACAAGCCCGAGAACATCGTGATCGA AATGGCCAGAGAGAACCAGACCACCCAGA AGGGACAGAAGAACAGCCGCGAGAGAATG AAGCGGATCGAAGAGGGCATCAAAGAGCT GGGCAGCCAGATCCTGAAAGAACACCCCG TGGAAAACACCCAGCTGCAGAACGAGAAG CTGTACCTGTACTACCTGCAGAATGGGCGG GATATGTACGTGGACCAGGAACTGGACATC AACCGGCTGTCCGACTACGATGTGGACCAT ATCGTGCCTCAGAGCTTTCTGAAGGACGAC TCCATCGACAACAAGGTGCTGACCAGAAGC GACAAGAACCGGGGCAAGAGCGACAACGT GCCCTCCGAAGAGGTCGTGAAGAAGATGA AGAACTACTGGCGGCAGCTGCTGAACGCC AAGCTGATTACCCAGAGAAAGTTCGACAAT CTGACCAAGGCCGAGAGAGGCGGCCTGAG CGAACTGGATAAGGCCGGCTTCATCAAGAG ACAGCTGGTGGAAACCCGGCAGATCACAAA GCACGTGGCACAGATCCTGGACTCCCGGA TGAACACTAAGTACGACGAGAATGACAAGC TGATCCGGGAAGTGAAAGTGATCACCCTGA AGTCCAAGCTGGTGTCCGATTTCCGGAAGG ATTTCCAGTTTTACAAAGTGCGCGAGATCAA CAACTACCACCACGCCCACGACGCCTACCT GAACGCCGTCGTGGGAACCGCCCTGATCA AAAAGTACCCTAAGCTGGAAAGCGAGTTCG TGTACGGCGACTACAAGGTGTACGACGTGC GGAAGATGATCGCCAAGAGCGAGCAGGAA ATCGGCAAGGCTACCGCCAAGTACTTCTTC TACAGCAACATCATGAACTTTTTCAAGACCG AGATTACCCTGGCCAACGGCGAGATCCGG AAGCGGCCTCTGATCGAGACAAACGGCGA AACCGGGGAGATCGTGTGGGATAAGGGCC GGGATTTTGCCACCGTGCGGAAAGTGCTGA GCATGCCCCAAGTGAATATCGTGAAAAAGA CCGAGGTGCAGACAGGCGGCTTCAGCAAA GAGTCTATCCTGCCCAAGAGGAACAGCGAT AAGCTGATCGCCAGAAAGAAGGACTGGGA CCCTAAGAAGTACGGCGGCTTCGACAGCC CCACCGTGGCCTATTCTGTGCTGGTGGTGG CCAAAGTGGAAAAGGGCAAGTCCAAGAAAC TGAAGAGTGTGAAAGAGCTGCTGGGGATCA CCATCATGGAAAGAAGCAGCTTCGAGAAGA ATCCCATCGACTTTCTGGAAGCCAAGGGCT ACAAAGAAGTGAAAAAGGACCTGATCATCA AGCTGCCTAAGTACTCCCTGTTCGAGCTGG AAAACGGCCGGAAGAGAATGCTGGCCTCT GCCGGCGAACTGCAGAAGGGAAACGAACT GGCCCTGCCCTCCAAATATGTGAACTTCCT GTACCTGGCCAGCCACTATGAGAAGCTGAA GGGCTCCCCCGAGGATAATGAGCAGAAAC AGCTGTTTGTGGAACAGCACAAGCACTACC TGGACGAGATCATCGAGCAGATCAGCGAGT TCTCCAAGAGAGTGATCCTGGCCGACGCTA ATCTGGACAAAGTGCTGTCCGCCTACAACA AGCACCGGGATAAGCCCATCAGAGAGCAG GCCGAGAATATCATCCACCTGTTTACCCTG ACCAATCTGGGAGCCCCTGCCGCCTTCAAG TACTTTGACACCACCATCGACCGGAAGAGG TACACCAGCACCAAAGAGGTGCTGGACGC CACCCTGATCCACCAGAGCATCACCGGCCT GTACGAGACACGGATCGACCTGTCTCAGCT GGGAGGCGACAAAAGGCCGGCGGCCACG AAAAAGGCCGGCCAGGCAAAAAAGAAAAAG
TAA SEQ ID sgGFP GGGCGAGGAGCGCACCGGGGGUUUUAGA NO. 18 GCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUA
GUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACC
GAGUCGGUGCUUUUUU SEQ ID Sonda CATGGTTGTGGCCATATTATCATCG NO. 19 RNase H SEQ ID PCR F da CGATCGTCGACATTCCTGAG NO. 20 Junção de Ligação
PCR F SEQ ID PCR R da ATGCTCGTCAAGAAGACAGG NO. 21 Junção de Ligação
SEQ ID ABPV TTTGGGAATCGCAACACAACATGGTTACCC NO. 22 ATAGATTGAGGAAATTTCCAATAAACTCAAT
CTTAAGGCTTGTTGTGTTGGACAAGGTGCC CTATTTAGGGTGAGGAGCCTTGCTGGCAGC CCCAGTGAATCCTCTATTGGATAGGAACAG CTATATTGGGTAGTTGTAGCAGTTGTATTCA AACGAATGCAGCGTTCCGAAATACCATACC T
SEQ ID CSFV GTATACGAGGTTAGTTCATTCTCGTATACAC NO. 23 GATTGGACAAATCAAAATTATAATTTGGTTC
AGGGCCTCCCTCCAGCGACGGCCGAACTG GGCTAGCCATGCCCATAGTAGGACTAGCAA ACGGAGGGACTAGCCGTAGTGGCGAGCTC CCTGGGTGGTCTAAGTCCTGAGTACAGGAC AGTCGTCAGTAGTTCGACGTGAGCAGAAGC CCACCTCGAGATGCTACGTGGACGAGGGC ATGCCCAAGACACACCTTAACCCTAGCGGG GGTCGCTAGGGTGAAATCACACCACGTGAT GGGAGTACGACCTGATAGGGCGCTGCAGA GGCCCACTATTAGGCTAGTATAAAAATCTCT
GCTGTACATGGCAC SEQ ID CVB3 TTAAAACAGCCTGTGGGTTGATCCCACCCA NO. 24 CAGGCCCATTGGGCGCTAGCACTCTGGTAT
CACGGTACCTTTGTGCGCCTGTTTTATACC CCCTCCCCCAACTGTAACTTAGAAGTAACA CACACCGATCAACAGTCAGCGTGGCACACC AGCCACGTTTTGATCAAGCACTTCTGTTACC CCGGACTGAGTATCAATAGACTGCTCACGC GGTTGAAGGAGAAAGCGTTCGTTATCCGGC CAACTACTTCGAAAAACCTAGTAACACCGT GGAAGTTGCAGAGTGTTTCGCTCAGCACTA CCCCAGTGTAGATCAGGTCGATGAGTCACC GCATTCCCCACGGGCGACCGTGGCGGTGG CTGCGTTGGCGGCCTGCCCATGGGGAAAC CCATGGGACGCTCTAATACAGACATGGTGC GAAGAGTCTATTGAGCTAGTTGGTAGTCCT CCGGCCCCTGAATGCGGCTAATCCTAACTG CGGAGCACACACCCTCAAGCCAGAGGGCA GTGTGTCGTAACGGGCAACTCTGCAGCGG AACCGACTACTTTGGGTGTCCGTGTTTCATT TTATTCCTATACTGGCTGCTTATGGTGACAA TTGAGAGATCGTTACCATATAGCTATTGGAT TGGCCATCCGGTGACTAATAGAGCTATTAT ATATCCCTTTGTTGGGTTTATACCACTTAGC TTGAAAGAGGTTAAAACATTACAATTCATTG
TTAAGTTGAATACAGCAAA SEQ ID EMCV2 TTGCCAGTCTGCTCGATATCGCAGGCTGGG NO. 25 TCCGTGACTACCCACTCCCCCTTTCAACGT
GAAGGCTACGATAGTGCCAGGGCGGGTAC TGCCGTAAGTGCCACCCCAAACAACAACAA CAAAACAAACTCCCCCTCCCCCCCCTTACT ATACTGGCCGAAGCCACTTGGAATAAGGCC GGTGTGCGTTTGTCTACATGCTATTTTCTAC CGCATTACCGTCTTATGGTAATGTGAGGGT CCAGAACCTGACCCTGTCTTCTTGACGAAC ACTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGACAAA GGAGTGTAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAG GAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTAAAGA CAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGG CAGCGGAACCCCCCACCTGGTGACAGGTG CCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGA TACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGT GCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAA GAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCA ACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTA CCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCT CGGTGCACGTGCTTTACACGTGTTGAGTCG AGGTGAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACC ACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAACCAC
GATTACAAT SEQ ID EV71 TTAAAACAGCTGTGGGTTGTCACCCACCCA NO. 26 CAGGGTCCACTGGGCGCTAGTACACTGGT
ATCTCGGTACCTTTGTACGCCTGTTTTATAC CCCCTCCCTGATTTGCAACTTAGAAGCAAC GCAAACCAGATCAATAGTAGGTGTGACATA CCAGTCGCATCTTGATCAAGCACTTCTGTAT CCCCGGACCGAGTATCAATAGACTGTGCAC ACGGTTGAAGGAGAAAACGTCCGTTACCCG GCTAACTACTTCGAGAAGCCTAGTAACGCC ATTGAAGTTGCAGAGTGTTTCGCTCAGCAC TCCCCCCGTGTAGATCAGGTCGATGAGTCA CCGCATTCCCCACGGGCGACCGTGGCGGT GGCTGCGTTGGCGGCCTGCCTATGGGGTA ACCCATAGGACGCTCTAATACGGACATGGC GTGAAGAGTCTATTGAGCTAGTTAGTAGTC CTCCGGCCCCTGAATGCGGCTAATCCTAAC TGCGGAGCACATACCCTTAATCCAAAGGGC AGTGTGTCGTAACGGGCAACTCTGCAGCG GAACCGACTACTTTGGGTGTCCGTGTTTCT TTTTATTCTTGTATTGGCTGCTTATGGTGAC AATTAAAGAATTGTTACCATATAGCTATTGG ATTGGCCATCCAGTGTCAAACAGAGCTATT GTATATCTCTTTGTTGGATTCACACCTCTCA CTCTTGAAACGTTACACACCCTCAATTACAT TATACTGCTGAACACGAAGCG
SEQ ID HAV TTCAAGAGGGGTTTCCGGAGTTTTCCGGAG NO. 27 CCCCTCTTGGAAGTCCATGGTGAGGGGACT
TGATACCTCACCGCCGTTTGCCTAGGCTAT AGGCTAAATTTCCCTTTCCCTGTCCTTCCCT TATTTCCCTTTATCTTGTTTGTAAATATTAAT TCCTGCAGGTTCAGGGTTCTTTAATCTGTTT CTCTATAAGAACACTCAATTTTCACGCTTTC TGTCTTCTTTCTTCCAGGGCTCTCCCCTTGC CCTAGGCTCTGGCCGTTGCGCCCGGCGGG GTCAACTCCATGATTAGCATGGAGCTGTAG GAGTCTAAATTGGGGACGCAGATGTTTGGG ACGTCGCCTTGCAGTGTTAACTTGGCTCTC ATGAACCTCTTTGATCTTTCACAAGGGGTA GGCTACGGGTGAAACCCCTTAGGCTAATAC TTCTATGAAGAGATGCCTTGGATAGGGTAA CAGCGGCGGATATTGGTGAGTTGTTAAGAC AAAAACCATTCAACGCCGGAGGACTGGCTC TCATCCAGTGGATGCATTGAGTGAATTGATT GTCAGGGCTGTCTTTAGGTTTAATCTCAGA CCTCTCTGTGCTTAGGGCAAACACTATTTG GCCTTAAATGGGATCCTGTGAGAGGGGGT CCCTCCATTGACAGCTGGACTGTTCTTTGG GGCCTTATGTAGTGTTTGCCTCTGAGGTAC TCAGGGGCATTTAGGTTTTTCCTCACTCTTA
AACAATA SEQ ID HRV2 TTAAAACTGGATCCAGGTTGTTCCCACCTG NO. 28 GATTTCCCACAGGGAGTGGTACTCTGTTAT
TACGGTAACTTTGTACGCCAGTTTTATCTCC CTTCCCCCATGTAACTTAGAAGTTTTTCACA AAGACCAATAGCCGGTAATCAGCCAGATTA CTGAAGGTCAAGCACTTCTGTTTCCCCGGT CAATGTTGATATGCTCCAACAGGGCAAAAA CAACTGCGATCGTTAACCGCAAAGCGCCTA CGCAAAGCTTAGTAGCATCTTTGAAATCGTT TGGCTGGTCGATCCGCCATTTCCCCTGGTA GACCTGGCAGATGAGGCTAGAAATACCCCA CTGGCGACAGTGTTCTAGCCTGCGTGGCT GCCTGCACACCCTATGGGTGTGAAGCCAAA CAATGGACAAGGTGTGAAGAGCCCCGTGT GCTCGCTTTGAGTCCTCCGGCCCCTGAATG TGGCTAACCTTAACCCTGCAGCTAGAGCAC GTAACCCAATGTGTATCTAGTCGTAATGAG CAATTGCGGGATGGGACCAACTACTTTGGG TGTCCGTGTTTCACTTTTTCCTTTATATTTGC TTATGGTGACAATATATACAATATATATATTG GCACCATGG
SEQ ID HTLV GGCTCGCATCTCTCCTTCACGCGCCCGCC NO. 29 GCCCTACCTGAGGCCGCCATCCACGCCGG
TTGAGTCGCGTTCTGCCGCCTCCCGCCTGT GGTGCCTCCTGAACTGCGTCCGCCGTCTA GGTAAGTTTAGAGCTCAGGTCGAGACCGG GCCTTTGTCCGGCGCTCCCTTGGAGCCTAC CTAGACTCAGCCGGCTCTCCACGCTTTGCC TGACCCTGCTTGTTCAACTCTGCGTCTTTGT TTCGTTTTCTGTTCTGCGCCGCTACAGATC GAAAGTTCCACCCCTTTCCCTTTCATTCACG ACTGACTGCCGGCTTGGCCCACGGCCAAG TACCGGCGACTCCGTTGGCTCGGAGCCAG CGACAGCCCATCCTATAGCACTCTCCAGGA GAGAAACTTAGTACACAGTTGGGGGCTCGT CCGGGATACGAGCGCCCCTTTATTCCCTAG GCA
SEQ ID PV TTAAAACAGCTCTGGGGTTGTACCCACCCC NO. 30 AGAGGCCCACGTGGCGGCTAGTACTCCGG
TATTGCGGTACCCTTGTACGCCTGTTTTATA CTCCCTTCCCGTAACTTAGACGCACAAAAC CAAGTTCAATAGAAGGGGGTACAAACCAGT ACCACCACGAACAAGCACTTCTGTTTCCCC GGTGATGTCGTATAGACTGCTTGCGTGGTT GAAAGCGACGGATCCGTTATCCGCTTATGT ACTTCGAGAAGCCCAGTACCACCTCGGAAT CTTCGATGCGTTGCGCTCAGCACTCAACCC CAGAGTGTAGCTTAGGCTGATGAGTCTGGA CATCCCTCACCGGTGACGGTGGTCCAGGC TGCGTTGGCGGCCTACCTATGGCTAACGCC ATGGGACGCTAGTTGTGAACAAGGTGTGAA GAGCCTATTGAGCTACATAAGAATCCTCCG GCCCCTGAATGCGGCTAATCCCAACCTCGG AGCAGGTGGTCACAAACCAGTGATTGGCCT GTCGTAACGCGCAAGTCCGTGGCGGAACC GACTACTTTGGGTGTCCGTGTTTCCTTTTAT TTTATTGTGGCTGCTTATGGTGACAATCACA GATTGTTATCATAAAGCGAATTGGATTGGC CATCCGGTGAAAGTGAGACTCATTATCTAT CTGTTTGCTGGATCCGCTCCATTGAGTGTG TTTACTCTAAGTACAATTTCAACAGTTATTTC
AATCAGACAATTGTATCATA SEQ ID CVB3- GGGAGACCCTCGACCGTCGATTGTCCACT NO. 31 GLuc-pAC GGTCAACAATAGATGACTTACAACTAATCG (Total) GAAGGTGCAGAGACTCGACGGGAGCTACC
CTAACGTCAAGACGAGGGTAAAGAGAGAGT CCAATTCTCAAAGCCAATAGGCAGTAGCGA AAGCTGCAAGAGAATGAAAATCCGTTGACC TTAAACGGTCGTGTGGGTTCAAGTCCCTCC ACCCCCACGCCGGAAACGCAATAGCCGAA AAACAAAAAACAAAAAAAACAAAAAAAAAAC CAAAAAAACAAAACACATTAAAACAGCCTGT GGGTTGATCCCACCCACAGGCCCATTGGG CGCTAGCACTCTGGTATCACGGTACCTTTG TGCGCCTGTTTTATACCCCCTCCCCCAACT GTAACTTAGAAGTAACACACACCGATCAAC AGTCAGCGTGGCACACCAGCCACGTTTTGA TCAAGCACTTCTGTTACCCCGGACTGAGTA TCAATAGACTGCTCACGCGGTTGAAGGAGA AAGCGTTCGTTATCCGGCCAACTACTTCGA AAAACCTAGTAACACCGTGGAAGTTGCAGA GTGTTTCGCTCAGCACTACCCCAGTGTAGA TCAGGTCGATGAGTCACCGCATTCCCCACG GGCGACCGTGGCGGTGGCTGCGTTGGCG GCCTGCCCATGGGGAAACCCATGGGACGC TCTAATACAGACATGGTGCGAAGAGTCTAT TGAGCTAGTTGGTAGTCCTCCGGCCCCTGA ATGCGGCTAATCCTAACTGCGGAGCACACA CCCTCAAGCCAGAGGGCAGTGTGTCGTAA CGGGCAACTCTGCAGCGGAACCGACTACTT TGGGTGTCCGTGTTTCATTTTATTCCTATAC TGGCTGCTTATGGTGACAATTGAGAGATCG TTACCATATAGCTATTGGATTGGCCATCCG GTGACTAATAGAGCTATTATATATCCCTTTG TTGGGTTTATACCACTTAGCTTGAAAGAGGT TAAAACATTACAATTCATTGTTAAGTTGAATA CAGCAAAATGGGAGTCAAAGTTCTGTTTGC CCTGATCTGCATCGCTGTGGCCGAGGCCA AGCCCACCGAGAACAACGAAGACTTCAACA TCGTGGCCGTGGCCAGCAACTTCGCGACC ACGGATCTCGATGCTGACCGCGGGAAGTT GCCCGGCAAGAAGCTGCCGCTGGAGGTGC TCAAAGAGATGGAAGCCAATGCCCGGAAAG CTGGCTGCACCAGGGGCTGTCTGATCTGC CTGTCCCACATCAAGTGCACGCCCAAGATG AAGAAGTTCATCCCAGGACGCTGCCACACC TACGAAGGCGACAAAGAGTCCGCACAGGG CGGCATAGGCGAGGCGATCGTCGACATTC CTGAGATTCCTGGGTTCAAGGACTTGGAGC CCATGGAGCAGTTCATCGCACAGGTCGATC TGTGTGTGGACTGCACAACTGGCTGCCTCA AAGGGCTTGCCAACGTGCAGTGTTCTGACC TGCTCAAGAAGTGGCTGCCGCAACGCTGT GCGACCTTTGCCAGCAAGATCCAGGGCCA GGTGGACAAGATCAAGGGGGCCGGTGGTG ACTAAAAAAAACAAAAAACAAAACGGCTATT ATGCGTTACCGGCGAGACGCTACGGACTTA AATAATTGAGCCTTAAAGAAGAAATTCTTTA AGTGGATGCTCTCAAACTCAGGGAAACCTA AATCTAGTTATAGACAAGGCAATCCTGAGC CAAGCCGAAGTAGTAATTAGTAAGACCAGT
GGACAATCGACGGATAACAGCATATCTAG SEQ ID GLuc Li- GGGAGACCCTCGAATGGGAGTCAAAGTTCT
NO. 32 near Não GTTTGCCCTGATCTGCATCGCTGTGGCCGA modificada GGCCAAGCCCACCGAGAACAACGAAGACT (Total) TCAACATCGTGGCCGTGGCCAGCAACTTCG
CGACCACGGATCTCGATGCTGACCGCGGG AAGTTGCCCGGCAAGAAGCTGCCGCTGGA GGTGCTCAAAGAGATGGAAGCCAATGCCC GGAAAGCTGGCTGCACCAGGGGCTGTCTG ATCTGCCTGTCCCACATCAAGTGCACGCCC AAGATGAAGAAGTTCATCCCAGGACGCTGC CACACCTACGAAGGCGACAAAGAGTCCGC ACAGGGCGGCATAGGCGAGGCGATCGTCG ACATTCCTGAGATTCCTGGGTTCAAGGACT TGGAGCCCATGGAGCAGTTCATCGCACAG GTCGATCTGTGTGTGGACTGCACAACTGGC TGCCTCAAAGGGCTTGCCAACGTGCAGTGT TCTGACCTGCTCAAGAAGTGGCTGCCGCAA CGCTGTGCGACCTTTGCCAGCAAGATCCAG GGCCAGGTGGACAAGATCAAGGGGGCCGG
TGGTGACTAATCTAG SEQ ID HCV gccagccccctgatgggggcgacactccaccatgaatcactc NO. 35 ccctgtgaggaactactgtcttcacgcagaaagcgtctagccat ggcgttagtatgagtgtcgtgcagcctccaggaccccccctccc gggagagccatagtggtctgcggaaccggtgagtacaccgga attgccaggacgaccgggtcctttcttggataaacccgctcaat gcctggagatttgggcgtgcccccgcaagactgctagccgag SEQ ID EMCV cccccctctccctccccccctaacgttactggccgaagccgcttg NO. 36 gaataaggccggtgtgcgtttgtctatatgttattttccaccatattg ccgtcttttggcaatgtgagggcccggaaacctggccctgtcttct tgacgagcattcctaggggtctttcccctctcgccaaaggaatgc aaggtctgttgaatgtcgtgaaggaagcagttcctctggaagctt cttgaagacaaacaacgtctgtagcgaccctttgc
SEQ ID NRF CAGAGTAATGACATGGTTCCTTCCATCCTC NO. 37 CAAAGGTGACCAATAATAGTTTGTAAGTATC
ATTATGAACTAATGAATTTTCAACATATTTGA TATATTTCAATCCATTGCCATCATTGTTCTTA TCGATATTTGAGTTGGCTCACTTTGCCAGTA AGAGTCTATTCAAATTGGCTTCTGAGTCCAT TTGACACAACACCT
SEQ ID CRPV AAAGCAAAAATGTGATCTTGCTTGTAAATAC NO. 38 AATTTTGAGAGGTTAATAAATTACAAGTAGT
GCTATTTTTGTATTTAGGTTAGCTATTTAGC TTTACGTTCCAGGATGCCTAGTGGCAGCCC CACAATATCCAGGAAGCCCTCTCTGCGGTT TTTCAGATTAGGTAGTCGAAAAACCTAAGAA ATTTACCTGCTACAT
SEQ ID GTX TTCTGACATCCGGCGGGTATTTCAGAACCG NO. 39 GCGGGTAGTACTGTACCGGCGGGTTTCTG
ACATCCGGCGGGTTACAGTCATCCGGCGG GTTACTACAGTCCGGCGGGTTACTCAGAAC CGGCGGGTTAGAATTCCTCCGGCGGGTGA
CTCACAACCCCAGAAACAGAGCC SEQ ID Rbm3 TTTATAATTTCTTCTTCCAGAAGAATTTGTTG NO. 40 GTAAAGCCACC
SEQ ID TMEV CAATCTTTGATGTCGTCTGCGGTGAATACG NO. 41 CTAATCGTGTTTTCACCATCCTTGGCAAAGA
GAACGGTCTCCTGACTGTTGAACAAGCCGT GCTTGGCTTGCCGGGTATGGATCCCATGGA GAAAGACACCTCCCCTGGATTGCCCTACAC CCAACAAGGACTCAGACGAACTG
SEQ ID PPV CTAGGGCGCGCCAGTCCTCCAAACACTCAA NO. 42 CACACAGACCCGGAGGCTGTCGCTTCAGG
TGTGTCATCTATCACAGGTCCCATGTCGAC ATTTATGGCATCACCCACTGTTGAGGAACTT GCCGGAGACACATCAGATAGGTTGTTCCAG CTAATTGCAGGTAACTCATCCCTTATTACCC
AGGAGTCAGCACGACT SEQ ID Ana1 5' GaaaccaactttattactatattccccacaA NO. 43 SEQ ID Ana2 5' cgccggaaacgcaatagccgaaaaacaaaaaacaaaaaa NO. 44 (homolo- A gia inter- na) SEQ ID Ana2 3' aaaaaacaaaaaacaaaacggctattatgcgttaccggcg NO. 45 (homolo-
gia inter- na) SEQ ID Ana3 5' cgccggaaacgcaatagccgaaaaacaaaaaacaaaaaa NO. 46 Aacaaaaaaaaaaccaaaaaaacaaaacaca SEQ ID Ana4 5' cgccggaaacgcaatagccgaaaaacaaaaaacaaaaaa NO. 47 Aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa SEQ ID Ana5 5' TGATCTGaaaccaactttattactatattccccacaA NO. 48 (homolo- gia inter- na) SEQ ID Ana6 5' GaaaccaactttattactatattcctcttaA NO. 49 (PolioV) SEQ ID Ana7 5' GaaaccaactttattactggcatatccgtccccacaA NO. 50 SEQ ID Ana pA 5' aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa NO. 51 SEQ ID Ana pA 3' aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa NO. 52 SEQ ID Ana pAC acaaaaaaaaaaccaaaaaaacaaaacaca NO. 53 5' SEQ ID Ana pT 5' ttttttttttttttttttttttttttttttttt NO. 54 SEQ ID Ana pT 3' ttttttttttttttttttttttttttttttttt NO. 55 SEQ ID Ana pC 5' ccccccccccccccccccccccccccccccccc NO. 56 SEQ ID Ana pC 3' ccccccccccccccccccccccccccccccccc NO. 57 SEQ ID Ana pG 3' ggggggggggggggggggggggggggggggggg NO. 58 SEQ ID BG 5' ACATTTGCTTCTGACACAACTGTGTTCACTA NO. 59 GCAACCTCAAACAGACACC SEQ ID BG 3' gctcgctttcttgctgtccaatttctattaaaggttcctttgttccctaa NO. 60 gtccaactactaaactgggggatattatgaagggccttgagcat ctggattctgcctaataaaaaacatttattttcattgc
SEQ ID 5' HHV GGACAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACG NO. 61 (também CTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGA conhecido CCGATCCAGCCTCCGCGGCCGGGAACGGT simples- GCATTGGAACGCGGATTCCCCGTGCCAAG mente AGTGACTCACCGTCCTTGACACG como '5' UTR') SEQ ID 3' HGH CGGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAG NO. 62 (também TGCCTCTCCTGGCCCTGGAAGTTGCCACTC conhecido CAGTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAAT simples- TAAGTTGCATCAAGCT mente como '3' UTR') SEQ ID AL 5' ctagcttttctcttctgtcaaccccacacgcctttggcaca NO. 63 SEQ ID AL 3' CATCACATTTAAAAGCATCTCAGCCTACCAT NO. 64 GAGAATAAGAGAAAGAAAATGAAGATCAAA
AGCTTATTCATCTGTTTTTCTTTTTCGTTGGT GTAAAGCCAACACCCTGTCTAAAAAACATAA ATTTCTTTAATCATTTTGCCTCTTTTCTCTGT
GCTTCAATTAATAAAAAATGGAAAGAATCG SEQ ID Ana1 5' ccgtcgattgtccactggtc NO. 65 SEQ ID Ana1 3' gaccagtggacaatcgacgg NO. 66 SEQ ID T4 5' ine- aatctgataaat NO. 67 rente SEQ ID T4 3' ine- atttatcagatt NO. 68 rente SEQ ID T41 5' agcctacgatcgggctaacagctcgaatctgataaat NO. 69 SEQ ID T41 3' atttatcagattcgagctgttagcccgatcgtaggct NO. 70 SEQ ID T42 5' GAatggaattggttctaca NO. 71
SEQ ID T42 3' TGTAGGACTAATTCCATTT NO. 72 SEQ ID T4 5' Fra- ggttctaca NO. 73 co SEQ ID T4 3' Fra- TGTAGGACT NO. 74 co SEQ ID Ana2 5' ggtaactgtccgtcgattgtccactggtc NO. 75 SEQ ID Ana2 3' gaccagtggacaatcgacggacagttacc NO. 76
[00222] Wesselhoeft, R.A., et al., "RNA Circularization Diminishes Immunogenicity and Can Extend Translation Duration In Vivo," Molecu- lar Cell, vol. 74, pages 508-520 (2019) é incorporado neste documento por referência em sua totalidade.
[00223] Os ensinamentos de todas as patentes, pedidos publicados e referências citadas neste documento são incorporados por referência em sua totalidade.
[00224] Embora as modalidades de exemplo tenham sido particu- larmente mostradas e descritas, será entendido por aqueles versados na técnica que várias mudanças na forma e detalhes podem ser feitas nas mesmas, sem se afastar do escopo das modalidades abrangidas pelas reivindicações anexas.

Claims (62)

REIVINDICAÇÕES
1. Vetor para produzir o RNA circular, caracterizado pelo fato de que compreende os seguintes elementos operativamente co- nectados uns aos outros e dispostos na seguinte sequência: a) um braço de homologia 5’, b) um fragmento de íntron de Grupo I 3’ contendo um dinu- cleotídeo do sítio de junção 3', c) uma sequência espaçadora 5’, d) um sítio de entrada do ribossomo interno (IRES), e) uma região de codificação de proteína ou região de não codificação, f) uma sequência espaçadora 3’, g) um fragmento de íntron de Grupo I 5’ contendo um dinu- cleotídeo do sítio de junção 5', e h) um braço de homologia 3’, o referido vetor permite a produção de um RNA circular que é transladável ou biologicamente ativo dentro das células eucarióticas.
2. Vetor, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o fragmento de íntron de Grupo I 3’ e o fragmento de íntron de Grupo I 5' são de um gene de Cyanobacterium Anabaena sp. pré-tRNA-Leu ou gene Td do fago T4.
3. Vetor, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o fragmento de íntron de Grupo I 3’ e o fragmento de íntron de Grupo I 5' são de um gene de Cyanobacterium Anabaena sp. pré-tRNA-Leu.
4. Vetor, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o fragmento de íntron de Grupo I 3’ e o fragmento de íntron de Grupo I 5' são de um gene Td do fago T4.
5. Vetor, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o IRES é selecionado a partir de uma sequência de
IRES do vírus da síndrome de Taura, vírus do Triatoma, vírus da ence- falomielite de Theiler, Vírus símio 40, vírus de Solenopsis invicta 1, ví- rus de Rhopalosiphum padi, vírus da Reticuloendoteliose, poliovírus humano 1, vírus do intestino de Plautia stali, vírus da abelha da Caxe- mira, rinovírus Humano 2, vírus-1 Homalodisca coagulata, Vírus da Imunodeficiência Humana tipo 1, vírus-1 de Homalodisca coagulata, vírus de Himetobi P, vírus da Hepatite C, Vírus da hepatite A, Vírus da hepatite GB, vírus da doença do pé e boca, Enterovírus humano 71, Vírus da rinite equina, Vírus tipo Ectropis obliqua picorna, Vírus da En- cefalomiocardite (EMCV), Vírus de Drosophila C, Vírus de Crucifer to- bamo, Vírus de Cricket paralysis, Vírus da diarreia viral bovina 1, Vírus da Célula Rainha Negra, Vírus da paralisia letal por afídeo, Vírus da encefalomielite aviária, Vírus da paralisia da abelha aguda, Vírus da mancha do anel clorótico de Hibiscus, Vírus da febre suína clássica, FGF2 Humano, SFTPAl Humano, AMLl/RUNXl Humano, Drosophila antennapedia, AQP4 Humano, AT1R Humano, BAG-1 Humano, BCL2 Humano, BiP Humano, c-IAPl Humano, c-myc Humano, eIF4G Huma- no, NDST4L de Rato, LEF1 Humano, HIF1 alfa de Rato, n.myc Huma- no, Gtx de Rato, P27kipl Humano, PDGF2/c-sis Humano, p53 Huma- no, Pim-1 Humano, Rbm3 de Rato, Drosophila reaper, Scamper Cani- no, Drosophila Ubx, Salivirus, Cosavirus, Parechovirus, UNR Humano, UtrA de Camundongo, VEGF-A Humano, XIAP Humano, Drosophila hairless, TFIID de S. cerevisiae, YAP1 de S. cerevisiae, c-src Humano, FGF-1 Humano, Picomavirus de Símio, Vírus Turnip crinkle, um aptâ- mero para eIF4G, Coxsackievirus B3 (CVB3) ou Coxsackievirus A (CVB1/2).
6. Vetor de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pe- lo fato de que o IRES é uma sequência de IRES de Coxsackievirus B3 (CVB3).
7. Vetor, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o IRES é uma sequência de IRES do vírus da encefa- lomiocardite (EMCV).
8. Vetor, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a região de codificação da proteína ou região de não codificação é uma região de codificação da proteína que codifica uma proteína eucariótica ou uma proteína procariótica.
9. Vetor, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a região de codificação de proteína ou região de não codificação é uma região de codificação de proteína que codifica uma proteína humana ou uma proteína não humana.
10. Vetor, de acordo com a reivindicação 8 ou 9, caracteri- zado pelo fato de que a região de codificação da proteína codifica um anticorpo.
11. Vetor, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a proteína humana ou proteína não humana é seleci- onada a partir de hFIX, SP-B, VEGF-A, metilmalonil-CoA mutase hu- mana (hMUT), CFTR, autoantígenos de câncer e enzimas de edição de genes como Cpf1, nucleases de dedo de zinco (ZFNs) e nucleases efetoras similares a ativadores de transcrição (TALENs).
12. Vetor, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 11, caracterizado pelo fato de que a proteína é uma proteína para uso terapêutico.
13. Vetor, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo anti-HIV humano.
14. Vetor, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo biespecífico.
15. Vetor, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o anticorpo biespecífico se liga a CD3 e CLDN6 ou se liga a CD19 e CD22.
16. Vetor, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a proteína é uma proteína para uso em diagnóstico.
17. Vetor, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a região de codificação da proteína codifica a Gaussia luciferase (Gluc), Vagalume luciferase (Fluc), proteína fluorescente verde realçada (eGFP), eritropoetina humana (hEPO) ou Cas9 endo- nuclease.
18. Vetor, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que cada braço de homologia tem cerca de 5-50 nucleotí- deos no comprimento.
19. Vetor, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que cada braço de homologia tem cerca de 9-19 nucleotí- deos no comprimento.
20. Vetor, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que cada sequência espaçadora tem pelo menos 10 nu- cleotídeos no comprimento.
21. Vetor, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que cada sequência espaçadora tem pelo menos 15 nu- cleotídeos no comprimento.
22. Vetor, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que cada sequência espaçadora tem pelo menos 30 nu- cleotídeos no comprimento.
23. Vetor, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma sequência espaçadora é uma se- quência polyA.
24. Vetor, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma sequência espaçadora é uma se- quência polyA-C.
25. Vetor, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um promotor de RNA polimerase posicionado a montante do braço de homologia 5’.
26. Vetor, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o promotor de RNA polimerase é um promotor de RNA polimerase do vírus T7, vírus T6, vírus SP6, vírus T3 ou vírus T4.
27. Vetor, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o vetor é usado para transcrever RNA circular com uma faixa de tamanho de cerca de 500 a cerca de 10.000 nt.
28. Vetor, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o IRES é um IRES de Coxsackievirus B3 (CVB3), a região de codificação codifica a luciferase de Guassia (Gluc) e as se- quências espaçadoras são polyA-C.
29. Vetor, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o fragmento de íntron 3’ compreende uma sequência derivada de íntron de Grupo I 3’-proximal incluindo o dinucleotídeo do sítio de junção 3’ e opcionalmente a sequência correspondente ao éxon natural adjacente, e o fragmento de íntron 5' compreende uma sequência derivada do íntron de Grupo I 5’-proximal incluindo o dinu- cleotídeo do sítio de junção 5' e opcionalmente a sequência corres- pondente ao éxon adjacente.
30. RNA circular, caracterizado pelo fato de que é produzi- do pelo vetor como definido na reivindicação 1.
31. RNA circular, de acordo com a reivindicação 30, carac- terizado pelo fato de que tem pelo menos cerca de 1 kb.
32. Método de expressão de proteína em uma célula, , ca- racterizado pelo fato de que o referido método compreende a transfec- ção do RNA circular como definido na reivindicação 30 na célula.
33. Método, de acordo com a reivindicação 32, caracteriza- do pelo fato de que o RNA circular é transfectado na célula usando lipofecção ou eletroporação.
34. Método, de acordo com a reivindicação 32, caracteriza- do pelo fato de que o RNA circular é transfectado na célula usando um nanotransportador.
35. Método, de acordo com a reivindicação 34, caracteriza- do pelo fato de que o nanotransportador é um lipídio, polímero ou um híbrido lipo-polimérico.
36. Método, de acordo com a reivindicação 30, caracteriza- do pelo fato de que o RNA circular compreende um IRES de coxsacki- evírus B3.
37. Método de purificação do RNA circular, como definido na reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que funciona o RNA através de uma coluna de exclusão por tamanho em tris-EDTA ou tampão de citrato em um sistema de cromatografia líquida de alto de- sempenho (HPLC).
38. Método, de acordo com a reivindicação 37, caracteriza- do pelo fato de que o RNA é executado através da coluna de exclusão por tamanho em tris-EDTA ou tampão de citrato a um pH na faixa de cerca de 4-7 a uma taxa de fluxo de cerca de 0,01-5mL/minuto.
39. Vetor para produzir o RNA circular, caracterizado pelo fato de que o referido vetor compreende os seguintes elementos ope- rativamente conectados uns aos outros e dispostos na seguinte se- quência: a) um braço de homologia 5’, b) um fragmento de íntron de Grupo I 3’ contendo um dinu- cleotídeo do sítio de junção 3', c) uma sequência espaçadora 5’, d) um sítio de entrada do ribossomo interno (IRES), e) uma região de codificação de proteína ou região de não codificação, f) um fragmento de íntron de Grupo I 5’ contendo um dinu- cleotídeo do sítio de junção 5', e g) um braço de homologia 3’,
o referido vetor permite a produção de um RNA circular que é transladável dentro das células eucarióticas.
40. Vetor para produzir o RNA circular, caracterizado pelo fato de que o referido vetor compreende os seguintes elementos ope- rativamente conectados uns aos outros e dispostos na seguinte se- quência: a) um braço de homologia 5’, b) um fragmento de íntron de Grupo I 3’ contendo um dinu- cleotídeo do sítio de junção 3', c) um sítio de entrada do ribossomo interno (IRES), d) uma região de codificação de proteína ou região de não codificação, e) uma sequência espaçadora 3’, f) um fragmento de íntron de Grupo I 5’ contendo um dinu- cleotídeo do sítio de junção 5', e g) um braço de homologia 3’, o referido vetor permite a produção de um RNA circular que é transladável dentro das células eucarióticas.
41. Método de purificação de RNA circular, caracterizado pelo fato de que o referido método compreende: executar o RNA circu- lar através de uma coluna de exclusão por tamanho em tris-EDTA ou tampão de citrato em um sistema de cromatografia líquida de alto de- sempenho (HPLC) e tratar o RNA circular com fosfatase após a exe- cução do RNA circular através da coluna de exclusão por tamanho, produzindo assim o RNA circular purificado.
42. Método, de acordo com a reivindicação 41, caracteriza- do pelo fato de que o tratamento com fosfatase é seguido por trata- mento com RNase R.
43. Método, de acordo com a reivindicação 41, caracteriza- do pelo fato de que o RNA circular purificado é formulado em nanopar-
tículas.
44. Método, de acordo com a reivindicação 41, caracteriza- do pelo fato de que o RNA circular é executado através da coluna de exclusão por tamanho a um pH na faixa de cerca de 4-8.
45. Método, de acordo com a reivindicação 44, caracteriza- do pelo fato de que o RNA circular é executado através da coluna de exclusão por tamanho a uma taxa de fluxo de cerca de 0,01-5,0 mL/minuto.
46. Método de produção de RNA circular do RNA precursor transcrito de um vetor, caracterizado pelo fato de que compreende os seguintes elementos operativamente conectados uns aos outros e dis- postos na seguinte sequência: a) um braço de homologia 5’, b) um fragmento de íntron de Grupo I 3’ contendo um dinu- cleotídeo do sítio de junção 3', c) uma sequência espaçadora 5’, d) uma região de codificação de proteína ou região de não codificação, e) uma sequência espaçadora 3’, f) um fragmento de íntron de Grupo I 5’ contendo um dinu- cleotídeo do sítio de junção 5', e g) um braço de homologia 3’, o método compreendendo a incubação do RNA precursor na presença de íons de magnésio e nucleotídeo ou nucleosídeo de quanosina a uma temperatura na qual ocorre a circularização de RNA.
47. Método, de acordo com a reivindicação 46, caracteriza- do pelo fato de que o vetor compreende ainda um sítio de entrada do ribossomo interno (IRES) entre a sequência espaçadora 5' e a região de codificação da proteína.
48. Método, de acordo com a reivindicação 46, caracteriza-
do pelo fato de que os nucleosídeos do RNA precursor não são modi- ficados.
49. Método, de acordo com a reivindicação 46, caracteriza- do pelo fato de que o RNA precursor contém pelo menos uma modifi- cação de nucleosídeo.
50. Método, de acordo com a reivindicação 49, caracteriza- do pelo fato de que até 100% dos nucleosídeos do RNA precursor são modificados.
51. Método, de acordo com a reivindicação 49, caracteriza- do pelo fato de que pelo menos uma modificação de nucleosídeo é uma modificação de uridina ou uma modificação de adenosina.
52. Método, de acordo com a reivindicação 49, caracteriza- do pelo fato de que pelo menos uma modificação de nucleosídeo é selecionada a partir de N6-metiladenosina (m6A), pseudouridina (), N1-metilpseudouridina (m1) e 5-metoxiuridina (5moU).
53. Método, de acordo com a reivindicação 49, caracteriza- do pelo fato de que o RNA precursor é modificado com metilpseudou- ridina (m1).
54. RNA circular, caracterizado pelo fato de que é produzi- do pelo método como definido na reivindicação 49.
55. Método de expressão de proteína em uma célula, ca- racterizado pelo fato de que o referido método compreende a transfec- ção do RNA circular como definido na reivindicação 54 na célula.
56. Método de produção de RNA circular com eficiência de translação realçada, caracterizado pelo fato de que o referido método compreende a incorporação de nucleosídeos artificiais em um RNA precursor durante a transcrição de um vetor que codifica o RNA pre- cursor e a circularização do RNA precursor para formar o RNA circular.
57. Método de produção de RNA circular com estabilidade de expressão de proteína realçada, caracterizado pelo fato de que o referido método compreende a incorporação de nucleosídeos artificiais em um RNA precursor durante a transcrição de um vetor que codifica o RNA precursor e circularização do RNA precursor para formar o RNA circular.
58. Método de produção de RNA circular com imunogenici- dade reduzida, caracterizado pelo fato de que o referido método com- preende a incorporação de nucleosídeos artificiais em um RNA pre- cursor durante a transcrição de um vetor que codifica o RNA precursor e circularização do RNA precursor para formar o RNA circular.
59. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 56 a 58, caracterizado pelo fato de que os nucleosídeos artificiais compreendem pelo menos uma uridina modificada ou nucleosídeo de adenosina.
60. Método de produção de RNA circular, caracterizado pe- lo fato de que compreende a sintetização do RNA precursor de ligação por splint usando uma concentração em excesso de um monofosfato de nucleotídeo em relação ao trifosfato de nucleotídeo análogo.
61. Método, de acordo com a reivindicação 60, caracteriza- do pelo fato de que o nucleotídeo é monofosfato de guanosina.
62. Vetor para produzir o RNA circular, caracterizado pelo fato de que o referido vetor compreende os seguintes elementos ope- rativamente conectados uns aos outros e dispostos na seguinte se- quência: a) um braço de homologia 5’, b) um fragmento de íntron de Grupo I 3’ contendo um dinu- cleotídeo do sítio de junção 3', c) uma sequência espaçadora 5' opcional, d) um sítio de entrada do ribossomo interno opcional (IRES), e) uma região de codificação de proteína ou região de não codificação, f) uma sequência espaçadora 3’ opcional, g) um fragmento de íntron de Grupo I 5’ contendo um dinu- cleotídeo do sítio de junção 5', e h) um braço de homologia 3’, o referido vetor permite a produção de um RNA circular que é transladável dentro das células eucarióticas.
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