CN118256490A - 一种环状rna、组合物和治疗疾病的方法 - Google Patents

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R·A·韦塞尔赫夫特
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Abstract

本发明涉及一种环状RNA、组合物和治疗疾病的方法，所述环状RNA包含按以下顺序排列的以下元件：a)3'I组自剪接内含子‑外显子的相邻外显子序列，b)内部核糖体进入位点(IRES)，c)蛋白质编码区或非编码区，和d)5'I组自剪接内含子‑外显子的相邻外显子序列。公开了用于工程化的环状RNA的方法和构建体。

Description

一种环状RNA、组合物和治疗疾病的方法
本申请是分案申请，其原申请的国际申请号为PCT/US2019/035531，中国国家申请号为201980037613.3，申请日为2019年6月5日，发明名称为“用于在真核细胞中翻译的环状RNA”。
相关申请
本申请要求于2019年5月22日提交的美国临时申请62/851,548、2019年1月10日提交的美国临时申请62/791,028和2018年6月6日提交的美国临时申请62/681,617的权益。上述申请的全部教导通过引用并入本文。
通过引用并入ASCII文本文件中的材料。
本申请通过引用并入与此同时提交的以下ASCII文本文件中包含的序列表：
a)文件名：00502311003_FinalSequenceListing.txt；创建于2019年6月4日，大小为55KB。
政府支持
本发明是在美国国防部先进研究项目局的W32P4Q-13-1-0011和美国国立卫生研究院的5R01HL125428的政府支持下完成的。政府拥有本发明的某些权利。
技术领域
本发明涉及一种环状RNA、组合物和治疗疾病的方法。
背景技术
信使RNA(mRNA)具有广泛的治疗和工程应用潜力。然而，对其使用的一个基本限制是其在生物系统中相对较短的半衰期。因此，需要从全长RNA信息中延长蛋白质表达的持续时间。
发明内容
在某些方面，本文提供了用于制备环状RNA(circRNA)的载体。
在某些实施方式中，所述载体包含以下彼此可操作地连接的元件，并且在某些实施方式中，以下列顺序排列：a.)5'同源臂，b.)3'I组内含子片段，其包含3'剪接位点二核苷酸，c.)蛋白质编码或非编码区，d.)5'I组内含子片段，其包含5'剪接位点二核苷酸，和e.)3'同源臂。在某些实施方式中，所述载体允许在真核细胞内产生可翻译和/或具有生物学活性的环状RNA。在某些实施方式中，生物活性RNA是例如miRNA海绵或长的非编码RNA。
在某些实施方式中，所述载体包含以下彼此可操作地连接并按以下顺序排列的元件：a.)5'同源臂，b.)3'I组内含子片段，其包含3'剪接位点二核苷酸，c.)可选地，5'间隔子序列，d.)可选地，内部核糖体进入位点(IRES)，e.)蛋白质编码或非编码区，f.)可选地，3'间隔子序列，g.)5'I组内含子片段，其包含5'剪接位点二核苷酸，和h.)3'同源臂。在某些实施方式中，所述载体允许在真核细胞内产生可翻译和/或具有生物学活性的环状RNA。
在某些实施方式中，所述载体包含以下彼此可操作地连接并按以下顺序排列的元件：a.)5'同源臂，b.)3'I组内含子片段，其包含3'剪接位点二核苷酸，c.)5'间隔子序列，d.)内部核糖体进入位点(IRES)，e.)蛋白质编码或非编码区，f.)5'I组内含子片段，其包含5'剪接位点二核苷酸，和g.)3'同源臂。在某些实施方式中，所述载体允许在真核细胞内产生可翻译和/或具有生物学活性的环状RNA。
在某些实施方式中，所述载体包含以下彼此可操作地连接并按以下顺序排列的元件：a.)5'同源臂，b.)3'I组内含子片段，其包含3'剪接位点二核苷酸，c.)5'间隔子序列，d.)蛋白质编码或非编码区，e.)3'间隔子序列，f.)5'I组内含子片段，其包含5'剪接位点二核苷酸，和g.)3'同源臂。在某些实施方式中，所述载体允许在真核细胞内产生可翻译和/或具有生物学活性的环状RNA。
在某些实施方式中，所述载体包含以下彼此可操作地连接并按以下顺序排列的元件：a.)5'同源臂，b.)3'I组内含子片段，其包含3'剪接位点二核苷酸，c.)内部核糖体进入位点(IRES)，d.)蛋白质编码或非编码区，e.)3'间隔子序列，f.)5'I组内含子片段，其包含5'剪接位点二核苷酸，和g.)3'同源臂。在某些实施方式中，所述载体允许在真核细胞内产生可翻译和/或具有生物学活性的环状RNA。
在某些实施方式中，所述载体包含以下彼此可操作地连接并按以下顺序排列的元件：a.)5'同源臂，b.)3'I组内含子片段，其包含3'剪接位点二核苷酸，c.)蛋白质编码或非编码区，d.)3'间隔子序列，e.)5'I组内含子片段，其包含5'剪接位点二核苷酸，和f.)3'同源臂。在某些实施方式中，所述载体允许在真核细胞内产生可翻译和/或具有生物学活性的环状RNA。
在某些实施方式中，所述载体包含以下彼此可操作地连接并按以下顺序排列的元件：a.)5'同源臂，b.)3'I组内含子片段，其包含3'剪接位点二核苷酸，c.)5'间隔子序列，d.)蛋白质编码或非编码区，e.)5'I组内含子片段，其包含5'剪接位点二核苷酸，和f.)3'同源臂。在某些实施方式中，所述载体允许在真核细胞内产生可翻译和/或具有生物学活性的环状RNA。
在某些实施方式中，所述载体包含以下彼此可操作地连接并按以下顺序排列的元件：a.)5'同源臂，b.)3'I组内含子片段，其包含3'剪接位点二核苷酸，c.)内部核糖体进入位点(IRES)，d.)蛋白质编码或非编码区，e.)5'I组内含子片段，其包含5'剪接位点二核苷酸，和f.)3'同源臂。在某些实施方式中，所述载体允许在真核细胞内产生可翻译和/或具有生物学活性的环状RNA。
在某些实施方式中，所述载体包含以下彼此可操作地连接并按以下顺序排列的元件：a.)5'同源臂，b.)3'I组内含子片段，其包含3'剪接位点二核苷酸，c.)5'间隔子序列，d.)内部核糖体进入位点(IRES)，e.)蛋白质编码或非编码区，f.)3'间隔子序列，g.)5'I组内含子片段，其包含5'剪接位点二核苷酸，和g.)3'同源臂。在某些实施方式中，所述载体允许在真核细胞内产生可翻译和/或具有生物学活性的环状RNA。
在一个实施方式中，所述3'I组内含子片段和/或5'I组内含子片段来自蓝藻鱼腥藻属pre-tRNA-Leu基因或T4噬菌体Td基因。
在一个实施方式中，所述3'I组内含子片段和/或5'I组内含子片段来自蓝藻鱼腥藻属pre-tRNA-Leu基因。
在另一实施方式中，如果存在，则IRES序列是以下的IRES序列：Taura综合征病毒、吸血猎蝽(Triatoma)病毒、泰累尔氏(Theiler)脑脊髓炎病毒、猿猴病毒40、红火蚁病毒1、禾谷缢管蚜病毒、网状内皮增生症病毒、福曼脊髓灰质炎病毒1、大豆尺蠖病毒、克什米尔蜂病毒、人鼻病毒2、琉璃叶蝉病毒-1、人免疫缺陷病毒1型、琉璃叶蝉病毒-1、虱P病毒、丙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒、GB型肝炎病毒、口蹄疫病毒、人肠道病毒71、马鼻病毒、茶尺蠖样病毒、脑心肌炎病毒(EMCV)、果蝇C病毒、十字花科烟草病毒、蟋蟀麻痹病毒、牛病毒性腹泻病毒1、黑皇后细胞病毒、蚜虫致死麻痹病毒、禽脑脊髓炎病毒、急性蜂麻痹病毒、芙蓉枯黄环斑病毒、猪瘟病毒、人类FGF2、人类SFTPA1、人类AMLl/RUNXl、果蝇触角足(Drosophilaantennapedia)、人类AQP4、人类AT1R、人类BAG-1、人类BCL2、人类BiP、人类c-IAPl、人类c-myc、人类eIF4G、小鼠NDST4L、人类LEF1、小鼠HIF1α、人类n.myc、小鼠Gtx、人类p27kipl、人类PDGF2/c-sis、人类p53、人类Pim-1、小鼠Rbm3、果蝇reaper、犬Scamper、果蝇Ubx、人类UNR、小鼠UtrA、人类VEGF-A、人类XIAP、唾液病毒、柯萨病毒、双埃柯病毒、果蝇hairless、酿酒酵母TFIID、酿酒酵母YAP1、人类c-src、人类FGF-1、猿猴小核糖核酸病毒、芜菁绉缩病病毒、eIF4G的适体、柯萨奇病毒B3(CVB3)或柯萨奇病毒A (CVB1/2)。在另一实施方式中，IRES是柯萨奇病毒B3(CVB3)的IRES序列。在另一实施方式中，IRES是脑心肌炎病毒的IRES序列。
在一个实施方式中，蛋白质编码区编码真核或原核来源的蛋白质。在另一实施方式中，蛋白质编码区编码人蛋白质或非人蛋白质。在某些实施方式中，蛋白质编码区编码一种或多种抗体。例如，在某些实施方式中，蛋白质编码区编码人抗体。在一个实施方式中，蛋白质编码区编码选自以下的蛋白质：hFIX、SP-B、VEGF-A、人甲基丙二酰辅酶A变异酶(hMUT)、CFTR、癌症自身抗原以及其他基因编辑酶，如Cpf1、锌指核酸酶(ZFNs)和转录激活因子样效应蛋白核酸酶(TALENs)。另一实施方式中，蛋白质编码区编码用于治疗用途的蛋白质。在一个实施方式中，由蛋白质编码区编码的人抗体是抗HIV抗体。在一个实施方式中，由蛋白质编码区编码的抗体是双特异性抗体。在一个实施方式中，所述双特异性抗体对CD19和CD22具有特异性。在另一实施方式中，所述双特异性抗体对CD3和CLDN6具有特异性。在一个实施方式中，蛋白质编码区编码用于诊断用途的蛋白质。在一个实施方式中，蛋白质编码区编码高斯荧光素酶(Gluc)、萤火虫荧光素酶(Fluc)、增强型绿色荧光蛋白(eGFP)、人促红细胞生成素(hEPO)或Cas9核酸内切酶。
在一个实施方式中，5'同源臂的长度为约5-50个核苷酸。在另一实施方式中，5'同源臂的长度为约9-19个核苷酸。在某些实施方式中，5'同源臂的长度为至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19个核苷酸。在某些实施方式中，5'同源臂的长度不超过50、45、40、35、30、25或20个核苷酸。在某些实施方式中，5'同源臂的长度为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19个核苷酸。
在一个实施方式中，3'同源臂的长度为约5-50个核苷酸。在另一实施方式中，3'同源臂的长度为约9-19个核苷酸。在某些实施方式中，3'同源臂的长度为至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19个核苷酸。在某些实施方式中，3'同源臂的长度不超过50、45、40、35、30、25或20个核苷。在某些实施方式中，3'同源臂的长度为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19个核苷酸。
在一个实施方式中，5'间隔子序列的长度为至少10个核苷酸。在另一实施方式中，5'间隔子序列的长度为至少15个核苷酸。在另一实施方式中，5'间隔子序列的长度为至少30个核苷酸。在某些实施方式中，5'间隔子序列的长度为至少7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25或30个核苷酸。在某些实施方式中，5'间隔子序列的长度不超过100、90、80、70、60、50、45、40、35或30个核苷酸。在某些实施方式中，5'间隔子序列的长度为20至50个核苷酸。在某些实施方式中，5'间隔子序列的长度为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸。在一个实施方式中，5'间隔子序列是polyA序列。在另一实施方式中，5'间隔子序列是polyA-C序列。
在一个实施方式中，3'间隔子序列的长度为至少10个核苷酸。在另一实施方式中，3'间隔子序列的长度为至少15个核苷酸。在另一实施方式中，3'间隔子序列的长度为至少30个核苷酸。在某些实施方式中，3'间隔子序列的长度为至少7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25或30个核苷酸。在某些实施方式中，3'间隔子序列的长度不超过100、90、80、70、60、50、45、40、35或30个核苷酸。在某些实施方式中，3'间隔子序列的长度为20至50个核苷酸。在某些实施方式中，3'间隔子序列的长度为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸。在一个实施方式中，3'间隔子序列是polyA序列。在另一实施方式中，5'间隔子序列是polyA-C序列。
在一个实施方式中，载体还包含RNA聚合酶启动子。在另一实施方式中，RNA聚合酶启动子是T7病毒RNA聚合酶启动子、T6病毒RNA聚合酶启动子、SP6病毒RNA聚合酶启动子、T3病毒RNA聚合酶启动子或T4病毒RNA聚合酶启动子。
在一个实施方式中，载体用于转录大小范围为约500至约10,000个核苷酸的环状RNA。在某些实施方式中，环状RNA的大小为至少500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1,000、1,100、1,200、1,300、1,400、1,500、1,600、1,700、1,800、1,900、2,000、2,500、3,000、3,500、4,000、4,500或5,000个核苷酸。在某些实施方式中，环状RNA的大小不超过10,000、9,000、8,000、7,000、6,000、5,000或4,000个核苷酸。
在另一实施方式中，IRES是来自柯萨奇病毒B3(CVB3)的IRES序列，蛋白质编码区编码高斯荧光素酶(Gluc)，间隔子序列是polyA-C。
在某些实施方式中，如果存在，IRES的长度为至少约50个核苷酸。在一个实施方式中，载体包含含有天然序列的IRES。在一个实施方式中，载体包含IRES，其包含合成序列。
在一个实施方式中，本发明涉及一种用于制备环状RNA的载体，所述载体包含以下彼此可操作地连接并按以下顺序排列的元件：a.)5'同源臂，b.)3'I组内含子片段，其包含3'剪接位点二核苷酸，c.)5'间隔子序列，d.)内部核糖体进入位点(IRES)，e.)蛋白质编码或非编码区，f.)5'I组内含子片段，其包含5'剪接位点二核苷酸，和g.)3'同源臂。在某些实施方式中，所述载体允许在真核细胞内产生可翻译和/或具有生物学活性的环状RNA。
在一个实施方式中，本发明涉及一种用于制备环状RNA的载体，所述载体包含以下彼此可操作地连接并按以下顺序排列的元件：a.)5'同源臂，b.)3'I组内含子片段，其包含3'剪接位点二核苷酸，c.)内部核糖体进入位点(IRES)，d.)蛋白质编码或非编码区，e.)间隔子(例如第二间隔子)序列，f.)5'I组内含子片段，其包含5'剪接位点二核苷酸，和g.)3'同源臂。在某些实施方式中，所述载体允许在细胞(例如，真核细胞)内产生可翻译和/或具有生物学活性的环状RNA。
在某些实施方式中，本文提供的载体不包含多克隆位点(MCS)。
在一个实施方式中，本发明涉及环状RNA。在某些实施方式中，所述环状RNA是由本文提供的载体产生的环状RNA。在某些实施方式中，所述环状RNA按以下顺序包含：a.)5'间隔子序列，b.)内部核糖体进入位点(IRES)，c.)蛋白质编码或非编码区，和d.)3'间隔子序列。在某些实施方式中，所述环状RNA还包含3'I组内含子片段的部分，其是3'剪接位点二核苷酸的3'。在某些实施方式中，所述环状RNA还包含5'I组内含子片段的部分，其是5'剪接位点二核苷酸的5'。在某些实施方式中，所述环状RNA为至少500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000或4500个核苷酸。在一个实施方式中，所述环状RNA为至少约10个核苷酸。在一个实施方式中，所述环状RNA为约500nt或小于500nt。在一个实施方式中，所述环状RNA为至少约1kb。所述环状RNA可以是未修饰的，部分修饰的或完全修饰的。在一个实施方式中，所述环状RNA包含至少一种核苷修饰。在一个实施方式中，环状RNA的至多100％的核苷被修饰。在一个实施方式中，至少一种核苷修饰是尿苷修饰或腺苷修饰。在一个实施方式中，至少一种核苷修饰选自N6-甲基腺苷(m6A)、假尿苷(ψ)、N1-甲基假尿苷(m1ψ)和5-甲氧基尿苷(5moU)。在一个实施方式中，前体RNA用甲基假尿苷(m1ψ)修饰。
在另一实施方式中，本发明涉及在细胞中表达蛋白质的方法，所述方法包括将环状RNA转染到细胞中。在一个实施方式中，所述方法包括使用脂质转染或电穿孔进行转染。在另一实施方式中，使用纳米载体将环状RNA转染到细胞中。在另一实施方式中，纳米载体是脂质、聚合物或脂质-聚合物杂化物(lipo-polymeric hybrid)。在另一实施方式中，所述环状RNA包含柯萨奇病毒B3 IRES。
在一个实施方式中，本发明涉及一种纯化环状RNA的方法，该方法包括使RNA通过高效液相色谱(HPLC)系统中的tris-EDTA或柠檬酸盐缓冲液中的尺寸排阻柱。在另一实施方式中，使RNA在约4-7范围内的pH下在tris-EDTA或柠檬酸盐缓冲液中以约0.01-5mL/分钟的流速通过尺寸排阻柱。在一个实施方式中，HPLC去除以下一种或多种：内含子片段、带切口的线性RNA、线性和环状连接以及由体外转录和剪接反应产生的杂质。
在一个实施方式中，本文提供了一种前体RNA。在某些实施方式中，前体RNA是通过将本文提供的载体进行体外转录产生的环状RNA。在某些实施方式中，前体RNA按以下顺序包含：a.)5'同源臂，b.)3'I组内含子片段，其包含3'剪接位点二核苷酸，c.)5'间隔子序列，d.)内部核糖体进入位点(IRES)，e.)蛋白质编码或非编码区，f.)3'间隔子序列，f.)5'I组内含子片段，其包含5'剪接位点二核苷酸，和g.)3'同源臂。所述前体RNA可以是未修饰的，部分修饰的或完全修饰的。在一个实施方式中，所述前体RNA包含至少一种核苷修饰。在一个实施方式中，前体RNA的至多100％的核苷被修饰。在一个实施方式中，至少一种核苷修饰是尿苷修饰或腺苷修饰。在一个实施方式中，至少一种核苷修饰选自N6-甲基腺苷(m6A)、假尿苷(ψ)、N1-甲基假尿苷(m1ψ)和5-甲氧基尿苷(5moU)。在一个实施方式中，前体RNA用甲基假尿苷(m1ψ)修饰。
在另一实施方式中，本发明涉及纯化环状RNA的方法，所述方法包括：使环状RNA(例如，本文提供的环状RNA)通过高效液相色谱(HPLC)系统中的tris-EDTA或柠檬酸盐缓冲液中的尺寸排阻柱，并且在环状RNA通过尺寸排阻柱后，用磷酸酶处理所述环状RNA，从而产生纯化的环状RNA。在一个实施方式中，磷酸酶处理后是RNA酶R处理。在一个实施方式中，将纯化的环状RNA配制成纳米颗粒。在一个实施方式中，环状RNA在约4-8的pH下通过尺寸排阻柱。在一个实施方式中，环状RNA以约0.01-5.0mL/分钟的流速通过尺寸排阻柱。
在某些实施方式中，本文的方法中所用的HPLC可包括水性缓冲液，其包含盐，如磷酸盐缓冲液，其pH在约4至约7.5之间。
在另一实施方式中，本发明涉及由前体RNA制备环状RNA的方法，所述方法包括使用本文提供的载体。在某些实施方式中，所述方法包括a.)通过载体的体外转录合成前体RNA，和b.)在存在镁离子和鸟苷酸(quanosine nuleotide)或核苷的情况下，在RNA环化发生的温度(例如，20℃至60℃之间)下温育前体RNA。在某些实施方式中，所述载体包含以下彼此可操作地连接并按以下顺序排列的元件：a)5'同源臂，b)3'I组内含子片段，其包含3'剪接位点二核苷酸，c)5'间隔子序列，d)蛋白质编码或非编码区，e)3'间隔子序列，f)5'I组内含子片段，其包含5'剪接位点二核苷酸，和g)3'同源臂，所述载体允许在真核细胞内可翻译的环状RNA的产生。在一个实施方式中，所述方法还包含在5'间隔子序列和蛋白质编码区之间的内部核糖体进入位点(IRES)。
在一个实施方式中，本发明涉及从通过本文提供的载体的体外转录产生的前体RNA制备环状RNA的方法。在某些实施方式中，所述方法包括在存在镁离子和鸟苷核苷酸或核苷的情况下，在RNA环化发生的温度(例如，20℃至60℃之间)下温育前体RNA。在某些实施方式中，所述前体RNA的核苷是未修饰的。所述前体RNA可以是未修饰的，部分修饰的或完全修饰的。在一个实施方式中，所述前体RNA可以是天然存在的。在一个实施方式中，所述前体RNA包含至少一种核苷修饰。在一个实施方式中，前体RNA的至多100％的核苷被修饰。在一个实施方式中，至少一种核苷修饰是尿苷修饰或腺苷修饰。在一个实施方式中，至少一种核苷修饰选自N6-甲基腺苷(m6A)、假尿苷(ψ)、N1-甲基假尿苷(m1ψ)和5-甲氧基尿苷(5moU)。在一个实施方式中，前体RNA用甲基假尿苷(m1ψ)修饰。
在一个实施方式中，本发明涉及通过本文公开的载体和/或方法产生的环状RNA。在一个实施方式中，本发明涉及包含本文提供的环状RNA(例如，通过载体、前体RNA和/或本文公开的方法产生的环状RNA)的组合物，例如，药物组合物。
在一个实施方式中，本发明涉及在细胞中表达蛋白质的方法，所述方法包括将本文提供的环状RNA转染到细胞中。
如本文所用，“前体RNA”是指通过体外转录(例如，由本文提供的载体)产生的线性RNA分子。该前体RNA分子包含完整的circRNA序列，以及使RNA环化所需的剪接序列(内含子片段和同源臂)。这些剪接序列(内含子片段和同源臂)在环化过程中从前体RNA中除去，产生circRNA和两个内含子/同源臂线性RNA片段。前体RNA可以是未修饰的，部分修饰的或完全修饰的。在一个实施方式中，前体RNA仅包含天然存在的核苷酸。
在一个实施方式中，本发明涉及一种制备具有提高的翻译效率的环状RNA的方法，所述方法包括在编码前体RNA的载体的转录过程中将人工核苷掺入前体RNA中并环化前体RNA以形成环状RNA。
在另一实施方式中，本发明涉及制备具有增强的蛋白质表达稳定性的环状RNA的方法，所述方法包括在编码前体RNA的载体的转录过程中将人工核苷掺入前体RNA中并环化前体RNA以形成环状RNA。
在另一实施方式中，本发明涉及制备具有降低的免疫原性的环状RNA的方法，所述方法包括在编码前体RNA的载体的转录过程中将人工核苷掺入前体RNA中并环化前体RNA以形成环状RNA。
在某些实施方式中，本文提供的载体可用于在合适的条件(例如，本文提供的条件)下转录前体RNA，所述的将会自剪接成circRNA。在一个实施方式中，该circRNA的长度在约200至约10,000个核苷酸之间。
在一个实施方式中，本文提供的载体在编码前体RNA的区域的上游(例如，在5'同源臂的上游)包含RNA聚合酶启动子。在某些实施方式中，启动子可以被T7噬菌体RNA聚合酶识别。
附图说明
从以下对示例性实施方式的更具体的描述中，前述内容将变得显而易见，如附图中所示，其中，在所有不同的视图中，相同的附图标记指代相同的部分。附图不一定按比例绘制，而是将重点放在说明实施方式上。
专利或申请文件包含至少一张彩色附图。专利局将根据要求和必要的费用，提供带有彩色附图的本专利或专利申请公开的副本。
图1A是显示排列的内含子-外显子构建体设计和剪接机理的实例的示意图。将T4噬菌体Td基因的I组催化内含子一分为二，以保留对于核酶折叠至关重要的结构元件。将外显子片段2(E2)连接到外显子片段1(E1)的上游，并且在外显子-外显子连接处插入长度约为1.1kb的编码区。在剪接过程中，鸟苷核苷酸的3'羟基在5'剪接位点进行酯交换反应。切除5'内含子片段，中间体末端的游离羟基在3'剪接位点进行第二次酯交换反应，导致插入区域环化和3'内含子的切除。
图1B显示了用于同源臂设计的前体RNA二级结构的RNA折叠预测。颜色表示碱基配对概率，红色表示较高的概率。没有同源臂，预计在前体分子的末端之间不会发生碱基配对。箭头指向添加的同源臂。
图1C显示了证明同源臂对剪接的作用的琼脂糖凝胶。如图所示，推定的circRNA的分子量比重的前体RNA高。
(-)：无同源臂。弱：弱同源臂，9nt。强：强同源臂，19nt。
图1D显示了证实前体RNA环化的琼脂糖凝胶。C：经受环化条件的前体RNA(具有强同源臂)。C+R：泳道C，用RNA酶R消化。C+R+H：泳道C+R，用寡核苷酸引导的RNA酶H消化。U：未经历环化条件的前体RNA。U+H：泳道U，用寡核苷酸引导的RNA酶H消化。
图1E显示了图1D的C+R泳道中描绘的跨越样品剪接点的RT-PCR的Sanger测序输出。
图1F显示了在设计的间隔子的背景下RNAFold对前体RNA二级结构的预测。黑色箭头表示对核酶功能潜在重要的二级结构。
图1G显示了证明间隔子对剪接的作用的琼脂糖凝胶。(-)：无间隔子.D：破坏性间隔子。P1：容许性间隔子1。P2：容许性间隔子2。
图1H显示了用于内部同源区域设计的前体RNA二级结构的RNAFold预测。缺乏明显的内部同源性(鱼腥藻1.0)，并引入了由黑色箭头指示的内部同源性(鱼腥藻2.0)。“剪接气泡”表示同源臂和内部同源区域之间的区域，其中包含剪接核酶。
图1I显示了证明内部同源性对剪接的作用的琼脂糖凝胶。
图1J显示了琼脂糖凝胶，其比较了优化的T4噬菌体剪接反应与优化的鱼腥藻剪接反应。鱼腥草内含子两等份长度大致相等，尽管具有更强的同源臂，但与T4噬菌体内含子两等份相比，剪接后保持结合的可能性较小。
图2A是显示了示例工程化的自剪接前体RNA设计的元件的示意图。评估从de-novo工程化的前体RNA产生的一系列蛋白质编码circRNA的环化功效和翻译。
图2B显示了在环化和再环化(R-)后包含EMCC IRES和可变插入物的前体RNA的琼脂糖凝胶，所述可变插入物包括高斯荧光素酶(GLuc)、人促红细胞生成素(hEpo)、EGFP、萤火虫荧光素酶(FLuc)或Cas9编码区。CircRNA通过RNA酶R降解(R+)富集。
图2C是显示了通过分光光度法评估的，用RNA酶R处理20μg剪接反应得到的大约circRNA产率的柱状图(数据表示为平均值+SD，n＝3)。
图2D是显示了用编码GLuc的circRNA转染24小时后，HEK293细胞的上清液中发光的柱状图(数据表示为平均值+SD，n＝4，*p<0.05)。
图2E是柱状图，显示了在用编码hEpo的circRNA转染24小时后，人促红细胞生成素在HEK293细胞的上清液中的表达(数据表示为平均值+SD，n＝4，*p<0.05)。
图2F显示了用编码EGFP的circRNA转染24小时后HEK293细胞中的GFP荧光。
图2G是显示用编码FLuc的circRNA转染24小时后HEK293细胞的裂解物中发光的柱状图(数据表示为平均值+SD，n＝4，*p<0.05)。
图2H是显示FACS分析的图，其证明用单独的sgGFP(circCas9-)转染4天后HEK293-EF1a-GFP细胞中的GFP消融，其由GFP阴性细胞群的出现指示。
图2I是显示FACS分析的图，其证明用编码Cas9的circRNA(circCas9+)转染4天后HEK293-EF1a-GFP细胞中的GFP消融，其由GFP阴性细胞群的出现指示。
图3A是显示在含有在GLuc(左柱，黑色)和FLuc(右柱，灰色)情况下的一组病毒5'UTR IRES序列的circRNA转染24小时后，HEK293细胞的上清液中发光的柱状图(数据表示为平均值+SD，n＝4)。
图3B是显示用含有GLuc编码区和功能性IRES的circRNA转染24小时后HEK293细胞的上清液中发光的柱状图。测量添加将IRES与剪接点分开的polyA(30)或polyAC(30)间隔子序列的效果。(-)：无间隔子。pAC：由腺苷和胞嘧啶组成的30nt间隔子。pA：由腺苷组成的30nt间隔子(数据表示为平均值+SD，n＝4，*p<0.05)。
图3C是显示在通过图3B)中的IRES转染最有效的circRNA 24小时后，HEK293(左，黑色)和HeLa(右，灰色)细胞的上清液中的发光的柱状图(数据表示为平均值+SD，n＝4)。
图3D是显示线性GLuc RNA的HPLC色谱图(上)和CVB3-GLuc-pAC剪接反应(下)的图。
图3E显示了通过不同方法纯化的CVB3-GLuc-pAC的琼脂糖凝胶。C：剪接反应。+R：用RNA酶R处理的剪接反应。+G,R：剪接反应凝胶提取，然后用RNA酶R处理。+H,R：剪接反应HPLC纯化，然后用RNA酶R处理。
图3F显示了在用通过图3E所示的不同方法纯化的CVB3-GLuc-pAC剪接反应转染24小时后，HEK293细胞的上清液中的发光(数据表示为平均值+SD，n＝4，*p<0.05)。
图3G显示了图3D中的数据的HPLC级分的琼脂糖凝胶。从左至右：级分1、2、3、4、5。
图3H是显示用CVB3-GLuc-pAC circRNA或经修饰或未经修饰的线性GLuc mRNA转染24小时后HEK293(左)和HeLa(右)细胞上清液的发光的柱状图(数据表示为平均值+SD，n＝4HEK293，n＝3HeLa，*p<0.05)。
图3I是显示在用CVB3-GLuc-pAC circRNA或经修饰或未经修饰的线性GLuc mRNA转染后24小时开始并持续6天的HEK293细胞的上清液中的发光的图(数据表示为平均值+SD，n＝4HEK293)。
图3J是显示用CVB3-GLuc-pAC circRNA或经修饰或未经修饰的线性GLuc mRNA转染的HEK293(左)和HeLa(右)细胞在6天内产生的相对累积发光的图(数据表示为平均值+SD，n＝4HEK293，n＝3HeLa，*p<0.05)。
图3K是显示在用CVB3-GLuc-pAC circRNA或经修饰的或未经修饰的线性GLucmRNA转染后24小时开始并持续6天的HeLa细胞的上清液中的发光的图(数据表示为平均值+SD，n＝3HeLa)。
图4A显示了使用包含优化的间隔子和同源臂的排列的I组内含子，插入长度对RNA环化效率的影响。1.2：1200nt circRNA。2.4：2400nt circRNA。4.8：4800nt circRNA。
图4B是显示含有不同工程化序列的前体分子的剪接效率的凝胶定量的柱状图。WHA：弱同源臂。SHA：强同源臂。DS：破坏性间隔子。PS：容许性间隔子(permissive spacer)。Ana：鱼腥藻碱基。IH：内部同源性。
图5A是显示了按长度排列的在包含不同中间编码区的circRNA中的剪接效率和切口的凝胶定量的柱状图(ImageJ)。剪接效率表示为非前体(圆形，切口)与前体RNA的比率。切口表示为切口RNA与非切口长RNA(前体，圆形)的比率。
图5B显示了琼脂糖凝胶，其展示了在剪接处包含5'和3'剪接位点的小缺失的作用。
图5C是显示在用编码GLuc并含有EMVC IRES或具有缺失剪接位点的相同前体RNA的circRNA转染24小时后，HEK293细胞上清液中的发光的柱状图(数据表示为平均值+SD，n＝4)。
图6A是显示在circRNA的情况下测试功能性的其他IRES序列和推定IRES序列的柱状图。
图6B是在剪接点处的RNAFold预测前体RNA二级结构的示意图。排除IRES、编码区和内含子。
图6C是显示在通过图3B中的IRES转染最有效的circRNA 24小时后，Min6细胞的上清液中的发光的柱状图(数据表示为平均值+SD，n＝4)。
图6D是显示在通过图3B中的IRES转染最有效的circRNA 24小时后，A549细胞的上清液中的发光的柱状图(数据表示为平均值+SD，n＝4)。
图7A-图7J.图7A-图7F显示了circRNA的设计、合成和纯化的实例。图7A)前体RNA设计和自剪接概述。颜色表示所用RNA的不同区域。图7B)在该图中引入和使用的RNA的示意图。Δ剪接位点(ΔS)与前体RNA相同，不同之处在于包含两个剪接位点的小缺失。图7C)显示在剪接、RNA酶R消化、HPLC纯化和寡核苷酸引导的RNA酶H消化后的前体RNA的琼脂糖凝胶。环状RNA被RNA酶H消化成一个主要条带，而ΔS消化成两个主要条带，从而确认了环状性。图7D)显示了应用于circRNA的累积纯化方法的琼脂糖凝胶。+RNA酶R：仅用RNA酶R消化的未纯化的circRNA。+HPLC：未纯化的circRNA HPLC纯化，然后用RNA酶R消化。+Phos：未纯化的circRNA HPLC纯化，然后用磷酸酶处理，然后用RNA酶R消化。图7E)用不同circRNA制品转染的293细胞的细胞活力、GLuc表达稳定性和细胞因子释放，如图7D中所述。转染后3天评估细胞活力。转染24小时后评估细胞因子释放(数据表示为平均值+SD，ns＝不显著p<0.05，ND＝未检测到)。图7F)从图7D中描述的不同circRNA制品转染的A549细胞的细胞活力、circRNA表达稳定性和细胞因子释放。转染后3天评估细胞活力。转染后24小时评估细胞因子释放(数据表示为平均值+SD，n＝3，ND＝未检测到，*p<0.05)。图7G-J显示了Δ剪接位点(ΔS)的表征。图7G)在该图中引入和使用的RNA的示意图。ΔS是剪接位点缺失的线性circRNA前体(用x标记)。ΔS是经聚腺苷酸化并用磷酸酶处理。图7H)显示用于分配分子量和条带的梯度的琼脂糖凝胶。ΔS无法检测到环化。图7I)用circRNA或ΔS转染293细胞24小时后的GLuc表达((数据表示为平均值+SD，n＝3)。图7J)在用circRNA或ΔS转染293细胞后的3天内，GLuc蛋白的生产稳定性(数据表示为平均值+SD，n＝3)。
图8A-图8G.图8A-图8F显示了剪接反应分级和免疫原性评估。图8A)在该图中引入和使用的RNA示意图。HMW：高分子量；此部分包含线性和环形串联。图8B)上图：未纯化的剪接反应的HPLC色谱图。下图：纯化部分的琼脂糖凝胶。难以充分分离前体RNA，因此改用ΔS。图8C)如图8B)所述用不同的HPLC级分转染A549细胞24小时后细胞因子释放(数据表示为平均值+SD，n＝3，*p<0.05)。图8D)如b)中所述用不同HPLC级分转染A549细胞36小时后的细胞活力(数据表示为平均值+SD，n＝3，*p<0.05)。图8E)用所示RNA转染A549细胞18小时后，RIG-I和IFN-β1转录物的诱导。3p-hpRNA是5'三磷酸发夹RNA，是RIG-I的特异性激动剂((数据表示为平均值+SD，n＝3，*p<0.05)。图8F)用RNA酶R消化的剪接反应或circRNA晚期级分转染A549细胞18小时后，RIG-I和IFN-β1转录物的诱导(数据表示为平均值+SD，n＝3，*p<0.05)。图8G显示了用图7D中描述的不同circRNA制品转染A549(左)和293(右)细胞后在培养基中评估的其他细胞因子(数据表示为平均值+SD，n＝3)。在大多数情况下，检测到的这些分析物水平极低，排除了观察到显著差异的可能性。
图9A-图9O.图9A-图9F显示了相对于线性mRNA的circRNA免疫原性的测定。图9A)在该图中引入和使用的RNA示意图。线性mRNA不包含IRES或其他可能引起结构特异性免疫应答的结构化特征。图9B)显示circRNA前体被m1ψ修饰的琼脂糖凝胶。图9C)显示纯化的未经修饰的和经修饰的RNA的琼脂糖凝胶。用m1ψ修饰可降低表观分子量。图9D)用未经修饰的circRNA或m1ψ-circRNA转染293或A549细胞24小时后的GLuc表达(数据表示为平均值+SD，n＝3)。图9E)用未经修饰的或m1ψ线性mRNA或circRNA转染的293细胞的细胞活力、GLuc表达稳定性和细胞因子释放。转染后3天评估细胞活力。转染24小时后评估细胞因子释放(数据表示为平均值+SD，n＝3，ns＝不显著p<0.05，ND＝未检测到)。图9F)用未经修饰的或m1ψ线性mRNA或circRNA转染的A549细胞的细胞活力、GLuc表达稳定性和细胞因子释放。转染后3天评估细胞活力。转染后24小时评估细胞因子释放(数据表示为平均值+SD，n＝3，ND＝未检测到，*p<0.05)。图9G)描绘了GLuc活性(RLU)。图9H)用不同的HPLC级分转染A549细胞后，在培养基中评估了另外的细胞因子，如图9H所示(数据表示为平均值+SD，n＝3，*p<0.05)。图9I模拟转染或未转染293细胞36小时后的细胞活力(左)，和模拟转染后或未转染293细胞24小时后的转录物诱导(右；相对于未转染的诱导倍数；数据表示为平均值+SD，n＝2，ns＝不显著)。图9J)用MessengerMax模拟转染或未转染24小时后，A549细胞分泌的IL-6和RANTES(数据表示为平均值+SD，n＝3)。图9K)用纯化的circRNA转染A549细胞24小时后，RIG-I和IFN-β1的转录物诱导，该circRNA包含合成的RIG-I配体(3p-hpRNA)，表示为占转染总RNA的百分比(数据表示为平均值+SD，n＝3，*p<0.05)。图9L)用指定的RNA转染HeLa细胞24小时后，RIG-1和IFN-β1转录物诱导(数据表示为平均值+SD，n＝3，*p<0.05)。图9M)用20ng所示RNA转染150,000个A549细胞2-8小时后，转录物诱导的时间过程(数据表示为平均值+SD，n＝2)。图9N)以指定RNA转染融合度为80％的RAW264.7细胞24小时后的GLuc表达(左)。GLuc在2天内的表达稳定性(右；数据表示为平均值+SD，n＝3)。用指定RNA转染RAW264.7细胞24小时后的转录物诱导(数据表示为平均值+SD，n＝2)。图9O)含有EMCC IRES并编码GFP(circGFP)的环状RNA的分析。展示circGFP环化和纯化的circGFP(左)的琼脂糖凝胶。用40ng circRNA反向转染20,000个A549细胞36小时后，A549的细胞活力(右)。用指定RNA反向转染A549细胞24小时后的转录物诱导(下；数据表示为平均值+SD，n＝2，ns＝不显著)。
图10A-图10I.图10A-图10F显示了TLR的CircRNA逃避。图10A)引入并用于TLR实验的RNA示意图。由于包含内含子和同源臂的缺失，线性circRNA包含与剪接circRNA相同的所有序列元素。图10B)相对于无效对照，用所示RNA转染TLR报告细胞36小时后的SEAP表达(数据表示为平均值+SD，n＝3，ns＝不显著，*p<0.05)。图10C)相对于无效对照，用晚期circRNA级分转染TLR8报告细胞36小时后的SEAP表达。(-)：培养基不含核苷。C：培养基含有胞苷(3.5mM)。U：培养基中含有尿苷(3.5mM)；(数据表示为平均值+SD，n＝3，ns＝不显著，*p<0.05)。图10D)引入并用于TLR切口RNA实验的RNA示意图。图10E)琼脂糖凝胶显示了替代的circRNA切口策略。图10F)相对于无效对照，用指示的RNA转染TLR报告细胞36小时后的SEAP表达(数据表示为平均值+SD，n＝3，*p<0.05)。图10G-I显示了夹板连接优化。图10G)夹板连接前体RNA设计和剪接概述。图10H)用于连接的不同夹板。值得注意的是，这些优化是利用包含NaeI限制性切割位点的质粒进行线性化的，从而导致在体外转录过程中形成不需要的RNA副产物(在Ligase(-)和Splint(-)条件下显示为外来条带)。对于图9A-F和图10A-F中使用的GLuc和hEpo夹板连接，该位点变为XbaI。OH：悬垂(5',3')；Tm：熔融温度。图10I)显示了环化条件的优化。
图11A-图11F.图11A-图11D显示了体内的hEpo circRNA表征。图11A)将350ng未修饰的或与MessengerMax复合的m1ψ线性mRNA或circRNA注入内脏脂肪组织6小时后的血清hEpo表达(相对于分子量表达数据，mean+SD，n＝3)。图11B)在42小时内血清中的相对hEpo表达(数据表示为平均值+SD，n＝3)。图11C)将350ng所示RNA注射入内脏脂肪6小时后在血清中检测到细胞因子(数据表示为平均值+SD，n＝3，*p<0.05)。图11D)通过注射与MessengerMax复合的经修饰萤火虫荧光素酶mRNA证实注射部位。图11E显示了未经修饰的或m1ψ线性mRNA或circRNA转染的293细胞的细胞活力、GLuc表达稳定性和细胞因子释放。转染后3天评估细胞活力。转染24小时后评估细胞因子释放(数据表示为平均值+SD，n＝3，ns＝不显著p<0.05，ND＝未检测到)。图11F显示了用未经修饰的或m1ψ线性mRNA或circRNA转染293和A549细胞后在培养基中评估的其他细胞因子(参见图9E，9F；数据表示为平均值+SD，n＝3)。在大多数情况下，检测到的这些分析物水平极低，排除了观察到显著差异的可能性。
图12A-图12I.图12A-图12F显示了LNP-circRNA表征。图12A)LNP-circRNA的Cryo-TEM图像。图12B)用等摩尔量的LNP-5moU-mRNA或未经修饰的LNP-circRNA转染293细胞24小时后的hEpo表达(左)和hEpo蛋白在3天内的表达稳定性(右；数据表示为平均值+SD，n＝3)。图12C)用LNP-5moU-mRNA或未经修饰的LNP-circRNA转染A549细胞24小时后，RIG-I和IFN-β1转录物的诱导。TR：转染试剂加200ng RNA(MessengerMax)；LNP(1x)：200ng LNP-RNA；LNP(2x)：400ng LNP-RNA；L：5moU-mRNA；C：circRNA(数据表示为平均值+SD，n＝3，ns＝不显著，p<0.05)。图12D)相对于无效对照，用c)中指示的RNA转染TLR报告细胞48小时后的SEAP表达(数据表示为平均值+SD，n＝3)。图12E)将1.5皮摩尔的LNP-5moU-mRNA或未经修饰的LNP-circRNA注射到内脏脂肪中6小时后的血清hEpo表达(数据表示为平均值+SD，n＝5线性5moU，环形；n＝3模拟)。图12F)注射LNP-RNA后42小时内血清中的相对hEpo表达(数据表示为平均值+SD，n＝5线性5moU，环形；n＝3模拟)。图12G)图9G中描绘的线性RNA的琼脂糖凝胶。图12H)相对于无效对照，在存在或不存在变化浓度的尿苷的情况下，用a)中所示的加尾线性RNA转染TLR8报告细胞36小时后的SEAP表达(数据表示为平均值+SD，n＝2)。图12I)包括一个额外的阳性对照的来自10F的完整数据。
图13显示了未纯化的hEpo剪接反应的HPLC色谱图。
图14A-图14D显示了hEpo circRNA的体外表征。图14A)显示纯化的未经修饰和经修饰的RNA的琼脂糖凝胶。图14B)用等摩尔量的m1ψ-mRNA或未经修饰的circRNA转染293细胞24小时后的hEpo表达(数据表示为平均值+SD，n＝3)。图14C)用相同重量的未经修饰或m1ψ线性mRNA或circRNA转染的293细胞的细胞活力、hEpo蛋白产生稳定性和24小时蛋白表达。转染36小时后评估细胞活力(数据表示为平均值+SD，n＝3)。图14D)用等重量的未经修饰或m1ψ线性mRNA或circRNA转染的A549细胞的细胞活力、hEpo蛋白生产稳定性和24小时蛋白表达。转染36小时后评估细胞活力(数据表示为平均值+SD，n＝3)。
图15显示了腹腔内注射等重量的所示RNA 6小时后在血清中检测到的其他细胞因子(见图10F；数据表示为平均值+SD，n＝3)。在大多数情况下，检测到的这些分析物水平极低，排除了观察到显著差异的可能性。
图16A-图16D显示了体内LNP-RNA的表征。图16A)LNP-RNA的理化特性(数据表示为平均值±SD，n＝3)。图16B)通过注射配制到cKK-E12 LNP中的萤火虫荧光素酶mRNA来证明注射部位。在6和24小时检测到的发光表明局部递送至内脏脂肪。图16C)在腹腔内注射配制到cKK-E12 LNP中的750ng所示RNA 6小时后，在血清中检测到的细胞因子(数据表示为平均值+SD，n＝3)。图16D)腹腔内注射配制到cKK-E12LNP中的750ng所示RNA 24小时后，内脏脂肪组织中的转录物诱导(数据表示为平均值+SD，n＝3)。图16E)静脉注射0.1mg/kg 5moU-mRNA或未经修饰的circRNA 6小时后肝脏中的血清hEpo表达(左)和42小时内相对hEpo表达(右；相对于分子量呈现数据，平均值+SD，n＝3)。
图17显示了在体外转录之后直接包含T4噬菌体排列的内含子、EMCV IRES、GLuc阅读框和强同源臂的前体RNA的环化。前体RNA在指定温度下加热，在冰上冷却，然后在55摄氏度下剪接。
图18A-图18C显示了前体RNA的环化。图18A显示了包含T4或鱼腥藻排列的内含子、EMCV IRES、GLuc阅读框、强同源臂和不同GTP浓度的5'间隔子的前体RNA的环化。图18B显示了在不同浓度的RNA下图18A中描述的前体RNA的环化。图18C显示了通过使用三种替代方案排除种类的相互转化完成的剪接而产生的主要顶部条带和底部条带的凝胶提取。
图19显示了在293细胞中144小时内来自没有间隔子或线性mRNA的EMCV-circRNA的GLuc的稳定性和表达图。
图20A-图20D图20A)在HeLa细胞中在144小时内，在没有间隔子和具有或不具有UTR的情况下，来自EMCV-circRNA的GLuc的稳定性和表达。图20B)在293细胞中在144小时内，在没有间隔子和具有或不具有UTR的情况下，来自EMCV-circRNA的GLuc的稳定性和表达。图20C)在具有5'间隔子和具有或不具有不同的UTR的情况下，来自CVB3-circRNA的GLuc表达。Trilink：购自Trilink的5mC/伪修饰的线性mRNA。图20D)包含T4排列的内含子、EMCVIRES、GLuc阅读框、强同源臂、具有或不具有不同UTR的5'间隔子的前体RNA的环化。R：RNA酶R消化。
图21A-图21G.图21A-图21D)293和HeLa细胞中来自具有5'间隔子和具有不同IRES序列的circRNA的GLuc表达。图21E-图21F)293和HeLa细胞中来自具有5'间隔子和具有不同IRES序列的circRNA的GLuc表达。除非另有说明，否则CircRNA包含CVB3 IRES。Trilink：购自Trilink的5mC/伪修饰的线性mRNA。21G)比较293细胞中不同RNA种类的StemFect转染试剂和脂质纳米颗粒(LNP)递送。
图22A-图22B.图22A-图22B)在293和HeLa细胞中，具有鱼腥藻排列的内含子、5'间隔子和具有或不具有不同polyN序列的CVB3-circRNA的GLuc表达。
图23A-图23B.图23A)比较排列的内含子序列背景对293细胞中具有5'间隔子的circRNA和所示IRES的GLuc表达的影响。图23B)来自包含T4排列的内含子、5'间隔子和不同的IRES序列的circRNA或线性mRNA的GLuc的血清表达。将RNA配制到肝归巢LNP中，然后静脉注射。注射后6小时收集血清。
图24显示了来自含有具有5'和3'间隔子的circRNA和CVB3 IRES的质粒在HeLa细胞中的GLuc表达。基本质粒不包含CVB3 IRES。dSplice位点包含突变的剪接位点，可在转录后取消环化。
图25A-图25B.图25A)包含鱼腥藻排列的内含子、GLuc阅读框、强同源臂、5'和3'间隔子以及所示的IRES的前体RNA的环化。图25B)包含鱼腥藻排列的内含子、FLuc阅读框、强同源臂、5'和3'间隔子以及所示的IRES的前体RNA的环化。
图26A-图26B.图26A)HeLa细胞。图26B)A594细胞。转染指定circRNA制剂后，RIG-I和IFNB1诱导折叠。所有制剂均含有具有鱼腥藻排列内含子的circRNA、GLuc阅读框、强同源臂、5'和3'间隔子以及CVB3 IRES。未纯化：总剪接反应。GMP：在GMP是GTP12.5倍的情况下转录的CircRNA前体。3phpRNA：三磷酸发夹RNA阳性对照。
具体实施方式
以下是示例实施方式的描述。
如本文所述，开发了外源性circRNA以延长全长RNA信息中蛋白质表达的持续时间。首先，通过合理设计有助于剪接的无处不在的辅助序列，将一种自剪接内含子工程化为可在体外有效环化各种RNA，编码诸如Cas9之类的蛋白质。从这些circRNA在真核细胞中产生功能蛋白，并结合了不同的内部核糖体进入位点(IRES)和内部多腺苷束(internalpolyadenosine tracts)的翻译被最大化。通过高效液相色谱纯化的工程化的circRNA在产生的蛋白质的量和产生稳定性方面均显示出卓越的蛋白质产生质量。本文提供的方法和组合物有利于使用外源性circRNA在真核细胞中稳健和稳定地表达蛋白质，从而使circRNA成为线性mRNA的有希望的替代物。
真核细胞内源性环状RNA(circRNA)由于其普遍性和潜在的生物学功能范围而引起了人们越来越大的兴趣(Barrett，S.P.&Salzman，J.，“Circular RNAs：analysis，expression and potential functions,”Development，143(11):1838-1847(2016))。大多数circRNA都是通过反向剪接产生的，并且似乎起着非编码的作用(Barrett，S.P.&Salzman，J.，“Circular RNAs：analysis，expression and potential functions,”Development，143(11):1838-1847(2016)；Chen，L.&Yang，L.，“Regulation of circRNAbiogenesis,”RNA Biology，12(4):381-388(2015)；Jeck，W.R.and Sharpless，N.E.，“Detecting and characterizing circular RNAs,”Nat.Biotechnol.，32:453–461(2014)；Wang，Y.&Wang，Z.，“Efficient backsplicing produces translatable circularmRNAs,”RNA，21(2):172-179(2014)；Hansen，T.B.等，“Natural RNA circles function asefficient microRNA sponges,”Nature，495(7441):384-388(2013)；Li，Z.等，“Exon-intron circular RNAs regulate transcription in the nucleus,”NatureStructural&Molecular Biology，22(3):256-264(2015))。然而，已经提出，对果蝇内源性的某些circRNA可能被翻译成蛋白质(Legnini，I.等，“Circ-ZNF609 Is a Circular RNAthat Can Be Translated and Functions in Myogenesis,”Molecular Cell，66(1):22-37.e9(2017)；Pamudurti，N.R.等，“Translation of CircRNAs,”Molecular Cell，66(1)(2017))。
除了具有蛋白质编码潜力外，内源性circRNA缺乏核酸外切酶介导的降解所必需的自由端，从而使其对RNA转换的几种机制具有抗性，并且与线性mRNA对应物相比，它们具有更长的寿命(Chen，L.&Yang，L.，“Regulation of circRNA biogenesis,”RNA Biology，12(4):381-388(2015)；Enuka，Y.等，“Circular RNAs are long-lived and display onlyminimal early alterations in response to a growth factor,”Nucleic AcidsResearch，44(3):1370-1383(2015))。因此，环化可以允许稳定通常半衰期短的mRNA，因此可以提高外源性mRNA在各种应用中的整体功效(Kaczmarek，J.C.等，“Advances in thedelivery of RNA therapeutics：from concept to clinical reality,”GenomeMedicine，9(1)(2017)；Fink，M.等，“Improved translation efficiency of injectedmRNA during early embryonic development,”Developmental Dynamics，235(12):3370-3378(2006)；Ferizi，M.，等，“Stability analysis of chemically modified mRNA usingmicropattern-based single-cell arrays,”Lab Chip，15(17):3561-3571(2015))。然而，长体外转录(IVT)RNA的有效环化，circRNA的纯化以及从circRNA充分表达蛋白质是重要的障碍，必须克服这些障碍才能实现其蛋白质编码潜力。如本文所述，在一个实施方式中，提出了一种工程方法来产生外源性circRNA，以在细胞(例如真核细胞)中有效和持久地表达蛋白质。
缩写
GFP 绿色荧光蛋白
ORF 开放阅读框
IRES内部核糖体进入位点
UTR 非翻译区
HEK 人胚肾
IRES内部核糖体进入位点
EMCV脑心肌炎病毒，小核糖核酸病毒
PIE排列的内含子-外显子剪接位点
在一个实施方式中，本发明涉及用于制备环状RNA的载体，所述载体包含以下彼此可操作连接并按以下顺序排列的元件：a.)5'同源臂，b.)3'I组内含子片段，其包含3'剪接位点二核苷酸，c.)可选地，5'间隔子序列，d.)可选地，内部核糖体进入位点(IRES)，e.)蛋白质编码或非编码区，f.)可选地，3'间隔子序列，g.)5'I组内含子片段，其包含5'剪接位点二核苷酸，和h.)3'同源臂，所述载体允许在真核细胞内产生可翻译和/或具有生物活性的环状RNA。
如本文所用，元件的字母(例如，“a.)–h.)”)仅出于清楚的目的而使用。另外，应当理解的是，在替代实施方式中，可以以不同的顺序布置元件，和/或可以省略一个或多个元件。
如本文所用，如果载体的元件位于载体上，则载体的元件是“可操作地连接的”，使得它们可以被转录以形成前体RNA，然后可以使用本文提供的方法将其环化为环状RNA。
在一个实施方式中，本发明涉及用于制备circRNA的载体(例如，质粒)，所述载体包含以下可操作地彼此连接并按以下顺序排列的元件：a.)5'同源臂，b.)3'I组内含子片段，c.)可选的5'间隔子序列，d.)可选的内部核糖体进入位点(IRES)，e.)蛋白质编码或非编码区，f.)可选的3'间隔子序列，g.)5'I组内含子片段，其包含5'剪接位点二核苷酸，和h.)3'同源臂，所述载体允许在真核细胞内产生可翻译或具有生物学活性的circRNA。
如本文所用，“同源臂”是以下任一连续序列，1)预测与RNA中的另一序列(如另一个同源臂)的至少约75％(例如，至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％，约100％)形成碱基对，2)长度至少7nt且不超过250nt，位于3'内含子片段之前和附近或包含在其中，和/或5'内含子片段之后和附近或包含在其中，以及可选地，4)预测与RNA中的意外序列(例如，非同源臂序列)的碱基配对少于50％(例如，少于45％，少于40％，少于35％，少于30％，少于25％)。“强同源臂”是指与RNA中的另一同源臂碱基配对时，Tm大于50摄氏度的同源臂。
如本文所用，3'I组内含子片段是与天然I组内含子的3'近端片段至少75％(例如，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，100％)同源的连续序列，包括3'剪接位点二核苷酸，以及可选地，相邻外显子序列，其长度至少为1个核苷酸(例如，长度为至少5个核苷酸，长度为至少10个核苷酸，长度为至少15个核苷酸，长度为至少20个核苷酸，长度为至少25个核苷酸，长度为至少50个核苷酸)。在一个实施方式中，所包括的相邻外显子序列约为天然外显子的长度。在某些实施方式中，5'I组内含子片段是与天然I组内含子的5'近端片段至少75％(例如，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，100％)同源的连续序列，包括5'剪接位点二核苷酸和可选地，相邻外显子序列，其长度至少为1个核苷酸(例如，长度为至少5个核苷酸，长度为至少10个核苷酸，长度为至少15个核苷酸，长度为至少20个核苷酸，长度为至少25个核苷酸，长度为至少50个核苷酸)。在一个实施方式中，所包括的相邻外显子序列约为天然外显子的长度。
如本文所用，“间隔子”是指以下任何连续的核苷酸序列：1)预测避免干扰近端结构，例如来自IRES，编码或非编码区或内含子，2)长度至少为7个核苷酸(可选地不超过100个核苷酸)，3)位于3'内含子片段的下游和附近和/或5'内含子片段的上游和附近，和/或4)包含以下一个或多个：a)至少5nt长的非结构化区域b)预测与远端(即，非相邻)序列至少5nt长碱基配对的区域，其包括另一个间隔子，和/或c)至少7nt长的结构化区域，其范围限于间隔子的序列。
如本文所用，关于序列的“干扰”是指预测或凭经验确定以改变RNA中其他结构的折叠的序列，如IRES或I组内含子衍生的序列。
如本文所用，关于RNA的“非结构化”是指未被RNAFold软件或类似的预测工具预测以与其自身或相同RNA分子中的其他序列形成结构(例如，发夹环)的RNA序列。
如本文所用，关于RNA的“结构化”是指通过RNAFold软件或类似的预测工具预测以与其自身或相同RNA分子中的其他序列形成结构(例如发夹环)的RNA序列。
在某些实施方式中，间隔子序列可以是例如至少10个核苷酸的长度，至少15个核苷酸的长度或至少30个核苷酸的长度。在某些实施方式中，间隔子序列的长度为至少7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25或30个核苷酸。在某些实施方式中，间隔子序列的长度不超过100、90、80、70、60、50、45、40、35或30个核苷酸。在某些实施方式中，间隔子序列的长度为20至50个核苷酸。在某些实施方式中，间隔子序列的长度为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸。
间隔子序列可以是polyA序列、polyA-C序列、polyC序列或poly-U序列，或者可以根据IRES对间隔子序列进行特异性改造。本文所述的间隔子序列可具有两个功能：(1)促进环化和(2)通过允许内含子和IRES正确折叠来促进功能性。更具体而言，本文所述的间隔子序列被设计成具有三个优先级：1)对于近端内含子和IRES结构的折叠是惰性的；2)充分分离内含子和IRES二级结构；和3)包含一个间隔子-间隔子互补区域，以促进“剪接气泡”的形成。在一个实施方式中，载体与许多可能的IRES和编码或非编码区以及两个间隔子序列兼容。
在某些实施方式中，RNA折叠计算机软件，例如RNAFold，可以用于指导载体的各种元件的设计，包括间隔子。
在某些实施方式中，载体中用于制备环状RNA的一个或多个元件与天然序列具有至少75％的序列同一性，包括例如IRES和内含子片段元件。在某些实施方式中，蛋白质编码区或非编码区不是天然存在的核苷酸序列。在某些实施方式中，蛋白质编码区编码天然或合成蛋白质。
在某些实施方式中，编码或非编码区可以是天然或合成序列。在某些实施方式中，编码区可编码嵌合抗原受体、免疫调节蛋白和/或转录因子。在某些实施方式中，非编码区可以编码可以改变细胞行为(例如淋巴细胞行为)的序列。在某些实施方式中，非编码序列对细胞RNA序列是反义的。
在一个实施方式中，所述载体可以包含5'间隔子序列，但不包含3'间隔子序列。在另一实施方式中，所述载体可以包3'间隔子序列，但不包含5'间隔子序列。在另一实施方式中，所述载体可以既不包含5'间隔子序列，也不包含3'间隔子序列。在另一实施方式中，所述载体不包含IRES序列。在另一实施方式中，所述载体不包含IRES序列、5'间隔子序列或3'间隔子序列。
如本文所用，“载体”是指一段DNA，它是合成的(例如，使用PCR)，或者是从病毒、质粒或高等生物的细胞中提取的，可以将外来DNA片段插入或已经插入其中以进行克隆和/或表达目的。在某些实施方式中，载体可以稳定地维持在生物体中。载体可包含，例如，复制起点、选择性标记或报告基因，如抗生素抗性或GFP，和/或多克隆位点(MCS)。该术语包括线性DNA片段(例如，PCR产物、线性的质粒片段)、质粒载体、病毒载体、粘粒、细菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)等。在一个实施方式中，本文提供的载体包含多克隆位点(MCS)。在一个实施方式中，本文提供的载体不包含MCS。
I组内含子自剪接序列的实例包括但不限于衍生自T4噬菌体基因td或蓝藻鱼腥藻属pre-tRNA-Leu基因的自剪接排列的的内含子-外显子序列。
蛋白质编码区可以编码真核或原核来源的蛋白质。在某些实施方式中，蛋白质可以是用于治疗或诊断用途的任何蛋白质。例如，蛋白质编码区可以编码人蛋白质或抗体。在某些实施方式中，蛋白质可以选自但不限于hFIX、SP-B、VEGF-A、人甲基丙二酰-CoA突变酶(hMUT)、CFTR、癌症自身抗原和其他基因编辑酶，例如Cpf1、锌指核酸酶(ZFN)和转录激活因子样效应蛋白核酸酶(TALEN)。在某些实施方式中，载体或circRNA缺乏蛋白质编码序列。在某些实施方式中，前体RNA是质粒和circRNA之间的必需中间体。
5'和3'同源臂可以是合成序列，与内部同源区域不同，但功能相似。同源臂的长度可以是例如约5-50个核苷酸，约9-19个核苷酸，例如，长度为约5，约10，约20，约30，约40或约50个核苷酸。在另一实施方式中，同源臂的长度可以是9个核苷酸。在另一实施方式中，同源臂的长度可以是19个核苷酸。在某些实施方式中，同源臂的长度为至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19个核苷酸。在某些实施方式中，同源臂的长度不超过50、45、40、35、30、25或20个核苷酸。在某些实施方式中，同源臂的长度为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25，26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸。
在某些实施方式中，所述载体包含IRES序列。IRES序列可以选自但不限于以下的IRES序列：Taura综合征病毒、吸血猎蝽病毒、泰累尔氏脑脊髓炎病毒、猿猴病毒40、红火蚁病毒1、禾谷缢管蚜病毒、网状内皮增生症病毒、福曼脊髓灰质炎病毒1、大豆尺蠖病毒、克什米尔蜂病毒、人鼻病毒2、琉璃叶蝉病毒-1、人免疫缺陷病毒1型、琉璃叶蝉病毒-1、虱P病毒、丙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒、GB型肝炎病毒、口蹄疫病毒、人肠道病毒71、马鼻病毒、茶尺蠖样病毒、脑心肌炎病毒(EMCV)、果蝇C病毒、十字花科烟草病毒、蟋蟀麻痹病毒、牛病毒性腹泻病毒1、黑皇后细胞病毒、蚜虫致死麻痹病毒、禽脑脊髓炎病毒、急性蜂麻痹病毒、芙蓉枯黄环斑病毒、猪瘟病毒、人类FGF2、人类SFTPA1、人类AMLl/RUNXl、果蝇触角、人类AQP4、人类AT1R、人类BAG-1、人类BCL2、人类BiP、人类c-IAPl、人类c-myc、人类eIF4G、小鼠NDST4L、人类LEF1、小鼠HIF1α、人类n.myc、小鼠Gtx、人类p27kipl、人类PDGF2/c-sis、人类p53、人类Pim-1、小鼠Rbm3、果蝇reaper、犬Scamper、果蝇Ubx、人类UNR、小鼠UtrA、人类VEGF-A、人类XIAP、果蝇hairless、酿酒酵母TFIID、酿酒酵母YAP1、人类c-src、人类FGF-1、猿猴小核糖核酸病毒、芜菁绉缩病病毒、eIF4G的适体、柯萨奇病毒B3(CVB3)或柯萨奇病毒A (CVB1/2)。野生型IRES序列也可以被修饰并在本发明中有效。在某些实施方式中，IRES序列的长度为约50个核苷酸。
在某些实施方式中，为了在细胞中表达蛋白质，可以使用例如脂质转染或电穿孔将环状RNA转染到细胞中。在另一实施方式中，使用纳米载体将环状RNA转染到细胞中。纳米载体可以是例如脂质、聚合物或脂质-聚合物杂化物。
所述环状RNA可以通过在高效液相色谱(HPLC)系统中通过在tris-EDTA中或柠檬酸盐缓冲液中使RNA通过尺寸排阻柱的方法来纯化。在一个实施方式中，使RNA在约4-7范围内的pH下在tris-EDTA或柠檬酸盐缓冲液中以约0.01-5mL/分钟的流速通过尺寸排阻柱。
在某些实施方式中，本文提供的是一种通过使用本文提供的载体作为模板(例如，本文提供的具有位于5'同源臂上游的RNA聚合酶启动子的载体)进行体外转录来产生前体RNA的方法。
在某些实施方式中，相对于类似的三磷酸核苷酸，在本文所述的体外转录反应中核苷酸、核苷或化学修饰的核苷酸或核苷的使用是浓度过量的。“浓度过量”被定义为大于类似三磷酸核苷酸的浓度，目的是改变5'末端核苷酸，特别是通过防止纳入5'三磷酸基序而降低circRNA制剂的免疫原性，或者通过包括必要的5'单磷酸基序来允许前体分子的酶促环化。
在某些实施方式中，过量使用的核苷酸是鸟苷单磷酸(GMP)。在其他实施方式中，过量使用的核苷酸是GDP、ADP、CDP、UDP、AMP、CMP、UMP、鸟苷、腺苷、胞苷、尿苷或任何化学修饰的核苷酸或核苷。在某些实施方式中，过量是约10倍的过量。在某些实施方式中，过量为约12.5倍的过量。
在一个实施方式中，在体外转录反应中，核苷酸、核苷或化学修饰的核苷酸或核苷的使用浓度比类似三磷酸核苷酸至少高约10倍。
在某些实施方式中，然后在体外转录反应中，将由在比类似三磷酸核苷酸过量至少约10倍的核苷酸、核苷或化学修饰的核苷酸或核苷存在下合成的前体RNA产生的circRNA，通过HPLC纯化以达到最小的免疫原性。
药物组合物/施用
在本公开的实施方式中，本文所述和/或使用本文所述的载体和/或方法产生的circRNA产物可以以组合物(例如药物组合物)的形式提供。
因此，在某些实施方式中，本发明还涉及组合物，例如包含circRNA(circRNA产物)和药学上可接受的载体的组合物。一方面，本公开提供了包含有效量的本文所述的circRNA和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。本公开的药物组合物可以包含本文所述的circRNA，以及一种或多种药学或生理学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。在某些实施方式中，本公开的药物组合物可以包含circRNA表达细胞，例如，如本文所述的多种circRNA表达细胞，与一种或多种药学或生理学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂组合。
在某些实施方式中，药学上可接受的载体可以是药物组合物中除对受试者无毒的活性成分以外的成分。
药学上可接受的载体可以包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。药学上可接受的载体的实例是生理上相容的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等，如盐、缓冲液、糖类、抗氧化剂、水性或非水性载体、防腐剂、润湿剂、表面活性剂或乳化剂或其组合。可以基于载体的活性和制剂的所需特性，如稳定性和/或最小氧化，通过实验确定药物组合物中的药学上可接受的载体的量。
在某些实施方式中，此类组合物可包含缓冲液，如乙酸、柠檬酸、组氨酸、硼酸、甲酸、琥珀酸、磷酸、碳酸、苹果酸、天冬氨酸、Tris缓冲液、HEPPSO、HEPES、中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，如葡萄糖、蔗糖、甘露糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸，如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；抗细菌和抗真菌剂；和防腐剂。
在某些实施方式中，本发明的组合物可以配制用于肠胃外或非肠胃外施用的多种方式。在一个实施方式中，可以将组合物配制成用于输注或静脉内施用。本文公开的组合物可以例如作为无菌液体制剂提供，例如等渗水溶液、乳液、悬浮液、分散体或粘性组合物，其可以缓冲至所需的pH。适用于口服给药的制剂可以包括液体溶液、胶囊剂、小药囊、片剂、锭剂和糖锭，在合适的液体中的液体悬浮液粉末和乳剂。
一方面，本公开内容涉及施用治疗有效量的包含本文所述的circRNA的组合物以用于治疗患有疾病或病症(例如癌症)的或处于发展疾病或病症的风险中的受试者。另一方面，本公开涉及使用治疗有效量的包含本文所述的circRNA的组合物用于治疗患有涉及涉及功能基因丧失的疾病的受试者。
在某些实施方式中，所述治疗旨在延长circRNA到蛋白质的翻译。
本公开的药物组合物可以适合于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用的量和频率取决于受试者的病情、受试者疾病的类型和严重性等因素，尽管适当的剂量可以通过临床试验确定。
术语“治疗”是指治疗性治疗，其中目的是减慢(减轻)不期望的生理变化或疾病，或在治疗期间提供有益的或期望的临床结果。有益或理想的临床结果包括无论是可检测还是不可检测的症状缓解、疾病程度减轻、疾病状态稳定(即不恶化)、疾病进展延迟或减慢、疾病状态改善或减轻和/或缓解(无论是部分还是全部)。“治疗”也可能意味着与如果受试者未接受治疗的预期生存期相比生存期延长。需要治疗的受试者包括已经患有不希望的生理变化或疾病的那些受试者以及易于发生生理变化或疾病的那些受试者。
在本文中可互换使用的“治疗有效量”或“有效量”是指在必要的剂量和时间段内达到期望的治疗效果的有效量。治疗有效量可以根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和重量以及疗法或疗法组合在个体中引起期望的反应的能力等因素而变化。有效疗法或疗法组合的实例指标包括，例如，改善患者的健康状况，减轻疾病负担，阻止或延缓疾病进展，和/或没有疾病进展至身体其他部位。
如本文所用，术语“受试者”是指动物。术语“受试者”和“患者”在本文可以互换使用。这样，“受试者”包括正在接受疾病或疾病预防治疗的人，例如患者。
如本文所用，术语“剪接位点二核苷酸”是指与剪接位点接界的两个核苷酸。
在某些实施方式中，本文描述的方法可以用于治疗属于任何分类的动物受试者。这种动物的实例包括哺乳动物，如小鼠、仓鼠、兔、猫、狗、牛、猪或马)。哺乳动物可以是猴子、人和猿。在一个实施方式中，哺乳动物是人类。
在本发明的实施方式的背景下有用的递送系统可以包括时释性、缓释性和持续释放的递送系统，使得组合物的递送发生在待治疗的部位敏化之前，并且有足够的时间引起敏化。所述组合物可以与其他治疗剂或疗法联合使用。这样的系统可以避免组合物的重复施用，从而增加了受试者和医师的便利，并且可以特别适合于本发明的某些组合物实施方式。
释放递送系统包括基于聚合物的系统，如聚丙交酯-乙交酯、共聚草酸酯、聚酯酰胺、聚原酸酯、聚己内酯、聚羟基丁酸和聚酸酐。上述含药物的聚合物的微胶囊描述于，例如，美国专利第5,075,109号。递送系统还包括非聚合物系统，该非聚合物系统是脂质，包括固醇，如胆固醇、胆固醇酯，以及脂肪酸或中性脂肪，如单甘油二酯和甘油三酯；硅橡胶系统(sylastic system)；基于肽的系统；水凝胶释放系统；蜡涂层；使用常规粘合剂和赋形剂的压片；部分融合的植入物；等等。在某些实施方式中，脂质纳米颗粒或聚合物被用作本文所述的治疗性circRNA的递送载体，包括将RNA递送至组织。
在某些实施方式中，组合物的施用可以以任何方式进行，例如通过肠胃外或非胃肠外施用，包括通过气雾吸入、注射、输注、摄取、输血、植入或移植。例如，本文所述的组合物可通过静脉内(i.v.)注射、鼻内、鞘内或腹膜内经动脉、皮内、皮下、肿瘤内、髓内、结节内、肌内施用于患者。一方面，本发明的组合物静脉内施用。一方面，本发明的组合物通过皮内或皮下注射施用于受试者。所述组合物可以例如直接注射到肿瘤、淋巴结、组织、器官或感染部位。
在一个实施方式中，可以在一天、两天、三天、四天、五天、六天、一周、两周、三周、一个月、五周、六周、七周、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月以上之后重复施用。重复治疗也是可能的，如长期施用药。重复施用可以相同剂量或不同剂量进行。
在某些实施方式中，组合物可以在本发明的方法中通过维持疗法施用，如每周一次，持续6个月以上。
在一个实施方式中，细胞在引入后4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15天可以瞬时表达本文所述的circRNA。circRNA的瞬时表达可能受到递送方法的影响。在一个实施方式中，通过电穿孔将circRNA转导到细胞中。在一个实施方式中，通过本领域已知的脂质转染方法将circRNA引入细胞。
在某些实施方式中，如本文所述的circRNA可以与其他已知试剂和疗法组合使用。如本文所用，“组合”施用是指在受试者的治疗过程中向受试者提供两种(或多种)不同的治疗，例如，在受试者被诊断出患有疾病之后和在疾病治愈或消除或由于其他原因停止治疗之前提供两种以上治疗。在某些实施方式中，当开始第二种治疗时，一种治疗仍在进行中，因此在施用方面存在重叠。在本文中有时将其称为“同时”或“并发递送”。在其他实施方式中，一种治疗的递送在另一种治疗的递送开始之前结束。在任一种情况的某些实施方式中，由于联合施用，治疗更有效。例如，第二种治疗更有效，例如，较少的第二次治疗就可以看到相同的效果，或者与在没有第一治疗的情况下进行第二治疗或在第一治疗中观察到类似情况相比，第二次治疗在更大程度上减轻了症状。在某些实施方式中，递送使得症状或与病症相关的其他参数的减少大于在不存在另一种治疗的情况下递送一种治疗所观察到的减少。两种处理的效果可以是部分累加、完全累加或大于累加。递送可以使得当递送第二种治疗时仍然可以检测到递送的第一种治疗的效果。
在其他实施方式中，本文所述的组合物可以与外科手术、放射、化学疗法、抗体或其他试剂组合用于治疗方案。
实施例
实施例1
外源RNA环化有三种通用策略：使用溴化氰或类似的缩合剂的化学方法，使用RNA或DNA连接酶的酶促方法以及使用自剪接内含子的核酶学方法(Petkovic，S.&Muller，S.，“RNA circularization strategies in vivo and in vitro,”Nucleic Acids Research，43(4):2454-2465(2015)；Beadudry，D.&Perreault，J.，“An efficient strategy for thesynthesis of circular RNA molecules,”Nucleic Acids Research，23(15):3064-3066(1995)；Micura，R.，“Cyclic Oligoribonucleotides(RNA)by Solid-Phase Synthesis，“Chemistry-A European Journal，5(7):2077-2082(1999))。据报道，利用置换的I组催化内含子的核酶法更适用于长RNA环化，仅需添加GTP和Mg2+作为辅因子(Petkovic，S.&Muller，S.，“RNA circularization strategies in vivo and in vitro,”Nucleic AcidsResearch，43(4):2454-2465(2015))。这种排列的内含子-外显子(PIE)剪接策略由侧接半内含子序列的融合部分外显子组成(Puttaraju，M.&Been，M.，“Group I permuted intron-exon(PIE)sequences self-splice to produce circular exons,”Nucleic AcidsResearch，20(20):5357-5364(1992))。在体外，这些构建体会经历I组催化内含子的双重酯交换反应，但是由于外显子已经融合，因此它们以5'到3'的连接环被共价切除。(图1A)(Petkovic，S.&Muller，S.，“RNA circularization strategies in vivo and in vitro,”Nucleic Acids Research，43(4):2454-2465(2015))。使用此策略作为创建编码蛋白质的环状RNA的起点，插入一个1.1kb的序列，该序列包含全长脑心肌炎病毒(EMCV)IRES，高斯荧光素酶(GLuc)信息以及在T4噬菌体的胸苷酸合酶(Td)基因中的排列的I组催化内含子的3'和5'内含子之间的PIE构建体的两个与外显子片段相对应的短区域(E1和E2)(图1A，表1)(Ford，E.&Ares，M.，“Synthesis of circular RNA in bacteria and yeast using RNAcyclase ribozymes derived from a group I intron of phage T4,”Proceedings ofthe National Academy of Sciences，91(8):3117-3121(1994))。前体RNA是通过失控转录(run-off transcription)合成的，然后在镁离子和GTP的存在下加热以促进环化，基本上如先前针对较短RNA的环化所述(Ford，E.&Ares，M.，“Synthesis of circular RNA inbacteria and yeast using RNA cyclase ribozymes derived from a group I intronof phage T4,”Proceedings of the National Academy of Sciences，91(8):3117-3121(1994))。然而，没有获得剪接产品。据推测，剪接位点之间的长干扰区域可能降低剪接位点彼此相互作用并形成稳定的复合物的能力，从而降低了剪接效率。确实，天然I组内含子的5'和3'剪接位点之间的干扰区域平均长度为300-500个核苷酸，而我们构建的工程RNA的中间区域长了2至4倍(Vicens，Q.，等，“Toward predicting self-splicing and protein-facilitated splicing of group I introns,”RNA，14(10):2013-2029(2008))。因此，设计了长度为9(弱)或19(强)个核苷酸的完全互补的“同源臂”，并将其放置在前体RNA的5'和3'末端，目的是使5'和3'拼接点彼此靠近(图1B，表1)。通过前体RNA条带的消失评估，这些同源臂的添加将弱同源臂的剪接效率从0％提高到16％，将强同源臂的剪接效率提高到48％(图1C)。为了确保主要的剪接产物是环状的，用RNA酶R处理剪接反应(图1D)。在经过RNA酶R处理的剪接反应的假定剪接点处测序揭示了连接的外显子，与用RNA酶H消化的线性前体产生的两条条带相比，用寡核苷酸靶向的RNA酶H消化RNA酶R处理的剪接反应产生了一条条带(图1D和图1E)。这些数据表明，circRNA是这些剪接反应的主要产物，琼脂糖凝胶电泳使环形剪接产物与线性前体分子、切口圈、剪接中间体和切除的内含子简单有效地分离。
为了进一步提高从自剪接前体RNA产生circRNA的效率，考虑了可能影响成功环化的其他因素。3'PIE剪接位点位于IRES的近端，并且由于两个序列高度结构化，因此假设IRES内的序列可能会干扰剪接核酶的折叠，无论是在3'剪接位点的近端还是通过长距离接触在5'剪接位点的远端。为了使这些结构独立折叠，设计了3'PIE剪接位点和IRES之间的一系列间隔子，并预测将容许或破坏剪接(图1F，表1)。容许性间隔子被设计成保留内含子序列内存在的二级结构，这对于核酶的活性可能是重要的，而破坏性间隔子被设计成破坏两个内含子的一半，特别是5'一半。预测容许进行剪接的间隔子序列的添加将剪接效率从46％增加到87％(P1和P2)，而添加破坏性间隔子序列则完全废除了剪接(图1G)。包含同源臂和合理设计的间隔子的这种改进的构建体能够使长度接近5kb的RNA环化(图4A-图4B)。还探索了使用来自鱼腥藻前tRNA的替代I组催化内含子的方法(Puttaraju，M.&Been，M.，“Group I permuted intron-exon(PIE)sequences self-splice to produce circularexons,”Nucleic Acids Research，20(20):5357-5364(1992))。应用了用于提高排列的T4噬菌体内含子剪接反应效率的相同优化技术。有趣的是，在优化过程中，我们注意到从T4催化内含子切换到鱼腥藻催化内含子可能会导致IRES和编码区3'端之间的内部同源性短伸展的减弱，这可能有助于孤立的“剪接气泡”的形成(图1H)。使用排列的鱼腥藻催化内含子，加强这种内部同源性，进一步将剪接效率从84％进一步提高到95％(图1H和图1I，表1)。与T4催化内含子相比，鱼腥藻催化内含子的使用导致circRNA切口减少了37％(图1I和图1J)。由于增加的剪接效率和完整的circRNA输出，工程化的鱼腥藻PIE系统被证明总体上优于工程化的T4 PIE系统(图1J)。
外显子2和GLuc编码序列之间的内部同源性使得优化的鱼腥藻PIE系统与非GLuc干扰区域不相容。为了使circRNA构建体能够有效环化各种长干扰RNA序列，基于对影响排列的催化I组内含子剪接功效的参数的理解，从头设计了一对间隔子序列。这些间隔子序列被设计为具有三个优先级：1)对于近端内含子和IRES结构的折叠是惰性的；2)充分分离内含子和IRES二级结构；和3)包含一个间隔子-间隔子互补区域，以促进“剪接气泡”的形成(图2A，表1)。还包括前体分子5'和3'端的同源臂。在这些序列之间插入一个EMCV IRES以及五个不同蛋白质的编码区，其包括高斯荧光素酶、萤火虫荧光素酶、eGFP、人类促红细胞生成素和Cas9核酸内切酶。实现了所有五个RNA序列的环化(图2B，表1)；环化效率与逐步设计的构建体的环化效率相匹配(图1J)，并且在插入物之间可高度重现，但也取决于大小，长RNA环化效率较低(图5A)。此外，发现长circRNA在存在镁离子时更容易形成切口，从而导致在体外转录和RNA酶R消化消化过程中和之后积累了带切口的circRNA，从而降低了RNA酶R处理的样品的总产率和纯度(图2B和图2C，图5A)。RNA酶R不能完全消化抗性的鱼腥藻内含子(图2B，底部带)或环形连接(图2B，顶部带)。
已证明内源性circRNA可产生少量蛋白质(Legnini，I.等，“Circ-ZNF609 IsaCircular RNA that Can Be Translated and Functions in Myogenesis,”MolecularCell，66(1):22-37.e9(2017))。作为评估工程化circRNA产生蛋白质的能力的一种方法，将每种构建体的RNA酶R消化的剪接反应转染到人胚胎肾细胞(HEK293)中。通过发光测量，转染高斯或萤火虫荧光素酶circRNA导致功能性蛋白质的大量产生(图2D和图2G)。同样地，从促红细胞生成素circRNA的转染在细胞培养基中检测到人促红细胞生成素，并且从EGFPcircRNA的转染观察到EGFP荧光(图2E和图2F)。与仅sgRNA的对照相比，将Cas9 circRNA与针对GFP的sgRNA共转染到组成性表达GFP的HEK293细胞中，导致高达97％的细胞消融荧光(图2H和图2I)。由于剪接反应的RNA酶R消化并不总是完全，并且前体RNA包含功能性IRES，因此创建了GLuc构建体的剪接位点缺失突变体，以测量杂质对蛋白质表达的潜在贡献。当以与RNA酶R消化的剪接反应等重量的量转染时，该剪接位点缺失突变体产生了几乎检测不到的蛋白质水平(图5B和图5C)。
为了建立外源性circRNA作为现有线性mRNA技术的可靠替代品，希望最大化蛋白质表达。由IRES介导的不依赖于封端的翻译可以表现出不同水平的效率，这取决于细胞的情况，并且通常被认为没有包含在双顺反子线性mRNA中的封端依赖于性翻译有效(Borman，A.M.等，“Comparison of Picornaviral IRES-Driven Internal Initiation ofTranslation in Cultured Cells of Different Origins,”Nucleic Acids Research，25(5):925-932(1997))。同样，polyA尾通过聚腺苷酸结合蛋白的作用稳定并提高线性mRNA中的翻译起始效率(Imataka，H.，“A newly identified N-terminal amino acid sequenceof human eIF4G binds poly(A)-binding protein and functions in poly(A)-dependent translation,”The EMBO Journal，17.24:7480-489(1998)；Kahvejian，A.等，“Mammalian poly(A)-binding protein is a eukaryotic translation initiationfactor，which acts via multiple mechanisms,”Genes&Development，19(1):104-113(2005))。然而，尚未研究不同的IRES序列的效率以及在circRNA环境中包含polyA片段的效率。用来自含有已知或推定的IRES的几个病毒转录物的5'UTR序列以及几个其他推定的IRES序列(表1，图6A)替换了EMCV IRES(Weingarten-Gabbay，S.等，“Systematicdiscovery of cap-independent translation sequences in human and viralgenomes,”Science，351(6270)(2016))。已经发现，来自柯萨奇病毒B3(CVB3)的IRES比HEK293细胞中常用的EMCC IRES有效1.5倍(图3A)。由于靠近IRES的二级结构(包括直接位于IRES后面的编码区域内)具有破坏IRES折叠和翻译起始的潜力，因此在萤火虫荧光素酶的背景下测试了选定的病毒IRES序列。尽管CVB3 IRES仍然优于所有其他IRES，但其他几种IRES(尤其是脊髓灰质炎IRES)的功效也发生了显著变化(图3B)。测试了将内部polyA序列或polyAC间隔子对照添加到IRES序列，结果表明，从工程化circRNA驱动蛋白质产率超过背景水平的能力会改变蛋白质表达。发现这两个序列均改善了所有构建体中的表达，这可能是由于IRES序列的开始与外显子-外显子剪接连接之间的更大的非结构化分离所致，预计其将维持稳定的结构(图3B，图6B)。这种更大程度的非结构化分离可以减少位阻，从而阻止起始因子与IRES结构的结合。在EMCV和脊髓灰质炎病毒IRES的情况下，polyA序列的表达改善超过了非结构化polyAC间隔子所见的改善。这可能表明聚腺苷酸结合蛋白的缔合可以增强IRES效率。在为每个IRES选择最有效的polyA或polyAC构建体后，探索了IRES在不同细胞类型中的功效，包括人宫颈腺癌(HeLa)、人肺癌(A549)和永生化小鼠胰腺β细胞(Min6)。jIRES功效随类型而异，但是CVB3 IRES在所有测试的类型中均更优异(图3C、图6C和图6D)。
circRNA制品的纯度是使从circRNA生产蛋白质最大化和避免先天细胞免疫应答所必需的另一个因素。已经显示，通过HPLC去除dsRNA可消除免疫激活并改善线性核苷修饰的IVT mRNA的翻译(Kariko，K.等，“Generating the optimal mRNA for therapy：HPLCpurification eliminates immune activation and improves translation ofnucleoside-modified，protein-encoding mRNA,”Nucleic Acids Research，39(21):e142-e142(2011))。然而，尚未报道从IVT副产物和环化反应中纯化circRNA的可扩展方法，其中包括可能与RNA感受器结合并诱导细胞免疫应答的dsRNA和三磷酸RNA(Kariko，K.等，“Generating the optimal mRNA for therapy：HPLC purification eliminates immuneactivation and improves translation of nucleoside-modified，protein-encodingmRNA,”Nucleic Acids Research，39(21):e142-e142(2011))。尽管由于加工过程中的轻度降解而无法完全避免带切口的circRNA，但使用少量凝胶提取和使用较大量的剪接反应起始材料进行尺寸排阻HPLC可获得基本上纯的(90％环状，10％带切口)circRNA(图3D和图3E)。在这两种情况下，都用RNA酶R处理进行纯化，以消除大部分降解的RNA。当将凝胶提取的或HPLC纯化的circRNA的蛋白质表达与RNA酶R消化的剪接反应进行比较时，发现HPLC纯化是优于单独的RNA酶R消化的优异纯化方法(图3E和图3F)。
外源性circRNA翻译效率是否与线性mRNA相当，并且circRNA蛋白产生是否表现出稳定性差异，是未知的。使用HPLC纯化的工程化的circRNA，将高斯荧光素酶编码circRNA(CVB3-GLuc-pAC)的稳定性和功效与等摩尔量的未经修饰的经典5'甲基鸟嘌呤封端和3'polyA尾线性GLuc mRNA以及市售的核苷修饰的线性GLuc mRNA(Trilink)进行比较。转染后24小时通过发光评估的蛋白质产生表明，在HEK293细胞中在此早期时间点，circRNA比未经修饰的线性mRNA多产生811.2％的蛋白质(图3H)。有趣的是，circRNA比经修饰的mRNA也多产生了54.5％的蛋白质，这表明从circRNA产生稳健的蛋白质不需要进行核苷修饰。在HeLa细胞中获得了相似的结果(图3H)。在六天内收集的发光数据表明，在HEK293细胞中，circRNA的蛋白质产生相对于线性mRNA有所延长，circRNA的蛋白质产生半衰期为80小时，而从未经修饰和经修饰的线性mRNA的蛋白质产生的半衰期分别约为43和45小时(图3I)。由于增加的表达或稳定性，在其整个生命期内circRNA还比未经修饰和经修饰的线性mRNA产生的蛋白质要多得多(图3J和图3K)。在HeLa细胞中，circRNA表现出116小时的蛋白质生产半衰期，而未经修饰和经修饰的线性mRNA的蛋白质产生的半衰期分别约为44和49小时(图3I)。与未经修饰和经修饰的线性mRNA相比，这再次导致circRNA在其整个生命期内产生显著更多的蛋白质(图3J和图3K)。
从外源mRNA获得稳定的蛋白质生产一直是mRNA生物技术的长期目标。环状RNA的生产效率低、纯化困难和蛋白表达较弱，已使环状RNA适应此目的的可能性受到抑制。事实上，在全面评估从circRNA产生蛋白质的稳定性之前，必须克服这些障碍。使用包括本文所述的同源臂和间隔子的载体的基于模块排列的1组催化内含子的系统允许宽范围的长RNA的有效环化。另外，已表明优化的circRNA能够产生大量蛋白质，并且可以通过HPLC有效地纯化。最后，研究表明，与未经修饰和经修饰的线性RNA相比，circRNA可以在更长的时间内产生更多数量的蛋白质，这提供了证据证明circRNA可以作为mRNA的替代物来稳定表达治疗性蛋白质。
图17的结果显示，通过提高温度可以促进具有次优构建体的RNA环化，但是以增加的降解为代价。
图18A-图18C的结果显示环化对GTP浓度敏感，对RNA浓度不敏感，并且凝胶上的两个条带不互换(分别为A、B、C)；这也是强同源臂/5’间隔子环化的实例。
图19的结果显示从未优化的circRNA构建体的蛋白表达低–无间隔子，强同源臂；证明了纯化对circRNA表达/稳定性的重要性。
图20A和图20B的结果显示UTR可以改善circRNA的表达。图20C的结果显示，当与5'间隔子结合使用时，添加UTR的表达优势消失了，这表明UTR可以充当间隔子。图20D的结果显示了所有使用相同的间隔子/同源臂的含有UTR的构建体的有效环化。
图21A-图21G的结果显示了使用不同的IRES或间隔子序列的表达测定。图21E和图21F中的pA/UTR条件使用EMCV IRES，在某些情况下能够将表达提高到CVB3IRES的水平。图21G显示转染试剂和纳米颗粒的比较；在这里似乎没有什么不同。
图22A和图22B的结果显示了添加不同的5'或3'间隔子(除了现有的设计间隔子之外)可以调节表达。
图23A和图23B的结果显示了内含子可以不同程度干扰来自不同IRES序列的翻译；鱼腥藻对CVB3/polioV IRES的干扰较小，而T4噬菌体对EMCV的干扰较小。图23B显示了对不同IRES(通过LNP的小鼠肝脏)的体内评估。
图24的结果显示，与促进具有缺失剪接位点的相同circRNA前体分子的转录的质粒相比，促进哺乳动物细胞中circRNA前体分子的转录的质粒没有显示出增强的蛋白质翻译，表明在哺乳动物细胞中不发生环化。
图25A和25B的结果显示，含有一组带有高斯或萤火虫荧光素酶编码区的IRES序列的构建体的环化效率–尽管插入片段不同，效率仍保持一致。这些构建体均具有相同的剪接序列(定义为间隔子、同源臂和内部同源性(这是间隔子的一部分)。
图26A和26B的结果显示，在体外转录反应中单磷酸鸟苷的峰值(超过三磷酸鸟苷)降低了circRNA制品的免疫原性。单磷酸鸟苷最好与HPLC结合以用于敏感细胞。
材料和方法
克隆和诱变
蛋白质编码、I类自剪接内含子和IRES序列是化学合成的(Integrated DNATechnologies)，并使用NEBuilder HiFi DNA Assembly试剂盒(New England Biolabs)通过Gibson装配克隆到含有T7 RNA聚合酶启动子的PCR线性质粒载体中。使用Q5定点诱变试剂盒(New England Biolabs)引入间隔子、同源臂和其他微小变化。
circRNA设计、合成和纯化
使用RNAFold来预测RNA结构(Vicens，Q.等，“Toward predicting self-splicingand protein-facilitated splicing of group I introns,”RNA，14(10):2013-2029(2008))。经修饰的线性GLuc mRNA获自Trilink Biotechnologies。使用T7高产率RNA合成试剂盒(New England Biolabs)通过从线性质粒DNA模板进行体外转录来合成未经修饰的线性mRNA或circRNA前体。体外转录后，将反应用DNA酶I(New England Biolabs)处理20分钟。DNA酶处理后，使用MEGAclear Transcription Clean-up试剂盒(Ambion)对未经修饰的线性mRNA进行柱纯化。然后将RNA加热至70℃持续5分钟，然后立即置于冰上3分钟，然后根据制造商的说明，使用mRNA cap-2'-O-甲基转移酶(NEB)和牛痘菌封端酶(NEB)将RNA进行封端。根据制造商的说明，使用大肠杆菌PolyA聚合酶(NEB)将多腺苷尾添加到加封端的线性转录物中，将完全加工的mRNA进行柱纯化。对于circRNA，在DNA酶处理后，添加额外的GTP至终浓度2mM，然后将反应在55℃加热15分钟。然后将RNA进行柱纯化。在某些情况下，将纯化的RNA重新循环：将RNA加热至70℃持续5分钟，之后，将GTP与含镁的缓冲液(50mM Tris-HCl，10mM MgCl2，1mM DTT，pH 7.5；New England Biolabs)一起添加至终浓度2mM。然后将RNA加热至55℃持续8分钟，然后进行柱纯化。为了富集circRNA，将20μg RNA用水稀释(最终体积为86μL)，然后在65℃加热3分钟，然后在冰上冷却3分钟。加入20U RNA酶R和10μL的10xRNA酶R缓冲液(Epicenter)，并将该反应在37℃温育15分钟；在反应中途加入另外的10URNA酶R。RNA酶R消化的RNA进行柱纯化。使用E-gel EX 1-2％程序在E-gel iBase(Invitrogen)上的2％ E-gel EX琼脂糖凝胶(Invitrogen)上分离RNA。使用其他琼脂糖凝胶系统未获得足够的circRNA分离。使用蓝光透射将条带可视化，并使用ImageJ量化条带。对于凝胶提取，从凝胶上切下对应于circRNA的条带，然后使用Zymoclean Gel RNA提取试剂盒(Zymogen)提取。对于高效液相色谱，将30μg RNA在65℃加热3分钟，然后在冰上放置3分钟。RNA在Agilent 1100系列HPLC(Agilent)上通过4.6x300mm尺寸排阻柱，其粒径为5μm，孔径为(Sepax Technologies；部件号：215980P-4630)。RNA在不含RNA酶的TE缓冲液(10mM Tris，1mM EDTA，pH:6)中以0.3mL/分钟的流速运行。通过260nm处的UV吸光度检测RNA，但是在没有UV检测的情况下收集RNA。所得的RNA级分用5M乙酸铵沉淀，重悬于水中，然后在某些情况下如上所述用RNA酶R处理。
RNA酶H切口分析
在DNA探针(表1)的存在下，剪接反应用RNA酶R富集circRNA，然后进行了柱纯化，将其在65℃加热5分钟，摩尔过量为5倍，然后在室温下退火。在提供的反应缓冲液中，用RNA酶H(New England Biolabs)在37℃处理反应15分钟。消化后将RNA进行柱纯化。
逆转录和cDNA合成
对于剪接连接测序，剪接反应用RNA酶R富集circRNA，然后进行柱纯化在65℃加热5分钟，并在冰上冷却3分钟以标准化二级结构。根据制造商的建议，使用对推定circRNA内部区域具有特异性的引物用Superscript IV(Invitrogen)进行逆转录反应。使用Q5聚合酶(New England Biolabs)和一对跨越剪接点的引物合成用于测序的PCR产物。
组织培养和转染
将HEK293、HEK293-GFP、HeLa和A549细胞在补充有10％热灭活的胎牛血清(hiFBS，Gibco)和青霉素/链霉素的Dulbecco改良的Eagle培养基(4500mg/L葡萄糖)中于37℃和5％CO2进行培养。Min6培养基另外补充有5％hiFBS、20mM HEPES(Gibco)和50μMβ-巯基乙醇(BioRad)。每2-3天传代细胞。对于图2A-图2I所示的所有circRNA数据集，除了Cas9以外，按照制造商的说明，使用Lipofectamine MessengerMax(Invitrogen)，将40-100ng RNA酶R处理的剪接反应或HPLC纯化的circRNA转入96孔板，每孔10,000个HEK293细胞/100μL。对于Cas9，使用MessengerMax将100ng体外转录的sgRNA单独逆转或与150ng RNA酶R处理的Cas9剪接反应共转染到24孔板中，每孔50,000个HEK293-GFP细胞/500μL。对于图3A-图3K所示的所有RNA数据集，使用MessengerMax将等摩尔量的每种RNA反向转染到96孔板中，每孔10,000个HEK293、HeLa或A549细胞/100μL。将Min6细胞以96孔板形式转染，融合度为60-80％。
蛋白质表达分析
对于发光测定，在转染后24小时收获细胞和培养基。为了检测高斯荧光素酶的发光，将10-20μL的组织培养基转移到平底白壁板(Corning)中。将包括稳定剂(New EnglandBiolabs)的25μL BioLux高斯荧光素酶试剂添加到每个样品中，并在45秒后在Infinite200Pro微孔板读数器(Tecan)上测量发光。为了检测萤火虫荧光素酶的发光，将100μLBright-Glo荧光素酶试剂(Promega)添加到每个孔中，混合并温育5分钟。然后将100μL的培养基和荧光素酶试剂混合物转移至平底的白壁板上，并如上所述检测发光。转染后24小时检测到GFP荧光，并使用EVOS FL细胞成像仪(Invitrogen)拍摄图像。基本上根据制造商的说明，通过固相夹心ELISA(R&D Systems)检测促红细胞生成素，不同之处在于使用转染后24小时的细胞培养上清液，并在使用前按1：200稀释样品。
流式细胞术
在转染96小时后，通过流式细胞术检测了CRISPR-Cas9介导的GFP消融。用胰蛋白酶消化HEK293-GFP和HEK293对照细胞，并将其悬浮在补充有10％胎牛血清和青霉素/链霉素的Dulbecco改良版Eagle培养基(4500mg/L葡萄糖)中。然后将细胞在FACS缓冲液(PBS，5％加热灭活的胎牛血清)中洗涤两次，并根据制造商的说明重新悬浮在含有Sytox BlueDead Cell Stain(Thermo Fisher)的FACS缓冲液中，或者将单独的FACS缓冲液用于GFP和空白对照。在BD FACSCelesta流式细胞仪(BD Biosciences)上检测到10,000个事件的荧光。在Flowjo(Flowjo LLC)中分析数据。
统计
假设方差不相等，通过双尾不成对的Welch's t检验对结果进行统计分析。当p<0.05时，差异被认为是显著的。图例中显示了各个实验的统计细节。
实施例2
环状RNA(circRNA)是一类具有连续结构的单链RNA，其具有增强的稳定性和缺乏与各种细胞蛋白相互作用所必需的末端基序。此处显示未经修饰的外源性circRNA能够绕过细胞RNA感受器，从而避免在RIG-1和toll样受体(TLR)感受态细胞和小鼠中引起免疫应答。发现circRNA制剂的免疫原性和蛋白质表达稳定性取决于纯度，少量的污染线性RNA会导致强大的细胞免疫应答。未经修饰的circRNA在体外的免疫原性低于未经修饰的线性mRNA，部分归因于逃避了TLR感应，并引起了类似于尿苷修饰的线性mRNA诱导的细胞因子应答。此外，发现circRNA的尿苷修饰破坏了内部核糖体进入位点(IRES)介导的翻译，并且对细胞因子的反应没有显著影响。最后，数据显示了体内外源性circRNA传递和翻译的首次证明，并且数据表明，与未经修饰和尿苷修饰的线性mRNA相比，circRNA翻译在脂肪组织中得到扩展。
介绍
CircRNA是一类具有一系列蛋白质编码和非编码功能的RNA(Legnini，I.等Circ-ZNF609 Is a Circular RNA that Can Be Translated and Functions inMyogenesis.Mol.Cell 66,22–37.e9(2017)；Li，Z.等Exon-intron circular RNAsregulate transcription in the nucleus.Nat.Struct.Mol.Biol.22，256–264(2015)；Hansen，T.B.等Natural RNA circles function as efficient microRNAsponges.Nature 495，384–388(2013)；和Barrett，S.P.&Salzman，J.Circular RNAs：analysis，expression and potential functions.Development 143，1838–1847(2016)。真核细胞通过反向剪接产生circRNA，而病毒病原体(如丁型肝炎病毒和植物类病毒)的基因组也可以是环状的(Chen，L.-L.&Yang，L.Regulation of circRNA biogenesis.RNABiol.12，381–388(2015)；Jeck，W.R.&Sharpless，N.E.Detecting and characterizingcircular RNAs.Nat.Biotechnol.32，453–461(2014)；Wang，Y.&Wang，Z.Efficientbacksplicing produces translatable circular mRNAs.RNA 21，172–179(2014)；Sanger，H.L.，Klotz，G.，Riesner，D.，Gross，H.J.&Kleinschmidt，A.K.Viroids aresingle-stranded covalently closed circular RNA molecules existing as highlybase-paired rod-like structures.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.73，3852–3856(1976)；Kos，A.，Dijkema，R.，Arnberg，A.C.，van der Meide，P.H.&Schellekens，H.The hepatitisdelta(delta)virus possesses a circular RNA.Nature 323，558–560(1986)；Chen，Y.G.等Sensing Self and Foreign Circular RNAs by Intron Identity.Mol.Cell 67，228–238.e5(2017))。最近有人提出，使用RIG-1作为外源性circRNA的胞质感受器，细胞已经进化出了一种用来识别内源性和外源性circRNA的剪接依赖性机制(Chen，Y.G.等SensingSelf and Foreign Circular RNAs by Intron Identity.Mol.Cell 67，228–238.e5(2017))。尽管circRNA不包含RIG-I激活所需的三磷酸基序，但已表明RIG-I可能与缺乏宿主核蛋白的circRNA瞬时相互作用，从而导致RIG-I介导的抗病毒反应(Chen，Y.G.等Sensing Self and Foreign Circular RNAs by Intron Identity.Mol.Cell 67，228–238.e5(2017)；Loo，Y.M.&Gale，M.，Jr.Immune signaling by RIG-I-like receptors.-PubMed-NCBI.获自：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21616437。(访问时间：2018年5月7日)。然而，RIG-I介导的circRNA识别机制尚不清楚。除RIG-I外，circRNA还可能与其他RNA感受器相互作用，例如内体TLR 3、7和8，这些感受器已被证明响应于线性ssRNA和dsRNA基序以及RNA降解产物(如尿苷和鸟苷-尿苷富集片段)可激活信号传导，(Tanji，H.等Toll-like receptor 8senses degradation products of single-strandedRNA.Nat.Struct.Mol.Biol.22，109–115(2015)；Zhang，Z.等Structural AnalysisReveals that Toll-like Receptor 7Is a Dual Receptor for Guanosine and Single-Stranded RNA.Immunity 45，737–748(2016)；Bell，J.K.，Askins，J.，Hall，P.R.，Davies，D.R.&Segal，D.M.The dsRNA binding site of human Toll-like receptor3.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.103，8792–8797(2006)；和Tatematsu，M.，Nishikawa，F.，Seya，T.&Matsumoto，M.Toll-like receptor 3recognizes incomplete stem structuresin single-stranded viral RNA.Nat.Commun.4，1833(2013))。为了减少对外源性RNA的先天细胞免疫应答，已开发出了用于线性mRNA的核苷修饰，如假尿苷(ψ)、N1-甲基假尿苷(m1ψ)和5-甲氧基尿苷(5moU)(Svitkin，Y.V.等N1-methyl-pseudouridine in mRNA enhancestranslation through eIF2α-dependent and independent mechanisms by increasingribosome density.(Nucleic Acids Res.45，6023–6036(2017)；Karikó，K.，Muramatsu，H.，Ludwig，J.&Weissman，D.Generating the optimal mRNA for therapy：HPLCpurification eliminates immune activation and improves translation ofnucleoside-modified，protein-encoding mRNA.Nucleic Acids Res.39，e142(2011)；Karikó，K.等Incorporation of Pseudouridine Into mRNA Yields SuperiorNonimmunogenic With Increased Translational Capacity and BiologicalStability.Mol.Ther.16，1833(2008))。这些修饰已显示可防止线性mRNA激活TLR和RIG-I(Karikó，K.，Buckstein，M.，Ni，H.&Weissman，D.Suppression of RNA recognition byToll-like receptors：the impact of nucleoside modification and theevolutionary origin of RNA.Immunity 23，165–175(2005)；Durbin，A.F.，Wang，C.，Marcotrigiano，J.&Gehrke，L.RNAs Containing Modified Nucleotides Fail ToTrigger RIG-I Conformational Changes for Innate Immune Signaling.MBio 7，(2016))。N6-甲基腺苷(m6A)对RNA的修饰已证明可在内源性线性和circRNA中介导封端非依赖性翻译(Meyer等2015；Yang等2017)。TLR对circRNA免疫原性的贡献以及核苷修饰对外源circRNA翻译、稳定性和免疫原性的影响尚未报道。
最近，开发了用于在哺乳动物细胞中稳定蛋白质生产的circRNA(Wesselhoeft,R.A.,Kowalski,P.S.&Anderson,D.G.Engineering circular RNA for potent andstable translation in eukaryotic cells.Nat.Commun.9,2629(2018))。如本文所述，在体外和体内研究了外源性circRNA的免疫原性和可翻译性，以确定circRNA在蛋白质生产应用中的潜在效用。本文证明外源性circRNA不刺激RIG-1和TLR感受态细胞中的细胞免疫应答。另外，已经表明，与线性mRNA不同，IRES依赖性circRNA在蛋白质表达和免疫原性方面不受m1ψ修饰或在蛋白质表达方面不受m6A修饰。发现circRNA与脂质纳米颗粒介导的递送相容，并且在体内有效翻译而不会引起RNA介导的先天免疫应答，而与脂肪组织中尿苷修饰的线性mRNA相比，circRNA的蛋白质表达显示出更高的稳定性。
结果
外源性circRNA的纯化消除免疫原性
使用先前报道的优化的排列的内含子-外显子(PIE)剪接方法，通过失控转录合成了circRNA前体，其包含柯萨奇病毒B3内部核糖体进入位点(CVB3 IRES)，高斯荧光素酶(GLuc)信息，两个设计的间隔子序列，两个对应于PIE构建体外显子片段的短区，排列的鱼腥藻pre-tRNA I组内含子的3'和5'内含子片段(图7A-图7B)(Wesselhoeft，R.A.，Kowalski，P.S.&Anderson，D.G.Engineering circular RNA for potent and stabletranslation in eukaryotic cells.Nat.Commun.9，2629(2018)；Puttaraju，M.&Been，M.Group I permuted intron-exon(PIE)sequences self-splice to produce circularexons.Nucleic Acids Res.20，5357–5364(1992))。在存在GTP和Mg2+的情况下，这些前体RNA分子会经历I组催化内含子的双重酯交换反应，但是由于外显子已经融合，因此两个内含子片段之间的区域被切除为共价5'至3'连接环(图7A)(Puttaraju，M.&Been，M.Group Ipermuted intron-exon(PIE)sequences self-splice to produce circularexons.Nucleic Acids Res.20，5357–5364(1992))。为了确认获得了环状产物，将剪接反应用RNA酶R(3'至5'RNA核酸外切酶)处理，并观察到推定的circRNA条带富集(图7C)(Suzuki，H.等Characterization of RNase R-digested cellular RNA source that consists oflariat and circular RNAs from pre-mRNA splicing.Nucleic Acids Res.34，e63–e63(2006))。随后通过HPLC纯化RNA酶R处理的剪接反应，然后用寡核苷酸靶向的RNA酶H消化产生了一条主要条带，与RNA酶H消化的线性前体RNA(其包含与circRNA前体相同的所有序列元素的RNA，除剪接位点核苷酸外)获得的两条主要条带相反(图7C，ΔS)，证实了环状性。与转染入293细胞后的聚腺苷酸化和磷酸酶处理的线性前体相比，含有circRNA的剪接反应显示出改善的蛋白质生产和蛋白质生产的表达稳定性(图7G-图7J)。
为了探测circRNA的免疫原性，选择了两种细胞系(人胚胎肾293；人肺癌A549)，观察到它们在转染未纯化的circRNA剪接反应后引起差异性的细胞活力和GLuc表达稳定性反应(图7E和图7F)。环化方案完成后，期望这些剪接反应包含circRNA，切除的三磷酸化内含子，线性和环状连接以及线性RNA和circRNA的降解产物，其中某些被三磷酸化。尽管在本文所用的环化条件下剪接反应几乎完成，但也存在某些三磷酸化的线性前体RNA。然后将几个步骤应用于未纯化的剪接反应中进行纯化，并通过凝胶电泳确认circRNA富集：RNA酶R富集circRNA，HPLC去除非环状成分，磷酸酶去除残留的三磷酸酯(图7D)。为了确定先天细胞对转染RNA的免疫响应程度，监测了多种细胞因子和趋化因子向培养基中的释放，以及来自circRNA的蛋白质表达稳定性和细胞活力。
发现与未转染的对照相比，剪接反应的RNA酶R消化不足以消除A549细胞中的细胞因子释放(图7F，图8G)。尽管我们确实注意到与未纯化的剪接反应相比，IL-6的显著减少和IFN-α1的显著增加，但是添加HPLC纯化不足以消除细胞因子的释放，这表明RNA酶R和HPLC的联合使用可能耗尽了某些免疫原性的RNA种类，同时使其他种类富集(图7F)。尽管注意到与未纯化的剪接反应相比，IL-6减少，但添加HPLC纯化还是不足以消除细胞因子的释放(图7F)。有趣的是，在HPLC纯化后和RNA酶R消化之前添加磷酸酶处理可显著降低我们在A549细胞中评估的所有上调细胞因子的表达，分泌的MCP1、IL-6、IFN-α1、TNF-α和IP-10下降到检测不到或未转染的基线水平(图7F)。没有观察到293细胞中大量的细胞因子释放，这与circRNA纯度的程度相对不影响这些细胞的3天蛋白质表达稳定性表型的观察结果一致，并且先前的报道表明293细胞不表达几种关键的RNA感受器(图7E，图8G)(Hornung，V.等Quantitative expression of toll-like receptor 1-10mRNA in cellular subsets of人类peripheral blood mononuclear cells and sensitivity to CpG oligodeoxynucleotides.J.Immunol.168，4531–4537(2002))。相反，增加的circRNA纯度改善了转染的A549细胞中的GLuc表达稳定性，其中完全纯化的circRNA表现出与转染的293细胞相似的稳定性表型(图7E和图7F)。同样，转染后3天，增加circRNA纯度的趋势改善了A549细胞的活力，而293细胞活力仍未受到很大影响，这与293细胞中缺乏炎症信号传导和随着circRNA纯度增加而减少了A549细胞中的炎症信号相一致(图7E和图7F)。总之，这些结果表明，circRNA的纯度强烈影响其免疫原性，并且完全纯化的circRNA的免疫原性明显低于未纯化或未完全纯化的剪接反应。从circRNA产生蛋白质的稳定性还取决于circRNA纯度和转染的细胞类型对污染RNA种类的敏感性。在用剪接反应或完全纯化的circRNA转染A549细胞后的前8个小时内，监控RIG-1、IFN-β1、IL-6和RANTES转录物诱导的时程实验并未显示出对circRNA的瞬时反应(图9M)。纯化的circRNA同样无法在RAW264.7鼠巨噬细胞中诱导促炎转录物(图9N)。为了将这些发现概括为另一种合成的circRNA构建体，我们测试了响应于用含有EMCV IRES和EGFP编码区的纯化circRNA转染A549细胞的促炎转录物的诱导作用，再次未能观察到实质性诱导作用(图9O)。这些数据表明，剪接反应的非环状成分是先前研究中观察到的免疫原性的原因，并且circRNA不是RIG-1的天然配体。
剪接反应的非环状成分有助于免疫原性
为了探索circRNA剪接反应中免疫原性的来源，通过HPLC纯化剪接反应的每个组分，并评估了转染A549细胞后的细胞因子释放和细胞活力(图8A和图8B)。因为难以从剪接反应获得合适的纯线性前体RNA，所以分别合成并纯化了剪接位点缺失突变体(ΔS)形式的前体RNA(图8B，右下)。另外，将circRNA峰分成两个级分以控制带切口的RNA峰重叠(图8B)。响应于剪接反应中存在的大多数种类以及前体RNA，观察到稳健的IL-6、RANTES和IP-10释放(图8C，图9G)。早期circRNA级分引起的细胞因子响应与其他非circRNA级分相当，表明即使相对少量的线性RNA污染物也能在A549细胞中诱导大量的细胞免疫应答。晚期circRNA级分未引起超过未转染对照的细胞因子应答。与细胞因子释放的观察结果一致，对于转染后36小时的A549细胞活力，晚期circRNA片段明显高于所有其他片段(图8D)。
因为先前已经报道了circRNA可能在自我调节反馈环中诱导RIG-I转录，所以在用晚期circRNA HPLC级分转染A549细胞后，对RIG-I和IFN-β1转录物的诱导进行了分析(Chen，Y.G.等Sensing Self and Foreign Circular RNAs by IntronIdentity.Mol.Cell 67，228–238.e5(2017))。与前体RNA和未纯化的剪接反应相比，对于晚期circRNA级分，观察到RIG-1和IFN-β1转录物的诱导显著更弱(图8E)。此外，发现仅用RNA酶R处理剪接反应不足以消除这种作用(图8F)，而纯化的circRNA被非常少量的RIG-I配体3p-hpRNA污染会诱导大量的RIG-I转录(图9I)。在HeLa细胞中，转染RNA酶R的剪接反应，而不是纯化的circRNA，诱导了RIG-I和IFN-β1，尽管发现HeLa细胞对污染RNA种类的敏感性不及A549细胞(图9L)。这些数据表明，剪接反应的非环状成分是先前研究中观察到的免疫原性的原因，并且circRNA不是RIG-1的内源性配体。
circRNA的核苷修饰具有破坏性
据报道，诸如5-甲基胞苷(m5C)、N6-甲基腺苷(m6A)和假尿苷(ψ)的核苷修饰可通过阻止核糖核苷酸与细胞RNA感受器(如内体TLR 3、7和8和RIG-I)相互作用而降低体外和某些情况下体内线性mRNA的免疫原性(Karikó，K.，Buckstein，M.，Ni，H.&Weissman，D.Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors：the impact ofnucleoside modification and the evolutionary origin of RNA.Immunity 23，165–175(2005)；Durbin，A.F.，Wang，C.，Marcotrigiano，J.&Gehrke，L.RNAs ContainingModified Nucleotides Fail To Trigger RIG-I Conformational Changes for InnateImmune Signaling.MBio 7，(2016))。据报道，N6-甲基腺苷(m6A)可在线性RNA以及单独地内源性circRNA上介导内部核糖体的进入和翻译。然而这些修饰对体内mRNA效用的影响可能是可变的，因为递送至肝脏的ψ-mRNA不会降低免疫原性或提高蛋白质产率(Kauffman，K.J.等Efficacy and immunogenicity of unmodified and pseudouridine-modifiedmRNA delivered systemically with lipid nanoparticles in vivo.Biomaterials109，78–87(2016))。最近，据报道，与ψ的掺入相比，m1ψ的掺入在更大程度上降低了mRNA的免疫原性并改善了蛋白质表达(Svitkin，Y.V.等N1-methyl-pseudouridine in mRNAenhances translation through eIF2α-dependent and independent mechanisms byincreasing ribosome density.Nucleic Acids Res.45，6023–6036(2017)和Andries，O.等N(1)-methylpseudouridine-incorporated mRNA outperforms pseudouridine-incorporated mRNA by providing enhanced protein expression and reducedimmunogenicity in mammalian cell lines and mice.J.Control.Release 217，337–344(2015))。尚未测试核苷修饰对circRNA翻译效率和免疫原性的影响。由于先前的circRNA纯化存在困难，因此尚未评估纯化的circRNA相对于未经修饰的线性mRNA的免疫原性。因此，试图评估与在A549和293细胞中的未经修饰的和m1ψ修饰的线性mRNA相比，纯化的未经修饰的和m1ψ修饰的circRNA的GLuc蛋白表达稳定性和细胞因子释放概况(图9A)。
使用PIE方法环化m1ψ-circRNA的最初尝试失败，因为在PIE构建体前体中用m1ψ完全替代尿苷消除了核酶活性，而部分替代则大大降低了剪接效率(图9B)。使用T4 RNA连接酶I和夹板寡核苷酸制备circRNA的另一种方法设计成使前体RNA的末端接近以进行连接(图10G)(Sonja Petkovic,S.M.RNA circularization strategies in vivo and invitro.Nucleic Acids Res.43,2454(2015))。使用优化的夹板寡核苷酸和退火条件，获得了1.5kb前体RNA的40％环化效率(图10H和图10I)。用m 1ψ完全替代尿苷并不妨碍使用该方法的环化，并且获得了完全改性的环状产物(图9C)。
用m1ψ-circRNA转染293和A549细胞后，未观察到蛋白质表达，因此未确定来自修饰的circRNA的蛋白质表达的稳定性(图9D)。与未经修饰的和经修饰的线性mRNA相比，未经修饰的circRNA在HEK293和A549细胞中显示出增强的蛋白质表达稳定性(图9E和图9F)。有趣的是，已发现，尽管进行了封端、磷酸酶处理和HPLC纯化以去除RIG-1配体，但未经修饰的线性mRNA在免疫应答性A549细胞中比未经修饰的circRNA引起更大的细胞因子应答。相反，m1ψ-circRNA和m1ψ-mRNA均未显著改变细胞因子释放曲线(图9F、图11E)。在未经修饰的线性mRNA而不是未经修饰的circRNA或m1ψ-RNAs转染时，A549的细胞活力降低(图9F)。与来自图7A-F的数据一致，未检测到转染后24小时的293细胞因子释放和转染后3天的细胞活力的显著差异(图9E，图11E)。这些实验表明，circRNA的免疫原性不如封端和聚腺苷酸化的线性mRNA，而且circRNA的核苷修饰对于保护先天免疫感受器是不必要的。
CircRNA逃避了toll样受体的检测
由于封端和聚腺苷酸化的线性mRNA能够触发细胞因子分泌，而circRNA则不能，因此研究了不同RNA激活报告细胞中TLR的能力。已知TLR 3、7和8可检测内体中的RNA并引发炎症级联反应(Takumi Kawasaki，T.K.Toll-Like Receptor SignalingPathways.Front.Immunol.5，(2014))。TLR3结合病毒ssRNA中的dsRNA和茎结构，而TLR7和人TLR8结合ssRNA和核苷降解产物(对于TLR7而言鸟苷和对于TLR8而言尿苷)，这两种配体都是激活TLR所必需的(Tanji，H.等Toll-like receptor 8senses degradation productsof single-stranded RNA.Nat.Struct.Mol.Biol.22，109–115(2015)；Zhang，Z.等Structural Analysis Reveals that Toll-like Receptor 7Is aDual Receptor forGuanosine and Single-Stranded RNA.Immunity 45，737–748(2016)；Bell，J.K.，Askins，J.，Hall，P.R.，Davies，D.R.&Segal，D.M.The dsRNA binding site of human Toll-likereceptor 3.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.103，8792–8797(2006)；和Tatematsu，M.，Nishikawa，F.，Seya，T.&Matsumoto，M.Toll-like receptor 3recognizes incompletestem structures in single-stranded viral RNA.Nat.Commun.4，1833(2013))。为了控制线性和环状RNA之间的结构和序列差异，构建了circRNA的线性版本。该构建体包含剪接的circRNA的所有组分，并且是通过缺失内含子和同源臂序列(线性的RNA，图10A，图12G)而产生的。另外，所有线性RNA均用磷酸酶另外处理(在封端的RNA的情况下，封端后)并通过HPLC纯化。尽管在TLR7报告细胞中未发现对线性或环状RNA的应答，但TLR3和TLR8报告细胞均被封端的线性RNA、聚腺苷酸化的线性RNA、带切口的circRNA部分和早期circRNA部分激活(图10B)。有趣的是，类似于m1ψ-mRNA，晚期circRNA级分在任何细胞系中均不会引起TLR介导的响应(图10B)。然而，在用circRNA转染的TLR8报告细胞的培养基中添加尿苷而不是胞苷可部分逆转此效应并导致SEAP分泌，这表明为TLR8激活所需的两个RNA降解信号之一的反式添加可以补偿TLR8检测到的circRNA的缺乏(图10C，图12H)。
接下来，使用两种方法将纯化的circRNA线性化：在镁离子存在下加热处理circRNA，以及DNA寡核苷酸引导的RNA酶H消化(图10D)。两种方法都产生了带有少量完整circRNA的主要全长线性RNA，尽管热处理导致了较大比例的较低分子量线性RNA降解产物(图10E)。通过加热和RNA酶H降解的circRNA的转染促使TLR8报告细胞中SEAP分泌(图4F)。尽管通过体外转录的线性RNA激活了TLR3，但在降解或完整条件的TLR3和TLR7报告细胞中未观察到激活(图4F，图12I)。这些结果表明，circRNA能够避免被TLR检测到，而TLR8逃逸是环形构象的结果。
外源性circRNA可在体内翻译
首先检查未经修饰的和经m1ψ修饰的人促红细胞生成素(hEpo)线性mRNA和circRNA的翻译和免疫原性，除编码区域外，其线性mRNA与图9A所示相同(图13，图14A)。m1ψ-mRNA和未经修饰的circRNA的等摩尔转染导致293细胞中稳健蛋白质表达(图14B)。与293和A549细胞等重量转染后的GLuc线性mRNA和circRNA相比，hEpo线性mRNA和circRNA表现出相似的相对蛋白表达模式和细胞活力(图14C和D)。在小鼠中，将hEpo circRNA或线性mRNA注射到内脏脂肪中后，在血清中检测到hEpo(图11A和图11D)。注射未经修饰的circRNA后检测到的hEpo的降解速度比未经修饰的或m1ψ-mRNA慢，并且在注射后42小时仍然存在(图11B)。观察到在注射未纯化的circRNA剪接反应或未经修饰的线性mRNA后血清hEpo迅速下降(图11B)。此外，未纯化的剪接反应的注射产生了在血清中可检测到的细胞因子应答，这对于包括纯化的circRNA在内的其他RNA，未观察到(图11C，图15)。
CircRNA与脂质纳米颗粒相容
脂质纳米颗粒已显示出可作为治疗性RNA的递送载体的巨大潜力，包括将mRNA递送至组织(Oberli，M.A.等Lipid Nanoparticle Assisted mRNA Delivery for PotentCancer Immunotherapy.Nano Lett.17，1326–1335(2017)；Yanez Arteta，M.等Successfulreprogramming of cellular protein production through mRNA delivered byfunctionalized lipid nanoparticles.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.115，E3351–E3360(2018)；和Kaczmarek，J.C.，Kowalski，P.S.&Anderson，D.G.Advances in the deliveryof RNA therapeutics：from concept to clinical reality.Genome Med.9，60(2017))。为了评估脂质纳米颗粒在体内递送circRNA的功效，将纯化的circRNA与可电离的类脂质cKK-E12配制成纳米颗粒(Dong，Y.等Lipopeptide nanoparticles for potent andselective siRNA delivery in rodents and nonhuman primates.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.111，3955–3960(2014)；和Kauffman，K.J.等Optimization of LipidNanoparticle Formulations for mRNA Delivery in Vivo with Fractional Factorialand Definitive ScreeningDesigns.Nano Lett.15，7300–7306(2015))。这些颗粒形成均匀的多层结构，其平均大小、多分散性指数和封装效率类似于包含用5-甲氧基尿苷修饰的市售对照线性mRNA的颗粒(5moU，图12A，表2)。与5moU-mRNA相比，封装在LNP中的纯化hEpocircRNA在添加到293细胞后显示出稳健的表达(图12B，左)。该可商购的mRNA的表现类似于先前相对于circRNA所使用的m1ψ-mRNA(图14C)。293细胞中LNP-RNA的蛋白质表达稳定性与转染试剂递送的RNA相似，不同之处在于5moU-mRNA和circRNA的衰变略有延迟(图12B，右)。LNP中的封装不会在体外改变RIG-I/IFN-β1的诱导或TLR激活，未经修饰的circRNA无法以类似于5moU-mRNA的方式激活免疫感受器(图12C和图12D)。
在小鼠中，将LNP-RNA局部注射到内脏脂肪组织中(图16B)。在将LNP-RNA注射入内脏脂肪或静脉内递送至肝脏后6小时，来自circRNA的血清hEPo表达较低，但与5moU-mRNA的水平相当(图12E，图16E)。脂肪注射未经修饰的LNP-circRNA后检测到的血清hEpo的衰减比LNP-5moU-mRNA的衰减更慢，血清中存在的表达衰减延迟类似于体外观察到的(图12F)；然而，静脉内注射LNP-circRNA后检测到的血清hEpo以与LNP-5moU-mRNA相同的速率衰减(图16E)。在注射LNP-5moU-mRNA或LNP-circRNA后，未观察到血清细胞因子的增加或局部RIG-1、TNF-α或IL-6转录物的诱导(图16C和图16D)。
表2
cKK-E12制剂 多分散性 大小强度平均值 封装效率(％)
5moU-mRNA 0.14±0.02 92±6 75±6
未纯化的 0.13±0.04 87±7 75±13
环状的 0.12±0.03 95±7 77±14
LNP-RNA的理化特性(数据表示为平均值±SD，n＝3)。
讨论
在这项工作中，证明了外源性circRNA逃避了RNA感受器，并且在注入小鼠脂肪组织后，其表达相对于线性mRNA有所扩展。尽管先前检查circRNA免疫原性的研究表明，由于缺乏相关的宿主剪接因子，外源性circRNA引发了由RIG-I介导的强先天细胞免疫应答(Chen等，2017)，但这项研究发现circRNA不能激活几种已知的细胞RNA感受器，包括TLR和RIG-I(Chen，Y.G.等Sensing Self and Foreign CircularRNAs by IntronIdentity.Mol.Cell 67，228–238.e5(2017))。这些不一致的结果可能是circRNA制备中杂质的结果。先前的研究已使用通过RNA酶R纯化的circRNA(Chen，Y.G.等Sensing Self andForeign Circular RNAs by Intron Identity.Mol.Cell 67，228–238.e5(2017))。这项研究发现，用RNA酶R处理不足以获得纯的circRNA，并富集多种抗性RNA物质，其包括circRNA和具有结构化3'末端的线性RNA。此外，即使少量的污染性线性RNA，也足以引起稳健的细胞免疫应答(图9C)，其中某些线性RNA可能带有三磷酸并且可能在HPLC纯化后存在。circRNA的HPLC纯化存在独特的困难，因为带切口的circRNA和完整的circRNA的分子量相等，它们各自的峰部分重叠。三磷酸化前体RNA的降解产物也会在circRNA峰内分离，因此需要温和的circRNA制备。磷酸酶处理，在存在二价阳离子的情况下将热暴露降至最低，并且严格的HPLC峰选择可以减少这些危害。使用此处所述的纯化方案，发现尽管没有与circRNA相关的宿主剪接因子，与剪接反应的其他成分或小鼠脂肪组织相比，circRNA未从TLR和RIG-I感受态细胞引发大量的先天免疫应答。使用此处描述的纯化方案，发现与剪接反应的其他成分或小鼠脂肪组织相比，circRNA不会从TLR和RIG-1感受态细胞引发大量的先天免疫应答。另外，从纯化的circRNA产生的蛋白质比从未纯化的circRNA产生的蛋白质明显更稳定，并且纯化的circRNA的转染导致细胞活力大大提高(图7F，图8D)，两者都是非环状污染物引起的抗病毒反应的指标(Loo，Y.M.&Gale，M.，Jr.Immune signaling by RIG-I-likereceptors.-PubMed-NCBI.获自：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21616437。(访问时间：2018年5月7日))。据报道，核苷修饰，特别是尿苷修饰，可通过阻止RNA感受器检测来降低线性mRNA免疫原性，这对于某些组织类型中的RNA功能可能很重要(Karikó，K.，Buckstein，M.，Ni，H.&Weissman，D.Suppression of RNA recognition by Toll-likereceptors：the impact of nucleoside modification and the evolutionary originof RNA.Immunity 23，165–175(2005)；Durbin，A.F.，Wang，C.，Marcotrigiano，J.&Gehrke，L.RNAs Containing Modified Nucleotides Fail To Trigger RIG-I ConformationalChanges for Innate Immune Signaling.MBio 7，(2016))。使用此处所述的构建体，与体外和在脂肪组织中的未经修饰的mRNA相比，观察到来自m1ψ-mRNA的增强的蛋白表达稳定性(图9E，图11B)。这可能是免疫逃逸的次要结果，也可能是修饰的无关主要作用。用m1ψ修饰circRNA前体分子会干扰PIE构建体中的剪接以及酶促环化RNA的翻译，这表明m1ψ会显著改变核酶和IRES结构的折叠。
已证明用m6A修饰RNA可促进活细胞内源性线性和环状RNA以及细胞裂解液中外源线性RNA的封端非依赖性翻译(Meyer等2015；Yang等2017)。我们发现用m6A部分取代腺苷不足以驱动活细胞中外源完整或线性化circRNA的翻译，这与先前的报道一致，表明核RNA结合蛋白参与协助m6A依赖性翻译(图9F,图9G)(Lin等2016)。
与线性mRNA不同，circRNA高度依赖折叠的RNA结构，包括排列的I组内含子和IRES，用于剪接和翻译。用m1ψ和m6A修饰circRNA前体分子会干扰PIE构建体中的剪接和酶促环化RNA中的翻译，表明修饰显著改变了这些结构元件的折叠(图9B、图9D、图9F、图9G)。
已证明掺入ψ可以增强碱基堆积的相互作用，这可能导致结构改变；然而，其他核苷修饰可能与核酶和IRES结构更兼容，并允许研究在稳定过程中修饰的circRNA翻译(Davis，D.R.Stabilization of RNA stacking by pseudouridine.Nucleic AcidsRes.23，5020(1995))。虽然已知经修饰的线性mRNA能够避免被TLR检测，但令人惊讶的是发现未经修饰的circRNA表现出相同的特性。最近，已经报道了TLR7和TLR8的配体是RNA的降解产物，包括短片段的ssRNA和核苷(Tanji，H.等Toll-like receptor 8sensesdegradation products of single-stranded RNA.Nat.Struct.Mol.Biol.22，109–115(2015)；Zhang，Z.等Structural Analysis Reveals that Toll-like Receptor 7IsaDual Receptor for Guanosine and Single-Stranded RNA.Immunity 45，737–748(2016))。据推测这些降解产物是RNA内化后不久由内体中的核酸酶产生的(Roers，A.，Hiller，B.&Hornung，V.Recognition of Endogenous Nucleic Acids by the InnateImmune System.Immunity 44，739–754(2016))。circRNA的连续结构可以赋予其对内体核酸酶的抗性，从而导致逃避这些检测器。在这种情况下，预期内体核酸酶主要由核酸外切酶组成，因为预期核酸内切酶的存在会导致circRNA降解。与这种假设一致，向TLR8报告细胞的培养基中添加两个协同的TLR8配体之一尿苷能够部分消除circRNA的免疫逃避特性，这表明缺乏降解产物，因此核酸酶抗性可能确实是circRNA逃避TLR8的原因。然而，尚未将降解产物定义为TLR3的配体，该circRNA在TLR3过表达的293细胞中也似乎逃逸，尽管它包含与激活TLR3的线性circRNA相同的dsRNA基序。RNA降解产物可能以与TLR8相似的方式在二聚化界面处与TLR3结合(Roers，A.，Hiller，B.&Hornung，V.Recognition of EndogenousNucleic Acids by the Innate Immune System.Immunity 44，739–754(2016))。还观察到了线性circRNA在TLR3激活中的差异，其中体外转录的线性circRNA引起TLR3介导的应答，而通过降解纯化的circRNA产生的线性circRNA则没有(图10B和图10F)。通过加热或RNA酶H降解circRNA可能会破坏对于稳健的TLR3激活所需的dsRNA结构。
与转染试剂复合或在LNP内脂肪内注射circRNA，产生的hEpo表达比来自m1ψ-mRNA或5moU-mRNA的hEpo表达更稳定(图11B和图12F)。然而，尽管观察到在24小时时在293细胞中circRNA产生的hEpo产率比m1ψ-mRNA或5moU-mRNA等摩尔转染的hEpo产率高近两倍，但在体内来自circRNA的hEpo表达却相对降低。有几个因素可能导致此结果。CVB3 IRES最初被选择用于circRNA是基于其在人类细胞系中驱动翻译的能力(Wesselhoeft，R.A.，Kowalski，P.S.&Anderson，D.G.Engineering circular RNA for potent and stabletranslation in eukaryotic cells.Nat.Commun.9，2629(2018))。因此，小鼠脂肪或肝组织可能不是CVB3 IRES介导的翻译的理想细胞类型。IRES序列还必须与带有m7G封端的内源转录物竞争翻译起始因子。因此，相对于转录物密度，使用病毒IRES序列启动翻译的circRNA在具有更高启动因子密度的细胞中可能更有效。需要其他IRES序列在多种组织中驱动circRNA进行翻译的能力的全面表征。
尽管6小时时来自circRNA的相对表达量可与从脂肪组织获得的相对量相当，通过LNP静脉内递送至肝脏的circRNA的蛋白质表达稳定性并未得到增强(图12E和图16E)。该结果突出了组织特异性稳定性，其可能取决于多种因素，包括一般的RNA周转率或核酸内切酶活性，序列特异性翻译抑制或降解以及是否存在RNA稳定蛋白。circRNA内miRNA结合位点的评估和改变或序列特异性降解基序的缺失可能会进一步增强circRNA的稳定性和在所选组织中的表达。
在注射了未纯化的剪接反应的小鼠中检测到血清细胞因子的增加，但是在注射了未经修饰的mRNA、m1ψ-mRNA/5moU-mRNA或circRNA的小鼠中未检测到这种反应。与体外结果一致，观察到注射未经修饰的mRNA和未纯化的剪接反应后，hEpo表达迅速降低，而注射m1ψ-mRNA/5moU-mRNA和circRNA后的血清hEpo保持相对稳定，表明m1ψ-mRNA/5moU-mRNA和circRNA不会引起实质性的免疫应答，从而导致体内RNA降解。将circRNA配制到LNP中不会改变免疫感受器的相互作用，并且在注射LNP-RNA后对血清细胞因子和局部促炎转录水平的分析并未显示出针对LNP传递的circRNA的免疫应答。
据认为，circRNA在某些组织中的表达稳定性增强，并且circRNA避免免疫感受器而无需进行核苷修饰的能力证明了circRNA作为表达治疗性蛋白的载体的潜力。
方法：
RNA设计、合成和纯化
使用T7高产率RNA合成试剂盒(New England Biolabs(NEB))通过线性质粒DNA模板的失控体外转录合成线性mRNA或circRNA前体，并用N1-甲基假尿苷(TrilinkBiotechnologies)完全替代尿苷，以用于修饰线性或环状RNA。体外转录后，将反应用DNA酶I(NEB)处理15分钟。DNA酶处理后，使用MEGAclear Transcription Clean-up试剂盒(Ambion)对RNA进行柱纯化。然后将RNA加热至70℃持续3分钟，并立即置于冰上2分钟，然后根据制造商的说明，使用mRNAcap-2'-O-甲基转移酶(NEB)和牛痘菌封端酶(NEB)将线性RNA进行封端。根据制造商的说明，使用大肠杆菌PolyA聚合酶(NEB)将多腺苷尾添加到封端的线性转录物中，然后将完全加工的mRNA进行柱纯化。对于circRNA，将GTP与含镁的缓冲液(50mM Tris-HCl，10mM MgCl2，1mM DTT，pH 7.5；NEB)一起添加至终浓度为2mM，然后将反应在55℃加热8分钟。然后将RNA进行柱纯化。在某些情况下，用RNA酶R消化circRNA：在水中稀释20μg RNA(最终体积为86μL)，然后在70℃加热3分钟，然后在冰上冷却2分钟。加入20URNA酶R和10μL的10x RNA酶R缓冲液(Applied Biological Materials)，并将反应在37℃温育15分钟；在反应中加入另外的10U RNA酶R。RNA酶R消化的RNA进行了柱纯化。在某些情况下，RNA用磷酸酶(CIP，NEB)处理：如上所述，将20μg RNA稀释、加热和冷却，然后将Cutsmart缓冲液(NEB)与20U CIP一起添加至终浓度1X。将反应在37℃温育15分钟。将经磷酸酶处理的RNA进行柱纯化。将RNA稀释在50％甲酰胺中，在70℃变性3分钟，然后冷却至室温。然后使用E-gel EX 1-2％程序在E-gel iBase(Invitrogen)上的2％E-gel EX琼脂糖凝胶(Invitrogen)上分离RNA；ssRNA Ladder(NEB)被用作标准物。使用蓝光透射将条带可视化，并使用ImageJ量化条带。对于高效液相色谱法，将30μg RNA在65℃加热3分钟，然后在冰上放置2分钟。RNA在Agilent 1100系列HPLC(Agilent)上通过4.6x300mm尺寸排阻柱，其粒径为5μm，孔径为(Sepax Technologies；部件号：215980P-4630)。RNA在不含RNA酶的TE缓冲液(10mM Tris，1mM EDTA，pH：6)中以0.3mL/min的流速运行。通过260nm处的UV吸光度检测RNA，但是在没有UV检测的情况下收集RNA。将所得的RNA级分用5M乙酸铵沉淀，重悬于水中，然后在某些情况下如上所述进行进一步的酶处理。5moU经修饰的萤火虫萤光素酶和hEpo mRNA从Trilink Biotechnologies获得。
夹板连接
设计用于夹板介导的连接的线性前体，使其具有与PIE环状circRNA相同的所有序列特征，不同之处在于在前体RNA的5'和3'末端上添加了短的衔接子序列。这些衔接子序列与用于环化的夹板具有相同的同源性(最优夹板：5'-GTTTGTGGTTCGTGCGTCTCCGTGCTGTTCTGTTGGTGTGGG-3'(SEQ ID NO：33)。夹板连接前体RNA的合成如前所述，但将过量10倍的GMP加入到体外转录反应中。将25μg纯化的前体RNA在5μM的浓度DNA夹板的存在下在90μL反应中加热至70℃持续5分钟。使反应冷却至室温，然后加入T4 RNA连接酶I缓冲液(NEB)至终浓度为1X。ATP加入至终浓度1mM。添加50U T4 RNA连接酶I(NEB)。将反应液于37℃孵育30分钟，然后进行柱纯化。
RNA酶H切口
在5倍摩尔过量的DNA探针(5'-TTGAACCCAGGAATCTCAGG-3'(SEQ ID NO：34))的存在下用RNA酶R富集circRNA，然后进行柱纯化，或通过HPLC纯化的剪接反应于70℃加热5分钟，然后在室温下进行退火。将反应物在所提供的反应缓冲液中用RNA酶H(New EnglandBiolabs)在37℃处理15分钟。消化后将RNA进行柱纯化。
组织培养、转染和细胞活力
将293和A549细胞RAW264.7细胞(ATCC)以及HEK-Blue小鼠TLR3、小鼠TLR7、人类TLR8、Null1和Null2细胞(Invivogen)在补充有10％加热灭活的胎牛血清(hiFBS，Gibco)和青霉素/链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基(4500mg/L葡萄糖)中在37℃和5％CO2培养。HEK293和HeLa细胞支原体测试呈阴性。每2-3天传代细胞。对于293和A549细胞，根据制造商的说明，使用Lipofectamine MessengerMax(Invitrogen)将40ng RNA反向转染至96孔板，每孔10,000个细胞/100μL。对于HEK-Blue细胞，使用Lipofectamine MessengerMax将100ngRNA反向转染至96孔板，每孔40,000个细胞/100μL。对于在RNA收获和qPCR之前转染的A549细胞，使用Lipofectamine MessengerMax将200ng RNA反向转染至24孔板，每孔100,000个细胞。对于在多个时间点评估蛋白质表达的实验，将培养基完全去除并在每个时间点进行更换。对于分析了SEAP活性或细胞因子的实验，在转染和评估之间不替换培养基。对于所有转染实验，将RNA加热至70℃持续3分钟，并立即在冰上放置2分钟，然后再与转染试剂复合。细胞转染后36-72小时使用MultiTox试剂盒(Promega)评估细胞活力。为了通过TLR报告基因和空细胞检测SEAP分泌，转染后36-48小时收获培养基，并与HEK-Blue检测试剂(Invivogen)混合，至终浓度为1X。将培养基和检测试剂在37℃温育过夜，然后在Infinite200Pro微孔板读数器(Tecan)上测量640nm的吸光度。R848、polyI:C和3p-hpRNA均来自Invivogen。
蛋白质表达分析
对于发光分析，转染后24小时收获培养基。为了检测高斯荧光素酶的发光，将20μL组织培养基转移到平底白壁板(Corning)上。将包括稳定剂(New England Biolabs)的25μLBioLux高斯荧光素酶试剂添加到每个样品中，并在45秒后在Infinite 200Pro微孔板读数器(Tecan)上测量发光。基本上根据制造商的说明，通过固相夹心ELISA(R&D Systems)检测到人促红细胞生成素。通过Fireplex免疫分析(Abcam)检测图1A-图1J、图3A-图3K和图5A-图5C中的细胞因子。通过单独或多重免疫测定(Eve Technologies)检测了图2A-图2I和图6A-图6D中的细胞因子。
逆转录和qPCR
转染后24小时，根据制造商的说明，使用RNeasy Mini Plus试剂盒(Qiagen)或RNeasy脂质试剂盒(Qiagen)洗涤细胞，收获并纯化RNA，用于从小鼠脂肪组织中提取RNA。使用随机六聚体(Thermo Fisher Scientific)，用高容量cDNA反转录试剂盒从总RNA合成第一链cDNA。购买了基因特异性TaqMan引物(Thermo Fisher Scientific)；人类引物：GAPDH(Hs99999905_m1)，DDX58(Hs01061436_m1)，IFN-β1(Hs01077958_s1)；小鼠引物：Gapdh(Mm99999915_g1)，Ddx58(Mm01216853_m1)，Il-6(Mm00446190_m1)，Tnf(Mm00443258_m1)。使用LightCycler 480Probe Master Mix(Roche)和LightCycler 480仪器(Roche)进行qPCR反应。对于每个样品，根据比较Ct方法处理阈值循环值(Ct)。将基因表达水平相对于管家基因GAPDH的表达进行标准化。
动物实验
所有动物实验均在MIT动物护理和使用委员会的指导下进行。将30-35g C57Bl/6雌性小鼠随机分为治疗组或对照组，通过右下侧乳腺脂肪垫和腹膜向内脏脂肪中注入总体积为50μL的与MessengerMax或1.5皮摩尔LNP-RNA复合的350ng RNA，或通过尾静脉注射0.1mg/kg LNP-RNA进行静脉注射。在指定的时间点通过尾出血或心脏穿刺将血液样本收集到BD Microtainer管中。为了收集血清，使血液凝结15-30分钟，然后在室温下以2000xg离心5分钟。如前所述，检测到2μL血清中的人促红细胞生成素。为了收集脂肪组织，处死小鼠，取出整个下内脏脂肪组织，并在液氮中冷冻，以用于随后的RNA分离。
脂质纳米颗粒制剂
如前所述，使用注射泵通过在微流控设备中以1：3的体积比混合乙醇和水相来制备LNP。简而言之，通过溶解摩尔比为35：16：46.5：2.5的可电离的类脂质cKK-E12、1,2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE，Avanti)、胆固醇(Sigma)和1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基-(聚乙二醇)-2000](铵盐)(C14-PEG 2000，Avanti)的混合物制备乙醇相。在具有线性mRNA或circRNA的10mM柠檬酸盐缓冲液(pH 3)中制备水相。在室温下，在Slide-A-LyzerTMG2透析盒，20,000MWCO(Thermo Fisher)中，将LNP对PBS透析2小时。根据制造商的方案，使用Quant-iT RiboGreen分析(Thermo Fisher)分析封装在LNP纳米颗粒中的mRNA的浓度。通过比较在不存在和存在1％(v/v)Triton X-100的情况下的测量结果来计算将mRNA封装到LNP中的效率。使用Zetasizer Nano ZS(Malvern Instruments，Worcestershire，UK)，通过动态光散射(DLS)分析了纳米粒径、多分散性(PDI)和ζ电位。LNP水动力直径以体积加权模式报告，其是三个独立测量值的平均值。
CRYO-TEM
对于低温透射电子显微镜(Cryo-TEM)，样品在Gatan Cryo Plunge III(Cp3)上制备。简而言之，将3μL的样品滴到覆盖有连续碳膜并在液态乙烷中冷冻的花边铜格栅上。随后，将冷冻的格栅安装在Gatan 626单倾斜冷冻保持器上。使用在200kV下操作的JEOL2100FEG显微镜以10,000-60,000的放大倍数进行成像。所有图像均使用Gatan2kx2kUltraScan CCD相机在低剂量条件下记录。
数据分析和统计
对于图10A-图10I和图12A-图12I图中的TLR数据，将在TLR报告细胞中测得的吸光度，相对于在与mTLR3和hTLR8的五个NF-κB和AP-1结合位点融合的IFN-β最小启动子的控制下的仅包含具有SEAP的质粒的空报告细胞，或在与mTLR7(Invivogen)的五个NF-κB和AP-1结合位点融合的IL-12p40最小启动子的控制下的仅包含具有SEAP的质粒的空报告细胞中测得的吸光度，进行标准化。对于所有多日GLuc和hEpo数据，每种条件下的表达均相对于表达的第一天。假设方差不相等，通过双尾不成对的Welch's t检验对结果进行统计分析。当p<0.05时，差异被认为是显著的。对于所有研究，给出的数据代表一项独立实验。
STAR方法：
Wesselhoeft，R.A.，等，“RNA Circularization Diminishes Immunogenicityand Can Extend Translation Duration In Vivo,”Molecular Cell，vol.74，第508-520页(2019)通过引用以其整体并入本文。
本文引用的所有专利、公开申请和参考文献的教导通过引用以其整体并入本文。
虽然已经具体地示出和描述了示例实施方式，但是本领域技术人员将理解，可以在不脱离所附权利要求所涵盖的实施方式的范围的情况下在其中进行形式和细节上的各种改变。

Claims (24)

1.一种环状RNA，其包含按以下顺序排列的以下元件：
a)3'I组自剪接内含子-外显子的相邻外显子序列，
b)内部核糖体进入位点(IRES)，
c)蛋白质编码区或非编码区，和
d)5'I组自剪接内含子-外显子的相邻外显子序列。
2.如权利要求1所述的环状RNA，其中，所述3'I组自剪接内含子-外显子的相邻外显子序列或所述5'I组自剪接内含子-外显子的相邻外显子序列的长度为至少1个核苷酸。
3.如权利要求1所述的环状RNA，其中，所述3'I组自剪接内含子-外显子的相邻外显子序列或所述5'I组自剪接内含子-外显子的相邻外显子序列的长度约为天然外显子的长度。
4.如权利要求1所述的环状RNA，其中，所述3'I组自剪接内含子-外显子的相邻外显子序列或所述5'I组自剪接内含子-外显子的相邻外显子序列来自蓝藻鱼腥藻。
5.如权利要求1所述的环状RNA，其中，所述3'I组自剪接内含子-外显子的相邻外显子序列或所述5'I组自剪接内含子-外显子的相邻外显子序列来自蓝藻鱼腥藻属pre-tRNA-Leu基因。
6.如权利要求1所述的环状RNA，所述环状RNA还包含一个或多个5'间隔子序列或3'间隔子序列。
7.如权利要求6所述的环状RNA，其中：
a)所述5'间隔子序列包含5'内部同源区域，并且
b)所述3'间隔子序列包含3'内部同源区域。
8.如权利要求6所述的环状RNA，其中：
a)所述5'间隔子序列的长度为至少7个核苷酸，和/或
b)所述3'间隔子序列的长度为至少7个核苷酸。
9.如权利要求6所述的环状RNA，其中：
a)所述5'间隔子序列的长度为至少100个核苷酸，和/或
b)所述3'间隔子序列的长度为至少100个核苷酸。
10.如权利要求6所述的环状RNA，其中：
a)所述5'间隔子序列的长度为10-60个核苷酸，和/或
b)所述3'间隔子序列的长度为10-60个核苷酸。
11.如权利要求6所述的环状RNA，其中：
a)所述5'间隔子序列包含polyA序列、polyC序列、polyA-C序列或poly-U序列，和/或
b)所述3'间隔子序列包含polyA序列、polyC序列、polyA-C序列或poly-U序列。
12.如权利要求1所述的环状RNA，其包含按以下顺序排列的以下元件：
a)所述3'I组自剪接内含子-外显子的相邻外显子序列，
b)5'间隔子序列，
c)所述内部核糖体进入位点(IRES)，
d)所述蛋白质编码区或非编码区，
e)3'间隔子序列，和
f)所述5'I组自剪接内含子-外显子的相邻外显子序列。
13.如权利要求1所述的环状RNA，其中，所述IRES选自以下的IRES序列：Taura综合征病毒、吸血猎蝽病毒、泰累尔氏脑脊髓炎病毒、猿猴病毒40、红火蚁病毒1、禾谷缢管蚜病毒、网状内皮增生症病毒、人脊髓灰质炎病毒1、大豆尺蠖病毒、克什米尔蜂病毒、人鼻病毒2、琉璃叶蝉病毒-1、人免疫缺陷病毒1型、琉璃叶蝉病毒-1、虱P病毒、丙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒、GB型肝炎病毒、口蹄疫病毒、人肠道病毒71、马鼻病毒、茶尺蠖样病毒、脑心肌炎病毒(EMCV)、果蝇C病毒、十字花科烟草病毒、蟋蟀麻痹病毒、牛病毒性腹泻病毒1、黑皇后细胞病毒、蚜虫致死麻痹病毒、禽脑脊髓炎病毒、急性蜂麻痹病毒、芙蓉枯黄环斑病毒、猪瘟病毒、人类FGF2、人类SFTPA1、人类AMLl/RUNXl、果蝇触角足、人类AQP4、人类AT1R、人类BAG-1、人类BCL2、人类BiP、人类c-IAPl、人类c-myc、人类eIF4G、小鼠NDST4L、人类LEF1、小鼠HIF1α、人类n.myc、小鼠Gtx、人类p27kipl、人类PDGF2/c-sis、人类p53、人类Pim-1、小鼠Rbm3、果蝇reaper、犬Scamper、果蝇Ubx、唾液病毒、柯萨病毒、双埃柯病毒、人类UNR、小鼠UtrA、人类VEGF-A、人类XIAP、果蝇hairless、酿酒酵母TFIID、酿酒酵母YAP1、人类c-src、人类FGF-1、猿猴小核糖核酸病毒、芜菁绉缩病病毒、eIF4G的适体、柯萨奇病毒B3(CVB3)或柯萨奇病毒A(CVB1/2)。
14.如权利要求1所述的环状RNA，其中，所述IRES是来自柯萨奇病毒B3(CVB3)、脑心肌炎病毒(EMCV)或唾液病毒的IRES序列。
15.如权利要求1所述的环状RNA，其中，所述蛋白质编码区或非编码区是编码真核蛋白质或原核蛋白质的蛋白质编码区。
16.如权利要求1所述的环状RNA，其中，所述蛋白质编码区或非编码区是编码人蛋白质、非人蛋白质或合成蛋白质的蛋白质编码区。
17.如权利要求1所述的环状RNA，其中，所述蛋白质编码区或非编码区是编码嵌合抗原受体、治疗性蛋白或结合蛋白的蛋白质编码区。
18.如权利要求1所述的环状RNA，其中，所述环状RNA的大小为500至10,000个核苷酸。
19.如权利要求1所述的环状RNA，其中，所述环状RNA的大小为至少1,000个核苷酸。
20.一种组合物，其包含：
a)有效量的环状RNA，其中所述环状RNA包含按以下顺序排列的以下元件：
i)3'I组自剪接内含子-外显子的相邻外显子序列，
ii)内部核糖体进入位点(IRES)，
iii)蛋白质编码区或非编码区，和
iv)5'I组自剪接内含子-外显子的相邻外显子序列；以及
b)选自由脂质、聚合物或脂质-聚合物杂化物组成的组中的纳米载体。
21.一种组合物，其包含：
a)有效量的环状RNA，其中所述环状RNA包含按以下顺序排列的以下元件：
i)3'I组自剪接内含子-外显子的相邻外显子序列，
ii)内部核糖体进入位点(IRES)，
iii)蛋白质编码区或非编码区，和
iv)5'I组自剪接内含子-外显子的相邻外显子序列；以及
b)药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
22.一种治疗疾病的方法，所述方法包括对有需要的受试者施用有效量的环状RNA，其中所述环状RNA包含按以下顺序排列的以下元件：
a)3'I组自剪接内含子-外显子的相邻外显子序列，
b)内部核糖体进入位点(IRES)，
c)蛋白质编码区或非编码区，和
d)5'I组自剪接内含子-外显子的相邻外显子序列。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述3'I组自剪接内含子-外显子的相邻外显子序列或所述5'I组自剪接内含子-外显子的相邻外显子序列的长度为至少1个核苷酸。
24.如权利要求22所述的方法，其中，所述3'I组自剪接内含子-外显子的相邻外显子序列或所述5'I组自剪接内含子-外显子的相邻外显子序列的长度为约天然外显子的长度。
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