CN109069506A - 用于治疗癌症的方法中的共济失调-毛细血管扩张突变的和Rad3-相关的蛋白激酶(ATR)抑制剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及共济失调‑毛细血管扩张突变的和Rad3‑相关的蛋白激酶(ATR)抑制剂，其用于治疗BAF‑复合体缺陷型癌症的方法中。本发明还提供了用于鉴别ATR抑制剂以用于治疗BAF‑复合体基因突变型或缺陷型癌症的方法。还提供了与使用ATR抑制剂治疗滑膜肉瘤有关的医疗用途和方法。

Description

用于治疗癌症的方法中的共济失调-毛细血管扩张突变的和 Rad3-相关的蛋白激酶(ATR)抑制剂

发明领域

本发明涉及用于治疗BAF-复合体缺陷型癌症的方法中的共济失调-毛细血管扩张突变的和Rad3-相关的蛋白激酶(ATR)抑制剂，且具体说来涉及利用合成致死(如使用ATR抑制剂)治疗癌症(如ARID1A缺陷型癌症)的材料和方法。本发明还提供鉴别ATR抑制剂用于治疗BAF复合体基因突变型或缺陷型癌症的方法。还提供了与使用ATR抑制剂治疗滑膜肉瘤有关的医疗用途和方法。

发明背景

每年，大多数新癌症药物批准是针对现有的靶标的，而仅仅两种或三种化合物是针对新型分子而许可的。这反映了涉及鉴别和验证对疾病发病机制关键的蛋白质的困难、时间和成本，而不是提示有限的靶标数量。结果是许多关键的蛋白质仍未成药(undrugged)，且因此丧失了开发新型疗法的时机。此情况可通过使用鉴别关键分子靶标的方法得到改善，所述分子靶标是与病情发展有关的途径的基础。例如，如基因靶向的技术可为强有力的，其中基因可被选择性地失活或被敲除。然而，这种方法受到其成本和低通量的限制。此外，实情通常是，当前癌症治疗方法由于具有相似临床表型的组归入一类，而不考虑作为它们基础的不同分子病理学。这种分子异质性的后果在于，个体常展现对药物治疗的巨大差异。因此，靶向个体癌症的基础分子生物学的疗法越来越成为有吸引力的方法。

ATR(共济失调-毛细血管扩张突变(ATM)的和Rad3-相关的蛋白激酶)是细胞DNA损伤响应(DDR)的关键组分(1)。ATR由单链DNA区域激活，其常常作为复制应激的结果而存在(2-4)。致癌基因激活可诱导复制应激和对ATR检查点功能的依赖，从而提供使用小分子ATR抑制剂(ATRi)作为癌症治疗剂的一个理由(5)。近来，目前在I期临床试验中发现了有效且特异的ATRi，包括VE-821和VX-970(亦称VE-822)(Vertex)(5)。然而，至今，仅在典型的DNA修复基因ERCC1(10)、XRCC1(11)和ATM(12)中的缺陷被提出作为单试剂ATRi敏感性的预测性生物标记。也不清楚除典型DDR以外的过程是否可能影响ATRi敏感性并且其它常见的癌症驱动基因是否可能改变对这些试剂的响应。

在本领域中仍然需要新的治疗策略，具体说来，靶向不同形式癌症的遗传相关性的那些新治疗策略。

发明概述

概括地说，本发明是基于试图鉴别合成的致死遗传因子作为用于ATR抑制剂敏感性的生物标记的研究。这些结果是基于使用ATR抑制剂VE-821和VX-970的示例性证据。在临床前研究中，VE-821已显示增强许多DNA破坏剂的细胞毒性效应(6-9)，提示ATR抑制剂(ATRi)可具有作为化学增敏剂的临床效用。然而，可能使用ATRi例如作为治疗癌症的单一试剂的情况还不太清楚。

抑制ATR激酶活性的药物(ATRi)最近已进入癌症治疗的1期临床试验，主要作为化学敏化剂。为了揭示单试剂ATRi响应的遗传定子，本发明的工作进行了一系列的合成致死遗传筛选，发现在BAF复合体肿瘤抑制子基因ARID1A中的缺陷在体外和体内深深地使肿瘤细胞对ATRi敏感。ATRi在ARID1A突变细胞中引发早熟有丝分裂进入、基因组不稳定和细胞凋亡，即可能由预存的拓扑异构酶和DNA解连环缺陷所引起的效应。BAF-复合体缺陷存在于≈20％人类肿瘤中。本文所述的研究发现其它BAF肿瘤抑制子基因的抑制也会造成ATRi敏感性，提示此合成致死法可具有更宽效用。此资料因此提供关于BAF缺陷被评定为ATRi响应的生物标记的临床前和基本原理。在如下所述的研究中，我们致力于鉴别单试剂ATRi敏感性的临床上可行的决定簇。使用大规模遗传筛选，鉴别了BAF组分ARID1A作为ATRi的合成致死靶标。基于此资料，本发明提出，ARID1A和BAF缺陷可充当ATRi敏感性的临床上有用的生物标记。

SWItch/Sucrose Non-Fermentable(SWI/SNF)染色质重塑复合体由多种组分组成，包括蛋白质如ARID1A、SMARCA4和SMARCB1，它们具有肿瘤抑制子作用(13)。虽然SWI/SNF复合体的蛋白质组成极大地变化，但存在两种主要型式的SWI/SNF，即BAF和PBAF(14)。当作为一组时，SWI/SNF组分据估计在几乎20％所有人类肿瘤中有突变，使得此复合体的丢失成为癌症中最常见的改变(13)。

另外，由于已知在与滑膜肉瘤有关的基因中的易位也导致BAF-复合体缺陷，所以本发明扩展至用ATR抑制剂治疗滑膜肉瘤，如通过以下实验所证明，其中含有这种基因易位缺陷的细胞系对ATR抑制剂是敏感的。实验证明，此效应是通用的，因为细胞系对靶向共济失调-毛细血管扩张突变的和Rad3-相关的蛋白激酶(ATR)的ssRNAi分子是敏感的。

在本发明中，对ATR的提及表示共济失调-毛细血管扩张突变(ATM)和Rad3-相关蛋白激酶。在本发明中，对ATR的提及表示具有HGNC ID:882的共济失调-毛细血管扩张突变(ATM)和Rad3-相关蛋白激酶。ATR的HUGO Gene Symbol报告可见于：http:// www.genenames.org/cgi-bin/gene_symbol_report？hgnc_id＝HGNC:882，其提供了对ATR核酸和氨基酸序列的链接，以及对同源鼠和大鼠蛋白的提及。

公开了ATR抑制剂(ATRi)，其用于治疗在一个或多个选自以下的BAF-复合体基因中有突变或缺陷的癌症：ARID1A、ARID1B、ARID2、SMARCA2、SMARCA4、SMARCB1、SMARCC2、SMARCC1、SMARCD1、SMARCD2、SMARCD3、SMARCE1、ACTL6A、ACTL6B和/或PBRM1，且尤其用于治疗在BAF-复合体基因ARID1A中有突变或缺陷的癌症。

因此，在第一方面中，本发明提供了一种用于治疗患有癌症的个体的方法中的共济失调-毛细血管扩张突变的和Rad3-相关的蛋白激酶抑制剂(ATRi)，其中所述癌症在一个或多个BAF-复合体基因中有突变或缺陷。

另一方面，本发明提供了一种用于治疗患有癌症的个体的方法中的共济失调-毛细血管扩张突变的和Rad3-相关的蛋白激酶抑制剂(ATRi)，所述癌症在一个或多个BAF-复合体基因中有突变或缺陷，所述方法包括：

(a)在从个体获得的样品中确定所述癌症是否在一个或多个BAF-复合体基因中有突变或缺陷，及

(b)向个体施用治疗有效量的ATR抑制剂，其中癌症具有一个或多个BAF-复合体基因突变或缺陷。

举例来说，突变或缺陷的BAF-复合体基因选自以下一个或多个：ARID1A、ARID1B、ARID2、SMARCA2、SMARCA4、SMARCB1、SMARCC2、SMARCC1、SMARCD1、SMARCD2、SMARCD3、SMARCE1、ACTL6A、ACTL6B和/或PBRM1。更优选地，突变或缺陷的BAF-复合体基因选自以下一个或多个：ARID1A、ARID1B、ARID2、SMARCA2、SMARCA4和SMARCB1，且更优选地，突变或缺陷的BAF-复合体基因为ARID1A。

另一方面，本发明提供了一种用于治疗患有滑膜肉瘤的个体的方法中的共济失调-毛细血管扩张突变的和Rad3-相关的蛋白激酶抑制剂(ATRi)。

另一方面，本发明提供了一种用于治疗患有滑膜肉瘤的个体的方法中的共济失调-毛细血管扩张突变的和Rad3-相关的蛋白激酶抑制剂(ATRi)，所述滑膜肉瘤在一个或多个选自SSX1、SSX2或SS18的基因中有突变或缺陷，所述方法包括：

(a)在从个体获得的样品中确定所述癌症是否在一个或多个BAF-复合体基因中有突变或缺陷，及

(b)向个体施用治疗有效量的ATR抑制剂，其中癌症在一个或多个选自SSX1、SSX2和/或SS18的基因中有突变或缺陷。

所述突变或缺陷可为编码SS18-SSX1或SS18-SSX2融合蛋白的易位。

另一方面，本发明提供了一种选择患有癌症的个体以用共济失调-毛细血管扩张突变的和Rad3-相关的蛋白激酶抑制剂(ATRi)治疗的方法，所述方法包括：

(a)在从个体获得的样品中确定所述癌症是否在一个或多个BAF-复合体基因中有突变或缺陷，及

(b)选择个体以便用ATR抑制剂治疗，其中癌症具有一个或多个BAF-复合体基因突变或缺陷；以及

(c)提供适于向个体施用的ATR抑制剂。

任选地，所述方法还可包括向个体施用治疗有效量的ATR抑制剂。

另一方面，本发明提供了一种用共济失调-毛细血管扩张突变的和Rad3-相关的蛋白激酶抑制剂(ATRi)治疗患有癌症的个体的方法，所述方法包括：

(a)在从个体获得的样品中确定所述癌症是否在一个或多个BAF-复合体基因中有突变或缺陷，及

(b)选择个体以便用ATR抑制剂治疗，其中癌症具有一个或多个BAF-复合体基因突变或缺陷；以及

(c)提供适于向个体施用的ATR抑制剂；以及

(d)向个体施用治疗有效量的ATR抑制剂。

另一方面，本发明提供了一种选择患有滑膜肉瘤的个体的以用共济失调-毛细血管扩张突变的和Rad3-相关的蛋白激酶抑制剂(ATRi)治疗的方法，所述方法包括：

(a)在从个体获得的样品中确定滑膜肉瘤是否在一个或多个选自SSX1、SSX2和/或SS18的基因中有突变或缺陷；及

(b)选择个体以用所述ATR抑制剂来治疗，其中滑膜肉瘤在所述一个或多个选自SSX1、SSX2和/或SS18的基因中具有一个或多个突变或缺陷；以及

(c)提供适于向个体施用的ATR抑制剂。

所述突变或缺陷可为编码SS18-SSX1或SS18-SSX2融合蛋白的易位。

任选地，本发明还包括向个体施用治疗有效量的ATR抑制剂。

另一方面，本发明提供了一种用共济失调-毛细血管扩张突变的和Rad3-相关的蛋白激酶抑制剂(ATRi)治疗患有滑膜肉瘤的个体的方法，所述方法包括：

(a)在从个体获得的样品中确定滑膜肉瘤是否在一个或多个选自SSX1、SSX2和/或SS18的基因中有突变或缺陷，及

(b)选择个体以用所述ATR抑制剂来治疗，其中滑膜肉瘤在所述一个或多个选自SSX1、SSX2和/或SS18的基因中具有一个或多个突变或缺陷；以及

(c)提供适于向个体施用的ATR抑制剂；以及

(d)向个体施用治疗有效量的ATR抑制剂。

所述突变或缺陷可为编码SS18-SSX1或SS18-SSX2融合蛋白的易位。因此，所述方法可包括确定滑膜肉瘤是否具有编码SS18-SSX1或SS18-SSX2融合蛋白的易位的步骤。

另一方面，测试样品以确定癌症是否在一个或多个BAF-复合体基因中有突变或缺陷的步骤对从个体的癌或非癌细胞中获得的核酸序列进行。合适的技术是本领域中公知的并且包括以下的使用：直接测序、杂交至探针、限制性片段长度多态性(RFLP)分析、单链构象多态性(SSCP)、特异性等位基因的PCR扩增、通过PCR扩增DNA靶标然后进行微型测序测定、PCR期间的等位基因辨别、遗传位分析(Genetic Bit Analysis)、焦磷酸测序、寡核苷酸连接测定、解链曲线分析、针对杂合性丢失(LOH)的测试或下一代测序(NGS)技术。

在其它实施方案中，测试是对从个体的癌或非癌细胞中获得的RNA序列进行。在仍另一些实施方案中，测试是对从个体的癌或非癌细胞中获得的蛋白质进行。

现在参照附图举例但非限制性地描述本发明的实施方案。然而，由本公开来看，本发明的多种进一步的方面和实施方案对于那些领域内的技术人员而言是显而易见的。

“和/或”当在本文中使用时被认为是两个指定特征或组分各自的具体公开，有或没有另一个。举例来说，“A和/或B”被认为是(i)A、(ii)B及(iii)A和B各自的具体公开，就好像各自在本文中单独列举一般。

除非上下文另外规定，以上列举的特征的说明和定义不限于本发明的任何具体方面或实施方案并且同样适用于所述的所有方面和实施方案。

附图简述

图1.RNAi筛选揭示了ATRi敏感性的遗传定子。A.VE-821的结构及描述了在MCF12A和HCC1143细胞中的平行VE-821化学敏化筛选的工作流程的示意图。B.来自在化学敏化筛选中使用的所有1280个siRNA的VE-821药效(DE)Z评分的散点图。示出了用于定义候选合成致死相互作用的-2(红线)的DE Z评分阈值。C.在MCF12A和HCC1143细胞中DE<-2VE-821敏化命中(hits)的文氏图(Venn diagram)。所示数字表示敏化基因的数目。在两个细胞系中具有<-2的DE Z评分的30个基因中，已鉴别了七个非常确定的肿瘤抑制子基因。D.示出了在化学敏化筛选中对照、非靶向、siRNA(siALLSTAR、siCON1、siCON2)及ARID1A siRNA的DE Z评分的直方图。所示的值为来自三份同样筛选的中值且误差棒代表SD。E.来自用靶向ARID1A(红色)或siCon1(蓝色)的siRNA转染的HCC1143细胞的384孔板细胞存活数据。转染后24小时，将细胞暴露于VE-821连续五天。误差棒代表来自一式三份实验的SD。存活曲线siARID1A对比siCON1p-值<0.0001，ANOVA。F.示出了来自实验(E)的ARID1A蛋白沉默的蛋白质印迹。

图2.体外ARID1A/ATR合成致死。A.VX-970的化学结构。B.在人ARID1A等基因HCT116细胞中ARID1A的蛋白质印迹。C.在6孔板克隆发生测定中菌落的图像。将HCT116ARID1A等基因(^+/+和^-/-)细胞系暴露于浓度渐增的VE-821(0、0.1、1uM)和VX-970(0、0.01、0.05uM)持续14天。D和E.暴露于浓度渐增的VE-821和VX-970持续14天的HCT116ARID1A等基因(^+/+和^-/-)细胞系的剂量响应克隆发生存活曲线。误差棒代表来自一式三份实验的SD，ANOVA p-值<0.0001。F.暴露于VX-970持续五天的人类肿瘤细胞系的曲线下面积(AUC)盒须对比图。将ARID1A野生型肿瘤细胞系(n＝15)与ARID1A突变细胞系(n＝9)相比。学生t检验(Student’s t-test)p＝0.00594。G.小鼠Arid1a等基因ES细胞系的剂量响应克隆发生存活曲线。根据(C)进行实验。误差棒代表来自一式三份实验的SD，ANOVA p值<0.0001。H.在小鼠ES Arid1a等基因细胞中Arid1a蛋白表达的蛋白质印迹。I.用ATR siRNA转染的86种人类肿瘤细胞系的Z评分盒须对比图。将细胞系用siRNA转染并在五天后通过Cell Titre Glo试剂评估细胞存活力。发现ARID1A野生型(n＝65)和ARID1A突变体(n＝21)的ATR siRNA Z评分在统计上是不同的(p＝0.0084，中值排列检验)。

图3.体内ARID1A/ATR合成致死。A.在携带建立的HCT116 ARID1A^+/+和ARID1A^-/-异种移植物的小鼠中VX-970疗法实验的示意图。将细胞皮下接种于裸小鼠中并允许肿瘤建立持续10天。然后将小鼠随机分到VX-970(60mg/kg，每周4次，通过经口管饲)或媒介物的治疗方案中。接着对小鼠进行治疗接下来的40天。监测肿瘤体积每周两次。B.来自(A)的相对肿瘤体积图，其示出了VX-970的功效和ARID1A^-/-异种移植物的选择性，*p＝0.024,ANOVA。C.在具有非建立的HCT116ARID1A^+/+和ARID1A^-/-异种移植物的小鼠中肿瘤发病率实验的示意图。将小鼠用如前所述的细胞接种，随机分配，然后用VX-970治疗。在细胞植入之日，开始VX-970或媒介物治疗。每周两次监测肿瘤体积并在40天后评定总体肿瘤发病率。D.在HCT116ARID1A^+/+和ARID1A^-/-细胞植入之后40天发病率的条形图。各组含有15只动物且条柱上的分数表示其中形成可测量的异种移植物的动物的数目。*p＝0.027费希尔精确检验(Fisher’s exact test)。E和F.在(C)中所述的实验中的肿瘤生长。*p＝0.015ANOVA。G.来自TOV21G(ARID1A突变体)和RMG1(ARID1A野生型)细胞的VX-970剂量响应曲线。将细胞暴露于VX-970持续5天。H.蛋白质印迹，其示出了在细胞裂解之前暴露于浓度渐增的VX-970持续24小时的TOV21G细胞中的PARP裂解。在细胞裂解之前将细胞暴露于喜树碱(Cpt；1uM，24小时)作为阳性对照。通过蛋白质印迹检测PARP-1、裂解的PARP-1(85kDa片段)和微管蛋白。I.条形图，其示出了在暴露于浓度渐增的VX-970持续24小时的RMG1和TOV21G细胞中的细胞凋亡分数。使用Caspase-Glo评定半胱天冬酶3/7活性并使用CellTitre-Glo评估总细胞存活力。对于每个剂量测定Caspase-Glo(即细胞凋亡细胞)和CellTitre-Glo(即活细胞)的发光比并且针对DMSO治疗样品进行归一化。*学生t检验，p<0.05。J.在携带建立的TOV21G的小鼠中VX-970疗法实验的示意图。根据(A)进行实验，但仅用28天治疗。K.来自(J)的相对肿瘤体积图，其示出了在TOV21G异种移植物中VX-970的功效，*p＝0.014，ANOVA。L.在28天治疗之后TOV21G异种移植物的图像。

图4.ARID1A缺陷型细胞由于染色体解连环缺陷而依赖于G2/M细胞周期检查点。A.条形图，其示出了通过双重胸苷阻断在G1/早S期中同步化并释放到新鲜培养基中的HCT116ARID1A^+/+和ARID1A^-/-细胞中的G2/M分数。示出了在释放之后0、7、8、9和10小时在细胞周期的G2/M期中的细胞百分比。B.条形图，其示出了在丝氨酸10上具有组蛋白H3的磷酸化的细胞的相对量。当示出时，用siARID1A转染HCT116ARID1A^+/+细胞。48小时后，将细胞固定并用FITC-P-S10组蛋白H3和碘化丙啶染色。通过FACS定量有丝分裂细胞(P-S10阳性和2N)。星号表示通过学生t检验得出的所示比较之间的统计上显著的差异。C.蛋白质印迹，其示出了在HCT116 ARID1A^+/+和ARID1A^-/-细胞中胞质部分中的Cyclin B1蛋白。D.条形图，其示出了与ARID1A^+/+相比在HCT116ARID1A^-/-细胞中后期桥的升高的水平。将细胞用DAPI染色。在3次生物重复实验中最少对50个后期进行评分。*p＝0.038，学生t检验。E.来自实验(E)的正常后期和后期桥的代表性图像。比例尺代表20um。F.核和染色质结合的TOP2A的蛋白质印迹。将所示细胞系用靶向ARID1A的siRNA或对照siRNA转染。48小时后，将亚细胞部分分离并将所生成的蛋白质印迹针对所述蛋白质进行免疫印迹。G.条形图，其示出了衍生自(F)的TOP2A蛋白的定量。H.来自OCCC细胞系的核和染色质结合的TOP2A的蛋白质印迹。根据(F)进行实验。

图5.ATRi对细胞周期进程、染色体不稳定、DNA损伤和细胞凋亡的影响。A.条形图，其示出了通过双重胸苷阻断在G1/早S期中同步化并释放到含有DMSO或VX-970(500nM)的新鲜培养基中的HCT116ARID1A^+/+和ARID1A^-/-细胞中的G2/M分数。在PI染色之后通过FACS测量G2/M中的细胞的百分比。B.条形图，其示出了在暴露于VX-970(0.5uM，8小时)的HCT116ARID1A^-/-和ARID1A^+/+细胞中后期桥的增加的水平。将细胞用DAPI染色。在3次生物重复实验中最少对50个后期进行评分。*p＝0.023，学生t检验。C.条形图，其示出了在固定之前暴露于VX-970(0.5uM)或DMSO持续8小时的TOV21G细胞中的后期桥的出现率。根据(B)进行实验。p＝0.006学生t检验。D.在暴露于DMSO或VX-970(1uM)之后，来自HCT116ARID1A^+/+和ARID1A^-/-细胞的有丝分裂分散图像。比例尺代表20um。E.条形图，其示出了在暴露于VX-970(1uM)的HCT116ARID1A^+/+和ARID1A^-/-细胞中的染色体异常程度。*p<0.05，学生t检验。F.蛋白质印迹，其示出了在细胞裂解之前暴露于VX-970(0.5uM)持续所示时间的HCT116ARID1A^+/+和ARID1A^-/-细胞中的γH2AX。G.条形图，其示出了在暴露于浓度渐增的VX-970持续24小时的细胞中的细胞凋亡分数。根据图3I进行实验。H.蛋白质印迹，其示出了在暴露于VX-970的HCT116ARID1A^+/+和ARID1A^-/-细胞中的PARP裂解。根据图3H进行实验。

图6.BAF-复合体缺陷引起对ATR抑制的敏感性。A.在人细胞中BAF-复合体组成的示意图。B.来自用靶向ARID1B或SMARCA4的siRNA转染的HCT116细胞的剂量响应曲线。转染之后48小时，将细胞暴露于VX-970持续5天。误差棒代表来自一式三份实验的SD。p<0.0001，siARID1B和siSMARCA4对比siCON的ANOVA。C.蛋白质印迹，其示出了在实验(B)中的ARID1B和SMARCA4沉默。D.来自四个OCCC细胞系，即3个SMARCA4野生型(蓝色；RMG1、KK和ES2)和1个SMARCA4突变体(红色；TOV112D)的VX-970剂量响应曲线。E.条形图，其示出了在用靶向SMARCA4或ARID1A的siRNA转染的HCC1143和Hela细胞中五天VX-970暴露之后的存活分数，*p<0.05，通过学生t检验，与siCon相比。F.蛋白质印迹，其示出了在用靶向ARID1A、ARID1B或SMARCA4的siRNA转染的HCT116细胞中染色质结合的TOP2A的水平。转染之后48小时分析细胞。G.关于所提出的驱动ARID1A缺陷型细胞对ATRi的敏感性的机制的模型。针对ARID1A(或ARID1B/SMARCA4)的丧失功能基因组改变导致BAF-复合体的功能失调。这又引起TOP2A与染色质的结合减少，从而降低染色体解连环的效率。解连环缺陷激活了ATR依赖性G2/M细胞周期检查点，从而允许细胞分辨连环的染色体。暴露于ATRi的BAF缺陷型细胞进展到具有连环的染色体的有丝分裂。这导致DNA断裂、染色体不稳定及最终的细胞凋亡。

图7.遗传依赖性图谱表征将ATR鉴别为滑膜肉瘤肿瘤细胞中的遗传依赖性。A.在五个平行siRNA筛选中使用的滑膜肉瘤(SS)肿瘤细胞。B.siRNA筛选的示意图(左)、表明高效率转染的来自HS-SY-II的siRNA Z评分(如由低siPLK1Z评分所示，中)及来自两次HS-SY-IIsiRNA筛选的示例性复制物siRNA Z评分(右)。C-E.在siRNA筛选中鉴别的SS肿瘤细胞系中的候选遗传依赖性。示出了与非SS肿瘤细胞系(“Panel”)相比，五个SS肿瘤细胞系(“SS”)的siRNA Z评分。所示p值衍生自中值排列t检验。

图8.ATR遗传依赖性滑膜肉瘤肿瘤细胞-部分1。A.来自图7中所述的siRNA筛选的ATR siRNA Z评分，根据肿瘤细胞系的癌组织学进行分类。B.剂量-反应存活曲线，其示出了与ATRi抗性HCT116细胞相比，SS肿瘤细胞系对ATR小分子抑制剂(ATRi)VX970的敏感性。将细胞暴露于药物持续五天并使用CellTiter-Glo评估细胞存活力。对于每个SS肿瘤细胞系，剂量响应ANOVA p<0.0001对比HCT116。C.剂量-反应存活曲线，其示出了与ATRi抗性ARID1A野生型HCT116细胞(HCT116ARID1A^+/+)和ARID1A缺陷型HCT116细胞(HCT116ARID1A^–/–)相比，SS肿瘤细胞系对VX970的敏感性。将细胞暴露于药物持续五天并使用CellTiter-Glo评估细胞存活力。对于每个SS肿瘤细胞系和HCT116 ARID1A^–/–，剂量响应ANOVA p<0.0001对比HCT116 ARID1A^+/+。D.在肿瘤细胞系中的VX970曲线下面积(AUC)值。ARID1A缺陷型细胞标示为“ARID1A^–/–”，尤因氏瘤肿瘤细胞系显示为“EWS”。E.在携带建立的滑膜肉瘤PDX,SA13412小鼠中对VX970治疗的抗肿瘤响应。示出了在开始VX970治疗之后的中值肿瘤体积。误差棒代表平均标准误差(SEM)。F.来自(E)的数据的Kaplan-Meier存活图。对数秩Mantel p＝0.026。G.蛋白质印迹，其示出了滑膜肉瘤融合蛋白在HCT116细胞中的表达。丢失SSX1的最后八个残基(Δ71-78)的SS18-SSX1变体显示为d71-78。H.条形图，其示出了在滑膜肉瘤融合蛋白于HCT116细胞中表达之后AXIN2mRNA的诱导。I-K.剂量-响应存活曲线，其示出了滑膜肉瘤融合蛋白在HCT116细胞中的表达导致ATRi敏感性。SSX18-SSX1或SSX18-SSX2的表达导致ATRi敏感性，但Δ71-78的表达则不会。

图9.ATR遗传依赖性滑膜肉瘤肿瘤细胞-部分2。A.ATR siRNA造成SS肿瘤细胞中的细胞抑制。将细胞用ATR siRNA转染并在五天后通过利用Cell Titre Glo评估细胞存活力。示出了存活分数的条形图在左侧和中间示出。示出了ATR蛋白沉默的蛋白质印迹在右侧示出。来自图7中所述的siRNA筛选的Z评分，根据肿瘤细胞系的癌组织学进行分类。B.剂量-响应存活曲线，其示出了与ATRi抗性HCT116细胞和非肿瘤细胞(HFF1，MCF10A)相比，SS肿瘤细胞系对ATR小分子抑制剂(ATRi)VX970的敏感性。将细胞暴露于药物持续五天并使用CellTiter-Glo评估细胞存活力。对于每个SS肿瘤细胞系，剂量响应ANOVA p<0.0001对比HCT116。C.在暴露于VX970的肿瘤细胞系中VX970存活分数50值。ARID1A缺陷型细胞标示为“ARID1A^–/–”，尤因氏瘤肿瘤细胞系显示为“EWS”。D,E.剂量-响应存活曲线，其示出了与ATRi抗性HCT116细胞相比，SS肿瘤细胞系对另外的ATR小分子抑制剂(ATRi)AZD6738、AZ20和VE821的敏感性。将细胞暴露于药物持续五天并使用CellTiter-Glo评估细胞存活力。

图10.ATR抑制剂引发SS肿瘤细胞中的复制叉应激。A.条形图，其示出了由SYO1细胞暴露于VX970所引起的细胞凋亡，通过半胱天冬酶Glo来评估。误差棒代表来自一式三份实验的SEM。p值衍生自学生t检验。B.蛋白质印迹，其示出了在暴露于VX970持续24小时的SYO1细胞中的PARP1裂解。C.蛋白质印迹，其示出了在暴露于VX970(0.1μM)的SYO1细胞中的H2AX磷酸化(γH2AX)。D.共焦显微图像，其示出了在暴露于VX970(0.1μM，24小时)的SYO1细胞中的H2AX磷酸化。E.描绘了来自(D)的数据的条形图。误差棒代表来自100个图像的SEM。p值衍生自学生t检验。F.在暴露于0.1μM VX970持续两小时的SYO1细胞中的复制叉速度。p值衍生自学生t检验。G.在SS18-SSX1融合蛋白的异位表达的存在和不存在下，在暴露于0.1μMVX970持续两小时的HCT116细胞中的复制叉速度。p值衍生自学生t检验。SS18-SSX1的表达或对VX970的暴露降低了叉速度。组合的SS18-SSX1表达和VX970暴露促进了叉速度的降低。H和I.来自暴露于VX970的SYO1细胞的FACS图。0.1μM VX970暴露造成S期细胞的增加及亚G₁部分的增加。

详述

在与SWI/SNF BAF缺陷有关的以下基因中有缺陷(突变、表达丧失)的癌症

在本发明中，对在一个或多个BAF-复合体基因中有突变或缺陷的癌症的提及表示其蛋白产物包括多亚基SWI/SNF染色质重塑复合体“BRG1-或HRBM-相关因子”(BAF)和聚溴相关BAF(PBAF)的成员。它们在转录、复制和DNA修复期间介导ATP依赖性染色质重塑过程并且对于分化和增殖是关键的。复合体的几种组分用作肿瘤抑制子(参见Reisman,Oncogene28:1653-1668,2009，在此以引用的方式并入)。BAF-复合体基因包括但不限于ARID1A、ARID1B、ARID2、SMARCA2、SMARCA4、SMARCB1、SMARCC2、SMARCC1、SMARCD1、2和3、SMARCE1、ACTL6A和ACTL6B、以及PBRM1。

在本发明中，对ARID1A的提及表示富含AT的相互作用结构域1A，其具有HGNC ID:11110。ARID1A的HUGO Gene Symbol报告可见于：http://www.genenames.org/cgi-bin/ gene_symbol_report？hgnc_id＝HGNC:11110，其提供了对ARID1A核酸和氨基酸序列的链接以及对同源鼠和大鼠蛋白的提及。ARID1A位于1p36.11中[15]，即在人类癌症中经常丢失的一个区域[17]。

在本发明中，对ARID1B的提及表示富含AT的相互作用结构域1B，其具有HGNC ID:18040。ARID1B的HUGO Gene Symbol报告可见于：http://www.genenames.org/cgi-bin/ gene_symbol_report？hgnc_id＝HGNC:18040，其提供了对ARID1B核酸和氨基酸序列的链接以及对同源鼠和大鼠蛋白的提及。

在本发明中，对ARID2的提及表示富含AT的相互作用结构域2，其具有HGNC ID:18037。ARID2的HUGO Gene Symbol报告可见于：http://www.genenames.org/cgi-bin/ gene_symbol_report？hgnc_id＝HGNC:18037，其提供了对ARID2核酸和氨基酸序列的链接以及对同源鼠和大鼠蛋白的提及。

在本发明中，对SMARCA2的提及表示染色质的SWI/SNF相关的、基质相关的、肌动蛋白依赖性调节子，亚家族a成员2，其具有HGNC ID:11098。SMARCA2的HUGO Gene Symbol报告可见于：http://www.genenames.org/cgi-bin/gene_symbol_report？hgnc_id＝HGNC: 11098，其提供了对SMARCA2核酸和氨基酸序列的链接以及对同源鼠和大鼠蛋白的提及。

在本发明中，对SMARCA4的提及表示染色质的SWI/SNF相关的、基质相关的、肌动蛋白依赖性调节子，亚家族a成员4，其具有HGNC ID:11100。SMARCA4的HUGO Gene Symbol报告可见于：http://www.genenames.org/cgi-bin/gene_symbol_report？hgnc_id＝HGNC: 11100，其提供了对SMARCA4核酸和氨基酸序列的链接以及对同源鼠和大鼠蛋白的提及。

在本发明中，对SMARCB1的提及表示染色质的SWI/SNF相关的、基质相关的、肌动蛋白依赖性调节子，亚家族b成员1，其具有HGNC ID:11103。SMARCB1的HUGO Gene Symbol报告可见于：http://www.genenames.org/cgi-bin/gene_symbol_report？hgnc_id＝HGNC: 11103，其提供了对SMARCB1核酸和氨基酸序列的链接以及对同源鼠和大鼠蛋白的提及。

在本发明中，对SMARCC1的提及表示染色质的SWI/SNF相关的、基质相关的、肌动蛋白依赖性调节子，亚家族c成员1，其具有HGNC ID:11104。SMARCC1的HUGO Gene Symbol报告可见于：http://www.genenames.org/cgi-bin/gene_symbol_report？hgnc_id＝HGNC: 11104，其提供了对SMARCC1核酸和氨基酸序列的链接以及对同源鼠和大鼠蛋白的提及。

在本发明中，对SMARCC2的提及表示染色质的SWI/SNF相关的、基质相关的、肌动蛋白依赖性调节子，亚家族c成员2，其具有HGNC ID:11105。SMARCC2的HUGO Gene Symbol报告可见于：http://www.genenames.org/cgi-bin/gene_symbol_report？hgnc_id＝HGNC: 11105，其提供了对SMARCC2核酸和氨基酸序列的链接以及对同源鼠和大鼠蛋白的提及。

在本发明中，对SMARCD1的提及表示染色质的SWI/SNF相关的、基质相关的、肌动蛋白依赖性调节子，亚家族d成员1，其具有HGNC ID:11106。SMARCD1的HUGO Gene Symbol报告可见于：http://www.genenames.org/cgi-bin/gene_symbol_report？hgnc_id＝HGNC: 11106，其提供了对SMARCD1核酸和氨基酸序列的链接以及对同源鼠和大鼠蛋白的提及。

在本发明中，对SMARCD2的提及表示染色质的SWI/SNF相关的、基质相关的、肌动蛋白依赖性调节子，亚家族d成员2，其具有HGNC ID:11107。SMARCD2的HUGO Gene Symbol报告可见于：http://www.genenames.org/cgi-bin/gene_symbol_report？hgnc_id＝HGNC: 11107，其提供了对SMARCD2核酸和氨基酸序列的链接以及对同源鼠和大鼠蛋白的提及。

在本发明中，对SMARCD3的提及表示染色质的SWI/SNF相关的、基质相关的、肌动蛋白依赖性调节子，亚家族d成员3，其具有HGNC ID:11108。SMARCD3的HUGO Gene Symbol报告可见于：http://www.genenames.org/cgi-bin/gene_symbol_report？hgnc_id＝HGNC: 11108，其提供了对SMARCD3核酸和氨基酸序列的链接以及对同源鼠和大鼠蛋白的提及。

在本发明中，对SMARCE1的提及表示染色质的SWI/SNF相关的、基质相关的、肌动蛋白依赖性调节子，亚家族e成员1，其具有HGNC ID:11109。SMARCE1的HUGO Gene Symbol报告可见于：http://www.genenames.org/cgi-bin/gene_symbol_report？hgnc_id＝HGNC: 11109，其提供了对SMARCE1核酸和氨基酸序列的链接以及对同源鼠和大鼠蛋白的提及。

在本发明中，对ACTL6A的提及表示具有HGNC ID:24124的肌动蛋白样6A。ACTL6A的HUGO Gene Symbol报告可见于：http://www.genenames.org/cgi-bin/gene_symbol_ report？hgnc_id＝HGNC:24124，其提供了对ACTL6A核酸和氨基酸序列的链接以及对同源鼠和大鼠蛋白的提及。

在本发明中，对ACTL6B的提及表示具有HGNC ID:160的肌动蛋白样6A。ACTL6B的HUGO Gene Symbol报告可见于：http://www.genenames.org/cgi-bin/gene_symbol_ report？hgnc_id＝HGNC:160，其提供了对ACTL6B核酸和氨基酸序列的链接以及对同源鼠和大鼠蛋白的提及。

在本发明中，对PBRM1的提及表示具有HGNC ID:30064的聚溴1。PBRM1的HUGO GeneSymbol报告可见于：http://www.genenames.org/cgi-bin/gene_symbol_report？hgnc_id ＝HGNC:30064，其提供了对PBRM1核酸和氨基酸序列的链接以及对同源鼠和大鼠蛋白的提及。

在与滑膜肉瘤有关的以下基因中具有基因易位缺陷的癌症

滑膜肉瘤(SS)是一种侵袭性且难治类型的软组织肉瘤，其主要影响青少年和青壮年(AYA)。SS具有不良的结果和有限的治疗选择(Nielsen,Poulin等人2015)，但在大多数情况下，用手术治疗限局性SS，有时与化疗或放疗组合。在此背景下的化疗通常是由阿霉素或异环磷酰胺组成(Spurrell,Fisher等人2005)。患有晚期转移性SS的患者尤其具有不良的长期存活率。例如，具有远处转移的那些患者仅有8.9％的10年存活率，相较而言具有局部肿瘤的患者的为69％(Sultan,Rodriguez-Galindo等人2009)。总的来说，这些因素突出了SS的另外且更特定的靶向治疗方法是有效控制此疾病所需的。

由于已知在与滑膜肉瘤有关的基因中的易位也导致BAF-复合体缺陷，所以本发明扩展至用ATR抑制剂治疗滑膜肉瘤，如通过以下实验所证明，其中含有这种基因易位缺陷的细胞系对ATR抑制剂是敏感的。实验证明，此效应是通用的，因为细胞系对靶向共济失调-毛细血管扩张突变的和Rad3-相关的蛋白激酶(ATR)的ssRNAi分子是敏感的。

绝大多数的SS的特征在于t(X；18)染色体易位，这被用作该疾病的诊断性生物标记(Clark,Rocques等人1994)。在SS中，t(X；18)易位将SS18(滑膜肉瘤易位，染色体18)基因的开头10个外显子与SSX(滑膜肉瘤，X断裂点)基因家族SSX1、SSX2或SSX4中的一个的最后三个外显子融合(Clark,Rocques等人1994，Amary,Berisha等人2007)。这些易位编码SS18-SSX1、SS18-SSX2或SS18-SSX4融合蛋白，其各自以足以驱使肿瘤发展的水平出现。例如，SS18-SSX1或SS18-SSX2当在转基因小鼠的Myf5成肌细胞谱系的细胞中表达时足以生成具有100％外显率的肿瘤(Haldar,Hancock等人2007，Jones,Barrott等人2016)。在细胞遗传学方面，SS肿瘤除SS18-SSX易位之外展现显著较少的复发突变(Vlenterie,Hillebrandt等人2015)，这支持关于肿瘤发生是由融合基因单独驱动的假设。若干研究已证明SS肿瘤展现基因组不稳定性，这似乎在成年患者以及患有晚期转移性疾病的患者中更为常见(Lagarde,Przybyl等人2013,Pryzbyl,Sciot等人2014,Vlenterie,Hillebrand等人2015)。

虽然SS18和SSX蛋白不含任何已知的DNA结合域，但两种野生型蛋白都参与了转录的调控(de Bruijn,Allander等人2006，Garcia,Shaffer等人2012，Garcia,Shaffer等人2012，Kadoch和Crabtree 2013)。至少部分程度上，SS18的转录功能可能与其作为BAF SWI/SNF复合体的一部分的作用有关(Thaete,Brett等人1999，Nagai,Tanaka等人2001)。BAF-复合体经由被认为控制转录的ATP依赖性过程介导核小体重塑(Wilson和Roberts 2011，Smith-Roe,Nakamura等人2015)，但还在包括DNA修复的多种其它过程中发挥作用(Shen,Peng等人2015，Smith-Roe,Nakamura等人2015)。野生型SS18蛋白与BAF-复合体的多种其它成分(包括SMARCA4、ARID1A和SMARCB1)相互作用。在由SS18-SSX融合物所引起的这些相互作用中的改变也可能在滑膜肉瘤的发病机制中起作用(Middeljans,Wan等人2012，Kadoch和Crabtree 2013)。举例来说，SS18-SSX1融合蛋白与BAF相互作用，但置换野生型SS18蛋白和来自BAF-复合体的另外的BAF组分SMARCB1(Kadoch和Crabtree 2013)。

来自BAF的SMARCB1的置换导致它的蛋白酶体降解，其中降低水平的BAF相关的SMARCB1是滑膜肉瘤细胞系和肿瘤的特征(Kadoch和Crabtree 2013，Ito,Asano等人2015)。来自BAF-复合体的SMARCB1的丢失也与基因表达的调控改变有关。例如，在原代人类新生儿成纤维细胞中，SS18-SSX1的表达及后续SMARCB1的丢失导致来自SOX2基因的启动子的抑制性多梳复合体的驱除(性别决定区Y-框2)，SOX2基因编码SRY相关的HMG-框(SOX)家族转录因子(Kadoch和Crabtree 2013)。由此引起了SOX2表达的增加，这是滑膜肉瘤细胞存活所需的(Kadoch和Crabtree 2013)。有趣的是，SMARCB1的纯合突变或丢失是在恶性杆状肿瘤(MRT)中观察到的唯一的细胞发生异常(Versteege,Sevenet等人1998，McKenna,Sansam等人2008)；提示SMARCB1可充当肿瘤抑制子基因。多个其它BAF-复合体编码基因也牵连于包括ARID1A和SMARCA4的癌症发病机制中，且最近提出，BAF-复合体突变可在多达20％的人类癌症中存在(Kadoch,Hargreaves等人2013)。

与滑膜肉瘤有关的基因易位缺陷的优选实例包括在SSX1、SSX2和SS18中的缺陷。

在本发明中，对SSX1的提及表示具有HGNC ID:11335的滑膜肉瘤，X断裂点1。SSX1的HUGO Gene Symbol报告可见于：http://www.genenames.org/cgi-bin/gene_symbol_ report？hgnc_id＝HGNC:11335，其提供了对SSX1核酸和氨基酸序列的链接以及对同源鼠和大鼠蛋白的提及。

在本发明中，对SSX2的提及表示具有HGNC ID:11336的滑膜肉瘤，X断裂点2。SSX2的HUGO Gene Symbol报告可见于：http://www.genenames.org/cgi-bin/gene_symbol_ report？hgnc_id＝HGNC:11336，其提供了对SSX2核酸和氨基酸序列的链接以及对同源鼠和大鼠蛋白的提及。

在本发明中，对SS18的提及表示具有HGNC ID:11340的滑膜肉瘤易位，染色体18。SS18的HUGO Gene Symbol报告可见于：http://www.genenames.org/cgi-bin/gene_ symbol_report？hgnc_id＝HGNC:11340，其提供了对SS18核酸和氨基酸序列的链接以及对同源鼠和大鼠蛋白的提及。SS18为BAF-复合体的专门和稳定的亚基，其异常形式产生功能失调的BAF-复合体，由此使在滑膜肉瘤中的增殖进展(Kadoch等人,“ReversibleDisruption of mSWI/SNF(BAF)Complexes by the SS18-SSX Oncogenic Fusion inSynovial Sarcoma.”Cell 153.1(2013):71–85.PMC.Web.2016年1月8日)。

在与滑膜肉瘤有关的以下基因中有缺陷(功能丧失突变、表达丧失)的癌症：

在本发明中，对SSX1的提及表示具有HGNC ID:11335的滑膜肉瘤，X断裂点1。SSX1的HUGO Gene Symbol报告可见于：http://www.genenames.org/cgi-bin/gene_symbol_ report？hgnc_id＝HGNC:11335，其提供了对SSX1核酸和氨基酸序列的链接以及对同源鼠和大鼠蛋白的提及。

在本发明中，对SSX2的提及表示具有的滑膜肉瘤，X断裂点2。SSX2的HUGO GeneSymbol报告可见于：http://www.genenames.org/cgi-bin/gene_symbol_report？hgnc_id ＝HGNC:11336，其提供了对SSX2核酸和氨基酸序列的链接以及对同源鼠和大鼠蛋白的提及。

根据类似的基本原理，在与滑膜肉瘤有关的基因中具有缺陷(功能丧失突变、表达丧失)的癌症也可用共济失调-毛细血管扩张突变的和Rad3-相关的蛋白激酶(ATR)抑制剂(ATRi)来靶向，具体说来，具有与滑膜肉瘤有关的缺陷的基因，如SSX1和SSX2。具体说来，缺陷可为编码SS18-SSX1或SS18-SSX2融合物的易位。

抑制剂

在本发明中，共济失调-毛细血管扩张突变的和Rad3-相关的蛋白激酶(ATR)抑制剂(ATRi)是指抑制ATR的表达水平或激酶活性的化合物或物质，其可被采用或筛选用作供治疗BAF-复合体基因突变型或缺陷型癌症之用的根据本发明的ATR抑制剂。已知一些抑制剂并且通过使用针对这些靶标的筛选技术可发现其它实例。

ATR抑制化合物可为小分子、肽片段、抗体或其片段、或siRNA。ATRi化合物的实例包括但不限于：AZ20、BEZ235(NVP-BEZ235，达托里昔布)、ETP-46464、VE-821、VE-822(VX-970)、AZD6738、NU6027、CP-466722、CGK733、KU-60019、KU-55933、五味子乙素和Mirin。具体说来，本文所提供的数据提示靶向ATR的小分子抑制剂或siRNA能够在一个或多个BAF-复合体基因有突变或缺陷的癌症类型中引起一般的抗癌效应。或者，所述抑制剂可包含具有中和活性的抗体或其片段。

小分子抑制剂

作为ATR抑制剂并可根据本发明使用的小分子化合物的实例如下。

在本发明中，对AZ20的提及表示具有ChemSpider ID:29361340的4-环己基甲氧基-5-亚硝基嘧啶-2,6-二胺。AZ20及结构的ChemS pider报告可见于：http://www.chemspider.com/Chemical-Structure.2936 1340.html。AZ20为具有体内抗肿瘤活性的ATR激酶选择性抑制剂(23)。

在本发明中，对BEZ235(NVP-BEZ235，达托里昔布)的提及表示具有ChemSpiderID:10151099的2-甲基-2-{4-(3-甲基-2-氧代基-8-(3-喹啉基)-2,3-二氢-1H-咪唑并(4,5-c)喹啉-1-基)苯基}丙腈。BEZ235及结构的ChemSpider报告可见于：http://www.chemspider.com/Chemical-Structure.10151099.html。最初开发作为双重PI3K/MTOR抑制剂，BEZ235也对ATR具有相当大的活性(25)。

在本发明中，对ETP-46464的提及表示具有ChemSpider ID:29785252的2-甲基-2-{4-(2-氧代基-9-(3-喹啉基)-2H-(1,3)噁嗪并(5,4-c)喹啉-1(4H)-基)苯基}丙腈。ETP-46464及结构的ChemSpider报告可见于：http://www.chemspider.com/Chemical-Structure.29785252.html。ETP-46464为ATR激酶活性抑制剂(25)。

在本发明中，对VE-821的提及表示具有ChemSpider ID:25991555的3-氨基-6-(4-甲基磺酰基苯基)-N-苯基-吡嗪-2-甲酰胺。VE-821及结构的ChemSpider报告可见于：http://www.chemspider.com/Chemical-Structure.25991555.html。VE-821为ATR激酶抑制剂，其增强许多DNA损伤剂的细胞毒性效应(6-9)。

在本发明中，对VE-822(VX-970)的提及表示具有ChemSpider ID:30773968的5-[4-(异丙基磺酰基)苯基]-3-(3-{4-[(甲基氨基)甲基]苯基}-1,2-噁唑-5-基)-2-吡嗪胺。VE-822及结构的ChemSpider报告可见于：http://www.chemspider.com/Chemical-Structure.30773968.html。VE-822为目前在I期临床试验中的特异性且有效的ATR抑制剂(6)。

在本发明中，对AZD6738的提及表示具有ChemSpider ID:805 4780的6-[5-(3-氰基-5-氟苯基)-1,2,4-噁二唑-3-基]烟腈。AZD6538及结构的ChemSpider报告可见于：http://www.chemspider.com/Chemical-Structure.8054780.html。由于具有改善的溶解度、药效学和生物利用率的AZ20类似物，所以AZF6738为有效的且选择性的ATR抑制剂(26)。

在本发明中，对NU6027的提及表示具有ChemSpider ID:352956的4-环己基甲氧基-5-亚硝基嘧啶-2,6-二胺。NU60727及结构的ChemSpider报告可见于：http://www.chemspider.com/Chemical-Structure.352956.html。NU6027最初被开发作为CDK2抑制剂，但也有效地抑制ATR活性(27)。

在本发明中，对CP-466722的提及表示具有ChemSpider ID:27445283的1-(6,7-二甲氧基-4-喹唑啉基)-3-(2-吡啶基)-1H-1,2,4-三唑-5-胺。CP-466722及结构的ChemSpider报告可见于：http://www.chemspider.com/Chemical-Structure.27445283.html。

在本发明中，对CGK733的提及表示具有ChemSpider ID:5037512的2,2-二苯基-N-(2,2,2-三氯-1-{[(4-氟-3-硝基苯基)氨基硫代甲酰基]氨基}乙基)乙酰胺。CGK733及结构的ChemSpider报告可见于：http://www.chemspider.com/Chemical-Structure.5037512.html。CGK733最初被鉴别为ATM和ATR的抑制剂且已显示抑制细胞周期蛋白D1水平并抑制细胞增殖[28]。

在本发明中，对KU-60019的提及表示具有ChemSpider ID:28294997的2-[(2R,6S)-2,6-二甲基吗啉-4-基]-N-[5-[4-氧代基-6-(1-哌啶基)吡喃-2-基]-9H-噻吨-2-基]乙酰胺。KU-60019及结构的ChemSpider报告可见于：http://www.chemspider.com/Chemical-Structure.28294997.html。

在本发明中，对KU-55933的提及表示具有ChemSpider ID:4442218的2-(吗啉-4-基)-6-(噻蒽-1-基)-4H-吡喃-4-酮。KU-55933及结构的ChemSpider报告可见于：http://www.chemspider.com/Chemical-Structure.4442218.html。

在本发明中，对Mirin的提及表示具有ChemSpider ID:1016643的4-噻唑烷酮,5-(对羟基苯亚甲基)-2-亚氨基-。Mirin及结构的Che mSpider报告可见于：http://www.chemspider.com/Chemical-Structure.1016643.html。

在本发明中，对五味子乙素的提及表示具有ChemSpider ID 97221的1,2,3,13-四甲氧基-6,7-二甲基-5,6,7,8-四氢苯并[3',4']环辛[1',2':4,5]苯并[1,2-d][1,3]间二氧杂环戊烯。五味子乙素及结构的ChemSpider报告可见于：http://www.chemspider.com/Chemical-Structure.97221.html。五味子乙素为ATR的选择性抑制剂(29)。

另一类抑制剂为本文之式的化合物，包括式A(即式A-I、A-I-a、A-II、A-II-a等)或任何本文之式的化合物。

在一些实施方案中，抑制ATR的化合物是由式A-I表示：

或其药学上可接受的盐，

其中：

R¹为具有0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-6元单环环芳基环或杂芳基环，其中所述单环环芳基环或杂芳基环任选地稠合至另一个环以形成具有0-6个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的8-10元双环环芳基环或杂芳基环；各R¹任选地被1-5个J¹基团取代；

R²为具有0-3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-6元单环环芳基环或杂芳基环，其中所述单环环芳基环或杂芳基环任选地稠合至另一个环以形成具有0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的8-10元双环环芳基环或杂芳基环；各R²任选地被1-5个J²基团取代；

L为–C(O)NH–或–C(O)N(C_1-6烷基)–；

n为0或1；

各J¹和J²独立地为卤基、–CN、–NO₂、–V¹–R或–(V²)_m–Q；

V¹为C_1-10脂族链，其中0-3个亚甲基单元任选并独立地被O、NR”、S、C(O)、S(O)或S(O)₂置换；V¹任选地被1-6次出现的J^V1取代；

V²为C_1-10脂族链，其中0-3个亚甲基单元任选并独立地被O、NR”、S、C(O)、S(O)或S(O)₂置换；V²任选地被1-6次出现的J^V2取代；

m为0或1；

Q为具有0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的3-8元饱和或不饱和单环环，或具有0-6个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的9-10元饱和或不饱和双环环；各Q任选地被0-5个J^Q取代；

各J^V1或J^V2独立地为卤素、CN、NH₂、NO₂、C_1-4脂族、NH(C_1-4脂族)、N(C_1-4脂族)₂、OH、O(C_1-4脂族)、CO₂H、CO₂(C_1-4脂族)、C(O)NH₂、C(O)NH(C_1-4脂族)、C(O)N(C_1-4脂族)₂、-NHCO(C_1-4脂族)、N(C_1-4脂族)CO(C_1-4脂族)、SO₂(C_1-4脂族)、NHSO₂(C_1-4脂族)或N(C_1-4脂族)SO₂(C_1-4脂族)，其中所述C_1-4脂族任选地被卤基取代；

R为H或C_1-6脂族，其中所述C_1-6脂族任选地被1-4次出现的以下各基团取代：NH₂、NH(C_1-4脂族)、N(C_1-4脂族)₂、卤素、C_1-4脂族、OH、O(C_1-4脂族)、NO₂、CN、CO₂H、CO₂(C_1-4脂族)、CO(C_1-4脂族)、O(卤基C_1-4脂族)或卤基C_1-4脂族；

各J^Q独立地为卤基、氧代基、CN、NO₂、X-R或–(X)_p-Q⁴；

p为0或1；

X为C_1-10脂族；其中所述C_1-6脂族的1-3个亚甲基单元任选地被-NR、-O-、-S-、C(O)、S(O)₂或S(O)置换；其中X任选并独立地被1-4次出现的以下各基团取代：NH₂、NH(C_1-4脂族)、N(C_1-4脂族)₂、卤素、C_1-4脂族、OH、O(C_1-4脂族)、NO₂、CN、CO(C_1-4脂族)、CO₂H、CO₂(C_1-4脂族)、C(O)NH₂、C(O)NH(C_1-4脂族)、C(O)N(C_1-4脂族)₂、SO(C_1-4脂族)、SO₂(C_1-4脂族)、SO₂NH(C_1-4脂族)、SO₂N(C_1-4脂族)₂、NHC(O)(C_1-4脂族)、N(C_1-4脂族)C(O)(C_1-4脂族)，其中所述C_1-4脂族任选地被1-3次出现的卤基取代；

Q⁴为具有0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的3-8元饱和或不饱和单环环，或具有0-6个独立地选自氮、氧或硫的8-10元饱和或不饱和双环环；各Q⁴任选地被1-5个J^Q4取代；

J^Q4为卤基、CN或C_1-4烷基，其中至多2个亚甲基单元任选地被O、NR*、S、C(O)、S(O)或S(O)₂置换；

R为H或C_1-4烷基，其中所述C_1-4烷基任选地被1-4个卤基取代；

R’、R”和R*各自独立地为H、C_1-4烷基或不存在；其中所述C_1-4烷基任选地被1-4个卤基取代。

在一些实施方案中，抑制ATR的化合物为化合物A-1：

或其药学上可接受的盐。

在一些实施方案中，抑制ATR的化合物是由式AI-a表示：

或其药学上可接受的盐；

其中：

环A为

J⁵o为H、F、Cl、C_1-4脂族、O(C_1-3脂族)或OH；

J⁵p为

J⁵p1为H、C_1-4脂族、氧杂环丁烷基、四氢呋喃基、四氢哌喃基；其中J⁵p1任选地被1-2次出现的OH或卤基取代；

J⁵p2为H、甲基、乙基、CH₂F、CF₃或CH₂OH；

J²o为H、CN或SO₂CH₃；

J²m为H、F、Cl或甲基；

J²p为-SO₂(C_1-6烷基)、-SO₂(C_3-6环烷基)、-SO₂(4-6元杂环基)、-SO₂(C_1-4烷基)N(C_1-4烷基)₂或-SO₂(C_1-4烷基)-(4-6元杂环基)，其中所述杂环基含有1个选自氧、氮或硫的杂原子；且其中所述J²p任选地被1-3次出现的卤基、OH或O(C_1-4烷基)取代。

在一些实施方案中，环A为在一些实施方案中，环A为

在一些实施方案中，抑制ATR的化合物为化合物A-2：

或其药学上可接受的盐。

在一些实施方案中，抑制ATR的化合物是由式A-II表示：

或其药学上的盐，

其中：

R¹⁰独立地选自氟、氯或–C(J¹⁰)₂CN；

J¹⁰独立地选自H或C_1-2烷基；或

两次出现的J¹⁰与其所附接的碳原子一起形成3-4元任选取代的碳环环；

R²⁰独立地选自H；卤基；-CN；NH₂；任选被0-3次出现的氟取代的C_1-2烷基；或C_1-3脂族链，其中所述脂族链的至多两个亚甲基单元任选地被-O-、-NR^a-、-C(O)-或–S(O)_z置换；

R³独立地选自H；卤基；任选被1-3次出现的卤基取代的C_1-4烷基；C_3-4环烷基；-CN；或C_1-3脂族链，其中所述脂族链的至多两个亚甲基单元任选地被-O-、-NR^a-、-C(O)-或–S(O)_z置换；

R⁴独立地选自Q¹或C_1-10脂族链，其中所述脂族链的至多四个亚甲基单元任选地被-O-、-NR^a-、-C(O)-或-S(O)_z-置换；各R⁴任选地被0-5次出现的J^Q1取代；或

R³和R⁴与其所结合的原子一起形成具有0-2个选自氧、氮或硫的杂原子的5-6元芳族环或非芳族环；所述由R³和R⁴形成的环任选地被0-3次出现的J^Z取代；

Q¹独立地选自3-7元完全饱和、部分不饱和或芳族单环环，所述3-7元环具有0-3个选自氧、氮或硫的杂原子；或7-12元完全饱和、部分不饱和或芳族双环环，所述7-12元环具有0-5个选自氧、氮或硫的杂原子；

J^z独立地选自C_1-6脂族、＝O、卤基或→O；

J^Q1独立地选自–CN；卤基；＝O；Q²；或C_1-8脂族链，其中所述脂族链的至多三个亚甲基单元任选被-O-、-NR^a-、-C(O)-或-S(O)_z-置换；每次出现的J^Q1任选被0-3次出现的J^R取代；或

在同一原子上两次出现的J^Q1与其所连接的原子一起形成具有0-2个选自氧、氮或硫的杂原子的3-6元环；其中由两次出现的J^Q1形成的环任选地被0-3次出现的J^X取代；或

两次出现的J^Q1与Q¹一起形成6-10元饱和或部分不饱和桥接环体系；

Q²独立地选自3-7元完全饱和、部分不饱和或芳族单环环，所述3-7元环具有0-3个选自氧、氮或硫的杂原子；或7-12元完全饱和、部分不饱和或芳族双环环，所述7-12元环具有0-5个选自氧、氮或硫的杂原子；

J^R独立地选自–CN；卤基；＝O；→O；Q³；或C_1-6脂族链，其中所述脂族链的至多三个亚甲基单元任选地被-O-、-NR^a-、-C(O)-或-S(O)_z-置换；各J^R任选地被0-3次出现的J^T取代；或

在同一原子上两次出现的J^R与其所连接的原子一起形成具有0-2个选自氧、氮或硫的杂原子的3-6元环；其中所述由两次出现的J^R形成的环任选地被0-3次出现的J^X取代；或

两次出现的J^R与Q²一起形成6-10元饱和或部分不饱和桥接环体系；

Q³为3-7元完全饱和、部分不饱和或芳族单环环，所述3-7元环具有0-3个选自氧、氮或硫的杂原子；或7-12元完全饱和、部分不饱和或芳族双环环，所述7-12元环具有0-5个选自氧、氮或硫的杂原子；

J^X独立地选自-CN；＝O；卤基；或C_1-4脂族链，其中所述脂族链的至多两个亚甲基单元任选地被-O-、-NR^a-、-C(O)-或-S(O)_z-置换；

J^T独立地选自卤基、-CN；→O；＝O；-OH；C_1-6脂族链，其中所述脂族链的至多两个亚甲基单元任选地被-O-、-NR^a-、-C(O)-或-S(O)_z-置换；或具有0-2个选自氧、氮或硫的杂原子的3-6元非芳族环；每次出现的J^T任选地被0-3次出现的J^M取代；或

在同一原子上两次出现的J^T与其所连接的原子一起形成具有0-2个选自氧、氮或硫的杂原子的3-6元环；或

两次出现的J^T与Q³一起形成6-10元饱和或部分不饱和桥接环体系；

J^M独立地选自卤基或C_1-6脂族；

J为H或Cl；

z为0、1或2；并且

R^a独立地选自H或C_1-4脂族。

在一些实施方案中，R¹和R³为氟。在一些实施方案中，R⁴is Q¹.在一些实施方案中，Q¹独立地选自哌啶基和咪唑基。

在一些实施方案中，抑制ATR的化合物为化合物A-3：

或其药学上可接受的盐。

在一些实施方案中，抑制ATR的化合物是由式A-II-a表示：

或其药学上可接受的盐，

其中：

R¹⁰独立地选自氟、氯或–C(J¹⁰)₂CN；

J¹⁰独立地选自H或C_1-2烷基；或

两次出现的J¹与其所附接的碳原子一起形成任选取代的3-4元碳环环；

R³独立地选自H；氯；氟；任选被1-3次出现的卤基取代的C_1-4烷基；C_3-4环烷基；-CN；或C_1-3脂族链，其中所述脂族链的至多两个亚甲基单元任选地被-O-、-NR^a-、-C(O)-或–S(O)_z置换；

L¹为H；具有0-2个选自氧、氮或硫的杂原子的3-7元芳族环或非芳族环；或C_1-6脂族链，其中所述脂族链的至多两个亚甲基单元任选地被-O-、-NR^a-、-C(O)-或–S(O)_z置换；各L¹任选地被C_1-4脂族；-CN；卤基；-OH；或具有0-2个选自氧、氮或硫的杂原子的3-6元非芳族环取代；

L²为H；具有0-2个选自氧、氮或硫的杂原子的3-7元芳族环或非芳族环；或C_1-6脂族链，其中所述脂族链的至多两个亚甲基单元任选地被-O-、-NR^a-、-C(O)-或–S(O)_z置换；各L²任选地被C_1-4脂族；-CN；卤基；-OH；或具有0-2个选自氧、氮或硫的杂原子的3-6元非芳族环取代；或

L¹和L²与其所附接的氮一起形成环D；环D任选地被0-5次出现的J^G取代；

L³为H；C_1-3脂族；或CN；

环D独立地选自具有1-2个选自氧、氮或硫的3-7元杂环基环；或具有1-5个选自氧、氮或硫的杂原子的7-12元完全饱和或部分不饱和双环环；

J^G独立地选自卤基；-CN；-N(R°)₂；→O；3-6元碳环环基；具有1-2个选自氧、氮或硫的杂原子的3-6元杂环基；或C_1-4烷基链，其中所述烷基链的至多两个亚甲基单元任选地被-O-、-NR^a-、-C(O)-或–S(O)_z置换；各J^G任选地被0-2次出现的J^K取代。

在同一原子上两次出现的J^G与其所连接的原子一起形成具有0-2个选自氧、氮或硫的杂原子的3-6元环；或

两次出现的J^G与环D一起形成6-10元饱和或部分不饱和桥接环体系；

J^K为具有0-2个选自氧、氮或硫的杂原子的3-7元芳族环或非芳族环；

z为0、1或2；并且

R^a和R°为H或C_1-4烷基。

在一些实施方案中，R¹和R³为氟。

在一些实施方案中，所述抑制ATR的化合物为化合物A-4：

或其药学上可接受的盐。

在一些实施方案中，所述抑制ATR的化合物为：

或其药学上可接受的盐。

如上所述的ATR化合物可通过本领域中已知的任何合适的方法来制备，例如WO2015/187451；WO 2015/085132；WO 2014/089379；WO 2014/089379；WO 2014/143242；WO2014/143241；WO 2015/084384；WO 2014/143240；WO 2013/071094；WO 2013/071093；WO2013/071090；WO 2013/071088；WO 2013/049859；WO 2013/049719；WO 2013/049720；WO2013/049722；WO 2013/071085；WO 2013/049726；WO 2012/178125；WO 2012/178124；WO2012/178123；WO 2012/138938；WO 2012/138938；WO 2011/163527；WO 2011/143423；WO2011/143426；WO 2011/143425；WO 2011/143422；WO 2011/143419；WO 2011/143399；WO2010/054398；和WO 2010/071837。

可在本发明中使用的ATR抑制剂的其它实例包括在以下专利中所述的那些化合物：WO 2015/187451；WO 2015/085132；WO 2015/187451；WO 2015/085132；WO 2014/089379；WO 2014/089379；WO 2014/143242；WO 2014/143241；WO 2015/084384；WO 2014/143240；WO 2014/089379；WO 2013/071094；WO 2013/071093；WO 2013/071090；WO 2013/071088；WO 2013/049859；WO 2013/049719；WO 2013/049720；WO 2013/049722；WO 2013/071085；WO 2013/049726；WO 2012/178125；WO 2012/178124；WO 2012/178123；WO 2012/138938；WO 2012/138938；WO 2011/163527；WO 2011/143423；WO 2011/143426；WO 2011/143425；WO 2011/143422；WO 2011/143419；WO 2011/143399；WO 2010/054398；和WO 2010/071837，所有这类化合物及化合物式以引用的方式并入本文。

出于本申请的目的，应理解当两次出现的J^Q与Q¹一起形成桥接环体系时，两次出现的J^Q附接以分隔Q¹的原子。另外，当两次出现的J^R与Q²一起形成桥接环体系时，两次出现的J^R附接以分隔Q²的原子。此外，当两次出现的J^T与Q³一起形成桥接环体系时，两次出现的J^T附接以分隔Q³的原子。进一步，当两次出现的J^W与W一起形成桥接环体系时，两次出现的J^W附接以分隔W的原子。最终，当两次出现的J^G与环D一起形成桥接环体系时，两次出现的J^G附接以分隔环D的原子。

本领域技术人员应理解在→O中的箭头表示配价键。

本发明的化合物包括本文通常描述的那些，且进一步由本文所公开的类别、亚类和种类示出。除非另外指出，否则应用如本文所用的以下定义。出于本发明的目的，化学元素是根据元素周期表(Periodic Table of the Elements),CAS版本,Handbook ofChemistry and Physics,第75版来鉴别。另外，有机化学的一般原理描述于以下文献中：“Organic Chemistry”,Thomas Sorrell,University Science Books,Sausalito:1999及“March’s Advanced Organic Chemistry”,第5版,编者:Smith,M.B.和March,J.,JohnWiley&Sons,New York:2001，其全部内容在此以引用方式并入。

如本文所述，原子的规定数值范围包括其中的任何整数。举例来说，具有1-4个原子的基团可具有1、2、3或4个原子。

如本文所述，本发明化合物可任选地被一个或多个取代基取代，如本文一般示出或如由本发明的具体类别、亚类及种类所例示。应当理解，短语“任选取代的”与短语“取代的或未被取代的”可互换使用。一般说来，术语“取代的”无论前面是否有术语“任选地”都指的是在给定结构中的氢基被指定的取代基的基团置换。除非另外指出，任选取代的基团可在基团的各个可取代的位置处具有取代基，且当在任何给定结构中的一个以上位置可被一个以上选自指定基团的取代基取代时，在每个位置处的取代基可为相同或不同的。由本发明预期的取代基的组合优选地为能形成稳定或化学上可行的化合物的那些。

除非另外指出，由环中心画出的键连接的取代基意指所述取代基可键合至环中的任何位置。在下文的实施例i中，例如，J^w可键合至吡啶环上的任何位置。对于双环环，画出的一个通过两个环的键表示取代基可键合双环环的任何位置。在下文的实施例ii中，例如，J^w可键合至5元环(例如在氮原子上)并且键合至6元环。

如本文所用，术语“稳定的”是指当出于本文所公开的一个或多个目的而经历允许其生产、检测、回收、纯化和使用的条件时基本上不改变的化合物。在一些实施方案中，稳定化合物或化学上可行的化合物是当在水分或其它化学反应性条件不存在下保持在40℃或更低的温度下持续至少一周时基本上不改变的化合物。

如本文所用，术语“配价键”被定义为在分子种类之间相互作用后形式的配价键，其中一个充当有待在所形成的复合体中共享的电子对的供体且另一个充当该电子对的受体。

如本文所用，术语“脂族”或“脂族基团”意指直链(即非支链)、支链或环状的取代或未被取代的烃链，其为完全饱和的或含有一个或多个不饱和单元，所述不饱和单元具有附接至分子其余部分的单个连接点。

除非另有规定，脂族基团含有1-20个脂族碳原子。在一些实施方案中，脂族基团含有1-10个脂族碳原子。在其它实施方案中，脂族基团含有1-8个脂族碳原子。在另一些实施方案中，脂族基团含有1-6个脂族碳原子，且在又一些实施方案中，脂族基团含有1-4个脂族碳原子。脂族基团可为直链或支链、取代或未被取代的烷基、烯基或炔基。具体实例包括但不限于甲基、乙基、异丙基、正丙基、仲丁基、乙烯基、正丁烯基、乙炔基和叔丁基。脂族基团也可为环状的或具有直链或支链与环状基团的组合。这种类型的脂族基团的实例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环己烯基、-CH₂-环丙基、CH₂CH₂CH(CH₃)-环己基。

术语“环脂族”(或“碳环”或“碳环基”)是指单环C₃-C₈烃或双环C₈-C₁₂烃，其为完全饱和的或含有一个或多个不饱和单元，但其中没有芳族，所述不饱和单元具有附接至分子其余部分的单个连接点，其中所述双环环体系中的任何单个环具有3-7个成员。环脂族基团的实例包括但不限于环烷基和环烯基。具体实例包括但不限于环己基、环丙基和环丁基。

如本文所用，术语“杂环”、“杂环基”或“杂环的”意指非芳族、单环、双环或三环环体系，其中一个或多个环成员是独立选择的杂原子。在一些实施方案中，“杂环”、“杂环基”或“杂环的”基团具有3至14个环成员，其中一个或多个环成员为独立地选自氧、硫、氮或磷的杂原子，且体系中的各环含有3至7个环成员。

杂环的实例包括但不限于3-1H-苯并咪唑-2-酮、3-(1-烷基)-苯并咪唑-2-酮、2-四氢呋喃基、3-四氢呋喃基、2-四氢噻吩基、3-四氢噻吩基、2-吗啉代、3-吗啉代、4-吗啉代、2-硫代吗啉代、3-硫代吗啉代、4-硫代吗啉代、1-吡咯烷基、2-吡咯烷基、3-吡咯烷基、1-四氢哌嗪基、2-四氢哌嗪基、3-四氢哌嗪基、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、1-吡唑啉基、3-吡唑啉基、4-吡唑啉基、5-吡唑啉基、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-哌啶基、2-噻唑烷基、3-噻唑烷基、4-噻唑烷基、1-咪唑啶基、2-咪唑啶基、4-咪唑啶基、5-咪唑啶基、吲哚啉基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基、苯并硫杂环戊烷、苯并二噻烷和1,3-二氢咪唑-2-酮。

环状基团(例如，环脂族和杂环)可为线性稠合的、桥连的或螺环的。

术语“杂原子”意指氧、硫、氮、磷或硅中的一个或多个(包括，氮、硫、磷或硅的任何氧化形式；任何碱性氮的季铵化形式或；杂环的可取代的氮，例如N(如在3,4-二氢-2H-吡咯基中)、NH(如在吡咯烷基中)或NR⁺(如在N-取代的吡咯烷基中))。

如本文所用，术语“不饱和的”意指具有一个或多个不饱和单元的部分。如本领域技术人员所知，不饱和基团可为部分不饱和或完全不饱和的。部分不饱和基团的实例包括但不限于丁烯、环己烯和四氢吡啶。完全不饱和基团可为芳族的、反芳族的或非芳族的。完全不饱和基团的实例包括但不限于苯基、环辛四烯、吡啶基、噻吩基和1-甲基吡啶-2(1H)-酮。

如本文所用，术语“烷氧基”或“硫代烷基”是指通过氧(“烷氧基”)或硫(“硫代烷基”)原子附接的如先前所定义的烷基。

术语“卤烷基”、“卤烯基”、“卤脂族”和“卤烷氧基”意指视情况而定被一个或多个卤素原子取代的烷基、烯基或烷氧基。此术语包括全氟化烷基，如-CF₃和-CF₂CF₃。

术语“卤素”、“卤基”和“hal”意指F、Cl、Br或I。

术语“芳基”如单独或作为在“芳基烷基”、“芳基烷氧基”或“芳氧基烷基”中较大部分的一部分使用时是指具有总共5至14个环成员的单环、双环和三环体系，其中体系中的至少一个环是芳族的，且其中体系中的各环含有3至7个环成员。术语“芳基”可与术语“芳环”互换使用。

术语“杂芳基”单独或作为在“杂芳基烷基”或“杂芳基烷氧基”中较大部分的一部分使用时是指具有总共5至14个环成员的单环、双环和三环环体系，其中体系中的至少一个环是芳族的，体系中的至少一个环含有一个或多个杂原子，且其中体系中的各环含有3至7个环成员。术语“杂芳基”可与术语“杂芳基环”或术语“杂芳族”互换使用。杂芳基环的实例包括但不限于2-呋喃基、3-呋喃基、N-咪唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、5-咪唑基、苯并咪唑基、3-异噁唑基、4-异噁唑基、5-异噁唑基、2-噁唑基、4-噁唑基、5-噁唑基、N-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-嘧啶基、哒嗪基(例如3-哒嗪基)、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、四唑基(例如5-四唑基)、三唑基(例如2-三唑基和5-三唑基)、2-噻吩基、3-噻吩基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、吲哚基(例如2-吲哚基)、吡唑基(例如2-吡唑基)、异噻唑基、1,2,3-噁二唑基、1,2,5-噁二唑基、1,2,4-噁二唑基、1,2,3-三唑基、1,2,3-噻二唑基、1,3,4-噻二唑基、1,2,5-噻二唑基、嘌呤基、吡嗪基、1,3,5-三嗪基、喹啉基(例如2-喹啉基、3-喹啉基、4-喹啉基)以及异喹啉基(例如1-异喹啉基、3-异喹啉基或4-异喹啉基)。

应理解，术语“杂芳基”包括以两种不同形式之间的平衡存在的某些类型的杂芳环。更具体地，例如，如羟基吡啶和吡啶酮(且同样地，羟基嘧啶和嘧啶酮)的种类意图涵盖于“杂芳基”的定义内。

如本文所用的术语“保护基(protecting group)”和“保护基(protectivegroup)”是可互换的并且指的是用于临时阻断具有多个反应性位点的化合物中的一个或多个所需官能团的试剂。在某些实施方案中，保护基具有一种或多种或优选所有以下特征：a)以良好的产率选择性地添加到官能团中以得到受保护的底物，其b)对在其它反应性位点的一个或多个处进行的反应是稳定的；以及c)可通过不会攻击再生的脱保护的官能团的试剂以良好的产率被选择性地移除。如本领域技术人员应理解，在一些情况下，试剂不会攻击化合物中的其它反应性基团。在其它情况下，试剂还可与化合物中的其它反应性基团反应。保护基的实例详述Greene,T.W.,Wuts,P.G的“Protective Groups in Organic Synthesis”,第三版,John Wiley&Sons,New York:1999(及此书的其它版本)中，其全部内容在此以引用的方式并入。如本文所用的术语“氮保护基”是指用于临时阻断多官能化合物中的一个或多个所需氮反应性位点的试剂。优选的氮保护基也具有针对以上保护基所例示的特征，并且某些示例性氮保护基也详述于Greene,T.W.,Wuts,P.G的“Protective Groups in OrganicSynthesis”,第三版,John Wiley&Sons,New York:1999的第7章中，其全部内容在此以引用的方式并入。

在一些实施方案中，烷基或脂族链的亚甲基单元任选地被另一个原子或基团置换。这种原子或基团的实例包括但不限于氮、氧、硫、-C(O)-、-C(＝N-CN)-、-C(＝NR)-、-C(＝NOR)-、-SO-和-SO₂-。这些原子或基团可合并以形成较大基团。这种较大基团的实例包括但不限于-OC(O)-、-C(O)CO-、-CO₂-、-C(O)NR-、-C(＝N-CN)、-NRCO-、-NRC(O)O-、-SO₂NR-、-NRSO₂-、-NRC(O)NR-、-OC(O)NR-和-NRSO₂NR-，其中R为例如H或C_1-6脂族。应理解，这些基团可经由单键、双键或三键键合至脂族链的亚甲基单元。经由双键键合至脂族链的任选置换物(在此情况下为氮原子)的一个实例将为–CH₂CH＝N-CH₃。在一些情况下，尤其在末端处，任选的置换物可经由三键键合至脂族基团。其一个实例为CH₂CH₂CH₂C≡N。应理解，在此情形下，末端氮没有键合至另一个原子。

还应理解，术语“亚甲基单元”也可指的是支链或取代的亚甲基单元。例如，在异丙基部分[-CH(CH₃)₂]中，置换首个描述的“亚甲基单元”的氮原子(例如NR)将产生二甲胺[-N(CH₃)₂]。在如这些的情况下，本领域技术人员应理解氮原子不能具有任何键合至其的另外的原子，并且在此情况下，来自“NR”的“R”将不存在。

除非另外指出，任选的置换形成化学上稳定的化合物。任选的置换可在链内和/或链端处发生，即，既可在附接点处和/或也可在末端处。两个任选的置换也可在链内彼此靠近，只要其产生化学上稳定的化合物。例如，C₃脂族可任选地被2个氮原子置换以形成–C–N≡N。任选的取代也可完全取代链中的所有碳原子。例如，C₃脂族可任选地被-NR-、-C(O)-和-NR-置换以形成-NRC(O)NR-(脲)。

除非另外指出，如果置换发生在末端处，那么置换原子结合至末端上的氢原子。举例来说，如果-CH₂CH₂CH₃的亚甲基单元任选被-O-置换，那么所生成的化合物可为-OCH₂CH₃、-CH₂OCH₃或-CH₂CH₂OH。在另一实例中，如果-CH₂CH₂CH₃的亚甲基单元任选被-NH-置换，那么所生成的化合物可为-NHCH₂CH₃、-CH₂NHCH₃或-CH₂CH₂NH₂。应理解，如果末端原子不含任何自由价电子，那么在末端处不需要氢原子(例如-CH₂CH₂CH＝O或-CH₂CH₂C≡N)。

除非另外指出，本文所描绘的结构还意图包括该结构的所有异构(例如，对映异构、非对映异构、几何、构象和旋转)形式。例如，每个不对称中心的R和S构型、(Z)和(E)双键异构体、及(Z)和(E)构象异构体都包括在本发明中。如本领域技术人员应理解，取代基可围绕任何可旋转的键自由地旋转。举例来说，画作的取代基还表示

因此，本发明化合物的单一立体化学异构体以及对映异构体、非对映异构体、几何、构象和旋转混合物都在本发明的范围内。

除非另外指出，本发明化合物的所有互变异构形式都在本发明的范围内。

另外，除非另外指出，本文所描绘的结构还意图包括仅在存在一个或多个同位素富集原子上不同的化合物。例如，具有本发明结构、只是将其中的氢置换为氘或氚或者将碳置换为¹³C-或¹⁴C-富集碳的化合物，也在本发明的范围之内。这种化合物适用作例如生物检定中的分析工具或探针。

本文所述的化合物可以游离形式或适当时作为盐存在。对那些药学上可接受的盐特别关注，因为它们适用于出于医学目的施用如下所述的化合物。出于分离和纯化目的，药学上不可接受的盐适用于制造过程中，且在一些情况下，用于分离立体异构形式的本发明化合物或其中间体。

药学上可接受的盐是本领域中公知的。例如，S.M.Berge等人在J.PharmaceuticalSciences,1977,66,1-19中详细地描述了药学上可接受的盐，所述文献以引用的方式并入本文。本文所述的化合物的药学上可接受的盐包括衍生自合适的无机和有机酸和碱的那些盐。这些盐可在化合物的最终分离和纯化期间就地制备。

当本文所述的化合物含有碱性基团或足够碱性的生物电子等排体时，酸加成盐可通过以下步骤来制备：1)使呈游离碱形式的纯化的化合物与合适的有机或无机酸反应，及2)分离由此形成的盐。实际上，酸加成盐可能是一种更方便的使用形式并且使用的盐与使用的游离碱形式相当。

药学上可接受的无毒酸加成盐的实例是氨基与以下无机酸形成的盐：如盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸和高氯酸；或氨基与以下有机酸形成的盐：如乙酸、草酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、丁二酸或丙二酸或通过使用如离子交换的领域中使用的其它方法。其它药学上可接受的盐包括己二酸盐、藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、甲酸盐、富马酸盐、葡萄糖酸盐、甘油磷酸盐、羟乙酸盐、葡糖酸盐、羟乙酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐、乳糖醛酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐(palmitate)、棕榈酸盐(palmoate)、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、特戊酸盐、丙酸盐、水杨酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、对甲苯磺酸盐、十一烷酸盐、戊酸盐等等。

当本文所述的化合物含有羧基或足够酸性的生物电子等排体时，碱加成盐可通过以下步骤来制备：1)使呈其酸形式的纯化的化合物与合适的有机或无机碱反应，及2)分离由此形成的盐。实际上，碱加成盐的使用可能更为方便并且使用的盐形式固有地与使用的游离酸形式相当。衍生自适当的碱的盐包括碱金属(例如，钠、锂和钾)、碱土金属(例如，镁和钙)、铵以及N⁺(C_1-4烷基)₄盐。本发明还预期了本文所公开的化合物的任何碱性含氮基团的季铵化。可通过这种季铵化获得水或油溶性或可分散的产物。

碱加成盐包括药学上可接受的金属和胺盐。合适的金属盐包括钠、钾、钙、钡、锌、镁和铝。钠和钾盐通常是优选的。其它药学上可接受的盐包括(适当时)使用如下抗衡离子形成的无毒的铵、季铵和胺阳离子：卤离子、氢氧根、羧酸根、硫酸根、磷酸根、硝酸根、低级烷基磺酸根和芳基磺酸根。合适的无机碱加成盐是由金属碱制备，所述金属碱包括氢化钠、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化铝、氢氧化锂、氢氧化镁、氢氧化锌等。合适的胺碱加成盐是由在药物化学中经常使用的胺来制备，因为它们毒性低且为医学使用所接受。氨、乙二胺、N-甲基-葡糖胺、赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、胆碱、N,N’-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、二乙醇胺、普鲁卡因、N-苄基苯乙胺、二乙胺、哌嗪、三(羟甲基)-氨基甲烷、氢氧化四甲铵、三乙胺、二苄胺、麻黄胺、脱氢枞胺、N-乙基哌啶、苯甲基胺、四甲铵、四乙铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、乙胺、碱性氨基酸、二环己胺等是合适的碱加成盐的实例。

其它酸和碱(但本身在药学上不可接受)可用于盐的制备中，所述盐适用作供获得本文所述的化合物及其药学上可接受的酸或碱加成盐之用的中间体。

应理解本发明包括不同药学上可接受的盐的混合物/组合以及呈游离形式的化合物与药学上可接受的盐的混合物/组合。

本文所述的化合物也可以药学上可接受的溶剂化物(例如水合物)和包合物形式存在。如本文所用，术语“药学上可接受的溶剂化物”是由一个或多个药学上可接受的溶剂分子缔合到本文所述的一种化合物所形成的溶剂化物。术语溶剂化物包括水合物(例如，半水合物、一水合物、二水合物、三水合物、四水合物等)。

如本文所用，术语“水合物”意指本文所述的化合物或其盐，还包含化学计量或非化学计量的通过非共价分子间力结合的水。

如本文所用，术语“包合物”意指呈晶格形式的本文所述的化合物或其盐，其含有间隙(例如通道)，其中捕集有客体分子(例如，溶剂或水)。

除本文所述的化合物之外，包括这些化合物的前药的药学上可接受的衍生物也可用于组合物中以治疗或预防本文所鉴别的病症。

siRNA抑制剂

适用于治疗PTEN突变或缺陷型癌症的另一类抑制剂包括一个或多个SWI/SNFBAF-复合体基因或其互补物的核酸抑制剂，其通过下调活性多肽的产生来抑制活性或功能。这可使用本领域中公知的常规方法，例如通过筛选使用如实施例中所述的实时PCR来监测。

可使用反义或RNAi技术抑制有丝分裂激酶的表达。使用这些方法下调基因表达现已是本领域中广为接受的。

可以设计反义寡核苷酸，用来与核酸、前体mRNA或成熟mRNA的互补序列相杂交，干扰碱基切除修复途径组分的产生，以使得其表达减少或完全或大致完全被抑制。除靶向编码序列之外，反义技术也可用于靶向基因的控制序列，例如在5'侧翼序列中，借此反义寡核苷酸可干扰表达控制序列。反义序列的构建及其用途描述于例如Peyman&Ulman,ChemicalReviews,90:543-584,1990及Crooke,Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.,32:329-376,1992中。

可体外或离体生成寡核苷酸以便于施用，或者可在其中需要下调的细胞内在体内生成反义RNA。因此，双链DNA可以“反向方向”置于启动子的控制下，以使得DNA的反义链的转录产生与由靶基因的有义链转录的正常mRNA互补的RNA。互补的反义RNA序列则被认为与mRNA结合以形成双链体，从而抑制内源性mRNA由靶基因翻译成蛋白质。这是否为实际作用模式仍然还不确定。然而，确定的事实是该技术起作用。

不一定使用对应于呈反向方向的编码序列的完整序列。例如，可使用足够长度的片段。对本领域技术人员来说常规的是从基因的编码或侧翼序列的各种部分中筛选各种尺寸的片段以使反义抑制的水平最佳化。可为有利的是包括初始蛋氨酸ATG密码子及或许初始密码子上游的一个或多个核苷酸。合适的片段可具有约14-23个核苷酸，例如，约15、16或17个核苷酸。

反义的替代是使用插入与靶基因具有相同方向的有义中的靶基因的全部或部分的拷贝，以便通过共抑制减少靶基因的表达(Angell&Baulcombe,The EMBO Journal 16(12):3675-3684,1997及Voinnet&Baulcombe,Nature,389:553,1997)。发现双链RNA(dsRNA)在基因沉默中比有义或反义链单独都甚至更有效(Fire等人,Nature 391,806-811,1998)。dsRNA介导的沉默是基因特异性的且常称为RNA干扰(RNAi)。与在秀丽隐杆线虫、果蝇、植物和哺乳动物中使用RNAi使基因沉默有关的方法是本领域中已知的(Fire,Trends Genet.,15:358-363,19999；Sharp,RNA interference,Genes Dev.15:485-4902001；Hammond等人,Nature Rev.Genet.2:110-1119,2001；Tuschl,Chem.Biochem.2:239-245,2001；Hamilton等人,Science 286:950-952,1999；Hammond等人,Nature 404:293-296,2000；Zamore等人,Cell,101:25-33,2000；Bernstein,Nature,409:363-366,2001；Elbashir等人,Genes Dev.,15:188-200,2001；WO01/29058；WO99/32619以及Elbashir等人,Nature,411:494-498,2001)。

RNA干扰是一个两步过程。首先，dsRNA在细胞内裂解以产生长度为约21-23nt的短干扰RNA(siRNA)，其具有5'末端磷酸和3'短突出端(～2nt)。siRNA靶向相应的mRNA序列特别用于破坏(Zamore,Nature Structural Biology,8,9,746-750,2001。

也可使用具有3'-突出端的相同结构的化学合成的siRNA双链体来有效地诱导RNAi(Zamore等人,Cell,101:25-33,2000)。已显示合成siRNA双链体在广泛的哺乳动物细胞系中特异性地抑制内源和外源基因的表达(Elbashir等人,Nature,411:494-498,2001)。

另一种可能性是使用以下核酸：一旦转录便产生能在特异性位点处切割核酸的核糖酶，且因此也适用于影响基因表达，参见，例如Kashani-Sabet&Scanlon,Cancer GeneTherapy,2(3):213-223,1995及Mercola&Cohen,Cancer Gene Therapy,2(1):47-59,1995。

可使用小RNA分子来调节基因表达。这些包括通过小干扰RNA(siRNA)的mRNA的靶向降解、转录后基因沉默(PTG)、通过微小RNA(miRNA)的mRNA的发育调节序列特异性翻译阻遏以及靶向转录基因沉默。

还证明了RNAi机构和小RNA在异染色质复合体的靶向及在特定的染色体位点处的表观遗传基因沉默中的作用。双链RNA(dsRNA)依赖性转录后沉默，也称为RNA干扰(RNAi)，它是一种现象，其中dsRNA复合体可在短期靶向同源性的特异性基因以便沉默。其用作信号以促进具有序列同一性的mRNA的降解。20-nt siRNA通常足够长以诱导基因特异性沉默，但足够短以逃避宿主响应。靶基因产物表达的减少可为广泛的，其中由几个siRNA分子诱导90％的沉默。

在本领域中，这些RNA序列根据其来源被称为“短或小干扰RNA”(siRNA)或“微小RNA”(miRNA)。两种类型的序列都可用于通过结合至互补RNA并触发mRNA清除(RNAi)或阻止mRNA翻译成蛋白质来下调基因表达。siRNA是通过长双链RNA的加工而得到并且当在自然界中发现时，通常是外生源的。微小干扰RNA(miRNA)是内源性编码的小非编码RNA，通过加工短发夹而得到。siRNA和miRNA都可抑制具有部分互补靶序列的mRNA的翻译而无RNA裂解并且降解具有全互补序列的mRNA。

siRNA配体通常是双链，并且为了使靶基因功能的RNA介导的下调的有效性最佳，优选地选择siRNA分子的长度以确保校正由RISC复合体对siRNA的识别，RISC复合体介导siRNA对mRNA靶标的识别，且由此siRNA足够短以减少宿主响应。

miRNA配体通常是单链并且具有部分互补的区域以使配体能形成发夹。miRNA是由DNA转录的RNA基因，但没有翻译成蛋白质。编码miRNA基因的DNA序列比miRNA更长。此DNA序列包含miRNA序列和近似反向互补链。当此DNA序列转录成单链RNA分子时，miRNA序列与其反向互补碱基对形成部分双链的RNA节段。微小RNA序列的设计论述于John等人,PLoSBiology,11(2),1862-1879,2004中。

通常，RNA配体意图模拟具有以下数量核糖核苷酸(或其合成类似物)的siRNA或miRNA的效应：介于10与40个之间，更优选介于17与30个核糖核苷酸之间、更优选介于19与25个核糖核苷酸之间且最优选介于21与23个核糖核苷酸之间。在采用双链siRNA的本发明的一些实施方案中，分子可具有例如一个或两个(核糖)核苷酸的对称的3'突出端，通常是dTdT 3'突出端的UU。基于本文所提供的公开内容，本领域技术人员可容易设计合适的siRNA和miRNA序列，例如，使用如Ambion's siRNA finder的资源，参见http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html。siRNA和miRNA序列可以合成方式产生并外源地加入以导致基因下调或使用表达系统(例如载体)产生。在一个优选实施方案中，siRNA是合成得到的。

更长的双链RNA可在细胞中进行加工以产生siRNA(例如，参见Myers,NatureBiotechnology,21:324-328,2003)。更长的dsRNA分子可具有例如一个或两个(核糖)核苷酸的对称的3'或5'突出端，或可具有钝端。更长的dsRNA分子可为25个核苷酸或更长。优选地，更长的dsRNA分子的长度介于25与30个核苷酸之间。更优选地，更长的dsRNA分子的长度介于25与27个核苷酸之间。最优选地，更长的dsRNA分子的长度为27个核苷酸。长度为30个核苷酸或更长的dsRNA可使用载体pDECAP来表达(Shinagawa等人,Genes and Dev.,17:1340-5,2003)。

另一替代方案为短发夹RNA分子(shRNA)在细胞中的表达。shRNA比合成siRNA更稳定。shRNA是由通过小环序列分隔的短反向重复序列组成。一个反向重复序列与基因靶标互补。在细胞中，通过DICER将shRNA加工成siRNA，siRNA降解靶基因mRNA并抑制表达。在一个优选实施方案中，shRNA是通过由载体进行转录而内源性地(在细胞内)产生。shRNA可通过在RNA聚合酶III启动子如人H1或7SK启动子或RNA聚合酶II启动子的控制下用编码shRNA序列的载体转染细胞而在细胞内产生。或者，shRNA可通过由载体进行转录而外源性地(体外)合成。shRNA随后可直接引入到细胞中。优选地，shRNA序列长度介于40与100个碱基之间、更优选地介于40与70个碱基之间。发夹的茎的长度优选介于19与30个碱基对之间。所述茎可含有G-U配对以使发夹结构稳定。

在一个实施方案中，通过由载体的转录，内源地(在细胞内)产生siRNA、更长的dsRNA或miRNA。载体可以本领域中已知的任何方式引入细胞中。任选地，可使用组织特异性启动子调节RNA序列的表达。在又一实施方案中，通过由载体的转录，外源地(体外)产生siRNA、更长的dsRNA或miRNA。

或者，可使用本领域中已知的标准固相或液相合成技术来合成siRNA分子。核苷酸之间的键可为磷酸二酯键或替代物，例如，下式的连接基团：P(O)S，(硫代磷酰胺酯)；P(S)S，(二硫代磷酰胺酯)；P(O)NR'2；P(O)R'；P(O)OR6；CO；或CONR'2，其中R为H(或盐)或烷基(1-12C)且R6为通过-O-或-S-与相邻核苷酸相连的烷基(1-9C)。

除了天然存在的碱基之外，还可使用修饰过的核苷酸碱基，并且所述修饰过的碱基可赋予含有它们的siRNA分子以有利的性质。

例如，修饰过的碱基可提高siRNA分子的稳定性，由此减少沉默所需的量。修饰过的碱基的存在也可提供比未修饰的siRNA更稳定或较不稳定的siRNA分子。

术语‘修饰过的核苷酸碱基’包括具有共价修饰的碱基和/或糖的核苷酸。例如，修饰过的核苷酸包括具有糖的核苷酸，其共价地附接到在3'位处除羟基外且在5'位处除磷酸基外的低分子量有机基团上。由此修饰的核苷酸还可包括2'取代的糖，如2'-O-甲基-；2-O-烷基；2-O-烯丙基；2'-S-烷基；2'-S-烯丙基；2'-氟-；2'-卤基或2；叠氮基核糖、碳环糖类似物、a-端基异构糖；差向异构糖，如阿拉伯糖、木糖或来苏糖、吡喃糖、呋喃糖和景天庚酮糖。

修饰的核苷酸是本领域中已知的并且包括烷基化嘌呤和嘧啶、酰化嘌呤和嘧啶、及其它杂环。这些类别的嘧啶和嘌呤是本领域中已知的并且包括假异胞嘧啶、N4,N4-乙基胞嘧啶、8-羟基-N6-甲基腺嘌呤、4-乙酰基胞嘧啶、5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶、5氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、肌苷、N6-异戊基-腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基假尿嘧啶、1-甲基鸟嘌呤、2,2-二甲基鸟嘌呤、2甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、-D-甘露糖基辫苷(queosine)、5-甲氧基羰基甲基尿嘧啶、5甲氧基尿嘧啶、2甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、假尿嘧啶、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5甲基尿嘧啶、N-尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、尿嘧啶5-氧基乙酸、辫苷、2-硫胞嘧啶、5-丙基尿嘧啶、5-丙基胞嘧啶、5-乙基尿嘧啶、5乙基胞嘧啶、5-丁基尿嘧啶、5-戊基尿嘧啶、5-戊基胞嘧啶及2,6,二氨基嘌呤、甲基假尿嘧啶、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基胞嘧啶。

抗体

抗体在本发明中可用作适用于治疗BAF-复合体基因突变型或缺陷型癌症的一类抑制剂的实例，且更具体地作为ATR抑制剂。它们还可用于本文所公开的方法中以用于评价患有癌症的个体或预测患有癌症的个体的响应，具体说来，用于确定个体是否患有可根据本发明治疗的BAF-复合体基因突变型或缺陷型癌症。

如本文所用，术语“抗体”包括天然的、或部分或完全合成产生的免疫球蛋白。该术语还包括包含抗体结合域的任何多肽或蛋白质。包含抗原结合域的抗体片段为如Fab、scFv、Fv、dAb、Fd；及双抗体。有可能采用单克隆及其它抗体并使用重组DNA技术以产生其它抗体或保留原始抗体的特异性的嵌合分子。这种技术可包括将编码抗体的免疫球蛋白可变区或互补决定区(CDR)的DNA引入不同免疫球蛋白的恒定区或恒定区加构架区中。参见，例如EP 0 184 187 A、GB 2,188,638 A或EP 0 239 400 A。

抗体可以许多方式经修饰并且术语“抗体分子”应被视为涵盖具有抗体抗原结合域的任何特异性结合成员或物质，所述抗体抗原结合域具有所需特异性。因此，此术语涵盖抗体片段和衍生物，包括包含免疫球蛋白结合域的任何多肽，不管是天然的抑或完整或部分合成的。因此包括融合至另一个多肽的包含免疫球蛋白结合域或等效物的嵌合分子。嵌合抗体的克隆和表达描述于EP 0 120 694 A和EP 0 125 023 A中。

已显示，全抗体的片段可执行结合抗原的功能。结合片段的实例为：(i)由VL、VH、CL和CH1结构域组成的Fab片段；(ii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iii)由单一抗体的VL和VH结构域组成的Fv片段；(iv)由VH结构域组成的dAb片段(Ward,E.S.等人,Nature341,544-546(1989))；(v)分离的CDR区；(vi)F(ab')2片段，即包含两个连接的Fab片段的二价片段；(vii)单链Fv分子(scFv)，其中VH结构域与VL结构域是通过肽接头连接，所述肽接头允许两个结构域缔合以形成抗原结合位点(Bird等人,Science,242；423-426,1988；Huston等人,PNAS USA,85:5879-5883,1988)；(viii)双特异性单链Fv二聚体(WO 93/11161)及(ix)“双抗体”，通过基因融合构建的多价或多特异性片段(WO 94/13804；Holliger等人,P.N.A.S.USA,90:6444-6448,1993)；(x)免疫粘附素(WO 98/50431)。Fv、scFv或双抗体分子可通过并入二硫桥以连接VH与VL结构域而稳定(Reiter等人,NatureBiotech,14:1239-1245,1996)。还可制得包含连接到CH3结构域上的scFv的微型抗体(Hu等人,Cancer Res.,56:3055-3061,1996)。

将根据本发明使用的优选抗体分离，也就是说，不含污染物，如能结合其它多肽的抗体；和/或不含血清组分。为了某些目的，单克隆抗体是优选的，虽然多克隆抗体在本发明的范围内。

抗体对样品的反应性可通过任何适当手段来确定。一种可能性为用单独的报道分子进行标记。报道分子可以直接或间接产生可检测(优选可测量)的信号。报道分子的键合可以是直接或间接的、共价的(例如经由肽键)或非共价的。通过肽键的键合可能是重组表达编码抗体和报道分子的基因融合物的结果。一种优选模式是通过每个抗体与具有光谱分离吸收或发射特性的单独的荧光染料、磷或激光激发染料的共价键。合适的荧光染料包括荧光素、罗丹明、藻红蛋白和德克萨斯红(Texas Red)。合适的产色染料包括二氨基联苯胺。

其它报道分子包括大分子胶状颗粒或微粒物，如有色的、磁性或顺磁性的乳胶珠，及可以直接或间接引起可目测的、可电子检测的或可另外记录的检测信号的生物或化学活性剂。例如，这些分子可以是催化发生或改变颜色或引起电特性改变的反应的酶。它们可以是分子可激动的，由此能量状态之间的电子跃迁导致特征性光谱吸收或发射。它们可包括与生物传感器结合使用的化学实体。可采用生物素/抗生物素蛋白或生物素/链霉抗生物素和碱性磷酸酶检测系统。

根据本发明的抗体可用于筛选多肽在例如含有如所讨论的细胞或细胞裂解物的测试样品中的存在，并且可用于纯化和/或分离根据本发明的多肽，例如，在通过由编码核酸的表达产生多肽之后。抗体可调节它们所结合的多肽的活性，且因此，如果所述多肽在个体中具有有害影响，那么可适用于治疗情况中(可包括预防)。

BAF-复合体基因

BAF-复合体基因是构成多亚基SWI/SNF染色质重塑复合体“BRG1或HRBM相关因子”(BAF)和聚溴相关BAF(PBAF)的一组已建立的蛋白质。它们介导ATP依赖性染色质重塑过程，该过程对于分化和增殖很重要。

复合体的几种组分用作肿瘤抑制子(参见Reisman,Oncogene 28:1653-1668,2009)。BAF-复合体基因包括但不限于ARID1A、ARID1B、ARID2、SMARCA2、SMARCA4、SMARCB1、SMARCC2、SMARCC1、SMARCD1、2和3、SMARCE1、ACTL6A、ACTL6B及PBRM1。BAF-复合体基因(该基因有缺陷的癌症可根据本发明来治疗)的一个优选实例是ARID1A(富含AT的DNA相互作用结构域1A)，也称为OSA、p270和BAF250A。ARID1A位于1p36.11(16)-一个在人类癌症中常常丢失的区域(17)-并且可在多达30％的肾癌和10％的乳癌中有缺陷(18)。

癌症的治疗

本发明提供了用ATR抑制剂治疗BAF-复合体基因缺陷或突变型癌症的方法和医学用途。BAF-复合体基因缺陷或突变型癌症可像这样通过以下操作来鉴别：测试来自个体的癌细胞样品被，例如以确定一个或多个BAF-复合体基因蛋白是否含有一个或多个突变。已知BAF-复合体基因突变在许多不同肿瘤类型中以高频出现。具有最高BAF-复合体突变率的癌症是滑膜肉瘤、卵巢透明细胞癌(75％)、结肠直肠癌(55％)、黑色素瘤(39％)、肺癌(35％)、肝细胞癌(33％)、胃癌(32％)、膀胱癌(22％)、血液恶性肿瘤(15％)、鳞状细胞癌(14％)、浆液性卵巢癌(12％)、乳腺癌(11％)、胰腺癌(10％)、成神经管细胞瘤(8％)、肾癌(6％)和神经胶质瘤(6％)。在所有肿瘤类型中，BAF-复合体基因突变的平均出现率是19.6％(13)。(Shain&Pollack,PLoS One.2013；8(1):e55119.)。

具有如Kadoch,C.,等人(Proteomic and bioinformatic analysis ofmammalian SWI/SNF complexes identifies extensive roles in humanmalignancy.Nat Genet 45,592-601(2013))中所定义的SWI/SNF BAF 中的缺陷的癌症包括结肠直肠癌、卵巢透明细胞癌、浆液性卵巢癌、胰腺癌、胃癌、膀胱癌、肝细胞癌、肾癌、鳞状细胞癌、乳腺癌、成神经管细胞瘤、神经胶质瘤、黑色素瘤、肺癌、血液恶性肿瘤和滑膜肉瘤。

在一些实施方案中，BAF缺陷型癌症的特征在于在体细胞癌前或癌性细胞中出现一个或多个BAF-复合体基因突变或缺陷。在又一实施方案中，BAF缺陷型癌症的特征在于在单个患者的种系中出现一个或多个BAF-复合体基因突变。

在一些实施方案中，BAF-复合体基因缺陷或突变型癌症可像这样通过以下操作来鉴别：测试来自个体的癌细胞样品以测定一个或多个BAF-复合体基因的表达，以便评价蛋白质的表达是否不存在或与正常相比以降低水平存在。

在其它实施方案中，BAF缺陷型癌症的特征在于在BAF-复合体基因中有缺陷的癌细胞或展现BAF-复合体基因的表观遗传失活或蛋白质功能丧失的癌细胞。

更一般地说，可通过测定来自个体的细胞样品中的BAF多肽的活性将癌症鉴别为BAF缺陷型癌症。样品可为来自个体的正常细胞，其中所述个体在一个或多个BAF基因中具有突变或所述样品可为癌细胞，例如，其中形成肿瘤的细胞展现了在BAF活性中的缺陷。活性可相对于对照来测定，例如，相对于非癌细胞，在癌细胞中有缺陷的情况下，优选来自同一组织。一个或多个BAF基因的活性可通过使用本领域中公知的的技术来测定，如蛋白质印迹分析、免疫组织学、染色体异常、酶促或DNA结合测定及基于质粒的测定。

样品可为来自个体的正常细胞，其中所述个体在一个或多个BAF-复合体基因中具有突变或所述样品可为癌细胞，例如，其中形成肿瘤的细胞含有一个或多个BAF-复合体基因突变。活性可相对于对照来测定，例如，相对于非癌细胞，在癌细胞中有缺陷的情况下，优选来自同一组织。

BAF-复合体基因表达的测定可包括测定BAF-复合体基因mRNA在样品中的存在或量。这种方法是本领域技术人员公知的。举例来说，其包括通过以下操作确定BAF-复合体基因mRNA的存在：(i)使用能够与BAF-复合体基因核酸杂交的标记过的探针；和/或(ii)使用包括基于BAF-复合体基因核酸序列的一个或多个引物的PCR来测定BAF-复合体基因转录物是否存在于样品中。探针还可固定为包括在微阵列中的序列。

在一个实施方案中，检测BAF-复合体基因mRNA是通过从肿瘤样品中提取RNA并具体地使用定量实时RT-PCR测量一个或多个BAF-复合体基因的表达来进行。或者或另外，可使用微阵列分析，使用从肿瘤样品中提取的RNA来评价BAF-复合体基因的表达，所述微阵列分析使用固定在底物上以形成阵列的多个探针来测量一组基因的mRNA的水平。

在一些实施方案中，癌症可通过确定一个或多个对应于基因丢失的染色体异常(例如，染色体的部分或全部丢失)在来自个体肿瘤的细胞样品中的存在而鉴别为BAF缺陷型。染色体异常可通过本领域中已知的任何核型分析技术来目测，包括但不限于Giemesa染色、奎吖因染色、Hoechst 33258染色、DAPI(4’-6-二氨基-2-苯基吲哚)染色、道诺霉素染色和荧光原位杂交。在又一实施方案中，BAF-复合体基因为ARID1A且所述缺陷是由包括至少来自染色体1的片段1p36.11的丢失的染色体异常来确定。

在一些实施方案中，癌症可通过确定一个或多个编码BAF-复合体多肽的核酸中的变异(例如，多态性或突变)在来自个体的细胞样品中的存在而鉴别为BAF缺陷型癌症。序列变异(如突变和多态性)可包括相对于野生型核苷酸序列在一个或多个核苷酸中的缺失、插入或取代。所述一个或多个变异可在核酸序列的编码或非编码区中并且可减少或消除BAF基因的表达或功能。换言之，变体核酸可编码具有降低或消除的活性的变体多肽或可编码在细胞内几乎没有或没有表达的野生型多肽，例如通过改变调控元件的活性。变体核酸可具有相对于野生型序列的一处或多处突变或多态性。

或者或另外，在本发明中，确定患者是否患有BAF缺陷型癌症可通过BAF-复合体蛋白质表达的分析来进行，例如，通过检查一个或多个BAF-复合体蛋白质的水平是否受到抑制。

在一些方面中，BAF-复合体蛋白质的存在或量可使用能够特异性地结合至BAF-复合体蛋白质或其片段的结合剂来确定。一个优选类型的BAF-复合体蛋白质结合剂是能够特异性地结合BAF-复合体蛋白质或其片段的抗体。抗体可经标记以使得其能够被检测或能够在与一种或多种其它物质反应之后检测，例如，使用经标记或能够产生可检测的结果的二级抗体，例如在ELISA类型测定中。作为替代，经标记的结合剂可用于蛋白质印迹中以检测BAF-复合体蛋白质。

或者或另外，用于确定BAF-复合体蛋白质存在的方法可例如使用免疫组织化学(IHC)分析对肿瘤样品进行。IHC分析可使用石蜡固定样品或冷冻组织样品进行，并且一般包括对样品进行染色以突出BAF-复合体蛋白质的存在和位置。

在本发明的一些实施方案中，BAF缺陷型癌症的特征在于在基因或蛋白质序列中的一个或多个突变、在选自以下的BAF-复合体基因中的缺陷和/或不存在：ARID1A、ARID1B、ARID2、SMARCA2、SMARCA4、SMARCB1、SMARCC2、SMARCC1、SMARCD1、SMARCD2、SMARCD3、SMARCE1、ACTL6A、ACTL6B和/或PBRM1中的一个或多个。更优选地，突变或缺陷的BAF-复合体基因选自ARID1A、ARID1B、ARID2、SMARCA2、SMARCA4和SMARCB1中的一个或多个，且更优选地，突变或缺陷的BAF-复合体基因是ARID1A。

在一些实施方案中，BAF缺陷型癌症的特征在于ARID1A中的一个或多个突变、缺陷和/或不存在。

另一方面，本发明提供了一种测定，其包括：

在从患有癌症的个体获得的生物样品中测量或定量在选自以下的一个或多个BAF-复合体基因中的突变或缺陷：ARID1A、ARID1B、ARID2、SMARCA2、SMARCA4、SMARCB1、SMARCC2、SMARCC1、SMARCD1、SMARCD2、SMARCD3、SMARCE1、ACTL6A、ACTL6B和/或PBRM1中的一个或多个；以及

将一个或多个BAF-复合体基因的测量或定量出的量与参照值相比较，并且如果一个或多个BAF-复合体基因相对于参照值有突变或缺陷，那么将个体鉴别为具有以下增加的概率：对共济失调-毛细血管扩张突变的和Rad3-相关的蛋白激酶(ATR)抑制剂的治疗有反应。

另一方面，本发明提供了一种测定，其包括：

在从患有滑膜肉瘤的个体获得的生物样品中测量或定量在选自SSX1、SSX2和/或SS18的一个或多个基因中的突变或缺陷；以及

将选自SSX1、SSX2和/或SS18的一个或多个基因的测量或定量出的量与参照值相比较，并且如果一个或多个BAF-复合体基因相对于参照值有突变或缺陷，那么将个体鉴别为具有以下增加的概率：对共济失调-毛细血管扩张突变的和Rad3-相关的蛋白激酶(ATR)抑制剂的治疗有反应。

筛选ATR抑制剂的方法

本发明还包括筛选方法，其采用ATR作为蛋白质靶标用于筛选候选化合物，以发现ATR抑制剂。因此，可进行用于鉴别候选试剂的筛选方法，所述候选试剂能够抑制ATR，以便后续用于开发供治疗BAF-复合体基因突变型或缺陷型癌症或治疗滑膜肉瘤之用的试剂。适宜地，这可在测定缓冲液中完成以帮助测定的组分相互作用，并且呈多孔形式以测试多种候选试剂。然后可在一种或多种候选化合物的存在和不存在下测定ATR的活性，以确定给定的候选物是否为ATR抑制剂。

举例来说，候选试剂可为本文所公开的一种蛋白质靶标的已知抑制剂、抗体、肽、核酸分子或有机或无机化合物，例如，分子量小于100Da。在一些情况下，使用化合物候选试剂是优选的。然而，对于任何类型的候选试剂，组合文库技术提供一种测试潜在巨大数量的不同物质调节靶蛋白质活性的能力的有效方法。这种文库及其用途是本领域中已知的。本发明还特别设想了筛选已知用于治疗其它病状且尤其治疗其它形式的癌症的候选试剂。这样做的优点在于：已知治疗剂的患者或疾病谱可使用本文所公开的筛选技术来扩大或修改；或对于开发中的治疗剂，建立与治疗BAF-复合体基因突变型或缺陷型癌症相关的患者或疾病谱。

在鉴别候选试剂用于进一步研究之后，可对所讨论的试剂进行测试以便确定其是否不会使正常细胞致死或另外适于治疗用途。这些研究之后，试剂可在药剂、药物组合物或剂型的制备中制造和/或使用。

在下列情况时，在筛选测定中前导试剂或化合物从最初符合开始的开发较为理想：当所讨论的试剂较难获得或成本较高时，或者所述试剂不适合某种特定的施用方法时，例如，肽是不适于口服组合物的活性剂，因为它们在消化道中很快被蛋白酶降解。模拟物的设计、合成和测试通常可用来避免对大量分子的目标特性进行随机筛选。

在从具有给定目标特性的化合物设计模拟物的过程中通常采用几个步骤。首先，确定化合物中在目标特性的决定中关键和/或重要的具体部分。在肽的情况下，这可通过系统地改变肽中的氨基酸残基完成，例如通过依次取代每个残基。已知构成化合物活性区域的这些部分或残基是它的“药效基团”。

一旦发现药效基团，使用一系列来源的数据，例如分光镜技术、X射线衍射数据和NMR，根据其物理特性，例如立体化学、成键、大小和/或电荷模拟它的结构。计算分析、相似性作图(其模拟药效基团的电荷和/或体积，而不是原子之间的成键)及其它技术可用于此模拟过程。在此方法的改进方案中，模拟了配体及其结合配偶体的三维结构。这在配体和/或结合配偶体在结合时改变构象的情况下尤其有用，允许模型在模拟物的设计中考虑到这点。

然后选择可以将模拟药效基团的化学基团移植于其上的模板分子。可以便利地选择模板分子及移植于其上的化学基团以使模拟物在保留前导化合物生物活性的同时还易于合成、可能呈药学上可接受的,并在体内不降解。通过此种途径发现的模拟物可经筛选以观察其是否具有目标特性或体现目标特性的程度。然后经过进一步的优化或修饰以找到一个或多个最终模拟物，用于体内或临床测试。

药物组合物

本文中用于治疗BAF缺陷型癌症的活性剂可单独施用，但通常最好在药物组合物中提供它们，所述药物组合物还包含一种或多种药学上可接受的载体、佐剂、赋形剂、稀释剂、填充剂、缓冲剂、稳定剂、防腐剂、润滑剂或本领域技术人员所熟知的其它材料及任选其它治疗剂或预防剂。药物组合物的组分的实例提供于Remington’s PharmaceuticalSciences,第20版,2000,pub.Lippincott,Williams&Wilkins中。

这些化合物或其衍生物可在本发明中用于治疗BAF缺陷型癌症。如本文所用，治疗剂的“衍生物”包括盐、配位复合物、酯如体内可水解的酯、游离酸或碱、水合物、前药或脂质、偶联配偶体。

本发明化合物的盐优选在生理上充分耐受且是无毒的。盐的许多实例为本领域技术人员所知。具有酸性基团如磷酸根或硫酸根的化合物可以与碱金属或碱土金属如Na、K、Mg和Ca，以及与有机胺如三乙胺和三(2-羟乙基)胺形成盐。可在具有碱性基团(例如胺)的化合物与无机酸如盐酸、磷酸或硫酸；或有机酸如乙酸、柠檬酸、安息香酸、富马酸或酒石酸之间形成盐。具有酸性和碱性基团的化合物可形成内盐。

可以使用本领域中公知的技术在化合物中存在的羟基或羧基与适当的羧酸或醇反应配偶体之间形成酯。

衍生物包括化合物的前药，其可在体内或体外转化为母体化合物中的一种。典型地，化合物的至少一种生物活性在化合物的前药形式中将降低，并且可通过转化前药以释放化合物或其代谢物而被激活。

其它衍生物包括化合物的偶联配偶体，其中化合物例如通过以化学方式偶联到化合物上或以物理方式与其结合而连接到偶联配偶体上。偶联配偶体的实例包括标记或报道分子、支撑底物、载体或转运分子、效应分子、药物、抗体或抑制剂。偶联配偶体可经由化合物上的适当官能团(如羟基、羧基或氨基)共价连接到本发明化合物上。其它衍生物包括用脂质体配制化合物。

如本文所用的术语“药学上可接受的”包括在合理的医学判断范围内，适用于与受试者(例如人类)的组织接触而无过度毒性、刺激性、过敏响应或其它问题或并发症，与合理的利益/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。每个载体、赋形剂等必须在与制剂的其它成分相容的意义上是“可接受的”。

用于根据本发明治疗BAF缺陷型癌症的本文所公开的活性剂优选以“预防有效量”或“治疗有效量”(视情况而定，有时预防也可以看作是治疗)施用于个体，这些量足以显示对个体的益处。实际施用量和施用速度和时程将取决于所治疗疾病的性质和严重性。治疗处方，例如剂量的确定等属于全科医师和其他医师的职责，并且通常要考虑所治疗的病症、个体患者的状况、递送部位、施用方法及执业医生已知的其它因素。以上提及的技术和方案的实例可见于Remington’s Pharmaceutical Sciences,第20版,2000,Lippincott,Williams&Wilkins中。组合物可单独或以与其它治疗组合形式同时或依次施用，这取决于所治疗的病状。

便利地，制剂可以单位剂型存在并且可通过药学领域众所周知的任何方法制备。这种方法包括使活性化合物与可构成一种或多种辅助成分的载体相结合的步骤。一般说来，制剂通过将活性化合物与液体载体或细分散的固体载体或这两者均匀并亲密地结合，然后必要时使产物成型来制备。

本文所公开的用于治疗BAF缺陷型癌症的试剂可通过任何方便的施用途径向受试者施用，不管是全身/外周地抑或在所需作用位点处，施用途径包括但不限于经口(例如，通过摄取)；局部的(包括例如经皮、鼻内、眼部、颊内和舌下)；肺(例如，通过吸入或吹入疗法，使用例如气溶胶，例如经由口或鼻)；直肠；阴道；胃肠外，例如通过注射，包括皮下、皮内、肌内、静脉内、动脉内、心内、鞘内、脊柱内、囊内、包膜下、眶内、腹膜内、气管内、表皮下、关节内、蛛网膜下和胸骨内；通过贮库的植入，例如，皮下或肌内。

适于经口施用(例如通过摄取)的制剂可作为以下形式存在：离散单元，如胶囊剂、扁囊剂或片剂，每个含有预定量的活性化合物；粉剂或颗粒剂；在水性液体或非水性液体中的溶液或混悬液；或水包油液体乳液或油包水液体乳液；团注剂；干药糖剂；或糊剂。

适于胃肠外施用(例如，通过注射，包括皮肤、皮下、肌内、静脉内和皮内)的制剂包括水性和非水性等渗、无热原的无菌注射溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、防腐剂、稳定剂、抑菌剂和致使制剂与预期接受者的血液等渗的溶质；以及水性和非水性无菌混悬液，其可包括悬浮剂和增稠剂、和脂质体或经设计以使化合物靶向血液组分或一个或多个器官的其它微粒系统。适用于这类制剂中的等渗媒介物的实例包括氯化钠注射液、林格氏溶液或林格氏乳酸注射液。典型地，活性化合物在溶液中的浓度为约1ng/ml至约10mg/ml，例如约10ng/ml至约1mg/ml。制剂可存在于单位剂量或多剂量密封容器中，例如安瓿和小瓶，并且可保存在冷冻干燥(冻干)条件下，仅需要添加无菌液体载体，例如注射用水，在使用之前立即添加。临时注射溶液和混悬液可从无菌粉剂、颗粒剂和片剂来制备。制剂可呈脂质体或其它微粒系统的形式，其被设计以使活性化合物靶向血液组分或一个或多个器官。

包含本文所公开的用于治疗BAF-复合体基因突变型或缺陷型癌症的试剂的组合物可在本文所述的方法中与标准化疗方案组合或与放射疗法结合使用。其它化疗剂的实例包括安吖啶(Amsidine)、博来霉素、白消安、卡培他滨(Xeloda)、卡铂、卡莫司汀(BCNU)、氮芥苯丁酸(Leukeran)、顺铂、克拉屈滨(Leustat)、氯法拉滨(Evoltra)、Crisantaspase(Erwinase)、环磷酰胺、阿糖胞苷(ARA-C)、氮烯唑胺(DTIC)、更生霉素(放线菌素D)、柔红霉素、多西他赛(泰索帝)、阿霉素、表柔比星、依托泊苷(Vepesid，VP-16)、氟达拉滨(Fludara)、氟尿嘧啶(5-FU)、吉西他滨(Gemzar)、羟基脲(羟基尿素，Hydrea)、伊达比星(Zavedos)、异环磷酰胺(Mitoxana)、依立替康(CPT-11，Campto)、甲酰四氢叶酸(亚叶酸)、脂质体阿霉素(Caelyx，Myocet)、脂质体柔红霉素洛莫司汀、美法仑、巯基嘌呤、美司钠(Mesna)、氨甲蝶呤、丝裂霉素、米托蒽醌、奥沙利铂(Eloxatin)、紫杉醇(紫杉酚)、培美曲塞(Alimta)、喷司他丁(Nipent)、甲基苄肼、雷替曲塞链脲霉素替加氟尿嘧啶(Uftoral)、替莫唑胺(Temodal)、替尼泊苷(Vumon)、硫替派、硫鸟嘌呤(6-TG)(Lanvis)、拓扑替康(Hycamtin)、苏消安、长春花碱(Velbe)、长春新碱(Oncovin)、长春地辛(Eldisine)或长春瑞滨(诺维本)、或PARP抑制剂(奥拉帕尼(Lynparza)、鲁卡帕尼、尼拉帕尼、维利帕尼和Talazoparib)。

在整个治疗过程中，体内施用可以一个剂量连续或间断地(例如，以分开的剂量，以适宜的间隔)进行。确定最有效的施用方式和剂量的方法是本领域技术人员公知的，并随着治疗所用的制剂、治疗的目的、所治疗的靶细胞以及所治疗的受试者而改变。单次或多次施用可按主治医师选择的剂量水平和模式进行。

通常，活性化合物的合适剂量范围为每公斤受试者体重每天约100mg至约250mg。当活性化合物为盐、酯、前药等时，基于母体化合物计算所施用的量，且因此有待使用的实际重量成比例地增加。

实验实施例

实施例1

方法

细胞培养

ES2和TOV21G由美国典型培养物保藏中心(American Type Tissue Collection)获得。RMG-1、SMOV2、KOC7C、HCH1、OVAS、OVISE、OVMANA、OVTOKO、OVSAYO和KK由HiroakiItamochi博士(Tottori University School of Medicine,Yonago,Japan)赠送。使卵巢透明细胞癌系在具有10％FCS的McCoys中生长。细胞系的身份在2013年3月使用StemElite试剂盒(Promega)通过短同向重复序列(STR)分型证实。ARID1A HCT116等基因细胞系由Horizon Discovery获得并生长在具有10％FCS的McCoys中。Arid1a无效和野生型小鼠胚胎干细胞从Zhong Wang博士(Harvard Medical School,USA)处获得并且在明胶包被的板上生长于具有10％FCS的DMEM中，其中补充有0.1mM NEAA、1mM丙酮酸钠、0.1mMβ巯基乙醇和2000U LIF/ml。

VE-821 siRNA筛选

siRNA文库购自Dharmacon。如正文中所述来选择基因。各孔含有靶向靶转录物的不同序列的四种截然不同的siRNA物质的SMART汇集物。每个板补充有阴性siCONTROL(12个孔；Dharmacon)和阳性对照(4个孔，siPLK1，Dharmacon)。将RNAi筛选条件优化并且如先前21所述生成原始CellTitre-Glo(Promega)发光存活力读数。在转染之后24小时以1μM的浓度添加VE-821或媒介物(DMSO)于培养基中并使细胞暴露持续5天。如[21]中所述进行siRNA筛选的统计分析

化学品

ATR抑制剂VE-821和VX-970由Vertex Pharmaceuticals提供。奥拉帕尼和BMN673购自Selleck Chemicals；顺铂购自Sigma。

蛋白质印迹和抗体

全细胞蛋白质提取物由在补充有蛋白酶抑制剂混合物片剂(Roche,West Sussex,UK)的NET-N缓冲液(20mM Tris pH 7.6、1mM EDTA、1％NP40、150mM NaCl)中裂解的细胞制备。用预制Bis-Tris凝胶(Invitrogen,Paisley,UK)进行蛋白质印迹。将以下一级抗体用于此研究中；ARID1A(Cell Signalling)、ARID1B(Cell Signalling)、SMARCA4(CellSignalling)、ATR(Santa Cruz)、PT1989 ATR(Gene Tex)、微管蛋白(Sigma)、SMARCB1(Abcam)、γH2AX(Cell Signalling)、PARP-1(Santa Cruz)、埃兹蛋白(Cell Signalling)、TOP2A(Cell Signalling)、细胞周期蛋白B1(Cell Signalling)、核纤层蛋白A/C(CellSignalling)、ARID2(Abcam)和PBRM1(Cell Signalling)。

细胞存活力测定

短期存活测定是在384孔板中进行的。将指数生长的细胞以500个细胞/孔的浓度铺板。在接种之后24h添加药物并且将细胞连续暴露于药物持续五天，之后使用CellTitre-Glo发光(Promega)评估细胞存活力。对于克隆发生测定，将细胞接种于6孔板(500个细胞/孔)中并在接种14天之后连续暴露于药物24h。每72小时更换含有新鲜药物的培养基。将细胞用10％三氯乙酸固定并用磺酰罗丹明B(Sigma-Aldrich,Gillingham,UK)染色。对菌落手动计数。至少一式三份地进行所有基于细胞的测定。

细胞周期分析解连环

将细胞以2x 105个细胞/孔的密度铺板于6孔板上并孵育24小时，之后添加ATRi或0.1％DMSO持续指定的时间段。孵育之后，收集粘附细胞，然后用磷酸盐缓冲盐水(PBS)中冷的50(v/v)％乙醇固定。接着用RNA酶A处理细胞30分钟，之后用碘化丙啶(PI,Sigma)进行核酸染色。使用BD FACSDiva软件(BD Biosciences)，在BD LSR II流式细胞仪上分析样品。对于同步实验，将细胞用2mM胸苷孵育12小时，洗涤并用培养基孵育16小时，接着在2mM胸苷中再孵育12小时。然后将细胞释放到含有VX-970或DMSO的培养基中并且如上固定样品以用于细胞周期分析。

p-H3测定解连环

实验处理之后，使用冷50％乙醇和PBS固定细胞。分析之前，将细胞离心并且再悬浮于Triton-X100在PBS中的1mL 0.25％(v/v)溶液中15分钟。离心之后，将细胞再悬浮于含有1％(w/v)BSA和0.75μg P-S10组蛋白H3抗体(Jackson ImmunoResearch)的100μL PBS溶液中。在室温下孵育样品3小时。然后将样品离心并用含有1％BSA的PBS溶液洗涤。随后将细胞悬浮于100μL的以1:30稀释于具有1％BSA的PBS中的FITC标记的山羊抗兔二级抗体(Jackson ImmunoResearch)中。将样品在黑暗中孵育30分钟并且再悬浮于含有PI(5μg/mL)和RNA酶(1mg/mL)的PBS溶液中。使用BD FACSDiva软件(BD Biosciences)，在BD LSR II流式细胞仪上分析样品。

细胞凋亡测定

将HCT116等基因和OCCC细胞以高密度(15-20,000个/孔)铺板于96孔板中。24小时后，添加VX-970的连续稀释液持续指定的时间段。根据制造方案进行ApoTox-Glo^TM TriplexAssay(Promega)。

体内功效研究

使用HCT116ARID1A^+/+、HCT116ARID1A^-/-和TOV21G细胞进行体内功效研究，这些细胞被皮下地注射于雌性CD-1裸小鼠的胁腹中。将动物通过口服管饲法用单独的媒介物(10％D-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯)或VX-970(60mg/kg，于10％D-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯中)处理。每周四次施用处理，持续指定的时间长度。通过卡尺每周两次(twice)手动地测量肿瘤并且当肿瘤在任何方向上达到>15mm时便将动物处死。

后期桥分析

使细胞在聚赖氨酸包被的盖玻片上生长24小时，之后暴露于指定的处理剂。将样品固定于甲醛(4％)中，于Triton X-100(0.2％)中透化并用DAPI进行DNA染色。然后在Leica共焦显微镜上以60倍对载玻片成像。

有丝分裂铺展物

在暴露于指定处理剂之后，将细胞用0.5％秋水仙碱孵育4小时。将细胞收集，于PBS中洗涤并在37C下于0.56％KCl中孵育20分钟。然后固定样品(3甲醇:1乙酸)并添加DAPI。将细胞溶液滴于清洁的盖玻片上并且在Leica共焦显微镜上以60倍对有丝分裂铺展物成像。

结果

遗传筛选鉴别ARID1A作为ATRi合成致死配偶体

为了揭示单试剂ATRi响应的临床上可行的遗传定子，进行一系列高通量RNAi化学敏化筛选，其中将细胞用siRNA文库转染，然后暴露于高度有效的和选择性的ATR催化抑制剂VE-821(Ki＝13nM；15)。基于以下研究选择作为用于筛选的细胞系的p53突变型、三阴性(ERα-、PR-、ERBB2-ve)乳腺肿瘤细胞系HCC1143，该研究表明ATR抑制剂可在p53突变癌症中显示一些效用。为了模拟ATRi对正常细胞的效应，还筛选了非肿瘤的乳腺上皮细胞模型MCF12A。这通过评估顺铂诱导的ATR p.T1989自磷酸化证实了，两种细胞系都保留了功能性ATR激活途径^16,17。为了鉴别临床上可行的效应，RNAi文库包括1280个siRNA，它们靶向癌症中复发突变的基因¹⁸、激酶(由于其作为药物靶标的固有易处理性)及DNA损伤响应基因¹⁹，鉴于ATR抑制剂增强这些过程中的缺陷的潜力^7,20。使用siRNA文库将HCC1143和MCF12A细胞在384孔板格式中转染，然后暴露于VE-821(1μM)或媒介物(DMSO)持续随后的四天，此时使用Cell Titre Glo试剂(Promega)估计细胞存活力(图1A)。

将来自一式三份筛选的数据用于计算描述每个siRNA对VE-821敏化21的效应的Z评分，并且在HCC1143中鉴别出150种显著的(Z<-2)VE-821敏感性引起的效应且在MCF12A中鉴别出179种(图1B、C)。ATR siRNA引起显著的VE-821敏化，如同靶向其它ATR激活因子(RAD17、RAD1、RAD9A)的siRNA一样。靶向ERCC4和ATM的siRNA也使细胞对VE-821敏化，与ATRi合成致死一致，从而给予筛选结果以置信度。

为了鉴别在不同遗传背景下操作的ATRi合成致死效应，对HCC1143与MCF12A数据进行比较并且鉴别引起VE-821敏感性的30个共同的siRNA，包括以下的那些靶向组分：HR/范科尼贫血(Fanconi Anemia)途径(FANCE、SLX4、PALB2)、DNA错配修复(MSH4、PMS2)和跨损伤合成(RAD18)途径(图1C)。我们还鉴别了在此清单中的七个肿瘤抑制子基因(ATM、FANCE、GCP3、IDH1、PALB2、PMS2、ARID1A；图1C、D)。沉默ARID1A使细胞对ATRi敏化的观察结果尤其是有趣的，因为ARID1A在多种肿瘤类型中复发突变(45％卵巢透明细胞癌、14-19％胃、膀胱和肝细胞肿瘤以及2-3％乳腺肿瘤¹³)且目前对于ARID1A突变型肿瘤没有可用的经许可的靶向疗法。

使用许多正交方法证实了ARID1A/ATRi合成致死性相互作用。在HCC1143细胞中，siRNA SMARTPool降低了ARID1A蛋白质水平并且显著地提高对VE-821的敏感性(p<0.0001，ANOVA，图1E、F)，如同单独的ARID1A siRNA一样。ARID1A siRNA还引起对目前正在1期试验中评估的ATRi(即VX-970)的敏感性(图2A)，表明合成致死对VE-821没有特异性。为了评估ARID1A功能的组成型丧失是否也引起ATRi敏感性，利用含有野生型ARID1A(ARID1A^+/+)或纯合突变型功能丧失ARID1A等位基因(p.Q456*/p.Q456*；称为ARID1A^-/-；图2B)的人类结肠直肠HCT116等基因细胞。在克隆发生存活测定中，与ARID1A^+/+相比，ATRi暴露显著地减少ARID1A^-/-细胞的存活(p<0.0001，通过ANOVA，图2C-E)。这些观察结果似乎没有反映出ARID1A^-/-细胞对靶向疗法的普遍的、非特异性的敏感性，因为紫杉酚或氨甲蝶呤都没有引发ARID1A^-/-选择性。在HCT116ARID1A^-/-模型中ARID1A合成致死的观察结果不仅证实了介于ARID1A与ATR抑制之间的合成致死相互作用，而且确定了所述效应不局限于来自乳腺谱系的细胞。还评估了ATRi在肿瘤细胞系的遗传学和组织学上不同组中的敏感性，观察到具有功能丧失ARID1A突变的那些(n＝9)作为一个组比无ARID1A突变的那些对VX-970显著更敏感(n＝15，p＝0.005，学生t检验，图2F)。如果不大于在ATRi敏感性的其它候选生物标记如ATM或ERCC1下所见的，那么与ARID1A突变型细胞有关的ATRi敏感性的量级是相当的。

此外，发现VX-970的ARID1A^-/-选择性对于其它提出的ARID1A靶向剂如PARP抑制剂(PARPi)或顺铂来说更大^22,23。为了弄清ATR/ARID1A合成致死相互作用是否是种特异性的，对等基因Arid1a^+/+和Arid1a^-/-小鼠胚胎干(ES)细胞进行研究²⁴。在克隆发生测定中，VX-970和VE-821都选择性地靶向Arid1a^-/-ES细胞(p<0.001，ANOVA，图2G、H)。最终，为了弄清ARID1A/ATRi合成致死可能对ATR的催化抑制有特异性的可能性，在86种人类肿瘤细胞系中生成siRNA敏感性数据(²⁵及Campbell等人，审查中的手稿)。观察到与ARID1A野生型肿瘤细胞相比(n＝65)，ATR siRNA对ARID1A突变型肿瘤细胞(n＝21)具有显著更大的生长抑制作用(p＝0.0084，MP检验，图2I)。为了证实这点，在HCT116ARID1A^-/-和ARID1A^+/+细胞中通过siRNA使ATR沉默，并且发现ATR siRNA选择性地靶向ARID1A^-/-细胞(p<0.05，学生t检验)。总的来说，这些数据表明通过化学抑制或基因沉默实现的ATR功能的消除在ARID1A缺陷下是合成致死的。

体内ATR/ARID1A合成致死

评估了在临床试验中评估的ATRi(VX-970)是否显示针对ARID1A缺陷型肿瘤的体内功效。使用具有建立的HCT116ARID1A^+/+或ARID1A^-/-皮下异种移植物的小鼠(图3A)，发现VX-970对ARID1A^+/+异种移植物没有影响(p＝0.43，ANOVA)，但显著地抑制ARID1A^-/-异种移植物的生长(p＝0.05，ATR/BAF合成致死9 ANOVA，图3B)。还在独立实验中发现，VX-970可防止HCT116 ARID1A^-/-异种移植物(ARID1A^-/-肿瘤形成频率＝27％(对于VX-970处理的小鼠)对比73％(媒介物处理的小鼠)，p＝0.027费希尔精确检验)的建立，但对ARID1A^+/+异种移植物的发生率没有影响(分别为80％对比87％，p＝1费希尔精确检验，图3C、D)。在此实验中，持续的VX-970处理还显著减缓ARID1A^-/-肿瘤的生长(p＝0.015，ANOVA)，但没有减小ARID1A^+/+异种移植物(p＝0.63，ANOVA，图3E、F)。

最终，评估了VX-970在具有天然存在的ARID1A突变的肿瘤细胞系异种移植物中的体内功效。在体外研究中，发现ARID1A缺陷型TOV21G人卵巢透明细胞癌(OCCC)细胞系(ARID1A p.548fs/p.756fs)与ARID1A野生型OCCC细胞系RMG1相比对VE-821和VX-970更敏感(图3G，p<0.005，AVOVA)并且还展现在ATRi暴露之后的DNA损伤和细胞凋亡响应(图3H、I)。在体内，VX-970处理与媒介物相比显著地抑制已建立的TOV21G肿瘤的生长(p＝0.014，ANOVA，图3J-L)，再次表明ARID1A/ATR合成致死可在使用ATR抑制的情况下在体内被利用。

ATR抑制靶向ARID1A缺陷型细胞中的DNA解连环缺陷

响应于复制叉应激，ATR活性引发在S内和G2/M检查点处的细胞周期停滞²⁶。检验了以下假设：ARID1A缺陷型细胞对ATRi的敏感性可部分归因于对这些检查点的依赖的增加。为了研究这个，使用双重胸苷阻断使ARID1A等基因细胞在G1/S处同步，然后监测细胞周期释放之后的时间细胞周期进程。ARID1A^+/+和ARID1A^-/-细胞都以相似的速率进展通过S期，7小时后在G2/M处达到峰值(图4A)。然而，当在G2/M处的ARID1A^+/+细胞的比例在同步化后7-10小时之间迅速地下降时，ARID1A^-/-细胞具有通过G2/M的延迟进展；释放之后10小时，25％的ARID1A^-/-细胞保持在G2/M，相比之下，在ARID1A^+/+中仅有11％(图4A)。为了直接评估G2/M转变，通过借助于FACS评估磷酸-Ser10组蛋白H3阳性细胞的比例来监测有丝分裂进入，注意到对比ARID1A^+/+，在ARID1A^-/-细胞中有50％的有丝分裂进入减少(图4B)。检查有丝分裂细胞周期蛋白B1的亚细胞定位，其在应激状态下穿梭至胞质，由此阻断有丝分裂进入²⁷。观察到与ARID1A^+/+细胞相比，在ARID1A^-/-细胞中更高的胞质细胞周期蛋白B1水平，与G2/M检查点增加的接合一致(图4C)。这表明ARID1A的组成型和诱发的丧失都引起细胞周期进展通过G2/M的延迟。

G2/M细胞周期检查点可由各种细胞应激激活，所述细胞应激包括完全染色体解连环的失效，即由拓扑异构酶IIa(TOP2A)介导的过程²⁸。最近，已显示BAF-复合体为TOP2A定位至染色质所需的²⁹。在具有BAF-复合体缺陷的小鼠细胞中，受损的TOP2A定位引起DNA解连环中的缺陷²⁹。通过评估后期桥的频率(即延迟解连环的结果)可以确定DNA解连环缺陷是否也可能存在于ARID1A缺陷型细胞中。与ARID1A^+/+细胞相比，ARID1A^-/-细胞展现后期桥数量的显著增加(p＝0.038，学生t检验，图4D、E)。还注意到与ARID1A^+/+细胞相比，ARID1A^-/-细胞展现降低水平的染色质结合的TOP2A，如同其中ARID1A表达已被siRNA沉默的细胞一样(图4F、G)。在一组OCCC细胞系中，还发现具有ARID1A突变的那些与ARID1A野生型细胞相比展现染色质结合的TOP2A的减少(图4H)。这些观察结果表明ARID1A缺陷型人类肿瘤细胞在TOP2A介导的染色体解连环中有缺陷。

ATR参与不能使染色体完全解连环之后的G2/M检查点的起始^27,30。由此得出以下假设：ATR的抑制可能解除由ARID1A缺陷型细胞中的解连环缺陷所引起的G2/M检查点，并且这可能促进合成致死。通过评估同步化细胞的细胞周期进展，发现VX-970消除了先前在ARID1A^-/-细胞中所见的G2/M延迟(图5A)。G2/M检查点的ATRi-诱导的消除还提高后期桥在ARID1A^-/-HCT116细胞(p＝0.023，学生t检验，图5B)和ARID1A无效TOV21G细胞(p＝0.006，学生t检验，图5C)中的频率，大概是因为由ATR抑制所引起的增强的通过G2/M的转变限制了使姐妹染色单体有效解连环的能力。

为了评估这些事件对基因组完整性的影响，检查了来自VX-970暴露的ARID1A等基因细胞的有丝分裂染色体。VX-970引发了ARID1A^-/-细胞中染色体畸变频率的显著增加(p＝0.0007，学生t检验，图5D、E)。另外，观察到通过VX-970的γH2AX诱导，即一种在ARID1A^-/-细胞中更明显的效应(图5F)。还在ARID1A缺陷型TOV21G细胞中观察到相似的γH2AX响应(图3B)。除这些效应之外，如通过与ARID1A^+/+细胞相比在ARID1A^-/-细胞中更高的半胱天冬酶-3/7激活(p<0.05，学生t检验，图5G)所示，VX-970暴露引起ARID1A选择性细胞凋亡响应，即也在TOV21G(ARID1A突变型OCCC)而不是RMG1(ARID1A野生型OCCC)细胞中观察到的效应(图3C)。还评估了通过测量PARP-裂解的细胞凋亡的诱导。喜树碱在ARID1A^-/-和ARID1A^+/+细胞中引发了相似水平的裂解，提示两种基因分型具有功能性细胞凋亡响应。相反，VX-970在ARID1A^-/-细胞中引起比ARID1A^+/+细胞中水平高得多的PARP-裂解(图5H)。

另外的BAF组分的失活使细胞对ATRi敏化

ARID1A是BAF复合体的一个组分。进行了鉴别另外的BAF组分是否展示与ATRi相似的合成致死相互作用的实验(图6A)。SMARCA4、ARID1B或SMARCB1的沉默个别地提高HCT116细胞对VX-970的敏感性(p<0.0001，ANOVA，图6B、C)。还发现TOV112D细胞，即具有功能丧失SMARCA4突变(p.L639fs*7)的OCCC细胞系，对ATRi比ARID1A和SMARCA4两者的OCCC细胞系野生型显著更敏感(图6D)。在HCC1143和HeLa细胞中，由SMARCA4沉默所引起的VX-970敏感性与由ARID1A siRNA所引起的相当(图6E)。还发现SMARCA4或ARID1B在HCT116细胞中的沉默显著地降低染色质结合的TOP2A水平(图6F)，重复了ARID1A功能障碍时所见的效应。这些结果表明ARID1A的典型功能，即其作为BAF复合体的一部分的作用，对于确定ATR抑制剂响应可能是关键的。

讨论

本发明所基于的数据提示ATR抑制剂可具有作为用于ARID1A缺陷型癌症和具有BAF复合体中的其它缺陷的那些疾病的单试剂治疗的潜力。ARID1A突变在人类癌症中的高度复发性质及临床ATR抑制剂的可用性提示，一旦1期临床试验完成，便可开始生物标记驱动的概念验证试验以评估这些试剂的功效。这些可在其中存在高频ARID1A突变的癌症类型中进行，如卵巢透明细胞癌，其中标准护理治疗响应也受到限制且几乎不存在靶向方法。还发现ARID1A缺陷在来自其它癌症组织(例如，乳腺癌和结肠直肠癌)的模型中引起ATR抑制剂敏感性，此方法也可能具有较宽的效用。同样，在另外的BAF肿瘤抑制子基因中的缺陷也引起对ATR抑制的敏感性的观察结果也可提示ATR抑制剂的较宽效用。最终，由于与鉴别合成致死效应相伴的挑战之一是辨别容易被另外的分子改变消除的那些与对这些效应有抗性的那些³¹，注意到ARID1A/ATR合成致死相互作用在多种细胞模型系统中运行且因此可能对另外的分子改变有适应性并且可适于临床评估。

从机理上看，本发明的数据为ARID1A/ATR抑制剂合成致死提出以下模型(图6G)：(i)ARID1A缺陷引起TOP2A染色质结合减少(图4F)；(ii)这造成了DNA解连环缺陷(图4D、E)，且因此，G2/M检查点激活(图4A、B、C)；(iii)经由ATRi消除此细胞周期检查点，迫使ARID1A缺陷型细胞进入具有连环的DNA的有丝分裂(图5A)；最终(iv)在胞质分裂期间连环的DNA的随后剪切导致DNA双链断裂、总染色体不稳定及细胞凋亡(图5D-H)。可能存在也促进此效应的其它额外机理。例如，ATR功能的降低还与ATRi敏感性的增加有关¹⁰并且ATR活性有可能解释了我们的观察结果。此机理还可提示以下可能性：可用ATRi靶向的其它解连环缺陷型癌症可能在ARID1A突变型细胞中受损，尽管我们在一系列ARID1A缺陷型肿瘤细胞中检测到稳健的ATR蛋白质表达和自身磷酸化。或者，利用端粒维持的ALT途径的细胞还对ATRi32敏感，并且这可能也有影响，尽管此处使用的模型都不是ALT阳性的。总的来说，ARID1A/ATR合成致死所针对的解连环缺陷似乎是这些观察结果所基于的最简单的机理并且还提示其它解连环缺陷型癌症可用ATRi靶向的可能性。

实施例2

更近来使用的一种鉴别癌症中的治疗靶标的方法是鉴别并利用遗传依赖性，如合成致死和基因成瘾效应，它们与特定的癌症驱动基因缺陷有关。例如，BRCA1或BRCA2肿瘤抑制子基因与小分子PARP抑制剂之间的合成致死相互作用提供了在治疗BRCA1/2突变型卵巢和前列腺癌中使用PARP抑制剂的理由(Lord,Tutt等人2015，Mateo,Carreira等人2015)。此特定的合成致死相互作用通过抑制DNA损伤响应(DDR)分子网络的组分PARP1来靶向肿瘤抑制子基因缺陷。在人类细胞中，如在低等生物体中，DDR由一系列重叠机制组成，这些机制在面对DNA损伤时保持基因组的完整性(Lord和Ashworth 2016)。在若干保守DDR途径中的关键要件之一是激酶ATR(共济失调毛细血管扩张和Rad3相关的)。ATR响应于在引起复制叉停滞(例如，复制型解旋酶与DNA聚合酶的解偶联)的条件下或在双链断裂(DSB)修复期间在细胞中积聚的单链DNA(ssDNA)而被激活(Nam和Cortez 2011)。在这些情况下，ssDNA被人复制蛋白A(RPA)结合，所述RPA募集ATR和ATR相互作用蛋白(ATRIP)，而ATRIP又促进ATR激活。活性ATR使包括p53、组蛋白H2AX和CHK1激酶在内的多个底物蛋白上的丝氨酸/苏氨酸残基磷酸化。经由这些靶蛋白，ATR促进S期中的细胞周期停滞及已停滞的复制叉的稳定化。这些事件允许在细胞继续到G2和有丝分裂之前DNA损伤的修复。ATR因此是在引起复制型应激及其它形式的DNA损伤的条件下维持基因组完整性的关键(Nam和Cortez 2011，Gaillard,Garcia-Muse等人2015)。

ATR在细胞周期和基因组完整性的维持中的重要性已经使人们对ATR抑制剂在癌症中的治疗潜力有了极大兴趣。目前，若干小分子ATR抑制剂已在I期临床试验的研究中(NCT02157792、NCT02223923)。这些药物成功的临床应用将需要鉴别最可能有响应的患者群，且在这点上，若干研究旨在鉴别ATR抑制剂敏感性的生物标记。类似于PARP抑制剂作为用于BRCA1/2突变型癌症的疗法的实例(Lord和Ashworth 2016)，已显示当与顺铂(Reaper,Griffiths等人2011，Pires,Olcina等人2012，Huntoon,Flatten等人2013，Josse,Martin等人2014)、ERCC1(Mohni,Kavanaugh等人2014)、XRCC1(Sultana,Abdel-Fatah等人2013)和ATM(Kwok,Davies等人2015，Kwok,Davies等人2015)组合时，合成致死相互作用在ATR与包括p53在内的若干DDR相关基因之间存在。虽然SS是经常用DNA损伤化疗治疗的疾病，但关于SS肿瘤细胞对DDR网络的要件的依赖性的内容知之甚少。

在此，我们着手通过在SS细胞系中进行一系列平行高通量的小干扰RNA(siRNA)筛选来鉴别用于SS的新型治疗靶标。使用此方法，鉴别了在SS细胞中对ATR的出乎意外的依赖性。此遗传依赖性不仅通过ATR基因的沉默而明显，而且重要的是可使用临床小分子ATR抑制剂而被利用和靶向。

结果

滑膜肉瘤肿瘤细胞系的RNA干扰图谱表征将ATR鉴别为候选遗传依赖性

为了鉴别滑膜肉瘤中的候选治疗靶标，在五种常用的SS肿瘤细胞系中进行大规模的RNA干扰筛选：HS-SY-II、ASKA、YAMOTO、CME1和SYO1(图7A)。选择这些肿瘤细胞系是因为它们在SS中具有两种最常见的融合物(SS18-SSX1或SS18-SSX2)中的一种并且易于在每个模型中在384孔板格式中进行高效率的siRNA转染(图7B中所示的实例)。在优化转染条件下，将每个肿瘤细胞系用384孔板排列的siRNA文库逆转染，所述文库经设计以靶向1600个基因，包括720个激酶和激酶相关基因、Wnt途径基因、DNA修复基因以及在人类癌症中复发性改变的基因(由Cancer Gene Census所定义)。基于其作为药物靶标的药理学易处理性来选择激酶，而选择Wnt相关基因是因为此分子途径参与滑液及其它软组织肉瘤的发病机制中(Vijayakumar,Liu等人2011，Barham,Frump等人2013，Trautmann,Sievers等人2013)。在siRNA转染以后，将细胞再连续培养五天，此时使用CellTiterGlo发光测定(Promega)估计细胞存活力。总的说来，针对每个细胞系进行三次复制物筛选并且将来自这些复制物的数据在最终分析中组合，为每个siRNA计算稳健的Z评分(参见方法)以估计其对肿瘤细胞存活力的影响。

为了鉴别可能对SS有特异性的遗传依赖性，将SS肿瘤细胞系中的siRNA Z评分与最近针对来自不同组的癌症组织型的117个肿瘤细胞系所述的蛋白激酶组siRNA Z评分概况相比较(Campbell,Ryan等人2016)。用以下筛选来强化这些数据：在40个另外的肿瘤细胞系中的另外的蛋白激酶组siRNA筛选、在74个肿瘤细胞系中的癌基因普查/DNA修复文库siRNA筛选以及在总共15个肿瘤细胞系中的Wnt途径siRNA筛选。在比较SS模型中的siRNA概况时，注意到一系列的候选SS遗传依赖性，包括与Wnt信号传导有关的那些(例如，Wnt配体Wnt7B和β连环蛋白(catenein)相互作用蛋白，BCL9L PMID：18627596，图7C)、可成药的从未存在于有丝分裂中-A(NIMA)家族成员PMID：23132929 NEK1、2和4以及DREAM复合体激酶DYRK1A(图7D)。先前已发现DYRK1A在骨肉瘤(OS)中的RB1(pRb)肿瘤抑制子缺陷下是合成致死的(Campbell,Ryan等人2016)。发现SS肿瘤细胞系对DYRK1A siRNA的敏感性与在RB1无效OS肿瘤细胞系中所见的具有相同尺度(图7D)。

还发现SS肿瘤细胞系对siRNA敏感，所述siRNA经设计以靶向DNA修复蛋白，包括共济失调毛细血管扩张和Rad3相关的(ATR)、ATR激活蛋白、RAD9A和RAD18以及通过同源重组的双链断裂修复所涉及的两种肿瘤抑制子蛋白BRCA1和BRCA2(图7E)。

滑膜肉瘤中的ATR基因依赖可用临床ATR抑制剂引发并且由SS18-SSX1和SS18-SSX2融合蛋白的表达引起

鉴别ATR为遗传依赖性出于以下许多原因而尤其有趣：(i)当比较来自不同癌症组织的肿瘤细胞系的ATR siRNA Z评分时，发现SS肿瘤细胞系是其中最敏感的并且以相对一致的方式反应(图8A)；(ii)虽然SS经常用DNA损伤化疗来治疗，但对于其对ATR抑制剂的敏感性却知之甚少，所述ATR抑制剂可利用DNA损伤响应(DDR)中的肿瘤特异性缺陷；(iii)ATR的小分子抑制剂如VX970和AZD6738最近已进入癌症治疗的1期临床试验(NCT02157792、NCT02223923)，提示此遗传依赖性是临床上可行的。

在验证实验中确认了SS肿瘤细胞系对siRNA的敏感性(图9A)之后，我们评估了五个SS肿瘤细胞系对临床ATR抑制剂(ATRi)VX970(Vertex Pharmaceuticals)的敏感性。与先前证实的ATRi抗性HCT116细胞PMID:27958275相比，所有五个SS肿瘤细胞系都对VX970很敏感(ANOVA p<0.0001)，每个展现SF50值≈0.1(引起50％细胞存活减少所需的浓度)(图7B)。当将SS肿瘤细胞系的敏感性与HFF1成纤维细胞和非肿瘤上皮MCF10A细胞相比时，也是这种情况(图9B)。先前证明了肿瘤抑制基因ARID1A中的缺陷引起ATRi敏感性(PMID:27958275)。发现当ARID1A的两个拷贝都由于基因靶向而变成功能障碍时，SS肿瘤细胞系与HCT116细胞对VX970同样敏感(图7C)。此外，当比较SS肿瘤细胞系与具有同ATRi敏感性有关的其它分子缺陷(即ATM基因缺陷)的那些细胞、具有ARID1A改变的那些细胞及具有EWS-FLI融合物(PMID:27577084)的尤因氏肉瘤肿瘤细胞的VX970敏感性时，SS肿瘤细胞系显示了与尤因氏肉瘤肿瘤细胞和具有ARID1A缺陷的肿瘤细胞中的那些相当的VX970敏感性(图7D，图9C)。在SS肿瘤细胞系中的这种对ATRi的一致体外敏感性不限于VX970并且还在包括以下的其它ATRi下观察到：临床ATRi AZD6738(AstraZeneca(Llona-Minguez,Hoglund等人2014))和工具箱抑制剂AZ20(AstraZeneca(Llona-Minguez,Hoglund等人2014))和VE821(VertexPharmaceuticals(Charrier,Durrant等人2011))(图9D、E)。此外，用VX970处理具有建立的患者来源的滑膜肉瘤异种移植物(PDX SA13412)的小鼠引起肿瘤生长抑制(ANOVA p<0.0001，图8E)和存活时间增加(对数秩Mantel p＝0.026，图8F)，提示这可能是值得进一步研究的效应。

虽然这些实验强烈地提示SS肿瘤细胞可对ATR抑制非常敏感，但没有正式地证实这些效应与SS18-SSX家族融合蛋白的表达有关。发现与包括HFF1成纤维细胞在内的许多细胞不同，HCT116细胞(ATRi抗性)能够耐受来自慢病毒构建体的SS18-SSX1或SS18-SSX2cDNA的表达。此外，SS18-SSX1或SS18-SSX2在HCT116细胞中的表达概括出与SS融合物基因表达有关的三个特征，即内源性SS18表达的适度减少、SWI/SNF组分SMARCB1水平的降低(两者可能都是由来自SWI/SNF BAF复合体的SS18和SMARCB1的置换引起)(Kadoch和Crabtree2013，Ito,Asano等人2015)及典型Wnt途径靶基因AXIN2的上调(图8G、H)。Kadoch和Crabtree最近已确定在SS18-SSX1融合蛋白的C端处的残基对来自SWI/SNF复合体的SMARCB1的置换是关健的(Kadoch和Crabtree 2013)。与全长SS18-SSX1或SS18-SSX2融合蛋白的表达相比，缺失了SSX1的最后八个残基(Δ71-78)的SS18-SSX1变型的表达没有引起SMARCB1水平的降低，也没有造成AXIN2mRNA的增加(图8G、H)。当评估表达SS18-SSX1、SS18-SSX2或Δ71-78的HCT116细胞的ATRi敏感性时，发现SS18-SSX1和SS18-SSX2都引起ATRi敏感性而不是Δ71-78的表达(图8I-K)的显著(ANOVA p<0.0001)提高，该效应也在间充质U20S骨肉瘤细胞中复现。

ATRi在SS肿瘤细胞中导致细胞凋亡和复制叉应激且以细胞周期蛋白E依赖性方式造成合成致死

在来源于癌的肿瘤细胞中的ATRi诱导的细胞毒性常常与复制叉应激的提高有关。发现暴露于ATRi的SS肿瘤细胞经历细胞凋亡(γH2AX)，即复制叉应激的生物标记(图10C-D)。为了正式评估复制叉应激，使用DNA纤维分析(Schwab和Niedzwiedz 2011)且发现在SYO1细胞中，VX970造成复制叉速度的明显减小(p<0.0001，图10E)，确认了γH2AX分析的结果。此外，发现SS18-SSX1在HCT116细胞中的表达单独引起复制叉速度的适度而显著的减小(p<0.0001,)，但这是通过添加VX970而增强的(图10F)，提示ATR抑制可能靶向由滑膜肉瘤融合物所引起的复制叉应激。与此假设一致，发现SS肿瘤细胞当暴露于VX970时在S期中停滞(图10G)。

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Wilson，B.G.and C.W.Roberts(2011).″SWI/SNF nucleosome remodellers andcancer.″Nat Rev Cancer 11(7)：481-492.

Claims (61)

1.一种共济失调-毛细血管扩张突变的和Rad3-相关的蛋白激酶抑制剂(ATRi)，其用于治疗患有癌症的个体的方法中，其中所述癌症在一个或多个BAF-复合体基因中有突变或缺陷。

2.一种共济失调-毛细血管扩张突变的和Rad3-相关的蛋白激酶抑制剂(ATRi)，其用于治疗患有癌症的个体的方法中，所述癌症在一个或多个BAF-复合体基因中有突变或缺陷，所述方法包括：

(a)在从所述个体获得的样品中确定所述癌症是否在一个或多个BAF-复合体基因中有突变或缺陷，和

(b)向其中所述癌症具有一个或多个BAF-复合体基因突变或缺陷的所述个体施用治疗有效量的ATR抑制剂。

3.根据权利要求1所述的用于治疗方法中的ATR抑制剂，其中所述癌症在选自以下的一个或多个BAF-复合体基因中有突变或缺陷：ARID1A、ARID1B、ARID2、SMARCA2、SMARCA4、SMARCB1、SMARCC2、SMARCC1、SMARCD1、SMARCD2、SMARCD3、SMARCE1、ACTL6A、ACTL6B和/或PBRM1。

4.根据权利要求1或权利要求2所述的用于治疗方法中的ATR抑制剂，其中所述突变或缺陷的BAF-复合体基因选自ARID1A、ARID1B、ARID2、SMARCA2、SMARCA4和SMARCB1中的一个或多个。

5.根据前述权利要求中任一项所述的用于治疗方法中的ATR抑制剂，其中所述癌症在一个或多个BAF-复合体基因中有突变或缺陷，所述BAF-复合体基因为ARID1A。

6.一种共济失调-毛细血管扩张突变的和Rad3-相关的蛋白激酶抑制剂(ATRi)，其用于治疗患有滑膜肉瘤的个体的方法中。

7.一种共济失调-毛细血管扩张突变的和Rad3-相关的蛋白激酶抑制剂(ATRi)，其用于治疗患有滑膜肉瘤的个体的方法中，所述滑膜肉瘤在一个或多个选自SSX1、SSX2或SS18的基因中有突变或缺陷，所述方法包括：

(a)在从所述个体获得的样品中确定所述癌症是否在一个或多个BAF-复合体基因中有突变或缺陷，和

(b)向其中所述癌症在一个或多个选自SSX1、SSX2和/或SS18的基因中有突变或缺陷的个体施用治疗有效量的ATR抑制剂。

8.根据权利要求5或权利要求6所述的用于治疗方法中的ATR抑制剂，其中所述突变或缺陷为易位缺陷、功能丧失突变或表达丧失突变。

9.根据权利要求1-4中任一项所述的用于治疗方法中的ATR抑制剂，其中所述BAF-复合体突变型或缺陷型癌症为滑膜肉瘤、卵巢透明细胞癌、结肠直肠癌、黑色素瘤、肺癌、肝细胞癌、胃癌、膀胱癌、血液恶性肿瘤、鳞状细胞癌、浆液性卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、成神经管细胞瘤、肾癌或神经胶质瘤。

10.根据前述权利要求中任一项所述的用于治疗方法中的ATR抑制剂，其中所述抑制剂为核酸抑制剂、抗体、小分子或肽。

11.根据权利要求9所述的用于治疗方法中的ATR抑制剂，其中所述抑制剂为AZ20、BEZ235(NVP-BEZ235，达托里昔布)、ETP-46464、VE-821、VE-822(VX-970)、AZD6738、NU6027、CP-466722、CGK733、KU-60019、KU-55933、五味子乙素或Mirin。

12.根据权利要求9所述的用于治疗方法中的ATR抑制剂，其中所述抑制剂为siRNA分子。

13.根据前述权利要求中任一项所述的用于治疗方法中的ATR抑制剂，其中用ATR抑制剂进行的治疗与一种或多种其它抗癌疗法组合。

14.根据权利要求12所述的用于治疗方法中的ATR抑制剂，其中用ATR抑制剂进行的治疗与一种或多种其它化疗剂联合使用。

15.根据权利要求9至13中任一项所述的用于治疗方法中的ATR抑制剂，其中用ATR抑制剂进行的治疗与放射疗法联合使用。

16.根据前述权利要求中任一项所述的用于治疗方法中的ATR抑制剂，其中确定所述个体是否患有在一个或多个BAF-复合体基因中有突变或缺陷的癌症的步骤包括测量从所述个体获得的样品中的一个或多个BAF-复合体基因的蛋白质表达以便确定所述一个或多个蛋白质是否有突变或缺陷。

17.根据权利要求15所述的用于治疗方法中的ATR抑制剂，其中测定一种或多种BAF-复合体蛋白质的表达的步骤包括以下一个或多个：使用免疫组织化学测定肿瘤样品中的BAF-复合体蛋白质表达，测定BAF-复合体蛋白质表达包括通过ELISA或蛋白质印迹测量细胞裂解物中的BAF-复合体蛋白质水平，和/或测定BAF-复合体蛋白质表达包括使用能够特异性地结合至BAF-复合体蛋白质或其片段的结合剂。

18.根据前述权利要求中任一项所述的用于治疗方法中的ATR抑制剂，其中确定所述个体是否患有在一个或多个BAF-复合体基因中有突变或缺陷的癌症的步骤对由以下中提取的基因组核酸进行：从肿瘤中获得的癌细胞样品、在血液中循环的癌细胞样品或在血液中循环的癌细胞核酸样品。

19.根据权利要求16所述的用于治疗方法中的ATR抑制剂，其中所述测定一个或多个BAF-复合体基因的表达的步骤包括由癌细胞样品中提取RNA并通过实时PCR和/或通过使用能够杂交至BAF-复合体基因RNA的探针测量表达。

20.根据权利要求18所述的用于治疗方法中的ATR抑制剂，其中所述探针固定在微阵列中。

21.根据前述权利要求中任一项所述的用于治疗方法中的ATR抑制剂，其中所述确定所述个体是否患有在一个或多个BAF-复合体基因中有缺陷的癌症的步骤包括通过从所述个体获得的样品的核型分析鉴别由染色体不稳定导致的基因丢失。

22.根据权利要求20所述的用于治疗方法中的ATR抑制剂，其中所述BAF-复合体基因为ARID1A，且ARID1A丢失由来自染色体1的至少1p36.11的丢失指示。

23.一种用共济失调-毛细血管扩张突变的和Rad3-相关的蛋白激酶抑制剂(ATRi)选择患有癌症的个体的方法，所述方法包括：

(a)在从所述个体获得的样品中确定所述癌症是否在一个或多个BAF-复合体基因中有突变或缺陷，和

(b)选择所述个体以便用所述ATR抑制剂治疗，其中所述癌症具有一个或多个BAF-复合体基因突变或缺陷；以及

(c)提供适于向所述个体施用的ATR抑制剂。

24.根据权利要求22所述的方法，其中所述方法还包括向所述个体施用治疗有效量的ATR抑制剂。

25.一种用共济失调-毛细血管扩张突变的和Rad3-相关的蛋白激酶抑制剂(ATRi)治疗患有癌症的个体的方法，所述方法包括：

(a)在从所述个体获得的样品中确定所述癌症是否在一个或多个BAF-复合体基因中有突变或缺陷，和

(b)选择所述个体以便用ATR抑制剂治疗，其中所述癌症具有一个或多个BAF-复合体基因突变或缺陷；以及

(c)提供适于向所述个体施用的ATR抑制剂；以及

(d)向所述个体施用治疗有效量的ATR抑制剂。

26.根据权利要求22至24中任一项所述的方法，其中所述癌症在选自以下的一个或多个BAF-复合体基因中有突变或缺陷：ARID1A、ARID1B、ARID2、SMARCA2、SMARCA4、SMARCB1、SMARCC2、SMARCC1、SMARCD1、SMARCD2、SMARCD3、SMARCE1、ACTL6A、ACTL6B和/或PBRM1。

27.根据权利要求22至25中任一项所述的方法，其中所述突变或缺陷的BAF-复合体基因选自ARID1A、ARID1B、ARID2、SMARCA2、SMARCA4和SMARCB1中的一个或多个。

28.根据权利要求22至26中任一项所述的方法，其中所述癌症在一个或多个BAF-复合体基因中有突变或缺陷，所述BAF-复合体基因为ARID1A。

29.一种选择患有滑膜肉瘤的个体以用共济失调-毛细血管扩张突变的和Rad3-相关的蛋白激酶抑制剂(ATRi)进行治疗的方法，所述方法包括：

(a)在从所述个体获得的样品中确定所述滑膜肉瘤是否在一个或多个选自SSX1、SSX2和/或SS18的基因中有突变或缺陷；和

(b)选择所述个体以用所述ATR抑制剂来治疗，其中所述滑膜肉瘤在所述一个或多个选自SSX1、SSX2和/或SS18的基因中具有一个或多个突变或缺陷；以及

(c)提供适于向所述个体施用的ATR抑制剂。

30.根据权利要求28所述的方法，其中所述方法还包括向所述个体施用治疗有效量的ATR抑制剂。

31.一种用于用共济失调-毛细血管扩张突变的和Rad3-相关的蛋白激酶抑制剂(ATRi)治疗患有滑膜肉瘤的个体的方法，所述方法包括：

(a)在从所述个体获得的样品中确定所述滑膜肉瘤是否在一个或多个选自SSX1、SSX2和/或SS18的基因中有突变或缺陷，和

(b)选择所述个体以用所述ATR抑制剂来治疗，其中所述滑膜肉瘤在所述一个或多个选自SSX1、SSX2和/或SS18的基因中具有一个或多个突变或缺陷；和

(c)提供适于向所述个体施用的ATR抑制剂；以及

(d)向所述个体施用治疗有效量的ATR抑制剂。

32.如权利要求28至30中任一项所述的方法，其中所述突变或缺陷为易位缺陷、功能丧失突变或表达丧失突变。

33.根据权利要求22至31中任一项所述的方法，其中所述BAF-复合体突变型或缺陷型癌症为滑膜肉瘤、卵巢透明细胞癌、结肠直肠癌、黑色素瘤、肺癌、肝细胞癌、胃癌、膀胱癌、血液恶性肿瘤、鳞状细胞癌、浆液性卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、成神经管细胞瘤、肾癌或神经胶质瘤。

34.根据权利要求22至32中任一项所述的方法，其中步骤(a)包括测试从所述个体获得的细胞样品以确定它们是否为BAF-复合体基因突变的或缺陷的，其包括测量从所述个体获得的样品中的一个或多个BAF-复合体基因的蛋白质表达以便确定所述蛋白质是否有突变或缺陷。

35.根据权利要求33所述的方法，其中所述测试从所述个体获得的细胞样品以确定它们是否为BAF-复合体基因突变的或缺陷的步骤包括以下一个或多个：使用免疫组织化学测定肿瘤样品中的BAF-复合体蛋白质表达，测定BAF-复合体蛋白质表达通过ELISA或蛋白质印迹测量细胞裂解物中的BAF-复合体蛋白质水平，和/或测定BAF-复合体蛋白质表达包括使用能够特异性地结合至BAF-复合体蛋白质或其片段的结合剂。

36.根据权利要求22至34中任一项所述的方法，其中步骤(a)包括测试从所述个体获得的细胞样品以确定它们是否为BAF-复合体基因突变的或缺陷的，其是对由以下中提取的基因组核酸进行的：从肿瘤中获得的癌细胞样品、在血液中循环的癌细胞样品或在血液中循环的癌细胞核酸样品。

37.根据权利要求35所述的方法，其中所述测试从所述个体获得的细胞样品以确定它们是否为BAF-复合体基因突变的或缺陷的步骤包括由癌细胞样品中提取RNA并通过实时PCR和/或通过使用能够杂交至BAF-复合体基因RNA的探针测量表达。

38.根据权利要求36所述的方法，其中所述探针固定在微阵列中。

39.根据权利要求34所述的方法，其中步骤(a)包括测试从所述个体获得的细胞样品以确定它们是否为BAF-复合体基因突变的或缺陷的，其包括由癌细胞样品中提取DNA并通过以下方法来鉴别突变的存在：直接测序、杂交至探针、限制性片段长度多态性(RFLP)分析、单链构象多态性(SSCP)、特异性等位基因的PCR扩增、通过PCR扩增DNA靶标然后进行微型测序测定、PCR期间的等位基因辨别、遗传位分析、焦磷酸测序、寡核苷酸连接测定、解链曲线分析、针对杂合性丢失(LOH)的测试或下一代测序技术。

40.根据权利要求22至38中任一项所述的方法，其中步骤(a)包括测试从所述个体获得的细胞样品以确定它们是否为BAF-复合体基因突变的或缺陷的，其包括通过从所述个体获得的样品的核型分析鉴别由染色体不稳定导致的基因丢失。

41.根据权利要求39所述的方法，其中所述BAF-复合体基因为ARID1A，且ARID1A丢失由来自染色体1的至少1p36.11的丢失指示。

42.根据权利要求22至40中任一项所述的方法，其中所述ATR抑制剂为核酸抑制剂、抗体、小分子或肽。

43.根据权利要求38所述的方法，其中所述抑制剂为AZ20、BEZ235(NVP-BEZ235，达托里昔布)、ETP-46464、VE-821、VE-822(VX-970)、AZD6738、NU6027、CP-466722、CGK733、KU-60019、KU-55933、五味子乙素或Mirin。

44.根据权利要求38所述的方法，其中所述抑制剂为siRNA分子。

45.根据权利要求22至40中任一项所述的方法，其中用ATR抑制剂进行的治疗与一种或多种其它抗癌疗法组合。

46.根据权利要求41所述的方法，其中用ATR抑制剂进行的治疗与一种或多种其它化疗剂联合使用。

47.根据权利要求41所述的方法，其中用ATR抑制剂进行的治疗与放射疗法联合使用。

48.根据权利要求1-9和12-21中任一项所述使用的ATRi或根据权利要求22-41和44-46中任一项所述的方法，其中所述ATRi由式A-I表示：

或其药学上可接受的盐，

其中：

R¹为具有0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-6元单环环芳基环或杂芳基环，其中所述单环环芳基环或杂芳基环任选地稠合至另一个环以形成具有0-6个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的8-10元双环环芳基环或杂芳基环；各R¹任选地被1-5个J¹基团取代；

R²为具有0-3个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-6元单环环芳基环或杂芳基环，其中所述单环环芳基环或杂芳基环任选地稠合至另一个环以形成具有0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的8-10元双环环芳基环或杂芳基环；各R²任选地被1-5个J²基团取代；

L为–C(O)NH–或–C(O)N(C_1-6烷基)–；

n为0或1；

各J¹和J²独立地为卤基、–CN、–NO₂、–V¹–R或–(V²)_m–Q；

V¹为C_1-10脂族链，其中0-3个亚甲基单元任选并独立地被O、NR”、S、C(O)、S(O)或S(O)₂置换；V¹任选地被1-6次出现的J^V1取代；

V²为C_1-10脂族链，其中0-3个亚甲基单元任选并独立地被O、NR”、S、C(O)、S(O)或S(O)₂置换；V²任选地被1-6次出现的J^V2取代；

m为0或1；

Q为具有0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的3-8元饱和或不饱和单环环，或具有0-6个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的9-10元饱和或不饱和双环环；各Q任选地被0-5个J^Q取代；

各J^V1或J^V2独立地为卤素、CN、NH₂、NO₂、C_1-4脂族、NH(C_1-4脂族)、N(C_1-4脂族)₂、OH、O(C_1-4脂族)、CO₂H、CO₂(C_1-4脂族)、C(O)NH₂、C(O)NH(C_1-4脂族)、C(O)N(C_1-4脂族)₂、NHCO(C_1-4脂族)、N(C_1-4脂族)CO(C_1-4脂族)、SO₂(C_1-4脂族)、NHSO₂(C_1-4脂族)或N(C_1-4脂族)SO₂(C_1-4脂族)，其中所述C_1-4脂族任选地被卤基取代；

R为H或C_1-6脂族，其中所述C_1-6脂族任选地被1-4次出现的以下各基团取代：NH₂、NH(C_1-4脂族)、N(C_1-4脂族)₂、卤素、C_1-4脂族、OH、O(C_1-4脂族)、NO₂、CN、CO₂H、CO₂(C_1-4脂族)、CO(C_1-4脂族)、O(卤基C_1-4脂族)或卤基C_1-4脂族；

各J^Q独立地为卤基、氧代基、CN、NO₂、X-R或–(X)_p-Q⁴；

p为0或1；

X为C_1-10脂族；其中所述C_1-6脂族的1-3个亚甲基单元任选地被-NR、-O-、-S-、C(O)、S(O)₂或S(O)置换；其中X任选并独立地被1-4次出现的以下各基团取代：NH₂、NH(C_1-4脂族)、N(C_1-4脂族)₂、卤素、C_1-4脂族、OH、O(C_1-4脂族)、NO₂、CN、CO(C_1-4脂族)、CO₂H、CO₂(C_1-4脂族)、C(O)NH₂、C(O)NH(C_1-4脂族)、C(O)N(C_1-4脂族)₂、SO(C_1-4脂族)、SO₂(C_1-4脂族)、SO₂NH(C_1-4脂族)、SO₂N(C_1-4脂族)₂、NHC(O)(C_1-4脂族)、N(C_1-4脂族)C(O)(C_1-4脂族)，其中所述C_1-4脂族任选地被1-3次出现的卤基取代；

Q⁴为具有0-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的3-8元饱和或不饱和单环环，或具有0-6个独立地选自氮、氧或硫的8-10元饱和或不饱和双环环；各Q⁴任选地被1-5个J^Q4取代；

J^Q4为卤基、CN或C_1-4烷基，其中至多2个亚甲基单元任选被O、NR*、S、C(O)、S(O)或S(O)₂取代；

R为H或C_1-4烷基，其中所述C_1-4烷基任选地被1-4个卤基取代；

R’、R”和R*各自独立地为H、C_1-4烷基或不存在；其中所述C_1-4烷基任选地被1-4个卤基取代；

其中所述癌症在ATM信号传导途径中具有一个或多个缺陷。

49.根据权利要求47所述使用的ATRi或方法，其中所述ATR抑制剂是由式A-I-a表示：

或其药学上可接受的盐；

其中：

环A为

J⁵o为H、F、Cl、C_1-4脂族、O(C_1-3脂族)或OH；

J⁵p为

J⁵p1为H、C_1-4脂族、氧杂环丁烷基、四氢呋喃基、四氢哌喃基；其中J⁵p1任选地被1-2次出现的OH或卤基取代；

J⁵p2为H、甲基、乙基、CH₂F、CF₃或CH₂OH；

J²o为H、CN或SO₂CH₃；

J²m为H、F、Cl或甲基；

J²p为-SO₂(C_1-6烷基)、-SO₂(C_3-6环烷基)、-SO₂(4-6元杂环基)、-SO₂(C_1-4烷基)N(C_1-4烷基)₂或-SO₂(C_1-4烷基)-(4-6元杂环基)，其中所述杂环基含有1个选自氧、氮或硫的杂原子；且其中所述J²p任选地被1-3次出现的卤基、OH或O(C_1-4烷基)取代。

50.根据权利要求48所述使用的ATRi或方法，其中环A为

51.根据权利要求48所述使用的ATRi或方法，其中环A为

52.根据权利要求47所述使用的ATRi或方法，其中抑制ATR的化合物为化合物A-2：

或其药学上可接受的盐。

53.根据权利要求47所述使用的ATRi或方法，其中所述ATR抑制剂是由式A-II表示：

或其药学上的盐，

其中：

R¹⁰独立地选自氟、氯或–C(J¹⁰)₂CN；

J¹⁰独立地选自H或C_1-2烷基；或

两次出现的J¹⁰与其所附接的碳原子一起形成3-4元任选取代的碳环环；

R²⁰独立地选自H；卤基；-CN；NH₂；任选被0-3次出现的氟取代的C_1-2烷基；或C_1-3脂族链，其中所述脂族链的至多两个亚甲基单元任选地被-O-、-NR^a-、-C(O)-或–S(O)_z置换；

R³独立地选自H；卤基；任选被1-3次出现的卤基取代的C_1-4烷基；C_3-4环烷基；-CN；或C_1-3脂族链，其中所述脂族链的至多两个亚甲基单元任选地被-O-、-NR^a-、-C(O)-或–S(O)_z置换；

R⁴独立地选自Q¹或C_1-10脂族链，其中所述脂族链的至多四个亚甲基单元任选地被-O-、-NR^a-、-C(O)-或-S(O)_z-置换；各R⁴任选地被0-5次出现的J^Q1取代；或

R³和R⁴与其所结合的原子一起形成具有0-2个选自氧、氮或硫的杂原子的5-6元芳族环或非芳族环；由R³和R⁴形成的环任选地被0-3次出现的J^Z取代；

Q¹独立地选自3-7元完全饱和、部分不饱和或芳族单环环，所述3-7元环具有0-3个选自氧、氮或硫的杂原子；或7-12元完全饱和、部分不饱和或芳族双环环，所述7-12元环具有0-5个选自氧、氮或硫的杂原子；

J^z独立地选自C_1-6脂族、＝O、卤基或→O；

J^Q1独立地选自–CN；卤基；＝O；Q²；或C_1-8脂族链，其中所述脂族链的至多三个亚甲基单元任选被-O-、-NR^a-、-C(O)-或-S(O)_z-置换；每次出现的J^Q1任选被0-3次出现的J^R取代；或

在同一原子上两次出现的J^Q1与其所连接的原子一起形成具有0-2个选自氧、氮或硫的杂原子的3-6元环；其中由两次出现的J^Q1形成的环任选地被0-3次出现的J^X取代；或

两次出现的J^Q1与Q¹一起形成6-10元饱和或部分不饱和桥接环体系；

Q²独立地选自3-7元完全饱和、部分不饱和或芳族单环环，所述3-7元环具有0-3个选自氧、氮或硫的杂原子；或7-12元完全饱和、部分不饱和或芳族双环环，所述7-12元环具有0-5个选自氧、氮或硫的杂原子；

J^R独立地选自–CN；卤基；＝O；→O；Q³；或C_1-6脂族链，其中所述脂族链的至多三个亚甲基单元任选地被-O-、-NR^a-、-C(O)-或-S(O)_z-置换；各J^R任选地被0-3次出现的J^T取代；或

在同一原子上两次出现的J^R与其所连接的原子一起形成具有0-2个选自氧、氮或硫的杂原子的3-6元环；其中所述由两次出现的J^R形成的环任选地被0-3次出现的J^X取代；或

两次出现的J^R与Q²一起形成6-10元饱和或部分不饱和桥接环体系；

Q³为3-7元完全饱和、部分不饱和或芳族单环环，所述3-7元环具有0-3个选自氧、氮或硫的杂原子；或7-12元完全饱和、部分不饱和或芳族双环环，所述7-12元环具有0-5个选自氧、氮或硫的杂原子；

J^X独立地选自-CN；＝O；卤基；或C_1-4脂族链，其中所述脂族链的至多两个亚甲基单元任选地被-O-、-NR^a-、-C(O)-或-S(O)_z-置换；

J^T独立地选自卤基、-CN；→O；＝O；-OH；C_1-6脂族链，其中所述脂族链的至多两个亚甲基单元任选地被-O-、-NR^a-、-C(O)-或-S(O)_z-置换；或具有0-2个选自氧、氮或硫的杂原子的3-6元非芳族环；每次出现的J^T任选地被0-3次出现的J^M取代；或

在同一原子上两次出现的J^T与其所连接的原子一起形成具有0-2个选自氧、氮或硫的杂原子的3-6元环；或

两次出现的J^T与Q³一起形成6-10元饱和或部分不饱和桥接环体系；

J^M独立地选自卤基或C_1-6脂族；

J为H或Cl；

z为0、1或2；并且

R^a独立地选自H或C_1-4脂族。

54.根据权利要求52所述使用的ATRi或方法，其中R¹和R³为氟。

55.根据权利要求52所述使用的ATRi或方法，其中R⁴为Q¹。

56.根据权利要求54所述使用的ATRi或方法，其中Q¹独立地选自哌啶基和咪唑基。

57.根据权利要求47所述使用的ATRi或方法，其中所述ATR抑制剂为化合物A-3：

或其药学上可接受的盐。

58.根据权利要求47所述使用的ATRi或方法，其中所述ATR抑制剂是由式A-II-a表示：

或其药学上可接受的盐，

其中：

R¹⁰独立地选自氟、氯或–C(J¹⁰)₂CN；

J¹⁰独立地选自H或C_1-2烷基；或

两次出现的J¹与其所附接的碳原子一起形成任选取代的3-4元碳环环；

R³独立地选自H；氯；氟；任选被1-3次出现的卤基取代的C_1-4烷基；C_3-4环烷基；-CN；或C_1-3脂族链，其中所述脂族链的至多两个亚甲基单元任选地被-O-、-NR^a-、-C(O)-或–S(O)_z置换；

L¹为H；具有0-2个选自氧、氮或硫的杂原子的3-7元芳族环或非芳族环；或C_1-6脂族链，其中所述脂族链的至多两个亚甲基单元任选地被-O-、-NR^a-、-C(O)-或–S(O)_z置换；各L¹任选地被C_1-4脂族；-CN；卤基；-OH；或具有0-2个选自氧、氮或硫的杂原子的3-6元非芳族环取代；

L²为H；具有0-2个选自氧、氮或硫的杂原子的3-7元芳族环或非芳族环；或C_1-6脂族链，其中所述脂族链的至多两个亚甲基单元任选地被-O-、-NR^a-、-C(O)-或–S(O)_z置换；各L²任选地被C_1-4脂族；-CN；卤基；-OH；或具有0-2个选自氧、氮或硫的杂原子的3-6元非芳族环取代；或

L¹和L²与其所附接的氮一起形成环D；环D任选地被0-5次出现的J^G取代；

L³为H；C_1-3脂族；或CN；

环D独立地选自具有1-2个选自氧、氮或硫的3-7元杂环基环；或具有1-5个选自氧、氮或硫的杂原子的7-12元完全饱和或部分不饱和双环环；

J^G独立地选自卤基；-CN；-N(R°)₂；→O；3-6元碳环基；具有1-2个选自氧、氮或硫的杂原子的3-6元杂环基；或C_1-4烷基链，其中所述烷基链的至多两个亚甲基单元任选地被-O-、-NR^a-、-C(O)-或–S(O)_z置换；各J^G任选地被0-2次出现的J^K取代。

在同一原子上两次出现的J^G与其所连接的原子一起形成具有0-2个选自氧、氮或硫的杂原子的3-6元环；或

两次出现的J^G与环D一起形成6-10元饱和或部分不饱和桥接环体系；

J^K为具有0-2个选自氧、氮或硫的杂原子的3-7元芳族环或非芳族环；

z为0、1或2；并且

R^a和R°为H或C_1-4烷基。

59.根据权利要求57所述使用的ATRi或方法，其中R¹和R³为氟。

60.根据权利要求47所述使用的ATRi或方法，其中所述ATR抑制剂为化合物A-4：

或其药学上可接受的盐。

61.根据权利要求47所述使用的ATRi或方法，其中所述抑制ATR的化合物为：

或其药学上可接受的盐。