CN115867291A - 环状rna组合物和方法 - Google Patents
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Abstract
本文描述了环状RNA和转移媒介物，以及相关的组合物和方法。在一些实施方案中，本发明的环状RNA包含I组内含子片段、间隔区、IRES、双链体形成区和表达序列。在一些实施方案中，所述表达序列编码嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，与线性RNA相比，本发明的环状RNA具有改进的表达、功能稳定性、免疫原性、制造容易性和/或半衰期。在一些实施方案中，与现有RNA环化方法相比，本发明的方法和构建体产生改进的环化效率、剪接效率和/或纯度。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年5月22日提交的美国临时专利申请第62/851,548号；2019年6月4日提交的美国临时专利申请第62/857,121号；2019年6月5日提交的国际专利申请第PCT/US2019/035531号；2019年12月4日提交的美国临时专利申请第62/943,796号；2019年12月4日提交的美国临时专利申请第62/943,779号；以及2020年2月10日提交的美国临时专利申请第62/972,194号的权益和优先权，所述专利的公开内容出于所有目的特此以引用的方式整体并入。
背景技术
常规基因疗法涉及使用DNA来将所需遗传信息插入宿主细胞中。引入细胞中的DNA通常在一定程度上整合至一个或多个转染细胞的基因组中，从而允许所引入的遗传物质在宿主中的长效作用。虽然这类持续作用可具有实质益处，但是外源性DNA整合至宿主基因组中也可具有许多有害效应。举例来说，可能所引入的DNA将插入完整基因中，导致阻碍或甚至完全消除内源性基因的功能的突变。因此，使用DNA的基因疗法可导致损害所治疗宿主的重要遗传功能，如例如，消除或有害减少必需酶的产生或干扰对于细胞生长的调控起关键作用的基因，从而导致未经调控的或癌性的细胞增殖。另外，使用常规基于DNA的基因疗法，为了有效表达所需基因产物，必需包括强启动子序列，这也可导致细胞中的正常基因表达的调控的不良变化。也可能基于DNA的遗传物质将导致诱导不需要的抗DNA抗体，其进而可触发可能致命的免疫应答。使用病毒载体的基因治疗方法也可导致不良免疫应答。在一些情况下，病毒载体甚至可整合至宿主基因组中。另外，临床级病毒载体的产生也昂贵并且费时。所引入的遗传物质使用病毒载体的靶向递送还可能难以控制。因此，虽然已经评估了基于DNA的基因疗法使用病毒载体递送分泌的蛋白(美国专利第6,066,626号；US2004/0110709)，但这些方法可能因这些各种原因而受到限制。
与DNA相比，使用RNA作为基因治疗剂大致上更安全，因为RNA不涉及稳定整合至转染细胞的基因组中的风险，由此消除了所引入的遗传物质将干扰必需基因的正常运作或导致引起有害或致癌效应的突变的顾虑，并且外来的启动子序列不为有效翻译所编码蛋白质所需要，再次避免了可能有害的副作用。此外，mRNA不需要进入细胞核来执行其功能，而DNA必须克服这一主要障碍。
环状RNA可用于设计和产生稳定形式的RNA。RNA分子的环化为RNA结构和功能的研究提供了优点，特别是在分子易于以无活性构象折叠的情况下(Wang和Ruffner，1998)。环状RNA对体内应用也可特别令人感兴趣和有用，尤其是在基于RNA的基因表达控制和治疗学的研究领域，包括蛋白质替代疗法和疫苗接种。
使用经遗传修饰以表达嵌合抗原受体(CAR)的T细胞和靶向癌细胞上的抗原的重组T细胞受体(TCR)是用于治疗癌症的有吸引力的治疗策略。然而，修饰T细胞以表达CAR和TCR的当前方法以及由此产生的疗法与细胞因子释放综合征(CRS)和其他并发症形式的毒性相关。仍然需要更安全的工程改造细胞的方法来表达CAR和重组TCR。
在本发明之前，存在用于体外制备环化RNA的三种主要技术：夹板介导法、内含子-外显子置换法(permuted intron-exon method)和RNA连接酶介导法。然而，现有方法受到可环化的RNA的大小限制，从而限制了它们的治疗应用。
发明内容
在一个方面，本文提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含：环状RNA多核苷酸，所述环状RNA多核苷酸按以下顺序包含3'I组内含子片段、内部核糖体进入位点(IRES)、编码嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)复合物蛋白质的表达序列和5'I组内含子片段以及包含(i)可电离脂质、(ii)结构脂质和(iii)PEG修饰的脂质中的至少一者的转移媒介物，其中所述转移媒介物能够将所述环状RNA多核苷酸递送至存在于人受试者中的人免疫细胞，使得所述CAR在所述人免疫细胞中翻译并在所述人免疫细胞的表面上表达。
在一些实施方案中，所述药物组合物被配制用于向有需要的人受试者静脉内施用。在一些实施方案中，所述3'I组内含子片段和5'I组内含子片段是鱼腥藻属I组内含子片段。
在某些实施方案中，所述3'内含子片段和5'内含子片段由完整内含子中的L9a-5置换位点限定。在某些实施方案中，所述3'内含子片段和5'内含子片段由完整内含子中的L8-2置换位点限定。
在一些实施方案中，所述IRES来自桃拉综合征病毒、锥蝽病毒、蒂勒脑脊髓炎病毒(Theiler's encephalomyelitis virus)、猿猴病毒40、红火蚁病毒1、禾谷缢管蚜病毒、网状内皮增生病病毒、人脊髓灰质炎病毒1、斯氏珀蝽(Plautia stali)肠病毒、克什米尔蜜蜂病毒、人鼻病毒2、琉璃叶蝉病毒-1、人免疫缺陷病毒1型、琉璃叶蝉病毒-1、Himetobi P病毒、丙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒、GB型肝炎病毒、口蹄疫病毒、人肠道病毒71、马鼻炎病毒、茶尺蠖微小RNA病毒样病毒、脑心肌炎病毒、果蝇C病毒、人柯萨奇病毒B3、十字花科植物烟草花叶病毒、蟋蟀麻痹病毒、牛病毒性腹泻病毒1、黑蜂王台病毒、蚜虫致死性麻痹病毒、禽脑脊髓炎病毒、急性蜜蜂麻痹病毒、木槿褪绿环斑病毒、猪瘟病毒、人FGF2、人SFTPA1、人AML1/RUNX1、果蝇触角足、人AQP4、人AT1R、人BAG-1、人BCL2、人BiP、人c-IAPl、人c-myc、人eIF4G、小鼠NDST4L、人LEF1、小鼠HIF1α、人n.myc、小鼠Gtx、人p27kipl、人PDGF2/c-sis、人p53、人Pim-1、小鼠Rbm3、果蝇reaper、犬Scamper、果蝇Ubx、人UNR、小鼠UtrA、人VEGF-A、人XIAP、果蝇无毛、酿酒酵母TFIID、酿酒酵母YAP1、烟草蚀纹病毒、芜菁皱缩病毒、EMCV-A、EMCV-B、EMCV-Bf、EMCV-Cf、EMCV pEC9、小双节RNA病毒(Picoirnavirus)、HCV QC64、人寇沙病毒(Human Cosavirus)E/D、人寇沙病毒F、人寇沙病毒JMY、鼻病毒NAT001、HRV14、HRV89、HRVC-02、HRV-A21、萨力病毒(Salivirus)A SH1、萨力病毒FHB、萨力病毒NG-J1、人副肠孤病毒1、Crohivirus B、Yc-3、Rosavirus M-7、Shanbavirus A、Pasivirus A、Pasivirus A 2、艾柯病毒E14、人副肠孤病毒5、爱知病毒(Aichi Virus)、甲型肝炎病毒HA16、Phopivirus、CVA10、肠道病毒C、肠道病毒D、肠道病毒J、人趋肝性病毒(Pegivirus)2、GBV-C GT110、GBV-C K1737、GBV-C Iowa、趋肝性病毒A 1220、Pasivirus A 3、萨佩洛病毒(Sapelovirus)、Rosavirus B、Bakunsa病毒、震颤病毒(Tremovirus)A、猪Pasivirus1、PLV-CHN、PasivirusA、Sicinivirus、肝炎病毒K、肝炎病毒A、BVDV1、边界病病毒、BVDV2、CSFV-PK15C、SF573双顺反子病毒、湖北微小RNA病毒样病毒、CRPV、萨力病毒A BN5、萨力病毒A BN2、萨力病毒A02394、萨力病毒A GUT、萨力病毒A CH、萨力病毒A SZ1、萨力病毒FHB、CVB3、CVB1、艾柯病毒7、CVB5、EVA71、CVA3、CVA12、EV24或eIF4G的适体。
在一些实施方案中，所述IRES包括CVB3 IRES或其片段或变体，或者其中所述IRES包含根据SEQ ID NO:65的序列。在一些实施方案中，所述IRES包括萨力病毒(salivirus)SZ1 IRES或其片段或变体。在某些实施方案中，所述IRES包含根据SEQ ID NO:63的序列。在一些实施方案中，所述药物组合物包含位于所述3'I组内含子片段与所述IRES之间的第一内部间隔区，以及位于所述表达序列与所述5'I组内含子片段之间的第二内部间隔区。在某些实施方案中，所述第一内部间隔区和第二内部间隔区各自具有约10至约60个核苷酸的长度。
在一些实施方案中，所述CAR或TCR复合物蛋白质包含对选自下组的抗原具有特异性的抗原结合结构域：CD19、CD123、CD22、CD30、CD171、CS-1、C型凝集素样分子-1、CD33、表皮生长因子受体变体III(EGFRvIII)、双唾液酸神经节苷脂GD2、双唾液酸神经节苷脂GD3、TNF受体家族成员、B细胞成熟抗原(BCMA)、Tn抗原((Tn Ag)或(GaINAca-Ser/Thr))、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、Fms样酪氨酸激酶3(FLT3)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)、CD38、CD44v6、癌胚抗原(CEA)、上皮细胞粘附分子(EPCAM)、B7H3(CD276)、KIT(CD117)、白细胞介素-13受体亚基α-2、间皮素、白细胞介素11受体α(IL-11Ra)、前列腺干细胞抗原(PSCA)、蛋白酶丝氨酸21、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、Lewis(Y)抗原、CD24、血小板源性生长因子受体β(PDGFR-β)、阶段特异性胚胎抗原4(SSEA-4)、CD20、叶酸受体α、HER2、HER3、粘蛋白1、细胞表面相关(MUC1)、表皮生长因子受体(EGFR)、神经细胞粘附分子(NCAM)、前列腺酶、前列腺酸性磷酸酶(PAP)、延伸因子2突变型(ELF2M)、肝配蛋白B2、成纤维细胞活化蛋白α(FAP)、胰岛素样生长因子1受体(IGF-I受体)、碳酸酐酶IX(CAIX)、蛋白酶体(前体，巨蛋白因子)亚基β型9(LMP2)、糖蛋白100(gp100)、由断裂点簇区(BCR)和艾贝尔森鼠白血病病毒致癌基因同系物1(Abl)组成的致癌基因融合蛋白(bcr-abl)、酪氨酸酶、肝配蛋白A型受体2(EphA2)、岩藻糖基GM1、唾液酸化路易斯粘附分子(sLe)、神经节苷脂GM3、转谷氨酰胺酶5(TGS5)、高分子量黑素瘤相关抗原(HMWMAA)、o-乙酰基-GD2神经节苷脂(OAcGD2)、叶酸受体β、肿瘤内皮标志物1(TEM1/CD248)、肿瘤内皮标志物7相关(TEM7R)、紧密连接蛋白6(CLDN6)、紧密连接蛋白18.2(CLDN18.2)、促甲状腺激素受体(TSHR)、G蛋白偶联受体C类5组成员D(GPRC5D)、染色体X开放阅读框61(CXORF61)、CD97和CD179a。
在一些实施方案中，所述CAR或TCR复合物蛋白质包含CAR，所述CAR包含对CD19具有特异性的抗原结合结构域。在一些实施方案中，所述CAR或TCR复合物蛋白质包含CAR，所述CAR包含选自下组的共刺激结构域：CD28、4-1BB、OX40、CD27、CD30、ICOS、GITR、CD40、CD2、SLAM以及它们的组合。在一些实施方案中，所述CAR或TCR复合物蛋白质包含CAR，所述CAR包含CD3ζ信号传导结构域。在一些实施方案中，所述CAR或TCR复合物蛋白质包含CAR，所述CAR包含CH2CH3、CD28和/或CD8间隔区结构域。在一些实施方案中，所述CAR或TCR复合物蛋白质包含CAR，所述CAR包含CD28或CD8跨膜结构域。
在一些实施方案中，所述CAR或TCR复合物蛋白质包含CAR，所述CAR包含：抗原结合结构域、间隔区结构、跨膜结构域、共刺激结构域和细胞内T细胞信号传导结构域。
在一些实施方案中，所述CAR或TCR复合物蛋白质包含多特异性CAR，所述多特异性CAR包含针对至少2种不同抗原的抗原结合结构域。在一些实施方案中，所述CAR或TCR复合物蛋白质包含选自下组的TCR复合物蛋白质：TCRα、TCRβ、TCRγ和TCRδ。在一些实施方案中，所述转移媒介物包括脂质纳米颗粒、核-壳纳米颗粒、生物可降解纳米颗粒、生物可降解脂质纳米颗粒、聚合物纳米颗粒或生物可降解聚合物纳米颗粒。
在一些实施方案中，所述药物组合物还包含靶向部分。在某些实施方案中，在没有细胞分离或纯化的情况下，所述靶向部分介导受体介导的内吞作用或直接融合至选定细胞群或组织的选定细胞中。在某些实施方案中，所述靶向部分能够结合至选自下组的蛋白质：CD3、CD4、CD8、CD5、CD7、PD-1、4-1BB、CD28、C1q和CD2。在某些实施方案中，所述靶向部分包含对巨噬细胞、树突细胞、NK细胞、NKT或T细胞抗原具有特异性的抗体。在某些实施方案中，所述靶向部分包括scFv、纳米抗体、肽、微型抗体、多核苷酸适体、重链可变区、轻链可变区或其片段。
在一些实施方案中，所述药物组合物以有效治疗人受试者的癌症的量施用。在一些实施方案中，与包含含有编码相同CAR的外源性DNA的T细胞或载体的药物组合物相比，所述药物组合物具有增强的安全性特征。
在一些实施方案中，所述组合物中少于1重量％的多核苷酸是双链RNA、DNA夹板或三磷酸化RNA。
在一些实施方案中，所述药物组合物中少于1重量％的多核苷酸和蛋白质是双链RNA、DNA夹板、三磷酸化RNA、磷酸酶蛋白质、蛋白质连接酶和加帽酶。在一些实施方案中，所述转移媒介物包含多于一种环状RNA多核苷酸。
在另一个方面，本公开提供了一种环状RNA多核苷酸，所述环状RNA多核苷酸按以下顺序包含3'I组内含子片段、内部核糖体进入位点(IRES)、编码嵌合抗原受体(CAR)或TCR复合物蛋白质的表达序列和5'I组内含子片段。
在一些实施方案中，所述3'I组内含子片段和5'I组内含子片段是鱼腥藻属I组内含子片段。在某些实施方案中，所述3'内含子片段和5'内含子片段由完整内含子中的L9a-5置换位点限定。在某些实施方案中，所述3'内含子片段和5'内含子片段由完整内含子中的L8-2置换位点限定。在某些实施方案中，所述IRES包括CVB3 IRES或其片段或变体。在某些实施方案中，所述IRES具有根据SEQ ID NO:65的序列。在某些实施方案中，所述IRES包括萨力病毒SZ1 IRES或其片段或变体。在某些实施方案中，所述IRES具有根据SEQ ID NO:63的序列。
在一些实施方案中，所述环状RNA多核苷酸包含位于所述3'I组内含子片段与所述IRES之间的第一内部间隔区，以及位于所述表达序列与所述5'I组内含子片段之间的第二内部间隔区。
在某些实施方案中，所述第一内部间隔区和第二内部间隔区各自具有约10至约60个核苷酸的长度。
在一些实施方案中，所述环状RNA多核苷酸由天然核苷酸组成。在一些实施方案中，所述环状RNA多核苷酸还包含编码治疗性蛋白质的第二表达序列。在一些实施方案中，所述治疗性蛋白质包含检查点抑制剂。在某些实施方案中，所述治疗性蛋白质包含细胞因子。
在一些实施方案中，所述CAR或TCR复合物蛋白质包含对选自下组的抗原具有特异性的抗原结合结构域：CD19、CD123、CD22、CD30、CD171、CS-1、C型凝集素样分子-1、CD33、表皮生长因子受体变体III(EGFRvIII)、双唾液酸神经节苷脂GD2、双唾液酸神经节苷脂GD3、TNF受体家族成员、B细胞成熟抗原(BCMA)、Tn抗原((Tn Ag)或(GaINAca-Ser/Thr))、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、Fms样酪氨酸激酶3(FLT3)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)、CD38、CD44v6、癌胚抗原(CEA)、上皮细胞粘附分子(EPCAM)、B7H3(CD276)、KIT(CD117)、白细胞介素-13受体亚基α-2、间皮素、白细胞介素11受体α(IL-11Ra)、前列腺干细胞抗原(PSCA)、蛋白酶丝氨酸21、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、Lewis(Y)抗原、CD24、血小板源性生长因子受体β(PDGFR-β)、阶段特异性胚胎抗原4(SSEA-4)、CD20、叶酸受体α、HER2、HER3、粘蛋白1、细胞表面相关(MUC1)、表皮生长因子受体(EGFR)、神经细胞粘附分子(NCAM)、前列腺酶、前列腺酸性磷酸酶(PAP)、延伸因子2突变型(ELF2M)、肝配蛋白B2、成纤维细胞活化蛋白α(FAP)、胰岛素样生长因子1受体(IGF-I受体)、碳酸酐酶IX(CAIX)、蛋白酶体(前体，巨蛋白因子)亚基β型9(LMP2)、糖蛋白100(gp100)、由断裂点簇区(BCR)和艾贝尔森鼠白血病病毒致癌基因同系物1(Ab1)组成的致癌基因融合蛋白(bcr-ab1)、酪氨酸酶、肝配蛋白A型受体2(EphA2)、岩藻糖基GM1、唾液酸化路易斯粘附分子(sLe)、神经节苷脂GM3、转谷氨酰胺酶5(TGS5)、高分子量黑素瘤相关抗原(HMWMAA)、o-乙酰基-GD2神经节苷脂(OAcGD2)、叶酸受体β、肿瘤内皮标志物1(TEM1/CD248)、肿瘤内皮标志物7相关(TEM7R)、紧密连接蛋白6(CLDN6)、紧密连接蛋白18.2(CLDN18.2)、促甲状腺激素受体(TSHR)、G蛋白偶联受体C类5组成员D(GPRC5D)、染色体X开放阅读框61(CXORF61)、CD97和CD179a。
在一些实施方案中，所述CAR或TCR复合物蛋白质包含CAR，所述CAR包含对CD19具有特异性的抗原结合结构域。在一些实施方案中，所述CAR或TCR复合物蛋白质包含CAR，所述CAR包含选自下组的共刺激结构域：CD28、4-1BB、OX40、CD27、CD30、ICOS、GITR、CD40、CD2、SLAM以及它们的组合。在一些实施方案中，所述CAR或TCR复合物蛋白质包含CAR，所述CAR包含CD3ζ信号传导结构域。在一些实施方案中，所述CAR或TCR复合物蛋白质包含CAR，所述CAR包含CH2CH3、CD28和/或CD8间隔区结构域。在一些实施方案中，所述CAR或TCR复合物蛋白质包含CAR，所述CAR包含CD28或CD8跨膜结构域。
在一些实施方案中，所述CAR或TCR复合物蛋白质包含CAR，所述CAR包含：抗原结合结构域、间隔区结构、跨膜结构域、共刺激结构域和细胞内T细胞信号传导结构域。
在一些实施方案中，所述CAR或TCR复合物蛋白质包含多特异性CAR，所述多特异性CAR包含针对至少2种不同抗原的抗原结合结构域。在一些实施方案中，所述CAR或TCR复合物蛋白质包含选自下组的TCR复合物蛋白质：TCRα、TCRβ、TCRγ和TCRδ。
在一些实施方案中，所述环状RNA多核苷酸由天然核苷酸组成。
在一些实施方案中，所述环状RNA多核苷酸表达序列是密码子优化的。在一些实施方案中，所述环状RNA多核苷酸被优化为缺乏存在于等效的预先优化的多核苷酸中的至少一个微小RNA结合位点。在一些实施方案中，所述环状RNA多核苷酸被优化为缺乏存在于等效的预先优化的多核苷酸中的至少一个核酸内切酶敏感位点。在一些实施方案中，所述环状RNA多核苷酸被优化为缺乏存在于等效的预先优化的多核苷酸中的至少一个RNA编辑敏感位点。
在一些实施方案中，所述环状RNA多核苷酸在人中的体内功能性半衰期大于具有相同表达序列的等效线性RNA多核苷酸的体内功能性半衰期。在一些实施方案中，所述环状RNA多核苷酸具有约100个核苷酸至约10千碱基的长度。在一些实施方案中，所述环状RNA多核苷酸具有至少约20小时的功能性半衰期。在一些实施方案中，所述环状RNA多核苷酸在人细胞中具有至少约20小时的治疗效果持续时间。在一些实施方案中，所述环状RNA多核苷酸在人细胞中的治疗效果持续时间大于或等于包含相同表达序列的等效线性RNA多核苷酸的治疗效果持续时间。在一些实施方案中，所述环状RNA多核苷酸在人细胞中的功能性半衰期大于或等于包含相同表达序列的等效线性RNA多核苷酸的功能性半衰期。
在另一个方面，本公开提供了一种DNA载体，所述DNA载体按以下顺序包含5'双链体形成区、具有第一置换位点的鱼腥藻属3'I组内含子片段、内部核糖体进入位点(IRES)、编码嵌合抗原受体(CAR)多肽的表达序列、具有第二置换位点的鱼腥藻属5'I组内含子片段和3'双链体形成区。
在一些实施方案中，所述3'I组内含子片段和5'I组内含子片段是鱼腥藻属I组内含子片段。在一些实施方案中，所述3'内含子片段和5'内含子片段由完整内含子中的L9a-5置换位点限定。在一些实施方案中，所述3'内含子片段和5'内含子片段由完整内含子中的L8-2置换位点限定。在一些实施方案中，所述IRES包括CVB3 IRES或其片段或变体。
在一些实施方案中，所述IRES编码根据SEQ ID NO:65的序列。在一些实施方案中，所述IRES包括萨力病毒SZ1 IRES或其片段或变体。在一些实施方案中，所述IRES编码根据SEQ ID NO:63的序列。在一些实施方案中，所述环状RNA多核苷酸按以下顺序包含5'双链体形成区、3'I组内含子片段、内部核糖体进入位点(IRES)、编码嵌合抗原受体(CAR)或TCR复合物蛋白质的表达序列、5'I组内含子片段和3'双链体形成区。在一些实施方案中，所述5'双链体形成区和3'双链体形成区各自具有约70％的GC核苷酸。在一些实施方案中，所述5'双链体形成区和3'双链体形成区各自具有约30个核苷酸的长度。
在一些实施方案中，所述DNA载体包含位于所述5'双链体形成区与所述3'I组内含子片段之间的第一外部间隔区，以及位于所述5'I组内含子片段与所述3'双链体形成区之间的第二外部间隔区。在一些实施方案中，所述第一外部间隔区和第二外部间隔区各自具有约10至约60个核苷酸的长度。在一些实施方案中，所述5'双链体形成区与所述3'I组内含子片段直接相邻，并且其中所述5'I组内含子片段与所述3'双链体形成区直接相邻。在一些实施方案中，所述DNA载体包含位于所述3'I组内含子片段与所述IRES之间的第一内部间隔区，以及位于所述表达序列与所述5'I组内含子片段之间的第二内部间隔区。在一些实施方案中，所述第一外部间隔区和第二内部间隔区各自具有约10至约60个核苷酸的长度。
在一些实施方案中，所述CAR或TCR复合物蛋白质包含对选自下组的抗原具有特异性的抗原结合结构域：CD19、CD123、CD22、CD30、CD171、CS-1、C型凝集素样分子-1、CD33、表皮生长因子受体变体III(EGFRvIII)、双唾液酸神经节苷脂GD2、双唾液酸神经节苷脂GD3、TNF受体家族成员、B细胞成熟抗原(BCMA)、Tn抗原((Tn Ag)或(GaINAca-Ser/Thr))、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、Fms样酪氨酸激酶3(FLT3)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)、CD38、CD44v6、癌胚抗原(CEA)、上皮细胞粘附分子(EPCAM)、B7H3(CD276)、KIT(CD117)、白细胞介素-13受体亚基α-2、间皮素、白细胞介素11受体α(IL-11Ra)、前列腺干细胞抗原(PSCA)、蛋白酶丝氨酸21、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、Lewis(Y)抗原、CD24、血小板源性生长因子受体β(PDGFR-β)、阶段特异性胚胎抗原4(SSEA-4)、CD20、叶酸受体α、HER2、HER3、粘蛋白1、细胞表面相关(MUC1)、表皮生长因子受体(EGFR)、神经细胞粘附分子(NCAM)、前列腺酶、前列腺酸性磷酸酶(PAP)、延伸因子2突变型(ELF2M)、肝配蛋白B2、成纤维细胞活化蛋白α(FAP)、胰岛素样生长因子1受体(IGF-I受体)、碳酸酐酶IX(CAIX)、蛋白酶体(前体，巨蛋白因子)亚基β型9(LMP2)、糖蛋白100(gp100)、由断裂点簇区(BCR)和艾贝尔森鼠白血病病毒致癌基因同系物1(Abl)组成的致癌基因融合蛋白(bcr-abl)、酪氨酸酶、肝配蛋白A型受体2(EphA2)、岩藻糖基GM1、唾液酸化路易斯粘附分子(sLe)、神经节苷脂GM3、转谷氨酰胺酶5(TGS5)、高分子量黑素瘤相关抗原(HMWMAA)、o-乙酰基-GD2神经节苷脂(OAcGD2)、叶酸受体β、肿瘤内皮标志物1(TEM1/CD248)、肿瘤内皮标志物7相关(TEM7R)、紧密连接蛋白6(CLDN6)、紧密连接蛋白18.2(CLDN18.2)、促甲状腺激素受体(TSHR)、G蛋白偶联受体C类5组成员D(GPRC5D)、染色体X开放阅读框61(CXORF61)、CD97和CD179a。
在一些实施方案中，所述CAR或TCR复合物蛋白质包含CAR，所述CAR包含对CD19具有特异性的抗原结合结构域。在一些实施方案中，所述CAR或TCR复合物蛋白质包含CAR，所述CAR包含选自下组的共刺激结构域：CD28、4-1BB、OX40、CD27、CD30、ICOS、GITR、CD40、CD2、SLAM以及它们的组合。在一些实施方案中，所述CAR或TCR复合物蛋白质包含CAR，所述CAR包含CD3ζ信号传导结构域。在一些实施方案中，所述CAR或TCR复合物蛋白质包含CAR，所述CAR包含CH2CH3、CD28和/或CD8间隔区结构域。在一些实施方案中，所述CAR或TCR复合物蛋白质包含CAR，所述CAR包含CD28或CD8跨膜结构域。
在一些实施方案中，所述CAR或TCR复合物蛋白质包含CAR，所述CAR包含：抗原结合结构域、间隔区结构、跨膜结构域、共刺激结构域和细胞内T细胞信号传导结构域。
在一些实施方案中，所述CAR或TCR复合物蛋白质包含多特异性CAR，所述多特异性CAR包含针对至少2种不同抗原的抗原结合结构域。在一些实施方案中，所述CAR或TCR复合物蛋白质包含选自下组的TCR复合物蛋白质：TCRα、TCRβ、TCRγ和TCRδ。
在另一个方面，本公开提供了一种真核细胞，所述真核细胞包含环状RNA多核苷酸，所述环状RNA多核苷酸按以下顺序包含3'I组内含子片段、内部核糖体进入位点(IRES)、编码嵌合抗原受体(CAR)或TCR复合物蛋白质的表达序列和5'I组内含子片段。在一些实施方案中，所述真核细胞包括人细胞。在一些实施方案中，所述真核细胞包括免疫细胞。在一些实施方案中，所述真核细胞包括T细胞。
在另一个方面，本公开提供了一种真核细胞群，所述真核细胞群包含环状RNA多核苷酸，所述环状RNA多核苷酸按以下顺序包含3'I组内含子片段、内部核糖体进入位点(IRES)、编码嵌合抗原受体(CAR)或TCR复合物蛋白质的表达序列和5'I组内含子片段，其中所述真核细胞群在其细胞表面上表达由所述环状RNA多核苷酸编码的CAR或TCR复合物蛋白质。
在一些实施方案中，所述细胞群包含NK细胞、NKT细胞、巨噬细胞、树突细胞、αβT细胞、γδT细胞或它们的组合。在一些实施方案中，所述细胞群包含T细胞。在一些实施方案中，所述群包含CD3+ T细胞。在一些实施方案中，所述群包含CD4+ T细胞。在一些实施方案中，所述群包含CD8+ T细胞。在一些实施方案中，所述真核细胞群以有效治疗有需要的人受试者的癌症的量施用。在一些实施方案中，与包含编码相同CAR的线性RNA的等效真核细胞群相比，所述细胞群更有效或更长时间地杀死肿瘤细胞。
在另一个方面，本文提供了一种制备真核细胞群的方法，所述方法包括使所述群中的细胞与包含环状RNA多核苷酸的转移媒介物接触，所述环状RNA多核苷酸按以下顺序包含3'I组内含子片段、内部核糖体进入位点(IRES)、编码嵌合抗原受体(CAR)或TCR复合物蛋白质的表达序列和5'I组内含子片段，其中所述转移媒介物包含(i)可电离脂质、(ii)结构脂质和(iii)PEG修饰的脂质，其中所述转移媒介物能够将所述环状RNA多核苷酸递送至人免疫细胞，使得所述CAR在所述人免疫细胞中翻译并在所述人免疫细胞的表面上表达。
在另一个方面，本文提供了一种治疗有需要的受试者的方法，所述方法包括施用治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包含：环状RNA多核苷酸，所述环状RNA多核苷酸按以下顺序包含3'I组内含子片段、内部核糖体进入位点(IRES)、编码嵌合抗原受体(CAR)或TCR复合物蛋白质的表达序列和5'I组内含子片段；和转移媒介物，所述转移媒介物包含(i)可电离脂质、(ii)结构脂质和(ii)PEG修饰的脂质，其中所述转移媒介物能够将所述环状RNA多核苷酸递送至人免疫细胞，使得所述CAR在所述人免疫细胞中翻译并在所述人免疫细胞的表面上表达。
在一些实施方案中，所述受试者患有选自下组的癌症：急性淋巴细胞性癌、急性骨髓性白血病(AML)、肺泡横纹肌肉瘤、膀胱癌(例如，膀胱癌)、骨癌、脑癌(例如，成神经管细胞瘤)、乳腺癌、肛门癌、肛管癌或肛门直肠癌、眼癌、肝内胆管癌、关节癌、颈癌、胆囊癌或胸膜癌、鼻癌、鼻腔癌或中耳癌、口腔癌、外阴癌、慢性淋巴细胞性白血病、慢性骨髓性癌症、结肠癌、食道癌、宫颈癌、纤维肉瘤、胃肠类癌肿瘤、头颈癌(例如头颈鳞状细胞癌)、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、肾癌、喉癌、白血病、液体肿瘤、肝癌、肺癌(例如，非小细胞肺癌和肺腺癌)、淋巴瘤、间皮瘤、肥大细胞瘤、黑素瘤、多发性骨髓瘤、鼻咽癌、非霍奇金淋巴瘤、B-慢性淋巴细胞性白血病、毛细胞白血病、急性淋巴细胞性白血病(ALL)和伯基特淋巴瘤、卵巢癌、胰腺癌、腹膜癌、网膜癌和肠系膜癌、咽癌、前列腺癌、直肠癌、肾癌、皮肤癌、小肠癌、软组织癌、实体瘤、滑膜肉瘤、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌和输尿管癌。
在另一个方面，本文提供了一种RNA多核苷酸，所述RNA多核苷酸包含内部核糖体进入位点(IRES)、编码嵌合抗原受体(CAR)多肽的表达序列和至少一个自环化元件。
在一些实施方案中，所述RNA多核苷酸包含5'双链体形成区、具有第一置换位点的鱼腥藻属3'I组内含子片段、内部核糖体进入位点(IRES)、编码嵌合抗原受体(CAR)多肽的表达序列、具有第二置换位点的鱼腥藻属5'I组内含子片段和3'双链体形成区。在一些实施方案中，所述RNA多核苷酸包含5'双链体形成区、第一置换位点、内部核糖体进入位点(IRES)、编码嵌合抗原受体(CAR)多肽的表达序列、第二置换位点和3'双链体形成区。在一些实施方案中，所述自环化元件是I组内含子片段。在一些实施方案中，3'I组内含子片段和5'内含子片段。在一些实施方案中，所述3'I组内含子片段和5'I组内含子片段是鱼腥藻属I组内含子片段。在一些实施方案中，所述3'内含子片段和5'内含子片段由完整内含子中的L9a-5置换位点限定。在一些实施方案中，所述3'内含子片段和5'内含子片段由完整内含子中的L8-2置换位点限定。在一些实施方案中，所述RNA多核苷酸能够在不存在酶的情况下环化。在一些实施方案中，所述RNA多核苷酸由天然核苷酸组成。
在另一个方面，本公开提供了一种适合用于合成上述实施方案之一的RNA多核苷酸的DNA载体。
在一些实施方案中，本公开的环状RNA多核苷酸以非脂质聚合物核-壳纳米颗粒的形式递送至靶细胞。
以引用的方式并入
本说明书中所提及的所有公布、专利和专利申请以引用的方式并入本文，其引用程度如同已明确且个别地指示将各个别公布、专利和专利申请以引用的方式并入本文一般。
附图说明
图1描绘用包含高斯荧光素酶表达序列和各种IRES序列的环状RNA转染后24小时HEK293细胞(图1A)、HepG2细胞(图1B)或1C1C7(图1C)细胞的上清液中的发光。
图2描绘用包含高斯荧光素酶表达序列和具有不同长度的各种IRES序列的环状RNA转染后24小时HEK293细胞(图2A)、HepG2细胞(图2B)或1C1C7(图2C)细胞的上清液中的发光。
图3描绘如通过发光测量的3天内HepG2(图3A)或1C1C7(图3B)细胞中选定IRES构建体的稳定性。
图4A和4B描绘如通过来自细胞的上清液中分泌的高斯荧光素酶的发光所测量的来自Jurkat细胞中的选定IRES构建体的蛋白质表达。
图5A和5B描绘如通过发光测量的3天内Jurkat细胞中的选定IRES构建体的稳定性。
图6描绘编码高斯荧光素酶的经修饰的线性、未纯化的环状或纯化的环状RNA的24小时发光(图6A)或3天内的相对发光(图6B)的比较。
图7描绘用经修饰的线性、未纯化的环状或纯化的环状RNA对Jurkat细胞进行电穿孔后IFNγ(图7A)、IL-6(图7B)、IL-2(图7C)、RIG-I(图7D)、IFN-β1(图7E)和TNFα(图7F)的转录物诱导。
图8描绘人原代单核细胞(图8A)和巨噬细胞(图8B和图8C)中编码高斯荧光素酶的环状RNA和经修饰的线性RNA的发光比较。
图9描绘用包含高斯荧光素酶表达序列和不同IRES序列的环状RNA转导后原代T细胞的上清液中3天内的相对发光(图9A)或24小时发光(图9B)。
图10描绘用包含高斯荧光素酶表达序列的环状RNA或经修饰的线性RNA转导后原代T细胞的上清液中的24小时发光(图10A)、或3天内的相对发光(图10B)以及PBMC中的24小时发光(图10C)。
图11描绘具有不同置换位点的RNA构建体的HPLC色谱图(图11A)和环化效率(图11B)。
图12描绘具有不同内含子和/或置换位点的RNA构建体的HPLC色谱图(图12A)和环化效率(图12B)。
图13描绘具有或不具有同源臂的3种RNA构建体的HPLC色谱图(图13A)和环化效率(图13B)。
图14描绘没有同源臂或具有不同长度和GC含量的同源臂的3种RNA构建体的环化效率。
图15A和15B描绘HPLC HPLC色谱图，其显示强同源臂对提高剪接效率的贡献、选定构建体中环化效率与切口之间的关系、以及假设展示提高的环化效率的置换位点和同源臂的组合。
图16示出模拟电穿孔(左)或用编码CAR的环状RNA(右)电穿孔并与表达GFP和萤火虫荧光素酶的Raji细胞共培养的T细胞的荧光图像。
图17示出模拟电穿孔(顶部)或用编码CAR的环状RNA电穿孔(底部)并与表达GFP和萤火虫荧光素酶的Raji细胞共培养的T细胞的明场(左)、荧光(中)和叠加(右)图像。
图18描绘模拟电穿孔或用编码不同CAR序列的环状RNA电穿孔的T细胞对Raji靶细胞的特异性裂解。
图19描绘用包含高斯荧光素酶表达序列和不同IRES序列的线性或环状RNA转导后24小时Jurkat细胞(左)或静息原代人CD3+ T细胞(右)的上清液中的发光(图19A)，以及在3天内的相对发光(图19B)。
图20描绘用经修饰的线性、未纯化的环状或纯化的环状RNA对人CD3+ T细胞进行电穿孔后的IFN-β1(图20A)、RIG-I(图20B)、IL-2(图20C)、IL-6(图20D)、IFNγ(图20E)和TNFα(图20F)的转录物诱导。
图21描绘如通过萤火虫发光检测确定的用编码CAR的circRNA电穿孔的人原代CD3+ T细胞对Raji靶细胞的特异性裂解(图21A)，和用不同量的编码CAR序列的环状或线性RNA电穿孔后24小时的IFNγ转录物诱导(图21B)。
图22描绘如通过检测萤火虫发光确定的用编码CAR的环状或线性RNA以不同的E:T比率电穿孔的人原代CD3+T细胞对靶细胞或非靶细胞的特异性裂解(图22A和图22B)。
图23描绘在电穿孔后第1、3、5和7天，用编码CAR的RNA电穿孔的人CD3+ T细胞对靶细胞的特异性裂解。
图24描绘用编码CD19或BCMA靶向CAR的环状RNA电穿孔的人CD3+ T细胞对靶细胞的特异性裂解。
图25描绘用于同源臂设计的前体RNA二级结构的RNAFold预测。碱基越深表示碱基配对概率越高。在没有同源臂的情况下，则预测前体分子的末端之间不会发生碱基配对。
图26描绘前体RNA环化的琼脂糖凝胶确认。C：经受环化条件的前体RNA(具有强同源臂)。C+R：泳道C，用RNA酶R消化。C+R+H：泳道C+R，用寡核苷酸引导的RNA酶H消化。U：未经受环化条件的前体RNA。U+H：泳道U，用寡核苷酸引导的RNA酶H消化。
图27描绘跨图26中泳道C+R中描绘的样品的剪接接点的RT-PCR的桑格测序输出。
图28描绘在设计的间隔区的背景下前体RNA二级结构的RNAFold预测。将对核酶功能潜在重要的二级结构用黑色箭头标识。
图29描绘展示间隔区对剪接的影响的琼脂糖凝胶。(-)：无间隔区。D：破坏性间隔区。P1：容许间隔区1。P2：容许间隔区2。用于内部同源区域设计的前体RNA二级结构的cRNAFold预测。缺乏显著内部同源性(鱼腥藻属1.0)和引入的内部同源性(鱼腥藻属2.0)由黑色箭头指示。剪接泡表示为同源臂与含有剪接核酶的内部同源区之间的区域。
图30是显示工程化的自剪接前体RNA设计的元件的示意图。
图31示出在用CVB3-GLuc-pAC circRNA或经修饰的或未经修饰的线性GLuc mRNA转染后24小时HEK293(左，黑色轮廓)和HeLa(右，灰色轮廓)细胞的上清液中的发光(n＝4HEK293，n＝3HeLa)。
图32示出在用CVB3-GLuc-pAC circRNA或经修饰的或未经修饰的线性GLuc mRNA转染后24小时开始并持续6天的HEK293细胞的上清液中的发光(n＝4)。
图33给出前体RNA设计和自剪接的概述。阴影表示本文所述的RNA的不同区域。
图34描绘来自用不同circRNA制剂(+RNA酶R，仅用RNA酶R消化的未纯化的circRNA；+HPLC，未纯化的circRNA，HPLC纯化，然后用RNA酶R消化；+Phos，未纯化的circRNA，HPLC纯化，用磷酸酶处理，然后用RNA酶R消化)转染的A549细胞的细胞活力、circRNA表达稳定性和细胞因子释放。转染后3天评估细胞活力。转染后24小时评估细胞因子释放(数据表示为平均值+SD；n＝3；*p<0.05；ND，未检测到)。
图35描绘引入且用于TLR实验的RNA的示意图。由于涵盖内含子和同源臂的缺失，线性化circRNA含有与剪接的circRNA相同的所有序列元件。
图36示出从四个供体分离并用circRNA电穿孔的原代人T细胞上抗CD19 CAR的表面表达。
图37A示出用circRNA电穿孔的活T细胞的CAR+比例(图37A)和图36中4个人供体中CD4和CD8阳性T细胞的比例(图37B)。
图38示出模拟电穿孔或用编码抗CD19 CAR的circRNA或线性RNA电穿孔的T细胞在减少表达荧光素酶的CD19+靶细胞和CD19-非靶细胞的生物发光方面的功效。
图39示出用具有不同IRES的编码抗CD19 CAR的circRNA电穿孔并在电穿孔后与表达荧光素酶的Raji或K562细胞共培养5天(图39A)或1天(图39B)的T细胞的功效。(Oro-B1＝circKymriah；CVB3 IRES，Oro-152＝circKymriah；萨力病毒SZ1 IRES，L9a-5置换位点)
图40示出用编码抗CD19 CAR的circRNA电穿孔的T细胞对靶细胞和非靶细胞的裂解。图40A示出用具有抗CD19 CAR表达序列和CVB3 IRES或萨力病毒SZ1 IRES的circRNA电穿孔的原代人T细胞对CD19+Raji细胞和CD19-K562细胞的裂解。图40B示出用不同比例的具有抗CD19 CAR表达序列的circRNA或线性mRNA电穿孔的原代人T细胞对CD19+Raji细胞和CD19-K562细胞的裂解。图40C示出不同比例的用具有抗CD19 CAR表达序列的circRNA电穿孔的原代人T细胞对CD19+Raji细胞和CD19-K562细胞的裂解。
图41示出与用编码抗CD19 CAR的慢病毒转导的T细胞相比，用编码抗CD19 CAR的circRNA电穿孔的T细胞在裂解CD19+Raji细胞方面的功效。图41A示出与用编码抗CD19 CAR的慢病毒转导的T细胞相比，在10个Raji细胞比1个T细胞的比率下，编码抗CD19 CAR的circRNA在裂解CD19+Raji细胞方面的特异性裂解。图41B示出模拟电穿孔或用编码抗CD19CAR的慢病毒或circRNA电穿孔的表达抗CD19 CAR的T细胞的百分比。图41C示出在CD19+Raji细胞存在或不存在的情况下共培养的用编码抗CD19 CAR的circRNA电穿孔的T细胞中干扰素γmRNA的诱导。(Oro-B1＝circKymriah；CVB3 IRES，Oro-B6＝linKymriah)
图42示出用编码抗CD19CAR的circRNA或线性mRNA电穿孔的原代人CD3+ T细胞中抗CD19 CAR表达的稳定性。
图43示出在共培养实验中用编码CAR的circRNA电穿孔的THP-1单核细胞在裂解表达荧光素酶的Raji细胞方面的功效。
图44示出用编码抗鼠CD19 CAR的circRNA电穿孔的T细胞在裂解CD19+A20细胞和CD19-K562细胞方面的功效。
具体实施方式
本文提供了包含环状RNA的药物组合物和转移媒介物，例如脂质纳米颗粒。可将本文提供的环状RNA递送至和/或靶向转移媒介物(例如纳米颗粒)或包含转移媒介物的组合物中的细胞。在一些实施方案中，所述环状RNA还可以转移媒介物或包含转移媒介物的组合物形式递送给受试者。在一些实施方案中，所述转移媒介物是纳米颗粒。在一些实施方案中，所述纳米颗粒是脂质纳米颗粒、非脂质聚合物核-壳纳米颗粒或生物可降解纳米颗粒。在一些实施方案中，所述转移媒介物包含一种或多种可电离脂质、PEG修饰的脂质、辅助脂质和/或结构脂质。
在一些实施方案中，转移媒介物包封环状RNA并且包含可电离脂质、结构脂质和PEG修饰的脂质。在一些实施方案中，转移媒介物包封环状RNA并且包含可电离脂质、结构脂质、PEG修饰的脂质和辅助脂质。
不希望受理论束缚，据认为本文所述的转移媒介物保护包封的环状RNA免于降解并提供环状RNA在体内和体外至靶细胞的有效递送。
本公开的实施方案提供根据制剂中组分脂质的相应摩尔比描述的脂质组合物。在一个实施方案中，可电离脂质的mol-％可以是约10mol-％至约80mol-％。在一个实施方案中，可电离脂质的mol-％可以是约20mol-％至约70mol-％。在一个实施方案中，可电离脂质的mol-％可以是约30mol-％至约60mol-％。在一个实施方案中，可电离脂质的mol-％可以是约35mol-％至约55mol-％。在一个实施方案中，可电离脂质的mol-％可以是约40mol-％至约50mol-％。在一些实施方案中，转移媒介物批次的可电离脂质mol-％将是目标mol-％的±30％、±25％、±20％、±15％、±10％、±5％或±2.5％。在某些实施方案中，转移媒介物批次间可变性将小于15％、小于10％或小于5％。
在一个实施方案中，辅助脂质的mol-％可以是约1mol-％至约50mol-％。在一个实施方案中，辅助脂质的mol-％可以是约2mol-％至约45mol-％。在一个实施方案中，辅助脂质的mol-％可以是约3mol-％至约40mol-％。在一个实施方案中，辅助脂质的mol-％可以是约4mol-％至约35mol-％。在一个实施方案中，辅助脂质的mol-％可以是约5mol-％至约30mol-％。在一个实施方案中，辅助脂质的mol-％可以是约10mol-％至约20mol-％。在一些实施方案中，转移媒介物批次的辅助脂质mol-％将是目标mol-％的±30％、±25％、±20％、±15％、±10％、±5％或±2.5％。
在一个实施方案中，结构脂质的mol-％可以是约10mol-％至约80mol-％。在一个实施方案中，结构脂质的mol-％可以是约20mol-％至约70mol-％。在一个实施方案中，结构脂质的mol-％可以是约30mol-％至约60mol-％。在一个实施方案中，结构脂质的mol-％可以是约35mol-％至约55mol-％。在一个实施方案中，结构脂质的mol-％可以是约40mol-％至约50mol-％。在一些实施方案中，转移媒介物批次的结构脂质mol-％将是目标mol-％的±30％、±25％、±20％、±15％、±10％、±5％或±2.5％。
在一个实施方案中，PEG修饰的脂质的mol-％可以是约0.1mol-％至约10mol-％。在一个实施方案中，PEG修饰的脂质的mol-％可以是约0.2mol-％至约5mol-％。在一个实施方案中，PEG修饰的脂质的mol-％可以是约0.5mol-％至约3mol-％。在一个实施方案中，PEG修饰的脂质的mol-％可以是约1mol-％至约2mol-％。在一个实施方案中，PEG修饰的脂质的mol-％可以是约1.5mol-％。在一些实施方案中，转移媒介物批次的PEG修饰的脂质mol-％将是目标mol-％的±30％、±25％、±20％、±15％、±10％、±5％或±2.5％。
还考虑了包含一种或多种本文公开的化合物的药物组合物，并且特别是转移媒介物。在某些实施方案中，此类转移媒介物包含本文公开的PEG修饰的脂质、可电离脂质、辅助脂质和/或结构脂质中的一者或多者。还考虑了包含一种或多种本文公开的化合物并且还包含一种或多种额外脂质的转移媒介物。在某些实施方案中，此类转移媒介物负载有或以其他方式包封环状RNA。
本发明的转移媒介物包封环状RNA。在某些实施方案中，由本发明的化合物或药物和脂质体组合物包封的多核苷酸包括编码蛋白质或酶的RNA(例如，编码例如苯丙氨酸羟化酶(PAH)的circRNA)。本发明考虑使用此类多核苷酸作为治疗剂，所述治疗剂能够由靶细胞表达以产生(并且在某些情况下，分泌)功能性酶或蛋白质，如例如在国际申请第PCT/US2010/058457号和2011年6月8日提交的美国临时申请第61/494,881号中所公开，所述申请的教义以引用的方式整体并入本文。例如，在某些实施方案中，在靶细胞表达一种或多种多核苷酸后，可观察到受试者缺乏的功能性酶或蛋白质(例如尿素循环酶或与溶酶体贮积症相关的酶)的产生。作为另一个实例，由转移媒介物包封的环状RNA可编码T细胞受体蛋白或嵌合抗原受体(CAR)。
本文还提供了通过向受试者施用有效量的包含编码功能性蛋白质的环状RNA和本文所述的转移媒介物的组合物来治疗所述受试者的疾病的方法。在一些实施方案中，所述环状RNA被包封在转移媒介物内。在某些实施方案中，此类方法可增强(例如，增加)多核苷酸的表达和/或增加一种或多种靶细胞和组织(例如，肝细胞)中功能性多肽产物的产生和分泌。通常，此类方法包括使靶细胞与包含或以其他方式包封circRNA的一种或多种化合物和/或转移媒介物接触。
在某些实施方案中，转移媒介物(例如，脂质纳米颗粒)部分基于它们促进靶细胞(例如，环状RNA)转染的能力来配制。在另一个实施方案中，可选择和/或制备转移媒介物(例如，脂质纳米颗粒)以优化环状RNA至靶细胞、组织或器官的递送。例如，如果靶细胞是肝细胞，则可优化药物和/或脂质体组合物的性质(例如，大小、电荷和/或pH)以有效地将这种组合物(例如，脂质纳米颗粒)递送至靶细胞或器官，减少免疫清除和/或促进在靶细胞或器官中的保留。或者，如果靶组织是中枢神经系统，则转移媒介物的选择和制备必须考虑其在血脑屏障内的渗透和保留和/或使用将此类组合物(例如脂质纳米颗粒)直接递送至这种靶组织(例如，通过脑血管内施用)的替代方式。在某些实施方案中，转移媒介物可与促进包封材料跨血脑屏障转移的剂(例如，破坏或改善血脑屏障的渗透性并由此增强环状RNA至靶细胞的转移的剂)组合。虽然本文所述的转移媒介物(例如脂质纳米颗粒)可促进将circRNA引入靶细胞中，但将聚阳离子(例如聚L-赖氨酸和鱼精蛋白)作为共聚物添加至包含药物组合物的一种或多种脂质纳米颗粒在一些情况下可在体外和体内在许多细胞系中使几种类型的转移媒介物的转染效率显著增强2-28倍(参见，N.J.Caplen等人,Gene Ther.1995；2:603；S.Li等人,Gene Ther.1997；4,891.)。在一些实施方案中，靶细胞是免疫细胞。在一些实施方案中，靶细胞是T细胞。
在某些实施方案中，本文所述的转移媒介物(例如，脂质纳米颗粒)通过将多种脂质组分(例如，本文公开的一种或多种化合物)与一种或多种聚合物组分组合来制备。例如，可使用HGT4003、DOPE、胆固醇和DMG-PEG2000制备脂质纳米颗粒。脂质纳米颗粒可由不同比例的额外脂质组合组成，包括例如HGT4001、DOPE和DMG-PEG2000。构成脂质纳米颗粒的可电离脂质、辅助脂质、结构脂质和/或PEG修饰的脂质的选择以及此类脂质彼此的相对摩尔比是基于选定脂质的特性、预期靶细胞或组织的性质以及待由脂质纳米颗粒递送的材料或多核苷酸的特性。额外考虑因素包括，例如，烷基链的饱和度，以及选定脂质的尺寸、电荷、pH、pKa、融合原性(fusogenicity)和毒性。
本文所述的转移媒介物可允许包封的多核苷酸到达靶细胞，或者可在判别基础上优先允许包封的多核苷酸到达靶细胞或器官(例如，转移媒介物可集中在施用了此类转移媒介物的受试者的肝或脾中)。可替代地，转移媒介物可限制包封的多核苷酸至其他非靶向细胞或器官的递送，其中包封的多核苷酸的存在可能是不合需要的或效用有限的。
将多核苷酸(例如circRNA)负载或包封到转移媒介物中可用于保护多核苷酸免受可含有使此类多核苷酸降解的酶或化学品和/或引起此类多核苷酸的快速排泄的系统或受体的环境(例如血清)的影响。因此，在一些实施方案中，本文所述的组合物能够增强包封的多核苷酸的稳定性，特别是关于此类多核苷酸将暴露于其中的环境而言。
在某些实施方案中，本文提供了用于制备环状RNA的载体，所述载体包含5'双链体形成区、3'I组内含子片段、任选的第一间隔区、内部核糖体进入位点(IRES)、表达序列、任选的第二间隔区、5'I组内含子片段和3'双链体形成区。在一些实施方案中，这些元件以上述顺序定位在载体中。在一些实施方案中，所述载体还包含位于3'I组内含子片段与IRES之间的内部5'双链体形成区以及表达序列与5'I组内含子片段之间的内部3'双链体形成区。在一些实施方案中，内部双链体形成区能够在彼此之间形成双链体但不能与外部双链体形成区形成双链体。在一些实施方案中，内部双链体形成区是第一和第二间隔区的一部分。另外的实施方案包括环状RNA多核苷酸，包括使用本文提供的载体制备的环状RNA多核苷酸；包含这种环状RNA的组合物；包含这种环状RNA的细胞；使用和制备此类载体、环状RNA、组合物和细胞的方法。
在一些实施方案中，本文提供的方法包括将本文提供的环状RNA多核苷酸施用至细胞中以用于治疗或产生有用的蛋白质，如嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)复合物蛋白质。在一些实施方案中，由于环状RNA对核糖核酸酶的抗性，所述方法有利于在真核细胞内产生与线性RNA相比具有更长半衰期的所需多肽。
环状RNA多核苷酸缺乏核酸外切酶介导的降解所需的游离末端，从而使它们与等效线性RNA相比对几种RNA降解机制具有抗性并允许延长的半衰期。环化允许稳定通常具有短半衰期的RNA多核苷酸，并提高外源性mRNA在各种应用中的总体功效。在一个实施方案中，本文提供的环状RNA多核苷酸在真核细胞(例如，哺乳动物细胞，如人细胞)中的半衰期是至少20小时(例如，至少80小时)。
1.定义
如本文所用，术语“circRNA”或“环状多核糖核苷酸”或“环状RNA”可互换使用并且是指通过共价键形成环状结构的多核糖核苷酸。
如本文所用，术语“3'I组内含子片段”是指与天然I组内含子的包含剪接位点二核苷酸和任选的一段天然外显子序列的3'-近端具有75％或更高相似性的序列。
如本文所用，术语“5'I组内含子片段”是指与天然I组内含子的包含剪接位点二核苷酸和任选的一段天然外显子序列的5'-近端具有75％或更高相似性的序列。
如本文所用，术语“置换位点”是指I组内含子中的位点，其中在内含子置换之前进行切割。这种切割产生3'和5'I组内含子片段，所述片段被置换为在一段待环化的前体RNA的任一侧上。
如本文所用，术语“剪接位点”是指部分或完全包含在I组内含子中并且在RNA环化期间其之间的磷酸二酯键被裂解的二核苷酸。
如本文所用，术语“治疗性蛋白质”是指当以翻译的核酸的形式直接或间接施用于受试者时具有治疗、诊断和/或预防作用和/或引发所需的生物学和/或药理作用的任何蛋白质。
如本文所用，术语“免疫原性”是指诱导对物质的免疫应答的潜力。当生物体的免疫系统或某种类型的免疫细胞暴露于免疫原性物质时，可诱导免疫应答。术语“非免疫原性”是指缺乏或不存在对物质的高于可检测阈值的免疫应答。当生物体的免疫系统或某种类型的免疫细胞暴露于非免疫原性物质时，未检测到免疫应答。在一些实施方案中，当通过免疫原性测定测量时，如本文提供的非免疫原性环状多核糖核苷酸不会诱导高于预定阈值的免疫应答。在一些实施方案中，当生物体的免疫系统或某种类型的免疫细胞暴露于如本文提供的非免疫原性环状多核糖核苷酸时，未检测到先天性免疫应答。在一些实施方案中，当生物体的免疫系统或某种类型的免疫细胞暴露于如本文提供的非免疫原性环状多核糖核苷酸时，未检测到适应性免疫应答。
如本文所用，术语“环化效率”是指所得环状多核糖核苷酸与其线性起始材料相比的测量值。
如本文所用，术语“翻译效率”是指从核糖核苷酸转录物产生蛋白质或肽的速率或量。在一些实施方案中，翻译效率可表示为每给定量的编码蛋白质或肽的转录物所产生的蛋白质或肽的量。
术语“核苷酸”是指核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、其修饰形式或其类似物。核苷酸包括物质，所述物质包括嘌呤(例如，腺嘌呤、次黄嘌呤、鸟嘌呤及其衍生物和类似物)以及嘧啶(例如，胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶及其衍生物和类似物)。核苷酸类似物包括在碱基、糖和/或磷酸的化学结构中具有经修饰的核苷酸，包括但不限于，5'-位置嘧啶修饰、8'-位置嘌呤修饰、胞嘧啶环外胺处的修饰和5-溴-尿嘧啶的取代；和2'-位置糖修饰，包括但不限于糖修饰的核糖核苷酸，其中2'-OH被诸如H、OR、R、卤代基、SH、SR、NH2、NHR、NR2或CN的基团取代，其中R是如本文所定义的烷基部分。核苷酸类似物还意在包括具有碱基，例如肌苷、辫苷、黄嘌呤；糖类，如2'-甲基核糖；非天然磷酸二酯键联，如甲基膦酸酯、硫代磷酸酯和肽键联的核苷酸。核苷酸类似物包括5-甲氧基尿苷、1-甲基假尿苷和6-甲基腺苷。
术语“核酸”和“多核苷酸”在本文中可互换使用以描述任何长度(例如大于约2个碱基、大于约10个碱基、大于约100个碱基、大于约500个碱基、大于1000个碱基或多达约10,000个或更多个碱基)、由核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)组成的聚合物，并且可酶促或合成产生(例如，如美国专利第5,948,902号和其中引用的参考文献中所述)，其可以类似于两种天然存在的核酸的序列特异性方式与天然存在的核酸杂交，例如可参与沃森-克里克(Watson-Crick)碱基配对相互作用。天然存在的核酸由核苷酸组成，所述核苷酸包括鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶(分别为G、C、A、T和U)。
如本文所用术语“核糖核酸”和“RNA”意指由核糖核苷酸组成的聚合物。
如本文所用的术语“脱氧核糖核酸”和“DNA”意指由脱氧核糖核苷酸组成的聚合物。
“分离的”或“纯化的”通常是指物质(例如，在一些实施方案中，化合物、多核苷酸、蛋白质、多肽、多核苷酸组合物或多肽组合物)的分离，使得所述物质占它所存在于其中的样品的显著百分比(例如，大于1％、大于2％、大于5％、大于10％、大于20％、大于50％或更多，通常高达约90％-100％)。在某些实施方案中，基本上纯化的组分占样品的至少50％、80％-85％或90％-95％。用于纯化目标多核苷酸和多肽的技术在本领域中是熟知的，并且包括例如离子交换色谱法、亲和色谱法以及根据密度进行沉降。通常，当物质相对于样品的其他组分以大于其天然存在的量存在于样品中时，则所述物质是纯化的。
如本文所用的术语“双链体的”、“双链的”或“杂交的”是指通过含有互补序列的核酸的两条单链的杂交形成的核酸。在大多数情况下，基因组DNA是双链的。序列可完全互补或部分互补。
如本文所用，关于RNA的“非结构化”是指未被RNAFold软件或类似预测工具预测与自身或同一RNA分子中的其他序列形成结构(例如，发夹环)的RNA序列。在一些实施方案中，可使用核酸酶保护测定来在功能上表征非结构化RNA。
如本文所用，关于RNA的“结构化”是指被RNAFold软件或类似预测工具预测与自身或同一RNA分子中的其他序列形成结构(例如，发夹环)的RNA序列。
如本文所用，当两个“双链体形成区”、“同源臂”或“同源区”与彼此的反向互补序列具有足够水平的序列同一性以充当杂交反应的底物时，所述两个区域彼此互补或是互补的。如本文所用，当多核苷酸序列与反向互补序列或“互补”序列同一或共享序列同一性时，所述多核苷酸序列具有“同源性”。同源区域和对应同源区域的反向互补序列之间的序列同一性百分比可以是允许杂交发生的任何序列同一性百分比。在一些实施方案中，本发明多核苷酸的内部双链体形成区能够与另一个内部双链体形成区形成双链体并且不与外部双链体形成区形成双链体。
线性核酸分子被称为具有“5'-末端”(5'端)和“3'-末端”(3'端)，因为核酸磷酸二酯键联存在于取代单核苷酸的糖部分的5'碳和3'碳处。多核苷酸的末端核苷酸是其5'末端核苷酸，在所述末端核苷酸处新键联将是与5'碳的键联。多核苷酸的末端核苷酸是其3'末端核苷酸，在所述末端核苷酸处新键联将是与3'碳的键联。如本文所用，末端核苷酸是位于3'-或5'-末端的末端位置处的核苷酸。
“转录”是指使用DNA分子作为模板，通过RNA聚合酶形成或合成RNA分子。本发明关于用于转录的RNA聚合酶没有限制。例如，在一些实施方案中，可使用T7型RNA聚合酶。
“翻译”是指基于RNA模板由核糖体形成多肽分子。
应当理解，本文所用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，而并非旨在进行限制。如在本说明书和所附权利要求中所使用，除非内容另外明确指明，否则单数形式“一个/种(a/an)”和“所述(the)”包括复数指代物。因此，例如，提及“一个细胞”包括两个或更多个细胞的组合，或细胞的整个培养物；提及“多核苷酸”实际上包括所述多核苷酸的许多拷贝。除非明确规定或从上下文显而易见，否则如本文所使用，术语“或”被理解为包括在内。除非本文中或和说明书其余部分下文中另有定义，否则本文使用的所有技术性和科学性术语具有与本发明所属领域的技术人员通常所理解的相同的含义。
除非明确规定或从上下文显而易见，否则如本文所用，术语“约”应理解为在本领域的正常公差范围内，例如在平均值的2个标准偏差以内。“约”可理解为在所述值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、0.09％、0.08％、0.07％、0.06％、0.05％、0.04％、0.03％、0.02％或0.01％内。除非另外从上下文显而易见，否则本文提供的所有数值都由术语“约”修饰。
如本文所用，术语“编码”泛指任何过程，其中聚合大分子中的信息用于指导与第一个分子不同的第二个分子的产生。第二分子可具有与第一分子的化学性质不同的化学结构。
“共同施用”是指将本文提供的治疗剂与一种或多种额外治疗剂时间上足够接近地联合施用，使得本文提供的治疗剂可增强一种或多种额外治疗剂的效果，反之亦然。
如本文所用，术语“治疗”和“预防”以及源自其的词不一定意味着100％或完全治疗或预防。而是，存在不同程度的治疗或预防，本领域普通技术人员认为所述治疗或预防具有潜在益处或治疗效果。由本文公开的方法提供的治疗或预防可包括治疗或预防疾病的一种或多种疾患或症状。此外，出于本文的目的，“预防”可包括延迟疾病或其症状或疾患的发作。
如本文所用，术语“表达序列”可指编码产物例如肽或多肽、调控性核酸或非编码核酸的核酸序列。编码肽或多肽的示例性表达序列可包含多个核苷酸三联体，所述核苷酸三联体中的每一者可编码氨基酸并被称为“密码子”。
如本文所用，“间隔区”是指多核苷酸序列的范围从1个核苷酸至数百或数千个核苷酸、沿多核苷酸序列分隔两个其他元件的区域。序列可被限定或者可以是随机的。间隔区通常是非编码的。在一些实施方案中，间隔区包括双链体形成区。
如本文所用，“剪接位点”是指在剪接反应期间在其之间发生磷酸二酯键裂解的一个或多个二核苷酸。“5'剪接位点”是指内含子(例如I组内含子)的天然5'二核苷酸，而“3'剪接位点”是指内含子的天然3'二核苷酸。
如本文所用，“内部核糖体进入位点”或“IRES”是指大小范围从10nt至1000nt或更大、能够在没有典型RNA帽结构的情况下起始多肽的翻译的RNA序列或结构元件。IRES的长度通常是约500nt至约700nt。
如本文所用，“miRNA位点”是指多核苷酸内的能够与天然miRNA序列的至少8个核苷酸形成双链体的一段核苷酸。
如本文所用，“核酸内切酶位点”是指多核苷酸内能够被核酸内切酶蛋白识别并裂解的一段核苷酸。
如本文所用，“双顺反子RNA”是指包含编码两种不同蛋白质的两个表达序列的多核苷酸。这些表达序列通常被可裂解的肽如2A位点或IRES序列隔开。
如本文所用，术语“共配制”是指包含两种或更多种核酸或核酸和其他活性药物物质的纳米颗粒制剂。通常，比率是等摩尔的或定义为两种或更多种核酸或核酸与其他活性药物物质的比率计量的量。
如本文所用，“转移媒介物”包括任何标准药物载体、稀释剂、赋形剂等，其通常旨在与包括核酸在内的生物活性剂的施用结合使用。
如本文所用，短语“脂质纳米颗粒”是指包含一种或多种脂质(例如，在一些实施方案中，阳离子脂质、非阳离子脂质和PEG修饰的脂质)的转移媒介物。
如本文所使用，短语“阳离子脂质”是指在选定pH，如生理pH下携带净正电荷的许多脂质种类中的任一种。
如本文所使用，短语“非阳离子脂质”是指任何中性、两性离子或阴离子脂质。
如本文所使用，短语“阴离子脂质”是指在选定pH，如生理pH下携带净负电荷的许多脂质种类中的任一种。
如本文所用，短语“可电离脂质”是指在选定pH(如生理pH 4)下携带净正电荷并在其他pH(如生理pH 7)下携带中性电荷的多种脂质种类中的任一种。
在一些实施方案中，本文公开的脂质(例如可电离脂质)包含一个或多个可裂解基团。术语“裂解”和“可裂解的”在本文中用于意指主题官能团中或邻近主题官能团的原子之间的一种或多种化学键(例如，共价键、氢键、范德华力和/或离子相互作用中的一者或多者)被破坏(例如，水解)或在暴露于选定条件时(例如，在暴露于酶促条件时)能够被破坏。在某些实施方案中，可裂解基团是二硫化物官能团，并且在特定实施方案中是能够在暴露于选定生物条件(例如，细胞内条件)时被裂解的二硫化物基团。在某些实施方案中，可裂解基团是在暴露于选定生物条件时能够被裂解的酯官能团。例如，二硫化物基团可通过酶促或通过水解、氧化或还原反应裂解。在裂解这种二硫化物官能团时，可释放与其结合的一个或多个官能部分或基团(例如，一个或多个头基和/或尾基)。示例性的可裂解基团可包括但不限于二硫化物基团、酯基团、醚基团和它们的任何衍生物(例如，烷基酯和芳基酯)。在某些实施方案中，可裂解基团不是酯基或醚基。在一些实施方案中，可裂解基团键合(例如，通过氢键、范德华力、离子相互作用和共价键中的一者或多者键合)至一个或多个官能部分或基团(例如，至少一个头基和至少一个尾基)。在某些实施方案中，所述官能部分或基团中的至少一者是亲水性的(例如，包含咪唑、胍、氨基、亚胺、烯胺、任选取代的烷基氨基和吡啶基中的一者或多者的亲水性头基)。
如本文所用，术语“亲水性的”用于定性地表示官能团是水优选的，并且通常此类基团是水溶性的。例如，本文公开了包含与一个或多个亲水性基团(例如，亲水性头基)键合的可裂解二硫化物(S—S)官能团的化合物，其中此类亲水性基团包含或选自由以下组成的组：咪唑、胍、氨基、亚胺、烯胺、任选取代的烷基氨基(例如，烷基氨基如二甲基氨基)和吡啶基。
在某些实施方案中，构成本文公开的化合物的部分的至少一个官能团本质上是疏水性的(例如，包含天然存在的脂质如胆固醇的疏水性尾基)。如本文所用，术语“疏水性的”用于定性地表示官能团是避水的，并且通常此类基团不溶于水。例如，本文公开了包含与一个或多个疏水性基团键合的可裂解官能团(例如，二硫化物(S—S)基团)的化合物，其中此类疏水性基团包含一种或多种天然存在的脂质如胆固醇，和/或任选取代的、可变饱和或不饱和的C6-C20烷基和/或任选取代的、可变饱和或不饱和的C6-C20酰基。
在某些实施方案中，本文公开的化合物包含例如至少一个亲水性头基和至少一个疏水性尾基，各自与至少一个可裂解基团键合，从而使此类化合物具有两亲性。如本文用于描述化合物或组合物，术语“两亲性”是指在极性(例如，水)和非极性(例如，脂质)环境两者中均溶解的能力。例如，在某些实施方案中，本文公开的化合物包含至少一个亲脂性尾基(例如，胆固醇或C6-C20烷基)和至少一个亲水性头基(例如，咪唑)，各自与可裂解基团(例如，二硫化物)键合。
应当注意，用于描述本发明的化合物并且特别是构成此类化合物的官能团的术语“头基”和“尾基”为了便于参考用于描述一个或多个官能团相对于其他官能团的取向而使用。例如，在某些实施方案中，亲水性头基(例如胍)键合(例如，通过氢键、范德华力、离子相互作用和共价键中的一者或多者)至可裂解官能团(例如，二硫化物基团)，所述可裂解官能团进而与疏水性尾基(例如，胆固醇)键合。
如本文所用，术语“烷基”是指直链和支链C1-C40烃(例如，C6-C20烃)，并且包括饱和和不饱和烃两者。在某些实施方案中，烷基可包含一个或多个环状烷基和/或一个或多个杂原子如氧、氮或硫并且可任选地被取代基(例如，烷基、卤基、烷氧基、羟基、氨基、芳基、醚、酯或酰胺中的一者或多者)取代。在某些实施方案中，考虑的烷基包括(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯。诸如例如“C6-C20”的名称的使用旨在指代具有所述范围碳原子的烷基(例如，直链或支链并且包括烯烃和烷基)。
如本文所用，术语“芳基”是指环部分中含有六至十个碳的芳族基团(例如，单环、双环和三环结构)。芳基可任选地通过可用碳原子取代，并且在某些实施方案中可包括一个或多个杂原子，如氧、氮或硫。
在某些实施方案中，化合物和此类化合物作为其组分的转移媒介物(例如脂质纳米颗粒)表现出增强的(例如增加的)转染一种或多种靶细胞的能力。因此，本文还提供可转染一种或多种靶细胞的方法。此类方法通常包括使一种或多种靶细胞与本文公开的化合物和/或药物组合物接触的步骤，以使得一种或多种靶细胞被包封在其中的环状RNA转染。如本文所用，术语“转染(transfect)”或“转染(transfection)”是指将一种或多种包封材料(例如，核酸和/或多核苷酸)细胞内引入细胞中，或优选引入靶细胞中。术语“转染效率”是指由经受转染的靶细胞吸收、引入经受转染的靶细胞中和/或由经受转染的靶细胞表达的此类包封材料(例如，多核苷酸)的相对量。在一些实施方案中，转染效率可通过转染后由靶细胞产生的报告多核苷酸产物的量来估计。在一些实施方案中，转移媒介物具有高转染效率。在一些实施方案中，转移媒介物具有至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的转染效率。
如本文所用，术语“脂质体”通常是指由排列在一个或多个球形双层中的脂质(例如，两亲性脂质)构成的囊泡。在某些实施方案中，脂质体是脂质纳米颗粒(例如，包含一种或多种本文公开的可电离脂质化合物的脂质纳米颗粒)。此类脂质体可以是单层或多层囊泡，所述囊泡具有由亲脂性材料形成的膜和含有待递送至一种或多种靶细胞、组织和器官的包封circRNA的水性内部。在某些实施方案中，本文所述的组合物包含一个或多个脂质纳米颗粒。可用于形成所考虑的脂质体和脂质纳米颗粒的合适脂质(例如，可电离脂质)的实例包括一种或多种本文公开的化合物(例如，HGT4001、HGT4002、HGT4003、HGT4004和/或HGT4005)。此类脂质体和脂质纳米颗粒还可包含额外的可电离脂质，如C12-200、DLin-KC2-DMA和/或HGT5001、辅助脂质、结构脂质、PEG修饰的脂质、MC3、DLinDMA、DLinkC2DMA、cKK-E12、ICE、HGT5000、DODAC、DDAB、DMRIE、DOSPA、DOGS、DODAP、DODMA、DMDMA、DODAC、DLenDMA、DMRIE、CLinDMA、CpLinDMA、DMOBA、DOcarbDAP、DLinDAP、DLincarbDAP、DLinCDAP、KLin-K-DMA、DLin-K-XTC2-DMA、HGT4003以及它们的组合。
如本文所用，短语“非阳离子脂质”、“非阳离子辅助脂质”和“辅助脂质”可互换使用并且是指任何中性脂质、两性离子脂质或阴离子脂质。
如本文所使用，短语“阴离子脂质”是指在选定pH，如生理pH下携带净负电荷的许多脂质种类中的任一种。
如本文所用，短语“生物可降解脂质”或“可降解脂质”是指在宿主环境中以几分钟、几小时或几天的数量级分解的多种脂质种类中的任一种，从而理想地使它们毒性较小且不太可能随时间推移在宿主中累积。对脂质的常见修饰包括酯键和二硫键等，以增加脂质的生物降解性。
如本文所用，短语“生物可降解PEG脂质”或“可降解PEG脂质”是指许多脂质种类中的任一种，其中PEG分子以几分钟、几小时或几天的数量级在宿主环境中从脂质裂解，从而理想地使它们的免疫原性降低。对PEG脂质的常见修饰包括酯键和二硫键等，以增加脂质的生物降解性。
在本发明的某些实施方案中，制备转移媒介物(例如脂质纳米颗粒)以包封一种或多种材料或治疗剂(例如circRNA)。将所需治疗剂(例如，circRNA)并入转移媒介物的过程在本文中称为“负载”或“包封”(Lasic等人,FEBS Lett.,312:255-258,1992)。转移媒介物负载或包封的材料(例如，circRNA)可完全或部分位于转移媒介物的内部空间中、转移媒介物的双层膜内或与转移媒介物的外表面缔合。
如本文所用，术语“结构脂质”是指固醇以及含固醇部分的脂质。
如本文所定义，“固醇”是由类固醇组成的类固醇的亚组。
如本文所用，术语“结构脂质”是指固醇以及含固醇部分的脂质。
如本文所用，术语“PEG”是指任何聚乙二醇或其他聚亚烷基醚聚合物。
如本文一般定义的，“PEG-OH脂质”(在本文中也称为“羟基-聚乙二醇化脂质”)是在脂质上具有一个或多个羟基(-OH)的聚乙二醇化脂质。
如本文所用，“磷脂”是包含磷酸酯部分和一个或多个碳链，如不饱和脂肪酸链的脂质。
术语“抗体”(Ab)包括但不限于特异性地结合至抗原的糖蛋白免疫球蛋白。一般而言，抗体可包含通过二硫键互连的至少两条重(H)链和两条轻(L)链，或其抗原结合分子。每条H链包含重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区。重链恒定区包含三个恒定结构域，CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区(本文缩写为VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个恒定结构域，CL。VH和VL区可进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，其间散布着较保守的区域，称为框架区(FR)。每个VH和VL包含三个CDR和四个FR，以下列顺序从氨基末端至羧基末端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的不同细胞(例如，效应细胞)以及经典补体系统的第一组分。抗体可包括例如单克隆抗体、重组产生的抗体、单特异性抗体、多特异性抗体(包括双特异性抗体)、人抗体、工程化抗体、人源化抗体、嵌合抗体、免疫球蛋白、合成抗体、包含两个重链和两个轻链分子的四聚抗体、抗体轻链单体、抗体重链单体、抗体轻链二聚体、抗体重链二聚体、抗体轻链-抗体重链对、胞内抗体、抗体融合物(本文有时称为“抗体缀合物”)、异源缀合物抗体、单结构域抗体、单价抗体、单链抗体或单链Fv(scFv)、骆驼化抗体、亲和体(affybody)、Fab片段、F(ab')2片段、二硫化物连接的Fv(sdFv)、抗独特型(anti-id)抗体(包括例如抗-抗Id抗体)、微型抗体、结构域抗体、合成抗体(有时在本文中称为“抗体模拟物”)和上述任一者的抗原结合片段。在一些实施方案中，本文所述的抗体是指多克隆抗体群。
免疫球蛋白可源自任何公知的同种型，包括但不限于IgA、分泌型IgA、IgG和IgM。IgG亚类也是本领域技术人员众所周知的，包括但不限于人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。“同种型”是指由重链恒定区基因编码的Ab类或亚类(例如IgM或IgG1)。举例来说，术语“抗体”包括天然存在的和非天然存在的抗体；单克隆和多克隆抗体；嵌合和人源化抗体；人或非人抗体；全合成抗体；和单链抗体。非人抗体可通过重组方法进行人源化以降低其在人中的免疫原性。在没有明确说明的情况下并且除非上下文另有说明，否则术语“抗体”还包括任何上述免疫球蛋白的抗原结合片段或抗原结合部分，并且包括单价和二价片段或部分，以及单链抗体。
“抗原结合分子”、“抗原结合部分”或“抗体片段”是指包含所述分子所来源的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)的任何分子。抗原结合分子可包括抗原互补决定区(CDR)。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段、dAb、线性抗体、scFv抗体和由抗原结合分子形成的多特异性抗体。肽体(即包含肽结合结构域的Fc融合分子)是合适的抗原结合分子的另一个实例。在一些实施方案中，抗原结合分子结合至肿瘤细胞上的抗原。在一些实施方案中，抗原结合分子结合至过度增生性疾病中所涉及的细胞上的抗原或结合至病毒或细菌抗原。在一些实施方案中，抗原结合分子结合至BCMA。在其他实施方案中，抗原结合分子是特异性地结合至抗原的抗体片段，包括其一个或多个互补决定区(CDR)。在其他实施方案中，抗原结合分子是单链可变片段(scFv)。在一些实施方案中，抗原结合分子包含avimer或由avimer组成。
如本文所用，术语“可变区”或“可变结构域”可互换使用并且在本领域中是常见的。可变区通常是指抗体的一部分，一般而言是轻链或重链的一部分，通常是成熟重链中的约氨基末端110至120个氨基酸和成熟轻链中的约90至115个氨基酸，其在抗体之间的序列方面广泛不同并且用于特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。序列的变异性集中在称为互补决定区(CDR)的那些区域中，而可变结构域中保守性更高的区域被称为框架区(FR)。不希望受任何特定机制或理论的束缚，据信轻链和重链的CDR主要负责抗体与抗原的相互作用和特异性。在一些实施方案中，可变区是人可变区。在一些实施方案中，可变区包含啮齿动物或鼠CDR和人框架区(FR)。在特定实施方案中，可变区是灵长类动物(例如，非人灵长类动物)可变区。在一些实施方案中，可变区包含啮齿动物或鼠CDR和灵长类动物(例如，非人灵长类动物)框架区(FR)。
术语“VL”和“VL结构域”可互换使用来指抗体或其抗原结合分子的轻链可变区。
术语“VH”和“VH结构域”可互换使用来指抗体或其抗原结合分子的重链可变区。
CDR的许多定义是常用的：Kabat编号、Chothia编号、AbM编号或contact编号。AbM定义是Oxford Molecular的AbM抗体建模软件所使用的两者之间的折衷。接触定义是基于对可用复杂晶体结构的分析。术语“Kabat编号”和类似术语在本领域中是公认的，并且是指对抗体或其抗原结合分子的重链和轻链可变区中的氨基酸残基进行编号的系统。在某些方面，可根据Kabat编号系统来确定抗体的CDR(参见例如，Kabat EA和Wu TT(1971)Ann NYAcad Sci 190:382-391以及Kabat EA等人,(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第五版,美国卫生和公共服务部,NIH出版号91-3242)。使用Kabat编号系统，抗体重链分子内的CDR通常存在于氨基酸位置31至35(其任选地可在35之后包含一个或两个另外氨基酸(在Kabat编号方案中称为35A和35B))(CDR1)、氨基酸位置50至65(CDR2)和氨基酸位置95至102(CDR3)。使用Kabat编号系统，抗体轻链分子内的CDR通常存在于氨基酸位置24至34(CDR1)、氨基酸位置50至56(CDR2)和氨基酸位置89至97(CDR3)。在一个具体实施方案中，已经根据Kabat编号方案确定了本文所述的抗体的CDR。在某些方面，可根据Chothia编号方案来确定抗体的CDR，其是指免疫球蛋白结构环的位置(参见例如，Chothia C和Lesk AM,(1987),J Mol Biol 196:901-917；Al-Lazikani B等人,(1997)JMol Biol 273:927-948；Chothia C等人,(1992)J Mol Biol 227:799-817；Tramontano A等人,(1990)J Mol Biol 215(1):175-82；以及美国专利号7,709,226)。通常，当使用Kabat编号惯例时，Chothia CDR-H1环存在于重链氨基酸26至32、33或34处，Chothia CDR-H2环存在于重链氨基酸52至56处，并且Chothia CDR-H3环存在于重链氨基酸95至102，而ChothiaCDR-L1环存在于轻链氨基酸24至34处，Chothia CDR-L2环存在于轻链氨基酸50至56处，并且Chothia CDR-L3环存在于轻链氨基酸89至97处。当使用Kabat编号惯例编号时，ChothiaCDR-HI环的末端根据环的长度而在H32与H34之间变化(这是由于Kabat编号方案将插入放置于H35A和H35B处；如果35A或35B不存在，则环结束于32处；如果仅35A存在，则环结束于33处；如果35A和35B均存在，则环结束于34处)。在一个具体实施方案中，已经根据Chothia编号方案确定了本文所述的抗体的CDR。
如本文所用，术语“恒定区”和“恒定结构域”是可互换的，并且在本领域中具有共同含义。恒定区是不直接参与抗体与抗原的结合、但可表现出多种效应功能，如与Fc受体的相互作用的抗体部分，例如轻链和/或重链的羧基末端部分。相对于免疫球蛋白可变结构域，免疫球蛋白分子的恒定区通常具有更保守的氨基酸序列。
“结合亲和力”通常是指分子(例如，抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如，抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，否则如本文中所用，“结合亲和力”是指反映结合对的成员(例如，抗体与抗原)之间的1:1相互作用的固有结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可由解离常数(KD或Kd)表示。亲和力可以本领域中已知的多种方式来测量和/或表示，包括但不限于平衡解离常数(KD)和平衡缔合常数(KA或Ka)。KD是根据koff/kon的商计算的，而KA是根据kon/koff的商计算的。kon是指例如抗体与抗原的缔合速率常数，并且koff是指例如抗体与抗原的解离。kon和koff可通过本领域普通技术人员已知的技术，如
或KinExA来确定。
如本文所用，“保守性氨基酸取代”是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替代的一种氨基酸取代。在本领域中已经定义了具有侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合分子的CDR内或框架区内的一个或多个氨基酸残基可被具有相似侧链的氨基酸残基置换。
如本文所用，术语“异源的”是指来自除天然存在的序列以外的任何来源。
如本文所用，“表位”是本领域中的术语，并且是指抗体可与其特异性地结合的抗原的局部区域。表位可以是例如多肽的连续氨基酸(线性或连续表位)，或者表位可例如来自一种或多种多肽的两个或更多个非连续区域(构象性、非线性、不连续或非连续的表位)。在一些实施方案中，抗体所特异性地结合的表位可通过例如NMR光谱法、X射线衍射晶体学研究、ELISA测定、结合质谱法的氢/氘交换(例如，液相色谱电喷雾质谱法)、基于阵列的寡肽扫描测定和/或诱变作图(例如，定点诱变作图)来确定。对于X射线晶体学，可使用本领域中任何已知的方法来完成结晶(例如，Giege R等人,(1994)Acta Crystallogr D BiolCrystallogr 50(Pt 4):339-350；McPherson A(1990)Eur J Biochem 189:1-23；ChayenNE(1997)Structure 5:1269-1274；McPherson A(1976)J Biol Chem 251:6300-6303)。抗体：抗原晶体可使用众所周知的X射线衍射技术进行研究，并且可使用计算机软件如X-PLOR(Yale University,1992,由Molecular Simulations,Inc.分售；参见例如Meth Enzymol(1985)第114和115卷,Wyckoff HW等人编辑；U.S.2004/0014194)和BUSTER(Bricogne G(1993)Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 49(Pt 1):37-60；Bricogne G(1997)MethEnzymol 276A:361-423,Carter CW编辑；Roversi P等人,(2000)Acta Crystallogr DBiol Crystallogr 56(Pt 10):1316-1323)进行改善。
如本文所用，如果抗原与第一结合分子、抗体或其抗原结合分子之间的相互作用阻断、限制、抑制或以其他方式降低参考结合分子、参考抗体或其抗原结合分子与抗原相互作用的能力，则所述抗原结合分子、抗体或其抗原结合分子与参考抗体或其抗原结合分子“交叉竞争”。交叉竞争可以是完全的，例如结合分子与抗原的结合完全阻断参考结合分子结合抗原的能力，或者它可以是部分的，例如结合分子与抗原的结合降低参考结合分子结合抗原的能力。在一些实施方案中，与参考抗原结合分子交叉竞争的抗原结合分子与参考抗原结合分子结合相同或重叠的表位。在其他实施方案中，与参考抗原结合分子交叉竞争的抗原结合分子与参考抗原结合分子结合不同的表位。众多类型的竞争性结合测定可用于确定一种抗原结合蛋白是否与另一抗原结合蛋白竞争，例如：固相直接或间接放射免疫测定(RIA)；固相直接或间接酶免疫测定(EIA)；夹心式竞争测定(Stahli等人,1983,Methodsin Enzymology 9:242-253)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(Kirkland等人,1986,J.Immunol.137:3614-3619)；固相直接标记测定；固相直接标记夹心式测定(Harlow和Lane,1988,Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press)；使用1-125标记进行的固相直接标记RIA(Morel等人,1988,Molec.Immunol.25:7-15)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(Cheung等人,1990,Virology 176:546-552)；以及直接标记RIA(Moldenhauer等人,1990,Scand.J.Immunol.32:77-82)。
如本文所用，术语“免疫特异性地结合”、“免疫特异性地识别”、“特异性地结合”和“特异性地识别”是抗体上下文中的类似术语，并且是指结合至抗原(例如表位或免疫复合物)的分子，同样本领域技术人员理解这种结合。例如，特异性地结合至抗原的分子可结合至其他肽或多肽，通常具有较低的亲和力，如通过例如免疫测定、
KinExA3000仪器(Sapidyne Instruments,Boise,ID)或本领域中已知的其他测定所确定的。在一个具体实施方案中，特异性地结合至抗原的分子以与所述分子结合至另一抗原时的KA相比至少2log、2.5log、3log、4log或更大的KA结合至抗原。
“抗原”是指激发免疫应答或能够被抗体或抗原结合分子结合的任何分子。免疫应答可涉及抗体产生或特定免疫活性细胞的激活或两者。本领域技术人员将容易地理解任何大分子(包括几乎所有的蛋白质或肽)都可用作抗原。抗原可内源性表达，即由基因组DNA表达，或者可重组表达。抗原可对某种组织(如癌细胞)具有特异性，或者它可被广泛表达。此外，较大分子的片段可充当抗原。在一些实施方案中，抗原是肿瘤抗原。
术语“自体的”是指源自同一个体的任何材料，所述材料之后将被重新引入所述个体。例如，本文所述的工程化自体细胞疗法(eACTTM)方法涉及从患者收集淋巴细胞，然后将其工程化以表达例如CAR构建体，然后施用回至同一患者。
术语“同种异体”是指源自一个个体的任何材料，所述材料然后引入同一物种的另一个个体，例如同种异体T细胞移植。
“癌症”是指广泛的各种疾病，其特征在于体内异常细胞的不受控制的生长。不受调控的细胞分裂和生长导致恶性肿瘤的形成，所述恶性肿瘤侵入邻近组织并且还可通过淋巴系统或血流转移至身体的远端部分。“癌症”或“癌组织”可包括肿瘤。可通过本文公开的方法治疗的癌症的实例包括但不限于免疫系统的癌症，包括淋巴瘤、白血病、骨髓瘤和其他白细胞恶性肿瘤。在一些实施方案中，本文公开的方法可用于减小源自例如以下的肿瘤的肿瘤大小：骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内恶性黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门癌、胃癌、睾丸癌、子宫癌、多发性骨髓瘤、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤(PMBC)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、转化滤泡性淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤(SMZL)、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌症、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、尿道癌、阴茎癌、慢性或急性白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)(包括非T细胞ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、儿童实体瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾癌或输尿管癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊髓轴肿瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境诱导的癌症包括石棉诱导的那些癌症、其他B细胞恶性肿瘤和所述癌症的组合。在一些实施方案中，本文公开的方法可用于减小源自例如以下的肿瘤的肿瘤大小：肉瘤和癌、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、卡波济氏肉瘤、软组织肉瘤和其他肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝细胞癌、肺癌、结肠直肠癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌(例如胰腺、结肠、卵巢、肺、乳腺、胃、前列腺、子宫颈或食道的腺癌)、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、韦尔姆斯氏瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、膀胱癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、肾盂癌、CNS肿瘤(如胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑素瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤)。特定癌症可对化学疗法或放射疗法有反应，或者癌症可能是难治的。难治性癌症是指不适合手术干预的癌症，并且所述癌症最初对化学疗法或放射疗法没有反应，或者随时间推移癌症变得没有反应。
如本文所用，“抗肿瘤效应”是指可呈现为肿瘤体积减小、肿瘤细胞数量减少、肿瘤细胞增殖减少、转移的数量减少、总体或无进展存活增加、预期寿命增加或与肿瘤相关的各种生理症状的改善的生物效应。抗肿瘤效应也可指预防肿瘤的发生，例如疫苗。
如本文所用，“细胞因子”是指由一个细胞响应于与特定抗原接触而释放的非抗体蛋白，其中细胞因子与第二细胞相互作用以介导第二细胞中的反应。如本文所用的“细胞因子”是指由一个细胞群释放的作为细胞间介质作用于另一细胞的蛋白质。细胞因子可由细胞内源性表达或施用于受试者。细胞因子可由免疫细胞(包括巨噬细胞、树突细胞、B细胞、T细胞和肥大细胞)释放以传播免疫应答。细胞因子可在受体细胞中诱导各种反应。细胞因子可包括稳态细胞因子、趋化因子、促炎性细胞因子、效应物和急性期蛋白。例如，稳态细胞因子，包括白细胞介素(IL)7和IL-15促进免疫细胞存活和增殖，并且促炎性细胞因子可促进炎性应答。稳态细胞因子的实例包括但不限于IL-2、IL-4、IL-5、IL-7、IL-10、IL-12p40、IL-12p70、IL-15和干扰素(IFN)γ。促炎性细胞因子的实例包括但不限于IL-la、IL-lb、IL-6、IL-13、IL-17a、IL-23、IL-27、肿瘤坏死因子(TNF)-α、TNF-β、成纤维细胞生长因子(FGF)2、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、可溶性细胞间粘附分子1(sICAM-1)、可溶性血管粘附分子1(sVCAM-1)、血管内皮生长因子(VEGF)、VEGF-C、VEGF-D和胎盘生长因子(PLGF)。效应物的实例包括但不限于颗粒酶A、颗粒酶B、可溶性Fas配体(sFasL)、TGF-β、IL-35和穿孔素。急性期蛋白的实例包括但不限于C反应蛋白(CRP)和血清淀粉样蛋白A(SAA)。
如本文所用的术语“淋巴细胞”包括自然杀伤(NK)细胞、T细胞或B细胞。NK细胞是一种类型的细胞毒性(细胞毒性)淋巴细胞，其代表固有免疫系统的主要组分。NK细胞排斥肿瘤和被病毒感染的细胞。它通过细胞凋亡或程序性细胞死亡的过程起作用。它们被称为“自然杀手”，因为它们不需要激活即可杀死细胞。T细胞在细胞介导的免疫(无抗体参与)中起主要作用。它的T细胞受体(TCR)将自身与其他淋巴细胞类型区分开来。胸腺是免疫系统的专门器官，主要负责T细胞的成熟。存在六种类型的T细胞，即：辅助T细胞(例如CD4+细胞)、细胞毒性T细胞(也称为TC、细胞毒性T淋巴细胞、CTL、T杀伤细胞、溶细胞性T细胞、CD8+T细胞或杀伤T细胞)、记忆T细胞((i)干记忆TSCM细胞，如初始细胞，是CD45RO-、CCR7+、CD45RA+、CD62L+(L-选择素)、CD27+、CD28+和IL-7Ra+的，但它们也表达大量CD95、IL-2R[TCXCR3和LFA-1，并显示出记忆细胞所特有的许多功能属性)；(ii)中心记忆TCM细胞表达L-选择素和CCR7，它们分泌IL-2，但不分泌IFNy或IL-4，和(iii)效应记忆TEM细胞，然而，不表达L-选择素或CCR7，但产生效应细胞因子，如IFNγ和IL-4)、调节性T细胞(Treg、抑制性T细胞或CD4+CD25+或CD4+FoxP3+调节性T细胞)、自然杀伤T细胞(NKT)和γδT细胞。另一方面，B细胞在体液免疫(有抗体参与)中起主要作用。它制造抗体和抗原并发挥抗原呈递细胞(APC)的作用，并在通过抗原相互作用激活后转变为短寿命和长寿命的记忆B细胞和浆细胞。在哺乳动物中，未成熟的B细胞在骨髓中形成，它的名字由此而来。
术语“遗传工程化”或“工程化”是指修饰细胞的基因组的方法，包括但不限于缺失编码或非编码区或其一部分或插入编码区或其一部分。在一些实施方案中，经修饰的细胞是淋巴细胞，例如T细胞，其可从患者或供体获得。可修饰细胞以表达掺入细胞基因组中的外源构建体，例如嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)。
“免疫应答”是指免疫系统的细胞(例如，T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、树突细胞和嗜中性粒细胞)以及由任何这些细胞或肝脏产生的可溶性大分子(包括抗体、细胞因子和补体)的作用，所述作用导致侵入病原体、感染病原体的细胞或组织、癌细胞或其他异常细胞、或者在自身免疫性或病理性炎症的情况下正常人细胞或组织的选择性靶向、结合、损伤、破坏和/或从脊椎动物体内清除。
如本文所用，“共刺激信号”是指与初级信号(如TCR/CD3连接)组合导致T细胞反应(如但不限于增殖和/或关键分子的上调或下调)的信号。
如本文所用，“共刺激配体”包括抗原呈递细胞上的分子，所述分子特异性地结合T细胞上的同源共刺激分子。共刺激配体的结合提供介导T细胞反应(包括但不限于增殖、激活、分化等)的信号。例如，通过使T细胞受体(TCR)/CD3复合物与负载有肽的主要组织相容性复合物(MHC)分子结合，共刺激配体诱导除刺激分子提供的主要信号以外的信号。共刺激配体可包括但不限于3/TR6、4-IBB配体、激动剂或结合Toll配体受体的抗体、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、CD30配体、CD40、CD7、CD70、CD83、疱疹病毒进入介质(HVEM)、人白细胞抗原G(HLA-G)、ILT4、免疫球蛋白样转录物(ILT)3、诱导型共刺激配体(ICOS-L)、细胞间粘附分子(ICAM)、与B7-H3、淋巴毒素β受体特异性地结合的配体、MHC I类链相关蛋白A(MICA)、MHC I类链相关蛋白B(MICB)、0X40配体、PD-L2或程序性死亡(PD)LI。共刺激配体包括但不限于与T细胞上存在的共刺激分子特异性地结合的抗体，所述共刺激分子如但不限于4-1BB、B7-H3、CD2、CD27、CD28、CD30、CD40、CD7、ICOS、与CD83特异性地结合的配体、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、自然杀伤细胞受体C(NKG2C)、OX40、PD-1或肿瘤坏死因子超家族成员14(TNFSF14或LIGHT)。
“共刺激分子”是T细胞上与共刺激配体特异性地结合、从而介导T细胞的共刺激应答(如但不限于增殖)的同源结合配偶体。共刺激分子包括但不限于，“共刺激分子”是T细胞上与共刺激配体特异性地结合、从而介导T细胞的共刺激应答(如但不限于增殖)的同源结合配偶体。共刺激分子包括但不限于4-1BB/CD137、B7-H3、BAFFR、BLAME(SLAMF8)、BTLA、CD33、CD 45、CD100(SEMA4D)、CD103、CD134、CD137、CD154、CD16、CD160(BY55)、CD 18、CD19、CD19a、CD2、CD22、CD247、CD27、CD276(B7-H3)、CD28、CD29、CD3(α；β；δ；ε；γ；ζ)、CD30、CD37、CD4、CD4、CD40、CD49a、CD49D、CD49f、CD5、CD64、CD69、CD7、CD80、CD83配体、CD84、CD86、CD8α、CD8β、CD9、CD96(Tactile)、CD1-la、CDl-lb、CDl-lc、CDl-ld、CDS、CEACAM1、CRT AM、DAP-10、DNAM1(CD226)、Fcγ受体、GADS、GITR、HVEM(LIGHTR)、IA4、ICAM-1、ICAM-1、ICOS、Igα(CD79a)、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、整联蛋白、ITGA4、ITGA4、ITGA6、IT GAD、ITGAE、ITGAL、ITGAM、ITGAX、ITGB2、ITGB7、ITGB1、KIRDS2、LAT、LFA-1、LFA-1、LIGHT、LIGHT(肿瘤坏死因子超家族成员14；TNFSF14)、LTBR、Ly9(CD229)、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1(CD1 la/CD18)、MHC I类分子、NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80(KLRF1)、0X40、PAG/Cbp、PD-1、PSGL1、SELPLG(CD162)、信号传导淋巴细胞激活分子、SLAM(SLAMF1；CD150；IPO-3)、SLAMF4(CD244；2B4)、SLAMF6(NTB-A；Lyl08)、SLAMF7、SLP-76、TNF、TNFr、TNFR2、Toll配体受体、TRANCE/RANKL、VLA1或VLA-6，或它们的片段、截短或组合。
如本文所用，表述“序列同一性”或例如包含“与……50％同一性的序列”是指在比较窗口上序列在逐个核苷酸或逐个氨基酸的基础上同一的程度。因此，“序列同一性百分比”可通过以下方式进行计算：在比较窗口上比较两个最佳比对的序列、确定两个序列中出现同一核酸碱基((例如，A、T、C、G、I)或或同一氨基酸残基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位置数以得到匹配位置数，用匹配位置数除以比较窗口中的位置总数(即窗口大小)，并将结果乘以100而得到序列同一性百分比。包括与本文所述的任何参考序列具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核苷酸和多肽，通常其中多肽变体保持参考多肽的至少一种生物活性。
2.载体、前体RNA和环状RNA
在某些方面，本文提供了包含3'剪接后I组内含子片段、任选的第一间隔区、内部核糖体进入位点(IRES)、表达序列、任选的第二间隔区和5'剪接后I组内含子片段的环状RNA多核苷酸。在一些实施方案中，这些区域按所述顺序排列。在一些实施方案中，环状RNA通过本文提供的方法或由本文提供的载体制备。
在某些实施方案中，本文提供的载体(例如，包含5'同源区、3'I组内含子片段、任选的第一间隔区、内部核糖体进入位点(IRES)、表达序列、任选的第二间隔区)、5'I组内含子片段和3'同源区)的转录导致形成能够环化的前体线性RNA多核苷酸。在一些实施方案中，当在鸟苷核苷酸或核苷(例如，GTP)和二价阳离子(例如，Mg2+)存在下孵育时，此前体线性RNA多核苷酸环化。
在一些实施方案中，本文提供的载体和前体RNA多核苷酸包含第一(5')双链体形成区和第二(3')双链体形成区。在某些实施方案中，第一同源区和第二同源区可形成完美或不完美的双链体。因此，在某些实施方案中，至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的第一双链体形成区和第二双链体形成区可彼此碱基配对。在一些实施方案中，预测双链体形成区与RNA中的非预期序列(例如，非双链体形成区序列)的碱基配对小于50％(例如，小于45％、小于40％、小于35％、小于30％、小于25％)。在一些实施方案中，在前体RNA链的末端包括此类双链体形成区并且邻近或非常靠近I组内含子片段使I组内含子片段彼此靠近，从而增加剪接效率。在一些实施方案中，双链体形成区的长度是3至100个核苷酸(例如，长度为3-75个核苷酸、长度为3-50个核苷酸、长度为20-50个核苷酸、长度为35-50个核苷酸、长度为5-25个核苷酸、长度为9-19个核苷酸)。在一些实施方案中，双链体形成区的长度是约3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸。在一些实施方案中，双链体形成区具有约9至约50个核苷酸的长度。在一个实施方案中，双链体形成区具有约9至约19个核苷酸的长度。在一些实施方案中，双链体形成区具有约20至约40个核苷酸的长度。在某些实施方案中，双链体形成区具有约30个核苷酸的长度。
在某些实施方案中，本文提供的载体、前体RNA和环状RNA包含第一(5')和/或第二(3')间隔区。在一些实施方案中，在3'I组内含子片段与IRES之间包括间隔区可通过防止它们相互作用来保护那些区域中的二级结构，从而提高剪接效率。在一些实施方案中，第一间隔区(在3'I组内含子片段与IRES之间)和第二间隔区(在表达序列与5'I组内含子片段之间)包含额外的碱基配对区，所述碱基配对区被预测为与彼此碱基配对而不是与第一和第二双链体形成区碱基配对。在一些实施方案中，这种间隔区碱基配对使I组内含子片段彼此靠近，从而进一步提高剪接效率。此外，在一些实施方案中，第一双链体形成区和第二双链体形成区之间的碱基配对的组合，以及单独地第一间隔区和第二间隔区之间的碱基配对的组合，促进剪接泡的形成，所述剪接泡含有侧接相邻碱基配对区域的I组内含子片段(图25)。典型的间隔区是具有一种或多种以下特性的连续序列：1)预计可避免干扰近端结构，例如IRES、表达序列或内含子；2)长度是至少7nt且不超过100nt；3)位于3'内含子片段之后且与其相邻和/或位于5'内含子片段之前且与其相邻；和4)含有以下中的一者或多者：a)至少5nt长的非结构化区域，b)至少5nt长的与远端序列(包括另一个间隔区)碱基配对的区域，和c)范围限制于间隔区序列的至少7nt长的结构化区域。间隔区可具有若干区域，包括非结构化区域、碱基配对区域、发夹/结构化区域以及它们的组合。在一个实施方案中，间隔区具有结构化区域，所述结构化区域具有高GC含量。在一个实施方案中，间隔区内的区域与同一间隔区内的另一区域碱基配对。在一个实施方案中，间隔区内的区域与另一个间隔区内的区域碱基配对。在一个实施方案中，间隔区包含一个或多个发夹结构。在一个实施方案中，间隔区包含一个或多个发夹结构，所述发夹结构具有4至12个核苷酸的茎和2至10个核苷酸的环。在一个实施方案中，在3'I组内含子片段与IRES之间存在额外的间隔区。在一个实施方案中，这个额外的间隔区防止IRES的结构化区域干扰3'I组内含子片段的折叠或降低这种情况发生的程度。在一些实施方案中，5’间隔区序列的长度是至少7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25或30个核苷酸。在一些实施方案中，5’间隔区序列的长度不超过100、90、80、70、60、50、45、40、35或30个核苷酸。在一些实施方案中，5'间隔区序列的长度介于5与50、10与50、20与50、20与40、和/或25与35个核苷酸之间。在某些实施方案中，5'间隔区序列的长度是10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸。在一个实施方案中，5'间隔区序列是polyA序列。在另一个实施方案中，5'间隔区序列是polyAC序列。在一个实施方案中，间隔区包含约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的polyAC含量。在一个实施方案中，间隔区包含约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的多聚嘧啶(C/T或C/U)含量。
在某些实施方案中，3'I组内含子片段是与天然I组内含子的3'近端片段，包括3'剪接位点二核苷酸和任选的长度至少1nt(例如，长度至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或30nt)和至多外显子的长度的相邻外显子序列至少75％同源(例如，至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源)的连续序列。通常，5'I组内含子片段是与天然I组内含子的5'近端片段，包括5'剪接位点二核苷酸和任选的长度至少1nt(例如，长度至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或30nt)和至多外显子的长度的相邻外显子序列至少75％同源(例如，至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源)的连续序列。如Umekage等人(2012)所描述并在图33中说明，3'I组内含子片段和5'I组内含子片段的外部部分在环化中被除去，从而导致本文提供的环状RNA仅包含由长度至少1nt的任选外显子序列形成的3'I组内含子片段的部分和由长度至少1nt的任选外显子序列形成的5'I组内含子片段，如果此类序列存在于非环化前体RNA上。由环状RNA所保留的3'I组内含子片段的部分在本文中称为剪接后3'I组内含子片段。由环状RNA所保留的5'I组内含子片段的部分在本文中称为剪接后5'I组内含子片段。
在某些实施方案中，本文提供的载体、前体RNA和环状RNA包含内部核糖体进入位点(IRES)。包含IRES允许从环状RNA翻译一个或多个开放阅读框(例如，形成表达序列的开放阅读框)。IRES元件吸引真核核糖体翻译起始复合物并促进翻译起始。参见例如，Kaufman等人,Nuc.Acids Res.(1991)19:4485-4490；Gurtu等人,Biochem.Biophys.Res.Comm.(1996)229:295-298；Rees等人,BioTechniques(1996)20:102-110；Kobayashi等人,BioTechniques(1996)21:399-402；以及Mosser等人,BioTechniques 1997 22150-161)。
多种IRES序列可获得并且包括源自多种病毒的序列，如源自诸如脑心肌炎病毒(EMCV)UTR的小核糖核酸病毒的前导序列(Jang等人J.Virol.(1989)63:1651-1660)、脊髓灰质炎前导序列、甲型肝炎病毒前导序列、丙型肝炎病毒IRES、人鼻病毒2型IRES(Dobrikova等人,Proc.Natl.Acad.Sci.(2003)100(25):15125-15130)、来自口蹄疫病毒的IRES元件(Ramesh等人,Nucl.Acid Res.(1996)24:2697-2700)、贾第虫病毒IRES(Garlapati等人,J.Biol.Chem.(2004)279(5):3389-3397)等。
在一些实施方案中，所述IRES是以下病毒的IRES序列：桃拉综合征病毒、锥椿病毒、蒂勒脑脊髓炎病毒、猿猴病毒40、红火蚁病毒1、禾谷缢管蚜病毒、网状内皮增生病病毒、人脊髓灰质炎病毒1、斯氏珀蝽肠病毒、克什米尔蜜蜂病毒、人鼻病毒2、琉璃叶蝉病毒-1、人免疫缺陷病毒1型、Himetobi P病毒、丙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒、GB型肝炎病毒、口蹄疫病毒、人肠道病毒71、马鼻炎病毒、茶尺蠖微小RNA病毒样病毒、脑心肌炎病毒、果蝇C病毒、人柯萨奇病毒B3、十字花科植物烟草花叶病毒、蟋蟀麻痹病毒、牛病毒性腹泻病毒1、黑蜂王台病毒、蚜虫致死性麻痹病毒、禽脑脊髓炎病毒、急性蜜蜂麻痹病毒、木槿褪绿环斑病毒、猪瘟病毒、人FGF2、人SFTPA1、人AML1/RUNX1、果蝇触角足、人AQP4、人AT1R、人BAG-1、人BCL2、人BiP、人c-IAPl、人c-myc、人eIF4G、小鼠NDST4L、人LEF1、小鼠HIF1α、人n.myc、小鼠Gtx、人p27kipl、人PDGF2/c-sis、人p53、人Pim-1、小鼠Rbm3、果蝇reaper、犬Scamper、果蝇Ubx、人UNR、小鼠UtrA、人VEGF-A、人XIAP、果蝇无毛、酿酒酵母TFIID、酿酒酵母YAP1、烟草蚀纹病毒、芜菁皱缩病毒、EMCV-A、EMCV-B、EMCV-Bf、EMCV-Cf、EMCV pEC9、小双节RNA病毒、HCVQC64、人寇沙病毒E/D、人寇沙病毒F、人寇沙病毒JMY、鼻病毒NAT001、HRV14、HRV89、HRVC-02、HRV-A21、萨力病毒A SH1、萨力病毒FHB、萨力病毒NG-J1、人副肠孤病毒1、CrohivirusB、Yc-3、Rosavirus M-7、Shanbavirus A、Pasivirus A、Pasivirus A 2、艾柯病毒E14、人副肠孤病毒5、爱知病毒、甲型肝炎病毒HA16、Phopivirus、CVA10、肠道病毒C、肠道病毒D、肠道病毒J、人趋肝性病毒2、GBV-C GT110、GBV-C K1737、GBV-C Iowa、趋肝性病毒A 1220、PasivirusA 3、萨佩洛病毒、Rosavirus B、Bakunsa病毒、震颤病毒A、猪Pasivirus1、PLV-CHN、Pasivirus A、Sicinivirus、肝炎病毒K、肝炎病毒A、BVDV1、边界病病毒、BVDV2、CSFV-PK15C、SF573双顺反子病毒、湖北微小RNA病毒样病毒、CRPV、萨力病毒A BN5、萨力病毒ABN2、萨力病毒A 02394、萨力病毒A GUT、萨力病毒A CH、萨力病毒A SZ1、萨力病毒FHB、CVB3、CVB1、艾柯病毒7、CVB5、EVA71、CVA3、CVA12、EV24或eIF4G的适体。
在一些实施方案中，本文的多核苷酸包含表达序列。在一些实施方案中，表达序列编码CAR。在一些实施方案中，多核苷酸包含多于1个表达序列，例如2、3、4或5个表达序列。在一些实施方案中，一个这样的表达序列编码CAR并且另一个编码另一种治疗性蛋白质，如检查点抑制剂，例如PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂或CTLA-4抑制剂的抑制剂。在一些实施方案中，多核苷酸包含编码CAR的第一表达序列和编码程序性死亡1(PD-1)、PD-L1、PD-L2、细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)、TIM-3、CEACAM(例如，CEACAM-1、-3和/或-5)、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GALS、腺苷、TGFR(例如TGFRβ)、B7-H1、B7-H4(VTCN1)、OX-40、CD137、CD40或LAGS的抑制剂的第二表达序列。在一些实施方案中，抑制剂是纳武单抗、派姆单抗、伊匹单抗或阿特珠单抗。在一些实施方案中，表达序列编码被裂解成2个或更多个功能单元的蛋白质，例如CAR和另一种治疗性蛋白质。
在某些实施方案中，本文提供的多核苷酸包含CAR或TCR复合物蛋白质编码区。CAR或TCR复合物蛋白质编码区是编码嵌合抗原受体(CAR)或任何T细胞受体(TCR)复合物蛋白质的序列。在一些实施方案中，CAR或TCR复合物蛋白质编码CAR。在一些实施方案中，CAR或TCR复合物蛋白质编码区在双顺反子构建体中编码两种CAR。在一些实施方案中，CAR或TCR复合物蛋白质编码TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD3ζ、CD4和/或CD8。在一些实施方案中，CAR或TCR复合物蛋白质编码人工TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD3ζ、CD4和/或CD8变体。在一些实施方案中，CAR或TCR复合物蛋白质编码天然TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD3ζ、CD4和/或CD8变体。在一些实施方案中，CAR或TCR复合物编码区以终止密码子结束。在一些实施方案中，CAR或TCR复合物编码区以终止盒结束。
在某些实施方案中，本文提供的载体包含3'UTR。在一些实施方案中，3'UTR来自人β珠蛋白、人α珠蛋白爪蟾β珠蛋白、爪蟾α珠蛋白、人催乳素、人GAP-43、人eEFlal、人Tau、人TNFα、登革热病毒、汉坦病毒小mRNA、布尼亚病毒小mRNA、芜菁黄花叶病毒、丙型肝炎病毒、风疹病毒、烟草花叶病毒、人IL-8、人肌动蛋白、人GAPDH、人微管蛋白、木槿褪绿环斑病毒(hibiscus chlorotic rinsgspot virus)、土拨鼠肝炎病毒翻译后调控元件、辛德毕斯病毒、芜菁皱缩病毒、烟草蚀纹病毒或委内瑞拉马脑炎病毒。
在一些实施方案中，本文提供的载体包含5'UTR。在一些实施方案中，5'UTR来自人β珠蛋白、非洲爪蟾β珠蛋白、人α珠蛋白、非洲爪蟾α珠蛋白、风疹病毒、烟草花叶病毒、小鼠Gtx、登革热病毒、热休克蛋白70kDa蛋白1A、烟草醇脱氢酶、烟草蚀纹病毒、芜菁皱缩病毒或腺病毒三联前导序列。
在一些实施方案中，本文提供的载体包含polyA区。在一些实施方案中，polyA区是至少30个核苷酸长或至少60个核苷酸长。
在一些实施方案中，本文提供的DNA(例如，载体)、线性RNA(例如，前体RNA)和/或环状RNA多核苷酸的长度介于300与10000、400与9000、500与8000、600与7000、700与6000、800与5000、900与5000、1000与5000、1100与5000、1200与5000、1300与5000、1400与5000和/或1500与5000个核苷酸之间。在一些实施方案中，多核苷酸的长度是至少300nt、400nt、500nt、600nt、700nt、800nt、900nt、1000nt、1100nt、1200nt、1300nt、1400nt、1500nt、2000nt、2500nt、3000nt、3500nt、4000nt、4500nt或5000nt。在一些实施方案中，多核苷酸的长度不超过3000nt、3500nt、4000nt、4500nt、5000nt、6000nt、7000nt、8000nt、9000nt或10000nt。在一些实施方案中，本文提供的DNA、线性RNA和/或环状RNA多核苷酸的长度是约300nt、400nt、500nt、600nt、700nt、800nt、900nt、1000nt、1100nt、1200nt、1300nt、1400nt、1500nt、2000nt、2500nt、3000nt、3500nt、4000nt、4500nt、5000nt、6000nt、7000nt、8000nt、9000nt或10000nt。
在某些实施方案中，本文提供的多核苷酸是环状RNA多核苷酸或者可用于制备环状RNA多核苷酸。此类多核苷酸包含CAR或TCR复合物蛋白质编码结构域。某些当前CAR和重组TCR治疗使用编码CAR或重组TCR的DNA来工程化细胞，从而与CAR或重组TCR表达的瞬时形式相产生更大的毒性，并引入有害诱变的风险。替代方案是编码CAR或重组TCR复合物蛋白质的线性RNA。然而，线性RNA遭受短的体内半衰期，从而限制治疗功效。在某些实施方案中，本文提供的编码CAR或重组TCR复合物蛋白质的环状RNA多核苷酸提供瞬时表达的毒性优势，同时与线性RNA相比提高治疗的治疗功效。本文所述的环化RNA的方法(包括添加与I组内含子片段相邻的同源区)允许高环化效率和大RNA多核苷酸的环化。
在一些实施方案中，本文提供了载体。在某些实施方案中，载体按以下顺序包含a)5'同源区，b)3'I组内含子片段，c)任选的第一间隔区序列，d)IRES，e)表达序列(例如，CAR或TCR复合物蛋白质编码区)，f)任选的第二间隔区序列，g)5'I组内含子片段，和h)3'同源区。在一些实施方案中，载体包含位于5'同源区上游的转录启动子。
在一些实施方案中，本文提供了前体RNA。在某些实施方案中，前体RNA是通过本文提供的载体的体外转录产生的线性RNA。在一些实施方案中，前体RNA按以下顺序包含a)5'同源区，b)3'I组内含子片段，c)任选的第一间隔区序列，d)IRES，e)表达序列(例如，CAR或TCR复合物蛋白质编码区)，f)任选的第二间隔区序列，g)5'I组内含子片段，和h)3'同源区。前体RNA可以是未经修饰的、部分经修饰的或完全经修饰的。
在某些实施方案中，本文提供了环状RNA。在某些实施方案中，环状RNA是由本文提供的载体产生的环状RNA。在一些实施方案中，环状RNA是通过本文提供的前体RNA的环化产生的环状RNA。在一些实施方案中，环状RNA按以下顺序包含a)第一间隔区序列，b)IRES，c)表达序列(例如CAR或TCR复合物蛋白质编码区)，和d)第二间隔区序列。在一些实施方案中，环状RNA还包含3'I组内含子片段的位于3'剪接位点的3'的部分。在一些实施方案中，环状RNA还包含5'I组内含子片段的位于5'剪接位点的5'的部分。在一些实施方案中，环状RNA的大小是至少500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000或4500个核苷酸。环状RNA可以是未经修饰的、部分经修饰的或完全经修饰的。
在一些实施方案中，与包含相同表达序列的mRNA相比，本文提供的环状RNA具有更高的功能稳定性。在一些实施方案中，与包含相同表达序列、5moU修饰、优化的UTR、帽和/或polyA尾的mRNA相比，本文提供的环状RNA具有更高的功能稳定性。
在一些实施方案中，本文提供的环状RNA多核苷酸具有至少5小时、10小时、15小时、20小时、30小时、40小时、50小时、60小时、70小时或80小时的功能性半衰期。在一些实施方案中，本文提供的环状RNA多核苷酸具有5-80、10-70、15-60和/或20-50小时的功能性半衰期。在一些实施方案中，本文提供的环状RNA多核苷酸的功能性半衰期大于(例如，至少1.5倍，至少2倍)编码相同蛋白质的等效线性RNA多核苷酸的功能性半衰期。在一些实施方案中，功能性半衰期可通过检测功能性蛋白质合成来评估。
在一些实施方案中，本文提供的环状RNA多核苷酸具有至少5小时、10小时、15小时、20小时、30小时、40小时、50小时、60小时、70小时或80小时的半衰期。在一些实施方案中，本文提供的环状RNA多核苷酸具有5-80、10-70、15-60和/或20-50小时的半衰期。在一些实施方案中，本文提供的环状RNA多核苷酸的半衰期大于(例如，至少1.5倍，至少2倍)编码相同蛋白质的等效线性RNA多核苷酸的半衰期。
在一些实施方案中，本文提供的环状RNA可具有比等效线性mRNA更高的表达量值，例如，在向细胞施用RNA后24小时具有更高的表达量值。在一些实施方案中，与包含相同表达序列、5moU修饰、优化的UTR、帽和/或polyA尾的mRNA相比，本文提供的环状RNA具有更高的表达量值。在一些实施方案中，本文提供的环状RNA可具有比等效线性mRNA更高的稳定性。在一些实施方案中，这可通过测量体外或体内电穿孔后的受体存在和密度来显示，其中测量时间点超过1周。在一些实施方案中，这可通过经由qPCR或ISH测量RNA存在来显示。
在一些实施方案中，当暴露于生物体的免疫系统或某种类型的免疫细胞时，本文提供的环状RNA的免疫原性可低于等效mRNA。在一些实施方案中，当暴露于生物体的免疫系统或某种类型的免疫细胞时，本文提供的环状RNA与细胞因子的调节产生相关。例如，在一些实施方案中，与包含相同表达序列的mRNA相比，当暴露于生物体的免疫系统或某种类型的免疫细胞时，本文提供的环状RNA与IFN-β1、RIG-I、IL-2、IL-6、IFNγ和/或TNFα的产生减少相关。在一些实施方案中，与包含相同表达序列的mRNA相比，当暴露于生物体的免疫系统或某种类型的免疫细胞时，本文提供的环状RNA与更少IFN-β1、RIG-I、IL-2、IL-6、IFNγ和/或TNFα转录诱导相关。在一些实施方案中，本文提供的环状RNA的免疫原性低于包含相同表达序列的mRNA。在一些实施方案中，本文提供的环状RNA的免疫原性低于包含相同表达序列、5moU修饰、优化的UTR、帽和/或polyA尾的mRNA。在某些实施方案中，由于细胞因子释放综合征(CRS)，当在免疫细胞(例如T细胞)上表达CAR或TCR复合物蛋白质时，本文提供的环状RNA可导致比使用DNA进行病毒(例如慢病毒)工程化更低的毒性。在一些实施方案中，这可通过测量通过ELISA和/或qPCR评估的体外感染/转染后的细胞因子(例如IL6)释放来显示。
在某些实施方案中，由于细胞因子释放综合征(CRS)，当在免疫细胞(例如T细胞)上表达CAR或TCR复合物蛋白质时，本文提供的环状RNA可导致比使用DNA进行病毒(例如慢病毒)工程化更低的毒性。在一些实施方案中，这可通过测量通过ELISA和/或qPCR评估的体外感染/转染后的细胞因子(例如IL6)释放来显示。
在一些实施方案中，由于缺乏环状RNA的插入诱变，当在免疫细胞(例如T细胞)上表达CAR或TCR复合物蛋白质时，本文提供的环状RNA可导致比使用DNA进行病毒(例如慢病毒)工程化更低的毒性。在一些实施方式中，这可通过证明环状RNA不整合到基因组中来显示，而通过慢病毒递送的DNA可通过在施用环状RNA或DNA后进行测序来显示。在某些实施方案中，本文提供的环状RNA可按原样转染到细胞中，或者可以DNA载体形式转染并在细胞中转录。从转染的DNA载体转录环状RNA可通过添加的聚合酶或由转染到细胞中的核酸编码的聚合酶、或优选通过内源性聚合酶进行。
在某些实施方案中，本文提供的环状RNA多核苷酸包含经修饰的RNA核苷酸和/或经修饰的核苷。在一些实施方案中，经修饰的核苷是m5C(5-甲基胞苷)。在另一个实施方案中，经修饰的核苷是m5U(5-甲基尿苷)。在另一个实施方案中，经修饰的核苷是m6A(N6-甲基腺苷)。在另一个实施方案中，经修饰的核苷是s2U(2-硫代尿苷)。在另一个实施方案中，经修饰的核苷是Ψ(假尿苷)。在另一个实施方案中，经修饰的核苷是Um(2'-O-甲基尿苷)。在其他实施方案中，经修饰的核苷是m1A(1-甲基腺苷)；m2A(2-甲基腺苷)；Am(2’-O-甲基腺苷)；ms2m6A(2-甲硫基-N6-甲基腺苷)；i6A(N6-异戊烯基腺苷)；ms2i6A(2-甲硫基-N6异戊烯基腺苷)；io6A(N6-(顺式-羟基异戊烯基)腺苷)；ms2io6A(2-甲硫基-N6-(顺式-羟基异戊烯基)腺苷)；g6A(N6-甘氨酰氨基甲酰基腺苷)；t6A(N6-苏氨酰氨基甲酰基腺苷)；ms2t6A(2-甲硫基-N6-苏氨酰氨基甲酰基腺苷)；m6t6A(N6-甲基-N6-苏氨酰氨基甲酰基腺苷)；hn6A(N6-羟基正缬氨酰氨基甲酰基腺苷)；ms2hn6A(2-甲硫基-N6-羟基正缬氨酰氨基甲酰基腺苷)；Ar(p)(2’-O-核糖基腺苷(磷酸))；I(肌苷)；m1I(1-甲基肌苷)；m1Im(1,2’-O-二甲基肌苷)；m3C(3-甲基胞苷)；Cm(2’-O-甲基胞苷)；s2C(2-硫代胞苷)；ac4C(N4-乙酰基胞苷)；f5C(5-甲酰基胞苷)；m5Cm(5,2′-O-二甲基胞苷)；ac4Cm(N4-乙酰基-2'-O-甲基胞苷)；k2C(赖氨酸)；m1G(1-甲基鸟苷)；m2G(N2-甲基鸟苷)；m7G(7-甲基鸟苷)；Gm(2′-O-甲基鸟苷)；m2 2G(N2,N2-二甲基鸟苷)；m2Gm(N2,2’-O-二甲基鸟苷)；m2 2Gm(N2,N2,2’-O-三甲基鸟苷)；Gr(p)(2’-O-核糖基鸟苷(磷酸))；yW(怀丁苷)；o2yW(过氧怀丁苷)；OHyW(羟基怀丁苷)；OHyW*(修饰不足的羟基怀丁苷)；imG(怀俄苷)；mimG(甲基怀俄苷)；Q(辫苷)；oQ(环氧辫苷)；galQ(半乳糖基-辫苷)；manQ(甘露糖基-辫苷)；preQ0(7-氰基-7-脱氮鸟苷)；preQ1(7-氨基甲基-7-脱氮鸟苷)；G+(古嘌苷)；D(二氢尿苷)；m5Um(5,2’-O-二甲基尿苷)；s4U(4-硫代尿苷)；m5s2U(5-甲基-2-硫代尿苷)；s2Um(2-硫代-2'-O-甲基尿苷)；acp3U(3-(3-氨基-3-羧丙基)尿苷)；ho5U(5-羟基尿苷)；mo5U(5-甲氧基尿苷)；cmo5U(尿苷5-羟乙酸)；mcmo5U(尿苷5-羟乙酸甲酯)；chm5U(5-(羧基羟甲基)尿苷))；mchm5U(5-(羧基羟甲基)尿苷甲酯)；mcm5U(5-甲氧基羰基甲基尿苷)；mcm5Um(5-甲氧基羰基甲基-2'-O-甲基尿苷)；mcm5s2U(5-甲氧基羰基甲基-2-硫代尿苷)；nm5S2U(5-氨基甲基-2-硫代尿苷)；mnm5U(5-甲基氨基甲基尿苷)；mnm5s2U(5-甲基氨基甲基-2-硫代尿苷)；mnm5se2U(5-甲基氨基甲基-2-硒代尿苷)；ncm5U(5-氨基甲酰基甲基尿苷)；ncm5Um(5-氨基甲酰基甲基-2'-O-甲基尿苷)；cmnm5U(5-羧甲基氨基甲基尿苷)；cmnm5Um(5-羧甲基氨基甲基-2'-O-甲基尿苷)；cmnm5s2U(5-羧甲基氨基甲基-2-硫代尿苷)；m6 2A(N6,N6-二甲基腺苷)；Im(2'-O-甲基肌苷)；m4C(N4-甲基胞苷)；m4Cm(N4,2’-O-二甲基胞苷)；hm5C(5-羟甲基胞苷)；m3U(3-甲基尿苷)；cm5U(5-羧甲基尿苷)；m6Am(N6,2’-O-二甲基腺苷)；m6 2Am(N6,N6,O-2’-三甲基腺苷)；m2,7G(N2,7-二甲基鸟苷)；m2,2,7G(N2,N2,7-三甲基鸟苷)；m3Um(3,2’-O-二甲基尿苷)；m5D(5-甲基二氢尿苷)；f5Cm(5-甲酰基-2'-O-甲基胞苷)；m1Gm(1,2’-O-二甲基鸟苷)；m1Am(1,2’-O-二甲基腺苷)；τm 5U(5-牛磺酸甲基尿苷)；τm5s2U(5-牛磺酸甲基-2-硫代尿苷))；imG-14(4-脱甲基怀俄苷)；imG2(异怀俄苷)；或ac6A(N6-乙酰基腺苷)。
在一些实施方案中，经修饰的核苷可包括选自下组的化合物：吡啶-4-酮核糖核苷、5-氮杂-尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代尿苷、4-硫代假尿苷、2-硫代-假尿苷、5-羟基尿苷、3-甲基尿苷、5-羧甲基-尿苷、1-羧甲基-假尿苷、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺酸甲基尿苷、1-牛磺酸甲基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫代-尿苷、1-牛磺酸甲基-4-硫代-尿苷、5-甲基-尿苷、1-甲基假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-脱氮-假尿苷、二氢尿苷、二氢假尿苷、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-甲氧基尿苷、2-甲氧基-4-硫代-尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、5-氮杂-胞苷、假异胞苷、3-甲基-胞苷、N4-乙酰基胞苷、5-甲酰基胞苷、N4-甲基胞苷、5-羟甲基胞苷、1-甲基假异胞苷、吡咯并-胞苷、吡咯并-假异胞苷、2-硫代-胞苷、2-硫代-5-甲基-胞苷、4-硫代-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-1-脱氮-假异胞苷、1-甲基-1-脱氮-假异胞苷、泽布拉恩、5-氮杂-泽布拉恩、5-甲基-泽布拉恩、5-氮杂-2-硫代-泽布拉恩、2-硫代-泽布拉恩、2-甲氧基-胞苷、2-甲氧基-5-甲基-胞苷、4-甲氧基-假异胞苷、4-甲氧基-1-甲基-假异胞苷、2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、7-脱氮-腺嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-腺嘌呤、7-脱氮-2-氨基嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-2-氨基嘌呤、7-脱氮-2,6-二氨基嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-2,6-二氨基嘌呤、1-甲基腺苷、N6-甲基腺苷、N6-异戊烯基腺苷、N6-(顺式-羟基异戊烯基)腺苷、2-甲硫基-N6-(顺式-羟基异戊烯基)腺苷、N6-甘氨酰氨基甲酰基腺苷、N6-苏氨酰氨基甲酰基腺苷、2-甲硫基-N6-苏氨酰氨基甲酰基腺苷、N6,N6-二甲基腺苷、7-甲基腺嘌呤、2-甲硫基-腺嘌呤、2-甲氧基-腺嘌呤、肌苷、1-甲基-肌苷、怀俄苷、怀丁苷、7-脱氮-鸟苷、7-脱氮-8-氮杂-鸟苷、6-硫代-鸟苷、6-硫代-7-脱氮-鸟苷、6-硫代-7-脱氮-8-氮杂-鸟苷、7-甲基-鸟苷、6-硫代-7-甲基-鸟苷、7-甲基肌苷、6-甲氧基-鸟苷、1-甲基鸟苷、N2-甲基鸟苷、N2,N2-二甲基鸟苷、8-氧代-鸟苷、7-甲基-8-氧代-鸟苷、1-甲基-6-硫代-鸟苷、N2-甲基-6-硫代-鸟苷和N2,N2-二甲基-6-硫代-鸟苷。在另一个实施方案中，修饰独立地选自由以下组成的组：5-甲基胞嘧啶、假尿苷和1-甲基假尿苷。
在一些实施方案中，经修饰的核糖核苷包括5-甲基胞苷、5-甲氧基尿苷、1-甲基-假尿苷、N6-甲基腺苷和/或假尿苷。在一些实施方案中，此类经修饰的核苷提供额外的稳定性和对免疫激活的抗性。
在特定实施方案中，多核苷酸可以是密码子优化的。密码子优化的序列可以是这样的序列，其中编码多肽的多核苷酸中的密码子已被取代以增加多肽的表达、稳定性和/或活性。影响密码子优化的因素包括但不限于以下中的一者或多者：(i)两个或更多个生物体或基因或合成构建的偏倚表之间的密码子偏倚的变化，(ii)生物体内、基因或一组基因内的密码子偏倚程度的变化，(iii)密码子(包括背景)的系统变异，(iv)根据其解码tRNA的密码子变异，(v)根据GC％的密码子变异，无论是整体还是在三联体的一个位置中，(vi)与参考序列(例如天然存在的序列)相似度的变化，(vii)密码子频率截止的变化，(viii)从DNA序列转录的mRNA的结构性质，(ix)关于密码子取代组的设计所基于的DNA序列的功能的先前了解，和/或(x)每个氨基酸的密码子组的系统变异。在一些实施方案中，密码子优化的多核苷酸可最小化核酶碰撞和/或限制表达序列与IRES之间的结构干扰。
在某些实施方案中，本文提供的环状RNA在细胞内部产生。在一些实施方案中，前体RNA在细胞质中由噬菌体RNA聚合酶或在细胞核中由宿主RNA聚合酶II使用DNA模板(例如，在一些实施方案中，使用本文提供的载体)转录、然后环化。
在某些实施方案中，将本文提供的环状RNA注射到动物(例如，人)中，以使得由环状RNA分子编码的多肽(例如，CAR或TCR复合物蛋白质)在动物体内表达。
3.有效负载
在一些实施方案中，表达序列编码治疗性蛋白质。在一些实施方案中，治疗性蛋白质选自表1中所列的蛋白质。
表1-蛋白质表达序列和递送制剂
在一些实施方案中，多核苷酸编码由亚基组成的蛋白质，所述亚基由多于一个基因编码。例如，蛋白质可以是异二聚体，其中蛋白质的每个链或亚基由单独基因编码。有可能在转移媒介物中递送多于一个circRNA分子，并且每个circRNA编码蛋白质的单独亚基。可替代地，单一circRNA可被工程化以编码多于一个亚基。在某些实施方案中，可在单独转移媒介物中施用编码单独亚基的单独circRNA分子。
4.可电离脂质
在本文公开的某些实施方案中是脂质，所述脂质可用作转移媒介物的组分以促进或增强环状RNA至一个或多个靶细胞的递送和释放(例如，通过渗透或与此类靶细胞的脂质膜融合)。
在一些实施方案中，脂质或转移媒介物是如国际专利申请第PCT/US2010/061058号的第32-55页、美国申请公布第US2019/0314524号的第86-117段、国际专利申请第PCT/US2018/058555号的第43-146页、国际专利申请第PCT/US2018/053569号的第46-51页、国际专利申请第PCT/US2017/028981号的第195-217段、美国申请公布第US2019/0321489号的第82-95段、美国申请公布第US2019/0314284号的第5-19和/或38-77段、国际专利申请第PCT/US2019/025246号的表1-4、美国申请公布第20190091164号的第92-107段、国际专利申请第PCT/US2019/015913号的第78-97、109-164和/或190-217页中描述的脂质，所述专利各自的内容以引用的方式整体并入本文。
在一些实施方案中，脂质或转移媒介物是可电离脂质。在某些实施方案中，可电离脂质包含一个或多个可裂解官能团(例如，二硫化物)，所述官能团允许例如亲水性官能头基与化合物的亲脂性官能尾基解离(例如，在暴露于氧化、还原或酸性条件时)，从而促进一个或多个靶细胞的脂质双层中的相变。在一些实施方案中，可电离脂质是如美国专利第9,708,628号的式1所表示或如表1或2中所列的脂质，所述专利的内容以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，可电离脂质如美国专利第9,765,022号的第7-13页所述或如美国专利第9,765,022号的式1所表示，所述专利的内容以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，可电离脂质描述于国际专利申请号PCT/US2019/016362的第12-24页中或如国际专利申请PCT/US2019/016362的式1所表示，所述专利的内容以引用的方式整体并入本文。
在一些实施方案中，脂质或转移媒介物是如国际专利申请第PCT/US2010/061058号、第PCT/US2018/058555号、第PCT/US2018/053569号、第PCT/US2017/028981号、第PCT/US2019/025246号、第PCT/US2019/015913号、第PCT/US2019/016362号、第PCT/US2019/016362号、美国申请公布第US2019/0314524号、第US2019/0321489号、第US2019/0314284号和第US2019/0091164号以及美国专利第9,708,628号和第9,765,022号中所述的脂质，所述申请的内容以引用的方式整体并入本文。
在一些实施方案中，可用作转移媒介物的组分以促进或增强环状RNA至一种或多种靶细胞的递送和释放的脂质可以是表2中列出的一种或多种脂质。
表2-示例性脂质
5.PEG脂质
考虑了聚乙二醇(PEG)修饰的磷脂和衍生脂质(如衍生神经酰胺(PEG-CER)，包括N-辛酰基-鞘氨醇-1-[琥珀酰基(甲氧基聚乙二醇)-2000](C8 PEG-2000神经酰胺)使用和包含于本文所述的脂质体和药物组合物中，优选与本文公开的一种或多种化合物和脂质组合。预期的PEG修饰的脂质包括但不限于与具有C6-C20长度的烷基链的脂质共价连接的长度多达5kDa的聚乙二醇链。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法中采用的PEG修饰的脂质是1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油、甲氧基聚乙二醇(2000MW PEG)“DMG-PEG2000”。将PEG修饰的脂质添加至脂质递送媒介物可防止复合物聚集，并且还可提供用于增加循环寿命和增加脂质-多核苷酸组合物递送至靶组织的手段，(Klibanov等人(1990)FEBS Letters,268(1):235-237)，或者它们可被选择为在体内快速交换出制剂(参见美国专利第5,885,613号)。特别有用的可交换脂质是具有较短酰基链(例如，C14或C18)的PEG-神经酰胺。本发明的PEG修饰的磷脂和衍生脂质可占脂质体脂质纳米颗粒中存在的总脂质约0％至约20％、约0.5％至约20％、约1％至约15％、约4％至约10％或约2％摩尔比。
在一个实施方案中，PEG修饰的脂质描述于国际专利申请PCT/US2019/015913中。在一个实施方案中，转移媒介物包含一种或多种PEG修饰的脂质。
PEG-脂质的非限制性实例包括PEG修饰的磷脂酰乙醇胺和磷脂酸、PEG-神经酰胺缀合物(例如，PEG-CerC14或PEG-CerC20)、PEG修饰的二烷基胺和PEG修饰的1,2-二酰氧基丙-3-胺。此类脂质也称为聚乙二醇化脂质。例如，PEG脂质可以是PEG-c-DOMG、PEG-DMG、PEG-DLPE、PEG-DMPE、PEG-DPPC或PEG-DSPE脂质。
在一些实施方案中，PEG-脂质包括但不限于1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油甲氧基聚乙二醇(PEG-DMG)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基(聚乙二醇)](PEG-DSPE)、PEG-二固醇基甘油(PEG-DSG)、PEG-二棕榈油基、PEG-二油基、PEG-二硬脂基、PEG-二酰基甘油酰胺(PEG-DAG)、PEG-二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(PEG-DPPE)或PEG-l,2-二肉豆蔻酰基氧基丙基-3-胺(PEG-c-DMA)。
在一个实施方案中，PEG-脂质选自由以下组成的组：PEG修饰的磷脂酰乙醇胺、PEG修饰的磷脂酸、PEG修饰的神经酰胺、PEG修饰的二烷基胺、PEG修饰的二酰基甘油、PEG修饰的二烷基甘油以及它们的混合物。
在一些实施方案中，PEG-脂质的脂质部分包括长度为约C14至约C22、如约C14至约C16的那些。在一些实施方案中，PEG部分(例如mPEG-NH2)具有约1000、2000、5000、10,000、15,000或20,000道尔顿的大小。在一个实施方案中，PEG-脂质是PEG2k-DMG。
在一个实施方案中，本文所述的脂质纳米颗粒可包含PEG脂质，其是非扩散性PEG。非扩散性PEG的非限制性实例包括PEG-DSG和PEG-DSPE。
PEG脂质是本领域已知的，如美国专利第8158601号和国际公布第WO 2015/130584A2号中描述的那些，所述专利以引用的方式整体并入本文。
一般来说，本文所述的各式的一些其他脂质组分(例如，PEG脂质)可如国际专利申请第PCT/US2016/000129号中所述来合成，所述专利申请以引用的方式整体并入本文。
脂质纳米颗粒组合物的脂质组分可包括一种或多种包含聚乙二醇的分子，如PEG或PEG修饰的脂质。此类物质可替代地称为聚乙二醇化脂质。PEG脂质是用聚乙二醇修饰的脂质。PEG脂质可选自包括以下的非限制性组：PEG修饰的磷脂酰乙醇胺、PEG修饰的磷脂酸、PEG修饰的神经酰胺、PEG修饰的二烷基胺、PEG修饰的二酰基甘油、PEG修饰的二烷基甘油以及它们的混合物。例如，PEG脂质可以是PEG-c-DOMG、PEG-DMG、PEG-DLPE、PEG-DMPE、PEG-DPPC或PEG-DSPE脂质。
在一些实施方案中，PEG修饰的脂质是PEG-DMG的经修饰形式。PEG-DMG具有以下结构：
在一个实施方案中，可用于本发明的PEG脂质可以是国际公布第WO2012099755号中描述的PEG化脂质，所述国际公布的内容以引用的方式整体并入本文。可修饰本文所述的这些示例性PEG脂质中的任一者以在PEG链上包含羟基。在某些实施方案中，PEG脂质是PEG-OH脂质。在某些实施方案中，PEG-OH脂质在PEG链上包括一个或多个羟基。在某些实施方案中，PEG-OH或羟基-PEG化脂质在PEG链的末端包含-OH基团。每种可能性代表本发明的单独实施方案。
在一些实施方案中，PEG脂质是式(P1)的化合物：
或其盐或异构体，其中：
r是介于1与100之间的整数；
R是C10-40烷基、C10-40烯基或C10-40炔基；并且任选地R的一个或多个亚甲基独立地被C3-10亚碳环基、4至10元亚杂环基、C6-10亚芳基、4至10元亚杂芳基、-N(RN)-、-O-、-S-、-C(O)-,-C(O)N(RN)-、-NRNC(O)-、-NRNC(O)N(RN)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)O-,-OC(O)N(RN)-、-NRNC(O)O-、-C(O)S-、-SC(O)-、-C(＝NRN)-、-C(＝NRN)N(RN)-、-NRNC(＝NRN)-、-NRNC(＝NRN)N(RN)-,-C(S)-、-C(S)N(RN)-、-NRNC(S)-、-NRNC(S)N(RN)-、-S(O)-、-OS(O)-、-S(O)O-、-OS(O)O-、-OS(O)2-、-S(O)2O-、-OS(O)2O-、-N(RN)S(O)-、-S(O)N(RN)-、-N(RN)S(O)N(RN)-、-OS(O)N(RN)-、-N(RN)S(O)O-、-S(O)2-、-N(RN)S(O)2-、-S(O)2N(RN)-、-N(RN)S(O)2N(RN)-、-OS(O)2N(RN)-、或-N(RN)S(O)2O-置换；并且
RN的每个实例独立地是氢、C1-6烷基或氮保护基团。
例如，R是C17烷基。例如，PEG脂质是式(P1-a)的化合物：
或其盐或异构体，其中r是介于1与100之间的整数。
例如，PEG脂质是下式的化合物：
6.辅助脂质
在一些实施方案中，本文所述的转移媒介物(例如，LNP)包含一种或多种非阳离子辅助脂质。在一些实施方案中，辅助脂质是磷脂。在一些实施方案中，辅助脂质是磷脂替代物或取代物。在一些实施方案中，磷脂或磷脂替代物可以是例如一种或多种饱和或(多)不饱和磷脂，或磷脂替代物或它们的组合。一般来说，磷脂包含磷脂部分和一个或多个脂肪酸部分。
磷脂部分可选自，例如，由以下组成的非限制性组：磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、2-溶血磷脂酰胆碱和鞘磷脂。
脂肪酸部分可选自，例如，由以下组成的非限制性组：月桂酸、肉豆蔻酸、肉豆蔻脑酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、α-亚麻酸、芥酸、植烷酸、花生酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、山嵛酸、二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸。
磷脂包括但不限于甘油磷脂，如磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油和磷脂酸。磷脂还包括鞘磷脂(phosphosphingolipid)，如鞘磷脂(sphingomyelin)。
在一些实施方案中，辅助脂质是1,2-二硬脂酰基-177-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC)类似物、DSPC替代物、油酸或油酸类似物。
在一些实施方案中，辅助脂质是非磷脂酰胆碱(PC)两性离子脂质、DSPC类似物、油酸、油酸类似物或DSPC替代物。
在一些实施方案中，辅助脂质描述于PCT/US2018/053569中。适用于本公开的脂质组合物中的辅助脂质包括例如多种中性、不带电荷的或两性离子脂质。此类辅助脂质优选与一种或多种本文公开的化合物和脂质组合使用。辅助脂质的实例包括但不限于，5-十七烷基苯-1,3-二醇(间苯二酚)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、磷酸胆碱(DOPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、磷脂酰胆碱(PLPC)、1,2-二硬脂酰sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DAPC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、卵磷脂酰胆碱(EPC)、二月桂酰磷脂酰胆碱(DLPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、1-肉豆蔻酰基-2-棕榈酰磷脂酰胆碱(MPPC)、1-棕榈酰基-2-肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(PMPC)、1-棕榈酰基-2-硬脂酰磷脂酰胆碱(PSPC)、1,2-二花生酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DBPC)、1-硬脂酰基-2-棕榈酰磷脂酰胆碱(SPPC)、1,2-双二十碳烯酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DEPC)、棕榈酰油酰基磷脂酰胆碱(POPC)、溶血磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二亚油酰磷脂酰胆碱二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、棕榈酰油酰基磷脂酰乙醇胺(POPE)、溶血磷脂酰乙醇胺以及它们的组合。在一个实施方案中，辅助脂质可以是二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)或二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(DMPE)。在另一个实施方案中，辅助脂质可以是二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)。辅助脂质的功能是稳定和改进转移媒介物的加工。此类辅助脂质优选与其他赋形剂(例如本文公开的一种或多种可电离脂质)组合使用。在一些实施方案中，当与可电离脂质组合使用时，辅助脂质可占脂质纳米颗粒中存在的总脂质的5％至约90％或约10％至约70％摩尔比。
7.结构脂质
在一个实施方案中，结构脂质描述于国际专利申请PCT/US2019/015913中。
本文所述的转移媒介物包含一种或多种结构脂质。在脂质纳米颗粒中并入结构脂质可有助于减轻颗粒中其他脂质的聚集。结构脂质可包括但不限于胆固醇、粪固醇、麦角固醇、菜籽固醇(bassicasterol)、番茄碱、番茄苷、熊果酸、α-生育酚以及它们的混合物。在某些实施方案中，结构脂质是胆固醇。在某些实施方案中，结构脂质包括胆固醇和皮质类固醇(如例如，泼尼松龙、地塞米松、泼尼松和氢化可的松)或它们的组合。
在一些实施方案中，结构脂质是固醇。在某些实施方案中，结构脂质是类固醇。在某些实施方案中，结构脂质是胆固醇。在某些实施方案中，结构脂质是胆固醇的类似物。在某些实施方案中，结构脂质是α-生育酚。
本文所述的转移媒介物包含一种或多种结构脂质。将结构脂质并入转移媒介物(例如脂质纳米颗粒)中可有助于减轻颗粒中其他脂质的聚集。在某些实施方案中，结构脂质包括胆固醇和皮质类固醇(如例如，泼尼松龙、地塞米松、泼尼松和氢化可的松)或它们的组合。
在一些实施方案中，结构脂质是固醇。结构脂质可包括但不限于固醇(例如植物固醇或动物固醇)。
在某些实施方案中，结构脂质是类固醇。例如，固醇可包括但不限于胆固醇、β-谷固醇、粪固醇、麦角固醇、谷固醇、菜油固醇、豆固醇、菜籽固醇、麦角固醇、番茄碱、番茄苷、熊果酸或α-生育酚。
8.嵌合抗原受体
嵌合抗原受体(CARs或CAR-T)是基因工程化受体。这些工程化受体可通过如本文所述的环状RNA插入免疫细胞(包括T细胞)中并由所述免疫细胞表达。对于CAR，可对单个受体进行编程以识别特定抗原，并在与所述抗原结合时激活免疫细胞以攻击并破坏带有所述抗原的细胞。当这些抗原存在于肿瘤细胞上时，表达CAR的免疫细胞可靶向并杀死肿瘤细胞。在一些实施方案中，由多核苷酸编码的CAR包含(i)特异性地结合至靶抗原的抗原结合分子，(ii)铰链结构域、跨膜结构域和细胞内结构域，和(iii)激活结构域。
在某些方面，本文提供了包含编码嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)复合物蛋白质的蛋白质编码区的载体、前体RNA和环状RNA多核苷酸。
CAR是人工构建的杂合蛋白或多肽，其含有与T细胞信号传导结构域连接的抗原结合结构域(例如，单链可变片段(scFv))。CAR的特征包括它们利用单克隆抗体的抗原结合性质将T细胞特异性和反应性重定向至至少一个选定靶标(例如，以非MHC限制性方式)的能力。CAR识别非MHC限制性抗原的能力使表达CAR的T细胞能够独立于抗原加工而识别抗原，从而绕过肿瘤逃逸的主要机制。双特异性CAR对两种不同的抗原具有特异性。在一个实施方案中，本文提供的某些多核苷酸编码双特异性CAR。
在一些实施方案中，CAR包含跨膜结构域。在一个实施方案中，跨膜结构域包括CD8跨膜结构域。在一些实施方案中，CAR包含CD8α(CD8α)铰链和跨膜结构域。在一个优选的实施方案中，CD8是人的。CAR可包含少于完整的CD8蛋白。在一个实施方案中，跨膜结构域包括CD28跨膜结构域。在一些实施方案中，CAR包含CD28铰链和跨膜结构域。在一个优选的实施方案中，CD28是人的。CAR可包含少于完整的CD28蛋白。
在一些实施方案中，根据本公开的CAR的取向包含与共刺激结构域和激活结构域串联的抗原结合结构域(如scFv)。共刺激结构域可包含细胞外部分、跨膜部分和细胞内部分中的一者或多者。在其他实施方案中，可串联使用多个共刺激结构域。
在一些实施方案中，CAR包含CAR蛋白质间隔区。CAR蛋白质间隔区可位于任何上述结构域之间。在一个实施方案中，CAR包含IgG重链恒定结构域(CH2CH3)间隔区。在另一实施方案中，CAR蛋白质间隔区可位于scFv与跨膜结构域之间。在一个优选的实施方案中，间隔区的序列(例如CH2CH3)是人的。
在一些实施方案中，CAR或TCR复合物蛋白质是TCR复合物蛋白质(即，构成TCR复合物的一部分的蛋白质)。在一些实施方案中，TCR复合物蛋白质是重组的、天然存在的蛋白质。在一些实施方案中，TCR复合物蛋白质是构成TCR复合物的一部分的蛋白质的人工型式。在一些实施方案中，TCR复合物蛋白质是TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、CD3ζ、CD4或CD8。在一些实施方案中，TCR复合物蛋白质包含人工结合结构域和/或共刺激结构域。
在某些实施方案中，TCR复合物蛋白质包含与天然TCR Vα、Vβ、Cα和/或Cβ的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，每种CDR或TCR复合物蛋白质包含来自与目标靶标特异性地结合的TCR或其片段或衍生物的零个变化或至多一个、二个或三个变化。
抗原结合结构域
通过并入与所述靶向抗原相互作用的抗原结合分子，可将CAR工程化为与抗原(例如细胞表面抗原)结合。在一些实施方案中，抗原结合分子是其抗体片段，例如一个或多个单链抗体片段(scFv)。scFv是具有连接在一起的抗体重链和轻链的可变区的单链抗体片段。参见美国专利第7,741,465号和第6,319,494号以及Eshhar等人,Cancer ImmunolImmunotherapy(1997)45:131-136。scFv保留亲本抗体与靶抗原特异性相互作用的能力。scFv可用于嵌合抗原受体中，因为它们可工程化为与其他CAR组分一起作为单链的一部分表达。同上。还参见Krause等人,J.Exp.Med.,第188卷,第4期,1998(619-626)；Finney等人,Journal of Immunology,1998,161:2791-2797。应当理解，抗原结合分子通常包含在CAR的细胞外部分内，使得它能够识别并结合至目标抗原。双特异性和多特异性CAR涵盖在本发明的范围内，对多于一个目标靶标具有特异性。在一些实施方案中，抗原结合结构域是对靶抗原具有特异性的适体或纳米抗体。
在一些实施方案中，抗原结合分子包含单链，其中重链可变区和轻链可变区通过接头连接。在一些实施方案中，VH位于接头的N端，并且VL位于接头的C端。在其他实施方案中，VL位于接头的N端，并且VH位于接头的C端。在一些实施方案中，接头包含至少约5、至少约8、至少约10、至少约13、至少约15、至少约18、至少约20、至少约25、至少约30、至少约35、至少约40、至少约45、至少约50、至少约60、至少约70、至少约80、至少约90或至少约100个氨基酸。
在一些实施方案中，CAR或TCR包含对选自下组的抗原具有特异性的抗原结合结构域：CD19、CD123、CD22、CD30、CD171、CS-1、C型凝集素样分子-1、CD33、表皮生长因子受体变体III(EGFRvIII)、神经节苷脂G2(GD2)、神经节苷脂GD3、TNF受体家族成员B细胞成熟(BCMA)、Tn抗原((Tn Ag)或(GaINAca-Ser/Thr))、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、Fms样酪氨酸激酶3(FLT3)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)、CD38、CD44v6、癌胚抗原(CEA)、上皮细胞粘附分子(EPCAM)、B7H3(CD276)、KIT(CD117)、白细胞介素-13受体亚基α-2、间皮素、白细胞介素11受体α(IL-11Ra)、前列腺干细胞抗原(PSCA)、蛋白酶丝氨酸21、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、Lewis(Y)抗原、CD24、血小板源性生长因子受体β(PDGFR-β)、阶段特异性胚胎抗原-4(SSEA-4)、CD20、叶酸受体α、HER2、HER3、粘蛋白1、细胞表面相关(MUC1)、表皮生长因子受体(EGFR)、神经细胞粘附分子(NCAM)、前列腺酶、前列腺酸性磷酸酶(PAP)、延伸因子2突变型(ELF2M)、肝配蛋白B2、成纤维细胞活化蛋白α(FAP)、胰岛素样生长因子1受体(IGF-I受体)、碳酸酐酶IX(CAIX)、蛋白酶体(前体，巨蛋白因子)亚基β型9(LMP2)、糖蛋白100(gp100)、由断裂点簇区(BCR)和艾贝尔森鼠白血病病毒致癌基因同系物1(Abl)组成的致癌基因融合蛋白(bcr-abl)、酪氨酸酶、肝配蛋白A型受体2(EphA2)、岩藻糖基GM1、唾液酸路易斯粘附分子(sLe)、神经节苷脂GM3、转谷氨酰胺酶5(TGS5)、高分子量黑素瘤相关抗原(HMWMAA)、o-乙酰基-GD2神经节苷脂(OAcGD2)、叶酸受体β、肿瘤内皮标志物1(TEM1/CD248)、肿瘤内皮标志物7相关(TEM7R)、紧密连接蛋白6(CLDN6)、紧密连接蛋白18.2(CLDN18.2)、促甲状腺激素受体(TSHR)、G蛋白偶联受体C类5组成员D(GPRC5D)、染色体X开放阅读框61(CXORF61)、CD97、CD179a、间变性淋巴瘤激酶(ALK)、聚唾液酸、胎盘特异性1(PLAC1)、globoH甘神经酰胺(GloboH)的六糖部分、乳腺分化抗原(NY-BR-1)、尿溶蛋白2(UPK2)、甲型肝炎病毒细胞受体1(HAVCR1)、肾上腺素受体β3(ADRB3)、泛连接蛋白3(PANX3)、G蛋白偶联受体20(GPR20)、淋巴细胞抗原6复合物、基因座K9(LY6K)、嗅觉受体51E2(OR51E2)、TCRγ交替阅读框蛋白(TARP)、维尔姆斯肿瘤蛋白(WT1)、癌症/睾丸抗原1(NY-ESO-1)、癌症/睾丸抗原2(LAGE-1a)、MAGE家族成员(包括MAGE-A1、MAGE-A3和MAGE-A4)、位于染色体12p上的ETS易位变体基因6(ETV6-AML)、精子蛋白17(SPA17)、X抗原家族成员1A(XAGE1)、血管生成素结合细胞表面受体2(Tie 2)、黑素瘤癌症睾丸抗原1(MAD-CT-1)、黑素瘤癌症睾丸抗原2(MAD-CT-2)、Fos相关抗原1、肿瘤蛋白p53(p53)、p53突变体、前列腺素、存活、端粒酶、前列腺癌肿瘤抗原-1、由T细胞识别的黑素瘤抗原1、大鼠肉瘤(Ras)突变体、人端粒酶逆转录酶(hTERT)、肉瘤易位断裂点、黑素瘤细胞凋亡抑制剂(ML-IAP)、ERG(跨膜蛋白酶丝氨酸2(TMPRSS2)ETS融合基因)、N-乙酰基葡糖胺基-转移酶V(NA17)、配对盒蛋白Pax-3(PAX3)、雄激素受体、细胞周期蛋白B1、v-myc禽类骨髓细胞瘤病病毒致癌基因神经母细胞瘤源性同源物(MYCN)、Ras同源物家族成员C(RhoC)、酪氨酸酶相关蛋白2(TRP-2)、细胞色素P450 1B1(CYP1B1)、CCCTC结合因子(锌指蛋白)样、由T细胞识别的鳞状细胞癌抗原3(SART3)、配对盒蛋白Pax-5(PAX5)、前顶体蛋白结合蛋白sp32(OY-TES1)、淋巴细胞特异性蛋白质酪氨酸激酶(LCK)、A激酶锚定蛋白4(AKAP-4)、滑膜肉瘤、X断裂点2(SSX2)、高级糖化终末产物的受体(RAGE-1)、肾遍在1(RU1)、肾遍在2(RU2)、豆荚蛋白酶、人乳头瘤病毒E6(HPV E6)、人乳头瘤病毒E7(HPV E7)、肠羧基酯酶、热休克蛋白70-2突变型(mut hsp70-2)、CD79a、CD79b、CD72、白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR1)、IgA受体的Fc片段(FCAR或CD89)、白细胞免疫球蛋白样受体亚家族A成员2(LILRA2)、CD300分子样家族成员f(CD300LF)、C型凝集素结构域家族12成员A(CLEC12A)、骨髓基质细胞抗原2(BST2)、含有EGF样模块的粘蛋白样激素受体样2(EMR2)、淋巴细胞抗原75(LY75)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖Glypican-3(GPC3)、Fc受体样5(FCRL5)、MUC16、5T4、8H9、αvβθ整联蛋白、αvβ6整联蛋白、甲胎蛋白(AFP)、B7-H6、ca-125、CA9、CD44、CD44v7/8、CD52、E-钙粘蛋白、EMA(上皮膜抗原)、上皮糖蛋白-2(EGP-2)、上皮糖蛋白-40(EGP-40)、ErbB4、上皮肿瘤抗原(ETA)、叶酸结合蛋白(FBP)、激酶插入结构域受体(KDR)、k-轻链、L1细胞粘附分子、MUC18、NKG2D、癌胚抗原(h5T4)、肿瘤/睾丸抗原1B、GAGE、GAGE-1、BAGE、SCP-1、CTZ9、SAGE、CAGE、CT10、MART-1、免疫球蛋白λ样多肽1(IGLL1)、乙型肝炎表面抗原结合蛋白(HBsAg)、病毒衣壳抗原(VCA)、早期抗原(EA)、EBV核抗原(EBNA)、HHV-6p41早期抗原、HHV-6B U94潜伏抗原、HHV-6B p98晚期抗原、巨细胞病毒(CMV)抗原、大T抗原、小T抗原、腺病毒抗原、呼吸道合胞病毒(RSV)抗原、血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)、副流感1型抗原、副流感2型抗原、副流感3型抗原、副流感4型抗原、人偏肺病毒(HMPV)抗原、丙型肝炎病毒(HCV)核心抗原、HIV p24抗原、人T细胞淋巴营养性病毒(HTLV-1)抗原、梅克尔细胞多瘤病毒小T抗原、梅克尔细胞多瘤病毒大T抗原、卡波济氏肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)裂解核抗原以及KSHV潜伏核抗原。
铰链/间隔区结构域
在一些实施方案中，本公开的CAR包含铰链或间隔区结构域。在一些实施方案中，铰链/间隔区结构域可包含截短的铰链/间隔区结构域(THD)，THD结构域是完整铰链/间隔区结构域(“CHD”)的截短型式。在一些实施方案中，细胞外结构域来自或源自(例如，包含全部或其片段)ErbB2、血型糖蛋白A(GpA)、CD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD4、CD7、CD8a、CD8[T CDlla(IT GAL)、CDl lb(IT GAM)、CDl lc(ITGAX)、CDl ld(IT GAD)、CD18(ITGB2)、CD19(B4)、CD27(TNFRSF7)、CD28、CD28T、CD29(ITGB1)、CD30(TNFRSF8)、CD40(TNFRSF5)、CD48(SLAMF2)、CD49a(ITGA1)、CD49d(ITGA4)、CD49f(ITGA6)、CD66a(CEACAM1)、CD66b(CEACAM8)、CD66c(CEACAM6)、CD66d(CEACAM3)、CD66e(CEACAM5)、CD69(CLEC2)、CD79A(B细胞抗原受体复合物相关α链)、CD79B(B细胞抗原受体复合物相关β链)、CD84(SLAMF5)、CD96(Tactile)、CD100(SEMA4D)、CD103(ITGAE)、CD134(0X40)、CD137(4-1BB)、CD150(SLAMF1)、CD158A(KIR2DL1)、CD158B1(KIR2DL2)、CD158B2(KIR2DL3)、CD158C(KIR3DP1)、CD158D(KIRDL4)、CD158F1(KIR2DL5A)、CD158F2(KIR2DL5B)、CD158K(KIR3DL2)、CD160(BY55)、CD162(SELPLG)、CD226(DNAM1)、CD229(SLAMF3)、CD244(SLAMF4)、CD247(CD3-ζ)、CD258(LIGHT)、CD268(BAFFR)、CD270(TNFSF14)、CD272(BTLA)、CD276(B7-H3)、CD279(PD-1)、CD314(NKG2D)、CD319(SLAMF7)、CD335(NK-p46)、CD336(NK-p44)、CD337(NK-p30)、CD352(SLAMF6)、CD353(SLAMF8)、CD355(CRT AM)、CD357(TNFRSF18)、诱导性T细胞共刺激因子(ICOS)、LFA-1(CDl la/CD18)、NKG2C、DAP-10、ICAM-1、NKp80(KLRF1)、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Rα、LFA-1、SLAMF9、LAT、GADS(GrpL)、SLP-76(LCP2)、PAG1/CBP、CD83配体、Fcγ受体、MHC 1类分子、MHC 2类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白蛋白质、细胞因子受体、整联蛋白、激活NK细胞受体、Toll配体受体以及其片段或组合。铰链或间隔区结构域可源自天然来源或源自合成来源。
在一些实施方案中，铰链或间隔区结构域位于抗原结合分子(例如，scFv)与跨膜结构域之间。以这种取向，铰链/间隔区结构域提供抗原结合分子与表达CAR的细胞膜表面之间的距离。在一些实施方案中，铰链或间隔区结构域来自或源自免疫球蛋白。在一些实施方案中，铰链或间隔区结构域选自IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgD、IgE和IgM或其片段的铰链/间隔区。在一些实施方案中，铰链或间隔区结构域包含、来自或源自CD8α的铰链/间隔区。在一些实施方案中，铰链或间隔区结构域包含、来自或源自CD28的铰链/间隔区。在一些实施方案中，铰链或间隔区结构域包含CD8α的铰链/间隔区的片段或CD28的铰链/间隔区的片段，其中所述片段是小于完整铰链/间隔区的任何片段。在一些实施方案中，CD8α铰链/间隔区的片段或CD28铰链/间隔区的片段包含排除CD8α铰链/间隔区或CD28铰链/间隔区的N端或C端或两者处的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20个氨基酸的氨基酸序列。
跨膜结构域
本公开的CAR还可包含跨膜结构域和/或细胞内信号传导结构域。跨膜结构域可被设计为与CAR的细胞外结构域融合。它可类似地融合至CAR的细胞内结构域。在一些实施方案中，使用与CAR中的结构域之一天然相关的跨膜结构域。在一些情况下，可对跨膜结构域进行选择或修饰(例如，通过氨基酸取代)以避免此类结构域结合至相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域，以便使与受体复合物的其他成员的相互作用最小化。跨膜结构域可源自天然来源或合成来源。在来源是天然来源的情况下，所述结构域可源自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。
跨膜区可源自(即，包含)受体酪氨酸激酶(例如，ErbB2)、血型糖蛋白A(GpA)、4-1BB/CD137、激活NK细胞受体、免疫球蛋白蛋白质、B7-H3、BAFFR、BFAME(SEAMF8)、BTEA、CD100(SEMA4D)、CD103、CD160(BY55)、CD 18、CD 19、CD 19a、CD2、CD247、CD27、CD276(B7-H3)、CD28、CD29、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD30、CD4、CD40、CD49a、CD49D、CD49f、CD69、CD7、CD84、CD8α、CD8β、CD96(Tactile)、CD1 la、CD1 lb、CD1 lc、CD1 Id、CDS、CEACAM1、CRT AM、细胞因子受体、DAP-10、DNAM1(CD226)、Fcγ受体、GADS、GITR、HVEM(EIGHTR)、IA4、ICAM-1、ICAM-1、Igα(CD79a)、IE-2Rβ、IE-2Rγ、IE-7Rα、诱导性T细胞共刺激因子(ICOS)、整联蛋白、ITGA4、ITGA4、ITGA6、IT GAD、ITGAE、ITGAE、IT GAM、ITGAX、ITGB2、ITGB7、ITGB1、KIRDS2、EAT、LFA-1、LFA-1、与CD83特异性地结合的配体、LIGHT、LIGHT、LTBR、Ly9(CD229)、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1；CDl-la/CD18)、MHC 1类分子、NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80(KLRF1)、OX-40、PAG/Cbp、程序性死亡-1(PD-1)、PSGL1、SELPLG(CD162)、信号传导淋巴细胞激活分子(SLAM蛋白)、SLAM(SLAMF1；CD150；IPO-3)、SLAMF4(CD244；2B4)、SLAMF6(NTB-A；Lyl08)、SLAMF7、SLP-76、TNF受体蛋白、TNFR2、TNFSF14、Toll配体受体、TRANCE/RANKL、VLA1或VLA-6或其片段、截短或组合。
在一些实施方案中，受体酪氨酸激酶可源自(例如，包含)胰岛素受体(InsR)、胰岛素样生长因子I受体(IGF1R)、胰岛素受体相关受体(IRR)、血小板源性生长因子受体α(PDGFRa)、血小板源性生长因子受体β(PDGFRfi)、KIT原癌基因受体酪氨酸激酶(Kit)、集落刺激因子1受体(CSFR)、fms相关酪氨酸激酶3(FLT3)、fms相关酪氨酸激酶1(VEGFR-1)、激酶插入结构域受体(VEGFR-2)、fms相关酪氨酸激酶4(VEGFR-3)、成纤维细胞生长因子受体1(FGFR1)、成纤维细胞生长因子受体2(FGFR2)、成纤维细胞生长因子受体3(FGFR3)、成纤维细胞生长因子受体4(FGFR4)、蛋白酪氨酸激酶7(CCK4)、神经营养受体酪氨酸激酶1(trkA)、神经营养受体酪氨酸激酶2(trkB)、神经营养受体酪氨酸激酶3(trkC)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体2(ROR2)、肌肉相关受体酪氨酸激酶(MuSK)、MET原癌基因、受体酪氨酸激酶(MET)、巨噬细胞刺激1受体(Ron)、AXL受体酪氨酸激酶(Axl)、TYR03蛋白酪氨酸激酶(Tyro3)、MER原癌基因、酪氨酸激酶(Mer)、具有免疫球蛋白样和EGF样结构域的酪氨酸激酶1(TIE1)、TEK受体酪氨酸激酶(TIE2)、EPH受体A1(EphAl)、EPH受体A2(EphA2)、(EPH受体A3)EphA3、EPH受体A4(EphA4)、EPH受体A5(EphA5)、EPH受体A6(EphA6)、EPH受体A7(EphA7)、EPH受体A8(EphA8)、EPH受体A10(EphAlO)、EPH受体B1(EphBl)、EPH受体B2(EphB2)、EPH受体B3(EphB3)、EPH受体B4(EphB4)、EPH受体B6(EphB6)、ret原癌基因(Ret)、受体样酪氨酸激酶(RYK)、盘状结构域受体酪氨酸激酶1(DDR1)、盘状结构域受体酪氨酸激酶2(DDR2)、c-ros致癌基因1、受体酪氨酸激酶(ROS)、凋亡相关酪氨酸激酶(Lmrl)、狐猴酪氨酸激酶2(Lmr2)、狐猴酪氨酸激酶3(Lmr3)、白细胞受体酪氨酸激酶(LTK)、ALK受体酪氨酸激酶(ALK)或丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶1(STYK1)。
共刺激结构域
在某些实施方案中，CAR包含共刺激结构域。在一些实施方案中，共刺激结构域包含4-1BB(CD137)、CD28或两者，和/或细胞内T细胞信号传导结构域。在一个优选的实施方案中，共刺激结构域是人CD28、人4-1BB或两者，并且细胞内T细胞信号传导结构域是人CD3ζ(ζ)。4-1BB、CD28、CD3ζ或这些中的任一者可分别包含少于完整的4-1BB、CD28或CD3ζ。嵌合抗原受体可并入共刺激(信号传导)结构域以增加其效力。参见美国专利第7,741,465号和第6,319,494号以及Krause等人和Finney等人(同上)；Song等人,Blood 119:696-706(2012)；Kalos等人,Sci Transl.Med.3:95(2011)；Porter等人,N.Engl.J.Med.365:725-33(2011)和Gross等人,Amur.Rev.Pharmacol.Toxicol.56:59-83(2016)。
在一些实施方案中，共刺激结构域包含SEQ ID NO:318或320的氨基酸序列。
细胞内信号传导结构域
本文公开的工程化T细胞的细胞内(信号传导)结构域可向激活结构域提供信号传导，所述激活结构域然后激活免疫细胞的至少一种正常效应功能。例如，T细胞的效应功能可以是溶细胞活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。
在一些实施方案中，合适的细胞内信号传导结构域包括(例如，包含)但不限于4-1BB/CD137、激活NK细胞受体、免疫球蛋白蛋白质、B7-H3、BAFFR、BLAME(SLAMF8)、BTLA、CD100(SEMA4D)、CD103、CD160(BY55)、CD18、CD19、CD 19a、CD2、CD247、CD27、CD276(B7-H3)、CD28、CD29、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD30、CD4、CD40、CD49a、CD49D、CD49f、CD69、CD7、CD84、CD8α、CD8β、CD96(Tactile)、CD1 la、CD1 lb、CD1 lc、CD1 Id、CDS、CEACAM1、CRT AM、细胞因子受体、DAP-10、DNAM1(CD226)、Fcγ受体、GADS、GITR、HVEM(LIGHTR)、IA4、ICAM-1、ICAM-1、Igα(CD79a)、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Rα、诱导性T细胞共刺激因子(ICOS)、整联蛋白、ITGA4、ITGA4、ITGA6、IT GAD、ITGAE、ITGAL、IT GAM、ITGAX、ITGB2、ITGB7、ITGB1、KIRDS2、LAT、LFA-1、LFA-1、与CD83特异性地结合的配体、LIGHT、LIGHT、LTBR、Ly9(CD229)、Lyl08)、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1；CDl-la/CD18)、MHC 1类分子、NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80(KLRF1)、OX-40、PAG/Cbp、程序性死亡-1(PD-1)、PSGL1、SELPLG(CD162)、信号传导淋巴细胞激活分子(SLAM蛋白)、SLAM(SLAMF1；CD150；IPO-3)、SLAMF4(CD244；2B4)、SLAMF6(NTB-A、SLAMF7、SLP-76、TNF受体蛋白、TNFR2、TNFSF14、Toll配体受体、TRANCE/RANKL、VLA1或VLA-6或其片段、截短或组合。
CD3是天然T细胞上T细胞受体的元件，并且已被证明是CAR中重要的细胞内激活元件。在一些实施方案中，CD3是CD3ζ。在一些实施方案中，激活结构域包含与SEQ ID NO:319的多肽序列具有至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一性的氨基酸序列。
9.多核苷酸的产生
本文提供的载体可使用分子生物学的标准技术制备。例如，本文提供的载体的各种元件可使用重组方法获得，如通过从细胞中筛选cDNA和基因组文库，或通过从已知包含多核苷酸的载体产生它们。
基于已知序列，本文提供的载体的各种元件也可合成产生，而不是克隆。完整序列可由通过标准方法制备并组装成完整序列的重叠寡核苷酸组装。参见例如，Edge,Nature(1981)292:756；Nambair等人,Science(1984)223:1299；和Jay等人,J.Biol.Chem.(1984)259:631 1。
因此，特定核苷酸序列可从具有所需序列的载体获得，或者在适当的情况下使用本领域已知的各种寡核苷酸合成技术如定点诱变和聚合酶链式反应(PCR)技术完全或部分地合成。获得编码所需载体元件的核苷酸序列的一种方法是使常规自动化多核苷酸合成仪中产生的重叠合成寡核苷酸的互补组退火，然后用合适的DNA连接酶连接并通过PCR扩增连接的核苷酸序列。参见例如，Jayaraman等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1991)88:4084-4088。此外，可使用寡核苷酸指导的合成(Jones等人,Nature(1986)54:75-82)、预先存在的核苷酸区域的寡核苷酸指导的诱变(Riechmann等人,Nature(1988)332:323-327和Verhoeyen等人,Science(1988)239:1534-1536)以及使用T4 DNA聚合酶对有缺口的寡核苷酸进行酶促填充(Queen等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1989)86:10029-10033)。
本文提供的前体RNA可通过在允许由载体编码的前体RNA转录的条件下孵育本文提供的载体来产生。例如，在一些实施方案中，通过在允许体外转录的条件下将本文提供的载体与相容的RNA聚合酶一起孵育来合成前体RNA，所述载体在其5'双链体形成区和/或表达序列上游包含RNA聚合酶启动子。在一些实施方案中，通过噬菌体RNA聚合酶在细胞内孵育载体或通过宿主RNA聚合酶II在细胞核中孵育载体。
在某些实施方案中，本文提供了通过使用本文提供的载体作为模板(例如，具有位于5'同源区上游的RNA聚合酶启动子的本文提供的载体)进行体外转录来产生前体RNA的方法。
在某些实施方案中，所得前体RNA可用于通过在镁离子和鸟苷核苷酸或核苷存在下在RNA环化发生的温度(例如介于20℃与60℃之间)下孵育来产生环状RNA(例如，本文提供的环状RNA多核苷酸)。
因此，在某些实施方案中，本文提供了制备环状RNA的方法。在某些实施方案中，所述方法包括通过以下方式合成前体RNA：使用本文提供的载体(例如，按以下顺序包含5'同源区、3'I组内含子片段、第一间隔区、内部核糖体进入位点(IRES)、表达序列、第二间隔区、5'I组内含子片段和3'同源区的载体)作为模板转录(例如，失控转录(run-offtranscription))并在二价阳离子(例如镁离子)和GTP存在下孵育所得前体RNA，以使得其环化形成环状RNA。在一些实施方案中，本发明的前体RNA能够在不存在镁离子和GTP和/或没有与镁离子和GTP孵育的步骤的情况下环化。在一些实施方案中，在过量GMP存在下进行转录。
在一些实施方案中，包含环状RNA的组合物已被纯化。环状RNA可通过本领域常用的任何已知方法纯化，如柱色谱法、凝胶过滤色谱法和尺寸排阻色谱法。在一些实施方案中，纯化包括以下步骤中的一个或多个：磷酸酶处理、HPLC尺寸排阻纯化和RNA酶R消化。在一些实施方案中，纯化依次包括以下步骤：RNA酶R消化、磷酸酶处理和HPLC尺寸排阻纯化。在一些实施方案中，纯化包括反相HPLC。在一些实施方案中，与未纯化的RNA相比，纯化的组合物含有更少的双链RNA、DNA夹板、三磷酸化RNA、磷酸酶蛋白、蛋白连接酶、加帽酶和/或切口RNA。在一些实施方案中，纯化的组合物的免疫原性低于未纯化的组合物。在一些实施方案中，与暴露于未纯化的组合物的免疫细胞相比，暴露于纯化组合物的免疫细胞产生更少的IFN-β1、RIG-I、IL-2、IL-6、IFNγ和/或TNFα。
10.纳米颗粒
在某些方面，本文提供了包含本文提供的环状RNA的药物组合物。在某些实施方案中，将此类药物组合物用纳米颗粒配制以促进递送。
在某些实施方案中，本文提供的环状RNA可以转移媒介物例如纳米颗粒或包含纳米颗粒的组合物的形式递送和/或靶向至细胞。在一些实施方案中，所述环状RNA还可以转移媒介物或包含转移媒介物的组合物形式递送给受试者。在一些实施方案中，所述转移媒介物是纳米颗粒。在一些实施方案中，所述纳米颗粒是脂质纳米颗粒、非脂质聚合物核-壳纳米颗粒或生物可降解纳米颗粒。在一些实施方案中，转移媒介物包含一种或多种阳离子脂质、非阳离子脂质、可电离脂质、PEG修饰的脂质、聚谷氨酸脂质、透明质酸脂质、聚β-氨基酯、聚β氨基肽或带正电荷的肽。
在一个实施方案中，可选择和/或制备转移媒介物以优化circRNA至靶细胞的递送。例如，如果靶细胞是肝细胞，则可优化转移媒介物的性质(例如，大小、电荷和/或pH)以有效地将这种转移媒介物递送至靶细胞，减少免疫清除和/或促进在所述靶细胞中的保留。可替代地，如果靶细胞是中枢神经系统(例如，用于治疗神经退行性疾病的circRNA可特异性地靶向脑或脊髓组织)，则转移媒介物的选择和制备必须考虑渗透；和保留在血脑屏障内和/或使用将这种转移媒介物直接递送至这种靶细胞的替代方式。在一个实施方案中，本发明的组合物可与促进外源性circRNA转移的剂(例如，破坏或改善血脑屏障渗透性且由此增强外源性circRNA至靶细胞的转移的剂)组合。
本发明考虑使用转移媒介物来促进将核酸递送至靶细胞。脂质体(例如，脂质体脂质纳米颗粒)通常可用于研究、工业和医学中的各种应用，特别是用作体内诊断性或治疗性化合物的转移媒介物(Lasic,Trends Biotechnol.,16:307-321,1998；Drummond等人,Pharmacol.Rev.,51:691-743,1999)并且通常被表征为微观囊泡，所述微观囊泡具有通过一个或多个双层的膜与外部介质隔离的内部水性空间。脂质体的双层膜通常由两亲性分子形成，如合成或天然来源的脂质，所述脂质包含空间分离的亲水性和疏水性结构域(Lasic,Trends Biotechnol.,16:307-321,1998)。脂质体的双层膜也可通过两亲性聚合物和表面活性剂(例如，聚合物囊泡、囊泡等)来形成。
在本发明的上下文中，转移媒介物通常用于将环状RNA运输至靶细胞。对于本发明的目的，转移媒介物被制备为含有所需的核酸。将所需实体(例如，核酸)并入脂质体的过程通常被称为负载(Lasic等人,FEBS Lett.,312:255-258,1992)。并入脂质体的核酸可完全或部分位于脂质体的内部空间、脂质体的双层膜内，或与脂质体膜的外部表面相关联。将circRNA并入转移媒介物如脂质体的目的经常是保护核酸免于可能含有使核酸降解的酶或化学品和/或导致核酸快速排泄的系统或受体的环境。因此，在本发明的一个实施方案中，选定的转移媒介物能够增强其中所含的circRNA的稳定性。脂质体能够允许包封的circRNA到达靶细胞和/或可允许包封的circRNA到达靶细胞，或者可替代地限制这种circRNA递送至其他部位或细胞，在所述部位或细胞中所施用的circRNA的存在可能是无用的或不合乎需要的。此外，将circRNA并入转移媒介物例如阳离子脂质体中也有助于将这种circRNA递送至靶细胞中。
理想地，转移媒介物被制备为包封一种或多种所需的circRNA，以使得组合物展现高转染效率和增强的稳定性。虽然脂质体可促进将核酸引入靶细胞中，但添加聚阳离子(例如，聚L-赖氨酸和鱼精蛋白)作为共聚物可促进并在一些情况下使几种类型的阳离子脂质体在体外和体内在许多细胞系中的转染效率显著增强2-28倍。(参见N J.Caplen等人,GeneTher.1995；2:603；S.Li等人,Gene Ther.1997；4,891。)
在本发明的一个实施方案中，转移媒介物被配制为脂质纳米颗粒。在一个实施方案中，脂质纳米颗粒被配制成将一种或多种circRNA递送至一种或多种靶细胞。合适脂质的实例包括磷脂酰基化合物(例如，磷脂酰甘油、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、鞘脂、脑苷脂和神经节苷脂)。还考虑使用聚合物作为转移媒介物，不论单独或与其它转移媒介物组合。合适的聚合物可包括例如聚丙烯酸酯、聚氰基丙烯酸烷基酯、聚丙交酯、聚丙交酯-聚乙交酯共聚物、聚己内酯、葡聚糖、白蛋白、明胶、海藻酸盐、胶原、壳聚糖、环糊精、树枝状聚合物和聚乙烯亚胺。在一个实施方案中，转移媒介物被配制为脂质，如美国专利申请16/065,067中所述，所述申请整体并入本文。在一个实施方案中，基于其促进circRNA转染至靶细胞的能力来选择转移媒介物。
本发明考虑使用脂质纳米颗粒作为包含阳离子脂质的转移媒介物，以包封和/或增强将circRNA递送至靶细胞中，所述靶细胞将充当蛋白质产生的贮库。所考虑的脂质纳米颗粒可通过包括使用一种或多种阳离子脂质、非阳离子脂质和PEG-修饰是脂质的不同比率的多组分脂质混合物来制备。一些阳离子脂质已经在文献中描述，其中许多可商购获得。
用于本发明的组合物和方法中的合适的阳离子脂质包括在国际专利公布WO2010/053572和/或美国专利申请15/809,680中描述的那些，例如C12-200。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法采用脂质纳米颗粒，所述脂质纳米颗粒包含在2012年3月29日提交的美国临时专利申请61/617,468(以引用的方式并入本文)中描述的可电离阳离子脂质，如例如，(15Z,18Z)—N,N-二甲基-6-(9Z,12Z)-十八-9,12-二烯-1-基)二十四-15,18-二烯-1-胺(HGT5000)、(15Z,18Z)—N,N-二甲基-6-((9Z,12Z)-十八-9,12-二烯-1-基)二十四-4,15,18-三烯-1-胺(HGT5001)和(15Z,18Z)—N,N-二甲基-6-((9Z,12Z)-十八-9,12-二烯-1-基)二十四-5,15,18-三烯-1-胺(HGT5002)。
在一些实施方案中，使用阳离子脂质N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵或“DOTMA”。(Felgner等人(Proc.Nat'l Acad.Sci.84,7413(1987)；美国专利第4,897,355号)。DOTMA可单独配制或可与中性脂质、二油酰磷脂-乙醇胺或“DOPE”或其它阳离子或非阳离子脂质组合成转移媒介物或脂质纳米颗粒，并且此类脂质体可用于增强将核酸递送至靶细胞中。其他合适的阳离子脂质包括例如，5-羧基精基甘氨酸二十八烷基酰胺或“DOGS”、2,3-二油酰氧基-N-[2(精胺-甲酰胺基)乙基]-N,N-二甲基-1-丙铵或“DOSPA”(Behr等人Proc.Nat.'l Acad.Sci.86,6982(1989)；美国专利第5,171,678号；第5,334,761号)、1,2-二油酰基-3-二甲基铵-丙烷或“DODAP”、1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷或“DOTAP”。所考虑的阳离子脂质还包括1,2-二硬脂酰氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷或“DSDMA”、1,2-二油酰氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷或“DODMA”、1,2-二亚油醇氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷或“DLinDMA”、1,2-二亚油烯醇氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷或“DLenDMA”、N-二油酰基-N,N-二甲基氯化铵或“DODAC”、N,N-二硬脂酰基-N,N-二甲基溴化铵或“DDAB”、N-(1,2-二肉豆蔻氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羟乙基溴化铵或“DMRIE”、3-二甲基氨基-2-(胆甾-5-烯-3-β-氧基丁烷-4-氧基)-1-(顺式,顺式-9,12-十八二烯氧基)丙烷或“CLinDMA”、2-[5'-(胆甾-5-烯-3-β-氧基)-3'-氧杂戊氧基)-3-二甲基1-1-(顺式,顺式-9’,1-2’-十八二烯氧基)丙烷或“CpLinDMA”、N,N-二甲基-3,4-二油酰氧基苄胺或“DMOBA”、1,2-N,N'-二油基氨基甲酰基-3-二甲基氨基丙烷或“DOcarbDAP”、2,3-二亚油醇氧基-N,N-二甲基丙胺或“DLinDAP”、1,2-N,N'-二亚油醇氨基甲酰基-3-二甲基氨基丙烷或“DLincarbDAP”、1,2-二亚油醇氨基甲酰基-3-二甲氨基丙烷或“DLinCDAP”、2,2-二亚油醇-4-二甲氨基甲基-[1,3]-二氧戊环或“DLin-K-DMA”、2,2-二亚油醇-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环或“DLin-K-XTC2-DMA”和2-(2,2-二((9Z,12Z)-十八-9,12-二烯-1-基)-1,3-二氧杂环戊-4-基)-N,N-二甲基乙胺(DLin-KC2-DMA))(参见，WO2010/042877；Semple等人,Nature Biotech.28:172-176(2010))或其混合物。(Heyes,J.等人,J Controlled Release107:276-287(2005)；Morrissey,D V.等人,Nat.Biotechnol.23(8):1003-1007(2005)；PCT公布WO2005/121348A1)。
本发明还考虑使用基于胆固醇的阳离子脂质。这类基于胆固醇的阳离子脂质可单独或与其它阳离子或非阳离子脂质组合来使用。合适的基于胆固醇的阳离子脂质包括，例如，GL67、DC-Chol(N,N-二甲基-N-乙基甲酰胺基胆固醇)、1,4-双(3-N-油基氨基-丙基)哌嗪(Gao等人Biochem.Biophys.Res.Comm.179,280(1991)；Wolf等人BioTechniques 23,139(1997)；美国专利第5,744,335号)或ICE。
另外，几种试剂可商购以增强转染功效。合适的实例包括LIPOF ECTIN(DOTMA:DOPE)(Invitrogen,Carlsbad,CA)、LIPOFECTAM INE(DOSPA:DOPE)(Invitrogen)、LIPOFECTAMINE2000.(Invitrog en)、FUGENE(Promega,Madison,WI)、TRANSFECTAM(DOGS)(Promega)和EFFECTENE(Qiagen,Valencia,CA)。
还考虑了阳离子脂质，如基于二烷基氨基的、基于咪唑的和基于胍的脂质，如美国专利10,413,618中描述的那些。
在其他实施方案中，本文所述的组合物和方法涉及脂质纳米颗粒，所述脂质纳米颗粒包含一种或多种可裂解脂质，例如像一种或多种阳离子脂质或包含可裂解二硫化物(S—S)官能团的化合物(例如，HGT4001、HGT4002、HGT4003、HGT4004和HGT4005)，如美国临时申请第61/494,745号中进一步描述，所述临时申请的完整教义以引用的方式整体并入本文。
本发明也涵盖使用聚乙二醇(PEG)修饰的磷脂和衍生脂质如衍生神经酰胺(PEG-CER)，包括N-辛酰基-鞘氨醇-1-[丁二酰(甲氧基聚乙二醇)-2000](C8 PEG-2000神经酰胺)，单独或与其它脂质组合，它们一起构成转移媒介物(例如，脂质纳米颗粒)。预期的PEG修饰的脂质包括但不限于与具有C6-C20长度的烷基链的脂质共价连接的长度多达5kDa的聚乙二醇链。添加此类组分可防止复合物聚集，并且还可提供用于增加循环寿命和增加脂质-核酸组合物递送至靶细胞的手段，(Klibanov等人(1990)FEBS Letters,268(1):235-237)，或者它们可被选择为在体内快速交换出制剂(参见美国专利第5,885,613号)。特别有用的可交换脂质是具有较短酰基链(例如，C14或C18)的PEG-神经酰胺。本发明的PEG修饰的磷脂和衍生脂质可占转移媒介物中存在的总脂质的约0％至约20％、约0.5％至约20％、约1％至约15％、约4％至约10％或约2％摩尔比。
本发明还考虑使用非阳离子脂质，包括美国专利申请15/809,680中描述的那些。非阳离子脂质包括但不限于二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰油酰-磷脂酰乙醇胺(POPE)、二油酰-磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺甲基)-环已烷-1-甲酸酯(DOPE-mal)、二棕榈酰基磷脂酰基乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰基磷酸乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰-磷脂酰基-乙醇胺(DSPE)、16-O-单甲基PE、16-O-二甲基PE、18-1-反式PE、1-硬脂酰-2-油酰基-磷脂酰乙醇胺(SOPE)、胆固醇或其混合物。此类非阳离子脂质可单独使用或与其他赋形剂例如阳离子脂质组合使用。当与阳离子脂质组合使用，非阳离子脂质可占转移媒介物中存在的总脂质的5％至约90％或约10％至约70％摩尔比。
转移媒介物(例如，脂质纳米颗粒)可通过组合多种脂质和/或聚合物组分来制备。例如，转移媒介物可使用40:30:25:5摩尔比的C12-200、DOPE、胆固醇、DMG-PEG2K或18:56:20:6摩尔比的DODAP、DOPE、胆固醇、DMG-PEG2K或40:20:35:5摩尔比的HGT5000、DOPE、胆固醇、DMG-PEG2K或40:20:35:5摩尔比的HGT5001、DOPE、胆固醇、DMG-PEG2K来制备。构成脂质纳米颗粒的阳离子脂质、非阳离子脂质和/或PEG修饰的脂质的选择以及此类脂质彼此的相对摩尔比是基于选定脂质的特性、预期靶细胞的性质、待递送的circRNA的特性。额外考虑因素包括，例如，烷基链的饱和度，以及选定脂质的尺寸、电荷、pH、pKa、融合原性和毒性。因此，摩尔比可相应地调节。举例来说，在一些实施方案中，脂质纳米颗粒中阳离子脂质的百分比可大于10％、大于20％、大于30％、大于40％、大于50％、大于60％或大于70％。脂质纳米颗粒中非阳离子脂质的百分比可大于5％、大于10％、大于20％、大于30％或大于40％。脂质纳米颗粒中胆固醇的百分比可大于10％、大于20％、大于30％或大于40％。脂质纳米颗粒中PEG修饰的脂质的百分比可大于1％、大于2％、大于5％、大于10％或大于20％。
用于本发明的组合物中的转移媒介物可通过目前在本领域中已知的各种技术来制备。多层囊泡(MLV)可使用常规技术来制备，例如，通过将选定脂质沉积于合适容器或器皿的内侧壁上、将所述脂质溶解于适当溶剂中、然后蒸发溶剂以在器皿内侧留下薄膜、或喷雾干燥。水相然后可在涡旋运动下添加至器皿，其导致形成MLV。单层囊泡(ULV)然后可通过均质化、超声处理或挤出多层囊泡来形成。此外，ULV可通过洗涤剂移除技术形成。
在本发明的某些实施方案中，本发明的组合物包含转移媒介物，其中circRNA在转移媒介物的表面上缔合并且包封于相同转移媒介物内。例如，在制备本发明的组合物期间，阳离子转移媒介物可通过静电相互作用与circRNA缔合。
在某些实施方案中，本发明的组合物可负载有诊断性放射性核素、荧光材料或在体外和体内应用中均可检测的其他材料。例如，用于本发明中的合适的诊断材料可包括若丹明-二油酰磷脂酰乙醇胺(Rh-PE)、绿色荧光蛋白circRNA(GFP circRNA)、海肾荧光素酶circRNA和萤火虫荧光素酶circRNA。
在一些实施方案中，转移媒介物的合适尺寸的选择考虑了靶细胞或组织的部位，并且在一定程度上考虑了制备脂质体的应用。在一些实施方案中，可能需要限制circRNA对某些细胞或组织的转染。例如，为了靶向肝细胞，可将转移媒介物的大小设计成使得其尺寸小于内衬肝脏中的肝窦的内皮层的开窗部。因此，适当大小的转移媒介物可容易地渗透此类内皮开窗部以到达靶肝细胞。可替代地，转移媒介物的大小可被设计成使得脂质体的尺寸具有足够的直径以限制或明确避免分布到某些细胞或组织中。例如，转移媒介物的大小可被设计成使得其尺寸大于内衬肝窦的内皮层的开窗部，从而限制转移媒介物分布至肝细胞。一般而言，转移媒介物的大小在约25至250nm的范围内。在一些实施方案中，转移媒介物的大小小于约250nm、175nm、150nm、125nm、100nm、75nm、50nm、25nm或10nm。
本领域已知的多种替代方法可用于确定转移媒介物的群的大小。一种这样的大小确定方法描述于美国专利第4,737,323号中，所述专利以引用的方式并入本文。通过水浴或探针超声处理对脂质体悬浮液进行超声处理产生大小逐渐减小至直径小于约0.05微米的小ULV。均质化是依赖于剪切能量将大脂质体破碎成较小脂质体的另一种方法。在典型均质化程序中，使MLV再循环穿过标准乳液均化器直到观察到选定脂质体大小，通常介于约0.1与约0.5微米之间。脂质体囊泡的大小可通过准电光散射(QELS)确定，如Bloomfield,Ann.Rev.Biophys.Bioeng.,10:421-450(1981)中所描述，所述文献以引用的方式并入本文。通过对形成的脂质体进行超声处理，可减小平均脂质体直径。间歇性超声循环可与QELS评估交替进行，以引导有效的脂质体合成。
此外，在某些实施方案中，本文提供的环状RNA可使用一种或多种脂质体、脂质复合物或脂质纳米颗粒来配制。在一个实施方案中，环状RNA可配制在脂质纳米颗粒中，如在国际公布第WO2012170930号中描述的那些，所述公布以引用的方式整体并入本文。在一个实施方案中，脂质可以是可裂解脂质，如在国际公布第WO2012170889号中描述的那些，所述公布以引用的方式整体并入本文。在一个实施方案中，环状RNA的药物组合物可包含在国际公布第2012099755号中描述的至少一种PEG化的脂质，所述公布以引用的方式并入本文。在一个实施方案中，脂质纳米颗粒制剂可通过在国际公布第WO2011127255号或第WO2008103276号中描述的方法来配制，所述公布各自以引用的方式整体并入本文。脂质纳米颗粒可涂覆有共聚物或与共聚物缔合，如但不限于嵌段共聚物，如在国际公布第WO2013012476号中描述的支链聚醚-聚酰胺嵌段共聚物，所述公布以引用的方式整体并入本文。脂质体、脂质复合物或脂质纳米颗粒可用于提高环状RNA定向蛋白质产生的功效，因为这些制剂可能能够增加环状RNA的细胞转染，增加环状RNA的体内或体外半衰期，和/或允许受控释放。
在实施方案中，多核苷酸编码由亚基组成的蛋白质，所述亚基由多于一个基因编码。例如，蛋白质可以是异二聚体，其中蛋白质的每个链或亚基由单独基因编码。有可能在转移媒介物中递送多于一个circRNA分子，并且每个circRNA编码蛋白质的单独亚基。可替代地，单一circRNA可被工程化以编码多于一个亚基(例如在单链Fv抗体的情况下)。在某些实施方案中，可在单独转移媒介物中施用编码单独亚基的单独circRNA分子。
本发明还考虑通过被动和主动靶向手段对靶细胞和组织的区别性靶向。被动靶向现象利用体内转移媒介物的自然分布模式，而不依赖于使用额外的赋形剂或手段来增强靶细胞对转移媒介物的识别。例如，经受网状内皮系统的细胞的吞噬作用的转移媒介物可能在肝或脾中累积，并且因此，可提供被动地将组合物递送至此类靶细胞的手段。
可替代地，本发明考虑主动靶向，其涉及使用可与转移媒介物键合(共价或非共价)的靶向部分以促进此类转移媒介物在某些靶细胞或靶组织的定位。例如，靶向可通过在转移媒介物中或转移媒介物上包含一个或多个内源性靶向部分以促进分布至靶细胞或组织来介导。靶组织对靶向部分的识别积极促进转移媒介物和/或其内容物在靶细胞和组织中的组织分布和细胞摄取(例如，在转移媒介物中或转移媒介物上包含载脂蛋白-E靶向配体促进转移媒介物的识别和与肝细胞表达的内源性低密度脂蛋白受体的结合)。如本文所提供，组合物可包含能够增强组合物对靶细胞的亲和力的部分。靶向部分可在配制期间或配制后连接至脂质颗粒的外双层。这些方法是本领域熟知的。此外，一些脂质颗粒制剂可采用融合聚合物，如PEAA、血凝素、其他脂肽(参见美国专利申请序列号08/835,281和60/083,294，所述专利以引用的方式并入本文)和其他可用于体内和/或细胞内递送的特征。在其他一些实施方案中，本发明的组合物表现出提高的转染功效，和/或表现出对目标靶细胞或组织的增强的选择性。因此，所考虑的是包含一个或多个部分(例如，肽、适体、寡核苷酸、维生素或其他分子)的组合物，所述一个或多个部分能够增强组合物以及其核酸内容物对于靶细胞或组织的亲和力。合适的部分可任选地结合或连接至转移媒介物的表面。在一些实施方案中，靶向部分可跨越转移媒介物的表面或被包封在转移媒介物内。合适的部分是基于它们的物理、化学或生物性质(例如，选择性亲和力和/或对靶细胞表面标志物或特征的识别)来选择的。细胞特异性靶位点及其相应的靶向配体可广泛不同。选择合适的靶向部分使得可以利用靶细胞的独特特征，从而允许组合物区分靶细胞和非靶细胞。例如，本发明的组合物可包含选择性地增强对肝细胞的识别或与肝细胞的亲和力(例如，通过受体介导的对此类表面标记物的识别和结合)的表面标记物(例如，载脂蛋白-B或载脂蛋白-E)。作为实例，使用半乳糖作为靶向部分将预期将本发明的组合物引导至实质肝细胞，或者可替代地使用含有甘露糖的糖残基作为靶向配体将预期将本发明的组合物引导至肝内皮细胞(例如，可优先结合至肝细胞中存在的无唾液酸糖蛋白受体的含甘露糖的糖残基)。(参见Hillery A M,等人“Drug Delivery and Targeting:For Pharmacists andPharmaceutical Scientists”(2002)Taylor&Francis,Inc.)。与转移媒介物(例如脂质纳米颗粒)中存在的部分缀合的此类靶向部分的呈现因此有助于本发明的组合物在靶细胞和组织中的识别和吸收。合适的靶向部分的实例包括一种或多种肽、蛋白质、适体、维生素和寡核苷酸。
在特定实施方案中，转移媒介物包含靶向部分。在一些实施方案中，靶向部分选择性地介导受体介导的内吞作用进入特定细胞群。在一些实施方案中，靶向部分能够结合至T细胞抗原。在一些实施方案中，靶向部分能够结合至NK、NKT、树突细胞或巨噬细胞抗原。在一些实施方案中，靶向部分能够结合至选自下组的蛋白质：CD3、CD4、CD8、PD-1、4-1BB、CD5、CD7、C1q和CD2。在一些实施方案中，靶向部分是单链Fv(scFv)片段、纳米抗体、肽、基于肽的大环、微型抗体、重链可变区、轻链可变区或其片段。在一些实施方案中，靶向部分选自抗T细胞受体基序抗体、抗T细胞α链抗体、抗T细胞β链抗体、抗T细胞γ链抗体、抗T细胞δ链抗体、抗CCR7抗体、抗CD3抗体、抗CD4抗体、抗CD5抗体、抗CD7抗体、抗CD8抗体、抗CD11b抗体、抗CD11c抗体、抗CD16抗体、抗CD19抗体、抗CD20抗体、抗CD21抗体、抗CD22抗体、抗CD25抗体、抗CD28抗体、抗CD34抗体、抗CD35抗体、抗CD40抗体、抗CD45RA抗体、抗CD45RO抗体、抗CD52抗体、抗CD56抗体、抗CD62L抗体、抗CD68抗体、抗CD80抗体、抗CD95抗体、抗CD117抗体、抗CD127抗体、抗CD133抗体、抗CD137(4-1BB)抗体、抗CD163抗体、抗C1q抗体、抗F4/80抗体、抗IL-4Rα抗体、抗Sca-1抗体、抗CTLA-4抗体、抗GITR抗体、抗GARP抗体、抗LAP抗体、抗颗粒酶B抗体、抗LFA-1抗体、抗转铁蛋白受体抗体及其片段。
在一些实施方案中，根据美国专利申请15/809,680中描述的方法配制环状RNA。在一些实施方案中，本发明提供了将环状RNA包封在脂质纳米颗粒中的方法，所述方法包括将脂质成形为预先形成的脂质纳米颗粒(即，在不存在RNA的情况下形成)、然后将预先形成的脂质纳米颗粒与RNA合并的步骤。在一些实施方案中，与在没有预先形成脂质纳米颗粒的步骤的情况下(例如，将脂质直接与RNA合并)制备的相同RNA制剂相比，新的配制方法产生在体外和体内具有更高效力(肽或蛋白质表达)和更高功效(生物学相关终点的改善)与潜在更好的耐受性的RNA制剂。在一些实施方案中，靶向部分是淋巴细胞上胞外酶的小分子结合剂。胞外酶的小分子结合剂包括A2A抑制剂CD73抑制剂、CD39或腺苷酸受体A2aR和A2bR。潜在小分子包括AB928。
在一些实施方案中，转移媒介物如Shobaki N,Sato Y,Harashima H.Mixinglipids to manipulate the ionization status of lipid nanoparticles forspecific tissue targeting.Int J Nanomedicine.2018；13:8395-8410.(2018年12月10日发布)中所述来配制和/或靶向。在一些实施方案中，转移媒介物由3种脂质类型组成。在一些实施方案中，转移媒介物由4种脂质类型组成。在一些实施方案中，转移媒介物由5种脂质类型组成。在一些实施方案中，转移媒介物由6种脂质类型组成。
对于RNA的某些阳离子脂质纳米颗粒制剂，为了实现RNA的高包封，必须加热缓冲液(例如柠檬酸盐缓冲液)中的RNA。在那些过程或方法中，加热需要在配制过程之前进行(即加热单独的组分)，因为配制后加热(纳米颗粒的形成后)不会提高脂质纳米颗粒中RNA的包封效率。相比之下，在本发明方法的一些实施方案中，RNA的加热顺序似乎不影响RNA包封百分比。在一些实施方案中，在配制过程之前或之后不需要加热(即，保持在环境温度)包含预先形成的脂质纳米颗粒的溶液、包含RNA的溶液和包含脂质纳米颗粒包封的RNA的混合溶液中的一者或多者。
RNA可提供在溶液中以与脂质溶液混合，使得RNA可被包封在脂质纳米颗粒中。合适的RNA溶液可以是含有各种浓度的待包封RNA的任何水溶液。例如，合适的RNA溶液可含有浓度等于或大于约0.01mg/ml、0.05mg/ml、0.06mg/ml、0.07mg/ml、0.08mg/ml、0.09mg/ml、0.1mg/ml、0.15mg/ml、0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml、0.6mg/ml、0.7mg/ml、0.8mg/ml、0.9mg/ml或1.0mg/ml的RNA。在一些实施方案中，合适的RNA溶液可含有浓度在约0.01-1.0mg/ml、0.01-0.9mg/ml、0.01-0.8mg/ml、0.01-0.7mg/ml、0.01-0.6mg/ml、0.01-0.5mg/ml、0.01-0.4mg/ml、0.01-0.3mg/ml、0.01-0.2mg/ml、0.01-0.1mg/ml、0.05-1.0mg/ml、0.05-0.9mg/ml、0.05-0.8mg/ml、0.05-0.7mg/ml、0.05-0.6mg/ml、0.05-0.5mg/ml、0.05-0.4mg/ml、0.05-0.3mg/ml、0.05-0.2mg/ml、0.05-0.1mg/ml、0.1-1.0mg/ml、0.2-0.9mg/ml、0.3-0.8mg/ml、0.4-0.7mg/ml或0.5-0.6mg/ml范围内的RNA。
通常，合适的RNA溶液还可含有缓冲剂和/或盐。一般而言，缓冲剂可包括HEPES、硫酸铵、Tris、碳酸氢钠、柠檬酸钠、乙酸钠、磷酸钾或磷酸钠。在一些实施方案中，缓冲剂的合适浓度可在约0.1mM至100mM、0.5mM至90mM、1.0mM至80mM、2mM至70mM、3mM至60mM、4mM至50mM、5mM至40mM、6mM至30mM、7mM至20mM、8mM至15mM或9至12mM的范围内。
示例性盐可包括氯化钠、氯化镁和氯化钾。在一些实施方案中，RNA溶液中盐的合适浓度可在约1mM至500mM、5mM至400mM、10mM至350mM、15mM至300mM、20mM至250mM、30mM至200mM、40mM至190mM、50mM至180mM、50mM至170mM、50mM至160mM、50mM至150mM或50mM至100mM的范围内。
在一些实施方案中，合适的RNA溶液可具有在约3.5-6.5、3.5-6.0、3.5-5.5、3.5-5.0、3.5-4.5、4.0-5.5、4.0-5.0、4.0-4.9、4.0-4.8、4.0-4.7、4.0-4.6或4.0-4.5范围内的pH。
可使用多种方法来制备适用于本发明的RNA溶液。在一些实施方案中，RNA可直接溶解于本文所述的缓冲溶液中。在一些实施方案中，可在与脂质溶液混合用于包封之前通过将RNA储备溶液与缓冲溶液混合来产生RNA溶液。在一些实施方案中，可在与脂质溶液混合用于包封之前立即通过将RNA储备溶液与缓冲溶液混合来产生RNA溶液。
根据本发明，脂质溶液含有适于形成用于包封RNA的转移媒介物的脂质混合物。在一些实施方案中，合适的脂质溶液是基于乙醇的。例如，合适的脂质溶液可含有溶解于纯乙醇(即100％乙醇)中的所需脂质的混合物。在另一个实施方案中，合适的脂质溶液是基于异丙醇的。在另一个实施方案中，合适的脂质溶液是基于二甲亚砜的。在另一个实施方案中，合适的脂质溶液是合适溶剂(包括但不限于乙醇、异丙醇和二甲亚砜)的混合物。
合适的脂质溶液可含有各种浓度的所需脂质的混合物。在一些实施方案中，合适的脂质溶液可含有总浓度在约0.1-100mg/ml、0.5-90mg/ml、1.0-80mg/ml、1.0-70mg/ml、1.0-60mg/ml、1.0-50mg/ml、1.0-40mg/ml、1.0-30mg/ml、1.0-20mg/ml、1.0-15mg/ml、1.0-10mg/ml、1.0-9mg/ml、1.0-8mg/ml、1.0-7mg/ml、1.0-6mg/ml或1.0-5mg/ml范围内的所需脂质的混合物。
任何所需的脂质可以适合于包封RNA的任何比例混合。在一些实施方案中，合适的脂质溶液含有所需脂质的混合物，所述脂质包括阳离子脂质、辅助脂质(例如，非阳离子脂质和/或胆固醇脂质)和/或聚乙二醇化脂质。在一些实施方案中，合适的脂质溶液含有所需脂质的混合物，所述脂质包括一种或多种阳离子脂质、一种或多种辅助脂质(例如，非阳离子脂质和/或胆固醇脂质)和一种或多种聚乙二醇化脂质。
11.靶细胞
在一些实施方案中，靶细胞缺乏目标蛋白质或酶。例如，当需要将核酸递送至肝细胞时，肝细胞代表靶细胞。在一些实施方案中，本发明的组合物在区别性基础上转染靶细胞(即，不转染非靶细胞)。本发明的组合物还可被制备成优先靶向多种靶细胞，所述靶细胞包括但不限于肝细胞、上皮细胞、造血细胞、上皮细胞、内皮细胞、肺细胞、骨细胞、干细胞、间充质细胞、神经细胞(例如脑膜、星形胶质细胞、运动神经元、背根神经节细胞和前角运动神经元)、感光细胞(例如视杆细胞和视锥细胞)、视网膜色素上皮细胞、分泌细胞、心脏细胞、脂肪细胞、血管平滑肌细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞、β细胞、垂体细胞、滑膜衬里细胞、卵巢细胞、睾丸细胞、成纤维细胞、B细胞、T细胞、树突细胞、巨噬细胞、网织红细胞、白细胞、粒细胞和肿瘤细胞。
本发明的组合物可被制备成优先分布至诸如心脏、肺、肾、肝和脾中的靶细胞。在一些实施方案中，本发明的组合物分布至肝脏的细胞中以促进肝脏的细胞(例如肝细胞)递送和随后表达包含在其中的circRNA。靶细胞可充当能够产生并全身排泄功能性蛋白质或酶的生物“储库”或“贮库”。因此，在本发明的一个实施方案中，转移媒介物可在递送时靶向肝细胞和/或优先分布至肝脏的细胞。在一个实施方案中，在靶肝细胞转染后，负载于媒介物中的circRNA被翻译并且功能性蛋白质产物产生、分泌且全身分布。在其他实施方案中，除肝细胞以外的细胞(例如，肺、脾、心脏、眼或中枢神经系统的细胞)可用作蛋白质产生的贮库位置。
在一个实施方案中，本发明的组合物促进受试者的一种或多种功能性蛋白质和/或酶的内源性产生。在本发明的一个实施方案中，转移媒介物包含编码缺陷型蛋白质或酶的circRNA。在将此类组合物分布至靶组织并随后转染此类靶细胞后，负载至转移媒介物(例如脂质纳米颗粒)中的外源性circRNA可在体内翻译以产生由外源施用的circRNA编码的功能性蛋白质或酶(例如，受试者所缺乏的蛋白质或酶)。因此，本发明的组合物利用受试者翻译外源性或重组制备的circRNA以产生内源性翻译的蛋白质或酶且由此产生(并在适用的情况下分泌)功能性蛋白质或酶的能力。表达的或翻译的蛋白质或酶的特征还可在于在体内包含在重组制备的蛋白质或酶中通常不存在的天然的翻译后修饰，从而进一步降低翻译的蛋白质或酶的免疫原性。
施用编码缺陷性蛋白质或酶的circRNA避免将核酸递送至靶细胞内的特定细胞器的需要。相反，在转染靶细胞并将核酸递送至靶细胞的细胞质后，转移媒介物的circRNA内容物可被翻译并表达功能性蛋白质或酶。
在一些实施方案中，环状RNA包含一个或多个miRNA结合位点。在一些实施方案中，环状RNA包含由存在于一种或多种非靶细胞或非靶细胞类型(例如，库普弗细胞)中且不存在于一种或多种靶细胞或靶细胞类型(例如，肝细胞)中的miRNA识别的一个或多个miRNA结合位点。在一些实施方案中，与一种或多种靶细胞或靶细胞类型(例如，肝细胞)相比，环状RNA包含由在一种或多种非靶细胞或非靶细胞类型(例如，库普弗细胞)中以增加的浓度存在的miRNA识别的一个或多个miRNA结合位点。miRNA被认为通过与RNA分子内的互补序列配对、从而导致基因沉默来发挥作用。
12.药物组合物
在某些实施方案中，本文提供了包含本文提供的治疗剂的组合物(例如药物组合物)。在一些实施方案中，治疗剂是本文提供的环状RNA多核苷酸。在一些实施方案中，治疗剂是本文提供的载体。在一些实施方案中，治疗剂是包含本文提供的环状RNA或载体的细胞(例如，人细胞，如人T细胞)。在某些实施方案中，组合物还包含药学上可接受的载剂。在一些实施方案中，本文提供的组合物包含本文提供的治疗剂与其他药物活性剂或药物的组合，所述药物活性剂或药物如抗炎药或能够靶向B细胞抗原的抗体，例如，抗CD20抗体，例如利妥昔单抗；化学治疗剂例如天冬酰胺酶、白消安、卡铂、顺铂、道诺霉素、阿霉素、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、甲氨蝶呤、紫杉醇、利妥昔单抗、长春碱、长春新碱等。在优选的实施方案中，药物组合物包含本文提供的细胞或其群。
关于药物组合物，药学上可接受的载剂可以是任何常规使用的那些，并且仅受化学-物理考量(如溶解度和缺乏与活性剂的反应性)和施用途径限制。本文所述的药学上可接受的载剂(例如媒介物、佐剂、赋形剂和稀释剂)是本领域技术人员熟知的，并且公众容易获得。优选药学上可接受的载剂是对治疗剂呈化学惰性且在使用条件下没有有害副作用或毒性的一种载剂。
载剂的选择将部分取决于特定的治疗剂以及用于施用所述治疗剂的特定方法。因此，本文提供的药物组合物有多种合适的制剂。
在某些实施方案中，药物组合物包含防腐剂。在某些实施方案中，合适的防腐剂可包括例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸钠和苯扎氯铵。任选地，可使用两种或更多种防腐剂的混合物。防腐剂或其混合物通常以总组合物的约0.0001重量％至约2重量％的量存在。
在一些实施方案中，药物组合物包含缓冲剂。在一些实施方案中，合适的缓冲剂可包括例如柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸、磷酸钾和各种其他酸和盐。可任选地使用两种或更多种缓冲剂的混合物。缓冲剂或其混合物通常以总组合物的约0.001重量％至约4重量％的量存在。
在一些实施方案中，药物组合物中治疗剂的浓度可变化，例如按重量计小于约1％，或至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或约50％或更高，并且根据所选择的特定施用模式可主要通过流体体积和粘度进行选择。
用于口服、气雾剂、胃肠外(例如，皮下、静脉内、动脉内、肌肉内、皮内、腹膜内和鞘内)和局部施用的以下制剂仅仅是示例性的并且绝不是限制性的。可使用多于一种途径来施用本文提供的治疗剂，并且在某些情况下，特定途径可提供比另一种途径更直接且更有效的反应。
适用于口服施用的制剂可包含以下或由以下组成：(a)液体溶液，如溶解在稀释剂(如水、盐水或橙汁)中的有效量的治疗剂；(b)胶囊、小药囊、片剂、锭剂和糖锭剂，各自含有预定量的固体或颗粒形式的活性成分；(c)粉末；(d)在适当液体中的悬浮液；以及(e)合适的乳液。液体制剂可包含稀释剂，如水和醇，例如乙醇、苄基醇和聚乙烯醇，其中添加或不添加药学上可接受的表面活性剂。胶囊形式可以是普通的硬壳或软壳明胶类型，其含有例如表面活性剂、润滑剂和惰性填充剂(如乳糖、蔗糖、磷酸钙和玉米淀粉)。片剂形式可包含乳糖、蔗糖、甘露糖醇、玉米淀粉、马铃薯淀粉、藻酸、微晶纤维素、阿拉伯树胶、明胶、瓜尔胶、胶体二氧化硅、交联羧甲基纤维素钠、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸锌、硬脂酸和其他赋形剂、着色剂、稀释剂、缓冲剂、崩解剂、润湿剂、防腐剂、调味剂以及其他药理学上相容的赋形剂中的一种或多种。锭剂形式可包含具有调味剂(通常为蔗糖、阿拉伯胶或黄蓍胶)的治疗剂。锭剂(pastille)可包含具有惰性基质的治疗剂，所述惰性基质如明胶和甘油、或蔗糖和阿拉伯胶、乳剂、凝胶等，此外还含有本领域已知的此类赋形剂。
适用于胃肠外施用的制剂包括水性和非水性等张无菌注射溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和致使制剂与预期接受者的血液等张的溶质；以及水性和非水性无菌悬浮液，其可包含悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。在一些实施方案中，本文提供的治疗剂可在药物载剂(诸如无菌液体或液体混合物)中在生理学上可接受的稀释剂中施用，所述无菌液体或液体混合物包括水、盐水、水性右旋糖以及相关糖溶液、醇(诸如乙醇或十六烷醇)、二醇(诸如丙二醇或聚乙二醇)、二甲亚砜、甘油、缩酮如2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4-甲醇、醚、聚(乙二醇)400、油、脂肪酸、脂肪酸酯或甘油酯或乙酰化脂肪酸甘油酯，其中添加或不添加药学上可接受的表面活性剂(如皂或洗涤剂)、悬浮剂(如果胶、卡波姆、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素或羧甲基纤维素)或乳化剂和其他药物佐剂。
在一些实施方案中可用于胃肠外制剂中的油包括石油、动物油、植物油或合成油。油的具体实例包括花生、大豆、芝麻、棉籽、玉米、橄榄、凡士林和矿物油。用于胃肠外制剂的合适的脂肪酸包括油酸、硬脂酸和异硬脂酸。油酸乙酯和肉豆蔻酸异丙酯是合适的脂肪酸酯的实例。
用于胃肠外制剂的某些实施方案中的合适的皂包括脂肪碱金属、铵和三乙醇胺盐，并且合适的洗涤剂包括(a)阳离子洗涤剂，诸如例如二甲基二烷基卤化铵和烷基吡啶鎓卤化物，(b)阴离子洗涤剂，例如像烷基、芳基和烯烃磺酸酯、烷基、烯烃、醚以及单酸甘油酯硫酸酯和磺基琥珀酸盐，(c)非离子洗涤剂，例如像脂肪胺氧化物、脂肪酸链烷醇酰胺和聚氧乙烯-聚丙烯共聚物，(d)两性洗涤剂，例如像烷基-β-氨基丙酸盐和2-烷基-咪唑啉季铵盐以及(e)它们的混合物。
在一些实施方案中，胃肠外制剂含有溶液中例如约0.5重量％至约25重量％的治疗剂。可使用防腐剂和缓冲剂。为了最小化或消除注射部位的刺激，此类组合物可含有具有例如约12至约17的亲水-亲油平衡(HLB)的一种或多种非离子表面活性剂。此类制剂中表面活性剂的量通常将在例如约5重量％至约15重量％的范围内。合适的表面活性剂包括聚乙二醇、脱水山梨糖醇脂肪酸酯诸如脱水山梨醇单油酸酯、以及环氧乙烷与疏水基质的高分子量加合物(通过环氧丙烷与丙二醇的缩合形成)。胃肠外制剂可以单位剂量或多剂量密封容器如安瓿或小瓶形式呈现，并且可储存于冷冻干燥(冻干)条件下，仅需在使用前即刻添加无菌液体赋形剂(例如水)以供注射。即时注射溶液和悬浮液可从先前所述种类的无菌粉末、颗粒和片剂制备。
在某些实施方案中，本文提供了可注射制剂。可注射组合物对有效药物载剂的要求是本领域普通技术人员众所周知的(参见例如，Pharmaceutics and PharmacyPractice,J.B.Lippincott Company,Philadelphia,PA,Banker和Chalmers,编,第238-250页(1982)；以及ASHP Handbook on Injectable Drugs,Toissel,第4版,第622-630页(1986))。
在一些实施方案中，本文提供了局部制剂。局部制剂(包括可用于经皮药物释放的那些)在本文提供的某些实施方案的上下文中适合施加至皮肤。在一些实施方案中，治疗剂单独或与其他合适的组分组合可制成气雾剂制剂以通过吸入施用。这些气雾剂制剂可被置于加压可接受的推进剂中，如二氯二氟甲烷、丙烷、氮等。它们也可被配制成药物用于非加压制备，诸如在喷雾器或雾化器中。此类喷雾制剂也可用于喷雾粘膜。
在某些实施方案中，本文提供的治疗剂可配制成包合复合物，如环糊精包合复合物或脂质体。脂质体可用于使治疗剂靶向特定组织。脂质体也可用于增加治疗剂的半衰期。许多方法可用于制备脂质体，如在例如Szoka等人,Ann.Rev.Biophys.Bioeng.,9,467(1980)以及美国专利4,235,871、4,501,728、4,837,028和5,019,369中所描述。
在一些实施方案中，本文提供的治疗剂被配制在定时释放、延迟释放或持续释放递送系统中，使得组合物的递送在待治疗部位的致敏之前发生并且有足够的时间引起待治疗部位的致敏。此类系统可避免治疗剂的重复施用，从而增加受试者和医生的便利，并且可能特别适用于本文提供的某些组合物实施方案。在一个实施方案中，本发明的组合物被配制为使得它们适合于其中所含的circRNA的延长释放。这种延长释放组合物可以延长的给药间隔方便地施用于受试者。例如，在一个实施方案中，本发明的组合物每天两次、每天或每隔一天施用至受试者。在一个实施方案中，本发明的组合物每周两次、每周一次、每十天、每两周、每三周、每四周、每月一次、每六周、每八周、每三个月、每四个月、每六个月、每八个月、每九个月或每年一次施用至受试者。
在一些实施方案中，由本发明的多核苷酸编码的蛋白质由靶细胞产生持续量的时间。例如，蛋白质可在施用后产生持续超过一小时、超过四小时、超过六小时、超过12小时、超过24小时、超过48小时或超过72小时。在一些实施方案中，多肽在施用后约六小时以峰值水平表达。在一些实施方案中，多肽的表达至少维持在治疗水平。在一些实施方案中，多肽在施用后至少以治疗水平表达超过1小时、超过4小时、超过6小时、超过12小时、超过24小时、超过48小时或超过72小时。在一些实施方案中，多肽在患者血清或组织(例如肝脏或肺)中以治疗水平可检测到。在一些实施方案中，可检测多肽的水平来自circRNA组合物在施用后超过1小时、超过4小时、超过6小时、超过12小时、超过24小时、超过48小时或超过72小时的时间段内的连续表达。
在某些实施方案中，由本发明的多核苷酸编码的蛋白质以高于正常生理水平的水平产生。与对照相比，蛋白质水平可增加。在一些实施方案中，对照是正常个体或正常个体群中多肽的基线生理水平。在其他实施方案中，对照是相关蛋白质或多肽缺乏的个体或相关蛋白质或多肽缺乏的个体群中多肽的基线生理水平。在一些实施方案中，对照可以是向其施用组合物的个体中相关蛋白质或多肽的正常水平。在其他实施方案中，对照是在其他治疗干预后，例如在直接注射相应多肽后，在一个或多个相当的时间点时多肽的表达水平。
在某些实施方案中，在施用后3天、4天、5天或1周或更长时间可检测到由本发明的多核苷酸编码的蛋白质的水平。可在血清和/或组织(例如肝或肺)中观察到分泌蛋白的水平增加。
在一些实施方案中，所述方法产生由本发明的多核苷酸编码的蛋白质的持续循环半衰期。例如，可检测到蛋白质持续比通过皮下注射蛋白质或编码蛋白质的mRNA观察到的半衰期长数小时或数天。在一些实施方案中，蛋白质的半衰期是1天、2天、3天、4天、5天或1周或更长时间。
许多类型的释放递送系统是可用的并且是本领域普通技术人员已知的。它们包括基于聚合物的系统，如聚(丙交酯-乙交酯)、共聚草酸酯、聚己内酯、聚酯酰胺、聚原酸酯、聚羟基丁酸和聚酐。含有药物的前述聚合物的微胶囊描述于例如美国专利5,075,109中。递送系统还包括非聚合物系统，其是脂质，包括固醇如胆固醇、胆固醇酯和脂肪酸或中性脂肪如甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯；水凝胶释放系统；弹性系统(sylastic system)；基于肽的系统：蜡包衣；使用常规粘合剂和赋形剂的压制片剂；部分融合的植入物等。具体实例包括但不限于：(a)侵蚀系统，其中活性组合物以某种形式包含在基质内，如美国专利4,452,775、4,667,014、4,748,034和5,239,660中描述的那些；以及(b)扩散系统，其中活性组分以受控速率从聚合物中渗透，如美国专利3,832,253和3,854,480中所描述。此外，可使用基于泵的硬件递送系统，其中一些适用于植入。
在一些实施方案中，治疗剂可通过连接部分与靶向部分直接或间接缀合。用于将治疗剂与靶向部分缀合的方法是本领域已知的。参见例如，Wadwa等人,J,Drug Targeting3:111(1995)和美国专利5,087,616。
在一些实施方案中，本文提供的治疗剂被配制成贮库形式，使得治疗剂释放到其被施用的身体中的方式关于时间和体内的位置进行控制(参见例如，美国专利4,450,150)。治疗剂的贮库形式可以是例如包含治疗剂和多孔或无孔材料(如聚合物)的可植入组合物，其中治疗剂被材料包封或扩散到材料中和/或降解无孔材料。然后将贮库植入体内所需的位置，并且治疗剂以预定速率从植入物中释放。
13.治疗方法
在某些方面，本文提供了治疗和/或预防疾患(例如癌症)的方法，所述方法包括将本文提供的药物组合物引入有需要的受试者(例如患有癌症的受试者)中。在一些实施方案中，药物组合物包含本文提供的环状RNA多核苷酸。在一些实施方案中，药物组合物包含本文提供的载体。在一些实施方案中，药物组合物包含含有本文提供的多核苷酸(例如，本文提供的环状RNA或载体)的细胞(例如，人细胞，如人T细胞)。
因此，在某些实施方案中，本文提供了治疗和/或预防受试者(例如哺乳动物受试者，如人受试者)的疾病的方法。不受特定理论或机制的束缚，CAR和TCR复合物蛋白质具有生物活性，例如识别抗原(例如CD19)的能力，使得CAR或TCR在由细胞表达时能够介导针对表达CAR或TCR对其具有特异性的抗原(例如CD19)的细胞的免疫应答。在这方面，本文提供的实施方案提供治疗或预防哺乳动物的癌症的方法，所述方法包括以有效治疗或预防哺乳动物的癌症的量向所述哺乳动物施用其治疗剂和/或本文提供的药物组合物。
在某些实施方案中，将本文提供的治疗剂与一种或多种另外的治疗剂(例如，在同一药物组合物中或在单独的药物组合物中)共同施用。在一些实施方案中，可首先施用本文提供的治疗剂，然后可施用一种或多种另外的治疗剂，或反之亦然。可替代地，本文提供的治疗剂和一种或多种另外的治疗剂可同时施用。在一些实施方案中，可与本文提供的治疗剂共同施用的另外的治疗剂是T细胞活性细胞因子，如IL-2、IL-7、IL-15和/或IL-21。
在某些实施方案中，治疗剂是包含环状RNA或本文提供的载体的细胞或细胞群，所述细胞表达由所述环状RNA或载体编码的CAR或TCR复合物蛋白质。在一些实施方案中，所施用的细胞对于被治疗的受试者而言是同种异体的。在一些实施方案中，所施用的细胞对于被治疗的受试者而言是自体的。
在某些实施方案中，所述方法还包括在施用治疗剂之前对受试者进行淋巴细胞清除。淋巴细胞清除的实例包括但不限于非清髓性淋巴细胞清除化学疗法、清髓性淋巴细胞清除化学疗法、全身照射等。
在一些实施方案中，受试者是哺乳动物。在一些实施方案中，本文所指的哺乳动物可以是任何哺乳动物，包括但不限于啮齿目哺乳动物，如小鼠和仓鼠，或兔形目哺乳动物，如兔。哺乳动物可来自食肉目，包括猫科动物(猫)和犬科动物(狗)。哺乳动物可来自偶蹄目，包括牛科动物(牛)和猪科动物(猪)；或奇蹄目哺乳动物，包括马科动物(马)。哺乳动物可属于灵长目、直翅目或类猴目(猴)或类人猿目(人和猿)。优选地，哺乳动物是人。
14.序列
表3-示例性IRES序列。
在一些实施方案中，本发明的IRES是具有如表3所列的序列(SEQ ID NO:1-72)的IRES。在一些实施方案中，IRES是萨力病毒IRES。在一些实施方案中，IRES是萨力病毒SZ1IRES。
表4.-鱼腥藻属置换位点5'内含子片段序列。
在一些实施方案中，5'内含子片段是具有表4中所列序列的片段。通常，含有表4中列出的5'内含子片段的构建体将含有如表5中列出的相应3'内含子片段(例如，两者均表示具有L9a-8置换位点的片段)。
表5-鱼腥藻属置换位点3'内含子片段序列。
在一些实施方案中，3'内含子片段是具有表5中所列序列的片段。在一些实施方案中，含有表5中所列的3'内含子片段的构建体将含有如表4中所列的相应5'内含子片段(例如，两者均表示具有L9a-8置换位点的片段)。
表6-非鱼腥藻属置换位点5'内含子片段序列。
在一些实施方案中，5'内含子片段是具有表6中所列序列的片段。含有表6中所列的5'内含子片段的构建体将含有如表7中所列的相应3'内含子片段(例如，两者均表示具有Azop1内含子的片段)。
表7-非鱼腥藻属置换位点3'内含子片段序列。
在一些实施方案中，3'内含子片段是具有表7中所列序列的片段。含有表7中所列的3'内含子片段的构建体将含有如表6中所列的相应5'内含子片段(例如，两者均表示具有Azop1内含子的片段)。
表8-间隔区和鱼腥藻属5'内含子片段序列。
在一些实施方案中，间隔区和5'内含子片段是具有如表8中所列序列的间隔区和片段。
表9-间隔区和鱼腥藻属3'内含子片段序列。
在一些实施方案中，间隔区和3'内含子片段是具有如表9中所列的序列的间隔区和内含子片段。
表10 -CAR序列
在一些实施方案中，CAR具有如表10中所列的序列。
表11 -CAR结构域序列。
在一些实施方案中，由本发明的多核苷酸编码的CAR结构域具有如表11中所列的序列。
本文描述了优选实施方案。阅读上述说明书后那些优选实施方案的变型对于本领域普通技术人员可变得明显。发明人希望技术人员适当地采用此类变型，并且发明人意图以其它方式而不是如本文所特别描述的来实施本发明。因此，本发明包括在适用法律允许的本发明随附的权利要求中叙述的主题的所有修改和等效物。此外，除非本文另外指示或明显地与上下文矛盾，否则本发明涵盖其所有可能变型中的上述要素的任何组合。
实施例
Wesselhoeft等人(2019)RNA Circularization Diminishes Immunogenicityand Can Extend Translation Duration In Vivo.Molecular Cell.74(3),508-520和Wesselhoeft等人(2018)Engineering circular RNA for Potent and StableTranslation in Eukaryotic Cells.Nature Communications.9,2629以引用的方式整体并入。
本发明将参考以下实施例进一步详细地描述，但不限于以下实施例。这些实施例涵盖说明的任何和所有变型，旨在向本领域普通技术人员提供关于如何制备和使用本发明的完整公开和描述，并且不意图限制被视为本发明的事物的范围。
实施例1
实施例1A：外部同源区允许使用置换内含子外显子(PIE)环化策略环化长前体RNA。
将含有全长脑心肌炎病毒(EMCV)IRES、高斯荧光素酶(GLuc)表达序列和置换内含子-外显子(PIE)构建体的两个短外显子片段的1.1kb序列插入T4噬菌体的胸苷酸合酶(Td)基因中置换的I组催化内含子的3'内含子与5'内含子之间。前体RNA是通过失控转录合成的。通过在镁离子和GTP存在下加热前体RNA来尝试环化，但没有获得剪接产物。
设计完美互补的9个核苷酸和19个核苷酸长的同源区并添加在前体RNA的5'和3'端。这些同源臂的添加将9个核苷酸同源区的剪接效率从0％增加至16％，并将19个核苷酸同源区的剪接效率提高到48％，如通过前体RNA条带的消失所评估。
将剪接产物用RNA酶R处理。跨RNA酶R处理的剪接反应的推定剪接接点的测序揭示连接的外显子，并且用寡核苷酸靶向的RNA酶H消化RNA酶R处理的剪接反应产生单一条带，相比之下由RNA酶H消化的线性前体产生两个条带。这表明环状RNA是含有9或19个核苷酸长的外部同源区的前体RNA的剪接反应的主要产物。
实施例1B：保护IRES和PIE剪接位点的二级结构的间隔区提高环化效率。
设计一系列间隔区并插入3'PIE剪接位点与IRES之间。这些间隔区旨在保护或破坏IRES、3'PIE剪接位点和/或5'剪接位点中内含子序列内的二级结构。添加旨在保护二级结构的间隔区序列产生87％的剪接效率，而添加破坏性间隔区序列导致没有可检测的剪接。
实施例2
实施例2A：除了外部同源区之外，内部同源区产生剪接泡并允许翻译若干表达序列。
间隔区被设计为非结构化的，与内含子和IRES序列非同源，并且含有间隔区-间隔区同源区。将这些插入构建体中的5'外显子与IRES之间以及3'外显子与表达序列之间，所述构建体含有外部同源区、EMCV IRES以及高斯荧光素酶(总长度：1289nt)、萤火虫荧光素酶(2384nt)、eGFP(1451nt)、人促红细胞生成素(1313nt)和Cas9核酸内切酶(4934nt)的表达序列。实现了所有5个构建体的环化。利用T4噬菌体和鱼腥藻属内含子的构建体的环化大致相等。对于较短的序列，环化效率更高。为了测量翻译，将每个构建体转染到HEK293细胞中。高斯和萤火虫荧光素酶转染的细胞产生稳健反应，如通过发光所测量，在用促红细胞生成素circRNA转染的细胞培养基中可检测到人促红细胞生成素，并且从用EGFP circRNA转染的细胞中观察到EGFP荧光。与仅sgRNA对照相比，将Cas9 circRNA与针对GFP的sgRNA共转染到组成性表达GFP的细胞中导致高达97％的细胞的荧光消融。
实施例2B：使用CVB3 IRES增加蛋白质产生。
制备了具有内部和外部同源区和不同IRES的构建体，所述IRES含有高斯荧光素酶或萤火虫荧光素酶表达序列。转染后24小时，通过HEK293细胞上清液中的发光测量蛋白质产生。在两种情况下，柯萨奇病毒B3(CVB3)IRES构建体产生的蛋白质最多。
实施例2C：使用polyA或polyAC间隔区增加蛋白质产生。
将30个核苷酸长的polyA或polyAC间隔区添加构建体中的IRES与剪接接点之间，每个IRES产生实施例2B中的蛋白质。转染后24小时，通过HEK293细胞上清液中的发光测量高斯荧光素酶活性。与没有间隔区的对照构建体相比，两种间隔区均改善了每个构建体中的表达。
实施例3
与用相当的未经修饰的或经修饰的线性RNA转染的细胞相比，用环状RNA转染的HEK293或HeLa细胞产生更多的蛋白质。
将HPLC纯化的高斯荧光素酶编码circRNA(CVB3-GLuc-pAC)与规范的未经修饰的5'甲基鸟苷加帽和3'polyA加尾的线性GLuc mRNA和市售核苷修饰(假尿苷，5-甲基胞嘧啶)的线性GLuc mRNA(来自Trilink)进行比较。转染后24小时测量发光，揭示circRNA在HEK293细胞中产生比未经修饰的线性mRNA多811.2％的蛋白质，并且比经修饰的mRNA多54.5％的蛋白质。在HeLa细胞中获得了类似的结果，并且将编码人促红细胞生成素的优化的circRNA与用5-甲氧基尿苷修饰的线性mRNA进行了比较。
在6天内收集发光数据。在HEK293细胞中，circRNA转染导致蛋白质产生半衰期为80小时，相比之下未经修饰的线性mRNA为43小时，并且经修饰的线性mRNA为45小时。在HeLa细胞中，circRNA转染导致蛋白质产生半衰期为116小时，相比之下未经修饰的线性mRNA为44小时，并且经修饰的线性mRNA为49小时。在两种细胞类型中，CircRNA在其整个生命周期中产生的蛋白质显著多于未经修饰的和经修饰的线性mRNA两者。
实施例4
实施例4A：通过RNA酶消化、HPLC纯化和磷酸酶处理纯化circRNA降低免疫原性。完全纯化的环状RNA的免疫原性显著低于未纯化或部分纯化的环状RNA。蛋白质表达稳定性和细胞活力取决于细胞类型和环状RNA纯度。
将人胚肾293(HEK293)和人肺癌A549细胞用以下转染：
a.未纯化的GLuc环状RNA剪接反应的产物，
b.剪接反应的RNA酶R消化的产物，
c.剪接反应的RNA酶R消化和HPLC纯化的产物，或
d.剪接反应的RNA酶消化、HPLC纯化和磷酸酶处理的产物。
与未转染的对照相比，剪接反应的RNA酶R消化不足以阻止A549细胞中的细胞因子释放。
添加HPLC纯化也不足以阻止细胞因子释放，尽管与未纯化的剪接反应相比，存在白细胞介素-6(IL-6)的显著减少和干扰素-α1(IFN-α1)的显著增加。
在HPLC纯化之后和RNA酶R消化之前添加磷酸酶处理显著降低了A549细胞中评估的所有上调细胞因子的表达。分泌的单核细胞趋化蛋白1(MCP1)、IL-6、IFN-α1、肿瘤坏死因子α(TNFα)和IFNγ诱导蛋白-10(IP-10)降至不可检测或未转染的基线水平。
HEK293细胞中没有大量细胞因子释放。当用更高纯度的环状RNA转染时，A549细胞具有提高的GLuc表达稳定性和细胞活力。完全纯化的环状RNA具有与转染的293细胞相似的稳定性表型。
实施例4B：环状RNA不会引起显著免疫原性并且不是RIG-I配体。
将A549细胞用剪接反应的产物转染。
将A549细胞用以下转染：
a.未纯化的环状RNA，
b.高分子量(线性和环状拼接)RNA，
c.环状(切口)RNA，
d.纯化的环状RNA的早期级分(与切口RNA峰重叠较多)，
e.纯化的环状RNA的后期级分(与切口RNA峰重叠较少)，
f.在环化过程中切除的内含子，或
g.媒介物(即未转染的对照)。
由于难以从剪接反应中获得适当纯的线性前体RNA，将前体RNA以剪接位点缺失突变体(DS)的形式单独合成和纯化。在每种情况下测量细胞因子释放和细胞活力。
观察到响应于剪接反应中存在的大多数物质以及前体RNA的稳健IL-6、RANTES和IP-10释放。早期circRNA级分引发了与其他非circRNA级分相当的细胞因子反应，从而表明即使相对少量的线性RNA污染物也能够在A549细胞中诱导显著细胞免疫应答。后期circRNA级分没有引发超过来自未转染对照的细胞因子反应。与所有其他级分相比，对于后期circRNA级分在转染后36小时的A549细胞活力显著更高。
分析了用后期circRNA HPLC级分、前体RNA或未纯化的剪接反应转染A549细胞后的RIG-I和IFN-β1转录物诱导。与前体RNA和未纯化的剪接反应相比，后期circRNA级分的RIG-I和IFN-β1转录物的诱导较弱。单独RNA酶R处理剪接反应不足以消除这种效应。将极少量的RIG-I配体3p-hpRNA添加至环状RNA诱导显著RIG-I转录。在HeLa细胞中，RNA酶R消化的剪接反应的转染诱导RIG-I和IFN-β1，但纯化的circRNA则不。总体而言，与A549细胞相比，HeLa细胞对污染RNA种类不那么敏感。
在用剪接反应或完全纯化的circRNA转染A549细胞后的前8小时内，监测RIG-I、IFN-β1、IL-6和RANTES转录物诱导的时程实验并未揭示针对circRNA的瞬时应答。纯化的circRNA同样未能在RAW264.7鼠巨噬细胞中诱导促炎性转录物。
用含有EMCV IRES和EGFP表达序列的纯化circRNA转染A549细胞。这未能产生对促炎性转录物的实质性诱导。这些数据表明，剪接反应的非环状组分是造成先前研究中观察到的免疫原性的原因，并且circRNA不是RIG-I的天然配体。
实施例5
环状RNA避免TLR的检测。
用多个线性或环状RNA构建体转染TLR 3、7和8报告细胞系，并测量分泌的胚胎碱性磷酸酶(SEAP)。
通过缺失内含子和同源臂序列构建线性化RNA。然后用磷酸酶处理线性RNA构建体(在加帽RNA的情况下，在加帽后)并通过HPLC纯化。
尝试的转染均未在TLR7报告细胞中产生应答。TLR3和TLR8报告细胞被加帽的线性化RNA、聚腺苷酸化的线性化RNA、切口circRNAHPLC级分和早期circRNA级分激活。后期circRNA级分和m1ψ-mRNA不会在任何细胞系中引起TLR介导的应答。
在第二实验中，将circRNA使用两种方法线性化：在镁离子存在下用加热处理circRNA和DNA寡核苷酸引导的RNA酶H消化。两种方法均产生了大部分全长线性RNA和少量完整circRNA。将TLR3、7和8报告细胞用环状RNA、通过加热降解的环状RNA或通过RNA酶H降解的环状RNA转染，并在转染后36小时测量SEAP分泌。TLR8报告细胞响应于两种形式的降解的环状RNA分泌SEAP，但对环状RNA转染的反应并不比模拟转染更大。尽管体外转录的线性化RNA激活TLR3，但在TLR3和TLR7报告细胞中未观察到在降解或完整条件下的激活。
实施例6
与线性RNA相比，未经修饰的环状RNA产生增加的持续体内蛋白质表达。
对小鼠注射并用未经修饰和m1ψ经修饰的人促红细胞生成素(hEpo)线性mRNA和circRNA转染HEK293细胞。m1ψ-mRNA和未经修饰的circRNA的等摩尔转染在HEK293细胞中产生稳健蛋白质表达。在HEK293和A549细胞的等重量转染后，hEpo线性mRNA和circRNA显示出与GLuc线性mRNA和circRNA相比相似的相对蛋白质表达模式和细胞活力。
在小鼠中，将hEpo circRNA或线性mRNA注射进内脏脂肪后，在血清中检测到hEpo。注射未经修饰的circRNA后检测到的hEpo比来自未修饰或m1ψ-mRNA的衰减更慢，并且在注射后42小时仍然存在。注射未纯化的circRNA剪接反应物或未经修饰的线性mRNA后，血清hEpo迅速下降。注射未纯化的剪接反应产生了在血清中可检测到的细胞因子反应，而对于其他RNA(包括纯化的circRNA)未观察到。
实施例7
环状RNA可通过脂质纳米颗粒在体内或体外有效递送。
纯化的环状RNA被配制成具有可电离类脂质cKK-E12的脂质纳米颗粒(LNP)(Dong等人,2014；Kauffman等人,2015)。颗粒形成均匀的多层结构，其平均大小、多分散性指数和包封效率与含有用5moU修饰的市售对照线性mRNA的颗粒相似。
当包封在LNP中并添加至HEK293细胞中时，纯化的hEpo circRNA显示出比5moU-mRNA更高的表达。LNP-RNA在HEK293细胞中的表达稳定性与通过转染试剂递送的RNA的表达稳定性相似，除了5moU-mRNA和circRNA的衰减略有延迟。未经修饰的circRNA和5moU-mRNA均未能在体外激活RIG-I/IFN-β1。
在小鼠中，LNP-RNA通过局部注射到内脏脂肪组织中递送或静脉内递送至肝脏。在两种情况下，来自circRNA的血清hEpo表达较低，但与递送后6小时来自5moU-mRNA的表达相当。脂肪注射未经修饰的LNP-circRNA后检测到的血清hEpo比LNP-5moU-mRNA的衰减得更慢，其中血清中存在的表达衰减延迟与体外观察到的相似，但静脉内注射LNP-circRNA或LNP-5moU-mRNA后的血清hEpo以大致相同的速率衰减。在这些情况中的任一者下，血清细胞因子或局部RIG-I、TNFα或IL-6转录物诱导均没有增加。
实施例8
IRES在HEK293、HepG2和1C1C7细胞中的表达和功能稳定性。
将包含鱼腥藻属内含子/外显子区域、高斯荧光素酶表达序列和不同IRES的构建体环化。使用Lipofectamine MessengerMax将100ng的每种环化反应分别转染到20,000个HEK293细胞、HepG2细胞和1C1C7细胞中。24小时后评估每种上清液中的发光作为蛋白质表达的量度。在HEK293细胞中，包含Crohivirus B、萨力病毒FHB、爱知病毒、萨力病毒HG-J1和肠道病毒J IRES的构建体在24小时时产生最多的发光(图1A)。在HepG2细胞中，包含爱知病毒、萨力病毒FHB、EMCV-Cf和CVA3 IRES的构建体在24小时时产生高发光(图1B)。在1C1C7细胞中，包含萨力病毒FHB、爱知病毒、萨力病毒NG-J1和萨力病毒A SZ-1IRES的构建体在24小时时产生高发光(图1C)。
观察到较大的IRES在24小时时产生较大的发光的趋势。较短的总序列长度往往提高环化效率，因此选择高表达和相对短的IRES可产生改进的构建体。在HEK293细胞中，使用Crohivirus B IRES的构建体产生最高的发光，尤其是与其他类似长度的IRES相比(图2A)。针对IRES大小绘制的来自HepG2和1C1C7细胞中IRES构建体的表达在图2B和2C中。
在3天内测量了HepG2和1C1C7细胞中选定IRES构建体的功能稳定性。在用100ng的每种环化反应转染20,000个细胞后，每24小时测量来自上清液中分泌的高斯荧光素酶的发光，然后完全更换培养基。萨力病毒A GUT和萨力病毒FHB在HepG2细胞中表现出最高的功能稳定性，并且萨力病毒N-J1和萨力病毒FHB在1C1C7细胞中产生最稳定的表达(图3A和3B)。
实施例9
IRES在Jurkat细胞中的表达和功能稳定性。
将包含鱼腥藻属内含子/外显子区域、高斯荧光素酶表达序列和先前测试的IRES子组的2组构建体环化。将60,000个Jurkat细胞用1μg的每种环化反应进行电穿孔。在电穿孔后24小时测量来自上清液中分泌的高斯荧光素酶的发光。CVB3 IRES构建体均包含于两组中，以用于组之间以及与先前定义的IRES功效的比较。CVB1和萨力病毒A SZ1 IRES构建体在24小时时产生最多的表达。数据可在图4A和4B中找到。
在3天内测量每轮电穿孔Jurkat细胞中IRES构建体的功能稳定性。在用1μg的每种环化反应对60,000个细胞进行电穿孔后，每24小时测量来自上清液中分泌的高斯荧光素酶的发光，然后完全更换培养基(图5A和5B)。
与其他构建体相比，萨力病毒A SZ1和萨力病毒A BN2 IRES构建体具有高功能稳定性。
实施例10
Jurkat细胞中环状和线性RNA的表达、功能稳定性和细胞因子释放。
将包含鱼腥藻属内含子/外显子区域、高斯荧光素酶表达序列和萨力病毒FHBIRES的构建体环化。包含高斯荧光素酶表达序列和约150nt polyA尾且经修饰以用5-甲氧基尿苷(5moU)置换100％的尿苷的mRNA可商购获得，并且购自Trilink。5moU核苷酸修饰已被证明提高mRNA的稳定性和表达(Bioconjug Chem.2016 Mar 16；27(3):849-53)。测量并比较了Jurkat细胞中经修饰的mRNA、环化反应(不纯)和通过尺寸排阻HPLC纯化的circRNA(纯)的表达(图6A)。用1μg的每种RNA种类对60,000个细胞进行电穿孔后24小时，测量来自上清液中分泌的高斯荧光素酶的发光。
在用1ug的每种RNA种类对60,000个细胞进行电穿孔后，每24小时测量来自上清液中分泌的高斯荧光素酶的发光，然后完全更换培养基。图6B是Jurkat细胞中经修饰mRNA和circRNA在3天内的功能稳定性数据的比较。
用1μg的上述每种RNA种类和3p-hpRNA(5'三磷酸发夹RNA，其是已知的RIG-I激动剂)对60,000个Jurkat细胞进行电穿孔后18小时测量IFNγ(图7A)、IL-6(图7B)、IL-2(图7C)、RIG-I(图7D)、IFN-β1(图7E)和TNFα(图7F)转录物诱导。
实施例11
环状和线性RNA在单核细胞和巨噬细胞中的表达。
将包含鱼腥藻属内含子/外显子区域、高斯荧光素酶表达序列和萨力病毒FHBIRES的构建体环化。包含高斯荧光素酶表达序列和约150nt polyA尾且经修饰以用5-甲氧基尿苷(5moU)置换100％的尿苷的mRNA购自Trilink。在人原代单核细胞(图8A)和人原代巨噬细胞(图8B)中测量了环状和经修饰的mRNA的表达。用1μg的每种RNA种类对60,000个细胞进行电穿孔后24小时，测量来自上清液中分泌的高斯荧光素酶的发光。还在人原代巨噬细胞电穿孔后4天测量了发光，每24小时更换培养基(图8C)。在每种情况下，发光的差异在统计学上是显著的(p<0.05)。
实施例12
IRES在原代T细胞中的表达和功能稳定性。
将包含鱼腥藻属内含子/外显子区域、高斯荧光素酶表达序列和先前测试的IRES子组的构建体环化，并将反应产物通过尺寸排阻HPLC纯化。将150,000个原代人CD3+ T细胞用1μg的每种circRNA进行电穿孔。在电穿孔后24小时测量来自上清液中分泌的高斯荧光素酶的发光(图9A)。爱知病毒和CVB3 IRES构建体在24小时时具有最多表达。
还在电穿孔后每24小时测量发光持续3天，以比较每种个构建体的功能稳定性(图9B)。具有萨力病毒A SZ1 IRES的构建体是最稳定的。
实施例13
环状和线性RNA在原代T细胞和PBMC中的表达和功能稳定性。
将包含鱼腥藻属内含子/外显子区域、高斯荧光素酶表达序列和萨力病毒A SZ1IRES或萨力病毒FHB IRES的构建体环化。包含高斯荧光素酶表达序列和约150nt polyA尾且经修饰以用5-甲氧基尿苷(5moU)置换100％的尿苷的mRNA购自Trilink。测量萨力病毒ASZ1 IRES HPLC纯化的环状和经修饰的mRNA在人原代CD3+ T细胞中的表达。测量萨力病毒FHB HPLC纯化的环状、未纯化的环状和经修饰的mRNA在人PBMC中的表达。用1μg的每种RNA种类对150,000个细胞进行电穿孔后24小时，测量来自上清液中分泌的高斯荧光素酶的发光。原代人T细胞的数据显示在图10A和10B中，并且PBMC的数据显示在图10C中。在每种情况下，纯化的环状RNA与未纯化的环状RNA或线性RNA之间的表达差异是显著的(p<0.05)。
在电穿孔后在3天内每24小时测量来自原代T细胞上清液中分泌的高斯荧光素酶的发光，以比较构建体功能稳定性。数据在图10B中示出。对于原代T细胞，来自纯化的环状RNA与线性RNA之间第1天测量的相对发光的差异在第2天和第3天是显著的。
实施例14
根据鱼腥藻属内含子中的置换位点的环化效率。
产生了包含CVB3 IRES、高斯荧光素酶表达序列、鱼腥藻属内含子/外显子区域、间隔区、内部同源区和同源臂的RNA构建体。通过HPLC测量使用传统鱼腥藻属内含子置换位点和P9中5个连续置换位点的构建体的环化效率。P9中5个连续置换位点的HPLC色谱图如图11A所示。
在各种置换位点测量环化效率。环化效率被定义为以下各项的HPLC色谱图曲线下面积：circRNA/(circRNA+前体RNA)。每个置换位点的环化效率的分级量化在图11B中。选择了3个置换位点(如图11B所示)进行进一步研究。
此实施例中的环状RNA通过体外转录(IVT)，然后通过旋转柱进行纯化来进行环化。如果包括与Mg2+和鸟苷核苷酸孵育的额外步骤，则所有构建体的环化效率将可能更高；然而，除去这一步骤允许环状RNA构建体之间的比较和优化。这种优化水平对于保持大RNA构建体(如编码嵌合抗原受体的那些构建体)的高环化效率特别有用。
实施例15
选择性内含子的环化效率。
创建了含有可变物种起源或置换位点的置换1组内含子和若干恒定元件的前体RNA，所述若干恒定元件包括：CVB3 IRES、高斯荧光素酶表达序列、间隔区、内部同源区和同源臂。环化数据可见于图12中。图12A示出解析前体、CircRNA和内含子的色谱图。图12B基于图12A中所示的色谱图提供环化效率的分级量化，作为内含子构建体的函数。
此实施例中的环状RNA通过体外转录(IVT)，然后旋转柱纯化来进行环化。如果包括与Mg2+和鸟苷核苷酸孵育的额外步骤，则所有构建体的环化效率将可能更高；然而，除去这一步骤允许环状RNA构建体之间的比较和优化。这种优化水平对于保持大RNA构建体(如编码嵌合抗原受体的那些构建体)的高环化效率特别有用。
实施例16
根据同源臂存在或长度的环化效率。
产生了包含CVB3 IRES、高斯荧光素酶表达序列、鱼腥藻属内含子/外显子区域、间隔区和内部同源区的RNA构建体。用30nt、25％GC同源臂或无同源臂(“NA”)测试代表3个鱼腥藻属内含子置换位点的构建体。使这些构建体环化，无需Mg2+孵育步骤。测量并比较环化效率。数据可在图13中找到。对于缺乏同源臂的每个构建体，环化效率更高。图13A提供环化效率的分级量化；图13B提供解析前体、circRNA和内含子的色谱图。
对于3个置换位点中的每一个，产生了具有10nt、20nt和30nt臂长以及25％、50％和75％GC含量的构建体。测量这些构建体的剪接效率并且与没有同源臂的构建体进行比较(图14)。剪接效率被定义为剪接反应中游离内含子相对于总RNA的比例。
图15A(左)示出HPLC色谱图，从而表明强同源臂对提高剪接效率的贡献。左上：75％GC含量，10nt同源臂。左中：75％GC含量，20nt同源臂。左下：75％GC含量，30nt同源臂。
图15A(右)示出HPLC色谱图，其显示与切口增加配对的剪接效率增加，在circRNA峰上显示为肩峰。右上：75％GC含量，10nt同源臂。右中：75％GC含量，20nt同源臂。右下：75％GC含量，30nt同源臂。
图15B(左)示出假设证明提高的环化效率的置换位点和同源臂的选定组合。
图15B(右)示出假设证明提高的环化效率的置换位点和同源臂的选定组合，用大肠杆菌polyA聚合酶处理。
此实施例中的环状RNA通过体外转录(IVT)，然后旋转柱纯化来进行环化。如果包括与鸟苷核苷酸的额外Mg2+孵育步骤，则所有构建体的环化效率将可能更高；然而，除去这一步骤允许环状RNA构建体之间的比较和优化。这种优化水平对于保持大RNA构建体(如编码嵌合抗原受体的那些构建体)的高环化效率特别有用。
实施例17
编码CAR的环状RNA
将包含鱼腥藻属内含子/外显子区域、Kymriah嵌合抗原受体(CAR)表达序列和CVB3 IRES的构建体环化。将100,000个人原代CD3+ T细胞用500ng的circRNA电穿孔，并与稳定表达GFP和荧火虫荧光素酶的Raji细胞共培养24小时。效应物与靶标比率(E:T比率)0.75:1。将100,000个人原代CD3+ T细胞模拟电穿孔并共培养作为对照(图16)。
将一组100,000个人原代CD3+ T细胞模拟电穿孔或用1μg的circRNA电穿孔，然后与稳定表达GFP和萤火虫荧光素酶的Raji细胞共培养48小时。E:T比率10:1(图17)。
Raji靶细胞的特异性裂解的定量通过检测萤火虫发光来确定(图18)。将100,000个模拟电穿孔或用编码不同CAR序列的circRNA电穿孔的人原代CD3+ T细胞与稳定表达GFP和萤火虫荧光素酶的Raji细胞共培养48小时。特异性裂解％定义为1-[CAR条件发光]/[模拟条件发光]。E:T比率10:1。
实施例18
环状和线性RNA在Jurkat细胞和静息人T细胞中的表达和功能稳定性。
将包含鱼腥藻属内含子/外显子区域、高斯荧光素酶表达序列和先前测试的IRES子组的构建体环化，并将反应产物通过尺寸排阻HPLC纯化。将150,000个Jurkat细胞用1μg的环状RNA或5moU-mRNA进行电穿孔。电穿孔后24小时测量来自上清液中分泌的高斯荧光素酶的发光(图19A左)。用1μg环状RNA或5moU-mRNA对150,000个静息原代人CD3+ T细胞(刺激后10天)进行电穿孔。在电穿孔后24小时测量来自上清液中分泌的高斯荧光素酶的发光(图19A右)。
在电穿孔后每24小时测量来自上清液中分泌的高斯荧光素酶的发光，然后完全更换培养基。功能稳定性数据显示在图19B中。在每种情况下，环状RNA比线性RNA具有更高的功能稳定性，在Jurkat细胞中差异更明显。
实施例19
用线性RNA或不同环状RNA构建体电穿孔的细胞的IFN-β1、RIG-I、IL-2、IL-6、IFNγ和TNFα转录物诱导。
将包含鱼腥藻属内含子/外显子区域、高斯荧光素酶表达序列和先前测试的IRES子组的构建体环化，并将反应产物通过尺寸排阻HPLC纯化。将150,000个CD3+人T细胞用1μg的环状RNA、5moU-mRNA或免疫刺激阳性对照聚肌苷:胞嘧啶进行电穿孔。在电穿孔后18小时测量IFN-β1(图20A)、RIG-I(图20B)、IL-2(图20C)、IL-6(图20D)、IFN-γ(图20E)和TNF-α(图20F)转录物诱导。
实施例20
用不同量的环状或线性RNA电穿孔的CAR表达细胞特异性裂解靶细胞和IFNγ转录物诱导；CAR表达细胞以不同E:T比率对靶细胞和非靶细胞的特异性裂解。
将包含鱼腥藻属内含子/外显子区域、抗CD19 CAR表达序列和CVB3 IRES的构建体环化，并将反应产物通过尺寸排阻HPLC进行纯化。将150,000个模拟电穿孔或用不同数量的编码抗CD19 CAR序列的circRNA电穿孔的人原代CD3+ T细胞与稳定表达GFP和萤火虫荧光素酶的Raji细胞以2:1的E:T比率共培养12小时。Raji靶细胞的特异性裂解％通过检测萤火虫发光来测定(图21A)。特异性裂解％定义为1-[CAR条件发光]/[模拟条件发光]。在电穿孔后24小时测量IFNγ转录物诱导(图21B)。
将150,000个人原代CD3+ T细胞模拟电穿孔或用500ng编码抗CD19 CAR序列的circRNA或m1ψ-mRNA电穿孔，然后与稳定表达萤火虫荧光素酶的Raji细胞以不同E:T比率共培养24小时。Raji靶细胞的特异性裂解通过检测萤火虫发光来确定(图22A)。特异性裂解被定义为1-[CAR条件发光]/[模拟条件发光]。
将表达CAR的T细胞也与稳定表达萤火虫荧光素酶的Raji或K562细胞以不同E:T比率共培养24小时。Raji靶细胞或K562非靶细胞的特异性裂解通过检测萤火虫发光来确定(图22B)。特异性裂解％被定义为1-[CAR条件发光]/[模拟条件发光]。
实施例21
用编码CAR的环状RNA或线性RNA电穿孔的T细胞对靶细胞的特异性裂解。
将包含鱼腥藻属内含子/外显子区域、抗CD19 CAR表达序列和CVB3 IRES的构建体环化，并将反应产物通过尺寸排阻HPLC纯化。用500ng环状RNA或等摩尔量的m1ψ-mRNA(各自编码CD19靶向CAR)对人原代CD3+ T细胞进行电穿孔。将Raji细胞在7天内以10:1的E:T比例添加至CAR-T细胞培养物中。在第1、3、5和7天测量两种构建体的特异性裂解％(图23)。
实施例22
表达抗CD19 CAR或抗BCMA CAR的T细胞对Raji细胞的特异性裂解。
将包含鱼腥藻属内含子/外显子区域、抗CD19或抗BCMA CAR表达序列和CVB3 IRES的构建体环化，并将反应产物通过尺寸排阻HPLC纯化。将150,000个原代人CD3+ T细胞用500ng的circRNA电穿孔，然后与Raji细胞以2:1的E:T比例共培养。在电穿孔后12小时测量特异性裂解％(图24)。
实施例23
化合物的合成
本发明的代表性可电离脂质的合成描述于PCT申请PCT/US2016/052352、PCT/US2016/068300、PCT/US2010/061058、PCT/US2018/058555、PCT/US2018/053569、PCT/US2017/028981、PCT/US2019/025246、PCT/US2018/035419、PCT/US2019/015913以及公布号为20190314524、20190321489和20190314284的美国申请，所述申请各自的内容以引用的方式整体并入本文。
实施例24
纳米颗粒组合物的产生
为了研究用于将环状RNA递送至细胞的安全且有效的纳米颗粒组合物，制备并测试了一系列制剂。具体地，对纳米颗粒组合物的脂质组分中的特定要素及其比例进行了优化。
纳米颗粒可用混合方法如两种流体流的微流体和T型接合混合来制备，其中一种流体流含有环状RNA，并且另一种流体流具有脂质组分。
通过将可电离脂质、任选的辅助脂质(如可从Avanti Polar Lipids,Alabaster,AL获得的DOPE、DSPC或油酸)、PEG脂质(例如1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油甲氧基聚乙二醇，也称为PEG-DMG，可从Avanti Polar Lipids,Alabaster,AL获得)和结构脂质如胆固醇在溶剂(例如乙醇)中以约例如50mM的浓度合并来制备脂质组合物。应将溶液冷藏以在例如-20℃下储存。将脂质合并以产生所需的摩尔比(参见例如下表12和13)并用水和乙醇稀释至例如介于约5.5mM与约25mM之间的最终脂质浓度。
表12
在一些实施方案中，转移媒介物具有如表12中所述的配方。
表13
在一些实施方案中，转移媒介物具有如表13中所述的配方，其中化合物是指如本文所述的环状RNA。
对于包含circRNA的纳米颗粒组合物，将在去离子水中浓度为0.1mg/ml的circRNA的溶液在pH介于3与4之间的缓冲液，例如50mM柠檬酸钠缓冲液中稀释以形成储备溶液。
通过将脂质溶液与包含环状RNA的溶液以介于约5:1至约50:1之间的脂质组分与circRNA wt:wt比率合并来制备包含环状RNA和脂质组分的纳米颗粒组合物。使用例如基于NanoAssemblr微流体的系统以介于约10ml/min与约18ml/min之间的流速将脂质溶液快速注射到circRNA溶液中，以产生水与乙醇比率介于约1:1与约4:1之间的悬浮液。
可通过渗析来加工纳米颗粒组合物以除去乙醇并实现缓冲液交换。使用Slide-A-Lyzer盒(Thermo Fisher Scientific Inc.Rockford,IL)将制剂针对pH 7.4、体积为初产物200倍的磷酸盐缓冲盐水(PBS)透析两次，其中分子量截断是10kDa。第一次透析在室温下进行3小时。然后将制剂在4℃下透析过夜。将所得纳米颗粒悬浮液通过0.2μm无菌过滤器(Sarstedt,Nümbrecht,Germany)过滤到玻璃小瓶中并用卷边封闭物密封。通常获得0.01mg/ml至0.10mg/ml的纳米颗粒组合物溶液。
上述方法诱导纳米沉淀和颗粒形成。
替代方法(包括但不限于T-接合和直接注入)可用于实现相同的纳米沉淀。B.纳米颗粒组合物的表征
Zetasizer Nano ZS(Malvern Instruments Ltd,Malvern,Worcestershire,UK)可用于测定纳米颗粒组合物的粒度、多分散性指数(PDI)和ζ电位，在1×PBS中测定粒度并且在15mM PBS中测定ζ电位。
紫外-可见光谱可用于测定纳米颗粒组合物中circRNA的浓度。将100μL的在1×PBS中稀释的制剂添加至900μL的甲醇和氯仿的4:1(v/v)混合物中。在混合后，例如在DU800分光光度计(Beckman Coulter,Beckman Coulter,Inc.,Brea,CA)上在230nm与330nm之间记录溶液的吸收光谱。可基于纳米颗粒组合物中使用的circRNA的消光系数以及在例如260nm波长处的吸光度与在例如330nm波长处的基线值之间的差异来计算所述组合物中的circRNA的浓度。
可使用QUANT-ITTM 
RNA测定(Invitrogen CorporationCarlsbad,CA)来评价纳米颗粒组合物对circRNA的包封。将样品在TE缓冲溶液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 7.5)中稀释至大约5μg/mL的浓度。将50μL的稀释样品转移至聚苯乙烯96孔板，并且将50μL的TE缓冲液或50μL的2％Triton X-100溶液添加至孔中。将板在37℃的温度下孵育15分钟。将
试剂在TE缓冲液中1:100稀释，并且将100μL的此溶液添加至每个孔中。可使用荧光板读取器(Wallac Victor 1420Multilabel Counter；PerkinElmer,Waltham,MA)在例如约480nm的激发波长和例如约520nm的发射波长下测量荧光强度。从每个样品的荧光值中减去试剂空白的荧光值，并且通过用完整样品(没有添加TritonX-100)的荧光强度除以分解样品(通过添加Triton X-100造成)的荧光值来确定游离circRNA的百分比。C.
体内制剂研究：
为了监测各种纳米颗粒组合物将circRNA递送至靶细胞的效率，制备了包含circRNA的不同纳米颗粒组合物并将其施用于啮齿动物群。向小鼠静脉内、肌肉内、动脉内或肿瘤内施用包括具有脂质纳米颗粒配方的纳米颗粒组合物的单一剂量。在一些情况下，可使小鼠吸入剂量。剂量大小可在0.001mg/kg至10mg/kg的范围内，其中10mg/kg描述对于每1kg小鼠体重在纳米颗粒组合物中包含10mg circRNA的剂量。也可使用包含PBS的对照组合物。
将纳米颗粒组合物施用于小鼠后，可通过酶联免疫吸附测定(ELISA)、生物发光成像或其他方法来测量特定制剂及其剂量的剂量递送曲线、剂量响应和毒性。还可评价蛋白质表达的时程。从啮齿动物中收集的用于评价的样品可包括血液和组织(例如，来自肌肉内注射部位的肌肉组织和内部组织)；样品采集可涉及动物的处死。
通过施用包含circRNA的组合物诱导的更高的蛋白质表达水平将指示更高的circRNA翻译和/或纳米颗粒组合物circRNA递送效率。由于认为非RNA组分本身不会影响翻译机制，因此较高的蛋白质表达水平可能指示相对于其他纳米颗粒组合物或所述纳米颗粒组合物不存在的情况，给定纳米颗粒组合物对circRNA的递送效率更高。
实施例25
纳米颗粒组合物的表征
Zetasizer Nano ZS(Malvern Instruments Ltd,Malvern,Worcestershire,UK)可用于测定转移媒介物组合物的粒度、多分散性指数(PDI)和ζ电位，在1×PBS中测定粒度并且在15mM PBS中测定ζ电位。
紫外-可见光谱法可用于测定转移媒介物组合物中治疗剂和/或预防剂(例如RNA)的浓度。将100μL在1×PBS中的稀释制剂添加至900μL的甲醇与氯仿的4:1(v/v)混合物中。在混合后，例如在DU 800分光光度计(Beckman Coulter,Beckman Coulter,Inc.,Brea,CA)上在230nm与330nm之间记录溶液的吸收光谱。可基于转移媒介物组合物中使用的治疗剂和/或预防剂的消光系数以及在例如260nm波长处的吸光度与在例如330nm波长处的基线值之间的差异来计算所述组合物中的治疗剂和/或预防剂的浓度。
对于包含RNA的转移媒介物组合物，可使用QUANT-ITTM 
RNA测定(Invitrogen Corporation Carlsbad,CA)来评价转移媒介物组合物对RNA的包封。将样品在TE缓冲溶液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 7.5)中稀释至大约5μg/mL的浓度。将50μL的稀释样品转移至聚苯乙烯96孔板，并且将50μL的TE缓冲液或50μL的2％Triton X-100溶液添加至孔中。将板在37℃的温度下孵育15分钟。将
试剂在TE缓冲液中1:100稀释，并且将100μL的此溶液添加至每个孔中。可使用荧光平板读取器(Wallac Victor1420 Multilablel Counter；Perkin Elmer,Waltham,MA)在例如约480nm的激发波长和例如约520nm的发射波长下测量荧光强度。从每个样品的荧光值中减去试剂空白的荧光值，
并且通过用完整样品(没有添加Triton X-100)的荧光强度除以分解样品(通过添加Triton X-100造成)的荧光值来确定游离RNA的百分比。
实施例26
T细胞靶向
为了使转移媒介物靶向T细胞，将T细胞抗原结合剂(例如抗CD8抗体)偶联至转移媒介物的表面。将抗T细胞抗原抗体在PBS中的EDTA存在下用过量的DTT轻度还原，以暴露游离铰链区硫醇。为了除去DTT，使抗体通过脱盐柱。异双功能交联剂SM(PEG)24用于将抗体锚定至负载circRNA的转移媒介物的表面(胺基存在于PEG脂质的头基中，抗体上的游离硫醇基团由DTT产生，SM(PEG)24使胺与硫醇基团之间交联)。将转移媒介物首先与过量的SM(PEG)24一起孵育并离心以除去未反应的交联剂。然后将激活的转移媒介物与过量的还原性抗T细胞抗原抗体一起孵育。使用离心过滤装置除去未结合的抗体。
实施例27
使用RV88的含RNA的转移媒介物。
在此实施例中，使用带有阳离子脂质RV88的2-D涡旋微流体芯片合成含有RNA的转移媒介物，以用于递送circRNA。
表14
RV88、DSPC和胆固醇均在乙醇中以10mg/ml的浓度在硼硅小瓶中制备。脂质14:0-PEG2K PE也在硼硅玻璃小瓶中以4mg/ml的浓度制备。通过在乙醇中对脂质进行超声处理2分钟来使脂质在储备液浓度下溶解。然后将溶液在设置为170rpm的轨道倾斜振荡器上在37℃下加热10分钟。然后将小瓶在26℃下平衡至少45分钟。然后通过添加如表15中所示体积的储备脂质来混合脂质。然后用乙醇调节溶液，使得最终脂质浓度是7.92mg/ml。
表15
RNA被制备为含有75mM柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)和RNA浓度为1.250mg/ml的储备溶液。然后用pH 6.0的75mM柠檬酸盐缓冲液将RNA的浓度调节至0.1037mg/ml，平衡至26℃。然后将溶液在26℃下孵育至少25分钟。
将微流体室用乙醇清洗，并通过将注射器负载RNA溶液和另一个注射器负载乙醇脂质来制备neMYSIS注射泵。将两个注射器都在neMESYS软件的控制下负载。然后将溶液以2的水相与有机相比率和22ml/min的总流速(对于RNA 14.67ml/min，且对于脂质溶液7.33ml/min)施加至混合芯片上。两个泵同步启动。将从微流体芯片流动的混合器溶液以4x1 ml级分收集，其中第一级分作为废物丢弃。通过使用G-25微型脱盐柱将含有RNA脂质体的剩余溶液交换为pH 7.5的10mM Tris-HCl、1mM EDTA。缓冲液交换后，分别通过DLS分析和Ribogreen测定对材料的大小和RNA截留进行表征。
实施例28
使用RV94的含RNA的转移媒介物。
在此实施例中，使用带有阳离子脂质RV94的2-D涡旋微流体芯片合成含有RNA的脂质体，以用于递送circRNA。
表16
脂质如实施例27中使用表17中指定的材料量制备至7.92mg/ml的最终脂质浓度。
表17
circRNA的水溶液被制备为含有75mM柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)和circRNA浓度为1.250mg/ml的储备溶液。然后用pH 6.0的75mM柠檬酸盐缓冲液将RNA的浓度调节至0.1037mg/ml，平衡至26℃。然后将溶液在26℃下孵育至少25分钟。
将微流体室用乙醇清洗，并通过将注射器负载RNA溶液和另一个注射器负载乙醇脂质来制备neMYSIS注射泵。将两个注射器都在neMESYS软件的控制下负载。然后将溶液以2的水相与有机相比率和22ml/min的总流速(对于RNA 14.67ml/min，且对于脂质溶液7.33ml/min)施加至混合芯片上。两个泵同步启动。将从微流体芯片流动的混合器溶液以4x1 ml级分收集，其中第一级分作为废物丢弃。如上所述，通过使用G-25微型脱盐柱将含有circRNA转移媒介物的剩余溶液交换为pH 7.5的10mM Tris-HCl、1mM EDTA。缓冲液交换后，分别通过DLS分析和Ribogreen测定对材料的大小和RNA截留进行表征。脂质体的生物物理分析示于表18中。
表18
实施例29
用于在线混合的通用方案。
制备单独的且分开的储备溶液-一种含有脂质，并且另一种含有circRNA。通过溶解在90％乙醇中来制备含有所需脂质或脂质混合物、DSPC、胆固醇和PEG脂质的脂质储备液。剩余的10％是低pH柠檬酸盐缓冲液。脂质储备液的浓度是4mg/mL。这种柠檬酸盐缓冲液的pH可在介于pH 3与pH 5之间的范围内，取决于所使用的脂质的类型。circRNA也以4mg/mL浓度溶解在柠檬酸盐缓冲液中。制备5mL的每种储备溶液。
储备溶液是完全透明的，并且确保脂质在与circRNA合并之前完全溶解。可加热储备溶液以完全溶解脂质。所述过程中使用的circRNA可以是未经修饰的或经修饰的寡核苷酸，并且可与亲脂性部分如胆固醇缀合。
通过将每种溶液泵送至T形接头来将单独储备液合并。双头Watson-Marlow泵用于同时控制两个流的开始和停止。将1.6mm聚丙烯管进一步缩小至0.8mm管以增加线性流速。将聚丙烯线(ID＝0.8mm)连接至T型接头的任一侧。聚丙烯T的线性边缘为1.6mm，最终体积为4.1mm3。将聚丙烯线的每个大端(1.6mm)放入含有溶解的脂质储备液或溶解的circRNA的试管中。在T形接头之后，在合并流的出口处放置单根管。然后将管延伸至具有2x体积PBS的容器中，并快速搅拌。泵的流速设置为300rpm或110mL/min。通过透析除去乙醇并交换为PBS。然后使用离心或渗滤将脂质制剂浓缩至适当的工作浓度。
C57BL/6小鼠(Charles River Labs,MA)通过尾静脉注射接受盐水或配制的circRNA。在施用后的不同时间点，通过眶后取血收集血清样品。使用显色测定(BiophenFVTI,Aniara Corporation,OH)来测定样品中因子VII蛋白的血清水平。为了确定因子VII的肝脏RNA水平，将动物处死并收获肝脏，并在液氮中速冻。从冷冻组织制备组织裂解物，并使用分支DNA测定(QuantiGene Assay,Panomics,CA)对因子VII的肝脏RNA水平进行定量。
在C57BL/6小鼠中静脉内(推注)注射后48小时，在FVTI siRNA处理的动物中评价FVII活性。按照制造商的说明书在微孔板规模下，使用市售试剂盒测量FVII以用于确定血清或组织中的蛋白质水平。针对未处理的对照小鼠测定FVII减少，并且结果表示为残留FVII％。两种剂量水平(0.05和0.005mg/kg FVII siRNA)用于筛选每种新型脂质体组合物。
实施例30
使用预先形成的囊泡的circRNA制剂。
使用预先形成的囊泡法制备含有阳离子脂质的转移媒介物。将阳离子脂质、DSPC、胆固醇和PEG-脂质分别以40/10/40/10的摩尔比溶解于乙醇中。将脂质混合物添加至水性缓冲液(50mM柠檬酸盐，pH 4)中，混合至分别30％(体积/体积)和6.1mg/mL的最终乙醇和脂质浓度，并在挤出前在室温下平衡2分钟。在22℃下，使用Lipex挤出机(Northern Lipids,Vancouver,BC)将水合脂质通过两个堆叠的80nm孔径过滤器(Nuclepore)挤出，直到获得通过Nicomp分析确定的70-90nm的囊泡直径。对于不形成小囊泡的阳离子脂质混合物，用较低pH的缓冲液(50mM柠檬酸盐，pH 3)使脂质混合物水合以质子化DSPC头基上的磷酸基团有助于形成稳定的70-90nm囊泡。
将FVII circRNA(溶解在含有30％乙醇的50mM柠檬酸盐pH 4水溶液中)添加至囊泡中，在混合下以约5mL/min的速率预平衡至35℃。在达到0.06(wt wt)的最终目标circRNA/脂质比率后，将混合物在35℃下再孵育30分钟，以允许囊泡重组和FVIIRNA的包封。然后除去乙醇并通过透析或切向流渗滤用PBS(155mM NaCl、3mM Na2HP04、ImM KH2P04，pH 7.5)置换外部缓冲液。在使用尺寸排阻旋转柱或离子交换旋转柱除去未包封的RNA后，确定最终包封的circRNA与脂质比率。
实施例31
同源区改善前体RNA环化
设计工程化的环状RNA以优化稳定性，并且在表达蛋白质方面比线性mRNA更有效(R.Wesselhoeft等人,2018)。此环状RNA源自按以下顺序含有以下各项的载体：5'同源区、3'I组内含子片段、第一间隔区、内部核糖体进入位点(IRES)、蛋白质编码区、第二间隔区、5'I组内含子片段和3'同源区。
两个同源区均使用置换内含子外显子方法创建，所述方法利用自剪接I组催化内含子，如来自T4噬菌体Td基因的内含子，以在仅添加鸟苷核苷酸或核苷和Mg2+的情况下促进RNA环化(Petkovic S.和Muller S.(2015)RNA circularization strategies in vivoand in vitro.Nucleic Acids Research.43,2454-2465，所述文献以引用的方式整体并入)。由此产生的置换内含子-外显子(PIE)区域允许RNA的5'和3'端共价连接并形成环状RNA。这些PIE区域被工程化为具有彼此完美互补以形成“同源区”的5'和3'端。设计了9个核苷酸长的弱同源区和19个核苷酸长的强同源区，并使用RNAFold来预测二级结构(图25)。添加这些同源区域使含有EMCV IRES和编码高斯荧光素酶的构建体的剪接效率对于弱同源区域从0％提高至16％，并且对于强同源区从0％提高至48％。琼脂糖凝胶上剪接产物的存在证实了有效的环化(图26)。相比之下，当用相同RNA酶H处理线性mRNA时，结果包括不能有效分离出环化RNA的两种产物(图27)。
包括两个间隔区以确保结构将独立折叠以形成环状RNA(图28)。这些间隔序列被建立为：(1)非结构化且与近端内含子和IRES序列非同源；(2)将内含子和IRES二级结构隔开，以使它们各自独立地相互折叠；和(3)含有互补的间隔区-间隔区的区域，从而允许形成掩蔽的剪接泡(图30)。添加允许剪接的间隔区序列使剪接效率从46％提高至87％，而破坏性间隔区序列完全消除剪接(图29)。当用同源区、间隔区、EMCV IRES和编码区测试前体RNA时，序列实现了环化。
实施例32
与线性RNA相比，工程化环状RNA提供更高的稳定性
使用HPLC纯化的工程化环状RNA测定环状RNA的稳定性(A.Wesselhoef,2018)。环状RNA是编码高斯荧光素酶的环状RNA(CVB3-GLuc-pAC)。规范的未经修饰的5'甲基鸟苷加帽和3'polyA加尾的线性GLuc mRNA以及核苷修饰的(假尿苷，5-甲基胞嘧啶)线性GLucmRNA作为与环状构建体的线性比较。在转染24小时内在HEK293和HeLa细胞的上清液中进行发光，然后每天连续监测GLuc活性，持续6天。转染24小时后，与线性未经修饰的mRNA相比，外源性环状RNA产生多811.2％的蛋白质(图31)。在24小时内，与经修饰的线性mRNA相比，环状RNA也产生多54.5％的蛋白质(图31)。在6天的跨度期间，HEK293细胞中的环状RNA表现出80小时的蛋白质产生半衰期，而未经修饰和经修饰的线性mRNA分别进行43和45小时的半衰期(图32)。由于环状RNA具有更高的蛋白质产生和更长的蛋白质产生半衰期，因此环状RNA提供比线性mRNA更高的稳定性。
实施例33
环状RNA编码CAR的纯化促进免疫原性的有效除去
使用工程化的环状RNA，从前体RNA分子的翻译中纯化的进一步步骤降低免疫原性(R.Wesselhoeft等人,2019)。剪接反应期间的最佳纯化包括RNA酶R、高效液相色谱法(HPLC)、用寡核苷酸靶向RNA酶H和磷酸酶消化以除去残留的三磷酸。环状RNA免疫原性的有效性，观察了两种细胞系(人胚肾，293；人肺癌，A549)在含有柯萨奇病毒B3内部核糖体进入位点(CVB3 IRES)、蛋白质编码信息、两个设计的间隔区序列、来自PIE构建体的两个短外显子片段以及置换鱼腥藻属pre-tRNA I组内含子的3'和5'内含子区段的环状RNA前体中的差异细胞活力和CAR表达稳定性反应(图33)。对于人肺癌细胞系处理，单独RNA酶R和HPLC不足以减少白细胞介素-6(IL-6)的细胞因子释放(图34)并进一步导致干扰素-α1(IFN-α1)的显著增加。HPLC后和RNA酶消化前的磷酸酶处理显示与未纯化的环状RNA相比，增加的细胞活力，更高的归一化的GLuc活性以及单核细胞趋化蛋白1(MCP1)、IL-6、IF-α、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和IFN-γ诱导蛋白-10(IP-10)的不可检测或未转染的基线水平。
实施例34
工程化的环状RNA编码CAR避免Toll样受体降解
环状RNA可避免Toll样受体(TLR)检测。当TLR 3、7和8检测内体中的RNA时，它们结合至RNA并导致炎症反应(T.Kawasaki和T.Kawai,2014)。将缺少内含子和同源臂序列的环状RNA的线性化型式用磷酸酶和HPLC处理。当RNA是环状而不是线性时，TLR 3和8的显示大大降低的相对SEAP活性。
实施例35
实施例35A-通过脂质纳米颗粒的环状RNA递送提供蛋白质在体内或体外的有效表达
通过将乙醇中的MC3、DSPC(Avanti Polar Lipids,Alabaster,Ala.)、胆固醇(Sigma-Aldrich,Taufkirchen,Germany)、DMG-PEG(NOF,Bouwelven,Belgium)和DSPE-PEG(50:10.5:38:1.4:0.5摩尔比)的1体积脂质混合物与乙酸盐缓冲液中的3体积的环状RNA(1:16w/w环状RNA与脂质)通过以2mL/min的合并流速(对于乙醇为0.5mL/min，并且对于水性缓冲液为1.5mL/min)注射在微流体混合装置
(PrecisionNanosystems,Vancouver BC)中进行混合来合成LNP。使用Slide-A-Lyzer盒(10kda截断值，Thermo Fisher Scientific Inc.Rockford,Ill.)以200倍的初始体积将所得混合物针对磷酸盐缓冲盐水(PBS)(pH 7.4)透析两次持续16小时以除去乙醇。将所得纳米颗粒悬浮液通过0.2μm无菌过滤器(Sarstedt,Numbrecht,Germany)过滤到玻璃小瓶中并用卷边封闭物密封。
制剂的表征
使用Zetasizer Nano ZS(Malvern Instruments有限责任公司,Malvern,Worcestershire,UK)测定环状RNA纳米颗粒的粒度、多分散指数(PDI)和ζ电位，在PBS中测定粒度并且在15mM PBS中测定ζ电位。
紫外-可见光谱用于测定环状RNA纳米颗粒制剂的浓度。将LNP在甲醇和氯仿溶液的4:1(v/v)混合物中按10比1稀释。混合之后，在DU 800分光光度计(Beckman Coulter,Beckman Coulter,Inc.,Brea,Calif.)上在230nm与330nm之间记录溶液的吸收光谱。可基于纳米颗粒制剂中使用的环状RNA的消光系数以及用从260nm波长的值与330nm处的基线之间的差异减去的基线来计算所述制剂中的环状RNA。
使用QUANT-ITTM 
RNA测定(Invitrogen Corporation Carlsbad,Calif.)来评价纳米颗粒对环状RNA的包封。根据制造商的说明书制备样品。使用荧光板读取器(Wallac Victor 1420Multilabel Counter；Perkin Elmer,Waltham,Mass.)在约480nm的激发波长和约520nm的发射波长下测量荧光强度。从每个样品的荧光值中减去试剂空白的荧光值，并且通过用完整样品(没有添加Triton X-100)的荧光强度除以分解样品(通过添加Triton X-100造成)的荧光值来确定游离环状RNA的百分比。
将靶向配体连接至LNP。
首先，根据对CD3、CD4或CD8的结合能力来选择纳米抗体。优选地使用结合、诱导快速内化但不会过度刺激T细胞的CD3抗体。一旦选择了纳米抗体，就使用用本领域普通技术人员已知的技术的定点诱变来产生具有单一表面暴露的半胱氨酸的纳米抗体。
纳米抗体首先通过反应性半胱氨酸与炔基缀合以进行点击化学。通过将炔烃-马来酰亚胺与没有选择的还原剂(无DTT或BME)的纳米抗体以10倍摩尔比的炔烃-马来酰亚胺与纳米抗体混合，将单个游离半胱氨酸标记(Hermanson,Bioconjugation techniques,第3版,2013，以引用的方式并入)。用具有2x 100体积的PBS的amicon过滤器透析掉游离的炔烃接头基团。
通过点击化学和添加铜作为催化剂使纯化的纳米抗体炔烃与DSPE-PEG-叠氮化物反应，并在Presolski等人(Presolski等人2011,Current protocols in chemicalbiology 3:153-162)中进行了描述。一旦纳米抗体被修饰，就添加250nm胆固醇以产生脂质修饰的纳米抗体的胶束制剂。
为了将脂质修饰的纳米抗体胶束并入LNP中，将脂质纳米抗体与LNP在4C下以1:1纳米抗体与环状RNA重量的比例孵育48小时。通过使用1MDa截止膜(BioLabs,LTS)进行透析，将纳米抗体标记的LNP与游离纳米抗体脂质分离。还与标准品相比，通过ELISA或蛋白质印迹测量了纳米抗体并入。
实施例35B-将环状RNA配制成聚合物纳米颗粒以递送至T细胞。
PBAE聚合物合成
PBAE聚合物是使用先前的方法合成的(Mangraviti等人,ACS Nano 9,1236-1249(2015))。简言之，将1,4-丁二醇二丙烯酸酯与4-氨基-1-丁醇以1.1:1摩尔比的二丙烯酸酯与胺单体混合。混合后，在搅拌下在90℃下反应24小时以产生丙烯酸酯封端的聚(4-氨基-1-丁醇-共-1,4-丁二醇二丙烯酸酯)。将聚合物以每ml四氢呋喃(THF)1.15g的比例溶解。为了形成哌嗪封端的447聚合物，将溶解于13ml THF中的786mg的1-(3-氨基丙基)-4-甲基哌嗪添加至聚合物/THF溶液中。将所得混合物在搅拌下孵育2小时，然后用5体积的乙醚沉淀。倾析溶剂后，将聚合物用2体积的乙醚洗涤，并真空干燥2天，然后用于在DMSO中形成100mg/ml的储备液。将聚合物储存在-20℃。
PGA-抗体缀合。
将15kD聚谷氨酸(来自Alamanda Polymers)溶解在水中以形成20mg/ml并超声处理10分钟。添加等体积的水中的4mg/ml 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(Thermo Fisher)，在室温下混合5分钟。然后将所得激活的PGA与抗体在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中以4:1的摩尔比合并，并在室温下混合6小时。为了除去未连接的PGA，通过50,000NMWCO膜(Millipore)将溶液与PBS交换3次。使用NanoDrop 2000分光光度计(ThermoScientific)测定抗体浓度。用于T细胞实验的抗体是抗CD3(克隆OKT3)、抗CD4(克隆OKT4)、抗CD8(克隆OKT8)和抗CD28(克隆9.3，全部来自BioXCell)。克隆C1.18.4用作对照抗体。对于HSC转导，使用多克隆山羊抗小鼠IgG和多克隆山羊抗小鼠CD105抗体(Fisher)。
纳米颗粒(NP)制备
将环状RNA储备液在无菌、无核酸酶的25mM乙酸钠缓冲液pH 5.2(NaOAc)中稀释至100μg/ml。将DMSO中的PBAE-447聚合物在NaOAc中稀释至6mg/ml，并以60:1(w:w)的比例添加至环状RNA中。将混合物涡旋15秒并在室温下孵育5分钟以形成NP。为了将靶向元件添加至纳米颗粒，将PGA连接的抗体在NaOAc中稀释至250μg/ml，并以2.5:1(w:w)的比例添加至环状RNA。将混合物涡旋15秒并在室温下孵育5分钟以形成包被在PGA抗体中的NP。PGA-PEG和其他封闭剂也可混合，以产生在血清中具有更长半衰期的NP颗粒。
通过将纳米颗粒与作为冷冻保护剂的60mg/ml D-蔗糖混合来冻干纳米颗粒，并在液氮中快速冷冻，之后在FreeZone 2.5L冻干系统(Labconco)中对其进行加工。冻干的NP储存在-80℃下直至使用。对于应用，将冻干的NP重新悬浮在一定体积的无菌水中，以恢复其原始浓度。
实施例36
在体外将CAR环状RNA引入细胞中
可使用脂质聚合物转染试剂将环状RNA引入真核细胞的细胞质中。例如，可将<5uL水或储存缓冲液(pH 5-7)中的100ng的circRNA与OptiMem(Gibco)混合至5uL最终体积。另外，可将0.2uL MessengerMax转染试剂(Thermo Fisher)与OptiMem(Gibco)混合至5uL最终体积。然后可将此第二混合物添加至第一混合物中以产生circRNA、OptiMem和MessengerMax转染试剂的混合物，所述混合物然后可在短期孵育(5-30分钟)后添加至10,000-50,000个真核细胞的培养基中以促进circRNA的细胞内化。可替代地，可使用例如Neon电穿孔系统(Thermo Fisher)将circRNA电穿孔到真核细胞中。可将1ug的circRNA在1,600V下电穿孔到200,000个T细胞中，持续10ms，3个脉冲，体积高达100uL。可替代地，可使用脂质纳米颗粒或与circRNA复合的聚合物将circRNA引入真核细胞中。
实施例37
CAR在用环状RNA转导的T细胞上的表达
将工程化的环状RNA编码CAR通过脂质纳米颗粒递送至T细胞以产生表达CAR的T细胞。为了确定翻译效率，工程化的环状RNA包含CAR编码区。然后用CAR编码circRNA转染T细胞。然后使用流式细胞术分析细胞表面上的CAR表达(S.De Olivera等人，2013)。荧光素异硫氰酸酯缀合的多克隆F(Ab')2片段山羊抗人IgG1Fcγ(Jackson ImmunoResearchLaboratories,West Grove,PA)(55.5ng/105个细胞)用于检测位于细胞表面上的CAR构建体中人IgG间隔区的存在。将Jurkat细胞用CD19-CAR稳定转导，与对照T细胞相比，表达率超过96％。用PBS进一步洗涤表达CAR的T细胞。流式细胞仪结果显示T细胞对CAR的表达。
实施例38
实施例38A-编码CAR的circRNA的转染导致来自T细胞的最少细胞因子释放
与使用慢病毒相比，使用工程化的环状RNA表达CAR产生的细胞因子释放更少。在基因疗法中使用慢病毒作为载体的主要缺点之一是由不稳定的包装细胞或HIV的gag或pol基因表达引起的细胞因子释放，从而导致级联细胞毒性效应(O.Merten,2016)。与CAR的慢病毒递送相比，使用环状RNA产生的CAR转导的T细胞几乎不释放细胞因子。
细胞因子释放可通过细胞因子释放测定来确定。例如，使用治疗性mAb进行CRA(S.Vessillier等人，2015)。纯化的人IgG4κ和IgG1用作同种型对照(AMS BiotechnologyLtd,UK)，并且抗CD28激动剂(Biolegend,UK)用作对照以评估CD28超激动剂的特异性。使用
Ultra-4离心过滤单元(Millipore Ltd,UK)从对照mAb中除去叠氮化钠，并使用鲎阿米巴样细胞裂解物凝胶凝块测试确认无内毒素。由于人FcγRI和FcγRIIIa根据人IgG1结合鼠IgG2a，因此将莫罗单抗-CD3反应与人IgG1同种型对照进行比较。10μg ml-1的植物凝集素(PHA；Sigma-Aldrich Ltd,UK)用作阳性对照。PBMC SP CRA通过以下方式进行：以1μg孔-1的mAb浓度湿包被微量滴定板的孔1小时，然后洗涤以除去未结合的mAb，然后添加PBMC持续48小时(Eastwood等人,2010；Eastwood等人,2013)。PBMC HDC CRA通过向以高密度预孵育48小时的PBMC添加1μg ml-1的mAb和24小时刺激来进行(
等人,2011；Bartholomaeus等人,2014)。WB和10％(v/v)WB CRA在5μg ml-1的mAb浓度和48小时刺激下进行，如之前所述(Wolf等人,2012；Bailey等人,2013)。选择所有浓度是为了与先前公开的使用这些方法释放的细胞因子的发现具有可比性。虽然不是公开的方法，但WB SP和10％(v/v)WB SP CRA根据mAb包衣浓度为1μg孔-1的PBMC SP CRA作为对照进行。所有测定均在96孔圆底微量滴定板(Sigma Aldrich Ltd)中进行，PBMC SP和HDC CRA使用每孔200μl完全培养基中的2×105个PBMC，WB CRA使用每孔含有0.7-2.0×106个WBC的200μl WB，并且10％(v/v)WB CRA使用200μl孔-1的完全培养基中后者的十分之一。CRA比较使用同一组供体进行，除了PBMC HDC CRA使用一组不同的8个供体。根据制造商的说明书，使用EasySepTM血型糖蛋白A阳性细胞耗减混合物(Stemcell Technologies,UK)评估从肝素化WB中选择性耗减RBC的效应。血沉棕黄层是通过离心从全血制备的，并在室温下与抗血型糖蛋白A试剂一起孵育15分钟，然后添加磁性纳米颗粒，并进一步孵育10分钟。然后通过免疫磁性分离除去RBC。95％-99％的RBC耗减通过视觉评估确认。将几乎完全由血浆耗减的多形核白细胞、淋巴细胞和单核细胞组成的所得白细胞(WBC)悬浮液在完全培养基中调节至1×106ml-1，并用于200μl孔-1和mAb包衣浓度为1μg孔-1TGN1412的WBC SP CRA中。为了研究对TGN1412相关细胞因子释放的抑制，将WBC重新悬浮于自体WB中或添加10-200μg孔-1的GYPA(Sigma-Aldrich Ltd)。为了评估IL-2对TGN1412相关细胞因子释放的影响，将浓度为5μg ml-1的达利珠单抗(IL-2R拮抗剂)添加至细胞中，并如上所述在涂铺于PBMC SP CRA中之前预孵育10分钟。根据制造商的说明书(Meso Scale Discovery,USA)，使用定制的MSD板测量培养物上清液中IFNγ、IL-2、IL-13和IL-8的浓度。TNFα和IL-17浓度通过ELISA定量，如之前所述(Eastwood等人,2010；Eastwood等人,2013)。
细胞因子释放测定是针对使用慢病毒工程化的T细胞以及在建立CAR转导的T细胞时使用工程化的环状RNA完成的。T细胞工程化的环状RNA产生的细胞因子显著更少。
实施例38B-源自工程化的环状RNA的CAR转导的T细胞杀死肿瘤细胞
使用工程化的环状RNA产生的CAR转导的T细胞能够杀死肿瘤细胞。向新生小鼠(其是针对人IL-3、SCF和GM-CSF转基因的)注射胎儿肝脏CD34+或其他造血干细胞以产生人源化免疫系统(HIS)小鼠。5-6周后，确认人造血作用的植入。然后进行杀伤测定以确定这些CAR转导的T细胞的有效性。例如，将UPN035(原代CD3+和CD8+ T细胞的寡克隆群)转染以表达嵌合ScFv免疫受体，所述免疫受体指导CD19+靶细胞的特异性细胞溶解(L.Cao等人,“Development and application of a multiplexable flow-cytometry-based assay toquantify cell-mediated cytolysis,”Cytometry Part A 77A(6):534-545(2010))。例如，进行4-h51Cr释放测定，其中将90％-95％汇合的U251T细胞在含有Na51CrO4的杜氏改良的伊格尔氏培养基(DMEM)溶液中标记过夜(C.Brown等人,“Biophotonic cytotoxicityassay for high-throughput screening of cytolytic killing,”J.Immunol.Methods297(1-2):39-52(2005))。第二天，将U251T细胞用EDTA溶液洗涤，酪氨酸化，重悬于DMEM中，在37℃下孵育60分钟，然后再次用DMEM洗涤。将靶细胞与递增数量的CD8+效应CTL在V形底96孔微孔板中在5％CO2和37℃下共培养。1-4小时后，除去50％的上清液并用Cobra II auto-γ(Packard)对释放的51Cr进行计数。裂解百分比是基于与通过在1％SDS中涂铺靶细胞确定的100％裂解对照以及通过在不含效应细胞的培养基中涂铺靶细胞确定的0％裂解对照相比的合并阳性得分计算的。CAR转导的T细胞有效杀死肿瘤细胞。
实施例38C-源自工程化的环状RNA的CAR转导的T细胞杀死肿瘤细胞
通过将表达荧光素酶的Eu-ALL01白血病细胞注射到4-6周龄的雌性白化病C57BL.6J-Tyr小鼠中来产生血液癌症系统。注射后一周，将小鼠随机分成三组。将第1组的小鼠用含有表达eGFP的环状RNA的对照纳米颗粒制剂治疗。将第2组的小鼠用含有编码CD19特异性CAR的环状RNA的测试纳米颗粒制剂治疗。将第3组的小鼠用含有编码CD19特异性CAR的线性经修饰的RNA的测试纳米颗粒制剂治疗。
随时间推移，通过静脉内施用D-荧光素在小鼠中检测到表达荧光素酶的白血病，并在注射D-荧光素后10分钟在Xenogen IVIS光谱成像系统(Xenogen)上对小鼠进行成像。第1组的小鼠表现出快速白血病扩散。与第3组小鼠相比，第2组小鼠在早期时间点和稍后时间点的白血病发光量减少。与第2组小鼠相比，第3组小鼠更早出现白血病反弹和癌细胞数量增加，这是由于与环状RNA构建体相比，线性经修饰的RNA构建体的稳定性较低。
实施例39
TCR复合物蛋白质表达的检测
在使用纳米颗粒或电穿孔递送编码TCR复合物蛋白质的环状RNA后，通过流式细胞术确认TCR复合物蛋白质的表达。TCR复合物蛋白质可通过使用适当的抗靶抗体检测(例如，CD19特异性TCR复合物蛋白质的表达可用抗CD19 scFv抗体检测)。将T细胞在染色缓冲液中洗涤并重新悬浮在PBS中。对于死细胞排除，将细胞例如与
Fixable Aqua死细胞染色剂(Invitrogen)一起在冰上孵育30分钟。将细胞用PBS洗涤并重新悬浮在染色缓冲液中。将FACS缓冲液添加至每个管，并通过离心使细胞沉淀。TCR复合物蛋白质的表面表达通过例如
R-藻红蛋白标记的人抗肿瘤抗原IgGl Fc或肿瘤抗原-Fc来检测。将抗体或可溶性肿瘤抗原添加至相应的样品并进行孵育。然后洗涤细胞，并对T细胞进行表面标记物染色。
实施例40
在体内实体瘤异种移植物小鼠模型中的表达重组TCR复合物蛋白质的T细胞处理
使用工程化的环状RNA产生表达重组TCR的T细胞。使原代人实体瘤细胞在免疫受损的小鼠中生长。示例性实体癌细胞包括实体肿瘤细胞系，如在癌症基因组图谱(TCGA)和/或广泛癌细胞系百科全书(CCLE，参见Barretina等人,Nature 483:603(2012))中提供的。示例性实体癌细胞包括从肺癌、卵巢癌、黑素瘤、结肠癌、胃癌、肾细胞癌、食道癌、胶质瘤、尿路上皮癌、视网膜母细胞瘤、乳腺癌、非霍奇金淋巴瘤、胰腺癌、霍奇金淋巴瘤、骨髓瘤、肝细胞癌、白血病、宫颈癌、胆管癌、口腔癌、头颈癌或间皮瘤分离的原发性肿瘤细胞。这些小鼠用于测试在人肿瘤异种移植物模型中表达重组TCR复合物蛋白质的T细胞的功效。在皮下植入或注射1x105-1x107个肿瘤细胞后，在开始处理前允许肿瘤生长至200-500mm3。然后将表达重组TCR的T细胞引入小鼠。响应于用包含本发明的TCR复合物蛋白质的人T细胞处理的肿瘤缩小可通过肿瘤大小的卡尺测量或通过跟踪由表达ffluc的肿瘤细胞发出的荧光素酶蛋白(ffluc)信号的强度来评估。
实施例41
与慢病毒相比，使用环状RNA的工程化CAR表达导致更少的细胞因子释放综合征
与使用慢病毒作为载体时相比，使用工程化的环状RNA来产生CAR表达更不易受到细胞因子释放综合征的影响。将工程化以表达CD19特异性CAR的细胞与使用慢病毒工程化以表达CD19特异性CAR的细胞进行比较。将每种类型的载体转染到T细胞中，然后将所述T细胞递送至小鼠，还向所述小鼠施用表达CD19的细胞系。通过ELISA随时间推移监测小鼠的IL-6表达。与施用使用慢病毒产生的CAR-T细胞的小鼠相比，施用使用环状RNA产生的CAR-T细胞的小鼠产生更少的IL-6。
实施例42
实施例42A-与使用经修饰的mRNA产生的表达CAR的T细胞相比，使用环状RNA产生的表达CAR的T细胞在体外表现出更长时间的功能性杀伤。
将Eμ-ALL01白血病细胞(或B16F10黑素瘤细胞作为对照)用膜染料PKH-26(Sigma-Aldrich)标记，用含有10％胎牛血清的RPMI洗涤，并以1×105个肿瘤细胞/ml的浓度重新悬浮于相同的培养基中。将用编码靶向CD19的CAR的环状RNACAR-T构建体或编码靶向CD19的CAR的经修饰的mRNA构建体转染的T细胞以不同的效应物与靶细胞比率添加至96孔板中的悬浮液(最终体积，200μl)并在37℃下孵育3小时。将细胞转移至V形底96孔板。在转导后的第1、2、3、4、6、8和10天，测试转导的T细胞杀死表达CD19的Eμ-ALL01白血病细胞的能力。与使用经修饰的mRNA产生的表达CAR的T细胞相比，使用环状RNA产生的表达CAR的T细胞在杀死表达CD19的细胞中发挥作用的时间更长。
实施例42B-与使用经修饰的mRNA产生的表达CAR的T细胞相比，使用环状RNA产生的表达CAR的T细胞在体外表现出更长时间的细胞因子分泌。
CAR-T细胞是通过转导CD19特异性编码的CAR环状RNA或CD19特异性编码CAR的经修饰的mRNA产生的。在对受照射的Eμ-ALL01白血病细胞或B16F10黑素瘤对照刺激后24小时(IL-2)或48小时(IFN-γ和TNF-α)，用ELISA(R&D Systems)测量T细胞细胞因子释放。在转导后的第1、2、3、4、6、8、10天刺激T细胞并测试细胞因子释放，以证明与使用经修饰的mRNA产生的CAR-T细胞相比，使用环状RNA产生的CAR-T细胞产生更多的细胞因子持续更长的时间段。
此外，通过用可溶性CD19荧光标记蛋白标记CAR-T转导的细胞来测量CD19 CAR构建体的表达。然后在培养基中洗涤细胞，并使用流式细胞术评估CD19 CAR的功能性表达。与经修饰的mRNA转导的T细胞相比，环状RNA转导的CD19 CAR细胞在较晚的时间点显示出更长时间的功能性表达。
实施例43
用编码CAR的circRNA对原代人T细胞进行电穿孔
将从四个不同供体分离的150,000个原代人T细胞用250ng具有鱼腥藻属内含子/外显子区域、抗CD19 CAR表达序列和CVB3 IRES的circRNA进行电穿孔。孵育24小时后，使用本领域普通技术人员已知的标准技术和试剂通过流式细胞术分析来分析细胞的抗CD19CAR的表面表达。
如图36和37所示，可对原代人T细胞进行电穿孔以在活T细胞群中实现显著的表面CAR表达。
实施例44
circRNA CAR T细胞针对CD19+靶细胞的功效
将包含鱼腥藻属内含子/外显子区域和抗CD19 CAR表达序列的构建体环化。将150,000个人原代CD3+ T细胞模拟电穿孔或用250ng编码针对CD19的CAR的circRNA电穿孔。电穿孔后1天，将10,000个T细胞与10,000个稳定表达萤火虫荧光素酶的靶细胞或非靶细胞共培养24小时。Daudi或Nalm6靶细胞或K562非靶细胞的剩余细胞的定量通过检测萤火虫发光来确定(图38)。
实施例45
实施例45A-电穿孔后5天具有不同IRES序列的circRNA CAR T细胞的功效
将包含鱼腥藻属内含子/外显子区域、抗CD19 CAR表达序列和CVB3 IRES或萨力病毒SZ1 IRES的构建体环化。将150,000个人原代CD3+ T细胞模拟电穿孔或用250ng circRNA电穿孔。接种10,000个细胞用于共培养实验。电穿孔后5天，将10,000个稳定表达萤火虫荧光素酶的Raji或K562细胞与接种的T细胞共培养24小时。特异性裂解被定义为(1-[CAR条件发光]/[模拟条件发光])*100(图39A)。
实施例45B-电穿孔后1天circRNA CAR T细胞的功效
将包含鱼腥藻属内含子/外显子区域、抗CD19 CAR表达序列和CVB3 IRES的构建体环化。将来自4个不同供体的150,000个人原代CD3+ T细胞模拟电穿孔或用250ng circRNA电穿孔。接种10,000个细胞用于共培养实验。电穿孔后1天，将10,000个稳定表达萤火虫荧光素酶的Raji(靶)或K562(非靶)细胞与接种的T细胞共培养24小时。特异性裂解被定义为(1-[CAR条件发光]/[模拟条件发光])*100(图39B)
实施例46
实施例46A-circRNA CAR T细胞的裂解动力学
将包含鱼腥藻属内含子/外显子区域、抗CD19 CAR表达序列和CVB3 IRES或萨力病毒SZ1 IRES的构建体环化。在48小时内，用150ng或250ng circRNA对人原代CD3+ T细胞进行电穿孔。将Raji-luc中靶细胞或K562-luc脱靶细胞与经修饰的CD3+ T细胞以1:1的比例共培养。测量了Raji-luc和K562-luc细胞的发光(图40A)。
实施例46B-circRNA CAR T细胞的裂解动力学
K562靶细胞的特异性裂解的定量通过检测萤火虫发光来确定。将150,000个人原代CD3+ T细胞模拟电穿孔或用250ng circRNA电穿孔。接种10,000个细胞用于共培养实验。电穿孔后1天，将2,000、10,000或50,000个稳定表达萤火虫荧光素酶的K562细胞与接种的T细胞共培养24小时。特异性裂解被定义为(1-[CAR条件发光]/[模拟条件发光])*100(图40B)
实施例46C-共培养配给量对circRNA CAR T细胞裂解动力学的影响
Raji靶细胞的特异性裂解的定量通过检测萤火虫发光来确定。将150,000个人原代CD3+ T细胞模拟电穿孔或用250ng circRNA电穿孔。接种10,000个细胞用于共培养实验。电穿孔后1天，将2,000、10,000或50,000个稳定表达萤火虫荧光素酶的Raji细胞与接种的T细胞共培养24小时。特异性裂解被定义为(1-[CAR条件发光]/[模拟条件发光])*100(图40c)
实施例47
circRNA CAR T细胞与用线性CAR RNA电穿孔或用CAR慢病毒转导的细胞的比较
将包含鱼腥藻属内含子/外显子区域、抗CD19 CAR表达序列和萨力病毒SZ1 IRES的构建体环化。将CD3+原代人T细胞用circRNA电穿孔或用编码抗CD19 CAR的慢病毒感染。在有或没有Raji靶细胞的情况下培养24小时后测量干扰素γ转录物诱导(图41A)。还测量了CAR+ T细胞的比例(图41B)。测量了模拟电穿孔、用编码针对CD19的CAR的circRNA电穿孔或用编码针对CD19的CAR的慢病毒感染的人原代CD3+ T细胞对Raji靶细胞的特异性裂解(图41C)。
实施例48
CircRNA的稳定性
将包含鱼腥藻属内含子/外显子区域、抗CD19 CAR表达序列和萨力病毒SZ1 IRES的构建体环化。在用250ng编码抗CD19 CAR的线性mRNA或circRNA对150,000个原代人CD3+T细胞进行电穿孔后1-5天测量CAR表面表达。刺激后5天对T细胞进行电穿孔。用DAPI评估细胞活力。分析活细胞的CD3和CAR表达(图48)。
实施例49
人单核细胞中的CAR表达
将包含鱼腥藻属内含子/外显子区域和CAR表达序列的构建体环化。将THP-1M0细胞模拟电穿孔或用250ng编码CAR的circRNA电穿孔。接种10,000个细胞用于共培养实验。电穿孔后1天，将10,000个稳定表达萤火虫荧光素酶的Raji细胞与接种的THP-1M0细胞共培养24小时。通过检测萤火虫发光确定存活Raji靶细胞的定量。在用编码高斯荧光素酶的circRNA和0-90ng的dsCircRNA对THP-1M0细胞进行电穿孔后24或48小时，还测量了上清液中的发光。(图43)。
实施例50
人单核细胞中的CAR表达
将包含鱼腥藻属内含子/外显子区域和抗鼠CD19 CAR表达序列的构建体环化。将CD3+ T细胞模拟电穿孔或用环状RNA电穿孔，并与A20靶细胞或K462非靶细胞共培养。测量了特异性裂解(图44)。
Claims (117)
1.一种药物组合物，所述药物组合物包含：
a.环状RNA多核苷酸，所述环状RNA多核苷酸按以下顺序包含3'I组内含子片段、内部核糖体进入位点(IRES)、编码嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)复合物蛋白质的表达序列和5'I组内含子片段；和
b.转移媒介物，所述转移媒介物包含(i)可电离脂质、(ii)结构脂质和(iii)PEG修饰的脂质中的至少一者，其中所述转移媒介物能够将所述环状RNA多核苷酸递送至人受试者中存在的人免疫细胞，使得所述CAR在所述人免疫细胞中翻译并在所述人免疫细胞的表面上表达。
2.如权利要求1所述的药物组合物，其被配制用于向有需要的人受试者静脉内施用。
3.如权利要求1或2所述的药物组合物，其中所述3'I组内含子片段和所述5'I组内含子片段是鱼腥藻属I组内含子片段。
4.如权利要求3所述的药物组合物，其中所述3'内含子片段和所述5'内含子片段由完整内含子中的L9a-5置换位点限定。
5.如权利要求3所述的药物组合物，其中所述3'内含子片段和所述5'内含子片段由完整内含子中的L8-2置换位点限定。
6.如权利要求1-5中任一项所述的药物组合物，其中所述IRES来自桃拉综合征病毒、锥蝽病毒、蒂勒脑脊髓炎病毒、猿猴病毒40、红火蚁病毒1、禾谷缢管蚜病毒、网状内皮增生病病毒、人脊髓灰质炎病毒1、斯氏珀蝽肠病毒、克什米尔蜜蜂病毒、人鼻病毒2、琉璃叶蝉病毒-1、人免疫缺陷病毒1型、琉璃叶蝉病毒-1、Himetobi P病毒、丙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒、GB型肝炎病毒、口蹄疫病毒、人肠道病毒71、马鼻炎病毒、茶尺蠖微小RNA病毒样病毒、脑心肌炎病毒、果蝇C病毒、人柯萨奇病毒B3、十字花科植物烟草花叶病毒、蟋蟀麻痹病毒、牛病毒性腹泻病毒1、黑蜂王台病毒、蚜虫致死性麻痹病毒、禽脑脊髓炎病毒、急性蜜蜂麻痹病毒、木槿褪绿环斑病毒、猪瘟病毒、人FGF2、人SFTPA1、人AML1/RUNX1、果蝇触角足、人AQP4、人AT1R、人BAG-1、人BCL2、人BiP、人c-IAPl、人c-myc、人eIF4G、小鼠NDST4L、人LEF1、小鼠HIF1α、人n.myc、小鼠Gtx、人p27kipl、人PDGF2/c-sis、人p53、人Pim-1、小鼠Rbm3、果蝇reaper、犬Scamper、果蝇Ubx、人UNR、小鼠UtrA、人VEGF-A、人XIAP、果蝇无毛、酿酒酵母TFIID、酿酒酵母YAP1、烟草蚀纹病毒、芜菁皱缩病毒、EMCV-A、EMCV-B、EMCV-Bf、EMCV-Cf、EMCV pEC9、小双节RNA病毒、HCV QC64、人寇沙病毒E/D、人寇沙病毒F、人寇沙病毒JMY、鼻病毒NAT001、HRV14、HRV89、HRVC-02、HRV-A21、萨力病毒A SH1、萨力病毒FHB、萨力病毒NG-J1、人副肠孤病毒1、Crohivirus B、Yc-3、Rosavirus M-7、Shanbavirus A、Pasivirus A、Pasivirus A 2、艾柯病毒E14、人副肠孤病毒5、爱知病毒、甲型肝炎病毒HA16、Phopivirus、CVA10、肠道病毒C、肠道病毒D、肠道病毒J、人趋肝性病毒2、GBV-C GT110、GBV-C K1737、GBV-C Iowa、趋肝性病毒A 1220、Pasivirus A 3、萨佩洛病毒、Rosavirus B、Bakunsa病毒、震颤病毒A、猪Pasivirus 1、PLV-CHN、Pasivirus A、Sicinivirus、肝炎病毒K、肝炎病毒A、BVDV1、边界病病毒、BVDV2、CSFV-PK15C、SF573双顺反子病毒、湖北微小RNA病毒样病毒、CRPV、萨力病毒A BN5、萨力病毒A BN2、萨力病毒A 02394、萨力病毒A GUT、萨力病毒A CH、萨力病毒ASZ1、萨力病毒FHB、CVB3、CVB1、艾柯病毒7、CVB5、EVA71、CVA3、CVA12、EV24或eIF4G的适体。
7.如权利要求6所述的药物组合物，其中所述IRES包括CVB3IRES或其片段或变体，或者其中所述IRES包含根据SEQ ID NO:65的序列。
8.如权利要求6所述的药物组合物，其中所述IRES包括萨力病毒SZ1 IRES或其片段或变体。
9.如权利要求8所述的药物组合物，其中所述IRES包含根据SEQ ID NO:63的序列。
10.如权利要求1-9中任一项所述的药物组合物，其包含位于所述3'I组内含子片段与所述IRES之间的第一内部间隔区，以及位于所述表达序列与所述5'I组内含子片段之间的第二内部间隔区。
11.如权利要求10所述的药物组合物，其中所述第一内部间隔区和所述第二内部间隔区各自具有约10至约60个核苷酸的长度。
12.如权利要求1-11中任一项所述的药物组合物，其中所述CAR或TCR复合物蛋白质包含对选自下组的抗原具有特异性的抗原结合结构域：CD19、CD123、CD22、CD30、CD171、CS-1、C型凝集素样分子-1、CD33、表皮生长因子受体变体III(EGFRvIII)、双唾液酸神经节苷脂GD2、双唾液酸神经节苷脂GD3、TNF受体家族成员、B细胞成熟抗原(BCMA)、Tn抗原((Tn Ag)或(GaINAca-Ser/Thr))、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、Fms样酪氨酸激酶3(FLT3)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)、CD38、CD44v6、癌胚抗原(CEA)、上皮细胞粘附分子(EPCAM)、B7H3(CD276)、KIT(CD117)、白细胞介素-13受体亚基α-2、间皮素、白细胞介素11受体α(IL-11Ra)、前列腺干细胞抗原(PSCA)、蛋白酶丝氨酸21、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、Lewis(Y)抗原、CD24、血小板源性生长因子受体β(PDGFR-β)、阶段特异性胚胎抗原4(SSEA-4)、CD20、叶酸受体α、HER2、HER3、粘蛋白1、细胞表面相关(MUC1)、表皮生长因子受体(EGFR)、神经细胞粘附分子(NCAM)、前列腺酶、前列腺酸性磷酸酶(PAP)、延伸因子2突变型(ELF2M)、肝配蛋白B2、成纤维细胞活化蛋白α(FAP)、胰岛素样生长因子1受体(IGF-I受体)、碳酸酐酶IX(CAIX)、蛋白酶体(前体，巨蛋白因子)亚基β型9(LMP2)、糖蛋白100(gp100)、由断裂点簇区(BCR)和艾贝尔森鼠白血病病毒致癌基因同系物1(Abl)组成的致癌基因融合蛋白(bcr-abl)、酪氨酸酶、肝配蛋白A型受体2(EphA2)、岩藻糖基GM1、唾液酸化路易斯粘附分子(sLe)、神经节苷脂GM3、转谷氨酰胺酶5(TGS5)、高分子量黑素瘤相关抗原(HMWMAA)、o-乙酰基-GD2神经节苷脂(OAcGD2)、叶酸受体β、肿瘤内皮标志物1(TEM1/CD248)、肿瘤内皮标志物7相关(TEM7R)、紧密连接蛋白6(CLDN6)、紧密连接蛋白18.2(CLDN18.2)、促甲状腺激素受体(TSHR)、G蛋白偶联受体C类5组成员D(GPRC5D)、染色体X开放阅读框61(CXORF61)、CD97和CD179a。
13.如权利要求12所述的药物组合物，其中所述CAR或TCR复合物蛋白质包含CAR，所述CAR包含对CD19具有特异性的抗原结合结构域。
14.如权利要求1-13中任一项所述的药物组合物，其中所述CAR或TCR复合物蛋白质包含CAR，所述CAR包含选自下组的共刺激结构域：CD28、4-1BB、OX40、CD27、CD30、ICOS、GITR、CD40、MYD88、CD2、SLAM以及它们的组合。
15.如权利要求1-14中任一项所述的药物组合物，其中所述CAR或TCR复合物蛋白质包含CAR，所述CAR包含CD3ζ信号传导结构域。
16.如权利要求1-15中任一项所述的药物组合物，其中所述CAR或TCR复合物蛋白质包含CAR，所述CAR包含CH2CH3、CD28和/或CD8间隔区结构域。
17.如权利要求1-16中任一项所述的药物组合物，其中所述CAR或TCR复合物蛋白质包含CAR，所述CAR包含CD28或CD8跨膜结构域。
18.如权利要求1-17中任一项所述的药物组合物，其中所述CAR或TCR复合物蛋白质包含CAR，所述CAR包含：
a.抗原结合结构域，
b.间隔区结构域，
c.跨膜结构域，
d.共刺激结构域，和
e.细胞内T细胞信号传导结构域。
19.如权利要求1-18中任一项所述的药物组合物，其中所述CAR或TCR复合物蛋白质包含多特异性CAR，所述多特异性CAR包含针对至少2种不同抗原的抗原结合结构域。
20.如权利要求1-19中任一项所述的药物组合物，其中所述CAR或TCR复合物蛋白质包含选自下组的TCR复合物蛋白质：TCRα、TCRβ、TCRγ和TCRδ。
21.如权利要求1-20中任一项所述的药物组合物，其中所述转移媒介物包括脂质纳米颗粒、核-壳纳米颗粒、生物可降解纳米颗粒、生物可降解脂质纳米颗粒、聚合物纳米颗粒或生物可降解聚合物纳米颗粒。
22.如权利要求1-21中任一项所述的药物组合物，其还包含靶向部分。
23.如权利要求22所述的药物组合物，其中在没有细胞分离或纯化的情况下，所述靶向部分介导受体介导的内吞作用或直接融合至选定细胞群或组织的选定细胞中。
24.如权利要求22所述的药物组合物，其中所述靶向部分能够结合至选自下组的蛋白质：CD3、CD4、CD8、CD5、CD7、PD-1、4-1BB、CD28、C1q和CD2。
25.如权利要求22所述的药物组合物，其中所述靶向部分包含对巨噬细胞、树突细胞、NK细胞、NKT或T细胞抗原具有特异性的抗体。
26.如权利要求22-25中任一项所述的药物组合物，其中所述靶向部分包含scFv、纳米抗体、肽、微型抗体、多核苷酸适体、重链可变区、轻链可变区或其片段。
27.如权利要求1-26中任一项所述的药物组合物，所述药物组合物处于有效治疗所述人受试者的癌症的量。
28.如权利要求1-27中任一项所述的药物组合物，其中与包含含有编码相同CAR的外源性DNA的T细胞或载体的药物组合物相比，所述药物组合物具有增强的安全性特征。
29.如权利要求1-28中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物中少于1重量％的多核苷酸是双链RNA、DNA夹板或三磷酸化RNA。
30.如权利要求1-29中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物中少于1重量％的多核苷酸和蛋白质是双链RNA、DNA夹板、三磷酸化RNA、磷酸酶蛋白质、蛋白质连接酶和加帽酶。
31.如权利要求1-30中任一项所述的药物组合物，其中所述转移媒介物包含多于一种环状RNA多核苷酸。
32.一种环状RNA多核苷酸，所述环状RNA多核苷酸按以下顺序包含3'I组内含子片段、内部核糖体进入位点(IRES)、编码嵌合抗原受体(CAR)或TCR复合物蛋白质的表达序列和5'I组内含子片段。
33.如权利要求32所述的环状RNA多核苷酸，其中所述3'I组内含子片段和所述5'I组内含子片段是鱼腥藻属I组内含子片段。
34.如权利要求33所述的环状RNA多核苷酸，其中所述3'内含子片段和所述5'内含子片段由完整内含子中的L9a-5置换位点限定。
35.如权利要求33所述的环状RNA多核苷酸，其中所述3'内含子片段和所述5'内含子片段由完整内含子中的L8-2置换位点限定。
36.如权利要求32-35中任一项所述的环状RNA多核苷酸，其中所述IRES包括CVB3 IRES或其片段或变体。
37.如权利要求36所述的环状RNA多核苷酸，其中所述IRES具有根据SEQ ID NO:65的序列。
38.如权利要求32所述的环状RNA多核苷酸，其中所述IRES包括萨力病毒SZ1 IRES或其片段或变体。
39.如权利要求38所述的环状RNA多核苷酸，其中所述IRES具有根据SEQ ID NO:63的序列。
40.如权利要求32-39中任一项所述的环状RNA多核苷酸，所述环状RNA多核苷酸包含位于所述3'I组内含子片段与所述IRES之间的第一内部间隔区，以及位于所述表达序列与所述5'I组内含子片段之间的第二内部间隔区。
41.如权利要求40所述的环状RNA多核苷酸，其中所述第一内部间隔区和所述第二内部间隔区各自具有约10至约60个核苷酸的长度。
42.如权利要求32-41中任一项所述的环状RNA多核苷酸，所述环状RNA多核苷酸由天然核苷酸组成。
43.如权利要求32-42中任一项所述的环状RNA多核苷酸，所述环状RNA多核苷酸还包含编码治疗性蛋白质的第二表达序列。
44.如权利要求43所述的环状RNA多核苷酸，其中所述治疗性蛋白质包含检查点抑制剂。
45.如权利要求43所述的环状RNA多核苷酸，其中所述治疗性蛋白质包含细胞因子。
46.如权利要求32-45中任一项所述的环状RNA多核苷酸，其中所述CAR或TCR复合物蛋白质包含对选自下组的抗原具有特异性的抗原结合结构域：CD19、CD123、CD22、CD30、CD171、CS-1、C型凝集素样分子-1、CD33、表皮生长因子受体变体III(EGFRvIII)、双唾液酸神经节苷脂GD2、双唾液酸神经节苷脂GD3、TNF受体家族成员、B细胞成熟抗原(BCMA)、Tn抗原((Tn Ag)或(GaINAca-Ser/Thr))、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、Fms样酪氨酸激酶3(FLT3)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)、CD38、CD44v6、癌胚抗原(CEA)、上皮细胞粘附分子(EPCAM)、B7H3(CD276)、KIT(CD117)、白细胞介素-13受体亚基α-2、间皮素、白细胞介素11受体α(IL-11Ra)、前列腺干细胞抗原(PSCA)、蛋白酶丝氨酸21、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、Lewis(Y)抗原、CD24、血小板源性生长因子受体β(PDGFR-β)、阶段特异性胚胎抗原4(SSEA-4)、CD20、叶酸受体α、HER2、HER3、粘蛋白1、细胞表面相关(MUC1)、表皮生长因子受体(EGFR)、神经细胞粘附分子(NCAM)、前列腺酶、前列腺酸性磷酸酶(PAP)、延伸因子2突变型(ELF2M)、肝配蛋白B2、成纤维细胞活化蛋白α(FAP)、胰岛素样生长因子1受体(IGF-I受体)、碳酸酐酶IX(CAIX)、蛋白酶体(前体，巨蛋白因子)亚基β型9(LMP2)、糖蛋白100(gp100)、由断裂点簇区(BCR)和艾贝尔森鼠白血病病毒致癌基因同系物1(Abl)组成的致癌基因融合蛋白(bcr-abl)、酪氨酸酶、肝配蛋白A型受体2(EphA2)、岩藻糖基GM1、唾液酸化路易斯粘附分子(sLe)、神经节苷脂GM3、转谷氨酰胺酶5(TGS5)、高分子量黑素瘤相关抗原(HMWMAA)、o-乙酰基-GD2神经节苷脂(OAcGD2)、叶酸受体β、肿瘤内皮标志物1(TEM1/CD248)、肿瘤内皮标志物7相关(TEM7R)、紧密连接蛋白6(CLDN6)、紧密连接蛋白18.2(CLDN18.2)、促甲状腺激素受体(TSHR)、G蛋白偶联受体C类5组成员D(GPRC5D)、染色体X开放阅读框61(CXORF61)、CD97和CD179a。
47.如权利要求32-46中任一项所述的环状RNA多核苷酸，其中所述CAR或TCR复合物蛋白质包含CAR，所述CAR包含对CD19具有特异性的抗原结合结构域。
48.如权利要求32-47中任一项所述的环状RNA多核苷酸，其中所述CAR或TCR复合物蛋白质包含CAR，所述CAR包含选自下组的共刺激结构域：CD28、4-1BB、OX40、CD27、CD30、ICOS、GITR、CD40、CD2、SLAM以及它们的组合。
49.如权利要求32-48中任一项所述的环状RNA多核苷酸，其中所述CAR或TCR复合物蛋白质包含CAR，所述CAR包含CD3ζ信号传导结构域。
50.如权利要求32-49中任一项所述的环状RNA多核苷酸，其中所述CAR或TCR复合物蛋白质包含CAR，所述CAR包含CH2CH3、CD28和/或CD8间隔区结构域。
51.如权利要求32-50中任一项所述的环状RNA多核苷酸，其中所述CAR或TCR复合物蛋白质包含CAR，所述CAR包含CD28或CD8跨膜结构域。
52.如权利要求32-51中任一项所述的环状RNA多核苷酸，其中所述CAR或TCR复合物蛋白质包含CAR，所述CAR包含：
a.抗原结合结构域，
b.间隔区结构域，
c.跨膜结构域，
d.共刺激结构域，和
e.细胞内T细胞信号传导结构域。
53.如权利要求32-52中任一项所述的环状RNA多核苷酸，其中所述CAR或TCR复合物蛋白质包含多特异性CAR，所述多特异性CAR包含针对至少2种不同抗原的抗原结合结构域。
54.如权利要求32-53中任一项所述的环状RNA多核苷酸，其中所述CAR或TCR复合物蛋白质包含选自下组的TCR复合物蛋白质：TCRα、TCRβ、TCRγ和TCRδ。
55.如权利要求32-54中任一项所述的环状RNA多核苷酸，所述环状RNA多核苷酸由天然核苷酸组成。
56.如权利要求32所述的环状RNA多核苷酸，其中所述表达序列是密码子优化的。
57.如权利要求32-56中任一项所述的环状RNA多核苷酸，所述环状RNA多核苷酸被优化为缺乏存在于等效预先优化的多核苷酸中的至少一个微小RNA结合位点。
58.如权利要求32-57中任一项所述的环状RNA多核苷酸，所述环状RNA多核苷酸被优化为缺乏存在于等效预先优化的多核苷酸中的至少一个核酸内切酶敏感位点。
59.如权利要求32-58中任一项所述的环状RNA多核苷酸，所述环状RNA多核苷酸被优化为缺乏存在于等效预先优化的多核苷酸中的至少一个RNA编辑敏感位点。
60.如权利要求32-59中任一项所述的环状RNA多核苷酸，所述环状RNA多核苷酸在人中的体内功能性半衰期大于具有相同表达序列的等效线性RNA多核苷酸的体内功能性半衰期。
61.如权利要求32-60中任一项所述的环状RNA多核苷酸，所述环状RNA多核苷酸具有约100个核苷酸至约10千碱基的长度。
62.如权利要求32-61中任一项所述的环状RNA多核苷酸，所述环状RNA多核苷酸具有至少约20小时的功能性半衰期。
63.如权利要求32-62中任一项所述的环状RNA多核苷酸，所述环状RNA多核苷酸在人细胞中具有至少约20小时的治疗效果持续时间。
64.如权利要求32-63中任一项所述的环状RNA多核苷酸，所述环状RNA多核苷酸在人细胞中的治疗效果持续时间大于或等于包含相同表达序列的等效线性RNA多核苷酸的治疗效果持续时间。
65.如权利要求32-64中任一项所述的环状RNA多核苷酸，所述环状RNA多核苷酸在人细胞中的功能性半衰期大于或等于包含相同表达序列的等效线性RNA多核苷酸的功能性半衰期。
66.一种DNA载体，所述DNA载体按以下顺序包含5'双链体形成区、具有第一置换位点的鱼腥藻属3'I组内含子片段、内部核糖体进入位点(IRES)、编码嵌合抗原受体(CAR)多肽的表达序列、具有第二置换位点的鱼腥藻属5'I组内含子片段和3'双链体形成区。
67.如权利要求66所述的DNA载体，其中所述3'I组内含子片段和所述5'I组内含子片段是鱼腥藻属I组内含子片段。
68.如权利要求67所述的DNA载体，其中所述3'内含子片段和所述5'内含子片段由完整内含子中的L9a-5置换位点限定。
69.如权利要求67所述的DNA载体，其中所述3'内含子片段和所述5'内含子片段由完整内含子中的L8-2置换位点限定。
70.如权利要求66-69中任一项所述的DNA载体，其中所述IRES包括CVB3 IRES或其片段或变体。
71.如权利要求70所述的DNA载体，其中所述IRES编码根据SEQ ID NO:65的序列。
72.如权利要求66-69中任一项所述的DNA载体，其中所述IRES包括萨力病毒SZ1 IRES或其片段或变体。
73.如权利要求72所述的DNA载体，其中所述IRES编码根据SEQ ID NO:63的序列。
74.如权利要求66-73中任一项所述的DNA载体，其中所述环状RNA多核苷酸按以下顺序包含5'双链体形成区、3'I组内含子片段、内部核糖体进入位点(IRES)、编码嵌合抗原受体(CAR)或TCR复合物蛋白质的表达序列、5'I组内含子片段和3'双链体形成区。
75.如权利要求74所述的DNA载体，其中所述5'双链体形成区和3'双链体形成区各自具有约70％的GC核苷酸。
76.如权利要求74或权利要求75所述的DNA载体，其中所述5'双链体形成区和3'双链体形成区各自具有约30个核苷酸的长度。
77.如权利要求74-76中任一项所述的DNA载体，所述DNA载体包含位于所述5'双链体形成区与所述3'I组内含子片段之间的第一外部间隔区，以及位于所述5'I组内含子片段与所述3'双链体形成区之间的第二外部间隔区。
78.如权利要求77所述的DNA载体，其中所述第一外部间隔区和所述第二外部间隔区各自具有约10至约60个核苷酸的长度。
79.如权利要求74-78中任一项所述的DNA载体，其中所述5'双链体形成区与所述3'I组内含子片段直接相邻，并且其中所述5'I组内含子片段与所述3'双链体形成区直接相邻。
80.如权利要求66-79中任一项所述的DNA载体，所述DNA载体包含位于所述3'I组内含子片段与所述IRES之间的第一内部间隔区，以及位于所述表达序列与所述5'I组内含子片段之间的第二内部间隔区。
81.如权利要求80所述的DNA载体，其中所述第一内部间隔区和所述第二内部间隔区各自具有约10至约60个核苷酸的长度。
82.如权利要求66-81中任一项所述的DNA载体，其中所述CAR或TCR复合物蛋白质包含对选自下组的抗原具有特异性的抗原结合结构域：CD19、CD123、CD22、CD30、CD171、CS-1、C型凝集素样分子-1、CD33、表皮生长因子受体变体III(EGFRvIII)、双唾液酸神经节苷脂GD2、双唾液酸神经节苷脂GD3、TNF受体家族成员、B细胞成熟抗原(BCMA)、Tn抗原((Tn Ag)或(GaINAca-Ser/Thr))、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、Fms样酪氨酸激酶3(FLT3)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)、CD38、CD44v6、癌胚抗原(CEA)、上皮细胞粘附分子(EPCAM)、B7H3(CD276)、KIT(CD117)、白细胞介素-13受体亚基α-2、间皮素、白细胞介素11受体α(IL-11Ra)、前列腺干细胞抗原(PSCA)、蛋白酶丝氨酸21、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、Lewis(Y)抗原、CD24、血小板源性生长因子受体β(PDGFR-β)、阶段特异性胚胎抗原4(SSEA-4)、CD20、叶酸受体α、HER2、HER3、粘蛋白1、细胞表面相关(MUC1)、表皮生长因子受体(EGFR)、神经细胞粘附分子(NCAM)、前列腺酶、前列腺酸性磷酸酶(PAP)、延伸因子2突变型(ELF2M)、肝配蛋白B2、成纤维细胞活化蛋白α(FAP)、胰岛素样生长因子1受体(IGF-I受体)、碳酸酐酶IX(CAIX)、蛋白酶体(前体，巨蛋白因子)亚基β型9(LMP2)、糖蛋白100(gp100)、由断裂点簇区(BCR)和艾贝尔森鼠白血病病毒致癌基因同系物1(Abl)组成的致癌基因融合蛋白(bcr-abl)、酪氨酸酶、肝配蛋白A型受体2(EphA2)、岩藻糖基GM1、唾液酸化路易斯粘附分子(sLe)、神经节苷脂GM3、转谷氨酰胺酶5(TGS5)、高分子量黑素瘤相关抗原(HMWMAA)、o-乙酰基-GD2神经节苷脂(OAcGD2)、叶酸受体β、肿瘤内皮标志物1(TEM1/CD248)、肿瘤内皮标志物7相关(TEM7R)、紧密连接蛋白6(CLDN6)、紧密连接蛋白18.2(CLDN18.2)、促甲状腺激素受体(TSHR)、G蛋白偶联受体C类5组成员D(GPRC5D)、染色体X开放阅读框61(CXORF61)、CD97和CD179a。
83.如权利要求66-82中任一项所述的DNA载体，其中所述CAR或TCR复合物蛋白质包含CAR，所述CAR包含对CD19具有特异性的抗原结合结构域。
84.如权利要求66-83中任一项所述的DNA载体，其中所述CAR或TCR复合物蛋白质包含CAR，所述CAR包含选自下组的共刺激结构域：CD28、4-1BB、OX40、CD27、CD30、ICOS、GITR、CD40、CD2、SLAM以及它们的组合。
85.如权利要求66-84中任一项所述的DNA载体，其中所述CAR或TCR复合物蛋白质包含CAR，所述CAR包含CD3ζ信号传导结构域。
86.如权利要求66-85中任一项所述的DNA载体，其中所述CAR或TCR复合物蛋白质包含CAR，所述CAR包含CH2CH3、CD28和/或CD8间隔区结构域。
87.如权利要求66-86中任一项所述的DNA载体，其中所述CAR或TCR复合物蛋白质包含CAR，所述CAR包含CD28或CD8跨膜结构域。
88.如权利要求66-87中任一项所述的DNA载体，其中所述CAR或TCR复合物蛋白质包含CAR，所述CAR包含：
a.抗原结合结构域，
b.间隔区结构域，
c.跨膜结构域，
d.共刺激结构域，和
e.细胞内T细胞信号传导结构域。
89.如权利要求66-88中任一项所述的DNA载体，其中所述CAR或TCR复合物蛋白质包含多特异性CAR，所述多特异性CAR包含针对至少2种不同抗原的抗原结合结构域。
90.如权利要求66-89中任一项所述的DNA载体，其中所述CAR或TCR复合物蛋白质包含选自下组的TCR复合物蛋白质：TCRα、TCRβ、TCRγ和TCRδ。
91.一种包含环状RNA多核苷酸的真核细胞，所述环状RNA多核苷酸按以下顺序包含3'I组内含子片段、内部核糖体进入位点(IRES)、编码嵌合抗原受体(CAR)或TCR复合物蛋白质的表达序列和5'I组内含子片段。
92.如权利要求91所述的真核细胞，其中所述真核细胞包括人细胞。
93.如权利要求91或92所述的真核细胞，其中所述真核细胞包括免疫细胞。
94.如权利要求91-93中任一项所述的真核细胞，其中所述真核细胞包括T细胞。
95.一种真核细胞群，所述真核细胞群包含环状RNA多核苷酸，所述环状RNA多核苷酸按以下顺序包含3'I组内含子片段、内部核糖体进入位点(IRES)、编码嵌合抗原受体(CAR)或TCR复合物蛋白质的表达序列和5'I组内含子片段，其中所述真核细胞群在其细胞表面上表达由所述环状RNA多核苷酸编码的所述CAR或TCR复合物蛋白质。
96.如权利要求95所述的真核细胞群，其中所述细胞群包含NK细胞、NKT细胞、巨噬细胞、树突细胞、αβT细胞、γδT细胞或它们的组合。
97.如权利要求95或96所述的真核细胞群，其中所述细胞群包含T细胞。
98.如权利要求97所述的真核细胞群，其中所述群包含CD3+T细胞。
99.如权利要求97所述的真核细胞群，其中所述群包含CD4+T细胞。
100.如权利要求97所述的真核细胞群，其中所述群包含CD8+T细胞。
101.如权利要求95-100中任一项所述的真核细胞群，所述真核细胞群处于有效治疗有需要的人受试者的癌症的量。
102.如权利要求95-101中任一项所述的真核细胞群，其中与包含编码相同CAR的线性RNA的等效真核细胞群相比，所述细胞群更有效或更长时间地杀死肿瘤细胞。
103.一种制备真核细胞群的方法，所述方法包括使所述群中的细胞与包含环状RNA多核苷酸的转移媒介物接触，所述环状RNA多核苷酸按以下顺序包含3'I组内含子片段、内部核糖体进入位点(IRES)、编码嵌合抗原受体(CAR)或TCR复合物蛋白质的表达序列和5'I组内含子片段，其中所述转移媒介物包含(i)可电离脂质、(ii)结构脂质和(iii)PEG修饰的脂质，其中所述转移媒介物能够将所述环状RNA多核苷酸递送至人免疫细胞，使得所述CAR在所述人免疫细胞中翻译并在所述人免疫细胞的表面上表达。
104.一种治疗有需要的受试者的方法，所述方法包括施用治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包含：
a.环状RNA多核苷酸，所述环状RNA多核苷酸按以下顺序包含3'I组内含子片段、内部核糖体进入位点(IRES)、编码嵌合抗原受体(CAR)或TCR复合物蛋白质的表达序列和5'I组内含子片段；以及
b.转移媒介物，所述转移媒介物包含(i)可电离脂质、(ii)结构脂质和(iii)PEG修饰的脂质，其中所述转移媒介物能够将所述环状RNA多核苷酸递送至人免疫细胞，使得所述CAR在所述人免疫细胞中翻译并在所述人免疫细胞的表面上表达。
105.如权利要求104所述的方法，其中所述受试者患有选自下组的癌症：急性淋巴细胞性癌、急性骨髓性白血病(AML)、肺泡横纹肌肉瘤、膀胱癌(例如，膀胱癌)、骨癌、脑癌(例如，成神经管细胞瘤)、乳腺癌、肛门癌、肛管癌或肛门直肠癌、眼癌、肝内胆管癌、关节癌、颈癌、胆囊癌或胸膜癌、鼻癌、鼻腔癌或中耳癌、口腔癌、外阴癌、慢性淋巴细胞性白血病、慢性骨髓性癌症、结肠癌、食道癌、宫颈癌、纤维肉瘤、胃肠类癌肿瘤、头颈癌(例如头颈鳞状细胞癌)、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、肾癌、喉癌、白血病、液体肿瘤、肝癌、肺癌(例如，非小细胞肺癌和肺腺癌)、淋巴瘤、间皮瘤、肥大细胞瘤、黑素瘤、多发性骨髓瘤、鼻咽癌、非霍奇金淋巴瘤、B-慢性淋巴细胞性白血病、毛细胞白血病、急性淋巴细胞性白血病(ALL)和伯基特淋巴瘤、卵巢癌、胰腺癌、腹膜癌、网膜癌和肠系膜癌、咽癌、前列腺癌、直肠癌、肾癌、皮肤癌、小肠癌、软组织癌、实体瘤、滑膜肉瘤、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌和输尿管癌。
106.一种RNA多核苷酸，所述RNA多核苷酸包含内部核糖体进入位点(IRES)、编码嵌合抗原受体(CAR)多肽的表达序列和至少一个自环化元件。
107.如权利要求106所述的RNA多核苷酸，所述RNA多核苷酸包含5'双链体形成区、具有第一置换位点的鱼腥藻属3'I组内含子片段、内部核糖体进入位点(IRES)、编码嵌合抗原受体(CAR)多肽的表达序列、具有第二置换位点的鱼腥藻属5'I组内含子片段和3'双链体形成区。
108.如权利要求106或107所述的RNA多核苷酸，所述RNA多核苷酸包含5'双链体形成区、第一置换位点、内部核糖体进入位点(IRES)、编码嵌合抗原受体(CAR)多肽的表达序列、第二置换位点和3'双链体形成区。
109.如权利要求106-108中任一项所述的RNA多核苷酸，其中所述自环化元件是I组内含子片段。
110.如权利要求108或109所述的RNA多核苷酸，所述RNA多核苷酸包含3'I组内含子片段和5'内含子片段。
111.如权利要求110所述的RNA多核苷酸，其中所述3'I组内含子片段和所述5'I组内含子片段是鱼腥藻属I组内含子片段。
112.如权利要求111所述的RNA多核苷酸，其中所述3'内含子片段和所述5'内含子片段由完整内含子中的L9a-5置换位点限定。
113.如权利要求111所述的环状RNA多核苷酸，其中所述3'内含子片段和所述5'内含子片段由完整内含子中的L8-2置换位点限定。
114.如权利要求110-113中任一项所述的RNA多核苷酸，所述RNA多核苷酸能够在不存在酶的情况下环化。
115.如权利要求106-114中任一项所述的RNA多核苷酸，所述RNA多核苷酸由天然核苷酸组成。
116.一种DNA载体，所述DNA载体适用于合成权利要求106-115中任一项所述的RNA多核苷酸。
117.如权利要求32-65中任一项所述的环状RNA多核苷酸，其中所述环状RNA多核苷酸在非脂质聚合物核-壳纳米颗粒中被递送至靶细胞。
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