CN114438178B - 人鼠同源小鼠环状rna基因序列的检测方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种人鼠同源小鼠环状RNA基因序列的检测方法及其应用，本发明提供的检测方法包括以下步骤：S1：提供所述人源环状RNA的有效序列；S2：获得与所述有效序列的小鼠同源序列的目标小鼠基因；S3：获得所述有效序列在步骤S2获得的所述目标小鼠基因的全序列中的位置；S4：根据S3得到的所述位置设计针对所述有效序列的引物；S5：采用S4得到的所述引物检测所述目标小鼠基因是否表达。采用本发明提供的检测方法能够简便、快捷、准确地找到现有circRNA数据库中未有的鼠源circRNA序列，并验证此段序列是否可以被转录出来，为进一步在动物水平上验证circRNA的生物学功能提供了研究基础。
Description
技术领域
本发明涉及一种人鼠同源小鼠环状RNA基因序列的检测方法及其应用。
技术背景
circRNAs(Circular RNAs，环形RNA分子)是一类不具有5'末端帽子和3'末端poly(A)尾巴、并以共价键形成环形结构的非编码RNA分子。随着生物学技术的快速发展，2012年，Salzman通过RNA-Seq方法首次报道了～80个环状RNA。至此借助于高通量测序技术，大量的circRNA分子被相继发现，Jeck等在人类成纤维细胞中检测出了高达25000多种的circRNA；而Memczak等通过RNA-seq数据结合人白细胞数据库鉴定出1950种人类circRNA、1903种小鼠circRNA(其中81种与人类circRNA相同)和724种线虫circRNA。许多研究表明，circRNA在肺纤维化的发生发展过程中起着重要作用。circHECTD1通过调节ZC3H12A介导的泛素化过程，影响下游HECTD1的表达，从而调控SiO2诱导肺巨噬细胞极性转化，释放相关炎性因子和纤维化因子，加速肺部纤维化过程。大量的研究表明了环状RNA在生物的生长发育、胁迫应答、疾病发生和发展方面有密切联系，是未来疾病诊断和治疗的潜在靶点。
RNA-Seq方法已成为研究circRNA的常用方法，通常利用RNAseq方法检测差异表达的circRNA，进而挑选某一个circRNA探究其机制。通常使用预处理的人源细胞或临床样品鉴定得到差异表达的circRNA，可以在人源细胞水平上探究其功能，但由于circRNA的ID是由其染色体位置信息组成的，不同的circRNA数据库收录的circRNA有各自规定的命名方式，有时在动物水平上进行研究时无法直接得知其对应的鼠源circRNA是哪一个。故需要一种能够准确确定与人源circRNA基因序列同源的鼠源circRNA是否存在的方法。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种人鼠同源小鼠环状RNA基因序列的检测方法，该方法用于确定是否存在与人源环状RNA同源的鼠源环状RNA，具有简便、快捷、准确的优点。本发明还提供了该人鼠同源小鼠环状RNA基因序列的检测方法的应用。
本发明的第一方面提供了一种人鼠同源小鼠环状RNA基因序列的检测方法，其包括以下步骤：S1：提供所述人源环状RNA的有效序列；S2：获得与所述有效序列的小鼠同源序列的目标小鼠基因；S3：获得所述有效序列在步骤S2获得的所述目标小鼠基因的全序列中的位置；S4：根据S3得到的所述位置设计针对所述有效序列的引物；S5：采用S4得到的所述引物检测所述目标小鼠基因是否表达。
根据本发明的一些实施方式，步骤S1中，所述人源环状RNA的有效序列为靶向敲低人源环状RNA表达的siRNA序列。根据本发明的一些具体实施方式，步骤S1中，具体通过以下方法获得所述人源环状RNA的有效序列：获得所述人源环状RNA的完整序列，设计针对人源环状RNA的siRNA，并验证其有效性，能够靶向敲低人源环状RNA表达的siRNA序列则为人源环状RNA的有效序列。
根据本发明的一些实施方式，步骤S2中，通过NCBI数据库获得与所述有效序列的小鼠同源序列的目标小鼠基因。根据本发明的一些具体实施方式，通过NCBI-blast网站(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)搜索获得与所述有效序列的小鼠同源序列的目标小鼠基因。
根据本发明的一些实施方式，步骤S3中，通过NCBI数据库(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)获得所述目标小鼠基因的全序列。根据本申请的一些具体实施方式，通过在NCBI-blastn-enter query sequence中输入所述人源环状RNA的有效序列，其中筛选条件organism为Mus(taxid:10088)，即可获得与人源环状RNA同源的目标小鼠基因，通过结果中的accession即可得到所述目标小鼠基因的全序列。
根据本发明的一些实施方式，步骤S3中，通过将所述有效序列与所述目标小鼠基因的全序列进行对比，获得所述有效序列在步骤S2获得的所述目标小鼠基因的全序列中的位置。根据本申请的一些具体实施方式，将步骤S3中的所述目标小鼠基因的全序列保存为word文档，通过比对word文档中与步骤S1中所述的有效序列相同的序列在小鼠基因全序列中的位置。
根据本发明的一些实施方式，步骤S4中，根据所述位置在所述目标小鼠基因的全序列的上游100bp内和下游100bp内分别设计引物。
根据本发明的一些实施方式，所述引物的长度为18bp-30bp。根据本发明的一些实施方式，所述引物的Tm值为55℃-65℃，优选为58℃-62℃。根据本申请的一些实施方式，上游引物和下游引物的Tm值要保持接近，最好不超过5℃。根据本发明的一些实施方式，所述引物的GC含量为40％-60％。根据本申请的一些实施方式，使用NCBI primer-blast或其他软件进行比对，所述引物的特异性要较好(比如不能扩增出与目的基因片段相似大小的其他基因片段)。
根据本发明的一些实施方式，步骤S5中，通过实时荧光定量PCR方法检测所述目标小鼠基因是否表达。
根据本发明的一些实施方式，步骤S5中，所述实时荧光定量PCR方法采用小鼠肺组织的RNA逆转录得到的序列进行检测。
本发明中，术语“有效序列”为人源环状RNA中的一小段，是已验证过的能够靶向敲低人源环状RNA的序列，以此为目标找到的鼠源序列后续也可以作为靶向敲低的目标之一。
根据本发明的检测方法，仅需得知靶向人源环状RNA的有效siRNA序列，便可通过网站快速的查找到可能存在的同源鼠源序列，进而简单的设计实时荧光定量PCR引物，通过结合实验的方法便能检测到此段同源鼠源序列是否能够被转录。此外，本领域技术人员能够理解地，本发明的检测方法也适用于寻找人与其他动物种属的同源序列，只需要将本发明的检测方法中的涉及小鼠的特征替换为其他动物种属即可。
本发明的第二方面提供了根据第一方面所述的检测方法在检测是否存在与人源环状RNA同源的鼠源环状RNA中的应用。
根据本发明的一些实施方式，所述人源环状RNA为has_circ_00085439基因。
本发明的第三方面提供了根据第一方面所述的检测方法在环状RNA的生物学功能研究中的应用。
采用本发明提供的检测方法通过简便的网站查找结合实时荧光定量PCR的实验方法，就能够找到现有circRNA数据库中未有的鼠源circRNA序列，并验证此段序列是否可以被转录出来，为进一步在动物水平上验证circRNA的生物学功能提供了研究基础。
附图说明
图1示出了根据本发明的实施例1步骤(2)得到的has_circ_00085439同源的小鼠序列所属基因。
图2示出了根据本发明的实施例1步骤(2)得到的has_circ_00085439及同源的小鼠Tbc1d31基因序列的对比结果。
图3示出了根据本发明的实施例1步骤(5)得到的扩增曲线。
图4示出了根据本发明的实施例1步骤(5)得到的溶解曲线。
具体实施方式
以下结合实例和附图对本发明的具体实施作出进一步说明，旨在说明本发明，而不应视为对本发明的限制。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。以下实施例中所使用的试剂和材料均为市售产品。
实施例1has_circ_00085439基因序列在小鼠中表达
使用60Co伽马射线照射野生型人肺上皮细胞(HBE细胞)和P53基因敲除型HBE细胞以建立肺纤维化发生的细胞模型，即细胞发生上皮间质转化模型，在照射后24小时收集两组细胞样品进行高通量测序分析。结果显示，与野生型HBE细胞相比，P53基因敲除型HBE细胞中circRNA的表达有显著变化，总共有38个circRNA的表达发生显著变化，其中has_circ_00085439(circBase ID)在野生型HBE细胞中，照射后表达显著增加，且已经过细胞实验验证其表达水平变化与测序结果一致。这提示放射可以诱导肺上皮细胞中has_circ_00085439的表达，表明在放射诱导肺上皮细胞发生上皮间质转化过程中has_circ_00085439很有可能发挥了重要的作用。
为了在动物水平上进一步研究has_circ_00085439在放射所致肺纤维化中的作用，查找了circBase、circbank等多个circRNA数据库中人源has_circ_00085439所对应的鼠源序列，但无法查找到对应鼠源序列。基于此，发明人采用一种新的方法以寻找与人源circRNA具有相同序列的鼠源circRNA及探究此基因序列是否可以转录，具体步骤如下：
步骤(1)：委托吉玛公司设计针对siRNA-hsa_circ_00085439的有效序列：AATTATAGTGAACATT，并验证其有效性，其能够靶向敲低人源环状RNA表达。
步骤(2)：在NCBI-blast网站(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)搜索已验证过siRNA-hsa_circ_00085439的有效序列：AATTATAGTGAACATT，其中筛选条件organism为Mus(taxid:10088)，得到has_circ_00085439这段序列的小鼠同源序列所属的基因，结果如图1所示。由图1可知，第一个结果Tbc1d31基因与人源转录本基因相同。将siRNA-hsa_circ_00085439的有效序列与小鼠Tbc1d31基因序列比对，结果如图2所示，query代表hsa_circ_00085439的有效序列，subject(Sbjct)代表找到的Tbc1d31与hsa_circ_00085439有效序列相匹配的序列，是100％匹配的。通过图1中的第一个结果Musmusculus TBC1 domain family,member 31(Tbc1d31),transcript variant X5所对应的Accession，获得此小鼠基因的全序列，如序列表中SEQ ID NO:1所示；
步骤(3)：获得步骤(2)获得的此小鼠基因的全序列中与has_circ_00085439同源序列的位置(如下所示序列的划线加粗处加斜体所示的序列)；
步骤(4)：在与has_circ_00085439同源序列的序列上下游100bp内(划线加粗处)设计引物。正向引物序列为：CGTTTGCGTGGACTGCATAG；反向引物序列为：ATGGTCCCCAGCAATGAAGG。并检查此引物的退火温度及特异性等特征，结果如表1，上下游引物退火温度分别为59.9℃和60.03℃，特异性较好。
表1
步骤(5)：提取三只野生型C57BL/6小鼠肺组织的RNA，逆转录，利用步骤(4)设计的引物，逆转录得到的cDNA为模版，通过实时荧光定量PCR检测此段小鼠基因是否有表达。结果发现，内参基因CT值分别为23.56，26.36，0；目的片段PCR结果的CT值分别为31.62、31.87和0，表明除了第三例样本无数值外，小鼠此段同源基因是可以表达并被检测到的。并且通过图3的扩增曲线可以得知与hsa_circ_00085439同源的小鼠序列能够被扩增出来(30个循环后能够被检测到荧光)，图4的溶解曲线图说明针对hsa_circ_00085439同源的小鼠序列所设计的实时荧光定量PCR引物的特异性较好(单峰，且最适温度稳定)。
上述实施例表明利用本发明提供的基因序列检测方法，可以通过很简便的网站查找结合实时荧光定量PCR的实验方法找到已有circRNA数据库中未有的鼠源circRNA序列，并验证此段序列是否可以被转录出来，为进一步在动物水平上验证circRNA的生物学功能提供了研究基础。
应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明作出修改，以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例，相反，本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。
序列表
<110> 申请人 中南大学
<120> 人鼠同源小鼠环状RNA基因序列的检测方法及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 464
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 1
acgcagcctc ttgtgtgacg tcagtgggag tctttgcccc ctcccccatt tgttttggtt 60
cccatggtgc ctgcctaagc gatcttggtg tttctgatta cctacgtttg cgtggactgc 120
atagtatcac ttgggttcat acctcgagaa ttatagtgaa cattgttcac agcacttctg 180
aataccatcc caaagtcttg cggtttttga atgtggcttt tgatggctca ggcgattcct 240
tcattgctgg ggaccatcag ggaaacatct atgtttttga cttgcatgga aacaggttta 300
atcttgttca gcgaacagca caagcgtgca cagctctggc ctttaatctt cgtagaaagt 360
ctgagttcct tgtggcgtta gctgattatt ctattaaatg ttttgataca gtcaccaagg 420
agctggttag ctggatgaga ggacacgagt cgtcggtgtg ttcc 464
Claims (9)
1.一种人鼠同源小鼠环状RNA基因序列的检测方法，其包括以下步骤：
S1：提供人源环状RNA的有效序列，所述人源环状RNA的有效序列为靶向敲低人源环状RNA表达的siRNA序列；
S2：获得所述有效序列的小鼠同源序列所属的目标小鼠基因；
S3：确定所述有效序列在所述目标小鼠基因的全序列中的位置；
S4：根据S3得到的所述位置设计针对所述有效序列的引物；
S5：采用S4得到的所述引物检测所述目标小鼠基因是否表达。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤S2中，通过NCBI数据库获得所述有效序列的小鼠同源序列所属的目标小鼠基因。
3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，步骤S3中，通过NCBI数据库获得所述目标小鼠基因的全序列。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，步骤S3中，通过将所述有效序列与所述目标小鼠基因的全序列进行对比，获得所述有效序列在所述目标小鼠基因的全序列中的位置。
5.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，步骤S4中，根据所述位置在所述有效序列的上游100bp内和下游100bp内分别设计引物。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述引物的长度为18bp-30bp，所述引物的Tm值为55℃-65℃，所述引物的GC含量为40％-60％。
7.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，步骤S5中，通过实时荧光定量PCR方法检测所述目标小鼠基因是否表达。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，步骤S5中，所述实时荧光定量PCR方法采用小鼠肺组织的RNA逆转录得到的序列进行检测。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的检测方法在检测是否存在与人源环状RNA同源的鼠源环状RNA中的应用，所述人源环状RNA为hsa circ 0085439基因。
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| CircInteractome: A web tool for exploring circular RNAs and their interacting proteinsand microRNAs;Dawood B. Dudekula等;RNA BIOLOGY;第13卷(第1期);34-42 * |
| 小鼠Nanog基因的克隆及对人宫颈癌上皮细胞的作用;窦琳;吕长荣;李军;贾文文;赵婷;窦忠英;;中国组织工程研究与临床康复(第07期);1239-1242 * |
| 环状RNA的生物特征及其在植物中的研究进展;尹军良;马东方;刘乐承;夏雨晨;朱永兴;;西北植物学报(第12期);2510-2518 * |
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