JP2022527763A - 修飾環状ポリリボヌクレオチドを含む組成物及びその使用 - Google Patents

修飾環状ポリリボヌクレオチドを含む組成物及びその使用 Download PDF

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カーベジアン，アバク
プルギス，ニコラス・マッカートニー
ブール，アレクサンドラ・ソフィー デ
シフエンテス－ロハス，キャサリン
ペク，キ・ヨン
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フラッグシップ パイオニアリング イノベーションズ シックス，エルエルシー
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Abstract

本発明は、概して、修飾環状ポリリボヌクレオチドの医薬組成物及び調製並びにその使用に関する。【選択図】図１－１

Description

相互参照
本出願は、２０１９年３月２５日に出願された米国仮特許出願第６２／８２３，５７３号明細書の利益を主張するものであり、これの内容全体は、参照により本明細書に援用される。
特定の環状ポリリボヌクレオチドは、健常人の組織及び細胞を含むヒト組織及び細胞中に遍在的に存在する。
本開示は、薬学的に許容される担体又は賦形剤及び連続非修飾ヌクレオチドの第１の部分を含む環状ポリリボヌクレオチドを含む医薬組成物を提供する。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ポリリボヌクレオチド及び連続非修飾ヌクレオチドの第１の部分を含む。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチドは、対象に送達される。
本開示は、対象における環状ポリリボヌクレオチドの免疫原性を減少又は低下させる方法であって、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドを提供する工程であって、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド及び５％以下の修飾ヌクレオチドを有する少なくとも約５～１０００連続ヌクレオチドを含む第１の部分を含む、工程と；ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドを、対象に投与する工程と；対象の細胞又は組織における対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチドと比較して、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドに対して減少した免疫原性を得る工程とを含む方法を提供する。ある実施形態において、対象における環状ポリリボヌクレオチドの免疫原性を低下又は減少させる方法は、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドを提供する工程であって、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ポリリボヌクレオチド及び連続非修飾ヌクレオチドの第１の部分を含む、工程と、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドを、対象に投与する工程と、対象の細胞又は組織における対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチドと比較して、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドに対して低下又は減少した免疫原性を得る工程とを含む。ある実施形態において、第１の部分は、ＩＲＥＳを含む。ある実施形態において、第１の部分は、少なくとも約５～１０００連続非修飾ヌクレオチドを含む。ある実施形態において、第１の部分は、５’－メチルシチジンプソイドウリジン、又はＮ１－メチル－プソイドウリジンを欠いている。ある実施形態において、第１の部分中の５％以下のヌクレオチドが、修飾ヌクレオチドである。ある実施形態において、第１の部分のＩＲＥＳ中の５％以下のヌクレオチドが、修飾ヌクレオチドである。
本開示は、対象における１つ以上の発現配列を発現させる方法であって、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドを提供する工程であって、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド及び５％以下の修飾ヌクレオチドを有する少なくとも約５～１０００連続ヌクレオチドを含む第１の部分を含む、工程と；ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドを、対象に投与する工程と、対象の細胞又は組織における完全修飾環状ポリリボヌクレオチド同等物中の１つ以上の発現配列の発現と比較して、１つ以上の発現配列の増加した発現を得る工程とを含む方法を提供する。ある実施形態において、対象における１つ以上の発現配列を発現させる方法は、少なくとも１つの修飾ポリリボヌクレオチド、連続非修飾ヌクレオチドの第１の部分、及び１つ以上の発現配列を含むハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドを提供する工程と、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドを、対象に投与する工程と、対象の細胞又は組織における完全修飾環状ポリリボヌクレオチド同等物中の１つ以上の発現配列の発現と比較して、１つ以上の発現配列の増加した発現を得る工程とを含む。ある実施形態において、第１の部分は、ＩＲＥＳを含む。ある実施形態において、第１の部分は、少なくとも約５～１０００連続非修飾ヌクレオチドを含む。ある実施形態において、第１の部分は、５’－メチルシチジン、プソイドウリジン、又はＮ１－メチル－プソイドウリジンを欠いている。ある実施形態において、第１の部分中の５％以下のヌクレオチドが、修飾ヌクレオチドである。ある実施形態において、第１の部分のＩＲＥＳ中の５％以下のヌクレオチドが、修飾ヌクレオチドである。
本開示は、対象における環状ポリリボヌクレオチドの安定性を増加させる方法であって、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドを提供する工程であって、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド及び５％以下の修飾ヌクレオチドを有する少なくとも約５～１０００連続ヌクレオチドを含む第１の部分を含む、工程と；ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドを、対象に投与する工程と、対象の細胞又は組織における対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチドと比較して、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドに対して増加した安定性を得る工程とを含む方法を提供する。ある実施形態において、対象における環状ポリリボヌクレオチドの安定性を増加させる方法は、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドを提供する工程であって、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ポリリボヌクレオチド及び連続非修飾ヌクレオチドの第１の部分を含む、工程と、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドを、対象に投与する工程と、対象の細胞又は組織における対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチドと比較して、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドに対して増加した安定性を得る工程とを含む。ある実施形態において、第１の部分は、ＩＲＥＳを含む。ある実施形態において、第１の部分は、少なくとも約５～１０００連続非修飾ヌクレオチドを含む。ある実施形態において、第１の部分は、５’－メチルシチジン、プソイドウリジン、又はＮ１－メチル－プソイドウリジンを欠いている。ある実施形態において、第１の部分中の５％以下のヌクレオチドが、修飾ヌクレオチドである。ある実施形態において、第１の部分のＩＲＥＳ中の５％以下のヌクレオチドが、修飾ヌクレオチドである。
ある態様において、対象における環状ポリリボヌクレオチドの免疫原性を減少させる方法は、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドを提供する工程であって、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド及び少なくとも約５～１０００連続非修飾ヌクレオチドを含む第１の部分を含む、工程と；ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドを、対象に投与する工程と；対象の細胞又は組織における対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチドと比較して、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドに対して減少した免疫原性を得る工程とを含む。
ある態様において、対象における環状ポリリボヌクレオチドの免疫原性を低下させる方法であって、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドを提供する工程であって、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド及び少なくとも約５～１０００連続非修飾ヌクレオチドを含む第１の部分を含む、工程と；ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドを、対象に投与する工程と；対象の細胞又は組織における対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチドと比較して、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドに対して減少した免疫原性を得る工程とを含む。
ある実施形態において、第１の部分は、少なくとも約５、１０、２０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、又は１０００連続非修飾ヌクレオチドを含む。ある実施形態において、第１の部分は、５’－メチルシチジン又はプソイドウリジンを欠いている。ある実施形態において、第１の部分中の５％以下のヌクレオチドが、修飾ヌクレオチドである。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、翻訳能を有する。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、ａ）対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチドより、少なくとも約０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．５、１．６、１．８、２、２．２、２．５、２．８、若しくは３倍高い発現を有し；ｂ）対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチドより、少なくとも約１．１、１．２、１．３、１．５、１．６、１．８、２、２．２、２．５、２．８、３、３．２、３．３、３．５、３．８、４．０、４．２、４．５、４．８、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、若しくは１０．０倍長い半減期を有し；ｃ）対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチドより長い半減期を有し；又はｄ）ＲＩＧ－Ｉ、ＴＬＲ－３、ＴＬＲ－７、ＴＬＲ－８、ＭＤＡ－５、ＬＧＰ－２、ＯＡＳ、ＯＡＳＬ、ＰＫＲ、及びＩＦＮ－βのうちの少なくとも１つの発現若しくはシグナル伝達若しくは活性化によって評価した際に、対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチドより、少なくとも約１．１、１．２、１．３、１．５、１．６、１．８、２、２．２、２．５、２．８、３、３．２、３．３、３．５、３．８、４．０、４．２、４．５、４．８、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、若しくは１０．０倍低い免疫原性を有する。ある実施形態において、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドは、ａ）Ｎ（６）メチルアデノシン（ｍ６Ａ）、５’－メチルシチジン、及びプソイドウリジン；ｂ）２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－Ｏ－ＭＯＥ）、２’－Ｏ－アミノプロピル、２’－デオキシ、Ｔ－デオキシ－２’－フルオロ、２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＯＥ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノプロピル（２’－Ｏ－ＤＭＡＰ）、Ｔ－Ｏ－ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）、２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）、ロックト核酸（ＬＮＡ）、エチレン核酸（ＥＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、１’，５’－アンヒドロヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、モルホリノ、メチルホスホネートヌクレオチド、チオホスホネートヌクレオチド、及び２’－フルオロＮ３－Ｐ５’－ホスホロアミダイト；又はｃ）表２からのいずれかの修飾ヌクレオチドからなる群から選択される。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドの少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は９９％のヌクレオチドが、修飾ヌクレオチドである。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、非修飾ヌクレオチドからなる、タンパク質、ペプチド、生体分子、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は細胞標的に結合するように構成される結合部位を含む。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上の発現配列を含む。ある実施形態において、第１の部分は、非修飾ヌクレオチドからなるＩＲＥＳを含む。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドの１つ以上の発現配列は、ａ）完全修飾環状ポリリボヌクレオチド同等物より高い翻訳効率；ｂ）完全修飾環状ポリリボヌクレオチド同等物より、少なくとも約０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．５、１．６、１．８、２、２．２、２．５、２．８、若しくは３倍高い翻訳効率；ｃ）対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチドより高い翻訳効率；又はｄ）対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチドより、少なくとも約０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．５、１．６、１．８、２、２．２、２．５、２．８、若しくは３倍高い翻訳効率を有する。
ある態様において、対象における１つ以上の発現配列を発現させる方法は、１つ以上の発現配列を含むハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドを提供する工程であって、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド及び少なくとも約５、１０、２０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、若しくは１０００連続非修飾ヌクレオチドを含む第１の部分を含む、工程と；ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドを、対象に投与する工程と；対象の細胞又は組織における完全修飾環状ポリリボヌクレオチド同等物中の対応する１つ以上の発現配列の発現と比較して、１つ以上の発現配列の増加した発現を得る工程とを含む。
ある態様において、対象における環状ポリリボヌクレオチドの安定性を増加させる方法であって、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドを提供する工程であって、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、修飾環状ポリリボヌクレオチド及び少なくとも約５、１０、２０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、若しくは１０００連続非修飾ヌクレオチドを含む第１の部分を含む、工程と；ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドを、対象に投与する工程と；対象の細胞又は組織における対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチドと比較して、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドに対して増加した安定性を得る工程とを含む方法。
ある実施形態において、第１の部分は、ＩＲＥＳを含む。
一態様において、本開示は、薬学的に許容される担体又は賦形剤及びハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドを含む医薬組成物であって、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド及び第１の部分を含み、第１の部分は、少なくとも約５、１０、２０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、又は１０００連続非修飾ヌクレオチドを含む、医薬組成物を提供する。この態様の特定の実施形態において、第１の部分は、５％以下の修飾ヌクレオチドを含む。
別の態様において、本開示は、薬学的に許容される担体又は賦形剤及びハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドを含む医薬組成物であって、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド及び第１の部分を含み、第１の部分は、少なくとも約５、１０、２０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、又は１０００連続ヌクレオチドを含み、第１の部分は、５’－メチルシチジン又はプソイドウリジンを欠いている、医薬組成物を提供する。この態様の特定の実施形態において、第１の部分は、５％以下の修飾ヌクレオチドを含む。
ある態様において、医薬組成物は、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドを含み、ここで、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド；第１の標的、例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、又は細胞標的の第１の結合部分に結合するように構成される第１の結合部位を含む第１の部分（ここで、第１の結合部分は、非修飾ヌクレオチドからなる第１の環状ポリリボヌクレオチド（環状ＲＮＡ）結合モチーフである）を含み；ここで、第１の標的及びハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、複合体を形成する。
ある態様において、医薬組成物は、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドを含み、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド；第１の標的、例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、又は細胞標的の第１の結合部分に結合するように構成される第１の結合部位を含む第１の部分（ここで、第１の結合部分は、非修飾ヌクレオチドからなる第１の環状ポリリボヌクレオチド（環状ＲＮＡ）結合モチーフである）；及び第２の標的の第２の結合部分に結合するように構成される第２の結合部位（ここで、第２の結合部分は、第２の環状ＲＮＡ結合モチーフである）を含み、第１の結合部分は、第２の結合部分と異なり、第１の標的、第２の標的、及びハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、複合体を形成し、第１の標的又は第２の標的は、マイクロＲＮＡでない。
ある態様において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドを含む医薬組成物であって、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド；第１の標的の第１の結合部分に結合するように構成される第１の結合部位を含む第１の部分（ここで、第１の結合部分は、第１の環状ポリリボヌクレオチド（環状ＲＮＡ）結合モチーフである）；及び第２の標的の第２の結合部分に結合するように構成される第２の結合部位（ここで、第２の結合部分は、第２の環状ＲＮＡ結合モチーフである）を含み、第１の結合部分は、第２の結合部分と異なり、第１の標的及び第２の標的は両方とも、マイクロＲＮＡである。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチドより低い免疫原性を有する。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチドより、少なくとも約１．１、１．２、１．３、１．５、１．６、１．８、２、２．２、２．５、２．８、３、３．２、３．３、３．５、３．８、４．０、４．２、４．５、４．８、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、又は１０．０倍長い半減期を有する。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチドより長い半減期を有する。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、ＲＩＧ－Ｉ、ＴＬＲ－３、ＴＬＲ－７、ＴＬＲ－８、ＭＤＡ－５、ＬＧＰ－２、ＯＡＳ、ＯＡＳＬ、ＰＫＲ、及びＩＦＮ－βのうちの少なくとも１つの発現若しくはシグナル伝達若しくは活性化によって評価した際に、対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチドより、少なくとも約１．１、１．２、１．３、１．５、１．６、１．８、２、２．２、２．５、２．８、３、３．２、３．３、３．５、３．８、４．０、４．２、４．５、４．８、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、若しくは１０．０倍低い免疫原性を有する。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチドより長い半減期を有する。ある実施形態において、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドは、Ｎ（６）メチルアデノシン（ｍ６Ａ）、５’－メチルシチジン、及びプソイドウリジンからなる群から選択される。ある実施形態において、少なくとも１つの修飾核酸は、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－Ｏ－ＭＯＥ）、２’－Ｏ－アミノプロピル、２’－デオキシ、Ｔ－デオキシ－２’－フルオロ、２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＯＥ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノプロピル（２’－Ｏ－ＤＭＡＰ）、Ｔ－Ｏ－ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）、２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）、ロックト核酸（ＬＮＡ）、エチレン核酸（ＥＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、１’，５’－アンヒドロヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、モルホリノ、メチルホスホネートヌクレオチド、チオホスホネートヌクレオチド、及び２’－フルオロＮ３－Ｐ５’－ホスホロアミダイトからなる群から選択される。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドの少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は９９％のヌクレオチドが、修飾ヌクレオチドである。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチドは、非修飾ヌクレオチドからなる、ペプチド、タンパク質、生体分子、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は細胞標的に結合するように構成される結合部位を含む。ある実施形態において、第１の部分は、結合部位を含む。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチドは、非修飾ヌクレオチドからなる内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を含む。ある実施形態において、第１の部分は、ＩＲＥＳを含む。特定の実施形態において、ＩＲＥＳは、５％以下の修飾ヌクレオチドを含む。
ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上の発現配列を含む。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上の発現配列及びＩＲＥＳを含み、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、ＩＲＥＳの外部に、５’－メチルシチジン、プソイドウリジン、又はそれらの組合せを含む。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドの１つ以上の発現配列は、対応する完全修飾環状ポリリボヌクレオチドより高い翻訳効率を有する。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドの１つ以上の発現配列は、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド同等物より、少なくとも約０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．５、１．６、１．８、２、２．２、２．５、２．８、又は３倍高い翻訳効率を有する。ある実施形態において、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド同等物は、第１の部分の外部の少なくとも１つの修飾ヌクレオチド及び第１の部分中の５％超の修飾ヌクレオチドを含む。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドの１つ以上の発現配列は、対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチドより高い翻訳効率を有する。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドの１つ以上の発現配列は、対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチドより、少なくとも約０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．５、１．６、１．８、２、２．２、２．５、２．８、又は３倍高い翻訳効率を有する。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドの１つ以上の発現配列は、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド同等物より高い翻訳効率を有する。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドの１つ以上の発現配列は、１０％超の修飾ヌクレオチドを含む第１の部分を有する完全修飾環状ポリリボヌクレオチドより高い翻訳効率を有する。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドの１つ以上の発現配列は、１００％修飾されたプソイドウリジン又は５’メチルシトシンを含む第１の部分を有する完全修飾環状ポリリボヌクレオチドより高い翻訳効率を有する。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドの１つ以上の発現配列は、修飾ヌクレオチドを含む第１の部分を有する完全修飾環状ポリリボヌクレオチド同等物より、少なくとも約１．２、１．３、１．５、１．６、１．８、２、２．２、２．５、２．８、３、３．２、３．３、３．５、３．８、４．０、４．２、４．５、４．８、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、又は１０．０倍高い翻訳効率を有する。ある実施形態において、翻訳効率は、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド若しくは完全修飾環状ポリリボヌクレオチド同等物を含む細胞、又はインビトロ翻訳系（例えば、ウサギ網状赤血球溶解物）のいずれかにおいて測定される。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、ローリングサークル型翻訳の能力がある。
ある実施形態において、１つ以上の発現配列のそれぞれは、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドにおけるスタガー要素によって後続の発現配列から隔てられ、１つ以上の発現配列のローリングサークル型翻訳は、少なくとも２つのポリペプチド分子を生成する。ある実施形態において、薬学的に許容される担体又は賦形剤は、エタノールである。ある実施形態において、スタガー要素は、（ａ）単一の発現配列の２回の翻訳から、又は（ｂ）２つ以上の発現配列の１回以上の翻訳からの単一のポリペプチドの生成を防止する。ある実施形態において、スタガー要素は、１つ以上の発現配列から切り離された配列である。ある実施形態において、スタガー要素は、１つ以上の発現配列の発現配列の一部を含む。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、ローリングサークル型翻訳の能力があり、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドのローリングサークル型翻訳中に生成される全ポリペプチド（モル／モル）の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％が別個のポリペプチドであるように構成され、別個のポリペプチドのそれぞれは、１つ以上の発現配列の１回の翻訳又は１回未満の翻訳から生成される。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドのローリングサークル型翻訳中に生成される全ポリペプチド（モル／モル）の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％が別個のポリペプチドであるように構成され、全ポリペプチドにわたる別個の産物の量比率がインビトロ翻訳系において試験される。ある実施形態において、インビトロ翻訳系は、ウサギ網状赤血球溶解物を含む。ある実施形態において、スタガー要素は、１つ以上の発現配列の少なくとも１つの３’末端にあり、スタガー要素は、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドのローリングサークル型翻訳中にリボソームを停滞させるように構成される。ある実施形態において、スタガー要素は、２Ａ配列及び２Ａ様配列からなる群から選択されるペプチド配列をコードする。ある実施形態において、スタガー要素は、ＧＰであるＣ末端配列を有する配列をコードする。ある実施形態において、スタガー要素は、Ｄ（Ｖ／Ｉ）ＥｘＮＰＧＰ（ここで、ｘ＝任意のアミノ酸である）であるＣ末端コンセンサス配列を有する配列をコードする。ある実施形態において、スタガー要素は、ＧＤＶＥＳＮＰＧＰ、ＧＤＩＥＥＮＰＧＰ、ＶＥＰＮＰＧＰ、ＩＥＴＮＰＧＰ、ＧＤＩＥＳＮＰＧＰ、ＧＤＶＥＬＮＰＧＰ、ＧＤＩＥＴＮＰＧＰ、ＧＤＶＥＮＰＧＰ、ＧＤＶＥＥＮＰＧＰ、ＧＤＶＥＱＮＰＧＰ、ＩＥＳＮＰＧＰ、ＧＤＩＥＬＮＰＧＰ、ＨＤＩＥＴＮＰＧＰ、ＨＤＶＥＴＮＰＧＰ、ＨＤＶＥＭＮＰＧＰ、ＧＤＭＥＳＮＰＧＰ、ＧＤＶＥＴＮＰＧＰ、ＧＤＩＥＱＮＰＧＰ、及びＤＳＥＦＮＰＧＰからなる群から選択される配列をコードする。ある実施形態において、スタガー要素は、１つ以上の発現配列のそれぞれの３’末端にある。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド中の第１の発現配列のスタガー要素は、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド中の第１の発現配列に続く発現配列の第１の翻訳開始配列の上流（５’末端側）にあり、スタガー要素と第１の翻訳開始配列との間の距離は、第１の発現配列及び後続の発現配列の連続した翻訳を可能にする。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド中の第１の発現配列のスタガー要素は、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド中の第１の発現に続く発現配列の第１の翻訳開始配列の上流（５’末端側）にあり、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、連続して翻訳され、対応するハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド中の第２の発現配列の第２の翻訳開始配列の上流にある第２のスタガー要素を含む対応するハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、連続して翻訳されておらず、対応するハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド中の第２のスタガー要素は、第２の翻訳開始配列、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド中のスタガー要素と第１の翻訳開始との間の距離より例えば少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、又はそれ以上大きい距離にある。ある実施形態において、スタガー要素と第１の翻訳開始との間の距離は、少なくとも２ｎｔ、３ｎｔ、４ｎｔ、５ｎｔ、６ｎｔ、７ｎｔ、８ｎｔ、９ｎｔ、１０ｎｔ、１１ｎｔ、１２ｎｔ、１３ｎｔ、１４ｎｔ、１５ｎｔ、１６ｎｔ、１７ｎｔ、１８ｎｔ、１９ｎｔ、２０ｎｔ、２５ｎｔ、３０ｎｔ、３５ｎｔ、４０ｎｔ、４５ｎｔ、５０ｎｔ、５５ｎｔ、６０ｎｔ、６５ｎｔ、７０ｎｔ、７５ｎｔ、又はそれ以上である。ある実施形態において、第２のスタガー要素と第２の翻訳開始との間の距離は、スタガー要素と第１の翻訳開始との間の距離より少なくとも２ｎｔ、３ｎｔ、４ｎｔ、５ｎｔ、６ｎｔ、７ｎｔ、８ｎｔ、９ｎｔ、１０ｎｔ、１１ｎｔ、１２ｎｔ、１３ｎｔ、１４ｎｔ、１５ｎｔ、１６ｎｔ、１７ｎｔ、１８ｎｔ、１９ｎｔ、２０ｎｔ、２５ｎｔ、３０ｎｔ、３５ｎｔ、４０ｎｔ、４５ｎｔ、５０ｎｔ、５５ｎｔ、６０ｎｔ、６５ｎｔ、７０ｎｔ、７５ｎｔ、又はそれ以上大きい。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドにおける第１の発現配列に続く発現配列は、第１の発現配列以外の発現配列である。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドにおける第１の発現配列の後続の発現配列は、第１の発現配列である。
ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、ａ）エンクリプトゲン；ｂ）スタガー要素；ｃ）調節要素；ｄ）複製要素；及びｆ）疑似二本鎖二次構造から選択される少なくとも１つの構造要素を含む。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、ａ）線状同等物より高い翻訳効率；ｂ）複数の翻訳産物の化学量論的翻訳効率；ｃ）エンクリプトゲンを欠いた同等物より低い免疫原性；ｄ）線状同等物より増加した半減期；及びｅ）細胞分裂中の持続性から選択される少なくとも１つの機能特性を含む。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、線状同等物より少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、又は少なくとも１００倍高い翻訳効率を有する。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、線状同等物より少なくとも５倍高い翻訳効率を有する。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、ａ）５’－ＵＴＲ；ｂ）３’－ＵＴＲ；ｃ）ポリ－Ａ配列；ｄ）５’－キャップ；ｅ）終止要素；ｆ）エキソヌクレアーゼによる分解感受性；及びｇ）キャップ結合タンパク質への結合の少なくとも１つを欠いている。ある実施形態において、１つ以上の発現配列は、コザック開始配列を含む。ある実施形態において、疑似らせん構造は、少なくとも１つの非二本鎖セグメントを有する少なくとも１つの二本鎖ＲＮＡセグメントを含む。ある実施形態において、疑似らせん構造は、反復配列、例えばＡリッチ配列で連結される第１の配列及び第２の配列を含む。ある実施形態において、エンクリプトゲンは、スプライシング要素を含む。ある実施形態において、エンクリプトゲンは、タンパク質結合部位、例えばリボヌクレオチド結合タンパク質を含む。ある実施形態において、エンクリプトゲンは、例えば、免疫応答、例えばＣＴＬ応答を回避するために免疫タンパク質結合部位を含む。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、例えば、ＲＩＧ－Ｉ、ＴＬＲ－３、ＴＬＲ－７、ＴＬＲ－８、ＭＤＡ－５、ＬＧＰ－２、ＯＡＳ、ＯＡＳＬ、ＰＫＲ、及びＩＦＮ－βのうちの少なくとも１つの発現若しくはシグナル伝達若しくは活性化によって評価した際に、エンクリプトゲンを欠いた同等物より少なくとも２倍低い免疫原性を有する。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、リボスイッチをさらに含む。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、アプタザイムをさらに含む。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、非標準的翻訳開始配列、例えばＧＵＧ、ＣＵＧ開始コドン、例えばストレス条件下での発現を開始させる翻訳開始配列を含む。ある実施形態において、１つ以上の発現配列は、ペプチドをコードする。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、調節核酸、例えばノンコーディングＲＮＡを含む。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、約２０塩基～約２０ｋｂの範囲のサイズを有する。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、線状ポリリボヌクレオチドの環状化によって合成される。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、同じヌクレオチド配列又は異なるヌクレオチド配列のいずれかを有する複数の発現配列を含む。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、分解、例えばエキソヌクレアーゼに対して実質的に抵抗性である。
ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、第１の標的、例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、細胞膜などの第１の結合部分に結合するように構成される第１の結合部位（ここで、第１の結合部分は、第１の環状ポリリボヌクレオチド（環状ＲＮＡ）結合モチーフである）；及び第２の標的の第２の結合部分に結合するように構成される第２の結合部位（ここで、第２の結合部分は、第２の環状ＲＮＡ結合モチーフである）を含む修飾環状ポリリボヌクレオチドを含み、第１の結合部分は、第２の結合部分と異なり、第１の標的、第２の標的、及びハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、複合体を形成し、第１の標的又は第２の標的は、マイクロＲＮＡでない。
ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、第１の標的の第１の結合部分に結合するように構成される第１の結合部位（ここで、第１の結合部分は、第１の環状ポリリボヌクレオチド（環状ＲＮＡ）結合モチーフである）；及び第２の標的の第２の結合部分に結合するように構成される第２の結合部位（ここで、第２の結合部分は、第２の環状ＲＮＡ結合モチーフである）を含むハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドを含み、第１の結合部分は、第２の結合部分と異なり、第１の標的及び第２の標的は両方とも、マイクロＲＮＡである。
ある実施形態において、第１及び第２の標的は、互いに相互作用する。ある実施形態において、複合体は、細胞過程を調節する。ある実施形態において、第１及び第２の標的は、同じであり、第１及び第２の結合部位は、異なる部分に結合する。ある実施形態において、第１及び第２の標的は、異なる。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、第３又はそれ以上の結合部分に結合するように構成される１つ以上のさらなる結合部位をさらに含む。ある実施形態において、１つ以上の標的が同じであり、１つ以上の結合部位が、異なる部分に結合するように構成される。ある実施形態において、複合体の形成が、細胞過程を調節する。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、第１及び第２の標的と接触されたとき、第１又は第２の標的に関連する細胞過程を調節する。ある実施形態において、第１及び第２の標的は、複合体において互いに相互作用する。ある実施形態において、細胞過程は、疾患又は病態の発症に関連する。ある実施形態において、細胞過程は、ハイブリッド修飾環状ポリリボ核酸の翻訳と異なる。ある実施形態において、細胞過程は、疾患又は病態の発症に関連する。ある実施形態において、第１の標的は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子を含み、第２の標的は、タンパク質を含む。ある実施形態において、複合体は、ＤＮＡ分子の指向性転写、ＤＮＡ分子のエピジェネティックリモデリング、又はＤＮＡ分子の分解を調節する。ある実施形態において、第１の標的は、第１のタンパク質を含み、第２の標的は、第２のタンパク質を含む。ある実施形態において、複合体は、第１のタンパク質の分解、第１のタンパク質の転座、若しくはシグナル伝達を調節し、又は天然タンパク質機能を調節し、又は第１及び第２のタンパク質の間の直接相互作用によって形成される複合体の形成を阻害する。ある実施形態において、第１の標的は、第１のリボ核酸（ＲＮＡ）分子を含み、第２の標的は、第２のＲＮＡ分子を含む。ある実施形態において、複合体は、第１のＲＮＡ分子の分解を調節する。ある実施形態において、第１の標的は、タンパク質を含み、第２の標的は、ＲＮＡ分子を含む。ある実施形態において、複合体は、タンパク質の転座を調節し、又はタンパク質とＲＮＡ分子との間の直接相互作用によって形成される複合体の形成を阻害する。ある実施形態において、第１の結合部分は、受容体を含み、第２の結合部分は、受容体の基質を含む。ある実施形態において、複合体は、受容体の活性化を阻害する。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチドは、標的の結合部分に結合するように構成される結合部位を含み、ここで、結合部分は、リボ核酸（ＲＮＡ）結合モチーフであり、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、翻訳能が欠損しているか又は翻訳能に欠陥があり、標的は、マイクロＲＮＡでない。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、標的の結合部分に結合するように構成される結合部位を含み、ここで、結合部分は、リボ核酸（ＲＮＡ）結合モチーフであり、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、翻訳能が欠損しているか又は翻訳能に欠陥があり、標的は、マイクロＲＮＡである。ある実施形態において、標的は、ＤＮＡ分子を含む。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドへの結合部分の結合が、ＤＮＡ分子の転写の干渉を調節する。ある実施形態において、標的は、タンパク質を含む。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドへの結合部分の結合が、他の分子とのタンパク質の相互作用を阻害する。ある実施形態において、タンパク質は受容体であり、修飾環状ポリリボヌクレオチドへの第１の結合部分の結合が、受容体を活性化する。ある実施形態において、タンパク質は第１の酵素であり、ここで、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、第２の酵素に結合するように構成される第２の結合部位をさらに含み、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドへの第１及び第２の酵素の結合が、第１及び第２の酵素の酵素活性を調節する。ある実施形態において、標的は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子を含む。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドへの結合部分の結合が、ｍＲＮＡ分子の翻訳の干渉を調節する。ある実施形態において、標的は、リボソームを含む。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドへの結合部分の結合が、翻訳過程の干渉を調節する。ある実施形態において、標的は、環状ＲＮＡ分子を含む。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドへの結合部分の結合が、環状ＲＮＡ分子を隔離する。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドへの結合部分の結合が、マイクロＲＮＡ分子を隔離する。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、細胞標的の膜上で結合部分に結合するように構成される結合部位を含み；ここで、結合部分は、リボ核酸（ＲＮＡ）結合モチーフである。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、第２の細胞標的における第２の結合部分に結合するように構成される第２の結合部位をさらに含み、ここで、第２の結合部分は、第２のＲＮＡ結合モチーフである。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、両方の標的に結合するように構成される。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、第２の結合部分に結合するように構成される第２の結合部位をさらに含み、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドへの両方の標的の結合が、第１の標的の立体配座変化を誘導し、それによって、標的の下流のシグナル伝達を誘導する。
ある実施形態において、本開示は、担体、例えば、膜又は脂質二重層中で製剤化される本明細書に記載される組成物を提供する。
一態様において、本開示は、疾患又は病態を有する対象に、本明細書に記載される医薬組成物を投与する工程を含む、処置の方法を提供する。
一態様において、本開示は、医薬組成物を製造する方法であって、本明細書に記載されるハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドを生成する工程を含む方法を提供する。
一態様において、本開示は、本明細書に記載されるハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドを作製する方法であって、核酸配列を有する線状ポリリボヌクレオチドを、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドとして環状化する工程を含む方法を提供する。
一態様において、本開示は、本明細書に記載される組成物を含む操作された細胞を提供する。
定義
本発明は、特定の実施形態に関して及び特定の図を参照して説明されるが、本発明は、それらに限定されず、特許請求の範囲のみによって限定される。これ以降に記載される用語は、一般に、特に示されない限り、それらの一般的な意味で理解されるべきである。
「医薬組成物」という用語は、医薬組成物内に含まれる環状ポリリボヌクレオチドが治療によるヒト又は動物の身体の処置のために使用され得ることも開示することが意図される。したがって、それは、「治療に使用するための環状ポリリボヌクレオチド」と同等であることが意図される。
本明細書に記載される、環状ポリリボヌクレオチド、このような環状ポリリボヌクレオチドを含む組成物、このような環状ポリリボヌクレオチドを使用する方法などは、異なる要素、例えば複製要素、発現配列、スタガー要素及びエンクリプトゲン（例えば、実施例１０を参照されたい）又は例えば発現配列、スタガー要素及び調節要素（例えば、実施例３２及び４０を参照されたい）を含む環状ポリリボヌクレオチドエフェクターが、異なる技術効果（例えば、実施例１０及び４０における線状同等物より増加した翻訳効率並びに実施例４０における線状同等物より増加した半減期）を達成するのにどのように使用され得るかを示す実施例に部分的に基づいている。これ以降の説明が、実施例において考えられる特定の発見及び組合せの様々な変形を想定していることは、特にこれらの実施例に基づいている。
本明細書において使用される際、「環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）」又は「環状ポリリボヌクレオチド」又は「環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃｕｌａｒ ＲＮＡ）」という用語は、同義的に使用され、遊離末端を有さない（すなわち、遊離３’及び／又は５’末端がない）構造を有するポリリボヌクレオチド分子、例えば、共有結合又は非共有結合を介して環状又はエンドレス構造を形成するポリリボヌクレオチドを意味する。
本明細書において使用される際、「修飾環状ポリリボヌクレオチド」又は「修飾環状ＲＮＡ（ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｃｉｒｃｕｌａｒ ＲＮＡ）」又は「修飾環状ＲＮＡ（ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｃｉｒｃＲＮＡ）」という用語は、同義的に使用され、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む環状ポリリボヌクレオチドを意味する。修飾環状ＲＮＡは、分子の全長に沿って均一に修飾されても又はされなくてもよい。
本明細書において使用される際、「ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド同等物」又は「ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド」又は「ハイブリッド修飾環状ＲＮＡ（ｈｙｂｒｉｄ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｃｉｒｃＲＮＡ）」又は「ハイブリッド修飾環状ＲＮＡ（ｈｙｂｒｉｄ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｃｉｒｃｕｌａｒ ＲＮＡ）」という用語は、同義的に使用され、対照修飾環状ポリリボヌクレオチドと同じヌクレオチド配列を有し、且つ５％以下の本明細書に記載される修飾ヌクレオチドを含む連続ヌクレオチドの第１の部分を有する修飾環状ポリリボヌクレオチドを意味する。ある実施形態において、連続ヌクレオチドの第１の部分は、非修飾ヌクレオチドを含む（すなわち、修飾ヌクレオチドを含まないか又は非修飾ヌクレオチドのみを含む）。例えば、連続非修飾ヌクレオチドの第１の部分は、ＩＲＥＳを含む。ハイブリッド修飾環状ＲＮＡは、その全長に沿って修飾されても又はされなくてもよい。例えば、特定の実施形態において、ハイブリッド修飾環状ＲＮＡは、［（全てのシトシン＝メチルシトシン）＋（全てのウリジン＝プソイドウリジン）＋（非修飾ＩＲＥＳ）］である。別の例において、修飾されたハイブリッドは、［（全てのアデノシン＝ｍ６ａ）＋非修飾ＩＲＥＳ］である。
本明細書において使用される際、「完全修飾（ｆｕｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ）環状ポリリボヌクレオチド同等物」又は「完全に修飾された（ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ）環状ポリリボヌクレオチド同等物」又は「完全長修飾環状ポリリボヌクレオチド」又は「完全修飾環状ＲＮＡ」という用語は、同義的に使用され、対照ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドと同じヌクレオチド配列を有し、且つ対照ハイブリッド環状ポリリボヌクレオチドの第１の部分に対応する５％以下の修飾ヌクレオチドを含む第１の部分を有する修飾環状ポリリボヌクレオチドを意味する。例えば、第１の部分は、５％以下の修飾ヌクレオチド（すなわち、修飾ＩＲＥＳ）を有するＩＲＥＳを含む。完全修飾環状ＲＮＡは、分子の全長に沿って均一に修飾されても又はされなくてもよい。例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチドは、５％超の修飾ヌクレオチドを有するＩＲＥＳを含む第１の部分を含み、第１の部分の外部の５０％のヌクレオチドが、修飾ヌクレオチドである（例えば、第１の部分の外部のウリジンの５０％が、プソイドウリジンである）。特定の実施形態において、完全修飾環状ポリリボヌクレオチドは、［（全てのシトシン＝メチルシトシン）＋（全てのウリジン＝プソイドウリジン）＋修飾ＩＲＥＳ］である。別の例において、完全修飾環状ポリリボヌクレオチドは、［（全てのアデノシン＝ｍ６ａ）＋修飾ＩＲＥＳ］である。
本明細書において使用される際、「修飾リボヌクレオチド」という用語は、以下の表１中の化学式によって示される天然非修飾ヌクレオチドアデノシン（Ａ）、ウリジン（Ｕ）、グアニン（Ｇ）、シチジン（Ｃ）、及びモノホスフェートなどの、非修飾天然リボヌクレオチドの化学組成物に対する１つ以上の化学修飾を有する任意のリボヌクレオチド類似体又は誘導体を意味する。ある実施形態において、修飾リボヌクレオチドの化学修飾は、糖、核酸塩基、又はヌクレオシド間結合などの、リボヌクレオチドのいずれか１つ以上の官能基に対する（例えば、連結するホスフェート／ホスホジエステル結合／ホスホジエステル骨格に対する）修飾である。
本明細書において使用される際、「線状同等物」という用語は、環状ポリリボヌクレオチドと同じか又は類似のヌクレオチド配列（例えば、１００％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、又はそれらの間の任意のパーセンテージの配列類似性）を有し、且つ２つの遊離末端を有するポリリボヌクレオチド分子（及びそのフラグメント）（すなわち、環状化ポリリボヌクレオチドの非環状化形態（及びそのフラグメント））である。ある実施形態において、線状同等物（例えば、環状化前形態）は、環状ポリリボヌクレオチドと同じか又は類似のヌクレオチド配列（例えば、１００％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、又はそれらの間の任意のパーセンテージ配列類似性）及び同じか又は類似の核酸修飾を有し、且つ２つの遊離末端を有するポリリボヌクレオチド分子（及びそのフラグメント）（すなわち、環状化ポリリボヌクレオチドの非環状化形態（及びそのフラグメント））である。ある実施形態において、線状同等物は、環状ポリリボヌクレオチドと同じか又は類似のヌクレオチド配列（例えば、１００％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、又はそれらの間の任意のパーセンテージの配列類似性）及び異なる核酸修飾を有するか又は核酸修飾を有さず、且つ２つの遊離末端を有するポリリボヌクレオチド分子（及びそのフラグメント）（すなわち、環状化ポリリボヌクレオチドの非環状化形態（及びそのフラグメント））である。ある実施形態において、線状同等物であるポリリボヌクレオチド分子のフラグメントは、線状同等物ポリリボヌクレオチド分子より短い線状同等物ポリリボヌクレオチド分子の任意の部分である。ある実施形態において、線状同等物は、５’キャップをさらに含む。ある実施形態において、線状同等物は、ポリアデノシン尾部をさらに含む。ある実施形態において、線状同等物は、３’ＵＴＲをさらに含む。ある実施形態において、線状同等物は、５’ＵＴＲをさらに含む。
本明細書において使用される際、「フラグメント」という用語は、ヌクレオチド分子より短い少なくとも１つのヌクレオチドであるヌクレオチド分子の任意の部分を意味する。例えば、ヌクレオチド分子は、環状ポリリボヌクレオチド分子であり得、そのフラグメントは、環状ポリリボヌクレオチド分子の一部である、ポリリボヌクレオチド又は任意の数の連続ポリリボヌクレオチドであり得る。別の例として、ヌクレオチド分子は、線状ポリリボヌクレオチド分子であり得、そのフラグメントは、線状ポリリボヌクレオチド分子の一部である、モノリボヌクレオチド又は任意の数の連続ポリリボヌクレオチドであり得る。
本明細書において使用される際、「エンクリプトゲン」という用語は、免疫細胞による検出を低下させ、避け、且つ／若しくは回避し、及び／又は環状ポリリボヌクレオチドに対する免疫応答の誘導を低下させるのに役立つ環状ポリリボヌクレオチドの核酸配列又は構造である。
本明細書において使用される際、「発現配列」という用語は、産物、例えばペプチド若しくはポリペプチド又は調節核酸をコードする核酸配列である。ペプチド又はポリペプチドをコードする例示的な発現配列は、複数のヌクレオチド三つ組を含むことができ、これらは、それぞれアミノ酸をコードすることができ、「コドン」と呼ばれる。
本明細書において使用される際、「免疫タンパク質結合部位」という用語は、免疫タンパク質に結合するヌクレオチド配列である。ある実施形態において、免疫タンパク質結合部位は、外因性であるものとして環状ポリリボヌクレオチドをマスクするのに役立ち、例えば、免疫タンパク質結合部位は、環状ポリリボヌクレオチドが免疫タンパク質によって認識及び結合されることを防ぐタンパク質（例えば、競合阻害剤）によって結合され得、それにより環状ポリリボヌクレオチドに対する免疫応答を低下させるか又は回避する。本明細書において使用される際、「免疫タンパク質」という用語は、例えば、免疫原、例えば環状ポリリボヌクレオチドなどに対する免疫応答に関連する任意のタンパク質又はペプチドである。免疫タンパク質の非限定的な例としては、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、抗体（免疫グロブリン）、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）タンパク質、補体タンパク質及びＲＮＡ結合タンパク質が挙げられる。
本明細書において使用される際、「疑似らせん構造」という語句は、環状ポリリボヌクレオチドの高次構造であり、ここで、環状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部がらせん構造に折り畳まれる。
本明細書において使用される際、「疑似二本鎖二次構造」という語句は、環状ポリリボヌクレオチドの高次構造であり、ここで、環状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部が内部二本鎖を形成する。
本明細書において使用される際、「調節要素」という用語は、環状ポリリボヌクレオチド内の発現配列の発現を調節する核酸配列などの部分である。
本明細書において使用される際、「反復ヌクレオチド配列」という用語は、ＤＮＡ若しくはＲＮＡのストレッチ内又はゲノム全体にわたる反復核酸配列である。ある実施形態において、反復ヌクレオチド配列は、ポリＣＡ又はポリＴＧ（ＵＧ）配列を含む。ある実施形態において、反復ヌクレオチド配列は、イントロンのＡｌｕファミリー中の反復される配列を含む。
本明細書において使用される際、「複製要素」という用語は、複製に有用であるか、又は環状ポリリボヌクレオチドの転写を開始させる配列及び／又はモチーフである。
本明細書において使用される際、「スタガー要素」という用語は、翻訳中のリボソームの休止を誘導するヌクレオチド配列などの部分である。ある実施形態において、スタガー要素は、強いαらせん傾向を有するアミノ酸の非保存配列、続いてコンセンサス配列－Ｄ（Ｖ／Ｉ）ＥｘＮＰＧ Ｐ（ここで、ｘ＝任意のアミノ酸である）である。ある実施形態において、スタガー要素は、グリセロール、非核酸連結部分、化学修飾、修飾核酸又はそれらの任意の組合せなどの化学部分を含み得る。
本明細書において使用される際、「実質的に抵抗性」という用語は、対照と比較して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の抵抗性を有するものを意味する。
本明細書において使用される際、「化学量論的翻訳」という用語は、環状ポリリボヌクレオチドから翻訳された発現産物の実質的に同等の生成である。例えば、２つの発現配列を有する環状ポリリボヌクレオチドでは、環状ポリリボヌクレオチドの化学量論的翻訳は、２つの発現配列の発現産物が実質的に等しい量を有し得ること、例えば２つの発現配列間の量の差（例えば、モルの差）が約０又は１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％若しくは２０％未満、又はそれらの間の任意のパーセンテージであり得ることを意味し得る。
本明細書において使用される際、「翻訳開始配列」という用語は、環状ポリリボヌクレオチド中の発現配列の翻訳を開始させる核酸配列である。
本明細書において使用される際、「終止要素」という用語は、環状ポリリボヌクレオチド中の発現配列の翻訳を停止させる核酸配列などの部分である。
本明細書において使用される際、「翻訳効率」という用語は、リボヌクレオチド転写産物からのタンパク質又はペプチド産生の速度又は量を意味する。ある実施形態において、翻訳効率は、例えば、所与の翻訳系、例えばウサギ網状赤血球溶解物のようなインビトロ翻訳系において又は真核細胞若しくは原核細胞のようなインビボ翻訳系において、例えば所与の期間で、タンパク質又はペプチドをコードする所与の量の１転写産物当たりで生成されるタンパク質又はペプチドの量として表され得る。
本明細書において使用される際、「環状化効率」という用語は、得られる環状ポリリボヌクレオチドの、その出発材料と比べた測定値を意味する。
本明細書において使用される際、「免疫原性」という用語は、物質に対する免疫応答を誘導する可能性である。ある実施形態において、生物又はある種の免疫細胞の免疫系が免疫原性物質に曝されたとき、免疫応答が誘導され得る。「非免疫原性」という用語は、物質に対する検出可能な閾値を超える免疫応答の欠如又は非存在である。ある実施形態において、生物又はある種の免疫細胞の免疫系が非免疫原性物質に曝されたとき、免疫応答が検出されない。ある実施形態において、本明細書において提供される非免疫原性環状ポリリボヌクレオチドは、免疫原性アッセイによって測定される際に所定の閾値を超える免疫応答を誘導しない。例えば、免疫原性アッセイを用いて、環状ポリリボヌクレオチド）に対して自然免疫応答を測定する（例えば、炎症マーカーを測定する）際、本明細書において提供される非免疫原性ポリリボヌクレオチドは、所定の閾値より低いレベルで自然免疫応答の産生をもたらし得る。所定の閾値は、例えば、対照参照に対する自然免疫応答によって生じるマーカーのレベルの１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、又は１０倍以下であり得る。
本明細書において使用される際、「薬学的に許容される」という用語は、生物学的に又は他の形で不都合でない成分を指し、例えば、成分は、顕著な望ましくない生物学的影響を引き起こさずに、又はそれが含まれる製剤の他の成分のいずれかと有害な形で相互作用せずに、本発明の医薬製剤に組み込まれ、本明細書に記載される対象に投与され得る。特定の実施形態において、「薬学的に許容される」という用語が、賦形剤を指すように使用される際、それは、成分が、毒性試験及び製造試験の必要な基準を満たしていること、又はそれが、米国食品医薬品局（Ｕ．Ｓ．Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）によって作製された不活性成分ガイドに含まれることを示す。
本明細書において使用される際、「担体」という用語は、環状ポリリボヌクレオチドの共有結合修飾によって、部分的に若しくは完全に封入剤によって、又はそれらの組合せで、細胞内への組成物（例えば、環状ポリリボヌクレオチド）の輸送又は送達を容易にする化合物、組成物、試薬、又は分子を意味する。担体の非限定的な例としては、炭水化物担体（例えば、無水物修飾フィトグリコーゲン若しくはグリコーゲン型材料）、ナノ粒子（例えば、環状ポリリボヌクレオチドを封入するか若しくはそれに共有結合されるナノ粒子）、リポソーム、フソソーム、エクスビボ分化された網状赤血球、エキソソーム、タンパク質担体（例えば、環状ポリリボヌクレオチドに共有結合されるタンパク質）、又はカチオン性担体（例えば、カチオン性リポポリマー若しくはトランスフェクション試薬）が挙げられる。
本明細書において使用される際、「ネイキッド送達（ｎａｋｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ）」という用語は、担体を用いず、且つ細胞への送達を助ける部分への共有結合修飾を有さない、細胞への送達のための製剤を意味する。ネイキッド送達製剤は、任意のトランスフェクション試薬、カチオン性担体、炭水化物担体、ナノ粒子担体、又はタンパク質担体を含まない。例えば、環状ポリリボヌクレオチドのネイキッド送達製剤は、共有結合修飾を有さない環状ポリリボヌクレオチドを含み、且つ担体を含まない製剤である。
「希釈剤」という用語は、本明細書に記載される組成物（例えば、環状ポリリボヌクレオチドを含む組成物）が希釈又は溶解され得る不活性溶媒を含むビヒクルを意味する。希釈剤は、ＲＮＡ可溶化剤、緩衝液、等張剤、又はそれらの混合物であり得る。希釈剤は、液体希釈剤又は固体希釈剤であり得る。液体希釈剤の非限定的な例としては、水又は他の溶媒、可溶化剤及び乳化剤、例えばエチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３－ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油（特に、綿実油、落花生油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、及びゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール及びソルビタンの脂肪酸エステル、及び１，３－ブタンジオールが挙げられる。固体希釈剤の非限定的な例としては、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、リン酸二カルシウム、硫酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、リン酸ナトリウムラクトース、スクロース、セルロース、微結晶性セルロース、カオリン、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、塩化ナトリウム、乾燥デンプン、トウモロコシデンプン、又は粉砂糖が挙げられる。
参照による援用
本明細書に記載される全ての刊行物、特許及び特許出願は、それぞれの個々の刊行物、特許又は特許出願が具体的に及び個別に参照により援用されていることが示されているのと同程度に、参照により本明細書に援用される。
本発明の実施形態の以下の詳細な説明は、添付の図面と共に読んだときによりよく理解されるであろう。本発明を例示する目的のために、本明細書で例示される実施形態が図面に示される。しかしながら、本発明は、図面に示される実施形態の正確な構成及び手段に限定されないことが理解されるべきである。
図１Ａ、１Ｂ、および１Ｃは、修飾環状ＲＮＡが細胞内で翻訳されたことを示す。 図１Ａ、１Ｂ、および１Ｃは、修飾環状ＲＮＡが細胞内で翻訳されたことを示す。 図１Ａ、１Ｂ、および１Ｃは、修飾環状ＲＮＡが細胞内で翻訳されたことを示す。 図２Ａ、２Ｂ、および２Ｃは、修飾環状ＲＮＡが、トランスフェクトされた細胞内のＭＤＡ５、ＯＡＳ及びＩＦＮ－β発現によって評価した際、細胞に対する非修飾環状ＲＮＡと比較して低下した免疫原性を有することを示す。 図２Ａ、２Ｂ、および２Ｃは、修飾環状ＲＮＡが、トランスフェクトされた細胞内のＭＤＡ５、ＯＡＳ及びＩＦＮ－β発現によって評価した際、細胞に対する非修飾環状ＲＮＡと比較して低下した免疫原性を有することを示す。 図２Ａ、２Ｂ、および２Ｃは、修飾環状ＲＮＡが、トランスフェクトされた細胞内のＭＤＡ５、ＯＡＳ及びＩＦＮ－β発現によって評価した際、細胞に対する非修飾環状ＲＮＡと比較して低下した免疫原性を有することを示す。 ハイブリッド修飾環状ＲＮＡが、細胞内のＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ５、ＩＦＮ－β、及びＯＡＳ発現によって評価した際、非修飾環状ＲＮＡと比較して低下した免疫原性を有することを示す。 開始コドン、ＧＦＰをコードするＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）、スタガー要素（２Ａ）、エンクリプトゲン及びＩＲＥＳ（内部リボソーム進入部位）を含有する環状ＲＮＡの例示的なインビトロ生成プロセスの概略図を示す。 環状ＲＮＡの例示的なインビボ生成プロセスの概略図を示す。 開始コドン、ＧＦＰをコードするＯＲＦ、スタガー要素（２Ａ）及びエンクリプトゲンを含む例示的な環状ＲＮＡの設計を示す。 ２つの異なる環状ＲＮＡのインビボ化学量論的タンパク質発現を示す概略図である。 例示的な環状ＲＮＡからのマウスモデルにおけるインビボタンパク質発現を示す概略図である。 その構造情報についてドットブロット分析にかけられ得る、１つの二本鎖ＲＮＡセグメントを有する例示的な環状ＲＮＡの概略図を示す。 その構造情報についてＳＨＡＰＥ分析にかけられ得る、疑似らせん構造（ＨＤＶｍｉｎ）を有する例示的な環状ＲＮＡの概略図を示す。 ＨＤＡｇ結合活性を示す、機能的疑似らせん構造（ＨＤＶｍｉｎ）を有する例示的な環状ＲＮＡの概略図を示す。 例示的な自己複製可能な環状ＲＮＡの転写、自己切断及びライゲーションを示す概略図である。 様々な例示的な環状ＲＮＡのインビトロ生成を示す変性ＰＡＧＥゲル画像である。 様々な例示的な環状ＲＮＡの環状化効率をまとめたグラフである。 その線状同等物と比較して、例示的な環状ＲＮＡの低下した分解感受性を示す変性ＰＡＧＥゲル画像である。 例示的な精製プロセス後の例示的な環状ＲＮＡを示す変性ＰＡＧＥゲル画像である。 ＩＲＥＳ、キャップ、５’及び３’ＵＴＲを欠いた例示的な環状ＲＮＡによるＦｌａｇタンパク質（約１５ｋＤａ）の発現を示すウエスタンブロット画像である。 例示的な環状ＲＮＡのローリングサークル型翻訳を示すウエスタンブロット画像である。 例示的なスタガー要素を用いた又は用いない様々な例示的な環状ＲＮＡからの別個のタンパク質又は連続した長鎖ペプチドの生成を示すウエスタンブロット画像を示す。 例示的なスタガー要素又は終止要素（終止コドン）を用いた様々な例示的な環状ＲＮＡ間のタンパク質発現の比較を示すウエスタンブロット画像である。 ２つの例示的な環状ＲＮＡから翻訳されたタンパク質産物のウエスタンブロット分析からのシグナル強度をまとめたグラフである。 ビヒクル対照ＲＮＡと比較した、例示的な環状ＲＮＡ及びその線状同等物の翻訳産物のルシフェラーゼ活性をまとめたグラフである。 例示的な環状ＲＮＡの半減期を試験する時間経過実験における異なる収集時点におけるＲＮＡ量をまとめたグラフである。 線状及び環状ＲＮＡの両方を捕捉したプライマーを用いた細胞への送達の２４時間後の線状及び環状ＲＮＡレベルのｑＲＴ－ＰＣＲ分析を示すグラフである。 環状ＲＮＡに対して特異的なプライマーを用いた線状及び環状ＲＮＡレベルのｑＲＴ－ＰＣＲ分析を示すグラフである。 ＥＧＦタンパク質及びβ－チューブリンローディングコントロールについて調べられた環状ＲＮＡ及び線状ＲＮＡからの細胞溶解物のブロットを示す画像である。 環状ＲＮＡ又は線状ＲＮＡでトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞からの免疫関連遺伝子のｑＲＴ－ＰＣＲ分析を示すグラフである。 ローリングサークル型翻訳によって環状ＲＮＡから発現されたタンパク質のルシフェラーゼ活性を示すグラフである。 環状ＲＮＡ又は線状ＲＮＡから発現されたタンパク質のルシフェラーゼ活性を示すグラフである。 ローリングサークル型翻訳によって線状ＲＮＡ又は環状ＲＮＡから発現されたタンパク質のルシフェラーゼ活性を示すグラフである。 ＩＲＥＳ翻訳開始によって環状ＲＮＡから発現されたタンパク質のルシフェラーゼ活性を示すグラフである。 ＩＲＥＳ開始及びローリングサークル型翻訳によって環状ＲＮＡから発現されたタンパク質のルシフェラーゼ活性を示すグラフである。 環状ＲＮＡ又は線状ＲＮＡからの発現産物のタンパク質ブロットを示す画像である。 環状ＲＮＡ又は線状ＲＮＡからの発現産物のタンパク質ブロットを示す画像である。 例示的な環状ＲＮＡの疑似二本鎖構造を有する予測構造を示す。 例示的な環状ＲＮＡの疑似らせん構造を有する予測構造を示す。 例示的な環状ＲＮＡの反復配列と連結された疑似らせん構造を有する予測構造を示す。 例示的な環状ＲＮＡのＲＮＡｓｅ Ｈによる分解が、コンカテマーＲＮＡではなく環状ＲＮＡと一致する核酸分解産物を生成したという実験データを示す。 様々なＲＮＡ長さの形成のために生成された様々な長さのＤＮＡの電気泳動画像を示す。 様々な長さの環状結合に対するＲＮＡｓｅ Ｒ処理及びｑＰＣＲ分析を用いてＲＮＡの環状化を確認した実験データを示す。 タンパク質結合部位位を有する例示的な環状ＲＮＡの生成を示す。 ｍｉＲＮＡ結合部位を有する例示的な環状ＲＮＡの生成を示す。 自己スプライシングによる例示的な環状ＲＮＡの生成を示す。 線状対照と比較して、分割細胞内の環状ＲＮＡのより高い安定性を示す実験データを示す。 複数の発現配列を有する例示的な環状ＲＮＡからのタンパク質発現及び複数の発現配列を有する例示的な環状ＲＮＡのローリングサークル型翻訳を示す実験データを示す。 マウスへの注入後、環状ＲＮＡが、注入の３、４及び７日後の時点でマウスの肝臓における線状ＲＮＡより高いレベルで検出されたことを示す。 マウスへのガウシアルシフェラーゼを発現する環状ＲＮＡ又は線状ＲＮＡの注入後、ガウシアルシフェラーゼ活性が環状ＲＮＡの投与の１、２、７、１１、１６及び２３日後の時点で血漿中において検出された一方、その活性が修飾線状ＲＮＡの投与の１及び２日後の時点でのみ血漿中において検出されたことを示す。 マウスへのガウシアルシフェラーゼを発現する環状ＲＮＡ又は線状ＲＮＡの注入後、ガウシアルシフェラーゼ活性が環状ＲＮＡの投与の１、２、７、１１、１６及び２３日後の時点で血漿中において検出された一方、その活性が修飾線状ＲＮＡの投与の１及び２日後の時点でのみ血漿中において検出されたことを示す。 ＲＮＡの注入後、線状ＲＮＡではなく環状ＲＮＡがＲＮＡの投与の１６日後の時点で肝臓及び脾臓中で検出されたことを示す。 ＲＮＡの注入後、環状ＲＮＡではなく線状ＲＮＡが、ＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ－５、ＩＦＮ－Ｂ及びＯＡＳによって評価した際、免疫原性を示したことを示す。 様々な例示的な環状化方法を示す。 修飾ヌクレオチドを含有する環状ＲＮＡが、修飾ｍＲＮＡと比較して、及び非修飾ヌクレオチドのみで生成される環状ＲＮＡと比較して、インビボで低下した免疫原性を有することを示す。 修飾ヌクレオチドを含有する環状ＲＮＡが、その完全非修飾同等物及び修飾ｍＲＮＡより、インビボで増加した安定性を有することを示す。
本発明は、一般に、環状ポリリボヌクレオチドの医薬組成物及び製剤並びにその使用に関する。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ポリリボヌクレオチド及び連続非修飾ヌクレオチドの第１の部分を含む。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチドは、対象に送達される。
本開示は、対象における環状ポリリボヌクレオチドの免疫原性を低下又は減少させる方法であって、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドを提供する工程であって、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ポリリボヌクレオチド及び５％以下の修飾ヌクレオチドを有する連続ヌクレオチドの第１の部分を含む、工程と、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドを、対象に投与する工程と、対象の細胞又は組織における対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチドと比較して、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドに対して減少した免疫原性を得る工程とを含む方法を提供する。ある実施形態において、対象における環状ポリリボヌクレオチドの免疫原性を減少又は低下させる方法は、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドを提供する工程であって、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド及び５％以下の修飾ヌクレオチドを有する少なくとも約５～１０００連続ヌクレオチドを含む第１の部分を含む、工程と；ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドを、対象に投与する工程と；対象の細胞又は組織における対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチドと比較して、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドに対して減少した免疫原性を得る工程とを含む。ある実施形態において、対象における環状ポリリボヌクレオチドの免疫原性を低下又は減少させる方法は、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドを提供する工程であって、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ポリリボヌクレオチド及び連続非修飾ヌクレオチドの第１の部分を含む、工程と、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドを、対象に投与する工程と、対象の細胞又は組織における対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチドと比較して、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドに対して減少した免疫原性を得る工程とを含む。ある実施形態において、第１の部分は、ＩＲＥＳを含む。ある実施形態において、第１の部分は、少なくとも約５～１０００連続非修飾ヌクレオチドを含む。ある実施形態において、第１の部分は、５’－メチルシチジン又はプソイドウリジンを欠いている。ある実施形態において、第１の部分中の５％以下のヌクレオチドが、修飾ヌクレオチドである。
本開示は、対象における１つ以上の発現配列を発現させる方法であって、少なくとも１つの修飾ポリリボヌクレオチド、５％以下の修飾ヌクレオチドを有する連続ヌクレオチドの第１の部分、及び１つ以上の発現配列を含むハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドを提供する工程と、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドを、対象に投与する工程と、対象の細胞又は組織における完全修飾環状ポリリボヌクレオチド中の対応する１つ以上の発現配列の発現と比較して、１つ以上の発現配列の増加した発現を得る工程とを含む方法を提供する。ある実施形態において、対象における１つ以上の発現配列を発現させる方法は、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドを提供する工程であって、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド及び５％以下の修飾ヌクレオチドを有する少なくとも約５～１０００連続ヌクレオチドを含む第１の部分を含む、工程と；ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドを、対象に投与する工程と、対象の細胞又は組織における完全修飾環状ポリリボヌクレオチド同等物中の１つ以上の発現配列の発現と比較して、１つ以上の発現配列の増加した発現を得る工程とを含む。ある実施形態において、対象における１つ以上の発現配列を発現させる方法は、少なくとも１つの修飾ポリリボヌクレオチド、連続非修飾ヌクレオチドの第１の部分、及び１つ以上の発現配列を含むハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドを提供する工程と、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドを、対象に投与する工程と、対象の細胞又は組織における完全修飾環状ポリリボヌクレオチド中の対応する１つ以上の発現配列の発現と比較して、１つ以上の発現配列の増加した発現を得る工程とを含む。ある実施形態において、第１の部分は、ＩＲＥＳを含む。ある実施形態において、第１の部分は、少なくとも約５～１０００連続非修飾ヌクレオチドを含む。ある実施形態において、第１の部分は、５’－メチルシチジン又はプソイドウリジンを欠いている。ある実施形態において、第１の部分中の５％以下のヌクレオチドが、修飾ヌクレオチドである。
本開示は、対象における環状ポリリボヌクレオチドの安定性を増加させる方法であって、ハイブリッド環状ポリリボヌクレオチドを提供する工程であって、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ポリリボヌクレオチド及び５％以下の修飾ヌクレオチドを有する連続ヌクレオチドの第１の部分を含む、工程と、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドを、対象に投与する工程と、対象の細胞又は組織における対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチドと比較して、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドに対して増加した安定性を得る工程とを含む方法を提供する。ある実施形態において、対象における環状ポリリボヌクレオチドの安定性を増加させる方法は、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドを提供する工程であって、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド及び５％以下の修飾ヌクレオチドを有する少なくとも約５～１０００連続ヌクレオチドを含む第１の部分を含む、工程と；ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドを、対象に投与する工程と、対象の細胞又は組織における対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチドと比較して、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドに対して増加した安定性を得る工程とを含む。ある実施形態において、対象における環状ポリリボヌクレオチドの安定性を増加させる方法は、ハイブリッド環状ポリリボヌクレオチドを提供する工程であって、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ポリリボヌクレオチド及び連続非修飾ヌクレオチドの第１の部分を含む、工程と、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドを、対象に投与する工程と、対象の細胞又は組織における対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチドと比較して、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドに対して増加した安定性を得る工程とを含む。ある実施形態において、第１の部分は、ＩＲＥＳを含む。ある実施形態において、第１の部分は、少なくとも約５～１０００連続非修飾ヌクレオチドを含む。ある実施形態において、第１の部分は、５’－メチルシチジン又はプソイドウリジンを欠いている。ある実施形態において、第１の部分中の５％以下のヌクレオチドが、修飾ヌクレオチドである。
修飾環状ポリリボヌクレオチドを使用する方法
ある態様において、本明細書に記載される本発明は、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドの組成物を使用する方法及びハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドの送達を含む。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、対象に送達される。対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチドと比較して、対象への本明細書に記載されるハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドの投与は、対象の細胞又は組織における、低下若しくは減少した免疫原性、増加した翻訳効率（例えば、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドにおける１つ以上の発現配列の増加した発現）、又は増加した安定性をもたらし得る。完全修飾環状ポリリボヌクレオチド同等物と比較して、対象への本明細書に記載されるハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドの投与は、対象の細胞又は組織における増加した翻訳効率（例えば、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドにおける１つ以上の発現配列の増加した発現）をもたらし得る。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ポリリボヌクレオチド及び連続非修飾ヌクレオチドの第１の部分を含む。ある実施形態において、本開示は、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドを使用する方法であって、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド及び第１の部分を含み、第１の部分は、少なくとも約５連続非修飾ヌクレオチドを含む方法を提供する。ある実施形態において、ハイブリッド環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上の発現配列を含む。
ある実施形態において、第１の部分は、５％以下の修飾ヌクレオチドを有する少なくとも約５～１０００連続ヌクレオチドを含む。ある実施形態において、第１の部分は、少なくとも約５～１０００連続非修飾ヌクレオチドを含む。ある実施形態において、第１の部分は、５’－メチルシチジン、プソイドウリジン、又はＮ１－メチル－プソイドウリジンを欠いている。ある実施形態において、第１の部分中の５％以下のヌクレオチドが修飾される。ある実施形態において、第１の部分中の０％、１％、２％、３％、４％、又は５％以下のヌクレオチドが修飾される。ある実施形態において、第１の部分中のヌクレオチドは修飾されない。ある実施形態において、第１の部分は、ＩＲＥＳである。ある実施形態において、第１の部分は、５％以下の修飾ヌクレオチドを含むＩＲＥＳである。ある実施形態において、第１の部分は、修飾ヌクレオチドを含まない（例えば、非修飾ヌクレオチドのみを含む）ＩＲＥＳである。ある実施形態において、第１の部分は、非修飾ヌクレオチドからなるＩＲＥＳである。ある実施形態において、第１の部分は、非修飾ヌクレオチドからなる、タンパク質、ペプチド、生体分子、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は細胞標的に結合するように構成される結合部位を含む。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、翻訳能を有する。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、薬学的に許容される担体又は賦形剤をさらに含む医薬組成物中にある。
ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド及び連続非修飾ヌクレオチドを含む第１の部分を含み得る。修飾ヌクレオチドは、第１の部分の外部にある。ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドの修飾ポリリボヌクレオチドは、表１中の化学式によって示される天然非修飾ヌクレオチドアデノシン（Ａ）、ウリジン（Ｕ）、グアニン（Ｇ）、シチジン（Ｃ）、及びモノホスフェートなどの、非修飾天然リボヌクレオチドの化学組成物に対する１つ以上の化学修飾を有する類似体又は誘導体であり得る。修飾リボヌクレオチドの化学修飾は、糖、核酸塩基、又はヌクレオシド間結合などの、リボヌクレオチドのいずれか１つ以上の官能基に対する（例えば、連結するホスフェート／ホスホジエステル結合／ホスホジエステル骨格に対する）修飾であり得る。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド環状ポリリボヌクレオチド）の修飾ヌクレオチドは、参照により本明細書に援用される、Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｗ．Ｖ．，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１６ Ｊｕｎ１７；３５２（６２９２）：１４０８－１４１２において特定されるものなど、又はこの文献中のものなどの、当業者によって公知の任意の修飾であり得る。例えば、修飾は、表２に記載されるとおりであり得る。
Figure 2022527763000002
Figure 2022527763000003
ある実施形態において、修飾ヌクレオチドは、Ｎ（６）メチルアデノシン（ｍ６Ａ）、５’－メチルシチジン（５ｍＣ）、プソイドウリジン、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－Ｏ－ＭＯＥ）、２’－Ｏ－アミノプロピル、２’－デオキシ、Ｔ－デオキシ－２’－フルオロ、２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＯＥ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノプロピル（２’－Ｏ－ＤＭＡＰ）、Ｔ－Ｏ－ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）、２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）、ロックト核酸（ＬＮＡ）、エチレン核酸（ＥＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、１’，５’－アンヒドロヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、モルホリノ、メチルホスホネートヌクレオチド、チオホスホネートヌクレオチド、及び２’－フルオロＮ３－Ｐ５’－ホスホロアミダイトからなる群から選択される。ある実施形態において、修飾ヌクレオチドは、参照により本明細書に援用される、Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｗ．Ｖ．，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１６ Ｊｕｎ１７；３５２（６２９２）：１４０８－１４１２において特定されるものなど、又はこの文献中のものなどの、当業者によって公知の任意の修飾ヌクレオチドである。
本明細書に記載されるハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドの第１の部分は、少なくとも約５～１０００連続ヌクレオチドを含む。ある実施形態において、第１の部分は、少なくとも約５～１０００、１０～１０００、２０～１０００、５０～１０００、１００～１０００、２００～１０００、３００～１０００、４００～１０００、５００～１０００、６００～１０００、７００～１０００、８００～１０００、９００～１０００、又は９００～２０００連続ヌクレオチドを含む。本明細書に記載されるハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドの第１の部分は、５％以下の修飾ヌクレオチドを有する連続ヌクレオチドを含み得る。ある実施形態において、第１の部分は、０％、１％、２％、３％、４％、又は５％以下の修飾ヌクレオチドを含む連続ヌクレオチドを含む。ある実施形態において、第１の部分は、ＩＲＥＳである。ある実施形態において、第１の部分は、５％以下の修飾ヌクレオチドを含むＩＲＥＳである。ある実施形態において、第１の部分は、修飾ヌクレオチドを含まない（例えば、非修飾ヌクレオチドのみを含む）ＩＲＥＳである。ある実施形態において、第１の部分は、非修飾ヌクレオチドからなるＩＲＥＳである。本明細書に記載されるハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドの第１の部分は、連続非修飾ヌクレオチドを含み得る。第１の部分は、少なくとも約５連続非修飾ヌクレオチドを含み得る。ある実施形態において、第１の部分は、少なくとも約５～１０００連続非修飾ヌクレオチドを含む。ある実施形態において、第１の部分は、少なくとも約５～１０００、１０～１０００、２０～１０００、５０～１０００、１００～１０００、２００～１０００、３００～１０００、４００～１０００、５００～１０００、６００～１０００、７００～１０００、８００～１０００、９００～１０００、又は９００～２０００連続非修飾ヌクレオチドを含む。ある実施形態において、第１の部分は、少なくとも約５、１０、２０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、又は１０００、又はそれらの間の任意の数の連続非修飾ヌクレオチドを含む。ある実施形態において、第１の部分は、５、１０、２０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、又はそれらの間の任意の数の連続非修飾ヌクレオチドを含む。第１の部分は、ＩＲＥＳを含み得る。ある実施形態において、第１の部分は、５’－メチルシチジン、プソイドウリジン、又はＮ１－メチル－プソイドウリジンを欠いている。ある実施形態において、第１の部分は、Ｎ（６）メチルアデノシン（ｍ６Ａ）、５’－メチルシチジン（５ｍＣ）、プソイドウリジン、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－Ｏ－ＭＯＥ）、２’－Ｏ－アミノプロピル、２’－デオキシ、Ｔ－デオキシ－２’－フルオロ、２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＯＥ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノプロピル（２’－Ｏ－ＤＭＡＰ）、Ｔ－Ｏ－ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）、２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）、ロックト核酸（ＬＮＡ）、エチレン核酸（ＥＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、１’，５’－アンヒドロヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、モルホリノ、メチルホスホネートヌクレオチド、チオホスホネートヌクレオチド、及び２’－フルオロＮ３－Ｐ５’－ホスホロアミダイトからなる群から選択される修飾を欠いている。ある実施形態において、第１の部分は、参照により本明細書に援用される、Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｗ．Ｖ．，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１６ Ｊｕｎ１７；３５２（６２９２）：１４０８－１４１２において特定されるものなど、又はこの文献中のものなどの、当業者によって公知のヌクレオチド修飾を欠いている。
本明細書に記載されるハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、第１の部分の外部に、５’－メチルシチジン、プソイドウリジン、又はそれらの組合せを含み得る。ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、Ｎ（６）メチルアデノシン（ｍ６Ａ）、５’－メチルシチジン（５ｍＣ）、プソイドウリジン、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－Ｏ－ＭＯＥ）、２’－Ｏ－アミノプロピル、２’－デオキシ、Ｔ－デオキシ－２’－フルオロ、２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＯＥ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノプロピル（２’－Ｏ－ＤＭＡＰ）、Ｔ－Ｏ－ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）、２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）、ロックト核酸（ＬＮＡ）、エチレン核酸（ＥＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、１’，５’－アンヒドロヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、モルホリノ、メチルホスホネートヌクレオチド、チオホスホネートヌクレオチド、及び２’－フルオロＮ３－Ｐ５’－ホスホロアミダイトからなる群から選択される修飾を含み得、ここで、修飾ヌクレオチドは、第１の部分の外部にある。ある実施形態において、第１の部分の外部の修飾ヌクレオチドは、参照により本明細書に援用される、Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｗ．Ｖ．，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１６ Ｊｕｎ１７；３５２（６２９２）：１４０８－１４１２において特定されるものなど、又はこの文献中のものなどの、当業者によって公知の任意の修飾ヌクレオチドである。
低下した免疫原性
対象における環状ポリリボヌクレオチドの免疫原性を低下又は減少させる方法は、ハイブリッド環状ポリリボヌクレオチドを提供する工程であって、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ポリリボヌクレオチド及び連続非修飾ヌクレオチドの第１の部分を含む、工程と、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドを、対象に投与する工程と、対象の細胞又は組織における対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチドと比較して、修飾環状ポリリボヌクレオチドに対して低下又は減少した免疫原性を得る工程と含み得る。ある実施形態において、第１の部分は、少なくとも約５、１０、２０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、又は１０００連続非修飾ヌクレオチドを含む。ある実施形態において、第１の部分中の５％以下のヌクレオチドが修飾される。ある実施形態において、第１の部分中の１％、２％、３％、４％、又は５％以下のヌクレオチドが修飾される。ある実施形態において、第１の部分中のヌクレオチドは修飾されない。ある実施形態において、第１の部分は、ＩＲＥＳである。ある実施形態において、第１の部分は、非修飾ヌクレオチドからなる、タンパク質、ペプチド、生体分子、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は細胞標的に結合するように構成される結合部位を含む。ある実施形態において、第１の部分は、５％以下の修飾ヌクレオチドを含むＩＲＥＳである。ある実施形態において、第１の部分は、修飾ヌクレオチドを含まないＩＲＥＳである。ある実施形態において、第１の部分は、非修飾ヌクレオチドからなるＩＲＥＳである。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチドに対して低下又は減少した免疫原性は、対象の細胞又は組織における対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチドと比較して、少なくとも約１．１、１．２、１．３、１．５、１．６、１．８、２、２．２、２．５、２．８、３、３．２、３．３、３．５、３．８、４．０、４．２、４．５、４．８、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、又は１０．０倍低い。
ある実施形態において、本明細書に開示されるハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、対象への投与後、対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチドと比較して、低下又は減少した免疫原性を有する。ある実施形態において、本明細書に開示されるハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、対象への投与後、対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチドより、少なくとも約１．１、１．２、１．３、１．５、１．６、１．８、２、２．２、２．５、２．８、３、３．２、３．３、３．５、３．８、４．０、４．２、４．５、４．８、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、若しくは１０．０倍低い免疫原性を有する。ある実施形態において、本明細書に記載される免疫原性は、対象へのハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドの投与後、ＲＩＧ－Ｉ、ＴＬＲ－３、ＴＬＲ－７、ＴＬＲ－８、ＭＤＡ－５、ＬＧＰ－２、ＯＡＳ、ＯＡＳＬ、ＰＫＲ、及びＩＦＮ－βのうちの少なくとも１つの発現又はシグナル伝達又は活性化のレベルによって評価される。
増加した翻訳効率
本開示は、対象における１つ以上の発現配列を発現させる方法であって、少なくとも１つの修飾ポリリボヌクレオチド、連続非修飾ヌクレオチドの第１の部分、及び１つ以上の発現配列を含むハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドを提供する工程と、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドを、対象に投与する工程と、対象の細胞又は組織における完全修飾環状ポリリボヌクレオチド同等物の対応する１つ以上の発現配列の発現と比較して、１つ以上の発現配列の増加した発現を得る工程とを含む方法を提供する。ある実施形態において、第１の部分は、少なくとも約５、１０、２０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、又は１０００連続非修飾ヌクレオチドを含む。ある実施形態において、第１の部分中の５％以下のヌクレオチドが修飾される。ある実施形態において、第１の部分中の１％、２％、３％、４％、又は５％以下のヌクレオチドが修飾される。ある実施形態において、第１の部分中のヌクレオチドは修飾されない。ある実施形態において、第１の部分は、ＩＲＥＳである。ある実施形態において、第１の部分は、非修飾ヌクレオチドからなる、タンパク質、ペプチド、生体分子、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は細胞標的に結合するように構成される結合部位を含む。ある実施形態において、第１の部分は、５％以下の修飾ヌクレオチドを含むＩＲＥＳである。ある実施形態において、第１の部分は、修飾ヌクレオチドを含まないＩＲＥＳである。ある実施形態において、第１の部分は、非修飾ヌクレオチドからなるＩＲＥＳである。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上の発現配列を含む。
ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドの１つ以上の発現配列の増加した発現は、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド同等物の１つ以上の発現配列と同様であるか又はそれより高い。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドの１つ以上の発現配列の増加した発現は、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド同等物の１つ以上の発現配列より、少なくとも約０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．５、１．６、１．８、２、２．２、２．５、２．８、又は３倍高い。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドの１つ以上の発現配列の発現の増加した発現は、対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチドと同様であるか又はそれより高い。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドの１つ以上の発現配列の増加した発現は、対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチドより、少なくとも約０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．５、１．６、１．８、２、２．２、２．５、２．８、又は３倍高い。
ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドの１つ以上の配列の発現の増加した発現は、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド同等物より、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％、５００％、６００％、７０％、８００％、９００％、１０００％、２０００％、５０００％、１００００％、１０００００％、又はそれ以上高い。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドの１つ以上の配列の発現の増加した発現は、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド同等物より少なくとも約１０％高い。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドの１つ以上の配列の発現の増加した発現は、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド同等物より少なくとも約２０％高い。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドの１つ以上の配列の発現の増加した発現は、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド同等物より少なくとも約５０％高い。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドの１つ以上の配列の発現の増加した発現は、対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチドのものより、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％、５００％、６００％、７０％、８００％、９００％、１０００％、２０００％、５０００％、１００００％、１０００００％、又はそれ以上高い。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドの１つ以上の配列の発現の増加した発現は、対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチドのものより少なくとも約１０％高い。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドの１つ以上の配列の発現の増加した発現は、対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチドのものより少なくとも約２０％高い。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドの１つ以上の配列の発現の増加した発現は、対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチドのものより少なくとも約５０％高い。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドの１つ以上の配列の発現の増加した発現は、対象への投与後、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２８日、若しくはそれ以上、又はそれらの間の任意の日の時点である。
ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドの１つ以上の発現配列の発現は、対象への投与後、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド同等物の１つ以上の発現配列と同様であるか又はそれより高い翻訳効率を有する。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドの１つ以上の発現配列は、対象への投与後、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド同等物の１つ以上の発現配列より、少なくとも約０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．５、１．６、１．８、２、２．２、２．５、２．８、又は３倍高い翻訳効率を有する。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドの１つ以上の発現配列の発現は、対象への投与後、対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチドと同様であるか又はそれより高い翻訳効率を有する。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドの１つ以上の発現配列は、対象への投与後、対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチドより、少なくとも約０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．５、１．６、１．８、２、２．２、２．５、２．８、若しくは３倍高い翻訳効率を有する。
ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドの１つ以上の発現配列の発現は、対象への投与後、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２８日、若しくはそれ以上、又はそれらの間の任意の日の時点で、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド同等物の１つ以上の発現配列と同様であるか又はそれより高い翻訳効率を有する。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドの１つ以上の発現配列は、対象への投与後、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２８日、若しくはそれ以上、又はそれらの間の任意の日の時点で、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド同等物の１つ以上の発現配列より、少なくとも約０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．５、１．６、１．８、２、２．２、２．５、２．８、又は３倍高い翻訳効率を有する。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドの１つ以上の発現配列の発現は、対象への投与後、対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチドと同様であるか又はそれより高い翻訳効率を有する。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドの１つ以上の発現配列は、対象への投与後、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２８日、若しくはそれ以上、又はそれらの間の任意の日の時点で、対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチドより、少なくとも約０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．５、１．６、１．８、２、２．２、２．５、２．８、若しくは３倍高い翻訳効率を有する。
ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドの１つ以上の発現配列の増加した発現は、対象への投与後、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２８日、若しくはそれ以上、又はそれらの間の任意の日の時点で、５％超、又は少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、若しくは１００％の修飾ヌクレオチドを含む第１の部分を有する完全修飾環状ポリリボヌクレオチド同等物と同様であるか又はそれより高い。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドの１つ以上の発現配列の増加した発現は、対象への投与後、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２８日、若しくはそれ以上、又はそれらの間の任意の日の時点で、５％超、又は少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、若しくは１００％の修飾ヌクレオチドを含む第１の部分を有する完全修飾環状ポリリボヌクレオチド同等物より、少なくとも約１．１、１．２、１．３、１．５、１．６、１．８、２、２．２、２．５、２．８、３、３．２、３．３、３．５、３．８、４．０、４．２、４．５、４．８、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、又は１０．０倍高い。
ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドの１つ以上の発現配列の増加した発現は、５％超、又は少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、若しくは１００％の修飾ヌクレオチドを含む第１の部分を有する完全修飾環状ポリリボヌクレオチド同等物と同様であるか又はそれより高い。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドの１つ以上の発現配列の増加した発現は、５％超、又は少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、若しくは１００％の修飾ヌクレオチドを含む第１の部分を有する完全修飾環状ポリリボヌクレオチド同等物より、少なくとも約１．１、１．２、１．３、１．５、１．６、１．８、２、２．２、２．５、２．８、３、３．２、３．３、３．５、３．８、４．０、４．２、４．５、４．８、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、又は１０．０倍高い。
ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドの１つ以上の発現配列の増加した発現は、対象への投与後、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２８日、若しくはそれ以上、又はそれらの間の任意の日の時点で、５％超、又は少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、若しくは１００％の修飾ヌクレオチドを含む第１の部分を有する完全修飾環状ポリリボヌクレオチド同等物と同様であるか又はそれより高い。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドの１つ以上の発現配列の増加した発現は、対象への投与後、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２８日、若しくはそれ以上、又はそれらの間の任意の日の時点で、５％超、又は少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、若しくは１００％の修飾ヌクレオチドを含む第１の部分を有する完全修飾環状ポリリボヌクレオチド同等物より、少なくとも約１．１、１．２、１．３、１．５、１．６、１．８、２、２．２、２．５、２．８、３、３．２、３．３、３．５、３．８、４．０、４．２、４．５、４．８、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、又は１０．０倍高い。
ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドの１つ以上の配列の発現の増加した発現は、対象への投与後、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２８日、若しくはそれ以上、又はそれらの間の任意の日の時点で、５％超、又は少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、若しくは１００％の修飾ヌクレオチドを含む第１の部分を有する完全修飾環状ポリリボヌクレオチド同等物のものより、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％、５００％、６００％、７０％、８００％、９００％、１０００％、２０００％、５０００％、１００００％、１０００００％、又はそれ以上高い。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドの１つ以上の配列の発現の増加した発現は、対象への投与後、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２８日、若しくはそれ以上、又はそれらの間の任意の日の時点で、５％超又は少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、若しくは１００％の修飾ヌクレオチドを含む第１の部分を有する完全修飾環状ポリリボヌクレオチド同等物のものより少なくとも約１０％高い。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドの１つ以上の配列の発現の増加した発現は、対象への投与後、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２８日、若しくはそれ以上、又はそれらの間の任意の日の時点で、５％超、又は少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、若しくは１００％の修飾ヌクレオチドを含む第１の部分を有する完全修飾環状ポリリボヌクレオチド同等物のものより少なくとも約２０％高い。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドの１つ以上の配列の発現の増加した発現は、対象への投与後、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２８日、若しくはそれ以上、又はそれらの間の任意の日の時点で、５％超、又は少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、若しくは１００％の修飾ヌクレオチドを含む第１の部分を有する完全修飾環状ポリリボヌクレオチド同等物のものより少なくとも約５０％高い。
本明細書に記載される際、ある実施形態において、翻訳効率又は増加した発現は、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド若しくは対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチド若しくは完全修飾環状ポリリボヌクレオチド同等物を含む細胞、又はインビトロ翻訳系（例えば、ウサギ網状赤血球溶解物）のいずれかにおいて測定される。
増加した安定性
本開示は、対象における環状ポリリボヌクレオチドの安定性を増加させる方法であって、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドを提供する工程であって、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ポリリボヌクレオチド及び連続非修飾ヌクレオチドの第１の部分を含む、工程と、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドを、対象に投与する工程と、対象の細胞又は組織における対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチドと比較して、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドに対して増加した安定性を得る工程とを含む方法を提供する。ある実施形態において、第１の部分は、少なくとも約５、１０、２０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、又は１０００連続非修飾ヌクレオチドを含む。ある実施形態において、第１の部分中の５％以下のヌクレオチドが修飾される。ある実施形態において、第１の部分中の１％、２％、３％、４％、又は５％以下のヌクレオチドが修飾される。ある実施形態において、第１の部分中のヌクレオチドは修飾されない。ある実施形態において、第１の部分は、ＩＲＥＳである。ある実施形態において、第１の部分は、非修飾ヌクレオチドからなる、タンパク質、ペプチド、生体分子、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は細胞標的に結合するように構成される結合部位を含む。ある実施形態において、第１の部分は、５％以下の修飾ヌクレオチドを含むＩＲＥＳである。ある実施形態において、第１の部分は、修飾ヌクレオチドを含まないＩＲＥＳである。ある実施形態において、第１の部分は、非修飾ヌクレオチドからなるＩＲＥＳである。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドの増加した安定性は、対象の細胞又は組織における対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチドと比較して、少なくとも約１．１、１．２、１．３、１．５、１．６、１．８、２、２．２、２．５、２．８、３、３．２、３．３、３．５、３．８、４．０、４．２、４．５、４．８、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、又は１０．０倍高い。
ある実施形態において、本明細書に開示されるハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、対象への投与後、対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチドと比較して、増加した安定性を有する。ある実施形態において、開示されるハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、対象への投与後、対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチドより、少なくとも約１．１、１．２、１．３、１．５、１．６、１．８、２、２．２、２．５、２．８、３、３．２、３．３、３．５、３．８、４．０、４．２、４．５、４．８、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、又は１０．０倍高い増加した安定性を有する。
ある実施形態において、本明細書に開示されるハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、対象への投与後、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２８日、若しくはそれ以上、又はそれらの間の任意の日の時点で、対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチドと比較して増加した安定性を有する。ある実施形態において、本明細書に開示されるハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、対象への投与後１４日の時点で、対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチドと比較して増加した安定性を有する。ある実施形態において、開示されるハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、対象への投与後、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２８日、若しくはそれ以上、又はそれらの間の任意の日の時点で、対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチドより、少なくとも約１．１、１．２、１．３、１．５、１．６、１．８、２、２．２、２．５、２．８、３、３．２、３．３、３．５、３．８、４．０、４．２、４．５、４．８、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、又は１０．０倍高い増加した安定性を有する。ある実施形態において、開示されるハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、対象への投与後１４日の時点で、対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチドより、少なくとも約１．１、１．２、１．３、１．５、１．６、１．８、２、２．２、２．５、２．８、３、３．２、３．３、３．５、３．８、４．０、４．２、４．５、４．８、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、又は１０．０倍高い増加した安定性を有する。
ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、対象への投与後、対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチドより長い半減期を有する。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、対象への投与後、対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチドより、少なくとも約１．１、１．２、１．３、１．５、１．６、１．８、２、２．２、２．５、２．８、３、３．２、３．３、３．５、３．８、４．０、４．２、４．５、４．８、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、又は１０．０倍長い半減期を有する。ある実施形態において、半減期は、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド又は対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチドを、細胞内に導入し、細胞の内部に導入されたハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド又は対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチドのレベルを測定することによって測定される。
ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、対象への投与後、少なくとも、対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチドのものの半減期を有する。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、対象への投与後、対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチドのものより増加した半減期を有する。ある実施形態において、半減期は、対象への投与後、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、又はそれ以上増加される。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、対象への投与後、少なくとも約１時間～約３０日間、又は少なくとも約２時間、６時間、１２時間、１８時間、２４時間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、２０日間、２１日間、２２日間、２３日間、２４日間、２５日間、２６日間、２７日間、２８日間、２９日間、３０日間、６０日間、若しくはそれ以上又はそれらの間の任意の時間にわたって、細胞内での半減期又は持続性を有する。特定の実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、対象への投与後、約１０分間以下～約７日間、又は約１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２４時間、３６時間、４８時間、６０時間、７２時間、４日間、５日間、６日間、７日間以下、若しくはそれらの間の任意の時間にわたって、細胞内での半減期又は持続性を有する。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、対象への投与後、細胞が分裂している間、細胞内での半減期又は持続性を有する。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、対象への投与後、分裂後に、細胞内での半減期又は持続性を有する。特定の実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、対象への投与後、約１０分間超～約３０日間、又は少なくとも約１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、２４時間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、２０日間、２１日間、２２日間、２３日間、２４日間、２５日間、２６日間、２７日間、２８日間、２９日間、３０日間、６０日間、若しくはそれ以上又はそれらの間の任意の時間にわたって、分割している細胞内での半減期又は持続性を有する。
ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、対象への投与後、細胞分裂中、細胞内で持続する。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、対象への投与後、有糸分裂後、娘細胞内で持続する。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、対象への投与後、細胞内で複製され、娘細胞に継代される。ある実施形態において、細胞は、対象への投与後、少なくとも２５％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の効率で、少なくとも１つのハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドを、娘細胞に継代する。ある実施形態において、減数分裂を起こしている細胞は、対象への投与後、少なくとも２５％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の効率で、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドを、娘細胞に継代する。ある実施形態において、有糸分裂を起こしている細胞は、対象への投与後、少なくとも２５％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の効率で、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドを、娘細胞に継代する。
修飾環状ポリリボヌクレオチド
修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、本明細書に記載される方法に使用される。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ポリリボヌクレオチド及び連続非修飾ヌクレオチドの第１の部分を含む。ある実施形態において、本明細書に記載されるハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド及び第１の部分を含み、ここで、第１の部分は、少なくとも約５、１０、２０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、又は１０００連続非修飾ヌクレオチドを含む。ある実施形態において、第１の部分中の５％以下のヌクレオチドが修飾される。ある実施形態において、第１の部分中の０％、１％、２％、３％、４％、又は５％以下のヌクレオチドが修飾される。ある実施形態において、第１の部分中のヌクレオチドは修飾されない。ある実施形態において、第１の部分は、ＩＲＥＳである。ある実施形態において、第１の部分は、５％以下の修飾ヌクレオチドを含むＩＲＥＳである。ある実施形態において、第１の部分は、修飾ヌクレオチドを含まないＩＲＥＳである。ある実施形態において、第１の部分は、非修飾ヌクレオチドからなるＩＲＥＳである。ある実施形態において、第１の部分は、非修飾ヌクレオチドからなる、タンパク質、ペプチド、生体分子、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は細胞標的に結合するように構成される結合部位を含む。ある実施形態において、第１の部分は、５’－メチルシチジン、プソイドウリジン、又はＮ１－メチル－プソイドウリジンを欠いている。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、薬学的に許容される担体又は賦形剤をさらに含む医薬組成物中にある。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、対象に送達される。本明細書に記載されるハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド同等物と比較して、低下若しくは減少した免疫原性、増加した翻訳効率（例えば、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドにおける１つ以上の発現配列の増加した発現）、又は増加した安定性を有し得る。
第１の部分は、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド中の５％以下の修飾ヌクレオチドを有する連続ヌクレオチドを含む。ある実施形態において、第１の部分中の０％、１％、２％、３％、４％、又は５％以下の連続ヌクレオチドが修飾される。第１の部分は、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド中の連続非修飾ヌクレオチドを含む。第１の部分は、少なくとも約５連続非修飾ヌクレオチドを含み得る。ある実施形態において、第１の部分は、０％、１％、２％、３％、４％、又は５％以下の修飾ヌクレオチドを有する、少なくとも約５、１０、２０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、又は１０００連続ヌクレオチドを含む。ある実施形態において、第１の部分は、０％、１％、２％、３％、４％、又は５％以下の修飾ヌクレオチドを有する、少なくとも約５～１０００連続ヌクレオチドを含む。ある実施形態において、第１の部分は、０％、１％、２％、３％、４％、又は５％以下の修飾ヌクレオチドを有する、少なくとも約５～１０００、１０～１０００、２０～１０００、５０～１０００、１００～１０００、２００～１０００、３００～１０００、４００～１０００、５００～１０００、６００～１０００、７００～１０００、８００～１０００、９００～１０００、又は９００～２０００連続ヌクレオチドを含む。ある実施形態において、第１の部分は、少なくとも約５、１０、２０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、又は１０００連続非修飾ヌクレオチドを含む。ある実施形態において、第１の部分は、少なくとも約５～１０００連続非修飾ヌクレオチドを含む。ある実施形態において、第１の部分は、少なくとも約５～１０００、１０～１０００、２０～１０００、５０～１０００、１００～１０００、２００～１０００、３００～１０００、４００～１０００、５００～１０００、６００～１０００、７００～１０００、８００～１０００、９００～１０００、又は９００～２０００連続非修飾ヌクレオチドを含む。ある実施形態において、第１の部分は、５、１０、２０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、又はそれらの間の任意の数の連続非修飾ヌクレオチドを含む。第１の部分は、ＩＲＥＳを含み得る。ある実施形態において、第１の部分は、結合部位を含む。ある実施形態において、第１の部分は、ペプチド、タンパク質、生体分子、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は細胞標的に結合するように構成される結合部位を含む。
ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、ＩＲＥＳ要素又はタンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、若しくは細胞標的に結合するように構成される結合部位を除いて、環状ポリリボヌクレオチド全体にわたって、修飾ヌクレオチド、例えば、５’メチルシチジン及びプソイドウリジンを有する。これらの場合、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチドと比較して、より低い免疫原性を有する。これらの場合、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、５’メチルシチジン及びプソイドウリジンを含まない対応する環状ポリリボヌクレオチドを比較して、より低い免疫原性を有する。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチドより、少なくとも約１．１、１．２、１．３、１．５、１．６、１．８、２、２．２、２．５、２．８、３、３．２、３．３、３．５、３．８、４．０、４．２、４．５、４．８、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、若しくは１０．０倍低い免疫原性を有する。ある実施形態において、本明細書に記載される免疫原性は、ＲＩＧ－Ｉ、ＴＬＲ－３、ＴＬＲ－７、ＴＬＲ－８、ＭＤＡ－５、ＬＧＰ－２、ＯＡＳ、ＯＡＳＬ、ＰＫＲ、及びＩＦＮ－βのうちの少なくとも１つの発現又はシグナル伝達又は活性化によって評価される。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチド、例えば、５’メチルシチジン及びプソイドウリジンを含まない対応する環状ポリリボヌクレオチドより長い半減期を有する。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチドより、少なくとも約１．１、１．２、１．３、１．５、１．６、１．８、２、２．２、２．５、２．８、３、３．２、３．３、３．５、３．８、４．０、４．２、４．５、４．８、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、又は１０．０倍長い、より長い半減期を有する。ある実施形態において、半減期は、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド又は対応する環状ポリリボヌクレオチドを、細胞内に導入し、細胞の内部に導入されたハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド又は対応する環状ポリリボヌクレオチドのレベルを測定することによって測定される。
修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含み得る。本明細書に記載されるハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、連続非修飾ヌクレオチド及び少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む第１の部分を含み得る。修飾ヌクレオチドは、第１の部分の外部にある。修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）の修飾ポリリボヌクレオチドは、本明細書に記載されるように示される天然非修飾ヌクレオチドアデノシン（Ａ）、ウリジン（Ｕ）、グアニン（Ｇ）、シチジン（Ｃ）などの、非修飾天然リボヌクレオチドの化学組成物に対する１つ以上の化学修飾を有する類似体又は誘導体であり得る。修飾リボヌクレオチドの化学修飾は、糖、核酸塩基、又はヌクレオシド間結合などの、リボヌクレオチドのいずれか１つ以上の官能基に対する（例えば、連結するホスフェート／ホスホジエステル結合／ホスホジエステル骨格に対する）修飾であり得る。
ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、１つ以上の転写後修飾（例えば、キャッピング、切断、ポリアデニル化、スプライシング、ポリ－Ａ配列、メチル化、アシル化、リン酸化、リジン及びアルギニン残基のメチル化、アセチル化並びにチオール基及びチロシン残基のニトロシル化など）を含む。１つ以上の転写後修飾は、ＲＮＡにおいて同定された１００を超える様々なヌクレオシド修飾のいずれかなどの任意の転写後修飾であり得る（Ｒｏｚｅｎｓｋｉ，Ｊ，Ｃｒａｉｎ，Ｐ，ａｎｄ ＭｃＣｌｏｓｋｅｙ，Ｊ．（１９９９）。Ｔｈｅ ＲＮＡ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｄａｔａｂａｓｅ：１９９９ ｕｐｄａｔｅ．Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２７：１９６－１９７）。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、ピリジン－４－オンリボヌクレオシド、５－アザ－ウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオウリジン、４－チオ－プソイドウリジン、２－チオ－プソイドウリジン、５－ヒドロキシウリジン、３－メチルウリジン、５－カルボキシメチル－ウリジン、１－カルボキシメチル－プソイドウリジン、５－プロピニル－ウリジン、１－プロピニル－プソイドウリジン、５－タウリノメチルウリジン、１－タウリノメチル－プソイドウリジン、５－タウリノメチル－２－チオ－ウリジン、１－タウリノメチル－４－チオ－ウリジン、５－メチル－ウリジン、１－メチル－プソイドウリジン、４－チオ－１－メチル－プソイドウリジン、２－チオ－１－メチル－プソイドウリジン、１－メチル－１－デアザ－プソイドウリジン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－プソイドウリジン、ジヒドロウリジン、ジヒドロプソイドウリジン、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－ジヒドロプソイドウリジン、２－メトキシウリジン、２－メトキシ－４－チオ－ウリジン、４－メトキシ－プソイドウリジン、及び４－メトキシ－２－チオ－プソイドウリジンからなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオシドを含む。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチドは、５－アザ－シチジン、プソイドシチジン、３－メチル－シチジン、Ｎ４－アセチルシチジン、５－ホルミルシチジン、Ｎ４－メチルシチジン、５－ヒドロキシメチルシチジン、１－メチル－プソイドシチジン、ピロロ－シチジン、ピロロ－プソイドシチジン、２－チオ－シチジン、２－チオ－５－メチル－シチジン、４－チオ－プソイドシチジン、４－チオ－１－メチル－プソイドシチジン、４－チオ－１－メチル－１－デアザ－プソイドシチジン、１－メチル－１－デアザ－プソイドシチジン、ゼブラリン、５－アザ－ゼブラリン、５－メチル－ゼブラリン、５－アザ－２－チオ－ゼブラリン、２－チオ－ゼブラリン、２－メトキシ－シチジン、２－メトキシ－５－メチル－シチジン、４－メトキシ－プソイドシチジン、及び４－メトキシ－１－メチル－プソイドシチジンからなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオシドを含む。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチドは、２－アミノプリン、２、６－ジアミノプリン、７－デアザ－アデニン、７－デアザ－８－アザ－アデニン、７－デアザ－２－アミノプリン、７－デアザ－８－アザ－２－アミノプリン、７－デアザ－２，６－ジアミノプリン、７－デアザ－８－アザ－２，６－ジアミノプリン、１－メチルアデノシン、Ｎ６－メチルアデノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデノシン、Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、Ｎ６－グリシニルカルバモイル（ｇｌｙｃｉｎｙｌｃａｒｂａｍｏｙｌ）アデノシン、Ｎ６－トレオニルカルバモイルアデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－トレオニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６，Ｎ６－ジメチルアデノシン、７－メチルアデニン、２－メチルチオ－アデニン、及び２－メトキシ－アデニンからなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオシドを含む。ある実施形態において、ｍＲＮＡは、イノシン、１－メチル－イノシン、ワイオシン、ワイブトシン、７－デアザ－グアノシン、７－デアザ－８－アザ－グアノシン、６－チオ－グアノシン、６－チオ－７－デアザ－グアノシン、６－チオ－７－デアザ－８－アザ－グアノシン、７－メチル－グアノシン、６－チオ－７－メチル－グアノシン、７－メチルイノシン、６－メトキシ－グアノシン、１－メチルグアノシン、Ｎ２－メチルグアノシン、Ｎ２，Ｎ２－ジメチルグアノシン、８－オキソ－グアノシン、７－メチル－８－オキソ－グアノシン、１－メチル－６－チオ－グアノシン、Ｎ２－メチル－６－チオ－グアノシン、及びＮ２，Ｎ２－ジメチル－６－チオ－グアノシンからなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオシドを含む。
ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、Ｎ（６）メチルアデノシン（ｍ６Ａ）、５’－メチルシチジン（５ｍＣ）、プソイドウリジン、又はＮ１－メチル－プソイドウリジン、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－Ｏ－ＭＯＥ）、２’－Ｏ－アミノプロピル、２’－デオキシ、Ｔ－デオキシ－２’－フルオロ、２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＯＥ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノプロピル（２’－Ｏ－ＤＭＡＰ）、Ｔ－Ｏ－ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）、２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）、ロックト核酸（ＬＮＡ）、エチレン核酸（ＥＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、１’，５’－アンヒドロヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、モルホリノ、メチルホスホネートヌクレオチド、チオホスホネートヌクレオチド、及び２’－フルオロＮ３－Ｐ５’－ホスホロアミダイトからなる群から選択される少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、参照により本明細書に援用される、Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｗ．Ｖ．，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１６ Ｊｕｎ１７；３５２（６２９２）：１４０８－１４１２において特定されるものなど、又はこの文献中のものなどの、当業者によって公知のヌクレオチド修飾を含む。
修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、糖、核酸塩基、又はヌクレオシド間結合などに対する（例えば、連結するホスフェート／ホスホジエステル結合／ホスホジエステル骨格に対する）任意の有用な修飾を含み得る。ピリミジン核酸塩基の１つ以上の原子は、任意選択的に置換されるアミノ、任意選択的に置換されるチオール、任意選択的に置換されるアルキル（例えば、メチル若しくはエチル）、又はハロ（例えば、クロロ若しくはフルオロ）で置き換えられ得るか又は置換され得る。特定の実施形態において、修飾（例えば、１つ以上の修飾）は、糖及びヌクレオシド間結合のそれぞれに存在する。修飾は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックト核酸（ＬＮＡ）又はそのハイブリッド）へのリボ核酸（ＲＮＡ）の修飾であり得る。さらなる修飾が本明細書に記載される。
ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、翻訳効率を高めるために、少なくとも１つのＮ（６）メチルアデノシン（ｍ６Ａ）修飾を含む。ある実施形態において、Ｎ（６）メチルアデノシン（ｍ６Ａ）修飾は、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）の免疫原性を低下又は減少させ得る。
ある実施形態において、修飾は、化学修飾又は細胞誘導性修飾を含み得る。例えば、細胞内ＲＮＡ修飾のいくつかの非限定的な例は、Ｎａｔ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，２０１７，１８：２０２－２１０からの“ＲＮＡ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｃｏｏｐｅｒａｔｅ ｔｏ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ”においてＬｅｗｉｓ及びＰａｎによって記載されている。
「プソイドウリジン」は、別の実施形態において、ｍ１ａｃｐ３Ψ（１－メチル－３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）プソイドウリジンを指す。別の実施形態において、この用語は、ｍ１Ψ（１－メチルプソイドウリジン）を指す。別の実施形態において、この用語は、Ψｍ（２’－Ｏ－メチルプソイドウリジンを指す。別の実施形態において、この用語は、ｍ５Ｄ（５－メチルジヒドロウリジン）を指す。別の実施形態において、この用語は、ｍ３Ψ（３－メチルプソイドウリジン）を指す。別の実施形態において、この用語は、さらに修飾されないプソイドウリジン部分を指す。別の実施形態において、この用語は、上記のプソイドウリジンのいずれかのモノホスフェート、ジホスフェート、又はトリホスフェートを指す。別の実施形態において、この用語は、当該技術分野において公知の任意の他のプソイドウリジンを指す。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドのリボヌクレオチドに対する化学修飾は、免疫回避を促進し得る。修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、参照により本明細書に援用される、“Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”，Ｂｅａｕｃａｇｅ、Ｓ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（Ｅｄｓ．），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳＡに記載されているものなど、当該技術分野において十分に確立された方法によって合成及び／又は修飾され得る。修飾としては、例えば、末端修飾、例えば、５’末端修飾（リン酸化（一－、二－及び三－リン酸化）、共役、反転結合など）、３’末端修飾（共役、ＤＮＡヌクレオチド、反転結合など）、塩基修飾（例えば、安定化塩基、不安定化塩基、又は広いレパートリーのパートナーと塩基対合する塩基による置換）、塩基の除去（脱塩基ヌクレオチド）、又は共役塩基が挙げられる。修飾リボヌクレオチド塩基は、５－メチルシチジン及びプソイドウリジンも含み得る。ある実施形態において、塩基修飾は、環状ポリリボヌクレオチドのいくつかの機能的効果を挙げると、発現、免疫応答、安定性、細胞内局在化を調節し得る。ある実施形態において、修飾としては、双直交（ｂｉ－ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ）ヌクレオチド、例えば非天然塩基が挙げられる。例えば、参照により本明細書に援用されるＫｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ，Ｃｈｅｍ Ｃｏｍｍｕｎ（Ｃａｍｂ），２０１７，５３：１２３０９，ＤＯＩ：１０．１０３９／ｃ７ｃｃ０６６６１ａを参照されたい。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの１つ以上のリボヌクレオチドの糖修飾（例えば、２’位若しくは４’位における）又は糖の置換、並びに骨格修飾は、ホスホジエステル結合の修飾又は置換を含む。修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）の具体例としては、限定はされないが、ホスホジエステル結合の修飾又は置換を含む、ヌクレオシド間修飾などの修飾骨格又は非天然ヌクレオシド間結合を含む環状ポリリボヌクレオチドが挙げられる。修飾骨格を有する修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）としては、中でも特に、骨格中にリン原子を有さないものが挙げられる。本出願の趣旨では、且つ当該技術分野において時々参照されるように、それらのヌクレオシド間骨格中にリン原子を有さない修飾ＲＮＡも、オリゴヌクレオシドであると考えられ得る。特定の実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、そのヌクレオシド間骨格中にリン原子を有するリボヌクレオチドを含む。
修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）骨格としては、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’－アルキレンホスホネート及びキラルホスホネートなどのメチル及び他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’－アミノホスホロアミデート及びアミノアルキルホスホロアミデートなどのホスホロアミデート、チオノホスホロアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、及びこれらの通常の３’－５’結合、２’－５’連結類似体を有するボラノホスフェート、及び逆極性を有するものが挙げられ、ここで、ヌクレオシド単位の隣接する対が連結される（３’－５’を５’－３’に又は２’－５’を５’－２’に）。様々な塩、混合塩及び遊離酸形態も含まれる。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、負の電荷又は正の電荷を帯び得る。
修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）に組み込まれ得る修飾ヌクレオチドは、ヌクレオシド間結合（例えば、ホスフェート骨格）上で修飾され得る。本明細書において、ポリヌクレオチド骨格に関して、「ホスフェート」及び「ホスホジエステル」という語句は、同義的に使用される。骨格リン酸基は、酸素原子の１つ以上を様々な置換基で置換することによって修飾され得る。さらに、修飾ヌクレオシド及びヌクレオチドは、本明細書に記載される別のヌクレオシド間結合による非修飾ホスフェート部分の大規模な置換を含み得る。修飾リン酸基の例としては、限定はされないが、ホスホロチオエート、ホスホロセレネート、ボラノホスフェート、ボラノリン酸エステル、水素ホスホネート、ホスホロアミデート、ホスホロジアミデート、アルキル又はアリールホスホネート、及びホスホトリエステルが挙げられる。ホスホロジチオエートは、両方の非連結酸素が硫黄で置換されている。ホスフェートリンカーは、窒素（架橋ホスホロアミデート）、硫黄（架橋ホスホロチオエート）、及び炭素（架橋メチレン－ホスホネート）による連結酸素の置換によっても修飾され得る。
非天然ホスホロチオエート骨格結合によってＲＮＡ及びＤＮＡポリマーに安定性を与えるためにａ－チオ置換ホスフェート部分が提供される。ホスホロチオエートＤＮＡ及びＲＮＡは、増加したヌクレアーゼ耐性、したがって細胞環境内でのより長い半減期を有する。環状ポリリボヌクレオチドに連結されたホスホロチオエートは、細胞の自然免疫分子のより弱い結合／活性化によって自然免疫応答を低減すると予測される。
特定の実施形態において、修飾ヌクレオシドとしては、α－チオ－ヌクレオシド（例えば、５’－０－（１－チオホスフェート）－アデノシン、５’－０－（１－チオホスフェート）－シチジン（ａ－チオ－シチジン）、５’－０－（１－チオホスフェート）－グアノシン、５’－０－（１－チオホスフェート）－ウリジン、又は５’－０－（１－チオホスフェート）－プソイドウリジン）が挙げられる。
リン原子を含有しないヌクレオシド間結合を含む、本発明に従って用いられ得る他のヌクレオシド間結合が本明細書に記載される。
ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、１つ以上の細胞毒性ヌクレオシドを含み得る。例えば、細胞毒性ヌクレオシドは、二機能性修飾などの環状ポリリボヌクレオチドに組み込まれ得る。細胞毒性ヌクレオシドとしては、限定はされないが、アデノシンアラビノシド、５－アザシチジン、４’－チオ－アラシチジン、シクロペンテニルシトシン、クラドリビン、クロファラビン、シタラビン、シトシンアラビノシド、１－（２－Ｃ－シアノ－２－デオキシ－β－Ｄ－アラビノ－ペントフラノシル）－シトシン、デシタビン、５－フルオロウラシル、フルダラビン、フロクスウリジン、ゲムシタビン、テガフール及びウラシルの組合せ、テガフール（（ＲＳ）－５－フルオロ－１－（テトラヒドロフラン－２－イル）ピリミジン－２，４（ｌＨ，３Ｈ）－ジオン）、トロキサシタビン、テザシタビン、２’－デオキシ－２’－メチリデンシチジン（ＤＭＤＣ）、及び６－メルカプトプリンが挙げられる。さらなる例としては、フルダラビンホスフェート、Ｎ４－ベヘノイル－１－β－Ｄ－アラビノフラノシルシトシン、Ｎ４－オクタデシル－１－β－Ｄ－アラビノフラノシルシトシン、Ｎ４－パルミトイル－１－（２－Ｃ－シアノ－２－デオキシ－β－Ｄ－アラビノ－ペントフラノシル）シトシン、及びＰ－４０５５（シタラビン５’－エライジン酸エステル）が挙げられる。
修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、分子の全長に沿って均一に修飾されても又はされなくてもよい。例えば、ヌクレオチドの１つ以上若しくは全てのタイプ（例えば、天然ヌクレオチド、プリン又はピリミジン、又はＡ、Ｇ、Ｕ、Ｃ、Ｉ、ｐＵのいずれか１つ以上若しくは全て）は、環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）において、又はその所与の所定の配列領域において均一に修飾されても又はされなくてもよい。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、プソイドウリジンを含む。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、イノシンを含み、これは、免疫系が、ウイルスＲＮＡに対して内在性であるものとして環状ポリリボヌクレオチドを特徴付けることを促進し得る。イノシンの組み込みは、向上したＲＮＡ安定性／減少した分解も媒介し得る。例えば、全体が参照により援用されるＹｕ，Ｚ．ｅｔ ａｌ．（２０１５）ＲＮＡ ｅｄｉｔｉｎｇ ｂｙ ＡＤＡＲ１ ｍａｒｋｓ ｄｓＲＮＡ ａｓ “ｓｅｌｆ”．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２５，１２８３－１２８４を参照されたい。
ある実施形態において、その所与の配列領域（例えば、第１の部分又は非修飾部分でない）中のハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド中の全てのヌクレオチドが修飾される。ある実施形態において、修飾としては、発現を増大し得るか及び／又は免疫応答を弱め得るｍ６Ａ；免疫応答を弱め得るイノシン；ＲＮＡ安定性、又は翻訳の読み過ごしを増大し得るプソイドウリジン（スタガー要素）、安定性を増大し得るか、及び／又は免疫応答を弱め得るｍ５Ｃ；及び細胞内転座（例えば、核局在化）を促進する２，２，７－トリメチルグアノシンが挙げられる。
様々な糖修飾、ヌクレオチド修飾、及び／又はヌクレオシド間結合（例えば、骨格構造）が、環状ポリリボヌクレオチド中の様々な位置に存在し得る。当業者は、修飾環状ポリリボヌクレオチドの機能が実質的に低下されないように、ヌクレオチド類似体又は他の修飾が、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）の任意の位置に位置し得ることを理解するであろう。修飾は、ノンコーディング領域の修飾でもあり得る。修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、約１％～約１００％の修飾ヌクレオチド（全ヌクレオチド含量に対して、又はヌクレオチドの１つ以上のタイプ、すなわち、Ａ、Ｇ、Ｕ若しくはＣのいずれか１つ以上に対して）又はその間の任意のパーセンテージ（例えば、１％～２０％＞、１％～２５％、１％～５０％、１％～６０％、１％～７０％、１％～８０％、１％～９０％、１％～９５％、１０％～２０％、１０％～２５％、１０％～５０％、１０％～６０％、１０％～７０％、１０％～８０％、１０％～９０％、１０％～９５％、１０％～１００％、２０％～２５％、２０％～５０％、２０％～６０％、２０％～７０％、２０％～８０％、２０％～９０％、２０％～９５％、２０％～１００％、５０％～６０％、５０％～７０％、５０％～８０％、５０％～９０％、５０％～９５％、５０％～１００％、７０％～８０％、７０％～９０％、７０％～９５％、７０％～１００％、８０％～９０％、８０％～９５％、８０％～１００％、９０％～９５％、９０％～１００％、及び９５％～１００％）を含み得る。
ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、完全に修飾された環状ポリリボヌクレオチド又は完全修飾環状ポリリボヌクレオチドであり、全て若しくは実質的に全ての修飾アデノシン残基、全て若しくは実質的に全ての修飾ウリジン残基、全て若しくは実質的に全ての修飾グアニン残基、全て若しくは実質的に全ての修飾シチジン残基、又はそれらの任意の組合せを含む。ある実施形態において、環状ＲＮＡは、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、又は８０％の修飾ヌクレオチドを含み得る。ある実施形態において、完全修飾環状ＲＮＡは、実質的に全て（例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、若しくは９９％、又は約１００％超）の修飾ヌクレオチドを含む。ある実施形態において、本明細書において提供される修飾環状ポリリボヌクレオチドは、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドである。ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを有し得、連続非修飾ヌクレオチドの一部（例えば、第１の部分／非修飾部分）を有し得る。ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドのこの非修飾部分は、少なくとも約５、１０、１５、若しくは２０連続非修飾ヌクレオチド、又はそれらの間の任意の数を有し得る。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドの非修飾部分は、少なくとも約３０、４０、４０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１８０、２００、２２０、２５０、２８０、３００、３２０、３５０、３８０、４００、４２０、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、若しくは１０００連続非修飾ヌクレオチド、又はそれらの間の任意の数を有する。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又はそれ以上の非修飾部分を有する。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、３０、４０、５０、７０、８０、１００、１２０、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、又はそれ以上の修飾ヌクレオチドを有する。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１％、２％、５％、７％、８％、１０％、１２％、１５％、１８％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は９９％であるが、１００％未満の、修飾されたヌクレオチドを有する。ある実施形態において、非修飾部分は、結合部位を含む。ある実施形態において、非修飾部分は、ペプチド、タンパク質、生体分子、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は細胞標的に結合するように構成される結合部位を含む。ある実施形態において、非修飾部分は、ＩＲＥＳを含む。
ある場合において、本明細書に記載されるハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、完全に修飾された以外は同じである対応する環状ポリリボヌクレオチドと比較して、同様の免疫原性を有する。例えば、そのＩＲＥＳ要素を除いて全体にわたって５’メチルシチジン及びプソイドウリジンを有するハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、全体にわたって５’メチルシチジン及びプソイドウリジンを有し、且つ非修飾シチジン及びウリジンを有さない以外は同じである対応する環状ポリリボヌクレオチドと比較して、同様の免疫原性又はより低い免疫原性を有し得る。ある実施形態において、そのＩＲＥＳ要素を除いて全体にわたって５’メチルシチジン及びプソイドウリジンを有するハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、全体にわたって５’メチルシチジン及びプソイドウリジンを有し、且つ非修飾シチジン及びウリジンを有さない以外は同じである対応する環状ポリリボヌクレオチドの翻訳効率と同様であるか又はそれより高い翻訳効率を有する。
ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、非修飾である、例えば、修飾ヌクレオチドを有さない結合部位を有する。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、非修飾である、例えば、修飾ヌクレオチドを有さない、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は細胞標的に結合するように構成される結合部位を有する。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、非修飾である、例えば、修飾ヌクレオチドを有さない内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を有する。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）中の５％以下のヌクレオチドが、修飾ヌクレオチドである。ある実施形態において、ＩＲＥＳ中のヌクレオチドが修飾されていない。ある実施形態において、ＩＲＥＳ中の０％、１％、２％、３％、４％、又は５％以下のヌクレオチドが修飾される。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、結合部位を除いて全体にわたって修飾ヌクレオチドを有する。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、ペプチド、タンパク質、生体分子、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は細胞標的に結合するように構成される結合部位を除いて全体にわたって修飾ヌクレオチドを有する。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、ＩＲＥＳ要素を除いて全体にわたって修飾ヌクレオチドを有する。他の実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、ＩＲＥＳ要素及び１つ以上の他の部分を除いて全体にわたって修飾ヌクレオチドを有する。特定の理論によって制約されるのを望むものではないが、非修飾ＩＲＥＳ要素は、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドに、翻訳の能力を与え、例えば、修飾ヌクレオチドを有さない対応する環状ポリリボヌクレオチドと同様であるか又はそれより高い、１つ以上の発現配列についての翻訳効率を有するようにする。
ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、少なくとも、線状同等物、例えば、線状発現配列、又は線状環状ポリリボヌクレオチドのものの半減期を有する。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、線状同等物のものより増加した半減期を有する。ある実施形態において、半減期は、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、又はそれ以上増加される。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、少なくとも約１時間～約３０日間、又は少なくとも約２時間、６時間、１２時間、１８時間、２４時間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、２０日間、２１日間、２２日間、２３日間、２４日間、２５日間、２６日間、２７日間、２８日間、２９日間、３０日間、６０日間、若しくはそれ以上又はそれらの間の任意の時間にわたって、細胞内での半減期又は持続性を有する。特定の実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、約１０分間以下～約７日間、又は約１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２４時間、３６時間、４８時間、６０時間、７２時間、４日間、５日間、６日間、７日間以下、若しくはそれらの間の任意の時間にわたって、細胞内での半減期又は持続性を有する。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、細胞が分割している間、細胞内での半減期又は持続性を有する。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、分割後の細胞内での半減期又は持続性を有する。特定の実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、約１０分間超～約３０日間、又は少なくとも約１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、２４時間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、２０日間、２１日間、２２日間、２３日間、２４日間、２５日間、２６日間、２７日間、２８日間、２９日間、３０日間、６０日間、若しくはそれ以上又はそれらの間の任意の時間にわたって、分割している細胞内での半減期又は持続性を有する。
ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、１つ以上の発現配列を含み、インビボで対象の細胞内における持続的発現のために構成される。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、後の時点での細胞内における１つ以上の発現配列の発現が前の時点と等しいか又はそれより多いように構成される。このような実施形態において、１つ以上の発現配列の発現は、比較的安定したレベルに維持され得るか、又は時間と共に増加し得る。発現配列の発現は、長期間にわたって比較的に安定的であり得る。例えば、ある場合において、少なくとも７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２３日、又はそれ以上の期間にわたる細胞内における１つ以上の発現配列の発現は、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、又は５％減少しない。ある場合において、ある場合において、細胞内における１つ以上の発現配列の発現は、少なくとも７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２３日、又はそれ以上にわたって、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、又は５％を超えて変化しないレベルに維持される。
ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、哺乳動物、例えばヒトにおいて非免疫原性である。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、水産養殖動物（魚、カニ、エビ、カキなど）に由来する細胞、哺乳動物細胞、例えばペット若しくは動物園の動物（ネコ、イヌ、トカゲ、鳥類、ライオン、トラ及びクマなど）に由来する細胞、家畜若しくは使役動物（ウマ、ウシ、ブタ、ニワトリなど）に由来する細胞、ヒト細胞、培養細胞、初代細胞若しくは細胞株、幹細胞、前駆細胞、分化した細胞、胚細胞、癌細胞（例えば、腫瘍形成性、転移性）、非腫瘍形成性細胞（正常細胞）、胎児細胞、胚細胞、成体細胞、有糸分裂細胞、非有糸分裂細胞、又はそれらの任意の組合せにおいて複製することが可能であるか又は複製する。ある実施形態において、本発明は、本明細書に記載される修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）を含む細胞を含み、ここで、細胞は、水産養殖動物（魚、カニ、エビ、カキなど）に由来する細胞、哺乳動物細胞、例えばペット若しくは動物園の動物（ネコ、イヌ、トカゲ、鳥類、ライオン、トラ、クマなど）に由来する細胞、家畜若しくは使役動物（ウマ、ウシ、ブタ、ニワトリなど）に由来する細胞、ヒト細胞、培養細胞、初代細胞若しくは細胞株、幹細胞、前駆細胞、分化した細胞、生殖細胞、癌細胞（例えば、腫瘍形成性、転移性）、非腫瘍形成性細胞（正常細胞）、胎児細胞、胚細胞、成体細胞、有糸分裂細胞、非有糸分裂細胞又はそれらの任意の組合せである。ある実施形態において、細胞は、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）を含むように改変される。
ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、細胞機能を、例えば一時的に又は長期間調節する。特定の実施形態において、少なくとも約１時間～約３０日間又は少なくとも約２時間、６時間、１２時間、１８時間、２４時間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、２０日間、２１日間、２２日間、２３日間、２４日間、２５日間、２６日間、２７日間、２８日間、２９日間、３０日間、６０日間若しくはそれを超える時間又はそれらの間の任意の時間にわたって持続する、調節などの細胞機能は、安定して変化される。特定の実施形態において、例えば約３０分間以下～約７日間又は約１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２４時間、３６時間、４８時間、６０時間、７２時間、４日間、５日間、６日間、７日間以下又はそれらの間の任意の時間にわたって持続する、調節などの細胞機能は、一時的に変化される。
ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、少なくとも約２０ヌクレオチド、少なくとも約３０ヌクレオチド、少なくとも約４０ヌクレオチド、少なくとも約５０ヌクレオチド、少なくとも約７５ヌクレオチド、少なくとも約１００ヌクレオチド、少なくとも約２００ヌクレオチド、少なくとも約３００ヌクレオチド、少なくとも約４００ヌクレオチド、少なくとも約５００ヌクレオチド、少なくとも約１，０００ヌクレオチド、少なくとも約２，０００ヌクレオチド、少なくとも約５，０００ヌクレオチド、少なくとも約６，０００ヌクレオチド、少なくとも約７，０００ヌクレオチド、少なくとも約８，０００ヌクレオチド、少なくとも約９，０００ヌクレオチド、少なくとも約１０，０００ヌクレオチド、少なくとも約１２，０００ヌクレオチド、少なくとも約１４，０００ヌクレオチド、少なくとも約１５，０００ヌクレオチド、少なくとも約１６，０００ヌクレオチド、少なくとも約１７，０００ヌクレオチド、少なくとも約１８，０００ヌクレオチド、少なくとも約１９，０００ヌクレオチド又は少なくとも約２０，０００ヌクレオチドである。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、リボソームのための結合部位に対応するのに十分なサイズのものであり得る。当業者は、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）の最大サイズが、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）を生成し、且つ／又は修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）を使用する技術的制約の範囲内である程度の大きさであり得ることを理解することができる。理論によって制約されるものではないが、ＲＮＡの複数のセグメントが、ＤＮＡ並びにＲＮＡの「列」を生成するようにアニールされたそれらの５’及び３’遊離末端（それらは、最終的に、１つの５’遊離末端及び１つの３’遊離末端のみが残るときに環状化され得る）から生成され得ることが可能である。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）の最大サイズは、ＲＮＡをパッケージングと、標的に送達する能力によって制限され得る。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）のサイズは、有用なポリペプチドをコードするのに十分な長さであり、したがって少なくとも２０，０００ヌクレオチド、少なくとも１５，０００ヌクレオチド、少なくとも１０，０００ヌクレオチド、少なくとも７，５００ヌクレオチド又は少なくとも５，０００ヌクレオチド、少なくとも４，０００ヌクレオチド、少なくとも３，０００ヌクレオチド、少なくとも２，０００ヌクレオチド、少なくとも１，０００ヌクレオチド、少なくとも５００ヌクレオチド、少なくとも４００ヌクレオチド、少なくとも３００ヌクレオチド、少なくとも２００ヌクレオチド、少なくとも１００ヌクレオチドの長さが有用であり得る。
ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、本明細書の他の箇所に記載される１つ以上の要素を含む。ある実施形態において、要素は、スペーサー配列又はリンカーによって互いに隔てられ得る。ある実施形態において、要素は、１リボヌクレオチド、２ヌクレオチド、約５ヌクレオチド、約１０ヌクレオチド、約１５ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド、約６０ヌクレオチド、約８０ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド、約１５０ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド、約２５０ヌクレオチド、約３００ヌクレオチド、約４００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド、約６００ヌクレオチド、約７００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド、約９００ヌクレオチド、約１０００ヌクレオチド、最大で約１ｋｂ、少なくとも約１０００ヌクレオチド、それらの間のヌクレオチドの任意の量だけ互いに隔てられ得る。ある実施形態において、１つ以上の要素は、例えば、スペーサー要素を欠いて、互いに連続している。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド中の１つ以上の要素は、立体配座柔軟性がある。ある実施形態において、立体配座柔軟性は、配列が二次構造を実質的に含まないことによる。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、本明細書に記載される１つ以上の所望の機能又は特性に対応する、例えば、リボソームのための結合部位、例えば、翻訳、例えば、ローリングサークル型翻訳に対応する二次又は三次構造を含む。
ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、特定の配列特性を含む。例えば、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、特定のヌクレオチド組成物を含み得る。あるこのような実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、１つ以上のプリンリッチ領域（アデニン又はグアノシン）を含み得る。あるこのような実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、１つ以上のプリンリッチ領域（アデニン又はグアノシン）を含み得る。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、１つ以上のＡＵリッチ領域又は要素（ＡＲＥ）を含み得る。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、１つ以上のアデニンリッチ領域を含み得る。
ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、本明細書の他の箇所に記載される１つ以上の反復要素を含み得る。
ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、本明細書の他の箇所に記載される１つ以上の修飾を含む。
修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、参照配列に対して１つ以上の置換、挿入及び／又は付加、欠失、及び共有結合修飾を含み得、特に親ポリリボヌクレオチドが本発明の範囲内に含まれる。
発現配列
ペプチド又はポリペプチド
ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、ペプチド又はポリペプチドをコードする少なくとも１つの発現配列を含む。このようなペプチドとしては、限定はされないが、低分子ペプチド、ペプチド模倣物（例えば、ペプトイド）、アミノ酸及びアミノ酸類似体が挙げられる。ペプチドは、直鎖状又は分枝鎖状であり得る。このようなペプチドは、１モル当たり約５，０００グラム未満の分子量、１モル当たり約２，０００グラム未満の分子量、１モル当たり約１，０００グラム未満の分子量、１モル当たり約５００グラム未満の分子量並びにこのような化合物の塩、エステル及び他の薬学的に許容される形態を有し得る。このようなペプチドとしては、限定はされないが、神経伝達物質、ホルモン、薬剤、毒素、ウイルス若しくは微生物粒子、合成分子及びそれらのアゴニスト又はアンタゴニストが挙げられる。
ポリペプチドは、直鎖状又は分枝鎖状であり得る。ポリペプチドは、約５～約４０，０００アミノ酸、約１５～約３５，０００アミノ酸、約２０～約３０，０００アミノ酸、約２５～約２５，０００アミノ酸、約５０～約２０，０００アミノ酸、約１００～約１５，０００アミノ酸、約２００～約１０，０００アミノ酸、約５００～約５，０００アミノ酸、約１，０００～約２，５００アミノ酸又はそれらの間の任意の範囲の長さを有し得る。ある実施形態において、ポリペプチドは、約４０，０００未満のアミノ酸、約３５，０００未満のアミノ酸、約３０，０００未満のアミノ酸、約２５，０００未満のアミノ酸、約２０，０００未満のアミノ酸、約１５，０００未満のアミノ酸、約１０，０００未満のアミノ酸、約９，０００未満のアミノ酸、約８，０００未満のアミノ酸、約７，０００未満のアミノ酸、約６，０００未満のアミノ酸、約５，０００未満のアミノ酸、約４，０００未満のアミノ酸、約３，０００未満のアミノ酸、約２，５００未満のアミノ酸、約２，０００未満のアミノ酸、約１，５００未満のアミノ酸、約１，０００未満のアミノ酸、約９００未満のアミノ酸、約８００未満のアミノ酸、約７００未満のアミノ酸、約６００未満のアミノ酸、約５００未満のアミノ酸、約４００未満のアミノ酸、約３００未満のアミノ酸又はそれを下回る長さを有し、有用であり得る。
ペプチド又はポリペプチドのいくつかの例としては、限定はされないが、蛍光タグ又はマーカー、抗原、ペプチド治療薬、天然生物活性ペプチドに由来する合成若しくはアナログペプチド、アゴニスト若しくはアンタゴニストペプチド、抗菌ペプチド、孔形成ペプチド、二環式ペプチド、標的化若しくは細胞毒性ペプチド、分解若しくは自壊性ペプチド及び複数の分解若しくは自壊性ペプチドが挙げられる。本明細書に記載される本発明において有用なペプチドとしては、抗原結合ペプチド、例えば抗原結合抗体又は抗体様フラグメント、例えば一本鎖抗体、ナノボディも挙げられる（例えば、Ｓｔｅｅｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．２０１６．Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ ａｓ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：ｂｉｇ ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ ｆｏｒ ｓｍａｌｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙ：２１（７）：１０７６－１１３を参照されたい）。このような抗原結合ペプチドは、細胞質抗原、核抗原、小器官内抗原に結合し得る。
ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、１つ以上のＲＮＡ発現配列を含み、これらは、それぞれポリペプチドをコードし得る。ポリペプチドは、かなりの量で生成され得る。したがって、ポリペプチドは、生成され得る任意のタンパク質分子であり得る。ポリペプチドは、細胞から分泌されるか、又は細胞の細胞質、核若しくは膜区画に限局され得るポリペプチドであり得る。いくつかのポリペプチドとしては、限定はされないが、ウイルスエンベロープタンパク質の少なくとも一部、代謝調節酵素（例えば、脂質又はステロイド産生を調節する）、抗原、トレラゲン、サイトカイン、毒素、非存在が疾患に関連する酵素、及び切断されるまで動物内（例えば、動物の腸内）で活性でないポリペプチド、及びホルモンが挙げられる。
ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、タンパク質、例えば治療用タンパク質をコードする発現配列を含む。ある実施形態において、本明細書に開示される修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）から発現され得る治療用タンパク質は、酸化防止活性、結合、積み荷受容体活性、触媒活性、分子担体活性、分子機能調節剤、分子トランスデューサ活性、栄養貯留活性、タンパク質タグ、構造分子活性、毒素活性、転写調節活性、翻訳調節活性又は輸送活性を有する。治療用タンパク質のいくつかの例としては、限定はされないが、酵素補充タンパク質、補充用のタンパク質、タンパク質ワクチン接種、抗原（例えば腫瘍抗原、ウイルス、細菌）、ホルモン、サイトカイン、抗体、免疫療法（例えば、癌）、リプログラミング／分化転換因子、転写因子、キメラ抗原受容体、トランスポザーゼ又はヌクレアーゼ、免疫エフェクター（例えば、免疫応答／シグナルに対する感受性に影響を与える）、調節された死エフェクタータンパク質（例えば、アポトーシス又は壊死の誘導因子）、腫瘍の非溶解性阻害剤（例えば、癌タンパク質の阻害剤）、エピジェネティック修飾剤、エピジェネティック酵素、転写因子、ＤＮＡ又はタンパク質修飾酵素、ＤＮＡ挿入剤、排出ポンプ阻害剤、核内受容体活性化剤若しくは阻害剤、プロテアソーム阻害剤、酵素用の競合阻害剤、タンパク質合成エフェクター若しくは阻害剤、ヌクレアーゼ、タンパク質フラグメント若しくはドメイン、リガンド若しくは受容体及びＣＲＩＳＰＲシステム若しくはその構成要素が挙げられる。
ある実施形態において、本明細書に開示される修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）から発現され得る例示的なタンパク質としては、ヒトタンパク質、例えば受容体結合タンパク質、ホルモン、成長因子、成長因子受容体モジュレータ及び再生タンパク質（例えば、増殖及び分化に関与しているタンパク質、例えば創傷治癒のための治療用タンパク質）が挙げられる。ある実施形態において、本明細書に開示される修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）から発現され得る例示的なタンパク質としては、ＥＧＦ（上皮成長因子）が挙げられる。ある実施形態において、本明細書に開示される修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）から発現され得る例示的なタンパク質としては、酵素、例えばオキシドレダクターゼ酵素、代謝酵素、ミトコンドリア酵素、オキシゲナーゼ、デヒドロゲナーゼ、ＡＴＰ非依存性酵素及びデサチュラーゼが挙げられる。ある実施形態において、本明細書に開示される修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）から発現され得る例示的なタンパク質としては、細胞内タンパク質又は細胞質タンパク質が挙げられる。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ルシフェラーゼ（ｎＬｕｃ）を発現する。ある実施形態において、本明細書に開示される修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）から発現され得る例示的なタンパク質としては、分泌タンパク質、例えば、分泌酵素が挙げられる。ある場合において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、血液中で治療効果のある短い半減期を有し得る分泌タンパク質を発現するか、又は細胞内局在化シグナルを有するタンパク質、若しくは分泌シグナルペプチドを有するタンパク質であり得る。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、ガウシアルシフェラーゼ（ｇＬｕｃ）を発現する。ある場合において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、非ヒトタンパク質、例えば蛍光タンパク質、エネルギー移動受容体、又はＦｌａｇ、Ｍｙｃ、若しくはＨｉｓのようなタンパク質タグを発現する。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）から発現され得る例示的なタンパク質としては、ＧＦＰが挙げられる。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、タグ化タンパク質、例えばタンパク質タグを含有する融合タンパク質又は改変タンパク質、例えばキチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｆｃタグ、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ＡｖｉＴａｇ（ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ）、カルモジュリン－タグ（ＫＲＲＷＫＫＮＦＩＡＶＳＡＡＮＲＦＫＫＩＳＳＳＧＡＬ）；ポリグルタメートタグ（ＥＥＥＥＥＥ）；Ｅ－タグ（ＧＡＰＶＰＹＰＤＰＬＥＰＲ）；ＦＬＡＧ－タグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）、ＨＡ－タグ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ）；Ｈｉｓ－タグ（ＨＨＨＨＨＨ）；Ｍｙｃ－タグ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）；ＮＥ－タグ（ＴＫＥＮＰＲＳＮＱＥＥＳＹＤＤＮＥＳ）；Ｓ－タグ（ＫＥＴＡＡＡＫＦＥＲＱＨＭＤＳ）；ＳＢＰ－タグ（ＭＤＥＫＴＴＧＷＲＧＧＨＶＶＥＧＬＡＧＥＬＥＱＬＲＡＲＬＥＨＨＰＱＧＱＲＥＰ）；Ｓｏｆｔａｇ １（ＳＬＡＥＬＬＮＡＧＬＧＧＳ）；Ｓｏｆｔａｇ ３（ＴＱＤＰＳＲＶＧ）；Ｓｐｏｔ－タグ（ＰＤＲＶＲＡＶＳＨＷＳＳ）；Ｓｔｒｅｐ－タグ（Ｓｔｒｅｐ－タグＩＩ：ＷＳＨＰＱＦＥＫ）；ＴＣタグ（ＣＣＰＧＣＣ）；Ｔｙタグ（ＥＶＨＴＮＱＤＰＬＤ）；Ｖ５タグ（ＧＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＤＳＴ）；ＶＳＶ－タグ（ＹＴＤＩＥＭＮＲＬＧＫ）；又はＸｐｒｅｓｓタグ（ＤＬＹＤＤＤＤＫ）を発現する。
ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、抗体、例えば、抗体フラグメント、又はその部分を発現する。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）によって発現される抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭなどの任意のアイソタイプのものであり得る。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、抗体の一部、例えば軽鎖、重鎖、Ｆｃフラグメント、ＣＤＲ（相補性決定領域）、Ｆｖフラグメント、又はＦａｂフラグメント、そのさらなる部分を発現する。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、抗体の１つ以上の部分を発現する。例えば、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、２つ以上の発現配列を含むことができ、これらは、それぞれ抗体の一部を発現し、これらの集合が抗体を構成し得る。ある場合において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、抗体の重鎖をコードする１つの発現配列、及び抗体の軽鎖をコードする別の発現配列を含む。ある場合において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）が細胞又は無細胞環境で発現される場合、軽鎖及び重鎖は、適切な修飾、折り畳み、又は機能的抗体を形成する他の翻訳後修飾に供され得る。
調節要素
ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、調節要素、例えば修飾環状ポリリボヌクレオチド内の発現配列の発現を調節する配列を含む。
調節要素は、発現産物をコードする発現配列に隣接して位置する配列を含み得る。調節要素は、隣接する配列に動作可能に連結され得る。調節要素は、調節要素が存在しない場合に発現される産物の量と比較して、発現される産物の量を増加させ得る。さらに、１つの調節要素が、並んで結合された複数の発現配列について発現される産物の量を増加させ得る。したがって、１つの調節要素が１つ以上の発現配列の発現を促進することができる。複数の調節要素が当業者に周知である。
本明細書において提供される調節要素は、選択的翻訳配列を含み得る。本明細書において使用される際、「選択的翻訳配列」という用語は、修飾環状ポリリボヌクレオチド、例えば特定のリボスイッチアプタザイム中の発現配列の翻訳を選択的に開始させるか又は活性化する核酸配列を指し得る。調節要素は、選択的分解配列も含み得る。本明細書において使用される際、「選択的分解配列」という用語は、修飾環状ポリリボヌクレオチド又は修飾環状ポリリボヌクレオチドの発現産物の分解を開始させる核酸配列を指し得る。例示的な選択的分解配列は、リボスイッチアプタザイム及びｍｉＲＮＡ結合部位を含み得る。
ある実施形態において、調節要素は、翻訳モジュレータである。翻訳モジュレータは、修飾環状ポリリボヌクレオチド中の発現配列の翻訳を調節し得る。翻訳モジュレータは、翻訳エンハンサー又はサプレッサーであり得る。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、少なくとも１つの発現配列に隣接する少なくとも１つの翻訳モジュレータを含む。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、各発現配列に隣接する翻訳モジュレータを含む。ある実施形態において、翻訳モジュレータは、各発現配列の１つの側又は両側に存在して、発現産物、例えばペプチド及び又はポリペプチドの分離をもたらす。
ある実施形態において、翻訳開始配列は、調節要素として機能し得る。ある実施形態において、翻訳開始配列は、ＡＵＧコドンを含む。ある実施形態において、翻訳開始配列は、ＡＵＧ、ＣＵＧ、ＧＵＧ、ＵＵＧ、ＡＣＧ、ＡＵＣ、ＡＵＵ、ＡＡＧ、ＡＵＡ又はＡＧＧなどの任意の真核生物開始コドンを含む。ある実施形態において、翻訳開始配列は、コザック配列を含む。ある実施形態において、翻訳は、選択的条件、例えばストレス誘発性条件下で別の翻訳開始配列、例えばＡＵＧコドン以外の翻訳開始配列から開始する。非限定的な例として、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）の翻訳は、ＡＣＧなどの別の翻訳開始配列から開始する。別の非限定的な例として、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）翻訳は、別の翻訳開始配列、ＣＴＧ／ＣＵＧから開始し得る。さらに別の非限定的な例として、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）翻訳は、別の翻訳開始配列、ＧＴＧ／ＧＵＧから開始し得る。さらに別の非限定的な例として、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、反復ＲＮＡ、例えばＣＧＧ、ＧＧＧＧＣＣ、ＣＡＧ、ＣＴＧの短いストレッチを含む別の翻訳開始配列などのリピート関連非ＡＵＧ（ＲＡＮ）配列から翻訳を開始し得る。
限定はされないが、開始コドン又は別の開始コドンなど、翻訳を開始させるコドンに隣接するヌクレオチドは、修飾環状ポリリボヌクレオチドの翻訳効率、長さ及び／又は構造に影響を与えることが知られている。（例えば、内容全体が参照により本明細書に援用されるＭａｔｓｕｄａ ａｎｄ Ｍａｕｒｏ ＰＬｏＳ ＯＮＥ，２０１０ ５：１１を参照されたい）。翻訳を開始するコドンに隣接するヌクレオチドのいずれかをマスクすることを用いて、修飾環状ポリリボヌクレオチドの翻訳開始の位置、翻訳効率、長さ及び／又は構造を変化させ得る。
一実施形態において、マスキング剤は、マスクされた開始コドン又は別の開始コドンにおける翻訳開始の可能性を低下させるために、コドンをマスクするか又は隠すために、開始コドン又は別の開始コドンの近くで使用され得る。マスキング剤の非限定的な例としては、アンチセンスロックト核酸（ＬＮＡ）オリゴヌクレオチド及びエクソン接合部複合体（ＥＪＣ）が挙げられる。（例えば、内容全体が参照により本明細書に援用されるＭａｔｓｕｄａ ａｎｄ Ｍａｕｒｏ ｄｅｓｃｒｉｂｉｎｇ ｍａｓｋｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ ＬＮＡ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ ＥＪＣｓ（ＰＬｏＳ ＯＮＥ，２０１０ ５：１１）を参照されたい）。別の実施形態において、マスキング剤は、翻訳が別の開始コドンから開始する可能性を増加させるために、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）の開始コドンをマスクするために使用され得る。
ある実施形態において、翻訳は、限定はされないが、ＧＲＳＦ－１の存在下におけるウイルス誘発性選択などの選択的条件下で開始され、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、ＧＲＳＦ－１結合部位を含み、例えばｈｔｔｐ：／／ｊｖｉ．ａｓｍ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／７６／２０／１０４１７．ｆｕｌｌを参照されたい。
翻訳開始配列
ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、ポリペプチドをコードし、翻訳開始配列、例えば開始コドンを含み得る。ある実施形態において、翻訳開始配列は、コザック又はシャイン・ダルガノ配列を含む。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、発現配列に隣接する翻訳開始配列、例えばコザック配列を含む。ある実施形態において、翻訳開始配列は、非コード開始コドンである。ある実施形態において、翻訳開始配列、例えばコザック配列は、各発現配列の１つの側又は両側に存在して、発現産物の分離をもたらす。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、発現配列に隣接する少なくとも１つの翻訳開始配列を含む。ある実施形態において、翻訳開始配列は、修飾環状ポリリボヌクレオチドに立体配座柔軟性を与える。ある実施形態において、翻訳開始配列は、修飾環状ポリリボヌクレオチドの実質的に一本鎖領域内にある。
修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、限定はされないが、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０又は６０超の開始コドンなどの２つ以上の開始コドンを含み得る。翻訳は、第１の開始コドン上で開始し得るか、又は第１の開始コドンの下流で開始し得る。
ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、第１の開始コドンでないコドン、例えばＡＵＧから開始し得る。修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）の翻訳は、限定はされないが、ＡＣＧ、ＡＧＧ、ＡＡＧ、ＣＴＧ／ＣＵＧ、ＧＴＧ／ＧＵＧ、ＡＴＡ／ＡＵＡ、ＡＴＴ／ＡＵＵ、ＴＴＧ／ＵＵＧなどの別の翻訳開始配列から開始し得る（それぞれの内容全体が参照により本明細書に援用されるＴｏｕｒｉｏｌ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ ９５（２００３）１６９－１７８及びＭａｔｓｕｄａ ａｎｄ Ｍａｕｒｏ ＰＬｏＳ ＯＮＥ，２０１０ ５：１１を参照されたい）。ある実施形態において、翻訳は、選択的条件、例えばストレス誘発性条件下で別の翻訳開始配列から開始する。非限定的な例として、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）の翻訳は、ＡＣＧなどの別の翻訳開始配列から開始し得る。別の非限定的な例として、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）翻訳は、別の翻訳開始配列、ＣＴＧ／ＣＵＧから開始し得る。さらに別の非限定的な例として、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）翻訳は、別の翻訳開始配列、ＧＴＧ／ＧＵＧから開始し得る。さらに別の非限定的な例として、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、反復ＲＮＡ、例えばＣＧＧ、ＧＧＧＧＣＣ、ＣＡＧ、ＣＴＧの短いストレッチを含む別の翻訳開始配列などのリピート関連非ＡＵＧ（ＲＡＮ）配列から翻訳を開始し得る。
ある実施形態において、翻訳は、Ｒｏｃａｇｌａｔｅｓによる真核生物開始因子４Ａ（ｅＩＦ４Ａ）処理によって開始される（翻訳は、４３Ｓスキャニングをブロックすることによって抑制されて、ＲｏｃＡ－ｅＩＦ４Ａ標的配列を有する転写産物からの早期の上流の翻訳開始及び減少したタンパク質発現につながり、例えばｗｗｗ．ｎａｔｕｒｅ．ｃｏｍ／ａｒｔｉｃｌｅｓ／ｎａｔｕｒｅ１７９７８を参照されたい）。
ＩＲＥＳ
ある実施形態において、本明細書に記載される修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）要素を含む。修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）中に含むのに好適なＩＲＥＳ要素は、真核生物リボソームにかみ合うことが可能なＲＮＡ配列を含む。ある実施形態において、ＩＲＥＳ要素は、少なくとも約５ｎｔ、少なくとも約８ｎｔ、少なくとも約９ｎｔ、少なくとも約１０ｎｔ、少なくとも約１５ｎｔ、少なくとも約２０ｎｔ、少なくとも約２５ｎｔ、少なくとも約３０ｎｔ、少なくとも約４０ｎｔ、少なくとも約５０ｎｔ、少なくとも約１００ｎｔ、少なくとも約２００ｎｔ、少なくとも約２５０ｎｔ、少なくとも約３５０ｎｔ又は少なくとも約５００ｎｔである。一実施形態において、ＩＲＥＳ要素は、限定はされないが、ウイルス、哺乳動物及びショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）を含む生物のＤＮＡに由来する。このようなウイルスＤＮＡは、限定はされないが、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）ｃＤＮＡ及びポリオウイルスｃＤＮＡと共にピコルナウイルス相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に由来し得る。一実施形態において、ＩＲＥＳ要素が由来するショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）ＤＮＡとしては、限定はされないが、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）に由来するアンテナペディア遺伝子が挙げられる。
ある実施形態において、ＩＲＥＳ要素は、ウイルスに少なくとも部分的に由来し、例えば、それは、ＡＢＰＶ＿ＩＧＲｐｒｅｄ、ＡＥＶ、ＡＬＰＶ＿ＩＧＲｐｒｅｄ、ＢＱＣＶ＿ＩＧＲｐｒｅｄ、ＢＶＤＶ１＿１－３８５、ＢＶＤＶ１＿２９－３９１、ＣｒＰＶ＿５ＮＣＲ、ＣｒＰＶ＿ＩＧＲ、ｃｒＴＭＶ＿ＩＲＥＳｃｐ、ｃｒＴＭＶ＿ＩＲＥＳｍｐ７５、ｃｒＴＭＶ＿ＩＲＥＳｍｐ２２８、ｃｒＴＭＶ＿ＩＲＥＳｃｐ、ｃｒＴＭＶ＿ＩＲＥＳｃｐ、ＣＳＦＶ、ＣＶＢ３、ＤＣＶ＿ＩＧＲ、ＥＭＣＶ－Ｒ、ＥｏＰＶ＿５ＮＴＲ、ＥＲＡＶ＿２４５－９６１、ＥＲＢＶ＿１６２－９２０、ＥＶ７１＿１－７４８、ＦｅＬＶ－Ｎｏｔｃｈ２、ＦＭＤＶ＿ｔｙｐｅ＿Ｃ、ＧＢＶ－Ａ、ＧＢＶ－Ｂ、ＧＢＶ－Ｃ、ｇｙｐｓｙ＿ｅｎｖ、ｇｙｐｓｙＤ５、ｇｙｐｓｙＤ２、ＨＡＶ＿ＨＭ１７５、ＨＣＶ＿ｔｙｐｅ＿１ａ、ＨｉＰＶ＿ＩＧＲｐｒｅｄ、ＨＩＶ－１、ＨｏＣＶ１＿ＩＧＲｐｒｅｄ、ＨＲＶ－２、ＩＡＰＶ＿ＩＧＲｐｒｅｄ、ｉｄｅｆｉｘ、ＫＢＶ＿ＩＧＲｐｒｅｄ、ＬＩＮＥ－１＿ＯＲＦ１＿－１０１＿ｔｏ＿－１、ＬＩＮＥ－１＿ＯＲＦ１＿－３０２＿ｔｏ＿－２０２、ＬＩＮＥ－１＿ＯＲＦ２＿－１３８＿ｔｏ＿－８６、ＬＩＮＥ－１＿ＯＲＦ１＿－４４＿ｔｏ＿－１、ＰＳＩＶ＿ＩＧＲ、ＰＶ＿ｔｙｐｅ１＿Ｍａｈｏｎｅｙ、ＰＶ＿ｔｙｐｅ３＿Ｌｅｏｎ、ＲＥＶ－Ａ、ＲｈＰＶ＿５ＮＣＲ、ＲｈＰＶ＿ＩＧＲ、ＳＩＮＶ１＿ＩＧＲｐｒｅｄ、ＳＶ４０＿６６１－８３０、ＴＭＥＶ、ＴＭＶ＿ＵＩ＿ＩＲＥＳｍｐ２２８、ＴＲＶ＿５ＮＴＲ、ＴｒＶ＿ＩＧＲ又はＴＳＶ＿ＩＧＲなどのウイルスＩＲＥＳ要素に由来し得る。ある実施形態において、ＩＲＥＳ要素は、ＡＭＬ１／ＲＵＮＸ１、Ａｎｔｐ－Ｄ、Ａｎｔｐ－ＤＥ、Ａｎｔｐ－ＣＤＥ、Ａｐａｆ－１、Ａｐａｆ－１、ＡＱＰ４、ＡＴ１Ｒ＿ｖａｒ１、ＡＴ１Ｒ＿ｖａｒ２、ＡＴ１Ｒ＿ｖａｒ３、ＡＴ１Ｒ＿ｖａｒ４、ＢＡＧ１＿ｐ３６ｄｅｌｔａ２３６ｎｔ、ＢＡＧ１＿ｐ３６、ＢＣＬ２、ＢｉＰ＿－２２２＿－３、ｃ－ＩＡＰ１＿２８５－１３９９、ｃ－ＩＡＰ１＿１３１３－１４６２、ｃ－ｊｕｎ、ｃ－ｍｙｃ、Ｃａｔ－１＿２２４、ＣＣＮＤ１、ＤＡＰ５、ｅＩＦ４Ｇ、ｅＩＦ４ＧＩ－ｅｘｔ、ｅＩＦ４ＧＩＩ、ｅＩＦ４ＧＩＩ－ｌｏｎｇ、ＥＬＧ１、ＥＬＨ、ＦＧＦ１Ａ、ＦＭＲ１、Ｇｔｘ－１３３－１４１、Ｇｔｘ－１－１６６、Ｇｔｘ－１－１２０、Ｇｔｘ－１－１９６、ｈａｉｒｌｅｓｓ、ＨＡＰ４、ＨＩＦ１ａ、ｈＳＮＭ１、Ｈｓｐ１０１、ｈｓｐ７０、ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ９０、ＩＧＦ２＿ｌｅａｄｅｒ２、Ｋｖ１．４＿１．２、Ｌ－ｍｙｃ、ＬａｍＢ１＿－３３５＿－１、ＬＥＦ１、ＭＮＴ＿７５－２６７、ＭＮＴ＿３６－１６０、ＭＴＧ８ａ、ＭＹＢ、ＭＹＴ２＿９９７－１１５２、ｎ－ＭＹＣ、ＮＤＳＴ１、ＮＤＳＴ２、ＮＤＳＴ３、ＮＤＳＴ４Ｌ、ＮＤＳＴ４Ｓ、ＮＲＦ＿－６５３＿－１７、ＮｔＨＳＦ１、ＯＤＣ１、ｐ２７ｋｉｐ１、ｐ５３＿１２８－２６９、ＰＤＧＦ２／ｃ－ｓｉｓ、Ｐｉｍ－１、ＰＩＴＳＬＲＥ＿ｐ５８、Ｒｂｍ３、ｒｅａｐｅｒ、Ｓｃａｍｐｅｒ、ＴＦＩＩＤ、ＴＩＦ４６３１、Ｕｂｘ＿１－９６６、Ｕｂｘ＿３７３－９６１、ＵＮＲ、Ｕｒｅ２、ＵｔｒＡ、ＶＥＧＦ－Ａ＿－１３３＿－１、ＸＩＡＰ＿５－４６４、ＸＩＡＰ＿３０５－４６６又はＹＡＰ１などの細胞ＩＲＥＳに少なくとも部分的に由来する。ある実施形態において、ＩＲＥＳ要素は、合成ＩＲＥＳ、例えば（ＧＡＡＡ）１６、（ＰＰＴ１９）４、ＫＭＩ１、ＫＭＩ１、ＫＭＩ２、ＫＭＩ２、ＫＭＩＸ、Ｘ１又はＸ２を含む。
ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、少なくとも１つ（例えば、２、３、４、５つ、又はそれ以上）の発現配列に隣接する少なくとも１つのＩＲＥＳを含む。ある実施形態において、ＩＲＥＳは、少なくとも１つ（例えば、２、３、４、５つ、又はそれ以上）の発現配列の両側に隣接する。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、各発現配列の１つの側又は両側に存在して、得られるペプチド及び又はポリペプチドの分離をもたらす１つ以上のＩＲＥＳ配列を含む。
終止要素
ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、１つ以上の発現配列を含み、各発現配列は、終止要素を有していても又は有していなくてもよい。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、１つ以上の発現配列を含み、発現配列は、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）が連続して翻訳されるように終止要素を欠いている。終止要素の排除は、リボソームの停滞又は落下がないために、発現産物、例えばペプチド又はポリペプチドのローリングサークル型翻訳又は連続した発現をもたらし得る。このような実施形態において、ローリングサークル型翻訳は、各発現配列を介して連続した発現産物を発現する。ある他の実施形態において、発現配列の終止要素は、スタガー要素の一部であり得る。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）中の１つ以上の発現配列は、終止要素を含む。しかしながら、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）中の後続の（例えば、第２、第３、第４、第５などの）発現配列のローリングサークル型翻訳又は発現が行われる。このような場合、リボソームが終止要素、例えば終止コドンに遭遇し、翻訳を終止するとき、発現産物は、リボソームから落下し得る。ある実施形態において、翻訳は、リボソーム、例えばリボソームの少なくとも１つのサブユニットが修飾環状ポリリボヌクレオチドと接触状態を保ちながら終止される。
ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、１つ以上の発現配列の末端に終止要素を含む。ある実施形態において、１つ以上の発現配列連続して２つ以上の終止要素を含む。このような実施形態において、翻訳が終止され、ローリングサークル型翻訳が終止される。ある実施形態において、リボソームは、修飾環状ポリリボヌクレオチドと完全に離脱する。あるこのような実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）中の後続の（例えば、第２、第３、第４、第５などの）発現配列の生成は、リボソームが翻訳の開始前に修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）と再度かみ合うことを必要とし得る。一般に、終止要素は、翻訳の終止を示すインフレームヌクレオチド三つ組、例えば、ＵＡＡ、ＵＧＡ、ＵＡＧを含む。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）中の１つ以上の終止要素は、限定はされないが、翻訳を終止し得るオフフレーム又は－１及び＋１シフトされたリーディングフレーム（例えば、隠れた停止）などのフレームシフト終止要素である。フレームシフト終止要素は、発現配列の第２及び第３のリーディングフレームに現れるヌクレオチド三つ組、ＴＡＡ、ＴＡＧ、及びＴＧＡを含む。フレームシフト終止要素は、細胞に有害であることが多い、ｍＲＮＡの読み違いを防ぐ際に重要であり得る。
スタガー要素
ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、発現配列に隣接する少なくとも１つのスタガー要素を含む。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、各発現配列に隣接するスタガー要素を含む。ある実施形態において、スタガー要素は、各発現配列の１つの側又は両側に存在して、発現産物、例えばペプチド及び又はポリペプチドの分離をもたらす。ある実施形態において、スタガー要素は、１つ以上の発現配列の一部である。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、１つ以上の発現配列を含み、１つ以上の発現配列のそれぞれは、修飾環状ポリリボヌクレオチドにおけるスタガー要素によって後続の発現配列から隔てられる。ある実施形態において、スタガー要素は、（ａ）単一の発現配列の２回の翻訳から、又は（ｂ）２つ以上の発現配列の１回以上の翻訳からの単一のポリペプチドの生成を防止する。ある実施形態において、スタガー要素は、１つ以上の発現配列から切り離された配列である。ある実施形態において、スタガー要素は、１つ以上の発現配列の発現配列の一部を含む。
ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、スタガー要素を含む。ローリングサークル型翻訳を維持しながら、連続した発現産物、例えばペプチド又はポリペプチドの生成を避けるために、スタガー要素は、翻訳中のリボソームの休止を誘導するために含まれ得る。ある実施形態において、スタガー要素は、１つ以上の発現配列の少なくとも１つの３’末端にある。スタガー要素は、修飾環状ポリリボヌクレオチドのローリングサークル型翻訳中にリボソームを停滞させるように構成され得る。スタガー要素としては、限定はされないが、２Ａ様又はＣＨＹＳＥＬ（シス作用性ヒドロラーゼ要素）配列が挙げられる。ある実施形態において、スタガー要素は、Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＥＸ５ＮＰＧＰ（ここで、Ｘ１は、存在しないか、又はＧ若しくはＨであり、Ｘ２は、存在しないか、又はＤ若しくはＧであり、Ｘ３は、Ｄ、又はＶ、又はＩ、又はＳ、又はＭであり、Ｘ５は、任意のアミノ酸である）であるＣ末端コンセンサス配列を有する配列をコードする。ある実施形態において、この配列は、強いαらせん傾向を有するアミノ酸の非保存配列、続いてコンセンサス配列－Ｄ（Ｖ／Ｉ）ＥｘＮＰＧ Ｐ（ここで、ｘ＝任意のアミノ酸である）を含む。スタガー要素のいくつかの非限定的な例としては、ＧＤＶＥＳＮＰＧＰ、ＧＤＩＥＥＮＰＧＰ、ＶＥＰＮＰＧＰ、ＩＥＴＮＰＧＰ、ＧＤＩＥＳＮＰＧＰ、ＧＤＶＥＬＮＰＧＰ、ＧＤＩＥＴＮＰＧＰ、ＧＤＶＥＮＰＧＰ、ＧＤＶＥＥＮＰＧＰ、ＧＤＶＥＱＮＰＧＰ、ＩＥＳＮＰＧＰ、ＧＤＩＥＬＮＰＧＰ、ＨＤＩＥＴＮＰＧＰ、ＨＤＶＥＴＮＰＧＰ、ＨＤＶＥＭＮＰＧＰ、ＧＤＭＥＳＮＰＧＰ、ＧＤＶＥＴＮＰＧＰ、ＧＤＩＥＱＮＰＧＰ及びＤＳＥＦＮＰＧＰが挙げられる。
ある実施形態において、本明細書に記載されるスタガー要素は、本明細書に記載されるコンセンサス配列のＧとＰとの間などで発現産物を切断する。１つの非限定的な例として、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、発現産物を切断するために少なくとも１つのスタガー要素を含む。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、少なくとも１つの発現配列に隣接するスタガー要素を含む。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、各発現配列の後にスタガー要素を含む。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、スタガー要素を含み、スタガー要素は、各発現配列の１つの側又は両側に存在して、各発現配列からの個々のペプチド及び又はポリペプチドの翻訳をもたらす。
ある実施形態において、スタガー要素は、翻訳中にリボソームの休止を誘導する１つ以上の修飾ヌクレオチド又は非天然ヌクレオチドを含む。非天然ヌクレオチドは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノ及びロックト核酸（ＬＮＡ）並びにグリコール核酸（ＧＮＡ）及びトレオース核酸（ＴＮＡ）を含み得る。これらなどの例は、分子の骨格に対する変化により、天然ＤＮＡ又はＲＮＡと区別される。例示的な修飾は、糖、核酸塩基、ヌクレオシド間結合に対する（例えば、連結するホスフェート／ホスホジエステル結合／ホスホジエステル骨格に対する）任意の修飾及び翻訳中にリボソームの休止を誘導し得るそれらの任意の組合せを含み得る。本明細書において提供される例示的な修飾のいくつかが本明細書の他の箇所に記載される。
ある実施形態において、スタガー要素は、他の形態で修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）中に存在する。例えば、ある例示的な修飾環状ポリリボヌクレオチドにおいて、スタガー要素は、修飾環状ポリリボヌクレオチド中の第１の発現配列の終止要素及び第１の発現配列に続く発現の第１の翻訳開始配列から終止要素を隔てるヌクレオチドスペーサー配列を含む。いくつかの例において、第１の発現配列の第１のスタガー要素は、修飾環状ポリリボヌクレオチド中の第１の発現配列に続く発現の第１の翻訳開始配列の上流（５’末端側）にある。ある場合において、第１の発現配列及び第１の発現配列に続く発現配列は、修飾環状ポリリボヌクレオチド中の２つの別個の発現配列である。第１のスタガー要素と第１の翻訳開始配列との間の距離は、第１の発現配列及びその後続の発現配列の連続した翻訳を可能にし得る。ある実施形態において、第１のスタガー要素は、終止要素を含み、第１の発現配列の発現産物をその後続の発現配列の発現産物から隔て、それにより別個の発現産物を形成する。ある場合において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）中の後続の配列の第１の翻訳開始配列の上流の第１のスタガー要素を含む修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、連続して翻訳される一方、第２の発現配列に続く発現配列の第２の翻訳開始配列の上流にある第２の発現配列のスタガー要素を含む対応する修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、連続して翻訳されない。ある場合において、修飾環状ポリリボヌクレオチド中に１つのみの発現配列があり、第１の発現配列及びその後続の発現配列は、同じ発現配列である。ある例示的な修飾環状ポリリボヌクレオチドにおいて、スタガー要素は、修飾環状ポリリボヌクレオチド中の第１の発現配列の第１の終止要素及び終止要素を下流の翻訳開始配列から隔てるヌクレオチドスペーサー配列を含む。あるこのような例において、第１のスタガー要素は、修飾環状ポリリボヌクレオチド中の第１の発現配列の第１の翻訳開始配列の上流（５’末端側）にある。ある場合において、第１のスタガー要素と第１の翻訳開始配列との間の距離は、第１の発現配列及び任意の後続の発現配列の連続した翻訳を可能にする。ある実施形態において、第１のスタガー要素は、第１の発現配列のある回の発現産物を第１の発現配列の次回の発現産物から隔て、それにより別個の発現産物を形成する。ある場合において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）中の第１の発現配列の第１の翻訳開始配列の上流の第１のスタガー要素を含む修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、連続して翻訳される一方、対応する修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）中の第２の発現配列の第２の翻訳開始配列の上流のスタガー要素を含む対応する修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、連続して翻訳されない。ある場合において、第２のスタガー要素と第２の翻訳開始配列との間の距離は、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）中の第１のスタガー要素と第１の翻訳開始との間の距離より、対応する修飾環状ポリリボヌクレオチド中で少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍又は１０倍大きい。ある場合において、第１のスタガー要素と第１の翻訳開始との間の距離は、少なくとも２ｎｔ、３ｎｔ、４ｎｔ、５ｎｔ、６ｎｔ、７ｎｔ、８ｎｔ、９ｎｔ、１０ｎｔ、１１ｎｔ、１２ｎｔ、１３ｎｔ、１４ｎｔ、１５ｎｔ、１６ｎｔ、１７ｎｔ、１８ｎｔ、１９ｎｔ、２０ｎｔ、２５ｎｔ、３０ｎｔ、３５ｎｔ、４０ｎｔ、４５ｎｔ、５０ｎｔ、５５ｎｔ、６０ｎｔ、６５ｎｔ、７０ｎｔ、７５ｎｔ又はそれを超える。ある実施形態において、第２のスタガー要素と第２の翻訳開始との間の距離は、第１のスタガー要素と第１の翻訳開始との間の距離より少なくとも２ｎｔ、３ｎｔ、４ｎｔ、５ｎｔ、６ｎｔ、７ｎｔ、８ｎｔ、９ｎｔ、１０ｎｔ、１１ｎｔ、１２ｎｔ、１３ｎｔ、１４ｎｔ、１５ｎｔ、１６ｎｔ、１７ｎｔ、１８ｎｔ、１９ｎｔ、２０ｎｔ、２５ｎｔ、３０ｎｔ、３５ｎｔ、４０ｎｔ、４５ｎｔ、５０ｎｔ、５５ｎｔ、６０ｎｔ、６５ｎｔ、７０ｎｔ、７５ｎｔ又はそれを超えて大きい。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、２つ以上の発現配列を含む。
調節核酸
ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、調節核酸をコードし、例えば、内在性遺伝子及び／又は外来性遺伝子の発現を調節する１つ以上の発現配列を含む。ある実施形態において、本明細書において提供される修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）の発現配列は、限定はされないが、ｔＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｅｘＲＮＡ、ｓｃａＲＮＡ、Ｙ ＲＮＡ、及びｈｎＲＮＡなどのノンコーディングＲＮＡのような調節核酸に対してアンチセンスである配列を含み得る。
一実施形態において、調節核酸は、宿主遺伝子を標的にする。調節核酸としては、全体が参照により本明細書に援用される国際特許公開番号国際公開第２０１９１１８９１９Ａ１号パンフレットの［０１７７］及び［０１８１］～［０１８９］に記載される調節核酸のいずれかが挙げられる。
ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）などの調節核酸を含む。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、ガイドＲＮＡを含むか、又はガイドＲＮＡをコードする。ｇＲＮＡ短鎖合成ＲＮＡは、不完全なエフェクター部分に結合するのに必要な「足場」配列及びゲノム標的のためのユーザー定義の約２０ヌクレオチド標的化配列から構成される。実際に、ガイドＲＮＡ配列は、一般に、１７～２４ヌクレオチド（例えば、１９、２０又は２１ヌクレオチド）の長さを有し、標的化核酸配列に対して相補的であるように設計される。カスタムｇＲＮＡジェネレータ及びアルゴリズムは、有効なガイドＲＮＡの設計に使用するために市販されている。遺伝子編集は、天然ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体を模倣し、ｔｒａｃｒＲＮＡ（ヌクレアーゼに結合するため）及び少なくとも１つのｃｒＲＮＡ（編集のために標的化される配列にヌクレアーゼをガイドするため）の両方を含有する改変された（合成）単一ＲＮＡ分子であるキメラ「シングルガイドＲＮＡ」（「ｓｇＲＮＡ」）を用いても行われた。化学修飾されたｓｇＲＮＡは、ゲノム編集に有効であることも実証され、例えばＨｅｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，９８５－９９１を参照されたい。
ｇＲＮＡは、特定のＤＮＡ配列（例えば、遺伝子のプロモータ、エンハンサー、サイレンサー若しくはリプレッサーに隣接するか又はそれらの中にある配列）を認識し得る。
一実施形態において、ｇＲＮＡは、遺伝子編集のためのＣＲＩＳＰＲシステムの一部として使用される。遺伝子編集のために、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、所望の標的ＤＮＡ配列に対応する１つ又は複数のガイドＲＮＡ配列を含むように設計され得、例えばＣｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３９：８１９－８２３；Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，８：２２８１－２３０８を参照されたい。ｇＲＮＡ配列の少なくとも約１６又は１７ヌクレオチドが、ＤＮＡ切断が起こるためにＣａｓ９によって必要とされ；Ｃｐｆ１について、ｇＲＮＡ配列の少なくとも約１６ヌクレオチドが、検出可能なＤＮＡ切断を達成するために必要とされる。
修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、遺伝子によってコードされるＲＮＡの発現を調節し得る。複数の遺伝子が、互いにある程度の配列相同性を共有し得るため、ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、十分な配列相同性を有する遺伝子のクラスを標的にするように設計され得る。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、異なる遺伝子標的間で共有されるか又は特定の遺伝子標的に固有の配列に対する相補性を有する配列を含有し得る。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、いくつかの遺伝子間で相同性を有するＲＮＡ配列の保存領域を標的にし、それにより遺伝子ファミリー（例えば、異なる遺伝子アイソフォーム、スプライス変異、突然変異遺伝子など）におけるいくつかの遺伝子を標的にするように設計され得る。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、単一の遺伝子の特定のＲＮＡ配列に固有の配列を標的にするように設計され得る。
ある実施形態において、発現配列は、５０００ｂｐ未満（例えば、約５０００ｂｐ、４０００ｂｐ、３０００ｂｐ、２０００ｂｐ、１０００ｂｐ、９００ｂｐ、８００ｂｐ、７００ｂｐ、６００ｂｐ、５００ｂｐ、４００ｂｐ、３００ｂｐ、２００ｂｐ、１００ｂｐ、５０ｂｐ、４０ｂｐ、３０ｂｐ、２０ｂｐ、１０ｂｐ未満又はそれを下回る）の長さを有する。ある実施形態において、発現配列は、独立して又はそれに加えて、１０ｂｐ超（例えば、少なくとも約１０ｂｐ、２０ｂｐ、３０ｂｐ、４０ｂｐ、５０ｂｐ、６０ｂｐ、７０ｂｐ、８０ｂｐ、９０ｂｐ、１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１０００ｋｂ、１．１ｋｂ、１．２ｋｂ、１．３ｋｂ、１．４ｋｂ、１．５ｋｂ、１．６ｋｂ、１．７ｋｂ、１．８ｋｂ、１．９ｋｂ、２ｋｂ、２．１ｋｂ、２．２ｋｂ、２．３ｋｂ、２．４ｋｂ、２．５ｋｂ、２．６ｋｂ、２．７ｋｂ、２．８ｋｂ、２．９ｋｂ、３ｋｂ、３．１ｋｂ、３．２ｋｂ、３．３ｋｂ、３．４ｋｂ、３．５ｋｂ、３．６ｋｂ、３．７ｋｂ、３．８ｋｂ、３．９ｋｂ、４ｋｂ、４．１ｋｂ、４．２ｋｂ、４．３ｋｂ、４．４ｋｂ、４．５ｋｂ、４．６ｋｂ、４．７ｋｂ、４．８ｋｂ、４．９ｋｂ、５ｋｂ又はそれを超える）の長さを有する。
ある実施形態において、発現配列は、本明細書に記載される特徴の１つ以上、例えば１つ以上のペプチド又はタンパク質をコードする配列、１つ以上の調節要素、１つ以上の調節核酸、例えば１つ以上のノンコーディングＲＮＡ、他の発現配列及びそれらの任意の組合せを含む。
翻訳効率
ある実施形態において、本明細書において提供される修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）の翻訳効率は、参照、例えば線状同等物、線状発現配列、線状修飾環状ポリリボヌクレオチド、又は完全修飾環状ポリリボヌクレオチド同等物より高い。ある実施形態において、本明細書において提供される修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、参照の翻訳効率より少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％、５００％、６００％、７０％、８００％、９００％、１０００％、２０００％、５０００％、１００００％、１０００００％、又はそれ以上高い翻訳効率を有する。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、線状同等物のものより１０％高い翻訳効率を有する。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、線状同等物のものより３００％高い翻訳効率を有する。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド同等物のものより１０％高い翻訳効率を有する。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド同等物のものより３００％高い翻訳効率を有する。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、対応する環状ポリリボヌクレオチドのものより少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％、５００％、６００％、７０％、８００％、９００％、１０００％、２０００％、５０００％、１００００％、１０００００％、又はそれ以上高い翻訳効率を有する。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、対応する環状ポリリボヌクレオチドのものより少なくとも約１０％高い翻訳効率を有する。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、対応する環状ポリリボヌクレオチドのものより少なくとも約２０％高い翻訳効率を有する。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、対応する環状ポリリボヌクレオチドのものより少なくとも約５０％高い翻訳効率を有する。
ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、化学量論比の発現産物を生成する。ローリングサークル型翻訳は、実質的に同等の比率で発現産物を連続して生成する。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、発現産物が実質的に同等の比率で生成されるような化学量論的翻訳効率を有する。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、複数の発現産物、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、又はそれ以上の発現配列からの産物の化学量論的翻訳効率を有する。
ローリングサークル型翻訳
ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）の翻訳が開始されたら、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）に結合されたリボソームは、修飾環状ポリリボヌクレオチドの少なくとも１回の翻訳を完了する前に修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）から離脱しない。ある実施形態において、本明細書に記載される修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、ローリングサークル型翻訳の能力がある。ある実施形態において、ローリングサークル型翻訳中、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）の翻訳が開始されたら、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）に結合されたリボソームは、修飾環状ポリリボヌクレオチドの少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも８回、少なくとも９回、少なくとも１０回、少なくとも１１回、少なくとも１２回、少なくとも１３回、少なくとも１４回、少なくとも１５回、少なくとも２０回、少なくとも３０回、少なくとも４０回、少なくとも５０回、少なくとも６０回、少なくとも７０回、少なくとも８０回、少なくとも９０回、少なくとも１００回、少なくとも１５０回、少なくとも２００回、少なくとも２５０回、少なくとも５００回、少なくとも１０００回、少なくとも１５００回、少なくとも２０００回、少なくとも５０００回、少なくとも１００００回、少なくとも１０５回、又は少なくとも１０６回の翻訳を完了する前に修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）から離脱しない。
ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）のローリングサークル型翻訳は、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）の２回以上の翻訳から翻訳されたポリペプチド産物（「連続した」発現産物）の生成をもたらす。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、スタガー要素を含み、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）のローリングサークル型翻訳は、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）の１回の翻訳又は１回未満の翻訳から生成されるポリペプチド産物（「別個の」発現産物）の生成をもたらす。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）のローリングサークル型翻訳中に生成される全ポリペプチド（モル／モル）の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％が別個のポリペプチドであるように構成される。ある実施形態において、全ポリペプチドにわたる別個の産物の量比率がインビトロ翻訳系において試験される。ある実施形態において、量比率の試験に使用されるインビトロ翻訳系は、ウサギ網状赤血球溶解物を含む。ある実施形態において、量比率は、真核細胞若しくは原核細胞、培養細胞又は生物内の細胞などのインビボ翻訳系において試験される。
非翻訳領域
ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む。遺伝子を含むゲノム領域のＵＴＲは、転写され得るが、翻訳されていない。ある実施形態において、ＵＴＲは、本明細書に記載される発現配列の翻訳開始配列の上流に含まれ得る。ある実施形態において、ＵＴＲは、本明細書に記載される発現配列の下流に含まれ得る。ある場合において、第１の発現配列のための１つのＵＴＲは、第２の発現配列のための別のＵＴＲと同じであるか又はそれと連続しているか又はそれと重複している。ある実施形態において、イントロンは、ヒトイントロンである。ある実施形態において、イントロンは、完全長ヒトイントロン、例えばＺＫＳＣＡＮ１である。
ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、中に埋め込まれたアデノシン及びウリジンの１つ以上のストレッチを有するＵＴＲを含む。これらのＡＵリッチシグネチャーは、発現産物のターンオーバ速度を上昇させ得る。
ＵＴＲ ＡＵリッチ要素（ＡＲＥ）の導入、除去、又は修飾は、修飾環状ポリリボヌクレオチドの安定性又は免疫原性を調節するのに有用であり得る。特定の修飾環状ポリリボヌクレオチドを改変するとき、ＡＲＥの１つ以上のコピーが修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）に導入され得、ＡＲＥのコピーが発現産物の翻訳及び／又は生成を調節し得る。同様に、ＡＲＥは、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）中で同定され、除去又は改変されて細胞内安定性を調節し、したがって得られるタンパク質の翻訳及び生成に影響を与え得る。
任意の遺伝子からの任意のＵＴＲは、修飾環状ポリリボヌクレオチドのそれぞれの隣接領域に組み込まれ得ることが理解されるべきである。本明細書において提供される修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）において使用され得る例示的なＵＴＲとしては、全体が参照により本明細書に援用される国際特許公開番号国際公開第２０１９１１８９１９Ａ１号パンフレットの［０２００］～［０２０１］に記載されるものが挙げられる。
ポリＡ配列
ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、ポリ－Ａ配列を含み得る。ある実施形態において、ポリ－Ａ配列の長さは、１０ヌクレオチド長を超える。一実施形態において、ポリ－Ａ配列は、１５ヌクレオチド長を超える（例えば、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００、１，９００、２，０００、２，５００、及び３，０００ヌクレオチド又はこれらを超える）。ある実施形態において、ポリ－Ａ配列は、全体が参照により本明細書に援用される国際特許公開番号国際公開第２０１９１１８９１９Ａ１号パンフレットの［０２０２］～［０２０４］中のポリ－Ａ配列の説明に従って設計される。
ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、ポリＡを含むか、ポリＡを欠いているか、又は修飾環状ポリリボヌクレオチドの１つ以上の特性を調節するための修飾ポリＡを有する。ある実施形態において、ポリＡを欠いた又は修飾ポリＡを有する修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、１つ以上の機能特性、例えば、免疫原性、半減期、発現効率などを改善する。
ＲＮＡ結合
ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、１つ以上のＲＮＡ結合部位を含む。マイクロＲＮＡ（又はｍｉＲＮＡ）は、核酸分子の３’ＵＴＲに結合し、核酸分子安定性を低下させるか又は翻訳を阻害することによって遺伝子発現を下方制御する短鎖ノンコーディングＲＮＡである。修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、１つ以上のマイクロＲＮＡ標的配列、マイクロＲＮＡ配列、又はマイクロＲＮＡシードを含み得る。このような配列は、内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２００５／０２６１２１８号明細書、米国特許出願公開第２００５／００５９００５号明細書、及び国際特許公開番号国際公開第２０１９１１８９１９Ａ１号パンフレットの［０２０７］～［０２１５］において教示されるものなど、任意の公知のマイクロＲＮＡに対応し得る。
タンパク質結合
ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、タンパク質、例えばリボソームが、ＲＮＡ配列における内部部位に結合することを可能にする１つ以上のタンパク質結合部位を含む。タンパク質結合部位、例えばリボソーム結合部位を修飾環状ポリリボヌクレオチド中に操作することにより、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、宿主の免疫系の構成要素から修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）をマスクすることにより、宿主の免疫系を回避するか若しくは宿主の免疫系によって減少された検出を有し得、調節された分解又は調節された翻訳を有し得る。
ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、例えば、免疫応答、例えばＣＴＬ（細胞傷害性Ｔリンパ球）応答を回避するために少なくとも１つの免疫タンパク質結合部位を含む。ある実施形態において、免疫タンパク質結合部位は、免疫タンパク質に結合し、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）を外因性であるものとしてマスクするのに役立つヌクレオチド配列である。ある実施形態において、免疫タンパク質結合部位は、免疫タンパク質に結合し、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）を外因性又は外来性であるものとして隠すのに役立つヌクレオチド配列である。
線状ＲＮＡへのリボソームのかみ合いの従来の機構は、ＲＮＡのキャップされた５’末端に結合するリボソームを含む。５’末端から、リボソームが開始コドンに移動すると直ちに第１のペプチド結合が形成される。本発明によれば、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）の翻訳の内部の開始（すなわちキャップ非依存的）は、遊離末端又はキャップされた末端を必要としない。むしろ、リボソームは、非キャップ内部部位に結合し、それにより、リボソームは、開始コドンにおけるポリペプチド伸長を開始する。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、リボソーム結合部位、例えば開始コドンを含む１つ以上のＲＮＡ配列を含む。
天然５’ＵＴＲは、翻訳開始のために役割を果たす特徴を有する。それらは、リボソームが多くの遺伝子の翻訳を開始させるプロセスに関与することが一般的に知られているコザック配列のようなシグネチャーを有する。コザック配列は、コンセンサスＣＣＲ（Ａ／Ｇ）ＣＣＡＵＧＧを有し、ここで、Ｒは、開始コドン（ＡＵＧ）の３塩基上流のプリン（アデニン又はグアニン）であり、その後、別の「Ｇ」が続く。５’ＵＴＲは、伸長因子結合に関与する二次構造にも関与することが知られている。
ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、タンパク質に結合するタンパク質結合配列をコードする。ある実施形態において、タンパク質結合配列は、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）を標的にするか又はそれを特定の標的に限局する。ある実施形態において、タンパク質結合配列は、タンパク質のアルギニンリッチ領域に特異的に結合する。
ある実施形態において、タンパク質結合部位としては、限定はされないが、ＡＣＩＮ１、ＡＧＯ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、ＡＴＸＮ２、ＡＵＨ、ＢＣＣＩＰ、ＣＡＰＲＩＮ１、ＣＥＬＦ２、ＣＰＳＦ１、ＣＰＳＦ２、ＣＰＳＦ６、ＣＰＳＦ７、ＣＳＴＦ２、ＣＳＴＦ２Ｔ、ＣＴＣＦ、ＤＤＸ２１、ＤＤＸ３、ＤＤＸ３Ｘ、ＤＤＸ４２、ＤＧＣＲ８、ＥＩＦ３Ａ、ＥＩＦ４Ａ３、ＥＩＦ４Ｇ２、ＥＬＡＶＬ１、ＥＬＡＶＬ３、ＦＡＭ１２０Ａ、ＦＢＬ、ＦＩＰ１Ｌ１、ＦＫＢＰ４、ＦＭＲ１、ＦＵＳ、ＦＸＲ１、ＦＸＲ２、ＧＮＬ３、ＧＴＦ２Ｆ１、ＨＮＲＮＰＡ１、ＨＮＲＮＰＡ２Ｂ１、ＨＮＲＮＰＣ、ＨＮＲＮＰＫ、ＨＮＲＮＰＬ、ＨＮＲＮＰＭ、ＨＮＲＮＰＵ、ＨＮＲＮＰＵＬ１、ＩＧＦ２ＢＰ１、ＩＧＦ２ＢＰ２、ＩＧＦ２ＢＰ３、ＩＬＦ３、ＫＨＤＲＢＳ１、ＬＡＲＰ７、ＬＩＮ２８Ａ、ＬＩＮ２８Ｂ、ｍ６Ａ、ＭＢＮＬ２、ＭＥＴＴＬ３、ＭＯＶ１０、ＭＳＩ１、ＭＳＩ２、ＮＯＮＯ、ＮＯＮＯ－、ＮＯＰ５８、ＮＰＭ１、ＮＵＤＴ２１、ＰＣＢＰ２、ＰＯＬＲ２Ａ、ＰＲＰＦ８、ＰＴＢＰ１、ＲＢＦＯＸ２、ＲＢＭ１０、ＲＢＭ２２、ＲＢＭ２７、ＲＢＭ４７、ＲＮＰＳ１、ＳＡＦＢ２、ＳＢＤＳ、ＳＦ３Ａ３、ＳＦ３Ｂ４、ＳＩＲＴ７、ＳＬＢＰ、ＳＬＴＭ、ＳＭＮＤＣ１、ＳＮＤ１、ＳＲＲＭ４、ＳＲＳＦ１、ＳＲＳＦ３、ＳＲＳＦ７、ＳＲＳＦ９、ＴＡＦ１５、ＴＡＲＤＢＰ、ＴＩＡ１、ＴＮＲＣ６Ａ、ＴＯＰ３Ｂ、ＴＲＡ２Ａ、ＴＲＡ２Ｂ、Ｕ２ＡＦ１、Ｕ２ＡＦ２、ＵＮＫ、ＵＰＦ１、ＷＤＲ３３、ＸＲＮ２、ＹＢＸ１、ＹＴＨＤＣ１、ＹＴＨＤＦ１、ＹＴＨＤＦ２、ＹＷＨＡＧ、ＺＣ３Ｈ７Ｂ、ＰＤＫ１、ＡＫＴ１及びＲＮＡに結合する任意の他のタンパク質などのタンパク質への結合部位が挙げられる。
エンクリプトゲン
本明細書に記載される際、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、細胞の自然免疫応答を低下させるか、避けるか又は回避するためにエンクリプトゲンを含む。一態様において、細胞に送達されると、参照化合物、例えば記載される修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）、対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチド、エンクリプトゲンを欠いた修飾環状ポリリボヌクレオチドに対応する線状ポリヌクレオチドによって引き起こされる応答と比較して、宿主からの低下された免疫応答をもたらす修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）が本明細書において提供される。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、エンクリプトゲンを欠いた同等物より低い免疫原性を有する。
ある実施形態において、エンクリプトゲンは、安定性を向上させる。核酸分子及び翻訳の安定性に関してＵＴＲが果たす調節的役割についての証拠が増加している。ＵＴＲの調節的特徴は、修飾環状ポリリボヌクレオチドの安定性を向上させるために、エンクリプトゲンに含まれ得る。
ある実施形態において、５’又は３’ＵＴＲは、修飾環状ポリリボヌクレオチド中のエンクリプトゲンを構成し得る。例えば、ＵＴＲ ＡＵリッチ要素（ＡＲＥ）の除去又は修飾は、修飾環状ポリリボヌクレオチドの安定性又は免疫原性を調節するのに有用であり得る。
ある実施形態において、発現配列、例えば翻訳可能領域におけるＡＵリッチ要素（ＡＲＥ）の修飾の除去は、修飾環状ポリリボヌクレオチドの安定性又は免疫原性を調節するのに有用であり得る。
ある実施形態において、エンクリプトゲンは、ｍｉＲＮＡ結合部位又は任意の他のノンコーディングＲＮＡへの結合部位を含む。例えば、本明細書に記載される修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）へのｍｉＲ－１４２部位の組み込みは、造血細胞における発現を調節するだけではなく、修飾環状ポリリボヌクレオチドにおいてコードされるタンパク質に対する免疫応答を低下させるか又はなくすことができる。
ある実施形態において、エンクリプトゲンは、タンパク質、例えば免疫タンパク質がＲＮＡ配列に結合することを可能にする１つ以上のタンパク質結合部位を含む。タンパク質結合部位を、修飾環状ポリリボヌクレオチド中に操作することにより、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、宿主の免疫系の構成要素から修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）をマスクすることにより、宿主の免疫系を回避するか若しくは宿主の免疫系によって減少された検出を有し得、調節された分解、又は調節された翻訳を有し得る。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、例えば、免疫応答、例えばＣＴＬ応答を回避するために少なくとも１つの免疫タンパク質結合部位を含む。ある実施形態において、免疫タンパク質結合部位は、免疫タンパク質に結合し、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）を外因性であるものとしてマスクするのに役立つヌクレオチド配列である。
ある実施形態において、エンクリプトゲンは、１つ以上の修飾ヌクレオチドを含む。例示的な修飾は、糖、核酸塩基、ヌクレオシド間結合に対する（例えば、結合ホスフェート／ホスホジエステル結合／ホスホジエステル骨格に対する）任意の修飾及び修飾環状ポリリボヌクレオチドに対する免疫応答を防ぐか又は低下させ得るそれらの任意の組合せを含み得る。本明細書において提供される例示的な修飾のいくつかが以下に詳細に説明される。
ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、参照化合物、例えば修飾を欠いた修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）によって引き起こされる応答と比較して、宿主からの免疫応答を低下させるために、本明細書の他の箇所に記載される１つ以上の修飾を含む。特に、１つ以上のイノシンの追加は、ウイルスに対して内在性であるものとしてＲＮＡを区別することが示されている。例えば、全体が参照により援用されるＹｕ，Ｚ．ｅｔ ａｌ．（２０１５）ＲＮＡ ｅｄｉｔｉｎｇ ｂｙ ＡＤＡＲ１ ｍａｒｋｓ ｄｓＲＮＡ ａｓ “ｓｅｌｆ”．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２５，１２８３－１２８４を参照されたい。
ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、ｓｈＲＮＡのための１つ以上の発現配列又はｓｉＲＮＡにプロセシングされ得るＲＮＡ配列を含み、ｓｈＲＮＡ又はｓｉＲＮＡは、ＲＩＧ－１を標的にし、ＲＩＧ－１の発現を低下させる。ＲＩＧ－１は、外来性環状ＲＮＡを感知することができ、外来性環状ＲＮＡの分解をもたらす。したがって、ＲＩＧ－１標的化ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ又は任意の他の調節核酸のための配列を有する環状ポリヌクレオチドは、修飾環状ポリリボヌクレオチドに対する免疫、例えば宿主細胞免疫を低下させ得る。
ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、細胞の自然免疫応答を低下させるか、避けるか又は回避する際に修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）を補助する配列、要素又は構造を欠いている。あるこのような実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、ポリＡ配列、５’末端、３’末端、リン酸基、ヒドロキシル基、又はそれらの任意の組合せを欠き得る。
リボスイッチ
ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、１つ以上のリボスイッチを含む。
リボスイッチは、典型的に、小さい標的分子に直接結合することができる修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）の一部であると考えられ、その標的の結合がＲＮＡ翻訳、発現産物安定性及び活性に影響を与える（Ｔｕｃｋｅｒ Ｂ Ｊ，Ｂｒｅａｋｅｒ Ｒ Ｒ（２００５），Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ １５（３）：３４２－８）。したがって、リボスイッチを含む修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、その標的分子の存在又は非存在に応じて、自らの活性を調節するのに直接関与する。ある実施形態において、リボスイッチは、別個の分子に対するアプタマーのような親和性の領域を有する。したがって、本発明のより広い文脈において、非コード核酸内に含まれる任意のアプタマーは、かさ容積からの分子の隔離のために使用され得る。「（リボ）スイッチ」活性による事象の下流での報告が特に有利であり得る。
ある実施形態において、リボスイッチは、限定はされないが、転写終結、翻訳開始の阻害、ｍＲＮＡ自己切断及び真核生物におけるスプライシング経路の変更を含む遺伝子発現に影響を与え得る。リボスイッチは、トリガー分子の結合又は除去によって遺伝子発現を制御するように機能し得る。したがって、リボスイッチを含む修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）を、リボスイッチを活性化、不活性化又はブロックする条件に供して、発現を変化させる。発現は、例えば、ＲＮＡに結合するリボソームの転写の終止又はブロックの結果として変化され得る。トリガー分子又はその類似体の結合は、リボスイッチの性質に応じて、ＲＮＡ分子の発現を低下させるか若しくは防ぐか、又はＲＮＡ分子の発現を促進するか若しくは増加させ得る。リボスイッチのいくつかの例が本明細書に記載される。
環状ジ－ＧＭＰリボスイッチ、ＦＭＮリボスイッチ（ＲＦＮ要素とも呼ばれる）、ｇｌｍＳリボスイッチ、グルタミンリボスイッチ、グリシンリボスイッチ、リジンリボスイッチ（Ｌ－ｂｏｘとも呼ばれる）、ＰｒｅＱ１リボスイッチ（例えば、ＰｒｅＱ１－ｌリボスイッチ及びＰｒｅＱ１－ｌｌリボスイッチ）、プリンリボスイッチ、ＳＡＨリボスイッチ、ＳＡＭリボスイッチ、ＳＡＭ－ＳＡＨリボスイッチ、テトラヒドロ葉酸リボスイッチ、テオフィリン結合リボスイッチ、チミンピロリン酸結合リボスイッチ、Ｔ．テングコンジェンシス（Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ）ｇｌｍＳ触媒リボスイッチ、ＴＰＰリボスイッチ（ＴＨＩ－ボックスとも呼ばれる）、Ｍｏｃｏリボスイッチ、又はアデニン感知ａｄｄ－Ａリボスイッチ、これらはそれぞれ、全体が参照により本明細書に援用される国際特許公開番号国際公開第２０１９１１８９１９Ａ１号パンフレットの［０２３５］～［０２５２］に記載されている。
アプタザイム
ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、アプタザイムを含む。アプタザイムは、アプタマー領域がアロステリック制御要素として使用され、触媒ＲＮＡ（後述される「リボザイム」）の領域に結合される条件的発現のためのスイッチである。ある実施形態において、アプタザイムは、細胞型特異的翻訳において活性である。ある実施形態において、アプタザイムは、細胞状態特異的翻訳、例えばウイルス感染細胞で又はウイルス核酸若しくはウイルスタンパク質の存在下で活性である。
リボザイム（ＲＮＡ酵素又は触媒ＲＮＡとも呼ばれるリボ核酸酵素に由来する）は、化学反応を触媒するＲＮＡ分子である。
リボザイムのいくつかの非限定的な例としては、ハンマーヘッド型リボザイム、ＶＬリボザイム、リードザイム、ヘアピン型リボザイム、及び全体が参照により本明細書に援用される国際特許公開番号国際公開第２０１９１１８９１９Ａ１号パンフレットの［０２５４］～［０２５９］に記載される他のリボザイムが挙げられる。
ある実施形態において、本明細書に記載される修飾環状ＲＮＡは、ＲＮＡの転写及び複製に使用され得る。例えば、環状ＲＮＡは、ノンコーディングＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、又はｓｈＲＮＡをコードするのに使用され得る。ある実施形態において、環状ＲＮＡは、アンチセンスｍｉＲＮＡ及び転写要素を含み得る。転写後、このような環状ＲＮＡは、機能的な線状ｍｉＲＮＡを生成し得る。環状ＲＮＡ発現及び調節適用の非限定的な例が、表３に列挙される。
Figure 2022527763000004
標的結合
ある実施形態において、修飾環状ＲＮＡ（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、１つ以上の標的に結合する。一実施形態において、環状ＲＮＡは、ＤＮＡ標的及びタンパク質標的の両方に結合し、例えば、転写を媒介する。別の実施形態において、環状ＲＮＡ（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、タンパク質複合体を合わせて、例えば、シグナル伝達を媒介する。別の実施形態において、環状ＲＮＡ（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、タンパク質などの２つ以上の異なる標的に結合し、例えば、これらのタンパク質を細胞質に輸送する。ある実施形態において、医薬組成物は、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドを含み、ここで、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド；第１の標的、例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、又は細胞標的の第１の結合部分に結合するように構成される第１の結合部位を含む第１の部分（ここで、第１の結合部分は、非修飾ヌクレオチドからなる第１の環状ポリリボヌクレオチド（環状ＲＮＡ）結合モチーフである）を含み；ここで、第１の標的及びハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、複合体を形成する。ある実施形態において、医薬組成物は、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドを含み、ここで、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド；第１の標的、例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、又は細胞標的の第１の結合部分に結合するように構成される第１の結合部位を含む第１の部分（ここで、第１の結合部分は、非修飾ヌクレオチドからなる第１の環状ポリリボヌクレオチド（環状ＲＮＡ）結合モチーフである）；及び第２の標的の第２の結合部分に結合するように構成される第２の結合部位（ここで、第２の結合部分は、第２の環状ＲＮＡ結合モチーフである）を含み、第１の結合部分は、第２の結合部分と異なり、第１の標的、第２の標的、及びハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、複合体を形成し、第１の標的又は第２の標的は、マイクロＲＮＡでない。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドを含む医薬組成物であって、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド；第１の標的の第１の結合部分に結合するように構成される第１の結合部位を含む第１の部分（ここで、第１の結合部分は、第１の環状ポリリボヌクレオチド（環状ＲＮＡ）結合モチーフである）；及び第２の標的の第２の結合部分に結合するように構成される第２の結合部位（ここで、第２の結合部分は、第２の環状ＲＮＡ結合モチーフである）を含み、第１の結合部分は、第２の結合部分と異なり、第１の標的及び第２の標的は両方とも、マイクロＲＮＡである、医薬組成物。ある実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、非修飾ヌクレオチドからなる、タンパク質、ペプチド、生体分子、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は細胞標的に結合するように構成される結合部位を含む第１の部分を含む。ある実施形態において、本明細書に記載される第１の部分は、非修飾ヌクレオチドからなる、タンパク質、ペプチド、生体分子、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は細胞標的に結合するように構成される結合部位を含む。
ある実施形態において、修飾環状ＲＮＡ（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びタンパク質の少なくとも１つに結合し、それによって、細胞過程を調節する（例えば、タンパク質発現を変化させる）。ある実施形態において、合成修飾環状ＲＮＡ（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、選択されるＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク質の少なくとも１つの部分、例えば、結合部分との相互作用のための結合部位を含み、それによって、内在性同等物との結合で競合する。
一実施形態において、合成修飾環状ＲＮＡ（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、ｍｉＲＮＡを結合及び／又は隔離する。別の実施形態において、合成修飾環状ＲＮＡ（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、タンパク質を結合及び／又は隔離する。別の実施形態において、合成修飾環状ＲＮＡは、ｍＲＮＡを結合及び／又は隔離する。別の実施形態において、合成修飾環状ＲＮＡ（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、リボソームを結合及び／又は隔離する。別の実施形態において、合成修飾環状ＲＮＡ（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、修飾環状ＲＮＡを結合及び／又は隔離する。別の実施形態において、合成修飾環状ＲＮＡは、長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）又は任意の他のノンコーディングＲＮＡ、例えば、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、長鎖ノンコーディングＲＮＡ、ｓｈＲＮＡを結合及び／又は隔離する。結合及び／又は隔離部位に加えて、修飾環状ＲＮＡは、分解要素を含み得、これは、結合及び／又は隔離されたＲＮＡ及び／又はタンパク質の分解をもたらす。
一実施形態において、修飾環状ＲＮＡ（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、ｌｎｃＲＮＡ又はｌｎｃＲＮＡの配列を含み、例えば、修飾環状ＲＮＡは、天然の、非環状ｌｎｃＲＮＡ又はそのフラグメントの配列を含む。一実施形態において、ｌｎｃＲＮＡ又はｌｎｃＲＮＡの配列は、スペーサー配列を用いて又は用いずに環状化されて、合成修飾環状ＲＮＡ（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）を形成する。
一実施形態において、修飾環状ＲＮＡ（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、リボザイム活性を有する。一実施形態において、修飾環状ＲＮＡ（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、リボザイムとして作用し、病原性又は内在性ＲＮＡ、ＤＮＡ、小分子又はタンパク質を切断するのに使用され得る。一実施形態において、修飾環状ＲＮＡ（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、酵素活性を有する。一実施形態において、合成修飾環状ＲＮＡ（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、ＲＮＡ（例えば、ウイルスＲＮＡ）を特異的に認識及び切断することができる。別の実施形態において、修飾環状ＲＮＡ（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、タンパク質を特異的に認識及び切断することができる。別の実施形態において、修飾環状ＲＮＡ（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、小分子を特異的に認識及び分解することができる。
一実施形態において、修飾環状ＲＮＡ（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、自滅性（ｉｍｍｏｌａｔｉｎｇ）又は自己切断性又は切断可能修飾環状ＲＮＡである。一実施形態において、修飾環状ＲＮＡ（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、ＲＮＡ、例えば、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、長鎖ノンコーディングＲＮＡ、ｓｈＲＮＡを送達するのに使用され得る。一実施形態において、合成修飾環状ＲＮＡ（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、（１）自己切断可能要素（例えば、ハンマーヘッド型、スプライシング要素）、（２）切断動員部位（例えば、ＡＤＡＲ）、（３）分解性リンカー（グリセロール）、（４）化学的リンカー、及び／又は（５）スペーサー配列によって隔てられるマイクロＲＮＡから構成される。別の実施形態において、合成修飾環状ＲＮＡは、（１）自己切断可能要素（例えば、ハンマーヘッド型、スプライシング要素）、（２）切断動員部位（例えば、ＡＤＡＲ）、（３）分解性リンカー（グリセロール）、（４）、化学的リンカー、及び／又は（５）スペーサー配列によって隔てられるｓｉＲＮＡから構成される。
一実施形態において、修飾環状ＲＮＡは、転写／複製可能な修飾環状ＲＮＡである。この修飾環状ＲＮＡ（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、任意のタイプのＲＮＡをコードし得る。一実施形態において、合成修飾環状ＲＮＡは、アンチセンスｍｉＲＮＡ及び転写要素を有する。一実施形態において、転写後、線状機能的ｍｉＲＮＡは、修飾環状ＲＮＡ（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）から生成される。
一実施形態において、修飾環状ＲＮＡ（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、翻訳要素と組み合わせて上記の属性の１つ以上を有する。
標的
修飾環状ＲＮＡ（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、標的の結合部分のための少なくとも１つの結合部位を含む。標的としては、限定はされないが、核酸（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ－ＤＮＡハイブリッド）、小分子（例えば、薬剤）、アプタマー、ポリペプチド、タンパク質、脂質、炭水化物、抗体、ウイルス、ウイルス粒子、膜、多成分複合体、細胞、他の細胞部分、それらのいずれかのフラグメント、及びそれらの任意の組合せが挙げられる。（例えば、Ｆｒｅｄｒｉｋｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２０：４７３－７７；Ｇｕｌｌｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，（２００４）ＰＮＡＳ、１０１：８４２０－２４を参照されたい）。例えば、標的は、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、１つ以上の二本鎖領域及び１つ以上の一本鎖領域を含むＤＮＡ又はＲＮＡ、ＲＮＡ－ＤＮＡハイブリッド、小分子、アプタマー、ポリペプチド、タンパク質、脂質、炭水化物、抗体、抗体フラグメント、抗体の混合物、ウイルス粒子、膜、多成分複合体、細胞、細胞部分、その任意のフラグメント、又はそれらの任意の組合せである。
ある実施形態において、標的は、ポリペプチド、タンパク質、又はその任意のフラグメントである。例えば、標的は、精製ポリペプチド、単離ポリペプチド、融合タグ化ポリペプチド、細胞の膜ウイルス若しくはビリオンに結合されたか又はそれにわたるポリペプチド、細胞質タンパク質、細胞内タンパク質、細胞外タンパク質、キナーゼ、ホスファターゼ、アロマターゼ、ヘリカーゼ、プロテアーゼ、オキシドレダクターゼ、レダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、グリコシラーゼ、細胞外基質タンパク質、リガーゼ、イオン輸送体、チャネル、細孔（ｐｏｒｅ）、アポトーシスタンパク質、細胞接着タンパク質、病原性タンパク質、異常発現するタンパク質、転写因子、転写制御因子、翻訳タンパク質、シャペロン、分泌タンパク質、リガンド、ホルモン、サイトカイン、ケモカイン、核タンパク質、受容体、膜貫通受容体、シグナル伝達物質、抗体、膜タンパク質、内在性膜タンパク質、表在性膜タンパク質、細胞壁タンパク質、球状タンパク質、繊維状タンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質、染色体タンパク質、その任意のフラグメント、又はそれらの任意の組合せであり得る。ある実施形態において、標的は、異種ポリペプチドである。ある実施形態において、標的は、トランスフェクションなどの分子技術を用いて、細胞内で過剰発現されるタンパク質である。ある実施形態において、標的は、組み換えポリペプチドである。例えば、標的は、細菌（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））、酵母、哺乳動物、又は昆虫細胞から産生されるサンプル（例えば、生物によって過剰発現されるタンパク質）中にある。ある実施形態において、標的は、突然変異、挿入、欠失、又は多型を有するポリペプチドである。ある実施形態において、標的は、生物に免疫を与えるか、又は抗体産生などの、生物における免疫応答を生成するために使用される、ポリペプチドなどの抗原である。
ある実施形態において、標的は、抗体である。抗体は、別の分子の特定の空間的及び極性構造に特異的に結合し得る。抗体は、モノクローナル、ポリクローナル、又は組み換え抗体であり得、宿主の免疫化及び血清（ポリクローナル）の収集などの当該技術分野において周知の技術によって、又は連続ハイブリッド細胞株を調製し、分泌タンパク質（モノクローナル）を収集することによって、又は少なくとも、天然抗体の特異的結合に必要なアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、若しくはその突然変異形態をクローニングし、発現させることによって、調製され得る。天然の抗体は、ジスルフィド結合によって相互に連結される少なくとも２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を含むタンパク質であり得る。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び重鎖定常領域から構成され得る。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３から構成され得る。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び軽鎖定常領域から構成され得る。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬから構成され得る。ＶＨ及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存性の高い領域が散在する相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる高度可変領域にさらに細分され得る。各ＶＨ及びＶＬは、以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４でアミノ末端からカルボキシ末端へと配置される３つのＣＤＲ及び４つのＦＲから構成され得る。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）及び古典的な補体系の第１の成分（Ｃ１ ｑ）を含む、宿主組織又は因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。抗体は、任意のアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、クラス（例えば、ｌｇＧ１、ｌｇＧ２、ｌｇＧ３、ｌｇＧ４、ｌｇＡ１及びｌｇＡ２）、サブクラス又はその修飾形態のものであり得る。抗体は、完全な免疫グロブリン又はそのフラグメントを含み得る。抗体フラグメントは、抗原などの結合部分に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ以上のフラグメントを指し得る。さらに、特定の分子に対する結合親和性が維持される限り、免疫グロブリン又はそれらのフラグメントの凝集体、ポリマー、及びコンジュゲートも含まれる。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂフラグメント、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなる１価フラグメント；Ｆ（ａｂ）２フラグメント、ヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって連結される２つのＦａｂフラグメントを含む２価フラグメント；ＶＨ及びＣＨ１ドメインを含むＦｄフラグメント；抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖフラグメント；ＶＨドメインからなる単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）フラグメント（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４－４６）；並びに単離ＣＤＲ及びＶＬ及びＶＨ領域が対になって１価分子を形成する一本鎖フラグメント（ｓｃＦｖ）（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている；例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－２６；及びＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）ＰＮＡＳ ８５：５８７９－８３を参照されたい）が挙げられる。したがって、抗体フラグメントとしては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄＡｂなどが挙げられる。２つのドメインＶＬ及びＶＨが、別個の遺伝子によってコードされるが、それらは、組み換え方法を用いて、それらが単一のタンパク質鎖として作製されるのを可能にする人工ペプチドリンカーによって結合され得る。このような一本鎖抗体は、１つ以上の抗原結合部分を含む。これらの抗体フラグメントは、当業者に公知の従来の技術を用いて得ることができ、フラグメントは、インタクトな抗体と同じように実用性についてスクリーニングされ得る。抗体は、ヒト、ヒト化、キメラ、単離された、イヌ、ネコ、ロバ、ヒツジ、任意の植物、動物、又は哺乳動物であり得る。
ある実施形態において、標的は、リボヌクレオチド及び／又はデオキシリボヌクレオチド（アデニン、グアニン、チミン、若しくはシトシン）のポリマー形態、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）である。ＤＮＡは、線状ＤＮＡ分子（例えば、制限断片）、ウイルス、プラスミド、及び染色体に見られる二本鎖ＤＮＡを含む。ある実施形態において、ポリヌクレオチド標的は、一本鎖、二本鎖、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、染色体、遺伝子、ノンコーディングゲノム配列、ゲノムＤＮＡ（例えば、断片化ゲノムＤＮＡ）、精製ポリヌクレオチド、単離ポリヌクレオチド、ハイブリダイズされたポリヌクレオチド、転写因子結合部位、ミトコンドリアＤＮＡ、リボソームＲＮＡ、真核生物ポリヌクレオチド、原核生物ポリヌクレオチド、合成されたポリヌクレオチド、ライゲートされたポリヌクレオチド、組み換えポリヌクレオチド、核酸類似体を含有するポリヌクレオチド、メチル化ポリヌクレオチド、脱メチル化ポリヌクレオチド、その任意のフラグメント、又はそれらの任意の組合せである。ある実施形態において、標的は、組み換えポリヌクレオチドである。ある実施形態において、標的は、異種ポリヌクレオチドである。例えば、標的は、細菌（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））、酵母、哺乳動物、又は昆虫細胞から産生されるポリヌクレオチド（例えば、生物に対して異種のポリヌクレオチド）である。ある実施形態において、標的は、突然変異、挿入、欠失、又は多型を有するポリヌクレオチドである。
ある実施形態において、標的は、アプタマーである。アプタマーは、高い特異性及び親和性で、タンパク質などの結合部分に結合する単離核酸分子である。アプタマーは、その所与の標的に特異的に結合するための化学的接触を提供する特定の立体配座内に保持される３次元構造である。アプタマーは、核酸ベースの分子であるが、アプタマーと、遺伝子及びｍＲＮＡなどの他の核酸分子との間には根本的な相違がある。後者の場合、核酸構造は、その線状塩基配列を介して情報をコードし、したがって、この配列は、情報記憶の機能にとって重要である。完全に対照的に、標的分子の特異的結合に基づくアプタマー機能は、保存された線状塩基配列（ノンコーディング配列）に完全に依存するわけではなく、特定の二次／三次／四次構造に依存する。アプタマーが有し得る任意のコーディングポテンシャルは、完全に偶発的なものであり、その同族標的へのアプタマーの結合においていかなる役割も果たさない。アプタマーはまた、特定のタンパク質に結合する天然の核酸配列と区別されなければならない。これらの後者の配列は、天然の核酸（例えば、核酸結合タンパク質）の転写、翻訳、及び輸送に関与するタンパク質の特殊な下位群に結合する、生物のゲノム内に埋め込まれた天然の配列である。他方で、アプタマーは、短い、単離された、非天然の核酸分子である。核酸結合タンパク質に結合するアプタマーが特定され得るが、ほとんどの場合、このようなアプタマーは、自然における核酸結合タンパク質によって認識される配列に対する配列同一性をほとんど又は全く有さない。さらに重要なことに、アプタマーは、実質的に全てのタンパク質（核酸結合タンパク質だけではない）並びに小分子、炭水化物、ペプチドなどを含む該当するほぼ全てのパートナーに結合し得る。ほとんどのパートナーについて、タンパク質でさえ、それが結合する天然の核酸配列は存在しない。このような配列を有するパートナー、例えば、核酸結合タンパク質について、このような配列は、しっかりと結合するアプタマーと比較して、自然に使用される比較的低い結合親和性の結果として、アプタマーと異なる。アプタマーは、選択されたパートナーに特異的に結合し、パートナーの活性又は結合相互作用を調節することが可能であり、例えば、結合を介して、アプタマーは、それらのパートナーが機能する能力を遮断し得る。パートナーへの特異的結合の機能的特性は、アプタマーの固有の特性である。典型的なアプタマーは、６～３５ｋＤａのサイズ（２０～１００ヌクレオチド）であり、マイクロモル濃度からナノモル濃度以下の親和性でそのパートナーに結合し、密接に関連する標的を区別し得る（例えば、アプタマーは、同じ遺伝子ファミリーからの関連タンパク質に選択的に結合し得る）。アプタマーは、特定のパートナーと結合するために、水素結合、静電相補性、疎水性接触、及び立体排除などの一般的に見られる分子間相互作用を使用することが可能である。アプタマーは、高い特異性及び親和性、低い免疫原性、生物学的効力、及び優れた薬物動態特性を含む、治療剤及び診断剤として使用するためのいくつかの望ましい特徴を有する。アプタマーは、共有結合された相補的ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションから形成される分子ステム及びループ構造（例えば、ヘアピンループ構造）を含み得る。ステムは、ハイブリダイズされたポリヌクレオチドを含み、ループは、２つの相補的なポリヌクレオチドを共有結合する領域である。
ある実施形態において、標的は、小分子である。例えば、小分子は、大環状分子、阻害剤、薬剤、又は化学化合物であり得る。ある実施形態において、小分子は、５つ以下の水素結合供与体を含有する。ある実施形態において、小分子は、１０個以下の水素結合受容体を含有する。ある実施形態において、小分子は、５００ダルトン以下の分子量を有する。ある実施形態において、小分子は、約１８０～５００ダルトンの分子量を有する。ある実施形態において、小分子は、５以下のオクタノール－水分配係数ｌｏｐ Ｐを含む。ある実施形態において、小分子は、－０．４～５．６の分配係数ｌｏｇ Ｐを含む。ある実施形態において、小分子は、４０～１３０のモル屈折率を有する。ある実施形態において、小分子は、約２０～約７０個の原子を含有する。ある実施形態において、小分子は、１４０オングストローム２以下の極性表面積を有する。
ある実施形態において、標的は、細胞である。例えば、標的は、インタクトな細胞、化合物（例えば、薬剤）で処理された細胞、固定された細胞、溶解細胞、又はそれらの任意の組合せである。ある実施形態において、標的は、単一細胞である。ある実施形態において、標的は、複数の細胞である。
ある実施形態において、単一の標的又は複数の（例えば、２つ以上）標的は、複数の結合部分を有する。一実施形態において、単一の標的は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又はそれ以上の結合部分を有し得る。一実施形態において、標的の混合物又はライブラリーなどの２つ以上の標的は、サンプル中にあり、サンプルは、２つ以上の結合部分を含む。ある実施形態において、単一の標的又は複数の標的は、複数の異なる結合部分を含む。例えば、複数の標的は、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００、１，０００、２，０００、３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、１０，０００、１１，０００、１２，０００、１３，０００、１４，０００、１５，０００、１６，０００、１７，０００、１８，０００、１９，０００、２０，０００、２５，０００、又は３０，０００の結合部分を含み得る。
標的は、少なくとも２つの異なる結合部分を含む複数の結合部分を含み得る。例えば、結合部分は、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、２，０００、３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、１０，０００、１１，０００、１２，０００、１３，０００、１４，０００、１５，０００、１６，０００、１７，０００、１８，０００、１９，０００、２０，０００、２１，０００、２２，０００、２３，０００、２４，０００、又は２５，０００の異なる結合部分を含む複数の結合部分を含み得る。
結合部位及び結合部分
ある場合において、修飾環状ＲＮＡ（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、１つの結合部位を含む。ある実施形態において、第１の部分は、非修飾ヌクレオチドからなる、タンパク質、ペプチド、生体分子、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は細胞標的に結合するように構成される結合部位を含む。ある実施形態において、第１の部分は、非修飾ヌクレオチドからなる、タンパク質、ペプチド、生体分子、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は細胞標的、又はそれらの組合せに結合するように構成される１つ以上の結合部位を含む。ある場合において、修飾環状ＲＮＡ（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、少なくとも２つの結合部位を含む。例えば、修飾環状ＲＮＡは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、又はそれ以上の結合部位を含み得る。ある実施形態において、本明細書に記載される修飾環状ＲＮＡ（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、１つ以上の標的の１つ以上の結合部分に結合する分子足場である。各標的は、限定はされないが、異なるか又は同じ核酸（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ－ＤＮＡハイブリッド）、小分子（例えば、薬剤）、アプタマー、ポリペプチド、タンパク質、脂質、炭水化物、抗体、ウイルス、ウイルス粒子、膜、多成分複合体、細胞、細胞部分、それらのいずれかのフラグメント、及びそれらの任意の組合せであり得る。ある実施形態において、１つ以上の結合部位は、同じ標的の１つ以上の結合部分に結合する。ある実施形態において、１つ以上の結合部位は、異なる標的の１つ以上の結合部分に結合する。ある実施形態において、修飾環状ＲＮＡは、１つ以上の標的の１つ以上の結合部分のための足場として働く。ある実施形態において、修飾環状ＲＮＡ（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、１つ以上の標的の１つ以上の結合部分に特異的に結合することによって、細胞過程を調節する。ある実施形態において、本明細書に記載される修飾環状ＲＮＡ（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、対象とする１つ以上の特異的標的のための結合部位を含む。ある実施形態において、修飾環状ＲＮＡ（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、対象とする各結合部分のための複数の結合部位又は結合部位の組合せを含む。例えば、修飾環状ＲＮＡ（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、ＤＮＡ又はＲＮＡなどのポリヌクレオチド標的のための結合部位を含む。例えば、修飾環状ＲＮＡ（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、ｍＲＮＡ標的のための結合部位を含む。例えば、修飾環状ＲＮＡ（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、ｒＲＮＡ標的のための結合部位を含む。例えば、修飾環状ＲＮＡは、ｔＲＮＡ標的のための結合部位を含む。例えば、修飾環状ＲＮＡ（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、ゲノムＤＮＡ標的のための結合部位を含む。
ある場合において、修飾環状ＲＮＡ（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、一本鎖ＤＮＡにおける結合部分のための結合部位を含む。ある場合において、修飾環状ＲＮＡ（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、二本鎖ＤＮＡにおける結合部分のための結合部位を含む。ある場合において、修飾環状ＲＮＡ（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、抗体における結合部分のための結合部位を含む。ある場合において、修飾環状ＲＮＡ（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、ウイルス粒子における結合部分のための結合部位を含む。ある場合において、修飾環状ＲＮＡ（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、小分子における結合部分のための結合部位を含む。ある場合において、修飾環状ＲＮＡ（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、細胞内又は細胞における結合部分のための結合部位を含む。ある場合において、修飾環状ＲＮＡ（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、ＲＮＡ－ＤＮＡハイブリッドにおける結合部分のための結合部位を含む。ある場合において、修飾環状ＲＮＡ（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、メチル化ポリヌクレオチドにおける結合部分のための結合部位を含む。ある場合において、修飾環状ＲＮＡ（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、非メチル化ポリヌクレオチドにおける結合部分のための結合部位を含む。ある場合において、修飾環状ＲＮＡ（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、アプタマーにおける結合部分のための結合部位を含む。ある場合において、修飾環状ＲＮＡ（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、ポリペプチドにおける結合部分のための結合部位を含む。ある場合において、修飾環状ＲＮＡ（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、ポリペプチド、タンパク質、タンパク質フラグメント、タグ化タンパク質、抗体、抗体フラグメント、小分子、ウイルス粒子（例えば、膜貫通タンパクを含むウイルス粒子）、又は細胞における結合部分のための結合部位を含む。
ある場合において、結合部分は、少なくとも２つのアミド結合を含む。ある場合において、結合部分は、ホスホジエステル結合を含まない。ある場合において、結合部分は、ＤＮＡ又はＲＮＡでない。
本明細書において提供される修飾環状ＲＮＡ（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、複合体における結合部分のための１つ以上の結合部位を含み得る。本明細書において提供される修飾環状ＲＮＡ（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、複合体を形成するために、標的のための１つ以上の結合部位を含み得る。本明細書において提供される修飾環状ＲＮＡ（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、修飾環状ＲＮＡ（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）と標的との間に複合体を形成し得る。ある実施形態において、修飾環状ＲＮＡ（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、単一の標的と複合体を形成する。ある実施形態において、修飾環状ＲＮＡ（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、２つ以上の標的の複合体と複合体を形成する。ある実施形態において、修飾環状ＲＮＡ（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、３つ以上の標的の複合体と複合体を形成する。ある実施形態において、２つ以上の修飾環状ＲＮＡ（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、単一の標的と複合体を形成する。ある実施形態において、２つ以上の修飾環状ＲＮＡ（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、２つ以上の標的と複合体を形成する。ある実施形態において、第１の修飾環状ＲＮＡ（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、第１の標的の第１の結合部分及び第２の標的の第２の異なる結合部分と複合体を形成する。ある実施形態において、第１の修飾環状ＲＮＡ（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、第１の標的の第１の結合部分と複合体を形成し、第２の修飾環状ＲＮＡ（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、第２の標的の第２の結合部分と複合体を形成する。
ある実施形態において、修飾環状ＲＮＡ（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、１つ以上の抗体－ポリペプチド複合体、ポリペプチド－ポリペプチド複合体、ポリペプチド－ＤＮＡ複合体、ポリペプチド－ＲＮＡ複合体、ポリペプチド－アプタマー複合体、ウイルス粒子－抗体複合体、ウイルス粒子－ポリペプチド複合体、ウイルス粒子－ＤＮＡ複合体、ウイルス粒子－ＲＮＡ複合体、ウイルス粒子－アプタマー複合体、細胞－抗体複合体、細胞－ポリペプチド複合体、細胞－ＤＮＡ複合体、細胞－ＲＮＡ複合体、細胞－アプタマー複合体、小分子－ポリペプチド複合体、小分子－ＤＮＡ複合体、小分子－アプタマー複合体、小分子－細胞複合体、小分子－ウイルス粒子複合体、及びそれらの組合せにおける１つ以上の結合部分のための結合部位を含み得る。
ある場合において、結合部分は、ポリペプチド、タンパク質、又はそのフラグメント上にある。ある実施形態において、結合部分は、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域、又はポリペプチド、タンパク質、若しくはそのフラグメントの一部を含む。例えば、結合部分は、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域、又は単離ポリペプチド、細胞のポリペプチド、精製ポリペプチド、若しくは組み換えポリペプチドの一部を含む。例えば、結合部分は、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域、又は抗体若しくはそのフラグメントの一部を含む。例えば、結合部分は、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域、又は転写因子の一部を含む。例えば、結合部分は、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域、又は受容体の一部を含む。例えば、結合部分は、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域、又は膜貫通受容体の一部を含む。結合部分は、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域、又は単離、精製、及び／若しくは組み換えポリペプチドの一部の上にあるか又はそれらを含み得る。結合部分は、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域、又は分析物（例えば、溶解物）の混合物の一部の上にある結合部分又はそれらを含む。例えば、結合部分は、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域、又は複数の細胞に由来するか若しくは単一細胞の溶解物に由来する部分上にあるか又はそれらを含む。
ある場合において、結合部分は、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域、若しくは小分子の一部の上にあるか又はそれらを含む。例えば、結合部分は、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域、若しくは薬剤の一部の上にあるか又はそれらを含む。例えば、結合部分は、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域、若しくは化合物の一部の上にあるか又はそれらを含む。例えば、結合部分は、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域、若しくは有機化合物の一部の上にあるか又はそれらを含む。ある場合において、結合部分は、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域、又は９００ダルトン以下の分子量を有する小分子の一部の上にあるか又はそれらを含む。ある場合において、結合部分は、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域、若しくは５００ダルトン以上の分子量を有する小分子の一部の上にあるか又はそれらを含む。結合部分は、例えば、組合せ手段によって生成される化合物のライブラリー、すなわち、化合物多様性コンビナトリアルライブラリーを含む、天然又は合成分子のライブラリーから得られる。コンビナトリアルライブラリー、並びにそれらの生成及びスクリーニングのための方法は、当該技術分野において公知であり、米国特許第５，７４１，７１３号明細書；同第５，７３４，０１８号明細書；同第５，７３１，４２３号明細書；同第５，７２１，０９９号明細書；同第５，７０８，１５３号明細書；同第５，６９８，６７３号明細書；同第５，６８８，９９７号明細書；同第５，６８８，６９６号明細書；同第５，６８４，７１１号明細書；同第５，６４１，８６２号明細書；同第５，６３９，６０３号明細書；同第５，５９３，８５３号明細書；同第５，５７４，６５６号明細書；同第５，５７１，６９８号明細書；同第５，５６５，３２４号明細書；同第５，５４９，９７４号明細書；同第５，５４５，５６８号明細書；同第５，５４１，０６１号明細書；同第５，５２５，７３５号明細書；同第５，４６３，５６４号明細書；同第５，４４０，０１６号明細書；同第５，４３８，１１９号明細書；及び同第５，２２３，４０９号明細書に記載されており、これらの開示内容は、参照により本明細書に援用される。
結合部分は、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域、若しくは特異的結合対のメンバー（例えば、リガンド）の一部の上にあるか又はそれらを含み得る。結合部分は、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域、又は１価（モノエピトープ（ｍｏｎｏｅｐｉｔｏｐｉｃ））若しくは多価（ポリエピトープ（ｐｏｌｙｅｐｉｔｏｐｉｃ））の部分の上にあるか又はそれらを含み得る。結合部分は、抗原性又はハプテン性であり得る。結合部分は、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域、又は少なくとも１つの共通のエピトープ若しくは決定基を共有する単一の分子若しくは複数の分子の部分の上にあるか又はそれらを含み得る。結合部分は、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域、又は細胞（例えば、細菌細胞、植物細胞、若しくは動物細胞）の部分の一部の上にあるか又はそれらを含み得る。結合部分は、自然な環境（例えば、組織）、培養細胞、又は微生物（例えば、細菌、真菌、原生動物、若しくはウイルス）、又は溶解細胞中のいずれかにあり得る。結合部分は、（例えば、化学的に）修飾されて、限定はされないが、色素（例えば、蛍光色素）、リン酸基、炭水化物基などのポリペプチド修飾部分、又はメチル基などのポリヌクレオチド修飾部分などの１つ以上のさらなる結合部位を提供し得る。
ある場合において、結合部分は、宿主由来のサンプルに見られる、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域、又は分子の一部の上にあるか又はそれらを含む。宿主由来のサンプルは、体液（例えば、尿、血液、血漿、血清、唾液、精液、便、唾液、脳脊髄液、涙液、粘液など）を含む。サンプルは、直接調べられ得、又は結合部分をより容易に検出可能にするように前処理されてもよい。サンプルは、生物又は元生物に由来するある量の物質を含む。サンプルは、天然、組み換え、合成、又は非天然であり得る。結合部分は、細胞溶解物又は細胞培養培地、インビトロ翻訳サンプル、又はサンプル（例えば、細胞溶解物）由来の免疫沈降において、自然に又は組み換えにより細胞から発現される上記のいずれかであり得る。
ある場合において、標的の結合部分は、無細胞系又はインビトロで発現される。例えば、標的の結合部分は、細胞抽出物中にある。ある場合において、標的の結合部分は、ＤＮＡ鋳型、並びに転写及び翻訳用の試薬と共に細胞抽出物中にある。使用され得る細胞抽出物の例示的な供給源としては、小麦胚芽、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、ウサギ網状赤血球、超好熱菌、ハイブリドーマ、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞、昆虫細胞、及び哺乳類細胞（例えば、ヒト細胞）が挙げられる。標的ポリペプチドを発現させる（例えば、アレイ上に標的ポリペプチドを生成する）のに使用され得る例示的な無細胞方法としては、タンパク質インサイチュアレイ（ＰＩＳＡ）、複数スポッティング技術（ＭＩＳＴ）、自己集合ｍＲＮＡ翻訳、核酸プログラム可能タンパク質アレイ（ＮＡＰＰＡ）、ナノウェルＮＡＰＰＡ、ＤＮＡアレイからタンパク質アレイ（ＤＡＰＡ）、膜フリーＤＡＰＡ、ナノウェルコピー及びμＩＰ－マイクロインタリオプリント（ｍｉｃｒｏｉｎｔａｇｌｉｏ ｐｒｉｎｔｉｎｇ）、及びｐＭＡＣ－タンパク質マイクロアレイコピーが挙げられる（Ｋｉｌｂ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｇ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．２０１４，１４，３５２－３６４を参照されたい）。
ある場合において、標的の結合部分は、ＤＮＡ鋳型からインサイチュで（例えば、並んだ固体基質上で）合成される。ある場合において、複数の結合部分は、並行して又は単一の反応において、複数の対応するＤＮＡ鋳型からインサイチュで合成される。インサイチュの標的ポリペプチド発現のための例示的な方法としては、Ｓｔｅｖｅｎｓ、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ８（９）：Ｒ１７７－Ｒ１８５（２０００）；Ｋａｔｚｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３（３）：１５０－６．（２００５）；Ｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９（１）：４－９．（２００８）；Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０５（５６８０）：８６－９０．（２００４）；Ｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２９（１５）：Ｅ７３－３（２００１）；Ａｎｇｅｎｅｎｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ５（９）：１６５８－６６（２００６）；Ｔａｏ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２４（１０）：１２５３－４（２００６）；Ａｎｇｅｎｅｎｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７６（７）：１８４４－９（２００４）；Ｋｉｎｐａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３６（２）：１４９－５４（２００４）；Ｔａｋｕｌａｐａｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ．１１（８）：４３８２－９１（２０１２）；Ｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ５（２）：１７５－７（２００８）；Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ ａｎｄ Ｊ．ＬａＢａｅｒ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ １７（４）：３３４－３３６（２００６）；Ｈｅ ａｎｄ Ｗａｎｇ，Ｂｉｏｍｏｌ Ｅｎｇ ２４（４）：３７５－８０（２００７）；及びＨｅ ａｎｄ Ｔａｕｓｓｉｇ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２７４（１－２）：２６５－７０（２００３）に記載されるものが挙げられる。
ある場合において、核酸標的の結合部分は、少なくとも６ヌクレオチド、例えば、少なくとも８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０、又は１００ヌクレオチドの範囲を含む。ある場合において、タンパク質標的の結合部分は、ヌクレオチドの連続した区間を含む。ある場合において、タンパク質標的の結合部分は、ヌクレオチドの不連続の区間を含む。ある場合において、核酸標的の結合部分は、核酸配列中のヌクレオチドの欠失、付加、交換（ｓｗａｐ）、又は切断を含む、突然変異又は機能的突然変異の部位を含む。
ある場合において、タンパク質標的の結合部分は、少なくとも６アミノ酸、例えば、少なくとも８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０、又は１００アミノ酸の範囲を含む。ある場合において、タンパク質標的の結合部分は、アミノ酸の連続した区間を含む。ある場合において、タンパク質標的の結合部分は、アミノ酸の不連続の区間を含む。ある場合において、タンパク質標的の結合部分は、ポリペプチド配列中のアミノ酸の欠失、付加、交換、又は切断を含む、突然変異又は機能的突然変異の部位を含む。
ある実施形態において、結合部分は、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域、若しくは膜結合タンパク質の一部の上にあるか又はそれらを含む。例示的な膜結合タンパク質としては、限定はされないが、ＧＰＣＲ（例えば、アドレナリン受容体、アンジオテンシン受容体、コレシストキニン受容体、ムスカリン性アセチルコリン受容体、ニューロテンシン受容体、ガラニン受容体、ドーパミン受容体、オピオイド受容体、セロトニン受容体、ソマトスタチン受容体など）、イオンチャネル（例えば、ニコチン性アセチルコリン受容体、ナトリウムチャネル、カリウムチャネルなど）、受容体チロシンキナーゼ、受容体セリン／トレオニンキナーゼ、受容体グアニル酸シクラーゼ、成長因子及びホルモン受容体（例えば、上皮成長因子（ＥＧＦ）受容体）、及びその他が挙げられる。結合部分はまた、ドメイン、フラグメント、エピトープ、領域、又は膜結合タンパク質の突然変異体若しくは修飾変異体の一部の上にあるか又はそれらを含み得る。例えば、ＧＰＣＲのある１つ又は複数の点突然変異は、機能を保持し、疾患に関与する（例えば、Ｓｔａｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗ １８：４３０－３７を参照されたい）。
ある実施形態において、修飾環状ＲＮＡ（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、他の細胞内分子に結合するための他の結合モチーフを含み得る。修飾環状ＲＮＡ（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）適用の非限定的な例が、表４に列挙される。
Figure 2022527763000005
ＲＮＡ結合部位
ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、１つ以上のＲＮＡ結合部位を含む。ある実施形態において、第１の部分は、非修飾ヌクレオチドからなる１つ以上のＲＮＡ結合部位を含む。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、内在性遺伝子及び／又は外来性遺伝子の発現を調節するＲＮＡ結合部位を含む。ある実施形態において、ＲＮＡ結合部位は、宿主遺伝子の発現を調節する。ＲＮＡ結合部位は、内在性遺伝子にハイブリダイズする配列（例えば、本明細書に記載されるｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｇＲＮＡのための配列）、ウイルスＤＮＡ若しくはＲＮＡなどの外因性核酸にハイブリダイズする配列、ＲＮＡにハイブリダイズする配列、遺伝子転写に干渉する配列、ＲＮＡ翻訳に干渉する配列、ＲＮＡを安定させるか若しくは分解を標的にすることなどによってＲＮＡを不安定にする配列、又はＤＮＡ－又はＲＮＡ結合因子を調節する配列を含み得る。
ある実施形態において、ＲＮＡ結合部位は、ｔＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｌｉｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｅｘＲＮＡ、ｓｃａＲＮＡ、Ｙ ＲＮＡ、及びｈｎＲＮＡ結合部位のうちの１つであり得る。ＲＮＡ結合部位は、当業者に周知である。
特定のＲＮＡ結合部位が、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の生物学的プロセスを介して遺伝子発現を阻害することができる。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチドは、典型的に１５～５０塩基対（約１８～２５塩基対など）を有し、且つ細胞内で発現される標的遺伝子中のコード配列と同一の（相補的な）若しくはほぼ同一の（実質的に相補的な）核酸塩基配列を有するＲＮＡ又はＲＮＡ様構造を有するＲＮＡｉ分子を含む。ＲＮＡｉ分子としては、限定はされないが、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、メロ二本鎖（ｍｅｒｏｄｕｐｌｅｘ）、及びダイサー基質（ｄｉｃｅｒ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）が挙げられる。
ある実施形態において、ＲＮＡ結合部位は、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡを含む。ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡは、内在性ｍｉＲＮＡ遺伝子のプロセシング経路中の中間体に類似している。ある実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡとして機能することができ、逆も同様である。ｓｉＲＮＡのようなマイクロＲＮＡは、ＲＩＳＣを用いて、標的遺伝子を下方制御するが、ｓｉＲＮＡと異なり、ほとんどの動物ｍｉＲＮＡは、ｍＲＮＡを切断しない。代わりに、ｍｉＲＮＡは、翻訳抑制又はポリＡ除去及びｍＲＮＡ分解によってタンパク質出力を減少させる。公知のｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍＲＮＡ ３’－ＵＴＲ内にあり；ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡの５’末端からのヌクレオチド２～８に対してほぼ完全な相補性を有する部位を標的にするようである。この領域は、シード領域として知られている。ｓｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡは、置き換え可能であるため、外因性ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡとのシード相補性を有するｍＲＮＡを下方制御することができる。３’－ＵＴＲ内の複数の標的部位は、より強い下方制御を与えることができる。
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、核酸分子の３’－ＵＴＲに結合し、核酸分子安定性を低下させるか又は翻訳を阻害することによって遺伝子発現を下方制御する短鎖ノンコーディングＲＮＡである。修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、１つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列、ｍｉＲＮＡ配列、又はｍｉＲＮＡシードを含み得る。このような配列は、任意のｍｉＲＮＡに対応し得る。
ｍｉＲＮＡ配列は、「シード」領域、すなわち、成熟ｍｉＲＮＡの２～８位の領域中の配列を含み、この配列は、ｍｉＲＮＡ標的配列に対するワトソン・クリック相補性を有する。ｍｉＲＮＡシードは、成熟ｍｉＲＮＡの２～８又は２～７位を含み得る。ある実施形態において、ｍｉＲＮＡシードは、７個のヌクレオチド（例えば、成熟ｍｉＲＮＡのヌクレオチド２～８）を含み得、ここで、対応するｍｉＲＮＡ標的におけるシード相補的部位は、ｍｉＲＮＡ１位と反対のアデニン（Ａ）に隣接する。ある実施形態において、ｍｉＲＮＡシードは、６個のヌクレオチド（例えば、成熟ｍｉＲＮＡのヌクレオチド２～７）を含み得、対応するｍｉＲＮＡ標的におけるシード相補的部位は、ｍｉＲＮＡ１位と反対のアデニン（Ａ）に隣接する。
ｍｉＲＮＡシードの塩基は、標的配列と実質的に相補性であり得る。ｍｉＲＮＡ標的配列を修飾環状ポリリボヌクレオチド中に操作することにより、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、宿主の免疫系を回避するか若しくは宿主の免疫系によって検出され得、調節された分解、又は調節された翻訳を有し得る。このプロセスは、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）送達時のオフターゲット効果の危険を低下させる。
修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、標的遺伝子の約５～約２５連続ヌクレオチドと同一のｍｉＲＮＡ配列を含み得る。ある実施形態において、ｍｉＲＮＡ配列は、ｍＲＮＡを標的にし、ジヌクレオチドＡＡで開始し、約３０％～７０％、約３０％～６０％、約４０％～６０％、又は約４５％～５５％のＧＣ－含量を含み、例えば標準的なＢＬＡＳＴ検索によって決定した際、それが導入されるべきである哺乳動物のゲノム中の標的以外の任意のヌクレオチド配列との高いパーセンテージの同一性を有さない。
逆に、ｍｉＲＮＡ結合部位は、特定の組織におけるタンパク質発現を調節するために、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）から出るように操作され得る（すなわち、そのような修飾環状ポリリボヌクレオチドから除去され得る）。複数の組織における発現の調節は、導入若しくは除去又は１つ若しくはいくつかのｍｉＲＮＡ結合部位を通して行われ得る。
ｍｉＲＮＡがｍＲＮＡを調節し、それによってタンパク質発現を調節することが知られている組織の例としては、限定はされないが、肝臓（ｍｉＲ－１２２）、筋肉（ｍｉＲ－１３３、ｍｉＲ－２０６、ｍｉＲ－２０８）、内皮細胞（ｍｉＲ－１７－９２、ｍｉＲ－１２６）、骨髄細胞（ｍｉＲ－１４２－３ｐ、ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｍｉＲ－１６、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－２２３、ｍｉＲ－２４、ｍｉＲ－２７）、脂肪組織（ｌｅｔ－７、ｍｉＲ－３０ｃ）、心臓（ｍｉＲ－ｌｄ、ｍｉＲ－１４９）、腎臓（ｍｉＲ－１９２、ｍｉＲ－１９４、ｍｉＲ－２０４）、及び肺上皮細胞（ｌｅｔ－７、ｍｉＲ－１３３、ｍｉＲ－１２６）が挙げられる。ＭｉＲＮＡは、血管新生（ｍｉＲ－１３２）などの複雑な生物学的プロセスも調節し得る。本明細書に記載される修飾環状ポリリボヌクレオチドにおいて、このようなプロセスに関与するｍｉＲＮＡの結合部位は、生物学的に関連する細胞型に対して又は関連する生物学的プロセスに関連して、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）からの発現を調整するために除去又は導入され得る。ある実施形態において、ｍｉＲＮＡ結合部位は、例えば、ｍｉＲ－７を含む。
様々な細胞型のｍｉＲＮＡの発現パターンの理解により、本明細書に記載される修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、特定の細胞型で又は特定の生物学的条件下のみでのより標的化された発現のために操作され得る。組織特異的ｍｉＲＮＡ結合部位の導入により、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、組織において又は生物学的条件に関連して最適なタンパク質発現のために設計され得る。
さらに、ｍｉＲＮＡシード部位は、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）に組み込まれて、生物学的改善をもたらす、特定の細胞における発現を調節することができる。この例は、ｍｉＲ－１４２部位の組み込みである。本明細書に記載される修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）へのｍｉＲ－１４２部位の組み込みは、造血細胞における発現を調節し得るだけではなく、修飾環状ポリリボヌクレオチドにおいてコードされるタンパク質に対する免疫応答を低下させるか又はなくすこともできる。
ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ、例えば、２、３、４、５、６、又はそれ以上を含む。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、ヌクレオチド配列のいずれか１つ又は標的配列に対して相補的な配列との少なくとも約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は１００％のヌクレオチド配列同一性を有するｍｉＲＮＡを含む。
公知のｍｉＲＮＡ配列の一覧は、調査機関、例えば、Ｗｅｌｌｃｏｍｅ Ｔｒｕｓｔ Ｓａｎｇｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｐｅｎｎ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｓｌｏａｎ Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ、及びＥｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙによって維持されているデータベースにおいて見られる。ＲＮＡｉ分子は、当該技術分野において公知の技術によって容易に設計及び生成され得る。さらに、コンピューターによる手段を用いて、有効及び特定の配列モチーフを決定することができる。
ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、長鎖ノンコーディングＲＮＡを含む。長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）は、１００ヌクレオチドより長い非タンパク質コード転写産物を含む。より長い長さは、ｌｎｃＲＮＡを、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、及び他の短鎖ＲＮＡなどの小分子調節ＲＮＡと区別する。一般に、大部分（約７８％）のｌｎｃＲＮＡは、組織特異的であると特徴付けられる。近傍のタンパク質コード遺伝子（哺乳動物ゲノム中の全ｌｎｃＲＮＡの約２０％というかなりの割合を占める）と反対方向に転写される分岐ｌｎｃＲＮＡが、近傍の遺伝子の転写を調節し得る。
ＲＮＡ結合部位の長さは、約５～３０ヌクレオチド、約１０～３０ヌクレオチド、又は約１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、若しくはそれ以上のヌクレオチドであり得る。対象とする標的とのＲＮＡ結合部位の同一性の程度は、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％であり得る。
ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、１つ以上の大きい遺伝子間ノンコーディングＲＮＡ（ｌｉｎｃＲＮＡ）結合部位を含む。ＬｉｎｃＲＮＡは、長鎖ノンコーディングＲＮＡの大部分を構成する。ＬｉｎｃＲＮＡは、ノンコーディング転写産物であり、ある実施形態において、約２００ヌクレオチドを超える長さである。ある実施形態において、ｌｉｎｃＲＮＡは、タンパク質コード遺伝子と類似のエクソン－イントロン－エクソン構造を有するが、オープンリーディングフレームを包含せず、タンパク質をコードしない。ＬｉｎｃＲＮＡ発現は、コード遺伝子と比較して著しく組織特異的であり得る。ＬｉｎｃＲＮＡは、隣接するタンパク質コード遺伝子の対のものと同程度にではあるが、典型的にそれらの隣接する遺伝子と共発現される。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、環状化ｌｉｎｃＲＮＡを含む。
ある実施形態において、本明細書に開示される修飾環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上のｌｉｎｃＲＮＡ、例えば、ＦＩＲＲＥ、ＬＩＮＣ００９６９、ＰＶＴ１、ＬＩＮＣ０１６０８、ＪＰＸ、ＬＩＮＣ０１５７２、ＬＩＮＣ００３５５、Ｃ１ｏｒｆ１３２、Ｃ３ｏｒｆ３５、ＲＰ１１－７３４、ＬＩＮＣ０１６０８、ＣＣ－４９９Ｂ１５．５、ＣＡＳＣ１５、ＬＩＮＣ００９３７、及びＲＰ１１－１９１を含む。
公知のｌｉｎｃＲＮＡ及びｌｎｃＲＮＡ配列の一覧は、調査機関、例えば、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ａｎｄ Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｄｉａｍａｎｔｉｎａ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ａｔ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄ、Ｇｈｅｎｔ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、及びＳｕｎ Ｙａｔ－ｓｅｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙによって維持されているデータベースにおいて見られる。ＬｉｎｃＲＮＡ及びｌｎｃＲＮＡ分子は、当該技術分野において公知の技術によって容易に設計及び生成され得る。さらに、コンピューターによる手段を用いて、有効及び特定の配列モチーフを決定することができる。
ＲＮＡ結合部位は、内在性遺伝子又は遺伝子産物（例えば、ｍＲＮＡ）の全て又はフラグメントに対して実質的に相補的な又は完全に相補的な配列を含み得る。相補的な配列は、イントロンとエクソンとの間の境界にある配列を補完して、転写のためのｍＲＮＡへの、特定の遺伝子の新たに生成された核ＲＮＡ転写産物の成熟を防止し得る。相補的な配列は、その遺伝子のためのｍＲＮＡとハイブリダイズすることによって遺伝子に特異的であり得、その翻訳を防止し得る。ＲＮＡ結合部位は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はそれらの誘導体若しくはハイブリッドなどの、内在性遺伝子又は遺伝子産物の全て又はフラグメントに対してアンチセンス又は実質的にアンチセンスである配列を含み得る。
ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、典型的に、約５～５０００塩基対（特定のＲＮＡ構造に応じて、例えば、ｍｉＲＮＡ５～３０ｂｐ、ｌｎｃＲＮＡ２００～５００ｂｐ）のＲＮＡ又はＲＮＡ様構造を有し、細胞内で発現される標的遺伝子中のコード配列と同一の（相補的な）又はほぼ同一の（実質的に相補的な）核酸塩基配列を有するＲＮＡ結合部位を含む。
ＤＮＡ結合部位
ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）のための配列などのＤＮＡ結合部位を含む。ある実施形態において、第１の部分は、非修飾ヌクレオチドからなる１つ以上のＤＮＡ結合部位を含む。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、ガイドＲＮＡ又はｇＲＮＡ配列に対する相補体を含む。ｇＲＮＡ短鎖合成ＲＮＡは、不完全なエフェクター部分に結合するのに必要な「足場」配列及びゲノム標的のためのユーザー定義の約２０ヌクレオチド標的化配列から構成される。ガイドＲＮＡ配列は、１７～２４ヌクレオチド（例えば、１９、２０、又は２１ヌクレオチド）の長さを有し、標的化核酸配列に対して相補的であり得る。カスタムｇＲＮＡジェネレータ及びアルゴリズムは、有効なガイドＲＮＡの設計に使用され得る。遺伝子編集は、天然ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体を模倣し、ｔｒａｃｒＲＮＡ（ヌクレアーゼに結合するため）及び少なくとも１つのｃｒＲＮＡ（編集のために標的化される配列にヌクレアーゼをガイドするため）の両方を含有する改変された（合成）単一ＲＮＡ分子であるキメラ「シングルガイドＲＮＡ」（「ｓｇＲＮＡ」）を用いて行われ得る。化学修飾されたｓｇＲＮＡは、ゲノム編集に有効であり得る。
ｇＲＮＡは、特定のＤＮＡ配列（例えば、遺伝子のプロモータ、エンハンサー、サイレンサー、若しくはリプレッサーに隣接するか又はそれらの中にある配列）を認識し得る。
ある実施形態において、ｇＲＮＡは、遺伝子編集のためのＣＲＩＳＰＲシステムの一部である。遺伝子編集のために、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、所望の標的ＤＮＡ配列に対応する１つ又は複数のガイドＲＮＡ配列を含むように設計され得る。ｇＲＮＡ配列は、ＤＮＡを切断するために、Ｃａｓ９又は他のエキソヌクレアーゼとの相互作用のために、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、又はそれ以上のヌクレオチドを含み得、例えば、Ｃｐｆ１が、検出可能なＤＮＡ切断のために、ｇＲＮＡ配列の少なくとも約１６ヌクレオチドと相互作用する。
ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、二本鎖ＤＮＡにおける主溝に結合する配列を含む。１つのこのような場合、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）及び二本鎖ＤＮＡによって生じる三つ組構造の特異性及び安定性は、フーグスティーン型水素結合によって得られ、これは、二本鎖ＤＮＡにおける古典的なワトソン・クリック塩基対合において形成されるものと異なる。一例において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、主溝を介して標的二本鎖のプリンリッチ鎖に結合する。
ある実施形態において、三つ組形成は、標的二本鎖のプリンリッチ鎖と比べて、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）の配向によって区別される２つのモチーフにおいて起こる。ある場合において、修飾環状ポリリボヌクレオチド中のポリピリミジン配列区間が、平行に（すなわち、二本鎖のプリンリッチ鎖と同じ５’から３’の配向で）フーグスティーン型水素結合を介して二本鎖ＤＮＡのポリプリン配列区間に結合する一方、ポリプリン区間（Ｒ）は、逆フーグスティーン型水素結合を介して二本鎖のプリン鎖に逆平行に結合する。逆平行において、プリンモチーフは、Ｇ：Ｇ－Ｃ、Ａ：Ａ－Ｔ、又はＴ：Ａ－Ｔの三つ組を含む一方；平行において、ピリミジンモチーフは、Ｃ＋：Ｇ－Ｃ又はＴ：Ａ－Ｔ三つ組（ここで、Ｃ＋が、Ｎ３位におけるプロトン化シトシンを表す）の標準的な三つ組を含む。修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）中の逆平行ＧＡ及びＧＴ配列は、中性ｐＨで安定した三つ組を形成し得る一方、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）中の平行ＣＴ配列は、酸性ｐＨで結合し得る。修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）中のシトシンにおけるＮ３は、プロトン化され得る。５－メチル－ＣによるＣの置換は、５－メチル－Ｃがシトシンより高いｐＫを有するため、生理的ｐＨで、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）中のＣＴ配列の結合を可能にし得る。少なくとも１０塩基対のプリン及びピリミジンモチーフの両方について、連続したホモプリン－ホモピリミジン配列区間は、二本鎖ＤＮＡへの修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）の結合を補助するが、これは、より短い三つ組は、生理的条件下で不安定であり得、配列の中断は、三つ組構造を不安定にし得るためである。ある実施形態において、三つ組形成のためのＤＮＡ二本鎖標的は、１つの鎖中に連続したプリン塩基を含む。ある実施形態において、三つ組形成のための標的は、ＤＮＡ二本鎖の１つの鎖中にホモプリン配列及び相補鎖中にホモピリミジン配列を含む。
ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）を含む三つ組は、安定した構造である。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）を含む三つ組は、例えば、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、若しくはそれ以上増加される、増加した半減期、例えば、少なくとも約１時間～約３０日間、又は少なくとも約２時間、６時間、１２時間、１８時間、２４時間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、２０日間、２１日間、２２日間、２３日間、２４日間、２５日間、２６日間、２７日間、２８日間、２９日間、３０日間、６０日間、若しくはそれ以上又はそれらの間の任意の時間にわたって持続性を示す。
タンパク質結合部位
ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、１つ以上のタンパク質結合部位を含む。ある実施形態において、第１の部分は、非修飾ヌクレオチドからなる１つ以上のタンパク質結合部位を含む。一実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、参照化合物、例えば、タンパク質結合部位、例えば、線状ＲＮＡを欠いた修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）によって引き起こされる応答と比較して、宿主からの免疫応答を低下させるタンパク質結合部位を含む。
ある実施形態において、本明細書に開示される修飾環状ポリリボヌクレオチドは、タンパク質、例えば、リボソームに結合する１つ以上のタンパク質結合部位を含む。タンパク質結合部位、例えば、リボソーム結合部位を、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）中に操作することにより、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、宿主の免疫系を回避するか若しくは宿主の免疫系によって減少された検出を有し得、調節された分解、又は調節された翻訳を有し得る。
ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、例えば、宿主の免疫系の構成要素から修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）をマスクする、例えば、ＣＴＬ応答を回避するために、少なくとも１つの免疫タンパク質結合部位を含む。ある実施形態において、免疫タンパク質結合部位は、免疫タンパク質に結合し、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）を非内在性であるものとしてマスクするのに役立つヌクレオチド配列である。
線状ＲＮＡへのリボソームのかみ合いの従来の機構は、ＲＮＡのキャップされた５’末端に結合するリボソームを含む。５’末端から、リボソームが開始コドンに移動すると直ちに第１のペプチド結合が形成される。本発明によれば、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）の翻訳の内部の開始（すなわちキャップ非依存的）は、遊離末端又はキャップされた末端を必要としない。むしろ、リボソームは、非キャップ内部部位に結合し、それにより、リボソームは、開始コドンにおけるポリペプチド伸長を開始する。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、リボソーム結合部位、例えば開始コドンを含む１つ以上のＲＮＡ配列を含む。
ある実施形態において、本明細書に開示される修飾環状ポリリボヌクレオチドは、タンパク質に結合するタンパク質結合配列を含む。ある実施形態において、タンパク質結合配列は、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）を標的にするか又はそれを特定の標的に限局する。ある実施形態において、タンパク質結合配列は、タンパク質のアルギニンリッチ領域に特異的に結合する。
ある実施形態において、タンパク質結合部位としては、限定はされないが、ＡＣＩＮ１、ＡＧＯ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、ＡＴＸＮ２、ＡＵＨ、ＢＣＣＩＰ、ＣＡＰＲＩＮ１、ＣＥＬＦ２、ＣＰＳＦ１、ＣＰＳＦ２、ＣＰＳＦ６、ＣＰＳＦ７、ＣＳＴＦ２、ＣＳＴＦ２Ｔ、ＣＴＣＦ、ＤＤＸ２１、ＤＤＸ３、ＤＤＸ３Ｘ、ＤＤＸ４２、ＤＧＣＲ８、ＥＩＦ３Ａ、ＥＩＦ４Ａ３、ＥＩＦ４Ｇ２、ＥＬＡＶＬ１、ＥＬＡＶＬ３、ＦＡＭ１２０Ａ、ＦＢＬ、ＦＩＰ１Ｌ１、ＦＫＢＰ４、ＦＭＲ１、ＦＵＳ、ＦＸＲ１、ＦＸＲ２、ＧＮＬ３、ＧＴＦ２Ｆ１、ＨＮＲＮＰＡ１、ＨＮＲＮＰＡ２Ｂ１、ＨＮＲＮＰＣ、ＨＮＲＮＰＫ、ＨＮＲＮＰＬ、ＨＮＲＮＰＭ、ＨＮＲＮＰＵ、ＨＮＲＮＰＵＬ１、ＩＧＦ２ＢＰ１、ＩＧＦ２ＢＰ２、ＩＧＦ２ＢＰ３、ＩＬＦ３、ＫＨＤＲＢＳ１、ＬＡＲＰ７、ＬＩＮ２８Ａ、ＬＩＮ２８Ｂ、ｍ６Ａ、ＭＢＮＬ２、ＭＥＴＴＬ３、ＭＯＶ１０、ＭＳＩ１、ＭＳＩ２、ＮＯＮＯ、ＮＯＮＯ－、ＮＯＰ５８、ＮＰＭ１、ＮＵＤＴ２１、ＰＣＢＰ２、ＰＯＬＲ２Ａ、ＰＲＰＦ８、ＰＴＢＰ１、ＲＢＦＯＸ２、ＲＢＭ１０、ＲＢＭ２２、ＲＢＭ２７、ＲＢＭ４７、ＲＮＰＳ１、ＳＡＦＢ２、ＳＢＤＳ、ＳＦ３Ａ３、ＳＦ３Ｂ４、ＳＩＲＴ７、ＳＬＢＰ、ＳＬＴＭ、ＳＭＮＤＣ１、ＳＮＤ１、ＳＲＲＭ４、ＳＲＳＦ１、ＳＲＳＦ３、ＳＲＳＦ７、ＳＲＳＦ９、ＴＡＦ１５、ＴＡＲＤＢＰ、ＴＩＡ１、ＴＮＲＣ６Ａ、ＴＯＰ３Ｂ、ＴＲＡ２Ａ、ＴＲＡ２Ｂ、Ｕ２ＡＦ１、Ｕ２ＡＦ２、ＵＮＫ、ＵＰＦ１、ＷＤＲ３３、ＸＲＮ２、ＹＢＸ１、ＹＴＨＤＣ１、ＹＴＨＤＦ１、ＹＴＨＤＦ２、ＹＷＨＡＧ、ＺＣ３Ｈ７Ｂ、ＰＤＫ１、ＡＫＴ１、及びＲＮＡに結合する任意の他のタンパク質などのタンパク質への結合部位が挙げられる。
他の結合部位
ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、非ＲＮＡ又は非ＤＮＡ標的への１つ以上の結合部位を含む。ある実施形態において、第１の部分は、非修飾ヌクレオチドからなる、非ＲＮＡ又は非ＤＮＡ標的への１つ以上の結合部位を含む。ある実施形態において、結合部位は、小分子、アプタマー、脂質、炭水化物、ウイルス粒子、膜、多成分複合体、細胞、細胞部分、又はその任意のフラグメント結合部位のうちの１つであり得る。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、脂質への１つ以上の結合部位を含む。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、炭水化物への１つ以上の結合部位を含む。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、炭水化物への１つ以上の結合部位を含む。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、膜への１つ以上の結合部位を含む。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、多成分複合体、例えば、リボソーム、ヌクレオソーム、転写機構などへの１つ以上の結合部位を含む。
隔離
ある実施形態において、本明細書に記載される修飾環状ＲＮＡ（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、細胞過程を調節するために、標的、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、及び他の細胞成分を隔離する。対象とする標的のための結合部位を有する修飾環状ＲＮＡ（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、標的の結合で内在性結合パートナーと競合し得る。ある実施形態において、本明細書に記載される修飾環状ＲＮＡ（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、ｍｉＲＮＡを隔離する。ある実施形態において、本明細書に記載される修飾環状ＲＮＡ（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、ｍＲＮＡを隔離する。ある実施形態において、本明細書に記載される修飾環状ＲＮＡ（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、タンパク質を隔離する。ある実施形態において、本明細書に記載される修飾環状ＲＮＡ（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、リボソームを隔離する。ある実施形態において、本明細書に記載される修飾環状ＲＮＡ（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、他の修飾環状ＲＮＡを隔離する。ある実施形態において、本明細書に記載される修飾環状ＲＮＡは、ノンコーディングＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、又はｓｈＲＮＡを隔離する。ある実施形態において、本明細書に記載される修飾環状ＲＮＡ（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、隔離された標的、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、又は修飾環状ＲＮＡに結合される他の細胞成分を分解する分解要素を含む。修飾環状ＲＮＡ（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）隔離適用の非限定的な例が、表５に列挙される。
Figure 2022527763000006
ある実施形態において、本明細書に記載される修飾環状ＲＮＡ（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）を使用する方法のいずれも、翻訳要素と組み合わされ得る。翻訳要素を含有する本明細書に記載される修飾環状ＲＮＡは、ＲＮＡをタンパク質に翻訳し得る。
切断配列
ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、少なくとも１つの切断配列を含む。ある実施形態において、切断配列は、発現配列に隣接する。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、自滅性修飾環状ＲＮＡ又は切断可能修飾環状ＲＮＡ又は自己切断性修飾環状ＲＮＡなどの切断配列を含む。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、２つ以上の切断配列を含み、これは、複数の産物、例えば、ｍｉＲＮＡ、線状ＲＮＡ、より小さい修飾環状ポリリボヌクレオチドなどへの、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）の分離をもたらす。
ある実施形態において、切断配列は、リボザイムＲＮＡ配列を含む。リボザイム（ＲＮＡ酵素又は触媒ＲＮＡとも呼ばれるリボ核酸酵素に由来する）は、化学反応を触媒するＲＮＡ分子である。多くの天然リボザイムは、それら自体のホスホジエステル結合の１つの加水分解、又は他のＲＮＡにおける結合の加水分解のいずれかを触媒するが、それらは、リボソームのアミノトランスフェラーゼ活性を触媒することも分かっている。触媒ＲＮＡは、インビトロ方法によって「発生」され得る。上述されるリボスイッチ活性と同様に、リボザイム及びそれらの反応生成物が遺伝子発現を調節し得る。ある実施形態において、リボザイムが、かさ容積からの分子の化学変換のために細胞内の多くのコピーに存在するように、触媒ＲＮＡ又はリボザイムをより大きいノンコーディングＲＮＡ内に配置することができる。ある実施形態において、アプタマー及びリボザイムの両方を、同じノンコーディングＲＮＡ中でコードすることができる。
自滅性配列
ある実施形態において、本明細書に記載される修飾環状ＲＮＡ（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、自滅性修飾環状ＲＮＡ又は切断可能修飾環状ＲＮＡ又は自己切断性修飾環状ＲＮＡを含む。修飾環状ＲＮＡは、例えば、ＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｌｉｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、又はｓｈＲＮＡを含む細胞成分を送達し得る。ある実施形態において、修飾環状ＲＮＡ（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、（ｉ）自己切断可能要素；（ｉｉ）切断動員部位；（ｉｉｉ）分解性リンカー；（ｉｖ）化学的リンカー；及び／又は（ｖ）スペーサー配列によって隔てられるｍｉＲＮＡを含む。ある実施形態において、修飾環状ＲＮＡは、（ｉ）自己切断可能要素；（ｉｉ）切断動員部位（例えば、ＡＤＡＲ）；（ｉｉｉ）分解性リンカー（例えば、グリセロール）；（ｉｖ）化学的リンカー；及び／又は（ｖ）スペーサー配列によって隔てられるｓｉＲＮＡを含む。自己切断可能要素の非限定的な例としては、ハンマーヘッド型、スプライシング要素、ヘアピン型、デルタ肝炎ウイルス（ＨＤＶ）、Ｖａｒｋｕｄ Ｓａｔｅｌｌｉｔｅ（ＶＳ）、及びｇｌｍＳリボザイムが挙げられる。修飾環状ＲＮＡ（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）無調節（ｉｍｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）適用の非限定的な例が、表６に列挙される。
Figure 2022527763000007
環状化
一実施形態において、線状修飾ポリリボヌクレオチドは、環状化、又はコンカテマー化され得る。ある実施形態において、線状非修飾ポリリボヌクレオチド分子は、線状修飾ポリリボヌクレオチド分子にライゲートされて、線状ハイブリッド修飾ポリリボヌクレオチド分子を生成し、それが、環状化又はコンカテマー化されて、本明細書に記載されるハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドを生成し得る。ある実施形態において、線状ポリリボヌクレオチド分子は、第１の部分の外部のヌクレオチドが修飾される場合に修飾されないポリリボヌクレオチドの配列を有する第１の部分を含み、次に、それが、環状化又はコンカテマー化されて、本明細書に記載されるハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドを生成し得る。ある実施形態において、線状ハイブリッド修飾ポリリボヌクレオチドは、製剤化及び／又は送達の前に、インビトロで環状化され得る。ある実施形態において、線状修飾ポリリボヌクレオチド（例えば、線状完全修飾ポリリボヌクレオチド又は線状ハイブリッド修飾線状ポリリボヌクレオチド）は、細胞内で環状化され得る。
細胞外環状化
ある実施形態において、線状修飾ポリリボヌクレオチド（例えば、線状完全修飾ポリリボヌクレオチド又は線状ハイブリッド修飾ポリリボヌクレオチド）は、化学的方法を用いて環状化又はコンカテマー化されて、修飾環状ポリリボヌクレオチドを形成する。ある化学的方法において、核酸（例えば、線状修飾環状ポリリボヌクレオチド）の５’末端及び３’末端は、互いに近づけると、分子の５’末端と３’末端との間で新たな共有結合を形成し得る化学的に反応性の基を含む。５’末端は、ＮＨＳエステル反応性基を含有し得、３’末端は、３’－アミノ末端ヌクレオチドを含有し得、有機溶媒中において、線状ＲＮＡ分子の３’末端における３’－アミノ末端ヌクレオチドが、５’－ＮＨＳ－エステル部分上で求核攻撃を起こして、新たな５’－／３’－アミド結合を形成するようになっている。
一実施形態において、ＤＮＡ又はＲＮＡリガーゼを用いて、５’－リン酸化核酸分子（例えば、線状修飾ポリリボヌクレオチド又は線状ハイブリッド修飾ポリリボヌクレオチド）を核酸（例えば、線状核酸）の３’－ヒドロキシル基に酵素的に連結して、新たなホスホロジエステル結合を形成し得る。例の反応において、線状修飾ポリリボヌクレオチド（例えば、線状完全修飾ポリリボヌクレオチド又は線状ハイブリッド修飾ポリリボヌクレオチド）は、製造業者のプロトコルに従って１～１０単位のＴ４ ＲＮＡリガーゼと共に１時間にわたって３７℃でインキュベートされる（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）。ライゲーション反応は、酵素的ライゲーション反応を補助するために並んだ５’－及び３’－領域の両方と塩基対合することが可能な線状核酸の存在下で起こり得る。一実施形態において、ライゲーションは、スプリントライゲーションである。例えば、ＳｐｌｉｎｔＲ（登録商標）リガーゼのようなスプリントリガーゼがスプリントライゲーションに使用され得る。スプリントライゲーションでは、一本鎖ＲＮＡのような一本鎖ポリヌクレオチド（スプリント）は、２つの末端が一本鎖スプリントとのハブリダイゼーション時に並置され得るように線状ポリリボヌクレオチドの両方の末端とハイブリダイズするように設計され得る。したがって、スプリントリガーゼは、線状修飾ポリリボヌクレオチドの並置される２つの末端のライゲーションを触媒して、修飾環状ポリリボヌクレオチドを生成し得るか、又は線状ハイブリッド修飾ポリリボヌクレオチドの並置される２つの末端のライゲーションを触媒して、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドを生成し得る。
一実施形態において、ＤＮＡ又はＲＮＡリガーゼは、修飾環状ポリヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）の合成に使用され得る。非限定的な例として、リガーゼは、ｃｉｒｃリガーゼ又は環状リガーゼであり得る。
一実施形態において、線状修飾ポリリボヌクレオチド（例えば、線状完全修飾ポリリボヌクレオチド又は線状ハイブリッド修飾ポリリボヌクレオチド）の５’末端又は３’末端のいずれかは、インビトロ転写中、得られる線状修飾ポリリボヌクレオチド（例えば、線状完全修飾ポリリボヌクレオチド又は線状ハイブリッド修飾ポリリボヌクレオチド）が、線状修飾ポリリボヌクレオチド（例えば、線状完全修飾ポリリボヌクレオチド又は線状ハイブリッド修飾ポリリボヌクレオチド）の５’末端を、線状修飾ポリリボヌクレオチド（例えば、線状完全修飾ポリリボヌクレオチド又は線状ハイブリッド修飾ポリリボヌクレオチド）の３’末端にライゲートすることが可能な活性リボザイム配列を含むように、リガーゼリボザイム配列をコードし得る。リガーゼリボザイムは、グループＩイントロン、デルタ肝炎ウイルス、ヘアピン型リボザイムに由来し得るか、又はＳＥＬＥＸ（指数関数的濃縮によるリガンドの体系的な進化）によって選択され得る。リボザイムリガーゼ反応は、０～３７℃の温度で１～２４時間行われ得る。
一実施形態において、線状修飾ポリリボヌクレオチド（例えば、線状完全修飾ポリリボヌクレオチド又は線状ハイブリッド修飾ポリリボヌクレオチド）は、少なくとも１つの非核酸部分を用いることによって環状化又はコンカテマー化され得る。一態様において、少なくとも１つの非核酸部分は、線状修飾環状ポリリボヌクレオチドを環状化又はコンカテマー化するために、線状修飾環状ポリリボヌクレオチドの５’末端の近傍及び／又は３’末端の近傍の領域又は特徴と反応し得る。別の態様において、少なくとも１つの非核酸部分は、線状修飾環状ポリリボヌクレオチド５’末端及び／又は３’末端に位置するか又は連結されるか又はその近傍にあり得る。考えられる非核酸部分は、同種又は異種であり得る。非限定的な例として、非核酸部分は、疎水性結合、イオン結合、生分解性結合及び／又は切断可能な結合などの結合であり得る。別の非限定的な例として、非核酸部分は、ライゲーション部分である。さらに別の非限定的な例として、非核酸部分は、本明細書に記載されるアプタマー又は非核酸リンカーなどのオリゴヌクレオチド又はペプチド部分であり得る。
一実施形態において、線状修飾ポリリボヌクレオチド（例えば、線状完全修飾ポリリボヌクレオチド又は線状ハイブリッド修飾ポリリボヌクレオチド）は、線状修飾ポリリボヌクレオチド（例えば、線状完全修飾ポリリボヌクレオチド又は線状ハイブリッド修飾ポリリボヌクレオチド）５’及び３’末端における、その近傍における若しくはそのような５’及び３’末端に連結された、原子間、分子表面間の吸引力を引き起こす非核酸部分により、環状化又はコンカテマー化され得る。非限定的な例として、１つ以上の線状修飾ポリリボヌクレオチド（例えば、線状完全修飾ポリリボヌクレオチド又は線状ハイブリッド修飾ポリリボヌクレオチド）は、分子間力又は分子内力によって環状化又はコンカテマー化され得る。分子間力の非限定的な例としては、双極子－双極子力、双極子－誘起双極子力、誘起双極子－誘起双極子力、ファン・デル・ワールス力及びロンドン分散力が挙げられる。分子内力の非限定的な例としては、共有結合、金属結合、イオン結合、共鳴結合、アグノスティック結合（ａｇｎｏｓｔｉｃ ｂｏｎｄ）、双極子結合、共役、超共役及び反結合が挙げられる。
一実施形態において、線状修飾ポリリボヌクレオチド（例えば、線状完全修飾ポリリボヌクレオチド又は線状ハイブリッド修飾ポリリボヌクレオチド）は、５’末端の近傍及び３’末端の近傍にリボザイムＲＮＡ配列を含み得る。リボザイムＲＮＡ配列は、配列がリボザイムの残りの部分に曝されるとき、ペプチドに共有結合し得る。一態様において、５’末端及び３’末端の近傍でリボザイムＲＮＡ配列に共有結合されたペプチドは、互いに結合して、線状修飾ポリリボヌクレオチド（例えば、線状完全修飾ポリリボヌクレオチド又は線状ハイブリッド修飾ポリリボヌクレオチド）を環状化又はコンカテマー化させ得る。別の態様において、５’末端及び３’末端の近傍でリボザイムＲＮＡに共有結合されたペプチドは、限定はされないが、タンパク質ライゲーションなどの当該技術分野において公知の様々な方法を用いたライゲーションに線状一次構築物又は線状ｍＲＮＡを供した後、それらを環状化又はコンカテマー化させ得る。本発明の線状一次構築物若しくは線状ＲＮＡに使用するためのリボザイムの非限定的な例又はペプチドを組み込み且つ／又は共有結合するための方法の非限定的な一覧が米国特許出願公開第２００３００８２７６８号明細書に記載されており、その内容全体が参照により本明細書に援用される。
ある実施形態において、線状修飾ポリリボヌクレオチド（例えば、線状完全修飾ポリリボヌクレオチド又は線状ハイブリッド修飾ポリリボヌクレオチド）は、例えば、５’トリホスフェートをＲＮＡ ５’ピロホスホヒドロラーゼ（ＲｐｐＨ）又はＡＴＰジホスホヒドロラーゼ（アピラーゼ）と接触させることによって５’モノホスフェートに転化される核酸の５’トリホスフェートを含み得る。代わりに、線状修飾ポリリボヌクレオチド（例えば、線状完全修飾ポリリボヌクレオチド又は線状ハイブリッド修飾ポリリボヌクレオチド）の５’トリホスフェートを５’モノホスフェートに転化することは、（ａ）線状修飾ポリリボヌクレオチド（例えば、線状完全修飾ポリリボヌクレオチド又は線状ハイブリッド修飾ポリリボヌクレオチド）の５’ヌクレオチドをホスファターゼ（例えば、アンタークティック（Ａｎｔａｒｃｔｉｃ）ホスファターゼ、エビ由来アルカリホスファターゼ、又は仔牛小腸由来ホスファターゼ）と接触させて、３つ全てのホスフェートを除去する工程；及び（ｂ）工程（ａ）後の５’ヌクレオチドを、１つのホスフェートを追加するキナーゼ（例えば、ポリヌクレオチドキナーゼ）と接触させる工程を含む２工程反応によって行われ得る。
ある実施形態において、本明細書において提供される環状化方法の環状化効率は、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％又は１００％である。ある実施形態において、本明細書において提供される環状化方法の環状化効率は、少なくとも約４０％である。
スプライシング要素
ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、少なくとも１つのスプライシング要素を含む。本明細書において提供される修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）において、スプライシング要素は、修飾環状ポリリボヌクレオチドのスプライシングを媒介し得る完全なスプライシング要素であり得る。代わりに、スプライシング要素は、完了したスプライシング事象からの残留スプライシング要素でもあり得る。例えば、ある場合において、線状ポリリボヌクレオチドのスプライシング要素は、線状ポリリボヌクレオチドの環状化をもたらすスプライシング事象を媒介することができ、それにより、得られる修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、このようなスプライシングを介した環状化事象からの残留スプライシング要素を含む。ある場合において、残留スプライシング要素は、スプライシングを媒介することができない。他の場合、残留スプライシング要素は、特定の状況下でスプライシングを依然として媒介することができる。ある実施形態において、スプライシング要素は、少なくとも１つの発現配列に隣接する。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、各発現配列に隣接するスプライシング要素を含む。ある実施形態において、スプライシング要素は、各発現配列の１つの側又は両側にあり、発現産物、例えばペプチド及び又はポリペプチドの分離をもたらす。
ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、複製されると、スプライスされた末端が互いに結合される内部のスプライシング要素を含む。いくつかの例は、スプライス部位配列及びＡｌｕＳｑ２、ＡｌｕＪｒ及びＡｌｕＳｚなどの短い逆方向反復（３０～４０ｎｔ）、隣接するイントロン中の逆方向配列、隣接するイントロン中のＡｌｕ要素並びに隣接するエクソンを有するバックスプライス部位の２００ｂｐ前にある（上流にある）又は後ろにある（下流にある）配列など、バックスプライス事象の近位にある（ｓｕｐｔａｂｌｅ４富化モチーフ）シス－配列要素に見られるモチーフを有する小型のイントロン（＜１００ｎｔ）を含み得る。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、内部のスプライシング要素として本明細書の他の箇所に記載される少なくとも１つの反復ヌクレオチド配列を含む。このような実施形態において、反復ヌクレオチド配列は、イントロンのＡｌｕファミリーからの反復配列を含み得る。ある実施形態において、スプライシングに関連するリボソーム結合タンパク質は、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）生合成を調節し得る（例えば、Ｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄ及びＱｕａｋｉｎｇ（ＱＫＩ）スプライシング因子）。
ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、修飾環状ポリリボヌクレオチドの頭尾接合部（ｈｅａｄ－ｔｏ－ｔａｉｌ ｊｕｎｃｔｉｏｎ）に隣接する標準スプライス部位を含み得る。
ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、２つの３－ヌクレオチドバルジによって隣接される４－塩基対ステムを含むバルジ－ヘリックス－バルジモチーフを含み得る。切断がバルジ領域中の部位で起こり、末端５’－ヒドロキシル基及び２’，３’－環状ホスフェートを有する特徴的なフラグメントを生成する。環状化は、３’，５’－ホスホジエステル架橋を形成する同じ分子の２’，３’－環状ホスフェートへの５’－ＯＨ基の求核攻撃によって進行する。
ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、ＨＰＲ要素を有する多量体反復ＲＮＡ配列を含み得る。ＨＰＲは、２’，３’－環状ホスフェート及び５’－ＯＨ末端を含む。ＨＰＲ要素は、線状環状ポリリボヌクレオチド修飾環状ポリリボヌクレオチドの５’末端及び３’末端を自己プロセシングし、それによって末端を互いにライゲートする。
ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、自己ライゲーションを媒介する配列を含み得る。一実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、自己ライゲートするために、ＨＤＶ配列（例えば、ＨＤＶ複製ドメイン保存配列、
Figure 2022527763000008
 ）を含み得る。一実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、自己ライゲートするために、ループＥ配列（例えば、ＰＳＴＶｄ中）を含み得る。別の実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、自己環状化イントロン、例えば、５’及び３’スプライス接合部、又はグループＩ、グループＩＩ若しくはグループＩＩＩイントロンなどの自己環状化触媒イントロンを含み得る。グループＩイントロン自己スプライシング配列の非限定的な例は、Ｔ４バクテリオファージ遺伝子ｔｄに由来する自己スプライシング置換イントロン－エクソン配列、及びテトラヒメナ属（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ）の介在配列（ＩＶＳ）ｒＲＮＡを含み得る。
他の環状化方法
ある実施形態において、線状修飾環状ポリリボヌクレオチドは、個々のイントロン内に又は隣接するイントロンにわたって反復又は非反復核酸配列を含む相補的配列を含み得る。反復核酸配列は、修飾環状ポリリボヌクレオチドのセグメント内に存在する配列である。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、反復核酸配列を含む。ある実施形態において、反復ヌクレオチド配列は、ポリＣＡ又はポリＵＧ配列を含む。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、修飾環状ポリリボヌクレオチドの別のセグメント中の相補的な反復核酸配列にハイブリダイズする少なくとも１つの反復核酸配列を含み、ハイブリダイズされたセグメントが内部二本鎖を形成する。ある実施形態において、２つの別個の修飾環状ポリリボヌクレオチドからの反復核酸配列及び相補的な反復核酸配列がハイブリダイズして、単一の環状化ポリリボヌクレオチドを生成し、ハイブリダイズされたセグメントが内部二本鎖を形成する。ある実施形態において、相補的配列は、線状修飾環状ポリリボヌクレオチドの５’及び３’末端において見られる。ある実施形態において、相補的配列は、約３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００又はそれを超える対合ヌクレオチドを含む。
ある実施形態において、環状化の化学的方法が、修飾環状ポリリボヌクレオチドを生成するのに使用され得る。このような方法としては、限定はされないが、クリック化学（例えば、アルキン及びアジドに基づく方法又はクリック可能な塩基）、オレフィンメタセシス、ホスホロアミデートライゲーション、ヘミアミナール－イミン架橋、塩基修飾及びそれらの任意の組合せが挙げられる。
ある実施形態において、環状化の酵素的方法は、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）を生成するのに使用され得る。ある実施形態において、ライゲーション酵素、例えばＤＮＡ又はＲＮＡリガーゼは、環状ポリリボヌクレアーゼ若しくは相補体の鋳型、環状ポリリボヌクレアーゼの相補鎖又は環状ポリリボヌクレアーゼを生成するのに使用され得る。
修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）の環状化は、当該技術分野において公知の方法、例えばＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２０１５，４３（４）：２４５４－２４６５からのＰｅｔｋｏｖｉｃ及びＭｕｌｌｅｒによる“ＲＮＡ ｃｉｒｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ”及びＲＮＡ Ｂｉｏｌ，２０１７，１４（８）：１０１８－１０２７からのＭｕｌｌｅｒ及びＡｐｐｅｌによる“Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃｉｒｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＲＮＡ”に記載されているものによって行われ得る。
複製要素
修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、複製に有用な配列及び／又はモチーフをコードし得る。修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）の複製は、相補体修飾環状ポリリボヌクレオチドを生成することによって行われ得る。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、転写を開始させるためのモチーフを含み、ここで、転写は、修飾環状ポリリボヌクレオチドによってコードされる内在性細胞機構（ＤＮＡ依存的ＲＮＡポリメラーゼ）又はＲＮＡ依存的ＲＮＡポリメラーゼのいずれかによって駆動される。ローリングサークル型転写事象の産物は、単位長において相補的又は伝播される修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）のいずれかを生成するためにリボザイムによって切断され得る。リボザイムは、修飾環状ポリリボヌクレオチド、その相補体、又はトランスにおけるＲＮＡ配列によってコードされ得る。ある実施形態において、コードされたリボザイムは、環状ＲＮＡ伝播を制御するためにリボザイムの活性を調節する（阻害又は促進する）配列又はモチーフを含み得る。ある実施形態において、単位長配列は、細胞内ＲＮＡリガーゼによって環状形態にライゲートされ得る。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、自己増幅に役立つ複製要素を含む。このような複製要素の例としては、全体が参照により本明細書に援用される国際特許公開番号国際公開第２０１９１１８９１９Ａ１号パンフレットの［０２８０］～［０２８２］に記載されるものが挙げられる。別の実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）から複製された長い転写産物を、特定の長さに切断するために、少なくとも１つのリボザイム配列を含み、ここで、別のコードされたリボザイムがリボザイム配列において転写産物を切断する。環状化は、修飾環状ポリリボヌクレオチドに対する相補体を形成する。
ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、例えば、エキソヌクレアーゼによる分解に対して実質的に抵抗性である。
ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、細胞内で複製する。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、約１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～７５％、７５％～８０％、８０％～８５％、８５％～９０％、９０％～９５％、９５％～９９％、又はそれらの間の任意のパーセンテージの速度において細胞内で複製する。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、細胞内で複製され、娘細胞に送られる。ある実施形態において、細胞は、少なくとも２５％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の効率で少なくとも１つの修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）を娘細胞に送る。ある実施形態において、減数分裂を起こしている細胞は、少なくとも２５％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の効率で修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）を娘細胞に送る。ある実施形態において、有糸分裂を起こしている細胞は、少なくとも２５％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の効率で修飾環状ポリリボヌクレオチドハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）を娘細胞に送る。
ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、宿主細胞内で複製する。一実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞内で複製することが可能である。
ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチドハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、宿主細胞内で複製するが、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、例えば、宿主の染色体により、宿主のゲノムに組み込まれない。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、例えば、宿主の染色体により、ごくわずかな組み換え頻度を有する。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、例えば、宿主の染色体により、例えば、約１．０ｃＭ／Ｍｂ、０．９ｃＭ／Ｍｂ、０．８ｃＭ／Ｍｂ、０．７ｃＭ／Ｍｂ、０．６ｃＭ／Ｍｂ、０．５ｃＭ／Ｍｂ、０．４ｃＭ／Ｍｂ、０．３ｃＭ／Ｍｂ、０．２ｃＭ／Ｍｂ、０．１ｃＭ／Ｍｂ未満、又はそれ以下の組み換え頻度を有する。
他の配列
ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、別の核酸配列をさらに含む。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は人工核酸を含む他の配列を含み得る。他の配列としては、限定はされないが、ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｇＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、又は他のＲＮＡｉ分子をコードする、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、又は配列が挙げられる。一実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、修飾環状ポリリボヌクレオチドと同じ遺伝子発現産物の異なる遺伝子座を標的にするためにｓｉＲＮＡを含む。一実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、修飾環状ポリリボヌクレオチドと異なる遺伝子発現産物を標的にするためにｓｉＲＮＡを含む。
ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、５’－ＵＴＲを欠いている。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、３’－ＵＴＲを欠いている。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、ポリ－Ａ配列を欠いている。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、終止要素を欠いている。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、内部リボソーム進入部位を欠いている。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、エキソヌクレアーゼによる分解感受性を欠いている。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）が分解感受性を欠いていることは、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）が、エキソヌクレアーゼによって分解されないか、又はエキソヌクレアーゼの非存在下と同等又は同様の限られた程度にエキソヌクレアーゼの存在下でのみ分解されることを意味し得る。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、エキソヌクレアーゼによる分解を欠いている。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、エキソヌクレアーゼに曝されたときに減少した分解を有する。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、キャップ結合タンパク質への結合を欠いている。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、５’キャップを欠いている。
ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、５’－ＵＴＲを欠いており、その１つ以上の発現配列からタンパク質を発現する能力がある。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、３’－ＵＴＲを欠いており、その１つ以上の発現配列からタンパク質を発現する能力がある。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、ポリ－Ａ配列を欠いており、その１つ以上の発現配列からタンパク質を発現する能力がある。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、終止要素を欠いており、その１つ以上の発現配列からタンパク質を発現する能力がある。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、内部リボソーム進入部位を欠いており、その１つ以上の発現配列からタンパク質を発現する能力がある。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、キャップを欠いており、その１つ以上の発現配列からタンパク質を発現する能力がある。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、５’－ＵＴＲ、３’－ＵＴＲ、及びＩＲＥＳを欠いており、その１つ以上の発現配列からタンパク質を発現する能力がある。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、以下の配列の１つ以上を含む：１つ以上のｍｉＲＮＡをコードする配列、１つ以上の複製タンパク質をコードする配列、外来性遺伝子をコードする配列、治療薬をコードする配列、調節要素（例えば、翻訳モジュレータ、例えば翻訳エンハンサー又はサプレッサー）、翻訳開始配列、内在性遺伝子（ｓｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ）を標的にする１つ以上の調節核酸、及び治療用ｍＲＮＡ又はタンパク質をコードする配列。
他の配列は、約２～約１００００ｎｔ、約２～約５０００ｎｔ、約１０～約１００ｎｔ、約５０～約１５０ｎｔ、約１００～約２００ｎｔ、約１５０～約２５０ｎｔ、約２００～約３００ｎｔ、約２５０～約３５０ｎｔ、約３００～約５００ｎｔ、約１０～約１０００ｎｔ、約５０～約１０００ｎｔ、約１００～約１０００ｎｔ、約１０００～約２０００ｎｔ、約２０００～約３０００ｎｔ、約３０００～約４０００ｎｔ、約４０００～約５０００ｎｔ又はそれらの間の任意の範囲の長さを有し得る。
その環状化の結果として、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、それを線状ＲＮＡと区別するいくつかの特徴を含み得る。例えば、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、線状ＲＮＡと比較して、エキソヌクレアーゼによる分解に対する感受性がより低い。したがって、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、特に、エキソヌクレアーゼの存在下でインキュベートされるとき、線状ＲＮＡより安定している。線状ＲＮＡと比較した修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）の増加した安定性により、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）が、ポリペプチドを生成する細胞形質転換試薬としてより有用になり、線状ＲＮＡより容易に及びより長く貯蔵可能になる。エキソヌクレアーゼで処理された修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）の安定性は、ＲＮＡ分解が起こったかどうかを決定する、当該技術分野において標準的な方法を用いて（例えば、ゲル電気泳動によって）試験され得る。
さらに、線状ＲＮＡと異なり、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）が、仔牛小腸由来ホスファターゼなどのホスファターゼと共にインキュベートされるとき、脱リン酸化に対する感受性がより低い。
ヌクレオチドスペーサー配列
ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、スペーサー配列を含む。
ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、少なくとも１つのスペーサー配列を含む。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、１、２、３、４、５、６、７つ、又はそれ以上のスペーサー配列を含む。
ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、全体が参照により本明細書に援用される国際特許公開番号国際公開第２０１９１１８９１９Ａ１号パンフレットの［０２９５］～［０３０２］中の説明に従って構成される１つ以上のスペーサー配列を含む。
非核酸リンカー
本明細書に記載される修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、非核酸リンカーも含み得る。ある実施形態において、本明細書に記載される修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、記載される配列又は要素の１つ以上の間に非核酸リンカーを有する。一実施形態において、本明細書に記載される１つ以上の配列又は要素は、リンカーを用いて連結される。非核酸リンカーは、化学結合、例えば、１つ以上の共有結合又は非共有結合であり得る。ある実施形態において、非核酸リンカーは、ペプチド又はタンパク質リンカーである。このようなリンカーは、２～３０アミノ酸、又はそれ以上のものであり得る。リンカーは、全体が参照により本明細書に援用される国際特許公開番号国際公開第２０１９１１８９１９Ａ１号パンフレットの［０３０４］～［０３０７］に記載されるものなどの、可撓性、剛性又は切断可能なリンカーを含む。
安定性／半減期
ある実施形態において、本明細書において提供される修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、対照、例えば同じヌクレオチド配列を有するが、環状されていない線状ポリリボヌクレオチド（線状同等物）又は対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチドより増加した半減期を有する。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、分解、例えばエキソヌクレアーゼに対して実質的に抵抗性である。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、自己分解に対して抵抗性である。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、酵素切断部位、例えばダイサー切断部位を欠いている。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、対照、例えば、線状同等物又は対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチドより、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１２０％、少なくとも約１４０％、少なくとも約１５０％、少なくとも約１６０％、少なくとも約１８０％、少なくとも約２００％、少なくとも約３００％、少なくとも約４００％、少なくとも約５００％、少なくとも約６００％、少なくとも約７００％ 少なくとも約８００％、少なくとも約９００％、少なくとも約１０００％又は少なくとも約１００００％長い半減期を有する。
ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、細胞分裂中に細胞内で持続する。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、有糸分裂後に娘細胞内で持続する。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、細胞内で複製され、娘細胞に送られる。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）の自己複製を媒介する複製要素を含む。ある実施形態において、複製要素は、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）に対して相補的な線状ポリリボヌクレオチド（線状相補性）への修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）の転写を媒介する。ある実施形態において、線状相補性ポリリボヌクレオチドは、相補的な修飾環状ポリリボヌクレオチドに細胞内においてインビボで環状化され得る。ある実施形態において、相補的ポリリボヌクレオチドは、出発修飾環状ポリリボヌクレオチドと同じか又は類似したヌクレオチド配列を有する別の修飾環状ポリリボヌクレオチドにさらに自己複製し得る。１つの例示的な自己複製要素としては、ＨＤＶ複製ドメインが挙げられる（Ｂｅｅｈａｒｒｙ ｅｔ ａｌ，Ｖｉｒｏｌ，２０１４，４５０－４５１：１６５－１７３によって記載されるように）。ある実施形態において、細胞は、少なくとも２５％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の効率で少なくとも１つの修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）を娘細胞に送る。ある実施形態において、減数分裂を起こしている細胞は、少なくとも２５％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の効率で修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）を娘細胞に送る。ある実施形態において、有糸分裂を起こしている細胞は、少なくとも２５％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の効率で修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）を娘細胞に送る。
構造
ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、高次構造、例えば二次又は三次構造を含む。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、全体が参照により本明細書に援用される国際特許公開番号国際公開第２０１９１１８９１９Ａ１号パンフレットに記載されるものなどの、高次構造を含むように構成される。
医薬組成物
本発明は、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤と組み合わせた組成物を含む。医薬組成物は、１つ以上のさらなる活性物質、例えば治療的及び／又は予防的に活性な物質を任意選択的に含み得る。本発明の医薬組成物は、滅菌されており且つ／又はパイロジェンフリーであり得る。医薬品の製剤化及び／又は製造における概論は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２１ｓｔ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５（参照により本明細書に援用される）に見られる。
本明細書において提供される医薬組成物の説明は、主に、ヒトへの投与に好適な医薬組成物に関するが、このような組成物は、一般に、任意の他の動物、例えば、非ヒト動物、例えば、非ヒト哺乳動物への投与に好適であることが当業者によって理解されるであろう。組成物を様々な動物への投与に好適にするための、ヒトへの投与に好適な医薬組成物の変更は、十分に理解されており、通常の技能を有する獣医薬理学者は、あったとしても通常の実験のみでこのような変更を設計及び／又は行うことができる。医薬組成物の投与が想定される対象としては、限定はされないが、ヒト及び／又は他の霊長類；ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコ、イヌ、マウス、及び／又はラットなどの商業的に関連する哺乳動物を含む哺乳動物；及び／又は家禽、ニワトリ、カモ、ガチョウ、及び／又はシチメンチョウなどの商業的に関連する鳥類が挙げられる。
本明細書に記載される医薬組成物の製剤は、薬理学の技術分野において公知であるか又は今後開発される任意の方法によって調製され得る。一般に、このような調製方法は、有効成分を賦形剤及び／又は１つ以上の他の補助成分と組み合わせて、次に必要に応じて及び／又は望ましい場合、生成物を分割、成形及び／又は包装する工程を含む。
送達
本明細書に記載される修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、薬学的に許容される担体又は賦形剤を含む医薬組成物に含まれ得る。本明細書に記載される修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、送達担体と共に医薬組成物に含まれ得る。ある実施形態において、本明細書に記載される修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、担体を含まない医薬組成物に含まれ得る。ある実施形態において、本明細書に記載される修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、非経口で許容される希釈剤を含む医薬組成物に含まれ得る。ある実施形態において、本明細書に記載される修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、エタノールを含む医薬組成物に含まれ得る。本明細書に開示される方法は、本明細書に開示される修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）、本明細書に開示される組成物、又は本明細書に開示される医薬組成物のインビボ送達の方法であって、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）、組成物、又は医薬組成物を、対象の細胞若しくは組織、又は対象に非経口的に投与する工程を含む方法を含む。
本明細書に記載される医薬組成物は、例えば、医薬品賦形剤又は担体を含むように製剤化され得る。医薬担体は、膜、脂質二重層、及び／又はポリマー担体、例えば、リポソーム、例えば、ナノ粒子、例えば、脂質ナノ粒子であり得、修飾環状ポリリボヌクレオチドの部分的又は完全な封入などによる公知の方法によって、それを必要とする対象（例えば、ヒト又は非ヒト農用動物又は家畜、例えば、ウシ、イヌ、ネコ、ウマ、家禽）に送達され得る。このような方法としては、限定はされないが、トランスフェクション（例えば、脂質媒介性、カチオン性ポリマー、リン酸カルシウム、デンドリマー）；エレクトロポレーション又は膜破壊の他の方法（例えば、ヌクレオフェクション）、ウイルス送達（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、ＡＡＶ）、微量注入、微粒子銃（「遺伝子銃」）、フゲン（ｆｕｇｅｎｅ）、直接音波負荷、細胞スクイージング、光学的トランスフェクション、プロトプラスト融合、インペールフェクション、マグネトフェクション、エキソソーム媒介性移動、脂質ナノ粒子媒介性移動及びそれらの任意の組合せが挙げられる。送達の方法は、例えば、Ｇｏｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｎｄ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｊｕｌｙ ２０１５、２６（７）：４４３－４５１．ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｕｍ．２０１５．０７４；及びＺｕｒｉｓ ｅｔ ａｌ．Ｃａｔｉｏｎｉｃ ｌｉｐｉｄ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｅｎａｂｌｅｓ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｂａｓｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１４ Ｏｃｔ ３０；３３（１）：７３－８０にも記載されている。
ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）又は医薬組成物は、ネイキッド送達製剤として送達され得る。ネイキッド送達製剤は、担体を用いずに、共有結合修飾又は環状ポリリボヌクレオチドの部分的若しくは完全な封入なしで、環状ポリリボヌクレオチド（例えば、本明細書に記載されるハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）を細胞に送達する。
ネイキッド送達製剤は、担体を含まない製剤であり、ここで、環状ポリリボヌクレオチド（例えば、本明細書に記載されるハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、細胞への送達を助ける部分に結合する共有結合修飾を有さず、又は環状ポリリボヌクレオチドの部分的若しくは完全な封入なしである。ある実施形態において、細胞への送達を助ける部分に結合する共有結合修飾を有さないハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、細胞への送達を助けるタンパク質、小分子、粒子、ポリマー、又はバイオポリマーに共有結合されない。
ある実施形態において、ネイキッド送達製剤は、トランスフェクション試薬、カチオン性担体、炭水化物担体、ナノ粒子担体、又はタンパク質担体のうちのいずれか又は全てを含まなくてもよい。例えば、ネイキッド送達製剤は、フィトグリコーゲンオクテニルスクシネート、フィトグリコーゲンβ－デキストリン、無水物修飾フィトグリコーゲンβ－デキストリン、リポフェクタミン、ポリエチレンイミン、ポリ（トリメチレンイミン）、ポリ（テトラメチレンイミン）、ポリプロピレンイミン、アミノグリコシド－ポリアミン、ジデオキシ－ジアミノ－β－シクロデキストリン、スペルミン、スペルミジン、ポリ（２－ジメチルアミノ）エチルメタクリレート、ポリ（リジン）、ポリ（ヒスチジン）、ポリ（アルギニン）、カチオン化ゼラチン、デンドリマー、キトサン、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ－［１－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、１－［２－（オレオイルオキシ）エチル］－２－オレイル－３－（２－ヒドロキシエチル）イミダゾリニウムクロリド（ＤＯＴＩＭ）、２，３－ジオレイルオキシ－Ｎ－［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－プロパンアミニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）、３Ｂ－［Ｎ－（Ｎ，Ｎ’－ジメチルアミノエタン）－カルバモイル］コレステロール塩酸塩（ＤＣ－コレステロールＨＣｌ）、ジヘプタデシルアミドグリシルスペルミジン（ＤＯＧＳ）、Ｎ，Ｎ－ジステアリル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ－（１，２－ジミリスチルオキシプロパ－３－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、Ｎ，Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）、高比重リポタンパク質（ＨＤＬ）、又はグロブリンを含まなくてもよい。
ネイキッド送達製剤は、非担体賦形剤を含み得る。ある実施形態において、非担体賦形剤は、不活性成分を含み得る。ある実施形態において、非担体賦形剤は、緩衝液、例えばＰＢＳを含み得る。ある実施形態において、非担体賦形剤は、溶媒、非水性溶媒、希釈剤（例えば、非経口で許容される希釈剤）、懸濁助剤、表面活性剤、等張剤、増粘剤、乳化剤、保存料、ポリマー、ペプチド、タンパク質、細胞、ヒアルロニダーゼ、分散剤、造粒剤、崩壊剤、結合剤、緩衝剤、滑沢剤、又は油であり得る。
ある実施形態において、ネイキッド送達製剤は、希釈剤（例えば、非経口で許容される希釈剤）を含み得る。希釈剤は、液体希釈剤又は固体希釈剤であり得る。ある実施形態において、希釈剤は、ＲＮＡ可溶化剤、緩衝液、又は等張剤であり得る。ＲＮＡ可溶化剤の例としては、水、エタノール、メタノール、アセトン、ホルムアミド、及び２－プロパノールが挙げられる。緩衝液の例としては、２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ビス－トリス、２－［（２－アミノ－２－オキソエチル）－（カルボキシメチル）アミノ］酢酸（ＡＤＡ）、Ｎ－（２－アセトアミド）－２－アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、ピペラジン－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、２－［［１，３－ジヒドロキシ－２－（ヒドロキシメチル）プロパン－２－イル］アミノ］エタンスルホン酸（ＴＥＳ）、３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、トリス、トリシン、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ、ビシン、又はホスフェートが挙げられる。等張剤の例としては、グリセリン、マンニトール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、トレハロース、又はスクロースが挙げられる。
本発明は、本明細書に記載されるハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドを含む宿主又は宿主細胞にさらに関する。ある実施形態において、宿主又は宿主細胞は、植物、昆虫、細菌、真菌、脊椎動物、哺乳動物（例えば、ヒト）、又は他の生物若しくは細胞である。
ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、宿主において非免疫原性である。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、参照化合物、例えば記載される修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）又はエンクリプトゲンを欠いた修飾環状ポリリボヌクレオチドに対応する線状ポリヌクレオチドによって引き起こされる応答と比較して、宿主の免疫系による応答が減少されるか、又は宿主の免疫系による応答を生成することができない。いくつかの免疫応答としては、限定はされないが、液性免疫応答（例えば、抗原特異的抗体の産生）及び細胞媒介性免疫応答（例えば、リンパ球増殖）が挙げられる。
ある実施形態において、宿主又は宿主細胞が修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）と接触される（例えば、それに送達又は投与される）。ある実施形態において、宿主は、ヒトなどの哺乳動物である。宿主中の修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）、発現産物、又はその両方の量は、投与後の任意の時点で測定され得る。特定の実施形態において、培養物中の宿主成長の時間経過が決定される。成長が修飾環状ポリリボヌクレオチドの存在下で増加又は減少される場合、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）又は発現産物又はその両方は、宿主の成長を増加又は減少させるのに有効であると特定される。
送達の方法
本明細書に記載される修飾環状ポリリボヌクレオチド分子（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）を、細胞、組織又は対象に送達する方法は、本明細書に記載される医薬組成物を、細胞、組織、又は対象に投与することを含む。
ある実施形態において、送達する方法は、インビボ方法である。例えば、本明細書に記載される修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）を送達する方法は、それを必要とする対象に、本明細書に記載される医薬組成物を、それを必要とする対象に非経口的に投与することを含む。別の例として、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）を、対象の細胞又は組織に送達する方法は、本明細書に記載される医薬組成物を、細胞又は組織に非経口的に投与することを含む。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、対象における生物学的反応を引き起こすのに有効な量である。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、対象における細胞又は組織に対する生物学的影響を与えるのに有効な量である。ある実施形態において、本明細書に記載される医薬組成物は、担体を含む。ある実施形態において、本明細書に記載される医薬組成物は、希釈剤を含み、任意の担体を含まない。ある実施形態において、非経口投与は、静脈内に、筋肉内に、眼内に、又は局所的に行われる。
ある実施形態において、医薬組成物は、経口投与される。ある実施形態において、医薬組成物は、経鼻的に投与される。ある実施形態において、医薬組成物は、吸入によって投与される。ある実施形態において、医薬組成物は、局所的に投与される。ある実施形態において、医薬組成物は、眼内に投与される。ある実施形態において、医薬組成物は、直腸内に投与される。ある実施形態において、医薬組成物は、注入によって投与される。投与は、全身投与又は局所投与であり得る。ある実施形態において、医薬組成物は、非経口的に投与される。ある実施形態において、医薬組成物は、静脈内に、動脈内に、腹腔内に、皮内に、頭蓋内に、髄腔内に、リンパ内に（ｉｎｔｒａｌｙｍｐｈａｔｉｃｌｙ）、皮下に、又は筋肉内に投与される。ある実施形態において、医薬組成物は、眼内投与、蝸牛内（内耳）投与、又は気管内投与によって投与される。ある実施形態において、本明細書に記載される送達の方法のいずれかは、担体を用いて行われる。ある実施形態において、本明細書に記載されるいずれかの送達の方法は、担体又は細胞透過剤を用いずに行われる。
細胞及び小胞ベースの担体
本明細書に記載される修飾環状ＲＮＡ（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）組成物又は製剤は、小胞又は他の膜ベースの担体中で細胞に投与され得る。
実施形態において、本明細書に記載される医薬組成物中の修飾環状ＲＮＡ（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、細胞、小胞又は他の膜ベースの担体中で又はそれを介して投与される。一実施形態において、修飾環状ＲＮＡを含む医薬組成物は、リポソーム又は他の同様の小胞中で製剤化され得る。リポソームは、内部水性区画を囲む単層若しくは多層脂質二重層及び比較的不透過性の外部親油性リン脂質二重層から構成される球形小胞構造である。リポソームは、アニオン性、中性又はカチオン性であり得る。リポソームは、生体適合性、非毒性であり、親水性及び親油性薬剤分子の両方を送達し、それらのカーゴを血漿酵素による分解から保護し、生体膜及び血液脳関門（ＢＢＢ）をわたってそれらの負荷を輸送することができる（概説について、例えば、Ｓｐｕｃｈ ａｎｄ Ｎａｖａｒｒｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｖｏｌ．２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ４６９６７９，１２ ｐａｇｅｓ，２０１１．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／４６９６７９を参照されたい）。
小胞は、いくつかの異なるタイプの脂質から作製され得るが；リン脂質が、薬剤担体としてリポソームを生成するために最も一般的に使用される。多層小胞脂質の調製のための方法は、当該技術分野において公知である（例えば、多層小胞脂質調製に関連するその教示内容が、参照により本明細書に援用される米国特許第６，６９３，０８６号明細書を参照されたい）。小胞形成は、脂質膜が水溶液と混合されるときに自発的であり得るが、それは、ホモジナイザー、ソニケーター、又は押し出し装置を使用することによって振とうする形で力を加えることによって促進することもできる（概説について、例えば、Ｓｐｕｃｈ ａｎｄ Ｎａｖａｒｒｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｖｏｌ．２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ４６９６７９，１２ ｐａｇｅｓ，２０１１．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／４６９６７９を参照されたい）。押し出された脂質は、押し出された脂質調製に関連するその教示内容が、参照により本明細書に援用されるＴｅｍｐｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ，１５：６４７－６５２，１９９７に記載されるように、サイズを減少させるフィルタを通して押し出すことによって調製され得る。
脂質ナノ粒子は、本明細書に記載される修飾環状ＲＮＡ組成物（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）又は製剤のための生体適合性及び生分解性送達系を提供する担体の別の例である。ナノ構造脂質担体（ＮＬＣ）は、ＳＬＮの特徴を保ち、薬剤安定性及び負荷容量を向上させ、薬剤の漏出を防ぐ改質された固体脂質ナノ粒子（ＳＬＮ）である。ポリマーナノ粒子（ＰＮＰ）は、薬剤送達の重要な構成要素である。これらのナノ粒子は、有効に、薬剤送達を特定の標的に向け、薬剤安定性及び制御された薬剤放出を向上させ得る。リポソーム及びポリマーを組み合わせた新たなタイプの担体である脂質－ポリマーナノ粒子（ＰＬＮ）も用いられ得る。これらのナノ粒子は、ＰＮＰ及びリポソームの補完的な利点を有する。ＰＬＮは、コア－シェル構造から構成され；ポリマーコアが、安定した構造を提供し、リン脂質シェルが、良好な生体適合性を提供する。したがって、２つの構成要素が、薬剤封入効率を高め、表面改質を促進し、水溶性薬剤の漏出を防ぐ。概説について、例えば、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．２０１７，Ｎａｎｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ７，１２２；ｄｏｉ：１０．３３９０／ｎａｎｏ７０６０１２２を参照されたい。
担体のさらなる非限定的な例としては、炭水化物担体（例えば、無水物修飾フィトグリコーゲン若しくはグリコーゲン型材料）、タンパク質担体（例えば、環状ポリリボヌクレオチドに共有結合されるタンパク質）、又はカチオン性担体（例えば、カチオン性リポポリマー若しくはトランスフェクション試薬）が挙げられる。炭水化物担体の非限定的な例としては、フィトグリコーゲンオクテニルスクシネート、フィトグリコーゲンβ－デキストリン、及び無水物修飾フィトグリコーゲンβ－デキストリンが挙げられる。カチオン性担体の非限定的な例としては、リポフェクタミン、ポリエチレンイミン、ポリ（トリメチレンイミン）、ポリ（テトラメチレンイミン）、ポリプロピレンイミン、アミノグリコシド－ポリアミン、ジデオキシ－ジアミノ－β－シクロデキストリン、スペルミン、スペルミジン、ポリ（２－ジメチルアミノ）エチルメタクリレート、ポリ（リジン）、ポリ（ヒスチジン）、ポリ（アルギニン）、カチオン化ゼラチン、デンドリマー、キトサン、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ－［１－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、１－［２－（オレオイルオキシ）エチル］－２－オレイル－３－（２－ヒドロキシエチル）イミダゾリニウムクロリド（ＤＯＴＩＭ）、２，３－ジオレイルオキシ－Ｎ－［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－プロパンアミニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）、３Ｂ－［Ｎ－（Ｎ，Ｎ’－ジメチルアミノエタン）－カルバモイル］コレステロール塩酸塩（ＤＣ－コレステロールＨＣｌ）、ジヘプタデシルアミドグリシルスペルミジン（ＤＯＧＳ）、Ｎ，Ｎ－ジステアリル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ－（１，２－ジミリスチルオキシプロパ－３－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、及びＮ，Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）が挙げられる。タンパク質担体の非限定的な例としては、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）、高比重リポタンパク質（ＨＤＬ）、又はグロブリンが挙げられる。
エキソソームも、本明細書に記載される環状ＲＮＡ組成物又は製剤のための薬剤送達ビヒクルとして使用され得る。概説について、Ｈａ ｅｔ ａｌ．Ｊｕｌｙ ２０１６．Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ Ｂ．Ｖｏｌｕｍｅ ６，Ｉｓｓｕｅ ４，Ｐａｇｅｓ ２８７－２９６；ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ａｐｓｂ．２０１６．０２．００１を参照されたい。
エクスビボ分化された赤血球も、本明細書に記載される環状ＲＮＡ組成物又は製剤のための担体として使用され得る。例えば、国際公開第２０１５０７３５８７号パンフレット；国際公開第２０１７１２３６４６号パンフレット；国際公開第２０１７１２３６４４号パンフレット；国際公開第２０１８１０２７４０号パンフレット；国際公開第２０１６１８３４８２号パンフレット；国際公開第２０１５１５３１０２号パンフレット；国際公開第２０１８１５１８２９号パンフレット；国際公開第２０１８００９８３８号パンフレット；Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．２０１４．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１１１（２８）：１０１３１－１０１３６；米国特許第９，６４４，１８０号明細書；Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１７．Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ８：４２３；Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．２０１４．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１１１（２８）：１０１３１－１０１３６を参照されたい。
例えば、国際公開第２０１８２０８７２８号パンフレットに記載されるようなフソソーム組成物も、本明細書に記載される修飾環状ＲＮＡ（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）又はその医薬組成物を送達するための担体として使用され得る。
ビロソーム及びウイルス様粒子（ＶＬＰ）も、本明細書に記載される修飾環状ＲＮＡ又はその医薬組成物を、標的とされる細胞に送達するための担体として使用され得る。
例えば、国際特許公開番号国際公開第２０１１０９７４８０号パンフレット、国際公開第２０１３０７０３２４号パンフレット、国際公開第２０１７００４５２６号パンフレット、又は国際公開第２０２００４１７８４号パンフレットに記載されるような植物ナノ小胞及び植物メッセンジャーパック（ＰＭＰ）も、本明細書に記載される環状ＲＮＡ又はその医薬組成物を送達するための担体として使用され得る。
生成の方法
ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、非天然であり、組み換え技術（以下に詳細に記載される方法、例えばＤＮＡプラスミドを用いてインビトロで得られる）又は化学合成を用いて生成され得るデオキシリボ核酸配列を含む。
ＲＮＡ環を生成するのに使用されるＤＮＡ分子が、天然の元の核酸配列のＤＮＡ配列、その修飾形態又は自然界で通常見られない合成ポリペプチド（例えば、キメラ分子又は融合タンパク質）をコードするＤＮＡ配列を含む得ることは、本発明の範囲内である。ＤＮＡ及びＲＮＡ分子は、限定はされないが、部位特異的突然変異誘発、突然変異を誘発するための核酸分子の化学的処理、核酸フラグメントの制限酵素切断、核酸フラグメントのライゲーション、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅及び／又は核酸配列の選択された領域の突然変異誘発、オリゴヌクレオチド混合物の合成及び核酸分子の混合物を「構築する」ための混合物群のライゲーション並びにそれらの組合せなど、古典的な突然変異誘発技術及び組み換え技術を含む様々な技術を用いて修飾され得る。
修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、限定はされないが、化学合成及び酵素的合成を含む任意の利用可能な技術に従って調製され得る。ある実施形態において、線状一次構築物又は線状ｍＲＮＡは、環状化又はコンカテマー化されて、本明細書に記載される修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）を生成し得る。環状化又はコンカテマー化の機構は、限定はされないが、化学的、酵素的、スプリントライゲーション）又はリボザイム触媒方法などの方法によって行われ得る。新たに形成される５’－／３’－結合は、分子内結合又は分子間結合であり得る。
本明細書に記載される修飾環状ポリリボヌクレオチドを作製する方法は、例えば、Ｋｈｕｄｙａｋｏｖ＆Ｆｉｅｌｄｓ，Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ＤＮＡ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ（２００２）；Ｚｈａｏ，Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｔｏｏｌｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，（Ｆｉｒｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（２０１３）；及びＥｇｌｉ＆Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，（Ｆｉｒｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ（２０１２）に記載されている。
修飾環状ポリリボヌクレオチドを合成する様々な方法は、当該技術分野でも記載されている（例えば、それぞれの内容全体が参照により本明細書に援用される米国特許第６２１０９３１号明細書、米国特許第５７７３２４４号明細書、米国特許第５７６６９０３号明細書、米国特許第５７１２１２８号明細書、米国特許第５４２６１８０号明細書、米国特許出願公開第２０１００１３７４０７号明細書、国際公開第１９９２００１８１３号パンフレット及び国際公開第２０１００８４３７１号パンフレットを参照されたい）。
ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチドは、生成不純物、例えば遊離リボ核酸、線状又はニックＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質などを除去するために、生成後にクリーンアップされ得る。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチドは、当該技術分野において一般的に使用される任意の公知の方法によって精製され得る。非限定的な精製方法の例としては、カラムクロマトグラフィー、ゲル排除、サイズ排除などが挙げられる。
発現の方法
本発明は、タンパク質発現のための方法であって、本明細書において提供される修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）の少なくとも領域を翻訳することを含む方法を含む。
ある実施形態において、タンパク質発現のための方法は、ポリペプチドへの、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）の全長の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％の翻訳を含む。ある実施形態において、タンパク質発現のための方法は、少なくとも５アミノ酸、少なくとも１０アミノ酸、少なくとも１５アミノ酸、少なくとも２０アミノ酸、少なくとも５０アミノ酸、少なくとも１００アミノ酸、少なくとも１５０アミノ酸、少なくとも２００アミノ酸、少なくとも２５０アミノ酸、少なくとも３００アミノ酸、少なくとも４００アミノ酸、少なくとも５００アミノ酸、少なくとも６００アミノ酸、少なくとも７００アミノ酸、少なくとも８００アミノ酸、少なくとも９００アミノ酸又は少なくとも１０００アミノ酸のポリペプチドへの、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）の翻訳を含む。ある実施形態において、タンパク質発現のための方法は、約５アミノ酸、約１０アミノ酸、約１５アミノ酸、約２０アミノ酸、約５０アミノ酸、約１００アミノ酸、約１５０アミノ酸、約２００アミノ酸、約２５０アミノ酸、約３００アミノ酸、約４００アミノ酸、約５００アミノ酸、約６００アミノ酸、約７００アミノ酸、約８００アミノ酸、約９００アミノ酸又は約１０００アミノ酸のポリペプチドへの、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）の翻訳を含む。ある実施形態において、本方法は、本明細書において提供される連続したポリペプチド、本明細書において提供される別個のポリペプチド又はその両方への修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）の翻訳を含む。
ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）の少なくとも領域の翻訳は、ウサギ網状赤血球溶解物など、インビトロで行われる。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）の少なくとも領域の翻訳は、例えば、真核細胞のトランスフェクション、又は細菌などの原核細胞の形質転換後、インビボで行われる。
ある態様において、本開示は、対象における１つ以上の発現配列のインビボ発現の方法であって、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）を対象の細胞に投与する工程であって、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、１つ以上の発現配列を含む、工程と；細胞内の修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）から１つ以上の発現配列を発現する工程とを含む方法を提供する。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、後の時点での細胞内における１つ以上の発現配列の発現が前の時点と等しいか又はそれより多いように構成される。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、少なくとも７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２３日、又はそれ以上の期間にわたる細胞内における１つ以上の発現配列の発現が、約４０％を超えて減少しないように構成される。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、細胞内における１つ以上の発現配列の発現が、少なくとも７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２３日、又はそれ以上にわたって、約４０％を超えて変化しないレベルに維持されるように構成される。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）の投与は、本明細書に記載される任意の送達方法を用いて行われる。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）は、静脈注射によって対象に投与される。ある実施形態において、修飾環状ポリリボヌクレオチド（例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド又はハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチド）の投与としては、限定はされないが、出産前投与、新生児期投与、出生後投与、経口、注入によるもの（例えば、静脈内、動脈内、腹腔内、皮内、皮下及び筋肉内）、眼内投与及び鼻腔内投与によるものが挙げられる。
ある実施形態において、タンパク質発現のための方法は、翻訳産物の修飾、折り畳み又は他の翻訳後修飾を含む。ある実施形態において、タンパク質発現のための方法は、例えば、細胞機構を介したインビボでの翻訳後修飾を含む。
番号付けされた実施形態
［１］薬学的に許容される担体又は賦形剤及び修飾環状ポリリボヌクレオチドを含む医薬組成物であって、修飾環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド及び第１の部分を含み、第１の部分は、少なくとも約５、１０、２０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、又は１０００連続非修飾ヌクレオチドを含む、医薬組成物。
［２］薬学的に許容される担体又は賦形剤及び修飾環状ポリリボヌクレオチドを含む医薬組成物であって、修飾環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド及び第１の部分を含み、第１の部分は、少なくとも約５、１０、２０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、又は１０００連続ヌクレオチドを含み、第１の部分は、５’－メチルシチジン又はプソイドウリジンを欠いている、医薬組成物。
［３］修飾環状ポリリボヌクレオチドは、対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチドより低い免疫原性を有する、番号付けされた実施形態［１］又は［２］に記載の医薬組成物。
［４］修飾環状ポリリボヌクレオチドは、対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチドより、少なくとも約１．１、１．２、１．３、１．５、１．６、１．８、２、２．２、２．５、２．８、３、３．２、３．３、３．５、３．８、４．０、４．２、４．５、４．８、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、又は１０．０倍長い半減期を有する、いずれか１つの番号付けされた実施形態［１］～［３］に記載の医薬組成物。
［５］修飾環状ポリリボヌクレオチドは、対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチドより長い半減期を有する、いずれか１つの番号付けされた実施形態［１］～［４］に記載の医薬組成物。
［６］修飾環状ポリリボヌクレオチドは、ＲＩＧ－Ｉ、ＴＬＲ－３、ＴＬＲ－７、ＴＬＲ－８、ＭＤＡ－５、ＬＧＰ－２、ＯＡＳ、ＯＡＳＬ、ＰＫＲ、及びＩＦＮ－βのうちの少なくとも１つの発現若しくはシグナル伝達若しくは活性化によって評価した際に、対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチドより、少なくとも約１．１、１．２、１．３、１．５、１．６、１．８、２、２．２、２．５、２．８、３、３．２、３．３、３．５、３．８、４．０、４．２、４．５、４．８、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、若しくは１０．０倍低い免疫原性を有する、いずれか１つの番号付けされた実施形態［１］～［５］に記載の医薬組成物。
［７］修飾環状ポリリボヌクレオチドは、対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチドより長い半減期を有する、いずれか１つの番号付けされた実施形態［１］～［６］に記載の医薬組成物。
［８］少なくとも１つの修飾ヌクレオチドは、Ｎ（６）メチルアデノシン（ｍ６Ａ）、５’－メチルシチジン、及びプソイドウリジンからなる群から選択される、いずれか１つの番号付けされた実施形態［１］～［７］に記載の医薬組成物。
［９］少なくとも１つの修飾核酸は、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－Ｏ－ＭＯＥ）、２’－Ｏ－アミノプロピル、２’－デオキシ、Ｔ－デオキシ－２’－フルオロ、２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＯＥ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノプロピル（２’－Ｏ－ＤＭＡＰ）、Ｔ－Ｏ－ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）、２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）、ロックト核酸（ＬＮＡ）、エチレン核酸（ＥＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、１’，５’－アンヒドロヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、モルホリノ、メチルホスホネートヌクレオチド、チオホスホネートヌクレオチド、及び２’－フルオロＮ３－Ｐ５’－ホスホロアミダイトからなる群から選択される、いずれか１つの番号付けされた実施形態［１］～［８］に記載の医薬組成物。
［１０］修飾環状ポリリボヌクレオチドの少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は９９％のヌクレオチドが、修飾ヌクレオチドである、いずれか１つの番号付けされた実施形態［１］～［９］に記載の医薬組成物。
［１１］環状ポリリボヌクレオチドは、非修飾ヌクレオチドからなる、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は細胞標的に結合するように構成される結合部位を含む、いずれか１つの番号付けされた実施形態［１］～［１０］に記載の医薬組成物。
［１２］第１の部分は、結合部位を含む、番号付けされた実施形態［１１］に記載の医薬組成物。
［１３］修飾環状ポリリボヌクレオチドは、非修飾ヌクレオチドからなるＩＲＥＳを含む、いずれか１つの番号付けされた実施形態［１］～［１２］に記載の医薬組成物。
［１４］第１の部分は、ＩＲＥＳを含む、いずれか１つの番号付けされた実施形態［１］～［１３］に記載の医薬組成物。
［１５］修飾環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上の発現配列を含む、いずれか１つの番号付けされた実施形態［１］～［１４］に記載の医薬組成物。
［１６］修飾環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上の発現配列及びＩＲＥＳを含み、修飾環状ポリリボヌクレオチドは、ＩＲＥＳの外部に、５’－メチルシチジン、プソイドウリジン、又はそれらの組合せを含む、いずれか１つの番号付けされた実施形態［１］～［１５］に記載の医薬組成物。
［１７］修飾環状ポリリボヌクレオチドの１つ以上の発現配列は、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド同等物より高い翻訳効率を有する、いずれか１つの番号付けされた実施形態［１］～［１６］に記載の医薬組成物。
［１８］修飾環状ポリリボヌクレオチドの１つ以上の発現配列は、完全修飾環状ポリリボヌクレオチド同等物より、少なくとも約０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．５、１．６、１．８、２、２．２、２．５、２．８、３倍高い翻訳効率を有する、いずれか１つの番号付けされた実施形態［１］～［１７］に記載の医薬組成物。
［１９］完全修飾環状ポリリボヌクレオチド同等物は、第１の部分の外部の少なくとも１つの修飾ヌクレオチド及び第１の部分中の５％超の修飾ヌクレオチドヌクレオチドを含む、番号付けされた実施形態［１７］又は［１８］のいずれか１つに記載の医薬組成物。
［２０］修飾環状ポリリボヌクレオチドの１つ以上の発現配列は、対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチドより高い翻訳効率を有する、いずれか１つの番号付けされた実施形態［１］～［１９］に記載の医薬組成物。
［２１］修飾環状ポリリボヌクレオチドの１つ以上の発現配列は、対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチドより、少なくとも約０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．５、１．６、１．８、２、２．２、２．５、２．８、３倍高い翻訳効率を有する、いずれか１つの番号付けされた実施形態［１］～［２０］に記載の医薬組成物。
［２２］修飾環状ポリリボヌクレオチドの１つ以上の発現配列は、修飾ヌクレオチドを含む第１の部分を有する対応する環状ポリリボヌクレオチドより高い翻訳効率を有する、いずれか１つの番号付けされた実施形態［１］～［２１］に記載の医薬組成物。
［２３］環状ポリリボヌクレオチドの１つ以上の発現配列は、１０％超の修飾ヌクレオチドを含む第１の部分を有する対応する環状ポリリボヌクレオチドより高い翻訳効率を有する、番号付けされた実施形態［１］～［２２］のいずれか１つに記載の医薬組成物。
［２４］修飾環状ポリリボヌクレオチドの１つ以上の発現配列は、修飾ヌクレオチドを含む第１の部分を有する対応する環状ポリリボヌクレオチドより、少なくとも約１．２、１．３、１．５、１．６、１．８、２、２．２、２．５、２．８、３、３．２、３．３、３．５、３．８、４．０、４．２、４．５、４．８、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、又は１０．０倍高い翻訳効率を有する、いずれか１つの番号付けされた実施形態［１］～［２３］に記載の医薬組成物。
［２５］翻訳効率は、環状ポリリボヌクレオチド若しくは対応する環状ポリリボヌクレオチドを含む細胞、又はインビトロ翻訳系（例えば、ウサギ網状赤血球溶解物）のいずれかにおいて測定される、番号付けされた実施形態［１７］～［２３］のいずれか１つに記載の医薬組成物。
［２６］修飾環状ポリリボヌクレオチドは、ローリングサークル型翻訳の能力がある、いずれか１つの番号付けされた実施形態［１］～［２５］に記載の医薬組成物。
［２７］１つ以上の発現配列のそれぞれは、環状ポリリボヌクレオチドにおけるスタガー要素によって後続の発現配列から隔てられ、１つ以上の発現配列のローリングサークル型翻訳は、少なくとも２つのポリペプチド分子を生成する、番号付けされた実施形態［１５］～［２６］のいずれか１つに記載の医薬組成物。
［２８］薬学的に許容される担体又は賦形剤は、エタノールである、番号付けされた実施形態［１］～［２７］のいずれか１つに記載の医薬組成物。
［２９］スタガー要素は、（ａ）単一の発現配列の２回の翻訳から、又は（ｂ）２つ以上の発現配列の１回以上の翻訳からの単一のポリペプチドの生成を防止する、番号付けされた実施形態［２７］に記載の医薬組成物。
［３０］スタガー要素は、１つ以上の発現配列から切り離された配列である、番号付けされた実施形態［２７］又は［２９］に記載の医薬組成物。
［３１］スタガー要素は、１つ以上の発現配列の発現配列の一部を含む、番号付けされた実施形態［２７］又は［２９］に記載の医薬組成物。
［３２］修飾環状ポリリボヌクレオチドは、ローリングサークル型翻訳の能力があり、修飾環状ポリリボヌクレオチドは、修飾環状ポリリボヌクレオチドのローリングサークル型翻訳中に生成される全ポリペプチド（モル／モル）の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％が別個のポリペプチドであるように構成され、別個のポリペプチドのそれぞれは、１つ以上の発現配列の１回の翻訳又は１回未満の翻訳から生成される、番号付けされた実施形態１～２４のいずれか１つに記載の医薬組成物。
［３３］修飾環状ポリリボヌクレオチドは、修飾環状ポリリボヌクレオチドのローリングサークル型翻訳中に生成される全ポリペプチド（モル／モル）の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％が別個のポリペプチドであるように構成され、全ポリペプチドにわたる別個の産物の量比率がインビトロ翻訳系において試験される、番号付けされた実施形態［３２］に記載の医薬組成物。
［３４］インビトロ翻訳系は、ウサギ網状赤血球溶解物を含む、番号付けされた実施形態［３３］に記載の医薬組成物。
［３５］スタガー要素は、１つ以上の発現配列の少なくとも１つの３’末端にあり、スタガー要素は、修飾環状ポリリボヌクレオチドのローリングサークル型翻訳中にリボソームを停滞させるように構成される、番号付けされた実施形態［２７］～［３４］のいずれか１つに記載の医薬組成物。
［３６］スタガー要素は、２Ａ配列及び２Ａ様配列からなる群から選択されるペプチド配列をコードする、番号付けされた実施形態［２７］～［３５］のいずれか１つに記載の医薬組成物。
［３７］スタガー要素は、ＧＰであるＣ末端配列を有する配列をコードする、番号付けされた実施形態［２７］～［３６］のいずれか１つに記載の医薬組成物。
［３８］スタガー要素は、Ｄ（Ｖ／Ｉ）ＥｘＮＰＧＰ（ここで、ｘ＝任意のアミノ酸である）であるＣ末端コンセンサス配列を有する配列をコードする、番号付けされた実施形態［２７］～［３７］のいずれか１つに記載の医薬組成物。
［３９］スタガー要素は、ＧＤＶＥＳＮＰＧＰ、ＧＤＩＥＥＮＰＧＰ、ＶＥＰＮＰＧＰ、ＩＥＴＮＰＧＰ、ＧＤＩＥＳＮＰＧＰ、ＧＤＶＥＬＮＰＧＰ、ＧＤＩＥＴＮＰＧＰ、ＧＤＶＥＮＰＧＰ、ＧＤＶＥＥＮＰＧＰ、ＧＤＶＥＱＮＰＧＰ、ＩＥＳＮＰＧＰ、ＧＤＩＥＬＮＰＧＰ、ＨＤＩＥＴＮＰＧＰ、ＨＤＶＥＴＮＰＧＰ、ＨＤＶＥＭＮＰＧＰ、ＧＤＭＥＳＮＰＧＰ、ＧＤＶＥＴＮＰＧＰ、ＧＤＩＥＱＮＰＧＰ、及びＤＳＥＦＮＰＧＰからなる群から選択される配列をコードする、番号付けされた実施形態［２７］～［３８］のいずれか１つに記載の医薬組成物。
［４０］スタガー要素は、１つ以上の発現配列のそれぞれの３’末端にある、番号付けされた実施形態［２７］～［３９］のいずれか１つに記載の医薬組成物。
［４１］修飾環状ポリリボヌクレオチド中の第１の発現配列のスタガー要素は、修飾環状ポリリボヌクレオチド中の第１の発現配列に続く発現配列の第１の翻訳開始配列の上流（５’末端側）にあり、スタガー要素と第１の翻訳開始配列との間の距離は、第１の発現配列及び後続の発現配列の連続した翻訳を可能にする、番号付けされた実施形態［２７］～［４０］のいずれか１つに記載の医薬組成物。
［４２］修飾環状ポリリボヌクレオチド中の第１の発現配列のスタガー要素は、環状ポリリボヌクレオチド中の第１の発現に続く発現配列の第１の翻訳開始配列の上流（５’末端側）にあり、環状ポリリボヌクレオチドは、連続して翻訳され、対応する修飾環状ポリリボヌクレオチド中の第２の発現配列の第２の翻訳開始配列の上流にある第２のスタガー要素を含む対応する修飾環状ポリリボヌクレオチドは、連続して翻訳されておらず、対応する修飾環状ポリリボヌクレオチド中の第２のスタガー要素は、第２の翻訳開始配列、修飾環状ポリリボヌクレオチド中のスタガー要素と第１の翻訳開始との間の距離より例えば少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍大きい距離にある、番号付けされた実施形態［２７］～［４０］のいずれか１つに記載の医薬組成物。
［４３］スタガー要素と第１の翻訳開始との間の距離は、少なくとも２ｎｔ、３ｎｔ、４ｎｔ、５ｎｔ、６ｎｔ、７ｎｔ、８ｎｔ、９ｎｔ、１０ｎｔ、１１ｎｔ、１２ｎｔ、１３ｎｔ、１４ｎｔ、１５ｎｔ、１６ｎｔ、１７ｎｔ、１８ｎｔ、１９ｎｔ、２０ｎｔ、２５ｎｔ、３０ｎｔ、３５ｎｔ、４０ｎｔ、４５ｎｔ、５０ｎｔ、５５ｎｔ、６０ｎｔ、６５ｎｔ、７０ｎｔ、７５ｎｔ、又はそれ以上である、番号付けされた実施形態［４１］又は［４２］に記載の医薬組成物。
［４４］第２のスタガー要素と第２の翻訳開始との間の距離は、スタガー要素と第１の翻訳開始との間の距離より少なくとも２ｎｔ、３ｎｔ、４ｎｔ、５ｎｔ、６ｎｔ、７ｎｔ、８ｎｔ、９ｎｔ、１０ｎｔ、１１ｎｔ、１２ｎｔ、１３ｎｔ、１４ｎｔ、１５ｎｔ、１６ｎｔ、１７ｎｔ、１８ｎｔ、１９ｎｔ、２０ｎｔ、２５ｎｔ、３０ｎｔ、３５ｎｔ、４０ｎｔ、４５ｎｔ、５０ｎｔ、５５ｎｔ、６０ｎｔ、６５ｎｔ、７０ｎｔ、７５ｎｔ、又はそれ以上大きい、番号付けされた実施形態［４１］又は［４２］に記載の医薬組成物。
［４５］修飾環状ポリリボヌクレオチドにおける第１の発現配列に続く発現配列は、第１の発現配列以外の発現配列である、番号付けされた実施形態［４１］～［４３］のいずれか１つに記載の医薬組成物。
［４６］修飾環状ポリリボヌクレオチドにおける第１の発現配列の後続の発現配列は、第１の発現配列である、番号付けされた実施形態［４１］～［４３］のいずれか１つに記載の医薬組成物。
［４７］修飾環状ポリリボヌクレオチドは、
ａ）エンクリプトゲン；
ｂ）スタガー要素；
ｃ）調節要素；
ｄ）複製要素；及び
ｆ）疑似二本鎖二次構造
から選択される少なくとも１つの構造要素を含む、いずれかの前の番号付けされた実施形態に記載の医薬組成物。
［４８］修飾環状ポリリボヌクレオチドは、
ａ）線状同等物より高い翻訳効率；
ｂ）複数の翻訳産物の化学量論的翻訳効率；
ｃ）エンクリプトゲンを欠いた同等物より低い免疫原性；
ｄ）線状同等物より増加した半減期；及び
ｅ）細胞分裂中の持続性
から選択される少なくとも１つの機能特性を含む、いずれかの前の番号付けされた実施形態に記載の医薬組成物。
［４９］修飾環状ポリリボヌクレオチドは、線状同等物より少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、又は少なくとも１００倍高い翻訳効率を有する、いずれかの前の番号付けされた実施形態に記載の医薬組成物。
［５０］修飾環状ポリリボヌクレオチドは、線状同等物より少なくとも５倍高い翻訳効率を有する、いずれかの前の番号付けされた実施形態に記載の医薬組成物。
［５１］修飾環状ポリリボヌクレオチドは、
ａ）５’－ＵＴＲ；
ｂ）３’－ＵＴＲ；
ｃ）ポリ－Ａ配列；
ｄ）５’－キャップ；
ｅ）終止要素；
ｆ）エキソヌクレアーゼによる分解感受性；及び
ｇ）キャップ結合タンパク質への結合
の少なくとも１つを欠いている、いずれかの前の番号付けされた実施形態に記載の医薬組成物。
［５２］１つ以上の発現配列は、コザック開始配列を含む、番号付けされた実施形態［２６］～［５１］のいずれか１つに記載の医薬組成物。
［５３］疑似らせん構造は、少なくとも１つの非二本鎖セグメントを有する少なくとも１つの二本鎖ＲＮＡセグメントを含む、番号付けされた実施形態［４７］～［５２］のいずれか１つに記載の医薬組成物。
［５４］疑似らせん構造は、反復配列、例えばＡリッチ配列で連結される第１の配列及び第２の配列を含む、番号付けされた実施形態［５３］に記載の医薬組成物。
［５５］エンクリプトゲンは、スプライシング要素を含む、番号付けされた実施形態［４７］～［５４］のいずれか１つに記載の医薬組成物。
［５６］エンクリプトゲンは、タンパク質結合部位、例えばリボヌクレオチド結合タンパク質を含む、いずれかの前の番号付けされた実施形態に記載の医薬組成物。
［５７］エンクリプトゲンは、例えば、免疫応答、例えばＣＴＬ応答を回避するために免疫タンパク質結合部位を含む、いずれかの前の番号付けされた実施形態に記載の医薬組成物。
［５８］修飾環状ポリリボヌクレオチドは、例えば、ＲＩＧ－Ｉ、ＴＬＲ－３、ＴＬＲ－７、ＴＬＲ－８、ＭＤＡ－５、ＬＧＰ－２、ＯＡＳ、ＯＡＳＬ、ＰＫＲ、及びＩＦＮ－βのうちの少なくとも１つの発現若しくはシグナル伝達若しくは活性化によって評価した際に、エンクリプトゲンを欠いた同等物より少なくとも２倍低い免疫原性を有する、いずれかの前の番号付けされた実施形態に記載の医薬組成物。
［５９］修飾環状ポリリボヌクレオチドは、リボスイッチをさらに含む、いずれかの前の番号付けされた実施形態に記載の医薬組成物。
［６０］修飾環状ポリリボヌクレオチドは、アプタザイムをさらに含む、いずれかの前の番号付けされた実施形態に記載の医薬組成物。
［６１］修飾環状ポリリボヌクレオチドは、非標準的翻訳開始配列、例えばＧＵＧ、ＣＵＧ開始コドン、例えばストレス条件下での発現を開始させる翻訳開始配列を含む、いずれかの前の番号付けされた実施形態に記載の医薬組成物。
［６２］１つ以上の発現配列は、ペプチドをコードする、いずれかの前の番号付けされた実施形態に記載の医薬組成物。
［６３］修飾環状ポリリボヌクレオチドは、調節核酸、例えばノンコーディングＲＮＡを含む、いずれかの前の番号付けされた実施形態に記載の医薬組成物。
［６４］環状ポリリボヌクレオチドは、約２０塩基～約２０ｋｂの範囲のサイズを有する、いずれかの前の番号付けされた実施形態に記載の医薬組成物。
［６５］修飾環状ポリリボヌクレオチドは、線状ポリリボヌクレオチドの環状化によって合成される、いずれかの前の番号付けされた実施形態に記載の医薬組成物。
［６６］修飾環状ポリリボヌクレオチドは、同じヌクレオチド配列又は異なるヌクレオチド配列のいずれかを有する複数の発現配列を含む、いずれかの前の番号付けされた実施形態に記載の医薬組成物。
［６７］修飾環状ポリリボヌクレオチドは、分解、例えばエキソヌクレアーゼに対して実質的に抵抗性である、いずれかの前の番号付けされた実施形態に記載の医薬組成物。
［６８］修飾環状ポリリボヌクレオチドは、
ａ．修飾環状ポリリボヌクレオチドであって、
ｂ．第１の標的、例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、細胞膜などの第１の結合部分に結合するように構成される第１の結合部位（ここで、第１の結合部分は、第１の環状ポリリボヌクレオチド（環状ＲＮＡ）結合モチーフである）；及び
ｃ．第２の標的の第２の結合部分に結合するように構成される第２の結合部位（ここで、第２の結合部分は、第２の環状ＲＮＡ結合モチーフである）
を含む、修飾環状ポリリボヌクレオチドを含み、
ｄ．第１の結合部分は、第２の結合部分と異なり、
ｅ．第１の標的、第２の標的、及び修飾環状ポリリボヌクレオチドは、複合体を形成し、
ｆ．第１の標的又は第２の標的は、マイクロＲＮＡでない、いずれかの前の番号付けされた実施形態に記載の医薬組成物。
［６９］修飾環状ポリリボヌクレオチドは、
ａ．修飾環状ポリリボヌクレオチドであって、
第１の標的の第１の結合部分に結合するように構成される第１の結合部位（ここで、第１の結合部分は、第１の環状ポリリボヌクレオチド（環状ＲＮＡ）結合モチーフである）；及び
第２の標的の第２の結合部分に結合するように構成される第２の結合部位（ここで、第２の結合部分は、第２の環状ＲＮＡ結合モチーフである）
を含む、修飾環状ポリリボヌクレオチドを含み、
ｂ．第１の結合部分は、第２の結合部分と異なり、
ｃ．第１の標的及び第２の標的は両方とも、マイクロＲＮＡである、いずれかの前の番号付けされた実施形態に記載の医薬組成物。
［７０］第１及び第２の標的は、互いに相互作用する、番号付けされた実施形態［６８］又は［６９］に記載の医薬組成物。
［７１］複合体は、細胞過程を調節する、番号付けされた実施形態［６８］～［７０］のいずれか１つに記載の医薬組成物。
［７２］第１及び第２の標的は、同じであり、第１及び第２の結合部位は、異なる部分に結合する、番号付けされた実施形態［６８］～［７１］のいずれか１つに記載の医薬組成物。
［７３］第１及び第２の標的は、異なる、番号付けされた実施形態［６８］～［７２］のいずれか１つに記載の医薬組成物。
［７４］修飾環状ポリリボヌクレオチドは、第３又はそれ以上の結合部分に結合するように構成される１つ以上のさらなる結合部位をさらに含む、番号付けされた実施形態［６８］～［７３］のいずれか１つに記載の医薬組成物。
［７５］１つ以上の標的が同じであり、１つ以上の結合部位が、異なる部分に結合するように構成される、番号付けされた実施形態［６８］～［７４］のいずれか１つに記載の医薬組成物。
［７６］複合体の形成が、細胞過程を調節する、番号付けされた実施形態［６８］～［７５］のいずれか１つに記載の医薬組成物。
［７７］修飾環状ポリリボヌクレオチドは、第１及び第２の標的と接触されたとき、第１又は第２の標的に関連する細胞過程を調節する、番号付けされた実施形態［６８］～［７６］のいずれか１つに記載の医薬組成物。
［７８］第１及び第２の標的は、複合体において互いに相互作用する、番号付けされた実施形態［６８］～［７７］のいずれか１つに記載の医薬組成物。
［７９］細胞過程は、疾患又は病態の発症に関連する、番号付けされた実施形態［６８］～［７８］のいずれか１つに記載の医薬組成物。
［８０］細胞過程は、環状ポリリボ核酸の翻訳と異なる、番号付けされた実施形態［７１］～［７９］のいずれか１つに記載の医薬組成物。
［８１］細胞過程は、疾患又は病態の発症に関連する、番号付けされた実施形態［７１］～［８０］のいずれか１つに記載の医薬組成物。
［８２］第１の標的は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子を含み、第２の標的は、タンパク質を含む、番号付けされた実施形態［６８］～［８１］のいずれか１つに記載の医薬組成物。
［８３］複合体は、ＤＮＡ分子の指向性転写、ＤＮＡ分子のエピジェネティックリモデリング、又はＤＮＡ分子の分解を調節する、番号付けされた実施形態［６８］～［８２］のいずれか１つに記載の医薬組成物。
［８４］第１の標的は、第１のタンパク質を含み、第２の標的は、第２のタンパク質を含む、番号付けされた実施形態［６８］～［８３］のいずれか１つに記載の医薬組成物。
［８５］複合体は、第１のタンパク質の分解、第１のタンパク質の転座、若しくはシグナル伝達を調節し、又は天然タンパク質機能を調節し、又は第１及び第２のタンパク質の間の直接相互作用によって形成される複合体の形成を阻害する、番号付けされた実施形態［６８］～［８４］のいずれか１つに記載の医薬組成物。
［８６］第１の標的は、第１のリボ核酸（ＲＮＡ）分子を含み、第２の標的は、第２のＲＮＡ分子を含む、番号付けされた実施形態［６８］～［８５］のいずれか１つに記載の医薬組成物。
［８７］複合体は、第１のＲＮＡ分子の分解を調節する、番号付けされた実施形態［８６］に記載の医薬組成物。
［８８］第１の標的は、タンパク質を含み、第２の標的は、ＲＮＡ分子を含む、番号付けされた実施形態［６８］～［８７］のいずれか１つに記載の医薬組成物。
［８９］複合体は、タンパク質の転座を調節し、又はタンパク質とＲＮＡ分子との間の直接相互作用によって形成される複合体の形成を阻害する、番号付けされた実施形態［６８］～［８８］のいずれか１つに記載の医薬組成物。
［９０］第１の結合部分は、受容体を含み、第２の結合部分は、受容体の基質を含む、番号付けされた実施形態［６８］～［８９］のいずれか１つに記載の医薬組成物。
［９１］複合体は、受容体の活性化を阻害する、番号付けされた実施形態［６８］～［９０］のいずれか１つに記載の医薬組成物。
［９２］修飾環状ポリリボヌクレオチドは、標的の結合部分に結合するように構成される結合部位を含み、ここで、結合部分は、リボ核酸（ＲＮＡ）結合モチーフであり、修飾環状ポリリボヌクレオチドは、翻訳能が欠損しているか又は翻訳能に欠陥があり、標的は、マイクロＲＮＡでない、いずれかの前の番号付けされた実施形態に記載の医薬組成物。
［９３］修飾環状ポリリボヌクレオチドは、標的の結合部分に結合するように構成される結合部位を含み、ここで、結合部分は、リボ核酸（ＲＮＡ）結合モチーフであり、修飾環状ポリリボヌクレオチドは、翻訳能が欠損しているか又は翻訳能に欠陥があり、標的は、マイクロＲＮＡである、いずれかの前の番号付けされた実施形態に記載の医薬組成物。
［９４］標的は、ＤＮＡ分子を含む、番号付けされた実施形態［９２］又は［９３］に記載の医薬組成物。
［９５］修飾環状ポリリボヌクレオチドへの結合部分の結合が、ＤＮＡ分子の転写の干渉を調節する、番号付けされた実施形態［９２］～［９４］のいずれか１つに記載の医薬組成物。
［９６］標的は、タンパク質を含む、番号付けされた実施形態［９２］～［９５］のいずれか１つに記載の医薬組成物。
［９７］修飾環状ポリリボヌクレオチドへの結合部分の結合が、他の分子とのタンパク質の相互作用を阻害する、番号付けされた実施形態［９６］に記載の医薬組成物。
［９８］タンパク質は受容体であり、修飾環状ポリリボヌクレオチドへの第１の結合部分の結合が、受容体を活性化する、番号付けされた実施形態［９６］又は［９７］に記載の医薬組成物。
［９９］タンパク質は第１の酵素であり、修飾環状ポリリボヌクレオチドは、第２の酵素に結合するように構成される第２の結合部位をさらに含み、修飾環状ポリリボヌクレオチドへの第１及び第２の酵素の結合は、第１及び第２の酵素の酵素活性を調節する、番号付けされた実施形態［９６］～［９８］のいずれか１つに記載の医薬組成物。
［１００］標的は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子を含む、番号付けされた実施形態［９２］～［９９］のいずれか１つに記載の医薬組成物。
［１０１］修飾環状ポリリボヌクレオチドへの結合部分の結合は、ｍＲＮＡ分子の翻訳の干渉を調節する、番号付けされた実施形態［１００］に記載の医薬組成物。
［１０２］標的は、リボソームを含む、番号付けされた実施形態［９２］～［１０１］のいずれか１つに記載の医薬組成物。
［１０３］修飾環状ポリリボヌクレオチドへの結合部分の結合は、翻訳過程の干渉を調節する、番号付けされた実施形態［１０２］に記載の医薬組成物。
［１０４］標的は、環状ＲＮＡ分子を含む、番号付けされた実施形態［９２］～［１０３］のいずれか１つに記載の医薬組成物。
［１０５］修飾環状ポリリボヌクレオチドへの結合部分の結合は、環状ＲＮＡ分子を隔離する、番号付けされた実施形態［１０４］に記載の医薬組成物。
［１０６］修飾環状ポリリボヌクレオチドへの結合部分の結合は、マイクロＲＮＡ分子を隔離する、番号付けされた実施形態［９２］～［１０５］のいずれか１つに記載の医薬組成物。
［１０７］修飾環状ポリリボヌクレオチドは、細胞標的の膜上で結合部分に結合するように構成される結合部位を含み；ここで、結合部分は、リボ核酸（ＲＮＡ）結合モチーフである、前の番号付けされた実施形態のいずれか１つに記載の医薬組成物。
［１０８］修飾環状ポリリボヌクレオチドは、第２の細胞標的における第２の結合部分に結合するように構成される第２の結合部位をさらに含み、ここで、第２の結合部分は、第２のＲＮＡ結合モチーフである、前の番号付けされた実施形態のいずれか１つに記載の医薬組成物。
［１０９］修飾環状ポリリボヌクレオチドは、両方の標的に結合するように構成される、前の番号付けされた実施形態のいずれか１つに記載の医薬組成物。
［１１０］修飾環状ポリリボヌクレオチドは、第２の結合部分に結合するように構成される第２の結合部位をさらに含み、環状ポリリボヌクレオチドへの両方の標的の結合が、第１の標的の立体配座変化を誘導し、それによって、標的の下流のシグナル伝達を誘導する、前の番号付けされた実施形態のいずれか１つに記載の医薬組成物。
［１１１］担体、例えば、膜又は脂質二重層中で製剤化される、いずれかの前の番号付けされた実施形態に記載の医薬組成物。
［１１２］修飾環状ポリリボヌクレオチドを対象に送達する方法であって、前の番号付けされた実施形態のいずれか１つに記載の医薬組成物を対象に投与する工程を含む方法。
［１１３］対象における環状ポリリボヌクレオチドの免疫原性を減少又は低下させる方法であって、
ハイブリッド環状ポリリボヌクレオチドを提供する工程であって、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド及び少なくとも約５、１０、２０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、若しくは１０００連続非修飾ヌクレオチドを含む第１の部分を含む、工程と；
ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドを、対象に投与する工程と；
対象の細胞又は組織における対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチドと比較して、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドに対して減少又は低下した免疫原性を得る工程とを含む方法。
［１１４］対象における１つ以上の発現配列を発現させる方法であって、
１つ以上の発現配列を含む修飾環状ポリリボヌクレオチドを提供する工程であって、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド及び少なくとも約５、１０、２０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、若しくは１０００連続非修飾ヌクレオチドを含む第１の部分を含む、工程と；
ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドを、対象に投与する工程と；
対象の細胞又は組織における完全修飾環状ポリリボヌクレオチド同等物中の１つ以上の発現配列の発現と比較して、１つ以上の発現配列の増加した発現を得る工程とを含む方法。
［１１５］対象における環状ポリリボヌクレオチドの安定性を増加させる方法であって、
ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドを提供する工程であって、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、修飾環状ポリリボヌクレオチド及び少なくとも約５、１０、２０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、若しくは１０００連続非修飾ヌクレオチドを含む第１の部分を含む、工程と；
ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドを、対象に投与する工程と；
対象の細胞又は組織における対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチドと比較して、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドに対して向上した安定性を得る工程とを含む方法。
［１１６］処置の方法であって、疾患又は病態を有する対象に、いずれかの前の組成物の番号付けされた実施形態に記載の医薬組成物を投与する工程を含む、処置の方法。
［１１７］医薬組成物を製造する方法であって、いずれかの前の組成物の番号付けされた実施形態に記載の修飾環状ポリリボヌクレオチドを生成する工程を含む方法。
［１１８］いずれかの前の組成物の番号付けされた実施形態に記載の修飾環状ポリリボヌクレオチドを作製する方法であって、核酸配列を有する線状ポリリボヌクレオチドを、修飾環状ポリリボヌクレオチドとして環状化する工程を含む方法。
［１１９］ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドを作製する方法であって、非修飾第１の部分を、修飾線状ポリリボヌクレオチドにライゲートして、ハイブリッド線状ポリリボヌクレオチドを生成する工程と、ハイブリッド線状ポリリボヌクレオチドを環状化する工程とを含む方法。
［１２０］いずれかの前の組成物の番号付けされた実施形態に記載の組成物を含む操作された細胞。
［１２１］対象における環状ポリリボヌクレオチドの免疫原性を減少又は低下させる方法であって、
ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドを提供する工程であって、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド及び５％以下の修飾ヌクレオチドを有する約５～１０００連続ヌクレオチドを含む第１の部分を含む、工程と；
ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドを、対象に投与する工程と；
対象の細胞又は組織における対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチドと比較して、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドに対して減少又は低下した免疫原性を得る工程とを含む方法。
［１２２］第１の部分は、少なくとも約５、１０、２０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、又は１０００連続ヌクレオチドを含む、番号付けされた実施形態［１２１］に記載の方法。
［１２３］第１の部分は、非修飾ヌクレオチドからなる、番号付けされた実施形態［１２１］又は［１２２］に記載の方法。
［１２４］第１の部分は、少なくとも約５、１０、２０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、又は１０００連続非修飾ヌクレオチドを含む、番号付けされた実施形態［１２１］～［１２３］のいずれか１つに記載の方法。
［１２５］第１の部分は、５’－メチルシチジン又はプソイドウリジンを欠いている、番号付けされた実施形態［１２１］～［１２４］のいずれか１つに記載の方法。
［１２６］環状ポリリボヌクレオチドは、翻訳能を有する、番号付けされた実施形態［１２１］～［１２５］のいずれか１つに記載の方法。
［１２７］ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、
ａ．対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチドより、少なくとも約０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．５、１．６、１．８、２、２．２、２．５、２．８、３倍高い発現を有し；
ｂ．対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチドより、少なくとも約１．１、１．２、１．３、１．５、１．６、１．８、２、２．２、２．５、２．８、３、３．２、３．３、３．５、３．８、４．０、４．２、４．５、４．８、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、若しくは１０．０倍長い半減期を有し；
ｃ．対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチドより長い半減期を有し；又は
ｄ．ＲＩＧ－Ｉ、ＴＬＲ－３、ＴＬＲ－７、ＴＬＲ－８、ＭＤＡ－５、ＬＧＰ－２、ＯＡＳ、ＯＡＳＬ、ＰＫＲ、及びＩＦＮ－βのうちの少なくとも１つの発現若しくはシグナル伝達若しくは活性化によって評価した際に、対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチドより、少なくとも約１．１、１．２、１．３、１．５、１．６、１．８、２、２．２、２．５、２．８、３、３．２、３．３、３．５、３．８、４．０、４．２、４．５、４．８、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、若しくは１０．０倍低い免疫原性を有する、番号付けされた実施形態［１２１］～［１２６］のいずれか１つに記載の方法。
［１２８］少なくとも１つの修飾ヌクレオチドは、
ａ．Ｎ（６）メチルアデノシン（ｍ６Ａ）、５’－メチルシチジン、及びプソイドウリジン；
ｂ．２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－Ｏ－ＭＯＥ）、２’－Ｏ－アミノプロピル、２’－デオキシ、Ｔ－デオキシ－２’－フルオロ、２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＯＥ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノプロピル（２’－Ｏ－ＤＭＡＰ）、Ｔ－Ｏ－ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）、２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）、ロックト核酸（ＬＮＡ）、エチレン核酸（ＥＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、１’，５’－アンヒドロヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、モルホリノ、メチルホスホネートヌクレオチド、チオホスホネートヌクレオチド、及び２’－フルオロＮ３－Ｐ５’－ホスホロアミダイト；又は
ｃ．表２中のいずれかの修飾ヌクレオチド
からなる群から選択される、番号付けされた実施形態［１２１］～［１２７］のいずれか１つに記載の方法。
［１２９］ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドの少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は９９％のヌクレオチドが、修飾ヌクレオチドである、番号付けされた実施形態［１２１］～［１２８］のいずれか１つに記載の方法。
［１３０］ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、非修飾ヌクレオチドからなる、タンパク質、ペプチド、生体分子、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は細胞標的に結合するように構成される結合部位を含む、番号付けされた実施形態［１２１］～［１２９］のいずれか１つに記載の方法。
［１３１］ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上の発現配列を含む、番号付けされた実施形態［１２１］～［１３０］のいずれか１つに記載の方法。
［１３２］第１の部分は、非修飾ヌクレオチド又は５％以下の修飾ヌクレオチドからなるＩＲＥＳを含む、番号付けされた実施形態［１２１］～［１３１］のいずれか１つに記載の方法。
［１３３］ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドの１つ以上の発現配列は、
ａ．完全修飾環状ポリリボヌクレオチド同等物より高い翻訳効率；
ｂ．完全修飾環状ポリリボヌクレオチド同等物より、少なくとも約０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．５、１．６、１．８、２、２．２、２．５、２．８、３倍高い翻訳効率；
ｃ．対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチドより高い翻訳効率；又は
ｄ．対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチドより、少なくとも約０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．５、１．６、１．８、２、２．２、２．５、２．８、３倍高い翻訳効率
を有する、番号付けされた実施形態［１３１］又は［１３２］に記載の方法。
［１３４］対象における１つ以上の発現配列を発現させる方法であって、
１つ以上の発現配列を含むハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドを提供する工程であって、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド及び５％以下の修飾ヌクレオチドを有する約５～１０００連続ヌクレオチドを含む第１の部分を含む、工程と；；
ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドを、対象に投与する工程と；
対象の細胞又は組織における完全修飾環状ポリリボヌクレオチド同等物中の対応する１つ以上の発現配列の発現と比較して、１つ以上の発現配列の増加した発現を得る工程とを含む方法。
［１３５］対象における環状ポリリボヌクレオチドの安定性を増加させる方法であって、
ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドを提供する工程であって、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド及び５％以下の修飾ヌクレオチドを有する約５～１０００連続ヌクレオチドを含む第１の部分を含む、工程と；
ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドを、対象に投与する工程と；
対象の細胞又は組織における対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチドと比較して、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドに対して増加した安定性を得る工程とを含む方法。
［１３６］第１の部分は、ＩＲＥＳを含む、番号付けされた実施形態［１３４］又は［１３５］に記載の方法。
［１３７］第１の部分は、少なくとも約５、１０、２０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、又は１０００連続ヌクレオチドを含む、番号付けされた実施形態［１３４］～［１３６］のいずれか１つに記載の方法。
［１３８］第１の部分は、非修飾ヌクレオチドからなる、番号付けされた実施形態［１３４］～［１３７］のいずれか１つに記載の方法。
［１３９］第１の部分は、少なくとも約５、１０、２０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、又は１０００連続非修飾ヌクレオチドを含む、番号付けされた実施形態［１３４］～［１３８］のいずれか１つに記載の方法。
［１４０］ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上の発現配列を含む、番号付けされた実施形態［１３４］～［１３９］のいずれか１つに記載の方法。
［１４１］環状ポリリボヌクレオチドは、翻訳能を有する、番号付けされた実施形態［１３４］～［１４０］のいずれか１つに記載の方法。
［１４２］少なくとも１つの修飾ヌクレオチドは、
ａ．Ｎ（６）メチルアデノシン（ｍ６Ａ）、５’－メチルシチジン、及びプソイドウリジン；
ｂ．２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－Ｏ－ＭＯＥ）、２’－Ｏ－アミノプロピル、２’－デオキシ、Ｔ－デオキシ－２’－フルオロ、２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＯＥ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノプロピル（２’－Ｏ－ＤＭＡＰ）、Ｔ－Ｏ－ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）、２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）、ロックト核酸（ＬＮＡ）、エチレン核酸（ＥＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、１’，５’－アンヒドロヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、モルホリノ、メチルホスホネートヌクレオチド、チオホスホネートヌクレオチド、及び２’－フルオロＮ３－Ｐ５’－ホスホロアミダイト；又は
ｃ．表２中のいずれかの修飾ヌクレオチド
からなる群から選択される、番号付けされた実施形態［１３４］～［１４１］のいずれか１つに記載の方法。
［１４３］第１の部分は、非修飾ヌクレオチド又は５％以下の修飾ヌクレオチドからなるＩＲＥＳを含む、番号付けされた実施形態［１３４］～［１４２］のいずれか１つに記載の方法。
本明細書に引用される全ての参考文献及び刊行物は、参照により本明細書に援用される。
上述される実施形態は、上記の機能特性を得るために組み合わされ得る。これは、得られる例示的な組合せ及び機能特性を記載する以下の実施例によっても示される。表７は、上述される様々な要素がどのように組み合わされ得るか、及び観察される機能特性を示す例示的な概要を示す。
Figure 2022527763000009
Figure 2022527763000010
以下の実施例は、本発明のある実施形態をさらに例示するために提供されるが、本発明の範囲を限定することを意図されておらず；それらの例示的な性質により、当業者に公知の他の手順、方法又は技術が代わりに使用され得ることが理解されるであろう。国際特許公開番号国際公開第２０１９１１８９１９Ａ１号パンフレットの［０３７６］～［０３９２］、［０４００］～［０４１５］、［０４３３］～［０４４０］、及び［０６２０］～［０６３３］に記載される実施例５、６、９、１４、１５、及び５０～５２、並びにそれらの対応する図面は、全体が参照により本明細書に援用される。
実施例１：修飾ヌクレオチドを有する環状ＲＮＡが生成され、翻訳され、環状ＲＮＡの免疫原性を低下させた
この実施例は、タンパク質産物を生成した修飾環状ポリリボヌクレオチドの生成を実証する。さらに、この実施例は、ヌクレオチド修飾を有するように操作された環状ＲＮＡが線状ＲＮＡと比較して低下した免疫原性を有していたことを実証する。
１つ以上の望ましい特性を含み、且つ修飾ヌクレオチドの完全又は部分的な組み込みを有するように操作された非天然環状ＲＮＡを生成した。以下の実施例に示されるように、完全長修飾線状ＲＮＡ又は修飾及び非修飾線状ＲＮＡのハイブリッドを環状化し、ナノルシフェラーゼ（ＮＬｕｃ）の発現を評価した。さらに、修飾環状ＲＮＡは、非修飾環状ＲＮＡと比較して、ＢＪ細胞内における免疫関連遺伝子の低下した活性化を有することが示された（ＭＤＡ５、ＯＡＳ及びＩＦＮ－β発現のｑ－ＰＣＲ）。
ＷＴ ＥＭＣＶ Ｎｌｕｃ ｓｔｏｐスペーサーを有する環状ＲＮＡを生成した。完全な修飾置換のために、修飾ヌクレオチド、プソイドウリジン及びメチルシトシン又はｍ６Ａを、インビトロ転写反応中、標準的な非修飾ヌクレオチド、ウリジン及びシトシン又はアデノシンのそれぞれの代わりに加えた。ハイブリッド構築物について、ＷＴ ＥＭＣＶ ＩＲＥＳをＮＬｕｃ ＯＲＦとは別々に合成した。ＷＴ ＥＭＣＶ ＩＲＥＳを修飾又は非修飾ヌクレオチドのいずれかを用いて合成した。対照的に、ＮＬｕｃ ＯＲＦ配列を、インビトロ転写反応中、標準的な非修飾ヌクレオチド、ウリジン及びシトシン又はアデノシンのそれぞれの代わりに、修飾ヌクレオチド、プソイドウリジン及びメチルシトシン又はｍ６Ａを用いて合成した。修飾又は非修飾ＩＲＥＳ及び修飾ＯＲＦの合成後、これらの２つのオリゴヌクレオチドを、Ｔ４ ＤＮリガーゼを用いて一緒にライゲートした。図１Ａに示されるように、修飾環状ＲＮＡを生成した。
完全修飾又はハイブリッド修飾構築物からのＮＬｕｃの発現効率を測定するために、０．１ｐｍｏｌの線状及び環状ＲＮＡを６時間にわたってＢＪ線維芽細胞中にトランスフェクトした。ｎＬｕｃ発現をトランスフェクションの６時間、２４時間、４８時間、及び７２時間後の時点で測定した。
自然免疫応答遺伝子のレベルを、フェノール系抽出試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて細胞から単離された全ＲＮＡから細胞中で監視した。全ＲＮＡ（５００ｎｇ）を逆転写に供して、ｃＤＮＡを生成した。ｑＲＴ－ＰＣＲ分析を、色素ベースの定量的ＰＣＲミックス（ＢｉｏＲａｄ）を用いて行った。
図１Ｂ及び１Ｃに示されるように、修飾環状ＲＮＡを翻訳した。図２Ａ～Ｃに示されるように、環状ＲＮＡでトランスフェクトされたＢＪ細胞からの免疫関連遺伝子のｑＲＴ－ＰＣＲレベルは、非修飾環状ＲＮＡトランスフェクト細胞と比較して、ＭＤＡ５、ＯＡＳ及びＩＦＮ－β発現の低下を示した。したがって、レシピエント細胞内における免疫原性関連遺伝子の誘導は、非修飾環状ＲＮＡトランスフェクト細胞と比較して、修飾環状ＲＮＡでトランスフェクトされた細胞内で減少された。
実施例２：修飾ヌクレオチドを有する環状ＲＮＡが、免疫原性を低下させた
この実施例は、タンパク質産物を生成した修飾環状ポリリボヌクレオチドの生成を実証する。さらに、この実施例は、ヌクレオチド修飾を有するように操作された環状ＲＮＡが非修飾ＲＮＡと比較して低下した免疫原性を有していたことを実証する。
１つ以上の望ましい特性を含み、且つ修飾ヌクレオチドの完全又は部分的な組み込みを有するように操作された非天然環状ＲＮＡを生成した。以下の実施例に示されるように、完全長修飾線状ＲＮＡ又は修飾及び非修飾線状ＲＮＡのハイブリッドを環状化し、ナノルシフェラーゼ（ＮＬｕｃ）の発現を評価した。さらに、修飾環状ＲＮＡは、非修飾環状ＲＮＡと比較して、ＢＪ細胞内における免疫関連遺伝子の低下した活性化を有することが示された（ＭＤＡ５、ＯＡＳ及びＩＦＮ－β発現のｑ－ＰＣＲ）。
ＷＴ ＥＭＣＶ ＮＬｕｃ ｓｔｏｐスペーサーを有する環状ＲＮＡを生成した。修飾置換のために、修飾ヌクレオチド、プソイドウリジン及びメチルシトシン又はｍ６Ａを、インビトロ転写反応中、標準的な非修飾ヌクレオチド、ウリジン及びシトシン又はアデノシンのそれぞれの代わりに加えた。ＷＴ ＥＭＣＶ ＩＲＥＳをｎＬｕｃ ＯＲＦとは別々に合成した。ＷＴ ＥＭＣＶ ＩＲＥＳを、修飾（完全修飾）又は非修飾ヌクレオチド（ハイブリッド修飾）のいずれかを用いて合成した。対照的に、ｎＬｕｃ ＯＲＦ配列を、インビトロ転写反応中、全配列について、標準的な非修飾ヌクレオチド、ウリジン及びシトシン又はアデノシンのそれぞれの代わりに、修飾ヌクレオチド、プソイドウリジン及びメチルシトシン又はｍ６Ａを用いて合成した。修飾又は非修飾ＩＲＥＳ及び修飾ＯＲＦの合成後、これらの２つのオリゴヌクレオチドを、Ｔ４ ＤＮリガーゼを用いて一緒にライゲートした。図３に示されるように、ハイブリッド修飾環状ＲＮＡを生成した。
発現効率を測定するために、ハイブリッド修飾環状ＲＮＡを、細胞中にトランスフェクトし、免疫タンパク質の発現を測定した。自然免疫応答遺伝子の発現レベルを、非修飾環状ＲＮＡ、又はプソイドウリジン及びメチルシトシン若しくはｍ６Ａ修飾のいずれかを有するハイブリッド修飾環状ＲＮＡでトランスフェクトされたＢＪ細胞中で監視した。全ＲＮＡを、フェノール系抽出試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて細胞から単離し、逆転写に供して、ｃＤＮＡを生成した。免疫関連遺伝子についてのｑＲＴ－ＰＣＲ分析を、色素ベースの定量的ＰＣＲミックス（ＢｉｏＲａｄ）を用いて行った。
図３に示されるように、ハイブリッド修飾環状ＲＮＡ、プソイドウリジン及びメチルシトシンハイブリッド修飾環状ＲＮＡでトランスフェクトされたＢＪ細胞からの免疫関連遺伝子のｑＲＴ－ＰＣＲレベルは、非修飾環状ＲＮＡトランスフェクト細胞と比較して、低下したレベルのＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ５、ＩＦＮ－β及びＯＡＳ発現を示し、これは、免疫原性関連遺伝子を活性化したこのハイブリッド修飾環状ＲＮＡの低下した免疫原性を示す。実施例２６に示される完全修飾環状ＲＮＡと異なり、ｍ６Ａハイブリッド修飾環状ＲＮＡは、非修飾環状ＲＮＡトランスフェクト細胞と同様のレベルのＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ５、ＩＦＮ－β及びＯＡＳ発現を示した。したがって、非修飾環状ＲＮＡと比較して、環状ＲＮＡのハイブリッド修飾、並びに修飾のレベルは、免疫原性関連遺伝子の活性化に影響を与えた。
実施例３：修飾ヌクレオチドを有する環状ＲＮＡが生成され、タンパク質に選択的に結合した
この実施例は、タンパク質結合を支援する修飾環状ポリリボヌクレオチドの生成を実証する。さらに、この実施例は、免疫系監視に関与するタンパク質と選択的に相互作用するヌクレオチド修飾を有するように操作された環状ＲＮＡが、非修飾ＲＮＡと比較して、低下した免疫原性を有することを実証する。
修飾ヌクレオチドの完全又は部分的な組み込みを含むように操作された非天然環状ＲＮＡを生成した。以下の実施例に示されるように、完全長修飾線状ＲＮＡ又は修飾及び非修飾線状ＲＮＡのハイブリッドを環状化し、タンパク質足場を、ｎＬｕｃ発現の測定によって評価した。さらに、選択的に修飾された環状ＲＮＡは、非修飾環状ＲＮＡと比較して、ＢＪ細胞内における免疫関連遺伝子を活性化するタンパク質との低下した相互作用を有していた（ＭＤＡ５、ＯＡＳ及びＩＦＮ－β発現のｑ－ＰＣＲ）。
ＷＴ ＥＭＣＶ Ｎｌｕｃ ｓｔｏｐスペーサーを有する環状ＲＮＡを生成した。修飾置換のために、修飾ヌクレオチド、プソイドウリジン及びメチルシトシン又はｍ６Ａを、インビトロ転写反応中、標準的な非修飾ヌクレオチド、ウリジン及びシトシン又はアデノシンのそれぞれの代わりに加えた。ＷＴ ＥＭＣＶ ＩＲＥＳをｎＬｕｃ ＯＲＦとは別々に合成した。ＷＴ ＥＭＣＶ ＩＲＥＳを、修飾（完全に修飾された）又は非修飾ヌクレオチド（ハイブリッド修飾）のいずれかを用いて合成した。対照的に、ｎＬｕｃ ＯＲＦ配列を、インビトロ転写反応中、全配列について、標準的な非修飾ヌクレオチド、ウリジン及びシトシン又はアデノシンのそれぞれの代わりに、修飾ヌクレオチド、プソイドウリジン及びメチルシトシン又はｍ６Ａを用いて合成した。修飾又は非修飾ＩＲＥＳ及び修飾ＯＲＦの合成後、これらの２つのオリゴヌクレオチドを、Ｔ４ ＤＮリガーゼを用いて一緒にライゲートした。図１Ａに示されるように、完全に修飾された（上側の構築物）又はハイブリッド修飾（下側の構築物）環状ＲＮＡを生成した。
タンパク質足場効率を測定するために、完全に修飾された又はハイブリッド修飾構築物からのｎＬｕｃの発現を測定した。０．１ｐｍｏｌの線状及び環状ＲＮＡを、６時間にわたってＢＪ線維芽細胞中にトランスフェクトした後、ｎＬｕｃ発現を、トランスフェクションの６時間、２４時間、４８時間及び７２時間後の時点で測定した。
図１Ｂ及び１Ｃに示されるように、完全に修飾された環状ＲＮＡは、タンパク質翻訳結果によって測定した際、非修飾環状ＲＮＡと比較して、非常に低下したタンパク質結合能を有していた。対照的に、ハイブリッド修飾は、タンパク質、例えばタンパク質翻訳機構への同程度又は増加した結合を実証した。
タンパク質足場効率をさらに測定するために、完全に修飾された環状ＲＮＡを、細胞中にトランスフェクトし、免疫タンパク質へのタンパク質足場を測定した。自然免疫応答遺伝子を活性化する免疫タンパク質へのタンパク質足場のレベルを、非修飾環状ＲＮＡ、又はプソイドウリジン及びメチルシトシン若しくはｍ６Ａ修飾のいずれかを有する完全に修飾された環状ＲＮＡでトランスフェクトされたＢＪ細胞中で監視した。全ＲＮＡを、フェノール系抽出試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて細胞から単離し、逆転写に供して、ｃＤＮＡを生成した。免疫関連遺伝子についてのｑＲＴ－ＰＣＲ分析を、色素ベースの定量的ＰＣＲミックス（ＢｉｏＲａｄ）を用いて行った。
図１Ａ～Ｃに示されるように、完全に修飾された環状ＲＮＡ、プソイドウリジン及びメチルシトシンの両方又はｍ６Ａで完全に修飾された環状ＲＮＡでトランスフェクトされたＢＪ細胞からの免疫関連遺伝子のｑＲＴ－ＰＣＲレベルは、非修飾環状ＲＮＡトランスフェクト細胞と比較して、低下したレベルのＭＤＡ５、ＯＡＳ及びＩＦＮ－β発現を示し、これは、修飾環状ＲＮＡと、免疫原性関連遺伝子を活性化する免疫タンパク質との間の減少したタンパク質足場を示す。したがって、非修飾環状ＲＮＡと比較して、環状ＲＮＡの修飾は、タンパク質足場に影響を与えた。選択的修飾が、タンパク質翻訳機構の結合を可能にした一方、完全な修飾は、トランスフェクトされたレシピエント細胞内で免疫原性関連遺伝子を活性化するタンパク質への結合を減少させた。
実施例４：非修飾ＩＲＥＳを有するが、ＯＲＦ中に修飾ヌクレオチドを有する環状ＲＮＡが、修飾ＩＲＥＳ及びＯＲＦ中に修飾ヌクレオチドを有する環状ＲＮＡと比較して、インビボで翻訳を増加させた
この実施例は、環状ＲＮＡ中に修飾ヌクレオチドを含むが、ＩＲＥＳ中に修飾を含まないことが、ＩＲＥＳ中に修飾を有する修飾環状ＲＮＡと比較して、インビボで環状ＲＮＡ翻訳を増加させたことを説明する。
ＯＲＦ中に修飾ヌクレオチドを有する環状ＲＮＡを生成するために、２つのＩＶＴ鋳型を別々に増幅した。第１の部分（配列番号１：１～６８６ｎｔ）は、５’スペーサー、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ及び３８ヌクレオチドのＧＬｕｃ ＯＲＦを含む。第２の部分（配列番号２：６８７～１２０３ｎｔ）は、ＧＬｕｃの残りのＯＲＦ領域及び３’スペーサーを有する。
ＲＮＡの第１の部分が、修飾ヌクレオチド又は非修飾ヌクレオチドのいずれかを有する線状ＲＮＡとして、インビトロ転写によってＤＮＡ鋳型から生成される。修飾された第１の部分は、Ｎ１－メチル－プソイドウリジンで完全に置換される。非修飾の第１の部分は、非修飾ヌクレオチドを用いて生成される。
第２の部分は、インビトロ転写によってＤＮＡ鋳型から生成され、Ｎ１－メチル－プソイドウリジンで完全に置換される。
転写されたＲＮＡの各バッチを、ＲＮＡクリーンアップキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｔ２０５０）を用いて個々に精製し、ＲｐｐＨで処理する（ＮＥＢ、Ｍ０３５６）。第２の精製の後、以下のＲＮＡ－ＲＮＡライゲーション反応が行われる：（１）非修飾の第１の部分＋第２の部分；（２）修飾された第１の部分＋第２の部分。
これらのライゲーションは、ＤＮＡスプリントを用いて、以下のように行われる：２ｕＭの選択された第１の部分ＲＮＡ、２ｕＭの第２の部分ＲＮＡ、２．５６ｕＭのスプリントＤＮＡ（５’－ＧＧＣＴＴＧＧＣＣＴＣＧＧＣＣＡＣＡＧＣＧＡＴＧＣＡＧＡＴＣ－３’）、５０ｍＭのＮａＣｌを組み合わせる。この混合物を７５℃で１０分間インキュベートし、次に、ゆっくりと３７℃に冷却する。混合物を、４時間にわたって、５０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＡＴＰ、１ｍＭのＤＴＴ、０．１６Ｕ／ｕＬのＲＮａｓｅ阻害剤（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｎ２１１５）及び１５Ｕ／ｕＬのＴ４ ＤＮリガーゼ（ＮＥＢ、Ｍ０２０２Ｍ）の存在下で、ライゲーションのためにさらにインキュベートする。ライゲートされたＲＮＡを、Ｍｏｎａｒｃｈ ＲＮＡ精製カラム（ＮＥＢ、Ｔ２０５０）を用いて精製する。ＲＮＡ－ＲＮＡライゲーションの効率を、尿素－ＰＡＧＥにおいて分離することによって監視し、画像を定量する。
ライゲートされたＲＮＡの環状化のために、各環状化混合物を、独立して、１ｕＭのライゲートされたＲＮＡ、２ｕＭのスプリントＤＮＡ（５’－ＧＴＴＴＴＴＣＧＧＣＴＡＴＴＣＣＣＡＡＴＡＧＣＣＧＴＴＴＴＧ－３’）、５０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、２ｍＭのＭｇＣｌ２及び４００ｕＭのＡＴＰを用いて調製する。この混合物を、７５℃で１０分間加熱し、２０分間にわたってゆっくりと室温に冷却する。冷却後、０．２Ｕ／ｕＬのＴ４ ＲＮＡリガーゼ２（ＮＥＢ、Ｍ０２３９）及び０．４Ｕ／ｕＬのＲＮＡｓｅ阻害剤（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｎ２１１５）を加え、反応物を４時間インキュベートする。ライゲートされたＲＮＡを、エタノール沈殿を用いて精製する。環状ＲＮＡを、尿素－ＰＡＧＥで精製し、緩衝液（０．５Ｍの酢酸ナトリウム、０．１％のＳＤＳ、１ｍＭのＥＤＴＡ）で溶離させ、エタノールで沈殿させ、ＲＮＡ貯蔵溶液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＡＭ７０００）中で再懸濁させる。
（１）ハイブリッド修飾環状ＲＮＡ：非修飾の第１の部分＋第２の部分；及び（２）完全修飾環状ＲＮＡ：修飾された第１の部分＋第２の部分を生成する。
ＲＮＡを、ＰＢＳ中で、１０％のＴｒａｎｓＩＴ（ＭｉｒｕｓＢｉｏ）及び５％のＢｏｏｓｔ（ＭｉｒｕｓＢｉｏ）を用いて製剤化する。注入の全体積は、各用量につき１００ｕＬである。最終的なＲＮＡ濃度は、０．１ｐｍｏｌ／ｕＬ（１０ｐｍｏｌ／マウス）である。各用量（１００ｕＬ）を、マウスの尾静脈を介して静脈内に注入する。注入されない動物、及びビヒクルのみ（ＲＮＡなし）を注入された動物を、対照として使用する。
血液サンプル（５０ｕＬ）を、投与の６時間、１、２、３、７、１４、２１、２８及び３５日後の時点で、各マウスの尾静脈からＥＤＴＡチューブ中に採取する。血漿を、４℃で、１３００ｇで２５分間にわたる遠心分離によって単離し、ガウシアルシフェラーゼ、分泌酵素の活性を、製造業者の説明書に従って、ガウシアルシフェラーゼフラッシュ活性アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて試験する。簡潔に述べると、５０ｕＬの１Ｘ ＧＬｕｃ基質を、９６ウェル透明底プレートのウェル中で５ｕＬの血漿に注入して、ＧＬｕｃルシフェラーゼ活性アッセイを行う。プレートを、発光測定装置（Ｐｒｏｍｅｇａ）において混合した直後に読み取る。
ハイブリッド修飾環状ＲＮＡを注入されたマウス由来の血液が、完全修飾環状ＲＮＡと比較して及び対照と比較して、より高いルシフェラーゼ活性を示すことが予測される。この実施例は、ハイブリッド修飾環状ＲＮＡが、完全修飾環状ＲＮＡと比較して及び対照と比較して、より多い量のガウシアルシフェラーゼを発現することを実証する。
この実施例は、非修飾ＩＲＥＳを有するが、他の箇所に修飾ヌクレオチドを有する環状ＲＮＡ（ハイブリッド修飾環状ＲＮＡ）が、完全修飾環状ＲＮＡと比較して、インビボでより高い発現を示すことを実証する。
実施例５：非修飾ＩＲＥＳを有するが、ＯＲＦ中に修飾ヌクレオチドを有する環状ＲＮＡが、完全に非修飾の環状ＲＮＡと比較して、インビボで増加したＲＮＡ翻訳を有する
この実施例は、環状ＲＮＡ中に修飾ヌクレオチドを含むことが、インビボで環状ＲＮＡ発現を増加させることを実証する。
この実施例において、ガウシアルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）をコードするＯＲＦ、翻訳要素としてＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、並びに５’及び３’スペーサー領域を有する環状ＲＮＡを設計した。
ＯＲＦ中に修飾ヌクレオチドを有する環状ＲＮＡを生成するために、２つのＩＶＴ鋳型を別々に増幅した。第１の部分（配列番号１：１～６８６ｎｔ）は、５’スペーサー、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ及び３８ヌクレオチドのＧＬｕｃ ＯＲＦを含んでいた。第２の部分（配列番号２：６８７～１２０３ｎｔ）は、ＧＬｕｃの残りのＯＲＦ領域及び３’スペーサーを有していた。ＲＮＡの第１の部分を、非修飾ヌクレオチドを有する線状ＲＮＡとして、インビトロ転写によって、ＤＮＡ鋳型から生成した。第２の部分を、３つの異なる条件下（（１）非修飾ヌクレオチドを有する（２）プソイドウリジン及び５－メチル－シチジンで完全に置換された（３）Ｎ１－メチル－プソイドウリジンで完全に置換された）で、インビトロ転写によって、ＤＮＡ鋳型から生成した。
転写されたＲＮＡの各バッチを、ＲＮＡクリーンアップキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｔ２０５０）を用いて個々に精製し、ＲｐｐＨで処理した（ＮＥＢ、Ｍ０３５６）。第２の精製の後、ＲＮＡの各バッチを、ＲＮＡ－ＲＮＡライゲーションに供した。ＲＮＡの第１の部分（ＩＲＥＳを含有する）及びＲＮＡの第２の部分の形態のそれぞれを、ＤＮＡスプリントを用いてアニールした。
各反応を、以下のように行った：２ｕＭの第１の部分ＲＮＡ、２ｕＭの選択された第２の部分ＲＮＡ、２．５６ｕＭのスプリントＤＮＡ（５’－ＧＧＣＴＴＧＧＣＣＴＣＧＧＣＣＡＣＡＧＣＧＡＴＧＣＡＧＡＴＣ－３’）、５０ｍＭのＮａＣｌを組み合わせた。この混合物を、７５℃で１０分間インキュベートし、次に、ゆっくりと３７℃に冷却した。混合物を、４時間にわたって、５０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＡＴＰ、１ｍＭのＤＴＴ、０．１６Ｕ／ｕＬのＲＮａｓｅ阻害剤（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｎ２１１５）及び１５Ｕ／ｕＬのＴ４ ＤＮリガーゼ（ＮＥＢ、Ｍ０２０２Ｍ）の存在下で、ライゲーションのためにさらにインキュベートした。ライゲートされたＲＮＡを、Ｍｏｎａｒｃｈ ＲＮＡ精製カラム（ＮＥＢ、Ｔ２０５０）を用いて精製した。ＲＮＡ－ＲＮＡライゲーションの効率を、尿素－ＰＡＧＥにおいて分離することによって監視し、画像を定量した。
ＲＮＡ－ＲＮＡライゲートされた材料は、以下のとおりであった：
（１）ライゲートされた非修飾（Ｕｎｍｏｄ．）ＲＮＡ：第１の部分＋非修飾ヌクレオチドを有する第２の部分
（２）ライゲートされたＲＮＡ ｐＵ／５ｍＣ：第１の部分＋プソイドウリジン及び５－メチル－シチジンで完全に置換された第２の部分
（３）ライゲートされたＲＮＡ Ｎ１ｍΨ：第１の部分＋Ｎ１－メチル－プソイドウリジンで完全に置換された第２の部分。
ライゲートされたＲＮＡの環状化のために、各環状化混合物を、独立して、１ｕＭのライゲートされたＲＮＡ、２ｕＭのスプリントＤＮＡ（５’－ＧＴＴＴＴＴＣＧＧＣＴＡＴＴＣＣＣＡＡＴＡＧＣＣＧＴＴＴＴＧ－３’）、５０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、２ｍＭのＭｇＣｌ２及び４００ｕＭのＡＴＰを用いて調製した。この混合物を、７５℃で１０分間加熱し、２０分間にわたってゆっくりと室温に冷却した。冷却後、０．２Ｕ／ｕＬのＴ４ ＲＮＡリガーゼ２（ＮＥＢ、Ｍ０２３９）及び０．４Ｕ／ｕＬのＲＮＡｓｅ阻害剤（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｎ２１１５）を加え、反応物を４時間インキュベートした。ライゲートされたＲＮＡを、エタノール沈殿を用いて精製した。環状ＲＮＡを尿素－ＰＡＧＥで精製し、緩衝液（０．５Ｍの酢酸ナトリウム、０．１％のＳＤＳ、１ｍＭのＥＤＴＡ）で溶離させ、エタノールで沈殿させ、ＲＮＡ貯蔵溶液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＡＭ７０００）中で再懸濁させた。
さらに、ＧＬｕｃをコードするｍＲＮＡ（プソイドウリジン及び５－メチル－Ｃで完全に置換された）を、Ｔｒｉｌｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。ＧＬｕｃ及びヒトαグロビン５’及び３’ＵＴＲをコードする第２のｍＲＮＡ対照を、ＣｌｅａｎＣａｐ（商標）ＡＧを用いた共転写キャッピングを用いて、インビトロ転写によって、社内で生成した。社内で合成されたｍＲＮＡを、Ｍｏｎａｒｃｈ ＲＮＡ精製カラム（ＮＥＢ、Ｔ２０５０）を用いて精製し、上述されるようにゲル溶出に供した。
ＲＮＡを、ＰＢＳ中で、１０％のＴｒａｎｓＩＴ（ＭｉｒｕｓＢｉｏ）及び５％のＢｏｏｓｔ（ＭｉｒｕｓＢｉｏ）を用いて製剤化する。注入の全体積は、各用量につき１００ｕＬである。最終的なＲＮＡ濃度は、０．１ｐｍｏｌ／ｕＬ（１０ｐｍｏｌ／マウス）である。各用量（１００ｕＬ）を、マウスの尾静脈を介して静脈内に注入する。注入されない動物、及びビヒクルのみ（ＲＮＡなし）を注入された動物を、対照として使用する。血液サンプル（５０ｕＬ）を、投与の６時間、１、２、３、７、１４、２１、２８及び３５日後の時点で、各マウスの尾静脈からＥＤＴＡチューブ中に採取する。血漿を、４℃で、１３００ｇで２５分間にわたる遠心分離によって単離し、ガウシアルシフェラーゼ、分泌酵素の活性を、製造業者の説明書に従って、ガウシアルシフェラーゼフラッシュ活性アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて試験する。簡潔に述べると、５０ｕＬの１Ｘ ＧＬｕｃ基質を、９６ウェル透明底プレートのウェル中で５ｕＬの血漿に注入して、ＧＬｕｃルシフェラーゼ活性アッセイを行う。プレートを、発光測定装置（Ｐｒｏｍｅｇａ）において混合した直後に読み取る。
ライゲートされたＲＮＡ ｐＵ／５ｍＣから生成された環状ＲＮＡ及びライゲートされたＲＮＡ Ｎ１ｍΨから生成された環状ＲＮＡを注入されたマウス由来の血液が、ライゲートされた非修飾ＲＮＡから生成された環状ＲＮＡと比較して、より高いルシフェラーゼ活性、並びに修飾及び非修飾ｍＲＮＡの両方と比較して、より高いルシフェラーゼ活性を示すことが予測される。この実施例は、ライゲートされたＲＮＡ ｐＵ／５ｍＣから生成された環状ＲＮＡ及びライゲートされたＲＮＡ Ｎ１ｍΨから生成された環状ＲＮＡが、ライゲートされた非修飾ＲＮＡから生成された環状ＲＮＡと比較して、より多い量のガウシアルシフェラーゼ、並びに修飾及び非修飾ｍＲＮＡの両方と比較して、より高いルシフェラーゼ活性を発現することを説明する。この実施例はまた、ライゲートされたＲＮＡ ｐＵ／５ｍＣから生成された環状ＲＮＡ及びライゲートされたＲＮＡ Ｎ１ｍΨから生成された環状ＲＮＡが、ライゲートされた非修飾ＲＮＡから生成された環状ＲＮＡと比較して、増加した期間にわたってガウシアルシフェラーゼを発現し、並びに修飾及び非修飾ｍＲＮＡの両方と比較して、より高いルシフェラーゼ活性を発現することを説明する。
この実施例は、非修飾ＩＲＥＳを有するが、他の箇所に修飾ヌクレオチドを有する環状ＲＮＡが、その非修飾同等物と比較して、より長い及び増加した発現を示すことを説明する。
この実施例は、非修飾ＩＲＥＳを有するが、他の箇所に修飾ヌクレオチドを有する環状ＲＮＡが、修飾ｍＲＮＡ及び非修飾ｍＲＮＡと比較して、より長い及び増加した発現を示すことを説明する。
実施例６：非修飾ＩＲＥＳを有するが、ＯＲＦ中に修飾ヌクレオチドを有する環状ＲＮＡが、対応する非修飾環状ＲＮＡと比較して、インビボで増加したＲＮＡ安定性を有する
この実施例は、環状ＲＮＡ中に修飾ヌクレオチドを含むことが、インビボで環状ＲＮＡ安定性を増加させることを実証する。
この実施例において、ガウシアルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）をコードするＯＲＦ、翻訳要素としてＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、並びに５’及び３’スペーサー領域を有する環状ＲＮＡを設計した。
ＯＲＦ中に修飾ヌクレオチドを有する環状ＲＮＡを生成するために、２つのＩＶＴ鋳型を別々に増幅した。第１の部分（配列番号１：１～６８６ｎｔ）は、５’スペーサー、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ及び３８ヌクレオチドのＧＬｕｃ ＯＲＦを含む。第２の部分（配列番号２：６８７～１２０３ｎｔ）は、ＧＬｕｃの残りのＯＲＦ領域及び３’スペーサーを有する。ＲＮＡの第１の部分を、非修飾ヌクレオチドを有する線状ＲＮＡとして、インビトロ転写によって、ＤＮＡ鋳型から生成した。第２の部分を、３つの異なる条件下（（１）非修飾ヌクレオチドを有する（２）プソイドウリジン及び５－メチル－シチジンで完全に置換された（３）Ｎ１－メチル－プソイドウリジンで完全に置換された）で、インビトロ転写によって、ＤＮＡ鋳型から生成した。
転写されたＲＮＡの各バッチを、ＲＮＡクリーンアップキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｔ２０５０）を用いて個々に精製し、ＲｐｐＨで処理した（ＮＥＢ、Ｍ０３５６）。第２の精製の後、ＲＮＡの各バッチを、ＲＮＡ－ＲＮＡライゲーションに供した。ＲＮＡの第１の部分（ＩＲＥＳを含有する）及びＲＮＡの第２の部分の形態のそれぞれを、ＤＮＡスプリントを用いてアニールした。
各反応を、以下のように行った：２ｕＭの第１の部分ＲＮＡ、２ｕＭの選択された第２の部分ＲＮＡ、２．５６ｕＭのスプリントＤＮＡ（５’－ＧＧＣＴＴＧＧＣＣＴＣＧＧＣＣＡＣＡＧＣＧＡＴＧＣＡＧＡＴＣ－３’）、５０ｍＭのＮａＣｌを組み合わせた。この混合物を、７５℃で１０分間インキュベートし、次に、ゆっくりと３７℃に冷却した。混合物を、４時間にわたって、５０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＡＴＰ、１ｍＭのＤＴＴ、０．１６Ｕ／ｕＬのＲＮａｓｅ阻害剤（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｎ２１１５）及び１５Ｕ／ｕＬのＴ４ ＤＮリガーゼ（ＮＥＢ、Ｍ０２０２Ｍ）の存在下で、ライゲーションのためにさらにインキュベートした。ライゲートされたＲＮＡを、Ｍｏｎａｒｃｈ ＲＮＡ精製カラム（ＮＥＢ、Ｔ２０５０）を用いて精製した。ＲＮＡ－ＲＮＡライゲーションの効率を、尿素－ＰＡＧＥにおいて分離することによって監視し、画像を定量した。
ＲＮＡ－ＲＮＡライゲートされた材料は、以下のとおりであった：
（１）ライゲートされた非修飾（Ｕｎｍｏｄ．）ＲＮＡ：第１の部分＋非修飾ヌクレオチドを有する第２の部分
（２）ライゲートされたＲＮＡ ｐＵ／５ｍＣ：第１の部分＋プソイドウリジン及び５－メチル－シチジンで完全に置換された第２の部分
（３）ライゲートされたＲＮＡ Ｎ１ｍΨ：第１の部分＋Ｎ１－メチル－プソイドウリジンで完全に置換された第２の部分。
ライゲートされたＲＮＡの環状化のために、各環状化混合物を、独立して、１ｕＭのライゲートされたＲＮＡ、２ｕＭのスプリントＤＮＡ（５’－ＧＴＴＴＴＴＣＧＧＣＴＡＴＴＣＣＣＡＡＴＡＧＣＣＧＴＴＴＴＧ－３’）、５０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、２ｍＭのＭｇＣｌ２及び４００ｕＭのＡＴＰを用いて調製した。この混合物を、７５℃で１０分間加熱し、２０分間にわたってゆっくりと室温に冷却した。冷却後、０．２Ｕ／ｕＬのＴ４ ＲＮＡリガーゼ２（ＮＥＢ、Ｍ０２３９）及び０．４Ｕ／ｕＬのＲＮＡｓｅ阻害剤（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｎ２１１５）を加え、反応物を４時間インキュベートした。ライゲートされたＲＮＡを、エタノール沈殿を用いて精製した。環状ＲＮＡを尿素－ＰＡＧＥで精製し、緩衝液（０．５Ｍの酢酸ナトリウム、０．１％のＳＤＳ、１ｍＭのＥＤＴＡ）で溶離させ、エタノールで沈殿させ、ＲＮＡ貯蔵溶液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＡＭ７０００）中で再懸濁させた。
さらに、ＧＬｕｃをコードするｍＲＮＡ（プソイドウリジン及び５－メチル－Ｃで完全に置換された）を、Ｔｒｉｌｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。ＧＬｕｃ並びにヒトαグロビン５’及び３’ＵＴＲをコードする第２のｍＲＮＡ対照を、ＣｌｅａｎＣａｐ（商標）ＡＧを用いた共転写キャッピングを用いて、インビトロ転写によって、社内で生成した。社内で合成されたｍＲＮＡを、Ｍｏｎａｒｃｈ ＲＮＡ精製カラム（ＮＥＢ、Ｔ２０５０）を用いて精製し、上述されるようにゲル溶出に供した。
ＲＮＡを、ＰＢＳ中で、１０％のＴｒａｎｓＩＴ（ＭｉｒｕｓＢｉｏ）及び５％のＢｏｏｓｔ（ＭｉｒｕｓＢｉｏ）を用いて製剤化する。注入の全体積は、各用量につき１００ｕＬである。最終的なＲＮＡ濃度は、０．１ｐｍｏｌ／ｕＬ（１０ｐｍｏｌ／マウス）である。各用量（１００ｕＬ）を、マウスの尾静脈を介して静脈内に注入する。注入されない動物、及びビヒクルのみ（ＲＮＡなし）を注入された動物を、対照として使用する。
肝臓及び脾臓組織を、注入の６時間及び７日後の時点でマウスから採取し、ＲＮＡｌａｔｅｒ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で貯蔵する。組織を、Ｔｒｉｚｏｌ中で均質化し、ＲＮＡを、Ｚｙｍｏ ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｐｌｕｓキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｄ４０６８）を用いて抽出する。ＲＮＡ安定性を、ＲＴ－ｑＰＣＲによって測定する。ＧＬｕｃ ＯＲＦ及び１８Ｓ ｒＲＮＡを、Ｂｉｏ－ｒａｄ ＣＦＸ３８４ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒを用いてトリプリケートで、Ｌｕｎａ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ ＲＴ－ｑＰＣＲシステム（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて、ｑＰＣＲによって測定する。相対値を、Ｐｆｆａｌ方法を用いて計算する。
ライゲートされたＲＮＡ ｐＵ／５ｍＣから生成された環状ＲＮＡ及びライゲートされたＲＮＡ Ｎ１ｍΨから生成された環状ＲＮＡを注入されたマウス由来の肝臓及び脾臓組織が、注入の７日後の時点で、ライゲートされた非修飾ＲＮＡから生成された環状ＲＮＡと比較して、増加した量のＧＬｕｃ ＯＲＦ、並びに修飾及び非修飾ｍＲＮＡの両方と比較して、より高いルシフェラーゼ活性を示すことが予測される。
この実施例は、非修飾ＩＲＥＳを有するが、他の箇所に修飾ヌクレオチドを有する環状ＲＮＡが、その非修飾同等物と比較して、より高い持続性及び安定性を示すことを説明する。
この実施例は、非修飾ＩＲＥＳを有するが、他の箇所に修飾ヌクレオチドを有する環状ＲＮＡが、修飾ｍＲＮＡ及び非修飾ｍＲＮＡと比較して、より高い持続性及び安定性を示すことを説明する。
実施例７：非修飾ＩＲＥＳを有するが、ＯＲＦ中に修飾ヌクレオチドを有する環状ＲＮＡが、インビボで増加したＲＮＡ翻訳及び増加した安定性を有する
この実施例は、環状ＲＮＡ中に修飾ヌクレオチドを含むことが、インビボで環状ＲＮＡ発現及び安定性を増加させることを説明する。
この実施例において、ガウシアルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）をコードするＯＲＦ、翻訳要素としてＧｔｘ、並びに５’及び３’スペーサー領域を有する環状ＲＮＡを設計した。
ＯＲＦ中に修飾ヌクレオチドを有するが、ＩＲＥＳ中には有さない環状ＲＮＡを生成するために、ＩＲＥＳを、ウリジン、例えばＧｔｘ（配列：ＣＣＧＧＣＧＧＡＡ）を実質的に含まないように設計した。ＲＮＡを、（１）非修飾ヌクレオチドを有する（２）プソイドウリジンで完全に置換された及び（３）Ｎ１－メチル－プソイドウリジンで完全に置換された線状ＲＮＡとして、インビトロ転写によって、ＤＮＡ鋳型から生成する。
転写されたＲＮＡの各バッチを、ＲＮＡクリーンアップキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｔ２０５０）を用いて個々に精製し、ＲｐｐＨで処理する（ＮＥＢ、Ｍ０３５６）。
ＲＮＡの環状化のために、各環状化混合物を、独立して、１ｕＭのライゲートされたＲＮＡ、２ｕＭのスプリントＤＮＡ（５’－ＧＴＴＴＴＴＣＧＧＣＴＡＴＴＣＣＣＡＡＴＡＧＣＣＧＴＴＴＴＧ－３’）、５０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、２ｍＭのＭｇＣｌ２及び４００ｕＭのＡＴＰを用いて調製する。この混合物を、７５℃で１０分間加熱し、２０分間にわたってゆっくりと室温に冷却する。冷却後、０．２Ｕ／ｕＬのＴ４ ＲＮＡリガーゼ２（ＮＥＢ、Ｍ０２３９）及び０．４Ｕ／ｕＬのＲＮＡｓｅ阻害剤（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｎ２１１５）を加え、反応物を４時間インキュベートする。ライゲートされたＲＮＡを、エタノール沈殿を用いて精製する。環状ＲＮＡを、尿素－ＰＡＧＥで精製し、緩衝液（０．５Ｍの酢酸ナトリウム、０．１％のＳＤＳ、１ｍＭのＥＤＴＡ）で溶離させ、エタノールで沈殿させ、ＲＮＡ貯蔵溶液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＡＭ７０００）中で再懸濁させる。
さらに、ＧＬｕｃをコードするｍＲＮＡ（プソイドウリジン又はＮ１－メチル－プソイドウリジンで完全に置換された）を、Ｔｒｉｌｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入する。ＧＬｕｃ並びにヒトαグロビン５’及び３’ＵＴＲをコードする第２のｍＲＮＡ対照を、ＣｌｅａｎＣａｐ（商標）ＡＧを用いた共転写キャッピングを用いて、インビトロ転写によって、社内で生成する。社内で合成されたｍＲＮＡを、Ｍｏｎａｒｃｈ ＲＮＡ精製カラム（ＮＥＢ、Ｔ２０５０）を用いて精製し、上述されるようにゲル溶出に供した。
ＲＮＡを、ＰＢＳ中で、１０％のＴｒａｎｓＩＴ（ＭｉｒｕｓＢｉｏ）及び５％のＢｏｏｓｔ（ＭｉｒｕｓＢｉｏ）を用いて製剤化する。注入の全体積は、各用量につき１００ｕＬである。最終的なＲＮＡ濃度は、０．１ｐｍｏｌ／ｕＬ（１０ｐｍｏｌ／マウス）である。各用量（１００ｕＬ）を、マウスの尾静脈を介して静脈内に注入する。注入されない動物、及びビヒクルのみ（ＲＮＡなし）を注入された動物を、対照として使用する。
肝臓及び脾臓組織を、注入の６時間及び７日後の時点でマウスから採取し、ＲＮＡｌａｔｅｒ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で貯蔵する。組織をＴｒｉｚｏｌ中で均質化し、ＲＮＡを、Ｚｙｍｏ ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｐｌｕｓキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｄ４０６８）を用いて抽出した。ＲＮＡ安定性を、ＲＴ－ｑＰＣＲによって測定する。ＧＬｕｃ ＯＲＦ及び１８Ｓ ｒＲＮＡを、Ｂｉｏ－ｒａｄ ＣＦＸ３８４ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒを用いてトリプリケートで、Ｌｕｎａ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ ＲＴ－ｑＰＣＲシステム（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて、ｑＰＣＲによって測定する。相対値を、Ｐｆｆａｌ方法を用いて計算する。
ｐＵ修飾を有するように生成された環状ＲＮＡ及びＮ１ｍΨ修飾から生成された環状ＲＮＡを注入されたマウス由来の肝臓及び脾臓組織が、注入の７日後の時点で、非修飾ＲＮＡから生成された環状ＲＮＡと比較して、増加した量のＧＬｕｃ ＯＲＦ、並びに修飾及び非修飾ｍＲＮＡの両方と比較して、より高いルシフェラーゼ活性を示すことが予測される。
この実施例は、非修飾ＩＲＥＳを有するが、他の箇所に修飾ヌクレオチドを有する環状ＲＮＡが、その対応する非修飾環状ＲＮＡと比較して、より高い持続性及び安定性を示すことを説明する。
この実施例は、非修飾ＩＲＥＳを有するが、他の箇所に修飾ヌクレオチドを有する環状ＲＮＡが、修飾ｍＲＮＡ及び非修飾ｍＲＮＡと比較して、より高い発現、持続性、及び安定性を示すことを説明する。
実施例８：修飾ヌクレオチドを含有する環状ＲＮＡが、非修飾ヌクレオチドのみで生成された環状ＲＮＡと比較して、インビボで低下した免疫原性を有する
この実施例は、環状ＲＮＡ中に修飾ヌクレオチドを含むことが、インビボで環状ＲＮＡ免疫原性を低下させることを実証する。
この実施例において、環状ＲＮＡは、ガウシアルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）をコードするＯＲＦ並びに５’及び３’ヒトα－グロビンＵＴＲを含む。
ＩＲＥＳを欠いた（翻訳能が欠損している）環状ＲＮＡを、完全に非修飾のヌクレオチド又はプソイドウリジンへのウラシルの置換及び５－メチル－シチジンへのシトシンの置換のいずれかを用いて、インビトロで生成した。このために、完全に非修飾のヌクレオチド又は修飾されたウラシル及びシトシン置換を有する線状ＲＮＡを、転写を駆動するＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモータに加えて、上に列挙される全てのモチーフを含むＤＮＡ鋳型からインビトロで転写した。転写されたＲＮＡを、ＲＮＡクリーンアップキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｔ２０５０）を用いて精製し、製造業者の説明に従ってＲＮＡ ５’ホスホヒドロラーゼ（ＲｐｐＨ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０３５６）で処理し、ＲＮＡ精製カラム（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｔ２０５０）を用いて再度精製した。ＲｐｐＨで処理された線状ＲＮＡを、スプリントＤＮＡ（５’－ＧＡＣＣＡＧＡＡＧＡＧＴＣＣＣＴＧＣＴＧＣＣＣＡＣＴＣＡＧＡ－３’）及びＴ４ ＲＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０２３９）を用いて環状化した。環状ＲＮＡを尿素－ＰＡＧＥで精製し、緩衝液（０．５Ｍの酢酸ナトリウム、０．１％のＳＤＳ、１ｍＭのＥＤＴＡ）で溶離させ、エタノールで沈殿させ、ＲＮＡ貯蔵溶液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＡＭ７０００）中で再懸濁させた。
ＲＮＡを、ＰＢＳ中で、１５％のＴｒａｎｓＩＴ（ＭｉｒｕｓＢｉｏ）及び７．５％のＢｏｏｓｔ（ＭｉｒｕｓＢｉｏ）を用いて製剤化した。注入の全体積は、各用量につき１００ｕＬであった。０．１ｐｍｏｌ／ｕＬ．（１０ｐｍｏｌ／マウス）の最終的なＲＮＡ濃度。各用量（１００ｕＬ）を、マウスの尾静脈を介して静脈内に注入した。注入されない動物、ビヒクルのみ（ＲＮＡなし）を注入された動物を対照として使用した。肝臓及び脾臓を、注入の１及び２日後の時点で採取し、ＲＮＡｌａｔｅｒ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で貯蔵した。
組織をＴｒｉｚｏｌ中で均質化し、ＲＮＡを、Ｚｙｍｏ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｐｌｕｓキットを用いて抽出した。ＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ５、ＩＮＦａ、ＩＦＮＢ、ＩＦＮｇ、ＴＮＦａ及びＩＬ６、並びにハウスキーパー遺伝子１８Ｓ ｒＲＮＡを含む免疫応答遺伝子を、Ｂｉｏ－ｒａｄ ＣＦＸ３８４ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒを用いてトリプリケートで、Ｌｕｎａ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ ＲＴ－ｑＰＣＲシステム（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて、ｑＰＣＲによって測定した。相対値を、Ｐｆｆａｆｌ方法（Ｐｆａｆｆｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２００１）を用いて計算した。
修飾ヌクレオチドを含有する環状ＲＮＡを使用した場合、マウスは、修飾ヌクレオチドを含有しなかったその環状ＲＮＡ同等物；及びその修飾ｍＲＮＡ同等物と比較して、免疫マーカー（ＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ５、ＩＮＦａ、ＩＦＮｂ、ＩＮＦｇ、ＴＮＦａ及びＩＬ６）のかなり低い発現を示した（図４９）。
この実施例は、修飾ヌクレオチドを含有する環状ＲＮＡが、非修飾ヌクレオチドのみを含有していた環状ＲＮＡと比較して、動物に注入したときに、より低い免疫原性を誘導したことを実証する。
実施例９：修飾ヌクレオチドを含有する環状ＲＮＡが、その完全に非修飾の環状ＲＮＡ同等物及び修飾ｍＲＮＡと比較して、インビボで増加した安定性を有する
この実施例は、環状ＲＮＡ中に修飾ヌクレオチドを含むことが、インビボで環状ＲＮＡ安定性を増加させることを実証する。
この実施例において、環状ＲＮＡは、ガウシアルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）をコードするＯＲＦ並びに５’及び３’ヒトα－グロビンＵＴＲを含む。
ＩＲＥＳを欠いた（翻訳能が欠損している）環状ＲＮＡを、完全に非修飾のヌクレオチド又はプソイドウリジンへのウラシルの置換及び５－メチル－シチジンへのシトシンの置換のいずれかを用いて、インビトロで生成した。このために、完全に非修飾のヌクレオチド又は修飾されたウラシル及びシトシン置換を有する線状ＲＮＡを、転写を駆動するＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモータに加えて、上に列挙される全てのモチーフを含むＤＮＡ鋳型から、インビトロで転写した。転写されたＲＮＡを、ＲＮＡクリーンアップキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｔ２０５０）を用いて精製し、製造業者の説明に従ってＲＮＡ ５’ホスホヒドロラーゼ（ＲｐｐＨ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０３５６）で処理し、ＲＮＡ精製カラム（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｔ２０５０）を用いて再度精製した。ＲｐｐＨで処理された線状ＲＮＡを、スプリントＤＮＡ（５’－ＧＡＣＣＡＧＡＡＧＡＧＴＣＣＣＴＧＣＴＧＣＣＣＡＣＴＣＡＧＡ－３’）及びＴ４ ＲＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０２３９）を用いて環状化した。環状ＲＮＡを尿素－ＰＡＧＥで精製し、緩衝液（０．５Ｍの酢酸ナトリウム、０．１％のＳＤＳ、１ｍＭのＥＤＴＡ）で溶離させ、エタノールで沈殿させ、ＲＮＡ貯蔵溶液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＡＭ７０００）中で再懸濁させた。
対照として、プソイドウリジン及び５－メチル－シチジンで完全に置換された線状ＲＮＡを生成し、キャップ類似体でキャップし、上述されるように尿素－ＰＡＧＥで精製した。
ＲＮＡを、ＰＢＳ中で、１５％のＴｒａｎｓＩＴ（ＭｉｒｕｓＢｉｏ）及び７．５％のＢｏｏｓｔ（ＭｉｒｕｓＢｉｏ）を用いて製剤化した。注入の全体積は、各用量につき１００ｕＬであった。０．１ｐｍｏｌ／ｕＬ．１０ｐｍｏｌ／マウス）の最終的なＲＮＡ濃度。各用量（１００ｕＬ）を、マウスの尾静脈を介して静脈内に注入した。注入されない動物、ビヒクルのみ（ＲＮＡなし）を注入された動物を対照として使用した。肝臓及び脾臓を、注入の１、２、７及び１４日後の時点で採取し、ＲＮＡｌａｔｅｒ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で貯蔵した。
組織をＴｒｉｚｏｌ中で均質化し、ＲＮＡを、Ｚｙｍｏ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｐｌｕｓキットを用いて抽出した。環状ＲＮＡ及び線状ＲＮＡを、Ｂｉｏ－ｒａｄ ＣＦＸ３８４ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒを用いてトリプリケートで、ＲＴ－ｑＰＣＲ Ｌｕｎａ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ ＲＴ－ｑＰＣＲシステム（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）によって検出した。対照として、１８Ｓ ｒＲＮＡを測定した。相対値を、Ｐｆｆａｆｌ方法（Ｐｆａｆｆｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２００１）を用いて計算した。
この実施例において、修飾ヌクレオチドを含有する環状ＲＮＡが、修飾ヌクレオチドを含有しなかった（非修飾ヌクレオチドのみを含有していた）環状ＲＮＡより長い期間にわたって、肝臓及び脾臓中に存在し；修飾ｍＲＮＡより長い期間にわたって、肝臓及び脾臓中に存在していた（図５０）。
この実施例は、修飾ヌクレオチドを用いて生成された環状ＲＮＡが、非修飾ヌクレオチドを用いて生成された環状ＲＮＡと比較した際及び修飾ｍＲＮＡと比較した際に、注入の１４日後の時点でより安定していることを実証する。
実施例１０：インビトロ環状ＲＮＡ生成
この実施例は、環状ＲＮＡのインビトロ生成を実証する。
図４に示されるように、環状ＲＮＡは、開始コドン（配列番号１）、ＯＲＦ（配列番号２）、スタガー要素（配列番号３）、エンクリプトゲン（配列番号４）及びＩＲＥＳ（配列番号５）を用いて設計される。環状化は、ローリングサークル型翻訳、別個のＯＲＦ発現及び制御されたタンパク質化学量論のための交互のスタガー要素を有する複数のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、ＲＮＡ免疫原性を弱めるか又は軽減するためのエンクリプトゲン及びポリ－Ａ配列なしでリボソーム進入のためのＲＮＡを標的にする任意選択のＩＲＥＳを可能にする。
この実施例において、環状ＲＮＡは、以下のように生成される。非修飾線状ＲＮＡは、５’－及び３’－ＺＫＳＣＡＮ１イントロン及び２Ａ配列に連結されたＧＦＰをコードするＯＲＦを有するＤＮＡセグメントから、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いてインビトロ転写によって合成される。転写されたＲＮＡがＲＮＡ精製システム（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製され、製造業者の説明に従ってアルカリホスファターゼ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＥＦ０６５２）で処理され、ＲＮＡ精製システムを用いて再度精製される。
スプリントライゲーション環状ＲＮＡは、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ，Ｉｎｃ．、Ｍ０２０２Ｍ）を用いて転写された線状ＲＮＡ及びＤＮＡスプリントの処理によって生成され、環状ＲＮＡは、ＲＮａｓｅ Ｒ処理による富化後、単離される。ＲＮＡ品質がアガロースゲル又は自動化電気泳動（Ａｇｉｌｅｎｔ）によって評価される。
実施例１１：インビボ環状ＲＮＡ生成、細胞培養
この実施例は、環状ＲＮＡのインビボ生成を実証する。
ＧＦＰ（配列番号２）が発現ベクター、例えばｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ａｄｄｇｅｎｅ）（配列番号６）にクローニングされる。図５に示されるように、このベクターは、細胞内での環状ＲＮＡ生成を誘発するように突然変異誘発される（配列番号６及びＫｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ ２０１５によって記載される）。
ＨｅＬａ細胞を、ペニシリン－ストレプトマイシン及び１０％のウシ胎仔血清が補充された、高グルコース（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中において、３７℃及び５％のＣＯ２で成長させる。１マイクログラムの上記の発現プラスミドを、脂質トランスフェクション試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてトランスフェクトし、トランスフェクト細胞からの全ＲＮＡを、トランスフェクションの１時間～２０日後、製造業者の説明に従ってフェノール系ＲＮＡ単離試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて単離する。
ＧＦＰ環状ＲＮＡ及びｍＲＮＡレベルを測定するために、ランダムヘキサマーを用いたｑＰＣＲ逆転写が行われる。要するに、ＲＴ－ｑＰＣＲのために、同じ供給源からのＨｅｌａ細胞の全ＲＮＡ及びＲＮａｓｅ Ｒ－消化ＲＮＡがＲＴ－ＰＣＲのための鋳型として使用される。ＧＦＰ ｍＲＮＡ及び環状ＧＦＰ ＲＮＡのｃＤＮＡを調製するために、逆転写反応は、製造業者の説明に従って逆転写酵素（Ｓｕｐｅｒ－Ｓｃｒｉｐｔ ＩＩ：ＲＮａｓｅ Ｈ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びランダムヘキサマーを用いて行われる。増幅されたＰＣＲ産物が６％のＰＡＧＥを用いて分析され、臭化エチジウム染色によって視覚化される。富化因子を推定するために、ＰＣＲ産物がデンシトメトリー（ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）によって定量化され、全ＲＮＡサンプルの濃度がＵＶ吸光度によって測定される。
さらなるＲＮＡ測定がノーザンブロット分析を用いて行われる。簡潔には、全細胞抽出物を、フェノール系試薬（ＴＲＩｚｏｌ）を用いて得るか、又は核及び細胞質タンパク質抽出物を市販のキット（ＣｅｌＬｙｔｉｃ ＮｕＣＬＥＡＲ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ，Ｓｉｇｍａ）を用いて細胞の分画によって得る。ＲＮＡポリメラーゼＩＩ転写を阻害するために、細胞を３７℃で０～６時間にわたってフラボピリドール（１ｍＭの最終濃度；Ｓｉｇｍａ）で処理する。ＲＮａｓｅ Ｒ処理のために、１０ｍｇの全ＲＮＡを３７℃で１時間にわたって２０ＵのＲＮａｓｅ Ｒ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）で処理する。
オリゴヌクレオチドプローブを用いたノーザンブロットが以下のように行われる。オリゴヌクレオチドプローブ、ＰＣＲプライマーが標準的なプライマー設計ツールを用いて設計される。Ｔ７プロモータ配列がリバースプライマーに加えられて、インビトロ転写反応におけるアンチセンスプローブが得られる。インビトロ転写は、製造業者の説明に従ってＤＩＧ－ＲＮＡ標識用ミックスを用いて、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いて行われる。ＤＮＡ鋳型がＤＮＡ Ｉ消化によって除去され、ＲＮＡプローブがフェノールクロロホルム抽出及びその後の沈殿によって精製される。プローブは、５０ｎｇ／ｍｌで使用される。全ＲＮＡ（２μｇ～１０μｇ）を、グリオキサールローディングダイ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて変性させ、ＭＯＰＳ緩衝液中１．２％のアガロースゲル上で分解させる。ゲルを２０分間にわたって１×ＴＢＥに浸漬させ、セミドライブロッティングシステム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて１時間（１５Ｖ）にわたってＨｙｂｏｎｄ－Ｎ＋膜（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に移す。膜を乾燥させ、１２０，０００μＪ ｃｍ－２で１回、（２６５ｎｍで）ＵＶ架橋させる。プレハイブリダイゼーションを１時間にわたって６８℃で行い、ＤＩＧで標識したインビトロで転写されたＲＮＡプローブを一晩ハイブリダイズする。膜を３０分間にわたって６８℃において２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳで３回洗浄した後、６８℃において０．２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳで３０分間３回洗浄する。免疫検出は、アルカリホスファターゼ抗体と直接共役された抗ＤＩＧを用いて行われる。免疫活性ビースは、化学発光アルカリホスファターゼ基質（ＣＤＰ ｓｔａｒ試薬）並びに画像検出及び定量化システムＬＡＳ－４０００検出システム）を用いて視覚化される。
実施例１２：環状ＲＮＡの調製及びインビトロ翻訳
この実施例は、環状ＲＮＡからの遺伝子産物の遺伝子発現及び検出を実証する。
この実施例において、環状ＲＮＡは、開始コドン（配列番号１）、ＧＦＰ ＯＲＦ（配列番号２）、スタガー要素（配列番号３）、ヒト由来エンクリプトゲン（配列番号４）を用いて、且つＩＲＥＳ（配列番号５）を用いて若しくは用いずに設計される（図６を参照されたい）。この実施例において、環状ＲＮＡは、実施例１０及び１１に記載されるように、インビトロで又は細胞内で生成される。
環状ＲＮＡを３０℃においてウサギ網状赤血球溶解物（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｆｉｔｃｈｂｕｒｇ，ＷＩ，ＵＳＡ）中で５時間又は一晩インキュベートする。反応混合物の最終組成物は、７０％のウサギ網状赤血球溶解物、１０μＭのメチオニン及びロイシン、２０μＭのメチオニン及びロイシン以外のアミノ酸及び０．８Ｕ／μＬのＲＮａｓｅ阻害剤（日本大阪の東洋紡（Ｔｏｙｏｂｏ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ））を含む。アリコートを混合物から取り、１０～２０％の勾配のポリアクリルアミド／ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ゲル（日本東京のアトー（Ａｔｔｏ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ））上で分離させる。上清を除去し、ペレットを２×ＳＤＳサンプル緩衝液（０．１２５Ｍのトリス－ＨＣｌ、ｐＨ６．８、４％のＳＤＳ、３０％のグリセロール、５％の２－メルカプトエタノール、０．０１％のブロモフェノールブルー）に７０℃で１５分間溶解させる。ヘモグロビンタンパク質がこのプロセス中に除去される一方、ヘモグロビン以外のタンパク質が濃縮される。
５分間にわたる１，４００×ｇでの遠心分離後、上清を１０～２０％の勾配のポリアクリルアミド／ＳＤＳゲル上で分析する。市販の標準（ＢｉｏＲａｄ）がサイズマーカーとして使用される。セミドライ方法を用いてポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に電気泳動転写された後、ブロットが化学発光キット（Ｒｏｃｋｌａｎｄ）を用いて視覚化される。
ＧＦＰタンパク質が細胞溶解物中で視覚化され、ローリングサークル型翻訳の結果として、線状ＲＮＡより環状ＲＮＡ中で多い量で検出されることが予測される。
実施例１３：環状ＲＮＡからの化学量論的タンパク質発現
この実施例は、タンパク質を化学量論的に発現する環状ＲＮＡの能力を実証する。
この実施例において、１つの環状ＲＮＡは、エンクリプトゲン（配列番号４）及びＧＦＰをコードするＯＲＦ（配列番号２）及びＲＦＰをコードするＯＲＦ（配列番号８）を、ＧＦＰ及びＲＦＰ ＯＲＦに隣接するスタガー要素（配列番号３）と共に含むように設計される（図７を参照されたい）。別の環状ＲＮＡが同様に設計されるが、隣接する２Ａ配列の代わりに、それは、ＧＦＰ及びＲＦＰ ＯＲＦ間に終止及び開始コドンを有する。環状ＲＮＡは、実施例１０及び１１に記載されるように、インビトロで又は細胞内で生成される。
環状ＲＮＡを３０℃においてウサギ網状赤血球溶解物（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｆｉｔｃｈｂｕｒｇ，ＷＩ，ＵＳＡ）中で５時間又は一晩インキュベートする。反応混合物の最終組成物は、７０％のウサギ網状赤血球溶解物、１０μＭのメチオニン及びロイシン、２０μＭのメチオニン及びロイシン以外のアミノ酸及び０．８Ｕ／μＬのＲＮａｓｅ阻害剤（日本大阪の東洋紡（Ｔｏｙｏｂｏ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ））を含む。アリコートを混合物から取り、１０～２０％の勾配のポリアクリルアミド／ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ゲル（日本東京のアトー（Ａｔｔｏ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ））上で分離させる。上清を除去し、ペレットを２×ＳＤＳサンプル緩衝液（０．１２５Ｍのトリス－ＨＣｌ、ｐＨ６．８、４％のＳＤＳ、３０％のグリセロール、５％の２－メルカプトエタノール、０．０１％のブロモフェノールブルー）に７０℃で１５分間溶解させる。ヘモグロビンタンパク質がこのプロセス中に除去される一方、ヘモグロビン以外のタンパク質が濃縮される。
５分間にわたる１，４００×ｇでの遠心分離後、上清を１０～２０％の勾配のポリアクリルアミド／ＳＤＳゲル上で分析する。市販の標準（ＢｉｏＲａｄ）がサイズマーカーとして使用される。セミドライ方法を用いてポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に電気泳動転写された後、ブロットが化学発光キット（Ｒｏｃｋｌａｎｄ）を用いて視覚化される。
ＧＦＰ及びＲＦＰ ＯＲＦが終止及び開始コドンによって隔てられていない環状ＲＮＡは、いずれのタンパク質も等量で有する一方、ＯＲＦ間に開始及び終止コドンを含む環状ＲＮＡで処理された細胞は、いずれのタンパク質も異なる量で有することが予測される。
実施例１４：インビボ発現
この実施例は、インビボの環状ＲＮＡからタンパク質を発現する能力を実証する。
この実施例では、環状ＲＮＡは、エンクリプトゲン（配列番号４）及びＧＦＰをコードするＯＲＦ（配列番号２）又はＲＦＰ（配列番号８）又はルシフェラーゼ（配列番号１０）を、ＧＦＰ、ＲＦＰ又はルシフェラーゼＯＲＦに隣接するスタガー要素（配列番号３）と共に含むように設計される（図８を参照されたい）。環状ＲＮＡは、実施例１０及び１１に記載されるように、インビトロで又は細胞内で生成される。
６～８週齢の雄ＢＡＬＢ／ｃマウスに、３００ｍｇ／ｋｇ（６ｍｇ）の環状ＲＮＡ（５０ｕＬ ｖｏｌ）を、本明細書に記載されるＧＦＰ、ＲＦＰ若しくはルシフェラーゼＯＲＦ又は対照としての線状ＲＮＡと共に皮内（ＩＤ）、筋肉内（ＩＭ）、経口（ＰＯ）、腹腔内（ＩＰ）又は静脈内（ＩＶ）投与によって投与する。動物に単回投与又は３回の注入（１日目、３日目、５日目）を与える。
血液、心臓、肺、脾臓、腎臓、肝臓及び皮膚注入部位を非投与対照マウスから、且つ投与の２、４、８、２４、４８、７２、９６、１２０、１６８及び２６４時間後の時点（ｎ＝４匹のマウス／時点）で採取する。血液サンプルを試験の終了時に頸静脈穿刺から採取する。
血清及び組織の両方についての環状ＲＮＡ定量化が分岐ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）（Ｐａｎｏｍｉｃｓ／Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）の定量化を用いて行われる。公知の量のＲＮＡ（非処理の組織サンプルに加えられる）の各プレートに関する標準曲線は、処理された組織中のＲＮＡを定量化するために使用される。ピコグラム（ｐｇ）単位で計算される量は、プレートに適用される溶解物中の計量された組織の量に対して正規化される。タンパク質発現（ＲＦＰ又はＧＦＰ）は、前の実施例に記載されるように、各組織におけるＦＡＣＳ又はウエスタンブロットによって評価される。
ルシフェラーゼ環状ＲＮＡを投与されたマウスの別の群に３ｍｇのルシフェリンを投与の６、２４、４８、７２及び９６時間後の時点で注入し、動物をインビボイメージングシステム（ＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）においてイメージングする。投与の６時間後の時点で３匹の動物を殺処分し、解剖し、筋肉、皮膚、流入領域リンパ節、肝臓及び脾臓をエクスビボでイメージングする。
マウスは、処理された組織においてＧＦＰ、ＲＦＰ又はルシフェラーゼを発現することが予測される。
実施例１５：環状ＲＮＡは、少なくとも１つの二本鎖ＲＮＡセグメントを含む
この実施例は、環状ＲＮＡが少なくとも１つの二本鎖ＲＮＡセグメントを含むことを実証する。
この実施例において、環状ＲＮＡは、上述される方法の１つにより、ＧＦＰ ＯＲＦ及びＩＲＥＳを含むように合成される（図９を参照されたい）。Ｊ２及びＫ１モノクローナル抗体によるドットブロットアッセイを用いて、少なくとも４０ｂｐの長さの二本鎖ＲＮＡ構造を測定する。環状ＲＮＡ（２００ｎｇ）をナイロン膜（スーパーチャージ（ｓｕｐｅｒ ｃｈａｒｇｅｄ）Ｎｙｔｒａｎ）上にブロッティングし、乾燥させ、ＴＢＳ－Ｔ緩衝液（５０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０、ｐＨ７．４）中５％の脱脂粉乳でブロックし、６０分間にわたってｄｓＲＮＡ特異的ｍＡｂ Ｊ２又はＫ１（Ｅｎｇｌｉｓｈ＆Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｎｓｕｌｔｉｎｇ）と共にインキュベートする。膜をＴＢＳ－Ｔで６回洗浄し、次にＨＲＰ共役ロバ抗マウスＩｇ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）で処理し、次に６回洗浄し、ドットを、増強化学発光ウエスタンブロット検出試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて視覚化する。
環状ＲＮＡは、内部の疑似二本鎖ＲＮＡセグメントを生成することが予測される。
実施例１６：環状ＲＮＡは、疑似二本鎖構造を含む
この実施例は、環状ＲＮＡが疑似二本鎖構造を含むことを実証する。
この実施例において、環状ＲＮＡは、ＨＤＶｍｉｎの発現の追加を伴って及び伴わずに、上述される方法の１つによって合成される（Ｇｒｉｆｆｉｎ ｅｔ ａｌ ２０１４）。このＲＮＡ配列は、疑似らせん構造を形成し（図１０を参照されたい）、陽性対照として使用される（Ｇｒｉｆｆｉｎ ｅｔ ａｌ ２０１４によって示されるように）。
環状ＲＮＡ構造が機能的疑似二本鎖構造を含むかどうかを試験するために、本発明者らは、プライマー伸長（ＳＨＡＰＥ）によって分析される選択的２’ＯＨアシル化を用いて二次構造を決定する。ＳＨＡＰＥは、単一ヌクレオチド分解におけるＲＮＡの局所的骨格柔軟性を評価する。ＳＨＡＰＥ求電子剤に対する塩基位置の反応性は、二次構造に関連している：塩基対合された位置は、反応性が弱く、非対合位置は、より反応性が高い。
ＳＨＡＰＥが環状ＲＮＡ、ＨＤＶｍｉｎ及び線状ＲＮＡにおいて行われる。ＳＨＡＰＥは、それぞれＷｉｌｋｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ ２００６及びＧｒｉｆｆｉｎ ２０１４ ｅｔ ａｌによって本質的に報告されるＮ－メチルイサト酸無水物（ＮＭＩＡ）又はシアン化ベンゾイル（ＢｚＣＮ）を用いて行われる。ＢｚＣＮを用いたＳＨＡＰＥについて簡潔に述べると、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中の１ｕｌの８００ｍＭのＢｚＣＮを、１６０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０、１Ｕ／ｌのＲＮＡｓｅ阻害剤（例えば、ＳｕｐｅｒａｓｅＩｎ ＲＮａｓｅ阻害剤）中の３～６ｐｍｏｌのＲＮＡを含有する２０ｕｌの反応混合物に加え、３７℃で１分間インキュベートする。対照反応混合物は、ＢｚＣＮなしで１ｕｌのＤＭＳＯを含む。ＢｚＣＮとのインキュベーション後、ＲＮＡをフェノールクロロホルムで抽出し、製造業者によって指示されるように精製し（例えば、ＲＮＡ Ｃｌｅａｎ＆Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ－５キットを用いて）、６ｕｌの１０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０中で再懸濁させる。一染料系を用いて、ＢｚＣＮ付加物を検出する。ＲＮＡを、６－カルボキシフルオレセイン（６－ＦＡＭ）で標識されたプライマーでアニールする。プライマー伸長は、インキュベーション条件に対する以下の変更を伴い、製造業者の推奨に従って逆転写酵素（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ－Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて行われる：４２℃で５分、５５℃で３０分、６５℃で２５分及び７５℃で１５分。２つのシーケンシングラダーは、プライマー伸長反応において０．５ｍＭのｄｄＡＴＰ又は０．５ｍＭのｄｄＣＴＰのいずれかを用いて生成される。プライマー伸長産物をエタノールで沈殿させ、洗浄して、過剰な塩を除去し、市販のサイズ標準（例えば、Ｌｉｚサイズ標準Ｇｅｎｅｗｉｚ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｅｒｖｉｃｅ）と共にキャピラリー電気泳動によって分解する。
そのままの電気泳動図を、一次フラグメント分析ツール（例えば、ＰｅａｋＳｃａｎｎｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏ－ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて分析する。次に、電気泳動図の各位置におけるピークを積分する。分析される各ＲＮＡについて、各プライマー伸長反応のためのバックグラウンドが、ＢｚＣＮで処理されないＲＮＡにおいて行われる陰性対照反応のバックグラウンドに対して正規化されるように、ローディングエラー（ｌｏａｄｉｎｇ ｅｒｒｏｒ）を補正するためのｙ軸スケーリングが行われる。シグナル減衰補正が各反応についてデータに適用される。ピークは、２つのシーケンシング反応から生成されるラダーに整列される。各位置において、陰性対照のピーク面積が、ＢｚＣＮ処理されたサンプルにおけるピーク面積から差し引かれ；次に、これらの値が、差し引かれたピーク面積を、差し引かれたピーク面積の上位２％～１０％の平均で除算することにより、正規化ＳＨＡＰＥ反応性に換算される。
ＳＨＡＰＥ分析に加えて、本発明者らは、ＮＭＲ（Ｍａｒｃｈａｎｋａ ｅｔ ａｌ ２０１５）；ヒドロキシル基プロービング（Ｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ ２０１２）；又はＤＭＳ及びＣＭＴＣ及びケトキサールの組合せ（Ｔｉｊｅｒｉｎａ ｅｔ ａｌ ２００７及びＺｉｅｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ ２００１）を行う。
環状ＲＮＡは、疑似二本鎖構造を有することが予測される。
実施例１７：環状ＲＮＡは、機能的疑似らせん構造を含む
この実施例は、環状ＲＮＡが機能的疑似らせん構造を含むことを実証する。
この実施例において、環状ＲＮＡは、３９５Ｌの発現の追加を伴い、上述される方法の１つによって合成される（Ｄｅｆｅｎｂａｕｇｈ ｅｔ ａｌ ２００９）。このＲＮＡ配列は、疑似らせん構造（上に示されるように、ＲＮＡ二次構造折り畳みアルゴリズムｍｆｏｌｄ及びＤｅｆｅｎｂａｕｇｈ ｅｔ ａｌ ２００９によって）、図１１。この構造は、Ｄ型肝炎抗原（ＨＤＡｇ）との複合体形成に必須である。
したがって、環状ＲＮＡ構造が機能的疑似構造を含むかどうかを試験するために、本発明者らは、環状ＲＮＡ及び線状ＲＮＡを、ＨＤＡｇ－１６０又はＨＤＡｇ－１９５と共にインキュベートし、ＥＭＳＡアッセイを用いて結合を分析する。結合反応を、１０ｍＭのトリス－ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、２５ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＮａＣｌ、０．１ｇ／ｌのウシ血清アルブミン（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、５％のグリセロール、０．５ｍＭのＤＴＴ、０．２Ｕ／ｌのＲＮａｓｅ阻害剤（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）及び１ｍＭのフッ化フェニルメチルスルホニル溶液を含む２５ｕｌ中で行う。環状ＲＮＡを０～１１０ｎＭの範囲の濃度のＨＤＡｇタンパク質（Ｄｅｆｅｎｂａｕｇｈ ｅｔ ａｌ ２００９によって記載されるように得られた）と共にインキュベートする。反応混合物を氷上で集めて、３７℃で１時間インキュベートし、２．５時間にわたって２４０Ｖで０．５トリス－ボレート－ＥＤＴＡ中において６％の天然ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動させる。遊離及び結合ＲＮＡのレベルを、核酸染色（例えば、ゲルレッド（ｇｅｌｒｅｄ））を用いて決定する。結合は、バックグラウンドを差し引いた全レーンの強度に対する非結合ＲＮＡの強度として計算される。
環状ＲＮＡは、機能的疑似らせん構造を有することが予測される。
実施例１８：自己転写／複製
この実施例において、環状ＲＮＡは、ＨＤＶ複製ドメインの発現の追加（Ｂｅｅｈａｒｒｙ ｅｔ ａｌ ２０１４によって記載されるように）、アンチゲノム複製コンピテントリボザイム及び核局在化シグナルを伴い、上述される方法の１つによって合成される。これらのＲＮＡ配列は、環状ＲＮＡが核に位置することを可能にし、ここで、宿主ＲＮＡポリメラーゼがＲＮＡに結合し、ＲＮＡを転写する。次に、このＲＮＡは、リボザイムを用いて自己切断される。次に、ＲＮＡは、ライゲートされ、再度自己複製される（図１２を参照されたい）。
環状ＲＮＡ（１～５マイクログラム）は、上述される技術を用いてＨｅＬａ細胞中にトランスフェクトされる。ＨｅＬａ細胞を、ペニシリン－ストレプトマイシン及び１０％のウシ胎仔血清が補充された、高グルコース（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中において３７℃及び５％のＣＯ２で成長させる。トランスフェクション後、ＨｅＬａ細胞をさらに４～７２時間培養し、次にトランスフェクトされた細胞からの全ＲＮＡをトランスフェクションの１時間～２０日後、製造業者の説明に従ってフェノール系ＲＮＡ単離試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて単離し、ＨＤＶドメインをコードする環状ＲＮＡの総量を決定し、本明細書に記載されるようにｑＰＣＲを用いて、対照環状ＲＮＡと比較する。
実施例１９：環状ＲＮＡ環状化
この実施例は、スプリントライゲーションを用いた環状ＲＮＡのインビトロ生成を実証する。
非天然環状ＲＮＡは、１つ以上の望ましい特性を含むように操作され得、組み換えＤＮＡ技術を用いて生成され得る。以下の実施例に示されるように、スプリントライゲーションが線状ＲＮＡを環状化した。
環状ＲＮＡ１を、終止コドン（２６４ｎｔ）なしで三重ＦＬＡＧタグ化ＥＧＦをコードするように設計した。それは、翻訳開始のために開始コドンにおいてコザック配列（配列番号１１）を有する。環状ＲＮＡ２は、それが終止要素（三重終止コドン）（２７３ｎｔ、配列番号１２）を有することを除いて、環状ＲＮＡ１と同一の配列を有する。環状ＲＮＡ３を、終止要素（終止コドン）（３３０ｎｔ）なしで、スタガー要素（２Ａ配列、配列番号１３）によって隣接される三重ＦＬＡＧタグ化ＥＧＦをコードするように設計した。環状ＲＮＡ４は、それが終止要素（三重終止コドン）（３３９ｎｔ）を有することを除いて、環状ＲＮＡ３と同一の配列を有する。
この実施例において、環状ＲＮＡを以下のように生成した。インビトロ転写のためのＤＮＡ鋳型を、Ｔ７プロモータを有するフォワードプライマー及び２－Ｏ－メチル化ヌクレオチドをリバースプライマーと共に有する対応する配列（ＩＤＴ）を有するｇＢｌｏｃｋｓ遺伝子フラグメントから増幅した。増幅されたＤＮＡ鋳型を、ＤＮＡゲル精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてゲル精製した。２５０～５００ｎｇの精製されたＤＮＡ鋳型をインビトロ転写に供した。線状、５’－一リン酸化インビトロ転写産物を７．５ｍＭのＧＭＰ、１．５ｍＭのＧＴＰ、７．５ｍＭのＵＴＰ、７．５ｍＭのＣＴＰ及び７．５ｍＭのＡＴＰの存在下において、対応する配列を有する各ＤＮＡ鋳型からＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いて生成した。約４０μｇの線状ＲＮＡを各反応において生成した。インキュベーション後、各反応をＤＮａｓｅで処理して、ＤＮＡ鋳型を除去した。インビトロ転写ＲＮＡを２．５Ｍの酢酸アンモニウムの存在下においてエタノールで沈殿させて、取り込まれないモノマーを除去した。
転写された線状ＲＮＡを、鋳型としての２０ｎｔのスプリントＤＮＡオリゴマー（配列番号１４）上でＴ４ ＲＮＡリガーゼ２を用いて環状化した。スプリントＤＮＡを、線状ＲＮＡの１０ｎｔの各５’又は３’末端をアニールするように設計した。スプリントＤＮＡ（３μＭ）でアニールした後、１μＭの線状ＲＮＡを３７Ｃ又は４時間で０．５Ｕ／μｌのＴ４ ＲＮＡリガーゼ２と共にインキュベートした。Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２を含まない混合物を陰性対照として使用した。
線状ＲＮＡの環状化を６％の変性ＰＡＧＥにおいてＲＮＡを分離することによって監視した。よりゆっくりと移動するＲＮＡバンドは、それらの環状構造のため、変性ポリアクリルアミドゲルにおける線状ＲＮＡより環状ＲＮＡと一致する。図１３から分かるように、ＲＮＡ混合物へのリガーゼの追加（＋レーン）は、リガーゼを欠いた混合物（－レーン）中に存在する線状ＲＮＡバンドを超えるようである新たなバンドを生成した。よりゆっくりと移動するバンドは、全てのＲＮＡ混合物において見られ、これは、陰性対照と比較して、複数の構築物で行われる成功したスプリントライゲーション（例えば、環状化）を示す。
実施例２０：ＲＮＡ環状化効率
この実施例は、ＲＮＡスプリントライゲーションの環状化効率を実証する。
１つ以上の望ましい特性を含むように操作された非天然環状ＲＮＡがスプリント媒介性環状化を用いて生成され得る。以下の実施例に示されるように、スプリントライゲーションは、対照より高い効率で線状ＲＮＡを環状化した。
実施例９に記載される環状ＲＮＡ１、環状ＲＮＡ２、環状ＲＮＡ３及び環状ＲＮＡ４をここでも使用した。環状ＲＮＡ５を、２Ａ配列によって隣接されるＦＬＡＧタグ化ＥＧＦ、続いてＦＬＡＧタグ化ナノルシフェラーゼ（８７３ｎｔ、配列番号１７）をコードするように設計した。環状ＲＮＡ６は、ナノルシフェラーゼ配列（７６２ｎｔ、配列番号１８）の末端において、ＥＧＦ及びナノルシフェラーゼ遺伝子及び終止要素（三重終止コドン）間に終止要素（三重終止コドン）を含んでいたことを除いて、環状ＲＮＡ５と同一の配列を有する。
この実施例において、ＲＮＡの環状化効率を測定するために、６つの異なるサイズの線状ＲＮＡ（２６４ｎｔ、２７３ｎｔ、３３０ｎｔ、３３９ｎｔ、８７３ｎｔ及び７６２ｎｔ）を生成し、実施例９に記載されるように環状化した。環状ＲＮＡを６％の変性ＰＡＧＥによって分解し、線状又は環状ＲＮＡについてのゲルにおける対応するＲＮＡバンドを精製のために切除した。切除されたＲＮＡゲルバンドを破砕し、ＲＮＡを、８００μｌの３００ｍＭのＮａＣｌで一晩溶離させた。ゲル破片を遠心分離フィルタによって除去し、ＲＮＡを０．３Ｍの酢酸ナトリウムの存在下においてエタノールで沈殿させた。
環状化効率を以下のように計算した。溶離された環状ＲＮＡの量を、溶離された全ＲＮＡの量（環状＋線状ＲＮＡ）で除算し、結果を図１４中のグラフとして示した。
Ｔ４ ＲＮＡｓｅリガーゼ２を用いた線状ＲＮＡのライゲーションは、対照より高い効率速度で環状ＲＮＡを生成した。傾向データは、より多い構築物がより高い速度で環状化されたことを示し、例えば、約８００ｎｔを有する線状ＲＮＡが、約８０％の環状化効率を有することが示された一方、約２００～４００ｎｔを有する線状ＲＮＡは、５０％～８０％の範囲の環状化効率を有していた。
実施例２１：分解感受性を欠いた環状ＲＮＡ
この実施例は、線状ＲＮＡと比較した、ＲＮＡｓｅ Ｒによる分解に対する環状ＲＮＡの感受性を実証する。
環状ＲＮＡは、５’及び３’末端の欠如のために、線状ＲＮＡよりエキソヌクレアーゼ分解に対して抵抗性である。以下の実施例に示されるように、環状ＲＮＡは、その線状ＲＮＡ同等物より分解に対する感受性が低い。
環状ＲＮＡ５を生成し、本明細書に記載されるアッセイに使用するために実施例１１に記載されるように環状化した。
環状ＲＮＡ５の環状化を試験するために、２０ｎｇ／μｌの線状又は環状ＲＮＡ５を３０分間にわたって３７℃において、２Ｕ／μｌのＲＮＡｓｅ Ｒ、線状ＲＮＡを消化するが、ラリアット又は環状ＲＮＡ構造を消化しない３’－５’エキソリボヌクレアーゼと共にインキュベートした。インキュベーション後、反応混合物を６％の変性ＰＡＧＥによって分析した。
エキソヌクレアーゼを欠いたレーンに存在する線状ＲＮＡバンドは、環状ＲＮＡ５レーンに存在せず（図１５を参照されたい）、これは、環状ＲＮＡ５が、線状ＲＮＡ対照と比較して、エキソヌクレアーゼ処理に対するより高い抵抗性を示したことを示す。
実施例２２：環状ＲＮＡの単離及び精製
この実施例は、環状ＲＮＡ精製を実証する。
特定の実施形態において、前の実施例に記載される環状ＲＮＡが単離され、コードされるタンパク質産物の発現前に精製され得る。この実施例は、ＵＲＥＡゲル分離を用いた単離を記載している。以下の実施例に示されるように、環状ＲＮＡを単離し、精製した。
実施例１１に記載される環状ＲＮＡ１、環状ＲＮＡ２、環状ＲＮＡ３、環状ＲＮＡ４、環状ＲＮＡ５及び環状ＲＮＡ６を本明細書に記載されるように単離した。
この実施例において、線状及び環状ＲＮＡを記載されるように生成した。環状ＲＮＡを精製するために、ライゲーション混合物を６％の変性ＰＡＧＥにおいて分解し、環状ＲＮＡのそれぞれに対応するＲＮＡバンドを切除した。切除されたＲＮＡゲルフラグメントを破砕し、ＲＮＡを８００μｌの３００ｍＭのＮａＣｌで一晩溶離させた。ゲル破片を遠心分離フィルタによって除去し、ＲＮＡを０．３Ｍの酢酸ナトリウムの存在下においてエタノールで沈殿させた。溶離された環状ＲＮＡを６％の変性ＰＡＧＥによって分析した（図１６を参照されたい）。
単一のバンドを、可変サイズを有する環状ＲＮＡについてＰＡＧＥによって視覚化した。
実施例２３：タンパク質発現の検出
この実施例は、環状ＲＮＡからのインビトロタンパク質発現を実証する。
タンパク質発現は、ｍＲＮＡから特定のタンパク質を生成するプロセスである。このプロセスは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）へのＤＮＡの転写、続いてポリペプチド鎖へのｍＲＮＡの翻訳を含み、このポリペプチド鎖が最終的に機能的タンパク質に折り畳まれ、特定の細胞内又は細胞外の位置に標的化され得る。
以下の実施例に示されるように、タンパク質を環状ＲＮＡ配列からインビトロで発現させた。
環状ＲＮＡを、終止要素（終止コドン）（３３０ｎｔ、配列番号１９）なしで、２Ａ配列によって隣接される三重ＦＬＡＧタグ化ＥＧＦをコードするように設計した。
線状又は環状ＲＮＡを２５μｌの体積中において、３０℃で、ウサギ網状赤血球溶解物中で５時間にわたってインキュベートした。反応混合物の最終組成物は、７０％のウサギ網状赤血球溶解物、２０μＭアミノ酸、０．８Ｕ／μｌのＲＮａｓｅ阻害剤及び１μｇの線状又は環状ＲＮＡを含有していた。インキュベーション後、ヘモグロビンタンパク質を、酢酸（０．３２μｌ）及び水（３００μｌ）を反応混合物（１６μｌ）に加え、１５℃で１０分間にわたって２０，８１７×ｇで遠心分離することによって除去した。上清を除去し、ペレットを３０ｌの２×ＳＤＳサンプル緩衝液に溶解させ、１５分間にわたって７０℃でインキュベートした。５分間にわたる１４００×ｇでの遠心分離後、上清を１０～２０％の勾配のポリアクリルアミド／ＳＤＳゲル上で分析した。
ドライ転写方法を用いてニトロセルロース膜に電気泳動転写した後、ブロットを抗ＦＬＡＧ抗体及び抗マウスＩｇＧペルオキシダーゼと共にインキュベートした。ブロットを、ＥＣＬキットを用いて視覚化し（図１７を参照されたい）、ウエスタンブロットバンド強度をＩｍａｇｅＪによって測定した。
蛍光が検出され、発現産物が存在することが示された。したがって、環状ＲＮＡがタンパク質の発現を駆動することが示された。
実施例２４：ＩＲＥＳ非依存的発現
この実施例は、環状ＲＮＡがＩＲＥＳの非存在下で発現を駆動することを実証する。
ＩＲＥＳ又は内部リボソーム進入部位は、キャップ非依存的に翻訳開始を可能にするＲＮＡ要素である。環状ＲＮＡがＩＲＥＳの非存在下でＦｌａｇタンパク質の発現を駆動することが示された。
環状ＲＮＡを、終止要素（終止コドン）（３３０ｎｔ、配列番号１９）なしで、２Ａ配列によって隣接される三重ＦＬＡＧタグ化ＥＧＦをコードするように設計した。
線状又は環状ＲＮＡを２５μｌの体積中において、３０℃で、ウサギ網状赤血球溶解物中で５時間にわたってインキュベートした。反応混合物の最終組成物は、７０％のウサギ網状赤血球溶解物、２０μＭのアミノ酸、０．８Ｕ／μｌのＲＮａｓｅ阻害剤及び１μｇの線状又は環状ＲＮＡを含んでいた。インキュベーション後、ヘモグロビンタンパク質を、酢酸（０．３２μｌ）及び水（３００μｌ）を反応混合物（１６μｌ）に加え、１５℃で１０分間にわたって２０，８１７×ｇで遠心分離することによって除去した。上清を除去し、ペレットを３０ｌの２×ＳＤＳサンプル緩衝液に溶解させ、１５分間にわたって７０℃でインキュベートした。５分間にわたる１４００×ｇでの遠心分離後、上清を１０～２０％の勾配のポリアクリルアミド／ＳＤＳゲル上で分析した。
ドライ転写方法を用いてニトロセルロース膜に電気泳動転写した後、ブロットを抗ＦＬＡＧ抗体及び抗マウスＩｇＧペルオキシダーゼと共にインキュベートした。ブロットを、増強化学発光（ＥＣＬ）キットを用いて視覚化し（図１８を参照されたい）、ウエスタンブロットバンド強度をＩｍａｇｅＪによって測定した。
発現産物は、ＩＲＥＳの非存在下でも環状ＲＮＡ反応混合物中で検出された。
実施例２５：キャップ非依存的発現
この実施例は、環状ＲＮＡがキャップの非存在下で発現を駆動できることを実証する。
キャップは、ｍＲＮＡの５’末端において特異的に改変されたヌクレオチドである。５’キャップは、線状ｍＲＮＡの安定性並びに翻訳開始のために有用である。環状ＲＮＡは、キャップの非存在下で産物の発現を駆動した。
環状ＲＮＡを、終止要素（終止コドン）（３３０ｎｔ、配列番号１９）なしで、２Ａ配列によって隣接される三重ＦＬＡＧタグ化ＥＧＦをコードするように設計した。
線状又は環状ＲＮＡを２５μｌの体積中において、３０℃で、ウサギ網状赤血球溶解物中で５時間にわたってインキュベートした。反応混合物の最終組成物は、７０％のウサギ網状赤血球溶解物、２０μＭのアミノ酸、０．８Ｕ／μｌのＲＮａｓｅ阻害剤及び１μｇの線状又は環状ＲＮＡを含んでいた。インキュベーション後、ヘモグロビンタンパク質を、酢酸（０．３２μｌ）及び水（３００μｌ）を反応混合物（１６μｌ）に加え、１５℃で１０分間にわたって２０，８１７×ｇで遠心分離することによって除去した。上清を除去し、ペレットを１５分間にわたって７０℃で３０μｌの２×ＳＤＳサンプル緩衝液に溶解させた。５分間にわたる１４００×ｇでの遠心分離後、上清を１０～２０％の勾配のポリアクリルアミド／ＳＤＳゲル上で分析した。
ドライ転写方法を用いてニトロセルロース膜に電気泳動転写した後、ブロットを抗ＦＬＡＧ抗体及び抗マウスＩｇＧペルオキシダーゼと共にインキュベートした。ブロットを、ＥＣＬキットを用いて視覚化し（図１７を参照されたい）、ウエスタンブロットバンド強度をＩｍａｇｅＪによって測定した。
発現産物は、キャップの非存在下でも環状ＲＮＡ反応混合物中で検出された。
実施例２６：５’－ＵＴＲなしでの発現
この実施例は、５’非翻訳領域を欠いた環状ＲＮＡからのインビトロタンパク質発現を実証する。
５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）は、ＲＮＡ転写産物の下流のタンパク質翻訳を促進する開始コドンの直接上流にある領域である。
以下の実施例に示されるように、環状ＲＮＡ配列中の５’－非翻訳領域は、インビトロタンパク質発現に必要でなかった。
環状ＲＮＡを、終止要素（終止コドン）（３３０ｎｔ、配列番号１９）なしで、２Ａ配列によって隣接される三重ＦＬＡＧタグ化ＥＧＦをコードするように設計した。
線状又は環状ＲＮＡを２５μｌの体積中において、３０℃で、ウサギ網状赤血球溶解物中で５時間にわたってインキュベートした。反応混合物の最終組成物は、７０％のウサギ網状赤血球溶解物、２０μＭのアミノ酸、０．８Ｕ／μｌのＲＮａｓｅ阻害剤及び１μｇの線状又は環状ＲＮＡを含んでいた。インキュベーション後、ヘモグロビンタンパク質を、酢酸（０．３２μｌ）及び水（３００μｌ）を反応混合物（１６μｌ）に加え、１５℃で１０分間にわたって２０，８１７×ｇで遠心分離することによって除去した。上清を除去し、ペレットを３０ｌの２×ＳＤＳサンプル緩衝液に溶解させ、１５分間にわたって７０℃でインキュベートした。５分間にわたる１４００×ｇでの遠心分離後、上清を１０～２０％の勾配のポリアクリルアミド／ＳＤＳゲル上で分析した。
ドライ転写方法を用いてニトロセルロース膜に電気泳動転写した後、ブロットを抗ＦＬＡＧ抗体及び抗マウスＩｇＧペルオキシダーゼと共にインキュベートした。ブロットを、ＥＣＬキットを用いて視覚化し（図１７を参照されたい）、ウエスタンブロットバンド強度をＩｍａｇｅＪによって測定した。
発現産物は、５’ＵＴＲの非存在下でも環状ＲＮＡ反応混合物中で検出された。
実施例２７：３’－ＵＴＲなしでの発現
この実施例は、３’－ＵＴＲを欠いた環状ＲＮＡからのインビトロタンパク質発現を実証する。
３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）は、翻訳終止コドンの直接下流にある領域であり、遺伝子発現に転写後に影響を与え得る調節領域を含む。３’－非翻訳領域は、ｍＲＮＡの局在化、安定性、輸送、及び翻訳効率に影響を与えることにより、遺伝子発現において役割も果たし得る。さらに、３’－ＵＴＲの構造特性並びに別のポリアデニル化のその使用が遺伝子発現において役割を果たし得る。
以下の実施例に示されるように、環状ＲＮＡ配列中の３’－ＵＴＲは、インビトロタンパク質発現に必要でなかった。
環状ＲＮＡを、終止要素（終止コドン）（３３０ｎｔ、配列番号１９）なしで、２Ａ配列によって隣接される三重ＦＬＡＧタグ化ＥＧＦをコードするように設計した。
線状又は環状ＲＮＡを２５μｌの体積中において、３０℃で、ウサギ網状赤血球溶解物中で５時間にわたってインキュベートした。反応混合物の最終組成物は、７０％のウサギ網状赤血球溶解物、２０μＭのアミノ酸、０．８Ｕ／μｌのＲＮａｓｅ阻害剤及び１μｇの線状又は環状ＲＮＡを含んでいた。インキュベーション後、ヘモグロビンタンパク質を、酢酸（０．３２μｌ）及び水（３００μｌ）を反応混合物（１６μｌ）に加え、１５℃で１０分間にわたって２０，８１７×ｇで遠心分離することによって除去した。上清を除去し、ペレットを３０ｌの２×ＳＤＳサンプル緩衝液に溶解させ、１５分間にわたって７０℃でインキュベートした。５分間にわたる１４００×ｇでの遠心分離後、上清を１０～２０％の勾配のポリアクリルアミド／ＳＤＳゲル上で分析した。
ドライ転写方法を用いてニトロセルロース膜に電気泳動転写した後、ブロットを抗ＦＬＡＧ抗体及び抗マウスＩｇＧペルオキシダーゼと共にインキュベートした。ブロットを、ＥＣＬキットを用いて視覚化し（図１７を参照されたい）、ウエスタンブロットバンド強度をＩｍａｇｅＪによって測定した。
発現産物は、３’ＵＴＲの非存在下でも環状ＲＮＡ反応混合物中で検出された。
実施例２８：終止コドンを用いない発現
この実施例は、終止コドンを欠いた環状ＲＮＡからのローリングサークル型翻訳後のポリペプチド産物の生成を実証する。
タンパク質は、アミノ酸の固有の配列から構成されるポリペプチドに基づいている。各アミノ酸は、コドンと呼ばれるヌクレオチド三つ組によってｍＲＮＡ中でコードされる。タンパク質翻訳中、ｍＲＮＡ中の各コドンは、成長しているポリペプチド鎖中のアミノ酸の付加に対応する。終止要素又は終止コドンは、結合解放因子によってこのプロセスの終了を示し、それによりリボソームサブユニットを分離させて、アミノ酸鎖を解放する。
以下の実施例に示されるように、終止コドンを欠いた環状ＲＮＡは、ローリングサークル型翻訳により、反復したポリペプチド配列から構成される大きいポリペプチド産物を生成した。
環状ＲＮＡを、終止要素（終止コドン）（２６４ｎｔ、配列番号２０）なしで、三重ＦＬＡＧタグ化ＥＧＦをコードするように設計し、翻訳開始に有利に作用するように開始コドンにおいてコザック配列を含んでいた。
線状又は環状ＲＮＡを２５μｌの体積中において、３０℃で、ウサギ網状赤血球溶解物中で５時間にわたってインキュベートした。反応混合物の最終組成物は、７０％のウサギ網状赤血球溶解物、２０μＭのアミノ酸、０．８Ｕ／μｌのＲＮａｓｅ阻害剤及び１μｇの線状又は環状ＲＮＡを含んでいた。インキュベーション後、ヘモグロビンタンパク質を、酢酸（０．３２μｌ）及び水（３００μｌ）を反応混合物（１６μｌ）に加え、１５℃で１０分間にわたって２０，８１７×ｇで遠心分離することによって除去した。上清を除去し、ペレットを３０ｌの２×ＳＤＳサンプル緩衝液に溶解させ、１５分間にわたって７０℃でインキュベートした。５分間にわたって１４００×ｇでの遠心分離後、上清を１０～２０％の勾配のポリアクリルアミド／ＳＤＳゲル上で分析した。
ドライ転写方法を用いてニトロセルロース膜に電気泳動転写した後、ブロットを抗ＦＬＡＧ抗体及び抗マウスＩｇＧペルオキシダーゼと共にインキュベートした。ブロットを、ＥＣＬキットを用いて視覚化し（図１８を参照されたい）、ウエスタンブロットバンド強度をＩｍａｇｅＪによって測定した。
発現産物は、終止コドンの非存在下でも環状ＲＮＡ反応混合物中で検出された。
実施例２９：終止要素（終止コドン）を用いない別個のタンパク質の発現
この実施例は、終止要素（終止コドン）を欠いた環状ＲＮＡから翻訳された別個のタンパク質産物の生成を実証する。
２Ａペプチドなどのスタガー要素は、約２０ａａの短いアミノ酸配列を含み得、これは、単一のｍＲＮＡからの等モルレベルの複数の遺伝子の生成を可能にする。スタガー要素は、リボソームに、２Ａ要素のＣ末端におけるペプチド結合の合成をスキップさせて、２Ａ配列の末端と下流の次のペプチドとの間の分離をもたらすことによって機能し得る。分離は、Ｃ末端上に見られるグリシン及びプロリン残基間で起こり、上流のシストロンは、末端に加えられたいくつかのさらなる残基を有する一方、下流のシストロンは、プロリンから開始する。
以下の実施例に示されるように、終止要素（終止コドン）を欠いた環状ＲＮＡは、大きいポリペプチドポリマーを生成し（図１９の左側のパネル：スタガーなし－環状ＲＮＡレーン）、コード領域の３’末端における２Ａ配列の包含は、同等の線状ＲＮＡ構築物によって生成されるものと同等のサイズで別個のタンパク質の生成をもたらした（図１９の右側のパネル：スタガー－環状ＲＮＡレーン）。
環状ＲＮＡを、終止要素（終止コドン）（２６４ｎｔ、配列番号２０）なり及びスタガー要素なしで、三重ＦＬＡＧタグ化ＥＧＦをコードするように設計した。第２の環状ＲＮＡを、終止要素（終止コドン）（３３０ｎｔ、配列番号１９）なしで、２Ａ配列によって隣接される三重ＦＬＡＧタグ化ＥＧＦをコードするように設計した。
線状又は環状ＲＮＡを２５μｌの体積中において、３０℃で、ウサギ網状赤血球溶解物中で５時間にわたってインキュベートした。反応混合物の最終組成物は、７０％のウサギ網状赤血球溶解物、２０μＭのアミノ酸、０．８Ｕ／μｌのＲＮａｓｅ阻害剤及び１μｇの線状又は環状ＲＮＡを含んでいた。インキュベーション後、ヘモグロビンタンパク質を、酢酸（０．３２μｌ）及び水（３００μｌ）を反応混合物（１６μｌ）に加え、１５℃で１０分間にわたって２０，８１７×ｇで遠心分離することによって除去した。上清を除去し、ペレットを３０ｌの２×ＳＤＳサンプル緩衝液に溶解させ、１５分間にわたって７０℃でインキュベートした。５分間にわたる１４００×ｇでの遠心分離後、上清を１０～２０％の勾配のポリアクリルアミド／ＳＤＳゲル上で分析した。
ドライ転写方法を用いてニトロセルロース膜に電気泳動転写した後、ブロットを抗ＦＬＡＧ抗体及び抗マウスＩｇＧペルオキシダーゼと共にインキュベートした。ブロットを、ＥＣＬキットを用いて視覚化し（図１９を参照されたい）、ウエスタンブロットバンド強度をＩｍａｇｅＪによって測定した。
別個の発現産物が検出され、これは、スタガー要素を含む環状ＲＮＡが終止要素（終止コドン）の非存在下でも個々のタンパク質の発現を駆動したことを示す。
実施例３０：ローリングサークル型翻訳
この実施例は、スタガー要素を用いた、環状ＲＮＡからのタンパク質の増加したインビトロ生合成を実証する。
非天然環状ＲＮＡを、スタガー要素を欠いた環状ＲＮＡを用いたタンパク質発現と比較するために、スタガー要素を含むように操作した。以下の実施例に示されるように、スタガー要素は、このような配列を欠いた以外は同一の環状ＲＮＡと比較して、タンパク質を過剰発現した。
環状ＲＮＡを、終止要素（例えば、並んだ３つの終止コドン）（２７３ｎｔ、配列番号２１）を用いて、三重ＦＬＡＧタグ化ＥＧＦをコードするように設計した。第２の環状ＲＮＡを、終止要素（終止コドン）（３３０ｎｔ、配列番号１９）なしで、２Ａ配列によって隣接される三重ＦＬＡＧタグ化ＥＧＦをコードするように設計した。
線状又は環状ＲＮＡを、２５μｌの体積中において、３０℃で、ウサギ網状赤血球溶解物中で５時間にわたってインキュベートした。反応混合物の最終組成物は、７０％のウサギ網状赤血球溶解物、２０μＭのアミノ酸、０．８Ｕ／μｌのＲＮａｓｅ阻害剤及び１μｇの線状又は環状ＲＮＡを含有していた。インキュベーション後、ヘモグロビンタンパク質を、酢酸（０．３２μｌ）及び水（３００μｌ）を反応混合物（１６μｌ）に加え、１５℃で１０分間にわたって２０，８１７×ｇで遠心分離することによって除去した。上清を除去し、ペレットを３０ｌの２×ＳＤＳサンプル緩衝液に溶解させ、１５分間にわたって７０℃でインキュベートした。５分間にわたる１４００×ｇでの遠心分離後、上清を１０～２０％の勾配のポリアクリルアミド／ＳＤＳゲル上で分析した。
ドライ転写方法を用いてニトロセルロース膜に電気泳動転写した後、ブロットを抗ＦＬＡＧ抗体及び抗マウスＩｇＧペルオキシダーゼと共にインキュベートした。ブロットを、ＥＣＬキットを用いて視覚化し（図２０を参照されたい）、ウエスタンブロットバンド強度をＩｍａｇｅＪによって測定した。
別個の発現産物が検出され、これは、スタガー要素を含む環状ＲＮＡが終止要素（終止コドン）の非存在下でも個々のタンパク質の発現を駆動したことを示す。
実施例３１：インビトロでの生物活性タンパク質の発現
この実施例は、環状ＲＮＡからの生物活性タンパク質のインビトロ生合成を実証する。
非天然環状ＲＮＡを、生物活性治療用タンパク質を発現するように操作した。以下の実施例に示されるように、生物活性タンパク質が網状赤血球溶解物中で環状ＲＮＡから発現された。
環状ＲＮＡを、２Ａ配列によって隣接されるＦＬＡＧタグ化ＥＧＦ、続いてＦＬＡＧタグ化ナノルシフェラーゼ（８７３ｎｔ、配列番号１７）をコードするように設計した。
線状又は環状ＲＮＡを２５μｌの体積中において、３０℃で、ウサギ網状赤血球溶解物中で５時間にわたってインキュベートした。反応混合物の最終組成物は、７０％のウサギ網状赤血球溶解物、２０μＭアミノ酸、０．８Ｕ／μｌのＲＮａｓｅ阻害剤を含有していた。翻訳混合物中のルシフェラーゼ活性を、製造業者のプロトコル（Ｐｒｏｍｅｇａ）に従ってルシフェラーゼアッセイシステムを用いて監視した。
図２１に示されるように、対照ビヒクルＲＮＡよりはるかに高い蛍光が環状ＲＮＡ及び線状ＲＮＡの両方で検出され、これは、発現産物が存在していたことを示す。したがって、環状ＲＮＡが生物活性タンパク質を発現することが示された。
実施例３２：線状ＲＮＡ同等物より長い半減期を有する環状ＲＮＡ
この実施例は、環状ＲＮＡが、線状ＲＮＡと比較して延長された半減期を有するように操作されることを実証する。
治療用タンパク質をコードする環状ＲＮＡは、例えば、線状ＲＮＡと比較して、延長された生物学的半減期に起因する、より高いレベルのコードされたタンパク質を生成する能力をレシピエント細胞に与えた。以下の実施例に示されるように、環状ＲＮＡは、網状赤血球溶解物中でその線状ＲＮＡ同等物より長い半減期を有していた。
環状ＲＮＡを、２Ａ配列によって隣接されるＦＬＡＧタグ化ＥＧＦ、続いてＦＬＡＧタグ化ナノルシフェラーゼ（８７３ｎｔ、配列番号１７）をコードするように設計した。
この実施例において、時間経過実験がＲＮＡ安定性を監視するために行われた。１００ｎｇの線状又は環状ＲＮＡをウサギ網状赤血球溶解物と共にインキュベートし、サンプルを１時間、５時間、１８時間及び３０時間の時点で収集した。全ＲＮＡを、フェノール系試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて溶解物から単離し、ｃＤＮＡを逆転写によって生成した。ｑＲＴ－ＰＣＲ分析を、色素ベースの定量的ＰＣＲ反応ミックス（ＢｉｏＲａｄ）を用いて行った。
図２２に示されるように、より高い濃度の環状ＲＮＡが線状ＲＮＡより後の時点で検出された。したがって、環状ＲＮＡは、より安定しているか、又はその線状同等物と比較して増加した半減期を有していた。
実施例３３：環状ＲＮＡは、細胞内における線状ＲＮＡより長い半減期を実証した
この実施例は、環状ＲＮＡが細胞内に送達され、線状ＲＮＡと比較して細胞内での増加した半減期を有することを実証する。
非天然環状ＲＮＡを、生物活性治療用タンパク質を発現するように操作した。以下の実施例に示されるように、環状ＲＮＡは、その線状ＲＮＡ同等物と比較してより高いレベルで存在し、これは、環状ＲＮＡのより長い半減期を実証している。
この実施例において、環状ＲＮＡ及び線状ＲＮＡを、コザック、２Ａによって隣接されるＥＧＦ、終止又は非終止配列（配列番号１１、１９、２０、２１）をコードするように設計した。細胞中のＲＮＡの半減期を監視するために、０．１×１０６個の細胞を１２ウェルプレートの各ウェル上で平板培養した。１日後、１μｇの線状又は環状ＲＮＡを、脂質ベースのトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて各ウェル中でトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、全ＲＮＡを、フェノール系抽出試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて細胞から単離した。全ＲＮＡ（５００ｎｇ）を逆転写に供して、ｃＤＮＡを生成した。ｑＲＴ－ＰＣＲ分析を、色素ベースの定量的ＰＣＲミックス（ＢｉｏＲａｄ）を用いて行った。プライマー配列は、以下のとおりであった：線状又は環状ＲＮＡについてのプライマー、Ｆ：ＡＣＧＡＣＧＧＴＧＴＧＴＧＣＡＴＧＴＡＴ、Ｒ：ＴＴＣＣＣＡＣＣＡＣＴＴＣＡＧＧＴＣＴＣ；環状ＲＮＡについてのプライマー、Ｆ：ＴＡＣＧＣＣＴＧＣＡＡＣＴＧＴＧＴＴＧＴ、Ｒ：ＴＣＧＡＴＧＡＴＣＴＴＧＴＣＧＴＣＧＴＣ。
環状ＲＮＡは、その線状同等物と同様に、２９３Ｔ細胞中で問題なくトランスフェクトされた。２４時間後、保持された環状及び線状ＲＮＡを、ｑＰＣＲを用いて測定した。図２３Ａ及びＢに示されるように、環状ＲＮＡは、線状ＲＮＡと比較して細胞内におけるより長い半減期を有することが示された。
実施例３４：合成環状ＲＮＡを細胞内で翻訳し、合成環状ＲＮＡをローリングサークル型翻訳によって翻訳した
この実施例は、細胞内での合成環状ＲＮＡの翻訳を実証する。
以下の実施例に示されるように、環状ＲＮＡ及び線状ＲＮＡを、終止要素（配列番号１１）なしで、コザック、３ｘＦＬＡＧ－ＥＧＦ配列をコードするように設計した。環状ＲＮＡがポリマーＥＧＦに翻訳された一方、線状ＲＮＡが翻訳されず、これは、細胞が合成環状ＲＮＡのローリングサークル型翻訳を行ったことを実証している。
この実施例において、細胞内での線状又は環状ＲＮＡの翻訳効率を監視するために、０．１×１０６個の細胞を１２ウェルプレートの各ウェル上で平板培養した。１日後、１μｇの線状又は環状ＲＮＡを、脂質ベースのトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて各ウェル中でトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、２００μｌのＲＩＰＡ緩衝液を各ウェルに加えることにより、細胞を収集した。次に、１０μｇの細胞溶解物タンパク質を１０～２０％の勾配のポリアクリルアミド／ＳＤＳゲル上で分析した。ドライ転写方法を用いて、ニトロセルロース膜に電気泳動転写した後、ブロットを抗ＦＬＡＧ抗体及び抗マウスＩｇＧペルオキシダーゼと共にインキュベートした。ローディングコントロールとして、抗βチューブリン抗体を使用した。ブロットを、増強化学発光（ＥＣＬ）キットを用いて視覚化した。ウエスタンブロットバンド強度をＩｍａｇｅＪによって測定した。
環状ＲＮＡは、その線状同等物と同様に、２９３Ｔ細胞中で問題なくトランスフェクトされた。しかしながら、図２４は、トランスフェクションの２４時間後、ＥＧＦタンパク質が環状ＲＮＡトランスフェクト細胞中で検出された一方、線状ＲＮＡトランスフェクト細胞中で検出されなかったことを示す。したがって、環状ＲＮＡは、線状ＲＮＡと比較して、ローリングサークル型翻訳によって細胞内で翻訳された。
実施例３５：合成環状ＲＮＡは、細胞内における低下した免疫原性遺伝子発現を実証した
この実施例は、環状ＲＮＡが線状ＲＮＡと比較して低下した免疫原性を有するように操作されることを実証する。
治療用タンパク質をコードした環状ＲＮＡは、線状ＲＮＡと比較して、レシピエント細胞内での免疫原性関連遺伝子（ＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ５、ＰＫＡ及びＩＦＮ－β）の低下した誘導を示した。ＲＩＧ－Ｉは、短い５’トリホスフェート非キャップ二本鎖又は一本鎖ＲＮＡを認識し得る一方、ＭＤＡ５は、より長いｄｓＲＮＡを認識し得る。ＲＩＧ－Ｉ及びＭＤＡ５の両方は、ＭＡＶＳを活性化し、抗ウイルス応答を引き起こすことに関与し得る。ＰＫＲは、ｄｓＲＮＡによって活性化され、ＩＦＮ－βなどのインターフェロンによって誘導され得る。以下の実施例に示されるように、環状ＲＮＡは、ｑ－ＰＣＲによるＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ５、ＰＫＲ及びＩＦＮ－βの発現によって評価した際、類似した線状ＲＮＡより、２９３Ｔ細胞内における免疫関連遺伝子の低下した活性化を有することが示された。
環状ＲＮＡ及び線状ＲＮＡを、（１）コザック、終止要素（配列番号１１）を有さない３ｘＦＬＡＧ－ＥＧＦ配列；（２）コザック、終止要素（終止コドン）（配列番号２１）によって隣接された３ｘＦＬＡＧ－ＥＧＦ；（３）コザック、２Ａ配列（配列番号１９）によって隣接された３ｘＦＬＡＧ－ＥＧＦ；又は（４）コザック、２Ａ配列によって隣接された３ｘＦＬＡＧ－ＥＧＦ配列、続いて終止要素（終止コドン）（配列番号２０）のいずれかをコードするように設計した。
この実施例において、０．１×１０６個の細胞を１２ウェルプレートの各ウェル中で平板培養することにより、自然免疫応答遺伝子のレベルを細胞内で監視した。１日後、１μｇの線状又は環状ＲＮＡを、脂質ベースのトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて各ウェル中でトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、全ＲＮＡを、フェノール系抽出試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて細胞から単離した。全ＲＮＡ（５００ｎｇ）を逆転写に供して、ｃＤＮＡを生成した。ｑＲＴ－ＰＣＲ分析を、色素ベースの定量的ＰＣＲミックス（ＢｉｏＲａｄ）を用いて行った。
使用されるプライマー配列：ＧＡＰＤＨについてのプライマー、Ｆ：ＡＧＧＧＣＴＧＣＴＴＴＴＡＡＣＴＣＴＧＧＴ、Ｒ：ＣＣＣＣＡＣＴＴＧＡＴＴＴＴＧＧＡＧＧＧＡ；ＲＩＧ－Ｉ、Ｆ：ＴＧＴＧＧＧＣＡＡＴＧＴＣＡＴＣＡＡＡＡ、Ｒ：ＧＡＡＧＣＡＣＴＴＧＣＴＡＣＣＴＣＴＴＧＣ；ＭＤＡ５、Ｆ：ＧＧＣＡＣＣＡＴＧＧＧＡＡＧＴＧＡＴＴ、Ｒ：ＡＴＴＴＧＧＴＡＡＧＧＣＣＴＧＡＧＣＴＧ；ＰＫＲ、Ｆ：ＴＣＧＣＴＧＧＴＡＴＣＡＣＴＣＧＴＣＴＧ、Ｒ：ＧＡＴＴＣＴＧＡＡＧＡＣＣＧＣＣＡＧＡＧ；ＩＦＮ－β、Ｆ：ＣＴＣＴＣＣＴＧＴＴＧＴＧＣＴＴＣＴＣＣ、Ｒ：ＧＴＣＡＡＡＧＴＴＣＡＴＣＣＴＧＴＣＣＴＴＧ。
図２５に示されるように、環状ＲＮＡでトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞からの免疫関連遺伝子のｑＲＴ－ＰＣＲレベルは、線状ＲＮＡトランスフェクト細胞と比較して、ＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ５、ＰＫＲ及びＩＦＮ－βの減少を示した。したがって、レシピエント細胞内における免疫原性関連遺伝子の誘導は、線状ＲＮＡトランスフェクト細胞と比較して、環状ＲＮＡトランスフェクト細胞内で減少された。
実施例３６：細胞内におけるローリングサークル型翻訳による合成環状ＲＮＡからの増加した発現
この実施例は、細胞内における合成環状ＲＮＡのローリングサークル型翻訳からの増加した発現を実証する。
環状ＲＮＡを、終止要素（終止コドン）なしで、ナノルシフェラーゼ遺伝子又はＥＧＦ陰性対照遺伝子と共にＩＲＥＳを含むように設計した。細胞をＥＧＦ陰性対照（配列番号２２）；ｎＬＵＣ ｓｔｏｐ（配列番号２３）：ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、スタガー配列（２Ａ配列）、３ｘ ＦＬＡＧタグ化ｎＬＵＣ配列、スタガー配列（２Ａ配列）及び終止コドン；又はｎＬＵＣスタガー（配列番号２４）：ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、スタガー配列（２Ａ配列）、３ｘ ＦＬＡＧタグ化ｎＬＵＣ配列及びスタガー配列（２Ａ配列）でトランスフェクトした。図２６に示されるように、両方の環状ＲＮＡは、機能的ルシフェラーゼ活性を有する翻訳産物を生成した。
この実施例において、環状ＲＮＡの翻訳を細胞内で監視した。具体的には、０．１×１０６個の細胞を１２ウェルプレートの各ウェル上で平板培養した。１日後、３００ｎｇの環状ＲＮＡを、脂質ベースのトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて各ウェル中でトランスフェクトした。２４時間後、１００μｌのＲＩＰＡ緩衝液を加えることにより、細胞を収集した。溶解物中のナノルシフェラーゼ活性を、その製造業者のプロトコル（Ｐｒｏｍｅｇａ）に従ってルシフェラーゼアッセイシステムを用いて測定した。
図２６に示されるように、両方の環状ＲＮＡが細胞内でタンパク質を発現した。しかしながら、スタガー要素、例えば２Ａ配列を含み、終止要素（終止コドン）を欠いた環状ＲＮＡは、終止要素（終止コドン）を有する環状ＲＮＡより、機能的ルシフェラーゼ活性を有するより高いレベルのタンパク質産物を生成した。
実施例３７：細胞内で翻訳される合成環状ＲＮＡ
この実施例は、細胞内における合成環状ＲＮＡ翻訳を実証する。さらに、この実施例は、環状ＲＮＡがその線状同等物より多くの発現産物を生成したことを示す。
環状ＲＮＡは、その線状同等物と同様に、２９３Ｔ細胞中で問題なくトランスフェクトされた。細胞を、陰性対照としてＥＧＦをコードする環状ＲＮＡ（配列番号２２）：ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、スタガー配列（２Ａ配列）、３ｘ ＦＬＡＧタグ化ＥＧＦ配列、スタガー配列（２Ａ配列）；線状又は環状ｎＬＵＣ（配列番号２３）：ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、スタガー配列（２Ａ配列）、３ｘ ＦＬＡＧタグ化ｎＬｕｃ配列、スタガー配列（２Ａ配列）及び終止コドンでトランスフェクトした。図２７に示されるように、環状ＲＮＡは、細胞内でナノルシフェラーゼにおいて翻訳された。
線状又は環状ＲＮＡ翻訳を細胞内で監視した。具体的には、０．１×１０６個の細胞を１２ウェルプレートの各ウェル上で平板培養した。１日後、３００ｎｇの線状又は環状ＲＮＡを、脂質ベースのトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて各ウェル中でトランスフェクトした。２４時間後、１００μｌのＲＩＰＡ緩衝液を加えることにより、細胞を収集した。溶解物中のナノルシフェラーゼ活性を、その製造業者のプロトコル（Ｐｒｏｍｅｇａ）に従ってルシフェラーゼアッセイシステムを用いて測定した。
図２７に示されるように、環状ＲＮＡ翻訳産物が細胞内で検出された。特に、環状ＲＮＡは、その線状ＲＮＡ同等物と比較して、より高いレベルのルシフェラーゼ活性又は生成された増加したタンパク質を有していた。
実施例３８：合成環状ＲＮＡからのローリングサークル型翻訳が細胞内で機能的タンパク質産物を生成した
この実施例は、終止要素（終止コドン）を欠いた、例えば細胞内において、終止要素（終止コドン）を欠き、スタガー要素を有する、合成環状ＲＮＡからの機能的タンパク質産物のローリングサークル型翻訳を実証する。さらに、この実施例は、スタガー要素を有する環状ＲＮＡがその線状同等物より多い機能的タンパク質産物を発現したことを示す。
環状ＲＮＡは、その線状同等物と同様に、２９３Ｔ細胞中で問題なくトランスフェクトされた。細胞を環状ＲＮＡ ＥＧＦ陰性対照（配列番号２２）；線状及び環状ｎＬＵＣ（配列番号２４）：ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、スタガー配列（２Ａ配列）、３ｘ ＦＬＡＧタグ化ｎＬｕｃ配列、スタガー配列（２Ａ配列）でトランスフェクトした。図２８に示されるように、環状ＲＮＡは、細胞内でナノルシフェラーゼ中において翻訳された。
線状又は環状ＲＮＡ翻訳を細胞内で監視した。具体的には、０．１×１０６個の細胞を１２ウェルプレートの各ウェル上で平板培養した。１日後、３００ｎｇの線状又は環状ＲＮＡを、脂質ベースのトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて各ウェル中でトランスフェクトした。２４時間後、１００μｌのＲＩＰ緩衝液を加えることにより、細胞を収集した。溶解物中のナノルシフェラーゼ活性を、その製造業者のプロトコル（Ｐｒｏｍｅｇａ）に従ってルシフェラーゼアッセイシステムを用いて測定した。
図２８に示されるように、環状ＲＮＡ翻訳産物が細胞内で検出された。特に、終止要素（終止コドン）を有さない環状ＲＮＡは、その線状ＲＮＡ同等物より、機能的ルシフェラーゼ活性を有するより高いレベルのタンパク質産物を生成した。
実施例３９：合成環状ＲＮＡが細胞内におけるＩＲＥＳ開始によって翻訳される
この実施例は、細胞内におけるＩＲＥＳによる合成環状ＲＮＡ翻訳開始を実証する。
環状ＲＮＡを、ナノルシフェラーゼ遺伝子又はＥＧＦ陰性対照遺伝子と共にコザック配列又はＩＲＥＳを含むように設計した。細胞をＥＧＦ陰性対照（配列番号２２）、ｎＬＵＣコザック（配列番号２５）：コザック配列、１ｘ ＦＬＡＧタグ化ＥＧＦ配列、スタガー配列（Ｔ２Ａ配列）、１ｘ ＦＬＡＧタグ化ｎＬＵＣ、スタガー配列（Ｐ２Ａ配列）及び終止コドン；又はｎＬＵＣ ＩＲＥＳ（配列番号２３）：ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、スタガー配列（２Ａ配列）、３ｘ ＦＬＡＧタグ化ｎＬＵＣ配列、スタガー配列（２Ａ配列）及び終止コドンでトランスフェクトした。図２９に示されるように、ＩＲＥＳを有する環状ＲＮＡは、コザック配列を有する環状ＲＮＡと比較して、より高いタンパク質レベルに対応する、より高いレベルのルシフェラーゼ活性を示した。
この実施例において、環状ＲＮＡの翻訳を細胞内で監視した。具体的には、０．１×１０６個の細胞を１２ウェルプレートの各ウェル上で平板培養した。１日後、３００ｎｇの環状ＲＮＡを、脂質ベースのトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて各ウェル中でトランスフェクトした。２４時間後、１００μｌのＲＩＰＡ緩衝液を加えることにより、細胞を収集した。溶解物中のナノルシフェラーゼ活性を、その製造業者のプロトコル（Ｐｒｏｍｅｇａ）に従ってルシフェラーゼアッセイシステムを用いて測定した。
図２９に示されるように、環状ＲＮＡは、ＩＲＥＳによりタンパク質発現を開始させ、コザックを有する環状ＲＮＡがタンパク質発現を開始させるより、機能的ルシフェラーゼ活性を有するより高いレベルのタンパク質産物を生成した。
実施例４０：細胞内における合成環状ＲＮＡのローリングサークル型翻訳
この実施例は、ＩＲＥＳによりタンパク質産生を開始させる細胞内における合成環状ＲＮＡのローリングサークル型翻訳によるより多いタンパク質産生を実証する。
環状ＲＮＡを、終止要素（終止コドン）を用いるか又は用いずに、ナノルシフェラーゼ遺伝子又はＥＧＦ陰性対照と共にコザック配列又はＩＲＥＳを含むように設計した。細胞をＥＧＦ陰性対照（配列番号２２）；ｎＬＵＣ ＩＲＥＳ ｓｔｏｐ（配列番号２３）：ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、スタガー配列（２Ａ配列）、３ｘ ＦＬＡＧタグ化ｎＬＵＣ配列、スタガー配列（２Ａ配列）及び終止コドン；又はｎＬＵＣ ＩＲＥＳスタガー（配列番号２４）：ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、スタガー配列（２Ａ配列）、３ｘ ＦＬＡＧタグ化ｎＬＵＣ配列及びスタガー配列（２Ａ配列）でトランスフェクトした。図３０に示されるように、両方の環状ＲＮＡが発現産物を生成し、ローリングサークル型翻訳を実証し、ＩＲＥＳを有し終止要素を有さない（例えば、コザック配列を有さない）環状ＲＮＡは、ＩＲＥＳを有さず終止要素を有する（例えば、コザック配列を有する）環状ＲＮＡより、機能的ルシフェラーゼ活性を有するより高いレベルのタンパク質産物を開始及び生成し、これは、ローリングサークル型翻訳を実証している。
この実施例において、環状ＲＮＡの翻訳を細胞内で監視した。具体的には、０．１×１０６個の細胞を１２ウェルプレートの各ウェル上で平板培養した。１日後、３００ｎｇの環状ＲＮＡを、脂質ベースのトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて各ウェル中でトランスフェクトした。２４時間後、１００μｌのＲＩＰＡ緩衝液を加えることにより、細胞を収集した。溶解物中のナノルシフェラーゼ活性を、その製造業者のプロトコル（Ｐｒｏｍｅｇａ）に従ってルシフェラーゼアッセイシステムを用いて測定した。
図３０に示されるように、環状ＲＮＡを、両方の環状ＲＮＡから与えられるローリングサークル型方法により、細胞内でタンパク質に翻訳した。しかしながら、終止要素（終止コドン）を欠いた環状ＲＮＡである。しかしながら、環状ＲＮＡのローリングサークル型翻訳は、ＩＲＥＳでより多いタンパク質産生を開始させ、終止要素コザック翻訳開始を有する環状ＲＮＡと比較して、機能的ルシフェラーゼ活性を有するより多くのタンパク質産物を生成した。
実施例４１：環状ＲＮＡから発現される増加したタンパク質
この実施例は、細胞内における合成環状ＲＮＡ翻訳を実証する。さらに、この実施例は、環状ＲＮＡが、その線状同等物より、適切な分子量のより多い発現産物を生成したことを示す。
線状及び環状ＲＮＡを、終止要素（終止コドン）と共にナノルシフェラーゼ遺伝子を含むように設計した。細胞を、ビヒクル：トランスフェクション試薬のみ；線状ｎＬＵＣ（配列番号２３）：ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、スタガー要素（２Ａ配列）、３ｘ ＦＬＡＧタグ化ｎＬｕｃ配列、スタガー要素（２Ａ配列）及び終止要素（終止コドン）；又は環状ｎＬＵＣ（配列番号２３）：ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、スタガー要素（２Ａ配列）、３ｘ ＦＬＡＧタグ化ｎＬｕｃ配列、スタガー要素（２Ａ配列）及び終止要素（終止コドン）でトランスフェクトした。図３１に示されるように、環状ＲＮＡは、線状ＲＮＡと比較して、適切な分子量を有する、より多いレベルのタンパク質を生成した。
２４時間後、１００μｌのＲＩＰＡ緩衝液を加えることにより、細胞を収集した。５分間にわたる１４００×ｇでの遠心分離後、上清を１０～２０％の勾配のポリアクリルアミド／ＳＤＳゲル上で分析した。
ドライ転写方法を用いてニトロセルロース膜に電気泳動転写した後、ブロットを抗ＦＬＡＧ抗体及び抗マウスＩｇＧペルオキシダーゼと共にインキュベートした。ブロットを、ＥＣＬキットを用いて視覚化し、ウエスタンブロットバンド強度をＩｍａｇｅＪによって測定した。
図３１に示されるように、環状ＲＮＡは、細胞内でタンパク質に翻訳された。特に、環状ＲＮＡは、その線状ＲＮＡ同等物と比較して、適切な分子量を有するより高いレベルのタンパク質を生成した。
実施例４２：合成環状ＲＮＡのローリングサークル型翻訳が細胞内で別個のタンパク質産物を生成した
この実施例は、別個のタンパク質産物が、終止要素（終止コドン）を欠いた、例えば細胞内において、終止要素（終止コドン）の代わりにスタガー要素を有する合成環状ＲＮＡからのローリングサークル型翻訳によって翻訳されたことを実証する。さらに、この実施例は、スタガー要素を有する環状ＲＮＡが、その線状同等物より、適切な分子量を有するより多いタンパク質産物を発現したことを示す。
環状ＲＮＡを、終止要素（終止コドン）の代わりに、スタガー要素と共にナノルシフェラーゼ遺伝子を含むように設計した。細胞をビヒクル：トランスフェクション試薬のみ；線状ｎＬＵＣ（配列番号２４）：ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、スタガー要素（２Ａ配列）、３ｘ ＦＬＡＧタグ化ｎＬｕｃ配列及びスタガー要素（２Ａ配列）；又は環状ｎＬＵＣ（配列番号２４）：ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、スタガー要素（２Ａ配列）、３ｘ ＦＬＡＧタグ化ｎＬｕｃ配列及びスタガー要素（２Ａ配列）でトランスフェクトした。図３２に示されるように、環状ＲＮＡは、線状ＲＮＡと比較して、適切な分子量を有するより高いレベルのタンパク質を生成した。
２４時間後、１００μｌのＲＩＰＡ緩衝液を加えることにより、細胞を収集した。５分間にわたる１４００×ｇでの遠心分離後、上清を１０～２０％の勾配のポリアクリルアミド／ＳＤＳゲル上で分析した。
ドライ転写方法を用いてニトロセルロース膜に電気泳動転写した後、ブロットを抗ＦＬＡＧ抗体及び抗マウスＩｇＧペルオキシダーゼと共にインキュベートした。ブロットを、ＥＣＬキットを用いて視覚化し、ウエスタンブロットバンド強度をＩｍａｇｅＪによって測定した。
図３２に示されるように、環状ＲＮＡ翻訳産物が細胞内で検出された。特に、終止要素（終止コドン）を有さない環状ＲＮＡは、その線状ＲＮＡ同等物より、適切な分子量を有するより高いレベルの別個のタンパク質産物を生成した。
実施例４３：疑似二本鎖、らせん構造を有する環状ＲＮＡの調製
この実施例は、環状ＲＮＡが疑似二本鎖及びらせん構造の両方を有していたことを実証する。
非天然環状ＲＮＡを、疑似二本鎖、らせん構造を採用するように操作した。同様の構造は、固有に長い生体内半減期を有する天然環状ＲＮＡの縮合に関与することが示された（Ｇｒｉｆｆｉｎ ｅｔ ａｌ ２０１４，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２０１４ Ｊｕｌ；８８（１３）：７４０２－１１．ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＶＩ．００４４３－１４，Ｇｕｅｄｊ ｅｔ ａｌ，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．２０１４ Ｄｅｃ；６０（６）：１９０２－１０．ｄｏｉ：１０．１００２／ｈｅｐ．２７３５７）。
この実施例において、環状ＲＮＡを、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、ＯＲＦとしての３ＸＦＬＡＧでタグ化されたＮｌｕｃ及びスタガー配列（ＥＭＣＶ ２Ａ ３ＸＦＬＡＧ Ｎｌｕｃ ２Ａ ｎｏ ｓｔｏｐ）をコードするように設計した、ＲＮＡ二次構造を評価するために、熱力学的ＲＮＡ構造予測ツール（ＲＮＡｆｏｌｄ）を使用した（Ｖｉｅｎｎａ ＲＮＡ）。さらに、ＲＮＡ三次構造を、ＲＮＡモデリングアルゴリズムを用いて分析した。
図３３及び３４に示されるように、環状ＲＮＡは、疑似二本鎖、らせん構造を採用したようにモデル化される。
実施例４４：反復配列と連結された疑似らせん構造を有する環状ＲＮＡの調製
この実施例は、環状ＲＮＡが、反復配列と連結された疑似らせん構造を有するように設計され得ることを実証する。
非天然環状ＲＮＡを、反復配列と連結された疑似らせん構造を採用するように操作した。同様の構造は、固有に長い生体内半減期を有する天然環状ＲＮＡの縮合に関与することが示された（Ｇｒｉｆｆｉｎ ｅｔ ａｌ ２０１４、Ｇｕｅｄｊ ｅｔ ａｌ ２０１４）。
この実施例において、環状ＲＮＡを、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、Ｎｌｕｃ及び反復配列（配列番号２６）を含むスペーサーをコードするように設計した。ＲＮＡ三次構造を評価するためにＲＮＡモデリングアルゴリズムを使用した。
図３５に示されるように、環状ＲＮＡは、疑似らせん構造を採用したようにモデル化される。
実施例４５：環状化ＲＮＡは、環状であり、コンカテマーでない
この実施例は、ＲＮＡｓｅ Ｈによる環状ＲＮＡ分解が、環状ＲＮＡと一致し、コンカテマーＲＮＡと一致しない核酸分解産物を生成したことを実証する。
ＲＮＡは、リガーゼと共にインキュベートされる場合、反応しないか又は分子内若しくは分子間結合を形成することができないかのいずれかであり、これは、それぞれ環状（遊離末端がない）又はコンカテマーＲＮＡを生成する。相補的ＤＮＡプライマー及びＲＮＡｓｅ Ｈ、ＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖を認識する非特異的エンドヌクレアーゼによる各タイプのＲＮＡの処理は、出発ＲＮＡ材料に応じて、特定のサイズの固有の数の分解産物を生成することが予測される。
以下の実施例に示されるように、ライゲートされたＲＮＡは、ＲＮＡｓｅ Ｈ分解によって生成されるＲＮＡの数及びサイズに基づいて環状であり、コンカテマーでないことが示された。
ＥＭＣＶ Ｔ２Ａ ３ＸＦＬＡＧ－Ｎｌｕｃ Ｐ２Ａを含有する環状ＲＮＡ及び線状ＲＮＡを生成した。
ＲＮＡ（１２９９ｎｔ）の環状化状態を試験するために、０．０５ｐｍｏｌｅ／μｌの線状又は環状ＲＮＡを２０分間にわたって３７℃において、１０３７－１０４６ｎｔのＲＮＡ（ＣＡＣＣＧＣＴＣＡＧＧＡＣＡＡＴＣＣＴＴ、配列番号５５）に対して、０．２５Ｕ／μｌのＲＮＡｓｅ Ｈ、ＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖を消化するエンドリボヌクレアーゼ及び０．３ｐｍｏｌｅ／μｌのオリゴマーと共にインキュベートした。インキュベーション後、反応混合物を６％の変性ＰＡＧＥによって分析した。
上述される使用される線状ＲＮＡについて、ＤＮＡプライマーの結合及びＲＮＡｓｅ Ｈによるその後の切断後、２つの切断産物が１０４１ｎｔ及び２５８ｎｔで得られることが予測される。コンカテマーが２５８、１０４１及び１２９９ｎｔの３つの切断産物を生成することが予測される。環状が単一の１２９９ｎｔ切断産物を生成することが予測される。
ＲＮＡｓｅエンドヌクレアーゼと共にインキュベートされた線状ＲＮＡレーン中のバンドの数は、予測されるように１０４１ｎｔ及び２５８ｎｔの２つのバンドを生成した一方、１２９９ｎｔの単一のバンドは、環状ＲＮＡレーンにおいて生成され（図３６を参照されたい）、これは、環状ＲＮＡが実際に環状であり、コンカテマーでなかったことを示す。
実施例４６：大きい環状ＲＮＡの調製
この実施例は、約２０塩基～約６．２Ｋｂの範囲の環状ポリリボヌクレオチドの生成を実証する。
１つ以上の望ましい特性を含むように操作された非天然環状ＲＮＡは、所望の機能に応じたサイズの範囲で生成された。以下の実施例に示されるように、最大で６２００ｎｔの線状ＲＮＡが環状化された。
プラスミドｐＣＤＮＡ３．１／ＣＡＴ（６．２ｋｂ）をここで使用した。プライマーを、規則的な間隔でｐＣＤＮＡ３．１／ＣＡＴにアニールして、５００ｎｔ、１０００ｎｔ、２０００ｎｔ、４０００ｎｔ、５０００ｎｔ及び６２００ｎｔに対応するＤＮＡオリゴヌクレオチドを生成するように設計した。示されるＤＮＡオリゴヌクレオチドのインビトロ転写を行って、対応するサイズの線状ＲＮＡを生成した。環状ＲＮＡを、スプリントＤＮＡを用いて、これらのＲＮＡオリゴヌクレオチドから生成した。
ＲＮＡの環状化効率を測定するために、６つの異なるサイズの線状ＲＮＡ（５００ｎｔ、１０００ｎｔ、２０００ｎｔ、４０００ｎｔ、５０００ｎｔ及び６２００ｎｔ）を生成した。それらを、ＤＮＡスプリント及びＴ４ ＤＮＡリガーゼ２を用いて環状化した。対照として、１つの反応をＴ４ ＲＮＡリガーゼなしで行った。環状化サンプルの半分をＲＮＡｓｅ Ｒで処理して、線状ＲＮＡを除去した。
環状化効率を監視するために、各サンプルを、ｑＰＣＲを用いて分析した。図３７に示されるように、環状ＲＮＡを異なる長さの様々なＤＮＡから生成した。図３８に示されるように、ＲＮＡの環状化を、環状接合部に対して、ＲＮＡｓｅ Ｒ処理及びｑＰＣＲ分析を用いて確認した。この実施例は、様々な長さの環状ＲＮＡ生成を実証する。
実施例４７：タンパク質結合部位を用いて操作される環状ＲＮＡ
この実施例は、タンパク質結合部位を有する環状ＲＮＡの生成を実証する。
この実施例において、１つの環状ＲＮＡは、ＣＶＢ３ ＩＲＥＳ（配列番号５６）及びガウシアルシフェラーゼ（Ｇｌｕｃ）をコードするＯＲＦ（配列番号５７）、続いて少なくとも１つのタンパク質結合部位を含むように設計される。特定の例では、シンドビスウイルス３’ＵＴＲからのＨｕＲ結合配列（配列番号５２）を用いて、環状ＲＮＡ免疫原性に対するタンパク質結合の影響を試験する。ＨｕＲ結合配列は、２つの要素、ＵＲＥ（Ｕリッチ要素；配列番号５０）及びＣＳＥ（保存配列要素；配列番号５１）を含む。ＨｕＲ結合配列を有さない又はＵＲＥを有する環状ＲＮＡが対照として使用される。アナベナ属（Ａｎａｂａｅｎａ）自己触媒イントロン及びエクソン配列の一部をＣＶＢ３ ＩＲＥＳ（配列番号５６）の前に配置する。環状ＲＮＡは、記載されるようにインビトロで生成される。図３９に示されるように、環状ＲＮＡは、ＨｕＲ結合部位を含有するように生成された。
環状ＲＮＡ免疫原性に対するＲＮＡ結合タンパク質の影響を監視するために、細胞を９６ウェルプレートの各ウェル中で平板培養する。１日後、５００ｎｇの環状ＲＮＡを、脂質ベースのトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて各ウェル中にトランスフェクトする。翻訳効率／ＲＮＡ安定性／免疫原性を毎日最大で７２時間監視する。Ｇｌｕｃ活性を監視するために培地を収集する。ＲＮＡレベルを測定するための細胞溶解物を、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって相対的遺伝子発現の測定を可能にするキットを用いて調製する。
製造業者の説明（Ｐｉｅｒｃｅ）に従ってガウシアルシフェラーゼフラッシュアッセイキットを用いて、Ｇｌｕｃ活性を測定することにより、翻訳効率を監視する。
ｑＲＴ－ＰＣＲ分析のために、ｃＤＮＡは、製造業者の説明（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従って細胞溶解物調製キットを用いて生成される。ｑＲＴ－ＰＣＲ分析は、ＰＣＲマスターミックス（Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ ＩＩ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｑＲＴ－ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ）及びＰＣＲサイクラー（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０）を用いて３連で行われる。環状ＲＮＡ安定性をＮｌｕｃに対するプライマーによって測定する。ＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ５、ＯＡＳ、ＯＡＳＬ及びＰＫＲなどの周知の自然免疫調節因子のｍＲＮＡレベルを定量化し、アクチン値に対して正規化する。
実施例４８：調節核酸部位を有する環状ＲＮＡの調製
この実施例は、調節ＲＮＡ結合部位を有する環状ＲＮＡのインビトロ生成を実証する。
異なる細胞型は、特定のＲＮＡ配列を標的にする独自の核酸調節機構を有する。環状ＲＮＡ中のこれらの特定の配列をコードすることは、異なる細胞型における独自の特性を与え得る。以下の実施例に示されるように、環状ＲＮＡは、マイクロＲＮＡ結合部位をコードするように操作された。
この実施例において、環状ＲＮＡは、ＷＴ ＥＭＣＶ ＩＲＥＳをコードする配列、ｍｉｒ６９２マイクロＲＮＡ結合部位（ＧＡＧＧＵＧＣＵＣＡＡＡＧＡＧＡＵ）及びＩＲＥＳ－ＯＲＦに隣接する２つのスペーサー要素を含んでいた。
環状ＲＮＡをインビトロで生成した。転写を駆動するＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモータに加えて、上に列挙される全てのモチーフを含むＤＮＡ鋳型から非修飾線状ＲＮＡをインビトロで転写した。転写されたＲＮＡを、ＲＮＡクリーンアップキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｔ２０５０）を用いて精製し、製造業者の説明に従ってＲＮＡ５’－ホスホヒドロラーゼ（ＲｐｐＨ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０３５６）で処理し、ＲＮＡ精製カラムを用いて再度精製した。ＲｐｐＨで処理されたＲＮＡを、スプリントＤＮＡ（ＧＧＣＴＡＴＴＣＣＣＡＡＴＡＧＣＣＧＴＴ）及びＴ４ ＲＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０２３９）を用いて環状化した。環状ＲＮＡを尿素－ＰＡＧＥで精製し（図４０）、緩衝液（０．５Ｍの酢酸ナトリウム、０．１％のＳＤＳ、１ｍＭのＥＤＴＡ）で溶離させ、エタノールで沈殿させ、ＲＮａｓｅフリー水中で再懸濁させた。
図４０に示されるように、環状ＲＮＡを、ｍｉＲＮＡ結合部位を用いて生成した。
実施例４９：環状ＲＮＡの自己スプライシング
この実施例は、自己スプライシングによって環状ＲＮＡを生成する能力を実証する。
この実施例では、環状ＲＮＡは、ＣＶＢ３ ＩＲＥＳ、ガウシアルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）をコードするＯＲＦ及びＩＲＥＳ－ＯＲＦに隣接する２つのスペーサー要素を含んでいた。
環状ＲＮＡをインビトロで生成した。上に列挙される全てのモチーフを含むＤＮＡ鋳型から非修飾線状ＲＮＡをインビトロで転写した。インビトロ転写反応は、１μｇの鋳型ＤＮＡ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモータ、１０×Ｔ７反応緩衝液、７．５ｍＭのＡＴＰ、７．５ｍＭのＣＴＰ、７．５ｍＭのＧＴＰ、７．５ｍＭのＵＴＰ、１０ｍＭのＤＴＴ、４０ＵのＲＮａｓｅ阻害剤及びＴ７酵素を含んでいた。転写を３７℃で４時間行った。転写されたＲＮＡは、３７℃で１５分間１ＵのＤＮａｓｅ Ｉで処理されたＤＮａｓｅであった。自己スプライシングによる環状化に有利に作用するように、さらなるＧＴＰを２ｍＭの最終濃度に加え、５５℃で１５分間インキュベートした。次に、ＲＮＡをカラム精製し、ＵＲＥＡ－ＰＡＧＥによって視覚化した。
図４１は、自己スプライシングによって生成された環状ＲＮＡを示す。
実施例５０：エンクリプトゲンを含むスプライシング要素を有する環状ＲＮＡ
この実施例は、環状ＲＮＡが、低下した免疫原性を有するように操作されることを実証する。
この実施例では、環状ＲＮＡは、ＣＶＢ３ ＩＲＥＳ、ガウシアルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）をコードするＯＲＦ及びＩＲＥＳ－ＯＲＦに隣接する２つのスペーサー要素を含んでおり、これらの２つのスペーサー要素は、アナベナ属（Ａｎａｂａｅｎａ）自己触媒イントロン及びエクソン配列（配列番号５９）の一部であるスプライシング要素を含む。
環状ＲＮＡは、インビトロで生成される。
この実施例において、細胞を１２ウェルプレートの各ウェル中で平板培養することにより、自然免疫応答遺伝子のレベルを細胞内で監視する。１日後、１μｇの線状又は環状ＲＮＡは、脂質ベースのトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて各ウェル中にトランスフェクトされる。トランスフェクションの２４時間後、全ＲＮＡは、フェノール系抽出試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて細胞から単離される。全ＲＮＡ（５００ｎｇ）を逆転写に供して、ｃＤＮＡを生成する。ｑＲＴ－ＰＣＲ分析は、色素ベースの定量的ＰＣＲミックス（ＢｉｏＲａｄ）を用いて行われる。
スプライシング要素を含む環状ＲＮＡでトランスフェクトされたＢＪ細胞からの免疫関連遺伝子のｑＲＴ－ＰＣＲレベルは、線状ＲＮＡトランスフェクト細胞と比較して、ＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ５、ＰＫＲ及びＩＦＮ－βの減少を示すことが予測される。したがって、レシピエント細胞内における免疫原性関連遺伝子の誘導は、線状ＲＮＡトランスフェクト細胞と比較して、環状ＲＮＡトランスフェクト細胞内で減少されることが予測される。
実施例５１：細胞分裂中の環状ＲＮＡの持続性
この実施例は、細胞分裂中の環状ポリリボヌクレオチドの持続性を実証する。１つ以上の望ましい特性を含むように操作された非天然環状ＲＮＡは、分解されずに細胞分裂を通して細胞内で持続し得る。以下の実施例に示されるように、ガウシアルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）を発現する環状ＲＮＡをＨｅＬａ細胞内で７２時間にわたって監視した。
この実施例において、１３０７ｎｔの環状ＲＮＡは、ＣＶＢ３ ＩＲＥＳ、ガウシアルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）をコードするＯＲＦ及びＩＲＥＳ－ＯＲＦに隣接する２つのスペーサー要素を含んでいた。
細胞分裂にわたる環状ＲＮＡの持続性をＨｅＬａ細胞内で監視した。９６ウェルプレート中の５０００個の細胞／ウェルは、環状ＲＮＡでトランスフェクトされた懸濁液であった。Ｂｒｉｇｈｔ細胞イメージングをＡｖｏｓ ｉｍａｇｅｒ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）において行い、細胞計数を、０時間、２４時間、４８時間、７２時間及び９６時間の時点で発光細胞生存アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて行った。ガウシアルシフェラーゼ酵素活性をタンパク質発現の指標として毎日監視し、ｇＬｕｃ発現を、ガウシアルシフェラーゼ活性アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて、２４時間ごとにウェルから除去された上清中で毎日監視した。５０μｌの１Ｘ Ｇｌｕｃ基質を５μｌの血漿に加えて、Ｇｌｕｃルシフェラーゼ活性アッセイを行った。プレートを、発光測定装置（Ｐｒｏｍｅｇａ）において混合した直後に読み取った。
環状ＲＮＡからのタンパク質の発現は、分裂細胞内で線状ＲＮＡより高いレベルで検出された（図４２）。環状ＲＮＡを有する細胞は、測定される全ての時点において、線状ＲＮＡと比較してより高い細胞分裂速度を有していた。この実施例は、その線状ＲＮＡ同等物より、細胞分裂中の環状ＲＮＡの増加した検出を実証する。
実施例５２：ローリングサークル型翻訳は、複数の発現配列を生成した
この実施例は、単一の構築物から複数のタンパク質を発現する環状ＲＮＡの能力を実証する。さらに、この実施例は、複数のＯＲＦをコードする環状ＲＮＡのローリングサークル型翻訳を実証する。この実施例は、単一の構築物からの２つのタンパク質の発現をさらに実証する。
１つの環状ＲＮＡ（ｍｔＥＭＣＶ Ｔ２Ａ ３ＸＦＬＡＧ－ＧＦＰ Ｆ２Ａ ３ＸＦＬＡＧ－Ｎｌｕｃ Ｐ２Ａ ＩＳスペーサー）を、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ（配列番号５８）及び３ＸＦＬＡＧタグを有するＧＦＰをコードするＯＲＦ及び３ＸＦＬＡＧタグを有するナノルシフェラーゼ（Ｎｌｕｃ）をコードするＯＲＦを含むようにローリングサークル型翻訳のために設計した。スタガー要素（２Ａ）は、ＧＦＰ及びＮｌｕｃ ＯＲＦに隣接していた。別の環状ＲＮＡを同様に設計したが、Ｎｌｕｃ ＯＲＦとスペーサーとの間に三重終止コドンを含んでいた。アナベナ属（Ａｎａｂａｅｎａ）自己触媒イントロン及びエクソン配列の一部がＥＭＣＶ ＩＲＥＳの前に含まれていた。環状ＲＮＡを記載されるようにインビトロで生成した。
環状ＲＮＡからのタンパク質の発現をインビトロ又は細胞内で監視した。インビトロ分析の場合、環状ＲＮＡを３０℃においてウサギ網状赤血球溶解物（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｆｉｔｃｈｂｕｒｇ，ＷＩ，ＵＳＡ）中で３時間インキュベートした。反応混合物の最終組成物は、７０％のウサギ網状赤血球溶解物、２０μＭの完全アミノ酸及び０．８Ｕ／μＬのＲＮａｓｅ阻害剤（日本大阪の東洋紡（Ｔｏｙｏｂｏ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ））を含んでいた。
インキュベーション後、ヘモグロビンタンパク質を、酢酸（０．３２μｌ）及び水（３００μｌ）を反応混合物（１６μｌ）に加え、１５℃で１０分間にわたって２０，８１７×ｇで遠心分離することによって除去した。上清を除去し、ペレットを２×ＳＤＳサンプル緩衝液に溶解させ、１５分間にわたって７０℃でインキュベートした。５分間にわたる１４００×ｇでの遠心分離後、上清を１０～２０％の勾配のポリアクリルアミド／ＳＤＳゲル上で分析した。
細胞内での分析のため、細胞内での環状ＲＮＡの翻訳効率を監視するために細胞を１２ウェルプレートの各ウェル中で平板培養した。１日後、５００ｎｇの環状ＲＮＡを、脂質ベースのトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて各ウェル中でトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、２００μｌのＲＩＰＡ緩衝液を各ウェルに加えることにより、細胞を収集した。次に、１０μｇの細胞溶解物タンパク質を１０～２０％の勾配のポリアクリルアミド／ＳＤＳゲル上で分析した。
ドライ転写方法を用いて、網状赤血球溶解物及び細胞からのサンプルをニトロセルロース膜に電気泳動転写した後、ブロットを抗ＦＬＡＧ抗体及び抗マウスＩｇＧペルオキシダーゼと共にインキュベートした。ローディングコントロールとして、抗βチューブリン抗体を使用した。ブロットを、増強化学発光（ＥＣＬ）キットを用いて視覚化した。ウエスタンブロットバンド強度をＩｍａｇｅＪによって測定した。
図４３に示されるように、ＧＦＰ及びｎＬｕｃをコードする環状ＲＮＡは、２つのタンパク質産物を生成した。三重終止を有さない環状ＲＮＡからの翻訳は、三重終止コドンを有する環状ＲＮＡより多い両方のタンパク質産物を生成した。最後に、三重終止を有する及び有さない両方の環状ＲＮＡは、それぞれ１／３．２４及び１／３．３７の比率でタンパク質を発現した。
実施例５３：環状ＲＮＡがインビボで投与され、より長い半減期／増加した安定性を示した
この実施例は、環状ＲＮＡを送達する能力及びインビボの線状ＲＮＡと比較して、環状ＲＮＡの増加した安定性を実証する。
この実施例では、環状ＲＮＡを、ナノルシフェラーゼ（Ｎｌｕｃ）をコードするＯＲＦ及びスタガー配列（ＥＭＣＶ ２Ａ ３ＸＦＬＡＧ Ｎｌｕｃ ２Ａ ｎｏ ｓｔｏｐ及びＥＭＣＶ ２Ａ ３ＸＦＬＡＧ Ｎｌｕｃ ２Ａ ｓｔｏｐ）と共にＥＭＣＶ ＩＲＥＳを含むように設計した。環状ＲＮＡをインビトロで生成した。
Ｂａｌｂ／ｃマウスに環状ＲＮＡをＮｌｕｃ ＯＲＦ又は対照としての線状ＲＮＡと共に静脈内（ＩＶ）尾静脈投与によって注入した。動物に、製造業者の説明に従い、脂質ベースのトランスフェクション試薬（Ｍｉｒｕｓ）中で製剤化された単回用量の５μｇのＲＮＡを投与した。
マウスを殺処分し、肝臓を投与の３、４及び７日後の時点で採取した（ｎ＝２匹のマウス／時点）。肝臓を採取し、ＲＮＡ安定化試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で貯蔵した。組織を、マイクロチューブホモジナイザ（Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてＲＩＰＡ緩衝液中で均質化し、ＲＮＡを、ｃＤＮＡ合成のためにフェノール系ＲＮＡ抽出試薬を用いて抽出した。ｑＰＣＲを用いて、肝臓中の線状及び環状ＲＮＡの両方の存在を測定した。
組織におけるＲＮＡ検出をｑＰＣＲによって行った。線状及び環状ＲＮＡを検出するために、Ｎｌｕｃ ＯＲＦを増幅するプライマーを使用した。（Ｆ：ＡＧＡＴＴＴＣＧＴＴＧＧＧＧＡＣＴＧＧＣ、Ｒ：ＣＡＣＣＧＣＴＣＡＧＧＡＣＡＡＴＣＣＴＴ）。環状ＲＮＡのみを検出するために、５’－３’接合物を増幅するプライマーは、線状ＲＮＡ構築物ではなく環状ＲＮＡ構築物の検出を可能にした（Ｆ：ＣＴＧＧＡＧＡＣＧＴＧＧＡＧＧＡＧＡＡＣ、Ｒ：ＣＣＡＡＡＡＧＡＣＧＧＣＡＡＴＡＴＧＧＴ）。
環状ＲＮＡは、注入の３、４－及び７日後の時点でマウスの肝臓中において線状ＲＮＡより高いレベルで検出された（図４４）。したがって、環状ＲＮＡが投与され、投与後少なくとも７日間においてインビボで検出可能であった。
実施例５４：環状ＲＮＡのインビボ発現、半減期及び非免疫原性
この実施例は、インビボで環状ＲＮＡから発現を駆動する能力を実証する。それは、線状ＲＮＡと比較して、環状ＲＮＡの増加した半減期を実証する。最後に、それは、環状ＲＮＡがインビボで非免疫原性であるように操作されたことを実証する。
この実施例では、環状ＲＮＡは、ＣＶＢ３ ＩＲＥＳ、ガウシアルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）をコードするＯＲＦ及びＩＲＥＳ－ＯＲＦに隣接する２つのスペーサー要素を含んでいた。
環状ＲＮＡをインビトロで生成した。上に列挙される全てのモチーフ並びに転写を駆動するＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモータを含むＤＮＡ鋳型から非修飾線状ＲＮＡをインビトロで転写した。転写されたＲＮＡを、ＲＮＡクリーンアップキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｔ２０５０）を用いて精製し、製造業者の説明に従ってＲＮＡ５’－ホスホヒドロラーゼ（ＲｐｐＨ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０３５６）で処理し、ＲＮＡ精製カラムを用いて再度精製した。ＲｐｐＨで処理されたＲＮＡを、スプリントＤＮＡ（ＧＴＣＡＡＣＧＧＡＴＴＴＴＣＣＣＡＡＧＴＣＣＧＴＡＧＣＧＴＣＴＣ）及びＴ４ ＲＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０２３９）を用いて環状化した。環状ＲＮＡを尿素－ＰＡＧＥで精製し、緩衝液（０．５Ｍの酢酸ナトリウム、０．１％のＳＤＳ、１ｍＭのＥＤＴＡ）で溶離させ、エタノールで沈殿させ、ＲＮａｓｅフリー水中で再懸濁させた。
マウスに、ガウシアルシフェラーゼＯＲＦ又は対照としての線状ＲＮＡと共に２．５μｇの環状ＲＮＡの単回の尾静脈注入投与を与え、これらの両方は、担体として脂質ベースのトランスフェクション試薬（Ｍｉｒｕｓ）中で製剤化された。
投与の１、２、７、１１、１６及び２３日後の時点で血液サンプル（５０μｌ）を各マウスの尾静脈からＥＤＴＡチューブ中に採取した。血漿を４℃において１３００ｇで２５分間にわたって遠心分離によって単離し、ガウシアルシフェラーゼ、分泌酵素の活性を、ガウシアルシフェラーゼ活性アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて試験した。５０μｌの１Ｘ Ｇｌｕｃ基質を５μｌの血漿に加えて、Ｇｌｕｃルシフェラーゼ活性アッセイを行った。プレートを、発光測定装置（Ｐｒｏｍｅｇａ）において混合した直後に読み取った。
ガウシアルシフェラーゼ活性は、環状ＲＮＡの投与の１、２、７、１１、１６及び２３日後の時点で血漿中において検出された（図４５Ａ～Ｂ）。
対照的に、ガウシアルシフェラーゼ活性は、修飾線状ＲＮＡの投与の１及び２日後の時点でのみ血漿中で検出された。線状ＲＮＡ由来タンパク質からの酵素活性は、６日又はそれを超える時点でバックグラウンドレベルを超えて検出されなかった（図４５Ａ～Ｂ）。
１６日目に肝臓を３匹の動物から切除し、全ＲＮＡを、フェノール系抽出試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて細胞から単離した。全ＲＮＡ（５００ｎｇ）を逆転写に供して、ｃＤＮＡを生成した。ｑＲＴ－ＰＣＲ分析を、色素ベースの定量的ＰＣＲミックス（ＢｉｏＲａｄ）を用いて行った。
図４６に示されるように、線状ＲＮＡではなく環状ＲＮＡのｑＲＴ－ＰＣＲレベルは、１６日目に肝臓及び脾臓の両方において検出された。図４７に示されるように、線状ＲＮＡでトランスフェクトされた肝臓からの免疫関連遺伝子は、ＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ５、ＩＦＮ－Ｂ及びＯＡＳの増加した発現を示した一方、環状ＲＮＡでトランスフェクトされた肝臓は、１６日目に、担体でトランスフェクトされた動物と比較して、これらのマーカーＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ５、ＰＫＲ及びＩＦＮ－βの増加した発現を示さなかった。したがって、レシピエント細胞内における免疫原性関連遺伝子の誘導は、トランスフェクトされた肝臓からの環状ＲＮＡ中に存在しなかった。
この実施例は、環状ＲＮＡが注入の複数日数後に血漿中のタンパク質活性のレベルを有して、長期間にわたってインビボでタンパク質を発現したことを実証する。マウス血漿中のガウシアルシフェラーゼの半減期が約２０分間である場合（Ｔａｎｎｏｕｓ，Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．，２００９，４（４）：５８２－５９１を参照されたい）、同様の活性レベルは、環状ＲＮＡからの連続した発現を示す。さらに、環状ＲＮＡは、免疫関連遺伝子を誘導せずに、その修飾線状ＲＮＡ同等物より長い発現プロファイルを示した。
配列表
配列番号１（開始コドン）
ＡＵＧ
配列番号２（ＧＦＰ）
ＥＧＦＰ：
Figure 2022527763000011
配列番号３（スタガー要素）
Ｐ２Ａ：ｇｃｔａｃｔａａｃｔｔｃａｇｃｃｔｇｃｔｇａａｇｃａｇｇｃｔｇｇｃｇａｃｇｔｇｇａｇｇａｇａａｃｃｃｔｇｇａｃｃｔ
Ｔ２Ａ：ｇａｇｇｇｃａｇｇｇｇａａｇｔｃｔａｃｔａａｃａｔｇｃｇｇｇｇａｃｇｔｇｇａｇｇａａａａｔｃｃｃｇｇｃｃｃａ
Ｅ２Ａ：ｃａｇｔｇｔａｃｔａａｔｔａｔｇｃｔｃｔｃｔｔｇａａａｔｔｇｇｃｔｇｇａｇａｔｇｔｔｇａｇａｇｃａａｃｃｃａｇｇｔｃｃｃ
その他：Ｆ２Ａ、ＢｍＣＰＶ２Ａ、ＢｍＩＦＶ２Ａ
配列番号４ ＺＫＳＣＡＮイントロン
Figure 2022527763000012
配列番号５（ＩＲＥＳ）
ＩＲＥＳ（ＥＭＣＶ）：
Figure 2022527763000013
配列番号６（ａｄｄｇｅｎｅ ｐ３．１ラッカーゼ）
ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ラッカーゼ２ ＭＣＳエクソンベクター配列６９２６ｂｐ
Figure 2022527763000014
Figure 2022527763000015
Figure 2022527763000016
Figure 2022527763000017
配列番号８（ＲＦＰ）
ｍＣｈｅｒｒｙ：
Figure 2022527763000018
配列番号９（リボスイッチ）
アプタザイム（テオフィリン依存性、Ａｕｓｌａｎｄｅｒ ２０１０ Ｍｏｌ Ｂｉｏｓｙｓを参照されたい）：
Figure 2022527763000019
配列番号１０（ルシフェラーゼ）
ｎＬｕｃ：
Figure 2022527763000020
配列番号１１
コザック３ＸＦＬＡＧ－ＥＧＦ ｎｏｓｔｏｐ（２６４ｂｐ）
Figure 2022527763000021
 ５～１３：コザック配列
１４～２６２：３ＸＦＬＡＧ－ＥＧＦ
配列番号１２
コザック３ＸＦＬＡＧ－ＥＧＦ ｓｔｏｐ（２７３ｂｐ）
Figure 2022527763000022
 ５～１３：コザック配列
１４～２６２：３ＸＦＬＡＧ－ＥＧＦ
２６３～２７１：三重終止コドン
配列番号１３
コザック３ＸＦＬＡＧ－ＥＧＦ Ｐ２Ａ ｎｏｓｔｏｐ（３３０ｂｐ）
Figure 2022527763000023
 ５～１３：コザック配列
１４～２６２：３ＸＦＬＡＧ－ＥＧＦ
２６３～３２８：Ｐ２Ａ
配列番号１４
構築物コザック３ＸＦＬＡＧ－ＥＧＦ ｎｏｓｔｏｐ（２６４ｂｐ）についてのスプリント
ＧＧＴＧＧＣＴＣＣＣＡＧＧＣＧＣＡＧＴＴ
配列番号１５
構築物コザック３ＸＦＬＡＧ－ＥＧＦ ｓｔｏｐ（２７３ｂｐ）についてのスプリント
ＧＧＴＧＧＣＴＣＣＣＡＧＴＴＡＣＴＡＴＣ
配列番号１６
構築物コザック３ＸＦＬＡＧ－ＥＧＦ Ｐ２Ａ ｎｏｓｔｏｐ（３３０ｂｐ）についてのスプリント
ＧＧＴＧＧＣＴＣＣＣＡＧＡＧＧＴＣＣＡＧ
配列番号１７
コザック１ＸＦＬＡＧ－ＥＧＦ Ｔ２Ａ １ＸＦＬＡＧ－Ｎｌｕｃ Ｐ２Ａ ｎｏｓｔｏｐ（８７３ｂｐ）
Figure 2022527763000024
 ５～１３：コザック配列
１４～２０２：１ＸＦＬＡＧ－ＥＧＦ
２０３～２６５：Ｔ２Ａ
２６６～８０５：１ＸＦＬＡＧ－Ｎｌｕｃ
８０６～８７１：Ｐ２Ａ
配列番号１８
コザック１ＸＦＬＡＧ－ＥＧＦ ｓｔｏｐ １ＸＦＬＡＧ－Ｎｌｕｃ ｓｔｏｐ（７６２ｂｐ）
Figure 2022527763000025
 ５～１３：コザック配列
１４～２０２：１ＸＦＬＡＧ－ＥＧＦ
２０３～２１１：三重終止コドン
２１２～７５１：１ＸＦＬＡＧ－Ｎｌｕｃ
７５２～７６０：三重終止コドン
配列番号１９
コザック３ＸＦＬＡＧ－ＥＧＦ Ｐ２Ａ ｎｏｓｔｏｐ（３３０ｂｐ）
Figure 2022527763000026
 ５～１３：コザック配列
１４～２６２：３ＸＦＬＡＧ－ＥＧＦ
２６３～３２８：Ｐ２Ａ
配列番号２０
コザック３ＸＦＬＡＧ－ＥＧＦ ｎｏｓｔｏｐ（２６４ｂｐ）
Figure 2022527763000027
 ５～１３：コザック配列
１４～２６２：３ＸＦＬＡＧ－ＥＧＦ
配列番号２１
コザック３ＸＦＬＡＧ－ＥＧＦ ｓｔｏｐ（２７３ｂｐ）
Figure 2022527763000028
 ５～１３：コザック配列
１４～２６２：３ＸＦＬＡＧ－ＥＧＦ
２６３～２７１：三重終止コドン
配列番号２２
ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ Ｔ２Ａ ３ＸＦＬＡＧ－ＥＧＦ Ｐ２Ａ ｎｏｓｔｏｐ（９５４ｂｐ）
Figure 2022527763000029
 ５～５７４：ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ
５７５～６３７：Ｔ２Ａ
６３８～８８６：３ＸＦＡＬＧ－ＥＧＦ
８８７～９５２：Ｐ２Ａ
配列番号２３
ＥＭＣＶ Ｔ２Ａ ３ＸＦＬＡＧ Ｎｌｕｃ Ｐ２Ａ ｓｔｏｐ（１３１４ｎｔ）
Figure 2022527763000030
 ５～５７４：ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ
５７５～６３７：Ｔ２Ａ
６３８～１２３７：３ＸＦＬＡＧ Ｎｌｕｃ
１２３８～１３０３：Ｐ２Ａ
１３０４～１３１２：三重終止コドン
配列番号２４
ＥＭＣＶ Ｔ２Ａ ３ＸＦＬＡＧ Ｎｌｕｃ Ｐ２Ａ ｎｏｓｔｏｐ（１３０５ｎｔ）
Figure 2022527763000031
 ５～５７４：ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ
５７５～６３７：Ｔ２Ａ
６３８～１２３７：３ＸＦＬＡＧ Ｎｌｕｃ
１２３８～１３０３：Ｐ２Ａ
配列番号２５
コザック１ＸＦＬＡＧ－ＥＧＦ Ｔ２Ａ １ＸＦＬＡＧ－ＮＬｕｃ Ｐ２Ａ ｓｔｏｐ（８８２ｂｐ）
Figure 2022527763000032
 ５～１３：コザック配列
１４～２０２：１ＸＦＬＡＧ－ＥＧＦ
２６６～８０５：１ＸＦＬＡＧ－ＮＬｕｃ
８０６～８７１：Ｐ２Ａ
８７２～８８０：三重終止コドン
配列番号２６
例示的な反復スペーサー配列
Figure 2022527763000033
配列番号２７
ｐＣＤＮＡ３．１／ＣＡＴから鋳型を増幅するために実施例４３に使用されるフォワードプライマー
ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＣＣＣＡＡＧＣＴＧＧＣ
配列番号２８
ｐＣＤＮＡ３．１／ＣＡＴから０．５ｋｂ鋳型を増幅するために実施例４３に使用されるリバースプライマー
Figure 2022527763000034
配列番号２９
ｐＣＤＮＡ３．１／ＣＡＴから１ｋｂ鋳型を増幅するために実施例４３に使用されるリバースプライマー
Figure 2022527763000035
配列番号３０
ｐＣＤＮＡ３．１／ＣＡＴから２ｋｂ鋳型を増幅するために実施例４３に使用されるリバースプライマー
Figure 2022527763000036
配列番号３１
ｐＣＤＮＡ３．１／ＣＡＴから４ｋｂ鋳型を増幅するために実施例４３に使用されるリバースプライマー
Figure 2022527763000037
配列番号３２
ｐＣＤＮＡ３．１／ＣＡＴから５ｋｂ鋳型を増幅するために実施例４３に使用されるリバースプライマー
Figure 2022527763000038
配列番号３３
ｐＣＤＮＡ３．１／ＣＡＴから６．２ｋｂ鋳型を増幅するために実施例４３に使用されるリバースプライマー
Figure 2022527763000039
配列番号３４
ｐＣＤＮＡ３．１／ＣＡＴから線状転写産物を検出するために実施例４３に使用されるフォワードｑＰＣＲプライマー
ＡＴＴＣＴＴＧＣＣＣＧＣＣＴＧＡＴＧＡＡ
配列番号３５
ｐＣＤＮＡ３．１／ＣＡＴから線状転写産物を検出するために実施例４３に使用されるリバースｑＰＣＲプライマー
ＴＴＧＣＴＣＡＴＧＧＡＡＡＡＣＧＧＴＧＴ
配列番号３６
ｐＣＤＮＡ３．１／ＣＡＴから環状転写産物を検出するために実施例４３に使用されるフォワードｑＰＣＲプライマー
ＴＧＡＴＣＣＴＧＣＡＣＴＡＴＧＧＣＡＣＡ
配列番号３７
ｐＣＤＮＡ３．１／ＣＡＴから環状転写産物を検出するために実施例４３に使用されるリバースｑＰＣＲプライマー
ＣＴＧＧＡＣＴＡＧＴＧＧＡＴＣＣＧＡＧＣ
配列番号３８
ＡＣＴＩＮを検出するために実施例４４に使用されるフォワードプライマー配列
ＧＡＣＧＡＧＧＣＣＣＡＧＡＧＣＡＡＧＡＧＡＧＧ
配列番号３９
ＡＣＴＩＮを検出するために実施例４４に使用されるリバースプライマー配列
ＧＧＴＧＴＴＧＡＡＧＧＴＣＴＣＡＡＡＣＡＴＧ
配列番号４０
ＲＩＧ－Ｉを検出するために実施例４４に使用されるフォワードプライマー配列
ＴＧＴＧＧＧＣＡＡＴＧＴＣＡＴＣＡＡＡＡ
配列番号４２
ＲＩＧ－Ｉを検出するために実施例４４に使用されるリバースプライマー配列
ＧＡＡＧＣＡＣＴＴＧＣＴＡＣＣＴＣＴＴＧＣ
配列番号４２
ＭＤＡ５を検出するために実施例４４に使用されるフォワードプライマー配列
ＧＧＣＡＣＣＡＴＧＧＧＡＡＧＴＧＡＴＴ
配列番号４３
ＭＤＡ５を検出するために実施例４４に使用されるリバースプライマー配列
ＡＴＴＴＧＧＴＡＡＧＧＣＣＴＧＡＧＣＴＧ
配列番号４４
ＰＫＲを検出するために実施例４４に使用されるフォワードプライマー配列
ＴＣＧＣＴＧＧＴＡＴＣＡＣＴＣＧＴＣＴＧ
配列番号４５
ＰＫＲを検出するために実施例４４に使用されるリバースプライマー配列
ＧＡＴＴＣＴＧＡＡＧＡＣＣＧＣＣＡＧＡＧ
配列番号４６
ＩＦＮ－βを検出するために実施例４４に使用されるフォワードプライマー配列
ＣＴＣＴＣＣＴＧＴＴＧＴＧＣＴＴＣＴＣＣ
配列番号４７
ＩＦＮ－βを検出するために実施例４４に使用されるリバースプライマー配列
ＧＴＣＡＡＡＧＴＴＣＡＴＣＣＴＧＴＣＣＴＴＧ。
配列番号４８
ＥＭＣＶ Ｔ２Ａ ３ＸＦＬＡＧ－ＧＦＰ Ｆ２Ａ ３ＸＦＡＬＧ－Ｎｌｕｃ Ｐ２Ａ ＩＳ
Figure 2022527763000040
Figure 2022527763000041
配列番号４９
ＥＭＣＶ Ｔ２Ａ ３ＸＦＬＡＧ－ＧＦＰ Ｆ２Ａ ３ＸＦＡＬＧ－Ｎｌｕｃ Ｐ２Ａ ＩＳ
Figure 2022527763000042
Figure 2022527763000043
Figure 2022527763000044
配列番号５０
ＵＲＥ
ＵＣＡＵＡＡＵＣＡＡＵＵＵＡＵＵＡＵＵＵＵＣＵＵＵＵＡＵＵＵＵＡＵＵＣＡＣＡＵＡＡＵＵＵＵＧＵＵＵＵＵ
配列番号５１
ＣＳＥ
ＡＵＵＵＵＧＵＵＵＵＵＡＡＣＡＵＵＵＣ
配列番号５２
ＵＲＥ／ＣＳＥ
Figure 2022527763000045
配列番号５３
ＣＶＢ３－ＧＬｕｃ－ＳＴＯＰ－ＵＲＥ
Figure 2022527763000046
Figure 2022527763000047
配列番号５４
ＣＶＢ３－ＧＬｕｃ－ＳＴＯＰ－ＵＲＥ／ＣＳＥ
Figure 2022527763000048
Figure 2022527763000049
配列番号５５
実施例４２に使用される相補的プライマー
ＣＡＣＣＧＣＴＣＡＧＧＡＣＡＡＴＣＣＴＴ
配列番号５６
ＣＶＢ３ ＩＲＥＳ
Figure 2022527763000050
配列番号５７
Ｇｌｕｃ
Figure 2022527763000051
配列番号５８
終止突然変異を有するＥＭＣＶ ＩＲＥＳ
Figure 2022527763000052
配列番号５９
スペーサー１
Figure 2022527763000053
 スペーサー２
ＡＡＡＡＡＡＣＡＡＡＡＡＡＣＡＡＡＡＣＧＧＣＵＡＵＵＡＵＧＣＧＵＵＡＣＣＧＧＣＧＡＧＡＣＧＣＵＡＣＧＧＡＣＵＵ
配列番号６０
Figure 2022527763000054
ＷＴ ＥＭＣＶ Ｇｌｕｃ ＩＳ
Figure 2022527763000055
５’スペーサー
Figure 2022527763000056
３’スペーサー
ＡＡＡＡＡＡＣＡＡＡＡＡＡＣＡＡＡＡＣＧＧＣＴＡＴＴ
配列番号１（第１の部分：５’スペーサー＋ＷＴ ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ＋３８ｎｔのＯＲＦ）
Figure 2022527763000057
配列番号２（第２の部分：ＯＲＦ＋３’スペーサー）
Figure 2022527763000058
第１の部分を増幅するフォワードプライマー
Figure 2022527763000059
第１の部分を増幅するリバースプライマー
ｍＡｍＣＡＧＣＧＡＴＧＣＡＧＡＴＣＡＧＧＧＣ
第２の部分を増幅するフォワードプライマー
ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＣＣＧＡＧＧＣＣＡＡＧＣＣＣＡＣＣＧ
第２の部分を増幅するリバースプライマー
ｍＡｍＡＴＡＧＣＣＧＴＴＴＴＧＴＴＴＴＴＴＧＴＴＴＴＴＴＴＴＡＧＴＣＡＣＣＡＣＣＧＧＣＣＣＣＣＴ
グロビンＧＬｕｃ
Figure 2022527763000060
ヒトグロビン５’ＵＴＲ
ＡＣＴＣＴＴＣＴＧＧＴＣＣＣＣＡＣＡＧＡＣＴＣＡＧＡＧＡＧＡＡＣＣＣＡＣＣ
ヒトグロビン３’ＵＴＲ
Figure 2022527763000061
グロビンＧＬｕｃフォワードプライマー
ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＣＴＣＴＴＣＴＧＧＴＣＣＣＣＡＣＡＧＡＣＴＣＡＧ
グロビンＧＬｕｃリバースプライマー
ＴＧＣＴＧＣＣＣＡＣＴＣＡＧＡＣＴＴＴＡＴＴＣ

Claims (17)

  1. 対象における環状ポリリボヌクレオチドの免疫原性を減少させる方法であって、
    ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドを提供する工程であって、前記ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド及び少なくとも約５～１０００連続非修飾ヌクレオチドを含む第１の部分を含む、工程と；
    前記ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドを、前記対象に投与する工程と；
    前記対象の細胞又は組織における対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチドと比較して、前記ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドに対して減少した免疫原性を得る工程とを含む方法。
  2. 前記第１の部分は、少なくとも約５、１０、２０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、又は１０００連続非修飾ヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記第１の部分は、５’－メチルシチジン又はプソイドウリジンを欠いている、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記環状ポリリボヌクレオチドは、翻訳能を有する、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、
    （ａ）対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチドより、少なくとも約０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．５、１．６、１．８、２、２．２、２．５、２．８、３倍高い発現を有し；
    （ｂ）対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチドより、少なくとも約１．１、１．２、１．３、１．５、１．６、１．８、２、２．２、２．５、２．８、３、３．２、３．３、３．５、３．８、４．０、４．２、４．５、４．８、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、若しくは１０．０倍長い半減期を有し；
    （ｃ）対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチドより長い半減期を有し；又は
    （ｄ）ＲＩＧ－Ｉ、ＴＬＲ－３、ＴＬＲ－７、ＴＬＲ－８、ＭＤＡ－５、ＬＧＰ－２、ＯＡＳ、ＯＡＳＬ、ＰＫＲ、及びＩＦＮ－βのうちの少なくとも１つの発現若しくはシグナル伝達若しくは活性化によって評価した際に、対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチドより、少なくとも約１．１、１．２、１．３、１．５、１．６、１．８、２、２．２、２．５、２．８、３、３．２、３．３、３．５、３．８、４．０、４．２、４．５、４．８、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、若しくは１０．０倍低い免疫原性を有する、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記少なくとも１つの修飾ヌクレオチドは、
    （ａ）Ｎ（６）メチルアデノシン（ｍ６Ａ）、５’－メチルシチジン、及びプソイドウリジン；
    （ｂ）２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－Ｏ－ＭＯＥ）、２’－Ｏ－アミノプロピル、２’－デオキシ、Ｔ－デオキシ－２’－フルオロ、２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＯＥ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノプロピル（２’－Ｏ－ＤＭＡＰ）、Ｔ－Ｏ－ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）、２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）、ロックト核酸（ＬＮＡ）、エチレン核酸（ＥＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、１’，５’－アンヒドロヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、モルホリノ、メチルホスホネートヌクレオチド、チオホスホネートヌクレオチド、及び２’－フルオロＮ３－Ｐ５’－ホスホロアミダイト；又は
    （ｃ）表２中のいずれかの修飾ヌクレオチドからなる群から選択される、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドの少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は９９％のヌクレオチドが、修飾ヌクレオチドである、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、非修飾ヌクレオチドからなる、タンパク質、ペプチド、生体分子、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は細胞標的に結合するように構成される結合部位を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上の発現配列を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  10. 第１の部分は、非修飾ヌクレオチドからなるＩＲＥＳを含む、請求項１～７又は９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドの１つ以上の発現配列は、
    （ａ）完全修飾環状ポリリボヌクレオチド同等物より高い翻訳効率；
    （ｂ）完全修飾環状ポリリボヌクレオチド同等物より、少なくとも約０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．５、１．６、１．８、２、２．２、２．５、２．８、３倍高い翻訳効率；
    （ｃ）対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチドより高い翻訳効率；又は
    （ｄ）対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチドより、少なくとも約０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．５、１．６、１．８、２、２．２、２．５、２．８、３倍高い翻訳効率
    を有する、請求項９又は１０に記載の方法。
  12. 対象における１つ以上の発現配列を発現させる方法であって、
    １つ以上の発現配列を含むハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドを提供する工程であって、前記ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド及び少なくとも約５、１０、２０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、若しくは１０００連続非修飾ヌクレオチドを含む第１の部分を含む、工程と；
    前記ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドを、前記対象に投与する工程と；
    前記対象の細胞又は組織における完全修飾環状ポリリボヌクレオチド同等物中の対応する１つ以上の発現配列の発現と比較して、前記１つ以上の発現配列の増加した発現を得る工程とを含む方法。
  13. 対象における環状ポリリボヌクレオチドの安定性を増加させる方法であって、
    ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドを提供する工程であって、前記ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、修飾環状ポリリボヌクレオチド及び少なくとも約５、１０、２０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、若しくは１０００連続非修飾ヌクレオチドを含む第１の部分を含む、工程と；
    前記ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドを、前記対象に投与する工程と；
    前記対象の細胞又は組織における対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチドと比較して、前記ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドに対して増加した安定性を得る工程とを含む方法。
  14. 前記第１の部分は、ＩＲＥＳを含む、請求項１２又は１３に記載の方法。
  15. ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドを含む医薬組成物であって、前記ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、
    少なくとも１つの修飾ヌクレオチド；
    第１の標的、例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、又は細胞標的の第１の結合部分に結合するように構成される第１の結合部位を含む第１の部分（ここで、前記第１の結合部分は、非修飾ヌクレオチドからなる第１の環状ポリリボヌクレオチド（環状ＲＮＡ）結合モチーフである）を含み；
    ここで、前記第１の標的及び前記ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、複合体を形成する、医薬組成物。
  16. ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドを含む医薬組成物であって、前記ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、
    少なくとも１つの修飾ヌクレオチド；
    第１の標的、例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、又は細胞標的の第１の結合部分に結合するように構成される第１の結合部位を含む第１の部分（ここで、前記第１の結合部分は、非修飾ヌクレオチドからなる第１の環状ポリリボヌクレオチド（環状ＲＮＡ）結合モチーフである）；及び
    第２の標的の第２の結合部分に結合するように構成される第２の結合部位（ここで、前記第２の結合部分は、第２の環状ＲＮＡ結合モチーフである）を含み、
    前記第１の結合部分は、前記第２の結合部分と異なり、
    前記第１の標的、前記第２の標的、及び前記ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、複合体を形成し、
    前記第１の標的又は前記第２の標的は、マイクロＲＮＡでない、医薬組成物。
  17. ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドを含む医薬組成物であって、前記ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、
    少なくとも１つの修飾ヌクレオチド；
    第１の標的の第１の結合部分に結合するように構成される第１の結合部位を含む第１の部分（ここで、前記第１の結合部分は、第１の環状ポリリボヌクレオチド（環状ＲＮＡ）結合モチーフである）；及び
    第２の標的の第２の結合部分に結合するように構成される第２の結合部位（ここで、前記第２の結合部分は、第２の環状ＲＮＡ結合モチーフである）を含み、
    前記第１の結合部分は、前記第２の結合部分と異なり、
    前記第１の標的及び前記第２の標的は両方とも、マイクロＲＮＡである、医薬組成物。
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