CN113661242A - 包含经修饰的环状多核糖核苷酸的组合物及其用途 - Google Patents

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凯瑟琳·西富恩特斯-罗贾斯
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Abstract

本发明总体上涉及经修饰的环状多核糖核苷酸的药物组合物和制剂及其用途。

Description

包含经修饰的环状多核糖核苷酸的组合物及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年3月25日提交的美国临时申请号62/823,573的权益，将该临时申请的全部内容通过援引并入。
背景技术
某些环状多核糖核苷酸普遍存在于人的组织和细胞中，包括健康个体的组织和细胞。
发明内容
本披露提供了药物组合物，这些药物组合物包含药学上可接受的载体或赋形剂和环状多核糖核苷酸，该环状多核糖核苷酸包含连续的未修饰核苷酸的第一部分。在一些实施例中，该环状多核糖核苷酸包含至少一种经修饰的多核糖核苷酸和连续的未修饰核苷酸的第一部分。在一些实施例中，将该经修饰的环状多核糖核苷酸递送至受试者。
本披露提供了一种在受试者中减少或降低环状多核糖核苷酸的免疫原性的方法，该方法包括：提供杂交修饰的环状多核糖核苷酸，其中该杂交修饰的环状多核糖核苷酸包含至少一种经修饰的核苷酸和第一部分，该第一部分包含至少约5至1000个连续核苷酸，这些连续核苷酸具有不超过5％的经修饰的核苷酸；将该杂交修饰的环状多核糖核苷酸施用至该受试者；以及在该受试者的细胞或组织中获得与相应的未修饰的环状多核糖核苷酸相比减少的该杂交修饰的环状多核糖核苷酸的免疫原性。在一些实施例中，在受试者中降低或减少环状多核糖核苷酸的免疫原性的方法包括提供杂交修饰的环状多核糖核苷酸，其中该杂交修饰的环状多核糖核苷酸包含至少一种经修饰的多核糖核苷酸和连续的未修饰核苷酸的第一部分；将该杂交修饰的环状多核糖核苷酸施用至该受试者；以及在该受试者的细胞或组织中获得与相应的未修饰的环状多核糖核苷酸相比降低或减少的该杂交修饰的环状多核糖核苷酸的免疫原性。在一些实施例中，该第一部分包含IRES。在一些实施例中，该第一部分包含至少约5至1000个连续的未修饰核苷酸。在一些实施例中，该第一部分缺少5’-甲基胞苷、假尿苷、或N1-甲基-假尿苷。在一些实施例中，该第一部分中不超过5％的核苷酸是经修饰的核苷酸。在一些实施例中，该第一部分的该IRES中不超过5％的核苷酸是经修饰的核苷酸。
本披露提供了一种在受试者中表达一个或多个表达序列的方法，该方法包括：提供杂交修饰的环状多核糖核苷酸，其中该杂交修饰的环状多核糖核苷酸包含至少一种经修饰的核苷酸和第一部分，该第一部分包含至少约5至1000个连续核苷酸，这些连续核苷酸具有不超过5％的经修饰的核苷酸；将该杂交修饰的环状多核糖核苷酸施用至该受试者；以及在该受试者的细胞或组织中获得与完全修饰的环状多核糖核苷酸对应物中的一个或多个表达序列的表达相比增加的该一个或多个表达序列的表达。在一些实施例中，在受试者中表达一个或多个表达序列的方法包括提供杂交修饰的环状多核糖核苷酸，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸包含至少一种经修饰的多核糖核苷酸、连续的未修饰核苷酸的第一部分、和该一个或多个表达序列；将该杂交修饰的环状多核糖核苷酸施用至该受试者；以及在该受试者的细胞或组织中获得与完全修饰的环状多核糖核苷酸对应物中的一个或多个表达序列的表达相比增加的该一个或多个表达序列的表达。在一些实施例中，该第一部分包含IRES。在一些实施例中，该第一部分包含至少约5至1000个连续的未修饰核苷酸。在一些实施例中，该第一部分缺少5’-甲基胞苷、假尿苷、或N1-甲基-假尿苷。在一些实施例中，该第一部分中不超过5％的核苷酸是经修饰的核苷酸。在一些实施例中，该第一部分的该IRES中不超过5％的核苷酸是经修饰的核苷酸。
本披露提供了一种在受试者中增加环状多核糖核苷酸的稳定性的方法，该方法包括：提供杂交修饰的环状多核糖核苷酸，其中该杂交修饰的环状多核糖核苷酸包含至少一种经修饰的核苷酸和第一部分，该第一部分包含至少约5至1000个连续核苷酸，这些连续核苷酸具有不超过5％的经修饰的核苷酸；将该杂交修饰的环状多核糖核苷酸施用至该受试者；以及在该受试者的细胞或组织中获得与相应的未修饰的环状多核糖核苷酸相比增加的该杂交修饰的环状多核糖核苷酸的稳定性。在一些实施例中，在受试者中增加环状多核糖核苷酸的稳定性的方法包括提供杂交修饰的环状多核糖核苷酸，其中该杂交修饰的环状多核糖核苷酸包含至少一种经修饰的多核糖核苷酸和连续的未修饰核苷酸的第一部分；将该杂交修饰的环状多核糖核苷酸施用至该受试者；以及在该受试者的细胞或组织中获得与相应的未修饰的环状多核糖核苷酸相比增加的该杂交修饰的环状多核糖核苷酸的稳定性。在一些实施例中，该第一部分包含IRES。在一些实施例中，该第一部分包含至少约5至1000个连续的未修饰核苷酸。在一些实施例中，该第一部分缺少5’-甲基胞苷、假尿苷、或N1-甲基-假尿苷。在一些实施例中，该第一部分中不超过5％的核苷酸是经修饰的核苷酸。在一些实施例中，该第一部分的该IRES中不超过5％的核苷酸是经修饰的核苷酸。
在一些方面，在受试者中减少环状多核糖核苷酸的免疫原性的方法包括：提供杂交修饰的环状多核糖核苷酸，其中该杂交修饰的环状多核糖核苷酸包含至少一种经修饰的核苷酸和第一部分，该第一部分包含至少约5至1000个连续的未修饰核苷酸；将该杂交修饰的环状多核糖核苷酸施用至该受试者；以及在该受试者的细胞或组织中获得与相应的未修饰的环状多核糖核苷酸相比减少的该杂交修饰的环状多核糖核苷酸的免疫原性。
在一些方面，在受试者中降低环状多核糖核苷酸的免疫原性的方法包括：提供杂交修饰的环状多核糖核苷酸，其中该杂交修饰的环状多核糖核苷酸包含至少一种经修饰的核苷酸和第一部分，该第一部分包含至少约5至1000个连续的未修饰核苷酸；将该杂交修饰的环状多核糖核苷酸施用至该受试者；以及在该受试者的细胞或组织中获得与相应的未修饰的环状多核糖核苷酸相比减少的该杂交修饰的环状多核糖核苷酸的免疫原性。
在一些实施例中，该第一部分包含至少约5、10、20、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、或1000个连续的未修饰核苷酸。在一些实施例中，该第一部分缺少5’-甲基胞苷或假尿苷。在一些实施例中，该第一部分中不超过5％的核苷酸是经修饰的核苷酸。在一些实施例中，该环状多核糖核苷酸具有翻译能力。在一些实施例中，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸：a)具有比相应的未修饰环状多核糖核苷酸高至少约0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.5、1.6、1.8、2、2.2、2.5、2.8、或3倍的表达；b)具有比相应的未修饰的环状多核糖核苷酸高至少约1.1、1.2、1.3、1.5、1.6、1.8、2、2.2、2.5、2.8、3、3.2、3.3、3.5、3.8、4.0、4.2、4.5、4.8、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、或10.0倍的半衰期；c)具有比相应的未修饰的环状多核糖核苷酸更高的半衰期；或d)具有比相应的未修饰的环状多核糖核苷酸低至少约1.1、1.2、1.3、1.5、1.6、1.8、2、2.2、2.5、2.8、3、3.2、3.3、3.5、3.8、4.0、4.2、4.5、4.8、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、或10.0倍的免疫原性，如通过RIG-I、TLR-3、TLR-7、TLR-8、MDA-5、LGP-2、OAS、OASL、PKR、和IFN-β中的至少一种的表达或信号传导或激活评估的。在一些实施例中，该至少一种经修饰的核苷酸选自下组，该组由以下组成：a)N(6)甲基腺苷(m6A)、5’-甲基胞苷、和假尿苷；b)2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基(2’-O-MOE)、2’-O-氨基丙基、2’-脱氧、T-脱氧-2’-氟、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)、2’-O-二甲基氨基乙基(2’-O-DMAOE)、2’-O-二甲基氨基丙基(2’-O-DMAP)、T-O-二甲基氨基乙基氧基乙基(2’-O-DMAEOE)、2’-O-N-甲基乙酰胺基(2’-O-NMA)、锁核酸(LNA)、乙烯核酸(ENA)、肽核酸(PNA)、1’,5’-脱水己糖醇核酸(HNA)、吗啉代、甲基膦酸酯核苷酸、硫醇膦酸酯核苷酸、和2’-氟N3-P5’-亚磷酰胺；或c)来自表2的任何经修饰的核苷酸。在一些实施例中，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸的至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、或99％核苷酸是经修饰的核苷酸。在一些实施例中，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸包含由未修饰的核苷酸组成的结合位点，该结合位点被配置为结合至蛋白质、肽、生物分子、DNA、RNA、或细胞靶标。在一些实施例中，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸包含一个或多个表达序列。在一些实施例中，该第一部分包含由未修饰的核苷酸组成的IRES。在一些实施例中，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸的一个或多个表达序列具有：a)比完全修饰的环状多核糖核苷酸对应物更高的翻译效率；b)比完全修饰的环状多核糖核苷酸对应物高至少约0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.5、1.6、1.8、2、2.2、2.5、2.8、或3倍的翻译效率；c)比相应的未修饰的环状多核糖核苷酸更高的翻译效率；或d)比相应的未修饰的环状多核糖核苷酸高至少约0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.5、1.6、1.8、2、2.2、2.5、2.8、或3倍的翻译效率。
在一些方面，在受试者中表达一个或多个表达序列的方法包括：提供包含一个或多个表达序列的杂交修饰的环状多核糖核苷酸，其中该杂交修饰的环状多核糖核苷酸包含至少一种经修饰的核苷酸和第一部分，该第一部分包含至少约5、10、20、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、或1000个连续的未修饰核苷酸；将该杂交修饰的环状多核糖核苷酸施用至该受试者；以及在该受试者的细胞或组织中获得与完全修饰的环状多核糖核苷酸对应物中相应的一个或多个表达序列的表达相比增加的该一个或多个表达序列的表达。
在一些方面，在受试者中增加环状多核糖核苷酸的稳定性的方法包括：提供杂交修饰的环状多核糖核苷酸，其中该杂交修饰的环状多核糖核苷酸包含经修饰的环状多核糖核苷酸和第一部分，该第一部分包含至少约5、10、20、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、或1000个连续的未修饰核苷酸；将该杂交修饰的环状多核糖核苷酸施用至该受试者；以及在该受试者的细胞或组织中获得与相应的未修饰的环状多核糖核苷酸相比增加的该杂交修饰的环状多核糖核苷酸的稳定性。
在一些实施例中，该第一部分包含IRES。
在一方面，本披露提供了一种药物组合物，该药物组合物包含药学上可接受的载体或赋形剂和杂交修饰的环状多核糖核苷酸，其中该杂交修饰的环状多核糖核苷酸包含至少一种经修饰的核苷酸和第一部分，并且其中该第一部分包含至少约5、10、20、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、或1000个连续的未修饰核苷酸。在此方面的某些实施例中，该第一部分包含不超过5％的经修饰的核苷酸。
在另一方面，本披露提供了一种药物组合物，该药物组合物包含药学上可接受的载体或赋形剂和杂交修饰的环状多核糖核苷酸，其中该杂交修饰的环状多核糖核苷酸包含至少一种经修饰的核苷酸和第一部分，并且其中该第一部分包含至少约5、10、20、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、或1000个连续核苷酸，并且其中该第一部分缺少5’-甲基胞苷或假尿苷。在此方面的某些实施例中，该第一部分包含不超过5％的经修饰的核苷酸。
在一些方面，药物组合物包含杂交修饰的环状多核糖核苷酸，其中该杂交修饰的环状多核糖核苷酸包含：至少一种经修饰的核苷酸；第一部分，该第一部分包含由未修饰的核苷酸组成的第一结合位点，该第一结合位点被配置为结合第一靶标，例如RNA、DNA、蛋白质、或细胞靶标的第一结合部分，其中该第一结合部分是第一环状多核糖核苷酸(circRNA)结合基序；其中该第一靶标和该杂交修饰的环状多核糖核苷酸形成复合物。
在一些方面，药物组合物包含杂交修饰的环状多核糖核苷酸，其中该杂交修饰的环状多核糖核苷酸包含：至少一种经修饰的核苷酸；第一部分，该第一部分包含由未修饰的核苷酸组成的第一结合位点，该第一结合位点被配置为结合第一靶标，例如RNA、DNA、蛋白质、或细胞靶标的第一结合部分，其中该第一结合部分是第一环状多核糖核苷酸(circRNA)结合基序；以及第二结合位点，该第二结合位点被配置为结合第二靶标的第二结合部分，其中该第二结合部分是第二circRNA结合基序，其中该第一结合部分不同于该第二结合部分，其中该第一靶标、该第二靶标、和该杂交修饰的环状多核糖核苷酸形成复合物，并且其中该第一靶标或该第二靶标不是微RNA。
在一些方面，药物组合物包含杂交修饰的环状多核糖核苷酸，其中该杂交修饰的环状多核糖核苷酸包含：至少一种经修饰的核苷酸；第一部分，该第一部分包含第一结合位点，该第一结合位点被配置为结合第一靶标的第一结合部分，其中该第一结合部分是第一环状多核糖核苷酸(circRNA)结合基序；以及第二结合位点，该第二结合位点被配置为结合第二靶标的第二结合部分，其中该第二结合部分是第二circRNA结合基序，其中该第一结合部分不同于该第二结合部分，并且其中该第一靶标和该第二靶标两者均是微RNA。在一些实施例中，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸具有比相应的未修饰的环状多核糖核苷酸更低的免疫原性。在一些实施例中，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸具有比相应的未修饰的环状多核糖核苷酸高至少约1.1、1.2、1.3、1.5、1.6、1.8、2、2.2、2.5、2.8、3、3.2、3.3、3.5、3.8、4.0、4.2、4.5、4.8、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、或10.0倍的半衰期。在一些实施例中，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸具有比相应的未修饰的环状多核糖核苷酸更高的半衰期。在一些实施例中，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸具有比相应的未修饰的环状多核糖核苷酸低至少约1.1、1.2、1.3、1.5、1.6、1.8、2、2.2、2.5、2.8、3、3.2、3.3、3.5、3.8、4.0、4.2、4.5、4.8、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、或10.0倍的免疫原性，如通过RIG-I、TLR-3、TLR-7、TLR-8、MDA-5、LGP-2、OAS、OASL、PKR、和IFN-β中的至少一种的表达或信号传导或激活评估的。在一些实施例中，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸具有比相应的未修饰的环状多核糖核苷酸更高的半衰期。在一些实施例中，该至少一种经修饰的核苷酸选自下组，该组由以下组成：N(6)甲基腺苷(m6A)、5’-甲基胞苷、和假尿苷。在一些实施例中，该至少一种经修饰的核酸选自下组，该组由以下组成：2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基(2’-O-MOE)、2’-O-氨基丙基、2’-脱氧、T-脱氧-2’-氟、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)、2’-O-二甲基氨基乙基(2’-O-DMAOE)、2’-O-二甲基氨基丙基(2’-O-DMAP)、T-O-二甲基氨基乙基氧基乙基(2’-O-DMAEOE)、2’-O-N-甲基乙酰胺基(2’-O-NMA)、锁核酸(LNA)、乙烯核酸(ENA)、肽核酸(PNA)、1’,5’-脱水己糖醇核酸(HNA)、吗啉代、甲基膦酸酯核苷酸、硫醇膦酸酯核苷酸、和2’-氟N3-P5’-亚磷酰胺。在一些实施例中，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸的至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、或99％核苷酸是经修饰的核苷酸。在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸包含由未修饰的核苷酸组成的结合位点，该结合位点被配置为结合肽、蛋白质、生物分子、DNA、RNA、或细胞靶标。在一些实施例中，该第一部分包含该结合位点。在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸包含由未修饰的核苷酸组成的内部核糖体进入位点(IRES)。在一些实施例中，该第一部分包含IRES。在某些实施例中，该IRES包含不超过5％的经修饰的核苷酸。
在一些实施例中，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸包含一个或多个表达序列。在一些实施例中，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸包含该一个或多个表达序列和该IRES，并且其中该杂交修饰的环状多核糖核苷酸在该IRES之外包含5’-甲基胞苷、假尿苷、或其组合。在一些实施例中，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸的该一个或多个表达序列具有比相应的完全修饰的环状多核糖核苷酸更高的翻译效率。在一些实施例中，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸的该一个或多个表达序列具有比完全修饰的环状多核糖核苷酸对应物高至少约0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.5、1.6、1.8、2、2.2、2.5、2.8、或3倍的翻译效率。在一些实施例中，该完全修饰的环状多核糖核苷酸对应物在第一部分之外包含至少一种经修饰的核苷酸并且在该第一部分中包含超过5％的经修饰的核苷酸。在一些实施例中，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸的该一个或多个表达序列具有比相应的未修饰的环状多核糖核苷酸更高的翻译效率。在一些实施例中，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸的该一个或多个表达序列具有比相应的未修饰的环状多核糖核苷酸高至少约0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.5、1.6、1.8、2、2.2、2.5、2.8、或3倍的翻译效率。在一些实施例中，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸的该一个或多个表达序列具有比完全修饰的环状多核糖核苷酸对应物更高的翻译效率。在一些实施例中，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸的该一个或多个表达序列具有的翻译效率比具有包含超过10％的经修饰的核苷酸的第一部分的完全修饰的环状多核糖核苷酸更高。在一些实施例中，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸的该一个或多个表达序列具有的翻译效率比具有包含100％的经修饰的假尿苷或5’甲基胞苷的第一部分的完全修饰的环状多核糖核苷酸更高。在一些实施例中，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸的该一个或多个表达序列具有的翻译效率比具有包含经修饰的核苷酸的第一部分的完全修饰的环状多核糖核苷酸对应物高至少约1.2、1.3、1.5、1.6、1.8、2、2.2、2.5、2.8、3、3.2、3.3、3.5、3.8、4.0、4.2、4.5、4.8、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、或10.0倍。在一些实施例中，该翻译效率是在包含该杂交修饰的环状多核糖核苷酸或该完全修饰的环状多核糖核苷酸对应物的细胞中、或者在体外翻译系统(例如，兔网织红细胞裂解物)中测量的。在一些实施例中，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸能够滚环翻译。
在一些实施例中，该一个或多个表达序列中的每一个通过该杂交修饰的环状多核糖核苷酸上的交错元件与后继的表达序列隔开，其中该一个或多个表达序列的滚环翻译生成至少两个多肽分子。在一些实施例中，该药学上可接受的载体或赋形剂是乙醇。在一些实施例中，该交错元件阻止由(a)单个表达序列的两轮翻译或(b)两个或更多个表达序列的一轮或多轮翻译生成单一多肽。在一些实施例中，该交错元件是与该一个或多个表达序列分离的序列。在一些实施例中，该交错元件包含该一个或多个表达序列中的表达序列的一部分。在一些实施例中，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸能够滚环翻译，其中该杂交修饰的环状多核糖核苷酸被配置为使得在该杂交修饰的环状多核糖核苷酸的滚环翻译期间生成的总多肽中的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％(摩尔/摩尔)是离散多肽，并且其中这些离散多肽中的每一个都是由该一个或多个表达序列的单轮翻译或少于单轮翻译生成的。在一些实施例中，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸被配置为使得在该杂交修饰的环状多核糖核苷酸的滚环翻译期间生成的总多肽中的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％(摩尔/摩尔)是离散多肽，并且其中在体外翻译系统中测试这些离散产物相对于这些总多肽的量比。在一些实施例中，该体外翻译系统包含兔网织红细胞裂解物。在一些实施例中，该交错元件位于该一个或多个表达序列中至少一个的3’端，并且其中该交错元件被配置为在该杂交修饰的环状多核糖核苷酸的滚环翻译期间使核糖体停滞。在一些实施例中，该交错元件编码肽序列，该肽序列选自由2A序列和2A样序列组成的组。在一些实施例中，该交错元件编码具有C末端序列为GP的序列。在一些实施例中，该交错元件编码具有C末端共有序列为D(V/I)ExNPGP的序列，其中x＝任何氨基酸。在一些实施例中，该交错元件编码选自下组的序列，该组由以下组成：GDVESNPGP、GDIEENPGP、VEPNPGP、IETNPGP、GDIESNPGP、GDVELNPGP、GDIETNPGP、GDVENPGP、GDVEENPGP、GDVEQNPGP、IESNPGP、GDIELNPGP、HDIETNPGP、HDVETNPGP、HDVEMNPGP、GDMESNPGP、GDVETNPGP、GDIEQNPGP、和DSEFNPGP。在一些实施例中，该交错元件在该一个或多个表达序列中的每一个的3’端。在一些实施例中，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸中的第一表达序列的该交错元件在该杂交修饰的环状多核糖核苷酸中该第一表达序列后继的表达序列的第一翻译起始序列的上游(5’)，并且其中该交错元件与该第一翻译起始序列之间的距离使得该第一表达序列和该后继表达序列能够连续翻译。在一些实施例中，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸中的第一表达序列的该交错元件在该杂交修饰的环状多核糖核苷酸中该第一表达序列后继的表达序列的第一翻译起始序列的上游(5’)，其中该杂交修饰的环状多核糖核苷酸被连续翻译，其中在杂交修饰的相应环状多核糖核苷酸中第二表达序列的第二翻译起始序列上游包含第二交错元件的该相应的杂交修饰的环状多核糖核苷酸不被连续翻译，并且其中该相应的杂交修饰的环状多核糖核苷酸中的该第二交错元件与该第二翻译起始序列的距离更大，例如是该杂交修饰的环状多核糖核苷酸中的该交错元件与该第一翻译起始之间距离的至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍大、或更大。在一些实施例中，该交错元件与该第一翻译起始之间的距离是至少2nt、3nt、4nt、5nt、6nt、7nt、8nt、9nt、10nt、11nt、12nt、13nt、14nt、15nt、16nt、17nt、18nt、19nt、20nt、25nt、30nt、35nt、40nt、45nt、50nt、55nt、60nt、65nt、70nt、75nt、或更大。在一些实施例中，该第二交错元件与该第二翻译起始之间的距离是至少2nt、3nt、4nt、5nt、6nt、7nt、8nt、9nt、10nt、11nt、12nt、13nt、14nt、15nt、16nt、17nt、18nt、19nt、20nt、25nt、30nt、35nt、40nt、45nt、50nt、55nt、60nt、65nt、70nt、75nt、或大于该第一交错元件与该第一翻译起始之间的距离。在一些实施例中，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸上的该第一表达序列后继的表达序列是不同于该第一表达序列的表达序列。在一些实施例中，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸上的该第一表达序列的该后继表达序列是该第一表达序列。
在一些实施例中，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸包含至少一种选自以下的结构元件：a)加密原(encryptogen)；b)交错元件；c)调控元件；d)复制元件；和f)准双链二级结构。在一些实施例中，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸包含至少一种选自以下的功能特征：a)比线性对应物更高的翻译效率；b)多种翻译产物的化学计量翻译效率；c)比缺少加密原的对应物更低的免疫原性；d)相比于线性对应物增加的半衰期；和e)细胞分裂期间的持续性。在一些实施例中，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸具有比线性对应物高至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少150％、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍、或至少100倍的翻译效率。在一些实施例中，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸具有比线性对应物高至少5倍的翻译效率。在一些实施例中，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸缺少以下中的至少一种：a)5’-UTR；b)3’-UTR；c)聚A序列；d)5’-帽；e)终止元件；f)核酸外切酶的降解易感性；和g)与帽结合蛋白的结合。在一些实施例中，该一个或多个表达序列包含科扎克(Kozak)起始序列。在一些实施例中，该准螺旋结构包含至少一个双链RNA区段与至少一个非双链区段。在一些实施例中，该准螺旋结构包含与重复序列例如富A序列连接的第一序列和第二序列。在一些实施例中，该加密原包含剪接元件。在一些实施例中，该加密原包含蛋白质结合位点，例如核糖核苷酸结合蛋白。在一些实施例中，该加密原包含免疫蛋白结合位点，例如以逃避免疫应答，例如CTL应答。在一些实施例中，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸具有比缺少该加密原的对应物低至少2倍的免疫原性，例如，如通过RIG-I、TLR-3、TLR-7、TLR-8、MDA-5、LGP-2、OAS、OASL、PKR、和IFN-β中的至少一种的表达或信号传导或激活评估的。在一些实施例中，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸进一步包含核糖开关。在一些实施例中，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸进一步包含适体酶。在一些实施例中，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸包含非典范翻译起始序列，例如GUG、CUG起始密码子，例如在应激条件下起始表达的翻译起始序列。在一些实施例中，该一个或多个表达序列编码肽。在一些实施例中，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸包含调控核酸，例如非编码RNA。在一些实施例中，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸具有的大小在约20个碱基至约20kb的范围内。在一些实施例中，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸通过线性多核糖核苷酸的环化来合成。在一些实施例中，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸包含具有相同核苷酸序列或不同核苷酸序列的多个表达序列。在一些实施例中，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸基本上对降解例如核酸外切酶有抗性。
在一些实施例中，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸包含：经修饰的环状多核糖核苷酸，该经修饰的环状多核糖核苷酸包含：第一结合位点，该第一结合位点被配置为结合第一靶标，例如RNA、DNA、蛋白质、细胞膜等的第一结合部分，其中该第一结合部分是第一环状多核糖核苷酸(circRNA)结合基序；以及第二结合位点，该第二结合位点被配置为结合第二靶标的第二结合部分，其中该第二结合部分是第二circRNA结合基序，其中该第一结合部分不同于该第二结合部分，其中该第一靶标、该第二靶标、和该杂交修饰的环状多核糖核苷酸形成复合物，并且其中该第一靶标或该第二靶标不是微RNA。
在一些实施例中，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸包含：杂交修饰的环状多核糖核苷酸，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸包含：第一结合位点，该第一结合位点被配置为结合第一靶标的第一结合部分，其中该第一结合部分是第一环状多核糖核苷酸(circRNA)结合基序；以及第二结合位点，该第二结合位点被配置为结合第二靶标的第二结合部分，其中该第二结合部分是第二circRNA结合基序，其中该第一结合部分不同于该第二结合部分，并且其中该第一靶标和该第二靶标两者均是微RNA。
在一些实施例中，该第一靶标和该第二靶标彼此相互作用。在一些实施例中，该复合物调节细胞过程。在一些实施例中，该第一靶标和该第二靶标是相同的，并且该第一结合位点和该第二结合位点结合不同的部分。在一些实施例中，该第一靶标和该第二靶标是不同的。在一些实施例中，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸进一步包含被配置为结合第三或更多个结合部分的一个或多个另外结合位点。在一些实施例中，一个或多个靶标是相同的并且一个或多个结合位点被配置为结合不同的部分。在一些实施例中，该复合物的形成调节细胞过程。在一些实施例中，当与该第一靶标和该第二靶标接触时，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸调节与该第一靶标或该第二靶标相关的细胞过程。在一些实施例中，该第一靶标和该第二靶标在该复合物中彼此相互作用。在一些实施例中，该细胞过程与疾病或病症的发病机理相关。在一些实施例中，该细胞过程不同于该杂交修饰的环状多核糖核酸的翻译。在一些实施例中，该细胞过程与疾病或病症的发病机理相关。在一些实施例中，该第一靶标包括脱氧核糖核酸(DNA)分子，并且该第二靶标包括蛋白质。在一些实施例中，该复合物调节该DNA分子的定向转录、该DNA分子的表观遗传重塑、或该DNA分子的降解。在一些实施例中，该第一靶标包括第一蛋白质，并且该第二靶标包括第二蛋白质。在一些实施例中，该复合物调节该第一蛋白质的降解、该第一蛋白质的易位、或信号转导，或者调节天然蛋白质功能、或抑制通过该第一蛋白质与该第二蛋白质之间的直接相互作用形成的复合物的形成。在一些实施例中，该第一靶标包括第一核糖核酸(RNA)分子，并且该第二靶标包括第二RNA分子。在一些实施例中，该复合物调节该第一RNA分子的降解。在一些实施例中，该第一靶标包括蛋白质，并且该第二靶标包括RNA分子。在一些实施例中，该复合物调节该蛋白质的易位或抑制通过该蛋白质与该RNA分子之间的直接相互作用形成的复合物的形成。在一些实施例中，该第一结合部分包括受体，并且该第二结合部分包括该受体的底物。在一些实施例中，该复合物抑制该受体的激活。在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸包含结合位点，该结合位点被配置为结合靶标的结合部分，其中该结合部分是核糖核酸(RNA)结合基序，其中该杂交修饰的环状多核糖核苷酸没有翻译能力或有翻译缺陷，并且其中该靶标不是微RNA。在一些实施例中，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸包含结合位点，该结合位点被配置为结合靶标的结合部分，其中该结合部分是核糖核酸(RNA)结合基序，其中该杂交修饰的环状多核糖核苷酸没有翻译能力或有翻译缺陷，并且其中该靶标是微RNA。在一些实施例中，该靶标包括DNA分子。在一些实施例中，该结合部分与该杂交修饰的环状多核糖核苷酸的结合调节DNA分子的转录干扰。在一些实施例中，该靶标包括蛋白质。在一些实施例中，该结合部分与该杂交修饰的环状多核糖核苷酸的结合抑制该蛋白质与其他分子的相互作用。在一些实施例中，该蛋白质是受体，并且其中该第一结合部分与该经修饰的环状多核糖核苷酸的结合激活该受体。在一些实施例中，该蛋白质是第一酶，其中该杂交修饰的环状多核糖核苷酸进一步包含第二结合位点，该第二结合位点被配置为结合至第二酶，并且其中该第一酶和该第二酶与该杂交修饰的环状多核糖核苷酸的结合调节该第一酶和该第二酶的酶活性。在一些实施例中，该靶标包括信使RNA(mRNA)分子。在一些实施例中，该结合部分与该杂交修饰的环状多核糖核苷酸的结合调节该mRNA分子的翻译干扰。在一些实施例中，该靶标包括核糖体。在一些实施例中，该结合部分与该杂交修饰的环状多核糖核苷酸的结合调节翻译过程的干扰。在一些实施例中，该靶标包括环状RNA分子。在一些实施例中，该结合部分与该杂交修饰的环状多核糖核苷酸的结合螯合该环状RNA分子。在一些实施例中，该结合部分与该杂交修饰的环状多核糖核苷酸的结合螯合微RNA分子。在一些实施例中，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸包含结合位点，该结合位点被配置为结合细胞膜靶标上的结合部分；并且其中该结合部分是核糖核酸(RNA)结合基序。在一些实施例中，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸进一步包含第二结合位点，该第二结合位点被配置为结合第二细胞靶标上的第二结合部分，其中该第二结合部分是第二RNA结合基序。在一些实施例中，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸被配置为结合至两个靶标。在一些实施例中，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸进一步包含第二结合位点，该第二结合位点被配置为结合第二结合部分，并且其中两个靶标与该杂交修饰的环状多核糖核苷酸的结合诱导该第一靶标的构象变化，从而诱导该靶标的下游的信号转导。
在一些实施例中，本披露提供了如本文所述的组合物，该组合物被配制在载体，例如膜或脂质双层中。
在一方面，本披露提供了一种治疗方法，该治疗方法包括将如本文所述的药物组合物施用至患有疾病或病症的受试者。
在一方面，本披露提供了一种生产药物组合物的方法，该方法包括生成如本文所述的杂交修饰的环状多核糖核苷酸。
在一方面，本披露提供了一种制备如本文所述的杂交修饰的环状多核糖核苷酸的方法，该方法包括使具有核酸序列的线性多核糖核苷酸环化为该杂交修饰的环状多核糖核苷酸。
在一方面，本披露提供了一种工程化细胞，该工程化细胞包含如本文所述的组合物。
定义
本发明将针对特定实施例并参考某些附图进行描述，但是本发明不限于此，而是仅由权利要求来限定。除非另有说明，否则下文陈述的术语通常应以其常见意义来理解。
术语“药物组合物”旨在还披露包含在药物组合物中的环状多核糖核苷酸可用于通过疗法治疗人体或动物体。因此，这意味着等同于“用于在疗法中使用的环状多核糖核苷酸”。
如本文所述的环状多核糖核苷酸、包含此类环状多核糖核苷酸的组合物、使用此类环状多核糖核苷酸的方法等部分地基于以下实例，这些实例说明了包含不同的元件，例如复制元件、表达序列、交错元件和加密原(参见例如，实例10)或例如表达序列、交错元件和调控元件(参见例如，实例32和实例40)的环状多核糖核苷酸效应子可如何用于实现不同的技术效果(例如，实例10和40中与线性对应物相比增加的翻译效率和实例40中相比于线性对应物增加的半衰期)。基于尤其这些实例，下文中的描述设想了实例中所考虑的具体发现和组合的各种变型。
如本文使用的，术语“circRNA”或“环状多核糖核苷酸”或“环状RNA”可互换使用，并且意指具有没有游离端(即，没有游离3’和/或5’端)的结构的多核糖核苷酸分子，例如通过共价或非共价键形成环状或环形结构的多核糖核苷酸。
如本文使用的，术语“经修饰的环状多核糖核苷酸”或“经修饰的环状RNA”或“经修饰的circRNA”可互换使用，并且意指包含至少一种经修饰的核苷酸的环状多核糖核苷酸。经修饰的环状RNA可以是或者可以不是沿着分子的整个长度均一地修饰的。
如本文使用的，术语“杂交修饰的环状多核糖核苷酸对应物”或“杂交修饰的环状多核糖核苷酸”或“杂交修饰的circRNA”或“杂交修饰的环状RNA”可互换使用，并且意指这样的经修饰的环状多核糖核苷酸，该经修饰的环状多核糖核苷酸具有与参考经修饰的环状多核糖核苷酸相同的核苷酸序列并且具有连续核苷酸的第一部分，该第一部分包含不超过5％的如本文所述的经修饰的核苷酸。在一些实施例中，该连续核苷酸的第一部分包含未修饰的核苷酸(即不包含经修饰的核苷酸或仅包含未修饰的核苷酸)。例如，连续的未修饰核苷酸的第一部分包含IRES。杂交修饰的环状RNA可以是或者可以不是沿着其整个长度修饰的。例如，在特定的实施例中，杂交修饰的环状RNA是[(所有胞嘧啶＝甲基胞嘧啶)+(所有尿苷＝假尿苷)+(未修饰的IRES)]。在另一个实例中，杂交修饰的是[(所有腺苷＝m6a)+未修饰的IRES]。
如本文使用的，术语“完全修饰的(fully modified)环状多核糖核苷酸对应物”或“完全修饰的(completely modified)环状多核糖核苷酸”或“全长修饰的环状多核糖核苷酸”或“完全修饰的环状RNA”可互换使用，并且意指这样的经修饰的环状多核糖核苷酸，该经修饰的环状多核糖核苷酸具有与参考杂交修饰的环状多核糖核苷酸相同的核苷酸序列并且具有对应于参考杂交修饰的环状多核糖核苷酸的第一部分、包含超过5％的经修饰的核苷酸的第一部分。例如，第一部分包含具有超过5％的经修饰的核苷酸的IRES(即，经修饰的IRES)。完全修饰的环状RNA可以是或者可以不是沿着分子的整个长度均一地修饰的。例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸包含第一部分，该第一部分包含具有超过5％的经修饰的核苷酸的IRES，并且在第一部分之外的50％核苷酸是经修饰的核苷酸(例如，在第一部分之外的50％尿苷是假尿苷)。在特定的实施例中，完全修饰的环状多核糖核苷酸是[(所有胞嘧啶＝甲基胞嘧啶)+(所有尿苷＝假尿苷)+经修饰的IRES]。在另一个实例中，完全修饰的环状多核糖核苷酸是[(所有腺苷＝m6a)+经修饰的IRES]。
如本文使用的，术语“经修饰的核糖核苷酸”意指具有对未修饰的天然核糖核苷酸的化学组成(诸如如由下表1中的化学式所示的天然未修饰的核苷酸腺苷(A)、尿苷(U)、鸟嘌呤(G)、胞苷(C)，和单磷酸酯)的一个或多个化学修饰的任何核糖核苷酸类似物或衍生物。在一些实施例中，经修饰的核糖核苷酸的化学修饰是对核糖核苷酸的任何一个或多个官能团，诸如糖、核碱基或核苷间键(例如对连接的磷酸酯/对磷酸二酯键/对磷酸二酯主链)的修饰。
如本文使用的，术语“线性对应物”是与环状多核糖核苷酸具有相同或相似的核苷酸序列(例如，100％、95％、90％、85％、80％、75％、或其间的任何百分比的序列相似性)并且具有两个游离端的多核糖核苷酸分子(及其片段)(即，环状多核糖核苷酸的未环化形式(及其片段))。在一些实施例中，线性对应物(例如，环化前形式)是与环状多核糖核苷酸具有相同或相似的核苷酸序列(例如，100％、95％、90％、85％、80％、75％、或其间的任何百分比序列相似性)并且具有相同或相似的核酸修饰，并且具有两个游离端的多核糖核苷酸分子(及其片段)(即，环状多核糖核苷酸的未环化形式(及其片段))。在一些实施例中，线性对应物是与环状多核糖核苷酸具有相同或相似的核苷酸序列(例如，100％、95％、90％、85％、80％、75％、或其间的任何百分比的序列相似性)并且具有不同的核酸修饰或不具有核酸修饰，并且具有两个游离端的多核糖核苷酸分子(及其片段)(即，环状多核糖核苷酸的未环化形式(及其片段))。在一些实施例中，作为线性对应物的多核糖核苷酸分子的片段是线性对应物多核糖核苷酸分子的任何部分，该任何部分短于线性对应物多核糖核苷酸分子。在一些实施例中，线性对应物进一步包含5’帽。在一些实施例中，线性对应物进一步包含聚腺苷尾。在一些实施例中，线性对应物进一步包含3’UTR。在一些实施例中，线性对应物进一步包含5’UTR。
如本文使用的，术语“片段”意指核苷酸分子的任何部分，该任何部分是短于核苷酸分子的至少一个核苷酸。例如，核苷酸分子可以是环状多核糖核苷酸分子并且其片段可以是作为环状多核糖核苷酸分子的一部分的多核糖核苷酸或任何数量的连续多核糖核苷酸。作为另一个实例，核苷酸分子可以是线性多核糖核苷酸分子并且其片段可以是作为线性多核糖核苷酸分子的一部分的单核糖核苷酸或任何数量的连续多核糖核苷酸。
如本文使用的，术语“加密原”是环状多核糖核苷酸的核酸序列或结构，该核酸序列或结构有助于降低、逃避和/或避免免疫细胞的检测和/或降低针对环状多核糖核苷酸的免疫应答的诱导。
如本文使用的，术语“表达序列”是编码产物(例如，肽或多肽)的核酸序列、或调控核酸。编码肽或多肽的示例性表达序列可以包含多个核苷酸三联体，其中每一个都可以编码氨基酸，并且被称为“密码子”。
如本文使用的，术语“免疫蛋白结合位点”是与免疫蛋白结合的核苷酸序列。在一些实施例中，免疫蛋白结合位点有助于掩蔽为外源性的环状多核糖核苷酸，例如，免疫蛋白结合位点可以被蛋白质(例如，竞争性抑制剂)结合，从而阻止环状多核糖核苷酸被免疫蛋白识别和结合，从而降低或避免针对环状多核糖核苷酸的免疫应答。如本文使用的，术语“免疫蛋白”是与免疫应答(例如像针对免疫原，例如环状多核糖核苷酸)相关的任何蛋白质或肽。免疫蛋白的非限制性实例包括T细胞受体(TCR)、抗体(免疫球蛋白)、主要组织相容性复合体(MHC)蛋白、补体蛋白、和RNA结合蛋白。
如本文使用的，短语“准螺旋结构”是环状多核糖核苷酸的高阶结构，其中环状多核糖核苷酸的至少一部分折叠成螺旋结构。
如本文使用的，短语“准双链二级结构”是环状多核糖核苷酸的高阶结构，其中环状多核糖核苷酸的至少一部分产生内部双链。
如本文使用的，术语“调控元件”是修饰环状多核糖核苷酸内表达序列的表达的部分，诸如核酸序列。
如本文使用的，术语“重复核苷酸序列”是一段DNA或RNA内或整个基因组内的重复核酸序列。在一些实施例中，重复核苷酸序列包括聚CA序列或聚TG(UG)序列。在一些实施例中，重复核苷酸序列包括内含子Alu家族中的重复序列。
如本文使用的，术语“复制元件”是可用于复制或者起始环状多核糖核苷酸转录的序列和/或基序。
如本文使用的，术语“交错元件”是在翻译期间诱导核糖体暂停的部分，诸如核苷酸序列。在一些实施例中，交错元件是具有强α-螺旋倾向的氨基酸的非保守序列，其后接共有序列-D(V/I)ExNPG P，其中x＝任何氨基酸。在一些实施例中，交错元件可以包括化学部分，诸如甘油、非核酸连接部分、化学修饰、经修饰的核酸、或其任何组合。
如本文使用的，术语“基本上对……有抗性”意指相比于参考物具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％抗性的物质。
如本文使用的，术语“化学计量翻译”是从环状多核糖核苷酸翻译的表达产物的基本当量的产生。例如，对于具有两个表达序列的环状多核糖核苷酸，环状多核糖核苷酸的化学计量翻译可以意指两个表达序列的表达产物可以具有基本当量的量，例如两个表达序列之间的量差(例如，摩尔差)可以是约0，或小于1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％或20％、或其间的任何百分比。
如本文使用的，术语“翻译起始序列”是起始环状多核糖核苷酸中表达序列的翻译的核酸序列。
如本文使用的，术语“终止元件”是终止环状多核糖核苷酸中表达序列的翻译的部分，诸如核酸序列。
如本文使用的，术语“翻译效率”意指从核糖核苷酸转录物产生蛋白质或肽的速率或量。在一些实施例中，翻译效率可以表示为给定量的编码蛋白质或肽的转录物产生的蛋白质或肽的量，例如在给定的时间段内，例如在给定的翻译系统，例如体外翻译系统(像兔网织红细胞裂解物)或体内翻译系统(像真核细胞或原核细胞)中。
如本文使用的，术语“环化效率”意指所得环状多核糖核苷酸相对于其起始材料的测量。
如本文使用的，术语“免疫原性”是针对物质诱导免疫应答的潜力。在一些实施例中，当生物体的免疫系统或某种类型的免疫细胞暴露于免疫原性物质时，可以诱导免疫应答。术语“非免疫原性”是对于物质缺少或不存在高于可检测阈值的免疫应答。在一些实施例中，当生物体的免疫系统或某种类型的免疫细胞暴露于非免疫原性物质时，未检测到免疫应答。在一些实施例中，当通过免疫原性测定测量时，如本文提供的非免疫原性环状多核糖核苷酸不会诱导超过预定阈值的免疫应答。例如，当使用免疫原性测定来测量针对环状多核糖核苷酸的先天性免疫应答(诸如测量炎性标记物)时，如本文提供的非免疫原性多核糖核苷酸可以导致水平低于预定阈值的先天性免疫应答的产生。预定阈值可以是例如由针对对照参考物的先天性免疫应答产生的一种或多种标记物水平的至多1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍。
如本文使用的，术语“药学上可接受的”是指不是生物学上或其他方面不期望的组分，例如可以将该组分掺入至本发明的药物配制品中并且施用至如本文所述的受试者，而不会引起任何显著的不期望的生物学效应或者以有害的方式与包含其的配制品的任何其他组分相互作用。在某些实施例中，当使用术语“药学上可接受的”来指赋形剂时，这意味着该组分满足了毒理学和制造测试的要求标准，或者它根据通过美国食品与药物管理局(U.S.Food and Drug Administration)编制的非活性成分指南被包含。
如本文使用的，术语“载体”意指通过经由部分或完全包封剂或其组合共价修饰环状多核糖核苷酸来促进将组合物(例如，环状多核糖核苷酸)转运或递送至细胞中的化合物、组合物、试剂、或分子。载体的非限制性实例包括碳水化合物载体(例如，酸酐修饰的植物糖原或糖原型材料)、纳米颗粒(例如，包封或共价连接结合至环状多核糖核苷酸的纳米颗粒)、脂质体、融合体、离体分化的网织红细胞、外来体、蛋白质载体(例如，共价连接至环状多核糖核苷酸的蛋白质)、或阳离子载体(例如，阳离子脂质聚合物或转染试剂)。
如本文使用的，术语“裸递送”意指用于在不借助载体并且不对部分进行有助于递送至细胞的共价修饰的情况下递送至细胞的配制品。裸递送配制品不含任何转染试剂、阳离子载体、碳水化合物载体、纳米颗粒载体、或蛋白质载体。例如，环状多核糖核苷酸的裸递送配制品是包含无共价修饰的环状多核糖核苷酸并且不含载体的配制品。
术语“稀释剂”意指包含本文所述的组合物(例如，包含环状多核糖核苷酸的组合物)可以稀释或溶解于其中的非活性溶剂的媒介物。稀释剂可以是RNA增溶剂、缓冲液、等渗剂、或其混合物。稀释剂可以是液体稀释剂或固体稀释剂。液体稀释剂的非限制性实例包括水或其他溶剂、增溶剂和乳化剂，诸如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油(特别是棉籽油、落花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和脱水山梨糖醇的脂肪酸酯、和1,3-丁二醇。固体稀释剂的非限制性实例包括碳酸钙、碳酸钠、磷酸钙、磷酸二钙、硫酸钙、磷酸氢钙、磷酸钠、乳糖、蔗糖、纤维素、微晶纤维素、高岭土、甘露醇、山梨糖醇、肌醇、氯化钠、干淀粉、玉米淀粉、或糖粉。
通过援引并入
本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请通过援引并入本文，其程度如同明确地和单独地指示将每篇单独的公开、专利或专利申请通过援引并入本文。
附图说明
当结合附图阅读时，将更好地理解本发明的实施例的以下详细描述。出于说明本发明的目的，在附图中示出了本发明示例的实施例。然而，应理解，本发明不限于附图中所示实施例的精确安排和手段。
图1A、1B和1C显示，经修饰的环状RNA在细胞中被翻译。
图2A、2B和2C显示，与未修饰的环状RNA相比，如通过转染细胞中的MDA5、OAS和IFN-β表达评估的，经修饰的环状RNA对细胞具有降低的免疫原性。
图3显示，与未修饰的环状RNA相比，如通过细胞中的RIG-I、MDA5、IFN-β、和OAS表达评估的，杂交修饰的环状RNA具有降低的免疫原性。
图4示出了环状RNA的示例性体外产生过程示意图，该环状RNA含有起始密码子、编码GFP的ORF(开放阅读框)、交错元件(2A)、加密原、和IRES(内部核糖体进入位点)。
图5示出了环状RNA的示例性体内产生过程的示意图。
图6示出了示例性环状RNA的设计，该环状RNA包含起始密码子、编码GFP的ORF、交错元件(2A)、和加密原。
图7示出了展示两种不同的环状RNA的体内化学计量蛋白质表达的示意图(A和B)。
图8是展示了在小鼠模型中示例性环状RNA的体内蛋白质表达的示意图。
图9示出了具有一个双链RNA区段的示例性环状RNA的示意图，可以对该示例性环状RNA进行其结构信息的斑点印迹分析。
图10示出了具有准螺旋结构(HDVmin)的示例性环状RNA的示意图，可以对该示例性环状RNA进行其结构信息的SHAPE分析。
图11示出了具有功能性准螺旋结构(HDVmin)的示例性环状RNA的示意图，该示例性环状RNA展示了HDAg结合活性。
图12是展示了示例性的可自复制的环状RNA的转录、自裂解和连接的示意图。
图13是展示了不同的示例性环状RNA的体外产生的变性PAGE凝胶图像。
图14是汇总了不同示例性环状RNA的环化效率的图。
图15是展示了示例性环状RNA与其线性对应物相比降解易感性降低的变性PAGE凝胶图像。
图16是展示了在示例性纯化过程之后的示例性环状RNA的变性PAGE凝胶图像。
图17是展示了通过示例性环状RNA(缺少IRES、帽、5’和3’UTR)的Flag蛋白(约15kDa)表达的蛋白质印迹图像。
图18是展示了示例性环状RNA的滚环翻译的蛋白质印迹图像。
图19示出了蛋白质印迹图像，这些蛋白质印迹图像展示了来自具有或不具有示例性交错元件的不同示例性环状RNA的离散蛋白质或连续长肽的产生。
图20A是蛋白质印迹图像，该蛋白质印迹图像展示了具有示例性交错元件或终止元件(终止密码子)的不同示例性环状RNA之间的蛋白质表达的比较。
图20B是汇总了来自从两种示例性环状RNA翻译的蛋白质产物的蛋白质印迹分析的信号强度的图。
图21是汇总了与媒介物对照RNA相比，示例性环状RNA及其线性对应物的翻译产物的萤光素酶活性的图。
图22是总结了在测试示例性环状RNA的半衰期的时程实验中在不同采集时间点的RNA数量的图。
图23A是示出了使用捕获线性和环状RNA两者的引物进行的对递送至细胞后24小时的线性和环状RNA水平的qRT-PCR分析的图。
图23B是示出了使用对环状RNA具有特异性的引物进行的对线性和环状RNA水平的qRT-PCR分析的图。
图24是示出了针对EGF蛋白和β-微管蛋白上样对照探测的来自环状RNA和线性RNA的细胞裂解物的印迹的图像。
图25是示出了对来自用环状RNA或线性RNA转染的293T细胞的免疫相关基因的qRT-PCR分析的图。
图26是示出了由环状RNA经由滚环翻译表达的蛋白质的萤光素酶活性的图。
图27是示出了由环状RNA或线性RNA表达的蛋白质的萤光素酶活性的图。
图28是示出了由线性RNA或环状RNA经由滚环翻译表达的蛋白质的萤光素酶活性的图。
图29是示出了由环状RNA经由IRES翻译起始表达的蛋白质的萤光素酶活性的图。
图30是示出了由环状RNA经由IRES起始和滚环翻译表达的蛋白质的萤光素酶活性的图。
图31是示出了环状RNA或线性RNA的表达产物的蛋白质印迹的图像。
图32是示出了环状RNA或线性RNA的表达产物的蛋白质印迹的图像。
图33示出了示例性环状RNA的具有准双链结构的预测结构。
图34示出了示例性环状RNA的具有准螺旋结构的预测结构。
图35示出了示例性环状RNA的具有与重复序列连接的准螺旋结构的预测结构。
图36展示了如下的实验数据，即通过示例性环状RNA的RNA酶H降解产生的核酸降解产物与环状RNA(而非连环化RNA)一致。
图37示出了用于产生各种RNA长度所生成的不同长度DNA的电泳图像。
图38示出了如下的实验数据，即使用RNA酶R处理和针对各种长度的环状接合点的qPCR分析证实了RNA环化。
图39示出了具有蛋白质结合位点的示例性环状RNA的生成。
图40示出了具有miRNA结合位点的示例性环状RNA的生成。
图41示出了通过自剪接对示例性环状RNA的生成。
图42示出了如下的实验数据，该数据展示了与线性对照相比，环状RNA在正进行分裂的细胞中有更高的稳定性。
图43示出了如下的实验数据，该数据展示了具有多个表达序列的示例性环状RNA的蛋白质表达以及具有多个表达序列的示例性环状RNA的滚环翻译。
图44显示，在注射至小鼠中之后，在注射后3天、4天和7天在小鼠肝脏中检测到的环状RNA水平高于线性RNA。
图45A和45B显示，在将表达高斯萤光素酶的环状RNA或线性RNA注射至小鼠中之后，在给予环状RNA后1天、2天、7天、11天、16天和23天在血浆中检测到高斯萤光素酶活性，而仅在给予经修饰的线性RNA后1天和2天在血浆中检测到其活性。
图46显示，在注射RNA之后，在施用RNA后16天在肝脏和脾脏中检测到环状RNA而非线性RNA。
图47显示，在注射RNA之后，如通过RIG-I、MDA-5、IFN-B和OAS评估的，线性RNA而非环状RNA显示出免疫原性。
图48示出了不同的示例性环化方法。
图49显示，与经修饰的mRNA相比并且与仅用未修饰的核苷酸生成的环状RNA相比，含有经修饰的核苷酸的环状RNA具有降低的体内免疫原性。
图50显示，含有经修饰的核苷酸的环状RNA与其完全未修饰的对应物和经修饰的mRNA相比具有增加的体内稳定性。
具体实施方式
本发明总体上涉及环状多核糖核苷酸的药物组合物和制剂及其用途。在一些实施例中，该环状多核糖核苷酸包含至少一种经修饰的多核糖核苷酸和连续的未修饰核苷酸的第一部分。在一些实施例中，将该经修饰的环状多核糖核苷酸递送至受试者。
本披露提供了一种在受试者中降低或减少环状多核糖核苷酸的免疫原性的方法，该方法包括提供杂交修饰的环状多核糖核苷酸，其中该杂交修饰的环状多核糖核苷酸包含至少一种经修饰的多核糖核苷酸和具有不超过5％的经修饰的核苷酸的连续核苷酸的第一部分；将该杂交修饰的环状多核糖核苷酸施用至该受试者；以及在该受试者的细胞或组织中获得与相应的未修饰的环状多核糖核苷酸相比减少的该杂交修饰的环状多核糖核苷酸的免疫原性。在一些实施例中，在受试者中减少或降低环状多核糖核苷酸的免疫原性的方法包括：提供杂交修饰的环状多核糖核苷酸，其中该杂交修饰的环状多核糖核苷酸包含至少一种经修饰的核苷酸和第一部分，该第一部分包含至少约5至1000个连续核苷酸，这些连续核苷酸具有不超过5％的经修饰的核苷酸；将该杂交修饰的环状多核糖核苷酸施用至该受试者；以及在该受试者的细胞或组织中获得与相应的未修饰的环状多核糖核苷酸相比减少的该杂交修饰的环状多核糖核苷酸的免疫原性。在一些实施例中，在受试者中降低或减少环状多核糖核苷酸的免疫原性的方法包括提供杂交修饰的环状多核糖核苷酸，其中该杂交修饰的环状多核糖核苷酸包含至少一种经修饰的多核糖核苷酸和连续的未修饰核苷酸的第一部分；将该杂交修饰的环状多核糖核苷酸施用至该受试者；以及在该受试者的细胞或组织中获得与相应的未修饰的环状多核糖核苷酸相比减少的该杂交修饰的环状多核糖核苷酸的免疫原性。在一些实施例中，该第一部分包含IRES。在一些实施例中，该第一部分包含至少约5至1000个连续的未修饰核苷酸。在一些实施例中，该第一部分缺少5’-甲基胞苷或假尿苷。在一些实施例中，该第一部分中不超过5％的核苷酸是经修饰的核苷酸。
本披露提供了一种在受试者中表达一个或多个表达序列的方法，该方法包括提供杂交修饰的环状多核糖核苷酸，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸包含至少一种经修饰的多核糖核苷酸、具有不超过5％的经修饰的核苷酸的连续核苷酸的第一部分、和该一个或多个表达序列；将该杂交修饰的环状多核糖核苷酸施用至该受试者；以及在该受试者的细胞或组织中获得与完全修饰的环状多核糖核苷酸中相应的一个或多个表达序列的表达相比增加的该一个或多个表达序列的表达。在一些实施例中，在受试者中表达一个或多个表达序列的方法包括：提供杂交修饰的环状多核糖核苷酸，其中该杂交修饰的环状多核糖核苷酸包含至少一种经修饰的核苷酸和第一部分，该第一部分包含至少约5至1000个连续核苷酸，这些连续核苷酸具有不超过5％的经修饰的核苷酸；将该杂交修饰的环状多核糖核苷酸施用至该受试者；以及在该受试者的细胞或组织中获得与完全修饰的环状多核糖核苷酸对应物中的一个或多个表达序列的表达相比增加的该一个或多个表达序列的表达。在一些实施例中，在受试者中表达一个或多个表达序列的方法包括提供杂交修饰的环状多核糖核苷酸，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸包含至少一种经修饰的多核糖核苷酸、连续的未修饰核苷酸的第一部分、和该一个或多个表达序列；将该杂交修饰的环状多核糖核苷酸施用至该受试者；以及在该受试者的细胞或组织中获得与完全修饰的环状多核糖核苷酸中相应的一个或多个表达序列的表达相比增加的该一个或多个表达序列的表达。在一些实施例中，该第一部分包含IRES。在一些实施例中，该第一部分包含至少约5至1000个连续的未修饰核苷酸。在一些实施例中，该第一部分缺少5’-甲基胞苷或假尿苷。在一些实施例中，该第一部分中不超过5％的核苷酸是经修饰的核苷酸。
本披露提供了一种在受试者中增加环状多核糖核苷酸的稳定性的方法，该方法包括提供杂交的环状多核糖核苷酸，其中该杂交修饰的环状多核糖核苷酸包含至少一种经修饰的多核糖核苷酸和具有不超过5％的经修饰的核苷酸的连续核苷酸的第一部分；将该杂交修饰的环状多核糖核苷酸施用至该受试者；以及在该受试者的细胞或组织中获得与相应的未修饰的环状多核糖核苷酸相比增加的该杂交修饰的环状多核糖核苷酸的稳定性。在一些实施例中，在受试者中增加环状多核糖核苷酸的稳定性的方法包括：提供杂交修饰的环状多核糖核苷酸，其中该杂交修饰的环状多核糖核苷酸包含至少一种经修饰的核苷酸和第一部分，该第一部分包含至少约5至1000个连续核苷酸，这些连续核苷酸具有不超过5％的经修饰的核苷酸；将该杂交修饰的环状多核糖核苷酸施用至该受试者；以及在该受试者的细胞或组织中获得与相应的未修饰的环状多核糖核苷酸相比增加的该杂交修饰的环状多核糖核苷酸的稳定性。在一些实施例中，在受试者中增加环状多核糖核苷酸的稳定性的方法包括提供杂交的环状多核糖核苷酸，其中该杂交修饰的环状多核糖核苷酸包含至少一种经修饰的多核糖核苷酸和连续的未修饰核苷酸的第一部分；将该杂交修饰的环状多核糖核苷酸施用至该受试者；以及在该受试者的细胞或组织中获得与相应的未修饰的环状多核糖核苷酸相比增加的该杂交修饰的环状多核糖核苷酸的稳定性。在一些实施例中，该第一部分包含IRES。在一些实施例中，该第一部分包含至少约5至1000个连续的未修饰核苷酸。在一些实施例中，该第一部分缺少5’-甲基胞苷或假尿苷。在一些实施例中，该第一部分中不超过5％的核苷酸是经修饰的核苷酸。
使用经修饰的环状多核糖核苷酸的方法
在一些方面，本文所述的本发明包括使用杂交修饰的环状多核糖核苷酸的组合物和递送杂交修饰的环状多核糖核苷酸的方法。在一些实施例中，将该杂交修饰的环状多核糖核苷酸递送至受试者。与相应的未修饰的环状多核糖核苷酸相比，向受试者施用如本文所述的杂交修饰的环状多核糖核苷酸可以在该受试者的细胞或组织中导致降低或减少的免疫原性、增加的翻译效率(例如，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸中一个或多个表达序列的增加表达)、或增加的稳定性。与完全修饰的环状多核糖核苷酸对应物相比，向受试者施用如本文所述的杂交修饰的环状多核糖核苷酸可以在该受试者的细胞或组织中导致增加的翻译效率(例如，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸中一个或多个表达序列的增加表达)。在一些实施例中，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸包含至少一种经修饰的多核糖核苷酸和连续的未修饰核苷酸的第一部分。在一些实施例中，本披露提供了一种使用杂交修饰的环状多核糖核苷酸的方法，其中该杂交修饰的环状多核糖核苷酸包含至少一种经修饰的核苷酸和第一部分，并且其中该第一部分包含至少约5个连续的未修饰核苷酸。在一些实施例中，该杂交的环状多核糖核苷酸包含一个或多个表达序列。
在一些实施例中，该第一部分包含至少约5至1000个连续核苷酸，这些连续核苷酸具有不超过5％的经修饰的核苷酸。在一些实施例中，该第一部分包含至少约5至1000个连续的未修饰核苷酸。在一些实施例中，该第一部分缺少5’-甲基胞苷、假尿苷、或N1-甲基-假尿苷。在一些实施例中，该第一部分中不超过5％的核苷酸是经修饰的。在一些实施例中，该第一部分中不超过0％、1％、2％、3％、4％、或5％的核苷酸是经修饰的。在一些实施例中，该第一部分中没有核苷酸是经修饰的。在一些实施例中，该第一部分是IRES。在一些实施例中，该第一部分是包含不超过5％的经修饰的核苷酸的IRES。在一些实施例中，该第一部分是不包含经修饰的核苷酸(例如，仅包含未修饰的核苷酸)的IRES。在一些实施例中，该第一部分是由未修饰的核苷酸组成的IRES。在一些实施例中，第一部分包含由未修饰的核苷酸组成的结合位点，该结合位点被配置为结合至蛋白质、肽、生物分子、DNA、RNA、或细胞靶标。在一些实施例中，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸具有翻译能力。在一些实施例中，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸是在药物组合物中，该药物组合物进一步包含药学上可接受的载体或赋形剂。
杂交修饰的环状多核糖核苷酸可以包含至少一种经修饰的核苷酸和第一部分，该第一部分包含连续的未修饰核苷酸。经修饰的核苷酸在该第一部分之外。杂交修饰的环状多核糖核苷酸的经修饰的多核糖核苷酸可以是具有对未修饰的天然核糖核苷酸的化学组成(诸如如表1中的化学式所示的天然未修饰的核苷酸腺苷(A)、尿苷(U)、鸟嘌呤(G)、胞苷(C)，和单磷酸酯)的一个或多个化学修饰的类似物或衍生物。该经修饰的核糖核苷酸的化学修饰可以是对核糖核苷酸的任何一个或多个官能团，诸如糖、核碱基或核苷间键(例如对连接的磷酸酯/对磷酸二酯键/对磷酸二酯主链)的修饰。在一些实施例中，经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交的环状多核糖核苷酸)的经修饰的核苷酸可以是本领域技术人员已知的任何修饰，诸如在或如在Gilbert,W.V.等人Science[科学].2016年6月17日；352(6292):1408-1412中鉴定的那些，将该文献通过援引并入本文。例如，修饰可以如表2中所述的。
表1.未修饰的天然核糖核苷
Figure BDA0003282415270000301
Figure BDA0003282415270000311
表2.示例性核苷酸修饰
Figure BDA0003282415270000312
Figure BDA0003282415270000321
在一些实施例中，经修饰的核苷酸选自下组，该组由以下组成：N(6)甲基腺苷(m6A)、5’-甲基胞苷(5mC)、假尿苷、2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基(2’-O-MOE)、2’-O-氨基丙基、2’-脱氧、T-脱氧-2’-氟、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)、2’-O-二甲基氨基乙基(2’-O-DMAOE)、2’-O-二甲基氨基丙基(2’-O-DMAP)、T-O-二甲基氨基乙基氧基乙基(2’-O-DMAEOE)、2’-O-N-甲基乙酰胺基(2’-O-NMA)、锁核酸(LNA)、乙烯核酸(ENA)、肽核酸(PNA)、1’,5’-脱水己糖醇核酸(HNA)、吗啉代、甲基膦酸酯核苷酸、硫醇膦酸酯核苷酸、和2’-氟N3-P5’-亚磷酰胺。在一些实施例中，经修饰的核苷酸可以是本领域技术人员已知的任何经修饰的核苷酸，诸如在或如在Gilbert,W.V.等人Science[科学].2016年6月17日；352(6292):1408-1412中鉴定的那些，将该文献通过援引并入本文。
如本文所述的杂交修饰的环状多核糖核苷酸的该第一部分包含至少约5至1000个连续核苷酸。在一些实施例中，该第一部分包含至少约5至1000、10至1000、20至1000、50至1000、100至1000、200至1000、300至1000、400至1000、500至1000、600至1000、700至1000、800至1000、900至1000、或900至2000个连续核苷酸。如本文所述的杂交修饰的环状多核糖核苷酸的该第一部分可以包含连续核苷酸，这些连续核苷酸具有不超过5％的经修饰的核苷酸。在一些实施例中，该第一部分包含连续核苷酸，这些连续核苷酸包含不超过0％、1％、2％、3％、4％、或5％的经修饰的核苷酸。在一些实施例中，该第一部分是IRES。在一些实施例中，该第一部分是包含不超过5％的经修饰的核苷酸的IRES。在一些实施例中，该第一部分是不包含经修饰的核苷酸(例如，仅包含未修饰的核苷酸)的IRES。在一些实施例中，该第一部分是由未修饰的核苷酸组成的IRES。如本文所述的杂交修饰的环状多核糖核苷酸的该第一部分可以包含连续的未修饰核苷酸。该第一部分可以包含至少约5个连续的未修饰核苷酸。在一些实施例中，该第一部分包含至少约5至1000个连续的未修饰核苷酸。在一些实施例中，该第一部分包含至少约5至1000、10至1000、20至1000、50至1000、100至1000、200至1000、300至1000、400至1000、500至1000、600至1000、700至1000、800至1000、900至1000、或900至2000个连续的未修饰核苷酸。在一些实施例中，该第一部分包含至少约5、10、20、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、或1000个、或其间的任何数量的连续的未修饰核苷酸。在一些实施例中，该第一部分包含5、10、20、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000个、或其间的任何数量的连续的未修饰核苷酸。该第一部分可以包含IRES。在一些实施例中，该第一部分缺少5’-甲基胞苷、假尿苷、或N1-甲基-假尿苷。在一些实施例中，该第一部分缺少选自下组的经修饰的核苷酸，该组由以下组成：N(6)甲基腺苷(m6A)、5’-甲基胞苷(5mC)、假尿苷、2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基(2’-O-MOE)、2’-O-氨基丙基、2’-脱氧、T-脱氧-2’-氟、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)、2’-O-二甲基氨基乙基(2’-O-DMAOE)、2’-O-二甲基氨基丙基(2’-O-DMAP)、T-O-二甲基氨基乙基氧基乙基(2’-O-DMAEOE)、2’-O-N-甲基乙酰胺基(2’-O-NMA)、锁核酸(LNA)、乙烯核酸(ENA)、肽核酸(PNA)、1’,5’-脱水己糖醇核酸(HNA)、吗啉代、甲基膦酸酯核苷酸、硫醇膦酸酯核苷酸、和2’-氟N3-P5’-亚磷酰胺。在一些实施例中，该第一部分缺乏本领域技术人员已知的核苷酸修饰，诸如在或如在Gilbert,W.V.等人Science[科学].2016年6月17日；352(6292):1408-1412中鉴定的那些，将该文献通过援引并入本文。
如本文所述的杂交修饰的环状多核糖核苷酸可以在该第一部分之外包含5’-甲基胞苷、假尿苷、或其组合。该杂交修饰的环状多核糖核苷酸可以包含选自下组的经修饰的核苷酸，该组由以下组成：N(6)甲基腺苷(m6A)、5’-甲基胞苷(5mC)、假尿苷、2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基(2’-O-MOE)、2’-O-氨基丙基、2’-脱氧、T-脱氧-2’-氟、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)、2’-O-二甲基氨基乙基(2’-O-DMAOE)、2’-O-二甲基氨基丙基(2’-O-DMAP)、T-O-二甲基氨基乙基氧基乙基(2’-O-DMAEOE)、2’-O-N-甲基乙酰胺基(2’-O-NMA)、锁核酸(LNA)、乙烯核酸(ENA)、肽核酸(PNA)、1’,5’-脱水己糖醇核酸(HNA)、吗啉代、甲基膦酸酯核苷酸、硫醇膦酸酯核苷酸、和2’-氟N3-P5’-亚磷酰胺，其中该经修饰的核苷酸在该第一部分之外。在一些实施例中，在该第一部分之外的该经修饰的核苷酸可以是本领域技术人员已知的任何经修饰的核苷酸，诸如在或如在Gilbert,W.V.等人Science[科学].2016年6月17日；352(6292):1408-1412中鉴定的那些，将该文献通过援引并入本文。
降低的免疫原性
在受试者中降低或减少环状多核糖核苷酸的免疫原性的方法可以包括提供杂交的环状多核糖核苷酸，其中该杂交修饰的环状多核糖核苷酸包含至少一种经修饰的多核糖核苷酸和连续的未修饰核苷酸的第一部分；将该杂交修饰的环状多核糖核苷酸施用至该受试者；以及在该受试者的细胞或组织中获得与相应的未修饰的环状多核糖核苷酸相比降低或减少的该经修饰的环状多核糖核苷酸的免疫原性。在一些实施例中，该第一部分包含至少约5、10、20、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、或1000个连续的未修饰核苷酸。在一些实施例中，该第一部分中不超过5％的核苷酸是经修饰的。在一些实施例中，该第一部分中不超过1％、2％、3％、4％、或5％的核苷酸是经修饰的。在一些实施例中，该第一部分中没有核苷酸是经修饰的。在一些实施例中，该第一部分是IRES。在一些实施例中，第一部分包含由未修饰的核苷酸组成的结合位点，该结合位点被配置为结合至蛋白质、肽、生物分子、DNA、RNA、或细胞靶标。在一些实施例中，该第一部分是包含不超过5％的经修饰的核苷酸的IRES。在一些实施例中，该第一部分是不包含经修饰的核苷酸的IRES。在一些实施例中，该第一部分是由未修饰的核苷酸组成的IRES。在一些实施例中，在该受试者的细胞或组织中，该经修饰的环状多核糖核苷酸的降低或减少的免疫原性与相应的未修饰的环状多核糖核苷酸相比低至少约1.1、1.2、1.3、1.5、1.6、1.8、2、2.2、2.5、2.8、3、3.2、3.3、3.5、3.8、4.0、4.2、4.5、4.8、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、或10.0倍。
在一些实施例中，在施用至受试者之后，如本文披露的杂交修饰的环状多核糖核苷酸具有与相应的未修饰的环状多核糖核苷酸相比降低或减少的免疫原性。在一些实施例中，在施用至受试者之后，如本文披露的杂交修饰的环状多核糖核苷酸具有比相应的未修饰的环状多核糖核苷酸低至少约1.1、1.2、1.3、1.5、1.6、1.8、2、2.2、2.5、2.8、3、3.2、3.3、3.5、3.8、4.0、4.2、4.5、4.8、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、或10.0倍的免疫原性。在一些实施例中，如本文所述的免疫原性通过在将该杂交修饰的环状多核糖核苷酸施用至受试者之后RIG-I、TLR-3、TLR-7、TLR-8、MDA-5、LGP-2、OAS、OASL、PKR、和IFN-β中的至少一种的表达或信号传导或激活水平来评估。
增加的翻译效率
本披露提供了一种在受试者中表达一个或多个表达序列的方法，该方法包括提供杂交修饰的环状多核糖核苷酸，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸包含至少一种经修饰的多核糖核苷酸、连续的未修饰核苷酸的第一部分、和该一个或多个表达序列；将该杂交修饰的环状多核糖核苷酸施用至该受试者；以及在该受试者的细胞或组织中获得与完全修饰的环状多核糖核苷酸对应物的相应的一个或多个表达序列的表达相比增加的该一个或多个表达序列的表达。在一些实施例中，该第一部分包含至少约5、10、20、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、或1000个连续的未修饰核苷酸。在一些实施例中，该第一部分中不超过5％的核苷酸是经修饰的。在一些实施例中，该第一部分中不超过1％、2％、3％、4％、或5％的核苷酸是经修饰的。在一些实施例中，该第一部分中没有核苷酸是经修饰的。在一些实施例中，该第一部分是IRES。在一些实施例中，第一部分包含由未修饰的核苷酸组成的结合位点，该结合位点被配置为结合至蛋白质、肽、生物分子、DNA、RNA、或细胞靶标。在一些实施例中，该第一部分是包含不超过5％的经修饰的核苷酸的IRES。在一些实施例中，该第一部分是不包含经修饰的核苷酸的IRES。在一些实施例中，该第一部分是由未修饰的核苷酸组成的IRES。在一些实施例中，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸包含一个或多个表达序列。
在一些实施例中，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸的该一个或多个表达序列的增加表达相似于或高于完全修饰的环状多核糖核苷酸对应物的一个或多个表达序列。在一些实施例中，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸的该一个或多个表达序列的增加表达比完全修饰的环状多核糖核苷酸对应物的一个或多个表达序列高至少约0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.5、1.6、1.8、2、2.2、2.5、2.8、或3倍。在一些实施例中，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸的该一个或多个表达序列的表达的增加表达相似于或高于相应的未修饰的环状多核糖核苷酸。在一些实施例中，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸的该一个或多个表达序列的增加表达比相应的未修饰的环状多核糖核苷酸高至少约0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.5、1.6、1.8、2、2.2、2.5、2.8、或3倍。
在一些实施例中，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸的该一个或多个序列的表达的增加表达比完全修饰的环状多核糖核苷酸对应物高至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％、200％、250％、300％、350％、400％、450％、500％、600％、70％、800％、900％、1000％、2000％、5000％、10000％、100000％、或更多。在一些实施例中，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸的该一个或多个序列的表达的增加表达比完全修饰的环状多核糖核苷酸对应物高至少约10％。在一些实施例中，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸的该一个或多个序列的表达的增加表达比完全修饰的环状多核糖核苷酸对应物高至少约20％。在一些实施例中，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸的该一个或多个序列的表达的增加表达比完全修饰的环状多核糖核苷酸对应物高至少约50％。在一些实施例中，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸的该一个或多个序列的表达的增加表达比相应的未修饰的环状多核糖核苷酸的该表达高至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％、200％、250％、300％、350％、400％、450％、500％、600％、70％、800％、900％、1000％、2000％、5000％、10000％、100000％、或更多。在一些实施例中，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸的该一个或多个序列的表达的增加表达比相应的未修饰的环状多核糖核苷酸的该表达高至少约10％。在一些实施例中，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸的该一个或多个序列的表达的增加表达比相应的未修饰的环状多核糖核苷酸的该表达高至少约20％。在一些实施例中，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸的该一个或多个序列的表达的增加表达比相应的未修饰的环状多核糖核苷酸的该表达高至少约50％。在一些实施例中，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸的该一个或多个序列的表达的增加表达是在施用至受试者之后1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、28天、或更长时间、或其间的任一天。
在一些实施例中，在施用至受试者之后，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸的该一个或多个表达序列的表达具有相似于或高于完全修饰的环状多核糖核苷酸对应物的一个或多个表达序列的翻译效率。在一些实施例中，在施用至受试者之后，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸的该一个或多个表达序列具有比完全修饰的环状多核糖核苷酸对应物的一个或多个表达序列高至少约0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.5、1.6、1.8、2、2.2、2.5、2.8、或3倍的翻译效率。在一些实施例中，在施用至受试者之后，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸的该一个或多个表达序列的表达具有相似于或高于相应的未修饰的环状多核糖核苷酸的翻译效率。在一些实施例中，在施用至受试者之后，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸的该一个或多个表达序列具有比相应的未修饰的环状多核糖核苷酸高至少约0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.5、1.6、1.8、2、2.2、2.5、2.8、或3倍的翻译效率。
在一些实施例中，在施用至受试者之后1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、28天、或更长时间、或其间的任一天，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸的该一个或多个表达序列的表达具有相似于或高于完全修饰的环状多核糖核苷酸对应物的一个或多个表达序列。在一些实施例中，在施用至受试者之后1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、28天、或更长时间、或其间的任一天，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸的该一个或多个表达序列具有比完全修饰的环状多核糖核苷酸对应物的一个或多个表达序列高至少约0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.5、1.6、1.8、2、2.2、2.5、2.8、或3倍的翻译效率。在一些实施例中，在施用至受试者之后，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸的该一个或多个表达序列的表达具有相似于或高于相应的未修饰的环状多核糖核苷酸的翻译效率。在一些实施例中，在施用至受试者之后1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、28天、或更长时间、或其间的任一天，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸的该一个或多个表达序列具有比相应的未修饰的环状多核糖核苷酸高至少约0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.5、1.6、1.8、2、2.2、2.5、2.8、或3倍的翻译效率。
在一些实施例中，在施用至受试者之后1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、28天、或更长时间、或其间的任一天，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸的该一个或多个表达序列的增加表达相似于或高于具有第一部分(该第一部分包含超过5％，或至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或100％的经修饰核苷酸)的完全修饰的环状多核糖核苷酸对应物。在一些实施例中，在施用至受试者之后1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、28天、或更长时间、或其间的任一天，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸的该一个或多个表达序列的增加表达比具有第一部分(该第一部分包含超过5％，或至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或100％的经修饰的核苷酸)的完全修饰的环状多核糖核苷酸对应物高至少约1.1、1.2、1.3、1.5、1.6、1.8、2、2.2、2.5、2.8、3、3.2、3.3、3.5、3.8、4.0、4.2、4.5、4.8、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、或10.0倍。
在一些实施例中，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸的该一个或多个表达序列的增加表达相似于或高于具有第一部分(该第一部分包含超过5％，或至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或100％的经修饰的核苷酸)的完全修饰的环状多核糖核苷酸对应物。在一些实施例中，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸的该一个或多个表达序列的增加表达比具有第一部分(该第一部分包含超过5％，或至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或100％的经修饰的核苷酸)的完全修饰的环状多核糖核苷酸对应物高至少约1.1、1.2、1.3、1.5、1.6、1.8、2、2.2、2.5、2.8、3、3.2、3.3、3.5、3.8、4.0、4.2、4.5、4.8、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、或10.0倍。
在一些实施例中，在施用至受试者之后1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、28天、或更长时间、或其间的任一天，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸的该一个或多个表达序列的增加表达相似于或高于具有第一部分(该第一部分包含超过5％，或至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或100％的经修饰核苷酸)的完全修饰的环状多核糖核苷酸对应物。在一些实施例中，在施用至受试者之后1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、28天、或更长时间、或其间的任一天，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸的该一个或多个表达序列的增加表达比具有第一部分(该第一部分包含超过5％，或至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或100％的经修饰的核苷酸)的完全修饰的环状多核糖核苷酸对应物高至少约1.1、1.2、1.3、1.5、1.6、1.8、2、2.2、2.5、2.8、3、3.2、3.3、3.5、3.8、4.0、4.2、4.5、4.8、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、或10.0倍。
在一些实施例中，在施用至受试者之后1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、28天、或更长时间、或其间的任一天，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸的该一个或多个序列的表达的增加表达比具有第一部分(该第一部分包含超过5％，或至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或100％的经修饰的核苷酸)的完全修饰的环状多核糖核苷酸对应物的该表达高至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％、200％、250％、300％、350％、400％、450％、500％、600％、70％、800％、900％、1000％、2000％、5000％、10000％、100000％、或更多。在一些实施例中，在施用至受试者之后1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、28天、或更长时间、或其间的任一天，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸的该一个或多个表达序列的表达的增加表达比具有第一部分(该第一部分包含超过5％，或至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或100％的经修饰的核苷酸)的完全修饰的环状多核糖核苷酸对应物的该表达高至少约10％。在一些实施例中，在施用至受试者之后1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、28天、或更长时间、或其间的任一天，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸的该一个或多个表达序列的表达的增加表达比具有第一部分(该第一部分包含超过5％，或至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或100％的经修饰的核苷酸)的完全修饰的环状多核糖核苷酸对应物的该表达高至少约20％。在一些实施例中，在施用至受试者之后1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、28天、或更长时间、或其间的任一天，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸的该一个或多个表达序列的表达的增加表达比具有第一部分(该第一部分包含超过5％，或至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或100％的经修饰的核苷酸)的完全修饰的环状多核糖核苷酸对应物的该表达高至少约50％。
如本文所述，在一些实施例中，该翻译效率或增加的表达是在包含该杂交修饰的环状多核糖核苷酸或该相应的未修饰的环状多核糖核苷酸或该完全修饰的环状多核糖核苷酸对应物的细胞中、或者在体外翻译系统(例如，兔网织红细胞裂解物)中测量的。
增加的稳定性
本披露提供了一种在受试者中增加环状多核糖核苷酸的稳定性的方法，该方法包括提供杂交修饰的环状多核糖核苷酸，其中该杂交修饰的环状多核糖核苷酸包含至少一种经修饰的多核糖核苷酸和连续的未修饰核苷酸的第一部分；将该杂交修饰的环状多核糖核苷酸施用至该受试者；以及在该受试者的细胞或组织中获得与相应的未修饰的环状多核糖核苷酸相比增加的该杂交修饰的环状多核糖核苷酸的稳定性。在一些实施例中，该第一部分包含至少约5、10、20、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、或1000个连续的未修饰核苷酸。在一些实施例中，该第一部分中不超过5％的核苷酸是经修饰的。在一些实施例中，该第一部分中不超过1％、2％、3％、4％、或5％的核苷酸是经修饰的。在一些实施例中，该第一部分中没有核苷酸是经修饰的。在一些实施例中，该第一部分是IRES。在一些实施例中，第一部分包含由未修饰的核苷酸组成的结合位点，该结合位点被配置为结合至蛋白质、肽、生物分子、DNA、RNA、或细胞靶标。在一些实施例中，该第一部分是包含不超过5％的经修饰的核苷酸的IRES。在一些实施例中，该第一部分是不包含经修饰的核苷酸的IRES。在一些实施例中，该第一部分是由未修饰的核苷酸组成的IRES。在一些实施例中，在该受试者的细胞或组织中，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸的增加稳定性与相应的未修饰的环状多核糖核苷酸相比高至少约1.1、1.2、1.3、1.5、1.6、1.8、2、2.2、2.5、2.8、3、3.2、3.3、3.5、3.8、4.0、4.2、4.5、4.8、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、或10.0倍。
在一些实施例中，在施用至受试者之后，如本文披露的杂交修饰的环状多核糖核苷酸具有与相应的未修饰的环状多核糖核苷酸相比增加的稳定性。在一些实施例中，在施用至受试者之后，如披露的杂交修饰的环状多核糖核苷酸具有比相应的未修饰的环状多核糖核苷酸高至少约1.1、1.2、1.3、1.5、1.6、1.8、2、2.2、2.5、2.8、3、3.2、3.3、3.5、3.8、4.0、4.2、4.5、4.8、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、或10.0倍的增加稳定性。
在一些实施例中，在施用至受试者之后1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、28天、或更长时间、或其间的任一天，如本文披露的杂交修饰的环状多核糖核苷酸具有与相应的未修饰的环状多核糖核苷酸相比增加的稳定性。在一些实施例中，在施用至受试者之后14天，如本文披露的杂交修饰的环状多核糖核苷酸具有与相应的未修饰的环状多核糖核苷酸相比增加的稳定性。在一些实施例中，在施用至受试者之后1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、28天、或更长时间、或其间的任一天，如披露的杂交修饰的环状多核糖核苷酸具有比相应的未修饰的环状多核糖核苷酸高至少约1.1、1.2、1.3、1.5、1.6、1.8、2、2.2、2.5、2.8、3、3.2、3.3、3.5、3.8、4.0、4.2、4.5、4.8、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、或10.0倍的增加稳定性。在一些实施例中，在施用至受试者之后14天，如披露的杂交修饰的环状多核糖核苷酸具有比相应的未修饰的环状多核糖核苷酸高至少约1.1、1.2、1.3、1.5、1.6、1.8、2、2.2、2.5、2.8、3、3.2、3.3、3.5、3.8、4.0、4.2、4.5、4.8、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、或10.0倍的增加稳定性。
在一些实施例中，在施用至受试者之后，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸具有比相应的未修饰的环状多核糖核苷酸更高的半衰期。在一些实施例中，在施用至受试者之后，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸具有比相应的未修饰的环状多核糖核苷酸高至少约1.1、1.2、1.3、1.5、1.6、1.8、2、2.2、2.5、2.8、3、3.2、3.3、3.5、3.8、4.0、4.2、4.5、4.8、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、或10.0倍的半衰期。在一些实施例中，通过以下方式来测量半衰期：将该杂交修饰的环状多核糖核苷酸或该相应的未修饰的环状多核糖核苷酸引入至细胞中并且测量该细胞内所引入的杂交修饰的环状多核糖核苷酸或相应的未修饰的环状多核糖核苷酸的水平。
在一些实施例中，在施用至受试者之后，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸具有至少为相应的未修饰的环状多核糖核苷酸的半衰期的半衰期。在一些实施例中，在施用至受试者之后，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸具有相比于相应的未修饰的环状多核糖核苷酸的半衰期增加的半衰期。在一些实施例中，在施用至受试者之后，半衰期增加了约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、或更多。在一些实施例中，在施用至受试者之后，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸在细胞中的半衰期或持续性是至少约1小时至约30天，或至少约2小时、6小时、12小时、18小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、60天、或更长时间或其间的任何时间。在某些实施例中，在施用至受试者之后，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸在细胞中的半衰期或持续性是不超过约10分钟至约7天、或不超过约1小时、2小时，3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、24小时、36小时、48小时、60小时、72小时、4天、5天、6天、7天、或其间的任何时间。在一些实施例中，在施用至受试者之后，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸在正进行细胞分裂的细胞中具有半衰期或持续性。在一些实施例中，在施用至受试者之后，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸在分裂后细胞中具有半衰期或持续性。在某些实施例中，在施用至受试者之后，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸在正进行分裂的细胞中的半衰期或持续性大于约10分钟至约30天，或是至少约1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、60天、或更长时间或其间的任何时间。
在一些实施例中，在施用至受试者之后，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸在细胞分裂期间持续存在于细胞中。在一些实施例中，在施用至受试者之后，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸在有丝分裂后持续存在于子细胞中。在一些实施例中，在施用至受试者之后，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸在细胞内复制并传递至子细胞。在一些实施例中，在施用至受试者之后，细胞以至少25％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、或99％的效率将至少一种杂交修饰的环状多核糖核苷酸传递至子细胞。在一些实施例中，在施用至受试者之后，正经历减数分裂的细胞以至少25％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、或99％的效率将该杂交修饰的环状多核糖核苷酸传递至子细胞。在一些实施例中，在施用至受试者之后，正经历有丝分裂的细胞以至少25％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、或99％的效率将该杂交修饰的环状多核糖核苷酸传递至子细胞。
经修饰的环状多核糖核苷酸
在本文所述的方法中使用经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)。在一些实施例中，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸包含至少一种经修饰的多核糖核苷酸和连续的未修饰核苷酸的第一部分。在一些实施例中，如本文所述的杂交修饰的环状多核糖核苷酸包含至少一种经修饰的核苷酸和第一部分，并且其中该第一部分包含至少约5、10、20、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、或1000个连续的未修饰核苷酸。在一些实施例中，该第一部分中不超过5％的核苷酸是经修饰的。在一些实施例中，该第一部分中不超过0％、1％、2％、3％、4％、或5％的核苷酸是经修饰的。在一些实施例中，该第一部分中没有核苷酸是经修饰的。在一些实施例中，该第一部分是IRES。在一些实施例中，该第一部分是包含不超过5％的经修饰的核苷酸的IRES。在一些实施例中，该第一部分是不包含经修饰的核苷酸的IRES。在一些实施例中，该第一部分是由未修饰的核苷酸组成的IRES。在一些实施例中，第一部分包含由未修饰的核苷酸组成的结合位点，该结合位点被配置为结合至蛋白质、肽、生物分子、DNA、RNA、或细胞靶标。在一些实施例中，该第一部分缺少5’-甲基胞苷、假尿苷、或N1-甲基-假尿苷。在一些实施例中，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸是在药物组合物中，该药物组合物进一步包含药学上可接受的载体或赋形剂。在一些实施例中，将该杂交修饰的环状多核糖核苷酸递送至受试者。与完全修饰的环状多核糖核苷酸对应物相比，如本文所述的杂交修饰的环状多核糖核苷酸可以具有降低或减少的免疫原性、增加的翻译效率(例如，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸中一个或多个表达序列的增加表达)、或增加的稳定性。
该第一部分在该杂交修饰的环状多核糖核苷酸中包含连续核苷酸，这些连续核苷酸具有不超过5％的经修饰的核苷酸。在一些实施例中，该第一部分中不超过0％、1％、2％、3％、4％、或5％的连续核苷酸是经修饰的。该第一部分在该杂交修饰的环状多核糖核苷酸中包含连续的未修饰核苷酸。该第一部分可以包含至少约5个连续的未修饰核苷酸。在一些实施例中，该第一部分包含至少约5、10、20、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、或1000个连续核苷酸，这些连续核苷酸具有不超过0％、1％、2％、3％、4％、或5％的经修饰的核苷酸。在一些实施例中，该第一部分包含至少约5至1000个连续核苷酸，这些连续核苷酸具有不超过0％、1％、2％、3％、4％、或5％的经修饰的核苷酸。在一些实施例中，该第一部分包含至少约5至1000、10至1000、20至1000、50至1000、100至1000、200至1000、300至1000、400至1000、500至1000、600至1000、700至1000、800至1000、900至1000、或900至2000个连续核苷酸，这些连续核苷酸具有不超过0％、1％、2％、3％、4％、或5％的经修饰的核苷酸。在一些实施例中，该第一部分包含至少约5、10、20、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、或1000个连续的未修饰核苷酸。在一些实施例中，该第一部分包含至少约5至1000个连续的未修饰核苷酸。在一些实施例中，该第一部分包含至少约5至1000、10至1000、20至1000、50至1000、100至1000、200至1000、300至1000、400至1000、500至1000、600至1000、700至1000、800至1000、900至1000、或900至2000个连续的未修饰核苷酸。在一些实施例中，该第一部分包含5、10、20、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000个、或其间的任何数量的连续的未修饰核苷酸。该第一部分可以包含IRES。在一些实施例中，该第一部分包含结合位点。在一些实施例中，该第一部分包含结合位点，该结合位点被配置为结合肽、蛋白质、生物分子、DNA、RNA、或细胞靶标。
在一些实施例中，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸除了IRES元件或被配置为结合蛋白质、DNA、RNA、或细胞靶标的结合位点之外，遍及该环状多核糖核苷酸具有经修饰的核苷酸，例如5’甲基胞苷和假尿苷。在这些情况下，与相应的未修饰的环状多核糖核苷酸相比，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸具有更低的免疫原性。在这些情况下，与不包含5’甲基胞苷和假尿苷的相应的环状多核糖核苷酸相比，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸具有更低的免疫原性。在一些实施例中，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸具有比相应的未修饰的环状多核糖核苷酸低至少约1.1、1.2、1.3、1.5、1.6、1.8、2、2.2、2.5、2.8、3、3.2、3.3、3.5、3.8、4.0、4.2、4.5、4.8、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、或10.0倍的免疫原性。在一些实施例中，如本文所述的免疫原性通过RIG-I、TLR-3、TLR-7、TLR-8、MDA-5、LGP-2、OAS、OASL、PKR、和IFN-β中的至少一种的表达或信号传导或激活来评估。在一些实施例中，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸具有比相应的未修饰的环状多核糖核苷酸(例如，不包含5’甲基胞苷和假尿苷的相应的环状多核糖核苷酸)更高的半衰期。在一些实施例中，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸具有比相应的未修饰的环状多核糖核苷酸高至少约1.1、1.2、1.3、1.5、1.6、1.8、2、2.2、2.5、2.8、3、3.2、3.3、3.5、3.8、4.0、4.2、4.5、4.8、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、或10.0倍的更高半衰期。在一些实施例中，通过以下方式来测量半衰期：将该杂交修饰的环状多核糖核苷酸或该相应的环状多核糖核苷酸引入至细胞中并且测量该细胞内所引入的杂交修饰的环状多核糖核苷酸或相应的环状多核糖核苷酸的水平。
经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)可以包含至少一种经修饰的核苷酸。如本文所述的杂交修饰的环状多核糖核苷酸可以包含含有连续的未修饰核苷酸的第一部分和至少一种经修饰的核苷酸。经修饰的核苷酸在该第一部分之外。经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)的经修饰的多核糖核苷酸可以是具有对未修饰的天然核糖核苷酸的化学组成(诸如如本文所示的天然未修饰的核苷酸腺苷(A)、尿苷(U)、鸟嘌呤(G)、胞苷(C))的一个或多个化学修饰的类似物或衍生物。经修饰的核糖核苷酸的化学修饰可以是对核糖核苷酸的任何一个或多个官能团，诸如糖、核碱基或核苷间键(例如，对连接的磷酸酯/对磷酸二酯键/对磷酸二酯主链)的修饰。
在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包括一个或多个转录后修饰(例如，加帽、裂解、聚腺苷酸化、剪接、聚A序列、甲基化、酰化、磷酸化、赖氨酸和精氨酸残基的甲基化、乙酰化、以及硫醇基团和酪氨酸残基的亚硝基化等)。该一个或多个转录后修饰可以是任何转录后修饰，诸如已经在RNA中鉴定出的多于一百种不同的核苷修饰中的任一种(Rozenski,J,Crain,P和McCloskey,J.(1999).The RNA Modification Database:1999update[RNA修饰数据库:1999年更新].Nucl Acids Res[核酸研究]27:196-197)。在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包含至少一种选自下组的核苷，该组由以下组成：吡啶-4-酮核糖核苷、5-氮杂-尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫尿苷、4-硫代-假尿苷、2-硫代-假尿苷、5-羟基尿苷、3-甲基尿苷、5-羧基甲基-尿苷、1-羧基甲基-假尿苷、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺酸基甲基尿苷、1-牛磺酸基甲基-假尿苷、5-牛磺酸基甲基-2-硫代-尿苷、1-牛磺酸基甲基-4-硫代-尿苷、5-甲基-尿苷、1-甲基-假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-去氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-去氮-假尿苷、二氢尿苷、二氢假尿苷、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-甲氧基尿苷、2-甲氧基-4-硫代-尿苷、4-甲氧基-假尿苷、和4-甲氧基-2-硫代-假尿苷。在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸包含至少一种选自下组的核苷，该组由以下组成：5-氮杂-胞苷、假异胞苷、3-甲基-胞苷、N4-乙酰基胞苷、5-甲酰基胞苷、N4-甲基胞苷、5-羟基甲基胞苷、1-甲基-假异胞苷、吡咯并-胞苷、吡咯并-假异胞苷、2-硫代-胞苷、2-硫代-5-甲基-胞苷、4-硫代-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-1-去氮-假异胞苷、1-甲基-1-去氮-假异胞苷、折布拉林(zebularine)、5-氮杂-折布拉林、5-甲基-折布拉林、5-氮杂-2-硫代-折布拉林、2-硫代-折布拉林、2-甲氧基-胞苷、2-甲氧基-5-甲基-胞苷、4-甲氧基-假异胞苷、和4-甲氧基-1-甲基-假异胞苷。在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸包含至少一种选自下组的核苷，该组由以下组成：2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、7-去氮-腺嘌呤、7-去氮-8-氮杂-腺嘌呤、7-去氮-2-氨基嘌呤、7-去氮-8-氮杂-2-氨基嘌呤、7-去氮-2,6-二氨基嘌呤、7-去氮-8-氮杂-2,6-二氨基嘌呤、1-甲基腺苷、N6-甲基腺苷、N6-异戊烯基腺苷、N6-(顺式-羟基异戊烯基)腺苷、2-甲基硫代-N6-(顺式-羟基异戊烯基)腺苷、N6-甘氨酰氨甲酰基腺苷、N6-苏氨酰氨甲酰基腺苷、2-甲基硫代-N6-苏氨酰氨甲酰基腺苷、N6,N6-二甲基腺苷、7-甲基腺嘌呤、2-甲基硫代-腺嘌呤、和2-甲氧基-腺嘌呤。在一些实施例中，mRNA包含至少一种选自下组的核苷，该组由以下组成：1-甲基-肌苷、怀俄苷、怀丁苷、7-去氮-鸟苷、7-去氮-8-氮杂-鸟苷、6-硫代-鸟苷、6-硫代-7-去氮-鸟苷、6-硫代-7-去氮-8-氮杂-鸟苷、7-甲基-鸟苷、6-硫代-7-甲基-鸟苷、7-甲基肌苷、6-甲氧基-鸟苷、1-甲基鸟苷、N2-甲基鸟苷、N2,N2-二甲基鸟苷、8-氧代-鸟苷、7-甲基-8-氧代-鸟苷、1-甲基-6-硫代-鸟苷、N2-甲基-6-硫代-鸟苷、和N2,N2-二甲基-6-硫代-鸟苷。
在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包含至少一种选自下组的经修饰的核苷酸，该组由以下组成：N(6)甲基腺苷(m6A)、5’-甲基胞苷(5mC)、假尿苷、或N1-甲基-假尿苷、2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基(2’-O-MOE)、2’-O-氨基丙基、2’-脱氧、T-脱氧-2’-氟、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)、2’-O-二甲基氨基乙基(2’-O-DMAOE)、2’-O-二甲基氨基丙基(2’-O-DMAP)、T-O-二甲基氨基乙基氧基乙基(2’-O-DMAEOE)、2’-O-N-甲基乙酰胺基(2’-O-NMA)、锁核酸(LNA)、乙烯核酸(ENA)、肽核酸(PNA)、1’,5’-脱水己糖醇核酸(HNA)、吗啉代、甲基膦酸酯核苷酸、硫醇膦酸酯核苷酸、和2’-氟N3-P5’-亚磷酰胺。在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包含本领域技术人员已知的核苷酸修饰，诸如在或如在Gilbert,W.V.等人Science[科学].2016年6月17日；352(6292):1408-1412中鉴定的那些，将该文献通过援引并入本文。
该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)可以包括任何有用的修饰，诸如对糖、核碱基或核苷间键(例如，对连接的磷酸酯/对磷酸二酯键/对磷酸二酯主链)。嘧啶核碱基的一个或多个原子可以被任选取代的氨基、任选取代的硫醇、任选取代的烷基(例如，甲基或乙基)或卤代(例如，氯代或氟代)替代或取代。在某些实施例中，在糖和核苷间键中的每一个中存在修饰(例如，一个或多个修饰)。修饰可以是对脱氧核糖核酸(DNA)、苏糖核酸(TNA)、乙二醇核酸(GNA)、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)或其杂交体的核糖核酸(RNA)修饰。本文描述了另外的修饰。
在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包括至少一个N(6)甲基腺苷(m6A)修饰以增加翻译效率。在一些实施例中，N(6)甲基腺苷(m6A)修饰可以降低或减少该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)的免疫原性。
在一些实施例中，修饰可以包括化学或细胞诱导的修饰。例如，细胞内RNA修饰的一些非限制性实例由Lewis和Pan,“RNA modifications and structures cooperate toguide RNA-protein interactions[RNA修饰和结构协作指导RNA-蛋白质相互作用]”,NatReviews Mol Cell Biol[自然评论：分子细胞生物学],2017,18:202-210所描述。
在另一个实施例中，“假尿苷”是指m1acp3Ψ(1-甲基-3-(3-氨基-3-羧丙基)假尿苷。在另一个实施例中，该术语是指m1Ψ(1-甲基假尿苷)。在另一个实施例中，该术语是指Ψm(2′-O-甲基假尿苷)。在另一个实施例中，该术语是指m5D(5-甲基二氢尿苷)。在另一个实施例中，该术语是指m3Ψ(3-甲基假尿苷)。在另一个实施例中，该术语是指未经进一步修饰的假尿苷部分。在另一个实施例中，该术语是指任何上述假尿苷的单磷酸酯、二磷酸酯、或三磷酸酯。在另一个实施例中，该术语是指本领域已知的任何其他假尿苷。每种可能性代表本发明的单独实施例。
在一些实施例中，对该环状多核糖核苷酸的核糖核苷酸的化学修饰可以增强免疫逃避。该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)可以通过本领域充分建立的方法合成和/或修饰，这些方法诸如在Current protocols in nucleic acid chemistry[核酸化学实验室指南],Beaucage,S.L等人(编辑),John Wiley&Sons[约翰威利公司],New York[纽约州],NY[纽约],USA[美国](通过援引特此并入本文)中描述的那些。修饰包括例如端部修饰，例如5'端修饰(磷酸化(单、二和三磷酸化)、缀合、反向连接等)、3'端修饰(缀合、DNA核苷酸、反向连接等)；碱基修饰(例如，用稳定的碱基、不稳定的碱基或与扩展的配偶体库碱基配对的碱基替代)；碱基去除(脱碱基核苷酸)、或碱基缀合。经修饰的核糖核苷酸碱基还可以包括5-甲基胞苷和假尿苷。在一些实施例中，碱基修饰可以调节环状多核糖核苷酸的表达、免疫应答、稳定性、亚细胞定位(举几个功能效应)。在一些实施例中，修饰包括双正交核苷酸，例如非天然碱基。参见例如，Kimoto等人,Chem Commun(Camb)[化学通讯(剑桥)],2017,53:12309,DOI:10.1039/c7cc06661a，将该文献通过援引以其全文特此并入。
在一些实施例中，该环状多核糖核苷酸的一个或多个核糖核苷酸的糖修饰(例如，在2'位置或4'位置)或糖替代以及主链修饰可以包括磷酸二酯键的修饰或替代。经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)的具体实例包括但不限于包括经修饰的主链或非天然核苷间键(如核苷间修饰，包括磷酸二酯键的修饰或替代)的环状多核糖核苷酸。具有经修饰的主链的经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)尤其包括在主链中不具有磷原子的那些。出于本申请的目的，并且如本领域中有时提及的，在其核苷间主链中不具有磷原子的经修饰的RNA也可以被认为是寡核苷。在特定的实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)将包括在其核苷间主链中具有磷原子的核糖核苷酸。
经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)主链可以包括例如硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其他烷基膦酸酯(诸如3'-亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯)、亚膦酸酯、氨基磷酸酯(诸如3'-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯)、硫羰氨基磷酸酯、硫羰烷基膦酸酯、硫羰烷基磷酸三酯和具有正常3'-5'键的硼烷磷酸酯、这些的2'-5'连接类似物、以及具有其中相邻的核苷单元对是3'-5'至5'-3'或2'-5'至5'-2'连接的反向极性的那些。也包括各种盐、混合盐和游离酸形式。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸可以带负电荷或带正电荷。
可掺入该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)中的经修饰的核苷酸可以在核苷间键(例如，磷酸酯主链)上被修饰。在本文中，在多核苷酸主链的上下文中，短语“磷酸酯”和“磷酸二酯”可互换使用。可以通过用不同的取代基替代一个或多个氧原子来修饰主链磷酸酯基团。此外，经修饰的核苷和核苷酸可以包括用如本文所述的另一个核苷间键进行的对未修饰的磷酸酯部分的整体替代。经修饰的磷酸酯基团的实例包括但不限于硫代磷酸酯、磷酸硒酸酯(phosphoroselenate)、硼烷磷酸酯(boranophosphate)、硼烷磷酸酯(boranophosphateester)、氢膦酸酯、氨基磷酸酯、二氨基磷酸酯、烷基或芳基膦酸酯、和磷酸三酯。二硫代磷酸酯的两个非连接氧都被硫替代。也可以通过用氮(桥连的氨基磷酸酯)、硫(桥连的硫代磷酸酯)和碳(桥连的亚甲基膦酸酯)替代连接氧来修饰磷酸酯接头。
提供a-硫代取代的磷酸酯部分以通过非天然硫代磷酸酯主链键赋予RNA和DNA聚合物稳定性。硫代磷酸酯DNA和RNA具有增加的核酸酶抗性，并且因此在细胞环境中具有更长的半衰期。预期与环状多核糖核苷酸连接的硫代磷酸酯通过细胞先天性免疫分子的更弱结合/激活来降低先天性免疫应答。
在具体的实施例中，经修饰的核苷包括α-硫代-核苷(例如，5'-0-(1-硫代磷酸酯)-腺苷、5'-0-(1-硫代磷酸酯)-胞苷(a-硫代胞苷)、5'-0-(1-硫代磷酸酯)-鸟苷、5'-0-(1-硫代磷酸酯)-尿苷或5'-0-(1-硫代磷酸酯)-假尿苷)。
本文描述了可根据本发明使用的其他核苷间键，包括不包含磷原子的核苷间键。
在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)可以包括一种或多种细胞毒性核苷。例如，细胞毒性核苷可以被掺入环状多核糖核苷酸中，诸如双功能修饰。细胞毒性核苷可以包括但不限于阿糖腺苷、5-氮杂胞苷、4'-硫代-阿糖胞苷、环戊烯基胞嘧啶、克拉屈滨、氯法拉滨、阿糖胞苷、胞嘧啶阿糖胞苷、1-(2-C-氰基-2-脱氧-β-D-阿拉伯-戊呋喃糖基)-胞嘧啶、地西他滨、5-氟尿嘧啶、氟达拉滨、氟尿苷、吉西他滨、替加氟和尿嘧啶的组合、替加氟((RS)-5-氟-1-(四氢呋喃-2-基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮)、曲沙他滨、替扎西他滨、2'-脱氧-2'-亚甲基胞苷(DMDC)和6-巯基嘌呤。另外的实例包括氟达拉滨磷酸酯、N4-山嵛酰基-1-β-D-阿拉伯戊呋喃糖基胞嘧啶、N4-十八烷基-1-β-D-阿拉伯戊呋喃糖基胞嘧啶、N4-棕榈酰基-1-(2-C-氰基-2-脱氧-β-D-阿拉伯-戊呋喃糖基)胞嘧啶、和P-4055(阿糖胞苷5'-花生酸酯)。
该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)可以是或者可以不是沿着分子的整个长度均一地修饰的。例如，一种或多种或所有类型的核苷酸(例如，天然存在的核苷酸、嘌呤或嘧啶，或A、G、U、C、I、pU中的任何一种或多种或全部)在该环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)中、或在其给定的预定序列区域中可以被或者可以不被均一地修饰。在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包括假尿苷。在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包括肌苷，肌苷可以帮助免疫系统将该环状多核糖核苷酸表征为内源性而不是病毒RNA。肌苷的掺入还可以介导改善的RNA稳定性/减少的降解。参见例如，Yu,Z等人,(2015)RNA editing byADAR1 marks dsRNA as“self”[通过ADAR1进行的RNA编辑将dsRNA标记为“自身”].CellRes[细胞研究].25,1283-1284，将该文献通过援引以其全文并入本文。
在一些实施例中，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸中在其给定序列区域(例如，不是第一部分或未修饰的部分)中的所有核苷酸是经修饰的。在一些实施例中，修饰可以包括可增强表达和/或可减弱免疫应答的m6A；可减弱免疫应答的肌苷；可增加RNA稳定性、或翻译通读(交错元件)的假尿苷；可增加稳定性和/或可减弱免疫应答的m5C；以及有助于亚细胞移位(例如，核定位)的2,2,7-三甲基鸟苷。
在该环状多核糖核苷酸的各个位置上可以存在不同的糖修饰、核苷酸修饰和/或核苷间键(例如，主链结构)。本领域普通技术人员将理解，核苷酸类似物或其他一个或多个修饰可以位于该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)的任何一个或多个位置，使得该经修饰的环状多核糖核苷酸的功能基本上不降低。修饰也可以是非编码区修饰。该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)可以包括从约1％至约100％的经修饰的核苷酸(相对于总核苷酸含量，或相对于一种或多种类型的核苷酸，即A、G、U或C中的任何一种或多种)或任何中间百分比(例如，从1％至20％>、从1％至25％、从1％至50％、从1％至60％、从1％至70％、从1％至80％、从1％至90％、从1％至95％、从10％至20％、从10％至25％、从10％至50％、从10％至60％、从10％至70％、从10％至80％、从10％至90％、从10％至95％、从10％至100％、从20％至25％、从20％至50％、从20％至60％、从20％至70％、从20％至80％、从20％至90％、从20％至95％、从20％至100％、从50％至60％、从50％至70％、从50％至80％、从50％至90％、从50％至95％、从50％至100％、从70％至80％、从70％至90％、从70％至95％、从70％至100％、从80％至90％、从80％至95％、从80％至100％、从90％至95％、从90％至100％、和从95％至100％)。
在一些实施例中，环状多核糖核苷酸是完全修饰的(completely modified)环状多核糖核苷酸或完全修饰的(fully modified)环状多核糖核苷酸，并且包含全部或基本上全部的经修饰的腺苷残基、全部或基本上全部的经修饰的尿苷残基、全部或基本上全部的经修饰的鸟嘌呤残基、全部或基本上全部的经修饰的胞苷残基、或其任何组合。在一些实施例中，circRNA可以包含至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、或80％的经修饰的核苷酸。在一些实施例中，完全修饰的circRNA包含基本上所有(例如，大于80％、85％、90％、95％、97％、98％、或99％、或约100％)的经修饰的核苷酸。在一些实施例中，本文提供的经修饰的环状多核糖核苷酸是杂交修饰的环状多核糖核苷酸。杂交修饰的环状多核糖核苷酸可以具有至少一种经修饰的核苷酸，并且可以具有连续的未修饰核苷酸的部分(例如，第一部分/未修饰的部分)。该杂交修饰的环状多核糖核苷酸的此未修饰的部分可以具有至少约5、10、15、或20个、或其间的任何数量的连续的未修饰核苷酸。在一些实施例中，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸的该未修饰的部分具有至少约30、40、40、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、180、200、220、250、280、300、320、350、380、400、420、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、或1000个、或其间的任何数量的连续的未修饰核苷酸。在一些实施例中，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或更多个未修饰的部分。在一些实施例中，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、30、40、50、70、80、100、120、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1000、或更多个经修饰的核苷酸。在一些实施例中，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸具有至少1％、2％、5％、7％、8％、10％、12％、15％、18％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、80％、90％、95％、或99％但少于100％的核苷酸是经修饰的。在一些实施例中，未修饰的部分包含结合位点。在一些实施例中，未修饰的部分包含结合位点，该结合位点被配置为结合肽、蛋白质、生物分子、DNA、RNA、或细胞靶标。在一些实施例中，未修饰的部分包含IRES。
在一些情况下，与相应的在其他方面相同但已被完全修饰的环状多核糖核苷酸相比，如本文所述的杂交修饰的环状多核糖核苷酸具有相似的免疫原性。例如，与相应的环状多核糖核苷酸(其在其他方面相同但遍及具有5’甲基胞苷和假尿苷并且不具有未修饰的胞苷和尿苷)相比，杂交修饰的环状多核糖核苷酸(其除了其IRES元件之外，遍及具有5’甲基胞苷和假尿苷)可以具有类似的免疫原性或更低的免疫原性。在一些实施例中，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸(其除了其IRES元件之外，遍及具有5’甲基胞苷和假尿苷)具有的翻译效率相似于或高于相应的环状多核糖核苷酸(其在其他方面相同但遍及具有5’甲基胞苷和假尿苷并且不具有未修饰的胞苷和尿苷)的翻译效率。
在一些实施例中，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸具有未修饰(例如，不具有经修饰的核苷酸)的结合位点。在一些实施例中，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸具有未修饰(例如，不具有经修饰的核苷酸)的结合位点，该结合位点被配置为结合至蛋白质、DNA、RNA、或细胞靶标。在一些实施例中，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸具有未修饰(例如，不具有经修饰的核苷酸)的内部核糖体进入位点(IRES)。在一些实施例中，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸在内部核糖体进入位点(IRES)中具有不超过5％、为经修饰的核苷酸的核苷酸。在一些实施例中，IRES中没有核苷酸是经修饰的。在一些实施例中，IRES中不超过0％、1％、2％、3％、4％、或5％的核苷酸是经修饰的。在一些实施例中，杂交修饰的环状多核糖核苷酸除了结合位点之外，遍及具有经修饰的核苷酸。在一些实施例中，杂交修饰的环状多核糖核苷酸除了被配置为结合肽、蛋白质、生物分子、DNA、RNA、或细胞靶标的结合位点之外，遍及具有经修饰的核苷酸。在一些实施例中，杂交修饰的环状多核糖核苷酸除了IRES元件之外，遍及具有经修饰的核苷酸。在其他实施例中，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸除了IRES元件和一个或多个其他部分之外，遍及具有经修饰的核苷酸。不希望受某一理论的束缚，未修饰的IRES元件使该杂交修饰的环状多核糖核苷酸有翻译能力，例如，对于该一个或多个表达序列而言具有相似于或高于没有任何经修饰的核苷酸的相应的环状多核糖核苷酸的翻译效率。
在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)具有的半衰期至少是线性对应物(例如，线性表达序列、或线性环状多核糖核苷酸)的半衰期。在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)具有相比于线性对应物的半衰期增加的半衰期。在一些实施例中，半衰期增加了约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、或更多。在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)在细胞中的半衰期或持续性是至少约1小时至约30天，或至少约2小时、6小时、12小时、18小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、60天、或更长时间或其间的任何时间。在某些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)在细胞中的半衰期或持续性是不超过约10分钟至约7天、或不超过约1小时、2小时，3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、24小时、36小时、48小时、60小时、72小时、4天、5天、6天、7天、或其间的任何时间。在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)在正进行细胞分裂的细胞中具有半衰期或持续性。在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)在分裂后细胞中具有半衰期或持续性。在某些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)在正进行分裂的细胞中的半衰期或持续性大于约10分钟至约30天，或是至少约1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、60天、或更长时间或其间的任何时间。
在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包含一个或多个表达序列，并且被配置用于在受试者体内细胞中的持续表达。在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)被配置为使得该一个或多个表达序列在细胞中在较晚的时间点的表达等于或高于较早的时间点。在此类实施例中，该一个或多个表达序列的表达可以维持在相对稳定的水平或可以随时间增加。表达序列的表达可以在延长的时间段内相对稳定。例如，在一些情况下，该一个或多个表达序列在细胞中在至少7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、23、或更多天的时间段内的表达不会减少50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、或5％。在一些情况下，在一些情况下，该一个或多个表达序列在细胞中在至少7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、23、或更多天内的表达维持在变化不超过50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、或5％的水平。
在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)在哺乳动物，例如人中是非免疫原性的。在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)能够在来自水产养殖动物(鱼、蟹、虾、牡蛎等)的细胞、哺乳动物细胞(例如，来自宠物或动物园动物(猫、狗、蜥蜴、鸟、狮子、老虎、熊等)的细胞、来自农场或役用动物(马、牛、猪、鸡等)的细胞、人细胞)、培养的细胞、原代细胞或细胞系、干细胞、祖细胞、分化细胞、生殖细胞、癌细胞(例如，致瘤的、转移的)、非致瘤细胞(正常细胞)、胎儿细胞、胚胎细胞、成年细胞、有丝分裂细胞、非有丝分裂细胞、或其任何组合中复制或者在其中复制。在一些实施例中，本发明包括包含本文所述的经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)的细胞，其中该细胞是来自水产养殖动物(鱼、蟹、虾、牡蛎等)的细胞、哺乳动物细胞(例如，来自宠物或动物园动物(猫、狗、蜥蜴、鸟、狮子、老虎熊等)的细胞、来自农场或役用动物(马、牛、猪、鸡等)的细胞、人细胞)、培养的细胞、原代细胞或细胞系、干细胞、祖细胞、分化细胞、生殖细胞、癌细胞(例如，致瘤的、转移的)、非致瘤细胞(正常细胞)、胎儿细胞、胚胎细胞、成年细胞、有丝分裂细胞、非有丝分裂细胞、或其任何组合。在一些实施例中，细胞被修饰以包含该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)。
在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)例如瞬时地或长期地调节细胞功能。在某些实施例中，细胞功能发生稳定改变，诸如调节持续存在至少约1小时至约30天，或至少约2小时、6小时、12小时、18小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、60天或更长时间或其间的任何时间。在某些实施例中，细胞功能发生瞬时改变，诸如调节持续存在不超过约30分钟至约7天、或不超过约1小时、2小时，3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、24小时、36小时、48小时、60小时、72小时、4天、5天、6天、7天或其间的任何时间。
在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)是至少约20个核苷酸、至少约30个核苷酸、至少约40个核苷酸、至少约50个核苷酸、至少约75个核苷酸、至少约100个核苷酸、至少约200个核苷酸、至少约300个核苷酸、至少约400个核苷酸、至少约500个核苷酸、至少约1,000个核苷酸、至少约2,000个核苷酸、至少约5,000个核苷酸、至少约6,000个核苷酸、至少约7,000个核苷酸、至少约8,000个核苷酸、至少约9,000个核苷酸、至少约10,000个核苷酸、至少约12,000个核苷酸、至少约14,000个核苷酸、至少约15,000个核苷酸、至少约16,000个核苷酸、至少约17,000个核苷酸、至少约18,000个核苷酸、至少约19,000个核苷酸、或至少约20,000个核苷酸。在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)可以具有足够的大小以容纳核糖体的结合位点。本领域技术人员可以理解，经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)的最大大小可以与产生经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)和/或使用该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)的技术限制内的一样大。不受理论的束缚，有可能的是，可以从DNA产生RNA的多个区段并且其5'游离端和3'游离端退火以产生一“串”RNA，当仅留有一个5'游离端和一个3'游离端时，该“串”RNA最终可以被环化。在一些实施例中，经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)的最大大小可能受包装RNA并且将其递送至靶标的能力所限制。在一些实施例中，经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)的大小是足以编码有用的多肽的长度，并且因此至少20,000个核苷酸、至少15,000个核苷酸、至少10,000个核苷酸、至少7,500个核苷酸或至少5,000个核苷酸、至少4,000个核苷酸、至少3,000个核苷酸、至少2,000个核苷酸、至少1,000个核苷酸、至少500个核苷酸、至少400个核苷酸、至少300个核苷酸、至少200个核苷酸、至少100个核苷酸的长度可能是有用的。
在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包含一个或多个本文其他处所述的元件。在一些实施例中，这些元件可以通过间隔子序列或接头彼此隔开。在一些实施例中，这些元件可以通过1个核糖核苷酸、2个核苷酸、约5个核苷酸、约10个核苷酸、约15个核苷酸、约20个核苷酸、约30个核苷酸、约40个核苷酸、约50个核苷酸、约60个核苷酸、约80个核苷酸、约100个核苷酸、约150个核苷酸、约200个核苷酸、约250个核苷酸、约300个核苷酸、约400个核苷酸、约500个核苷酸、约600个核苷酸、约700个核苷酸、约800个核苷酸、约900个核苷酸、约1,000个核苷酸、最多约1kb、至少约1,000个核苷酸、其间任何量的核苷酸彼此隔开。在一些实施例中，一个或多个元件彼此连续，例如，缺少间隔子元件。在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸中的一个或多个元件是构象柔性的。在一些实施例中，构象柔性是由于序列基本上不含二级结构。在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包含二级或三级结构，该二级或三级结构容纳本文所述的一种或多种期望的功能或特征，例如容纳核糖体的结合位点，例如翻译，例如滚环翻译。
在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包含特定的序列特征。例如，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)可以包含特定的核苷酸组成。在一些此类实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)可以包括一个或多个嘌呤富集区(腺嘌呤或鸟苷)。在一些此类实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)可以包括一个或多个嘌呤富集区(腺嘌呤或鸟苷)。在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)可以包括一个或多个AU富集区或元件(ARE)。在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)可以包括一个或多个腺嘌呤富集区。
在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)可以包括一个或多个本文其他处所述的重复元件。
在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包含一个或多个本文其他处所述的修饰。
相对于参考序列(特别地亲本多核糖核苷酸)，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)可以包括本发明范围内包括的一个或多个取代、插入和/或添加、缺失、和共价修饰。
表达序列
肽或多肽
在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包含至少一个编码肽或多肽的表达序列。这种肽可以包括但不限于小肽、拟肽(例如，类肽)、氨基酸、和氨基酸类似物。肽可以是直链或支链的。这种肽可以具有小于约5,000克/摩尔的分子量、小于约2,000克/摩尔的分子量、小于约1,000克/摩尔的分子量、小于约500克/摩尔的分子量和此类化合物的盐、酯和其他药学上可接受的形式。这种肽可以包括但不限于神经递质、激素、药物、毒素、病毒或微生物颗粒、合成分子及其激动剂或拮抗剂。
多肽可以是直链或支链的。多肽的长度可以是从约5个至约40,000个氨基酸、约15个至约35,000个氨基酸、约20个至约30,000个氨基酸、约25个至约25,000个氨基酸、约50个至约20,000个氨基酸、约100个至约15,000个氨基酸、约200个至约10,000个氨基酸、约500个至约5,000个氨基酸、约1,000至约2,500个氨基酸、或其间的任何范围。在一些实施例中，长度少于约40,000个氨基酸、少于约35,000个氨基酸、少于约30,000个氨基酸、少于约25,000个氨基酸、少于约20,000个氨基酸、少于约15,000个氨基酸、少于约10,000个氨基酸、少于约9,000个氨基酸、少于约8,000个氨基酸、少于约7,000个氨基酸、少于约6,000个氨基酸、少于约5,000个氨基酸、少于约4,000个氨基酸、少于约3,000个氨基酸、少于约2,500个氨基酸、少于约2,000个氨基酸、少于约1,500个氨基酸、少于约1,000个氨基酸、少于约900个氨基酸、少于约800个氨基酸、少于约700个氨基酸、少于约600个氨基酸、少于约500个氨基酸、少于约400个氨基酸、少于约300个氨基酸、或更少的多肽可能是有用的。
肽或多肽的一些实例包括但不限于荧光标签或标记物、抗原、治疗性肽、天然生物活性肽的合成或类似物肽、激动剂或拮抗剂肽、抗微生物肽、成孔肽、双环肽、靶向或细胞毒性肽、降解或自毁肽、以及多种降解或自毁肽。可用于本文所述的本发明的肽还包括抗原结合肽，例如抗原结合抗体或抗体样片段，诸如单链抗体、纳米抗体(参见例如，Steeland等人2016.Nanobodies as therapeutics:big opportunities for small antibodies.[纳米抗体作为治疗剂：小抗体的巨大机会]Drug Discov Today[今日药物发现]:21(7):1076-113)。此类抗原结合肽可以结合细胞质抗原、核抗原、细胞内抗原。
在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包含一个或多个RNA表达序列，其中的每一个可以编码多肽。多肽可以大量产生。这样，多肽可以是可产生的任何蛋白质分子。多肽可以是可从细胞分泌或定位于细胞的细胞质、细胞核或膜区室的多肽。一些多肽包括但不限于以下中的至少一部分：病毒包膜蛋白、代谢调控酶(例如，调控脂质或类固醇的产生)、抗原、耐受原、细胞因子、毒素、其不存在与疾病相关的酶、和在动物体内没有活性直至被裂解(例如，在动物的肠道中)的多肽、以及激素。
在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包括编码蛋白质例如治疗性蛋白质的表达序列。在一些实施例中，可以由本文披露的经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)表达的治疗性蛋白质具有抗氧化活性、结合活性、运货受体活性、催化活性、分子载体活性、分子功能调节剂、分子换能器(moleculartransducer)活性、营养储库活性、蛋白质标签、结构分子活性、毒素活性、转录调节剂活性、翻译调控剂活性、或转运蛋白活性。治疗性蛋白质的一些实例可以包括但不限于酶替代蛋白质、用于补充的蛋白质、蛋白疫苗、抗原(例如，肿瘤抗原、病毒、细菌)、激素、细胞因子、抗体、免疫疗法(例如，癌症)、细胞重编程/转分化因子、转录因子、嵌合抗原受体、转座酶或核酸酶、免疫效应子(例如，影响对免疫应答/信号的易感性)、经调控的死亡效应子蛋白(例如，细胞凋亡或坏死的诱导物)、肿瘤的非溶解性抑制剂(例如，癌蛋白抑制剂)、表观遗传修饰剂、表观遗传酶、转录因子、DNA或蛋白质修饰酶、DNA嵌入剂、外排泵抑制剂、核受体激活剂或抑制剂、蛋白酶体抑制剂、酶竞争性抑制剂、蛋白质合成效应剂或抑制剂、核酸酶、蛋白质片段或结构域、配体或受体、以及CRISPR系统或其组分。
在一些实施例中，可以由本文披露的经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)表达的示例性蛋白质包括人蛋白，例如受体结合蛋白、激素、生长因子、生长因子受体调节子和再生蛋白质(例如，增殖和分化涉及的蛋白质，例如用于伤口愈合的治疗性蛋白质)。在一些实施例中，可以由本文披露的经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)表达的示例性蛋白质包括EGF(表皮生长因子)。在一些实施例中，可以由本文披露的经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)表达的示例性蛋白质包括酶，例如，氧化还原酶、代谢酶、线粒体酶、加氧酶、脱氢酶、非ATP依赖型酶、和去饱和酶。在一些实施例中，可以由本文披露的经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)表达的示例性蛋白质包括细胞内蛋白质或胞质蛋白质。在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)表达
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萤光素酶(nLuc)。在一些实施例中，可以由本文披露的经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)表达的示例性蛋白质包括分泌蛋白，例如分泌酶。在一些情况下，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)表达如下的分泌蛋白，该分泌蛋白在血液中具有较短的治疗性半衰期，或者可以是具有亚细胞定位信号的蛋白质，或者是具有分泌信号肽的蛋白质。在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)表达高斯萤光素酶(gLuc)。在一些情况下，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)表达非人蛋白，例如荧光蛋白、能量转移受体或蛋白标签像Flag、Myc、或His。在一些实施例中，可以由该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)表达的示例性蛋白质包括GFP。在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)表达标签化蛋白，例如含有蛋白标签的融合蛋白或工程化蛋白，例如几丁质结合蛋白(CBP)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、Fc标签、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、Avi标签(GLNDIFEAQKIEWHE)、钙调蛋白标签(KRRWKKNFIAVSAANRFKKISSSGAL)、聚谷氨酸标签(EEEEEE)、E标签(GAPVPYPDPLEPR)、FLAG标签(DYKDDDDK)、HA标签(YPYDVPDYA)、His标签(HHHHHH)、Myc标签(EQKLISEEDL)、NE标签(TKENPRSNQEESYDDNES)、S标签(KETAAAKFERQHMDS)、SBP标签(MDEKTTGWRGGHVVEGLAGELEQLRARLEHHPQGQREP)、Sof标签1(SLAELLNAGLGGS)、Sof标签3(TQDPSRVG)、Spot标签(PDRVRAVSHWSS)、Strep标签(Strep标签II：WSHPQFEK)、TC标签(CCPGCC)、Ty标签(EVHTNQDPLD)、V5标签(GKPIPNPLLGLDST)、VSV标签(YTDIEMNRLGK)、或Xpress标签(DLYDDDDK)。
在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)表达抗体，例如抗体片段、或其一部分。在一些实施例中，由该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)表达的抗体可以是任何同种型，诸如IgA、IgD、IgE、IgG、IgM。在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)表达抗体的一部分，诸如轻链、重链、Fc片段、CDR(互补决定区)、Fv片段、或Fab片段、其另一部分。在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)表达抗体的一个或多个部分。例如，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)可以包含多于一个表达序列，其中每一个表达抗体的一部分，并且其总和可以构成抗体。在一些情况下，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包含一个编码抗体重链的表达序列和另一个编码抗体轻链的表达序列。在一些情况下，当该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)在细胞或无细胞环境中表达时，轻链和重链可以经受适当的修饰、折叠或其他翻译后修饰以形成功能性抗体。
调控元件
在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包含调控元件，例如修饰该经修饰的环状多核糖核苷酸内表达序列的表达的序列。
调控元件可以包括与编码表达产物的表达序列相邻定位的序列。调控元件可以可操作地连接至相邻序列。与不存在调控元件时表达的产物的量相比，调控元件可以增加表达的产物的量。另外，一个调控元件可以增加串联连接的多个表达序列表达的产物的量。因此，一个调控元件可以增强一个或多个表达序列的表达。多个调控元件是本领域普通技术人员熟知的。
如本文提供的调控元件可以包括选择性翻译序列。如本文使用的，术语“选择性翻译序列”可以是指在经修饰的环状多核糖核苷酸中选择性地起始或激活表达序列的翻译的核酸序列，例如某些核糖开关适体酶。调控元件还可以包括选择性降解序列。如本文使用的，术语“选择性降解序列”可以指起始经修饰的环状多核糖核苷酸或经修饰的环状多核糖核苷酸的表达产物的降解的核酸序列。示例性选择性降解序列可以包括核糖开关适体酶和miRNA结合位点。
在一些实施例中，调控元件是翻译调节子。翻译调节子可以调节该经修饰的环状多核糖核苷酸中表达序列的翻译。翻译调节子可以是翻译增强子或翻译抑制子。在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包括与至少一个表达序列相邻的至少一个翻译调节子。在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包括与每个表达序列相邻的翻译调节子。在一些实施例中，翻译调节子存在于每个表达序列的一侧或两侧，导致例如一种或多种肽和/或一种或多种多肽的表达产物的隔开。
在一些实施例中，翻译起始序列可以充当调控元件。在一些实施例中，翻译起始序列包含AUG密码子。在一些实施例中，翻译起始序列包含任何真核起始密码子，如AUG、CUG、GUG、UUG、ACG、AUC、AUU、AAG、AUA或AGG。在一些实施例中，翻译起始序列包含科扎克序列。在一些实施例中，翻译在例如应激诱导条件的选择性条件下在替代性翻译起始序列，例如不同于AUG密码子的翻译起始序列处开始。作为非限制性实例，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)的翻译可以在替代性翻译起始序列诸如ACG处开始。作为另一个非限制性实例，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)翻译可以在替代性翻译起始序列CTG/CUG处开始。作为又另一个非限制性实例，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)翻译可以在替代性翻译起始序列GTG/GUG处开始。作为又另一个非限制性实例，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)可以在重复相关的非AUG(RAN)序列，诸如包括短段的重复RNA例如CGG、GGGGCC、CAG、CTG的替代性翻译起始序列处开始翻译。
已知侧接起始翻译的密码子(诸如但不限于起始密码子或替代性起始密码子)的核苷酸会影响该经修饰的环状多核糖核苷酸的翻译效率、长度和/或结构。(参见例如，Matsuda和Mauro,PLoS ONE[公共科学图书馆综合],2010 5:11；将其内容通过援引以其全文并入本文)。掩蔽侧接起始翻译的密码子的任何核苷酸可用于改变该经修饰的环状多核糖核苷酸的翻译起始位置、翻译效率、长度和/或结构。
在一个实施例中，可以在起始密码子或替代性起始密码子附近使用掩蔽剂，以掩蔽或隐藏密码子，从而降低在被掩蔽的起始密码子或替代性起始密码子处起始翻译的可能性。掩蔽剂的非限制性实例包括反义锁核酸(LNA)寡核苷酸和外显子接合复合体(EJC)。(参见例如，描述掩蔽剂LNA寡核苷酸和EJC的Matsuda和Mauro(PLoS ONE[公共科学图书馆综合],2010 5:11)；将其内容通过援引以其全文并入本文)。在另一个实施例中，掩蔽剂可用于掩蔽该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)的起始密码子，以增加翻译将在替代性起始密码子处起始的可能性。
在一些实施例中，翻译在选择性条件下起始，该选择性条件诸如但不限于在存在GRSF-1时的病毒诱导选择，并且该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包括GRSF-1结合位点，参见例如http://jvi.asm.org/content/76/20/10417.full。
翻译起始序列
在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)编码多肽并且可以包含翻译起始序列，例如起始密码子。在一些实施例中，翻译起始序列包括科扎克或夏因-达尔加诺(Shine-Dalgarno)序列。在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包括与表达序列相邻的翻译起始序列，例如科扎克序列。在一些实施例中，翻译起始序列是非编码起始密码子。在一些实施例中，翻译起始序列(例如，科扎克序列)存在于每个表达序列的一侧或两侧，导致表达产物的隔开。在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包括与表达序列相邻的至少一个翻译起始序列。在一些实施例中，翻译起始序列为该经修饰的环状多核糖核苷酸提供构象柔性。在一些实施例中，翻译起始序列基本上在该经修饰的环状多核糖核苷酸的单链区域内。
该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)可以包括多于1个起始密码子，诸如但不限于至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17、至少18个、至少19个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少50个、至少60个或多于60个起始密码子。翻译可以在第一个起始密码子上起始或可以在第一个起始密码子的下游起始。
在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)可以在不是第一起始密码子的密码子，例如AUG处起始。该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)的翻译可以在替代性翻译起始序列，诸如但不限于ACG、AGG、AAG、CTG/CUG、GTG/GUG、ATA/AUA、ATT/AUU、TTG/UUG处起始(参见Touriol等人,Biology of the Cell[细胞生物学]95(2003)169-178以及Matsuda和Mauro,PLoS ONE[公共科学图书馆综合],20105:11；将这些文献中每一个的内容通过援引以其全文并入本文)。在一些实施例中，翻译在例如应激诱导条件的选择性条件下在替代性翻译起始序列处开始。作为非限制性实例，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)的翻译可以在替代性翻译起始序列诸如ACG处开始。作为另一个非限制性实例，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)翻译可以在替代性翻译起始序列CTG/CUG处开始。作为又另一个非限制性实例，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)翻译可以在替代性翻译起始序列GTG/GUG处开始。作为又另一个非限制性实例，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)可以在重复相关的非AUG(RAN)序列，诸如包括短段的重复RNA例如CGG、GGGGCC、CAG、CTG的替代性翻译起始序列处开始翻译。
在一些实施例中，翻译是通过用Rocaglates处理真核起始因子4A(eIF4A)来起始的(通过阻断43S扫描来阻遏翻译，导致过早的上游翻译起始以及携带RocA-eIF4A靶序列的转录物的蛋白质表达降低，参见例如，www.nature.com/articles/nature17978)。
IRES
在一些实施例中，本文所述的经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包含内部核糖体进入位点(IRES)元件。在经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)中包括的适合IRES元件包括能够接合真核核糖体的RNA序列。在一些实施例中，IRES元件是至少约5nt、至少约8nt、至少约9nt、至少约10nt、至少约15nt、至少约20nt、至少约25nt、至少约30nt、至少约40nt、至少约50nt、至少约100nt、至少约200nt、至少约250nt、至少约350nt、或至少约500nt。在一个实施例中，IRES元件衍生自生物体的DNA，该生物体包括但不限于病毒、哺乳动物和果蝇。此类病毒DNA可以衍生自但不限于小核糖核酸病毒互补DNA(cDNA)、脑心肌炎病毒(EMCV)cDNA和脊髓灰质炎病毒cDNA。在一个实施例中，衍生IRES元件的果蝇DNA包括但不限于来自黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)的触角足基因。
在一些实施例中，IRES元件至少部分地衍生自病毒，例如，它可以衍生自病毒IRES元件，诸如ABPV_IGRpred、AEV、ALPV_IGRpred、BQCV_IGRpred、BVDV1_1-385、BVDV1_29-391、CrPV_5NCR、CrPV_IGR、crTMV_IREScp、crTMV_IRESmp75、crTMV_IRESmp228、crTMV_IREScp、crTMV_IREScp、CSFV、CVB3、DCV_IGR、EMCV-R、EoPV_5NTR、ERAV_245-961、ERBV_162-920、EV71_1-748、FeLV-Notch2、FMDV_型_C、GBV-A、GBV-B、GBV-C、gypsy_env、gypsyD5、gypsyD2、HAV_HM175、HCV_type_1a、HiPV_IGRpred、HIV-1、HoCV1_IGRpred、HRV-2、IAPV_IGRpred、idefix、KBV_IGRpred、LINE-1_ORF1_-101_至_-1、LINE-1_ORF1_-302_至_-202、LINE-1_ORF2_-138_至_-86、LINE-1_ORF1_-44_至_-1、PSIV_IGR、PV_型1_Mahoney、PV_型3_Leon、REV-A、RhPV_5NCR、RhPV_IGR、SINV1_IGRpred、SV40_661-830、TMEV、TMV_UI_IRESmp228、TRV_5NTR、TrV_IGR、或TSV_IGR。在一些实施例中，IRES元件至少部分地衍生自细胞IRES，诸如AML1/RUNX1、Antp-D、Antp-DE、Antp-CDE、Apaf-1、Apaf-1、AQP4、AT1R_var1、AT1R_var2、AT1R_var3、AT1R_var4、BAG1_p36delta236nt、BAG1_p36、BCL2、BiP_-222_-3、c-IAP1_285-1399、c-IAP1_1313-1462、c-jun、c-myc、Cat-1_224、CCND1、DAP5、eIF4G、eIF4GI-ext、eIF4GII、eIF4GII-长、ELG1、ELH、FGF1A、FMR1、Gtx-133-141、Gtx-1-166、Gtx-1-120、Gtx-1-196、无毛(hairless)、HAP4、HIF1a、hSNM1、Hsp101、hsp70、hsp70、Hsp90、IGF2_leader2、Kv1.4_1.2、L-myc、LamB1_-335_-1、LEF1、MNT_75-267、MNT_36-160、MTG8a、MYB、MYT2_997-1152、n-MYC、NDST1、NDST2、NDST3、NDST4L、NDST4S、NRF_-653_-17、NtHSF1、ODC1、p27kip1、p53_128-269、PDGF2/c-sis、Pim-1、PITSLRE_p58、Rbm3、收割者(reaper)、Scamper、TFIID、TIF4631、Ubx_1-966、Ubx_373-961、UNR、Ure2、UtrA、VEGF-A_-133_-1、XIAP_5-464、XIAP_305-466、或YAP1。在一些实施例中，IRES元件包括合成IRES，例如，(GAAA)16、(PPT19)4、KMI1、KMI1、KMI2、KMI2、KMIX、X1或X2。
在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包括侧接至少一个(例如，2、3、4、5、或更多个)表达序列的至少一个IRES。在一些实施例中，IRES侧接至少一个(例如，2、3、4、5、或更多个)表达序列的两侧。在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)在每个表达序列的一侧或两侧上包括一个或多个IRES序列，导致一种或多种肽和/或一种或多种多肽的隔开。
终止元件
在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包括一个或多个表达序列，并且每个表达序列可以具有或可以不具有终止元件。在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包括一个或多个表达序列，并且表达序列缺少终止元件，使得该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)被连续翻译。由于缺少核糖体停滞或脱落，终止元件的排除可能导致表达产物例如肽或多肽的滚环翻译或连续表达。在这种实施例中，滚环翻译通过每个表达序列表达连续表达产物。在一些其他实施例中，表达序列的终止元件可以是交错元件的一部分。在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)中的一个或多个表达序列包含终止元件。然而，在该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)中进行滚环翻译或后继(例如，第二、第三、第四、第五等)表达序列的表达。在此类情况下，当核糖体遇到终止元件(例如，终止密码子)并终止翻译时，表达产物可以从核糖体上脱落。在一些实施例中，在核糖体例如核糖体的至少一个亚基与该经修饰的环状多核糖核苷酸保持接触时翻译终止。
在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)在一个或多个表达序列的端部包括终止元件。在一些实施例中，一个或多个表达序列连续包含两个或更多个终止元件。在此类实施例中，翻译终止并且滚环翻译终止。在一些实施例中，核糖体与该经修饰的环状多核糖核苷酸完全脱离。在一些此类实施例中，在该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)中后继(例如，第二、第三、第四、第五等)表达序列的产生可能需要核糖体在起始翻译之前与该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)重新接合。通常，终止元件包括发出翻译终止信号的框内核苷酸三联体，例如UAA、UGA、UAG。在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)中的一个或多个终止元件是阅读框移位的终止元件，诸如但不限于，可以终止翻译的脱框(off-frame)或-1和+1移位的阅读框(例如，隐藏的终止)。阅读框移位的终止元件包括出现在表达序列的第二阅读框和第三阅读框中的核苷酸三联体，TAA、TAG和TGA。阅读框移位的终止元件可能对防止通常对细胞有害的mRNA误读很重要。
交错元件
在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包括与表达序列相邻的至少一个交错元件。在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包括与每个表达序列相邻的交错元件。在一些实施例中，交错元件存在于每个表达序列的一侧或两侧，导致例如一种或多种肽和/或一种或多种多肽的表达产物的隔开。在一些实施例中，交错元件是一个或多个表达序列的一部分。在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包含一个或多个表达序列，并且一个或多个表达序列中的每一个通过该经修饰的环状多核糖核苷酸上的交错元件与后继的表达序列隔开。在一些实施例中，该交错元件阻止由(a)单个表达序列的两轮翻译或(b)两个或更多个表达序列的一轮或多轮翻译生成单一多肽。在一些实施例中，该交错元件是与该一个或多个表达序列分离的序列。在一些实施例中，该交错元件包含该一个或多个表达序列中的表达序列的一部分。
在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包括交错元件。为了避免在保持滚环翻译的同时产生连续表达产物，例如肽或多肽，可以包括交错元件以在翻译期间诱导核糖体暂停。在一些实施例中，交错元件在一个或多个表达序列中的至少一个的3’端。交错元件可以被配置为在该经修饰的环状多核糖核苷酸的滚环翻译期间使核糖体停滞。交错元件可以包括但不限于2A样或CHYSEL(顺式作用的水解酶元件)序列。在一些实施例中，交错元件编码具有C末端共有序列为X1X2X3EX5NPGP的序列，其中X1不存在或是G或H，X2不存在或是D或是G，X3是D或V或I或S或M，X5是任何氨基酸。在一些实施例中，此序列包含具有强α-螺旋倾向的氨基酸的非保守序列，其后接共有序列-D(V/I)ExNPG P，其中x＝任何氨基酸。交错元件的一些非限制性实例包括GDVESNPGP、GDIEENPGP、VEPNPGP、IETNPGP、GDIESNPGP、GDVELNPGP、GDIETNPGP、GDVENPGP、GDVEENPGP、GDVEQNPGP、IESNPGP、GDIELNPGP、HDIETNPGP、HDVETNPGP、HDVEMNPGP、GDMESNPGP、GDVETNPGP、GDIEQNPGP、和DSEFNPGP。
在一些实施例中，本文所述的交错元件裂解表达产物，诸如在本文所述的共有序列的G与P之间。作为一个非限制性实例，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包括至少一个交错元件以裂解表达产物。在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包括与至少一个表达序列相邻的交错元件。在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包括在每个表达序列后的交错元件。在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包括存在于每个表达序列的一侧或两侧的交错元件，导致由每个表达序列翻译一种或多种单独肽和/或多肽。
在一些实施例中，交错元件包含一个或多个在翻译过程中诱导核糖体暂停的经修饰的核苷酸或非天然核苷酸。非天然核苷酸可以包括肽核酸(PNA)、吗啉代和锁核酸(LNA)、以及乙二醇核酸(GNA)和苏糖核酸(TNA)。诸如此类的实例通过改变分子主链而不同于天然存在的DNA或RNA。示例性修饰可以包括对糖、核碱基、核苷间键(例如对连接的磷酸酯/对磷酸二酯键/对磷酸二酯主链)及其任何组合进行的可在翻译期间诱导核糖体暂停的任何修饰。本文提供的一些示例性修饰在本文其他处描述。
在一些实施例中，交错元件以其他形式存在于该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)中。例如，在一些示例性经修饰的环状多核糖核苷酸中，交错元件包含该经修饰的环状多核糖核苷酸中第一表达序列的终止元件，和将终止元件与第一表达序列后继表达的第一翻译起始序列隔开的核苷酸间隔子序列。在一些实例中，第一表达序列的第一交错元件在该经修饰的环状多核糖核苷酸中第一表达序列后继表达的第一翻译起始序列的上游(5’)。在一些情况下，第一表达序列和第一表达序列后继表达序列是该经修饰的环状多核糖核苷酸中的两个隔开的表达序列。第一交错元件与第一翻译起始序列之间的距离可以使得第一表达序列及其后继表达序列能够连续翻译。在一些实施例中，第一交错元件包括终止元件，并且将第一表达序列的表达产物与其后继表达序列的表达产物隔开，从而产生离散的表达产物。在一些情况下，在该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)中后继序列的第一翻译起始序列上游包含第一交错元件的该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)被连续翻译，而在第二表达序列后继表达序列的第二翻译起始序列的上游包含第二表达序列的交错元件的相应的经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)不被连续翻译。在一些情况下，该经修饰的环状多核糖核苷酸中仅存在一个表达序列，并且第一表达序列及其后继表达序列是相同的表达序列。在一些示例性经修饰的环状多核糖核苷酸中，交错元件包含该经修饰的环状多核糖核苷酸中第一表达序列的第一终止元件，和将终止元件与下游翻译起始序列隔开的核苷酸间隔子序列。在一些此类实例中，第一交错元件在该经修饰的环状多核糖核苷酸中第一表达序列的第一翻译起始序列的上游(5’)。在一些情况下，第一交错元件与第一翻译起始序列之间的距离使得能够连续翻译第一表达序列和任何后继表达序列。在一些实施例中，第一交错元件将第一表达序列的一轮表达产物与第一表达序列的下一轮表达产物隔开，从而产生离散的表达产物。在一些情况下，在该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)中第一表达序列第一翻译起始序列上游包含第一交错元件的该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)被连续翻译，而在相应的经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)中第二表达序列的第二翻译起始序列的上游包含交错元件的相应的经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)不被连续翻译。在一些情况下，相应的经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)中第二交错元件与第二翻译起始序列之间的距离是该经修饰的环状多核糖核苷酸中第一交错元件与第一翻译起始序列之间的距离的至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、或10倍大。在一些情况下，第一交错元件与第一翻译起始之间的距离是至少2nt、3nt、4nt、5nt、6nt、7nt、8nt、9nt、10nt、11nt、12nt、13nt、14nt、15nt、16nt、17nt、18nt、19nt、20nt、25nt、30nt、35nt、40nt、45nt、50nt、55nt、60nt、65nt、70nt、75nt、或更大。在一些实施例中，第二交错元件与第二翻译起始之间的距离是至少2nt、3nt、4nt、5nt、6nt、7nt、8nt、9nt、10nt、11nt、12nt、13nt、14nt、15nt、16nt、17nt、18nt、19nt、20nt、25nt、30nt、35nt、40nt、45nt、50nt、55nt、60nt、65nt、70nt、75nt、或大于第一交错元件与第一翻译起始之间的距离。在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包含多于一个表达序列。
调控核酸
在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包含一个或多个编码调控核酸(例如，修饰内源性基因和/或外源性基因的表达)的表达序列。在一些实施例中，如本文提供的经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)的表达序列可以包括与调控核酸像非编码RNA诸如但不限于tRNA、lncRNA、miRNA、rRNA、snRNA、微RNA、siRNA、piRNA、snoRNA、snRNA、exRNA、scaRNA、Y RNA和hnRNA反义的序列。
在一个实施例中，调控核酸靶向宿主基因。调控核酸可以包括国际专利公开号WO2019118919 A1的[0177]和[0181]-[0189]中所述的任一种调控核酸，将该国际专利公开通过援引以其全文并入本文。
在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包含调控核酸，诸如指导RNA(gRNA)。在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包含指导RNA或编码指导RNA。gRNA短合成RNA由与不完整的效应子部分结合所必需的“支架”序列和用于基因组靶标的用户定义的约20个核苷酸靶向序列构成。在实践中，指导RNA序列通常被设计为具有17-24个核苷酸(例如，19、20或21个核苷酸)的长度，并且与靶向性核酸序列互补。定制的gRNA生成器和算法可从商业上获得，用于设计有效的指导RNA。还已经使用嵌合的“单指导RNA”(“sgRNA”)(一种模拟天然存在的crRNA-tracrRNA复合物并包含tracrRNA(用于结合核酸酶)和至少一个crRNA(以将核酸酶指导至被靶向进行编辑的序列)的工程化(合成)单RNA分子)实现了基因编辑。也已经证明，在基因组编辑中，化学修饰的sgRNA是有效的；参见例如，Hendel等人(2015)Nature Biotechnol.[自然生物技术],985-991。
gRNA可以识别特定的DNA序列(例如，与基因的启动子、增强子、沉默子或阻遏子相邻或在其内的序列)。
在一个实施例中，gRNA被用作CRISPR系统的一部分用于基因编辑。出于基因编辑的目的，可以将该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)设计为包含一个或多个与所期望的靶DNA序列相对应的指导RNA序列；参见例如，Cong等人(2013)Science[科学],339:819-823；Ran等人(2013)NatureProtocols[自然实验手册],8:2281-2308。为了发生DNA裂解，Cas9需要gRNA序列的至少约16或17个核苷酸；对于Cpf1，需要gRNA序列的至少约16个核苷酸来实现可检测的DNA裂解。
该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)可以调节基因编码的RNA的表达。因为多个基因可能彼此共享一定程度的序列同源性，所以在一些实施例中，可以将该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)设计为靶向具有充分序列同源性的一类基因。在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)可以含有与在不同基因靶标之间共享的序列或为特定基因靶标所特有的序列具有互补性的序列。在一些实施例中，可以将该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)设计为靶向在若干基因之间具有同源性的RNA序列的保守区，从而靶向一个基因家族中的若干基因(例如，不同基因同种型、剪接变体、突变基因等)。在一些实施例中，可以将该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)设计为靶向为单一基因的特定RNA序列所特有的序列。
在一些实施例中，表达序列的长度少于5000bp(例如，少于约5000bp、4000bp、3000bp、2000bp、1000bp、900bp、800bp、700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp、50bp、40bp、30bp、20bp、10bp、或更少)。在一些实施例中，表达序列独立地或额外地具有大于10bp的长度(例如，至少约10bp、20bp、30bp、40bp、50bp、60bp、70bp、80bp、90bp、100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000kb、1.1kb、1.2kb、1.3kb、1.4kb、1.5kb、1.6kb、1.7kb、1.8kb、1.9kb、2kb、2.1kb、2.2kb、2.3kb、2.4kb、2.5kb、2.6kb、2.7kb、2.8kb、2.9kb、3kb、3.1kb、3.2kb、3.3kb、3.4kb、3.5kb、3.6kb、3.7kb、3.8kb、3.9kb、4kb、4.1kb、4.2kb、4.3kb、4.4kb、4.5kb、4.6kb、4.7kb、4.8kb、4.9kb、5kb、或更大)。
在一些实施例中，表达序列包含本文所述的一种或多种特征，例如，编码一种或多种肽或蛋白质的序列、一种或多种调控元件、一种或多种调控核酸(例如，一种或多种非编码序列RNA)、其他表达序列及其任何组合。
翻译效率
在一些实施例中，如本文提供的经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)的翻译效率大于参考物，例如线性对应物、线性表达序列、线性经修饰的环状多核糖核苷酸、或完全修饰的环状多核糖核苷酸对应物。在一些实施例中，如本文提供的经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)具有的翻译效率比参考物的翻译效率高至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％、200％、250％、300％、350％、400％、450％、500％、600％、70％、800％、900％、1000％、2000％、5000％、10000％、100000％、或更高。在一些实施例中，经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)具有的翻译效率比线性对应物的翻译效率高10％。在一些实施例中，经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)具有的翻译效率比线性对应物的翻译效率高300％。在一些实施例中，杂交修饰的环状多核糖核苷酸具有的翻译效率比完全修饰的环状多核糖核苷酸对应物的翻译效率高10％。在一些实施例中，杂交修饰的环状多核糖核苷酸具有的翻译效率比完全修饰的环状多核糖核苷酸对应物的翻译效率高300％。在一些实施例中，杂交修饰的环状多核糖核苷酸具有的翻译效率比相应的环状多核糖核苷酸的翻译效率高至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％、200％、250％、300％、350％、400％、450％、500％、600％、70％、800％、900％、1000％、2000％、5000％、10000％、100000％、或更多。在一些实施例中，杂交修饰的环状多核糖核苷酸具有的翻译效率比相应的环状多核糖核苷酸的翻译效率高至少约10％。在一些实施例中，杂交修饰的环状多核糖核苷酸具有的翻译效率比相应的环状多核糖核苷酸的翻译效率高至少约20％。在一些实施例中，杂交修饰的环状多核糖核苷酸具有的翻译效率比相应的环状多核糖核苷酸的翻译效率高至少约50％。
在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)产生化学计量比的表达产物。滚环翻译连续地以基本上当量的比率产生表达产物。在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)具有化学计量的翻译效率，使得表达产物以基本上当量的比率产生。在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)具有多种表达产物(例如，来自2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个表达序列的产物)的化学计量翻译效率。
滚环翻译
在一些实施例中，一旦起始该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)的翻译，在完成该经修饰的环状多核糖核苷酸的至少一轮翻译之前，结合至该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)的核糖体不会与该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)脱离。在一些实施例中，如本文所述的经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)能够滚环翻译。在一些实施例中，在滚环翻译期间，一旦起始该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)的翻译，在完成该经修饰的环状多核糖核苷酸的至少2轮、至少3轮、至少4轮、至少5轮、至少6轮、至少7轮、至少8轮、至少9轮、至少10轮、至少11轮、至少12轮、至少13轮、至少14轮、至少15轮、至少20轮、至少30轮、至少40轮、至少50轮、至少60轮、至少70轮、至少80轮、至少90轮、至少100轮、至少150轮、至少200轮、至少250轮、至少500轮、至少1000轮、至少1500轮、至少2000轮、至少5000轮、至少10000轮、至少105轮或至少106轮翻译之前，结合至该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)的核糖体不会与该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)脱离。
在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)的滚环翻译导致生成多肽产物，该多肽产物由该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)的多于一轮翻译翻译出(“连续”表达产物)。在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包含交错元件，并且该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)的滚环翻译导致生成多肽产物，该多肽产物由该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)的单轮翻译或少于单轮翻译生成(“离散”表达产物)。在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)被配置为使得在该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)的滚环翻译期间生成的总多肽中的至少10％、20％、30％、40％、50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％(摩尔/摩尔)是离散多肽。在一些实施例中，在体外翻译系统中测试离散产物相对于总多肽的量比。在一些实施例中，用于测试量比的体外翻译系统包含兔网织红细胞裂解物。在一些实施例中，在体内翻译系统诸如真核细胞或原核细胞、培养细胞或生物体中的细胞中测试量比。
非翻译区
在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包含非翻译区(UTR)。包含基因的基因组区域的UTR可以转录但不翻译。在一些实施例中，UTR可以被包括在本文所述的表达序列的翻译起始序列的上游。在一些实施例中，UTR可以被包括在本文所述的表达序列的下游。在一些情况下，第一表达序列的一个UTR与第二表达序列的另一个UTR相同或连续或重叠。在一些实施例中，内含子是人内含子。在一些实施例中，内含子是全长人内含子，例如ZKSCAN1。
在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包含内嵌有一段或多段的腺苷和尿苷的UTR。这些AU富集签名可能会增加表达产物的转化率。
UTR AU富集元件(ARE)的引入、去除或修饰可用于调节该经修饰的环状多核糖核苷酸的稳定性或免疫原性。当工程化特定的经修饰的环状多核糖核苷酸时，可以将ARE的一个或多个拷贝引入至该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)中，并且ARE的这些拷贝可以调节表达产物的翻译和/或产生。同样，可以对ARE进行鉴定和去除或工程化至该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)中以调节细胞内稳定性，并且由此影响所得蛋白质的翻译和产生。
应理解，可以将来自任何基因的任何UTR掺入该经修饰的环状多核糖核苷酸的相应侧接区中。可以在本文提供的经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)中使用的示例性UTR可以包括国际专利公开号WO2019118919 A1的[0200]-[0201]中所述的那些，将该国际专利公开通过援引以其全文并入本文。
聚A序列
在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)可以包括聚A序列。在一些实施例中，聚A序列的长度大于10个核苷酸。在一个实施例中，聚A序列的长度大于15个核苷酸(例如，至少或大于约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1,000、1,100、1,200、1,300、1,400、1,500、1,600、1,700、1,800、1,900、2,000、2,500、和3,000个核苷酸)。在一些实施例中，根据国际专利公开号WO 2019118919 A1的[0202]-[0204]中的聚A序列的描述设计聚A序列，将该国际专利公开通过援引以其全文并入本文。
在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包含聚A、缺少聚A、或具有经修饰的聚A以调节该经修饰的环状多核糖核苷酸的一种或多种特征。在一些实施例中，缺少聚A或具有经修饰的聚A的该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)改善了一种或多种功能特征，例如免疫原性、半衰期、表达效率等。
RNA结合
在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包含一个或多个RNA结合位点。微RNA(或miRNA)是短非编码RNA，与核酸分子的3'UTR结合并且通过降低核酸分子的稳定性或通过抑制翻译来下调基因表达。该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)可以包含一种或多种微RNA靶序列、微RNA序列、或微RNA种子。此类序列可以对应于任何已知的微RNA，诸如在美国公开US 2005/0261218、美国公开US 2005/0059005、以及国际专利公开号WO 2019118919 A1的[0207]-[0215]中传授的那些，将这些专利的内容通过援引以其全文并入本文。
蛋白质结合
在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包括一个或多个蛋白质结合位点，使得蛋白质例如核糖体能够结合至RNA序列中的内部位点。通过将蛋白质结合位点(例如，核糖体结合位点)工程化至该经修饰的环状多核糖核苷酸中，通过掩蔽该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)而免受宿主免疫系统组分的影响，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)可以逃避宿主的免疫系统的检测或具有减少的宿主的免疫系统的检测、具有经调节的降解、或经调节的翻译。
在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包含至少一个免疫蛋白结合位点，例如以逃避免疫应答，例如CTL(细胞毒性T淋巴细胞)应答。在一些实施例中，免疫蛋白结合位点是结合至免疫蛋白并且有助于掩蔽为外源的该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)的核苷酸序列。在一些实施例中，免疫蛋白结合位点是结合至免疫蛋白并且有助于隐藏为外源或外来的该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)的核苷酸序列。
核糖体与线性RNA接合的传统机制包括核糖体与RNA的加帽5'端的结合。从5'端，核糖体迁移到起始密码子，于是形成第一肽键。根据本发明，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)的翻译的内部起始(即，非帽依赖性)不需要游离端或加帽端。而是，核糖体结合至未加帽的内部位点，由此核糖体在起始密码子处开始多肽延长。在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包括一个或多个RNA序列，该一个或多个RNA序列包含核糖体结合位点，例如起始密码子。
天然5'UTR具有在翻译起始中起作用的特征。它们具有公知参与核糖体启动多种基因的翻译的过程中的签名，像科扎克序列。科扎克序列具有共有CCR(A/G)CCAUGG，其中R是起始密码子(AUG)的三个碱基上游的嘌呤(腺嘌呤或鸟嘌呤)，后接另一个“G”。还已知5'UTR形成参与延长因子结合的二级结构。
在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)编码与蛋白质结合的蛋白质结合序列。在一些实施例中，蛋白质结合序列将该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)靶向或定位至特定靶标。在一些实施例中，蛋白质结合序列特异性结合蛋白质的精氨酸富集区。
在一些实施例中，蛋白质结合位点包括但不限于以下与蛋白质的结合位点：诸如ACIN1、AGO、APOBEC3F、APOBEC3G、ATXN2、AUH、BCCIP、CAPRIN1、CELF2、CPSF1、CPSF2、CPSF6、CPSF7、CSTF2、CSTF2T、CTCF、DDX21、DDX3、DDX3X、DDX42、DGCR8、EIF3A、EIF4A3、EIF4G2、ELAVL1、ELAVL3、FAM120A、FBL、FIP1L1、FKBP4、FMR1、FUS、FXR1、FXR2、GNL3、GTF2F1、HNRNPA1、HNRNPA2B1、HNRNPC、HNRNPK、HNRNPL、HNRNPM、HNRNPU、HNRNPUL1、IGF2BP1、IGF2BP2、IGF2BP3、ILF3、KHDRBS1、LARP7、LIN28A、LIN28B、m6A、MBNL2、METTL3、MOV10、MSI1、MSI2、NONO、NONO-、NOP58、NPM1、NUDT21、PCBP2、POLR2A、PRPF8、PTBP1、RBFOX2、RBM10、RBM22、RBM27、RBM47、RNPS1、SAFB2、SBDS、SF3A3、SF3B4、SIRT7、SLBP、SLTM、SMNDC1、SND1、SRRM4、SRSF1、SRSF3、SRSF7、SRSF9、TAF15、TARDBP、TIA1、TNRC6A、TOP3B、TRA2A、TRA2B、U2AF1、U2AF2、UNK、UPF1、WDR33、XRN2、YBX1、YTHDC1、YTHDF1、YTHDF2、YWHAG、ZC3H7B、PDK1、AKT1、和任何其他结合RNA的蛋白质。
加密原
如本文所述，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包含加密原以降低、逃避或避免细胞的先天性免疫应答。在一方面，本文提供了经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)，当被递送至细胞时，该经修饰的环状多核糖核苷酸与由参考化合物(例如对应于所述经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)的线性多核苷酸、相应的未修饰的环状多核糖核苷酸、缺少加密原的经修饰的环状多核糖核苷酸)触发的应答相比，导致宿主的免疫应答降低。在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)具有比缺少加密原的对应物更小的免疫原性。
在一些实施例中，加密原增强了稳定性。关于UTR在核酸分子的稳定性和翻译方面发挥调控作用的证据越来越多。UTR的调控特征可以包含在加密原中，以增强该经修饰的环状多核糖核苷酸的稳定性。
在一些实施例中，5’或3’UTR可以构成经修饰的环状多核糖核苷酸中的加密原。例如，UTR AU富集元件(ARE)的去除或修饰可用于调节该经修饰的环状多核糖核苷酸的稳定性或免疫原性。
在一些实施例中，表达序列，例如可翻译区中AU富集元件(ARE)的去除或修饰可用于调节该经修饰的环状多核糖核苷酸的稳定性或免疫原性。
在一些实施例中，加密原包含miRNA结合位点或与任何其他非编码RNA的结合位点。例如，将miR-142位点掺入本文所述的经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)中不仅可以调节造血细胞中的表达，还可以降低或消除对该经修饰的环状多核糖核苷酸中编码的蛋白质的免疫应答。
在一些实施例中，加密原包含一个或多个蛋白质结合位点，使得蛋白质(例如，免疫蛋白质)能够结合至RNA序列。通过将蛋白质结合位点工程化至该经修饰的环状多核糖核苷酸中，通过掩蔽该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)而免受宿主免疫系统组分的影响，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)可以逃避宿主免疫系统的检测或具有减少的宿主免疫系统的检测、具有经调节的降解、或经调节的翻译。在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包含至少一个免疫蛋白结合位点，例如以逃避免疫应答，例如CTL应答。在一些实施例中，免疫蛋白结合位点是结合至免疫蛋白并且有助于掩蔽为外源的该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)的核苷酸序列。
在一些实施例中，加密原包含一种或多种经修饰的核苷酸。示例性修饰可以包括对糖、核碱基、核苷间键(例如对连接的磷酸酯/对磷酸二酯键/对磷酸二酯主链)及其任何组合进行的可防止或降低针对该经修饰的环状多核糖核苷酸的免疫应答的任何修饰。以下详细描述了本文提供的一些示例性修饰。
在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包含一个或多个如本文其他处所述的修饰，以与由参考化合物(例如缺少修饰的经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸))触发的应答相比，降低宿主的免疫应答。特别地，已显示添加一个或多个肌苷区分RNA是内源性还是病毒性。参见例如，Yu,Z等人,(2015)RNAediting by ADAR1 marks dsRNA as“self”[通过ADAR1进行的RNA编辑将dsRNA标记为“自身”].Cell Res[细胞研究].25,1283-1284，将该文献通过援引以其全文并入本文。
在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包括一个或多个shRNA的表达序列或可被加工成siRNA的RNA序列，并且shRNA或siRNA靶向RIG-1并降低RIG-1的表达。RIG-1可以感测外来环状RNA，并且导致外来环状RNA降解。因此，具有靶向RIG-1的shRNA、siRNA或任何其他调控核酸的序列的环状多核苷酸可以降低针对该经修饰的环状多核糖核苷酸的免疫力，例如宿主细胞免疫力。
在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)缺少有助于该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)降低、逃避或避免细胞的先天性免疫应答的序列、元件或结构。在一些此类实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)可能缺少聚A序列、5’端、3’端、磷酸酯基团、羟基基团、或其任何组合。
核糖开关
在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包含一个或多个核糖开关。
核糖开关典型地被认为是该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)的一部分，该一部分可以直接结合小的靶分子，并且其与靶标的结合会影响RNA翻译、表达产物的稳定性和活性(Tucker B J,Breaker R R(2005),Curr Opin Struct Biol[结构生物学新见]15(3):342-8)。因此，根据核糖开关靶分子的存在或不存在，包括核糖开关的该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)直接参与调控其自身的活性。在一些实施例中，核糖开关具有适体样亲和力区域用于单独的分子。因此，在本发明的更广泛的上下文中，包含在非编码核酸中的任何适体都可以用于从大体积中螯合分子。经由“(核糖)开关”活性的事件的下游报告可能是特别有利的。
在一些实施例中，核糖开关可以对基因表达具有影响，包括但不限于转录终止、翻译起始抑制、mRNA自裂解、以及在真核生物中剪接途径的改变。核糖开关可以通过触发分子的结合或去除来控制基因表达。因此，使包括核糖开关的经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)经受激活、失活或阻断核糖开关的条件以改变表达。表达可以由于例如转录终止或核糖体与RNA结合的阻断而改变。根据核糖开关的性质，触发分子或其类似物的结合可以减少或阻止RNA分子的表达或者促进或增加RNA分子的表达。本文描述了核糖开关的一些实例。
环二-GMP核糖开关、FMN核糖开关(也称为RFN-元件)、glmS核糖开关、谷氨酰胺核糖开关、甘氨酸核糖开关、赖氨酸核糖开关(也称为L-盒)、PreQ1核糖开关(例如，PreQ1-l核糖开关和PreQ1-ll核糖开关)、嘌呤核糖开关、SAH核糖开关、SAM核糖开关、SAM-SAH核糖开关、四氢叶酸核糖开关、茶碱结合核糖开关、胸腺嘧啶焦磷酸盐结合核糖开关、腾冲嗜热菌(T.tengcongensis)glmS催化性核糖开关、TPP核糖开关(也称为THI-盒)、Moco核糖开关、或腺嘌呤感测add-A核糖开关，其中每一种描述于国际专利公开号WO 2019118919 A1的[0235]-[0252]中，将该国际专利公开通过援引以其全文并入本文。
适体酶
在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包含适体酶。适体酶是用于条件性表达的开关，在该条件性表达中适体区域用作变构控制元件并且偶联至催化性RNA区域(如下所述的“核酶”)。在一些实施例中，适体酶在细胞类型特异性翻译中具有活性。在一些实施例中，适体酶在细胞状态特异性翻译(例如，病毒感染的细胞或存在病毒核酸或病毒蛋白)下具有活性。
核酶(来自核糖核酸酶，也称为RNA酶或催化性RNA)是催化化学反应的RNA分子。
核酶的一些非限制性实例包括锤头核酶、VL核酶、先导酶(leadzyme)、发夹核酶、以及国际专利公开号WO 2019118919 A1的[0254]-[0259]中所述的其他核酶，将该国际专利公开通过援引以其全文并入本文。
在一些实施例中，本文所述的经修饰的circRNA可用于RNA的转录和复制。例如，circRNA可用于编码非编码RNA、lncRNA、miRNA、tRNA、rRNA、snoRNA、ncRNA、siRNA或shRNA。在一些实施例中，circRNA可以包括反义miRNA和转录元件。转录后，此类circRNA可以产生功能性的线性miRNA。circRNA表达和调节应用的非限制性实例列于表3中。
表3
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靶标结合
在一些实施例中，经修饰的circRNA(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)结合一个或多个靶标。在一个实施例中，circRNA结合DNA靶标和蛋白质靶标两者，并且例如介导转录。在另一个实施例中，circRNA(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)使蛋白质复合物聚集在一起，并且例如介导信号转导。在另一个实施例中，circRNA(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)结合两个或更多个不同的靶标，诸如蛋白质，并且例如，将这些蛋白质穿梭至细胞质。在一些实施例中，药物组合物包含杂交修饰的环状多核糖核苷酸，其中该杂交修饰的环状多核糖核苷酸包含：至少一种经修饰的核苷酸；第一部分，该第一部分包含由未修饰的核苷酸组成的第一结合位点，该第一结合位点被配置为结合第一靶标，例如RNA、DNA、蛋白质、或细胞靶标的第一结合部分，其中该第一结合部分是第一环状多核糖核苷酸(circRNA)结合基序；其中该第一靶标和该杂交修饰的环状多核糖核苷酸形成复合物。在一些实施例中，药物组合物包含杂交修饰的环状多核糖核苷酸，其中该杂交修饰的环状多核糖核苷酸包含：至少一种经修饰的核苷酸；第一部分，该第一部分包含由未修饰的核苷酸组成的第一结合位点，该第一结合位点被配置为结合第一靶标，例如RNA、DNA、蛋白质、或细胞靶标的第一结合部分，其中该第一结合部分是第一环状多核糖核苷酸(circRNA)结合基序；以及第二结合位点，该第二结合位点被配置为结合第二靶标的第二结合部分，其中该第二结合部分是第二circRNA结合基序，其中该第一结合部分不同于该第二结合部分，其中该第一靶标、该第二靶标、和该杂交修饰的环状多核糖核苷酸形成复合物，并且其中该第一靶标或该第二靶标不是微RNA。在一些实施例中，药物组合物包含杂交修饰的环状多核糖核苷酸，其中该杂交修饰的环状多核糖核苷酸包含：至少一种经修饰的核苷酸；第一部分，该第一部分包含第一结合位点，该第一结合位点被配置为结合第一靶标的第一结合部分，其中该第一结合部分是第一环状多核糖核苷酸(circRNA)结合基序；以及第二结合位点，该第二结合位点被配置为结合第二靶标的第二结合部分，其中该第二结合部分是第二circRNA结合基序，其中该第一结合部分不同于该第二结合部分，并且其中该第一靶标和该第二靶标两者均是微RNA。在一些实施例中，该杂交修饰的环状多核糖核苷酸包含第一部分，该第一部分包含由未修饰的核苷酸组成的结合位点，该结合位点被配置为结合至蛋白质、肽、生物分子、DNA、RNA、或细胞靶标。在一些实施例中，如本文所述的第一部分包含由未修饰的核苷酸组成的结合位点，该结合位点被配置为结合至蛋白质、肽、生物分子、DNA、RNA、或细胞靶标。
在一些实施例中，经修饰的circRNA(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)结合DNA、RNA、和蛋白质中的至少一种，并且从而调控细胞过程(例如，改变蛋白质表达)。在一些实施例中，合成的经修饰的circRNA(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包括用于与选择的DNA、RNA或蛋白质的至少一个部分，例如结合部分相互作用的结合位点，从而与内源性对应物竞争结合。
在一个实施例中，合成的经修饰的circRNA(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)结合和/或螯合miRNA。在另一个实施例中，合成的经修饰的circRNA(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)结合和/或螯合蛋白质。在另一个实施例中，合成的经修饰的circRNA结合和/或螯合mRNA。在另一个实施例中，合成的经修饰的circRNA(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)结合和/或螯合核糖体。在另一个实施例中，合成的经修饰的circRNA(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)结合和/或螯合经修饰的circRNA。在另一个实施例中，合成的经修饰的circRNA结合和/或螯合长非编码RNA(lncRNA)或任何其他非编码RNA，例如miRNA、tRNA、rRNA、snoRNA、ncRNA、siRNA、长非编码RNA、shRNA。除了结合和/或螯合位点，该经修饰的circRNA还可以包括降解元件，该降解元件将导致结合和/或螯合的RNA和/或蛋白质的降解。
在一个实施例中，经修饰的circRNA(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包含lncRNA或lncRNA的序列，例如，经修饰的circRNA包含天然存在的非环状lncRNA的序列或其片段。在一个实施例中，在具有或不具有间隔子序列的情况下将lncRNA或lncRNA的序列环化，以形成合成的经修饰的circRNA(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)。
在一个实施例中，经修饰的circRNA(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)具有核酶活性。在一个实施例中，经修饰的circRNA(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)可用于充当核酶并且裂解致病性或内源性RNA、DNA、小分子或蛋白质。在一个实施例中，经修饰的circRNA(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)具有酶活性。在一个实施例中，合成的经修饰的circRNA(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)能够特异性识别和裂解RNA(例如，病毒RNA)。在另一个实施例中，经修饰的circRNA(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)能够特异性识别和裂解蛋白质。在另一个实施例中，经修饰的circRNA(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)能够特异性识别和降解小分子。
在一个实施例中，经修饰的circRNA(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)是牺牲型或自裂解或可裂解的经修饰的circRNA。在一个实施例中，经修饰的circRNA(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)可用于递送RNA，例如miRNA、tRNA、rRNA、snoRNA、ncRNA、siRNA、长非编码RNA、shRNA。在一个实施例中，合成的经修饰的circRNA(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)由被(1)可自裂解的元件(例如，锤头结构、剪接元件)、(2)裂解募集位点(例如，ADAR)、(3)可降解接头(丙三醇)、(4)化学接头、和/或(5)间隔子序列隔开的微RNA构成。在另一个实施例中，合成的经修饰的circRNA由被(1)可自裂解的元件(例如，锤头结构、剪接元件)、(2)裂解募集位点(例如，ADAR)、(3)可降解接头(丙三醇)、(4)化学接头、和/或(5)间隔子序列隔开的siRNA构成。
在一个实施例中，经修饰的circRNA是具有转录/复制能力的经修饰的circRNA。此经修饰的circRNA(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)可以编码任何类型的RNA。在一个实施例中，合成的经修饰的circRNA具有反义miRNA和转录元件。在一个实施例中，在转录后，从经修饰的circRNA(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)生成线性功能性miRNA。
在一个实施例中，经修饰的circRNA(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)具有上述属性中的一种或多种与翻译元件的组合。
靶标
经修饰的circRNA(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包含至少一个结合靶标的结合部分的结合位点。靶标包括但不限于核酸(例如，RNA、DNA、RNA-DNA杂交体)、小分子(例如，药物)、适体、多肽、蛋白质、脂质、碳水化合物、抗体、病毒、病毒颗粒、膜、多组分复合物、细胞、其他细胞部分、其任何片段、及其任何组合。(参见例如，Fredriksson等人,(2002)Nat Biotech[自然生物技术]20:473-77；Gullberg等人,(2004)PNAS[美国国家科学院院刊],101:8420-24)。例如，靶标是单链RNA、双链RNA、单链DNA、双链DNA、包含一个或多个双链区域和一个或多个单链区域的DNA或RNA、RNA-DNA杂交体、小分子、适体、多肽、蛋白质、脂质、碳水化合物、抗体、抗体片段、抗体混合物、病毒颗粒、膜、多组分复合物、细胞、细胞部分、其任何片段、或其任何组合。
在一些实施例中，靶标是多肽、蛋白质、或其任何片段。例如，靶标可以是经纯化的多肽、分离的多肽、融合标签化多肽、附接至或跨越细胞或病毒或病毒体的膜的多肽、细胞质蛋白、细胞内蛋白、细胞外蛋白、激酶、磷酸酶、芳香化酶、解旋酶、蛋白酶、氧化还原酶、还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶、糖基化酶、细胞外基质蛋白、连接酶、离子转运蛋白、通道、孔、凋亡蛋白、细胞粘附蛋白、致病蛋白、异常表达的蛋白、转录因子、转录调节物、翻译蛋白、分子伴侣、分泌蛋白、配体、激素、细胞因子、趋化因子、核蛋白、受体、跨膜受体、信号转导物、抗体、膜蛋白、整合膜蛋白、外周膜蛋白、细胞壁蛋白、球状蛋白、纤维蛋白、糖蛋白、脂蛋白、染色体蛋白、其任何片段、或其任何组合。在一些实施例中，靶标是异源多肽。在一些实施例中，靶标是使用分子技术(诸如转染)在细胞中过表达的蛋白质。在一些实施例中，靶标是重组多肽。例如，靶标是在由细菌(例如，大肠杆菌)、酵母、哺乳动物或昆虫细胞(例如，生物体过表达的蛋白质)产生的样品中。在一些实施例中，靶标是具有突变、插入、缺失或多态性的多肽。在一些实施例中，靶标是抗原，诸如用于免疫生物体或在生物体中生成免疫应答，诸如用于抗体产生的多肽。
在一些实施例中，靶标是抗体。抗体可以特异性结合至另一个分子的特定空间和极性组织。抗体可以是单克隆抗体、多克隆抗体、或重组抗体，并且可以通过本领域熟知的技术制备，这些技术诸如免疫宿主并收集血清(多克隆)，或通过制备连续的杂交细胞系并收集分泌蛋白(单克隆)，或通过克隆和表达核苷酸序列或其诱变形式，这些核苷酸序列或其诱变形式至少编码天然抗体的特异性结合所需的氨基酸序列。天然存在的抗体可以是包含通过二硫键相互连接的至少两个重(H)链和两个轻(L)链的蛋白质。每个重链可以由重链可变区(VH)和重链恒定区构成。重链恒定区可以由三个结构域CH1、CH2和CH3构成。每个轻链可以由轻链可变区(VL)和轻链恒定区构成。轻链恒定区可以由一个结构域CL构成。VH和VL区可以进一步再分为高变区，称为互补决定区(CDR)，其间插着更为保守的区，称为框架区(FR)。每个VH和VL由从氨基末端至羧基末端按以下顺序排列的三个CDR和四个FR构成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、和FR4。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子(包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)以及经典补体系统的第一组分(C1 q))的结合。抗体可以是任何同种型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如，lgG1、lgG2、lgG3、lgG4、lgA1和lgA2)、亚类或其经修饰的形式。抗体可以包括完整的免疫球蛋白或其片段。抗体片段可以是指抗体的保留特异性结合至结合部分(诸如抗原)的能力的一个或多个片段。另外，还包括免疫球蛋白或其片段的聚集体、聚合物和缀合物，只要维持对特定分子的结合亲和力即可。抗体片段的实例包括Fab片段，一种由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；F(ab)2片段，一种包含由二硫桥在铰链区连接的两个Fab片段的双价片段；由VH和CH1结构域组成的Fd片段；由抗体的单一臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；由VH结构域组成的单结构域抗体(dAb)片段(Ward等人,(1989)Nature[自然]341:544-46)；以及分离的CDR和单链片段(scFv)，其中VL和VH区配对以形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见例如，Bird等人,(1988)Science[科学]242:423-26；和Huston等人,(1988)PNAS[美国国家科学院院刊]85:5879-83)。因此，抗体片段包括Fab、F(ab)2、scFv、Fv、dAb等。尽管两个结构域VL和VH由单独的基因编码，但是可以使用重组方法将这两个结构域通过能够使它们形成为单条蛋白质链的人工肽接头来接合。此类单链抗体包括一个或多个抗原结合部分。这些抗体片段可以使用本领域技术人员已知的常规技术获得，并且可以以与完整抗体相同的方式筛选这些片段的效用。抗体可以是人的、人源化的、嵌合的、分离的、狗、猫、驴、绵羊、任何植物、动物、或哺乳动物的。
在一些实施例中，靶标是核糖核苷酸和/或脱氧核糖核苷酸(腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或胞嘧啶)的聚合形式，诸如DNA或RNA(例如，mRNA)。DNA包括在线性DNA分子(例如，限制性片段)、病毒、质粒、和染色体中发现的双链DNA。在一些实施例中，多核苷酸靶标是单链、双链、小干扰RNA(siRNA)、信使RNA(mRNA)、转运RNA(tRNA)、染色体、基因、非编码基因组序列、基因组DNA(例如，片段化的基因组DNA)、经纯化的多核苷酸、分离的多核苷酸、杂交的多核苷酸、转录因子结合位点、线粒体DNA、核糖体RNA、真核多核苷酸、原核多核苷酸、合成的多核苷酸、连接的多核苷酸、重组多核苷酸、含有核酸类似物的多核苷酸、甲基化多核苷酸、脱甲基化多核苷酸、其任何片段、或其任何组合。在一些实施例中，靶标是重组多核苷酸。在一些实施例中，靶标是异源多核苷酸。例如，靶标是由细菌(例如，大肠杆菌)、酵母、哺乳动物或昆虫细胞产生的多核苷酸(例如，与生物体异源的多核苷酸)。在一些实施例中，靶标是具有突变、插入、缺失或多态性的多核苷酸。
在一些实施例中，靶标是适体。适体是分离的核酸分子，该核酸分子以高特异性和亲和力结合至结合部分，诸如蛋白质。适体是保持为一种或多种特定构象的三维结构，该三维结构提供化学接触以特异性结合其给定靶标。尽管适体是基于核酸的分子，但适体与其他核酸分子(诸如基因和mRNA)之间存在根本差异。在这些其他核酸分子中，核酸结构通过其线性碱基序列编码信息，因此此序列对信息存储的功能很重要。完全相反，基于靶分子的特异性结合的适体功能并不完全依赖于保守的线性碱基序列(非编码序列)，而是特定的二级/三级/四级结构。适体可能具有的任何编码潜能都是完全偶然的，并且无论怎样都不在适体与其同源靶标的结合中起作用。还必须将适体与结合至某些蛋白质的天然存在的核酸序列区别开。这些后者的序列是嵌入生物体基因组内的天然存在的序列，这些序列与参与天然存在的核酸(例如，核酸结合蛋白)的转录、翻译和转运的蛋白质的特定亚组结合。另一方面，适体是短的、分离的、非天然存在的核酸分子。尽管可以鉴定出结合核酸结合蛋白的适体，但在大多数情况下，此类适体与自然界中由核酸结合蛋白识别的序列具有极少或没有序列同一性。更重要的是，适体可以结合几乎任何蛋白质(不仅是核酸结合蛋白)以及几乎任何目的配偶体，包括小分子、碳水化合物、肽等。对于大多数配偶体，甚至蛋白质，与其结合的天然核酸序列不存在。对于确实具有这种序列的那些配偶体，例如核酸结合蛋白，由于与紧密结合的适体相比，自然界中使用的结合亲和力相对较低，因此此类序列将不同于适体。适体能够特异性结合至选择的配偶体并且例如通过结合来调节配偶体的活性或结合相互作用，适体可以阻断其配偶体起功能的能力。与配偶体特异性结合的功能特性是适体的固有特性。典型的适体的大小是6-35kDa(20-100个核苷酸)，以微摩尔至亚纳摩尔分子亲和力结合其配偶体，并且可以区分紧密相关的靶标(例如，适体可以选择性地结合来自相同基因家族的相关蛋白)。适体能够使用通常见到的分子间相互作用，诸如氢键、静电互补性、疏水性接触和空间排阻来与特定配偶体结合。适体具有用作治疗和诊断的许多期望的特征，包括高特异性和亲和力、低免疫原性、生物学功效以及优异的药代动力学特性。适体可以包含由共价连接的互补多核苷酸的杂交形成的分子茎和环结构(例如，发夹环结构)。茎包含杂交的多核苷酸，并且环是共价连接两个互补多核苷酸的区域。
在一些实施例中，靶标是小分子。例如，小分子可以是大环分子、抑制剂、药物、或化合物。在一些实施例中，小分子含有不超过五个氢键供体。在一些实施例中，小分子含有不超过十个氢键受体。在一些实施例中，小分子具有500道尔顿或更小的分子量。在一些实施例中，小分子具有从约180至500道尔顿的分子量。在一些实施例中，小分子含有不超过五的辛醇-水分配系数lop P。在一些实施例中，小分子具有从-0.4至5.6的分配系数log P。在一些实施例中，小分子具有从40至130的摩尔折射率。在一些实施例中，小分子含有从约20至约70个原子。在一些实施例中，小分子具有140埃2或更小的极性表面积。
在一些实施例中，靶标是细胞。例如，靶标是完整细胞、用化合物(例如，药物)处理的细胞、固定的细胞、裂解的细胞、或其任何组合。在一些实施例中，靶标是单个细胞。在一些实施例中，靶标是多个细胞。
在一些实施例中，单个靶标或多个(例如，两个或更多个)靶标具有多个结合部分。在一个实施例中，单个靶标可以具有2、3、4、5、6、7、8、9、10个、或更多个结合部分。在一个实施例中，样品中有两个或更多个靶标，诸如靶标的混合物或文库，并且样品包含两个或更多个结合部分。在一些实施例中，单个靶标或多个靶标包含多个不同的结合部分。例如，多个可以包括至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、500、1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、10,000、11,000、12,000、13,000、14,000、15,000、16,000、17,000、18,000、19,000、20,000、25,000、或30,000个结合部分。
靶标可以包含多个结合部分，该多个结合部分包含至少2个不同的结合部分。例如，结合部分可以包含多个结合部分，该多个结合部分包含至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、10,000、11,000、12,000、13,000、14,000、15,000、16,000、17,000、18,000、19,000、20,000、21,000、22,000、23,000、24,000、或25,000个不同的结合部分。
结合位点和结合部分
在一些情况下，经修饰的circRNA(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包含一个结合位点。在一些实施例中，第一部分包含由未修饰的核苷酸组成的结合位点，该结合位点被配置为结合至蛋白质、肽、生物分子、DNA、RNA、或细胞靶标。在一些实施例中，第一部分包含一个或多个由未修饰的核苷酸组成的结合位点，该一个或多个结合位点被配置为结合至蛋白质、肽、生物分子、DNA、RNA、或细胞靶标、或其组合。在一些情况下，经修饰的circRNA(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包含至少两个结合位点。例如，经修饰的circRNA可以包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、或更多个结合位点。在一些实施例中，本文所述的经修饰的circRNA(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)是结合一个或多个靶标的一个或多个结合部分的分子支架。每个靶标可以是但不限于不同或相同的核酸(例如，RNA、DNA、RNA-DNA杂交体)、小分子(例如，药物)、适体、多肽、蛋白质、脂质、碳水化合物、抗体、病毒、病毒颗粒、膜、多组分复合物、细胞、细胞部分、其任何片段、及其任何组合。在一些实施例中，该一个或多个结合位点结合至相同靶标的一个或多个结合部分。在一些实施例中，该一个或多个结合位点结合至不同靶标的一个或多个结合部分。在一些实施例中，经修饰的circRNA充当一个或多个靶标的一个或多个结合部分的支架。在一些实施例中，经修饰的circRNA(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)通过特异性结合至一个或多个靶标的一个或多个结合部分来调节细胞过程。在一些实施例中，本文所述的经修饰的circRNA(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包括针对一个或多个目的特定靶标的结合位点。在一些实施例中，经修饰的circRNA(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包括针对每个目的结合部分的多个结合位点或结合位点组合。例如，经修饰的circRNA(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包括针对多核苷酸靶标(诸如DNA或RNA)的结合位点。例如，经修饰的circRNA(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包括针对mRNA靶标的结合位点。例如，经修饰的circRNA(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包括针对rRNA靶标的结合位点。例如，经修饰的circRNA包括针对tRNA靶标的结合位点。例如，经修饰的circRNA(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包括针对基因组DNA靶标的结合位点。
在一些情况下，经修饰的circRNA(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包含针对单链DNA上的结合部分的结合位点。在一些情况下，经修饰的circRNA(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包含针对双链DNA上的结合部分的结合位点。在一些情况下，经修饰的circRNA(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包含针对抗体上的结合部分的结合位点。在一些情况下，经修饰的circRNA(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包含针对病毒颗粒上的结合部分的结合位点。在一些情况下，经修饰的circRNA(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包含针对小分子上的结合部分的结合位点。在一些情况下，经修饰的circRNA(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包含针对细胞中或细胞上的结合部分的结合位点。在一些情况下，经修饰的circRNA(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包含针对RNA-DNA杂交体上的结合部分的结合位点。在一些情况下，经修饰的circRNA(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包含针对甲基化多核苷酸上的结合部分的结合位点。在一些情况下，经修饰的circRNA(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包含针对未甲基化多核苷酸上的结合部分的结合位点。在一些情况下，经修饰的circRNA(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包含针对适体上的结合部分的结合位点。在一些情况下，经修饰的circRNA(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包含针对多肽上的结合部分的结合位点。在一些情况下，经修饰的circRNA(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包含针对多肽、蛋白质、蛋白质片段、标签化蛋白、抗体、抗体片段、小分子、病毒颗粒(例如，包含跨膜蛋白的病毒颗粒)、或细胞上的结合部分的结合位点。
在一些情况下，结合部分包含至少两个酰胺键。在一些情况下，结合部分不包含磷酸二酯键。在一些情况下，结合部分不是DNA或RNA。
本文提供的经修饰的circRNA(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)可以包括一个或多个针对复合物上的结合部分的结合位点。本文提供的经修饰的circRNA(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)可以包括一个或多个针对靶标的结合位点以形成复合物。本文提供的经修饰的circRNA(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)可以形成经修饰的circRNA(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)与靶标之间的复合物。在一些实施例中，经修饰的circRNA(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)与单个靶标形成复合物。在一些实施例中，经修饰的circRNA(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)与两个或更多个靶标的复合物形成复合物。在一些实施例中，经修饰的circRNA(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)与三个或更多个靶标的复合物形成复合物。在一些实施例中，两个或更多个经修饰的circRNA(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)与单个靶标形成复合物。在一些实施例中，两个或更多个经修饰的circRNA(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)与两个或更多个靶标形成复合物。在一些实施例中，第一经修饰的circRNA(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)与第一靶标的第一结合部分和第二靶标的第二不同结合部分形成复合物。在一些实施例中，第一经修饰的circRNA(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)与第一靶标的第一结合部分形成复合物，并且第二经修饰的circRNA(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)与第二靶标的第二结合部分形成复合物。
在一些实施例中，经修饰的circRNA(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)可以包括针对以下上的一个或多个结合部分的结合位点：一种或多种抗体-多肽复合物、多肽-多肽复合物、多肽-DNA复合物、多肽-RNA复合物、多肽-适体复合物、病毒颗粒-抗体复合物、病毒颗粒-多肽复合物、病毒颗粒-DNA复合物、病毒颗粒-RNA复合物、病毒颗粒-适体复合物、细胞-抗体复合物、细胞-多肽复合物、细胞-DNA复合物、细胞-RNA复合物、细胞-适体复合物、小分子-多肽复合物、小分子-DNA复合物、小分子-适体复合物、小分子-细胞复合物、小分子-病毒颗粒复合物、及其组合。
在一些情况下，结合部分在多肽、蛋白质、或其片段上。在一些实施例中，结合部分包含多肽、蛋白质或其片段的结构域、片段、表位、区域或一部分。例如，结合部分包含分离的多肽、细胞的多肽、经纯化的多肽或重组多肽的结构域、片段、表位、区域或一部分。例如，结合部分包含抗体或其片段的结构域、片段、表位、区域或一部分。例如，结合部分包含转录因子的结构域、片段、表位、区域或一部分。例如，结合部分包含受体的结构域、片段、表位、区域或一部分。例如，结合部分包含跨膜受体的结构域、片段、表位、区域或一部分。结合部分可以在分离的、纯化的和/或重组的多肽的结构域、片段、表位、区域或一部分上或者包含分离的、纯化的和/或重组的多肽的结构域、片段、表位、区域或一部分上。结合部分包括分析物(例如，裂解物)的混合物上的结合部分或者分析物(例如，裂解物)的混合物的结构域、片段、表位、区域或一部分。例如，结合部分在来自多个细胞或来自单个细胞的裂解物的结构域、片段、表位、区域或一部分上或者包含来自多个细胞或来自单个细胞的裂解物的结构域、片段、表位、区域或一部分。
在一些情况下，结合部分在小分子的结构域、片段、表位、区域或一部分上或者包含小分子的结构域、片段、表位、区域或一部分。例如，结合部分在药物的结构域、片段、表位、区域或一部分上或者包含药物的结构域、片段、表位、区域或一部分。例如，结合部分在化合物的结构域、片段、表位、区域或一部分上或者包含化合物的结构域、片段、表位、区域或一部分。例如，结合部分在有机化合物的结构域、片段、表位、区域或一部分上或者包含有机化合物的结构域、片段、表位、区域或一部分。在一些情况下，结合部分在分子量为900道尔顿或更小的小分子的结构域、片段、表位、区域或一部分上或者包含分子量为900道尔顿或更小的小分子的结构域、片段、表位、区域或一部分。在一些情况下，结合部分在分子量为500道尔顿或更大的小分子的结构域、片段、表位、区域或一部分上或者包含分子量为500道尔顿或更大的小分子的结构域、片段、表位、区域或一部分。结合部分可以例如从天然存在或合成分子的文库获得，该文库包括通过组合手段产生的化合物的文库，即化合物多样性组合文库。组合文库及其产生和筛选的方法是本领域已知的，并且在以下专利中进行了描述：美国专利号5,741,713；5,734,018；5,731,423；5,721,099；5,708,153；5,698,673；5,688,997；5,688,696；5,684,711；5,641,862；5,639,603；5,593,853；5,574,656；5,571,698；5,565,324；5,549,974；5,545,568；5,541,061；5,525,735；5,463,564；5,440,016；5,438,119；和5,223,409，将这些专利的披露内容通过援引并入本文。
结合部分可以在特异性结合对的成员(例如，配体)的结构域、片段、表位、区域或一部分上或者包含特异性结合对的成员(例如，配体)的结构域、片段、表位、区域或一部分。结合部分可以在单价(单表位)或多价(多表位)的结构域、片段、表位、区域或一部分上或者包含单价(单表位)或多价(多表位)的结构域、片段、表位、区域或一部分。结合部分可以是抗原的或半抗原的。结合部分可以在共享至少一个共同表位或决定簇位点的单个分子或多个分子的结构域、片段、表位、区域或一部分上或者包含共享至少一个共同表位或决定簇位点的单个分子或多个分子的结构域、片段、表位、区域或一部分。结合部分可以在细胞(例如，细菌细胞、植物细胞或动物细胞)的一部分的结构域、片段、表位、区域或一部分上或者包含细胞(例如，细菌细胞、植物细胞或动物细胞)的一部分的结构域、片段、表位、区域或一部分。结合部分可以在天然环境(例如，组织)、培养的细胞、或微生物(例如，细菌、真菌、原生动物或病毒)、或裂解的细胞中。可以修饰(例如，化学地)结合部分，以提供一个或多个另外的结合位点，诸如但不限于染料(例如，荧光染料)、多肽修饰性部分(诸如磷酸酯基团、碳水化合物基团等)、或多核苷酸修饰性部分(诸如甲基基团)。
在一些情况下，结合部分在来自宿主的样品中发现的分子的结构域、片段、表位、区域或部分上或者包含来自宿主的样品中发现的分子的结构域、片段、表位、区域或部分。来自宿主的样品包括体液(例如，尿液、血液、血浆、血清、唾液、精液、粪便、痰、脑脊髓液、眼泪、粘液等)。样品可以直接检查或者可以进行预处理以使结合部分更易于检测。样品包括一定数量的来自有生命物或先前有生命物的物质。样品可以是天然的、重组的、合成的或非天然存在的。结合部分可以是以上中的任一种，其从细胞天然或重组表达、在细胞裂解物或细胞培养基中、是体外翻译的样品、或是来自样品(例如，细胞裂解物)的免疫沉淀。
在一些情况下，靶标的结合部分在无细胞系统中或在体外表达。例如，靶标的结合部分在细胞提取物中。在一些情况下，靶标的结合部分在细胞提取物中，该细胞提取物具有DNA模板以及用于转录和翻译的试剂。可以使用的细胞提取物的示例性来源包括小麦胚芽、大肠杆菌、兔网织红细胞、极端嗜热菌、杂交瘤、爪蟾属(Xenopus)卵母细胞、昆虫细胞、和哺乳动物细胞(例如，人细胞)。可用于表达靶多肽(例如，在阵列上产生靶多肽)的示例性无细胞方法包括蛋白质原位阵列(PISA)、多重斑点技术(MIST)、自组装mRNA翻译、核酸可编程蛋白阵列(NAPPA)、纳米孔NAPPA、DNA阵列至蛋白质阵列(DAPA)、无膜DAPA、纳米孔复制和μIP-微凹版印刷、以及pMAC-蛋白质微阵列复制(参见Kilb等人,Eng.Life Sci.[生命科学工程]2014,14,352-364)。
在一些情况下，靶标的结合部分是从DNA模板原位(例如，在阵列的固体基底上)合成的。在一些情况下，平行或在单一反应中从多个相应的DNA模板原位合成多个结合部分。用于原位靶多肽表达的示例性方法包括以下文献中描述的那些：Stevens,Structure[结构]8(9):R177-R185(2000)；Katzen等人,Trends Biotechnol.[生物技术趋势]23(3):150-6.(2005)；He等人,Curr.Opin.Biotechnol.[生物技术新见]19(1):4-9.(2008)；Ramachandran等人,Science[科学]305(5680):86-90.(2004)；He等人,Nucleic AcidsRes.[核酸研究]29(15):E73-3(2001)；Angenendt等人,Mol.Cell Proteomics[分子与细胞蛋白组学]5(9):1658-66(2006)；Tao等人,Nat Biotechnol[自然生物技术]24(10):1253-4(2006)；Angenendt等人,Anal.Chem.[分析化学]76(7):1844-9(2004)；Kinpara等人,J.Biochem.[生物化学杂志]136(2):149-54(2004)；Takulapalli等人,J.Proteome Res.[蛋白组学研究杂志]11(8):4382-91(2012)；He等人,Nat.Methods[自然方法]5(2):175-7(2008)；Chatterjee和J.LaBaer,Curr Opin Biotech[生物技术新见]17(4):334-336(2006)；He和Wang,Biomol Eng[生物分子工程]24(4):375-80(2007)；以及He和Taussig,J.Immunol.Methods[免疫学方法杂志]274(1-2):265-70(2003)。
在一些情况下，核酸靶标的结合部分包含至少6个核苷酸，例如，至少8、9、10、12、15、20、25、30、40、50、或100个核苷酸的跨度。在一些情况下，蛋白质靶标的结合部分包含连续核苷酸段。在一些情况下，蛋白质靶标的结合部分包含不连续核苷酸段。在一些情况下，核酸靶标的结合部分包含突变或功能性突变的位点，该突变或功能性突变包括核酸序列中核苷酸的缺失、添加、交换、或截短。
在一些情况下，蛋白质靶标的结合部分包含至少6个氨基酸，例如至少8、9、10、12、15、20、25、30、40、50、或100个氨基酸的跨度。在一些情况下，蛋白质靶标的结合部分包含连续氨基酸段。在一些情况下，蛋白质靶标的结合部分包含不连续氨基酸段。在一些情况下，蛋白质靶标的结合部分包含突变或功能性突变的位点，该突变或功能性突变包括多肽序列中氨基酸的缺失、添加、交换、或截短。
在一些实施例中，结合部分在膜结合蛋白的结构域、片段、表位、区域或一部分上或者包含膜结合蛋白的结构域、片段、表位、区域或一部分。示例性的膜结合蛋白包括但不限于GPCR(例如，肾上腺素能受体、血管紧张素受体、胆囊收缩素受体、毒蕈碱乙酰胆碱受体、神经降压素受体、甘丙肽受体、多巴胺受体、阿片受体、血清素受体、钠受体等)、离子通道(例如，烟碱乙酰胆碱受体、钠通道、钾通道等)、受体酪氨酸激酶、受体丝氨酸/苏氨酸激酶、受体鸟苷酸环化酶、生长因子和激素受体(例如，表皮生长因子(EGF)受体)等。结合部分也可以在膜结合蛋白的突变体或修饰变体的结构域、片段、表位、区域或一部分上或者包含膜结合蛋白的突变体或修饰变体的结构域、片段、表位、区域或一部分。例如，GPCR的一些单点或多点突变保留功能并且在疾病中涉及(参见例如，Stadel等人,(1997)Trends inPharmacological Review[药理学趋势综述]18:430-37)。
在一些实施例中，经修饰的circRNA(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)可以包括用于结合其他细胞内分子的其他结合基序。经修饰的circRNA(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)应用的非限制性实例列于表4中。
表4
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RNA结合位点
在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包含一个或多个RNA结合位点。在一些实施例中，第一部分包含一个或多个由未修饰的核苷酸组成的RNA结合位点。在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包含修饰内源性基因和/或外源性基因的表达的RNA结合位点。在一些实施例中，RNA结合位点调节宿主基因的表达。RNA结合位点可以包括与内源性基因(例如，如本文所述的miRNA、siRNA、mRNA、lncRNA、RNA、DNA、反义RNA、gRNA的序列)杂交的序列、与外源性核酸(诸如病毒DNA或RNA)杂交的序列、与RNA杂交的序列、干扰基因转录的序列、干扰RNA翻译的序列、稳定RNA或使RNA不稳定(诸如通过靶向降解)的序列、或调节DNA或RNA结合因子的序列。
在一些实施例中，RNA结合位点可以是tRNA、lncRNA、lincRNA、miRNA、rRNA、snRNA、微RNA、siRNA、piRNA、snoRNA、snRNA、exRNA、scaRNA、Y RNA、和hnRNA结合位点之一。RNA结合位点是本领域普通技术人员熟知的。
某些RNA结合位点可以通过RNA干扰(RNAi)的生物学过程抑制基因表达。在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸包含RNAi分子，该RNAi分子具有RNA或RNA样结构，典型地具有15-50个碱基对(诸如约18-25个碱基对)并且具有与细胞内表达的靶基因中的编码序列相同(互补)或几乎相同(基本上互补)的核碱基序列。RNAi分子包括但不限于：短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微RNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)、部分双链体(meroduplex)、和切丁酶(dicer)底物。
在一些实施例中，RNA结合位点包含siRNA或shRNA。siRNA和shRNA类似于内源性miRNA基因加工途径中的中间体。在一些实施例中，siRNA可以充当miRNA，并且反之亦然。像siRNA一样，微RNA可以使用RISC来下调靶基因，但是与siRNA不同，大多数动物miRNA都不裂解mRNA。相反，miRNA通过翻译抑制或聚A去除和mRNA降解来降低蛋白质输出。已知的miRNA结合位点位于mRNA 3’-UTR内；miRNA似乎靶向与从miRNA 5’端的第2-8个核苷酸几乎完全互补的位点。此区域称为种子区域。因为siRNA和miRNA是可互换的，所以外源性siRNA可以下调具有与siRNA的种子互补性的mRNA。3’-UTR内的多个靶位点可以提供更强的下调。
微RNA(miRNA)是短非编码RNA，与核酸分子的3’-UTR结合并且通过降低核酸分子的稳定性或通过抑制翻译来下调基因表达。该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)可以包含一种或多种miRNA靶序列、miRNA序列、或miRNA种子。此类序列可以对应于任何miRNA。
miRNA序列包含“种子”区域，即成熟miRNA的第2-8位区域中的序列，该序列与miRNA靶序列具有沃森-克里克互补性。miRNA种子可以包含成熟miRNA的第2-8位或第2-7位。在一些实施例中，miRNA种子可以包含7个核苷酸(例如，成熟miRNA的第2-8个核苷酸)，其中相应miRNA靶标中的种子互补位点侧接与miRNA第1位相对的腺嘌呤(A)。在一些实施例中，miRNA种子可以包含6个核苷酸(例如，成熟miRNA的第2-7个核苷酸)，其中相应miRNA靶标中的种子互补位点侧接与miRNA第1位相对的腺嘌呤(A)。
miRNA种子的碱基可以与靶序列基本上互补。通过将miRNA靶序列工程化至该经修饰的环状多核糖核苷酸中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)可以逃避宿主免疫系统的检测或被宿主免疫系统检测到、具有经调节的降解、或经调节的翻译。此过程可以降低经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)递送时脱靶效应的危险。
该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)可以包括与靶基因约5至约25个连续核苷酸相同的miRNA序列。在一些实施例中，miRNA序列靶向mRNA并且从二核苷酸AA开始，包含约30％-70％、约30％-60％、约40％-60％、或约45％-55％的GC含量，并且例如通过标准BLAST搜索测定，与要引入其中的哺乳动物基因组中的靶标以外的任何核苷酸序列不具有高百分比同一性。
相反，可以将miRNA结合位点工程化出该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)(即从其中去除)，以调节特定组织中的蛋白质表达。对多种组织中表达的调控可以通过引入或去除一个或若干个miRNA结合位点来实现。
已知miRNA调控mRNA并且从而调控蛋白质表达的组织的实例包括但不限于肝脏(miR-122)、肌肉(miR-133、miR-206、miR-208)、内皮细胞(miR-17-92、miR-126)、骨髓细胞(miR-142-3p、miR-142-5p、miR-16、miR-21、miR-223、miR-24、miR-27)、脂肪组织(let-7、miR-30c)、心脏(miR-ld、miR-149)、肾脏(miR-192、miR-194、miR-204)、和肺上皮细胞(let-7、miR-133、miR-126)。MiRNA还可以调控复杂的生物学过程，诸如血管生成(miR-132)。在本文所述的经修饰环状多核糖核苷酸中，可以去除或引入此类过程中所涉及的miRNA的结合位点，以使该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)的表达适应生物学相关的细胞类型或相关生物学过程的情况。在一些实施例中，miRNA结合位点包括例如miR-7。
通过理解miRNA在不同细胞类型中的表达模式，可以将本文所述的经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)工程化用于在特定细胞类型中或仅在特定生物学条件下的更有靶向性的表达。通过引入组织特异性miRNA结合位点，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)可以设计用于在组织中或在生物学条件背景下的最佳蛋白质表达。
另外，可以将miRNA种子位点掺入至该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)中以调节某些细胞中的表达，从而导致生物学改善。此方面的一个实例是miR-142位点的掺入。将miR-142位点掺入至本文所述的经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)中可以调节造血细胞中的表达，还可以降低或消除对该经修饰的环状多核糖核苷酸中编码的蛋白质的免疫应答。
在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸包含至少一种miRNA，例如2种、3种、4种、5种、6种、或更多种。在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包含miRNA，该miRNA与这些核苷酸序列中任一个或与和靶序列互补的序列具有至少约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、或100％核苷酸序列同一性。
已知miRNA序列的列表可以在研究组织维护的数据库中找到，这些研究组织例如维康信托基金会桑格研究院(Wellcome Trust Sanger Institute)、宾夕法尼亚生物信息学中心(Penn Center for Bioinformatics)、斯隆凯特灵癌症中心(Memorial SloanKettering Cancer Center)、和欧洲分子生物学实验室(European Molecule BiologyLaboratory)。RNAi分子可以是通过本领域已知的技术易于设计和产生的。另外，计算工具可用于确定有效和特定的序列基序。
在一些实施例中，经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包含长非编码RNA。长非编码RNA(lncRNA)包括长于100个核苷酸的非蛋白质编码转录物。较长的长度将lncRNA与小调控RNA(诸如miRNA、siRNA和其他短RNA)区分开。通常，大多数(约78％)lncRNA的特征为组织特异性的。以与附近蛋白编码基因相反的方向转录的发散lncRNA(占哺乳动物基因组中总lncRNA的约20％大比例)可以调控附近基因的转录。
RNA结合位点的长度可以在约5至30个核苷酸之间，在约10至30个核苷酸之间，或可以是约11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个、或更多个核苷酸。RNA结合位点与目的靶标的同一性程度可以是至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％。
在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包括一个或多个大型基因间非编码RNA(lincRNA)结合位点。LincRNA构成了大部分的长非编码RNA。LincRNA是非编码转录物，并且在一些实施例中，长度超过约200个核苷酸。在一些实施例中，lincRNA具有外显子-内含子-外显子结构，类似于蛋白质编码基因，但是不包含开放阅读框并且不编码蛋白质。与编码基因相比，LincRNA表达可以是严格组织特异性的。LincRNA典型地与其相邻基因共表达，其程度与成对的相邻蛋白质编码基因相似。在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包含环化的lincRNA。
在一些实施例中，本文披露的经修饰的环状多核糖核苷酸包括一个或多个lincRNA，例如FIRRE、LINC00969、PVT1、LINC01608、JPX、LINC01572、LINC00355、C1orf132、C3orf35、RP11-734、LINC01608、CC-499B15.5、CASC15、LINC00937、和RP11-191。
已知lincRNA和lncRNA序列的列表可以在研究组织(例如，基因组和整合生物学研究所(Institute of Genomics and Integrative Biology)、昆士兰大学迪亚曼蒂纳研究所(Diamantina Institute at the University of Queensland)、根特大学(GhentUniversity)和中山大学(Sun Yat-sen University))维护的数据库中找到。LincRNA和lncRNA分子可以是通过本领域已知的技术易于设计和产生的。另外，计算工具可用于确定有效和特定的序列基序。
RNA结合位点可以包含与内源性基因或基因产物(例如，mRNA)的全部或片段基本上互补、或完全互补的序列。互补序列可以与内含子与外显子之间的边界处的序列互补，以防止特定基因的新生成的核RNA转录物成熟为用于转录的mRNA。互补序列可以通过与基因的mRNA杂交并且防止其翻译而对该基因具有特异性。RNA结合位点可以包含与内源性基因或基因产物(诸如DNA、RNA或其衍生物或杂交体)的全部或片段反义或基本上反义的序列。
在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包含RNA结合位点，该RNA结合位点具有RNA或RNA样结构，典型地在约5-5000个碱基对之间(取决于特定的RNA结构，例如miRNA 5-30bp，lncRNA200-500bp)，并且具有与细胞内表达的靶基因中的编码序列相同(互补)或几乎相同(基本上互补)的核碱基序列。
DNA结合位点
在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包含DNA结合位点，诸如指导RNA(gRNA)的序列。在一些实施例中，第一部分包含一个或多个由未修饰的核苷酸组成的DNA结合位点。在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包含指导RNA或gRNA序列的互补序列。gRNA短合成RNA由与不完整的效应子部分结合所必需的“支架”序列和用于基因组靶标的用户定义的约20个核苷酸靶向序列构成。指导RNA序列可以具有17-24个核苷酸(例如19、20或21个核苷酸)的长度，并且与靶核酸序列互补。定制的gRNA生成器和算法可用于设计有效的指导RNA。可以使用嵌合的“单指导RNA”(“sgRNA”)(一种模拟天然存在的crRNA-tracrRNA复合物并包含tracrRNA(用于结合核酸酶)和至少一个crRNA(以将核酸酶指导至被靶向进行编辑的序列)的工程化(合成)单RNA分子)实现基因编辑。经化学修饰的sgRNA可以在基因组编辑中有效。
gRNA可以识别特定的DNA序列(例如，与基因的启动子、增强子、沉默子或阻遏子相邻或在其内的序列)。
在一些实施例中，gRNA是用于基因编辑的CRISPR系统的一部分。对于基因编辑，可以将该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)设计为包含一个或多个与所期望的靶DNA序列相对应的指导RNA序列。gRNA序列可以包括至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、或更多个核苷酸用于与Cas9或其他核酸外切酶相互作用以裂解DNA，例如，Cpf1与gRNA序列的至少约16个核苷酸相互作用以实现可检测的DNA裂解。
在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包括结合双链体DNA中的大沟的序列。在一个这种情况下，由该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)和双链体DNA产生的三链体结构的特异性和稳定性是经由胡斯坦(Hoogsteen)氢键提供，这些胡斯坦氢键不同于双链DNA中经典沃森-克里克碱基配对中形成的那些氢键。在一种情况下，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)通过大沟与靶双链体的富嘌呤链结合。
在一些实施例中，三链体形成发生在两个基序中，这两个基序通过该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)相对于靶双链体的富嘌呤链的取向来区别。在一些情况下，经修饰的环状多核糖核苷酸中的多嘧啶序列段经由胡斯坦氢键以平行方式(即与双链体的富嘌呤链相同的5’至3’方向)结合至双链体DNA的多嘌呤序列段，而多嘌呤段(R)经由反向胡斯坦氢键以反平行方式结合至双链体的嘌呤链。在反平行中，嘌呤基序包含G:G-C、A:A-T或T:A-T的三联体；而在平行中，嘧啶基序包含C+:G-C的典范三联体或T:A-T三联体(其中C+表示N3位置的质子化胞嘧啶)。经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)中的反平行GA和GT序列在中性pH下可以形成稳定的三链体，而经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)中的平行CT序列可以在酸性pH下结合。该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)中的胞嘧啶上N3可以被质子化。用5-甲基-C取代C可能允许在生理pH下结合该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)中的CT序列，因为5-甲基-C具有比胞嘧啶更高的pK。对于嘌呤和嘧啶基序两者，连续的至少10个碱基对的同型嘌呤-同型嘧啶序列段有助于经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)结合至双链体DNA，因为较短的三链体在生理条件下可能不稳定，并且序列中的中断可能使三链体结构不稳定。在一些实施例中，针对三链体形成的DNA双链体靶在一条链中包括连续的嘌呤碱基。在一些实施例中，针对三链体形成的靶标包括在DNA双链体的一条链中的同型嘌呤序列和在互补链中的同型嘧啶序列。
在一些实施例中，包含经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)的三链体是稳定的结构。在一些实施例中，包含经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)的三链体表现出增加的半衰期，例如增加约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或更大，例如，持续至少约1小时至约30天，或至少约2小时、6小时、12小时、18小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、60天、或更长时间或其间的任何时间。
蛋白质结合位点
在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包括一个或多个蛋白质结合位点。在一些实施例中，第一部分包含一个或多个由未修饰的核苷酸组成的蛋白质结合位点。在一个实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包括蛋白质结合位点，以与由参考化合物(例如，缺少蛋白质结合位点的经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)，例如线性RNA)触发的应答相比，降低宿主的免疫应答。
在一些实施例中，本文披露的经修饰的环状多核糖核苷酸包括一个或多个蛋白质结合位点以结合蛋白质，例如核糖体。通过将蛋白质结合位点(例如，核糖体结合位点)工程化至该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)可以逃避宿主免疫系统的检测或具有减少的宿主免疫系统的检测、具有经调节的降解、或经调节的翻译。
在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包含至少一个免疫蛋白结合位点，例如以掩蔽该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)而免受宿主免疫系统组分的影响，例如逃避CTL应答。在一些实施例中，免疫蛋白结合位点是结合至免疫蛋白并且有助于掩蔽为非内源性的该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)的核苷酸序列。
核糖体与线性RNA接合的传统机制包括核糖体与RNA的加帽5’端的结合。从5’端，核糖体迁移到起始密码子，于是形成第一肽键。根据本发明，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)的翻译的内部起始(即，非帽依赖性)不需要游离端或加帽端。而是，核糖体结合至未加帽的内部位点，由此核糖体在起始密码子处开始多肽延长。在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包括一个或多个RNA序列，该一个或多个RNA序列包含核糖体结合位点，例如起始密码子。
在一些实施例中，本文披露的经修饰的环状多核糖核苷酸包含与蛋白质结合的蛋白质结合序列。在一些实施例中，蛋白质结合序列将经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)靶向或定位至特定靶标。在一些实施例中，蛋白质结合序列特异性结合蛋白质的精氨酸富集区。
在一些实施例中，蛋白质结合位点包括但不限于针对以下蛋白质的结合位点：诸如ACIN1、AGO、APOBEC3F、APOBEC3G、ATXN2、AUH、BCCIP、CAPRIN1、CELF2、CPSF1、CPSF2、CPSF6、CPSF7、CSTF2、CSTF2T、CTCF、DDX21、DDX3、DDX3X、DDX42、DGCR8、EIF3A、EIF4A3、EIF4G2、ELAVL1、ELAVL3、FAM120A、FBL、FIP1L1、FKBP4、FMR1、FUS、FXR1、FXR2、GNL3、GTF2F1、HNRNPA1、HNRNPA2B1、HNRNPC、HNRNPK、HNRNPL、HNRNPM、HNRNPU、HNRNPUL1、IGF2BP1、IGF2BP2、IGF2BP3、ILF3、KHDRBS1、LARP7、LIN28A、LIN28B、m6A、MBNL2、METTL3、MOV10、MSI1、MSI2、NONO、NONO-、NOP58、NPM1、NUDT21、PCBP2、POLR2A、PRPF8、PTBP1、RBFOX2、RBM10、RBM22、RBM27、RBM47、RNPS1、SAFB2、SBDS、SF3A3、SF3B4、SIRT7、SLBP、SLTM、SMNDC1、SND1、SRRM4、SRSF1、SRSF3、SRSF7、SRSF9、TAF15、TARDBP、TIA1、TNRC6A、TOP3B、TRA2A、TRA2B、U2AF1、U2AF2、UNK、UPF1、WDR33、XRN2、YBX1、YTHDC1、YTHDF1、YTHDF2、YWHAG、ZC3H7B、PDK1、AKT1、和任何其他结合RNA的蛋白质。
其他结合位点
在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包含一个或多个针对非RNA或非DNA靶标的结合位点。在一些实施例中，第一部分包含一个或多个由未修饰的核苷酸组成的针对非RNA或非DNA靶标的结合位点。在一些实施例中，结合位点可以是小分子、适体、脂质、碳水化合物、病毒颗粒、膜、多组分复合物、细胞、细胞部分、或其任何片段的结合位点中之一。在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包含一个或多个针对脂质的结合位点。在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包含一个或多个针对碳水化合物的结合位点。在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包含一个或多个针对碳水化合物的结合位点。在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包含一个或多个针对膜的结合位点。在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包含一个或多个针对多组分复合物例如核糖体、核小体、转录机器等的结合位点。
螯合
在一些实施例中，本文所述的经修饰的circRNA(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)螯合靶标，例如DNA、RNA、蛋白质和其他细胞组分以调控细胞过程。具有针对目的靶标的结合位点的经修饰的circRNA(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)可以与内源性结合配偶体竞争靶标结合。在一些实施例中，本文所述的经修饰的circRNA(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)螯合miRNA。在一些实施例中，本文所述的经修饰的circRNA(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)螯合mRNA。在一些实施例中，本文所述的经修饰的circRNA(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)螯合蛋白质。在一些实施例中，本文所述的经修饰的circRNA(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)螯合核糖体。在一些实施例中，本文所述的经修饰的circRNA(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)螯合其他经修饰的circRNA。在一些实施例中，本文所述的经修饰的circRNA螯合非编码RNA、lncRNA、miRNA、tRNA、rRNA、snoRNA、ncRNA、siRNA、或shRNA。在一些实施例中，本文所述的经修饰的circRNA(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包括降解元件，该降解元件降解被螯合的靶标，例如DNA、RNA、蛋白质或与经修饰的circRNA结合的其他细胞组分。经修饰的circRNA(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)螯合应用的非限制性实例列于表5中。
表5
Figure BDA0003282415270001191
在一些实施例中，使用本文所述的经修饰的circRNA(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)的任一种方法可以与翻译元件组合。本文所述的含有翻译元件的经修饰的circRNA可以将RNA翻译成蛋白质。
裂解序列
在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包括至少一个裂解序列。在一些实施例中，裂解序列与表达序列相邻。在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包括裂解序列，诸如在牺牲型经修饰的circRNA或可裂解的经修饰的circRNA或自裂解的经修饰的circRNA中。在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包含两个或更多个裂解序列，导致该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)分离成多种产物，例如miRNA、线性RNA、较小的经修饰的环状多核糖核苷酸等。
在一些实施例中，裂解序列包括核酶RNA序列。核酶(来自核糖核酸酶，也称为RNA酶或催化性RNA)是催化化学反应的RNA分子。许多天然核酶催化其自身的磷酸二酯键之一的水解，或催化其他RNA中的键的水解，但也发现天然核酶催化核糖体的氨基转移酶活性。催化性RNA可以通过体外方法“演变”。类似于上文讨论的核糖开关活性，核酶及其反应产物可以调控基因表达。在一些实施例中，将催化性RNA或核酶置于较大的非编码RNA中，这使得核酶以许多拷贝存在于细胞内，用于大体积分子的化学转化的目的。在一些实施例中，适体和核酶都可以在相同的非编码RNA中编码。
牺牲型顺序
在一些实施例中，本文所述的经修饰的circRNA(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包括牺牲型经修饰的circRNA或可裂解的经修饰的circRNA或自裂解的经修饰的circRNA。经修饰的circRNA可以递送细胞组分，包括例如RNA、lncRNA、lincRNA、miRNA、tRNA、rRNA、snoRNA、ncRNA、siRNA、或shRNA。在一些实施例中，经修饰的circRNA(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包括被以下隔开的miRNA：(i)可自裂解的元件；(ii)裂解募集位点；(iii)可降解接头；(iv)化学接头；和/或(v)间隔子序列。在一些实施例中，经修饰的circRNA包括被以下隔开的siRNA：(i)可自裂解的元件；(ii)裂解募集位点(例如，ADAR)；(iii)可降解接头(例如，丙三醇)；(iv)化学接头；和/或(v)间隔子序列。可自裂解的元件的非限制性实例包括锤头结构、剪接元件、发夹、丁型肝炎病毒(HDV)、Varkud卫星(VS)和glmS核酶。经修饰的circRNA(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)牺牲型应用的非限制性实例列于表6中。
表6
Figure BDA0003282415270001201
环化
在一个实施例中，线性经修饰的多核糖核苷酸可以被环化、或连环化。在一些实施例中，将线性未修饰的多核糖核苷酸分子连接至线性经修饰的多核糖核苷酸分子以产生线性杂交修饰的多核糖核苷酸分子，该线性杂交修饰的多核糖核苷酸分子可以被环化或连环化以产生如本文所述的杂交修饰的环状多核糖核苷酸。在一些实施例中，线性多核糖核苷酸分子包含具有未经修饰的多核糖核苷酸序列的第一部分，当在第一部分之外的核苷酸经修饰时，该线性多核糖核苷酸分子然后可以被环化或连环化以产生如本文所述的杂交修饰的环状多核糖核苷酸。在一些实施例中，该线性杂交修饰的多核糖核苷酸可以在配制和/或递送之前被体外环化。在一些实施例中，该线性经修饰的多核糖核苷酸(例如，线性完全修饰的多核糖核苷酸或线性杂交修饰的线性多核糖核苷酸)可以在细胞内环化。
细胞外环化
在一些实施例中，使用化学方法环化、或连环化该线性经修饰的多核糖核苷酸(例如，线性完全修饰的多核糖核苷酸或线性杂交修饰的多核糖核苷酸)以形成经修饰的环状多核糖核苷酸。在一些化学方法中，核酸(例如，线性经修饰的环状多核糖核苷酸)的5'端和3'端包括化学反应性基团，当这些化学反应性基团彼此靠近时，可以在分子的5'端与3'端之间形成新的共价键。5'端可以含有NHS酯反应性基团，并且3'端可以含有3'-氨基末端的核苷酸，使得在有机溶剂中，线性RNA分子3'端上的3'-氨基末端的核苷酸将在5'-NHS-酯部分上经历亲核攻击，从而形成新的5'-/3'-酰胺键。
在一个实施例中，DNA或RNA连接酶可以用于将5'-磷酸化的核酸分子(例如，线性经修饰的多核糖核苷酸或线性杂交修饰的多核糖核苷酸)酶促连接至核酸(例如，线性核酸)的3'-羟基基团，从而形成新的磷酸二酯键。在示例性反应中，根据制造商的方案，将线性经修饰的多核糖核苷酸(例如，线性完全修饰的多核糖核苷酸或线性杂交修饰的多核糖核苷酸)与1-10单位的T4 RNA连接酶(新英格兰生物学实验室公司(New EnglandBiolabs)，马萨诸塞州伊普斯威奇(Ipswich,MA))在37℃下孵育1小时。连接反应可以在存在线性核酸时发生，该线性核酸能够与并列的5'和3'区域两者碱基配对，以辅助酶促连接反应。在一个实施例中，连接是夹板连接。例如，可以使用夹板连接酶(像
Figure BDA0003282415270001221
连接酶)进行夹板连接。对于夹板连接，单链多核苷酸(夹板)(像单链RNA)可以被设计成与线性多核糖核苷酸的两个末端杂交，使得在与单链夹板杂交时可以将两个末端并列。因此，夹板连接酶可以催化线性经修饰的多核糖核苷酸并列的两个末端的连接，从而生成经修饰的环状多核糖核苷酸，或者催化线性杂交修饰的多核糖核苷酸并列的两个末端的连接，从而产生杂交修饰的环状多核糖核苷酸。
在一个实施例中，DNA或RNA连接酶可用于该经修饰的环状多核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)的合成。作为一个非限制性实例，连接酶可以是circ连接酶或环状连接酶。
在一个实施例中，该线性经修饰的多核糖核苷酸(例如，线性完全修饰的多核糖核苷酸或线性杂交修饰的多核糖核苷酸)的5'或3'端可以编码连接酶核酶序列，使得在体外转录期间，所得线性经修饰的多核糖核苷酸(例如，线性完全修饰的多核糖核苷酸或线性杂交修饰的多核糖核苷酸)包括活性核酶序列，该活性核酶序列能够连接该线性经修饰的多核糖核苷酸(例如，线性完全修饰的多核糖核苷酸或线性杂交修饰的多核糖核苷酸)的5'端至该线性经修饰的多核糖核苷酸(例如，线性完全修饰的多核糖核苷酸或线性杂交修饰的多核糖核苷酸)的3'端。连接酶核酶可以衍生自第I组内含子、丁型肝炎病毒、发夹核酶，或者可以通过SELEX(通过指数富集进行的配体系统进化)进行选择。核酶连接酶反应在0℃与37℃之间的温度下可能需要1至24小时。
在一个实施例中，可以通过使用至少一个非核酸部分将线性经修饰的多核糖核苷酸(例如，线性完全修饰的多核糖核苷酸或线性杂交修饰的多核糖核苷酸)环化或连环化。在一方面，该至少一个非核酸部分可以与该线性经修饰的环状多核糖核苷酸的5'末端附近和/或3'末端附近的区域或特征反应，以环化或连环化该线性经修饰的环状多核糖核苷酸。在另一方面，该至少一个非核酸部分可以位于或连接至或邻近该线性经修饰的环状多核糖核苷酸的5'末端和/或3'末端。设想的非核酸部分可以是同源或异源的。作为一个非限制性实例，非核酸部分可以是键，诸如疏水键、离子键、可生物降解的键和/或可裂解的键。作为另一个非限制性实例，非核酸部分是连接部分。作为又另一个非限制性实例，非核酸部分可以是寡核苷酸或肽部分，诸如本文所述的适体或非核酸接头。
在一个实施例中，线性经修饰的多核糖核苷酸(例如，线性完全修饰的多核糖核苷酸或线性杂交修饰的多核糖核苷酸)可以由于非核酸部分而被环化或连环化，该非核酸部分引起位于、邻近或连接至该线性经修饰的多核糖核苷酸(例如，线性完全修饰的多核糖核苷酸或线性杂交修饰的多核糖核苷酸)的5'和3'端的原子、分子表面之间的吸引力。作为一个非限制性实例，可以通过分子间作用力或分子内作用力将一个或多个线性经修饰的多核糖核苷酸(例如，线性完全修饰的多核糖核苷酸或线性杂交修饰的多核糖核苷酸)环化或连环化。分子间作用力的非限制性实例包括偶极-偶极力、偶极诱导偶极力、诱导偶极诱导偶极力、范德华力和色散力。分子内作用力的非限制性实例包括共价键、金属键、离子键、共振键、抓氢键(agnostic bond)、偶极键、缀合、超缀合和反向键。
在一个实施例中，该线性经修饰的多核糖核苷酸(例如，线性完全修饰的多核糖核苷酸或线性杂交修饰的多核糖核苷酸)可以在5'末端附近和3'末端附近包含核酶RNA序列。当序列暴露于核酶的其余部分时，核酶RNA序列可以共价地连接至肽。在一方面，共价地连接至5'末端和3'末端附近的核酶RNA序列的肽可以彼此缔合，从而引起线性经修饰的多核糖核苷酸(例如，线性完全修饰的多核糖核苷酸或线性杂交修饰的多核糖核苷酸)环化或连环化。在另一方面，共价地连接至核酶RNA序列5'末端和3'末端附近的肽可以引起线性初级构建体或线性mRNA在使用本领域已知的方法(诸如但不限于蛋白连接)进行连接后环化或连环化。用于在本发明的线性初级构建体或线性RNA中使用的核酶的非限制性实例，或掺入和/或共价地连接肽的方法的非穷举列表在美国专利公开号US 20030082768中描述，将该专利申请的内容通过援引以其全文并入本文。
在一些实施例中，该线性经修饰的多核糖核苷酸(例如，线性完全修饰的多核糖核苷酸或线性杂交修饰的多核糖核苷酸)可以包括例如通过以下方式被转化为5'单磷酸的核酸的5'三磷酸：使5'三磷酸与RNA5'焦磷酸水解酶(RppH)或ATP二磷酸水解酶(三磷酸腺苷双磷酸酶)接触。替代性地，将该线性经修饰的多核糖核苷酸(例如，线性完全修饰的多核糖核苷酸或线性杂交修饰的多核糖核苷酸)的5'三磷酸转化为5'单磷酸可以通过两步反应发生，该两步反应包括：(a)使该线性经修饰的多核糖核苷酸(例如，线性完全修饰的多核糖核苷酸或线性杂交修饰的多核糖核苷酸)的5'核苷酸与磷酸酶(例如，热敏磷酸酶、虾碱性磷酸酶或小牛肠磷酸酶)接触以去除所有三个磷酸；以及(b)在步骤(a)之后，使5'核苷酸与添加单一磷酸的激酶(例如，多核苷酸激酶)接触。
在一些实施例中，本文提供的环化方法的环化效率是至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、或100％。在一些实施例中，本文提供的环化方法的环化效率是至少约40％。
剪接元件
在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包括至少一个剪接元件。在如本文提供的经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)中，剪接元件可以是可以介导该经修饰的环状多核糖核苷酸的剪接的完整剪接元件。替代性地，剪接元件也可以是来自完成的剪接事件的剩余剪接元件。例如，在一些情况下，线性多核糖核苷酸的剪接元件可以介导导致该线性多核糖核苷酸环化的剪接事件，从而所得的经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包含来自这种剪接介导的环化事件的剩余剪接元件。在一些情况下，剩余剪接元件无法介导任何剪接。在其他情况下，剩余剪接元件在某些情况下仍可以介导剪接。在一些实施例中，剪接元件与至少一个表达序列相邻。在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包括与每个表达序列相邻的剪接元件。在一些实施例中，剪接元件在每个表达序列的一侧或两侧，导致例如一种或多种肽和/或一种或多种多肽的表达产物的隔开。
在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包括内部剪接元件，该内部剪接元件在被复制时，剪接端部被接合在一起。一些实例可以包括具有剪接位点序列和短反向重复序列(30-40nt)的微型内含子(<100nt)，诸如AluSq2、AluJr和AluSz、侧接内含子中的反向序列、侧接内含子中的Alu元件以及在反向剪接事件近侧的(suptable4富集基序)顺式序列元件中发现的基序，诸如带有侧接外显子的反向剪接位点之前(上游)或之后(下游)200bp中的序列。在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包括至少一个本文其他处所述的重复核苷酸序列作为内部剪接元件。在此类实施例中，重复核苷酸序列可以包括来自内含子Alu家族的重复序列。在一些实施例中，剪接相关核糖体结合蛋白可以调控经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)的生物发生(例如，盲肌蛋白和震动蛋白(QKI)剪接因子)。
在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)可以包括侧接该经修饰的环状多核糖核苷酸的头尾接合点处的典范剪接位点。
在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)可以包括隆起-螺旋-隆起基序，该基序包含侧接两个3-核苷酸隆起的4-碱基对茎。裂解发生在隆起区域的一个位点处，生成末端为5′-羟基基团和2′,3′-环状磷酸酯的特征片段。通过将5′-OH基团亲核攻击到形成3′,5′-磷酸二酯桥的同一分子的2′,3′-环状磷酸酯上来进行环化。
在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)可以包括具有HPR元件的多聚体重复RNA序列。HPR包含2′,3′-环状磷酸酯和5′-OH末端。HPR元件自处理该线性环状多核糖核苷酸经修饰的环状多核糖核苷酸的5′和3′端，从而将端部连接在一起。
在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)可以包括介导自连接的序列。在一个实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)可以包括HDV序列(例如，HDV复制结构域保守序列，GGCUCAUCUCGACAAGAGGCGGCAGUCCUCAGUACUCUUACUCUUUUCUGUAAAGAGGAGACUGCUGGACUCGCCGCCCAAGUUCGAGCAUGAGCC或GGCUAGAGGCGGCAGUCCUCAGUACUCUUACUCUUUUCUGUAAAGAGGAGACUGCUGGACUCGCCGCCCGAGCC)以进行自连接。在一个实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)可以包括环E序列(例如，在PSTVd中)以进行自连接。在另一个实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)可以包括自环化内含子，例如5′和3’剪接接合点，或自环化催化性内含子，诸如I型、II型或III型内含子。I型内含子自剪接序列的非限制性实例可以包括衍生自T4噬菌体基因td的自剪接置换内含子-外显子序列、和四膜虫的插入序列(IVS)rRNA。
其他环化方法
在一些实施例中，线性经修饰的环状多核糖核苷酸可以包括互补序列，包括单独内含子内或跨侧接内含子的重复或非重复核酸序列。重复核酸序列是在该经修饰的环状多核糖核苷酸的区段内出现的序列。在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包括重复核酸序列。在一些实施例中，重复核苷酸序列包括聚CA序列或聚UG序列。在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包括与该经修饰的环状多核糖核苷酸的另一区段中的互补重复核酸序列杂交的至少一个重复核酸序列，其中杂交的区段形成内部双链。在一些实施例中，来自两个单独的经修饰的环状多核糖核苷酸的重复核酸序列和互补重复核酸序列杂交以生成单一环化多核糖核苷酸，其中杂交的区段形成内部双链。在一些实施例中，互补序列存在于该线性经修饰的环状多核糖核苷酸的5’端和3’端。在一些实施例中，互补序列包括约3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、或更多个配对的核苷酸。
在一些实施例中，环化化学方法可用于生成该经修饰的环状多核糖核苷酸。此类方法可以包括但不限于点击化学(例如，基于炔烃和叠氮化物的方法，或可点击的碱基)、烯烃复分解、氨基磷酸酯连接、半缩醛胺-亚胺交联、碱基修饰、及其任何组合。
在一些实施例中，环化酶促方法可用于生成该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)。在一些实施例中，连接酶(例如，DNA或RNA连接酶)可用于生成环状多核糖核苷酸或互补体的模板、环状多核糖核苷酸的互补链、或环状多核糖核苷酸。
该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)的环化可以通过本领域已知的方法完成，这些方法例如，Petkovic和Muller,“RNA circularization strategies in vivo and in vitro[体内和体外的RNA环化策略]”Nucleic Acids Res[核酸研究],2015,43(4):2454-2465；以及Muller和Appel,“In vitro circularization of RNA[RNA的体外环化]”RNA Biol[RNA生物学],2017,14(8):1018-1027中描述的那些方法。
复制元件
该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)可以编码可用于复制的序列和/或基序。经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)的复制可以通过生成互补的经修饰的环状多核糖核苷酸来发生。在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包括起始转录的基序，其中转录由该经修饰的环状多核糖核苷酸编码的内源性细胞机器(DNA依赖性RNA聚合酶)或RNA依赖性RNA聚合酶驱动。滚环转录事件的产物可以被核酶切割，以生成单位长度的互补或增殖的经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)。核酶可以由该经修饰的环状多核糖核苷酸、其互补体、或由反式RNA序列编码。在一些实施例中，编码的核酶可以包括调控(抑制或促进)核酶的活性以控制环状RNA增殖的序列或基序。在一些实施例中，单位长度序列可以通过细胞RNA连接酶连接成环状形式。在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包括有助于自扩增的复制元件。此类复制元件的实例包括国际专利公开号WO 2019118919 A1的[0280]-[0282]中所述的那些，将该国际专利公开通过援引以其全文并入本文。在另一个实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包括至少一个核酶序列，以将从该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)复制的长转录物裂解至特定长度，其中另一种编码的核酶在核酶序列处切割转录物。环化形成该经修饰的环状多核糖核苷酸的互补体。
在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)基本上对例如核酸外切酶的降解有抗性。
在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)在细胞内复制。在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)在细胞内的复制速率是在约10％-20％、20％-30％、30％-40％、40％-50％、50％-60％、60％-70％、70％-75％、75％-80％、80％-85％、85％-90％、90％-95％、95％-99％之间、或其间的任何百分比。在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)在细胞内复制并且传递至子细胞。在一些实施例中，细胞以至少25％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、或99％的效率将至少一种经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)传递至子细胞。在一些实施例中，正经历减数分裂的细胞以至少25％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、或99％的效率将该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)传递至子细胞。在一些实施例中，正经历有丝分裂的细胞以至少25％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、或99％的效率将该经修饰的环状多核糖核苷酸杂交修饰的环状多核糖核苷(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)传递至子细胞。
在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)在宿主细胞内复制。在一个实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)能够在哺乳动物细胞例如人细胞中复制。
虽然在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸杂交修饰的环状多核糖核苷酸在宿主细胞中复制，但是该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)未整合到宿主的基因组中，例如未与宿主的染色体整合。在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)具有例如与宿主的染色体的可忽略的重组频率。在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)例如与宿主的染色体的重组频率例如小于约1.0cM/Mb、0.9cM/Mb、0.8cM/Mb、0.7cM/Mb、0.6cM/Mb、0.5cM/Mb、0.4cM/Mb、0.3cM/Mb、0.2cM/Mb、0.1cM/Mb、或更低。
其他序列
在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)进一步包括另外的核酸序列。在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)可以包含其他序列，这些其他序列包括DNA、RNA、或人工核酸。其他序列可以包括但不限于基因组DNA，cDNA或编码tRNA、mRNA、rRNA、miRNA、gRNA、siRNA、或其他RNAi分子的序列。在一个实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包括siRNA，以靶向与该经修饰的环状多核糖核苷酸相同的基因表达产物的不同基因座。在一个实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包括siRNA，以靶向与该经修饰的环状多核糖核苷酸不同的基因表达产物。
在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)缺少5’-UTR。在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)缺少3’-UTR。在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)缺少聚A序列。在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)缺少终止元件。在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)缺少内部核糖体进入位点。在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)缺少核酸外切酶的降解易感性。在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)缺少降解易感性的事实可能意味着该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)不被核酸外切酶降解，或在仅存在核酸外切酶时被降解的有限程度与不存在核酸外切酶时相当或相似。在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)缺少核酸外切酶的降解。在一些实施例中，当暴露于核酸外切酶时，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)具有减少的降解。在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)缺少与帽结合蛋白的结合。在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)缺少5’帽。
在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)缺少5’-UTR，并且能够从其一个或多个表达序列表达蛋白质。在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)缺少3’-UTR，并且能够从其一个或多个表达序列表达蛋白质。在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)缺少聚A序列，并且能够从其一个或多个表达序列表达蛋白质。在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)缺少终止元件，并且能够从其一个或多个表达序列表达蛋白质。在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)缺少内部核糖体进入位点，并且能够从其一个或多个表达序列表达蛋白质。在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)缺少帽，并且能够从其一个或多个表达序列表达蛋白质。在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)缺少5’-UTR、3’-UTR和IRES，并且能够从其一个或多个表达序列表达蛋白质。在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包含以下序列中的一种或多种：编码一个或多个miRNA的序列、编码一个或多个复制蛋白的序列、编码外源性基因的序列、编码治疗剂的序列、调控元件(例如，翻译调节子，例如翻译增强子或抑制子)、翻译起始序列、靶向内源性基因的一种或多种调控核酸(siRNA、lncRNA、shRNA)和编码治疗性mRNA或蛋白质的序列。
其他序列的长度可以是从约2nt至约10000nt、约2nt至约5000nt、约10nt至约100nt、约50nt至约150nt、约100nt至约200nt、约150nt至约250nt、约200至约300nt、约250nt至约350nt、约300nt至约500nt、约10nt至约1000nt、约50nt至约1000nt、约100nt至约1000nt、约1000nt至约2000nt、约2000nt至约3000nt、约3000nt至约4000nt、约4000nt至约5000nt、或其间的任何范围。
作为其环化的结果，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)可能包括某些使其区别于线性RNA的特征。例如，与线性RNA相比，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)较不易被核酸外切酶降解。这样，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)比线性RNA更稳定，尤其是在核酸外切酶存在下孵育时。该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)与线性RNA相比的增加稳定性使得经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)作为生产多肽的细胞转化试剂更加有用，并且与线性RNA相比，存储更容易且时间更长。可以使用本领域标准的方法测试用核酸外切酶处理的该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)的稳定性，这些方法确定是否已经发生RNA降解(例如，通过凝胶电泳)。
此外，与线性RNA不同，当该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)与磷酸酶诸如小牛肠磷酸酶一起孵育时，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)较不易去磷酸化。
核苷酸间隔子序列
在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包含间隔子序列。
在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包含至少一个间隔子序列。在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包含1、2、3、4、5、6、7个、或更多个间隔子序列。
在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包含根据国际专利公开号WO 2019118919 A1的[0295]-[0302]中的描述配置的一个或多个间隔子序列，将该国际专利公开通过援引以其全文并入本文。非核酸接头
本文所述的经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)还可以包含非核酸接头。在一些实施例中，本文所述的经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)在本文所述的一个或多个序列或元件之间具有非核酸接头。在一个实施例中，本文所述的一个或多个序列或元件与接头连接。非核酸接头可以是化学键，例如一个或多个共价键或非共价键。在一些实施例中，非核酸接头是肽接头或蛋白质接头。这种接头可以在2-30个氨基酸之间，或更长。接头包括柔性、刚性或可裂解接头，诸如国际专利公开号WO2019118919 A1的[0304]-[0307]中所述的那些，将该国际专利公开通过援引以其全文并入本文。
稳定性/半衰期
在一些实施例中，本文提供的经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)具有相比于参考物(例如，具有相同核苷酸序列但未被环化的线性多核糖核苷酸(线性对应物)或相应的未修饰的环状多核糖核苷酸)增加的半衰期。在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)基本上对降解例如核酸外切酶有抗性。在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)对自降解有抗性。在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)缺少酶促裂解位点，例如dicer裂解位点。在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)的半衰期比参考物(例如，线性对应物或相应的未修饰的环状多核糖核苷酸)长至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约120％、至少约140％、至少约150％、至少约160％、至少约180％、至少约200％、至少约300％、至少约400％、至少约500％、至少约600％、至少约700％、至少约800％、至少约900％、至少约1000％或至少约10000％。
在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)在细胞分裂期间持续存在于细胞中。在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)在有丝分裂后持续存在于子细胞中。在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)在细胞内复制并且传递至子细胞。在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包含介导该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)的自复制的复制元件。在一些实施例中，复制元件介导该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)转录成与该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)互补(线性互补)的线性多核糖核苷酸。在一些实施例中，线性互补的多核糖核苷酸可以在细胞中体内环化为互补的经修饰的环状多核糖核苷酸。在一些实施例中，互补的多核糖核苷酸可以进一步自复制成另一种经修饰的环状多核糖核苷酸，该经修饰的环状多核糖核苷酸具有与起始经修饰的环状多核糖核苷酸相同或相似的核苷酸序列。一种示例性自复制元件包括HDV复制结构域(如Beeharry等人,Virol[病毒学],2014,450-451:165-173所述)。在一些实施例中，细胞以至少25％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、或99％的效率将至少一种经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)传递至子细胞。在一些实施例中，正经历减数分裂的细胞以至少25％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、或99％的效率将该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)传递至子细胞。在一些实施例中，正经历有丝分裂的细胞以至少25％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、或99％的效率将该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)传递至子细胞。
结构
在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包含高阶结构，例如二级或三级结构。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸被配置成用于包含高阶结构，诸如国际专利公开号WO 2019118919A1中所述的那些，将该国际专利公开通过援引以其全文并入本文。
药物组合物
本发明包括与一种或多种药学上可接受的赋形剂组合的组合物。药物组合物可以任选地包含一种或多种另外的活性物质，例如治疗和/或预防活性物质。本发明的药物组合物可以是无菌的和/或无热原的。可以在以下中找到药剂的配制和/或制造中的一般考虑：例如，Remington:The Science and Practice of Pharmacy[雷明顿：药物科学与实践]第21版,Lippincott Williams&Wilkins[利平科特·威廉斯和威尔金斯出版公司],2005(通过援引并入本文)。
尽管本文提供的药物组合物的描述主要针对适合于施用至人的药物组合物，但是本领域技术人员应理解，此类组合物通常适合于施用至任何其他动物，例如非人动物，例如非人哺乳动物。为了使组合物适合于施用给各种动物而对适合于施用至人的药物组合物的修饰是熟知的，并且普通兽医药理师可以仅通过普通的实验(如果有的话)来设计和/或进行这种修饰。设想施用药物组合物的受试者包括但不限于人和/或其他灵长类动物；哺乳动物，包括商业相关的哺乳动物，诸如牛、猪、马、绵羊、猫、狗、小鼠和/或大鼠；和/或鸟类，包括商业相关的鸟类，诸如家禽、鸡、鸭、鹅和/或火鸡。
本文所述的药物组合物的配制品可以通过药理学领域中已知的或以后开发的任何方法来制备。通常，此类制备方法包括以下步骤：使活性成分与赋形剂和/或一种或多种其他辅助成分结合，并且然后，如果必要和/或期望的话，将产品分开、成形和/或包装。
递送
本文所述的经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)可以包括在包含药学上可接受的载体或赋形剂的药物组合物中。本文所述的经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)可以包括在具有递送载体的药物组合物中。在一些实施例中，如本文所述的经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)可以包括在不含任何载体的药物组合物中。在一些实施例中，如本文所述的经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)可以包括在包含肠胃外可接受的稀释剂的药物组合物中。在一些实施例中，如本文所述的经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)可以包括在包含乙醇的药物组合物中。如本文披露的方法包括体内递送如本文披露的经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)、如本文披露的组合物、或如本文披露的药物组合物的方法，该方法包括将该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)、组合物、或药物组合物肠胃外施用至受试者的细胞或组织、或受试者。
可以将本文所述的药物组合物配制为例如包括药物赋形剂或载体。药物载体可以是膜、脂质双层和/或聚合物载体，例如脂质体，诸如纳米颗粒，例如脂质纳米颗粒，并且通过已知方法，诸如经由部分或完全包封该经修饰的环状多核糖核苷酸递送至有需要的受试者(例如人或非人农业动物或家畜，例如牛、狗、猫、马、家禽)。此类方法包括但不限于转染(例如，脂质介导的阳离子聚合物、磷酸钙、树状聚合物)；电穿孔或其他破坏膜的方法(例如，核转染)、病毒递送(例如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、AAV)、显微注射、微粒轰击(“基因枪”)、fugene、直接声波加载、细胞挤压、光转染、原生质体融合、刺穿感染、磁转染、外来体介导的转移、脂质纳米颗粒介导的转移、及其任何组合。递送方法也描述于例如Gori等人,Delivery and Specificity of CRISPR/Cas9 Genome Editing Technologies forHuman Gene Therapy[用于人类基因疗法的CRISPR/Cas9基因组编辑技术的递送和特异性].Human Gene Therapy[人类基因疗法疗].2015年7月,26(7):443-451.doi:10.1089/hum.2015.074；和Zuris等人,Cationic lipid-mediated delivery of proteins enablesefficient protein-based genome editing in vitro and in vivo[阳离子脂质介导的蛋白质递送能够在体外和体内实现高效的基于蛋白质的基因组编辑].Nat Biotechnol[自然生物技术].2014年10月30日；33(1):73-80。
在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)或药物组合物可以作为裸递送配制品递送。裸递送配制品在不借助载体并且不对环状多核糖核苷酸(例如，如本文所述的杂交修饰的环状多核糖核苷酸)进行共价修饰或者不部分或完全包封该环状多核糖核苷酸的情况下将该环状多核糖核苷酸递送至细胞。
裸递送配制品是不含载体的配制品，并且其中该环状多核糖核苷酸(例如，如本文所述的杂交修饰的环状多核糖核苷酸)没有结合有助于递送至细胞的部分的共价修饰或者该环状多核糖核苷酸未被部分或完全包封。在一些实施例中，没有与有助于递送至细胞的部分结合的共价修饰的杂交修饰的环状多核糖核苷酸是未与有助于递送至细胞的蛋白质、小分子、颗粒、聚合物、或生物聚合物共价结合。
在一些实施例中，裸递送配制品可以不含以下中的任一种或全部：转染试剂、阳离子载体、碳水化合物载体、纳米颗粒载体、或蛋白质载体。例如，裸递送配制品可以不含植物糖原辛烯基琥珀酸酯、植物糖原β-糊精、酸酐修饰的植物糖原β-糊精、lipofectamine、聚乙烯亚胺、聚(三亚甲基亚胺)、聚(四亚甲基亚胺)、聚丙烯亚胺、氨基糖苷-多胺、双脱氧-二氨基-b-环糊精、精胺、亚精胺、聚(2-二甲氨基)乙基甲基丙烯酸酯、聚(赖氨酸)、聚(组氨酸)、聚(精氨酸)、阳离子化明胶、树状聚合物、壳聚糖、1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP)、N-[1-(2,3-二油酰基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)、1-[2-(油酰基氧基)乙基]-2-油烯基-3-(2-羟乙基)咪唑啉鎓氯化物(DOTIM)、2,3-二油酰基氧基-N-[2(精胺甲酰胺基)乙基]-N,N-二甲基-1-丙烷铵三氟乙酸酯(DOSPA)、3B-[N—(N\N'-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基]胆固醇盐酸盐(DC-胆固醇HC1)、双十七烷基酰胺基甘氨酰亚精胺(DOGS)、N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化铵(DDAB)、N-(1,2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羟乙基溴化铵(DMRIE)、N,N-二油烯基-N,N-二甲基氯化铵(DODAC)、人血清白蛋白(HSA)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)、或球蛋白。
裸递送配制品可以包含非载体赋形剂。在一些实施例中，非载体赋形剂可以包括非活性成分。在一些实施例中，非载体赋形剂可以包括缓冲液，例如PBS。在一些实施例中，非载体赋形剂可以是溶剂、非水性溶剂、稀释剂(例如，肠胃外可接受的稀释剂)、悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂、乳化剂、防腐剂、聚合物、肽、蛋白质、细胞、透明质酸酶、分散剂、制粒剂、崩解剂、粘结剂、缓冲剂、润滑剂、或油。
在一些实施例中，裸递送配制品可以包含稀释剂(例如，肠胃外可接受的稀释剂)。稀释剂可以是液体稀释剂或固体稀释剂。在一些实施例中，稀释剂可以是RNA增溶剂、缓冲液、或等渗剂。RNA增溶剂的实例包括水、乙醇、甲醇、丙酮、甲酰胺、和2-丙醇。缓冲液的实例包括2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、Bis-Tris、2-[(2-氨基-2-氧乙基)-(羧甲基)氨基]乙酸(ADA)、N-(2-乙酰胺基)-2-氨基乙烷磺酸(ACES)、哌嗪-N,N′-双(2-乙烷磺酸)(PIPES)、2-[[1,3-二羟基-2-(羟甲基)丙-2-基]氨基]乙烷磺酸(TES)、3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸(HEPES)、Tris、Tricine、Gly-Gly、Bicine或磷酸盐。等渗剂的实例包括甘油、甘露醇、聚乙二醇、丙二醇、海藻糖、或蔗糖。
本发明进一步涉及一种宿主或宿主细胞，该宿主或宿主细胞包含本文所述的杂交修饰的环状多核糖核苷酸。在一些实施例中，宿主或宿主细胞是植物、昆虫、细菌、真菌、脊椎动物、哺乳动物(例如，人)或其他生物体或细胞。
在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)在宿主中是非免疫原性的。在一些实施例中，与由参考化合物(例如，对应于所述经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)的线性多核苷酸或缺少加密原的经修饰的环状多核糖核苷酸)触发的应答相比，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)具有降低的宿主免疫系统的应答或不能产生该应答。一些免疫应答包括但不限于体液免疫应答(例如，抗原特异性抗体的产生)和细胞介导的免疫应答(例如，淋巴细胞增殖)。
在一些实施例中，使宿主或宿主细胞接触(例如，递送至或施用至)该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)。在一些实施例中，宿主是哺乳动物，诸如人。可以在施用后的任何时间测量宿主中该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)、表达产物、或两者的量。在某些实施例中，测定培养物中宿主生长的时程。如果在该经修饰的环状多核糖核苷酸存在时生长增加或减少，则该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)或表达产物或两者都被鉴定为在增加或减少宿主的生长方面是有效的。
递送方法
将如本文所述的经修饰的环状多核糖核苷酸分子(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)递送至细胞、组织或受试者的方法包括将如本文所述的药物组合物施用至该细胞、组织或受试者。
在一些实施例中，该递送方法是体内方法。例如，递送如本文所述的经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)的方法包括向有需要的受试者肠胃外施用如本文所述的药物组合物。作为另一个实例，将经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)递送至受试者的细胞或组织的方法包括向该细胞或组织肠胃外施用如本文所述的药物组合物。在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)是处于有效引起受试者中的生物学应答的量下。在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)是有效对受试者中的细胞或组织具有生物学效应的量。在一些实施例中，如本文所述的药物组合物包含载体。在一些实施例中，如本文所述的药物组合物包含稀释剂并且不含任何载体。在一些实施例中，肠胃外施用是以静脉内、肌肉内、眼科、或局部方式。
在一些实施例中，药物组合物以口服方式施用。在一些实施例中，药物组合物以经鼻方式施用。在一些实施例中，药物组合物通过吸入施用。在一些实施例中，药物组合物以局部方式施用。在一些实施例中，药物组合物以眼科方式施用。在一些实施例中，药物组合物以直肠方式施用。在一些实施例中，药物组合物通过注射施用。施用可以是全身性施用或局部施用。在一些实施例中，药物组合物以肠胃外方式施用。在一些实施例中，药物组合物以静脉内、动脉内、腹膜内、皮内、颅内、鞘内、淋巴管内、皮下、或肌肉内方式施用。在一些实施例中，药物组合物经由眼内施用、耳蜗内(耳内)施用、或气管内施用来施用。在一些实施例中，如本文所述的任何递送方法是用载体进行的。在一些实施例中，如本文所述的任何递送方法是在不借助于载体或细胞渗透剂的情况下进行的。
基于细胞和囊泡的载体
可以将本文所述的经修饰的环状RNA(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)组合物或制剂施用至基于囊泡或其他膜的载体中的细胞。
在实施例中，在基于细胞、囊泡或其他膜的载体中或经由该载体施用本文所述的药物组合物中的经修饰的环状RNA(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)。在一个实施例中，包含该经修饰circRNA的药物组合物可以配制在脂质体或其他类似的囊泡中。脂质体是球形囊泡结构，这些球形囊泡结构由围绕内部水性隔室的单层或多层的脂质双层和相对不可渗透的外部亲脂性磷脂双层构成。脂质体可以是阴离子的、中性的或阳离子的。脂质体具有生物相容性，无毒，可以递送亲水性和亲脂性药物分子，保护其货物免受血浆酶的降解，并且将其负载转运穿过生物膜和血脑屏障(BBB)(关于综述，参见例如，Spuch和Navarro,Journal of Drug Delivery[药物递送杂志],第2011卷,文章ID 469679,第12页,2011.doi:10.1155/2011/469679)。
囊泡可以由若干种不同类型的脂质制成；然而，磷脂最常用于生成脂质体作为药物载体。制备多层囊泡脂质的方法是本领域已知的(参见例如美国专利号6,693,086，其关于多层囊泡脂质制备的教导通过援引并入本文)。尽管当脂质膜与水性溶液混合时，囊泡形成可以是自发的，但也可以通过经由使用均质器、超声波仪或挤压设备以振荡的形式施加力来加快囊泡形成(关于综述，参见例如，Spuch和Navarro,Journal of Drug Delivery[药物递送杂志],第2011卷,文章ID 469679,第12页,2011.doi:10.1155/2011/469679)。可以通过挤出通过具有减小尺寸的过滤器来制备挤出的脂质，如Templeton等人,NatureBiotech[自然生物技术],15:647-652,1997中所述，将该文献关于挤出脂质制备的传授内容通过援引并入本文中。
脂质纳米颗粒是为本文所述的经修饰的环状RNA(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)组合物或制剂提供生物相容性和可生物降解递送系统的载体的另一个实例。纳米结构化的脂质载体(NLC)是经修饰的固体脂质纳米颗粒(SLN)，这些经修饰的固体脂质纳米颗粒保留了SLN的特征、改善了药物稳定性和负载能力、并且防止了药物泄漏。聚合物纳米颗粒(PNP)是药物递送的重要组成部分。这些纳米颗粒可以有效地将药物递送指导至特定靶标并且改善药物稳定性和受控的药物释放。也可以使用脂质聚合物纳米颗粒(PLN)，即一种组合了脂质体和聚合物的新型载体。这些纳米颗粒具有PNP和脂质体的互补优势。PLN由核-壳结构构成；聚合物核提供了稳定的结构，并且磷脂壳提供了良好的生物相容性。这样，这两种组分增加了药物包封效率、促进了表面修饰、并且防止了水溶性药物的泄漏。对于综述，参见例如，Li等人2017,Nanomaterials[纳米材料]7,122；doi:10.3390/nano7060122。
载体的另外的非限制性实例包括碳水化合物载体(例如，酸酐修饰的植物糖原或糖原型材料)、蛋白质载体(例如，共价连接至环状多核糖核苷酸的蛋白质)、或阳离子载体(例如，阳离子脂质聚合物或转染试剂)。碳水化合物载体的非限制性实例包括植物糖原辛烯基琥珀酸酯、植物糖原β-糊精、和酸酐修饰的植物糖原β-糊精。阳离子载体的非限制性实例包括lipofectamine、聚乙烯亚胺、聚(三亚甲基亚胺)、聚(四亚甲基亚胺)、聚丙烯亚胺、氨基糖苷-多胺、双脱氧-二氨基-b-环糊精、精胺、亚精胺、聚(2-二甲氨基)乙基甲基丙烯酸酯、聚(赖氨酸)、聚(组氨酸)、聚(精氨酸)、阳离子化明胶、树状聚合物、壳聚糖、1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP)、N-[1-(2,3-二油酰基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)、1-[2-(油酰基氧基)乙基]-2-油烯基-3-(2-羟乙基)咪唑啉鎓氯化物(DOTIM)、2,3-二油酰基氧基-N-[2(精胺甲酰胺基)乙基]-N,N-二甲基-1-丙烷铵三氟乙酸酯(DOSPA)、3B-[N—(N\N'-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基]胆固醇盐酸盐(DC-胆固醇HC1)、双十七烷基酰胺基甘氨酰亚精胺(DOGS)、N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化铵(DDAB)、N-(1,2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羟乙基溴化铵(DMRIE)、和N,N-二油烯基-N,N-二甲基氯化铵(DODAC)。蛋白质载体的非限制性实例包括人血清白蛋白(HSA)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)、或球蛋白。
外来体也可用作本文所述的环状RNA组合物或制剂的药物递送媒介物。关于综述，参见Ha等人2016年7月.Acta Pharmaceutica Sinica B[药学学报B].第6卷,第4期,第287-296页；https://doi.org/10.1016/j.apsb.2016.02.001。
离体分化的红细胞也可用作本文所述环状RNA组合物或制剂的载体。参见例如，WO2015073587；WO 2017123646；WO 2017123644；WO 2018102740；WO 2016183482；WO2015153102；WO 2018151829；WO 2018009838；Shi等人2014.Proc Natl Acad Sci USA[美国国家科学院院刊].111(28):10131-10136；美国专利9,644,180；Huang等人2017.NatureCommunications[自然通讯]8:423；Shi等人2014.Proc Natl Acad Sci USA[美国国家科学院院刊].111(28):10131-10136。
例如如WO 2018208728中所述的融合体组合物也可以用作递送如本文所述的经修饰的环状RNA(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)或其药物组合物的载体。
病毒体和病毒样颗粒(VLP)也可以用作将如本文所述的经修饰的环状RNA或其药物组合物递送至所靶向细胞的载体。
例如如国际专利公开号WO 2011097480、WO 2013070324、WO 2017004526、或WO2020041784中所述的植物纳米囊泡和植物信使包(PMP)也可以用作递送如本文所述的环状RNA或其药物组合物的载体。
产生方法
在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包含非天然存在的脱氧核糖核酸序列，并且可以使用重组技术(以下详细描述的方法；例如，使用DNA质粒体外衍生)或化学合成产生。
在本发明的范围内，用于产生RNA环的DNA分子可以包括天然存在的原始核酸序列的DNA序列、其修饰形式、或编码通常未在自然界中发现的合成多肽的DNA序列(例如，嵌合分子或融合蛋白)。DNA和RNA分子可以使用多种技术修饰，这些多种技术包括但不限于经典诱变技术和重组技术，诸如定点诱变、化学处理核酸分子以诱导突变、限制性酶裂解核酸片段、连接核酸片段、聚合酶链式反应(PCR)扩增和/或诱变核酸序列的选定区域、合成寡核苷酸混合物以及连接混合物基团以“建造”核酸分子混合物、及其组合。
该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)可以根据任何可用的技术制备，该技术包括但不限于化学合成和酶促合成。在一些实施例中，线性初级构建体或线性mRNA可以被环化、或连环化以产生本文所述的经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)。环化或连环化的机制可以通过诸如但不限于化学、酶促、夹板连接或核酶催化的方法来发生。新形成的5'-/3'-键可以是分子内键或分子间键。
制备本文所述的经修饰的环状多核糖核苷酸的方法描述于以下文献中：例如，Khudyakov和Fields,Artificial DNA:Methods and Applications[人工DNA：方法与应用],CRC Press[CRC出版社](2002)；Zhao,Synthetic Biology:Tools and Applications[合成生物学：工具与应用](第一版),Academic Press[学术出版社](2013)；以及Egli和Herdewijn,Chemistry and Biology of Artificial Nucleic Acids[人工核酸的化学与生物学],(第一版),Wiley-VCH[威利-VCH出版社](2012)。
多种合成经修饰的环状多核糖核苷酸的方法也在本领域中进行了描述(参见例如，美国专利号US 6210931、美国专利号US 5773244、美国专利号US 5766903、美国专利号US 5712128、美国专利号US 5426180、美国公开号US 20100137407、国际公开号WO1992001813和国际公开号WO 2010084371；将这些专利中的每一篇的内容通过援引以其全文并入本文)。
在一些实施例中，可以在产生后净化该经修饰的环状多核糖核苷酸以去除生产杂质，例如游离的核糖核酸、线性或带切口RNA、DNA、蛋白质等。在一些实施例中，可以通过本领域中常用的任何已知方法纯化该经修饰的环状多核糖核苷酸。非限制性纯化方法的实例包括柱色谱法、凝胶切除、尺寸排阻等。
表达方法
本发明包括用于蛋白质表达的方法，该方法包括翻译本文提供的经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)的至少一个区域。
在一些实施例中，用于蛋白质表达的方法包括将该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)的总长度的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或至少95％翻译成多肽。在一些实施例中，用于蛋白质表达的方法包括将该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)翻译成具有至少5个氨基酸、至少10个氨基酸、至少15个氨基酸、至少20个氨基酸、至少50个氨基酸、至少100个氨基酸、至少150个氨基酸、至少200个氨基酸、至少250个氨基酸、至少300个氨基酸、至少400个氨基酸、至少500个氨基酸、至少600个氨基酸、至少700个氨基酸、至少800个氨基酸、至少900个氨基酸、或至少1000个氨基酸的多肽。在一些实施例中，用于蛋白质表达的方法包括将该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)翻译成具有约5个氨基酸、约10个氨基酸、约15个氨基酸、约20个氨基酸、约50个氨基酸、约100个氨基酸、约150个氨基酸、约200个氨基酸、约250个氨基酸、约300个氨基酸、约400个氨基酸、约500个氨基酸、约600个氨基酸、约700个氨基酸、约800个氨基酸、约900个氨基酸、或约1000个氨基酸的多肽。在一些实施例中，这些方法包括将该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)翻译成如本文提供的连续多肽、如本文提供的离散多肽、或两者。
在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)的至少一个区域的翻译在体外，诸如兔网织红细胞裂解物中发生。在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)的至少一个区域的翻译在体内发生，例如，在真核细胞的转染或原核细胞(诸如细菌)的转化之后。
在一些方面，本披露提供了在受试者体内表达一个或多个表达序列的方法，该方法包括：将经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)施用至受试者的细胞，其中该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)包含该一个或多个表达序列；以及在细胞中表达来自该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)的该一个或多个表达序列。在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)被配置为使得该一个或多个表达序列在细胞中在较晚的时间点的表达等于或高于较早的时间点。在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)被配置为使得一个或多个表达序列在细胞中的表达在至少7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、23、或更多天的时间段内减少不大于约40％。在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)被配置为使得一个或多个表达序列在细胞中在至少7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、23、或更多天的表达维持在变化不超过约40％的水平。在一些实施例中，使用本文所述的任何递送方法进行该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)的施用。在一些实施例中，将该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)经由静脉内注射施用至受试者。在一些实施例中，该经修饰的环状多核糖核苷酸(例如，完全修饰的环状多核糖核苷酸或杂交修饰的环状多核糖核苷酸)的施用包括但不限于产前施用、新生儿施用、产后施用、口服、通过注射(例如，静脉内、动脉内、腹膜内、皮内、皮下和肌肉内)、通过眼科施用和通过鼻内施用。
在一些实施例中，用于蛋白质表达的方法包括翻译产物的修饰、折叠或其他翻译后修饰。在一些实施例中，用于蛋白质表达的方法包括体内翻译后修饰，例如经由细胞机器。
编号的实施例
[1]一种药物组合物，该药物组合物包含药学上可接受的载体或赋形剂和经修饰的环状多核糖核苷酸，其中该经修饰的环状多核糖核苷酸包含至少一种经修饰的核苷酸和第一部分，并且其中该第一部分包含至少约5、10、20、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、或1000个连续的未修饰核苷酸。
[2]一种药物组合物，该药物组合物包含药学上可接受的载体或赋形剂和经修饰的环状多核糖核苷酸，其中该经修饰的环状多核糖核苷酸包含至少一种经修饰的核苷酸和第一部分，并且其中该第一部分包含至少约5、10、20、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、或1000个连续核苷酸，并且其中该第一部分缺少5’-甲基胞苷或假尿苷。
[3]如编号实施例[1]或[2]所述的药物组合物，其中该经修饰的环状多核糖核苷酸具有比相应的未修饰的环状多核糖核苷酸更低的免疫原性。
[4]根据编号实施例[1]-[3]中任一项所述的药物组合物，其中该经修饰的环状多核糖核苷酸具有比相应的未修饰的环状多核糖核苷酸高至少约1.1、1.2、1.3、1.5、1.6、1.8、2、2.2、2.5、2.8、3、3.2、3.3、3.5、3.8、4.0、4.2、4.5、4.8、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、或10.0倍的半衰期。
[5]如编号实施例[1]-[4]中任一项所述的药物组合物，其中该经修饰的环状多核糖核苷酸具有比相应的未修饰的环状多核糖核苷酸更高的半衰期。
[6]如编号实施例[1]-[5]中任一项所述的药物组合物，其中该经修饰的环状多核糖核苷酸具有比相应的未修饰的环状多核糖核苷酸低至少约1.1、1.2、1.3、1.5、1.6、1.8、2、2.2、2.5、2.8、3、3.2、3.3、3.5、3.8、4.0、4.2、4.5、4.8、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、或10.0倍的免疫原性，如通过RIG-I、TLR-3、TLR-7、TLR-8、MDA-5、LGP-2、OAS、OASL、PKR、和IFN-β中的至少一种的表达或信号传导或激活评估的。
[7]如编号实施例[1]-[6]中任一项所述的药物组合物，其中该经修饰的环状多核糖核苷酸具有比相应的未修饰的环状多核糖核苷酸更高的半衰期。
[8]如编号实施例[1]-[7]中任一项所述的药物组合物，其中该至少一种经修饰的核苷酸选自下组，该组由以下组成：N(6)甲基腺苷(m6A)、5’-甲基胞苷、和假尿苷。
[9]如编号实施例[1]-[8]中任一项所述的药物组合物，其中该至少一种经修饰的核酸选自下组，该组由以下组成：2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基(2’-O-MOE)、2’-O-氨基丙基、2’-脱氧、T-脱氧-2’-氟、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)、2’-O-二甲基氨基乙基(2’-O-DMAOE)、2’-O-二甲基氨基丙基(2’-O-DMAP)、T-O-二甲基氨基乙基氧基乙基(2’-O-DMAEOE)、2’-O-N-甲基乙酰胺基(2’-O-NMA)、锁核酸(LNA)、乙烯核酸(ENA)、肽核酸(PNA)、1’,5’-脱水己糖醇核酸(HNA)、吗啉代、甲基膦酸酯核苷酸、硫醇膦酸酯核苷酸、和2’-氟N3-P5’-亚磷酰胺。
[10]如编号实施例[1]-[9]中任一项所述的药物组合物，其中该经修饰的环状多核糖核苷酸的至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、或99％核苷酸是经修饰的核苷酸。
[11]如编号实施例[1]-[10]中任一项所述的药物组合物，其中该环状多核糖核苷酸包含由未修饰的核苷酸组成的结合位点，该结合位点被配置为结合至蛋白质、DNA、RNA、或细胞靶标。
[12]如编号实施例[11]所述的药物组合物，其中该第一部分包含该结合位点。
[13]如编号实施例[1]-[12]中任一项所述的药物组合物，其中该经修饰的环状多核糖核苷酸包含由未修饰的核苷酸组成的IRES。
[14]如编号实施例[1]-[13]中任一项所述的药物组合物，其中该第一部分包含IRES。
[15]如编号实施例[1]-[14]中任一项所述的药物组合物，其中该经修饰的环状多核糖核苷酸包含一个或多个表达序列。
[16]如编号实施例[1]-[15]中任一项所述的药物组合物，其中该经修饰的环状多核糖核苷酸包含该一个或多个表达序列和该IRES，并且其中该经修饰的环状多核糖核苷酸在该IRES之外包含5’-甲基胞苷、假尿苷、或其组合。
[17]如编号实施例[1]-[16]中任一项所述的药物组合物，其中该经修饰的环状多核糖核苷酸的一个或多个表达序列具有比完全修饰的环状多核糖核苷酸对应物更高的翻译效率。
[18]如编号实施例[1]-[17]中任一项所述的药物组合物，其中该经修饰的环状多核糖核苷酸的一个或多个表达序列具有比完全修饰的环状多核糖核苷酸对应物高至少约0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.5、1.6、1.8、2、2.2、2.5、2.8、3倍的翻译效率。
[19]如编号实施例[17]或[18]中任一项所述的药物组合物，其中该完全修饰的环状多核糖核苷酸对应物在第一部分之外包含至少一种经修饰的核苷酸并且在该第一部分中包含超过5％的经修饰的核苷酸。
[20]如编号实施例[1]-[19]中任一项所述的药物组合物，其中该经修饰的环状多核糖核苷酸的一个或多个表达序列具有比相应的未修饰的环状多核糖核苷酸更高的翻译效率。
[21]如编号实施例[1]-[20]中任一项所述的药物组合物，其中该经修饰的环状多核糖核苷酸的一个或多个表达序列具有比相应的未修饰的环状多核糖核苷酸高至少约0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.5、1.6、1.8、2、2.2、2.5、2.8、3倍的翻译效率。
[22]如编号实施例[1]-[21]中任一项所述的药物组合物，其中该经修饰的环状多核糖核苷酸的一个或多个表达序列具有比具有包含经修饰的核苷酸的第一部分的相应环状多核糖核苷酸更高的翻译效率。
[23]如编号实施例[1]-[22]中任一项所述的药物组合物，其中该环状多核糖核苷酸的一个或多个表达序列具有比具有包含超过10％的经修饰的核苷酸的第一部分的相应环状多核糖核苷酸更高的翻译效率。
[24]如编号实施例[1]-[23]中任一项所述的药物组合物，其中该经修饰的环状多核糖核苷酸的一个或多个表达序列具有比具有包含经修饰的核苷酸的第一部分的相应环状多核糖核苷酸高至少约1.2、1.3、1.5、1.6、1.8、2、2.2、2.5、2.8、3、3.2、3.3、3.5、3.8、4.0、4.2、4.5、4.8、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、或10.0倍的翻译效率。
[25]如编号实施例[17]-[23]中任一项所述的药物组合物，其中该翻译效率是在包含该环状多核糖核苷酸或该相应的环状多核糖核苷酸的细胞中、或者在体外翻译系统(例如，兔网织红细胞裂解物)中测量的。
[26]如编号实施例[1]-[25]中任一项所述的药物组合物，其中该经修饰的环状多核糖核苷酸能够滚环翻译。
[27]如编号实施例[15]-[26]中任一项所述的药物组合物，其中该一个或多个表达序列中的每一个通过该环状多核糖核苷酸上的交错元件与后继的表达序列隔开，其中该一个或多个表达序列的滚环翻译生成至少两个多肽分子。
[28]如编号实施例[1]-[27]中任一项所述的药物组合物，其中该药学上可接受的载体或赋形剂是乙醇。
[29]如编号实施例[27]所述的药物组合物，其中该交错元件阻止由(a)单个表达序列的两轮翻译或(b)两个或更多个表达序列的一轮或多轮翻译生成单一多肽。
[30]如编号实施例[27]或[29]所述的药物组合物，其中该交错元件是与该一个或多个表达序列分离的序列。
[31]如编号实施例[27]或[29]所述的药物组合物，其中该交错元件包含该一个或多个表达序列中的表达序列的一部分。
[32]如编号实施例1-24中任一项所述的药物组合物，其中该经修饰的环状多核糖核苷酸能够滚环翻译，其中该经修饰的环状多核糖核苷酸被配置为使得在该经修饰的环状多核糖核苷酸的滚环翻译期间生成的总多肽中的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％(摩尔/摩尔)是离散多肽，并且其中这些离散多肽中的每一个都是由该一个或多个表达序列的单轮翻译或少于单轮翻译生成的。
[33]如编号实施例[32]所述的药物组合物，其中该经修饰的环状多核糖核苷酸被配置为使得在该经修饰的环状多核糖核苷酸的滚环翻译期间生成的总多肽中的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％(摩尔/摩尔)是离散多肽，并且其中在体外翻译系统中测试这些离散产物相对于这些总多肽的量比。
[34]如编号实施例[33]所述的药物组合物，其中该体外翻译系统包含兔网织红细胞裂解物。
[35]如编号实施例[27]-[34]中任一项所述的药物组合物，其中该交错元件位于该一个或多个表达序列中至少一个的3’端，并且其中该交错元件被配置为在该经修饰的环状多核糖核苷酸的滚环翻译期间使核糖体停滞。
[36]如编号实施例[27]-[35]中任一项所述的药物组合物，其中该交错元件编码肽序列，该肽序列选自由2A序列和2A样序列组成的组。
[37]如编号实施例[27]-[36]中任一项所述的药物组合物，其中该交错元件编码具有C末端序列为GP的序列。
[38]如编号实施例[27]-[37]中任一项所述的药物组合物，其中该交错元件编码具有C末端共有序列为D(V/I)ExNPGP的序列，其中x＝任何氨基酸。
[39]如编号实施例[27]-[38]中任一项所述的药物组合物，其中该交错元件编码选自下组的序列，该组由以下组成：GDVESNPGP、GDIEENPGP、VEPNPGP、IETNPGP、GDIESNPGP、GDVELNPGP、GDIETNPGP、GDVENPGP、GDVEENPGP、GDVEQNPGP、IESNPGP、GDIELNPGP、HDIETNPGP、HDVETNPGP、HDVEMNPGP、GDMESNPGP、GDVETNPGP、GDIEQNPGP、和DSEFNPGP。
[40]如编号实施例[27]-[39]中任一项所述的药物组合物，其中该交错元件在该一个或多个表达序列中的每一个的3’端。
[41]如编号实施例[27]-[40]中任一项所述的药物组合物，其中该经修饰的环状多核糖核苷酸中第一表达序列的该交错元件在该经修饰的环状多核糖核苷酸中该第一表达序列后继的表达序列的第一翻译起始序列的上游(5’)，并且其中该交错元件与该第一翻译起始序列之间的距离使得该第一表达序列和该后继表达序列能够连续翻译。
[42]如编号实施例[27]-[40]中任一项所述的药物组合物，其中该经修饰的环状多核糖核苷酸中第一表达序列的该交错元件在该环状多核糖核苷酸中该第一表达序列后继的表达序列的第一翻译起始序列的上游(5’)，其中该环状多核糖核苷酸被连续翻译，其中在相应的经修饰的环状多核糖核苷酸中第二表达序列的第二翻译起始序列上游包含第二交错元件的该经修饰的相应环状多核糖核苷酸不被连续翻译，并且其中该相应的经修饰的环状多核糖核苷酸中的该第二交错元件与该第二翻译起始序列的距离更大，例如是该经修饰的环状多核糖核苷酸中的该交错元件与该第一翻译起始之间距离的至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍大。
[43]如编号实施例[41]或[42]所述的药物组合物，其中该交错元件与该第一翻译起始之间的距离是至少2nt、3nt、4nt、5nt、6nt、7nt、8nt、9nt、10nt、11nt、12nt、13nt、14nt、15nt、16nt、17nt、18nt、19nt、20nt、25nt、30nt、35nt、40nt、45nt、50nt、55nt、60nt、65nt、70nt、75nt、或更大。
[44]如编号实施例[41]或[42]所述的药物组合物，其中该第二交错元件与该第二翻译起始之间的距离是至少2nt、3nt、4nt、5nt、6nt、7nt、8nt、9nt、10nt、11nt、12nt、13nt、14nt、15nt、16nt、17nt、18nt、19nt、20nt、25nt、30nt、35nt、40nt、45nt、50nt、55nt、60nt、65nt、70nt、75nt、或大于该第一交错元件与该第一翻译起始之间的距离。
[45]如编号实施例[41]-[43]中任一项所述的药物组合物，其中该经修饰的环状多核糖核苷酸上的该第一表达序列后继的表达序列是不同于该第一表达序列的表达序列。
[46]如编号实施例[41]-[43]中任一项所述的药物组合物，其中该经修饰的环状多核糖核苷酸上的该第一表达序列的该后继表达序列是该第一表达序列。
[47]如任一前述编号实施例所述的药物组合物，其中该经修饰的环状多核糖核苷酸包含至少一种选自以下的结构元件：
a)加密原；
b)交错元件；
c)调控元件；
d)复制元件；以及
f)准双链二级结构。
[48]如任一前述编号实施例所述的药物组合物，其中该经修饰的环状多核糖核苷酸包含至少一种选自以下的功能特征：
a)比线性对应物更高的翻译效率；
b)多种翻译产物的化学计量翻译效率；
c)比缺少加密原的对应物更低的免疫原性；
d)相比于线性对应物增加的半衰期；以及
e)细胞分裂期间的持续性。
[49]如任一前述编号实施例所述的药物组合物，其中该经修饰的环状多核糖核苷酸具有比线性对应物高至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少150％、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍、或至少100倍的翻译效率。
[50]如任一前述编号实施例所述的药物组合物，其中该经修饰的环状多核糖核苷酸具有比线性对应物高至少5倍的翻译效率。
[51]如任一前述编号实施例所述的药物组合物，其中该经修饰的环状多核糖核苷酸缺少以下中的至少一种：
a)5’-UTR；
b)3’-UTR；
c)聚A序列；
d)5’-帽；
e)终止元件；
f)核酸外切酶的降解易感性；以及
g)与帽结合蛋白的结合。
[52]如编号实施例[26]-[51]中任一项所述的药物组合物，其中该一个或多个表达序列包含科扎克起始序列。
[53]如编号实施例[47]-[52]中任一项所述的药物组合物，其中该准螺旋结构包含至少一个双链RNA区段与至少一个非双链区段。
[54]如编号实施例[53]所述的药物组合物，其中该准螺旋结构包含与重复序列例如富A序列连接的第一序列和第二序列。
[55]如编号实施例[47]-[54]中任一项所述的药物组合物，其中该加密原包含剪接元件。
[56]如任一前述编号实施例所述的药物组合物，其中该加密原包含蛋白质结合位点，例如核糖核苷酸结合蛋白。
[57]如任一前述编号实施例所述的药物组合物，其中该加密原包含免疫蛋白结合位点，例如以逃避免疫应答，例如CTL应答。
[58]如任一前述编号实施例所述的药物组合物，其中该经修饰的环状多核糖核苷酸具有比缺少该加密原的对应物低至少2倍的免疫原性，例如，如通过RIG-I、TLR-3、TLR-7、TLR-8、MDA-5、LGP-2、OAS、OASL、PKR、和IFN-β中的至少一种的表达或信号传导或激活评估的。
[59]如任一前述编号实施例所述的药物组合物，其中该经修饰的环状多核糖核苷酸进一步包含核糖开关。
[60]如任一前述编号实施例所述的药物组合物，其中该经修饰的环状多核糖核苷酸进一步包含适体酶。
[61]如任一前述编号实施例所述的药物组合物，其中该经修饰的环状多核糖核苷酸包含非典范翻译起始序列，例如GUG、CUG起始密码子，例如在应激条件下起始表达的翻译起始序列。
[62]如任一前述编号实施例所述的药物组合物，其中该一个或多个表达序列编码肽。
[63]如任一前述编号实施例所述的药物组合物，其中该经修饰的环状多核糖核苷酸包含调控核酸，例如非编码RNA。
[64]如任一前述编号实施例所述的药物组合物，其中该环状多核糖核苷酸具有的大小在约20个碱基至约20kb的范围内。
[65]如任一前述编号实施例所述的药物组合物，其中该经修饰的环状多核糖核苷酸通过线性多核糖核苷酸的环化来合成。
[66]如任一前述编号实施例所述的药物组合物，其中该经修饰的环状多核糖核苷酸包含多个具有相同核苷酸序列或不同核苷酸序列的表达序列。
[67]如任一前述编号实施例所述的药物组合物，其中该经修饰的环状多核糖核苷酸基本上对降解例如核酸外切酶有抗性。
[68]如任一前述编号实施例所述的药物组合物，其中该经修饰的环状多核糖核苷酸包含：
a.经修饰的环状多核糖核苷酸，该经修饰的环状多核糖核苷酸包含：
b.第一结合位点，该第一结合位点被配置为结合第一靶标，例如RNA、DNA、蛋白质、细胞膜等的第一结合部分，其中该第一结合部分是第一环状多核糖核苷酸(circRNA)结合基序；以及
c.第二结合位点，该第二结合位点被配置为结合第二靶标的第二结合部分，其中该第二结合部分是第二circRNA结合基序，
d.其中该第一结合部分不同于该第二结合部分，
e.其中该第一靶标、该第二靶标、和该经修饰的环状多核糖核苷酸形成复合物，并且
f.其中该第一靶标或该第二靶标不是微RNA。
[69]如任一前述编号实施例所述的药物组合物，其中该经修饰的环状多核糖核苷酸包含：
a.经修饰的环状多核糖核苷酸，该经修饰的环状多核糖核苷酸包含：
第一结合位点，该第一结合位点被配置为结合第一靶标的第一结合部分，其中该第一结合部分是第一环状多核糖核苷酸(circRNA)结合基序；以及
第二结合位点，该第二结合位点被配置为结合第二靶标的第二结合部分，其中该第二结合部分是第二circRNA结合基序，
b.其中该第一结合部分不同于该第二结合部分，并且
c.其中该第一靶标和该第二靶标两者均是微RNA。
[70]如编号实施例[68]或[69]所述的药物组合物，其中该第一靶标和该第二靶标彼此相互作用。
[71]如编号实施例[68]-[70]中任一项所述的药物组合物，其中该复合物调节细胞过程。
[72]如编号实施例[68]-[71]中任一项所述的药物组合物，其中该第一靶标和该第二靶标是相同的，并且该第一结合位点和该第二结合位点结合不同的部分。
[73]如编号实施例[68]-[72]中任一项所述的药物组合物，其中该第一靶标和该第二靶标是不同的。
[74]如编号实施例[68]-[73]中任一项所述的药物组合物，其中该经修饰的环状多核糖核苷酸进一步包含被配置为结合第三或更多个结合部分的一个或多个另外结合位点。
[75]如编号实施例[68]-[74]中任一项所述的药物组合物，其中一个或多个靶标是相同的并且一个或多个结合位点被配置为结合不同的部分。
[76]如编号实施例[68]-[75]中任一项所述的药物组合物，其中该复合物的形成调节细胞过程。
[77]如编号实施例[68]-[76]中任一项所述的药物组合物，其中当与该第一靶标和该第二靶标接触时，该经修饰的环状多核糖核苷酸调节与该第一靶标或该第二靶标相关的细胞过程。
[78]如编号实施例[68]-[77]中任一项所述的药物组合物，其中该第一靶标和该第二靶标在该复合物中彼此相互作用。
[79]如编号实施例[68]-[78]中任一项所述的药物组合物，其中该细胞过程与疾病或病症的发病机理相关。
[80]如编号实施例[71]-[79]中任一项所述的药物组合物，其中该细胞过程不同于该环状多核糖核酸的翻译。
[81]如编号实施例[71]-[80]中任一项所述的药物组合物，其中该细胞过程与疾病或病症的发病机理相关。
[82]如编号实施例[68]-[81]中任一项所述的药物组合物，其中该第一靶标包括脱氧核糖核酸(DNA)分子，并且该第二靶标包括蛋白质。
[83]如编号实施例[68]-[82]中任一项所述的药物组合物，其中该复合物调节该DNA分子的定向转录、该DNA分子的表观遗传重塑、或该DNA分子的降解。
[84]如编号实施例[68]-[83]中任一项所述的药物组合物，其中该第一靶标包括第一蛋白质，并且该第二靶标包括第二蛋白质。
[85]如编号实施例[68]-[84]中任一项所述的药物组合物，其中该复合物调节该第一蛋白质的降解、该第一蛋白质的易位、或信号转导，或者调节天然蛋白质功能、或抑制通过该第一蛋白质与该第二蛋白质之间的直接相互作用形成的复合物的形成。
[86]如编号实施例[68]-[85]中任一项所述的药物组合物，其中该第一靶标包括第一核糖核酸(RNA)分子，并且该第二靶标包括第二RNA分子。
[87]如编号实施例[86]所述的药物组合物，其中该复合物调节该第一RNA分子的降解。
[88]如编号实施例[68]-[87]中任一项所述的药物组合物，其中该第一靶标包括蛋白质，并且该第二靶标包括RNA分子。
[89]如编号实施例[68]-[88]中任一项所述的药物组合物，其中该复合物调节该蛋白质的易位或抑制通过该蛋白质与该RNA分子之间的直接相互作用形成的复合物的形成。
[90]如编号实施例[68]-[89]中任一项所述的药物组合物，其中该第一结合部分包括受体，并且该第二结合部分包括该受体的底物。
[91]如编号实施例[68]-[90]中任一项所述的药物组合物，其中该复合物抑制该受体的激活。
[92]如任一前述编号实施例所述的药物组合物，其中该经修饰的环状多核糖核苷酸包含结合位点，该结合位点被配置为结合靶标的结合部分，其中该结合部分是核糖核酸(RNA)结合基序，其中该经修饰的环状多核糖核苷酸没有翻译能力或有翻译缺陷，并且其中该靶标不是微RNA。
[93]如任一前述编号实施例所述的药物组合物，其中该经修饰的环状多核糖核苷酸包含结合位点，该结合位点被配置为结合靶标的结合部分，其中该结合部分是核糖核酸(RNA)结合基序，其中该经修饰的环状多核糖核苷酸没有翻译能力或有翻译缺陷，并且其中该靶标是微RNA。
[94]如编号实施例[92]或[93]所述的药物组合物，其中该靶标包括DNA分子。
[95]如编号实施例[92]-[94]中任一项所述的药物组合物，其中该结合部分与该经修饰的环状多核糖核苷酸的结合调节DNA分子的转录干扰。
[96]如编号实施例[92]-[95]中任一项所述的药物组合物，其中该靶标包括蛋白质。
[97]如编号实施例[96]所述的药物组合物，其中该结合部分与该经修饰的环状多核糖核苷酸的结合抑制该蛋白质与其他分子的相互作用。
[98]如编号实施例[96]或[97]所述的药物组合物，其中该蛋白质是受体，并且其中该第一结合部分与该经修饰的环状多核糖核苷酸的结合激活该受体。
[99]如编号实施例[96]-[98]中任一项所述的药物组合物，其中该蛋白质是第一酶，其中该经修饰的环状多核糖核苷酸进一步包含第二结合位点，该第二结合位点被配置为结合至第二酶，并且其中该第一酶和该第二酶与该经修饰的环状多核糖核苷酸的结合调节该第一酶和该第二酶的酶活性。
[100]如编号实施例[92]-[99]中任一项所述的药物组合物，其中该靶标包括信使RNA(mRNA)分子。
[101]如编号实施例[100]所述的药物组合物，其中该结合部分与该经修饰的环状多核糖核苷酸的结合调节该mRNA分子的翻译干扰。
[102]如编号实施例[92]-[101]中任一项所述的药物组合物，其中该靶标包括核糖体。
[103]如编号实施例[102]所述的药物组合物，其中该结合部分与该经修饰的环状多核糖核苷酸的结合调节翻译过程的干扰。
[104]如编号实施例[92]-[103]中任一项所述的药物组合物，其中该靶标包括环状RNA分子。
[105]如编号实施例[104]所述的药物组合物，其中该结合部分与该经修饰的环状多核糖核苷酸的结合螯合该环状RNA分子。
[106]如编号实施例[92]-[105]中任一项所述的药物组合物，其中该结合部分与该经修饰的环状多核糖核苷酸的结合螯合微RNA分子。
[107]如前述编号实施例中任一项所述的药物组合物，其中该经修饰的环状多核糖核苷酸包含结合位点，该结合位点被配置为结合细胞膜靶标上的结合部分；并且其中该结合部分是核糖核酸(RNA)结合基序。
[108]如前述编号实施例中任一项所述的药物组合物，其中该经修饰的环状多核糖核苷酸进一步包含第二结合位点，该第二结合位点被配置为结合第二细胞靶标上的第二结合部分，其中该第二结合部分是第二RNA结合基序。
[109]如前述编号实施例中任一项所述的药物组合物，其中该经修饰的环状多核糖核苷酸被配置为结合至两个靶标。
[110]如前述编号实施例中任一项所述的药物组合物，其中该经修饰的环状多核糖核苷酸进一步包含第二结合位点，该第二结合位点被配置为结合第二结合部分，并且其中两个靶标与该环状多核糖核苷酸的结合诱导该第一靶标的构象变化，从而诱导该靶标的下游的信号转导。
[111]如任一项前述编号实施例所述的药物组合物，该药物组合物被配制在载体，例如膜或脂质双层中。
[112]一种将经修饰的环状多核糖核苷酸递送至受试者的方法，该方法包括将前述编号实施例中任一项所述的药物组合物施用至该受试者。
[113]一种在受试者中减少或降低环状多核糖核苷酸的免疫原性的方法，该方法包括：
提供杂交的环状多核糖核苷酸，其中该杂交修饰的环状多核糖核苷酸包含至少一种经修饰的核苷酸和第一部分，该第一部分包含至少约5、10、20、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、或1000个连续的未修饰核苷酸；
将该杂交修饰的环状多核糖核苷酸施用至该受试者；以及
在该受试者的细胞或组织中获得与相应的未修饰的环状多核糖核苷酸相比减少或降低的该杂交修饰的环状多核糖核苷酸的免疫原性。
[114]一种在受试者中表达一个或多个表达序列的方法，该方法包括：
提供包含该一个或多个表达序列的经修饰的环状多核糖核苷酸，其中该杂交修饰的环状多核糖核苷酸包含至少一种经修饰的核苷酸和第一部分，该第一部分包含至少约5、10、20、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、或1000个连续的未修饰核苷酸；
将该杂交修饰的环状多核糖核苷酸施用至该受试者；以及
在该受试者的细胞或组织中获得与完全修饰的环状多核糖核苷酸对应物中的一个或多个表达序列的表达相比增加的该一个或多个表达序列的表达。
[115]一种在受试者中增加环状多核糖核苷酸的稳定性的方法，该方法包括：
提供杂交修饰的环状多核糖核苷酸，其中该杂交修饰的环状多核糖核苷酸包含经修饰的环状多核糖核苷酸和第一部分，该第一部分包含至少约5、10、20、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、或1000个连续的未修饰核苷酸；
将该杂交修饰的环状多核糖核苷酸施用至该受试者；以及
在该受试者的细胞或组织中获得与相应的未修饰的环状多核糖核苷酸相比增加的该杂交修饰的环状多核糖核苷酸的稳定性。
[116]一种治疗方法，该治疗方法包括将如任一前述组合物编号实施例所述的药物组合物施用至患有疾病或病症的受试者。
[117]一种生产药物组合物的方法，该方法包括生成如任一前述组合物编号实施例所述的经修饰的环状多核糖核苷酸。
[118]一种制备如任一前述组合物编号实施例所述的经修饰的环状多核糖核苷酸的方法，该方法包括使具有核酸序列的线性多核糖核苷酸环化为该经修饰的环状多核糖核苷酸。
[119]一种制备杂交修饰的环状多核糖核苷酸的方法，该方法包括将未修饰的第一部分连接至经修饰的线性多核糖核苷酸以产生杂交的线性多核糖核苷酸，并且使该杂交的线性多核糖核苷酸环化。
[120]一种工程化细胞，该工程化细胞包含如任一前述组合物编号实施例所述的组合物。
[121]一种在受试者中减少或降低环状多核糖核苷酸的免疫原性的方法，该方法包括：
提供杂交修饰的环状多核糖核苷酸，其中该杂交修饰的环状多核糖核苷酸包含至少一种经修饰的核苷酸和第一部分，该第一部分包含约5至1000个连续核苷酸，这些连续核苷酸具有不超过5％的经修饰的核苷酸；
将该杂交修饰的环状多核糖核苷酸施用至该受试者；以及
在该受试者的细胞或组织中获得与相应的未修饰的环状多核糖核苷酸相比减少或降低的该杂交修饰的环状多核糖核苷酸的免疫原性。
[122]如编号实施例[121]所述的方法，其中该第一部分包含至少约5、10、20、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、或1000个连续核苷酸。
[123]如编号实施例[121]或[122]所述的方法，其中该第一部分由未修饰的核苷酸组成。
[124]如编号实施例[121]-[123]中任一项所述的方法，其中该第一部分包含至少约5、10、20、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、或1000个连续的未修饰核苷酸。
[125]如编号实施例[121]-[124]中任一项所述的方法，其中该第一部分缺少5’-甲基胞苷或假尿苷。
[126]如编号实施例[121]-[125]中任一项所述的方法，其中该环状多核糖核苷酸具有翻译能力。
[127]如编号实施例[121]-[126]中任一项所述的方法，其中该杂交修饰的环状多核糖核苷酸：
a.具有比相应的未修饰的环状多核糖核苷酸高至少约0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.5、1.6、1.8、2、2.2、2.5、2.8、3倍的表达；
b.具有比相应的未修饰的环状多核糖核苷酸高至少约1.1、1.2、1.3、1.5、1.6、1.8、2、2.2、2.5、2.8、3、3.2、3.3、3.5、3.8、4.0、4.2、4.5、4.8、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、或10.0倍的半衰期；
c.具有比相应的未修饰的环状多核糖核苷酸更高的半衰期；或
d.具有比相应的未修饰的环状多核糖核苷酸低至少约1.1、1.2、1.3、1.5、1.6、1.8、2、2.2、2.5、2.8、3、3.2、3.3、3.5、3.8、4.0、4.2、4.5、4.8、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、或10.0倍的免疫原性，如通过RIG-I、TLR-3、TLR-7、TLR-8、MDA-5、LGP-2、OAS、OASL、PKR、和IFN-β中的至少一种的表达或信号传导或激活评估的。
[128]如编号实施例[121]-[127]中任一项所述的方法，其中该至少一种经修饰的核苷酸选自下组，该组由以下组成：
a.N(6)甲基腺苷(m6A)、5’-甲基胞苷、和假尿苷；
b.2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基(2’-O-MOE)、2’-O-氨基丙基、2’-脱氧、T-脱氧-2’-氟、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)、2’-O-二甲基氨基乙基(2’-O-DMAOE)、2’-O-二甲基氨基丙基(2’-O-DMAP)、T-O-二甲基氨基乙基氧基乙基(2’-O-DMAEOE)、2’-O-N-甲基乙酰胺基(2’-O-NMA)、锁核酸(LNA)、乙烯核酸(ENA)、肽核酸(PNA)、1’,5’-脱水己糖醇核酸(HNA)、吗啉代、甲基膦酸酯核苷酸、硫醇膦酸酯核苷酸、和2’-氟N3-P5’-亚磷酰胺；或
c.表2中的任何经修饰的核苷酸。
[129]如编号实施例[121]-[128]中任一项所述的方法，其中该杂交修饰的环状多核糖核苷酸的至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、或99％核苷酸是经修饰的核苷酸。
[130]如编号实施例[121]-[129]中任一项所述的方法，其中该杂交修饰的环状多核糖核苷酸包含由未修饰的核苷酸组成的结合位点，该结合位点被配置为结合至蛋白质、肽、生物分子、DNA、RNA、或细胞靶标。
[131]如编号实施例[121]-[130]中任一项所述的方法，其中该杂交修饰的环状多核糖核苷酸包含一个或多个表达序列。
[132]如编号实施例[121]-[131]中任一项所述的方法，其中该第一部分包含由未修饰的核苷酸或不超过5％的经修饰的核苷酸组成的IRES。
[133]如编号实施例[131]或[132]所述的方法，其中该杂交修饰的环状多核糖核苷酸的一个或多个表达序列具有：
a.比完全修饰的环状多核糖核苷酸对应物更高的翻译效率；
b.比完全修饰的环状多核糖核苷酸对应物高至少约0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.5、1.6、1.8、2、2.2、2.5、2.8、3倍的翻译效率；
c.比相应的未修饰的环状多核糖核苷酸更高的翻译效率；或
d.比相应的未修饰的环状多核糖核苷酸高至少约0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.5、1.6、1.8、2、2.2、2.5、2.8、3倍的翻译效率。
[134]一种在受试者中表达一个或多个表达序列的方法，该方法包括：
提供包含一个或多个表达序列的杂交修饰的环状多核糖核苷酸，其中该杂交修饰的环状多核糖核苷酸包含至少一种经修饰的核苷酸和第一部分，该第一部分包含约5至1000个连续核苷酸，这些连续核苷酸具有不超过5％的经修饰的核苷酸；
将该杂交修饰的环状多核糖核苷酸施用至该受试者；以及
在该受试者的细胞或组织中获得与完全修饰的环状多核糖核苷酸对应物中相应的一个或多个表达序列的表达相比增加的该一个或多个表达序列的表达。
[135]一种在受试者中增加环状多核糖核苷酸的稳定性的方法，该方法包括：
提供杂交修饰的环状多核糖核苷酸，其中该杂交修饰的环状多核糖核苷酸包含至少一种经修饰的核苷酸和第一部分，该第一部分包含约5至1000个连续核苷酸，这些连续核苷酸具有不超过5％的经修饰的核苷酸；
将该杂交修饰的环状多核糖核苷酸施用至该受试者；以及
在该受试者的细胞或组织中获得与相应的未修饰的环状多核糖核苷酸相比增加的该杂交修饰的环状多核糖核苷酸的稳定性。
[136]如编号实施例[134]或[135]所述的方法，其中该第一部分包含IRES。
[137]如编号实施例[134]-[136]中任一项所述的方法，其中该第一部分包含至少约5、10、20、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、或1000个连续核苷酸。
[138]如编号实施例[134]-[137]中任一项所述的方法，其中该第一部分由未修饰的核苷酸组成。
[139]如编号实施例[134]-[138]中任一项所述的方法，其中该第一部分包含至少约5、10、20、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、或1000个连续的未修饰核苷酸。
[140]如编号实施例[134]-[139]中任一项所述的方法，其中该杂交修饰的环状多核糖核苷酸包含一个或多个表达序列。
[141]如编号实施例[134]-[140]中任一项所述的方法，其中该环状多核糖核苷酸具有翻译能力。
[142]如编号实施例[134]-[141]中任一项所述的方法，其中该至少一种经修饰的核苷酸选自下组，该组由以下组成：
a.N(6)甲基腺苷(m6A)、5’-甲基胞苷、和假尿苷；
b.2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基(2’-O-MOE)、2’-O-氨基丙基、2’-脱氧、T-脱氧-2’-氟、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)、2’-O-二甲基氨基乙基(2’-O-DMAOE)、2’-O-二甲基氨基丙基(2’-O-DMAP)、T-O-二甲基氨基乙基氧基乙基(2’-O-DMAEOE)、2’-O-N-甲基乙酰胺基(2’-O-NMA)、锁核酸(LNA)、乙烯核酸(ENA)、肽核酸(PNA)、1’,5’-脱水己糖醇核酸(HNA)、吗啉代、甲基膦酸酯核苷酸、硫醇膦酸酯核苷酸、和2’-氟N3-P5’-亚磷酰胺；或
c.表2中的任何经修饰的核苷酸。
[143]如编号实施例[134]-[142]中任一项所述的方法，其中该第一部分包含由未修饰的核苷酸或不超过5％的经修饰的核苷酸组成的IRES。
本文引用的所有参考文献和出版物均通过援引并入本文。
可以组合上述实施例以实现前述功能特征。以下实例也说明了这一点，这些实例阐述了示例性的组合和所实现的功能特征。表7提供了示例性概述，该示例性概述示出了上述不同元件可以组合的方式以及观察到的功能特征。
表7.实例中的示例性元件
Figure BDA0003282415270001681
Figure BDA0003282415270001691
实例
提供以下实例以进一步说明本发明的一些实施例，但并非旨在限制本发明的范围；通过其示例性性质将理解，可以替代性地使用本领域技术人员已知的其他程序、方法或技术。将如国际专利公开号WO 2019118919 A1的[0376]-[0392]、[0400]-[0415]、[0433]-[0440]和[0620]-[0633]中所述的实例5、6、9、14、15和50-52及其相应图通过援引以其全文并入本文。
实例1：生成、翻译具有经修饰的核苷酸的环状RNA且环状RNA的免疫原性降低
此实例展示了产生蛋白质产物的经修饰的环状多核糖核苷酸的生成。另外，此实例展示了与线性RNA相比，用核苷酸修饰工程化的环状RNA具有降低的免疫原性。
产生了非天然存在的环状RNA，该环状RNA被工程化以包含一种或多种所期望特性，并且具有全部或部分掺入的经修饰的核苷酸。如以下实例中所示，将全长经修饰的线性RNA或者经修饰的和未修饰的线性RNA的杂交体环化，并且评估纳米萤光素酶(NLuc)的表达。另外，与未修饰的环状RNA相比，经修饰的环状RNA在BJ细胞中显示出降低的免疫相关基因激活(MDA5、OAS和IFN-β表达的q-PCR)。
生成了具有WT EMCV Nluc终止间隔子的环状RNA。对于完全的修饰取代，在体外转录反应期间，分别添加了经修饰的核苷酸假尿苷和甲基胞嘧啶或m6A代替标准的未修饰的核苷酸尿苷和胞嘧啶或腺苷。对于杂交构建体，WT EMCV IRES与NLuc ORF分开合成。使用经修饰的或未修饰的核苷酸合成WT EMCV IRES。相比之下，在体外转录反应期间，分别使用经修饰的核苷酸假尿苷和甲基胞嘧啶或m6A代替标准的未修饰的核苷酸尿苷和胞嘧啶或腺苷合成了NLuc ORF序列。在合成经修饰的或未修饰的IRES和经修饰的ORF之后，使用T4 DNA连接酶将这两个寡核苷酸连接在一起。如图1A中所示，生成了经修饰的环状RNA。
为了测量完全修饰或杂交修饰的构建体中NLuc的表达效率，将0.1pmol线性RNA和环状RNA转染至BJ成纤维细胞中持续6h。在转染后6小时、24小时、48小时和72小时测量nLuc表达。
使用基于酚的提取试剂(英杰公司(Invitrogen))，在细胞中监测从细胞中分离的总RNA中的先天性免疫应答基因的水平。将总RNA(500ng)进行逆转录以生成cDNA。使用基于染料的定量PCR混合物(伯乐公司)进行qRT-PCR分析。
如图1B和1C中所示，翻译了经修饰的环状RNA。如图2A-C中所示，与未修饰的环状RNA转染细胞相比，用环状RNA转染的BJ细胞的免疫相关基因的qRT-PCR水平显示出MDA5、OAS和IFN-β表达的降低。因此，与未修饰的环状RNA转染细胞相比，在用经修饰的环状RNA转染的细胞中受体细胞中免疫原性相关基因的诱导减少。
实例2：具有经修饰的核苷酸的环状RNA降低免疫原性
此实例展示了产生蛋白质产物的经修饰的环状多核糖核苷酸的生成。另外，此实例展示了，与未修饰的RNA相比，使用核苷酸修饰工程化的环状RNA具有降低的免疫原性。
产生了非天然存在的环状RNA，该环状RNA被工程化以包含一种或多种所期望特性，并且具有全部或部分掺入的经修饰的核苷酸。如以下实例中所示，将全长经修饰的线性RNA或者经修饰的和未修饰的线性RNA的杂交体环化，并且评估纳米萤光素酶(NLuc)的表达。另外，与未修饰的环状RNA相比，经修饰的环状RNA在BJ细胞中显示出降低的免疫相关基因激活(MDA5、OAS和IFN-β表达的q-PCR)。
生成了具有WT EMCV NLuc终止间隔子的环状RNA。对于修饰取代，在体外转录反应期间，分别添加了经修饰的核苷酸假尿苷和甲基胞嘧啶或m6A代替标准的未修饰的核苷酸尿苷和胞嘧啶或腺苷。WT EMCV IRES与nLuc ORF分开合成。使用经修饰的(完全修饰的)或未修饰的核苷酸(杂交修饰的)合成WT EMCV IRES。相比之下，在体外转录反应期间，对于整个序列分别使用经修饰的核苷酸假尿苷和甲基胞嘧啶或m6A代替标准的未修饰的核苷酸尿苷和胞嘧啶或腺苷合成了nLuc ORF序列。在合成经修饰的或未修饰的IRES和经修饰的ORF之后，使用T4 DNA连接酶将这两个寡核苷酸连接在一起。如图3中所示，生成杂交修饰的环状RNA。
为了测量表达效率，将杂交修饰的环状RNA转染至细胞中并且测量免疫蛋白的表达。在用未修饰的环状RNA、或经假尿苷和甲基胞嘧啶或m6A修饰杂交修饰的环状RNA转染的BJ细胞中，监测先天性免疫应答基因的表达水平。使用基于酚的提取试剂(英杰公司)从细胞中分离总RNA，并且进行反转录以生成cDNA。使用基于染料的定量PCR混合物(伯乐公司)对免疫相关基因进行qRT-PCR分析。
如图3中所示，与未修饰的环状RNA转染细胞相比，用杂交修饰的环状RNA(即假尿苷和甲基胞嘧啶杂交修饰的环状RNA)转染的BJ细胞的免疫相关基因的qRT-PCR水平显示出降低的RIG-I、MDA5、IFN-β和OAS表达水平，这表明此杂交修饰的环状RNA的降低的激活免疫原性相关基因的免疫原性。与实例26中所示的完全修饰的环状RNA不同，m6A杂交修饰的环状RNA显示出与未修饰的环状RNA转染细胞相似的RIG-I、MDA5、IFN-β和OAS表达水平。因此，与未修饰的环状RNA相比，环状RNA的杂交修饰以及修饰水平对激活免疫原性相关基因有影响。
实例3：生成具有经修饰的核苷酸的环状RNA，并选择性结合蛋白
此实例展示了支持蛋白质结合的经修饰的环状多核糖核苷酸的生成。另外，此实例展示了与未修饰的RNA相比，经工程化具有核苷酸修饰的环状RNA(其与免疫系统监测中涉及的蛋白质选择性相互作用)具有降低的免疫原性。
产生了非天然存在的环状RNA，该环状RNA被工程化以包括全部或部分掺入的经修饰的核苷酸。如以下实例中所示，将全长经修饰的线性RNA或者经修饰的和未修饰的线性RNA的杂交体环化，并且通过测量nLuc表达来评估蛋白质支架。另外，与未修饰的环状RNA相比，选择性修饰的环状RNA与激活BJ细胞中免疫相关基因(MDA5、OAS和IFN-β表达的q-PCR)的蛋白质的相互作用减少。
生成了具有WT EMCV Nluc终止间隔子的环状RNA。对于修饰取代，在体外转录反应期间，分别添加了经修饰的核苷酸假尿苷和甲基胞嘧啶或m6A代替标准的未修饰的核苷酸尿苷和胞嘧啶或腺苷。WT EMCV IRES与nLuc ORF分开合成。使用经修饰的(完全修饰的)或未修饰的核苷酸(杂交修饰的)合成WT EMCV IRES。相比之下，在体外转录反应期间，对于整个序列分别使用经修饰的核苷酸假尿苷和甲基胞嘧啶或m6A代替标准的未修饰的核苷酸尿苷和胞嘧啶或腺苷合成了nLuc ORF序列。在合成经修饰的或未修饰的IRES和经修饰的ORF之后，使用T4 DNA连接酶将这两个寡核苷酸连接在一起。如在图1A中所示，生成了完全修饰的(上构建体)或杂交修饰的(下构建体)环状RNA。
为了测量蛋白质支架效率，测量了来自完全修饰的或杂交修饰的构建体的nLuc表达。将0.1pmol线性RNA和环状RNA转染至BJ成纤维细胞中持续6h之后，在转染后6小时、24小时、48小时和72小时测量nLuc表达。
如图1B和1C中所示，与未修饰的环状RNA相比，如通过蛋白质翻译输出测量的，完全修饰的环状RNA具有大大降低的蛋白质结合能力。相比之下，杂交修饰展示出差不多的或增加的与蛋白质(例如，蛋白质翻译机器)的结合。
为了进一步测量蛋白质支架效率，将完全修饰的环状RNA转染至细胞中，并且测量针对免疫蛋白的蛋白质支架。在用未修饰的环状RNA、或经假尿苷和甲基胞嘧啶或m6A修饰完全修饰的环状RNA转染的BJ细胞中，监测针对激活先天性免疫应答基因的免疫蛋白的蛋白质支架水平。使用基于酚的提取试剂(英杰公司)从细胞中分离总RNA，并且进行反转录以生成cDNA。使用基于染料的定量PCR混合物(伯乐公司)对免疫相关基因进行qRT-PCR分析。
如图1A-C中所示，与未修饰的环状RNA转染细胞相比，用完全修饰的环状RNA(即假尿苷和甲基胞嘧啶两者或m6A完全修饰的环状RNA)转染的BJ细胞的免疫相关基因的qRT-PCR水平显示出降低的MDA5、OAS和IFN-β表达水平，这表明经修饰的环状RNA与激活免疫原性相关基因的免疫蛋白之间减少的蛋白质支架。因此，与未修饰的环状RNA相比，环状RNA的修饰对蛋白质支架有影响。选择性修饰允许结合蛋白质翻译机器，而完全修饰减少了与激活转染受体细胞中免疫原性相关基因的蛋白质的结合。
实例4：与具有经修饰的IRES和在ORF中具有经修饰的核苷酸的circRNA相比，具有 未修饰的IRES但在ORF中具有经修饰的核苷酸的circRNA具有增加的体内翻译
此实例描述了，与在IRES具有修饰的经修饰的circRNA相比，在circRNA中包括经修饰的核苷酸但在IRES中没有修饰增加了体内的circRNA翻译。
为了生成在ORF中具有经修饰的核苷酸的circRNA，分开扩增两种IVT模板。第一节段(序列#1：1-686nt)包括5’间隔子、EMCV IRES和38个核苷酸的GLuc ORF。第二节段(序列#2：687-1203nt)具有GLuc的剩余ORF区和3’间隔子。
经由体外转录由DNA模板将RNA的第一节段生成为具有经修饰的核苷酸或未修饰的核苷酸的线性RNA。将经修饰的第一节段用N1-甲基-假尿苷完全取代。用未修饰的核苷酸生成未修饰的第一节段。
经由体外转录由DNA模板生成第二节段并且将其用N1-甲基-假尿苷完全取代。
用RNA净化试剂盒(新英格兰生物学实验室公司，T2050)单独纯化每个批次的转录RNA，并且对其进行RppH处理(新英格兰生物学实验室公司(NEB)，M0356)。在第二次纯化后，发生以下RNA-RNA连接反应：(1)未修饰的第一节段+第二节段；(2)经修饰的第一节段+第二节段。
如下使用DNA夹板进行这些连接：将2uM的选择的第一节段RNA、2uM的第二节段RNA、2.56uM的夹板DNA(5’-GGCTTGGCCTCGGCCACAGCGATGCAGATC-3’)、50mM NaCl合并。将此混合物在75℃下孵育10min，并且然后缓慢冷却至37℃。将混合物在50mM Tris-HCl、10mMMgCl2、1mM ATP、1mM DTT、0.16U/uL RNA酶抑制剂(普洛麦格公司(Promega)，N2115)和15U/uL T4 DNA连接酶(新英格兰生物学实验室公司，M0202M)存在时进一步孵育以进行连接，持续4小时。用Monarch RNA纯化柱(新英格兰生物学实验室公司，T2050)纯化连接的RNA。通过在尿素-PAGE上分离来监测RNA-RNA连接的效率，并且对其进行图像定量。
对于连接的RNA的环化，用1uM的连接的RNA、2uM的夹板DNA(5’-GTTTTTCGGCTATTCCCAATAGCCGTTTTG-3’)、50mM Tris-HCl、2mM MgCl2和400uM ATP独立地制备每种环化混合物。将此混合物在75℃下加热10min并且在室温下经20min缓慢冷却。在冷却后，添加0.2U/uL的T4 RNA连接酶2(新英格兰生物学实验室公司，M0239)和0.4U/uL的RNA酶抑制剂(普洛麦格公司，N2115)，并且将反应物孵育4小时。通过乙醇沉淀纯化连接的RNA。将环状RNA进行尿素-PAGE纯化，在缓冲液(0.5M乙酸钠，0.1％SDS，1mM EDTA)中洗脱，乙醇沉淀，并且重悬于RNA储存溶液(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific)，AM7000)中。
生成(1)杂交修饰的circRNA：未修饰的第一节段+第二节段；和(2)完全修饰的circRNA：经修饰的第一节段+第二节段。
将RNA与10％TransIT(麦鲁斯生物公司(MirusBio))和5％加强剂(Boost)(麦鲁斯生物公司)一起配制在PBS中。对于每种剂量，注射的总体积是100uL。最终的RNA浓度是0.1pmol/uL(10pmol/小鼠)。经由小鼠尾静脉来静脉内注射每种剂量(100uL)。使用未注射的动物和仅用媒介物(无RNA)注射的动物作为对照。
在给予后6小时、1、2、3、7、14、21、28和35天，收集每只小鼠的尾静脉血液样品(50uL)到EDTA管中。通过在4℃下以1300g离心25min分离血浆，并且按照制造商的说明，使用高斯萤光素酶快速活性测定(赛默科技皮尔斯公司(Thermo Scientific Pierce))测试了高斯萤光素酶(一种分泌酶)的活性。简言之，将50uL 1X GLuc底物注射至96孔透明底板的孔中的5uL血浆中，以进行GLuc萤光素酶活性测定。在混合后立即在发光检测仪器(普洛麦格公司)中读取板。
预期与完全修饰的circ RNA相比并且与对照相比，来自用杂交修饰的circRNA注射的小鼠的血液显示出更高的萤光素酶活性。此实例展示了与完全修饰的circRNA相比并且与对照相比，杂交修饰的circRNA表达更高量的高斯萤光素酶。
此实例展示了与完全修饰的circRNA相比，具有未修饰的IRES但在其他处具有经修饰的核苷酸的circRNA(杂交修饰的circRNA)显示出更高的体内表达。
实例5：与完全未修饰的circRNA相比，具有未修饰的IRES但在ORF中具有经修饰的 核苷酸的circRNA具有增加的体内RNA翻译
此实例展示了在circRNA中包括经修饰的核苷酸增加了体内的circRNA表达。
在此实例中，circRNA被设计为具有编码高斯萤光素酶(GLuc)的ORF、作为翻译元件的EMCV IRES、以及5’和3’间隔子区。
为了生成在ORF中具有经修饰的核苷酸的circRNA，分开扩增两种IVT模板。第一节段(序列#1：1-686nt)包括5’间隔子、EMCV IRES和38个核苷酸的GLuc ORF。第二节段(序列#2：687-1203nt)具有GLuc的剩余ORF区和3’间隔子。经由体外转录由DNA模板将RNA的第一节段生成为具有未修饰的核苷酸的线性RNA。在三种不同的条件下经由体外转录由DNA模板生成第二节段：(1)具有未修饰的核苷酸，(2)用假尿苷和5-甲基-胞苷完全取代，(3)用N1-甲基-假尿苷完全取代。
用RNA净化试剂盒(新英格兰生物学实验室公司，T2050)单独纯化每个批次的转录RNA，并且对其进行RppH处理(新英格兰生物学实验室公司，M0356)。在第二次纯化后，对每个批次的RNA进行RNA-RNA连接。使用DNA夹板退火RNA的第一节段(含有IRES)和RNA的每种形式的第二节段。
如下进行每种反应：将2uM的第一节段RNA、2uM的选择的第二节段RNA、2.56uM的夹板DNA(5’-GGCTTGGCCTCGGCCACAGCGATGCAGATC-3’)、50mM NaCl合并。将此混合物在75℃下孵育10min，并且然后缓慢冷却至37℃。将混合物在50mM Tris-HCl、10mM MgCl2、1mM ATP、1mM DTT、0.16U/uL RNA酶抑制剂(普洛麦格公司，N2115)和15U/uL T4 DNA连接酶(新英格兰生物学实验室公司，M0202M)存在时进一步孵育以进行连接，持续4小时。用Monarch RNA纯化柱(新英格兰生物学实验室公司，T2050)纯化连接的RNA。通过在尿素-PAGE上分离来监测RNA-RNA连接的效率，并且对其进行图像定量。
RNA-RNA连接的物质是：
(1)未修饰的连接的RNA：第一节段+具有未修饰的核苷酸的第二节段
(2)连接的RNA pU/5mC：第一节段+用假尿苷和5-甲基-胞苷完全取代的第二节段
(3)连接的RNA N1mΨ：第一节段+用N1-甲基-假尿苷完全取代的第二节段。
对于连接的RNA的环化，用1uM的连接的RNA、2uM的夹板DNA(5’-GTTTTTCGGCTATTCCCAATAGCCGTTTTG-3’)、50mM Tris-HCl、2mM MgCl2和400uM ATP独立地制备每种环化混合物。将此混合物在75℃下加热10min并且在室温下经20min缓慢冷却。在冷却后，添加0.2U/uL的T4 RNA连接酶2(新英格兰生物学实验室公司，M0239)和0.4U/uL的RNA酶抑制剂(普洛麦格公司，N2115)，并且将反应物孵育4小时。通过乙醇沉淀纯化连接的RNA。将环状RNA进行尿素-PAGE纯化，在缓冲液(0.5M乙酸钠，0.1％SDS，1mM EDTA)中洗脱，乙醇沉淀，并且重悬于RNA储存溶液(赛默飞世尔科技公司，AM7000)中。
另外，从垂林克生物技术公司(Trilink Biotechnologies)购买编码GLuc的mRNA(用假尿苷和5-甲基-C完全取代)。通过体外转录内部生成编码GLuc和人α球蛋白5’和3’UTR的第二mRNA对照，其中用CleanCapTMAG进行共转录加帽。用Monarch RNA纯化柱(新英格兰生物学实验室公司，T2050)纯化内部合成的mRNA，并且如上所述对其进行凝胶洗脱。
将RNA与10％TransIT(麦鲁斯生物公司)和5％加强剂(麦鲁斯生物公司)一起配制在PBS中。对于每种剂量，注射的总体积是100uL。最终的RNA浓度是0.1pmol/uL(10pmol/小鼠)。经由小鼠尾静脉来静脉内注射每种剂量(100uL)。使用未注射的动物和仅用媒介物(无RNA)注射的动物作为对照。在给予后6小时、1、2、3、7、14、21、28和35天，收集每只小鼠的尾静脉血液样品(50uL)到EDTA管中。通过在4℃下以1300g离心25min分离血浆，并且按照制造商的说明，使用高斯萤光素酶快速活性测定(赛默科技皮尔斯公司)测试了高斯萤光素酶(一种分泌酶)的活性。简言之，将50uL 1X GLuc底物注射至96孔透明底板的孔中的5uL血浆中，以进行GLuc萤光素酶活性测定。在混合后立即在发光检测仪器(普洛麦格公司)中读取板。
预期来自用由连接的RNA pU/5mC生成的circRNA和由连接的RNA N1mΨ生成的circRNA注射的小鼠的血液显示出与由未修饰的连接的RNA生成的circRNA相比更高的萤光素酶活性，和与经修饰和未修饰两种的mRNA相比更高的萤光素酶活性。此实例描述了由连接的RNA pU/5mC生成的circRNA和由连接的RNA N1mΨ生成的circRNA与由未修饰的连接的RNA生成的circRNA相比表达更高量的高斯萤光素酶，并且与经修饰和未修饰两种的mRNA相比表达更高的萤光素酶活性。此实例还描述了由连接的RNA pU/5mC生成的circRNA和由连接的RNA N1mΨ生成的circRNA与由未修饰的连接的RNA生成的circRNA相比在增加的时间段内表达高斯萤光素酶，并且与经修饰和未修饰两种的mRNA相比表达更高的萤光素酶活性。
此实例描述了具有未修饰的IRES但在其他处具有经修饰的核苷酸的circRNA与其未修饰的对应物相比显示出更长时间且增加的表达。
此实例描述了与经修饰的mRNA和未修饰的mRNA相比，具有未修饰的IRES但在其他处具有经修饰的核苷酸的circRNA显示出更长时间且增加的表达。
实例6：与相应的未修饰的circRNA相比，具有未修饰的IRES但在ORF中具有经修饰 的核苷酸的circRNA具有增加的体内RNA稳定性
此实例展示了在circRNA中包括经修饰的核苷酸增加了体内的circRNA稳定性。
在此实例中，circRNA被设计为具有编码高斯萤光素酶(GLuc)的ORF、作为翻译元件的EMCV IRES、以及5’和3’间隔子区。
为了生成在ORF中具有经修饰的核苷酸的circRNA，分开扩增两种IVT模板。第一节段(序列#1：1-686nt)包括5’间隔子、EMCV IRES和38个核苷酸的GLuc ORF。第二节段(序列#2：687-1203nt)具有GLuc的剩余ORF区和3’间隔子。经由体外转录由DNA模板将RNA的第一节段生成为具有未修饰的核苷酸的线性RNA。在三种不同的条件下经由体外转录由DNA模板生成第二节段：(1)具有未修饰的核苷酸，(2)用假尿苷和5-甲基-胞苷完全取代，(3)用N1-甲基-假尿苷完全取代。
用RNA净化试剂盒(新英格兰生物学实验室公司，T2050)单独纯化每个批次的转录RNA，并且对其进行RppH处理(新英格兰生物学实验室公司，M0356)。在第二次纯化后，对每个批次的RNA进行RNA-RNA连接。使用DNA夹板退火RNA的第一节段(含有IRES)和RNA的每种形式的第二节段。
如下进行每种反应：将2uM的第一节段RNA、2uM的选择的第二节段RNA、2.56uM的夹板DNA(5’-GGCTTGGCCTCGGCCACAGCGATGCAGATC-3’)、50mM NaCl合并。将此混合物在75℃下孵育10min，并且然后缓慢冷却至37℃。将混合物在50mM Tris-HCl、10mM MgCl2、1mM ATP、1mM DTT、0.16U/uL RNA酶抑制剂(普洛麦格公司，N2115)和15U/uL T4 DNA连接酶(新英格兰生物学实验室公司，M0202M)存在时进一步孵育以进行连接，持续4小时。用Monarch RNA纯化柱(新英格兰生物学实验室公司，T2050)纯化连接的RNA。通过在尿素-PAGE上分离来监测RNA-RNA连接的效率，并且对其进行图像定量。
RNA-RNA连接的物质是：
(1)未修饰的连接的RNA：第一节段+具有未修饰的核苷酸的第二节段
(2)连接的RNA pU/5mC：第一节段+用假尿苷和5-甲基-胞苷完全取代的第二节段
(3)连接的RNA N1mΨ：第一节段+用N1-甲基-假尿苷完全取代的第二节段。
对于连接的RNA的环化，用1uM的连接的RNA、2uM的夹板DNA(5’-GTTTTTCGGCTATTCCCAATAGCCGTTTTG-3’)、50mM Tris-HCl、2mM MgCl2和400uM ATP独立地制备每种环化混合物。将此混合物在75℃下加热10min并且在室温下经20min缓慢冷却。在冷却后，添加0.2U/uL的T4 RNA连接酶2(新英格兰生物学实验室公司，M0239)和0.4U/uL的RNA酶抑制剂(普洛麦格公司，N2115)，并且将反应物孵育4小时。通过乙醇沉淀纯化连接的RNA。将环状RNA进行尿素-PAGE纯化，在缓冲液(0.5M乙酸钠，0.1％SDS，1mM EDTA)中洗脱，乙醇沉淀，并且重悬于RNA储存溶液(赛默飞世尔科技公司，AM7000)中。
另外，从垂林克生物技术公司购买编码GLuc的mRNA(用假尿苷和5-甲基-C完全取代)。通过体外转录内部生成编码GLuc和人α球蛋白5’和3’UTR的第二mRNA对照，其中用CleanCapTMAG进行共转录加帽。用Monarch RNA纯化柱(新英格兰生物学实验室公司，T2050)纯化内部合成的mRNA，并且如上所述对其进行凝胶洗脱。
将RNA与10％TransIT(麦鲁斯生物公司)和5％加强剂(麦鲁斯生物公司)一起配制在PBS中。对于每种剂量，注射的总体积是100uL。最终的RNA浓度是0.1pmol/uL(10pmol/小鼠)。经由小鼠尾静脉来静脉内注射每种剂量(100uL)。使用未注射的动物和仅用媒介物(无RNA)注射的动物作为对照。
在注射后6小时和7天从小鼠收集肝脏和脾脏组织并且将其储存在RNAlater(赛默飞世尔科技公司)中。在Trizol中匀质化组织，并且使用Zymo小量制备plus试剂盒(Zymo研究公司(Zymo Research)，D4068)提取RNA。通过RT-qPCR测量RNA稳定性。使用伯乐公司(Bio-rad)CFX384热循环仪，一式三份使用
Figure BDA0003282415270001811
通用一步RT-qPCR系统(新英格兰生物学实验室公司)，通过qPCR测量GLuc ORF和18S rRNA。使用Pffal方法计算相对值。
预期在注射后7天，来自用由连接的RNA pU/5mC生成的circRNA和由连接的RNAN1mΨ生成的circRNA注射的小鼠的肝脏和脾脏组织显示出与由未修饰的连接的RNA生成的circRNA相比增加的GLuc ORF数量，和与经修饰和未修饰两种的mRNA相比更高的萤光素酶活性。
此实例描述了具有未修饰的IRES但在其他处具有经修饰的核苷酸的circRNA与其未修饰的对应物相比显示出更高的持续性和稳定性。
此实例描述了与经修饰的mRNA和未修饰的mRNA相比，具有未修饰的IRES但在其他处具有经修饰的核苷酸的circRNA显示出更高的持续性和稳定性。
实例7：具有未修饰的IRES但在ORF中具有经修饰的核苷酸的circRNA具有增加的 RNA翻译和增加的体内稳定性
此实例描述了在circRNA中包括经修饰的核苷酸增加了体内的circRNA表达和稳定性。
在此实例中，circRNA被设计为具有编码高斯萤光素酶(GLuc)的ORF、作为翻译元件的Gtx、以及5’和3’间隔子区。
为了将circRNA生成为在ORF中具有经修饰的核苷酸但在IRES中不具有经修饰的核苷酸，IRES被设计为基本上不含尿苷，例如Gtx(序列：CCGGCGGAA)。经由体外转录由DNA模板将RNA生成为(1)具有未修饰的核苷酸、(2)用假尿苷完全取代和(3)用N1-甲基-假尿苷完全取代的线性RNA。
用RNA净化试剂盒(新英格兰生物学实验室公司，T2050)单独纯化每个批次的转录RNA，并且对其进行RppH处理(新英格兰生物学实验室公司(NEB)，M0356)。
对于RNA的环化，用1uM的连接的RNA、2uM的夹板DNA(5’-GTTTTTCGGCTATTCCCAATAGCCGTTTTG-3’)、50mM Tris-HCl、2mM MgCl2和400uM ATP独立地制备每种环化混合物。将此混合物在75℃下加热10min并且在室温下经20min缓慢冷却。在冷却后，添加0.2U/uL的T4 RNA连接酶2(新英格兰生物学实验室公司，M0239)和0.4U/uL的RNA酶抑制剂(普洛麦格公司，N2115)，并且将反应物孵育4小时。通过乙醇沉淀纯化连接的RNA。将CircRNA进行尿素-PAGE纯化，在缓冲液(0.5M乙酸钠，0.1％SDS，1mM EDTA)中洗脱，乙醇沉淀，并且重悬于RNA储存溶液(赛默飞世尔科技公司，AM7000)中。
另外，从垂林克生物技术公司购买编码GLuc的mRNA(用假尿苷或N1-甲基-假尿苷完全取代)。通过体外转录内部生成编码GLuc和人α球蛋白5’和3’UTR的第二mRNA对照，其中用CleanCapTMAG进行共转录加帽。用Monarch RNA纯化柱(新英格兰生物学实验室公司，T2050)纯化内部合成的mRNA，并且如上所述对其进行凝胶洗脱。
将RNA与10％TransIT(麦鲁斯生物公司)和5％加强剂(麦鲁斯生物公司)一起配制在PBS中。对于每种剂量，注射的总体积是100uL。最终的RNA浓度是0.1pmol/uL(10pmol/小鼠)。经由小鼠尾静脉来静脉内注射每种剂量(100uL)。使用未注射的动物和仅用媒介物(无RNA)注射的动物作为对照。
在注射后6小时和7天从小鼠收集肝脏和脾脏组织并且将其储存在RNAlater(赛默飞世尔科技公司)中。在Trizol中匀质化组织，并且使用Zymo小量制备plus试剂盒(Zymo研究公司，D4068)提取RNA。通过RT-qPCR测量RNA稳定性。使用伯乐公司CFX384热循环仪，一式三份使用
Figure BDA0003282415270001831
通用一步RT-qPCR系统(新英格兰生物学实验室公司)，通过qPCR测量GLucORF和18S rRNA。使用Pffal方法计算相对值。
预期在注射后7天，来自用生成为具有pU修饰的circRNA和由N1mΨ修饰生成的circRNA注射的小鼠的肝脏和脾脏组织显示出与由未修饰的RNA生成的circRNA相比增加的GLuc ORF数量，和与经修饰和未修饰两种的mRNA相比更高的萤光素酶活性。
此实例描述了具有未修饰的IRES但在其他处具有经修饰的核苷酸的circRNA与其相应的未修饰circRNA相比显示出更高的持续性和稳定性。
此实例描述了与经修饰的mRNA和未修饰的mRNA相比，具有未修饰的IRES但在其他处具有经修饰的核苷酸的circRNA显示出更高的表达、持续性和稳定性。
实例8：与仅用未修饰的核苷酸生成的环状RNA相比，含有经修饰的核苷酸的环状 RNA具有降低的体内免疫原性
此实例展示了在环状RNA中包括经修饰的核苷酸降低环状RNA的体内免疫原性。
在此实例中，环状RNA包括编码高斯萤光素酶(GLuc)的ORF以及5’和3’人α-球蛋白UTR。
将缺少IRES(没有翻译能力)的环状RNA体外生成为具有完全未修饰的核苷酸或具有尿嘧啶至假尿苷和胞嘧啶至5-甲基-胞苷的取代。为此，从包含以上列出的所有基序以及用于驱动转录的T7 RNA聚合酶启动子的DNA模板体外转录具有完全未修饰的核苷酸或具有经修饰的尿嘧啶和胞嘧啶取代的线性RNA。将转录的RNA用RNA净化试剂盒(新英格兰生物学实验室公司，T2050)纯化，按照制造商的说明用RNA 5’磷酸水解酶(RppH)(新英格兰生物学实验室公司，M0356)处理，并且再次用RNA纯化柱(英格兰生物学实验室公司，T2050)纯化。使用夹板DNA(5’-GACCAGAAGAGTCCCTGCTGCCCACTCAGA-3’)和T4 RNA连接酶2(新英格兰生物学实验室公司，M0239)将RppH处理的线性RNA环化。将环状RNA进行尿素-PAGE纯化，在缓冲液(0.5M乙酸钠，0.1％SDS，1mM EDTA)中洗脱，乙醇沉淀，并且重悬于RNA储存溶液(赛默飞世尔科技公司，AM7000)中。
将RNA与15％TransIT(麦鲁斯生物公司)和7.5％加强剂(麦鲁斯生物公司)一起配制在PBS中。对于每种剂量，注射的总体积是100uL。最终的RNA浓度是0.1pmol/uL(10pmol/小鼠)。经由小鼠尾静脉来静脉内注射每种剂量(100uL)。使用未注射的动物和仅用媒介物(无RNA)注射的动物作为对照。在注射后1和2天收获肝脏和脾脏并且将其储存在RNAlater(赛默飞世尔科技公司)中。
在Trizol中匀质化组织，并且使用Zymo小量制备Plus试剂盒提取RNA。使用伯乐公司CFX384热循环仪，一式三份使用
Figure BDA0003282415270001841
通用一步RT-qPCR系统(新英格兰生物学实验室公司)，通过qPCR测量免疫应答基因(包括RIG-I、MDA5、INFa、IFNB、IFNg、TNFa和IL6)以及管家基因18S rRNA。使用Pffal方法(Pfaffl Nucleic Acids Res[核酸研究]2001)计算相对值。
当使用含有经修饰的核苷酸的环状RNA时，与其不含有经修饰的核苷酸的环状RNA对应物和其经修饰的mRNA对应物相比，小鼠表现出免疫标记物(RIG-I、MDA5、INFa、IFNb、INFg、TNFa和IL6)的显著更低的表达(图49)。
此实例展示了当注射至动物中时，与仅含有未修饰的核苷酸的环状RNA相比，含有经修饰的核苷酸的环状RNA诱导更低的免疫原性。
实例9：含有经修饰的核苷酸的环状RNA与其完全未修饰的环状RNA对应物和经修 饰的mRNA相比具有增加的体内稳定性
此实例展示了在环状RNA中包括经修饰的核苷酸增加环状RNA的体内稳定性。
在此实例中，环状RNA包括编码高斯萤光素酶(GLuc)的ORF以及5’和3’人α-球蛋白UTR。
将缺少IRES(没有翻译能力)的环状RNA体外生成为具有完全未修饰的核苷酸或具有尿嘧啶至假尿苷和胞嘧啶至5-甲基-胞苷的取代。为此，从包含以上列出的所有基序以及用于驱动转录的T7 RNA聚合酶启动子的DNA模板体外转录具有完全未修饰的核苷酸或具有经修饰的尿嘧啶和胞嘧啶取代的线性RNA。将转录的RNA用RNA净化试剂盒(新英格兰生物学实验室公司，T2050)纯化，按照制造商的说明用RNA 5’磷酸水解酶(RppH)(新英格兰生物学实验室公司，M0356)处理，并且再次用RNA纯化柱(英格兰生物学实验室公司，T2050)纯化。使用夹板DNA(5’-GACCAGAAGAGTCCCTGCTGCCCACTCAGA-3’)和T4 RNA连接酶2(新英格兰生物学实验室公司，M0239)将RppH处理的线性RNA环化。将环状RNA进行尿素-PAGE纯化，在缓冲液(0.5M乙酸钠，0.1％SDS，1mM EDTA)中洗脱，乙醇沉淀，并且重悬于RNA储存溶液(赛默飞世尔科技公司，AM7000)中。
作为对照，将线性RNA生成为用假尿苷和5-甲基-胞苷完全取代、用帽类似物加帽，并且如上所述进行尿素-PAGE纯化。
将RNA与15％TransIT(麦鲁斯生物公司)和7.5％加强剂(麦鲁斯生物公司)一起配制在PBS中。对于每种剂量，注射的总体积是100uL。最终的RNA浓度是0.1pmol/uL(10pmol/小鼠)。经由小鼠尾静脉来静脉内注射每种剂量(100uL)。使用未注射的动物和仅用媒介物(无RNA)注射的动物作为对照。在注射后1、2、7和14天收获肝脏和脾脏并且将其储存在RNAlater(赛默飞世尔科技公司)中。
在Trizol中匀质化组织，并且使用Zymo小量制备Plus试剂盒提取RNA。使用伯乐公司CFX384热循环仪，一式三份通过RT-qPCR
Figure BDA0003282415270001861
通用一步RT-qPCR系统(新英格兰生物学实验室公司)检测环状RNA和线性RNA。作为对照，测量18S rRNA。使用Pffal方法(PfafflNucleic Acids Res[核酸研究]2001)计算相对值。
在此实例中，含有经修饰的核苷酸的环状RNA在肝脏和脾脏中存在的时间段长于不含有经修饰的核苷酸(仅未修饰的核苷酸)的环状RNA；并且在肝脏和脾脏中存在的时间段长于经修饰的mRNA(图50)。
此实例展示了与用未修饰的核苷酸生成的环状RNA相比和与经修饰的mRNA相比，用经修饰的核苷酸生成的环状RNA在注射后14天更稳定。
实例10：体外环状RNA产生
此实例展示了环状RNA的体外产生。
环状RNA被设计为具有图4中所示的起始密码子(SEQ ID NO:1)、一个或多个ORF(SEQ ID NO:2)、一个或多个交错元件(SEQ ID NO:3)、一个或多个加密原(SEQ ID NO:4)、和IRES(SEQ ID NO:5)。环化使得能够滚环翻译多个开放阅读框(ORF)，该多个开放阅读框具有用于离散ORF表达和受控的蛋白质化学计量的交替性交错元件、用于减弱或减轻RNA免疫原性的一个或多个加密原、以及靶向RNA用于核糖体进入的任选IRES，而没有聚A序列。
在此实例中，如下生成环状RNA。使用T7 RNA聚合酶，通过体外转录由具有5’-和3’-ZKSCAN1内含子和编码连接至2A序列的GFP的ORF的DNA区段合成未修饰的线性RNA。将转录的RNA用RNA纯化系统(凯杰公司(QIAGEN))纯化，按照制造商的说明用碱性磷酸酶(赛默飞世尔科技公司，EF0652)处理，并且再次用RNA纯化系统纯化。
通过使用T4 DNA连接酶(新英格兰生物公司(New England Bio,Inc.)，M0202M)处理转录的线性RNA和DNA夹板来生成夹板连接环状RNA，并且在用RNA酶R处理富集后分离出环状RNA。RNA质量通过琼脂糖凝胶或自动电泳(安捷伦公司(Agilent))进行评估。
实例11：体内环状RNA产生，细胞培养
此实例展示了环状RNA的体内产生。
将GFP(SEQ ID NO:2)克隆至表达载体，例如pcDNA3.1(+)(阿德基因公司(Addgene))(SEQ ID NO:6)中。将此载体诱变以诱导细胞中的环状RNA产生(SEQ ID NO:6且如Kramer等人2015所述)，如图5中所示。
将HeLa细胞在37℃和5％CO2下，在补充有青霉素-链霉素和10％胎牛血清、含高葡萄糖的杜尔贝科氏改良伊格培养基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)(DMEM)(生命技术公司(Life Technologies))中生长。使用脂质转染试剂(生命技术公司)转染一微克上述表达质粒，并且根据制造商的说明，在转染后的1小时与20天之间，使用基于酚的RNA分离试剂(生命技术公司)从转染的细胞中分离总RNA。
为了测量GFP环状RNA和mRNA水平，使用随机六聚体进行qPCR逆转录。简而言之，对于RT-qPCR，将来自同一来源的Hela细胞的总RNA和RNA酶R消化的RNA用作RT-PCR的模板。为了制备GFP mRNA和环状GFP RNA的cDNA，根据制造商的说明，使用逆转录酶(Super-ScriptII:RNA酶H；英杰公司)和随机六聚体进行逆转录反应。使用6％PAGE分析扩增的PCR产物，并且通过溴化乙锭染色可视化。为了估算富集因子，通过光密度法(ImageQuant；分子动力学公司(Molecular Dynamics))定量PCR产物，并且通过UV吸光度测量总RNA样品的浓度。
用RNA印迹分析进行另外的RNA测量。简言之，使用基于酚的试剂(TRIzol)获得全细胞提取物，或者使用商业试剂盒(CelLytic核提取试剂盒，西格玛公司(Sigma))对细胞进行分级分离来获得核蛋白提取物和细胞质蛋白提取物。为了抑制RNA聚合酶II转录，在37℃下用夫拉平度(flavopiridol)(终浓度1mM；西格玛公司)处理细胞0-6h。对于RNA酶R处理，将10mg的总RNA用20U的RNA酶R(奕必城公司(Epicentre))在37℃下处理1h。
使用寡核苷酸探针的RNA印迹如下进行。使用标准引物设计工具设计寡核苷酸探针、PCR引物。将T7启动子序列添加至反向引物以获得体外转录反应中的反义探针。根据制造商的说明，使用T7 RNA聚合酶与DIG-RNA标记混合物进行体外转录。通过DNA I消化去除DNA模板，并且通过酚氯仿提取和随后的沉淀纯化RNA探针。探针以50ng/ml使用。使用乙二醛上样染料(安拜昂公司(Ambion))使总RNA(2μg-10μg)变性，并且在MOPS缓冲液中的1.2％琼脂糖凝胶上解析。将凝胶在1×TBE中浸泡20min，并且使用半干印迹系统(伯乐公司)将其转移至Hybond-N+膜(通用电气医疗集团(GE Healthcare))上持续1h(15V)。将膜干燥，并且在120,000μJ cm-2下进行1次UV交联(在265nm)。在68℃下进行预杂交1h，并且将DIG标记的体外转录的RNA探针杂交过夜。将膜在2×SSC、0.1％SDS中在68℃下洗涤三次持续30min，随后在0.2×SSC、0.1％SDS中在68℃下洗涤三次(30min)。用与碱性磷酸酶抗体直接缀合的抗DIG进行免疫检测。使用化学发光碱性磷酸酶底物(CDP star试剂)和图像检测和定量系统(LAS-4000检测系统)可视化免疫反应条带。
实例12：环状RNA的制备和体外翻译
此实例展示了环状RNA的基因表达和基因产物的检测。
在此实例中，环状RNA被设计为具有起始密码子(SEQ ID NO:1)、GFP ORF(SEQ IDNO:2)、一个或多个交错元件(SEQ ID NO:3)、一个或多个人源加密原(SEQ ID NO:4)且具有或不具有IRES(SEQ ID NO:5)，参见图6。在此实例中，在体外或细胞中生成环状RNA，如实例10和11中所述。
将环状RNA在兔网织红细胞裂解物(普洛麦格公司，美国威斯康星州菲奇堡(Fitchburg,WI,USA))中在30℃下孵育5h或过夜。反应混合物的最终组成包含70％兔网织红细胞裂解物、10μM甲硫氨酸和亮氨酸、20μM除甲硫氨酸和亮氨酸以外的氨基酸和0.8U/μLRNA酶抑制剂(东洋纺公司(Toyobo)，日本大阪(Osaka,Japan))。从混合物中取出等分试样，并且在10％-20％梯度聚丙烯酰胺/十二烷基硫酸钠(SDS)凝胶(安进公司(Atto)，日本东京(Tokyo,Japan))上分离。去除上清液，并且将沉淀物在70℃下溶解于2×SDS样品缓冲液(0.125M Tris-HCl，pH 6.8，4％SDS，30％甘油，5％2-巯基乙醇，0.01％溴酚蓝)中持续15min。在此过程中去除血红蛋白，而浓缩除血红蛋白以外的蛋白质。
以1,400×g离心5min后，在10％-20％梯度聚丙烯酰胺/SDS凝胶上分析上清液。使用可商购获得的标准品(伯乐公司)作为大小标记物。使用半干法电转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(默克密理博公司(Millipore))之后，使用化学发光试剂盒(安诺伦公司(Rockland))可视化印迹。
预期GFP蛋白在细胞裂解物中可视化，并且由于滚环翻译，在环状RNA中检测到比线性RNA中更高的数量。
实例13：环状RNA的化学计量蛋白质表达
此实例展示了环状RNA化学计量表达蛋白质的能力。
在此实例中，一种环状RNA被设计为包含加密原(SEQ ID NO:4)和编码GFP的ORF(SEQ ID NO:2)和编码RFP的ORF(SEQ ID NO:8)，具有侧接GFP和RFP ORF的交错元件(SEQID NO:3)，参见图7。类似地设计另一种环状RNA，然而它将在GFP与RFP ORF之间具有终止和起始密码子，而不是侧接2A序列。在体外或细胞中生成环状RNA，如实例10和11中所述。
将环状RNA在兔网织红细胞裂解物(普洛麦格公司，美国威斯康星州菲奇堡)中在30℃下孵育5h或过夜。反应混合物的最终组成包含70％兔网织红细胞裂解物、10μM甲硫氨酸和亮氨酸、20μM除甲硫氨酸和亮氨酸以外的氨基酸和0.8U/μL RNA酶抑制剂(东洋纺公司，日本大阪)。从混合物中取出等分试样，并且在10％-20％梯度聚丙烯酰胺/十二烷基硫酸钠(SDS)凝胶(安进公司，日本东京)上分离。去除上清液，并且将沉淀物在70℃下溶解于2×SDS样品缓冲液(0.125M Tris-HCl，pH6.8，4％SDS，30％甘油，5％2-巯基乙醇，0.01％溴酚蓝)中持续15 min。在此过程中去除血红蛋白，而浓缩除血红蛋白以外的蛋白质。
以1,400×g离心5min后，在10％-20％梯度聚丙烯酰胺/SDS凝胶上分析上清液。使用可商购获得的标准品(伯乐公司)作为大小标记物。使用半干法电转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(默克密理博公司)之后，使用化学发光试剂盒(安诺伦公司)可视化印迹。
预期GFP和RFP ORF未被终止密码子和起始密码子隔开的环状RNA将具有相等量的每种蛋白质，而使用在ORF之间包括起始密码子和终止密码子的环状RNA处理的细胞将具有不同量的每种蛋白质。
实例14：体内表达
此实例展示了环状RNA体内表达蛋白质的能力。
对于此实例，环状RNA被设计为包含一个或多个加密原(SEQ ID NO:4)和编码GFP(SEQ ID NO:2)或RFP(SEQ ID NO:8)或萤光素酶(SEQ ID NO:10)的ORF，具有侧接GFP、RFP或萤光素酶ORF的交错元件(SEQ ID NO:3)，参见图8。在体外或细胞中生成环状RNA，如实例10和11中所述。
经由皮内(ID)、肌肉内(IM)、口服(PO)、腹膜内(IP)或静脉内(IV)施用使6-8周龄的雄性BALB/c小鼠接受300mg/kg(6mg)如本文所述具有GFP、RFP或萤光素酶ORF的环状RNA(50uL体积)、或作为对照的线性RNA。使动物接受单次剂量或三次注射(第1天、第3天、第5天)。
从未给予的对照小鼠以及给予后2、4、8、24、48、72、96、120、168和264小时收集血液、心脏、肺、脾、肾、肝和皮肤注射位点(n＝4只小鼠/时间点)。在研究终止时从颈静脉穿刺收集血样。
使用分支DNA(bDNA)定量(潘诺米克公司(Panomics)/昂飞公司(Affymetrix))对血清和组织进行环状RNA定量。使用每个板上已知量RNA(添加至未处理的组织样品)的标准曲线来定量已处理组织中的RNA。将以皮克(pg)为单位的计算量相对于施加至板上的裂解物中的称重组织量归一化。如先前实例中所述，通过FACS或蛋白质印迹评价每个组织中的蛋白质表达(RFP或GFP)。
在给予后6、24、48、72和96小时，向独立组的已给予萤光素酶环状RNA的小鼠注射3mg萤光素，并且在体内成像系统(IVIS光谱，珀金埃尔默公司(PerkinElmer))上对动物成像。在给予后6小时，处死并解剖三只动物，并且对肌肉、皮肤、引流淋巴结、肝脏和脾脏离体成像。
预期小鼠在已处理的组织中表达GFP、RFP或萤光素酶。
实例15：环状RNA包含至少一个双链RNA区段
此实例展示了环状RNA包含至少一个双链RNA区段。
在此实例中，通过先前所述方法之一合成环状RNA，以包含GFP ORF和IRES，参见图9。将利用J2和K1单克隆抗体的斑点印迹测定来测量长度为至少40bp的双链RNA结构。将环状RNA(200ng)印迹到尼龙膜(超负荷Nytran)上，干燥，用在TBS-T缓冲液(50mM Tris-HCl，150mM NaCl，0.05％Tween-20，pH 7.4)中的5％脱脂干乳粉封闭，并且与dsRNA特异性mAbJ2或K1(英语和科学咨询公司(English&Scientific Consulting))一起孵育60min。将膜用TBS-T洗涤六次，然后用HRP缀合驴抗小鼠Ig(杰克森免疫公司(Jackson Immunology))处理，然后洗涤六次，并且使用增强的化学发光蛋白质印迹检测试剂(安玛西亚公司(Amersham))可视化斑点。
预期环状RNA产生内部准双链RNA区段。
实例16：环状RNA包含准双链结构
此实例展示了环状RNA包含准双链结构。
在此实例中，通过先前所述方法之一合成环状RNA，其中添加或不添加HDVmin表达(Griffin等人,2014)。此RNA序列形成准螺旋结构，参见图10，并且用作阳性对照(如Griffin等人2014所示)。
为了测试环状RNA结构是否包含功能性准双链结构，我们将使用通过引物延伸(SHAPE)分析的选择性2’OH酰化确定二级结构。SHAPE以单核苷酸分辨率评估RNA中的局部主链柔性。碱基位置对SHAPE亲电试剂的反应性与二级结构有关：碱基配对的位置反应性较弱，而未配对的位置反应性较高。
SHAPE是在环状RNA、HDVmin和包含线性RNA上进行的。分别基本上如Wilkinson等人2006和Griffin 2014等人所报道的，用N-甲基靛红酸酐(NMIA)或苯甲酰氰(BzCN)进行SHAPE。简而言之，对于使用BzCN的SHAPE，将1ul的在二甲基亚砜(DMSO)中的800mM BzCN添加至含有在160mM Tris(pH 8.0)中的3至6pmol RNA、1U/l RNA酶抑制剂(例如SuperaseInRNA酶抑制剂)的20ul反应混合物中，并且在37℃下孵育1min。对照反应混合物包含不含BzCN的1ul DMSO。与BzCN一起孵育后，使用酚氯仿提取RNA，并且按照制造商的说明进行纯化(例如，使用RNA Clean&Concentrator-5试剂盒)，并且重悬于6ul 10mM Tris(pH 8.0)中。使用单染料系统检测BzCN加合物。使用标记有6-羧基荧光素(6-FAM)的引物退火RNA。根据制造商的建议，使用逆转录酶(SuperScript III-英杰公司)进行引物延伸，其中对孵育条件进行以下修改：在42℃下5min、在55℃下30min、在65℃下25min和在75℃下15min。在引物延伸反应中使用0.5mM ddATP或0.5mM ddCTP生成两个测序阶梯。将引物延伸产物用乙醇沉淀，洗涤以去除多余的盐，并且连同市售大小标准品(例如Liz大小标准品金唯智公司(Genewiz)片段分析服务)通过毛细管电泳解析。
使用原片段分析工具(例如PeakScanner应用生物系统公司(Applied Bio-systems))分析原始电泳图。然后对电泳图中每个位置的峰进行积分。对于所分析的每种RNA，进行y轴缩放以校正上样错误，以便将每个引物延伸反应的背景相对于对未用BzCN处理的RNA进行的阴性对照反应的背景归一化。将信号衰减校正应用于每个反应的数据。将峰与由两个测序反应产生的阶梯对齐。在每个位置，从BzCN处理的样品的峰面积中减去阴性对照的峰面积；然后，通过以下方式来将这些值转换为归一化的SHAPE反应性：用减去的峰面积除以减去的峰面积最高2％至10％的平均值。
除SHAPE分析之外，我们还将进行NMR(Marchanka等人2015)；羟基自由基探测(Ding等人2012)；或DMS和CMTC以及凯托沙(Kethoxal)的组合(Tijerina等人2007和Ziehler等人2001)。
预期环状RNA将具有准双链结构。
实例17：环状RNA包含功能性准螺旋结构
此实例展示了环状RNA包含功能性准螺旋结构。
在此实例中，通过先前所述方法之一合成环状RNA，其中添加395L的表达(Defenbaugh等人2009)。此RNA序列形成准螺旋结构(如上所示，通过RNA二级结构折叠算法mfold和Defenbaugh等人2009)(图11)。此结构对于与丁型肝炎抗原(HDAg)形成复合物至关重要。
因此，为了测试环状RNA结构是否包含功能性准结构，我们将环状RNA和线性RNA与HDAg-160或HDAg-195一起孵育，并且使用EMSA测定分析结合。在包含10mM Tris-HCl(pH7.0)、25mM KCl、10mM NaCl、0.1g/l牛血清白蛋白(新英格兰生物学实验室公司)、5％甘油、0.5mM DTT、0.2U/l RNA酶抑制剂(应用生物系统公司)和1mM苯基甲基磺酰氟溶液的25ul中进行结合反应。将环状RNA与浓度范围为从0-110nM的HDAg蛋白(如通过Defenbaugh等人2009所述获得)一起孵育。将反应混合物在冰上组合，在37℃下孵育1h，并且在240V下在0.5Tris-硼酸酯-EDTA中的6％天然聚丙烯酰胺凝胶上电泳2.5h。使用核酸染色(例如gelred)测定游离和结合RNA的水平。结合将计算为相对于整个泳道强度减去背景的未结合RNA强度。
预期环状RNA将具有功能性准螺旋结构。
实例18：自转录/复制
在此实例中，通过先前所述方法之一合成环状RNA，其中添加一个或多个HDV复制结构域的表达(如通过Beeharry等人2014所述)、有反基因组复制能力的核酶和核定位信号。这些RNA序列使环状RNA位于其中宿主RNA聚合酶将结合并转录RNA的核中。然后，使用核酶使此RNA自裂解。然后将RNA连接并再次自复制，参见图12。
使用上述技术将环状RNA(1-5微克)转染至HeLa细胞中。将HeLa细胞在37℃和5％CO2下，在补充有青霉素-链霉素和10％胎牛血清、含高葡萄糖的杜尔贝科氏改良伊格培养基(DMEM)(生命技术公司)中生长。在转染后，将HeLa细胞再培养4-72小时，然后在转染后1小时至20天，按照制造商的说明，使用基于酚的RNA分离试剂(生命技术公司)从转染细胞中分离总RNA，并且将使用如本文所述的qPCR确定编码HDV结构域的环状RNA的总量并与对照环状RNA进行比较。
实例19：环状RNA环化
此实例展示了使用夹板连接体外产生环状RNA。
可以将非天然存在的环状RNA工程化以包含一种或多种所期望的特性，并且可以使用重组DNA技术来产生。如以下实例中所示，夹板连接环化线性RNA。
CircRNA1被设计为编码没有终止密码子的三联FLAG标签化EGF(264nt)。它在用于翻译起始的起始密码子处具有科扎克序列(SEQ ID NO:11)。CirRNA2具有与环状RNA1相同的序列，除了它具有终止元件(三联终止密码子)(273nt，SEQ ID NO:12)。环状RNA3被设计为编码如下的三联FLAG标签化EGF，其侧接交错元件(2A序列，SEQ ID NO:13)、无终止元件(终止密码子)(330nt)。CircRNA4具有与环状RNA3相同的序列，除了它具有终止元件(三联终止密码子)(339nt)。
在此实例中，如下生成环状RNA。从gBlocks基因片段中扩增出用于体外转录的DNA模板，该基因片段具有有着带有T7启动子的正向引物的相应序列(IDT)和有着反向引物的2-O-甲基化核苷酸。用DNA凝胶纯化试剂盒(凯杰公司)对扩增的DNA模板进行凝胶纯化。将250-500ng经纯化的DNA模板进行体外转录。在7.5mM GMP、1.5mM GTP、7.5mM UTP、7.5mMCTP和7.5mM ATP存在时，使用T7 RNA聚合酶从具有相应序列的每个DNA模板生成线性5’-单磷酸化的体外转录物。每个反应中生成约40μg线性RNA。孵育后，将每个反应用DNA酶处理以去除DNA模板。在2.5M乙酸铵存在时，用乙醇沉淀体外转录的RNA，以去除未掺入的单体。
使用T4 RNA连接酶2，在作为模板的20nt夹板DNA寡聚体(SEQ ID NO:14)上环化转录的线性RNA。夹板DNA被设计为使线性RNA的每个5’或3’端退火10nt。用夹板DNA(3μM)退火之后，将1μM线性RNA与0.5U/μl T4 RNA连接酶2在37C下孵育4小时。将无T4 RNA连接酶2的混合物用作阴性对照。
通过在6％变性PAGE上分离RNA来监测线性RNA的环化。在变性聚丙烯酰胺凝胶上，较慢迁移的RNA条带(由于其环状结构)对应于环状RNA，而不是线性RNA。如图13中可见，向RNA混合物中添加连接酶(+泳道)生成新的条带，这些条带出现在存在于缺少连接酶(-泳道)的混合物中的线性RNA条带之上。在所有RNA混合物中均出现较慢迁移的条带，这表明与阴性对照相比，多种构建体成功发生了夹板连接(例如，环化)。
实例20：RNA环化效率
此实例展示了RNA夹板连接的环化效率。
经工程化以包含一种或多种所期望特性的非天然存在环状RNA可以使用夹板介导的环化产生。如以下实例中所示，夹板连接环化的线性RNA的效率高于对照。
也在此处使用如实例9中所述的CircRNA1、CircRNA2、CircRNA3、和CircRNA4。CircRNA5被设计为编码如下的FLAG标签化EGF，其侧接2A序列且后接FLAG标签化纳米萤光素酶(873nt，SEQ ID NO:17)。CircRNA6具有与环状RNA5相同的序列，除了它在EGF与纳米萤光素酶基因之间包括终止元件(三联终止密码子)和在纳米萤光素酶序列端部包括终止元件(三联终止密码子)(762nt，SEQ ID NO:18)。
在此实例中，为了测量RNA的环化效率，如实例9中所述生成6种不同大小的线性RNA(264nt、273nt、330nt、339nt、873nt和762nt)并环化。通过6％变性PAGE解析环状RNA，并且切除凝胶上线性RNA或环状RNA的相应RNA条带用于纯化。压碎切除的RNA凝胶条带，并且用800μl 300mM NaCl过夜洗脱RNA。通过离心过滤器去除凝胶碎片，并且在0.3M乙酸钠存在时用乙醇沉淀RNA。
如下计算环化效率。将洗脱的环状RNA的量除以总洗脱RNA量(环状+线性RNA)，并且结果如图14中的图所描绘。
使用T4 RNA酶连接酶2连接线性RNA产生环状RNA的效率高于对照。趋势数据表明，较大的构建体以较高的速率环化，例如，具有约800nt的线性RNA显示出具有约80％的环化效率，而具有约200-400nt的线性RNA显示出具有在50％至80％范围内的环化效率。
实例21：缺少降解易感性的环状RNA
此实例展示了与线性RNA相比，环状RNA对RNA酶R降解的易感性。
由于缺少5’和3’端，环状RNA比线性RNA对核酸外切酶降解更具抗性。如以下实例中所示，环状RNA比其线性RNA对应物更不易降解。
如实例11中所述生成CircRNA5并环化以用于本文所述的测定中。
为了测试CircRNA5的环化，将20ng/μl线性或CircRNA5与2U/μl RNA酶R(一种消化线性RNA但不消化套索或环状RNA结构的3’至5’外切核糖核酸酶)一起在37℃下孵育30min。孵育后，通过6％变性PAGE分析反应混合物。
CircRNA5泳道中不存在缺少核酸外切酶的泳道中存在的线性RNA条带(参见图15)，这表明CircRNA5与线性RNA对照相比显示出对核酸外切酶处理的更高抗性。
实例22：环状RNA的分离和纯化
此实例展示了环状RNA的纯化。
在某些实施例中，如先前实例中所述，环状RNA可以在表达编码的蛋白质产物之前被分离和纯化。此实例描述了使用UREA凝胶分离进行的分离。如以下实例所示，分离并纯化环状RNA。
如本文所述分离如实例11中所述的CircRNA1、CircRNA2、CircRNA3、CircRNA4、CircRNA5、和CircRNA6。
在此实例中，如所述生成线性和环状RNA。为了纯化环状RNA，在6％变性PAGE上解析连接混合物，并且切除对应于环状RNA中的每一种的RNA条带。压碎切除的RNA凝胶片段，并且用800μl 300mM NaCl过夜洗脱RNA。通过离心过滤器去除凝胶碎片，并且在0.3M乙酸钠存在时用乙醇沉淀RNA。通过6％变性PAGE分析洗脱的环状RNA，参见图16。
通过PAGE可视化具有可变大小的环状RNA的单条条带。
实例23：蛋白质表达的检测
此实例展示了环状RNA的体外蛋白质表达。
蛋白质表达是由mRNA生成特定蛋白质的过程。此过程包括将DNA转录成信使RNA(mRNA)，随后将mRNA翻译成多肽链，这些多肽链最终被折叠成功能性蛋白，并且可以靶向至特定的亚细胞或细胞外位置。
如以下实例中所示，由环状RNA序列体外表达蛋白质。
环状RNA被设计为编码如下的三联FLAG标签化EGF，其侧接2A序列、无终止元件(终止密码子)(330nt，SEQ ID NO:19)。
将线性RNA或环状RNA在25μl体积中的兔网织红细胞裂解物中在30℃下孵育5小时。反应混合物的最终组成含有70％兔网织红细胞裂解物、20μM氨基酸、0.8U/μl RNA酶抑制剂和1μg线性RNA或环状RNA。孵育后，通过向反应混合物(16μl)中添加乙酸(0.32μl)和水(300μl)并且在15℃下以20,817xg离心10min来去除血红蛋白。去除上清液，并且将沉淀物溶解于30°l的2x SDS样品缓冲液中，并且在70℃下孵育15min。以1400x g离心5min后，在10％-20％梯度聚丙烯酰胺/SDS凝胶上分析上清液。
使用干转移法电转移到硝酸纤维素膜上后，将印迹与抗FLAG抗体和抗小鼠IgG过氧化物酶一起孵育。用ECL试剂盒可视化印迹(参见图17)并且通过ImageJ测量蛋白质印迹条带强度。
检测到荧光表明存在表达产物。因此，显示了环状RNA驱动蛋白质的表达。
实例24：非IRES依赖性表达
此实例展示了在不存在IRES时环状RNA驱动表达。
IRES或内部核糖体进入位点是允许以非帽依赖性方式进行翻译起始的RNA元件。显示了在不存在IRES时环状RNA驱动Flag蛋白的表达。
环状RNA被设计为编码如下的三联FLAG标签化EGF，其侧接2A序列、无终止元件(终止密码子)(330nt，SEQ ID NO:19)。
将线性RNA或环状RNA在25μl体积中的兔网织红细胞裂解物中在30℃下孵育5小时。反应混合物的最终组成包含70％兔网织红细胞裂解物、20μM氨基酸、0.8U/μl RNA酶抑制剂和1μg线性RNA或环状RNA。孵育后，通过向反应混合物(16μl)中添加乙酸(0.32μl)和水(300μl)并且在15℃下以20,817xg离心10min来去除血红蛋白。去除上清液，并且将沉淀物溶解于30°l的2x SDS样品缓冲液中，并且在70℃下孵育15min。以1400xg离心5min后，在10％-20％梯度聚丙烯酰胺/SDS凝胶上分析上清液。
使用干转移法电转移到硝酸纤维素膜上后，将印迹与抗FLAG抗体和抗小鼠IgG过氧化物酶一起孵育。用增强化学发光(ECL)试剂盒可视化印迹(参见图18)并且通过ImageJ测量蛋白质印迹条带强度。
即使在不存在IRES时，在环状RNA反应混合物中也检测到表达产物。
实例25：非帽依赖性表达
此实例展示了在不存在帽时环状RNA能够驱动表达。
帽是mRNA的5’端上经过特别改变的核苷酸。5’帽对于线性mRNA的稳定性和翻译起始很有用。环状RNA在不存在帽时驱动产物的表达。
环状RNA被设计为编码如下的三联FLAG标签化EGF，其侧接2A序列、无终止元件(终止密码子)(330nt，SEQ ID NO:19)。
将线性RNA或环状RNA在25μl体积中的兔网织红细胞裂解物中在30℃下孵育5小时。反应混合物的最终组成包含70％兔网织红细胞裂解物、20μM氨基酸、0.8U/μl RNA酶抑制剂和1μg线性RNA或环状RNA。孵育后，通过向反应混合物(16μl)中添加乙酸(0.32μl)和水(300μl)并且在15℃下以20,817xg离心10min来去除血红蛋白。去除上清液，并且将沉淀物在70℃下溶解于30μl 2x SDS样品缓冲液中15min。以1400x g离心5min后，在10％-20％梯度聚丙烯酰胺/SDS凝胶上分析上清液。
使用干转移法电转移到硝酸纤维素膜上后，将印迹与抗FLAG抗体和抗小鼠IgG过氧化物酶一起孵育。用ECL试剂盒可视化印迹(参见图17)并且通过ImageJ测量蛋白质印迹条带强度。
即使在不存在帽时，在环状RNA反应混合物中也检测到表达产物。
实例26：无5’-UTR的表达
此实例展示了缺少5’非翻译区的环状RNA的体外蛋白质表达。
5′非翻译区(5′UTR)是起始密码子直接上游的区域，该区域有助于RNA转录物的下游蛋白质翻译。
如以下实例中所示，环状RNA序列中的5’-非翻译区对于体外蛋白质表达不是必需的。
环状RNA被设计为编码如下的三联FLAG标签化EGF，其侧接2A序列、无终止元件(终止密码子)(330nt，SEQ ID NO:19)。
将线性RNA或环状RNA在25μl体积中的兔网织红细胞裂解物中在30℃下孵育5小时。反应混合物的最终组成包含70％兔网织红细胞裂解物、20μM氨基酸、0.8U/μl RNA酶抑制剂和1μg线性RNA或环状RNA。孵育后，通过向反应混合物(16μl)中添加乙酸(0.32μl)和水(300μl)并且在15℃下以20,817xg离心10min来去除血红蛋白。去除上清液，并且将沉淀物溶解于30°l的2x SDS样品缓冲液中，并且在70℃下孵育15min。以1400xg离心5min后，在10％-20％梯度聚丙烯酰胺/SDS凝胶上分析上清液。
使用干转移法电转移到硝酸纤维素膜上后，将印迹与抗FLAG抗体和抗小鼠IgG过氧化物酶一起孵育。用ECL试剂盒可视化印迹(参见图17)并且通过ImageJ测量蛋白质印迹条带强度。
即使在不存在5’UTR时，在环状RNA反应混合物中也检测到表达产物。
实例27：无3’-UTR的表达
此实例展示了缺少3’-UTR的环状RNA的体外蛋白质表达。
3’非翻译区(3'-UTR)是翻译终止密码子直接下游的区域，并且包括可在转录后影响基因表达的调控区。3'-非翻译区还可以通过影响mRNA的定位、稳定性、输出和翻译效率在基因表达中发挥作用。另外，3'-UTR的结构特征及其替代性聚腺苷酸化的用途可以在基因表达中起作用。
如以下实例中所示，环状RNA序列中的3’-UTR对于体外蛋白质表达不是必需的。
环状RNA被设计为编码如下的三联FLAG标签化EGF，其侧接2A序列、无终止元件(终止密码子)(330nt，SEQ ID NO:19)。
将线性RNA或环状RNA在25μl体积中的兔网织红细胞裂解物中在30℃下孵育5小时。反应混合物的最终组成包含70％兔网织红细胞裂解物、20μM氨基酸、0.8U/μl RNA酶抑制剂和1μg线性RNA或环状RNA。孵育后，通过向反应混合物(16μl)中添加乙酸(0.32μl)和水(300μl)并且在15℃下以20,817xg离心10min来去除血红蛋白。去除上清液，并且将沉淀物溶解于30°l的2x SDS样品缓冲液中，并且在70℃下孵育15min。以1400xg离心5min后，在10％-20％梯度聚丙烯酰胺/SDS凝胶上分析上清液。
使用干转移法电转移到硝酸纤维素膜上后，将印迹与抗FLAG抗体和抗小鼠IgG过氧化物酶一起孵育。用ECL试剂盒可视化印迹(参见图17)并且通过ImageJ测量蛋白质印迹条带强度。
即使在不存在3’UTR时，在环状RNA反应混合物中也检测到表达产物。
实例28：无终止密码子的表达
此实例展示了缺少终止密码子的环状RNA在滚环翻译后多肽产物的生成。
蛋白质基于多肽，这些多肽由独特的氨基酸序列构成。每个氨基酸均由称为密码子的核苷酸三联体在mRNA中编码。蛋白质翻译期间，mRNA中的每个密码子都对应于正在增长的多肽链中氨基酸的添加。终止元件或终止密码子通过结合释放因子来指示此过程的终止，该终止导致核糖体亚基解离，释放氨基酸链。
如以下实例中所示，缺少终止密码子的环状RNA经由滚环翻译生成了由重复的多肽序列构成的大型多肽产物。
环状RNA被设计为编码无终止元件(终止密码子)的三联FLAG标签化EGF(264nt，SEQ ID NO:20)，并且在起始密码子处包括科扎克序列以促进翻译起始。
将线性RNA或环状RNA在25μl体积中的兔网织红细胞裂解物中在30℃下孵育5小时。反应混合物的最终组成包含70％兔网织红细胞裂解物、20μM氨基酸、0.8U/μl RNA酶抑制剂和1μg线性RNA或环状RNA。孵育后，通过向反应混合物(16μl)中添加乙酸(0.32μl)和水(300μl)并且在15℃下以20,817xg离心10min来去除血红蛋白。去除上清液，并且将沉淀物溶解于30°l的2x SDS样品缓冲液中，并且在70℃下孵育15min。以1400xg离心5min后，在10％-20％梯度聚丙烯酰胺/SDS凝胶上分析上清液。
使用干转移法电转移到硝酸纤维素膜上后，将印迹与抗FLAG抗体和抗小鼠IgG过氧化物酶一起孵育。用ECL试剂盒可视化印迹(参见图18)并且通过ImageJ测量蛋白质印迹条带强度。
即使在不存在终止密码子时，在环状RNA反应混合物中也检测到表达产物。
实例29：无终止元件(终止密码子)的离散蛋白质表达
此实例展示了从缺少终止元件(终止密码子)的环状RNA翻译的离散蛋白质产物的生成。
交错元件(诸如2A肽)可以包括约20aa的短氨基酸序列，该短氨基酸序列允许单一mRNA产生等摩尔水平的多个基因。交错元件可以通过使核糖体跳过2A元件C末端的肽键合成来起作用，导致2A序列端部与下一个下游肽之间的隔开。隔开发生在C末端上发现的甘氨酸与脯氨酸残基之间，并且上游的顺反子在端部添加了一些额外的残基，而下游的顺反子则以脯氨酸开始。
如以下实例中所示，缺少终止元件(终止密码子)的环状RNA生成大型多肽聚合物(图19左图：无交错-环状RNA泳道)，并且在编码区的3’端包含2A序列导致产生的离散蛋白质的大小与当量线性RNA构建体生成的大小相当(图19右图：交错-环状RNA泳道)。
环状RNA被设计为编码如下的三联FLAG标签化EGF，其无终止元件(终止密码子)(264nt，SEQ ID NO:20)并且无交错元件。第二环状RNA被设计为编码如下的三联FLAG标签化EGF，其侧接2A序列、无终止元件(终止密码子)(330nt，SEQ ID NO:19)。
将线性RNA或环状RNA在25μl体积中的兔网织红细胞裂解物中在30℃下孵育5小时。反应混合物的最终组成包含70％兔网织红细胞裂解物、20μM氨基酸、0.8U/μlRNA酶抑制剂和1μg线性RNA或环状RNA。孵育后，通过向反应混合物(16μl)中添加乙酸(0.32μl)和水(300μl)并且在15℃下以20,817xg离心10min来去除血红蛋白。去除上清液，并且将沉淀物溶解于30°l的2x SDS样品缓冲液中，并且在70℃下孵育15min。以1400xg离心5min后，在10％-20％梯度聚丙烯酰胺/SDS凝胶上分析上清液。
使用干转移法电转移到硝酸纤维素膜上后，将印迹与抗FLAG抗体和抗小鼠IgG过氧化物酶一起孵育。用ECL试剂盒可视化印迹(参见图19)并且通过ImageJ测量蛋白质印迹条带强度。
检测到离散的表达产物，这表明即使在不存在终止元件(终止密码子)时，包含交错元件的环状RNA也驱动了单独蛋白质的表达。
实例30：滚环翻译
此实例展示了使用交错元件提高环状RNA的体外蛋白质生物合成。
将非天然存在的环状RNA工程化以包含交错元件，以将蛋白质表达与缺少交错元件的环状RNA进行比较。如以下实例中所示，与缺少交错元件的其他相同环状RNA相比，这种序列过表达了蛋白质。
环状RNA被设计为编码具有终止元件(例如，串联的三个终止密码子)的三联FLAG标签化EGF(273nt，SEQ ID NO:21)。第二环状RNA被设计为编码如下的三联FLAG标签化EGF，其侧接2A序列、无终止元件(终止密码子)(330nt，SEQ ID NO:19)。
将线性RNA或环状RNA在25μl体积中的兔网织红细胞裂解物中在30℃下孵育5小时。反应混合物的最终组成含有70％兔网织红细胞裂解物、20μM氨基酸、0.8U/μl RNA酶抑制剂和1μg线性RNA或环状RNA。孵育后，通过向反应混合物(16μl)中添加乙酸(0.32μl)和水(300μl)并且在15℃下以20,817xg离心10min来去除血红蛋白。去除上清液，并且将沉淀物溶解于30°l的2x SDS样品缓冲液中，并且在70℃下孵育15min。以1400xg离心5min后，在10％-20％梯度聚丙烯酰胺/SDS凝胶上分析上清液。
使用干转移法电转移到硝酸纤维素膜上后，将印迹与抗FLAG抗体和抗小鼠IgG过氧化物酶一起孵育。用ECL试剂盒可视化印迹(参见图20)并且通过ImageJ测量蛋白质印迹条带强度。
检测到离散的表达产物，这表明即使在不存在终止元件(终止密码子)时，包含交错元件的环状RNA也驱动了单独蛋白质的表达。
实例31：生物活性蛋白质的体外表达
此实例展示了由环状RNA体外生物合成生物活性蛋白质。
将非天然存在的环状RNA工程化，以表达具有生物活性的治疗性蛋白质。如以下实例中所示，由网织红细胞裂解物中的环状RNA表达了生物活性蛋白质。
环状RNA被设计为编码如下的FLAG标签化EGF，其侧接2A序列且后接FLAG标签化纳米萤光素酶(873nt，SEQ ID NO:17)。
将线性RNA或环状RNA在25μl体积中的兔网织红细胞裂解物中在30℃下孵育5小时。反应混合物的最终组成含有70％兔网织红细胞裂解物、20μM氨基酸、0.8U/μl RNA酶抑制剂。根据制造商的方案(普洛麦格公司)，使用萤光素酶测定系统监测翻译混合物中的萤光素酶活性。
如图21中所示，在环状RNA和线性RNA情况下检测到的荧光均远高于对照媒介物RNA，这表明存在表达产物。因此，显示了环状RNA表达生物活性蛋白质。
实例32：具有比线性RNA对应物更长半衰期的环状RNA
此实例展示了工程化以与线性RNA相比具有更长的半衰期的环状RNA。
编码治疗性蛋白质的环状RNA为受体细胞提供了产生更高水平的编码蛋白质的能力，这起源于例如与线性RNA相比延长的生物学半衰期。如以下实例中所示，环状RNA在网织红细胞裂解物中具有长于其线性RNA对应物的半衰期。
环状RNA被设计为编码如下的FLAG标签化EGF，其侧接2A序列且后接FLAG标签化纳米萤光素酶(873nt，SEQ ID NO:17)。
在此实例中，进行了时程实验以监测RNA的稳定性。将100ng线性RNA或环状RNA与兔网织红细胞裂解物一起孵育，并且在1小时、5小时、18小时和30小时收集样品。使用基于酚的试剂(英杰公司)从裂解物中分离总RNA，并且通过逆转录生成cDNA。使用基于染料的定量PCR反应混合物(伯乐公司)进行qRT-PCR分析。
如图22中所示，在较晚的时间点检测到的环状RNA浓度高于线性RNA。因此，环状RNA与其线性对应物相比更稳定或具有增加的半衰期。
实例33：环状RNA在细胞中展示了比线性RNA更长的半衰期
此实例展示了环状RNA被递送至细胞中并且在细胞中具有与线性RNA相比增加的半衰期。
将非天然存在的环状RNA工程化，以表达具有生物活性的治疗性蛋白质。如以下实例中所示，环状RNA与其线性RNA对应物相比以更高的水平存在，这展示环状RNA的半衰期更长。
在此实例中，环状RNA和线性RNA被设计为编码科扎克EGF，其侧接2A、终止序列或无终止序列(SEQ ID NO:11、19、20、21)。为了监测RNA在细胞中的半衰期，将0.1x 106个细胞铺板至12孔板的每个孔中。1天后，使用基于脂质的转染试剂(英杰公司)将1μg线性RNA或环状RNA转染至每个孔中。转染后二十四小时，使用基于酚的提取试剂(英杰公司)从细胞中分离总RNA。将总RNA(500ng)进行逆转录以生成cDNA。使用基于染料的定量PCR混合物(伯乐公司)进行qRT-PCR分析。引物序列如下：用于线性RNA或环状RNA的引物，F：ACGACGGTGTGTGCATGTAT，R：TTCCCACCACTTCAGGTCTC；用于环状RNA的引物，F：TACGCCTGCAACTGTGTTGT，R：TCGATGATCTTGTCGTCGTC。
环状RNA及其线性对应物成功转染至293T细胞中。24小时后，使用qPCR测量剩余的环状RNA和线性RNA。如图23A和B中所示，显示了环状RNA在细胞中具有与线性RNA相比更长的半衰期。
实例34：在细胞中翻译了合成环状RNA，并且经由滚环翻译翻译了合成环状RNA
此实例展示了在细胞中合成环状RNA的翻译。
如以下实例中所示，环状RNA和线性RNA被设计为编码无终止元件的科扎克3xFLAG-EGF序列(SEQ ID NO:11)。环状RNA被翻译成聚合物EGF，而线性RNA没有，这展示细胞对合成环状RNA进行了滚环翻译。
在此实例中，将0.1x106个细胞铺板至12孔板的每个孔中以监测细胞中线性RNA或环状RNA的翻译效率。1天后，使用基于脂质的转染试剂(英杰公司)将1μg线性RNA或环状RNA转染至每个孔中。转染后二十四小时，通过向每个孔中添加200μl RIPA缓冲液来收获细胞。接下来，在10％-20％梯度聚丙烯酰胺/SDS凝胶上分析10μg细胞裂解物蛋白质。使用干转移法电转移到硝酸纤维素膜上后，将印迹与抗FLAG抗体和抗小鼠IgG过氧化物酶一起孵育。作为上样对照，使用了抗β微管蛋白抗体。用增强的化学发光(ECL)试剂盒可视化印迹。通过ImageJ测量蛋白质印迹条带强度。
环状RNA及其线性对应物成功转染至293T细胞中。然而，图24显示转染后24小时，在环状RNA转染细胞中检测到EGF蛋白质，而在线性RNA转染细胞中未检测到。因此，与线性RNA相比，环状RNA经由滚环翻译在细胞中翻译。
实例35：合成环状RNA在细胞中展示出降低的免疫原性基因表达
此实例展示了工程化以与线性RNA相比具有降低的免疫原性的环状RNA。
编码治疗性蛋白质的环状RNA在受体细胞中提供与线性RNA相比减少的免疫原性相关基因(RIG-I、MDA5、PKA和IFN-β)诱导。RIG-I可以识别短的5’三磷酸酯无帽双链或单链RNA，而MDA5可以识别更长的dsRNA。RIG-I和MDA5均可参与激活MAVS并且触发抗病毒应答。PKR可以被dsRNA激活，并且被干扰素(诸如IFN-β)诱导。如以下实例中所示，如通过q-PCR通过RIG-I、MDA5、PKR和IFN-β的表达评估的，显示了环状RNA在293T细胞中具有与类似线性RNA相比减少的免疫相关基因激活。
环状RNA和线性RNA被设计为编码(1)科扎克3xFLAG-EGF序列，无终止元件(SEQ IDNO:11)；(2)科扎克3xFLAG-EGF，其侧接终止元件(终止密码子)(SEQ ID NO:21)；(3)科扎克3xFLAG-EGF，其侧接2A序列(SEQ ID NO:19)；或(4) 科扎克3xFLAG-EGF序列，其侧接2A序列、后接终止元件(终止密码子)(SEQ ID NO:20)。
在此实例中，通过将0.1x 106个细胞铺板至12孔板的每个孔中来监测细胞中先天性免疫应答基因的水平。1天后，使用基于脂质的转染试剂(英杰公司)将1μg线性RNA或环状RNA转染至每个孔中。转染后二十四小时，使用基于酚的提取试剂(英杰公司)从细胞中分离总RNA。将总RNA(500ng)进行逆转录以生成cDNA。使用基于染料的定量PCR混合物(伯乐公司)进行qRT-PCR分析。
使用的引物序列：用于GAPDH的引物，F：AGGGCTGCTTTTAACTCTGGT，R：CCCCACTTGATTTTGGAGGGA；RIG-I，F：TGTGGGCAATGTCATCAAAA， R：GAAGCACTTGCTACCTCTTGC；MDA5，F：GGCACCATGGGAAGTGATT，R：ATTTGGTAAGGCCTGAGCTG；PKR，F：TCGCTGGTATCACTCGTCTG，R：GATTCTGAAGACCGCCAGAG；IFN-β，F：CTCTCCTGTTGTGCTTCTCC，R：GTCAAAGTTCATCCTGTCCTTG。
如图25中所示，与线性RNA转染细胞相比，用环状RNA转染的293T细胞的免疫相关基因的qRT-PCR水平显示出RIG-I、MDA5、PKR和IFN-β的降低。因此，与线性RNA转染细胞相比，在环状RNA转染的细胞中受体细胞中免疫原性相关基因的诱导减少。
实例36：在细胞中合成环状RNA经由滚环翻译的表达增加
此实例展示了在细胞中合成环状RNA经由滚环翻译的表达增加。
环状RNA被设计为包含随有纳米萤光素酶基因或EGF阴性对照基因的IRES，无终止元件(终止密码子)。用以下转染细胞：EGF阴性对照(SEQ ID NO:22)；nLUC终止(SEQ ID NO:23)：EMCV IRES、交错序列(2A序列)、3x FLAG标签化nLUC序列、交错序列(2A序列)、和终止密码子；或nLUC交错(SEQ ID NO:24)：EMCV IRES、交错序列(2A序列)、3x FLAG标签化nLUC序列、和交错序列(2A序列)。如图26中所示，两种环状RNA均产生具有功能性萤光素酶活性的翻译产物。
在此实例中，在细胞中监测环状RNA的翻译。具体而言，将0.1x106个细胞铺板至12孔板的每个孔中。1天后，使用基于脂质的转染试剂(英杰公司)将300ng环状RNA转染至每个孔中。24小时后，通过添加100μl RIPA缓冲液收获细胞。根据制造商的方案(普洛麦格公司)，使用萤光素酶测定系统测量裂解物中的纳米萤光素酶活性。
如图26中所示，两种环状RNA均在细胞中表达蛋白质。然而，具有交错元件(例如，2A序列)、缺少终止元件(终止密码子)的环状RNA比具有终止元件(终止密码子)的环状RNA产生了更高水平的具有功能性萤光素酶活性的蛋白质产物。
实例37：在细胞中翻译的合成环状RNA
此实例展示了在细胞中的合成环状RNA翻译。另外，此实例显示，环状RNA比其线性对应物产生更多的表达产物。
环状RNA及其线性对应物成功转染至293T细胞中。用以下转染细胞：作为阴性对照的编码EGF的环状RNA(SEQ ID NO:22)：EMCV IRES、交错序列(2A序列)、3x FLAG标签化EGF序列、交错序列(2A序列)；线性或环状nLUC(SEQ ID NO:23)：EMCV IRES、交错序列(2A序列)、3x FLAG标签化nLuc序列、交错序列(2A序列)、和终止密码子。如图27中所示，环状RNA在细胞中被翻译成纳米萤光素酶。
在细胞中监测线性RNA或环状RNA翻译。具体而言，将0.1x106个细胞铺板至12孔板的每个孔中。1天后，使用基于脂质的转染试剂(英杰公司)将300ng线性RNA或环状RNA转染至每个孔中。24小时后，通过添加100μlRIPA缓冲液收获细胞。根据制造商的方案(普洛麦格公司)，使用萤光素酶测定系统测量裂解物中的纳米萤光素酶活性。
如图27中所示，在细胞中检测到环状RNA翻译产物。特别地，环状RNA与其线性RNA对应物相比具有更高水平的萤光素酶活性或增加的产生蛋白质。
实例38：在细胞中合成环状RNA的滚环翻译产生功能性蛋白质产物
此实例展示了在细胞中由缺少终止元件(终止密码子)，例如具有缺少终止元件(终止密码子)的交错元件的合成环状RNA滚环翻译功能性蛋白质产物。另外，此实例显示，具有交错元件的环状RNA比其线性对应物表达更多的功能性蛋白质产物。
环状RNA及其线性对应物成功转染至293T细胞中。用以下转染细胞：环状RNA EGF阴性对照(SEQ ID NO:22)；线性和环状nLUC(SEQ ID NO:24)：EMCV IRES、交错序列(2A序列)、3x FLAG标签化nLuc序列、交错序列(2A序列)。如图28中所示，环状RNA在细胞中被翻译成纳米萤光素酶。
在细胞中监测线性RNA或环状RNA翻译。具体而言，将0.1x106个细胞铺板至12孔板的每个孔中。1天后，使用基于脂质的转染试剂(英杰公司)将300ng线性RNA或环状RNA转染至每个孔中。24小时后，通过添加100μl RIPA缓冲液收获细胞。根据制造商的方案(普洛麦格公司)，使用萤光素酶测定系统测量裂解物中的纳米萤光素酶活性。
如图28中所示，在细胞中检测到环状RNA翻译产物。特别地，无终止元件(终止密码子)的环状RNA比其线性RNA对应物产生更高水平的具有功能性萤光素酶活性的蛋白质产物。
实例39：在细胞中经由IRES起始翻译的合成环状RNA
此实例展示了在细胞中用IRES的合成环状RNA翻译起始。
环状RNA被设计为包含随有纳米萤光素酶基因或EGF阴性对照基因的科扎克序列或IRES。用以下转染细胞：EGF阴性对照(SEQ ID NO:22)；nLUC科扎克(SEQ ID NO:25)：科扎克序列、1x FLAG标签化EGF序列、交错序列(T2A序列)、1x FLAG标签化nLUC、交错序列(P2A序列)和终止密码子；或nLUC IRES(SEQ ID NO:23)：EMCV IRES、交错序列(2A序列)、3xFLAG标签化nLUC序列、交错序列(2A序列)和终止密码子。如图29中所示，与具有科扎克序列的环状RNA相比，具有IRES的环状RNA展示了较高水平的萤光素酶活性，这对应于较高的蛋白质水平。
在此实例中，在细胞中监测环状RNA的翻译。具体而言，将0.1x106个细胞铺板至12孔板的每个孔中。1天后，使用基于脂质的转染试剂(英杰公司)将300ng环状RNA转染至每个孔中。24小时后，通过添加100μl RIPA缓冲液收获细胞。根据制造商的方案(普洛麦格公司)，使用萤光素酶测定系统测量裂解物中的纳米萤光素酶活性。
如图29中所示，与具有科扎克起始蛋白质表达的环状RNA相比，环状RNA用IRES起始了蛋白质表达并且产生了更高水平的具有功能性萤光素酶活性的蛋白质产物。
实例40：在细胞中合成环状RNA的滚环翻译
此实例展示了在细胞中合成环状RNA经由滚环翻译的更高蛋白质产生，该合成环状RNA用IRES起始蛋白质产生。
环状RNA被设计为包含随有纳米萤光素酶基因或EGF阴性对照的科扎克序列或IRES，具有或无终止元件(终止密码子)。用以下转染细胞：EGF阴性对照(SEQ ID NO:22)；nLUC IRES终止(SEQ ID NO:23)：EMCV IRES、交错序列(2A序列)、3x FLAG标签化nLUC序列、交错序列(2A序列)和终止密码子；或nLUC IRES交错(SEQ ID NO:24)：EMCV IRES、交错序列(2A序列)、3x FLAG标签化nLUC序列、和交错序列(2A序列)。如图30中所示，两种环状RNA产生的表达产物都展示了滚环翻译，并且与具有终止元件、无IRES(例如，具有科扎克序列)的环状RNA相比，无终止元件、具有IRES(例如，无科扎克序列)的环状RNA起始并产生了更高水平的具有功能性萤光素酶活性的蛋白质产物，这展示了滚环翻译。
在此实例中，在细胞中监测环状RNA的翻译。具体而言，将0.1x106个细胞铺板至12孔板的每个孔中。1天后，使用基于脂质的转染试剂(英杰公司)将300ng环状RNA转染至每个孔中。24小时后，通过添加100μl RIPA缓冲液收获细胞。根据制造商的方案(普洛麦格公司)，使用萤光素酶测定系统测量裂解物中的纳米萤光素酶活性。
如图30中所示，经由从两种环状RNA得出的滚环方法在细胞中将环状RNA翻译成蛋白质。但是，环状RNA缺少终止元件(终止密码子)。然而，与具有终止元件科扎克翻译起始的环状RNA相比，环状RNA的滚环翻译使用IRES起始了更高的蛋白质产生，并且产生了更多的具有功能性萤光素酶活性的蛋白质产物。
实例41：由环状RNA表达的蛋白质增加
此实例展示了在细胞中的合成环状RNA翻译。另外，此实例显示，环状RNA比其线性对应物产生更多具有正确分子量的表达产物。
线性RNA和环状RNA被设计为包含具有终止元件(终止密码子)的纳米萤光素酶基因。用以下转染细胞：媒介物：仅转染试剂；线性nLUC(SEQ ID NO:23)：EMCV IRES、交错元件(2A序列)、3x FLAG标签化nLuc序列、交错元件(2A序列)、和终止元件(终止密码子)；或环状nLUC(SEQ ID NO:23)：EMCV IRES、交错元件(2A序列)、3x FLAG标签化nLuc序列、交错元件(2A序列)、和终止元件(终止密码子)。如图31中所示，与线性RNA相比，环状RNA产生更高水平的具有正确分子量的蛋白质。
24小时后，通过添加100μl RIPA缓冲液收获细胞。以1400xg离心5min后，在10％-20％梯度聚丙烯酰胺/SDS凝胶上分析上清液。
使用干转移法电转移到硝酸纤维素膜上后，将印迹与抗FLAG抗体和抗小鼠IgG过氧化物酶一起孵育。用ECL试剂盒可视化印迹并且通过ImageJ测量蛋白质印迹条带强度。
如图31中所示，环状RNA在细胞中被翻译成蛋白质。特别地，环状RNA与其线性RNA对应物相比产生更高水平的具有正确分子量的蛋白质。
实例42：在细胞中合成环状RNA的滚环翻译产生离散蛋白质产物
此实例展示了在细胞中由缺少终止元件(终止密码子)，例如具有交错元件代替终止元件(终止密码子)的合成环状RNA经由滚环翻译翻译了离散蛋白质产物。另外，此实例显示，具有交错元件的环状RNA比其线性对应物表达更多具有正确分子量的蛋白质产物。
环状RNA被设计为包含具有交错元件代替终止元件(终止密码子)的纳米萤光素酶基因。用以下转染细胞：媒介物：仅转染试剂；线性nLUC(SEQ ID NO:24)：EMCV IRES、交错元件(2A序列)、3x FLAG标签化nLuc序列、和交错元件(2A序列)；或环状nLUC(SEQ ID NO:24)：EMCV IRES、交错元件(2A序列)、3x FLAG标签化nLuc序列、和交错元件(2A序列)。如图32中所示，与线性RNA相比，环状RNA产生更高水平的具有正确分子量的蛋白质。
24小时后，通过添加100μl RIPA缓冲液收获细胞。以1400xg离心5min后，在10％-20％梯度聚丙烯酰胺/SDS凝胶上分析上清液。
使用干转移法电转移到硝酸纤维素膜上后，将印迹与抗FLAG抗体和抗小鼠IgG过氧化物酶一起孵育。用ECL试剂盒可视化印迹并且通过ImageJ测量蛋白质印迹条带强度。
如图32中所示，在细胞中检测到环状RNA翻译产物。特别地，无终止元件(终止密码子)的环状RNA比其线性RNA对应物产生更高水平的具有正确分子量的离散蛋白质产物。
实例43：具有准双链螺旋结构的环状RNA的制备
此实例展示了具有准双链和螺旋两种结构的环状RNA。
将非天然存在的环状RNA工程化为采用准双链螺旋结构。显示了相似的结构参与天然存在的环状RNA的缩合，该环状RNA具有独特的长体内半衰期(Griffin等人2014,JVirol.[病毒学杂志]2014年7月；88(13):7402-11.doi:10.1128/JVI.00443-14；Guedj等人,Hepatology[肝脏学].2014年12月；60(6):1902-10.doi:10.1002/hep.27357)。
在此实例中，环状RNA被设计为编码EMCV IRES、作为ORF的用3XFLAG标签化的Nluc和交错序列(EMCV 2A 3XFLAG Nluc 2A无终止)。为了评价RNA二级结构，使用了热力学RNA结构预测工具(RNAfold)(Vienna RNA)。另外，使用RNA建模算法分析RNA三级结构。
如图33和34中所示，将环状RNA建模为采用准双链螺旋结构。
实例44：具有与重复序列连接的准螺旋结构的环状RNA的制备
此实例展示了可以将环状RNA设计为具有与重复序列连接的准螺旋结构。
将非天然存在的环状RNA工程化以采用与重复序列连接的准螺旋结构。显示了相似的结构参与天然存在的环状RNA的缩合，该环状RNA具有独特的长体内半衰期(Griffin等人2014，Guedj等人2014)。
在此实例中，环状RNA被设计为编码EMCV IRES、Nluc和包括重复序列(SEQ ID NO:26)的间隔子。为了评价RNA三级结构，使用了RNA建模算法。
如图35中所示，将环状RNA建模为采用准螺旋结构。
实例45：环化RNA是环状的而非连环化的
此实例展示了通过RNA酶H的环状RNA降解产生与环状RNA(而非连环化RNA)一致的核酸降解产物。
当与连接酶一起孵育时，RNA不能反应或形成分子内或分子间键，分别生成环状(无游离端)或连环化RNA。使用互补DNA引物和RNA酶H(一种识别DNA/RNA双链体的非特异性核酸内切酶)处理每种类型的RNA，预期会根据起始RNA物质产生独特数量的具有特定大小的降解产物。
如以下实例中所示，基于RNA酶H降解产生的RNA的数量和大小，显示了连接的RNA是环状的而非连环化的。
生成了含有EMCV T2A 3XFLAG-Nluc P2A的环状RNA和线性RNA。
为了测试RNA(1299nt)的环化状态，将0.05pmol/μl线性RNA或环状RNA与0.25U/μlRNA酶H(消化DNA/RNA双链体的内切核糖核酸酶)和0.3pmol/μl针对1037-1046nt RNA(CACCGCTCAGGACAATCCTT，SEQ ID NO:55)的寡聚体在37℃下孵育20min。孵育后，通过6％变性PAGE分析反应混合物。
对于上述使用的线性RNA，预期在DNA引物结合并随后被RNA酶H裂解后，获得1041nt和258nt的两种裂解产物。预期连环体产生258nt、1041nt和1299nt的三种裂解产物。预期环状产生单一1299nt裂解产物。
与RNA酶核酸内切酶一起孵育的线性RNA泳道中的条带数量产生了预期的两条1041nt和258nt条带，而在环状RNA泳道中产生了1299nt的单条条带(参见图36)，这表明环状RNA实际上是环状的而非连环化的。
实例46：大型circRNA的制备
此实例展示了约20个碱基至约6.2kb的范围内的环状多核糖核苷酸的生成。
根据所期望功能，在一定大小范围内产生了经工程化以包含一种或多种所期望特性的非天然存在的环状RNA。如以下实例中所示，将高达6200nt的线性RNA环化。
在此使用了质粒pCDNA3.1/CAT(6.2kb)。将引物设计为以规则的间隔退火至pCDNA3.1/CAT，以生成对应于500nt、1000nt、2000nt、4000nt、5000nt和6200nt的DNA寡核苷酸。对指示DNA寡核苷酸进行体外转录以生成相应大小的线性RNA。使用夹板DNA从这些RNA寡核苷酸生成环状RNA。
为了测量RNA的环化效率，生成了6种不同大小的线性RNA(500nt、1000nt、2000nt、4000nt、5000nt和6200nt)。使用DNA夹板和T4 DNA连接酶2将它们环化。作为对照，在没有T4RNA连接酶的情况下进行一个反应。将一半的环化样品用RNA酶R处理以去除线性RNA。
为了监测环化效率，使用qPCR分析每个样品。如图37中所示，环状RNA由多种不同长度的DNA生成。如图38中所示，使用RNA酶R处理和针对环状接合点的qPCR分析证实了RNA的环化。此实例展示了各种长度的环状RNA的产生。
实例47：经工程化具有蛋白质结合位点的环状RNA
此实例展示了具有蛋白质结合位点的环状RNA的生成。
在此实例中，一种环状RNA被设计为包含CVB3 IRES(SEQ ID NO:56)和编码高斯萤光素酶(Gluc)的ORF(SEQ ID NO:57)，后接至少一个蛋白质结合位点。对于一个具体实例，使用辛德毕斯病毒(Sindbis virus)3’UTR的HuR结合序列(SEQ ID NO:52)来测试蛋白质结合对环状RNA免疫原性的影响。HuR结合序列包含两个元件，即URE(富U元件；SEQ ID NO:50)和CSE(保守序列元件；SEQ ID NO:51)。将无HuR结合序列或有URE的环状RNA用作对照。鱼腥藻属(Anabaena)自催化内含子和外显子序列的一部分位于CVB3 IRES(SEQ ID NO:56)之前。如所述在体外生成环状RNA。如图39中所示，生成了含有HuR结合位点的环状RNA。
为了监测RNA结合蛋白对环状RNA免疫原性的影响，将细胞铺板至96孔板的每个孔中。1天后，使用基于脂质的转染试剂(英杰公司)将500ng环状RNA转染至每个孔中。每天监测翻译效率/RNA稳定性/免疫原性，长达72小时。收获培养基以监测Gluc活性。用试剂盒制备用于测量RNA水平的细胞裂解物，该试剂盒允许通过实时RT-PCR(英杰公司)测量相对基因表达。
根据制造商的说明(皮尔斯公司(Pierce))，用高斯萤光素酶快速测定试剂盒测量Gluc活性来监测翻译效率。
对于qRT-PCR分析，使用细胞裂解物制备试剂盒根据制造商的说明(英杰公司)生成cDNA。使用PCR主混合物(Brilliant II SYBR绿qRT-PCR主混合物)和PCR循环仪(LightCycler 480)一式三份进行qRT-PCR分析。通过针对Nluc的引物测量环状RNA的稳定性。对熟知的先天性免疫调控剂(诸如RIG-I、MDA5、OAS、OASL和PKR)的mRNA水平进行定量，并且相对于肌动蛋白值进行归一化。
实例48：具有调控核酸位点的环状RNA的制备
此实例展示了具有调控RNA结合位点的环状RNA的体外产生。
不同的细胞类型具有独特的核酸调控机制来靶向特定的RNA序列。在环状RNA中编码这些特定序列可以在不同细胞类型中赋予独特的特性。如以下实例中所示，将环状RNA工程化以编码微RNA结合位点。
在此实例中，环状RNA包含编码WT EMCV IRES的序列、mir692微RNA结合位点(GAGGUGCUCAAAGAGAU)、和两个侧接IRES-ORF的间隔子元件。
在体外生成环状RNA。从除了用于驱动转录的T7 RNA聚合酶启动子之外还包含以上列出的所有基序的DNA模板体外转录未修饰的线性RNA。将转录的RNA用RNA净化试剂盒(新英格兰生物学实验室公司，T2050)纯化，按照制造商的说明用RNA 5’-磷酸水解酶(RppH)(新英格兰生物学实验室公司，M0356)处理，并且再次用RNA纯化柱纯化。使用夹板DNA(GGCTATTCCCAATAGCCGTT)和T4 RNA连接酶2(新英格兰生物学实验室公司，M0239)将RppH处理的RNA环化。将环状RNA进行尿素-PAGE纯化(图40)，在缓冲液(0.5M乙酸钠，0.1％SDS，1mM EDTA)中洗脱，乙醇沉淀并且重悬于无RNA酶的水中。
如图40中所示，生成了具有miRNA结合位点的环状RNA。
实例49：环状RNA的自剪接
此实例展示了通过自剪接产生环状RNA的能力。
对于此实例，环状RNA包含CVB3 IRES、编码高斯萤光素酶(GLuc)的ORF、和两个侧接IRES-ORF的间隔子元件。
在体外生成环状RNA。从包括以上列出的所有基序的DNA模板体外转录未修饰的线性RNA。体外转录反应包含1μg模板DNA T7RNA聚合酶启动子、10X T7反应缓冲液、7.5mMATP、7.5mM CTP、7.5mM GTP、7.5mM UTP、10mM DTT、40U RNA酶抑制剂、和T7酶。在37℃下进行转录4h。将转录的RNA用1U的DNA酶I在37℃下DNA酶处理15min。为了有利于通过自剪接进行的环化，添加额外的GTP至终浓度2mM，在55℃下孵育15min。然后将RNA进行柱纯化，并且通过尿素-PAGE可视化。
图41示出了通过自剪接生成的环状RNA。
实例50：具有包含加密原的剪接元件的环状RNA
此实例展示了工程化以具有降低的免疫原性的环状RNA。
对于此实例，环状RNA包含CVB3 IRES、编码高斯萤光素酶(GLuc)的ORF、和两个侧接IRES-ORF的间隔子元件，这两个间隔子元件包含为鱼腥藻属自催化内含子和外显子序列(SEQ ID NO:59)的一部分的剪接元件。
在体外生成环状RNA。
在此实例中，通过将细胞铺板至12孔板的每个孔中来监测细胞中先天性免疫应答基因的水平。1天后，使用基于脂质的转染试剂(英杰公司)将1μg线性RNA或环状RNA转染至每个孔中。转染后二十四小时，使用基于酚的提取试剂(英杰公司)从细胞中分离总RNA。将总RNA(500ng)进行逆转录以生成cDNA。使用基于染料的定量PCR混合物(伯乐公司)进行qRT-PCR分析。
预期与线性RNA转染细胞相比，用包含剪接元件的环状RNA转染的BJ细胞的免疫相关基因的qRT-PCR水平显示出RIG-I、MDA5、PKR和IFN-β的降低。因此，预期与线性RNA转染细胞相比，在环状RNA转染的细胞中受体细胞中免疫原性相关基因的诱导减少。
实例51：细胞分裂期间环状RNA的持续性
此实例展示了环状多核糖核苷酸在细胞分裂期间的持续性。经工程化以包含一种或多种所期望特性的非天然存在的环状RNA可以通过细胞分裂在细胞中持续存在而不会被降解。如以下实例中所示，在HeLa细胞中在72h内监测表达环状高斯萤光素酶(GLuc)的环状RNA。
在此实例中，1307nt环状RNA包含CVB3 IRES、编码高斯萤光素酶(GLuc)的ORF、和两个侧接IRES-ORF的间隔子元件。
在HeLa细胞中监测环状RNA在细胞分裂中的持续性。将96孔板中5000个细胞/孔用环状RNA悬浮转染。在Avos成像仪(赛默飞世尔公司)中进行亮细胞成像，并且在0h、24h、48h、72h和96h使用发光细胞活力测定(普洛麦格公司)进行细胞计数。通过使用高斯萤光素酶活性测定(赛默科技皮尔斯公司)，每天监测高斯萤光素酶活性以作为蛋白质表达的量度，并且在每24h从孔中移取的上清液中每天监测gLuc表达。将50μl1X Gluc底物添加至5μl血浆中，以进行Gluc萤光素酶活性测定。在混合后立即在发光检测仪器(普洛麦格公司)上读取板。
在正进行分裂的细胞中，检测到的环状RNA的蛋白质表达水平高于线性RNA(图42)。在所有测量时间点，与线性RNA相比，具有环状RNA的细胞具有更高的细胞分裂率。此实例展示了在细胞分裂期间环状RNA的检测与其线性RNA对应物相比增加。
实例52：滚环翻译产生多个表达序列
此实例展示了环状RNA从单一构建体表达多种蛋白质的能力。另外，此实例展示了编码多个ORF的环状RNA的滚环翻译。此实例进一步展示了两种蛋白质从单一构建体的表达。
一种环状RNA(mtEMCV T2A 3XFLAG-GFP F2A 3XFLAG-Nluc P2A IS间隔子)被设计为用于滚环翻译，以包含EMCV IRES(SEQ ID NO:58)、和编码具有3XFLAG标签的GFP的ORF和编码具有3XFLAG标签的纳米萤光素酶(Nluc)的ORF。交错元件(2A)侧接GFP和Nluc ORF。类似地设计了另一种环状RNA，但是在Nluc ORF与间隔子之间包含三联终止密码子。鱼腥藻属自催化内含子和外显子序列的一部分包含在EMCV IRES之前。如所述在体外生成环状RNA。
在体外或在细胞中监测环状RNA的蛋白质表达。对于体外分析，将环状RNA在兔网织红细胞裂解物(普洛麦格公司，美国威斯康星州菲奇堡)中在30℃下孵育3h。反应混合物的最终组成包含70％兔网织红细胞裂解物、20μM完整氨基酸和0.8U/μL RNA酶抑制剂(东洋纺公司，日本大阪)。
孵育后，通过向反应混合物(16μl)中添加乙酸(0.32μl)和水(300μl)并且在15℃下以20,817xg离心10min来去除血红蛋白。去除上清液，并且将沉淀物溶解于2x SDS样品缓冲液中，并且在70℃下孵育15min。以1400xg离心5min后，在10％-20％梯度聚丙烯酰胺/SDS凝胶上分析上清液。
对于细胞中的分析，将细胞铺板至12孔板的每个孔中，以监测细胞中环状RNA的翻译效率。1天后，使用基于脂质的转染试剂(英杰公司)将500ng环状RNA转染至每个孔中。转染后48小时，通过向每个孔中添加200μl RIPA缓冲液收获细胞。接下来，在10％-20％梯度聚丙烯酰胺/SDS凝胶上分析10μg细胞裂解物蛋白质。
使用干转移法将样品从网织红细胞裂解物和细胞电转移到硝酸纤维素膜上后，将印迹与抗FLAG抗体和抗小鼠IgG过氧化物酶一起孵育。作为上样对照，使用了抗β微管蛋白抗体。用增强的化学发光(ECL)试剂盒可视化印迹。通过ImageJ测量蛋白质印迹条带强度。
如图43中所示，编码GFP和nLuc的环状RNA产生2种蛋白质产物。与有三联终止密码子的环状RNA相比，无三联终止密码子的环状RNA的翻译生成的两种蛋白质产物更多。最后，有和无三联终止密码子的环状RNA分别以1/3.24和1/3.37的比率表达蛋白质。
实例53：体内施用环状RNA并显示出更长半衰期/增加的稳定性
此实例展示了在体内，与线性RNA相比，递送环状RNA的能力和环状RNA的增加稳定性。
对于此实例，环状RNA被设计为包含随有编码纳米萤光素酶(Nluc)的ORF和交错序列的EMCV IRES(EMCV 2A 3XFLAG Nluc 2A无终止和EMCV 2A 3XFLAG Nluc 2A终止)。在体外生成环状RNA。
经由静脉内(IV)尾静脉施用，向Balb/c小鼠注射具有Nluc ORF的环状RNA或作为对照的线性RNA。根据制造商的说明，使动物接受在基于脂质的转染试剂(麦鲁斯公司)中配制的单剂5μg RNA。
处死小鼠，并且在给予后3、4和7天收集肝脏(n＝2只小鼠/时间点)。收集肝脏并将其储存在RNA稳定试剂(英杰公司)中。使用微管匀浆器(赛默飞世尔科技公司)在RIPA缓冲液中匀质化组织，并且使用基于酚的RNA提取试剂提取RNA用于cDNA合成。使用qPCR来测量肝脏中线性RNA和环状RNA两者的存在。
通过qPCR在组织中进行RNA检测。为了检测扩增的线性和环状RNA引物，使用了Nluc ORF。(F：AGATTTCGTTGGGGACTGGC，R：CACCGCTCAGGACAATCCTT)。为了仅检测环状RNA，扩增5’-3’接合点的引物允许检测环状而非线性RNA构建体(F：CTGGAGACGTGGAGGAGAAC，R：CCAAAAGACGGCAATATGGT)。
在注射后3、4和7天，在小鼠肝脏中检测到的环状RNA水平高于线性RNA(图44)。因此，施用环状RNA并且在施用后至少7天可在体内检测到。
实例54：环状RNA的体内表达、半衰期和非免疫原性
此实例展示了环状RNA体内驱动表达的能力。它展示了与线性RNA相比，环状RNA的半衰期增加。最后，它展示了环状RNA被工程化为在体内为非免疫原性的。
对于此实例，环状RNA包含CVB3 IRES、编码高斯萤光素酶(GLuc)的ORF、和两个侧接IRES-ORF的间隔子元件。
在体外生成环状RNA。未修饰的线性RNA从包含以上列出的所有基序以及用于驱动转录的T7 RNA聚合酶启动子的DNA模板体外转录。将转录的RNA用RNA净化试剂盒(新英格兰生物学实验室公司，T2050)纯化，按照制造商的说明用RNA 5’-磷酸水解酶(RppH)(新英格兰生物学实验室公司，M0356)处理，并且再次用RNA纯化柱纯化。使用夹板DNA(GTCAACGGATTTTCCCAAGTCCGTAGCGTCTC)和T4RNA连接酶2(新英格兰生物学实验室公司，M0239)将RppH处理的RNA环化。将环状RNA进行尿素-PAGE纯化，在缓冲液(0.5M乙酸钠，0.1％SDS，1mM EDTA)中洗脱，乙醇沉淀并且重悬于无RNA酶的水中。
使小鼠接受2.5μg具有高斯萤光素酶ORF的环状RNA、或作为对照的线性RNA(两者均在作为载体的基于脂质的转染试剂(麦鲁斯公司)中配制)的单剂尾静脉注射。
在给予后1、2、7、11、16和23天，收集每只小鼠的尾静脉血液样品(50μl)到EDTA管中。通过在4℃下以1300g离心25min分离血浆，并且使用高斯萤光素酶活性测定(赛默科技皮尔斯公司)测试了高斯萤光素酶(一种分泌酶)的活性。将50μl 1X Gluc底物添加至5μl血浆中，以进行Gluc萤光素酶活性测定。在混合后立即在发光检测仪器(普洛麦格公司)中读取板。
在给予环状RNA后1、2、7、11、16和23天，在血浆中检测到高斯萤光素酶活性(图45A-B)。
相比之下，高斯萤光素酶活性仅在给予经修饰的线性RNA后1和2天在血浆中检测到。在第6天或以后，未检测到高于背景水平的线性RNA衍生蛋白的酶活性(图45A-B)。
在第16天，切开三只动物的肝脏，并且使用基于酚的提取试剂(英杰公司)从细胞中分离总RNA。将总RNA(500ng)进行逆转录以生成cDNA。使用基于染料的定量PCR混合物(伯乐公司)进行qRT-PCR分析。
如图46中所示，在第16天，在肝脏和脾脏两者中均检测到环状RNA而非线性RNA的qRT-PCR水平。如图47中所示，在第16天与载体转染的动物相比，用线性RNA转染的肝脏的免疫相关基因显示出RIG-I、MDA5、IFN-B和OAS的增加表达，而用环状RNA转染的肝脏未显示出这些标记物的RIG-I、MDA5、PKR、和IFN-β的增加表达。因此，在来自转染肝脏的环状RNA中不存在受体细胞中免疫原性相关基因的诱导。
此实例展示了环状RNA在更长时间段内体内表达蛋白质，在注射后数天时在血浆中具有蛋白质活性水平。鉴于高斯萤光素酶在小鼠血浆中的半衰期是约20min(参见Tannous,Nat Protoc.[自然实验手册],2009,4(4):582-591)，相似的活性水平指示环状RNA的连续表达。此外，环状RNA显示出比其经修饰的线性RNA对应物更长的表达谱，而不诱导免疫相关基因。
序列表
SEQ ID NO:1(起始密码子)
AUG
SEQ ID NO:2(GFP)
EGFP：
Figure BDA0003282415270002251
SEQ ID NO:3(交错元件)
P2A：gctactaacttcagcctgctgaagcaggctggcgacgtggaggagaaccctggacct
T2A：gagggcaggggaagtctactaacatgcggggacgtggaggaaaatcccggccca
E2A：cagtgtactaattatgctctcttgaaattggctggagatgttgagagcaacccaggtccc
其他：F2A、BmCPV2A、BmIFV2A
SEQ ID NO:4ZKSCAN内含子
Figure BDA0003282415270002252
或
Figure BDA0003282415270002261
SEQ ID NO:5(IRES)
IRES(EMCV)：
Figure BDA0003282415270002262
SEQ ID NO:6(addgene p3.1漆酶)
pcDNA3.1(+)漆酶2MCS外显子载体序列6926bp
Figure BDA0003282415270002271
Figure BDA0003282415270002281
Figure BDA0003282415270002291
Figure BDA0003282415270002301
SEQ ID NO:8(RFP)
mCherry：
Figure BDA0003282415270002311
SEQ ID NO:9(核糖开关)
适体酶(茶碱依赖性，参见Auslander 2010Mol Biosys[分子生物系统])：
Figure BDA0003282415270002312
SEQ ID NO:10(萤光素酶)
nLuc：
Figure BDA0003282415270002313
序列ID 11
科扎克3XFLAG-EGF无终止(264bp)
Figure BDA0003282415270002321
5-13：科扎克序列
14-262：3XFLAG-EGF
SEQ ID NO:12
科扎克3XFLAG-EGF终止(273bp)
Figure BDA0003282415270002322
5-13：科扎克序列
14-262：3XFLAG-EGF
263-271：三联终止密码子
SEQ ID NO:13
科扎克3XFLAG-EGF P2A无终止(330bp)
Figure BDA0003282415270002323
5-13：科扎克序列
14-262：3XFLAG-EGF
263-328：P2A
SEQ ID NO:14
构建体科扎克3XFLAG-EGF无终止(264bp)夹板
GGTGGCTCCCAGGCGCAGTT
SEQ ID NO:15
构建体科扎克3XFLAG-EGF终止(273bp)夹板
GGTGGCTCCCAGTTACTATC
SEQ ID NO:16
构建体科扎克3XFLAG-EGF P2A无终止(330bp)夹板
GGTGGCTCCCAGAGGTCCAG
SEQ ID NO:17
科扎克1XFLAG-EGF T2A 1XFLAG-Nluc P2A无终止(873bp)
Figure BDA0003282415270002341
5-13：科扎克序列
14-202：1XFLAG-EGF
203-265：T2A
266-805：1XFLAG-Nluc
806-871：P2A
SEQ ID NO:18
科扎克1XFLAG-EGF终止1XFLAG-Nluc终止(762bp)
Figure BDA0003282415270002351
5-13：科扎克序列
14-202：1XFLAG-EGF
203-211：三联终止密码子
212-751：1XFLAG-Nluc
752-760：三联终止密码子
SEQ ID NO:19
科扎克3XFLAG-EGF P2A无终止(330bp)
Figure BDA0003282415270002352
5-13：科扎克序列
14-262：3XFLAG-EGF
263-328：P2A
SEQ ID NO:20
科扎克3XFLAG-EGF无终止(264bp)
Figure BDA0003282415270002361
5-13：科扎克序列
14-262：3XFLAG-EGF
SEQ ID NO:21
科扎克3XFLAG-EGF终止(273bp)
Figure BDA0003282415270002362
5-13：科扎克序列
14-262：3XFLAG-EGF
263-271：三联终止密码子
SEQ ID NO:22
EMCV IRES T2A 3XFLAG-EGF P2A无终止(954bp)
Figure BDA0003282415270002371
5-574：EMCV IRES
575-637：T2A
638-886：3XFALG-EGF
887-952：P2A
SEQ ID NO:23
EMCV T2A 3XFLAG Nluc P2A终止(1314nt)
Figure BDA0003282415270002381
5-574：EMCV IRES
575-637：T2A
638-1237：3XFLAG Nluc
1238-1303：P2A
1304-1312：三联终止密码子
SEQ ID NO:24
EMCV T2A 3XFLAG Nluc P2A无终止(1305nt)
Figure BDA0003282415270002391
5-574：EMCV IRES
575-637：T2A
638-1237：3XFLAG Nluc
1238-1303：P2A
SEQ ID NO:25
科扎克1XFLAG-EGF T2A 1XFLAG-NLuc P2A终止(882bp)
Figure BDA0003282415270002401
5-13：科扎克序列
14-202：1XFLAG-EGF
266-805：1XFLAG-NLuc
806-871：P2A
872-880：三联终止密码子
SEQ ID NO:26
示例性重复间隔子序列
Figure BDA0003282415270002402
SEQ ID NO:27
实例43中使用的用于扩增pCDNA3.1/CAT的模板的正向引物
CGCGGATCCTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGC
SEQ ID NO:28
实例43中使用的用于扩增pCDNA3.1/CAT的0.5kb模板的反向引物
Figure BDA0003282415270002411
SEQ ID NO:29
实例43中使用的用于扩增pCDNA3.1/CAT的1kb模板的反向引物
Figure BDA0003282415270002412
SEQ ID NO:30
实例43中使用的用于扩增pCDNA3.1/CAT的2kb模板的反向引物
Figure BDA0003282415270002413
SEQ ID NO:31
实例43中使用的用于扩增pCDNA3.1/CAT的4kb模板的反向引物
Figure BDA0003282415270002414
SEQ ID NO:32
实例43中使用的用于扩增pCDNA3.1/CAT的5kb模板的反向引物
Figure BDA0003282415270002421
SEQ ID NO:33
实例43中使用的用于扩增pCDNA3.1/CAT的6.2kb模板的反向引物
Figure BDA0003282415270002422
SEQ ID NO:34
实例43中使用的用于检测pCDNA3.1/CAT的线性转录物的正向qPCR引物
ATTCTTGCCCGCCTGATGAA
SEQ ID NO:35
实例43中使用的用于检测pCDNA3.1/CAT的线性转录物的反向qPCR引物
TTGCTCATGGAAAACGGTGT
SEQ ID NO:36
实例43中使用的用于检测pCDNA3.1/CAT的环状转录物的正向qPCR引物
TGATCCTGCACTATGGCACA
SEQ ID NO:37
实例43中使用的用于检测pCDNA3.1/CAT的环状转录物的反向qPCR引物
CTGGACTAGTGGATCCGAGC
SEQ ID NO:38
实例44中使用的用于检测肌动蛋白(ACTIN)的正向引物序列
GACGAGGCCCAGAGCAAGAGAGG
SEQ ID NO:39
实例44中使用的用于检测肌动蛋白的反向引物序列
GGTGTTGAAGGTCTCAAACATG
SEQ ID NO:40
实例44中使用的用于检测RIG-I的正向引物序列
TGTGGGCAATGTCATCAAAA
SEQ ID NO:42
实例44中使用的用于检测RIG-I的反向引物序列
GAAGCACTTGCTACCTCTTGC
SEQ ID NO:42
实例44中使用的用于检测MDA5的正向引物序列
GGCACCATGGGAAGTGATT
SEQ ID NO:43
实例44中使用的用于检测MDA5的反向引物序列
ATTTGGTAAGGCCTGAGCTG
SEQ ID NO:44
实例44中使用的用于检测PKR的正向引物序列
TCGCTGGTATCACTCGTCTG
SEQ ID NO:45
实例44中使用的用于检测PKR的反向引物序列
GATTCTGAAGACCGCCAGAG
SEQ ID NO:46
实例44中使用的用于检测IFN-β的正向引物序列
CTCTCCTGTTGTGCTTCTCC
SEQ ID NO:47
实例44中使用的用于检测IFN-β的反向引物序列
GTCAAAGTTCATCCTGTCCTTG。
SEQ ID NO:48
EMCV T2A 3XFLAG-GFP F2A 3XFALG-Nluc P2A IS
Figure BDA0003282415270002451
Figure BDA0003282415270002461
SEQ ID NO:49
EMCV T2A 3XFLAG-GFP F2A 3XFALG-Nluc P2A IS
Figure BDA0003282415270002462
Figure BDA0003282415270002471
SEQ ID NO:50
URE
Figure BDA0003282415270002481
SEQ ID NO:51
CSE
AUUUUGUUUUUAACAUUUC
SEQ ID NO:52
URE/CSE
Figure BDA0003282415270002482
SEQ ID NO:53
CVB3-GLuc-终止-URE
Figure BDA0003282415270002491
SEQ ID NO:54
CVB3-GLuc-终止-URE/CSE
Figure BDA0003282415270002501
SEQ ID NO:55
用于实例42的互补引物
CACCGCTCAGGACAATCCTT
SEQ ID NO:56
CVB3 IRES
Figure BDA0003282415270002511
SEQ ID NO:57
Gluc
Figure BDA0003282415270002512
SEQ ID NO:58
具有终止突变的EMCV IRES
Figure BDA0003282415270002521
SEQ ID NO:59
间隔子1
Figure BDA0003282415270002522
间隔子2
Figure BDA0003282415270002523
SEQ ID:60
Figure BDA0003282415270002524
WT EMCV Gluc IS
Figure BDA0003282415270002531
5’间隔子
Figure BDA0003282415270002532
3’间隔子
AAAAAACAAAAAACAAAACGGCTATT
序列#1(第一节段：5’间隔子+WT EMCV IRES+38nt ORF)
Figure BDA0003282415270002541
序列#2(第二节段：ORF+3’间隔子)
Figure BDA0003282415270002542
用于扩增第一节段的正向引物
Figure BDA0003282415270002543
用于扩增第一节段的反向引物
mAmCAGCGATGCAGATCAGGGC
用于扩增第二节段的正向引物
CGCGGATCCTAATACGACTCACTATAGGCCGAGGCCAAGCCCACCG
用于扩增第二节段的反向引物
mAmATAGCCGTTTTGTTTTTTGTTTTTTTTAGTCACCACCGGCCCCCT
球蛋白GLuc
Figure BDA0003282415270002551
人球蛋白5’UTR
ACTCTTCTGGTCCCCACAGACTCAGAGAGAACCCACC
人球蛋白3’UTR
Figure BDA0003282415270002561
球蛋白GLuc正向引物
CGCGGATCCTAATACGACTCACTATAGGGACTCTTCTGGTCCCCACAGACTCAG
球蛋白GLuc反向引物
TGCTGCCCACTCAGACTTTATTC。

Claims (17)

1.一种在受试者中减少环状多核糖核苷酸的免疫原性的方法，该方法包括：
提供杂交修饰的环状多核糖核苷酸，其中该杂交修饰的环状多核糖核苷酸包含至少一种经修饰的核苷酸和第一部分，该第一部分包含至少约5至1000个连续的未修饰核苷酸；
将该杂交修饰的环状多核糖核苷酸施用至该受试者；以及
在该受试者的细胞或组织中获得与相应的未修饰的环状多核糖核苷酸相比减少的该杂交修饰的环状多核糖核苷酸的免疫原性。
2.如权利要求1中任一项所述的方法，其中该第一部分包含至少约5、10、20、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、或1000个连续的未修饰核苷酸。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中该第一部分缺少5’-甲基胞苷或假尿苷。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中该环状多核糖核苷酸具有翻译能力。
5.如权利要求1-4所述的方法，其中该杂交修饰的环状多核糖核苷酸：
(a)具有比相应的未修饰的环状多核糖核苷酸高至少约0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.5、1.6、1.8、2、2.2、2.5、2.8、3倍的表达；
(b)具有比相应的未修饰的环状多核糖核苷酸高至少约1.1、1.2、1.3、1.5、1.6、1.8、2、2.2、2.5、2.8、3、3.2、3.3、3.5、3.8、4.0、4.2、4.5、4.8、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、或10.0倍的半衰期；
(c)具有比相应的未修饰的环状多核糖核苷酸更高的半衰期；或
(d)具有比相应的未修饰的环状多核糖核苷酸低至少约1.1、1.2、1.3、1.5、1.6、1.8、2、2.2、2.5、2.8、3、3.2、3.3、3.5、3.8、4.0、4.2、4.5、4.8、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、或10.0倍的免疫原性，如通过RIG-I、TLR-3、TLR-7、TLR-8、MDA-5、LGP-2、OAS、OASL、PKR、和IFN-β中的至少一种的表达或信号传导或激活评估的。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中该至少一种经修饰的核苷酸选自下组，该组由以下组成：
(a)N(6)甲基腺苷(m6A)、5’-甲基胞苷、和假尿苷；
(b)2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基(2’-O-MOE)、2’-O-氨基丙基、2’-脱氧、T-脱氧-2’-氟、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)、2’-O-二甲基氨基乙基(2’-O-DMAOE)、2’-O-二甲基氨基丙基(2’-O-DMAP)、T-O-二甲基氨基乙基氧基乙基(2’-O-DMAEOE)、2’-O-N-甲基乙酰胺基(2’-O-NMA)、锁核酸(LNA)、乙烯核酸(ENA)、肽核酸(PNA)、1’,5’-脱水己糖醇核酸(HNA)、吗啉代、甲基膦酸酯核苷酸、硫醇膦酸酯核苷酸、和2’-氟N3-P5’-亚磷酰胺；或
(c)表2中的任何经修饰的核苷酸。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中该杂交修饰的环状多核糖核苷酸的至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、或99％核苷酸是经修饰的核苷酸。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中该杂交修饰的环状多核糖核苷酸包含由未修饰的核苷酸组成的结合位点，该结合位点被配置为结合至蛋白质、肽、生物分子、DNA、RNA、或细胞靶标。
9.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中该杂交修饰的环状多核糖核苷酸包含一个或多个表达序列。
10.如权利要求1-7或9中任一项所述的方法，其中该第一部分包含由未修饰的核苷酸组成的IRES。
11.如权利要求9或10所述的方法，其中该杂交修饰的环状多核糖核苷酸的一个或多个表达序列具有：
(a)比完全修饰的环状多核糖核苷酸对应物更高的翻译效率；
(b)比完全修饰的环状多核糖核苷酸对应物高至少约0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.5、1.6、1.8、2、2.2、2.5、2.8、3倍的翻译效率；
(c)比相应的未修饰的环状多核糖核苷酸更高的翻译效率；或
(d)比相应的未修饰的环状多核糖核苷酸高至少约0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.5、1.6、1.8、2、2.2、2.5、2.8、3倍的翻译效率。
12.一种在受试者中表达一个或多个表达序列的方法，该方法包括：
提供包含一个或多个表达序列的杂交修饰的环状多核糖核苷酸，其中该杂交修饰的环状多核糖核苷酸包含至少一种经修饰的核苷酸和第一部分，该第一部分包含至少约5、10、20、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、或1000个连续的未修饰核苷酸；
将该杂交修饰的环状多核糖核苷酸施用至该受试者；以及
在该受试者的细胞或组织中获得与完全修饰的环状多核糖核苷酸对应物中相应的一个或多个表达序列的表达相比增加的该一个或多个表达序列的表达。
13.一种在受试者中增加环状多核糖核苷酸的稳定性的方法，该方法包括：
提供杂交修饰的环状多核糖核苷酸，其中该杂交修饰的环状多核糖核苷酸包含经修饰的环状多核糖核苷酸和第一部分，该第一部分包含至少约5、10、20、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、或1000个连续的未修饰核苷酸；
将该杂交修饰的环状多核糖核苷酸施用至该受试者；以及
在该受试者的细胞或组织中获得与相应的未修饰的环状多核糖核苷酸相比增加的该杂交修饰的环状多核糖核苷酸的稳定性。
14.如权利要求12或13所述的方法，其中该第一部分包含IRES。
15.一种药物组合物，该药物组合物包含杂交修饰的环状多核糖核苷酸，其中该杂交修饰的环状多核糖核苷酸包含：
至少一种经修饰的核苷酸；
第一部分，该第一部分包含由未修饰的核苷酸组成的第一结合位点，该第一结合位点被配置为结合第一靶标，例如RNA、DNA、蛋白质、或细胞靶标的第一结合部分，其中该第一结合部分是第一环状多核糖核苷酸(circRNA)结合基序；
其中该第一靶标和该杂交修饰的环状多核糖核苷酸形成复合物。
16.一种药物组合物，该药物组合物包含杂交修饰的环状多核糖核苷酸，其中该杂交修饰的环状多核糖核苷酸包含：
至少一种经修饰的核苷酸；
第一部分，该第一部分包含由未修饰的核苷酸组成的第一结合位点，该第一结合位点被配置为结合第一靶标，例如RNA、DNA、蛋白质、或细胞靶标的第一结合部分，其中该第一结合部分是第一环状多核糖核苷酸(circRNA)结合基序；以及
第二结合位点，该第二结合位点被配置为结合第二靶标的第二结合部分，其中该第二结合部分是第二circRNA结合基序，
其中该第一结合部分不同于该第二结合部分，
其中该第一靶标、该第二靶标、和该杂交修饰的环状多核糖核苷酸形成复合物，并且
其中该第一靶标或该第二靶标不是微RNA。
17.一种药物组合物，该药物组合物包含杂交修饰的环状多核糖核苷酸，其中该杂交修饰的环状多核糖核苷酸包含：
至少一种经修饰的核苷酸；
第一部分，该第一部分包含第一结合位点，该第一结合位点被配置为结合第一靶标的第一结合部分，其中该第一结合部分是第一环状多核糖核苷酸(circRNA)结合基序；以及
第二结合位点，该第二结合位点被配置为结合第二靶标的第二结合部分，其中该第二结合部分是第二circRNA结合基序，
其中该第一结合部分不同于该第二结合部分，并且
其中该第一靶标和该第二靶标两者均是微RNA。
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