JP2021531022A - 環状ポリリボヌクレオチドを含む組成物及びその使用 - Google Patents

環状ポリリボヌクレオチドを含む組成物及びその使用 Download PDF

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Abstract

本発明は、一般に、環状ポリリボヌクレオチドの医薬組成物及び製剤並びにそれらの使用に関する。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
[0001] 本出願は、２０１８年７月２４日に出願された米国仮特許出願第６２／７０２，７１４号明細書；２０１９年３月２５日に出願された同第６２／８２３，５６９号明細書；及び２０１９年６月１９日に出願された同第６２／８６３，６７０号明細書の優先権及びそれらからの利益を主張し、それらのそれぞれの内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
[0002] ある環状ポリリボヌクレオチドは、ヒト組織及び細胞、例として、健常個体の組織及び細胞中にユビキタスに存在する。
[0003] 本明細書に記載の本発明は、環状ポリリボヌクレオチドを含む組成物及びその使用方法を含む。
[0004] 一部の態様において、細胞中で標的を結合させる方法は、アプタマー配列を含み、アプタマー配列は、標的を結合させる二次構造を有する翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドを提供すること；及び翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドを細胞に送達し、翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドは、送達の少なくとも５日後に検出可能な標的との複合体を形成することを含む。一部の実施形態において、標的は、核酸分子、小分子、タンパク質、炭水化物、及び脂質からなる群から選択される。一部の実施形態において、標的は、遺伝子調節タンパク質である。一部の実施形態において、遺伝子調節タンパク質は、転写因子である。一部の実施形態において、核酸分子は、ＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子である。一部の実施形態において、複合体は、遺伝子発現をモジュレートする。一部の実施形態において、複合体は、ＤＮＡ分子の指向転写、ＤＮＡ分子のエピジェネティックリモデリング、又はＤＮＡ分子の分解をモジュレートする。一部の実施形態において、複合体は、標的の分解、標的のトランスロケーション、又は標的シグナル伝達をモジュレートする。一部の実施形態において、遺伝子発現は、疾患又は病態の病因と関連する。一部の実施形態において、複合体は、送達の少なくとも７、８、９、又は１０日後に検出可能である。一部の実施形態において、翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドは、送達の少なくとも５日後に存在する。一部の実施形態において、翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドは、送達の少なくとも６、７、８、９、又は１０日後に存在する。一部の実施形態において、翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドは、非修飾翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドである。一部の実施形態において、翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドは、準二本鎖（quasi-double-stranded）二次構造を有する。一部の実施形態において、アプタマー配列は、標的を結合させる三次構造をさらに有する。一部の実施形態において、細胞は、真核細胞である。一部の実施形態において、真核細胞は、ヒト細胞である。
[0005] 一部の態様において、細胞中で転写因子を結合させる方法は、転写因子を結合させるアプタマー配列を含む翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドを提供すること；及び翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドを細胞に送達し、翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドは、転写因子との複合体を形成し、遺伝子発現をモジュレートすることを含む。
[0006] 一部の態様において、細胞中で転写因子を隔離する方法は、転写因子を結合させるアプタマー配列を含む翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドを提供すること；及び翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドを細胞に送達し、翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドは、転写因子を結合させて細胞中で複合体を形成することにより転写因子を隔離することを含む。一部の実施形態において、細胞生存率は、複合体の形成後に減少する。
[0007] 一部の態様において、細胞毒性剤に対して細胞を感作させる方法は、転写因子を結合させるアプタマー配列を含む翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドを提供すること；並びに細胞毒性剤及び翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドを細胞に送達し、翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドは、細胞中で転写因子との複合体を形成し；それにより、翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドを欠く細胞と比較して細胞毒性剤に対して細胞を感作させることを含む。一部の実施形態において、細胞毒性剤に対する細胞の感作は、細胞毒性剤及び翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドの送達後に減少した細胞生存率をもたらす。一部の実施形態において、減少した細胞生存率は、細胞毒性剤及び翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドの送達の少なくとも２日後に４０％以上だけ減少する。
[0008] 一部の態様において、細胞中で病原性タンパク質を結合させる方法は、病原性タンパク質を結合させるアプタマー配列を含む翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドを提供すること；及び翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドを細胞に送達し、翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドは、病原性タンパク質の分解のために病原性タンパク質との複合体を形成することを含む。
[0009] 一部の態様において、細胞中でリボ核酸分子を結合させる方法は、リボ核酸分子の配列に相補的な配列を含む翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドを提供すること；及び翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドを細胞に送達し、翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドは、リボ核酸分子との複合体を形成することを含む。
[0010] 一部の態様において、細胞中でゲノムデオキシリボ核酸分子を結合させる方法は、ゲノムデオキシリボ核酸分子を結合させるアプタマー配列を含む翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドを提供すること；及び翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドを細胞に送達し、翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドは、ゲノムデオキシリボ核酸分子との複合体を形成し、遺伝子発現をモジュレートすることを含む。
[0011] 一部の態様において、細胞中で小分子を結合させる方法は、小分子を結合させるアプタマー配列を含む翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドを提供すること；及び翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドを細胞に送達し、翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドは、小分子との複合体を形成し、細胞プロセスをモジュレートすることを含む。一部の実施形態において、小分子は、９００ダルトン以下の分子量を有する有機化合物であり、細胞プロセスをモジュレートする。一部の実施形態において、小分子は、薬物である。一部の実施形態において、小分子は、フルオロフォアである。一部の実施形態において、小分子は、代謝産物である。
[0012] 一部の態様において、組成物は、アプタマー配列を含み、アプタマー配列は、標的を結合させる二次構造を有する翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドを含む。
[0013] 一部の態様において、医薬組成物は、アプタマー配列を含み、アプタマー配列は、標的を結合させる二次構造を有する翻訳不能環状ポリリボヌクレオチド；及び薬学的に許容可能な担体又は賦形剤を含む。
[0014] 一部の態様において、細胞は、本明細書に記載の翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドを含む。
[0015] 一部の態様において、治療が必要とされる対象を治療する方法は、本明細書に記載の組成物又は本明細書に記載の医薬組成物を投与することを含む。
[0016] 一部の態様において、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載の翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドである。
[0017] 一部の態様において、方法は、本明細書に記載の翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドを産生する方法である。
[0018] 一部の態様において、医薬組成物は、標的、例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、細胞の膜などを結合させる結合部位を含む環状ポリリボヌクレオチド；及び薬学的に許容可能な担体又は賦形剤を含み；標的及び環状ポリリボヌクレオチドは、複合体を形成し、標的は、マイクロＲＮＡでない。一部の態様において、医薬組成物は、第１の標的を結合させる第１の結合部位、及び第２の標的を結合させる第２の結合部位を含む環状ポリリボヌクレオチド；並びに薬学的に許容可能な担体又は賦形剤を含み；第１の結合部位は、第２の結合部位と異なり、第１の標的及び第２の標的は、両方ともマイクロＲＮＡである。一部の実施形態において、結合部位は、アプタマー配列を含む。一部の実施形態において、第１の結合部位は、第１のアプタマー配列を含み、第２の結合部位は、第２のアプタマー配列を含む。一部の実施形態において、アプタマー配列は、標的を結合させる二次構造を有する。一部の実施形態において、第１のアプタマー配列は、第１の標的を結合させる二次構造を有し、第２のアプタマー配列は、第２の標的を結合させる二次構造を有する。一部の実施形態において、結合部位は、第１の結合部位であり、標的は、第１の標的である。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、第２の標的に結合する第２の結合部位をさらに含む。一部の実施形態において、第１の標的は、第１の環状ポリリボヌクレオチド（ｃｉｒｃＲＮＡ）結合モチーフを含む。一部の実施形態において、第２の標的は、第２の環状ポリリボヌクレオチド（ｃｉｒｃＲＮＡ）結合モチーフを含む。一部の実施形態において、第１の標的、第２の標的、及び環状ポリリボヌクレオチドは、複合体を形成する。一部の実施形態において、第１及び第２の標的は、互いに相互作用する。一部の実施形態において、複合体は、細胞プロセスをモジュレートする。一部の実施形態において、第１及び第２の標的は同じであり、第１及び第２の結合部位は、第１の標的及び第２の標的上の異なる結合部位を結合させる。一部の実施形態において、第１の標的及び第２の標的は異なる。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、第３以上の標的を結合させる１つ以上の追加の結合部位をさらに含む。一部の実施形態において、１つ以上の標的は同じであり、１つ以上の追加の結合部位は、１つ以上の標的上の異なる結合部位を結合させる。一部の実施形態において、複合体の形成は、細胞プロセスをモジュレートする。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、第１及び第２の標的に接触した場合、第１又は第２の標的と関連する細胞プロセスをモジュレートする。一部の実施形態において、第１及び第２の標的は、複合体中で互いに相互作用する。一部の実施形態において、細胞プロセスは、疾患又は病態の病因と関連する。一部の実施形態において、細胞プロセスは、環状ポリリボ核酸の翻訳と異なる。一部の実施形態において、第１の標的は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子を含み、第２の標的は、タンパク質を含む。一部の実施形態において、複合体は、ＤＮＡ分子の指向転写、ＤＮＡ分子のエピジェネティックリモデリング、又はＤＮＡ分子の分解をモジュレートする。一部の実施形態において、第１の標的は、第１のタンパク質を含み、第２の標的は、第２のタンパク質を含む。一部の実施形態において、複合体は、第１のタンパク質の分解、第１のタンパク質のトランスロケーション、若しくはシグナル伝達をモジュレートし、又は天然タンパク質機能をモジュレートし、第１及び第２のタンパク質間の直接的な相互作用により形成される複合体の形成を阻害し、若しくはモジュレートする。一部の実施形態において、第１の標的又は第２の標的は、ユビキチンリガーゼである。一部の実施形態において、第１の標的は、第１のリボ核酸（ＲＮＡ）分子を含み、第２の標的は、第２のＲＮＡ分子を含む。一部の実施形態において、複合体は、第１のＲＮＡ分子の分解をモジュレートする。一部の実施形態において、第１の標的は、タンパク質を含み、第２の標的は、ＲＮＡ分子を含む。一部の実施形態において、複合体は、タンパク質のトランスロケーションをモジュレートし、又はタンパク質及びＲＮＡ分子間の直接的な相互作用により形成される複合体の形成を阻害する。一部の実施形態において、第１の標的は、受容体であり、第２の標的は、受容体の基質である。一部の実施形態において、複合体は、受容体の活性化を阻害する。
[0019] 一部の態様において、医薬組成物は、標的を結合させる結合部位を含む環状ポリリボヌクレオチド；及び薬学的に許容可能な担体又は賦形剤を含み；環状ポリリボヌクレオチドは、翻訳不能又は翻訳欠損であり、標的は、マイクロＲＮＡでない。一部の態様において、医薬組成物は、標的を結合させる結合部位を含み、標的は、リボ核酸（ＲＮＡ）結合モチーフを含む環状ポリリボ核酸；及び薬学的に許容可能な担体又は賦形剤を含み；環状ポリリボヌクレオチドは、翻訳不能又は翻訳欠損であり、標的は、マイクロＲＮＡである。一部の実施形態において、結合部位は、標的を結合させる二次構造を有するアプタマー配列を含む。一部の実施形態において、標的は、ＤＮＡ分子を含む。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドへの標的の結合は、ＤＮＡ分子の転写の干渉をモジュレートする。一部の実施形態において、標的は、タンパク質を含む。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドへの標的の結合は、タンパク質と他の分子との相互作用をモジュレートする。一部の実施形態において、タンパク質は、受容体であり、環状ポリリボヌクレオチドへの標的の結合は、受容体を活性化させる。一部の実施形態において、タンパク質は、第１の酵素であり、環状ポリリボヌクレオチドは、第２の酵素に結合する第２の結合部位をさらに含み、環状ポリリボヌクレオチドへの第１及び第２の酵素の結合は、第１及び第２の酵素の酵素活性をモジュレートする。一部の実施形態において、タンパク質は、ユビキチンリガーゼである。一部の実施形態において、標的は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子を含む。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドへの標的の結合は、ｍＲＮＡ分子の翻訳の干渉をモジュレートする。一部の実施形態において、標的は、リボソームを含む。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドへの標的の結合は、翻訳プロセスの干渉をモジュレートする。一部の実施形態において、標的は、環状ＲＮＡ分子を含む。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドへの標的の結合は、環状ＲＮＡ分子を隔離する。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドへの標的の結合は、マイクロＲＮＡ分子を隔離する。
[0020] 一部の態様において、医薬組成物は、細胞の膜（例えば、細胞壁膜、細胞小器官膜など）に結合する結合部位を含み、細胞の膜は、リボ核酸（ＲＮＡ）結合モチーフを含む環状ポリリボヌクレオチド；及び薬学的に許容可能な担体又は賦形剤を含む。一部の実施形態において、結合部位は、細胞の膜（例えば、細胞壁膜、細胞小器官膜など）を結合させる二次構造を有するアプタマー配列を含む。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、第２の標的に結合する第２の結合部位をさらに含み、第２の標的は、第２のＲＮＡ結合モチーフを含む。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、細胞の膜及び第２の標的に結合する。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、第２の細胞標的に結合する第２の結合部位をさらに含み、環状ポリリボヌクレオチドへの細胞標的及び第２の細胞標的の結合は、細胞標的の立体構造変化を誘導し、それにより細胞標的の下流のシグナル伝達を誘導する。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、翻訳不能又は翻訳欠損である。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ａ）エンクリプトゲン（encryptogen）；ｂ）スプライシングエレメント；ｃ）調節配列；ｄ）複製配列；ｅ）準二本鎖二次構造；ｆ）準ヘリカル構造；及びｇ）発現配列からなる群から選択される少なくとも１つの構造エレメントをさらに含む。一部の実施形態において、準ヘリカル構造は、少なくとも１つの非二本鎖セグメントを有する少なくとも１つの二本鎖ＲＮＡセグメントを含む。一部の実施形態において、準ヘリカル構造は、反復配列により結合している第１の配列及び第２の配列を含む。一部の実施形態において、エンクリプトゲンは、スプライシングエレメントを含む。一部の実施形態において、環状ポリリボ核酸は、少なくとも１つの修飾核酸を含む。一部の実施形態において、少なくとも１つの修飾核酸は、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル、２’−デオキシ、Ｔ−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、Ｔ−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）、２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）、ロック核酸（ＬＮＡ）、エチレン核酸（ＥＮＡ）、ぺプチド核酸（ＰＮＡ）、１’，５’−アンヒドロヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、モルホリノ、メチルホスホネートヌクレオチド、チオールホスホネートヌクレオチド、及び２’−フルオロＮ３−Ｐ５’−ホスホラミダイトからなる群から選択される。一部の実施形態において、エンクリプトゲンは、少なくとも１つの修飾核酸を含む。一部の実施形態において、エンクリプトゲンは、タンパク質結合部位を含む。一部の実施形態において、エンクリプトゲンは、免疫タンパク質結合部位を含む。一部の実施形態において、環状ポリリボ核酸は、ＲＩＧ−Ｉ、ＴＬＲ−３、ＴＬＲ−７、ＴＬＲ−８、ＭＤＡ−５、ＬＧＰ−２、ＯＡＳ、ＯＡＳＬ、ＰＫＲ、及びＩＦＮ−βの少なくとも１つの発現、シグナリング、又は活性化により評価してエンクリプトゲンを欠く対応物よりも少なくとも２倍低い免疫原性を有する。一部の実施形態において、環状ポリリボ核酸は、約２０塩基から約２０ｋｂのサイズを有する。一部の実施形態において、環状ポリリボ核酸は、線状ポリヌクレオチドの環状化を介して合成される。一部の実施形態において、環状ポリリボ核酸は、分解に実質的に抵抗性である。
[0021] 一部の態様において、医薬組成物は、標的に結合する結合部位を含み、標的は、リボ核酸（ＲＮＡ）結合モチーフを含む環状ポリリボヌクレオチド；及び薬学的に許容可能な担体又は賦形剤を含み、環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド及び少なくとも約５、１０、２０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、又は１０００個の連続非修飾ヌクレオチドを含む第１の部分を含む。一部の態様において、医薬組成物は、標的に結合する結合部位を含み、標的は、リボ核酸（ＲＮＡ）結合モチーフを含む環状ポリリボヌクレオチド；及び薬学的に許容可能な担体又は賦形剤を含み、環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド及び少なくとも約５、１０、２０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、又は１０００個の連続ヌクレオチドを含む第１の部分を含み、第１の部分は、シュードウリジンも５’−メチルシチジンも欠く。一部の実施形態において、結合部位は、標的を結合させる二次構造を有するアプタマー配列を含む。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチドよりも低い免疫原性を有する。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ＲＩＧ−Ｉ、ＴＬＲ−３、ＴＬＲ−７、ＴＬＲ−８、ＭＤＡ−５、ＬＧＰ−２、ＯＡＳ、ＯＡＳＬ、ＰＫＲ、及びＩＦＮ−βからなる群の少なくとも１つの発現又はシグナリング又は活性化により評価して、対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチドよりも少なくとも約１．１、１．２、１．３、１．５、１．６、１．８、２、２．２、２．５、２．８、３、３．２、３．３、３．５、３．８、４．０、４．２、４．５、４．８、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、又は１０．０倍低い免疫原性を有する。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチドよりも長い半減期を有する。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチドよりも少なくとも約１．２、１．３、１．５、１．６、１．８、２、２．２、２．５、２．８、３、３．２、３．３、３．５、３．８、４．０、４．２、４．５、４．８、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、又は１０．０倍長い半減期を有する。一部の実施形態において、半減期は、環状ポリリボヌクレオチド又は対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチドを細胞中に導入し、細胞内部の導入された環状ポリリボヌクレオチド又は対応する環状ポリリボヌクレオチドのレベルを測定することにより測定される。一部の実施形態において、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドは、Ｎ（６）メチルアデノシン（ｍ６Ａ）、５’−メチルシチジン、及びシュードウリジンからなる群から選択される。一部の実施形態において、少なくとも１つの修飾核酸は、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル、２’−デオキシ、Ｔ−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、Ｔ−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）、２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）、ロック核酸（ＬＮＡ）、エチレン核酸（ＥＮＡ）、ぺプチド核酸（ＰＮＡ）、１’，５’−アンヒドロヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、モルホリノ、メチルホスホネートヌクレオチド、チオールホスホネートヌクレオチド、及び２’−フルオロＮ３−Ｐ５’−ホスホラミダイトからなる群から選択される。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドのヌクレオチドの少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は９９％は、修飾ヌクレオチドである。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、非修飾ヌクレオチドからなる、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は細胞標的に結合する結合部位を含む。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、非修飾ヌクレオチドからなる内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含む。一部の実施形態において、結合部位は、非修飾ヌクレオチドからなる。一部の実施形態において、結合部位は、非修飾ヌクレオチドからなるＩＲＥＳを含む。一部の実施形態において、第１の部分は、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、細胞標的を結合させる結合部位を含む。一部の実施形態において、第１の部分は、ＩＲＥＳを含む。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上の発現配列を含む。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上の発現配列及びＩＲＥＳを含み、環状ポリリボヌクレオチドは、ＩＲＥＳ外部の５’−メチルシチジン、シュードウリジン、又はそれらの組合せを含む。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの１つ以上の発現配列は、対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチドよりも高い翻訳効率を有するように構成される。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの１つ以上の発現配列は、対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチドよりも少なくとも約０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．５、１．６、１．８、２、２．２、２．５、２．８、又は３倍高い翻訳効率を有する。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの１つ以上の発現配列は、修飾ヌクレオチドを含む第１の部分を有する対応する環状ポリリボヌクレオチドよりも高い翻訳効率を有する。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの１つ以上の発現配列は、１０％超の修飾ヌクレオチドを含む第１の部分を有する対応する環状ポリリボヌクレオチドよりも高い翻訳効率を有する。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの１つ以上の発現配列は、修飾ヌクレオチドを含む第１の部分を有する対応する環状ポリリボヌクレオチドよりも少なくとも約１．２、１．３、１．５、１．６、１．８、２、２．２、２．５、２．８、３、３．２、３．３、３．５、３．８、４．０、４．２、４．５、４．８、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、又は１０．０倍高い翻訳効率を有する。一部の実施形態において、翻訳効率は、環状ポリリボヌクレオチド若しくは対応する環状ポリリボヌクレオチドを含む細胞中で、又はインビトロ翻訳系（例えば、ウサギ網状赤血球溶解物）中のいずれかで測定される。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、開示される実施形態のいずれか１つの環状ポリリボヌクレオチドである。
[0022] 一部の態様において、治療の方法は、上記開示の実施形態のいずれか１つの医薬組成物を、疾患又は病態を有する対象に投与することを含む。
[0023] 一部の態様において、医薬組成物を産生する方法は、開示の実施形態のいずれか１つの環状ポリリボヌクレオチドを生成することを含む。
[0024] 一部の態様において、実施形態のいずれか１つの組成物は、担体、例えば、膜又は脂質二重層中で配合される。
[0025] 一部の態様において、開示の実施形態のいずれか１つの環状ポリリボヌクレオチドを作製する方法は、環状ポリリボヌクレオチドとしての核酸配列を有する線状ポリリボヌクレオチドを環状化させることを含む。
[0026] 一部の態様において、遺伝子操作細胞は、開示の実施形態のいずれか１つの組成物を含む。
参照による組み込み
[0027] 本明細書に挙げられる全ての刊行物、特許、及び特許出願は、それぞれの個々の刊行物、特許、又は特許出願が具体的且つ個別的に参照により組み込まれることが示されるのと同じ程度に参照により本明細書に組み込まれる。
[0028] 特許又は出願書類は、有色の少なくとも１つの図面を含有する。有色図面を有する本特許又は特許出願刊行物のコピーは、請求及び必要な費用の支払い時に省庁により提供される。本発明の実施形態の以下の詳細な説明は、添付の図面とともに精読される場合により良好に理解される。本発明の説明の目的のため、図面において、目下例示の実施形態が示される。しかしながら、本発明は、図面に示される実施形態の正確な配置及び手段に限定されるものではないことを理解すべきである。
[0029] 図１は、環状ポリリボヌクレオチド分子足場の一例を説明する。 [0030] 図２は、トランス−リボザイム環状ポリリボヌクレオチドの一例を説明する。 [0031] 図３は、環状ポリリボヌクレオチドによるタンパク質発現の模式図を説明する。 [0032] 図４は、脂質、例えば、膜のための環状ポリリボヌクレオチド分子足場の一例を説明する。 [0033] 図５Ａは、ＤＮＡのための環状ポリリボヌクレオチド分子足場の一例を説明する。 [0034] 図５Ｂは、配列特異的ＤＮＡ結合モチーフを有する環状ポリリボヌクレオチド分子足場の一例を説明する。ｃｉｒｃＲＮＡは、ＤＮＡ二重鎖の主溝に結合して第３の鎖の配向に基づく平行又は逆平行三重鎖構造を形成し得る。例示的な平行三重鎖構造は、ＴＡ・Ｕ、ＣＧ・Ｇ及びＣＧ・Ｃ（ＤＮＡ ＤＮＡ・ＲＮＡ）を含む。例示的な逆平行三重鎖構造は、ＴＡ・Ａ、ＴＡ・Ｕ及びＣＧ・Ｇ（ＤＮＡ ＤＮＡ・ＲＮＡ）を含む。 [0035] 図５Ｃは、転写因子結合及び／又はｍＲＮＡ転写の干渉のためのＤＨＦＲ遺伝子のエンハンサー領域に特異的なＤＮＡ結合モチーフを有する環状ポリリボヌクレオチド分子足場の一例を説明する。 [0036] 図５Ｄは、転写因子結合及び／又はｍＲＮＡ転写の干渉のためのＭＥＧ３遺伝子のエンハンサー領域に特異的なＤＮＡ結合モチーフを有する環状ポリリボヌクレオチド分子足場の一例を説明する。 [0037] 図５Ｅは、転写因子結合及び／又はｍＲＮＡ転写の干渉のためのＥＰＳ遺伝子のエンハンサー領域に特異的なＤＮＡ結合モチーフを有する環状ポリリボヌクレオチド分子足場の一例を説明する。 [0038] 図６は、ＲＮＡのための環状ポリリボヌクレオチド分子足場の一例を説明する。 [0039] 図７Ａは、標的ＲＮＡを隔離し、及び／又は分解するための標的ＲＮＡのための環状ポリリボヌクレオチド分子足場の一例を説明する。 [0040] 図７Ｂは、ＲＮＡ及びＲＮＡを標的化する酵素（例えば、ＲＮＡの分解を誘導するデキャッピング酵素）のための環状ポリリボヌクレオチド分子足場の一例を説明する。 [0041] 図７Ｃは、（例えば、標的遺伝子翻訳をドライブするための）ＲＮＡ、ＤＮＡ及びタンパク質のための環状ポリリボヌクレオチド分子足場の一例を説明する。 [0042] 図８は、タンパク質（例えば、ＦＵＳ／ＴＤＰ４３／ＡＴＸＮ２、ＰＲＰＦ８、ＧＥＭＩＮ５、ＣＵＧ ＢＰ１及びＬＩＮ２８Ａ）のための環状ポリリボヌクレオチド分子足場の一例を説明する。 [0043] 図９Ａは、修飾環状ＲＮＡが細胞中でタンパク質翻訳機構を結合させることを示す。 図９Ｂは、修飾環状ＲＮＡが細胞中でタンパク質翻訳機構を結合させることを示す。 図９Ｃは、修飾環状ＲＮＡが細胞中でタンパク質翻訳機構を結合させることを示す。 [0044] 図１０Ａは、修飾環状ＲＮＡが、免疫関連遺伝子（ＭＤＡ５、ＯＡＳ、及びＩＦＮ−β発現）の活性化により評価して細胞中で非修飾環状ＲＮＡと比較して低減した免疫タンパク質への結合を有することを示す。 図１０Ｂは、修飾環状ＲＮＡが、免疫関連遺伝子（ＭＤＡ５、ＯＡＳ、及びＩＦＮ−β発現）の活性化により評価して細胞中で非修飾環状ＲＮＡと比較して低減した免疫タンパク質への結合を有することを示す。 図１０Ｃは、修飾環状ＲＮＡが、免疫関連遺伝子（ＭＤＡ５、ＯＡＳ、及びＩＦＮ−β発現）の活性化により評価して細胞中で非修飾環状ＲＮＡと比較して低減した免疫タンパク質への結合を有することを示す。 [0045] 図１１は、ハイブリッド修飾環状ＲＮＡが、ＲＩＧ−Ｉ、ＭＤＡ５、ＩＦＮ−β、及びＯＡＳ発現により評価して細胞中で非修飾環状ＲＮＡと比較して低減した免疫原性を有することを示す。 [0046] 図１２は、環状ＲＮＡアプタマーが、線状アプタマーと比較して増加した細胞内送達及び小分子標的への向上した結合を示すことを実証する。 [0047] 図１３は、標的タンパク質への、タンパク質結合モチーフを含有する環状ＲＮＡの結合を説明する。 [0048] 図１４は、小分子−環状ＲＮＡコンジュゲートが、その小分子により標的化されるタンパク質に結合することを実証する。 [0049] 図１５は、環状ＲＮＡ−小分子コンジュゲートと特異的生物活性タンパク質との相互作用を実証する。 [0050] 図１６は、例えば、酵素（Ｅｎｚ）及び標的基質（基質）との複合体を形成するための足場として作用し得、酵素による標的基質の修飾（Ｍ）を容易にする２つの結合部位を有するｃｉｒｃＲＮＡを説明する。 [0051] 図１７は、スクランブル化結合アプタマー配列を有するＲＮＡが、ＮＦ−ｋＢのｐ５０サブユニットに対する結合親和性を示さなかった一方、ＮＦ−ｋＢ結合アプタマー配列を有する線状及び環状ＲＮＡの両方がｐ５０サブユニットに類似の親和性で結合したことを実証する電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）からの画像を示す。 [0052] 図１８は、ＮＦ−ｋＢ結合アプタマー配列を有する環状ＲＮＡによる処理が、その線状対応物と比較してＡ５４９細胞の細胞生存率の減少に導いたことを示す。 [0053] 図１９は、ドキソルビシン（ｄｏｘ）抵抗性Ａ５４９肺癌細胞系において、線状ＲＮＡ及びｄｏｘによる同時処理が２日目に細胞生存率を減少させ、環状アプタマー及びｄｏｘによる同時処理が１及び２日目の両方でより多い細胞死をもたらしたことを示す。 [0054] 図２０は、細胞中に送達され、ユビキチン系による分解のために細胞中で標的ＢＲＤ４タンパク質をタグ化する例示的な環状ＲＮＡを示す模式図である。 [0055] 図２１は、サリドマイド及びＪＱ１小分子を含有する環状ＲＮＡが、細胞中でＢＲＤ４を分解し得たことを実証するウエスタンブロット画像及び定量チャートを示す。 [0056] 図２２は、ＨｅＬａ細胞培養物への環状ＲＮＡ（エンドレスアプタマー）又は線状ＲＮＡ（線状アプタマー）の送達後の異なる時点においてＴＯ−１ビオチンに結合した場合のアプタマー蛍光を示す。蛍光画像（上段）は、環状ＲＮＡ（エンドレスアプタマー）又は線状ＲＮＡ（線状アプタマー）の送達の６時間、１日、及び１０日後にＴＯ−１ビオチンに結合した場合のアプタマー蛍光を示す。グラフ（下段）は、環状ＲＮＡ（エンドレスアプタマー）、線状ＲＮＡ（線状アプタマー）、又はＴＯ−１ビオチン単独（対照）の送達の６時間、１日、３日、５日、７日、１０日、及び１２日後のＨｅＬａ細胞培養物中の蛍光細胞の割合を示す。 [0057] 図２３は、ＨｕＲが、ＨｕＲ ＲＮＡ結合アプタマーモチーフを有する環状ＲＮＡを結合させ、ストレプトアビジンプルダウンが、結合アプタマーモチーフを有さない環状ＲＮＡ、ＨｕＲ ＲＮＡ結合アプタマーモチーフを有する環状ＲＮＡ、及びＲＮＡ結合アプタマーモチーフを有する環状ＲＮＡと比較してＲＮＡ結合アプタマーモチーフを有するＲＮＡを生じさせたことを示す。 [0058] 図２４はＨｕＲが、ＨｕＲ ＤＮＡ結合アプタマーモチーフを有する環状ＲＮＡを結合させ、ストレプトアビジンプルダウンが、結合アプタマーモチーフを有さない環状ＲＮＡ、ＨｕＲ ＤＮＡ結合アプタマーモチーフを有する環状ＲＮＡ、及びＤＮＡを有する環状ＲＮＡと比較してＤＮＡ結合アプタマーモチーフを有するＲＮＡを生じさせたことを示す。 [0059] 図２５は、１×ＨｕＲ結合モチーフ、２×ＨｕＲ結合モチーフ、及び３×ＨｕＲ結合モチーフを有する環状ＲＮＡと比較して低い、ＨｕＲ結合モチーフを有さない環状ＲＮＡからの分泌タンパク質発現を示す。
[0060] 本発明は、一般に、環状ポリリボヌクレオチドの医薬組成物及び製剤並びにそれらの使用に関する。
[0061] いくつかの態様が説明のための実施例用途を参照して以下に記載される。多数の具体的な詳細、関係、及び方法が、本明細書に記載の特徴部の十分な理解を提供するために記載されることを理解すべきである。しかしながら、当業者は、本明細書に記載の特徴部を、具体的な詳細の１つ以上を用いずに、又は他の方法を用いて実施することができることを容易に認識する。本明細書に記載の特徴部は、作用又はイベントの説明される順序に限定されるものではなく、そのため、一部の作用は、異なる順序で、及び／又は他の作用若しくはイベントと同時に生じ得る。さらに、本明細書に記載の特徴部に従う方法を実行するために全ての説明される作用又はイベントが要求されるわけではない。
[0062] 本明細書において使用される用語は、特定の場合を記載する目的のためのものにすぎず、限定するものではない。本明細書において使用される単数形「１つの（ａ）」、「１つの（an）」及び「その（the）」は、文脈が明らかにそうでないことを示さない限り、複数形も含むものとする。さらに、用語「含む（including）」、「含む（includes）」、「有する（having）」、「有する（has）」、「有する（witｈ）」、又はそれらの変形語が詳細な説明及び／又は特許請求の範囲のいずれかにおいて使用される程度で、そのような用語は用語「含む（comprising）」と同様の様式で包含的であるものとする。
定義
[0063] 本明細書において使用される用語「ｃｉｒｃＲＮＡ」又は「環状ＲＮＡ」又は「環状ポリリボヌクレオチド」は、共有又は非共有結合を介して環状構造を形成するポリリボヌクレオチドを指す。
[0064] 本明細書において使用される用語「エンクリプトゲン」は、免疫細胞による検出の低減、回避、及び／若しくは忌避を補助し、且つ／又は環状ポリリボヌクレオチドに対する免疫応答の誘導を低減させる環状ポリリボヌクレオチドの核酸配列を指す。
[0065] 本明細書において使用される用語「発現配列」は、産物、例えば、ぺプチド若しくはポリペプチドをコードする核酸配列、又は調節核酸を指す。
[0066] 本明細書において使用される用語「免疫タンパク質結合部位」は、免疫タンパク質に結合し、非内因性のものとしての環状ポリリボヌクレオチドのマスキングを補助するヌクレオチド配列を指す。
[0067] 本明細書において使用される用語「修飾リボヌクレオチド」は、糖、核酸塩基、又はヌクレオシド間結合の少なくとも１つの修飾を有するヌクレオチドを指す。
[0068] 本明細書において使用される語句「準ヘリカル構造」は、環状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部がヘリカル構造にフォールドする、環状ポリリボヌクレオチドの高次構造を指す。
[0069] 本明細書において使用される語句「準二本鎖二次構造」は、環状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部が二本鎖を作出する、環状ポリリボヌクレオチドの高次構造を指す。
[0070] 本明細書において使用される用語「調節配列」は、発現産物を改変する核酸配列を指す。
[0071] 本明細書において使用される用語「反復ヌクレオチド配列」は、ＤＮＡのストレッチ内の又はゲノム全体にわたる反復核酸配列を指す。一部の実施形態において、反復ヌクレオチド配列としては、ポリＣＡ又はポリＴＧ配列が挙げられる。一部の実施形態において、反復ヌクレオチド配列としては、イントロンのＡｌｕファミリー中の繰り返し配列が挙げられる。
[0072] 本明細書において使用される用語「複製エレメント」は、環状ポリリボヌクレオチドの複製に有用な、又はその転写を開始させる配列及び／又はモチーフを指す。
[0073] 本明細書において使用される用語「選択的翻訳配列」は、環状ポリリボヌクレオチド中の発現配列の翻訳を選択的に開始させ、又は活性化させる核酸配列を指す。
[0074] 本明細書において使用される用語「選択的分解配列」は、環状ポリリボヌクレオチド中の発現配列の翻訳を開始させる核酸配列を指す。
[0075] 本明細書において使用される用語「スタッガー（stagger）配列」は、翻訳の間にリボソームポージングを誘導するヌクレオチド配列を指す。一部の実施形態において、スタッガー配列は、強力なα−ヘリカル傾向を有するアミノ酸の非保存的配列とその後のコンセンサス配列−Ｄ（Ｖ／Ｉ）ＥｘＮＰＧ Ｐ（ｘは、任意のアミノ酸である）である。
[0076] 本明細書において使用される用語「実質的に抵抗性」は、参照と比較して少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の抵抗性を有するものである。
[0077] 本明細書において使用される用語「複合体」は、互いについての親和性を有する少なくとも２つの部分（例えば、化学物質又は生化学物質）間の会合物を指す。例えば、少なくとも２つの部分は、標的（例えば、タンパク質）及び環状ＲＮＡ分子である。
[0078] 「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、互換的に使用され、共有結合（例えば、アミド結合）により結合している２つ以上のアミノ酸のポリマーを指す。本明細書に記載のポリペプチドとしては、全長タンパク質（例えば、完全にプロセシングされたタンパク質）及びより短いアミノ酸配列（例えば、天然発生タンパク質の断片又は合成ポリペプチド断片）を挙げることができる。ポリペプチドは、天然発生アミノ酸（例えば、天然に合成されるぺプチド中に共通して見出され、一文字略号Ａ、Ｒ、Ｎ、Ｃ、Ｄ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ及びＶにより公知の２０個のアミノ酸のもの）及び非天然発生アミノ酸（例えば、天然で合成されるぺプチド中に共通して見出される２０個のアミノ酸のものでないアミノ酸、例として、合成アミノ酸、アミノ酸アナログ、及びアミノ酸模倣体）を含み得る。
[0079] 本明細書において使用される用語「結合部位」は、別の実体、例えば、化合物、タンパク質、核酸などと相互作用する環状ポリリボヌクレオチドの領域を指す。結合部位は、アプタマー配列を含み得る。
[0080] 本明細書において使用される用語「結合部分」は、結合部位により結合され得る標的の領域、例えば、領域、ドメイン、断片、エピトープ、又は核酸（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド）の一部、化合物、小分子（例えば、薬物）、アプタマー、ポリペプチド、タンパク質、脂質、炭水化物、抗体、ウイルス、ウイルス粒子、膜、多成分複合体、細胞小器官、細胞、他の細胞部分、それらの任意の断片、及びそれらの任意の組合せを指す。
[0081] 本明細書において使用される用語「アプタマー配列」は、標的分子に特異的に結合する非天然発生又は合成オリゴヌクレオチドを指す。典型的には、アプタマーは、２０〜２５０ヌクレオチドである。典型的には、アプタマーは、配列相同性ではなく二次構造を介してその標的に結合する。
[0082] 本明細書において使用される用語「小分子」は、９００ダルトン以下の分子量を有する有機化合物を指す。小分子は、細胞プロセスをモジュレートし得、又はフルオロフォアである。
[0083] 本明細書において使用される用語「コンジュゲーション部分」は、コンジュゲーションの方法における使用のための官能基を含む修飾ヌクレオチドを指す。
[0084] 本明細書において使用される用語「線状対応物」は、環状ポリリボヌクレオチドと同じヌクレオチド配列及び核酸修飾を有し、２つのフリー末端を有するポリリボヌクレオチド（すなわち、環状化ポリリボヌクレオチドの非環状化バージョン）を指す。一部の実施形態において、線状対応物は、５’キャップをさらに含む。一部の実施形態において、線状対応物は、ポリアデノシンテールをさらに含む。一部の実施形態において、線状対応物は、３’ＵＴＲをさらに含む。一部の実施形態において、線状対応物は、５’ＵＴＲをさらに含む。
環状ポリリボヌクレオチド
[0085] 本明細書に記載の環状ポリリボヌクレオチド（ｃｉｒｃＲＮＡ）は、共有又は非共有結合を介して連続構造を形成するポリリボヌクレオチドである。
[0086] 本明細書に記載の本発明は、合成ｃｉｒｃＲＮＡを含む組成物及びその使用方法を含む。環状構造に起因して、ｃｉｒｃＲＮＡは、対応する線状ＲＮＡと比較して改善された安定性、増加した半減期、低減した免疫原性、及び／又は改善された機能性（例えば、本明細書に記載の機能）を有し得る。一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、細胞への環状ＲＮＡの送達の少なくとも５日後に検出可能である。一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、細胞への環状ＲＮＡの送達の６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、又は１６日後に検出可能である。環状ＲＮＡは、当技術分野において公知の任意の技術を使用して検出することができる。
[0087] 一部の実施形態において、ｃｉｒｃＲＮＡは、環状アプタマーである。一実施形態において、ｃｉｒｃＲＮＡは、１つ以上の標的に結合する１つ以上の結合部位を含む。一実施形態において、ｃｉｒｃＲＮＡは、アプタマー配列を含む。一実施形態において、ｃｉｒｃＲＮＡは、ＤＮＡ標的及びタンパク質標的の両方を結合させ、例えば、転写を媒介する。別の実施形態において、ｃｉｒｃＲＮＡは、タンパク質複合体を引き合わせ、例えば、翻訳後修飾又はシグナル伝達を媒介する。別の実施形態において、ｃｉｒｃＲＮＡは、２つ以上の異なる標的、例えば、タンパク質を結合させ、例えば、それらのタンパク質を細胞質にシャトリングし、又は標的の１つ以上の分解を媒介する。
[0088] 一部の実施形態において、ｃｉｒｃＲＮＡは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びタンパク質の少なくとも１つを結合させ、それにより細胞プロセスを調節する（例えば、タンパク質発現を変更し、遺伝子発現をモジュレートし、細胞シグナリングをモジュレートするなど）。一部の実施形態において、合成ｃｉｒｃＲＮＡは、標的又は選択ＤＮＡ、ＲＮＡ若しくはタンパク質の少なくとも１つの部分、例えば、結合部分との相互作用のための結合部位を含み、それにより内因性対応物との結合において競合する。
[0089] 一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、細胞プロセスを調節する（例えば、タンパク質発現を変更し、遺伝子発現をモジュレートし、細胞シグナリングをモジュレートするなど）複合体を形成する。一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、標的（例えば、転写因子）に結合することにより細胞毒性剤（例えば、化学療法剤）に対して細胞を感作させ、低減した細胞生存率をもたらす。例えば、細胞毒性剤に対する細胞の感作は、細胞毒性剤及び環状ＲＮＡの送達後に減少した細胞生存率をもたらす。一部の実施形態において、減少した細胞生存率は、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％、又はそれらの間の任意の割合だけ減少する。
[0090] 一部の実施形態において、複合体は、細胞への環状ＲＮＡの送達の６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、又は１６日後に検出可能である。
[0091] 一実施形態において、合成ｃｉｒｃＲＮＡは、ｍｉＲＮＡを結合させ、且つ／又は隔離する。別の実施形態において、合成ｃｉｒｃＲＮＡは、タンパク質を結合させ、且つ／又は隔離する。別の実施形態において、合成ｃｉｒｃＲＮＡは、ｍＲＮＡを結合させ、且つ／又は隔離する。別の実施形態において、合成ｃｉｒｃＲＮＡは、リボソームを結合させ、且つ／又は隔離する。別の実施形態において、合成ｃｉｒｃＲＮＡは、ｃｉｒｃＲＮＡを結合させ、且つ／又は隔離する。別の実施形態において、合成ｃｉｒｃＲＮＡは、長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）又は任意の他の非コードＲＮＡ、例えば、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、長鎖非コードＲＮＡ、ｓｈＲＮＡを結合させ、且つ／又は隔離する。ｃｉｒｃＲＮＡは、結合及び／又は隔離部位の他、結合及び／又は隔離ＲＮＡ及び／又はタンパク質の分解をもたらす分解エレメントを含み得る。
[0092] 一実施形態において、ｃｉｒｃＲＮＡは、ｌｎｃＲＮＡ又はｌｎｃＲＮＡの配列を含み、例えば、ｃｉｒｃＲＮＡは、天然発生非環状ｌｎｃＲＮＡの配列又はその断片を含む。一実施形態において、ｌｎｃＲＮＡ又はｌｎｃＲＮＡの配列は、スペーサー配列を用いて又は用いずに環状化されて合成ｃｉｒｃＲＮＡを形成する。
[0093] 一実施形態において、ｃｉｒｃＲＮＡは、リボザイム活性を有する。一実施形態において、ｃｉｒｃＲＮＡは、リボザイムとして作用させ、病原性又は内因性ＲＮＡ、ＤＮＡ、小分子又はタンパク質を開裂させるために使用することができる。一実施形態において、ｃｉｒｃＲＮＡは、酵素活性を有する。一実施形態において、合成ｃｉｒｃＲＮＡは、ＲＮＡ（例えば、ウイルスＲＮＡ）を特異的に認識し、開裂し得る。別の実施形態において、ｃｉｒｃＲＮＡは、タンパク質を特異的に認識し、開裂し得る。別の実施形態において、ｃｉｒｃＲＮＡは、小分子を特異的に認識し、分解し得る。
[0094] 一実施形態において、ｃｉｒｃＲＮＡは、自己犠牲（immolating）又は自己開裂又は開裂性ｃｉｒｃＲＮＡである。一実施形態において、ｃｉｒｃＲＮＡは、ＲＮＡ、例えば、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、長鎖非コードＲＮＡ、ｓｈＲＮＡを送達するために使用することができる。一実施形態において、合成ｃｉｒｃＲＮＡは、（１）自己開裂性エレメント（例えば、ハンマーヘッド、スプライシングエレメント）、（２）開裂リクルートメント部位（例えば、ＡＤＡＲ）、（３）分解性リンカー（例えば、グリセロール）、（４）化学リンカー、及び／又は（５）スペーサー配列により離隔されるマイクロＲＮＡから構成される。別の実施形態において、合成ｃｉｒｃＲＮＡは、（１）自己開裂性エレメント（例えば、ハンマーヘッド、スプライシングエレメント）、（２）開裂リクルートメント部位（例えば、ＡＤＡＲ）、（３）分解性リンカー（例えば、グリセロール）、（４）化学リンカー、及び／又は（５）スペーサー配列により離隔されるｓｉＲＮＡから構成される。
[0095] 一実施形態において、ｃｉｒｃＲＮＡは、転写／複製可能ｃｉｒｃＲＮＡである。このｃｉｒｃＲＮＡは、任意のタイプのＲＮＡをコードし得る。一実施形態において、合成ｃｉｒｃＲＮＡは、アンチセンスｍｉＲＮＡ及び転写エレメントを有する。一実施形態において、転写後、線状機能ｍｉＲＮＡがｃｉｒｃＲＮＡから生成される。一実施形態において、ｃｉｒｃＲＮＡは、翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドである。
[0096] 一実施形態において、ｃｉｒｃＲＮＡは、翻訳エレメントとの組合せにおける上記特質の１つ以上を有する。
[0097] 一部の実施形態において、ｃｉｒｃＲＮＡは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、ｃｉｒｃＲＮＡは、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、又は８０％の修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、ｃｉｒｃＲＮＡは、実質的に全て（例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、若しくは９９％超、又は約１００％）の修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、ｃｉｒｃＲＮＡは、修飾ヌクレオチド及び非修飾連続ヌクレオチドの一部を含み、それはハイブリッド修飾ｃｉｒｃＲＮＡと称することができる。非修飾連続ヌクレオチドの一部は、ハイブリッド修飾ｃｉｒｃＲＮＡ中のタンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は細胞標的を結合させるように構成される非修飾結合部位であり得る。非修飾連続ヌクレオチドの一部は、ハイブリッド修飾ｃｉｒｃＲＮＡ中の非修飾ＩＲＥＳであり得る。他の実施形態において、ｃｉｒｃＲＮＡは修飾ヌクレオチドを欠き、それは非修飾ｃｉｒｃＲＮＡと称することができる。
標的
[0098] ｃｉｒｃＲＮＡは、標的のための、例えば、標的の結合部分のための少なくとも１つの結合部位を含み得る。ｃｉｒｃＲＮＡは、標的に結合する少なくとも１つのアプタマー配列を含み得る。一部の実施形態において、ｃｉｒｃＲＮＡは、１つ以上の標的のための１つ以上の結合部位を含む。標的としては、限定されるものではないが、核酸（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド）、小分子（例えば、薬物、フルオロフォア、代謝産物）、アプタマー、ポリペプチド、タンパク質、脂質、炭水化物、抗体、ウイルス、ウイルス粒子、膜、多成分複合体、細胞小器官、細胞、他の細胞部分、それらの任意の断片、及びそれらの任意の組合せが挙げられる。（例えば、Fredriksson et al., (2002) Nat Biotech 20: 473-77; Gullberg et al., (2004) PNAS, 101: 8420-24参照）。例えば、標的は、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、１つ以上の二本鎖領域及び１つ以上の一本鎖領域を含むＤＮＡ又はＲＮＡ、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド、小分子、アプタマー、ポリペプチド、タンパク質、脂質、炭水化物、抗体、抗体断片、抗体の混合物、ウイルス粒子、膜、多成分複合体、細胞、細胞部分、それらの任意の断片、又はそれらの任意の組合せである。
[0099] 一部の実施形態において、標的は、ポリペプチド、タンパク質、又はそれらの任意の断片である。例えば、標的は、精製ポリペプチド、単離ポリペプチド、融合タグ化ポリペプチド、細胞又はウイルス又はビリオンの膜に付着している又はそれを貫通するポリペプチド、細胞質タンパク質、細胞内タンパク質、細胞外タンパク質、キナーゼ、チロシンキナーゼ、セリン／トレオニンキナーゼ、ホスファターゼ、アロマターゼ、ホスホジエステラーゼ、シクラーゼ、ヘリカーゼ、プロテアーゼ、オキシドレダクターゼ、レダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、グリコシラーゼ、細胞外マトリックスタンパク質、リガーゼ、ユビキチンリガーゼ、翻訳後修飾に影響を与える任意のリガーゼ、イオントランスポーター、チャネル、細孔、アポトーシスタンパク質、細胞接着タンパク質、病原性タンパク質、異常発現タンパク質、転写因子、転写調節因子、翻訳タンパク質、エピジェネティック因子、エピジェネティック調節因子、クロマチン調節因子、シャペロン、分泌タンパク質、リガンド、ホルモン、サイトカイン、ケモカイン、核タンパク質、受容体、膜貫通受容体、受容体チロシンキナーゼ、Ｇタンパク質共役受容体、成長因子受容体、核内受容体、ホルモン受容体、シグナル伝達因子、抗体、膜タンパク質、内在性膜タンパク質、表在性膜タンパク質、細胞壁タンパク質、球状タンパク質、繊維状タンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質、染色体タンパク質、癌原遺伝子、癌遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、それらの任意の断片、又はそれらの任意の組合せであり得る。一部の実施形態において、標的は、異種ポリペプチドである。一部の実施形態において、標的は、分子技術、例えば、形質移入を使用して細胞中で過剰発現されるタンパク質である。一部の実施形態において、標的は、組換えポリペプチドである。例えば、標的は、細菌（例えば、大腸菌）、酵母、哺乳動物、又は昆虫細胞から産生される試料中に存在する（例えば、生物体により過剰発現されるタンパク質）。一部の実施形態において、標的は、突然変異、挿入、欠失、又は多型を有するポリペプチドである。一部の実施形態において、標的は、細胞（例えば、健常細胞又は疾患若しくは病態と関連する細胞）により天然に発現されるポリペプチドである。一部の実施形態において、標的は、生物体を免疫化するため又は生物体中の免疫応答を生成するために、例えば、抗体産生に使用される抗原、例えば、ポリペプチドである。
[0100] 一部の実施形態において、標的は、抗体である。抗体は、別の分子の特定の空間及び極性組織に特異的に結合し得る。抗体は、モノクローナル、ポリクローナル、又は組換え抗体であり得、当技術分野において周知の技術、例えば、宿主の免疫化及び血清の回収により（ポリクローナル）、又は連続継代性ハイブリッド細胞系を調製し、分泌タンパク質を回収することにより（モノクローナル）、又は少なくとも天然抗体の特異的結合に要求されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、若しくはその突然変異誘発バージョンをクローニング及び発現させることにより調製することができる。天然発生抗体は、ジスルフィド結合により相互連結される少なくとも２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を含むタンパク質であり得る。それぞれの重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び重鎖定常領域から構成され得る。重鎖定常領域は、３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３を含み得る。それぞれの軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び軽鎖定常領域を含み得る。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬを含み得る。ＶＨ及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称されるより保存された領域が散在する相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変の領域にさらに下位分類することができる。それぞれのＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端にかけて配置される３つのＣＤＲ及び４つのＦＲから以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４で構成され得る。抗体の定常領域は、宿主組織又は因子、例として、免疫系の種々の細胞（例えば、エフェクター細胞）及び古典的補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。抗体は、任意のアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、クラス（例えば、ｌｇＧ１、ｌｇＧ２、ｌｇＧ３、ｌｇＧ４、ｌｇＡ１及びｌｇＡ２）、サブクラス又はそれらの改変バージョンのものであり得る。抗体としては、完全免疫グロブリン又はその断片を挙げることができる。抗体断片は、結合部分、例えば、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ以上の断片を指し得る。さらに、免疫グロブリン又はその断片の凝集体、ポリマー、及びコンジュゲートも、特定の分子についての結合親和性が維持される限り含まれる。抗体断片の例としては、Ｆａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなる一価断片；Ｆ（ａｂ）２断片、ヒンジ領域におけるジスルフィド架橋により結合している２つのＦａｂ断片を含む二価断片；ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖ断片；ＶＨドメインからなる単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）断片（Ward et al., (1989) Nature 341: 544-46)；並びに単離ＣＤＲ並びにＶＬ及びＶＨ領域が対合して一価分子を形成する単鎖断片（ｓｃＦｖ）（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知；例えば、Bird et al., (1988) Science 242: 423-26；及びHuston et al., (1988) PNAS 85: 5879-83参照）が挙げられる。したがって、抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄＡｂなどが挙げられる。２つのドメインＶＬ及びＶＨは別個の遺伝子によりコードされるが、それらは組換え法を使用して、それらを単一タンパク質鎖として作製することができる人工ぺプチドリンカーにより結合することができる。このような単鎖抗体は、１つ以上の抗原結合部分を含む。抗体は、多価抗体、例えば、二価、三価、四価、五価、六価、七価、又は八価抗体であり得る。抗体は、多重特異的抗体であり得る。例えば、二重特異的、三重特異的、四重特異的、五重特異的、六重特異的、七重特異的、又は八重特異的抗体を、例えば、任意の２つ以上の抗原結合剤（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ＩｇＧ）の組合せを組換え結合することにより生成することができる。多重特異的抗体は、２つ以上の標的、例えば、分解機構及び分解の標的基質、又はユビキチンリガーゼ及びユビキチン化の基質を接近させるために使用することができる。これらの抗体断片は、当業者に公知の慣用の技術を使用して得ることができ、断片は、インタクト抗体と同じ様式で有益性についてスクリーニングすることができる。抗体は、ヒト、ヒト化、キメラ、単離、イヌ、ネコ、ロバ、ヒツジ、任意の植物、動物、又は哺乳動物抗体であり得る。
[0101] 一部の実施形態において、標的は、リボヌクレオチド及び／又はデオキシリボヌクレオチド（アデニン、グアニン、チミン、又はシトシン）のポリマー形態、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）である。ＤＮＡとしては、線状ＤＮＡ分子（例えば、制限断片）、ウイルス、プラスミド、及び染色体中で見出される二本鎖ＤＮＡが挙げられる。一部の実施形態において、ポリヌクレオチド標的は、一本鎖、二本鎖、小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、染色体、遺伝子、非コードゲノム配列、ゲノムＤＮＡ（例えば、断片化ゲノムＤＮＡ）、精製ポリヌクレオチド、単離ポリヌクレオチド、ハイブリダイズポリヌクレオチド、転写因子結合部位、ミトコンドリアＤＮＡ、リボソームＲＮＡ、真核生物ポリヌクレオチド、原核生物ポリヌクレオチド、合成ポリヌクレオチド、ライゲートポリヌクレオチド、組換えポリヌクレオチド、核酸アナログを含有するポリヌクレオチド、メチル化ポリヌクレオチド、脱メチル化ポリヌクレオチド、それらの任意の断片、又はそれらの任意の組合せが挙げられる。一部の実施形態において、標的は、組換えポリヌクレオチドである。一部の実施形態において、標的は、異種ポリヌクレオチドである。例えば、標的は、細菌（例えば、大腸菌）、酵母、哺乳動物、又は昆虫細胞から産生されるポリヌクレオチド（例えば、その生物体に対して異種のポリヌクレオチド）である。一部の実施形態において、標的は、突然変異、挿入、欠失、又は多型を有するポリヌクレオチドである。
[0102] 一部の実施形態において、標的は、アプタマーである。アプタマーは、高い特異性及び親和性で結合部分又は標的分子、例えば、タンパク質を結合させる単離核酸分子である。アプタマーは、その所与の標的を特異的に結合するための化学的接触を提供する、ある立体構造で保持される三次元構造である。アプタマーは核酸ベース分子であるが、アプタマー及び他の核酸分子、例えば、遺伝子及びｍＲＮＡ間には根本的な差異が存在する。後者の場合、核酸構造は、その線状塩基配列を介して情報をコードし、したがってこの配列は情報保存の機能に重要である。完全に対照的に、標的分子の特異的結合に基づくアプタマー機能は、保存線状塩基配列（非コード配列）に完全に依存するわけではなく、特定の二次／三次／四次構造に依存する。アプタマーが有し得る任意のコード潜在性は偶発的であり、アプタマーのそのコグネイト標的への結合において役割を担うとは考えられない。アプタマーは、あるタンパク質に結合する天然発生核酸配列から区別される。これらの天然発生核酸配列は、天然発生核酸の転写、翻訳、及び輸送に関与するタンパク質の特殊サブグループ（例えば、核酸結合タンパク質）に結合する生物体のゲノム内に埋め込まれた天然発生配列である。他方、アプタマーは、非天然発生核酸分子である。核酸結合タンパク質を結合させるアプタマーを同定することができる一方、ほとんどの場合、そのようなアプタマーは、天然で核酸結合タンパク質により認識される配列との配列同一性をほとんど有さず、又は有さない。より重要なことに、アプタマーは、実質的にあらゆるタンパク質（核酸結合タンパク質だけでない）及びほぼあらゆる目的パートナー、例として、小分子、炭水化物、ぺプチドなどを結合させ得る。ほとんどのパートナーについて、タンパク質についても、それが結合する天然発生核酸配列は存在しない。このような配列を有するパートナー、例えば、核酸結合タンパク質について、そのような配列は、タイトに結合するアプタマーと比較して天然で使用される比較的低い結合親和性の結果としてアプタマーと異なる。アプタマーは、選択パートナーに特異的に結合し、パートナーの活性又は結合相互作用を、例えば、結合を介してモジュレートし得、アプタマーは、そのパートナーが機能する能力を遮断し得る。パートナーへの特異的結合の機能的特性は、アプタマーの固有の特性である。アプタマーは、６〜３５ｋＤａであり得る。アプタマーは、２０〜２５０ヌクレオチドであり得る。アプタマーは、マイクロモル濃度からナノモル濃度以下の親和性でそのパートナーを結合させ得、密接に関連する標的を区別し得る（例えば、アプタマーは、同じ遺伝子ファミリーからの関連タンパク質を選択的に結合し得る）。一部の場合、アプタマーは、１つの分子にのみ結合する。一部の場合、アプタマーは、目的分子のファミリーメンバーを結合させる。一部の場合、アプタマーは、複数の異なる分子に結合する。アプタマーは、一般に見られる分子間相互作用、例えば、水素結合、静電相補性、疎水性接触、及び立体排除を使用して特異的パートナーと結合し得る。アプタマーは、治療薬及び診断薬としての使用のための多数の所望の特徴、例として、高い特異性及び親和性、低い免疫原性、生物学的効力、並びに優れた薬物動態特性を有する。アプタマーは、共有結合している相補性ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションから形成される分子ステム及びループ構造（例えば、ヘアピンループ構造）を含み得る。ステムは、ハイブリダイズポリヌクレオチドを含み、ループは、２つの相補性ポリヌクレオチドを共有結合させる領域である。アプタマーは、アプタマー配列を含む線状リボ核酸（例えば、線状アプタマー）又はアプタマー配列を含む環状ポリリボ核酸（例えば、環状アプタマー）であり得る。
[0103] 一部の実施形態において、標的は、小分子である。例えば、小分子は、大環状分子、阻害剤、薬物、又は化合物であり得る。一部の実施形態において、小分子は、５つ以下の水素結合供与体を含有する。一部の実施形態において、小分子は、１０個以下の水素結合受容体を含有する。一部の実施形態において、小分子は、５００ダルトン以下の分子量を有する。一部の実施形態において、小分子は、約１８０〜５００ダルトンの分子量を有する。一部の実施形態において、小分子は、５以下のオクタノール／水分配係数ｌｏｐ Ｐを含有する。一部の実施形態において、小分子は、−０．４〜５．６の分配係数ｌｏｇ Ｐを有する。一部の実施形態において、小分子は、４０〜１３０のモル屈折率を有する。一部の実施形態において、小分子は、約２０〜約７０個の原子を含有する。一部の実施形態において、小分子は、１４０オングストローム２以下の極性表面積を有する。
[0104] 一部の実施形態において、標的、細胞である。例えば、標的は、インタクト細胞、化合物（例えば、薬物）により処理された細胞、固定細胞、溶解細胞、又はそれらの任意の組合せである。一部の実施形態において、標的は、単一細胞である。一部の実施形態において、標的は、複数の細胞である。
[0105] 一部の実施形態において、ｃｉｒｃＲＮＡは、単一標的又は複数（例えば、２つ以上）の標的に対する結合部位を含む。一実施形態において、単一ｃｉｒｃＲＮＡは、単一標的のための２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上の異なる結合部位を含む。一実施形態において、単一ｃｉｒｃＲＮＡは、単一標的のための同じ結合部位の２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上を含む。一実施形態において、単一ｃｉｒｃＲＮＡは、１つ以上の異なる標的のための２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上の異なる結合部位を含む。一実施形態において、２つ以上の標的は、試料、例えば、混合物又は標的のライブラリー中に存在し、試料は、２つ以上の標的に結合する２つ以上の結合部位を含むｃｉｒｃＲＮＡを含む。
[0106] 一部の実施形態において、単一標的又は複数（例えば、２つ以上）の標的は、複数の結合部分を有する。一実施形態において、単一標的は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上の結合部分を有し得る。一実施形態において、２つ以上の標的は、試料、例えば、混合物又は標的のライブラリー中に存在し、試料は、２つ以上の結合部分を含む。一部の実施形態において、単一標的又は複数の標的は、複数の異なる結合部分を含む。例えば、複数のものは、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００、１，０００、２，０００、３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、１０，０００、１１，０００、１２，０００、１３，０００、１４，０００、１５，０００、１６，０００、１７，０００、１８，０００、１９，０００、２０，０００、２５，０００、又は３０，０００個の結合部分を含み得る。
[0107] 標的は、少なくとも２つの異なる結合部分を含む複数の結合部分を含み得る。例えば、結合部分は、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、２，０００、３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、１０，０００、１１，０００、１２，０００、１３，０００、１４，０００、１５，０００、１６，０００、１７，０００、１８，０００、１９，０００、２０，０００、２１，０００、２２，０００、２３，０００、２４，０００、又は２５，０００個の異なる結合部分を含む複数の結合部分を含み得る。
結合部位及び結合部分
[0108] 一部の例において、ｃｉｒｃＲＮＡは、１つの結合部位を含む。結合部位は、アプタマー配列を含み得る。一部の例において、ｃｉｒｃＲＮＡは、少なくとも２つの結合部位を含む。例えば、ｃｉｒｃＲＮＡは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個以上の結合部位を含み得る。一部の実施形態において、本明細書に記載のｃｉｒｃＲＮＡは、１つ以上の標的、又は１つ以上の標的の１つ以上の結合部分を結合させる分子足場である。それぞれの標的は、限定されるものではないが、異なる又は同じ核酸（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド）、小分子（例えば、薬物）、アプタマー、ポリペプチド、タンパク質、脂質、炭水化物、抗体、ウイルス、ウイルス粒子、膜、多成分複合体、細胞、細胞部分、それらの任意の断片、及びそれらの任意の組合せであり得る。一部の実施形態において、１つ以上の結合部位は、同じ標的に結合する。一部の実施形態において、１つ以上の結合部位は、同じ標的の１つ以上の結合部分に結合する。一部の実施形態において、１つ以上の結合部位は、１つ以上の異なる標的に結合する。一部の実施形態において、１つ以上の結合部位は、異なる標的の１つ以上の結合部分に結合する。一部の実施形態において、ｃｉｒｃＲＮＡは、１つ以上の標的への１つ以上の結合のための足場として作用する。一部の実施形態において、ｃｉｒｃＲＮＡは、１つ以上の標的の１つ以上の結合部分のための足場として作用する。一部の実施形態において、ｃｉｒｃＲＮＡは、１つ以上の１つ以上の標的に特異的に結合することにより細胞プロセスをモジュレートする。一部の実施形態において、ｃｉｒｃＲＮＡは、１つ以上の標的の１つ以上の結合部分に特異的に結合することにより細胞プロセスをモジュレートする。一部の実施形態において、ｃｉｒｃＲＮＡは、１つ以上の標的に特異的に結合することにより細胞プロセスをモジュレートする。一部の実施形態において、本明細書に記載のｃｉｒｃＲＮＡは、１つ以上の目的特異的標的のための結合部位を含む。一部の実施形態において、ｃｉｒｃＲＮＡは、複数の結合部位又はそれぞれの目的標的のための結合部位の組合せを含む。一部の実施形態において、ｃｉｒｃＲＮＡは、複数の結合部位又はそれぞれの目的結合部分のための結合部位の組合せを含む。例えば、ｃｉｒｃＲＮＡは、ポリペプチド標的のための１つ以上の結合部位を含み得る。一部の実施形態において、ｃｉｒｃＲＮＡは、ポリヌクレオチド標的、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ、ｍＲＮＡ標的、ｒＲＮＡ標的、ｔＲＮＡ標的、又はゲノムＤＮＡ標的のための１つ以上の結合部位を含む。
[0109] 一部の例において、ｃｉｒｃＲＮＡは、一本鎖ＤＮＡのための結合部位を含む。一部の例において、ｃｉｒｃＲＮＡは、二本鎖ＤＮＡのための結合部位を含む。一部の例において、ｃｉｒｃＲＮＡは、抗体のための結合部位を含む。一部の例において、ｃｉｒｃＲＮＡは、ウイルス粒子のための結合部位を含む。一部の例において、ｃｉｒｃＲＮＡは、小分子のための結合部位を含む。一部の例において、ｃｉｒｃＲＮＡは、細胞中で又は細胞上で結合する結合部位を含む。一部の例において、ｃｉｒｃＲＮＡは、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドのための結合部位を含む。一部の例において、ｃｉｒｃＲＮＡは、メチル化ポリヌクレオチドのための結合部位を含む。一部の例において、ｃｉｒｃＲＮＡは、非メチル化ポリヌクレオチドのための結合部位を含む。一部の例において、ｃｉｒｃＲＮＡは、アプタマーのための結合部位を含む。一部の例において、ｃｉｒｃＲＮＡは、ポリペプチドのための結合部位を含む。一部の例において、ｃｉｒｃＲＮＡは、ポリペプチド、タンパク質、タンパク質断片、タグ化タンパク質、抗体、抗体断片、小分子、ウイルス粒子（例えば、膜貫通タンパク質を含むウイルス粒子）、又は細胞のための結合部位を含む。一部の例において、ｃｉｒｃＲＮＡは、一本鎖ＤＮＡ上の結合部分のための結合部位を含む。一部の例において、ｃｉｒｃＲＮＡは、二本鎖ＤＮＡ上の結合部分のための結合部位を含む。一部の例において、ｃｉｒｃＲＮＡは、抗体上の結合部分のための結合部位を含む。一部の例において、ｃｉｒｃＲＮＡは、ウイルス粒子上の結合部分のための結合部位を含む。一部の例において、ｃｉｒｃＲＮＡは、小分子上の結合部分のための結合部位を含む。一部の例において、ｃｉｒｃＲＮＡは、細胞中又は細胞上の結合部分のための結合部位を含む。一部の例において、ｃｉｒｃＲＮＡは、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド上の結合部分のための結合部位を含む。一部の例において、ｃｉｒｃＲＮＡは、メチル化ポリヌクレオチド上の結合部分のための結合部位を含む。一部の例において、ｃｉｒｃＲＮＡは、非メチル化ポリヌクレオチド上の結合部分のための結合部位を含む。一部の例において、ｃｉｒｃＲＮＡは、アプタマー上の結合部分のための結合部位を含む。一部の例において、ｃｉｒｃＲＮＡは、ポリペプチド上の結合部分のための結合部位を含む。一部の例において、ｃｉｒｃＲＮＡは、ポリペプチド、タンパク質、タンパク質断片、タグ化タンパク質、抗体、抗体断片、小分子、ウイルス粒子（例えば、膜貫通タンパク質を含むウイルス粒子）、又は細胞上の結合部分のための結合部位を含む。
[0110] 一部の例において、結合部位は、少なくとも２つのアミド結合を含む標的の一部に結合する。一部の例において、結合部位は、ホスホジエステル結合を含む標的の一部に結合しない。一部の例において、標的の一部は、ＤＮＡでもＲＮＡでもない。一部の例において、結合部分は、少なくとも２つのアミド結合を含む。一部の例において、結合部分は、ホスホジエステル結合を含まない。一部の例において、結合部分は、ＤＮＡでもＲＮＡでもない。
[0111] 本明細書に提供されるｃｉｒｃＲＮＡは、複合体上の結合部分のための１つ以上の結合部位を含み得る。本明細書に提供されるｃｉｒｃＲＮＡは、複合体を形成するための標的のための１つ以上の結合部位を含み得る。例えば、本明細書に提供されるｃｉｒｃＲＮＡは、ｃｉｒｃＲＮＡ及び標的間の複合体を形成するための足場として作用し得る。一部の実施形態において、ｃｉｒｃＲＮＡは、単一標的との複合体を形成する。一部の実施形態において、ｃｉｒｃＲＮＡは、２つの標的との複合体を形成する。一部の実施形態において、ｃｉｒｃＲＮＡは、３つの標的との複合体を形成する。一部の実施形態において、ｃｉｒｃＲＮＡは、４つの標的との複合体を形成する。一部の実施形態において、ｃｉｒｃＲＮＡは、５つ以上の標的との複合体を形成する。一部の実施形態において、ｃｉｒｃＲＮＡは、２つ以上の標的の複合体との複合体を形成する。一部の実施形態において、ｃｉｒｃＲＮＡは、３つ以上の標的の複合体との複合体を形成する。一部の実施形態において、２つ以上のｃｉｒｃＲＮＡは、単一標的との複合体を形成する。一部の実施形態において、２つ以上のｃｉｒｃＲＮＡは、２つ以上の標的との複合体を形成する。一部の実施形態において、第１のｃｉｒｃＲＮＡは、第１の標的の第１の結合部分及び第２の標的の第２の異なる結合部分との複合体を形成する。一部の実施形態において、第１のｃｉｒｃＲＮＡは、第１の標的の第１の結合部分との複合体を形成し、第２のｃｉｒｃＲＮＡは、第２の標的の第２の結合部分との複合体を形成する。
[0112] 一部の実施形態において、ｃｉｒｃＲＮＡは、１つ以上の抗体−ポリペプチド複合体、ポリペプチド−ポリペプチド複合体、ポリペプチド−ＤＮＡ複合体、ポリペプチド−ＲＮＡ複合体、ポリペプチド−アプタマー複合体、ウイルス粒子−抗体複合体、ウイルス粒子−ポリペプチド複合体、ウイルス粒子−ＤＮＡ複合体、ウイルス粒子−ＲＮＡ複合体、ウイルス粒子−アプタマー複合体、細胞−抗体複合体、細胞−ポリペプチド複合体、細胞−ＤＮＡ複合体、細胞−ＲＮＡ複合体、細胞−アプタマー複合体、小分子−ポリペプチド複合体、小分子−ＤＮＡ複合体、小分子−アプタマー複合体、小分子−細胞複合体、小分子−ウイルス粒子複合体、及びそれらの組合せのための結合部位を含み得る。
[0113] 一部の実施形態において、ｃｉｒｃＲＮＡは、１つ以上の抗体−ポリペプチド複合体、ポリペプチド−ポリペプチド複合体、ポリペプチド−ＤＮＡ複合体、ポリペプチド−ＲＮＡ複合体、ポリペプチド−アプタマー複合体、ウイルス粒子−抗体複合体、ウイルス粒子−ポリペプチド複合体、ウイルス粒子−ＤＮＡ複合体、ウイルス粒子−ＲＮＡ複合体、ウイルス粒子−アプタマー複合体、細胞−抗体複合体、細胞−ポリペプチド複合体、細胞−ＤＮＡ複合体、細胞−ＲＮＡ複合体、細胞−アプタマー複合体、小分子−ポリペプチド複合体、小分子−ＤＮＡ複合体、小分子−アプタマー複合体、小分子−細胞複合体、小分子−ウイルス粒子複合体、及びそれらの組合せ上の１つ以上の結合部分のための結合部位を含み得る。
[0114] 一部の例において、結合部位は、ポリペプチド、タンパク質、又はそれらの断片に結合する。一部の実施形態において、結合部位は、標的のポリペプチド、タンパク質、又はそれらの断片のドメイン、断片、エピトープ、領域、又は一部に結合する。例えば、結合部位は、単離ポリペプチド、細胞のポリペプチド、精製ポリペプチド、又は組換えポリペプチドのドメイン、断片、エピトープ、領域、又は一部に結合する。例えば、結合部位は、抗体又はその断片のドメイン、断片、エピトープ、領域、又は一部に結合する。例えば、結合部位は、転写因子のドメイン、断片、エピトープ、領域、又は一部に結合する。例えば、結合部位は、受容体のドメイン、断片、エピトープ、領域、又は一部に結合する。例えば、結合部位は、膜貫通受容体のドメイン、断片、エピトープ、領域、又は一部に結合する。結合部位は、単離、精製、及び／又は組換えポリペプチドのドメイン、断片、エピトープ、領域、又は一部に結合し得る。結合部位は、被分析物の混合物（例えば、溶解物）のドメイン、断片、エピトープ、領域、又は一部に結合し得る。例えば、結合部位は、複数の細胞から又は単一細胞の溶解物からのドメイン、断片、エピトープ、領域、又は一部に結合する。結合部位は、標的の結合部分に結合し得る。一部の例において、結合部分は、ポリペプチド、タンパク質、又はそれらの断片上に存在する。一部の実施形態において、結合部分は、ポリペプチド、タンパク質、又はそれらの断片のドメイン、断片、エピトープ、領域、又は一部を含む。例えば、結合部分は、単離ポリペプチド、細胞のポリペプチド、精製ポリペプチド、又は組換えポリペプチドのドメイン、断片、エピトープ、領域、又は一部を含む。例えば、結合部分は、抗体又はその断片のドメイン、断片、エピトープ、領域、又は一部を含む。例えば、結合部分は、転写因子のドメイン、断片、エピトープ、領域、又は一部を含む。例えば、結合部分は、受容体のドメイン、断片、エピトープ、領域、又は一部を含む。例えば、結合部分は、膜貫通受容体のドメイン、断片、エピトープ、領域、又は一部を含む。結合部分は、単離、精製、及び／又は組換えポリペプチドのドメイン、断片、エピトープ、領域、又は一部上に存在し得、又はそれらを含む。結合部分は、被分析物の混合物（例えば、溶解物）のドメイン、断片、エピトープ、領域、又は一部上の結合部分、又はそれらを含む。例えば、結合部分は、複数の細胞から又は単一細胞の溶解物からのドメイン、断片、エピトープ、領域、又は一部上に存在し、又はそれらを含む。
[0115] 一部の例において、結合部位は、化合物（例えば、小分子）のドメイン、断片、エピトープ、領域、又は一部に結合する。例えば、結合は、薬物のドメイン、断片、エピトープ、領域、又は一部に結合する。例えば、結合部位は、化合物のドメイン、断片、エピトープ、領域、又は一部に結合する。例えば、結合部分は、有機化合物のドメイン、断片、エピトープ、領域、又は一部に結合する。一部の例において、結合部位は、９００ダルトン以下の分子量を有する小分子のドメイン、断片、エピトープ、領域、又は一部に結合する。一部の例において、結合部位は、５００ダルトン以上の分子量を有する小分子のドメイン、断片、エピトープ、領域、又は一部に結合する。結合部位が結合する小分子の一部は、例えば、天然発生又は合成分子のライブラリー、例として、コンビナトリアル手段を介して産生される化合物のライブラリー、すなわち、化合物多様性コンビナトリアルライブラリーから得ることができる。コンビナトリアルライブラリー、並びにその産生及びスクリーニングの方法は当技術分野において公知であり、開示が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，７４１，７１３号明細書；同第５，７３４，０１８号明細書；同第５，７３１，４２３号明細書；同第５，７２１，０９９号明細書；同第５，７０８，１５３号明細書；同第５，６９８，６７３号明細書；同第５，６８８，９９７号明細書；同第５，６８８，６９６号明細書；同第５，６８４，７１１号明細書；同第５，６４１，８６２号明細書；同第５，６３９，６０３号明細書；同第５，５９３，８５３号明細書；同第５，５７４，６５６号明細書；同第５，５７１，６９８号明細書；同第５，５６５，３２４号明細書；同第５，５４９，９７４号明細書；同第５，５４５，５６８号明細書；同第５，５４１，０６１号明細書；同第５，５２５，７３５号明細書；同第５，４６３，５６４号明細書；同第５，４４０，０１６号明細書；同第５，４３８，１１９号明細書；同第５，２２３，４０９号明細書に記載されている。結合部位は、小分子の結合部分に結合し得る。一部の例において、結合部分は、小分子のドメイン、断片、エピトープ、領域、又は一部上に存在し、又はそれらを含む。例えば、結合部分は、薬物のドメイン、断片、エピトープ、領域、又は一部上に存在し、又はそれらを含む。例えば、結合部分は、化合物のドメイン、断片、エピトープ、領域、又は一部上に存在し、又はそれらを含む。例えば、結合部分は、有機化合物のドメイン、断片、エピトープ、領域、又は一部上に存在し、又はそれらを含む。一部の例において、結合部分は、９００ダルトン以下の分子量を有する小分子のドメイン、断片、エピトープ、領域、又は一部上に存在し、又はそれらを含む。一部の例において、結合部分は、５００ダルトン以上の分子量を有する小分子のドメイン、断片、エピトープ、領域、又は一部上に存在し、又はそれらを含む。結合部分は、例えば、天然発生又は合成分子のライブラリー、例として、コンビナトリアル手段を介して産生される化合物のライブラリー、すなわち、化合物多様性コンビナトリアルライブラリーから得ることができる。コンビナトリアルライブラリー、並びにその産生及びスクリーニングの方法は当技術分野において公知であり、開示が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，７４１，７１３号明細書；同第５，７３４，０１８号明細書；同第５，７３１，４２３号明細書；同第５，７２１，０９９号明細書；同第５，７０８，１５３号明細書；同第５，６９８，６７３号明細書；同第５，６８８，９９７号明細書；同第５，６８８，６９６号明細書；同第５，６８４，７１１号明細書；同第５，６４１，８６２号明細書；同第５，６３９，６０３号明細書；同第５，５９３，８５３号明細書；同第５，５７４，６５６号明細書；同第５，５７１，６９８号明細書；同第５，５６５，３２４号明細書；同第５，５４９，９７４号明細書；同第５，５４５，５６８号明細書；同第５，５４１，０６１号明細書；同第５，５２５，７３５号明細書；同第５，４６３，５６４号明細書；同第５，４４０，０１６号明細書；同第５，４３８，１１９号明細書；同第５，２２３，４０９号明細書に記載されている。
[0116] 結合部位は、特異的結合ペア（例えば、リガンド）のメンバーのドメイン、断片、エピトープ、領域、又は一部に結合し得る。結合部位は、一価（モノエピトープ）又は多価（ポリエピトープ）のドメイン、断片、エピトープ、領域、又は一部に結合し得る。結合部位は、標的の抗原性又はハプテン性部分に結合し得る。結合部位は、単一分子又は少なくとも１つの共通するエピトープ若しくは決定基部位を共有する複数の分子のドメイン、断片、エピトープ、領域、又は一部に結合し得る。結合部位は、細胞（例えば、細菌細胞、植物細胞、又は動物細胞）の一部分のドメイン、断片、エピトープ、領域、又は一部に結合し得る。結合部位は、天然環境（例えば、組織）、培養細胞、又は微生物（例えば、細菌、真菌、原生動物又はウイルス）、又は溶解細胞中に存在する標的に結合し得る。結合部位は、１つ以上の追加の結合部位を提供するために（例えば、化学的に）修飾されている標的の一部、例えば、限定されるものではないが、色素（例えば、蛍光色素）、ポリペプチド修飾部分、例えば、ホスフェート基、炭水化物基など、又はポリヌクレオチド修飾部分、例えば、メチル基に結合し得る。結合部位は、特異的結合ペアのメンバーの結合部分に結合し得る。結合部分は、特異的結合ペア（例えば、リガンド）のメンバーのドメイン、断片、エピトープ、領域、又は一部上に存在し、又はそれらを含み得る。結合部分は、一価（モノエピトープ）又は多価（ポリエピトープ）のドメイン、断片、エピトープ、領域、又は一部上に存在し、又はそれらを含み得る。結合部分は、抗原性又はハプテン性であり得る。結合部分は、単一分子又は少なくとも１つの共通するエピトープ若しくは決定基部位を共有する複数の分子のドメイン、断片、エピトープ、領域、又は一部上に存在し、又はそれらを含み得る。結合部分は、細胞（例えば、細菌細胞、植物細胞、又は動物細胞）の一部分のドメイン、断片、エピトープ、領域、又は一部上に存在し、又はそれらを含み得る。結合部分は、天然環境（例えば、組織）、培養細胞、又は微生物（例えば、細菌、真菌、原生動物、又はウイルス）、又は溶解細胞中のいずれかに存在し得る。結合部分は、１つ以上の追加の結合部位、例えば、限定されるものではないが、色素（例えば、蛍光色素）、ポリペプチド修飾部分、例えば、リン酸基、炭水化物基など、又はポリヌクレオチド修飾部分、例えば、メチル基を提供するために（例えば、化学的に）修飾されていてよい。
[0117] 一部の例において、結合部位は、宿主からの試料中で見出される分子のドメイン、断片、エピトープ、領域、又は一部に結合する。結合部位は、宿主からの試料中で見出される分子の結合部分に結合し得る。一部の例において、結合部分は、宿主からの試料中で見出される分子のドメイン、断片、エピトープ、領域、又は一部上に存在し、又はそれらを含む。宿主からの試料としては、体液（例えば、尿、血液、血漿、血清、唾液、精液、糞便、痰、脳脊髄液、涙液、粘液など）が挙げられる。試料は、直接試験することができ、又は結合部分をより容易に検出可能とするように前処理することができる。試料は、生物又は死滅生物からのある量の物質を含む。試料は、天然、組換え、合成、又は非天然発生であり得る。結合部位は、細胞から天然に又は組換えにより発現され、細胞溶解物若しくは細胞培養培地、インビトロ翻訳試料、又は試料（例えば、細胞溶解物）からの免疫沈降物中に存在する上記のいずれかに結合し得る。結合部分は、細胞から天然に又は組換えにより発現され、細胞溶解物若しくは細胞培養培地、インビトロ翻訳試料、又は試料（例えば、細胞溶解物）からの免疫沈降物中に存在する上記のいずれかであり得る。
[0118] 一部の例において、結合部位は、無細胞系又はインビトロで発現される標的に結合する。例えば、結合部位は、細胞抽出物中で標的に結合する。一部の例において、結合部位は、ＤＮＡテンプレート、並びに転写及び翻訳のための試薬を有する細胞抽出物中の標的に結合する。結合部位は、無細胞系又はインビトロで発現される標的の結合部分に結合し得る。一部の例において、標的の結合部分は、無細胞系又はインビトロで発現される。例えば、標的の結合部分は、細胞抽出物中に存在する。一部の例において、標的の結合部分は、ＤＮＡテンプレート、並びに転写及び翻訳のための試薬を有する細胞抽出物中に存在する。使用することができる細胞抽出物の例示的な資源としては、小麦胚芽、大腸菌、ウサギ網状赤血球、超耐熱性細菌、ハイブリドーマ、ゼノパス属（Xenopus）卵母細胞、昆虫細胞、及び哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）が挙げられる。標的ポリペプチドを発現させるため（例えば、アレイ上で標的ポリペプチドを産生させるため）に使用することができる例示的な無細胞法としては、タンパク質インサイチュアレイ（Protein in situ arrays）（ＰＩＳＡ）、マルチプルスポッティング技術（Multiple spotting technique）（ＭＩＳＴ）、自己集合ｍＲＮＡ翻訳、核酸プログラマブルタンパク質アレイ（Nucleic acid programmable protein array）（ＮＡＰＰＡ）、ナノウェルＮＡＰＰＡ、ＤＮＡアレイ−タンパク質アレイ（DNA array to protein array）（ＤＡＰＡ）、メンブレンフリー（membrane-free）ＤＡＰＡ、ナノウェルコピー化及びμＩＰ−マイクロインタリオプリンティング、並びにｐＭＡＣ−タンパク質マイクロアレイコピー化が挙げられる（Kilb et al., Eng. Life Sci. 2014, 14, 352-364参照）。
[0119] 一部の例において、結合部位は、ＤＮＡテンプレートからインサイチュで（例えば、アレイの固体基板上で）合成される標的に結合する。結合部位は、インサイチュで合成される標的の結合部分に結合し得る。一部の例において、標的の結合部分は、ＤＮＡテンプレートからインサイチュで（例えば、アレイの固体基板上で）合成される。一部の例において、複数の結合部分は、複数の対応するＤＮＡテンプレートから並行又は単一反応でインサイチュで合成される。インサイチュ標的ポリペプチド発現の例示的方法としては、Stevens, Structure 8(9): R177-R185 (2000)；Katzen et al., Trends Biotechnol. 23(3): 150-6. (2005)；He et al., Curr. Opin. Biotechnol. 19(1): 4-9. (2008)；Ramachandran et al., Science 305 (5680): 86-90. (2004)；He et al., Nucleic Acids Res. 29(15): E73-3 (2001)；Angenendt et al., Mol. Cell Proteomics 5(9): 1658-66 (2006)；Tao et al, Nat Biotechnol 24(10): 1253-4 (2006)；Angenendt et al., Anal. Chem. 76(7): 1844-9(2004)；Kinpara et al., J. Biochem. 136(2): 149-54 (2004)；Takulapalli et al., J. Proteome Res. 11(8): 4382-91 (2012)；He et al., Nat. Methods 5(2): 175-7 (2008)；Chatterjee and J. LaBaer, Curr Opin Biotech 17(4): 334-336 (2006)；He and Wang, Biomol Eng 24(4): 375-80 (2007)；及びHe and Taussig, J. Immunol. Methods 274(1-2): 265-70 (2003)に記載のものが挙げられる。
[0120] 一部の例において、結合部位は、少なくとも６ヌクレオチド、例えば、少なくとも８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０、又は１００ヌクレオチドのスパンを含む核酸標的に結合する。一部の例において、結合部位は、ヌクレオチドの連続ストレッチを含むタンパク質標的に結合する。一部の例において、結合部位は、ヌクレオチドの非連続ストレッチを含むタンパク質標的に結合する。一部の例において、結合部位は、核酸配列中のヌクレオチドの突然変異又は機能的突然変異、例として、欠失、付加、スワップ、又はトランケーションの部位を含む核酸標的に結合する。結合部位は、核酸標的の結合部分に結合し得る。一部の例において、核酸標的の結合部分は、少なくとも６ヌクレオチド、例えば、少なくとも８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０、又は１００ヌクレオチドのスパンを含む。一部の例において、タンパク質標的の結合部分は、ヌクレオチドの連続ストレッチを含む。一部の例において、タンパク質標的の結合部分は、ヌクレオチドの非連続ストレッチを含む。一部の例において、核酸標的の結合部分は、核酸配列中のヌクレオチドの突然変異又は機能的突然変異、例として、欠失、付加、スワップ、又はトランケーションの部位を含む。
[0121] 一部の例において、結合部位は、少なくとも６アミノ酸、例えば、少なくとも８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０、又は１００アミノ酸のスパンを含むタンパク質標的に結合する。一部の例において、結合部位は、アミノ酸の連続ストレッチを含むタンパク質標的に結合する。一部の例において、結合部位は、アミノ酸の非連続ストレッチを含むタンパク質標的に結合する。一部の例において、結合部位は、ポリペプチド配列中のアミノ酸の突然変異又は機能的突然変異、例として、欠失、付加、スワップ、又はトランケーションの部位を含むタンパク質標的に結合する。結合部位は、タンパク質標的の結合部分に結合し得る。一部の例において、タンパク質標的の結合部分は、少なくとも６アミノ酸、例えば、少なくとも８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０、又は１００アミノ酸のスパンを含む。一部の例において、タンパク質標的の結合部分は、アミノ酸の連続ストレッチを含む。一部の例において、タンパク質標的の結合部分は、アミノ酸の非連続ストレッチを含む。一部の例において、タンパク質標的の結合部分は、ポリペプチド配列中のアミノ酸の突然変異又は機能的突然変異、例として、欠失、付加、スワップ、又はトランケーションの部位を含む。
[0122] 一部の実施形態において、結合部位は、膜結合タンパク質のドメイン、断片、エピトープ、領域、又は一部に結合する。結合部位は、膜結合タンパク質の結合部分に結合し得る。一部の実施形態において、結合部分は、膜結合タンパク質のドメイン、断片、エピトープ、領域、又は一部上に存在し、又はそれらを含む。例示的な膜結合タンパク質としては、限定されるものではないが、ＧＰＣＲ（例えば、アドレナリン受容体、アンジオテンシン受容体、コレシストキニン受容体、ムスカリン性アセチルコリン受容体、ニューロテンシン受容体、ガラニン受容体、ドーパミン受容体、オピオイド受容体、エロトニン（erotonin）受容体、ソマトスタチン受容体など）、イオンチャネル（例えば、ニコチン性アセチルコリン受容体、ナトリウムチャネル、カリウムチャネルなど）、非興奮性及び興奮性チャネル、受容体チロシンキナーゼ、受容体セリン／トレオニンキナーゼ、受容体グアニル酸シクラーゼ、成長因子及びホルモン受容体（例えば、上皮成長因子（ＥＧＦ）受容体）などが挙げられる。結合部位は、膜結合タンパク質の突然変異体又は修飾バリアントのドメイン、断片、エピトープ、領域、又は一部に結合し得る。結合部位は、膜結合タンパク質の突然変異体又は修飾バリアントの結合部分に結合し得る。結合部分は、膜結合タンパク質の突然変異体又は修飾バリアントのドメイン、断片、エピトープ、領域、又は一部上にも存在し、又はそれらも含み得る。例えば、一部のＧＰＣＲの単一又は複数の点突然変異は機能を保持し、疾患に関与する（例えば、Stadel et al., (1997) Trends in Pharmacological Review 18: 430-37参照）。
[0123] 結合部位は、例えば、ユビキチンリガーゼのドメイン、断片、エピトープ、領域、又は一部に結合する。結合部位は、例えば、ユビキチンアダプター、プロテアソームアダプター、又はプロテアソームタンパク質のドメイン、断片、エピトープ、領域、又は一部に結合する。結合部位は、例えば、エンドサイトーシス、食作用、リソソーム経路、オートファジー経路、マクロオートファジー、マイクロオートファジー、シャペロン媒介オートファジー、多胞体経路、又はそれらの組合せに関与するタンパク質のドメイン、断片、エピトープ、領域、又は一部に結合する。一部の例において、結合部位は、結合部分に結合する。結合部分は、例えば、ユビキチンリガーゼのドメイン、断片、エピトープ、領域、又は一部を含み得る。結合部分は、例えば、ユビキチンアダプター、プロテアソームアダプター、又はプロテアソームタンパク質のドメイン、断片、エピトープ、領域、又は一部を含み得る。結合部分は、例えば、エンドサイトーシス、食作用、リソソーム経路、オートファジー経路、マクロオートファジー、マイクロオートファジー、シャペロン媒介オートファジー、多胞体経路、又はそれらの組合せに関与するタンパク質のドメイン、断片、エピトープ、領域、又は一部を含み得る。
[0124] 結合部位は、例えば、疾患又は病態と関連するタンパク質のドメイン、断片、エピトープ、領域、又は一部に結合する。結合部位は、例えば、癌原遺伝子のドメイン、断片、エピトープ、領域、又は一部に結合する。結合部位は、例えば、癌遺伝子のドメイン、断片、エピトープ、領域、又は一部に結合する。結合部位は、例えば、腫瘍抑制遺伝子のドメイン、断片、エピトープ、領域、又は一部に結合する。結合部位は、例えば、炎症遺伝子（例えば、サイトカイン）のドメイン、断片、エピトープ、領域、又は一部に結合する。結合部位は、結合部分に結合し得る。結合部分は、例えば、疾患又は病態と関連するタンパク質のドメイン、断片、エピトープ、領域、又は一部を含み得る。結合部分は、例えば、癌原遺伝子のドメイン、断片、エピトープ、領域、又は一部を含み得る。結合部分は、例えば、癌遺伝子のドメイン、断片、エピトープ、領域、又は一部を含み得る。結合部分は、例えば、腫瘍抑制遺伝子のドメイン、断片、エピトープ、領域、又は一部を含み得る。結合部分は、例えば、炎症遺伝子（例えば、サイトカイン）のドメイン、断片、エピトープ、領域、又は一部を含み得る。
[0125] 図１は、配列特異的ＲＮＡ結合モチーフ、配列特異的ＤＮＡ結合モチーフ、及びタンパク質特異的結合モチーフを有する環状ポリリボヌクレオチドの一例を示す。一部の実施形態において、ｃｉｒｃＲＮＡは、他の細胞内分子の結合のための他の結合モチーフを含み得る。ｃｉｒｃＲＮＡ用途の非限定的な例は、表１に列挙される。
Figure 2021531022
ＲＮＡ結合部位
[0126] 一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上のＲＮＡ結合部位を含む。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、内因性遺伝子及び／又は外因性遺伝子の発現を改変するＲＮＡ結合部位を含む。一部の実施形態において、ＲＮＡ結合部位は、宿主遺伝子の発現をモジュレートする。ＲＮＡ結合部位は、内因性遺伝子（例えば、本明細書に記載のｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｇＲＮＡについての配列）にハイブリダイズする配列、外因性核酸、例えば、ウイルスＤＮＡ若しくはＲＮＡにハイブリダイズする配列、ＲＮＡにハイブリダイズする配列、遺伝子転写を干渉する配列、ＲＮＡ翻訳を干渉する配列、例えば、分解の標的化を介してＲＮＡを安定化させ、若しくはＲＮＡを脱安定化させる配列、又はＤＮＡ若しくはＲＮＡ結合因子をモジュレートする配列を含み得る。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ＲＮＡに結合するアプタマー配列を含む。アプタマー配列は、内因性遺伝子（例えば、本明細書に記載のｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｇＲＮＡについての配列）に、外因性核酸、例えば、ウイルスＤＮＡ若しくはＲＮＡに、ＲＮＡに、遺伝子転写を干渉する配列に、ＲＮＡ翻訳を干渉する配列に、例えば、分解の標的化を介してＲＮＡを安定化させ、若しくはＲＮＡを脱安定化させる配列に、又はＤＮＡ若しくはＲＮＡ結合因子をモジュレートする配列に結合し得る。アプタマー配列の二次構造は、ＲＮＡに結合し得る。環状ＲＮＡは、アプタマー配列をＲＮＡに結合することによりＲＮＡとの複合体を形成し得る。
[0127] 一部の実施形態において、ＲＮＡ結合部位は、ｔＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｌｉｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｅｘＲＮＡ、ｓｃａＲＮＡ、Ｙ ＲＮＡ、及びｈｎＲＮＡ結合部位のものであり得る。ＲＮＡ結合部位は、当業者に周知である。
[0128] あるＲＮＡ結合部位は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の生物学的プロセスを介して遺伝子発現を阻害し得る。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、典型的には、１５〜５０塩基対（例えば、約１８〜２５塩基対）を有し、細胞内で発現される標的遺伝子中のコード配列に同一（相補的）又はほぼ同一（実質的に相補的）の核酸塩基配列を有するＲＮＡ又はＲＮＡ様構造を有するＲＮＡｉ分子を含む。ＲＮＡｉ分子としては、限定されるものではないが、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、メロデュプレックス（meroduplex）、及びダイサー基質が挙げられる。
[0129] 一部の実施形態において、ＲＮＡ結合部位は、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡを含む。ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡは、内因性ｍｉＲＮＡ遺伝子のプロセシング経路における中間体が類似する。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡとして機能し得、その逆も可能である。マイクロＲＮＡ、例えば、ｓｉＲＮＡは、ＲＩＳＣを使用して標的遺伝子を下方調節し得るが、ｓｉＲＮＡとは異なり、ほとんどの動物ｍｉＲＮＡは、ｍＲＮＡを開裂しない。その代わり、ｍｉＲＮＡは、翻訳抑制又はポリＡ除去及びｍＲＮＡ分解を介してタンパク質アウトプットを低減させる。公知のｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍＲＮＡ３’−ＵＴＲ内に存在し；ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡの５’末端からのヌクレオチド２〜８とのほぼ完全な相補性を有する部位を標的化すると考えられる。この領域は、シード領域として公知である。ｓｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡは互換的であるため、外因性ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡとのシード相補性を有するｍＲＮＡを下方調節し得る。３’−ＵＴＲ内の複数の標的部位は、より強力な下方調節を与え得る。
[0130] マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、核酸分子の３’−ＵＴＲに結合し、核酸分子安定性を低減させることにより、又は翻訳を阻害することにより遺伝子発現を下方調節する短鎖非コードＲＮＡである。環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列、ｍｉＲＮＡ配列、又はｍｉＲＮＡシードを含み得る。このような配列は、任意のｍｉＲＮＡに対応し得る。
[0131] ｍｉＲＮＡ配列は、「シード」領域、すなわち、配列がｍｉＲＮＡ標的配列とのワトソン・クリック相補性を有する成熟ｍｉＲＮＡの２〜８位の領域中の配列を含む。ｍｉＲＮＡシードは、成熟ｍｉＲＮＡの２〜８又は２〜７位を含み得る。一部の実施形態において、ｍｉＲＮＡシードは、７ヌクレオチド（例えば、成熟ｍｉＲＮＡのヌクレオチド２〜８）を含み得、対応するｍｉＲＮＡ標的中のシード相補的部位は、ｍｉＲＮＡ１位と対向するアデニン（Ａ）によりフランキングされている。一部の実施形態において、ｍｉＲＮＡシードは、６ヌクレオチド（例えば、成熟ｍｉＲＮＡのヌクレオチド２〜７）を含み得、対応するｍｉＲＮＡ標的中のシード相補的部位は、１位におけるｍｉＲＮＡと対向するアデニン（Ａ）によりフランキングされている。
[0132] ｍｉＲＮＡシードの塩基は、標的配列と実質的に相補的であり得る。ｍｉＲＮＡ標的配列を環状ポリリボヌクレオチド中に遺伝子操作することにより、環状ポリリボヌクレオチドは宿主の免疫系を回避し、又はそれにより検出され得、モジュレートされた分解、又はモジュレートされた翻訳を有する。このプロセスは、環状ポリリボヌクレオチド送達時のオフターゲット効果の危険性を低減させ得る。
[0133] 環状ポリリボヌクレオチドは、標的遺伝子の約５〜約２５個の連続ヌクレオチドと同一のｍｉＲＮＡ配列を含み得る。一部の実施形態において、ｍｉＲＮＡ配列はｍＲＮＡを標的化し、ジヌクレオチドＡＡから始まり、約３０％〜７０％、約３０％〜６０％、約４０％〜６０％、又は約４５％〜５５％のＧＣ含有率を含み、例えば、標準的なＢＬＡＳＴ検索により決定して、それを導入すべき哺乳動物のゲノム中の標的以外の任意のヌクレオチド配列との高い同一性の割合を有さない。
[0134] 逆に、ｍｉＲＮＡ結合部位を環状ポリリボヌクレオチドから遺伝子操作により排除（すなわち、除去）して特異的組織中のタンパク質発現をモジュレートすることができる。複数の組織中の発現の調節は、１つ又はいくつかのｍｉＲＮＡ結合部位の導入又は除去を介して達成することができる。
[0135] ｍｉＲＮＡがｍＲＮＡを調節し、それによりタンパク質発現を調節することが公知の組織の例としては、限定されるものではないが、肝臓（ｍｉＲ−１２２）、筋肉（ｍｉＲ−１３３、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−２０８）、内皮細胞（ｍｉＲ−１７−９２、ｍｉＲ−１２６）、骨髄細胞（ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−２７）、脂肪組織（ｌｅｔ−７、ｍｉＲ−３０ｃ）、心臓（ｍｉＲ−ｌｄ、ｍｉＲ−１４９）、腎臓（ｍｉＲ−１９２、ｍｉＲ−１９４、ｍｉＲ−２０４）、及び肺上皮細胞（ｌｅｔ−７、ｍｉＲ−１３３、ｍｉＲ−１２６）が挙げられる。ｍｉＲＮＡは、複雑な生物学的プロセス、例えば、血管新生も調節し得る（ｍｉＲ−１３２）。本明細書に記載の環状ポリリボヌクレオチドにおいて、そのようなプロセスに関与するｍｉＲＮＡのための結合部位を除去し、又は導入して環状ポリリボヌクレオチドからの発現を生物学的に関連する細胞タイプに又は関連する生物学的プロセスの状況に合わせることができる。一部の実施形態において、ｍｉＲＮＡ結合部位は、例えば、例えば、ｍｉＲ−７を含む。
[0136] 異なる細胞タイプにおけるｍｉＲＮＡの発現パターンの理解を介して、本明細書に記載の環状ポリリボヌクレオチドは、特異的細胞タイプ中で又は特異的生物学的条件下でのみ、より標的化される発現のために遺伝子操作することができる。組織特異的ｍｉＲＮＡ結合部位の導入を介して、環状ポリリボヌクレオチドは、組織中又は生物学的条件の状況における最適なタンパク質発現のために設計することができる。
[0137] さらに、ｍｉＲＮＡシード部位を環状ポリリボヌクレオチド中に取り込んで生物学的改善をもたらすある細胞中の発現をモジュレートすることができる。この一例は、ｍｉＲ−１４２部位の取り込みである。本明細書に記載の環状ポリリボヌクレオチド中へのｍｉＲ−１４２部位の取り込みは、造血細胞中の発現をモジュレートし得るだけでなく、環状ポリリボヌクレオチド中でコードされるタンパク質に対する免疫応答も低減させ、又は停止させ得る。
[0138] 一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ、例えば、２、３、４、５、６つ以上のものを含む。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ヌクレオチド配列又は標的配列に相補的な配列のいずれか１つとの少なくとも約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は１００％のヌクレオチド配列同一性を有するｍｉＲＮＡを含む。
[0139] 公知のｍｉＲＮＡ配列のリストは、研究機関、例えば、Wellcome Trust Sanger Institute, Penn Center for Bioinformatics, Memorial Sloan Kettering Cancer Center、及びEuropean Molecule Biology Laboratoryにより維持されるデータベースに見出すことができる。ＲＮＡｉ分子は、当技術分野において公知の技術により容易に設計し、産生することができる。さらに、計算ツールを使用して有効且つ特異的な配列モチーフを決定することができる。
[0140] 一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、長鎖非コードＲＮＡを含む。長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）は、１００ヌクレオチドよりも長い非タンパク質コード転写産物を含む。より長い長さは、ｌｎｃＲＮＡを小分子調節ＲＮＡ、例えば、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、及び他の短鎖ＲＮＡと区別する。一般に、ｌｎｃＲＮＡの大多数（約７８％）は、組織特異的であることを特徴とする。隣接タンパク質コード遺伝子と逆方向で転写される多様なｌｎｃＲＮＡ（哺乳動物ゲノムにおける全ｌｎｃＲＮＡのかなりの比率約２０％を占める）は、隣接遺伝子の転写を調節し得る。
[0141] ＲＮＡ結合部位の長さは、約５〜３０ヌクレオチド、約１０〜３０ヌクレオチド、又は約１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチド以上であり得る。目的標的に対するＲＮＡ結合部位の同一性の程度は、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％であり得る。
[0142] 一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上の長鎖遺伝子間非コードＲＮＡ（ｌｉｎｃＲＮＡ）結合部位を含む。ｌｉｎｃＲＮＡは、長鎖非コードＲＮＡの大半を占める。ｌｉｎｃＲＮＡは、非コード転写産物であり、一部の実施形態において、約２００ヌクレオチド長超である。一部の実施形態において、ｌｉｎｃＲＮＡは、タンパク質コード遺伝子と同様のエキソン−イントロン−エキソン構造を有するが、オープンリーディングフレームを包含せず、タンパク質をコードしない。ｌｉｎｃＲＮＡ発現は、コード遺伝子と比較して顕著に組織特異的であり得る。ｌｉｎｃＲＮＡは、典型的には、それらの隣接遺伝子と、隣接タンパク質コード遺伝子のペアのものと類似の程度で同時発現される。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、環状化ｌｉｎｃＲＮＡを含む。
[0143] 一部の実施形態において、本明細書に開示される環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上のｌｉｎｃＲＮＡ、例えば、ＦＩＲＲＥ、ＬＩＮＣ００９６９、ＰＶＴ１、ＬＩＮＣ０１６０８、ＪＰＸ、ＬＩＮＣ０１５７２、ＬＩＮＣ００３５５、Ｃ１ｏｒｆ１３２、Ｃ３ｏｒｆ３５、ＲＰ１１−７３４、ＬＩＮＣ０１６０８、ＣＣ−４９９Ｂ１５．５、ＣＡＳＣ１５、ＬＩＮＣ００９３７、及びＲＰ１１−１９１を含む。
[0144] 公知のｌｉｎｃＲＮＡ及びｌｎｃＲＮＡ配列のリストは、研究機関、例えば、Institute of Genomics and Integrative Biology, Diamantina Institute at the University of Queensland, Ghent University、及びSun Yat-sen Universityにより維持されるデータベースに見出すことができる。ｌｉｎｃＲＮＡ及びｌｎｃＲＮＡ分子は、当技術分野において公知の技術により容易に設計し、産生することができる。さらに、計算ツールを使用して有効且つ特異的な配列モチーフを決定することができる。
[0145] ＲＮＡ結合部位は、内因性遺伝子又は遺伝子産物（例えば、ｍＲＮＡ）の全て又は断片に実質的に相補的な、又は完全に相補的な配列を含み得る。相補的配列は、特異的遺伝子の新たに生成される核内ＲＮＡ転写産物の転写のためのｍＲＮＡへの成熟を防止するためのイントロン及びエキソン間の境界における相補配列であり得る。相補的配列は、遺伝子のためのｍＲＮＡとハイブリダイズすることによりその遺伝子に特異的であり、その翻訳を防止し得る。ＲＮＡ結合部位は、内因性遺伝子又は遺伝子産物、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はそれらの誘導体若しくはハイブリッドの全て又は断片に対してアンチセンス又は実質的にアンチセンスである配列を含み得る。
[0146] 一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、典型的には、約５〜５０００塩基対（特異的ＲＮＡ構造に依存し、例えば、ｍｉＲＮＡ ５〜３０ｂｐ、ｌｎｃＲＮＡ ２００〜５００ｂｐ）のＲＮＡ又はＲＮＡ様構造を有するＲＮＡ結合部位を含み、細胞内で発現される標的遺伝子中のコード配列と同一（相補的）又はほぼ同一（実質的に相補的）の核酸塩基配列を有する。
ＤＮＡ結合部位
[0147] 一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ＤＮＡ結合部位、例えば、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）のための配列を含む。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ガイドＲＮＡ又はｇＲＮＡ配列に対する相補鎖を含む。ｇＲＮＡ短鎖合成ＲＮＡは、不完全なエフェクター部分への結合に必要な「足場」配列及び使用者により規定されるゲノム標的のための約２０ヌクレオチドの標的化配列から構成される。ガイドＲＮＡ配列は、１７〜２４ヌクレオチド（例えば、１９、２０、又は２１ヌクレオチド）の長さを有し得、標的化される核酸配列に相補的である。有効なガイドＲＮＡの設計において、カスタムｇＲＮＡジェネレータ及びアルゴリズムを使用することができる。遺伝子編集は、キメラ「単一ガイドＲＮＡ」（「ｓｇＲＮＡ」）、天然発生ｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体を模倣し、ｔｒａｃｒＲＮＡ（ヌクレアーゼ結合用）及び少なくとも１つのｃｒＲＮＡ（ヌクレアーゼを編集のために標的化される配列にガイドするため）の両方を含有する遺伝子操作（合成）単一ＲＮＡ分子を使用して達成することができる。化学修飾ｓｇＲＮＡは、ゲノム編集において有効であり得る。
[0148] ｇＲＮＡは、特異的ＤＮＡ配列（例えば、遺伝子のプロモーター、エンハンサー、サイレンサー、又はリプレッサーに隣接する又はその中の配列）を認識し得る。
[0149] 一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、遺伝子編集のためのＣＲＩＳＰＲ系の一部分である。遺伝子編集のため、環状ポリリボヌクレオチドは、所望の標的ＤＮＡ配列に対応する１つ又は複数のガイドＲＮＡ配列を含むように設計することができる。ｇＲＮＡ配列は、Ｃａｓ９又はＤＮＡを開裂する他のエキソヌクレアーゼとの相互作用のための少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個以上のヌクレオチドを含み得、例えば、Ｃｐｆ１は、検出可能なＤＮＡ開裂のためにｇＲＮＡ配列の少なくとも約１６ヌクレオチドと相互作用する。
[0150] 一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ＤＮＡに結合し得るアプタマー配列を含む。アプタマー配列の二次構造は、ＤＮＡに結合し得る。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ＤＮＡへのアプタマー配列の結合によりＤＮＡとの複合体を形成する。
[0151] 一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、二重鎖ＤＮＡ中の主溝を結合させる配列を含む。このような１つの例において、環状ポリリボヌクレオチド及び二重鎖ＤＮＡにより作出される三重鎖構造の特異性及び安定性は、二重鎖ＤＮＡ中の古典的ワトソン・クリック塩基対合において形成されるものと異なるフーグスティーン水素結合を介して得られる。一例において、環状ポリリボヌクレオチドは、主溝を介して標的二重鎖のプリンリッチ鎖に結合する。
[0152] 一部の実施形態において、三重鎖形成は、標的二重鎖のプリンリッチ鎖に関する環状ポリリボヌクレオチドの配向により区別される２つのモチーフ中で生じる。一部の例において、環状ポリリボヌクレオチド中のポリピリミジン配列ストレッチは、平行様式で（すなわち、二重鎖のプリンリッチ鎖と同じ５’〜３’配向で）フーグスティーン水素結合を介して二重鎖ＤＮＡのポリプリン配列ストレッチに結合する一方、ポリプリンストレッチ（Ｒ）は、逆フーグスティーン水素結合を介して二重鎖のプリン鎖と逆平行様式で結合する。逆平行において、プリンモチーフは、Ｇ：Ｇ−Ｃ、Ａ：Ａ−Ｔ、又はＴ：Ａ−Ｔのトリプレットを含む一方、平行において、ピリミジンモチーフは、Ｃ＋：Ｇ−Ｃ又はＴ：Ａ−Ｔトリプレット（Ｃ＋は、Ｎ３位上のプロトン化シトシンを表す）のカノニカルトリプルを含む。環状ポリリボヌクレオチド中の逆平行ＧＡ及びＧＴ配列は、中性ｐＨにおいて安定的な三重鎖を形成し得る一方、環状ポリリボヌクレオチド中の平行ＣＴ配列は、酸性ｐＨにおいて結合し得る。環状ポリリボヌクレオチド中のシトシン上のＮ３は、プロトン化され得る。５−メチル−ＣによるＣの置換は、５−メチル−Ｃがシトシンよりも高いｐＫを有するため生理学的ｐＨにおいて環状ポリリボヌクレオチド中のＣＴ配列の結合を許容し得る。プリン及びピリミジンモチーフの両方について、少なくとも１０塩基対の連続ホモプリン−ホモピリミジン配列ストレッチは、二重鎖ＤＮＡへの環状ポリリボヌクレオチド結合を補助する。それというのも、より短い三重鎖は生理学的条件下で不安定であり得、配列の中断は三重鎖構造を脱安定化し得るためである。一部の実施形態において、三重鎖形成のためのＤＮＡ二重鎖標的は、一方の鎖中の連続プリン塩基を含む。一部の実施形態において、三重鎖形成のための標的は、ＤＮＡ二重鎖の一方の鎖中のホモプリン配列及び相補鎖中のホモピリミジン配列を含む。
[0153] 一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドを含む三重鎖は、安定的構造である。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドを含む三重鎖は、増加した半減期、例えば、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％以上だけ増加した半減期、例えば、少なくとも１時間〜約３０日間、又は少なくとも約２時間、６時間、１２時間、１８時間、２４時間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、２０日間、２１日間、２２日間、２３日間、２４日間、２５日間、２６日間、２７日間、２８日間、２９日間、３０日間、６０日間以上又はそれらの間の任意の時間の持続を示す。
タンパク質結合部位
[0154] 一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上のタンパク質結合部位を含む。一部の実施形態において、タンパク質結合部位は、アプタマー配列を含む。一実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、参照化合物、例えば、タンパク質結合部位を欠く環状ポリリボヌクレオチド、例えば、線状ＲＮＡにより誘発される応答と比較して宿主からの免疫応答を低減させるためのタンパク質結合部位を含む。
[0155] 一部の実施形態において、本明細書に開示される環状ポリリボヌクレオチドは、タンパク質、例えば、リボソームを結合させるための１つ以上のタンパク質結合部位を含む。タンパク質結合部位、例えば、リボソーム結合部位を環状ポリリボヌクレオチド中に遺伝子操作することにより、環状ポリリボヌクレオチドは、宿主の免疫系を回避し、又はそれによる低減した検出を有し、モジュレートされた分解、又はモジュレートされた翻訳を有し得る。
[0156] 一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、例えば、宿主の免疫系の構成成分から環状ポリリボヌクレオチドをマスキングするため、例えば、ＣＴＬ応答を回避するための少なくとも１つの免疫タンパク質結合部位を含む。一部の実施形態において、免疫タンパク質結合部位は、免疫タンパク質に結合し、非内因性のものとしての環状ポリリボヌクレオチドのマスキングを補助するヌクレオチド配列である。
[0157] 線状ＲＮＡへのリボソームエンゲージメントの慣習的な機序は、ＲＮＡのキャップ５’末端へのリボソーム結合を含む。５’末端からリボソームは開始コドンに移動し、その時点で第１のぺプチド結合が形成される。本発明によれば、環状ポリリボヌクレオチドの内部開始（すなわち、キャップ非依存性）又は翻訳は、フリー末端もキャップ末端も要求しない。むしろ、リボソームは非キャップ内部部位に結合し、それによりリボソームは、開始コドンにおいてポリペプチド伸長を開始する。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、リボソーム結合部位、例えば、開始コドンを含む１つ以上のＲＮＡ配列を含む。
[0158] 一部の実施形態において、本明細書に開示される環状ポリリボヌクレオチドは、タンパク質に結合するタンパク質結合配列を含む。一部の実施形態において、タンパク質結合配列は、環状ポリリボヌクレオチドを標的化し、又は特異的標的に局在化させる。一部の実施形態において、タンパク質結合配列は、タンパク質のアルギニンリッチ領域を特異的に結合する。
[0159] 一部の実施形態において、本明細書に開示される環状ポリリボヌクレオチドは、標的タンパク質にそれぞれ結合する１つ以上のタンパク質結合部位を含み、例えば、２つ以上のタンパク質を接近させるための足場として作用する。一部の実施形態において、本明細書に開示される環状ポリヌクレオチドは、標的タンパク質にそれぞれ結合する２つのタンパク質結合部位を含み、それにより標的タンパク質を接近させる。一部の実施形態において、本明細書に開示される環状ポリヌクレオチドは、標的タンパク質にそれぞれ結合する３つのタンパク質結合部位を含み、それにより３つの標的タンパク質を接近させる。一部の実施形態において、本明細書に開示される環状ポリヌクレオチドは、標的タンパク質にそれぞれ結合する４つのタンパク質結合部位を含み、それぞれ４つの標的タンパク質を接近させる。一部の実施形態において、本明細書に開示される環状ポリヌクレオチドは、標的タンパク質にそれぞれ結合する５つ以上のタンパク質結合部位を含み、５つ以上の標的タンパク質を接近させる。一部の実施形態において、標的タンパク質は同じである。一部の実施形態において、標的タンパク質は異なる。一部の実施形態において、標的タンパク質の接近は、タンパク質複合体の形成を促進する。例えば、本開示の環状ポリリボヌクレオチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個以上の標的タンパク質を含む複合体の形成を促進するための足場として作用し得る。一部の実施形態において、２つ以上の標的タンパク質の接近は、２つ以上の標的タンパク質の相互作用を促進する。一部の実施形態において、２つ以上の標的タンパク質の接近は、酵素反応をモジュレートし、促進し、又は阻害する。一部の実施形態において、２つ以上の標的タンパク質の接近は、シグナル伝達経路をモジュレートし、促進し、又は阻害する。
[0160] 一部の実施形態において、タンパク質結合部位としては、限定されるものではないが、タンパク質、例えば、ＡＣＩＮ１、ＡＧＯ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、ＡＴＸＮ２、ＡＵＨ、ＢＣＣＩＰ、ＣＡＰＲＩＮ１、ＣＥＬＦ２、ＣＰＳＦ１、ＣＰＳＦ２、ＣＰＳＦ６、ＣＰＳＦ７、ＣＳＴＦ２、ＣＳＴＦ２Ｔ、ＣＴＣＦ、ＤＤＸ２１、ＤＤＸ３、ＤＤＸ３Ｘ、ＤＤＸ４２、ＤＧＣＲ８、ＥＩＦ３Ａ、ＥＩＦ４Ａ３、ＥＩＦ４Ｇ２、ＥＬＡＶＬ１、ＥＬＡＶＬ３、ＦＡＭ１２０Ａ、ＦＢＬ、ＦＩＰ１Ｌ１、ＦＫＢＰ４、ＦＭＲ１、ＦＵＳ、ＦＸＲ１、ＦＸＲ２、ＧＮＬ３、ＧＴＦ２Ｆ１、ＨＮＲＮＰＡ１、ＨＮＲＮＰＡ２Ｂ１、ＨＮＲＮＰＣ、ＨＮＲＮＰＫ、ＨＮＲＮＰＬ、ＨＮＲＮＰＭ、ＨＮＲＮＰＵ、ＨＮＲＮＰＵＬ１、ＩＧＦ２ＢＰ１、ＩＧＦ２ＢＰ２、ＩＧＦ２ＢＰ３、ＩＬＦ３、ＫＨＤＲＢＳ１、ＬＡＲＰ７、ＬＩＮ２８Ａ、ＬＩＮ２８Ｂ、ｍ６Ａ、ＭＢＮＬ２、ＭＥＴＴＬ３、ＭＯＶ１０、ＭＳＩ１、ＭＳＩ２、ＮＯＮＯ、ＮＯＮＯ−、ＮＯＰ５８、ＮＰＭ１、ＮＵＤＴ２１、ｐ５３、ＰＣＢＰ２、ＰＯＬＲ２Ａ、ＰＲＰＦ８、ＰＴＢＰ１、ＲＢＦＯＸ１、ＲＢＦＯＸ２、ＲＢＦＯＸ３、ＲＢＭ１０、ＲＢＭ２２、ＲＢＭ２７、ＲＢＭ４７、ＲＮＰＳ１、ＳＡＦＢ２、ＳＢＤＳ、ＳＦ３Ａ３、ＳＦ３Ｂ４、ＳＩＲＴ７、ＳＬＢＰ、ＳＬＴＭ、ＳＭＮＤＣ１、ＳＮＤ１、ＳＲＲＭ４、ＳＲＳＦ１、ＳＲＳＦ３、ＳＲＳＦ７、ＳＲＳＦ９、ＴＡＦ１５、ＴＡＲＤＢＰ、ＴＩＡ１、ＴＮＲＣ６Ａ、ＴＯＰ３Ｂ、ＴＲＡ２Ａ、ＴＲＡ２Ｂ、Ｕ２ＡＦ１、Ｕ２ＡＦ２、ＵＮＫ、ＵＰＦ１、ＷＤＲ３３、ＸＲＮ２、ＹＢＸ１、ＹＴＨＤＣ１、ＹＴＨＤＦ１、ＹＴＨＤＦ２、ＹＷＨＡＧ、ＺＣ３Ｈ７Ｂ、ＰＤＫ１、ＡＫＴ１、及びＲＮＡを結合させる任意の他のタンパク質に対する結合部位が挙げられる。
[0161] 一部の実施形態において、タンパク質結合部位は、タンパク質に結合する核酸配列、例えば、転写因子、エンハンサー、リプレッサー、ポリメラーゼ、ヌクレアーゼ、ヒストン、又はＤＮＡを結合させる任意の他のタンパク質を結合させ得る配列である。一部の実施形態において、タンパク質結合部位は、タンパク質に結合するアプタマー配列である。一部の実施形態において、アプタマー配列の二次構造は、タンパク質を結合させる。一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、タンパク質へのアプタマー配列の結合によりタンパク質との複合体を形成する。
[0162] 一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、小分子又はその一部分にコンジュゲートされ、小分子又はその一部分は、標的、例えば、タンパク質に結合する。小分子は、修飾ヌクレオチドを介して、例えば、クリック化学により環状ＲＮＡにコンジュゲートさせることができる。タンパク質に結合し得る小分子の例としては、限定されるものではないが、４−ヒドロキシタモキシフェン（４−ＯＨＴ）、ＡＣ２２０、アファチニブ、アミノピラゾールアナログ、ＡＲアンタゴニスト、ＢＩ−７２７３、ボスチニブ、セリチニブ、クロロアルカン、ダサチニブ、フォレチニブ、ゲフィチニブ、ＨＩＦ−１α−由来（Ｒ）−ヒドロキシプロリン、ＨＪＢ９７、ヒドロキシプロリンベースリガンド、ＩＡＣＳ−７ｅ、イブルチニブ、イブルチニブ誘導体、ＪＱ１、ラパチニブ、ＬＣＬ１６１誘導体、レナリドミド、ヌトリン小分子、ＯＴＸ０１５、ＰＤＥ４阻害剤、ポマリドミド、ｒｉｐｋ２阻害剤、ＲＮ４８６、Ｓｉｒｔ２阻害剤３ｂ、ＳＮＳ−０３２、Ｓｔｅｅｌ因子、ＴＢＫ１阻害剤、サリドマイド、サリドマイド誘導体、チアゾリジンジオンベースリガンド、ＶＨ０３２誘導体、ＶＨＬリガンド２、ＶＨＬ−１、ＶＬ−２６９、及びそれらの誘導体が挙げられる。
[0163] 一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、２つ以上の小分子、例えば、２、３、４、５、６、７、８，９、１０個以上の小分子にコンジュゲートされる。一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、２つ以上の異なる小分子、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上の異なる小分子にコンジュゲートされる。一部の実施形態において、環状ＲＮＡにコンジュゲートされる２つ以上の小分子は、それらのそれぞれの標的タンパク質をリクルートして接近させるように構成され、それは、標的タンパク質間の相互作用、及び／又は他の分子及び細胞変化をもたらし得る。例えば、環状ＲＮＡは、ＪＱ１及びサリドマイドの両方、又はそれらの誘導体にコンジュゲートさせることができ、それはしたがってＪＱ１の標的タンパク質、例えば、ＢＥＴファミリータンパク質、及びサリドマイドの標的タンパク質、例えば、Ｅ３リガーゼをリクルートし得る。一部の例において、ＪＱ１及びサリドマイドとコンジュゲートされた環状ＲＮＡは、ＪＱ１、又はその誘導体を介してＢＥＴファミリータンパク質をリクルートし、サリドマイド又はその誘導体を介してリクルートされるＥ３リガーゼによりユビキチンによりＢＥＴファミリータンパク質をタグ化し、したがってタグ化されたＢＥＴファミリータンパク質の分解をもたらす。
他の結合部位
[0164] 一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、非ＲＮＡ又は非ＤＮＡ標的に対する１つ以上の結合部位を含む。一部の実施形態において、結合部位は、小分子、アプタマー、脂質、炭水化物、ウイルス粒子、膜、多成分複合体、細胞、細胞部分、又はそれらの任意の断片の結合部位のものであり得る。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、脂質に対する１つ以上の結合部位を含む。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、炭水化物に対する１つ以上の結合部位を含む。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、炭水化物に対する１つ以上の結合部位を含む。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、膜に対する１つ以上の結合部位を含む。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、多成分複合体、例えば、リボソーム、ヌクレオソーム、転写機構などに対する１つ以上の結合部位を含む。
[0165] 一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、アプタマー配列を含む。アプタマー配列は、本明細書に記載の任意の標的（例えば、核酸分子、小分子、タンパク質、炭水化物、脂質など）に結合し得る。アプタマー配列は、標的を結合させ得る二次構造を有する。一部の実施形態において、アプタマー配列は、標的を結合させ得る三次構造を有する。一部の実施形態において、アプタマー配列は、標的を結合させ得る四次構造を有する。環状ポリリボヌクレオチドは、アプタマー配列を介して標的に結合して複合体を形成し得る。一部の実施形態において、複合体は、少なくとも５日間検出可能である。一部の実施形態において、複合体は、少なくとも２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間検出可能である。
隔離
[0166] 一部の実施形態において、本明細書に記載のｃｉｒｃＲＮＡは、標的、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、及び他の細胞構成成分を隔離して細胞プロセスを調節する。目的標的のための結合部位を有するｃｉｒｃＲＮＡは、内因性結合パートナーと標的の結合について競合し得る。一部の実施形態において、本明細書に記載のｃｉｒｃＲＮＡは、ｍｉＲＮＡを隔離する。一部の実施形態において、本明細書に記載のｃｉｒｃＲＮＡは、ｍＲＮＡを隔離する。一部の実施形態において、本明細書に記載のｃｉｒｃＲＮＡは、タンパク質を隔離する。一部の実施形態において、本明細書に記載のｃｉｒｃＲＮＡは、リボソームを隔離する。一部の実施形態において、本明細書に記載のｃｉｒｃＲＮＡは、他のｃｉｒｃＲＮＡを隔離する。一部の実施形態において、本明細書に記載のｃｉｒｃＲＮＡは、非コードＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、又はｓｈＲＮＡを隔離する。一部の実施形態において、本明細書に記載のｃｉｒｃＲＮＡは、ｃｉｒｃＲＮＡに結合した隔離標的、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、又は他の細胞構成成分を分解する分解エレメントを含む。ｃｉｒｃＲＮＡ隔離用途の非限定的な例を表２に列挙する。
Figure 2021531022
[0167] 一部の実施形態において、本明細書に記載のｃｉｒｃＲＮＡを使用する方法のいずれも、翻訳エレメントとの組合せであり得る。翻訳エレメントを含有する本明細書に記載のｃｉｒｃＲＮＡは、ＲＮＡをタンパク質に翻訳し得る。図３は、配列特異的ＲＮＡ結合モチーフ、配列特異的ＤＮＡ結合モチーフ、タンパク質特異的結合モチーフ（タンパク質１）、及び調節ＲＮＡモチーフ（ＲＮＡ１）を含有するｃｉｒｃＲＮＡにより容易にされるタンパク質発現の模式図を説明する。調節ＲＮＡモチーフは、ＲＮＡ転写及びタンパク質発現を開始させ得る。
非翻訳領域
[0168] 一部の実施形態において、本明細書に開示されるｃｉｒｃＲＮＡは、エンクリプトゲンを含み得る。一部の実施形態において、エンクリプトゲンは、非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む。遺伝子のＵＴＲは、転写され得るが翻訳され得ない。一部の実施形態において、ＵＴＲは、本明細書に記載の発現配列の翻訳開始配列の上流に含めることができる。一部の実施形態において、ＵＴＲは、本明細書に記載の発現配列の下流に含めることができる。一部の例において、第１の発現配列についてのあるＵＴＲは、第２の発現配列についての別のＵＴＲと同じであり、又はそれと連続的であり、又はそれと重複する。一部の実施形態において、イントロンは、ヒトイントロンである。一部の実施形態において、イントロンは、全長ヒトイントロン、例えば、ＺＫＳＣＡＮ１である。
[0169] 一部の実施形態において、エンクリプトゲンは、安定性を向上させる。一部の実施形態において、ＵＴＲの調節フィーチャーをエンクリプトゲン中に含めて環状ポリリボヌクレオチドの安定性を向上させることができる。
[0170] 一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、中に埋め込まれたアデノシン及びウリジンの１つ以上のストレッチを有するＵＴＲを含む。ＡＵリッチシグネチャーは、発現産物の回転速度を増加させ得る。
[0171] ＵＴＲ ＡＵリッチエレメント（ＡＲＥ）の導入、除去、又は修飾は、環状ポリリボヌクレオチドの安定性又は免疫原性をモジュレートするために有用であり得る。特異的環状ポリリボヌクレオチドを遺伝子操作する場合、ＡＲＥの１つ以上のコピーを導入して環状ポリリボヌクレオチドを脱安定化させることができ、ＡＲＥのコピーは、翻訳を減少させ、及び／又は発現産物の産生を減少させ得る。同様に、ＡＲＥを同定し、除去し、又は突然変異させて細胞内安定性を増加させ、したがって翻訳及び得られるタンパク質の産生を増加させることができる。
[0172] 任意の遺伝子からのＵＴＲは、環状ポリリボヌクレオチドのそれぞれのフランキング領域中に取り込むことができる。さらに、任意の公知の遺伝子の複数の野生型ＵＴＲを利用することができる。一部の実施形態において、野生型遺伝子のバリアントでない人工ＵＴＲを使用することができる。これらのＵＴＲ又はそれらの一部は、それらが選択された転写産物と同じ配向で配置することができ、又は配向若しくは局在を変更することができる。したがって、５’−又は３’−ＵＴＲは、１つ以上の他の５’−又は３’−ＵＴＲにより逆位化し、短縮させ、延長させ、又はキメラにすることができる。本明細書において使用される用語「変更」は、それがＵＴＲ配列に関する場合、ＵＴＲを参照配列に対して何らかの手法で変化させたことを意味する。例えば、３’−又は５’−ＵＴＲは、上記教示の配向若しくは局在の変化により野生型若しくは天然ＵＴＲに対して変更することができ、又は追加のヌクレオチドの包含、ヌクレオチドの欠失、ヌクレオチドのスワップ若しくは転移により変更することができる。「変更」ＵＴＲ（３’であろうが５’であろうが）を産生するこれらの変化のいずれも、バリアントＵＴＲを含む。
[0173] 一部の実施形態において、二重ＵＴＲ、三重ＵＴＲ、又は四重ＵＴＲ、例えば、５’−又は３’−ＵＴＲを使用することができる。本明細書において使用される「二重」ＵＴＲは、同じＵＴＲの２つのコピーが連続して又は実質的に連続してコードされるものである。例えば、二重β−グロビン３’−ＵＴＲを本発明の一部の実施形態において使用することができる。
エンクリプトゲン
[0174] 本明細書に記載のとおり、環状ポリリボヌクレオチドは、細胞の自然免疫応答を低減させ、回避し、又は忌避するためのエンクリプトゲンを含み得る。一部の実施形態において、本明細書に提供される環状ポリリボヌクレオチドは、参照化合物、例えば、記載の環状ポリリボヌクレオチドに対応する線状ポリヌクレオチド又はエンクリプトゲンを欠く環状ポリリボヌクレオチドにより誘発される応答と比較して宿主からの低減した免疫応答をもたらす。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、エンクリプトゲンを欠く対応物よりも低い免疫原性を有する。
[0175] 一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、哺乳動物、例えば、ヒトにおいて非免疫原性である。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞中で複製し得る。
[0176] 一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、配列又は発現産物を含む。
[0177] 一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも線状対応物、例えば、線状発現配列、又は線状環状ポリリボヌクレオチドの半減期を有する。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、線状対応物のものと比べて増加した半減期を有する。一部の実施形態において、半減期は、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％以上だけ増加する。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１時間〜約３０日間、又は少なくとも約２時間、６時間、１２時間、１８時間、２４時間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、２０日間、２１日間、２２日間、２３日間、２４日間、２５日間、２６日間、２７日間、２８日間、２９日間、３０日間、６０日間以上又はそれらの間の任意の時間の、細胞中の半減期又は持続性を有する。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、約１０分間〜約７日間、又は約１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２４時間、３６時間、４８時間、６０時間、７２時間、４日間、５日間、６日間、７日間、又はそれらの間の任意の時間以下の細胞中の半減期又は持続を有する。
[0178] 一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、細胞機能を、例えば、一過的に又は長期間モジュレートする。ある実施形態において、細胞機能は安定的に変更され、例えば、モジュレーションは、少なくとも約１時間〜約３０日間、又は少なくとも約２時間、６時間、１２時間、１８時間、２４時間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、２０日間、２１日間、２２日間、２３日間、２４日間、２５日間、２６日間、２７日間、２８日間、２９日間、３０日間、６０日間以上又はそれらの間の任意の時間、持続する。ある実施形態において、細胞機能は一過的に変更され、例えば、モジュレーションは、約３０分間〜約７日間以下、又は約１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２４時間、３６時間、４８時間、６０時間、７２時間、４日間、５日間、６日間、７日間、又はそれらの間の任意の時間以下、持続する。
[0179] 一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも約２０塩基対、少なくとも約３０塩基対、少なくとも約４０塩基対、少なくとも約５０塩基対、少なくとも約７５塩基対、少なくとも約１００塩基対、少なくとも約２００塩基対、少なくとも約３００塩基対、少なくとも約４００塩基対、少なくとも約５００塩基対、又は少なくとも約１，０００塩基対である。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、リボソームのための結合部位を収容するために十分なサイズのものであり得る。当業者は、環状ポリリボヌクレオチドの最大サイズは、環状ポリリボヌクレオチドの産生及び／又は環状ポリリボヌクレオチドを使用の技術的制約内で可能な限り大きくてよいことを認識することができる。理論により拘束されるものではないが、ＲＮＡの複数のセグメントをＤＮＡから産生し、それらの５’及び３’フリー末端をアニールしてＲＮＡの「ストリング」を産生し、１つの５’及び１つの３’フリー末端のみが残る場合にそれを最終的に環状化させることができることが考えられる。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの最大サイズは、ＲＮＡをパッケージングし、それを標的に送達する能力により限定され得る。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドのサイズは、有用なポリペプチドをコードするために十分な長さであり、したがって、約２０，０００塩基対未満、約１５，０００塩基対未満、約１０，０００塩基対未満、約７，５００塩基対未満、又は約５，０００塩基対未満、約４，０００塩基対未満、約３，０００塩基対未満、約２，０００塩基対未満、約１，０００塩基対未満、約５００塩基対未満、約４００塩基対未満、約３００塩基対未満、約２００塩基対未満、約１００塩基対未満の長さが有用であり得る。
開裂配列
[0180] 一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの開裂配列を含む。一部の実施形態において、開裂配列は、発現配列に隣接する。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、例えば、自己犠牲ｃｉｒｃＲＮＡ又は開裂性ｃｉｒｃＲＮＡ又は自己開裂ｃｉｒｃＲＮＡ中の開裂配列を含む。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、２つ以上の開裂配列を含み、環状ポリリボヌクレオチドの複数の産物、例えば、ｍｉＲＮＡ、線状ＲＮＡ、より小さい環状ポリリボヌクレオチドなどへの分離をもたらす。
[0181] 一部の実施形態において、開裂配列は、リボザイムＲＮＡ配列を含む。リボザイム（リボ核酸酵素から、ＲＮＡ酵素又は触媒ＲＮＡとも呼ばれる）は、化学反応を触媒するＲＮＡ分子である。多くの天然リボザイムは、それら自体のホスホジエステル結合の１つの加水分解、又は他のＲＮＡ中の結合の加水分解のいずれかを触媒するが、それらは、リボソームのアミノトランスフェラーゼ活性を触媒することも見出されている。触媒ＲＮＡは、インビトロ法により「進化」させることができる。上記考察のリボスイッチ活性と同様に、リボザイム及びその反応産物は、遺伝子発現を調節し得る。一部の実施形態において、触媒ＲＮＡ又はリボザイムは、バルク容量からの分子の化学的変換の目的のためにリボザイムが細胞内で多くのコピーにおいて存在するようにより大きい非コードＲＮＡ内に配置することができる。一部の実施形態において、アプタマー及びリボザイムは、両方とも同じ非コードＲＮＡ中でコードさせることができる。
自己犠牲配列
[0182] 一部の実施形態において、本明細書に記載のｃｉｒｃＲＮＡは、自己犠牲ｃｉｒｃＲＮＡ又は開裂性ｃｉｒｃＲＮＡ又は自己開裂ｃｉｒｃＲＮＡを含む。ｃｉｒｃＲＮＡは、細胞構成成分、例として、例えば、ＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｌｉｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、又はｓｈＲＮＡを送達し得る。一部の実施形態において、ｃｉｒｃＲＮＡは、（ｉ）自己開裂性エレメント；（ｉｉ）開裂リクルートメント部位；（ｉｉｉ）分解性リンカー；（ｉｖ）化学リンカー；及び／又は（ｖ）スペーサー配列により離隔されるｍｉＲＮＡを含む。一部の実施形態において、ｃｉｒｃＲＮＡは、（ｉ）自己開裂性エレメント；（ｉｉ）開裂リクルートメント部位（例えば、ＡＤＡＲ）；（ｉｉｉ）分解性リンカー（例えば、グリセロール）；（ｉｖ）化学リンカー；及び／又は（ｖ）スペーサー配列により離隔されるｓｉＲＮＡを含む。自己開裂性エレメントの非限定的な例としては、ハンマーヘッド、スプライシングエレメント、ヘアピン、デルタ肝炎ウイルス（ＨＤＶ）、バークドサテライト（Varkud Satellite）（ＶＳ）、及びｇｌｍＳリボザイムが挙げられる。ｃｉｒｃＲＮＡ自己犠牲用途の非限定的な例を表４に列挙する。
Figure 2021531022
発現配列
ぺプチド又はポリペプチド
[0183] 一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ぺプチド又はポリペプチドをコードする配列を含む。
[0184] ポリペプチドは、直鎖又は分枝であり得る。ポリペプチドは、約５〜約４０００アミノ酸、約１５〜約３５００アミノ酸、約２０〜約３０００アミノ酸、約２５〜約２５００アミノ酸、約５０〜約２０００アミノ酸、又はその間の任意の範囲の長さを有し得る。一部の実施形態において、ポリペプチドは、約４０００アミノ酸未満、約３５００アミノ酸未満、約３０００アミノ酸未満、約２５００アミノ酸未満、又は約２０００アミノ酸未満、約１５００アミノ酸未満、約１０００アミノ酸未満、約９００アミノ酸未満、約８００アミノ酸未満、約７００アミノ酸未満、約６００アミノ酸未満、約５００アミノ酸未満、約４００アミノ酸未満、約３００アミノ酸未満、又はそれ以下の数未満の長さを有し、有用であり得る。
[0185] 一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、それぞれがポリペプチドをコードし得る１つ以上のＲＮＡ配列を含む。ポリペプチドは、かなりの量で産生することができる。したがって、ポリペプチドは、産生させることができる任意のタンパク質性分子であり得る。ポリペプチドは、細胞から分泌させ、又は細胞の細胞質、核若しくは膜コンパートメントに局在化させることができるポリペプチドであり得る。
[0186] 一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、タンパク質、例えば、治療タンパク質をコードする配列を含む。治療タンパク質の一部の例としては、限定されるものではないが、タンパク質置換物、タンパク質補給物、ワクチン接種物、抗原（例えば、腫瘍抗原、ウイルス、及び細菌）、ホルモン、サイトカイン、抗体、免疫療法薬（例えば、癌）、細胞リプログラミング／分化転換因子、転写因子、キメラ抗原受容体、トランスポザーゼ又はヌクレアーゼ、免疫エフェクター（例えば、免疫応答／シグナルに対する感受性に影響する）、調節デス受容体タンパク質（例えば、アポトーシス又は壊死の誘導因子）、腫瘍の非溶解阻害剤（例えば、癌タンパク質の阻害剤）、エピジェネティック修飾剤、エピジェネティック酵素、転写因子、ＤＮＡ又はタンパク質修飾酵素、ＤＮＡインターカレート剤、排出ポンプ阻害剤、核内受容体アクチベーター又は阻害剤、プロテアソーム阻害剤、酵素についての競合阻害剤、タンパク質合成エフェクター又は阻害剤、ヌクレアーゼ、タンパク質断片又はドメイン、リガンド又は受容体、及びＣＲＩＳＰＲ系又はその構成成分が挙げられる。
調節配列
[0187] 一部の実施形態において、調節配列は、プロモーターである。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの発現配列に隣接する少なくとも１つのプロモーターを含む。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、それぞれの発現配列に隣接するプロモーターを含む。一部の実施形態において、プロモーターは、それぞれの発現配列の片側又は両側上に存在し、発現産物、例えば、ペプチド及び又はポリペプチドの分離をもたらす。
[0188] 環状ポリリボヌクレオチドは、遺伝子によりコードされるＲＮＡの発現をモジュレートし得る。複数の遺伝子がある程度の互いとの配列相同性を共有し得るため、環状ポリリボヌクレオチドは、十分な配列相同性を有する遺伝子のクラスを標的化するように設計することができる。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、異なる遺伝子標的の間で共有され、又は特異的遺伝子標的について特有である配列との相補性を有する配列を含有し得る。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、いくつかの遺伝子間の相同性を有するＲＮＡ配列の保存領域を標的化し、それにより遺伝子ファミリーのいくつかの遺伝子を標的化するように設計することができる。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、単一遺伝子の特異的ＲＮＡ配列に特有である配列を標的化するように設計することができる。
[0189] 一部の実施形態において、発現配列は、５０００ｂｐ未満（例えば、約５０００ｂｐ、４０００ｂｐ、３０００ｂｐ、２０００ｂｐ、１０００ｂｐ、９００ｂｐ、８００ｂｐ、７００ｂｐ、６００ｂｐ、５００ｂｐ、４００ｂｐ、３００ｂｐ、２００ｂｐ、１００ｂｐ、５０ｂｐ、４０ｂｐ、３０ｂｐ、２０ｂｐ、１０ｂｐ未満、又はそれ以下）未満の長さを有する。一部の実施形態において、発現配列は、独立して、又は追加して、１０ｂｐ超（例えば、少なくとも約１０ｂｐ、２０ｂｐ、３０ｂｐ、４０ｂｐ、５０ｂｐ、６０ｂｐ、７０ｂｐ、８０ｂｐ、９０ｂｐ、１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１０００ｋｂ、１．１ｋｂ、１．２ｋｂ、１．３ｋｂ、１．４ｋｂ、１．５ｋｂ、１．６ｋｂ、１．７ｋｂ、１．８ｋｂ、１．９ｋｂ、２ｋｂ、２．１ｋｂ、２．２ｋｂ、２．３ｋｂ、２．４ｋｂ、２．５ｋｂ、２．６ｋｂ、２．７ｋｂ、２．８ｋｂ、２．９ｋｂ、３ｋｂ、３．１ｋｂ、３．２ｋｂ、３．３ｋｂ、３．４ｋｂ、３．５ｋｂ、３．６ｋｂ、３．７ｋｂ、３．８ｋｂ、３．９ｋｂ、４ｋｂ、４．１ｋｂ、４．２ｋｂ、４．３ｋｂ、４．４ｋｂ、４．５ｋｂ、４．６ｋｂ、４．７ｋｂ、４．８ｋｂ、４．９ｋｂ、５ｋｂ以上）の長さを有する。
[0190] 一部の実施形態において、発現配列は、本明細書に記載の特徴部の１つ以上を含み、例えば、１つ以上のぺプチド又はタンパク質をコードする配列、１つ以上の調節核酸、１つ以上の非コードＲＮＡ、及び他の発現配列である。
内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）
[0191] 一部の実施形態において、本明細書に記載の環状ポリリボヌクレオチドは、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）エレメントを含む。好適なＩＲＥＳエレメントは、真核生物リボソームにエンゲージし得るＲＮＡ配列を含有し得る。一部の実施形態において、ＩＲＥＳエレメントは、少なくとも約５０塩基対、少なくとも約１００塩基対、少なくとも約２００塩基対、少なくとも約２５０塩基対、少なくとも約３５０塩基対、又は宇約５００塩基対である。一部の実施形態において、ＩＲＥＳエレメントは、生物体、例として、限定されるものではないが、ウイルス、哺乳動物、及びショウジョウバエ属（Drosophila）のＤＮＡに由来する。ウイルスＤＮＡは、例えば、ピコルナウイルスｃＤＮＡ、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）ｃＤＮＡ、及びポリオウイルスｃＤＮＡに由来し得る。一部の実施形態において、ＩＲＥＳエレメントが由来するショウジョウバエ属ＤＮＡとしては、例えば、キイロショウジョウバエからのアンテナペディア遺伝子を挙げることができる。
[0192] 一部の実施形態において、本明細書に記載の環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つ（例えば、２、３、４、５つ以上）の発現配列をフランキングする少なくとも１つのＩＲＥＳを含む。一部の実施形態において、ＩＲＥＳは、少なくとも１つ（例えば、２、３、４、５つ以上）の発現配列の両側をフランキングし得る。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、それぞれの発現配列の片側又は両側上の１つ以上のＩＲＥＳ配列を含み得、得られるぺプチド及び又はポリペプチドの分離をもたらす。
翻訳開始配列
[0193] 一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドはポリペプチドをコードし、翻訳開始配列、例えば、開始コドンを含み得る。一部の実施形態において、翻訳開始配列は、コザック又はシャイン・ダルガルノ配列を含む。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、発現配列に隣接する翻訳開始配列、例えば、コザック配列を含む。一部の実施形態において、翻訳開始配列、例えば、コザック配列は、それぞれの発現配列の片側又は両側上に存在し、発現産物の分離をもたらす。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、発現配列に隣接する少なくとも１つの翻訳開始配列を含む。
[0194] 天然５’−ＵＴＲは、翻訳開始において役割を担うフィーチャーを担持し得る。天然５’−ＵＴＲは、リボソームが多くの遺伝子の翻訳を開始させるプロセスに関与し得るシグネチャー、例えば、コザック配列を保有し得る。コザック配列は、コンセンサスＣＣＲ（Ａ／Ｇ）ＣＣＡＵＧＧ（Ｒは、別の「Ｇ」が続く開始コドン（ＡＵＧ）の３塩基上流のプリン（アデニン又はグアニン）である）を有する。５’−ＵＴＲは、伸長因子結合に関与する二次構造も形成し得る。
[0195] 環状ポリリボヌクレオチドは、２つ以上の開始コドン、例えば、限定されるものではないが、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、又は６０個超の開始コドンを含み得る。翻訳は、最初の開始コドン上で開始し、又は最初の開始コドンの下流で開始し得る。
[0196] 一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、最初の開始コドン、例えば、ＡＵＧでないコドンにおいて開始し得る。環状ポリリボヌクレオチドの翻訳は、代替的翻訳開始配列、例えば、限定されるものではないが、ＡＣＧ、ＡＧＧ、ＡＡＧ、ＣＴＧ／ＣＵＧ、ＧＴＧ／ＧＵＧ、ＡＴＡ／ＡＵＡ、ＡＴＴ／ＡＵＵ、ＴＴＧ／ＵＵＧにおいて開始し得る。一部の実施形態において、翻訳は、選択的条件、例えば、ストレス誘導条件下で代替的翻訳開始配列において開始する。非限定的な例として、環状ポリリボヌクレオチドの翻訳は、代替的翻訳開始配列、例えば、ＡＣＧにおいて開始し得る。別の非限定的な例として、環状ポリリボヌクレオチド翻訳は、代替的翻訳開始配列ＣＴＧ／ＣＵＧにおいて開始し得る。さらに別の非限定的な例として、環状ポリリボヌクレオチド翻訳は、代替的翻訳開始配列ＧＴＧ／ＧＵＧにおいて開始し得る。さらに別の非限定的な例として、環状ポリリボヌクレオチドは、リピート関連非ＡＵＧ（ＲＡＮ）配列、例えば、反復ＲＮＡの短鎖ストレッチを含む代替的翻訳開始配列、例えば、ＣＧＧ、ＧＧＧＧＣＣ、ＣＡＧ、ＣＴＧにおいて翻訳を開始させ得る。
[0197] 翻訳を開始させるコドンをフランキングするヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチドの翻訳効率、長さ及び／又は構造に影響を与え得る。翻訳を開始させるコドンをフランキングするヌクレオチドのいずれかのマスキングを使用して環状ポリリボヌクレオチドの翻訳開始の位置、翻訳効率、長さ、及び／又は構造を変更することができる。
[0198] 一部の実施形態において、マスキング剤は、開始コドン又は代替的開始コドン付近で使用してコドンをマスキング又は隠蔽してマスキングされた開始コドン又は代替的開始コドンにおける翻訳開始の確率を低減させることができる。マスキング剤の非限定的な例としては、アンチセンスロック核酸（ＬＮＡ）オリゴヌクレオチド及びエキソン−ジャンクション複合体（ＥＪＣ）が挙げられる。一部の実施形態において、マスキング剤を使用して環状ポリリボヌクレオチドの開始コドンをマスキングして翻訳が代替的開始コドンにおいて開始する見込みを増加させることができる。
[0199] 一部の実施形態において、翻訳は、選択的条件下で、例えば、限定されるものではないが、ＧＲＳＦ−１の存在下のウイルス誘導選択で開始され、環状ポリリボヌクレオチドは、ＧＲＳＦ−１結合部位を含む。
[0200] 一部の実施形態において、翻訳は、ロカグラートによる真核生物開始因子４Ａ（ｅＩＦ４Ａ）処理により開始される。翻訳は、４３Ｓスキャニングを遮断することにより抑制し、未成熟の上流翻訳開始をもたらし、ＲｏｃＡ−ｅＩＦ４Ａ標的配列を担持する転写産物からのタンパク質発現を低減させることができる。
終結配列
[0201] 一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上の発現配列を含み、それぞれの発現配列は、終結配列を有し得る。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上の発現配列を含み、発現配列は、終結配列を欠き、その結果、環状ポリリボヌクレオチドは継続的に翻訳される。終結配列の排除は、リボソーム停滞又は脱離の欠落に起因してローリングサークル翻訳又は発現産物、例えば、ぺプチド又はポリペプチドの継続的産生をもたらし得る。このような実施形態において、ローリングサークル翻訳は、それぞれの発現配列を介して継続的発現産物を産生する。
[0202] 一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、スタッガー配列を含む。継続的発現産物、例えば、ぺプチド又はポリペプチドの産生を忌避する一方、ローリングサークル翻訳を維持するため、スタッガー配列を含めて翻訳の間にリボソームポージングを誘導することができる。スタッガー配列としては、２Ａ様又はＣＨＹＳＥＬ（シス作用ヒドロラーゼエレメント）配列を挙げることができる。一部の実施形態において、スタッガーエレメントは、Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＥＸ５ＮＰＧＰ（Ｘ１は、不存在又はＧ若しくはＨであり、Ｘ２は、不存在又はＤ若しくはＧであり、Ｘ３は、Ｄ又はＶ又はＩ又はＳ又はＭであり、Ｘ５は、任意のアミノ酸である）であるＣ末端コンセンサス配列を有する配列をコードする。一部の実施形態において、この配列は、強力なα−ヘリカル傾向を有するアミノ酸の非保存的配列とそれに続くコンセンサス配列−Ｄ（Ｖ／Ｉ）ＥｘＮＰＧＰ（ｘ＝任意のアミノ酸）を含む。スタッガーエレメントの一部の非限定的な例としては、ＧＤＶＥＳＮＰＧＰ、ＧＤＩＥＥＮＰＧＰ、ＶＥＰＮＰＧＰ、ＩＥＴＮＰＧＰ、ＧＤＩＥＳＮＰＧＰ、ＧＤＶＥＬＮＰＧＰ、ＧＤＩＥＴＮＰＧＰ、ＧＤＶＥＮＰＧＰ、ＧＤＶＥＥＮＰＧＰ、ＧＤＶＥＱＮＰＧＰ、ＩＥＳＮＰＧＰ、ＧＤＩＥＬＮＰＧＰ、ＨＤＩＥＴＮＰＧＰ、ＨＤＶＥＴＮＰＧＰ、ＨＤＶＥＭＮＰＧＰ、ＧＤＭＥＳＮＰＧＰ、ＧＤＶＥＴＮＰＧＰ、ＧＤＩＥＱＮＰＧＰ、及びＤＳＥＦＮＰＧＰが挙げられる。
[0203] 一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上の発現配列の末端における終結配列を含む。一部の実施形態において、１つ以上の発現配列は、終結配列を欠く。一般に、終結配列は、翻訳の終結をシグナリングするインフレームヌクレオチドトリプレット、例えば、ＵＡＡ、ＵＧＡ、ＵＡＧを含む。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド中の１つ以上の終結配列は、フレームシフト終結配列、例えば、限定されるものではないが、翻訳を終結させ得るオフフレーム又は−１及び＋１シフトリーディングフレーム（例えば、隠された終止）である。フレームシフト終結配列としては、発現配列の第２及び第３のリーディングフレーム中に出現するヌクレオチドトリプルＴＡＡ、ＴＡＧ、及びＴＧＡが挙げられる。フレームシフト終結配列は、細胞に有害であることが多いｍＲＮＡのミスリードの防止において重要であり得る。
[0204] 一部の実施形態において、本明細書に記載のスタッガー配列は、翻訳を終結させ、及び／又は発現産物を本明細書に記載のコンセンサス配列のＧ及びＰ間で開裂し得る。１つの非限定的な例として、環状ポリリボヌクレオチドは、翻訳を終結させ、及び／又は発現産物を開裂させるための少なくとも１つのスタッガー配列を含む。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの発現配列に隣接するスタッガー配列を含む。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、それぞれの発現配列の後にスタッガー配列を含む。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、それぞれの発現配列の片側又は両側上に存在するスタッガー配列を含み、それぞれの発現配列からの個々のぺプチド及び又はポリペプチドの翻訳をもたらす。
ポリＡ配列
[0205] 一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ポリＡ配列を含む。一部の実施形態において、ポリＡ配列の長さは、１０ヌクレオチド長超である。一部の実施形態において、ポリＡ配列は、１５ヌクレオチド長超（例えば、少なくとも又は約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００、１，９００、２，０００、２，５００、及び３，０００ヌクレオチド超）である。一部の実施形態において、ポリＡ配列は、約１０〜約３，０００ヌクレオチド（例えば、３０〜５０、３０〜１００、３０〜２５０、３０〜５００、３０〜７５０、３０〜１，０００、３０〜１，５００、３０〜２，０００、３０〜２，５００、５０〜１００、５０〜２５０、５０〜５００、５０〜７５０、５０〜１，０００、５０〜１，５００、５０〜２，０００、５０〜２，５００、５０〜３，０００、１００〜５００、１００〜７５０、１００〜１，０００、１００〜１，５００、１００〜２，０００、１００〜２，５００、１００〜３，０００、５００〜７５０、５００〜１，０００、５００〜１，５００、５００〜２，０００、５００〜２，５００、５００〜３，０００、１，０００〜１，５００、１，０００〜２，０００、１，０００〜２，５００、１，０００〜３，０００、１，５００〜２，０００、１，５００〜２，５００、１，５００〜３，０００、２，０００〜３，０００、２，０００〜２，５００、及び２，５００〜３，０００）である。
[0206] 一部の実施形態において、ポリＡ配列は、環状ポリリボヌクレオチド全体の長さに対して設計される。設計は、コード領域の長さ、特定のフィーチャー若しくは領域（例えば、第１の又はフランキング領域）の長さに基づき、又は環状ポリリボヌクレオチドから発現される最終産物の長さに基づき得る。これに関して、ポリＡ配列は、環状ポリリボヌクレオチド又はそのフィーチャーよりも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００％超長くてよい。ポリＡ配列は、環状ポリリボヌクレオチドの一部として設計することもできる。これに関して、ポリＡ配列は、構築物の全長又は構築物の全長からポリＡ配列を引いたものの１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上であり得る。さらに、ポリＡ結合タンパク質のための遺伝子操作結合部位及び環状ポリリボヌクレオチドのコンジュゲーションは、発現を向上させ得る。
[0207] 一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ポリＡ−Ｇカルテットを含むように設計される。Ｇカルテットは、ＤＮＡ及びＲＮＡ中の両方のＧリッチ配列により形成され得る４つのグアニンヌクレオチドの環式水素結合配列である。一部の実施形態において、Ｇカルテットは、ポリＡ配列の末端において取り込むことができる。得られる環状ポリリボヌクレオチド構築物は、安定性、タンパク質産生、及び／又は他のパラメータ、例として、半減期について種々の時点においてアッセイすることができる。一部の実施形態において、ポリＡ−Ｇカルテットは、１２０ヌクレオチドのポリＡ配列を単独で使用して見られるものの少なくとも７５％と同等のタンパク質産生をもたらし得る。
リボスイッチ
[0208] 一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上のリボスイッチを含む。
[0209] リボスイッチは、小さい標的分子に直接結合し得、標的のその結合は、ＲＮＡ翻訳並びに発現産物の安定性及び活性に影響を与える環状ポリリボヌクレオチドの一部分であり得る。したがって、リボスイッチを含む環状ポリリボヌクレオチドは、標的分子の存在又は不存在に応じて環状ポリリボヌクレオチドの活性を調節し得る。一部の実施形態において、リボスイッチは、別個の分子についてのアプタマー様親和性の領域である。非コード核酸内に含まれる任意のアプタマーを、バルク容量からの分子の隔離のために使用することができる。一部の実施形態において、「（リボ）スイッチ」活性は、イベントの下流報告に使用することができる。
[0210] 一部の実施形態において、リボスイッチは、転写終結、翻訳開始の阻害、ｍＲＮＡ自己開裂、及び真核生物においてはスプライシング経路の変更により遺伝子発現をモジュレートする。リボスイッチは、トリガー分子の結合又は除去を介して遺伝子発現を制御し得る。したがって、リボスイッチを活性化させ、脱活性化させ、又は遮断する条件にリボスイッチを含む環状ポリリボヌクレオチドを供することは、遺伝子発現を変更し得る。例えば、遺伝子発現は、転写の終結又はＲＮＡへのリボソーム結合の遮断の結果として変更することができる。トリガー分子、又はそのアナログの結合は、リボスイッチの性質に応じてＲＮＡ分子の発現を低減させ／防止し得、又はその発現を促進し／増加させ得る。
[0211] 一部の実施形態において、リボスイッチは、アデノシルコバラミン（ビタミンＢ１２の補酵素形態）を結合させてコバラミン及び類似の代謝産物の生合成及び輸送を調節するコバラミンリボスイッチ（Ｂ１２エレメントとも）である。
[0212] 一部の実施形態において、リボスイッチは、サイクリックジ−ＧＭＰを結合させて種々の遺伝子を調節するサイクリックジ−ＧＭＰリボスイッチである。サイクリックジ−ＧＭＰリボスイッチの２つの非構造関連クラス：サイクリックジ−ＧＭＰ−Ｉ及びサイクリックジ−ＧＭＰ−ＩＩが存在する。
[0213] 一部の実施形態において、リボスイッチは、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）を結合させてリボフラビン生合成及び輸送を調節するＦＭＮリボスイッチ（ＲＦＮエレメントとも）である。
[0214] 一部の実施形態において、リボスイッチは、十分な濃度のグルコサミン−６−リン酸が存在する場合にそれ自体開裂するｇｌｍＳリボスイッチである。
[0215] 一部の実施形態において、リボスイッチは、グルタミンを結合させてグルタミン及び窒素代謝に関与する遺伝子を調節するグルタミンリボスイッチである。グルタミンリボスイッチは、不明機能の短鎖ぺプチドにも結合し得る。このようなリボスイッチは、２つの構造関連クラス：ｇｌｎＡ ＲＮＡモチーフ及び下流ぺプチドモチーフに収まる。
[0216] 一部の実施形態において、リボスイッチは、グリシンを結合させてグリシン代謝遺伝子を調節するグリシンリボスイッチである。これは、同じｍＲＮＡ中の２つの隣接アプタマードメインを含み、協調的結合を示す唯一の公知の天然ＲＮＡである。
[0217] 一部の実施形態において、リボスイッチは、リジンを結合させてリジン生合成、異化、及び輸送を調節するリジンリボスイッチ（Ｌ−ボックスとも）である。
[0218] 一部の実施形態において、リボスイッチは、プレキューオシンを結合させてこの前駆体のキューオシンへの合成又は輸送に関与する遺伝子を調節するｐｒｅＱ１リボスイッチである。ｐｒｅＱ１リボスイッチの２つの異なるクラスは、ｐｒｅＱ１−Ｉリボスイッチ及びｐｒｅＱ１−ＩＩリボスイッチである。ｐｒｅＱ１−Ｉリボスイッチの結合ドメインは、天然発生リボスイッチの中で非常に小さい。ストレプトコッカス属（Streptococcus）及びラクトコッカス属（Lactococcus）のある種にのみ見出されるｐｒｅＱ１−ＩＩリボスイッチは、完全に異なる構造を有し、ｐｒｅＱ１−Ｉリボスイッチよりも大きい。
[0219] 一部の実施形態において、リボスイッチは、プリンを結合させてプリン代謝及び輸送を調節するプリンリボスイッチである。異なる形態のプリンリボスイッチは、グアニン又はアデニンを結合させる。グアニン又はアデニンのいずれかについての特異性は、Ｙ７４位におけるリボスイッチ中の単一ピリミジンとのワトソン・クリック相互作用に依存する。グアニンリボスイッチにおいて、単一ピリミジンは、シトシン（すなわち、Ｃ７４）である。アデニンリボスイッチにおいて、単一ピリミジンは、ウラシル（すなわち、Ｕ７４）である。相同タイプのプリンリボスイッチは、デオキシグアノシンを結合させ得るが、単一ヌクレオチド突然変異よりも有意な差を有する。
[0220] 一部の実施形態において、リボスイッチは、Ｓ−アデノシルホモシステイン（ＳＡＨ）を結合させてメチル化反応においてＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）から産生されるＳＡＨの再循環に関与する遺伝子を調節するＳＡＨリボスイッチである。
[0221] 一部の実施形態において、リボスイッチは、Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）を結合させてメチオニン及びＳＡＭの生合成及び輸送を調節するＳＡＭリボスイッチである。３つの区別されるＳＡＭリボスイッチ：ＳＡＭ−Ｉ（元々はＳ−ボックスと呼ばれていた）、ＳＡＭ−ＩＩ、及びＳＭＫボックスが存在する。ＳＡＭ−Ｉは、細菌中に広く存在する。ＳＡＭ−ＩＩは、α−、β−、及び少数のγ−プロテオバクテリアにのみ見出される。ＳＭＫボックスリボスイッチは、ラクトバシルス目（Lactobacillales）に見出される。これら３つのリボスイッチの変種は、明白な配列類似性も構造類似性も有さない。第４の変種ＳＡＭ−ＩＶは、ＳＡＭ−Ｉのものと類似のリガンド結合コアを有するが、区別される足場の状況で有すると考えられる。
[0222] 一部の実施形態において、リボスイッチは、ＳＡＭ及びＳＡＨの両方に類似の親和性で結合するＳＡＭ−ＳＡＨリボスイッチである。
[0223] 一部の実施形態において、リボスイッチは、テトラヒドロ葉酸を結合させて遺伝子の合成及び輸送を調節するテトラヒドロ葉酸リボスイッチである。
[0224] 一部の実施形態において、リボスイッチは、テオフィリン結合リボスイッチ又はチミンピロリン酸結合リボスイッチである。
[0225] 一部の実施形態において、リボスイッチは、グルコサミン−６−リン酸を感知するサーモアナエロバクター・テングコンジェンシス（Thermoanaerobacter tengcongensis）からのｇｌｍＳ触媒リボスイッチである。
[0226] 一部の実施形態において、リボスイッチは、チアミンピロリン酸（ＴＰＰ）を結合させてチアミン生合成及び輸送、並びに類似の代謝産物の輸送を調節するＴＰＰリボスイッチ（Ｔｈｉ−ボックスとも）である。ＴＰＰリボスイッチは、真核生物に見出される。
[0227] 一部の実施形態において、リボスイッチは、モリブデン補因子を結合させてこの補酵素、及びモリブデン又はその誘導体を補因子として使用する酵素の生合成及び輸送に関与する遺伝子を調節するＭｏｃｏリボスイッチである。
[0228] 一部の実施形態において、リボスイッチは、ビブリオ・バルニフィカス（Vibrio vulnificus）のアデニンデアミナーゼ（ａｄｄ）コード遺伝子の５’−ＵＴＲに見出されるアデニン感知ａｄｄ−Ａリボスイッチである。
アプタザイム
[0229] 一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、アプタザイムを含む。アプタザイムは、アプタマー領域がアロステリック制御エレメントとして使用され、触媒ＲＮＡ（下記の「リボザイム」）の領域に結合される条件付き発現のためのスイッチである。一部の実施形態において、アプタザイムは、細胞タイプ特異的翻訳において活性である。一部の実施形態において、アプタザイムは、細胞状態特異的翻訳下で、例えば、ウイルス感染細胞下、又はウイルス核酸若しくはウイルスタンパク質の存在下で活性である。
[0230] リボザイムは、化学反応を触媒するＲＮＡ分子である。多くの天然リボザイムは、リボザイム自体のホスホジエステル結合の加水分解又は他のＲＮＡ中のホスホジエステル結合の加水分解を触媒し得る。天然リボザイムは、リボソームのアミノトランスフェラーゼ活性も触媒し得る。触媒ＲＮＡは、インビトロ法により「進化」させることができる。リボザイム及びリボザイムの反応産物は、遺伝子発現を調節し得る。一部の実施形態において、触媒ＲＮＡ又はリボザイムは、バルク容量からの分子の化学的変換のためにリボザイムが多くのコピーにおいて細胞内に存在するようにより大きい非コードＲＮＡ内に配置することができる。一部の実施形態において、アプタマー及びリボザイムは、両方とも、同じ非コードＲＮＡ中でコードさせることができる。
[0231] リボザイムの非限定的な例としては、ハンマーヘッドリボザイム、ＶＬリボザイム、リードザイム、及びヘアピンリボザイムが挙げられる。
[0232] 一部の実施形態において、アプタザイムは、ＲＮＡ配列を開裂し得、リガンド又はモジュレーターの結合の結果として調節することができるリボザイムである。リボザイムは、自己開裂リボザイムであり得る。したがって、これらのリボザイムは、リボザイム及びアプタマーの特性を組み合わせ得る。
[0233] 一部の実施形態において、アプタザイムは、本明細書に記載の環状ポリリボヌクレオチドの非翻訳領域中に含まれる。リガンド／モジュレーターの不存在下のアプタザイムは不活性であり、導入遺伝子の発現を許容し得る。発現は、リガンドの添加により停止させ、又は下方調節することができる。特定のモジュレーターの存在に応答して下方調節されるアプタザイムは、モジュレーターに応答する遺伝子発現の上方調節が望ましい制御系において使用することができる。
[0234] アプタザイムは、環状ポリリボヌクレオチド発現の自己調節のための系を発生させるために使用することもできる。例えば、特定の小分子の合成における律速酵素である本明細書に記載の環状ポリリボヌクレオチドのタンパク質産物は、小分子の存在下で増加した触媒活性を有するように選択されるアプタザイムを含むように改変して分子の合成のための自己調節フィードバックループを提供することができる。或いは、アプタザイム活性は、環状ポリリボヌクレオチドからのタンパク質産物、又は任意の他の細胞巨大分子の選択される感知の蓄積であり得る。
[0235] 一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、アプタマー配列を含み得る。アプタマーの非限定的な例としては、リゾチームを結合させるＲＮＡアプタマー、Ｔｏｇｇｌｅ−２５ｔ（トロンビンに高い特異性及び親和性で結合する２’−フルオロピリミジンヌクレオチドを含有するＲＮＡアプタマー）、ヒト免疫不全ウイルストランス作用応答エレメント（ＨＩＶ ＴＡＲ）を結合させるＲＮＡ−Ｔａｔ、ヘミンを結合させるＲＮＡアプタマー、インターフェロンγを結合させるＲＮＡアプタマー、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）を結合させるＲＮＡアプタマー、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）を結合させるＲＮＡアプタマー、ドーパミンを結合させるＲＮＡアプタマー、及び熱ショック因子１（ＨＳＦ１）を結合させるＲＮＡアプタマーが挙げられる。
[0236] 一部の実施形態において、本明細書に記載のｃｉｒｃＲＮＡは、ＲＮＡの転写及び複製に使用することができる。例えば、ｃｉｒｃＲＮＡを使用して非コードＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、又はｓｈＲＮＡをコードさせることができる。一部の実施形態において、ｃｉｒｃＲＮＡは、アンチセンスｍｉＲＮＡ及び転写エレメントを含み得る。転写後、このようなｃｉｒｃＲＮＡは、機能的線状ｍｉＲＮＡを産生し得る。ｃｉｒｃＲＮＡ発現及びモジュレーション用途の非限定的な例を表５に列挙する。
Figure 2021531022
複製エレメント
[0237] 環状ポリリボヌクレオチドは、複製に有用な配列及び／又はモチーフをコードし得る。環状ポリリボヌクレオチドの複製は、相補環状ポリリボヌクレオチドを生成することにより生じ得る。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、転写を開始させるためのモチーフを含み、転写は内因性細胞機構（ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ）又は環状ポリリボヌクレオチドによりコードされるＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのいずれかによりドライブされる。ローリングサークル転写イベントの産物は、リボザイムにより切断して単位長さにおける相補的又は伝播環状ポリリボヌクレオチドのいずれかを生成することができる。リボザイムは、環状ポリリボヌクレオチド、その相補鎖により、又はＲＮＡ配列によりトランスでコードさせることができる。一部の実施形態において、コードされるリボザイムは、ｃｉｒｃＲＮＡ伝播を制御するためのリボザイムの活性を調節する（阻害又は促進する）配列又はモチーフを含み得る。一部の実施形態において、単位長さ配列は、細胞ＲＮＡリガーゼにより環状形態にライゲートさせることができる。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、自己増幅を補助する複製エレメントを含む。このような複製エレメントの例としては、ＨＤＶ複製ドメイン並びに複製可能環状ＲＮＡセンス及び／又はアンチセンスリボザイム、例えば、
アンチゲノム ５’−ＣＧＧＧＵＣＧＧＣＡＵＧＧＣＡＵＣＵＣＣＡＣＣＵＣＣＵＣＧＣＧＧＵＣＣＧＡＣＣＵＧＧＧＣＡＵＣＣＧＡＡＧＧＡＧＧＡＣＧＣＡＣＧＵＣＣＡＣＵＣＧＧＡＵＧＧＣＵＡＡＧＧＧＡＧＡＧＣＣＡ−３’（配列番号１）、又は
ゲノム ５’−ＵＧＧＣＣＧＧＣＡＵＧＧＵＣＣＣＡＧＣＣＵＣＣＵＣＧＣＵＧＧＣＧＣＣＧＧＣＵＧＧＧＣＡＡＣＡＵＵＣＣＧＡＧＧＧＧＡＣＣＧＵＣＣＣＣＵＣＧＧＵＡＡＵＧＧＣＧＡＡＵＧＧＧＡＣＣＣＡ−３’（配列番号２）が挙げられる。
[0238] 一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、複製を補助するための本明細書に記載の少なくとも１つの開裂配列を含む。環状ポリリボヌクレオチド内の開裂配列は、環状ポリリボヌクレオチドから複製された長い転写産物を規定の長さに開裂し得、続いてそれが環状化して環状ポリリボヌクレオチドに対する相補鎖を形成し得る。
[0239] 別の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチドから複製された長い転写産物を規定の長さに開裂するための少なくとも１つのリボザイム配列を含み、別のコードリボザイムは、リボザイム配列において転写産物を切断する。環状化は、環状ポリリボヌクレオチドに対する相補鎖を形成する。
[0240] 一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、例えば、エキソヌクレアーゼによる分解に実質的に抵抗性である。
[0241] 一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、細胞内で複製する。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、約１０％〜２０％、２０％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、それらの間の任意の割合において細胞内で複製する。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは細胞内で複製し、娘細胞に移される。一部の実施形態において、細胞は、少なくとも１つの環状ポリリボヌクレオチドを娘細胞に少なくとも２５％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の効率で移す。一部の実施形態において、減数分裂を受ける細胞は、環状ポリリボヌクレオチドを娘細胞に少なくとも２５％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の効率で移す。一部の実施形態において、減数分裂を受ける細胞は、環状ポリリボヌクレオチドを娘細胞に少なくとも２５％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の効率で移す。
[0242] 一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、宿主細胞内で複製する。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞中で複製し得る。
[0243] 一部の実施形態において環状ポリリボヌクレオチドは宿主細胞中で複製する一方、環状ポリリボヌクレオチドは、宿主のゲノム中に、例えば、宿主の染色体とインテグレートしない。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、例えば、宿主の染色体との無視可能な組換え頻度を有する。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、例えば、約１．０ｃＭ／Ｍｂ、０．９ｃＭ／Ｍｂ、０．８ｃＭ／Ｍｂ、０．７ｃＭ／Ｍｂ、０．６ｃＭ／Ｍｂ、０．５ｃＭ／Ｍｂ、０．４ｃＭ／Ｍｂ、０．３ｃＭ／Ｍｂ、０．２ｃＭ／Ｍｂ、０．１ｃＭ／Ｍｂ未満、又はそれ以下の数未満の、例えば、宿主の染色体との組換え頻度を有する。
他の配列
[0244] 一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、別の核酸配列をさらに含む。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は人工核酸配列を含み得る。他の配列としては、限定されるものではないが、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、又はｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｇＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、若しくは他のＲＮＡｉ分子をコードする配列を挙げることができる。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチドと異なる遺伝子座又は同じ遺伝子発現産物の遺伝子座を標的化するためのｓｉＲＮＡをコードする配列を含む。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチドと異なる遺伝子発現産物を標的化するためのｓｉＲＮＡをコードする配列を含む。
[0245] 一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、５’−ＵＴＲを欠く。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、３’−ＵＴＲを欠く。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ポリＡ配列を欠く。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、終結配列を欠く。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、内部リボソーム進入部位を欠く。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、エキソヌクレアーゼによる分解感受性を欠く。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、キャップ結合タンパク質への結合を欠く。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、５’キャップを欠く。
[0246] 一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、以下の配列の１つ以上：１つ以上のｍｉＲＮＡをコードする配列、１つ以上の複製タンパク質をコードする配列、外因性遺伝子をコードする配列、治療薬をコードする配列、調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサー）、内因性遺伝子（ｓｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ）を標的化する１つ以上の調節配列をコードする配列、及び治療ｍＲＮＡ又はタンパク質をコードする配列を含む。
[0247] 他の配列は、約２〜約５０００ｎｔ、約１０〜約１００ｎｔ、約５０〜約１５０ｎｔ、約１００〜約２００ｎｔ、約１５０〜約２５０ｎｔ、約２００〜約３００ｎｔ、約２５０〜約３５０ｎｔ、約３００〜約５００ｎｔ、約１０〜約１０００ｎｔ、約５０〜約１０００ｎｔ、約１００〜約１０００ｎｔ、約１０００〜約２０００ｎｔ、約２０００〜約３０００ｎｔ、約３０００〜約４０００ｎｔ、約４０００〜約５０００ｎｔ、又はそれらの間の任意の範囲の長さを有し得る。
[0248] 環状ポリリボヌクレオチドは、その環状化の結果として、それを線状ＲＮＡと区別するある特徴を含み得る。例えば、環状ポリリボヌクレオチドは、エキソヌクレアーゼによる分解に対して線状ＲＮＡと比較して感受性でない。したがって、環状ポリリボヌクレオチドは、特にエキソヌクレアーゼの存在下でインキュベートされる場合、線状ＲＮＡよりも安定的である。線状ＲＮＡと比較して増加した環状ポリリボヌクレオチドの安定性により、環状ポリリボヌクレオチドはポリペプチドを産生するための細胞形質転換試薬としてより有用となり、線状ＲＮＡよりも容易に且つ長く貯蔵することができる。エキソヌクレアーゼにより処理された環状ポリリボヌクレオチドの安定性は、ＲＮＡ分解が生じたか否かを決定する当技術分野において標準的な方法を使用して（例えば、ゲル電気泳動により）試験することができる。
[0249] さらに、線状ＲＮＡと異なり、環状ポリリボヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチドがホスファターゼ、例えば、ウシ小腸ホスファターゼとインキュベートされる場合、脱リン酸化に対して感受性でない。
ヌクレオチドスペーサー配列
[0250] 一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、スペーサー配列を含む。
[0251] スペーサーは、スペーサーの全長にわたり、又はスペーサーの少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の連続核酸残基にわたり、例えば、６５％、６０％、５５％、５０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３９％、３８％、３７％、３６％、３５％、３４％、３３％、３２％、３１％、３０％、２９％、２８％、２７％、２６％、２５％、２４％、２３％、２２％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％又は１％未満の低いＧＣ含有率を有する核酸分子であり得る。一部の実施形態において、スペーサーは、二次構造を実質的に有さず、例えば、４０ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満、−３９、−３８、−３７、−３６、−３５、−３４、−３３、−３２、−３１、−３０、−２９、−２８、−２７、−２６、−２５、−２４、−２３、−２２、−２０、−１９、−１８、−１７、−１６、−１５、−１４、−１３、−１２、−１１、−１０、−９、−８、−７、−６、−５、−４、−３、−２又は−１ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満である。スペーサーは、核酸、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡを含み得る。
[0252] スペーサー配列は、ＲＮＡ配列、好ましくは、分泌シグナルぺプチドを含むタンパク質又はぺプチド配列をコードし得る。
[0253] スペーサー配列は、非コードであり得る。スペーサーが非コード配列である場合、開始コドンは隣接配列のコード配列中で提供することができる。一部の実施形態において、コード配列の最初の核酸残基は、開始コドン、例えば、ＡＵＧのＡ残基であり得ることが想定される。スペーサーがＲＮＡ又はタンパク質又はぺプチド配列をコードする場合、開始コドンはスペーサー配列中で提供することができる。
[0254] 一部の実施形態において、スペーサーは、本明細書に記載の別の配列に作動可能に結合している。
非核酸リンカー
[0255] 本明細書に記載の環状ポリリボヌクレオチドは、非核酸リンカーも含み得る。一部の実施形態において、本明細書に記載の環状ポリリボヌクレオチドは、本明細書に記載の配列又はエレメントの１つ以上の間の非核酸リンカーを有する。一部の実施形態において、本明細書に記載の１つ以上の配列又はエレメントは、リンカーと結合している。非核酸リンカーは、化学結合、例えば、１つ以上の共有結合又は非共有結合であり得る。一部の実施形態において、非核酸リンカーは、ぺプチド又はタンパク質リンカーである。このようなリンカーは、２〜３０アミノ酸、又はそれよりも長くてよい。リンカーとしては、本明細書に記載のフレキシブル、剛直又は開裂性リンカーが挙げられる。
[0256] 最も一般に使用されるフレキシブルリンカーは、主にＧｌｙ及びＳｅｒ残基のストレッチからなる配列を有する（「ＧＳ」リンカー）。フレキシブルリンカーは、ある程度の移動又は相互作用を要求するドメインの結合に有用であり得、小さい非極性（例えば、Ｇｌｙ）又は極性（例えば、Ｓｅｒ又はＴｈｒ）アミノ酸を含み得る。Ｓｅｒ又はＴｈｒの取り込みは、水分子との水素結合を形成することにより水溶液中のリンカーの安定性も維持し、したがってリンカー及びタンパク質部分間の不所望な相互作用も低減させ得る。
[0257] 剛直リンカーは、ドメイン間の固定距離を保つため、及びそれらの独立した機能を維持するために有用である。剛直リンカーは、融合物中の１つ以上の構成成分の安定性又は生物活性を保存するためにドメインの空間的分離が重要である場合にも有用であり得る。剛直リンカーは、αヘリックス構造又はＰｒｏリッチ配列（ＸＰ）ｎ（Ｘは、任意のアミノ酸、好ましくは、Ａｌａ、Ｌｙｓ、又はＧｌｕを指す）を有し得る。
[0258] 開裂性リンカーは、インビボでフリーの機能ドメインを放出し得る。一部の実施形態において、リンカーは、規定の条件下で、例えば、還元試薬又はプロテアーゼの存在下で開裂させることができる。インビボ開裂性リンカーは、ジスルフィド結合の可逆的性質を利用し得る。一例としては、２つのＣｙｓ残基間のトロンビン感受性配列（例えば、ＰＲＳ）が挙げられる。ＣＰＲＳＣのインビトロトロンビン処理はトロンビン感受性配列の開裂をもたらす一方、可逆的ジスルフィド結合は、インタクトのままである。融合物中のリンカーのインビボ開裂は、病理学的条件（例えば、癌又は炎症）下で規定の細胞又は組織中でインビボで発現され、又はある細胞コンパートメント内で拘束されるプロテアーゼによっても実行され得る。多くのプロテアーゼの特異性は、拘束コンパートメント中のリンカーのより緩慢な開裂を提供する。
[0259] 結合分子の例としては、疎水性リンカー、例えば、負荷電スルホン酸基；脂質、例えば、ポリ（−ＣＨ２−イピド（ｉｐｉｄ）、例えば、ポリ（−ＣＨｅ ｇポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基、その不飽和バリアント、そのヒドロキシル化バリアント、そのアミド化又はそうでなければＮ含有バリアント、非炭素リンカー；炭水化物リンカー；ホスホジエステルリンカー、又は２つ以上のポリペプチドを共有結合させ得る他の分子が挙げられる。非共有リンカー、例えば、ポリペプチドが例えばポリペプチドの疎水性領域又はポリペプチドの疎水性伸長部、例えばロイシン、イソロイシン、バリン、又はさらにはアラニン、フェニルアラニン、又はさらにはチロシン、メチオニン、グリシン又は他の疎水性残基リッチの一連の残基を介して結合している疎水性脂肪球も含まれる。ポリペプチドは、電荷ベース化学反応を使用してポリペプチドの正荷電部分が負電荷の別のポリペプチド又は核酸に結合するように結合することができる。
環状化
[0260] 一部の実施形態において、線状環状ポリリボヌクレオチドは、環化させ、又はコンカテマー化させることができる。一部の実施形態において、線状環状ポリリボヌクレオチドは、インビトロで配合及び／又は送達前に環化させることができる。一部の実施形態において、線状環状ポリリボヌクレオチドは、細胞内で環化させることができる。
細胞外環状化
[0261] 一部の実施形態において、線状環状ポリリボヌクレオチドは、化学的方法を使用して環化させ、又はコンカテマー化させて環状ポリリボヌクレオチドを形成する。一部の化学的方法において、核酸（例えば、線状環状ポリリボヌクレオチド）の５’末端及び３’末端は、一緒に接近した場合、分子の５’末端及び３’末端間の新たな共有結合を形成し得る化学反応基を含む。５’末端は、ＮＨＳエステル反応基を含有し得、３’末端は、３’アミノ末端化ヌクレオチドを含有し得、その結果、有機溶媒中で線状ＲＮＡ分子の３’末端上の３’−アミノ末端化ヌクレオチドは、５’−ＮＨＳ−エステル部分上の求核攻撃を受け、新たな５’又は３’−アミド結合を形成する。
[0262] 一部の実施形態において、ＤＮＡ又はＲＮＡリガーゼを使用して５’−リン酸化核酸分子（例えば、線状環状ポリリボヌクレオチド）を核酸（例えば、線状核酸）の３’−ヒドロキシル基に酵素的に結合し、新たなホスホジエステル結合を形成することができる。一例の反応において、線状環状ポリリボヌクレオチドを１〜１０単位のＴ４ＲＮＡリガーゼと製造業者のプロトコルに従って３７℃において１時間インキュベートする。ライゲーション反応は、並列する５’及び３’領域の両方と塩基対合して酵素的ライゲーション反応をアシストし得る線状核酸の存在下で生じ得る。
[0263] 一部の実施形態において、ＤＮＡ又はＲＮＡリガーゼは、環状ポリリボヌクレオチドの合成において使用することができる。非限定的な例として、リガーゼは、ｃｉｒｃリガーゼ又は環状リガーゼであり得る。
[0264] 一部の実施形態において、線状環状ポリリボヌクレオチドの５’又は３’末端のいずれかは、リガーゼリボザイム配列をコードし得、その結果、インビトロ転写の間、得られる線状環状ポリリボヌクレオチドは、線状環状ポリリボヌクレオチドの５’末端を線状環状ポリリボヌクレオチドの３’末端にライゲートし得る活性リボザイム配列を含む。リガーゼリボザイムは、グループＩイントロン、デルタ肝炎ウイルス、ヘアピンリボザイムに由来し得、又はＳＥＬＥＸ（指数関数的濃縮によるリガンドの体系的進化（systematic evolution of ligands by exponential enrichment））により選択することができる。リボザイムリガーゼ反応は、０〜３７℃の温度において１〜２４時間要し得る。
[0265] 一部の実施形態において、線状環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの非核酸部分を使用することにより環化させ、又はコンカテマー化させることができる。一態様において、少なくとも１つの非核酸部分は、線状環状ポリリボヌクレオチドの５’末端付近及び／又は３’末端付近の領域又はフィーチャーと反応して線状環状ポリリボヌクレオチドを環化させ、又はコンカテマー化させ得る。別の態様において、少なくとも１つの非核酸部分は、線状環状ポリリボヌクレオチドの５’末端及び／又は３’末端中に局在化させ、又はそれに若しくはその付近に結合することができる。企図される非核酸部分は、同種又は異種であり得る。非限定的な例として、非核酸部分は、結合、例えば、疎水性結合、イオン結合、生分解性結合及び／又は開裂性結合であり得る。別の非限定的な例として、非核酸部分は、ライゲーション部分である。さらに別の非限定的な例として、非核酸部分は、オリゴヌクレオチド又はぺプチド部分、例えば、本明細書に記載のアプタマー又は非核酸リンカーであり得る。
[0266] 一部の実施形態において、線状環状ポリリボヌクレオチドは、線状環状ポリリボヌクレオチドの５’及び３’末端における、その付近の又はそれに結合している原子、分子表面間の誘引を引き起こす非核酸部分に起因して環化させ、又はコンカテマー化させることができる。非限定的な例として、１つ以上の線状環状ポリリボヌクレオチドは、分子間力又は分子内力により環化させ、又はコンカテマー化させることができる。分子間力の非限定的な例としては、双極子−双極子力、双極子誘起双極子力、誘起双極子−誘起双極子力、ファンデルワールス力、及びロンドン分散力が挙げられる。分子内力の非限定的な例としては、共有結合、金属結合、イオン結合、共鳴結合、アゴニスト結合、双極子結合、コンジュゲーション、ハイパーコンジュゲーション及び反結合が挙げられる。
[0267] 一部の実施形態において、線状環状ポリリボヌクレオチドは、５’末端付近及び３’末端付近のリボザイムＲＮＡ配列を含み得る。リボザイムＲＮＡ配列は、配列がリボザイムの残部に露出される場合、ぺプチドに共有結合し得る。一態様において、５’末端及び３’末端付近のリボザイムＲＮＡ配列に共有結合しているぺプチドは互いに会合し、線状環状ポリリボヌクレオチドの環化又はコンカテマー化を引き起こし得る。別の態様において、５’末端及び３’末端付近のリボザイムＲＮＡ配列に共有結合しているぺプチドは、当技術分野において公知の種々の方法を使用するライゲーション、例えば、限定されるものではないが、タンパク質ライゲーションに供された後に線状一次構築物又は線状ｍＲＮＡの環化又はコンカテマー化を引き起こし得る。
[0268] 一部の実施形態において、線状環状ポリリボヌクレオチドは、例えば、５’三リン酸をＲＮＡ５’ピロホスホヒドロラーゼ（ＲｐｐＨ）又はＡＴＰジホスホヒドロラーゼ（アピラーゼ）と接触させることにより５’一リン酸に変換される核酸の５’三リン酸を含み得る。或いは、線状環状ポリリボヌクレオチドの５’三リン酸の５’一リン酸への変換は、（ａ）線状環状ポリリボヌクレオチドの５’ヌクレオチドをホスファターゼ（例えば、南極ホスファターゼ、シュリンプアルカリホスファターゼ、又はウシ小腸ホスファターゼ）と接触させて３つ全てのリン酸を除去すること；及び（ｂ）ステップ（ａ）の後の５’ヌクレオチドを、単一リン酸を付加するキナーゼ（例えば、ポリヌクレオチドキナーゼ）と接触させることを含む２ステップ反応により生じ得る。
スプライシングエレメント
[0269] 一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つのスプライシングエレメントを含む。一部の実施形態において、スプライシングエレメントは、少なくとも１つの発現配列に隣接する。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、それぞれの発現配列に隣接するスプライシングエレメントを含む。一部の実施形態において、スプライシングエレメントは、それぞれの発現配列の片側又は両側上に存在し、発現産物、例えば、ぺプチド及び又はポリペプチドの分離をもたらす。
[0270] 一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、複製される場合にスプライシングされる末端が一緒に結合する内部スプライシングエレメントを含む。一部の例としては、スプライス部位配列及び短鎖逆位リピート（３０〜４０ｎｔ）、例えば、ＡｌｕＳｑ２、ＡｌｕＪｒ、及びＡｌｕＳｚ、フランキングイントロン中の逆位配列、フランキングイントロン中のＡｌｕエレメント、及びバックスプライスイベントに近接するシス配列エレメント中に見出されるモチーフ（サプタブル（suptable）４濃縮モチーフ）、例えば、フランキングエキソンを有するバックスプライス部位の２００ｂｐ前（上流）又は後（下流）の配列を有する小型イントロン（＜１００ｎｔ）を挙げることができる。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、内部スプライシングエレメントとして本明細書の他箇所に記載の少なくとも１つの反復ヌクレオチド配列を含む。このような実施形態において、反復ヌクレオチド配列は、イントロンのＡｌｕファミリーからのリピート配列を含み得る。一部の実施形態において、スプライシング関連リボソーム結合タンパク質は、環状ポリリボヌクレオチド生合成、例えば、マッスルブラインド及びクエイキング（Quaking）（ＱＫＩ）スプライシング因子を調節し得る。
[0271] 一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチドの頭尾結合をフランキングするカノニカルスプライス部位を含み得る。
[0272] 一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、２つの３−ヌクレオチドバルジによりフランキングされる４塩基対ステムを含むバルジ−ヘリックス−バルジモチーフを含み得る。開裂はバルジ領域中の部位において生じ、末端５’−ヒドロキシル基及び２’，３’−サイクリックリン酸を有する特徴的な断片を生成する。環状化は、同じ分子の２’，３’−サイクリックリン酸上への５’−ＯＨ基の求核攻撃により進行し、３’，５’−ホスホジエステル架橋を形成する。
[0273] 一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ＨＰＲエレメントを保有するマルチマーリピートＲＮＡ配列を含み得る。ＨＰＲは、２’，３’−サイクリックリン酸及び５’−ＯＨ末端を含む。ＨＰＲエレメントは、線状環状ポリリボヌクレオチドの５’末端及び３’末端を自己プロセシングし、それにより末端を一緒にライゲートする。
[0274] 一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、自己ライゲーションを媒介する配列を含み得る。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、自己ライゲートするためのＨＤＶ配列（例えば、ＨＤＶ複製ドメイン保存配列、
ＧＧＣＵＣＡＵＣＵＣＧＡＣＡＡＧＡＧＧＣＧＧＣＡＧＵＣＣＵＣＡＧＵＡＣＵＣＵＵＡＣＵＣＵＵＵＵＣＵＧＵＡＡＡＧＡＧＧＡＧＡＣＵＧＣＵＧＧＡＣＵＣＧＣＣＧＣＣＣＡＡＧＵＵＣＧＡＧＣＡＵＧＡＧＣＣ（配列番号３）（Ｂｅｅｈａｒｒｙ ｅｔ ａｌ ２００４）又は
ＧＧＣＵＡＧＡＧＧＣＧＧＣＡＧＵＣＣＵＣＡＧＵＡＣＵＣＵＵＡＣＵＣＵＵＵＵＣＵＧＵＡＡＡＧＡＧＧＡＧＡＣＵＧＣＵＧＧＡＣＵＣＧＣＣＧＣＣＣＧＡＧＣＣ（配列番号４））を含み得る。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、自己ライゲートするためのループＥ配列（例えば、ＰＳＴＶｄ中）を含み得る。別の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、自己環状化イントロン、例えば、５’及び３’−スライスジャンクション、又は自己環状化触媒イントロン、例えば、グループＩ、グループＩＩ又はグループＩＩＩイントロンを含み得る。グループＩイントロン自己スプライシング配列の非限定的な例としては、Ｔ４バクテリオファージ遺伝子ｔｄに由来する自己スプライシング逆順イントロン−エキソン配列、及びテトラヒメナ属（Tetrahymena）の介在配列（ＩＶＳ）ｒＲＮＡを挙げることができる。
他の環状化法
[0275] 一部の実施形態において、線状環状ポリリボヌクレオチドは、個々のイントロン内の又はフランキングイントロンにわたる反復又は非反復核酸配列のいずれかを含む相補的配列を含み得る。反復核酸配列は、環状ポリリボヌクレオチドのセグメント内で生じる配列である。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、反復核酸配列を含む。一部の実施形態において、反復ヌクレオチド配列としては、ポリＣＡ又はポリＵＧ配列が挙げられる。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチドの別のセグメント中の相補的反復核酸配列にハイブリダイズする少なくとも１つの反復核酸配列を含み、ハイブリダイズされたセグメントは内部二重鎖を形成する。一部の実施形態において、２つの別個の環状ポリリボヌクレオチドからの反復核酸配列及び相補的反復核酸配列は、ハイブリダイズして単一の環状化ポリリボヌクレオチドを生成し、ハイブリダイズされたセグメントは内部二重鎖を形成する。一部の実施形態において、相補的配列は、線状環状ポリリボヌクレオチドの５’及び３’末端に見出される。一部の実施形態において、相補的配列は、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００個以上の対合ヌクレオチドを含む。
修飾
[0276] 一部の態様において、本明細書に記載の本発明は、組成物並びに修飾環状ポリリボヌクレオチドを使用し、作製する方法、及び修飾環状ポリリボヌクレオチドを送達する方法を含む。用語「修飾ヌクレオチド」は、非修飾天然リボヌクレオチド、例えば、表５の化学式により示される天然非修飾ヌクレオチドのアデノシン（Ａ）、ウリジン（Ｕ）、グアニニエ（guaninie）（Ｇ）、シチジン（Ｃ）、及び一リン酸の化学組成の１つ以上の化学的修飾を有する任意のヌクレオチドアナログ又は誘導体を指し得る。修飾リボヌクレオチドの化学的修飾は、リボヌクレオチドのいずれか１つ以上の官能基、例えば、糖、核酸塩基、又はヌクレオシド間結合の（例えば、結合リン酸の／ホスホジエステル結合の／ホスホジエステル骨格の）修飾であり得る。
Figure 2021531022
[0277] 環状ポリリボヌクレオチドは、参照配列、特に親ポリリボヌクレオチドに関する１つ以上の置換、挿入及び／又は付加、欠失、並びに共有結合修飾を含み得、それは本発明の範囲内に含まれる。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上の転写後修飾（例えば、キャッピング、開裂、ポリアデニル化、スプライシング、ポリＡ配列、メチル化、アシル化、リン酸化、リジン及びアルギニン残基のメチル化、アセチル化、並びにチオール基及びチロシン残基のニトロシル化など）を含む。環状ポリリボヌクレオチドは、例えば、糖、核酸塩基、又はヌクレオシド間結合の（例えば、結合リン酸の／ホスホジエステル結合の／ホスホジエステル骨格の）任意の有用な修飾を含み得る。ピリミジン核酸塩基の１つ以上の原子は、場合により置換されているアミノ、場合により置換されているチオール、場合により置換されているアルキル（例えば、メチル又はエチル）、又はハロ（例えば、クロロ又はフルオロ）により置き換えられ、又は置換されていてよい。ある実施形態において、修飾（例えば、１つ以上の修飾）は、糖及びヌクレオシド間結合のそれぞれに存在する。修飾は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ぺプチド核酸（ＰＮＡ）、ロック核酸（ＬＮＡ）又はそれらのハイブリッド）へのリボ核酸（ＲＮＡ）の修飾であり得る。追加の修飾は、本明細書に記載される。
[0278] 一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、翻訳効率を増加させるための少なくとも１つのＮ（６）メチルアデノシン（ｍ６Ａ）修飾を含む。
[0279] 一部の実施形態において、修飾としては、化学的又は細胞誘導修飾を挙げることができる。例えば、細胞内ＲＮＡ修飾の一部の非限定的な例は、Lewis and Panにより“RNA modifications and structures cooperate to guide RNA-protein interactions” from Nat Reviews Mol Cell Biol, 2017, 18: 202-210に記載されている。
[0280] 別の実施形態において、「シュードウリジン」は、ｍ１ａｃｐ３Ψ（１−メチル−３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）シュードウリジンを指す。別の実施形態において、この用語は、ｍ１Ψ（１−メチルシュードウリジン）を指す。別の実施形態において、この用語は、Ψｍ（２’−Ｏ−メチルシュードウリジンを指す。別の実施形態において、この用語は、ｍ５Ｄ（５−メチルジヒドロウリジン）を指す。別の実施形態において、この用語は、ｍ３Ψ（３−メチルシュードウリジン）を指す。別の実施形態において、この用語は、さらに修飾されないシュードウリジン部分を指す。別の実施形態において、この用語は、上記シュードウリジンいずれかの一リン酸、二リン酸、又は三リン酸を指す。別の実施形態において、この用語は、当技術分野において公知の任意の他のシュードウリジンを指す。それぞれの可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
[0281] 一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドのリボヌクレオチドの化学的修飾は、免疫回避を向上させ得る。修飾としては、例えば、末端修飾、例えば、５’末端修飾（リン酸化（モノ、ジ及びトリ）、コンジュゲーション、逆位結合など）、３’末端修飾（コンジュゲーション、ＤＮＡヌクレオチド、逆位結合など）、塩基修飾（例えば、安定化塩基、脱安定化塩基、又はパートナーの伸長レパートリーと塩基対合する塩基による置き換え）、塩基の除去（非塩基ヌクレオチド）、又はコンジュゲート塩基が挙げられる。修飾リボヌクレオチド塩基としては、５−メチルシチジン及びシュードウリジンも挙げることができる。一部の実施形態において、塩基修飾は、いくつかの機能的効果を挙げると、環状ポリリボヌクレオチドの発現、免疫応答、安定性、細胞内局在化をモジュレートし得る。一部の実施形態において、修飾としては、バイオルソゴナル（bi-orthogonal）ヌクレオチド、例えば、非天然塩基が挙げられる。
[0282] 一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの糖修飾（例えば、２’位又は４’位におけるもの）又は１つ以上のリボヌクレオチドの糖の置き換えとしては、骨格修飾と同様、ホスホジエステル結合の修飾又は置き換えが挙げられる。環状ポリリボヌクレオチドの非限定的な例としては、修飾骨格又は非天然ヌクレオシド結合、例えば、ホスホジエステル結合の修飾又は置き換えのものを有する環状ポリリボヌクレオチドが挙げられる。修飾骨格を有する環状ポリリボヌクレオチドとしては、とりわけ、骨格中のリン原子を有さないものが挙げられる。本出願の目的のため、及び当技術分野において時折参照されるものとして、ヌクレオシド間結合中のリン原子を有さない修飾ＲＮＡも、オリゴヌクレオシドとみなすことができる。特定の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、そのヌクレオシド間骨格中のリン原子を有するリボヌクレオチドを含む。
[0283] 修飾環状ポリリボヌクレオチド骨格としては、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチル及び他のアルキルホスホネート、例えば、３’−アルキレンホスホネート及びキラルホスホネート、ホスフィネート、ホスホラミデート、例えば、３’−アミノホスホラミデート及びアミノアルキルホスホラミデート、チオノホスホラミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、並びにボラノホスフェートであって、通常の３’−５’結合を有するもの、それらの２’−５’結合アナログ、及びヌクレオシド単位の隣接ペアが３’−５’から５’−３’に又は２’−５’から５’−２’に結合している逆の極性を有するものを挙げることができる。種々の塩、混合塩及び遊離酸形態も含まれる。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、負又は正に荷電していてよい。
[0284] 環状ポリリボヌクレオチド中に取り込むことができる修飾ヌクレオチドは、ヌクレオシド間結合（例えば、リン酸骨格）上で修飾することができる。ここで、ポリヌクレオチド骨格に関して、語句「リン酸」及び「ホスホジエステル」は、互換的に使用される。骨格リン酸基は、酸素原子の１つ以上を異なる置換基により置き換えることにより修飾することができる。さらに、修飾ヌクレオシド及びヌクレオチドは、非修飾リン酸部分の本明細書に記載の別のヌクレオシド間結合による大規模な置き換えを含み得る。修飾リン酸基の例としては、限定されるものではないが、ホスホロチオエート、ホスホロセレネート、ボラノホスフェート、ボラノホスフェートエステル、水素ホスホネート、ホスホラミデート、ホスホロジアミデート、アルキル又はアリールホスホネート、及びホスホトリエステルが挙げられる。ホスホロジチオエートは、硫黄により置き換えられている両方の非結合酸素を有する。リン酸リンカーは、結合酸素の窒素（架橋ホスホラミデート）、硫黄（架橋ホスホロチオエート）、及び炭素（架橋メチレン−ホスホネート）による置き換えにより修飾することもできる。
[0285] α−チオ置換リン酸部分は、非天然ホスホロチオエート骨格結合を介してＲＮＡ及びＤＮＡポリマーに安定性を付与するために提供される。ホスホロチオエートＤＮＡ及びＲＮＡは、細胞環境中の増加したヌクレアーゼ抵抗性及び続いて長い半減期を有する。環状ポリリボヌクレオチドに結合しているホスホロチオエートは、細胞自然免疫分子のより弱い結合／活性化を介して自然免疫応答を低減させることが予測される。
[0286] 一部の実施形態において、修飾ヌクレオシドとしては、α−チオ−ヌクレオシド（例えば、５’−Ｏ−（ｌ−チオホスフェート）−アデノシン、５’−Ｏ−（ｌ−チオホスフェート）−シチジン（α−チオ−シチジン）、５’−Ｏ−（ｌ−チオホスフェート）−グアノシン、５’−Ｏ−（ｌ−チオホスフェート）−ウリジン、又は５’−Ｏ−（１−チオホスフェート）−シュードウリジン）が挙げられる。他のヌクレオシド間結合としては、リン原子を含有しないヌクレオシド間結合を挙げることができる。
[0287] 一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上の細胞毒性ヌクレオシドを含み得る。例えば、細胞毒性ヌクレオシドは、環状ポリリボヌクレオチド中に例えば、二官能修飾で取り込むことができる。細胞毒性ヌクレオシドとしては、限定されるものではないが、アデノシンアラビノシド、５−アザシチジン、４’−チオ−アラシチジン、シクロペンテニルシトシン、クラドリビン、クロファラビン、シタラビン、シトシンアラビノシド、ｌ−（２−Ｃ−シアノ−２−デオキシ−β−Ｄ−アラビノ−ペントフラノシル）−シトシン、デシタビン、５−フルオロウラシル、フルダラビン、フロクスウリジン、ゲムシタビン、テガフール及びウラシルの組合せ、テガフール（（Ｒ，Ｓ）−５−フルオロ−ｌ−（テトラヒドロフラン−２−イル）ピリミジン−２，４（ｌＨ，３Ｈ）−ジオン）、トロキサシタビン、テザシタビン、２’−デオキシ−２’−メチリデンシチジン（ＤＭＤＣ）、及び６−メルカプトプリンを挙げることができる。追加の例としては、リン酸フルダラビン、Ｎ４−ベヘノイル−ｌ−β−Ｄ−アラビノフラノシルシトシン、Ｎ４−オクタデシル−１−β−Ｄ−アラビノフラノシルシトシン、Ｎ４−パルミトイル−ｌ−（２−Ｃ−シアノ−２−デオキシ−β−Ｄ−アラビノ−ペントフラノシル）シトシン、及びＰ−４０５５（シタラビン５’−エライジン酸エステル）が挙げられる。
[0288] 環状ポリリボヌクレオチドは、分子の全長に沿って均一に修飾することができる。例えば、ヌクレオチドの１つ以上又は全てのタイプ（例えば、天然発生ヌクレオチド、プリン若しくはピリミジン、又はＡ、Ｇ、Ｕ、Ｃ、Ｉ、ｐＵのいずれか１つ以上若しくは全て）を環状ポリリボヌクレオチド中で、又はその所与の所定配列領域中で均一に修飾することができる。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、シュードウリジンを含む。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ウイルスＲＮＡに対して内因性のものとして環状ポリリボヌクレオチドを特徴付ける免疫系を補助し得るイノシンを含む。イノシンの取り込みは、改善されたＲＮＡ安定性／低減した分解も媒介し得る。
[0289] 一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド中（又はその所与の配列領域中）の全てのヌクレオチドが修飾されている。一部の実施形態において、修飾は、発現を増大させ得るｍ６Ａ；免疫応答を減衰し得るイノシン；ＲＮＡ安定性、又は翻訳リードスルー（終止コドン＝コード可能性）を増加させ得るシュードウリジン、安定性を増加させ得るｍ５Ｃ；及び細胞内トランスロケーション（例えば、核局在化）を補助する２，２，７−トリメチルグアノシンを含み得る。
[0290] 環状ポリリボヌクレオチド中の種々の位置に、異なる糖修飾、ヌクレオチド修飾、及び／又はヌクレオシド間結合（例えば、骨格構造）が存在し得る。当業者は、環状ポリリボヌクレオチドの機能が実質的に減少しないように、ヌクレオチドアナログ又は他の修飾を環状ポリリボヌクレオチドの任意の位置に局在させることができることを認識する。修飾は、非コード領域修飾でもあり得る。環状ポリリボヌクレオチドは、約１％〜約１００％の修飾ヌクレオチド（全ヌクレオチド含有率に対し、又はヌクレオチドの１つ以上のタイプ、すなわち、Ａ、Ｇ、Ｕ、若しくはＣのいずれか１つ以上に対する）又は任意のその間の割合（例えば、１％〜２０％＞、１％〜２５％、１％〜５０％、１％〜６０％、１％〜７０％、１％〜８０％、１％〜９０％、１％〜９５％、１０％〜２０％、１０％〜２５％、１０％〜５０％、１０％〜６０％、１０％〜７０％、１０％〜８０％、１０％〜９０％、１０％〜９５％、１０％〜１００％、２０％〜２５％、２０％〜５０％、２０％〜６０％、２０％〜７０％、２０％〜８０％、２０％〜９０％、２０％〜９５％、２０％〜１００％、５０％〜６０％、５０％〜７０％、５０％〜８０％、５０％〜９０％、５０％〜９５％、５０％〜１００％、７０％〜８０％、７０％〜９０％、７０％〜９５％、７０％〜１００％、８０％〜９０％、８０％〜９５％、８０％〜１００％、９０％〜９５％、９０％〜１００％、及び９５％〜１００％）を含み得る。
[0291] 一部の実施形態において、本明細書に提供される環状ポリリボヌクレオチドは、修飾環状ポリリボヌクレオチドである。例えば、完全修飾環状ポリリボヌクレオチドは、全ての又は実質的に全ての修飾アデノシン残基、全ての又は実質的に全ての修飾ウリジン残基、全ての又は実質的に全ての修飾グアニン残基、全ての又は実質的に全ての修飾シチジン残基、又はそれらの任意の組合せを含む。一部の実施形態において、本明細書に提供される環状ポリリボヌクレオチドは、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドである。ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを有し得、連続非修飾ヌクレオチドの一部を有し得る。ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドのこの非修飾部は、少なくとも約５、１０、１５、又は２０個の連続非修飾ヌクレオチド、又はその間の任意数を有し得る。一部の実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドの非修飾部は、少なくとも約３０、４０、４０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１８０、２００、２２０、２５０、２８０、３００、３２０、３５０、３８０、４００、４２０、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、又は１０００個の連続非修飾ヌクレオチド、又はその間の任意数を有する。一部の実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上の非修飾部を有する。一部の実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、３０、４０、５０、７０、８０、１００、１２０、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００個以上の修飾ヌクレオチドを有する。一部の実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１％、２％、５％、７％、８％、１０％、１２％、１５％、１８％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は９９％であるが１００％未満の修飾されているヌクレオチドを有する。一部の実施形態において、非修飾部は、結合部位を含む。一部の実施形態において、非修飾部は、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は細胞標的を結合させるように構成される結合部位を含む。一部の実施形態において、非修飾部は、ＩＲＥＳを含む。
[0292] 一部の実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチドよりも低い免疫原性を有する。一部の実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチドよりも少なくとも約１．１、１．２、１．３、１．５、１．６、１．８、２、２．２、２．５、２．８、３、３．２、３．３、３．５、３．８、４．０、４．２、４．５、４．８、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、又は１０．０倍低い免疫原性を有する。一部の実施形態において、本明細書に記載の免疫原性は、ＲＩＧ−Ｉ、ＴＬＲ−３、ＴＬＲ−７、ＴＬＲ−８、ＭＤＡ−５、ＬＧＰ−２、ＯＡＳ、ＯＡＳＬ、ＰＫＲ、及びＩＦＮ−βの少なくとも１つの発現又はシグナリング又は活性化のレベルにより評価される。一部の実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチドよりも長い半減期を有する。一部の実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチドよりも少なくとも約１．１、１．２、１．３、１．５、１．６、１．８、２、２．２、２．５、２．８、３、３．２、３．３、３．５、３．８、４．０、４．２、４．５、４．８、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、又は１０．０倍長い半減期を有する。一部の実施形態において、半減期は、環状ポリリボヌクレオチド又は対応する環状ポリリボヌクレオチドを細胞中に導入し、細胞内部の導入された環状ポリリボヌクレオチド又は対応する環状ポリリボヌクレオチドのレベルを測定することにより測定される。
[0293] 一部の実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上の発現配列を含む。一部の実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドの１つ以上の発現配列は、対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチドと類似する又はそれよりも高い翻訳効率を有する。一部の実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドの１つ以上の発現配列は、対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチドよりも少なくとも約０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．５、１．６、１．８、２、２．２、２．５、２．８、又は３倍高い翻訳効率を有する。一部の実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドの１つ以上の発現配列は、修飾ヌクレオチドを含む一部（例えば、一部は、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドの非修飾部に対応する）を有する対応する環状ポリリボヌクレオチドよりも高い翻訳効率を有する。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの１つ以上の発現配列は、１０％超、又は少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％の修飾ヌクレオチドを含む第１の一部を有する対応する環状ポリリボヌクレオチドよりも高い翻訳効率を有するように構成される。一部の実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドの１つ以上の発現配列は、修飾ヌクレオチドを含む一部（例えば、一部は、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドの非修飾部に対応する）を有する対応する環状ポリリボヌクレオチドよりも少なくとも約１．１、１．２、１．３、１．５、１．６、１．８、２、２．２、２．５、２．８、３、３．２、３．３、３．５、３．８、４．０、４．２、４．５、４．８、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、又は１０．０倍高い翻訳効率を有する。本明細書に記載のとおり、一部の実施形態において、翻訳効率は、環状ポリリボヌクレオチド若しくは対応する環状ポリリボヌクレオチドを含む細胞中で、又はインビトロ翻訳系（例えば、ウサギ網状赤血球溶解物）中のいずれかで測定される。
[0294] 一部の実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、非修飾の、例えば、修飾ヌクレオチドを有さない結合部位を有する。一部の実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、非修飾の、例えば、修飾ヌクレオチドを有さない、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は細胞標的に結合するように構成される結合部位を有する。一部の実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、非修飾の、例えば、修飾ヌクレオチドを有さない内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を有する。一部の実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドである結合部位中の１０％以下のヌクレオチドを有する。一部の実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドである、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は細胞標的に結合するように構成される結合部位中の１０％以下のヌクレオチドを有する。一部の実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドである内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）中の１０％以下のヌクレオチドを有する。一部の実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、結合部位を除き全体にわたり修飾ヌクレオチドを有する。一部の実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は細胞標的を結合させるように構成される結合部位を除き全体にわたり修飾ヌクレオチドを有する。一部の実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、ＩＲＥＳエレメントを除き全体にわたり修飾ヌクレオチドを有する。他の実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、ＩＲＥＳエレメント及び１つ以上の他の一部を除き全体にわたり修飾ヌクレオチドを有する。ある理論により拘束されるものではないが、非修飾ＩＲＥＳエレメントはハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドを翻訳可能とし、それは例えば、いかなる修飾ヌクレオチドも有さない対応する環状ポリリボヌクレオチドと類似する又はそれよりも高い、１つ以上の発現配列についての翻訳効率を有する。
[0295] 一部の実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、ＩＲＥＳエレメント又はタンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、若しくは細胞標的を結合させるように構成される結合部位を除き環状ポリリボヌクレオチドの全体にわたり修飾ヌクレオチド、例えば、５’メチルシチジン及びシュードウリジンを有する。これらの場合、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、５’メチルシチジン及びシュードウリジンを含まない対応する環状ポリリボヌクレオチドと比較して高い又は低い免疫原性を有する。一部の実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチドよりも少なくとも約１．１、１．２、１．３、１．５、１．６、１．８、２、２．２、２．５、２．８、３、３．２、３．３、３．５、３．８、４．０、４．２、４．５、４．８、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、又は１０．０倍低い免疫原性を有する。一部の実施形態において、本明細書に記載の免疫原性は、ＲＩＧ−Ｉ、ＴＬＲ−３、ＴＬＲ−７、ＴＬＲ−８、ＭＤＡ−５、ＬＧＰ−２、ＯＡＳ、ＯＡＳＬ、ＰＫＲ、及びＩＦＮ−βの少なくとも１つの発現又はシグナリング又は活性化により評価される。一部の実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチド、例えば、５’メチルシチジン及びシュードウリジンを含まない対応する環状ポリリボヌクレオチドよりも長い半減期を有する。一部の実施形態において、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチドよりも少なくとも約１．１、１．２、１．３、１．５、１．６、１．８、２、２．２、２．５、２．８、３、３．２、３．３、３．５、３．８、４．０、４．２、４．５、４．８、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、又は１０．０倍長い、長い半減期を有する。一部の実施形態において、半減期は、環状ポリリボヌクレオチド又は対応する環状ポリリボヌクレオチドを細胞中に導入し、細胞内部の導入された環状ポリリボヌクレオチド又は対応する環状ポリリボヌクレオチドのレベルを測定することにより測定される。
[0296] 一部の例において、本明細書に記載のハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、他の点では同じであるが完全に修飾されている対応する環状ポリリボヌクレオチドと比較して類似する免疫原性を有する。例えば、ＩＲＥＳエレメントを除き全体にわたり５’メチルシチジン及びシュードウリジンを有するハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、他の点では同じであるが全体にわたり５’メチルシチジン及びシュードウリジンを有し、非修飾シチジン及びウリジンを有さない対応する環状ポリリボヌクレオチドと比較して類似する免疫原性又は低い免疫原性を有し得る。一部の実施形態において、ＩＲＥＳエレメントを除き全体にわたり５’メチルシチジン及びシュードウリジンを有するハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドは、他の点では同じであるが全体にわたり５’メチルシチジン及びシュードウリジンを有し、非修飾シチジン及びウリジンを有さない対応する環状ポリリボヌクレオチドの翻訳効率と類似する又はそれよりも高い翻訳効率を有する。
環状ポリリボヌクレオチドのコンジュゲーション
[0297] 本開示のｃｉｒｃＲＮＡは、例えば、化合物（例えば、小分子）、抗体若しくはその断片、ぺプチド、タンパク質、アプタマー、薬物、又はそれらの組合せにコンジュゲートさせることができる。一部の実施形態において、小分子はｃｉｒｃＲＮＡにコンジュゲートされ、それにより小分子を含むｃｉｒｃＲＮＡを生成することができる。
[0298] 本開示のｃｉｒｃＲＮＡは、コンジュゲーションを容易にするためのコンジュゲーション部分を含み得る。コンジュゲーション部分は、例えば、環状ポリリボヌクレオチドの内部部位に、又は線状ポリヌクレオチドの５’末端、３’末端、若しくは内部部位に取り込むことができる。コンジュゲーション部分は、化学的又は酵素的に取り込むことができる。例えば、コンジュゲーション部分は、固相オリゴヌクレオチド合成の間に同時転写的に（例えば、寛容性ＲＮＡポリメラーゼにより）又は転写後に（例えば、ＲＮＡメチルトランスフェラーゼにより）取り込むことができる。コンジュゲーション部分は、修飾ヌクレオチド又はヌクレオチドアナログ、例えば、ブロモデオキシウリジンであり得る。コンジュゲーション部分は、反応基又は官能基、例えば、アジド基又はアルキン基を含み得る。コンジュゲーション部分は、化学選択的反応を受け得る。コンジュゲーション部分は、例えば、ジゴキシゲニン、２，４−ジニトロフェニル、ビオチン、アビジンを含むハプテン基であり得、又はアゾール、ニトロアリール化合物、ベンゾフラザン、トリテルペン、尿素、チオ尿素、ロテノン、オキサゾール、チアゾール、クマリン、シクロリグナン、ヘテロビアリール化合物、アゾアリール化合物若しくはベンゾジアゼピンから選択することができる。コンジュゲーション部分は、可逆的環状電子転位を受け得るジアリールエテン光スイッチを含み得る。コンジュゲーション部分は、求核試薬、カルバニオン、及び／又はα，β−不飽和カルボニル化合物を含み得る。
[0299] ｃｉｒｃＲＮＡは、化学反応を介して、例えば、クリック化学、シュタウディンガーライゲーション、Ｐｄ触媒Ｃ−Ｃ結合形成（例えば、鈴木・宮浦反応）、マイケル付加、オレフィンメタセシス、又は逆電子要請型ディールス・アルダーを使用してコンジュゲートさせることができる。クリック化学は、適切な反応条件において互いに急速且つ選択的に反応する（クリックする）官能基のペアを利用し得る。非限定的なクリック化学反応としては、アジド−アルキン付加環化、銅触媒１，３−双極子アジド−アルキン付加環化（ＣｕＡＡＣ）、歪み促進型アジド−アルキンクリック化学反応（ＳＰＡＡＣ）、及びテトラジン−アルケンライゲーションが挙げられる。
[0300] 官能化ヌクレオチドの非限定的な例としては、アジド修飾ＵＴＰアナログ、５−アジドメチル−ＵＴＰ、５−アジド−Ｃ３−ＵＴＰ、５−アジド−ＰＥＧ４−ＵＴＰ、５−エチニル−ＵＴＰ、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−ＵＴＰ、ビニル−ＵＴＰ、８−アジド−ＡＴＰ、３’−アジド−２’，３’−ｄｄＡＴＰ、５−アジド−ＰＥＧ４−ＣＴＰ、５−ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−ＣＴＰ、Ｎ６−アジドヘキシル−３’−ｄＡＴＰ、５−ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−ｄＣｐＧ、及び５−アジドプロピル−ＵＴＰが挙げられる。一部の実施形態において、ｃｉｒｃＲＮＡは、少なくとも１つの５−アジドメチル−ＵＴＰ、５−アジド−Ｃ３−ＵＴＰ、５−アジド−ＰＥＧ４−ＵＴＰ、５−エチニル−ＵＴＰ、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−ＵＴＰ、ビニル−ＵＴＰ、８−アジド−ＡＴＰ、５−アジド−ＰＥＧ４−ＣＴＰ、５−ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−ＣＴＰ、又は５−アジドプロピル−ＵＴＰを含む。
[0301] 選択単一修飾ヌクレオチド（例えば、２’位におけるアジドを含有する修飾Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、又はＴ）は、最適化条件下で（例えば、固相化学的合成を介して）部位特異的に取り込むことができる。２’位におけるアジドを含有する複数のヌクレオチドは、例えば、インビトロ転写反応の間にヌクレオチドを置換する（例えば、ＵＴＰを５−アジド−Ｃ３−ＵＴＰについて置換する）ことにより取り込むことができる。
[0302] ｃｉｒｃＲＮＡコンジュゲートは、銅触媒クリック反応、例えば、アルキン官能化小分子及びアジド官能化ポリリボ核酸の銅触媒１，３−双極子アジド−アルキン付加環化（ＣｕＡＡＣ）を使用して生成することができる。線状ＲＮＡは、小分子とコンジュゲートさせることができる。例えば、線状ＲＮＡは、ポリ（Ａ）ポリメラーゼによりアジド誘導体化ヌクレオチドによりその３’末端において修飾することができる。アジドは、銅触媒又は歪み促進型アジド−アルキンクリック反応を介して小分子にコンジュゲートさせることができ、線状ＲＮＡは、環状化させることができる。
[0303] ｃｉｒｃＲＮＡコンジュゲートは、シュタウディンガー反応を使用して生成することができる。例えば、アジド官能化ヌクレオチドを含む環状ＲＮＡを、トリフェニルホスフィン−３，３’，３’’−トリスルホン酸（ＴＰＰＴＳ）の存在下でアルキン官能化小分子とコンジュゲートさせることができる。
[0304] ｃｉｒｃＲＮＡコンジュゲートは、鈴木・宮浦反応を使用して生成することができる。例えば、ハロゲン化ヌクレオチドアナログを含むｃｉｒｃＲＮＡを、コグネイト反応性パートナーの存在下で鈴木・宮浦反応に供することができる。例えば、５−ヨードウリジン三リン酸（ＩＵＴＰ）を含むｃｉｒｃＲＮＡを、Ｐｄ（ＯＡｃ）２及び２−アミノピリミジン−４，６−ジオール（ＡＤＨＰ）又はジメチルアミノ置換ＡＤＨＰ（ＤＭＡＤＨＰ）を有する触媒系中で使用して種々のボロン酸及びエステル基質の存在下でヨードウリジン標識ｃｉｒｃＲＮＡを官能化することができる。別の例において、８−ブロモグアノシンを含むｃｉｒｃＲＮＡを、Ｐｄ（ＯＡｃ）２及び水溶性トリフェニルホスファン−３，３’，３’’−トリスルホネートリガンドから構成される触媒系の存在下でアリールボロン酸と反応させることができる。
[0305] ｃｉｒｃＲＮＡコンジュゲートは、マイケル付加を使用して、例えば、電子リッチマイケル供与体とα，β−不飽和化合物（マイケル受容体）との反応を介して生成することができる。
構造
[0306] 一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、高次構造、例えば、二次又は三次構造を含む。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの相補的セグメントは、それ自体、二本鎖セグメントにフォールドし、それはペア、例えば、Ａ−Ｕ及びＣ−Ｇ間の水素結合と一緒に保持される。一部の実施形態において、末端ループに連結している二本鎖セグメントを有するステムとしても公知のヘリックスが、分子内で形成される。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、準二本鎖二次構造を有する少なくとも１つのセグメントを有する。一部の実施形態において、準二本鎖二次構造を有するセグメントは、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００個以上の対合ヌクレオチドを有する。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、準二本鎖二次構造を有する１つ以上のセグメント（例えば、２、３、４、５、６つ以上）を有する。一部の実施形態において、セグメントは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００個以上のヌクレオチドだけ離隔している。
[0307] １６個の考えられる塩基対合が存在するが、それらのうち、６つ（ＡＵ、ＧＵ、ＧＣ、ＵＡ、ＵＧ、ＣＧ）が現実的な塩基対を形成し得る。残りはミスマッチと呼ばれ、ヘリックス中で極めて低頻度で生じる。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの構造は、その機能に対する影響及び致命的結果なしでは容易に破壊され得ず、それは二次構造を維持するための選択を提供する。一部の実施形態において、ステムの一次構造（すなわち、それらのヌクレオチド配列）は依然として変動し得る一方、ヘリカル領域を依然として維持する。塩基の性質は高次構造にはそれほど重要でなく、それらが二次構造を保存する限り置換が可能である。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、準ヘリカル構造を有する。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、準ヘリカル構造を有する少なくとも１つのセグメントを有する。一部の実施形態において、準ヘリカル構造を有するセグメントは、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００個以上のヌクレオチドを有する。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、準ヘリカル構造を有する１つ以上のセグメント（例えば、２、３、４、５、６つ以上）を有する。一部の実施形態において、セグメントは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００個以上のヌクレオチドだけ離隔している。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、Ｕリッチ又はＡリッチ配列の少なくとも１つ又はそれらの組合せを含む。一部の実施形態において、Ｕリッチ及び／又はＡリッチ配列は、三重準ヘリックス構造を産生するように配置される。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、二重準ヘリカル構造を有する。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、二重準ヘリカル構造を有する１つ以上のセグメント（例えば、２、３、４、５、６つ以上）を有する。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、Ｃリッチ及び／又はＧリッチ配列の少なくとも１つを含む。一部の実施形態において、Ｃリッチ及び／又はＧリッチ配列は、三重準ヘリックス構造を産生するように配置される。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、安定化を補助する分子内三重準ヘリックス構造を有する。
[0308] 一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、（例えば、ホスホジエステル結合により離隔している）２つの準ヘリカル構造を有し、その結果、それらの末端塩基対はスタッキングし、準ヘリカル構造は同線状になり、「同軸的にスタッキングされた」下位構造をもたらす。
[0309] 一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位、少なくとも１つのｌｎｃＲＮＡ結合部位、及び／又は少なくとも１つのｔＲＮＡモチーフを有する。
送達
[0310] 本明細書に記載の環状ポリリボヌクレオチドは、送達担体を有する医薬組成物中に含めることができる。
[0311] 例えば、医薬賦形剤又は担体を含む本明細書に記載の医薬組成物を配合することができる。医薬担体は、膜、脂質二重層、及び／又はポリマー担体、例えば、リポソーム又は粒子、例えば、ナノ粒子、例えば、脂質ナノ粒子であり得、公知の方法によりそれが必要とされる対象（例えば、ヒト又は非ヒト農業動物若しくはドメスティックアニマル、例えば、ウシ、イヌ、ネコ、ウマ、家禽）に送達することができる。このような方法としては、限定されるものではないが、形質移入（例えば、脂質媒介、カチオン性ポリマー、リン酸カルシウム）；エレクトロポレーション又は膜破壊の他の方法（例えば、ヌクレオフェクション）、融合、及びウイルス送達（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、ＡＡＶ）が挙げられる。
[0312] 本発明はさらに、本明細書に記載の環状ポリリボヌクレオチドを含む宿主又は宿主細胞を対象とする。一部の実施形態において、宿主又は宿主細胞は、植物、昆虫、細菌、真菌、脊椎動物、哺乳動物（例えば、ヒト）、又は他の生物体若しくは細胞である。
[0313] 一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、宿主中で非免疫原性である。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、参照化合物、例えば、記載の環状ポリリボヌクレオチドに対応する線状ポリヌクレオチド、非修飾環状ポリリボヌクレオチド、又はエンクリプトゲンを欠く環状ポリリボヌクレオチドにより誘発される応答と比較して宿主の免疫系による減少した応答を有し、又はその応答を産生し得ない。一部の免疫応答としては、限定されるものではないが、体液性免疫応答（例えば、抗原特異的抗体の産生）及び細胞媒介免疫応答（例えば、リンパ球増殖）が挙げられる。
[0314] 一部の実施形態において、宿主又は宿主細胞を、環状ポリリボヌクレオチドと接触させる（例えば、それに送達し、又は投与する）。一部の実施形態において、宿主は、哺乳動物、例えば、ヒトである。宿主中の環状ポリリボヌクレオチド、発現産物、又はその両方の量は、投与後の任意の時点において測定することができる。ある実施形態において、培養物中の宿主成長のタイムコースが決定される。環状ポリリボヌクレオチドの存在下で成長が増加し、又は低減する場合、環状ポリリボヌクレオチド又は発現産物又はその両方は、宿主の成長の増加又は低減において有効であると同定される。
産生方法
[0315] 一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、非天然発生であり、組換えＤＮＡ技術又は化学的合成を使用して産生することができるデオキシリボ核酸配列を含む。
[0316] ＲＮＡ環状物を産生するために使用されるＤＮＡ分子が天然発生の元の核酸配列のＤＮＡ配列、その修飾バージョン、又は天然で通常見出されない合成ポリペプチド（例えば、キメラ分子又は融合タンパク質）をコードするＤＮＡ配列を含み得ることは、本発明の範囲内である。ＤＮＡ分子は、種々の技術、例として、限定されるものではないが、古典的突然変異誘発技術及び組換えＤＮＡ技術、例えば、部位特異的突然変異誘発、突然変異を誘導するための核酸分子の化学的処理、核酸断片の制限酵素開裂、核酸断片のライゲーション、核酸配列の選択領域のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅及び／又は突然変異誘発、オリゴヌクレオチド混合物の合成及び核酸分子の混合物を「構築する」ための混合物群のライゲーション及びそれらの組合せを使用して修飾することができる。
[0317] 環状ポリリボヌクレオチドは、例えば、化学的合成及び酵素的合成により調製することができる。一部の実施形態において、線状一次構築物又は線状ｍＲＮＡを、環化させ又はコンカテマー化させて本明細書に記載の環状ポリリボヌクレオチドを作出することができる。環化又はコンカテマー化の機序は、限定されるものではないが、化学的、酵素的、又はリボザイム触媒方法などの方法を介して生じ得る。新たに形成される５’−又は３’−結合は、分子内結合又は分子間結合であり得る。
医薬組成物
[0318] 本発明は、１つ以上の薬学的に許容可能な賦形剤との組合せの組成物を含む。医薬組成物は、場合により、１つ以上の追加の活性物質、例えば、治療及び／又は予防活性物質を含み得る。本発明の医薬組成物は、無菌及び／又はパイロジェンフリーであり得る。医薬剤の配合及び／又は製造における一般的な考察は、例えば、参照により本明細書に組み込まれるRemington: The Science and Practice of Pharmacy 21st ed., Lippincott Williams & Wilkins, 2005に見出すことができる。一態様において、本発明は、環状ポリリボヌクレオチドを生成することを含む、本明細書に記載の医薬組成物を産生する方法を含む。
[0319] 本明細書に提供される医薬組成物の説明は、主にヒトへの投与に好適な医薬組成物を対象とするが、そのような組成物は、一般に、任意の他の動物、例えば、非ヒト動物及び非ヒト哺乳動物への投与に好適であることが当業者により理解される。医薬組成物を種々の動物への投与に好適にするためのヒトへの投与に好適な医薬組成物の改変は十分に理解されており、当技術分野において通常の技能を有する獣医薬理学者は、そのような改変を設計し、及び／又は行うにしても単に通常の実験により実施することができる。医薬組成物の投与が企図される対象としては、限定されるものではないが、ヒト及び／又は他の霊長類；哺乳動物、例として、商業関連哺乳動物、例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコ、イヌ、マウス、及び／又はラット；及び／又は鳥類、例として、商業関連鳥類、例えば、家禽、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、及び／又はシチメンチョウが挙げられる。
[0320] 本明細書に記載の医薬組成物の配合物は、薬理学分野において公知の又は今後開発される任意の方法により調製することができる。一般に、このような調製法は、活性成分を賦形剤及び／又は１つ以上の他の副成分と会合させ、次いで必要により及び／又は所望により、生成物を分割し、成形し、及び／又は包装するステップを含む。
[0321] 本明細書に記載の医薬組成物は、正確な投与量の単一投与に好適な単位剤形であり得る。単位剤形において、配合物は、適切な量の１つ以上の化合物を含有する単位用量に分割される。単位投与量は、区別量の配合物を含有する包装の形態である。非限定的な例は、包装された注射剤、バイアル、又はアンプルである。水性懸濁液組成物は、単回用量の再封不可能容器中で包装することができる。複数回用量の再封可能容器は、例えば、保存剤との組合せで、又はそれを用いずに使用することができる。注射用配合物は、単位剤形で、例えば、アンプル中で、又は保存剤を有する複数回用量容器中で提供することができる。
[0322] 一態様において、本発明は、（ａ）標的、例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、細胞の膜などを結合させる結合部位を含む環状ポリリボヌクレオチド；及び（ｂ）薬学的に許容可能な担体又は賦形剤を含む医薬組成物であって、標的及び環状ポリリボヌクレオチドは、複合体を形成し、標的は、マイクロＲＮＡでない医薬組成物を含む。
[0323] 一部の実施形態において、結合部位は、第１の結合部位であり、標的は、第１の標的である。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、第２の標的に結合する第２の結合部位をさらに含む。
[0324] 一態様において、本発明は、（ａ）（ｉ）第１の標的を結合させる第１の結合部位；及び（ｉｉ）第２の標的を結合させる第２の結合部位を含む環状ポリリボヌクレオチド；並びに（ｂ）薬学的に許容可能な担体又は賦形剤を含む医薬組成物であって、第１の結合部位は、第２の結合部位と異なり、第１の標的及び第２の標的は、マイクロＲＮＡである医薬組成物を含む。
[0325] 一部の実施形態において、第１の標的は、第１の環状ポリリボヌクレオチド（ｃｉｒｃＲＮＡ）結合モチーフを含む。一部の実施形態において、第２の標的は、第２の環状ポリリボヌクレオチド（ｃｉｒｃＲＮＡ）結合モチーフを含む。一部の実施形態において、第１の標的、第２の標的、及び環状ポリリボヌクレオチドは、複合体を形成する。一部の実施形態において、第１の標的及び第２の標的は、互いに相互作用する。一部の実施形態において、複合体は、細胞に接触させた場合、細胞プロセスをモジュレートする。一部の実施形態において、複合体の形成は、細胞に接触させた場合、細胞プロセスをモジュレートする。このような実施形態において、細胞プロセスは、疾患又は病態の病因と関連する。
[0326] 一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、細胞に接触させた場合、第１又は第２の標的と関連する細胞プロセスをモジュレートする。一部の実施形態において、第１及び第２の標的は、複合体中で互いに相互作用する。一部の実施形態において、細胞プロセスは、疾患又は病態の病因と関連する。一部の実施形態において、細胞プロセスは、環状ポリリボヌクレオチドの翻訳と異なる。一部の実施形態において、第１の標的は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子を含み、標的は、タンパク質を含む。一部の実施形態において、複合体は、ＤＮＡ分子の指向転写、ＤＮＡ分子のエピジェネティックリモデリング、又はＤＮＡ分子の分解をモジュレートする。
[0327] 一部の実施形態において、第１の標的は、第１のタンパク質を含み、第２の標的は、第２のタンパク質を含む。このような実施形態において、複合体は、第１のタンパク質の分解、第１のタンパク質のトランスロケーション、若しくはシグナル伝達をモジュレートし、又は第１及び第２のタンパク質間の直接的な相互作用により形成される複合体の形成をモジュレートする（例えば、複合体の形成を阻害し、又は促進する）。
[0328] 一部の実施形態において、第１の標的は、第１のリボ核酸（ＲＮＡ）分子を含み、第２の標的は、第２のＲＮＡ分子を含む。このような実施形態において、複合体は、第１のＲＮＡ分子の分解をモジュレートし得る。
[0329] 一部の実施形態において、標的は、タンパク質を含み、第２の標的は、ＲＮＡ分子を含む。このような実施形態において、複合体は、タンパク質のトランスロケーションをモジュレートし、又はタンパク質及びＲＮＡ分子間の直接的な相互作用により形成される複合体の形成を阻害する。
[0330] 一部の実施形態において、第１の標的は、受容体であり、第２の標的は、受容体の基質である。このような実施形態において、複合体は、受容体の活性化を阻害する。本明細書において使用される「受容体」は、細胞外部からの化学的シグナルを受容するタンパク質分子を指し得る。化学的シグナルとしては、限定されるものではないが、小分子有機化合物（例えば、アミノ酸及びその誘導体、例えば、グルタミン酸、グリシン、γ酪酸）、脂質、タンパク質又はポリペプチド、ＤＮＡ及びＲＮＡ分子、並びにイオンを挙げることができる。受容体は、細胞膜上、細胞質中、又は細胞核中に存在し得る。受容体に結合する化学的シグナルは、一般に、受容体の「基質」と称することができる。化学的シグナルへの結合時、受容体は、１つ以上の細胞プロセス、例えば、シグナリング経路を開始させることにより細胞応答の一部の形態を引き起こし得る。本明細書に提供される受容体は、当業者が認識する任意のタイプ、例として、以下であり得る、（１）イオンチャネル型受容体、これは、速い神経伝達物質、例えば、アセチルコリン（ニコチン性）及びＧＡＢＡの標的であり得；それらの受容体の活性化は、膜を通るイオン移動の変化をもたらす。これらは、それぞれのサブユニットが細胞外リガンド結合ドメイン及び膜貫通ドメインからなるという点でヘテロマー構造を有し得、そしてその膜貫通ドメインは４つの膜貫通αヘリックスを含む。リガンド結合空隙は、サブユニット間の界面に局在し得る；（２）Ｇタンパク質共役型受容体、これは、いくつかのホルモン及び遅い神経伝達物質、例えば、ドーパミン、代謝型グルタミン酸についての受容体を含み得る。これらは、７つの膜貫通αヘリックスから構成され得る。αヘリックスを連結するループは、細胞外及び細胞内ドメインを形成し得る；（３）キナーゼ結合及び関連受容体（又は受容体チロシンキナーゼ）、これは、リガンド結合部位を含有する細胞外ドメイン及び酵素的機能を有することが多い細胞内ドメインから構成され得、単一の膜貫通αヘリックスにより結合している。インスリン受容体は、このタイプの受容体の一例であり、インスリンは、その対応する基質であり得る；（４）https://en.wikipedia.org/wiki/Nuclear_receptorの核内受容体、これらは、核中、又は細胞質中に局在し、それらのリガンドと結合した後に核に移動し得る。これらは、Ｃ末端リガンド結合領域、コアＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）及びＡＦ１（活性化機能１）領域を含有するＮ末端ドメインから構成され得る。ステロイド及び甲状腺ホルモン受容体は、このような受容体の例であり、それらの対応する基質としては、種々のステロイド及びホルモンを挙げることができる。
[0331] 一態様において、本発明は、（ａ）標的を結合させる結合部位を含む環状ポリリボヌクレオチド；及び（ｂ）薬学的に許容可能な担体又は賦形剤を含む医薬組成物であって、環状ポリリボヌクレオチドは、翻訳不能又は翻訳欠損であり、標的は、マイクロＲＮＡでない医薬組成物を含む。
[0332] 一態様において、本発明は、（ａ）標的を結合させる結合部位を含み、標的は、第１のリボ核酸（ＲＮＡ）結合モチーフを含む環状ポリリボヌクレオチド；及び（ｂ）薬学的に許容可能な担体又は賦形剤を含む医薬組成物であって、環状ポリリボヌクレオチドは、翻訳不能又は翻訳欠損であり、標的は、マイクロＲＮＡである医薬組成物を含む。
[0333] このような実施形態において、標的は、ＤＮＡ分子を含む。このような実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドへの標的の結合は、ＤＮＡ分子の転写の干渉をモジュレートする。このような実施形態において、標的は、タンパク質を含む。このような実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドへの標的の結合は、タンパク質と他の分子との相互作用を阻害する。このような実施形態において、タンパク質は、受容体であり、環状ポリリボヌクレオチドへの標的の結合は、受容体を活性化させる。このような実施形態において、タンパク質は、第１の酵素であり、環状ポリリボヌクレオチドは、第２の酵素に結合する第２の結合部位をさらに含み、環状ポリリボヌクレオチドへの第１及び第２の酵素の結合は、第１及び第２の酵素の酵素活性をモジュレートする。このような実施形態において、標的は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子を含む。このような実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドへの標的の結合は、ｍＲＮＡ分子の翻訳の干渉をモジュレートする。このような実施形態において、標的は、リボソームを含む。このような実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドへの標的の結合は、翻訳プロセスの干渉をモジュレートする。このような実施形態において、標的は、環状ＲＮＡ分子を含む。このような実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドへの標的の結合は、環状ＲＮＡ分子を隔離する。このような実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドへの標的の結合は、標的を隔離する。
[0334] 一態様において、本発明は、（ａ）標的細胞の細胞膜を結合させる結合部位を含み、標的細胞の細胞膜は、第１のリボ核酸（ＲＮＡ）結合モチーフを含む環状ポリリボヌクレオチド；及び（ｂ）薬学的に許容可能な担体又は賦形剤を含む医薬組成物を含む。
[0335] 一部の実施形態において、環状ポリリボ核酸は、第２の標的細胞の第２の膜を結合させる第２の結合部位をさらに含み、第２の標的細胞の第２の細胞膜は、第２のＲＮＡ結合モチーフを含む。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、標的細胞上の細胞膜及び第２の標的細胞の第２の細胞膜の両方に結合し、第１及び第２の標的細胞の細胞融合がモジュレートされる。
[0336] 一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、第２の標的を結合させる第２の結合部位をさらに含み、環状ポリリボヌクレオチドへの第１及び標的の両方の結合は、第１の標的の立体構造変化を誘導し、それにより第１の細胞中で第１の標的の下流のシグナル伝達を誘導する。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、翻訳不能又は翻訳欠損である。
[0337] 一部の実施形態において、環状ポリリボ核酸は、ａ）エンクリプトゲン；ｂ）スプライシングエレメント；ｃ）調節配列：ｄ）複製配列；ｅ）準二本鎖二次構造；及びｆ）発現配列から選択される少なくとも１つの構造エレメントをさらに含む。このような実施形態において、準ヘリカル構造は、少なくとも１つの非二本鎖セグメントを有する少なくとも１つの二本鎖ＲＮＡセグメントを含む。このような実施形態において、準ヘリカル構造は、反復配列、例えば、Ａリッチ配列により結合している第１の配列及び第２の配列を含む。一部の実施形態において、エンクリプトゲンは、スプライシングエレメントを含む。
[0338] 一部の実施形態において、環状ポリリボ核酸は、少なくとも１つの修飾核酸を含む。このような実施形態において、少なくとも１つの修飾核酸は、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル、２’−デオキシ、Ｔ−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、Ｔ−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）、２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）、ロック核酸（ＬＮＡ）、エチレン核酸（ＥＮＡ）、ぺプチド核酸（ＰＮＡ）、１’，５’−アンヒドロヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、モルホリノ、メチルホスホネートヌクレオチド、チオールホスホネートヌクレオチド、及び２’−フルオロＮ３−Ｐ５’−ホスホラミダイトからなる群から選択される。環状ポリリボヌクレオチドは、完全修飾環状ポリリボヌクレオチドであり得る。一部の実施形態において、投与される環状ポリリボヌクレオチドは、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドである。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、修飾ヌクレオチド及び非修飾ＩＲＥＳを含む。
[0339] 一部の実施形態において、エンクリプトゲンは、少なくとも１つの修飾核酸、例えば、シュードウリジン及びＮ（６）メチルアデノシン（ｍ６Ａ）を含む。一部の実施形態において、エンクリプトゲンは、タンパク質結合部位、例えば、リボ核酸結合タンパク質を含む。一部の実施形態において、エンクリプトゲンは、例えば、ＣＴＬ応答を回避するための免疫タンパク質結合部位を含む。
[0340] 一部の実施形態において、環状ポリリボ核酸は、ＲＩＧ−Ｉ、ＴＬＲ−３、ＴＬＲ−７、ＴＬＲ−８、ＭＤＡ−５、ＬＧＰ−２、ＯＡＳ、ＯＡＳＬ、ＰＫＲ、及びＩＦＮ−βの少なくとも１つの発現又はシグナリング又は活性化により評価してエンクリプトゲンを欠く対応物よりも少なくとも２倍低い免疫原性を有する。一部の実施形態において、環状ポリリボ核酸は、約２０塩基〜約２０ｋｂの範囲のサイズを有する。一部の実施形態において、環状ポリリボ核酸は、線状ポリヌクレオチドの環状化を介して合成される。一部の実施形態において、環状ポリリボ核酸は、分解に実質的に抵抗性である。
用途
[0341] 本明細書に記載の環状ポリリボヌクレオチドは、それが必要とされる細胞、組織又は対象に投与し、例えば、細胞機能又は細胞プロセス、例えば、細胞、組織又は対象において遺伝子発現をモジュレートすることができる。本発明はまた、細胞機能又は細胞プロセス、例えば、遺伝子発現をモジュレートする方法であって、それが必要とされる細胞、組織又は対象に本明細書に記載の環状ポリリボヌクレオチドを投与することを含む方法を企図する。投与される環状ポリリボヌクレオチドは、修飾環状ポリリボヌクレオチドであり得る。一部の実施形態において、投与される環状ポリリボヌクレオチドは、完全修飾環状ポリリボヌクレオチドである。一部の実施形態において、投与される環状ポリリボヌクレオチドは、ハイブリッド修飾環状ポリリボヌクレオチドである。他の実施形態において、投与される環状ポリリボヌクレオチドは、非修飾環状ポリリボヌクレオチドである。
実施形態段落
［１］（ａ）標的、例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、細胞の膜などを結合させる結合部位を含む環状ポリリボヌクレオチド；及び
（ｂ）薬学的に許容可能な担体又は賦形剤
を含む医薬組成物であって、
標的及び環状ポリリボヌクレオチドは、複合体を形成し、
標的は、マイクロＲＮＡでない医薬組成物。
［２］（ａ）
（ｉ）第１の標的を結合させる第１の結合部位、及び
（ｉｉ）第２の標的を結合させる第２の結合部位
を含む環状ポリリボヌクレオチド；並びに
（ｂ）薬学的に許容可能な担体又は賦形剤
を含む医薬組成物であって、
第１の結合部位は、第２の結合部位と異なり、
第１の標的及び第２の標的は、両方ともマイクロＲＮＡである医薬組成物。
［３］結合部位は、アプタマー配列を含む、段落［１］の医薬組成物。
［４］第１の結合部位は、第１のアプタマー配列を含み、第２の結合部位は、第２のアプタマー配列を含む、段落［２］の医薬組成物。
［５］アプタマー配列は、標的を結合させる二次構造を有する、請求項［３］の医薬組成物。
［６］第１のアプタマー配列は、第１の標的を結合させる二次構造を有し、第２のアプタマー配列は、第２の標的を結合させる二次構造を有する、請求項［４］の医薬組成物。
［７］結合部位は、第１の結合部位であり、標的は、第１の標的である、請求項［１］の医薬組成物。
［８］環状ポリリボヌクレオチドは、第２の標的に結合する第２の結合部位をさらに含む、段落［３］、［５］、及び［７］のいずれか１つの医薬組成物。
［９］第１の標的は、第１の環状ポリリボヌクレオチド（ｃｉｒｃＲＮＡ）結合モチーフを含む、段落［２］、［４］、［６］、［７］、及び［８］のいずれか１つの医薬組成物。
［１０］第２の標的は、第２の環状ポリリボヌクレオチド（ｃｉｒｃＲＮＡ）結合モチーフを含む、段落［２］、［４］、［６］、及び［７］〜［９］のいずれか１つの医薬組成物。
［１１］第１の標的、第２の標的，及び環状ポリリボヌクレオチドは、複合体を形成する、段落［２］、［４］、［６］、及び［７］〜［１０］のいずれか１つの医薬組成物。
［１２］第１及び第２の標的は、互いに相互作用する、段落［２］、［４］、［６］、及び［７］〜［１１］のいずれか１つの医薬組成物。
［１３］複合体は、細胞プロセスをモジュレートする、段落［１］、［３］、［５］、及び［７］〜［１２］のいずれか１つの医薬組成物。
［１４］第１及び第２の標的は、同じであり、第１及び第２の結合部位は、第１の標的及び第２の標的上の異なる結合部位を結合させる、段落［２］、［４］、［６］、及び［７］〜［１３］のいずれか１つの医薬組成物。
［１５］第１の標的及び第２の標的は異なる、段落［２］、［４］、［６］、及び［７］〜［１３］のいずれか１つの医薬組成物。
［１６］環状ポリリボヌクレオチドは、第３以上の標的を結合させる１つ以上の追加の結合部位をさらに含む、段落［２］、［４］、［６］、及び［７］〜［１５］のいずれか１つの医薬組成物。
［１７］１つ以上の標的は同じであり、１つ以上の追加の結合部位は、１つ以上の標的上の異なる結合部位を結合させる、段落［２］、［４］、［６］、及び［７］〜［１６］のいずれか１つの医薬組成物。
［１８］複合体の形成は、細胞プロセスをモジュレートする、段落［１］、［３］、［５］、及び［７］〜［１７］のいずれか１つの医薬組成物。
［１９］環状ポリリボヌクレオチドは、第１及び第２の標的に接触させた場合、第１又は第２の標的と関連する細胞プロセスをモジュレートする、段落［２］、［４］、［６］、及び［７］〜［１８］のいずれか１つの医薬組成物。
［２０］第１及び第２の標的は、複合体中で互いに相互作用する、段落［２］、［４］、［６］、及び［７］〜［１９］のいずれか１つの医薬組成物。
［２１］細胞プロセスは、疾患又は病態の病因と関連する、段落［１３］〜［２０］のいずれか１つの医薬組成物。
［２２］細胞プロセスは、環状ポリリボ核酸の翻訳と異なる、段落［１３］〜［２１］のいずれか１つの医薬組成物。
［２３］第１の標的は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子を含み、第２の標的は、タンパク質を含む、段落［２］、［４］、［６］、及び［７］〜［２２］のいずれか１つの医薬組成物。
［２４］複合体は、ＤＮＡ分子の指向転写、ＤＮＡ分子のエピジェネティックリモデリング、又はＤＮＡ分子の分解をモジュレートする、段落［１］、［３］、［５］、及び［７］〜［２３］のいずれか１つの医薬組成物。
［２５］第１の標的は、第１のタンパク質を含み、第２の標的は、第２のタンパク質を含む、段落［２］、［４］、［６］、及び［７］〜［２４］のいずれか１つの医薬組成物。
［２６］複合体は、第１のタンパク質の分解、第１のタンパク質のトランスロケーション、若しくはシグナル伝達をモジュレートし、又は天然タンパク質機能をモジュレートし、第１及び第２のタンパク質間の直接的な相互作用により形成される複合体の形成を阻害し、若しくはモジュレートする、段落［１］、［３］、［５］、及び［７］〜［２５］のいずれか１つの医薬組成物。
［２７］第１の標的又は第２の標的は、ユビキチンリガーゼである、段落［２］、［４］、［６］、及び［７］〜［２６］のいずれか１つの医薬組成物。
［２８］第１の標的は、第１のリボ核酸（ＲＮＡ）分子を含み、第２の標的は、第２のＲＮＡ分子を含む、段落［２］、［４］、［６］、及び［７］〜［２７］のいずれか１つの医薬組成物。
［２９］複合体は、第１のＲＮＡ分子の分解をモジュレートする、段落［２８］の医薬組成物。
［３０］第１の標的は、タンパク質を含み、第２の標的は、ＲＮＡ分子を含む、段落［２］、［４］、［６］、及び［７］〜［２９］のいずれか１つの医薬組成物。
［３１］複合体は、タンパク質のトランスロケーションをモジュレートし、又はタンパク質及びＲＮＡ分子間の直接的な相互作用により形成される複合体の形成を阻害する、段落［１］、［３］、［５］、及び［７］〜［３０］のいずれか１つの医薬組成物。
［３２］第１の標的は、受容体であり、第２の標的は、受容体の基質である、段落［２］、［４］、［６］、及び［７］〜［３１］のいずれか１つの医薬組成物。
［３３］複合体は、受容体の活性化を阻害する、段落［１］、［３］、［５］、及び［７］〜［３２］のいずれか１つの医薬組成物。
［３４］（ａ）標的を結合させる結合部位を含む環状ポリリボヌクレオチド；及び
（ｂ）薬学的に許容可能な担体又は賦形剤
を含む医薬組成物であって、
環状ポリリボヌクレオチドは、翻訳不能又は翻訳欠損であり、標的は、マイクロＲＮＡでない医薬組成物。
［３５］（ａ）標的を結合させる結合部位を含み、標的は、リボ核酸（ＲＮＡ）結合モチーフを含む環状ポリリボ核酸；及び
（ｂ）薬学的に許容可能な担体又は賦形剤
を含む医薬組成物であって、
環状ポリリボヌクレオチドは、翻訳不能又は翻訳欠損であり、標的は、マイクロＲＮＡである医薬組成物。
［３６］結合部位は、標的を結合させる二次構造を有するアプタマー配列を含む、段落［３４］及び［３５］のいずれか１つの医薬組成物。
［３７］標的は、ＤＮＡ分子を含む、段落［３４］及び［３６］のいずれか１つの医薬組成物。
［３８］環状ポリリボヌクレオチドへの標的の結合は、ＤＮＡ分子の転写の干渉をモジュレートする、段落［３４］〜［３７］のいずれか１つの医薬組成物。
［３９］標的は、タンパク質を含む、段落［３４］及び［３６］〜［３８］のいずれか１つの医薬組成物。
［４０］環状ポリリボヌクレオチドへの標的の結合は、タンパク質と他の分子との相互作用をモジュレートする、段落［３９］の医薬組成物。
［４１］タンパク質は、受容体であり、環状ポリリボヌクレオチドへの標的の結合は、受容体を活性化させる、段落［３９］〜［４０］のいずれか１つの医薬組成物。
［４２］タンパク質は、第１の酵素であり、環状ポリリボヌクレオチドは、第２の酵素に結合する第２の結合部位をさらに含み、環状ポリリボヌクレオチドへの第１及び第２の酵素の結合は、第１及び第２の酵素の酵素活性をモジュレートする、段落［３９］〜［４１］のいずれか１つの医薬組成物。
［４３］タンパク質は、ユビキチンリガーゼである、段落［３９］及び［４０］のいずれか１つの医薬組成物。
［４４］標的は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子を含む、段落［３４］、［３６］、及び［３８］のいずれか１つの医薬組成物。
［４５］環状ポリリボヌクレオチドへの標的の結合は、ｍＲＮＡ分子の翻訳の干渉をモジュレートする、段落［４４］の医薬組成物。
［４６］標的は、リボソームを含む、段落［３４］、［３６］、［３９］、及び［４０］のいずれか１つの医薬組成物。
［４７］環状ポリリボヌクレオチドへの標的の結合は、翻訳プロセスの干渉をモジュレートする、段落［３４］〜［４６］のいずれか１つの医薬組成物。
［４８］標的は、環状ＲＮＡ分子を含む、段落［３４］、［３６］、及び［３８］のいずれか１つの医薬組成物。
［４９］環状ポリリボヌクレオチドへの標的の結合は、環状ＲＮＡ分子を隔離する、段落［４８］の医薬組成物。
［５０］環状ポリリボヌクレオチドへの標的の結合は、マイクロＲＮＡ分子を隔離する、段落［３５］、［３６］、［３８］、及び［４７］のいずれか１つの医薬組成物。
［５１］（ａ）細胞の膜（例えば、細胞壁膜、細胞小器官膜など）に結合する結合部位を含み、細胞の膜は、リボ核酸（ＲＮＡ）結合モチーフを含む環状ポリリボヌクレオチド；及び
（ｂ）薬学的に許容可能な担体又は賦形剤
を含む医薬組成物。
［５２］結合部位は、細胞の膜（例えば、細胞壁膜、細胞小器官膜など）を結合させる二次構造を有するアプタマー配列を含む、段落［５１］の医薬組成物。
［５３］環状ポリリボヌクレオチドは、第２の標的に結合する第２の結合部位をさらに含み、第２の標的は、第２のＲＮＡ結合モチーフを含む、段落［５１］及び［５２］のいずれか１つの医薬組成物。
［５４］環状ポリリボヌクレオチドは、細胞の膜及び第２の標的に結合する、段落［５３］の医薬組成物。
［５５］環状ポリリボヌクレオチドは、第２の細胞標的に結合する第２の結合部位をさらに含み、環状ポリリボヌクレオチドへの細胞標的及び第２の細胞標的の結合は、細胞標的の立体構造変化を誘導し、それにより細胞標的の下流のシグナル伝達を誘導する、段落［５１］〜［５４］のいずれか１つの医薬組成物。
［５６］環状ポリリボヌクレオチドは、翻訳不能又は翻訳欠損である、段落［１］〜［５５］のいずれか１つの医薬組成物。
［５７］環状ポリリボヌクレオチドは、
ａ）エンクリプトゲン；
ｂ）スプライシングエレメント；
ｃ）調節配列；
ｄ）複製配列；
ｅ）準二本鎖二次構造；
ｆ）準ヘリカル構造；及び
ｇ）発現配列
からなる群から選択される少なくとも１つの構造エレメントをさらに含む、段落［１］〜［５６］のいずれか１つの医薬組成物。
［５８］準ヘリカル構造は、少なくとも１つの非二本鎖セグメントを有する少なくとも１つの二本鎖ＲＮＡセグメントを含む、段落［５７］の医薬組成物。
［５９］準ヘリカル構造は、反復配列により結合している第１の配列及び第２の配列を含む、段落［５７］及び［５８］のいずれか１つの医薬組成物。
［６０］エンクリプトゲンは、スプライシングエレメントを含む、段落［５７］〜［５９］のいずれか１つの医薬組成物。
［６１］環状ポリリボ核酸は、少なくとも１つの修飾核酸を含む、段落［１］〜［６０］のいずれか１つの医薬組成物。
［６２］少なくとも１つの修飾核酸は、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル、２’−デオキシ、Ｔ−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、Ｔ−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）、２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）、ロック核酸（ＬＮＡ）、エチレン核酸（ＥＮＡ）、ぺプチド核酸（ＰＮＡ）、１’，５’−アンヒドロヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、モルホリノ、メチルホスホネートヌクレオチド、チオールホスホネートヌクレオチド、及び２’−フルオロＮ３−Ｐ５’−ホスホラミダイトからなる群から選択される、段落［６１］の医薬組成物。
［６３］エンクリプトゲンは、少なくとも１つの修飾核酸を含む、段落［５７］〜［６２］のいずれか１つの医薬組成物。
［６４］エンクリプトゲンは、タンパク質結合部位を含む、段落［５７］〜［６３］のいずれか１つの医薬組成物。
［６５］エンクリプトゲンは、免疫タンパク質結合部位を含む、段落［５７］〜［６４］のいずれか１つの医薬組成物。
［６６］環状ポリリボ核酸は、ＲＩＧ−Ｉ、ＴＬＲ−３、ＴＬＲ−７、ＴＬＲ−８、ＭＤＡ−５、ＬＧＰ−２、ＯＡＳ、ＯＡＳＬ、ＰＫＲ、及びＩＦＮ−βの少なくとも１つの発現、シグナリング又は活性化により評価してエンクリプトゲンを欠く対応物よりも少なくとも２倍低い免疫原性を有する、段落［５７］〜［６５］のいずれか１つの医薬組成物。
［６７］環状ポリリボ核酸は、約２０塩基〜約２０ｋｂのサイズを有する、段落［１］〜［６６］のいずれか１つの医薬組成物。
［６８］環状ポリリボ核酸は、線状ポリヌクレオチドの環状化を介して合成される、段落［１］〜［６７］のいずれか１つの医薬組成物。
［６９］環状ポリリボ核酸は、分解に実質的に抵抗性である、段落［１］〜［６８］のいずれか１つの医薬組成物。
［７０］（ａ）標的に結合する結合部位を含み、標的は、リボ核酸（ＲＮＡ）結合モチーフを含む環状ポリリボヌクレオチド；及び
（ｂ）薬学的に許容可能な担体又は賦形剤
を含む医薬組成物であって、
環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド及び少なくとも約５、１０、２０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、又は１０００個の連続非修飾ヌクレオチドを含む第１の部分を含む医薬組成物。
［７１］（ａ）標的に結合する結合部位を含み、標的は、リボ核酸（ＲＮＡ）結合モチーフを含む環状ポリリボヌクレオチド；及び
（ｂ）薬学的に許容可能な担体又は賦形剤
を含む医薬組成物であって、
環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド及び少なくとも約５、１０、２０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、又は１０００個の連続ヌクレオチドを含む第１の部分を含み、第１の部分は、シュードウリジンも５’−メチルシチジンも欠く医薬組成物。
［７２］結合部位は、標的を結合させる二次構造を有するアプタマー配列を含む、段落［７０］及び［７１］のいずれか１つの医薬組成物。
［７３］環状ポリリボヌクレオチドは、対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチドよりも低い免疫原性を有する、段落［７０］〜［７２］のいずれか１つの医薬組成物。
［７４］環状ポリリボヌクレオチドは、ＲＩＧ−Ｉ、ＴＬＲ−３、ＴＬＲ−７、ＴＬＲ−８、ＭＤＡ−５、ＬＧＰ−２、ＯＡＳ、ＯＡＳＬ、ＰＫＲ、及びＩＦＮ−βからなる群の少なくとも１つの発現又はシグナリング又は活性化により評価して対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチドよりも少なくとも約１．１、１．２、１．３、１．５、１．６、１．８、２、２．２、２．５、２．８、３、３．２、３．３、３．５、３．８、４．０、４．２、４．５、４．８、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、又は１０．０倍低い免疫原性を有する、段落［７０］〜［７２］のいずれか１つの医薬組成物。
［７５］環状ポリリボヌクレオチドは、対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチドよりも長い半減期を有する、段落［７０］〜［７４］のいずれか１つの医薬組成物。
［７６］環状ポリリボヌクレオチドは、対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチドよりも少なくとも約１．２、１．３、１．５、１．６、１．８、２、２．２、２．５、２．８、３、３．２、３．３、３．５、３．８、４．０、４．２、４．５、４．８、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、又は１０．０倍長い半減期を有する、段落［７０］〜［７４］のいずれか１つの医薬組成物。
［７７］半減期は、環状ポリリボヌクレオチド又は対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチドを細胞中に導入し、細胞内部の導入された環状ポリリボヌクレオチド又は対応する環状ポリリボヌクレオチドのレベルを測定することにより測定される、段落［７５］及び［７６］のいずれか１つの医薬組成物。
［７８］少なくとも１つの修飾ヌクレオチドは、Ｎ（６）メチルアデノシン（ｍ６Ａ）、５’−メチルシチジン、及びシュードウリジンからなる群から選択される、段落［７０］〜［７７］のいずれか１つの医薬組成物。
［７９］少なくとも１つの修飾核酸は、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル、２’−デオキシ、Ｔ−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、Ｔ−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）、２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）、ロック核酸（ＬＮＡ）、エチレン核酸（ＥＮＡ）、ぺプチド核酸（ＰＮＡ）、１’，５’−アンヒドロヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、モルホリノ、メチルホスホネートヌクレオチド、チオールホスホネートヌクレオチド、及び２’−フルオロＮ３−Ｐ５’−ホスホラミダイトからなる群から選択される、段落７０〜［７７］のいずれか１つの医薬組成物。
［８０］環状ポリリボヌクレオチドのヌクレオチドの少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は９９％は、修飾ヌクレオチドである、段落［７０］〜［７９］のいずれか１つの医薬組成物。
［８１］環状ポリリボヌクレオチドは、非修飾ヌクレオチドからなる、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は細胞標的に結合する結合部位を含む、段落［７０］〜［８０］のいずれか１つの医薬組成物。
［８２］環状ポリリボヌクレオチドは、非修飾ヌクレオチドからなる内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含む、段落［７０］〜［８１］のいずれか１つの医薬組成物。
［８３］修飾部位は、非修飾ヌクレオチドからなる、段落［７０］〜［８０］のいずれか１つの医薬組成物。
［８４］結合部位は、非修飾ヌクレオチドからなるＩＲＥＳを含む、段落［８３］の医薬組成物。
［８５］第１の部分は、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は細胞標的を結合させる結合部位を含む、段落［７０］〜［８４］のいずれか１つの医薬組成物。
［８６］第１の部分は、ＩＲＥＳを含む、段落［７０］〜［８５］のいずれか１つの医薬組成物。
［８７］環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上の発現配列を含む、段落［７０］〜［８６］のいずれか１つの医薬組成物。
［８８］環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上の発現配列及びＩＲＥＳを含み、環状ポリリボヌクレオチドは、ＩＲＥＳ外部の５’−メチルシチジン、シュードウリジン、又はそれらの組合せを含む、段落［８２］〜［８７］のいずれか１つの医薬組成物。
［８９］環状ポリリボヌクレオチドの１つ以上の発現配列は、対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチドよりも高い翻訳効率を有するように構成される、段落［７０］〜［８８］のいずれか１つの医薬組成物。
［９０］環状ポリリボヌクレオチドの１つ以上の発現配列は、対応する非修飾環状ポリリボヌクレオチドよりも少なくとも約０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．５、１．６、１．８、２、２．２、２．５、２．８、又は３倍高い翻訳効率を有する、段落［７０］〜［８９］のいずれか１つの医薬組成物。
［９１］環状ポリリボヌクレオチドの１つ以上の発現配列は、修飾ヌクレオチドを含む第１の部分を有する対応する環状ポリリボヌクレオチドよりも高い翻訳効率を有する、段落［７０］〜［９０］のいずれか１つの医薬組成物。
［９２］環状ポリリボヌクレオチドの１つ以上の発現配列は、１０％超の修飾ヌクレオチドを含む第１の部分を有する対応する環状ポリリボヌクレオチドよりも高い翻訳効率を有する、段落［７０］〜［９０］のいずれか１つの医薬組成物。
［９３］環状ポリリボヌクレオチドの１つ以上の発現配列は、修飾ヌクレオチドを含む第１の部分を有する対応する環状ポリリボヌクレオチドよりも少なくとも約１．２、１．３、１．５、１．６、１．８、２、２．２、２．５、２．８、３、３．２、３．３、３．５、３．８、４．０、４．２、４．５、４．８、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、又は１０．０倍高い翻訳効率を有する、段落［７０］〜［９２］のいずれか１つの医薬組成物。
［９４］翻訳効率は、環状ポリリボヌクレオチド若しくは対応する環状ポリリボヌクレオチドを含む細胞中で、又はインビトロ翻訳系（例えば、ウサギ網状赤血球溶解物）中のいずれかで測定される、段落［８９］〜［９３］のいずれか１つの医薬組成物。
［９５］環状ポリリボヌクレオチドは、請求項０〜［６９］のいずれか１つの環状ポリリボヌクレオチドである、段落［７０］〜［９４］のいずれか１つの医薬組成物。
［９６］治療する方法であって、段落［１］〜［９５］のいずれか１つの医薬組成物を、疾患又は病態を有する対象に投与することを含む方法。
［９７］段落［１］〜［９５］のいずれか１つの環状ポリリボヌクレオチドを生成することを含む、医薬組成物を産生する方法。
［９８］担体、例えば、膜又は脂質二重層中で配合される、段落［１］〜［９５］のいずれか１つの環状ポリリボヌクレオチド。
［９９］環状ポリリボヌクレオチドとしての核酸配列を有する線状ポリリボヌクレオチドを環状化させることを含む、段落［１］〜［９５］のいずれか１つの環状ポリリボヌクレオチドを作製する方法。
［１００］請求項［１］〜［９５］のいずれか１つの組成物を含む、遺伝子操作細胞。
［１０１］細胞中で標的を結合させる方法であって、
アプタマー配列を含み、アプタマー配列は、標的を結合させる二次構造を有する翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドを提供すること；及び
翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドを細胞に送達し、翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドは、送達の少なくとも５日後に検出可能な標的との複合体を形成すること
を含む方法。
［１０２］細胞中で標的を結合させる方法であって、
翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドを細胞に送達し、翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドは、標的を結合させるアプタマー配列を含み、翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドは、送達の少なくとも５日後に検出可能な標的との複合体を形成すること
を含む方法。
［１０３］標的は、核酸分子、小分子、タンパク質、炭水化物、及び脂質からなる群から選択される、段落［１０１］及び［１０２］のいずれか１つの方法。
［１０４］標的は、遺伝子調節タンパク質である、段落［１０１］〜［１０３］のいずれか１つの方法。
［１０５］遺伝子調節タンパク質は、転写因子である、段落１０４の方法。
［１０６］核酸分子は、ＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子である、段落［１０３］の方法。
［１０７］複合体は、遺伝子発現をモジュレートする、段落［１０１］〜［１０６］のいずれか１つの方法。
［１０８］複合体は、ＤＮＡ分子の指向転写、ＤＮＡ分子のエピジェネティックリモデリング、又はＤＮＡ分子の分解をモジュレートする、段落［１０１］〜［１０７］のいずれか１つの方法。
［１０９］複合体は、標的の分解、標的のトランスロケーション、又は標的シグナル伝達をモジュレートする、段落［１０１］〜［１０８］のいずれか１つの方法。
［１１０］遺伝子発現は、疾患又は病態の病因と関連する、段落［１０７］〜［１０９］のいずれか１つの方法。
［１１１］複合体は、送達の少なくとも７、８、９、又は１０日後に検出可能である、段落［１０１］〜［１１０］のいずれか１つの方法。
［１１２］翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドは、送達の少なくとも５日後に存在する、段落［１０１］〜［１１１］のいずれか１つの方法。
［１１３］翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドは、送達の少なくとも６、７、８、９、又は１０日後に存在する、段落［１０１］〜［１１２］のいずれか１つの方法。
［１１４］翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドは、非修飾翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドである、段落［１０１］〜［１１３］のいずれか１つの方法。
［１１５］翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドは、準二本鎖二次構造を有する、段落［１０１］〜［１１４］のいずれか１つの方法。
［１１６］アプタマー配列は、標的を結合させる三次構造をさらに有する、段落［１０１］〜［１１５］のいずれか１つの方法。
［１１７］細胞は、真核細胞である、段落［１０１］〜［１１６］のいずれか１つの方法。
［１１８］真核細胞は、ヒト細胞である、段落［１１７］のいずれか１つの方法。
［１１９］細胞中で転写因子を結合させる方法であって、
転写因子を結合させるアプタマー配列を含む翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドを提供すること；及び
翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドを細胞に送達し、翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドは、転写因子との複合体を形成し、遺伝子発現をモジュレートすること
を含む方法。
［１２０］細胞中で転写因子を結合させる方法であって、
翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドを細胞に送達し、翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドは、転写因子を結合させるアプタマー配列を含み、翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドは、転写因子との複合体を形成し、遺伝子発現をモジュレートすること
を含む方法。
［１２１］細胞中で転写因子を隔離する方法であって、
転写因子を結合させるアプタマー配列を含む翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドを提供すること；及び
翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドを細胞に送達し、翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドは、転写因子を結合させて細胞中で複合体を形成することにより転写因子を隔離すること
を含む方法。
［１２２］細胞中で転写因子を隔離する方法であって、
翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドを細胞に送達し、翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドは、転写因子を結合させるアプタマー配列を含み、翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドは、転写因子を結合させて複合体を形成することにより転写因子を隔離すること
を含む方法。
［１２３］細胞生存率は、前記複合体の形成後に減少する、段落［１２１］及び［１２２］のいずれか１つの方法。
［１２４］細胞毒性剤に対して細胞を感作させる方法であって、
転写因子を結合させるアプタマー配列を含む翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドを提供すること；及び
細胞毒性剤及び翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドを細胞に送達し、翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドは、細胞中で転写因子との複合体を形成すること；
それにより翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドを欠く細胞と比較して細胞毒性剤に対して細胞を感作させること
を含む方法。
［１２５］細胞毒性剤に対して細胞を感作させる方法であって、
細胞毒性剤及び翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドを細胞に送達し、翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドは、転写因子を結合させるアプタマー配列を含み；翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドは、細胞中で転写因子との複合体を形成すること；
それにより翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドを欠く細胞と比較して細胞毒性剤に対して細胞を感作させること
を含む方法。
［１２６］細胞毒性剤に対する細胞の感作は、細胞毒性剤及び翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドの送達後に減少した細胞生存率をもたらす、段落［１２４］及び［１２５］のいずれか１つの方法。
［１２７］減少した細胞生存率は、細胞毒性剤及び翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドの送達の少なくとも２日後に４０％以上だけ減少する、段落［１２６］の方法。
［１２８］細胞中で病原性タンパク質を結合させる方法であって、
病原性タンパク質を結合させるアプタマー配列を含む翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドを提供すること；及び
翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドを細胞に送達し、翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドは、病原性タンパク質の分解のために病原性タンパク質との複合体を形成すること
を含む方法。
［１２９］細胞中で病原性タンパク質を結合させる方法であって、
翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドを細胞に送達し、翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドは、病原性タンパク質を結合させるアプタマー配列を含み；翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドは、病原性タンパク質の分解のために病原性タンパク質との複合体を形成すること
を含む方法。
［１３０］細胞中でリボ核酸分子を結合させる方法であって、
リボ核酸分子の配列に相補的な配列を含む翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドを提供すること；及び
翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドを細胞に送達し、翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドは、細胞中でリボ核酸分子との複合体を形成すること
を含む方法。
［１３１］細胞中でリボ核酸分子を結合させる方法であって、
翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドを細胞に送達し、翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドは、リボ核酸分子を結合させるアプタマー配列を含み；翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドは、細胞中でリボ核酸分子との複合体を形成すること
を含む方法。
［１３２］細胞中でゲノムデオキシリボ核酸分子を結合させる方法であって、
ゲノムデオキシリボ核酸分子を結合させるアプタマー配列を含む翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドを提供すること；及び
翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドを細胞に送達し、翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドは、ゲノムデオキシリボ核酸分子との複合体を形成し、遺伝子発現をモジュレートすること
を含む方法。
［１３３］細胞中でゲノムデオキシリボ核酸分子を結合させる方法であって、
翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドを細胞に送達し、翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドは、ゲノムデオキシリボ核酸分子を結合させるアプタマー配列を含み；翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドは、ゲノムデオキシリボ核酸分子との複合体を形成し、遺伝子発現をモジュレートすること
を含む方法。
［１３４］細胞中で小分子を結合させる方法であって、
小分子を結合させるアプタマー配列を含む翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドを提供すること；及び
翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドを細胞に送達し、翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドは、小分子との複合体を形成し、細胞プロセス（例えば、タンパク質分解、細胞シグナリング、遺伝子発現など）をモジュレートすること
を含む方法。
［１３５］細胞中で小分子を結合させる方法であって、
翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドを細胞に送達し、翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドは、小分子を結合させるアプタマー配列を含み；翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドは、小分子との複合体を形成し、細胞プロセス（例えば、タンパク質分解、細胞シグナリング、遺伝子発現など）をモジュレートすること
を含む方法。
［１３６］小分子は、９００ダルトン以下の分子量を有する有機化合物であり、細胞プロセスをモジュレートする、段落［１３４］及び［１３５］のいずれか１つの方法。
［１３７］小分子は、薬物である、段落［１３４］〜［１３６］のいずれか１つの方法。
［１３８］小分子は、フルオロフォアである、段落［１３４］及び［１３５］のいずれか１つの方法。
［１３９］小分子は、代謝産物である、段落［１３４］〜［１３６］のいずれか１つの方法。
［１４０］アプタマー配列を含み、アプタマー配列は、標的を結合させる二次構造を有する翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドを含む組成物。
［１４１］アプタマー配列を含み、アプタマー配列は、標的を結合させる二次構造を有する翻訳不能環状ポリリボヌクレオチド；及び薬学的に許容可能な担体又は賦形剤を含む医薬組成物。
［１４２］段落［１０１］〜［１４１］のいずれか１つの翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドを含む細胞。
［１４３］治療が必要とされる対象を治療する方法であって、段落［１０１］〜［１４０］のいずれか１つの組成物又は段落［１４１］の医薬組成物を投与することを含む方法。
［１４４］段落［１０１］〜［１４１］のいずれか１つの翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド。
［１４５］段落［１０１］〜［１４１］のいずれか１つの翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドを産生する方法。
[0342] 本明細書に引用される全ての参照文献及び刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。
[0343] 以下の実施例は、例えば、モデルエレメントを使用して本発明の一部の実施形態をさらに説明するために提供されるが、本発明の範囲を限定するものではなく；それらの例示的な性質により、当業者に公知の他の手順、方法、又は技術を代替的に使用することができることが理解される。
実施例１： ＤＮＡを結合させて遺伝子発現を調節する環状ＲＮＡ
[0344] 本実施例は、遺伝子発現を調節するためにＤＮＡに結合する環状ＲＮＡを記載する。
[0345] モデル標的遺伝子、この場合、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子内の配列を含むように、非天然発生環状ＲＮＡを遺伝子操作する。全ての生物体において見出されるとおり、ＤＨＦＲは、細胞中のテトラヒドロ葉酸の量の調節において重要な役割を担う。テトラヒドロ葉酸及びその誘導体は、細胞増殖及び細胞成長に重要なプリン及びチミジル酸合成に不可欠である。ＤＨＦＲは、核酸前駆体の合成において中心的役割を担う。以下の実施例に示されるとおり、環状ＲＮＡはＤＨＦＲ遺伝子に結合してその転写を抑制する。
[0346] 環状ＲＮＡは、ＤＨＦＲ結合配列 ５’−ＡＣＡＡＡＵＧＧＧＧＡＣＧＡＧＧＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＣＣ−３’（配列番号５）を含むように設計する。
[0347] 上記のＤＨＦＲ結合配列を含むＤＮＡセグメントからＴ７ＲＮＡポリメラーゼを使用するインビトロ転写により、非修飾線状ＲＮＡを合成する。転写されたＲＮＡをＲＮＡ精製系（ＱＩＡＧＥＮ）により精製し、アルカリホスファターゼ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＥＦ０６５２）により製造業者の説明書に従って処理し、ＲＮＡ精製系により再度精製する。
[0348] Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ，Ｉｎｃ．、Ｍ０２０２Ｍ）又はＴ４ＲＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ，Ｉｎｃ．、Ｍ０２３９Ｓ）を使用する転写された線状ＲＮＡ及びＤＮＡスプリントの処理によりスプリントライゲーション環状ＲＮＡを生成し、環状ＲＮＡをＲＮアーゼＲ処理による濃縮後に単離する。ＲＮＡ品質は、アガロースゲルにより又は自動電気泳動（Ａｇｉｌｅｎｔ）を介して評価する。
[0349] 図５Ｃに示されるとおり、ＤＨＦＲゲノムＤＮＡへの１つの環状ＲＮＡ結合は、いくつかの方法、例として、ゲノムＤＮＡへの直接的なＲＮＡ結合を評価するＣＨＡＲＴ−ｑＰＣＲ、ＤＨＦＲ転写産物特異的ｑＰＣＲ、並びに細胞増殖及び細胞成長アッセイを介して評価する。ＤＨＦＲ遺伝子への環状ＲＮＡの活性結合は、減少したＤＨＦＲ転写、プリン及びチミジル酸合成の減少、並びに減少した細胞増殖及び細胞成長をもたらすことが予測される。
実施例２： ｄｓＤＮＡを結合させて遺伝子発現を調節する環状ＲＮＡ
[0350] 本実施例は、遺伝子発現を調節するためにｄｓＤＮＡに結合する環状ＲＮＡを記載する。
[0351] 図５Ｄに示されるとおり、モデル標的遺伝子、この場合、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）標的配列に結合する配列を含むように、非天然発生環状ＲＮＡを遺伝子操作する。ＴＧＦ−βは、多くの細胞タイプにより分泌される。ＴＧＦ−β受容体への結合後、受容体はリン酸化し、シグナリングカスケードを活性化させ、それが様々な下流の基質及び調節タンパク質の活性化をもたらす。以下の実施例は、転写を抑制するためにＴＧＦ−β標的遺伝子に結合する環状ＲＮＡを記載する。
[0352] 環状ＲＮＡは、ＴＧＦ−β標的結合配列 ５’−ＣＧＧＡＧＡＧＣＡＧＡＧＡＧＧＧＡＧＣＧ−３’（配列番号６）を含むように設計する。
[0353] ＴＧＦ−β結合配列を有するＤＮＡセグメントからＴ７ＲＮＡポリメラーゼを使用するインビトロ転写により、非修飾線状ＲＮＡを合成する。転写されたＲＮＡをＲＮＡ精製系（ＱＩＡＧＥＮ）により精製し、アルカリホスファターゼ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＥＦ０６５２）により製造業者の説明書に従って処理し、ＲＮＡ精製系により再度精製する。
[0354] Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ，Ｉｎｃ．、Ｍ０２０２Ｍ）又はＴ４ＲＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ，Ｉｎｃ．、Ｍ０２３９Ｓ）を使用する転写された線状ＲＮＡ及びＤＮＡスプリントの処理によりスプリントライゲーション環状ＲＮＡを生成し、環状ＲＮＡをＲＮアーゼＲ処理による濃縮後に単離する。ＲＮＡ品質は、アガロースゲルにより又は自動電気泳動（Ａｇｉｌｅｎｔ）を介して評価する。
[0355] ｄｓＤＮＡへの環状ＲＮＡ結合は、三重鎖免疫捕捉アッセイを介して判定する。ここで、ビオチン標識三重鎖形成オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）ｓｓＲＮＡ分子（対照配列又は標的化配列 ５’−ＣＧＧＡＧＡＧＣＡＧＡＧＡＧＧＧＡＧＣＧ−３’（配列番号７）のいずれか）を使用して細胞内から又は細胞から単離された核から標的ＤＮＡ配列をプルダウンしてＲＮＡ−ＤＮＡ三重構造の形成を評価する。ビオチン化標的化又は対照ＴＦＯによりプルダウンされたＤＮＡをシーケンシングしてＲＮＡ−ｄｓＤＮＡプルダウン後に濃縮されたＤＮＡ配列を決定する。
[0356] ＲＮＡ−ＤＮＡ結合を実証する代替法としては、ＣＨＡＲＴ−ｑＰＣＲ及びゲル移動度シフトアッセイが挙げられ、そこで標的化ｓｓＲＮＡオリゴ（５’−ＣＧＧＡＧＡＧＣＡＧＡＧＡＧＧＧＡＧＣＧ−３’（配列番号７））は、標的ｄｓＤＮＡオリゴ（５’−ＡＧＡＧＡＧＡＧＧＧＡＧＡＧＡＧ−３’（配列番号８）及び３’−ＴＣＴＣＴＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＣ−５’（配列番号９））と相互作用するが、対照ＤＮＡオリゴと相互作用しない。
[0357] 標的ＲＮＡ結合後に誘導される機能的変化の追加の評価としては、ｑＰＣＲにより測定されるＴＧＦ−β標的遺伝子、例として、ＴＧＦＢ２、ＴＧＦＢＲ１及び／又はＳＭＡＤ２の変化が挙げられる。
実施例３： ＤＮＡを結合させて遺伝子発現を調節する環状ＲＮＡ
[0358] 本実施例は、転写因子結合を阻害するためにＤＮＡに結合する環状ＲＮＡを記載する。
[0359] 標的配列に対する結合配列、ここでは、γグロビン転写因子結合配列を含むように、非天然発生環状ＲＮＡを遺伝子操作する。胎児ヘモグロビンは、子宮中での発達の最後の７ヶ月の間のヒト胎児における主な酸素輸送タンパク質であり、新生児において生後ほぼ６ヶ月まで持続する。胎児ヘモグロビンは、成人ヘモグロビンよりも大きい親和性で酸素を結合させ、母体の血流からの酸素により良好に接近させて胎児を発達させる。新生児において、胎児ヘモグロビンは、生後およそ６ヶ月までに成人ヘモグロビンによりほぼ完全に置き換えられる。
[0360] ＧＡＴＡ−１は、−５６７Ｇγ／−５６６Ａγ−グロビンＧＡＴＡモチーフにおいて結合するリプレッサー複合体ＧＡＴＡ−１−ＦＯＧ−１−Ｍｉ２ｂの構成要素である。以下の実施例は、阻害転写因子／抑制複合体の結合を防止するために−５６７Ｇγ／−５６６Ａγ−グロビンＧＡＴＡモチーフ（アクセッションファイルＧＩ４５５０２５からのＧｅｎＢａｎｋ座標３３９９２〜３３９４５及びアクセッションファイルＧＩ４５５０２５からのＧｅｎＢａｎｋ座標３８７７２〜３８９３７、それぞれ）に結合する環状ＲＮＡを記載する。
[0361] 環状ＲＮＡは、阻害転写因子複合体ＧＡＴＡ１、Ｍｉ２ｂ又はＦＯＧ１が結合する非欠失結合配列を含むように設計する。
[0362] 転写因子結合配列を有するＤＮＡセグメントからＴ７ＲＮＡポリメラーゼを使用するインビトロ転写により、非修飾線状ＲＮＡを合成する。転写されたＲＮＡをＲＮＡ精製系（ＱＩＡＧＥＮ）により精製し、アルカリホスファターゼ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＥＦ０６５２）により製造業者の説明書に従って処理し、ＲＮＡ精製系により再度精製する。
[0363] Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ，Ｉｎｃ．、Ｍ０２０２Ｍ）又はＴ４ＲＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ，Ｉｎｃ．、Ｍ０２３９Ｓ）を使用する転写された線状ＲＮＡ及びＤＮＡスプリントの処理によりスプリントライゲーション環状ＲＮＡを生成し、環状ＲＮＡをＲＮアーゼＲ処理による濃縮後に単離する。ＲＮＡ品質は、アガロースゲルにより又は自動電気泳動（Ａｇｉｌｅｎｔ）を介して評価する。
[0364] ＤＮＡへの環状ＲＮＡ結合は、直接的ＤＮＡ結合法、例えば、ＣＨＡＲＴ−ｑＰＣＲを介して評価し、機能は、胎児ヘモグロビンの活性化及び発現などの方法を介して評価する。γ−グロビン遺伝子上流の調節エレメントへの環状ＲＮＡの活性結合は、転写因子ＢＣＬ１１Ａ、又は他の阻害転写因子の競合阻害をもたらしてＨｂＦ転写を活性化させることが予測される。ＨｂＦレベルの変化は、ＨＰＬＣ分析、フローサイトメトリー分析、及び／又はｑＰＣＲを介して測定することができる。
実施例４： ＤＮＡ二重鎖を結合させる環状ＲＮＡ
[0365] 本実施例は、ＤＮＡ二重鎖に結合する環状ＲＮＡを記載する。
[0366] 主溝に対するＤＮＡ結合配列を含むように、非天然発生環状ＲＮＡを遺伝子操作することができる。短鎖（１５−ｍｅｒ）ＲＮＡオリゴヌクレオチド（三重鎖形成オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ））は、安定的な三重ヘリカルＲＮＡ：ＤＮＡ複合体を形成し得る。三重鎖構造の第３の鎖（すなわち、ＴＦＯ）は、二重鎖ＤＮＡの主溝を通る経路に従う。三重鎖構造の特異性及び安定性は、二重鎖ＤＮＡ中の古典的ワトソン・クリック塩基対合で形成されるものと異なるフーグスティーン水素結合を介して実現される。ＴＦＯは、主溝を介して標的二重鎖のプリンリッチ鎖に結合する。
[0367] １０〜１５塩基のポリプリン配列を有するＤＮＡセグメントからＴ７ＲＮＡポリメラーゼを使用するインビトロ転写により、非修飾線状ＲＮＡを合成する。転写されたＲＮＡをＲＮＡ精製系（ＱＩＡＧＥＮ）により精製し、アルカリホスファターゼ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＥＦ０６５２）により製造業者の説明書に従って処理し、ＲＮＡ精製系により再度精製する。
[0368] Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ，Ｉｎｃ．、Ｍ０２０２Ｍ）又はＴ４ＲＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ，Ｉｎｃ．、Ｍ０２３９Ｓ）を使用する転写された線状ＲＮＡ及びＤＮＡスプリントの処理により、スプリントライゲーション環状ＲＮＡを生成し、環状ＲＮＡをＲＮアーゼＲ処理による濃縮後に単離する。ＲＮＡ品質は、アガロースゲルにより又は自動電気泳動（Ａｇｉｌｅｎｔ）を介して評価する。
[0369] ＤＮＡへの環状ＲＮＡ結合は、直接的ＤＮＡ結合法、例えば、ゲノムＤＮＡへの直接的ＲＮＡ結合を判定するＣＨＡＲＴ−ｑＰＣＲを介して評価する。ｄｓＤＮＡへの環状ＲＮＡ結合を判定する代替法としては、三重鎖免疫捕捉アッセイ及びゲル移動度シフトアッセイが挙げられる。
実施例５： ＲＮＡ転写産物を結合させ、隔離する環状ＲＮＡ
[0370] 本実施例は、ＲＮＡ転写産物に結合し、それを隔離する環状ＲＮＡを記載する。
[0371] ＲＮＡ転写産物のための１つ以上の新規結合配列を含むように、非天然発生環状ＲＮＡを遺伝子操作する。伸長ＣＧＧトラクトを有するＲＮＡ分子は、環状ＲＮＡ結合のために標的化される。以下の実施例に示されるとおり、環状ＲＮＡは、隔離のためにＲＮＡのリピート領域に結合する。
[0372] 環状ＲＮＡは、５０〜２２０個のＦＭＲ１伸長リピート５’−ＣＧＧ−３’に対する相補的配列を含むように設計する。
[0373] ５０〜２２０個のＦＭＲ１伸長リピートを有するＤＮＡセグメントからＴ７ＲＮＡポリメラーゼを使用するインビトロ転写により、非修飾線状ＲＮＡを合成する。転写されたＲＮＡをＲＮＡ精製系（ＱＩＡＧＥＮ）により精製し、アルカリホスファターゼ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＥＦ０６５２）により製造業者の説明書に従って処理し、ＲＮＡ精製系により再度精製する。
[0374] Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ，Ｉｎｃ．、Ｍ０２０２Ｍ）又はＴ４ＲＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ，Ｉｎｃ．、Ｍ０２３９Ｓ）を使用する転写された線状ＲＮＡ及びＤＮＡスプリントの処理によりスプリントライゲーション環状ＲＮＡを生成し、環状ＲＮＡをＲＮアーゼＲ処理による濃縮後に単離する。ＲＮＡ品質は、アガロースゲルにより又は自動電気泳動（Ａｇｉｌｅｎｔ）を介して評価する。
[0375] ＦＭＲ１ ｍＲＮＡへの環状ＲＮＡ結合は、環状ＲＮＡに相補的な修飾オリゴヌクレオチドを使用してＦＭＲ１ ｍＲＮＡをプルダウンし、それを逆転写させ、ｑＰＣＲ増幅させるオリゴヌクレオチドプルダウンｑＰＣＲアッセイにより判定する。結合は、２つの蛍光オリゴ、ＦＭＲ１ ｍＲＮＡに特異的なもの及び環状ＲＮＡに相補的なものの同時局在化並びにＲＮＡ ＦＩＳＨによる判定によっても評価する。
実施例６： ＲＮＡ転写産物を結合させ、隔離する環状ＲＮＡ
[0376] 本実施例は、ＲＮＡ転写産物に結合し、それを隔離する環状ＲＮＡを記載する。
[0377] ＲＮＡ転写産物のための１つ以上の新規結合配列を含むように、非天然発生環状ＲＮＡを遺伝子操作する。ＳＣＡ８は、ＣＴＧの伸長リピートを利用する。ＣＴＧリピートは、転写されるが翻訳されない遺伝子中で生じる。以下の実施例に示されるとおり、環状ＲＮＡは、隔離のためにｍＲＮＡのリピート領域に結合する。
[0378] 環状ＲＮＡは、５０〜１２０個のＳＣＡ８伸長リピート５’−ＣＵＧ−３’に対する相補的配列を含むように設計する。
[0379] ５０〜１２０個のＳＣＡ８伸長リピートを有するＤＮＡセグメントからＴ７ＲＮＡポリメラーゼを使用するインビトロ転写により、非修飾線状ＲＮＡを合成する。転写されたＲＮＡをＲＮＡ精製系（ＱＩＡＧＥＮ）により精製し、アルカリホスファターゼ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＥＦ０６５２）により製造業者の説明書に従って処理し、ＲＮＡ精製系により再度精製する。
[0380] Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ，Ｉｎｃ．、Ｍ０２０２Ｍ）又はＴ４ＲＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ，Ｉｎｃ．、Ｍ０２３９Ｓ）を使用する転写された線状ＲＮＡ及びＤＮＡスプリントの処理によりスプリントライゲーション環状ＲＮＡを生成し、環状ＲＮＡをＲＮアーゼＲ処理による濃縮後に単離する。ＲＮＡ品質は、アガロースゲルにより又は自動電気泳動（Ａｇｉｌｅｎｔ）を介して評価する。
[0381] ＳＣＡ１ ＲＮＡへの環状ＲＮＡ結合は、環状ＲＮＡに相補的な修飾オリゴヌクレオチドを使用してＳＣＡ８伸長リピートをプルダウンし、それを逆転写させ、ｑＰＣＲ増幅させるオリゴヌクレオチドプルダウンｑＰＣＲアッセイにより判定する。ＲＮＡ ＦＩＳＨも使用して２つの蛍光オリゴ、ＳＣＡ８ ＲＮＡに特異的なもの及び環状ＲＮＡに相補的なものの同時局在化により結合を評価し、それをＲＮＡ ＦＩＳＨにより判定する。
実施例７： ＲＮＡ転写産物を結合させ、隔離する環状ＲＮＡ
[0382] 本実施例は、ＲＮＡ転写産物に結合し、それを隔離する環状ＲＮＡを記載する。
[0383] ＲＮＡ転写産物のための１つ以上の新規結合配列を含むように、合成環状ＲＮＡを遺伝子操作する。ハンチンチン（ＨＴＴ）遺伝子は、その野生型形態中で６〜３５個のグルタミン残基のセグメントを含む。以下の実施例に示されるとおり、環状ＲＮＡは、隔離のためにｍＲＮＡのリピート領域に結合する。
[0384] 環状ＲＮＡは、４０〜１２０個のＨＴＴ伸長リピート５’−ＣＡＧ−３’に対する相補的配列を含むように設計する。
[0385] ４０〜１２０個のＨＴＴ伸長リピートを有するＤＮＡセグメントからＴ７ＲＮＡポリメラーゼを使用するインビトロ転写により、非修飾線状ＲＮＡを合成する。転写されたＲＮＡをＲＮＡ精製系（ＱＩＡＧＥＮ）により精製し、アルカリホスファターゼ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＥＦ０６５２）により製造業者の説明書に従って処理し、ＲＮＡ精製系により再度精製する。
[0386] Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ，Ｉｎｃ．、Ｍ０２０２Ｍ）又はＴ４ＲＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ，Ｉｎｃ．、Ｍ０２３９Ｓ）を使用する転写された線状ＲＮＡ及びＤＮＡスプリントの処理によりスプリントライゲーション環状ＲＮＡを生成し、環状ＲＮＡをＲＮアーゼＲ処理による濃縮後に単離する。ＲＮＡ品質は、アガロースゲルにより又は自動電気泳動（Ａｇｉｌｅｎｔ）を介して評価する。
[0387] ＨＴＴ ＲＮＡへの環状ＲＮＡ結合を評価する１つの方法は、環状ＲＮＡに相補的な修飾オリゴヌクレオチドを使用してＨＴＴ ＲＮＡをプルダウンし、それを逆転写させ、ｑＰＣＲ増幅させるオリゴヌクレオチドプルダウンｑＰＣＲアッセイにより判定する。ＲＮＡ ＦＩＳＨも使用して２つの蛍光オリゴ、ＨＴＴＡに特異的なもの及び環状ＲＮＡに相補的なものの同時局在化により結合を評価し、それをＲＮＡ ＦＩＳＨにより判定する。
実施例８： ＲＮＡ転写産物及び酵素を結合させ、隔離する環状ＲＮＡ
[0388] 本実施例は、ＲＮＡ分解を補助するためにＲＮＡ転写産物及びタンパク質に同時に結合し、それらを隔離する環状ＲＮＡを記載する。
[0389] 転写産物分解を補助するための転写産物及びタンパク質のための１つ以上の新規結合配列を含むように、非天然発生環状ＲＮＡを遺伝子操作する。アトロフィン−１タンパク質はＡＴＮ１によりコードされ、モデル系として使用される。コードされるタンパク質は、セリンリピート、交互の酸性及び塩基性アミノ酸の領域、並びに可変グルタミンリピートを含む。ＡＴＮ１遺伝子は、ＣＡＧトリヌクレオチドリピートと呼ばれるＤＮＡのセグメントを有する。
[0390] 真核細胞において、ほとんどのｍＲＮＡは、ｍＲＮＡ翻訳及び安定性に重要な５’モノメチルグアノシンキャップ構造及び３’ポリ（Ａ）テールを有する。５’キャップ構造の除去（デキャッピング）は、５’末端からのｍＲＮＡ本体の分解の前提条件である。Ｄｃｐ２タンパク質は、細胞中の主なｍＲＮＡデキャッピング酵素として同定されている。以下の実施例に示されるとおり、環状ＲＮＡは、隔離のためにｍＲＮＡのリピート領域に、及びｍＲＮＡのデキャッピングのためのＤｃｐ２タンパク質に結合する。
[0391] 環状ＲＮＡは、４０〜１２０個のＡＴＮ１伸長リピート５’−ＣＡＧ−３’に対する相補的配列及びＤｃｐ２による認識のためのＲＮＡキャップ構造を含むように設計する。
[0392] ４０〜１２０個のＡＴＮ１伸長リピート及びＤｃｐ２による認識のためのＲＮＡキャップ構造を有するＤＮＡセグメントからＴ７ＲＮＡポリメラーゼを使用するインビトロ転写により、非修飾線状ＲＮＡを合成する。転写されたＲＮＡをＲＮＡ精製系（ＱＩＡＧＥＮ）により精製し、アルカリホスファターゼ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＥＦ０６５２）により製造業者の説明書に従って処理し、ＲＮＡ精製系により再度精製する。Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ，Ｉｎｃ．、Ｍ０２０２Ｍ）又はＴ４ＲＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ，Ｉｎｃ．、Ｍ０２３９Ｓ）を使用する転写された線状ＲＮＡ及びＤＮＡスプリントの処理によりスプリントライゲーション環状ＲＮＡを生成し、環状ＲＮＡをＲＮアーゼＲ処理による濃縮後に単離する。ＲＮＡ品質は、アガロースゲルにより又は自動電気泳動（Ａｇｉｌｅｎｔ）を介して評価する。
[0393] ＡＴＮ１ ＲＮＡへの環状ＲＮＡ結合を評価する１つの方法は、環状ＲＮＡに相補的な修飾オリゴヌクレオチドを使用してＡＴＮ１ ＲＮＡをプルダウンし、それを逆転写させ、ｑＰＣＲ増幅させるオリゴヌクレオチドプルダウンｑＰＣＲアッセイにより判定する。デキャッピング機能は、スプリントライゲーション及び定量的ＲＴ−ＰＣＲを組み合わせるｑＳＬ−ＲＴ−ＰＣＲ（Blewett, et al., RNA, 2011, Mar, 17(3): 535-543）により判定する。
実施例９： ｍＲＮＡ置き換えのための環状ＲＮＡ
[0394] 本実施例は、標的ｍＲＮＡに結合し、リボザイム開裂部位を作出する環状ＲＮＡを記載する。
[0395] ピルビン酸キナーゼｍＲＮＡのＭ２アイソフォームに結合する配列を含むように、非天然発生環状ＲＮＡを遺伝子操作する。以下の実施例に示されるとおり、環状ＲＮＡは、ピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）の標的Ｍ２アイソフォームに結合し、その開裂をもたらす。
[0396] 環状ＲＮＡは、標的中でＶＳリボザイム開裂部位を生成するピルビン酸キナーゼのＭ２アイソフォームに相補的な配列を含むように設計する。環状ＲＮＡは、トランス作用ＶＳリボザイム開裂のための配列及びピルビン酸キナーゼのＭ１アイソフォームのためのコード配列をさらに含む。
[0397] Ｍ２アイソフォーム相補的配列、ＶＳリボザイム、及びＭ１コード配列を有するＤＮＡセグメントからＴ７ＲＮＡポリメラーゼを使用するインビトロ転写により、非修飾線状ＲＮＡを合成する。転写されたＲＮＡをＲＮＡ精製系（ＱＩＡＧＥＮ）により精製し、アルカリホスファターゼ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＥＦ０６５２）により製造業者の説明書に従って処理し、ＲＮＡ精製系により再度精製する。
[0398] Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ，Ｉｎｃ．、Ｍ０２０２Ｍ）又はＴ４ＲＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ，Ｉｎｃ．、Ｍ０２３９Ｓ）を使用する転写された線状ＲＮＡ及びＤＮＡスプリントの処理によりスプリントライゲーション環状ＲＮＡを生成し、環状ＲＮＡをＲＮアーゼＲ処理による濃縮後に単離する。ＲＮＡ品質は、アガロースゲルにより又は自動電気泳動（Ａｇｉｌｅｎｔ）を介して評価する。
[0399] ＰＫ Ｍ２ ｍＲＮＡへの環状ＲＮＡ結合及び同時分解は、ＲＴ−ＰＣＲにより判定する。ＰＫ Ｍ１ ｍＲＮＡの発現回復は、類似の様式で判定する。さらに、ＰＫ Ｍ１及びＰＫ Ｍ２タンパク質の発現をウエスタンブロッティングにより判定する。標的ＲＮＡ結合及び開裂後に誘導された機能的変化の証拠としては、細胞増殖アッセイが挙げられる。
実施例１０： 標的化ｍＲＮＡ開裂のための環状ＲＮＡ
[0400] 本実施例は、モデル標的ｍＲＮＡに結合し、リボザイム開裂部位を作出する環状ＲＮＡを記載する。
[0401] ＳＲＳＦ１ ｍＲＮＡに結合する配列を含むように、非天然発生環状ＲＮＡを遺伝子操作する。以下の実施例は、標的ＳＲＳＦ１ ｍＲＮＡに結合し、その開裂をもたらす環状ＲＮＡを記載する。
[0402] 環状ＲＮＡは、標的中のＶＳリボザイム開裂部位を生成するｔＳＲＳＦ１ ｍＲＮＡに相補的な配列を含むように設計する。環状ＲＮＡは、トランス作用ＶＳリボザイムのための配列及びピルビン酸キナーゼのＭ１アイソフォームのためのコード配列をさらに含有する。他のトランス作用リボザイム、例えば、ＨＤＶ、ハンマーヘッド、グループＩ、及び／又はグループＩＩを利用する。
[0403] ＳＲＳＦ１相補的配列、ＶＳリボザイムを有するＤＮＡセグメントからＴ７ＲＮＡポリメラーゼを使用するインビトロ転写により、非修飾線状ＲＮＡを合成する。転写されたＲＮＡをＲＮＡ精製系（ＱＩＡＧＥＮ）により精製し、アルカリホスファターゼ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＥＦ０６５２）により製造業者の説明書に従って処理し、ＲＮＡ精製系により再度精製する。
[0404] Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ，Ｉｎｃ．、Ｍ０２０２Ｍ）又はＴ４ＲＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ，Ｉｎｃ．、Ｍ０２３９Ｓ）を使用する転写された線状ＲＮＡ及びＤＮＡスプリントの処理によりスプリントライゲーション環状ＲＮＡを生成し、環状ＲＮＡをＲＮアーゼＲ処理による濃縮後に単離する。ＲＮＡ品質は、アガロースゲルにより又は自動電気泳動（Ａｇｉｌｅｎｔ）を介して評価する。
[0405] ＳＲＳＦ１ ｍＲＮＡへの環状ＲＮＡ結合及びその同時分解は、ＲＴ−ＰＣＲにより判定する。ＳＲＳＦ１タンパク質の発現は、ウエスタンブロッティングにより判定する。標的ＲＮＡ結合及び開裂後に誘導された変化についての追加の証拠としては、細胞増殖アッセイが挙げられる。
実施例１１： 環状ＲＮＡを隔離する環状ＲＮＡ
[0406] 本実施例は、環状ＲＮＡを結合させる環状ＲＮＡを記載する。
[0407] 環状ＲＮＡは、ある細胞系中に存在し得る。１つのそのような例は、ｃｉｒｃ−Ｄｎｍｔ１である。以下の実施例に示されるとおり、環状ＲＮＡは、ｃｉｒｃ−Ｄｎｍｔ１に結合する。
[0408] 環状ＲＮＡは、そのＲＮＡ−タンパク質相互作用を阻害するためのｃｉｒｃ−Ｄｎｍｔ１に対する相補的配列を含むように設計する。
[0409] 適切な配列を有するＤＮＡセグメントからＴ７ＲＮＡポリメラーゼを使用するインビトロ転写により、非修飾線状ＲＮＡを合成する。転写されたＲＮＡをＲＮＡ精製系（ＱＩＡＧＥＮ）により精製し、アルカリホスファターゼ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＥＦ０６５２）により製造業者の説明書に従って処理し、ＲＮＡ精製系により再度精製する。
[0410] Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ，Ｉｎｃ．、Ｍ０２０２Ｍ）又はＴ４ＲＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ，Ｉｎｃ．、Ｍ０２３９Ｓ）を使用する転写された線状ＲＮＡ及びＤＮＡスプリントの処理によりスプリントライゲーション環状ＲＮＡを生成し、環状ＲＮＡをＲＮアーゼＲ処理による濃縮後に単離する。ＲＮＡ品質は、アガロースゲルにより又は自動電気泳動（Ａｇｉｌｅｎｔ）を介して評価する。
[0411] ｃｉｒｃ−Ｄｎｍｔ１への環状ＲＮＡ結合を評価する１つの方法は、環状ＲＮＡの領域に相補的なビオチン化オリゴを使用する環状ＲＮＡのプルダウンとその後のＲＴ−ＰＣＲによるものである。さらに、電気泳動移動度シフトアッセイを使用して環状ＲＮＡ−ｃｉｒｃＤｎｍｔ１複合体を可視化する。
実施例１２： ２つのｍｉＲＮＡを隔離する環状ＲＮＡ
[0412] 本実施例は、２つの別個のｍｉＲＮＡを結合させる環状ＲＮＡを記載する。
[0413] 環状ＲＮＡは、２つのモデルｍｉＲＮＡ、ここではｍｉＲ−９及びｍｉＲ−１２６９に対する相補的配列を含むように設計する。
[0414] 適切な配列を有するＤＮＡセグメントからＴ７ＲＮＡポリメラーゼを使用するインビトロ転写により、非修飾線状ＲＮＡを合成する。転写されたＲＮＡをＲＮＡ精製系（ＱＩＡＧＥＮ）により精製し、アルカリホスファターゼ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＥＦ０６５２）により製造業者の説明書に従って処理し、ＲＮＡ精製系により再度精製する。
[0415] Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ，Ｉｎｃ．、Ｍ０２０２Ｍ）又はＴ４ＲＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ，Ｉｎｃ．、Ｍ０２３９Ｓ）を使用する転写された線状ＲＮＡ及びＤＮＡスプリントの処理によりスプリントライゲーション環状ＲＮＡを生成し、環状ＲＮＡをＲＮアーゼＲ処理による濃縮後に単離する。ＲＮＡ品質は、アガロースゲルにより又は自動電気泳動（Ａｇｉｌｅｎｔ）を介して評価する。
[0416] ｍｉＲ−９及びｍｉＲ−１２６９への環状ＲＮＡ結合を評価する１つの方法は、環状ＲＮＡの領域に相補的なビオチン化オリゴを使用する環状ＲＮＡのプルダウンとその後のＲＴ−ＰＣＲによるものである。さらに、電気泳動移動度シフトアッセイを使用して環状ＲＮＡ−ｍｉＲＮＡ−ｍｉＲＮＡ複合体を可視化する。
実施例１３： 少なくとも２つの個々のＲＮＡ転写産物を結合させ、隔離する環状ＲＮＡ
[0417] 本実施例は、少なくとも２つのモデルＲＮＡ転写産物に結合し、それらを隔離する環状ＲＮＡを記載する。
[0418] ＲＮＡ転写産物のための２つ以上の新規結合配列を含むように、合成環状ＲＮＡを遺伝子操作する。ＳＣＡ８は、ＣＴＧの伸長リピートを利用する。ＦＭＲ１遺伝子は、ＣＧＧ伸長部を含む。以下の実施例に示されるとおり、環状ＲＮＡは、隔離のためにＲＮＡ転写産物のリピート領域に結合する。
[0419] 以下の実施例に示されるとおり、環状ＲＮＡは、ＦＭＲ１又はＳＣＡ８伸長リピートのいずれかの隔離のためにＲＮＡのリピート領域に結合する。
[0420] 環状ＲＮＡは、５０〜２２０個のＦＭＲ１伸長リピート５’−ＣＧＧ−３’に対する相補的配列及び５０〜１２０個のＳＣＡ８伸長リピート５’−ＣＵＧ−３’に対する相補的配列を含むように設計する。
[0421] 伸長リピートを有するＤＮＡセグメントからＴ７ＲＮＡポリメラーゼを使用するインビトロ転写により、非修飾線状ＲＮＡを合成する。転写されたＲＮＡをＲＮＡ精製系（ＱＩＡＧＥＮ）により精製し、アルカリホスファターゼ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＥＦ０６５２）により製造業者の説明書に従って処理し、ＲＮＡ精製系により再度精製する。
[0422] Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ，Ｉｎｃ．、Ｍ０２０２Ｍ）又はＴ４ＲＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ，Ｉｎｃ．、Ｍ０２３９Ｓ）を使用する転写された線状ＲＮＡ及びＤＮＡスプリントの処理によりスプリントライゲーション環状ＲＮＡを生成し、環状ＲＮＡをＲＮアーゼＲ処理による濃縮後に単離する。ＲＮＡ品質は、アガロースゲルにより又は自動電気泳動（Ａｇｉｌｅｎｔ）を介して評価する。
[0423] ＦＭＲ１又はＳＣＡ１ ｍＲＮＡへの環状ＲＮＡ結合は、環状ＲＮＡに相補的な修飾オリゴヌクレオチドを使用してＦＭＲ１又はＳＣＡ１ ｍＲＮＡをプルダウンし、それを逆転写させ、ｑＰＣＲ増幅させるオリゴヌクレオチドプルダウンｑＰＣＲアッセイにより判定する。結合は、蛍光オリゴ、ＦＭＲ１又はＳＣＡ１ ｍＲＮＡに特異的なもの及び環状ＲＮＡに相補的なものの同時局在化によっても評価し、蛍光はＲＮＡ ＦＩＳＨにより判定する。
実施例１４： タンパク質を結合させる環状ＲＮＡ
[0424] 本実施例は、隔離のためにタンパク質に結合する環状ＲＮＡを記載する。
[0425] ＴＡＲ−ＤＮＡ結合タンパク質−４３（ＴＤＰ−４３）は、ｍＲＮＡプロセシング及び安定化に関与する多機能異種リボヌクレオタンパク質である。ＴＤＰ−４３は、２つのＲＮＡ認識モチーフ（ＲＲＭ）、核シャトリングを媒介する核局在化シグナル及び核輸送配列、並びにＴＤＰ−４３タンパク質相互作用及び機能に関与するＣ末端グリシンリッチドメイン（ＧＲＤ）を含む。以下の実施例に示されるとおり、環状ＲＮＡは、隔離のためにＴＤＰ−４３に結合する。
[0426] 環状ＲＮＡは、ＴＤＰ−４３を競合結合し、その結合／下流機能を阻害するためのＴＤＰ−４３ＲＮＡ結合モチーフ：５’−（ＵＧ）ｎＵＡ（ＵＧ）ｍ−３’、５’−ＧＡＧＡＧＡＧＣＧＣＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧＵＧＧＵＧＧＵＧＣＡＵＡ−３’（配列番号１０）又は（ＵＧ）６及びＣ末端グリシンリッチドメインのためのタンパク質結合配列を含むように設計する。
[0427] ＴＤＰ−４３ＲＮＡモチーフ及びＣ末端グリシンリッチドメインのためのタンパク質結合配列を含むＤＮＡセグメントからＴ７ＲＮＡポリメラーゼを使用するインビトロ転写により、非修飾線状ＲＮＡを合成する。転写されたＲＮＡをＲＮＡ精製系（ＱＩＡＧＥＮ）により精製し、アルカリホスファターゼ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＥＦ０６５２）により製造業者の説明書に従って処理し、ＲＮＡ精製系により再度精製する。
[0428] Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ，Ｉｎｃ．、Ｍ０２０２Ｍ）又はＴ４ＲＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ，Ｉｎｃ．、Ｍ０２３９Ｓ）を使用する転写された線状ＲＮＡ及びＤＮＡスプリントの処理によりスプリントライゲーション環状ＲＮＡを生成し、環状ＲＮＡをＲＮアーゼＲ処理による濃縮後に単離する。ＲＮＡ品質は、アガロースゲルにより又は自動電気泳動（Ａｇｉｌｅｎｔ）を介して評価する。
[0429] ＴＤＰ−４３への環状ＲＮＡ結合は、インビトロでＥＭＳＡ（ＲＮＡ電気泳動移動度シフトアッセイ）により判定する。ＴＤＰ−４３がｃｉｒｃＲＮＡに結合している場合、ゲル電気泳動の間の移動速度は、非結合環状ＲＮＡのものよりも緩慢である。さらに、環状ＲＮＡ特異的ｑＰＣＲと連結させた抗ＴＤＰ−４３抗体を使用するＲＩＰ（ＲＮＡ免疫沈降）を使用して細胞抽出物中の転写産物結合を判定する。環状ＲＮＡが隔離のためにＴＤＰ−４３に結合するか否かを評価するため、環状ＲＮＡにより処理された又はそれを有さない細胞中でＴＤＰ−４３局在化を分析する。環状ＲＮＡがＴＤＰ−４３を隔離する場合、ＴＤＰ−４３局在化は細胞質中で留まることが予測される。さらに、ＴＤＰ４３において環状ＲＮＡによる隔離は、増加した生存率をもたらすことが予測される。
実施例１５： タンパク質を結合させる環状ＲＮＡ
[0430] 本実施例は、隔離のためにタンパク質に結合する環状ＲＮＡを記載する。
[0431] プレｍＲＮＡプロセシングスプライシング因子８は、ヒトにおいてＰＲＰＦ８遺伝子によりコードされ、Ｕ２及びＵ１２依存性スプライソソームの両方の構成成分であるタンパク質であり、プレｍＲＮＡスプライシングプロセスにおける触媒ステップＩＩに不可欠であることが見出されている。以下の実施例に示されるとおり、環状ＲＮＡは、隔離のためにＰＲＰＦ８に結合する。
[0432] 環状ＲＮＡは、ＰＲＰＦ８に競合結合し、その機能を阻害するためのＰＲＰＦ８ＲＮＡ結合モチーフ ５’−ＡＵＵＧＣＣＵＡＵＡＧＡＡＣＵＵＡＵＡＡＣＧＡＡＣＡＵＧＧＵＵＣＵＵＧＣＣＵＵＵＵＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＵＣＣＧＧＧＵＧＵＵＧＵＣＵＣＣＡＵＡＧＡ−３’（配列番号１１）を含むように設計する。
[0433] ＰＲＰＦ８結合配列を含むＤＮＡセグメントからＴ７ＲＮＡポリメラーゼを使用するインビトロ転写により、非修飾線状ＲＮＡを合成する。転写されたＲＮＡをＲＮＡ精製系（ＱＩＡＧＥＮ）により精製し、アルカリホスファターゼ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＥＦ０６５２）により製造業者の説明書に従って処理し、ＲＮＡ精製系により再度精製する。
[0434] Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ，Ｉｎｃ．、Ｍ０２０２Ｍ）又はＴ４ＲＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ，Ｉｎｃ．、Ｍ０２３９Ｓ）を使用する転写された線状ＲＮＡ及びＤＮＡスプリントの処理によりスプリントライゲーション環状ＲＮＡを生成し、環状ＲＮＡをＲＮアーゼＲ処理による濃縮後に単離する。ＲＮＡ品質は、アガロースゲルにより又は自動電気泳動（Ａｇｉｌｅｎｔ）を介して評価する。
[0435] ＰＲＰＦ８への環状ＲＮＡ結合を評価する１つの方法は、ＥＭＳＡ（ＲＮＡ電気泳動移動度シフトアッセイ）である。ＰＲＰＦ８が環状ＲＮＡに結合している場合、ゲル電気泳動の間の移動速度は、非結合環状ＲＮＡのものよりも緩慢である。さらに、環状ＲＮＡ特異的ｑＰＣＲと連結させた抗ＰＲＰＦ８抗体を使用するＲＩＰ（ＲＮＡ免疫沈降）を使用して細胞抽出物中の転写産物結合を判定する。環状ＲＮＡがＰＲＰＦ８を隔離し、細胞機能を変更するか否かを評価するため、幹細胞表面マーカー、例えば、ＣＤ４４＋／ＣＤ２４＋の発現を環状ＲＮＡ送達後にＦＡＣＳにより判定する。
実施例１６： タンパク質を結合させる環状ＲＮＡ
[0436] 本実施例は、隔離のためにモデルタンパク質に結合する環状ＲＮＡを記載する。
[0437] ヒトＬＩＮ２８Ａホモログは、Ｎ末端低温ショックドメイン（ＣＳＤ）及び２つのＣ末端ＣｙｓＣｙｓＨｉｓＣｙｓ（ＣＣＨＣ）ジンクフィンガードメインを有するＲＮＡ結合タンパク質（ＲＢＰ）である。ヒトＬＩＮ２８Ａは、主に細胞質性であり、細胞構成成分、例えば、リボソーム、Ｐ体、及びストレス顆粒と会合する。以下の実施例に示されるとおり、環状ＲＮＡは、隔離のためにＬＩＮ２８Ａに結合する。
[0438] 環状ＲＮＡは、ｐｒｅＥＭ−ｌｅｔ−７ｆ配列、５’−ＧＧＧＧＵＡＧＵＧＡＵＵＵＵＡＣＣＣＵＧＧＡＧＡＵ−３’（配列番号１２）、及びＬＩＮ２８Ａを競合結合するためのＬＩＮ２８Ａ ＧＧＡＧ結合モチーフを有するＲＮＡ配列を含むように設計する。
[0439] ＬＩＮ２８Ａ結合配列を含むＤＮＡセグメントからＴ７ＲＮＡポリメラーゼを使用するインビトロ転写により、非修飾線状ＲＮＡを合成する。転写されたＲＮＡをＲＮＡ精製系（ＱＩＡＧＥＮ）により精製し、アルカリホスファターゼ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＥＦ０６５２）により製造業者の説明書に従って処理し、ＲＮＡ精製系により再度精製する。
[0440] Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ，Ｉｎｃ．、Ｍ０２０２Ｍ）又はＴ４ＲＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ，Ｉｎｃ．、Ｍ０２３９Ｓ）を使用する転写された線状ＲＮＡ及びＤＮＡスプリントの処理によりスプリントライゲーション環状ＲＮＡを生成し、環状ＲＮＡをＲＮアーゼＲ処理による濃縮後に単離する。ＲＮＡ品質は、アガロースゲルにより又は自動電気泳動（Ａｇｉｌｅｎｔ）を介して評価する。
[0441] ＬＩＮ２８Ａへの環状ＲＮＡ結合を評価する１つの方法は、ＥＭＳＡ（ＲＮＡ電気泳動移動度シフトアッセイ）である。ＬＩＮ２８Ａが環状ＲＮＡに結合している場合、ゲル電気泳動の間の移動速度は、非結合環状ＲＮＡのものよりも緩慢である。さらに、環状ＲＮＡ特異的ｑＰＣＲと連結させた抗ＬＩＮ２８Ａ抗体を使用するＲＩＰ（ＲＮＡ免疫沈降）を使用して細胞抽出物中の転写産物結合を判定し、ＬＩＮ２８Ａ免疫蛍光と環状ＲＮＡ ＦＩＳＨとの組合せを使用して細胞中の同時局在化を判定する。環状ＲＮＡが隔離のためにＬＩＮ２８Ａに結合し、細胞機能を変更したか否かを評価するため、環状ＲＮＡをヒト細胞中に送達する。環状ＲＮＡ処理時、成熟ＬＥＴ−７ｇの発現レベルをｑ−ＲＴ−ＰＣＲにより測定する。さらに、処理細胞の細胞成長をＭＴＴ法により測定する。
実施例１７： タンパク質を結合させる環状ＲＮＡ
[0442] 本実施例は、隔離のためにモデルタンパク質に結合する環状ＲＮＡを記載する。
[0443] ＣＵＧ結合タンパク質１（ＣＵＧＢＰ１）は、代替的スプライシングのレベルにおける遺伝子発現、ｍＲＮＡ分解、及び翻訳を調節する。転写後調節ネットワークは、ＲＮＡ結合タンパク質ＣＵＧ結合タンパク質１（ＣＵＧＢＰ１）を含み、それはＣＵＧＢＰ及びＥＬＡＶ様ファミリーメンバー１（ＣＥＬＦ１）とも称され、標的転写産物の３’−ＵＴＲ中に留まるＧＵリッチエレメント（ＧＲＥ）に結合し、ＧＲＥ含有転写産物の分解を媒介する。以下の実施例に示されるとおり、環状ＲＮＡは、隔離のためにＣＵＧＢＰ１に結合する。
[0444] 環状ＲＮＡは、ＣＵＧＢＰ１により認識され、ＣＵＧＢＰ１に競合結合するＵＧＵ（Ｇ／Ｕ）ＵＧＵ（Ｇ／Ｕ）ＵＧＵを有する少なくとも１つのＲＮＡモチーフを含むように設計する。
[0445] ＣＵＧＢＰ１結合配列を含むＤＮＡセグメントからＴ７ＲＮＡポリメラーゼを使用するインビトロ転写により、非修飾線状ＲＮＡを合成する。転写されたＲＮＡをＲＮＡ精製系（ＱＩＡＧＥＮ）により精製し、アルカリホスファターゼ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＥＦ０６５２）により製造業者の説明書に従って処理し、ＲＮＡ精製系により再度精製する。
[0446] Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ，Ｉｎｃ．、Ｍ０２０２Ｍ）又はＴ４ＲＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ，Ｉｎｃ．、Ｍ０２３９Ｓ）を使用する転写された線状ＲＮＡ及びＤＮＡスプリントの処理によりスプリントライゲーション環状ＲＮＡを生成し、環状ＲＮＡをＲＮアーゼＲ処理による濃縮後に単離する。ＲＮＡ品質は、アガロースゲルにより又は自動電気泳動（Ａｇｉｌｅｎｔ）を介して評価する。
[0447] ＣＵＧＢＰ１への環状ＲＮＡ結合を評価する１つの方法は、ＥＭＳＡ（ＲＮＡ電気泳動移動度シフトアッセイ）である。ＣＵＧＢＰ１が環状ＲＮＡに結合している場合、ゲル電気泳動の間の移動速度は、非結合環状ＲＮＡのものよりも緩慢である。さらに、環状ＲＮＡ特異的ｑＰＣＲと連結させた抗ＣＵＧＰ１抗体を使用するＲＩＰ（ＲＮＡ免疫沈降）を使用して細胞抽出物中の転写産物結合を判定し、ＣＵＧＰ１免疫蛍光と環状ＲＮＡ ＦＩＳＨとの組合せを使用して細胞中の同時局在化を判定する。環状ＲＮＡが隔離のためにＣＵＧＢＰ１に結合し、細胞機能を変更したか否かを評価するため、環状ＲＮＡを細胞中に送達し、比色ＭＴＴアッセイを使用して細胞増殖を測定する。
実施例１８： タンパク質を結合させる環状ＲＮＡ
[0448] 本実施例は、隔離のためにモデルタンパク質に結合する環状ＲＮＡを記載する。
[0449] Ｇｅｍｉｎ５は、ＲＮＡ結合タンパク質（ＲＢＰ）であり、ＲＢＳ１及びＲＢＳ２ドメインからなる非カノニカル二分ＲＮＡ結合部位を保有するＣ末端ドメインを有する主に細胞質性のタンパク質である。さら、Ｇｅｍｉｎ５は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ転写産物中に存在する７−メチルグアノシン（ｍ７Ｇ）キャップに結合し、内部リボソーム進入部位依存性翻訳を下方調節する。Ｇｅｍｉｎ５は、プラットフォームとして作用することによりリボソームへのその直接的結合を介して全タンパク質合成を制御し、区別されるＲＮＡ−タンパク質ネットワークのためのハブを提供し得る。以下の実施例は、隔離のためにＧＥＭＩＮ５に結合する環状ＲＮＡを記載する。
[0450] 環状ＲＮＡは、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）ＩＲＥＳ配列のドメイン５を含み、ＧＥＭＩＮ５を競合結合するように設計する。
[0451] ＧＥＭＩＮ５結合配列を含むＤＮＡセグメントからＴ７ＲＮＡポリメラーゼを使用するインビトロ転写により、非修飾線状ＲＮＡを合成する。転写されたＲＮＡをＲＮＡ精製系（ＱＩＡＧＥＮ）により精製し、アルカリホスファターゼ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＥＦ０６５２）により製造業者の説明書に従って処理し、ＲＮＡ精製系により再度精製する。
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ，Ｉｎｃ．、Ｍ０２０２Ｍ）又はＴ４ＲＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ，Ｉｎｃ．、Ｍ０２３９Ｓ）を使用する転写された線状ＲＮＡ及びＤＮＡスプリントの処理によりスプリントライゲーション環状ＲＮＡを生成し、環状ＲＮＡをＲＮアーゼＲ処理による濃縮後に単離する。ＲＮＡ品質は、アガロースゲルにより又は自動電気泳動（Ａｇｉｌｅｎｔ）を介して評価する。
[0452] ＧＥＭＩＮ５への環状ＲＮＡ結合を評価する１つの方法は、ＥＭＳＡ（ＲＮＡ電気泳動移動度シフトアッセイ）である。ＧＥＭＩＮ５が環状ＲＮＡに結合している場合、ゲル電気泳動の間の移動速度は、非結合環状ＲＮＡのものよりも緩慢である。さらに、環状ＲＮＡ特異的ｑＰＣＲと連結させた抗ＧＥＭＩＮ５抗体を使用するＲＩＰ（ＲＮＡ免疫沈降）を使用して細胞抽出物中の転写産物結合を判定し、ＧＥＭＩＮ５免疫蛍光と環状ＲＮＡ ＦＩＳＨとの組合せを使用して細胞中の同時局在化を判定する。環状ＲＮＡがＧＥＭＩＮ５を隔離し、翻訳を変更するか否かを評価するため、環状ＲＮＡをインビトロ翻訳アッセイに添加する。ＦＭＤＶ ＩＲＥＳを有するルシフェラーゼをコードする環状ＲＮＡの翻訳をＧＥＭＩＮ５タンパク質の存在下又は不存在下で、環状ＲＮＡを用いて又は用いずに測定する。ＧＥＭＩＮ５タンパク質により媒介された翻訳に対するＧＥＭＩＮ５隔離の効果は、発光リードアウトにより測定する。
実施例１９： ２つのタンパク質を結合させる環状ＲＮＡ
[0453] 本実施例は、２つのモデルタンパク質に同時に結合する環状ＲＮＡを記載する。
[0454] Ｅ３ユビキチンリガーゼ、ＭＤＭ２は、タンパク質、例えば、ｐ５３に結合し、それをユビキチン化し、それらをプロテアソームによる分解のためにマーキングする。以下の実施例は、図１６に説明されるとおり、ｐ５３のＭＤＭ２依存性ユビキチン化を向上させるためにＭＤＭ２及びｐ５３に同時に結合する環状ＲＮＡを記載する。
[0455] 環状ＲＮＡは、ＭＤＭ２及びｐ５３を結合させるＦＯＸ３ ＲＮＡの配列を含むように設計する。
[0456] 適切な配列を有するＤＮＡセグメントからＴ７ＲＮＡポリメラーゼを使用するインビトロ転写により、非修飾線状ＲＮＡを合成する。転写されたＲＮＡをＲＮＡ精製系（ＱＩＡＧＥＮ）により精製し、アルカリホスファターゼ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＥＦ０６５２）により製造業者の説明書に従って処理し、ＲＮＡ精製系により再度精製する。
[0457] Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ，Ｉｎｃ．、Ｍ０２０２Ｍ）又はＴ４ＲＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ，Ｉｎｃ．、Ｍ０２３９Ｓ）を使用する転写された線状ＲＮＡ及びＤＮＡスプリントの処理によりスプリントライゲーション環状ＲＮＡを生成し、環状ＲＮＡをＲＮアーゼＲ処理による濃縮後に単離する。ＲＮＡ品質は、アガロースゲルにより又は自動電気泳動（Ａｇｉｌｅｎｔ）を介して評価する。
[0458] ＭＤＭ２及びｐ５３への環状ＲＮＡ結合を評価する１つの方法は、それぞれのＲＮＡ−タンパク質複合体を可視化するための電気泳動移動度シフトアッセイによるもの、又は代替的に環状ＲＮＡの領域に相補的なビオチン化オリゴを使用する環状ＲＮＡのプルダウンとその後の免疫ブロッティングによるものである。さらに、環状ＲＮＡの結合を介するｐ５３のＭＤＭ２ユビキチン化は、抗ユビキチン抗体を用いる免疫ブロッティングを介して、又は質量分析によりアッセイする。
実施例２０： ＤＮＡ及びタンパク質を結合させる環状ＲＮＡ
[0459] 本実施例は、ＤＮＡ及びモデルタンパク質、ここではＣＢＰ／ｐ３００に同時に結合する環状ＲＮＡを記載する。
[0460] ＣＢＰ／ｐ３００タンパク質は、ｅＲＮＡとの相互作用を介してエンハンサー領域と会合する。ＣＢＰ／ｐ３００によるＲＮＡ結合は順次、ＣＢＰのヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）活性を向上させる。さらに、ＣＢＰ及びｐ３００は他のＨＡＴ並びに転写因子及び転写機構の構成成分と会合する。
[0461] 環状ＲＮＡは、ｅＭｄｍ２ ｅＲＮＡのＣＢＰ／ｐ３００結合領域及び標的ゲノム遺伝子座に相補的な領域を含むように設計する。
[0462] 適切な配列を有するＤＮＡセグメントからＴ７ＲＮＡポリメラーゼを使用するインビトロ転写により、非修飾線状ＲＮＡを合成する。転写されたＲＮＡをＲＮＡ精製系（ＱＩＡＧＥＮ）により精製し、アルカリホスファターゼ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＥＦ０６５２）により製造業者の説明書に従って処理し、ＲＮＡ精製系により再度精製する。
[0463] Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ，Ｉｎｃ．、Ｍ０２０２Ｍ）又はＴ４ＲＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ，Ｉｎｃ．、Ｍ０２３９Ｓ）を使用する転写された線状ＲＮＡ及びＤＮＡスプリントの処理によりスプリントライゲーション環状ＲＮＡを生成し、環状ＲＮＡをＲＮアーゼＲ処理による濃縮後に単離する。ＲＮＡ品質は、アガロースゲルにより又は自動電気泳動（Ａｇｉｌｅｎｔ）を介して評価する。
[0464] ＣＢＰ／ｐ３００及びＤＮＡへの環状ＲＮＡ結合を評価する１つの方法は、環状ＲＮＡの領域に相補的なビオチン化オリゴを使用する環状ＲＮＡのプルダウンとその後の免疫ブロット及びＰＣＲである。さらに、電気泳動移動度シフトアッセイを使用して環状ＲＮＡ−タンパク質−ＤＮＡ複合体を可視化する。抗Ｈ３Ｋ２７ａｃを用いるクロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）を実施して目的遺伝子座におけるヒストンアセチル化の変化を検出し、環状ＲＮＡ、ＣＢＰ、及び目的ゲノム領域間の結合を検出する。さらに、サイレントゲノム遺伝子座からの発現の向上をｑＰＣＲ、又はノザン／ウエスタンブロットを介してアッセイする。
実施例２１： ウイルスｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡを結合させる環状ＲＮＡ
[0465] 本実施例は、ウイルスｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡに同時に結合する環状ＲＮＡを記載する。
[0466] 単純ヘルペスウイルス−１型（ＨＳＶ−１）は、ウイルス転写を調節する複数のｍｉＲＮＡをコードする。ＨＳＶ−１−ｍｉＲ−Ｈ２７は、宿主転写調節因子Ｋｅｌｃｈ様２４（ＫＬＨＬ２４）のｍＲＮＡを結合させてウイルス最初期及び初期遺伝子の転写を誘導する。
[0467] 環状ＲＮＡは、ＨＳＶ−１ ｍｉＲ−Ｈ２７及びＫＬＨＬ２４に対する相補的配列を含むように設計する。
[0468] 適切な配列を有するＤＮＡセグメントからＴ７ＲＮＡポリメラーゼを使用するインビトロ転写により、非修飾線状ＲＮＡを合成する。転写されたＲＮＡをＲＮＡ精製系（ＱＩＡＧＥＮ）により精製し、アルカリホスファターゼ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＥＦ０６５２）により製造業者の説明書に従って処理し、ＲＮＡ精製系により再度精製する。
[0469] Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ，Ｉｎｃ．、Ｍ０２０２Ｍ）又はＴ４ＲＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ，Ｉｎｃ．、Ｍ０２３９Ｓ）を使用する転写された線状ＲＮＡ及びＤＮＡスプリントの処理によりスプリントライゲーション環状ＲＮＡを生成し、環状ＲＮＡをＲＮアーゼＲ処理による濃縮後に単離する。ＲＮＡ品質は、アガロースゲルにより又は自動電気泳動（Ａｇｉｌｅｎｔ）を介して評価する。
[0470] 両方の転写産物への環状ＲＮＡ結合を評価する１つの方法は、環状ＲＮＡの領域に相補的なビオチン化オリゴを使用する環状ＲＮＡのプルダウンとその後のＲＴ−ＰＣＲによるものである。さらに、電気泳動移動度シフトアッセイを使用して環状ＲＮＡ−ｍＲＮＡ−ｍｉＲＮＡ複合体を可視化することができる。
実施例２２： 脂質膜を結合させる環状ＲＮＡ
[0471] 本実施例は、脂質膜に結合する環状ＲＮＡを記載する。
[0472] 環状ＲＮＡは、脂質膜に特異的に結合するように設計することができる。以下の実施例は、膜に結合する環状ＲＮＡを記載する。細胞膜の結合を媒介することにより、環状ＲＮＡは、隣接細胞を互いに接近させ得る。
[0473] 環状ＲＮＡは、膜に結合するように設計される少なくとも１つのＲＮＡモチーフ（本明細書に記載の配列）を含むように設計する：
ＧＵＧＡＵＧＧＣＧＣＣＵＡＣＧＵＣＧＡＡＧＡＡＡＧＧＡＧＵＣＵＣＡＡＧＧＧＡＡＧＧＡＧＣＧＵＡＵＡＵＧＧＵＣＧＡＵＧＡＡＵＣＧＧＵＣＡＵＧＵＣＧＵＣＡＧＧＧＵ（配列番号１３）；
ＧＡＧＵＣＡＵＡＧＧＡＣＧＣＵＣＧＣＵＣＵＵＧＣＧＡＣＣＡＵＧＧＧＧＣＡＣＧＧＧＧＡＧＣＣＣＡＣＵＧＣＡＵＧＧＡＵＣＵ ＡＵＣＧＵＡＵ ＣＡＵＡＧＵＧＣＧＧＵ（配列番号１４）；
ＧＵＡＧＣＵＵＣＣＡＵＧＡＧＡＣＵＵＧＡＵＣＧＧＧＧＵＣＡＵＧＧＣＵＣＵＡＧＧＣＡＵＣＧＧＡＧＡＡＧＣＵＧＡＣＵＡＡＣＵ ＵＧＧＵＣＡＣＧＵＣＧＵＡＣＣＵＧＧＵ（配列番号１５）；
ＧＧＡＣＧＣＧＵＡＣＧＡＡＧＧＧＣＵＧＡＵＡＧＧＧＣＡＧＡＧＣＵＣＣＡＡＣＵＡＵＧＣＧＵＣＣＡＧＣＵＣＧＵＧＣＡＧＵＧＧＡＵＣＧＧＧＵＣＧＵＧＣＣＵＧＧＵ（配列番号１６）；及び
ＣＵＵＵＧＵＣＧＧＣＣＧＡＡＣＵＣＧＣＵＧＵＵＵＡＡＣＵＧＣＣＣＧＧＣＧＡＧＡＵＣＧＣＡＧＧＧＵＧＵＵＧＵＧＣＵＡＵＵ ＣＧＣＧＵＧＣＣＧＵＧＵＧ（配列番号１７）。
[0474] ＲＮＡ脂質結合モチーフの１つ以上を含むＤＮＡセグメントからＴ７ＲＮＡポリメラーゼを使用するインビトロ転写により、非修飾線状ＲＮＡを合成する。転写されたＲＮＡをＲＮＡ精製系（ＱＩＡＧＥＮ）により精製し、アルカリホスファターゼ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＥＦ０６５２）により製造業者の説明書に従って処理し、ＲＮＡ精製系により再度精製する。
[0475] Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ，Ｉｎｃ．、Ｍ０２０２Ｍ）を使用する転写された線状ＲＮＡ及びＤＮＡスプリントの処理によりスプリントライゲーション環状ＲＮＡを生成し、環状ＲＮＡをＲＮアーゼＲ処理による濃縮後に単離する。ＲＮＡ品質は、アガロースゲルにより又は自動電気泳動（Ａｇｉｌｅｎｔ）を介して評価する。
[0476] 脂質膜への環状ＲＮＡ結合を評価する１つの方法は、環状ＲＮＡとリポソームとのインキュベーションである。Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−１０００カラムを使用してリポソームを分別する。全ての非結合ＲＮＡを廃棄する。結合した環状ＲＮＡをｑＰＣＲ、又はノザンブロッティングを介して評価する。
実施例２３： ｓｉＲＮＡ送達のための環状ＲＮＡ
[0477] 本実施例は、いくつかのｓｉＲＮＡを送達する環状ＲＮＡを記載する。
[0478] モデル標的トランスサイレチン（ＴＴＲ）ｍＲＮＡに結合するｓｉＲＮＡ配列を含むように、非天然発生環状ＲＮＡを遺伝子操作する。以下の実施例は、トランスサイレチンタンパク質翻訳を阻害するために標的ＴＴＲ ｍＲＮＡに結合する環状ＲＮＡ由来ｓｉＲＮＡを記載する。
[0479] 環状ＲＮＡは、トランスサイレチンｍＲＮＡに結合するＴＴＲ ｍＲＮＡ（例えば、ａｕｇｇａａｕａｃｕ ｃｕｕｇｇｕｕａｃｔｔ）に相補的な配列を含み、このｍＲＮＡの開裂をもたらすように設計する。
[0480] ＴＴＲ相補的配列を有するＤＮＡセグメントからＴ７ＲＮＡポリメラーゼを使用するインビトロ転写により、非修飾線状ＲＮＡを合成する。転写されたＲＮＡをＲＮＡ精製系（ＱＩＡＧＥＮ）により精製し、アルカリホスファターゼ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＥＦ０６５２）により製造業者の説明書に従って処理し、ＲＮＡ精製系により再度精製する。
[0481] 環状ＲＮＡを生成するため、追加のフランキング相補的配列を用いて５’−リン酸及び３’−ＯＨを担持する２つのＲＮＡ末端を設計する。これらの相補的配列はハイブリダイズし、ニック化環状物をもたらす。このニックは、Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより閉鎖される。環状ＲＮＡ品質は、アガロース若しくはＰＡＧＥゲルにより、又は自動電気泳動（Ａｇｉｌｅｎｔ）を介して評価する。
[0482] ＴＴＲ ｍＲＮＡへの環状ＲＮＡ結合は、環状物内の特異的配列に相補的なビオチン化オリゴを使用する環状ＲＮＡのプルダウンとその後のＲＴ−ＰＣＲにより判定する。ｓｉＲＮＡ機能は、処理対非処理細胞においてＲＴ−ＰＣＲによりＴＴＲ標的ｍＲＮＡレベルを測定することにより判定する。ＴＴＲタンパク質の発現は、ウエスタンブロッティングにより判定する。
実施例２４： 修飾ヌクレオチドを有する環状ＲＮＡを生成し、それはタンパク質に選択的に結合した
[0483] 本実施例は、タンパク質結合を支持した修飾環状ポリリボヌクレオチドの生成を実証する。さらに、本実施例は、免疫系モニタリングに関与するタンパク質と選択的に相互作用したヌクレオチド修飾により遺伝子操作された環状ＲＮＡが、非修飾ＲＮＡと比較して低減した免疫原性を有したことを実証する。
[0484] 修飾ヌクレオチドの完全又は部分取り込みを含むように遺伝子操作された非天然発生環状ＲＮＡを産生した。以下の実施例に示されるとおり、全長修飾線状ＲＮＡ又は修飾及び非修飾線状ＲＮＡのハイブリッドを環状化させ、ｎＬｕｃ発現の測定を介してタンパク質足場形成を評価した。さらに、選択的修飾環状ＲＮＡは、非修飾環状ＲＮＡと比較してＢＪ細胞中で免疫関連遺伝子（ＭＤＡ５、ＯＡＳ及びＩＦＮ−β発現のｑＰＣＲ）を活性化させるタンパク質との低減した相互作用を有した。
[0485] ＷＴ ＥＭＣＶ Ｎｌｕｃ終止スペーサーを有する環状ＲＮＡを生成した。修飾置換のため、インビトロ転写反応の間に修飾ヌクレオチド、シュードウリジン及びメチルシトシン又はｍ６Ａを標準的非修飾ヌクレオチド、ウリジン及びシトシン又はアデノシンにそれぞれ代えて付加した。ＷＴ ＥＭＣＶ ＩＲＥＳは、ｎＬｕｃ ＯＲＦから別個に合成した。ＷＴ ＥＭＣＶ ＩＲＥＳは、修飾（完全修飾）又は非修飾ヌクレオチド（ハイブリッド修飾）のいずれかを使用して合成した。対照的に、ｎＬｕｃ ＯＲＦ配列は、インビトロ転写反応の間に配列全体について修飾ヌクレオチド、シュードウリジン及びメチルシトシン又はｍ６Ａを標準的非修飾ヌクレオチド、ウリジン及びシトシン又はアデノシンにそれぞれ代えて使用して合成した。修飾又は非修飾ＩＲＥＳ及び修飾ＯＲＦの合成後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを使用してこれら２つのオリゴヌクレオチドを一緒にライゲートした。図９Ａに示されるとおり、完全修飾（上段の構築物）又はハイブリッド修飾（下段の構築物）環状ＲＮＡを生成した。
[0486] タンパク質足場形成効率を測定するため、完全修飾又はハイブリッド修飾構築物からのｎＬｕｃの発現を測定した。０．１ｐｍｏｌの線状及び環状ＲＮＡをＢＪ線維芽細胞中に６時間形質移入した後、ｎＬｕｃ発現を形質移入の６時間、２４時間、４８時間及び７２時間後に測定した。
[0487] 図９Ｂ及び図９Ｃに示されるとおり、完全修飾環状ＲＮＡは、タンパク質翻訳アウトプットにより測定して、非修飾環状ＲＮＡと比較して大幅に低減したタンパク質結合能を有した。対照的に、ハイブリッド修飾は、タンパク質、例えば、タンパク質翻訳機構への同程度の又は増加した結合を実証した。
[0488] タンパク質足場形成効率をさらに測定するため、完全修飾環状ＲＮＡを細胞中に形質移入し、免疫タンパク質に対するタンパク質足場形成を測定した。自然免疫応答遺伝子を活性化させる免疫タンパク質に対するタンパク質足場形成のレベルを、非修飾環状ＲＮＡ、又はシュードウリジン及びメチルシトシン若しくはｍ６Ａ修飾のいずれかを有する完全修飾環状ＲＮＡにより形質移入されたＢＪ細胞においてモニタリングした。フェノールベース抽出試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して総ＲＮＡを細胞から単離し、逆転写に供してｃＤＮＡを生成した。色素ベース定量的ＰＣＲミックス（ＢｉｏＲａｄ）を使用して免疫関連遺伝子についてのｑＲＴ−ＰＣＲ分析を実施した。
[0489] 図１０Ａ〜Ｃに示されるとおり、完全修飾環状ＲＮＡ、シュードウリジン及びメチルシトシン両方又はｍ６Ａ完全修飾環状ＲＮＡにより形質移入されたＢＪ細胞からの免疫関連遺伝子のｑＲＴ−ＰＣＲレベルは、非修飾環状ＲＮＡ形質移入細胞と比較してＭＤＡ５、ＯＡＳ及びＩＦＮ−β発現の低減したレベルを示し、このことは、修飾環状ＲＮＡ及び免疫原性関連遺伝子を活性化させる免疫タンパク質間のタンパク質足場形成の低減を示した。したがって、環状ＲＮＡの修飾は、非修飾環状ＲＮＡと比較してタンパク質足場形成に対する影響を有した。選択的修飾はタンパク質翻訳機構の結合を可能とした一方、完全修飾は、形質移入レシピエント細胞中で免疫原性関連遺伝子を活性化させるタンパク質への結合を低減させた。
実施例２５： 修飾ヌクレオチドを有する環状ＲＮＡは免疫原性を低減させた
[0490] 本実施例は、タンパク質産物を産生した修飾環状ポリリボヌクレオチドの生成を実証する。さらに、本実施例は、ヌクレオチド修飾により遺伝子操作された環状ＲＮＡが非修飾ＲＮＡと比較して低減した免疫原性を有したことを実証する。
[0491] １つ以上の所望の特性を含むように遺伝子操作され、修飾ヌクレオチドの完全又は部分取り込みを有する非天然発生環状ＲＮＡを産生した。以下の実施例に示されるとおり、全長修飾線状ＲＮＡ又は修飾及び非修飾線状ＲＮＡのハイブリッドを環状化させ、ｎＬｕｃの発現を評価した。さらに、修飾環状ＲＮＡは、非修飾環状ＲＮＡと比較してＢＪ細胞中の免疫関連遺伝子（ＭＤＡ５、ＯＡＳ及びＩＦＮ−β発現のｑＰＣＲ）の低減した活性化を有することが示された。
[0492] ＷＴ ＥＭＣＶ Ｎｌｕｃ終止スペーサーを有する環状ＲＮＡを生成した。修飾置換のため、インビトロ転写反応の間に修飾ヌクレオチド、シュードウリジン及びメチルシトシン又はｍ６Ａを標準的非修飾ヌクレオチド、ウリジン及びシトシン又はアデノシンにそれぞれ代えて付加した。ＷＴ ＥＭＣＶ ＩＲＥＳは、ｎＬｕｃ ＯＲＦから別個に合成した。ＷＴ ＥＭＣＶ ＩＲＥＳは、修飾（完全修飾）又は非修飾ヌクレオチド（ハイブリッド修飾）のいずれかを使用して合成した。対照的に、ｎＬｕｃ ＯＲＦ配列は、インビトロ転写反応の間に配列全体について修飾ヌクレオチド、シュードウリジン及びメチルシトシン又はｍ６Ａを標準的非修飾ヌクレオチド、ウリジン及びシトシン又はアデノシンにそれぞれ代えて使用して合成した。修飾又は非修飾ＩＲＥＳ及び修飾ＯＲＦの合成後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを使用してこれら２つのオリゴヌクレオチドを一緒にライゲートした。図９に示されるとおり、ハイブリッド修飾環状ＲＮＡを生成した。
[0493] 発現効率を測定するため、ハイブリッド修飾環状ＲＮＡを細胞中に形質移入し、免疫タンパク質の発現を測定した。自然免疫応答遺伝子の発現レベルを、非修飾環状ＲＮＡ、又はシュードウリジン及びメチルシトシン若しくはｍ６Ａ修飾のいずれかを有するハイブリッド修飾環状ＲＮＡにより形質移入されたＢＪ細胞においてモニタリングした。フェノールベース抽出試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して総ＲＮＡを細胞から単離し、逆転写に供してｃＤＮＡを生成した。色素ベース定量的ＰＣＲミックス（ＢｉｏＲａｄ）を使用して免疫関連遺伝子についてのｑＲＴ−ＰＣＲ分析を実施した。
[0494] 図１１に示されるとおり、ハイブリッド修飾環状ＲＮＡ、シュードウリジン及びメチルシトシンハイブリッド修飾環状ＲＮＡにより形質移入されたＢＪ細胞からの免疫関連遺伝子のｑＲＴ−ＰＣＲレベルは、非修飾環状ＲＮＡ形質移入細胞と比較してＲＩＧ−Ｉ、ＭＤＡ５、ＩＦＮ−β及びＯＡＳ発現の低減したレベルを示し、このことは、免疫原性関連遺伝子を活性化させるこのハイブリッド修飾環状ＲＮＡの免疫原性の低減を示した。図２４に示される完全修飾環状ＲＮＡとは異なり、ｍ６Ａハイブリッド修飾環状ＲＮＡは、非修飾環状ＲＮＡ形質移入細胞と類似のＲＩＧ−Ｉ、ＭＤＡ５、ＩＦＮ−β及びＯＡＳ発現のレベルを示した。したがって、非修飾環状ＲＮＡと比較した環状ＲＮＡの修飾、及び修飾のレベルは、免疫原性関連遺伝子の活性化に対する影響を有した。
実施例２６： 環状ＲＮＡは小分子に結合した
[0495] 本実施例は、隔離／生物活性のために小分子を結合させる環状ＲＮＡを実証する。
[0496] 線状マンゴーＲＮＡアプタマーは、小分子、ＴＯ−１ビオチン色素により結合された場合に蛍光を発する。以下の実施例に示されるとおり、環状マンゴーＲＮＡは、隔離／生物活性のためにチアゾールオレンジ誘導体、ＴＯ−１ビオチンに結合する。
[0497] 環状ＲＮＡは、マンゴーＲＮＡ小分子結合アプタマー部位及び安定化ステム：５’−ＡＡＴＡＧＣＣＧ ＧＵＣＵＡＣＧＧＣＣ ＡＵＡＣＣＡＣＣＣＵ ＧＡＡＣＧＣＧＣＣＣ ＧＡＵＣＵＣＧＵＣＵ ＧＡＵＣＵＣＧＧＡＡＧＣＵＡＡＧＣＡＧＧ ＧＵＣＧＧＧＣＣＵＧ ＧＵＵＡＧＵＡＣＵＵ ＧＧＡＵＧＧＧＡＧＡ ＣＣＧＣＣＵＧＧＧＡＡＵＡＣＣＧＧＧＵＧ ＣＵＧＵＡＧＧＣＧＵ ＣＧＡＣＵＵＧＣＣＡ ＵＧＵＧＵＡＵＧＵＧ ＧＧＵＡＣＧＡＡＧＧＡＡＧＧＡＵＵＧＧＵ ＡＵＧＵＧＧＵＡＵＡ ＵＵＣＧＵＡＣＣＣＡ ＣＡＵＡＣＵＣＵＧＡ ＵＧＡＵＣＣＵＵＣＧ ＧＧＡＵＣＡＵＵＣＡ ＵＧＧＣＡＡ ＣＧＧＣＴＡＴＴ−３’（配列番号１８）、並びに環状化配列：５’−ＡＡＴＡＧＣＣＧ−３’（配列番号１９）及び５’−ＣＧＧＣＴＡＴＴ−３’（配列番号２０）を含むように設計した。
[0498] マンゴーＲＮＡモチーフ、ステム及び環状化配列を含むＤＮＡセグメントからＴ７ＲＮＡポリメラーゼを使用するインビトロ転写により、非修飾線状ＲＮＡを合成した。転写されたＲＮＡをＲＮＡクリーンアップキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｔ２０５０）により精製し、ＲＮＡ５’ホスホヒドロラーゼ（ＲｐｐＨ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０３５６）により製造業者の説明書に従って処理し、ＲＮＡ精製カラムにより再度精製した。環状化配列に相補的なスプリントＤＮＡ及びＴ４ＲＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０２３９）を使用してＲｐｐＨ処理ＲＮＡを環状化させた。環状ＲＮＡを尿素ＰＡＧＥ精製し、（０．５Ｍの酢酸ナトリウム、０．１％のＳＤＳ、１ｍＭのＥＤＴＡを含有する緩衝液中で溶出させ、エタノール沈殿させ、ＲＮアーゼフリー水中で再懸濁させた。ＲＮＡ品質は、尿素ＰＡＧＥにより又は自動電気泳動（Ａｇｉｌｅｎｔ）を介して評価する。
[0499] ＴＯ−１ビオチンへの環状ＲＮＡ結合は、インビトロで蛍光顕微鏡観察を使用してＢＪ線維芽細胞において判定した。ＴＯ−１ビオチンがＲＮＡに結合した場合、それはその蛍光を１００倍超、向上させた。線状又は環状アプタマー（５０ｎＭ）、及びＲＮＡなし対照をＢＪ線維芽細胞培養物の培地に添加した。形質移入試薬ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅを添加してＲＮＡ送達を確保した。培養物をＴＯ−１ビオチンにより処理し、蛍光を３及び６時間後に分析した。図１２に示されるとおり、増加した蛍光／安定性が３及び６時間の両方において環状アプタマーから検出された。
[0500] より効率的な送達及びより持続的な蛍光が、環状アプタマーについて観察された。
実施例２７： タンパク質を結合させた環状ＲＮＡ
[0501] 本実施例は、隔離のためにタンパク質に結合する環状ＲＮＡを実証する。
[0502] ヒト抗原受容体（ＨｕＲ）は、病原性タンパク質であり得、例えば、それは癌関連ｍＲＮＡ転写産物、例えば、癌原遺伝子、サイトカイン、成長因子、及び侵入因子についてのｍＲＮＡを結合させ、安定化させることが公知である。ＨｕＲは、複数の癌表現型を可能とすることにより中心的な腫瘍発生活性を有する。環状ＲＮＡによるＨｕＲの隔離は、複数の癌における腫瘍発生成長を減衰させ得る。以下の実施例に示されるとおり、環状ＲＮＡは、隔離のためにＨｕＲに結合し得る。
[0503] 環状ＲＮＡは、ＨｕＲを競合結合し、その結合／下流機能を阻害するためのＨｕＲ ＲＮＡ結合アプタマーモチーフ：５’−ＵＣＡＵＡＡＵＣＡＡ ＵＵＵＡＵＵＡＵＵＵＵＣＵＵＵＵＡＵＵＵＵＡ ＵＵＣＡＣＡＵＡＡＵＵＵＵＧＵＵＵＵＵ−３’（配列番号２１）、５’−ＡＵＵＵＵＧＵＵＵＵＵＡＡ ＣＡＵＵＵＣ−３’（配列番号２２）、５’−ＵＣＡＵＡＡＵＣＡＡＵＵＵＡＵＵＡＵＵＵＵＣＵＵＵＵＡＵＵＵＵＡＵＵＣＡＣＡＵＡＡＵＵＵＵＧＵＵＵ ＵＵＡＵＵＵＵＧＵＵＵＵＵＡＡＣＡＵＵＵＣ−３’（配列番号２３）を含むように設計した。
[0504] ＨｕＲ ＲＮＡモチーフ及びタンパク質結合配列を含むＤＮＡセグメントからＴ７ＲＮＡポリメラーゼを使用するインビトロ転写により、非修飾線状ＲＮＡを合成した。
[0505] 転写されたＲＮＡをＭｏｎａｒｃｈ ＲＮＡクリーンアップキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｔ２０５０）により精製し、ＲＮＡ５’−ホスホヒドロラーゼ（ＲｐｐＨ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０３５６）により製造業者の説明書に従って処理し、ＲＮＡ精製カラムにより再度精製した。環状化配列に相補的なスプリントＤＮＡ及びＴ４ＲＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０２３９）を使用してＲｐｐＨ処理ＲＮＡを環状化させた。環状ＲＮＡを尿素ＰＡＧＥ精製し、（０．５Ｍの酢酸ナトリウム、０．１％のＳＤＳ、１ｍＭのＥＤＴＡを含有する緩衝液中で溶出させ、エタノール沈殿させ、ＲＮアーゼフリー水中で再懸濁させた。ＲＮＡ品質は、尿素ＰＡＧＥにより又は自動電気泳動（Ａｇｉｌｅｎｔ）を介して評価した。
[0506] ＨｕＲへの環状ＲＮＡ結合は、インビトロでＨｕＲについてのＲＮＡ免疫沈降（ＲＩＰ）により判定した。ＨｕＲ ＲＮＡ結合モチーフを含有する環状ＲＮＡはＨｕＲタンパク質を結合させた一方、ＨｕＲ ＲＮＡ結合モチーフを欠く環状ＲＮＡはバックグラウンドを超える結合を示さなかった（図１３）。
[0507] この結果は、治療目的の生体分子へのｃｉｒｃＲＮＡの選択的結合を実証した。
実施例２８： 小分子を有する環状ＲＮＡはタンパク質を結合させた
[0508] 本実施例は、小分子に結合している環状ＲＮＡが選択タンパク質を結合させ、リクルートしたことを実証する。
[0509] サリドマイド、臨床承認薬（Ｔｈａｌｏｍｉｄ）は、細胞のタンパク質分解機構のメンバー、Ｅ３ユビキチンリガーゼを会合させることが公知である。サリドマイドを環状ＲＮＡに（例えば、クリック化学を介して）コンジュゲートさせることにより、サリドマイドコンジュゲート環状ＲＮＡは、細胞の分解機構を（例えば、環状ＲＮＡによっても標的化される）第２の疾患の原因となるタンパク質にリクルートし得る。以下の実施例に示されるとおり、小分子を環状ＲＮＡにコンジュゲートさせてＥ３ユビキチンリガーゼ、セレブロンを結合させた。
[0510] 環状ＲＮＡは、目的細胞内タンパク質と相互作用することが公知のアルキン官能化小分子のコンジュゲーションのための反応性ウリジン残基（例えば、５−アジド−Ｃ３−ＵＴＰ）を含むように設計した。
[0511] Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（Ｌｕｃｉｇｅｎ）を使用するインビトロ転写により、線状ＲＮＡを合成した。全てのＵＴＰをインビトロ転写反応において５−アジド−Ｃ３−ＵＴＰ（Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により置換してアジド官能化ＲＮＡを生成した。合成線状ＲＮＡをＲＮＡクリーンアップキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）により精製し、ＲＮＡ５’ピロホスホヒドロラーゼ（ＲｐｐＨ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）処理に供してピロリン酸を除去した。ＲｐｐＨ処理線状ＲＮＡを、ＲＮＡクリーンアップキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）により精製した。
[0512] 線状ＲＮＡをスプリントライゲーションにより生成した。ＲｐｐＨ処理線状ＲＮＡ（１００ｕＭ）及びスプリントＤＮＡ（２００ｕＭ）を、７５℃において５分間加熱し、室温において２０分間徐々に冷却することによりアニールした。ライゲーション反応は、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ２（０．２Ｕ／ｕｌ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）により３７℃において４時間実施した。ライゲートされた混合物をエタノール沈殿により精製した。環状ＲＮＡを単離するため、ライゲートされた混合物を４％の変性尿素ＰＡＧＥ上で分離した。ゲル上のＲＮＡをＳＹＢＲ−ｇｒｅｅｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）により染色し、トランスイルミネーター（Transilluminators）により可視化した。環状ＲＮＡについての対応するＲＮＡバンドを切断し、ゲルブレーカーチューブ（Ｉｓｔ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）により破砕した。環状ＲＮＡの溶出のため、環状ＲＮＡを有する破砕ゲルを溶出緩衝液（０．５Ｍの酢酸ナトリウム、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のＳＤＳ）と３７℃において１時間インキュベートし、上清を慎重に回収した。残りの破砕ゲル溶出物を別の溶出ラウンドに供し、合計３回繰り返した。環状ＲＮＡを有する溶出緩衝液を０．４５ｕｍ酢酸セルロースフィルターに通して濾過してゲルデブリを除去し、環状ＲＮＡをエタノール沈殿により精製／濃縮した。
[0513] アルキン官能化サリドマイド（Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を、アジド官能化環状ＲＮＡに製造業者の説明書（Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に基づくクリック化学反応キットによる銅触媒アジド−アルキンクリック化学反応（ＣｕＡＡＣ）を介してコンジュゲートさせた。サリドマイドコンジュゲート環状ＲＮＡを、ＲＮＡクリーンアップキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ）により精製した。
[0514] サリドマイドコンジュゲート環状ＲＮＡの結合特性をＧＳＴプルダウンを使用して分析し、次いでＲＮＡ検出のためにｑＰＣＲを行った。ＧＳＴプルダウンアッセイのため、サリドマイドコンジュゲート環状ＲＮＡ（２ｎＭ）を、サリドマイドと相互作用するＧＳＴ−Ｅ３ユビキチンリガーゼのセレブロン（５０ｎＭ）と、２５ｍＭのトリス−Ｃｌ（ｐＨ７．０）、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．５％のＮＰ−４０、５％のグリセロールの存在下で室温において２時間インキュベートした。サリドマイドコンジュゲーションなしのアジド官能化環状ＲＮＡを陰性対照として使用した。
[0515] ＲＮＡ−タンパク質混合物を、ＧＳＨアガロースビーズとさらに室温において１時間インキュベートしてＧＳＴ−ＧＳＨ相互作用を評価した。結合緩衝液により３回洗浄した後、ＧＳＨビーズに特異的に結合したＲＮＡをＴｒｉｚｏｌ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）により抽出した。抽出した環状ＲＮＡを逆転写させ、環状ＲＮＡに特異的なプライマー（フォワード：ＴＡＣＧＣＣＴＧＣＡＡＣＴＧＴＧＴＴＧＴ（配列番号２４）、リバース：ＴＣＧＡＴＧＡＴＣＴＴＧＴＣＧＴＣＧＴＣ（配列番号２５））を用いる定量的ＲＴ−ＰＣＲにより検出した。
[0516] 図１４は、サリドマイド小分子にコンジュゲートしている環状ＲＮＡがＧＳＴプルダウンアッセイにおいて高度に濃縮されたことを実証し、このことは、小分子を有する環状ＲＮＡが小分子を介して特異的タンパク質に結合したことを実証する。
実施例２９： 環状ＲＮＡは小分子を結合させた
[0517] 本実施例は、小分子に結合している環状ＲＮＡが二次タンパク質を特異的に結合したことを実証する。
[0518] 以下の実施例に示されるとおり、小分子を環状ＲＮＡにクリック反応させて二次タンパク質、例えば、Ｅ３ユビキチンリガーゼ及び標的を特異的に結合させるための足場を作出した。
[0519] 環状ＲＮＡは、任意の下流機能性のためのアルキン官能化又はアジド官能化小分子のコンジュゲーションのための反応性ウリジン残基（例えば、５−アジド−Ｃ３−ＵＴＰ又は５−エチル−ＵＴＰ）を含むように設計した。
[0520] Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（Ｌｕｃｉｇｅｎ）を使用するインビトロ転写により、線状ＲＮＡを合成した。全てのＵＴＰをインビトロ転写反応において５−アジド−Ｃ３−ＵＴＰ又は５−エチルＵＴＰ（Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により置換してアジド官能化又はアルキン官能化ＲＮＡをそれぞれ生成した。合成線状ＲＮＡをＲＮＡクリーンアップキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）により精製し、ＲＮＡ５’ピロホスホヒドロラーゼ（ＲｐｐＨ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）処理に供してピロリン酸を除去した。ＲｐｐＨ処理線状ＲＮＡをＲＮＡクリーンアップキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）により精製した。
[0521] 環状ＲＮＡをスプリントライゲーションにより生成した。ＲｐｐＨ処理線状ＲＮＡ（１００ｕＭ）及びスプリントＤＮＡ（２００ｕＭ）を、７５℃において５分間加熱し、室温において２０分間徐々に冷却することによりアニールした。ライゲーション反応は、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ２（０．２Ｕ／ｕｌ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）により３７℃において４時間実施した。ライゲートされた混合物をエタノール沈殿により精製した。
[0522] 環状ＲＮＡを単離するため、ライゲートされた混合物を６％の変性尿素ＰＡＧＥ上で分離した。ゲル上のＲＮＡをＳＹＢＲ−ｇｒｅｅｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）により染色し、トランスイルミネーター（Transilluminators）により可視化した。環状ＲＮＡについての対応するＲＮＡバンドを切断し、ゲルブレーカーチューブ（Ｉｓｔ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）により破砕した。環状ＲＮＡの溶出のため、環状ＲＮＡを有する破砕ゲルを溶出緩衝液（０．５Ｍの酢酸ナトリウム、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のＳＤＳ）と３７℃において１時間インキュベートし、上清を慎重に回収した。残りの破砕ゲル溶出物を別の溶出ラウンドに供し、合計３回繰り返した。環状ＲＮＡを有する溶出緩衝液を０．４５ｕｍ酢酸セルロースフィルターに通して濾過してゲルデブリを除去し、環状ＲＮＡをエタノール沈殿により精製／濃縮した。
[0523] アルキン官能化Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８色素又はアジド官能化Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８色素（Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を、アジド官能化環状ＲＮＡに製造業者の説明書（Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に基づくクリック化学反応キットによる銅触媒アジド−アルキンクリック化学反応（ＣｕＡＡＣ）を介してコンジュゲートさせた。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８色素コンジュゲート環状ＲＮＡを、ＲＮＡクリーンアップキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ）により精製した。
[0524] 色素コンジュゲーションは、環状ＲＮＡを６％の変性尿素ＰＡＧＥ上で分離することによりモニタリングした。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒｅ色素非コンジュゲート及びコンジュゲート環状ＲＮＡを比較のために並行してゲル上で分離した。ゲル上のＲＮＡからの蛍光を、ｉＢｒｉｇｈｔ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によりモニタリングした。蛍光をモニタリングした後、ゲルをＳＹＢＲ ｓａｆｅにより染色し、ゲル上のＲＮＡをｉＢｒｉｇｈｔ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により可視化した。
[0525] 小分子Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８を含有する環状ＲＮＡは、蛍光を発することが示され、このことは、環状ＲＮＡが機能的小分子を含有し得ることを実証した。
[0526] 図１５に説明されるとおり、サリドマイド小分子にコンジュゲートしている環状ＲＮＡは、蛍光により検出されるとおり区別されるＰＣＲ産物を産生し、このことは、小分子にコンジュゲートしている環状ＲＮＡが二次タンパク質と特異的に相互作用したことを実証した。
実施例３０： ２つの異なる小分子を結合させる環状ＲＮＡ
[0527] 本実施例は、小分子に結合している環状ＲＮＡによりリクルートされる２つの異なる選択タンパク質を記載する。
[0528] サリドマイド、臨床承認薬（Ｔｈａｌｏｍｉｄ）は、細胞のタンパク質分解機構のメンバー、Ｅ３ユビキチンリガーゼのセレブロンと会合することが公知である。サリドマイドを環状ＲＮＡに（例えば、クリック化学を介して）コンジュゲートさせることにより、サリドマイドコンジュゲート環状ＲＮＡは、細胞の分解機構を（例えば、環状ＲＮＡによっても標的化される）第２の疾患の原因となるタンパク質にリクルートし得る。以下の実施例に示されるとおり、２つの小分子（サリドマイド及びＪＱ１）を（１）隣接タンパク質のユビキチン化及び後続の分解のためにＥ３ユビキチンリガーゼのセレブロン、及び（２）ＢＥＴファミリータンパク質を結合させる小分子阻害剤であるＪＱ１を介してＢＥＴファミリータンパク質を結合させるために小分子を環状ＲＮＡにコンジュゲートさせる。
[0529] 環状ＲＮＡは、目的細胞内タンパク質と相互作用することが公知のアルキン官能化小分子のコンジュゲーションのための反応性ウリジン残基（例えば、５−アジド−Ｃ３−ＵＴＰ）を含むように設計する。
[0530] Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（Ｌｕｃｉｇｅｎ）を使用するインビトロ転写により、線状ＲＮＡを合成する。全てのＵＴＰをインビトロ転写反応において５−アジド−Ｃ３−ＵＴＰ（Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により置換してアジド官能化ＲＮＡを生成する。合成線状ＲＮＡをＲＮＡクリーンアップキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）により精製し、ＲＮＡ５’ピロホスホヒドロラーゼ（ＲｐｐＨ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）処理に供してピロリン酸を除去する。ＲｐｐＨ処理線状ＲＮＡをＲＮＡクリーンアップキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）により精製する。
[0531] 環状ＲＮＡをスプリントライゲーションにより生成する。ＲｐｐＨ処理線状ＲＮＡ（１００ｕＭ）及びスプリントＤＮＡ（２００ｕＭ）を、７５℃において５分間加熱し、室温において２０分間徐々に冷却することによりアニールする。ライゲーション反応は、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ２（０．２Ｕ／ｕｌ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）により３７℃において４時間実施する。ライゲートされた混合物をエタノール沈殿により精製する。環状ＲＮＡを単離するため、ライゲートされた混合物を４％の変性尿素ＰＡＧＥ上で分離する。ゲル上のＲＮＡをＳＹＢＲ−ｇｒｅｅｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）により染色し、トランスイルミネーター（Ｔｒａｎｓｉｌｌｕｍｉｎａｔｏｒｓ）により可視化する。環状ＲＮＡについての対応するＲＮＡバンドを切断し、ゲルブレーカーチューブ（Ｉｓｔ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）により破砕する。環状ＲＮＡの溶出のため、環状ＲＮＡを有する破砕ゲルを溶出緩衝液（０．５Ｍの酢酸ナトリウム、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のＳＤＳ）と３７℃において１時間インキュベートし、上清を慎重に回収する。残りの破砕ゲル溶出物を別の溶出ラウンドに供し、合計３回繰り返す。環状ＲＮＡを有する溶出緩衝液を０．４５ｕｍ酢酸セルロースフィルターに通して濾過してゲルデブリを除去し、環状ＲＮＡをエタノール沈殿により精製／濃縮する。
[0532] アルキン官能化サリドマイド及びアルキン官能化ＪＱ１（Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を、アジド官能化環状ＲＮＡに製造業者の説明書（Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に基づくクリック化学反応キットによる銅触媒アジド−アルキンクリック化学反応（ＣｕＡＡＣ）を介してコンジュゲートさせる。比較のため、３つの異なる種類の小分子コンジュゲート環状ＲＮＡを生成する：ＪＱ及びサリドマイドの両方、サリドマイドのみ、及びＪＱ１のみを有するＲＮＡ。小分子コンジュゲート環状ＲＮＡをＲＮＡクリーンアップキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ）により精製する。
[0533] Ｅ３ユビキチンリガーゼＣＲＢＮ及びＢＥＴファミリータンパク質への小分子コンジュゲート環状ＲＮＡ結合を、ＧＳＴプルダウンを使用して分析する。ＧＳＴ−ＣＲＢＮ（Ａｂｃａｍ）及びＢＥＴファミリータンパク質の１つ、ブロモドメイン含有タンパク質４（ＢＲＤ４、ＢＰＳＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）をこの実験に使用する。ＧＳＴプルダウンアッセイのため、サリドマイド及びＪＱ１コンジュゲート環状ＲＮＡ（２ｎＭ）を、ＧＳＴ−ＣＲＢＮ及びＢＲＤ４（それぞれ５０ｎＭ）と、２５ｍＭのトリス−Ｃｌ（ｐＨ７．０）、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．５％のＮＰ−４０、５％のグリセロールの存在下で室温において２時間インキュベートする。コンジュゲーションなしのアジド官能化環状ＲＮＡ、サリドマイドコンジュゲートＲＮＡ、及びＪＱ１コンジュゲートＲＮＡを陰性対照として使用する。ＲＮＡ−タンパク質混合物をＧＳＨアガロースビーズとさらにインキュベートして室温において１時間ＧＳＴ−ＧＳＨ相互作用させる。結合緩衝液により３回洗浄した後、ビーズを２つの等量部分に分離する。タンパク質結合をモニタリングするため、ビーズの一方の部分をＬａｍｍｌｉ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）の存在下で煮沸し、ＢＲＤ４抗体（ＢＲＤ４タンパク質検出用）及びＧＳＴ抗体（ＧＳＴ−ＣＲＢＮ検出用）を用いるウエスタンブロットに供する。ＲＮＡリクルートメントをモニタリングするため、ビーズ上のＲＮＡをＴｒｉｚｏｌ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）により抽出し、抽出した環状ＲＮＡを逆転写させ、ＲＮＡの環状形態に特異的なプライマー（フォワード：ＴＡＣＧＣＣＴＧＣＡＡＣＴＧＴＧＴＴＧＴ（配列番号２４）、リバース：ＴＣＧＡＴＧＡＴＣＴＴＧＴＣＧＴＣＧＴＣ（配列番号２５））を用いる定量的ＲＴ−ＰＣＲにより検出する。
[0534] サリドマイド及びＪＱ１小分子を含有する環状ＲＮＡは、ＧＳＴプルダウンにおいてＣＲＢＮ及びＢＥＴドメインタンパク質ＢＲＤ４の両方について高度に濃縮されることが予測され、このことは、環状ＲＮＡは小分子を含有し得るだけでなく、それはこの小分子コンジュゲートを使用して２つの特異的タンパク質に結合して選択タンパク質を分解し得ることを実証する。
実施例３１： 炭水化物を結合させる環状ＲＮＡ
[0535] 本実施例は、炭水化物に結合する環状ＲＮＡを記載する。
[0536] シアリルルイスＸは、膜タンパク質の四糖グリココンジュゲートである。これは、細胞接着の間にセレクチンタンパク質についてのリガンドとして作用する。以下の実施例に示されるとおり、環状ＲＮＡは、細胞接着を阻害するためにシアリルルイスＸに結合する。
[0537] 遺伝子操作環状ＲＮＡは、シアリルルイスＸ結合配列（例えば、５’−ＣＣＧＵＡＡＵＡＣＧＡＣＵＣＡＣＵＡＵＡＧＧＧＧＡＧＣＵＣＧＧＵＡＣＣＧＡＡＵＵＣＡＡＧＧＵＡＣＵＣＵＧＵＧＣＵＵＧＵＣＧＡＵＧＵＧＵＡＵＵＧＡＵＧＧＣＡＣＵＵＵＣＧＡＧＵＣＡＡＣＧＡＧＵＵＧＡＣＡＧＡＡＣＡＡＧＵＡＧＵＣＡＡＧＣＵＵＵＧＣＡＧＡＧＡＧＧＡＵＣＣＵＵ−３’（配列番号２６））を含むように設計する。
[0538] シアリルルイスＸ結合配列を含むＤＮＡセグメントからＴ７ＲＮＡポリメラーゼを使用するインビトロ転写により、非修飾線状ＲＮＡを合成する。転写されたＲＮＡをＲＮＡ精製系（ＱＩＡＧＥＮ）により精製し、アルカリホスファターゼ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＥＦ０６５２）により製造業者の説明書に従って処理し、ＲＮＡ精製系により再度精製する。Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ，Ｉｎｃ．、Ｍ０２０２Ｍ）又はＴ４ＲＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ，Ｉｎｃ．、Ｍ０２３９Ｓ）を使用する転写された線状ＲＮＡ及びＤＮＡスプリントの処理によりスプリントライゲーション環状ＲＮＡを生成し、環状ＲＮＡをＲＮアーゼＲ処理による濃縮後に単離する。ＲＮＡ品質は、アガロースゲルにより又は自動電気泳動（Ａｇｉｌｅｎｔ）を介して評価する。
[0539] シアリルルイスＸへの環状ＲＮＡ結合を評価する１つの方法は、シアリルルイスＸ媒介細胞接着を測定することである。Ｅ−セレクチンはシアリルルイスＸを認識し、前骨髄球性白血病細胞系ＨＬ６０の表面は、特にＴＮＦ−ａ処理後にシアリルルイスＸリッチである。組換え可溶性Ｅ−セレクチン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）をマイクロタイタープレート（２５０ｎｇ／ウェル）にｐＨ９．２の０．０５ＭのＮａＨＣＯ３（１０μｇ／ｍｌ）中で添加し、４℃において一晩インキュベートする。次いで、シアリルルイスＸ結合部位を有する又は有さない環状ＲＮＡ（１０μｇ／ｍＬ）をインキュベートする。ＴＮＦ−α活性化（１０ｎｇ／ｍｌ、２０時間）ＨＬ６０ヒト前骨髄球性白血病細胞をプレート上で室温において３０分間インキュベートし、洗浄し、接着細胞の数を測定する。
実施例３２： ウイルスを結合させる環状ＲＮＡ
[0540] 本実施例は、ウイルスに結合する環状ＲＮＡを記載する。
[0541] インフルエンザウイルスは、ヘマグルチニン（ＨＡ）及びノイラミニダーゼ（ＮＡ）を含む２つの膜糖タンパク質構成成分を有する。ＨＡ及びＮＡのそれぞれ約９００及び３００個のコピーが、それぞれのウイルス粒子の表面上で発現される。以下の実施例に示されるとおり、遺伝子操作環状ＲＮＡは、ウイルス結合のためにヘマグルチニンに結合するように設計する。
[0542] 環状ＲＮＡは、インフルエンザウイルスの表面に結合させるためのヘマグルチニン結合部位（例えば、５’−ＧＧＧＡＧＡＡＵＵＣＣＧＡＣＣＡＧＡＡＧＧＧＵＵＡＧＣＡＧＵＣＧＧＣＡＵＧＣＧＧＵＡＣＡＧＡＣＡＧＡＣＣＵＵＵＣＣＵＣＵＣＵＣＣＵＵＣＣＵＣＵＵＣＵ−３’（配列番号２７））を含むように設計する。
[0543] ヘマグルチニン結合配列を含むＤＮＡセグメントからＴ７ＲＮＡポリメラーゼを使用するインビトロ転写により、非修飾線状ＲＮＡを合成する。転写されたＲＮＡをＲＮＡ精製系（ＱＩＡＧＥＮ）により精製し、アルカリホスファターゼ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＥＦ０６５２）により製造業者の説明書に従って処理し、ＲＮＡ精製系により再度精製する。Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ，Ｉｎｃ．、Ｍ０２０２Ｍ）又はＴ４ＲＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ，Ｉｎｃ．、Ｍ０２３９Ｓ）を使用する転写された線状ＲＮＡ及びＤＮＡスプリントの処理によりスプリントライゲーション環状ＲＮＡを生成し、環状ＲＮＡをＲＮアーゼＲ処理による濃縮後に単離する。ＲＮＡ品質は、アガロースゲルにより又は自動電気泳動（Ａｇｉｌｅｎｔ）を介して評価する。
[0544] ヘマグルチニンへの環状ＲＮＡ結合を評価する１つの方法は、ＨＡ誘導膜融合に対するＲＮＡアプタマーの阻害効果である。ヘマグルチニンが環状ＲＮＡに結合している場合、膜融合は非結合環状ＲＮＡのものよりも低頻度で生じる。
[0545] ＨＡ誘導膜融合は、蛍光標識ウイルス及びヒト赤血球（ＲＢＣ）ゴースト膜を使用することにより試験する。Ａ／Ｐａｎａｍａ／２００７／１９９９（Ｈ３Ｎ２）のウイルス膜を蛍光脂質プローブ、オクタデシルローダミンＢ（Ｒ１８；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）により標識する。
[0546] 融合阻害アッセイのため、環状ＲＮＡ（０．５又は５ｍＭ）と混合したＨ３Ｎ２ウイルス（０．０５〜０．１ｍｇの総タンパク質／ｍｌ）を金属チャンバー中で載せたカバースリップ上のゴースト膜に添加する。ゴースト膜とのウイルス融合時、ウイルス及びゴースト膜間の脂質混合は、Ｒ１８の蛍光脱消光を誘導する。
実施例３３： 細胞を結合させる環状ＲＮＡ
[0547] 本実施例は、標的細胞タイプに結合する環状ＲＮＡを記載する。
[0548] 本実施例において、遺伝子操作環状ＲＮＡは、上記の方法の１つを介して設計する。環状ＲＮＡ及び線状ＲＮＡは、マンゴーアプタマー、安定化ステム、及び非コード領域：トランスフェリンアプタマー（例えば、ＧＧＧＧＧＡＵＣＡＡＵＣＣＡＡＧＧＧＡＣＣＣＧＧＡＡＡＣＧＣＵＣＣＣＵＵＡＣＡＣＣＣＣ（配列番号２８））を含むように設計する。このアプタマー領域はトランスフェリン受容体を結合させ、その受容体を発現する細胞にＲＮＡを結合させる。トランスフェリン受容体は、種々の細胞タイプ、例として、赤血球及び一部の癌細胞上で発現される。陰性対照として、ＲＮＡはアプタマー領域を含まないように設計する。
[0549] ＨｅＬａ細胞は、トランスフェリン受容体を発現することが公知の子宮頸癌細胞である。ＨｅＬａ細胞を標準的条件（１０％のＦＢＳを有するＤＭＥＭ中、３７℃において５％のＣＯ２下）下で成長させる。細胞を定期的に継代して指数的成長を維持する。ＴＯ−１ビオチンへの環状ＲＮＡ結合は、インビトロでＨｅＬａ細胞において蛍光顕微鏡観察を使用して判定する。ＴＯ−１ビオチンがＲＮＡに結合している場合、それはその蛍光を１００倍超、向上させる。アプタマーを有する又は有さない環状ＲＮＡ（５０ｎＭ）、及びＲＮＡなし対照をＨｅＬａ培養物の培地に添加する。脂質ベース形質移入試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加してＲＮＡ送達を確保する。培養物をＴＯ−１ビオチンにより処理し、蛍光を３及び６時間後に分析する。
実施例３４： アプタマーを結合させる環状ＲＮＡ
[0550] 本実施例は、アプタマーに結合する環状ＲＮＡを記載する。
[0551] 遺伝子操作環状ＲＮＡは、ＲＮＡアプタマーのための１つ以上の新規結合配列を含むように設計する。ＲＮＡアプタマーは、相補性を介して環状ＲＮＡ結合のために標的化される。以下の実施例に示されるとおり、環状ＲＮＡは、隔離のためにＬＩＮ２８Ａ結合アプタマー配列に相補的に結合する。
[0552] 環状ＲＮＡは、ＬＩＮ２８Ａ結合アプタマー配列５’−ＧＧＧＧＵＡＧＵＧＡＵＵＵＵＡＣＣＣＵＧＧＡＧＡＵ−３’（配列番号１２）に対する相補的配列を含むように設計する。
[0553] 相補的ＬＩＮ２８Ａ結合アプタマー配列を有するＤＮＡセグメントからＴ７ＲＮＡポリメラーゼを使用するインビトロ転写により、非修飾線状ＲＮＡを合成する。転写されたＲＮＡをＲＮＡ精製系（ＱＩＡＧＥＮ）により精製し、アルカリホスファターゼ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＥＦ０６５２）により製造業者の説明書に従って処理し、ＲＮＡ精製系により再度精製する。
[0554] Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ，Ｉｎｃ．、Ｍ０２０２Ｍ）又はＴ４ＲＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ，Ｉｎｃ．、Ｍ０２３９Ｓ）を使用する転写された線状ＲＮＡ及びＤＮＡスプリントの処理によりスプリントライゲーション環状ＲＮＡを生成し、環状ＲＮＡをＲＮアーゼＲ処理による濃縮後に単離する。ＲＮＡ品質は、アガロースゲルにより又は自動電気泳動（Ａｇｉｌｅｎｔ）を介して評価する。
[0555] ＬＩＮ２８Ａ結合アプタマーへの環状ＲＮＡ結合は、環状ＲＮＡに相補的な修飾オリゴヌクレオチドを使用してＬＩＮ２８Ａ結合アプタマーをプルダウンし、それを逆転写させ、ｑＰＣＲ増幅させるオリゴヌクレオチドプルダウンｑＰＣＲアッセイにより判定する。
実施例３５： 環状ＲＮＡは転写因子を結合させた
[0556] 本実施例は、隔離のためにタンパク質に結合した環状ＲＮＡを実証する。ＮＦ−ｋＢは、転写を活性化させ、生存経路を誘導する転写因子のファミリーである。以下の実施例に示されるとおり、環状ＲＮＡは、隔離のためにＮＦ−ｋＢに結合した。
[0557] 環状ＲＮＡは、ＮＦ−ｋＢを競合結合させ、その結合／下流機能を阻害するためにＮＦ−ｋＢ ＲＮＡ結合アプタマーモチーフ：５’−ａａａａａａａａａａＧＡＴＣＴＴＧＡＡＡＣＴＧＴＴＴＴＡＡＧＧＴＴＧＧＣＣＧＡＴＣＴＴａａａａａａ−３’（配列番号２９）を含むように設計した。ポリ（Ａ）ストレッチを内部結合モチーフに付加して（１）ライゲーションに適切なＲＮＡオリゴを作製し、アプタマーの二次構造を維持した。正確なフォールディングは、ＲＮＡｆｏｌｄ ＷｅｂＳｅｒｖｅｒを使用して確認した。対照として、スクランブル化ＲＮＡ配列を使用した（ａａａａａａａＴＴＣＴＣＣＧＡＡＣＧＴＧＴＣＡＣＧＴＴＴＣＡＡＧＡＧＡＡＣＧＴＧＡＣＡＣＧＴＴＣＧＧＡＧＡＡａａａａａａ（配列番号３０））。このスクランブル化ＲＮＡ配列は、Mi et al., Mol Ther. 2008 Jan; 16(1): 66-73に記載のとおりアプタマーと類似の３Ｄ構造にフォールドするが、いかなるタンパク質も標的化しない。
[0558] 市販の販売業者（ＩＤＴ）により５’一リン酸基及び３’ヒドロキシル基を用いてＮＦ−ｋＢ結合アプタマーモチーフを有するＲＮＡを合成した。ＲＮＡリガーゼ１（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０２０４Ｓ）を使用してＲＮＡオリゴをライゲートした。ＲＮアーゼＲを製造業者の説明書（Ｌｕｃｉｇｅｎ、ＲＮＲ０７２５０）に従って使用して残留線状ＲＮＡを試料から除去した。さらに、１５％の尿素ＰＡＧＥゲルから環状ＲＮＡを抽出することにより環状ｍＲＮＡを精製した。環状ＲＮＡをゲルから０．５Ｍの酢酸ナトリウム、０．１％のＳＤＳ、１ｍＭのＥＤＴＡを含有する緩衝液中で溶出させた。溶出物をスピンカラム（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｔ２０３０Ｓ）に通してランさせることにより、ゲル抽出からの残留ゲルデブリ又は塩を除去した。ＲＮＡをＲＮＡ貯蔵緩衝液（１ｍＭのクエン酸ナトリウム、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、ＡＭ７０００）中に溶出させ、ＲＮＡ品質を尿素ＰＡＧＥにより又は自動ゲルキャピラリー電気泳動（Ａｇｉｌｅｎｔ）を介して評価した。
[0559] 電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）を実施してＮＦ−ｋＢに対する環状ＲＮＡ結合親和性を評価した。１ｐモルの線状又は環状ＲＮＡを、ＲＮＡ濃度に対して変動濃度（すなわち、０、０．１、１、１０ｐモルのタンパク質）における組換えＮＦ−ｋＢ ｐ５０サブユニット（Ｃａｙｍｅｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、１０００９８１８）と、緩衝化反応物（２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２）中で室温において２０分間インキュベートした。試料を６％のＴＢＥ尿素ゲルに２００Ｖにおいて２５分間ランさせた。ゲルをＳｙｂｒＧｏｌｄ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓ１１４９４）により染色し、青色Ｅ−ゲルイメージングシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、４４６６６１２）によりイメージングした。
[0560] 図１７に実証されるとおり、スクランブル化結合アプタマー配列を有するＲＮＡは、ＮＦ−ｋＢのｐ５０サブユニットに対する結合親和性を示さなかった。ＮＦ−ｋＢ結合アプタマー配列の線状及び環状バージョンの両方が、ｐ５０サブユニットに類似の親和性で結合した。
[0561] ＮＦ−ｋＢへの環状ＲＮＡ結合は、インビトロでＮＦ−ｋＢについてのＥＭＳＡにより判定した。ＮＦ−ｋＢは、ＮＦ−ｋＢ ＲＮＡ結合アプタマーモチーフを含有する環状ＲＮＡを選択的に結合させた。この結果は、目的生体分子が環状ＲＮＡ中の配列により選択的に結合されることを実証した。
実施例３６： 環状ＲＮＡは標的タンパク質を隔離し、機能を阻害した
[0562] 本実施例は、環状ＲＮＡが細胞中でタンパク質に結合し、この隔離は機能の阻害をもたらすことを実証する。以下の実施例に示されるとおり、環状ＲＮＡは隔離のためにＮＦ−ｋＢに結合し、細胞中でＮＦ−ｋＢにより活性される生存の阻害をもたらす。
[0563] 環状、線状、及び線状スクランブル化ＲＮＡを上記のとおり設計し、合成した。
[0564] 非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）細胞系Ａ５４９におけるＮＦ−ｋＢ機能を、ＮＦ−ｋＢ結合アプタマー配列を有する環状ＲＮＡの送達後に、ＭＴＴアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｖ１３１５４）により細胞生存率を測定することにより決定した。簡潔に述べると、Ａ５４９細胞を１ｐモルの線状、線状スクランブル化、又は環状ＲＮＡにより脂質形質移入試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＬＭＲＮＡ００３）との複合体化後に形質移入した。生存率は、製造業者の説明書に従って実施されるＭＴＴアッセイにより測定した。
[0565] 図１８に実証されるとおり、線状ＲＮＡにより処理された細胞は、１日目における生存率の変化を実証せず、２日目における生存率のわずかな減少を実証した（１日目における１０１％の生存率、及び２日目における９７％）。対照的に、環状ＲＮＡにより処理された細胞は、１日目における生存率の測定可能な減少及び２日目までのより大きい増加を実証した（１日目における８９％及び２日目における８６％）。
[0566] まとめると、結果は、環状ＲＮＡが細胞中でＮＦ−ｋＢを結合させ、生存経路のＮＦ−ｋＢ活性化を阻害することを実証した。
実施例３７： 環状ＲＮＡはタンパク質を結合させ、隔離して化学療法薬感作に影響を与えた
[0567] 本実施例は、環状ＲＮＡが細胞中で標的タンパク質に結合し、標的タンパク質のシグナリング経路の阻害をもたらすことを実証する。以下の実施例に示されるとおり、環状ＲＮＡは化学療法抵抗性細胞中でＮＦ−ｋＢを隔離し、ＮＦ−ｋＢのシグナリングを阻害し、それにより化学療法薬に対して細胞を再感作させた。
[0568] 線状、線状スクランブル化、及び環状ＲＮＡを上記のとおり設計し、合成した。
[0569] 化学療法抵抗性非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）細胞系Ａ５４９におけるＮＦ−ｋＢ隔離の効果を、ＮＦ−ｋＢを標的化する環状ＲＮＡの送達及び化学療法剤への曝露後に決定した。細胞生存率をＭＴＴアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｖ１３１５４）により測定した。簡潔に述べると、Ａ５４９細胞を１ｐモルのスクランブル化線状対照、線状、又は環状ＲＮＡにより脂質形質移入試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＬＭＲＮＡ００３）との複合体化後に形質移入した。形質移入の２４時間後の細胞を、５ｕＭのドキソルビシンによりさらに１８時間処理した。生存率を、製造業者の説明書に従って実施されるＭＴＴアッセイにより測定した。ドキソルビシン処理を形質移入の４８及び７２時間後に繰り返した。
[0570] 図１９に実証されるとおり、スクランブル化線状ＲＮＡ（対照）によるドキソルビシン処理は、１日目におけるｄｏｘ抵抗性Ａ５４９肺癌細胞系における細胞生存率に影響を与えなかった。ドキソルビシンと線状ＲＮＡとの同時処理は、２日目における細胞生存率を減少させた（７８％の生存率）。対照的に、環状アプタマーとの同時処理は、１及び２日目の両方においてより多い細胞死をもたらした（１日目における７９％の生存率及び２日目における７３％の生存率）。
[0571] まとめると、結果は、環状ＲＮＡが細胞中でＮＦ−ｋＢを結合させ、ＮＦ−ｋＢ生存シグナリングを阻害し、それにより化学療法薬、ドキソルビシンに対する細胞の感受性を増加させることを実証した。
実施例３８： 環状ＲＮＡは分解のために標的タンパク質をタグ化した
[0572] 本実施例は、小分子に結合している環状ＲＮＡが２つの異なる選択タンパク質をリクルートし、それにより分解のために標的タンパク質をタグ化したことを実証する。
[0573] サリドマイド、臨床承認薬（Ｒｅｖｌｉｍｉｄ）は、細胞のタンパク質分解機構のメンバー、Ｅ３ユビキチンリガーゼと会合することが公知である。サリドマイドを環状ＲＮＡに（例えば、クリック化学を介して）コンジュゲートさせることにより、サリドマイドコンジュゲート環状ＲＮＡは、細胞の分解機構を（例えば、環状ＲＮＡによっても標的化される）第２の疾患惹起タンパク質にリクルートし得る。図２０は、細胞中に送達され、ユビキチン系による分解のために細胞中で標的ＢＲＤ４タンパク質をタグ化する例示的環状ＲＮＡを示す模式図である。以下の実施例に示されるとおり、２つの小分子（サリドマイド及びＪＱ１）を（１）隣接タンパク質のユビキチン化及び後続の分解のためにＥ３ユビキチンリガーゼのセレブロン、及び（２）ＢＥＴファミリータンパク質を結合させる小分子阻害剤であるＪＱ１を介してＢＥＴファミリータンパク質を結合させるために小分子を環状ＲＮＡにコンジュゲートさせた。
[0574] 環状ＲＮＡは、目的細胞内タンパク質と相互作用することが公知のアルキン官能化小分子のコンジュゲーションのための複数の（４９残基）反応性ウリジン残基（例えば、５−アジド−Ｃ３−ＵＴＰ）を含むように設計した。
[0575] Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（Ｌｕｃｉｇｅｎ）を使用するインビトロ転写により、線状ＲＮＡを合成した。全てのＵＴＰをインビトロ転写反応において５−アジド−Ｃ３−ＵＴＰ（Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により置換してアジド官能化ＲＮＡを生成した。合成線状ＲＮＡをＲＮＡクリーンアップキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）により精製し、ＲＮＡ５’ピロホスホヒドロラーゼ（ＲｐｐＨ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）処理に供してピロリン酸を除去した。ＲｐｐＨ処理線状ＲＮＡをＲＮＡクリーンアップキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）により精製した。
[0576] 環状ＲＮＡをスプリントライゲーションにより生成した。ＲｐｐＨ処理線状ＲＮＡ（１００ｕＭ）及びスプリントＤＮＡ（２００ｕＭ）を、７５℃において５分間加熱し、室温において２０分間徐々に冷却することによりアニールした。ライゲーション反応は、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ２（０．２Ｕ／ｕｌ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）により３７℃において４時間実施した。ライゲートされた混合物をエタノール沈殿により精製した。環状ＲＮＡを単離するため、ライゲートされた混合物を４％の変性尿素ＰＡＧＥ上で分離した。ゲル上のＲＮＡをＳＹＢＲ−ｇｒｅｅｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）により染色し、トランスイルミネーター（Transilluminators）により可視化した。環状ＲＮＡについての対応するＲＮＡバンドを切断し、ゲルブレーカーチューブ（Ｉｓｔ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）により破砕した。環状ＲＮＡの溶出のため、環状ＲＮＡを有する破砕ゲルを溶出緩衝液（０．５Ｍの酢酸ナトリウム、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のＳＤＳ）と３７℃において１時間インキュベートし、上清を慎重に回収した。残りの破砕ゲルを別の溶出ラウンドに供し、合計３回繰り返した。環状ＲＮＡを有する溶出緩衝液を０．４５μｍ酢酸セルロースフィルターに通して濾過してゲルデブリを除去し、環状ＲＮＡをエタノール沈殿により精製／濃縮した。
[0577] アルキン官能化サリドマイド及び／又はＪＱ１（チエノトリアゾロジアゼピン、Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を、アジド官能化環状ＲＮＡに製造業者の説明書（Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に基づくクリック化学反応キットによる銅触媒アジド−アルキンクリック化学反応（ＣｕＡＡＣ）を介してコンジュゲートさせた。比較のため、３つの異なる種類の小分子を環状ＲＮＡ：ＪＱ及びサリドマイドの両方、サリドマイドのみ、及びＪＱ１のみを有するＲＮＡにコンジュゲートさせた。小分子コンジュゲート環状ＲＮＡをＲＮＡクリーンアップキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ）により精製した。
[0578] 次いで、脂質形質移入試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造業者の説明書に従って使用することにより、これらの異なるＲＮＡをＨＥＫ２９３Ｔ細胞中に形質移入して標的タンパク質の分解をモニタリングした。１ｐモルのそれぞれのＲＮＡを使用してＨＥＫ２９３Ｔ細胞を形質移入し、細胞を１２ウェルプレート中にプレーティングした（最終２ｎＭ）。ＪＱ１及びサリドマイドの両方にコンジュゲートさせた環状ＲＮＡの場合、３ｐモルのＲＮＡをＨＥＫ２９３Ｔ細胞中に形質移入してＢＲＤ４分解に対する異なる濃度の環状ＲＮＡの効果を検査した（最終６ｎＭ）。陽性対照として、ＪＱ１及びサリドマイドの両方を有し、ＣＲＢＮリクルートメントを介して細胞中でＢＲＤ４タンパク質を分解することが公知のＰＲＯＴＡＣ ｄＢＥＴ１（Ｔｏｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用した（２ｕＭ、１０ｕＭの濃度）。陰性対照については、担体のみ及びコンジュゲーションなしの環状ＲＮＡを使用した。２４時間の形質移入後、プレート上にＲＩＰＡ緩衝液を直接添加することにより細胞を回収した。
[0579] Ｅ３ユビキチンリガーゼＣＲＢＮへの小分子コンジュゲート環状ＲＮＡ結合及びＢＥＴファミリータンパク質分解能は、ウエスタンブロットを使用して分析した。簡潔に述べると、１２ｕｇのタンパク質を４％〜１２％の勾配ビス・トリスゲル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上で分解し、ブロット転写システム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してニトロセルロース膜に転写した。ウサギ抗ＢＲＤ４抗体（Ａｂｃａｍ）を使用してＢＲＤ４タンパク質を検出し、ウサギ抗αチューブリン抗体（Ａｂｃａｍ）を使用してローディング対照としてαチューブリンを検出した。ＢＲＤ４及びαチューブリンのタンパク質バンドからの化学発光シグナルを、Ｆｃイメージングシステム（ＬＩ−ＣＯＲ）によりモニタリングした。
[0580] ＢＲＤ４タンパク質レベル及びローディング対照としてのαチューブリンは、ＩｍａｇｅＪを使用するデンシメトリーも使用して測定した。
[0581] 図２１に示されるとおり、サリドマイド及びＪＱ１小分子を含有する環状ＲＮＡは、ＢＲＤ４の正規化レベルにより実証されるとおりＢＲＤ４を分解し得た。この結果は、小分子を有する環状ＲＮＡが小分子コンジュゲートを使用して２つの特異的タンパク質に結合して標的タンパク質を分解することを実証した。
実施例３９： 環状ＲＮＡはその線状対応物よりも長く小分子を結合させた
[0582] 本実施例は、隔離／生物活性のために小分子を結合させる環状ＲＮＡを実施する。以下の実施例に示されるとおり、環状ＲＮＡは、その線状対応物よりも安定的である。
[0583] 線状マンゴーＲＮＡアプタマーは、小分子、ＴＯ−１ビオチン色素により結合されている場合、蛍光を発する。以下の実施例に示されるとおり、環状マンゴーＲＮＡは、隔離／生物活性のためにチアゾールオレンジ誘導体、ＴＯ−１ビオチンに結合した。
[0584] 環状ＲＮＡは、マンゴーＲＮＡ小分子結合部位及び安定化ステム：５’−ＡＡＴＡＧＣＣＧ ＧＵＣＵＡＣＧＧＣＣ ＡＵＡＣＣＡＣＣＣＵ ＧＡＡＣＧＣＧＣＣＣ ＧＡＵＣＵＣＧＵＣＵ ＧＡＵＣＵＣＧＧＡＡＧＣＵＡＡＧＣＡＧＧ ＧＵＣＧＧＧＣＣＵＧ ＧＵＵＡＧＵＡＣＵＵ ＧＧＡＵＧＧＧＡＧＡ ＣＣＧＣＣＵＧＧＧＡＡＵＡＣＣＧＧＧＵＧ ＣＵＧＵＡＧＧＣＧＵ ＣＧＡＣＵＵＧＣＣＡ ＵＧＵＧＵＡＵＧＵＧ ＧＧＵＡＣＧＡＡＧＧＡＡＧＧＡＵＵＧＧＵ ＡＵＧＵＧＧＵＡＵＡ ＵＵＣＧＵＡＣＣＣＡ ＣＡＵＡＣＵＣＵＧＡ ＵＧＡＵＣＣＵＵＣＧ ＧＧＡＵＣＡＵＵＣＡ ＵＧＧＣＡＡ ＣＧＧＣＴＡＴＴ−３’（配列番号１８）、並びに環状化配列５’−ＡＡＴＡＧＣＣＧ−３’（配列番号１９）及び５’−ＣＧＧＣＴＡＴＴ−３’（配列番号２０）を含むように設計した。
[0585] マンゴーＲＮＡモチーフ、ステム及び環状化配列を含むＤＮＡセグメントからＴ７ＲＮＡポリメラーゼを使用するインビトロ転写により、非修飾線状ＲＮＡを合成した。転写されたＲＮＡをＲＮＡクリーンアップキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｔ２０５０）により精製し、ＲＮＡ５’−ホスホヒドロラーゼ（ＲｐｐＨ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０３５６）により製造業者の説明書に従って処理し、ＲＮＡ精製カラムにより再度精製した。環状化配列に相補的なスプリントＤＮＡ及びＴ４ＲＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０２３９）を使用してＲｐｐＨ処理ＲＮＡを環状化させた。環状ＲＮＡを尿素ＰＡＧＥ精製し、（０．５Ｍの酢酸ナトリウム、０．１％のＳＤＳ、１ｍＭのＥＤＴＡを含有する緩衝液中で溶出させ、エタノール沈殿させ、ＲＮアーゼフリー水中で再懸濁させた。ＲＮＡ品質は、尿素ＰＡＧＥにより又は自動電気泳動（Ａｇｉｌｅｎｔ）を介して評価した。
[0586] ＴＯ−１ビオチンへの環状ＲＮＡ結合は、インビトロで蛍光顕微鏡観察を使用してＨｅＬａ細胞において判定した。ＴＯ−１ビオチンがＲＮＡに結合した場合、それはその蛍光を１００倍超、向上させた。線状又は環状アプタマー（５０ｎＭ）、及びＲＮＡなし対照をＢＪ線維芽細胞培養物の培地に添加した。形質移入試薬ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅを添加してＲＮＡ送達を確保した。培養物をＴＯ−１ビオチンにより処理し、蛍光を６時間及び１〜１２日目に分析した。図２２に示されるとおり、増加した蛍光／安定性が環状アプタマーから検出され、培養物中で少なくとも１０日間、蛍光が検出された。
実施例４０： 環状ＲＮＡはタンパク質及びＲＮＡを結合させた
[0587] 本実施例は、隔離のためにタンパク質及びＲＮＡに結合する環状ＲＮＡを実証する。
[0588] ヒト抗原受容体（ＨｕＲ）は、病原性タンパク質であり得、例えば、それは癌関連ｍＲＮＡ転写産物、例えば、癌原遺伝子、サイトカイン、成長因子、及び侵入因子についてのｍＲＮＡを結合させ、安定化させることが公知である。ＨｕＲは、複数の癌表現型を可能とすることにより中心的な腫瘍発生活性を有する。環状ＲＮＡによるＨｕＲの隔離は、複数の癌における腫瘍発生成長を減衰させ得る。
[0589] ＲＮＡは細胞代謝において重要な役割を担い、ＲＮＡ分子は複数の転写後プロセス、例えば、スプライシング、編集、修飾、翻訳、及び分解を受ける。
[0590] 以下の実施例に示されるとおり、環状ＲＮＡは、隔離のためにＨｕＲ及びＲＮＡに結合する。
[0591] 環状ＲＮＡは、ＨｕＲを競合結合させ、その結合／下流機能を阻害するためのＨｕＲ ＲＮＡ結合アプタマーモチーフ：５’−ＵＣＡＵＡＡＵＣＡＡ ＵＵＵＡＵＵＡＵＵＵＵＣＵＵＵＵＡＵＵＵＵＡＵＵＣＡＣＡＵＡＡＵＵＵＵＧＵＵＵＵＵ−３’（配列番号３１）及びＲＮＡ結合モチーフ：５’−ＣＧＡ ＧＡＣ ＧＣＴ ＡＣＧ ＧＡＣ ＴＴＡ ＡＡＡ ＴＣＣ ＧＴＴ ＧＡＣ−３’（配列番号３２）を含むように設計した。
[0592] ＨｕＲ ＲＮＡモチーフ及びタンパク質結合配列を含むＤＮＡセグメントからＴ７ＲＮＡポリメラーゼを使用するインビトロ転写により、非修飾線状ＲＮＡを合成した。
[0593] 環状ＲＮＡは、ＨｕＲを競合結合させ、その結合／下流機能を阻害するためのＨｕＲ ＲＮＡ結合アプタマーモチーフ：５’−ＵＣＡＵＡＡＵＣＡＡ ＵＵＵＡＵＵＡＵＵＵＵＣＵＵＵＵＡＵＵＵＵＡＵＵＣＡＣＡＵＡＡＵＵＵＵＧＵＵＵＵＵ−３’（配列番号３１）及びＲＮＡ結合アプタマーモチーフ：５’−ＣＧＡ ＧＡＣ ＧＣＴ ＡＣＧ ＧＡＣ ＴＴＡ ＡＡＡ ＴＣＣ ＧＴＴ ＧＡＣ−３’（配列番号３２）を含むように設計した。
[0594] ＨｕＲ ＲＮＡモチーフ及びタンパク質結合配列を含むＤＮＡセグメントからＴ７ＲＮＡポリメラーゼを使用するインビトロ転写により、非修飾線状ＲＮＡを合成した。
[0595] 転写されたＲＮＡをＲＮＡクリーンアップキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｔ２０５０）により精製し、ＲＮＡ５’−ホスホヒドロラーゼ（ＲｐｐＨ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０３５６）により製造業者の説明書に従って処理し、ＲＮＡ精製カラムにより再度精製した。環状化配列に相補的なスプリントＤＮＡ及びＴ４ＲＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０２３９）を使用してＲｐｐＨ処理ＲＮＡを環状化させた。環状ＲＮＡを尿素ＰＡＧＥ精製し、（０．５Ｍの酢酸ナトリウム、０．１％のＳＤＳ、１ｍＭのＥＤＴＡを含有する緩衝液中で溶出させ、エタノール沈殿させ、ＲＮアーゼフリー水中で再懸濁させた。ＲＮＡ品質は、尿素ＰＡＧＥにより又は自動電気泳動（Ａｇｉｌｅｎｔ）を介して評価した。
[0596] ＨｕＲ及びＲＮＡへの環状ＲＮＡ結合は、インビトロでＨｕＲ免疫沈降（ＩＰ）及びビオチンＲＮＡプルダウンアッセイの組合せとその後のｑＰＣＲにより判定した。Ｇタンパク質抗ＨｕＲ抗体に結合しているＨｕＲタンパク質を環状ＲＮＡとインキュベートし、洗浄し、低ｐＨにおいて溶出させた。結合材料をビオチン化ＲＮＡとインキュベートし、洗浄し、ストレプトアビジン・ダイナビーズによりプルダウンした。
[0597] 図２３に示されるとおり、ＨｕＲは、ＨｕＲ ＲＮＡ結合アプタマーモチーフを有する環状ＲＮＡを結合させ、ストレプトアビジンプルダウンは、ＲＮＡ結合アプタマーモチーフを有するＲＮＡを生じさせた。したがって、２つのＨｕＲ及びＲＮＡ結合モチーフが存在した場合、結合が観察された。この結果は、目的生体分子が選択的に結合されることを実証した。
実施例４１： 環状ＲＮＡはタンパク質及びＤＮＡを結合させた
[0598] 本実施例は、隔離のためにタンパク質及びＤＮＡに結合する環状ＲＮＡを実証する。
[0599] タンパク質及びＲＮＡによるＤＮＡ結合は、様々な細胞プロセス、すなわち、転写において肝要な役割を担う。
[0600] ヒト抗原受容体（ＨｕＲ）は、ｍＲＮＡ運命において中心的役割を担い、中心的な細胞機能を有するｍＲＮＡ標的の転写後調節において重要な役割を担い、それにより病因において重要なタンパク質となる。これは癌関連ｍＲＮＡ転写産物を結合させ、安定化させることが公知であり、したがってＨｕＲは複数の癌表現型を可能とすることにより中心的な腫瘍発生活性を有する。
[0601] 環状ＲＮＡの標的化及びそれとのそれらの接触の競合を使用してそれらの相互作用をモジュレートし、疾患及び非疾患プロセスにおいてアウトカムを制御することができた。
[0602] 環状ＲＮＡは、ＤＮＡ結合アプタマーモチーフ：５’−ＣＧＡ ＧＡＣ ＧＣＴ ＡＣＧ ＧＡＣ ＴＴＡ ＡＡＡ ＴＣＣ ＧＴＴ ＧＡＣ−３’（配列番号３２）ＲＮＡを有するように設計した。
[0603] ＤＮＡセグメントからＴ７ＲＮＡポリメラーゼを使用するインビトロ転写により、非修飾線状ＲＮＡを合成した。転写されたＲＮＡをＲＮＡクリーンアップキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｔ２０５０）により精製し、ＲＮＡ５’−ホスホヒドロラーゼ（ＲｐｐＨ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｍ０３５６）により製造業者の説明書に従って処理し、ＲＮＡ精製カラムにより再度精製した。環状化配列に相補的なスプリントＤＮＡ及びＴ４ＲＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０２３９）を使用してＲｐｐＨ処理ＲＮＡを環状化させた。環状ＲＮＡを尿素ＰＡＧＥ精製し、（０．５Ｍの酢酸ナトリウム、０．１％のＳＤＳ、１ｍＭのＥＤＴＡを含有する緩衝液中で溶出させ、エタノール沈殿させ、ＲＮアーゼフリー水中で再懸濁させた。ＲＮＡ品質は、尿素ＰＡＧＥにより評価した。
[0604] ＤＮＡ及びＨｕＲへの環状ＲＮＡ結合は、インビトロでＨｕＲ免疫沈降（ＩＰ）及びビオチン化ＤＮＡプルダウンアッセイの組合せとその後のＲＴ−ｑＰＣＲにより判定した。ＤＮＡ結合モチーフ又はＨｕＲモチーフを欠く環状ＲＮＡを、特異性対照として使用した。ビオチン化ＤＮＡは、ＤＮＡ結合アプタマーモチーフを有する環状ＲＮＡを結合させた。
[0605] Ｇタンパク質抗ＨｕＲビーズに結合しているＨｕＲタンパク質を環状ＲＮＡとインキュベートし、洗浄し、低ｐＨにおいて溶出させた。結合材料をビオチン化ＤＮＡとインキュベートし、洗浄し、ストレプトアビジン・ダイナビーズによりプルダウンした。図２４に示されるとおり、ＨｕＲは、ＨｕＲ ＤＮＡ結合アプタマーモチーフを有する環状ＲＮＡを結合させ、ストレプトアビジンプルダウンは、ＤＮＡ結合アプタマーモチーフを有するＲＮＡを生じさせた。したがって、２つのＨｕＲ及びＤＮＡ結合アプタマーモチーフが存在した場合、結合が観察された。この結果は、目的のタンパク質及びＤＮＡ分子が同じ環状構築物に選択的に結合されることを実証した。
実施例４２： 環状ＲＮＡはタンパク質を翻訳し、その翻訳に影響を与える異なるタンパク質に結合した
[0606] 本実施例は、タンパク質をコードし、環状ＲＮＡ翻訳において効果を有する異なるタンパク質を結合する環状ＲＮＡを実証する。
[0607] ヒト抗原受容体（ＨｕＲ）はｍＲＮＡ運命において中心的な役割を担い、中心的な細胞機能を有するｍＲＮＡ標的の転写後調節において重要な役割を担う。したがって、ＨｕＲを使用してＲＮＡ発現を制御することは、翻訳されるタンパク質投与量の制御を提供することができる。
[0608] 以下の実施例に示されるとおり、非天然発生環状ＲＮＡは、ガウシア属（Gaussia）ルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）、生物学的に活性な分泌タンパク質をコードし、ＨｕＲを結合させてＧＬｕｃ翻訳を調節するように遺伝子操作した。この環状ＲＮＡは、ＩＲＥＳ、ガウシア属ルシフェラーゼをコードするＯＲＦ、ＩＲＥＳ−ＯＲＦをフランキングする２つのスペーサーエレメント及びＨｕＲを結合させるための１×、２×又は３×ＨｕＲ結合アプタマーモチーフ：５’−ＵＣＡ ＵＡＡ ＵＣＡ ＡＵＵ ＵＡＵ ＵＡＵ ＵＵＵ ＣＵＵ ＵＵＡ ＵＵＵ ＵＡＵ ＵＣＡ ＣＡＵ ＡＡＵ ＵＵＵ ＧＵＵ ＵＵＵ−３’（配列番号３３）、５’−ＡＵＵ ＵＵＧ ＵＵＵ ＵＵＡ ＡＣＡ ＵＵＵＣ−３’（配列番号３４）、５’−ＵＣＡ ＵＡＡ ＵＣＡ ＡＵＵ ＵＡＵ ＵＡＵ ＵＵＵ ＣＵＵ ＵＵＡ ＵＵＵ ＵＡＵ ＵＣＡ ＣＡＵ ＡＡＵ ＵＵＵ ＧＵＵ ＵＵＵ ＡＵＵ ＵＵＧ ＵＵＵ ＵＵＡ ＡＣＡ ＵＵＵ Ｃ−３’（配列番号３５）を含んだ。
[0609] ＨｕＲ ＲＮＡモチーフ及びタンパク質結合配列を含むＤＮＡセグメントからＴ７ＲＮＡポリメラーゼを使用するインビトロ転写により、非修飾線状ＲＮＡを合成した。
[0610] 転写されたＲＮＡをＲＮＡクリーンアップキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｔ２０５０）により精製し、ＲＮＡ５’−ホスホヒドロラーゼ（ＲｐｐＨ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０３５６）により製造業者の説明書に従って処理し、ＲＮＡ精製カラムにより再度精製した。環状化配列に相補的なスプリントＤＮＡ及びＴ４ＲＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０２３９）を使用してＲｐｐＨ処理ＲＮＡを環状化させた。環状ＲＮＡを尿素ＰＡＧＥ精製し、（０．５Ｍの酢酸ナトリウム、０．１％のＳＤＳ、１ｍＭのＥＤＴＡを含有する緩衝液中で溶出させ、エタノール沈殿させ、ＲＮアーゼフリー水中で再懸濁させた。ＲＮＡ品質は、尿素ＰＡＧＥにより又は自動電気泳動（Ａｇｉｌｅｎｔ）を介して評価した。
[0611] ＨｕＲへの環状ＲＮＡ結合は、上記のとおりインビトロＲＮＡプルダウンアッセイにより決定した。
[0612] ＨｕＲ結合の効果及び細胞中の環状ＲＮＡタンパク質発現に対するその効果を判定するため、５×１０３個のＨｅＬａ細胞を脂質ベース形質移入試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び２ｎＭの環状ＲＮＡにより良好に逆形質移入した。ガウシア属ルシフェラーゼ活性を細胞培養上清において９６時間まで毎日モニタリングし、発現の尺度としてガウシア属ルシフェラーゼアッセイキットを製造業者の説明書に従って使用した。
[0613] 図２５は、ＨｕＲ結合アプタマー部位を有する環状ＲＮＡからのより低い分泌タンパク質発現を示す。さらに、ＧＬｕｃ発現レベルは、環状ＲＮＡ中のＨｕＲ結合アプタマーモチーフの数により変化した。本実施例は、遺伝子操作環状ＲＮＡからの翻訳のレベルが追加のタンパク質結合アプタマーにより影響を受けたことを実証する。

[0614] 本開示の好ましい実施形態を示し、本明細書に記載した一方、当業者には、そのような実施形態が例としてのみ提供されることが明らかである。多数のバリエーション、変更、及び置換が目下、本開示から逸脱せずに当業者に想到される。本明細書に記載の実施形態の種々の代替例を本開示の実施において用いることができることを理解すべきである。以下の特許請求の範囲は、本開示の範囲を規定すること並びにそれらの特許請求の範囲の範囲内の方法及び構造及びそれらの均等物がそれにより包含されることが意図される。

Claims (37)

  1. 細胞中で標的を結合させる方法であって、
    アプタマー配列を含み、前記アプタマー配列は、前記標的を結合させる二次構造を有する翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドを提供すること；及び
    前記翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドを前記細胞に送達し、前記翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドは、送達の少なくとも５日後に検出可能な前記標的との複合体を形成すること
    を含む方法。
  2. 前記標的は、核酸分子、小分子、タンパク質、炭水化物、及び脂質からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  3. 前記標的は、遺伝子調節タンパク質である、請求項１に記載の方法。
  4. 前記遺伝子調節タンパク質は、転写因子である、請求項３に記載の方法。
  5. 前記核酸分子は、ＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子である、請求項２に記載の方法。
  6. 前記複合体は、遺伝子発現をモジュレートする、請求項１に記載の方法。
  7. 前記複合体は、ＤＮＡ分子の指向転写、ＤＮＡ分子のエピジェネティックリモデリング、又はＤＮＡ分子の分解をモジュレートする、請求項１に記載の方法。
  8. 前記複合体は、前記標的の分解、前記標的のトランスロケーション、又は標的シグナル伝達をモジュレートする、請求項１に記載の方法。
  9. 前記遺伝子発現は、疾患又は病態の病因と関連する、請求項６に記載の方法。
  10. 前記複合体は、送達の少なくとも７、８、９、又は１０日後に検出可能である、請求項１に記載の方法。
  11. 前記翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドは、送達の少なくとも５日後に存在する、請求項１に記載の方法。
  12. 前記翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドは、送達の少なくとも６、７、８、９、又は１０日後に存在する、請求項１に記載の方法。
  13. 前記翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドは、非修飾翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
  14. 前記翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドは、準二本鎖二次構造を有する、請求項１に記載の方法。
  15. 前記アプタマー配列は、前記標的を結合させる三次構造をさらに有する、請求項１に記載の方法。
  16. 前記細胞は、真核細胞である、請求項１に記載の方法。
  17. 前記真核細胞は、ヒト細胞である、請求項１６に記載の方法。
  18. 細胞中で転写因子を結合させる方法であって、
    前記転写因子を結合させるアプタマー配列を含む翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドを提供すること；及び
    前記翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドを前記細胞に送達し、前記翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドは、前記転写因子との複合体を形成し、遺伝子発現をモジュレートすること
    を含む方法。
  19. 細胞中で転写因子を隔離する方法であって、
    前記転写因子を結合させるアプタマー配列を含む翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドを提供すること；及び
    前記翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドを前記細胞に送達し、前記翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドは、前記転写因子を結合させて前記細胞中で複合体を形成することにより前記転写因子を隔離すること
    を含む方法。
  20. 細胞生存率は、前記複合体の形成後に減少する、請求項１９に記載の方法。
  21. 細胞毒性剤に対して細胞を感作させる方法であって、
    転写因子を結合させるアプタマー配列を含む翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドを提供すること；並びに
    前記細胞毒性剤及び前記翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドを前記細胞に送達し、前記翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドは、前記細胞中で前記転写因子との複合体を形成すること
    を含み；
    それにより、前記翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドを欠く細胞と比較して前記細胞毒性剤に対して前記細胞を感作させる方法。
  22. 前記細胞毒性剤に対する前記細胞の前記感作は、前記細胞毒性剤及び前記翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドの前記送達後に減少した細胞生存率をもたらす、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記減少した細胞生存率は、前記細胞毒性剤及び前記翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドの前記送達の少なくとも２日後に４０％以上だけ減少する、請求項２２に記載の方法。
  24. 細胞中で病原性タンパク質を結合させる方法であって、
    前記病原性タンパク質を結合させるアプタマー配列を含む翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドを提供すること；及び
    前記翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドを前記細胞に送達し、前記翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドは、前記病原性タンパク質の分解のために前記病原性タンパク質との複合体を形成すること
    を含む方法。
  25. 細胞中でリボ核酸分子を結合させる方法であって、
    前記リボ核酸分子の配列に相補的な配列を含む翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドを提供すること；及び
    前記翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドを前記細胞に送達し、前記翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドは、前記リボ核酸分子との複合体を形成すること
    を含む方法。
  26. 細胞中でゲノムデオキシリボ核酸分子を結合させる方法であって、
    前記ゲノムデオキシリボ核酸分子を結合させるアプタマー配列を含む翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドを提供すること；及び
    前記翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドを前記細胞に送達し、前記翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドは、前記ゲノムデオキシリボ核酸分子との複合体を形成し、遺伝子発現をモジュレートすること
    を含む方法。
  27. 細胞中で小分子を結合させる方法であって、
    前記小分子を結合させるアプタマー配列を含む翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドを提供すること；及び
    前記翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドを前記細胞に送達し、前記翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドは、前記小分子との複合体を形成し、細胞プロセスをモジュレートすること
    を含む方法。
  28. 前記小分子は、９００ダルトン以下の分子量を有する有機化合物であり、細胞プロセスをモジュレートする、請求項２７に記載の方法。
  29. 前記小分子は、薬物である、請求項２７に記載の方法。
  30. 前記小分子は、フルオロフォアである、請求項２７に記載の方法。
  31. 前記小分子は、代謝産物である、請求項２７に記載の方法。
  32. アプタマー配列を含み、前記アプタマー配列は、標的を結合させる二次構造を有する翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドを含む組成物。
  33. アプタマー配列を含み、前記アプタマー配列は、標的を結合させる二次構造を有する翻訳不能環状ポリリボヌクレオチド；及び薬学的に許容可能な担体又は賦形剤を含む医薬組成物。
  34. 請求項３２に記載の翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドを含む細胞。
  35. 治療が必要とされる対象を治療する方法であって、請求項３２に記載の組成物又は請求項３３に記載の医薬組成物を投与することを含む方法。
  36. 請求項３２に記載の翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド。
  37. 請求項３２に記載の翻訳不能環状ポリリボヌクレオチドを産生する方法。
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