CN117616133A - 富集环状多核糖核苷酸的方法 - Google Patents

Abstract

本披露的方法可用于富集线性多核糖核苷酸和环状多核糖核苷酸的混合物中的环状多核糖核苷酸群体。

Description

富集环状多核糖核苷酸的方法

序列表

本申请与电子格式的序列表一起提交。序列表以名为51509-034WO2_Sequence_Listing_5_18_22__ST25的文件提供，创建于2022年5月18日，大小是6,438字节。序列表的电子格式的信息通过引用以其全文并入本文。

背景

与线性多核糖核苷酸相比，环状多核糖核苷酸显示出对核酸酶降解的增加的抵抗力，从而导致更长的半衰期。已知环状多核糖核苷酸是内源性存在的或可以是外源性环化的。外源性环化反应除了一些残余的线性多核糖核苷酸之外还产生成功环化的多核糖核苷酸的混合物。药物环状多核糖核苷酸制剂中线性多核糖核苷酸的存在可能具有意料之外的和不期望的效果。因此，相对于线性多核糖核苷酸，仍然需要富集、分离和/或纯化环状多核糖核苷酸的方法。

概述

本披露提供了产生富集的环状多核糖核苷酸群体的方法。具体地，本披露提供了通过用5’核酸外切酶和3’核酸外切酶消化线性多核糖核苷酸，从线性和环状多核糖核苷酸的混合物产生富集的环状多核糖核苷酸群体的方法。

在一方面，本披露提供了一种产生富集的环状多核糖核苷酸群体的方法，该方法包括：提供包括环状多核糖核苷酸和线性多核糖核苷酸的多核糖核苷酸群体；用0.01U至0.2U(例如，0.01U至0.16U、0.01U至0.12U、0.01U至0.0.8U、0.01U至0.04U、0.01U至0.02U、0.01U至0.012U、0.02U至0.2U、0.04U至0.2U、0.0.08U至0.2U、0.12U至0.2U、0.16U至0.2U)/1μg多核糖核苷酸的量的5’核酸外切酶消化该线性多核糖核苷酸的至少一部分；用以0.4U至4U(例如，0.4U至3.6U、0.4U至3.2U、0.4U至2.8U、0.4U至2.4U、0.4U至2U、0.4U至1.6U、0.4U至1.2U、0.4U至0.8U、0.8U至4U、1.2U至4U、1.6U至4U、2U至4U，24U至4U、2.8U至4U、3.2U至4U、3.6U至4U、以及0.4U至0.6U)/1μg多核糖核苷酸的量的3’核酸外切酶消化该线性多核糖核苷酸的至少一部分；从而产生富集的环状多核糖核苷酸群体。在一些实施例中，线性多核糖核苷酸的至少一部分的5’端包括单磷酸部分。在一些实施例中，用0.01U至0.2U/1μg多核糖核苷酸的量的5’核酸外切酶消化线性多核糖核苷酸的至少一部分的消化步骤在用0.4U至4U/1μg多核糖核苷酸量的3’核酸外切酶消化线性多核糖核苷酸的至少一部分之前进行。在一些实施例中，用0.01U至0.2U/1μg多核糖核苷酸的量的5’核酸外切酶消化线性多核糖核苷酸的至少一部分的消化步骤在用0.4U至4U/1μg多核糖核苷酸量的3’核酸外切酶消化线性多核糖核苷酸的至少一部分之后进行。在一些实施例中，用0.01U至0.2U/1μg多核糖核苷酸的量的5’核酸外切酶消化线性多核糖核苷酸的至少一部分的消化步骤和用0.4U至4U/1μg多核糖核苷酸量的3’核酸外切酶消化线性多核糖核苷酸的消化步骤的至少一部分相伴进行。

在一些实施例中，5'核酸外切酶是5'-磷酸依赖性核酸外切酶。在一些实施例中，5'核酸外切酶是Xrn-1。在一些实施例中，3'核酸外切酶是RNA酶R。在一些实施例中，3'核酸外切酶是核酸外切酶T。

在一些实施例中，用0.01U至0.2U/1μg多核糖核苷酸的量的5'核酸外切酶消化线性多核糖核苷酸的至少一部分的消化步骤进行30分钟至90分钟(例如，35分钟至90分钟、45分钟至90分钟、1小时至90分钟、75分钟至90分钟、30分钟至75分钟、30分钟至1小时、30分钟至45分钟、或30分钟至35分钟)。在一些实施例中，用0.4U至4U/1μg多核糖核苷酸的量的3'核酸外切酶消化线性多核糖核苷酸的至少一部分的消化步骤进行30分钟至90分钟(例如，35分钟至90分钟、45分钟至90分钟、1小时至90分钟、75分钟至90分钟、30分钟至75分钟、30分钟至1小时、30分钟至45分钟、或30分钟至35分钟)。

在一些实施例中，用0.01U至0.2U/1μg多核糖核苷酸的量的5’核酸外切酶消化线性多核糖核苷酸的至少一部分的消化步骤在约37℃的温度下进行。在一些实施例中，用0.4U至4U/1μg多核糖核苷酸的量的3’核酸外切酶消化线性多核糖核苷酸的至少一部分的消化步骤在约37℃的温度下进行。

在一些实施例中，用0.01U至0.2U/1μg多核糖核苷酸的量的5’核酸外切酶消化线性多核糖核苷酸的至少一部分的消化步骤和用1U至10U/2.5μg多核糖核苷酸量的3’核酸外切酶消化线性多核糖核苷酸的至少一部分的消化步骤在包含Mg²⁺的消化缓冲液中进行。在一些实施例中，消化缓冲液中的Mg²⁺具有0.05mM至1mM(例如，0.05mM至0.8mM、0.05mM至0.6mM、0.05mM至0.4mM、0.05mM至0.2mM、0.05mM至0.1mM、0.05mM至0.1mM、0.1mM至1mM、0.2mM至1mM、0.4mM至1mM、0.6mM至1mM、以及0.8mM至1mM)的浓度。

在一些实施例中，用0.01U至0.2U/1μg多核糖核苷酸的量的5’核酸外切酶消化线性多核糖核苷酸的至少一部分的消化步骤和用0.4U至4U/1μg多核糖核苷酸量的3’核酸外切酶消化线性多核糖核苷酸的至少一部分的消化步骤在包含二硫苏糖醇的消化缓冲液中进行。在一些实施例中，二硫苏糖醇的浓度为0.1mM至5mM(例如，0.1mM至4mM、0.1mM至3mM、0.1mM至2mM、0.1mM至1mM、0.1mM至0.5mM、0.5mM至5mM、1mM至5mM、2mM至5mM、3mM至5mM、或4mM至5mM)。在一些实施例中，用5'核酸外切酶消化线性多核糖核苷酸的至少一部分的消化步骤的5'核酸外切酶的量是0.012U至0.1U(例如，0.012U至0.08U、0.012U至0.06U、0.012U至0.04U、0.012U至0.1U、0.02U至0.1U、0.04U至0.1U、0.06U至0.1U、0.08U至0.15U)/1μg多核糖核苷酸。在一些实施例中，用5'核酸外切酶消化线性多核糖核苷酸的至少一部分的消化步骤的5'核酸外切酶的量为0.025U/1μg多核糖核苷酸。

在一些实施例中，用3'核酸外切酶消化线性多核糖核苷酸的至少一部分的消化步骤的3'核酸外切酶的量是0.4U至2U(例如，1U至1.8U、0.4U至1.6U、0.4U至1.4U、0.4U至1.2U、0.4U至1U、0.4U至0.8U、0.4U至0.6U、0.6U至2U、0.8U至2.5U、1至2U、1.2U至2U、1.4U至2U、1.6U至约2U、1.8U至2U)/1μg多核糖核苷酸。在一些实施例中，用3'核酸外切酶消化线性多核糖核苷酸的至少一部分的消化步骤的3'核酸外切酶的量为0.5U/1μg多核糖核苷酸。

在一些实施例中，在用0.01U至0.2U/1μg多核糖核苷酸的量的5’核酸外切酶消化线性多核糖核苷酸的至少一部分的消化步骤和用0.4U至4U/1μg多核糖核苷酸量的3’核酸外切酶消化线性多核糖核苷酸的至少一部分的消化步骤之后，环状多核糖核苷酸的百分比(w/w)为总多核苷酸的40％至95％(例如，40％至90％、40％至80％、40％至70％、40％至60％、40％至50％、50％至95％、60％至95％、70％至95％、80％至95％或者90％至95％)。在一些实施例中，在用0.01U至0.2U/1μg多核糖核苷酸的量的5’核酸外切酶消化线性多核糖核苷酸的至少一部分的消化步骤和用0.4U至4U/1μg多核糖核苷酸量的3’核酸外切酶消化线性多核糖核苷酸的至少一部分的消化步骤之后，环状多核糖核苷酸的百分比(w/w)为总多核苷酸的60％至90％(例如，60％至85％、60％至80％、60％至75％、60％至70％、60％至65％、65％至90％、70％至90％、75％至90％、80％至90％或者85％至90％)。在一些实施例中，在用0.01U至0.2U/1μg多核糖核苷酸的量的5’核酸外切酶消化线性多核糖核苷酸的至少一部分的消化步骤和用0.4U至4U/1μg多核糖核苷酸量的3’核酸外切酶消化线性多核糖核苷酸的至少一部分的消化步骤之后，环状多核糖核苷酸的百分比(w/w)为总多核苷酸的70％至90％(例如，70％至90％、70％至85％、70％至80％、70％至75％、75％至90％、80％至90％、或85％至90％)。在一些实施例中，在用0.01U至0.2U/1μg多核糖核苷酸的量的5’核酸外切酶消化线性多核糖核苷酸的至少一部分的消化步骤和用0.4U至4U/1μg多核糖核苷酸量的3’核酸外切酶消化线性多核糖核苷酸的至少一部分的消化步骤之后，环状多核糖核苷酸的总产率百分比(w/w)为70％至100％(例如，70％至95％、70％至90％、70％至85％、70％至80％、70％至75％、75％至100％、80％至100％、85％至100％、90％至100％和95％至100％)。

在另一方面，本披露提供了一种产生富集的环状多核糖核苷酸群体的方法，该方法包括：提供包括环状多核糖核苷酸和线性多核糖核苷酸的多核糖核苷酸群体；用5'核酸外切酶消化该线性多核糖核苷酸的至少一部分，并且用3'核酸外切酶消化该线性多核糖核苷酸的至少一部分，其中用5'核酸外切酶消化该线性多核糖核苷酸的至少一部分并且用3’核酸外切酶消化该线性多核糖核苷酸的至少一部分的消化步骤在消化缓冲液中进行，该消化缓冲液包括0.05mM至1mM(例如，0.05mM至0.8mM、0.05mM至0.6mM、0.05mM至0.4mM、0.05mM至0.2mM、0.05mM至0.1mM、0.05mM至0.1mM、0.1mM至1mM、0.2mM至1mM、0.4mM至1mM、0.6mM至1mM,至0.8mM至1mM)Mg²⁺和/或0.1mM至5mM(例如，0.1mM至4mM、0.1mM至3mM、0.1mM至2mM、0.1mM至1mM、0.1mM至0.5mM、0.5mM至5mM、1mM至5mM、2mM至5mM、3mM至5mM、或4mM至5mM)二硫苏糖醇；从而产生富集的环状多核糖核苷酸群体。

在一些实施例中，用5'核酸外切酶消化线性多核糖核苷酸的至少一部分的消化步骤在用3'核酸外切酶消化线性多核糖核苷酸的至少一部分的步骤之前进行。在一些实施例中，用5'核酸外切酶消化线性多核糖核苷酸的至少一部分的消化步骤在用3'核酸外切酶消化线性多核糖核苷酸的至少一部分的步骤之后进行。在一些实施例中，用5'核酸外切酶消化线性多核糖核苷酸的至少一部分的消化步骤和用3'核酸外切酶消化线性多核糖核苷酸的至少一部分的消化步骤相伴进行。

在一些实施例中，5'核酸外切酶的量是0.01U至0.2U(例如，0.01U至0.16U、0.01U至0.12U、0.01U至0.0.8U、0.01U至0.04U、0.01U至0.02U、0.01U至0.012U、0.02U至0.2U、0.04U至0.2U、0.0.08U至0.2U、0.12U至0.2U、0.16U至0.2U)/1μg多核糖核苷酸。在一些实施例中，3'核酸外切酶的量是0.4U至4U(例如，0.4U至3.6U、0.4U至3.2U、0.4U至2.8U、0.4U至2.4U、0.4U至2U、0.4U至1.6U、0.4U至1.2U、0.4U至0.8U、0.8U至4U、1.2U至4U、1.6U至4U、2U至4U，24U至4U、2.8U至4U、3.2U至4U、3.6U至4U、以及0.4U至0.6U)/1μg多核糖核苷酸。

在实施例中，线性多核糖核苷酸的至少一部分的5’端包括单磷酸部分。

在一些实施例中，5'核酸外切酶是5'-磷酸依赖性核酸外切酶。在一些实施例中，5'核酸外切酶是Xrn-1。在一些实施例中，3'核酸外切酶是RNA酶R。在一些实施例中，3'核酸外切酶是核酸外切酶T。

在一些实施例中，用5'核酸外切酶消化线性多核糖核苷酸的至少一部分的消化步骤进行30分钟至90分钟(例如，35分钟至90分钟、45分钟至90分钟、1小时至90分钟、75分钟至90分钟、30分钟至75分钟、30分钟至1小时、30分钟至45分钟、或30分钟至35分钟)。在一些实施例中，用5'核酸外切酶消化线性多核糖核苷酸的至少一部分的消化步骤进行45分钟至60分钟(例如，45分钟至55分钟、45分钟至50分钟、50分钟至60分钟，以及55分钟至60分钟)。在一些实施例中，用3'核酸外切酶消化线性多核糖核苷酸的至少一部分的消化步骤进行30分钟至90分钟(例如，35分钟至90分钟、45分钟至90分钟、1小时至90分钟、75分钟至90分钟、30分钟至75分钟、30分钟至1小时、30分钟至45分钟、或30分钟至35分钟)。在一些实施例中，用3'核酸外切酶消化线性多核糖核苷酸的至少一部分的消化步骤进行45分钟至60分钟(例如，45分钟至55分钟、45分钟至50分钟、50分钟至60分钟，以及55分钟至60分钟)。

在一些实施例中，用5’核酸外切酶消化线性多核糖核苷酸的至少一部分的消化步骤在约37℃的温度下进行。在一些实施例中，用3’核酸外切酶消化线性多核糖核苷酸的至少一部分的消化步骤在约37℃的温度下进行。

在一些实施例中，用5'核酸外切酶消化线性多核糖核苷酸的至少一部分的消化步骤的5'核酸外切酶的量是0.012U至0.1U(例如，0.012U至0.08U、0.012U至0.06U、0.012U至0.04U、0.012U至0.02U、0.02U至0.1U、0.04U至0.1U、0.06U至0.1U、0.08U至0.1U)/1μg多核糖核苷酸。在一些实施例中，用5'核酸外切酶消化线性多核糖核苷酸的至少一部分的消化步骤的5'核酸外切酶的量为0.025U/1μg多核糖核苷酸。

在一些实施例中，用3'核酸外切酶消化线性多核糖核苷酸的至少一部分的消化步骤的3'核酸外切酶的量是0.4U至2U(例如，0.4U至1.8U、0.4U至1.6U、0.4U至1.4U、0.4U至1.2U、0.4U至1U、0.4U至0.8U、0.4U至0.6U、0.6U至2U、0.8U至2U、1至2U、1.2U至2U、1.4U至2U、1.6U至2U、1.8U至2U)/1μg多核糖核苷酸。在一些实施例中，用3'核酸外切酶消化线性多核糖核苷酸的至少一部分的消化步骤的3'核酸外切酶的量为0.5U/1μg多核糖核苷酸。

在一些实施例中，在用5’核酸外切酶消化线性多核糖核苷酸的至少一部分的消化步骤和用3’核酸外切酶消化线性多核糖核苷酸的至少一部分的消化步骤之后，环状多核糖核苷酸的百分比(w/w)为总多核苷酸的40％至95％(例如，40％至90％、40％至80％、40％至70％、40％至60％、40％至50％、50％至95％、60％至95％、70％至95％、80％至95％或者90％至95％)。

在一些实施例中，在用5’核酸外切酶消化线性多核糖核苷酸的至少一部分的消化步骤和用5’核酸外切酶消化线性多核糖核苷酸的至少一部分的消化步骤之后，环状多核糖核苷酸的百分比(w/w)为总多核苷酸的60％至90％(例如，60％至85％、60％至80％、60％至75％、60％至70％、60％至65％、65％至90％、70％至90％、75％至90％、80％至90％或者85％至90％)。在一些实施例中，在用5’核酸外切酶消化线性多核糖核苷酸的至少一部分的消化步骤和用5’核酸外切酶消化线性多核糖核苷酸的至少一部分的消化步骤之后，环状多核糖核苷酸的百分比(w/w)是总核苷酸的70％至90％(例如，70％至90％、70％至85％、70％至80％、70％至75％、75％至90％、80％至90％、或85％至90％)。在一些实施例中，在用5'核酸外切酶消化线性多核糖核苷酸的至少一部分和用3'核酸外切酶消化线性多核糖核苷酸的至少一部分的消化步骤之后，环状多核糖核苷酸的总产率百分比(w/w)是70％至100％。

定义

为了有助于对本方面的理解，下面定义了多个术语。本文定义的术语具有如与本发明相关的领域中的普通技术人员通常理解的含义。术语如“一个/种(a、an)”和“该”并不旨在仅指单个实体，而是包括可以使用特定实例来说明的一般类别。本文的术语用于描述本发明的特定实施例，但是它们的使用不限制本发明，除非在权利要求中列出。

如本文使用的，在值的范围内提供的任何值都包括上限和下限、以及该上限和下限内含有的任何值。

如本文所用，术语“3’核酸外切酶”是指具有核酸外切酶活性的酶，其中该酶利用从核苷酸链的3’末端开始并以渐进的方式向核苷酸链的5’端继续的水解从核苷酸链上去除核苷酸。3’核酸外切酶包括但不限于核酸外切酶T、RNA酶PH、多核苷酸磷酸化酶、RNA酶D、RNA酶R和外切核糖核酸酶II。

如本文所用，术语“5’核酸外切酶”是指具有核酸外切酶活性的酶，其中该酶利用从核苷酸链的5’端开始并以渐进的方式向核苷酸链的3’末端继续的水解从核苷酸链上去除核苷酸。5'核酸外切酶包括但不限于Xrn-1、和Terminator^TM核酸外切酶。

如本文所用，术语“5'-磷酸依赖性核酸外切酶”是指以5'至3'渐进的方式消化具有5'单磷酸的多核苷酸的核酸外切酶(例如，Terminator^TM核酸外切酶和Xrn-1)。

如本文使用的，术语“circRNA”、“环状多核糖核苷酸”、“环状RNA”和“环状多核糖核苷酸分子”可互换使用，并且意指具有没有游离端(即，没有游离3'或5’端)的结构的多核糖核苷酸分子，例如通过共价或非共价键形成环状或环形结构的多核糖核苷酸分子。

如本文使用的，术语“环化效率”是所得环状多核糖核苷酸相对于其非环状起始材料的测量。

如本文所用，术语“circRNA制剂”、“环状多核糖核苷酸制剂”和“环状RNA制剂”可互换使用，并且意指包含circRNA分子和稀释剂、载剂、第一佐剂或其组合的组合物。

如本文所用，术语“消化的混合物”是指通过使线性多核糖核苷酸和环状多核糖核苷酸的混合物与消化酶(例如，5’核酸外切酶或3’核酸外切酶)接触而产生的包含线性多核糖核苷酸和环状多核糖核苷酸的混合物。

如本文所用，术语“用于消化的缓冲液”和“消化缓冲液”是指其中核酸酶(例如，核酸外切酶)具有活性并消化多核苷酸的至少一部分的缓冲液。消化缓冲液可以包括诸如缓冲剂、Mg²⁺和/或二硫苏糖醇(DTT)的组分。

如本文所用，术语“富集的群体”是指与另一环状和线性多核糖核苷酸群体相比具有更高百分比的环状多核糖核苷酸的多核糖核苷酸群体。

如本文所用，术语“片段”和“部分”是指比多核苷酸分子短至少一个核苷酸的多核苷酸分子的任何部分。例如，核苷酸分子可以是线性多核糖核苷酸分子并且其片段可以是单核糖核苷酸或作为线性多核糖核苷酸分子的一部分的任意数量的连续多核糖核苷酸。

如本文所用，术语“杂质”是存在于组合物中，例如如本文所述的药物组合物中的不需要的物质。在一些实施例中，杂质是与工艺有关的杂质。在一些实施例中，杂质是最终组合物中除所需产物以外，例如除如本文所述的活性药物成分(例如，环状或线性多核糖核苷酸)以外与产物有关的物质。如本文所用，术语“与工艺有关的杂质”是在最终的组合物、制剂或产物中，除本文所述的线性多核糖核苷酸以外，在组合物、制剂或产物的制造中使用、存在或生成的不需要的物质。在一些实施例中，与工艺有关的杂质是在多核糖核苷酸的合成或环化中使用的酶。如本文所用，术语“与产物有关的物质”是在组合物、制剂或产物或其任何中间体的合成过程中产生的物质或副产物。在一些实施例中，与产物有关的物质是脱氧核糖核苷酸片段。在一些实施例中，与产物有关的物质是脱氧核糖核苷酸单体。在一些实施例中，与产物有关的物质是以下的一种或多种：本文所述的多核糖核苷酸的衍生物或片段，例如10、9、8、7、6、5或4个核糖核酸、单核糖核酸、二核糖核酸或三核糖核酸的片段。

如本文所用，术语“线性对应物”是指具有与环状多核糖核苷酸相同或相似的核苷酸序列(例如，100％、95％、90％、85％、80％、75％或之间的任何百分比的序列同一性)并且具有两个游离末端(即，环状多核糖核苷酸的未环化形式(及其片段))的多核糖核苷酸分子(及其片段)。在一些实施例中，线性对应物(例如，环化前形式)是与环状多核糖核苷酸具有相同或相似的核苷酸序列(例如，100％、95％、90％、85％、80％、75％或其间的任何百分比序列同一性)并且具有相同或相似的核酸修饰的多核糖核苷酸分子(及其片段)并且具有两个游离端(即，环状多核糖核苷酸的未环化形式(及其片段))。在一些实施例中，线性对应物是具有与环状多核糖核苷酸相同或相似的核苷酸序列(例如，100％、95％、90％、85％、80％、75％或之间的任何百分比的序列同一性)和不同的核酸修饰或没有核酸修饰并且具有两个游离末端(即，环状多核糖核苷酸的未环化形式(及其片段))的多核糖核苷酸分子(及其片段)。在一些实施例中，作为线性对应物的多核糖核苷酸分子的片段是线性对应物多核糖核苷酸分子的比该线性对应物多核糖核苷酸分子短的任何部分。在一些实施例中，线性对应物进一步包括5’帽。在一些实施例中，线性对应物进一步包括聚腺苷尾。在一些实施例中，线性对应物进一步包括3’UTR。在一些实施例中，线性对应物进一步包括5’UTR。

如本文所用，术语“线性RNA”、“线性多核糖核苷酸”和“线性多核糖核苷酸分子”可互换使用并且意指具有5'末端和3’末端的多核糖核苷酸分子。5'和3'端中的一者或两者可以是游离端或接合至另一个部分。线性RNA包括尚未经历环化(例如，环化前)的RNA，并且可以用作起始材料通过例如夹板连接或化学、酶促、核酶或剪接催化的环化方法进行环化。

如本文所用，术语“混合物”意指由两种或更多种不同物质混合而成的材料。在一些情况下，本文所述的混合物可以是两种或更多种不同物质的均匀混合物，例如，在混合物的任何给定样品中，混合物可以具有相同比例的组分(例如，两种或更多种物质)。在一些情况下，本文所提供的混合物可以是两种或更多种不同物质的不均匀混合物，例如，混合物组分(例如，两种或更多种物质)的比例在整个混合物中可以不同。在一些情况下，混合物包含环状多核糖核苷酸和线性多核糖核苷酸。在一些实施例中，混合物包括环状多核糖核苷酸、线性多核糖核苷酸，并且可以包括线性多脱氧核糖核苷酸。在一些情况下，混合物是液体溶液，例如，混合物以液相存在。在一些情况下，可以将液体溶液视为包含液体溶剂和溶质。将溶质混合在液体溶剂中可以称为“溶解”过程。在一些情况下，液体溶液是液液溶液(例如，液体溶质溶解在液体溶剂中)，固液溶液(例如，固体溶质溶解在液体溶剂中)或气液溶液(例如，固体溶质溶解在液体溶剂中)。在一些情况下，存在一种以上的溶剂和/或一种以上的溶质。在一些情况下，混合物是胶体、液体悬浮液或乳液。在一些情况下，混合物是固体混合物，例如，混合物以固相存在。

如本文使用的，术语“经修饰的核糖核苷酸”意指具有至少一个针对糖、核碱基、或核苷间键的修饰的核苷酸。

如本文所用，术语“多核苷酸”意指包含一个或多个核酸亚基或核苷酸的分子，并且可以与“核酸”或“寡核苷酸”互换使用。多核苷酸可以包括一个或多个选自腺苷(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)或其变体的核苷酸。核苷酸可以包括核苷和至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个磷酸(PO₃)基团。核苷酸可以包括核碱基、五碳糖(核糖或脱氧核糖)以及一个或多个磷酸基团。核糖核苷酸是其中糖为核糖的核苷酸。多核糖核苷酸或核糖核酸或RNA可以指包括经由磷酸二酯键聚合的多个核糖核苷酸的大分子。脱氧核糖核苷酸是其中糖是脱氧核糖的核苷酸。

多脱氧核糖核苷酸或脱氧核糖核酸或DNA意指包括经由磷酸二酯键聚合的多个脱氧核糖核苷酸的大分子。核苷酸可以是核苷单磷酸或核苷多磷酸。核苷酸意指包括可检测标签(如发光标签)或标志物(例如，荧光团)的脱氧核糖核苷多磷酸，如例如脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)，其可以选自脱氧腺苷三磷酸(dATP)、脱氧胞苷三磷酸(dCTP)、脱氧鸟苷三磷酸(dGTP)、尿苷三磷酸(dUTP)和脱氧胸苷三磷酸(dTTP)dNTP。核苷酸可以包括可以掺入正在生长的核酸链中的任何亚基。这种亚基可以是A、C、G、T或U，或对一个或多个互补A、C、G、T或U有特异性或与嘌呤(即，A或G或其变体)或嘧啶(即，C、T或U或其变体)互补的任何其他亚基。在一些实例中，多核苷酸是脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)或其衍生物或变体。在一些情况下，仅举数例，多核苷酸是短干扰RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)、质粒DNA(pDNA)、短发夹RNA(shRNA)、小核RNA(snRNA)、信使RNA(mRNA)、前体mRNA(pre-mRNA)、反义RNA(asRNA)，并且涵盖核苷酸序列及其任何结构实施例，如单链、双链、三链、螺旋、发夹等。在一些情况下，多核苷酸分子是环状的。多核苷酸可以具有各种长度。核酸分子可以具有至少约10个碱基、20个碱基、30个碱基、40个碱基、50个碱基、100个碱基、200个碱基、300个碱基、400个碱基、500个碱基、1千碱基(kb)、2kb、3kb、4kb、5kb、10kb、50kb或更大的长度。可以从细胞或组织中分离多核苷酸。如本文所体现的，多核苷酸序列可以包括分离和纯化的DNA/RNA分子、合成的DNA/RNA分子和合成的DNA/RNA类似物。

多核苷酸，例如多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸，可以包括一种或多种核苷酸变体，包括一种或多种非标准核苷酸、一种或多种非天然核苷酸、一种或多种核苷酸类似物和/或经修饰的核苷酸。经修饰的核苷酸包括但不限于二氨基嘌呤、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫代尿苷、5-羧基甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基Q核苷、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基Q核苷、5'-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-D46-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-羟基乙酸(v)、怀丁氧苷(wybutoxosine)、假尿嘧啶、Q核苷(queosine)、2-硫代胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-羟基乙酸甲酯、尿嘧啶-5-羟基乙酸(v)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧啶、(acp3)w、2,6-二氨基嘌呤等。在一些情况下，核苷酸在其磷酸酯部分中可以包括修饰，包括对三磷酸酯部分的修饰。此类修饰的非限制性实例包括较大长度的磷酸链(例如，具有4、5、6、7、8、9、10个或更多个磷酸部分的磷酸链)和具有硫醇部分的修饰(例如，α-硫代三磷酸和β-硫代三磷酸)。核酸分子还可在碱基部分处(例如，在通常可用于与互补核苷酸形成氢键的一个或多个原子处和/或在通常不能与互补核苷酸形成氢键的一个或多个原子处)、糖部分或磷酸骨架处被修饰。核酸分子还可含有胺修饰的基团，诸如氨基烯丙基1-dUTP(aa-dUTP)和氨基己基丙烯酰胺-dCTP(aha-dCTP)，以允许胺反应性部分(诸如N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS))的共价附接。本披露的寡核苷酸中标准DNA碱基对或RNA碱基对的替代物可以提供更高的密度(以位/立方毫米计)、更高的安全性(抗天然毒素的偶然或有目的合成)、更容易辨别光程序性聚合酶(photo-programmed polymerases)或较低的二级结构。在Betz K,Malyshev DA,LavergneT,Welte W,Diederichs K,Dwyer TJ,Ordoukhanian P,Romesberg FE,MarxA.Nat.Chem.Biol.[自然-化学生物学]2012年7月；8(7):612-4中描述了与用于从头和/或扩增合成的天然和突变体聚合酶相容的此类替代性碱基对，该文献出于所有目的通过引用并入本文中。

如本文所用，短语“准螺旋结构”是环状多核糖核苷酸的高阶结构，其中环状多核糖核苷酸的至少一部分折叠成螺旋结构。

如本文所用，术语“总核糖核苷酸分子”和“总多核糖核苷酸”意指通过核糖核苷酸分子的总质量所测量的任何核糖核苷酸分子的总量，包括线性多核糖核苷酸分子、环状多核糖核苷酸分子、单体核糖核苷酸、其他多核糖核苷酸分子、其片段及其经修饰的变体。

如本文所用，术语“单位”是指表1中针对每种酶总结的在测定方法的特定方法下执行确定的催化活性所需的酶量。

表1.各种酶的单位的定义

附图说明

图1显示编码gLuc的线性多核糖核苷酸在用RNA酶R消化后被降解。

图2显示编码gLuc的线性多核糖核苷酸在用Terminator^TM核酸外切酶消化后被降解。

图3显示编码gLuc的线性多核糖核苷酸在用Xrn-1消化后被降解。

图4显示Terminator^TM核酸外切酶和RNA酶R的组合选择性降解编码gLuc的线性多核糖核苷酸。

图5显示使用Terminator^TM核酸外切酶和RNA酶R的组合富集连接后多核糖核苷酸混合物中的环状多核糖核苷酸。

图6显示，用优化浓度的5'和3'核酸外切酶相伴消化选择性降解连接后多核糖核苷酸混合物中的线性多核糖核苷酸，产生富集的环状多核糖核苷酸制剂。

图7显示使用5'和3'核酸外切酶的两种不同组合富集环状多核糖核苷酸。

图8显示在各种缓冲液和相应缓冲液对照中使用Terminator^TM核酸外切酶和RNA酶R的组合消化连接后多核糖核苷酸混合物的结果。

图9显示在各种缓冲液和相应缓冲液对照中使用Xrn-1和RNA酶R的组合消化连接后多核糖核苷酸混合物的结果。

图10显示在各种缓冲液和相应缓冲液对照中使用Xrn-1和RNA酶R的组合消化连接后多核糖核苷酸混合物的结果。

图11显示来自富集的环状多核糖核苷酸的高斯(Gaussia)荧光素酶的体外表达。

图12显示几种不同分子量的环状多核糖核苷酸的选择性富集的结果。

图13显示使用5'和3'核酸外切酶的几种不同组合进行相伴消化的结果。

具体实施方式

本披露提供了用于产生富集的环状多核糖核苷酸群体的方法。例如，使用本文描述的组合物和方法，可以通过以下来产生富集的环状多核糖核苷酸群体：提供包括环状多核糖核苷酸和线性多核糖核苷酸的多核糖核苷酸群体；用0.01U至0.2U/1μg多核糖核苷酸的量的5’核酸外切酶消化线性多核糖核苷酸的至少一部分；并且用0.4U至4U/1μg多核糖核苷酸的量的3’核酸外切酶消化线性多核糖核苷酸的至少一部分。本披露还提供了通过以下来产生富集的环状多核糖核苷酸群体的方法：提供包括环状多核糖核苷酸和线性多核糖核苷酸的多核糖核苷酸群体；用5'核酸外切酶消化线性多核糖核苷酸的至少一部分；并且用3'核酸外切酶消化线性多核糖核苷酸的至少一部分，其中消化步骤在包含0.05mM至1mMMg²⁺的消化缓冲液中进行，从而产生富集的环状多核糖核苷酸群体。

包括环状和线性多核糖核苷酸的多核糖核苷酸群体可以与5’核酸外切酶和3’核酸外切酶在足以允许线性多核糖核苷酸的至少一部分被消化的浓度、时间和温度下反应。

环状多核糖核苷酸的富集方法

在一方面，本披露提供了一种产生富集的环状多核糖核苷酸群体的方法。富集多核糖核苷酸群体中环状多核糖核苷酸的方法可以包括提供包含环状多核糖核苷酸和线性多核糖核苷酸的多核糖核苷酸群体；用5'核酸外切酶消化线性多核糖核苷酸的至少一部分；用3'核酸外切酶消化线性多核糖核苷酸的至少一部分，从而产生富集的环状多核糖核苷酸群体。5'核酸外切酶的量可以为0.01U至0.25U/1μg多核糖核苷酸，并且3'核酸外切酶的量可以为0.4U至4U/1μg多核糖核苷酸。

在另一方面，本披露提供了通过以下来产生富集的环状多核糖核苷酸群体的方法：提供包括环状多核糖核苷酸和线性多核糖核苷酸的多核糖核苷酸群体；用5'核酸外切酶消化线性多核糖核苷酸的至少一部分；用3'核酸外切酶消化线性多核糖核苷酸的至少一部分，其中消化缓冲液包含Mg²⁺和/或二硫苏糖醇(DTT)；从而产生富集的环状多核糖核苷酸群体。

核酸外切酶消化

在一个方面，包括环状多核糖核苷酸和线性多核糖核苷酸的多核糖核苷酸群体与5’核酸外切酶和3’核酸外切酶反应以产生富集的环状多核糖核苷酸群体。

在一些实施例中，线性多核糖核苷酸的至少一部分用5'核酸外切酶消化。在一些实施例中，线性多核糖核苷酸的至少一部分用3'核酸外切酶消化。在一些实施例中，在用3'核酸外切酶消化之前，用5'核酸外切酶消化线性多核糖核苷酸的至少一部分。在一些实施例中，在用5'核酸外切酶消化之前，用3'核酸外切酶消化线性多核糖核苷酸的至少一部分。在一些实施例中，用5'核酸外切酶和3'核酸外切酶相伴消化线性多核糖核苷酸的至少一部分。

在一些实施例中，5’核酸外切酶是5’-磷酸依赖性核酸外切酶(例如，Xrn-1或Terminator^TM核酸外切酶)。在一些实施例中，5'核酸外切酶是Xrn-1。在一些实施例中，5'核酸外切酶是Terminator^TM核酸外切酶。在一些实施例中，3'核酸外切酶是RNA酶R。在一些实施例中，3'核酸外切酶是核酸外切酶T。在一些实施例中，3'核酸外切酶是RNA酶PH。在一些实施例中，3'核酸外切酶是多核苷酸磷酸化酶。在一些实施例中，3'核酸外切酶是RNA酶D。在一些实施例中，3'核酸外切酶是外切核糖核酸酶II。

在一些实施例中，5'核酸外切酶的量是0.01U至0.2U(例如，0.01U至0.16U、0.01U至0.12U、0.01U至0.0.8U、0.01U至0.04U、0.01U至0.02U、0.01U至0.012U、0.02U至0.2U、0.04U至0.2U、0.0.08U至0.2U、0.12U至0.2U、0.16U至0.2U)/1μg多核糖核苷酸。在一些实施例中，5'核酸外切酶的量是0.012U至0.1U(例如，0.012U至0.08U、0.012U至0.06U、0.012U至0.04U、0.012U至0.02U、0.02U至0.1U、0.04U至0.1U、0.06U至0.1U、0.08U至0.1U)/1μg多核糖核苷酸。在一些实施例中，5'核酸外切酶的量是0.025U/1μg多核糖核苷酸。

在一些实施例中，3'核酸外切酶的量是0.4U至4U(例如，0.4U至3.6U、0.4U至3.2U、0.4U至2.8U、0.4U至2.4U、0.4U至2U、0.4U至1.6U、0.4U至1.2U、0.4U至0.8U、0.8U至4U、1.2U至4U、1.6U至4U、2U至4U，24U至4U、2.8U至4U、3.2U至4U、3.6U至4U、以及0.4U至0.6U)/1μg多核糖核苷酸。在一些实施例中，3’核酸外切酶的量是0.4U至2U(例如，0.4U至1.8U、0.4U至1.6U、0.4U至1.4U、0.4U至1.2U、0.4U至1U、0.4U至0.8U、0.4U至0.6U、0.6U至2U、0.8U至2U、1至2U、1.2U至2U、1.4U至2U、1.6U至2U、1.8U至2U)/1μg多核糖核苷酸。在一些实施例中，3'核酸外切酶的量是0.5U/1μg多核糖核苷酸。

在一些实施例中，5'核酸外切酶的浓度与3'核酸外切酶的浓度的比率是0.2U 5'核酸外切酶比4U 3'核酸外切酶/1μg多核糖核苷酸。

在一些实施例中，5'核酸外切酶与包括线性多核糖核苷酸和环状多核糖核苷酸的环状多核糖核苷酸群体的反应进行至少30分钟(例如，至少35分钟、至少1小时、至少1.5小时、至少2小时、至少5小时、至少12小时或至少24小时)。在一些实施例中，5'核酸外切酶与包括线性多核糖核苷酸和环状多核糖核苷酸的环状多核糖核苷酸群体的反应进行30分钟至90分钟(例如，35分钟至90分钟、45分钟至90分钟、1小时至90分钟、30分钟至75分钟、30分钟至1小时、30分钟至45分钟、或30分钟至35分钟)。在一些实施例中，用5'核酸外切酶消化线性多核糖核苷酸的至少一部分的消化步骤进行45分钟至60分钟(例如，45分钟至55分钟、45分钟至50分钟、50分钟至60分钟，以及55分钟至60分钟)。

在一些实施例中，3'核酸外切酶与包括线性多核糖核苷酸和环状多核糖核苷酸的环状多核糖核苷酸群体的反应进行至少30分钟(例如，至少35分钟、至少1小时、至少1.5小时、至少2小时、至少5小时、至少12小时或至少24小时)。在一些实施例中，5'核酸外切酶与包括线性多核糖核苷酸和环状多核糖核苷酸的环状多核糖核苷酸群体的反应进行30分钟至90分钟(例如，35分钟至90分钟、45分钟至90分钟、1小时至90分钟、30分钟至75分钟、30分钟至1小时、30分钟至45分钟、或30分钟至35分钟)。在一些实施例中，用3'核酸外切酶消化线性多核糖核苷酸的至少一部分的消化步骤进行45分钟至60分钟(例如，45分钟至55分钟、45分钟至50分钟、50分钟至60分钟，以及55分钟至60分钟)。

在一些实施例中，5’核酸外切酶与包括线性多核糖核苷酸和环状多核糖核苷酸的环状多核糖核苷酸群体的反应在30℃至42℃(例如，约31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃和41℃)的温度下进行。在一些实施例中，5’核酸外切酶与包括线性多核糖核苷酸和环状多核糖核苷酸的环状多核糖核苷酸群体的反应在约37℃的温度下进行。在一些实施例中，3’核酸外切酶与包括线性多核糖核苷酸和环状多核糖核苷酸的环状多核糖核苷酸群体的反应在30℃至42℃(例如，约31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃和41℃)的温度下进行。在一些实施例中，3’核酸外切酶与包括线性多核糖核苷酸和环状多核糖核苷酸的环状多核糖核苷酸群体的反应在约37℃的温度下进行。

消化缓冲液

在一个方面，包括环状多核糖核苷酸和线性多核糖核苷酸的多核糖核苷酸群体与5’核酸外切酶和3’核酸外切酶在消化缓冲液中反应以产生富集的环状多核糖核苷酸群体。

在一些实施例中，消化缓冲液包含0.05mM至1mM(例如，0.05mM至0.8mM、0.05mM至0.6mM、0.05mM至0.4mM、0.05mM至0.2mM、0.05mM至0.1mM、0.05mM至0.1mM、0.1mM至1mM、0.2mM至1mM、0.4mM至1mM、0.6mM至1mM、以及0.8mM至1mM)的Mg²⁺。在一些实施例中，消化缓冲液包含0.05mM至0.5mM(例如，0.05mM至0.1mM、0.05mM至0.2mM、0.05mM至0.3mM、0.05mM至0.4mM、0.1mM至0.5mM、0.2mM至0.5mM、0.3mM至0.5mM、以及0.4mM至0.5mM)Mg²⁺。在一些实施例中，消化缓冲液包含约0.1mM Mg²⁺。在一些实施例中，消化缓冲液包含约0.5mM Mg²⁺。Mg²⁺可以作为硫酸镁、氯化镁、乳酸镁、柠檬酸镁、碳酸镁或任何镁盐添加到消化缓冲液中。

在一些实施例中，消化缓冲液包括二硫苏糖醇(DTT)。在一些实施例中，消化缓冲液中DTT的浓度为0.1mM至5mM(例如，0.1mM至4mM、0.1mM至3mM、0.1mM至2mM、0.1mM至1mM、0.1mM至0.5mM、0.5mM至5mM、1mM至5mM、2mM至5mM、3mM至5mM、或4mM至5mM)。在一些实施例中，消化缓冲液中DTT的浓度为0.5mM至2mM(例如，0.5mM至0.7mM、0.5mM至1mM、0.5mM至1.2mM、0.5mM至1.5mM、0.5mM至1.7mM、1.7mM至2mM、1.5mM至2mM、1.2mM至2mM、1mM至2mM、或0.8mM至2mM)。在一些实施例中，消化缓冲液中DTT的浓度为1mM。

在一些实施例中，消化缓冲液包含NaCl。在一些实施例中，消化缓冲液包含10mM至1M的氯化钠；例如，消化缓冲液可以包含10mM至900mM、10mM至700mM、10mM至500mM、10mM至200mM、10mM至100mM、10mM至50mM、50mM至1M、100mM至1M、200mM至1M、500mM至1M、或700mM至1M NaCl。在一些实施例中，消化缓冲液包含10mM至200mM NaCl。在一些实施例中，消化缓冲液包含100mM NaCl。

在一些实施例中，消化缓冲液包含缓冲剂。在一些实施例中，缓冲剂包括Tris-HCl、Tris碱、HEPES、磷酸盐缓冲盐水(PBS)或其组合。例如，缓冲剂可以是Tris-HCl。在一些实施例中，消化缓冲液包含10mM和1M的缓冲剂；例如，消化缓冲液可以包含10mM至900mM、10mM至700mM、10mM至500mM、10mM至200mM、10mM至100mM、10mM至50mM、50mM至1M、100mM至1M、200mM至1M、500mM至1M、或700mM至1M的缓冲剂。在一些实施例中，消化缓冲液包含10mM和500mM的缓冲剂；例如，消化缓冲液可包括10mM至40mM、10mM至400mM、10mM至350mM、10mM至300mM、10mM至250mM、10mM至200mM、10mM至150mM、10mM至100mM、10mM至50mM、50mM至500mM、100mM至500mM、150mM至500mM、200mM至500mM、250mM至500mM、300mM至500mM、350mM至500mM、400mM至500mM、和450mM至500mM。在一些实施例中，消化缓冲液包含50mM的缓冲剂。

在一些实施例中，消化缓冲液具有6至8的pH。例如，消化缓冲液的pH可以是在6至7.8、6至7.5、6至7.2、6至7、6至6.8、6至6.5、6至6.3、6.3至8、6.5至8、6.8至8、7至8、7.3至8、7.5至8、以及7.8至8。

富集的环状多核糖核苷酸群体

在一些实施例中，用5'核酸外切酶和3'核酸外切酶消化后，环状多核糖核苷酸的百分比(w/w)为总多核苷酸的40％至95％(例如，40％至90％、40％至80％、40％至70％、40％至60％、40％至50％、50％至95％、60％至95％、70％至95％、80％至95％或者90％至95％)。在一些实施例中，用5'核酸外切酶和3'核酸外切酶消化后，环状多核糖核苷酸的百分比(w/w)为总多核苷酸的60％至90％(例如，60％至85％、60％至80％、60％至75％、60％至70％、60％至65％、65％至90％、70％至90％、75％至90％、80％至90％或者85％至90％)。在一些实施例中，用5'核酸外切酶和3'核酸外切酶消化后，环状多核糖核苷酸的百分比(w/w)是总多核苷酸的70％至90％(例如，70％至90％、70％至85％、70％至80％、70％至75％、75％至90％、80％至90％、或85％至90％)。在一些实施例中，用5'核酸外切酶和3'核酸外切酶消化后，环状多核糖核苷酸的总产率百分比(w/w)是60％至100％；例如，环状多核糖核苷酸的总产率百分比(w/w)是60％至95％、60％至90％、60％至85％、60％至80％、60％至75％、60％至70％、60％至65％、65％至100％、70％至100％、75％至100％、80％至100％、85％至100％、90％至100％、以及95％至100％。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的总产率百分比(w/w)是70％至100％；例如，环状多核糖核苷酸的产率百分比(w/w)是70％至95％、70％至90％、70％至85％、70％至80％、70％至75％、75％至100％、80％至100％、85％至100％、90％至100％、以及95％至100％。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的总产率百分比(w/w)是80％至100％；例如，环状多核糖核苷酸的总产率百分比(w/w)是80％至95％、80％至90％、80％至85％、85％至100％、90％至100％以及95％至100％。

环状多核糖核苷酸

本披露提供了可以从环状多核糖核苷酸和线性多核糖核苷酸的混合物中进行富集的环状多核糖核苷酸群体。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括本文所述的一个或多个元件。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺乏聚A序列(例如，在ORF的3’末端缺乏聚A序列)、缺乏游离3’末端、缺乏RNA聚合酶识别基序或其任何组合。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括如国际专利公开号WO 2019/118919(特此通过援引以其全文并入)中披露的任何特征或特征的任何组合。

在一些实施例中，多核糖核苷酸(例如，环状多核糖核苷酸)为至少约20个核苷酸、至少约30个核苷酸、至少约40个核苷酸、至少约50个核苷酸、至少约75个核苷酸、至少约100个核苷酸、至少约200个核苷酸、至少约300个核苷酸、至少约400个核苷酸、至少约500个核苷酸、至少约1,000个核苷酸、至少约2,000个核苷酸、至少约5,000个核苷酸、至少约6,000个核苷酸、至少约7,000个核苷酸、至少约8,000个核苷酸、至少约9,000个核苷酸、至少约10,000个核苷酸、至少约12,000个核苷酸、至少约14,000个核苷酸、至少约15,000个核苷酸、至少约16,000个核苷酸、至少约17,000个核苷酸、至少约18,000个核苷酸、至少约19,000个核苷酸或至少约20,000个核苷酸。在一些实施例中，多核糖核苷酸(例如，环状多核糖核苷酸)小于1.2kb、为1.2-1.4kb、为1.4-1.6kb、为3.5-4.5kb、为4.5-5.4kb或大于5.4kb

在一些实施例中，多核糖核苷酸(例如，环状多核糖核苷酸)可以具有足够的大小以容纳核糖体的结合位点。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的最大大小可以与产生环状多核糖核苷酸和/或使用环状多核糖核苷酸的技术限制内的一样大。不受任何特定理论的束缚，有可能RNA的多个区段可以从DNA产生并且其5'游离末端和3'游离末端退火以产生一“串”RNA，当只留有一个5'游离末端和一个3'游离末端时，该“串”RNA最终可能会被环化。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的最大尺寸可能受包装RNA并将其递送至靶标的能力所限制。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的大小是足以编码有用的多肽的长度，并且因此至少20,000个核苷酸、至少15,000个核苷酸、至少10,000个核苷酸、至少7,500个核苷酸或至少5,000个核苷酸、至少4,000个核苷酸、至少3,000个核苷酸、至少2,000个核苷酸、至少1,000个核苷酸、至少500个核苷酸、至少400个核苷酸、至少300个核苷酸、至少200个核苷酸、至少100个核苷酸或至少70个核苷酸的长度可能是有用的。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少核酸外切酶的降解易感性。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少降解易感性的事实可能意味着环状多核糖核苷酸不被核酸外切酶降解，或在仅存在核酸外切酶时被降解的有限程度例如与不存在核酸外切酶时相当或相似。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸不被核酸外切酶降解。在一些实施例中，当暴露于核酸外切酶时，环状多核糖核苷酸降解减少。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少与帽结合蛋白的结合。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少5’帽。

表达序列

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含编码肽或多肽的表达序列。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含至少一个编码肽或多肽的表达序列。这种肽可以包括但不限于小肽、拟肽(例如，类肽)、氨基酸、和氨基酸类似物。肽可以是直链或支链的。此种肽可具有小于约5,000克/摩尔的分子量、小于约2,000克/摩尔的分子量、小于约1,000克/摩尔的分子量、小于约500克/摩尔的分子量和此类化合物的盐、酯及其他药学上可接受的形式。此种肽可包括但不限于神经递质、激素、药物、毒素、病毒或微生物颗粒、合成分子及其激动剂或拮抗剂。

编码的多肽的长度可以是从约5个至约40,000个氨基酸、约15个至约35,000个氨基酸、约20个至约30,000个氨基酸、约25个至约25,000个氨基酸、约50个至约20,000个氨基酸、约100个至约15,000个氨基酸、约200个至约10,000个氨基酸、约500个至约5,000个氨基酸、约1,000至约2,500个氨基酸、或其间的任何范围。在一些实施例中，长度少于约40,000个氨基酸、少于约35,000个氨基酸、少于约30,000个氨基酸、少于约25,000个氨基酸、少于约20,000个氨基酸、少于约15,000个氨基酸、少于约10,000个氨基酸、少于约9,000个氨基酸、少于约8,000个氨基酸、少于约7,000个氨基酸、少于约6,000个氨基酸、少于约5,000个氨基酸、少于约4,000个氨基酸、少于约3,000个氨基酸、少于约2,500个氨基酸、少于约2,000个氨基酸、少于约1,500个氨基酸、少于约1,000个氨基酸、少于约900个氨基酸、少于约800个氨基酸、少于约700个氨基酸、少于约600个氨基酸、少于约500个氨基酸、少于约400个氨基酸、少于约300个氨基酸、或更少的多肽可能是有用的。

多肽可以大量产生。这样，该多肽可以是可以产生的任何蛋白质分子。多肽可以是可从细胞分泌或定位于细胞的细胞质、细胞核或膜区室的多肽。一些多肽包括但不限于以下中的至少一部分：病毒包膜蛋白、代谢调节酶(例如，调节脂质或类固醇的产生)、抗原、细胞因子、毒素、其不存在与疾病相关的酶、和在动物体内没有活性直至被切割(例如，在动物的肠道中)的多肽、以及激素。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含编码蛋白质例如治疗性蛋白质的表达序列。在一些实施例中，可以由本文披露的环状多核糖核苷酸表达的治疗性蛋白质具有抗氧化活性、结合活性、运货受体活性、催化活性、分子载剂活性、分子功能调节物、分子换能器活性、营养储库活性、蛋白质标签、结构分子活性、毒素活性、转录调节物活性、翻译调节物活性、或转运蛋白活性。治疗性蛋白质的一些实例可以包括但不限于酶替代蛋白质、用于补充的蛋白质、蛋白疫苗、抗原(例如，肿瘤抗原、病毒、细菌)、激素、细胞因子、抗体、免疫疗法(例如，癌症)、细胞重编程/转分化因子、转录因子、嵌合抗原受体、转座酶或核酸酶、免疫效应子(例如，影响对免疫应答/信号的易感性)、经调节的死亡效应子蛋白(例如，细胞凋亡或坏死的诱导物)、肿瘤的非溶解性抑制剂(例如，癌蛋白抑制剂)、表观遗传修饰剂、表观遗传酶、转录因子、DNA或蛋白质修饰酶、DNA嵌入剂、外排泵抑制剂、核受体活化剂或抑制剂、蛋白酶体抑制剂、酶竞争性抑制剂、蛋白质合成效应剂或抑制剂、核酸酶、蛋白质片段或结构域、配体或受体、以及CRISPR系统或其组分。

在一些实施例中，可以由本文披露的环状多核糖核苷酸表达的示例性蛋白质包括人蛋白，例如受体结合蛋白、激素、生长因子、生长因子受体调节子和再生蛋白质(例如，增殖和分化涉及的蛋白质，例如用于伤口愈合的治疗性蛋白质)。在一些实施例中，可以由本文披露的环状多核糖核苷酸可以的示例性蛋白质包括EGF(上皮生长因子)。在一些实施例中，可以由本文披露的环状多核糖核苷酸表达的示例性蛋白质包括酶，例如，氧化还原酶、代谢酶、线粒体酶、加氧酶、脱氢酶、非ATP依赖型蛋白酶和去饱和酶。在一些实施例中，可以由本文披露的环状多核糖核苷酸表达的示例性蛋白质包括细胞内蛋白质或胞质蛋白质。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸表达萤光素酶(nLuc)。在一些实施例中，可以由本文披露的环状多核糖核苷酸表达的示例性蛋白质包括分泌蛋白，例如分泌酶。在一些情况下，环状多核糖核苷酸表达如下的分泌蛋白，所述分泌蛋白可以在血液中具有较短半衰期，或者可以是具有亚细胞定位信号的蛋白，或者是具有分泌信号肽的蛋白。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸表达高斯萤光素酶(gLuc)。在一些情况下，环状多核糖核苷酸表达非人蛋白，例如荧光蛋白、能量转移受体或蛋白标签像Flag、Myc或His。在一些实施例中，可由环状多核糖核苷酸表达的示例性蛋白质包括GFP。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸表达带标签的蛋白质，例如融合蛋白或含有蛋白质标签的工程化蛋白质，该蛋白质标签是例如几丁质结合蛋白(CBP)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、Fc标签、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、AviTag、钙调蛋白标签、聚谷氨酸标签；E-标签、FLAG-标签)、HA-标签、His-标签、Myc-标签、NE-标签、S-标签、SBP-标签、Softag 1、Softag 3、Spot-标签、Strep-标签；TC标签、Ty标签、V5标签；VSV-标签；或Xpress标签。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸编码抗体例如抗体片段或其部分的表达。在一些实施例中，由环状多核糖核苷酸表达的抗体可以是任何同种型的，如IgA、IgD、IgE、IgG、IgM。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸表达抗体的一部分，如轻链、重链、Fc片段、CDR(互补决定区)、Fv片段、或Fab片段、其另外的部分。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸表达抗体的一个或多个部分。例如，环状多核糖核苷酸可以包含多于一个表达序列，其中每一个表达抗体的一部分，并且其总和可以构成抗体。在一些情况下，环状多核糖核苷酸包含一个编码抗体重链的表达序列和另一个编码抗体轻链的表达序列。在一些情况下，当环状多核糖核苷酸在细胞或无细胞环境中表达时，轻链和重链可以经受适当的修饰、折叠或其他翻译后修饰以形成功能性抗体。

调控元件

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括调控元件，例如修饰环状多核糖核苷酸内表达序列的表达的序列。调控元件可以包括位置与编码表达产物的表达序列相邻的序列。调控元件可以可操作地连接至相邻序列。与不存在调控元件时表达的产物的量相比，调控元件可以增加表达的产物的量。调控元件可用于增加由环状多核糖核苷酸编码的一种或多种多肽的表达。同样，调控元件可用于减少由环状多核糖核苷酸编码的一种或多种多肽的表达。在一些实施例中，一个调控元件可用于增加多肽的表达，而另一个调控元件可用于减少同一环状多核糖核苷酸上另一个多肽的表达。此外，一个调控元件可以增加串联连接的多个表达序列所表达的产物(例如，多肽)的量。因此，一个调控元件可以增强一个或多个表达序列(例如，多肽)的表达。也可以使用多种调控元件，例如，差异性地调控不同表达序列的表达。在一些实施例中，本文提供的调控元件可以包括选择性翻译序列。如本文所用，术语“选择性翻译序列”是指选择性地起始或激活环状多核糖核苷酸中的表达序列的翻译的核酸序列，例如某些核糖开关适体酶。调控元件还可以包括选择性降解序列。如本文所用，术语“选择性降解序列”是指起始环状多核糖核苷酸或环状多核糖核苷酸的表达产物的降解的核酸序列。在一些实施例中，调控元件是翻译调节子。翻译调节子可以调节环状多核糖核苷酸中表达序列的翻译。翻译调节子可以是翻译增强子或翻译抑制子。在一些实施例中，翻译起始序列可以充当调控元件。国际专利公开号WO 2019/118919的段落[0154]-[0161]中描述了调控元件的其他实例，将其特此通过援引以其全文并入。

已知侧接起始翻译的密码子(例如但不限于起始密码子或替代性起始密码子)的核苷酸会影响环状多核糖核苷酸的翻译效率、长度和/或结构。(参见例如Matsuda和MauroPLoS ONE[公共科学图书馆期刊],2010 5:11；其内容通过援引以其全文并入本文)。掩蔽侧接起始翻译的密码子的任何核苷酸可用于改变环状多核糖核苷酸的翻译起始位置、翻译效率、长度和/或结构。

在一个实施例中，可以在起始密码子或替代的起始密码子附近使用掩蔽剂，以掩蔽或隐藏密码子，以降低在被掩蔽的起始密码子或替代的起始密码子处起始翻译的可能性。在另一个实施例中，掩蔽剂可用于掩蔽环状多核糖核苷酸的起始密码子，以增加翻译将在替代性起始密码子处起始的可能性。

翻译起始序列

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸编码多肽并且包括翻译起始序列，例如起始密码子。在一些实施例中，翻译起始序列包括科扎克(Kozak)或夏因-达尔加诺(Shine-Dalgarno)序列。在一些实施例中，翻译起始序列包含科扎克序列。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括与表达序列相邻的翻译起始序列，例如科扎克序列。在一些实施例中，翻译起始序列是非编码起始密码子。在一些实施例中，翻译起始序列(例如，科扎克序列)存在于每个表达序列的一侧或两侧，导致表达产物的隔开。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括与表达序列相邻的至少一个翻译起始序列。在一些实施例中，翻译起始序列为环状多核糖核苷酸提供构象柔性。在一些实施例中，翻译起始序列基本上在环状多核糖核苷酸的单链区域内。在国际专利公开号WO 2019/118919的段落[0163]-[0165]中描述了翻译起始序列的其他实例，将其特此通过援引以其全文并入。

环状多核糖核苷酸可以包括多于1个起始密码子，例如但不限于至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17、至少18个、至少19个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少50个、至少60个或多于60个起始密码子。翻译可以在第一个起始密码子上起始或可以在第一个起始密码子的下游起始。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸可以起始于不是第一起始密码子(例如AUG)的密码子。环状多核糖核苷酸的翻译可以在替代性的翻译起始序列处起始，如国际专利公开号WO 2019/118919的[0164]中描述的那些，其通过援引以其全文并入本文。

在一些实施例中，翻译是通过用Rocaglates处理真核起始因子4A(eIF4A)来起始的(通过阻断43S扫描来阻遏翻译，导致过早的上游翻译起始以及携带RocA-eIF4A靶序列的转录本的蛋白质表达降低，参见例如，www.nature.com/articles/nature17978)。

交错元件

本披露的环状多核糖核苷酸可以包括切割结构域(例如，交错元件或切割序列)。术语“交错元件”是指在翻译期间诱导核糖体暂停的部分，诸如核苷酸序列。在一些实施例中，交错元件是具有强α螺旋倾向的氨基酸的非保守序列，其后是共有序列-D(V/I)ExNPGP(SEQ ID NO:2)，其中x＝任何氨基酸。在一些实施例中，交错元件可以包括化学部分，如甘油、非核酸连接部分、化学修饰、经修饰的核酸或其任何组合。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括与表达序列相邻的至少一个交错元件。在一些实施例中，交错元件存在于每个表达序列的一侧或两侧，导致表达产物的隔开。在一些实施例中，交错元件是一个或多个表达序列的一部分。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括一个或多个表达序列，并且该一个或多个表达序列中的每一个与后继的表达序列隔开。在一些实施例中，交错元件阻止(a)单个表达序列的两轮翻译或(b)两个或更多个表达序列的一轮或多轮翻译生成单个多肽。在一些实施例中，交错元件是与该一个或多个表达序列隔开的序列。在一些实施例中，交错元件包括该一个或多个表达序列的表达序列的一部分。

在国际专利公开号WO 2019/118919的段落[0172]-[0175]中描述了交错元件的实例，该专利公开特此通过援引以其全文并入。

为了避免产生连续表达产物，同时保持滚环翻译，可以包括交错元件以在翻译期间诱导核糖体暂停。在一些实施例中，交错元件在一个或多个表达序列中的至少一个的3'端。交错元件可以被配置为在环状多核糖核苷酸的滚环翻译期间使核糖体停滞。交错元件可包括但不限于2A样或CHYSEL(顺式作用的水解酶元件)序列。在一些实施例中，交错元件编码具有C-末端共有序列的序列，该共有序列是X₁X₂X₃EX₅NPGP(SEQ ID NO:22)，其中X₁不存在或者是G或H，X₂不存在或者是D或G，X₃是D或V或I或S或M，并且X₅是任何氨基酸。在一些实施例中，该序列包含具有强α-螺旋倾向的氨基酸的非保守序列，接着是共有序列-D(V/I)ExNPGP(SEQ ID NO:2)，其中x＝任何氨基酸。交错元件的一些非限制性实例包括GDVESNPGP(SEQ ID NO:3)、GDIEENPGP(SEQ ID NO:4)、VEPNPGP(SEQ ID NO:5)、IETNPGP(SEQ ID NO:6)、GDIESNPGP(SEQ ID NO:7)、GDVELNPGP(SEQ ID NO:8)、GDIETNPGP(SEQ ID NO:9)、GDVENPGP(SEQ ID NO:10)、GDVEENPGP(SEQ ID NO:11)、GDVEQNPGP(SEQ ID NO:12)、IESNPGP(SEQ ID NO:13)、GDIELNPGP(SEQ ID NO:14)、HDIETNPGP(SEQ ID NO:15)、HDVETNPGP(SEQ ID NO:16)、HDVEMNPGP(SEQ ID NO:17)、GDMESNPGP(SEQ ID NO:18)、GDVETNPGP(SEQ ID NO:19)、GDIEQNPGP(SEQ ID NO:20)和DSEFNPGP(SEQ ID NO:21)。

在一些实施例中，本文所述的交错元件切割表达产物，诸如在本文所述的共有序列的G和P之间。作为一个非限制性实例，环状多核糖核苷酸包括至少一个交错元件以切割表达产物。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括与至少一个表达序列相邻的交错元件。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括在每个表达序列后的交错元件。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含存在于每个表达序列的一侧或两侧的交错元件，导致由每个表达序列翻译一种或多种单独肽和/或一种或多种多肽。

在一些实施例中，交错元件包括一种或多种在翻译过程中诱导核糖体暂停的经修饰的核苷酸或非天然核苷酸。非天然核苷酸可以包括肽核酸(PNA)、吗啉代和锁核酸(LNA)、以及乙二醇核酸(GNA)和苏糖核酸(TNA)。诸如此类的实例通过改变分子主链而不同于天然存在的DNA或RNA。修饰可以包括对糖、核碱基、核苷间键(例如，对连接磷酸酯/磷酸二酯键/磷酸二酯主链)的修饰以及可以在翻译期间诱导核糖体暂停的它们的任何组合。本文提供的一些示例性修饰在本文其他处描述。

在一些实施例中，交错元件以其他形式存在于环状多核糖核苷酸中。例如，在一些示例性环状多核糖核苷酸中，交错元件包括环状多核糖核苷酸中的第一表达序列的终止元件，和将终止元件与第一表达序列后继表达的第一翻译起始序列隔开的核苷酸间隔子序列。在一些实例中，第一表达序列的第一交错元件在环状多核糖核苷酸中的第一表达序列后继表达的第一翻译起始序列的上游(5')。在一些情况下，第一表达序列和第一表达序列后继表达序列是环状多核糖核苷酸中的两个隔开的表达序列。第一交错元件和第一翻译起始序列之间的距离可以使得第一表达序列及其后继表达序列能够连续翻译。在一些实施例中，第一交错元件包括终止元件，并将第一表达序列的表达产物与其后继表达序列的表达产物隔开，从而产生离散的表达产物。在一些情况下，在环状多核糖核苷酸中后继序列的第一翻译起始序列上游包括第一交错元件的环状多核糖核苷酸被连续翻译，而在第二表达序列后继表达序列的第二翻译起始序列的上游包括第二表达序列的交错元件的对应环状多核糖核苷酸不被连续翻译。在一些情况下，环状多核糖核苷酸中仅存在一个表达序列，并且第一表达序列及其后继表达序列是相同的表达序列。在一些示例性环状多核糖核苷酸中，交错元件包括环状多核糖核苷酸中第一表达序列的第一终止元件，和将终止元件与下游翻译起始序列隔开的核苷酸间隔子序列。在一些此类实例中，环状多核糖核苷酸中第一交错元件在第一表达序列的第一翻译起始序列的上游(5')。在一些情况下，第一交错元件和第一翻译起始序列之间的距离使得能够连续翻译第一表达序列和任何后继表达序列。在一些实施例中，第一交错元件将第一表达序列的一轮表达产物与第一表达序列的下一轮表达产物分开，从而产生离散的表达产物。在一些情况下，在环状多核糖核苷酸中的第一序列的第一翻译起始序列上游包括第一交错元件的环状多核糖核苷酸被连续翻译，而在相应环状多核糖核苷酸中的第二表达序列的第二翻译起始序列上游包括交错元件的相应环状多核糖核苷酸不被连续翻译。在一些情况下，相应环状多核糖核苷酸中第二交错元件与第二翻译起始序列之间的距离是环状多核糖核苷酸中第一交错元件与第一翻译起始序列之间的距离的至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍大。在一些情况下，第一交错元件与第一翻译起始之间的距离为至少2nt、3nt、4nt、5nt、6nt、7nt、8nt、9nt、10nt、11nt、12nt、13nt、14nt、15nt、16nt、17nt、18nt、19nt、20nt、25nt、30nt、35nt、40nt、45nt、50nt、55nt、60nt、65nt、70nt、75nt或更大。在一些实施例中，第二交错元件与第二翻译起始之间的距离为至少2nt、3nt、4nt、5nt、6nt、7nt、8nt、9nt、10nt、11nt、12nt、13nt、14nt、15nt、16nt、17nt、18nt、19nt、20nt、25nt、30nt、35nt、40nt、45nt、50nt、55nt、60nt、65nt、70nt、75nt或大于第一交错元件和第一翻译起始之间的距离。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含多于一个表达序列。

IRES

在一些实施例中，本文所述的环状多核糖核苷酸包含内部核糖体进入位点(IRES)元件。在一些实施例中，本文所述的环状多核糖核苷酸包括多于一个(例如，2、3、4和5个)内部核糖体进入位点(IRES)元件。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸在每个表达序列的一侧或两侧上包括一个或多个IRES序列，导致所得的一种或多种肽和/或一种或多种多肽的隔开。在一些实施例中，IRES侧接至少一个(例如，2、3、4、5或更多个)表达序列的两侧。包括在环状多核糖核苷酸中的合适的IRES元件可以是能够接合真核核糖体的RNA序列。在一些实施例中，IRES是脑心肌炎病毒(EMCV)IRES。在一些实施例中，IRES是柯萨奇病毒(Coxsackievirus)(CVB3)IRES。在国际专利公开号WO 2019/118919的段落[0166]-[0168]中描述了IRES的其他实例，该专利公开特此通过援引以其全文并入。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少内部核糖体进入位点。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少内部核糖体进入位点，并且能够从其一个或多个表达序列表达蛋白。

翻译

在一些实施例中，一旦起始环状多核糖核苷酸的翻译，在完成环状多核糖核苷酸的至少一轮翻译之前，结合至环状多核糖核苷酸的核糖体不会与环状多核糖核苷酸脱离。在一些实施例中，如本文所述的环状多核糖核苷酸能够滚环翻译。在一些实施例中，在滚环翻译期间，一旦起始环状多核糖核苷酸的翻译，在完成环状多核糖核苷酸的至少2轮、至少3轮、至少4轮、至少5轮、至少6轮、至少7轮、至少8轮、至少9轮、至少10轮、至少11轮、至少12轮、至少13轮、至少14轮、至少15轮、至少20轮、至少30轮、至少40轮、至少50轮、至少60轮、至少70轮、至少80轮、至少90轮、至少100轮、至少150轮、至少200轮、至少250轮、至少500轮、至少1000轮、至少1500轮、至少2000轮、至少5000轮、至少10000轮、至少105轮或至少106轮翻译之前，结合至环状多核糖核苷酸的核糖体不会与环状多核糖核苷酸脱离。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的滚环翻译导致生成多肽产物，该多肽产物由环状多核糖核苷酸的多于一轮翻译得出(“连续”表达产物)。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括交错元件，并且环状多核糖核苷酸的滚环翻译导致生成多肽产物，该多肽产物由环状多核糖核苷酸的单轮翻译或少于单轮翻译生成(“离散”表达产物)。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸被构造为使得环状多核糖核苷酸的滚环翻译期间生成的总多肽(摩尔/摩尔)中的至少10％、20％、30％、40％、50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％是离散多肽。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸构造成使得总多肽的至少99％是离散多肽。在一些实施例中，在体外翻译系统中测试离散产物相对于总多肽的量比。在一些实施例中，用于测试量比的体外翻译系统包括兔网织红细胞裂解物。在一些实施例中，在体内翻译系统如真核细胞或原核细胞、培养细胞或生物体中的细胞中测试量比。

非翻译区

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括非翻译区(UTR)。包括基因的基因组区域的UTR可以转录但不翻译。在一些实施例中，UTR可以被包括在本文所述的表达序列的翻译起始序列的上游。在一些实施例中，UTR可以被包括在本文所述的表达序列的下游。在一些情况下，第一表达序列的一个UTR与第二表达序列的另一个UTR相同或连续或重叠。在一些实施例中，内含子是人内含子。在一些实施例中，内含子是全长人内含子，例如ZKSCAN1。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括内嵌有一段或多段的腺苷和尿苷的UTR。这些AU富集签名可能会增加表达产物的转化率。

富含UTR AU的元件(ARE)的引入、去除或修饰可用于调节环状多核糖核苷酸的稳定性或免疫原性(例如，免疫或炎性反应的一种或多种标志物的水平)。工程化特定的环状多核糖核苷酸时，可以将ARE的一个或多个拷贝引入环状多核糖核苷酸中，并且ARE的这些拷贝可以调节表达产物的翻译和/或产生。同样，可以对ARE进行鉴别和去除或工程化至环状多核糖核苷酸以调节细胞内稳定性，从而影响所得蛋白质的翻译和产生。

应当理解，可以将来自任何基因的任何UTR掺入环状多核糖核苷酸的相应侧翼区中。在国际专利公开号WO 2019/118919的段落[0197]-[201]中描述了示例性非翻译区，将其特此通过援引以其全文并入。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少5'-UTR，并且能够从其一个或多个表达序列表达蛋白。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少3'-UTR，并且能够从其一个或多个表达序列表达蛋白。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少5'-UTR。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少3'-UTR。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少终止元件，并且能够从其一个或多个表达序列表达蛋白。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少帽，并且能够从其一个或多个表达序列表达蛋白。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少5'-UTR、3'-UTR和IRES，并且能够从其一个或多个表达序列表达蛋白。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸进一步包括以下序列中的一个或多个：编码一个或多个miRNA的序列、编码一个或多个复制蛋白的序列、编码外源基因的序列、编码治疗剂的序列、调控元件(例如翻译调节子，例如翻译增强子或抑制子)、翻译起始序列、靶向内源基因(例如，siRNA、lncRNA、shRNA)的一种或多种调控核酸和编码治疗性mRNA或蛋白质的序列。

终止元件

环状多核糖核苷酸可以包括一个或多个表达序列，并且每个表达序列可以具有或可以不具有终止元件。国际专利公开号WO 2019/118919的段落[0169]-[0170]中描述了终止元件的其他实例，将其特此通过援引以其全文并入。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括聚A序列。在一些实施例中，聚A序列的长度大于10个核苷酸。在一个实施例中，poly-A序列的长度大于15个核苷酸(例如，至少或大于约10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、70个、80个、90个、100个、120个、140个、160个、180个、200个、250个、300个、350个、400个、450个、500个、600个、700个、800个、900个、1,000个、1,100个、1,200个、1,300个、1,400个、1,500个、1,600个、1,700个、1,800个、1,900个、2,000个、2,500个和3,000个核苷酸)。在一些实施例中，根据国际专利公开号WO 2019/118919的[0202]-[0204]中对聚A序列的描述来设计聚A序列，将其通过援引以其全文并入本文。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少聚A序列(例如，在ORF的3’末端缺少聚A序列)。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少终止元件。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少聚A序列(例如，在ORF的3’末端缺少聚A序列)并且能够从其一个或多个表达序列表达蛋白。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含一个或多个表达序列，并且表达序列缺少终止元件，使得环状多核糖核苷酸被连续翻译。由于缺少核糖体停滞或脱落，终止元件的排除可能导致表达产物例如肽或多肽的滚环翻译或连续表达。在此类实施例中，滚环翻译通过每个表达序列表达连续表达产物。在一些其他实施例中，表达序列的终止元件可以是交错元件的一部分。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸中的一个或多个表达序列包含终止元件。然而，在环状多核糖核苷酸中进行滚环翻译或后继(例如，第二、第三、第四、第五等)表达序列的表达。在此类情况下，当核糖体遇到终止元件(例如，终止密码子)并终止翻译时，表达产物可以从核糖体上脱落。在一些实施例中，在核糖体例如核糖体的至少一个亚基与环状多核糖核苷酸保持接触时翻译终止。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸在一个或多个表达序列的末端包括终止元件。在一些实施例中，一个或多个表达序列连续包含两个或更多个终止元件。在此类实施例中，终止翻译并且终止滚环翻译。在一些实施例中，核糖体与环状多核糖核苷酸完全脱离。在一些此类实施例中，在环状多核糖核苷酸中后继(例如，第二、第三、第四、第五等)表达序列的产生可能需要核糖体在起始翻译之前与环状多核糖核苷酸重新接合。通常，终止元件包括发出翻译终止信号的框内核苷酸三联体，例如UAA、UGA、UAG。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸中的一个或多个终止元件是阅读框移位的终止元件，例如但不限于，可终止翻译的脱框(off-frame)或-1及+1移位的阅读框(例如，隐藏的终止)。移码终止元件包括出现在表达序列的第二阅读框和第三阅读框中的核苷酸三联体TAA、TAG和TGA。阅读框移位的终止元件可能对防止通常对细胞有害的mRNA误读很重要。

RNA结合位点

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含一个或多个靶RNA结合位点。在一些实施方案中，环状多核糖核苷酸包括靶RNA结合位点，这些靶RNA结合位点修饰内源基因和/或外源基因的表达。在一些实施例中，靶RNA结合位点调节宿主基因的表达。靶RNA结合位点可以包括与内源性基因(例如，如本文所述的miRNA、siRNA、mRNA、lncRNA、RNA、DNA、反义RNA、gRNA的序列)杂交的序列、与外源性核酸(诸如病毒DNA或RNA)杂交的序列、与RNA杂交的序列、干扰基因转录的序列、干扰RNA翻译的序列、稳定RNA或使RNA不稳定(诸如通过靶向降解)的序列、或调节DNA或RNA结合因子的序列。在一些实施方案中，环状多核糖核苷酸包含与RNA结合的靶适体序列。靶适配体序列可以结合至内源基因(例如，如本文所述的miRNA、siRNA、mRNA、lncRNA、RNA、DNA、反义RNA、gRNA的序列)、外源核酸(例如病毒DNA或RNA)、RNA、干扰基因转录的序列、干扰RNA翻译的序列、稳定RNA或使RNA不稳定(例如通过靶向降解)的序列、或调节DNA-或RNA-结合因子的序列。靶适体序列的二级结构可以结合至RNA。通过将靶适体序列与RNA结合，环状RNA可以与RNA形成复合物。

在一些实施例中，靶RNA结合位点可以是tRNA、lncRNA、lincRNA、miRNA、rRNA、snRNA、微RNA、siRNA、piRNA、snoRNA、snRNA、exRNA、scaRNA、Y RNA、和hnRNA结合位点之一。靶RNA结合位点是本领域普通技术人员众所周知的。

某些靶RNA结合位点可以通过RNA干扰(RNAi)的生物学过程抑制基因表达。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含RNAi分子，所述RNAi分子具有RNA或RNA样结构，典型地具有15-50个碱基对(例如约18-25个碱基对)并且具有与细胞内表达的靶基因中的编码序列相同(互补)或几乎相同(基本上互补)的核碱基序列。RNAi分子包括但不限于：短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微RNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)、部分双链体(meroduplex)、和切丁酶(dicer)底物。在WO 2020/023655的段落[0129]-[0146]中描述了靶结合位点的其他实例，该专利特此通过援引以其全文并入。

DNA结合位点

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含靶DNA结合位点，诸如指导RNA(gRNA)的序列。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含指导RNA或gRNA序列的互补序列。gRNA短合成RNA由与不完整的效应子部分结合所必需的靶结合序列和用于基因组靶标的用户定义的约20个核苷酸靶向序列构成。指导RNA序列可以具有17-24个核苷酸(例如19、20或21个核苷酸)的长度，并且与靶核酸序列互补。定制的gRNA生成器和算法可用于设计有效的指导RNA。可以使用嵌合的“单指导RNA”(“sgRNA”)(一种模拟天然存在的crRNA-tracrRNA复合物并包含tracrRNA(用于结合核酸酶)和至少一个crRNA(以将核酸酶指导至被靶向进行编辑的序列)的工程化(合成)单RNA分子)实现基因编辑。经化学修饰的sgRNA可以在基因组编辑中有效。

gRNA可以识别特定的DNA序列(例如，与基因的启动子、增强子、沉默子或阻遏子相邻或在其内的序列)。

在一些实施例中，gRNA是用于基因编辑的CRISPR系统的一部分。对于基因编辑，可将环状多核糖核苷酸设计为包括一个或多个与所需的靶DNA序列相对应的指导RNA序列。gRNA序列可包括至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多个核苷酸与Cas9或其他外切核酸酶相互作用以切割DNA，例如，Cpf1与gRNA序列的至少约16个核苷酸相互作用以进行可检测的DNA切割。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含可与DNA结合的靶适配体序列。靶适体序列的二级结构可以结合至DNA。在一些实施方案中，环状多核糖核苷酸通过将靶适体序列与DNA结合而与DNA形成复合物。

结合DNA的环状多核糖核苷酸序列的进一步实例描述于WO 2020/023655的段落[0151]-[0153]中，该专利特此通过援引以其全文并入。

蛋白质结合

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括一个或多个蛋白质结合位点，使得蛋白质例如核糖体能够结合至RNA序列中的内部位点。通过将蛋白质结合位点(例如核糖体结合位点)工程化至环状多核糖核苷酸中，环状多核糖核苷酸可以逃避或更少地被宿主的免疫系统检测到，通过掩蔽宿主免疫系统成分中的环状多核糖核苷酸来调节降解或调节翻译。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含至少一个免疫蛋白质结合位点，例如以逃避免疫应答，例如CTL(细胞毒性T淋巴细胞)应答。在一些实施例中，免疫蛋白结合位点是结合至免疫蛋白并有助于将环状多核糖核苷酸掩蔽为外源的核苷酸序列。在一些实施例中，免疫蛋白结合位点是结合至免疫蛋白并有助于将环状多核糖核苷酸隐藏为外源或外来的核苷酸序列。

核糖体与线性RNA接合的传统机制包括核糖体与RNA的加帽5'末端的结合。从5’端，核糖体迁移到起始密码子，于是形成第一肽键。根据本发明，环状多核糖核苷酸的翻译的内部起始(即，非帽依赖性)不需要游离端或加帽端。准确的说，核糖体结合至未加帽的内部位点，由此核糖体在起始密码子处开始多肽延长。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含一个或多个RNA序列，所述一个或多个RNA序列包含核糖体结合位点，例如起始密码子。

天然5'UTR具有在翻译起始中起作用的特征。它们带有类似科扎克序列的签名，这些序列众所周知参与核糖体起始多种基因的翻译的过程。科扎克序列具有共有CCR(A/G)CCAUGG(SEQ ID NO:23)，其中R是起始密码子(AUG)的三个碱基上游的嘌呤(腺嘌呤或鸟嘌呤)，后接另一个“G”。还已知5'UTR形成参与延长因子结合的二级结构。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸编码与蛋白质结合的蛋白质结合序列。在一些实施例中，蛋白质结合序列靶向环状多核糖核苷酸或将其定位至特定靶标。在一些实施例中，蛋白结合序列特异性结合蛋白的精氨酸富集区。

在一些实施例中，蛋白质结合位点包括但不限于与蛋白质的结合位点，如ACIN1、AGO、APOBEC3F、APOBEC3G、ATXN2、AUH、BCCIP、CAPRIN1、CELF2、CPSF1、CPSF2、CPSF6、CPSF7、CSTF2、CSTF2T、CTCF、DDX21、DDX3、DDX3X、DDX42、DGCR8、EIF3A、EIF4A3、EIF4G2、ELAVL1、ELAVL3、FAM120A、FBL、FIP1L1、FKBP4、FMR1、FUS、FXR1、FXR2、GNL3、GTF2F1、HNRNPA1、HNRNPA2B1、HNRNPC、HNRNPK、HNRNPL、HNRNPM、HNRNPU、HNRNPUL1、IGF2BP1、IGF2BP2、IGF2BP3、ILF3、KHDRBS1、LARP7、LIN28A、LIN28B、m6A、MBNL2、METTL3、MOV10、MSI1、MSI2、NONO、NONO-、NOP58、NPM1、NUDT21、PCBP2、POLR2A、PRPF8、PTBP1、RBFOX2、RBM10、RBM22、RBM27、RBM47、RNPS1、SAFB2、SBDS、SF3A3、SF3B4、SIRT7、SLBP、SLTM、SMNDC1、SND1、SRRM4、SRSF1、SRSF3、SRSF7、SRSF9、TAF15、TARDBP、TIA1、TNRC6A、TOP3B、TRA2A、TRA2B、U2AF1、U2AF2、UNK、UPF1、WDR33、XRN2、YBX1、YTHDC1、YTHDF1、YTHDF2、YWHAG、ZC3H7B、PDK1、AKT1和任何其他结合RNA的蛋白质。

修饰

相对于参考序列(特别是亲本多核糖核苷酸)，本文所述的环状多核糖核苷酸可以包括本发明范围内包括的一个或多个取代、插入和/或添加、缺失和共价修饰。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括一个或多个转录后修饰(例如，加帽、裂解、聚腺苷酸化、剪接、聚A序列、甲基化、酰化、磷酸化、赖氨酸和精氨酸残基的甲基化、乙酰化、以及硫醇基团和酪氨酸残基的亚硝基化等)。该一个或多个转录后修饰可以是任何转录后修饰，诸如已经在RNA中鉴定出的多于一百种不同的核苷修饰中的任一种(Rozenski,J,Crain,P和McCloskey,J.(1999).The RNA Modification Database:1999update[RNA修饰数据库:1999年更新].Nucl Acids Res[核酸研究]27:196-197)。在一些实施例中，第一分离核酸包括信使RNA(mRNA)。在一些实施例中，该mRNA包括至少一个选自下组的核苷：诸如国际专利公开号WO 2019/118919的[0311]中描述的那些，该专利公开通过援引以其全文并入本文。

环状多核糖核苷酸可以包括任何有用的修饰，如针对糖、核碱基或核苷间键(例如对连接的磷酸酯/对磷酸二酯键/对磷酸二酯主链)。嘧啶核碱基的一个或多个原子可以被任选取代的氨基、任选取代的硫醇、任选取代的烷基(例如甲基或乙基)或卤代(例如氯代或氟代)替代或取代。在某些实施例中，在每个糖和核苷间键中存在修饰(例如，一个或多个修饰)。修饰可以核糖核酸(RNA)修饰为脱氧核糖核酸(DNA)、苏糖核酸(TNA)、乙二醇核酸(GNA)、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)或其杂交体的。本文描述了其他修饰。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括至少一种N(6)甲基腺苷(m6A)修饰以增加翻译效率。在一些实施例中，N(6)甲基腺苷(m6A)修饰可降低环状多核糖核苷酸的免疫原性(例如，降低免疫或炎性反应的一种或多种标志物的水平)。

在一些实施例中，修饰可以包括化学或细胞诱导的修饰。例如，细胞内RNA修饰的一些非限制性实例如Lewis和Pan在“RNA modifications and structures cooperate toguide RNA-protein interactions[核糖核酸的修饰和结构共同引导核糖核酸和蛋白的相互作用]”,Nat Reviews Mol Cell Biol[自然评论：分子细胞生物学],2017,18:202-210中所述。

在一些实施例中，对环状多核糖核苷酸或寡核苷酸的核糖核苷酸的化学修饰可以增强免疫逃避。环状多核糖核苷酸可以通过本领域众所周知的方法合成和/或修饰，如“Current protocols in nucleic acid chemistry[核酸化学现行方案]”,Beaucage,S.L等人(编辑),John Wiley&Sons[约翰·威利父子出版公司],纽约市,纽约州,美国(将其特此通过援引并入)中描述的那些方法。修饰包括例如端部修饰，如5'末端修饰(磷酸化(单、二和三磷酸化)、缀合、反向连接等)、3'端修饰(缀合、DNA核苷酸、反向连接等)、碱基修饰(例如，用稳定的碱基、不稳定的碱基或与扩展的亲本库碱基配对的碱基替代)、碱基去除(脱碱基核苷酸)或碱基缀合。经修饰的核糖核苷酸碱基还可包括5-甲基胞苷和假尿苷。在一些实施例中，举几个功能作用，碱基修饰可以调节环状多核糖核苷酸的表达、免疫反应、稳定性、亚细胞定位。在一些实施例中，修饰包括双正交核苷酸，例如，非天然碱基。参见例如，Kimoto等人,Chem Commun(Camb)[化学通讯(剑桥)],2017,53:12309,DOI:10.1039/c7cc06661a，将该文献通过援引以其全文特此并入。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸或寡核苷酸的一个或多个核糖核苷酸的糖修饰(例如在2'位置或4'位置)或糖替代以及主链修饰可以包括磷酸二酯键的修饰或替代。环状多核糖核苷酸的具体实例包括但不限于包括经修饰的主链或非天然核苷间键(如核苷间修饰，包括磷酸二酯键的修饰或替代)的环状多核糖核苷酸。具有经修饰的主链的环状多核糖核苷酸尤其包括在主链中不具有磷原子的那些。出于本申请的目的，并且如本领域中有时提及的，在其核苷间主链中不具有磷原子的经修饰的RNA也可以被认为是寡核苷。在特定实施例中，环状多核糖核苷酸将包括在其核苷间主链中具有磷原子的核糖核苷酸。

经修饰的环状多核糖核苷酸或寡核苷酸主链可以包括，例如，硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其他烷基膦酸酯(如3'-亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯)、亚膦酸酯、氨基磷酸酯(如3'-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯)、硫羰基氨基磷酸酯(thionophosphoramidate)、硫羰烷基膦酸酯、硫羰烷基磷酸三酯、和具有正常3'-5'键的硼烷磷酸酯，这些的2'-5'连接的类似物，以及具有相反极性的那些，其中相邻的核苷单元对3'-5'至5'-3'或2'-5'至5'-2'连接。也包括各种盐、混合盐和游离酸形式。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸可以带负电荷或带正电荷。

可掺入环状多核糖核苷酸或寡核苷酸中的经修饰的核苷酸可在核苷间键(例如磷酸酯主链)上被修饰。在此，在多核苷酸主链的上下文中，短语“磷酸酯”和“磷酸二酯”可互换使用。可以通过用不同的取代基替代一个或多个氧原子来修饰主链磷酸酯基团。此外，经修饰的核苷和核苷酸可以包括用如本文所述的另一个核苷间键合进行的对未经修饰的磷酸酯部分的整体替代。经修饰的磷酸酯基团的实例包括但不限于硫代磷酸酯、亚磷酸硒酸酯、硼酸磷酸酯(boranophosphates/boranophosphate esters)、氢膦酸酯、氨基磷酸酯、二氨基磷酸酯、烷基或芳基膦酸酯和磷酸三酯。二硫代磷酸酯的两个非连接氧都被硫替代。也可通过用氮(桥连的氨基磷酸酯)、硫(桥连的硫代磷酸酯)和碳(桥连的亚甲基膦酸酯)替代连接氧来修饰磷酸酯接头。

提供a-硫代取代的磷酸酯部分以通过非天然硫代磷酸酯主链键赋予RNA和DNA聚合物稳定性。硫代磷酸酯DNA和RNA具有增强的核酸酶抗性，并因此在细胞环境中具有更长的半衰期。与环状多核糖核苷酸连接的硫代磷酸酯有望通过减弱细胞先天免疫分子的结合/激活来降低先天免疫应答。

在特定的实施例中，经修饰的核苷包括α-硫代-核苷(例如5'-O-(1-硫代磷酸)-腺苷、5'-O-(1-硫代磷酸)-胞苷(α-硫代胞苷)、5'-O-(1-硫代磷酸)-鸟苷、5'-O-(1-硫代磷酸)-尿苷或5'-O-(1-硫代磷酸)-假尿苷)。

本文中描述了可根据本发明所采用的其他核苷间键，包括不含有磷原子的核苷间键。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸或寡核苷酸可以包括一种或多种细胞毒性核苷。例如，细胞毒性核苷可以被掺入环状多核糖核苷酸中，如双功能修饰。细胞毒性核苷可以包括但不限于阿糖腺苷、5-氮杂胞苷、4'-硫代阿糖胞苷、环戊烯基胞嘧啶、克拉屈滨、氯法拉滨、阿糖胞苷、胞嘧啶阿糖胞苷、l-(2-C-氰基-2-脱氧-β-D-阿拉伯-戊呋喃糖基)-胞嘧啶、地西他滨、5-氟尿嘧啶、氟达拉滨、氟尿苷、吉西他滨、替加氟和尿嘧啶的组合、替加氟((RS)-5-氟-l-(四氢呋喃-2-基)嘧啶-2,4(lH,3H)-二酮)、曲沙他滨、替扎西他滨、2'-脱氧-2'-亚甲基胞苷(DMDC)和6-巯基嘌呤。其他实例包括氟达拉滨磷酸酯、N4-山嵛酰基-l-β-D-阿拉伯戊呋喃糖基胞嘧啶、N4-十八烷基-1-β-D-阿拉伯戊呋喃糖基胞嘧啶、N4-棕榈酰基-l-(2-C-氰基-2-脱氧-β-D-阿拉伯-戊呋喃糖基)胞嘧啶和P-4055(阿糖胞苷5'-花生酸酯)。

环状多核糖核苷酸或寡核苷酸可以沿着分子的整个长度均一地修饰或可以不如此。例如，一种或多种或所有类型的核苷酸(例如，天然存在的核苷酸、嘌呤或嘧啶，或A、G、U、C、I、pU中的任一种或多种或全部)在环状多核糖核苷酸或寡核苷酸中，或在其给定的预定序列区域中可以被均一地修饰或可以不如此。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸或寡核苷酸包括假尿苷。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸或寡核苷酸包括肌苷，相对于病毒RNA，肌苷可以帮助免疫系统将环状多核糖核苷酸表征为内源性。肌苷的掺入还可以介导改善RNA稳定性/减少降解。参见例如Yu,Z等人,(2015)RNA editing by ADAR1 marks dsRNAas“self”.[通过ADAR1进行的RNA编辑将dsRNA标记为“自身”]Cell Res[细胞研究].25,1283-1284，其通过援引以其全文并入本文。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸或寡核苷酸(或其给定序列区域)中的所有核苷酸均被修饰。在一些实施例中，修饰可以包括可增强表达的m6A；可减弱免疫应答的肌苷；可增加RNA稳定性或翻译通读(交错元件)的假尿苷；可增加稳定性的m5C；以及有助于亚细胞易位(例如，核定位)的2,2,7-三甲基鸟苷。

在环状多核糖核苷酸或寡核苷酸的各个位置上可以存在不同的糖修饰、核苷酸修饰和/或核苷间键合(例如主链结构)。本领域普通技术人员将理解，核苷酸类似物或其他一个或多个修饰可以位于环状多核糖核苷酸或寡核苷酸的任何一个或多个位置，使得环状多核糖核苷酸的功能基本上不降低。修饰也可以是非编码区域修饰。环状多核糖核苷酸或寡核苷酸可包含约1％至约100％的经修饰核苷酸(相对于总核苷酸含量，或相对于一种或多种类型的核苷酸，即A、G、U或C中的任何一种或多种)或任何中间百分比(例如，1％至20％>、1％至25％、1％至50％、1％至60％、1％至70％、1％至80％、1％至90％、1％至95％、10％至20％、10％至25％、10％至50％、10％至60％、10％至70％、10％到80％、10％至90％、10％至95％、10％至100％、20％至25％、20％至50％、20％至60％、20％至70％、20％至80％、20％至90％、20％至95％、20％至100％、50％至60％、50％至70％、50％至80％、50％至90％、50％至95％、50％至100％、70％至80％、70％至90％、70％至95％、70％至100％、80％至90％、80％至95％、80％至100％、90％至95％、90％至100％和95％至100％)。

生产方法

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括非天然存在的脱氧核糖核酸序列，并且可以使用重组技术(例如，使用DNA质粒体外衍生)或化学合成或其组合产生。

在本披露的范围内，用于产生RNA环的DNA分子可以包括天然存在的原始核酸序列的DNA序列、其修饰形式或编码通常未在自然中发现的合成多肽的DNA序列(例如，嵌合分子或融合蛋白)。DNA和RNA分子可以使用多种技术修饰，包括但不限于经典诱变技术和重组技术，如定点诱变、化学处理核酸分子以诱导突变、限制性酶裂解核酸片段、连接核酸片段、聚合酶链式反应(PCR)扩增和/或诱变核酸序列的选定区域、合成寡核苷酸混合物以及连接混合物基团以“建造”核酸分子混合物、及其组合。

在一些实施例中，线性初级构建体或线性mRNA可被环化或连环化以产生本文所述的环状多核糖核苷酸。环化或连环化的机制可以通过诸如夹板连接方法的方法来发生。新形成的5'-/3'-键可以是分子内键或分子间键。

制备本文所述的环状多核糖核苷酸的方法描述于以下中，例如，Khudyakov&Fields,Artificial DNA:Methods and Applications[人工DNA：方法与应用],CRC Press[CRC出版社](2002)；Zhao,Synthetic Biology:Tools and Applications[合成生物学：工具与应用](第一版),Academic Press[学术出版社](2013)；以及Egli和Herdewijn,Chemistry and Biology of Artificial Nucleic Acids[人工核酸的化学与生物学],(第一版),Wiley-VCH[威利-VCH出版社](2012)。

环化

在一些实施例中，用于环化的线性多核糖核苷酸可以被环化或连环化。在一些实施例中，用于环化的线性多核糖核苷酸可以在配制和/或递送之前在体外环化。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸可以是与线性多核糖核苷酸的混合物。在一些实施例中，线性多核糖核苷酸具有与环状多核糖核苷酸相同的核酸序列。

细胞外环化

在一些实施例中，使用化学方法环化或连环化用于环化的线性多核糖核苷酸以形成环状多核糖核苷酸。在一些化学方法中，核酸(例如，用于环化的线性多核糖核苷酸)的5'-末端和3'-末端包括化学反应性基团，当基团彼此靠近时，可在分子的3'-末端和5'-末端之间形成新的共价键。5'-端可以含有NHS酯反应性基团，且3'-端可以含有3'-氨基末端的核苷酸，使得在有机溶剂中，线性RNA分子3'-端上的3'-氨基末端的核苷酸将在5'-NHS-酯部分上经历亲核攻击，形成新的5'-/3'-酰胺键。

在一些实施例中，使用DNA或RNA连接酶将5'-磷酸化的核酸分子(例如，用于环化的线性多核糖核苷酸)酶促连接至核酸(例如，线性核酸)的3'-羟基，形成新的磷酸二酯键。在示例性反应中，根据制造商的方案，将用于环化的线性多核糖核苷酸与1-10单位的T4RNA连接酶(新英格兰生物学实验室公司(New England Biolabs)，马萨诸塞州伊普斯威奇(Ipswich,MA))在37℃下孵育1小时。连接反应可以在存在线性核酸时发生，该线性核酸能够与并列的5'-和3'-区域碱基配对，以辅助酶促连接反应。在一些实施例中，连接是夹板连接。例如，夹板连接酶，如连接酶，可用于夹板连接，即RNA连接酶II、T4 RNA连接酶或T4 DNA连接酶。对于夹板连接，单链多核苷酸(夹板)，如单链RNA，可以被设计成与线性多核糖核苷酸的两个末端杂交，使得在与单链夹板杂交时可以将两个末端并列。因此，夹板连接酶可以催化线性多核糖核苷酸并列的两个末端的连接，生成环状多核糖核苷酸。

在一些实施例中，DNA或RNA连接酶用于环状多核苷酸的合成。在一些实施例中，用于环化的线性多核糖核苷酸的5'-末端或3'-末端可编码连接酶核酶序列，使得在体外转录期间，所得用于环化的线性多核糖核苷酸包括活性核酶序列，该活性核酶序列能够连接用于环化的线性多核糖核苷酸的5'-末端至用于环化的线性多核糖核苷酸的3'-末端。连接酶核酶可以衍生自第I组内含子、丁型肝炎病毒、发夹核酶，或者可以通过SELEX(通过指数富集进行的配体系统进化)进行选择。核酶连接酶反应在0℃至37℃的温度下可能需要1小时至24小时。

在一些实施例中，可通过使用至少一个非核酸部分将用于环化的线性多核糖核苷酸环化或连环化。在一方面，该至少一个非核酸部分可与用于环化的线性多核糖核苷酸的5'末端附近和/或3'末端附近的区域或特征反应，以环化或连环化用于环化的线性多核糖核苷酸。在另一方面，该至少一个非核酸部分可以位于或连接至或邻近用于环化的线性多核糖核苷酸的5'末端和/或3'末端。设想的非核酸部分可以是同源或异源的。作为一个非限制性实例，非核酸部分可以是键，如疏水键、离子键、可生物降解的键和/或可裂解的键。作为另一个非限制性实例，非核酸部分是连接部分。作为又一个非限制性实例，非核酸部分可以是寡核苷酸或肽部分，诸如，如本文所述的适配体或非核酸接头。

在一些实施例中，使用IVT和RNA聚合酶合成用于环化的线性多核糖核苷酸，其中用于IVT的核苷酸混合物可以含有相对于三磷酸鸟苷过量的单磷酸鸟苷，以优先产生具有5'单磷酸的RNA；纯化的IVT产物可以使用夹板DNA环化。

在一些实施例中，用于环化的线性多核糖核苷酸由于非核酸部分而被环化或连环化，造成位于、邻近或连接至用于环化的线性多核糖核苷酸的5’端和3'端的原子、分子表面之间的吸引。作为一个非限制性实例，可通过分子间作用力或分子内作用力将一个或多个用于环化的线性多核糖核苷酸环化或连环化。分子间作用力的非限制性实例包括偶极-偶极力、偶极诱导偶极力、诱导偶极-诱导偶极力、范德华力和伦敦色散力。分子内作用力的非限制性实例包括共价键、金属键、离子键、共振键、抓氢键(agnostic bond)、偶极键、缀合、超缀合和反向键。

在一些实施例中，用于环化的线性多核糖核苷酸可在5'末端附近和3'末端附近包含核酶RNA序列。当序列暴露于核酶的其余部分时，核酶RNA序列可以共价地连接至肽。在一方面，共价连接至5'末端和3'末端附近的核酶RNA序列的肽可以彼此缔合，引起用于环化的线性多核糖核苷酸环化或连环化。在另一方面，肽共价地连接至核酶RNA序列5'末端和3'末端附近可以引起线性初级构建体或线性mRNA在使用本领域已知的方法(诸如但不限于蛋白连接)进行连接后环化或连环化。用于本发明的线性初级构建体或线性RNA中的核酶的非限制性实例，或掺入和/或共价地连接肽的方法的非穷举列表在美国专利申请号US20030082768中描述，该专利内容通过援引以其全文并入本文。

在一些实施例中，用于环化的线性多核糖核苷酸可以包括核酸的5'三磷酸，例如通过使5'三磷酸与RNA 5'焦磷酸水解酶(RppH)或ATP二磷酸水解酶(脱磷酸酶)接触使其转化为5'单磷酸。在一些实施例中，线性多核糖核苷酸的至少一部分的5’端包括单磷酸部分。在一些实施例中，使包括环状和线性多核糖核苷酸在内的多核糖核苷酸群体在用5'核酸外切酶和/或3'核酸外切酶消化线性多核糖核苷酸的至少一部分之前与RppH接触。替代性地，将用于环化的线性多核糖核苷酸的5'三磷酸转化为5'单磷酸可通过两步反应完成，该两步反应包括：(a)使用于环化的线性多核糖核苷酸的5'核苷酸与磷酸酶(例如，热敏磷酸酶、虾碱性磷酸酶或小牛肠磷酸酶)接触以除去所有三个磷酸；以及(b)在步骤(a)之后，使5'核苷酸与添加单个磷酸酯的激酶(例如，多核苷酸激酶)接触。

在一些实施例中，本文提供的环化方法的环化效率为至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或100％。在一些实施例中，本文提供的环化方法的环化效率为至少约40％。在一些实施例中，所提供的环化方法的环化效率是约10％至约100％；例如，环化效率可为约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％和约99％。在一些实施例中，环化效率是约20％至约80％。在一些实施例中，环化效率是约30％至约60％。在一些实施例中，环化效率为约40％。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含内部剪接元件，所述内部剪接元件在被复制时，剪接端部被连接在一起。一些实例包含具有剪接位点序列及短反向重复序列(30-40nt)的微型内含子(<100nt)，例如AluSq2、AluJr及AluSz、侧接内含子中的反向序列、侧接内含子中的Alu元件以及在接近反向剪接事件的(suptable4富集基序)顺式序列元件中发现的基序，例如带有侧接外显子的反向剪接位点(backsplice site)之前(上游)或之后(下游)200bp中的序列。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括至少一个本文其他处所述的重复核苷酸序列作为内部剪接元件。在此类实施例中，重复核苷酸序列可以包括来自Alu家族内含子的重复序列。在一些实施例中，剪接相关的核糖体结合蛋白质可调节环状多核糖核苷酸的生物发生(例如盲肌蛋白和震动蛋白(QKI)剪接因子)。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸可包含侧接环状多核糖核苷酸的头尾接合点处的规范的剪接位点。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸可包含隆起-螺旋-隆起基序，所述基序包含侧接两个3-核苷酸隆起的4-碱基对茎。裂解发生在隆起区域的一个位点处，生成末端为5'-羟基和2',3'-环状磷酸酯的特征片段。通过将5'-OH基团亲核攻击到形成3',5'-磷酸二酯桥的同一分子的2',3'-环状磷酸酯上来进行环化。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸可包含具有HPR元件的多聚重复RNA序列。HPR包含2',3'-环状磷酸酯和5'-OH末端。HPR元件自处理线性环状多核糖核苷酸的5’端和3'端，由此将端连接在一起。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸可包含介导自连接的序列。在一个实施例中，环状多核糖核苷酸可以包括HDV序列(例如，HDV复制结构域保守序列，GGCUCAUCUCGACAAGAGGCGGCAGUCCUCAGUA CUCUUACUCUUUUCUGUAAAGAGGAGACUGCUGGACUCGCCGCCCAAGUUCGAGCAUGAGCC(Beeharry等人2004)(SEQ ID NO:24)或GGCUAGAGGCGGCAGUCCUCAGUACUCUUACUCUUUUCUGUAAAG AGGAGACUGCUGGACUCGCCGCCCGAGCC(SEQ ID NO:25))，以进行自连接。在一个实施例中，环状多核糖核苷酸可包括环E序列(例如在PSTVd中)以进行自连接。在另一个实施例中，环状多核糖核苷酸可以包括自环化内含子，例如5'和3'剪接接合，或自环化催化内含子，如I型、II型或III型内含子。I型内含子自剪接序列的非限制性实例可包含衍生自T4噬菌体基因td的自剪接置换内含子-外显子序列以及四膜虫的插入序列(IVS)rRNA。

其他环化方法

在一些实施例中，用于环化的线性多核糖核苷酸可以包括互补序列，包括个体内含子内或侧接内含子内的重复或非重复核酸序列。重复核酸序列是在环状多核糖核苷酸的区段内出现的序列。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括重复核酸序列。在一些实施例中，重复核苷酸序列包括聚CA序列或聚UG序列。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括与环状多核糖核苷酸的另一区段中的互补重复核酸序列杂交的至少一个重复核酸序列，其杂交的区段形成内部双链。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括与环状多核糖核苷酸的另一区段中的互补重复核酸序列杂交的1至10个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9和10个)重复核酸序列，其杂交的区段形成内部双链。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括与环状多核糖核苷酸的另一区段中的互补重复核酸序列杂交的2个重复核酸序列，其杂交的区段形成内部双链。在一些实施例中，两个单独的环状多核糖核苷酸的重复核酸序列和互补重复核酸序列杂交以生成单个环化多核糖核苷酸，杂交的区段形成内部双链。在一些实施例中，互补序列位于用于环化的线性多核糖核苷酸的5’端和3'端。在一些实施例中，互补序列包括约3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多个配对的核苷酸。

在一些实施例中，环化化学方法可用于生成环状多核糖核苷酸。此类方法可以包括但不限于点击化学(例如，基于炔烃和叠氮化物的方法，或可点击的碱基)、烯烃复分解、氨基磷酸酯连接、半亚胺-亚胺交联、碱基修饰及其任何组合。

在一些实施例中，环化酶促方法可用于生成环状多核糖核苷酸。在一些实施例中，连接酶，例如DNA或RNA连接酶，可用于生成环状多核糖核苷酸或互补物的模板、环状多核糖核苷酸的互补链或环状多核糖核苷酸。

环状多核糖核苷酸的环化可以通过本领域已知的方法完成，例如，Petkovic和Muller,“RNA circularization strategies in vivo and in vitro[体内外RNA环化策略]”Nucleic Acids Res[核酸研究],2015,43(4):2454-2465，以及Muller和Appel,“Invitro circularization of RNA[RNA的体外环化]”RNA Biol[RNA生物学],2017,14(8):1018-1027中描述的那些方法。

环状多核糖核苷酸可编码可用于复制的序列和/或基序。在国际专利公开号WO2019/118919的段落[0280]-[0286]中描述了示例性复制元件，该专利公开特此通过援引以其全文并入。

在一些实施例中，线性环状多核糖核苷酸可以包括互补序列，包括个体内含子内或侧接内含子内的重复或非重复核酸序列。重复核酸序列是在环状多核糖核苷酸的区段内出现的序列。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括重复核酸序列。在一些实施例中，重复核苷酸序列包括聚CA序列或聚UG序列。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括与环状多核糖核苷酸的另一区段中的互补重复核酸序列杂交的至少一个重复核酸序列，其杂交的区段形成内部双链。在一些实施例中，两个单独的环状多核糖核苷酸的重复核酸序列和互补重复核酸序列杂交以生成单个环化多核糖核苷酸，杂交的区段形成内部双链。在一些实施例中，互补序列位于线性环状多核糖核苷酸的5'端和3'端。在一些实施例中，互补序列包括约3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多个配对的核苷酸。

在一些实施例中，环化化学方法可用于生成环状多核糖核苷酸。此类方法可以包括但不限于点击化学(例如，基于炔烃和叠氮化物的方法，或可点击的碱基)、烯烃复分解、氨基磷酸酯连接、半亚胺-亚胺交联、碱基修饰及其任何组合。

复制元件

环状多核糖核苷酸可编码可用于复制的序列和/或基序。环状多核糖核苷酸的复制可以通过生成互补的环状多核糖核苷酸来发生。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含起始转录的基序，其中转录由环状多核糖核苷酸编码的内源性细胞机制(DNA依赖性RNA聚合酶)或RNA依赖性RNA聚合酶驱动。滚环转录事件的产物可被核酶切割，以生成单位长度的互补或增殖环状多核糖核苷酸。核酶可由环状多核糖核苷酸、其互补体或由反式RNA序列编码。在一些实施例中，编码的核酶可包含调节(抑制或促进)核酶的活性以控制环状RNA增殖的序列或基序。在一些实施例中，单位长度序列可通过细胞RNA连接酶连接成环状形式。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含有助于自扩增的复制元件。此类复制元件的实例包括但不限于本文别处描述的HDV复制结构域、马铃薯纺锤块茎类病毒的RNA启动子(参见例如Kolonko 2005Virology[病毒学])、以及具有复制能力的环状RNA有义和/或反义核酶，例如反基因组5’-CGGGUCGGC AUGGCAUCUCCACCUCCUCGCGGUCCGACCUGGGCAUCCGAAGGA GGACGCACGUCCACUCGGAUGGCUAAGGGAGAGCCA-3’(SEQ ID NO:26)或基因组5’-UGGCCGGCAUGGUCCCAGCCUCCUCGCUGGCG CCGGCUGGGCAACAUUCCGAGGGGACCGUCCCCUCGGUAAUGGCG AAUGGGACCCA-3’(SEQ ID NO:27)。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含如本文中所述的至少一个交错元件以帮助复制。环状多核糖核苷酸中的交错元件可以将环状多核糖核苷酸复制所得的长转录物切割至特定长度，其后可以环化以形成环状多核糖核苷酸的互补物。

在另一个实施例中，环状多核糖核苷酸包含至少一个核酶序列，以将环状多核糖核苷酸复制所得的长转录物切割至特定长度，其中另一种编码的核酶在核酶序列处切割转录物。环化形成环状多核糖核苷酸的互补物。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸基本上对例如核酸外切酶的降解有抗性。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸在细胞内进行复制。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸在细胞内的复制速率是在约10％-20％、20％-30％、30％-40％、40％-50％、50％-60％、60％-70％、70％-75％、75％-80％、80％-85％、85％-90％、90％-95％、95％-99％或其之间的任何百分比。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸在细胞内复制并传递给子细胞。在一些实施例中，细胞以至少25％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或99％的效率将至少一种环状多核糖核苷酸传递至子细胞。在一些实施例中，正经历减数分裂的细胞以至少25％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或99％的效率将环状多核糖核苷酸传递至子细胞。在一些实施例中，正经历有丝分裂的细胞以至少25％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或99％的效率将环状多核糖核苷酸传递至子细胞。

在一些实施例中，环状多核糖核苷酸在宿主细胞内进行复制。在一个实施例中，环状多核糖核苷酸能够在哺乳动物细胞(例如，人细胞)中进行复制。

虽然在一些实施例中，环状多核糖核苷酸在宿主细胞中进行复制，但环状多核糖核苷酸未整合到宿主的基因组中，例如未与宿主的染色体进行整合。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸具有例如与宿主的染色体的可忽略的重组频率。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸例如与宿主的染色体的重组频率例如小于约1.0cM/Mb、0.9cM/Mb、0.8cM/Mb、0.7cM/Mb、0.6cM/Mb、0.5cM/Mb、0.4cM/Mb、0.3cM/Mb、0.2cM/Mb、0.1cM/Mb或更低。

线性和环状RNA的检测

药物环状RNA制剂中线性RNA的存在可能具有意想不到的且有时不期望的影响。因此，可以相对于线性RNA富集、分离和/或纯化环状RNA；可以监测、评价和/或控制线性RNA的方法(例如，制造环状RNA制剂的方法)；以及使用此类药物组合物和制剂的方法。在一些实施例中，环状RNA制剂具有不超过阈值水平的线性RNA，例如环状RNA制剂相对于线性RNA经富集或经纯化以减少线性RNA。在一些实施例中，富集环状多核糖核苷酸群体，使得环状多核糖核苷酸和线性多核糖核苷酸的混合物包含阈值水平的环状多核糖核苷酸。

通常，药物制剂中元素的检测和定量包括使用参考标准品，该参考标准品是目的组分(例如，环状RNA、线性RNA、片段、杂质等)或是类似材料(例如，使用与环状RNA结构相同序列的线性RNA结构作为环状RNA的标准品)；或包括使用内标或来自测试样品的信号。在一些实施例中，标准品用于建立检测器对已知或相对量的材料的响应(响应因子)。在一些实施例中，响应因子是从一个或多个浓度的标准品确定的(例如，使用线性回归分析)。在一些实施例中，然后使用响应因子来从由于目的材料引起的信号确定该组分量。在一些实施例中，响应因子是值1或假设具有值1。

在一些实施例中，使用与环状多核糖核苷酸的线性形式的比较来确定药物组合物中线性相对于环状RNA的检测和定量。在一些实施例中，药物组合物中总核糖核苷酸的质量使用标准曲线确定，该标准曲线使用环状多核糖核苷酸的线性形式并且假设响应因子为1而生成。在一些实施例中，药物制剂中环状多核糖核苷酸的w/w百分比通过以下方式来确定：将通过多种已知量的环状多核糖核苷酸的线性形式的条带强度生成的标准曲线与药物制剂中环状多核糖核苷酸的条带强度进行比较。在一些实施例中，条带在基于凝胶的电泳期间产生，并且条带强度通过凝胶成像仪(例如，E-凝胶成像仪)来测量。在一些实施例中，当如本文所述评价时，环状多核糖核苷酸制剂包含小于阈值量(例如，其中阈值量是参考标准，例如关于环状多核糖核苷酸制剂的药物放行规格)的线性多核糖核苷酸分子。

在一些实施例中，药物组合物中带切口RNA相对于总RNA的检测和定量通过在凝胶提取包含环状RNA的制剂之后测序来确定。在一些实施例中，药物组合物中带切口RNA相对于线性RNA的检测和定量通过在凝胶提取包含环状RNA的制剂之后测序来确定。在一些实施例中，当如本文所述评价时，环状多核糖核苷酸制剂包含小于阈值量(例如，其中阈值量是参考标准，例如关于环状多核糖核苷酸制剂的药物放行规格)的带切口RNA、线性RNA或组合的线性和带切口RNA。例如，关于制剂中存在的线性多核糖核苷酸分子的量的参考标准是相对于制剂中的总核糖核苷酸分子不超过30％、20％、15％、10％、1％、0.5％或0.1％、或其间的任何百分比的线性多核糖核苷酸分子。在一些实施例中，关于制剂中存在的带切口多核糖核苷酸分子的量的参考标准是相对于制剂中的总核糖核苷酸分子不超过30％、20％、15％、10％、1％、0.5％或0.1％、或其间的任何百分比的带切口多核糖核苷酸分子。在一些实施例中，关于制剂中存在的线性和带切口多核糖核苷酸分子的量的参考标准是相对于制剂中的总核糖核苷酸分子不超过40％、30％、20％、15％、10％、1％、0.5％或0.1％、或其间的任何百分比的组合的线性多核糖核苷酸分子和带切口多核糖核苷酸分子。

在一些实施例中，将标准品在与样品相同的条件下运行。例如，使用与样品相同类型的凝胶、相同的缓冲液和相同的暴露来运行标准品。在进一步的实施例中，将标准品与样品平行运行。在一些实施例中，在来自主题制剂的多个样品中重复(例如，两次或一式三份)对元素的定量以获得平均结果。在一些实施例中，对线性RNA的定量使用平行毛细管电泳(例如，使用具有UV检测的片段分析仪或分析型HPLC)测量。

可替代地，为了测量存在的线性和环状RNA的量，使用两组引物进行qPCR逆转录(RT-qPCR)：一组跨连接位点，另一组是ORF特异性的。跨连接位点的引物报告环状RNA的水平，而ORF特异性的引物报告环状和线性RNA的水平。在一些实施例中，根据制造商的说明，使用逆转录酶(例如，Super-Script II:RNA酶H；英杰公司)和随机六聚体进行逆转录反应。在一些实施例中，使用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析扩增的PCR产物并通过溴化乙锭染色可视化。在一些实施例中，为了估计环状多核糖核苷酸的富集因子，可以使用光密度测定法对PCR产物进行定量，并且可以通过UV吸光度来测量总RNA样品的浓度。

其他实施例

在不脱离本发明的范围和精神的情况下，本发明所述的组合物、方法和用途的各种修改和变化对本领域技术人员将是显而易见的。虽已结合具体实施例描述了本发明，但应当理解，所要求的发明不应当过度地局限于此类具体实施例。事实上，对于本领域技术人员显而易见的用于进行本发明的所述方式的各种修改旨在落入本发明的范围内。

所有出版物、专利和专利申请均通过援引以其全文并入本文，其程度如同特别且单独地指出将每个单独的出版物、专利或专利申请通过援引以其全文并入一样。

实例

提出旨在说明而非限制本披露的以下实例，以向本领域普通技术人员提供可以如何使用、实现和评价本文所述的组合物和方法的描述。这些实例旨在仅是本披露的示例，而无意限制发明人视为其发明的内容范围。

实例1：用于线性多核糖核苷酸降解的核酸外切酶浓度的优化

此实例表明5'和3'核酸外切酶可用于降解线性多核糖核苷酸。

在此实验中，用0U、0.5U、0.625U、1U、1.25U、2.5U或5U的RNA酶R(3'核酸外切酶)在37℃下消化2.5μg编码高斯荧光素酶(gLuc)的线性多核糖核苷酸90分钟。每次消化均在Terminator^TMA缓冲液(鲁西基公司(Lucigen))中进行，用EDTA淬灭并通过凝胶电泳进行分析。TBE-脲凝胶用SYBR Safe染色并在iBright成像仪(英杰公司(Invitrogen))上成像。该实验的结果表明，线性多核糖核苷酸被3'核酸外切酶RNA酶R降解(图1)。选择0.5U的RNA酶R/1μg RNA并用于实例5和7(图6、8-10)。

在此实验中，用0U、0.025U、0.03U、0.05U、0.0625U、0.125U或0.25U的Terminator^TM核酸外切酶(5'核酸外切酶)在37℃下消化2.5μg编码gLuc的线性多核糖核苷酸60分钟。每次消化均在Terminator^TMA缓冲液(鲁西基公司(Lucigen))中进行，用EDTA淬灭并通过凝胶电泳进行分析。TBE-脲凝胶用SYBR Safe染色并在iBright成像仪(英杰公司(Invitrogen))上成像。该实验的结果表明，线性多核糖核苷酸被Terminator^TM5'核酸外切酶降解(图2)。选择0.025U的Terminator^TM核酸外切酶/1μg RNA并用于实例5和7(图6、8-10)。

在此实验中，用0U、0.025U、0.03U、0.05U、0.0625U、0.125U或0.25U的Xrn-1(5'核酸外切酶)在37℃下消化2.5μg编码gLuc的线性多核糖核苷酸60分钟。每次消化均在Terminator^TMA缓冲液(鲁西基公司(Lucigen))中进行，用EDTA淬灭并通过凝胶电泳进行分析。TBE-脲凝胶用SYBR Safe染色并在iBright成像仪(英杰公司(Invitrogen))上成像。该实验的结果表明，线性多核糖核苷酸被5'核酸外切酶Xrn-1降解(图3)。选择0.05U的Xrn-1/1μg RNA并用于实例5和7(图6、8-10)。

此实例1证明5'和3'核酸外切酶降解线性多核糖核苷酸。

实例2：编码高斯荧光素酶的环状多核糖核苷酸的体外产生

此实例描述了环状多核糖核苷酸的体外产生。

环状多核糖核苷酸设计带有IRES和编码高斯荧光素酶(GLuc)的ORF，以及IRES-ORF侧翼的两个间隔子元件。使用以下两种方法之一使用体外合成(IVT)生成环状多核糖核苷酸。

在第一种方法中，使用T7 RNA聚合酶通过IVT从具有上述元件的DNA片段合成未修饰的线性多核糖核苷酸。转录的多核糖核苷酸用RNA纯化系统(新英格兰生物学实验室公司(New England Biolabs,Inc.))纯化，按照制造商的说明用RNA5'磷酸水解酶(RppH)(新英格兰生物学实验室公司，M0356)处理，并再次用RNA纯化系统纯化。使用夹板DNA将RppH处理的线性多核糖核苷酸环化。

在第二种方法中，使用T7 RNA聚合酶通过IVT从具有上述元件的DNA片段合成未修饰的线性多核苷酸。用于IVT的核苷酸混合物含有相对于三磷酸鸟苷过量的单磷酸鸟苷，以优先产生具有5'单磷酸的RNA。按照制造商的说明，用RNA纯化系统(新英格兰生物学实验室公司)纯化转录的多核糖核苷酸。纯化的IVT产物使用夹板DNA进行环化。

通过分裂连接生成环状多核糖核苷酸，如下：将转录的线性多核糖核苷酸和DNA夹板(5’-GTTTTTCGGCTATTCCCAATAGCCGTTTTG-3’；SEQ ID NO:1)混合并退火并用RNA连接酶处理以产生连接后多核糖核苷酸混合物。环化反应的副产物是未反应的线性多核糖核苷酸。

实例3：使用5'和3'核酸外切酶的组合选择性降解线性多核糖核苷酸

此实例表明5'和3'核酸外切酶的组合可用于选择性降解线性多核糖核苷酸。

为了降解环化反应后未反应的线性多核糖核苷酸，使用了5'核酸外切酶和3'核酸外切酶的组合。在此实例中，将2.5μg包括如实例2中所述产生的环状和线性多核糖核苷酸的连接后多核糖核苷酸混合物用0.5U的Terminator^TM5'核酸外切酶和1U、2U、4U、6U、8U或10U的3'核酸外切酶RNA酶R在37℃消化90分钟。每次消化均在Terminator^TMA缓冲液(鲁西基公司(Lucigen))中进行，用EDTA淬灭并通过凝胶电泳进行分析。TBE-脲凝胶用SYBR Safe染色并在iBright成像仪(英杰公司(Invitrogen))上成像。通过Image Lab分析用核酸酶外切消化后为环状多核糖核苷酸的总多核糖核苷酸的百分比(％环状)和用核酸外切酶消化后与连接后存在的环状多核糖核苷酸的量相比剩余的环状多核糖核苷酸的百分比(％剩余)。此实例的结果显示5’和3’核酸外切酶的组合选择性地降解连接后多核糖核苷酸混合物中的线性多核糖核苷酸(图4)。

实例4：使用5'和3'核酸外切酶的组合富集环状多核糖核苷酸

此实例表明，可以在规模放大反应中使用5'和3'核酸外切酶的组合来富集环状多核糖核苷酸。

在此实例中，将如实例2中所述产生的1mg连接后多核糖核苷酸混合物用4000U的RNA酶R和200U的Terminator^TM核酸外切酶在37℃下相伴消化60分钟。消化均在Terminator^TMA缓冲液中进行，用EDTA淬灭并通过凝胶电泳进行分析。TBE-脲凝胶用SYBRSafe染色并在iBright成像仪(英杰公司(Invitrogen))上成像。通过Image Lab分析用核酸酶外切消化后为环状多核糖核苷酸的总多核糖核苷酸的百分比(％环状)和用核酸外切酶消化后与连接后存在的环状多核糖核苷酸的量相比剩余的环状多核糖核苷酸的百分比(％剩余)。此实例的结果表明，使用5’和3’核酸外切酶的组合富集了连接后多核糖核苷酸混合物中的环状多核糖核苷酸(图5)。

实例5：使用降低浓度的5'和3'核酸外切酶富集环状多核糖核苷酸

此实例表明，可以使用降低浓度的5'和3'核酸外切酶的组合来富集环状多核糖核苷酸。

在此实例中，将如实例2中所述产生的2.5μg连接后多核糖核苷酸混合物用(i)1.25U的RNA酶R和0.0625U的Terminator^TM核酸外切酶；或(ii)1.25U RNA酶R和0.0625U的Xrn-1在Terminator^TMA缓冲液中在37℃下相伴消化60分钟。每次消化均用EDTA淬灭并通过凝胶电泳进行分析。TBE-脲凝胶用SYBR Safe染色并在iBright成像仪(英杰公司)上成像。通过Image Lab分析用核酸酶外切消化后为环状多核糖核苷酸的总多核糖核苷酸的百分比(％环状)和用核酸外切酶消化后与连接后存在的环状多核糖核苷酸的量相比剩余的环状多核糖核苷酸的百分比(％剩余)。此实例的结果表明，用优化浓度的5'和3'核酸外切酶相伴消化选择性降解连接后多核糖核苷酸混合物中的线性多核糖核苷酸，产生富集的环状多核糖核苷酸制剂(图6)。

实例6：使用5'和3'核酸外切酶的组合富集环状多核糖核苷酸

此实例比较了用于富集环状多核糖核苷酸的5'和3'核酸外切酶的两种不同组合。

在此实例中，将如实例2中所述产生的2.5μg连接后多核糖核苷酸混合物用0.5U的RNA酶R(鲁西基公司或MC实验室(MC Labs))和0.025U的Terminator^TM(鲁西基公司)核酸外切酶/1μg RNA；或(ii)0.5U RNA酶R(鲁西基公司或MC实验室)和0.2U Xrn-1(新英格兰实验室)/1μg RNA在Terminator^TMA缓冲液中在37℃相伴消化60分钟。每次消化均用EDTA淬灭并通过凝胶电泳进行分析。TBE-脲凝胶用SYBR Safe染色并在iBright成像仪(英杰公司(Invitrogen))上成像。通过Image Lab分析用核酸酶外切消化后为环状多核糖核苷酸的总多核糖核苷酸的百分比(％环状)和用核酸外切酶消化后与连接后存在的环状多核糖核苷酸的量相比剩余的环状多核糖核苷酸的百分比(％剩余)。

如图7显示了此实例的结果(泳道1：NEB ssRNA梯；泳道2：2.5μg未处理的连接后混合物；泳道3：2.5μg用RNA酶R+Terminator^TM核酸外切酶处理的连接后混合物；泳道4：2.5μg用RNA酶R(鲁西基公司)+Xrn-1核酸外切酶处理的连接后混合物；泳道5：2.5μg用Xrn-1处理的连接后混合物；泳道6：2.5μg仅用Terminator^TM处理的连接后混合物；泳道7：2.5μg仅用RNA酶R(鲁西基公司)处理的连接后混合物；泳道8：2.5μg用Terminator^TM核酸外切酶和RNA酶R(MC实验室)处理的连接后混合物；泳道9：2.5μg用Xrn-1和RNA酶R(MC实验室)处理的连接后混合物；泳道：10：2.5μg用RNA酶R(MC实验室)处理的连接后混合物。连接后多核糖核苷酸混合物由64％环状多核糖核苷酸组成(泳道2)。用RNA酶R和Terminator^TM核酸外切酶消化后，连接后多核糖核苷酸混合物中的环状多核糖核苷酸富集至80％(泳道3和泳道8)环状多核糖核苷酸。用RNA酶R+Xrn-1消化后，连接后多核糖核苷酸混合物中的环状多核糖核苷酸用鲁西基公司RNA酶R富集至76％(泳道4)，用MC实验室RNA酶R富集至81％(泳道9)。仅单独使用Xrn-1或Terminator^TM核酸外切酶时，环状多核糖核苷酸的连接后混合物分别富集至69％(泳道5)或74％(泳道7)。当仅单独使用鲁西基公司RNA酶R或MC实验室RNA酶R时，环状多核糖核苷酸的连接后混合物分别富集至61％(泳道6)或74％(泳道10)。

实例7.鉴定用于富集环状多核糖核苷酸的核酸外切酶反应时间

此实例比较了用用于富集环状多核糖核苷酸的5'和3'核酸外切酶消化线性多核糖核苷酸的反应时间。

在此实验中，将如实例2中所述产生的3.75μg连接后多核糖核苷酸混合物用(i)15U RNA酶R和1.5U Terminator^TM核酸外切酶在Terminator^TM A缓冲液中相伴消化：反应在37℃下进行15、30、45、60、75、90、105或120分钟。每次消化均用EDTA淬灭并通过凝胶电泳进行分析。TBE-脲凝胶用SYBR Safe染色并在iBright成像仪(英杰公司(Invitrogen))上成像。通过Image Lab分析环状多核糖核苷酸的百分比。此实例的结果显示，反应时间≤90分钟导致在连接后且用核酸外切酶消化之前剩余的至少50％的环状多核糖核苷酸在用5’和3’核酸外切酶两者消化之后仍然剩余。此实例的结果还显示，反应时间≥15分钟导致所得的总多核糖核酸包括至少80％环状多核糖核苷酸。测试的每个反应时间的结果总结于表2中。

表2.用5'和3'核酸外切酶消化不同反应时间后环状多核糖核苷酸的富集

实例8：用于环状多核糖核苷酸富集的缓冲液条件的鉴定

此实例描述了使用5'和3'核酸外切酶的组合来鉴定用于富集环状多核糖核苷酸的缓冲液条件。

实验1

在此实验中，将如实例2中所述产生的2.5μg连接后多核糖核苷酸混合物用(i)1.25U的RNA酶R和0.0625U的Terminator^TM核酸外切酶；或(ii)1.25U的RNA酶R和0.0625U的Xrn-1在37℃下在以下缓冲液之一相伴消化60分钟：

缓冲液T：Terminator^TMA缓冲液(鲁西基公司；专有)

缓冲液1：100mM NaCl、50mM Tris-HCl(pH 8)

缓冲液2：100mM NaCl、50mM Tris-HCl(pH 8)、0.5mM MgCl₂

缓冲液3：100mM NaCl、50mM Tris-HCl(pH 8)、1mM DTT

缓冲液4：100mM NaCl、50mM Tris-HCl(pH 8)、0.5mM MgCl₂、1mM DTT

作为对照，将如实例2中所述产生的2.5μg连接后多核糖核苷酸混合物也在缓冲液1、缓冲液2、缓冲液3或缓冲液4中混合且不进行核酸外切酶消化(缓冲液对照)。每次消化均用EDTA淬灭并通过凝胶电泳进行分析。TBE-脲凝胶用SYBR Safe染色并在iBright成像仪(英杰公司(Invitrogen))上成像。通过Image Lab分析用核酸酶外切消化后为环状多核糖核苷酸的总多核糖核苷酸的百分比(％环状)和用核酸外切酶消化后与连接后存在的环状多核糖核苷酸的量相比剩余的环状多核糖核苷酸的百分比(％剩余)。

图8显示在各种缓冲液和相应缓冲液对照中使用Terminator^TM核酸外切酶和RNA酶R的组合消化的结果(泳道1：NEB ssRNA梯；泳道2：Terminator^TMA缓冲液(Terminator^TM+RNA酶R)；泳道3：缓冲液1对照(无核酸外切酶消化)；泳道4：缓冲液1(Terminator^TM+RNA酶R)；泳道5：缓冲液2对照(无核酸外切酶消化)；泳道6：缓冲液2(Terminator^TM+RNA酶R)；泳道7：缓冲液3对照(无核酸外切酶消化)；泳道8：缓冲液3(Terminator^TM+RNA酶R)；泳道9：缓冲液4对照(无核酸外切酶消化)；泳道10：缓冲液4(Terminator^TM+RNA酶R))。使用缓冲液2中的Terminator^TM核酸外切酶和RNA酶R组合消化后，连接后多核糖核苷酸混合物中的环状多核糖核苷酸富集至83％(泳道6)。

图9显示在各种缓冲液和相应缓冲液对照中使用Xrn-1和RNA酶R的组合消化的结果(泳道1：NEB ssRNA梯；泳道2：Terminator^TMA缓冲液(Xrn-1+RNA酶R)；泳道3：缓冲液1对照(无核酸外切酶消化)；泳道4：缓冲液1(Xrn-1+RNA酶R)；泳道5：缓冲液2对照(无核酸外切酶消化)；泳道6：缓冲液2(Xrn-1+RNA酶R)；泳道7：缓冲液3对照(无核酸外切酶消化)；泳道8：缓冲液3(Xrn-1+RNA酶R)；泳道9：缓冲液4对照(无核酸外切酶消化)；泳道10：缓冲液4(Xrn-1+RNA酶R))。这些结果表明，使用缓冲液2中的Xrn-1和RNA酶R组合消化后，连接后多核糖核苷酸混合物中的环状多核糖核苷酸富集至85％(泳道6)。

实验2

在此实验中，将如实例2中所述制备的2.5μg连接后多核糖核苷酸混合物用0.0625U的Xrn-1和1.25U的RNA酶R在以下缓冲液之一中在37℃下相伴消化60分钟：

Terminator^TMA缓冲液(鲁西基公司；专有)

Xrn-1缓冲液(100mM NaCl、50mM Tris-HCl、10mM MgCl2、1mM DTT；pH 7.9)

RNA酶R缓冲液(鲁西基公司)(100mM KCl、20mM Tris-HCl(pH8)、0.1mM MgCl2)

缓冲液2：100mM NaCl、50mM Tris-HCl(pH 8)、0.5mM MgCl2

作为对照，将如实例2中所述产生的2.5μg连接后多核糖核苷酸混合物也在每种缓冲液中混合且不进行核酸外切酶消化(缓冲液对照)。每次消化均用EDTA淬灭并通过凝胶电泳进行分析。TBE-脲凝胶用SYBR Safe染色并在iBright成像仪(英杰公司(Invitrogen))上成像。通过Image Lab分析用核酸酶外切消化后为环状多核糖核苷酸的总多核糖核苷酸的百分比(％环状)和用核酸外切酶消化后与连接后存在的环状多核糖核苷酸的量相比剩余的环状多核糖核苷酸的百分比(％剩余)。图10显示在各种缓冲液和相应缓冲液对照中使用Xrn-1和RNA酶R的组合消化的结果(泳道1：NEB ssRNA梯；泳道2：Terminator^TMA缓冲液对照(无核酸外切酶)；泳道3：Terminator^TMA缓冲液(Xrn-1+RNA酶R)；泳道4：Xrn-1缓冲液对照(无核酸外切酶消化)；泳道5：Xrn-1缓冲液(Xrn-1+RNA酶R)；泳道6：RNA酶R缓冲液对照(无核酸外切酶消化)；泳道7：RNA酶R缓冲液(Xrn-1+RNA酶R)；泳道8：缓冲液2对照(无核酸外切酶消化)；泳道9：缓冲液2(Xrn-1+RNA酶R)。这些结果表明，使用RNA酶R缓冲液2中的Xrn-1和RNA酶R组合消化后，连接后多核糖核苷酸混合物中的环状多核糖核苷酸富集至87％(泳道7)。使用缓冲液2中的Xrn-1和RNA酶R组合消化后，连接后多核糖核苷酸混合物中的环状多核糖核苷酸富集至85％(泳道9)。

实例9：从富集的环状RNA中体外表达高斯荧光素酶

此实例表明，使用双核酸外切酶富集的环状多核糖核苷酸表达的GLuc的水平与使用反相色谱法不使用双核酸外切酶纯化的环状多核糖核苷酸相当。

为了产生双核酸外切酶，将反相纯化的样品，即如实例2中所述产生的连接后多核糖核苷酸混合物用0.025U的Terminator^TM核酸外切酶/1μg RNA和0.5U的RNA酶R/1μg RNA在37℃相伴消化60分钟。用EDTA淬灭消化并通过反相色谱纯化。经过色谱和缓冲液交换后，通过体外表达测试纯化的环状多核糖核苷酸的表达。

为了产生反相纯化的样品，通过反相色谱法纯化连接后多核糖核苷酸混合物。经过色谱和缓冲液交换后，通过体外表达测试纯化的环状多核糖核苷酸的表达。

使用转染试剂(Lipofectamine MessengerMax(赛默飞世尔公司，LMRNA015))用0.1pmol纯化的环状多核糖核苷酸转染HeLa细胞(10,000个)。在6小时、24小时、48小时和72小时通过使用高斯荧光素酶活性测定(Pierce高斯荧光素酶快速测定试剂盒(16159))测量高斯荧光素酶的活性来分析上清液。

此实例表明从富集的环状RNA成功表达蛋白(图11)。

实例10：不同分子量的环状多核糖核苷酸的选择性富集

此实例展示了使用5'和3'核酸外切酶的组合选择性富集各种分子量大小的环状多核糖核苷酸的能力。

在此实例中，将150.0μg各种多核糖核苷酸与0.625U的RNA酶R和0.0625U的Terminator^TM核酸外切酶/1μg RNA在缓冲液2中于37℃相伴消化60分钟。对于所评估的每个编码的多核糖核苷酸ORF而言，分子量不同。RNA1-RNA6中的每个都是相同的环状多核糖核苷酸，具有不同大小的表达序列，分子量从左到右递增，范围从小于1.2kb到大于5.4kb。在每种情况下，消化均用EDTA淬灭，并通过阴离子交换高效液相色谱(AEX-HPLC)进行分析。将用核酸外切酶消化后为环状多核糖核苷酸的总多核糖核苷酸的百分比(％环状多核糖核苷酸)与消化前混合物的环状多核糖核苷酸的百分比进行比较。如图12显示了此实例选择性富集尺寸小于1.2kb、尺寸范围为1.2-1.4kb、1.4-1.6kb、3.5-4.5kb、4.5-5.4kb和大于5.4kb的环状多核糖核苷酸的结果。消化前总多核糖核苷酸的环状群体经测定分别为71.4％、59.0％、64.1％、21.9％、21.2％和17.6％。用RNA酶R和Terminator^TM消化后，发现这些相同多核糖核苷酸的环状群体分别富集至86.0％、79.4％、80.2％、32.0％、48.9％和25.7％。

实例11：使用5'和3'核酸外切酶的各种组合富集环状多核糖核苷酸

此实例展示了使用5'和3'核酸外切酶的四种组合选择性富集环状多核糖核苷酸群体的能力

在本实施例中，150.0μg多核糖核苷酸用(i)0.625U的RNA酶R(a)和0.0625U的Terminator^TM；(ii)0.625U RNA酶R(a)和0.0625U的Xrn-1；(iii)0.625U的RNA酶R(b)和0.0625U的Terminator^TM；或(iv)0.625U的RNA酶R(b)和0.0625U的Xrn-1核酸外切酶/1μgRNA在37℃相伴消化60分钟。每次消化均用EDTA淬灭，并通过阴离子交换高效液相色谱(AEX-HPLC)进行分析。将用核酸外切酶消化后为环状多核糖核苷酸的总多核糖核苷酸的百分比(％环状多核糖核苷酸)与消化前环状多核糖核苷酸的百分比进行比较。此实例的结果表明，可以用5'和3'核酸外切酶的各种组合来实现环状多核糖核苷酸种类的选择性富集。如图13显示使用(i)RNA酶R(a)和Terminator^TM；(ii)RNA酶R(a)和Xrn-1；(iii)RNA酶R(b)和Terminator^TM；以及(iv)RNA酶R(b)和Xrn-1的相伴消化的结果。在共消化过程之前，IVT后多核糖核苷酸混合物中环状多核糖核苷酸的百分比仅为18.2％。相伴消化后，发现环状多核糖核苷酸的百分比分别为富集至(i)36.0％±0.91％；(ii)39.0％±0.03％；(iii)30.2％±0.70％；以及(iv)36.5％±2.23％。

序列表

<110> 旗舰创业创新第六有限责任公司（Flagship Pioneering Innovations VI,LLC）

<120> 富集环状多核糖核苷酸的方法

<130> 51509-034WO2

<150> US 63/190,060

<151> 2021-05-18

<160> 27

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 1

Cys Ala Ala Thr Cys Gly Ala Cys Gly Gly Thr Cys Cys Cys Cys Cys

1 5 10 15

Thr Ala Gly Ala Ala Gly Ala Thr Ala Thr Gly Cys Thr Gly

20 25 30

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (2)..(2)

<223> Xaa是Val或Ile

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (4)..(4)

<223> Xaa是任何氨基酸

<400> 2

Asp Xaa Glu Xaa Asn Pro Gly Pro

1 5

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 3

Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro

1 5

<210> 4

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 4

Gly Asp Ile Glu Glu Asn Pro Gly Pro

1 5

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 5

Val Glu Pro Asn Pro Gly Pro

1 5

<210> 6

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 6

Ile Glu Thr Asn Pro Gly Pro

1 5

<210> 7

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 7

Gly Asp Ile Glu Ser Asn Pro Gly Pro

1 5

<210> 8

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 8

Gly Asp Val Glu Leu Asn Pro Gly Pro

1 5

<210> 9

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 9

Gly Asp Ile Glu Thr Asn Pro Gly Pro

1 5

<210> 10

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 10

Gly Asp Val Glu Asn Pro Gly Pro

1 5

<210> 11

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 11

Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro

1 5

<210> 12

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 12

Gly Asp Val Glu Gln Asn Pro Gly Pro

1 5

<210> 13

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 13

Ile Glu Ser Asn Pro Gly Pro

1 5

<210> 14

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 14

Gly Asp Ile Glu Leu Asn Pro Gly Pro

1 5

<210> 15

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 15

His Asp Ile Glu Thr Asn Pro Gly Pro

1 5

<210> 16

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 16

His Asp Val Glu Thr Asn Pro Gly Pro

1 5

<210> 17

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 17

His Asp Val Glu Met Asn Pro Gly Pro

1 5

<210> 18

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 18

Gly Asp Met Glu Ser Asn Pro Gly Pro

1 5

<210> 19

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 19

Gly Asp Val Glu Thr Asn Pro Gly Pro

1 5

<210> 20

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 20

Gly Asp Ile Glu Gln Asn Pro Gly Pro

1 5

<210> 21

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 21

Asp Ser Glu Phe Asn Pro Gly Pro

1 5

<210> 22

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (1)..(1)

<223> Xaa是不存在或Gly或His

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (2)..(2)

<223> Xaa是不存在或Asp或Gly

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (3)..(3)

<223> Xaa是Asp或Val或Ile或Ser或Met

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (5)..(5)

<223> Xaa是任何氨基酸

<400> 22

Xaa Xaa Xaa Glu Xaa Asn Pro Gly Pro

1 5

<210> 23

<211> 9

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(3)

<223> r是a或g

<400> 23

ccrccaugg 9

<210> 24

<211> 96

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 24

ggcucaucuc gacaagaggc ggcaguccuc aguacucuua cucuuuucug uaaagaggag 60

acugcuggac ucgccgccca aguucgagca ugagcc 96

<210> 25

<211> 74

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 25

ggcuagaggc ggcaguccuc aguacucuua cucuuuucug uaaagaggag acugcuggac 60

ucgccgcccg agcc 74

<210> 26

<211> 90

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 26

cgggucggca uggcaucucc accuccucgc gguccgaccu gggcauccga aggaggacgc 60

acguccacuc ggauggcuaa gggagagcca 90

<210> 27

<211> 88

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 27

uggccggcau ggucccagcc uccucgcugg cgccggcugg gcaacauucc gaggggaccg 60

uccccucggu aauggcgaau gggaccca 88

Claims (48)

1.一种产生富集的环状多核糖核苷酸群体的方法，所述方法包括：

(a)提供包含环状多核糖核苷酸和线性多核糖核苷酸的多核糖核苷酸群体；

(b)用0.01U至0.2U/1μg多核糖核苷酸的量的5’核酸外切酶消化所述线性多核糖核苷酸的至少一部分；并且

(c)用0.4U至4U/1μg多核糖核苷酸的量的3’核酸外切酶消化所述线性多核糖核苷酸的至少一部分；

从而产生富集的环状多核糖核苷酸群体。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述线性多核糖核苷酸的至少一部分的5’端包含单磷酸部分。

3.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中消化步骤(b)在步骤(c)之前进行。

4.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述消化步骤(b)在步骤(c)之后进行。

5.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中消化步骤(b)和(c)相伴进行。

6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述5'核酸外切酶是5'-磷酸依赖性核酸外切酶。

7.如权利要求6所述的方法，其中所述5'核酸外切酶是Xrn-1。

8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述3'核酸外切酶是RNA酶R。

9.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述3'核酸外切酶是核酸外切酶T。

10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中消化步骤(b)进行30分钟至90分钟。

11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中消化步骤(c)进行30分钟至90分钟。

12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述消化步骤(b)在约37℃的温度下进行。

13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述消化步骤(c)在约37℃的温度下进行。

14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中消化步骤(b)和(c)在包含Mg²⁺的消化缓冲液中进行。

15.如权利要求14所述的方法，其中所述消化缓冲液中的Mg²⁺具有0.05mM至1mM的浓度。

16.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其中消化步骤(b)和(c)在包含二硫苏糖醇的消化缓冲液中进行。

17.如权利要求16所述的方法，其中所述二硫苏糖醇具有0.1mM至5mM的浓度。

18.如权利要求1至17中任一项所述的方法，其中步骤(b)的5'核酸外切酶的量是0.012U至0.1U/1μg多核糖核苷酸。

19.如权利要求18所述的方法，其中步骤(b)的5'核酸外切酶的量是0.025U/1μg多核糖核苷酸。

20.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其中步骤(c)的3'核酸外切酶的量是0.4U至2U/1μg多核糖核苷酸。

21.如权利要求20所述的方法，其中步骤(c)的3'核酸外切酶的量是0.5U/1μg多核糖核苷酸。

22.如权利要求1-21中任一项所述的方法，其中，在消化步骤(b)和(c)之后，所述环状多核糖核苷酸的百分比(w/w)是总多核苷酸的40％至95％。

23.如权利要求22所述的方法，其中，在消化步骤(b)和(c)之后，所述环状多核糖核苷酸的百分比(w/w)是总多核苷酸的60％至90％。

24.如权利要求23所述的方法，其中，在消化步骤(b)和(c)之后，所述环状多核糖核苷酸的百分比(w/w)是总核苷酸的70％至90％。

25.如权利要求1-24中任一项所述的方法，其中，在消化步骤(b)和(c)之后，环状多核糖核苷酸的总产率百分比(w/w)是70％至100％。

26.一种产生富集的环状多核糖核苷酸群体的方法，所述方法包括：

(a)提供包含环状多核糖核苷酸和线性多核糖核苷酸的多核糖核苷酸群体；

(b)用5'核酸外切酶消化所述线性多核糖核苷酸的至少一部分，并且

(c)用3'核酸外切酶消化所述线性多核糖核苷酸的至少一部分，

其中消化步骤(b)和(c)在包含0.05mM至1mM Mg²⁺和/或0.1mM至5mM二硫苏糖醇的消化缓冲液中进行；

从而产生富集的环状多核糖核苷酸群体。

27.如权利要求26所述的方法，其中消化步骤(b)在步骤(c)之前进行。

28.如权利要求26所述的方法，其中所述消化步骤(b)在步骤(c)之后进行。

29.如权利要求26所述的方法，其中消化步骤(b)和(c)相伴进行。

30.如权利要求26-29中任一项所述的方法，其中所述5'核酸外切酶的量是0.01U至0.2U/1μg多核糖核苷酸。

31.如权利要求26-30中任一项所述的方法，其中所述3'核酸外切酶的量是0.4U至4U/1μg多核糖核苷酸。

32.如权利要求26-31中任一项所述的方法，其中所述线性多核糖核苷酸的至少一部分的5’端包含单磷酸部分。

33.如权利要求26-32中任一项所述的方法，其中所述5'核酸外切酶是5'-磷酸依赖性核酸外切酶。

34.如权利要求33所述的方法，其中所述5'核酸外切酶是Xrn-1。

35.如权利要求26-34中任一项所述的方法，其中所述3'核酸外切酶是RNA酶R。

36.如权利要求26-34中任一项所述的方法，其中所述3'核酸外切酶是核酸外切酶T。

37.如权利要求26-36中任一项所述的方法，其中消化步骤(b)进行30分钟至90分钟。

38.如权利要求26-37中任一项所述的方法，其中消化步骤(c)进行30分钟至90分钟。

39.如权利要求26-38中任一项所述的方法，其中所述消化步骤(b)在约37℃的温度下进行。

40.如权利要求26-39中任一项所述的方法，其中所述消化步骤(c)在约37℃的温度下进行。

41.如权利要求26-40中任一项所述的方法，其中步骤(b)的5'核酸外切酶的量是0.012U至0.1U/1μg多核糖核苷酸。

42.如权利要求41所述的方法，其中步骤(b)的5'核酸外切酶的量是0.025U/1μg多核糖核苷酸。

43.如权利要求26-42中任一项所述的方法，其中步骤(c)的3'核酸外切酶的量是0.4U至2U/1μg多核糖核苷酸。

44.如权利要求43所述的方法，其中步骤(c)的3'核酸外切酶的量是0.5U/1μg多核糖核苷酸。

45.如权利要求26-44中任一项所述的方法，其中，在消化步骤(b)和(c)之后，所述环状多核糖核苷酸的百分比(w/w)是总多核苷酸的40％至95％。

46.如权利要求45所述的方法，其中，在消化步骤(b)和(c)之后，所述环状多核糖核苷酸的百分比(w/w)是总多核苷酸的60％至90％。

47.如权利要求46所述的方法，其中，在消化步骤(b)和(c)之后，所述环状多核糖核苷酸的百分比(w/w)是总核苷酸的70％至90％。

48.如权利要求26-47中任一项所述的方法，其中，在消化步骤(b)和(c)之后，环状多核糖核苷酸的总产率百分比(w/w)是70％至100％。