KR20210135265A - 원형 폴리리보뉴클레오티드 및 그의 약제학적 조성물 - Google Patents

원형 폴리리보뉴클레오티드 및 그의 약제학적 조성물 Download PDF

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아박 카흐베지안
니콜라스 맥카트니 플러기스
뵈르 알렉산드라 소피 드
캐서린 시푸엔테스-로자스
기영 백
마이클 도나토 멜피
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플래그쉽 파이어니어링 이노베이션스 브이아이, 엘엘씨
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Abstract

본 발명은 일반적으로 원형 폴리리보뉴클레오티드의 약제학적 조성물 및 제제, 및 그의 용도에 관한 것이다.

Description

원형 폴리리보뉴클레오티드 및 그의 약제학적 조성물
상호 참조
본 출원은 2019년 3월 4일자 출원된 미국 가출원 제62/813,666호, 2019년 3월 28일자 출원된 미국 가출원 제62/825,683호, 2019년 4월 29일자 출원된 미국 가출원 제62/840,174호 및 2020년 1월 29일자 출원된 미국 가출원 제62/967,545호의 이익을 주장하며, 이의 전체 내용은 참조로 포함된다.
배경기술
특정 원형 폴리리보뉴클레오티드는 건강한 개체의 조직 및 세포를 포함하는 인간 조직 및 세포에 편재한다.
본 개시내용은 특정의 또는 감소된 양의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자를 갖는 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 약제학적 조성물 또는 제제, 및 그에 관련된 방법을 제공한다. 본 발명자들은 원형 폴리리보뉴클레오티드 약제학적 조성물 또는 제제 내의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자를 원형 폴리리보뉴클레오티드 약제학적 조성물 또는 제제로부터 검출하고/검출하거나 모니터링하고/모니터링하거나 제어하여야, 예를 들어, 감소시키거나 정제하여야 하는 것을 발견하였다.
약제학적 제제
일 양태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 약제학적 제제는 특정 방법에 의해 측정되는 경우 미리결정된 임계값 미만인 수준의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자를 포함하며, 예를 들어, 제제는 약제 출하 규격(pharmaceutical release specification)을 만족시키는 수준의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자를 포함하며, 예를 들어, 제제는 본원에 하기에 기술된 규격(예를 들어, w/v 규격 또는 w/w 규격)을 만족시키는 수준의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자를 포함한다. 일부 경우에, 규격은 특정 방법에 의해 측정되는 경우, 검출 한계 미만의 수준일 수 있다.
또 다른 양태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 약제학적 제제는 1 ng/㎖, 5 ng/㎖, 10 ng/㎖, 15 ng/㎖, 20 ng/㎖, 25 ng/㎖, 30 ng/㎖, 35 ng/㎖, 40 ng/㎖, 50 ng/㎖, 60 ng/㎖, 70 ng/㎖, 80 ng/㎖, 90 ng/㎖, 100 ng/㎖, 200 ng/㎖, 300 ng/㎖, 400 ng/㎖, 500 ng/㎖, 600 ng/㎖, 1 ㎍/ ㎖, 10 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖, 200 g/㎖, 300 ㎍/㎖, 400 ㎍/㎖, 500 ㎍/㎖, 600 ㎍/㎖, 700 ㎍/㎖, 800 ㎍/㎖, 900 ㎍/㎖, 1 ㎎/㎖, 1.5 ㎎/㎖ 또는 2 ㎎/㎖ 이하의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자를 포함한다.
또 다른 양태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 약제학적 제제는 약제학적 제제 내의 총 리보뉴클레오티드 분자에 비하여 적어도 30%(w/w), 40%(w/w), 50%(w/w), 60%(w/w), 70%(w/w), 80%(w/w), 85%(w/w), 90%(w/w), 91%(w/w), 92%(w/w), 93%(w/w), 94%(w/w), 95%(w/w), 96%(w/w), 97%(w/w), 98%(w/w), 99%(w/w), 99.1%(w/w), 99.2%(w/w), 99.3%(w/w), 99.4%(w/w), 99.5%(w/w), 99.6%(w/w), 99.7%(w/w), 99.8%(w/w), 99.9%(w/w) 또는 100%(w/w)의 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 약제학적 제제 내의 총 리보뉴클레오티드 분자의 적어도 30%(w/w), 40%(w/w), 50%(w/w), 60%(w/w), 70%(w/w), 80%(w/w), 85%(w/w), 90%(w/w), 91%(w/w), 92%(w/w), 93%(w/w), 94%(w/w), 95%(w/w), 96%(w/w), 97%(w/w), 98%(w/w), 99%(w/w), 99.1%(w/w), 99.2%(w/w), 99.3%(w/w), 99.4%(w/w), 99.5%(w/w), 99.6%(w/w), 99.7%(w/w), 99.8%(w/w), 99.9%(w/w) 또는 100%(w/w)는 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자이다. 일부 실시형태에서, 약제학적 제제 내의 총 리보뉴클레오티드 분자의 적어도 91%(w/w), 92%(w/w), 93%(w/w), 94%(w/w), 95%(w/w), 96%(w/w), 97%(w/w), 98%(w/w) 또는 99%(w/w)는 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자이다.
또 다른 양태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 약제학적 제제는 정제 단계(들) 이전의 제제 내의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 수준에 비하여 정제 단계 이후에(예를 들어, 하나의 또는 복수의 정제 단계 이후에) 적어도 30%(w/w), 적어도 40%(w/w), 적어도 50%(w/w), 적어도 60%(w/w), 적어도 70%(w/w), 적어도 80%(w/w), 적어도 90%(w/w) 또는 적어도 95%(w/w) 감소된 수준의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자를 갖는다.
또 다른 양태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 약제학적 제제는 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자, 및 약제학적 제제 내의 총 리보뉴클레오티드 분자의 5%(w/w) 이하의 닉킹된 폴리리보뉴클레오티드 분자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약제학적 제제 내의 총 리보뉴클레오티드 분자의 9%(w/w), 8%(w/w), 7%(w/w), 6%(w/w), 5%(w/w), 4%(w/w), 3%(w/w), 2%(w/w), 1%(w/w) 또는 0.5%(w/w) 이하의 닉킹된 폴리리보뉴클레오티드 분자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약제학적 제제 내의 총 리보뉴클레오티드 분자의 2%(w/w) 이하의 닉킹된 폴리리보뉴클레오티드 분자를 포함한다.
또 다른 양태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 약제학적 제제는 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자, 및 제제 내의 총 리보뉴클레오티드 분자의 0.5%(w/w), 1%(w/w), 2%(w/w), 3%(w/w), 4%(w/w), 5%(w/w), 6%(w/w), 7%(w/w), 8%(w/w), 9%(w/w) 또는 10%(w/w) 이하의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자를 포함한다.
상기 열거된 각각의 양태의 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 약제학적 제제는 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자, 및 제제 내의 총 리보뉴클레오티드 분자의 0.5%(w/w), 1%(w/w), 2%(w/w) 또는 5%(w/w) 이하의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자를 포함한다.
상기 열거된 각각의 양태의 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자는 발현 생성물(들), 예를 들어, 치료적 발현 생성물을 인코딩하는, 예를 들어, 치료적 단백질 또는 핵산을 인코딩하는 서열 또는 복수의 서열을 포함한다. 상기 열거된 각각의 양태의 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자는 스캐폴드(예를 들어, 압타머 서열)를 포함하는 서열 또는 복수의 서열을 포함한다.
상기 열거된 각각의 양태의 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 약제학적 제제 내의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 수준은 현미경관찰법, 분광광도법, 형광측정법, 변성 우레아 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 영상화, UV-Vis 분광광도법, RNA 전기영동, RNAse H 분석, UV 분광 또는 형광 검출기, 광 산란 기법, HPLC를 포함하는 분리 방법의 이용과 함께 또는 이것 없이 표면 플라스몬 공명(SPR)을 포함하는 임의의 적합한 방법에 의해, 분리-전 또는 분리-후 유도체화 방법의 이용과 함께 또는 이것 없이 HPLC, 칩 또는 겔 기반의 전기영동에 의해, 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 검출을 위해 은 또는 염료 염색 또는 방사성 붕괴를 사용하는 검출 방법 또는 현미경관찰법, 가시적 방법 또는 분광광도계를 사용하는 방법 또는 그의 임의의 조합을 사용하여 측정될 수 있다.
상기 열거된 각각의 양태의 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 약제학적 제제는 또한 약제학적 제제가 선형 폴리리보뉴클레오티드를 감소시키기 위한 농축 또는 정제 단계(또는 복수의 정제 단계)를 겪는 경우 정제 단계(들) 이전에 비하여, 대상체로의 투여 후에 감소된 면역 또는 염증 반응의 하나 이상의 마커(들)의 수준을 생성한다. 일부 실시형태에서, 면역 또는 염증 반응의 하나 이상의 마커(들)는 사이토카인 또는 면역원성 관련 유전자의 발현이다. 일부 실시형태에서, 면역 또는 염증 반응의 하나 이상의 마커(들)는 RIG-I, MDA5, PKR, IFN-베타, OAS 및 OASL로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자의 발현이다.
상기 열거된 각각의 양태의 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 약제학적 제제는 추가로 불순물, 예를 들어, 공정-관련 불순물 또는 제품-관련 물질이 실질적으로 없다. 일부 실시형태에서, 공정-관련 불순물은 단백질(예를 들어, 세포 단백질, 예컨대 숙주 세포 단백질), 데옥시리보핵산(예를 들어, 세포 데옥시리보핵산, 예컨대 숙주 세포 데옥시리보핵산), 모노데옥시리보뉴클레오티드 또는 디데옥시리보뉴클레오티드 분자, 효소(예를 들어, 뉴클레아제 또는 리가제), 시약 성분, 겔 성분 또는 크로마토그래피 물질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 불순물은 하기로부터 선택된다: 완충제 시약, 리가제, 뉴클레아제(예를 들어, 엑소뉴클레아제 또는 엔도뉴클레아제), RNase 저해제, RNase R, 데옥시리보뉴클레오티드 분자, 아크릴아미드 겔 잔해(debris) 및 모노데옥시리보뉴클레오티드 분자. 일부 실시형태에서, 약제학적 제제는 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자 밀리그램(㎎)당 0.1 ng, 1 ng, 5 ng, 10 ng, 15 ng, 20 ng, 25 ng, 30 ng, 35 ng, 40 ng, 50 ng, 60 ng, 70 ng, 80 ng, 90 ng, 100 ng, 200 ng, 300 ng, 400 ng 또는 500 ng 미만의 단백질 오염의 단백질 오염을 포함한다.
상기 열거된 각각의 양태의 일부 실시형태에서, 약제학적 제제는 추가로 약제학적 불순물 또는 오염물질이 실질적으로 없으며, 예를 들어, 약제학적 제제는 리물루스 변형세포 용해물(Limulus amebocyte lysate) 시험에 의해 측정하여, 10 EU/㎏ 미만의 내독소를 포함하거나, 내독소가 결여된다. 일부 실시형태에서, 약제학적 제제는 멸균 이전에 100 CFU/100 ㎖ 미만 또는 10 CFU/100 ㎖ 미만의 바이오버든(bioburden)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 약제학적 제제는 멸균 약제학적 제제이다. 일부 실시형태에서, 멸균 약제학적 제제는 무균 조건 하에서 시험되는 경우 100개 미만의 생존 가능한 미생물의 성장을 지원한다. 일부 실시형태에서, 약제학적 제제는 본 출원의 출원일 현재 공개된 미국 약전 71장(USP <71>)의 표준을 만족한다. 일부 실시형태에서, 약제학적 제제는 본 출원의 출원일 현재 공개된 미국 약전 85장(USP <85>)의 표준을 만족한다.
상기 열거된 각각의 양태의 일부 실시형태에서, 제제의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자는 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자 대응물 또는 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자 대응물의 단편을 포함한다. 상기 열거된 각각의 양태의 일부 실시형태에서, 제제의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자는 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자 대응물(예를 들어, 사전-원형화된 버전)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자는 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자 대응물 또는 그의 단편, 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자 비-대응물 또는 그의 단편 또는 그의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자는 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자 대응물(예를 들어, 사전-원형화된 버전), 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자 비-대응물 또는 그의 조합을 포함한다. 상기 열거된 각각의 양태의 일부 실시형태에서, 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자 단편은 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 20개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개, 100개, 200개, 300개, 400개, 500개, 1000개, 2000개, 3000개, 4000개, 5000개, 6000개, 7000개, 8000개, 9000개, 10000개, 11000개, 12000개 또는 그 초과의 뉴클레오티드 길이 또는 그 사이의 임의의 뉴클레오티드 수인 단편이다.
상기 열거된 각각의 양태의 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자는 준-나선 구조를 포함한다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자는 준-이중 가닥 이차 구조를 포함한다. 상기 열거된 각각의 양태의 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자는 하나 이상의 발현 서열 및 적어도 하나의 발현 서열의 3' 말단에 스태거(stagger) 요소를 포함한다. 상기 열거된 각각의 양태의 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자는 하나 이상의 압타머 서열을 포함한다. 상기 열거된 각각의 양태의 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자는 내인성 또는 천연 발생 원형 폴리리보뉴클레오티드 서열을 인코딩하는 서열을 갖는다.
상기 열거된 각각의 양태의 일부 실시형태에서, 약제학적 제제는 최종 원형 폴리리보뉴클레오티드 약물 제품의 중간체 약제학적 제제이다. 일부 실시형태에서, 약제학적 제제는 약물 물질 또는 활성 약제학적 성분(API)이다. 일부 실시형태에서, 약제학적 제제는 대상체로의 투여를 위한 약물 제품이다.
상기 열거된 각각의 양태의 일부 실시형태에서, 약제학적 제제는 적어도 0.1 ng/㎖, 0.5 ng/㎖, 1 ng/㎖, 5 ng/㎖, 10 ng/㎖, 50 ng/㎖, 0.1 ㎍/㎖, 0.5 ㎍/㎖, 1 ㎍/㎖, 2 ㎍/㎖, 5 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖, 20 ㎍/㎖, 30 ㎍/㎖, 40 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 60 ㎍/㎖, 70 ㎍/㎖, 80 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖, 200 ㎍/㎖, 300 ㎍/㎖, 500 ㎍/㎖, 1 ㎎/㎖, 2 ㎎/㎖, 3 ㎎/㎖, 4 ㎎/㎖, 5 ㎎/㎖, 10 ㎎/㎖, 100 ㎎/㎖, 200 ㎎/㎖ 또는 500 ㎎/㎖의 농도의 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자를 포함한다.
상기 열거된 각각의 양태의 일부 실시형태에서, 약제학적 제제는 0개의 DNA를 포함하거나, DNA가 실질적으로 없거나, 1 pg/㎖, 10 pg/㎖, 0.1 ng/㎖, 1 ng/㎖, 5 ng/㎖, 10 ng/㎖, 15 ng/㎖, 20 ng/㎖, 25 ng/㎖, 30 ng/㎖, 35 ng/㎖, 40 ng/㎖, 50 ng/㎖, 60 ng/㎖, 70 ng/㎖, 80 ng/㎖, 90 ng/㎖, 100 ng/㎖, 200 ng/㎖, 300 ng/㎖, 400 ng/㎖, 500 ng/㎖ 또는 1 ㎍/㎖ 이하의 DNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, DNA는 모노데옥시리보뉴클레오티드, 디데옥시리보뉴클레오티드 분자, 폴리데옥시리보뉴클레오티드 분자 또는 그의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 약제학적 제제는 분광광도계에 의해 측정하여 약 1.6 내지 2.3의 A260/A280 흡광도 비를 갖는다. 일부 실시형태에서, 약제학적 제제의 DNA 농도는 뉴클레오시드를 분해하는 효소에 의한 전체 DNA 분해 후에 정량적 액체 크로마토그래피-질량 분석법(LC-MS)에 의해 측정되며, DNA의 함량은 LC-MS에 의해 측정하여 각각의 염기(즉, A, C, G, T)의 표준 곡선으로부터 역 계산된다.
상기 열거된 각각의 양태의 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자에 비한 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 양은 실시예 2 또는 실시예 3의 방법을 사용하여 결정된다. 일부 실시형태에서, 약제학적 제제 내의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 양은 실시예 2의 방법을 사용하여 결정된다. 일부 실시형태에서, 약제학적 제제 내의 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 양은 실시예 3의 방법을 사용하여 결정된다.
폴리리보뉴클레오티드의 약제학적 제제의 제조 방법
또 다른 양태에서, 약제학적 조성물의 제조 방법은 하기를 포함한다: a) 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 제제를 제공하는 단계, b) 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 양을 감소시키도록 제제를 처리하는 단계, c) 선택적으로 처리 단계 이전에, 그 동안 및/또는 그 이후에 제제 내의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 양을 평가하는 단계, 및 d) 약제학적 이용을 위한 약제학적 조성물을 생성하도록 제제를 추가로 처리하는 단계. 일부 실시형태에서, 단계 d)의 추가의 처리는 하기 중 하나 이상을 포함한다: i) DNA 및/또는 단백질(예를 들어, 세포 단백질, 예컨대 숙주 세포 단백질) 및/또는 내독소를 실질적으로 제거하도록 제제를 처리하는 것; ii) 제제 내의 DNA 및/또는 단백질(예를 들어, 세포 단백질, 예컨대 숙주 세포 단백질) 및/또는 내독소의 양을 평가하는 것; iii) 제제를 약제학적 부형제를 사용하여 제형화하는 것; 및 iv) 선택적으로, 제제를 농축시키는 것.
또 다른 양태에서, 약제학적 약물 물질의 제조 방법은 하기를 포함한다: a) 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 제제를 제공하는 단계, b) 제제 내의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 양을 평가하는 단계, 및 c) 제제가 제제에 존재하는 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 양에 대한 참조 기준(예를 들어, 약제 출하 기준, 예를 들어, 본원에 기술된 약제 출하 기준 또는 참조 기준)을 만족하면, 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 제제를 약제학적 약물 물질로서 처리하는 단계.
또 다른 양태에서, 약제학적 약물 물질의 제조 방법은 하기를 포함한다: a) 복수의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자를 제공하는 단계; b) 복수의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자를 원형화시켜, 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 제제를 제공하는 단계; c) 제제에 남아 있는 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 양을 평가하는 단계; 및 d) 제제가 제제에 존재하는 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 양에 대한 참조 기준을 만족하면, 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 제제를 약제학적 약물 물질로서 처리하는 단계.
또 다른 양태에서, 약제학적 약물 물질의 제조 방법은 a) 복수의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자를 제공하는 단계; b) 복수의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자를 원형화시켜, 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 제제를 제공하는 단계; c) 제제에 남아 있는 선형 및/또는 닉킹된 폴리리보뉴클레오티드 분자의 양을 평가하는 단계; 및 d) 제제가 제제에 존재하는 선형 및/또는 닉킹된 폴리리보뉴클레오티드 분자의 양에 대한 참조 기준을 만족하면, 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 제제를 약제학적 약물 물질로서 처리하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 약제학적 약물 제품의 제조 방법은 하기를 포함한다: a) 복수의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자를 제공하는 단계; b) 복수의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자를 원형화시켜, 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 제제를 제공하는 단계; c) 제제 내의 선형 및/또는 닉킹된 폴리리보뉴클레오티드 분자의 양을 측정하는 단계; d) 제제가 제제에 존재하는 선형 및/또는 닉킹된 폴리리보뉴클레오티드 분자의 양에 대한 참조 기준을 만족하면, 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 제제를 약제학적 약물 제품으로서 제형화하는 단계; 및 e) 약제학적 약물 제품이 약제학적 약물 제품에 존재하는 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 양에 대한 참조 기준을 만족하면, 약제학적 약물 제품을 표지하고, 운송하는 단계.
또 다른 양태에서, 약제학적 약물 제품의 제조 방법은 하기를 포함한다: a) 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 제제를 제공하는 단계, b) 제제가 제제에 존재하는 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 양에 대한 참조 기준을 만족하면, 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 제제를 약제학적 약물 제품으로서 제형화하는 단계, c) 약제학적 약물 제품의 시료 내의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 양을 측정하는 단계, 및 d) 약제학적 약물 제품이 약제학적 약물 제품에 존재하는 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 양에 대한 참조 기준을 만족하면, 약제학적 약물 제품을 제형화하고/제형화하거나, 표지하고/표지하거나 운송하는 단계.
또 다른 양태에서, 약제학적 약물 제품의 제조 방법은 하기를 포함한다: a) 복수의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자를 제공하는 단계; b) 복수의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자를 원형화시켜, 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 제제를 제공하는 단계; c) 제제 내의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 양을 측정하는 단계; d) 제제가 제제에 존재하는 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 양에 대한 참조 기준을 만족하면, 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 제제를 약제학적 약물 제품으로서 제형화하는 단계; 및 e) 약제학적 약물 제품이 약제학적 약물 제품에 존재하는 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 양에 대한 참조 기준을 만족하면, 약제학적 약물 제품을 표지하고 운송하는 단계.
또 다른 양태에서, 약제학적 조성물의 제조 방법은 하기를 포함한다: a) 복수의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자를 제공하는 단계; b) 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자를 원형화시켜, 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 제제를 제공하는 단계; c) 제제에 남아 있는 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자를 실질적으로 제거하도록 제제를 처리하는 단계; d) 선택적으로, 처리 단계 후에 남아 있는 제제 내의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 양을 평가하는 단계; 및 e) 약제학적 이용을 위한 약제학적 조성물을 생성하도록 제제를 추가로 처리하는 단계. 일부 실시형태에서, 당해 방법은 f) 데옥시리보뉴클레오티드 분자를 실질적으로 제거하도록 제제를 처리하는 단계; g) 제제 내의 데옥시리보뉴클레오티드 분자의 양을 평가하는 단계; h) 제제를 약제학적 부형제를 사용하여 제형화하는 단계; i) 제제를 농축시키는 단계; 및 j) 제제 내의 데옥시리보뉴클레오티드 분자의 양을 프린트(print) 또는 디지털 매체에 기록하는 단계 중 하나 이상을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 당해 방법은 하기를 추가로 포함한다: f) 단백질 오염을 실질적으로 제거하도록 제제를 처리하는 단계; g) 제제 내의 단백질 오염의 양을 평가하는 단계; h) 제제를 약제학적 부형제를 사용하여 제형화하는 단계; 및 i) 제제를 농축시키는 단계. 일부 실시형태에서, 단계 d)의 추가의 단계는 하기 중 하나 이상을 포함한다: f) 내독소를 실질적으로 제거하도록 제제를 처리하는 단계; g) 제제 내의 내독소의 양을 평가하는 단계; h) 제제를 약제학적 부형제를 사용하여 제형화하는 단계; 및 i) 제제를 농축시키는 단계.
상기 양태의 각각의 일부 실시형태에서, 원형화시키는 단계는 스플린트 라이게이션(splint ligation)에 의해 수행된다. 상기 양태의 각각의 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 제제를 제형화시키는 단계는 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 제제를 약제학적 부형제와 조합하는 것을 포함한다.
상기 양태의 각각의 일부 실시형태에서, 당해 방법은 제제 내의 폴리리보뉴클레오티드 분자(예를 들어, 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자 및/또는 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자)의 양을 프린트 또는 디지털 매체에, 예를 들어, 제제에 대한 분석 증명서에 기록하는 단계를 추가로 포함한다.
상기 양태의 각각의 일부 실시형태에서, 제형화하는 단계는 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 제제를 약제학적 부형제와 조합하는 것을 포함한다.
상기 양태의 각각의 일부 실시형태에서, 참조 기준은 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 제제에 대한 약제 출하 규격이다. 예를 들어, 참조 기준은 하기 중 하나 이상일 수 있다: (a) 약제학적 제제에 존재하는 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 양이 특정 양, 예를 들어, 1 ng/㎖, 5 ng/㎖, 10 ng/㎖, 15 ng/㎖, 20 ng/㎖, 25 ng/㎖, 30 ng/㎖, 35 ng/㎖, 40 ng/㎖, 50 ng/㎖, 60 ng/㎖, 70 ng/㎖, 80 ng/㎖, 90 ng/㎖, 100 ng/㎖, 200 ng/㎖, 300 ng/㎖, 400 ng/㎖, 500 ng/㎖, 600 ng/㎖, 1 ㎍/㎖, 5 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖, 200 ㎍/㎖, 300 ㎍/㎖, 400 ㎍/㎖, 500 ㎍/㎖, 600 ㎍/㎖, 700 ㎍/㎖, 800 ㎍/㎖, 900 ㎍/㎖, 1 ㎎/㎖, 1.5 ㎎/㎖, 2 ㎎/㎖, 5 ㎎/㎖, 10 ㎎/㎖, 50 ㎎/㎖, 100 ㎎/㎖, 200 ㎎/㎖, 300 ㎎/㎖, 400 ㎎/㎖, 500 ㎎/㎖, 600 ㎎/㎖, 700 ㎎/㎖ 또는 750 ㎎/㎖ 이하의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자임; (b) 약제학적 약물 제품 또는 약제학적 약물 물질이 적어도 특정 양, 예를 들어, 0.1 ng/㎖, 0.5 ng/㎖, 1 ng/㎖, 5 ng/㎖, 10 ng/㎖, 50 ng/㎖, 0.1 ㎍/㎖, 0.5 ㎍/㎖,1 ㎍/㎖, 2 ㎍/㎖, 5 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖, 20 ㎍/㎖, 30 ㎍/㎖, 40 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 60 ㎍/㎖, 70 ㎍/㎖, 80 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖, 200 ㎍/㎖, 300 ㎍/㎖, 500 ㎍/㎖, 1 ㎎/㎖, 2 ㎎/㎖, 3 ㎎/㎖, 5 ㎎/㎖, 10 ㎎/㎖, 100 ㎎/㎖, 200 ㎎/㎖, 500 ㎎/㎖, 600 ㎎/㎖, 700 ㎎/㎖ 또는 750 ㎎/㎖의 농도의 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자를 포함함; 또는 (c) 약제학적 약물 제품 또는 약제학적 약물 물질이 약제학적 제제 내의 총 리보뉴클레오티드 분자에 비하여 적어도 특정 양, 예를 들어, 적어도 30%(w/w), 40%(w/w), 50%(w/w), 60%(w/w), 70%(w/w), 80%(w/w), 85%(w/w), 90%(w/w), 91%(w/w), 92%(w/w), 93%(w/w), 94%(w/w), 95%(w/w), 96%(w/w), 97%(w/w), 98%(w/w), 99%(w/w), 99.1%(w/w), 99.2%(w/w), 99.3%(w/w), 99.4%(w/w), 99.5%(w/w), 99.6%(w/w), 99.7%(w/w), 99.8%(w/w), 99.9%(w/w) 또는 100%(w/w)의 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자를 포함함.
상기 양태의 각각의 일부 실시형태에서, 제제에 존재하는 선형 및/또는 닉킹된 폴리리보뉴클레오티드 분자의 양에 대한 참조 기준은 하기로부터 선택된다: a) 제제 내의 총 리보뉴클레오티드 분자에 비하여 20%, 15%, 10%, 5%, 2%, 1% 또는 0.5%(w/w) 이하의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자; b) 제제 내의 총 리보뉴클레오티드 분자에 비하여 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5% 또는 0.1%(w/w) 이하의 닉킹된 폴리리보뉴클레오티드 분자; 또는 c) 제제 내의 총 리보뉴클레오티드 분자에 비하여 20%, 15%, 10%, 5%, 2%, 1% 또는 0.5%(w/w) 이하의 조합된 선형 및 닉킹된 폴리리보뉴클레오티드 분자.
상기 양태의 각각의 일부 실시형태에서, 약제학적 제제 내의 총 리보뉴클레오티드 분자의 적어도 80%(w/w)는 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자이다. 상기 양태의 각각의 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 제제 내의 총 리보뉴클레오티드 분자의 20%(w/w) 이하의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자를 포함한다. 상기 양태의 각각의 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 제제 내의 총 리보뉴클레오티드 분자의 10%(w/w) 이하의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자를 포함한다.
상기 양태의 각각의 일부 실시형태에서, 약제학적 제제 내의 (예를 들어, 총 리보뉴클레오티드 분자에 비한) 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자는 현미경관찰법에 의해, 분광광도법에 의해, 형광측정법에 의해, 변성 우레아 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 영상화에 의해, UV-Vis 분광광도법에 의해, RNA 전기영동에 의해, RNAse H 분석에 의해, UV 분광 또는 형광 검출기에 의해, 광 산란 기법에 의해, HPLC를 포함하는 분리 방법의 이용과 함께 또는 이것 없이 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해, 분리 전 또는 분리 후 유도체화 방법의 이용과 함께 또는 이것 없이 HPLC에 의해, 칩 또는 겔 기반의 전기영동에 의해, 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 검출을 위해 은 또는 염료 염색 또는 방사성 붕괴를 사용하는 검출 방법의 사용에 의해 또는 현미경관찰법, 가시적 방법 또는 분광광도계를 사용하는 방법에 의해 측정된다. 예를 들어, 총 리보뉴클레오티드 분자에 비한 원형 폴리리보뉴클레오티드의 양은 실시예 2 또는 실시예 3의 방법을 사용하여 결정될 수 있다.
상기 양태의 각각의 일부 실시형태에서, 약제학적 약물 제품 또는 약제학적 약물 물질은 추가로: (a) 리물루스 변형세포 용해물 시험에 의해 측정하여 10 EU/㎏ 미만의 내독소를 포함하거나 내독소가 결여되고/결여되거나; (b) 멸균 이전에 100 CFU/100 ㎖ 미만 또는 10 CFU/100 ㎖ 미만의 바이오버든을 포함하고/포함하거나; (c) 멸균 약물 제품 또는 멸균 약물 물질이고/이거나; (d) 무균 조건 하에서 시험되는 경우 100개 미만의 생존 가능한 미생물의 성장을 지원하고/지원하거나; (e) USP <71> 또는 USP <85>의 표준을 만족한다.
상기 양태의 각각의 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자는 하나 이상의 발현 서열 및 적어도 하나의 발현 서열의 3' 말단에 스태거 요소를 포함한다.
상기 양태의 각각의 일부 실시형태에서, 제제는 제제에 존재하는 DNA(예를 들어, 세포 DNA, 예컨대 숙주 세포 DNA)의 양에 대한 참조 기준을 추가로 만족한다. 일부 실시형태에서, 제제에 존재하는 DNA 분자의 양에 대한 참조 기준은 특정 양 이하, 예를 들어, 0개의 DNA 분자의 존재이거나, DNA 분자가 실질적으로 없거나, 1 pg/㎖, 10 pg/㎖, 0.1 ng/㎖, 1 ng/㎖, 5 ng/㎖, 10 ng/㎖, 15 ng/㎖, 20 ng/㎖, 25 ng/㎖, 30 ng/㎖, 35 ng/㎖, 40 ng/㎖, 50 ng/㎖, 60 ng/㎖, 70 ng/㎖, 80 ng/㎖, 90 ng/㎖, 100 ng/㎖, 200 ng/㎖, 300 ng/㎖, 400 ng/㎖ 또는 500 ng/㎖, 1㎍/㎖, 5 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖ 또는 100 ㎍/㎖ 이하의 DNA 분자이다.
상기 양태의 각각의 일부 실시형태에서, 제제는 제제에 존재하는 단백질 오염(예를 들어, 세포 단백질, 예컨대 숙주 세포 단백질 또는 공정 관련 단백질 불순물, 예를 들어, 효소)의 양에 대한 참조 기준을 추가로 만족한다. 일부 실시형태에서, 제제에 존재하는 단백질 오염의 양에 대한 참조 기준은 특정 양 미만, 예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자 밀리그램(㎎)당 0.1 ng, 1 ng, 5 ng, 10 ng, 15 ng, 20 ng, 25 ng, 30 ng, 35 ng, 40 ng, 50 ng, 60 ng, 70 ng, 80 ng, 90 ng, 100 ng, 200 ng, 300 ng, 400 ng 또는 500 ng 미만의 단백질 오염이다. 상기 양태의 각각의 일부 실시형태에서, 단백질 오염은 효소를 포함한다.
상기 양태의 각각의 일부 실시형태에서, 약제학적 약물 제품 또는 약제학적 약물 물질은 분광광도계에 의해 측정하여 약 1.6 내지 2.3의 A260/A280 흡광도 비를 포함한다.
상기 양태의 각각의 일부 실시형태에서, 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자는 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자 대응물 또는 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자 대응물의 단편을 포함한다. 상기 양태의 각각의 일부 실시형태에서, 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자는 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자 대응물(예를 들어, 사전-원형화된 버전)을 포함한다. 상기 양태의 각각의 일부 실시형태에서, 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자는 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자 대응물 또는 그의 단편, 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자 비-대응물 또는 그의 단편 또는 그의 조합을 포함한다. 상기 양태의 각각의 일부 실시형태에서, 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자는 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자 대응물(예를 들어, 사전-원형화된 버전), 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자 비-대응물 또는 그의 조합을 포함한다.
상기 열거된 각각의 양태의 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자는 발현 생성물(들), 예를 들어, 치료적 발현 생성물을 인코딩하는, 예를 들어, 치료적 단백질 또는 핵산을 인코딩하는 서열 또는 복수의 서열을 포함한다. 상기 열거된 각각의 양태의 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자는 스캐폴드를 포함하는 서열(예를 들어, 압타머 서열)을 갖는다. 상기 양태의 각각의 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자는 내인성 또는 천연 발생 원형 폴리리보뉴클레오티드 서열을 인코딩하는 서열을 갖는다. 이러한 실시형태에서, 약제학적 제제는 추가로 서열, 예를 들어, 발현 생성물을 인코딩하는 참조 서열에 대하여 적어도 80%(예를 들어, 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, 100% 또는 그 사이의 임의의 백분율)의 서열 동일성을 갖는 서열을 갖는 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자에 대한 참조 기준을 만족할 수 있다.
이용 방법
또 다른 양태에서, 대상체의 세포 또는 조직으로의 또는 대상체로의 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 전달 방법은 본원에 기술된 바와 같은 약제학적 제제, 본원에 기술된 바와 같은 약제학적 조성물, 본원에 기술된 바와 같은 약제학적 약물 물질 또는 본원에 기술된 바와 같은 약제학적 약물 제품을 대상체의 세포 또는 조직에 또는 대상체에 투여하는 단계를 포함하며, 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자는 예를 들어, 투여 단계 후 적어도 3일째(예를 들어, 적어도 4, 5, 6, 7, 10, 12, 15, 20, 24일째 또는 그 초과 또는 그 사이의 임의의 일자)에 세포, 조직 또는 대상체에서 검출된다.
또 다른 양태에서, 대상체의 세포 또는 조직으로의 또는 대상체로의 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 전달 방법은 본원에 기술된 바와 같은 약제학적 제제, 본원에 기술된 바와 같은 약제학적 조성물, 본원에 기술된 바와 같은 약제학적 약물 물질 또는 본원에 기술된 바와 같은 약제학적 약물 제품을 대상체의 세포 또는 조직에 또는 대상체에 투여하는 단계를 포함하며, 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 원형 폴리리보뉴클레오티드로부터 번역되는 생성물은 투여 단계 후 적어도 3일째에 세포, 조직 또는 대상체에서 검출된다.
또 다른 양태에서, 치료적 생성물의 전달을 필요로 하는 대상체의 세포 또는 조직으로의 또는 대상체로의 치료적 생성물의 전달 방법은 본원에 기술된 바와 같은 약제학적 제제, 본원에 기술된 바와 같은 약제학적 조성물, 본원에 기술된 바와 같은 약제학적 약물 물질 또는 본원에 기술된 바와 같은 약제학적 약물 제품을 대상체의 세포 또는 조직에 또는 대상체에 투여하는 단계를 포함한다. 각각의 상기 양태의 일부 실시형태에서, 조성물 또는 제제의 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자는 치료적 생성물을 포함하는 서열을 갖는 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자를 포함하며, 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자로부터 전사되거나 번역되는 치료적 생성물은 예를 들어, 투여 단계 후 적어도 3일째(예를 들어, 적어도 4일째, 5일째, 6일째, 7일째, 10일째, 12일째, 15일째, 20일째, 24일째 또는 그 초과 또는 그 사이의 임의의 일자)에 세포, 조직 또는 대상체에서 검출된다. 이 양태의 일부 실시형태에서, 조성물 또는 제제의 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자는 압타머를 포함하는 서열을 갖는 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자를 포함하며, 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자는 투여 단계 후 적어도 3일째(예를 들어, 적어도 4일째, 5일째, 6일째, 7일째, 10일째, 12일째, 15일째, 20일째, 24일째 또는 그 초과 또는 그 사이의 임의의 일자)에 세포, 조직 또는 대상체에서 검출된다. 이 양태의 일부 실시형태에서, 조성물 또는 제제의 원형 폴리리보뉴클레오티드는 내인성 또는 천연 발생 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자 서열을 갖는 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자를 포함하며, 내인성 또는 천연 발생 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자는 투여 단계 후 적어도 3일째(예를 들어, 적어도 4일째, 5일째, 6일째, 7일째, 10일째, 12일째, 15일째, 20일째, 24일째 또는 그 초과 또는 그 사이의 임의의 일자)에 세포, 조직 또는 대상체에서 검출된다.
또 다른 양태에서, 비경구적 핵산 전달 시스템은 (i) 본원에 기술된 바와 같은 약제학적 제제, 본원에 기술된 바와 같은 약제학적 조성물, 본원에 기술된 바와 같은 약제학적 약물 물질 또는 본원에 기술된 바와 같은 약제학적 약물 제품, 및 (ii) 비경구 투여가 가능한 희석제를 포함한다. 이 양태의 일부 실시형태에서, 약제학적 제제, 약제학적 조성물, 약제학적 약물 물질 또는 약제학적 약물 제품은 어떠한 담체도 없다.
또 다른 양태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 전달 방법은 본원에 기술된 바와 같은 약제학적 제제, 본원에 기술된 바와 같은 약제학적 조성물, 본원에 기술된 바와 같은 약제학적 약물 물질 또는 본원에 기술된 바와 같은 약제학적 약물 제품을 원형 폴리리보뉴클레오티드의 전달을 필요로 하는 대상체에 비경구적으로 투여하는 단계를 포함한다. 이 양태의 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 대상체에서 생물학적 반응을 야기하거나 유도하기에 유효한 양으로 존재한다. 이 양태의 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 대상체 내의 세포 또는 조직에서 생물학적 영향을 갖기에 유효한 양으로 존재한다. 이 양태의 일부 실시형태에서, 비경구적 투여는 정맥내로, 근육내로, 안과적으로 또는 국소로 이루어진다.
또 다른 양태에서, 대상체의 세포 또는 조직으로의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 전달 방법은 본원에 기술된 바와 같은 약제학적 제제, 본원에 기술된 바와 같은 약제학적 조성물, 본원에 기술된 바와 같은 약제학적 약물 물질 또는 본원에 기술된 바와 같은 약제학적 약물 제품을 세포 또는 조직에 비경구적으로 투여하는 단계를 포함한다. 이 양태의 일부 실시형태에서, 비경구적 투여는 정맥내로, 근육내로, 안과적으로 또는 국소로 이루어진다.
각각의 상기 양태의 일부 실시형태에서, 당해 방법은 투여 단계 이전에 세포, 조직 또는 대상체 내의 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자 또는 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자로부터 번역된 생성물의 존재를 평가하는 단계를 추가로 포함한다. 각각의 상기 양태의 일부 실시형태에서, 당해 방법은 투여 단계 후(예를 들어, 투여 단계 후 24시간째, 48시간째, 72시간째, 4일째, 7일째, 14일째 또는 그 초과 또는 그 사이의 임의의 일자)에 세포, 조직 또는 대상체 내의 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자 또는 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자로부터 번역된 생성물의 존재를 평가하는 단계를 추가로 포함한다. 상기 양태의 각각의 일부 실시형태에서, 약제학적 제제, 약제학적 조성물, 약제학적 약물 물질 또는 약제학적 약물 제품은 희석제(예를 들어, 비경구 투여가 가능한 희석제)를 포함하며, 어떠한 담체도 없다.
정의
본 발명은 특정 실시형태에 관하여 그리고 특정 도면을 참조하여 기술될 것이지만, 본 발명은 그에 제한되지 않고, 오직 청구범위에 의해서만 제한된다. 하기에 제시된 용어는 다르게 나타내지 않는 한, 일반적으로 그의 일반적인 의미로 이해될 것이다.
용어 "에 의해 수득 가능한", "에 의해 생성 가능한" 등은 청구범위 또는 실시형태가 화합물, 조성물, 생성물 등 그 자체를 지칭하는 것, 즉, 화합물, 조성물, 생성물 등이 화합물, 조성물, 생성물 등의 제조를 위해 기술된 방법에 의해 수득되거나 생성될 수 있지만, 화합물, 조성물, 생성물 등이 또한 기술된 방법과 다른 방법에 의해서도 수득되거나 생성될 수 있다는 것을 나타내기 위해 사용된다. 용어 "에 의해 수득되는", "에 의해 생성되는" 등은 화합물, 조성물, 생성물이 열거된 특정 방법에 의해 수득되거나 생성되는 것을 나타낸다. 용어 "에 의해 수득 가능한", "에 의해 생성 가능한" 등은, "에 의해 수득 가능한", "에 의해 생성 가능한" 등의 바람직한 실시형태로서 용어 "에 의해 수득되는", "에 의해 생성되는" 등도 개시하는 것이 이해될 것이다.
표현 "치료, 조절 등을 위한 화합물, 조성물, 생성물 등"은 치료, 조절 등의 표기된 목적에 적합한 화합물, 조성물, 생성물 등 그 자체를 지칭하는 것으로 이해되어야 한다. 표현 "치료, 조절 등을 위한 화합물, 조성물, 생성물 등"은 이러한 화합물, 조성물, 생성물 등이 치료, 조절 등에 사용하기 위한 것임을 바람직한 실시형태로서 추가로 개시한다.
표현 "...에 사용하기 위한 화합물, 조성물, 생성물 등" 또는 "...를 위한 약제, 약제학적 조성물, 수의학적 조성물, 진단적 조성물 등의 제조에서의 화합물, 조성물, 생성물 등의 용도"는 이러한 화합물, 조성물, 생성물 등이 인간 또는 동물 신체에 실시될 수 있는 치료적 방법에 사용될 것임을 나타낸다. 이들은 치료 방법 등에 관한 실시형태 및 청구범위의 동등한 개시내용으로서 간주된다. 이에 따라, 실시형태 또는 청구범위가 "질병을 앓는 것으로 의심되는 인간 또는 동물의 치료에 이용하기 위한 화합물"을 지칭한다면, 이것은 또한, "질병을 앓는 것으로 의심되는 인간 또는 동물을 치료하기 위한 약제의 제조에서의 화합물의 용도" 또는 "질병을 앓는 것으로 의심되는 인간 또는 동물로의 화합물의 투여에 의한 치료 방법"의 개시내용인 것으로 간주된다. 표현 "치료, 조절 등을 위한 화합물, 조성물, 생성물 등"은 치료, 조절 등의 표기된 목적에 적합한 화합물, 조성물, 생성물 등 그 자체를 지칭하는 것으로 이해되어야 한다.
용어 "약제학적 조성물"은 또한, 약제학적 조성물 내에 포함된 원형 폴리리보뉴클레오티드가 치료법에 의해 인간 또는 동물 신체의 치료를 위해 사용될 수 있음을 개시하도록 하고자 한다. 따라서, 이는 "치료법에 사용하기 위한 원형 폴리리보뉴클레오티드"와 등가인 것으로 여겨진다.
본원에 기술된 바와 같은 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자, 이러한 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자를 포함하는 조성물, 이러한 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제조 및 이용 방법 등은 원형 RNA 제제(예를 들어, 실시예 1 내지 12) 내의 선형 RNA 분자의 효과 및 (예를 들어, 실시예 13 이하 참조) 상이한 요소, 예를 들어, 복제 요소, 발현 서열, 스태거 요소 및 엔크립토겐(encryptogen)(예를 들어, 실시예 13 참조) 또는 예를 들어, 발현 서열, 스태거 요소 및 조절 요소(예를 들어, 실시예 34 및 44 참조)를 포함하는 원형 폴리리보뉴클레오티드 이펙터의 제조 및 이용, 및 그들의 기술적 효과(예를 들어, 실시예 43 및 44에서 선형 대응물보다 증가된 번역 효율 및 실시예 33 및 실시예 60에서 선형 대응물보다 증가된 반감기)를 예시한 실시예에 부분적으로 기초한다. 이하의 설명이 실시예에서 고려되는 특정 연구결과 및 조합의 다양한 변이를 고려하는 것은 이들 실시예에 특히 기초한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "총 리보뉴클레오티드 분자"는 리보뉴클레오티드 분자의 총 질량에 의해 측정되는 바와 같은, 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자, 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자, 단량체 리보뉴클레오티드, 기타 폴리리보뉴클레오티드 분자, 그의 단편 및 그의 변형된 변이를 포함하는 임의의 리보뉴클레오티드 분자의 총량을 의미한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "circRNA" 또는 "원형 폴리리보뉴클레오티드" 또는 "원형 RNA" 또는 "원형 폴리리보뉴클레오티드 분자"는 상호교환 가능하게 사용되며, 자유 말단을 갖지 않는 구조(즉, 자유 3' 및/또는 5' 말단 부재)를 갖는 폴리리보뉴클레오티드 분자, 예를 들어, 공유적 또는 비-공유적 결합을 통해 원형 또는 순환 구조를 형성하는 폴리리보뉴클레오티드 분자를 의미한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "단편"은 뉴클레오티드 분자보다 적어도 하나의 뉴클레오티드가 더 짧은 뉴클레오티드 분자의 임의의 부분을 의미한다. 예를 들어, 뉴클레오티드 분자는 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자일 수 있으며, 그의 단편은 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 일부인 모노리보뉴클레오티드 또는 임의의 수의 인접 폴리리보뉴클레오티드일 수 있다. 또 다른 예로서, 뉴클레오티드 분자는 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자일 수 있으며, 그의 단편은 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 일부인 폴리리보뉴클레오티드 또는 임의의 수의 인접 폴리리보뉴클레오티드일 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "엔크립토겐"은 면역 세포에 의한 검출의 감소, 회피 및/또는 모면을 보조하고/보조하거나 원형 폴리리보뉴클레오티드에 대한 면역 반응의 유도를 감소시키는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 핵산 서열 또는 구조이다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "발현 서열"은 생성물, 예를 들어, 펩티드 또는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열 또는 조절 핵산이다. 펩티드 또는 폴리펩티드를 코딩하는 예시적인 발현 서열은 복수의 뉴클레오티드 트라이어드(triad)를 포함할 수 있으며, 이의 각각은 아미노산을 코딩할 수 있고, "코돈"으로 명명된다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "면역단백질 결합 부위"는 면역단백질에 결합하는 뉴클레오티드 서열이다. 일부 실시형태에서, 면역단백질 결합 부위는 외인성으로서의 원형 폴리리보뉴클레오티드를 차폐하는 데 도움이 되며, 예를 들어, 면역단백질 결합 부위는 원형 폴리리보뉴클레오티드가 면역단백질에 의해 인식되고 결합되는 것을 방지하는 단백질(예를 들어, 경쟁적 저해제)에 의해 결합되어, 그에 의해, 원형 폴리리보뉴클레오티드에 대한 면역 반응을 감소시키거나 모면할 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "면역단백질"은 예를 들어, 면역원, 예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드에 대한 것과 같은 면역 반응과 연관된 임의의 단백질 또는 펩티드이다. 면역단백질의 비-제한적인 예는 T 세포 수용체(TCR), 항체(면역글로불린), 주요 조직적합성 복합체(MHC) 단백질, 보체 단백질 및 RNA 결합 단백질을 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "선형 RNA" 또는 "선형 폴리리보뉴클레오티드" 또는 "선형 폴리리보뉴클레오티드 분자"는 상호교환 가능하게 사용되며, 5' 및 3' 말단을 갖는 폴리리보뉴클레오티드 분자를 의미한다. 5' 및 3' 말단 중 하나 또는 둘 모두는 자유 말단이거나, 또 다른 모이어티에 연결될 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같이, 선형 RNA는 원형화를 겪지 않고(예를 들어, 사전-원형화되고), 예를 들어, 스플린트 라이게이션 또는 화학적, 효소적, 리보자임- 또는 스플라이싱-촉매작용된 원형화 방법을 통한 원형화를 위한 출발 물질로서 사용될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "닉킹된 RNA" 또는 "닉킹된 선형 폴리리보뉴클레오티드" 또는 "닉킹된 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자"는 상호교환 가능하게 사용되며, 원형 RNA의 닉킹 또는 분해로부터 초래되는 5' 및 3' 말단을 갖는 폴리리보뉴클레오티드 분자를 의미한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "비-원형 RNA"는 전체 닉킹된 RNA 및 선형 RNA를 의미한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "변형된 리보뉴클레오티드"는 당, 핵염기 또는 뉴클레오시드간 링키지에 대한 적어도 하나의 변형을 갖는 뉴클레오티드이다.
본원에 사용되는 바와 같이, 어구 "준-나선 구조"는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 고차 구조이며, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 적어도 일부는 나선 구조로 폴딩된다.
본원에 사용되는 바와 같이, 어구 "준-이중-가닥 이차 구조"는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 고차 구조이며, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 적어도 일부는 내부 이중 가닥을 생성한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "조절 요소"는 원형 폴리리보뉴클레오티드 내의 발현 서열의 발현을 변형시키는 모이어티, 예컨대 핵산 서열이다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "반복 뉴클레오티드 서열"은 DNA 또는 RNA의 스트레치 내의 또는 게놈 전체에 걸친 반복 핵산 서열이다. 일부 실시형태에서, 반복 뉴클레오티드 서열은 폴리 CA 또는 폴리 TG(UG) 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 반복 뉴클레오티드 서열은 Alu 패밀리의 인트론 내의 반복된 서열을 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "복제 요소"는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 전사를 개시하거나 복제에 유용한 서열 및/또는 모티프이다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "스태거 요소"는 번역 동안 리보솜 정지를 유도하는 모이어티, 예컨대 뉴클레오티드 서열이다. 일부 실시형태에서, 스태거 요소는 강력한 알파-나선 경향을 갖는 아미노산의 비-보존된 서열에 이어서 공통 서열 -D(V/I)ExNPG P이며, 여기서 x는 임의의 아미노산이다. 일부 실시형태에서, 스태거 요소는 화학적 모이어티, 예컨대 글리세롤, 비-핵산 연결 모이어티, 화학적 변형, 변형된 핵산 또는 그의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "실질적으로 저항성"은 참조물질과 비교시 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 이펙터에 대한 저항성을 갖는 것이다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "화학량론적 번역"은 원형 폴리리보뉴클레오티드로부터 번역되는 발현 생성물의 실질적으로 동등한 생성이다. 예를 들어, 2개의 발현 서열을 갖는 원형 폴리리보뉴클레오티드에 있어서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 화학량론적 번역은 2개의 발현 서열의 발현 생성물이 실질적으로 동등한 양을 갖는 것을 의미하며, 예를 들어, 2개의 발현 서열 간의 양의 차이(예를 들어, 몰 차이)는 약 0 또는 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15% 또는 20% 미만 또는 그 사이의 임의의 백분율일 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "번역 개시 서열"은 원형 폴리리보뉴클레오티드 내의 발현 서열의 번역을 개시하는 핵산 서열이다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "종결 요소"는 원형 폴리리보뉴클레오티드 내의 발현 서열의 번역을 종결시키는 모이어티, 예컨대 핵산 서열이다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "번역 효율"은 리보뉴클레오티드 전사물로부터의 단백질 또는 펩티드 생성의 속도 또는 양이다. 일부 실시형태에서, 번역 효율은 예를 들어, 주어진 기간에, 예를 들어, 주어진 번역 시스템, 예를 들어, 토끼 망상적혈구 용해물과 같은 시험관내 번역 시스템 또는 진핵 세포 또는 원핵 세포와 같은 생체내 번역 시스템에서, 단백질 또는 펩티드를 코딩하는 전사물의 주어진 양 당, 생성되는 단백질 또는 펩티드의 양으로서 표현될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "원형화 효율"은 생성된 원형 폴리리보뉴클레오티드 대 그의 비-원형 출발 물질의 척도이다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "면역원성"은 물질에 대한 면역 반응을 유도할 가능성이다. 일부 실시형태에서, 면역 반응은 유기체의 면역계 또는 특정 유형의 면역 세포가 면역원성 물질에 노출되는 경우에 유도될 수 있다. 용어 "비-면역원성"은 물질에 대한 검출 가능한 임계값을 초과하는 면역 반응의 결여 또는 그의 부재이다. 일부 실시형태에서, 유기체의 면역계 또는 특정 유형의 면역 세포가 비-면역원성 물질에 노출되는 경우에 면역 반응은 검출되지 않는다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공되는 바와 같은 비-면역원성 원형 폴리리보뉴클레오티드는 면역원성 검정에 의해 측정되는 경우 미리결정된 임계값을 초과하는 면역 반응을 유도하지 않는다. 예를 들어, 면역원성 검정을 사용하여 원형 폴리리보뉴클레오티드에 대해 발생한 항체 또는 염증성 마커를 측정하는 경우, 본원에 제공된 바와 같은 비-면역원성 폴리리보뉴클레오티드는 항체 또는 마커의 생성을 미리결정된 임계값보다 더 낮은 수준으로 야기할 수 있다. 미리결정된 임계값은 예를 들어, 대조군 참조물질에 의해 발생하는 항체 또는 마커의 수준의 최대 1.5배, 2배, 3배, 4배 또는 5배일 수 있다. 또 다른 예로서, 면역원성 검정을 사용하여 원형 폴리리보뉴클레오티드에 대한 선천 면역 반응을 측정하는 경우(예컨대, 염증성 마커의 측정), 본원에 제공되는 바와 같은 비-면역원성 폴리리보뉴클레오티드는 선천 면역 반응의 생성을 미리결정된 임계값보다 더 낮은 수준으로 야기할 수 있다. 미리결정된 임계값은 예를 들어, 대조군 참조물질에 대한 선천 반응에 의해 생성되는 마커의 수준의 최대 1.5배, 2배, 3배, 4배 또는 5배일 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "불순물"은 조성물, 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은 약제학적 조성물에 존재하는 원치 않는 물질이다. 일부 실시형태에서, 불순물은 공정-관련 불순물이다. 일부 실시형태에서, 불순물은 최종 조성물 내의 원하는 생성물 이외의, 예를 들어, 활성 약물 성분, 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은 원형 폴리리보뉴클레오티드 이외의 제품-관련 물질이다. 본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "공정-관련 불순물"은 본원에 기술된 선형 폴리리보뉴클레오티드 이외의 최종 조성물, 제제 또는 생성물 내의 원치 않는, 조성물, 제제 또는 생성물의 제조에서 사용되거나, 존재하거나, 생성되는 물질이다. 일부 실시형태에서, 공정-관련 불순물은 폴리리보뉴클레오티드의 합성 또는 원형화에 사용되는 효소이다. 본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "제품-관련 물질"은 조성물, 제제 또는 생성물 또는 그의 임의의 중간체의 합성 동안 생성되는 물질 또는 부산물이다. 일부 실시형태에서, 제품-관련 물질은 데옥시리보뉴클레오티드 단편이다. 일부 실시형태에서, 제품-관련 물질은 데옥시리보뉴클레오티드 단량체이다. 일부 실시형태에서, 제품-관련 물질은 하기 중 하나 이상이다: 본원에 기술된 폴리리보뉴클레오티드의 유도체 또는 단편, 예를 들어, 10개, 9개, 8개, 7개, 6개, 5개 또는 4개의 리보핵산, 모노리보핵산, 디리보핵산 또는 트리리보핵산의 단편.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "실질적으로 없는"은 생물학적, 화학적, 물리적 및/또는 약리학적 효과를 유도하는 데 필요한 수준보다 더 낮은 조성물, 제제 또는 생성물 또는 그의 임의의 중간체 내의 성분의 수준이다. 일부 실시형태에서, 조성물, 제제 또는 생성물은 성분의 수준이 미량으로만 검출 가능하거나, 수준이 분리 전 또는 분리 후 유도체화 방법과 함께 또는 이것 없이 관련 검출 기법(예를 들어, 크로마토그래피(컬럼 사용, 종이 사용, 겔 사용, HPLC 사용, UHPLC 사용 등 또는 IC에 의한, SEC에 의한, 역상에 의한, 음이온 교환에 의한, 혼합 방식에 의한 등) 또는 전기영동(UREA PAGE, 칩-기반, 폴리아크릴아미드 겔, RNA, 모세관, c-IEF 등)에 의해, 검출을 위해 은 또는 염료 염색 또는 방사성 붕괴를 사용하거나, 질량 분석법, UV-가시적, 형광, 광 산란, 굴절률에 기초한 검출 기법을 사용하여 검출 가능한 수준 미만이면, 성분이 실질적으로 없다. 대안적으로, 조성물, 제제 또는 생성물에 성분이 실질적으로 없는지의 여부는 분리 기술의 사용 없이 질량 분석법에 의해, 현미경관찰법에 의해, 원편광 이색성(CD) 분광법에 의해, UV 또는 UV-vis 분광광도법에 의해, 형광측정법(예를 들어, Qubit)에 의해, RNAse H 분석에 의해, 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 또는 검출을 위해 은 또는 염료 염색 또는 방사성 붕괴를 사용하는 방법에 의해 결정될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "선형 대응물"은 원형 폴리리보뉴클레오티드와 동일하거나 유사한 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75% 또는 그 사이의 임의의 백분율의 서열 유사성)을 갖고, 2개의 자유 말단(즉, 원형화된 폴리리보뉴클레오티드의 비원형화된 버전(및 그의 단편))을 갖는 폴리리보뉴클레오티드 분자(및 그의 단편)이다. 일부 실시형태에서, 선형 대응물(예를 들어, 사전-원형화된 버전)은 원형 폴리리보뉴클레오티드와 동일하거나 유사한 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75% 또는 그 사이의 임의의 백분율의 서열 유사성) 및 동일하거나 유사한 핵산 변형을 갖고, 2개의 자유 말단(즉, 원형화된 폴리리보뉴클레오티드의 비원형화된 버전(및 그의 단편))을 갖는 폴리리보뉴클레오티드 분자(및 그의 단편)이다. 일부 실시형태에서, 선형 대응물은 원형 폴리리보뉴클레오티드와 동일하거나 유사한 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75% 또는 그 사이의 임의의 백분율의 서열 유사성)과 상이한 핵산 변형을 갖거나, 핵산 변형을 갖지 않고, 2개의 자유 말단(즉, 원형화된 폴리리보뉴클레오티드의 비원형화된 버전(및 그의 단편))을 갖는 폴리리보뉴클레오티드 분자(및 그의 단편)이다. 일부 실시형태에서, 선형 대응물인 폴리리보뉴클레오티드 분자의 단편은 선형 대응물 폴리리보뉴클레오티드 분자보다 더 짧은 선형 대응물 폴리리보뉴클레오티드 분자의 임의의 부분이다. 일부 실시형태에서, 선형 대응물은 5' 캡을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 선형 대응물은 폴리 아데노신 테일을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 선형 대응물은 3' UTR을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 선형 대응물은 5' UTR을 추가로 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "압타머 서열"은 표적 분자에 특이적으로 결합하는 비-천연 발생 또는 합성 올리고뉴클레오티드이다. 전형적으로, 압타머는 20 내지 500개 뉴클레오티드이다. 전형적으로, 압타머는 서열 상동성보다는 2차 구조를 통해 그의 표적에 결합한다. 일부 실시형태에서, 합성 올리고뉴클레오티드는 표적 분자에 특이적으로 결합하는 천연 발생 올리고뉴클레오티드와 동일한 서열을 가질 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "담체"는 부분적으로 또는 완전히 캡슐화시키는 작용제 또는 그의 조합을 통한 원형 폴리리보뉴클레오티드의 공유적 변형에 의해 세포 내로의 조성물(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드)의 수송 또는 전달을 용이하게 하는 화합물, 조성물, 시약 또는 분자를 의미한다. 담체의 비제한적인 예에는 탄수화물 담체(예를 들어, 무수물-변형된 피토글리코겐 또는 글리코겐-유형 물질), 나노입자(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드를 캡슐화하거나 이에 공유적으로 연결되어 결합하는 나노입자), 리포좀, 푸소좀, 생체 외 분화된 망상적혈구, 엑소좀, 단백질 담체(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드에 공유적으로 연결된 단백질) 또는 양이온성 담체(예를 들어, 양이온성 리포폴리머(lipopolymer) 또는 트랜스펙션 시약)가 포함된다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "네이키드 전달"은 담체의 보조 없이, 그리고 세포로의 전달을 보조하는 모이어티에 대한 공유적 변형 없이 세포로의 전달을 위한 제형을 의미한다. 네이키드 전달 제형은 임의의 트랜스펙션 시약, 양이온성 담체, 탄수화물 담체, 나노입자 담체 또는 단백질 담체가 없다. 예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 네이키드 전달 제형은 공유적 변형 없이 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하며, 담체가 없는 제형이다.
용어 "희석제"는 본원에 기술된 조성물(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 조성물)이 희석되거나 용해될 수 있는 비활성 용매를 포함하는 비히클을 의미한다. 희석제는 RNA 가용화제, 완충제, 등장화제 또는 그의 혼합물일 수 있다. 희석제는 액체 희석제 또는 고체 희석제일 수 있다. 액체 희석제의 비제한적인 예에는 물 또는 기타 용매, 가용화제 및 유화제, 예컨대 에틸 알코올, 이소프로필 알코올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜, 디메틸포름아미드, 오일(특히, 목화씨, 땅콩, 옥수수, 배아, 올리브, 피마자 및 참깨), 글리세롤, 테트라하이드로푸르푸릴 알코올, 소르비탄의 폴리에틸렌 글리콜 및 지방산 에스테르 및 1,3-부탄디올이 포함된다. 고체 희석제의 비제한적인 예에는 탄산칼슘, 탄산나트륨, 인산칼슘, 인산이칼슘, 황산칼슘, 인산수소칼슘, 인산나트륨 락토스, 수크로스, 셀룰로스, 미세결정질 셀룰로스, 카올린, 만니톨, 소르비톨, 이노시톨, 염화나트륨, 건조 전분(dry starch), 옥수수 전분 또는 파우더 슈거(powdered sugar)가 포함된다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "비경구 투여가 가능한 희석제"는 조성물(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 조성물)의 비경구 투여를 위해 사용되는 희석제이다.
참조에 의한 포함
본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 구체적이고 개별적으로 참조로 포함되어 있는 것으로 나타낸 것과 동일한 정도로 본원에 참조로 포함된다.
본 발명의 실시형태의 하기 상세한 설명은 첨부된 도면과 함께 읽는 경우 더 잘 이해될 것이다. 본 발명의 예시의 목적을 위해, 본원에서 예시된 실시형태가 도면에 나타나 있다. 그러나, 본 발명은 도면에 나타낸 실시형태의 정확한 배열 및 수단으로 제한되지 않음을 이해해야 한다.
도 1은 원형 및 선형 RNA로의 프로브의 결합 및 이에 후속된 RNase H에 의한 RNA의 분해를 보여준다. 원형 RNA는 다수의 밴드로서 검출되는 선형 및 콘카테머 RNA에 비하여 단일의 절단된 선형 밴드로서 검출된다. 시료를 변성 폴리아크릴아미드 겔 상에 전개시키고, RNase H의 첨가를 사용한 또는 이를 사용하지 않은 분해 밴드를 비교함으로써 분해를 검출하였다.
도 2는 선형 RNA 밴드 세기를 선형 RNA 표준물질과 비교함으로써 변성 폴리아크릴아미드 겔 상에서 정량화된 선형 RNA 함량을 보여준다.
도 3은 변성 폴리아크릴아미드 겔의 상이한 밴드로부터 추출된 RNA의 정량화를 보여준다.
도 4는 미정제된 원형 RNA 제제에 비하여 BJ 섬유모세포에서의 시간이 지남에 따른 정제된 원형 RNA 제제의 지속성을 보여준다.
도 5는 상이한 양의 선형 RNA를 함유하는 원형 RNA 제제와 비교하여 BJ 섬유모세포에서의 시간이 지남에 따른 정제된 원형 RNA 제제의 발현 수준을 보여준다.
도 6은 정제된 원형 RNA가 투여 후 14일째에 생체외에서 간에서 측정하여, 마우스 내로의 주사 후에 더 높은 발현 뿐만 아니라 더 긴 발현을 갖는 것을 보여준다.
도 7은 6% 우레아 PAGE 겔에서 밴드 세기를 측정함으로써 계산되는 바와 같은 정제 이전 및 이후의 원형 RNA 대 선형 RNA의 비의 그래프를 보여준다. 밴드의 정량화는 하기와 같았다: 정제 이전에, 42.6%의 RNA 생성물이 원형 RNA였으며, 57.4%의 RNA 생성물이 선형 RNA(비정제된 RNA)였으며; 정제 후에, 50.4%의 RNA 생성물이 원형 RNA였으며, 49.6%의 RNA 생성물이 선형 RNA(정제된 circRNA)였다.
도 8은 84% 순도의 원형 RNA, 71% 순도의 원형 RNA 및 비히클 단독을 사용한 실험에서 트랜스펙션 후 6시간째, 24시간째, 48시간째, 72시간째, 96시간째 및 120시간째에 세포 내의 가우시아 루시퍼라제(Gaussia Luciferase) 활성을 보여준다.
도 9는 조합된 원형 RNA 및 선형 대응물 RNA 둘 모두로 트랜스펙션된 세포에 비하여 겔 정제된 원형 RNA 제제만으로 트랜스펙션된 세포를 보여준다. circRNA만이 조합된 원형 RNA 및 선형 대응물 RNA 제제에 비하여 증가된 안정성을 용량 의존적 방식으로 보였다.
도 10은 용량 의존적 방식으로 선천 면역 유전자, 예컨대 RIG-I, MDA-5, OAS 및 IFN-B의 상향조절을 나타내는 조합된 원형 RNA 및 선형 대응물 RNA 둘 모두로 트랜스펙션된 세포에 비하여, 겔 정제된 원형 RNA 제제만으로 트랜스펙션된 세포가 이들 선천 면역 유전자의 최소의 발현을 보인 것을 보여준다.
도 11은 인트론을 갖고 GFP를 발현하는 대조군 원형 RNA의 개략도를 보여준다.
도 12는 리보스위치에 대한 리간드의 존재 또는 부재 하에 원형 RNA로부터 GFP의 발현을 조절하는 합성 리보스위치(적색)를 갖는 예시적인 원형 RNA의 개략도를 보여준다.
도 13은 엔크립토겐(인트론)을 보유한 예시적인 원형 RNA로부터의 마우스 모델에서의 생체내 단백질 발현을 보여주는 개략도이다.
도 14는 구조 정보를 위해 점 블롯 분석으로 처리될 수 있는 하나의 이중-가닥 RNA 세그먼트를 갖는 예시적인 원형 RNA의 개략도를 보여준다.
도 15는 구조 정보를 위해 SHAPE 분석으로 처리될 수 있는 준-나선 구조(HDVmin)를 갖는 예시적인 원형 RNA의 개략도를 보여준다.
도 16은 HDAg 결합 활성을 보여주는 기능성 준-나선 구조(HDVmin)를 갖는 예시적인 원형 RNA의 개략도를 보여준다.
도 17은 예시적인 자가-복제 가능한 원형 RNA의 전사, 자가-절단 및 라이게이션을 보여주는 개략도이다.
도 18은 유사분열 동안 보존되고, 딸 세포에서 지속되는 예시적인 원형 RNA의 개략도를 보여준다. 나타낸 바와 같은 BrdU 펄스는 분열된 세포를 표지하기 위해 사용된다.
도 19는 상이한 예시적인 원형 RNA의 시험관내 생성을 보여주는 변성 PAGE 겔 이미지이다.
도 20은 상이한 예시적인 원형 RNA의 원형화 효율을 요약한 그래프이다.
도 21은 선형 대응물에 비하여 예시적인 원형 RNA의 감소된 분해 감수성을 보여주는 변성 PAGE 겔 이미지이다.
도 22는 예시적인 정제 과정 후의 예시적인 원형 RNA를 보여주는 변성 PAGE 겔 이미지이다.
도 23은 IRES, 캡, 5' 및 3' UTR을 결여한 예시적인 원형 RNA에 의한 Flag 단백질(약 15 kDa)의 발현을 보여주는 웨스턴 블롯 이미지이다.
도 24는 예시적인 원형 RNA의 회전환 번역을 보여주는 웨스턴 블롯 이미지이다.
도 25는 예시적인 스태거 요소가 존재하거나, 그것이 존재하지 않는 상이한 예시적인 원형 RNA로부터의 불연속 단백질 또는 긴 연속 펩티드의 생성을 보여주는 웨스턴 블롯 이미지를 보여준다.
도 26은 예시적인 스태거 요소 또는 종결 요소(정지 코돈)를 갖는 상이한 예시적인 원형 RNA 간의 단백질 발현의 비교를 보여주는 웨스턴 블롯 이미지이다.
도 27은 2개의 예시적인 원형 RNA로부터 번역되는 단백질 생성물의 웨스턴 블롯 분석으로부터의 신호 세기를 요약한 그래프이다.
도 28은 비히클 대조군과 비교하여, 예시적인 원형 RNA와 그의 선형 대응물의 번역 생성물의 루시퍼라제 활성을 요약한 그래프이다.
도 29는 선형 RNA에 비하여 예시적인 원형 RNA의 반감기를 시험하는 시간 추이 실험에서 상이한 수집 시점에서의 RNA의 양을 요약한 그래프이다.
도 30a는 세포로의 전달 24시간 후의, 선형 및 원형 RNA 둘 모두를 포획하는 프라이머를 사용한 선형 및 원형 RNA 수준의 qRT-PCR 분석을 보여주는 그래프이다.
도 30b는 원형 RNA에 특이적인 프라이머를 사용한 선형 및 원형 RNA 수준의 qRT-PCR 분석을 보여주는 그래프이다.
도 31은 EGF 단백질 및 베타-튜불린 로딩 대조군을 위해 프로빙된 원형 RNA 및 선형 RNA로부터의 세포 용해물의 블롯을 보여주는 이미지이다.
도 32는 원형 RNA 또는 선형 RNA로 트랜스펙션된 293T 세포로부터의 면역 관련 유전자의 qRT-PCR 분석을 보여주는 그래프이다.
도 33은 회전환 번역을 통해 원형 RNA로부터 발현되는 단백질의 루시퍼라제 활성을 보여주는 그래프이다.
도 34는 원형 RNA 또는 선형 RNA로부터 발현되는 단백질의 루시퍼라제 활성을 보여주는 그래프이다.
도 35는 회전환 번역을 통해 선형 RNA 또는 원형 RNA로부터 발현되는 단백질의 루시퍼라제 활성을 보여주는 그래프이다.
도 36은 IRES 번역 개시를 통해 원형 RNA로부터 발현되는 단백질의 루시퍼라제 활성을 보여주는 그래프이다.
도 37은 IRES 개시 및 회전환 번역을 통해 원형 RNA로부터 발현되는 단백질의 루시퍼라제 활성을 보여주는 그래프이다.
도 38은 원형 RNA 또는 선형 RNA로부터의 발현 생성물의 단백질 블롯을 보여주는 이미지이다.
도 39는 스태거 요소를 갖는 원형 RNA 또는 선형 RNA로부터의 발현 생성물의 단백질 블롯을 보여주는 이미지이다.
도 40은 예시적인 원형 RNA의 준-이중 가닥 구조를 갖는 예측된 구조를 보여준다.
도 41은 예시적인 원형 RNA의 준-나선 구조를 갖는 예측된 구조를 보여준다.
도 42는 예시적인 원형 RNA의 반복 서열과 연결된 준-나선 구조를 갖는 예측된 구조를 보여준다.
도 43은 예시적인 원형 RNA의 RNAse H에 의한 분해에 의해, 원형 RNA와 일치하고 콘카테머 RNA와 일치하지 않는 핵산 분해 생성물이 생성되었다는 실험 데이터를 보여준다.
도 44는 매우 다양한 RNA 길이를 생성하기 위해 생성된 상이한 길이의 DNA의 전기영동 이미지를 보여준다.
도 45는 RNAse R 처리 및 매우 다양한 길이의 원형 연접부에 대한 qPCR 분석을 사용한 RNA의 원형화를 입증한 실험 데이터를 보여준다.
도 46은 miRNA 결합 부위를 갖는 예시적인 원형 RNA의 생성을 보여준다.
도 47은 자가-스플라이싱에 의한 예시적인 원형 RNA의 생성을 보여준다.
도 48은 단백질 결합 부위를 갖는 예시적인 원형 RNA의 생성을 보여준다.
도 49는 선형 대조군에 비하여 분열 중인 세포에서의 원형 RNA의 더 높은 안정성을 보여주는 실험 데이터를 보여준다.
도 50은 복수의 발현 서열을 갖는 예시적인 원형 RNA로부터의 단백질 발현, 및 다수의 발현 서열을 갖는 예시적인 원형 RNA의 회전환 번역을 보여주는 실험 데이터를 보여준다.
도 51은 선형 대조군에 비하여 예시적인 원형 RNA의 트랜스펙션된 세포에 대한 감소된 독성을 보여주는 실험 데이터를 보여준다.
도 52는 예시적인 원형 RNA가 스트레스 조건 하에서 선형 RNA에 비하여 더 높은 수준으로 번역되었음을 보여준다.
도 53은 리보스위치를 갖는 원형 RNA의 생성을 보여준다.
도 54a, 도 54b 및 도 54c는 변형된 원형 RNA가 세포에서 번역되었음을 보여준다.
도 55a, 도 55b 및 도 55c는 변형된 원형 RNA가, 트랜스펙션된 세포에서의 MDA5, OAS 및 IFN-베타 발현에 의해 평가하여 비변형된 원형 RNA에 비하여 세포에 대해 감소된 면역원성을 갖는 것을 보여준다.
도 56은 마우스 내로 주사한 후에, 원형 RNA가 주사 후 3일째, 4일째 및 7일째에 마우스의 간에서 선형 RNA보다 더 높은 수준으로 검출되었음을 보여준다.
도 57a 및 도 57b는 가우시아 루시퍼라제를 발현하는 원형 RNA 또는 선형 RNA를 마우스 내로 주사한 후에, 가우시아 루시퍼라제 활성이 원형 RNA의 투여 후 1일째, 2일째, 7일째, 11일째, 16일째 및 23일째에 혈장 중에서 검출된 한편, 그의 활성이 오직 변형된 선형 RNA의 투여 후 1일째 및 2일째에만 혈장 중에서 검출되었음을 보여준다.
도 58은 RNA의 주사 후에, 원형 RNA가 RNA의 투여 후 16일째에 간 및 비장에서 검출되었지만, 선형 RNA는 그렇지 않았음을 보여준다.
도 59는 RNA의 주사 후에, 선형 RNA가 RIG-I, MDA-5, IFN-B 및 OAS에 의해 평가하여 면역원성을 보였지만, 원형 RNA는 그렇지 않았음을 보여준다.
본 발명은 일반적으로 원형 폴리리보뉴클레오티드의 약제학적 조성물 및 제제 및 그의 용도에 관한 것이다.
일부 양태에서, 본원에 기술된 본 발명은 원형 RNA 조성물, 제제, 및 원형 RNA 조성물 및 제제, 특히 감소된, 제어된 또는 특정 수준의 선형 RNA를 갖는 약제학적 원형 RNA 조성물 및 제제의 이용 및 제조 방법을 포함한다. 본원에, 예를 들어, 실시예 1 내지 12에 기술된 바와 같이, 원형 RNA 제제 내의 선형 RNA의 존재는 예를 들어, 원형 RNA의 발현 수준, 지속성, 반감기 및/또는 안정성; 및/또는 제제에 대한 면역 반응에 영향을 미칠 수 있다.
표 1은 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용의 간단한 요약을 제공하고자 하며, 이는 결코 배제하거나 제한하는 것이 아니다. 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용의 특정 양태는 표 1 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용 요약에 반영되지 않을 수 있다.
Figure pct00001
Figure pct00002
원형 폴리리보뉴클레오티드
일부 실시형태에서, 원형 RNA는 발현 생성물(들), 예를 들어, 치료적 발현 생성물(들)을 인코딩하는 서열 또는 복수의 서열을 가지며, 예를 들어, 원형 RNA는 치료적 단백질 또는 핵산을 인코딩한다. 일부 실시형태에서, 원형 RNA는 압타머를 포함하는 서열 또는 복수의 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, 원형 RNA는 내인성 또는 천연 발생 원형 폴리리보뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 80%(예를 들어, 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, 100% 또는 그 사이의 임의의 백분율) 서열 동일성을 갖는 서열을 인코딩하는 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, 원형 RNA 및 제제는 포유동물, 예를 들어, 인간에서 원치 않는 면역 반응을 야기하지 않는다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 적어도 그의 선형 대응물, 예를 들어, 선형 발현 서열 또는 선형 폴리리보뉴클레오티드의 것의 반감기를 갖는다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 그의 선형 대응물의 것보다 더 큰 반감기를 갖는다. 일부 실시형태에서, 반감기는 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50% 또는 그 초과 또는 그 사이의 임의의 백분율만큼 더 크다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 적어도 약 1시간 내지 약 30일 또는 적어도 약 2시간, 6시간, 12시간, 18시간, 24시간, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 21일, 22일, 23일, 24일, 25일, 26일, 27일, 28일, 29일, 30일, 60일 또는 그 초과 또는 그 사이의 임의의 시간 동안 세포에서 반감기 또는 지속성을 갖는다. 특정 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 약 10분 내지 약 7일 이하 또는 약 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 13시간, 14시간, 15시간, 16시간, 17시간, 18시간, 19시간, 20시간, 21시간, 22시간, 24시간, 36시간, 48시간, 60시간, 72시간, 4일, 5일, 6일, 7일 이하 또는 그 사이의 임의의 시간 동안 세포에서 반감기 또는 지속성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 세포가 분열하는 동안 세포에서 반감기 또는 지속성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 분열 후에 세포에서 반감기 또는 지속성을 갖는다. 특정 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 약 10분 내지 약 30일 초과 또는 적어도 약 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 13시간, 14시간, 15시간, 16시간, 17시간, 18시간, 24시간, 2일, 3,일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 21일, 22일, 23일, 24일, 25일, 26일, 27일, 28일, 29일, 30일, 60일 또는 그 초과 또는 그 사이의 임의의 시간 동안 분열 중인 세포에서 반감기 또는 지속성을 갖는다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 세포 기능을 예를 들어, 일시적으로 또는 장기간 조절한다. 특정 실시형태에서, 세포 기능은 안정적으로 변경되며, 예컨대, 조절은 적어도 약 1시간 내지 약 30일 또는 적어도 약 2시간, 6시간, 12시간, 18시간, 24시간, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 21일, 22일, 23일, 24일, 25일, 26일, 27일, 28일, 29일, 30일, 60일 또는 그 초과 또는 그 사이의 임의의 시간 동안 지속된다. 특정 실시형태에서, 세포 기능은 일시적으로 변경되며, 예컨대, 조절은 약 30분 내지 약 7일 이하 또는 약 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 13시간, 14시간, 15시간, 16시간, 17시간, 18시간, 19시간, 20시간, 21시간, 22시간, 24시간, 36시간, 48시간, 60시간, 72시간, 4일, 5일, 6일, 7일 이하 또는 그 사이의 임의의 시간 동안 지속된다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 적어도 약 20개 뉴클레오티드, 적어도 약 30개 뉴클레오티드, 적어도 약 40개 뉴클레오티드, 적어도 약 50개 뉴클레오티드, 적어도 약 75개 뉴클레오티드, 적어도 약 100개 뉴클레오티드, 적어도 약 200개 뉴클레오티드, 적어도 약 300개 뉴클레오티드, 적어도 약 400개 뉴클레오티드, 적어도 약 500개 뉴클레오티드, 적어도 약 1,000개 뉴클레오티드, 적어도 약 2,000개 뉴클레오티드, 적어도 약 5,000개 뉴클레오티드, 적어도 약 6,000개 뉴클레오티드, 적어도 약 7,000개 뉴클레오티드, 적어도 약 8,000개 뉴클레오티드, 적어도 약 9,000개 뉴클레오티드, 적어도 약 10,000개 뉴클레오티드, 적어도 약 12,000개 뉴클레오티드, 적어도 약 14,000개 뉴클레오티드, 적어도 약 15,000개 뉴클레오티드, 적어도 약 16,000개 뉴클레오티드, 적어도 약 17,000개 뉴클레오티드, 적어도 약 18,000개 뉴클레오티드, 적어도 약 19,000개 뉴클레오티드 또는 적어도 약 20,000개 뉴클레오티드이다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 리보솜에 대한 결합 부위를 수용하기에 충분한 크기의 것일 수 있다. 해당 분야의 숙련자는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 최대 크기가 원형 폴리리보뉴클레오티드의 생성 및/또는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 이용의 기술적 제약 이내 만큼 클 수 있음을 인식할 수 있다. 이론에 구속되지는 않지만, RNA의 다수의 세그먼트가 DNA로부터 생성될 수 있고, 그들의 5' 및 3' 자유 말단은 어닐링되어, RNA의 "스트링"을 생성하는 것이 가능하며, 이는 궁극적으로 오직 하나의 5' 및 하나의 3' 자유 말단이 남아있을 때 원형화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 최대 크기는 RNA의 패키징 및 표적으로의 전달 능력에 의해 제한된다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 크기는 유용한 폴리펩티드를 인코딩하기에 충분한 길이이며, 이에 따라, 적어도 20,000개 뉴클레오티드, 적어도 15,000개 뉴클레오티드, 적어도 10,000개 뉴클레오티드, 적어도 7,500개 뉴클레오티드 또는 적어도 5,000개 뉴클레오티드, 적어도 4,000개 뉴클레오티드, 적어도 3,000개 뉴클레오티드, 적어도 2,000개 뉴클레오티드, 적어도 1,000개 뉴클레오티드, 적어도 500개 뉴클레오티드, 적어도 400개 뉴클레오티드, 적어도 300개 뉴클레오티드, 적어도 200개 뉴클레오티드, 적어도 100개 뉴클레오티드의 길이가 유용할 수 있다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 본원의 다른 곳에 기술된 하나 이상의 요소를 포함한다. 일부 실시형태에서, 요소는 스페이서 서열 또는 링커에 의해 서로 분리될 수 있다. 일부 실시형태에서, 요소는 1개의 리보뉴클레오티드, 2개의 뉴클레오티드, 약 5개의 뉴클레오티드, 약 10개의 뉴클레오티드, 약 15개의 뉴클레오티드, 약 20개의 뉴클레오티드, 약 30개의 뉴클레오티드, 약 40개의 뉴클레오티드, 약 50개의 뉴클레오티드, 약 60개의 뉴클레오티드, 약 80개의 뉴클레오티드, 약 100개의 뉴클레오티드, 약 150개의 뉴클레오티드, 약 200개의 뉴클레오티드, 약 250개의 뉴클레오티드, 약 300개의 뉴클레오티드, 약 400개의 뉴클레오티드, 약 500개의 뉴클레오티드, 약 600개의 뉴클레오티드, 약 700개의 뉴클레오티드, 약 800개의 뉴클레오티드, 약 900개의 뉴클레오티드, 약 1000개의 뉴클레오티드, 최대 약 1 kb, 적어도 약 1000개의 뉴클레오티드, 그 사이의 임의의 양의 뉴클레오티드에 의해 서로 분리될 수 있다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 요소는 서로 인접하며, 예를 들어, 스페이서 요소를 결여한다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 내의 하나 이상의 요소는 입체형태적으로 유연성이다. 일부 실시형태에서, 입체형태적 유연성은 이차 구조가 실질적으로 없는 서열에 기인한다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 본원에 기술된 하나 이상의 요망되는 기능 또는 특징을 수용하는, 예를 들어, 리보솜에 대한 결합 부위, 예를 들어, 번역, 예를 들어, 회전환 번역을 수용하는 이차 또는 삼차 구조를 포함한다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 특정 서열 특징을 포함한다. 예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 특정 뉴클레오티드 조성을 포함할 수 있다. 일부 이러한 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 하나 이상의 퓨린 풍부 영역(아데닌 또는 구아노신)을 포함할 수 있다. 일부 이러한 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 하나 이상의 퓨린 풍부 영역(아데닌 또는 구아노신)을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 하나 이상의 AU 풍부 영역 또는 요소(ARE)를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 하나 이상의 아데닌 풍부 영역을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 본원의 다른 곳에 기술된 하나 이상의 반복 요소를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 본원의 다른 곳에 기술된 하나 이상의 변형을 포함한다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 하나 이상의 발현 서열을 포함하며, 생체내에서 대상체의 세포 내의 지속적인 발현을 위해 구성된다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 나중의 시점에서의 세포 내의 하나 이상의 발현 서열의 발현이 조기의 시점과 동일하거나, 그보다 더 크도록 구성된다. 이러한 실시형태에서, 하나 이상의 발현 서열의 발현은 상대적으로 안정한 수준으로 유지될 수 있거나, 시간이 지남에 따라 증가할 수 있다. 발현 서열의 발현은 연장된 기간 동안 상대적으로 안정할 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, 적어도 7일, 8일, 9일, 10일, 12일, 14일, 16일, 18일, 20일, 22일, 23일 또는 그 초과의 기간에 걸친 세포 내의 하나 이상의 발현 서열의 발현은 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10% 또는 5% 만큼 감소하지 않는다. 일부 경우에, 일부 경우에, 세포에서의 하나 이상의 발현 서열의 발현은 적어도 7일, 8일, 9일, 10일, 12일, 14일, 16일, 18일, 20일, 22일, 23일 또는 그 초과 동안 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10% 또는 5%를 초과하여 달라지지 않는 수준으로 유지된다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 수산양식 동물(어류, 게류, 새우, 굴 등) 유래의 세포, 포유동물 세포, 예를 들어, 애완동물 또는 동물원 동물(고양이, 개, 도마뱀, 조류, 사자, 호랑이 및 곰 등) 유래의 세포, 농장 또는 일하는 동물(말, 소, 돼지, 닭 등) 유래의 세포, 인간 세포, 배양된 세포, 일차 세포 또는 세포주, 줄기 세포, 전구 세포, 분화된 세포, 생식 세포, 암 세포(예를 들어, 종양형성, 전이성), 비-종양형성 세포(정상 세포), 태아 세포, 배아 세포, 성인 세포, 유사분열 세포, 비-유사분열 세포 또는 그의 임의의 조합에서 복제 가능하거나, 복제한다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 본원에 기술된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 세포를 포함하며, 세포는 수산양식 동물(어류, 게류, 새우, 굴 등) 유래의 세포, 포유동물 세포, 예를 들어, 애완동물 또는 동물원 동물(고양이, 개, 도마뱀, 조류, 사자, 호랑이 및 곰 등) 유래의 세포, 농장 또는 일하는 동물(말, 소, 돼지, 닭 등) 유래의 세포, 인간 세포, 배양된 세포, 일차 세포 또는 세포주, 줄기 세포, 전구 세포, 분화된 세포, 생식 세포, 암 세포(예를 들어, 종양형성, 전이성), 비-종양형성 세포(정상 세포), 태아 세포, 배아 세포, 성인 세포, 유사분열 세포, 비-유사분열 세포 또는 그의 임의의 조합이다. 일부 실시형태에서, 세포는 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하도록 변형된다.
원형 RNA의 제조 방법
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드를 제조하는 것은 비-천연 발생이며, 재조합 기술(하기 기술된 방법; 예를 들어, DNA 플라스미드를 사용하여 시험관 내에서 유래) 또는 화학적 합성을 사용하여 생성될 수 있는 데옥시리보핵산 서열을 제조하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 선형 폴리리보뉴클레오티드의 원형화는 스플린트 라이게이션에 의해 수행된다.
RNA 서클을 생성하는 데 사용되는 DNA 분자가 원래의 천연-발생 핵산 서열의 DNA 서열, 그의 변형된 버전 또는 자연에서 정상적으로 관찰되지 않는 합성 폴리펩티드(예를 들어, 키메라 분자 또는 융합 단백질)를 인코딩하는 DNA 서열을 포함할 수 있는 것이 본 발명의 범주 이내이다. DNA 및 RNA 분자는 고전적인 돌연변이유발 기법 및 재조합 기법, 예컨대 부위-지정 돌연변이유발, 돌연변이를 유도하기 위한 핵산 분자의 화학적 처리, 핵산 단편의 제한 효소 절단, 핵산 단편의 라이게이션, 핵산 서열의 선택된 영역의 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 증폭 및/또는 돌연변이유발, 올리고뉴클레오티드 혼합물의 합성 및 핵산 분자의 혼합물을 "구축"하기 위한 혼합물 군의 라이게이션 및 그의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 다양한 기법을 사용하여 변형될 수 있다.
원형 폴리리보뉴클레오티드는 화학적 합성 및 효소적 합성을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 임의의 이용 가능한 기법에 따라 제조될 수 있다. 일부 실시형태에서, 선형의 일차 구축물 또는 선형 mRNA를 환화시키거나 콘카테머화시켜, 본원에 기술된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 생성할 수 있다. 환화 또는 콘카테머화의 메커니즘은 방법, 예컨대 비제한적으로 화학적, 효소적, 스플린트 라이게이션 또는 리보자임 촉매작용된 방법을 통해 발생할 수 있다. 새로 형성된 5'-/3'-링키지는 분자내 링키지 또는 분자간 링키지일 수 있다.
본원에 기술된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제조 방법은 예를 들어, 문헌[Khudyakov & Fields, Artificial DNA: Methods and Applications, CRC Press (2002)]; 문헌[Zhao, Synthetic Biology: Tools and Applications, (First Edition), Academic Press (2013)]; 및 문헌[Egli & Herdewijn, Chemistry and Biology of Artificial Nucleic Acids, (First Edition), Wiley-VCH (2012)]에 기술되어 있다.
다양한 원형 폴리리보뉴클레오티드의 합성 방법은 또한, 해당 분야에 기술되어 있다(예를 들어, 미국 특허 제US6210931호, 미국 특허 제US5773244호, 미국 특허 제US5766903호, 미국 특허 제US5712128호, 미국 특허 제US5426180호, 미국 공개 제US20100137407호, 국제 공개 제WO1992001813호; 국제 공개 제WO2016197121호; 국제 공개 제WO2010084371호 참조; 이의 각각의 내용은 그들 전문이 본원에 참조로 포함됨).
예를 들어, 본원에서 실시예 13 이하에는 약제학적 원형 RNA 제제의 제조 및 특성화 방법이 기술된다.
선형 및 원형 RNA의 검출
본 발명자들은 약제학적 원형 RNA 제제 내의 선형 RNA의 존재가 예상치 않은, 때때로 바람직하지 않은 효과를 가질 수 있는 것을 발견하였다. 따라서, 본 발명은 특히 원형 RNA가 선형 RNA에 비하여 농축, 분리 및/또는 정제된 약제학적 조성물 및 제제; 선형 RNA가 모니터링, 평가 및/또는 제어될 수 있는 방법(예를 들어, 원형 RNA 제제의 제조 방법); 및 예를 들어, 이펙터, 예컨대 치료적 이펙터 또는 스캐폴드(예를 들어, 압타머 서열)를 세포, 조직 또는 대상체로 전달하기 위한 이러한 약제학적 조성물 및 제제의 이용 방법을 특징으로 한다. 일부 실시형태에서, 원형 RNA 제제는 임계값 이하의 수준의 선형 RNA를 가지며, 예를 들어, 원형 RNA 제제는 선형 RNA에 비하여 농축되거나, 선형 RNA를 감소시키기 위하여 정제된다.
일반적으로, 약제학적 제제 내의 요소의 검출 및 정량화는 관심 성분(예를 들어, 원형 RNA, 선형 RNA, 단편, 불순물 등)이거나 또는 유사한 물질(예를 들어, 원형 RNA에 대한 표준물질로서 원형 RNA 구조와 동일한 서열의 선형 RNA 구조 이용)인 참조 표준물질의 이용을 포함하거나, 내부 표준물질 또는 시험 시료로부터의 신호의 이용을 포함한다. 일부 실시형태에서, 표준물질은 알려져 있는 또는 상대적인 양의 물질에 대한 검출기로부터의 반응(반응 인자)을 확립하기 위하여 사용된다. 일부 실시형태에서, 반응 인자는 하나의 또는 다수의 농도에서 (예를 들어, 선형 회귀 분석을 사용하여) 표준물질로부터 결정된다. 일부 실시형태에서, 반응 인자를 이어서 사용하여, 상기 성분으로 인한 신호로부터 관심 물질의 양을 결정한다. 일부 실시형태에서, 반응 인자는 일의 값이거나, 일의 값을 갖는 것으로 가정된다.
일부 실시형태에서, 약제학적 조성물 내의 원형 RNA에 대한 선형 RNA의 검출 및 정량화는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 버전에 대한 비교를 사용하여 결정된다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물 내의 총 리보뉴클레오티드의 질량은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 버전을 사용하여 생성된 표준 곡선을 사용하여, 그리고, 일의 반응 인자를 가정하여 결정된다. 일부 실시형태에서, 약제학적 제제 내의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 w/w 백분율은 약제학적 제제 내의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 밴드 세기에 대한 다수의 알려져 있는 양의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 버전의 밴드 세기에 의해 생성되는 표준 곡선의 비교에 의해 결정된다. 일부 실시형태에서, 밴드는 겔-베이스 전기영동 동안 생성되며, 밴드 세기는 겔 이미저(imager)(예를 들어, E-겔 이미저)에 의해 측정된다. 예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드에 비한 선형 폴리리보뉴클레오티드의 양은 실시예 2 및/또는 실시예 3의 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 제제는 본원에 기술된 바와 같이 평가되는 경우 임계값 양(예를 들어, 임계값 양은 원형 폴리리보뉴클레오티드 제제에 대한 참조 기준, 예를 들어, 약제 출하 규격임) 미만의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자를 포함한다.
일부 실시형태에서, 약제학적 조성물 내의 전체 RNA에 대한 닉킹된 RNA의 검출 및 정량화는 원형 RNA를 포함하는 제제의 겔 추출 후에 시퀀싱에 의해 결정된다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물 내의 선형 RNA에 대한 닉킹된 RNA의 검출 및 정량화는 원형 RNA를 포함하는 제제의 겔 추출 후에 시퀀싱에 의해 결정된다. 예를 들어, 전체 RNA에 비한 닉킹된 폴리리보뉴클레오티드의 양은 실시예 5의 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 선형 RNA에 비한 닉킹된 폴리리보뉴클레오티드의 양은 실시예 5의 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 제제는 본원에 기술된 바와 같이 평가되는 경우 임계값 양(예를 들어, 임계값 양은 원형 폴리리보뉴클레오티드 제제에 대한 참조 기준, 예를 들어, 약제 출하 규격임) 미만의 닉킹된 RNA, 선형 RNA 또는 조합된 선형 및 닉킹된 RNA를 포함한다. 예를 들어, 제제에 존재하는 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 양에 대한 참조 기준은 제제 내의 총 리보뉴클레오티드 분자에 비한 30%, 20%, 15%, 10%, 1%, 0.5% 또는 0.1% 이하 또는 그 사이의 임의의 백분율의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자이다. 일부 실시형태에서, 제제에 존재하는 닉킹된 폴리리보뉴클레오티드 분자의 양에 대한 참조 기준은 제제 내의 총 리보뉴클레오티드 분자에 비한 30%, 20%, 15%, 10%, 1%, 0.5% 또는 0.1% 이하 또는 그 사이의 임의의 백분율의 닉킹된 폴리리보뉴클레오티드 분자이다. 일부 실시형태에서, 제제에 존재하는 선형 및 닉킹된 폴리리보뉴클레오티드 분자의 양에 대한 참조 기준은 제제 내의 총 리보뉴클레오티드 분자에 비하여 40%, 30%, 20%, 15%, 10%, 1%, 0.5% 또는 0.1% 이하 또는 그 사이의 임의의 백분율의 조합된 선형 폴리리보뉴클레오티드 및 닉킹된 폴리리보뉴클레오티드 분자이다.
일부 실시형태에서, 표준물질을 시료와 동일한 조건 하에서 전개시킨다. 예를 들어, 표준물질을 시료와 동일한 유형의 겔, 동일한 완충제 및 동일한 노출을 사용하여 전개시킨다. 추가의 실시형태에서, 표준물질을 시료와 병행하여 전개시킨다. 일부 실시형태에서, 요소의 정량화를 대상 제제 유래의 복수의 시료에서 (예를 들어, 2벌 또는 3벌로) 반복하여 평균 결과를 수득한다. 일부 실시형태에서, 선형 RNA의 정량화를 병행 모세관 전기영동을 사용하여(예를 들어, 단편 분석기(Fragment Analyzer) 또는 UV 검출과 함께 분석적 HPLC를 사용하여) 측정한다.
원형 RNA의 정제
원형 폴리리보뉴클레오티드를 원치 않는 물질(예컨대 원치 않는(예를 들어, 선형) RNA, 효소, DNA)로부터 분리, 농축 또는 정제시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 원치 않는 물질은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제조 및/또는 제작 과정에 존재하거나, 그로부터 기원한다. 본원에 기술된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 약제학적 제제, 약제학적 조성물, 약제학적 약물 물질 또는 약제학적 약물 제품에서의 제형화 이전에 농축 및/또는 정제시킬 수 있다. 본원에 기술된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 약제학적 제제, 약제학적 조성물, 약제학적 약물 물질 또는 약제학적 약물 제품에서의 제형화 동안 또는 그 이후에 농축 및/또는 정제시킬 수 있다.
일부 실시형태에서, 원형 RNA를 생성 동안 또는 그 이후에 정제하여, 바람직하지 않은 요소, 예를 들어, 선형 RNA 또는 닉킹된 RNA, 및 알려진 불순물, 예를 들어, 유리 리보핵산(예를 들어, 모노리보핵산, 디리보핵산 또는 트리리보핵산), DNA(예를 들어, 세포 DNA, 예컨대 숙주 세포 DNA), 세포 또는 공정-관련 단백질 불순물(예를 들어, 세포 또는 공정-관련 불순물) 등을 제거할 수 있다. 일부 실시형태에서, 불순물은 공정-관련 불순물이다. 일부 실시형태에서, 공정-관련 불순물은 단백질(예를 들어, 세포 단백질), 핵산(예를 들어, 세포 핵산), 완충제 또는 완충제 시약, 효소, 배지/시약 성분(예를 들어, 배지, 배지 첨가제, 전이 금속 또는 비타민), 분취용 또는 분석적 겔 성분(예를 들어, 아크릴아미드 잔해), DNA 또는 크로마토그래피 물질이다. 완충제 시약은 MgCl2, DTT, ATP, SDS, Na, 글리코겐, Tris-HCL 또는 EtOH일 수 있다. 완충제 시약은 아세트산염, Tris, 중탄산염, 인산염, 시트르산, 락트산염 또는 TEA를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 효소는 리가제일 수 있다. 리가제는 T4 RNA 리가제 2일 수 있다. 일부 실시형태에서, 불순물은 완충제 시약, 배지/시약 성분, 염, 리가제, 뉴클레아제, RNase 저해제, RNase R, 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자, 데옥시리보뉴클레오티드 분자, 아크릴아미드 잔해 또는 모노뉴클레오티드 분자이다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 해당 분야에서 통상적으로 사용되는 임의의 알려져 있는 방법에 의해 농축 또는 정제될 수 있다. 비제한적인 정제 방법의 예는 컬럼 크로마토그래피, 겔 절개, 크기 배제 등을 포함한다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 겔 정제, 예를 들어, UREA 겔 분리에 의해, 예를 들어, 실시예 3에 기술된 바와 같이 정제된다. 예를 들어, 원형 RNA는 변성 PAGE 상에서 분리될 수 있으며, 원형 RNA에 상응하는 밴드를 절개하고, 원형 RNA를 알려져 있는 방법을 사용하여 밴드로부터 용리시킬 수 있다. 이어서, 용리된 원형 RNA를 분석할 수 있다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 크로마토그래피, 예를 들어, 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC), 혼합-모드 크로마토그래피, 액체 크로마토그래피, 예를 들어, 역상 이온-쌍 크로마토그래피(IP-RP), 이온-교환 크로마토그래피(IE), 친화성 크로마토그래피(AC) 및 크기-배제 크로마토그래피(SEC) 및 그의 임의의 조합에 의해 정제된다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 구조적 특징을 이용하여, 그것을 선형 RNA 또는 불순물로부터 분리함으로써 정제된다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 실시예 9에 기술된 바와 같이 구조적 특징(예를 들어, 자유 말단의 결여)을 이용함으로써 정제된다. 예를 들어, 원형 RNA는 선형 RNA 대응물 및 그의 단편의 폴리아데닐화를 사용하여 동일한 뉴클레오티드 서열을 함유하는 혼합된 원형 RNA 및 선형 RNA 대응물의 풀을 포함하는 제제로부터 농축된다. 선형 RNA 대응물 또는 그의 단편의 3' 말단을 폴리(A) 폴리머라제를 사용하여 폴리아데닐화시켜, 3' 폴리아데닌 테일의 부가를 초래할 수 있다. 일부 실시형태에서, 3' 폴리아데닌 테일은 컬럼, 예컨대 친화성 컬럼을 사용한 선형 RNA 및 그의 단편의 풀다운(pulldown)을 가능하게 하여, 원형 RNA를 농축시킨다. 폴리(A) 폴리머라제는 또한 변형된 아데닌, 예컨대 비오티닐화된 N6-ATP 유사체를 혼입시킬 수 있다. 3' 폴리아데닌 테일 내로의 비오티닐화된 N6-ATP 유사체의 이 부가는 시스템, 예컨대 비오틴-스트렙트아비딘 결합 시스템에서 선형 RNA 및 그의 단편의 풀다운을 가능하게 한다. 대조적으로, 원형화된 RNA는 3' 말단을 갖지 않으며, 이에 따라, 폴리(A) 폴리머라제에 의해 폴리아데닐화되지 않고, 컨쥬게이션을 위한 폴리아데닐화된 테일을 갖지 않고, 풀다운에서 포획되지 않는다. 따라서, 원형 RNA는 풀다운 후에 제제에서 농축된다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 선형 RNA의 구조적 특징(예를 들어, 자유 말단의 존재)을 이용함으로써 정제된다. 예를 들어, 원형 RNA는 선형 RNA 대응물의 폴리아데닐화를 사용하여 동일한 뉴클레오티드 서열을 함유하는 혼합된 원형 RNA 및 선형 RNA 대응물의 풀을 포함하는 제제로부터 농축된다. 엑소뉴클레아제를 혼합된 풀에 첨가하여, 선형 RNA를 가수분해시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 엑소뉴클레아제는 3' 엑소뉴클레아제 또는 5' 엑소뉴클레아제일 수 있다. 일부 실시형태에서, 3' 엑소뉴클레아제 및 5' 엑소뉴클레아제가 사용될 수 있다.
일 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 제제(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드 약제학적 제제 또는 조성물 또는 원형 폴리리보뉴클레오티드 제제의 생성에서의 중간체)는 질량 기준으로 적어도 30%(w/w), 40%(w/w), 50%(w/w), 60%(w/w), 70%(w/w), 80%(w/w), 85%(w/w), 90%(w/w), 91%(w/w), 92%(w/w), 93%(w/w), 94%(w/w), 95%(w/w), 96%(w/w), 97%(w/w), 98%(w/w), 99%(w/w) 또는 100%(w/w) 순수하다. 순도는 해당 분야의 숙련자에게 알려져 있는 수많은 분석 기법 중 어느 하나, 예컨대 비제한적으로, 분리-전 또는 분리-후 유도체화 방법과 함께 또는 이것 없이 분리 기술, 예컨대 크로마토그래피(컬럼 사용, 종이 사용, 겔 사용, HPLC 사용, UHPLC 사용 등 또는 IC에 의한, SEC에 의한, 역상에 의한, 음이온 교환에 의한, 혼합 방식에 의한 등) 또는 전기영동(UREA PAGE, 칩-기반, 폴리아크릴아미드 겔, RNA, 모세관, c-IEF 등)의 이용에 의해, 질량 분석법, UV-가시적, 형광, 광 산란, 굴절률에 기초하거나 검출을 위해 은 또는 염료 염색 또는 방사성 붕괴를 사용하는 검출 기법을 사용하여 측정될 수 있다. 대안적으로, 순도는 분리 기술의 이용 없이, 질량 분석법에 의해, 현미경관찰법에 의해, 원편광 이색성(CD) 분광법에 의해, UV 또는 UV-vis 분광광도법에 의해, 형광측정법(예를 들어, Qubit)에 의해, RNAse H 분석에 의해, 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 또는 검출을 위해 은 또는 염료 염색 또는 방사성 붕괴를 사용하는 방법에 의해 결정될 수 있다.
일부 실시형태에서, 순도는 생물학적 시험 방법(예를 들어, 세포-기반의 또는 수용체-기반의 시험)에 의해 측정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본원에 기술된 제제 내의 리보뉴클레오티드 총 질량의 적어도 30%(w/w), 40%(w/w), 50%(w/w), 60%(w/w), 70%(w/w), 80%(w/w), 85%(w/w), 90%(w/w), 91%(w/w), 92%(w/w), 93%(w/w), 94%(w/w), 95%(w/w), 96%(w/w), 97%(w/w), 98%(w/w), 99%(w/w) 또는 100%(w/w)는 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자에 함유된다. 백분율은 해당 분야의 숙련자에게 알려져 있는 수많은 분석 기법 중 어느 하나, 예컨대, 비제한적으로 분리-전 또는 분리-후 유도체화 방법과 함께 또는 이것 없이 분리 기술, 예컨대 크로마토그래피(컬럼 사용, 종이 사용, 겔 사용, HPLC 사용, UHPLC 사용 등 또는 IC에 의한, SEC에 의한, 역상에 의한, 음이온 교환에 의한, 혼합 방식에 의한 등) 또는 전기영동(UREA PAGE, 칩-기반, 폴리아크릴아미드 겔, RNA, 모세관, c-IEF 등)의 이용에 의해, 질량 분석법, UV-가시적, 형광, 광 산란, 굴절률에 기초하거나, 검출을 위해 은 또는 염료 염색 또는 방사성 붕괴를 사용하는 검출 기법을 사용하여 측정될 수 있다. 대안적으로, 순도는 분리 기술의 이용 없이 질량 분석법에 의해, 현미경관찰법에 의해, 원편광 이색성(CD) 분광법에 의해, UV 또는 UV-vis 분광광도법에 의해, 형광측정법(예를 들어, Qubit)에 의해, RNAse H 분석에 의해, 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 또는 검출을 위해 은 또는 염료 염색 또는 방사성 붕괴를 사용하는 방법에 의해 결정될 수 있다.
일 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 제제(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드 약제학적 제제 또는 조성물 또는 원형 폴리리보뉴클레오티드 제제의 생성에서의 중간체)는 적어도 0.1 ng/㎖, 0.5 ng/㎖, 1 ng/㎖, 5 ng/㎖, 10 ng/㎖, 50 ng/㎖, 0.1 ㎍/㎖, 0.5 ㎍/㎖,1 ㎍/㎖, 2 ㎍/㎖, 5 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖, 20 ㎍/㎖, 30 ㎍/㎖, 40 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 60 ㎍/㎖, 70 ㎍/㎖, 80 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖, 200 ㎍/㎖, 300 ㎍/㎖, 500 ㎍/㎖, 1000 ㎍/㎖, 5000 ㎍/㎖, 10,000 ㎍/㎖, 100,000 ㎍/㎖, 200 ㎎/㎖, 300 ㎎/㎖, 400 ㎎/㎖, 500 ㎎/㎖, 600 ㎎/㎖, 650 ㎎/㎖, 700 ㎎/㎖ 또는 750 ㎎/㎖의 원형 폴리리보뉴클레오티드 농도를 갖는다. 일 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 제제(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드 약제학적 제제 또는 조성물 또는 원형 폴리리보뉴클레오티드 제제의 생성에서의 중간체)는 실질적으로 모노뉴클레오티드가 없거나, 1 pg/㎖, 10 pg/㎖, 0.1 ng/㎖, 1 ng/㎖, 5 ng/㎖, 10 ng/㎖, 15 ng/㎖, 20 ng/㎖, 25 ng/㎖, 30 ng/㎖, 35 ng/㎖, 40 ng/㎖, 50 ng/㎖, 60 ng/㎖, 70 ng/㎖, 80 ng/㎖, 90 ng/㎖, 100 ng/㎖, 200 ng/㎖, 300 ng/㎖, 400 ng/㎖, 500 ng/㎖, 1000 ㎍/㎖, 5000 ㎍/㎖, 10,000 ㎍/㎖ 또는 100,000 ㎍/㎖ 이하의 모노뉴클레오티드 함량을 갖는다. 일 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 제제(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드 약제학적 제제 또는 조성물 또는 원형 폴리리보뉴클레오티드 제제의 생성에서의 중간체)는 검출 한계 내지 최대 1 pg/㎖, 10 pg/㎖, 0.1 ng/㎖, 1 ng/㎖, 5 ng/㎖, 10 ng/㎖, 15 ng/㎖, 20 ng/㎖, 25 ng/㎖, 30 ng/㎖, 35 ng/㎖, 40 ng/㎖, 50 ng/㎖, 60 ng/㎖, 70 ng/㎖, 80 ng/㎖, 90 ng/㎖, 100 ng/㎖, 200 ng/㎖, 300 ng/㎖, 400 ng/㎖, 500 ng/㎖, 1000 ㎍/㎖, 5000 ㎍/㎖, 10,000 ㎍/㎖ 또는 100,000 ㎍/㎖의 모노뉴클레오티드 함량을 갖는다.
일 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 제제(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드 약제학적 제제 또는 조성물 또는 원형 폴리리보뉴클레오티드 제제의 생성에서의 중간체)는 질량 기준으로 총 뉴클레오티드의 0.1%(w/w), 0.2%(w/w), 0.3%(w/w), 0.4%(w/w), 0.5%(w/w), 0.6%(w/w), 0.7%(w/w), 0.8%(w/w), 0.9%(w/w), 1%(w/w), 2%(w/w), 3%(w/w), 4%(w/w), 5%(w/w), 6%(w/w), 7%(w/w), 8%(w/w), 9%(w/w), 10%(w/w), 15%(w/w), 20%(w/w), 25%(w/w), 30%(w/w) 이하 또는 그 사이의 임의의 백분율의 모노뉴클레오티드 함량을 가지며, 총 뉴클레오티드 함량은 데옥시리보뉴클레오티드 분자 및 리보뉴클레오티드 분자의 총 질량이다.
일 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 제제(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드 약제학적 제제 또는 조성물 또는 원형 폴리리보뉴클레오티드 제제의 생성에서의 중간체)는 1 ng/㎖, 5 ng/㎖, 10 ng/㎖, 15 ng/㎖, 20 ng/㎖, 25 ng/㎖, 30 ng/㎖, 35 ng/㎖, 40 ng/㎖, 50 ng/㎖, 6 0ng/㎖, 70 ng/㎖, 80 ng/㎖, 90 ng/㎖, 100 ng/㎖, 200 ng/㎖, 300 ng/㎖, 400 ng/㎖, 500ng/㎖, 600 ng/㎖, 1 ㎍/ ㎖, 10 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖, 200 g/㎖, 300 ㎍/㎖, 400 ㎍/㎖, 500 ㎍/㎖, 600 ㎍/㎖, 700 ㎍/㎖, 800 ㎍/㎖, 900 ㎍/㎖, 1 ㎎/㎖, 1.5 ㎎/㎖, 2㎎/㎖, 5 ㎎/㎖, 10 ㎎/㎖, 50 ㎎/㎖, 100 ㎎/㎖, 200 ㎎/㎖, 300 ㎎/㎖, 400 ㎎/㎖, 500 ㎎/㎖, 600 ㎎/㎖, 650 ㎎/㎖, 700 ㎎/㎖ 또는 750 ㎎/㎖ 이하의 선형 RNA 함량, 예를 들어, 선형 RNA 대응물 또는 RNA 단편을 갖는다. 일 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 제제(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드 약제학적 제제 또는 조성물 또는 원형 폴리리보뉴클레오티드 제제의 생성에서의 중간체)는 검출 한계 내지 최대 1 ng/㎖, 5 ng/㎖, 10 ng/㎖, 15 ng/㎖, 20 ng/㎖, 25 ng/㎖, 30 ng/㎖, 35 ng/㎖, 40 ng/㎖, 50 ng/㎖, 6 0ng/㎖, 70 ng/㎖, 80 ng/㎖, 90 ng/㎖, 100 ng/㎖, 200 ng/㎖, 300 ng/㎖, 400 ng/㎖, 500ng/㎖, 600 ng/㎖, 1 ㎍/ ㎖, 10 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖, 200 g/㎖, 300 ㎍/㎖, 400 ㎍/㎖, 500 ㎍/㎖, 600 ㎍/㎖, 700 ㎍/㎖, 800 ㎍/㎖, 900 ㎍/㎖, 1 ㎎/㎖, 1.5 ㎎/㎖, 2㎎/㎖, 5 ㎎/㎖, 10 ㎎/㎖, 50 ㎎/㎖, 100 ㎎/㎖, 200 ㎎/㎖, 300 ㎎/㎖, 400 ㎎/㎖, 500 ㎎/㎖, 600 ㎎/㎖, 650 ㎎/㎖, 700 ㎎/㎖ 또는 750 ㎎/㎖의 선형 RNA 함량, 예를 들어, 선형 RNA 대응물 또는 RNA 단편을 갖는다.
일 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 제제(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드 약제학적 제제 또는 조성물 또는 원형 폴리리보뉴클레오티드 제제의 생성에서의 중간체)는 10%(w/w), 9.9%(w/w), 9.8%(w/w), 9.7%(w/w), 9.6%(w/w), 9.5%(w/w), 9.4%(w/w), 9.3%(w/w), 9.2%(w/w), 9.1%(w/w), 9%(w/w), 8%(w/w), 7%(w/w), 6%(w/w), 5%(w/w), 4%(w/w), 3%(w/w), 2%(w/w), 1%(w/w), 0.5%(w/w) 또는 0.1%(w/w) 이하 또는 그 사이의 백분율의 닉킹된 RNA 함량을 갖는다. 일 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 제제(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드 약제학적 제제 또는 조성물 또는 원형 폴리리보뉴클레오티드 제제의 생성에서의 중간체)는 0만큼 낮은 닉킹된 RNA 함량을 갖거나, 닉킹된 RNA가 실질적으로 없다.
일 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 제제(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드 약제학적 제제 또는 조성물 또는 원형 폴리리보뉴클레오티드 제제의 생성에서의 중간체)는 30%(w/w), 25%(w/w), 20%(w/w), 15%(w/w), 10%(w/w), 9%(w/w), 8%(w/w), 7%(w/w), 6%(w/w), 5%(w/w), 4%(w/w), 3%(w/w), 2%(w/w), 1%(w/w), 0.5%(w/w) 또는 0.1%(w/w) 이하 또는 그 사이의 백분율의 조합된 선형 RNA 및 닉킹된 RNA 함량을 갖는다. 일 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 제제(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드 약제학적 제제 또는 조성물 또는 원형 폴리리보뉴클레오티드 제제의 생성에서의 중간체)는 0만큼 낮은 조합된 닉킹된 RNA 및 선형 RNA 함량을 갖거나, 닉킹된 및 선형 RNA가 실질적으로 없다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 제제(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드 약제학적 제제 또는 조성물 또는 원형 폴리리보뉴클레오티드 제제의 생성에서의 중간체)는 분석 방법, 예컨대 질량 분석법, UV 분광 또는 형광 검출기, 광 산란 기법, HPLC를 포함하는 분리 방법의 이용과 함께 또는 이것 없이 표면 플라스몬 공명(SPR)을 사용하는, 분리 전 또는 분리 후 유도체화 방법의 이용과 함께 또는 이것 없이 HPLC, 칩 또는 겔 기반의 전기영동에 의한 방법, 은 또는 염료 염색 또는 방사성 붕괴를 사용하는 검출 방법 또는 현미경관찰법, 가시적 방법 또는 분광광도계의 검출 한계 이하의 선형 RNA 함량, 예를 들어, 선형 RNA 대응물 또는 RNA 단편을 갖는다.
일 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 제제(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드 약제학적 제제 또는 조성물 또는 원형 폴리리보뉴클레오티드 제제의 생성에서의 중간체)는 예를 들어, 실시예 2의 방법에 의해 측정하여, 0.1%(w/w), 1%(w/w), 2%(w/w), 3%(w/w), 4%(w/w), 5%(w/w), 6%(w/w), 7%(w/w), 8%(w/w), 9%(w/w), 10%(w/w), 15%(w/w), 20%(w/w), 25%(w/w), 30%(w/w), 35%(w/w), 40%(w/w), 45%(w/w), 50%(w/w) 이하의 선형 RNA를 갖는다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 제제의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자는 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 선형 대응물 또는 그의 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 제제의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자는 선형 대응물(예를 들어, 사전-원형화된 버전)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 제제의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자는 원형 폴리리보뉴클레오티드에 대한 비-대응물 또는 그의 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 제제의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자는 원형 폴리리보뉴클레오티드에 대한 비-대응물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 대응물 및 원형 폴리리보뉴클레오티드의 비-대응물 또는 그의 단편의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 대응물 및 원형 폴리리보뉴클레오티드의 비-대응물의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자 단편은 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 20개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개, 100개, 200개, 300개, 400개, 500개, 1000개, 2000개, 3000개, 4000개, 5000개, 6000개, 7000개, 8000개, 9000개, 10000개, 11000개, 12000개 또는 그 초과의 뉴클레오티드 길이 또는 그 사이의 임의의 뉴클레오티드 수인 단편이다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 제제(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드 약제학적 제제 또는 조성물 또는 원형 폴리리보뉴클레오티드 제제의 생성에서의 중간체)는 예를 들어, 분광광도계에 의해 측정하여, 약 1.6 내지 약 2.3의 A260/A280 흡광도 비를 갖는다. 일부 실시형태에서, A260/A280 흡광도 비는 약 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5 또는 그 사이의 임의의 수이다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드 약제학적 제제 또는 조성물 또는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 생성에서의 중간체)는 예를 들어, 분광광도계에 의해 측정하여, 약 1.8 초과의 A260/A280 흡광도 비를 갖는다. 일부 실시형태에서, A260/A280 흡광도 비는 약 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9 또는 그 초과이다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 제제(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드 약제학적 제제 또는 조성물 또는 원형 폴리리보뉴클레오티드 제제의 생성에서의 중간체)는 불순물이 실질적으로 없다. 다양한 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 조성물 내의 적어도 하나의 불순물의 수준은 정제 또는 불순물을 제거하기 위한 처리 이전의 조성물의 불순물의 수준에 비하여 적어도 30%(w/w), 적어도 40%(w/w), 적어도 50%(w/w), 적어도 60%(w/w), 적어도　70%(w/w), 적어도 80%(w/w), 적어도 90%(w/w) 또는 적어도 95%(w/w) 감소된다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 공정-관련 불순물의 수준은 정제 또는 불순물을 제거하기 위한 처리 이전의 조성물의 공정-관련 불순물의 수준에 비하여 적어도 30%(w/w), 적어도 40%(w/w), 적어도 50%(w/w), 적어도 60%(w/w), 적어도　70%(w/w), 적어도 80%(w/w), 적어도 90%(w/w) 또는 적어도 95%(w/w) 감소된다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 제품-관련 물질의 수준은 정제 또는 불순물을 제거하기 위한 처리 이전의 조성물의 제품-관련 물질의 수준에 비하여 적어도 30%(w/w), 적어도 40%(w/w), 적어도 50%(w/w), 적어도 60%(w/w), 적어도　70%(w/w), 적어도 80%(w/w), 적어도 90%(w/w) 또는 적어도 95%(w/w) 감소된다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 제제(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드 약제학적 제제 또는 조성물 또는 원형 폴리리보뉴클레오티드 제제의 생성에서의 중간체)는 추가로 공정-관련 불순물이 실질적으로 없다. 일부 실시형태에서, 공정-관련 불순물은 단백질(예를 들어, 세포 단백질, 예컨대 숙주 세포 단백질), 데옥시리보핵산(예를 들어, 세포 데옥시리보핵산, 예컨대 숙주 세포 데옥시리보핵산), 모노데옥시리보뉴클레오티드 또는 디데옥시리보뉴클레오티드 분자, 효소(예를 들어, 뉴클레아제, 예컨대 엔도뉴클레아제 또는 엑소뉴클레아제 또는 리가제), 시약 성분, 겔 성분 또는 크로마토그래피 물질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 불순물은 하기로부터 선택된다: 완충제 시약, 리가제, 뉴클레아제, RNase 저해제, RNase R, 데옥시리보뉴클레오티드 분자, 아크릴아미드 겔 잔해 및 모노데옥시리보뉴클레오티드 분자. 일부 실시형태에서, 약제학적 제제는 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자 밀리그램(㎎)당 0.1 ng, 1 ng, 5 ng, 10 ng, 15 ng, 20 ng, 25 ng, 30 ng, 35 ng, 40 ng, 50 ng, 60 ng, 70 ng, 80 ng, 90 ng, 100 ng, 200 ng, 300 ng, 400 ng 또는 500 ng 미만의 단백질 오염의 단백질(예를 들어, 세포 단백질, 예컨대 숙주 세포 단백질) 오염을 포함한다.
일 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 제제(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드 약제학적 제제 또는 조성물 또는 원형 폴리리보뉴클레오티드 제제의 생성에서의 중간체)는 DNA 함량, 예를 들어, 주형 DNA 또는 세포 DNA(예를 들어, 숙주 세포 DNA)가 실질적으로 없거나, 0만큼 낮은 DNA 함량을 갖거나, 1 pg/㎖, 10 pg/㎖, 0.1 ng/㎖, 1 ng/㎖, 5 ng/㎖, 10 ng/㎖, 15 ng/㎖, 20 ng/㎖, 25 ng/㎖, 30 ng/㎖, 35 ng/㎖, 40 ng/㎖, 50 ng/㎖, 60 ng/㎖, 70 ng/㎖, 80 ng/㎖, 90 ng/㎖, 100 ng/㎖, 200 ng/㎖, 300 ng/㎖, 400 ng/㎖, 500 ng/㎖, 1000 ㎍/㎖, 5000 ㎍/㎖, 10,000 ㎍/㎖ 또는 100,000 ㎍/㎖ 이하의 DNA 함량을 갖는다.
일 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 제제(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드 약제학적 제제 또는 조성물 또는 원형 폴리리보뉴클레오티드 제제의 생성에서의 중간체)는 DNA 함량이 실질적으로 없거나, 0만큼 낮은 DNA 함량을 갖거나, 질량 기준으로 총 뉴클레오티드의 0.001%(w/w), 0.01%(w/w), 0.1%(w/w), 1%(w/w), 2%(w/w), 3%(w/w), 4%(w/w), 5%(w/w), 6%(w/w), 7%(w/w), 8%(w/w), 9%(w/w), 10%(w/w), 15%(w/w), 20%(w/w), 25%(w/w), 30%(w/w), 35%(w/w), 40%(w/w), 45%(w/w), 50%(w/w) 이하의 DNA 함량을 가지며, 총 뉴클레오티드 분자는 데옥시리보뉴클레오티드 함량 및 리보뉴클레오티드 분자의 총 질량이다. 일 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 제제(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드 약제학적 제제 또는 조성물 또는 원형 폴리리보뉴클레오티드 제제의 생성에서의 중간체)는 DNA 함량이 실질적으로 없거나, 0만큼 낮은 DNA 함량을 갖거나, 정량적 액체 크로마토그래피-질량 분석법(LC-MS)에 의해 뉴클레오시드를 분해하는 효소에 의한 총 DNA 분해 후에 측정하여, 질량 기준으로 총 뉴클레오티드의 0.001%(w/w), 0.01%(w/w), 0.1%(w/w), 1%(w/w), 2%(w/w), 3%(w/w), 4%(w/w), 5%(w/w), 6%(w/w), 7%(w/w), 8%(w/w), 9%(w/w), 10%(w/w), 15%(w/w), 20%(w/w), 25%(w/w), 30%(w/w), 35%(w/w), 40%(w/w), 45%(w/w), 50%(w/w) 이하의 DNA 함량을 가지며, DNA의 함량은 LC-MS에 의해 측정하여 각각의 염기(즉, A, C, G, T)의 표준 곡선으로부터 역 계산된다.
일 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 제제(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드 약제학적 제제 또는 조성물 또는 원형 폴리리보뉴클레오티드 제제의 생성에서의 중간체)는 0.1 ng/㎖, 1 ng/㎖, 5 ng/㎖, 10 ng/㎖, 15 ng/㎖, 20 ng/㎖, 25 ng/㎖, 30 ng/㎖, 35 ng/㎖, 40 ng/㎖, 50 ng/㎖, 60 ng/㎖, 70 ng/㎖, 80 ng/㎖, 90 ng/㎖, 100 ng/㎖, 200 ng/㎖, 300 ng/㎖, 400 ng/㎖ 또는 500 ng/㎖ 이하의 단백질(예를 들어, 세포 단백질(CP), 예를 들어, 효소, 생성-관련 단백질, 예를 들어, 담체 단백질) 오염을 갖는다. 일 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드 약제학적 제제 또는 조성물 또는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 생성에서의 중간체)는 검출 한계 내지 최대 0.1 ng/㎖, 1 ng/㎖, 5 ng/㎖, 10 ng/㎖, 15 ng/㎖, 20 ng/㎖, 25 ng/㎖, 30 ng/㎖, 35 ng/㎖, 40 ng/㎖, 50 ng/㎖, 60 ng/㎖, 70 ng/㎖, 80 ng/㎖, 90 ng/㎖, 100 ng/㎖, 200 ng/㎖, 300 ng/㎖, 400 ng/㎖ 또는 500 ng/㎖의 단백질(예를 들어, 생성-관련 단백질, 예컨대 세포 단백질(CP), 예를 들어, 효소) 오염을 갖는다.
일 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 제제(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드 약제학적 제제 또는 조성물 또는 원형 폴리리보뉴클레오티드 제제의 생성에서의 중간체)는 원형 폴리리보뉴클레오티드 밀리그램(㎎)당 0.1 ng, 1 ng, 5 ng, 10 ng, 15 ng, 20 ng, 25 ng, 30 ng, 35 ng, 40 ng, 50 ng, 60 ng, 70 ng, 80 ng, 90 ng, 100 ng, 200 ng, 300 ng, 400 ng 또는 500 ng 미만의 단백질(예를 들어, 생성-관련 단백질, 예컨대 세포 단백질(CP), 예를 들어, 효소) 오염을 갖는다. 일 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드 약제학적 제제 또는 조성물 또는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 생성에서의 중간체)는 검출 수준 내지 원형 폴리리보뉴클레오티드 밀리그램(㎎)당 최대 0.1 ng, 1 ng, 5 ng, 10 ng, 15 ng, 20 ng, 25 ng, 30 ng, 35 ng, 40 ng, 50 ng, 60 ng, 70 ng, 80 ng, 90 ng, 100 ng, 200 ng, 300 ng, 400 ng 또는 500 ng의 단백질(예를 들어, 생성-관련 단백질, 예컨대 세포 단백질(CP), 예를 들어, 효소) 오염을 갖는다.
일 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 제제(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드 약제학적 제제 또는 조성물 또는 원형 폴리리보뉴클레오티드 제제의 생성에서의 중간체)는 예를 들어, 리물루스 변형세포 용해물(LAL) 시험에 의해 측정하여, 낮은 수준의 내독소를 갖거나, 내독소가 실질적으로 부재한다. 일부 실시형태에서, 약제학적 제제 또는 조성물 또는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 생성에서의 중간체는 리물루스 변형세포 용해물 시험에 의해 측정하여 20 EU/㎏(중량), 10 EU/㎏, 5 EU/㎏, 1 EU/㎏ 미만의 내독소를 포함하거나, 내독소를 결여한다. 일 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 조성물은 낮은 수준의 뉴클레아제 또는 리가제를 갖거나, 뉴클레아제 또는 리가제가 없다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 제제(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드 약제학적 제제 또는 조성물 또는 원형 폴리리보뉴클레오티드 제제의 생성에서의 중간체)는 약 50%(w/w), 45%(w/w), 40%(w/w), 35%(w/w), 30%(w/w), 25%(w/w), 20%(w/w), 19%(w/w), 18%(w/w), 17%(w/w), 16%(w/w), 15%(w/w), 14%(w/w), 13%(w/w), 12%(w/w), 11%(w/w), 10%(w/w), 9%(w/w), 8%(w/w), 7%(w/w), 6%(w/w), 5%(w/w), 4%(w/w), 3%(w/w), 2%(w/w), 1%(w/w) 이하의 적어도 하나의 효소, 예를 들어, 폴리머라제, 예를 들어, RNA 폴리머라제를 포함한다.
일 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 제제(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드 약제학적 제제 또는 조성물 또는 원형 폴리리보뉴클레오티드 제제의 생성에서의 중간체)는 무균이거나 미생물이 실질적으로 없으며, 예를 들어, 조성물 또는 제제는 무균 조건 하에서 시험하여 100개 미만의 생존 가능한 미생물의 성장을 뒷받침하고/뒷받침하거나 조성물 또는 제제는 USP <71>의 표준을 만족하고/만족하거나 조성물 또는 제제는 USP <85>의 표준을 만족한다. 일부 실시형태에서, 약제학적 제제는 멸균 이전에 100 CFU/100 ㎖, 50 CFU/100 ㎖, 40 CFU/100 ㎖, 30 CFU/100 ㎖, 200 CFU/100 ㎖, 10 CFU/100 ㎖ 또는 10 CFU/100 ㎖ 미만의 바이오버든(bioburden)을 포함한다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 제제는 불순물을 제거하기 위한 해당 분야에 알려져 있는 기법, 예컨대 컬럼 크로마토그래피 또는 pH/바이얼 불활성화를 사용하여 추가로 정제될 수 있다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 제제는 원형 폴리리보뉴클레오티드 제제가 정제 단계(또는 복수의 정제 단계)를 겪는 경우, 정제 단계(들) 이전에 비하여 대상체로의 투여 후에 면역 또는 염증 반응의 하나 이상의 마커의 감소된 수준을 생성한다. 정제는 본원에 기술된 바와 같이, 예를 들어, 실시예 1 내지 8에서와 같이 수행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 면역 또는 염증 반응의 하나 이상의 마커는 사이토카인 또는 면역 반응 관련 유전자이다. 일부 실시형태에서, 면역 또는 염증 반응의 하나 이상의 마커는 유전자, 예컨대 RIG-I, MDA5, PKR, IFN-베타, OAS 및 OASL의 발현이다.
일 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 제제(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드 약제학적 제제 또는 조성물 또는 원형 폴리리보뉴클레오티드 제제의 생성에서의 중간체)는 예를 들어, 실시예 3에서 기술된 검정에 의해 측정하여, 발현 생성물, 예를 들어, 단백질, 예를 들어, 시험관내 번역 활성을 발현한다.
약제학적 조성물
본 발명은 하나 이상의 약제학적으로 허용 가능한 부형제와 조합된 조성물을 포함한다. 약제학적 조성물은 선택적으로 하나 이상의 추가의 활성 물질, 예를 들어, 치료적 및/또는 예방적 활성 물질을 포함할 수 있다. 약제학적 조성물은 본원에 기술된 조성물(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드, 예컨대 미국 식품의약국(FDA)에 의해 승인된, 및 비활성 성분 데이터베이스에 열거된 비활성 성분 중 어느 하나를 포함하는 조성물)을 위한 비히클 또는 매질로서 제공하는 비활성 물질을 선택적으로 포함할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 무균이고/이거나 발열원-부재일 수 있다. 약제학적 제제의 제형화 및/또는 제조에서의 일반적인 고려사항은 예를 들어, 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy 21st　ed., Lippincott Williams & Wilkins, 2005](본원에 참조로 포함됨)에서 찾을 수 있다. 비활성 물질의 비제한적인 예는 용매, 수성 용매, 비-수성 용매, 분산 매질, 희석제, 분산액, 현탁 보조제, 표면 활성제, 등장화제, 농후제, 유화제, 보존제, 폴리머, 펩티드, 단백질, 세포, 히알루로니다제, 분산제, 과립화제, 붕해제, 결합제, 완충제(예를 들어, 인산염 완충 염수(PBS)), 윤활제, 오일 및 그의 혼합물을 포함한다.
본원에 제공된 약제학적 조성물의 설명이 주로 인간으로의 투여에 적합한 약제학적 조성물에 관한 것이지만, 이러한 조성물이 일반적으로 임의의 다른 동물로의, 예를 들어, 비-인간 동물, 예를 들어, 비-인간 포유동물로의 투여에 적합한 것이 해당 분야의 숙련자에 의해 이해될 것이다. 조성물을 다양한 동물로의 투여에 적합하게 하기 위한, 인간으로의 투여에 적합한 약제학적 조성물의 변형은 널리 알려져 있으며, 숙련된 수의학 약리학자는, 존재하는 경우, 일상적인 실험만으로 이러한 변형을 설계하고/설계하거나 수행할 수 있다. 약제학적 조성물의 투여가 고려되는 대상체는 인간 및/또는 기타 영장류; 포유동물, 예컨대 상업적으로 관련된 포유동물, 예컨대 소, 돼지, 말, 양, 고양이, 개, 마우스 및/또는 랫트; 및/또는 조류, 예컨대 상업적으로 관련된 조류, 예컨대 가금류, 닭, 오리, 거위 및/또는 칠면조를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본원에 기술된 약제학적 조성물의 제형은 약리학 분야에 알려져 있거나, 이후에 개발되는 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 일반적으로, 이러한 제조 방법은 활성 성분이 부형제 및/또는 하나 이상의 다른 보조 성분과 회합되게 한 다음, 필요하면 그리고/또는 바람직하면, 생성물을 나누고/나누거나, 성형하고/성형하거나 패키징하는 단계를 포함한다.
약제학적 원형 RNA 제제의 제조 방법
본원에 개시된 바와 같은 약제학적 조성물, 약제학적 약물 물질 또는 약제학적 약물 제품의 제조 방법은 선형 RNA 및/또는 닉킹된 RNA를 감소시키도록 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제제를 처리하는 단계, 남아 있는 선형 RNA 및/또는 닉킹된 RNA의 양을 평가하는 단계, 및 약제학적 조성물, 약물 물질 또는 약제학적 이용을 위한 약물 제품을 생성하도록 제제를 추가로 처리하는 단계를 포함할 수 있다.
본원에 개시된 바와 같은 약제학적 조성물, 약제학적 약물 물질 또는 약제학적 약물 제품의 제조 방법은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제제를 제공하는 단계, 제제를 선형 RNA 및/또는 닉킹된 RNA의 양에 대하여 평가하는 단계, 및 평가가 선형 및/또는 닉킹된 RNA에 대한 미리결정된 참조 기준, 예컨대 약제 출하 규격을 만족하면, 약제학적 조성물, 약물 물질 또는 약제학적 이용을 위한 약물 제품을 생성하도록 제제를 처리하는 단계를 포함할 수 있다.
본원에 개시된 바와 같은 약제학적 조성물, 약제학적 약물 물질 또는 약제학적 약물 제품의 시험 방법은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제제를 제공하는 단계, 제제를 선형 RNA의 양에 대하여 평가하는 단계, 및 평가가 선형 RNA에 대한 미리결정된 참조 기준, 예컨대 약제 출하 규격을 만족하는지를 결정하는 단계를 포함할 수 있다.
본원에 개시된 바와 같은 약제학적 조성물, 약제학적 약물 물질 또는 약제학적 약물 제품의 시험 방법은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제제를 제공하는 단계, 제제를 닉킹된 RNA의 양에 대하여 평가하는 단계, 및 평가가 닉킹된 RNA에 대한 미리결정된 참조 기준, 예컨대 약제 출하 규격을 만족하는지를 결정하는 단계를 포함할 수 있다.
예를 들어, 제제에 존재하는 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 양에 대한 참조 기준은 1 ng/㎖, 5 ng/㎖, 10 ng/㎖, 15 ng/㎖, 20 ng/㎖, 25 ng/㎖, 30 ng/㎖, 35 ng/㎖, 40 ng/㎖, 50 ng/㎖, 60 ng/㎖, 70 ng/㎖, 80 ng/㎖, 90 ng/㎖, 100 ng/㎖, 200 ng/㎖, 300 ng/㎖, 400 ng/㎖, 500 ng/㎖, 600 ng/㎖, 1 ㎍/ ㎖, 10 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖, 200 g/㎖, 300 ㎍/㎖, 400 ㎍/㎖, 500 ㎍/㎖, 600 ㎍/㎖, 700 ㎍/㎖, 800 ㎍/㎖, 900 ㎍/㎖, 1 ㎎/㎖, 1.5 ㎎/㎖ 또는 2 ㎎/㎖ 이하의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 존재이다.
예를 들어, 제제에 존재하는 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 양에 대한 참조 기준은 약제학적 제제 내의 총 리보뉴클레오티드 분자의 적어도 30%(w/w), 40%(w/w), 50%(w/w), 60%(w/w), 70%(w/w), 80%(w/w), 85%(w/w), 90%(w/w), 91%(w/w), 92%(w/w), 93%(w/w), 94%(w/w), 95%(w/w), 96%(w/w), 97%(w/w), 98%(w/w), 99%(w/w), 99.1%(w/w), 99.2%(w/w), 99.3%(w/w), 99.4%(w/w), 99.5%(w/w), 99.6%(w/w), 99.7%(w/w), 99.8%(w/w), 99.9%(w/w) 또는 100%(w/w)의 분자이다.
예를 들어, 제제에 존재하는 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 양에 대한 참조 기준은 약제학적 제제 내의 총 리보뉴클레오티드 분자의 0.5%(w/w), 1%(w/w), 2%(w/w), 5%(w/w), 10%(w/w), 15%(w/w), 20%(w/w), 25%(w/w), 30%(w/w), 40%(w/w), 50%(w/w) 이하의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자이다.
예를 들어, 제제에 존재하는 닉킹된 폴리리보뉴클레오티드 분자의 양에 대한 참조 기준은 약제학적 제제 내의 총 리보뉴클레오티드 분자의 0.5%(w/w), 1%(w/w), 2%(w/w), 5%(w/w), 10%(w/w) 또는 15%(w/w) 이하의 닉킹된 폴리리보뉴클레오티드 분자이다.
예를 들어, 제제에 존재하는 조합된 닉킹된 및 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 양에 대한 참조 기준은 약제학적 제제 내의 총 리보뉴클레오티드 분자의 0.5%(w/w), 1%(w/w), 2%(w/w), 5%(w/w), 10%(w/w), 15%(w/w), 20%(w/w), 25%(w/w), 30%(w/w), 40%(w/w), 50%(w/w) 이하의 조합된 닉킹된 및 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자이다. 일부 실시형태에서, 약제학적 제제는 최종 원형 폴리리보뉴클레오티드 약물 제품의 중간체 약제학적 제제이다. 일부 실시형태에서, 약제학적 제제는 약물 물질 또는 활성 약제학적 성분(API)이다. 일부 실시형태에서, 약제학적 제제는 대상체로의 투여를 위한 약물 제품이다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제제는 (선형 RNA의 감소 이전에, 그 동안 또는 그 이후에) DNA, 단백질 오염(예를 들어, 세포 단백질, 예컨대 숙주 세포 단백질 또는 단백질 공정 불순물), 내독소, 모노뉴클레오티드 분자 및/또는 공정-관련 불순물을 실질적으로 제거하도록 추가로 처리된다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제제는 예를 들어, 그것이 선형 RNA 수준에 대한 규격을 만족하면, 이후에 약제학적 부형제와 조합된다. 일부 실시형태에서, 약제학적 부형제는 pH를 제어하기 위한 무기 또는 유기 완충제, 당, 아미노산 또는 원형 폴리리보뉴클레오티드 안정성을 위한 임의의 다른 물질, 염화나트륨 또는 장성을 조정하기 위한 임의의 다른 물질, 또는 계면활성제, 예컨대 비-이온성 계면활성제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 약제학적 부형제는 단당류, 이당류(예를 들어, 수크로스, 락토스 또는 트레할로스), 삼당류, 다당류, 아미노 당(예를 들어, 메글루민), 다가알코올, 염(예를 들어, 중탄산나트륨, 인산나트륨 또는 염화나트륨), 스테아르산마그네슘, 아미노산(예를 들어, 히스티딘 또는 아르기닌), 계면활성제(예를 들어, 글리세롤 또는 폴리소르베이트 80), 킬레이트제(예를 들어, EDTA), 캄포르술폰산 또는 동결건조보호제(예를 들어, 사이클로덱스트린)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 약제학적 부형제는 시트르산염 완충제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 약제학적 부형제는 공여자 메틸기 S-아데노실메티오닌(SAM)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 약제학적 부형제는 알파-테르피네올; 알파-토코페롤; 알파-토코페롤 아세테이트; 알파-토코페롤; 1,2,6-헥산트리올; 1,2-디미리스토일-Sn-글리세로-3-(포스포-S-); 1-글리세롤; 1,2-디미리스토일-Sn-글리세로-3-; 포스포콜린, 1,2-디올레오일-Sn-글리세로-3-포스포콜린; 1,2-디팔미토일-Sn-글리세로-3-(포스포-); Rac-(1-글리세롤); 1,2-디스테아로일-Sn-글리세로-3-(포스포-Rac-); 1,2-디스테아로일-Sn-글리세로-3-포스포콜린; 1-O-톨릴비구아니드; 2-에틸-1,6-헥산디올; 아세트산; 빙초산; 아세트산 무수물; 아세톤; 아세톤 중아황산나트륨; 아세틸화 라놀린 알코올; 아세틸화 모노글리세리드; 아세틸시스테인; 아세틸트립토판, DL-; 아크릴레이트 코폴리머; 아크릴산-이소옥틸 아크릴레이트 코폴리머; 아크릴 접착제 788; 활성탄; 애드코트(Adcote) 72A103; 아디프산; 아에로텍스(Aerotex) 수지 3730; 알라닌(주입); 응집된 알부민; 콜로이드성 알부민; 인간 알부민; 알코올; 탈수된 알코올; 변성된 알코올; 희석된 알코올; 알파덱스(Alfadex); 알긴산; 알킬 암모늄 술폰산 베타인; 알킬 아릴 술폰산나트륨; 알란토인(Allantoin); 알릴 알파-이오논; 아몬드 오일; 알루미늄 아세테이트; 알루미늄 클로르하이드록시 알란토이네이트; 수산화알루미늄; 수산화알루미늄 - 수화된 수크로스; 수산화알루미늄 겔; 수산화알루미늄 겔 F 500; 수산화알루미늄 겔 F 5000; 모노스테아르산알루미늄; 산화알루미늄; 알루미늄 폴리에스테르; 규산알루미늄; 알루미늄 전분 옥테닐숙시네이트; 스테아르산알루미늄; 알루미늄 서브아세테이트; 무수 황산알루미늄; 아머콜(Amerchol) C; 아머콜-Cab; 아미노메틸프로판올; 암모니아; 암모니아 용액; 진한 암모니아 용액; 아세트산암모늄; 수산화암모늄; 암모늄 라우릴 술페이트; 암모늄 노녹시놀-4 술페이트; C-12-C-15 선형의 암모늄 염; 일차 알코올 에톡실레이트; 황산암모늄; 암모닉스(Ammonyx); 양쪽성-2; 양쪽성-9; 아네톨(Anethole); 무수 시트르산; 무수 덱스트로스; 무수 락토스; 무수 시트르산삼나트륨; 아니시드 오일(Aniseed Oil); 아녹시드(Anoxid) Sbn; 소포제; 안티피린; 아파플루란(Apaflurane); 살구 커넬 오일 Peg-6 에스테르; 아쿠아포르(Aquaphor); 아르기닌; 알라셀(arlacel); 아스코르브산; 아스코르빌 팔미테이트; 아스파르트산; 발삼 페루(Balsam Peru); 황산바륨; 밀랍; 합성 밀랍; 베헤네트(Beheneth)-10; 벤토나이트; 염화벤즈알코늄; 벤젠술폰산; 염화벤제토늄; 브롬화벤조도데시늄; 벤조산; 벤질 알코올; 벤질 벤조에이트; 염화벤질; 베타덱스(Betadex); 비밥시티드(Bibapcitide); 비스무트 서브갈레이트; 붕산; 브로크리나트(Brocrinat); 부탄; 부틸 알코올; 비닐 메틸 에테르/말레산의 부틸 에스테르; 무수물 코폴리머(125000 Mw); 부틸 스테아레이트; 부틸화 하이드록시아니솔; 부틸화 하이드록시톨루엔; 부틸렌 글리콜; 부틸파라벤; 부티르산; C20-40 파레트(Pareth)-24; 카페인; 칼슘; 탄산칼슘; 염화칼슘; 글루셉트산칼슘; 수산화칼슘; 락트산칼슘; 칼코부트롤(Calcobutrol); 칼디아미드(Caldiamide) 나트륨; 칼록세테이트(Caloxetate) 트리소듐; 칼테리돌(Calteridol) 칼슘; 캐나다 발삼(Canada Balsam); 카프릴산/카프르산 트리글리세리드; 카프릴산/카프르산/스테아르산 트리글리세리드; 캅탄(Captan); 캅티솔(Captisol); 카라멜(Caramel); 카보머 1342; 카보머 1382; 카보머 934; 카보머 934p; 카보머 940; 카보머 941; 카보머 980; 카보머 981; 카보머 호모폴리머 유형 B(알릴); 펜타에리트리톨(가교형); 카보머 호모폴리머 유형 C(알릴); 펜타에리트리톨(가교형); 이산화탄소; 카복시 비닐 코폴리머; 카복시메틸셀룰로스; 카복시메틸셀룰로스 나트륨; 카복시폴리메틸렌; 카라기난; 카라기난 염; 피마자 오일; 시더잎 오일 셀룰로스; 미세결정질 셀룰로스; 세라신트(Cerasynt)-Se; 세레신(Ceresin); 세테아레트(Ceteareth)-12; 세테아레트-15; 세테아레트-30; 세테아릴 알코올/세테아레트-20; 세테아릴 에틸헥사노에이트; 세테트(Ceteth)-10; 세테트-2; 세테트-20; 세테트-23; 세토스테아릴 알코올; 세트리모늄 클로라이드; 세틸 알코올; 세틸 에스테르 왁스 1; 세틸 팔미테이트; 세틸피리디늄 클로라이드; 클로로부탄올; 클로로부탄올 반수화물 I; 무수 클로로부탄올; 클로로크레졸; 클로록실레놀; 콜레스테롤; 콜레트(Choleth); 콜레트-24; 시트레이트; 시트르산; 시트르산 일수화물; 수화 시트르산; 코카미드 에테르 술페이트; 코카민 옥시드; 코코 베타인; 코코 디에탄올아미드; 코코 모노에탄올아미드; 코코아; 코코-글리세리드; 코코넛 오일; 수소화 코코넛 오일; 코코넛 오일/팜핵 오일 글리세리드; 코코일 카프릴로카프레이트; 콜라 니티다(Cola Nitida) 종자 추출물; 콜라겐; 착색 현탁액; 옥수수 오일; 목화씨 오일; 크림 베이스(Cream Base); 크레아틴; 크레아티닌; 크로스카멜로스 나트륨; 크로스포비돈; 황산제2구리; 무수 황산제2구리; 사이클로메티콘; 사이클로메티콘/디메티콘 코폴리올; 시스테인; 시스테인 하이드로클로라이드; 무수 시스테인 하이드로클로라이드; D&C 적색 28호; D&C 적색 33호; D&C 적색 36호; D&C 적색 39호; D&C 황색 10호; 달팜프리딘(Dalfampridine); 다우베르트(Daubert) 1-5 Pestr(매트(Matte)) 164z; 데실 메틸 술폭시드; 데히다그 왁스(Dehydag Wax) Sx; 데하이드로아세트산; 데하이물스(Dehymuls) E; 데나토늄 벤조에이트; 데옥시콜산; 덱스트란; 덱스트란 40; 덱스트린; 덱스트로스; 덱스트로스 일수화물; 덱스트로스 용액; 디아트리조산; 디아졸리디닐 우레아; 디클로로벤질 알코올; 디클로로디플루오로메탄; 디클로로테트라플루오로에탄; 디에탄올아민; 디에틸 피로카보네이트; 디에틸 세바케이트; 디에틸렌 글리콜 모노에틸 에테르; 디에틸헥실 프탈레이트; 디하이드록시알루미늄 아미노아세테이트; 디이소프로판올아민; 디이소프로필 아디페이트; 디이소프로필 디리놀레에이트; 디메티콘 350; 디메티콘 코폴리올; 디메티콘 Mdx4-4210; 디메티콘 의료용 유체 360; 디메틸 이소소르비드; 디메틸 술폭시드; 디메틸아미노에틸 메타크릴레이트 - 부틸; 메타크릴레이트 - 메틸 메타크릴레이트, 코폴리머; 디메틸디옥타데실암모늄 벤토나이트; 디메틸실록산/메틸비닐실록산, 코폴리머; 디노세브(Dinoseb) 암모늄 염; 디팔미토일포스파티딜글리세롤; 디프로필렌 글리콜; 디소듐 코코암포디아세테이트; 디소듐 라우레트(Laureth) 술포숙시네이트; 디소듐 라우릴 술포숙시네이트; 디소듐 술포살리실레이트; 디소페닌(Disofenin); 디비닐벤젠 스티렌 코폴리머; Dmdm 하이단토인; 도코산올; 도큐세이트 나트륨; 듀로-탁(Duro-Tak) 280-2516; 듀로-탁 387-2516; 듀로-탁 80-1196; 듀로-탁 87-2070; 듀로-탁 87-2194; 듀로-탁 87-2287; 듀로-탁 87-2296; 듀로-탁 87-2888; 듀로-탁 87-2979; 에데테이트 칼슘 디소듐; 에데테이트 디소듐; 무수 에데테이트 디소듐; 에데테이트 소듐; 난 인지질; 엔트수폰(Entsufon); 엔트수폰; 에필락토스(Epilactose); 에피테트라사이클린 하이드로클로라이드; 에센스 부케(Essence Bouquet) 9200; 에탄올아민 하이드로클로라이드; 에틸 아세테이트; 에틸 올레에이트; 에틸셀룰로스; 에틸렌 글리콜; 에틸렌 비닐 아세테이트 코폴리머; 에틸렌디아민; 에틸렌디아민 디하이드로클로라이드; 에틸렌-프로필렌 코폴리머; 에틸렌-비닐 아세테이트 코폴리머; 에틸렌-비닐 아세테이트 코폴리머; 에틸헥실 하이드록시스테아레이트; 에틸파라벤; 유칼립톨(Eucalyptol); 엑사메타짐(Exametazime); 식용 지방; 경질 지방; 지방산 에스테르; 지방산 펜타에리트리올 에스테르; 지방산; 지방 알코올 시트레이트; 지방 알코올; Fd&C 청색 1호; Fd&C 녹색 3호; Fd&C 적색 4호; Fd&C 적색 40호; Fd&C 황색 10호; Fd&C 황색 5호; Fd&C 황색 6호; 염화제2철; 산화제2철; 향미제 89-186; 향미제 89-259; 향미제 Df-119; 향미제 Df-1530; 향미 증진제; 향미제 피그(Fig) 827118; 향미제 라즈베리 Pfc-8407; 향미제 로디아(Rhodia) 파마슈티컬 Rf 451호; 플루오로클로로하이드로카본; 포름알데히드; 포름알데히드; 분별화 코코넛 오일; 향료 3949-5; 향료 520a; 향료 6.007; 향료 91-122; 향료 9128-Y; 향료 93498g; 향료 발삼 소나무 5124호; 향료 부케 10328; 향료 케모덤(Chemoderm) 6401-B; 향료 케모덤 6411; 향료 크림 73457호; 향료 Cs-28197; 향료 펠톤(Felton) 066m; 향료 피르메니치(Firmenich) 47373; 향료 지보단(Givaudan) Ess 9090/1c; 향료 H-6540; 향료 허브 10396; 향료 Nj - 1085; 향료 P O Fl-147; 향료 Pa 52805; 향료 파라 덤(Pera Derm) D; 향료 Rbd-9819; 향료 쇼 머지(Shaw Mudge) U-7776; 향료 Tf 044078; 향료 웅게러 허니서클(Ungerer Honeysuckle) K 2771; 향료 웅게러 N5195; 프룩토스; 산화가돌리늄; 갈락토스; 감마 사이클로덱스트린; 젤라틴; 가교된 젤라틴; 겔폼 스폰지; 겔란 검(저 아실); 겔바(Gelva) 737; 겐티스산; 겐티스산 에탄올아미드; 글루셉테이트 소듐; 글루셉테이트 소듐 이수화물; 글루코노락톤; 글루쿠론산; 글루탐산; 글루타티온; 글리세린; 수소화 로진의 글리세롤 에스테르; 글리세릴 시트레이트; 글리세릴 이소스테아레이트; 글리세릴 라우레이트; 글리세릴 모노스테아레이트; 글리세릴 올레에이트; 글리세릴 올레에이트/프로필렌 글리콜; 글리세릴 팔미테이트; 글리세릴 리시놀레에이트; 글리세릴 스테아레이트; 글리세릴 스테아레이트 - 라우레트-23; 글리세릴 스테아레이트/Peg 스테아레이트; 글리세릴 스테아레이트/Peg-100 스테아레이트; 글리세릴 스테아레이트/Peg-40 스테아레이트; 글리세릴 스테아레이트-스테아르아미도에틸; 디에틸아민; 글리세릴 트리올레에이트; 글리신; 글리신 하이드로클로라이드; 글리콜 디스테아레이트; 글리콜 스테아레이트; 구아니딘 하이드로클로라이드; 구아검; 헤어 컨디셔너(18n195-1m); 헵탄; 헤타스타치(Hetastarch); 헥실렌 글리콜; 고밀도 폴리에틸렌; 히스티딘; 인간 알부민 마이크로스피어; 히알루로네이트 소듐; 탄화수소; 가소화된 탄화수소 겔; 염산; 희석된 염산; 하이드로코르티손; 하이드로겔 폴리머; 과산화수소; 수소화 피마자 오일; 수소화 팜 오일; 수소화 팜/팜핵 오일 Peg-6; 에스테르; 수소화 폴리부텐 635-690; 하이드록시드 이온; 하이드록시에틸 셀룰로스; 하이드록시에틸피페라진 에탄 술폰산; 하이드록시메틸 셀룰로스; 하이드록시옥타코사닐 하이드록시스테아레이트; 하이드록시프로필 셀룰로스; 하이드록시프로필 메틸셀룰로스 2906; 하이드록시프로필-B사이클로덱스트린; 하이프로멜로스(Hypromellose) 2208(15000 Mpa.S); 하이프로멜로스 2910(15000 Mpa.S); 하이프로멜로스; 이미드우레아(Imidurea); 아이오딘; 아이오독삼산; 이오페타민(Iofetamine) 하이드로클로라이드; 아이리쉬 모스(Irish Moss) 추출물; 이소부탄; 이소세테트(Isoceteth)-20; 이소류신; 이소옥틸 아크릴레이트; 이소프로필 알코올; 이소프로필 이소스테아레이트; 이소프로필 미리스테이트; 이소프로필 미리스테이트 - 미리스틸 알코올; 이소프로필 팔미테이트; 이소프로필 스테아레이트; 이소스테아르산; 이소스테아릴 알코올; 등장성 염화나트륨 용액; 젤렌(Jelene); 카올린; 카톤(Kathon) Cg; 카톤 Cg II; 락테이트; 락트산; 락트산; 락트산; 락토비온산; 락토스; 락토스 일수화물; 함수 락토스; 라네트; 라놀린; 라놀린 알코올 - 미네랄 오일; 라놀린 알코올; 무수 라놀린; 라놀린 콜레스테롤; 라놀린 비이온성 유도체; 에톡실화 라놀린; 수소화 라놀린; 라우르알코늄 클로라이드; 라우르아민 옥시드; 라우르디모늄 가수분해된 동물 콜라겐; 라우레트 술페이트; 라우레트-2; 라우레트-23; 라우레트-4 T; 라우르산 디에탄올아미드; 라우르산 미리스트산 디에탄올아미드; 라우로일 사르코신; 라우릴 락테이트; 라우릴 술페이트; 라반둘라 안구스티폴리아 플라워링(Lavandula Angustifolia Flowering); 레시틴; 비표백 레시틴; 난 레시틴; 수소화 레시틴; 수소화 대두 레시틴; 대두 레시틴; 레몬 오일; 류신; 레불린산; 리도페닌(Lidofenin); 경질 미네랄 오일; 경질 미네랄 오일(85 Ssu); 리모넨(Limonene), (+/-)-; 리포콜(Lipocol) Sc-15; 리신; 리신 아세테이트; 리신 일수화물; 규산알루미늄마그네슘; 규산알루미늄마그네슘 수화물; 염화마그네슘; 질산마그네슘; 스테아르산마그네슘; 말레산; 만니톨; 마프로픽스(Maprofix); 메브로페닌; 의료용 접착제 변형된 S-15; 의료용 안티폼 A-F 에멀젼; 메드로네이트(Medronate) 디소듐; 메드론산; 메글루민(Meglumine); 멘톨(Menthol); 메타크레졸(Metacresol); 메타인산; 메탄 술폰산; 메티오닌; 메틸 알코올; 메틸 글루세트(Gluceth)-10; 메틸 글루세트-20; 메틸 글루세트-20 세스퀴스테아레이트; 메틸 글루코스 세스퀴스테아레이트; 메틸 라우레이트; 메틸 피롤리돈; 메틸 살리실레이트; 메틸 스테아레이트; 메틸보론산; 메틸셀룰로스(4000 Mpa.S); 메틸셀룰로스; 메틸클로로이소티아졸리논; 메틸렌 블루; 메틸이소티아졸리논; 메틸파라벤; 미세결정질 왁스; 미네랄 오일; 모노 및 디글리세리드; 모노스테아릴 시트레이트; 모노티오글리세롤; 멀티스테롤 추출물; 미리스틸 알코올; 미리스틸 락테이트; 미리스틸-감마-피콜리늄 클로라이드; N-(카바모일-메톡시 Peg-40)-1,2-;디스테아로일-세팔린 소듐; N,N-디메틸아세트아미드; 니아신아미드(Niacinamide); 니옥심(Nioxime); 질산; Peg-2 스테아레이트; 아세트산 페닐수은; 질산 페닐수은; 난 포스파티딜 글리세롤; 인지질; 난 인지질; 포스포리폰 90g; 인산; 소나무 바늘 오일(피누스 실베스트리스(Pinus Sylvestris)); 피페라진 6수화물; 플라스티베이스(Plastibase)-50w; 폴라크릴린 이온토포레시스(Polacrilin Iontophoresis); 폴리드로늄 클로라이드; 폴록사머(Poloxamer) 124; 폴록사머 181; 폴록사머 182; 폴록사머 188; 폴록사머 237; 폴록사머 407; 폴리(비스(P-카복시페녹시)프로판; 무수물, 세바스산; 폴리(디메틸실록산/메틸비닐실록산/메틸하이드로겐실록산) 디메틸비닐, 디메틸하이드록시 또는 트리메틸 엔드블록(Endblocked); 폴리(Dl-락트산-코-글리콜산); 폴리(Dl-락트산-코-글리콜산); 폴리아크릴산(250000 Mw); 폴리부텐(1400 Mw); 폴리카보필(Polycarbophil); 폴리에스테르; 폴리에스테르 폴리아민 코폴리머; 폴리에스테르 레이온; 폴리에틸렌 글리콜 1000; 폴리에틸렌 글리콜 1450; 폴리에틸렌 글리콜 1500; 폴리에틸렌 글리콜 1540; 폴리에틸렌 글리콜 200; 폴리에틸렌 글리콜 300; 폴리에틸렌 글리콜 300-1600; 폴리에틸렌 글리콜 3350; 폴리에틸렌 글리콜 400; 폴리에틸렌 글리콜 4000; 폴리에틸렌 글리콜 540; 폴리에틸렌 글리콜 600; 폴리에틸렌 글리콜 6000; 폴리에틸렌 글리콜 8000; 폴리에틸렌 글리콜 900; 흑색 산화제2철 (<1%) 함유 고밀도 폴리에틸렌; 저밀도 폴리에틸렌; 황산바륨(20-24%);폴리에틸렌 T; 폴리에틸렌 테레프탈레이트; 폴리글락틴(Polyglactin); 폴리글리세릴-3 올레에이트; 폴리글리세릴-4 올레에이트; 폴리하이드록시에틸 메타크릴레이트; 폴리이소부틸렌; 폴리이소부틸렌(1100000 Mw); 폴리이소부틸렌(35000 Mw); 폴리이소부틸렌 178-236; 폴리이소부틸렌 241-294; 폴리이소부틸렌 35-39; 폴리이소부틸렌 저분자량; 폴리이소부틸렌 중등 분자량; 폴리이소부틸렌/폴리부텐 접착제; 폴리락티드; 폴리올; 폴리옥시에틸렌 - 폴리옥시프로필렌 1800; 폴리옥시에틸렌 알코올; 폴리옥시에틸렌 지방산 에스테르; 폴리옥시에틸렌 프로필렌; 폴리옥실 20 세토스테아릴 에테르; 폴리옥실 35 피마자 오일; 폴리옥실 40 수소화 피마자 오일; 폴리옥실 40 스테아레이트; 폴리옥실 400 스테아레이트; 폴리옥실 6 및 폴리옥실 32 팔미토스테아레이트; 폴리옥실 디스테아레이트; 폴리옥실 글리세릴 스테아레이트; 폴리옥실 라놀린; 폴리옥실 팔미테이트; 폴리옥실 스테아레이트; 폴리프로필렌; 폴리프로필렌 글리콜; 폴리쿼터늄-10; 폴리쿼터늄-7; 아크릴아미드/다드막(Dadmac); 폴리실록산; 폴리소르베이트 20; 폴리소르베이트 40; 폴리소르베이트 60; 폴리소르베이트 65; 폴리소르베이트 80; 폴리우레탄; 폴리비닐 아세테이트; 폴리비닐 알코올; 폴리비닐 클로라이드; 폴리비닐 클로라이드-폴리비닐 아세테이트, 코폴리머; 폴리비닐피리딘; 양귀비씨 오일; 칼리(Potash); 아세트산칼륨; 칼륨 명반; 중탄산칼륨; 중아황산칼륨; 염화칼륨; 시트르산칼륨; 수산화칼륨; 메타중아황산칼륨; 인산칼륨, 이염기성; 인산칼륨, 일염기성; 칼륨 비누; 소르브산칼륨; 포비돈 아크릴레이트 코폴리머; 포비돈 하이드로겔 이온토포레시스; 포비돈 K17; 포비돈 K25; 포비돈 K29/32; 포비돈 K30; 포비돈 K90; 포비돈 K90f; 포비돈/에이코센 코폴리머; 포비돈; Ppg-12/Smdi 코폴리머; Ppg-15 스테아릴 에테르; Ppg-20 메틸 글루코스 에테르 디스테아레이트; Ppg-26 올레에이트; 생성물 Wat; 프롤린; 프로뮬겐(Promulgen) D; 프로뮬겐 G; 프로판; 추진제 A-46; 프로필 갈레이트; 프로필렌 카보네이트; 프로필렌 글리콜; 프로필렌 글리콜 디아세테이트; 프로필렌 글리콜 디카프릴레이트; 프로필렌 글리콜 모노라우레이트; 프로필렌 글리콜 모노팔미토스테아레이트; 프로필렌 글리콜 팔미토스테아레이트; 프로필렌 글리콜 리시놀레에이트; 프로필렌 글리콜/디아졸리디닐; 우레아/메틸파라벤/프로필파라벤; 프로필파라벤; 프로타민 술페이트; 단백질 가수분해물; Pvm/Ma 코폴리머; 쿼터늄-15; 쿼터늄-15 시스-형태; 쿼터늄-52; Ra-2397; Ra-3011; 사카린; 사카린 소듐; 무수 사카린 소듐; 홍화 오일; Sd 알코올 3 a; Sd 알코올 40; Sd 알코올 40-2; Sd 알코올 40b; 세피네오(Sepineo) P 600; 세린; 참깨 오일; 시어 버터; 실라스틱(Silastic) 의료용 접착제; 실리콘 A형; 실리카; 규소; 이산화규소; 실리콘; 실리콘 접착제 4102; 실리콘 접착제 4502; 실리콘 접착제 바이오-Psa Q7-4201; 실리콘 접착제 바이오-Psa Q7-4301; 실리콘 에멀젼; 실리콘/폴리에스테르 필름 스트립; 시메티콘(Simethicone); 시메티콘 에멀젼; 시폰(Sipon) Ls 20np; 소다 회분; 아세트산나트륨; 무수 아세트산나트륨; 알킬황산나트륨; 아스코르브산나트륨; 벤조산나트륨; 중탄산나트륨; 중황산나트륨; 중아황산나트륨; 붕산나트륨; 붕산나트륨 10수화물; 탄산나트륨; 탄산나트륨 10수화물; 탄산나트륨 일수화물; 세토스테아릴황산나트륨; 염소산나트륨; 염화나트륨; 소듐 콜레스테릴 술페이트; 시트르산나트륨; 소듐 코코일 사르코시네이트; 소듐 데스옥시콜레이트; 디티온산나트륨; 소듐 도데실벤젠술포네이트; 소듐 포름알데히드 술폭실레이트; 글루콘산나트륨; 수산화나트륨; 차아염소산나트륨; 아이오딘화나트륨; 락트산나트륨; 락트산나트륨, L-; 소듐 라우레트-2 술페이트; 소듐 라우레트-3 술페이트; 소듐 라우레트-5 술페이트; 소듐 라우로일 사르코시네이트; 소듐 라우릴 술페이트; 소듐 라우릴 술포아세테이트; 메타중아황산나트륨; 질산나트륨; 인산나트륨; 인산나트륨 이수화물; 이염기성 인산나트륨; 무수 이염기성 인산나트륨; 이염기성 인산나트륨, 이수화물; 이염기성 인산나트륨, 12수화물; 이염기성 인산나트륨, 7수화물; 일염기성 인산나트륨; 무수 일염기성 인산나트륨; 일염기성 인산나트륨, 이수화물; 인산나트륨, 일염기성 또는 일수화물; 폴리아크릴산나트륨(2500000 Mw); 피로인산나트륨; 소듐 피롤리돈 카복실레이트; 소듐 스타치 글리콜레이트; 숙신산나트륨 6수화물; 황산나트륨; 무수 황산나트륨; 황산나트륨 10수화물; 아황산나트륨; 소듐 술포숙시네이트화 운데실레닉 또는 모노알킬올아미드; 타르트산나트륨; 티오글리콜산나트륨; 티오말산나트륨; 티오황산나트륨; 무수 티오황산나트륨; 트리메타인산나트륨; 자일렌술폰산나트륨; 소마이(Somay) 44; 소르브산; 소르비탄; 소르비탄 이소스테아레이트; 소르비탄 모노라우레이트; 소르비탄 모노올레에이트; 소르비탄 모노팔미테이트; 소르비탄 모노스테아레이트; 소르비탄 세스퀴올레에이트; 소르비탄 트리올레에이트; 소르비탄 트리스테아레이트; 소르비톨; 소르비톨 용액; 대두 가루; 대두 오일; 스피아민트 오일; 경랍; 스쿠알란; 안정화된 옥시클로로 복합체; 주석 2-에틸헥사노에이트; 염화제1주석; 무수 염화제1주석; 플루오르화제1주석; 타르트산주석; 전분; 예비젤라틴화된 전분 1500; 옥수수 전분; 스테아르알코늄 클로라이드; 스테아르알코늄 헥토라이트/프로필렌, 카보네이트; 스테아르아미도에틸 디에틸아민; 스테아레트(Steareth)-10; 스테아레트-100; 스테아레트-2; 스테아레트-20; 스테아레트-21; 스테아레트-40; 스테아르산; 스테아르산 디에탄올아미드; 스테아르옥시트리메틸실란; 스테아르트리모늄 가수분해된 동물; 콜라겐; 스테아릴 알코올 멸균수; 스티렌/이소프렌/스티렌 블록 코폴리머; 숙시머(Succimer); 숙신산; 수크랄로스; 수크로스; 수크로스 디스테아레이트; 수크로스 폴리에스테르; 술프아세트아미드 소듐; 근육내 술포부틸에테르 베타-사이클로덱스트린; 이산화황; 황산; 아황산; 술팍톨(Surfactol) Qs; 타가토스(Tagatos), D-; 활석; 톨 오일; 탈로우 글리세리드; 타르타르산; 타르타르산; 테녹스(Tenox); 테녹스-2; Tert-부틸 알코올; Tert-부틸 하이드로퍼옥시드; Tert-부틸하이드로퀴논; 테트라키스(2-메톡시이소부틸이소시아니드)구리(I); 테트라플루오로보레이트; 테트라프로필 오르토실리케이트; 테트로포스민(Tetrofosmin); 테오필린(Theophylline); 티메로살(Thimerosal); 트레오닌; 티몰(Thymol); 주석; 이산화티타늄; 토코페롤; 토코페르솔란(Tocophersolan); 트리아세틴(Triacetin); 트리카프릴린(Tricaprylin); 트리클로로모노플루오로메탄; 트리데세트(Trideceth)-10; 트리에탄올아민 라우릴 술페이트; 트리플루오로아세트산; 중쇄 트리글리세리드; 트리하이드록시 스테아린; 트리라네트(Trilaneth)-4 포스페이트; 트리라우레트(Trilaureth)-4 포스페이트; 시트르산삼나트륨 이수화물; 트리소듐 헤드타(Hedta); 트리톤 720; 트리톤 X-200; 트롤아민(Trolamine); 트로만타딘(Tromantadine); 트로메타민(Tromethamine); 트립토판; 틸록사폴(Tyloxapol); 티로신; 운데실렌산; 유니온(Union) 76 암스코-레스(Amsco-Res) 6038; 우레아; 발린; 식물성 오일; 수소화 식물성 오일 글리세리드; 수소화 식물성 오일; 베르세타미드(Versetamide); 비스카린(Viscarin); 비스코스(Viscose)/목화; 비타민 E; 유화 왁스, 웨코비(Wecobee) Fs; 백색 세레신(Ceresin) 왁스; 백색 왁스; 잔탄 검; 아연; 아세트산아연; 탄산아연; 염화아연; 또는 산화아연을 포함한다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제제는 지질 나노입자(LNP)와 조합된다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제제는 이후에 이당류, 예컨대 수크로스, 락토스 또는 트레할로스를 포함하는 약제학적 부형제와 조합된다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제제는 이후에 수크로스를 포함하는 약제학적 부형제와 조합된다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제제는 이후에 다당류를 포함하는 약제학적 부형제와 조합된다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제제는 이후에 계면활성제, 예컨대 글리세롤 또는 폴리소르베이트 80을 포함하는 약제학적 부형제와 조합된다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제제는 이후에 알파-토코페롤을 포함하는 약제학적 부형제와 조합된다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제제는 이후에 포스포콜린을 포함하는 약제학적 부형제와 조합된다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제제는 이후에 알코올을 포함하는 약제학적 부형제와 조합된다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제제는 이후에 이소프로필 알코올을 포함하는 약제학적 부형제와 조합된다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제제는 이후에 라놀린 알코올을 포함하는 약제학적 부형제와 조합된다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제제는 이후에 인간 알부민을 포함하는 약제학적 부형제와 조합된다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제제는 이후에 수산화알루미늄 겔 F 500을 포함하는 약제학적 부형제와 조합된다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제제는 이후에 아스파르트산을 포함하는 약제학적 부형제와 조합된다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제제는 이후에 황산바륨을 포함하는 약제학적 부형제와 조합된다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제제는 이후에 벤조산을 포함하는 약제학적 부형제와 조합된다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제제는 이후에 칼슘을 포함하는 약제학적 부형제와 조합된다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제제는 이후에 염화칼슘을 포함하는 약제학적 부형제와 조합된다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제제는 이후에 카복시메틸셀룰로스를 포함하는 약제학적 부형제와 조합된다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제제는 이후에 시트르산을 포함하는 약제학적 부형제와 조합된다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제제는 이후에 에틸렌 글리콜을 포함하는 약제학적 부형제와 조합된다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제제는 이후에 염화제이철을 포함하는 약제학적 부형제와 조합된다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제제는 이후에 탄화수소 겔을 포함하는 약제학적 부형제와 조합된다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제제는 이후에 염화마그네슘을 포함하는 약제학적 부형제와 조합된다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제제는 이후에 니아신아미드를 포함하는 약제학적 부형제와 조합된다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제제는 이후에 폴리에틸렌 글리콜을 포함하는 약제학적 부형제와 조합된다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제제는 이후에 염화칼륨을 포함하는 약제학적 부형제와 조합된다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제제는 이후에 프로필렌 글리콜을 포함하는 약제학적 부형제와 조합된다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제제는 이후에 탄산나트륨을 포함하는 약제학적 부형제와 조합된다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제제는 이후에 염화나트륨을 포함하는 약제학적 부형제와 조합된다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제제는 이후에 락트산나트륨을 포함하는 약제학적 부형제와 조합된다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제제는 이후에 아세트산아연을 포함하는 약제학적 부형제와 조합된다.
일부 실시형태에서, 불순물(예를 들어, 세포 단백질, 세포 핵산, 효소, 시약 성분, 겔 성분 또는 크로마토그래피 물질, 단백질 오염 또는 내독소 오염)의 양을 측정하여, 약제학적 조성물, 약제학적 약물 물질 또는 약제학적 약물 제품이 참조 기준을 만족하는지를 결정한다.
예를 들어, 제제에 존재하는 DNA의 양에 대한 참조 기준은 0개의 DNA 분자의 존재이거나, 실질적으로 DNA 분자가 없거나, 1 pg/㎖, 10 pg/㎖, 0.1 ng/㎖, 1 ng/㎖, 5 ng/㎖, 10 ng/㎖, 15 ng/㎖, 20 ng/㎖, 25 ng/㎖, 30 ng/㎖, 35 ng/㎖, 40 ng/㎖, 50 ng/㎖, 60 ng/㎖, 70 ng/㎖, 80 ng/㎖, 90 ng/㎖, 100 ng/㎖, 200 ng/㎖, 300 ng/㎖, 400 ng/㎖ 또는 500 ng/㎖, 1000 ㎍/㎖, 5000 ㎍/㎖, 10,000 ㎍/㎖ 또는 100,000 ㎍/㎖ 이하의 DNA이다.
예를 들어, 제제에 존재하는 단백질 오염의 양에 대한 참조 기준은 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자 밀리그램(㎎)당 0.1 ng, 1 ng, 5 ng, 10 ng, 15 ng, 20 ng, 25 ng, 30 ng, 35 ng, 40 ng, 50 ng, 60 ng, 70 ng, 80 ng, 90 ng, 100 ng, 200 ng, 300 ng, 400 ng 또는 500 ng 미만의 단백질 오염의 단백질 오염의 존재이다.
일부 실시형태에서, 약제학적 조성물, 약제학적 약물 물질 또는 약제학적 약물 제품에 존재하는 내독소의 양은 20 EU/㎏(중량), 10 EU/㎏, 5 EU/㎏, 1 EU/㎏ 미만이거나, 미리결정된 임계값 미만이며, 예를 들어, 제제는 특정 방법에 의한 검출 한계 미만의 수준의 내독소를 포함한다. 일부 실시형태에서, 참조 기준은 약제 출하 규격이다.
일부 실시형태에서, 약제학적 조성물, 약제학적 약물 물질 또는 약제학적 약물 제품은 멸균 약물 제품이거나, 미생물이 실질적으로 없다(예를 들어, 무균 조건 하에서 시험하여 100개 미만의 생존 가능한 미생물의 성장을 뒷받침한다). 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물, 약제학적 약물 물질 또는 약제학적 약물 제품은 USP <71>의 표준 및/또는 USP <85>의 표준을 만족한다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물, 약제학적 약물 물질 또는 약제학적 약물 제품은 추가로 약제학적 이용을 위하여 표지되고 운송된다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물, 약제학적 약물 물질 또는 약제학적 약물 제품은 멸균 전에 100 CFU/100 ㎖, 50 CFU/100 ㎖, 40 CFU/100 ㎖, 30 CFU/100 ㎖, 200 CFU/100 ㎖, 10 CFU/100 ㎖ 또는 10 CFU/100 ㎖ 미만의 바이오버든을 포함한다.
일부 실시형태에서, 약제학적 조성물, 약제학적 약물 물질 또는 약제학적 약물 제품은 적어도 0.1 ng/㎖, 0.5 ng/㎖, 1 ng/㎖, 5 ng/㎖, 10 ng/㎖, 50 ng/㎖, 0.1 ㎍/㎖, 0.5 ㎍/㎖,1 ㎍/㎖, 2 ㎍/㎖, 5 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖, 20 ㎍/㎖, 30 ㎍/㎖, 40 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 60 ㎍/㎖, 70 ㎍/㎖, 80 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖, 200 ㎍/㎖, 300 ㎍/㎖, 500 ㎍/㎖, 1 ㎎/㎖, 2 ㎎/㎖, 3 ㎎/㎖, 5 ㎎/㎖, 10 ㎎/㎖, 100 ㎎/㎖ 또는 500 ㎎/㎖의 농도의 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자를 포함한다.
일부 실시형태에서, 약제학적 조성물, 약제학적 약물 물질 또는 약제학적 약물 제품은 불순물을 제거하기 위한 해당 분야에 알려져 있는 기법, 예컨대 컬럼 크로마토그래피 또는 pH/바이얼 불활성화를 사용하여 추가로 정제될 수 있다.
원형화
일 실시형태에서, 선형의 원형 폴리리보뉴클레오티드는 환화되거나 콘카테머화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 선형의 원형 폴리리보뉴클레오티드는 제형화 및/또는 전달 이전에 시험관내에서 환화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 선형의 원형 폴리리보뉴클레오티드는 세포 내에서 환화될 수 있다.
세포외 원형화
일부 실시형태에서, 선형의 원형 폴리리보뉴클레오티드는 화학적 방법을 사용하여 환화되거나, 콘카테머화되어, 원형 폴리리보뉴클레오티드를 형성한다. 일부 화학적 방법에서, 핵산(예를 들어, 선형의 원형 폴리리보뉴클레오티드)의 5'-말단 및 3'-말단은 서로 가까이 있는 경우, 분자의 5'-말단과 3'-말단 사이에 새로운 공유 링키지를 형성할 수 있는 화학적 반응성 기를 포함한다. 5'-말단은 NHS-에스테르 반응성 기를 함유할 수 있으며, 3'-말단은 3'-아미노-말단 뉴클레오티드를 함유할 수 있으므로, 유기 용매 중에서 선형 RNA 분자의 3'-말단 상의 3'-아미노-말단 뉴클레오티드가 5'-NHS-에스테르 모이어티 상에서 친핵성 공격을 겪어 새로운 5'-/3'-아미드 결합을 형성할 것이다.
일 실시형태에서, DNA 또는 RNA 리가제를 사용하여, 5'-인산화된 핵산 분자(예를 들어, 선형의 원형 폴리리보뉴클레오티드)를 핵산(예를 들어, 선형 핵산)의 3'-하이드록실기에 효소적으로 연결하여, 새로운 포스포로디에스테르 링키지를 형성할 수 있다. 일례의 반응에서, 선형의 원형 폴리리보뉴클레오티드를 제조업체의 설명에 따라 37℃에서 1시간 동안 1 유닛 내지 10 유닛의 T4 RNA 리가제(미국 매사추세츠주 입스위치 소재의 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs))와 인큐베이션시킨다. 라이게이션 반응은 효소적 라이게이션 반응을 보조하기 위해, 병치 위치에서 5'- 및 3'-영역 둘 모두와 염기-쌍을 형성할 수 있는 선형 핵산의 존재 하에 발생할 수 있다. 일 실시형태에서, 라이게이션은 스플린트 라이게이션이다. 예를 들어, RNA 리가제 2와 같은 스플린트 리가제는 스플린트 라이게이션을 위해 사용될 수 있다. 스플린트 라이게이션을 위해, 단일 가닥 DNA와 같은 단일 가닥 폴리뉴클레오티드(스플린트)는 선형 폴리리보뉴클레오티드의 양 말단과 혼성화하여, 단일-가닥 스플린트와의 혼성화시에 2개의 말단이 병치될 수 있도록 설계될 수 있다. 이에 따라, RNA 리가제 2는 선형 폴리리보뉴클레오티드의 병치된 2개의 말단의 라이게이션을 촉매작용시켜, 공유적으로 연결된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 생성할 수 있다.
일 실시형태에서, DNA 또는 RNA 리가제는 원형 폴리뉴클레오티드의 합성에서 사용될 수 있다. 비-제한적인 예로서, 리가제는 circ 리가제 또는 원형 리가제일 수 있다.
일 실시형태에서, 선형의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 5'- 또는 3'-말단은 리가제 리보자임 서열을 인코딩하여, 시험관내 전사 동안, 생성된 선형의 원형 폴리리보뉴클레오티드가 선형의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 5'-말단을 선형의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 3'-말단에 라이게이션시킬 수 있는 활성 리보자임 서열을 포함하게 할 수 있다. 리가제 리보자임은 그룹 I 인트론, 델타 간염 바이러스, 헤어핀 리보자임으로부터 유래될 수 있거나, SELEX(지수적 농축에 의한 리간드의 계통 진화)에 의해 선택될 수 있다. 리보자임 리가제 반응은 0℃ 내지 37℃의 온도에서 1시간 내지 24시간 걸릴 수 있다.
일 실시형태에서, 선형의 원형 폴리리보뉴클레오티드는 적어도 하나의 비-핵산 모이어티를 사용함으로써 환화되거나 콘카테머화될 수 있다. 일 양태에서, 적어도 하나의 비-핵산 모이어티는 선형의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 5' 말단 근처 및/또는 3' 말단 근처에서 영역 또는 특징부와 반응하여, 선형의 원형 폴리리보뉴클레오티드를 환화시키거나 콘카테머화시킬 수 있다. 또 다른 양태에서, 적어도 하나의 비-핵산 모이어티는 선형의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 위치하거나, 그에 또는 그 근처에 연결될 수 있다. 고려되는 비-핵산 모이어티는 상동성 또는 이종성일 수 있다. 비-제한적인 예로서, 비-핵산 모이어티는 링키지, 예컨대 소수성 링키지, 이온성 링키지, 생분해성 링키지 및/또는 절단 가능한 링키지일 수 있다. 또 다른 비-제한적인 예로서, 비-핵산 모이어티는 라이게이션 모이어티이다. 또 다른 비-제한적인 예로서, 비-핵산 모이어티는 올리고뉴클레오티드 또는 펩티드 모이어티, 예컨대 본원에 기술된 바와 같은 압타머 또는 비-핵산 링커일 수 있다.
일 실시형태에서, 선형의 원형 폴리리보뉴클레오티드는 선형의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 5' 및 3' 말단에서의, 그 근처의 또는 그에 연결된 분자 표면, 원자 사이에 인력을 야기하는 비-핵산 모이어티로 인하여 환화되거나 콘카테머화될 수 있다. 비-제한적인 예로서, 하나 이상의 선형의 원형 폴리리보뉴클레오티드는 분자간 힘 또는 분자내 힘에 의해 환화되거나 콘카테머화될 수 있다. 분자간 힘의 비-제한적인 예는 쌍극자-쌍극자 힘, 쌍극자-유도된 쌍극자 힘, 유도된 쌍극자-유도된 쌍극자 힘, 반 데르 발스 힘(Van der Waals force) 및 런던 분산력(London dispersion force)을 포함한다. 분자내 힘의 비-제한적인 예는 공유 결합, 금속 결합, 이온 결합, 공명 결합, 아그노스트 결합(agnostic bond), 쌍극자 결합, 컨쥬게이션, 하이퍼컨쥬게이션 및 반결합(antibonding)을 포함한다.
일 실시형태에서, 선형의 원형 폴리리보뉴클레오티드는 5' 말단 근처 및 3' 말단 근처에 리보자임 RNA 서열을 포함할 수 있다. 리보자임 RNA 서열은 서열이 리보자임의 나머지에 노출되는 경우 펩티드에 공유적으로 연결될 수 있다. 일 양태에서, 5' 말단 및 3' 말단 근처에서 리보자임 RNA 서열에 공유적으로 연결되는 펩티드는 서로 회합하여, 선형의 원형 폴리리보뉴클레오티드가 환화되거나 콘카테머화되게 할 수 있다. 또 다른 양태에서, 5' 말단 및 3' 말단 근처에서 리보자임 RNA에 공유적으로 연결된 펩티드는 해당 분야에 공지된 다양한 방법, 예컨대 비제한적으로, 단백질 라이게이션을 사용하여 라이게이션 처리된 후에 선형의 일차 구축물 또는 선형의 mRNA가 환화되거나 콘카테머화되게 할 수 있다. 본 발명의 선형의 일차 구축물 또는 선형 RNA에 사용하기 위한 리보자임의 비-제한적인 예 또는 펩티드를 혼입시키고/시키거나 공유적으로 연결하기 위한 방법의 비-배타적인 목록은 미국 특허 출원 제US20030082768호에 기술되어 있으며, 이의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
일부 실시형태에서, 선형의 원형 폴리리보뉴클레오티드는 예를 들어, 5' 트리포스페이트를 RNA 5' 피로포스포하이드롤라제(RppH) 또는 ATP 디포스포하이드롤라제(아피라제)와 접촉시킴으로써 5' 모노포스페이트로 전환되는 핵산의 5' 트리포스페이트를 포함할 수 있다. 대안적으로, 선형의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 5' 트리포스페이트를 5' 모노포스페이트로 전환시키는 것은 하기를 포함하는 2-단계 반응에 의해 발생할 수 있다: (a) 선형의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 5' 뉴클레오티드를 포스파타제(예를 들어, 안타크틱(Antarctic) 포스파타제, 쉬림프(Shrimp) 알칼리성 포스파타제 또는 송아지 장내 포스파타제)와 접촉시켜, 모든 3개의 포스페이트를 제거하는 단계; 및 (b) 단계 (a) 후에 5' 뉴클레오티드를 단일의 포스페이트를 부가하는 키나제(예를 들어, 폴리뉴클레오티드 키나제)와 접촉시키는 단계.
일부 실시형태에서, 본원에 제공된 원형화 방법의 원형화 효율은 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 100%이다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공되는 원형화 방법의 원형화 효율은 적어도 약 40%이다.
스플라이싱 요소
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 적어도 하나의 스플라이싱 요소를 포함한다. 본원에 제공되는 바와 같은 원형 폴리리보뉴클레오티드에서, 스플라이싱 요소는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 스플라이싱을 매개할 수 있는 완전한 스플라이싱 요소일 수 있다. 대안적으로, 스플라이싱 요소는 또한 완료된 스플라이싱 사건으로부터의 잔류 스플라이싱 요소일 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, 선형 폴리리보뉴클레오티드의 스플라이싱 요소는 선형 폴리리보뉴클레오티드의 원형화를 초래하는 스플라이싱 사건을 매개할 수 있으며, 그에 의해, 생성된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 이러한 스플라이싱-매개된 원형화 사건으로부터의 잔류 스플라이싱 요소를 포함한다. 일부 경우에, 잔류 스플라이싱 요소는 어떠한 스플라이싱도 매개할 수 없다. 다른 경우에, 잔류 스플라이싱 요소는 특정 환경 하에서 여전히 스플라이싱을 매개할 수 있다. 일부 실시형태에서, 스플라이싱 요소는 적어도 하나의 발현 서열에 인접해 있다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 각 발현 서열에 인접한 스플라이싱 요소를 포함한다. 일부 실시형태에서, 스플라이싱 요소는 각 발현 서열의 한측 또는 양측 모두에 존재하여, 발현 생성물, 예를 들어, 펩티드(들) 및 또는 폴리펩티드(들)의 분리를 야기한다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 복제되는 경우에 스플라이싱된 말단이 함께 연결되는 내부 스플라이싱 요소를 포함한다. 일부 예는 스플라이스 부위 서열 및 짧은 역위 반복부(30개 내지 40개 뉴클레오티드), 예컨대 AluSq2, AluJr 및 AluSz를 갖는 미니어처 인트론(100개 미만의 뉴클레오티드) 및 측접 인트론 내의 역위 서열, 측접 인트론 내의 Alu 요소, 및 백스플라이스 사건에 근접한 시스-서열 요소에서 관찰되는 모티프(suptable4 풍부 모티프), 예컨대 측접하는 엑손을 갖는 백스플라이스 부위의 앞(그의 업스트림) 또는 뒤(그로부터 다운스트림) 200 bp 내의 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 본원의 다른 곳에 내부 스플라이싱 요소로서 기술된 적어도 하나의 반복 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 이러한 실시형태에서, 반복 뉴클레오티드 서열은 Alu 패밀리의 인트론으로부터의 반복된 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 스플라이싱-관련 리보솜 결합 단백질은 원형 폴리리보뉴클레오티드 생물발생을 조절할 수 있다(예를 들어, Muscleblind 및 Quaking(QKI) 스플라이싱 인자).
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 헤드-투-테일 연접부에 측접하는 정규 스플라이스 부위를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 2개의 3-뉴클레오티드 벌지(bulge)가 측접하는 4-염기쌍 스템(stem)을 포함하는 벌지-나선-벌지 모티프를 포함할 수 있다. 절단은 벌지 영역 내의 부위에서 발생하여, 말단 5'-하이드록실기 및 2',3'-사이클릭 포스페이트를 갖는 특징적인 단편을 생성한다. 원형화는 3',5'-포스포디에스테르 가교를 형성하는 동일한 분자의 2',3'-사이클릭 포스페이트 상으로의 5'-OH 기의 친핵성 공격에 의해 진행된다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 HPR 요소를 보유한 다량체 반복 RNA 서열을 포함할 수 있다. HPR은 2',3'-사이클릭 포스페이트 및 5'-OH 말단을 포함한다. HPR 요소는 선형의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 5'- 및 3'-말단을 자가-처리함으로써 말단을 함께 라이게이션시킨다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 자가-라이게이션을 매개하는 서열을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 자가-라이게이션하기 위해 HDV 서열(예를 들어, HDV 복제 도메인 보존된 서열, GGCUCAUCUCGACAAGAGGCGGCAGUCCUCAGUACUCUUACUCUUUUCUGUAAAGAGGAGACUGCUGGACUCGCCGCCCAAGUUCGAGCAUGAGCC 또는 GGCUAGAGGCGGCAGUCCUCAGUACUCUUACUCUUUUCUGUAAAGAGGAGACUGCUGGACUCGCCGCCCGAGCC)을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 자가-라이게이션하기 위해 (예를 들어, PSTVd 내의) 루프 E 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 자가-원형화 인트론, 예를 들어, 5' 및 3' 스플라이스 연접부 또는 자가-원형화 촉매적 인트론, 예컨대 그룹 I, 그룹 II 또는 그룹 III 인트론을 포함할 수 있다. 그룹 I 인트론 자가-스플라이싱 서열의 비제한적인 예는 T4 박테리오파지 유전자 td로부터 유래된 자가-스플라이싱 재배치된 인트론-엑손 서열 및 테트라히메나(Tetrahymena)의 개재 서열(IVS) rRNA를 포함할 수 있다.
기타 원형화 방법
일부 실시형태에서, 선형의 원형 폴리리보뉴클레오티드는 개별 인트론 내에 또는 측접 인트론에 걸쳐, 반복 또는 비반복 핵산 서열을 포함하는 상보성 서열을 포함할 수 있다. 반복 핵산 서열은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 세그먼트 내에 존재하는 서열이다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 반복 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 반복 뉴클레오티드 서열은 폴리 CA 또는 폴리 UG 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 또 다른 세그먼트 내의 상보성 반복 핵산 서열에 혼성화하는 적어도 하나의 반복 핵산 서열을 포함하며, 혼성화된 세그먼트는 내부 이중 가닥을 형성한다. 일부 실시형태에서, 2개의 개별 원형 폴리리보뉴클레오티드로부터의 반복 핵산 서열과 상보성 반복 핵산 서열은 혼성화하여, 단일의 원형화된 폴리리보뉴클레오티드를 생성하며, 혼성화된 세그먼트는 내부 이중 가닥을 형성한다. 일부 실시형태에서, 상보성 서열은 선형의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 5' 및 3' 말단에서 관찰된다. 일부 실시형태에서, 상보성 서열은 약 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 55개, 60개, 65개, 70개, 75개, 80개, 85개, 90개, 95개, 100개 또는 그 초과의 쌍이 형성된 뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 화학적 원형화 방법을 사용하여 원형 폴리리보뉴클레오티드를 생성할 수 있다. 이러한 방법은 클릭 화학(예를 들어, 알킨 및 아지드 기반의 방법 또는 클릭 가능한 염기), 올레핀 복분해, 포스포르아미데이트 라이게이션, 헤미아미날-이민 가교결합, 염기 변형 및 그의 임의의 조합을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 효소적 원형화 방법을 사용하여, 원형 폴리리보뉴클레오티드를 생성할 수 있다. 일부 실시형태에서, 라이게이션 효소, 예를 들어, DNA 또는 RNA 리가제를 사용하여, 원형 폴리리보뉴클레아제의 주형 또는 상보물, 원형 폴리리보뉴클레아제의 상보성 가닥 또는 원형 폴리리보뉴클레아제를 생성할 수 있다.
원형 폴리리보뉴클레오티드의 원형화는 해당 분야에 알려져 있는 방법, 예를 들어, 문헌["RNA circularization strategies in vivo and in vitro" by Petkovic and Muller from Nucleic Acids Res, 2015, 43(4): 2454-2465] 및 문헌["In vitro circularization of RNA" by Muller and Appel, from RNA Biol, 2017, 14(8):1018-1027]에 기술된 것들에 의해 달성될 수 있다.
발현 서열
펩티드 또는 폴리펩티드
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 펩티드 또는 폴리펩티드를 인코딩하는 적어도 하나의 발현 서열을 포함한다. 이러한 펩티드는 소형 펩티드, 펩티드모방체(예를 들어, 펩토이드(peptoid)), 아미노산 및 아미노산 유사체를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 펩티드는 선형 또는 분지형일 수 있다. 이러한 펩티드는 몰당 약 5,000 그램 미만의 분자량, 몰당 약 2,000 그램 미만의 분자량, 몰당 약 1,000 그램 미만의 분자량, 몰당 약 500 그램 미만의 분자량, 및 이러한 화합물의 염, 에스테르, 및 다른 약제학적으로 허용 가능한 형태를 가질 수 있다. 이러한 펩티드는 신경전달물질, 호르몬, 약물, 독소, 바이러스 또는 미생물 입자, 합성 분자 및 그의 효능제 또는 길항제를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
폴리펩티드는 선형 또는 분지형일 수 있다. 폴리펩티드는 약 5개 내지 약 40,000개 아미노산, 약 15개 내지 약 35,000개 아미노산, 약 20개 내지 약 30,000개 아미노산, 약 25개 내지 약 25,000개 아미노산, 약 50개 내지 약 20,000개 아미노산, 약 100개 내지 약 15,000개 아미노산, 약 200개 내지 약 10,000개 아미노산, 약 500개 내지 약 5,000개 아미노산, 약 1,000개 내지 약 2,500개 아미노산 또는 그 사이의 임의의 범위의 길이를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 약 40,000개 미만의 아미노산, 약 35,000개 미만의 아미노산, 약 30,000개 미만의 아미노산, 약 25,000개 미만의 아미노산, 약 20,000개 미만의 아미노산, 약 15,000개 미만의 아미노산, 약 10,000개 미만의 아미노산, 약 9,000개 미만의 아미노산, 약 8,000개 미만의 아미노산, 약 7,000개 미만의 아미노산, 약 6,000개 미만의 아미노산, 약 5,000개 미만의 아미노산, 약 4,000개 미만의 아미노산, 약 3,000개 미만의 아미노산, 약 2,500개 미만의 아미노산, 약 2,000개 미만의 아미노산, 약 1,500개 미만의 아미노산, 약 1,000개 미만의 아미노산, 약 900개 미만의 아미노산, 약 800개 미만의 아미노산, 약 700개 미만의 아미노산, 약 600개 미만의 아미노산, 약 500개 미만의 아미노산, 약 400개 미만의 아미노산, 약 300개 미만의 아미노산 또는 그 미만의 길이를 갖는 폴리펩티드가 유용할 수 있다.
대상 원형 폴리리보뉴클레오티드 내의 발현 서열에 의해 발현되는 펩티드 또는 폴리펩티드의 비제한적인 예는 그의 전문이 본원에 참조로 포함되는 국제 특허 공개 제WO2019118919A1호의 [0149], [0150] 및 [0152]에 기술된 것들을 포함한다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 단백질, 예를 들어, 치료적 단백질을 인코딩하는 발현 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 원형 폴리리보뉴클레오티드로부터 발현될 수 있는 치료적 단백질은 항산화 활성, 결합, 카고(cargo) 수용체 활성, 촉매적 활성, 분자 운반체 활성, 분자 기능 조절제, 분자 전달제 활성, 영양소 저장소 활성, 단백질 태그, 구조적 분자 활성, 독소 활성, 전사 조절제 활성, 번역 조절제 활성 또는 수송체 활성을 갖는다. 치료적 단백질의 일부 예는 효소 대체 단백질, 보충용 단백질, 단백질 백신접종, 항원(예를 들어, 종양 항원, 바이러스, 박테리아), 호르몬, 사이토카인, 항체, 면역요법제(예를 들어, 암), 세포 리프로그래밍(reprogramming)/전환분화 인자, 전사 인자, 키메라 항원 수용체, 전위효소 또는 뉴클레아제, (예를 들어, 면역 반응/신호에 대한 감수성에 영향을 미치는) 면역 이펙터, 조절된 사망 이펙터 단백질(예를 들어, 아폽토시스 또는 괴사의 유도제), 종양의 비-용해 저해제(예를 들어, 종양단백질의 저해제), 후성적 변형제, 후성적 효소, 전사 인자, DNA 또는 단백질 변형 효소, DNA-삽입제(DNA-intercalating agent), 유출 펌프 저해제, 핵 수용체 활성화제 또는 저해제, 프로테아좀 저해제, 효소에 대한 경쟁적 저해제, 단백질 합성 이펙터 또는 저해제, 뉴클레아제, 단백질 단편 또는 도메인, 리간드 또는 수용체, 및 CRISPR 시스템 또는 그의 성분을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 원형 폴리리보뉴클레오티드로부터 발현될 수 있는 예시적인 단백질은 세포내 단백질 또는 시토졸 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 리포터 분자, 예를 들어, NanoLuc® 루시퍼라제(nLuc)를 발현한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 원형 폴리리보뉴클레오티드로부터 발현될 수 있는 예시적인 단백질은 분비 단백질, 예를 들어, 분비 효소를 포함한다. 일부 경우에, 원형 폴리리보뉴클레오티드는, 혈중 짧은 반감기 치료제를 가질 수 있거나 하위세포 국소화 신호를 갖는 단백질 또는 분비 신호 펩티드를 갖는 단백질일 수 있는 분비 단백질을 발현한다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 가우시아 루시퍼라제(GLuc)를 발현한다. 일부 경우에, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 비-인간 단백질, 예를 들어, 형광 단백질, 에너지-전달 억셉터 또는 Flag, Myc 또는 His와 같은 단백질-태그를 발현한다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드로부터 발현될 수 있는 예시적인 단백질은 GFP를 포함한다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 태깅된 단백질, 예를 들어, 단백질 태그, 예를 들어, 키틴 결합 단백질(CBP), 말토스 결합 단백질(MBP), Fc 태그, 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST), SNAP-태그, 탠덤 단백질 A(ZZ) 태그, Halo-태그, AviTag(GLNDIFEAQKIEWHE), 칼모듈린(Calmodulin)-태그(KRRWKKNFIAVSAANRFKKISSSGAL); 폴리글루탐산염 태그(EEEEEE); E-태그(GAPVPYPDPLEPR); FLAG-태그(DYKDDDDK), HA-태그(YPYDVPDYA); His-태그(예를 들어, HHHHHH); Myc-태그(EQKLISEEDL); NE-태그(TKENPRSNQEESYDDNES); S-태그(KETAAAKFERQHMDS); SBP-태그(MDEKTTGWRGGHVVEGLAGELEQLRARLEHHPQGQREP); Softag 1(SLAELLNAGLGGS); Softag 3(TQDPSRVG); Spot-태그(PDRVRAVSHWSS); Strep-태그(Strep-tag II: WSHPQFEK); TC 태그(CCPGCC); Ty 태그(EVHTNQDPLD); V5 태그(GKPIPNPLLGLDST); VSV-태그(YTDIEMNRLGK); 또는 Xpress 태그(DLYDDDDK)를 함유하는 융합 단백질 또는 조작된 단백질을 발현한다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 항원 결합 단백질, 예를 들어, 항체, 예를 들어, 항체 단편 또는 그의 일부를 발현한다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드에 의해 발현되는 항체는 임의의 아이소타입, 예컨대 IgA, IgD, IgE, IgG, IgM의 것일 수 있다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 항체의 일부, 예컨대, 경쇄, 중쇄, Fc 단편, CDR(상보성 결정 영역), Fv 단편 또는 Fab 단편, 그의 추가의 부분을 발현한다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 항체의 하나 이상의 부분을 발현한다. 예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 1가지 초과의 발현 서열을 포함할 수 있으며, 그의 각각은 항체의 일부를 발현하며, 이의 합은 항체를 구성할 수 있다. 일부 경우에, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 항체의 중쇄를 코딩하는 하나의 발현 서열 및 항체의 경쇄를 코딩하는 또 다른 발현 서열을 포함한다. 일부 경우에, 원형 폴리리보뉴클레오티드가 세포 또는 무세포 환경에서 발현되는 경우에, 경쇄 및 중쇄는 적절한 변형, 폴딩 또는 다른 번역후 변형을 겪어 기능성 항체를 형성할 수 있다.
조절 요소
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 조절 요소, 예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드 내의 발현 서열의 발현을 변형시키는 서열을 포함한다.
조절 요소는, 발현 생성물을 인코딩하는 발현 서열에 인접하여 위치한 서열을 포함할 수 있다. 조절 요소는 인접 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 조절 요소는 조절 요소가 존재하지 않는 경우 발현되는 생성물의 양에 비하여, 발현되는 생성물의 양을 증가시킬 수 있다. 또한, 하나의 조절 요소는 탠덤으로 부착된 다수의 발현 서열에 대해 발현되는 생성물의 양을 증가시킬 수 있다. 그러므로, 하나의 조절 요소는 하나 이상의 발현 서열의 발현을 증강시킬 수 있다. 다수의 조절 요소는 해당 분야의 숙련자에게 널리 알려져 있다.
본원에 제공되는 바와 같은 조절 요소는 선택적 번역 서열을 포함할 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "선택적 번역 서열"은 원형 폴리리보뉴클레오티드 내의 발현 서열의 번역을 선택적으로 개시하거나 활성화시키는 핵산 서열, 예를 들어, 특정 리보스위치 압타자임을 지칭할 수 있다. 일부 실시형태에서, 조절 요소는 번역 조절자이다. 번역 조절자는 원형 폴리리보뉴클레오티드 내의 발현 서열의 번역을 조절할 수 있다. 번역 조절자는 번역 증강자 또는 억제자일 수 있다. 일부 실시형태에서, 번역 개시 서열은 조절 요소로서 기능할 수 있다. 번역을 개시하는 코돈, 예컨대, 비제한적으로 출발 코돈 또는 대안적인 출발 코돈에 측접한 뉴클레오티드는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 번역 효율, 길이 및/또는 구조에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다(예를 들어, 문헌[Matsuda and Mauro PLoS ONE, 2010 5: 11] 참조; 이의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨). 번역을 개시하는 코돈에 측접한 뉴클레오티드 중 임의의 것의 차폐를 사용하여 원형 폴리리보뉴클레오티드의 번역 개시의 위치, 번역 효율, 길이 및/또는 구조를 변경시킬 수 있다.
일 실시형태에서, 코돈을 차폐시키거나 숨기기 위해 차폐제를 출발 코돈 또는 대안적인 출발 코돈 근처에서 사용하여, 차폐된 출발 코돈 또는 대안적인 출발 코돈에서 번역 개시 확률을 감소시킬 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 번역이 대안적인 출발 코돈에서 개시할 확률을 증가시키기 위해, 차폐제를 사용하여 원형 폴리리보뉴클레오티드의 출발 코돈을 차폐할 수 있다.
본원에 제공되는 바와 같은 조절 요소는 그의 전문이 본원에 참조로 포함되는 국제 특허 공개 제WO2019118919A1호의 [0156] 내지 [0161]에 기술된 조절 요소 중 임의의 것을 포함할 수 있다.
번역 개시 서열
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 폴리펩티드를 인코딩하며, 번역 개시 서열, 예를 들어, 출발 코돈을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 번역 개시 서열은 코작 또는 샤인-달가노(Shine-Dalgarno) 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 발현 서열에 인접한 번역 개시 서열, 예를 들어, 코작 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 번역 개시 서열은 비-코딩 출발 코돈이다. 일부 실시형태에서, 번역 개시 서열, 예를 들어, 코작 서열은 각 발현 서열의 한측 또는 양측 모두에 존재하여, 발현 생성물의 분리를 야기한다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 발현 서열에 인접한 적어도 하나의 번역 개시 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 번역 개시 서열은 원형 폴리리보뉴클레오티드에 입체형태적 유연성을 제공한다. 일부 실시형태에서, 번역 개시 서열은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 실질적으로 단일 가닥의 영역 내에 존재한다.
원형 폴리리보뉴클레오티드는 1개 초과의 출발 코돈, 예컨대, 비제한적으로 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 25개, 적어도 30개, 적어도 35개, 적어도 40개, 적어도 50개, 적어도 60개 또는 60개 초과의 출발 코돈을 포함할 수 있다. 번역은 제1 출발 코돈 상에서 개시하거나, 제1 출발 코돈의 다운스트림에서 개시할 수 있다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 제1 출발 코돈, 예를 들어, AUG가 아닌 코돈에서 개시할 수 있다. 원형 폴리리보뉴클레오티드의 번역은 대안적인 번역 개시 서열, 예컨대, 그의 전문이 본원에 참조로 포함되는 국제 특허 공개 제WO2019118919A1호의 [0164]에 기술된 것들에서 개시할 수 있다.
일부 실시형태에서, 번역은 로카글레이트(Rocaglates)를 이용한 진핵 개시 인자 4A(eIF4A) 처리에 의해 개시된다(번역은 43S 스캐닝을 블로킹하여, 조기의 업스트림 번역 개시, 및 RocA-eIF4A 표적 서열을 갖는 전사물로부터의 감소된 단백질 발현을 야기함으로써 억제됨, 예를 들어, www.nature.com/articles/nature17978 참조).
IRES
일부 실시형태에서, 본원에 기술된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 요소를 포함한다. 원형 폴리리보뉴클레오티드 내에 포함시키기에 적합한 IRES 요소는 진핵 리보솜과 연계(engage)될 수 있는 RNA 서열, 예컨대 그의 전문이 본원에 참조로 포함되는 국제 특허 공개 제WO2019118919A1호의 [0166] 내지 [0167]에 기술된 것들을 포함한다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 적어도 하나의(예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 그 초과의) 발현 서열에 측접한 적어도 하나의 IRES를 포함한다. 일부 실시형태에서, IRES는 적어도 하나의(예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 그 초과의) 발현 서열의 양측 모두에 측접한다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 각 발현 서열의 한측 또는 양측 모두에 하나 이상의 IRES 서열을 포함하여, 생성된 펩티드(들) 및 또는 폴리펩티드(들)의 분리를 야기한다.
종결 요소
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 하나 이상의 발현 서열을 포함하며, 각각의 발현 서열은 종결 요소를 갖거나, 이를 갖지 않을 수 있다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 하나 이상의 발현 서열을 포함하고, 원형 폴리리보뉴클레오티드가 연속적으로 번역되도록, 발현 서열은 종결 요소를 결여한다. 종결 요소의 배제는 고착되거나 떨어지는 리보솜의 결여로 인하여 발현 생성물, 예를 들어, 펩티드 또는 폴리펩티드의 회전환 번역 또는 연속 발현을 초래할 수 있다. 이러한 일 실시형태에서, 회전환 번역은 각 발현 서열을 통하여 연속적 발현 생성물을 발현한다. 일부 다른 실시형태에서, 발현 서열의 종결 요소는 스태거 요소의 부분일 수 있다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 내의 하나 이상의 발현 서열은 종결 요소를 포함한다. 그러나, 원형 폴리리보뉴클레오티드 내의 후속(예를 들어, 제2, 제3, 제4, 제5 등의) 발현 서열의 회전환 번역 또는 발현이 수행된다. 이러한 예에서, 리보솜이 종결 요소, 예를 들어, 정지 코돈과 마주칠 때 발현 생성물은 리보솜에서 떨어질 수 있으며, 번역을 종결한다. 일부 실시형태에서, 리보솜, 예를 들어, 리보솜의 적어도 하나의 서브유닛이 원형 폴리리보뉴클레오티드와 접촉하여 유지되는 동안에 번역이 종결된다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 하나 이상의 발현 서열의 말단에 종결 요소를 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 발현 서열은 둘 이상의 종결 요소를 연속하여 포함한다. 이러한 실시형태에서, 번역이 종결되며 회전환 번역이 종결된다. 일부 실시형태에서, 리보솜은 원형 폴리리보뉴클레오티드와 완전히 탈연계(disengage)된다. 일부 이러한 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 내의 후속(예를 들어, 제2, 제3, 제4, 제5 등의) 발현 서열의 생성은 번역의 개시 이전에 리보솜이 원형 폴리리보뉴클레오티드와 재연계되는 것을 필요로 할 수 있다. 일반적으로, 종결 요소는 번역의 종결을 신호전달하는 프레임-내 뉴클레오티드 트리플렛, 예를 들어, UAA, UGA, UAG를 포함한다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 내의 하나 이상의 종결 요소는 프레임-시프트된 종결 요소, 예컨대 비제한적으로 번역을 종결시킬 수 있는 오프-프레임(off-frame) 또는 -1 및 +1 시프트된 리딩 프레임(예를 들어, 숨겨진 정지)이다. 프레임-시프트된 종결 요소는 발현 서열의 제2 및 제3 리딩 프레임에 나타나는 뉴클레오티드 트리플, TAA, TAG 및 TGA를 포함한다. 프레임-시프트된 종결 요소는 종종 세포에 유해한 mRNA의 오독(misread)을 방지하는 데 중요할 수 있다.
스태거 요소
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 발현 서열에 인접한 적어도 하나의 스태거 요소를 포함한다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 각 발현 서열에 인접한 스태거 요소를 포함한다. 일부 실시형태에서, 스태거 요소는 각 발현 서열의 한측 또는 양측 모두에 존재하여, 발현 생성물, 예를 들어, 펩티드(들) 및 또는 폴리펩티드(들)의 분리를 야기한다. 일부 실시형태에서, 스태거 요소는 하나 이상의 발현 서열의 일부이다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 하나 이상의 발현 서열을 포함하며, 하나 이상의 발현 서열의 각각은 스태거 요소 원형 폴리리보뉴클레오티드에 의해 후속 발현 서열로부터 분리된다. 일부 실시형태에서, 스태거 요소는 (a) 단일의 발현 서열의 2 라운드의 번역으로부터의 또는 (b) 둘 이상의 발현 서열의 1 라운드 이상의 번역으로부터의 단일 폴리펩티드의 생성을 방지한다. 일부 실시형태에서, 스태거 요소는 하나 이상의 발현 서열로부터 분리된 서열이다. 일부 실시형태에서, 스태거 요소는 하나 이상의 발현 서열 중 하나의 발현 서열의 일부를 포함한다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 스태거 요소를 포함한다. 회전환 번역을 유지하면서, 연속적 발현 생성물, 예를 들어, 펩티드 또는 폴리펩티드의 생성을 모면하기 위해, 스태거 요소를 포함시켜, 번역 동안 리보솜 정지를 유도할 수 있다. 일부 실시형태에서, 스태거 요소는 하나 이상의 발현 서열 중 적어도 하나의 3' 말단에 존재한다. 스태거 요소는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 회전환 번역 동안 리보솜을 고착시키도록 구성될 수 있다. 스태거 요소는 2A-유사 또는 CHYSEL(시스-작용 가수분해효소 요소) 서열을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 스태거 요소는 X1X2X3EX5NPGP인 C-말단 공통 서열을 갖는 서열을 인코딩하며, 여기서 X1은 부재하거나 G 또는 H이며, X2는 부재하거나 D 또는 G이며, X3은 D 또는 V 또는 I 또는 S 또는 M이며, X5는 임의의 아미노산이다. 일부 실시형태에서, 이 서열은 강력한 알파-나선 경향을 갖는 아미노산의 비-보존된 서열에 이어서 공통 서열 -D(V/I)ExNPG P를 포함하며, 여기서 x는 임의의 아미노산이다. 스태거 요소의 일부 비제한적인 예에는 GDVESNPGP, GDIEENPGP, VEPNPGP, IETNPGP, GDIESNPGP, GDVELNPGP, GDIETNPGP, GDVENPGP, GDVEENPGP, GDVEQNPGP, IESNPGP, GDIELNPGP, HDIETNPGP, HDVETNPGP, HDVEMNPGP, GDMESNPGP, GDVETNPGP, GDIEQNPGP 및 DSEFNPGP가 포함된다.
일부 실시형태에서, 본원에 기술된 스태거 요소는 발현 생성물, 예컨대 본원에 기술된 공통 서열의 G와 P 사이를 절단한다. 하나의 비-제한적인 예로서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 발현 생성물을 절단하도록 적어도 하나의 스태거 요소를 포함한다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 적어도 하나의 발현 서열에 인접한 스태거 요소를 포함한다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 각 발현 서열 이후에 스태거 요소를 포함한다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 각 발현 서열의 한측 또는 양측 모두에 존재하는 스태거 요소를 포함하여, 각각의 발현 서열로부터의 개별 펩티드(들) 및 또는 폴리펩티드(들)의 번역을 야기한다.
일부 실시형태에서, 스태거 요소는 번역 동안 리보솜 정지를 유도하는 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드 또는 비천연 뉴클레오티드를 포함한다. 비천연 뉴클레오티드는 펩티드 핵산(PNA), 모르폴리노 및 잠금 핵산(LNA), 및 글리콜 핵산(GNA) 및 트레오스 핵산(TNA)을 포함할 수 있다. 이들과 같은 예는 분자의 백본에 대한 변경에 의해 천연 발생 DNA 또는 RNA와 구분된다. 예시적인 변형은 번역 동안 리보솜 정지를 유도할 수 있는 당, 핵염기, (예를 들어, 연결 포스페이트로의 / 포스포디에스테르 링키지로의 / 포스포디에스테르 백본으로의) 뉴클레오시드간 링키지 및 그의 임의의 조합에 대한 임의의 변형을 포함할 수 있다. 본원에 제공되는 예시적인 변형 중 일부는 본원의 다른 곳에 기술된다.
일부 실시형태에서, 스태거 요소는 원형 폴리리보뉴클레오티드에 다른 형태로 존재한다. 예를 들어, 일부 예시적인 원형 폴리리보뉴클레오티드에서, 스태거 요소는 원형 폴리리보뉴클레오티드 내의 제1 발현 서열의 종결 요소, 및 종결 요소를 제1 발현 서열에 후속하는 발현의 제1 번역 개시 서열로부터 분리하는 뉴클레오티드 스페이서 서열을 포함한다. 일부 예에서, 제1 발현 서열의 제1 스태거 요소는 원형 폴리리보뉴클레오티드 내의 제1 발현 서열에 후속하는 발현의 제1 번역 개시 서열의 업스트림(그에 대해 5')에 존재한다. 일부 경우에, 제1 발현 서열 및 제1 발현 서열에 후속하는 발현 서열은 원형 폴리리보뉴클레오티드 내의 2개의 개별 발현 서열이다. 제1 스태거 요소와 제1 번역 개시 서열 사이의 거리는 제1 발현 서열과 그의 후속 발현 서열의 연속 번역을 가능하게 할 수 있다. 일부 실시형태에서, 제1 스태거 요소는 종결 요소를 포함하며, 제1 발현 서열의 발현 생성물을 그의 후속 발현 서열의 발현 생성물로부터 분리함으로써, 불연속 발현 생성물을 생성한다. 일부 경우에, 원형 폴리리보뉴클레오티드 내의 후속 서열의 제1 번역 개시 서열의 업스트림에 제1 스태거 요소를 포함하는 원형 폴리리보뉴클레오티드는 연속적으로 번역되는 한편, 제2 발현 서열에 후속하는 발현 서열의 제2 번역 개시 서열의 업스트림에 있는 제2 발현 서열의 스태거 요소를 포함하는 상응하는 원형 폴리리보뉴클레오티드는 연속적으로 번역되지 않는다. 일부 경우에, 원형 폴리리보뉴클레오티드에는 오직 하나의 발현 서열만이 존재하며, 제1 발현 서열 및 그의 후속 발현 서열은 동일한 발현 서열이다. 일부 예시적인 원형 폴리리보뉴클레오티드에서, 스태거 요소는 원형 폴리리보뉴클레오티드 내의 제1 발현 서열의 제1 종결 요소, 및 종결 요소를 다운스트림 번역 개시 서열로부터 분리하는 뉴클레오티드 스페이서 서열을 포함한다. 일부 이러한 예에서, 제1 스태거 요소는 원형 폴리리보뉴클레오티드 내의 제1 발현 서열의 제1 번역 개시 서열의 업스트림(그에 대해 5')에 존재한다. 일부 경우에, 제1 스태거 요소와 제1 번역 개시 서열 사이의 거리는 제1 발현 서열과 임의의 후속 발현 서열의 연속적 번역을 가능하게 한다. 일부 실시형태에서, 제1 스태거 요소는 제1 발현 서열의 1 라운드의 발현 생성물을 제1 발현 서열의 다음 라운드의 발현 생성물로부터 분리함으로써 불연속 발현 생성물을 생성한다. 일부 경우에, 원형 폴리리보뉴클레오티드 내의 제1 발현 서열의 제1 번역 개시 서열의 업스트림에 제1 스태거 요소를 포함하는 원형 폴리리보뉴클레오티드는 연속적으로 번역되는 한편, 상응하는 원형 폴리리보뉴클레오티드 내의 제2 발현 서열의 제2 번역 개시 서열의 업스트림에 스태거 요소를 포함하는 상응하는 원형 폴리리보뉴클레오티드는 연속적으로 번역되지 않는다. 일부 경우에, 제2 스태거 요소와 제2 번역 개시 서열 사이의 거리는 원형 폴리리보뉴클레오티드 내의 제1 스태거 요소와 제1 번역 개시 사이의 거리보다, 상응하는 원형 폴리리보뉴클레오티드에서 적어도 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배 또는 10배 더 멀다. 일부 경우에, 제1 스태거 요소와 제1 번역 개시 사이의 거리는 적어도 2개 뉴클레오티드, 3개 뉴클레오티드, 4개 뉴클레오티드, 5개 뉴클레오티드, 6개 뉴클레오티드, 7개 뉴클레오티드, 8개 뉴클레오티드, 9개 뉴클레오티드, 10개 뉴클레오티드, 11개 뉴클레오티드, 12개 뉴클레오티드, 13개 뉴클레오티드, 14개 뉴클레오티드, 15개 뉴클레오티드, 16개 뉴클레오티드, 17개 뉴클레오티드, 18개 뉴클레오티드, 19개 뉴클레오티드, 20개 뉴클레오티드, 25개 뉴클레오티드, 30개 뉴클레오티드, 35개 뉴클레오티드, 40개 뉴클레오티드, 45개 뉴클레오티드, 50개 뉴클레오티드, 55개 뉴클레오티드, 60개 뉴클레오티드, 65개 뉴클레오티드, 70개 뉴클레오티드, 75개 뉴클레오티드 또는 그 초과이다. 일부 실시형태에서, 제2 스태거 요소와 제2 번역 개시 사이의 거리는 제1 스태거 요소와 제1 번역 개시 사이의 거리보다 적어도 2개 뉴클레오티드, 3개 뉴클레오티드, 4개 뉴클레오티드, 5개 뉴클레오티드, 6개 뉴클레오티드, 7개 뉴클레오티드, 8개 뉴클레오티드, 9개 뉴클레오티드, 10개 뉴클레오티드, 11개 뉴클레오티드, 12개 뉴클레오티드, 13개 뉴클레오티드, 14개 뉴클레오티드, 15개 뉴클레오티드, 16개 뉴클레오티드, 17개 뉴클레오티드, 18개 뉴클레오티드, 19개 뉴클레오티드, 20개 뉴클레오티드, 25개 뉴클레오티드, 30개 뉴클레오티드, 35개 뉴클레오티드, 40개 뉴클레오티드, 45개 뉴클레오티드, 50개 뉴클레오티드, 55개 뉴클레오티드, 60개 뉴클레오티드, 65개 뉴클레오티드, 70개 뉴클레오티드, 75개 뉴클레오티드 또는 그 초과로 더 멀다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 1개 초과의 발현 서열을 포함한다.
조절 핵산
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 조절 핵산을 인코딩하는, 예를 들어, 내인성 유전자 및/또는 외인성 유전자의 발현을 변경시키는 하나 이상의 발현 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공되는 바와 같은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 발현 서열은 비-코딩 RNA, 예컨대 비제한적으로 tRNA, lncRNA, miRNA, rRNA, snRNA, 마이크로RNA, siRNA, piRNA, snoRNA, snRNA, exRNA, scaRNA, Y RNA 및 hnRNA와 같은 조절 핵산에 대해 안티센스인 서열을 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 조절 핵산은 유전자, 예컨대 숙주 유전자를 표적화한다. 조절 핵산은 본원에 그의 전문이 참조로 포함되는 국제 특허 공개 제WO2019118919A1호의 [0177] 및 [0181] 내지 [0189]에 기술된 조절 핵산 중 임의의 것을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 가이드 RNA(gRNA)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 가이드 RNA를 포함하거나 가이드 RNA를 인코딩한다. gRNA 짧은 합성 RNA는 불완전한 이펙터 모이어티로의 결합에 필요한 "스캐폴드" 서열, 및 게놈 표적에 대한 사용자-정의된 약 20개 뉴클레오티드 표적화 서열로 구성된다. 실시에 있어서, 가이드 RNA 서열은 일반적으로 17개 뉴클레오티드 내지 24개 뉴클레오티드(예를 들어, 19개 뉴클레오티드, 20개 뉴클레오티드 또는 21개 뉴클레오티드)의 길이를 갖고, 표적화된 핵산 서열에 상보성이도록 설계된다. 맞춤형(custom) gRNA 생성자 및 알고리즘이 효율적인 가이드 RNA의 설계에 사용하기 위해 상업적으로 이용 가능하다. 또한, 키메라 "단일 가이드 RNA"("sgRNA"), 천연 발생 crRNA-tracrRNA 복합체를 모방하며, tracrRNA(뉴클레아제로의 결합을 위함) 및 적어도 하나의 crRNA(뉴클레아제를 편집을 위해 표적화된 서열에 가이드함) 둘 모두를 함유하는 조작된(합성) 단일 RNA 분자를 사용하여 유전자 편집이 달성된 바 있다. 또한, 화학적으로 변형된 sgRNA는 게놈 편집에서 효율적인 것으로 입증된 바 있으며; 예를 들어, 문헌[Hendel et al. (2015) Nature Biotechnol., 985 - 991]을 참조한다.
gRNA는 특정 DNA 서열(예를 들어, 유전자의 프로모터, 증강자, 침묵자 또는 억제자에 인접한 또는 그 내의 서열)을 인식할 수 있다.
일 실시형태에서, gRNA는 유전자 편집을 위한 CRISPR 시스템의 부분으로서 사용된다. 유전자 편집의 목적을 위해, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 요망되는 표적 DNA 서열에 상응하는 하나의 또는 다중의 가이드 RNA 서열을 포함하도록 설계될 수 있으며; 예를 들어, 문헌[Cong et al. (2013) Science, 339:819-823]; 문헌[Ran et al. (2013) Nature Protocols, 8:2281 - 2308]을 참조한다. gRNA 서열의 적어도 약 16개 뉴클레오티드 또는 17개 뉴클레오티드는 DNA 절단의 발생을 위해 Cas9에 의해 요구되며; Cpf1에 있어서 gRNA 서열의 적어도 약 16개 뉴클레오티드는 검출 가능한 DNA 절단을 달성하는 데 필요하다.
원형 폴리리보뉴클레오티드는 유전자에 의해 인코딩된 RNA의 발현을 조절할 수 있다. 다수의 유전자가 서로 어느 정도의 서열 상동성을 공유할 수 있기 때문에, 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 충분한 서열 상동성을 갖는 유전자의 부류를 표적화하도록 설계될 수 있다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는, 상이한 유전자 표적들 중에 공유되거나 특이적인 유전자 표적에 특유한 서열에 대해 상보성을 갖는 서열을 함유할 수 있다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 몇몇의 유전자 간에 상동성을 갖는 RNA 서열의 보존된 영역을 표적화함으로써 유전자 패밀리 내의 몇몇의 유전자(예를 들어, 상이한 유전자 아이소폼, 스플라이스 변이체, 돌연변이 유전자 등)를 표적화하도록 설계될 수 있다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 단일의 유전자의 특정 RNA 서열에 특유한 서열을 표적화하도록 설계될 수 있다.
일부 실시형태에서, 발현 서열은 5000 bp 미만(예를 들어, 약 5000 bp, 4000 bp, 3000 bp, 2000 bp, 1000 bp, 900 bp, 800 bp, 700 bp, 600 bp, 500 bp, 400 bp, 300 bp, 200 bp, 100 bp, 50 bp, 40 bp, 30 bp, 20 bp, 10 bp 미만 또는 그 미만)의 길이를 갖는다. 일부 실시형태에서, 발현 서열은 독립적으로 또는 부가적으로 10 bp 초과(예를 들어, 적어도 약 10 bp, 20 bp, 30 bp, 40 bp, 50 bp, 60 bp, 70 bp, 80 bp, 90 bp, 100 bp, 200 bp, 300 bp, 400 bp, 500 bp, 600 bp, 700 bp, 800 bp, 900 bp, 1000 kb, 1.1 kb, 1.2 kb, 1.3 kb, 1.4 kb, 1.5 kb, 1.6 kb, 1.7 kb, 1.8 kb, 1.9 kb, 2 kb, 2.1 kb, 2.2 kb, 2.3 kb, 2.4 kb, 2.5 kb, 2.6 kb, 2.7 kb, 2.8 kb, 2.9 kb, 3 kb, 3.1 kb, 3.2 kb, 3.3 kb, 3.4 kb, 3.5 kb, 3.6 kb, 3.7 kb, 3.8 kb, 3.9 kb, 4 kb, 4.1 kb, 4.2 kb, 4.3 kb, 4.4 kb, 4.5 kb, 4.6 kb, 4.7 kb, 4.8 kb, 4.9 kb, 5 kb, 10 kb, 20 kb 또는 그 초과)의 길이를 갖는다.
일부 실시형태에서, 발현 서열은 본원에 기술된 특징, 예를 들어, 하나 이상의 펩티드 또는 단백질을 인코딩하는 서열, 하나 이상의 조절 요소, 하나 이상의 조절 핵산, 예를 들어, 하나 이상의 비-코딩 RNA, 다른 발현 서열 및 그의 임의의 조합 중 하나 이상을 포함한다.
번역 효율
일부 실시형태에서, 본원에 제공되는 바와 같은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 번역 효율은 참조물질, 예를 들어 선형 대응물, 선형 발현 서열 또는 선형의 원형 폴리리보뉴클레오티드보다 더 크다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공되는 바와 같은 원형 폴리리보뉴클레오티드는 참조물질의 번역 효율보다 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%, 500%, 600%, 70%, 800%, 900%, 1000%, 2000%, 5000%, 10000%, 100000% 또는 그 초과로 더 큰 번역 효율을 갖는다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 선형 대응물의 번역 효율보다 10% 더 큰 번역 효율을 갖는다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 선형 대응물의 번역 효율보다 300% 더 큰 번역 효율을 갖는다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 화학량론적 비의 발현 생성물을 생성한다. 회전환 번역은 발현 생성물을 실질적으로 동등한 비로 연속적으로 생성한다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 발현 생성물이 실질적으로 동등한 비로 생성되도록 화학량론적 번역 효율을 갖는다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 다중의 발현 생성물, 예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개 또는 그 초과의 발현 서열로부터의 생성물의 화학량론적 번역 효율을 갖는다.
회전환 번역
일부 실시형태에서, 일단 원형 폴리리보뉴클레오티드의 번역이 개시되면, 원형 폴리리보뉴클레오티드에 결합된 리보솜은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 적어도 1 라운드의 번역을 완료하기 전에 원형 폴리리보뉴클레오티드로부터 탈연계되지 않는다. 일부 실시형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 원형 폴리리보뉴클레오티드는 회전환 번역에 적격성이다. 일부 실시형태에서, 회전환 번역 동안, 일단 원형 폴리리보뉴클레오티드의 번역이 개시되면, 원형 폴리리보뉴클레오티드에 결합된 리보솜은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 적어도 2 라운드, 적어도 3 라운드, 적어도 4 라운드, 적어도 5 라운드, 적어도 6 라운드, 적어도 7 라운드, 적어도 8 라운드, 적어도 9 라운드, 적어도 10 라운드, 적어도 11 라운드, 적어도 12 라운드, 적어도 13 라운드, 적어도 14 라운드, 적어도 15 라운드, 적어도 20 라운드, 적어도 30 라운드, 적어도 40 라운드, 적어도 50 라운드, 적어도 60 라운드, 적어도 70 라운드, 적어도 80 라운드, 적어도 90 라운드, 적어도 100 라운드, 적어도 150 라운드, 적어도 200 라운드, 적어도 250 라운드, 적어도 500 라운드, 적어도 1000 라운드, 적어도 1500 라운드, 적어도 2000 라운드, 적어도 5000 라운드, 적어도 10000 라운드, 적어도 105 라운드 또는 적어도 106 라운드의 번역을 완료하기 전에, 원형 폴리리보뉴클레오티드로부터 탈연계되지 않는다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 회전환 번역은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 1 라운드 초과의 번역으로부터 번역되는 폴리펩티드 생성물("연속" 발현 생성물)의 생성을 야기한다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 스태거 요소를 포함하며, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 회전환 번역은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 단일 라운드의 번역 또는 단일 라운드 미만의 번역으로부터 생성되는 폴리펩티드 생성물("불연속" 발현 생성물)의 생성을 야기한다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 회전환 번역 동안 생성되는 총 폴리펩티드의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%(몰/몰)가 불연속 폴리펩티드이도록 구성된다. 일부 실시형태에서, 총 폴리펩티드에 비한 불연속 생성물의 양의 비는 시험관내 번역 시스템에서 시험된다. 일부 실시형태에서, 양의 비를 시험하기 위해 사용되는 시험관내 번역 시스템은 토끼 망상적혈구 용해물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 양의 비는 생체내 번역 시스템, 예컨대 진핵 세포 또는 원핵 세포, 배양된 세포, 또는 유기체 내의 세포에서 시험된다.
비번역 영역
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 비번역 영역(UTR)을 포함한다. 유전자를 포함하는 게놈 영역의 UTR은 전사되지만 번역되지 않을 수 있다. 일부 실시형태에서, UTR은 본원에 기술된 발현 서열의 번역 개시 서열의 업스트림에 포함될 수 있다. 일부 실시형태에서, UTR은 본원에 기술된 발현 서열의 다운스트림에 포함될 수 있다. 일부 경우에, 제1 발현 서열에 대한 하나의 UTR은 제2 발현 서열에 대한 또 다른 UTR과 동일하거나, 그와 연속되거나, 그와 중첩된다. 일부 실시형태에서, 인트론은 인간 인트론이다. 일부 실시형태에서, 인트론은 전장 인간 인트론, 예를 들어, ZKSCAN1이다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 내부에 매립된 아데노신 및 우리딘의 하나 이상의 스트레치를 갖는 UTR을 포함한다. 이들 AU 풍부 시그너처는 발현 생성물의 전환율을 증가시킬 수 있다.
UTR AU 풍부 요소(ARE)의 도입, 제거 또는 변형은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 안정성 또는 면역원성(예를 들어, 면역 또는 염증 반응의 하나 이상의 마커의 수준)을 조절하는 데 유용할 수 있다. 특정 원형 폴리리보뉴클레오티드를 조작하는 경우, ARE의 하나 이상의 카피를 원형 폴리리보뉴클레오티드로 도입할 수 있으며, ARE의 카피는 발현 생성물의 번역 및/또는 생성을 조절할 수 있다. 마찬가지로, ARE를 확인하고 제거하거나, 원형 폴리리보뉴클레오티드 내로 조작하여 세포내 안정성을 조절함으로써, 생성되는 단백질의 번역 및 생성에 영향을 미칠 수 있다.
임의의 유전자로부터의 임의의 UTR이 원형 폴리리보뉴클레오티드의 각 측접 영역 내로 혼입될 수 있음을 이해해야 한다. 본원에 제공된 원형 폴리리보뉴클레오티드에서 사용될 수 있는 예시적인 UTR은 그의 전문이 본원에 참조로 포함되는 국제 특허 공개 제WO2019118919A1호의 [0200] 내지 [0201]에 기술된 것들을 포함한다.
폴리A 서열
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 폴리-A 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리-A 서열의 길이는 10개 초과의 뉴클레오티드 길이이다. 일 실시형태에서, 폴리-A 서열은 15개 초과의 뉴클레오티드(예를 들어, 적어도 약 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 55개, 60개, 70개, 80개, 90개, 100개, 120개, 140개, 160개, 180개, 200개, 250개, 300개, 350개, 400개, 450개, 500개, 600개, 700개, 800개, 900개, 1,000개, 1,100개, 1,200개, 1,300개, 1,400개, 1,500개, 1,600개, 1,700개, 1,800개, 1,900개, 2,000개, 2,500개 및 3,000개 또는 그 초과의 뉴클레오티드) 길이이다. 일부 실시형태에서, 폴리-A 서열은 그의 전문이 본원에 참조로 포함되는 국제 특허 공개 제WO2019118919A1호의 [0202] 내지 [0204]에서의 폴리-A 서열의 설명에 따라 설계된다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 폴리A를 포함하거나, 폴리A를 결여하거나, 변형된 폴리A를 가져, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 하나 이상의 특징을 변경시킨다. 일부 실시형태에서, 폴리A를 결여하거나, 변형된 폴리A를 갖는 원형 폴리리보뉴클레오티드는 하나 이상의 기능적 특징, 예를 들어, 면역원성(예를 들어, 면역 또는 염증 반응의 하나 이상의 마커의 수준), 반감기, 발현 효율 등을 개선시킨다.
RNA-결합
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 하나 이상의 RNA 결합 부위를 포함한다. 마이크로RNA(또는 miRNA)는 핵산 분자의 3'UTR에 결합하는 짧은 비코딩 RNA이며, 핵산 분자 안정성을 감소시킴으로써 또는 번역을 저해함으로써 유전자 발현을 하향-조절한다. 원형 폴리리보뉴클레오티드는 하나 이상의 마이크로RNA 표적 서열, 마이크로RNA 서열 또는 마이크로RNA 씨드를 포함할 수 있다. 이러한 서열은 임의의 알려져 있는 마이크로RNA, 예컨대 미국 공개 제US2005/0261218호, 미국 공개 제US2005/0059005호, 및 국제 특허 공개 제WO2019118919A1호의 [0207] 내지 [0215]에 교시된 것들에 상응할 수 있으며, 이의 내용은 그들 전문이 본원에 참조로 포함된다.
단백질-결합
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 단백질, 예를 들어, 리보솜이 RNA 서열 내의 내부 부위에 결합할 수 있게 하는 하나 이상의 단백질 결합 부위를 포함한다. 단백질 결합 부위, 예를 들어, 리보솜 결합 부위를 원형 폴리리보뉴클레오티드 내로 조작함으로써, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 숙주의 면역계의 성분으로부터 원형 폴리리보뉴클레오티드를 차폐하여 숙주의 면역계를 회피하거나, 숙주의 면역계에 의한 검출이 감소되거나, 조절된 분해 또는 조절된 번역을 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 예를 들어, 면역 반응, 예를 들어, CTL(세포독성 T 림프구) 반응을 회피하기 위해 적어도 하나의 면역단백질 결합 부위를 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역단백질 결합 부위는 면역단백질에 결합하고, 외인성으로서 원형 폴리리보뉴클레오티드의 차폐를 보조하는 뉴클레오티드 서열이다. 일부 실시형태에서, 면역단백질 결합 부위는 면역단백질에 결합하고, 외인성 또는 외래로서 원형 폴리리보뉴클레오티드를 숨기는 것을 보조하는 뉴클레오티드 서열이다.
선형 RNA로의 리보솜 연계의 종래의 메커니즘은 RNA의 캡핑된 5' 말단으로의 리보솜 결합을 수반한다. 5' 말단으로부터, 리보솜은 개시 코돈으로 이동하며, 이때, 제1 펩티드 결합이 형성된다. 본 발명에 따라, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 번역의 내부 개시(즉, 캡-독립적)는 자유 말단 또는 캡핑된 말단을 필요로 하지 않는다. 오히려, 리보솜이 비-캡핑된 내부 부위에 결합함으로써 리보솜은 개시 코돈에서 폴리펩티드 신장을 시작한다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 리보솜 결합 부위, 예를 들어, 개시 코돈을 포함하는 하나 이상의 RNA 서열을 포함한다.
천연의 5'UTR은 번역 개시를 위해 역할을 수행하는 특징부를 갖는다. 그들은 리보솜이 많은 유전자의 번역을 개시하는 과정에 관여하는 것으로 흔히 알려져 있는 코작 서열과 같은 시그너처를 보유한다. 코작 서열은 공통 CCR(A/G)CCAUGG를 가지며, 여기서 R은 또 다른 'G'로 이어지는 출발 코돈(AUG)의 3개 염기 업스트림의 퓨린(아데닌 또는 구아닌)이다. 5' UTR은 또한 신장 인자 결합에 관여하는 이차 구조 형성하는 것으로 알려져 있다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 단백질에 결합하는 단백질 결합 서열을 인코딩한다. 일부 실시형태에서, 단백질 결합 서열은 원형 폴리리보뉴클레오티드를 특정 표적에 표적화하거나 국소화시킨다. 일부 실시형태에서, 단백질 결합 서열은 단백질의 아르기닌-풍부 영역에 특이적으로 결합한다.
일부 실시형태에서, 단백질 결합 부위는 단백질, 예컨대 ACIN1, AGO, APOBEC3F, APOBEC3G, ATXN2, AUH, BCCIP, CAPRIN1, CELF2, CPSF1, CPSF2, CPSF6, CPSF7, CSTF2, CSTF2T, CTCF, DDX21, DDX3, DDX3X, DDX42, DGCR8, EIF3A, EIF4A3, EIF4G2, ELAVL1, ELAVL3, FAM120A, FBL, FIP1L1, FKBP4, FMR1, FUS, FXR1, FXR2, GNL3, GTF2F1, HNRNPA1, HNRNPA2B1, HNRNPC, HNRNPK, HNRNPL, HNRNPM, HNRNPU, HNRNPUL1, IGF2BP1, IGF2BP2, IGF2BP3, ILF3, KHDRBS1, LARP7, LIN28A, LIN28B, m6A, MBNL2, METTL3, MOV10, MSI1, MSI2, NONO, NONO-, NOP58, NPM1, NUDT21, PCBP2, POLR2A, PRPF8, PTBP1, RBFOX2, RBM10, RBM22, RBM27, RBM47, RNPS1, SAFB2, SBDS, SF3A3, SF3B4, SIRT7, SLBP, SLTM, SMNDC1, SND1, SRRM4, SRSF1, SRSF3, SRSF7, SRSF9, TAF15, TARDBP, TIA1, TNRC6A, TOP3B, TRA2A, TRA2B, U2AF1, U2AF2, UNK, UPF1, WDR33, XRN2, YBX1, YTHDC1, YTHDF1, YTHDF2, YWHAG, ZC3H7B, PDK1, AKT1, 및 RNA에 결합하는 임의의 다른 단백질에 대한 결합 부위를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
엔크립토겐
본원에 기술된 바와 같이, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 세포의 선천적 면역 반응을 감소시키거나, 회피하거나, 모면하기 위해 엔크립토겐을 포함한다. 일 양태에서, 세포로 전달되는 경우, 참조 화합물, 예를 들어, 기술된 원형 폴리리보뉴클레오티드에 상응하는 선형 폴리뉴클레오티드, 또는 엔크립토겐을 결여한 원형 폴리리보뉴클레오티드에 의해 촉발되는 반응에 비하여, 숙주로부터 감소된 면역 반응을 초래하는 원형 폴리리보뉴클레오티드가 본원에 제공된다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 엔크립토겐을 결여한 대응물보다 더 적은 면역원성(예를 들어, 더 낮은 면역 또는 염증 반응의 하나 이상의 마커의 수준)을 갖는다.
일부 실시형태에서, 엔크립토겐은 안정성을 증강시킨다. 핵산 분자의 안정성 및 번역과 관련하여 UTR에 의해 수행되는 조절 역할에 대한 증거가 점점 더 많아지고 있다. UTR의 조절 특징을 엔크립토겐 내에 포함시켜, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 안정성을 증강시킬 수 있다.
일부 실시형태에서, 5' 또는 3' UTR은 원형 폴리리보뉴클레오티드 내의 엔크립토겐을 구성할 수 있다. 예를 들어, UTR AU 풍부 요소(ARE)의 제거 또는 변형은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 안정성 또는 면역원성을 조절(예를 들어, 면역 또는 염증 반응의 하나 이상의 마커의 수준을 조절)하는 데 유용할 수 있다.
일부 실시형태에서, 발현 서열, 예를 들어, 번역 가능한 영역 내의 AU 풍부 요소(ARE)의 변형의 제거는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 안정성 또는 면역원성을 조절(예를 들어, 면역 또는 염증 반응의 하나 이상의 마커의 수준을 조절)하는 데 유용할 수 있다.
일부 실시형태에서, 엔크립토겐은 miRNA 결합 부위, 또는 임의의 다른 비-코딩 RNA에 대한 결합 부위를 포함한다. 예를 들어, 본원에 기술된 원형 폴리리보뉴클레오티드 내로의 miR-142 부위의 혼입은 조혈 세포에서 발현을 조절할 수 있을 뿐 아니라, 원형 폴리리보뉴클레오티드에 인코딩된 단백질에 대한 면역 반응을 감소시키기거나 없앨 수 있다.
일부 실시형태에서, 엔크립토겐은 단백질, 예를 들어, 면역단백질이 RNA 서열에 결합할 수 있게 하는 하나 이상의 단백질 결합 부위를 포함한다. 단백질 결합 부위를 원형 폴리리보뉴클레오티드 내로 조작함으로써, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 숙주의 면역계의 성분으로부터 원형 폴리리보뉴클레오티드를 차폐하여 숙주의 면역계를 회피하거나, 숙주의 면역계에 의한 검출이 감소되거나, 조절된 분해 또는 조절된 번역을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 예를 들어, 면역 반응, 예를 들어, CTL 반응을 회피하기 위해 적어도 하나의 면역단백질 결합 부위를 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역단백질 결합 부위는 면역단백질에 결합하고, 외인성으로서 원형 폴리리보뉴클레오티드의 차폐를 보조하는 뉴클레오티드 서열이다.
일부 실시형태에서, 엔크립토겐은 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 예시적인 변형은 원형 폴리리보뉴클레오티드에 대한 면역 반응을 방지하거나 감소시킬 수 있는 당, 핵염기, (예를 들어, 연결 포스페이트로의 / 포스포디에스테르 링키지로의 / 포스포디에스테르 백본으로의) 뉴클레오시드간 링키지 및 그의 임의의 조합에 대한 임의의 변형을 포함할 수 있다. 본원에 제공된 예시적인 변형의 일부는 하기에 상세히 기술된다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 참조 화합물, 예를 들어, 변형을 결여한 원형 폴리리보뉴클레오티드에 의해 촉발되는 반응에 비하여 숙주로부터의 면역 반응을 감소시키기 위한, 본원의 다른 곳에 기술된 바와 같은 하나 이상의 변형을 포함한다. 특히, 하나 이상의 이노신의 부가는 RNA를 바이러스에 대해 내인성으로서 식별하는 것으로 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Yu, Z. et al. (2015) RNA editing by ADAR1 marks dsRNA as "self". Cell Res. 25, 1283-1284]을 참조하며, 이는 그 전문이 참조로 포함된다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 shRNA에 대한 하나 이상의 발현 서열, 또는 siRNA로 가공될 수 있는 RNA 서열을 포함하며, shRNA 또는 siRNA는 RIG-I을 표적화하고 RIG-I의 발현을 감소시킨다. RIG-I은 외래의 원형 RNA를 감지할 수 있으며, 외래의 원형 RNA의 분해를 야기한다. 따라서, RIG-1-표적화 shRNA, siRNA 또는 임의의 다른 조절 핵산에 대한 서열을 보유하는 원형 폴리뉴클레오티드는 원형 폴리리보뉴클레오티드에 대한 면역성, 예를 들어, 숙주 세포 면역성을 감소시킬 수 있다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 세포의 선천적 면역 반응의 감소, 회피 또는 모면에 있어서 원형 폴리리보뉴클레오티드를 보조하는 서열, 요소 또는 구조를 결여한다. 일부 이러한 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 폴리A 서열, 5' 말단, 3' 말단, 포스페이트 기, 하이드록실 기 또는 그의 임의의 조합을 결여할 수 있다.
리보스위치
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 하나 이상의 리보스위치를 포함한다.
리보스위치는, 전형적으로 작은 표적 분자에 직접 결합할 수 있으며 표적의 결합이 RNA 번역, 발현 생성물 안정성 및 활성에 영향을 미치는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 부분으로 여겨진다(문헌[Tucker B J, Breaker R R (2005), Curr Opin Struct Biol 15 (3): 342-8]). 따라서, 리보스위치를 포함하는 원형 폴리리보뉴클레오티드는 그의 표적 분자의 존재 또는 부재에 따라, 그의 자체의 활성을 조절하는 데 직접 관여한다. 일부 실시형태에서, 리보스위치는 개별 분자에 대한 압타머-유사 친화성의 영역을 갖는다. 따라서, 본 발명의 더 넓은 맥락에서, 비-코딩 핵산 내에 포함되는 임의의 압타머는 대량의 부피로부터 분자의 격리를 위해 사용될 수 있다. "(리보)스위치" 활성을 통한 사건의 다운스트림 정보 제공이 특히 유리할 수 있다.
일부 실시형태에서, 리보스위치는 전사 종결, 번역 개시의 저해, mRNA 자가-절단 및 진핵생물에서, 스플라이싱 경로의 변경을 포함하지만 이에 제한되지 않는 유전자 발현에 영향을 가질 수 있다. 리보스위치는 트리거 분자의 결합 또는 제거를 통해 유전자 발현을 제어하는 기능을 할 수 있다. 따라서, 리보스위치를 포함하는 원형 폴리리보뉴클레오티드를 리보스위치를 활성화시키거나, 불활성화시키거나, 차단하는 조건으로 처리하여, 발현을 변경시킨다. 발현은 예를 들어, 전사의 종결 또는 RNA로의 리보솜 결합의 차단의 결과로서 변경될 수 있다. 트리거 분자 또는 그의 유사체의 결합은 리보스위치의 성질에 따라, RNA 분자의 발현을 감소시키거나 방지하거나, RNA 분자의 발현을 촉진시키거나 증가시킬 수 있다. 리보스위치의 일부 예는 본원에 기술되어 있다.
일부 실시형태에서, 리보스위치는 사이클릭 디-GMP 리보스위치, FMN 리보스위치(또한, RFN-요소), glmS 리보스위치, 글루타민 리보스위치, 글리신 리보스위치, 라이신 리보스위치(또한, L-박스), PreQ1 리보스위치(예를 들어, PreQ1 -l 리보스위치 및 PreQ1 -ll 리보스위치), 퓨린 리보스위치, SAH 리보스위치, SAM 리보스위치, SAM-SAH 리보스위치, 테트라하이드로폴레이트 리보스위치, 테오필린 결합 리보스위치, 티민 피로포스페이트 결합 리보스위치, 티. 텡콘겐시스(T. tengcongensis) glmS 촉매적 리보스위치, TPP 리보스위치(또한 THI-박스), Moco 리보스위치 또는 아데닌 감지 add-A 리보스위치이며, 이의 각각은 그의 전문이 본원에 참조로 포함되는 국제 특허 공개 제WO2019118919A1호의 [0235] 내지 [0252]에 기술된다.
압타자임
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 압타자임을 포함한다. 압타자임은 조건적 발현을 위한 스위치이며, 여기서 압타머 영역은 알로스테릭 제어 요소로서 사용되며, 촉매적 RNA(하기 기술된 바와 같은 "리보자임")의 영역에 커플링된다. 일부 실시형태에서, 압타자임은 세포 유형 특이적 번역에서 활성이다. 일부 실시형태에서, 압타자임은 세포 상태 특이적 번역, 예를 들어, 바이러스 감염된 세포 하에서 또는 바이러스 핵산 또는 바이러스 단백질의 존재 하에서 활성이다.
(RNA 효소 또는 촉매적 RNA로도 지칭되는 리보핵산 효소로부터의) 리보자임은 화학 반응을 촉매작용하는 RNA 분자이다. 리보자임의 일부 비제한적인 예는 해머헤드(hammerhead) 리보자임, VL 리보자임, 리드자임(leadzyme), 헤어핀 리보자임, 및 그의 전문이 본원에 참조로 포함되는 국제 특허 공개 제WO2019118919A1호의 [0254] 내지 [0259]에 기술된 다른 리보자임을 포함한다.
복제 요소
원형 폴리리보뉴클레오티드는 복제에 유용한 서열 및/또는 모티프를 인코딩할 수 있다. 원형 폴리리보뉴클레오티드의 복제는 상보성 원형 폴리리보뉴클레오티드를 생성함으로써 발생할 수 있다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 전사를 개시하기 위한 모티프를 포함하며, 전사는 내인성 세포 기구(DNA-의존성 RNA 폴리머라제), 또는 원형 폴리리보뉴클레오티드에 의해 인코딩된 RNA-의존성 RNA 폴리머라제에 의해 유도된다. 회전환 전사 사건의 생성물은 리보자임에 의해 절단되어, 상보성 또는 증량된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 단위 길이로 생성할 수 있다. 리보자임은 원형 폴리리보뉴클레오티드, 그의 상보물에 의해 또는 RNA 서열에 의해 트랜스로 인코딩될 수 있다. 일부 실시형태에서, 인코딩된 리보자임은 원형 RNA 증량을 제어하기 위해 리보자임의 활성을 조절하는(저해하거나 촉진시키는) 서열 또는 모티프를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 단위-길이 서열은 세포 RNA 리가제에 의해 원형 형태로 라이게이션될 수 있다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 자가 증폭을 보조하는 복제 요소를 포함한다. 이러한 복제 요소의 예는 그의 전문이 본원에 참조로 포함되는 국제 특허 공개 제WO2019118919A1호의 [0280] 내지 [0282]에 기술된 것들을 포함한다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 예를 들어, 엑소뉴클레아제에 의한 분해에 대해 실질적으로 저항성이다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 세포 내에서 복제된다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 약 10% 내지 20%, 20% 내지 30%, 30% 내지 40%, 40% 내지 50%, 50% 내지 60%, 60% 내지 70%, 70% 내지 75%, 75% 내지 80%, 80% 내지 85%, 85% 내지 90%, 90% 내지 95%, 95% 내지 99%의 비 또는 그 사이의 임의의 백분율로 세포 내에서 복제된다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 세포 내에서 복제되며, 딸 세포로 이동된다. 일부 실시형태에서, 세포는 적어도 하나의 원형 폴리리보뉴클레오티드를 적어도 25%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 효율로 딸 세포로 이동시킨다. 일부 실시형태에서, 감수분열을 겪는 세포는 원형 폴리리보뉴클레오티드를 적어도 25%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 효율로 딸 세포로 이동시킨다. 일부 실시형태에서, 유사분열을 겪는 세포는 원형 폴리리보뉴클레오티드를 적어도 25%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 효율로 딸 세포로 이동시킨다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 숙주 세포 내에서 복제한다. 일 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 포유동물 세포, 예를 들어, 인간 세포에서 복제 가능하다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드가 숙주 세포에서 복제되는 동안, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 숙주의 게놈 내로, 예를 들어, 숙주의 염색체와 통합되지 않는다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 예를 들어, 숙주의 염색체와, 무시할 수 있는 재조합 빈도를 갖는다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 예를 들어, 숙주의 염색체와 예를 들어, 약 1.0 cM/Mb, 0.9 cM/Mb, 0.8 cM/Mb, 0.7 cM/Mb, 0.6 cM/Mb, 0.5 cM/Mb, 0.4 cM/Mb, 0.3 cM/Mb, 0.2 cM/Mb, 0.1 cM/Mb 미만 또는 그 미만의 재조합 빈도를 갖는다.
스캐폴드 서열
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자는 하나 이상의 스캐폴드 서열을 포함한다. 스캐폴드 서열은 압타머 서열일 수 있다. 상기 열거된 각각의 양태의 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자는 내인성 또는 천연 발생 원형 폴리리보뉴클레오티드 서열을 인코딩하는 서열을 갖는다.
일부 실시형태에서, circRNA는 하나 이상의 표적에 결합한다. 일부 실시형태에서, circRNA는 원형 압타머이다. 일 실시형태에서, circRNA는 하나 이상의 표적에 결합하는 하나 이상의 결합 부위를 포함한다. 일 실시형태에서, circ RNA는 압타머 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, circRNA는 DNA 표적 및 단백질 표적 둘 모두에 결합하며, 예를 들어, 전사를 매개한다. 또 다른 실시형태에서, circRNA는 단백질 복합체를 접촉시키며, 예를 들어, 번역후 변형 또는 신호 전달을 매개한다. 또 다른 실시형태에서, circRNA는 둘 이상의 상이한 표적, 예컨대 단백질에 결합하며, 예를 들어, 이들 단백질을 세포질로 왕복시키거나, 표적 중 하나 이상의 분해를 매개한다.
일부 실시형태에서, circRNA는 DNA, RNA 및 단백질 중 적어도 하나에 결합함으로써, 세포 과정을 조절한다(예를 들어, 단백질 발현을 변경시키는, 유전자 발현을 조절하는, 세포 신호전달을 조절하는 등이다). 일부 실시형태에서, 합성 circRNA는 표적 또는 적어도 하나의 모이어티, 예를 들어, 선택된 DNA, RNA 또는 단백질의 결합 모이어티와의 상호작용을 위한 결합 부위를 포함함으로써, 내인성 대응물과의 결합에서 경쟁한다.
일부 실시형태에서, 원형 RNA는 세포 과정을 조절하는(예를 들어, 단백질 발현을 변경시키는, 유전자 발현을 조절하는, 세포 신호전달을 조절하는 등인) 복합체를 형성한다. 일부 실시형태에서, 원형 RNA는 표적(예를 들어, 전사 인자)으로의 결합에 의해 세포독성제(예를 들어, 화학치료제)에 대하여 세포를 감작시키며, 이는 세포 생존력의 감소를 초래한다. 예를 들어, 세포독성제에 대한 세포의 감작은 세포독성제 및 원형 RNA의 전달 후에 감소된 세포 생존력을 초래한다. 일부 실시형태에서, 감소된 세포 생존력은 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 또는 그 내의 임의의 백분율 만큼 감소된다.
일부 실시형태에서, 복합체는 세포로의 원형 RNA의 전달 후에 적어도 5일 동안 검출 가능하다. 일부 실시형태에서, 복합체는 세포로의 원형 RNA의 전달 후에 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일 또는 16일 동안 검출 가능하다.
일 실시형태에서, 합성 circRNA는 miRNA에 결합하고/결합하거나 격리시킨다. 또 다른 실시형태에서, 합성 circRNA는 단백질에 결합하고/결합하거나 격리시킨다. 또 다른 실시형태에서, 합성 circRNA는 mRNA에 결합하고/결합하거나 격리시킨다. 또 다른 실시형태에서, 합성 circRNA는 리보솜에 결합하고/결합하거나 격리시킨다. 또 다른 실시형태에서, 합성 circRNA는 circRNA에 결합하고/결합하거나 격리시킨다. 또 다른 실시형태에서, 합성 circRNA는 긴-비코딩 RNA(lncRNA) 또는 임의의 다른 비-코딩 RNA, 예를 들어, miRNA, tRNA, rRNA, snoRNA, ncRNA, siRNA, 긴-비코딩 RNA, shRNA에 결합하고/결합하거나 격리시킨다. circRNA는 결합 및/또는 격리 부위 외에, 분해 요소를 포함할 수 있으며, 이는 결합된 및/또는 격리된 RNA 및/또는 단백질의 분해를 초래할 것이다.
일 실시형태에서, circRNA는 lncRNA 또는 lncRNA의 서열을 포함하며, 예를 들어, circRNA는 천연 발생, 비-원형 lncRNA의 서열 또는 그의 단편을 포함한다. 일 실시형태에서, lncRNA 또는 lncRNA의 서열은 스페이서 서열과 함께 또는 이것 없이 원형화되어, 합성 circRNA를 형성한다.
일 실시형태에서, circRNA는 리보자임 활성을 갖는다. 일 실시형태에서, 리보자임으로서 작용하고, 병원성 또는 내인성 RNA, DNA, 소분자 또는 단백질을 절단하도록 circRNA가 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, circRNA는 효소 활성을 갖는다. 일 실시형태에서, 합성 circRNA는 RNA(예를 들어, 바이러스 RNA)를 특이적으로 인식하고 절단할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, circRNA는 단백질을 특이적으로 인식하고 절단할 수 있다. 또 다른 실시형태에서 circRNA는 소분자를 특이적으로 인식하고 절단할 수 있다.
일 실시형태에서, circRNA는 희생(immolating) 또는 자가-절단 또는 절단 가능한 circRNA이다. 일 실시형태에서, circRNA를 사용하여 RNA, 예를 들어, miRNA, tRNA, rRNA, snoRNA, ncRNA, siRNA, 긴-비코딩 RNA, shRNA를 전달할 수 있다. 일 실시형태에서, 합성 circRNA는 (1) 자가-절단 가능한 요소(예를 들어, 해머헤드(hammerhead), 스플라이싱 요소), (2) 절단 동원 부위(예를 들어, ADAR), (3) 분해 가능한 링커(예를 들어, 글리세롤), (4) 화학적 링커 및/또는 (5) 스페이서 서열에 의해 분리된 마이크로RNA로 구성된다. 또 다른 실시형태에서, 합성 circRNA는 (1) 자가-절단 가능한 요소(예를 들어, 해머헤드, 스플라이싱 요소), (2) 절단 동원 부위(예를 들어, ADAR), (3) 절단 가능한 링커(예를 들어, 글리세롤), (4), 화학적 링커 및/또는 (5) 스페이서 서열에 의해 분리된 siRNA로 구성된다.
일 실시형태에서, circRNA는 전사적/복제 적격 circRNA이다. 이 circRNA는 임의의 유형의 RNA를 인코딩할 수 있다. 일 실시형태에서, 합성 circRNA는 안티-센스 miRNA 및 전사 요소를 갖는다. 일 실시형태에서, 선형 기능적 miRNA는 전사 후에, circRNA로부터 생성된다. 일 실시형태에서, circRNA는 번역 비적격 원형 폴리리보뉴클레오티드이다.
일 실시형태에서, circRNA는 번역 요소와 조합하여 상기 속성 중 하나 이상을 갖는다.
기타 서열
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 또 다른 핵산 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 DNA, RNA 또는 인공 핵산을 포함하는 기타 서열을 포함할 수 있다. 기타 서열은 게놈 DNA, cDNA, 또는 tRNA, mRNA, rRNA, miRNA, gRNA, siRNA 또는 다른 RNAi 분자를 인코딩하는 서열을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 일 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 원형 폴리리보뉴클레오티드와 동일한 유전자 발현 생성물의 상이한 유전자좌를 표적화하기 위한 siRNA를 포함한다. 일 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 원형 폴리리보뉴클레오티드와 상이한 유전자 발현 생성물을 표적화하기 위한 siRNA를 포함한다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 5'-UTR을 결여한다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 3'-UTR을 결여한다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 폴리-A 서열을 결여한다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 종결 요소를 결여한다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 내부 리보솜 진입 부위를 결여한다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 엑소뉴클레아제에 의한 분해 감수성을 결여한다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드가 분해 감수성을 결여한다는 사실은 원형 폴리리보뉴클레오티드가 엑소뉴클레아제에 의해 분해되지 않거나, 엑소뉴클레아제의 존재 하에서 엑소뉴클레아제의 부재 하에서와 유사하거나 비슷한, 제한된 정도로만 분해된다는 것을 의미할 수 있다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 엑소뉴클레아제에 의한 분해를 결여한다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 엑소뉴클레아제에 노출되는 경우 감소된 분해를 갖는다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 캡-결합 단백질로의 결합을 결여한다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 5' 캡을 결여한다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 5'-UTR을 결여하며, 그의 하나 이상의 발현 서열로부터 단백질이 발현되는 데 적격성이다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 3'-UTR을 결여하며, 그의 하나 이상의 발현 서열로부터 단백질이 발현되는 데 적격성이다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 폴리-A 서열을 결여하며, 그의 하나 이상의 발현 서열로부터 단백질이 발현되는 데 적격성이다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 종결 요소를 결여하며, 그의 하나 이상의 발현 서열로부터 단백질이 발현되는 데 적격성이다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 내부 리보솜 진입 부위를 결여하며, 그의 하나 이상의 발현 서열로부터 단백질이 발현되는 데 적격성이다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 캡을 결여하며, 그의 하나 이상의 발현 서열로부터 단백질이 발현되는 데 적격성이다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 5'-UTR, 3'-UTR 및 IRES를 결여하며, 그의 하나 이상의 발현 서열로부터 단백질이 발현되는 데 적격성이다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 하기의 서열 중 하나 이상을 포함한다: 하나 이상의 miRNA를 인코딩하는 서열, 하나 이상의 복제 단백질을 인코딩하는 서열, 외인성 유전자를 인코딩하는 서열, 치료제를 인코딩하는 서열, 조절 요소(예를 들어, 번역 조절제, 예를 들어, 번역 증강자 또는 억제자), 번역 개시 서열, 내인성 유전자를 표적화하는 하나 이상의 조절 핵산(siRNA, lncRNA, shRNA) 및 치료적 mRNA 또는 단백질을 인코딩하는 서열.
기타 서열은 약 2개 내지 약 10000개 뉴클레오티드, 약 2개 내지 약 5000개 뉴클레오티드, 약 10개 내지 약 100개 뉴클레오티드, 약 50개 내지 약 150개 뉴클레오티드, 약 100개 내지 약 200개 뉴클레오티드, 약 150개 내지 약 250개 뉴클레오티드, 약 200개 내지 약 300개 뉴클레오티드, 약 250개 내지 약 350개 뉴클레오티드, 약 300개 내지 약 500개 뉴클레오티드, 약 10개 내지 약 1000개 뉴클레오티드, 약 50개 내지 약 1000개 뉴클레오티드, 약 100개 내지 약 1000개 뉴클레오티드, 약 1000개 내지 약 2000개 뉴클레오티드, 약 2000개 내지 약 3000개 뉴클레오티드, 약 3000개 내지 약 4000개 뉴클레오티드, 약 4000개 내지 약 5000개 뉴클레오티드 또는 그 사이의 임의의 범위의 길이를 가질 수 있다.
그의 원형화의 결과로서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 그를 선형 RNA로부터 구분짓는 소정의 특징을 포함할 수 있다. 예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 선형 RNA에 비하여 엑소뉴클레아제에 의한 분해에 대한 감수성이 더 낮다. 이와 같이, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 특히 엑소뉴클레아제의 존재 하에 인큐베이션되는 경우에 선형 RNA보다 더 안정하다. 선형 RNA와 비교하여 원형 폴리리보뉴클레오티드의 안정성이 증가하여, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 폴리펩티드를 생성하기 위한 세포 형질전환 시약으로서 더욱 용이하게 되며, 선형 RNA보다 더욱 용이하고 더 오래 보관될 수 있다. 엑소뉴클레아제로 처리되는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 안정성은 (예를 들어, 겔 전기영동에 의해) RNA 분해가 발생했는지의 여부를 결정하는 해당 분야의 표준 방법을 사용하여 시험될 수 있다.
더욱이, 선형 RNA와 달리, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포스파타제, 예컨대 송아지 장내 포스파타제와 인큐베이션시키는 경우 탈인산화에 대한 감수성이 더 낮다.
뉴클레오티드 스페이서 서열
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 스페이서 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 적어도 하나의 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개 또는 그 초과의 스페이서 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 국제 특허 공개 제WO2019118919A1호의 [0295] 내지 [0302]에서의 설명에 따라 구성된 하나 이상의 스페이서 서열을 포함하며, 이는 본원에 그의 전문이 참조로 포함된다.
비-핵산 링커
본원에 기술된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 또한 비-핵산 링커를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본원에 기술된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 본원에 기술된 서열 또는 요소 중 하나 이상 사이에 비-핵산 링커를 갖는다. 일 실시형태에서, 본원에 기술된 하나 이상의 서열 또는 요소는 링커와 연결된다. 비-핵산 링커는 화학 결합, 예를 들어, 하나 이상의 공유 결합 또는 비-공유 결합일 수 있다. 일부 실시형태에서, 비-핵산 링커는 펩티드 또는 단백질 링커이다. 이러한 링커는 2개 내지 30개 아미노산 또는 그 초과일 수 있다. 링커는 유연성, 경성 또는 절단 가능한 링커, 예컨대 그의 전문이 본원에 참조로 포함되는 국제 특허 공개 제WO2019118919A1호의 [0304] 내지 [0307]에 기술된 것들을 포함한다.
안정성/반감기
일부 실시형태에서, 본원에 제공되는 원형 폴리리보뉴클레오티드 제제는 참조물질, 예를 들어 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖지만 원형화되지 않은 선형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 선형 대응물)에 비하여 증가된 반감기를 갖는다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 분해, 예를 들어, 엑소뉴클레아제에 대해 저항성이다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 자가-분해에 대해 저항성이다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 효소적 절단 부위, 예를 들어, 다이서(dicer) 절단 부위를 결여한다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 참조물질, 예를 들어, 선형 대응물보다 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 100%, 적어도 약 120%, 적어도 약 140%, 적어도 약 150%, 적어도 약 160%, 적어도 약 180%, 적어도 약 200%, 적어도 약 300%, 적어도 약 400%, 적어도 약 500%, 적어도 약 600%, 적어도 약 700% 적어도 약 800%, 적어도 약 900%,, 적어도 약 1000% 또는 적어도 약 10000% 더 긴 반감기를 갖는다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 세포 분열 동안 세포에서 지속된다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 유사분열 후에 딸 세포에서 지속된다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 세포 내에서 복제되며, 딸 세포로 이동된다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 자가-복제를 매개하는 복제 요소를 포함한다. 일부 실시형태에서, 복제 요소는 원형 폴리리보뉴클레오티드에 상보성(선형 상보성)인 선형 폴리리보뉴클레오티드로의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 전사를 매개한다. 일부 실시형태에서, 선형의 상보성 폴리리보뉴클레오티드는 세포 내에서 상보성 원형 폴리리보뉴클레오티드로 생체내에서 원형화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 상보성 폴리리보뉴클레오티드는 출발 원형 폴리리보뉴클레오티드와 동일한 또는 유사한 뉴클레오티드 서열을 갖는 또 다른 원형 폴리리보뉴클레오티드로 추가로 자가-복제될 수 있다. 하나의 예시적인 자가-복제 요소는 HDV 복제 도메인을 포함한다(문헌[Beeharry et al, Virol, 2014, 450-451:165-173]에 의해 기술된 바와 같음). 일부 실시형태에서, 세포는 적어도 하나의 원형 폴리리보뉴클레오티드를 적어도 25%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 효율로 딸 세포로 이동시킨다. 일부 실시형태에서, 감수분열을 겪는 세포는 원형 폴리리보뉴클레오티드를 적어도 25%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 효율로 딸 세포로 이동시킨다. 일부 실시형태에서, 유사분열을 겪는 세포는 원형 폴리리보뉴클레오티드를 적어도 25%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 효율로 딸 세포로 이동시킨다.
변형
원형 폴리리보뉴클레오티드는 참조 서열, 특히 모체 폴리리보뉴클레오티드에 대해 하나 이상의 치환, 삽입 및/또는 부가, 결실 및 공유적 변형을 포함할 수 있으며, 본 발명의 범주 내에 포함된다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 하나 이상의 전사-후 변형(예를 들어, 캡핑, 절단, 폴리아데닐화, 스플라이싱, 폴리-A 서열, 메틸화, 아실화, 인산화, 라이신 및 아르기닌 잔기의 메틸화, 아세틸화, 및 티올기 및 티로신 잔기의 니트로실화 등)을 포함한다. 하나 이상의 전사-후 변형은 임의의 전사-후 변형, 예컨대 RNA에서 확인된 바 있는 100가지 초과의 상이한 뉴클레오시드 변형 중 임의의 것일 수 있다(문헌[Rozenski, J, Crain, P, and McCloskey, J. (1999). The RNA Modification Database: 1999 update. Nucl Acids Res 27: 196-197]). 일부 실시형태에서, 제1 단리된 핵산은 메신저 RNA(mRNA)를 포함한다. 일부 실시형태에서, mRNA는 그의 전문이 본원에 참조로 포함되는 국제 특허 공개 제WO2019118919A1호의 [0311]에 기술된 것들과 같은 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 뉴클레오시드를 포함한다.
원형 폴리리보뉴클레오티드는 예컨대 당, 핵염기, 또는 (예를 들어, 연결 포스페이트로의 / 포스포디에스테르 링키지로의 / 포스포디에스테르 백본으로의) 뉴클레오시드간 링키지에 대한 임의의 유용한 변형을 포함할 수 있다. 피리미딘 핵염기의 하나 이상의 원자는 선택적으로 치환된 아미노, 선택적으로 치환된 티올, 선택적으로 치환된 알킬(예를 들어, 메틸 또는 에틸) 또는 할로(예를 들어, 클로로 또는 플루오로)로 대체되거나 치환될 수 있다. 특정 실시형태에서, 변형(예를 들어, 하나 이상의 변형)은 당 및 뉴클레오시드간 링키지의 각각에 존재한다. 변형은 리보핵산(RNA)으로부터 데옥시리보핵산(DNA), 트레오스 핵산(TNA), 글리콜 핵산(GNA), 펩티드 핵산(PNA), 잠금 핵산(LNA) 또는 그의 혼성물로의 변형일 수 있다). 추가의 변형은 본원에 기술된다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 번역 효율을 증가시키기 위해 적어도 하나의 N(6)메틸아데노신(m6A) 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, N(6)메틸아데노신(m6A) 변형은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 면역원성을 감소(예를 들어, 면역 또는 염증 반응의 하나 이상의 마커의 수준을 감소)시킬 수 있다.
일부 실시형태에서, 변형은 화학적 또는 세포 유도된 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 세포내 RNA 변형의 일부 비제한적인 예는 문헌[Lewis and Pan in "RNA modifications and structures cooperate to guide RNA-protein interactions" from Nat Reviews Mol Cell Biol, 2017, 18:202-210]에 기술되어 있다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 리보뉴클레오티드에 대한 화학적 변형은 면역 회피를 증강시킬 수 있다. 원형 폴리리보뉴클레오티드는 해당 분야에 널리 확립된 방법, 예컨대 본원에 참조로 포함된 문헌["Current protocols in nucleic acid chemistry," Beaucage, S.L. et al. (Eds.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, USA]에 기술된 것들에 의해 합성되고/합성되거나 변형될 수 있다. 변형은 예를 들어, 말단 변형, 예를 들어, 5' 말단 변형(인산화(단일-, 이중- 및 삼중-), 컨쥬게이션, 역위된 링키지 등), 3' 말단 변형(컨쥬게이션, DNA 뉴클레오티드, 역위된 링키지 등), 염기 변형(예를 들어, 안정화 염기, 불안정화 염기, 또는 파트너의 연장된 레퍼토리(expanded repertoire)와 염기 쌍을 형성하는 염기로의 대체), 염기의 제거(무염기 뉴클레오티드), 또는 컨쥬게이트된 염기를 포함한다. 변형된 리보뉴클레오티드 염기는 또한 5-메틸시티딘 및 슈도우리딘을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 염기 변형은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 몇 가지 기능적 효과를 말하자면, 발현, 면역 반응, 안정성, 하위세포 국소화를 조절할 수 있다. 일부 실시형태에서, 변형은 이원-직교 뉴클레오티드, 예를 들어, 비천연 염기를 포함한다. 예를 들어, 본원에 참조로 포함되는 문헌[Kimoto et al, Chem Commun (Camb), 2017, 53:12309, DOI: 10.1039/c7cc06661a]을 참조한다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 하나 이상의 리보뉴클레오티드가 그럴 수 있는 (예를 들어, 2' 위치 또는 4' 위치에서의) 당 변형 또는 당의 대체 및 백본 변형은 포스포디에스테르 링키지의 변형 또는 대체를 포함한다. 원형 폴리리보뉴클레오티드의 특정 예는, 변형된 백본을 포함하거나 천연 뉴클레오시드간 링키지, 예컨대 뉴클레오시드간 변형, 예컨대, 포스포디에스테르 링키지의 변형 또는 대체를 포함하지 않는 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 변형된 백본을 갖는 원형 폴리리보뉴클레오티드는 특히, 백본 내에 인 원자를 갖지 않는 것들을 포함한다. 본 출원의 목적을 위해, 때때로 해당 분야에 참조된 바와 같이, 그들의 뉴클레오시드간 백본 내에 인 원자를 갖지 않는 변형된 RNA는 또한 올리고뉴클레오시드인 것으로 간주될 수 있다. 특정 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 그의 뉴클레오시드간 백본 내에 인 원자를 갖는 리보뉴클레오티드를 포함할 것이다.
변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드 백본은 예를 들어, 포스포로티오에이트, 키랄 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬포스포트리에스테르, 메틸 및 기타 알킬 포스포네이트, 예컨대 3'-알킬렌 포스포네이트 및 키랄 포스포네이트, 포스피네이트, 포스포르아미데이트, 예컨대 3'-아미노 포스포르아미데이트 및 아미노알킬포스포르아미데이트, 티오노포스포르아미데이트, 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르 및 보통의 3'-5' 링키지를 갖는 보라노포스페이트, 이들의 2'-5' 연결된 유사체 및 역전된 극성을 갖는 것들을 포함할 수 있으며, 뉴클레오시드 단위의 인접 쌍은 3'-5'에서 5'-3'로 또는 2'-5'에서 5'-2'로 연결된다. 다양한 염, 혼합된 염 및 유리 산 형태도 포함된다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 음으로 하전되거나 양으로 하전될 수 있다.
원형 폴리리보뉴클레오티드 내로 혼입될 수 있는 변형된 뉴클레오티드는 뉴클레오시드간 링키지(예를 들어, 포스페이트 백본)에서 변형될 수 있다. 본원에서, 폴리뉴클레오티드 백본의 맥락에서, 어구 "포스페이트" 및 "포스포디에스테르"는 상호교환 가능하게 사용된다. 백본 포스페이트 기는 산소 원자 중 하나 이상을 상이한 치환기로 대체함으로써 변형될 수 있다. 추가로, 변형된 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드는 본원에 기술된 바와 같은 또 다른 뉴클레오시드간 링키지로의 비변형된 포스페이트 모이어티의 대량의 대체를 포함할 수 있다. 변형된 포스페이트 기의 예는 포스포로티오에이트, 포스포로셀레네이트, 보라노포스페이트, 보라노포스페이트 에스테르, 하이드로겐 포스포네이트, 포스포르아미데이트, 포스포로디아미데이트, 알킬 또는 아릴 포스포네이트 및 포스포트리에스테르를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 포스포로디티오에이트는 둘 모두 황에 의해 대체되는 비-연결 산소를 갖는다. 포스페이트 링커는 또한, 질소(가교된 포스포르아미데이트), 황(가교된 포스포로티오에이트) 및 탄소(가교된 메틸렌-포스포네이트)로의 연결 산소의 대체에 의해 변형될 수 있다.
비천연 포스포로티오에이트 백본 링키지를 통해 RNA 및 DNA 폴리머에 안정성을 부여하기 위해 a-티오 치환된 포스페이트 모이어티가 제공된다. 포스포로티오에이트 DNA 및 RNA는 증가된 뉴클레아제 저항성을 가지며, 결과적으로 세포 환경에서 더 긴 반감기를 갖는다. 원형 폴리리보뉴클레오티드에 연결된 포스포로티오에이트는 세포의 선천적 면역 분자의 더 약한 결합/활성화를 통하여 선천적 면역 반응을 감소시키는 것으로 예상된다.
특정 실시형태에서, 변형된 뉴클레오시드는 알파-티오-뉴클레오시드(예를 들어, 5'-0-(l-티오포스페이트)-아데노신, 5'-0-(l-티오포스페이트)-시티딘(a-티오-시티딘), 5'-0-(l-티오포스페이트)-구아노신, 5'-0-(l-티오포스페이트)-우리딘 또는 5'-0-(1-티오포스페이트)-슈도우리딘)를 포함한다.
인 원자를 함유하지 않는 뉴클레오시드간 링키지를 포함하는, 본 발명에 따라 사용될 수 있는 다른 뉴클레오시드간 링키지가 본원에 기술된다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 하나 이상의 세포독성 뉴클레오시드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 세포독성 뉴클레오시드가 원형 폴리리보뉴클레오티드 내로 혼입될 수 있다(예컨대, 이작용성 변형). 세포독성 뉴클레오시드는 아데노신 아라비노시드, 5-아자시티딘, 4'-티오-아라시티딘, 사이클로펜테닐시토신, 클라드리빈(cladribine), 클로파라빈(clofarabine), 시타라빈(cytarabine), 시토신 아라비노시드, l-(2-C-시아노-2-데옥시-베타-D-아라비노-펜토푸라노실)-시토신, 데시타빈(decitabine), 5-플루오로우라실, 플루다라빈(fludarabine), 플록스우리딘(floxuridine), 젬시타빈(gemcitabine), 테가푸르(tegafur)와 우라실의 조합, 테가푸르((RS)-5-플루오로-l-(테트라하이드로푸란-2-일)피리미딘-2,4(lH,3H)-디온), 트록사시타빈(troxacitabine), 테자시타빈(tezacitabine), 2'-데옥시-2'-메틸리덴시티딘(DMDC) 및 6-머캅토퓨린을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 추가의 예는 플루다라빈 포스페이트, N4-베헤노일-l-베타-D-아라비노푸라노실시토신, N4-옥타데실-1-베타-D-아라비노푸라노실시토신, N4-팔미토일-l-(2-C-시아노-2-데옥시-베타-D-아라비노-펜토푸라노실) 시토신 및 P-4055(시타라빈 5'-엘라이드산 에스테르)를 포함한다.
원형 폴리리보뉴클레오티드는 분자의 전체 길이를 따라 균일하게 변형될 수 있거나, 그렇지 않을 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 또는 모든 유형의 뉴클레오티드(예를 들어, 천연-발생 뉴클레오티드, 퓨린 또는 피리미딘 또는 A, G, U, C, I, pU 중 임의의 하나 이상 또는 전부)가 원형 폴리리보뉴클레오티드 내에서 또는 그의 주어진 소정의 서열 영역 내에서 균일하게 변형되거나 변형되지 않을 수 있다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 슈도우리딘을 포함한다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 이노신을 포함하며, 이는 면역계를 보조하여, 원형 폴리리보뉴클레오티드를 바이러스 RNA에 비해 내인성으로서 특성화할 수 있다. 이노신의 혼입은 또한 개선된 RNA 안정성/감소된 분해를 매개할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Yu, Z. et al. (2015) RNA editing by ADAR1 marks dsRNA as "self". Cell Res. 25, 1283-1284]을 참조하며, 이는 그 전문이 참조로 포함된다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 내의(또는 그의 주어진 서열 영역 내의) 모든 뉴클레오티드가 변형된다. 일부 실시형태에서, 변형은 발현을 증강시킬 수 있는 m6A; 면역 반응을 약화시킬 수 있는 이노신; RNA 안정성 또는 번역 초과(translational readthrough)를 증가시킬 수 있는 슈도우리딘(스태거 요소), 안정성을 증가시킬 수 있는 m5C; 및 하위세포 전좌(예를 들어, 핵 국소화)를 보조하는 2,2,7-트리메틸구아노신을 포함할 수 있다.
상이한 당 변형, 뉴클레오티드 변형 및/또는 뉴클레오시드간 링키지(예를 들어, 백본 구조)는 원형 폴리리보뉴클레오티드 내의 다양한 위치에 존재할 수 있다. 해당 분야의 숙련자는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 기능이 실질적으로 감소되지 않도록 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 변형(들)이 원형 폴리리보뉴클레오티드의 임의의 위치(들)에 위치할 수 있음을 인식할 것이다. 변형은 또한 비-코딩 영역 변형일 수 있다. 원형 폴리리보뉴클레오티드는 (전체 뉴클레오티드 함량과 관련하여, 또는 뉴클레오티드의 하나 이상의 유형, 즉, A, G, U 또는 C 중 임의의 하나 이상과 관련하여) 약 1% 내지 약 100% 변형된 뉴클레오티드 또는 임의의 개재 백분율(예를 들어, 1% 내지 20%>, 1% 내지 25%, 1% 내지 50%, 1% 내지 60%, 1% 내지 70%, 1% 내지 80%, 1% 내지 90%, 1% 내지 95%, 10% 내지 20%, 10% 내지 25%, 10% 내지 50%, 10% 내지 60%, 10% 내지 70%, 10% 내지 80%, 10% 내지 90%, 10% 내지 95%, 10% 내지 100%, 20% 내지 25%, 20% 내지 50%, 20% 내지 60%, 20% 내지 70%, 20% 내지 80%, 20% 내지 90%, 20% 내지 95%, 20% 내지 100%, 50% 내지 60%, 50% 내지 70%, 50% 내지 80%, 50% 내지 90%, 50% 내지 95%, 50% 내지 100%, 70% 내지 80%, 70% 내지 90%, 70% 내지 95%, 70% 내지 100%, 80% 내지 90%, 80% 내지 95%, 80% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100% 및 95% 내지 100%)을 포함할 수 있다.
구조
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 고차 구조, 예를 들어, 이차 또는 삼차 구조를 포함한다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 상보성 세그먼트는 스스로 이중 가닥 세그먼트로 폴딩되며, 쌍, 예를 들어, A-U와 C-G 사이에 수소 결합으로 결합된다. 일부 실시형태에서, 스템으로도 알려져 있는 나선은 분자 내에서 형성되어, 말단 루프에 연결된 이중-가닥 세그먼트를 갖는다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 준-이중-가닥 이차 구조를 갖는 적어도 하나의 세그먼트를 갖는다. 일부 실시형태에서, 준-이중-가닥 이차 구조를 갖는 세그먼트는 적어도 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 55개, 60개, 65개, 70개, 75개, 80개, 85개, 90개, 95개, 100개 또는 그 초과의 쌍을 형성한 뉴클레오티드를 갖는다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 준-이중-가닥 이차 구조를 갖는 하나 이상(예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 또는 그 초과)의 세그먼트를 갖는다. 일부 실시형태에서, 세그먼트는 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 55개, 60개, 65개, 70개, 75개, 80개, 85개, 90개, 95개, 100개 또는 그 초과의 뉴클레오티드에 의해 분리된다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 하나 이상의 서열은 실질적으로 단일 가닥 대 이중 가닥 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단일 가닥 대 이중 가닥의 비는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 기능에 영향을 미칠 수 있다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 하나 이상의 서열은 실질적으로 단일 가닥이다. 일부 실시형태에서, 실질적으로 단일 가닥인 원형 폴리리보뉴클레오티드의 하나 이상의 서열은 단백질- 또는 RNA-결합 부위를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 실질적으로 단일 가닥인 원형 폴리리보뉴클레오티드 서열은 입체형태적으로 유연성이어서, 증가된 상호작용을 가능하게 할 수 있다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 서열을 이러한 이차 구조를 포함하도록 의도적으로 조작하여, 단백질 또는 핵산에 결합시키거나, 단백질 또는 핵산 결합을 증가시킨다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 서열은 실질적으로 이중 가닥이다. 일부 실시형태에서, 실질적으로 이중 가닥인 원형 폴리리보뉴클레오티드의 하나 이상의 서열은 입체형태적 인식 부위, 예를 들어, 리보스위치 또는 압타자임을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 실질적으로 이중 가닥인 원형 폴리리보뉴클레오티드 서열은 입체형태적으로 경성일 수 있다. 일부 이러한 경우에, 입체형태적으로 경성인 서열은 단백질 또는 핵산의 결합으로부터 원형 폴리리보뉴클레오티드를 입체적으로 가릴 수 있다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 서열을 이러한 이차 구조를 포함하도록 의도적으로 조작하여, 단백질 또는 핵산 결합을 모면하거나 감소시킨다.
16가지의 가능한 염기-쌍 형성이 존재하지만, 이들 중 6가지(AU, GU, GC, UA, UG, CG)는 실제 염기-쌍을 형성할 수 있다. 나머지는 불일치로 지칭되며, 나선에서 매우 낮은 빈도로 발생한다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 구조는 그의 기능에 대한 영향 및 치명적인 결과 없이 용이하게 파괴될 수 없으며, 이는 이차 구조를 유지하기 위한 선택을 제공한다. 일부 실시형태에서, 스템(즉, 그들의 뉴클레오티드 서열)의 일차 구조는 여전히 다를 수 있지만, 여전히 나선 영역을 유지한다. 염기의 성질은 고차 구조에 부차적이며, 그들이 이차 구조를 보존하는 한, 치환이 가능하다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 준-나선 구조를 갖는다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 준-나선 구조를 갖는 적어도 하나의 세그먼트를 갖는다. 일부 실시형태에서, 준-나선 구조를 갖는 세그먼트는 적어도 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 55개, 60개, 65개, 70개, 75개, 80개, 85개, 90개, 95개, 100개 또는 그 초과의 뉴클레오티드를 갖는다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 준-나선 구조를 갖는 하나 이상(예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 또는 그 초과)의 세그먼트를 갖는다. 일부 실시형태에서, 세그먼트는 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 55개, 60개, 65개, 70개, 75개, 80개, 85개, 90개, 95개, 100개 또는 그 초과의 뉴클레오티드에 의해 분리된다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 U-풍부 또는 A-풍부 서열 중 적어도 하나 또는 그의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, U-풍부 및/또는 A-풍부 서열은 삼중 준-나선 구조를 생성할 방식으로 배열된다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 이중 준-나선 구조를 갖는다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 이중 준-나선 구조를 갖는 하나 이상(예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 또는 그 초과)의 세그먼트를 갖는다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 C-풍부 및/또는 G-풍부 서열 중 적어도 하나를 포함한다. 일부 실시형태에서, C-풍부 및/또는 G-풍부 서열은 삼중 준-나선 구조를 생성할 방식으로 배열된다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 안정화를 보조하는 분자내 삼중 준-나선 구조를 갖는다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 적어도 하나의 결합 부위, 예를 들어, 적어도 하나의 단백질 결합 부위, 적어도 하나의 miRNA 결합 부위, 적어도 하나의 lncRNA 결합 부위, 적어도 하나의 tRNA 결합 부위, 적어도 하나의 rRNA 결합 부위, 적어도 하나의 snRNA 결합 부위, 적어도 하나의 siRNA 결합 부위, 적어도 하나의 piRNA 결합 부위, 적어도 하나의 snoRNA 결합 부위, 적어도 하나의 snRNA 결합 부위, 적어도 하나의 exRNA 결합 부위, 적어도 하나의 scaRNA 결합 부위, 적어도 하나의 Y RNA 결합 부위, 적어도 하나의 hnRNA 결합 부위 및/또는 적어도 하나의 tRNA 모티프를 갖는다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 고차 구조, 예컨대 본원에 그의 전문이 참조로 포함되는 국제 특허 공개 제WO2019118919A1호에 기술된 것들을 포함하도록 구성된다.
전달
본원에 기술된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 또한 담체와 함께 또는 담체 없이 약제학적 조성물에 포함될 수 있다.
예를 들어, 담체, 예컨대 약제학적 담체 및/또는 폴리머 담체, 예를 들어, 리포좀을 포함하는, 본원에 기술된 약제학적 조성물은 제형화되며, 알려져 있는 방법에 의해 그를 필요로 하는 대상체(예를 들어, 인간 또는 비-인간 농업 동물 또는 가축, 예를 들어, 소, 개, 고양이, 말, 가금류)에 전달될 수 있다. 이러한 방법은 트랜스펙션(예를 들어, 지질-매개, 양이온성 폴리머, 인산칼슘, 덴드리머); 천기천공법 또는 다른 멤브레인 파괴 방법(예를 들어, 뉴클레오펙션(nucleofection)), 바이러스 전달(예를 들어, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스, AAV), 미세주입, 미세투사물 충격("유전자 총"), 퓨진(fugene), 직접 초음파 로딩, 세포 스퀴징, 광학적 트랜스펙션, 원형질체 융합, 임페일펙션(impalefection), 마그네토펙션(magnetofection), 엑소좀-매개 전달, 지질 나노입자-매개 전달 및 그의 임의의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 전달 방법은 또한, 예를 들어, 문헌[Gori et al., Delivery and Specificity of CRISPR/Cas9 Genome Editing Technologies for Human Gene Therapy. Human Gene Therapy. July 2015, 26(7): 443-451. doi:10.1089/hum.2015.074]; 및 문헌[Zuris et al. Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient protein-based genome editing in vitro and in vivo. Nat Biotechnol. 2014 Oct 30;33(1):73-80]에 기술되어 있다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 네이키드 전달 제형에서 전달될 수 있다. 네이키드 전달 제형은 담체의 보조 없이, 그리고 원형 폴리리보뉴클레오티드의 공유적 변형 또는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 부분적인 또는 완전한 캡슐화 없이, 원형 폴리리보뉴클레오티드를 세포로 전달한다.
네이키드 전달 제형은 담체가 없는 제형이며, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 세포로의 전달을 돕는 모이어티에 결합하는 공유적 변형 없이 존재하며, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 부분적으로 또는 완전히 캡슐화되지 않는다. 일부 실시형태에서, 세포로의 전달을 돕는 모이어티에 결합하는 공유적 변형이 없는 원형 폴리리보뉴클레오티드는 세포로의 전달을 돕는 모이어티, 예컨대 단백질, 소분자, 입자, 폴리머 또는 생체고분자에 공유적으로 결합되지 않는 폴리리보뉴클레오티드일 수 있다. 세포로의 전달을 돕는 모이어티에 결합하는 공유적 변형이 없는 폴리리보뉴클레오티드는 변형된 인산기를 함유하지 않을 수 있다. 예를 들어, 세포로의 전달을 돕는 모이어티에 결합하는 공유적 변형이 없는 폴리리보뉴클레오티드는 포스포로티오에이트, 포스포로셀레네이트, 보라노포스페이트, 보라노포스페이트 에스테르, 하이드로겐 포스포네이트, 포스포르아미데이트, 포스포로디아미데이트, 알킬 또는 아릴 포스포네이트 또는 포스포트리에스테르를 함유하지 않을 수 있다.
일부 실시형태에서, 네이키드 전달 제형에는 하기 중 임의의 것 또는 그의 전부가 없을 수 있다: 트랜스펙션 시약, 양이온성 담체, 탄수화물 담체, 나노입자 담체 또는 단백질 담체. 예를 들어, 네이키드 전달 제형에는 피토글리코겐 옥테닐 숙시네이트, 피토글리코겐 베타-덱스트린, 무수물-변형된 피토글리코겐 베타-덱스트린, 리포펙타민, 폴리에틸렌이민, 폴리(트리메틸렌이민), 폴리(테트라메틸렌이민), 폴리프로필렌이민, 아미노글리코시드-폴리아민, 디데옥시-디아미노-b-사이클로덱스트린, 스페르민, 스페르미딘, 폴리(2-디메틸아미노)에틸 메타크릴레이트, 폴리(라이신), 폴리(히스티딘), 폴리(아르기닌), 양이온화된 젤라틴, 덴드리머, 키토산, l,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP), N-[1-(2,3-디올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTMA), l-[2-(올레오일옥시)에틸]-2-올레일-3-(2-하이드록시에틸)이미다졸리늄 클로라이드(DOTIM), 2,3-디올레일옥시-N-[2(스페르민카복사미도)에틸]-N,N-디메틸-l-프로판아미늄 트리플루오로아세테이트(DOSPA), 3B-[N―(N＼N'-디메틸아미노에탄)-카바모일]콜레스테롤 하이드로클로라이드(DC-콜레스테롤 HCl), 디헵타데실아미도글리실 스페르미딘(DOGS), N,N-디스테아릴-N,N-디메틸암모늄 브로마이드(DDAB), N-(l,2-디미리스틸옥시프로프-3-일)-N,N-디메틸-N-하이드록시에틸 암모늄 브로마이드(DMRIE), N,N-디올레일-N,N-디메틸암모늄 클로라이드(DODAC), 인간 혈청 알부민(HSA), 저밀도 지질단백질(LDL), 고밀도 지질단백질(HDL) 또는 글로불린이 없을 수 있다.
네이키드 전달 제형은 비-담체 부형제를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 비-담체 부형제는 활성 세포-투과 효과를 나타내지 않는 비활성 성분을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 비-담체 부형제는 완충제, 예를 들어, PBS를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 비-담체 부형제는 용매, 비-수성 용매, 희석제, 현탁 조제, 계면 활성제, 등장화제, 농후제, 유화제, 보존제, 폴리머, 펩티드, 단백질, 세포, 히알루로니다제, 분산제, 과립화제, 붕해제, 결합제, 완충제, 윤활제 또는 오일일 수 있다.
일부 실시형태에서, 네이키드 전달 제형은 희석제, 예컨대 비경구 투여가 가능한 희석제를 포함할 수 있다. 희석제(예를 들어, 비경구 투여가 가능한 희석제)는 액체 희석제 또는 고체 희석제일 수 있다. 일부 실시형태에서, 희석제(예를 들어, 비경구 투여가 가능한 희석제)는 RNA 가용화제, 완충제 또는 등장화제일 수 있다. RNA 가용화제의 예에는 물, 에탄올, 메탄올, 아세톤, 포름아미드 및 2-프로판올을 포함한다. 완충제의 예에는 2-(N-모르폴리노)에탄술폰산(MES), 비스(Bis)-트리스(Tris), 2-[(2-아미노-2-옥소에틸)-(카복시메틸)아미노]아세트산(ADA), N-(2-아세트아미도)-2-아미노에탄술폰산(ACES), 피페라진-N,N'-비스(2-에탄술폰산)(PIPES), 2-[[1,3-디하이드록시-2-(하이드록시메틸)프로판-2-일]아미노]에탄술폰산(TES), 3-(N-모르폴리노)프로판술폰산(MOPS), 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산(HEPES), 트리스(Tris), 트리신(Tricine), Gly-Gly, 비신(Bicine) 또는 포스페이트가 포함된다. 등장화제의 예에는 글리세린, 만니톨, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 트레할로스 또는 수크로스가 포함된다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 바와 같은 약제학적 제제, 본원에 개시된 바와 같은 약제학적 조성물, 개시된 바와 같은 약제학적 약물 물질 또는 본원에 개시된 바와 같은 약제학적 약물 제품은 비경구 핵산 전달 시스템에 존재한다. 비경구 핵산 전달 시스템은 본원에 개시된 바와 같은 약제학적 제제, 본원에 개시된 바와 같은 약제학적 조성물, 개시된 바와 같은 약제학적 약물 물질 또는 본원에 개시된 바와 같은 약제학적 약물 제품 및 비경구 투여가 가능한 희석제를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 비경구 핵산 전달 시스템 내의 본원에 개시된 바와 같은 약제학적 제제, 본원에 개시된 바와 같은 약제학적 조성물, 개시된 바와 같은 약제학적 약물 물질 또는 본원에 개시된 바와 같은 약제학적 약물 제품은 어떠한 담체도 없다.
본 발명은 추가로 본원에 기술된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 숙주 또는 숙주 세포에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 숙주 또는 숙주 세포는 척추동물, 포유동물(예를 들어, 인간) 또는 다른 유기체 또는 세포이다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 참조 화합물, 예를 들어, 기술된 원형 폴리리보뉴클레오티드에 상응하는 선형 폴리뉴클레오티드, 또는 엔크립토겐을 결여한 원형 폴리리보뉴클레오티드에 의해 촉발되는 반응에 비하여, 숙주의 면역계에 의한 원치 않는 반응이 감소되거나, 반응을 생성하지 못한다. 실시형태들에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 숙주에서 비-면역원성이다. 일부 면역 반응은 체액성 면역 반응(예를 들어, 항원-특이적 항체의 생성) 및 세포-매개된 면역 반응(예를 들어, 림프구 증식)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 숙주 또는 숙주 세포는 원형 폴리리보뉴클레오티드와 접촉된다(예를 들어, 그로 전달되거나, 그에 투여된다). 일부 실시형태에서, 숙주는 포유동물, 예컨대 인간이다. 숙주 내의 원형 폴리리보뉴클레오티드, 발현 생성물 또는 둘 모두의 양은 투여 이후 임의의 시간에 측정될 수 있다. 특정 실시형태에서, 배양 중 숙주 성장의 시간 추이를 결정한다. 성장이 원형 폴리리보뉴클레오티드의 존재 하에 증가하거나 감소하면, 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 발현 생성물 또는 둘 모두는 숙주의 성장을 증가시키거나 감소시키는 데 효율적인 것으로 확인된다.
전달 방법
세포, 조직 또는 대상체로의 본원에 기술된 바와 같은 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 전달 방법은 본원에 기술된 바와 같은 약제학적 조성물, 약제학적 약물 물질 또는 약제학적 약물 제품을 세포, 조직 또는 대상체에 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 전달 방법은 생체내 방법이다. 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 전달 방법은 본원에 기술된 바와 같은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 전달을 필요로 하는 대상체에 본원에 기술된 바와 같은 약제학적 조성물, 약제학적 약물 물질 또는 약제학적 약물 제품을 본원에 기술된 바와 같은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 전달을 필요로 하는 대상체에 비경구적으로 투여하는 단계를 포함한다. 또 다른 예로서, 대상체의 세포 또는 조직으로의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 전달 방법은 본원에 기술된 바와 같은 약제학적 조성물, 약제학적 약물 물질 또는 약제학적 약물 제품을 세포 또는 조직에 비경구적으로 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 대상체에서 생물학적 반응을 야기하기에 유효한 양으로 존재한다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 대상체 내의 세포 또는 조직에 생물학적 효과를 갖기에 유효한 양이다. 일부 실시형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 약제학적 조성물, 약제학적 약물 물질 또는 약제학적 약물 제품은 담체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 약제학적 조성물, 약제학적 약물 물질 또는 약제학적 약물 제품은 희석제를 포함하며, 이는 어떠한 담체도 없다. 일부 실시형태에서, 비경구 투여는 정맥내로, 근육내로, 안과적으로 또는 국소로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 약제학적 조성물, 약제학적 약물 물질 또는 약제학적 약물 제품은 경구적으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물, 약제학적 약물 물질 또는 약제학적 약물 제품은 비강으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물, 약제학적 약물 물질 또는 약제학적 약물 제품은 흡입에 의해 투여된다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물, 약제학적 약물 물질 또는 약제학적 약물 제품은 국소로 투여된다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물, 약제학적 약물 물질 또는 약제학적 약물 제품은 안과적으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물, 약제학적 약물 물질 또는 약제학적 약물 제품은 직장내로 투여된다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물, 약제학적 약물 물질 또는 약제학적 약물 제품은 주사에 의해 투여된다. 투여는 전신 투여 또는 국소 투여일 수 있다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물, 약제학적 약물 물질 또는 약제학적 약물 제품은 비경구적으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물, 약제학적 약물 물질 또는 약제학적 약물 제품은 정맥내, 동맥내, 복강내, 피내, 두개내, 척추강내, 림프내, 피하 또는 근육내로 투여된다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물, 약제학적 약물 물질 또는 약제학적 약물 제품은 안구내 투여, 와우내(내이) 투여 또는 기관내 투여를 통해 투여된다. 일부 실시형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 전달 방법 중 임의의 것은 담체를 사용하여 수행된다. 일부 실시형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 임의의 전달 방법은 담체 또는 세포 투과제의 도움 없이 수행된다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 원형 폴리리보뉴클레오티드로부터 번역되는 생성물은 투여 단계 후 적어도 1일째, 적어도 2일째, 적어도 3일째, 적어도 4일째 또는 적어도 5일째에, 세포, 조직 또는 대상체에서 검출된다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 원형 폴리리보뉴클레오티드로부터 번역되는 생성물의 존재가 투여 단계 전에 세포, 조직 또는 대상체에서 평가된다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 원형 폴리리보뉴클레오티드로부터 번역되는 생성물의 존재는 투여 단계 후에 세포, 조직 또는 대상체에서 평가된다.
세포 및 소낭-기반의 담체
본원에 기술된 원형 RNA 조성물 또는 제제는 소낭 또는 다른 막-기반의 담체에서 세포에 투여될 수 있다.
실시형태들에서, 본원에 기술된 원형 RNA 조성물 또는 제제는 세포, 소낭 또는 다른 막-기반의 담체에서 또는 이를 통해 투여된다. 일 실시형태에서, 원형 RNA 조성물 또는 제제는 리포좀 또는 다른 유사한 소낭에서 제형화될 수 있다. 리포좀은 내부 수성 구획을 둘러싸는 단일 또는 다중 라멜라 지질 이중층 및 상대적으로 불투과성인 외측 친지성 인지질 이중층으로 구성된 구형 소낭 구조이다. 리포좀은 음이온성, 중성 또는 양이온성일 수 있다. 리포좀은 그들이 생체적합성이며, 비독성이고, 친수성 및 친지성 약물 분자를 둘 모두를 전달하고, 혈장 효소에 의한 분해로부터 그들의 카고를 보호하고, 생물학적 막 및 혈액 뇌 장벽(BBB)을 가로질러 그들의 로드를 수송할 수 있다(예를 들어, 검토를 위하여, 문헌[Spuch and Navarro, Journal of Drug Delivery, vol. 2011, Article ID 469679, 12 pages, 2011. doi:10.1155/2011/469679] 참조).
소낭은 몇몇의 상이한 유형의 지질로부터 제조될 수 있지만; 약물 담체로서 리포좀을 생성하는 데 인지질이 가장 흔히 사용된다. 다중 라멜라 소낭 지질의 제조 방법은 해당 분야에 알려져 있다(예를 들어, 미국 특허 제6,693,086호를 참조하며, 다중 라멜라 소낭 지질 제제에 관한 이의 교시는 본원에 참조로 포함됨). 지질 필름이 수용액과 혼합될 때 소낭 형성은 자발적일 수 있지만, 그것은 또한 균질화기, 초음파처리기 또는 압출 장치를 사용하는 것에 의해 진탕 형태로 힘을 인가함으로써 더 신속히 처리될 수 있다(예를 들어, 검토를 위해 문헌[Spuch and Navarro, Journal of Drug Delivery, vol. 2011, Article ID 469679, 12 pages, 2011. doi:10.1155/2011/469679] 참조). 압출된 지질은 문헌[Templeton et al., Nature Biotech, 15:647-652, 1997]에 기술된 바와 같이 감소하는 크기의 필터를 통해 압출시킴으로써 제조될 수 있으며, 압출된 지질 제제에 관한 상기 문헌의 교시는 본원에 참조로 포함된다.
지질 나노입자는 본원에 기술되는 원형 RNA 조성물 또는 제제를 위한 생체적합성 및 생분해성 전달 시스템을 제공하는 담체의 또 다른 예이다. 나노구조화된 지질 담체(NLC)는 SLN의 특징을 보유하고, 약물 안정성 및 부하능을 개선하고, 약물 누출을 방지하는 변형된 고체 지질 나노입자(SLN)이다. 폴리머 나노입자(PNP)는 약물 전달의 중요한 성분이다. 이들 나노입자는 특정 표적에 대한 약물 전달을 효과적으로 유도하며 약물 안정성 및 제어된 약물 방출을 개선할 수 있다. 리포좀 및 폴리머를 조합한 새로운 유형의 담체인 지질-폴리머 나노입자(PLN)가 또한 사용될 수 있다. 이들 나노입자는 PNP 및 리포좀의 상보적 이점을 보유한다. PLN은 코어-셸 구조로 구성되며; 폴리머 코어는 안정한 구조를 제공하며, 인지질 셸은 우수한 생체적합성을 제공한다. 이와 같이, 2개의 성분은 약물 캡슐화 효율을 증가시키고, 표면 변형을 촉진하고, 수용성 약물의 누출을 방지한다. 검토를 위해, 예를 들어, 문헌[Li et al. 2017, Nanomaterials 7, 122; doi:10.3390/nano7060122]을 참조한다.
담체의 추가의 비제한적인 예에는 탄수화물 담체(예를 들어, 무수물-변형된 피토글리코겐 또는 글리코겐-유형 물질), 단백질 담체(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드에 공유적으로 연결된 단백질) 또는 양이온성 담체(예를 들어, 양이온성 리포폴리머 또는 트랜스펙션 시약)가 포함된다. 탄수화물 담체의 비제한적인 예에는 피토글리코겐 옥테닐 숙시네이트, 피토글리코겐 베타-덱스트린 및 무수물-변형된 피토글리코겐 베타-덱스트린이 포함된다. 양이온성 담체의 비제한적인 예에는 리포펙타민(lipofectamine), 폴리에틸렌이민, 폴리(트리메틸렌이민), 폴리(테트라메틸렌이민), 폴리프로필렌이민, 아미노글리코시드-폴리아민, 디데옥시-디아미노-b-사이클로덱스트린, 스페르민, 스페르미딘, 폴리(2-디메틸아미노)에틸 메타크릴레이트, 폴리(라이신), 폴리(히스티딘), 폴리(아르기닌), 양이온화된 젤라틴, 덴드리머, 키토산, l,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP), N-[1-(2,3-디올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTMA), l-[2-(올레오일옥시)에틸]-2-올레일-3-(2-하이드록시에틸)이미다졸리늄 클로라이드(DOTIM), 2,3-디올레일옥시-N-[2(스페르민카복사미도)에틸]-N,N-디메틸-l-프로판아미늄 트리플루오로아세테이트(DOSPA), 3B-[N―(N＼N'-디메틸아미노에탄)-카바모일]콜레스테롤 하이드로클로라이드(DC-콜레스테롤 HC1), 디헵타데실아미도글리실 스페르미딘(DOGS), N,N-디스테아릴-N,N-디메틸암모늄 브로마이드(DDAB), N-(l,2-디미리스틸옥시프로프-3-일)-N,N-디메틸-N-하이드록시에틸 암모늄 브로마이드(DMRIE) 및 N,N-디올레일-N,N-디메틸암모늄 클로라이드(DODAC)가 포함된다. 단백질 담체의 비제한적인 예에는 인간 혈청 알부민(HSA), 저밀도 지질단백질(LDL), 고밀도 지질단백질(HDL) 또는 글로불린이 포함된다.
엑소좀은 또한 본원에 기술되는 원형 RNA 조성물 또는 제제를 위한 약물 전달 비히클로서 사용될 수 있다. 검토를 위해, 문헌[Ha et al. July 2016. Acta Pharmaceutica Sinica B. Volume 6, Issue 4, Pages 287-296]; https://doi.org/10.1016/j.apsb.2016.02.001을 참조한다.
생체외 분화된 적혈구는 또한 본원에 기술된 원형 RNA 조성물 또는 제제에 대한 담체로서 사용될 수 있다. 예를 들어, WO2015073587호; WO2017123646호; WO2017123644호; WO2018102740호; WO2016183482호; WO2015153102호; WO2018151829호; WO2018009838호; 문헌[Shi et al. 2014. Proc Natl Acad Sci USA. 111(28): 10131-10136]; 미국 특허 제9,644,180호; 문헌[Huang et al. 2017. Nature Communications 8: 423]; 문헌[Shi et al. 2014. Proc Natl Acad Sci USA. 111(28): 10131-10136]을 참조한다.
예를 들어, WO2018208728호에 기술된 바와 같은 푸소좀 조성물은 또한, 본원에 기술된 원형 RNA 조성물 또는 제제를 전달하기 위한 담체로서 사용될 수 있다.
비로좀 및 바이러스-유사 입자(VLP)는 또한, 본원에 기술된 원형 RNA 조성물 또는 제제를 표적화된 세포에 전달하기 위한 담체로서 사용될 수 있다.
예를 들어, WO2011097480호, WO2013070324호, WO2017004526호 또는 WO2020041784호에 기술된 바와 같은 식물 나노베지클(nanovesicle) 및 식물 메신저 팩(PMP)은 또한 본원에 기술된 원형 RNA 조성물 또는 제제를 전달하기 위한 담체로서 사용될 수 있다.
발현 방법
본 발명은 본원에 제공된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 적어도 하나의 영역을 번역하는 단계를 포함하는 단백질 발현 방법을 포함한다.
일부 실시형태에서, 단백질 발현 방법은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 총 길이의 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%의, 폴리펩티드로의 번역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단백질 발현 방법은 적어도 5개 아미노산, 적어도 10개 아미노산, 적어도 15개 아미노산, 적어도 20개 아미노산, 적어도 50개 아미노산, 적어도 100개 아미노산, 적어도 150개 아미노산, 적어도 200개 아미노산, 적어도 250개 아미노산, 적어도 300개 아미노산, 적어도 400개 아미노산, 적어도 500개 아미노산, 적어도 600개 아미노산, 적어도 700개 아미노산, 적어도 800개 아미노산, 적어도 900개 아미노산 또는 적어도 1000개 아미노산의 폴리펩티드로의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 번역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단백질 발현 방법은 약 5개 아미노산, 약 10개 아미노산, 약 15개 아미노산, 약 20개 아미노산, 약 50개 아미노산, 약 100개 아미노산, 약 150개 아미노산, 약 200개 아미노산, 약 250개 아미노산, 약 300개 아미노산, 약 400개 아미노산, 약 500개 아미노산, 약 600개 아미노산, 약 700개 아미노산, 약 800개 아미노산, 약 900개 아미노산 또는 약 1000개 아미노산의 폴리펩티드로의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 번역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 방법은 본원에 제공된 바와 같은 연속 폴리펩티드, 본원에 제공된 바와 같은 불연속 폴리펩티드 또는 둘 모두로의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 번역을 포함한다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 적어도 하나의 영역의 번역은 시험관내, 예컨대 토끼 망상적혈구 용해물에서 일어난다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 적어도 하나의 영역의 번역은 생체내에서, 예를 들어, 진핵 세포의 트랜스펙션 또는 원핵 세포, 예컨대 박테리아의 형질전환 후에 일어난다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 원형 폴리리보뉴클레오티드를 대상체의 세포에 투여하는 단계로서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 하나 이상의 발현 서열을 포함하는 단계; 및 세포 내에서 원형 폴리리보뉴클레오티드로부터 하나 이상의 발현 서열을 발현하는 단계를 포함하는, 대상체 내의 하나 이상의 발현 서열의 생체내 발현 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 나중의 시점에서의 세포 내의 하나 이상의 발현 서열의 발현이 조기의 시점과 동일하거나, 그보다 더 크도록 구성된다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 적어도 7일, 8일, 9일, 10일, 12일, 14일, 16일, 18일, 20일, 22일, 23일 또는 그 초과의 기간에 걸친 세포 내의 하나 이상의 발현 서열의 발현이 약 40%를 초과하여 감소하지 않도록 구성된다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 적어도 7일, 8일, 9일, 10일, 12일, 14일, 16일, 18일, 20일, 22일, 23일 또는 그 초과 동안 세포 내의 하나 이상의 발현 서열의 발현이 약 40%를 초과하여 달라지지 않는 수준으로 유지되도록 구성된다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 투여는 본원에 기술된 임의의 전달 방법을 사용하여 행한다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 정맥내 주사를 통해 대상체에게 투여된다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 투여는 산전 투여, 신생아 투여, 산후 투여, 경구, 주사에 의한 것(예를 들어, 정맥내, 동맥내, 복강내, 피내, 피하 및 근육내), 안과적 투여에 의한 것 및 비강내 투여에 의한 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 단백질 발현 방법은 번역 생성물의 변형, 폴딩 또는 다른 번역후 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단백질 발현 방법은 생체내의, 예를 들어, 세포 기구를 통한 번역후 변형을 포함한다.
본원에 열거된 모든 참고문헌 및 간행물은 본원에 참조로 포함된다.
상기 기술된 실시형태를 조합하여, 상기 언급된 기능적 특징을 달성할 수 있다. 이는 또한, 예시적인 조합 및 달성되는 기능적 특징이 제시된 하기의 실시예에 의해 예시된다.
넘버링된 실시형태 세트 #1
[1] 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 약제학적 제제로서, 약제학적 제제가 1 ng/㎖, 5 ng/㎖, 10 ng/㎖, 15 ng/㎖, 20 ng/㎖, 25 ng/㎖, 30 ng/㎖, 35 ng/㎖, 40 ng/㎖, 50 ng/㎖, 60 ng/㎖, 70 ng/㎖, 80 ng/㎖, 90 ng/㎖, 100 ng/㎖, 200 ng/㎖, 300 ng/㎖, 400 ng/㎖, 500 ng/㎖, 600 ng/㎖, 1 ㎍/ ㎖, 10 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖, 200 g/㎖, 300 ㎍/㎖, 400 ㎍/㎖, 500 ㎍/㎖, 600 ㎍/㎖, 700 ㎍/㎖, 800 ㎍/㎖, 900 ㎍/㎖, 1 ㎎/㎖, 1.5 ㎎/㎖ 또는 2 ㎎/㎖ 이하의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자를 포함하는 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 약제학적 제제.
[2] 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 약제학적 제제로서, 약제학적 제제가 약제학적 제제 내의 총 리보뉴클레오티드 분자의 0.5%(w/w), 1%(w/w), 2%(w/w), 5%(w/w), 10%(w/w), 15%(w/w), 20%(w/w), 25%(w/w), 30%(w/w), 40%(w/w), 50%(w/w) 이하의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자를 포함하는 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 약제학적 제제.
[3] 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 약제학적 제제로서, 약제학적 제제 내의 총 리보뉴클레오티드 분자의 적어도 30%(w/w), 40%(w/w), 50%(w/w), 60%(w/w), 70%(w/w), 80%(w/w), 85%(w/w), 90%(w/w), 91%(w/w), 92%(w/w), 93%(w/w), 94%(w/w), 95%(w/w), 96%(w/w), 97%(w/w), 98%(w/w) 또는 99%(w/w)가 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자인 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 약제학적 제제.
[4] 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 약제학적 제제로서, 약제학적 제제가 하나의 또는 복수의 정제 단계 이전의 RNA의 수준에 비하여 하나의 또는 복수의 정제 단계 후에 적어도 30%(w/w), 적어도 40%(w/w), 적어도 50%(w/w), 적어도 60%(w/w), 적어도 70%(w/w), 적어도 80%(w/w), 적어도 90%(w/w) 또는 적어도 95%(w/w) 감소된 선형 RNA의 수준을 갖는 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 약제학적 제제.
[5] 정제 이전에 비하여 정제 후에 감소된 수준의 면역 또는 염증 반응의 하나 이상의 마커를 갖는 단락 [1], [2], [3] 또는 [4]의 약제학적 제제.
[6] 면역 또는 염증 반응의 하나 이상의 마커가 사이토카인 또는 면역원성 관련 유전자인 단락 [5]의 약제학적 제제.
[7] 면역 또는 염증 반응의 하나 이상의 마커가 RIG-I, MDA5, PKR, IFN-베타, OAS 및 OASL로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자의 발현인 단락 [5] 또는 [6] 중 어느 한 단락의 약제학적 제제.
[8] 약제학적 제제 내의 총 리보뉴클레오티드 분자의 30%(w/w) 이하의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자를 포함하며, 숙주 세포 단백질, 숙주 세포 데옥시리보핵산, 효소, 시약 성분, 겔 성분 또는 크로마토그래피 물질로부터 선택되는 공정-관련 불순물이 실질적으로 없는 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 약제학적 제제.
[9] 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자가 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자 대응물을 포함하는 상기 단락 중 어느 한 단락의 약제학적 제제.
[10] 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자가 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자 대응물, 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자 비-대응물 또는 그의 조합을 포함하는 단락 [1] 내지 [2] 또는 [9] 중 어느 한 단락의 약제학적 제제.
[11] 약제학적 제제가 리물루스 변형세포 용해물 시험에 의해 측정되는 바와 같이 10 EU/㎏ 미만의 내독소를 포함하거나, 내독소를 결여한 단락 [1] 내지 [10] 중 어느 한 단락의 약제학적 제제.
[12] 약제학적 제제가 멸균 이전에 100 CFU/100 ㎖ 미만 또는 10 CFU/100 ㎖ 미만의 바이오버든을 포함하는 단락 [1] 내지 [11] 중 어느 한 단락의 약제학적 제제.
[13] 약제학적 제제가 멸균 약제학적 제제인 단락 [1] 내지 [11] 중 어느 한 단락의 약제학적 제제.
[14] 멸균 약제학적 제제가 무균 조건 하에서 시험하여 100개 미만의 생존 가능한 미생물의 성장을 지원하는 단락 [12]의 약제학적 제제.
[15] 약제학적 제제가 USP <71>의 표준을 만족하는 단락 [1] 내지 [14] 중 어느 한 단락의 약제학적 제제.
[16] 약제학적 제제가 USP <85>의 표준을 만족하는 단락 [1] 내지 [15] 중 어느 한 단락의 약제학적 제제.
[17] 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자가 준-나선 구조를 포함하는 단락 [1] 내지 [16] 중 어느 한 단락의 약제학적 제제.
[18] 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자가 준-이중 가닥 이차 구조를 포함하는 단락 [1] 내지 [17] 중 어느 한 단락의 약제학적 제제.
[19] 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자가 하나 이상의 발현 서열 및 적어도 하나의 발현 서열의 3' 말단에 스태거 요소를 포함하는 단락 [1] 내지 [18] 중 어느 한 단락의 약제학적 제제.
[20] 약제학적 제제가 최종 약물 제품의 중간체 약제학적 제제인 단락 [1] 내지 [19] 중 어느 한 단락의 약제학적 제제.
[21] 약제학적 제제가 대상체로의 투여를 위한 최종 약물 제품인 단락 [1] 내지 [19] 중 어느 한 단락의 약제학적 제제.
[22] 약제학적 제제가 적어도 0.1 ng/㎖, 0.5 ng/㎖, 1 ng/㎖, 5 ng/㎖, 10 ng/㎖, 50 ng/㎖, 0.1 ㎍/㎖, 0.5 ㎍/㎖,1 ㎍/㎖, 2 ㎍/㎖, 5 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖, 20 ㎍/㎖, 30 ㎍/㎖, 40 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 60 ㎍/㎖, 70 ㎍/㎖, 80 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖, 200 ㎍/㎖, 300 ㎍/㎖, 500 ㎍/㎖, 1 ㎎/㎖, 2 ㎎/㎖, 3 ㎎/㎖, 5 ㎎/㎖, 10 ㎎/㎖, 100 ㎎/㎖, 200 ㎎/㎖ 또는 500 ㎎/㎖, 600 ㎎/㎖, 650 ㎎/㎖, 700 ㎎/㎖ 또는 750 ㎎/㎖의 농도의 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자를 포함하는 단락 [1] 내지 [21] 중 어느 한 단락의 약제학적 제제.
[23] 제제가 1 pg/㎖, 10 pg/㎖, 0.1 ng/㎖, 1 ng/㎖, 5 ng/㎖, 10 ng/㎖, 15 ng/㎖, 20 ng/㎖, 25 ng/㎖, 30 ng/㎖, 35 ng/㎖, 40 ng/㎖, 50 ng/㎖, 60 ng/㎖, 70 ng/㎖, 80 ng/㎖, 90 ng/㎖, 100 ng/㎖, 200 ng/㎖, 300 ng/㎖, 400 ng/㎖, 500 ng/㎖, 1000 ㎍/㎖, 5000 ㎍/㎖, 10,000 ㎍/㎖ 또는 100,000 ㎍/㎖ 이하의 데옥시리보뉴클레오티드 분자를 포함하는 단락 [1] 내지 [22] 중 어느 한 단락의 약제학적 제제.
[24] 약제학적 제제가 분광광도계에 의해 측정하여 약 1.6 내지 2.3의 A260/A280 흡광도 비를 포함하는 단락 [1] 내지 [23] 중 어느 한 단락의 약제학적 제제.
[25] 약제학적 제제가 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자 밀리그램(㎎)당 1 pg, 10 pg, 0.1 ng, 1 ng, 5 ng, 10 ng, 15 ng, 20 ng, 25 ng, 30 ng, 35 ng, 40 ng, 50 ng, 60 ng, 70 ng, 80 ng, 90 ng, 100 ng, 200 ng, 300 ng, 400 ng 또는 500 ng 미만의 단백질 오염의 단백질 오염을 포함하는 단락 [1] 내지 [24] 중 어느 한 단락의 약제학적 제제.
[26] 단백질 오염이 효소를 포함하는 단락 [23]의 약제학적 제제.
[27] 효소가 뉴클레아제 또는 리가제인 단락 [24]의 약제학적 제제.
[28] 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자에 비한 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 양이 실시예 2 또는 실시예 3의 방법을 사용하여 결정되는 단락 [1] 내지 [27] 중 어느 한 단락의 약제학적 제제.
[29] 약제학적 제제 내의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 양이 실시예 2의 방법을 사용하여 결정되는 단락 [1], [2] 또는 [9] 내지 [28] 중 어느 한 단락의 약제학적 제제.
[30] 약제학적 제제 내의 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 양이 실시예 3의 방법을 사용하여 결정되는 단락 [3], [9] 또는 [11] 내지 [29] 중 어느 한 단락의 약제학적 제제.
[31] a) 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 제제를 제공하는 단계;
b) 제제에 남아 있는 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자를 실질적으로 제거하도록 제제를 처리하는 단계;
c) 선택적으로, 처리 단계 후에 제제에 남아 있는 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 양을 평가하는 단계; 및
d) 약제학적 이용을 위한 약제학적 조성물을 생성하도록 제제를 추가로 처리하는 단계를 포함하는 약제학적 조성물의 제조 방법.
[32] 단계 d)의 추가의 처리가 하기 중 하나 이상을 포함하는 단락 [31]의 방법:
e) 데옥시리보뉴클레오티드 분자를 실질적으로 제거하도록 제제를 처리하는 것;
f) 제제 내의 데옥시리보뉴클레오티드 분자의 양을 평가하는 것;
g) 제제를 약제학적 부형제를 사용하여 제형화하는 것;
h) 제제를 농축시키는 것; 및
i) 제제 내의 데옥시리보뉴클레오티드 분자의 양을 프린트 또는 디지털 매체에 기록하는 것.
[33] 단계 d)의 추가의 처리가 하기 중 하나 이상을 포함하는 단락 [31] 내지 [32] 중 어느 한 단락의 방법:
e) 단백질 오염을 실질적으로 제거하도록 제제를 처리하는 것;
f) 제제 내의 단백질 오염의 양을 평가하는 것;
g) 제제를 약제학적 부형제를 사용하여 제형화하는 것; 및
h) 제제를 농축시키는 것.
[34] 단계 d)의 추가의 처리가 하기 중 하나 이상을 포함하는 단락 [31] 내지 [33] 중 어느 한 단락의 방법:
e) 내독소를 실질적으로 제거하도록 제제를 처리하는 것;
f) 제제 내의 내독소의 양을 평가하는 것;
g) 제제를 약제학적 부형제를 사용하여 제형화하는 것; 및
h) 제제를 농축시키는 것.
[35] 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자가 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자 대응물을 포함하는 단락 [31] 내지 [34] 중 어느 한 단락의 방법.
[36] 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자가 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자 대응물, 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자 비-대응물 또는 그의 조합을 포함하는 단락 [31] 내지 [35] 중 어느 한 단락의 방법.
[37] 단백질 오염이 효소를 포함하는 단락 [31] 내지 [36] 중 어느 한 단락의 방법.
[38] a) 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 제제를 제공하는 단계;
b) 제제에 남아 있는 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 양을 평가하는 단계; 및
c) 제제가 제제에 존재하는 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 양에 대한 참조 기준을 만족하면, 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 제제를 약제학적 약물 물질로서 처리하는 단계를 포함하는 약제학적 약물 물질의 제조 방법.
[39] a) 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 제제를 제공하는 단계;
b) 제제 내의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 양을 측정하는 단계;
c) 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 제제가 제제에 존재하는 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 양에 대한 참조 기준을 만족하면, 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 제제를 약제학적 약물 제품으로서 제형화하는 단계; 및
d) 약제학적 약물 제품이 약제학적 약물 제품에 존재하는 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 양에 대한 참조 기준을 만족하면, 약제학적 약물 제품을 표지하고 운송하는 단계를 포함하는 약제학적 약물 제품의 제조 방법.
[40] 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 제제를 제형화하는 단계가 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 제제를 약제학적 부형제와 조합하는 것을 포함하는 단락 [38] 내지 [39] 중 어느 한 단락의 방법.
[41] 제제에 존재하는 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 양에 대한 참조 기준이 약제 출하 규격인 단락 [38] 내지 [40] 중 어느 한 단락의 방법.
[42] 약제학적 제제가 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 서열에 대한 참조 기준, 예를 들어, 참조 원형 폴리리보뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 80%(예를 들어, 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, 100%) 서열 동일성을 갖는 서열을 추가로 만족하는 단락 [41]의 방법.
[43] 제제에 존재하는 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 양에 대한 참조 기준이 1 ng/㎖, 5 ng/㎖, 10 ng/㎖, 15 ng/㎖, 20 ng/㎖, 25 ng/㎖, 30 ng/㎖, 35 ng/㎖, 40 ng/㎖, 50 ng/㎖, 60 ng/㎖, 70 ng/㎖, 80 ng/㎖, 90 ng/㎖, 100 ng/㎖, 200 ng/㎖, 300 ng/㎖, 400 ng/㎖, 500 ng/㎖, 600 ng/㎖, 1 ㎍/ ㎖, 10 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖, 200 g/㎖, 300 ㎍/㎖, 400 ㎍/㎖, 500 ㎍/㎖, 600 ㎍/㎖, 700 ㎍/㎖, 800 ㎍/㎖, 900 ㎍/㎖, 1 ㎎/㎖, 1.5 ㎎/㎖ 또는 2 ㎎/㎖ 이하의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 존재인 단락 [38] 내지 [42] 중 어느 한 단락의 방법.
[44] 제제에 존재하는 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 양에 대한 참조 기준이 현미경관찰법에 의해, 분광광도법에 의해, 형광측정법에 의해, 변성 우레아 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 영상화에 의해, UV-Vis 분광광도법에 의해, RNA 전기영동에 의해 또는 RNAse H 분석에 의해 측정되는 경우 특정 양 이하(예를 들어, 측정되는 경우 검출 가능하지 않은 수준 또는 검출 한계 미만의 수준)의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 존재인 단락 [38] 내지 [42] 중 어느 한 단락의 방법.
[45] 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자가 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자 대응물을 포함하는 단락 [38] 내지 [44] 중 어느 한 단락의 방법.
[46] 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자가 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자 대응물, 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자 비-대응물 또는 그의 조합을 포함하는 단락 [38] 내지 [45] 중 어느 한 단락의 방법.
[47] 약제학적 약물 제품 또는 약제학적 약물 물질이 적어도 0.1 ng/㎖, 0.5 ng/㎖, 1 ng/㎖, 5 ng/㎖, 10 ng/㎖, 50 ng/㎖, 0.1 ㎍/㎖, 0.5 ㎍/㎖,1 ㎍/㎖, 2 ㎍/㎖, 5 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖, 20 ㎍/㎖, 30 ㎍/㎖, 40 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 60 ㎍/㎖, 70 ㎍/㎖, 80 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖, 200 ㎍/㎖, 300 ㎍/㎖, 500 ㎍/㎖, 1 ㎎/㎖, 2 ㎎/㎖, 3 ㎎/㎖, 5 ㎎/㎖, 10 ㎎/㎖, 100 ㎎/㎖, 200 ㎎/㎖ 또는 500 ㎎/㎖의 농도의 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자를 포함하는 단락 [38] 내지 [46] 중 어느 한 단락의 방법.
[48] 약제학적 약물 제품 또는 약제학적 약물 물질이 약제학적 제제 내의 총 리보뉴클레오티드 분자에 비하여 적어도 30%(w/w), 40%(w/w), 50%(w/w), 60%(w/w), 70%(w/w), 80%(w/w), 85%(w/w), 90%(w/w), 91%(w/w), 92%(w/w), 93%(w/w), 94%(w/w), 95%(w/w), 96%(w/w), 97%(w/w), 98%(w/w) 또는 99%(w/w)의 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자를 포함하는 단락 [38] 내지 [47] 중 어느 한 단락의 방법.
[49] 약제학적 제제 내의 총 리보뉴클레오티드 분자에 비하여 적어도 30%(w/w), 40%(w/w), 50%(w/w), 60%(w/w), 70%(w/w), 80%(w/w), 85%(w/w), 90%(w/w), 91%(w/w), 92%(w/w), 93%(w/w), 94%(w/w), 95%(w/w), 96%(w/w), 97%(w/w), 98%(w/w) 또는 99%(w/w)의 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자가 현미경관찰법에 의해, 분광광도법에 의해, 형광측정법에 의해, 변성 우레아 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 영상화에 의해, UV-Vis 분광광도법에 의해, RNA 전기영동에 의해, RNAse H 분석에 의해, UV 분광 또는 형광 검출기에 의해, 광 산란 기법에 의해, HPLC를 포함하는 분리 방법의 이용과 함께 또는 이것 없이 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해, 분리 전 또는 분리 후 유도체화 방법의 이용과 함께 또는 이것 없이 HPLC에 의해, 칩 또는 겔 기반의 전기영동에 의해, 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 검출을 위해 은 또는 염료 염색 또는 방사성 붕괴를 사용하는 검출 방법의 사용에 의해 또는 현미경관찰법, 가시적 방법 또는 분광광도계를 사용하는 방법에 의해 측정되는 단락 [48]의 방법.
[50] 총 리보뉴클레오티드 분자에 비한 원형 폴리리보뉴클레오티드의 양이 실시예 3의 방법을 사용하여 결정되는 단락 [48] 또는 [49]의 방법.
[51] 약제학적 약물 제품 또는 약제학적 약물 물질이 리물루스 변형세포 용해물 시험에 의해 측정하여 10 EU/㎏ 미만의 내독소를 포함하거나, 내독소를 결여하는 단락 [38] 내지 [50] 중 어느 한 단락의 방법.
[52] 약제학적 약물 제품 또는 약제학적 약물 물질이 멸균 이전에 100 CFU/100 ㎖ 미만 또는 10 CFU/100 ㎖ 미만의 바이오버든을 포함하는 단락 [38] 내지 [51] 중 어느 한 단락의 방법.
[53] 약제학적 약물 제품 또는 약제학적 약물 물질이 멸균 약물 제품 또는 멸균 약물 물질인 단락 [38] 내지 [52] 중 어느 한 단락의 방법.
[54] 멸균 약물 제품 또는 멸균 약물 물질이 무균 조건 하에서 시험하여 100개 미만의 생존 가능한 미생물의 성장을 지원하는 단락 [53]의 방법.
[55] 약제학적 약물 제품 또는 약제학적 약물 물질이 USP <71>의 표준을 만족하는 단락 [38] 내지 [54] 중 어느 한 단락의 방법.
[56] 약제학적 약물 제품 또는 약제학적 약물 물질이 USP <85>의 표준을 만족하는 단락 [38] 내지 [55] 중 어느 한 단락의 방법.
[57] 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자가 하나 이상의 발현 서열 및 적어도 하나의 발현 서열의 3' 말단에 스태거 요소를 포함하는 단락 [38] 내지 [56] 중 어느 한 단락의 방법.
[58] 제제가 제제에 존재하는 데옥시리보뉴클레오티드 분자의 양에 대한 참조 기준을 추가로 만족하는 단락 [38] 내지 [57] 중 어느 한 단락의 방법.
[59] 제제에 존재하는 데옥시리보뉴클레오티드 분자의 양에 대한 참조 기준이 1 pg/㎖, 10 pg/㎖, 0.1 ng/㎖, 1 ng/㎖, 5 ng/㎖, 10 ng/㎖, 15 ng/㎖, 20 ng/㎖, 25 ng/㎖, 30 ng/㎖, 35 ng/㎖, 40 ng/㎖, 50 ng/㎖, 60 ng/㎖, 70 ng/㎖, 80 ng/㎖, 90 ng/㎖, 100 ng/㎖, 200 ng/㎖, 300 ng/㎖, 400 ng/㎖ 또는 500 ng/㎖, 1000 ㎍/㎖, 5000 ㎍/㎖, 10,000 ㎍/㎖ 또는 100,000 ㎍/㎖ 이하의 데옥시리보뉴클레오티드 분자의 존재인 단락 [58]의 방법.
[60] 제제가 제제에 존재하는 단백질 오염의 양에 대한 참조 기준을 추가로 만족하는 단락 [38] 내지 [59] 중 어느 한 단락의 방법.
[61] 제제에 존재하는 단백질 오염의 양에 대한 참조 기준이 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자 밀리그램(㎎)당 1 pg, 10 pg, 0.1 ng, 1 ng, 5 ng, 10 ng, 15 ng, 20 ng, 25 ng, 30 ng, 35 ng, 40 ng, 50 ng, 60 ng, 70 ng, 80 ng, 90 ng, 100 ng, 200 ng, 300 ng, 400 ng 또는 500 ng 미만의 단백질 오염의 단백질 오염의 존재인 단락 [60]의 방법.
[62] 약제학적 약물 제품 또는 약제학적 약물 물질이 분광광도계에 의해 측정하여 약 1.6 내지 2.3의 A260/A280 흡광도 비를 포함하는 단락 [38] 내지 [61] 중 어느 한 단락의 방법.
[63] 단락 [1] 내지 [27] 중 어느 한 단락의 약제학적 제제, 단락 [31] 내지 [37] 중 어느 한 단락의 약제학적 조성물, 단락 [38] 내지 [62] 중 어느 한 단락의 약제학적 약물 물질 또는 단락 [39] 내지 [62] 중 어느 한 단락의 약제학적 약물 제품을 대상체의 세포 또는 조직에 투여하는 단계를 포함하는 대상체로의 또는 대상체의 세포 또는 조직으로의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 전달 방법으로서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 원형 폴리리보뉴클레오티드로부터 번역되는 생성물이 투여 단계 후 적어도 3일째에 세포, 조직 또는 대상체에서 검출되는 방법.
[64] 투여 단계 전에 세포, 조직 또는 대상체 내의 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 원형 폴리리보뉴클레오티드로부터 번역되는 생성물의 존재를 평가하는 단계를 추가로 포함하는 단락 [63]의 방법.
[65] 투여 단계 후에 세포, 조직 또는 대상체 내의 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 원형 폴리리보뉴클레오티드로부터 번역되는 생성물의 존재를 평가하는 단계를 추가로 포함하는 단락 [63] 내지 [64] 중 어느 한 단락의 방법.
[66] (i) 단락 [1] 내지 [27] 중 어느 한 단락의 약제학적 제제, 단락 [31] 내지 [37] 중 어느 한 단락의 약제학적 조성물, 단락 [38] 내지 [62] 중 어느 한 단락의 약제학적 약물 물질 또는 단락 [39] 내지 [62] 중 어느 한 단락의 약제학적 약물 제품 및 (ii) 비경구 투여가 가능한 희석제를 포함하는 비경구 핵산 전달 시스템.
[67] 단락 [1] 내지 [27] 중 어느 한 단락의 약제학적 제제, 단락 [31] 내지 [37] 중 어느 한 단락의 약제학적 조성물, 단락 [38] 내지 [62] 중 어느 한 단락의 약제학적 약물 물질 또는 단락 [39] 내지 [62] 중 어느 한 단락의 약제학적 약물 제품은 어떠한 담체도 없는 단락 [66]의 비경구 핵산 전달 시스템.
[68] 원형 폴리리보뉴클레오티드의 전달을 필요로 하는 대상체에게 단락 [1] 내지 [27] 중 어느 한 단락의 약제학적 제제, 단락 [31] 내지 [37] 중 어느 한 단락의 약제학적 조성물, 단락 [38] 내지 [62] 중 어느 한 단락의 약제학적 약물 물질 또는 단락 [39] 내지 [62] 중 어느 한 단락의 약제학적 약물 제품을 원형 폴리리보뉴클레오티드의 전달을 필요로 하는 대상체에게 비경구적으로 투여하는 단계를 포함하는 대상체로의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 전달 방법.
[69] 원형 폴리리보뉴클레오티드가 대상체에서 생물학적 반응을 야기하기에 유효한 양으로 존재하는 단락 [68]의 방법.
[70] 원형 폴리리보뉴클레오티드가 대상체 내의 세포 또는 조직에 대하여 생물학적 효과를 갖기에 유효한 양으로 존재하는 단락 [68]의 방법.
[71] 단락 [1] 내지 [27] 중 어느 한 단락의 약제학적 제제, 단락 [31] 내지 [37] 중 어느 한 단락의 약제학적 조성물, 단락 [38] 내지 [62] 중 어느 한 단락의 약제학적 약물 물질 또는 단락 [39] 내지 [62] 중 어느 한 단락의 약제학적 약물 제품을 세포 또는 조직에 비경구적으로 투여하는 단계를 포함하는 대상체의 세포 또는 조직으로의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 전달 방법.
[72] 단락 [1] 내지 [27] 중 어느 한 단락의 약제학적 제제, 단락 [31] 내지 [37] 중 어느 한 단락의 약제학적 조성물, 단락 [38] 내지 [62] 중 어느 한 단락의 약제학적 약물 물질 또는 단락 [39] 내지 [62] 중 어느 한 단락의 약제학적 약물 제품이 담체를 포함하는 단락 [68] 내지 [71] 중 어느 한 단락의 방법.
[73] 단락 [1] 내지 [27] 중 어느 한 단락의 약제학적 제제, 단락 [31] 내지 [37] 중 어느 한 단락의 약제학적 조성물, 단락 [38] 내지 [62] 중 어느 한 단락의 약제학적 약물 물질 또는 단락 [39] 내지 [62] 중 어느 한 단락의 약제학적 약물 제품이 희석제를 포함하며, 어떠한 담체도 없는 단락 [68] 내지 [71] 중 어느 한 단락의 방법.
[74] 비경구 투여가 정맥내로, 근육내로, 안과적으로 또는 국소로 이루어지는 단락 [68] 내지 [73] 중 어느 한 단락의 방법.
넘버링된 실시형태 세트 #2
[1] a) 복수의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자를 제공하는 단계;
b) 선형 폴리리보뉴클레오티드를 원형화시켜, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제제를 생성하는 단계;
c) 남아 있는 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자를 실질적으로 제거하도록 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제제를 처리하는 단계;
d) 선택적으로, 처리 단계 후에 제제 내의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 양을 평가하는 단계; 및
e) 약제학적 이용을 위한 약제학적 조성물을 생성하도록 제제를 추가로 처리하는 단계를 포함하는 약제학적 조성물의 제조 방법.
[2] 단계 e)의 추가의 처리가 하기 중 하나 이상을 포함하는 단락 [1]의 방법:
f) 데옥시리보뉴클레오티드 분자를 실질적으로 제거하도록 제제를 처리하는 것;
g) 제제 내의 데옥시리보뉴클레오티드 분자의 양을 평가하는 것;
h) 제제를 약제학적 부형제를 사용하여 제형화하는 것;
i) 제제를 농축시키는 것; 및
j) 제제 내의 데옥시리보뉴클레오티드 분자의 양을 프린트 또는 디지털 매체에 기록하는 것.
[3] 단계 e)의 추가의 처리가 하기 중 하나 이상을 포함하는 단락 [1] 내지 [2] 중 어느 한 단락의 방법:
f) 단백질 오염을 실질적으로 제거하도록 제제를 처리하는 것;
g) 제제 내의 단백질 오염의 양을 평가하는 것;
h) 제제를 약제학적 부형제를 사용하여 제형화하는 것; 및
i) 제제를 농축시키는 것.
[4] 단계 e)의 추가의 처리가 하기 중 하나 이상을 포함하는 단락 [1] 내지 [3] 중 어느 한 단락의 방법:
f) 내독소를 실질적으로 제거하도록 제제를 처리하는 것;
g) 제제 내의 내독소의 양을 평가하는 것;
h) 제제를 약제학적 부형제를 사용하여 제형화하는 것; 및
i) 제제를 농축시키는 것.
[5] 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자가 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자 대응물 또는 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자 대응물의 단편을 포함하는 단락 [1] 내지 [4] 중 어느 한 단락의 방법.
[6] 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자가 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자 대응물 또는 그의 단편, 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자 비-대응물 또는 그의 단편 또는 그의 조합을 포함하는 단락 [1] 내지 [5] 중 어느 한 단락의 방법.
[7] 약제학적 조성물이 제제 내의 총 리보뉴클레오티드 분자에 비하여 20%, 15%, 10%, 5%, 2%, 1% 또는 0.5%(w/w) 이하의 조합된 선형 및 닉킹된 폴리리보뉴클레오티드 분자를 포함하는 단락 [1] 내지 [6] 중 어느 한 단락의 방법.
[8] 원형화가 스플린트 라이게이션을 포함하는 단락 [1] 내지 [7] 중 어느 한 단락의 방법.
[9] 단백질 오염이 효소를 포함하는 단락 [1] 내지 [7] 중 어느 한 단락의 방법.
[10] 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자에 비한 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 양이 실시예 2 또는 실시예 3의 방법을 사용하여 결정되는 단락 [1] 내지 [9] 중 어느 한 단락의 방법.
[11] 제제 내의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 양이 실시예 2의 방법을 사용하여 결정되는 단락 [1] 내지 [10] 중 어느 한 단락의 방법.
[12] 제제 내의 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 양이 실시예 3의 방법을 사용하여 결정되는 단락 [1] 내지 [11] 중 어느 한 단락의 방법.
[13] 약제학적 조성물이 제제 내의 총 리보뉴클레오티드 분자의 30%, 20%, 15%, 10%, 5%, 2%, 1% 또는 0.5%(w/w) 이하의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자를 포함하는 단락 [1] 내지 [12] 중 어느 한 단락의 방법.
[14] 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 약제학적 제제로서, 약제학적 제제가 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자 및 약제학적 제제 내의 총 리보뉴클레오티드 분자의 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5% 또는 0.1%(w/w) 이하의 닉킹된 폴리리보뉴클레오티드 분자를 포함하는 약제학적 제제.
[15] 정제 이전에 비하여 정제 이후에 감소된 수준의 면역 또는 염증 반응의 하나 이상의 마커를 갖는 단락 [14]의 약제학적 제제.
[16] 면역 또는 염증 반응의 하나 이상의 마커가 사이토카인 또는 면역원성 관련 유전자인 단락 [15]의 약제학적 제제.
[17] 면역 또는 염증 반응의 하나 이상의 마커가 RIG-I, MDA5, PKR, IFN-베타, OAS 및 OASL로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자의 발현인 단락 [15] 또는 [16] 중 어느 한 단락의 약제학적 제제.
[18] 세포 단백질, 세포 데옥시리보핵산, 효소, 시약 성분, 겔 성분 또는 크로마토그래피 물질로부터 선택되는 공정-관련 불순물이 실질적으로 없는 단락 [14] 내지 [17] 중 어느 한 단락의 약제학적 제제.
[19] 닉킹된 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자가 원형화-후 닉킹된 선형 폴리리보뉴클레오티드인 단락 [14] 내지 [18] 중 어느 한 단락의 약제학적 제제.
[20] 약제학적 제제가 리물루스 변형세포 용해물 시험에 의해 측정하여 10 EU/㎏ 미만의 내독소를 포함하거나, 내독소를 결여한 단락 [14] 내지 [19] 중 어느 한 단락의 약제학적 제제.
[21] 약제학적 제제가 멸균 전에 100 CFU/100 ㎖ 미만 또는 10 CFU/100 ㎖ 미만의 바이오버든을 포함하는 단락 [14] 내지 [20] 중 어느 한 단락의 약제학적 제제.
[22] 약제학적 제제가 멸균 약제학적 제제인 단락 [14] 내지 [21] 중 어느 한 단락의 약제학적 제제.
[23] 멸균 약제학적 제제가 무균 조건 하에서 시험하여 100개 미만의 생존 가능한 미생물의 성장을 지원하는 단락 [22]의 약제학적 제제.
[24] 약제학적 제제가 USP <71>의 표준을 만족하는 단락 [14] 내지 [23] 중 어느 한 단락의 약제학적 제제.
[25] 약제학적 제제가 USP <85>의 표준을 만족하는 단락 [14] 내지 [24] 중 어느 한 단락의 약제학적 제제.
[26] 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자가 하나 이상의 발현 서열 및 적어도 하나의 발현 서열의 3' 말단에 스태거 요소를 포함하는 단락 [14] 내지 [25] 중 어느 한 단락의 약제학적 제제.
[27] 약제학적 제제가 최종 약물 제품의 중간체 약제학적 제제인 단락 [14] 내지 [26] 중 어느 한 단락의 약제학적 제제.
[28] 약제학적 제제가 대상체로의 투여를 위한 최종 약물 제품인 단락 [14] 내지 [27] 중 어느 한 단락의 약제학적 제제.
[29] 약제학적 제제가 적어도 0.1 ng/㎖ 농도의 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자를 포함하는 단락 [14] 내지 [28] 중 어느 한 단락의 약제학적 제제.
[30] 약제학적 제제가 약 9%(w/w), 8%(w/w), 7%(w/w), 6%(w/w), 5%(w/w), 4%(w/w), 3%(w/w), 2%(w/w), 1%(w/w) 또는 0.5%(w/w) 이하의 닉킹된 폴리리보뉴클레오티드 분자를 포함하는 단락 [14] 내지 [29] 중 어느 한 단락의 약제학적 제제.
[31] 약제학적 제제 내의 총 리보뉴클레오티드 분자의 적어도 80%(w/w)가 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자인 단락 [14] 내지 [30] 중 어느 한 단락의 약제학적 제제.
[32] 약제학적 제제가 제제 내의 총 리보뉴클레오티드 분자의 20%(w/w) 이하의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자를 포함하는 단락 [14] 내지 [31] 중 어느 한 단락의 약제학적 제제.
실시예
하기의 실시예는 본 발명의 일부 실시형태를 추가로 예시하기 위해 제공되지만, 본 발명의 범주를 제한하려는 것이 아니며; 당업자에게 알려져 있는 다른 절차, 방법 또는 기법이 대안적으로 사용될 수 있다는 것이 그들의 예시적인 성질에 의해 이해될 것이다. 국제 특허 공개 제WO2019118919A1호의 [0356] 내지 [0375], [0393] 내지 [0405] 및 [0433] 내지 [0436]에 기술된 바와 같은 실시예 1 내지 3, 6, 9, 10 및 16, 및 그들의 상응하는 도면은 그들 전체가 본원에 참조로 포함된다.
하기의 표 2는 하기에 기술된 각각의 실시예의 내용의 간단한 요약을 제공하고자 하며, 이는 결코 배타적이지 않다. 실시예의 특정 양태가 표 2의 설명에 반영되지 않을 수 있다.
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
실시예 1: RNAse H-생성된 핵산 분해 생성물의 평가에 의한 원형 RNA 제제의 특성화
본 실시예는 RNAse H-생성된 핵산 분해 생성물에 대한 원형 RNA 제제의 평가에 의해 원형 생성물에 대하여 선형 및 콘카테머화 생성물을 검출할 수 있는 것을 보여준다.
RNA를 리가제와 함께 인큐베이션시키는 경우, 반응할 수 없거나, 분자내- 또는 분자간 결합을 형성하여, 각각 원형(유리 말단 부재) 또는 콘카테머 RNA(선형)를 생성할 수 있다. 상보성 DNA 프라이머 및 DNA/RNA 듀플렉스를 인식하는 비특이적인 엔도뉴클레아제인 RNAse H를 사용한 각각의 유형의 RNA의 처리는 시작 RNA 물질에 따라 독특한 수의 특정 크기의 분해 생성물을 생성하는 것으로 예상된다.
라이게이션된 RNA는 RNAse H 분해에 의해 생성되는 RNA의 수 및 크기에 기초하여, 콘카테머 RNA 오염이 없는 원형 RNA 또는 콘카테머 RNA 오염이 있는 원형 RNA인 것으로 나타날 수 있다. 프라이머 및 RNase H를 원형 RNA에 첨가하는 경우, 단일의 프라이머는 원형 RNA와 듀플렉스를 이루고, RNase H는 DNA/RNA 듀플렉스 영역을 분해하여, 단일의 선형 RNA 생성물을 초래한다. 프라이머 및 RNase H를 콘카테머에 첨가하는 경우, 적어도 2개의 프라이머는 콘카테머 RNA와 듀플렉스를 이루고, RNase H는 DNA/RNA 듀플렉스를 분해하여, 3가지 생성물을 초래하며; 한 생성물은 5' 말단에서 제1 프라이머 결합 영역까지의 RNA이고, 한 생성물은 함께 라이게이션된 콘카테머의 수에 따라 다수의 RNA를 포함할 수 있는 제1 프라이머 결합 영역과 다음의 프라이머 결합 영역 사이의 RNA이고, 마지막 생성물은 마지막 프라이머 결합 영역에서 3' 말단까지의 RNA이다. 프라이머 및 RNase H를 선형 RNA에 첨가하는 경우, 단일의 프라이머는 선형 RNA와 듀플렉스를 이루어, 5' 말단에서 프라이머 결합 영역까지의 RNA에 대한 한 생성물과, 프라이머 결합 영역에서 3' 말단까지에 대한 또 다른 생성물을 초래한다. 도 1의 좌측 그림은 이 전략을 예시한 것이다.
이 실시예에서, 원형 RNA를 하기와 같이 생성하였다. 비변형된 선형 RNA를 DNA 세그먼트로부터 T7 RNA 폴리머라제를 사용하여 시험관내 전사에 의해 합성하였다. 전사된 RNA를 RNA 정제 시스템(뉴 잉글랜드 바이오랩스, 인코포레이티드(New England Biolabs, Inc.))을 사용하여 정제하고, 제조업체의 설명에 따라 RNA 5' 피로포스포하이드롤라제(RppH)(뉴 잉글랜드 바이오랩스, 인코포레이티드, M0356)로 처리하고, RNA 정제 시스템을 사용하여 다시 정제하였다. 나노루시퍼라제(Nluc)를 인코딩하는 ORF를 갖는 IRES 및 IRES-ORF에 측접한 2개의 스페이서 요소를 포함하도록 원형 RNA를 설계하였다.
RNA의 원형화 상태를 시험하기 위하여, 0.05 pmole/㎕의 선형 또는 원형 RNA 제제를 37℃에서 30분 동안 DNA/RNA 듀플렉스를 분해하는 엔도리보뉴클레아제인, 0.25 U/㎕의 RNAse H 및 Nluc RNA에 상보적인 0.3 pmole/㎕ 올리고머(
Figure pct00007
)와 함께 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후에, 반응 혼합물을 6% 변성 PAGE에 의해 분석하였다. 겔을 SYBR-그린(green)으로 염색하고, E-겔 이미저(Imager)에 의해 가시화시켰다. 가시화된 겔 상의 밴드 세기를 측정하고 ImageJ에 의해 분석하였다.
도 1의 우측은 이 실험에서의 실제 절단 생성물을 보여준다. RNAse H 엔도뉴클레아제와 인큐베이션시킨 선형 RNA 레인(lane)에서의 밴드의 수는 예상되는 바와 같이 2개의 밴드를 생성한 한편, 레인 A의 경우에 원형 RNA 레인에서 단일의 밴드가 검출되었으며, 이는 원형 RNA가 사실상 원형이며 콘카테머가 아님을 나타낸다. 레인 B 및 레인 C의 경우에, 선형 및 콘카테머 오염으로부터의 밴드가 RNAse H 레인에서 나타나는 다수의 더 작은 단편 밴드의 존재로 인하여 RNase H 처리 후에 가시적이었다.
실시예 2: 원형 RNA 제제 내의 선형 RNA(표준 곡선)
이 실시예는 원형 RNA 제제 내의 선형 RNA의 계산을 보여준다.
이 실시예에서, 원형 RNA를 하기와 같이 생성하였다. 비변형된 선형 RNA를 DNA 세그먼트로부터 T7 RNA 폴리머라제를 사용하여 시험관내 전사에 의해 합성하였다. 전사된 RNA를 RNA 정제 시스템(뉴 잉글랜드 바이오랩스, 인코포레이티드)을 사용하여 정제하고, 제조업체의 설명에 따라 RNA 5' 피로포스포하이드롤라제(RppH)(뉴 잉글랜드 바이오랩스, 인코포레이티드, M0356)로 처리하고, RNA 정제 시스템을 사용하여 다시 정제하였다. 나노루시퍼라제(Nluc)를 인코딩하는 ORF를 갖는 IRES 및 IRES-ORF에 측접한 2개의 스페이서 요소를 포함하도록 원형 RNA를 설계하였다.
T4 DNA 리가제 2(뉴 잉글랜드 바이오랩스, 인코포레이티드, M0239)를 사용한 전사된 선형 RNA 및 DNA 스플린트의 처리에 의해 스플린트 라이게이션된 원형 RNA를 생성하였다.
원형 RNA를 정제하기 위하여, 라이게이션 혼합물을 4% 변성 PAGE 상에서 분리하고, 원형 RNA의 각각에 상응하는 RNA 밴드를 절개하였다. 절개된 RNA 겔 단편을 파쇄하고, RNA를 37℃에서 1시간 동안 겔 용리 완충제(0.5M NaOAc, 1mM EDTA 및 0.1% SDS)를 사용하여 용리시켰다. 상청액을 수집하고, 겔 용리 완충제를 파쇄된 겔에 첨가함으로써 RNA를 다시 한번 용리하고, 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 겔 잔해를 원심분리 필터에 의해 제거하고, RNA를 에탄올을 사용하여 침전시켰다. 용리된 원형 RNA를 6% 변성 PAGE에 의해 분석하였다. 겔을 SYBR-그린을 사용하여 염색하고, E-겔 이미저에 의해 가시화하였다.
알려져 있는 양 및 동일한 크기의 RNA(표준 RNA)의 밴드 세기를 비교함으로써 겔 상의 RNA의 양을 결정하였다. 표준 곡선을 생성하여, 겔 상의 미지의 시료의 양을 결정하였다(도 2). 표준 곡선을 생성하기 위하여, 1, 0.5, 0.2 및 0.05 pmole의 원형 RNA의 선형 대응물을 6% 변성 PAGE 상에 원형 RNA 제제와 병렬로 로딩하였다. 변성 겔을 SYBR-그린을 사용하여 염색하고, E-겔 이미저에 의해 가시화시켰다. 그 다음, 겔 상의 각각의 밴드 세기를 측정하고 ImageJ에 의해 분석하였다. 선형 RNA에 대한 표준 곡선을 각각의 상이한 레인에 로딩된 RNA의 밴드 세기의 분석을 통해 생성하였으며(모든 경우에 R2>0.98), 원형 RNA 제제 내의 선형 RNA의 양을 선형 RNA 표준 곡선에 기초하여 결정하였다.
상이한 시료 내의 선형 RNA의 양은 원형 RNA 제제 A에 있어서 하기와 같았다: 선형 RNA는 대략 0.31 mole/mole 또는 115.99 ng/395 ng 또는 30.2%인 것으로 계산되었다. 원형 RNA 제제 C에 있어서: 선형 RNA는 대략 0.45 mole/mole 또는 260.52 ng/488 ng 또는 49.2%인 것으로 계산되었다.
실시예 3: 원형 RNA 제제 내의 선형 RNA(겔 절개 및 추출)
이 실시예는 제제 내의 원형 RNA의 정제 및 정량화를 보여준다.
이 실시예에서, 원형 RNA를 하기와 같이 생성하였다. 비변형된 선형 RNA를 DNA 세그먼트로부터 T7 RNA 폴리머라제를 사용하여 시험관내 전사에 의해 합성하였다. 전사된 RNA를 RNA 정제 시스템(뉴 잉글랜드 바이오랩스, 인코포레이티드)을 사용하여 정제하고, 제조업체의 설명에 따라 RNA 5' 피로포스포하이드롤라제(뉴 잉글랜드 바이오랩스, 인코포레이티드, M0356)로 처리하고, RNA 정제 시스템을 사용하여 다시 정제하였다. 나노루시퍼라제(Nluc)를 인코딩하는 ORF를 갖는 IRES 및 IRES-ORF에 측접한 2개의 스페이서 요소를 포함하도록 원형 RNA를 설계하였다.
T4 DNA 리가제 2(뉴 잉글랜드 바이오랩스, 인코포레이티드, M0239)를 사용한 전사된 선형 RNA 및 DNA 스플린트의 처리에 의해 스플린트 라이게이션된 원형 RNA를 생성하였다.
원형 RNA를 정제하기 위하여, 라이게이션 혼합물을 6% 변성 PAGE 상에서 분리하고, 원형 RNA의 각각에 상응하는 RNA 밴드를 절개하였다. 절개된 RNA 겔 단편을 파쇄하고, RNA를 37℃에서 1시간 동안 겔 용리 완충제(0.5M NaOAc, 1mM EDTA 및 0.1% SDS)를 사용하여 용리시켰다. 상청액을 수집하고, 겔 용리 완충제를 파쇄된 겔에 첨가함으로써 RNA를 다시 한번 용리하고, 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 겔 잔해를 원심분리 필터에 의해 제거하고, RNA를 에탄올을 사용하여 0.3M 아세트산나트륨의 존재 하에 침전시켰다. 용리된 원형 RNA를 6% 변성 PAGE에 의해 분석하였다. 겔을 SYBR-그린을 사용하여 염색하고, E-겔 이미저에 의해 가시화하였다(도 3). 가시적인 밴드를 다시 절개하고, 겔 브레이커를 사용하여 파쇄시켰다. RNA를 추출하기 위하여, 겔 용리 완충제(0.5M NaOAc, 1mM EDTA, 0.1% SDS)를 파쇄된 겔에 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 상청액을 수집하고, 겔 용리 완충제를 파쇄된 겔에 첨가함으로써 RNA를 다시 한번 용리하고, 1시간 동안 인큐베이션하였다. 겔 잔해를 스핀 X 컬럼에 의해 제거하고, 추출된 RNA를 에탄올 침전시켰다. 개별 밴드로부터의 추출된 RNA를 Qubit3 형광계에 의해 측정하였다.
상이한 시료 유래의 추출된 RNA를 하기와 같이 정량화하였다: (제제 A) 대략 1446 ng의 원형 RNA 및 176 ng의 선형 RNA(89.1% 원형 RNA); (제제 B) 대략 934 ng의 원형 RNA 및 270 ng의 선형 RNA(77.5% 원형 RNA); 및 (제제 C) 대략 320 ng의 원형 RNA 및 396 ng의 선형 RNA(44.6% 원형 RNA).
실시예 4: 원형 RNA 제제 내의 선형 RNA
이 실시예는 제제 내의 총 리보뉴클레오티드 분자에 비하여 91%(w/w) 순수한 원형 RNA 분자의 생성 및 이에 후속된 생물학적 효과를 생성하기 위한 마우스 내의 투여를 보여준다.
이 실시예에서, 원형 RNA는 IRES, 가우시아 루시퍼라제(GLuc)를 인코딩하는 ORF 및 IRES-ORF에 측접한 2개의 스페이서 요소를 포함한다.
이 실시예에서, 원형 RNA를 시험관내에서 생성하였다. 비변형된 선형 RNA를 전사를 유도하기 위한 T7 RNA 폴리머라제 프로모터 및 상기 열거된 모든 모티프를 포함하는 DNA 주형으로부터 시험관내에서 전사시켰다. 전사된 RNA를 RNA 클린업(cleanup) 키트(뉴 잉글랜드 바이오랩스, T2050)를 사용하여 정제하고, 제조업체의 설명에 따라 RNA 5' 포스포하이드롤라제(RppH)(뉴 잉글랜드 바이오랩스, M0356)로 처리하고, RNA 정제 컬럼을 사용하여 다시 정제하였다. RppH 처리된 선형 RNA를 스플린트 DNA
Figure pct00008
및 T4 RNA 리가제 2(뉴 잉글랜드 바이오랩스, M0239)를 사용하여 원형화시켰다. 원형 RNA를 우레아-PAGE 정제하고, 완충제(0.5 M 아세트산나트륨, 0.1% SDS, 1 mM EDTA) 중에 용리시키고, 에탄올 침전하고, RNA 보관 용액(써모피셔 사이언티픽(ThermoFisher Scientific), 카탈로그 번호 AM7000) 중에 재현탁화시켰다.
선형 폴리리보뉴클레오티드는 최종 원형 RNA 생성물 제제에 남겨졌다. 최종 생성물 제제를 6% TBE-우레아 겔 상에서 전개시키고, 밴드를 ImageJ를 사용하여 분석함으로써 최종 생성물 제제 내의 원형 RNA의 순도 및 남아 있는 선형 RNA의 백분율을 각각의 뱃치(batch)에 대하여 정량화하였다. 총 RNA 세기에 비하여 원형 RNA의 세기를 계산함으로써 순도를 평가하고, 백분율로서 기록하였다. 여기서, 원형 RNA는 제제 내의 총 RNA에 비하여 91%(w/w) 순도의 것이었다.
투여 전에, 100 ㎕ 최종 부피 중 요망되는 0.25 pmole의 최종 원형 RNA 농도를 달성하도록 PBS 및 10% TransIT 담체를 첨가하였다. 마우스에 가우시아 루시퍼라제 ORF를 인코딩하는 0.25 pmole의 원형 RNA의 단일의 정맥내 꼬리-정맥 주사(100 ㎕)를 제공하였다.
혈액 시료(약 25 ㎕)를 서브몰(submolar) 채혈에 의해 각각의 마우스로부터 수집하였다. 혈액을 투여 후 제0시간째, 제6시간째, 제1일째, 제2일째, 제3일째, 제7일째, 제14일째, 제21일째, 제28일째 및 제35일째에 EDTA 튜브 내로 수집하였다. 혈장을 1300 g에서 4℃에서 30분 동안의 원심분리에 의해 단리하고, 분비된 효소인 가우시아 루시퍼라제의 활성을 가우시아 루시퍼라제 활성 검정(써모 사이언티픽 피어스)을 사용하여 시험하였다. 요약하여, 50 ㎕의 1x GLuc 기질을 5 ㎕의 혈장에 첨가하여, GLuc 루시퍼라제 활성 검정을 수행하였다. 플레이트를 발광계 기기(프로메가(Promega))에서 혼합 직후에 판독하였다.
가우시아 루시퍼라제 활성은 원형 RNA의 투여 후 6시간째 및 1일째, 2일째, 3일째, 7일째, 14일째 및 21일째에 혈장에서 검출되었다. 가장 높은 원형 RNA의 발현이 주사 후 대략 2일째에 관찰되었으며, 높은 수준의 발현이 연장된 기간 동안 유지되었으며, 21일째에 여전히 검출 가능하였다. 모든 시점에, 이들 활성의 수준은 음성 대조군(PBS 비히클 단독)에 대하여 관찰되는 것들보다 더 컸다.
이 실시예는 제제 내의 총 RNA에 비한 91%(w/w) 순도의 원형 RNA가 성공적으로 생성되었으며, 정맥내 주사를 통해 성공적으로 전달되었으며, 연장된 기간 동안 혈액 중에서 검출 가능한 단백질을 발현할 수 있었음을 보여준다.
실시예 5: 겔-정제된 원형 RNA 내의 닉킹된 원형 RNA의 정량화
이 실시예는 겔 추출에 의해 정제된 원형 RNA가 제제 내의 총 RNA 분자에 비하여 1.1%(w/w) 이하의 닉킹된 RNA를 함유하는 것을 보여준다.
이 실시예에서, RNA는 IRES, 가우시아 루시퍼라제(GLuc)를 인코딩하는 ORF 및 IRES-ORF에 측접한 2개의 스페이서 요소를 포함하였다.
이 실시예에서, 원형 RNA를 시험관내에서 생성하였다. 비변형된 선형 RNA를 전사를 유도하기 위한 T7 RNA 폴리머라제 프로모터 및 상기 열거된 모든 모티프를 포함하는 DNA 주형으로부터 시험관내에서 전사시켰다. 전사된 RNA를 RNA 클린업 키트(뉴 잉글랜드 바이오랩스, T2050)를 사용하여 정제하고, 제조업체의 설명에 따라 RNA 5' 포스포하이드롤라제(RppH)(뉴 잉글랜드 바이오랩스, M0356)로 처리하고, RNA 정제 컬럼을 사용하여 다시 정제하였다. RppH-처리된 선형 RNA를 스플린트 DNA(
Figure pct00009
) 및 T4 RNA 리가제 2(뉴 잉글랜드 바이오랩스, M0239)를 사용하여 원형화시켰다. 이는 라이게이션 연접부에서의 RNA의 원형화를 초래하여, 원형 RNA를 생성한다. 원형 RNA를 4% PAGE 겔 상에서 우레아-PAGE 정제하고, 완충제(0.5 M 아세트산나트륨, 0.1% SDS, 1 mM EDTA) 중에 용리시키고, 에탄올 침전하고, RNA 보관 용액(써모피셔 사이언티픽, 카탈로그 번호 AM7000) 중에 재현탁화시켰다. 이 실시예에서, 정제된 원형 RNA는 제제 내의 총 RNA에 비하여 80%(w/w)의 순도를 갖는 것으로 평가되었다.
이 실시예에서, 선형 RNA의 서열을 차세대 서열분석에 의해 평가하였다. 정제된 원형 RNA 제제(80% 순도)를 TruSeq Small RNA Workflow(일루미나(Illumina), RS-200-0012)에 기술된 라이브러리 제조 방법을 사용하여 NGS 파이프라인을 위하여 제조하였다. 이 방법에 의해, 높은 충실도로 3' 말단 동일성이 유지되었다. 요약하여, 어댑터를 용액 중 이용 가능한 3' 또는 5' 말단을 갖는 임의의 RNA 분자에 라이게이션시켰다. 무손상 원형 RNA는 이 라이게이션을 겪지 않을 것이며 - 결과적으로, 이 단계는 오직 비-원형 RNA만을 위해 선택된다. 이어서, 이들 생성물을 역 전사시키고, 증폭시켜, cDNA 라이브러리를 생성하며, 이를 이후에 정제하고, 품질-제어하고, 다중화시켰다. 이어서, 라이브러리를 일루미나 Miniseq 머신 상에서 서열분석하였다.
상기 기술된 것과 유사한 방식으로, RppH-처리 후의 시험관내 전사로부터의 선형 RNA 생성물을 서열분석을 위해 처리하였다.
판독물을 원형 RNA를 생성하기 위해 사용되는 주형 서열로 다시 맵핑하고, 라이게이션 연접부에 걸쳐 맵핑되는 판독물의 수를 평가함으로써 겔-정제된 원형 RNA 제제 내의 비-원형 RNA 및 IVT의 선형 RNA 생성물 둘 모두의 서열분석 결과를 비교하였다.
이 분석에서, 남아 있는 비-원형 RNA는 닉킹된 RNA 및 IVT로부터의 잔류 선형 RNA 생성물의 혼합물인 것으로 가정된다. 이 실시예에서, 비-원형 RNA가 오직 닉킹된 RNA만을 포함하는 것으로 가정되면, 라이게이션 연접부에 걸쳐 맵핑되는 단편의 백분율은 50%인 것으로 예상된다. 비-원형 RNA가 IVT로부터의 잔류 선형 RNA 생성물만을 포함하는 것으로 가정되면, 라이게이션 연접부에 걸쳐 맵핑되는 단편의 백분율은 0%인 것으로 예상된다. 이들 통계적 가정 및 대조 실험을 사용하여, 표준 곡선을 생성하였으며, 이는 닉킹된 RNA의 정량화를 가능하게 하였다. 이는 닉킹된 RNA로서 5.4%의 비-원형 RNA의 계산을 제공하였다.
이 실시예는 정제된 원형 RNA 제제의 비-원형 RNA 분획의 5.4%(w/w)(총 RNA의 1.1%(w/w)와 등가임)가 닉킹된 RNA였음을 보여준다.
실시예 6: 원형 RNA 제제에 존재하는 선형 RNA가 시험관내에서 발현 수준 및 지속성에 영향을 미쳤다
이 실시예는 원형 RNA 제제 내의 선형 RNA의 존재가 세포 내의 원형 RNA의 단백질 발현의 수준 및 지속성에 영향을 미치는 것을 보여준다.
이 실시예에서, 원형 RNA를 하기와 같이 생성하였다. 비변형된 선형 RNA를 DNA 세그먼트로부터 T7 RNA 폴리머라제를 사용하여 시험관내 전사에 의해 합성하였다. 전사된 RNA를 RNA 정제 시스템(뉴 잉글랜드 바이오랩스, 인코포레이티드)을 사용하여 정제하고, 제조업체의 설명에 따라 RNA 5' 피로포스포하이드롤라제(RppH)(뉴 잉글랜드 바이오랩스, 인코포레이티드, M0356)로 처리하고, RNA 정제 시스템을 사용하여 다시 정제하였다. 가우시아 루시퍼라제(gluc)를 인코딩하는 ORF를 갖는 IRES 및 IRES-ORF에 측접한 2개의 스페이서 요소를 포함하도록 원형 RNA를 설계하였다.
T4 DNA 리가제 2(뉴 잉글랜드 바이오랩스, 인코포레이티드, M0239)를 사용한 전사된 선형 RNA 및 DNA 스플린트의 처리에 의해 스플린트 라이게이션된 원형 RNA를 생성하였다.
라이게이션 혼합물을 겔 정제하여, 주형 DNA, 단백질 및 선형(비-원형화된) RNA를 제거하였다. RNA 제제를 4% 변성 PAGE 상에서 분리하고, 원형 RNA의 각각에 상응하는 RNA 밴드를 절개하였다. 절개된 RNA 겔 단편을 파쇄하고, RNA를 37℃에서 1시간 동안 겔 용리 완충제(0.5M NaOAc, 1mM EDTA 및 0.1% SDS)를 사용하여 용리시켰다. 상청액을 수집하고, 겔 용리 완충제를 파쇄된 겔에 첨가함으로써 RNA를 다시 한번 용리하고, 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 겔 잔해를 원심분리 필터에 의해 제거하고, RNA를 에탄올을 사용하여 침전시켰다.
세포 분열 동안 겔 정제된 원형 및 비정제된 RNA 제제의 지속성을 BJ 섬유아세포에서 모니터링하였다. 96-웰 플레이트 내의 세포를 지질-기반의 트랜스펙션 시약(써모피셔 사이언티픽(LMRNA003))을 사용하여 동일한 양의 겔 정제된 원형 RNA 또는 비정제된 RNA 제제 중 어느 하나로 현탁액(역) 트랜스펙션시켰다.
가우시아 루시퍼라제 효소 활성을 제조업체의 설명에 따라 루시퍼라세 효소 검정(써모 사이언티픽 피어스, 16158)을 사용하여 단백질 발현의 척도로서 투여 후 6시간째 및 1일 내지 5일째에 모니터링하였다. 요약하여, 1x 코엘렌테라진(coelenterazine) 기질을 트랜스펙션된 웰 유래의 세포 현탁액에 첨가하였다. 플레이트를 기질 첨가 직후에 발광계(프로메가)에서 판독하였다.
겔 정제된 원형 RNA 제제로 트랜스펙션된 세포로부터의 단백질 발현은 비정제된 RNA로 트랜스펙션된 세포보다 더 높은 수준으로, 그리고 더 긴 기간 동안 검출되었다(도 4). 5일의 경과에 걸쳐 비정제된 RNA에 비하여 정제된 원형 RNA 제제를 사용하여 약 100배 더 높은 발광(RLU)이 검출되었다.
실시예 7: 원형 RNA 제제에 존재하는 선형 RNA는 세포에서 용량 의존적 방식으로 발현에 영향을 미쳤다
이 실시예는 원형 RNA 제제 내의 선형 RNA가 용량 의존적 방식으로 발현에 부정적으로 영향을 미치는 것을 보여준다.
이 실시예에서, 원형 RNA 및 선형 RNA를 하기와 같이 생성하였다. 비변형된 선형 RNA를 DNA 세그먼트로부터 T7 RNA 폴리머라제를 사용하여 시험관내 전사에 의해 합성하였다. 전사된 RNA를 RNA 정제 시스템(뉴 잉글랜드 바이오랩스, 인코포레이티드)을 사용하여 정제하고, 제조업체의 설명에 따라 RNA 5' 피로포스포하이드롤라제(RppH)(뉴 잉글랜드 바이오랩스, 인코포레이티드, M0356)로 처리하고, RNA 정제 시스템을 사용하여 다시 정제하였다. 가우시아 루시퍼라제(gluc)를 인코딩하는 ORF를 갖는 IRES 및 IRES-ORF에 측접한 2개의 스페이서 요소를 포함하도록 원형 RNA를 설계하였다.
T4 DNA 리가제 2(뉴 잉글랜드 바이오랩스, 인코포레이티드, M0239)를 사용한 전사된 선형 RNA 및 DNA 스플린트의 처리에 의해 스플린트 라이게이션된 원형 RNA를 생성하였다.
원형 RNA를 정제하기 위하여, 라이게이션 혼합물을 4% 변성 PAGE 상에서 분리하고, 원형 RNA의 각각에 상응하는 RNA 밴드를 절개하였다. 선형 RNA를 동일한 4% 변성 PAGE 겔을 사용하여 정제하였다. 절개된 RNA 겔 단편(선형 또는 원형)을 파쇄하고, RNA를 37℃에서 1시간 동안 겔 용리 완충제(0.5M NaOAc, 1mM EDTA 및 0.1% SDS)를 사용하여 용리시켰다. 상청액을 수집하고, 겔 용리 완충제를 파쇄된 겔에 첨가함으로써 RNA를 다시 한번 용리하고, 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 겔 잔해를 원심분리 필터에 의해 제거하고, RNA를 에탄올을 사용하여 침전시켰다.
BJ 섬유아세포에서 세포 분열을 모니터링함으로써, 겔 정제된 원형 RNA를 갖는 제제에서 다양한 수준의 선형 RNA 대응물의 영향을 결정하였다. 96-웰 플레이트 내의 세포를 지질-기반의 트랜스펙션 시약(써모피셔 사이언티픽 (LMRNA003))을 사용하여 겔 정제된 원형 RNA 제제 또는 다양한 수준의 선형 RNA가 보충된 것을 제외하고, 동일한 양의 겔 정제된 원형 RNA 제제로 현탁액(역) 트랜스펙션시켰다. 가우시아 루시퍼라제 효소 활성을 제조업체의 설명에 따라 루시퍼라제 효소 검정(써모 사이언티픽 피어스, 16158)을 사용하여 단백질 발현의 척도로서 투여 후 6시간째 및 1일째 내지 5일째에 모니터링하였다. 요약하여, 1x 코엘렌테라진 기질을 트랜스펙션된 웰 유래의 세포 현탁액에 첨가하였다. 플레이트를 기질 첨가 직후에 발광계(프로메가)에서 판독하였다.
겔 정제된 원형 RNA 제제만으로 트랜스펙션된 세포로부터의 단백질 발현은 조합된 원형 및 선형 RNA로 트랜스펙션된 세포보다 더 긴 기간 동안 용량 의존적 방식으로 검출되었다(도 5). 정제된 원형 RNA의 수준만이 120시간의 시간 경과에 걸쳐 안정하게 유지되었지만, 원형 및 선형 RNA 둘 모두를 갖는 RNA 제제의 수준은 시간에 따라 감소되고, 감소 속도는 선형 RNA의 수준과 비례한다. 놀랍게도, 세포가 동일한 양의 원형 RNA로 트랜스펙션되고, 일부 시료가 2배 더 많은 코딩 RNA(선형과 조합된 원형)를 함유할지라도, 선형 RNA의 수준의 증가는 원형 RNA 양이 불변 유지되는 중에도, 시간이 지남에 따라 단백질 발현 수준에 역비례하여 영향을 미쳤다.
이 실시예는 감소된 선형 RNA의 수준을 갖는 원형 RNA가 개선된 발현, 예를 들어, 개선된 발현 수명을 갖는 것을 보여준다.
실시예 8: 원형 RNA 제제 내의 선형 RNA는 발현 수준 및 시간에 영향을 미쳤다(겔 영상화)
이 실시예는 원형 RNA 제제 내의 선형 RNA의 존재가 생체내에서 단백질 발현의 수준 및 지속성을 변경시키는 것을 보여준다.
이 실시예에서, 원형 RNA를 하기와 같이 생성하였다. 비변형된 선형 RNA를 DNA 세그먼트로부터 T7 RNA 폴리머라제를 사용하여 시험관내 전사에 의해 합성하였다. 전사된 RNA를 RNA 정제 시스템(뉴 잉글랜드 바이오랩스, 인코포레이티드)을 사용하여 정제하고, 제조업체의 설명에 따라 RNA 5' 피로포스포하이드롤라제(RppH)(뉴 잉글랜드 바이오랩스, 인코포레이티드, M0356)로 처리하고, RNA 정제 시스템을 사용하여 다시 정제하였다. 나노루시퍼라제(Nluc)를 인코딩하는 ORF를 갖는 IRES 및 IRES-ORF에 측접한 2개의 스페이서 요소를 포함하도록 원형 RNA를 설계하였다.
T4 DNA 리가제 2(뉴 잉글랜드 바이오랩스, 인코포레이티드, M0239)를 사용한 전사된 선형 RNA 및 DNA 스플린트의 처리에 의해 스플린트 라이게이션된 원형 RNA를 생성하였다.
원형 RNA를 정제하기 위하여, 라이게이션 혼합물을 4% 변성 PAGE 상에서 분리하고, 원형 RNA의 각각에 상응하는 RNA 밴드를 절개하였다. 절개된 RNA 겔 단편을 파쇄하고, RNA를 37℃에서 1시간 동안 겔 용리 완충제(0.5M NaOAc, 1mM EDTA 및 0.1% SDS)를 사용하여 용리시켰다. 상청액을 수집하고, 겔 용리 완충제를 파쇄된 겔에 첨가함으로써 RNA를 다시 한번 용리하고, 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 겔 잔해를 원심분리 필터에 의해 제거하고, RNA를 에탄올을 사용하여 침전시켰다. 용리된 원형 RNA를 6% 변성 PAGE에 의해 분석하였다. 겔을 SYBR-그린으로 염색하고, E-겔 이미저에 의해 가시화시켰다. 가시화된 겔 상의 밴드 세기를 측정하고, ImageJ에 의해 분석하였다(도 6).
개별 제제 내의 원형 및 선형 RNA를 보여주는 RNA 밴드를 E-겔 영상화에 의해 비교하였다. 원형 및 선형 RNA 함량을 UREA PAGE 겔 분석에 의해 정량화하였다. 요약하여, 겔을 개별 제제 내의 상대적인 양의 선형 및 원형 RNA 종에 대하여 분석하였다. 원형 RNA 함량의 백분율을 하기와 같이 계산하였다: 원형 RNA의 양을 총 RNA(원형 + 선형 RNA) 양으로 나누었다. 레인 A에서 circRNA의 백분율은 79.5%였으며, 레인 B에서는 53.9%이고, 레인 C에서는 44.8%였다.
Balb/c 마우스에 Nluc ORF를 갖는 원형 RNA, 또는 대조군으로서 선형 RNA를 포함하는 제제를 정맥내(IV) 꼬리 정맥 투여를 통해 주사하였다. 동물에는 제조업체의 설명에 따라 지질-기반의 트랜스펙션 시약(미루스(Mirus))에 제형화된 10 pmol의 총 RNA의 단일의 투여를 제공하였다.
RNA 투여 후 24시간째에, 마우스에 40 ㎍의 푸리마진(furimazine)(프로메가, N1120; 20 ㎕ 기질, 80 ㎕ PBS/용량)을 복강내 주사하고, 10분 인큐베이션 후에 생물발광 영상 획득(Bioluminescence Image Acquisition)을 사용하여 영상을 획득하였다. 투여 후 14일째에, 동물에 40 ㎍의 푸리마진(푸로게메가(Progemega), N1120, 20 ㎕ 기질, 80 ㎕ PBS/용량)을 복강내 주사하고, 희생시킨 다음, 간을 수집하였다. 간을 생물발광 영상 획득을 사용하여 수집 직후에 2분 동안 영상화하였다. 생물발광 영상 획득을 사용하여 선형 및 원형 RNA로부터 발현되는 나노-루시퍼라제의 존재를 측정하였다. 영상을 리빙 이미지(Living Image) 4.3.1(퍼킨엘머(PerkinElmer), MA) 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 전신 고정-부피 ROI를 각각의 개별 동물에 대하여 엎드린 및 반듯이 누운 이미지에 배치하였으며, 동물 확인에 기초하여 표지하였다. 총 유동(광자/초)을 모든 ROI에 대하여 계산하고 익스포팅하여(exported), 군들 간의 분석을 용이하게 하였다.
대략 44.8% 또는 대략 53.9% 원형 RNA를 갖는 제제 또는 선형 RNA에 비하여, 79.5% 원형 RNA를 갖는 제제는 24시간째에 생체내에서 더 높은 발현을 보였다. 또한, 더 높은 백분율의 원형 RNA 제제로부터의 루시퍼라제 발현을 투여 후 14일째에 간에서 생체외에서 분석하는 경우, 발현은 대략 79.5% 원형 RNA 제제로부터 유지되었지만, 대략 44.8% 또는 대략 53.9% 원형 RNA 제제로부터는 유지되지 않았다.
따라서, 원형 RNA 제제 내의 선형 RNA의 존재는 생체내에서 발현 및 지속성에 영향을 미친다.
실시예 9: 비오틴-표지된 아데노시드를 사용한 선형 RNA의 폴리아데닐화 및 후속된 스트렙트아비딘-매개의 포획을 통한 제제로부터 원형 RNA의 농축
이 실시예는 동일한 뉴클레오티드 서열을 함유하는 원형 RNA 및 선형 RNA 대응물의 혼합된 풀을 포함하는 제제로부터의 원형 RNA의 농축을 보여준다.
폴리(A) 폴리머라제를 사용한 RNA의 폴리아데닐화는 RNA로의 3' 폴리아데닌 테일의 부가를 초래한다. 이 과정은 RNA의 3' 말단이 컨쥬게이션을 위해 이용 가능한 것을 필요로 한다. RNA가 원형화되는 경우, 이러한 자유 말단이 존재하지 않는다. 폴리(A) 폴리머라제는 또한 변형된 아데닌, 예컨대 비오티닐화된 N6-ATP 유사체를 혼입시킬 수 있다. 이는 비오틴-스트렙트아비딘 결합 시스템을 사용한 비오티닐화된 폴리아데닐화 선형 RNA의 풀다운을 가능하게 한다. 따라서, 비오티닐화된 폴리아데닐화 선형 RNA 대응물은 그의 임의의 단편, 예컨대 모노리보뉴클레오티드를 포함하여, 이 비오틴-스트렙트아비딘 결합 시스템을 사용하여 풀다운에서 포획될 수 있다.
이 실시예에서, 원형 RNA(1.2 kb 길이)를 DNA 세그먼트로부터 T7 RNA 폴리머라제를 사용하여 시험관내 전사에 의해 생성되는 선형 RNA로부터 생성하였다. 전사된 RNA를 RNA 정제 시스템(뉴 잉글랜드 바이오랩스, 인코포레이티드)을 사용하여 정제하고, 제조업체의 설명에 따라 RNA 5' 피로포스포하이드롤라제(RppH)(뉴 잉글랜드 바이오랩스, 인코포레이티드, M0356)로 처리하고, RNA 정제 시스템을 사용하여 다시 정제하였다. RppH 처리된 선형 RNA를 스플린트 DNA 및 T4 RNA 리가제 2(뉴 잉글랜드 바이오랩스, M0239)를 사용하여 원형화시켰다.
라이게이션 후에, 원형 RNA 및 선형 RNA의 혼합물이 스플린트 DNA를 갖는 용액 중에 존재한다. 제공되는 반응 완충제(40 mM Tris-HCl, pH 8.0, 10 mM MgSO4, 10 mM CaCl2)와 함께 DNase I[프로메가, M610A]을 사용하여 남아 있는 스플린트를 분해하기 위해 DNAseI을 사용하였다. 이 반응을 37℃에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. RNA를 모나크(Monarch) RNA 클린업 키트[뉴 잉글랜드 바이오랩스, #T2040L]를 통해 반응 혼합물로부터 단리하였다.
폴리아데닐화 반응을 위하여, 2.5 ㎍의 라이게이션-후, DNaseI-처리 후 RNA를 풍부한 비오티닐화된 N6-ATP 유사체[제나 바이오사이언스(Jena Bioscience), NU-805-BIO] 및 제공되는 반응 완충제(100 mM Tris-HCl, pH 7.0, 3.0 mM MnCl2, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 500 ㎍/㎖ 아세틸화된 BSA, 50% 글리세롤)의 존재 하에 효모 폴리(A) 폴리머라제[써모 피셔 사이언티픽, 74225Z25KU]와 함께 인큐베이션시켰다. 반응을 37℃에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. RNA를 모나크 RNA 클린업 키트[뉴 잉글랜드 바이오랩스, #T2030L]를 통해 반응 혼합물로부터 단리하였다.
폴리아데닐화된 선형 RNA를 제거하기 위하여, 0.5 ㎍의 폴리아데닐화 반응으로부터의 RNA를 2x 결합/세척 완충제(10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM EDTA, 2 M NaCl)를 사용하여 1-대-1 희석에 의해 평형화시키고, 5 ㎕의 사전-평형화된 마이원(MyOne) 스트렙트아비딘 다이나비드(Dynabeads) C1[써모 피셔 사이언티픽, 65001] 비드 슬러리와 함께 인큐베이션시켰다. 비드를 자성 스캐폴드에 대한 2분 노출을 통해 상청액으로부터 분리하였다. 상청액을 RNA 함량에 대하여 A260 흡광도(나노드롭(Nanodrop))에 의해 분석하고, RNA 라이게이션 생성물 향상에 대하여 6% 우레아 PAGE에 의해 분석하였다. 바이오라드 이미지랩(Biorad ImageLab)을 사용하여, 모든 분석된 시료에 대한 상대적인 밴드 세기를 수동으로 정량화하였다.
이 실시예에서, 6% 우레아 PAGE 겔에서 밴드 세기를 측정함으로써, 원형 RNA 대 선형 RNA의 비를 계산하였다. 밴드의 정량화는 도 7에 나타나 있다: 정제 이전에, 42.6%의 RNA 생성물이 원형 RNA였고, 57.4%의 RNA 생성물이 선형 RNA(비정제된 RNA)였으며; 정제 후에, 50.4%의 RNA 생성물이 원형 RNA였고, 49.6%의 RNA 생성물이 선형 RNA였다(정제된 circRNA). 이 실시예는 비오티닐화된 아데닌 유사체를 사용한 선형 RNA의 폴리아데닐화에 이어서, 선형 RNA의 스트렙트아비딘-매개의 풀다운을 사용하여, 동일한 뉴클레오티드 서열을 함유하는 원형 RNA 및 선형 RNA 대응물의 혼합된 풀에서 원형 RNA의 8 퍼센트 증가를 보여준다.
실시예 10: 원형 RNA 제제에 존재하는 선형 RNA의 감소는 인코딩된 단백질의 발현을 증가시켰다
이 실시예는 대부분 원형 RNA인 조성물에 존재하는 선형 RNA의 감소가 세포 내의 인코딩된 단백질의 발현을 증가시키는 것을 보여준다.
이 실시예에 있어서, 원형 RNA는 IRES, 가우시아 루시퍼라제(GLuc)를 인코딩하는 ORF, 및 IRES-ORF에 측접한 2개의 스페이서 요소를 포함하였다.
2개의 뱃치의 원형 RNA를 생성하였다. 각 경우에, 원형 RNA를 시험관내에서 생성하였다. 비변형된 선형 RNA를 전사를 유도하기 위한 T7 RNA 폴리머라제 프로모터 및 상기 열거된 모든 모티프를 포함하는 DNA 주형으로부터 시험관내에서 전사시켰다. 전사된 RNA를 RNA 클린업 키트(뉴 잉글랜드 바이오랩스, T2050)를 사용하여 정제하고, 제조업체의 설명에 따라 RNA 5' 포스포하이드롤라제(RppH)(뉴 잉글랜드 바이오랩스, M0356)로 처리하고, RNA 정제 컬럼을 사용하여 다시 정제하였다. RppH 처리된 선형 RNA를 스플린트 DNA 5'-GGCTATTCCCAATAGCCGTT-3' 및 T4 RNA 리가제 2(뉴 잉글랜드 바이오랩스, M0239)를 사용하여 원형화시켰다. 원형 RNA를 우레아-PAGE 정제하고, 완충제(0.5 M 아세트산나트륨, 0.1% SDS, 1 mM EDTA) 중에 용리시키고, 에탄올 침전하고, RNA 보관 용액(써모피셔 사이언티픽, 카탈로그 번호 AM7000) 중에 재현탁화시켰다.
선형 RNA는 최종 원형 RNA 생성물에 남겨졌다. 최종 생성물을 6% TBE-우레아 겔 상에서 전개시키고, 밴드를 ImageJ를 사용하여 분석함으로써 최종 생성물 내의 원형 RNA의 순도 및 남아 있는 선형 RNA의 백분율을 각각의 뱃치에 대하여 정량화하였다. 총 RNA 세기에 비하여 circRNA의 세기를 계산함으로써 circRNA의 순도를 평가하고, 백분율로서 기록하였다. 여기서, 뱃치는 71% 순도 및 84% 순도의 것이었다.
0.2 pmole의 각각의 RNA 뱃치를 세포 트랜스펙션을 위해 사용하였다. RNA를 제조업체의 권고에 따라 Optimem 및 메신저 맥스(Messenger Max)와 조합하였다. 비히클 단독의 대조군을 유사하게 제조하였지만, 어떠한 RNA도 함유하지 않았다. 시간 = 0에, 각각의 제제를 BJ 섬유아세포에 첨가하였다.
가우시아 루시퍼라제의 활성을 가우시아 루시퍼라제 활성 검정(써모 사이언티픽 피어스)을 사용하여 시험하였다. 20 ㎕의 세포 상청액의 시료를 96 웰 플레이트(코닝(Corning) 3990)에 첨가하였다. 시료를 트랜스펙션 후 6시간째, 24시간째, 48시간째, 72시간째, 96시간째 및 120시간째에 취하였다. 요약하여, 1x 코엘렌테라진 기질을 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 기질 첨가 및 혼합 직후에 발광계 기기(프로메가)에서 판독하였다.
가우시아 루시퍼라제 활성은 트랜스펙션 후 6시간째, 24시간째, 48시간째, 72시간째, 96시간째 및 120시간째에 84% 순도의 원형 RNA를 사용하는 실험에서 세포 내에서 검출되었으며(도 8), 비히클 단독의 대조군에 의해 제공되는 발현보다 더 높았다. 84% 순도의 원형 RNA로부터 유래된 발현은 71% 순도의 원형 RNA로부터 유래된 발현보다 유의미하게 더 컸다. 트랜스펙션 후 24시간째에, GLuc 활성은 84% 순도의 원형 RNA를 트랜스펙션시킨 경우에, 71% 순도의 원형 RNA를 트랜스펙션시킨 경우에 비하여 397-배 더 컸다. GLuc 활성은 트랜스펙션 후 6시간째, 24시간째, 48시간째 및 72시간째에 71% 순도의 원형 RNA를 사용하는 실험에서 세포 내에서 검출되었으며(도 8), 비히클 단독의 대조군에 의해 제공되는 발현보다 더 높았다.
이 실시예는 더 큰 순도의(감소된 선형 RNA를 갖는) 원형 RNA가 인코딩된 단백질의 발현을 증가시키고, 연장시키는 것을 보여주었다.
실시예 11: 원형 RNA 제제에 존재하는 선형 RNA는 세포 내에서 용량 의존적 방식으로 원형 RNA 안정성에 영향을 미쳤다
이 실시예는 원형 RNA 제제 내의 선형 RNA 존재가 용량 의존적 방식으로 원형 RNA 안정성에 부정적으로 영향을 미치는 것을 보여준다.
이 실시예에서, 원형 RNA 및 선형 RNA를 하기와 같이 생성하였다. 비변형된 선형 RNA를 DNA 세그먼트로부터 T7 RNA 폴리머라제를 사용하여 시험관내 전사에 의해 합성하였다. 전사된 RNA를 RNA 정제 시스템(뉴 잉글랜드 바이오랩스, 인코포레이티드)을 사용하여 정제하고, 제조업체의 설명에 따라 RNA 5' 피로포스포하이드롤라제(RppH)(뉴 잉글랜드 바이오랩스, 인코포레이티드, M0356)로 처리하고, RNA 정제 시스템을 사용하여 다시 정제하였다. 가우시아 루시퍼라제(GLuc)를 인코딩하는 ORF를 갖는 IRES 및 IRES-ORF에 측접하는 2개의 스페이서 요소를 포함하도록 원형 RNA를 설계하였다.
T4 RNA 리가제 2(뉴 잉글랜드 바이오랩스, 인코포레이티드, M0239)를 사용한 전사된 선형 RNA 및 DNA 스플린트의 처리에 의해 스플린트 라이게이션된 원형 RNA를 생성하였다.
원형 RNA를 정제하기 위하여, 라이게이션 혼합물을 4% 변성 PAGE 상에서 분리하고, 원형 및 선형 RNA의 각각에 상응하는 RNA 밴드를 절개하였다. 절개된 RNA 겔 단편(선형 또는 원형)을 파쇄하고, RNA를 37℃에서 1시간 동안 겔 용리 완충제(0.5M NaOAc, 1mM EDTA 및 0.1% SDS)를 사용하여 용리시켰다. 상청액을 수집하고, 겔 용리 완충제를 파쇄된 겔에 첨가함으로써 RNA를 다시 한번 용리하고, 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 겔 잔해를 원심분리 필터에 의해 제거하고, RNA를 에탄올을 사용하여 침전시켰다.
BJ 섬유아세포에서 원형 RNA 수준을 모니터링함으로써 겔 정제된 원형 RNA의 제제 내의 다양한 수준의 선형 RNA 대응물의 영향을 결정하였다. 96-웰 플레이트 내의 세포를 지질-기반의 트랜스펙션 시약(써모피셔 사이언티픽(LMRNA003))을 사용하여 겔 정제된 원형 RNA 제제 또는 다양한 수준의 겔-정제된 선형 RNA가 보충된 동량의 겔 정제된 원형 RNA 제제 중 어느 하나로 트랜스펙션시켰다. 원형 RNA 수준을 트랜스펙션 후 6시간째 및 1일째 내지 5일째에 circRNA 특이적 Q-PCR에 의해 분석하였다. 요약하여, cDNA를 파워(Power) SYBR 그린 셀 투(cell to) ct 키트(써모피셔 사이언티픽, 카탈로그 번호 4402953)를 사용하여 제조업체의 설명에 따라, 랜덤 프라이밍에 의해 세포 용해물로부터 생성하였다. Q-PCR을 외측 프라이머 설계를 사용하여 수행하여 오직 circRNA만을 증폭시키고, 그의 선형 대응물을 증폭시키지 않았으며, 하우스키핑 유전자로서 β-액틴을 사용해 Pfaffl 방법을 사용하여 배수-변화를 계산하였다.
원형 RNA는 조합된 원형 및 선형 RNA 둘 모두로 트랜스펙션된 세포에 비하여, 겔 정제된 원형 RNA 제제 단독으로 트랜스펙션된 세포에서 용량 의존적 방식으로 더 긴 기간 동안 더 많은 양으로 검출되었다(도 9). 단독의 정제된 원형 RNA의 수준은 120시간의 시간 경과에 걸쳐 안정하게 유지되었지만; 원형 및 선형 RNA 둘 모두의 조합으로 트랜스펙션된 세포에서 검출되는 원형 RNA의 수준은 시간이 지남에 따라 감소되었으며, 감소 속도는 선형 RNA의 수준에 비례하였다. 놀랍게도, 세포가 동량의 원형 RNA로 트랜스펙션될지라도, 선형 RNA 존재는 시간이 지남에 따라 원형 RNA 수준에 역비례하여 영향을 미쳤다.
이 실시예는 선형 RNA로부터 원형 RNA의 정제가 원형 RNA 안정성에 영향을 미치는 것을 보여준다.
실시예 12: 원형 RNA 제제에 존재하는 선형 RNA는 세포에서 선천 면역 반응에 용량 의존적 방식으로 영향을 미쳤다
이 실시예는 원형 RNA 제제에 존재하는 선형 RNA가 선천 면역 반응에 용량 의존적 방식으로 부정적으로 영향을 미치는 것을 보여준다.
이 실시예에서, 원형 RNA 및 선형 RNA를 하기와 같이 생성하였다. 비변형된 선형 RNA를 DNA 세그먼트로부터 T7 RNA 폴리머라제를 사용하여 시험관내 전사에 의해 합성하였다. 전사된 RNA를 RNA 정제 시스템(뉴 잉글랜드 바이오랩스, 인코포레이티드)을 사용하여 정제하고, 제조업체의 설명에 따라 RNA 5' 피로포스포하이드롤라제(RppH)(뉴 잉글랜드 바이오랩스, 인코포레이티드, M0356)로 처리하고, RNA 정제 시스템을 사용하여 다시 정제하였다. 가우시아 루시퍼라제(GLuc)를 인코딩하는 ORF를 갖는 IRES 및 IRES-ORF에 측접하는 2개의 스페이서 요소를 포함하도록 원형 RNA를 설계하였다.
T4 RNA 리가제 2(뉴 잉글랜드 바이오랩스, 인코포레이티드, M0239)를 사용한 전사된 선형 RNA 및 DNA 스플린트의 처리에 의해 스플린트 라이게이션된 원형 RNA를 생성하였다.
원형 RNA를 정제하기 위하여, 라이게이션 혼합물을 4% 변성 PAGE 상에서 분리하고, 원형 및 선형 RNA의 각각에 상응하는 RNA 밴드를 절개하였다. 선형 RNA를 동일한 4% 변성 PAGE 겔을 사용하여 정제하였다. 절개된 RNA 겔 단편(선형 또는 원형)을 파쇄하고, RNA를 37℃에서 1시간 동안 겔 용리 완충제(0.5M NaOAc, 1mM EDTA 및 0.1% SDS)를 사용하여 용리시켰다. 상청액을 수집하고, 겔 용리 완충제를 파쇄된 겔에 첨가함으로써 RNA를 다시 한번 용리하고, 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 겔 잔해를 원심분리 필터에 의해 제거하고, RNA를 에탄올을 사용하여 침전시켰다.
BJ 섬유아세포에서 원형 RNA 수준을 모니터링함으로써 겔 정제된 원형 RNA의 제제 내의 다양한 수준의 선형 RNA 대응물의 영향을 결정하였다. 96-웰 플레이트 내의 세포를 지질-기반의 트랜스펙션 시약(써모피셔 사이언티픽(LMRNA003))을 사용하여 겔 정제된 원형 RNA 제제 또는 다양한 수준의 겔-정제된 선형 RNA가 보충된 것을 제외하고 동량의 겔 정제된 원형 RNA 제제 중 어느 하나로 현탁액(역) 트랜스펙션시켰다. 면역 유전자 수준을 트랜스펙션 후 6시간째 및 1일째 내지 5일째에 Q-PCR에 의해 분석하였다. 요약하여, cDNA를 파워 SYBR 그린 셀 투 ct 키트(써모피셔 사이언티픽, 카탈로그 번호 4402953)를 사용하여 제조업체의 설명에 따라, 랜덤 프라이밍에 의해 세포 용해물로부터 생성하였다. Q-PCR을 면역 유전자 특이적 프라이머를 사용하여 수행하였으며, 하우스키핑 유전자로서 β-액틴 및 Pfaffl 방법을 사용하여 상대적 RNA 수준을 계산하였다.
단독의 겔 정제된 원형 RNA 제제로 트랜스펙션시킨 세포 내의 원형 RNA는 선천 면역 유전자의 제한된 발현의 증가를 보였다. 역으로, 조합된 원형 및 선형 RNA로 트랜스펙션시킨 세포는 용량 의존적 방식으로 선천 면역 유전자의 상향조절을 보였다(도 10).
실시예 13: 세포 배양물 내의 비-면역원성
이 실시예는 세포 트랜스펙션 후의 원형 RNA의 면역원성의 생체내 평가를 보여준다.
이 실시예에서, 엔크립토겐, 예를 들어, ZKSCAN1 인트론 및 GFP ORF를 포함하도록 원형 RNA를 설계한다. 또한, 인트론이 있거나 이것이 없는 GFP ORF를 포함하도록 대조군 원형 RNA를 설계하며, 도 11을 참조한다. 실시예 1 및 2에 기술된 바와 같이 원형 RNA를 시험관내 또는 세포 내에서 생성한다. HeLa 세포를 500 ng의 원형 RNA로 트랜스펙션시킨다.
원형 RNA의 트랜스펙션은 하기의 조건을 포함한다: (1) 세포 배양 배지 중 네이키드(naked) 원형 RNA(문헌[Lingor et al 2004]); (2) 전기천공법(문헌[Muller et al 2015]); (3) 양이온성 지질(SNALP, 박스펙틴(Vaxfectin))(문헌[Chesnoy and Huang, 2000]); (3) 양이온성 폴리머(PEI, 폴리브렌, DEAE-덱스트란)(터보펙트(Turbofect)); (4) 바이러스-유사 입자(HPV로부터의 L1, 폴리오마바이러스로부터의 VP1)(문헌[Tonges et al 2006]); (5) 엑소좀(SBI로부터의 Exo-Fect); (6) 나노구조화된 인산칼슘(nanoCaP)(문헌[Olton et al 2006]); (6) 펩티드 형질도입 도메인(TAT, polyR, SP, pVEC, SynB1 등)(문헌[Zhang et al 2009]); (7) 소낭(VSV-G, TAMEL)(문헌[Liu et al 2017]); (8) 세포 스퀴징(squeezing); (SQZ 바이오테크놀로지즈(SQZ Biotechnologies)) (9) 나노입자(문헌[Neuhaus et al 2016]); 및/또는 (10) 마그네토펙션(magnetofection)(문헌[Mair et al 2009]). 트랜스펙션 방법을 세포 배양 배지(DMEM 10% FBS)에서 수행한 후에, 세포를 24시간 내지 48시간 동안 배양한다.
트랜스펙션 후 2시간째 내지 48시간째에, 배지를 제거하고, 표기된 RNA 및 트랜스펙션된 RNA의 상대적 발현을 qRT-PCR에 의해 측정한다.
qRT-PCR 분석을 위해, 전체 RNA를 제조업체의 설명에 따라 페놀 기반의 RNA 단리 용액(TRIzol) 및 RNA 단리 키트(퀴아젠)를 사용하여 세포로부터 단리한다. qRT-PCR 분석을 PCR 마스터 믹스(브릴리언트 II SYBR 그린 qRT-PCR 마스터 믹스) 및 PCR 사이클러(라이트사이클러(LightCycler) 480)를 사용하여 3벌로 수행한다. 널리 알려져 있는 선천적 면역성 조절자, 예컨대 RIG-I, MDA5, OAS, OASL 및 PKR에 대한 mRNA 수준을 정량화하고, 액틴, GAPDH 또는 HPRT 값에 대해 정규화시킨다. 원형 RNA 트랜스펙션을 위한 표기된 RNA 유전자의 상대적 발현을 트랜스펙션된 RNA의 수준에 의해 정규화시키고, 엔크립토겐(들)을 함유하지 않는 원형 RNA 트랜스펙션을 사용한 세포의 발현 수준과 비교한다.
qRT-PCR 분석에 더하여, 웨스턴 블롯 분석 및 면역-조직화학을 실시예 6에 상기 기술된 바와 같이 사용하여, GFP 발현 효율을 평가한다.
엔크립토겐(들)을 함유하는 GFP 양성 세포는 약화된 면역원성 반응을 보일 것으로 예상된다.
또한, (1) 일차 뮤린 수지상 세포; (2) TLR-7, 8 또는 9를 발현하는 인간 배아 신장 293 안정 세포(인비보겐(InvivoGen)); (3) 단핵구 유래 수지상 세포(올셀즈(AllCells)) 또는 (4) Raw 264.7 세포를 상기 기술된 바와 같이 GFP를 인코딩하는 원형 RNA를 생성하는 ZKSCAN1 또는 td 인트론을 포함하는 DNA 플라스미드로 트랜스펙션시킨다. 트랜스펙션 후 6시간 내지 48시간 후에, 세포 배양 상청액을 수집하고, 사이토카인 발현을 ELISA를 사용하여 측정한다. 세포 배양 상청액을 수집하는 경우, 노던 블롯, 유전자 발현 어레이 및 FACS 분석을 위해 세포를 수집한다.
ELISA를 위해, 인터페론-β(IFN-β), 케모카인(C-C 모티프) 리간드 5(CCL5), IL-12(비디 바이오사이언스즈(BD Biosciences)), IFN-α, TNF-α 및 IL-8(바이오소스 인터내셔널(Biosource International))을 위한 ELISA 키트를 사용한다. ELISA를 제조업체의 권고에 따라 수행한다. 원형 RNA 트랜스펙션된 세포에 대한 표기된 사이토카인의 발현을 대조군 RNA 트랜스펙션된 세포의 수준과 비교한다. 엔크립토겐을 갖는 원형 RNA로 트랜스펙션시킨 세포는 대조군 트랜스펙션된 세포에 비하여 감소된 사이토카인 발현을 가질 것으로 예상된다.
노던 블롯 분석을 위해. 시료를 이전에 기술된 바와 같이 처리하고 분석한다. 프로브는 플라스미드로터 유래되며, 인간 IFN-알파 13, IFN-베타(오픈 바이오시스템즈(Open Biosystems)), TNF-알파 또는 GAPDH(ATCC)의 코딩 영역에 대해 특이적이다. 엔크립토겐을 갖는 원형 RNA로 트랜스펙션시킨 세포는 대조군 트랜스펙션된 세포에 비하여 감소된 사이토카인 발현을 가질 것으로 예상된다.
유전자 발현 어레이를 위해, RNA를 페놀 기반의 용액(TRIzol) 및/또는 RNA 단리 키트(RNeasy 퀴아젠)를 사용하여 단리한다. RNA를 증폭시키고 분석한다(예를 들어, 일루미나 비드스테이션(Illumina BeadStation) 500GX 내의 일루미나(Illumina) 인간 HT12v4 칩). 모의 대조군 처리된 세포 내의 수준을 배수 증가의 계산을 위한 기준선으로서 사용한다. 엔크립토겐을 갖는 원형 RNA로 트랜스펙션시킨 세포는 대조군 트랜스펙션된 세포에 비하여 감소된 사이토카인 발현을 가질 것으로 예상된다.
FACS 분석을 위해, 세포를 CD83(리서치 다이아그노스틱스 인코포레이티드(Research Diagnostics Inc)), HLA-DR, CD80 또는 CD86에 대한 직접 컨쥬게이트된 항체로 염색하고, 유세포분석기에서 분석한다. 엔크립토겐을 갖는 원형 RNA로 트랜스펙션시킨 세포는 대조군 트랜스펙션된 세포에 비하여 감소된 이들 마커의 발현을 보일 것으로 예상된다.
실시예 14: 선택적 발현을 위한 리보스위치
이 실시예는 생체내에서 원형 RNA로부터의 단백질 발현을 제어하는 능력을 보여준다.
이 실시예를 위해, 엔크립토겐(들)(SEQ ID NO: 4), GFP를 인코딩하는 ORF(SEQ ID NO: 2)와 함께 GFP ORF에 측접하는 스태거 요소(2A 서열)(SEQ ID NO: 3)의 발현을 조절하는 합성 리보스위치(SEQ ID NO: 9)를 포함하도록 원형 RNA를 설계하며, 도 12를 참조한다. 본원에 그들 전체가 참조로 포함되는 국제 특허 공개 제WO2019118919A1호의 [0356] 내지 [0365]에 기술된 실시예 1 및 2 및 그들의 상응하는 도면에 기술된 바와 같이 원형 RNA를 시험관내 또는 세포 내에서 생성한다.
테오필린은 리보스위치의 활성화를 유도하여, 유전자 발현의 오프-스위치를 초래한다(문헌[Auslander et al 2010]에 기술된 바와 같음). 리보스위치가 원형 RNA로부터의 GFP 발현을 제어하는 것이 예상된다. 테오필린의 존재 하에서, GFP 발현이 관찰되는 것으로 예상되지 않는다.
HeLa 세포를 테오필린 의존성 합성 리보스위치(SEQ ID NO: 9)의 제어 하에 GFP를 인코딩하는 기술된 원형 RNA 500 ng으로 트랜스펙션시켜, 선택적 발현을 평가한다. 트랜스펙션 방법은 실시예 7에 기술되어 있다.
37℃ 및 5% CO2에서 24시간의 배양 후에, 세포를 1 nM 내지 3 mM 범위의 농도로 테오필린과 함께 또는 이것 없이 처리한다. 24시간의 연속 배양 후에, 세포를 실온에서 15분 동안 4% 파라포름알데히드 중에 고정하고, 0.2% 세제와 함께 PBS 중 10% FBS를 사용하여 45분 동안 블로킹하고 투과화시킨다. 그 다음, 시료를 실온에서 2시간 동안 또는 4℃에서 밤새, 10% FBS 및 0.1% 세제를 갖는 PBS 중에서 GFP에 대한 일차 항체(인비트로겐), 및 Alexa 488 및 DAPI와 컨쥬게이트된 이차 항체(인비트로겐)와 인큐베이션시킨다. 그 다음, 세포를 PBS를 사용하여 세척한 후에, 형광 현미경을 사용하여 GFP 발현에 대해 분석한다.
실시예 15: 생체내에서의 비-면역원성
이 실시예는 세포 트랜스펙션 후의 원형 RNA의 면역원성의 생체내 평가를 보여준다.
이 실시예에는 엔크립토겐(이 경우에는 인트론)을 보유한 원형 RNA의 투여 후의 면역 반응의 정량화 및 비교가 기술되며, 도 13을 참조한다. 일 실시형태에서, 엔크립토겐을 갖는 원형 RNA 중 임의의 것은 원형 RNA의 1회 이상의 투여 후에 대조군에 비하여 감소된(예를 들어, 대조군 RNA의 투여에 비하여 감소된) 면역원성 반응을 가질 것이다.
원형 RNA에 대한 면역원성의 척도는 혈청 중 사이토카인 수준이다.
이 실시예에서, 사이토카인 혈청 수준을 원형 RNA의 1회 이상의 투여 후에 시험한다. 이전의 실시예 중 어느 하나로부터의 원형 RNA를 피내(ID), 근육내(IM), 경구(PO), 복강내(IP) 또는 정맥내(IV)를 통해 6 내지 8주령 BALB/c 마우스 내로 투여한다. 혈청을 다음의 상이한 코호트로부터 얻는다: 엔크립토겐을 보유한 원형 RNA 및 엔크립토겐이 없는 원형 RNA의 주사(들)를 전신으로 및/또는 국소로 주사한 마우스.
수집된 혈청 시료를 PBS 중에 1 내지 10배 희석하고, 효소-연결 면역흡착 검정(PBL 바이오메디컬 랩스(PBL Biomedical Labs), 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재)에 의해 마우스 IFN-α 및 TNF-α(알앤디(R&D), 미국 미네소타주 미네아폴리스 소재)에 대해 분석한다.
혈청 중 사이토카인 수준에 더하여, 염증성 마커의 발현은 면역원성의 또 다른 척도이다. 이 실시예에서, 비히클(원형 RNA 부재), 선형 RNA 또는 원형 RNA로 처리된 마우스 유래의 비장 조직을 투여 후 1시간, 4시간 및 24시간째에 수집할 것이다. 시료를 하기의 기법 qRT-PCR 분석, 노던 블롯 또는 FACS 분석을 사용하여 분석할 것이다.
qRT-PCR 분석을 위해, RIG-I, MDA5, OAS, OASL, TNF-알파 및 PKR에 대한 mRNA 수준을 이전에 기술된 바와 같이 정량화한다.
노던 블롯 분석을 위해, 시료를 상기 기술된 바와 같이 처리하고 IFN-알파 13, IFN-베타(오픈 바이오시스템즈), TNF-알파 또는 GAPDH(ATCC)에 대해 분석한다.
FACS 분석을 위해, 세포를 CD83(리서치 다이다아그노스틱스 인코포레이티드), HLA-DR, CD80 또는 CD86에 대한 직접 컨쥬게이트된 항체로 염색하고, 유세포분석기에서 분석한다.
일 실시형태에서, 엔크립토겐을 갖는 원형 RNA는 (ELISA, 노던 블롯, FACS 및/또는 qRT-PCR에 의해 결정하여) 대조군 RNA에 비하여, 1회 또는 다수의 투여 후에 감소된 사이토카인 수준을 가질 것이다.
실시예 16: 원형 RNA는 적어도 하나의 이중-가닥 RNA 세그먼트를 포함한다
이 실시예는 원형 RNA가 적어도 하나의 이중-가닥 RNA 세그먼트를 포함하는 것을 보여준다.
이 실시예에서, GFP ORF 및 IRES를 포함하도록 원형 RNA를 이전에 기술된 방법 중 하나를 통해 합성하며, 도 14를 참조한다. J2 및 K1 모노클로널 항체를 사용한 점 블롯 검정을 사용하여, 적어도 40 bp 길이의 이중 가닥 RNA 구조를 측정할 것이다. 원형 RNA(200 ng)를 나일론 멤브레인(초 하전된 나이트란(Nytran)) 상으로 블롯팅하고, 건조시키고, TBS-T 완충제(50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0.05% Tween-20, pH 7.4) 중 5% 탈지 분유로 블로킹하고, dsRNA-특이적 mAb J2 또는 K1(잉글리쉬 앤드 사이언티픽 컨설팅(English & Scientific Consulting))과 60분 동안 인큐베이션시킨다. 멤브레인을 TBS-T로 6회 세척한 다음, HRP-컨쥬게이트된 당나귀 항-마우스 Ig(잭슨 이뮤놀로지(Jackson Immunology))로 처리한 후, 6회 세척하고, 점을 증강 화학발광 웨스턴 블롯 검출 시약(아머샴(Amersham))을 사용하여 가시화시킨다.
원형 RNA는 내부 준-이중 가닥 RNA 세그먼트를 생성하는 것으로 예상된다.
실시예 17: 원형 RNA는 준-이중-가닥 구조를 포함한다
이 실시예는 원형 RNA가 준-이중-가닥 구조를 포함하는 것을 보여준다.
이 실시예에서, 원형 RNA를 HDVmin(문헌[Griffin et al 2014])의 발현의 부가와 함께 또는 이것 없이 이전에 기술된 방법 중 하나를 통해 합성한다. 이러한 RNA 서열은 준-나선 구조를 형성하고, 도 15를 참조하며, 이를 양성 대조군으로서 사용한다(문헌[Griffin et al 2014]에 의해 나타낸 바와 같음).
원형 RNA 구조가 기능적 준-이중-가닥 구조를 포함하는지를 시험하기 위해, 본 발명자들은 프라이머 연장에 의해 분석되는 선택적 2'OH 아실화(SHAPE)를 사용하여 이차 구조를 결정할 것이다. SHAPE는 단일-뉴클레오티드 분해력으로 RNA에서 국부 백본 유연성을 평가한다. SHAPE 친전자체에 대한 염기 위치의 반응성은 이차 구조와 관련된다: 염기쌍이 형성된 위치는 약하게 반응성인 한편, 쌍이 형성되지 않은 위치는 더욱 고도로 반응성이다.
SHAPE를 원형 RNA, HDVmin 및 선형 RNA 함유에서 수행한다. SHAPE를 각각 본질적으로 문헌[Wilkinson et al 2006] 및 문헌[Griffin 2014 et al]에 의해 보고된 바와 같이 N-메틸이사토익 무수물(NMIA) 또는 벤조일 시아나이드(BzCN)를 사용하여 수행한다. BzCN을 사용한 SHAPE에 대해 요약하여, 디메틸 술폭시드(DMSO) 중 800 mM BzCN 1 ㎕를 160 mM Tris, pH 8.0 중 3 내지 6 pmol의 RNA, 1 U/l RNAse 저해제(예를 들어, SuperaseIn RNase 저해제)를 함유하는 20 ㎕의 반응 혼합물에 첨가하고, 37℃에서 1분 동안 인큐베이션시킨다. 대조군 반응 혼합물은 BzCN 없이 1 ㎕ DMSO를 포함한다. BzCN과의 인큐베이션 후에, RNA를 페놀 클로로포름을 사용하여 추출하고, 제조업체에 의해 지시된 바와 같이 정제하고(예를 들어, RNA 클린 앤드 컨센트레이터(Clean & Concentrator)-5 키트 사용), 6 ㎕의 10 mM Tris, pH 8.0 중에 재현탁시킨다. 1-염료 시스템을 사용하여 BzCN 부가물을 검출한다. RNA를 6-카복시플루오레세인(6-FAM)으로 표지된 프라이머와 어닐링시킨다. 제조업체의 권고에 따라 역전사효소(슈퍼스크립트 III - 인비트로겐)를 사용하여, 프라이머 연장을 인큐베이션 조건에 대한 하기의 변형과 함께 수행한다: 42℃에서 5분, 55℃에서 30분, 65℃에서 25분 및 75℃에서 15분. 프라이머 연장 반응에서 0.5 mM ddATP 또는 0.5 mM ddCTP 중 어느 하나를 사용하여 2개의 서열분석 래더를 생성한다. 프라이머 연장 생성물을 에탄올을 사용하여 침전시키고, 세척하여 과잉의 염을 제거하고, 상용의 크기 표준물질(예를 들어, Liz 크기 표준물질 젠위즈(Genewiz) 단편 분석 서비스(Fragment Analysis Service))과 함께 모세관 전기영동에 의해 분리한다.
미가공 전기영동도를 일차 단편 분석 툴(예를 들어, 피크스캐너(PeakScanner) 어플라이드 바이오- 시스템즈(Applied Bio- systems))을 사용하여 분석한다. 그 다음, 전기영동도에서 각 위치에서의 피크를 적분한다. 분석된 각 RNA에 있어서, 로딩 오차를 보정하기 위한 y 축 스케일링을 수행하여, 각 프라이머 연장 반응에 대한 백그라운드가 BzCN으로 처리되지 않은 RNA에서 수행되는 음성-대조군 반응의 것에 대해 정규화되게 한다. 신호 감쇠 보정을 각 반응에 대한 데이터에 적용한다. 피크를 2가지 서열분석 반응으로부터 생성된 래더에 대해 정렬한다. 각 위치에서, 음성 대조군의 피크 면적을 BzCN-처리된 시료에서의 피크 면적으로부터 감산한 다음; 감산된 피크 면적을 감산된 피크 면적의 최고 2% 내지 10%의 평균으로 나눔으로써 이들 값을 정규화된 SHAPE 반응성으로 전환시킨다.
SHAPE 분석에 더하여, 본 발명자들은 NMR(문헌[Marchanka et al 2015]); 하이드록실 라디칼 프로빙(문헌[Ding et al 2012]); 또는 DMS 및 CMTC 및 케톡살(Kethoxal)의 조합(문헌[Tijerina et al 2007] 및 문헌[Ziehler et al 2001])을 수행할 것이다.
원형 RNA는 준-이중-가닥 구조를 가질 것으로 예상된다.
실시예 18: 원형 RNA는 기능적 준-나선 구조를 포함한다
이 실시예는 원형 RNA가 기능적 준-나선 구조를 포함하는 것을 보여준다.
이 실시예에서, 원형 RNA를 395L의 발현의 부가와 함께, 이전에 기술된 방법 중 하나를 통해 합성한다(문헌[Defenbaugh et al 2009]). 이 RNA 서열은 준-나선 구조를 형성하며(상기 나타낸 바와 같이, RNA 이차 구조 폴딩 알고리즘 mfold 및 문헌[Defenbaugh et al 2009]에 의해), 도 16을 참조한다. 이 구조는 D형 간염 항원(HDAg)과의 복합체 형성에 필수적이다.
따라서, 원형 RNA 구조가 기능적 준-구조를 포함하는지를 시험하기 위해, 본 발명자들은 원형 RNA 및 선형 RNA를 HDAg-160 또는 HDAg-195와 인큐베이션시키고, EMSA 검정을 사용하여 결합을 분석할 것이다. 결합 반응을 10 mM Tris-HCl(pH 7.0), 25 mM KCl, 10 mM NaCl, 0.1 g/l 소 혈청 알부민(뉴 잉글랜드 바이오랩스), 5% 글리세롤, 0.5 mM DTT, 0.2 U/l RNase 저해제(어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)) 및 1 mM 페닐메틸술포닐 플루오라이드 용액을 포함하는 25 ㎕ 중에서 행한다. 원형 RNA를 0 내지 110 nM 범위의 농도로 HDAg 단백질(문헌[Defenbaugh et al 2009]에 기술된 바와 같이 수득됨)과 인큐베이션시킨다. 반응 혼합물을 얼음 상에서 모으고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션시키고, 240 V에서 2.5시간 동안 0.5 트리스-붕산염-EDTA 중 6% 고유(native) 폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동시킨다. 유리 및 결합된 RNA의 수준을 핵산 염색(예를 들어, gelred)을 사용하여 결정한다. 결합은 백그라운드를 제한 전체 레인의 세기에 비한 미결합된 RNA의 세기로서 계산할 것이다.
원형 RNA는 기능적 준-나선 구조를 가질 것으로 예상된다.
실시예 19: 자가-전사/복제
이 실시예에서, 원형 RNA를 HDV 복제 도메인(들)의 발현(문헌[Beeharry et al 2014]에 의해 기술된 바와 같음), 안티게놈 복제 적격 리보자임 및 핵 국소화 신호의 부가와 함께 이전에 기술된 방법 중 하나를 통해 합성한다. 이들 RNA 서열은 원형 RNA가 핵 내에 위치되게 하며, 여기서 숙주 RNA 폴리머라제가 결합하고 RNA를 전사할 것이다. 그 다음, 이 RNA는 리보자임을 사용하여 자가-절단된다. 그 다음, RNA는 라이게이션되고 다시 자가-복제되며, 도 17을 참조한다.
원형 RNA(1 내지 5 마이크로그램)를 상기 기술된 기법을 사용하여 HeLa 세포 내로 트랜스펙션시킬 것이다. HeLa 세포를 페니실린-스트렙토마이신 및 10% 우태아혈청이 보충된 고 글루코스를 갖는 둘베코 변형 이글스 배지(DMEM)(라이프 테크놀로지즈)에서 37℃ 및 5% CO2에서 성장시킨다. 트랜스펙션 후에, HeLa 세포를 추가 4시간 내지 72시간 동안 배양한 다음, 트랜스펙션된 세포로부터 전체 RNA를 트랜스펙션 후 1시간째 내지 20일째에 제조업체의 설명에 따라 페놀-기반의 RNA 단리 시약(라이프 테크놀로지즈)을 사용하여 단리하고, HDV 도메인을 인코딩하는 원형 RNA의 총량을 본원에 기술된 바와 같은 qPCR을 사용하여 결정하고, 대조군 원형 RNA와 비교할 것이다.
실시예 20: 딸 세포에서의 원형 RNA 보존
이 실시예에서, 원형 RNA를 이전에 기술된 방법 중 하나를 통해 합성한다. 엔크립토겐(SEQ ID NO: 4) 및 GFP를 인코딩하는 ORF(SEQ ID NO: 2)와 함께 GFP ORF에 측접한 스태거 요소(SEQ ID NO: 3)를 포함하도록 원형 RNA를 설계하며, 도 18을 참조한다.
인간 섬유아세포(예를 들어, IMR-90)를 조직 배양물 처리된 플레이트에서 5% CO2 하에 37℃에서 10% 우태아혈청(FBS; 인비트로겐)이 보충된 둘베코 변형 이글스 배지(DMEM; 인비트로겐)에서 성장시킨다. 세포를 정기적으로 계대하여, 지수적 성장을 유지한다. 지질 트랜스펙션 시약(2 ㎕; 인비트로겐)을 12-웰 조직 배양물 처리된 플레이트 중 하나의 웰 내의 1 ㎍의 원형 RNA 또는 선형 RNA(상기 기술됨)와, 145 ㎕의 환원된 혈청 배지(Opti-MEM I 용액)의 혼합물에 첨가한다. 실온에서 15분 동안 인큐베이션한 후에, 10% FBS가 있는 DMEM 중에 현탁화된 1×10^5개 HeLa 세포를 원형 RNA 용액(상기 기술됨)에 첨가한다. 37℃ 및 5% CO2에서 24시간 동안의 인큐베이션 후에, 세포를 BrdU(예를 들어, 시그마-알드리치)를 사용하여 펄싱시킨다. BrdU, 표지화 기간을 그들의 특정 집단 배가 시간에 따라 각 세포 유형에 대해 최적화시키며, 예를 들어, IMR-90 인간 섬유아세포는 27시간의 배가 시간을 가지며, 문헌[Elabd et al 2013]에 기술된 바와 같이 8시간 내지 9시간 동안 펄싱시킨다.
세포를 BrdU 펄스 후 1일째, 2일째, 3일째, 4일째, 5일째 및 10일째에 수집할 것이다. 세포의 하위세트를 q-rt-PCR로 단리하고, 또 다른 하위세트는 FACS 분석을 위한 것이다. GFP 원형 RNA 및 mRNA 수준을 측정하기 위해, 랜덤 헥사머를 사용한 qPCR 역전사를 그들 전체가 본원에 참조로 포함되는 국제 특허 공개 제WO2019118919A1호의 [0360] 내지 [0365]에 기술된 실시예 2 및 그의 상응하는 도면에 기술된 바와 같이 수행한다. 세포를 본원에 기술된 바와 같은 BrdU 및 GFP 항체를 사용하여 FACS를 사용해 분석할 것이다.
원형 RNA가 딸 세포에서 유지될 것이며, 딸 세포가 GFP 단백질을 발현할 것으로 예상된다.
실시예 21: 원형 RNA 원형화
이 실시예는 스플린트 라이게이션을 사용한 원형 RNA의 시험관내 생성을 보여준다.
비-천연 발생 원형 RNA를 조작하여 하나 이상의 바람직한 특성을 포함시킬 수 있으며, 재조합 DNA 기술을 사용하여 생성할 수 있다. 하기의 실시예에 나타낸 바와 같이, 스플린트 라이게이션은 선형 RNA를 원형화시킨다.
circRNA1을 정지 코돈 없이 삼중 FLAG 태깅된 EGF를 인코딩하도록 설계하였다(264개 뉴클레오티드). 이는 번역 개시를 위한 출발 코돈에 코작 서열(SEQ ID NO: 11)을 갖는다. cirRNA2는 그것이 종결 요소(삼중 정지 코돈)를 갖는 것을 제외하고 원형 RNA1과 동일한 서열을 갖는다(273개 뉴클레오티드, SEQ ID NO: 12). 원형 RNA3을 종결 요소(정지 코돈) 없이 스태거 요소(2A 서열, SEQ ID NO: 13)에 측접한 삼중 FLAG 태깅된 EGF를 인코딩하도록 설계하였다(330개 뉴클레오티드). circRNA4는 그것이 종결 요소(삼중 정지 코돈)를 갖는 것을 제외하고, 원형 RNA3과 동일한 서열을 갖는다(339개 뉴클레오티드).
이 실시예에서, 원형 RNA를 하기와 같이 생성하였다. 시험관내 전사를 위한 DNA 주형을 역방향 프라이머를 사용하여 2-O-메틸화된 뉴클레오티드 및 T7 프로모터-보유 정방향 프라이머를 사용하여 상응하는 서열(IDT)을 갖는 gBlocks 유전자 단편으로부터 증폭시켰다. 증폭된 DNA 주형을 DNA 겔 정제 키트(퀴아젠)를 사용하여 겔-정제하였다. 250 내지 500 ng의 정제된 DNA 주형을 시험관내 전사로 처리하였다. 선형, 5'-단일 인산화된 시험관내 전사물을 7.5 mM GMP, 1.5 mM GTP, 7.5 mM UTP, 7.5 mM CTP 및 7.5 mM ATP의 존재 하에, 상응하는 서열을 갖는 각 DNA 주형으로부터 T7 RNA 폴리머라제를 사용하여 생성하였다. 대략 40 ㎍의 선형 RNA가 각 반응에서 생성되었다. 인큐베이션 후에, 각 반응물을 DNase로 처리하여 DNA 주형을 제거하였다. 시험관내 전사된 RNA를 2.5 M 아세트산암모늄의 존재 하에 에탄올을 사용하여 침전시켜, 비혼입된 모노머를 제거하였다.
전사된 선형 RNA를 주형으로서 20개 뉴클레오티드 스플린트 DNA 올리고머(SEQ ID NO: 14)에서 T4 RNA 리가제 2를 사용하여 원형화시켰다. 스플린트 DNA를 선형 RNA 각각의 5' 또는 3' 말단의 10개 뉴클레오티드에 어닐링되도록 설계하였다. 스플린트 DNA(3 μM)와의 어닐링 후에, 1 μM 선형 RNA를 37℃ 또는 4시간째에 0.5 U/㎕ T4 RNA 리가제 2와 인큐베이션시켰다. T4 RNA 리가제 2가 없는 혼합물을 음성 대조군으로서 사용하였다.
선형 RNA의 원형화를 6% 변성 PAGE에서 RNA를 분리함으로써 모니터링하였다. 변성 폴리아크릴아미드 겔에서 더 느리게 이동하는 RNA 밴드는 선형 RNA보다는 원형 RNA에 상응하며, 이는 그들의 원형 구조 때문이다. 도 19에 나타낸 바와 같이, RNA 혼합물로의 리가제의 첨가(+ 레인)는 리가제를 결여한 혼합물(- 레인)에 존재하는 선형 RNA 밴드 위에 나타나는 새로운 밴드를 생성하였다. 더 느리게 이동하는 밴드는 모든 RNA 혼합물에서 나타났으며, 이는 음성 대조군에 비하여 다수의 구축물에서 발생하는 성공적인 스플린트 라이게이션(예를 들어, 원형화)을 나타낸다.
실시예 22: RNA 원형화 효율
이 실시예는 RNA 스플린트 라이게이션의 원형화 효율을 보여준다.
하나 이상의 바람직한 특성을 포함하도록 조작된 비-천연 발생 원형 RNA는 스플린트 매개된 원형화를 사용하여 생성될 수 있다. 하기의 실시예에 나타낸 바와 같이, 스플린트 라이게이션에 의해 대조군보다 더 높은 효율로 선형 RNA가 원형화되었다.
실시예 21에 기술된 바와 같은 CircRNA1, CircRNA2, CircRNA3 및 CircRNA4를 또한 여기서 사용하였다. CircRNA5를 2A 서열에 측접한 FLAG 태깅된 EGF에 이어서 FLAG 태깅된 나노 루시퍼라제를 인코딩하도록 설계하였다(873개 뉴클레오티드, SEQ ID NO: 17). CircRNA6은 그것이 EGF와 나노 루시퍼라제 유전자 사이에 종결 요소(삼중 정지 코돈)를 포함하고, 나노 루시퍼라제 서열의 말단에 종결 요소(삼중 정지 코돈)를 포함한 것을 제외하고 원형 RNA5와 동일한 서열을 갖는다(762개 뉴클레오티드, SEQ ID NO: 18).
이 실시예에서, RNA의 원형화 효율을 측정하기 위해, 6가지 상이한 크기의 선형 RNA(264개 뉴클레오티드, 273개 뉴클레오티드, 330개 뉴클레오티드, 339개 뉴클레오티드, 873개 뉴클레오티드 및 762개 뉴클레오티드)를 실시예 1에 기술된 바와 같이 생성하고 원형화시켰다. 원형 RNA를 6% 변성 PAGE에 의해 분리하고, 선형 또는 원형 RNA에 대한 겔 상의 상응하는 RNA 밴드를 정제를 위해 절개하였다. 절개된 RNA 겔 밴드를 분쇄하고, RNA를 800 ㎕의 300 mM NaCl을 사용하여 밤새 용리시켰다. 겔 잔해를 원심분리 필터에 의해 제거하였으며, RNA를 0.3 M 아세트산나트륨의 존재 하에 에탄올을 사용하여 침전시켰다.
원형화 효율을 하기와 같이 계산하였다. 용리된 원형 RNA의 양을 전체 용리된 RNA 양(원형 + 선형 RNA)으로 나누었으며, 결과는 도 20에 그래프로서 도시하였다.
T4 RNAse 리가제 2를 사용한 선형 RNA의 라이게이션에 의해, 대조군보다 더 높은 효율 비로 원형 RNA를 생성하였다. 트렌딩 데이터에 의해, 더 큰 구축물이 더 높은 비로 원형화되는 것으로 나타났으며, 예를 들어, 대략 800개 뉴클레오티드를 갖는 선형 RNA가 대략 80%의 원형화 효율을 갖는 것으로 나타난 한편, 대략 200 내지 400개 뉴클레오티드를 갖는 선형 RNA는 50% 내지 80%의 범위의 원형화 효율을 가졌다.
실시예 23: 분해 감수성을 결여한 원형 RNA
이 실시예는 RNase R에 의한 분해에 대한 원형 RNA 감수성을 선형 RNA와 비교하여 보여준다.
원형 RNA는 5' 및 3' 말단의 결여로 인하여 선형 RNA보다 엑소뉴클레아제 분해에 대해 더욱 저항성이다. 하기의 실시예에 나타낸 바와 같이, 원형 RNA는 그의 선형 RNA 대응물보다 분해에 대한 감수성이 더 낮았다.
본원에 기술된 검정에서 사용하기 위해 CircRNA5를 실시예 22에 기술된 바와 같이 생성하고 원형화시켰다.
CircRNA5의 원형화를 시험하기 위해, 20 ng/㎕의 선형 또는 CircRNA5를 2 U/㎕의 RNAse R, 선형 RNA를 분해하지만 올가미형 또는 원형 RNA 구조를 분해하지 않는 3'에서 5' 엑소리보뉴클레아제와 37℃에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후에, 반응 혼합물을 6% 변성 PAGE에 의해 분석하였다.
엑소뉴클레아제를 결여한 레인에 존재하는 선형 RNA 밴드가 CircRNA5 레인에서 부재하였으며(도 21 참조), 이는 CircRNA5가 선형 RNA 대조군에 비하여 엑소뉴클레아제 처리에 대하여 더 높은 저항성을 보였음을 나타낸다.
실시예 24: 원형 RNA의 단리 및 정제
이 실시예는 UREA 겔 분리를 사용한 원형 RNA 정제를 보여준다.
실시예 19 및 20에 기술된 바와 같은 CircRNA1, CircRNA2, CircRNA3, CircRNA4, CircRNA5 및 CircRNA6을 본원에 기술된 바와 같이 단리하였다.
이 실시예에서, 선형 및 원형 RNA를 기술된 바와 같이 생성하였다. 원형 RNA를 정제하기 위해, 라이게이션 혼합물을 6% 변성 PAGE에서 분리하고, 원형 RNA의 각각에 상응하는 RNA 밴드를 절개하였다. 절개된 RNA 겔 단편을 분쇄하고, RNA를 800 ㎕의 300 mM NaCl을 사용하여 밤새 용리시켰다. 겔 잔해를 원심분리 필터에 의해 제거하였으며, RNA를 0.3 M 아세트산나트륨의 존재 하에 에탄올을 사용하여 침전시켰다. 용리된 원형 RNA를 6% 변성 PAGE에 의해 분석하였으며, 도 22를 참조한다.
단일의 밴드를 다양한 크기를 갖는 원형 RNA에 대하여 PAGE에 의해 가시화시켰다.
실시예 25: 단백질 발현의 검출
이 실시예는 원형 RNA로부터의 시험관내 단백질 발현을 보여준다.
단백질 발현은 mRNA로부터 특정 단백질을 생성하는 과정이다. 이 과정은 메신저 RNA(mRNA)로의 DNA의 전사에 이어서, 폴리펩티드 쇄로의 mRNA의 번역을 포함하며, 이 폴리펩티드 쇄는 궁극적으로 기능적 단백질로 폴딩되며, 특정 하위세포 또는 세포외 위치에 표적화될 수 있다.
하기의 실시예에 나타낸 바와 같이, 단백질을 시험관내에서 원형 RNA 서열로부터 발현하였다.
원형 RNA를 종결 요소(정지 코돈) 없이 2A 서열에 측접한 삼중 FLAG 태깅된 EGF를 인코딩하도록 설계하였다(330개 뉴클레오티드, SEQ ID NO: 19).
선형 또는 원형 RNA를 25 ㎕의 부피에서 30℃에서 토끼 망상적혈구 용해물 중에 5시간 동안 인큐베이션시켰다. 반응 혼합물의 최종 조성은 70% 토끼 망상적혈구 용해물, 20 μM 아미노산, 0.8 U/㎕ RNase 저해제 및 1 ㎍의 선형 또는 원형 RNA를 함유하였다. 인큐베이션 후에, 아세트산(0.32 ㎕) 및 물(300 ㎕)을 반응 혼합물(16 ㎕)에 첨가하고 15℃에서 10분 동안 20,817 xg에서 원심분리시킴으로써 헤모글로빈 단백질을 제거하였다. 상청액을 제거하고, 펠렛을 30°l의 2x SDS 시료 완충제 중에 용해시키고, 70℃에서 15분 동안 인큐베이션시켰다. 1400 xg에서 5분 동안 원심분리한 후에, 상청액을 10% 내지 20% 기울기 폴리아크릴아미드/SDS 겔에서 분석하였다.
건식 전달 방법을 사용하여 니트로셀룰로스 멤브레인으로 전기전달한 후에, 블롯을 항-FLAG 항체 및 항-마우스 IgG 퍼옥시다제와 인큐베이션시켰다. 블롯을 ECL 키트로 가시화시켰으며(도 23 참조), 웨스턴 블롯 밴드 세기를 ImageJ에 의해 측정하였다.
형광이 검출되었으며, 이는 발현 생성물이 존재하였음을 나타낸다. 따라서, 원형 RNA는 단백질의 발현을 유도하는 것으로 나타났다.
실시예 26: IRES-독립적 발현
이 실시예는 IRES의 부재 하에 발현을 유도하는 원형 RNA를 보여준다.
IRES 또는 내부 리보솜 진입 부위는 캡-독립적 방식으로 번역 개시를 가능하게 하는 RNA 요소이다. 원형 RNA는 IRES의 부재 하에 Flag 단백질의 발현을 유도하는 것으로 나타났다.
원형 RNA를 종결 요소(정지 코돈) 없이 2A 서열에 측접한 삼중 FLAG 태깅된 EGF를 인코딩하도록 설계하였다(330개 뉴클레오티드, SEQ ID NO: 19).
선형 또는 원형 RNA를 25 ㎕의 부피에서 30℃에서 토끼 망상적혈구 용해물 중에 5시간 동안 인큐베이션시켰다. 반응 혼합물의 최종 조성은 70% 토끼 망상적혈구 용해물, 20 μM 아미노산, 0.8 U/㎕ RNase 저해제 및 1 ㎍의 선형 또는 원형 RNA를 포함하였다. 인큐베이션 후에, 아세트산(0.32 ㎕) 및 물(300 ㎕)을 반응 혼합물(16 ㎕)에 첨가하고 15℃에서 10분 동안 20,817 xg에서 원심분리시킴으로써 헤모글로빈 단백질을 제거하였다. 상청액을 제거하고, 펠렛을 30°l의 2x SDS 시료 완충제 중에 용해시키고, 70℃에서 15분 동안 인큐베이션시켰다. 1400 xg에서 5분 동안 원심분리한 후에, 상청액을 10% 내지 20% 기울기 폴리아크릴아미드/SDS 겔에서 분석하였다.
건식 전달 방법을 사용하여 니트로셀룰로스 멤브레인으로 전기전달한 후에, 블롯을 항-FLAG 항체 및 항-마우스 IgG 퍼옥시다제와 인큐베이션시켰다. 블롯을 증강된 화학발광(ECL) 키트로 가시화시켰으며(도 23 참조), 웨스턴 블롯 밴드 세기를 ImageJ에 의해 측정하였다.
발현 생성물은 심지어 IRES의 부재 하에서도 원형 RNA 반응 혼합물에서 검출되었다.
실시예 27: 캡-독립적 발현
이 실시예는 원형 RNA가 캡의 부재 하에 발현을 유도할 수 있음을 보여준다.
캡은 mRNA의 5' 말단 상의 특별히 변경된 뉴클레오티드이다. 5' 캡은 선형 mRNA의 안정성뿐만 아니라 번역 개시에 유용하다. 원형 RNA는 캡의 부재 하에 생성물의 발현을 유도하였다.
원형 RNA를 종결 요소(정지 코돈) 없이 2A 서열에 측접한 삼중 FLAG 태깅된 EGF를 인코딩하도록 설계하였다(330개 뉴클레오티드, SEQ ID NO: 19).
선형 또는 원형 RNA를 25 ㎕의 부피에서 30℃에서 토끼 망상적혈구 용해물 중에 5시간 동안 인큐베이션시켰다. 반응 혼합물의 최종 조성은 70% 토끼 망상적혈구 용해물, 20 μM 아미노산, 0.8 U/㎕ RNase 저해제 및 1 ㎍의 선형 또는 원형 RNA를 포함하였다. 인큐베이션 후에, 아세트산(0.32 ㎕) 및 물(300 ㎕)을 반응 혼합물(16 ㎕)에 첨가하고 15℃에서 10분 동안 20,817 xg에서 원심분리시킴으로써 헤모글로빈 단백질을 제거하였다. 상청액을 제거하고, 펠렛을 70℃에서 15분 동안 30 ㎕의 2x SDS 시료 완충제 중에 용해시켰다. 1400 xg에서 5분 동안 원심분리한 후에, 상청액을 10% 내지 20% 기울기 폴리아크릴아미드/SDS 겔에서 분석하였다.
건식 전달 방법을 사용하여 니트로셀룰로스 멤브레인으로 전기전달한 후에, 블롯을 항-FLAG 항체 및 항-마우스 IgG 퍼옥시다제와 인큐베이션시켰다. 블롯을 ECL 키트로 가시화시켰으며(도 23 참조), 웨스턴 블롯 밴드 세기를 ImageJ에 의해 측정하였다.
발현 생성물은 심지어 캡의 부재 하에서도 원형 RNA 반응 혼합물에서 검출되었다.
실시예 28: 5'-UTR 없이 발현
이 실시예는 5' 비번역 영역을 결여한 원형 RNA로부터의 시험관내 단백질 발현을 보여준다.
5' 비번역 영역(5' UTR)은 RNA 전사물의 다운스트림 단백질 번역을 보조하는 개시 코돈의 바로 업스트림의 영역이다.
하기의 실시예에 나타낸 바와 같이, 원형 RNA 서열 내의 5'-비번역 영역은 시험관내 단백질 발현에 필요하지 않았다.
원형 RNA를 종결 요소(정지 코돈) 없이 2A 서열에 측접한 삼중 FLAG 태깅된 EGF를 인코딩하도록 설계하였다(330개 뉴클레오티드, SEQ ID NO: 19).
선형 또는 원형 RNA를 25 ㎕의 부피에서 30℃에서 토끼 망상적혈구 용해물 중에 5시간 동안 인큐베이션시켰다. 반응 혼합물의 최종 조성은 70% 토끼 망상적혈구 용해물, 20 μM 아미노산, 0.8 U/㎕ RNase 저해제 및 1 ㎍의 선형 또는 원형 RNA를 포함하였다. 인큐베이션 후에, 아세트산(0.32 ㎕) 및 물(300 ㎕)을 반응 혼합물(16 ㎕)에 첨가하고 15℃에서 10분 동안 20,817 xg에서 원심분리시킴으로써 헤모글로빈 단백질을 제거하였다. 상청액을 제거하고, 펠렛을 30°l의 2x SDS 시료 완충제 중에 용해시키고, 70℃에서 15분 동안 인큐베이션시켰다. 1400 xg에서 5분 동안 원심분리한 후에, 상청액을 10% 내지 20% 기울기 폴리아크릴아미드/SDS 겔에서 분석하였다.
건식 전달 방법을 사용하여 니트로셀룰로스 멤브레인으로 전기전달한 후에, 블롯을 항-FLAG 항체 및 항-마우스 IgG 퍼옥시다제와 인큐베이션시켰다. 블롯을 ECL 키트로 가시화시켰으며(도 23 참조), 웨스턴 블롯 밴드 세기를 ImageJ에 의해 측정하였다.
발현 생성물은 심지어 5' UTR의 부재 하에서도 원형 RNA 반응 혼합물에서 검출되었다.
실시예 29: 3'-UTR 없이 발현
본 실시예는 3'-UTR을 결여한 원형 RNA로부터의 시험관내 단백질 발현을 보여준다.
3' 비번역 영역(3'-UTR)은 번역 종결 코돈의 바로 다운스트림 영역이며, 유전자 발현에 전사-후 영향을 미칠 수 있는 조절 영역을 포함한다. 3'-비번역 영역은 또한 mRNA의 국소화, 안정성, 유출 및 번역 효율에 영향을 미침으로써 유전자 발현에서 역할을 수행할 수 있다. 또한, 3'-UTR의 구조적 특징뿐만 아니라 대안적인 폴리아데닐화의 그의 이용은 유전자 발현에서 역할을 수행할 수 있다.
하기의 실시예에 나타낸 바와 같이, 원형 RNA 서열 내의 3'-UTR은 시험관내 단백질 발현에 필요하지 않았다.
원형 RNA를 종결 요소(정지 코돈) 없이 2A 서열에 측접한 삼중 FLAG 태깅된 EGF를 인코딩하도록 설계하였다(330개 뉴클레오티드, SEQ ID NO: 19).
선형 또는 원형 RNA를 25 ㎕의 부피에서 30℃에서 토끼 망상적혈구 용해물 중에 5시간 동안 인큐베이션시켰다. 반응 혼합물의 최종 조성은 70% 토끼 망상적혈구 용해물, 20 μM 아미노산, 0.8 U/㎕ RNase 저해제 및 1 ㎍의 선형 또는 원형 RNA를 포함하였다. 인큐베이션 후에, 아세트산(0.32 ㎕) 및 물(300 ㎕)을 반응 혼합물(16 ㎕)에 첨가하고 15℃에서 10분 동안 20,817 xg에서 원심분리시킴으로써 헤모글로빈 단백질을 제거하였다. 상청액을 제거하고, 펠렛을 30°l의 2x SDS 시료 완충제 중에 용해시키고, 70℃에서 15분 동안 인큐베이션시켰다. 1400 xg에서 5분 동안 원심분리한 후에, 상청액을 10% 내지 20% 기울기 폴리아크릴아미드/SDS 겔에서 분석하였다.
건식 전달 방법을 사용하여 니트로셀룰로스 멤브레인으로 전기전달한 후에, 블롯을 항-FLAG 항체 및 항-마우스 IgG 퍼옥시다제와 인큐베이션시켰다. 블롯을 ECL 키트로 가시화시켰으며(도 23 참조), 웨스턴 블롯 밴드 세기를 ImageJ에 의해 측정하였다.
발현 생성물은 심지어 3' UTR의 부재 하에서도 원형 RNA 반응 혼합물에서 검출되었다.
실시예 30: 종결 요소(정지 코돈) 없이 발현
이 실시예는 종결 요소(정지 코돈)를 결여한 원형 RNA로부터의 회전환 번역 후의 폴리펩티드 생성물의 생성을 보여준다.
단백질은 독특한 아미노산의 서열로 구성된 폴리펩티드에 기초한다. 각 아미노산은 코돈으로 지칭되는 뉴클레오티드 트리플렛(triplet)에 의해 mRNA에서 인코딩된다. 단백질 번역 동안, mRNA 내의 각 코돈은 성장 중인 폴리펩티드 쇄 내의 아미노산의 부가에 해당한다. 종결 요소 또는 정지 코돈은 방출 인자의 결합에 의해 이 과정의 종결을 신호전달하며, 이는 리보솜 서브유닛을 분리시켜, 아미노산 쇄를 방출시킨다.
하기의 실시예에 나타낸 바와 같이, 종결 코돈을 결여한 원형 RNA는 회전환 번역을 통해 반복된 폴리펩티드 서열로 구성된 큰 폴리펩티드 생성물을 생성하였다.
원형 RNA를 종결 요소(정지 코돈) 없이 삼중 FLAG 태깅된 EGF를 인코딩하도록 설계하였으며(264개 뉴클레오티드, SEQ ID NO: 20), 번역 개시를 유리하게 하기 위해 출발 코돈에 코작 서열을 포함하였다.
선형 또는 원형 RNA를 25 ㎕의 부피에서 30℃에서 토끼 망상적혈구 용해물 중에 5시간 동안 인큐베이션시켰다. 반응 혼합물의 최종 조성은 70% 토끼 망상적혈구 용해물, 20 μM 아미노산, 0.8 U/㎕ RNase 저해제 및 1 ㎍의 선형 또는 원형 RNA를 포함하였다. 인큐베이션 후에, 아세트산(0.32 ㎕) 및 물(300 ㎕)을 반응 혼합물(16 ㎕)에 첨가하고 15℃에서 10분 동안 20,817 xg에서 원심분리시킴으로써 헤모글로빈 단백질을 제거하였다. 상청액을 제거하고, 펠렛을 30°l의 2x SDS 시료 완충제 중에 용해시키고, 70℃에서 15분 동안 인큐베이션시켰다. 1400 xg에서 5분 동안 원심분리한 후에, 상청액을 10% 내지 20% 기울기 폴리아크릴아미드/SDS 겔에서 분석하였다.
건식 전달 방법을 사용하여 니트로셀룰로스 멤브레인으로 전기전달한 후에, 블롯을 항-FLAG 항체 및 항-마우스 IgG 퍼옥시다제와 인큐베이션시켰다. 블롯을 ECL 키트로 가시화시켰으며(도 24 참조), 웨스턴 블롯 밴드 세기를 ImageJ에 의해 측정하였다.
발현 생성물은 심지어 종결 요소(정지 코돈)의 부재 하에서도 원형 RNA 반응 혼합물에서 검출되었다.
실시예 31: 종결 요소(정지 코돈) 없이 불연속 단백질의 발현
이 실시예는 종결 요소(정지 코돈)를 결여한 원형 RNA로부터 번역되는 불연속 단백질 생성물의 생성을 보여준다.
스태거 요소, 예컨대 2A 펩티드는 짧은 아미노산 서열, 약 20개 아미노산을 포함할 수 있으며, 이는 단일의 mRNA로부터 등몰 수준의 다수의 유전자의 생성을 가능하게 한다. 스태거 요소는 리보솜이 2A 요소의 C-말단에서 펩티드 결합의 합성을 생략하게 하여 2A 서열의 말단과 다음의 펩티드 다운스트림 사이의 분리를 야기함으로써 기능할 수 있다. 분리는 C-말단에서 관찰되는 글리신과 프롤린 잔기 사이에서 발생하며, 업스트림 시스트론은 말단에 부가되는 소수의 추가의 잔기를 갖는 한편, 다운스트림 시스트론은 프롤린으로 시작한다.
하기의 실시예에 나타낸 바와 같이, 종결 요소(정지 코돈)를 결여한 원형 RNA는 큰 폴리펩티드 폴리머를 생성하였으며(도 16 좌측 패널: 스태거 부재 - 원형 RNA 레인), 코딩 영역의 3' 말단에서의 2A 서열의 포함은 동등한 선형 RNA 구축물에 의해 생성되는 것과 유사한 크기로 불연속 단백질이 생성되게 하였다(도 16 우측 패널: 스태거 - 원형 RNA 레인).
원형 RNA를 종결 요소(정지 코돈) 없이 그리고 스태거 요소 없이 삼중 FLAG 태깅된 EGF를 인코딩하도록 설계하였다(264개 뉴클레오티드, SEQ ID NO: 20). 제2 원형 RNA를 종결 요소(정지 코돈) 없이 2A 서열에 측접한 삼중 FLAG 태깅된 EGF를 인코딩하도록 설계하였다(330개 뉴클레오티드, SEQ ID NO: 19).
선형 또는 원형 RNA를 25 ㎕의 부피에서 30℃에서 토끼 망상적혈구 용해물 중에 5시간 동안 인큐베이션시켰다. 반응 혼합물의 최종 조성은 70% 토끼 망상적혈구 용해물, 20 μM 아미노산, 0.8 U/㎕ RNase 저해제 및 1 ㎍의 선형 또는 원형 RNA를 포함하였다. 인큐베이션 후에, 아세트산(0.32 ㎕) 및 물(300 ㎕)을 반응 혼합물(16 ㎕)에 첨가하고 15℃에서 10분 동안 20,817 xg에서 원심분리시킴으로써 헤모글로빈 단백질을 제거하였다. 상청액을 제거하고, 펠렛을 30°l의 2x SDS 시료 완충제 중에 용해시키고, 70℃에서 15분 동안 인큐베이션시켰다. 1400 xg에서 5분 동안 원심분리한 후에, 상청액을 10% 내지 20% 기울기 폴리아크릴아미드/SDS 겔에서 분석하였다.
건식 전달 방법을 사용하여 니트로셀룰로스 멤브레인으로 전기전달한 후에, 블롯을 항-FLAG 항체 및 항-마우스 IgG 퍼옥시다제와 인큐베이션시켰다. 블롯을 ECL 키트로 가시화시켰으며(도 25), 웨스턴 블롯 밴드 세기를 ImageJ에 의해 측정하였다.
불연속 발현 생성물을 검출하였으며, 이는 스태거 요소를 포함하는 원형 RNA가 심지어 종결 요소(정지 코돈)의 부재 하에서도 개별 단백질의 발현을 유도하였음을 나타낸다.
실시예 32: 회전환 번역
이 실시예는 스태거 요소를 사용하여 원형 RNA로부터 단백질의 상승된 시험관내 생합성을 보여준다.
비-천연 발생 원형 RNA가 스태거 요소를 포함하도록 조작하여, 스태거 요소를 결여한 원형 RNA와 단백질 발현을 비교하였다. 하기의 실시예에 나타낸 바와 같이, 스태거 요소를 포함하는 circRNA는 이러한 서열을 결여한 다르게는 동일한 원형 RNA와 비교하여 단백질을 과발현시켰다.
원형 RNA를 종결 요소(예를 들어, 탠덤으로 3개의 정지 코돈)와 함께 삼중 FLAG 태깅된 EGF를 인코딩하도록 설계하였다(273개 뉴클레오티드, SEQ ID NO: 21). 제2 원형 RNA를 종결 요소(정지 코돈) 없이 2A 서열에 측접된 삼중 FLAG 태깅된 EGF를 인코딩하도록 설계하였다(330개 뉴클레오티드, SEQ ID NO: 19).
선형 또는 원형 RNA를 25 ㎕의 부피에서 30℃에서 토끼 망상적혈구 용해물 중에 5시간 동안 인큐베이션시켰다. 반응 혼합물의 최종 조성은 70% 토끼 망상적혈구 용해물, 20 μM 아미노산, 0.8 U/㎕ RNase 저해제 및 1 ㎍의 선형 또는 원형 RNA를 함유하였다. 인큐베이션 후에, 아세트산(0.32 ㎕) 및 물(300 ㎕)을 반응 혼합물(16 ㎕)에 첨가하고 15℃에서 10분 동안 20,817 xg에서 원심분리시킴으로써 헤모글로빈 단백질을 제거하였다. 상청액을 제거하고, 펠렛을 30°l의 2x SDS 시료 완충제 중에 용해시키고, 70℃에서 15분 동안 인큐베이션시켰다. 1400 xg에서 5분 동안 원심분리한 후에, 상청액을 10% 내지 20% 기울기 폴리아크릴아미드/SDS 겔에서 분석하였다.
건식 전달 방법을 사용하여 니트로셀룰로스 멤브레인으로 전기전달한 후에, 블롯을 항-FLAG 항체 및 항-마우스 IgG 퍼옥시다제와 인큐베이션시켰다. 블롯을 ECL 키트로 가시화시켰으며(도 26 참조), 웨스턴 블롯 밴드 세기를 ImageJ에 의해 측정하였다. 도 27은 도 26에 나타낸 2개의 예시적인 원형 RNA로부터 번역되는 단백질 생성물의 웨스턴 블롯 분석으로부터의 신호 세기를 요약한 그래프를 보여주며, 이는 회전환 번역 동안 정지 코돈을 포함하는 circRNA에 비하여, 스태거 요소를 포함하고 정지 코돈을 포함하지 않는 circRNA로부터의 증가된 단백질 발현을 나타낸다.
불연속 발현 생성물이 검출되었으며, 이는 스태거 요소를 포함하는 원형 RNA가 심지어 종결 요소(정지 코돈)의 부재 하에서도 개별 단백질의 발현을 유도하였음을 나타낸다.
실시예 33: 시험관내에서의 생물학적 활성 단백질의 발현
이 실시예는 원형 RNA로부터의 생물학적 활성 단백질의 시험관내 생합성을 보여준다.
비-천연 발생 원형 RNA를 생물학적 활성 치료적 단백질을 발현하도록 조작하였다. 하기의 실시예에 나타낸 바와 같이, 생물학적 활성 단백질을 망상적혈구 용해물 중 원형 RNA로부터 발현시켰다.
원형 RNA를 2A 서열에 측접한 FLAG 태깅된 EGF에 이어서 FLAG 태깅된 나노-루시퍼라제를 인코딩하도록 설계하였다(873개 뉴클레오티드, SEQ ID NO: 17).
선형 또는 원형 RNA를 25 ㎕의 부피에서 30℃에서 토끼 망상적혈구 용해물 중에 5시간 동안 인큐베이션시켰다. 반응 혼합물의 최종 조성은 70% 토끼 망상적혈구 용해물, 20 μM 아미노산, 0.8 U/㎕ RNase 저해제를 함유하였다. 번역 혼합물 중 루시퍼라제 활성을 제조업체의 프로토콜(프로메가)에 따라 루시퍼라제 검정 시스템을 사용하여 모니터링하였다.
도 28에 나타낸 바와 같이, 대조군 비히클 RNA보다 원형 RNA 및 선형 RNA 둘 모두에서 훨씬 더 큰 형광이 검출되었으며, 이는 발현 생성물이 존재하였음을 나타낸다. 따라서, 원형 RNA는 생물학적 활성 단백질을 발현하는 것으로 나타났다.
실시예 34: 선형 RNA 대응물보다 더 긴 반감기를 갖는 원형 RNA
이 실시예는 선형 RNA에 비하여 연장된 반감기를 갖도록 조작된 원형 RNA를 보여준다.
치료적 단백질을 인코딩하는 원형 RNA는 예를 들어, 선형 RNA와 비교하여, 연장된 생물학적 반감기로부터 기인한 더 높은 수준의 인코딩된 단백질을 생성하는 능력을 갖는 수여자 세포를 제공하였다. 하기의 실시예에 나타낸 바와 같이, 원형 RNA는 망상적혈구 용해물에서 그의 선형 RNA 대응물보다 더 큰 반감기를 가졌다.
원형 RNA를 2A 서열에 측접한 FLAG 태깅된 EGF에 이어서 FLAG 태깅된 나노 루시퍼라제를 인코딩하도록 설계하였다(873개 뉴클레오티드, SEQ ID NO: 17).
이 실시예에서, 시간-추이 실험을 수행하여 RNA 안정성을 모니터링하였다. 100 ng의 선형 또는 원형 RNA를 토끼 망상적혈구 용해물과 인큐베이션시켰으며, 시료를 1시간째, 5시간째, 18시간째 및 30시간째에 수집하였다. 전체 RNA를 페놀-기반의 시약(인비트로겐)을 사용하여 용해물로부터 단리하였으며, cDNA를 역전사에 의해 생성하였다. qRT-PCR 분석을 염료-기반의 정량적 PCR 반응 믹스(바이오라드)를 사용하여 수행하였다.
도 29에 나타낸 바와 같이, 더 높은 농도의 원형 RNA가 선형 RNA보다 나중의 시점에 검출되었으며, 시간이 지남에 따른 원형 RNA의 농도의 감소 백분율이 선형 RNA의 것보다 더 낮았다. 따라서, 원형 RNA는 그의 선형 대응물에 비하여 더욱 안정하거나, 증가된 반감기를 가졌다.
실시예 35: 원형 RNA는 세포에서 선형 RNA보다 더 긴 반감기를 보였다
이 실시예는 원형 RNA가 세포 내로 전달되며, 선형 RNA와 비교하여 세포에서 증가된 반감기를 갖는 것을 보여준다.
비-천연 발생 원형 RNA를 생물학적 활성 치료적 단백질을 발현하도록 조작하였다. 하기의 실시예에 나타낸 바와 같이, 원형 RNA는 그의 선형 RNA 대응물에 비하여 더 높은 수준으로 존재하였으며, 이는 원형 RNA에 대해 더 긴 반감기를 나타낸다.
이 실시예에서, 원형 RNA 및 선형 RNA를 코작, 2A에 측접한 EGF, 정지 서열 또는 정지 부재 서열(no stop sequence)을 인코딩하도록 설계하였다(SEQ ID NO: 11, 19, 20, 21). 세포에서 RNA의 반감기를 모니터링하기 위해, 0.1x106개 세포를 12 웰 플레이트의 각 웰 상으로 플레이팅하였다. 1일 후에, 1 ㎍의 선형 또는 원형 RNA를 지질-기반의 트랜스펙션 시약(인비트로겐)을 사용하여 각 웰 내로 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션 후 24시간째에, 전체 RNA를 페놀-기반의 추출 시약(인비트로겐)을 사용하여 세포로부터 단리하였다. 전체 RNA(500 ng)를 역전사로 처리하여, cDNA를 생성하였다. qRT-PCR 분석을 염료-기반의 정량적 PCR 믹스(바이오라드)를 사용하여 수행하였다. 프라이머 서열은 하기와 같았다: 선형 또는 원형 RNA에 대한 프라이머,
Figure pct00010
; 원형 RNA에 대한 프라이머,
Figure pct00011
.
원형 RNA를 그의 선형 대응물과 마찬가지로 293T 세포 내로 성공적으로 트랜스펙션시켰다. 24시간 후에, 유지된 원형 및 선형 RNA를 qPCR을 사용하여 측정하였다. 원형 RNA는 선형 RNA에 비하여 트랜스펙션 후 24시간째에 세포에서 더 높은 농도를 갖는 것으로 나타났으며, 이는 원형 RNA가 선형 RNA의 반감기에 비하여 세포에서 더 긴 반감기를 갖는 것을 시사한다(도 30a 및 도 30b).
실시예 36: 합성 원형 RNA는 세포에서 번역되었으며, 합성 원형 RNA는 회전환 번역을 통해 번역되었다
이 실시예는 세포에서의 합성 원형 RNA의 번역을 보여준다.
하기의 실시예에 나타낸 바와 같이, 원형 RNA 및 선형 RNA를 종결 요소 없이, 코작, 3xFLAG-EGF 서열을 인코딩하도록 설계하였다(SEQ ID NO: 11). 원형 RNA는 폴리머 EGF로 번역된 한편, 선형 RNA는 그렇지 않았으며, 이는 세포가 합성 원형 RNA의 회전환 번역을 수행하였음을 보여준다.
이 실시예에서, 세포에서 선형 또는 원형 RNA의 번역 효율을 모니터링하기 위해, 0.1x106개 세포를 12 웰 플레이트의 각 웰 상으로 플레이팅하였다. 1일 후에, 1 ㎍의 선형 또는 원형 RNA를 지질-기반의 트랜스펙션 시약(인비트로겐)을 사용하여 각 웰 내로 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션 후 24시간째에, 200 ㎕의 RIPA 완충제를 각 웰 상에 첨가함으로써 세포를 수집하였다. 다음으로, 10 ㎍의 세포 용해물 단백질을 10% 내지 20% 기울기 폴리아크릴아미드/SDS 겔 상에서 분석하였다. 건식 전달 방법을 사용하여 니트로셀룰로스 멤브레인으로 전기전달한 후에, 블롯을 항-FLAG 항체 및 항-마우스 IgG 퍼옥시다제와 인큐베이션시켰다. 로딩 대조군으로서, 항-베타 튜불린 항체를 사용하였다. 블롯을 증강된 화학발광(ECL) 키트로 가시화시켰다. 웨스턴 블롯 밴드 세기를 ImageJ에 의해 측정하였다.
원형 RNA를 그의 선형 대응물과 마찬가지로 293T 세포 내로 성공적으로 트랜스펙션시켰다. 그러나, 도 31은 트랜스펙션 후 24시간째에, EGF 단백질이 원형 RNA 트랜스펙션된 세포에서 검출된 한편, 선형 RNA 트랜스펙션된 세포에서는 어느 것도 검출되지 않았음을 보여준다. 따라서, 원형 RNA는 세포에서 선형 RNA와 비교하여 회전환 번역을 통해 번역되었다.
실시예 37: 합성 원형 RNA는 세포에서 감소된 면역원성 유전자 발현을 보여준다
이 실시예는 선형 RNA에 비하여 감소된 면역 반응을 갖도록 조작된 원형 RNA를 보여준다.
치료적 단백질을 인코딩하는 원형 RNA는 선형 RNA와 비교하여, 수여자 세포에서 면역-관련 유전자(RIG-I, MDA5, PKR 및 IFN-베타)의 유도 감소를 제공하였다. RIG-I는 짧은 5' 트리포스페이트 비캡핑된 이중 가닥 또는 단일 가닥 RNA를 인식할 수 있는 한편, MDA5는 더 긴 dsRNA를 인식할 수 있다. RIG-I 및 MDA5는 둘 모두 MAVS의 활성화 및 항바이러스 반응의 촉발에 관여할 수 있다. PKR은 dsRNA에 의해 활성화되고, 인터페론, 예컨대 IFN-베타에 의해 유도될 수 있다. 하기의 실시예에 나타낸 바와 같이, q-PCR에 의한 RIG-I, MDA5, PKR 및 IFN-베타의 발현에 의해 평가하여, 원형 RNA는 293T 세포에서 유사한 선형 RNA보다 면역 관련 유전자의 활성화를 감소시킨 것으로 나타났다.
원형 RNA 및 선형 RNA가 (1) 종결 요소 없이 코작, 3xFLAG-EGF 서열(SEQ ID NO: 11); (2) 코작, 종결 요소(정지 코돈)에 측접한 3xFLAG-EGF(SEQ ID NO: 21); (3) 코작, 2A 서열에 측접한 3xFLAG-EGF(SEQ ID NO: 19); 또는 (4) 코작, 2A 서열에 측접한 3xFLAG-EGF 서열에 이어서 종결 요소(정지 코돈)(SEQ ID NO: 20)를 인코딩하도록 설계하였다.
이 실시예에서, 0.1x106개 세포를 12 웰 플레이트의 각 웰 내로 플레이팅함으로써 선천적 면역 반응 유전자의 수준을 세포에서 모니터링하였다. 1일 후에, 1 ㎍의 선형 또는 원형 RNA를 지질-기반의 트랜스펙션 시약(인비트로겐)을 사용하여 각 웰 내로 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션 후 24시간째에, 전체 RNA를 페놀-기반의 추출 시약(인비트로겐)을 사용하여 세포로부터 단리하였다. 전체 RNA(500 ng)를 역전사로 처리하여, cDNA를 생성하였다. qRT-PCR 분석을 염료-기반의 정량적 PCR 믹스(바이오라드)를 사용하여 수행하였다.
사용되는 프라이머 서열: GAPDH를 위한 프라이머,
Figure pct00012
Figure pct00013
; RIG-I,
Figure pct00014
Figure pct00015
; MDA5,
Figure pct00016
Figure pct00017
; PKR,
Figure pct00018
Figure pct00019
; IFN-베타,
Figure pct00020
Figure pct00021
.
도 32에 나타낸 바와 같이, 원형 RNA로 트랜스펙션시킨 293T 세포로부터의 면역 관련 유전자의 qRT-PCR 수준은 선형 RNA 트랜스펙션된 세포에 비하여 RIG-I, MDA5, PKR 및 IFN-베타의 감소를 보였다. 따라서, 수여자 세포 내의 면역원성 관련 유전자의 유도는 선형 RNA 트랜스펙션된 세포에 비하여 원형 RNA 트랜스펙션된 세포에서 감소하였다.
실시예 38: 세포에서 회전환 번역을 통한 합성 원형 RNA로부터의 발현 증가
이 실시예는 세포에서 합성 원형 RNA의 회전환 번역으로부터의 발현 증가를 보여준다.
원형 RNA를 종결 요소(정지 코돈) 없이 나노루시퍼라제 유전자 또는 EGF 음성 대조군 유전자와 함께 IRES를 포함하도록 설계하였다. 세포를 EGF 음성 대조군(SEQ ID NO: 22); nLUC 정지(SEQ ID NO: 23): EMCV IRES, 스태거 서열(2A 서열), 3x FLAG 태깅된 nLUC 서열, 스태거 서열(2A 서열) 및 정지 코돈; 또는 nLUC 스태거(SEQ ID NO: 24): EMCV IRES, 스태거 서열(2A 서열), 3x FLAG 태깅된 nLUC 서열 및 스태거 서열(2A 서열)로 트랜스펙션시켰다. 도 33에 나타낸 바와 같이, 원형 RNA 둘 모두는 기능성 루시퍼라제 활성을 갖는 번역 생성물을 생성하였다.
이 실시예에서, 원형 RNA의 번역을 세포에서 모니터링하였다. 구체적으로, 0.1x106개 세포를 12 웰 플레이트의 각 웰 상으로 플레이팅하였다. 1일 후에, 300 ng의 원형 RNA를 지질-기반의 트랜스펙션 시약(인비트로겐)을 사용하여 각 웰 내로 트랜스펙션시켰다. 24시간 후에, 100 ㎕의 RIPA 완충제를 첨가함으로써 세포를 수집하였다. 용해물 중 나노루시퍼라제 활성을 그의 제조업체의 프로토콜(프로메가)에 따라 루시퍼라제 검정 시스템을 사용하여 측정하였다.
도 33에 나타낸 바와 같이, 원형 RNA 둘 모두는 세포에서 단백질을 발현하였다. 그러나, 종결 요소(정지 코돈)를 결여한 스태거 요소, 예를 들어, 2A 서열을 갖는 원형 RNA는 종결 요소(정지 코돈)를 갖는 원형 RNA보다 더 높은 수준의, 기능성 루시퍼라제 활성을 갖는 단백질 생성물을 생성하였다.
실시예 39: 세포에서 번역되는 합성 원형 RNA
이 실시예는 세포 내의 합성 원형 RNA 번역을 보여준다. 또한, 이 실시예는 원형 RNA가 그의 선형 대응물보다 더 많은 발현 생성물을 생성하였음을 보여준다.
원형 RNA를 그의 선형 대응물과 마찬가지로 293T 세포 내로 성공적으로 트랜스펙션시켰다. 세포를 음성 대조군으로서 EGF를 인코딩하는 원형 RNA(SEQ ID NO: 22): EMCV IRES, 스태거 서열(2A 서열), 3x FLAG 태깅된 EGF 서열, 스태거 서열(2A 서열); 선형 또는 원형 nLUC(SEQ ID NO: 23): EMCV IRES, 스태거 서열(2A 서열), 3x FLAG 태깅된 nLuc 서열, 스태거 서열(2A 서열) 및 정지 코돈으로 트랜스펙션시켰다. 도 34에 나타난 바와 같이, 원형 RNA는 세포에서 나노루시퍼라제로 번역되었다.
선형 또는 원형 RNA 번역을 세포에서 모니터링하였다. 구체적으로, 0.1x106개 세포를 12 웰 플레이트의 각 웰 상으로 플레이팅하였다. 1일 후에, 300 ng의 선형 또는 원형 RNA를 지질-기반의 트랜스펙션 시약(인비트로겐)을 사용하여 각 웰 내로 트랜스펙션시켰다. 24시간 후에, 100 ㎕의 RIPA 완충제를 첨가함으로써 세포를 수집하였다. 용해물 중 나노루시퍼라제 활성을 그의 제조업체의 프로토콜(프로메가)에 따라 루시퍼라제 검정 시스템을 사용하여 측정하였다.
도 34에 나타낸 바와 같이, 원형 RNA 번역 생성물이 세포에서 검출되었다. 특히, 원형 RNA는 그의 선형 RNA 대응물에 비하여 더 높은 수준의 루시퍼라제 활성 또는 증가된 단백질 생성을 가졌다.
실시예 40: 합성 원형 RNA로부터의 회전환 번역에 의해 세포에서 기능성 단백질 생성물이 생성된다
이 실시예는 세포에서, 예를 들어, 종결 요소(정지 코돈)를 결여한 스태거 요소를 갖는, 종결 요소(정지 코돈)를 결여한 합성 원형 RNA로부터의 기능성 단백질 생성물의 회전환 번역을 보여준다. 또한, 이 실시예는 스태거 요소를 갖는 원형 RNA가 그의 선형 대응물보다 더 많은 기능성 단백질 생성물을 발현하였음을 보여준다.
원형 RNA를 그의 선형 대응물과 마찬가지로 293T 세포 내로 성공적으로 트랜스펙션시켰다. 세포를 원형 RNA EGF 음성 대조군(SEQ ID NO: 22); 선형 및 원형 nLUC(SEQ ID NO: 24): EMCV IRES, 스태거 서열(2A 서열), 3x FLAG 태깅된 nLuc 서열, 스태거 서열(2A 서열)로 트랜스펙션시켰다. 도 25에 나타낸 바와 같이, 원형 RNA는 세포에서 나노루시퍼라제로 번역되었다.
선형 또는 원형 RNA 번역을 세포에서 모니터링하였다. 구체적으로, 0.1x106개 세포를 12 웰 플레이트의 각 웰 상으로 플레이팅하였다. 1일 후에, 300 ng의 선형 또는 원형 RNA를 지질-기반의 트랜스펙션 시약(인비트로겐)을 사용하여 각 웰 내로 트랜스펙션시켰다. 24시간 후에, 100 ㎕의 RIPA 완충제를 첨가함으로써 세포를 수집하였다. 용해물 중 나노루시퍼라제 활성을 그의 제조업체의 프로토콜(프로메가)에 따라 루시퍼라제 검정 시스템을 사용하여 측정하였다.
도 35에 나타낸 바와 같이, 원형 RNA 번역 생성물이 세포에서 검출되었다. 특히, 종결 요소(정지 코돈)가 없는 원형 RNA는 그의 선형 RNA 대응물보다 더 높은 수준의, 기능성 루시퍼라제 활성을 갖는 단백질 생성물을 생성하였다.
실시예 41: 세포 내에서 IRES 개시를 통해 번역되는 합성 원형 RNA
이 실시예는 세포에서 IRES를 사용한 합성 원형 RNA 번역 개시를 보여준다.
원형 RNA를 나노루시퍼라제 유전자 또는 EGF 음성 대조군 유전자와 함께 코작 서열 또는 IRES를 포함하도록 설계하였다. 세포를 EGF 음성 대조군(SEQ ID NO: 22), nLUC 코작(SEQ ID NO: 25): 코작 서열, 1x FLAG 태깅된 EGF 서열, 스태거 서열(T2A 서열), 1x FLAG 태깅된 nLUC, 스태거 서열(P2A 서열) 및 정지 코돈; 또는 nLUC IRES(SEQ ID NO: 23): EMCV IRES, 스태거 서열(2A 서열), 3x FLAG 태깅된 nLUC 서열, 스태거 서열(2A 서열) 및 정지 코돈으로 트랜스펙션시켰다. 도 36에 나타낸 바와 같이, IRES를 갖는 원형 RNA는 코작 서열을 갖는 원형 RNA에 비하여, 더 높은 단백질 수준에 상응하는 더 높은 수준의 루시퍼라제 활성을 보였다.
이 실시예에서, 원형 RNA의 번역을 세포에서 모니터링하였다. 구체적으로, 0.1x106개 세포를 12 웰 플레이트의 각 웰 상으로 플레이팅하였다. 1일 후에, 300 ng의 원형 RNA를 지질-기반의 트랜스펙션 시약(인비트로겐)을 사용하여 각 웰 내로 트랜스펙션시켰다. 24시간 후에, 100 ㎕의 RIPA 완충제를 첨가함으로써 세포를 수집하였다. 용해물 중 나노루시퍼라제 활성을 그의 제조업체의 프로토콜(프로메가)에 따라 루시퍼라제 검정 시스템을 사용하여 측정하였다.
도 36에 나타낸 바와 같이, 원형 RNA는 IRES를 사용하여 단백질 발현을 개시하였으며, 코작 개시된 단백질 발현을 갖는 원형 RNA보다 더 높은 수준의, 기능성 루시퍼라제 활성을 갖는 단백질 생성물을 생성하였다.
실시예 42: 세포 내에서의 합성 원형 RNA의 회전환 번역
이 실시예는 IRES를 사용하여 단백질 생성을 개시하는 세포에서의 합성 원형 RNA의 회전환 번역을 통한 더 큰 단백질 생성을 보여준다.
원형 RNA를 종결 요소(정지 코돈)와 함께 또는 이것 없이 나노루시퍼라제 유전자 또는 EGF 음성 대조군과 함께 코작 서열 또는 IRES를 포함하도록 설계하였다. 세포를 EGF 음성 대조군(SEQ ID NO: 22); nLUC IRES 정지(SEQ ID NO: 23): EMCV IRES, 스태거 서열(2A 서열), 3x FLAG 태깅된 nLUC 서열, 스태거 서열(2A 서열) 및 정지 코돈; 또는 nLUC IRES 스태거(SEQ ID NO: 24): EMCV IRES, 스태거 서열(2A 서열), 3x FLAG 태깅된 nLUC 서열 및 스태거 서열(2A 서열)로 트랜스펙션시켰다. 도 37에 나타낸 바와 같이, 원형 RNA는 둘 모두 발현 생성물을 생성하였고, 이는 회전환 번역을 보여주며, 종결 요소 부재의 원형 RNA에서 IRES(예를 들어, 코작 서열 부재)는 IRES 없이(예를 들어, 코작 서열 존재) 종결 요소를 갖는 원형 RNA보다 더 높은 수준의, 기능성 루시퍼라제 활성을 갖는 단백질 생성물을 개시하고 생성하였으며, 이는 회전환 번역을 나타낸다.
이 실시예에서, 원형 RNA의 번역을 세포에서 모니터링하였다. 구체적으로, 0.1x106개 세포를 12 웰 플레이트의 각 웰 상으로 플레이팅하였다. 1일 후에, 300 ng의 원형 RNA를 지질-기반의 트랜스펙션 시약(인비트로겐)을 사용하여 각 웰 내로 트랜스펙션시켰다. 24시간 후에, 100 ㎕의 RIPA 완충제를 첨가함으로써 세포를 수집하였다. 용해물 중 나노루시퍼라제 활성을 그의 제조업체의 프로토콜(프로메가)에 따라 루시퍼라제 검정 시스템을 사용하여 측정하였다.
도 37에 나타낸 바와 같이, 원형 RNA는 세포 내에서 원형 RNA 둘 모두로부터 제공되는 회전환 방법을 통해 단백질로 번역되었다. 그러나, 원형 RNA의 회전환 번역은 종결 요소 코작 번역 개시를 갖는 원형 RNA에 비하여, IRES를 사용하여 더 큰 단백질 생성을 개시하고, 기능성 루시퍼라제 활성을 갖는 단백질 생성물을 더 많이 생성하였다.
실시예 43: 원형 RNA로부터 발현되는 증가된 단백질
이 실시예는 세포 내의 합성 원형 RNA 번역을 보여준다. 또한, 이본 실시예는 원형 RNA가 그의 선형 대응물보다 더 많은, 정확한 분자량의 발현 생성물을 생성하였음을 보여준다.
선형 및 원형 RNA를 종결 요소(정지 코돈)를 갖는 나노루시퍼라제 유전자를 포함하도록 설계하였다. 세포를 비히클: 트랜스펙션 시약만; 선형 nLUC(SEQ ID NO: 23): EMCV IRES, 스태거 요소(2A 서열), 3x FLAG 태깅된 nLuc 서열, 스태거 요소(2A 서열) 및 종결 요소(정지 코돈); 또는 원형 nLUC(SEQ ID NO: 23): EMCV IRES, 스태거 요소(2A 서열), 3x FLAG 태깅된 nLuc 서열, 스태거 요소(2A 서열) 및 종결 요소(정지 코돈)로 트랜스펙션시켰다. 도 28에 나타낸 바와 같이, 원형 RNA는 선형 RNA에 비하여 더 높은 수준의, 정확한 분자량을 갖는 단백질을 생성하였다.
24시간 후에, 100 ㎕의 RIPA 완충제를 첨가함으로써 세포를 수집하였다. 1400 xg에서 5분 동안 원심분리한 후에, 상청액을 10% 내지 20% 기울기 폴리아크릴아미드/SDS 겔에서 분석하였다.
건식 전달 방법을 사용하여 니트로셀룰로스 멤브레인으로 전기전달한 후에, 블롯을 항-FLAG 항체 및 항-마우스 IgG 퍼옥시다제와 인큐베이션시켰다. 블롯을 ECL 키트로 가시화시켰으며, 웨스턴 블롯 밴드 세기를 ImageJ에 의해 측정하였다.
도 38에 나타낸 바와 같이, 원형 RNA는 세포 내에서 단백질로 번역되었다. 특히, 원형 RNA는 그의 선형 RNA 대응물에 비하여 더 높은 수준의, 정확한 분자량을 갖는 단백질을 생성하였다.
실시예 44: 합성 원형 RNA의 회전환 번역에 의해, 세포 내에서 불연속 단백질 생성물이 생성된다
이 실시예는 불연속 단백질 생성물이 세포에서 예를 들어, 종결 요소(정지 코돈) 대신에 스태거 요소를 갖는, 종결 요소(정지 코돈)를 결여한 합성 원형 RNA로부터 회전환 번역을 통해 번역되었음을 보여준다. 또한, 이 실시예는 스태거 요소를 갖는 원형 RNA가 그의 선형 대응물보다 더 많은, 정확한 분자량을 갖는 단백질 생성물을 발현하였음을 보여준다.
원형 RNA를 종결 요소(정지 코돈) 대신에 스태거 요소를 갖는 나노루시퍼라제 유전자를 포함하도록 설계하였다. 세포를 비히클: 트랜스펙션 시약만; 선형 nLUC(SEQ ID NO: 24): EMCV IRES, 스태거 요소(2A 서열), 3x FLAG 태깅된 nLuc 서열 및 스태거 요소(2A 서열); 또는 원형 nLUC(SEQ ID NO: 24): EMCV IRES, 스태거 요소(2A 서열), 3x FLAG 태깅된 nLuc 서열 및 스태거 요소(2A 서열)로 트랜스펙션시켰다. 도 39에 나타낸 바와 같이, 원형 RNA는 선형 RNA에 비하여 더 높은 수준의, 정확한 분자량을 갖는 단백질을 생성하였다.
24시간 후에, 100 ㎕의 RIPA 완충제를 첨가함으로써 세포를 수집하였다. 1400 xg에서 5분 동안 원심분리한 후에, 상청액을 10% 내지 20% 기울기 폴리아크릴아미드/SDS 겔에서 분석하였다.
건식 전달 방법을 사용하여 니트로셀룰로스 멤브레인으로 전기전달한 후에, 블롯을 항-FLAG 항체 및 항-마우스 IgG 퍼옥시다제와 인큐베이션시켰다. 블롯을 ECL 키트로 가시화시켰으며, 웨스턴 블롯 밴드 세기를 ImageJ에 의해 측정하였다.
도 39에 나타낸 바와 같이, 원형 RNA 번역 생성물이 세포에서 검출되었다. 특히, 종결 요소(정지 코돈)가 없는 원형 RNA는 그의 선형 RNA 대응물보다 더 높은 수준의, 정확한 분자량을 갖는 불연속 단백질 생성물을 생성하였다.
실시예 45: 준-이중 가닥, 나선 구조를 갖는 원형 RNA의 제조
이 실시예는 원형 RNA가 준-이중 가닥 및 나선 구조 둘 모두를 지니는 것을 보여준다.
비-천연 발생 원형 RNA를 준-이중 가닥, 나선 구조를 채용하도록 조작하였다. 유사한 구조는 독특하게 긴 생체내 반감기를 지닌 천연 발생 원형 RNA의 축합에 관여하는 것으로 나타났다(문헌[Griffin et al 2014, J Virol. 2014 Jul;88(13):7402-11. doi: 10.1128/JVI.00443-14], 문헌[Guedj et al, Hepatology. 2014 Dec;60(6):1902-10. doi: 10.1002/hep.27357]).
이 실시예에서, 원형 RNA를 EMCV IRES, ORF로서 3XFLAG로 태깅된 Nluc, 및 스태거 서열(EMCV 2A 3XFLAG Nluc 2A no stop)을 인코딩하도록 설계하였다. RNA 이차 구조를 평가하기 위해, 열역학적 RNA 구조 예측 툴(RNAfold)을 사용하였다(Vienna RNA). 또한, RNA 삼차 구조를 RNA 모델링 알고리즘을 사용하여 분석하였다.
도 40 및 도 41에 나타낸 바와 같이, 원형 RNA는 채용된 준-이중 가닥, 나선 구조를 갖도록 모델링된다.
실시예 46: 반복 서열과 연결된 준-나선 구조를 갖는 원형 RNA의 제조
이 실시예는 원형 RNA가 반복 서열과 연결된 준-나선 구조를 지니도록 설계될 수 있음을 보여준다.
비-천연 발생 원형 RNA를 반복 서열과 연결된 준-나선 구조를 채용하도록 조작하였다. 유사한 구조는 독특하게 긴 생체내 반감기를 지닌 천연 발생 원형 RNA의 축합에 관여하는 것으로 나타났다(문헌[Griffin et al 2014], 문헌[Guedj et al 2014]).
이 실시예에서, 원형 RNA가 EMCV IRES, Nluc, 및 반복 서열을 포함하는 스페이서를 인코딩하도록 설계하였다(SEQ ID NO: 26). RNA 삼차 구조를 평가하기 위해, RNA 모델링 알고리즘을 사용하였다.
도 42에 나타낸 바와 같이, 원형 RNA는 준-나선 구조를 채용하도록 모델링된다.
실시예 47: 원형화된 RNA는 원형이며 콘카테머가 아니다
이 실시예는 RNase H에 의한 원형 RNA 분해에 의해, 원형이며 콘카테머가 아닌 RNA와 일치하는 핵산 분해 생성물이 생성되는 것을 보여준다.
RNA는 리가제와 인큐베이션시키는 경우, 반응하지 않거나, 분자내- 또는 분자간 결합을 형성하여, 각각 원형(자유 말단 부재) 또는 콘카테머 RNA를 생성할 수 있다. 상보성 DNA 프라이머, 및 DNA/RNA 듀플렉스를 인식하는 비특이적인 엔도뉴클레아제인 RNAse H를 사용하여 각 유형의 RNA를 처리하면, 출발 RNA 물질에 따라 특유한 수의 특정 크기의 분해 생성물이 생성되는 것으로 예상된다.
하기의 실시예에 나타낸 바와 같이, 라이게이션된 RNA는 RNase H 분해에 의해 생성되는 RNA의 수와 크기에 기초하여, 원형이며 콘카테머가 아닌 것으로 나타났다.
EMCV T2A 3XFLAG-Nluc P2A를 함유하는 원형 RNA 및 선형 RNA를 생성하였다.
RNA(1299개 뉴클레오티드)의 원형화 상태를 시험하기 위해, 0.05 pmole/㎕의 선형 또는 원형 RNA를 37℃에서 20분 동안 0.25 U/㎕의 RNAse H, 즉, DNA/RNA 듀플렉스를 분해하는 엔도리보뉴클레아제, 및 1037개 뉴클레오티드 내지 1046개 뉴클레오티드의 RNA에 대한 0.3 pmole/㎕의 올리고머(
Figure pct00022
, SEQ ID NO: 55)와 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후에, 반응 혼합물을 6% 변성 PAGE에 의해 분석하였다.
상기 기술된 바와 같이 사용된 선형 RNA에 있어서, DNA 프라이머의 결합, 및 후속된 RNase H에 의한 절단 후에 1041개 뉴클레오티드 및 258개 뉴클레오티드의 2가지 절단 생성물이 수득되는 것으로 예상된다. 콘카테머는 258개 뉴클레오티드, 1041개 뉴클레오티드 및 1299개 뉴클레오티드의 3가지 절단 생성물을 생성하는 것으로 예상된다. 원형은 단일의 1299개 뉴클레오티드 절단 생성물을 생성하는 것으로 예상된다.
RNase 엔도뉴클레아제와 인큐베이션시킨 선형 RNA 레인 내의 밴드의 수는 예상되는 바와 같이 1041개 뉴클레오티드 및 258개 뉴클레오티드의 2개의 밴드를 생성한 반면, 1299개 뉴클레오티드의 단일의 밴드가 원형 RNA 레인에서 생성되었으며(도 43 참조), 이는 원형 RNA가 사실상 원형이며 콘카테머가 아님을 나타낸다.
실시예 48: 대형 circRNA의 제조
이 실시예는 약 20개 염기 내지 약 6.2 Kb 범위의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 생성을 보여준다.
하나 이상의 바람직한 특성을 포함하도록 조작된 비-천연 발생 원형 RNA를 요망되는 기능에 따라 다양한 크기로 생성하였다. 하기의 실시예에 나타낸 바와 같이, 최대 6200개 뉴클레오티드의 선형 RNA를 원형화시켰다.
플라스미드 pCDNA3.1/CAT(6.2 kb)를 여기서 사용하였다. 500개 뉴클레오티드, 1000개 뉴클레오티드, 2000개 뉴클레오티드, 4000개 뉴클레오티드, 5000개 뉴클레오티드 및 6200개 뉴클레오티드에 상응하는 DNA 올리고뉴클레오티드를 생성하기 위해 규칙적인 간격으로 pCDNA3.1/CAT에 어닐링하도록 프라이머를 설계하였다. 표기된 DNA 올리고뉴클레오티드의 시험관내 전사를 수행하여, 상응하는 크기의 선형 RNA를 생성하였다. 스플린트 DNA를 사용하여 이들 RNA 올리고뉴클레오티드로부터 원형 RNA를 생성하였다.
RNA의 원형화 효율을 측정하기 위해, 6가지의 상이한 크기의 선형 RNA(500개 뉴클레오티드, 1000개 뉴클레오티드, 2000개 뉴클레오티드, 4000개 뉴클레오티드, 5000개 뉴클레오티드 및 6200개 뉴클레오티드)를 생성하였다. 이들을 DNA 스플린트 및 T4 DNA 리가제 2를 사용하여 원형화시켰다. 대조군으로서, 하나의 반응을 T4 RNA 리가제 없이 수행하였다. 원형화된 시료의 절반을 RNAse R로 처리하여, 선형 RNA를 제거하였다.
원형화 효율을 모니터링하기 위해, 각 시료를 qPCR을 사용하여 분석하였다. 도 44에 나타낸 바와 같이, 원형 RNA를 매우 다양한 상이한 길이의 DNA로부터 생성하였다. 도 45에 나타낸 바와 같이, RNA의 원형화를 RNAse R 처리, 및 원형 연접부에 대한 qPCR 분석을 사용하여 확인하였다. 이 실시예는 다양한 길이에 대한 원형 RNA 생성을 보여준다.
실시예 49: 단백질 결합 부위를 갖도록 조작된 원형 RNA
이 실시예는 단백질 결합 부위를 갖는 원형 RNA의 생성을 보여준다.
이 실시예에서, CVB3 IRES(SEQ ID NO: 56) 및 가우시아 루시퍼라제(Gluc)를 인코딩하는 ORF(SEQ ID NO: 57)에 이어서 적어도 하나의 단백질 결합 부위를 포함하도록 하나의 원형 RNA를 설계한다. 구체적인 예에 있어서, 신드비스 바이러스 3'UTR로부터의 HuR 결합 서열(SEQ ID NO: 52)을 사용하여 원형 RNA 면역원성에 대한 단백질 결합의 영향을 시험한다. HuR 결합 서열은 2가지 요소, URE(U-풍부 요소; SEQ ID NO: 50) 및 CSE(보존된 서열 요소; SEQ ID NO: 51)를 포함한다. HuR 결합 서열이 없는 또는 URE가 있는 원형 RNA를 대조군으로서 사용한다. 아나바에나(Anabaena) 자가촉매작용 인트론 및 엑손 서열의 부분은 CVB3 IRES(SEQ ID NO: 56) 이전에 위치된다. 원형 RNA는 기술된 바와 같이 시험관내에서 생성된다. 도 46에 나타낸 바와 같이, 원형 RNA는 HuR 결합 부위를 함유하도록 생성되었다.
원형 RNA 면역원성에 대한 RNA 결합 단백질의 영향을 모니터링하기 위해, 세포를 96 웰 플레이트의 각 웰 내로 플레이팅한다. 1일 후에, 500 ng의 원형 RNA를 지질-기반의 트랜스펙션 시약(인비트로겐)을 사용하여 각 웰 내로 트랜스펙션시킨다. 번역 효율/RNA 안정성/면역원성을 매일, 72시간까지 모니터링한다. 배지를 수집하여, Gluc 활성을 모니터링한다. RNA 수준을 측정하기 위한 세포 용해물을 리얼-타임 RT-PCR(인비트로겐)에 의해 상대적 유전자 발현의 측정을 가능하게 하는 키트를 사용하여 제조한다.
번역 효율을 제조업체의 설명(피어스(Pierce))에 따라 가우시아 루시퍼라제 플래시 검정 키트를 사용하여 Gluc 활성을 측정함으로써 모니터링한다.
qRT-PCR 분석을 위해, cDNA를 제조업체의 설명(인비트로겐)에 따라 세포 용해물 제조 키트를 사용하여 생성한다. qRT-PCR 분석을 PCR 마스터 믹스(브릴리언트 II SYBR 그린 qRT-PCR 마스터 믹스) 및 PCR 사이클러(라이트사이클러 480)를 사용하여 3벌로 수행한다. 원형 RNA 안정성을 Nluc에 대한 프라이머에 의해 측정한다. 널리 알려져 있는 선천적 면역성 조절자, 예컨대 RIG-I, MDA5, OAS, OASL 및 PKR에 대한 mRNA 수준을 정량화하고, 액틴 값에 대해 정규화시킨다.
실시예 50: 조절 핵산 부위를 갖는 원형 RNA의 제조
이 실시예는 조절 RNA 결합 부위를 갖는 원형 RNA의 시험관내 생성을 보여준다.
상이한 세포 유형은 특정 RNA 서열을 표적화하기 위한 특유한 핵산 조절 기구를 지닌다. 원형 RNA 내의 이들 특정 서열의 인코딩은 상이한 세포 유형에 특유한 특성을 부여할 수 있었다. 하기의 실시예에 나타낸 바와 같이, 원형 RNA를 마이크로RNA 결합 부위를 인코딩하도록 조작하였다.
이 실시예에서, 원형 RNA는 WT EMCV IRES를 인코딩하는 서열, mir692 마이크로RNA 결합 부위(
Figure pct00023
) 및 IRES-ORF에 측접한 2개의 스페이서 요소를 포함하였다.
원형 RNA를 시험관내에서 생성하였다. 전사를 유도하기 위한 T7 RNA 폴리머라제 프로모터에 더하여, 상기 열거된 모든 모티프를 포함하는 DNA 주형으로부터 비변형된 선형 RNA를 시험관내 전사하였다. 전사된 RNA를 제조업체의 설명에 따라 RNA 클린업 키트(뉴 잉글랜드 바이오랩스, T2050)로 정제하고, RNA 5'-포스포하이드롤라제(RppH)(뉴 잉글랜드 바이오랩스, M0356)로 처리하고, RNA 정제 컬럼으로 다시 정제하였다. RppH 처리된 RNA를 스플린트 DNA(
Figure pct00024
) 및 T4 RNA 리가제 2(뉴 잉글랜드 바이오랩스, M0239)를 사용하여 원형화시켰다. 원형 RNA를 우레아-PAGE 정제하고(도 47), 완충제(0.5 M 아세트산나트륨, 0.1% SDS, 1 mM EDTA) 중에 용리시키고, 에탄올 침전시키고, RNase 부재의 물 중에 재현탁시켰다.
도 47에 나타낸 바와 같이, miRNA 결합 부위를 갖는 원형 RNA를 생성하였다.
실시예 51: 원형 RNA의 자가-스플라이싱
이 실시예는 자가-스플라이싱에 의해 원형 RNA를 생성하는 능력을 보여준다.
이 실시예에 있어서, 원형 RNA는 CVB3 IRES, 가우시아 루시퍼라제(GLuc)를 인코딩하는 ORF, 및 IRES-ORF에 측접한 2개의 스페이서 요소를 포함하였다.
원형 RNA를 시험관내에서 생성하였다. 비변형된 선형 RNA를 상기 열거된 모든 모티프를 포함하는 DNA 주형으로부터 시험관내 전사하였다. 시험관내 전사 반응물은 1 ㎍의 주형 DNA T7 RNA 폴리머라제 프로모터, 10X T7 반응 완충제, 7.5 mM ATP, 7.5 mM CTP, 7.5 mM GTP, 7.5 mM UTP, 10 mM DTT, 40 U RNase 저해제 및 T7 효소를 포함하였다. 전사를 37℃에서 4시간 동안 수행하였다. 전사된 RNA를 37℃에서 15분 동안 1 U의 DNase I을 사용하여 DNase 처리하였다. 자가 스플라이싱에 의한 원형화를 유리하게 하기 위해, 추가의 GTP를 2 mM의 최종 농도로 첨가하고, 55℃에서 15분 동안 인큐베이션시켰다. 그 다음, RNA를 컬럼 정제하고, UREA-PAGE에 의해 가시화시켰다.
도 48은 자가-스플라이싱에 의해 생성되는 원형 RNA를 보여준다.
실시예 52: 엔크립토겐을 포함하는 스플라이싱 요소를 갖는 원형 RNA
이 실시예에 있어서, 원형 RNA는 CVB3 IRES, 가우시아 루시퍼라제(GLuc)를 인코딩하는 ORF 및 IRES-ORF에 측접한 2개의 스페이서 요소를 포함하며, 이들 2개의 스페이서 요소는 아나바에나 자가촉매작용 인트론 및 엑손 서열의 부분인 스플라이싱 요소를 포함한다(SEQ ID NO: 59).
원형 RNA를 시험관내에서 생성한다.
이 실시예에서, 세포를 12 웰 플레이트의 각 웰 내로 플레이팅함으로써 선천적 면역 반응 유전자의 수준을 세포에서 모니터링한다. 1일 후에, 1 ㎍의 선형 또는 원형 RNA를 지질-기반의 트랜스펙션 시약(인비트로겐)을 사용하여 각 웰 내로 트랜스펙션시킨다. 트랜스펙션 후 24시간째에, 전체 RNA를 페놀-기반의 추출 시약(인비트로겐)을 사용하여 세포로부터 단리한다. 전체 RNA(500 ng)를 역전사로 처리하여, cDNA를 생성한다. qRT-PCR 분석을 염료-기반의 정량적 PCR 믹스(바이오라드)를 사용하여 수행한다.
스플라이싱 요소를 포함하는 원형 RNA로 트랜스펙션된 BJ 세포로부터의 면역 관련 유전자의 qRT-PCR 수준을 선형 RNA 트랜스펙션된 세포에 비하여 RIG-I, MDA5, PKR 및 IFN-베타의 감소에 대하여 평가한다.
실시예 53: 세포 분열 동안 원형 RNA의 지속성
이 실시예는 세포 분열 동안 원형 폴리리보뉴클레오티드의 지속성을 보여준다. 하나 이상의 바람직한 특성을 포함하도록 조작된 비-천연 발생 원형 RNA는 분해되지 않고, 세포 분열 내내 세포에서 지속될 수 있다. 하기의 실시예에 나타낸 바와 같이, 가우시아 루시퍼라제(GLuc)를 발현하는 원형 RNA를 HeLa 세포에서 72시간의 일에 걸쳐 모니터링하였다.
이 실시예에서, 1307개 뉴클레오티드 원형 RNA는 CVB3 IRES, 가우시아 루시퍼라제(GLuc)를 인코딩하는 ORF, 및 IRES-ORF에 측접한 2개의 스페이서 요소를 포함하였다.
세포 분열에 걸친 원형 RNA의 지속성을 HeLa 세포에서 모니터링하였다. 96-웰 플레이트 내의 5000개 세포/웰을 원형 RNA로 현탁액 트랜스펙션시켰다. 명 세포 영상화를 아보스 이미저(Avos imager)(써모피셔)에서 수행하고, 0시간째, 24시간째, 48시간째, 72시간째 및 96시간째에 세포 계수를 발광 세포 생존력 검정(프로메가)을 사용하여 수행하였다. 가우시아 루시퍼라제 효소 활성을 단백질 발현의 척도로서 매일 모니터링하고, 가우시아 루시퍼라제 활성 검정(써모 사이언티픽 피어스)을 사용함으로써 24시간마다 웰로부터 제거된 상청액 중에서 gLuc 발현을 매일 모니터링하였다. 50 ㎕의 1X Gluc 기질을 5 ㎕의 혈장에 첨가하여, Gluc 루시퍼라제 활성 검정을 수행하였다. 혼합한 직후에 발광계 기기(프로메가) 상에서 플레이트를 판독하였다.
원형 RNA로부터의 단백질의 발현은 분열하는 세포에서 선형 RNA(트랜스펙션 후 48시간째에 약 7 RLU)보다 더 높은 수준(트랜스펙션 후 48시간째에 약 10 RLU) 으로 검출되었다(도 49). 원형 RNA를 갖는 세포는 측정된 모든 시점에 선형 RNA에 비하여 더 높은 세포 분열율을 가졌다. 이 실시예는 세포 분열 동안 그의 선형 RNA 대응물보다 증가된 원형 RNA의 검출을 보여준다.
실시예 54: 회전환 번역에 의해 복수의 발현 서열이 생성된다
이 실시예는 단일의 구축물로부터 다수의 단백질을 발현하는 원형 RNA의 능력을 보여준다. 추가로, 이 실시예는 다수의 ORF를 인코딩하는 원형 RNA의 회전환 번역을 보여준다. 이 실시예는 단일의 구축물로부터의 2가지 단백질의 발현을 추가로 보여준다.
하나의 원형 RNA(mtEMCV T2A 3XFLAG-GFP F2A 3XFLAG-Nluc P2A IS 스페이서)를 회전환 번역을 위해 EMCV IRES(SEQ ID NO: 58), 및 3XFLAG 태그와 함께 GFP를 인코딩하는 ORF 및 3XFLAG 태그와 함께 나노루시퍼라제(Nluc)를 인코딩하는 ORF를 포함하도록 설계하였다. 스태거 요소(2A)는 GFP 및 Nluc ORF에 인접하였다. 또 다른 원형 RNA를 유사하게 설계하였지만, Nluc ORF와 스페이서의 중간에 삼중 정지 코돈을 포함하였다. EMCV IRES 전에 아나바에나 자가촉매작용 인트론 및 엑손 서열의 부분을 포함시켰다. 원형 RNA를 기술된 바와 같이 시험관내에서 생성하였다.
원형 RNA로부터의 단백질의 발현을 시험관내에서 또는 세포 내에서 모니터링하였다. 시험관내 분석을 위해, 원형 RNA를 30℃에서 토끼 망상적혈구 용해물(프로메가, 미국 위스콘신주 피츠버그 소재) 중에 3시간 동안 인큐베이션시켰다. 반응 혼합물의 최종 조성은 70% 토끼 망상적혈구 용해물, 20 μM 완전 아미노산 및 0.8 U/㎕ RNase 저해제(일본 오사카 소재의 토요보(Toyobo))를 포함하였다.
인큐베이션 후에, 아세트산(0.32 ㎕) 및 물(300 ㎕)을 반응 혼합물(16 ㎕)에 첨가하고 15℃에서 10분 동안 20,817 xg에서 원심분리시킴으로써 헤모글로빈 단백질을 제거하였다. 상청액을 제거하고, 펠렛을 2x SDS 시료 완충제 중에 용해시키고, 70℃에서 15분 동안 인큐베이션시켰다. 1400 xg에서 5분 동안 원심분리한 후에, 상청액을 10% 내지 20% 기울기 폴리아크릴아미드/SDS 겔에서 분석하였다.
세포에서의 분석을 위해, 세포를 12 웰 플레이트의 각 웰 내로 플레이팅하여 세포에서 원형 RNA의 번역 효율을 모니터링하였다. 1일 후에, 500 ng의 원형 RNA를 지질-기반의 트랜스펙션 시약(인비트로겐)을 사용하여 각 웰 내로 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션 후 48시간째에, 200 ㎕의 RIPA 완충제를 각 웰 상에 첨가함으로써 세포를 수집하였다. 다음으로, 10 ㎍의 세포 용해물 단백질을 10% 내지 20% 기울기 폴리아크릴아미드/SDS 겔 상에서 분석하였다.
건식 전달 방법을 사용하여 망상적혈구 용해물 및 세포로부터의 시료를 니트로셀룰로스 멤브레인으로 전기전달한 후에, 블롯을 항-FLAG 항체 및 항-마우스 IgG 퍼옥시다제와 인큐베이션시켰다. 로딩 대조군으로서, 항-베타 튜불린 항체를 사용하였다. 블롯을 증강된 화학발광(ECL) 키트로 가시화시켰다. 웨스턴 블롯 밴드 세기를 ImageJ에 의해 측정하였다.
도 50에 나타낸 바와 같이, GFP 및 nLuc를 인코딩하는 원형 RNA는 2가지 단백질 생성물을 생성하였다. 삼중 정지가 없는 원형 RNA로부터의 번역은 삼중 정지 코돈을 갖는 원형 RNA보다 더 많은 단백질 생성물 둘 모두를 생성하였다. 마지막으로, 삼중 정지가 존재하는 및 이것이 부재하는 원형 RNA 둘 모두는 각각 1/3.24 및 1/3.37 비로 단백질을 발현하였다.
실시예 55: 원형 RNA는 선형 RNA에 비하여 감소된 독성을 보인다
이 실시예는 원형 RNA가 선형 RNA보다 독성이 더 낮다는 것을 보여준다.
이 실시예에 있어서, 원형 RNA는 EMCV IRES, 3XFLAG 태그를 가지며 어느 하나의 측 상에 스태거 요소(2A)에 측접한 NanoLuc를 인코딩하는 ORF 및 종결 요소(정지 코돈)를 포함한다. 원형 RNA를 본원에 기술된 바와 같이 시험관내에서 생성하고 정제하였다. 본 실시예에서 사용되는 선형 RNA는 글로빈 UTR을 갖는 nLuc를 인코딩하는 캡-변형된-폴리 A 테일형 RNA 또는 캡-비변형된-폴리 A 테일형 RNA였다.
세포 내의 RNA의 독성을 모니터링하기 위해, BJ 인간 섬유아세포를 96 웰 플레이트의 각 웰 상으로 플레이팅하였다. 50 ng의 원형 또는 캡-변형된-폴리A 테일형 선형 RNA를 제조업체의 권고에 따라 지질-기반의 트랜스펙션 시약(써모피셔)을 사용하여 0시간, 48시간 및 72시간 후에 트랜스펙션시켰다. 96시간째에 명 세포 영상화를 아보스 이미저(써모피셔)에서 수행하였다. 조건마다 전체 세포를 ImageJ를 사용하여 분석하였다.
도 51에 나타낸 바와 같이, 원형 RNA로 트랜스펙션된 배양물에서 이미지당 약 90 내지 100개의 세포가 존재하는 한편, 선형 Cap-Nluc-폴리 (A) RNA로 트랜스펙션된 배양물에서 이미지당 오직 약 40개의 세포만이 존재하였으며, 이는 원형 RNA의 트랜스펙션이 선형 RNA에 비하여 감소된 독성을 보이는 것을 나타낸다.
실시예 56: 스트레스 조건 하에서의 발현
이 실시예는 원형 RNA가 선형 RNA보다 스트레스 조건 하에서 더 잘 발현되었음을 보여준다.
이 실시예에 있어서, 원형 RNA는 EMCV IRES, 3XFLAG 태그를 가지며 스태거 요소에 측접한 NanoLuc를 인코딩하는 ORF를 포함한다. 원형 RNA를 기술된 바와 같이 시험관내에서 생성하고 정제하였다. 이 실시예에 사용되는 선형 RNA는 글로빈 UTR을 갖는 nLuc를 인코딩하는 캡핑된-폴리A 테일형 RNA였다.
세포로부터 가우시아 루시퍼라제의 발현을 모니터링하기 위해, BJ 인간 섬유아세포를 96 웰 플레이트의 각 웰 내로 플레이팅하였다. 50 ng의 원형 또는 캡-폴리A 테일형 선형 RNA를 제조업체의 권고에 따라 지질-기반의 트랜스펙션 시약을 사용하여 0시간, 48시간 및 72시간 후에 트랜스펙션시켰다. 가우시아 루시퍼라제 효소 활성을 단백질 발현의 척도로서 매일 모니터링하고, 가우시아 루시퍼라제 활성 검정(써모 사이언티픽 피어스)을 사용함으로써 24시간마다 웰로부터 제거된 상청액 중에서 gLuc 발현을 매일 모니터링하였다. 50 ㎕의 1X Gluc 기질을 5 ㎕의 혈장에 첨가하여, Gluc 루시퍼라제 활성 검정을 수행하였다. 혼합한 직후에 발광계 기기(프로메가) 상에서 플레이트를 판독하였다.
도 52에 나타낸 바와 같이, 원형 RNA는 스트레스 조건 하에서 선형 RNA(트랜스펙션 후 3일째에 약 2000 RLU 및 트랜스펙션 후 4일째에 검출 가능하지 않게 감소)에 비하여 더 높은 수준(트랜스펙션 후 3일째에 약 1000 RLU 및 트랜스펙션 후 6일째에 2000 RLU 초과)으로 번역되었다.
실시예 57: 선택적 발현을 위한 리보스위치
이 실시예는 원형 RNA로부터의 단백질 발현을 제어하는 능력을 보여준다.
이 실시예를 위해, NanoLuc를 인코딩하는 ORF의 발현을 조절하는 합성 리보스위치(SEQ ID NO: 60)를 포함하도록 원형 RNA를 설계하였으며, 도 43을 참조한다. 원형 RNA를 시험관내에서 생성하였다. 전사를 유도하기 위한 T7 RNA 폴리머라제 프로모터에 더하여, 상기 열거된 모든 모티프를 포함하는 DNA 주형으로부터 비변형된 선형 RNA를 시험관내 전사하였다. 전사된 RNA를 제조업체의 설명에 따라 RNA 클린업 키트(뉴 잉글랜드 바이오랩스, T2050)로 정제하고, RNA 5'-포스포하이드롤라제(RppH)(뉴 잉글랜드 바이오랩스, M0356)로 처리하고, RNA 정제 컬럼으로 다시 정제하였다. RppH 처리된 RNA를 스플린트 DNA(
Figure pct00025
) 및 T4 RNA 리가제 2(뉴 잉글랜드 바이오랩스, M0239)를 사용하여 원형화시켰다. 원형 RNA를 우레아-PAGE 정제하였다(도 53).
테오필린 또는 테트라사이클린은 그의 특정 리보스위치의 활성화를 유도하여, 유전자 발현의 오프-스위치를 초래한다(문헌[Auslander et al Mol Biosyst. 2010 May;6(5):807-14] 및 문헌[Ogawa et al, RNA. 2011 Mar;17(3):478-88. doi: 10.1261/rna.2433111. Epub 2011 Jan 11]에 기술된 바와 같음). 리보스위치는 원형 RNA로부터의 GFP 또는 NLuc 발현을 제어하는 것으로 예상된다. 따라서, 테오필린 또는 테트라사이클린의 첨가 후에 GFP 또는 NLuc 발현이 예상되지 않는다.
리보스위치의 효율을 무세포 번역 시스템 및 HeLa 세포에서 시험한다. 제조업체의 권고에 따라 무세포 번역 키트(프로메가, L4140)를 사용하고, NLuc ORF에 대해 발광계 기기(프로메가) 및 GFP ORF에 대해 세포 영상화 다중-모드 판독기(바이오테크(BioTek))를 사용하여 발광을 측정함으로써 무세포 번역을 수행한다.
세포 검정을 위해, HeLa 세포/웰을 테오필린 또는 테트라사이클린 의존성 합성 리보스위치의 제어 하에 GFP 또는 NLuc를 인코딩하는 기술된 원형 RNA 1 nM로 트랜스펙션시켜(theoN5에 대한 제1 PCR 정방향 프라이머,
Figure pct00026
, theoN5에 대한 제2 PCR 정방향 프라이머,
Figure pct00027
; tc-N5에 대한 제1 PCR 정방향 프라이머,
Figure pct00028
, tc-N5에 대한 제2 PCR 정방향 프라이머,
Figure pct00029
), 선택적 발현을 평가한다. 지질-기반의 트랜스펙션 시약을 제조업체의 권고에 따라 사용한다.
37℃ 및 5% CO2에서 24시간 배양한 후에, 세포를 원형 RNA에 인코딩된 리보스위치에 따라, 1 nM 내지 3 mM 범위의 농도로 테오필린 또는 테트라사이클린과 함께 또는 이것 없이 처리한다. 24시간의 연속 배양 후에, 형광 또는 발광을 평가한다. GFP에 있어서, 생 세포를 5% FBS 및 페니실린/스트렙토마이신 및 핵에 대한 염료를 갖는 형광 중성 DMEM 배지에서 영상화시킨다. NLuc에 있어서, 발광계 기기(프로메가)를 사용하여 제조업체의 설명에 따라 루시퍼라제 시스템을 사용하여 발광을 평가한다.
NLuc에 대한 DNA 주형(청색: 갈색날개노린재(Plautia stali) 장내 바이러스 IRES, 주황색: NLuc ORF)
Figure pct00030
Figure pct00031
eGFP에 대한 DNA 주형(청색: 갈색날개노린재 장내 바이러스 IRES, 주황색: eGFP ORF)
Figure pct00032
프라이머 서열
2에 대한 정방향 프라이머(밑줄: T7 프로모터)
Figure pct00033
theoN5에 대한 제1 PCR에서의 정방향 프라이머(주황색: 압타머; 적색: aIRES; 보라색: aaIRES)
Figure pct00034
TheoN5 제2 PCR
Figure pct00035
tc-N5에 대한 제1 PCR에서의 정방향 프라이머
Figure pct00036
tc-N5에 대한 제2 PCR에서의 정방향 프라이머
Figure pct00037
모든 PCR에서의 역방향 프라이머
Figure pct00038
연접부
Figure pct00039
스플린트
Figure pct00040
실시예 58: 변형된 뉴클레오티드를 갖는 원형 RNA를 생성하고, 번역하고, 원형 RNA의 면역 효과를 감소시켰다
이 실시예는 단백질 생성물을 생성하는 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 생성을 보여준다. 또한, 이 실시예는 뉴클레오티드 변형을 갖는 조작된 원형 RNA가 선형 RNA에 비하여 감소된 면역 효과를 가졌음을 보여준다.
하나 이상의 바람직한 특성을 포함하도록 조작되며 변형된 뉴클레오티드가 완전히 또는 부분적으로 혼입된 비-천연 발생 원형 RNA를 생성하였다. 하기의 실시예에 나타낸 바와 같이, 전장 변형된 선형 RNA, 또는 변형 및 비변형된 선형 RNA의 하이브리드를 원형화시키고, nLuc의 발현을 평가하였다. 또한, 변형된 원형 RNA는 비-변형된 원형 RNA에 비하여, BJ 세포에서 면역 관련 유전자(MDA5, OAS 및 IFN-베타 발현의 q-PCR)의 감소된 활성화를 갖는 것으로 나타났다.
WT EMCV Nluc 정지 스페이서를 갖는 원형 RNA를 생성하였다. 완전한 변형 치환을 위해, 변형된 뉴클레오티드, 슈도우리딘 및 메틸시토신 또는 m6A를 시험관내 전사 반응 동안 각각 표준 비변형 뉴클레오티드, 우리딘 및 시토신 또는 아데노신 대신에 첨가하였다. 하이브리드 구축물을 위해, WT EMCV IRES를 nLuc ORF로부터 개별적으로 합성하였다. WT EMCV IRES를 변형된 또는 비-변형된 뉴클레오티드를 사용하여 합성하였다. 대조적으로, nLuc ORF 서열을 시험관내 전사 반응 동안 각각 표준 비변형 뉴클레오티드, 우리딘 및 시토신 또는 아데노신 대신에, 변형된 뉴클레오티드, 슈도우리딘 및 메틸시토신 또는 m6A를 사용하여 합성하였다. 변형된 또는 비변형된 IRES와 변형된 ORF의 합성 후에, 이들 2가지 올리고뉴클레오티드를 T4 DNA 리가제를 사용하여 함께 라이게이션시켰다. 도 54a에 나타낸 바와 같이, 변형된 원형 RNA를 생성하였다.
완전히 변형되거나 하이브리드 변형된 구축물로부터 nLuc의 발현 효율을 측정하기 위해, 0.1 pmol의 선형 및 원형 RNA를 6시간 동안 BJ 섬유아세포 내로 트랜스펙션시켰다. nLuc 발현을 트랜스펙션 후 6시간째, 24시간째, 48시간째 및 72시간째에 측정하였다.
선천적 면역 반응 유전자의 수준을 페놀-기반의 추출 시약(인비트로겐)을 사용하여 세포로부터 단리된 전체 RNA로부터 세포에서 모니터링하였다. 전체 RNA(500 ng)를 역전사 처리하여, cDNA를 생성하였다. qRT-PCR 분석을 염료-기반의 정량적 PCR 믹스(바이오라드)를 사용하여 수행하였다.
도 54b 및 도 54c에 나타낸 바와 같이, 변형된 원형 RNA는 루시퍼라제 활성에 의해 측정되는 바와 같이 번역되었다. 도 55a, 도 55b 및 도 55c에 나타낸 바와 같이, 원형 RNA로 트랜스펙션된 BJ 세포로부터의 면역 관련 유전자의 qRT-PCR 수준은 비변형된 원형 RNA 트랜스펙션된 세포에 비하여 MDA5, OAS 및 IFN-베타 발현의 감소를 보였다. 따라서, 수여자 세포에서의 면역원성 관련 유전자의 유도는 비변형된 원형 RNA 트랜스펙션된 세포에 비하여 변형된 원형 RNA로 트랜스펙션된 세포에서 감소되었다.
실시예 59: 생체내에서 투여된 원형 RNA는 선형 RNA에 비하여 더 긴 반감기/증가된 안정성을 나타내었다
이 실시예는 원형 RNA를 전달하는 능력 및 생체내에서 선형 RNA에 비하여 원형 RNA의 증가된 안정성을 보여준다.
이 실시예에 있어서, 나노루시퍼라제(Nluc)를 인코딩하는 ORF 및 스태거 서열과 함께 EMCV IRES를 포함하도록 원형 RNA를 설계하였다(EMCV 2A 3XFLAG Nluc 2A no stop 및 EMCV 2A 3XFLAG Nluc 2A stop). 원형 RNA를 시험관내에서 생성하였다.
Balb/c 마우스에 Nluc ORF를 갖는 원형 RNA 또는 대조군으로서 선형 RNA를 정맥내(IV) 꼬리 정맥 투여를 통해 주사하였다. 제조업체의 설명에 따라 지질-기반의 트랜스펙션 시약(미루스) 중에 제형화된 단회 용량의 5 ㎍의 RNA를 동물에게 제공하였다.
마우스를 희생시키고, 투여 후 3일째, 4일째 및 7일째에 간을 수집하였다(n = 2마리 마우스/시점). 간을 수집하고, RNA 안정화 리젠(reagen)(인비트로겐)에서 보관하였다. 조직을 마이크로 튜브 균질화기(피셔 사이언티픽)를 사용하여 RIPA 완충제 중에 균질화시키고, RNA를 cDNA 합성을 위한 페놀-기반의 RNA 추출 시약을 사용하여 추출하였다. qPCR을 사용하여 간 내의 선형 및 원형 RNA 둘 모두의 존재를 측정하였다.
조직 내의 RNA 검출을 qPCR에 의해 수행하였다. 선형 및 원형 RNA를 검출하기 위해, Nluc ORF를 증폭시키는 프라이머를 사용하였다. (
Figure pct00041
Figure pct00042
). 오직 원형 RNA만을 검출하기 위해, 5'-3' 연접부를 증폭시키는 프라이머는 원형 RNA 구축물의 검출을 가능하게 하였지만, 선형 RNA 구축물의 검출을 가능하게 하지 않았다(
Figure pct00043
).
원형 RNA는 주사 후 3일째, 4일째 및 7일째에 마우스의 간에서 선형 RNA보다 더 높은 수준으로 검출되었다(도 56). 따라서, 원형 RNA를 투여하였으며, 투여 후 적어도 7일 동안 생체내에서 검출 가능하였다.
실시예 60: 원형 RNA의 생체내 발현, 반감기 및 비-면역원성
이 실시예는 생체내에서 원형 RNA로부터의 발현을 유도하는 능력을 보여준다. 그것은 선형 RNA에 비하여 원형 RNA의 증가된 반감기를 보여준다. 마지막으로, 이는 원형 RNA가 생체내에서 감소된 면역 효과를 가졌음을 보여준다.
이 실시예에 있어서, 원형 RNA는 CVB3 IRES, 가우시아 루시퍼라제(GLuc)를 인코딩하는 ORF, 및 IRES-ORF에 측접한 2개의 스페이서 요소를 포함하였다.
원형 RNA를 시험관내에서 생성하였다. 전사를 유도하기 위한 T7 RNA 폴리머라제 프로모터뿐만 아니라, 상기 열거된 모든 모티프를 포함하는 DNA 주형으로부터 비변형된 선형 RNA를 시험관내 전사하였다. 전사된 RNA를 제조업체의 설명에 따라 RNA 클린업 키트(뉴 잉글랜드 바이오랩스, T2050)로 정제하고, RNA 5'-포스포하이드롤라제(RppH)(뉴 잉글랜드 바이오랩스, M0356)로 처리하고, RNA 정제 컬럼으로 다시 정제하였다. RppH 처리된 RNA를 스플린트 DNA(
Figure pct00044
) 및 T4 RNA 리가제 2(뉴 잉글랜드 바이오랩스, M0239)를 사용하여 원형화시켰다. 원형 RNA를 우레아-PAGE 정제하고, 완충제(0.5 M 아세트산나트륨, 0.1% SDS, 1 mM EDTA) 중에 용리시키고, 에탄올 침전시키고, RNase 부재의 물 중에 재현탁시켰다.
마우스에 가우시아 루시퍼라제 ORF를 갖는 원형 RNA 또는 대조군으로서 선형 RNA 2.5 ㎍의 단일의 꼬리 정맥 주사 용량을 제공하였으며, 둘 모두 담체로서 지질-기반의 트랜스펙션 시약(미루스) 중에 제형화하였다.
혈액 시료(50 ㎕)를 투여 후 1일째, 2일째, 7일째, 11일째, 16일째 및 23일째에 각 마우스의 꼬리-정맥으로부터 EDTA 튜브 내로 수집하였다. 혈장을 1300 g, 4℃에서 25분 동안의 원심분리에 의해 단리하고, 분비된 효소인 가우시아 루시퍼라제의 활성을 가우시아 루시퍼라제 활성 검정(써모 사이언티픽 피어스)을 사용하여 시험하였다. 50 ㎕의 1X Gluc 기질을 5 ㎕의 혈장에 첨가하여, Gluc 루시퍼라제 활성 검정을 수행하였다. 혼합한 직후에 발광계 기기(프로메가)에서 플레이트를 판독하였다.
가우시아 루시퍼라제 활성은 원형 RNA의 투여 후 1일째, 2일째, 7일째, 11일째, 16일째 및 23일째에 혈장에서 검출되었다(도 57a 및 도 57b).
대조적으로, 가우시아 루시퍼라제 활성은 오직 변형된 선형 RNA의 투여 후 1일째 및 2일째에만 혈장에서 검출되었다. 선형 RNA 유래 단백질로부터의 효소 활성은 6일째 또는 그 이후에 백그라운드 수준을 초과하여 검출되지 않았다(도 57a 및 도 57b).
16일째에, 간을 3마리의 동물로부터 절제하고, 전체 RNA를 페놀-기반의 추출 시약(인비트로겐)을 사용하여 세포로부터 단리하였다. 전체 RNA(500 ng)를 역전사 처리하여, cDNA를 생성하였다. qRT-PCR 분석을 염료-기반의 정량적 PCR 믹스(바이오라드)를 사용하여 수행하였다.
도 58에 나타낸 바와 같이, 원형 RNA의 qRT-PCR 수준이 16일째에 간 및 비장 둘 모두에서 검출되었지만, 선형 RNA는 그렇지 않았다. 도 59에 나타낸 바와 같이, 16일째에 담체 트랜스펙션된 동물에 비하여 선형 RNA로 트랜스펙션된 간으로부터의 면역 관련 유전자는 RIG-I, MDA5, IFN-B 및 OAS의 발현 증가를 보였지만, 원형 RNA로 트랜스펙션된 간은 이들 마커 RIG-I, MDA5, PKR 및 IFN-베타의 발현 증가를 보이지 않았다. 따라서, 수여자 세포 내의 면역원성 관련 유전자의 유도는 트랜스펙션된 간으로부터 원형 RNA에 존재하지 않았다.
이 실시예는 주사 후 다수의 날에서의 혈장 중 단백질 활성의 수준을 사용하여, 연장된 기간 동안 생체내에서 원형 RNA가 단백질을 발현하였음을 보여주었다. 마우스 혈장에서의 가우시안 루시퍼라제(Gaussian Luciferase)의 반감기가 약 20분인 것을 고려해볼 때(문헌[Tannous, Nat Protoc., 2009, 4(4):582-591] 참조), 유사한 수준의 활성은 원형 RNA로부터의 연속 발현을 나타낸다. 추가로, 원형 RNA는 면역 관련 유전자를 유도하지 않고, 그의 변형된 선형 RNA 대응물보다 더 긴 발현 프로파일을 나타내었다.
서열 목록
SEQ ID NO: 1(출발 코돈)
Figure pct00045
SEQ ID NO: 2(GFP)
EGFP:
Figure pct00046
SEQ ID NO: 3(스태거 요소)
Figure pct00047
기타: F2A, BmCPV2A, BmIFV2A
SEQ ID NO: 4 ZKSCAN 인트론
Figure pct00048
또는
Figure pct00049
Figure pct00050
SEQ ID NO: 5 (IRES)
IRES(EMCV):
Figure pct00051
SEQ ID NO: 6(애드진(addgene) p3.1 락카제(laccase))
pcDNA3.1(+) 락카제2 MCS 엑손 벡터 서열 6926개 염기쌍
Figure pct00052
Figure pct00053
Figure pct00054
Figure pct00055
SEQ ID NO: 8 (RFP)
mCherry:
Figure pct00056
SEQ ID NO: 9(리보스위치)
압타자임(테오필린 의존성 문헌[Auslander 2010 Mol Biosys] 참조):
Figure pct00057
SEQ ID NO: 10(루시퍼라제)
nLuc:
Figure pct00058
SEQ ID NO: 11
코작 3XFLAG-EGF nostop(264개 염기쌍)
Figure pct00059
Figure pct00060
5-13: 코작 서열
14-262: 3XFLAG-EGF
SEQ ID NO: 12
코작 3XFLAG-EGF stop(273개 염기쌍)
Figure pct00061
5-13: 코작 서열
14-262: 3XFLAG-EGF
263-271: 삼중 정지 코돈
SEQ ID NO: 13
코작 3XFLAG-EGF P2A nostop(330개 염기쌍)
Figure pct00062
5-13: 코작 서열
14-262: 3XFLAG-EGF
263-328: P2A
SEQ ID NO: 14
코작 3XFLAG-EGF nostop(264개 염기쌍)을 구축하기 위한 스플린트
Figure pct00063
SEQ ID NO: 15
코작 3XFLAG-EGF stop(273개 염기쌍)을 구축하기 위한 스플린트
Figure pct00064
SEQ ID NO: 16
코작 3XFLAG-EGF P2A nostop(330개 염기쌍)을 구축하기 위한 스플린트
Figure pct00065
SEQ ID NO: 17
코작 1XFLAG-EGF T2A 1XFLAG-Nluc P2A nostop(873개 염기쌍)
Figure pct00066
5-13: 코작 서열
14-202: 1XFLAG-EGF
203-265: T2A
266-805: 1XFLAG-Nluc
806-871: P2A
SEQ ID NO: 18
코작 1XFLAG-EGF stop 1XFLAG-Nluc stop(762개 염기쌍)
Figure pct00067
5-13: 코작 서열
14-202: 1XFLAG-EGF
203-211: 삼중 정지 코돈
212-751: 1XFLAG-Nluc
752-760: 삼중 정지 코돈
SEQ ID NO: 19
코작 3XFLAG-EGF P2A nostop(330개 염기쌍)
Figure pct00068
5-13: 코작 서열
14-262: 3XFLAG-EGF
263-328: P2A
SEQ ID NO: 20
코작 3XFLAG-EGF nostop(264개 염기쌍)
Figure pct00069
5-13: 코작 서열
14-262: 3XFLAG-EGF
SEQ ID NO: 21
코작 3XFLAG-EGF stop(273개 염기쌍)
Figure pct00070
5-13: 코작 서열
14-262: 3XFLAG-EGF
263-271: 삼중 정지 코돈
SEQ ID NO: 22
EMCV IRES T2A 3XFLAG-EGF P2A nostop(954개 염기쌍)
Figure pct00071
Figure pct00072
5-574: EMCV IRES
575-637: T2A
638-886: 3XFALG-EGF
887-952: P2A
SEQ ID NO: 23
EMCV T2A 3XFLAG Nluc P2A stop(1314개 뉴클레오티드)
Figure pct00073
Figure pct00074
5-574: EMCV IRES
575-637: T2A
638-1237: 3XFLAG Nluc
1238-1303: P2A
1304-1312: 삼중 정지 코돈
SEQ ID NO: 24
EMCV T2A 3XFLAG Nluc P2A nostop(1305개 뉴클레오티드)
Figure pct00075
Figure pct00076
5-574: EMCV IRES
575-637: T2A
638-1237: 3XFLAG Nluc
1238-1303: P2A
SEQ ID NO: 25
코작 1XFLAG-EGF T2A 1XFLAG-NLuc P2A stop(882개 염기쌍)
Figure pct00077
5-13: 코작 서열
14-202: 1XFLAG-EGF
266-805: 1XFLAG-NLuc
806-871: P2A
872-880: 삼중 정지 코돈
SEQ ID NO: 26
예시적인 반복 스페이서 서열
Figure pct00078
SEQ ID NO: 27
pCDNA3.1/CAT로부터 주형을 증폭하기 위해 실시예 55에서 사용되는 정방향 프라이머
Figure pct00079
SEQ ID NO: 28
pCDNA3.1/CAT로부터 0.5 kb 주형을 증폭하기 위해 실시예 55에서 사용되는 역방향 프라이머
Figure pct00080
SEQ ID NO: 29
pCDNA3.1/CAT로부터 1 kb 주형을 증폭하기 위해 실시예 55에서 사용되는 역방향 프라이머
Figure pct00081
SEQ ID NO: 30
pCDNA3.1/CAT로부터 2 kb 주형을 증폭하기 위해 실시예 55에서 사용되는 역방향 프라이머
Figure pct00082
SEQ ID NO: 31
pCDNA3.1/CAT로부터 4 kb 주형을 증폭하기 위해 실시예 55에서 사용되는 역방향 프라이머
Figure pct00083
SEQ ID NO: 32
pCDNA3.1/CAT로부터 5 kb 주형을 증폭하기 위해 실시예 55에서 사용되는 역방향 프라이머
Figure pct00084
SEQ ID NO: 33
pCDNA3.1/CAT로부터 6.2 kb 주형을 증폭하기 위해 실시예 55에서 사용되는 역방향 프라이머
Figure pct00085
SEQ ID NO: 34
pCDNA3.1/CAT로부터의 선형 전사물을 검출하기 위해 실시예 55에서 사용되는 정방향 qPCR 프라이머
Figure pct00086
SEQ ID NO: 35
pCDNA3.1/CAT로부터의 선형 전사물을 검출하기 위해 실시예 55에서 사용되는 역방향 qPCR 프라이머
Figure pct00087
SEQ ID NO: 36
pCDNA3.1/CAT로부터의 원형 전사물을 검출하기 위해 실시예 55에서 사용되는 정방향 qPCR 프라이머
Figure pct00088
SEQ ID NO: 37
pCDNA3.1/CAT로부터의 원형 전사물을 검출하기 위해 실시예 55에서 사용되는 역방향 qPCR 프라이머
Figure pct00089
SEQ ID NO: 38
ACTIN을 검출하기 위해 실시예 56에서 사용되는 정방향 프라이머 서열
Figure pct00090
SEQ ID NO: 39
ACTIN을 검출하기 위해 실시예 56에서 사용되는 역방향 프라이머 서열
Figure pct00091
SEQ ID NO: 40
RIG-I을 검출하기 위해 실시예 56에서 사용되는 정방향 프라이머 서열
Figure pct00092
SEQ ID NO: 42
RIG-I을 검출하기 위해 실시예 56에서 사용되는 역방향 프라이머 서열
Figure pct00093
SEQ ID NO: 42
MDA5를 검출하기 위해 실시예 56에서 사용되는 정방향 프라이머 서열
Figure pct00094
SEQ ID NO: 43
MDA5를 검출하기 위해 실시예 56에서 사용되는 역방향 프라이머 서열
Figure pct00095
SEQ ID NO: 44
PKR을 검출하기 위해 실시예 56에서 사용되는 정방향 프라이머 서열
Figure pct00096
SEQ ID NO: 45
PKR을 검출하기 위해 실시예 56에서 사용되는 역방향 프라이머 서열
Figure pct00097
SEQ ID NO: 46
IFN-베타를 검출하기 위해 실시예 56에서 사용되는 정방향 프라이머 서열
Figure pct00098
SEQ ID NO: 47
IFN-베타를 검출하기 위해 실시예 56에서 사용되는 역방향 프라이머 서열
Figure pct00099
SEQ ID NO: 48
EMCV T2A 3XFLAG-GFP F2A 3XFALG-Nluc P2A IS
Figure pct00100
Figure pct00101
SEQ ID NO: 49
EMCV T2A 3XFLAG-GFP F2A 3XFALG-Nluc P2A IS
Figure pct00102
Figure pct00103
SEQ ID NO: 50
URE
Figure pct00104
SEQ ID NO: 51
CSE
Figure pct00105
SEQ ID NO: 52
URE/CSE
Figure pct00106
SEQ ID NO: 53
CVB3-GLuc-STOP-URE
Figure pct00107
Figure pct00108
SEQ ID NO: 54
CVB3-GLuc-STOP-URE/CSE
Figure pct00109
Figure pct00110
SEQ ID NO: 55
실시예 54를 위해 사용되는 상보성 프라이머
Figure pct00111
SEQ ID NO: 56
CVB3 IRES
Figure pct00112
SEQ ID NO: 57
Gluc
Figure pct00113
Figure pct00114
SEQ ID NO: 58
정지 돌연변이가 있는 EMCV IRES
Figure pct00115
SEQ ID NO: 59
스페이서 1
Figure pct00116
스페이서 2
Figure pct00117
SEQ ID:60
Figure pct00118
실시예 5에서 사용되는 가우시아 루시퍼라제 DNA 주형
Figure pct00119
실시예 5에서 사용되는 EMCV IRES
Figure pct00120
실시예 4에서 사용되는 가우시아 루시퍼라제 ORF
Figure pct00121
Figure pct00122
실시예 4에서 사용되는 EMCV IRES
Figure pct00123
SEQUENCE LISTING <110> FLAGSHIP PIONEERING INNOVATIONS VI, LLC <120> CIRCULAR POLYRIBONUCLEOTIDES AND PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS THEREOF <130> 55503-705.601 <140> PCT/US2020/021037 <141> 2020-03-04 <150> 62/967,545 <151> 2020-01-29 <150> 62/840,174 <151> 2019-04-29 <150> 62/825,683 <151> 2019-03-28 <150> 62/813,666 <151> 2019-03-04 <160> 134 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 3 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1 aug 3 <210> 2 <211> 717 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 2 atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60 ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120 ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180 ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240 cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300 ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360 gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420 aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480 ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540 gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600 tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660 ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaag 717 <210> 3 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 3 gctactaact tcagcctgct gaagcaggct ggcgacgtgg aggagaaccc tggacct 57 <210> 4 <211> 221 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 4 gtaaaaagag gtgaaaccta ttatgtgtga gcagggcaca gacgttgaaa ctggagccag 60 gagaagtatt ggcaggcttt aggttattag gtggttactc tgtcttaaaa atgttctggc 120 tttcttcctg catccactgg catactcatg gtctgttttt aaatatttta attcccattt 180 acaaagtgat ttacccacaa gcccaacctg tctgtcttca g 221 <210> 5 <211> 552 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 5 acgttactgg ccgaagccgc ttggaataag gccggtgtgc gtttgtctat atgttatttt 60 ccaccatatt gccgtctttt ggcaatgtga gggcccggaa acctggccct gtcttcttga 120 cgagcattcc taggggtctt tcccctctcg ccaaaggaat gcaaggtctg ttgaatgtcg 180 tgaaggaagc agttcctctg gaagcttctt gaagacaaac aacgtctgta gcgacccttt 240 gcaggcagcg gaacccccca cctggcgaca ggtgcctctg cggccaaaag ccacgtgtat 300 aagatacacc tgcaaaggcg gcacaacccc agtgccacgt tgtgagttgg atagttgtgg 360 aaagagtcaa atggctctcc tcaagcgtat tcaacaaggg gctgaaggat gcccagaagg 420 taccccattg tatgggatct gatctggggc ctcggtgcac atgctttaca tgtgtttagt 480 cgaggttaaa aaacgtctag gccccccgaa ccacggggac gtggttttcc tttgaaaaac 540 acgatgataa ta 552 <210> 6 <211> 6926 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 6 gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg 60 ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120 cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180 ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt 240 gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata 300 tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 360 cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 420 attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 480 atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 540 atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 600 tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg 660 actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc 720 aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg 780 gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca 840 ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagacccaa gctggctagc 900 gtttaaactt aagcttggta ccgagctcgg atccactagt ccagtgtggt ggaattccat 960 tgagaaatga ctgagttccg gtgctctcaa gtcattgatc tttgtcgact tttatttggt 1020 ctctgtaata acgacttcaa aaacattaaa ttctgttgcg aagccagtaa gctacaaaaa 1080 gaaaaaacaa gagagaatgc tatagtcgta tagtatagtt tcccgactat ctgataccca 1140 ttacttatct agggggaatg cgaacccaaa attttatcag ttttctcgga tatcgataga 1200 tattggggaa taaatttaaa taaataaatt ttgggcgggt ttagggcgtg gcaaaaagtt 1260 ttttggcaaa tcgctagaaa tttacaagac ttataaaatt atgaaaaaat acaacaaaat 1320 tttaaacacg tgggcgtgac agttttgggc ggttttaggg cgttagagta ggcgaggaca 1380 gggttacatc gactaggctt tgatcctgat caagaatata tatactttat accgcttcct 1440 tctacatgtt acctattttt caacgaatct agtatacctt tttactgtac gatttatggg 1500 tataataata agctaaatcg agactaagtt ttattgttat atatattttt tttattttat 1560 gcagaaatta attaaaccgg tcctgcaggt gatcaggcgc gccggttacc ggccggcccc 1620 gcggagcgta agtattcaaa attccaaaat tttttactag aaatattcga ttttttaata 1680 ggcagtttct atactattgt atactattgt agattcgttg aaaagtatgt aacaggaaga 1740 ataaagcatt tccgaccatg taaagtatat atattcttaa taaggatcaa tagccgagtc 1800 gatctcgcca tgtccgtctg tcttattgtt ttattaccgc cgagacatca ggaactataa 1860 aagctagaag gatgagtttt agcatacaga ttctagagac aaggacgcag agcaagtttg 1920 ttgatccatg ctgccacgct ttaactttct caaattgccc aaaactgcca tgcccacatt 1980 tttgaactat tttcgaaatt ttttcataat tgtattactc gtgtaaattt ccatcaattt 2040 gccaaaaaac tttttgtcac gcgttaacgc cctaaagccg ccaatttggt cacgcccaca 2100 ctattgagca attatcaaat tttttctcat tttattcccc aatatctatc gatatccccg 2160 attatgaaat tattaaattt cgcgttcgca ttcacactag ctgagtaacg agtatctgat 2220 agttggggaa atcgacttat tttttatata caatgaaaat gaatttaatc atatgaatat 2280 cgattatagc tttttattta atatgaatat ttatttgggc ttaaggtgta acctcctcga 2340 cataagactc acatggcgca ggcacattga agacaaaaat actcattgtc gggtctcgca 2400 ccctccagca gcacctaaaa ttatgtcttc aattattgcc aacattggag acacaattag 2460 tctgtggcac ctcaggcggc cgctcgagtc tagagggccc gtttaaaccc gctgatcagc 2520 ctcgactgtg ccttctagtt gccagccatc tgttgtttgc ccctcccccg tgccttcctt 2580 gaccctggaa ggtgccactc ccactgtcct ttcctaataa aatgaggaaa ttgcatcgca 2640 ttgtctgagt aggtgtcatt ctattctggg gggtggggtg gggcaggaca gcaaggggga 2700 ggattgggaa gacaatagca ggcatgctgg ggatgcggtg ggctctatgg cttctgaggc 2760 ggaaagaacc agctggggct ctagggggta tccccacgcg ccctgtagcg gcgcattaag 2820 cgcggcgggt gtggtggtta cgcgcagcgt gaccgctaca cttgccagcg ccctagcgcc 2880 cgctcctttc gctttcttcc cttcctttct cgccacgttc gccggctttc cccgtcaagc 2940 tctaaatcgg gggctccctt tagggttccg atttagtgct ttacggcacc tcgaccccaa 3000 aaaacttgat tagggtgatg gttcacgtag tgggccatcg ccctgataga cggtttttcg 3060 ccctttgacg ttggagtcca cgttctttaa tagtggactc ttgttccaaa ctggaacaac 3120 actcaaccct atctcggtct attcttttga tttataaggg attttgccga tttcggccta 3180 ttggttaaaa aatgagctga tttaacaaaa atttaacgcg aattaattct gtggaatgtg 3240 tgtcagttag ggtgtggaaa gtccccaggc tccccagcag gcagaagtat gcaaagcatg 3300 catctcaatt agtcagcaac caggtgtgga aagtccccag gctccccagc aggcagaagt 3360 atgcaaagca tgcatctcaa ttagtcagca accatagtcc cgcccctaac tccgcccatc 3420 ccgcccctaa ctccgcccag ttccgcccat tctccgcccc atggctgact aatttttttt 3480 atttatgcag aggccgaggc cgcctctgcc tctgagctat tccagaagta gtgaggaggc 3540 ttttttggag gcctaggctt ttgcaaaaag ctcccgggag cttgtatatc cattttcgga 3600 tctgatcaag agacaggatg aggatcgttt cgcatgattg aacaagatgg attgcacgca 3660 ggttctccgg ccgcttgggt ggagaggcta ttcggctatg actgggcaca acagacaatc 3720 ggctgctctg atgccgccgt gttccggctg tcagcgcagg ggcgcccggt tctttttgtc 3780 aagaccgacc tgtccggtgc cctgaatgaa ctgcaggacg aggcagcgcg gctatcgtgg 3840 ctggccacga cgggcgttcc ttgcgcagct gtgctcgacg ttgtcactga agcgggaagg 3900 gactggctgc tattgggcga agtgccgggg caggatctcc tgtcatctca ccttgctcct 3960 gccgagaaag tatccatcat ggctgatgca atgcggcggc tgcatacgct tgatccggct 4020 acctgcccat tcgaccacca agcgaaacat cgcatcgagc gagcacgtac tcggatggaa 4080 gccggtcttg tcgatcagga tgatctggac gaagagcatc aggggctcgc gccagccgaa 4140 ctgttcgcca ggctcaaggc gcgcatgccc gacggcgagg atctcgtcgt gacccatggc 4200 gatgcctgct tgccgaatat catggtggaa aatggccgct tttctggatt catcgactgt 4260 ggccggctgg gtgtggcgga ccgctatcag gacatagcgt tggctacccg tgatattgct 4320 gaagagcttg gcggcgaatg ggctgaccgc ttcctcgtgc tttacggtat cgccgctccc 4380 gattcgcagc gcatcgcctt ctatcgcctt cttgacgagt tcttctgagc gggactctgg 4440 ggttcgaaat gaccgaccaa gcgacgccca acctgccatc acgagatttc gattccaccg 4500 ccgccttcta tgaaaggttg ggcttcggaa tcgttttccg ggacgccggc tggatgatcc 4560 tccagcgcgg ggatctcatg ctggagttct tcgcccaccc caacttgttt attgcagctt 4620 ataatggtta caaataaagc aatagcatca caaatttcac aaataaagca tttttttcac 4680 tgcattctag ttgtggtttg tccaaactca tcaatgtatc ttatcatgtc tgtataccgt 4740 cgacctctag ctagagcttg gcgtaatcat ggtcatagct gtttcctgtg tgaaattgtt 4800 atccgctcac aattccacac aacatacgag ccggaagcat aaagtgtaaa gcctggggtg 4860 cctaatgagt gagctaactc acattaattg cgttgcgctc actgcccgct ttccagtcgg 4920 gaaacctgtc gtgccagctg cattaatgaa tcggccaacg cgcggggaga ggcggtttgc 4980 gtattgggcg ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc 5040 ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata 5100 acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg 5160 cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct 5220 caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa 5280 gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc 5340 tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt 5400 aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg 5460 ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg 5520 cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct 5580 tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaagaacagt atttggtatc tgcgctctgc 5640 tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg 5700 ctggtagcgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag 5760 aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag 5820 ggattttggt catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat 5880 gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct 5940 taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac 6000 tccccgtcgt gtagataact acgatacggg agggcttacc atctggcccc agtgctgcaa 6060 tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc cagatttatc agcaataaac cagccagccg 6120 gaagggccga gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag tctattaatt 6180 gttgccggga agctagagta agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca 6240 ttgctacagg catcgtggtg tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc agctccggtt 6300 cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg gttagctcct 6360 tcggtcctcc gatcgttgtc agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc atggttatgg 6420 cagcactgca taattctctt actgtcatgc catccgtaag atgcttttct gtgactggtg 6480 agtactcaac caagtcattc tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc tcttgcccgg 6540 cgtcaatacg ggataatacc gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa 6600 aacgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt 6660 aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag catcttttac tttcaccagc gtttctgggt 6720 gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt 6780 gaatactcat actcttcctt tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca 6840 tgagcggata catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat 6900 ttccccgaaa agtgccacct gacgtc 6926 <210> 7 <400> 7 000 <210> 8 <211> 708 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 8 atggtgagca agggcgagga ggataacatg gccatcatca aggagttcat gcgcttcaag 60 gtgcacatgg agggctccgt gaacggccac gagttcgaga tcgagggcga gggcgagggc 120 cgcccctacg agggcaccca gaccgccaag ctgaaggtga ccaagggtgg ccccctgccc 180 ttcgcctggg acatcctgtc ccctcagttc atgtacggct ccaaggccta cgtgaagcac 240 cccgccgaca tccccgacta cttgaagctg tccttccccg agggcttcaa gtgggagcgc 300 gtgatgaact tcgaggacgg cggcgtggtg accgtgaccc aggactcctc cctgcaggac 360 ggcgagttca tctacaaggt gaagctgcgc ggcaccaact tcccctccga 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atcatcccgt atgaaggtct gagcggcgac caaatgggcc agatcgaaaa aatttttaag 240 gtggtgtacc ctgtggatga tcatcacttt aaggtgatcc tgcactatgg cacactggta 300 atcgacgggg ttacgccgaa catgatcgac tatttcggac ggccgtatga aggcatcgcc 360 gtgttcgacg gcaaaaagat cactgtaaca gggaccctgt ggaacggcaa caaaattatc 420 gacgagcgcc tgatcaaccc cgacggctcc ctgctgttcc gagtaaccat caacggagtg 480 accggctggc ggctgtgcga acgcattctg gcgtaa 516 <210> 11 <211> 264 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 11 gggagccacc atggactaca aggacgacga cgacaagatc atcgactata aagacgacga 60 cgataaaggt ggcgactata aggacgacga cgacaaagcc attaatagtg actctgagtg 120 tcccctgtcc cacgacgggt actgcctcca cgacggtgtg tgcatgtata ttgaagcatt 180 ggacaagtac gcctgcaact gtgttgttgg ctacatcggg gagcgctgtc agtaccgaga 240 cctgaagtgg tgggaactgc gcct 264 <210> 12 <211> 273 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 12 gggagccacc atggactaca aggacgacga cgacaagatc atcgactata aagacgacga 60 cgataaaggt ggcgactata aggacgacga cgacaaagcc attaatagtg actctgagtg 120 tcccctgtcc cacgacgggt actgcctcca cgacggtgtg tgcatgtata ttgaagcatt 180 ggacaagtac gcctgcaact gtgttgttgg ctacatcggg gagcgctgtc agtaccgaga 240 cctgaagtgg tgggaactgc gctgatagta act 273 <210> 13 <211> 330 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 13 gggagccacc atggactaca aggacgacga cgacaagatc atcgactata aagacgacga 60 cgataaaggt ggcgactata aggacgacga cgacaaagcc attaatagtg actctgagtg 120 tcccctgtcc cacgacgggt actgcctcca cgacggtgtg tgcatgtata ttgaagcatt 180 ggacaagtac gcctgcaact gtgttgttgg ctacatcggg gagcgctgtc agtaccgaga 240 cctgaagtgg tgggaactgc gcggaagcgg agctactaac ttcagcctgc tgaagcaggc 300 tggagacgtg gaggagaacc ctggacctct 330 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial 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Sequence: Synthetic primer" <400> 112 ccccacttga ttttggaggg a 21 <210> 113 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 113 ggcaccatgg gaagtgatt 19 <210> 114 <211> 17 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 114 gaggugcuca aagagau 17 <210> 115 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 115 ccgttgtggt ctcccagata aacagtattt tgtcc 35 <210> 116 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 116 ataccagccg aaaggccctt ggcagagagg tctgaaaaga cctctgctga ctatgtgatc 60 ttattaaaat tagg 74 <210> 117 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic 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ttgtgcgaaa agaatctcac 240 ttcaagaaaa agaaactagt atggtcttca cactcgaaga tttcgttggg gactggcgac 300 agacagccgg ctacaacctg gaccaagtcc ttgaacaggg aggtgtgtcc agtttgtttc 360 agaatctcgg ggtgtccgta actccgatcc aaaggattgt cctgagcggt gaaaatgggc 420 tgaagatcga catccatgtc atcatcccgt atgaaggtct gagcggcgac caaatgggcc 480 agatcgaaaa aatttttaag gtggtgtacc ctgtggatga tcatcacttt aaggtgatcc 540 tgcactatgg cacactggta atcgacgggg ttacgccgaa catgatcgac tatttcggac 600 ggccgtatga aggcatcgcc gtgttcgacg gcaaaaagat cactgtaaca gggaccctgt 660 ggaacggcaa caaaattatc gacgagcgcc tgatcaaccc cgacggctcc ctgctgttcc 720 gagtaaccat caacggagtg accggctggc ggctgtgcga acgcattctg gcgtaactcg 780 agctcggtac ctgtccgcgg tcgcgacgta cgcgggcggc cgccataaat tggatccata 840 tatagggccc gggttataat tacctcaggt cgacgtccca tggttttgta tagaatttac 900 ggctagcgcc ggatgcgacg ccggtcgcgt cttatccggc cttcctatat caggcggtgt 960 ttaagacgcc gccgcttcgc ccaaatcctt atgccggttc gacgactgga caaaatactg 1020 tttatct 1027 <210> 121 <211> 1231 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 121 gacacgcggc cttccaagca gttagggaaa ccgacttctt tgaagaagaa agctgactat 60 gtgatcttat taaaattagg ttaaatttcg aggttaaaaa tagttttaat attgctatag 120 tcttagaggt cttgtatatt tatacttacc acacaagatg gaccggagca gccctccaat 180 atctagtgta ccctcgtgct cgctcaaaca ttaagtggtg ttgtgcgaaa agaatctcac 240 ttcaagaaaa agaaactagt atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc 300 ccatcctggt cgagctggac ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg 360 gcgagggcga tgccacctac ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc 420 tgcccgtgcc ctggcccacc ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc 480 gctaccccga ccacatgaag cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg 540 tccaggagcg caccatcttc ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga 600 agttcgaggg cgacaccctg gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg 660 acggcaacat cctggggcac aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca 720 tggccgacaa gcagaagaac ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg 780 acggcagcgt gcagctcgcc gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg 840 tgctgctgcc cgacaaccac tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg 900 agaagcgcga tcacatggtc ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca 960 tggacgagct gtacaagtaa ctcgagctcg gtacctgtcc gcggtcgcga cgtacgcggg 1020 cggccgccat aaattggatc catatatagg gcccgggtta taattacctc aggtcgacgt 1080 cccatggttt tgtatagaat ttacggctag cgccggatgc gacgccggtc gcgtcttatc 1140 cggccttcct atatcaggcg gtgtttaaga cgccgccgct tcgcccaaat ccttatgccg 1200 gttcgacgac tggacaaaat actgtttatc t 1231 <210> 122 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 122 gaaattaata cgactcacta tagggagacc acaacggttt ccctgactat gtgatc 56 <210> 123 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 123 agataaacag tattttgtcc agtcgtcgaa c 31 <210> 124 <211> 35 <212> DNA <213> 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Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 129 augggaguca aaguucuguu ugcccugauc ugcaucgcug uggccgaggc caagcccacc 60 gagaacaacg aagacuucaa caucguggcc guggccagca acuucgcgac cacggaucuc 120 gaugcugacc gcgggaaguu gcccggcaag aagcugccgc uggaggugcu caaagagaug 180 gaagccaaug cccggaaagc uggcugcacc aggggcuguc ugaucugccu gucccacauc 240 aagugcacgc ccaagaugaa gaaguucauc ccaggacgcu gccacaccua cgaaggcgac 300 aaagaguccg cacagggcgg cauaggcgag gcgaucgucg acauuccuga gauuccuggg 360 uucaaggacu uggagcccau ggagcaguuc aucgcacagg ucgaucugug uguggacugc 420 acaacuggcu gccucaaagg gcuugccaac gugcaguguu cugaccugcu caagaagugg 480 cugccgcaac gcugugcgac cuuugccagc aagauccagg gccaggugga caagaucaag 540 ggggccggug gugacuaa 558 <210> 130 <211> 552 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 130 acguuacugg ccgaagccgc uuggaauaag gccggugugc guuugucuau auguuauuuu 60 ccaccauauu gccgucuuuu ggcaauguga gggcccggaa accuggcccu gucuucuuga 120 cgagcauucc uaggggucuu uccccucucg ccaaaggaau gcaaggucug uugaaugucg 180 ugaaggaagc aguuccucug gaagcuucuu gaagacaaac aacgucugua gcgacccuuu 240 gcaggcagcg gaacccccca ccuggcgaca ggugccucug cggccaaaag ccacguguau 300 aagauacacc ugcaaaggcg gcacaacccc agugccacgu ugugaguugg auaguugugg 360 aaagagucaa auggcucucc ucaagcguau ucaacaaggg gcugaaggau gcccagaagg 420 uaccccauug uaugggaucu gaucuggggc cucggugcac augcuuuaca uguguuuagu 480 cgagguuaaa aaacgucuag gccccccgaa ccacggggac gugguuuucc uuugaaaaac 540 acgaugauaa ua 552 <210> 131 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 131 gagggcaggg gaagtctact aacatgcggg gacgtggagg aaaatcccgg ccca 54 <210> 132 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 132 cagtgtacta attatgctct cttgaaattg gctggagatg ttgagagcaa cccaggtccc 60 <210> 133 <211> 796 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 133 gtaagaagca aggtttcatt taggggaagg gaaatgattc aggacgagag tctttgtgct 60 gctgagtgcc tgtgatgaag aagcatgtta gtcctgggca acgtagcgag accccatctc 120 tacaaaaaat agaaaaatta gccaggtata gtggcgcaca cctgtgattc cagctacgca 180 ggaggctgag gtgggaggat tgcttgagcc caggaggttg aggctgcagt gagctgtaat 240 catgccacta ctccaacctg ggcaacacag caaggaccct gtctcaaaag ctacttacag 300 aaaagaatta ggctcggcac ggtagctcac acctgtaatc ccagcacttt gggaggctga 360 ggcgggcaga tcacttgagg tcaggagttt gagaccagcc tggccaacat ggtgaaacct 420 tgtctctact aaaaatatga aaattagcca ggcatggtgg cacattcctg taatcccagc 480 tactcgggag gctgaggcag gagaatcact tgaacccagg aggtggaggt tgcagtaagc 540 cgagatcgta ccactgtgct ctagccttgg tgacagagcg agactgtctt aaaaaaaaaa 600 aaaaaaaaaa aagaattaat taaaaattta aaaaaaaatg aaaaaaagct gcatgcttgt 660 tttttgtttt tagttattct acattgttgt cattattacc aaatattggg gaaaatacaa 720 cttacagacc aatctcagga 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Claims (40)

  1. a) 복수의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자를 제공하는 단계;
    b) 상기 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자를 원형화시켜, 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 제제를 제공하는 단계;
    c) 상기 제제에 남아 있는 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자를 실질적으로 제거하도록 상기 제제를 처리하는 단계;
    d) 선택적으로, 상기 처리 단계 후에 남아 있는 상기 제제 내의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 양을 평가하는 단계; 및
    e) 약제학적 이용을 위한 약제학적 조성물을 생성하도록 상기 제제를 추가로 처리하는 단계를 포함하는 약제학적 조성물의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서, 단계 d)의 추가의 처리가 하기 중 하나 이상을 포함하는 방법:
    f) 데옥시리보뉴클레오티드 분자를 실질적으로 제거하도록 상기 제제를 처리하는 것;
    g) 상기 제제 내의 데옥시리보뉴클레오티드 분자의 양을 평가하는 것;
    h) 상기 제제를 약제학적 부형제를 사용하여 제형화하는 것;
    i) 상기 제제를 농축시키는 것; 및
    j) 상기 제제 내의 데옥시리보뉴클레오티드 분자의 양을 프린트(print) 또는 디지털 매체에 기록하는 것.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 단계 d)의 추가의 처리가 하기 중 하나 이상을 포함하는 방법:
    f) 단백질 오염을 실질적으로 제거하도록 상기 제제를 처리하는 것;
    g) 상기 제제 내의 단백질 오염의 양을 평가하는 것;
    h) 상기 제제를 약제학적 부형제를 사용하여 제형화하는 것; 및
    i) 상기 제제를 농축시키는 것.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 d)의 추가의 처리가 하기 중 하나 이상을 포함하는 방법:
    f) 내독소를 실질적으로 제거하도록 상기 제제를 처리하는 것;
    g) 상기 제제 내의 내독소의 양을 평가하는 것;
    h) 상기 제제를 약제학적 부형제를 사용하여 제형화하는 것; 및
    i) 상기 제제를 농축시키는 것.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 원형화시키는 단계가 스플린트 라이게이션에 의해 수행되는 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자가 상기 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자 대응물, 상기 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자 비-대응물 또는 그의 조합을 포함하는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질 오염이 효소를 포함하는 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물이 상기 제제 내의 총 리보뉴클레오티드 분자의 20%(w/w) 이하의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자를 포함하는 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물이 상기 제제 내의 총 리보뉴클레오티드 분자의 10%(w/w) 이하의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자를 포함하는 방법.
  10. 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 약제학적 제제로서, 상기 약제학적 제제가 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자, 및 상기 약제학적 제제 내의 총 리보뉴클레오티드 분자의 5%(w/w) 이하의 닉킹된 폴리리보뉴클레오티드 분자를 포함하는 약제학적 제제.
  11. 제10항에 있어서, 상기 약제학적 제제 내의 총 리보뉴클레오티드 분자의 2%(w/w) 이하의 닉킹된 폴리리보뉴클레오티드 분자를 포함하는 약제학적 제제.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 약제학적 제제가
    (i) 리물루스 변형세포 용해물(Limulus amebocyte lysate) 시험에 의해 측정하여 10 EU/㎏ 미만의 내독소를 포함하거나 내독소를 결여하고/결여하거나;
    (ii) 멸균 전에 100 CFU/100 ㎖ 미만 또는 10 CFU/100 ㎖ 미만의 바이오버든(bioburden)을 포함하고/포함하거나;
    (iii) 멸균 약제학적 제제이며, 예를 들어, 무균 조건 하에 시험하여 100개 미만의 생존 가능한 미생물의 성장을 지원하고/지원하거나;
    (iv) USP <71>의 표준을 만족하고/만족하거나;
    (v) USP <85>의 표준을 만족하고/만족하거나;
    (vi) 최종 약물 제품의 중간체 약제학적 제제이고/이거나;
    (vii) 대상체로의 투여를 위한 최종 약물 제품이고/이거나;
    (viii) 적어도 0.1 ng/㎖의 농도의 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자를 포함하고/포함하거나;
    (ix) 약 9%(w/w), 8%(w/w), 7%(w/w), 6%(w/w), 5%(w/w), 4%(w/w), 3%(w/w), 2%(w/w), 1%(w/w) 또는 0.5%(w/w) 이하의 닉킹된 폴리리보뉴클레오티드 분자를 포함하고/포함하거나;
    (x) 세포 단백질, 세포 데옥시리보핵산, 효소, 시약 성분, 겔 성분 또는 크로마토그래피 물질로부터 선택되는 공정-관련 불순물이 실질적으로 없고/없거나;
    (xi) 정제 이전에 비하여 정제 이후에 면역 또는 염증 반응의 하나 이상의 마커의 수준이 감소되며, 예를 들어, 면역 또는 염증 반응의 하나 이상의 마커가 (a) 사이토카인 또는 면역원성 관련 유전자; 및/또는 (b) RIG-I, MDA5, PKR, IFN-베타, OAS 및 OASL로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자의 발현인 약제학적 제제.
  13. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자가 하나 이상의 발현 서열, 및 적어도 하나의 발현 서열의 3' 말단에 스태거 요소를 포함하는 약제학적 제제.
  14. 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제학적 제제 내의 총 리보뉴클레오티드 분자의 적어도 80%(w/w)가 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자인 약제학적 제제.
  15. 제10항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제학적 제제가 상기 제제 내의 총 리보뉴클레오티드 분자의 20%(w/w) 이하의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자를 포함하는 약제학적 제제.
  16. a) 복수의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자를 제공하는 단계;
    b) 상기 복수의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자를 원형화시켜, 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 제제를 제공하는 단계;
    c) 상기 제제에 남아 있는 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 양을 평가하는 단계; 및
    d) 상기 제제가 제제에 존재하는 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 양에 대한 참조 기준을 만족하면, 상기 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 제제를 약제학적 약물 물질로서 처리하는 단계를 포함하는 약제학적 약물 물질의 제조 방법.
  17. a) 복수의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자를 제공하는 단계;
    b) 상기 복수의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자를 원형화시켜, 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 제제를 제공하는 단계;
    c) 상기 제제 내의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 양을 측정하는 단계;
    d) 상기 제제가 제제에 존재하는 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 양에 대한 참조 기준을 만족하면, 상기 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 제제를 약제학적 약물 제품으로서 제형화하는 단계; 및
    e) 상기 약제학적 약물 제품이 약제학적 약물 제품에 존재하는 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 양에 대한 참조 기준을 만족하면, 상기 약제학적 약물 제품을 표지하고 운송하는 단계를 포함하는 약제학적 약물 제품의 제조 방법.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 상기 원형화시키는 단계가 스플린트 라이게이션에 의해 수행되는 방법.
  19. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 제제를 제형화시키는 단계가 상기 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자를 약제학적 부형제와 조합하는 것을 포함하는 방법.
  20. 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제에 존재하는 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 양에 대한 참조 기준이
    (i) 약제 출하 규격(pharmaceutical release specification); 또는
    (ii) 1 ng/㎖, 5 ng/㎖, 10 ng/㎖, 15 ng/㎖, 20 ng/㎖, 25 ng/㎖, 30 ng/㎖, 35 ng/㎖, 40 ng/㎖, 50 ng/㎖, 60 ng/㎖, 70 ng/㎖, 80 ng/㎖, 90 ng/㎖, 100 ng/㎖, 200 ng/㎖, 300 ng/㎖, 400 ng/㎖, 500 ng/㎖, 600 ng/㎖, 1 ㎍/ ㎖, 10 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖, 200 g/㎖, 300 ㎍/㎖, 400 ㎍/㎖, 500 ㎍/㎖, 600 ㎍/㎖, 700 ㎍/㎖, 800 ㎍/㎖, 900 ㎍/㎖, 1 ㎎/㎖, 1.5 ㎎/㎖ 또는 2 ㎎/㎖ 이하의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 존재; 또는
    (iii) 현미경관찰법에 의해, 분광광도법에 의해, 형광측정법에 의해, 변성 우레아 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 영상화에 의해, UV-Vis 분광광도법에 의해, RNA 전기영동에 의해 또는 RNAse H 분석에 의해 측정되는 경우, 특정 양 이하(예를 들어, 검출 불가능한 수준 또는 측정되는 경우 검출 한계 미만의 수준)의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 존재이며;
    선택적으로, 상기 약제학적 제제가 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 서열에 대한 참조 기준, 예를 들어, 참조 원형 폴리리보뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 80%(예를 들어, 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, 100%) 서열 동일성을 갖는 서열을 추가로 만족하는 방법.
  21. 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제학적 약물 제품 또는 약제학적 약물 물질이 하기를 포함하는 방법:
    (i) 적어도 0.1 ng/㎖, 0.5 ng/㎖, 1 ng/㎖, 5 ng/㎖, 10 ng/㎖, 50 ng/㎖, 0.1 ㎍/㎖, 0.5 ㎍/㎖,1 ㎍/㎖, 2 ㎍/㎖, 5 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖, 20 ㎍/㎖, 30 ㎍/㎖, 40 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 60 ㎍/㎖, 70 ㎍/㎖, 80 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖, 200 ㎍/㎖, 300 ㎍/㎖, 500 ㎍/㎖, 1 ㎎/㎖, 2 ㎎/㎖, 3 ㎎/㎖, 5 ㎎/㎖, 10 ㎎/㎖, 100 ㎎/㎖, 200 ㎎/㎖ 또는 500 ㎎/㎖ 농도의 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자; 또는
    (ii) 상기 약제학적 제제 내의 총 리보뉴클레오티드 분자에 비하여 적어도 30%(w/w), 40%(w/w), 50%(w/w), 60%(w/w), 70%(w/w), 80%(w/w), 85%(w/w), 90%(w/w), 91%(w/w), 92%(w/w), 93%(w/w), 94%(w/w), 95%(w/w), 96%(w/w), 97%(w/w), 98%(w/w) 또는 99%(w/w)의 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자.
  22. 제21항에 있어서, 상기 약제학적 제제 내의 총 리보뉴클레오티드 분자에 비하여 적어도 30%(w/w), 40%(w/w), 50%(w/w), 60%(w/w), 70%(w/w), 80%(w/w), 85%(w/w), 90%(w/w), 91%(w/w), 92%(w/w), 93%(w/w), 94%(w/w), 95%(w/w), 96%(w/w), 97%(w/w), 98%(w/w) 또는 99%(w/w)의 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자가 현미경관찰법에 의해, 분광광도법에 의해, 형광측정법에 의해, 변성 우레아 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 영상화에 의해, UV-Vis 분광광도법에 의해, RNA 전기영동에 의해, RNAse H 분석에 의해, UV 분광 또는 형광 검출기에 의해, 광 산란 기법에 의해, HPLC를 포함하는 분리 방법의 이용과 함께 또는 이것 없이 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해, 분리-전 또는 분리-후 유도체화 방법의 이용과 함께 또는 이것 없이 칩 또는 겔 기반의 전기영동에 의해, 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 검출을 위해 은 또는 염료 염색 또는 방사성 붕괴를 사용하는 검출 방법의 사용에 의해 또는 현미경관찰법, 가시적 방법 또는 분광광도계를 사용하는 방법에 의해 측정되는 방법.
  23. 제16항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제학적 약물 제품 또는 약제학적 약물 물질이
    (i) 리물루스 변형세포 용해물 시험에 의해 측정하여 10 EU/㎏ 미만의 내독소를 포함하거나, 내독소를 결여하고/결여하거나;
    (ii) 멸균 전에 100 CFU/100 ㎖ 미만 또는 10 CFU/100 ㎖ 미만의 바이오버든을 포함하고/포함하거나;
    (iii) 멸균 약물 제품 또는 멸균 약물 물질이며, 선택적으로, 무균 조건 하에 시험하여 100개 미만의 생존 가능한 미생물의 성장을 지원하고/지원하거나;
    (iv) USP <71>의 표준을 만족하고/만족하거나;
    (v) USP <85>의 표준을 만족하고/만족하거나;
    (vi) 분광광도계에 의해 측정하여 약 1.6 내지 2.3의 A260/A280 흡광도 비를 포함하는 방법.
  24. 제16항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자가 하나 이상의 발현 서열 및 적어도 하나의 발현 서열의 3' 말단에 스태거 요소를 포함하는 방법.
  25. 제16항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제가 하기의 참조 기준을 추가로 만족하는 방법:
    (i) 제제에 존재하는 데옥시리보뉴클레오티드 분자의 양에 있어서, 예를 들어, 1 ng/㎖, 5 ng/㎖, 10 ng/㎖, 15 ng/㎖, 20 ng/㎖, 25 ng/㎖, 30 ng/㎖, 35 ng/㎖, 40 ng/㎖, 50 ng/㎖, 60 ng/㎖, 70 ng/㎖, 80 ng/㎖, 90 ng/㎖, 100 ng/㎖, 200 ng/㎖, 300 ng/㎖, 400 ng/㎖ 또는 500 ng/㎖, 1000 ㎍/㎖, 5000 ㎍/㎖, 10,000 ㎍/㎖ 또는 100,000 ㎍/㎖ 이하의 데옥시리보뉴클레오티드 분자의 존재; 및/또는
    (ii) 제제에 존재하는 단백질 오염의 양에 있어서, 예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자 밀리그램(㎎)당 0.1 ng, 1 ng, 5 ng, 10 ng, 15 ng, 20 ng, 25 ng, 30 ng, 35 ng, 40 ng, 50 ng, 60 ng, 70 ng, 80 ng, 90 ng, 100 ng, 200 ng, 300 ng, 400 ng 또는 500 ng 미만의 단백질 오염의 단백질 오염의 존재.
  26. 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 약제학적 제제로서, 상기 약제학적 제제 내의 총 리보뉴클레오티드 분자의 적어도 91%(w/w), 92%(w/w), 93%(w/w), 94%(w/w), 95%(w/w), 96%(w/w), 97%(w/w), 98%(w/w) 또는 99%(w/w)가 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자인 약제학적 제제.
  27. 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 약제학적 제제로서, 상기 약제학적 제제가 상기 약제학적 제제 내의 총 리보뉴클레오티드 분자의 0.5%(w/w), 1%(w/w), 2%(w/w) 또는 5%(w/w) 이하의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자를 포함하는 약제학적 제제.
  28. 제26항 또는 제27항에 있어서, 상기 약제학적 제제가
    (i) 리물루스 변형세포 용해물 시험에 의해 측정하여 10 EU/㎏ 미만의 내독소를 포함하거나 내독소를 결여하고/결여하거나;
    (ii) 멸균 전에 100 CFU/100 ㎖ 미만 또는 10 CFU/100 ㎖ 미만의 바이오버든을 포함하고/포함하거나;
    (iii) 멸균 약제학적 제제이며, 예를 들어, 무균 조건 하에서 시험하여 100개 미만의 생존 가능한 미생물의 성장을 지원하고/지원하거나;
    (iv) USP <71>의 표준을 만족하고/만족하거나;
    (v) USP <85>의 표준을 만족하고/만족하거나;
    (vi) 최종 약물 제품의 중간체 약제학적 제제이고/이거나;
    (vii) 대상체로의 투여를 위한 최종 약물 제품이고/이거나;
    (viii) 적어도 0.1 ng/㎖, 0.5 ng/㎖, 1 ng/㎖, 5 ng/㎖, 10 ng/㎖, 50 ng/㎖, 0.1 ㎍/㎖, 0.5 ㎍/㎖,1 ㎍/㎖, 2 ㎍/㎖, 5 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖, 20 ㎍/㎖, 30 ㎍/㎖, 40 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 60 ㎍/㎖, 70 ㎍/㎖, 80 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖, 200 ㎍/㎖, 300 ㎍/㎖, 500 ㎍/㎖, 1 ㎎/㎖, 2 ㎎/㎖, 3 ㎎/㎖, 5 ㎎/㎖, 10 ㎎/㎖, 100 ㎎/㎖, 200 ㎎/㎖ 또는 500 ㎎/㎖ 농도의 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자를 포함하고/포함하거나;
    (ix) 1 ng/㎖, 5 ng/㎖, 10 ng/㎖, 15 ng/㎖, 20 ng/㎖, 25 ng/㎖, 30 ng/㎖, 35 ng/㎖, 40 ng/㎖, 50 ng/㎖, 60 ng/㎖, 70 ng/㎖, 80 ng/㎖, 90 ng/㎖, 100 ng/㎖, 200 ng/㎖, 300 ng/㎖, 400 ng/㎖, 500 ng/㎖, 1000 ㎍/㎖, 5000 ㎍/㎖, 10,000 ㎍/㎖ 또는 100,000 ㎍/㎖ 이하의 데옥시리보뉴클레오티드 분자를 포함하고/포함하거나;
    (x) 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자 밀리그램(㎎)당 0.1 ng, 1 ng, 5 ng, 10 ng, 15 ng, 20 ng, 25 ng, 30 ng, 35 ng, 40 ng, 50 ng, 60 ng, 70 ng, 80 ng, 90 ng, 100 ng, 200 ng, 300 ng, 400 ng 또는 500 ng 미만의 단백질 오염의 단백질 오염(예를 들어, 효소)을 포함하고/포함하거나;
    (xi) 분광광도계에 의해 측정하여 약 1.6 내지 2.3의 A260/A280 흡광도 비를 포함하고/포함하거나;
    (xii) 세포 단백질, 세포 데옥시리보핵산, 효소, 시약 성분, 겔 성분 또는 크로마토그래피 물질로부터 선택되는 공정-관련 불순물이 실질적으로 없고/없거나;
    (xiii) 정제 이전에 비하여 정제 이후에 면역 또는 염증 반응의 하나 이상의 마커의 감소된 수준을 갖는 약제학적 제제.
  29. 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자가
    (i) 준-나선 구조를 포함하고/포함하거나;
    (ii) 준-이중 가닥 이차 구조를 포함하고/포함하거나;
    (iii) 하나 이상의 발현 서열 및 적어도 하나의 발현 서열의 3' 말단에 스태거 요소를 포함하는 약제학적 제제.
  30. 제10항 내지 제15항 및 제26항 내지 제29항 중 어느 한 항의 약제학적 제제, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물, 제16항 및 제18항 내지 제25항 중 어느 한 항의 약제학적 약물 물질 또는 제17항 내지 제25항 중 어느 한 항의 약제학적 약물 제품을 대상체의 세포 또는 조직에 투여하는 단계를 포함하는 대상체로의 또는 대상체의 세포 또는 조직으로의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 전달 방법으로서, 상기 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 상기 원형 폴리리보뉴클레오티드로부터 번역되는 생성물이 상기 투여 단계 후 적어도 3일째에 세포, 조직 또는 대상체에서 검출되는 방법.
  31. 제30항에 있어서,
    (i) 투여 단계 이전에 세포, 조직 또는 대상체 내의 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 원형 폴리리보뉴클레오티드로부터 번역되는 생성물의 존재를 평가하는 단계; 및/또는
    (ii) 투여 단계 이후에 세포, 조직 또는 대상체 내의 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 원형 폴리리보뉴클레오티드로부터 번역되는 생성물의 존재를 평가하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  32. (i) 제10항 내지 제15항 및 제26항 내지 제29항 중 어느 한 항의 약제학적 제제, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물, 제16항 및 제18항 내지 제25항 중 어느 한 항의 약제학적 약물 물질 또는 제17항 내지 제25항 중 어느 한 항의 약제학적 약물 제품, 및 (ii) 비경구 투여가 가능한 희석제를 포함하는 비경구 핵산 전달 시스템.
  33. 원형 폴리리보뉴클레오티드의 전달을 필요로 하는 대상체에게 제10항 내지 제15항 및 제26항 내지 제29항 중 어느 한 항의 약제학적 제제, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물, 제16항 및 제18항 내지 제25항 중 어느 한 항의 약제학적 약물 물질 또는 제17항 내지 제25항 중 어느 한 항의 약제학적 약물 제품을 원형 폴리리보뉴클레오티드의 전달을 필요로 하는 대상체에게 비경구적으로 투여하는 단계를 포함하는 대상체로의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 전달 방법.
  34. 제10항 내지 제15항 및 제26항 내지 제29항 중 어느 한 항의 약제학적 제제, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물, 제16항 및 제18항 내지 제25항 중 어느 한 항의 약제학적 약물 물질 또는 제17항 내지 제25항 중 어느 한 항의 약제학적 약물 제품을 세포 또는 조직에 비경구적으로 투여하는 단계를 포함하는 대상체의 세포 또는 조직으로의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 전달 방법.
  35. 제33항 또는 제34항에 있어서, 제10항 내지 제15항 및 제26항 내지 제29항 중 어느 한 항의 약제학적 제제, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물, 제16항 및 제18항 내지 제25항 중 어느 한 항의 약제학적 약물 물질 또는 제17항 내지 제25항 중 어느 한 항의 약제학적 약물 제품이 담체를 포함하는 방법.
  36. 제32항의 비경구 핵산 전달 시스템 또는 제34항 또는 제35항의 방법으로서, 제10항 내지 제15항 및 제26항 내지 제29항 중 어느 한 항의 약제학적 제제, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물, 제16항 및 제18항 내지 제25항 중 어느 한 항의 약제학적 약물 물질 또는 제17항 내지 제25항 중 어느 한 항의 약제학적 약물 제품이 희석제를 포함하며 어떠한 담체도 없는 방법.
  37. 제33항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 비경구 투여가 정맥내로, 근육내로, 안과적으로 또는 국소로 이루어지는 방법.
  38. a) 복수의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자를 제공하는 단계;
    b) 상기 복수의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자를 원형화시켜, 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 제제를 제공하는 단계;
    c) 상기 제제에 남아 있는 선형 및/또는 닉킹된 폴리리보뉴클레오티드 분자의 양을 평가하는 단계; 및
    d) 상기 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 제제가 제제에 존재하는 선형 및/또는 닉킹된 폴리리보뉴클레오티드 분자의 양에 대한 참조 기준을 만족하면, 상기 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 제제를 약제학적 약물 물질로서 처리하는 단계를 포함하는 약제학적 약물 물질의 제조 방법.
  39. a) 복수의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자를 제공하는 단계;
    b) 상기 복수의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자를 원형화시켜, 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 제제를 제공하는 단계;
    c) 상기 제제 내의 선형 및/또는 닉킹된 폴리리보뉴클레오티드 분자의 양을 측정하는 단계;
    d) 상기 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 제제가 제제에 존재하는 선형 및/또는 닉킹된 폴리리보뉴클레오티드 분자의 양에 대한 참조 기준을 만족하면, 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 제제를 약제학적 약물 제품으로서 제형화하는 단계; 및
    e) 약제학적 약물 제품이 약제학적 약물 제품에 존재하는 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자의 양에 대한 참조 기준을 만족하면, 약제학적 약물 제품을 표지하고 운송하는 단계를 포함하는 약제학적 약물 제품의 제조 방법.
  40. 제38항 또는 제39항에 있어서, 제제에 존재하는 선형 및/또는 닉킹된 폴리리보뉴클레오티드 분자의 양에 대한 참조 기준이 하기로부터 선택되는 방법:
    (a) 제제 내의 총 리보뉴클레오티드 분자에 비하여 20%, 15%, 10%, 5%, 2%, 1% 또는 0.5%(w/w) 이하의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자;
    (b) 제제 내의 총 리보뉴클레오티드 분자에 비하여 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5% 또는 0.1%(w/w) 이하의 닉킹된 폴리리보뉴클레오티드 분자; 또는
    (c) 제제 내의 총 리보뉴클레오티드 분자에 비하여 20%, 15%, 10%, 5%, 2%, 1% 또는 0.5%(w/w) 이하의 조합된 선형 및 닉킹된 폴리리보뉴클레오티드 분자.
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