KR20220024647A - 원형 폴리리보뉴클레오티드의 투여 방법 - Google Patents

원형 폴리리보뉴클레오티드의 투여 방법 Download PDF

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KR20220024647A
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아박 카흐베지안
뵈르 알렉산드라 소피 드
니콜라스 맥카트니 플러기스
에리카 가브리엘 웨인스타인
캐서린 시푸엔테스-로자스
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플래그쉽 파이어니어링 이노베이션스 브이아이, 엘엘씨
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Abstract

본 발명은 일반적으로 약제학적 조성물의 투여 방법 및 이의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제제에 관한 것이다.

Description

원형 폴리리보뉴클레오티드의 투여 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 전체 내용이 본원에 참조로 포함되는 2019년 6월 19일자 출원된 미국 가출원 제62/863,725호에 대한 우선권 및 이로부터의 이익을 주장한다.
특정 원형 폴리리보뉴클레오티드는 건강한 개체의 조직 및 세포를 포함하는 인간 조직 및 세포에 편재한다.
본 개시는 일반적으로 원형 폴리리보뉴클레오티드의 투약 방법에 관한 것이다. 본원에 개시된 바와 같은 방법은 일반적으로 단백질을 인코딩하는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 조성물을 세포 또는 대상체에게 제공하는 단계를 포함하는 세포 또는 대상체에서의 단백질의 발현 방법, 결합 부위를 포함하는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 조성물을 세포 또는 대상체에게 제공하는 단계를 포함하는 세포 또는 대상체에서의 단백질의 결합 방법 또는 둘 모두에 관한 것이다. 투여 방법은 다수의 용량을 세포 또는 대상체에게 제공하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 다수의 투여는 재투여 또는 시간차(staggered) 투여이다. 원형 폴리리보뉴클레오티드의 조성물의 재투여 방법은 둘 이상의 조성물을 일반적으로 연장된 기간에 걸쳐, 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물)에게 제공하는 단계를 포함한다. 원형 폴리리보뉴클레오티드의 조성물의 시간차 투여 방법은 둘 이상의 조성물을 일반적으로 짧은 시간 간격에 걸쳐 제공하는 단계를 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 하기를 포함하는 포유동물에서의 단백질의 발현의 유지 방법을 특징으로 한다: (a) 단백질을 인코딩하는 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제1 조성물을 포유동물에게 제공하는 단계; 및 (b) 단계 (a) 이후 6시간째 내지 90일째에, 단백질을 인코딩하는 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제2 조성물을 포유동물에게 제공함으로써, 포유동물에서 단백질의 발현을 유지하는 단계.
이들 양태의 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 외인성 합성 원형 폴리리보뉴클레오티드이다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 폴리-A 서열, 복제 요소, 또는 둘 모두를 결여한다.
이들 양태의 일부 실시형태에서, 제1 조성물은 제1 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하고 제2 조성물은 제2 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하며, 제1 원형 폴리리보뉴클레오티드와 제2 원형 폴리리보뉴클레오티드는 동일하다. 일부 실시형태에서, 제1 조성물은 제1 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하고 제2 조성물은 제2 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하며, 제1 원형 폴리리보뉴클레오티드와 제2 원형 폴리리보뉴클레오티드는 상이하다.
이들 양태의 일부 실시형태에서, 제2 조성물을 제공하는 단계는 제1 조성물을 제공한 후에, 그리고 제1 조성물에 의해 발현되는 단백질의 제1 수준이 포유동물에서 실질적으로 검출 불가능하게 되기 전에 발생한다. 일부 실시형태에서, 제2 조성물을 제공하는 단계는 제1 조성물을 제공한 후에, 그리고 제1 조성물에 의해 발현되는 단백질의 제1 수준이 포유동물에서 50% 초과로 감소하기 전에 발생한다.
일부 실시형태에서, 당해 방법은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제3 조성물을 제2 조성물 이후에 포유동물에게 제공함으로써, 포유동물에서 단백질의 발현을 유지하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 당해 방법은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제3 조성물을 제2 조성물 이후에 포유동물에게 제공함으로써, 포유동물에서 단백질의 발현을 회복하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 제3 조성물을 제공하는 단계는 제2 조성물을 제공한 후에, 그리고 제1 및 제2 조성물에 의해 발현되는 단백질의 제2 수준이 포유동물에서 실질적으로 검출 불가능하게 되기 전에 발생한다. 일부 실시형태에서, 제3 조성물을 제공하는 단계는 제2 조성물을 제공한 후에, 그리고 포유동물에서 제1 및 제2 조성물에 의해 발현되는 단백질의 제2 수준이 50% 초과로 감소하기 전에 발생한다. 일부 실시형태에서, 당해 방법은 단백질을 인코딩하는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9 또는 제10 조성물을 제공하는 단계를 추가로 포함한다.
이들 양태의 일부 실시형태에서, 제1 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하며, 이는 어떠한 담체도 없다. 일부 실시형태에서, 제2 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하며, 이는 어떠한 담체도 없다. 일부 실시형태에서, 제3 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 제3 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하며, 이는 어떠한 담체도 없다.
이들 양태의 일부 실시형태에서, 제1 조성물에 의해 발현되는 단백질의 제1 수준은 제1 조성물을 제공한 후 1일째 내지 2일째의 가장 높은 단백질의 수준이다. 일부 실시형태에서, 제1 조성물에 의해 발현된 단백질의 제1 수준은 제1 조성물을 제공한 지 하루 후의 단백질의 최고 수준의 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%이다. 일부 실시형태에서, 단백질의 제2 수준이 제2 조성물의 제공 이후 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 또는 40 일 동안 제1 조성물을 제공한 지 하루 후의 단백질의 최고 수준의 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 또는 200%이다. 일부 실시형태에서, 단백질의 제3 수준이 제3 조성물의 제공 이후 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 또는 40 일 동안 제1 조성물을 제공한 지 하루 후의 단백질의 최고 수준의 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 또는 200%이다. 일부 실시형태에서, 제1 조성물의 제공 이후의 후속 조성물 각각에 대해, 각각의 후속 조성물 이후 발현된 단백질의 후속 수준은 각각의 후속 조성물의 제공 이후 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 또는 40 일 동안 제1 조성물을 제공한 지 하루 후의 단백질의 최고 수준의 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 또는 200%이다.
이들 양태의 일부 실시형태에서, 제2 조성물을 제공한 후의 단백질의 평균 수준은 제1 조성물로부터의 단백질의 제1 수준의 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 또는 110%이며, 단백질의 평균 수준은 제2 조성물을 제공한 후 1일째부터 단백질이 실질적으로 검출 불가능한 날까지 측정된다. 일부 실시형태에서, 제1 조성물 이후에 각각의 후속 조성물을 제공한 후의 단백질의 평균 수준은 제1 조성물로부터의 단백질의 제1 수준의 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 또는 110%이며, 단백질의 평균 수준은 각각의 후속 조성물을 제공한 후 1일째부터 단백질이 실질적으로 검출 불가능한 날까지 측정된다. 일부 실시형태에서, 단백질의 제1 수준은 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후 제1 조성물의 제공 이후 적어도 6시간, 1일, 2일, 3일, 5일, 7일, 14일, 21일, 28일, 또는 35일 동안 유지된다. 일부 실시형태에서, 단백질의 제1 수준은 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 후에 제1 조성물을 제공한 후 6시간 내지 90일 동안 유지된다. 일부 실시형태에서, 단백질의 제1 수준은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물, 제2 조성물, 및 제3 조성물을 제공한 이후 제1 조성물의 제공 이후 6시간 내지 270일 동안 유지된다. 일부 실시형태에서, 단백질의 제1 수준은 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 후에 제1 조성물을 제공한 후 6시간 내지 35일 동안 실질적으로 검출 불가능하다. 일부 실시형태에서, 단백질의 제1 수준은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물, 제2 조성물, 및 제3 조성물을 제공한 이후 제1 조성물의 제공 이후 적어도 6시간, 1일, 2일, 3일, 5일, 7일, 14일, 21일, 28일, 또는 35일 동안 유지된다. 일부 실시형태에서, 제2 조성물을 제공한 이후의 포유동물 내의 단백질의 제2 수준은 제1 조성물을 제공한 이후 포유동물 내의 단백질의 제1 수준보다 적어도 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 60% 높다. 일부 실시형태에서, 제3 조성물을 제공한 이후의 포유동물 내에서 생성된 단백질의 제3 수준은 제1 조성물을 제공한 이후 복수의 단백질의 제1 수준보다 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 60% 높다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 제공한 지 1시간, 12시간, 18시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 15일, 20일, 25일, 30일, 40일, 또는 45일 이후의 단백질의 제2 수준은 제1 조성물을 제공한 이후의 단백질의 제1 수준보다 적어도 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 60% 높다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제3 조성물을 제공한 지 1시간, 12시간, 18시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 15일, 20일, 25일, 30일, 40일, 또는 45일 이후의 단백질의 제3 수준은 제1 조성물을 제공한 이후의 단백질의 제1 수준보다 적어도 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 60% 높다. 일부 실시형태에서, 단백질은 치료적 단백질, 예를 들어, 에리트로포이에틴이다. 일부 실시형태에서, 단백질(예를 들어, 에리트로포이에틴)의 발현은 포유동물에서 반응(예를 들어, 망상적혈구 생성)을 유도한다. 본원에 기재된 양태의 일부 실시형태에서, 치료적 단백질은 효소 대체 단백질, 보충용 단백질, 호르몬, 사이토카인, 항체, 면역요법을 위한 단백질(예를 들어, 암), 세포 리프로그래밍(reprogramming)/전환분화 인자, 전사 인자, 키메라 항원 수용체, 전위효소 또는 뉴클레아제, (예를 들어, 면역 반응/신호에 대한 감수성에 영향을 미치는) 면역 이펙터, 조절된 사망 이펙터 단백질(예를 들어, 아폽토시스 또는 괴사의 유도제), 종양의 비-용해 저해제(예를 들어, 종양단백질의 저해제), 후성적 변형제, 후성적 효소, 전사 인자, DNA 또는 단백질 변형 효소, DNA-삽입제(DNA-intercalating agent), 유출 펌프 저해제, 핵 수용체 활성화제 또는 저해제, 프로테아좀 저해제, 효소에 대한 경쟁적 저해제, 단백질 합성 이펙터 또는 저해제, 뉴클레아제, 단백질 단편 또는 도메인, 리간드 또는 수용체, 또는 CRISPR 시스템 또는 그의 성분이다. 일부 실시형태에서, 단백질은 항원(예를 들어, 종양 항원, 바이러스 항원, 박테리아 항원)이다. 일부 실시형태에서, 단백질은 백신접종을 위한 단백질이다.
제2 양태에서, 본 발명은 단백질을 인코딩하는 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제1 조성물을 세포 또는 대상체에게 제공함으로써, 세포 또는 대상체에서 단백질의 발현을 유지하는 단계를 포함하는 세포 또는 대상체에서의 단백질의 발현의 유지 방법을 특징으로 한다.
제3 양태에서, 본 발명은 단계 (a) 이후 6시간째 내지 90일째에, 단백질을 인코딩하는 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제2 조성물을 세포 또는 대상체에게 제공함으로써, 세포 또는 대상체에서 단백질의 발현을 유지하는 단계를 포함하는 세포 또는 대상체에서의 단백질의 발현의 유지 방법을 특징으로 한다.
제4 양태에서, 본 발명은 대상체에서의 단백질의 발현 방법을 특징으로 하며, 방법은 단백질을 인코딩하는 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제1 조성물을 세포 또는 대상체에게 제공하는 단계를 포함하며, 세포 또는 대상체는 제1 수준의 인코딩된 단백질을 발현하고 (i) 제2 수준이 적어도 제1 수준만큼이거나, (ii) 제2 수준이 제1 수준의 20%를 넘게 차이나지 않으며; 그럼으로써 세포 또는 대상체 내의 인코딩된 단백질의 발현을 적어도 단백질의 제1 수준으로 유지한다.
제5 양태에서, 본 발명은 대상체에서의 단백질의 발현 방법을 특징으로 하며, 방법은 단백질을 인코딩하는 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제2 조성물을 세포 또는 대상체에게 제공하는 단계를 포함하며, 세포 또는 대상체는 제2 수준의 인코딩된 단백질을 발현하고 (i) 제2 수준이 적어도 제1 수준만큼이거나, (ii) 제2 수준이 제1 수준의 20%를 넘게 차이나지 않으며; 그럼으로써 세포 또는 대상체 내의 인코딩된 단백질의 발현을 적어도 단백질의 제1 수준으로 유지한다.
제6 양태에서, 본 발명은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 후의 세포 또는 대상체에서의 단백질의 수준과 비교하여 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 세포 또는 대상체에게 제공한 후의 세포 또는 대상체에서의 소정의 수준의 단백질의 발현 방법을 특징으로 하며, 방법은 단백질을 인코딩하는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물을 세포 또는 대상체에게 제공하는 단계를 포함하며, 세포 또는 대상체가 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물을 제공한 후에 소정의 수준의 단백질을 포함하고 (i) 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 제공한 후에 적어도 소정의 수준의 단백질을 포함하거나, (ii) 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 제공한 후에 소정의 수준의 20%를 넘게 차이나지 않는 수준의 단백질을 포함하는 단계를 포함하며, 그럼으로써 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후의 세포 또는 대상체 내의 단백질의 수준과 비교하여 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후의 세포 또는 대상체 내의 단백질의 발현 수준을 유지한다.
제7 양태에서, 본 발명은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 후의 세포 또는 대상체에서의 단백질의 수준과 비교하여 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 세포 또는 대상체에게 제공한 후의 세포 또는 대상체에서의 소정의 수준의 단백질의 발현 방법을 특징으로 하며, 방법은 제1 조성물 이후에 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 세포 또는 대상체에게 제공하는 단계로서, 세포 또는 대상체가 (i) 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 제공한 후에 적어도 소정의 수준의 단백질을 포함하거나, (ii) 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 제공한 후에 소정의 수준의 20%를 넘게 차이나지 않는 수준의 단백질을 포함하는 단계를 포함하며, 그럼으로써 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후의 세포 또는 대상체 내의 단백질의 수준과 비교하여 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후의 세포 또는 대상체 내의 단백질의 발현 수준을 유지한다.
이들 양태의 일부 실시형태에서, 제1 조성물을 제공하는 단계는 대상체 내의 제1 세포에 대해 이루어지고, 제2 조성물을 제공하는 단계는 대상체 내의 제2 세포에 대하여 이루어지며, 제1 세포 및 제2 세포는 동일한 세포이거나 상이한 세포이다. 일부 실시형태에서, 제2 조성물을 제공하는 단계는 제1 조성물을 제공한 후에, 그리고 제1 조성물에 의해 발현되는 단백질의 제1 수준이 세포 또는 대상체에서 실질적으로 검출 불가능하게 되기 전에 발생한다. 일부 실시형태에서, 제2 조성물을 제공하는 단계는 제1 조성물을 제공한 후에, 그리고 제1 조성물에 의해 발현되는 단백질의 제1 수준이 세포 또는 대상체에서 50% 넘게 감소하기 전에 발생한다. 일부 실시형태에서, 제2 조성물을 제공하는 단계는 제1 조성물을 제공한 후에, 그리고 제1 조성물에 의해 발현되는 단백질의 제1 수준이 세포 또는 대상체에서 25% 내지 75% 감소하기 전에 발생한다.
이들 양태의 일부 실시형태에서, 당해 방법은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제3 조성물을 제2 조성물 이후에 세포 또는 대상체에게 제공함으로써, 세포 또는 대상체에서 단백질의 발현을 적어도 제1 수준의 단백질로 유지하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 제3 조성물을 제공하는 단계는 제2 조성물을 제공한 후에, 그리고 (i) 제1 및 제2 조성물에 의해 발현되는 단백질의 제2 수준이 세포 또는 대상체에서 실질적으로 검출 불가능하게 되기 전에, 또는 (ii) 세포 또는 대상체에서 제1 및 제2 조성물에 의해 발현되는 단백질의 제2 수준이 50% 초과로 감소하기 전에 발생한다. 일부 실시형태에서, 당해 방법은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9 또는 제10 조성물을 제공하는 단계를 추가로 포함한다.
이들 양태의 일부 실시형태에서, 제2 조성물은 제1 조성물에 의해 발현된 세포 또는 대상체 내의 단백질의 수준이 실질적으로 검출 불가능하게 된 지 적어도 1분, 1시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 7일, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 12개월, 13개월, 14개월, 15개월, 16개월, 17개월, 18개월, 19개월, 20개월, 21개월, 또는 22개월 후에 세포 또는 대상체에 제공된다. 이들 양태의 일부 실시형태에서, 제2 조성물은 제1 조성물 이후 적어도 14일째에 그리고 제1 조성물 이후 90일 이내에, 세포 또는 대상체에게 제공된다.
일부 실시형태에서, 단백질의 제1 수준은 제1 조성물을 제공한 후 1일째의 단백질의 가장 높은 수준이다. 일부 실시형태에서, 단백질의 제1 수준은 제1 조성물을 제공한 지 하루 후의 단백질의 최고 수준의 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%이다.
일부 실시형태에서, 단백질의 제2 수준은 제2 조성물의 제공 이후 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 또는 30 일 동안 제1 조성물을 제공한 지 하루 후의 단백질의 최고 수준의 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 또는 130%이다. 일부 실시형태에서, 단백질의 제3 수준은 제3 조성물의 제공 이후 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 또는 30 일 동안 제1 조성물을 제공한 지 하루 후의 단백질의 최고 수준의 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 또는 130%이다. 일부 실시형태에서, 제1 조성물의 제공 이후의 후속 조성물 각각에 대해, 각각의 후속 조성물 이후 발현된 단백질의 후속 수준은 각각의 후속 조성물의 제공 이후 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 또는 30 일 동안 제1 조성물을 제공한 지 하루 후의 단백질의 최고 수준의 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 또는 130%이다. 일부 실시형태에서, 제2 조성물을 제공한 후의 단백질의 평균 수준은 제1 수준의 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 또는 110%이며, 단백질의 평균 수준은 제2 조성물을 제공한 후 1일째부터 단백질이 실질적으로 검출 불가능한 날까지 측정된다. 일부 실시형태에서, 제1 조성물 이후 각각의 후속 조성물을 제공한 후의 단백질의 평균 수준은 제1 수준의 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 또는 110%이며, 단백질의 평균 수준은 각각의 후속 조성물을 제공한 후 1일째부터 단백질이 실질적으로 검출 불가능한 날까지 측정된다. 일부 실시형태에서, 단백질의 제1 수준은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물, 및 제2 조성물을 제공한 이후 제1 조성물의 제공 이후 적어도 6시간, 1일, 2일, 3일, 5일, 7일, 14일, 21일, 28일, 또는 30일 동안 유지된다. 일부 실시형태에서, 단백질의 제1 수준은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물, 제2 조성물, 및 제3 조성물을 제공한 이후 제1 조성물의 제공 이후 적어도 6시간, 1일, 2일, 3일, 5일, 7일, 14일, 21일, 28일, 또는 30일 동안 유지된다. 일부 실시형태에서, 제2 조성물을 제공한 이후의 세포 또는 대상체 내의 단백질의 제2 수준은 제1 조성물을 제공한 이후 세포 또는 대상체 내의 단백질의 제1 수준보다 적어도 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 60% 높다. 일부 실시형태에서, 제3 조성물을 제공한 이후의 세포 또는 대상체 내에서 생성된 단백질의 제3 수준은 제1 조성물을 제공한 이후 복수의 단백질의 제1 수준보다 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 60% 높다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 제공한 지 1시간, 12시간, 18시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 15일, 20일, 25일, 30일, 40일, 또는 45일 이후의 단백질의 제2 수준은 제1 조성물을 제공한 이후의 단백질의 제1 수준보다 적어도 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 60% 높다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제3 조성물을 제공한 지 1시간, 12시간, 18시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 15일, 20일, 25일, 또는 30일 이후의 단백질의 제3 수준은 제1 조성물을 제공한 이후의 단백질의 제1 수준보다 적어도 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 60% 높다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물이 제공된 후의 세포 또는 대상체 내의 단백질의 수준은 적어도 1시간, 12시간, 18시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 15일, 20일, 25일, 또는 30일 동안 유지된다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후의 세포 또는 대상체 내의 단백질의 수준은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후 세포 또는 대상체 내의 단백질의 수준보다 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 60% 높다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후의 세포 또는 대상체 내의 단백질의 수준은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 제공한 이후 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 15일, 20일, 25일, 또는 30일 동안 원형의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후의 세포 또는 대상체 내의 단백질의 수준보다 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 60% 높다.
일부 실시형태에서, 단백질은 치료적 단백질, 예를 들어, 에리트로포이에틴이며, 그리고/또는 단백질(예를 들어, 에리트로포이에틴)의 발현은 세포 또는 대상체에서 반응(예를 들어, 망상적혈구 생성)을 유도한다. 일부 실시형태에서, 단백질은 항원(예를 들어, 종양 항원, 바이러스 항원, 박테리아 항원)이다. 일부 실시형태에서, 단백질은 백신접종을 위한 단백질이다.
제8 양태에서, 본 발명은 세포 또는 대상체에서의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 생산 방법을 특징으로 하며, 방법은 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제1 조성물을 세포 또는 대상체에 제공하는 단계로서, 세포 또는 대상체는 제1 조성물을 제공한 이후의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 수준을 포함하는 단계; 및 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 세포 또는 대상체에게 제공하는 단계로서, 세포 또는 대상체가 제2 수준의 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하며 (i) 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 수준이 적어도 제1 수준만큼이거나, (ii) 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 수준이 제2 조성물을 제공한 이후 제1 수준의 20%를 넘게 차이나지 않는 단계를 포함하며; 그럼으로써 세포 또는 대상체 내의 원형 폴리리보뉴클레오티드를 적어도 제1 수준으로 유지한다.
이 양태의 일부 실시형태에서, 제1 조성물은 제1 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하고 제2 조성물은 제2 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하며, (i) 제1 원형 폴리리보뉴클레오티드와 제2 원형 폴리리보뉴클레오티드는 동일하거나; 혹은 (ii) 제1 원형 폴리리보뉴클레오티드와 제2 원형 폴리리보뉴클레오티드는 상이하다. 이 양태의 일부 실시형태에서, 제1 원형 폴리리보뉴클레오티드는 제1 결합 부위를 포함하고/하거나 제1 단백질을 인코딩하며, 제2 원형 폴리리보뉴클레오티드는 제2 결합 부위를 포함하고/하거나 제2 단백질을 인코딩하며, 제1 결합 부위 및 제2 결합 부위는 동일하거나 상이한 결합 부위이고/이거나 제1 단백질 및 제2 단백질은 동일한 단백질 또는 상이한 단백질을 인코딩한다.
제9 양태에서, 본 발명은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 후의 세포 또는 대상체에서의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 수준과 비교하여 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 세포 또는 대상체에게 제공한 후의 세포 또는 대상체에서의 소정의 수준의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 생성 방법을 특징으로 하며, 방법은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물을 세포 또는 대상체에 제공하는 단계로서, 세포 또는 대상체가 제1 조성물을 제공한 이후의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준을 포함하는 단계; 및 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 세포 또는 대상체에게 제공하는 단계로서, 세포 또는 대상체가 (i) 적어도 제2 조성물을 제공한 이후의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준, 또는 (ii) 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준의 20%를 넘게 차이나지 않는 제2 조성물을 제공한 이후의 단백질의 수준을 포함하는 단계를 포함하며; 그럼으로써 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후의 세포 또는 대상체 내의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준과 비교하여 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후의 세포 또는 대상체 내의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준을 유지한다.
일부 실시형태에서, 제2 조성물을 제공하는 단계는 제1 조성물을 제공한 후에, 그리고 제1 조성물을 제공함으로써 생성되는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준이 세포 또는 대상체에서 실질적으로 검출 불가능하게 되기 전에 발생한다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 제공하는 단계는 제1 조성물 이후에, 그리고 제1 조성물에 의해 생성되는 세포 또는 대상체에서의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준이 실질적으로 검출 불가능하게 된 후에 발생한다. 일부 실시형태에서, 제2 조성물은 제1 조성물에 의해 생성된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준이 실질적으로 검출 불가능하게 된 지 적어도 1분, 1시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 7일, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 12개월, 13개월, 14개월, 15개월, 16개월, 17개월, 18개월, 19개월, 20개월, 21개월, 또는 22개월 후에 세포 또는 대상체에 제공된다. 일부 실시형태에서, 제2 조성물은 제1 조성물 이후 적어도 14일째에 그리고 제1 조성물 이후 90일 이내에 세포 또는 대상체에게 제공된다.
일부 실시형태에서, 당해 방법은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제3 조성물을 제2 조성물 이후에 세포 또는 대상체에게 제공함으로써, 제3 조성물을 제공한 후에 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준을 적어도 제1 수준으로 유지하는 단계를 추가로 포함하며, 선택적으로, 제3 조성물을 제공하는 단계는 제2 조성물을 제공한 후에, 그리고 (i) 세포 또는 대상체에서 제1 및 제2 조성물에 의해 생성되는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준이 세포 또는 대상체에서 실질적으로 검출 불가능하게 되기 전에, 또는 (ii) 세포 또는 대상체에서 제1 및 제2 조성물에 의해 생성되는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준이 50% 초과로 감소되기 전에; 또는 (iii) 세포 또는 대상체에서 제1 및 제2 조성물에 의해 생성되는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준이 세포 또는 대상체에서 25% 내지 75% 감소하기 전에 발생한다.
일부 실시형태에서, 당해 방법은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9 또는 제10 조성물을 세포 또는 대상체에게 제공하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 수준은 제1 조성물을 제공한 후 1일째의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 가장 높은 수준이다. 일부 실시형태에서, 제1 조성물의 제공 이후의 후속 조성물 각각에 대해, 각각의 후속 조성물 이후 발현된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 후속 수준은 각각의 후속 조성물의 제공 이후 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 또는 30 일 동안 제1 조성물을 제공한 지 하루 후의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 최고 수준의 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 또는 130%이다. 일부 실시형태에서, 제2 조성물을 제공한 후의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 평균 수준은 제1 수준의 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%이며, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 평균 수준은 제2 조성물을 제공한 후 1일째부터 원형 폴리리보뉴클레오티드가 실질적으로 검출 불가능한 날까지 측정된다. 일부 실시형태에서, 제1 조성물 이후 각각의 후속 조성물을 제공한 후의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 평균 수준은 제1 수준의 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%이며, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 평균 수준은 각각의 후속 조성물을 제공한 후 1일째부터 원형 폴리리보뉴클레오티드가 실질적으로 검출 불가능한 날까지 측정된다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 수준은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물이 제공된 후 적어도 6시간, 1일, 2일, 3일, 5일, 7일, 14일, 21일, 28일, 또는 30일 동안 유지된다. 일부 실시형태에서, 제2 조성물을 제공한 이후의 세포 또는 대상체 내의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 수준은 제1 조성물을 제공한 이후 세포 또는 대상체 내의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 수준보다 적어도 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 60% 높다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 제공한 지 1시간, 12시간, 18시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 15일, 20일, 25일, 또는 30일 이후의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 수준은 제1 조성물을 제공한 이후의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 수준보다 적어도 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 60% 높다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제3 조성물을 제공한 지 1시간, 12시간, 18시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 15일, 20일, 25일, 또는 30일 이후의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제3 수준은 제1 조성물을 제공한 이후의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 수준보다 적어도 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 60% 높다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물이 제공된 후의 세포 또는 대상체 내의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준은 적어도 1시간, 12시간, 18시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 15일, 20일, 25일, 또는 30일 동안 유지된다. 일부 실시형태에서, 제1 조성물에 의해 생산된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준은 제1 조성물을 제공한 지 하루 후의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 최고 수준의 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%이다. 일부 실시형태에서, 제2 조성물에 의해 생성된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준은 제2 조성물의 제공 이후 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 또는 30일 동안 제1 조성물을 제공한 지 하루 후의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 최고 수준의 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 또는 130%이다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후의 세포 또는 대상체 내의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후 세포 또는 대상체 내의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 수준보다 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 60% 높다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 제공한 이후 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 15일, 20일, 25일, 또는 30일 동안 원형의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 수준보다 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 60% 높다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제3 수준은 제3 조성물의 제공 이후 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 또는 30 일 동안 제1 조성물을 제공한 지 하루 후의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 최고 수준의 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 또는 130%이다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 수준은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제3 조성물이 제공된 후 적어도 6시간, 1일, 2일, 3일, 5일, 7일, 14일, 21일, 28일, 또는 30일 동안 유지된다. 일부 실시형태에서, 제3 조성물을 제공한 이후의 세포 또는 대상체 내의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제3 수준은 제1 조성물을 제공한 이후 복수의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 수준보다 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 60% 높다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제3 조성물을 제공한 지 1시간, 12시간, 18시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 15일, 20일, 25일, 또는 30일 이후의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제3 수준은 제1 조성물을 제공한 이후의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 수준보다 적어도 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 60% 높다.
일부 실시형태에서, 단백질(예를 들어, 에리트로포이에틴)은 대상체에서 반응(예를 들어, 망상적혈구의 생성)을 유도한다. 일부 실시형태에서, 단백질은 항원(예를 들어, 바이러스 항원, 박테리아 항원, 종양 항원)이다.
제10 양태에서, 본 발명은 표적에 대한 결합 부위를 포함하는 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제1 조성물을 세포 또는 대상체에게 제공하는 단계로서, 표적이 제1 수준으로 결합 부위에 결합하는 단계; 및 표적에 대한 결합 부위를 포함하는 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제2 조성물을 세포 또는 대상체에게 제공하는 단계로서, 표적이 제2 수준으로 결합 부위에 결합하며, (i) 제2 수준이 적어도 제1 수준만큼이거나, (ii) 제2 수준이 제1 수준의 20%를 넘게 차이나지 않는 단계를 포함하며;
그럼으로써 세포 또는 대상체 내의 표적의 결합을 적어도 결합의 제1 수준으로 유지하는, 세포 또는 대상체 내의 표적의 결합 방법을 특징으로 한다.
제11 양태에서, 본 발명은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 후의 세포 또는 대상체에서의 표적으로의 결합의 수준과 비교하여 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 세포 또는 대상체에게 제공한 후의 세포 또는 대상체에서의 표적의 결합 방법을 특징으로 하며, 방법은 (a) 결합 부위를 포함하는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물을 세포 또는 대상체에게 제공하는 단계로서, 상기 세포 또는 대상체가 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물을 제공한 후에 소정의 수준의 표적으로의 결합을 포함하는 단계; 및 (b) 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 제1 조성물 이후에 세포 또는 대상체에게 제공하는 단계로서, 상기 세포 또는 대상체가 (i) 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 제공한 후에 적어도 상기 수준의 표적으로의 결합, 또는 (ii) 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 제공한 후에 상기 수준의 20%를 넘게 차이나지 않는 수준의 표적으로의 결합을 포함하는 단계를 포함하며; 그럼으로써 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후의 세포 또는 대상체 내의 표적에 대한 결합 수준과 비교하여 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후의 세포 또는 대상체 내의 표적에 대한 결합 수준을 유지한다.
일부 실시형태에서, 제2 조성물을 제공하는 단계는 제1 조성물을 제공한 후에, 그리고 제1 조성물에 의한 결합의 제1 수준이 세포 또는 대상체에서 실질적으로 검출 불가능하게 되기 전에 발생한다. 일부 실시형태에서, 제2 조성물을 제공하는 단계는 제1 조성물을 제공한 후에, 그리고 제1 조성물에 의한 결합의 제1 수준이 세포 또는 대상체에서 50% 넘게 감소하기 전에 발생한다. 일부 실시형태에서, 제2 조성물을 제공하는 단계는 제1 조성물을 제공한 후에, 그리고 제1 조성물에 의한 결합의 제1 수준이 세포 또는 대상체에서 25% 내지 75% 감소하기 전에 발생한다.
일부 실시형태에서, 당해 방법은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제3 조성물을 제2 조성물 이후에 세포 또는 대상체에게 제공함으로써, 세포 또는 대상체에서 표적의 결합을 적어도 제1 수준의 결합으로 유지하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 제3 조성물을 제공하는 단계는 제2 조성물을 제공한 후에, 그리고 제1 및 제2 조성물에 의한 세포 또는 대상체 내의 표적의 결합의 제2 수준이 세포 또는 대상체에서 실질적으로 검출 불가능하게 되기 전에 발생한다.
일부 실시형태에서, 제3 조성물을 제공하는 단계는 제2 조성물을 제공한 후에, 그리고 세포 또는 대상체에서 제1 및 제2 조성물에 의한 결합의 제2 수준이 50% 넘게 감소하기 전에 발생한다.
일부 실시형태에서, 당해 방법은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9 또는 제10 조성물을 제공하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 제공하는 단계는 제1 조성물 이후에, 그리고 제1 조성물에 의한 결합의 수준이 실질적으로 검출 불가능하게 된 후에 발생한다. 일부 실시형태에서, 제2 조성물은 제1 조성물에 의한 결합의 수준이 실질적으로 검출 불가능하게 된 지 적어도 6시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 7일, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 12개월, 13개월, 14개월, 15개월, 16개월, 17개월, 18개월, 19개월, 20개월, 21개월, 또는 22개월 후에 세포 또는 대상체에 제공된다. 일부 실시형태에서, 제2 조성물은 제1 조성물 이후 14일째에, 그리고 제1 조성물 이후 90일 이내에 세포 또는 대상체에게 제공된다.
일부 실시형태에서, 결합의 제1 수준은 제1 조성물을 제공한 후 1일째의 결합의 가장 높은 수준이다. 일부 실시형태에서, 결합의 제1 수준은 제1 조성물을 제공한 지 하루 후의 결합의 최고 수준의 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%이다. 일부 실시형태에서, 결합의 제2 수준이 제2 조성물의 제공 이후 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 또는 45 일 동안 제1 조성물을 제공한 지 하루 후의 결합의 최고 수준의 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 또는 130%이다. 일부 실시형태에서, 결합의 제3 수준이 제3 조성물의 제공 이후 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 또는 30 일 동안 제1 조성물을 제공한 지 하루 후의 결합의 최고 수준의 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 또는 130%이다. 일부 실시형태에서, 제1 조성물의 제공 이후의 후속 조성물 각각에 대해, 각각의 후속 조성물 이후 결합의 후속 수준은 각각의 후속 조성물의 제공 이후 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 또는 30 일 동안 제1 조성물을 제공한 지 하루 후의 결합의 최고 수준의 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 또는 130%이다. 일부 실시형태에서, 제2 조성물을 제공한 후의 결합의 평균 수준은 제1 수준의 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 또는 110%이며, 결합의 평균 수준은 제2 조성물을 제공한 후 1일째부터 결합이 실질적으로 검출 불가능한 날까지 측정된다. 일부 실시형태에서, 제1 조성물 이후 각각의 후속 조성물을 제공한 후의 결합의 평균 수준은 제1 수준의 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 또는 110%이며, 결합의 평균 수준은 각각의 후속 조성물을 제공한 후 1일째부터 결합이 실질적으로 검출 불가능한 날까지 측정된다. 일부 실시형태에서, 결합의 제1 수준은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물, 및 제2 조성물을 제공한 이후 제1 조성물의 제공 이후 적어도 6시간, 1일, 2일, 3일, 5일, 7일, 14일, 21일, 28일, 또는 30일 동안 유지된다. 일부 실시형태에서, 제2 조성물을 제공한 이후의 세포 또는 대상체 내의 결합의 제2 수준은 제1 조성물을 제공한 이후 세포 또는 대상체 내의 결합의 제1 수준보다 적어도 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 60% 높다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 제공한 지 1시간, 12시간, 18시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 15일, 20일, 25일, 또는 30일 이후의 결합의 제2 수준은 제1 조성물을 제공한 이후의 결합의 제1 수준보다 적어도 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 60% 높다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물이 제공된 후의 세포 또는 대상체 내의 결합의 수준은 적어도 1시간, 12시간, 18시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 15일, 20일, 25일, 또는 30일 동안 유지된다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후의 세포 또는 대상체 내의 결합의 수준은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후 세포 또는 대상체 내의 결합의 수준보다 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 60% 높다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후의 세포 또는 대상체 내의 결합의 수준은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 제공한 이후 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 15일, 20일, 25일, 또는 30일 동안 원형의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후의 세포 또는 대상체 내의 결합의 수준보다 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 60% 높다.
일부 실시형태에서, 결합의 제1 수준은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물, 제2 조성물 및 제3 조성물을 제공한 후에, 제1 조성물을 제공한 후 적어도 6시간, 1일, 2일, 3일, 5일, 7일, 14일, 21일, 28일 또는 30일 동안 유지된다. 일부 실시형태에서, 제3 조성물을 제공한 후의 세포 또는 대상체에서의 결합의 제3 수준은 제1 조성물을 제공한 후의 결합의 제1 수준보다 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50% 또는 60% 더 높다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제3 조성물을 제공한 지 1시간, 12시간, 18시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 15일, 20일, 25일, 또는 30일 이후의 결합의 제3 수준은 제1 조성물을 제공한 이후의 결합의 제1 수준보다 적어도 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 60% 높다.
일부 실시형태에서, 제1 조성물의 원형 폴리리보뉴클레오티드와 제2 조성물의 원형 폴리리보뉴클레오티드는 동일하다. 일부 실시형태에서, 제1 조성물의 원형 폴리리보뉴클레오티드와 제2 조성물의 원형 폴리리보뉴클레오티드는 상이하다.
일부 실시형태에서, 제1 조성물 및 제2 조성물은 거의 동일한 양의 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 조성물은 제2 조성물보다 많은 양의 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 조성물은 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9 또는 제10 조성물보다 더 많은 양의 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 조성물의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 양은 제1 조성물의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 양의 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 또는 25%를 넘게 차이나지 않는다. 일부 실시형태에서, 제2 조성물의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 양은 제1 조성물의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 양보다 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 또는 25% 이하로 적다. 일부 실시형태에서, 제1 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 제3 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포는 동물 세포(예를 들어, 포유동물 세포, 예를 들어, 인간 세포)이다. 일부 실시형태에서, 세포는 대상체 내의 복수의 세포이다. 일부 실시형태에서, 제1 조성물 및/또는 제2 조성물은 1 ng/㎖, 5 ng/㎖, 10 ng/㎖, 15 ng/㎖, 20 ng/㎖, 25 ng/㎖, 30 ng/㎖, 35 ng/㎖, 40 ng/㎖, 50 ng/㎖, 60 ng/㎖, 70 ng/㎖, 80 ng/㎖, 90 ng/㎖, 100 ng/㎖, 200 ng/㎖, 300 ng/㎖, 400 ng/㎖, 500 ng/㎖, 600 ng/㎖, 1 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖, 200 g/㎖, 300 ㎍/㎖, 400 ㎍/㎖, 500 ㎍/㎖, 600 ㎍/㎖, 700 ㎍/㎖, 800 ㎍/㎖, 900 ㎍/㎖, 1 ㎎/㎖, 1.5 ㎎/㎖ 또는 2 ㎎/㎖ 이하의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 조성물 및/또는 제2 조성물은, 제1 조성물 및/또는 제2 조성물 내의 총 리보뉴클레오티드 분자에 비해 적어도 30%(w/w), 40%(w/w), 50%(w/w), 60%(w/w), 70%(w/w), 80%(w/w), 85%(w/w), 90%(w/w), 91%(w/w), 92%(w/w), 93%(w/w), 94%(w/w), 95%(w/w), 96%(w/w), 97%(w/w), 98%(w/w) 또는 99%(w/w)의 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 조성물 및/또는 제2 조성물 내의 총 리보뉴클레오티드 분자의 적어도 30%(w/w), 40%(w/w), 50%(w/w), 60%(w/w), 70%(w/w), 80%(w/w), 85%(w/w), 90%(w/w), 91%(w/w), 92%(w/w), 93%(w/w), 94%(w/w), 95%(w/w), 96%(w/w), 97%(w/w), 98%(w/w) 또는 99%(w/w)가 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자이다.
일부 실시형태에서, 대상체는 동물(예를 들어, 포유동물)이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 인간이다. 일부 실시형태에서, 단백질은 항원(예를 들어, 종양 항원, 박테리아 항원, 바이러스 항원)이다.
제12 양태에서, 본 발명은 세포에서의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 생산 방법을 특징으로 하며, 방법은 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제1 조성물을 세포에 제공하는 단계로서, 세포는 제1 조성물을 제공한 이후의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 수준을 포함하는 단계; 및 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 세포에 제공하는 단계로서, 세포는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 수준을 포함하며, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 수준은 적어도 제2 조성물을 제공한 이후의 제1 수준만큼인 단계를 포함하며, 그럼으로써 세포 내의 원형 폴리리보뉴클레오티드를 적어도 제1 수준으로 유지한다.
제13 양태에서, 본 발명은 포유동물에서의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 생산 방법을 특징으로 하며, 방법은 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제1 조성물을 포유동물에 제공하는 단계로서, 포유동물은 제1 조성물을 제공한 이후의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 수준을 포함하는 단계; 및 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 포유동물에 제공하는 단계로서, 포유동물은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 수준을 포함하며, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 수준은 적어도 제2 조성물을 제공한 이후의 제1 수준만큼인 단계를 포함하며, 그럼으로써 포유동물 내의 원형 폴리리보뉴클레오티드를 적어도 제1 수준으로 유지한다.
제14 양태에서, 본 발명은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 후의 세포에서의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 수준과 비교하여 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 세포에게 제공한 후의 세포에서의 소정의 수준의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 생성 방법을 특징으로 하며, 방법은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물을 세포에 제공하는 단계로서, 세포가 제1 조성물을 제공한 이후의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준을 포함하는 단계; 및 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 세포에 제공하는 단계로서, 세포가 적어도 제2 조성물을 제공한 이후의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준을 포함하는 단계를 포함하며, 그럼으로써 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후의 세포 내의 선형 대응물의 수준과 비교하여 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후의 세포 내의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준을 유지한다.
제15 양태에서, 본 발명은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 후의 포유동물에서의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 수준과 비교하여 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 포유동물에게 제공한 후의 포유동물에서의 소정의 수준의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 생성 방법을 특징으로 하며, 방법은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물을 포유동물에 제공하는 단계로서, 포유동물이 제1 조성물을 제공한 이후의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준을 포함하는 단계; 및 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 포유동물에 제공하는 단계로서, 포유동물이 적어도 제2 조성물을 제공한 이후의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준을 포함하는 단계를 포함하며, 그럼으로써 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후의 포유동물 내의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준과 비교하여 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후의 포유동물 내의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준을 유지한다.
제16 양태에서, 본 발명은 일반적으로 세포 내의 표적의 결합 방법을 특징으로 하며, 방법은 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제1 조성물을 세포에 제공하는 단계로서, 세포는 제1 조성물을 제공한 이후의 결합의 제1 수준을 포함하는 단계; 및 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 세포에 제공하는 단계로서, 세포는 결합의 제2 수준을 포함하며, 결합의 제2 수준은 적어도 제2 조성물을 제공한 이후의 제1 수준만큼인 단계를 포함하며, 그럼으로써 세포 내의 결합을 적어도 제1 수준으로 유지한다.
제17 양태에서, 본 발명은 일반적으로 포유동물 내의 표적의 결합 방법을 특징으로 하며, 방법은 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제1 조성물을 포유동물에 제공하는 단계로서, 포유동물은 제1 조성물을 제공한 이후의 결합의 제1 수준을 포함하는 단계; 및 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 포유동물에 제공하는 단계로서, 포유동물은 결합의 제2 수준을 포함하며, 결합의 제2 수준은 적어도 제2 조성물을 제공한 이후의 제1 수준만큼인 단계를 포함하며, 그럼으로써 포유동물 내의 결합을 적어도 제1 수준으로 유지한다.
제18 양태에서, 본 발명은 일반적으로 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 후의 세포 내의 결합의 수준과 비교하여 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 세포에게 제공한 후의 세포 내의 표적의 결합 방법을 특징으로 하며, 방법은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물을 세포에 제공하는 단계로서, 세포가 제1 조성물을 제공한 이후의 결합의 수준을 포함하는 단계; 및 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 세포에 제공하는 단계로서, 세포가 적어도 제2 조성물을 제공한 이후의 결합의 수준을 포함하는 단계를 포함하며, 그럼으로써 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후의 세포 내의 결합의 수준과 비교하여 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후의 세포 내의 결합의 수준을 유지한다.
제19 양태에서, 본 발명은 일반적으로 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 후의 포유동물 내의 결합의 수준과 비교하여 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 포유동물에게 제공한 후의 포유동물 내의 표적의 결합 방법을 특징으로 하며, 방법은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물을 포유동물에 제공하는 단계로서, 포유동물이 제1 조성물을 제공한 이후의 결합의 수준을 포함하는 단계; 및 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 포유동물에 제공하는 단계로서, 포유동물이 적어도 제2 조성물을 제공한 이후의 결합의 수준을 포함하는 단계를 포함하며, 그럼으로써 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후의 포유동물 내의 결합의 수준과 비교하여 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후의 포유동물 내의 결합의 수준을 유지한다.
정의
본 발명은 특정 실시형태에 관하여 그리고 특정 도면을 참조하여 기술될 것이지만, 본 발명은 그에 제한되지 않고, 오직 청구범위에 의해서만 제한된다. 이하에 기재된 용어는 일반적으로 다르게 지시되지 않는 한 그들의 일반적인 의미로 이해될 것이다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "circRNA" 또는 "원형 폴리리보뉴클레오티드" 또는 "원형 RNA"는 상호교환 가능하게 사용되며, 자유 말단을 갖지 않는 구조(즉, 자유 3' 및/또는 5' 말단 부재)를 갖는 폴리리보뉴클레오티드 분자, 예를 들어, 공유적 또는 비-공유적 결합을 통해 원형 또는 순환 구조를 형성하는 폴리리보뉴클레오티드 분자를 의미한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "압타머 서열"은 표적 분자에 특이적으로 결합하는 비-천연 발생 또는 합성 올리고뉴클레오티드이다. 전형적으로, 압타머는 20 내지 500개 뉴클레오티드이다. 전형적으로, 압타머는 서열 상동성보다는 2차 구조를 통해 그의 표적에 결합한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "엔크립토겐"은 면역 세포에 의한 검출의 감소, 회피 및/또는 모면을 보조하고/보조하거나 원형 폴리리보뉴클레오티드에 대한 면역 반응의 유도를 감소시키는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 핵산 서열 또는 구조이다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "발현 서열"은 생성물, 예를 들어, 펩티드 또는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열 또는 조절 핵산이다. 펩티드 또는 폴리펩티드를 코딩하는 예시적인 발현 서열은 복수의 뉴클레오티드 트라이어드(triad)를 포함하며, 이의 각각은 아미노산을 코딩하고, "코돈"으로 명명된다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 “외인성”은 생체분자(예컨대 원형 RNA)에 관하여 사용되는 경우, 생체분자가 사람의 손에 의해 숙주 게놈, 세포 또는 유기체 내로 도입된 것을 의미한다. 예를 들어, 재조합 DNA 기법 및/또는 생체분자를 세포 내로 내재화시키는 방법을 사용하여 기존의 게놈, 세포, 조직 또는 대상체 내로 부가되는 원형 RNA는 기존의 핵산 서열, 세포, 조직 또는 대상체, 및 생체분자를 보유하는 핵산 서열, 세포, 조직 또는 대상체의 임의의 자손에 대하여 외인성이다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "면역단백질 결합 부위"는 면역단백질에 결합하는 뉴클레오티드 서열이다. 일부 실시형태에서, 면역단백질 결합 부위는 외인성으로서의 원형 폴리리보뉴클레오티드를 차폐하는 데 도움이 되며, 예를 들어, 면역단백질 결합 부위는 원형 폴리리보뉴클레오티드가 면역단백질에 의해 인식되고 결합되는 것을 방지하는 단백질(예를 들어, 경쟁적 저해제)에 의해 결합되어, 그에 의해, 원형 폴리리보뉴클레오티드에 대한 면역 반응을 감소시키거나 모면한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "면역단백질"은 예를 들어, 면역원, 예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드에 대한 것과 같은 면역 반응과 연관된 임의의 단백질 또는 펩티드이다. 면역단백질의 비-제한적인 예는 T 세포 수용체(TCR), 항체(면역글로불린), 주요 조직적합성 복합체(MHC) 단백질, 보체 단백질 및 RNA 결합 단백질을 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 “변형된 리보뉴클레오티드”는 미변형 천연 리보뉴클레오티드, 예컨대 천연 미변형 뉴클레오티드 아데노신(A), 우리딘(U), 구아닌(G), 시티딘(C)의 화학적 조성에 대하여 하나 이상의 화학적 변형을 갖는 임의의 리보뉴클레오티드 유사체 또는 유도체를 의미한다. 일부 실시형태에서, 변형된 리보뉴클레오티드의 화학적 변형은 예컨대 당, 핵염기, 또는 (예를 들어, 연결 포스페이트로의 / 포스포디에스테르 링키지로의 / 포스포디에스테르 백본으로의) 뉴클레오시드간 링키지 등, 리보뉴클레오티드의 임의의 하나 이상의 작용성 기에 대한 변형을 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 어구 "준-나선 구조"는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 고차 구조이며, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 적어도 일부는 나선 구조로 폴딩된다.
본원에 사용되는 바와 같이, 어구 "준-이중-가닥 이차 구조"는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 고차 구조이며, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 적어도 일부는 내부 이중 가닥을 생성한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "조절 요소"는 원형 폴리리보뉴클레오티드 내의 발현 서열의 발현을 변형시키는 모이어티, 예컨대 핵산 서열이다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "반복 뉴클레오티드 서열"은 DNA 또는 RNA의 스트레치 내의 또는 게놈 전체에 걸친 반복 핵산 서열이다. 일부 실시형태에서, 반복 뉴클레오티드 서열은 폴리 CA 또는 폴리 TG(UG) 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 반복 뉴클레오티드 서열은 Alu 패밀리의 인트론 내의 반복된 서열을 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "복제 요소"는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 전사를 개시하거나 복제에 유용한 서열 및/또는 모티프이다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "스태거 요소"는 번역 동안 리보솜 정지를 유도하는 모이어티, 예컨대 뉴클레오티드 서열이다. 일부 실시형태에서, 스태거 요소는 강력한 알파-나선 경향을 갖는 아미노산의 비-보존된 서열에 이어서 공통 서열 -D(V/I)ExNPG P이며, 여기서 x는 임의의 아미노산이다. 일부 실시형태에서, 스태거 요소는 화학적 모이어티, 예컨대 글리세롤, 비 핵산 연결 모이어티, 화학적 변형, 변형된 핵산 또는 그의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "실질적으로 저항성"은 참조물질과 비교시 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 저항성을 갖는 것을 의미한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "화학량론적 번역"은 원형 폴리리보뉴클레오티드로부터 번역되는 발현 생성물의 실질적으로 동등한 생성을 의미한다. 예를 들어, 2개의 발현 서열을 갖는 원형 폴리리보뉴클레오티드에 있어서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 화학량론적 번역은 2개의 발현 서열의 발현 생성물이 실질적으로 동등한 양을 가질 수 있음을 의미할 수 있으며, 예를 들어, 2개의 발현 서열 간의 양의 차이(예를 들어, 몰 차이)는 약 0, 또는 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15% 또는 20% 미만일 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "번역 개시 서열"은 원형 폴리리보뉴클레오티드 내의 발현 서열의 번역을 개시하는 핵산 서열이다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "종결 요소"는 원형 폴리리보뉴클레오티드 내의 발현 서열의 번역을 종결시키는 모이어티, 예컨대 핵산 서열이다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "번역 효율"은 리보뉴클레오티드 전사물로부터의 단백질 또는 펩티드 생성의 속도 또는 양을 의미한다. 일부 실시형태에서, 번역 효율은 예를 들어, 주어진 기간에, 예를 들어, 주어진 번역 시스템, 예를 들어, 토끼 망상적혈구 용해물과 같은 시험관내 번역 시스템 또는 진핵 세포 또는 원핵 세포와 같은 생체내 번역 시스템에서, 단백질 또는 펩티드를 코딩하는 전사물의 주어진 양 당, 생성되는 단백질 또는 펩티드의 양으로서 표현될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "원형화 효율"은 생성된 원형 폴리리보뉴클레오티드 대 그의 원형 출발 물질의 척도이다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "면역원성"은 물질에 대한 면역 반응을 유도할 가능성을 지칭할 수 있다. 일부 실시형태에서, 면역 반응은 유기체의 면역계 또는 특정 유형의 면역 세포가 면역원성 물질에 노출되는 경우에 유도될 수 있다. 용어 "비-면역원성"은 물질에 대한 검출 가능한 임계값을 초과하는 면역 반응의 결여 또는 그의 부재이다. 일부 실시형태에서, 유기체의 면역계 또는 특정 유형의 면역 세포가 비-면역원성 물질에 노출되는 경우에 면역 반응은 검출되지 않는다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공되는 바와 같은 비-면역원성 원형 폴리리보뉴클레오티드는 면역원성 검정에 의해 측정되는 경우 사전결정된 임계값을 초과하는 면역 반응을 유도하지 않는다. 예를 들어, 면역원성 검정을 사용하여 원형 폴리리보뉴클레오티드에 대한 선천 면역 반응을 측정하는 경우(예컨대, 염증성 마커의 측정), 본원에 제공되는 바와 같은 비-면역원성 폴리리보뉴클레오티드는 선천 면역 반응의 생성을 사전결정된 임계값보다 더 낮은 수준으로 야기할 수 있다. 사전결정된 임계값은 예를 들어, 대조군 참조물질에 대한 선천 면역 반응에 의해 생성되는 마커(들)의 수준의 최대 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 또는 10배일 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 “실질적으로 검출 불가능한”은 관련 검출 기법(예를 들어, 크로마토그래피(컬럼, 종이, 겔, HPLC, UHPLC, IC, SEC 등), 전기영동(UREA PAGE, 칩-기반, 폴리아크릴아미드 겔, RNA, 모세관, c-IEF 등), 형광-기반 검출 기법 등)에 의해 검출 가능한 수준보다 더 낮은, 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 원형 폴리리보뉴클레오티드로부터 발현되는 단백질의 수준을 나타낼 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "선형 대응물"은 원형 폴리리보뉴클레오티드와 동일하거나 유사한 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75% 또는 그 사이의 임의의 백분율의 서열 유사성)을 갖고, 2개의 자유 말단(즉, 원형화된 폴리리보뉴클레오티드의 비원형화된 버전(및 그의 단편))을 갖는 폴리리보뉴클레오티드 분자(및 그의 단편)이다. 일부 실시형태에서, 선형 대응물(예를 들어, 사전-원형화된 버전)은 원형 폴리리보뉴클레오티드와 동일하거나 유사한 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75% 또는 그 사이의 임의의 백분율의 서열 유사성) 및 동일하거나 유사한 핵산 변형을 갖고, 2개의 자유 말단(즉, 원형화된 폴리리보뉴클레오티드의 비원형화된 버전(및 그의 단편))을 갖는 폴리리보뉴클레오티드 분자(및 그의 단편)이다. 일부 실시형태에서, 선형 대응물은 원형 폴리리보뉴클레오티드와 동일하거나 유사한 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75% 또는 그 사이의 임의의 백분율의 서열 유사성)과 상이한 핵산 변형을 갖거나, 핵산 변형을 갖지 않고, 2개의 자유 말단(즉, 원형화된 폴리리보뉴클레오티드의 비원형화된 버전(및 그의 단편))을 갖는 폴리리보뉴클레오티드 분자(및 그의 단편)이다. 일부 실시형태에서, 선형 대응물인 폴리리보뉴클레오티드 분자의 단편은 선형 대응물 폴리리보뉴클레오티드 분자보다 더 짧은 선형 대응물 폴리리보뉴클레오티드 분자의 임의의 부분이다. 일부 실시형태에서, 선형 대응물은 5' 캡을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 선형 대응물은 폴리 아데노신 테일을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 선형 대응물은 3' UTR을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 선형 대응물은 5' UTR을 추가로 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 “컨쥬게이션 모이어티”는 컨쥬게이션 방법에 사용하기 위한 작용기를 포함하는 변형된 뉴클레오티드를 나타낸다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "담체"는 부분적으로 또는 완전히 캡슐화시키는 작용제 또는 그의 조합을 통한 원형 폴리리보뉴클레오티드의 공유적 변형에 의해 세포 내로의 조성물(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드)의 수송 또는 전달을 용이하게 하는 화합물, 조성물, 시약 또는 분자를 의미한다. 담체의 비제한적인 예에는 탄수화물 담체(예를 들어, 무수물-변형된 피토글리코겐 또는 글리코겐-유형 물질), 나노입자(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드를 캡슐화하거나 이에 공유적으로 연결되어 결합하는 나노입자), 리포좀, 푸소좀, 생체 외 분화된 망상적혈구, 엑소좀, 단백질 담체(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드에 공유적으로 연결된 단백질) 또는 양이온성 담체(예를 들어, 양이온성 리포폴리머(lipopolymer) 또는 트랜스펙션 시약)가 포함된다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "네이키드 전달"은 담체의 보조 없이, 그리고 세포로의 전달을 보조하는 모이어티에 대한 공유적 변형 없이 세포로의 전달을 위한 제형을 의미한다. 네이키드 전달 제형은 임의의 트랜스펙션 시약, 양이온성 담체, 탄수화물 담체, 나노입자 담체 또는 단백질 담체가 없다. 예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 네이키드 전달 제형은 공유적 변형 없이 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하며, 담체가 없는 제형이다.
용어 "희석제"는 본원에 기술된 조성물(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 조성물)이 희석되거나 용해될 수 있는 비활성 용매를 포함하는 비히클을 의미한다. 희석제는 RNA 가용화제, 완충제, 등장화제 또는 그의 혼합물일 수 있다. 희석제는 액체 희석제 또는 고체 희석제일 수 있다. 액체 희석제의 비제한적인 예에는 물 또는 기타 용매, 가용화제 및 유화제, 예컨대 에틸 알코올, 이소프로필 알코올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜, 디메틸포름아미드, 오일(특히, 목화씨, 땅콩, 옥수수, 배아, 올리브, 피마자 및 참깨), 글리세롤, 테트라하이드로푸르푸릴 알코올, 소르비탄의 폴리에틸렌 글리콜 및 지방산 에스테르 및 1,3-부탄디올이 포함된다. 고체 희석제의 비제한적인 예에는 탄산칼슘, 탄산나트륨, 인산칼슘, 인산이칼슘, 황산칼슘, 인산수소칼슘, 인산나트륨 락토스, 수크로스, 셀룰로스, 미세결정질 셀룰로스, 카올린, 만니톨, 소르비톨, 이노시톨, 염화나트륨, 건조 전분(dry starch), 옥수수 전분 또는 파우더 슈거(powdered sugar)가 포함된다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 “반응” 또는 “반응 수준”은 자극제에 대한 노출로부터 초래되는 임의의 측정 가능한 변화 또는 임의의 수준의 측정 가능한 변화이다. 예를 들어, 측정 가능한 변화는 표현형(예를 들어, 세포적 표현형, 물리적 표현형, 분자적 표현형), 또는 자극제가 작동하는 것을 알려주는 임의의 특징의 변경 또는 변화이며, 예들 들어, 자극제에 대한 노출 후의 세포 형태의 변화, 소정의 세포 유형의 생성의 증가 또는 감소, 근육량의 증가 또는 감소를 포함한다. 추가의 예로서, 자극제는 결합 부위를 포함하는 단백질(예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드로부터 발현되는 에리트로포이에틴) 또는 원형 폴리리보뉴클레오티드이며, 반응 또는 반응 수준은 대상체에서의 결합 부위를 포함하는 단백질 또는 원형 폴리리보뉴클레오티드에 대한 노출 후의 표현형의 측정 가능한 변경(예를 들어, 대상체에서의 망상적혈구의 생성 또는 수준의 증가)이다.
참조에 의한 포함
본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 구체적이고 개별적으로 참조로 포함되어 있는 것으로 나타낸 것과 동일한 정도로 본원에 참조로 포함된다.
본 발명의 실시형태의 하기의 상세한 설명은 첨부된 도면과 함께 판독하는 경우 더 잘 이해될 것이다. 본 발명의 예시의 목적을 위하여, 본원에 예시된 실시형태가 도면에 나타나 있다. 그러나, 본 발명이 도면에 나타낸 실시형태의 정확한 배열 및 수단으로 제한되지 않음을 이해해야 한다.
도 1은 마우스 내로 주사한 후에, 원형 RNA가 주사 후 3일째, 4일째 및 7일째에 마우스의 간에서 선형 RNA보다 더 높은 수준으로 검출되었음을 보여준다.
도 2a 및 도 2b는 가우시아 루시퍼라제를 발현하는 원형 RNA 또는 선형 RNA를 마우스 내로 주사한 후에, 가우시아 루시퍼라제 활성이 원형 RNA의 투여 후 1일째, 2일째, 7일째, 11일째, 16일째 및 23일째에 혈장 중에서 검출된 한편, 그의 활성이 오직 변형된 선형 RNA의 투여 후 1일째 및 2일째에만 혈장 중에서 검출되었음을 보여준다.
도 3은 RNA의 주사 후에, 원형 RNA가 RNA의 투여 후 16일째에 간 및 비장에서 검출되었지만, 선형 RNA는 그렇지 않았음을 보여준다.
도 4은 RNA의 주사 후에, 선형 RNA가 RIG-I, MDA-5, IFN-B 및 OAS에 의해 평가시, 면역원성을 보였지만, 원형 RNA는 그렇지 않았음을 보여준다.
도 5는 선형 폴리리보뉴클레오티드 대응물(“선형”)과 비교하여 원형 폴리리보뉴클레오티드(“무단”)의 재투여 후의 마우스에서의 가우시아 루시퍼라제 발현의 지속성의 증가를 보여주는 실험 데이터를 보여준다.
도 6은 선형 폴리리보뉴클레오티드 대응물의 시간차 투여(“선형 3회 투여”) 또는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 단일의 투여(“무단”) 또는 선형 폴리리보뉴클레오티드 대응물의 단일의 투여(“선형”)와 비교하여 원형 폴리리보뉴클레오티드의 시간차 투여(”무단 3회 투여”) 후의 마우스에서의 가우시아 루시퍼라제 발현의 지속성의 증가를 나타내는 실험 데이터를 보여준다.
도 7은 선형 폴리리보뉴클레오티드 대응물의 단일의 투여(“선형 RNA”)와 비교하여 원형 폴리리보뉴클레오티드의 단일의 투여(“무단 RNA”), 단일의 투여(“선형 RNA”)와 비교하여 선형 폴리리보뉴클레오티드 대응물의 시간차 투여(“3회 투여 선형 RNA”), 또는 단일의 투여(“무단 RNA”)와 비교하여 원형 폴리리보뉴클레오티드의 시간차 투여(“3회 투여 무단 RNA”) 후의 마우스에서의 가우시아 루시퍼라제 발현의 지속성의 증가를 나타내는 실험 데이터를 보여준다.
도 8은 담체(TransIT)와 함께, 그리고 담체(미제형화됨) 없이 정맥내 투여된 원형 폴리리보뉴클레오티드가 주사한 지 다수일 후의 혈장 중 단백질 활성의 수준을 사용하여, 연장된 기간 동안 생체내에서 단백질을 발현하였음을 보여준다.
도 9는 주사 후 다수의 날에서의 혈장 중 단백질 활성의 수준을 사용하여, 담체 없이 근육내 투여된 원형 폴리리보뉴클레오티드가 연장된 기간 동안 생체내에서 단백질을 발현하였음을 보인다.
도 10은 원형 폴리리보뉴클레오티드가 정맥내 투여되어, 주사 후 다수의 일째에 혈장 중 단백질 활성의 수준과 함께 생체내에서 연장된 기간 동안 단백질을 발현하였으며 적어도 5회 재투여될 수 있다는 것을 보여준다.
도 11은 원형 폴리리보뉴클레오티드가 다수의 연속 주사 후에 연장된 기간 동안 생체 내에서 단백질을 발현하였으며, 혈장 중 증가된 수준의 단백질 활성을 갖는 것을 보여준다.
도 12는 망상적혈구의 수의 증가가 제1 용량의 미제형화된 RNA의 투여 후 3일째, 5일째, 7일째, 14일째, 21일째 및 28일째에 전혈에서 검출되었으며, 이후에 망상적혈구 계수가 본 발명자들의 마우스 집단에서 다시 3 내지 5%의 정상 범위가 되었음을 보여준다.
도 13은 망상적혈구의 수의 증가가 제1 용량의 TransIT-제형화된 RNA의 투여 후 3일째, 5일째, 7일째, 14일째, 21일째 및 28일째에 전혈에서 검출되었으며, 이후에 망상적혈구 계수가 본 발명자들의 마우스 집단에서 다시 3 내지 5%의 정상 범위가 되었음을 보여준다.
도 14는 비히클 단독 대조군과 비교하여 미제형화되는 경우에 망상적혈구 계수의 증가가 원형 RNA 투여 및 mRNA 투여에 대하여 검출되었음을 보여준다.
도 15는 비히클 단독 대조군과 비교하여 TransIT-제형화되는 경우에 망상적혈구 계수의 증가가 원형 RNA 투여 및 mRNA 투여에 대하여 검출되었음을 보여준다.
도 16는 출발-코돈, GFP를 코딩하는 ORF(오픈 리딩 프레임), 스태거 요소(2A), 엔크립토겐 및 IRES(내부 리보솜 진입 부위)를 함유하는 원형 RNA의 예시적인 시험관내 생성 과정의 개략도를 보여준다.
도 17는 원형 RNA의 예시적인 생체내 생성 과정의 개략도를 보여준다.
도 18은 출발-코돈, GFP를 코딩하는 ORF, 스태거 요소(2A) 및 엔크립토겐을 포함하는 예시적인 원형 RNA의 설계를 보여준다.
도 19a 및 도 19b는 2가지의 상이한 원형 RNA의 생체내 화학량론적 단백질 발현을 보여주는 개략도이다.
도 20는 원형 RNA 또는 선형 RNA로 트랜스펙션된 293T 세포로부터의 면역 관련 유전자의 qRT-PCR 분석을 보여주는 그래프이다.
도 21은 예시적인 원형 RNA로부터의 마우스 모델에서의 생체내 단백질 발현을 보여주는 개략도이다.
도 22는 마우스 모델에서의 예시적인 원형 RNA의 생체내 생체분포를 보여주는 개략도이다.
도 23은 엔크립토겐(인트론)을 보유한 예시적인 원형 RNA로부터의 마우스 모델에서의 생체내 단백질 발현을 보여주는 개략도이다.
도 24은 예시적인 정제 과정 후의 예시적인 원형 RNA를 보여주는 변성 PAGE 겔 이미지이다.
도 25은 IRES, 캡, 5' 및 3' UTR을 결여한 예시적인 원형 RNA에 의한 Flag 단백질(약 15 kDa)의 발현을 보여주는 웨스턴 블롯 이미지이다.
본 발명은 일반적으로 원형 폴리리보뉴클레오티드의 투약 방법에 관한 것이다. 본원에 개시된 바와 같은 투여 방법은 일반적으로 원형 폴리리보뉴클레오티드의 적어도 2개의 조성물을 제공한 후에 세포에서 소정의 수준의 단백질을 발현하거나 또는 소정의 수준의 원형 폴리리보뉴클레오티드를 생성하는 것에 관한 것이며, 여기서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 단백질을 인코딩한다. 본원에 개시된 바와 같은 투여 방법은 또한, 일반적으로 원형 폴리리보뉴클레오티드의 적어도 2개의 조성물을 제공한 후의 세포 내의 표적의 결합에 관한 것이며, 여기서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 단백질을 인코딩한다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 외인성 합성 원형 폴리리보뉴클레오티드이다.
일부 양태에서, 본 발명은 세포에서의 단백질의 발현 방법에 관한 것이며, 방법은 단백질을 인코딩하는 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제1 조성물을 세포에게 제공하는 단계로서, 세포가 제1 수준의 단백질을 발현하는 단계; 및 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제2 조성물을 세포에게 제공하는 단계로서, 세포가 제2 수준의 단백질을 발현하며, 제2 수준이 적어도 제1 수준만큼인 단계를 포함하며, 그럼으로써 세포 내의 단백질의 발현을 적어도 단백질의 제1 수준으로 유지한다. 일부 양태에서, 세포에서의 단백질의 발현 방법은 단백질을 인코딩하는 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제1 조성물을 세포에게 제공하는 단계로서, 세포가 제1 수준의 단백질을 발현하는 단계; 및 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제2 조성물을 세포에게 제공하는 단계로서, 세포가 제2 수준의 단백질을 발현하며, 제2 수준이 제1 수준의 20%를 넘게 차이나지 않는 단계를 포함하며, 그럼으로써 세포 내의 단백질의 발현을 적어도 단백질의 제1 수준으로 유지한다. 일부 양태에서, 세포에서의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 생성 방법은 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제1 조성물을 세포에 제공하는 단계로서, 세포는 제1 조성물을 제공한 이후의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 수준을 포함하는 단계; 및 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 세포에 제공하는 단계로서, 세포는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 수준을 포함하며, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 수준은 적어도 제1 수준만큼인 단계를 포함하며, 그럼으로써 세포 내의 원형 폴리리보뉴클레오티드를 적어도 제1 수준으로 유지한다. 일부 양태에서, 세포에서의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 생성 방법은 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제1 조성물을 세포에 제공하는 단계로서, 세포는 제1 조성물을 제공한 이후의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 수준을 포함하는 단계; 및 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 세포에게 제공하는 단계로서, 세포가 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 수준을 포함하며, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 수준이 제2 조성물을 제공한 이후 제1 수준의 20%를 넘게 차이나지 않는 단계를 포함하며, 그럼으로써 세포 내의 원형 폴리리보뉴클레오티드를 적어도 제1 수준으로 유지한다. 일부 양태에서, 세포에서의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 생성 방법은 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제1 조성물을 세포에 제공하는 단계로서, 세포는 제1 조성물을 제공한 이후의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 수준을 포함하는 단계; 및 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 세포에게 제공하는 단계로서, 세포가 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 수준을 포함하며, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 수준이 제2 조성물을 제공한 이후 제1 수준의 20%를 넘게 차이나지 않는 단계를 포함하며, 그럼으로써 세포 내의 원형 폴리리보뉴클레오티드를 적어도 제1 수준으로 유지한다. 일부 실시형태에서, 제2 조성물을 제공하는 단계는 제1 조성물을 제공한 후에, 그리고 제1 조성물에 의해 발현되는 단백질의 제1 수준이 세포에서 실질적으로 검출 불가능하게 되기 전에 발생한다.
일부 양태에서, 본 발명은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 후의 세포에서의 단백질의 수준과 비교하여 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 세포에게 제공한 후의 세포에서의 소정의 수준의 단백질의 발현 방법에 관한 것이며, 방법은 단백질을 인코딩하는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물을 세포에게 제공하는 단계로서, 세포가 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물을 제공한 후에 소정의 수준의 단백질을 포함하는 단계; 및 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 제1 조성물 이후에 세포에게 제공하는 단계로서, 세포가 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 제공한 후에 적어도 소정의 수준의 단백질을 포함하는 단계를 포함하며, 그럼으로써 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후의 세포 내의 단백질의 수준과 비교하여 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후의 세포 내의 단백질의 발현 수준을 유지한다. 일부 양태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 후의 세포에서의 단백질의 수준과 비교하여 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 세포에게 제공한 후의 세포에서의 소정의 수준의 단백질의 발현 방법은, 단백질을 인코딩하는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물을 세포에게 제공하는 단계로서, 세포가 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물을 제공한 후에 소정의 수준의 단백질을 포함하는 단계; 및 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 제1 조성물 이후에 세포에게 제공하는 단계로서, 세포가 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 제공한 후에 소정의 수준의 20%를 넘게 차이나지 않는 수준의 단백질을 포함하는 단계를 포함하며, 그럼으로써 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후의 세포 내의 단백질의 수준과 비교하여 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후의 세포 내의 단백질의 발현 수준을 유지한다. 일부 양태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 후의 세포에서의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 수준과 비교하여 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 세포에게 제공한 후의 세포에서의 소정의 수준의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 생성 방법은: 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물을 세포에 제공하는 단계로서, 세포가 제1 조성물을 제공한 이후의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준을 포함하는 단계; 및 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 세포에 제공하는 단계로서, 세포가 적어도 제2 조성물을 제공한 이후의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준을 포함하는 단계를 포함하며, 그럼으로써 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후의 세포 내의 선형 대응물의 수준과 비교하여 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후의 세포 내의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준을 유지한다. 일부 양태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 후의 세포에서의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 수준과 비교하여 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 세포에게 제공한 후의 세포에서의 소정의 수준의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 생성 방법은: 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물을 세포에 제공하는 단계로서, 세포가 제1 조성물을 제공한 이후의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준을 포함하는 단계; 및 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 세포에 제공하는 단계로서, 세포가 제1 조성물을 제공한 이후의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준의 20%를 넘게 차이나지 않는 제2 조성물을 제공한 이후의 단백질의 수준을 포함하는 단계를 포함하며, 그럼으로써 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후의 세포 내의 선형 대응물의 수준과 비교하여 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후의 세포 내의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준을 유지한다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 제공하는 단계는 제1 조성물 이후에, 그리고 제1 조성물에 의해 발현되는 세포 내의 단백질의 수준이 실질적으로 검출 불가능하게 된 후에 발생한다. 본원에 기술된 방법에서 사용되는 원형 폴리리보뉴클레오티드는 하나 이상의 발현 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 발현 서열 중 적어도 하나는 단백질을 인코딩한다. 단백질은 세포내 단백질, 막 단백질 또는 분비 단백질일 수 있다. 단백질은 치료적 단백질일 수 있다. 일부 실시형태에서, 치료적 단백질은 활성, 예를 들어, 항산화 활성, 결합, 카고(cargo) 수용체 활성, 촉매적 활성, 분자 운반체 활성, 분자 기능 조절제, 분자 전달제 활성, 영양소 저장소 활성, 단백질 태그, 구조적 분자 활성, 독소 활성, 전사 조절제 활성, 번역 조절제 활성 또는 수송체 활성을 가질 수 있다.
본원에 기술된 방법은 대상체를 치료하기 위한 치료적 또는 수의학적 방법일 수 있다. 본원에 기술된 방법을 사용하여 복수의 세포에서 질병을 치료할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본원에 기술된 방법은, 비-작용성이거나, 불량하게 작용성이거나, 불량하게 발현되는 단백질 또는 유전자 생성물로부터 초래되는 질병을 치료하기 위해 사용된다. 일부 실시형태에서, 본원에 기술된 방법은 유전병(예를 들어, 돌연변이, 치환, 결실, 확장(expansion) 또는 재조합), 암, 신경변성 질병, 심혈관 질병, 폐질병, 신장병, 간 질병, 유전병, 혈관 질병, 안과적 질병, 근골격 질병, 림프 질병, 청각 및 내이 질병, 대사 질병, 염증 질병, 자가면역 질병 또는 감염성 질병을 치료하기 위해 사용된다.
투약 방법
원형 폴리리보뉴클레오티드의 적어도 2회 용량 또는 2개의 조성물을 세포에게 제공한 후에, 세포에서 소정의 수준의 원형 폴리리보뉴클레오티드를 생성하거나 소정의 수준의 단백질을 발현하기 위한 투여 방법이 본원에 개시된다. 원형 폴리리보뉴클레오티드의 적어도 2회 용량 또는 2개의 조성물을 대상체에게 제공한(예를 들어, 투여한) 후에, 대상체(예를 들어, 포유동물, 예를 들어, 인간)에서 소정의 수준의 원형 폴리리보뉴클레오티드를 생성하거나 소정의 수준의 단백질을 발현하기 위한 투여 방법이 본원에 개시된다. 조성물은 단백질을 인코딩하는 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 조성물은 결합 부위를 포함하는 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 투여 방법은 일반적으로 연장된 기간에 걸친, 2회 이상의 용량으로의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 조성물의 재투여일 수 있다. 투여 방법은 짧은 시간 간격에 걸친 조성물의 시간차 투여일 수 있다. 일부 실시형태에서, 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 추가로 포함한다. 원형 폴리리보뉴클레오티드 유래의 단백질은 세포에서 발현될 수 있다.
일부 실시형태에서, 당해 방법은 적어도 제1 조성물 및 제2 조성물을 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물, 예를 들어, 인간)에게 제공하는(예를 들어, 투여하는) 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 제3 조성물, 제4 조성물, 제5 조성물, 제6 조성물, 제7 조성물, 제8 조성물, 제9 조성물, 제10 이상의 조성물을 제공하는(예를 들어, 투여) 것을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 추가의 조성물은 세포의 생애의 기간 동안 제공된다. 일부 실시형태에서, 세포 또는 대상체가 조성물로부터 이익을 얻는 동안 추가의 조성물이 제공된다(예를 들어, 투여된다). 일부 실시형태에서, 복수의 조성물은 이전의 조성물이 제공된(예를 들어, 투여된) 후에, 복수의 조성물 중 이전의 조성물로부터의 단백질 또는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준이 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물)에서 실질적으로 검출 불가능하게 되기 전에 임의의 조성물이 제공되는(예를 들어, 투여되는) 시간차 투여 요법에서 제공된다(예를 들어, 투여된다). 예를 들어, 시간차 요법에서 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공하기 위하여, 제1 조성물이 제공된(예를 들어, 투여된) 후에, 그리고 복수의 조성물 중 제1 조성물로부터의 단백질 또는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준이 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물)에서 실질적으로 검출 불가능하게 되기 전에 제2 조성물이 제공된다(예를 들어, 투여된다). 일부 실시형태에서, 이전의 조성물 이후에 제공되는(예를 들어, 투여되는) 임의의 조성물이 복수의 조성물 중 이전의 조성물로부터의 단백질 또는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준이 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물)에서 실질적으로 검출 불가능하게 된 후에 제공되는(예를 들어, 투여되는) 재투여 요법에서 복수의 조성물이 제공된다. 예를 들어, 재투여 요법에서 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공하기 위하여, 제2 조성물은, 제1 조성물이 제공된(예를 들어, 투여된) 후에 그리고 세포 또는 대상체에서 제1 조성물로부터의 단백질 또는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준이 세포 또는 대상체에서 실질적으로 검출 불가능하게 된 후에 제공된다(예를 들어, 투여된다).
일부 실시형태에서, 시간차 요법 또는 재투여 요법에서 제1 조성물은 제1 양의 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 시간차 요법 또는 재투여 요법에서 제2 조성물은 제2 양의 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 시간차 요법 또는 재투여 요법에서 제3 조성물, 제4 조성물, 제5 조성물, 제6 조성물, 제7 조성물, 제8 조성물, 제9 조성물, 제10 조성물 또는 그 이상은 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10 또는 그 이상의 양의 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 양은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 양과 동일하다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제3 양은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 양과 동일하다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10 또는 그 이상의 양은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 양과 동일하다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 양은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 양보다 적다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제3 양은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 양보다 적다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10 이상의 양은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 양보다 적다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 양은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 양보다 크다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제3 양은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 양보다 크다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10 이상의 양은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 양보다 크다. 일부 실시형태에서, 제2 조성물의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 양은 제1 조성물의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 양의 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 또는 25%를 넘게 차이나지 않는다. 일부 실시형태에서, 제2 조성물의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 양은 제1 조성물의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 양보다 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 또는 25% 이하로 적다. 일부 실시형태에서, 제2 조성물의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 양은 제1 조성물의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 양보다 0.1배 내지 1000배 더 많다. 일부 실시형태에서, 제2 조성물의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 양은 제1 조성물의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 양보다 0.1배, 1배, 5배, 10배, 100배 또는 1000배 더 많다. 일부 실시형태에서, 후속 조성물(예를 들어, 제1 조성물 이후에 투여되는 조성물)의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 양은 제1 조성물의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 양보다 0.1배, 1배, 5배, 10배, 100배 또는 1000배 더 많다. 일부 실시형태에서, 제2 조성물의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 양은 제1 조성물의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 양보다 0.1배 내지 1000배 더 적다. 일부 실시형태에서, 제2 조성물의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 양은 제1 조성물의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 양보다 0.1배, 1배, 5배, 10배, 100배 또는 1000배 더 적다. 일부 실시형태에서, 후속 조성물(예를 들어, 제1 조성물 이후에 투여되는 조성물)의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 양은 제1 조성물의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 양보다 0.1배, 1배, 5배, 10배, 100배 또는 1000배 더 적다. 일부 실시형태에서, (예를 들어, 소정의 양의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 이후의) 후속 조성물의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 양은 제1 조성물의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 양보다 0.1배 내지 1000배 더 많거나 더 적다. 일부 실시형태에서, (예를 들어, 소정의 양의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 이후의) 후속 조성물의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 양은 제1 조성물의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 양보다 0.1배, 1배, 5배, 10배, 100배 또는 1000배 더 많거나 더 적다. 예를 들어, 제1 조성물은 1배의 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하며, 제2 조성물은 제1 조성물과 비교하여 5배의 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하며, 제3 조성물은 제1 조성물과 비교하여 0.2배의 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 조성물은 제1 조성물의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 양과 비교하여 적어도 5배의 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 제1 조성물은 제2 조성물보다 많은 양의 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 조성물은 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9 또는 제10 조성물보다 더 많은 양의 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 제1 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 제3 조성물, 제4 조성물, 제5 조성물, 제6 조성물, 제7 조성물, 제8 조성물, 제9 조성물, 제10 이상의 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 제1 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하며, 이는 어떠한 담체도 없다. 일부 실시형태에서, 제2 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하며, 이는 어떠한 담체도 없다. 일부 실시형태에서, 제3 조성물, 제4 조성물, 제5 조성물, 제6 조성물, 제7 조성물, 제8 조성물, 제9 조성물, 제10 이상의 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 추가로 포함하며, 이는 어떠한 담체도 없다.
일부 실시형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 조성물(예를 들어, 제1 조성물, 제2 조성물, 제3 조성물 등)은 대상체(예를 들어, 포유동물)에게 전달된다. 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은 조성물(예를 들어, 제1 조성물, 제2 조성물, 제3 조성물 등)의 전달 방법은 본원에 기술된 바와 같은 조성물(예를 들어, 제1 조성물, 제2 조성물, 제3 조성물 등)의 투여를 필요로 하는 대상체에 그것을 비경구적으로 투여하는 단계를 포함한다. 또 다른 예로서, 대상체로의 조성물(예를 들어, 제1 조성물, 제2 조성물, 제3 조성물 등)의 전달 방법은 조성물을 대상체에게 비경구적으로 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 조성물(예를 들어, 제1 조성물, 제2 조성물, 제3 조성물 등)은 담체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 조성물(예를 들어, 제1 조성물, 제2 조성물, 제3 조성물 등)은 희석제를 포함하며, 이는 어떠한 담체도 없다. 일부 실시형태에서, 비경구 투여는 정맥내로, 근육내로, 안과적으로 또는 국소로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 조성물(예를 들어, 제1 조성물, 제2 조성물, 제3 조성물 등)은 경구 투여된다. 일부 실시형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 조성물(예를 들어, 제1 조성물, 제2 조성물, 제3 조성물 등)은 비강내 투여된다. 일부 실시형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 조성물(예를 들어, 제1 조성물, 제2 조성물, 제3 조성물 등)은 흡입 투여된다. 일부 실시형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 조성물(예를 들어, 제1 조성물, 제2 조성물, 제3 조성물 등)은 국소 투여된다. 일부 실시형태에서, 조성물은 점안 투여된다. 일부 실시형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 조성물(예를 들어, 제1 조성물, 제2 조성물, 제3 조성물 등)은 직장 투여된다. 일부 실시형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 조성물(예를 들어, 제1 조성물, 제2 조성물, 제3 조성물 등)은 주사 투여된다. 일부 실시형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 조성물(예를 들어, 제1 조성물, 제2 조성물, 제3 조성물 등)은 주입 투여된다. 투여는 전신 투여 또는 국소 투여일 수 있다. 일부 실시형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 조성물(예를 들어, 제1 조성물, 제2 조성물, 제3 조성물 등)은 비경구 투여된다. 일부 실시형태에서, 조성물(예를 들어, 제1 조성물, 제2 조성물, 제3 조성물 등)은 정맥내, 동맥내, 복강내, 피내, 두개내, 척추강내, 림프내, 피하 또는 근육내로 투여된다. 일부 실시형태에서, 조성물(예를 들어, 제1 조성물, 제2 조성물, 제3 조성물 등)은 안구내 투여, 와우내(내이) 투여 또는 기관내 투여를 통해 투여된다. 일부 실시형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 전달 방법 중 임의의 것은 담체를 사용하여 수행된다. 일부 실시형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 임의의 전달 방법은 담체의 도움 없이 수행된다.
본원에 기술된 바와 같은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 조성물은 대상체에서 반응을 유도할 수 있다. 일부 실시형태에서, 대상체에서의 반응의 유도 방법은 대상체에서 소정의 반응 수준을 유도하기 위하여, 결합 부위를 포함하고/하거나 단백질을 인코딩하는 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 제공하는(예를 들어, 투여하는) 단계를 포함한다. 특정 실시형태에서, 반응의 유도 방법은 에리트로포이에틴을 인코딩하는 원형 폴리리보뉴클레오티드를 대상체에게 제공하는(예를 들어, 투여하는) 단계를 포함하며, 대상체에서의 원형 폴리리보뉴클레오티드로부터의 에리트로포이에틴의 발현은 대상체에서 망상적혈구의 생성을 유도한다. 일부 실시형태에서, 대상체에서의 소정의 반응 수준의 유도 방법은 (a) 반응을 유도하는 본원에 기술된 바와 같은 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제1 조성물을 제공하는(예를 들어, 투여하는) 단계, 및 단계 (a) 이후 14일째 내지 90일째에, 본원에 기술된 바와 같은 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제2 조성물을 대상체에게 제공(예를 들어, 투여)함으로써, 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 후에 대상체에서 소정의 반응 수준을 유도하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 조성물은 투여 이후에 대상체에서 소정의 반응 또는 반응 수준을 유도하기 위하여 치료적 단백질을 인코딩한다. 일부 실시형태에서, 에리트로포이에틴을 인코딩하는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 조성물은 대상체에서 망상적혈구의 생성을 유도하기 위하여 대상체에게 제공된다. 일부 실시형태에서, 대상체에서의 망상적혈구의 유도 방법은 (a) 에리트로포이에틴을 인코딩하는 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제1 조성물을 대상체에게 제공하는(예를 들어, 투여하는) 단계; 및 (b) 단계 (a) 이후 6시간째 내지 90일째에, 에리트로포이에틴을 인코딩하는 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제2 조성물을 대상체에게 제공(예를 들어, 투여) 함으로써, 대상체에서 망상적혈구의 생성을 유도하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 당해 방법은 단계 (a) 이후 6시간째 내지 30일째에 제2 조성물을 제공하는(예를 들어, 투여하는) 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 당해 방법은 단계 (a) 이후 14일째 내지 90일째에 제2 조성물을 제공하는(예를 들어, 투여하는) 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 결합 부위를 포함하거나 단백질을 인코딩하는 원형 폴리리보뉴클레오티드를 제공하는 것으로부터의 반응 수준은 선형 대응물 폴리리보뉴클레오티드로부터의 반응 수준보다 더 크다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 후의 대상체에서의 반응 수준과 비교하여 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 대상체에게 제공한 후의 대상체에서의 소정의 반응 수준의 유도 방법은: 소정의 반응 수준을 유도하는 단백질을 인코딩하는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물을 대상체에게 제공하는(예를 들어, 투여하는) 단계로서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물이 제공된 후에 대상체가 소정의 반응 수준을 포함하는 단계; 및 단백질을 인코딩하는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 제1 조성물 이후에 대상체에게 제공(예를 들어, 투여)하는 단계로서, 대상체가 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물이 제공된 후에 적어도 소정의 반응 수준을 포함하는 단계를 포함하며; 그럼으로써 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물이 제공된(예를 들어, 투여된) 후의 대상체에서의 반응 수준과 비교하여 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물이 제공된(예를 들어, 투여된) 후에 대상체에서 소정의 반응 수준을 유지한다. 예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 후의 대상체에서의 망상적혈구 생성의 수준과 비교하여 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 대상체에게 제공한 후의 대상체에서의 소정의 수준의 망상적혈구 생성의 유도 방법은: 에리트로포이에틴을 인코딩하는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물을 대상체에게 제공하는(예를 들어, 투여하는) 단계로서, 대상체가 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물이 제공된(예를 들어, 투여된) 후에 소정의 수준의 망상적혈구 생성을 포함하는 단계; 및 에리트로포이에틴을 인코딩하는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 제1 조성물 이후에 대상체에게 제공(예를 들어, 투여)하는 단계로서, 대상체가 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물이 제공된(예를 들어, 투여된) 후에 적어도 소정의 수준의 망상적혈구 생성을 포함하는 단계를 포함하며; 그럼으로써 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물이 제공된(예를 들어, 투여된) 후의 대상체에서의 망상적혈구 생성의 수준과 비교하여 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물이 제공된(예를 들어, 투여된) 후에 대상체에서 소정의 수준의 망상적혈구 생성을 유지한다.
일부 실시형태에서, 투약(예를 들어, 시차 투약 또는 재투약)의 방법을 위해 사용되는 본원에 기재된 바와 같은 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 제1 조성물, 제2 조성물, 제3 조성물 등)의 조성은 1 ng/㎖, 5 ng/㎖, 10 ng/㎖, 15 ng/㎖, 20 ng/㎖, 25 ng/㎖, 30 ng/㎖, 35 ng/㎖, 40 ng/㎖, 50 ng/㎖, 60 ng/㎖, 70 ng/㎖, 80 ng/㎖, 90 ng/㎖, 100 ng/㎖, 200 ng/㎖, 300 ng/㎖, 400 ng/㎖, 500 ng/㎖, 600 ng/㎖, 1 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖, 200 g/㎖, 300 ㎍/㎖, 400 ㎍/㎖, 500 ㎍/㎖, 600 ㎍/㎖, 700 ㎍/㎖, 800 ㎍/㎖, 900 ㎍/㎖, 1 ㎎/㎖, 1.5 ㎎/㎖ 또는 2 ㎎/㎖ 이하의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 바와 같은 원형 폴리리보뉴클레오티드(예를 들어, 제1 조성물, 제2 조성물, 제3 조성물 등)의 조성은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 조성물(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 약제학적 조성물) 내의 총 리보뉴클레오티드 분자에 비하여 적어도 30%(w/w), 40%(w/w), 50%(w/w), 60%(w/w), 70%(w/w), 80%(w/w), 85%(w/w), 90%(w/w), 91%(w/w), 92%(w/w), 93%(w/w), 94%(w/w), 95%(w/w), 96%(w/w), 97%(w/w), 98%(w/w) 또는 99%(w/w)의 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 바와 같은 조성물 내의 총 리보뉴클레오티드 분자의 적어도 30%(w/w), 40%(w/w), 50%(w/w), 60%(w/w), 70%(w/w), 80%(w/w), 85%(w/w), 90%(w/w), 91%(w/w), 92%(w/w), 93%(w/w), 94%(w/w), 95%(w/w), 96%(w/w), 97%(w/w), 98%(w/w) 또는 99%(w/w)가 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자이다.
시차 투약(Staggered dosing)
원형 폴리리보뉴클레오티드의 적어도 2개의 조성물을 복수의 세포에게 제공한 후에, 복수의 세포에서 소정의 수준의 원형 폴리리보뉴클레오티드를 생성하거나, 소정의 수준의 단백질을 발현하거나, 소정의 수준의 표적으로의 결합을 생성하기 위한 시간차 투여 방법이 본원에 개시된다. 원형 폴리리보뉴클레오티드의 적어도 2개의 조성물을 대상체(예를 들어, 포유동물)에게 제공한(예를 들어, 투여한) 후에, 대상체(예를 들어, 포유동물, 예를 들어, 인간)에서 소정의 수준의 원형 폴리리보뉴클레오티드를 생성하거나, 소정의 수준의 단백질을 발현하거나, 소정의 수준의 표적으로의 결합을 생성하기 위한 시간차 투여 방법이 본원에 개시된다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 적어도 두 조성물은 동일한 조성물이다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 적어도 두 조성물은 상이한 조성물이다. 일부 실시형태에서, 동일한 조성물은 동일한 단백질을 인코딩하거나 동일한 결합 부위를 포함하는 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상이한 조성물은 상이한 단백질을 인코딩하거나 상이한 결합 부위를 포함하거나, 또는 그의 조합인 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 포유동물(예를 들어, 인간)에서의 단백질의 발현의 유지 방법은 (a) 단백질을 인코딩하는 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제1 조성물을 포유동물(예를 들어, 인간)에게 제공하는(예를 들어, 투여하는) 단계; 및 (b) 단계 (a) 이후 6시간째 내지 90일째에, 단백질을 인코딩하는 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제2 조성물을 포유동물에게 제공(예를 들어, 투여) 함으로써, 포유동물에서 단백질의 발현을 유지하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 포유동물(예를 들어, 인간)에서의 항원의 발현의 유지 방법은 (a) 항원을 인코딩하는 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제1 조성물을 포유동물에게 제공하는(예를 들어, 투여하는) 단계; 및 (b) 단계 (a) 이후 6시간째 내지 90일째에, 항원을 인코딩하는 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제2 조성물을 포유동물에게 제공(예를 들어, 투여)함으로써, 포유동물에서 단백질의 발현을 유지하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 외인성 합성 원형 폴리리보뉴클레오티드이다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 폴리-A 서열, 복제 요소, 또는 둘 모두를 결여한다.
일부 실시형태에서, 제2 조성물을 제공하는 것(예를 들어, 투여)은 단계 (a)의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 또는 90일, 또는 그 사이의 임의의 시간 이후이다. 일부 실시형태에서, 제2 조성물을 제공하는(예를 들어, 투여하는) 단계는 단계 (a) 이후 6시간째 내지 45일째에 이루어진다. 일부 실시형태에서, 제2 조성물을 제공하는(예를 들어, 투여하는) 단계는 단계 (a) 이후 6시간째 내지 30일째에 이루어진다. 일부 실시형태에서, 제2 조성물을 제공하는(예를 들어, 투여하는) 단계는 단계 (a) 이후 6시간 내지 30일에 더하여 원형 폴리리보뉴클레오티드에 의해 인코딩되는 단백질의 반감기 후에 이루어진다. 일부 실시형태에서, 제2 조성물을 제공하는(예를 들어, 투여하는) 단계는 단계 (a) 이후 14일 내지 30일에 더하여 원형 폴리리보뉴클레오티드에 의해 인코딩되는 단백질의 반감기 후에 이루어진다. 일부 실시형태에서, 제2 조성물을 제공하는(예를 들어, 투여하는) 단계는 단계 (a) 이후 14일 내지 65일에 더하여 원형 폴리리보뉴클레오티드에 의해 인코딩되는 단백질의 반감기 후에 이루어진다. 일부 실시형태에서, 제2 조성물을 제공하는(예를 들어, 투여하는) 단계는 단계 (a) 이후 21일 내지 41일에 더하여 원형 폴리리보뉴클레오티드에 의해 인코딩되는 단백질의 반감기 후에 이루어진다.
일부 실시형태에서, 제1 조성물은 제1 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하고 제2 조성물은 제2 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하며, 제1 원형 폴리리보뉴클레오티드와 제2 원형 폴리리보뉴클레오티드는 동일하다. 일부 실시형태에서, 제1 조성물은 제1 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하고 제2 조성물은 제2 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하며, 제1 원형 폴리리보뉴클레오티드와 제2 원형 폴리리보뉴클레오티드는 상이하다. 일부 실시형태에서, 제1 조성물은 제1 단백질을 인코딩하는 제1 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하고 제2 조성물은 제2 단백질을 인코딩하는 제2 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하며, 제1 단백질과 제2 단백질은 동일한 단백질이다. 일부 실시형태에서, 제1 조성물은 제1 단백질을 인코딩하는 제1 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하고 제2 조성물은 제2 단백질을 인코딩하는 제2 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하며, 제1 단백질과 제2 단백질은 상이한 단백질이다. 일부 실시형태에서, 제1 조성물은 제1 결합 부위를 포함하는 제1 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하고 제2 조성물은 제2 결합 부위를 포함하는 제2 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하며, 제1 결합 부위와 제2 결합 부위는 동일한 결합 부위이다. 일부 실시형태에서, 제1 조성물은 제1 결합 부위를 포함하는 제1 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하고 제2 조성물은 제2 결합 부위를 포함하는 제2 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하며, 제1 결합 부위와 제2 결합 부위는 상이한 결합 부위이다. 일부 실시형태에서, 제1 조성물은 단백질을 인코딩하는 제1 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하며 제2 원형 폴리리보뉴클레오티드는 결합 부위를 포함한다.
일부 실시형태에서, 제2 조성물을 제공하는 단계는 제1 조성물을 제공한 후에, 그리고 제1 조성물에 의해 발현되는 단백질의 제1 수준이 포유동물(예를 들어, 인간)에서 실질적으로 검출 불가능하게 되기 전에 발생한다. 일부 실시형태에서, 제2 조성물의 제공(예를 들어, 투여)은 제1 조성물이 제공(예를 들어, 투여)된 이후이면서 제1 조성물에 의해 발현된 단백질의 제1 수준이 포유동물에서 50% 보다 더 감소되기 이전에 일어난다. 일부 실시형태에서, 제2 조성물을 제공하는(예를 들어, 투여하는) 단계는 제1 조성물이 제공된(예를 들어, 투여된) 후에, 그리고 제1 조성물에 의해 발현되는 단백질의 제1 수준이 포유동물에서 실질적으로 검출 불가능하게 되기 전에 발생한다. 일부 실시형태에서, 제2 조성물의 제공(예를 들어, 투여)은 제1 조성물이 제공(예를 들어, 투여)된 이후이면서 제1 조성물에 의해 발현된 단백질의 제1 수준이 포유동물에서 25% 내지 75% 감소되기 이전에 일어난다. 일부 실시형태에서, 당해 방법은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제3 조성물을 제2 조성물 이후에 포유동물에게 제공(예를 들어, 투여)함으로써, 포유동물에서 단백질의 발현을 유지하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 제3 조성물을 제공하는(예를 들어, 투여하는) 단계는 제2 조성물이 제공된(예를 들어, 투여된) 후에, 그리고 제1 및 제2 조성물에 의해 발현되는 단백질의 제2 수준이 포유동물에서 실질적으로 검출 불가능하게 되기 전에 발생한다. 일부 실시형태에서, 제3 조성물을 제공하는(예를 들어, 투여하는) 단계는 제2 조성물이 제공된(예를 들어, 투여된) 후에, 그리고 포유동물에서 제1 및 제2 조성물에 의해 발현되는 단백질의 제2 수준이 25% 내지 75% 감소하기 전에 발생한다.
일부 실시형태에서, 대상체(예를 들어, 포유동물, 예를 들어, 인간)에서의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 생성 방법은: 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제1 조성물을 대상체(예를 들어, 포유동물)에게 제공하는(예를 들어, 투여하는) 단계로서, 제1 조성물이 제공된(예를 들어, 투여된) 후에 대상체(예를 들어, 포유동물)가 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 수준을 포함하는 단계; 및 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 대상체(예를 들어, 포유동물)에게 제공(예를 들어, 투여)하는 단계로서, 대상체(예를 들어, 포유동물)가 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 수준을 포함하며, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 수준이 적어도 제1 수준만큼인 단계를 포함하며; 그럼으로써 대상체(예를 들어, 포유동물)에서 원형 폴리리보뉴클레오티드를 적어도 제1 수준으로 유지한다. 일부 실시형태에서, 대상체(예를 들어, 포유동물, 예를 들어, 인간)에서의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 생성 방법은: 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제1 조성물을 대상체(예를 들어, 포유동물)에게 제공하는(예를 들어, 투여하는) 단계로서, 제1 조성물이 제공된(예를 들어, 투여된) 후에 대상체(예를 들어, 포유동물)가 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 수준을 포함하는 단계; 및 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 대상체(예를 들어, 포유동물)에게 제공(예를 들어, 투여)하는 단계로서, 제2 조성물이 제공된(예를 들어, 투여된) 후에 대상체(예를 들어, 포유동물)가 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 수준을 포함하며, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 수준이 제1 수준의 20%를 넘게 차이나지 않는 단계를 포함하며; 그럼으로써 대상체(예를 들어, 포유동물)에서 원형 폴리리보뉴클레오티드를 적어도 제1 수준으로 유지한다. 일부 실시형태에서, 대상체(예를 들어, 포유동물, 예를 들어, 인간)에서의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 생성 방법은: 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제1 조성물을 대상체(예를 들어, 포유동물)에게 제공하는(예를 들어, 투여하는) 단계로서, 제1 조성물이 제공된(예를 들어, 투여된) 후에 대상체(예를 들어, 포유동물)가 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 수준을 포함하는 단계; 및 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 대상체(예를 들어, 포유동물)에게 제공(예를 들어, 투여)하는 단계로서, 제2 조성물이 제공된(예를 들어, 투여된) 후에 대상체(예를 들어, 포유동물)가 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 수준을 포함하며, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 수준이 제1 수준의 1%, 5%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40% 또는 50%를 넘게 차이나지 않는 단계를 포함하며; 그럼으로써 대상체(예를 들어, 포유동물)에서 원형 폴리리보뉴클레오티드를 적어도 제1 수준으로 유지한다.
일부 실시형태에서, 단백질의 제1 수준은 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 후에, 제1 조성물이 제공된 후 6시간 내지 90일 동안 유지된다. 일부 실시형태에서, 단백질의 제1 수준은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물, 제2 조성물 및 제3 조성물을 제공한 후에, 제1 조성물이 제공된 후 6시간 내지 270일 동안 유지된다. 일부 실시형태에서, 단백질의 제1 수준은 제1 조성물 및 제2 조성물이 제공된 후에, 제1 조성물이 제공된 후 6시간 내지 35일 동안 실질적으로 검출 불가능하다.
또한, 제2 조성물은 제1 조성물을 제공한 후에, 그리고 대상체(예를 들어, 포유동물)에서의 제1 조성물로부터의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준이 대상체(예를 들어, 포유동물)에서 실질적으로 검출 불가능하게 되기 전에 제공될 수 있다. 일부 실시형태에서, 제2 조성물을 제공하는 단계는 제1 조성물이 제공된 후에, 그리고 제1 조성물에 의해 생성되는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 수준이 대상체(예를 들어, 포유동물)에서 50% 넘게 감소하기 전에 발생한다. 일부 실시형태에서, 제2 조성물을 제공하는 단계는 제1 조성물이 제공된 후에, 그리고 제1 조성물에 의해 생성되는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 수준이 대상체(예를 들어, 포유동물)에서 25% 내지 75% 감소하기 전에 발생한다. 일부 실시형태에서, 제2 조성물의 제공은 제1 조성물이 제공된 이후이면서 제1 조성물에 의해 생성된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 수준이 대상체(예를 들어, 포유동물)에서 1%, 5%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 또는 50% 보다 더 감소되기 이전에 일어난다.
일부 실시형태에서, 포유동물(예를 들어, 인간)에서의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 생성 방법은 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제1 조성물을 포유동물에게 제공하는(예를 들어, 투여하는) 단계로서, 제1 조성물이 제공된(예를 들어, 투여된) 후에 포유동물이 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 수준을 포함하는 단계; 및 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 포유동물에게 제공(예를 들어, 투여)하는 단계로서, 포유동물이 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 수준을 포함하며, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 수준이 적어도 제1 수준만큼인 단계를 포함하며; 그럼으로써 포유동물 내의 원형 폴리리보뉴클레오티드를 적어도 제1 수준으로 유지한다. 일부 실시형태에서, 포유동물(예를 들어, 인간)에서의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 생성 방법은 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제1 조성물을 포유동물에게 제공하는(예를 들어, 투여하는) 단계로서, 제1 조성물이 제공된 후에 포유동물이 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 수준을 포함하는 단계; 및 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 포유동물에게 제공(예를 들어, 투여)하는 단계로서, 제2 조성물이 제공된(예를 들어, 투여된) 후에 포유동물이 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 수준을 포함하며, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 수준이 제1 수준의 20%를 넘게 차이나지 않는 단계를 포함하며; 그럼으로써 포유동물 내의 원형 폴리리보뉴클레오티드를 적어도 제1 수준으로 유지한다. 일부 실시형태에서, 포유동물(예를 들어, 인간)에서의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 생성 방법은 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제1 조성물을 포유동물에게 제공하는(예를 들어, 투여하는) 단계로서, 제1 조성물이 제공된(예를 들어, 투여된) 후에 포유동물이 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 수준을 포함하는 단계; 및 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 포유동물에게 제공(예를 들어, 투여)하는 단계로서, 제2 조성물이 제공된(예를 들어, 투여된) 후에 포유동물이 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 수준을 포함하며, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 수준이 제1 수준의 1%, 5%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40% 또는 50%를 넘게 차이나지 않는 단계를 포함하며; 그럼으로써 포유동물 내의 원형 폴리리보뉴클레오티드를 적어도 제1 수준으로 유지한다.
또한, 제2 조성물은 제1 조성물이 제공된 후에, 그리고 포유동물에서의 제1 조성물로부터의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준이 포유동물에서 실질적으로 검출 불가능하게 되기 전에 제공될 수 있다. 일부 실시형태에서, 제2 조성물의 제공(예를 들어, 투여)은 제1 조성물이 제공(예를 들어, 투여)된 이후이면서 제1 조성물에 의해 생성된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 수준이 포유동물에서 50% 보다 더 감소되기 이전에 일어난다. 일부 실시형태에서, 제2 조성물의 제공(예를 들어, 투여)은 제1 조성물이 투여된 이후이면서 제1 조성물에 의해 생성된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 수준이 포유동물에서 25% 내지 75% 감소되기 이전에 일어난다. 일부 실시형태에서, 제2 조성물의 제공(예를 들어, 투여)은 제1 조성물이 제공(예를 들어, 투여)된 이후이면서 제1 조성물에 의해 생성된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 수준이 포유동물에서 1%, 5%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 또는 50% 보다 더 감소되기 이전에 일어난다.
일부 실시형태에서, 대상체(예를 들어, 포유동물, 예를 들어, 인간)에서의 단백질의 발현 방법은 단백질을 인코딩하는 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제1 조성물을 대상체(예를 들어, 포유동물)에게 제공하는(예를 들어, 투여하는) 단계로서, 대상체(예를 들어, 포유동물)가 제1 수준의 인코딩된 단백질을 발현하는 단계; 및 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제2 조성물을 대상체(예를 들어, 포유동물)에게 제공(예를 들어, 투여)하는 단계로서, 대상체(예를 들어, 포유동물)가 제2 수준의 인코딩된 단백질을 발현하며, 제2 수준이 적어도 제1 수준만큼인 단계를 포함하며; 그럼으로써 대상체(예를 들어, 포유동물)에서 인코딩된 단백질의 발현을 적어도 제1 수준의 인코딩된 단백질로 유지한다. 일부 실시형태에서, 대상체(예를 들어, 포유동물, 예를 들어, 인간)에서의 단백질의 발현 방법은 단백질을 인코딩하는 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제1 조성물을 대상체(예를 들어, 포유동물)에게 제공하는(예를 들어, 투여하는) 단계로서, 대상체(예를 들어, 포유동물)가 제1 수준의 인코딩된 단백질을 발현하는 단계; 및 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제2 조성물을 대상체(예를 들어, 포유동물)에게 제공(예를 들어, 투여)하는 단계로서, 대상체(예를 들어, 포유동물)가 제2 수준의 인코딩된 단백질을 발현하며, 제2 수준이 적어도 제1 수준만큼인 단계를 포함하며; 그럼으로써 대상체(예를 들어, 포유동물)에서의 인코딩된 단백질의 발현을 제1 수준의 인코딩된 단백질과 비교하여 유사한 수준으로 유지한다. 일부 실시형태에서, 대상체(예를 들어, 포유동물, 예를 들어, 인간)에서의 단백질의 발현 방법은 단백질을 인코딩하는 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제1 조성물을 대상체(예를 들어, 포유동물)에게 제공하는(예를 들어, 투여하는) 단계로서, 대상체(예를 들어, 포유동물)가 제1 수준의 단백질을 발현하는 단계; 및 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제2 조성물을 대상체(예를 들어, 포유동물)에게 제공(예를 들어, 투여)하는 단계로서, 대상체(예를 들어, 포유동물)가 제2 수준의 단백질을 발현하며, 제2 수준이 제1 수준의 20%를 넘게 차이나지 않는 단계를 포함하며; 그럼으로써 대상체(예를 들어, 포유동물)에서의 단백질의 발현을 적어도 제1 수준의 단백질로 유지한다. 일부 양태에서, 대상체(예를 들어, 포유동물, 예를 들어, 인간)에서의 단백질의 발현 방법은 단백질을 인코딩하는 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제1 조성물을 대상체(예를 들어, 포유동물)에게 제공하는(예를 들어, 투여하는) 단계로서, 대상체(예를 들어, 포유동물)가 제1 수준의 단백질을 발현하는 단계; 및 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제2 조성물을 대상체(예를 들어, 포유동물)에게 제공(예를 들어, 투여)하는 단계로서, 대상체(예를 들어, 포유동물)가 제2 수준의 단백질을 발현하며, 제2 수준이 제1 수준의 1%, 5%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40% 또는 50%를 넘게 차이나지 않는 단계를 포함하며; 그럼으로써 대상체(예를 들어, 포유동물)에서의 단백질의 발현을 적어도 제1 수준의 단백질로 유지한다. 또한, 제2 조성물은 제1 조성물이 제공된(예를 들어, 투여된) 후에, 그리고 제1 조성물에 의해 생성되는 단백질의 수준이 대상체(예를 들어, 포유동물)에서 실질적으로 검출 불가능하게 되기 전에 제공될(예를 들어, 투여될) 수 있다. 일부 실시형태에서, 제2 조성물은 제1 조성물이 제공된(예를 들어, 투여된) 후에, 그리고 제1 조성물에 의해 발현되는 단백질의 제1 수준이 대상체(예를 들어, 포유동물)에서 50% 초과로 감소하기 전에 제공된다(예를 들어, 투여된다). 일부 실시형태에서, 제2 조성물은 제1 조성물이 제공된(예를 들어, 투여된) 후에, 그리고 제1 조성물에 의해 발현되는 단백질의 제1 수준이 대상체(예를 들어, 포유동물)에서 25% 내지 75% 감소하기 전에 제공된다(예를 들어, 투여된다). 일부 실시형태에서, 제2 조성물의 제공(예를 들어, 투여)은 제1 조성물이 제공(예를 들어, 투여)된 이후이면서 제1 조성물에 의해 발현된 단백질의 제1 수준이 대상체(예를 들어, 포유동물)에서 1%, 5%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 또는 50% 보다 더 감소되기 이전에 일어난다.
일부 실시형태에서, 포유동물(예를 들어, 인간)에서의 단백질의 발현 방법은 단백질을 인코딩하는 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제1 조성물을 포유동물에게 제공하는(예를 들어, 투여하는) 단계로서, 포유동물이 제1 수준의 단백질을 발현하는 단계; 및 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제2 조성물을 포유동물에게 제공(예를 들어, 투여)하는 단계로서, 포유동물이 제2 수준의 단백질을 발현하며, 제2 수준이 적어도 제1 수준만큼인 단계를 포함하며; 그럼으로써 포유동물에서 단백질의 발현을 적어도 제1 수준의 단백질로 유지한다. 일부 양태에서, 포유동물(예를 들어, 인간)에서의 단백질의 발현 방법은 단백질을 인코딩하는 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제1 조성물을 포유동물에게 제공하는(예를 들어, 투여하는) 단계로서, 포유동물이 제1 수준의 단백질을 발현하는 단계; 및 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제2 조성물을 포유동물에게 제공(예를 들어, 투여)하는 단계로서, 포유동물이 제2 수준의 단백질을 발현하며, 제2 수준이 제1 수준의 20%를 넘게 차이나지 않는 단계를 포함하며; 그럼으로써 포유동물에서 단백질의 발현을 적어도 제1 수준의 단백질로 유지한다. 일부 양태에서, 포유동물(예를 들어, 인간)에서의 단백질의 발현 방법은 단백질을 인코딩하는 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제1 조성물을 포유동물에게 제공하는(예를 들어, 투여하는) 단계로서, 포유동물이 제1 수준의 단백질을 발현하는 단계; 및 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제2 조성물을 포유동물에게 제공(예를 들어, 투여)하는 단계로서, 포유동물이 제2 수준의 단백질을 발현하며, 제2 수준이 제1 수준의 1%, 5%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40% 또는 50%를 넘게 차이나지 않는 단계를 포함하며; 그럼으로써 포유동물에서 단백질의 발현을 적어도 제1 수준의 단백질로 유지한다. 또한, 제2 조성물은 제1 조성물이 제공된(예를 들어, 투여된) 후에, 그리고 제1 조성물에 의해 생성되는 단백질의 수준이 포유동물에서 실질적으로 검출 불가능하게 되기 전에 제공될(예를 들어, 투여될) 수 있다. 일부 실시형태에서, 제2 조성물은 제1 조성물이 제공된(예를 들어, 투여된) 후에, 그리고 제1 조성물에 의해 발현되는 단백질의 제1 수준이 포유동물에서 50% 초과로 감소하기 전에 제공된다(예를 들어, 투여된다). 일부 실시형태에서, 제2 조성물은 제1 조성물이 제공된(예를 들어, 투여된) 후에, 그리고 제1 조성물에 의해 발현되는 단백질의 제1 수준이 포유동물에서 25% 내지 75% 감소하기 전에 제공된다(예를 들어, 투여된다). 일부 실시형태에서, 제2 조성물의 제공(예를 들어, 투여)은 제1 조성물이 제공(예를 들어, 투여)된 이후이면서 제1 조성물에 의해 발현된 단백질의 제1 수준이 포유동물에서 1%, 5%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 또는 50% 보다 더 감소되기 이전에 일어난다.
일부 실시형태에서, 세포 내의 표적의 결합 방법은 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제1 조성물을 세포에게 제공하는 단계로서, 제1 조성물이 제공된 후에 세포가 제1 수준의 결합을 포함하는 단계; 및 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 세포에게 제공함으로써, 세포 내의 표적으로의 결합을 적어도 제1 수준으로 유지하는 단계로서, 세포가 제2 수준의 결합을 포함하며, 결합의 제2 수준이 적어도 제1 수준만큼인 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 내의 표적으로의 결합 방법은 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제1 조성물을 세포에게 제공하는 단계로서, 제1 조성물이 제공된 후에 세포가 제1 수준의 결합을 포함하는 단계; 및 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 세포에게 제공함으로써, 세포 내의 표적으로의 결합을 적어도 제1 수준으로 유지하는 단계로서, 세포가 제2 수준의 결합을 포함하며, 결합의 제2 수준이 제2 조성물을 제공한 이후 제1 수준의 20%를 넘게 차이나지 않는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 내의 표적으로의 결합 방법은 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제1 조성물을 세포에게 제공하는 단계로서, 제1 조성물이 제공된 후에 세포가 제1 수준의 결합을 포함하는 단계; 및 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 세포에게 제공함으로써, 세포 내의 표적으로의 결합을 적어도 제1 수준으로 유지하는 단계로서, 세포가 제2 수준의 결합을 포함하며, 결합의 제2 수준이 제2 조성물을 제공한 이후 제1 수준의 1%, 5%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 또는 50%를 넘게 차이나지 않는 단계를 포함한다.
또한, 제2 조성물은 제1 조성물이 제공된 후에, 그리고 세포에서의 제1 조성물로부터의 결합의 수준이 세포에서 실질적으로 검출 불가능하게 되기 전에 제공될 수 있다. 일부 실시형태에서, 제2 조성물의 제공은 제1 조성물이 제공된 이후이면서 제1 조성물에 의해 생성된 결합의 제1 수준이 세포에서 50% 보다 더 감소되기 이전에 일어난다. 일부 실시형태에서, 제2 조성물의 제공은 제1 조성물이 제공된 이후이면서 제1 조성물에 의해 생성된 결합의 제1 수준이 세포에서 25% 내지 75%만큼 감소되기 이전에 일어난다. 일부 실시형태에서, 제2 조성물의 제공은 제1 조성물이 제공된 이후이면서 제1 조성물에 의해 생성된 결합의 제1 수준이 세포에서 1%, 5%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 또는 50% 보다 더 감소되기 이전에 일어난다. 일부 실시형태에서, 세포 내의 표적의 결합 방법은 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제1 조성물을 세포에게 제공하는 단계로서, 제1 조성물이 제공된 후에 세포가 제1 수준의 결합을 포함하는 단계; 및 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 세포에게 제공함으로써, 세포 내의 표적으로의 결합을 적어도 제1 수준으로 유지하는 단계로서, 세포가 제2 수준의 결합을 포함하며, 결합의 제2 수준이 적어도 제1 수준만큼인 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 내의 표적으로의 결합 방법은 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제1 조성물을 세포에게 제공하는 단계로서, 제1 조성물이 제공된 후에 세포가 제1 수준의 결합을 포함하는 단계; 및 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 세포에게 제공함으로써, 세포 내의 표적으로의 결합을 적어도 제1 수준으로 유지하는 단계로서, 세포가 제2 수준의 결합을 포함하며, 결합의 제2 수준이 제2 조성물을 제공한 이후 제1 수준의 20%를 넘게 차이나지 않는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 내의 표적으로의 결합 방법은 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제1 조성물을 세포에게 제공하는 단계로서, 제1 조성물이 제공된 후에 세포가 제1 수준의 결합을 포함하는 단계; 및 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 세포에게 제공함으로써, 세포 내의 표적으로의 결합을 적어도 제1 수준으로 유지하는 단계로서, 세포가 제2 수준의 결합을 포함하며, 결합의 제2 수준이 제2 조성물을 제공한 이후 제1 수준의 1%, 5%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 또는 50%를 넘게 차이나지 않는 단계를 포함한다.
또한, 제2 조성물은 제1 조성물이 제공된 후에, 그리고 세포에서의 제1 조성물로부터의 결합의 수준이 세포에서 실질적으로 검출 불가능하게 되기 전에 제공될 수 있다. 일부 실시형태에서, 제2 조성물의 제공은 제1 조성물이 제공된 이후이면서 제1 조성물에 의해 생성된 결합의 제1 수준이 세포에서 50% 보다 더 감소되기 이전에 일어난다. 일부 실시형태에서, 제2 조성물의 제공은 제1 조성물이 제공된 이후이면서 제1 조성물에 의해 생성된 결합의 제1 수준이 세포에서 25% 내지 75%만큼 감소되기 이전에 일어난다. 일부 실시형태에서, 제2 조성물의 제공은 제1 조성물이 제공된 이후이면서 제1 조성물에 의해 생성된 결합의 제1 수준이 세포에서 1%, 5%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 또는 50% 보다 더 감소되기 이전에 일어난다.
일부 실시형태에서, 대상체(예를 들어, 포유동물, 예를 들어, 인간)에서의 표적의 결합 방법은 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제1 조성물을 대상체(예를 들어, 포유동물)에게 제공하는(예를 들어, 투여하는) 단계로서, 제1 조성물이 제공된(예를 들어, 투여된) 후에 대상체(예를 들어, 포유동물)가 결합의 제1 수준을 포함하는 단계; 및 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 대상체(예를 들어, 포유동물)에게 제공(예를 들어, 투여)하는 단계로서, 대상체(예를 들어, 포유동물)가 결합의 제2 수준을 포함하며, 결합의 제2 수준이 적어도 제1 수준만큼인 단계를 포함하며; 그럼으로써 대상체(예를 들어, 포유동물)내의 표적에 대한 결합을 적어도 제1 수준으로 유지한다. 일부 실시형태에서, 대상체(예를 들어, 포유동물, 예를 들어, 인간)에서의 표적으로의 결합 방법은 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제1 조성물을 대상체(예를 들어, 포유동물)에게 제공하는(예를 들어, 투여하는) 단계로서, 제1 조성물이 제공된(예를 들어, 투여된) 후에 대상체(예를 들어, 포유동물)가 결합의 제1 수준을 포함하는 단계; 및 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 대상체(예를 들어, 포유동물)에게 제공(예를 들어, 투여)하는 단계로서, 제2 조성물이 제공된(예를 들어, 투여된) 후에 대상체(예를 들어, 포유동물)가 결합의 제2 수준을 포함하며, 결합의 제2 수준이 제1 수준의 20%를 넘게 차이나지 않는 단계를 포함하며; 그럼으로써 대상체(예를 들어, 포유동물)내의 표적의 결합을 적어도 제1 수준으로 유지한다. 일부 실시형태에서, 대상체(예를 들어, 포유동물, 예를 들어, 인간)에서의 표적으로의 결합 방법은 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제1 조성물을 대상체(예를 들어, 포유동물)에게 제공하는(예를 들어, 투여하는) 단계로서, 제1 조성물이 제공된(예를 들어, 투여된) 후에 대상체(예를 들어, 포유동물)가 결합의 제1 수준을 포함하는 단계; 및 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 대상체(예를 들어, 포유동물)에게 제공(예를 들어, 투여)하는 단계로서, 제2 조성물이 제공된(예를 들어, 투여된) 후에 대상체(예를 들어, 포유동물)가 결합의 제2 수준을 포함하며, 결합의 제2 수준이 제1 수준의 1%, 5%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40% 또는 50%를 넘게 차이나지 않는 단계를 포함하며; 그럼으로써 대상체(예를 들어, 포유동물)내의 표적에 대한 결합을 적어도 제1 수준으로 유지한다.
또한, 제2 조성물은 제1 조성물이 제공된(예를 들어, 투여된) 후에, 그리고 대상체(예를 들어, 포유동물)에서의 제1 조성물로부터의 결합의 수준이 대상체(예를 들어, 포유동물)에서 실질적으로 검출 불가능하게 되기 전에 제공될(예를 들어, 투여될) 수 있다. 일부 실시형태에서, 제2 조성물의 제공(예를 들어, 투여)은 제1 조성물이 제공(예를 들어, 투여)된 이후이면서 제1 조성물에 의해 생성된 결합의 제1 수준이 대상체(예를 들어, 포유동물)에서 50% 보다 더 감소되기 이전에 일어난다. 일부 실시형태에서, 제2 조성물의 제공(예를 들어, 투여)은 제1 조성물이 제공(예를 들어, 투여)된 이후이면서 제1 조성물에 의해 생성된 결합의 제1 수준이 대상체(예를 들어, 포유동물)에서 25% 내지 75%만큼 감소되기 이전에 일어난다. 일부 실시형태에서, 제2 조성물의 제공(예를 들어, 투여)은 제1 조성물이 제공(예를 들어, 투여)된 이후이면서 제1 조성물에 의해 생성된 결합의 제1 수준이 대상체(예를 들어, 포유동물)에서 1%, 5%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 또는 50% 보다 더 감소되기 이전에 일어난다. 일부 실시형태에서, 대상체(예를 들어, 포유동물, 예를 들어, 인간)에서의 표적의 결합 방법은 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제1 조성물을 대상체(예를 들어, 포유동물)에게 제공하는(예를 들어, 투여하는) 단계로서, 제1 조성물이 제공된(예를 들어, 투여된) 후에 대상체(예를 들어, 포유동물)가 결합의 제1 수준을 포함하는 단계; 및 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 대상체(예를 들어, 포유동물)에게 제공(예를 들어, 투여)하는 단계로서, 대상체(예를 들어, 포유동물)가 결합의 제2 수준을 포함하며, 결합의 제2 수준이 적어도 제1 수준만큼인 단계를 포함하며; 그럼으로써 대상체(예를 들어, 포유동물)내의 표적에 대한 결합을 적어도 제1 수준으로 유지한다. 일부 실시형태에서, 대상체(예를 들어, 포유동물, 예를 들어, 인간)에서의 표적으로의 결합 방법은 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제1 조성물을 대상체(예를 들어, 포유동물)에게 제공하는(예를 들어, 투여하는) 단계로서, 제1 조성물이 제공된(예를 들어, 투여된) 후에 대상체(예를 들어, 포유동물)가 결합의 제1 수준을 포함하는 단계; 및 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 대상체(예를 들어, 포유동물)에게 제공(예를 들어, 투여)하는 단계로서, 제2 조성물이 제공된(예를 들어, 투여된) 후에 대상체(예를 들어, 포유동물)가 결합의 제2 수준을 포함하며, 결합의 제2 수준이 제1 수준의 20%를 넘게 차이나지 않는 단계를 포함하며; 그럼으로써 대상체(예를 들어, 포유동물)내의 표적의 결합을 적어도 제1 수준으로 유지한다. 일부 실시형태에서, 대상체(예를 들어, 포유동물)에서의 표적으로의 결합 방법은 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제1 조성물을 대상체(예를 들어, 포유동물)에게 제공하는(예를 들어, 투여하는) 단계로서, 제1 조성물이 제공된(예를 들어, 투여된) 후에 대상체(예를 들어, 포유동물)가 결합의 제1 수준을 포함하는 단계; 및 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 대상체(예를 들어, 포유동물)에게 제공(예를 들어, 투여)하는 단계로서, 제2 조성물이 제공된(예를 들어, 투여된) 후에 대상체(예를 들어, 포유동물)가 결합의 제2 수준을 포함하며, 결합의 제2 수준이 제1 수준의 1%, 5%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40% 또는 50%를 넘게 차이나지 않는 단계를 포함하며; 그럼으로써 대상체(예를 들어, 포유동물)내의 표적에 대한 결합을 적어도 제1 수준으로 유지한다.
또한, 제2 조성물은 제1 조성물이 제공된(예를 들어, 투여된) 후에, 그리고 대상체(예를 들어, 포유동물)에서의 제1 조성물로부터의 결합의 수준이 대상체(예를 들어, 포유동물)에서 실질적으로 검출 불가능하게 되기 전에 제공될(예를 들어, 투여될) 수 있다. 일부 실시형태에서, 제2 조성물의 제공(예를 들어, 투여)은 제1 조성물이 제공(예를 들어, 투여)된 이후이면서 제1 조성물에 의해 생성된 결합의 제1 수준이 대상체(예를 들어, 포유동물)에서 50% 보다 더 감소되기 이전에 일어난다. 일부 실시형태에서, 제2 조성물의 제공(예를 들어, 투여)은 제1 조성물이 제공(예를 들어, 투여)된 이후이면서 제1 조성물에 의해 생성된 결합의 제1 수준이 대상체(예를 들어, 포유동물)에서 25% 내지 75%만큼 감소되기 이전에 일어난다. 일부 실시형태에서, 제2 조성물의 제공(예를 들어, 투여)은 제1 조성물이 제공(예를 들어, 투여)된 이후이면서 제1 조성물에 의해 생성된 결합의 제1 수준이 대상체(예를 들어, 포유동물)에서 1%, 5%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 또는 50% 보다 더 감소되기 이전에 일어난다.
일부 실시형태에서, 시간차 투여 요법 또는 방법에서 제1 조성물 및 제2 조성물은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 하나 이상의 추가의 조성물로 이어질 수 있다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 추가의 조성물은 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10 또는 그 이상의 조성물을 포함한다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제3 조성물을 제2 조성물 이후에 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물, 예를 들어, 인간)에게 제공(예를 들어, 투여)함으로써, 제3 조성물이 제공된 후에 원형 폴리리보뉴클레오티드, 단백질 또는 결합의 수준을 적어도 제1 수준으로 유지한다. 일부 실시형태에서, 제3 조성물은 제2 조성물 이후에, 그리고 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물)에서 제1및 제2 조성물에 의해 생성되는 원형 폴리리보뉴클레오티드, 단백질 또는 결합의 수준이 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물)에서 실질적으로 검출 불가능하게 되기 전에 제공된다(예를 들어, 투여된다). 일부 실시형태에서, 제3 조성물은 제1 조성물이 제공된(예를 들어, 투여된) 후에, 그리고 제1 조성물에 의해 생성되는 원형 폴리리보뉴클레오티드, 이에 의해 발현되는 단백질 또는 이에 의해 생성되는 결합의 제1 수준이 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물)에서 50% 초과로 감소하기 전에 제공된다(예를 들어, 투여된다). 일부 실시형태에서, 제3 조성물은 제1 조성물이 제공된(예를 들어, 투여된) 후에, 그리고 제1 조성물에 의해 생성되는 원형 폴리리보뉴클레오티드, 이에 의해 발현되는 단백질 또는 이에 의해 생성되는 결합의 제1 수준이 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물)에서 25% 내지 75% 감소하기 전에 제공된다(예를 들어, 투여된다). 일부 실시형태에서, 제2 조성물은 제1 조성물이 제공(예를 들어, 투여)된 이후이면서 제1 조성물에 의해 생성된 원형 폴리리보뉴클레오티드, 제1 조성물에 의해 발현된 단백질, 또는 제1 조성물에 의한 결합의 제1 수준이 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물)에서 1%, 5%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 또는 50% 보다 더 감소되기 이전에 제공(예를 들어, 투여)된다. 시간차 투여를 위하여, 하나 이상의 추가의 조성물은 이전의 조성물을 제공한 후에, 그리고 이전의 조성물(들)에 의해 생성되는 원형 폴리리보뉴클레오티드, 결합 또는 단백질의 수준이 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물)에서 실질적으로 검출 불가능하게 되기 전에 제공될 수 있다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 추가의 조성물은 이전의 조성물이 제공된(예를 들어, 투여된) 후에, 그리고 이전의 조성물(들)에 의해 생성되는 원형 폴리리보뉴클레오티드, 결합 또는 단백질의 수준이 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물)에서 50% 초과로 감소하기 전에 제공된다(예를 들어, 투여된다). 일부 실시형태에서, 하나 이상의 추가의 조성물은 이전의 조성물이 제공된(예를 들어, 투여된) 후에, 그리고 이전의 조성물(들)에 의해 생성되는 원형 폴리리보뉴클레오티드, 결합 또는 단백질의 수준이 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물)에서 25% 내지 75% 감소하기 전에 제공된다(예를 들어, 투여된다). 일부 실시형태에서, 하나 이상의 추가의 조성물은 이전의 조성물이 제공된(예를 들어, 투여된) 후에, 그리고 이전의 조성물(들)에 의해 생성되는 원형 폴리리보뉴클레오티드, 결합 또는 단백질의 수준이 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물)에서 1%, 5%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40% 또는 50% 초과로 감소하기 전에 제공된다(예를 들어, 투여된다).
일부 실시형태에서, 제2 조성물은 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물) 내의 단백질의 수준이 제1 조성물을 투여하거나 제공하기 전의 대략적 단백질의 수준으로 복귀하기 전에 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물)에게 투여되거나 제공된다. 일부 실시형태에서, 제2 조성물은 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물) 내의 단백질의 수준이 제1 조성물을 투여하거나 제공하기 전의 대략적 단백질의 수준으로 복귀하기 전에 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물)에게 투여되거나 제공된다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 추가의 용량의 제3 조성물은 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물) 내의 단백질의 수준이 제1 조성물을 투여하거나 제공하기 전의 대략적 단백질의 수준으로 복귀하기 전에 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물)에게 투여되거나 제공된다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 추가의 조성물 중 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10 이상의 조성물은 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물) 내의 단백질의 수준이 제1 조성물을 투여하거나 제공하기 전의 대략적 단백질의 수준으로 복귀하기 전에 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물)에게 투여되거나 제공된다.
일부 실시형태에서, 조성물은 이전의 조성물을 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물)에게 투여하거나 제공한 후 소정의 시간 간격 후에 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물)에게 투여되거나 제공된다. 예를 들어, 제2 조성물은 제1 조성물을 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물)에게 투여하거나 제공한 후 제1 시간 간격 후에 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물)에게 투여되거나 제공될 수 있거나; 제3 조성물은 제2 조성물을 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물)에게 투여하거나 제공한 후 제2 시간 간격 후에 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물)에게 투여되거나 제공될 수 있거나; 제4 조성물은 제3 조성물을 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물)에게 투여하거나 제공한 후 제3 시간 간격 후에 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물)에게 투여되거나 제공될 수 있거나; 제5, 제6, 제7, 제8, 제9 이상의 조성물은 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9 이상의 조성물을 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물)에게 투여하거나 제공한 후 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9 이상의 시간 간격 후에 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물)에게 투여되거나 제공될 수 있다. 제1 시간 간격은 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물) 내의 단백질의 수준이 제1 조성물을 투여하거나 제공하기 전의 대략적 단백질의 수준으로 복귀하는데 필요한 시간의 양보다 더 짧을 수 있다.
일부 실시형태에서, 제2 시간 간격은 제1 시간 간격보다 더 길다. 일부 실시형태에서, 제3 시간 간격은 제1 시간 간격보다 더 길다. 일부 실시형태에서, 제4 시간 간격은 제1 시간 간격보다 더 길다. 일부 실시형태에서, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10 이상의 시간 간격은 제1 시간 간격보다 더 길다. 일부 실시형태에서, 제2 시간 간격은 제1 시간 간격과 동일하다. 일부 실시형태에서, 제3 시간 간격은 제1 시간 간격과 동일하다. 일부 실시형태에서, 제4 시간 간격은 제1 시간 간격과 동일하다. 일부 실시형태에서, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10 이상의 시간 간격은 제1 시간 간격과 동일하다. 일부 실시형태에서, 제2 시간 간격은 제1 시간 간격보다 더 짧다. 일부 실시형태에서, 제3 시간 간격은 제1 시간 간격보다 더 짧다. 일부 실시형태에서, 제4 시간 간격은 제1 시간 간격보다 더 짧다. 일부 실시형태에서, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10 이상의 시간 간격은 제1 시간 간격보다 더 짧다. 일부 실시형태에서, 제2 시간 간격은 제1 시간 간격보다 더 길다. 일부 실시형태에서, 제3 시간 간격은 제2 시간 간격보다 더 길다. 일부 실시형태에서, 제4 시간 간격은 제3 시간 간격보다 더 길다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 수준은 제1 조성물을 제공한 지 1일 내지 2일 후의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 최고 수준이다. 제1 조성물을 제공한 후 1일 내지 2일째의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 가장 높은 수준, 예를 들어, 제1 조성물을 제공한 후 24시간째 내지 48시간(예를 들어, 1일 내지 2일)째의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 피크 양. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 수준은 제1 조성물을 제공한 지 1일 내지 2일 후의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 최고 수준의 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%이다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 수준이 제2 조성물의 제공 이후 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 또는 40 일 동안 제1 조성물을 제공한 지 1일 내지 2일 후의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 최고 수준의 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 또는 200%이다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 수준은 제2 조성물을 제공한 후 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 12일, 15일, 20일, 25일, 30일, 35일 또는 40일 동안 제1 조성물을 제공한 후 1일 내지 2일째의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 가장 높은 수준보다 적어도 1배, 5배, 10배, 100배 또는 1000배 더 높다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제3 수준이 제3 조성물의 제공 이후 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 또는 40 일 동안 제1 조성물을 제공한 지 1일 내지 2일 후의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 최고 수준의 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 또는 200%이다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제3 수준은 제3 조성물을 제공한 후 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 12일, 15일, 20일, 25일, 30일, 35일 또는 40일 동안 제1 조성물을 제공한 후 1일 내지 2일째의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 가장 높은 수준보다 적어도 1배, 5배, 10배, 100배 또는 1000배 더 높다. 일부 실시형태에서, 제1 조성물의 제공 이후의 후속 조성물 각각에 대해, 각각의 후속 조성물 이후 발현된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 후속 수준은 각각의 후속 조성물의 제공 이후 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 또는 40 일 동안 제1 조성물을 제공한 지 1일 내지 2일 후의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 최고 수준의 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 또는 200%이다. 일부 실시형태에서, 제1 조성물 이후에 제공되는 각각의 후속 조성물에 있어서, 각각의 후속 조성물 이후에 발현되는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 후속 수준은 각각의 후속 조성물을 제공한 후 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 12일, 15일, 20일, 25일, 30일, 35일 또는 40일 동안 제1 조성물을 제공한 후 1일 내지 2일째의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 가장 높은 수준보다 적어도 1배, 5배, 10배, 100배 또는 1000배 더 높다.
일부 실시형태에서, 제2 조성물을 제공한 후의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 평균 수준은 제1 수준의 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%이며, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 평균 수준은 제2 조성물을 제공한 후 1일째부터 원형 폴리리보뉴클레오티드가 실질적으로 검출 불가능한 날까지 측정된다. 일부 실시형태에서, 제1 조성물 이후 각각의 후속 조성물을 제공한 후의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 평균 수준은 제1 수준의 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%이며, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 평균 수준은 각각의 후속 조성물을 제공한 후 1일째부터 원형 폴리리보뉴클레오티드가 실질적으로 검출 불가능한 날까지 측정된다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 수준은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물이 제공된 후 적어도 6시간, 1일, 2일, 3일, 5일, 7일, 14일, 21일, 28일, 또는 35일 동안 유지된다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 수준은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물이 제공된 후 적어도 6시간, 1일, 2일, 3일, 5일, 7일, 14일, 21일, 28일, 또는 35일 동안 유지된다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 수준은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제3 조성물이 제공된 후 적어도 6시간, 1일, 2일, 3일, 5일, 7일, 14일, 21일, 28일, 또는 35일 동안 유지된다. 일부 실시형태에서, 제2 조성물을 제공한 이후의 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물) 내의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 수준은 제1 조성물을 제공한 이후 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물) 내의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 수준보다 적어도 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 60% 높다. 일부 실시형태에서, 제3 조성물을 제공한 이후의 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물) 내의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제3 수준은 제1 조성물을 제공한 이후 복수의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 수준보다 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 60% 높다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 제공한 지 1시간, 12시간, 18시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 15일, 20일, 25일, 30일, 40일, 또는 45일 이후의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 수준은 제1 조성물을 제공한 이후의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 수준보다 적어도 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 60% 높다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제3 조성물을 제공한 지 1시간, 12시간, 18시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 15일, 20일, 25일, 30일, 40일, 또는 45일 이후의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제3 수준은 제1 조성물을 제공한 이후의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 수준보다 적어도 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 60% 높다.
일부 실시형태에서, 결합의 제1 수준은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물이 제공된 후 적어도 6시간, 1일, 2일, 3일, 5일, 7일, 14일, 21일, 28일, 또는 35일 동안 유지된다. 일부 실시형태에서, 결합의 제1 수준은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제3 조성물이 제공된 후 적어도 6시간, 1일, 2일, 3일, 5일, 7일, 14일, 21일, 28일, 또는 35일 동안 유지된다. 일부 실시형태에서, 제2 조성물을 제공한 이후의 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물) 내의 결합의 제2 수준은 제1 조성물을 제공한 이후 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물) 내의 결합의 제1 수준보다 적어도 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 60% 높다. 일부 실시형태에서, 제3 조성물을 제공한 이후의 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물) 내의 결합의 제3 수준은 제1 조성물을 제공한 이후 복수의 결합의 제1 수준보다 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 60% 높다.
일부 실시형태에서, 단백질의 제1 수준은 제1 조성물을 제공한 지 1일 내지 2일 후의 단백질의 최고 수준이다. 제1 조성물을 제공한 후 1일 내지 2일째의 단백질의 가장 높은 수준, 예를 들어, 제1 조성물을 제공한 후 24시간째 내지 48시간(예를 들어, 1일 내지 2일)째에 원형 폴리리보뉴클레오티드로부터 발현되는 단백질의 피크 양. 일부 실시형태에서, 단백질의 제1 수준은 제1 조성물을 제공한 지 1일 내지 2일 후의 단백질의 최고 수준의 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%이다. 일부 실시형태에서, 단백질의 제2 수준이 제2 조성물의 제공 이후 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 또는 40 일 동안 제1 조성물을 제공한 지 1일 내지 2일 후의 단백질의 최고 수준의 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 또는 200%이다. 일부 실시형태에서, 단백질의 제2 수준은 제2 조성물을 제공한 후 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 12일, 15일, 20일, 25일, 30일, 35일 또는 40일 동안 제1 조성물을 제공한 후 1일 내지 2일째의 단백질의 가장 높은 수준보다 적어도 1배, 5배, 10배, 100배 또는 1000배 더 높다. 일부 실시형태에서, 단백질의 제3 수준이 제3 조성물의 제공 이후 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 또는 40 일 동안 제1 조성물을 제공한 지 1일 내지 2일 후의 단백질의 최고 수준의 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 또는 200%이다. 일부 실시형태에서, 단백질의 제3 수준은 제3 조성물을 제공한 후 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 12일, 15일, 20일, 25일, 30일, 35일 또는 40일 동안 제1 조성물을 제공한 후 1일 내지 2일째의 단백질의 가장 높은 수준보다 적어도 1배, 5배, 10배, 100배 또는 1000배 더 높다. 일부 실시형태에서, 제1 조성물의 제공 이후의 후속 조성물 각각에 대해, 각각의 후속 조성물 이후 발현된 단백질의 후속 수준은 각각의 후속 조성물의 제공 이후 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 또는 40 일 동안 제1 조성물을 제공한 지 1일 내지 2일 후의 단백질의 최고 수준의 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 또는 200%이다. 일부 실시형태에서, 제1 조성물 이후에 제공되는 각각의 후속 조성물에 있어서, 각각의 후속 조성물 이후에 발현되는 단백질의 후속 수준은 각각의 후속 조성물을 제공한 후 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 12일, 15일, 20일, 25일, 30일, 35일 또는 40일 동안 제1 조성물을 제공한 후 1일 내지 2일째의 단백질의 가장 높은 수준보다 적어도 1배, 5배, 10배, 100배 또는 1000배 더 높다.
일부 실시형태에서, 제2 조성물을 제공한 후의 단백질의 평균 수준은 제1 수준의 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%이며, 단백질의 평균 수준은 제2 조성물을 제공한 후 1일째부터 단백질이 실질적으로 검출 불가능한 날까지 측정된다. 일부 실시형태에서, 제1 조성물 이후 각각의 후속 조성물을 제공한 후의 단백질의 평균 수준은 제1 수준의 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%이며, 단백질의 평균 수준은 각각의 후속 조성물을 제공한 후 1일째부터 단백질이 실질적으로 검출 불가능한 날까지 측정된다.
일부 실시형태에서, 단백질의 제1 수준은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물, 및 제2 조성물을 제공한 이후 제1 조성물이 제공된 이후 적어도 6시간, 1일, 2일, 3일, 5일, 7일, 14일, 21일, 28일, 또는 35일 동안 유지된다. 일부 실시형태에서, 단백질의 제1 수준은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물, 제2 조성물 및 제3 조성물을 제공한 후에, 제1 조성물이 제공된 후 적어도 6시간, 1일, 2일, 3일, 5일, 7일, 14일, 21일, 28일 또는 35일 동안 유지된다.
일부 실시형태에서, 제2 조성물을 제공한 이후의 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물) 내의 단백질의 제2 수준은 제1 조성물이 제공된 이후 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물) 내의 단백질의 제1 수준보다 적어도 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 60% 높다. 일부 실시형태에서, 제3 조성물을 제공한 이후의 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물) 내의 단백질의 제3 수준은 제1 조성물이 제공된 이후 복수의 단백질의 제1 수준보다 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 60% 높다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 제공한 지 1시간, 12시간, 18시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 15일, 20일, 25일, 30일, 40일, 또는 45일 이후의 단백질의 제2 수준은 제1 조성물이 제공된 이후의 단백질의 제1 수준보다 적어도 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 60% 높다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제3 조성물을 제공한 지 1시간, 12시간, 18시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 15일, 20일, 25일, 30일, 40일, 또는 45일 이후의 단백질의 제3 수준은 제1 조성물이 제공된 이후의 단백질의 제1 수준보다 적어도 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 60% 높다.
일부 실시형태에서, 제1 조성물의 단백질의 수준은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물이 제공된 후 적어도 1시간, 12시간, 18시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 15일, 20일, 25일, 30일, 40일, 또는 45일 동안 유지된다. 일부 실시형태에서, 제1 조성물의 단백질의 수준은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제3 조성물이 제공된 후 적어도 1시간, 12시간, 18시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 15일, 20일, 25일, 30일, 40일, 또는 45일 동안 유지된다. 일부 실시형태에서, 제1 조성물의 단백질의 수준은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제4 조성물, 제5 조성물, 제6 조성물, 제7 조성물, 제8 조성물, 제9 조성물, 제10 이상의 조성물이 제공된 후 적어도 1시간, 12시간, 18시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 15일, 20일, 25일, 30일, 40일, 또는 45일 동안 유지된다. 유지되는 단백질의 수준은 제1 조성물이 제공된 후 1일째의 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물)에서의 단백질의 수준이다. 일부 실시형태에서, 제1 조성물 이후의 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물) 내의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물이 제공된 후 적어도 1시간, 12시간, 18시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 15일, 20일, 25일, 30일, 40일, 또는 45일 동안 유지된다. 일부 실시형태에서, 제1 조성물 이후의 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물) 내의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제3 조성물이 제공된 후 적어도 1시간, 12시간, 18시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 15일, 20일, 25일, 30일, 40일, 또는 45일 동안 유지된다. 일부 실시형태에서, 제1 조성물 이후의 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물) 내의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제4 조성물, 제5 조성물, 제6 조성물, 제7 조성물, 제8 조성물, 제9 조성물, 제10 이상의 조성물이 제공된 후 적어도 1시간, 12시간, 18시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 15일, 20일, 25일, 30일, 40일, 또는 45일 동안 유지된다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 제공한 후의 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물) 내의 단백질의 수준은 제1 조성물을 제공한 이후 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물) 내의 단백질의 수준보다 1% 내지 5%, 5% 내지 10%, 10% 내지 15%, 15% 내지 20%, 20% 내지 25%, 25% 내지 30%, 30% 내지 35%, 35% 내지 40%, 40% 내지 45%, 45% 내지 50%, 50% 내지 55%, 55% 내지 60%, 60% 내지 65%, 65% 내지 70%, 70% 내지 75%, 75% 내지 80%, 80% 내지 85%, 85% 내지 90%, 90% 내지 92%, 92% 내지 94%, 94% 내지 95%, 95% 내지 96%, 96% 내지 97%, 97% 내지 98%, 98% 내지 99%, 10% 내지 30%, 10% 내지 40%, 10% 내지 50%, 10% 내지 60%, 10% 내지 70%, 10% 내지 80%, 10% 내지 90%, 10% 내지 95%, 40% 내지 50%, 40% 내지 60%, 40% 내지 70%, 40% 내지 80%, 40% 내지 90%, 40% 내지 95%, 60% 내지 80%, 60% 내지 90%, 60% 내지 95%, 또는 60% 내지 98% 높다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 제공한 후의 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물) 내의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준은 제1 조성물을 제공한 이후 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물) 내의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준보다 1% 내지 5%, 5% 내지 10%, 10% 내지 15%, 15% 내지 20%, 20% 내지 25%, 25% 내지 30%, 30% 내지 35%, 35% 내지 40%, 40% 내지 45%, 45% 내지 50%, 50% 내지 55%, 55% 내지 60%, 60% 내지 65%, 65% 내지 70%, 70% 내지 75%, 75% 내지 80%, 80% 내지 85%, 85% 내지 90%, 90% 내지 92%, 92% 내지 94%, 94% 내지 95%, 95% 내지 96%, 96% 내지 97%, 97% 내지 98%, 98% 내지 99%, 10% 내지 30%, 10% 내지 40%, 10% 내지 50%, 10% 내지 60%, 10% 내지 70%, 10% 내지 80%, 10% 내지 90%, 10% 내지 95%, 40% 내지 50%, 40% 내지 60%, 40% 내지 70%, 40% 내지 80%, 40% 내지 90%, 40% 내지 95%, 60% 내지 80%, 60% 내지 90%, 60% 내지 95%, 또는 60% 내지 98% 높다.
재투여
원형 폴리리보뉴클레오티드의 적어도 2개의 조성물을 세포에 제공한 후에, 세포에서 소정의 수준의 원형 폴리리보뉴클레오티드, 소정의 수준의 결합을 생성하거나, 단백질을 발현하기 위한 재투여 방법이 본원에 개시된다. 원형 폴리리보뉴클레오티드의 적어도 2개의 조성물을 세포에 제공한 후에, 대상체(예를 들어, 포유동물, 예를 들어, 인간)에서 소정의 수준의 원형 폴리리보뉴클레오티드, 소정의 수준의 결합을 생성하거나, 단백질을 발현하기 위한 재투여 방법이 본원에 개시된다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 적어도 두 조성물은 동일한 조성물이다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 적어도 두 조성물은 상이한 조성물이다. 일부 실시형태에서, 동일한 조성물은 동일한 단백질을 인코딩하거나 동일한 결합 부위를 포함하는 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상이한 조성물은 상이한 단백질을 인코딩하거나 상이한 결합 부위를 포함하는 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 조성물은 제1 단백질을 인코딩하는 제1 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하고 제2 조성물은 제2 단백질을 인코딩하는 제2 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하며, 제1 단백질과 제2 단백질은 동일한 단백질이다. 일부 실시형태에서, 제1 조성물은 제1 단백질을 인코딩하는 제1 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하고 제2 조성물은 제2 단백질을 인코딩하는 제2 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하며, 제1 단백질과 제2 단백질은 상이한 단백질이다. 일부 실시형태에서, 제1 조성물은 제1 결합 부위를 포함하는 제1 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하고 제2 조성물은 제2 결합 부위를 포함하는 제2 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하며, 제1 결합 부위와 제2 결합 부위는 동일한 결합 부위이다. 일부 실시형태에서, 제1 조성물은 제1 결합 부위를 포함하는 제1 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하고 제2 조성물은 제2 결합 부위를 포함하는 제2 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하며, 제1 결합 부위와 제2 결합 부위는 상이한 결합 부위이다. 일부 실시형태에서, 제1 조성물은 단백질을 인코딩하는 제1 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하며 제2 조성물은 결합 부위를 포함하는 제2 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 포유동물(예를 들어, 인간)에서의 단백질의 발현의 유지 방법은 (a) 단백질을 인코딩하는 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제1 조성물을 포유동물에게 제공하는(예를 들어, 투여하는) 단계; 및 (b) 단계 (a) 이후 6시간째 내지 90일째에, 단백질을 인코딩하는 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제2 조성물을 포유동물에게 제공(예를 들어, 투여)함으로써, 포유동물에서 단백질의 발현을 유지하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 조성물을 제공하는(예를 들어, 투여하는) 단계는 제1 조성물이 제공된(예를 들어, 투여된) 후에, 그리고 제1 조성물에 의해 발현되는 단백질의 제1 수준이 포유동물에서 실질적으로 검출 불가능하게 된 후에 발생한다. 일부 실시형태에서, 당해 방법은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제3 조성물을 제2 조성물 이후에 포유동물에게 제공(예를 들어, 투여)함으로써, 포유동물에서 단백질을 회복시키는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 포유동물(예를 들어, 인간)에서의 항원의 발현의 유지 방법은 (a) 항원을 인코딩하는 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제1 조성물을 포유동물에게 제공하는(예를 들어, 투여하는) 단계; 및 (b) 단계 (a) 이후 6시간째 내지 90일째에, 항원을 인코딩하는 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제2 조성물을 포유동물에게 제공(예를 들어, 투여)함으로써, 포유동물에서 단백질의 발현을 유지하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 제2 조성물을 제공하는 것(예를 들어, 투여)은 단계 (a)의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 또는 90일, 그 사이의 임의의 시간 이후이다. 일부 실시형태에서, 제2 조성물을 제공하는 것(예를 들어, 투여)은 단계 (a)의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 또는 90개월, 또는 그 사이의 임의의 시간 이후이다. 일부 실시형태에서, 제2 조성물을 제공하는(예를 들어, 투여하는) 단계는 단계 (a) 이후 1년, 2년, 3년, 4년, 5년, 6년, 7년, 8년, 9년, 10년, 11년, 12년, 13년, 14년, 15년, 16년, 17년, 18년, 19년 또는 20년, 또는 이들 사이의 임의의 시간에 이루어진다. 일부 실시형태에서, 제2 조성물을 제공하는(예를 들어, 투여하는) 단계는 단계 (a) 이후 6시간째 내지 45일째에 이루어진다. 일부 실시형태에서, 제2 조성물을 제공하는(예를 들어, 투여하는) 단계는 단계 (a) 이후 6시간째 내지 30일째에 이루어진다. 일부 실시형태에서, 제2 조성물을 제공하는(예를 들어, 투여하는) 단계는 단계 (a) 이후 6시간째 내지 65일째에 이루어진다. 일부 실시형태에서, 제2 조성물을 제공하는(예를 들어, 투여하는) 단계는 단계 (a) 이후 30일째 내지 45일째에 이루어진다. 일부 실시형태에서, 제2 조성물을 제공하는(예를 들어, 투여하는) 단계는 단계 (a) 이후 14일째 내지 30일째에 이루어진다. 일부 실시형태에서, 제2 조성물을 제공하는(예를 들어, 투여하는) 단계는 단계 (a) 이후 14일째 내지 45일째에 이루어진다. 일부 실시형태에서, 제2 조성물을 제공하는(예를 들어, 투여하는) 단계는 단계 (a) 이후 30일째 내지 65일째에 이루어진다. 일부 실시형태에서, 제2 조성물을 제공하는(예를 들어, 투여하는) 단계는 단계 (a) 이후 30일째 내지 90일째에 이루어진다.
일부 실시형태에서, 단백질의 제1 수준은 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한(예를 들어, 투여한) 후에, 제1 조성물이 제공된(예를 들어, 투여된) 후 6시간 내지 90일 동안 유지된다. 일부 실시형태에서, 단백질의 제1 수준은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물, 제2 조성물 및 제3 조성물을 제공한(예를 들어, 투여한) 후에, 제1 조성물이 제공된(예를 들어, 투여된) 후 6시간 내지 270일 동안 유지된다. 일부 실시형태에서, 단백질의 제1 수준은 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한(예를 들어, 투여한) 후에, 제1 조성물이 제공된(예를 들어, 투여한) 후 6시간 내지 35일 동안 실질적으로 검출 불가능하다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 후의 세포에서의 단백질의 수준과 비교하여 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 세포에게 제공한 후의 세포에서의 소정의 수준의 단백질의 발현 방법은, 단백질을 인코딩하는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물을 세포에게 제공하는 단계로서, 세포가 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물이 제공된 후에 소정의 수준의 단백질을 포함하는 단계; 및 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 제1 조성물 이후에 세포에게 제공하는 단계로서, 세포가 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물이 제공된 후에 적어도 소정의 수준의 단백질을 포함하는 단계를 포함하며, 그럼으로써 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물이 제공된 후의 세포에서의 단백질의 수준과 비교하여 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물이 제공된 후에 세포에서 소정의 수준의 단백질의 발현을 유지한다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물이 제공된 후의 세포에서의 단백질의 수준과 비교하여 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 세포에게 제공한 후의 세포에서의 소정의 수준의 단백질의 발현 방법은: 단백질을 인코딩하는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물을 세포에게 제공하는 단계로서, 세포가 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물이 제공된 후에 소정의 수준의 단백질을 포함하는 단계; 및 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 제1 조성물 이후에 세포에게 제공하는 단계로서, 세포가 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물이 제공된 후에 소정의 수준의 20%를 넘게 차이나지 않는 수준의 단백질을 포함하는 단계를 포함하며, 그럼으로써 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물이 제공된 이후의 세포 내의 단백질의 수준과 비교하여 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물이 제공된 이후의 세포 내의 단백질의 발현 수준을 유지한다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 후의 대상체(예를 들어, 포유동물)에서의 단백질의 수준과 비교하여 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 대상체(예를 들어, 포유동물)에게 제공한 후의 대상체(예를 들어, 포유동물)에서의 소정의 수준의 단백질의 발현 방법은: 단백질을 인코딩하는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물을 대상체(예를 들어, 포유동물)에게 제공(예를 들어, 투여)하는 단계로서, 대상체(예를 들어, 포유동물)가 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물이 제공(예를 들어, 투여)된 후에 소정의 수준의 단백질을 포함하는 단계; 및 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 제1 조성물 이후에 대상체(예를 들어, 포유동물)에게 제공(예를 들어, 투여)하는 단계로서, 대상체(예를 들어, 포유동물)가 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물이 제공(예를 들어, 투여)된 후에 적어도 소정의 수준의 단백질을 포함하는 단계를 포함하며, 그럼으로써 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물이 제공(예를 들어, 투여)된 이후의 대상체(예를 들어, 포유동물) 내의 단백질의 수준과 비교하여 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물이 제공(예를 들어, 투여)된 이후의 대상체(예를 들어, 포유동물) 내의 단백질의 발현 수준을 유지한다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 후의 대상체(예를 들어, 포유동물)에서의 단백질의 수준과 비교하여 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 대상체(예를 들어, 포유동물)에게 제공한 후의 대상체(예를 들어, 포유동물)에서의 소정의 수준의 단백질의 발현 방법은: 단백질을 인코딩하는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물을 대상체(예를 들어, 포유동물)에게 제공(예를 들어, 투여)하는 단계로서, 대상체(예를 들어, 포유동물)가 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물이 제공(예를 들어, 투여)된 후에 소정의 수준의 단백질을 포함하는 단계; 및 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 제1 조성물 이후에 대상체(예를 들어, 포유동물)에게 제공(예를 들어, 투여)하는 단계로서, 대상체(예를 들어, 포유동물)가 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물이 제공(예를 들어, 투여)된 후의 수준의 20%를 넘게 차이나지 않는 단백질의 수준을 포함하는 단계를 포함하며, 그럼으로써 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물이 제공(예를 들어, 투여)된 이후의 대상체(예를 들어, 포유동물) 내의 단백질의 수준과 비교하여 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물이 제공(예를 들어, 투여)된 이후의 대상체(예를 들어, 포유동물) 내의 단백질의 발현 수준을 유지한다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 후의 세포에서의 단백질의 수준과 비교하여 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 세포에게 제공한 후의 세포에서의 소정의 수준의 단백질의 발현 방법은, 단백질을 인코딩하는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물을 세포에게 제공하는 단계로서, 세포가 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물이 제공된 후에 소정의 수준의 단백질을 포함하는 단계; 및 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 제1 조성물 이후에 세포에게 제공하는 단계로서, 세포가 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물이 제공된 후의 수준의 1%, 5%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 또는 50% 를 넘게 차이나지 않는 단백질의 수준을 포함하는 단계를 포함하며, 그럼으로써 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후의 세포 내의 단백질의 수준과 비교하여 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후의 세포 내의 단백질의 발현 수준을 유지한다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 후의 대상체(예를 들어, 포유동물)에서의 단백질의 수준과 비교하여 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 대상체(예를 들어, 포유동물)에게 제공한 후의 대상체(예를 들어, 포유동물)에서의 소정의 수준의 단백질의 발현 방법은: 단백질을 인코딩하는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물을 대상체(예를 들어, 포유동물)에게 제공(예를 들어, 투여)하는 단계로서, 대상체(예를 들어, 포유동물)가 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물이 제공(예를 들어, 투여)된 후에 소정의 수준의 단백질을 포함하는 단계; 및 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 제1 조성물 이후에 대상체(예를 들어, 포유동물)에게 제공(예를 들어, 투여)하는 단계로서, 대상체(예를 들어, 포유동물)가 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물이 제공(예를 들어, 투여)된 후의 수준의 1%, 5%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 또는 50% 를 넘게 차이나지 않는 단백질의 수준을 포함하는 단계를 포함하며, 그럼으로써 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물이 제공(예를 들어, 투여)된 이후의 대상체(예를 들어, 포유동물) 내의 단백질의 수준과 비교하여 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물이 제공(예를 들어, 투여)된 이후의 대상체(예를 들어, 포유동물) 내의 단백질의 발현 수준을 유지한다.
또한, 제2 조성물은 제1 조성물을 제공한 후에, 그리고 제1 조성물에 의해 생성되는 단백질의 수준이 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물)에서 실질적으로 검출 불가능하게 된 후에 제공될 수 있다. 일부 실시형태에서, 제2 조성물은 제1 조성물에 의해 생성된 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물) 내의 단백질의 수준이 실질적으로 검출 불가능하게 된 지 적어도 1분, 1시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 7일, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 8개월, 10개월, 또는 1년 후에 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물)에 제공된다. 일부 실시형태에서, 제2 조성물은 제1 조성물에 의해 생성되는 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물)에서의 단백질의 수준이 실질적으로 검출 불가능한 후 1분 내지 20년 또는 이들 사이의 임의의 시간에 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물)에게 제공된다. 일부 실시형태에서, 제2 조성물은 제1 조성물의 이후 적어도 1분, 1시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 7일, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 8개월, 10개월, 또는 1년 후에 그리고 제1 조성물의 이후 20년, 15년, 또는 10년 미만에 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물)에 제공된다. 일부 실시형태에서, 제2 조성물은 1분 내지 20년 또는 이들 사이의 임의의 시간에 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물)에게 제공된다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 후의 세포에서의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 수준과 비교하여 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 세포에게 제공한 후의 세포에서의 소정의 수준의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 생성 방법은: 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물을 세포에 제공하는 단계로서, 세포가 제1 조성물을 제공한 이후의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준을 포함하는 단계; 및 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 세포에 제공하는 단계로서, 세포가 적어도 제2 조성물을 제공한 이후의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준을 포함하는 단계를 포함하며, 그럼으로써 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후의 세포 내의 선형 대응물의 수준과 비교하여 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후의 세포 내의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준을 유지한다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 후의 세포에서의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 수준과 비교하여 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 세포에게 제공한 후의 세포에서의 소정의 수준의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 생성 방법은: 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물을 세포에 제공하는 단계로서, 세포가 제1 조성물을 제공한 이후의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준을 포함하는 단계; 및 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 세포에 제공하는 단계로서, 세포가 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준의 20%를 넘게 차이나지 않는 제2 조성물을 제공한 이후의 단백질의 수준을 포함하는 단계를 포함하며; 그럼으로써 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물이 제공된 이후의 세포 내의 선형 대응물의 수준과 비교하여 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물이 제공된 이후의 세포 내의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준을 유지한다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 후의 대상체(예를 들어, 포유동물)에서의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 수준과 비교하여 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 대상체(예를 들어, 포유동물)에게 제공한 후의 대상체(예를 들어, 포유동물)에서의 소정의 수준의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 생성 방법은: 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물을 대상체(예를 들어, 포유동물)에게 제공(예를 들어, 투여)하는 단계로서, 대상체(예를 들어, 포유동물)가 제1 조성물이 제공(예를 들어, 투여)된 후에 소정의 수준의 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 단계; 및 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 대상체(예를 들어, 포유동물)에게 제공(예를 들어, 투여)하는 단계로서, 대상체(예를 들어, 포유동물)가 제2 조성물이 제공(예를 들어, 투여)된 후에 적어도 소정의 수준의 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 단계를 포함하며, 그럼으로써 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물이 제공(예를 들어, 투여)된 이후의 대상체(예를 들어, 포유동물) 내의 선형 대응물의 수준과 비교하여 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물이 제공(예를 들어, 투여)된 이후의 대상체(예를 들어, 포유동물) 내의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준을 유지한다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 후의 대상체(예를 들어, 포유동물)에서의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 수준과 비교하여 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 대상체(예를 들어, 포유동물)에게 제공한 후의 대상체(예를 들어, 포유동물)에서의 소정의 수준의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 생성 방법은: 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물을 대상체(예를 들어, 포유동물, 예를 들어, 인간)에게 제공(예를 들어, 투여)하는 단계로서, 대상체(예를 들어, 포유동물)가 제1 조성물이 제공(예를 들어, 투여)된 후에 소정의 수준의 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 단계; 및 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 대상체(예를 들어, 포유동물)에게 제공(예를 들어, 투여)하는 단계로서, 대상체(예를 들어, 포유동물)가 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준의 20%를 넘게 차이나지 않는 제2 조성물이 제공(예를 들어, 투여)된 후의 단백질의 수준을 포함하는 단계를 포함하며, 그럼으로써 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물이 제공(예를 들어, 투여)된 이후의 대상체(예를 들어, 포유동물) 내의 선형 대응물의 수준과 비교하여 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물이 제공(예를 들어, 투여)된 이후의 대상체(예를 들어, 포유동물) 내의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준을 유지한다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 후의 세포에서의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 수준과 비교하여 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 세포에게 제공한 후의 세포에서의 소정의 수준의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 생성 방법은: 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물을 세포에 제공하는 단계로서, 세포가 제1 조성물을 제공한 이후의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준을 포함하는 단계; 및 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 세포에 제공하는 단계로서, 세포가 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준의 1%, 5%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 또는 50%를 넘게 차이나지 않는 제2 조성물이 제공된 이후의 단백질의 수준을 포함하는 단계를 포함하며, 그럼으로써 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후의 세포 내의 선형 대응물의 수준과 비교하여 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후의 세포 내의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준을 유지한다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 후의 대상체(예를 들어, 포유동물)에서의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 수준과 비교하여 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 대상체(예를 들어, 포유동물, 예를 들어, 인간)에게 제공한 후의 대상체(예를 들어, 포유동물)에서의 소정의 수준의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 생성 방법은: 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물을 대상체(예를 들어, 포유동물)에게 제공(예를 들어, 투여)하는 단계로서, 대상체(예를 들어, 포유동물)가 제1 조성물이 제공(예를 들어, 투여)된 후에 소정의 수준의 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 단계; 및 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 대상체(예를 들어, 포유동물)에게 제공(예를 들어, 투여)하는 단계로서, 대상체(예를 들어, 포유동물)가 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준의 1%, 5%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 또는 50% 를 넘게 차이나지 않는 제2 조성물이 제공(예를 들어, 투여)된 후의 단백질의 수준을 포함하는 단계를 포함하며, 그럼으로써 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후의 대상체(예를 들어, 포유동물) 내의 선형 대응물의 수준과 비교하여 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후의 대상체(예를 들어, 포유동물) 내의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준을 유지한다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 외인성 합성 원형 폴리리보뉴클레오티드이다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 폴리-A 서열, 복제 요소, 또는 둘 모두를 결여한다.
일부 실시형태에서, 제1 조성물은 제1 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하고 제2 조성물은 제2 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하며, 제1 원형 폴리리보뉴클레오티드와 제2 원형 폴리리보뉴클레오티드는 동일하다. 일부 실시형태에서, 제1 조성물은 제1 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하고 제2 조성물은 제2 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하며, 제1 원형 폴리리보뉴클레오티드와 제2 원형 폴리리보뉴클레오티드는 상이하다.
또한, 제2 조성물은 제1 조성물을 제공한 후에, 그리고 제1 조성물로부터의 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물, 예를 들어, 인간)에서의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준이 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물, 예를 들어, 인간)에서 실질적으로 검출 불가능하게 되기 전에 제공될 수 있다. 일부 실시형태에서, 제2 조성물은 제1 조성물에 의해 생성된 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물, 예를 들어, 인간) 내의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준이 실질적으로 검출 불가능하게 된 지 적어도 1분, 1시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 7일, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 8개월, 10개월, 또는 1년 후에 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물)에 제공(예를 들어, 투여)된다. 일부 실시형태에서, 제2 조성물은 제1 조성물에 의해 생성되는 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물)에서의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준이 실질적으로 검출 불가능한 후 1분 내지 20년 또는 이들 사이의 임의의 시간에 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물, 예를 들어, 인간)에게 제공된다(예를 들어, 투여된다). 일부 실시형태에서, 제2 조성물은 제1 조성물의 이후 적어도 1분, 1시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 7일, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 8개월, 10개월, 또는 1년 후에 그리고 제1 조성물의 이후 20년, 15년, 또는 10년 미만에 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물, 예를 들어, 인간)에 제공된다. 일부 실시형태에서, 제2 조성물은 1분 내지 20년 또는 이들 사이의 임의의 시간에 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물, 예를 들어, 인간)에게 제공(예를 들어, 투여)된다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 후의 세포에서의 결합의 수준과 비교하여 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 세포에게 제공한 후의 세포에서의 표적의 결합 방법은: 단백질을 인코딩하는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물을 세포에게 제공하는 단계로서, 세포가 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물을 제공한 후에 소정의 수준의 결합을 포함하는 단계; 및 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 제1 조성물 이후에 세포에게 제공하는 단계로서, 세포가 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 제공한 후에 적어도 소정의 수준의 결합을 포함하는 단계를 포함하며, 그럼으로써 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후의 세포 내의 결합의 수준과 비교하여 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후의 세포 내의 결합의 발현 수준을 유지한다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 후의 세포에서의 단백질의 수준과 비교하여 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 세포에게 제공한 후의 세포에서의 표적으로의 결합 방법은: 단백질을 인코딩하는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물을 세포에게 제공하는 단계로서, 세포가 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물을 제공한 후에 소정의 수준의 단백질을 포함하는 단계; 및 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 제1 조성물 이후에 세포에게 제공하는 단계로서, 세포가 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 제공한 후에 소정의 수준의 20%를 넘게 차이나지 않는 수준의 결합을 포함하는 단계를 포함하며, 그럼으로써 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후의 세포 내의 결합의 수준과 비교하여 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후의 세포 내의 단백질의 수준을 유지한다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 후의 대상체(예를 들어, 포유동물)에서의 결합의 수준과 비교하여 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 대상체(예를 들어, 포유동물, 예를 들어, 인간)에게 제공한 후의 대상체(예를 들어, 포유동물)에서의 표적 결합 방법은: 단백질을 인코딩하는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물을 대상체(예를 들어, 포유동물, 예를 들어, 인간)에게 제공(예를 들어, 투여)하는 단계로서, 대상체(예를 들어, 포유동물)가 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물이 제공(예를 들어, 투여)된 후에 소정의 수준의 결합을 포함하는 단계; 및 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 제1 조성물 이후에 대상체(예를 들어, 포유동물)에게 제공(예를 들어, 투여)하는 단계로서, 대상체(예를 들어, 포유동물)가 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 제공한 후에 적어도 소정의 수준의 결합을 포함하는 단계를 포함하며, 그럼으로써 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물이 제공(예를 들어, 투여)된 이후의 대상체(예를 들어, 포유동물) 내의 결합의 수준과 비교하여 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물이 제공(예를 들어, 투여)된 이후의 대상체(예를 들어, 포유동물) 내의 결합의 발현 수준을 유지한다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 후의 대상체(예를 들어, 포유동물)에서의 단백질의 수준과 비교하여 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 대상체(예를 들어, 포유동물)에게 제공한 후의 대상체(예를 들어, 포유동물)에서의 표적으로의 결합 방법은: 단백질을 인코딩하는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물을 대상체(예를 들어, 포유동물, 예를 들어, 인간)에게 제공(예를 들어, 투여)하는 단계로서, 대상체(예를 들어, 포유동물)가 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물이 제공(예를 들어, 투여)된 후에 소정의 수준의 단백질을 포함하는 단계; 및 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 제1 조성물 이후에 대상체(예를 들어, 포유동물)에게 제공(예를 들어, 투여)하는 단계로서, 대상체(예를 들어, 포유동물)가 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물이 제공(예를 들어, 투여)된 후의 수준의 20%를 넘게 차이나지 않는 결합의 수준을 포함하는 단계를 포함하며, 그럼으로써 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공(예를 들어, 투여)한 이후의 대상체(예를 들어, 포유동물) 내의 단백질의 수준과 비교하여 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공(예를 들어, 투여)한 이후의 대상체(예를 들어, 포유동물) 내의 결합의 수준을 유지한다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 후의 세포에서의 결합의 수준과 비교하여 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 세포에게 제공한 후의 세포에서의 소정의 수준의 결합의 생성 방법은: 결합 부위를 포함하는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물을 세포에게 제공하는 단계로서, 상기 세포가 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물이 제공된 후에 소정의 수준의 표적으로의 결합을 포함하는 단계; 및 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 제1 조성물 이후에 세포에게 제공하는 단계로서, 세포가 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물이 제공된 후의 수준의 1%, 5%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 또는 50% 를 넘게 차이나지 않는 결합의 수준을 포함하는 단계를 포함하며, 그럼으로써 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후의 세포 내의 결합의 수준과 비교하여 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후의 세포 내의 결합의 발현 수준을 유지한다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 후의 대상체(예를 들어, 포유동물)에서의 결합의 수준과 비교하여 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 대상체(예를 들어, 포유동물, 예를 들어, 인간)에게 제공한 후의 대상체(예를 들어, 포유동물)에서의 표적 결합 방법은: 단백질을 인코딩하는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물을 대상체(예를 들어, 포유동물, 예를 들어, 인간)에게 제공(예를 들어, 투여)하는 단계로서, 대상체(예를 들어, 포유동물)가 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물이 제공(예를 들어, 투여)된 후에 소정의 수준의 결합을 포함하는 단계; 및 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 제1 조성물 이후에 대상체(예를 들어, 포유동물)에게 제공(예를 들어, 투여)하는 단계로서, 대상체(예를 들어, 포유동물)가 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물이 제공(예를 들어, 투여)된 후에 적어도 소정의 수준의 결합을 포함하는 단계를 포함하며, 그럼으로써 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후의 대상체(예를 들어, 포유동물) 내의 결합의 수준과 비교하여 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후의 대상체(예를 들어, 포유동물) 내의 결합의 발현 수준을 유지한다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 후의 대상체(예를 들어, 포유동물)에서의 단백질의 수준과 비교하여 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 대상체(예를 들어, 포유동물)에게 제공한 후의 대상체(예를 들어, 포유동물)에서의 표적으로의 결합 방법은: 단백질을 인코딩하는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물을 대상체(예를 들어, 포유동물)에게 제공(예를 들어, 투여)하는 단계로서, 대상체(예를 들어, 포유동물)가 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물이 제공(예를 들어, 투여)된 후에 소정의 수준의 단백질을 포함하는 단계; 및 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 제1 조성물 이후에 대상체(예를 들어, 포유동물)에게 제공(예를 들어, 투여)하는 단계로서, 대상체(예를 들어, 포유동물)가 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물이 제공(예를 들어, 투여)된 후의 수준의 20%를 넘게 차이나지 않는 결합의 수준을 포함하는 단계를 포함하며, 그럼으로써 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후의 대상체(예를 들어, 포유동물) 내의 단백질의 수준과 비교하여 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후의 대상체(예를 들어, 포유동물) 내의 결합의 수준을 유지한다.
또한, 제2 조성물은 제1 조성물을 제공한 후에, 그리고 제1 조성물에 의해 생성되는 단백질의 수준이 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물)에서 실질적으로 검출 불가능하게 된 후에 제공될 수 있다. 일부 실시형태에서, 제2 조성물은 제1 조성물에 의해 생성된 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물, 예를 들어, 인간) 내의 결합의 수준이 실질적으로 검출 불가능하게 된 지 적어도 1분, 1시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 7일, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 8개월, 10개월, 또는 1년 후에 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물)에 제공(예를 들어, 투여)된다. 일부 실시형태에서, 제2 조성물은 제1 조성물에 의해 생성되는 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물)에서의 결합의 수준이 실질적으로 검출 불가능한 후 1분 내지 20년 또는 이들 사이의 임의의 시간에 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물, 예를 들어, 인간)에게 제공된다(예를 들어, 투여된다). 일부 실시형태에서, 제2 조성물은 제1 조성물의 이후 적어도 1분, 1시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 7일, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 8개월, 10개월, 또는 1년 후에 그리고 제1 조성물의 이후 20년, 15년, 또는 10년 미만에 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물, 예를 들어, 인간)에 (예를 들어, 투여)제공된다. 일부 실시형태에서, 제2 조성물은 1분 내지 20년 또는 이들 사이의 임의의 시간에 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물, 예를 들어, 인간)에게 제공(예를 들어, 투여)된다.
일부 실시형태에서, 재투여 요법 또는 방법에서 제1 조성물 및 제2 조성물은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 하나 이상의 추가의 조성물로 이어질 수 있다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 추가의 조성물은 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10 또는 그 이상의 조성물을 포함한다. 재투여를 위하여, 하나 이상의 추가의 조성물은 이전의 조성물을 제공한 후에, 그리고 이전의 조성물(들)에 의해 생성되는 원형 폴리리보뉴클레오티드, 결합 또는 단백질의 수준이 복수의 세포에서(예를 들어, 대상체에서) 실질적으로 검출 불가능하게 된 후에 제공될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 추가의 조성물은 이전의 조성물에 의해 생성된 원형 폴리리보뉴클레오티드, 그것에 의해 생성된 결합, 또는 그것에 의해 발현된 단백질의 수준이 실질적으로 검출 불가능하게 된 후 적어도 1분째, 1시간째, 1일째, 2일째, 3일째, 4일째, 5일째, 7일째, 2주째, 3주째, 4주째, 5주째, 6주째, 2개월째, 3개월째, 4개월째, 5개월째, 6개월째, 8개월째, 10개월째 또는 1년째에 세포 또는 복수에게 제공된다. 재투여를 위하여, 하나 이상의 추가의 조성물은 이전의 조성물을 제공한 후에 제공될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 추가의 조성물은 이전의 조성물(들)을 제공한 후 적어도 1분째, 1시간째, 1일째, 2일째, 3일째, 4일째, 5일째, 7일째, 2주째, 3주째, 4주째, 5주째, 6주째, 2개월째, 3개월째, 4개월째, 5개월째, 6개월째, 8개월째, 10개월째 또는 1년째에 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물)에게 제공된다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 추가의 조성물은 이전의 조성물(들)을 제공한 후 1분째 내지 20년째에 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물)에게 제공된다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 추가의 조성물은 이전의 조성물(들)을 제공한 후 적어도 1분째, 1시간째, 1일째, 2일째, 3일째, 4일째, 5일째, 7일째, 2주째, 3주째, 4주째, 5주째, 6주째, 2개월째, 3개월째, 4개월째, 5개월째, 6개월째, 8개월째, 10개월째, 또는 1년째, 그러나 20년째 이하, 15년째, 또는 10년째에 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물)에게 제공된다.
일부 실시형태에서, 제2 조성물은 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물)에서의 단백질의 수준이 제1 조성물을 투여하거나 제공하기 전의 대략적인 단백질의 수준으로 복귀한 후에 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물, 예를 들어, 인간)에게 투여되거나 제공된다. 일부 실시형태에서, 제2 조성물은 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물)에서의 단백질의 수준이 제1 조성물을 투여하거나 제공하기 전의 대략적 단백질의 수준으로 복귀한 후 적어도 1분째, 1시간째, 1일째, 2일째, 3일째, 4일째, 5일째, 7일째, 2주째, 3주째, 4주째, 5주째, 6주째, 2개월째, 3개월째, 4개월째, 5개월째, 6개월째, 8개월째, 10개월째 또는 1년째에 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물)에게 제공된다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 추가의 조성물 중 제3 조성물은 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물)에서의 단백질의 수준이 제1 조성물을 투여하거나 제공하기 전의 대략적 단백질의 수준으로 복귀한 후에 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물)에게 투여되거나 제공된다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 추가의 조성물 중 제3 조성물은 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물)에서의 단백질의 수준이 제1 조성물을 투여하거나 제공하기 전의 대략적 단백질의 수준으로 복귀한 후 적어도 1분째, 1시간째, 1일째, 2일째, 3일째, 4일째, 5일째, 7일째, 2주째, 3주째, 4주째, 5주째, 6주째, 2개월째, 3개월째, 4개월째, 5개월째, 6개월째, 8개월째, 10개월째 또는 1년째에 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물)에게 투여되거나 제공된다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 추가의 조성물 중 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10 이상의 조성물은 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물)에서의 단백질의 수준이 제1 조성물을 투여하거나 제공하기 전의 대략적 단백질의 수준으로 복귀한 후에 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물)에게 투여되거나 제공된다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 추가의 조성물 중 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10 이상의 조성물은 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물)에서의 단백질의 수준이 제1 조성물을 투여하거나 제공하기 전의 대략적 단백질의 수준으로 복귀한 후 적어도 1분째, 1시간째, 1일째, 2일째, 3일째, 4일째, 5일째, 7일째, 2주째, 3주째, 4주째, 5주째, 6주째, 2개월째, 3개월째, 4개월째, 5개월째, 6개월째, 8개월째, 10개월째 또는 1년째에 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물)에게 투여되거나 제공된다. 일부 실시형태에서, 상기 기술된 바와 같은 조성물은 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물)에서의 단백질의 수준이 제1 조성물을 투여하거나 제공하기 전의 대략적 단백질의 수준으로 복귀한 후 1분째 내지 20년째에 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물)에게 투여되거나 제공된다.
일부 실시형태에서, 제2 조성물은 제1 조성물을 제공한 후에 세포에게 투여되거나 제공된다. 일부 실시형태에서, 제2 조성물은 제1 조성물을 제공한 이후 적어도 1분, 1시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 7일, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 8개월, 10개월, 또는 1년 후에 세포에 제공된다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 추가의 조성물 중 제3 조성물은 제1 조성물을 제공한 후에 세포에게 투여되거나 제공된다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 추가의 조성물 중 제3 조성물은 제1 조성물을 제공한 후 적어도 1분째, 1시간째, 1일째, 2일째, 3일째, 4일째, 5일째, 7일째, 2주째, 3주째, 4주째, 5주째, 6주째, 2개월째, 3개월째, 4개월째, 5개월째, 6개월째, 8개월째, 10개월째 또는 1년째에 세포에게 투여되거나 제공된다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 추가의 조성물 중 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10 이상의 조성물은 제1 조성물을 제공한 후에 세포에게 투여되거나 제공된다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 추가의 조성물 중 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10 이상의 조성물은 제1 조성물을 제공한 후 적어도 1분째, 1시간째, 1일째, 2일째, 3일째, 4일째, 5일째, 7일째, 2주째, 3주째, 4주째, 5주째, 6주째, 2개월째, 3개월째, 4개월째, 5개월째, 6개월째, 8개월째, 10개월째 또는 1년째에 세포에게 투여되거나 제공된다. 일부 실시형태에서, 상기 기술된 바와 같은 조성물은 제1 조성물을 제공한 후 1분째 내지 20년째에 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물)에게 투여되거나 제공된다.
일부 실시형태에서, 조성물은 이전의 조성물을 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물)에게 제공하거나 투여한 이후 소정의 시간 간격 후에 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물)에게 투여되거나 제공된다. 예를 들어, 제2 조성물은 제1 조성물을 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물)에게 투여하거나 제공한 후 제1 시간 간격 후에 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물)에게 투여되거나 제공될 수 있거나; 제3 조성물은 제2 조성물을 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물)에게 투여하거나 제공한 후 제2 시간 간격 후에 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물)에게 투여되거나 제공될 수 있거나; 제4 조성물은 제3 조성물을 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물)에게 투여하거나 제공한 후 제3 시간 간격 후에 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물)에게 투여되거나 제공될 수 있거나; 제5, 제6, 제7, 제8, 제9 이상의 조성물은 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9 이상의 조성물을 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물)에게 투여하거나 제공한 후 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9 이상의 시간 간격 후에 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물)에게 투여되거나 제공될 수 있다. 제1 시간 간격은 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물)에서의 단백질의 수준이 제1 조성물을 투여하거나 제공하기 전의 대략적 단백질의 수준으로 복귀하는데 필요한 시간의 양보다 더 길 수 있다.
일부 실시형태에서, 제2 시간 간격은 제1 시간 간격보다 더 길다. 일부 실시형태에서, 제3 시간 간격은 제1 시간 간격보다 더 길다. 일부 실시형태에서, 제4 시간 간격은 제1 시간 간격보다 더 길다. 일부 실시형태에서, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10 이상의 시간 간격은 제1 시간 간격보다 더 길다. 일부 실시형태에서, 제2 시간 간격은 제1 시간 간격과 동일하다. 일부 실시형태에서, 제3 시간 간격은 제1 시간 간격과 동일하다. 일부 실시형태에서, 제4 시간 간격은 제1 시간 간격과 동일하다. 일부 실시형태에서, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10 이상의 시간 간격은 제1 시간 간격과 동일하다. 일부 실시형태에서, 제2 시간 간격은 제1 시간 간격보다 더 짧다. 일부 실시형태에서, 제3 시간 간격은 제1 시간 간격보다 더 짧다. 일부 실시형태에서, 제4 시간 간격은 제1 시간 간격보다 더 짧다. 일부 실시형태에서, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10 이상의 시간 간격은 제1 시간 간격보다 더 짧다. 일부 실시형태에서, 제2 시간 간격은 제1 시간 간격보다 더 길다. 일부 실시형태에서, 제3 시간 간격은 제2 시간 간격보다 더 길다. 일부 실시형태에서, 제4 시간 간격은 제3 시간 간격보다 더 길다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물이 제공된 후의 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물) 내의 단백질의 수준은 적어도 1시간, 12시간, 18시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 15일, 20일, 25일, 또는 30일 동안 유지된다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후의 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물) 내의 단백질의 수준은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물) 내의 단백질의 수준보다 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 60% 높다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후의 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물) 내의 단백질의 수준은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 제공한 이후 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 15일, 20일, 25일, 30일, 40일, 또는 45일 동안 원형의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후의 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물) 내의 단백질의 수준보다 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 60% 높다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물이 제공된 후의 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물) 내의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준은 적어도 1시간, 12시간, 18시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 15일, 20일, 25일, 또는 30일 동안 유지된다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후의 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물) 내의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물) 내의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 수준보다 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 60% 높다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후의 복수의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 제공한 이후 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 15일, 20일, 25일, 30일, 40일, 또는 45일 동안 원형의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후의 복수의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 수준보다 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 60% 높다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물이 제공된 후의 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물) 내의 결합의 수준은 적어도 1시간, 12시간, 18시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 15일, 20일, 25일, 또는 30일 동안 유지된다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후의 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물) 내의 결합의 수준은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후 세포 또는 대상체(예를 들어, 포유동물) 내의 결합의 수준보다 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 60% 높다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후의 복수의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 제공한 이후 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 15일, 20일, 25일, 30일, 40일, 또는 45일 동안 원형의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후의 복수의 결합의 수준보다 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 60% 높다.
원형 폴리리보뉴클레오티드
본원에 기술된 원형 폴리리보뉴클레오티드 및 그의 조성물 또는 약제학적 조성물은 적어도 2회 용량의 원형 폴리리보뉴클레오티드를 복수의 세포에게 제공한 후에 복수의 세포에서 소정의 수준의 원형 폴리리보뉴클레오티드, 소정의 수준의 표적으로의 결합, 또는 소정의 수준의 단백질을 생성하기 위하여 치료적 및 수의학적 투여 방법에서 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 포유동물, 예를 들어, 인간에서 비-면역원성이다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 수산양식 동물(어류, 게류, 새우, 굴 등) 유래의 세포, 포유동물 세포, 예를 들어, 애완동물 또는 동물원 동물(고양이, 개, 도마뱀, 조류, 사자, 호랑이 및 곰 등) 유래의 세포, 농장 또는 일하는 동물(말, 소, 돼지, 닭 등) 유래의 세포, 인간 세포, 배양된 세포, 일차 세포 또는 세포주, 줄기 세포, 전구 세포, 분화된 세포, 생식 세포, 암 세포(예를 들어, 종양형성, 전이성), 비-종양형성 세포(정상 세포), 태아 세포, 배아 세포, 성인 세포, 유사분열 세포, 비-유사분열 세포 또는 그의 임의의 조합에서 복제 가능하거나, 복제된다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 본원에 기술된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 세포를 포함하며, 세포는 수산양식 동물(어류, 게류, 새우, 굴 등) 유래의 세포, 포유동물 세포, 예를 들어, 애완동물 또는 동물원 동물(고양이, 개, 도마뱀, 조류, 사자, 호랑이 및 곰 등) 유래의 세포, 농장 또는 일하는 동물(말, 소, 돼지, 닭 등) 유래의 세포, 인간 세포, 배양된 세포, 일차 세포 또는 세포주, 줄기 세포, 전구 세포, 분화된 세포, 생식 세포, 암 세포(예를 들어, 종양형성, 전이성), 비-종양형성 세포(정상 세포), 태아 세포, 배아 세포, 성인 세포, 유사분열 세포, 비-유사분열 세포 또는 그의 임의의 조합이다. 일부 실시형태에서, 세포는 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하도록 변형된다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 발현 생성물을 위한 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 표적에 결합하기 위한 결합 부위를 포함한다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 임의의 투여, 시간차 투여 또는 본원에 기술된 재투여 방법을 통해 복수의 세포에게 제공된다. 일부 실시형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 원형 폴리리보뉴클레오티드는 대상체에서 소정의 반응 또는 반응 수준을 유도한다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드에 포함된 서열에 의해 인코딩되는 발현 생성물은 복수의 세포 중 하나 이상의 세포에서 발현된다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 적어도 선형 대응물, 예를 들어, 선형 발현 서열 또는 선형의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 반감기를 갖는다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 선형 대응물의 것보다 증가된 반감기를 갖는다. 일부 실시형태에서, 반감기는 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50% 또는 그를 초과하여 크다.일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 적어도 약 1시간 내지 약 30일 또는 적어도 약 2시간, 6시간, 12시간, 18시간, 24시간, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 21일, 22일, 23일, 24일, 25일, 26일, 27일, 28일, 29일, 30일, 60일 또는 그 초과 또는 그 사이의 임의의 시간 동안 세포에서 반감기 또는 지속성을 갖는다. 특정 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 약 10분 내지 약 7일 이하 또는 약 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 13시간, 14시간, 15시간, 16시간, 17시간, 18시간, 19시간, 20시간, 21시간, 22시간, 24시간, 36시간, 48시간, 60시간, 72시간, 4일, 5일, 6일, 7일 이하 또는 그 사이의 임의의 시간 동안 세포에서 반감기 또는 지속성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 세포가 분열하는 동안 세포에서 반감기 또는 지속성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 분열 후에 세포에서 반감기 또는 지속성을 갖는다. 특정 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 약 10분 내지 약 30일 초과 또는 적어도 약 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 13시간, 14시간, 15시간, 16시간, 17시간, 18시간, 24시간, 2일, 3,일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 21일, 22일, 23일, 24일, 25일, 26일, 27일, 28일, 29일, 30일, 60일 또는 그 초과 또는 그 사이의 임의의 시간 동안 분열 중인 세포에서 반감기 또는 지속성을 갖는다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 세포 기능을 예를 들어, 일시적으로 또는 장기간 조절한다. 특정 실시형태에서, 세포 기능은 안정하게 변경되며, 예컨대 조절은 적어도 약 1시간 내지 약 30일, 또는 적어도 약 2시간, 6시간, 12시간, 18시간, 24시간, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 21일, 22일, 23일, 24일, 25일, 26일, 27일, 28일, 29일, 30일, 60일 이상 또는 그 사이의 임의의 시간 동안 지속된다. 특정 실시형태에서, 세포 기능은 일시적으로 변경되며, 예를 들어, 예컨대 조절은 약 30분 이하 내지 약 7일 또는 약 1시간 이하, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 13시간, 14시간, 15시간, 16시간, 17시간, 18시간, 19시간, 20시간, 21시간, 22시간, 24시간, 36시간, 48시간, 60시간, 72시간, 4일, 5일, 6일, 7일 또는 그 사이의 임의의 시간 동안 지속된다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 적어도 약 20개 뉴클레오티드, 적어도 약 30개 뉴클레오티드, 적어도 약 40개 뉴클레오티드, 적어도 약 50개 뉴클레오티드, 적어도 약 75개 뉴클레오티드, 적어도 약 100개 뉴클레오티드, 적어도 약 200개 뉴클레오티드, 적어도 약 300개 뉴클레오티드, 적어도 약 400개 뉴클레오티드, 적어도 약 500개 뉴클레오티드, 적어도 약 1,000개 뉴클레오티드, 적어도 약 2,000개 뉴클레오티드, 적어도 약 5,000개 뉴클레오티드, 적어도 약 6,000개 뉴클레오티드, 적어도 약 7,000개 뉴클레오티드, 적어도 약 8,000개 뉴클레오티드, 적어도 약 9,000개 뉴클레오티드, 적어도 약 10,000개 뉴클레오티드, 적어도 약 12,000개 뉴클레오티드, 적어도 약 14,000개 뉴클레오티드, 적어도 약 15,000개 뉴클레오티드, 적어도 약 16,000개 뉴클레오티드, 적어도 약 17,000개 뉴클레오티드, 적어도 약 18,000개 뉴클레오티드, 적어도 약 19,000개 뉴클레오티드 또는 적어도 약 20,000개 뉴클레오티드이다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 리보솜에 대한 결합 부위를 수용하기에 충분한 크기의 것일 수 있다. 당업자는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 최대 크기가 원형 폴리리보뉴클레오티드의 생성 및/또는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 이용의 기술적 제약 내에 있는 것만큼 클 수 있음을 인식할 수 있다. 이론에 구속되지는 않지만, RNA의 다수의 세그먼트가 DNA로부터 생성될 수 있고, 그들의 5' 및 3' 자유 말단은 어닐링되어, RNA의 "스트링"을 생성하는 것이 가능하며, 이는 궁극적으로 오직 하나의 5' 및 하나의 3' 자유 말단이 남아있을 때 원형화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 최대 크기는 RNA의 패키징 및 표적으로의 운반 능력에 의해 제한될 수 있다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 크기는 유용한 폴리펩티드를 인코딩하기에 충분한 길이이며, 이에 따라, 적어도 20,000개 뉴클레오티드, 적어도 15,000개 뉴클레오티드, 적어도 10,000개 뉴클레오티드, 적어도 7,500개 뉴클레오티드 또는 적어도 5,000개 뉴클레오티드, 적어도 4,000개 뉴클레오티드, 적어도 3,000개 뉴클레오티드, 적어도 2,000개 뉴클레오티드, 적어도 1,000개 뉴클레오티드, 적어도 500개 뉴클레오티드, 적어도 400개 뉴클레오티드, 적어도 300개 뉴클레오티드, 적어도 200개 뉴클레오티드, 또는 적어도 100개 뉴클레오티드의 길이가 유용할 수 있다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 하나 이상의 발현 서열을 포함하며, 생체내에서 대상체의 세포 내의 지속적인 발현을 위해 구성된다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 나중의 시점에서의 세포 내의 하나 이상의 발현 서열의 발현이 조기의 시점과 동일하거나, 그보다 더 크도록 구성된다. 이러한 실시형태에서, 하나 이상의 발현 서열의 발현은 상대적으로 안정한 수준으로 유지될 수 있거나, 시간이 지남에 따라 증가할 수 있다. 발현 서열의 발현은 연장된 기간 동안 상대적으로 안정할 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, 적어도 7일, 8일, 9일, 10일, 12일, 14일, 16일, 18일, 20일, 22일, 23일 또는 그 초과의 기간에 걸친 세포 내의 하나 이상의 발현 서열의 발현은 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10% 또는 5% 만큼 감소하지 않는다. 일부 경우에, 일부 경우에, 세포에서의 하나 이상의 발현 서열의 발현은 적어도 7일, 8일, 9일, 10일, 12일, 14일, 16일, 18일, 20일, 22일, 23일 또는 그 초과 동안 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10% 또는 5%를 초과하여 달라지지 않는 수준으로 유지된다.
발현 서열
원형 폴리리보뉴클레오티드의 적어도 2개의 조성물을 세포에 제공한 후에 세포에서 발현 서열로부터 소정의 수준의 단백질을 생성하는 투여 방법이 본원에 개시되며, 여기서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 단백질을 인코딩한다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 펩티드 또는 폴리펩티드를 인코딩하는 적어도 하나의 발현 서열을 포함한다. 이러한 펩티드는 소형 펩티드, 펩티드모방체(예를 들어, 펩토이드(peptoid)), 아미노산 및 아미노산 유사체를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 펩티드는 선형 또는 분지형일 수 있다. 이러한 펩티드는 몰당 약 5,000 그램 미만의 분자량, 몰당 약 2,000 그램 미만의 분자량, 몰당 약 1,000 그램 미만의 분자량, 몰당 약 500 그램 미만의 분자량, 및 이러한 화합물의 염, 에스테르, 및 다른 약제학적으로 허용 가능한 형태를 가질 수 있다. 이러한 펩티드는 신경전달물질, 호르몬, 약물, 독소, 바이러스 또는 미생물 입자, 합성 분자 및 그의 효능제 또는 길항제를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
폴리펩티드는 선형 또는 분지형일 수 있다. 폴리펩티드는 약 5개 내지 약 40,000개 아미노산, 약 15개 내지 약 35,000개 아미노산, 약 20개 내지 약 30,000개 아미노산, 약 25개 내지 약 25,000개 아미노산, 약 50개 내지 약 20,000개 아미노산, 약 100개 내지 약 15,000개 아미노산, 약 200개 내지 약 10,000개 아미노산, 약 500개 내지 약 5,000개 아미노산, 약 1,000개 내지 약 2,500개 아미노산 또는 그 사이의 임의의 범위의 길이를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 약 40,000개 미만의 아미노산, 약 35,000개 미만의 아미노산, 약 30,000개 미만의 아미노산, 약 25,000개 미만의 아미노산, 약 20,000개 미만의 아미노산, 약 15,000개 미만의 아미노산, 약 10,000개 미만의 아미노산, 약 9,000개 미만의 아미노산, 약 8,000개 미만의 아미노산, 약 7,000개 미만의 아미노산, 약 6,000개 미만의 아미노산, 약 5,000개 미만의 아미노산, 약 4,000개 미만의 아미노산, 약 3,000개 미만의 아미노산, 약 2,500개 미만의 아미노산, 약 2,000개 미만의 아미노산, 약 1,500개 미만의 아미노산, 약 1,000개 미만의 아미노산, 약 900개 미만의 아미노산, 약 800개 미만의 아미노산, 약 700개 미만의 아미노산, 약 600개 미만의 아미노산, 약 500개 미만의 아미노산, 약 400개 미만의 아미노산, 약 300개 미만의 아미노산 또는 그 미만의 길이를 갖는 폴리펩티드가 유용할 수 있다.
펩티드 또는 폴리펩티드의 일부 예는 형광 태그 또는 마커, 항원, 펩티드 치료제, 천연-생물활성 펩티드로부터의 합성 또는 유사체 펩티드, 효능제 또는 길항제 펩티드, 항-미생물 펩티드, 포어-형성 펩티드, 바이사이클릭 펩티드, 표적화 또는 세포독성 펩티드, 분해 또는 자가-파괴 펩티드, 및 분해 또는 자가-파괴 펩티드들을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 본원에 기술된 본 발명에 유용한 펩티드는 또한, 항원-결합 펩티드, 예를 들어, 항원 결합 항체 또는 항체-유사 단편, 예컨대 단일 쇄 항체, 나노바디(예를 들어, 문헌[Steeland et al. 2016. Nanobodies as therapeutics: big opportunities for small antibodies. Drug Discov Today: 21(7):1076-113] 참조)를 포함한다. 이러한 항원 결합 펩티드는 시토졸 항원, 핵 항원, 세포소기관-내 항원에 결합할 수 있다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 하나 이상의 RNA 발현 서열을 포함하며, 이의 각각은 폴리펩티드를 인코딩할 수 있다. 폴리펩티드는 상당한 양으로 생성될 수 있다. 따라서, 폴리펩티드는 생성될 수 있는 임의의 단백질성 분자일 수 있다. 폴리펩티드는 세포로부터 분비되거나, 세포의 세포질, 핵 또는 멤브레인 구획으로 국소화될 수 있는 폴리펩티드일 수 있다. 일부 폴리펩티드는 바이러스 외피 단백질, (예를 들어, 지질 또는 스테로이드 생성을 조절하는) 대사 조절 효소, 항원, 면역허용원(toleragen), 사이토카인, 독소, 그의 부재가 질병과 연관된 효소, 및 (예를 들어, 동물의 위에서) 절단될 때까지 동물에서 활성이 아닌 폴리펩티드 및 호르몬의 적어도 일부를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 단백질, 예를 들어, 치료적 단백질을 인코딩하는 발현 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 발현 서열의 발현 생성물은 단백질, 예를 들어, 치료적 단백질이다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 원형 폴리리보뉴클레오티드로부터 발현될 수 있는 치료적 단백질은 항산화 활성, 결합, 카고(cargo) 수용체 활성, 촉매적 활성, 분자 운반체 활성, 분자 기능 조절제, 분자 전달제 활성, 영양소 저장소 활성, 단백질 태그, 구조적 분자 활성, 독소 활성, 전사 조절제 활성, 번역 조절제 활성 또는 수송체 활성을 갖는다. 치료적 단백질의 일부 예는 효소 대체 단백질, 보충용 단백질, 단백질 백신접종, 항원(예를 들어, 종양 항원, 바이러스, 박테리아), 호르몬, 사이토카인, 항체, 면역요법제(예를 들어, 암), 세포 리프로그래밍(reprogramming)/전환분화 인자, 전사 인자, 키메라 항원 수용체, 전위효소 또는 뉴클레아제, (예를 들어, 면역 반응/신호에 대한 감수성에 영향을 미치는) 면역 이펙터, 조절된 사망 이펙터 단백질(예를 들어, 아폽토시스 또는 괴사의 유도제), 종양의 비-용해 저해제(예를 들어, 종양단백질의 저해제), 후성적 변형제, 후성적 효소, 전사 인자, DNA 또는 단백질 변형 효소, DNA-삽입제(DNA-intercalating agent), 유출 펌프 저해제, 핵 수용체 활성화제 또는 저해제, 프로테아좀 저해제, 효소에 대한 경쟁적 저해제, 단백질 합성 이펙터 또는 저해제, 뉴클레아제, 단백질 단편 또는 도메인, 리간드 또는 수용체, 및 CRISPR 시스템 또는 그의 성분을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 치료적 단백질은 항원이다. 일부 실시형태에서, 항원은 종양 항원, 박테리아 항원 또는 바이러스 항원이다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 원형 폴리리보뉴클레오티드로부터 발현될 수 있는 예시적인 단백질은 인간 단백질, 예를 들어, 수용체 결합 단백질, 호르몬, 성장 인자, 성장 인자 수용체 조절제 및 재생 단백질(예를 들어, 증식 및 분화에 연루되는 단백질, 예를 들어, 상처 치유를 위한 치료적 단백질)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 원형 폴리리보뉴클레오티드로부터 발현될 수 있는 예시적인 단백질은 EGF(상피 성장 인자)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 원형 폴리리보뉴클레오티드로부터 발현될 수 있는 예시적인 단백질은 효소, 예를 들어, 산화 환원 효소, 대사 효소, 미토콘드리아 효소, 옥시게나제, 데하이드로게나제, ATP-독립성 효소 및 불포화효소를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 원형 폴리리보뉴클레오티드로부터 발현될 수 있는 예시적인 단백질은 세포내 단백질 또는 시토졸 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 페닐알라닌 하이드록실라제를 발현한다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 NanoLuc® 루시퍼라제(nLuc)를 발현한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 원형 폴리리보뉴클레오티드로부터 발현될 수 있는 예시적인 단백질은 분비된 단백질, 예를 들어, 분비 효소를 포함한다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 에리트로포이에틴을 발현한다. 일부 경우에, 원형 폴리리보뉴클레오티드는, 혈중 짧은 반감기 치료제를 가질 수 있거나 하위세포 국소화 신호를 갖는 단백질 또는 분비 신호 펩티드를 갖는 단백질일 수 있는 분비 단백질을 발현한다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 가우시아 루시퍼라제(gLuc)를 발현한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 원형 폴리리보뉴클레오티드로부터 발현될 수 있는 예시적인 단백질은 막 단백질 또는 막횡단 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 막횡단 수용체, 예를 들어, G-단백질-커플링된 수용체(GPCR), 수용체 티로신 키나제(RTK), 항원 수용체 또는 키메라 항원 수용체를 발현한다. 일부 경우에, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 비-인간 단백질, 예를 들어, 형광 단백질, 에너지-전달 억셉터 또는 Flag, Myc 또는 His와 같은 단백질-태그를 발현한다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드로부터 발현될 수 있는 예시적인 단백질은 GFP를 포함한다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 태깅된 단백질, 예를 들어, 단백질 태그, 예를 들어, 키틴 결합 단백질(CBP), 말토스 결합 단백질(MBP), Fc 태그, 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST), AviTag(GLNDIFEAQKIEWHE), 칼모듈린(Calmodulin)-태그(KRRWKKNFIAVSAANRFKKISSSGAL); 폴리글루탐산염 태그(EEEEEE); E-태그(GAPVPYPDPLEPR); FLAG-태그(DYKDDDDK), HA-태그(YPYDVPDYA); His-태그(HHHHHH); Myc-태그(EQKLISEEDL); NE-태그(TKENPRSNQEESYDDNES); S-태그(KETAAAKFERQHMDS); SBP-태그(MDEKTTGWRGGHVVEGLAGELEQLRARLEHHPQGQREP); Softag 1(SLAELLNAGLGGS); Softag 3(TQDPSRVG); Spot-태그(PDRVRAVSHWSS); Strep-태그(Strep-tag II: WSHPQFEK); TC 태그(CCPGCC); Ty 태그(EVHTNQDPLD); V5 태그(GKPIPNPLLGLDST); VSV-태그(YTDIEMNRLGK); 또는 Xpress 태그(DLYDDDDK)를 함유하는 융합 단백질 또는 조작된 단백질을 발현한다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 항체, 예를 들어, 항체 단편 또는 그의 일부를 발현한다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드에 의해 발현되는 항체는 임의의 아이소타입, 예컨대 IgA, IgD, IgE, IgG, IgM의 것일 수 있다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 항체의 일부, 예컨대, 경쇄, 중쇄, Fc 단편, CDR(상보성 결정 영역), Fv 단편 또는 Fab 단편, 그의 추가의 부분을 발현한다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 항체의 하나 이상의 부분을 발현한다. 예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 1가지 초과의 발현 서열을 포함할 수 있으며, 그의 각각은 항체의 일부를 발현하며, 이의 합은 항체를 구성할 수 있다. 일부 경우에, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 항체의 중쇄를 코딩하는 하나의 발현 서열 및 항체의 경쇄를 코딩하는 또 다른 발현 서열을 포함한다. 일부 경우에, 원형 폴리리보뉴클레오티드가 세포 또는 무세포 환경에서 발현되는 경우에, 경쇄 및 중쇄는 적절한 변형, 폴딩 또는 다른 번역후 변형을 겪어 기능성 항체를 형성할 수 있다.
원형 폴리리보뉴클레오티드의 적어도 2개의 조성물을 세포에 제공한 후에 세포에서 소정의 수준의 단백질을 생성하는 투여 방법이 본원에 개시되며, 여기서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 단백질을 인코딩한다.
단백질은 세포내 단백질, 막 단백질 또는 분비된 단백질일 수 있다. 단백질은 세포로부터 분비되거나, 세포의 세포질, 핵 또는 멤브레인 구획으로 국소화될 수 있는 폴리펩티드일 수 있다. 단백질은 바이러스 외피 단백질, (예를 들어, 지질 또는 스테로이드 생성을 조절하는) 대사 조절 효소, 항원, 면역허용원(toleragen), 사이토카인, 독소, 그의 부재가 질병과 연관된 효소, 및 (예를 들어, 동물의 위에서) 절단될 때까지 동물에서 활성이 아닌 폴리펩티드 및 호르몬의 적어도 일부를 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 단백질은 치료적 단백질이다. 치료적 단백질은 항산화 활성, 결합, 카고(cargo) 수용체 활성, 촉매적 활성, 분자 운반체 활성, 분자 기능 조절제, 분자 전달제 활성, 영양소 저장소 활성, 단백질 태그, 구조적 분자 활성, 독소 활성, 전사 조절제 활성, 번역 조절제 활성 또는 수송체 활성을 가질 수 있다. 치료적 단백질의 일부 예는 효소 대체 단백질, 보충용 단백질, 단백질 백신접종, 항원(예를 들어, 종양 항원, 바이러스, 박테리아), 호르몬, 사이토카인, 항체, 면역요법제(예를 들어, 암), 세포 리프로그래밍(reprogramming)/전환분화 인자, 전사 인자, 키메라 항원 수용체, 전위효소 또는 뉴클레아제, (예를 들어, 면역 반응/신호에 대한 감수성에 영향을 미치는) 면역 이펙터, 조절된 사망 이펙터 단백질(예를 들어, 아폽토시스 또는 괴사의 유도제), 종양의 비-용해 저해제(예를 들어, 종양단백질의 저해제), 후성적 변형제, 후성적 효소, 전사 인자, DNA 또는 단백질 변형 효소, DNA-삽입제(DNA-intercalating agent), 유출 펌프 저해제, 핵 수용체 활성화제 또는 저해제, 프로테아좀 저해제, 효소에 대한 경쟁적 저해제, 단백질 합성 이펙터 또는 저해제, 뉴클레아제, 단백질 단편 또는 도메인, 리간드 또는 수용체, 및 CRISPR 시스템 또는 그의 성분을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 치료적 단백질은 인간 인자 VIII, 인간 인자 IX, REP1, 아데노신 데아미나제, 인간 NGF, 핵-인코딩된 ND4, SECRA2a, SUMO1, VEGF, PDE6A, p53, PBFD, ARSA, ABCD1, APOE4, RPGR, DCLRE1C, VEGF 165, PDGF-B, 감마-사르코글리칸(gamma-sarcoglycan), 디스트로핀(dystrophin), LAMP2B, CNGB3, 망막색소변성증 GTPase 조절제 또는 CLN6이다.
일부 실시형태에서, 단백질은 인간 단백질, 예를 들어, 수용체 결합 단백질, 호르몬, 성장 인자, 성장 인자 수용체 조절제 및 재생 단백질(예를 들어, 증식 및 분화에 연루되는 단백질, 예를 들어, 상처 치유를 위한 치료적 단백질)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단백질은 EGF(상피 성장 인자)이다. 일부 실시형태에서, 예시적인 단백질은 효소, 예를 들어, 산화환원효소, 대사 효소, 미토콘드리아 효소, 옥시게나제, 데하이드로게나제, ATP-독립성 효소 및 불포화효소를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 예시적인 단백질은 세포내 단백질 또는 시토졸 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 예시적인 단백질은 분비 단백질, 예를 들어, 분비 효소를 포함한다. 일부 경우에, 분비 단백질은 혈중 짧은 반감기 치료제를 가질 수 있거나 하위세포 국소화 신호를 갖는 단백질 또는 분비 신호 펩티드를 가질 수 있다. 일부 경우에, 단백질은 비-인간 단백질, 예를 들어, 형광 단백질, 에너지-전달 억셉터 또는 Flag, Myc 또는 His와 같은 단백질-태그를 발현한다. 일부 실시형태에서, 단백질은 태깅된 단백질, 예를 들어, 단백질 태그, 예를 들어, 키틴 결합 단백질(CBP), 말토스 결합 단백질(MBP), Fc 태그, 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST), AviTag(GLNDIFEAQKIEWHE), 칼모듈린(Calmodulin)-태그(KRRWKKNFIAVSAANRFKKISSSGAL); 폴리글루탐산염 태그(EEEEEE); E-태그(GAPVPYPDPLEPR); FLAG-태그(DYKDDDDK), HA-태그(YPYDVPDYA); His-태그(HHHHHH); Myc-태그(EQKLISEEDL); NE-태그(TKENPRSNQEESYDDNES); S-태그(KETAAAKFERQHMDS); SBP-태그(MDEKTTGWRGGHVVEGLAGELEQLRARLEHHPQGQREP); Softag 1(SLAELLNAGLGGS); Softag 3(TQDPSRVG); Spot-태그(PDRVRAVSHWSS); Strep-태그(Strep-tag II: WSHPQFEK); TC 태그(CCPGCC); Ty 태그(EVHTNQDPLD); V5 태그(GKPIPNPLLGLDST); VSV-태그(YTDIEMNRLGK); 또는 Xpress 태그(DLYDDDDK)를 함유하는 융합 단백질 또는 조작된 단백질을 발현한다.
일부 실시형태에서, 단백질은 항체, 예를 들어, 항체 단편 또는 그의 일부를 발현한다. 항체는 임의의 아이소타입, 예컨대 IgA, IgD, IgE, IgG, IgM의 것일 수 있다. 일부 실시형태에서, 단백질은 항체의 일부, 예컨대, 경쇄, 중쇄, Fc 단편, CDR(상보성 결정 영역), Fv 단편 또는 Fab 단편, 그의 추가의 부분을 발현한다. 일부 실시형태에서, 단백질은 항체의 하나 이상의 부분이다. 예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 1가지 초과의 발현 서열을 포함할 수 있으며, 그의 각각은 항체의 일부를 발현하며, 이의 합은 항체를 구성할 수 있다. 일부 경우에, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 항체의 중쇄를 코딩하는 하나의 발현 서열 및 항체의 경쇄를 코딩하는 또 다른 발현 서열을 포함한다. 일부 경우에, 원형 폴리리보뉴클레오티드가 세포 또는 무세포 환경에서 발현되는 경우에, 경쇄 및 중쇄는 적절한 변형, 폴딩 또는 다른 번역후 변형을 겪어 기능성 항체를 형성할 수 있다.
본 발명은 본원에 제공된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 적어도 하나의 영역을 번역하는 단계를 포함하는 단백질 발현 방법을 포함한다. 단백질 발현은 하나 이상의 세포에서, 예를 들어, 제1 조성물, 제2 조성물, 제3 조성물, 제4 조성물, 제5 조성물, 제6 조성물, 제7 조성물, 제8 조성물, 제9 조성물 또는 제10 조성물을 세포에게 제공한 후에 세포에서 발생할 수 있다.
일부 실시형태에서, 단백질 발현 방법은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 총 길이의 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%의, 폴리펩티드로의 번역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단백질 발현 방법은 적어도 5개 아미노산, 적어도 10개 아미노산, 적어도 15개 아미노산, 적어도 20개 아미노산, 적어도 50개 아미노산, 적어도 100개 아미노산, 적어도 150개 아미노산, 적어도 200개 아미노산, 적어도 250개 아미노산, 적어도 300개 아미노산, 적어도 400개 아미노산, 적어도 500개 아미노산, 적어도 600개 아미노산, 적어도 700개 아미노산, 적어도 800개 아미노산, 적어도 900개 아미노산 또는 적어도 1000개 아미노산의 폴리펩티드로의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 번역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단백질 발현 방법은 약 5개 아미노산, 약 10개 아미노산, 약 15개 아미노산, 약 20개 아미노산, 약 50개 아미노산, 약 100개 아미노산, 약 150개 아미노산, 약 200개 아미노산, 약 250개 아미노산, 약 300개 아미노산, 약 400개 아미노산, 약 500개 아미노산, 약 600개 아미노산, 약 700개 아미노산, 약 800개 아미노산, 약 900개 아미노산 또는 약 1000개 아미노산의 폴리펩티드로의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 번역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 방법은 본원에 제공된 바와 같은 연속 폴리펩티드, 본원에 제공된 바와 같은 별개의 폴리펩티드 또는 둘 모두로의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 번역을 포함한다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 적어도 하나의 영역의 번역은 시험관내, 예컨대 토끼 망상적혈구 용해물에서 일어난다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 적어도 하나의 영역의 번역은 생체내에서, 예를 들어, 진핵 세포의 트랜스펙션 또는 원핵 세포, 예컨대 박테리아의 형질전환 후에 일어난다. 일부 실시형태에서, 번역은 예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 조성물을 세포에게 제공한 후에 하나 이상의 세포에서 일어난다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 원형 폴리리보뉴클레오티드를 대상체의 세포에 투여하는 단계로서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 하나 이상의 발현 서열을 포함하는 단계; 및 세포 내에서 원형 폴리리보뉴클레오티드로부터 하나 이상의 발현 서열을 발현하는 단계를 포함하는, 대상체 내의 하나 이상의 발현 서열의 생체내 발현 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 나중의 시점에서의 세포 내의 하나 이상의 발현 서열의 발현이 조기의 시점과 동일하거나, 그보다 더 크도록 구성된다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 적어도 7일, 8일, 9일, 10일, 12일, 14일, 16일, 18일, 20일, 22일, 23일 또는 그 초과의 기간에 걸친 세포 내의 하나 이상의 발현 서열의 발현이 약 40%를 초과하여 감소하지 않게 발현한다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 적어도 7일, 8일, 9일, 10일, 12일, 14일, 16일, 18일, 20일, 22일, 23일 또는 그 초과 동안 세포 내의 하나 이상의 발현 서열의 발현이 약 40%를 초과하여 달라지지 않는 수준으로 유지되게 발현한다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 투여는 본원에 기술된 임의의 전달 방법을 사용하여 행한다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 정맥내 주사를 통해 대상체에게 투여된다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 투여는 산전 투여, 신생아 투여, 산후 투여, 경구, 주사에 의한 것(예를 들어, 정맥내, 동맥내, 피내, 두개내, 경막내, 림프내, 피하 및 근육내), 안과적 투여에 의한 것, 달팽이관내(내이) 투여에 의한 것, 비강내 투여에 의한 것, 기관내 투여에 의한 것, 및 흡입 투여에 의한 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 단백질 발현 방법은 번역 생성물의 변형, 폴딩 또는 다른 번역후 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단백질 발현 방법은 생체내 또는 세포 내의, 예를 들어, 세포 기구를 통한 번역후 변형을 포함한다.
결합 부위
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 적어도 하나의 결합 부위를 인코딩한다. 적어도 하나의 결합 부위는 표적, 예컨대 단백질, RNA 또는 DNA에 결합할 수 있다. 적어도 하나의 결합 부위는 단백질 결합 부위, RNA 결합 부위 또는 DNA 결합 부위일 수 있다. 적어도 하나의 결합 부위는 적어도 하나의 치료적 특징을 세포에 부여한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 결합 부위는 세포에 핵산(예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은 원형 폴리리보뉴클레오티드) 국소화를 부여한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 결합 부위는 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 세포에 핵산 활성을 부여한다(예를 들어, miRNA를 포함하는 세포에서 핵산 분해를 초래하는 miRNA 결합 부위이다). 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 결합 부위는 세포의 표면 상의 세포 수용체에 결합한다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 적어도 하나의 결합 부위가 세포의 표면 상의 세포 수용체에 결합하는 경우 본원에 기술된 바와 같이 세포 내로 내재화된다. 일부 실시형태에서, 적어도 결합 부위는 세포 내로의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 내재화를 보조하는 선형 폴리뉴클레오티드에 혼성화한다. 예를 들어, 선형 폴리뉴클레오티드는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 적어도 하나의 결합 부위에 혼성화하는 영역 및 세포의 표면 상의 세포 수용체에 결합하는 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 수용체에 결합하는 선형 폴리리보뉴클레오티드의 영역은 결합 후에 원형 폴리리보뉴클레오티드에 혼성화된 선형 폴리리보뉴클레오티드의 내재화를 초래한다.
일부 경우에, circRNA는 결합 부위를 포함한다. 결합 부위는 압타머를 포함할 수 있다. 일부 경우에, circRNA는 적어도 2개의 결합 부위를 포함한다. 예를 들어, circRNA는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 또는 그 이상의 결합 부위를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본원에 기술된 circRNA는 하나 이상의 표적의 하나 이상의 결합 모이어티, 또는 하나 이상의 표적에 결합하는 분자 스캐폴드이다. 각각의 표적은 상이한 또는 동일한 핵산(예를 들어, RNA, DNA, RNA-DNA 하이브리드), 소분자(예를 들어, 약물), 압타머, 폴리펩티드, 단백질, 지질, 탄수화물, 항체, 바이러스, 바이러스 입자, 막, 다-성분 복합체, 세포, 세포 모이어티, 그의 임의의 단편 및 그의 임의의 조합일 수 있지만, 이들에 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 결합 부위는 동일한 표적에 결합한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 결합 부위는 동일한 표적의 하나 이상의 결합 모이어티에 결합한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 결합 부위는 하나 이상의 상이한 표적에 결합한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 결합 부위는 상이한 표적의 하나 이상의 결합 모이어티에 결합한다. 일부 실시형태에서, circRNA는 하나 이상의 표적의 하나 이상의 결합에 대한 스캐폴드로서 작용한다. 일부 실시형태에서, circRNA는 하나 이상의 표적의 하나 이상의 결합 모이어티에 대한 스캐폴드로서 작용한다. 일부 실시형태에서, circRNA는 하나 이상의 하나 이상의 표적에 특이적으로 결합함으로써 세포 과정을 조절한다. 일부 실시형태에서, circRNA는 하나 이상의 표적의 하나 이상의 결합 모이어티에 특이적으로 결합함으로써 세포 과정을 조절한다. 일부 실시형태에서, circRNA는 하나 이상의 표적에 특이적으로 결합함으로써 세포 과정을 조절한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기술된 circRNA는 하나 이상의 특정한 관심 표적에 대한 결합 부위를 포함한다. 일부 실시형태에서, circRNA는 다수의 결합 부위 또는 각각의 관심 표적에 대한 결합 부위의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, circRNA는 다수의 결합 부위 또는 각각의 관심 결합 모이어티에 대한 결합 부위의 조합을 포함한다. 예를 들어, circRNA는 폴리펩티드 표적에 대한 하나 이상의 결합 부위를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, circRNA는 폴리뉴클레오티드 표적, 예컨대, DNA 또는 RNA, mRNA 표적, rRNA 표적, tRNA 표적 또는 게놈 DNA 표적에 대한 하나 이상의 결합 부위를 포함한다.
일부 경우에, circRNA는 단일-가닥 DNA에 대한 결합 부위를 포함한다. 일부 경우에, circRNA는 이중-가닥 DNA에 대한 결합 부위를 포함한다. 일부 경우에, circRNA는 항체에 대한 결합 부위를 포함한다. 일부 경우에, circRNA는 바이러스 입자에 대한 결합 부위를 포함한다. 일부 경우에, circRNA는 소분자에 대한 결합 부위를 포함한다. 일부 경우에, circRNA는 세포 내 또는 세포 상에 결합하는 결합 부위를 포함한다. 일부 경우에, circRNA는 RNA-DNA 하이브리드에 대한 결합 부위를 포함한다. 일부 경우에, circRNA는 메틸화된 폴리뉴클레오티드에 대한 결합 부위를 포함한다. 일부 경우에, circRNA는 비메틸화된 폴리뉴클레오티드에 대한 결합 부위를 포함한다. 일부 경우에, circRNA는 압타머에 대한 결합 부위를 포함한다. 일부 경우에, circRNA는 폴리펩티드에 대한 결합 부위를 포함한다. 일부 경우에, circRNA는 폴리펩티드, 단백질, 단백질 단편, 태깅된 단백질, 항체, 항체 단편, 소분자, 바이러스 입자(예를 들어, 막횡단 단백질을 포함하는 바이러스 입자) 또는 세포에 대한 결합 부위를 포함한다. 일부 경우에, circRNA는 단일-가닥 DNA의 결합 모이어티에 대한 결합 부위를 포함한다. 일부 경우에, circRNA는 이중-가닥 DNA의 결합 모이어티에 대한 결합 부위를 포함한다. 일부 경우에, circRNA는 항체 상의 결합 모이어티에 대한 결합 부위를 포함한다. 일부 경우에, circRNA는 바이러스 입자 상의 결합 모이어티에 대한 결합 부위를 포함한다. 일부 경우에, circRNA는 소분자 상의 결합 모이어티에 대한 결합 부위를 포함한다. 일부 경우에, circRNA는 세포 내 또는 세포 상의 결합 모이어티에 대한 결합 부위를 포함한다. 일부 경우에, circRNA는 RNA-DNA 하이브리드의 결합 모이어티에 대한 결합 부위를 포함한다. 일부 경우에, circRNA는 메틸화된 폴리뉴클레오티드 상의 결합 모이어티에 대한 결합 부위를 포함한다. 일부 경우에, circRNA는 비메틸화된 폴리뉴클레오티드 상의 결합 모이어티에 대한 결합 부위를 포함한다. 일부 경우에, circRNA는 압타머 상의 결합 모이어티에 대한 결합 부위를 포함한다. 일부 경우에, circRNA는 폴리펩티드 상의 결합 모이어티에 대한 결합 부위를 포함한다. 일부 경우에, circRNA는 폴리펩티드, 단백질, 단백질 단편, 태깅된 단백질, 항체, 항체 단편, 소분자, 바이러스 입자(예를 들어, 막횡단 단백질을 포함하는 바이러스 입자) 또는 세포 상의 결합 모이어티에 대한 결합 부위를 포함한다.
일부 경우에, 결합 부위는 적어도 2개의 아미드 결합을 포함하는 표적의 일부에 결합한다. 일부 경우에, 결합 부위는 포스포디에스테르 연결기를 포함하는 표적의 부분에 결합하지 않는다. 일부 경우에, 표적의 일부는 DNA 또는 RNA가 아니다. 일부 경우에, 결합 모이어티는 적어도 2개의 아미드 결합을 포함한다. 일부 경우에, 결합 모이어티는 포스포디에스테르 링키지를 포함하지 않는다. 일부 경우에, 결합 모이어티는 DNA 또는 RNA가 아니다.
본원에 제공되는 circRNA는 복합체 상의 결합 모이어티에 대한 하나 이상의 결합 부위를 포함할 수 있다. 본원에 제공되는 circRNA는 표적에 대한 하나 이상의 결합 부위를 포함하여, 복합체를 형성할 수 있다. 예를 들어, 본원에 제공되는 circRNA는 circRNA와 표적 사이에 복합체를 형성하기 위한 스캐폴드로서 작용할 수 있다. 일부 실시형태에서, circRNA는 단일의 표적과 복합체를 형성한다. 일부 실시형태에서, circRNA는 두 개의 표적과 복합체를 형성한다. 일부 실시형태에서, circRNA는 세 개의 표적과 복합체를 형성한다. 일부 실시형태에서, circRNA는 네 개의 표적과 복합체를 형성한다. 일부 실시형태에서, circRNA는 5개 이상의 표적과 복합체를 형성한다. 일부 실시형태에서, circRNA는 2개 이상의 표적의 복합체와 복합체를 형성한다. 일부 실시형태에서, circRNA는 3개 이상의 표적의 복합체와 복합체를 형성한다. 일부 실시형태에서, 2개 이상의 circRNA는 단일의 표적과 복합체를 형성한다. 일부 실시형태에서, 2개 이상의 circRNA는 2개 이상의 표적과 복합체를 형성한다. 일부 실시형태에서, 제1 circRNA는 제1 표적의 제1 결합 모이어티 및 제2 표적의 제2 상이한 결합 모이어티와 복합체를 형성한다. 일부 실시형태에서, 제1 circRNA는 제1 표적의 제1 결합 모이어티와 복합체를 형성하며, 제2 circRNA는 제2 표적의 제2 결합 모이어티와 복합체를 형성한다.
일부 실시형태에서, circRNA는 하나 이상의 항체-폴리펩티드 복합체, 폴리펩티드-폴리펩티드 복합체, 폴리펩티드-DNA 복합체, 폴리펩티드-RNA 복합체, 폴리펩티드-압타머 복합체, 바이러스 입자-항체 복합체, 바이러스 입자-폴리펩티드 복합체, 바이러스 입자-DNA 복합체, 바이러스 입자-RNA 복합체, 바이러스 입자-압타머 복합체, 세포-항체 복합체, 세포-폴리펩티드 복합체, 세포-DNA 복합체, 세포-RNA 복합체, 세포-압타머 복합체, 소분자-폴리펩티드 복합체, 소분자-DNA 복합체, 소분자-압타머 복합체, 소분자-세포 복합체, 소분자-바이러스 입자 복합체 및 그의 조합에 대한 결합 부위를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, circRNA는 하나 이상의 항체-폴리펩티드 복합체, 폴리펩티드-폴리펩티드 복합체, 폴리펩티드-DNA 복합체, 폴리펩티드-RNA 복합체, 폴리펩티드-압타머 복합체, 바이러스 입자-항체 복합체, 바이러스 입자-폴리펩티드 복합체, 바이러스 입자-DNA 복합체, 바이러스 입자-RNA 복합체, 바이러스 입자-압타머 복합체, 세포-항체 복합체, 세포-폴리펩티드 복합체, 세포-DNA 복합체, 세포-RNA 복합체, 세포-압타머 복합체, 소분자-폴리펩티드 복합체, 소분자-DNA 복합체, 소분자-압타머 복합체, 소분자-세포 복합체, 소분자-바이러스 입자 복합체 및 그의 조합 상의 하나 이상의 결합 모이어티에 대한 결합 부위를 포함할 수 있다.
일부 경우에, 결합 부위는 폴리펩티드, 단백질 또는 그의 단편 상에 결합한다. 일부 실시형태에서, 결합 부위는 표적의 폴리펩티드, 단백질 또는 그의 단편의 도메인, 단편, 에피토프, 영역 또는 부분에 결합한다. 예를 들어, 결합 부위는 단리된 폴리펩티드, 세포의 폴리펩티드, 정제된 폴리펩티드 또는 재조합 폴리펩티드의 도메인, 단편, 에피토프, 영역 또는 부분에 결합한다. 예를 들어, 결합 부위는 항체 또는 그의 단편의 도메인, 단편, 에피토프, 영역 또는 부분에 결합한다. 예를 들어, 결합 부위는 전사 인자의 도메인, 단편, 에피토프, 영역 또는 부분에 결합한다. 예를 들어, 결합 부위는 수용체의 도메인, 단편, 에피토프, 영역 또는 부분에 결합한다. 예를 들어, 결합 부위는 막횡단 수용체의 도메인, 단편, 에피토프, 영역 또는 부분에 결합한다. 결합 부위는 단리된, 정제된 및/또는 재조합 폴리펩티드의 도메인, 단편, 에피토프, 영역 또는 부분에 결합할 수 있다. 결합 부위는 분석물(예를 들어, 용해물)의 혼합물의 도메인, 단편, 에피토프, 영역 또는 부분에 결합할 수 있다. 예를 들어, 결합 부위는 복수의 세포 유래의 것 또는 단일의 세포의 용해물 유래의 것의 도메인, 단편, 에피토프, 영역 또는 부분에 결합한다. 결합 부위는 표적의 결합 모이어티에 결합할 수 있다. 일부 경우에, 결합 모이어티는 폴리펩티드, 단백질 또는 그의 단편 상에 존재한다. 일부 실시형태에서, 결합 모이어티는 폴리펩티드, 단백질 또는 그의 단편의 도메인, 단편, 에피토프, 영역 또는 부분을 포함한다. 예를 들어, 결합 모이어티는 단리된 폴리펩티드, 세포의 폴리펩티드, 정제된 폴리펩티드 또는 재조합 폴리펩티드의 도메인, 단편, 에피토프, 영역 또는 부분을 포함한다. 예를 들어, 결합 모이어티는 항체 또는 그의 단편의 도메인, 단편, 에피토프, 영역 또는 부분을 포함한다. 예를 들어, 결합 모이어티는 전사 인자의 도메인, 단편, 에피토프, 영역 또는 부분을 포함한다. 예를 들어, 결합 모이어티는 수용체의 도메인, 단편, 에피토프, 영역 또는 부분을 포함한다. 예를 들어, 결합 모이어티는 막횡단 수용체의 도메인, 단편, 에피토프, 영역 또는 부분을 포함한다. 결합 모이어티는 단리된, 정제된 및/또는 재조합 폴리펩티드의 도메인, 단편, 에피토프, 영역 또는 부분 상에 존재하거나 이를 포함할 수 있다. 결합 모이어티는 분석물(예를 들어, 용해물)의 혼합물의 도메인, 단편, 에피토프, 영역 또는 부분 상의 결합 모이어티, 또는 이를 포함한다. 예를 들어, 결합 모이어티는 복수의 세포 유래의 것 또는 단일의 세포의 용해물 유래의 것의 도메인, 단편, 에피토프, 영역 또는 부분 상에 존재하거나, 이를 포함한다.
일부 경우에, 결합 부위는 화합물(예를 들어, 소분자)의 도메인, 단편, 에피토프, 영역 또는 부분에 결합한다. 예를 들어, 결합은 약물의 도메인, 단편, 에피토프, 영역 또는 부분에 결합한다. 예를 들어, 결합 부위는 화합물의 도메인, 단편, 에피토프, 영역 또는 부분에 결합한다. 예를 들어, 결합 모이어티는 유기 화합물의 도메인, 단편, 에피토프, 영역 또는 부분에 결합한다. 일부 경우에, 결합 부위는 900 달톤 이하의 분자량을 갖는 소분자의 도메인, 단편, 에피토프, 영역 또는 부분에 결합한다. 일부 경우에, 결합 부위는 500 달톤 이상의 분자량을 갖는 소분자의 도메인, 단편, 에피토프, 영역 또는 부분에 결합한다. 결합 부위가 결합한 소분자의 부분은 예를 들어, 조합 수단을 통해 생성되는 화합물의 라이브러리, 즉, 화합물 다양성 조합 라이브러리를 포함하는 자연 발생 또는 합성 분자의 라이브러리로부터 수득될 수 있다. 조합 라이브러리 및 그들의 생성 및 스크리닝 방법은 당업계에 알려져 있으며, 미국 특허 제5,741,713호; 제5,734,018호; 제5,731,423호; 제5,721,099호; 제5,708,153호; 제5,698,673호; 제5,688,997호; 제5,688,696호; 제5,684,711호; 제5,641,862호; 제5,639,603호; 제5,593,853호; 제5,574,656호; 제5,571,698호; 제5,565,324호; 제5,549,974호; 제5,545,568호; 제5,541,061호; 제5,525,735호; 제5,463,564호; 제5,440,016호; 제5,438,119호; 제5,223,409호에 기술되어 있으며, 이의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다. 결합 부위는 소분자의 결합 모이어티에 결합할 수 있다. 일부 경우에, 결합 모이어티는 소분자의 도메인, 단편, 에피토프, 영역 또는 부분 상에 존재하거나 이를 포함한다. 예를 들어, 결합 모이어티는 약물의 도메인, 단편, 에피토프, 영역 또는 부분 상에 존재하거나 이를 포함한다. 예를 들어, 결합 모이어티는 화합물의 도메인, 단편, 에피토프, 영역 또는 부분 상에 존재하거나 이를 포함한다. 예를 들어, 결합 모이어티는 유기 화합물의 도메인, 단편, 에피토프, 영역 또는 부분 상에 존재하거나 이를 포함한다. 일부 경우에, 결합 모이어티는 900 달톤 이하의 분자량을 갖는 소분자의 도메인, 단편, 에피토프, 영역 또는 부분 상에 존재하거나 이를 포함한다. 일부 경우에, 결합 모이어티는 500 달톤 이하의 분자량을 갖는 소분자의 도메인, 단편, 에피토프, 영역 또는 부분 상에 존재하거나 이를 포함한다. 결합 모이어티는 예를 들어, 조합 수단을 통해 생성되는 화합물의 라이브러리, 즉, 화합물 다양성 조합 라이브러리를 포함하는 자연 발생 또는 합성 분자의 라이브러리로부터 수득될 수 있다. 조합 라이브러리 및 그들의 생성 및 스크리닝 방법은 당업계에 알려져 있으며, 미국 특허 제5,741,713호; 제5,734,018호; 제5,731,423호; 제5,721,099호; 제5,708,153호; 제5,698,673호; 제5,688,997호; 제5,688,696호; 제5,684,711호; 제5,641,862호; 제5,639,603호; 제5,593,853호; 제5,574,656호; 제5,571,698호; 제5,565,324호; 제5,549,974호; 제5,545,568호; 제5,541,061호; 제5,525,735호; 제5,463,564호; 제5,440,016호; 제5,438,119호; 제5,223,409호에 기술되어 있으며, 이의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다.
결합 부위는 특이적 결합 쌍(예를 들어, 리간드)의 구성원의 도메인, 단편, 에피토프, 영역, 또는 부분에 결합할 수 있다. 결합 부위는 1가(모노에피토프) 또는 다가(폴리에피토프)의 도메인, 단편, 에피토프, 영역, 또는 부분에 결합할 수 있다. 결합 부위는 표적의 항원 또는 합텐 부분에 결합할 수 있다. 결합 부위는 적어도 하나의 공통 에피토프 또는 결정기 부위를 공유하는 단일 분자 또는 복수의 분자의 도메인, 단편, 에피토프, 영역, 또는 부분에 결합할 수 있다. 결합 부위는 세포(예를 들어, 박테리아 세포, 식물 세포 또는 동물 세포)의 일부의 도메인, 단편, 에피토프, 영역, 또는 부분에 결합할 수 있다. 결합 부위는 천연 환경(예를 들어, 조직), 배양된 세포, 또는 미생물(예를 들어, 박테리아, 진균, 원생생물, 또는 바이러스), 또는 용해된 세포에 존재하는 표적에 결합할 수 있다. 결합 부위는 하나 이상의 추가의 결합 부위, 예컨대, 비제한적으로 염료(예를 들어, 형광 염료), 폴리펩티드 변형 모이어티, 예컨대 포스페이트기, 탄수화물기 등, 또는 폴리뉴클레오티드 변형 모이어티, 예컨대 메틸기를 제공하도록 (예를 들어, 화학적으로) 변형된 표적의 일부에 결합할 수 있다. 결합 부위는 특이적 결합 쌍의 구성원의 결합 모이어티에 결합할 수 있다. 결합 모이어티는 특이적 결합 쌍(예를 들어, 리간드)의 구성원의 도메인, 단편, 에피토프, 영역, 또는 부분 상에 존재하거나 이를 포함할 수 있다. 결합 모이어티는 1가(모노에피토프) 또는 다가(폴리에피토프)의 도메인, 단편, 에피토프, 영역, 또는 부분 상에 존재하거나 이를 포함할 수 있다. 결합 모이어티는 항원성 또는 합텐성일 수 있다. 결합 모이어티는 적어도 하나의 공통 에피토프 또는 결정기 부위를 공유하는 단일 분자 또는 복수의 분자의 도메인, 단편, 에피토프, 영역, 또는 부분 상에 존재하거나 이를 포함할 수 있다. 결합 모이어티는 세포(예를 들어, 박테리아 세포, 식물 세포 또는 동물 세포)의 일부의 도메인, 단편, 에피토프, 영역, 또는 부분 상에 존재하거나 이를 포함할 수 있다. 결합 모이어티는 천연 환경(예를 들어, 조직), 배양된 세포, 또는 미생물(예를 들어, 박테리아, 진균, 원생생물, 또는 바이러스), 또는 용해된 세포에 존재할 수 있다. 결합 모이어티는 하나 이상의 추가의 결합 부위, 예컨대, 비제한적으로 염료(예를 들어, 형광 염료), 폴리펩티드 변형 모이어티, 예컨대 포스페이트기, 탄수화물기 등, 또는 폴리뉴클레오티드 변형 모이어티, 예컨대 메틸기를 제공하도록 (예를 들어, 화학적으로) 변형될 수 있다.
일부 경우에, 결합 부위는 숙주 유래의 시료에서 관찰되는 분자의 도메인, 단편, 에피토프, 영역, 또는 부분에 결합한다. 결합 부위는 숙주 유래의 시료에서 관찰되는 분자의 결합 모이어티에 결합할 수 있다. 일부 경우에, 결합 모이어티는 숙주 유래의 시료에서 관찰되는 분자의 도메인, 단편, 에피토프, 영역, 또는 부분 상에 존재하거나 이를 포함한다. 숙주 유래의 시료에는 체액(예를 들어, 소변, 혈액, 혈장, 혈청, 타액, 정액, 대변, 가래, 뇌척수액, 누액, 점액 등)이 포함된다. 시료는 직접적으로 시험될 수 있거나, 결합 모이어티를 보다 쉽게 검출 가능하게 만들기 위해 사전처리될 수 있다. 시료에는 살아있는 것 또는 이전에 살아있던 것 유래의 다량의 물질이 포함된다. 시료는 천연, 재조합, 합성, 또는 비 자연 발생일 수 있다. 결합 부위는 세포 용해물 또는 세포 배양 배지, 시험관내 번역된 시료, 또는 시료(예를 들어, 세포 용해물)로부터의 면역침전에서, 천연적으로 또는 재조합적으로 세포로부터 발현되는 상술된 것 중 임의의 것에 결합할 수 있다. 결합 모이어티는 세포 용해물 또는 세포 배양 배지, 시험관내 번역된 시료, 또는 시료(예를 들어, 세포 용해물)로부터의 면역침전에서, 천연적으로 또는 재조합적으로 세포로부터 발현되는 상술된 것 중 임의의 것일 수 있다.
일부 경우에, 결합 부위는 무세포 시스템 또는 시험관내에서 발현되는 표적에 결합한다. 예를 들어, 결합 부위는 세포 추출물 내의 표적에 결합한다. 일부 경우에, 결합 부위는 DNA 주형, 및 전사 및 번역을 위한 시약을 갖는 세포 추출물 내의 표적에 결합한다. 결합 부위는 무세포 시스템 또는 시험관내에서 발현되는 표적의 결합 모이어티에 결합한다. 일부 경우에, 표적의 결합 모이어티는 무세포 시스템 또는 시험관내에서 발현된다. 예를 들어, 표적의 결합 모이어티는 세포 추출물에 존재한다. 일부 경우에, 표적의 결합 모이어티는 DNA 주형, 및 전사 및 번역을 위한 시약을 갖는 세포 추출물에 존재한다. 사용될 수 있는 세포 추출물의 예시적인 공급원에는 밀 배아, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 토끼 망상적혈구, 초호열균(hyperthermophile), 하이브리도마, 제노푸스(Xenopus) 난모세포, 곤충 세포, 및 포유동물 세포(예를 들어, 인간 세포)가 포함된다. 표적 폴리펩티드를 발현하기 위해(예를 들어, 어레이 상의 표적 폴리펩티드를 생성하기 위해) 사용될 수 있는 예시적인 무세포 방법에는 단백질 동소 어레이(PISA), 다중 스폿팅 기법(MIST), 자가-어셈블링된 mRNA 번역, 핵산 프로그래밍 가능한 단백질 어레이(NAPPA), 나노웰 NAPPA, DNA 어레이 투 단백질 어레이(DNA array to protein array: DAPA), 막-부재 DAPA, 나노웰 카핑 및 μIP-마이크로인타글리오 프린팅 및 pMAC-단백질 마이크로어레이 카핑이 포함된다(문헌[Kilb et al., Eng. Life Sci. 2014, 14, 352-364] 참조).
일부 경우에, 결합 부위는 DNA 주형으로부터 원 위치에서(예를 들어, 어레이의 고체 기재 상에서) 합성된 표적에 결합한다. 결합 부위는 원위치에서 합성되는 표적의 결합 모이어티에 결합할 수 있다. 일부 경우에, 표적의 결합 모이어티는 DNA 주형으로부터 원 위치에서(예를 들어, 어레이의 고체 기재 상에서) 합성된다. 일부 경우에, 복수의 결합 모이어티는 병렬로 또는 단일 반응에서 복수의 대응하는 DNA 주형으로부터 동소에서 합성된다. 동소 표적 폴리펩티드 발현을 위한 예시적인 방법에는 문헌[Stevens, Structure 8(9): R177-R185 (2000)]; 문헌[Katzen et al., Trends Biotechnol. 23(3):150-6. (2005)]; 문헌[He et al., Curr. Opin. Biotechnol. 19(1):4-9. (2008)]; 문헌[Ramachandran et al., Science 305(5680):86-90. (2004)]; 문헌[He et al., Nucleic Acids Res. 29(15):E73-3 (2001)]; 문헌[Angenendt et al., Mol. Cell Proteomics 5(9): 1658-66 (2006)]; 문헌[Tao et al, Nat Biotechnol 24(10):1253-4 (2006)]; 문헌[Angenendt et al., Anal. Chem. 76(7):1844-9 (2004)]; 문헌[Kinpara et al., J. Biochem. 136(2):149-54 (2004)]; 문헌[Takulapalli et al., J. Proteome Res. 11(8):4382-91 (2012)]; 문헌[He et al., Nat. Methods 5(2):175-7 (2008)]; 문헌[Chatterjee and J. LaBaer, Curr Opin Biotech 17(4):334-336 (2006)]; 문헌[He and Wang, Biomol Eng 24(4):375-80 (2007)]; 및 문헌[He and Taussig, J. Immunol. Methods 274(1-2):265-70 (2003)]에 기술된 것들이 포함된다.
일부 경우에, 결합 부위는 적어도 6개 뉴클레오티드, 예를 들어, 최소 8개, 9개, 10개, 12개, 15개, 20개, 25개, 30개, 40개, 50개 또는 100개 뉴클레오티드의 범위를 포함하는 핵산 표적에 결합한다. 일부 경우에, 결합 부위는 뉴클레오티드의 인접 스트레치를 포함하는 단백질 표적에 결합한다. 일부 경우에, 결합 부위는 뉴클레오티드의 비-인접 스트레치를 포함하는 단백질 표적에 결합한다. 일부 경우에, 결합 부위는 핵산 서열 내의 뉴클레오티드의 결실, 부가, 교환 또는 절두를 포함하는, 돌연변이 또는 기능적 돌연변이의 부위를 포함하는 핵산 표적에 결합한다. 결합 부위는 핵산 표적의 결합 모이어티에 결합할 수 있다. 일부 경우에, 핵산 표적의 결합 모이어티는 적어도 6개 뉴클레오티드, 예를 들어, 최소 8개, 9개, 10개, 12개, 15개, 20개, 25개, 30개, 40개, 50개 또는 100개 뉴클레오티드의 범위를 포함한다. 일부 경우에, 단백질 표적의 결합 모이어티는 뉴클레오티드의 인접 스트레치(stretch)를 포함한다. 일부 경우에, 단백질 표적의 결합 모이어티는 뉴클레오티드의 비-인접 스트레치를 포함한다. 일부 경우에, 핵산 표적의 결합 모이어티는 핵산 서열 내의 뉴클레오티드의 결실, 부가, 교환 또는 절두를 포함하는, 돌연변이 또는 기능적 돌연변이의 부위를 포함한다.
일부 경우에, 결합 부위는 적어도 6개 아미노산, 예를 들어, 최소 8개, 9개, 10개, 12개, 15개, 20개, 25개, 30개, 40개, 50개 또는 100개 아미노산의 범위를 포함하는 단백질 표적에 결합한다. 일부 경우에, 결합 부위는 아미노산의 인접 스트레치를 포함하는 단백질 표적에 결합한다. 일부 경우에, 결합 부위는 아미노산의 비-인접 스트레치를 포함하는 단백질 표적에 결합한다. 일부 경우에, 결합 부위는 폴리펩티드 서열 내의 아미노산의 결실, 부가, 교환 또는 절두를 포함하는, 돌연변이 또는 기능적 돌연변이의 부위를 포함하는 단백질 표적에 결합한다. 결합 부위는 단백질 표적의 결합 모이어티에 결합할 수 있다. 일부 경우에, 단백질 표적의 결합 모이어티는 적어도 6개 아미노산, 예를 들어, 최소 8개, 9개, 10개, 12개, 15개, 20개, 25개, 30개, 40개, 50개 또는 100개 아미노산의 범위를 포함한다. 일부 경우에, 단백질 표적의 결합 모이어티는 아미노산의 인접 스트레치를 포함한다. 일부 경우에, 단백질 표적의 결합 모이어티는 아미노산의 비-인접 스트레치를 포함한다. 일부 경우에, 단백질 표적의 결합 모이어티는 폴리펩티드 서열 내의 아미노산의 결실, 부가, 교환 또는 절두를 포함하는, 돌연변이 또는 기능적 돌연변이의 부위를 포함한다.
일부 실시형태에서, 결합 부위는 막 결합된 단백질의 도메인, 단편, 에피토프, 영역 또는 부분에 결합한다. 결합 부위는 막 결합 단백질의 결합 모이어티에 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 결합 모이어티는 막 결합된 단백질의 도메인, 단편, 에피토프, 영역 또는 부분 상에 존재하거나 이를 포함한다. 예시적인 막 결합된 단백질에는 비제한적으로 GPCR(예를 들어, 아드레날린성 수용체, 안지오텐신 수용체, 콜레시스토키닌 수용체, 무스카린성 아세틸콜린 수용체, 뉴로텐신 수용체, 갈라닌 수용체, 도파민 수용체, 오피오이드 수용체, 에로토닌 수용체, 소마토스타틴 수용체 등), 이온 채널(예를 들어, 니코틴성 아세틸콜린 수용체, 나트륨 채널, 칼륨 채널 등), 비흥분성 및 흥분성 채널, 수용체 티로신 키나제, 수용체 세린/트레오닌 키나제, 수용체 구아닐레이트 사이클라제, 성장 인자 및 호르몬 수용체(예를 들어, 표피 성장 인자(EGF) 수용체) 등이 포함된다. 결합 부위는 또한 막-결합된 단백질의 돌연변이체 또는 변형된 변이체의 도메인, 단편, 에피토프, 영역 또는 부분에 결합할 수 있다. 결합 부위는 막-결합된 단백질의 돌연변이체 또는 변형된 변이체의 결합 모이어티에 결합할 수 있다. 결합 모이어티는 또한 막-결합된 단백질의 돌연변이체 또는 변형된 변이체의 도메인, 단편, 에피토프, 영역 또는 부분 상에 존재하거나 이를 포함할 수 있다. 예를 들어, GPCR의 일부 단일 또는 다중 점 돌연변이는 기능을 보유하고 질병에 관여된다(예를 들어, 문헌[Stadel et al., (1997) Trends in Pharmacological Review 18:430-37] 참조).
결합 부위는 예를 들어, 유비퀴틴 리가제의 도메인, 단편, 에피토프, 영역 또는 부분에 결합한다. 결합 부위는 예를 들어, 유비퀴틴 어댑터, 프로테아좀 어댑터, 또는 프로테아좀 단백질의 도메인, 단편, 에피토프, 영역 또는 부분에 결합한다. 결합 부위는 예를 들어, 내식작용, 포식작용, 리포좀 경로, 자가포식 경로, 거대자가포식(macroautophagy), 미세자가포식(microautophagy), 샤페론-매개된 자가포식, 다소포체 경로 또는 그의 조합에 수반되는 단백질의 도메인, 단편, 에피토프, 영역 또는 부분에 결합한다.
RNA 결합 부위
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 하나 이상의 RNA 결합 부위를 포함한다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 조절 핵산을 인코딩하는, 예를 들어, 내인성 유전자 및/또는 외인성 유전자의 발현을 조절하는 RNA 결합 부위를 포함한다. 일부 실시형태에서, RNA 결합 부위는 숙주 유전자의 발현을 조절한다. RNA 결합 부위는 내인성 유전자(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 miRNA, siRNA, mRNA, lncRNA, RNA, DNA, 안티센스 RNA, gRNA에 대한 서열)에 혼성화되는 서열, 바이러스 DNA 또는 RNA와 같은 외인성 핵산에 혼성화하는 서열, RNA에 혼성화하는 서열, 유전자 전사를 간섭하는 서열, RNA 번역을 간섭하는 서열, RNA를 안정화시키거나, 예컨대 분해에 대한 표적화를 통하여 RNA를 불안정화시키는 서열, 및 DNA- 또는 RNA-결합 인자를 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 RNA에 결합하는 압타머 서열을 포함한다. 압타머는 내인성 유전자(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 miRNA, siRNA, mRNA, lncRNA, RNA, DNA, 안티센스 RNA, gRNA에 대한 서열)에, 바이러스 DNA 또는 RNA와 같은 외인성 핵산에, RNA에, 유전자 전사를 간섭하는 서열에, RNA 번역을 간섭하는 서열에, RNA를 안정화시키거나, 예컨대 분해에 대한 표적화를 통하여 RNA를 불안정화시키는 서열에, 그리고 DNA- 또는 RNA-결합 인자를 조절하는 서열에 결합할 수 있다. 압타머 서열의 이차 구조는 RNA에 결합할 수 있다. 원형 RNA는 RNA로의 압타머 서열의 결합에 의해 RNA와 복합체를 형성할 수 있다.
일부 실시형태에서, RNA 결합 부위는 tRNA, lncRNA, lincRNA, miRNA, rRNA, snRNA, 마이크로RNA, siRNA, piRNA, snoRNA, snRNA, exRNA, scaRNA, Y RNA 및 hnRNA 결합 부위 중 어느 하나일 수 있다. RNA 결합 부위는 당업자에게 널리 알려져 있다.
특정 RNA 결합 부위는 생물학적 RNA 간섭(RNAi) 과정을 통하여 유전자 발현을 저해할 수 있다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 전형적으로 15 내지 50개의 염기쌍(예컨대 약 18 내지 25개의 염기쌍)을 가지며 세포 내의 발현된 표적 유전자의 코딩 서열과 동일하거나(상보성이거나) 또는 거의 동일한(실질적으로 상보성인) 핵염기 서열을 갖는 RNA 또는 RNA-유사 구조를 갖는 RNAi 분자를 포함한다. RNAi 분자는 짧은 간섭 RNA(siRNA), 이중-가닥 RNA(dsRNA), 마이크로 RNA(miRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 메로듀플렉스(meroduplex) 및 다이서(dicer) 기질을 포함하나 이들에 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, RNA 결합 부위는 siRNA 또는 shRNA를 포함한다. siRNA 및 shRNA는 내인성 miRNA 유전자의 가공 경로 내의 중간체와 유사하다. 일부 실시형태에서, siRNA는 miRNA로서 기능할 수 있으며, 그 역도 그러하다. siRNA와 같이 마이크로RNA는 RISC를 사용하여, 표적 유전자를 하향조절할 수 있지만, siRNA와 달리, 대부분의 동물 miRNA는 mRNA를 절단하지 않는다. 대신에, miRNA는 번역 억제 또는 폴리A 제거 및 mRNA 분해를 통해 단백질 출력물을 감소시킨다. 공지된 miRNA 결합 부위는 mRNA 3' UTR 내에 존재하며; miRNA는 miRNA의 5' 말단으로부터 뉴클레오티드 2 내지 8에 대하여 거의 완벽하게 상보성을 갖는 부위를 표적화하는 것으로 보인다. 이러한 영역은 씨드 영역으로 공지되어 있다. siRNA 및 miRNA가 상호 교환 가능하기 때문에, 외인성 siRNA는 siRNA에 대하여 씨드 상보성을 갖는 mRNA를 하향조절한다. 3' UTR 내의 다수의 표적 부위는 더 강한 하향조절을 제공할 수 있다.
miRNA는 핵산 분자의 3'UTR에 결합하는 짧은 비코딩 RNA이며, 핵산 분자 안정성을 감소시킴으로써 또는 번역을 저해함으로써 유전자 발현을 하향-조절한다. 원형 폴리리보뉴클레오티드는 하나 이상의 miRNA 표적 서열, miRNA 서열 또는 miRNA 씨드를 포함할 수 있다. 이러한 서열은 임의의 miRNA에 대응할 수 있다.
miRNA 서열은 "씨드" 영역, 즉 성숙 miRNA의 위치 2 내지 8의 영역 내의 서열을 포함하며, 이 서열은 miRNA 표적 서열과 왓슨-크릭(Watson-Crick) 상보성을 갖는다. miRNA 씨드는 성숙 miRNA의 위치 2 내지 8, 또는 2 내지 7을 구성할 수 있다. 일부 실시형태에서, miRNA 씨드는 7개의 뉴클레오티드(예를 들어, 성숙 miRNA의 뉴클레오티드 2 내지 8)를 포함할 수 있으며, 상응하는 miRNA 표적 내의 씨드-상보성 부위에는 miRNA 위치 1과 상반되는 아데닌(A)이 측부 배치된다. 일부 실시형태에서, miRNA 씨드는 6개의 뉴클레오티드(예를 들어, 성숙 miRNA의 뉴클레오티드 2 내지 7)를 포함할 수 있으며, 상응하는 miRNA 표적 내의 씨드-상보성 부위에는 위치 1의 miRNA와 상반되는 아데닌(A)이 측부 배치된다.
miRNA 씨드의 염기는 표적 서열과 실질적으로 상보성일 수 있다. miRNA 표적 서열을 원형 폴리리보뉴클레오티드 내로 조작함으로써, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 숙주의 면역계를 회피하거나, 또는 그에 의해 검출될 수 있거나, 조절된 분해 또는 조절된 번역을 가질 수 있다. 이러한 과정은 원형 폴리리보뉴클레오티드 운반 시에 오프 표적 효과의 위험을 감소시킬 수 있다.
원형 폴리리보뉴클레오티드는 표적 유전자의 약 5개 내지 약 25개의 인접 뉴클레오티드와 동일한 miRNA 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, miRNA 서열은 mRNA를 표적화하고, 디뉴클레오티드 AA로 시작하며, 약 30% 내지 70%(약 30% 내지 60%, 약 40% 내지 60% 또는 약 45% 내지 55%)의 GC-함량을 포함하고, 예를 들어, 표준 BLAST 검색에 의해 결정시, 그것이 도입될 포유동물의 게놈 내의 표적 이외의 임의의 뉴클레오티드 서열과 높은 백분율의 동일성을 갖지 않는다.
역으로, miRNA 결합 부위를 원형 폴리리보뉴클레오티드 밖으로 조작하여(즉, 그로부터 제거하여), 특정 조직에서 단백질 발현을 조절할 수 있다. 다수의 조직에서의 발현의 조절은 도입 또는 제거 또는 하나 또는 몇몇의 miRNA 결합 부위(예를 들어, 세포내 핵산 활성을 부여하는 miRNA 결합 부위)를 통해 달성될 수 있다.
miRNA가 mRNA를 조절함으로써 단백질 발현을 조절하는 것으로 알려져 있는 조직의 예는 간(miR-122), 근육(miR-133, miR-206, miR-208), 내피 세포(miR-17-92, miR-126), 골수 세포(miR-142-3p, miR-142-5p, miR-16, miR-21, miR-223, miR-24, miR-27), 지방 조직(let-7, miR-30c), 심장(miR-ld, miR-149), 신장(miR-192, miR-194, miR-204) 및 폐 상피 세포(let-7, miR-133, miR-126)를 포함하나 이에 제한되지 않는다. miRNA는 또한 복잡한 생물학적 과정, 예컨대 혈관신생(miR-132)을 조절할 수 있다. 본원에 기술된 원형 폴리보뉴클레오티드에서, 이러한 과정에 관여하는 miRNA에 대한 결합 부위를 제거하거나 도입하여, 원형 폴리리보뉴클레오티드로부터의 발현을 생물학적으로 관련된 세포 유형에 또는 관련된 생물학적 과정의 상황에 맞춤화시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, miRNA 결합 부위는 예를 들어, miR-7을 포함한다.
상이한 세포 유형에서의 miRNA의 발현 패턴의 이해를 통하여, 본원에 기술된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 특정 세포 유형에서 또는 오직 특정 생물학적 조건 하에서만 더욱 표적화된 발현을 위해 조작될 수 있다. 조직-특이적 miRNA 결합 부위의 도입을 통하여, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 조직에서 또는 생물학적 조건의 상황에서 최적의 단백질 발현을 위해 설계될 수 있다.
또한, miRNA 씨드 부위를 원형 폴리리보뉴클레오티드 내로 혼입하여, 특정 세포에서 발현을 조절할 수 있으며, 이는 생물학적 개선을 초래한다. 이의 일례는 miR-142 부위의 혼입이다. 본원에 기술된 원형 폴리리보뉴클레오티드 내로의 miR-142 부위의 혼입은 조혈 세포에서 발현을 조절할 수 있을 뿐 아니라, 원형 폴리리보뉴클레오티드에 인코딩된 단백질에 대한 면역 반응을 감소시키기거나 없앨 수 있다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 적어도 하나의 miRNA, 예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 또는 그 초과를 포함한다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 표적 서열에 상보성인 서열 또는 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나와 적어도 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90% 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 100% 뉴클레오티드 서열 동일성을 갖는 miRNA를 포함한다.
공지된 miRNA 서열의 목록은 예를 들어, Wellcome Trust Sanger Institute, Penn Center for Bioinformatics, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 및 European Molecule Biology Laboratory와 같은 연구 기관에 의해 유지되는 데이터베이스에서 확인될 수 있다. RNAi 분자는 해당 분야에 알려진 기술에 의해 쉽게 설계되고 생성될 수 있다. 또한, 컴퓨터 툴이 효과적이고 특이적인 서열 모티프를 결정하기 위해 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 긴 비-코딩 RNA를 포함한다. 긴 비-코딩 RNA(lncRNA)는 100개 초과의 뉴클레오티드의 비-단백질 코딩 전사물을 포함한다. 더 긴 길이는 lncRNA를 작은 조절 RNA, 예컨대 miRNA, siRNA 및 다른 짧은 RNA와 구별한다. 일반적으로, 대다수(약 78%)의 lncRNA는 조직-특이적인 것으로 특성화된다. 근처의 단백질-코딩 유전자에 대하여 반대 방향으로 전사되는(포유동물 게놈 내에 총 lncRNA의 유의미한 비율 약 20%를 포함하는) 분지 lncRNA는 근처의 유전자의 전사를 조절할 수 있다.
RNA 결합 부위의 길이는 약 5 내지 30개의 뉴클레오티드, 약 10 내지 30개의 뉴클레오티드 또는 약 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30개 이상의 뉴클레오티드일 수 있다. 관심 부위에 대한 RNA 결합 부위의 동일성의 정도는 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%일 수 있다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 하나 이상의 거대 유전자간 비-코딩 RNA(lincRNA) 결합 부위를 포함한다. 거대 유전자간 비-코딩 RNA(LincRNA)는 긴 비-코딩 RNA의 대부분을 구성한다. LincRNA는 비-코딩 전사물이며, 일부 실시형태에서, 약 200개 초과의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시형태에서, lincRNA는 단백질-코딩 유전자와 유사하게 엑손-인트론-엑손 구조를 갖지만, 오픈-리딩 프레임을 포함하지 않고, 단백질을 코딩하지 않는다. LincRNA 발현은 코딩 유전자에 비해 두드러지게 조직-특이적일 수 있다. LincRNA는 전형적으로 이웃 단백질-코딩 유전자의 쌍의 그것과 유사한 정도로 그들의 이웃 유전자와 동시-발현된다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 환형화된 lincRNA을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 하나 이상의 lincRNA, 예를 들어, FIRRE, LINC00969, PVT1, LINC01608, JPX, LINC01572, LINC00355, C1orf132, C3orf35, RP11-734, LINC01608, CC-499B15.5, CASC15, LINC00937, 및 RP11-191을 포함한다.
알려진 lincRNA 및 lncRNA 서열의 목록은 연구 조직, 예를 들어 게노믹스 통합 생물학 연구소(Institute of Genomics and Integrative Biology), 퀸즐랜드 대학 디아만티나 연구소(Diamantina Institute at the University of Queensland), 겐트 대학(Ghent University), 및 중산 대학(Sun Yat-sen University)에 의해 유지되는 데이터베이스에서 확인될 수 있다. LincRNA 및 lncRNA 분자는 해당 분야에 알려진 기술에 의해 쉽게 설계되고 생성된다. 또한, 컴퓨터 툴이 효과적이고 특이적인 서열 모티프를 결정하기 위해 사용될 수 있다.
RNA 결합 부위는 내인성 유전자 또는 유전자 생성물(예를 들어, mRNA)의 전부 또는 그의 단편에 실질적으로 상보성이거나, 완전히 상보성인 서열을 포함할 수 있다. 상보성 서열은 인트론과 엑손의 경계의 서열에 상보적이어서, 전사를 위하여 특정 유전자의 새로 생성된 핵 RNA 전사물이 mRNA로 성숙하는 것을 방지할 수 있다. 상보성 서열은 그 유전자에 대한 mRNA와 혼성화됨으로써 유전자에 대해 특이적일 수 있고 그 번역을 방지할 수 있다. RNA 결합 부위는 내인성 유전자 또는 유전자 생성물(예를 들어, DNA, RNA, 또는 그의 유도체 또는 혼성체)의 전부 또는 그의 단편에 안티센스이거나 실질적으로 안티센스인 서열을 포함할 수 있다.
RNA 결합 부위는 내인성 유전자 또는 유전자 생성물(예를 들어, mRNA)의 전부 또는 그의 단편에 실질적으로 상보성이거나, 완전히 상보성인 서열을 포함할 수 있다. 상보성 서열은 인트론과 엑손의 경계의 서열에 상보적이어서, 전사를 위하여 특정 유전자의 새로 생성된 핵 RNA 전사물이 mRNA로 성숙하는 것을 방지할 수 있다. 상보성 서열은 그 유전자에 대한 mRNA와 혼성화됨으로써 유전자에 대해 특이적일 수 있고 그 번역을 방지할 수 있다. RNA 결합 부위는 내인성 유전자 또는 유전자 생성물(예를 들어, DNA, RNA, 또는 그의 유도체 또는 혼성체)의 전부 또는 그의 단편에 안티센스이거나 실질적으로 안티센스인 서열을 포함할 수 있다.
RNA 결합 부위는 선형 폴리리보뉴클레오티드의 한 영역에 실질적으로 상보성이거나, 완전히 상보성인 서열을 포함할 수 있다. 상보성 서열은 선형 폴리리보뉴클레오티드로의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 혼성화를 위하여 선형 폴리리보뉴클레오티드의 영역에 특이적일 수 있다. 일부 실시형태에서, 선형 폴리리보뉴클레오티드는 또한 세포 상의 단백질, 예컨대 수용체로의 결합을 위한 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 수용체에 결합하는 선형 폴리리보뉴클레오티드의 영역은 결합 후에 원형 폴리리보뉴클레오티드에 혼성화된 선형 폴리리보뉴클레오티드의 세포 내로의 내재화를 초래한다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 전형적으로 약 5개 내지 5000개 염기쌍(특정 RNA 구조에 따라, 예를 들어, miRNA 5 내지 30 bp, lncRNA 200 내지 500 bp)의 RNA 또는 RNA-유사 구조를 가지며 세포 내의 발현된 표적 유전자의 코딩 서열과 동일한(상보성인) 또는 거의 동일한(실질적으로 상보성인) 핵염기 서열을 가지는 RNA 결합 부위를 포함한다.
DNA 결합 부위
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 DNA 결합 부위, 예컨대 가이드 RNA(gRNA)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 가이드 RNA 또는 gRNA 서열에 대한 보체를 포함한다. gRNA 짧은 합성 RNA는 불완전한 이펙터 모이어티로의 결합에 필요한 "스캐폴드" 서열, 및 게놈 표적에 대한 사용자-정의된 약 20개 뉴클레오티드 표적화 서열로 구성된다. 가이드 RNA 서열은 17 내지 24개의 뉴클레오티드(예를 들어, 19, 20 또는 21개의 뉴클레오티드)의 길이를 가질 수 있으며 표적화된 핵산 서열에 대하여 상보성이다. 맞춤 gRNA 생성기 및 알고리즘이, 효과적인 가이드 RNA의 설계에서 사용될 수 있다. 유전자 편집은 또한, 자연 발생 crRNA-tracrRNA 복합체를 모방하고 tracrRNA(뉴클레아제에 결합) 및 적어도 하나의 crRNA(뉴클레아제를 편집에 대해 표적화된 서열로 가이드함) 둘 모두를 함유하는 엔지니어링된(합성) 단일 RNA 분자인, 키메라 "단일 가이드 RNA"("sgRNA")를 사용하여 달성될 수 있다. 화학적으로 변형된 sgRNA는 게놈 편집에 효과적일 수 있다.
gRNA는 특정 DNA 서열(예를 들어, 유전자의 프로모터, 증강자, 침묵자 또는 억제자에 인접한 또는 그 내의 서열)을 인식할 수 있다.
일부 실시형태에서, gRNA는 유전자 편집을 위한 CRISPR 시스템의 부분이다. 유전자 편집을 위해, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 요망되는 표적 DNA 서열에 상응하는 하나의 또는 다중의 가이드 RNA 서열을 포함하도록 설계될 수 있다. gRNA 서열에는 Cas9 또는 DNA를 절단하기 위한 다른 엑소뉴클레아제와의 상호작용을 위해 적어도 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개 이상의 뉴클레오티드가 포함될 수 있으며, 예를 들어, Cpf1은 검출 가능한 DNA 절단을 위해 gRNA 서열의 적어도 약 16개 뉴클레오티드와 상호작용한다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 DNA에 결합할 수 있는 압타머 서열을 포함한다. 압타머 서열의 이차 구조는 DNA에 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 DNA로의 압타머 서열의 결합에 의해 DNA와 복합체를 형성한다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 이중나선 DNA 내의 메이저 그루브를 결합하는 서열을 포함한다. 하나의 이러한 경우에, 원형 폴리리보뉴클레오티드 및 듀플렉스 DNA에 의해 생성되는 삼중체 구조의 특이성 및 안정성은 후그스틴(Hoogsteen) 수소 결합을 통해 제공되며, 이는 듀플렉스 DNA에서 전통적인 왓슨-크릭 염기쌍 형성에서 형성된 것들과 상이하다. 한 경우에, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 큰 홈을 통해 표적 듀플렉스의 퓨린-풍부 가닥에 결합한다.
일부 실시형태에서, 삼중체 형성은 표적 듀플렉스의 퓨린-풍부 가닥에 대한 원형 폴리리보뉴클레오티드의 배향에 의해 구별되는, 2개 모티프에서 일어난다. 일부 경우에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 내의 폴리피리미딘 서열 스트레치는 평행 방식으로(즉, 듀플렉스의 퓨린-풍부 가닥과 동일한 5'에서 3'으로의 배향으로) 후그스틴 수소 결합을 통해 듀플렉스 DNA의 폴리퓨린 서열 스트레치에 결합하는 반면, 폴리퓨린 스트레치(R)는 역-후그스틴 수소 결합을 통해 듀플렉스의 퓨린 가닥에 역평행 방식으로 결합한다. 역평행에서, 퓨린 모티프는 G:G-C, A:AT, 또는 T:A-T의 삼중체를 포함하는 반면; 평행에서, 피리미딘 모티프는 C+:G-C 또는 T:A-T 삼중체의 정규 삼중체를 포함한다(여기서, C+는 N3 위치 상의 양성자화된 시토신을 나타냄). 원형 폴리리보뉴클레오티드 내의 역평행 GA 및 GT 서열은 중성 pH에서 안정한 삼중체를 형성할 수 있는 반면, 원형 폴리리보뉴클레오티드 내의 평행 CT 서열은 산성 pH에서 결합할 수 있다. 원형 폴리리보뉴클레오티드 내의 시토신 상의 N3는 양성자화될 수 있다. 5-메틸C는 시토신보다 더 높은 pK를 가지므로, C의 5-메틸-C로의 치환은 생리학적 pH에서 원형 폴리리보뉴클레오티드 내의 CT 서열의 결합을 허용할 수 있다. 퓨린 및 피리미딘 모티프 둘 모두에 있어서, 적어도 10개 염기 쌍의 인접 호모퓨린-호모피리미딘 서열 스트레치가 듀플렉스 DNA로의 원형 폴리리보뉴클레오티드 결합을 돕는데, 이는 더 짧은 삼중체가 생리학적 조건 하에 불안정할 수 있고 서열에서의 단속이 삼중체 구조를 불안정화시킬 수 있기 때문이다. 일부 실시형태에서, 삼중체 형성을 위한 DNA 듀플렉스 표적은 하나의 가닥에서 연속 퓨린 염기를 포함한다. 일부 실시형태에서, 삼중체 형성을 위한 표적은 DNA 듀플렉스의 하나의 가닥에서 호모퓨린 서열 및 상보적 가닥에서 호모피리미딘 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 삼중체는 안정된 구조이다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 삼중체는 증가된 반감기, 예를 들어, 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 또는 그 이상, 예를 들어, 적어도 약 1시간 내지 약 30일, 또는 적어도 약 2시간, 6시간, 12시간, 18시간, 24시간, 2일, 3,일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 21일, 22일, 23일, 24일, 25일, 26일, 27일, 28일, 29일, 30일, 60일, 또는 그 초과 또는 그 사이의 임의의 시간 동안의 지속성을 나타낸다.
단백질 결합 부위
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 하나 이상의 단백질 결합 부위를 포함한다. 일부 실시형태에서, 단백질 결합 부위는 압타머 서열을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 참조 화합물, 예를 들어, 단백질 결합 부위, 예를 들어, 선형 RNA를 결여한 원형 폴리리보뉴클레오티드에 의해 촉발되는 반응에 비하여 숙주로부터의 면역 반응을 감소시키는 단백질 결합 부위를 포함한다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 단백질, 예를 들어, 리보솜을 결합하는 하나 이상의 단백질 결합 부위를 포함한다. 단백질 결합 부위, 예를 들어, 리보솜 결합 부위를 원형 폴리리보뉴클레오티드 내로 조작함으로써, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 숙주의 면역계를 회피하거나, 숙주의 면역계에 의한 검출이 감소되거나, 조절된 분해 또는 조절된 번역을 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 적어도 하나의 면역단백질 결합 부위를 포함하여, 예를 들어, 숙주의 면역계의 성분으로부터 원형 폴리리보뉴클레오티드를 차폐한다(예를 들어, CTL 반응을 회피한다). 일부 실시형태에서, 면역단백질 결합 부위는 면역단백질에 결합하고, 비-외인성으로서 원형 폴리리보뉴클레오티드의 차폐를 보조하는 뉴클레오티드 서열이다.
선형 RNA로의 리보솜 연계의 종래의 메커니즘은 RNA의 캡핑된 5' 말단으로의 리보솜 결합을 수반한다. 5' 말단으로부터, 리보솜은 개시 코돈으로 이동하며, 이때, 제1 펩티드 결합이 형성된다. 본 발명에 따라, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 내부 개시(즉, 캡-독립적) 또는 번역은 자유 말단 또는 캡핑된 말단을 필요로 하지 않는다. 오히려, 리보솜이 비-캡핑된 내부 부위에 결합함으로써 리보솜은 개시 코돈에서 폴리펩티드 신장을 시작한다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 리보솜 결합 부위, 예를 들어, 개시 코돈을 포함하는 하나 이상의 RNA 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 단백질에 결합하는 단백질 결합 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단백질 결합 서열은 원형 폴리리보뉴클레오티드를 특정 표적에 표적화하거나 국소화시킨다. 일부 실시형태에서, 단백질 결합 서열은 단백질의 아르기닌-풍부 영역에 특이적으로 결합한다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 하나 이상의 단백질 결합 부위를 포함하며, 이는 각각 표적 단백질에 결합하여, 예를 들어, 2개 이상의 단백질을 매우 근접하게 하는 스캐폴드로서 작용한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 원형 폴리뉴클레오티드는 2개의 단백질 결합 부위를 포함하며, 이는 각각 표적 단백질에 결합함으로써, 표적 단백질을 매우 근접하게 한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 원형 폴리뉴클레오티드는 3개의 단백질 결합 부위를 포함하며, 이는 각각 표적 단백질에 결합함으로써, 3개의 표적 단백질을 매우 근접하게 한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 원형 폴리뉴클레오티드는 4개의 단백질 결합 부위를 포함하며, 이는 각각 표적 단백질에 결합함으로써, 4개의 표적 단백질을 매우 근접하게 한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 원형 폴리뉴클레오티드는 5개 이상의 단백질 결합 부위를 포함하며, 이는 각각 표적 단백질에 결합함으로써, 5개 이상의 표적 단백질을 매우 근접하게 한다. 일부 실시형태에서, 표적 단백질들은 동일하다. 일부 실시형태에서, 표적 단백질들은 상이하다. 일부 실시형태에서, 표적 단백질을 매우 근접하게 하는 것은 단백질 복합체의 형성을 촉진시킨다. 예를 들어, 본 개시내용의 원형 폴리리보뉴클레오티드는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개 이상의 표적 단백질을 포함하는 복합체의 형성을 촉진시키기 위한 스캐폴드로서 작용할 수 있다. 일부 실시형태에서, 2개 이상의 표적 단백질을 매우 근접하게 하는 것은 2개 이상의 표적 단백질의 상호작용을 촉진시킨다. 일부 실시형태에서, 2개 이상의 표적 단백질을 매우 근접하게 하는 것은 효소 반응을 조절하거나, 촉진시키거나, 저해한다. 일부 실시형태에서, 2개 이상의 표적 단백질을 매우 근접하게 하는 것은 신호 전달 경로를 조절하거나, 촉진시키거나, 저해한다.
일부 실시형태에서, 단백질 결합 부위는 단백질, 예컨대 ACIN1, AGO, APOBEC3F, APOBEC3G, ATXN2, AUH, BCCIP, CAPRIN1, CELF2, CPSF1, CPSF2, CPSF6, CPSF7, CSTF2, CSTF2T, CTCF, DDX21, DDX3, DDX3X, DDX42, DGCR8, EIF3A, EIF4A3, EIF4G2, ELAVL1, ELAVL3, FAM120A, FBL, FIP1L1, FKBP4, FMR1, FUS, FXR1, FXR2, GNL3, GTF2F1, HNRNPA1, HNRNPA2B1, HNRNPC, HNRNPK, HNRNPL, HNRNPM, HNRNPU, HNRNPUL1, IGF2BP1, IGF2BP2, IGF2BP3, ILF3, KHDRBS1, LARP7, LIN28A, LIN28B, m6A, MBNL2, METTL3, MOV10, MSI1, MSI2, NONO, NONO-, NOP58, NPM1, NUDT21, p53, PCBP2, POLR2A, PRPF8, PTBP1, RBFOX1, RBFOX2, RBFOX3, RBM10, RBM22, RBM27, RBM47, RNPS1, SAFB2, SBDS, SF3A3, SF3B4, SIRT7, SLBP, SLTM, SMNDC1, SND1, SRRM4, SRSF1, SRSF3, SRSF7, SRSF9, TAF15, TARDBP, TIA1, TNRC6A, TOP3B, TRA2A, TRA2B, U2AF1, U2AF2, UNK, UPF1, WDR33, XRN2, YBX1, YTHDC1, YTHDF1, YTHDF2, YWHAG, ZC3H7B, PDK1, AKT1, 및 RNA에 결합하는 임의의 다른 단백질에 대한 결합 부위를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 단백질 결합 부위는 단백질에 결합하는 핵산 서열, 예를 들어, 전사 인자, 인핸서, 억제인자, 중합효소, 뉴클레아제, 히스톤 또는 DNA에 결합하는 임의의 다른 단백질에 결합할 수 있는 서열이다. 일부 실시형태에서, 단백질 결합 부위는 단백질에 결합하는 압타머 서열이다. 일부 실시형태에서, 압타머 서열의 이차 구조는 단백질에 결합한다. 일부 실시형태에서, 원형 RNA는 단백질로의 압타머 서열의 결합에 의해 단백질과 복합체를 형성한다.
일부 실시형태에서, 원형 RNA는 소분자 또는 그의 부분에 컨쥬게이트되며, 소분자 또는 그의 부분은 표적, 예컨대 단백질에 결합한다. 소분자는 변형된 뉴클레오티드를 통해, 예를 들어, 클릭 화학에 의해 원형 RNA에 컨쥬게이트될 수 있다. 단백질에 결합할 수 있는 소분자의 예에는 4-하이드록시타목시펜(4-OHT), AC220, 아파티닙(Afatinib), 아미노피라졸(aminopyrazole) 유사체, AR 길항제, BI-7273, 보수티닙(Bosutinib), 세리티닙(Ceritinib), 클로로알칸(Chloroalkane), 다사티닙(Dasatinib), 포레티닙(Foretinib), 제피티닙(Gefitinib), HIF-1α-유래(R)-하이드록시프롤린, HJB97, 하이드록시프롤린-기반의 리간드, IACS-7e, 이브루티닙(Ibrutinib), 이브루티닙 유도체, JQ1, 라파티닙(Lapatinib), LCL161 유도체, 레날리도미드(Lenalidomide), 누틀린(nutlin) 소분자, OTX015, PDE4 저해제, 포말리도미드(Pomalidomide), ripk2 저해제, RN486, Sirt2 저해제 3b, SNS-032, 스틸(Steel) 인자, TBK1 저해제, 탈리도미드(Thalidomide), 탈리도미드 유도체, 티아졸리딘디온-기반의 리간드, VH032 유도체, VHL 리간드 2, VHL-1, VL-269 및 그의 유도체가 포함되지만 이에 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 원형 RNA는 1개 초과의 소분자, 예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 이상의 소분자에 컨쥬게이트된다. 일부 실시형태에서, 원형 RNA는 1개 초과의 상이한 소분자, 예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 이상의 상이한 소분자에 컨쥬게이트된다. 일부 실시형태에서, 원형 RNA에 컨쥬게이트된 1개 초과의 소분자는 그들의 각각의 표적 단백질을 근접하게 동원하도록 구성되며, 이는 표적 단백질 간의 상호작용 및/또는 기타 분자적 및 세포적 변화를 야기할 수 있다. 예를 들어, 원형 RNA는 JQ1 및 탈리도미드 둘 모두 또는 그의 유도체에 컨쥬게이트될 수 있으며, 이에 따라 이는 JQ1의 표적 단백질, 예를 들어, BET 과 단백질 및 탈리도미드의 표적 단백질, 예를 들어, E3 리가제를 동원할 수 있다. 일부 경우에, JQ1 및 탈리도미드와 컨쥬게이트된 원형 RNA는 JQ1 또는 그의 유도체를 통해 BET 과 단백질을 동원하고, 탈리도미드 또는 그의 유도체를 통해 동원되는 E3 리가제에 의해 BET 과 단백질을 유비퀴틴으로 태깅하고, 이에 따라, 태깅된 BET 과 단백질의 분해를 야기한다.
다른 결합 부위
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 비-RNA 또는 비-DNA 표적에 대한 하나 이상의 결합 부위를 포함한다. 일부 실시형태에서, 결합 부위는 소분자, 압타머, 지질, 탄수화물, 바이러스 입자, 막, 다-성분 복합체, 세포, 세포성 모이어티, 또는 이의 임의의 결합 부위 단편 중 하나일 수 있다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 지질에 대한 하나 이상의 결합 부위를 포함한다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 탄수화물에 대한 하나 이상의 결합 부위를 포함한다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 탄수화물에 대한 하나 이상의 결합 부위를 포함한다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 막에 대한 하나 이상의 결합 부위를 포함한다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 다성분 복합체, 예를 들어, 리보좀, 뉴클레오좀, 전사 기구 등에 대한 하나 이상의 결합 부위를 포함한다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 압타머 서열을 포함한다. 압타머 서열은 본원에 기술된 바와 같은 임의의 표적(예를 들어, 핵산 분자, 소분자, 단백질, 탄수화물, 지질 등)에 결합할 수 있다. 압타머 서열은 표적에 결합할 수 있는 이차 구조를 갖는다. 일부 실시형태에서, 압타머 서열은 표적에 결합할 수 있는 3차 구조를 갖는다. 일부 실시형태에서, 압타머 서열은 표적에 결합할 수 있는 4차 구조를 갖는다. 원형 폴리리보뉴클레오티드는 압타머 서열을 통해 표적에 결합하여 복합체를 형성할 수 있다. 일부 실시형태에서, 복합체는 적어도 5일 동안 검출 가능하다. 일부 실시형태에서, 복합체는 적어도 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일 또는 16일 동안 검출 가능하다.
표적
적어도 하나의 결합 부위는 표적에 결합할 수 있다. 적어도 하나의 결합 부위는 표적에 결합하는 적어도 하나의 압타머 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, circRNA는 하나 이상의 표적에 대한 하나 이상의 결합 부위를 포함한다. 표적은 핵산(예를 들어, RNA, DNA, RNA-DNA 하이브리드), 소분자(예를 들어, 약물, 형광단, 대사물질), 압타머, 폴리펩티드, 단백질, 지질, 탄수화물, 항체, 바이러스, 바이러스 입자, 막, 다-성분 복합체, 세포소기관, 세포, 다른 세포 모이어티, 그의 임의의 단편, 및 그의 임의의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. (예를 들어, 문헌[Fredriksson et al., (2002) Nat Biotech 20:473-77]; 문헌[Gullberg et al., (2004) PNAS, 101:8420-24] 참조). 예를 들어, 표적은 단일-가닥 RNA, 이중-가닥 RNA, 단일-가닥 DNA, 이중-가닥 DNA, 하나 이상의 이중 가닥 영역 및 하나 이상의 단일 가닥 영역을 포함하는 DNA 또는 RNA, RNA-DNA 하이브리드, 소분자, 압타머, 폴리펩티드, 단백질, 지질, 탄수화물, 항체, 항체 단편, 항체의 혼합물, 바이러스 입자, 막, 다-성분 복합체, 세포, 세포 모이어티, 그의 임의의 단편 또는 그의 임의의 조합이다.
일부 실시형태에서, 표적은 폴리펩티드, 단백질 또는 그의 임의의 단편이다. 예를 들어, 표적은 정제된 폴리펩티드, 단리된 폴리펩티드, 융합 태깅된 폴리펩티드, 세포의 막 또는 바이러스 또는 비리온에 부착되거나 그에 걸쳐 있는 폴리펩티드, 세포질 단백질, 세포내 단백질, 세포외 단백질, 키나제, 티로신 키나제, 세린/트레오닌 키나제, 포스파타제, 아로마타제, 포스포디에스테라제, 사이클라제, 헬리카제, 프로테아제, 산화환원효소, 환원효소, 트랜스퍼라제, 가수분해효소, 리아제, 이성질화효소, 글리코실라제, 세포외 기질 단백질, 리가제, 유비퀴틴 리가제, 번역후 변형에 영향을 미치는 임의의 리가제, 이온 수송체, 채널, 포어, 세포사멸 단백질, 세포 부착 단백질, 병원성 단백질, 비정상적으로 발현되는 단백질, 전사 인자, 전사 조절자, 번역 단백질, 후성적 인자, 후성적 조절제, 염색질 조절제, 샤페론(chaperone), 분비된 단백질, 리간드, 호르몬, 사이토카인, 케모카인, 핵 단백질, 수용체, 막횡단 수용체, 티로신 키나제, G-단백질 결합된 수용체, 성장 인자 수용체, 핵 수용체, 호르몬 수용체, 신호 전달자, 항체, 막 단백질, 내재 막 단백질, 주변 막 단백질, 세포벽 단백질, 구형 단백질, 섬유성 단백질, 당단백질, 지질단백질, 염색체 단백질, 원종양유전자, 종양유전자, 종양-억제자 유전자, 그의 임의의 단편 또는 그의 임의의 조합일 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적은 이종 폴리펩티드이다. 일부 실시형태에서, 표적은 분자 기법, 예컨대 트랜스펙션을 사용하여 세포에서 과발현된 단백질이다. 일부 실시형태에서, 표적은 재조합 폴리펩티드이다. 예를 들어, 표적은 박테리아(예를 들어, 이. 콜라이(E. coli)), 효모, 포유동물 또는 곤충 세포로부터 생성되는 시료에 존재한다(예를 들어, 유기체에 의해 과발현되는 단백질). 일부 실시형태에서, 표적은 돌연변이, 삽입, 결실 또는 다형성을 갖는 폴리펩티드이다. 일부 실시형태에서, 표적은 세포(예를 들어, 건강한 세포 또는 질병 또는 질환과 연관된 세포)에 의해 천연적으로 발현되는 폴리펩티드이다. 일부 실시형태에서, 표적은 항원, 예컨대 유기체를 면역화시키기 위해 또는 유기체에서 면역 반응을 생성하기 위해, 예컨대 항체 생성을 위해 사용되는 폴리펩티드이다.
일부 실시형태에서, 표적은 항체이다. 항체는 또 다른 분자의 특정 공간적 및 극성 구조에 특이적으로 결합할 수 있다. 항체는 모노클로널, 폴리클로널 또는 재조합 항체일 수 있으며, 당업계에 널리 알려져 있는 기법, 예컨대 숙주의 면역화 및 혈청(폴리클로널)의 수집에 의해 또는 연속 하이브리드 세포주를 제조하고 분비된 단백질(모노클로널)을 수집함으로써 또는 적어도 천연 항체의 특이적인 결합에 필요한 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 그의 돌연변이된 버전을 클로닝하고 발현시킴으로써 제조될 수 있다. 자연 발생 항체는 이황화 결합에 의해 상호-연결된 적어도 2개의 중(H)쇄 및 2개의 경(L)쇄를 포함하는 단백질일 수 있다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(VH) 및 중쇄 불변 영역으로 구성될 수 있다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3를 포함할 수 있다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(VL) 및 경쇄 불변 영역을 포함할 수 있다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인, CL을 포함할 수 있다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역(FR)으로 지칭되는 더욱 보존된 영역이 산재된, 상보성 결정 영역(CDR)으로 지칭되는 초가변 영역으로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 아미노-말단에서 카복시-말단으로 하기의 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성될 수 있다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4. 항체의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포(예를 들어, 이펙터 세포) 및 전형적 보체계의 제1 성분(C1 q)을 포함한 숙주 조직 또는 인자로의 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다. 항체는 임의의 아이소타입(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 부류(예를 들어, lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, lgA1 및 lgA2), 그의 하위부류 또는 변형된 버전의 것일 수 있다. 항체는 완전한 면역글로불린 또는 그의 단편을 포함할 수 있다. 항체 단편은 결합 모이어티, 예컨대 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 나타낼 수 있다. 또한, 특정 분자에 대한 결합 친화성이 유지되는 한, 면역글로불린의 응집물, 폴리머 및 컨쥬게이트 또는 그들의 단편도 포함된다. 항체 단편의 예는 Fab 단편, VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편; F(ab)2 단편, 힌지 영역에서 이황화 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편; VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; 항체의 단일의 아암(arm)의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; VH 도메인으로 이루어진 단일 도메인 항체(dAb) 단편(문헌[Ward et al., (1989) Nature 341 :544-46]); 및 단리된 CDR 및 VL 및 VH 영역이 쌍을 형성하여 1가 분자를 형성하는 단일 쇄 단편(scFv)(단일 쇄 Fv(scFv)로도 알려져 있음; 예를 들어, 문헌[Bird et al., (1988) Science 242:423-26]; 및 문헌[Huston et al., (1988) PNAS 85:5879-83] 참조)을 포함한다. 따라서, 항체 단편은 Fab, F(ab)2, scFv, Fv, dAb 등을 포함한다. 2개의 도메인 VL 및 VH가 개별 유전자에 의해 코딩되지만, 그들은 재조합 방법을 사용하여, 인공 펩티드 링커에 의해 연결될 수 있으며, 이는 그들이 단일의 단백질 쇄로서 제조되게 할 수 있다. 이러한 단일 쇄 항체는 하나 이상의 항원 결합 모이어티를 포함한다. 항체는 다가 항체, 예를 들어, 2가, 3가, 4가, 5가, 6가, 7가 또는 8가 항체일 수 있다. 항체는 다중-특이적 항체일 수 있다. 예를 들어, 2중특이적, 3중특이적, 4중특이적, 5중특이적, 6중특이적, 7중특이적 또는 8중특이적 항체는 예를 들어, 임의의 둘 이상의 항원 결합 작용제(예를 들어, Fab, F(ab)2, scFv, Fv, IgG)의 조합을 재조합적으로 연결함으로써 생성될 수 있다. 다중-특이적 항체를 사용하여 둘 이상의 표적, 예를 들어, 분해 기구와 분해할 표적 기질, 또는 유비퀴틴 리가제와 유비퀴틴화할 기질을 매우 근접하게 할 수 있다. 이들 항체 단편은 당업자에게 알려져 있는 통상의 기법을 사용하여 수득될 수 있으며, 단편은 온전한 항체와 동일한 방식으로 유용성에 대하여 스크리닝될 수 있다. 항체는 인간, 인간화, 키메라, 단리된, 개, 고양이, 당나귀, 양, 임의의 식물, 동물 또는 포유동물일 수 있다.
일부 실시형태에서, 표적은 폴리머 형태의 리보뉴클레오티드 및/또는 데옥시리보뉴클레오티드(아데닌, 구아닌, 티민 또는 시토신), 예컨대 DNA 또는 RNA(예를 들어, mRNA)이다. DNA는 선형 DNA 분자(예를 들어, 제한 단편), 바이러스, 플라스미드 및 염색체에서 관찰되는 이중-가닥 DNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오티드 표적은 단일-가닥, 이중 가닥, 작은 간섭 RNA(siRNA), 메신저 RNA(mRNA), 전달 RNA(tRNA), 염색체, 유전자, 비코딩 게놈 서열, 게놈 DNA(예를 들어, 단편화된 게놈 DNA), 정제된 폴리뉴클레오티드, 단리된 폴리뉴클레오티드, 혼성화된 폴리뉴클레오티드, 전사 인자 결합 부위, 미토콘드리아 DNA, 리보솜 RNA, 진핵 폴리뉴클레오티드, 원핵 폴리뉴클레오티드, 합성된 폴리뉴클레오티드, 라이게이션된 폴리뉴클레오티드, 재조합 폴리뉴클레오티드, 핵산 유사체를 함유하는 폴리뉴클레오티드, 메틸화된 폴리뉴클레오티드, 탈메틸화된 폴리뉴클레오티드, 그의 임의의 단편, 또는 그의 임의의 조합이다. 일부 실시형태에서, 표적은 재조합 폴리뉴클레오티드이다. 일부 실시형태에서, 표적은 이종 폴리뉴클레오티드이다. 예를 들어, 표적은 박테리아(예를 들어, 이. 콜라이), 효모, 포유동물 또는 곤충 세포로부터 생성된 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 유기체에 대하여 이종인 폴리뉴클레오티드)이다. 일부 실시형태에서, 표적은 돌연변이, 삽입, 결실 또는 다형성을 갖는 폴리뉴클레오티드이다.
일부 실시형태에서, 표적은 압타머이다. 압타머는 결합 모이어티 또는 표적 분자, 예컨대 단백질에 높은 특이성 및 친화성으로 결합하는 단리된 핵산 분자이다. 압타머는 그의 주어진 표적에 특이적으로 결합하는 화학적 접촉을 제공하는 특정 입체형태(들)로 유지되는 3차원 구조이다. 압타머가 핵산 기반의 분자이지만, 압타머와 다른 핵산 분자, 예컨대 유전자와 mRNA 간에는 근본적 차이가 존재한다. 후자에 있어서, 핵산 구조는 그의 선형 염기 서열을 통해 정보를 인코딩하며, 이에 따라 이 서열은 정보 저장 기능에 중요하다. 완전히 대조적으로, 표적 분자의 특이적인 결합에 기초한 압타머 기능은 보존된 선형 염기 서열(비-코딩 서열)에 의해 전적으로 좌우되지 않으며, 오히려 특정 이차/삼차/사차 구조에 좌우된다. 압타머가 보유할 수 있는 임의의 코딩 능력은 우발적이며, 그의 동족체 표적으로의 압타머의 결합에서 어떤 역할을 한다고 여겨지지 않는다. 압타머는 특정 단백질에 결합하는 자연 발생 핵산 서열과 구별된다. 이들 후자의 서열은 자연 발생 핵산의 전사, 번역 및 수송에 수반되는 특수 하위군의 단백질(예를 들어, 핵산-결합 단백질)에 결합하는 유기체의 게놈 내에 매립된 자연 발생 서열이다. 반면, 압타머는 비-자연 발생 핵산 분자이다. 핵산-결합 단백질에 결합하는 압타머가 확인될 수 있지만, 대부분의 경우 이러한 압타머는 천연에서 핵산-결합 단백질에 의해 인식되는 서열에 대하여 서열 동일성을 거의 갖지 않거나 전혀 갖지 않는다. 가장 중요하게는, 압타머는 사실상 임의의 단백질(핵산-결합 단백질만이 아님)뿐만 아니라 소분자, 탄수화물, 펩티드 등을 포함하는 거의 모든 관심 파트너에 결합할 수 있다. 대부분의 파트너, 심지어 단백질에 있어서도, 그것이 결합하는 자연 발생 핵산 서열이 존재하지 않는다. 이러한 서열을 갖는 파트너, 예를 들어, 핵산-결합 단백질에 있어서, 이러한 서열은 단단히 결합하는 압타머에 비해 천연에서 사용되는 상대적으로 낮은 결합 친화성의 결과로서 압타머와 상이할 것이다. 압타머는 선택된 파트너에 특이적으로 결합하고, 예를 들어 결합을 통해, 파트너의 활성 또는 결합 상호작용을 조절할 수 있고, 압타머는 그들의 파트너의 작용 능력을 차단할 수 있다. 파트너에 특이적으로 결합하는 기능적 특성은 압타머의 고유 특성이다. 압타머는 6 내지 35 kDa일 수 있다. 압타머는 20 내지 500개 뉴클레오티드일 수 있다. 압타머는 마이크로몰 내지 나노몰 미만의 친화도로 그의 파트너에 결합할 수 있고, 밀접하게 관련이 있는 표적을 구별할 수 있다(예를 들어, 압타머는 동일한 유전자 과로부터의 관련 단백질에 선택적으로 결합할 수 있다). 일부 경우에, 압타머는 하나의 분자에만 결합한다. 일부 경우에, 압타머는 관심 분자의 과 구성원에 결합한다. 압타머는 일부 경우에 다수의 상이한 분자에 결합한다. 압타머는 특정 파트너와 결합하기 위해, 흔히 관찰되는 분자간 상호작용, 예컨대 수소 결합, 정전기적 상보성, 소수성 접촉, 및 입체적 배제를 사용할 수 있다. 압타머는 높은 특이성 및 친화성, 낮은 면역원성, 생물학적 효능, 및 뛰어난 약동학적 특성을 포함하는, 치료제 및 진단제로서 사용하기 위한 수많은 바람직한 특징을 갖는다. 압타머는 공유적으로 연결되는 상보적 폴리뉴클레오티드의 혼성화로부터 형성되는 분자 스템 및 루프 구조(예를 들어, 헤어핀 루프 구조)를 포함할 수 있다. 스템은 혼성화된 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 루프는 2개의 상보적 폴리뉴클레오티드를 공유적으로 연결하는 영역이다. 압타머는 압타머 서열을 포함하는 선형 리보핵산(예를 들어, 선형 압타머) 또는 압타머 서열을 포함하는 원형 폴리리보핵산(예를 들어, 원형 압타머)일 수 있다.
일부 실시형태에서, 표적은 소분자이다. 예를 들어, 소분자는 마크로사이클릭 분자, 저해제, 약물 또는 화합물일 수 있다. 일부 실시형태에서, 소분자는 5개 이하의 수소 결합 공여체를 함유한다. 일부 실시형태에서, 소분자는 10개 이하의 수소 결합 수용체를 함유한다. 일부 실시형태에서, 소분자는 500 달톤 이하의 분자량을 갖는다. 일부 실시형태에서, 소분자는 약 180 달톤 내지 500 달톤의 분자량을 갖는다. 일부 실시형태에서, 소분자는 5 이하의 옥탄올-물 분배 계수 lop P를 함유한다. 일부 실시형태에서, 소분자는 -0.4 내지 5.6의 분배 계수 lop P를 갖는다. 일부 실시형태에서, 소분자는 40 내지 130의 몰 굴절을 갖는다. 일부 실시형태에서, 소분자는 약 20개 내지 약 70개의 원자를 함유한다. 일부 실시형태에서, 소분자는 140 옹스트롬2 이하의 극성 표면적을 갖는다.
일부 실시형태에서, circRNA는 단일의 표적 또는 복수의(예를 들어, 둘 이상의) 표적에 결합하는 결합 부위를 포함한다. 일 실시형태에서, 단일의 circRNA는 하나 단일 표적에 대한 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 이상의 상이한 결합 부위를 포함한다. 일 실시형태에서, 단일의 circRNA는 하나 단일 표적에 대한 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 이상의 동일한 결합 부위를 포함한다. 일 실시형태에서, 단일의 circRNA는 하나 이상의 상이한 표적에 대한 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 이상의 상이한 결합 부위를 포함한다. 일 실시형태에서, 둘 이상의 표적은 시료, 예컨대 표적의 혼합물 또는 라이브러리에 존재하며, 시료는 둘 이상의 표적을 결합하는 둘 이상의 결합 부위를 포함하는 circRNA를 포함한다.
일부 실시형태에서, 단일의 표적 또는 복수의(예를 들어, 둘 이상의) 표적은 복수의 결합 모이어티를 갖는다. 일 실시형태에서, 단일의 표적은 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 이상의 결합 모이어티를 가질 수 있다. 일 실시형태에서, 둘 이상의 표적은 시료, 예컨대 표적의 혼합물 또는 라이브러리에 존재하며, 시료는 둘 이상의 결합 모이어티를 포함한다. 일부 실시형태에서, 단일의 표적 또는 복수의 표적은 복수의 상이한 결합 모이어티를 포함한다. 예를 들어, 상기 복수는 적어도 약 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개, 20개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개, 100개, 200개, 500개, 1,000개, 2,000개, 3,000개, 4,000개, 5,000개, 6,000개, 7,000개, 8,000개, 9,000개, 10,000개, 11,000개, 12,000개, 13,000개, 14,000개, 15,000개, 16,000개, 17,000개, 18,000개, 19,000개, 20,000개, 25,000개 또는 30,000개의 결합 모이어티를 포함할 수 있다.
표적은 적어도 2개의 상이한 결합 모이어티를 포함하는 복수의 결합 모이어티를 포함할 수 있다. 예를 들어, 결합 모이어티는 적어도 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 25개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개, 100개, 200개, 300개, 400개, 500개, 600개, 700개, 800개, 900개, 1,000개, 2,000개, 3,000개, 4,000개, 5,000개, 6,000개, 7,000개, 8,000개, 9,000개, 10,000개, 11,000개, 12,000개, 13,000개, 14,000개, 15,000개, 16,000개, 17,000개, 18,000개, 19,000개, 20,000개, 21,000개, 22,000개, 23,000개, 24,000개 또는 25,000개의 상이한 결합 모이어티를 포함하는 복수의 결합 모이어티를 포함할 수 있다.
원형 폴리리보뉴클레오티드 요소
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 단백질(예를 들어, 치료적 단백질)을 인코딩하는 서열 및/또는 적어도 하나의 결합 부위를 포함하는 것에 더하여 본원에 기술된 바와 같은 요소 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 폴리-A 테일을 결여한다. 일부 실시형태에서 원형 폴리리보뉴클레오티드는 복제 요소를 결여한다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 IRES을 결여한다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 캡을 결여한다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 본원에 그의 전체가 참조로 포함되는 WO2019/118919호에 개시된 바와 같은 임의의 특징 또는 특징의 임의의 조합을 포함한다.
예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 상기 개시된 것들에 더하여 하나 이상의 폴리펩티드 또는 펩티드를 인코딩하는 서열을 포함한다. 일부 예는 형광 태그 또는 마커, 항원, 펩티드 치료제, 천연-생물활성 펩티드로부터의 합성 또는 유사체 펩티드, 효능제 또는 길항제 펩티드, 항-미생물 펩티드, 포어-형성 펩티드, 바이사이클릭 펩티드, 표적화 또는 세포독성 펩티드, 분해 또는 자가-파괴 펩티드, 및 분해 또는 자가-파괴 펩티드들을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 본원에 기재된 바와 같은 추가적인 치료적 단백질을 인코딩하는 발현 서열을 추가로 포함한다. 조절 요소의 추가적인 예는 WO2019/118919의 문단 [0151] 내지 [0153]에 기술되어 있으며, 그의 전문이 본원에 참조로 포함된다.
예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 조절 요소, 예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드 내의 발현 서열의 발현을 변형시키는 서열을 포함한다. 조절 요소는, 발현 생성물을 인코딩하는 발현 서열에 인접하여 위치한 서열을 포함할 수 있다. 조절 요소는 인접 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 조절 요소는 조절 요소가 존재하지 않는 경우 발현되는 생성물의 양에 비하여, 발현되는 생성물의 양을 증가시킬 수 있다. 또한, 하나의 조절 요소는 탠덤으로 부착된 다수의 발현 서열에 대해 발현되는 생성물의 양을 증가시킬 수 있다. 그러므로, 하나의 조절 요소는 하나 이상의 발현 서열의 발현을 증강시킬 수 있다. 또한, 다수의 조절 요소를 사용하여, 예를 들어, 상이한 발현 서열의 발현을 차등적으로 조절할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공되는 바와 같은 조절 요소는 선택적 번역 서열을 포함할 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "선택적 번역 서열"은 원형 폴리리보뉴클레오티드 내의 발현 서열의 번역을 선택적으로 개시하거나 활성화시키는 핵산 서열, 예를 들어, 특정 리보스위치 압타자임을 지칭한다. 조절 요소는 또한 선택적 분해 서열을 포함할 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "선택적 분해 서열"은 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 발현 생성물의 분해를 개시하는 핵산 서열을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 조절 요소는 번역 조절자이다. 번역 조절자는 원형 폴리리보뉴클레오티드 내의 발현 서열의 번역을 조절할 수 있다. 번역 조절자는 번역 증강자 또는 억제자일 수 있다. 일부 실시형태에서, 번역 개시 서열은 조절 요소로서 기능할 수 있다. 조절 요소의 추가적인 예는 WO2019/118919의 문단 [0154] 내지 [0161]에 기술되어 있으며, 그의 전문이 본원에 참조로 포함된다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 단백질(예를 들어, 치료적 단백질)을 인코딩하는 서열 및/또는 적어도 하나의 결합 부위를 포함하며, 번역 개시 서열, 예를 들어, 출발 코돈을 포함한다. 일부 실시형태에서, 번역 개시 서열은 코작 또는 샤인-달가노(Shine-Dalgarno) 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 발현 서열에 인접한 번역 개시 서열, 예를 들어, 코작 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 번역 개시 서열은 비-코딩 출발 코돈이다. 일부 실시형태에서, 번역 개시 서열, 예를 들어, 코작 서열은 각 발현 서열의 한측 또는 양측 모두에 존재하여, 발현 생성물의 분리를 야기한다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 발현 서열에 인접한 적어도 하나의 번역 개시 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 번역 개시 서열은 원형 폴리리보뉴클레오티드에 입체형태적 유연성을 제공한다. 일부 실시형태에서, 번역 개시 서열은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 실질적으로 단일 가닥의 영역 내에 존재한다. 번역 개시 서열의 추가적인 예는 WO2019/118919의 문단 [0163] 내지 [0165]에 기술되어 있으며, 그의 전문이 본원에 참조로 포함된다.
일부 실시형태에서, 본원에 기술된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 요소를 포함한다. 원형 폴리리보뉴클레오티드 내에 포함시키기에 적합한 IRES 요소는 진핵 리보솜과 연계(engage)될 수 있는 RNA 서열일 수 있다. IRES의 추가적인 예는 WO2019/118919의 문단 [0166] 내지 [0168]에 기술되어 있으며, 그의 전문이 본원에 참조로 포함된다.
원형 폴리리보뉴클레오티드는 하나 이상의 발현 서열(예를 들어, 치료적 단백질)을 포함할 수 있으며, 각각의 발현 서열은 종결 요소를 갖거나, 이를 갖지 않을 수 있다. 종결 요소의 추가적인 예는 WO2019/118919의 문단 [0169] 내지 [0170]에 기술되어 있으며, 그의 전문이 본원에 참조로 포함된다.
본 개시내용의 원형 폴리리보뉴클레오티드는 스태거 요소를 포함할 수 있다. 용어 "스태거 요소"는 번역 동안 리보솜 정지를 유도하는 모이어티, 예컨대 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 스태거 요소는 강력한 알파-나선 경향을 갖는 아미노산의 비-보존된 서열에 이어서 공통 서열 -D(V/I)ExNPGP이며, 여기서 x는 임의의 아미노산이다. 일부 실시형태에서, 스태거 요소는 화학적 모이어티, 예컨대 글리세롤, 비 핵산 연결 모이어티, 화학적 변형, 변형된 핵산 또는 그의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 발현 서열에 인접한 적어도 하나의 스태거 요소를 포함한다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 각 발현 서열에 인접한 스태거 요소를 포함한다. 일부 실시형태에서, 스태거 요소는 각 발현 서열의 한측 또는 양측 모두에 존재하여, 발현 생성물, 예를 들어, 펩티드(들) 및/또는 폴리펩티드(들)의 분리를 야기한다. 일부 실시형태에서, 스태거 요소는 하나 이상의 발현 서열의 일부이다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 하나 이상의 발현 서열을 포함하며, 하나 이상의 발현 서열의 각각은 원형 폴리리보뉴클레오티드 상의 스태거 요소에 의해 후속 발현 서열로부터 분리된다. 일부 실시형태에서, 스태거 요소는 (a) 단일의 발현 서열의 2 라운드의 번역으로부터의 또는 (b) 둘 이상의 발현 서열의 1 라운드 이상의 번역으로부터의 단일 폴리펩티드의 생성을 방지한다. 일부 실시형태에서, 스태거 요소는 하나 이상의 발현 서열로부터 분리된 서열이다. 일부 실시형태에서, 스태거 요소는 하나 이상의 발현 서열 중 하나의 발현 서열의 일부를 포함한다.
스태거 요소의 추가적인 예는 WO2019/118919의 문단 [0172] 내지 [0175]에 기술되어 있으며, 그의 전문이 본원에 참조로 포함된다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 하나 이상의 조절 핵산 서열을 포함하거나 조절 핵산을 인코딩하는 하나 이상의 발현 서열, 예를 들어, 내인성 유전자 및/또는 외인성 유전자의 발현을 변경시키는 핵산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공되는 바와 같은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 발현 서열은 비-코딩 RNA, 예컨대 비제한적으로 tRNA, lncRNA, miRNA, rRNA, snRNA, 마이크로RNA, siRNA, piRNA, snoRNA, snRNA, exRNA, scaRNA, Y RNA 및 hnRNA와 같은 조절 핵산에 대해 안티센스인 서열을 포함할 수 있다.
조절 핵산의 추가적인 예는 WO2019/118919의 문단 [0177] 내지 [0194]에 기술되어 있으며, 그의 전문이 본원에 참조로 포함된다.
일부 실시형태에서, 본원에 제공되는 바와 같은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 번역 효율은 참조물질, 예를 들어 선형 대응물, 선형 발현 서열 또는 선형의 원형 폴리리보뉴클레오티드보다 더 크다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공되는 바와 같은 원형 폴리리보뉴클레오티드는 참조물질의 번역 효율보다 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%, 500%, 600%, 70%, 800%, 900%, 1000%, 2000%, 5000%, 10000%, 100000% 또는 그 초과로 더 큰 번역 효율을 갖는다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 선형 대응물의 번역 효율보다 10% 더 큰 번역 효율을 갖는다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 선형 대응물의 번역 효율보다 300% 더 큰 번역 효율을 갖는다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 화학량론적 비의 발현 생성물을 생성한다. 회전환 번역은 발현 생성물을 실질적으로 동등한 비로 연속적으로 생성한다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 발현 생성물이 실질적으로 동등한 비로 생성되도록 화학량론적 번역 효율을 갖는다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 다중의 발현 생성물, 예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개 또는 그 초과의 발현 서열로부터의 생성물의 화학량론적 번역 효율을 갖는다.
일부 실시형태에서, 일단 원형 폴리리보뉴클레오티드의 번역이 개시되면, 원형 폴리리보뉴클레오티드에 결합된 리보솜은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 적어도 1 라운드의 번역을 완료하기 전에 원형 폴리리보뉴클레오티드로부터 탈연계되지 않는다. 일부 실시형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 원형 폴리리보뉴클레오티드는 회전환 번역에 적격성이다. 일부 실시형태에서, 회전환 번역 동안, 일단 원형 폴리리보뉴클레오티드의 번역이 개시되면, 원형 폴리리보뉴클레오티드에 결합된 리보솜은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 적어도 2 라운드, 적어도 3 라운드, 적어도 4 라운드, 적어도 5 라운드, 적어도 6 라운드, 적어도 7 라운드, 적어도 8 라운드, 적어도 9 라운드, 적어도 10 라운드, 적어도 11 라운드, 적어도 12 라운드, 적어도 13 라운드, 적어도 14 라운드, 적어도 15 라운드, 적어도 20 라운드, 적어도 30 라운드, 적어도 40 라운드, 적어도 50 라운드, 적어도 60 라운드, 적어도 70 라운드, 적어도 80 라운드, 적어도 90 라운드, 적어도 100 라운드, 적어도 150 라운드, 적어도 200 라운드, 적어도 250 라운드, 적어도 500 라운드, 적어도 1000 라운드, 적어도 1500 라운드, 적어도 2000 라운드, 적어도 5000 라운드, 적어도 10000 라운드, 적어도 105 라운드 또는 적어도 106 라운드의 번역을 완료하기 전에, 원형 폴리리보뉴클레오티드로부터 탈연계되지 않는다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 회전환 번역은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 1 라운드 초과의 번역으로부터 번역되는 폴리펩티드 생성물("연속" 발현 생성물)의 생성을 야기한다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 스태거 요소를 포함하며, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 회전환 번역은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 단일 라운드의 번역 또는 단일 라운드 미만의 번역으로부터 생성되는 폴리펩티드 생성물("불연속" 발현 생성물)의 생성을 야기한다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 회전환 번역 동안 생성되는 총 폴리펩티드의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%(몰/몰)가 불연속 폴리펩티드이도록 구성된다. 일부 실시형태에서, 총 폴리펩티드에 비한 불연속 생성물의 양의 비는 시험관내 번역 시스템에서 시험된다. 일부 실시형태에서, 양의 비를 시험하기 위해 사용되는 시험관내 번역 시스템은 토끼 망상적혈구 용해물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 양의 비는 생체내 번역 시스템, 예컨대 진핵 세포 또는 원핵 세포, 배양된 세포, 또는 유기체 내의 세포에서 시험된다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 비번역 영역(UTR)을 포함한다. 유전자를 포함하는 게놈 영역의 UTR은 전사되지만 번역되지 않을 수 있다. 일부 실시형태에서, UTR은 본원에 기술된 발현 서열의 번역 개시 서열의 업스트림에 포함될 수 있다. 일부 실시형태에서, UTR은 본원에 기술된 발현 서열의 다운스트림에 포함될 수 있다. 일부 경우에, 제1 발현 서열에 대한 하나의 UTR은 제2 발현 서열에 대한 또 다른 UTR과 동일하거나, 그와 연속되거나, 그와 중첩된다. 일부 실시형태에서, 인트론은 인간 인트론이다. 일부 실시형태에서, 인트론은 전장 인간 인트론, 예를 들어, ZKSCAN1이다.
예시적인 비번역 영역은 본원에 그의 전체가 참조로 포함되는 WO2019/118919호의 단락 [0197] 내지 [201]에 기술된다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 폴리-A 서열을 포함할 수 있다. 예시적인 폴리-A 서열은 WO2019/118919의 문단 [0202] 내지 [0205]에 기술되어 있으며, 그의 전문이 본원에 참조로 포함된다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 폴리-A 서열을 결여한다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 하나 이상의 리보스위치를 포함한다. 예시적인 리보스위치는 WO2019/118919의 문단 [0232] 내지 [0252]에 기술되어 있으며, 그의 전문이 본원에 참조로 포함된다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 압타자임을 포함한다. 예시적인 압타자임은 WO2019/118919의 문단 [0253] 내지 [0259]에 기술되어 있으며, 그의 전문이 본원에 참조로 포함된다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 하나 이상의 RNA 결합 부위를 포함한다. 마이크로RNA(또는 miRNA)는 핵산 분자의 3'UTR에 결합하는 짧은 비코딩 RNA일 수 있으며, 핵산 분자 안정성을 감소시킴으로써 또는 번역을 저해함으로써 유전자 발현을 하향-조절한다. 원형 폴리리보뉴클레오티드는 하나 이상의 마이크로RNA 표적 서열, 마이크로RNA 서열 또는 마이크로RNA 씨드를 포함할 수 있다. 이러한 서열은 임의의 알려져 있는 마이크로RNA, 예컨대 미국 공개 제US2005/0261218호 및 미국 공개 제US2005/0059005호에 교시된 것들에 상응할 수 있으며, 이의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. RNA 결합 부위의 추가적인 예는 WO2019/118919의 문단 [0206] 내지 [0215]에 기술되어 있으며, 그의 전문이 본원에 참조로 포함된다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 단백질, 예를 들어, 리보솜이 RNA 서열 내의 내부 부위에 결합할 수 있게 하는 하나 이상의 단백질 결합 부위를 포함한다. 단백질 결합 부위의 추가적인 예는 WO2019/118919의 문단 [0218] 내지 [0221]에 기술되어 있으며, 그의 전문이 본원에 참조로 포함된다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 세포의 선천적 면역 반응을 감소시키거나, 회피하거나, 모면하기 위해 엔크립토겐을 포함한다. 일 양태에서, 세포로 전달되는 경우(예를 들어, 접촉), 참조 화합물, 예를 들어, 기술된 원형 폴리리보뉴클레오티드에 상응하는 선형 폴리뉴클레오티드, 또는 엔크립토겐을 결여한 원형 폴리리보뉴클레오티드에 의해 촉발되는 반응에 비하여, 숙주로부터 감소된 면역 반응을 초래하는 원형 폴리리보뉴클레오티드가 본원에 제공된다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 엔크립토겐을 결여한 대응물보다 더 적은 면역원성을 갖는다.
일부 실시형태에서, 엔크립토겐은 안정성을 증강시킨다. 핵산 분자의 안정성 및 번역과 관련하여 UTR에 의해 수행되는 조절 역할에 대한 증거가 점점 더 많아지고 있다. UTR의 조절 특징을 엔크립토겐 내에 포함시켜, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 안정성을 증강시킬 수 있다.
일부 실시형태에서, 5' 또는 3' UTR은 원형 폴리리보뉴클레오티드 내의 엔크립토겐을 구성할 수 있다. 예를 들어, UTR AU 풍부 요소(ARE)의 제거 또는 변형은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 안정성 또는 면역원성을 조절하는 데 유용할 수 있다.
일부 실시형태에서, 발현 서열, 예를 들어, 번역 가능한 영역 내의 AU 풍부 요소(ARE)의 변형의 제거는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 안정성 또는 면역원성을 조절하는 데 유용할 수 있다.
일부 실시형태에서, 엔크립토겐은 miRNA 결합 부위, 또는 임의의 다른 비-코딩 RNA에 대한 결합 부위를 포함한다. 예를 들어, 본원에 기술된 원형 폴리리보뉴클레오티드 내로의 miR-142 부위의 혼입은 조혈 세포에서 발현을 조절할 수 있을 뿐 아니라, 원형 폴리리보뉴클레오티드에 인코딩된 단백질에 대한 면역 반응을 감소시키기거나 없앨 수 있다.
일부 실시형태에서, 엔크립토겐은 단백질, 예를 들어, 면역단백질이 RNA 서열에 결합할 수 있게 하는 하나 이상의 단백질 결합 부위를 포함한다. 단백질 결합 부위를 원형 폴리리보뉴클레오티드 내로 조작함으로써, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 숙주의 면역계의 성분으로부터 원형 폴리리보뉴클레오티드를 차폐하여 숙주의 면역계를 회피하거나, 숙주의 면역계에 의한 검출이 감소되거나, 조절된 분해 또는 조절된 번역을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 예를 들어, 면역 반응, 예를 들어, CTL 반응을 회피하기 위해 적어도 하나의 면역단백질 결합 부위를 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역단백질 결합 부위는 면역단백질에 결합하고, 외인성으로서 원형 폴리리보뉴클레오티드의 차폐를 보조하는 뉴클레오티드 서열이다.
일부 실시형태에서, 엔크립토겐은 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 예시적인 변형은 원형 폴리리보뉴클레오티드에 대한 면역 반응을 방지하거나 감소시킬 수 있는 당, 핵염기, (예를 들어, 연결 포스페이트로의 / 포스포디에스테르 링키지로의 / 포스포디에스테르 백본으로의) 뉴클레오시드간 링키지 및 그의 임의의 조합에 대한 임의의 변형을 포함할 수 있다. 본원에 제공된 예시적인 변형의 일부는 하기에 상세히 기술된다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 참조 화합물, 예를 들어, 변형을 결여한 원형 폴리리보뉴클레오티드에 의해 촉발되는 반응에 비하여 숙주로부터의 면역 반응을 감소시키기 위한, 본원의 다른 곳에 기술된 바와 같은 하나 이상의 변형을 포함한다. 특히, 하나 이상의 이노신의 부가는 RNA를 바이러스에 대해 내인성으로서 식별하는 것으로 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Yu, Z. et al. (2015) RNA editing by ADAR1 marks dsRNA as "self". Cell Res. 25, 1283-1284]을 참조하며, 이는 그 전문이 참조로 포함된다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 shRNA에 대한 하나 이상의 발현 서열, 또는 siRNA로 가공될 수 있는 RNA 서열을 포함하며, shRNA 또는 siRNA는 RIG-I을 표적화하고 RIG-I의 발현을 감소시킨다. RIG-I은 외래의 원형 RNA를 감지할 수 있으며, 외래의 원형 RNA의 분해를 야기한다. 따라서, RIG-I-표적화 shRNA, siRNA 또는 임의의 다른 조절 핵산에 대한 서열을 보유하는 원형 폴리뉴클레오티드는 원형 폴리리보뉴클레오티드에 대한 면역성, 예를 들어, 숙주 세포 면역성을 감소시킬 수 있다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 세포의 선천적 면역 반응의 감소, 회피 또는 모면에 있어서 원형 폴리리보뉴클레오티드를 보조하는 서열, 요소 또는 구조를 결여한다. 일부 이러한 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 폴리A 서열, 5' 말단, 3' 말단, 포스페이트 기, 하이드록실 기 또는 그의 임의의 조합을 결여할 수 있다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리리보뉴클레오티드의 요소는 스페이서 서열 또는 링커에 의해 서로 분리될 수 있다. 예시적인 스페이서 서열은 WO2019/118919의 문단 [0293] 내지 [0302]에 기술되어 있으며, 그의 전문이 본원에 참조로 포함된다.
본원에 기술된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 또한 비-핵산 링커를 포함할 수 있다. 예시적인 비-핵산 링커는 WO2019/118919의 문단 [0303] 내지 [0307]에 기술되어 있으며, 그의 전문이 본원에 참조로 포함된다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 또 다른 핵산 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 DNA, RNA 또는 인공 핵산을 포함하는 기타 서열을 포함할 수 있다. 다른 서열은 게놈 DNA, cDNA, 또는 tRNA, mRNA, rRNA, miRNA, gRNA, siRNA 또는 다른 RNAi 분자를 인코딩하는 서열을 포함할 수 있지만, 이들에 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 원형 폴리리보뉴클레오티드와 동일한 유전자 발현 생성물의 상이한 유전자좌를 표적화하기 위한 siRNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 원형 폴리리보뉴클레오티드내에 존재하는 유전자 발현 생성물과는 상이한 유전자 발현 생성물을 표적화하기 위한 siRNA를 포함한다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 5'-UTR을 결여한다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 3'-UTR을 결여한다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 폴리-A 서열을 결여한다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 종결 요소를 결여한다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 내부 리보솜 진입 부위를 결여한다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 엑소뉴클레아제에 의한 분해 감수성을 결여한다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드가 분해 감수성을 결여한다는 사실은 원형 폴리리보뉴클레오티드가 엑소뉴클레아제에 의해 분해되지 않거나, 엑소뉴클레아제의 존재 하에서 예를 들어, 엑소뉴클레아제의 부재 하에서와 유사하거나 비슷한, 제한된 정도로만 분해된다는 것을 의미할 수 있다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 엑소뉴클레아제에 의해 분해되지 않는다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 엑소뉴클레아제에 노출되는 경우 감소된 분해를 갖는다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 캡-결합 단백질로의 결합을 결여한다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 5' 캡을 결여한다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 5'-UTR을 결여하며, 그의 하나 이상의 발현 서열로부터 단백질 발현에 적격성이다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 3'-UTR을 결여하며, 그의 하나 이상의 발현 서열로부터 단백질 발현에 적격성이다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 폴리-A 서열을 결여하며, 그의 하나 이상의 발현 서열로부터 단백질 발현에 적격성이다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 종결 요소를 결여하며, 그의 하나 이상의 발현 서열로부터 단백질 발현에 적격성이다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 내부 리보솜 진입 부위를 결여하며, 그의 하나 이상의 발현 서열로부터 단백질 발현에 적격성이다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 캡을 결여하며, 그의 하나 이상의 발현 서열로부터 단백질 발현에 적격성이다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 5'-UTR, 3'-UTR 및 IRES를 결여하며, 그의 하나 이상의 발현 서열로부터 단백질 발현에 적격성이다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 하기의 서열 중 하나 이상을 포함한다: 하나 이상의 miRNA를 인코딩하는 서열, 하나 이상의 복제 단백질을 인코딩하는 서열, 외인성 유전자를 인코딩하는 서열, 치료제를 인코딩하는 서열, 조절 요소(예를 들어, 번역 조절제, 예를 들어, 번역 증강자 또는 억제자), 번역 개시 서열, 내인성 유전자를 표적화하는 하나 이상의 조절 핵산(예를 들어, siRNA, lncRNA, shRNA) 및 치료적 mRNA 또는 단백질을 인코딩하는 서열.
그의 원형화의 결과로서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 그를 선형 RNA로부터 구분짓는 소정의 특징을 포함할 수 있다. 예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 선형 RNA에 비하여 엑소뉴클레아제에 의한 분해에 대한 감수성이 더 낮다. 이와 같이, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 특히 엑소뉴클레아제의 존재 하에 인큐베이션되는 경우에 선형 RNA보다 더 안정할 수 있다. 선형 RNA와 비교하여 원형 폴리리보뉴클레오티드의 안정성이 증가하여, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 폴리펩티드를 생성하기 위한 세포 형질전환 시약으로서 더욱 용이하게 될 수 있다(예를 들어, 항원 및/또는 에피토프가 항체 반응을 일으키도록). 선형 RNA와 비교하여 원형 폴리리보뉴클레오티드의 즈악된 안정성은 원형 폴리리보뉴클레오티드가 선형 RNA보다 더 용이하게 긴 기간 동안 저장되게 할 수 있다. 엑소뉴클레아제로 처리되는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 안정성은 (예를 들어, 겔 전기영동에 의해) RNA 분해가 발생했는지의 여부를 결정하는 해당 분야의 표준 방법을 사용하여 시험될 수 있다.
더욱이, 선형 RNA와 달리, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포스파타제, 예컨대 송아지 장내 포스파타제와 인큐베이션시키는 경우 탈인산화에 대한 감수성이 더 낮을 수 있다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 특정 서열 특징을 포함한다. 예를 들어, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 특정 뉴클레오티드 조성을 포함할 수 있다. 일부 이러한 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 하나 이상의 퓨린(아데닌 및/또는 구아노신) 풍부 영역을 포함할 수 있다. 일부 이러한 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 하나 이상의 퓨린 빈곤 영역을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 하나 이상의 AU 풍부 영역 또는 요소(ARE)를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 하나 이상의 아데닌 풍부 영역을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 본원의 다른 곳에 기술된 하나 이상의 반복 요소를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 본원의 다른 곳에 기술된 하나 이상의 변형을 포함한다.
원형 폴리리보뉴클레오티드는 참조 서열에 대해 하나 이상의 치환, 삽입 및/또는 부가, 결실 및 공유적 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 모체 폴리리보뉴클레오티드에 대해 하나 이상의 삽입, 부가, 결실, 및/또는 공유적 변형을 포함하는 원형 폴리리보뉴클레오티드는 본 개시의 범주 내에 포함된다. 예시적인 변형은 WO2019/118919의 문단 [0310] 내지 [0325]에 기술되어 있으며, 그의 전문이 본원에 참조로 포함된다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 고차 구조, 예를 들어, 이차 또는 삼차 구조를 포함한다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 상보성 세그먼트는 스스로 이중 가닥 세그먼트로 폴딩되며, 쌍, 예를 들어, A-U와 C-G 사이에 수소 결합으로 결합된다. 일부 실시형태에서, 스템으로도 알려져 있는 나선은 분자 내에서 형성되어, 말단 루프에 연결된 이중-가닥 세그먼트를 갖는다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 준-이중-가닥 이차 구조를 갖는 적어도 하나의 세그먼트를 갖는다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 하나 이상의 서열은 실질적으로 단일 가닥 대 이중 가닥 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단일 가닥 대 이중 가닥의 비는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 기능에 영향을 미칠 수 있다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 하나 이상의 서열은 실질적으로 단일 가닥이다. 일부 실시형태에서, 실질적으로 단일 가닥인 원형 폴리리보뉴클레오티드의 하나 이상의 서열은 단백질- 또는 RNA-결합 부위를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 실질적으로 단일 가닥인 원형 폴리리보뉴클레오티드 서열은 입체형태적으로 유연성이어서, 증가된 상호작용을 가능하게 할 수 있다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 서열을 이러한 이차 구조를 포함하도록 의도적으로 조작하여, 단백질 또는 핵산에 결합시키거나, 단백질 또는 핵산 결합을 증가시킨다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 서열은 실질적으로 이중 가닥이다. 일부 실시형태에서, 실질적으로 이중 가닥인 원형 폴리리보뉴클레오티드의 하나 이상의 서열은 입체형태적 인식 부위, 예를 들어, 리보스위치 또는 압타자임을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 실질적으로 이중 가닥인 원형 폴리리보뉴클레오티드 서열은 입체형태적으로 경성일 수 있다. 일부 이러한 경우에, 입체형태적으로 경성인 서열은 단백질 또는 핵산의 결합으로부터 원형 폴리리보뉴클레오티드를 입체적으로 가릴 수 있다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 서열을 이러한 이차 구조를 포함하도록 의도적으로 조작하여, 단백질 또는 핵산 결합을 모면하거나 감소시킨다.
16가지의 가능한 염기-쌍형성이 존재하지만, 이들 중 6가지(AU, GU, GC, UA, UG, CG)는 실제 염기-쌍을 형성할 수 있다. 나머지는 불일치로 지칭되며, 나선에서 매우 낮은 빈도로 발생한다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 구조는 그의 기능에 대한 영향 및 치명적인 결과 없이 용이하게 파괴될 수 없으며, 이는 이차 구조를 유지하기 위한 선택을 제공한다. 일부 실시형태에서, 스템(즉, 그들의 뉴클레오티드 서열)의 일차 구조는 여전히 다를 수 있지만, 여전히 나선 영역을 유지한다. 염기의 성질은 고차 구조에 부차적이며, 그들이 이차 구조를 보존하는 한, 치환이 가능하다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 준-나선 구조를 갖는다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 준-나선 구조를 갖는 적어도 하나의 세그먼트를 갖는다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 U-풍부 또는 A-풍부 서열 중 적어도 하나 또는 그의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, U-풍부 및/또는 A-풍부 서열은 삼중 준-나선 구조를 생성할 방식으로 배열된다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 이중 준-나선 구조를 갖는다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 이중 준-나선 구조를 갖는 하나 이상(예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 또는 그 초과)의 세그먼트를 갖는다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 C-풍부 및/또는 G-풍부 서열 중 적어도 하나를 포함한다. 일부 실시형태에서, C-풍부 및/또는 G-풍부 서열은 삼중 준-나선 구조를 생성할 방식으로 배열된다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 안정화를 보조하는 분자내 삼중 준-나선 구조를 갖는다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 그들의 말단 염기쌍이 적층되고, 준-나선 구조가 동시선형(colinear)이 되어, "동축 적층된" 하위구조를 초래하도록 (예를 들어, 포스포디에스테르 링키지에 의해 분리된) 2개의 준-나선 구조를 갖는다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 하나 이상의 모티프를 갖는 삼차 구조, 예를 들어, 슈도노트(pseudoknot), g-쿼드루플렉스(g-quadruplex), 나선 및 동축 적층물(coaxial stacking)을 포함한다.
본원에 개시된 바와 같은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 구조의 추가적인 예는 WO2019/118919의 문단 [0326] 내지 [0333]에 기술되어 있으며, 그의 전문이 본원에 참조로 포함된다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 바와 같은 원형 폴리리보뉴클레오티드는 예를 들어, 화합물(예를 들어, 소분자), 항체 또는 그의 단편, 펩티드, 단백질, 압타머, 약물 또는 그의 조합으로의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 컨쥬게이션을 위한 컨쥬게이션 모이어티를 포함한다. 일부 실시형태에서, 소분자는 circRNA에 컨쥬게이트됨으로써, 소분자를 포함하는 circRNA를 생성할 수 있다. 일부 실시형태에서, circRNA는 적어도 2개의 컨쥬게이션 모이어티, 예를 들어, 제1 소분자(예를 들어, JQ1)에 결합하는 제1 컨쥬게이션 모이어티, 및 제2 소분자(예를 들어, 탈리도미드)에 결합하는 제2 컨쥬게이션 분자를 포함한다. 일부 실시형태에서, circRNA는 소분자(예를 들어, 탈리도미드)에 결합하는 컨쥬게이션 모이어티 및 단백질(예를 들어, BRD4)에 결합하는 결합 부위를 포함한다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 적어도 약 20개 뉴클레오티드, 적어도 약 30개 뉴클레오티드, 적어도 약 40개 뉴클레오티드, 적어도 약 50개 뉴클레오티드, 적어도 약 75개 뉴클레오티드, 적어도 약 100개 뉴클레오티드, 적어도 약 200개 뉴클레오티드, 적어도 약 300개 뉴클레오티드, 적어도 약 400개 뉴클레오티드, 적어도 약 500개 뉴클레오티드, 적어도 약 1,000개 뉴클레오티드, 적어도 약 2,000개 뉴클레오티드, 적어도 약 5,000개 뉴클레오티드, 적어도 약 6,000개 뉴클레오티드, 적어도 약 7,000개 뉴클레오티드, 적어도 약 8,000개 뉴클레오티드, 적어도 약 9,000개 뉴클레오티드, 적어도 약 10,000개 뉴클레오티드, 적어도 약 12,000개 뉴클레오티드, 적어도 약 14,000개 뉴클레오티드, 적어도 약 15,000개 뉴클레오티드, 적어도 약 16,000개 뉴클레오티드, 적어도 약 17,000개 뉴클레오티드, 적어도 약 18,000개 뉴클레오티드, 적어도 약 19,000개 뉴클레오티드 또는 적어도 약 20,000개 뉴클레오티드이다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 리보솜에 대한 결합 부위를 수용하기에 충분한 크기의 것일 수 있다. 당업자는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 최대 크기가 원형 폴리리보뉴클레오티드의 생성 및/또는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 이용의 기술적 제약 내에 있는 것만큼 클 수 있음을 인식할 수 있다. 이론에 구속되지는 않지만, RNA의 다수의 세그먼트가 DNA로부터 생성될 수 있고, 그들의 5' 및 3' 자유 말단은 어닐링되어, RNA의 "스트링"을 생성하는 것이 가능하며, 이는 궁극적으로 오직 하나의 5' 및 하나의 3' 자유 말단이 남아있을 때 원형화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 최대 크기는 RNA의 패키징 및 표적으로의 운반 능력에 의해 제한될 수 있다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 크기는 유용한 폴리펩티드를 인코딩하기에 충분한 길이이며, 이에 따라, 적어도 20,000개 뉴클레오티드, 적어도 15,000개 뉴클레오티드, 적어도 10,000개 뉴클레오티드, 적어도 7,500개 뉴클레오티드, 또는 적어도 5,000개 뉴클레오티드, 적어도 4,000개 뉴클레오티드, 적어도 3,000개 뉴클레오티드, 적어도 2,000개 뉴클레오티드, 적어도 1,000개 뉴클레오티드, 적어도 500개 뉴클레오티드, 적어도 400개 뉴클레오티드, 적어도 300개 뉴클레오티드, 적어도 200개 뉴클레오티드, 적어도 100개 뉴클레오티드의 길이가 유용할 수 있다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 수산양식 동물(어류, 게류, 새우, 굴 등) 유래의 세포, 포유동물 세포, 예를 들어, 애완동물 또는 동물원 동물(고양이, 개, 도마뱀, 조류, 사자, 호랑이 및 곰 등) 유래의 세포, 농장 또는 일하는 동물(말, 소, 돼지, 닭 등) 유래의 세포, 인간 세포, 배양된 세포, 일차 세포 또는 세포주, 줄기 세포, 전구 세포, 분화된 세포, 생식 세포, 암 세포(예를 들어, 종양형성, 전이성), 비-종양형성 세포(정상 세포), 태아 세포, 배아 세포, 성인 세포, 유사분열 세포, 비-유사분열 세포 또는 그의 임의의 조합에서 복제 가능하거나, 복제한다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 본원에 기술된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 세포를 포함하며, 세포는 수산양식 동물(어류, 게류, 새우, 굴 등) 유래의 세포, 포유동물 세포, 예를 들어, 애완동물 또는 동물원 동물(고양이, 개, 도마뱀, 조류, 사자, 호랑이 및 곰 등) 유래의 세포, 농장 또는 일하는 동물(말, 소, 돼지, 닭 등) 유래의 세포, 인간 세포, 배양된 세포, 일차 세포 또는 세포주, 줄기 세포, 전구 세포, 분화된 세포, 생식 세포, 암 세포(예를 들어, 종양형성, 전이성), 비-종양형성 세포(정상 세포), 태아 세포, 배아 세포, 성인 세포, 유사분열 세포, 비-유사분열 세포 또는 그의 임의의 조합이다.
안정성 및 반감기
일부 실시형태에서, 본원에 제공되는 원형 폴리리보뉴클레오티드는 참조물질, 예를 들어 원형화되지 않은(선형 대응물) 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 선형 폴리리보뉴클레오티드에 비하여 증가된 반감기를 갖는다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 분해, 예를 들어, 엑소뉴클레아제 분해에 대해 실질적으로 저항성이다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 자가-분해에 대해 저항성이다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 효소적 절단 부위, 예를 들어, 다이서(dicer) 절단 부위를 결여한다. 본원에 개시된 바와 같은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 안정성 및 반감기의 추가적인 예는 WO2019/118919의 문단 [0308] 내지 [0309]에 기술되어 있으며, 그의 전문이 본원에 참조로 포함된다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 적어도 선형 대응물, 예를 들어, 선형 발현 서열 또는 선형의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 반감기를 갖는다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 선형 대응물의 것보다 증가된 반감기를 갖는다. 일부 실시형태에서, 반감기는 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50% 또는 그를 초과하여 증가된다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 세포에서 적어도 약 1시간 내지 약 30일, 또는 적어도 약 2시간, 6시간, 12시간, 18시간, 24시간, 2일, 3,일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 21일, 22일, 23일, 24일, 25일, 26일, 27일, 28일, 29일, 30일, 60일, 또는 그 초과 또는 그 사이의 임의의 시간 동안의 반감기 또는 지속성을 갖는다. 특정 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 약 10분 내지 약 7일 이하 또는 약 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 13시간, 14시간, 15시간, 16시간, 17시간, 18시간, 19시간, 20시간, 21시간, 22시간, 24시간, 36시간, 48시간, 60시간, 72시간, 4일, 5일, 6일, 7일 이하 또는 그 사이의 임의의 시간 동안 세포에서 반감기 또는 지속성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 세포가 분열하는 동안 세포에서 반감기 또는 지속성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 분열 후에 세포에서 반감기 또는 지속성을 갖는다. 특정 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 분열 중인 세포에서 약 약 10분 초과 내지 약 30일, 또는 적어도 약 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 13시간, 14시간, 15시간, 16시간, 17시간, 18시간, 24시간, 2일, 3,일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 21일, 22일, 23일, 24일, 25일, 26일, 27일, 28일, 29일, 30일, 60일, 또는 그 초과 또는 그 사이의 임의의 시간 동안의 반감기 또는 지속성을 갖는다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 양의 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%는 세포에서 적어도 약 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 12일, 14일 또는 16일의 기간 동안 지속된다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 포유동물, 예를 들어, 인간에서 비-면역원성이다.
생산 방법
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는, 비-천연 발생이며 재조합 기술(예를 들어, DNA 플라스미드를 사용하여 시험관내에서 유래), 화학적 합성, 또는 이들의 조합을 사용하여 생성될 수 있는 데옥시리보핵산 서열을 포함한다.
RNA 서클을 생성하는 데 사용되는 DNA 분자가 원래의 천연-발생 핵산 서열의 DNA 서열, 그의 변형된 버전 또는 자연에서 정상적으로 관찰되지 않는 합성 폴리펩티드(예를 들어, 키메라 분자 또는 융합 단백질, 예를 들어 다수의 항원 및/또는 에피토프를 포함하는 융합 단백질)를 인코딩하는 DNA 서열을 포함할 수 있는 것이 본 개시의 범주 이내이다. DNA 및 RNA 분자는 고전적인 돌연변이유발 기법 및 재조합 기법, 예컨대 부위-지정 돌연변이유발, 돌연변이를 유도하기 위한 핵산 분자의 화학적 처리, 핵산 단편의 제한 효소 절단, 핵산 단편의 라이게이션, 핵산 서열의 선택된 영역의 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 증폭 및/또는 돌연변이유발, 올리고뉴클레오티드 혼합물의 합성 및 핵산 분자의 혼합물을 "구축"하기 위한 혼합물 군의 라이게이션 및 그의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 다양한 기법을 사용하여 변형될 수 있다.
원형 폴리리보뉴클레오티드는 화학적 합성 및 효소적 합성을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 임의의 이용 가능한 기법에 따라 제조될 수 있다. 일부 실시형태에서, 선형의 일차 구축물 또는 선형 mRNA를 환화시키거나 콘카테머화시켜, 본원에 기술된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 생성할 수 있다. 환화 또는 콘카테머화의 메커니즘은 방법, 예컨대 비제한적으로 화학적, 효소적, 스플린트 라이게이션) 또는 리보자임 촉매작용된 방법을 통해 발생할 수 있다. 새로 형성된 5'-/3'-링키지는 분자내 링키지 또는 분자간 링키지일 수 있다.
본원에 기술된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제조 방법은 예를 들어, 문헌[Khudyakov & Fields, Artificial DNA: Methods and Applications, CRC Press (2002)]; 문헌[Zhao, Synthetic Biology: Tools and Applications, (First Edition), Academic Press (2013)]; 및 문헌[Egli & Herdewijn, Chemistry and Biology of Artificial Nucleic Acids, (First Edition), Wiley-VCH (2012)]에 기술되어 있다.
다양한 원형 폴리리보뉴클레오티드의 합성 방법은 또한, 해당 분야에 기술되어 있다(예를 들어, 미국 특허 제US6210931호, 미국 특허 제US5773244호, 미국 특허 제US5766903호, 미국 특허 제US5712128호, 미국 특허 제US5426180호, 미국 공개 제US20100137407호, 국제 공개 제WO1992001813호 및 국제 공개 제WO2010084371호 참조; 이의 각 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨).
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드를 정화하여, 예를 들어, 유리 리보핵산, 선형 또는 닉킹된 RNA, DNA, 단백질 등을 제거한다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드를 해당 분야에서 흔히 사용되는 임의의 알려져 있는 방법에 의해 정제할 수 있다. 비제한적인 정제 방법의 예는 컬럼 크로마토그래피, 겔 절개, 크기 배제 등을 포함한다.
원형화
일부 실시형태에서, 선형의 원형 폴리리보뉴클레오티드는 환화되거나 콘카테머화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 선형의 원형 폴리리보뉴클레오티드는 제형화 및/또는 전달 이전에 시험관내에서 환화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 선형의 원형 폴리리보뉴클레오티드는 세포 내에서 환화될 수 있다.
세포외 원형화
일부 실시형태에서, 선형의 원형 폴리리보뉴클레오티드는 화학적 방법을 사용하여 환화되거나, 콘카테머화되어, 원형 폴리리보뉴클레오티드를 형성한다. 일부 화학적 방법에서, 핵산(예를 들어, 선형의 원형 폴리리보뉴클레오티드)의 5'-말단 및 3'-말단은 서로 가까이 있는 경우, 분자의 5'-말단과 3'-말단 사이에 새로운 공유 링키지를 형성할 수 있는 화학적 반응성 기를 포함한다. 5'-말단은 NHS-에스테르 반응성 기를 함유할 수 있으며, 3'-말단은 3'-아미노-말단 뉴클레오티드를 함유할 수 있으므로, 유기 용매 중에서 선형 RNA 분자의 3'-말단 상의 3'-아미노-말단 뉴클레오티드가 5'-NHS-에스테르 모이어티 상에서 친핵성 공격을 겪어 새로운 5'-/3'-아미드 결합을 형성할 것이다.
일부 실시형태에서, DNA 또는 RNA 리가제를 사용하여, 5'-인산화된 핵산 분자(예를 들어, 선형의 원형 폴리리보뉴클레오티드)를 핵산(예를 들어, 선형 핵산)의 3'-하이드록실기에 효소적으로 연결하여, 새로운 포스포로디에스테르 링키지를 형성할 수 있다. 일례의 반응에서, 선형의 원형 폴리리보뉴클레오티드를 제조처의 프로토콜에 따라 37℃에서 1시간 동안 1 내지 10 유닛의 T4 RNA 리가제(미국 매사추세츠주 입스위치 소재의 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs))와 인큐베이션시킨다. 라이게이션 반응은 효소적 라이게이션 반응을 보조하기 위해, 병치 위치에서 5'- 및 3'-영역 둘 모두와 염기-쌍을 형성할 수 있는 선형 핵산의 존재 하에 발생할 수 있다. 일부 실시형태에서, 라이게이션은 스플린트 라이게이션이다. 예를 들어, SplintR® 리가제와 같은 스플린트 리가제는 스플린트 라이게이션을 위해 사용될 수 있다. 스플린트 라이게이션을 위해, 단일 가닥 RNA와 같은 단일 가닥의 폴리뉴클레오티드(스플린트)는 선형 폴리리보뉴클레오티드의 양 말단과 혼성화하여, 단일-가닥 스플린트와의 혼성화시에 2개의 말단이 병치될 수 있도록 설계될 수 있다. 이에 따라, 스플린트 리가제는 선형 폴리리보뉴클레오티드의 병치된 2개의 말단의 라이게이션을 촉매작용시켜, 원형 폴리리보뉴클레오티드를 생성할 수 있다.
일부 실시형태에서, DNA 또는 RNA 리가제는 원형 폴리뉴클레오티드의 합성에서 사용될 수 있다. 비-제한적인 예로서, 리가제는 circ 리가제 또는 원형 리가제일 수 있다.
일부 실시형태에서, 선형의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 5'- 또는 3'-말단은 리가제 리보자임 서열을 인코딩하여, 시험관내 전사 동안, 생성된 선형의 원형 폴리리보뉴클레오티드가 선형의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 5'-말단을 선형의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 3'-말단에 라이게이션시킬 수 있는 활성 리보자임 서열을 포함하게 할 수 있다. 리가제 리보자임은 그룹 I 인트론, 델타 간염 바이러스, 헤어핀 리보자임으로부터 유래될 수 있거나, SELEX(지수적 농축에 의한 리간드의 계통 진화)에 의해 선택될 수 있다. 리보자임 리가제 반응은 0℃ 내지 37℃의 온도에서 1시간 내지 24시간 걸릴 수 있다.
일부 실시형태에서, 선형의 원형 폴리리보뉴클레오티드는 적어도 하나의 비-핵산 모이어티를 사용함으로써 환화되거나 콘카테머화될 수 있다. 일 양태에서, 적어도 하나의 비-핵산 모이어티는 선형의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 5' 말단 근처 및/또는 3' 말단 근처에서 영역 또는 특징부와 반응하여, 선형의 원형 폴리리보뉴클레오티드를 환화시키거나 콘카테머화시킬 수 있다. 또 다른 양태에서, 적어도 하나의 비-핵산 모이어티는 선형의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 위치하거나, 그에 또는 그 근처에 연결될 수 있다. 고려되는 비-핵산 모이어티는 상동성 또는 이종성일 수 있다. 비-제한적인 예로서, 비-핵산 모이어티는 링키지, 예컨대 소수성 링키지, 이온성 링키지, 생분해성 링키지 및/또는 절단 가능한 링키지일 수 있다. 또 다른 비-제한적인 예로서, 비-핵산 모이어티는 라이게이션 모이어티이다. 또 다른 비-제한적인 예로서, 비-핵산 모이어티는 올리고뉴클레오티드 또는 펩티드 모이어티, 예컨대 본원에 기술된 바와 같은 압타머 또는 비-핵산 링커일 수 있다.
일부 실시형태에서, 선형의 원형 폴리리보뉴클레오티드는 선형의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 5' 및 3' 말단에서의, 그 근처의 또는 그에 연결된 분자 표면, 원자 사이에 인력을 야기하는 비-핵산 모이어티로 인하여 환화되거나 콘카테머화될 수 있다. 비-제한적인 예로서, 하나 이상의 선형의 원형 폴리리보뉴클레오티드는 분자간 힘 또는 분자내 힘에 의해 환화되거나 콘카테머화될 수 있다. 분자간 힘의 비-제한적인 예는 쌍극자-쌍극자 힘, 쌍극자-유도된 쌍극자 힘, 유도된 쌍극자-유도된 쌍극자 힘, 반 데르 발스 힘(Van der Waals force) 및 런던 분산력(London dispersion force)을 포함한다. 분자내 힘의 비-제한적인 예는 공유 결합, 금속 결합, 이온 결합, 공명 결합, 아그노스트 결합(agnostic bond), 쌍극자 결합, 컨쥬게이션, 하이퍼컨쥬게이션 및 반결합(antibonding)을 포함한다.
일부 실시형태에서, 선형의 원형 폴리리보뉴클레오티드는 5' 말단 근처 및 3' 말단 근처에 리보자임 RNA 서열을 포함할 수 있다. 리보자임 RNA 서열은 서열이 리보자임의 나머지에 노출되는 경우 펩티드에 공유적으로 연결될 수 있다. 일 양태에서, 5' 말단 및 3' 말단 근처에서 리보자임 RNA 서열에 공유적으로 연결되는 펩티드는 서로 회합하여, 선형의 원형 폴리리보뉴클레오티드가 환화되거나 콘카테머화되게 할 수 있다. 또 다른 양태에서, 5' 말단 및 3' 말단 근처에서 리보자임 RNA에 공유적으로 연결된 펩티드는 해당 분야에 공지된 다양한 방법, 예컨대 비제한적으로, 단백질 라이게이션을 사용하여 라이게이션 처리된 후에 선형의 일차 구축물 또는 선형의 mRNA가 환화되거나 콘카테머화되게 할 수 있다. 본 발명의 선형의 일차 구축물 또는 선형 RNA에 사용하기 위한 리보자임의 비-제한적인 예 또는 펩티드를 혼입시키고/시키거나 공유적으로 연결하기 위한 방법의 비-배타적인 목록은 미국 특허 출원 제US20030082768호에 기술되어 있으며, 이의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
일부 실시형태에서, 선형의 원형 폴리리보뉴클레오티드는 예를 들어, 5' 트리포스페이트를 RNA 5' 피로포스포하이드롤라제(RppH) 또는 ATP 디포스포하이드롤라제(아피라제)와 접촉시킴으로써 5' 모노포스페이트로 전환되는 핵산의 5' 트리포스페이트를 포함할 수 있다. 대안적으로, 선형의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 5' 트리포스페이트를 5' 모노포스페이트로 전환시키는 것은 (a) 선형의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 5' 뉴클레오티드를 포스파타제(예를 들어, 안타크틱(Antarctic) 포스파타제, 쉬림프(Shrimp) 알칼리성 포스파타제 또는 송아지 장내 포스파타제)와 접촉시켜, 3개 모두의 포스페이트를 제거하는 단계; 및 (b) 단계 (a) 후에 5' 뉴클레오티드를 단일의 포스페이트를 부가하는 키나제(예를 들어, 폴리뉴클레오티드 키나제)와 접촉시키는 단계를 포함하는 2-단계 반응에 의해 발생할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 제공된 원형화 방법의 원형화 효율은 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 100%이다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공되는 원형화 방법의 원형화 효율은 적어도 약 40%이다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 적어도 하나의 스플라이싱 요소를 포함한다. 예시적인 스플라이싱 요소는 본원에 그의 전체가 참조로 포함되는 WO2019/118919호의 단락 [0270] 내지 [0275]에 기술된다.
기타 원형화 방법
일부 실시형태에서, 선형의 원형 폴리리보뉴클레오티드는 개별 인트론 내에 또는 측접 인트론에 걸쳐, 반복 또는 비반복 핵산 서열을 포함하는 상보성 서열을 포함할 수 있다. 반복 핵산 서열은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 세그먼트 내에 존재하는 서열이다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 반복 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 반복 뉴클레오티드 서열은 폴리 CA 또는 폴리 UG 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 또 다른 세그먼트 내의 상보성 반복 핵산 서열에 혼성화하는 적어도 하나의 반복 핵산 서열을 포함하며, 혼성화된 세그먼트는 내부 이중 가닥을 형성한다. 일부 실시형태에서, 2개의 개별 원형 폴리리보뉴클레오티드로부터의 반복 핵산 서열과 상보성 반복 핵산 서열은 혼성화하여, 단일의 원형화된 폴리리보뉴클레오티드를 생성하며, 혼성화된 세그먼트는 내부 이중 가닥을 형성한다. 일부 실시형태에서, 상보성 서열은 선형의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 5' 및 3' 말단에서 관찰된다. 일부 실시형태에서, 상보성 서열은 약 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 55개, 60개, 65개, 70개, 75개, 80개, 85개, 90개, 95개, 100개 또는 그 초과의 쌍이 형성된 뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 화학적 원형화 방법을 사용하여 원형 폴리리보뉴클레오티드를 생성할 수 있다. 이러한 방법은 클릭 화학(예를 들어, 알킨 및 아지드 기반의 방법 또는 클릭 가능한 염기), 올레핀 복분해, 포스포르아미데이트 라이게이션, 헤미아미날-이민 가교결합, 염기 변형 및 그의 임의의 조합을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 효소적 원형화 방법을 사용하여, 원형 폴리리보뉴클레오티드를 생성할 수 있다. 일부 실시형태에서, 라이게이션 효소, 예를 들어, DNA 또는 RNA 리가제를 사용하여, 원형 폴리리보뉴클레아제의 주형 또는 상보물, 원형 폴리리보뉴클레아제의 상보성 가닥 또는 원형 폴리리보뉴클레아제를 생성할 수 있다.
원형 폴리리보뉴클레오티드의 원형화는 해당 분야에 알려져 있는 방법, 예를 들어, 문헌["RNA circularization strategies in vivo and in vitro" by Petkovic and Muller from Nucleic Acids Res, 2015, 43(4): 2454-2465] 및 문헌["In vitro circularization of RNA" by Muller and Appel, from RNA Biol, 2017, 14(8):1018-1027]에 기술된 것들에 의해 달성될 수 있다.
원형 폴리리보뉴클레오티드는 복제에 유용한 서열 및/또는 모티프를 인코딩할 수 있다. 예시적인 복제 요소는 본원에 그의 전체가 참조로 포함되는 WO2019/118919호의 단락 [0280] 내지 [0286]에 기술된다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 바와 같은 원형 폴리리보뉴클레오티드는 복제 요소를 결여한다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 폴리-A 서열 및 복제 요소를 결여한다.
투여 방법에서 본원에 기술된 원형 폴리리보뉴클레오티드 중 임의의 것을 사용하는 것이 본 개시내용의 범주 내에 있으며, 당해 방법은 제1 용량의 원형 폴리리보뉴클레오티드를 복수의 세포에게 제공하는 단계에 이어서, 제2 용량의 원형 폴리리보뉴클레오티드를 복수의 세포에게 제공하는 단계를 포함한다. 또한, 조성물 투여에서 본원에 기술된 원형 폴리리보뉴클레오티드 중 임의의 것을 사용하는 것이 본 개시내용의 범주 내에 있다. 원형 폴리리보뉴클레오티드는 발현 서열, 조절 요소 또는 비번역 영역 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 원형 폴리리보뉴클레오티드는 회전환 번역에 적격할 수 있다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 종결 요소를 결여한다. 원형 폴리리보뉴클레오티드는 발현 서열 중 적어도 하나의 3’ 말단에 스태거 요소를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 스태거 요소는 회전환 번역 동안 리보솜을 고착시킨다. 스태거 요소는 D(V/I)ExNPGP인 C-말단 공통 서열을 갖는 서열을 인코딩할 수 있으며, 여기서 x는 임의의 아미노산을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 내부 리보솜 진입 부위를 결여한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 발현 서열은 코작(Kozak) 개시 서열을 포함한다. 원형 폴리리보뉴클레오티드는 종결 요소, 예를 들어, 정지 코돈을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 엔크립토겐, 조절 요소, 복제 요소, 또는 유사-이중-나선 이차 구조 중 하나 이상을 포함한다. 원형 폴리리보뉴클레오티드는 하나 이상의 기능적 특징, 예를 들어, 선형 대응물보다 더 큰 번역 효율, 다수의 번역 생성물의 화학량론적 번역 효율, 엔크립토겐을 결여한 대응물보다 더 적은 면역원성, 선형 대응물에 비하여 증가된 반감기, 또는 세포 분열 동안의 지속성을 포함할 수 있다. 원형 폴리리보뉴클레오티드는 복제 도메인을 포함하여, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 자가-복제를 가능하게 할 수 있다.
약제학적 조성물
본 발명의 방법은 하나 이상의 약제학적으로 허용 가능한 부형제와 조합된 조성물을 제공하거나 투여하는 것을 포함한다. 원형 폴리리보뉴클레오티드의 조성물은 본원에 기술된 투여, 재투여 또는 시간차 투여 방법 중 임의의 것을 사용하여 약제학적 조성물로서 사용되거나 투여될 수 있다. 본원에 기술된 원형 폴리리보뉴클레오티드 조성물은 다양한 상이한 투여량 및 다양한 상이한 농도로 제공되거나 투여될 수 있다. 원형 폴리리보뉴클레오티드 조성물은 약제학적 조성물로서 제공되거나 투여될 수 있다. 약제학적 조성물은 하나 이상의 약제학적으로 관련된 담체 또는 부형제를 포함할 수 있다. 약제학적 조성물은 원형 폴리리보뉴클레오티드 및 하나 이상의 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함할 수 있다.
약제학적으로 허용 가능한 부형제는 비-담체 부형제일 수 있다. 비-담체 부형제는 조성물, 예컨대 본원에 기술된 바와 같은 원형 폴리리보뉴클레오티드를 위한 비히클 또는 매질로서 제공된다. 비-담체 부형제는 조성물, 예컨대 본원에 기술된 바와 같은 선형 폴리리보뉴클레오티드를 위한 비히클 또는 매질로서 제공된다. 비-담체 부형제의 비제한적인 예는 용매, 수성 용매, 비-수성 용매, 분산 매질, 희석제, 분산액, 현탁 보조제, 표면 활성제, 등장화제, 농후제, 유화제, 보존제, 폴리머, 펩티드, 단백질, 세포, 히알루로니다제, 분산제, 과립화제, 붕해제, 결합제, 완충제(예를 들어, 인산염 완충 염수(PBS)), 윤활제, 오일 및 그의 혼합물을 포함한다. 비-담체 부형제는 활성 세포-투과 효과를 나타내지 않는, 미국 식품의약국(FDA)에 의해 승인된, 및 비활성 성분 데이터베이스에 열거된 비활성 성분 중 어느 하나일 수 있다. 약제학적 조성물은 선택적으로 하나 이상의 추가의 활성 물질, 예를 들어, 치료적 및/또는 예방적 활성 물질을 포함할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 멸균 및/또는 발열원-부재일 수 있다. 약제의 제형화 및/또는 제조에서의 일반적인 고려사항은 예를 들어, 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy 21st ed., Lippincott Williams & Wilkins, 2005](본원에 참조로 포함됨)에서 찾을 수 있다.
본원에 기술된 약제학적 조성물은 치료 및 수의학에 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, (예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는) 본원에 제공되는 약제학적 조성물은 대상체로의 투여에 적합하며, 대상체는 비-인간 동물이며, 예를 들어, 수의학적 이용에 적합하다. 조성물이 다양한 동물로의 투여에 적합하게 만들기 위해 인간으로의 투여에 적합한 약제학적 조성물을 변형하는 것이 충분히 이해되며, 숙련된 수의학 약리학자는 존재한다면, 단지 일상적인 실험을 사용하여 이러한 변형을 설계하고/설계하거나 수행할 수 있다. 약제학적 조성물의 투여가 고려되는 대상체는 임의의 동물, 예를 들어, 인간 및/또는 기타 영장류; 포유동물, 예를 들어, 애완동물 및 가축 동물, 예컨대 상업적으로 관련된 포유동물, 예컨대 소, 돼지, 말, 양, 염소, 고양이, 개, 마우스 및/또는 랫트; 및/또는 조류, 예컨대 상업적으로 관련된 조류, 예컨대 앵무새, 가금류, 닭, 오리, 거위, 암탉 또는 수탉 및/또는 칠면조, 동물원 동물, 예를 들어, 고양이과; 비-포유류 동물, 예를 들어, 파충류, 어류, 양서류 등을 포함하지만, 이들에 제한되지 않는다.
본원에 기재된 약제학적 조성물의 제형은 약리학 분야에 알려져 있거나, 이후에 개발되는 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 일반적으로, 이러한 제조 방법은 활성 성분이 부형제 및/또는 하나 이상의 다른 보조 성분과 회합되게 한 다음, 필요하면 그리고/또는 바람직하면, 생성물을 나누고/나누거나, 성형하고/성형하거나 패키징하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제는 당(예를 들어, 수크로스, 락토스, 만니톨, 말토스, 소르비톨 또는 프룩토스), 중성염(예를 들어, 염화나트륨, 황산마그네슘, 염화마그네슘, 황산칼륨, 탄산나트륨, 아황산나트륨, 칼륨 산 인산염 또는 아세트산나트륨), 산성 성분(예를 들어, 푸마르산, 말레산, 아디프산, 시트르산 또는 아스코르브산), 알칼리성 성분(예를 들어, 트리스(하이드록시메틸) 아미노메탄(TRIS), 메글루민(meglumine), 나트륨 또는 칼륨의 삼염기성 또는 이염기성 인산염) 또는 아미노산(예를 들어, 글리신 또는 아르기닌)이다.
본원에 기술된 원형 폴리리보뉴클레오티드는 또한 운반 담체와 함께 약제학적 조성물에 포함될 수 있다.
본원에 기술된 약제학적 조성물은 예를 들어, 약제학적 부형제 또는 담체를 포함하도록 제형화될 수 있다. 약제학적 담체는 막, 지질 이중층, 및/또는 폴리머 담체, 예를 들어, 리포좀, 예컨대 나노입자, 예를 들어, 지질 나노입자일 수 있고, 이를 필요로 하는 대상체(예를 들어, 인간 또는 비-인간 농업용 동물 또는 가축, 예를 들어, 소, 개, 고양이, 말, 가금)에게, 알려진 방법에 의해, 예컨대 변형된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 부분적인 또는 완전한 캡슐화를 통해 전달될 수 있다. 이러한 방법은 트랜스펙션(예를 들어, 지질-매개, 양이온성 폴리머, 인산칼슘, 덴드리머); 천기천공법 또는 다른 멤브레인 파괴 방법(예를 들어, 뉴클레오펙션(nucleofection)), 바이러스 운반(예를 들어, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스, AAV), 미세주입, 미세투사물 충격("유전자 총"), 퓨진(fugene), 직접 초음파 로딩, 세포 스퀴징, 광학적 트랜스펙션, 원형질체 융합, 임페일펙션(impalefection), 마그네토펙션(magnetofection), 엑소좀-매개 전달, 지질 나노입자-매개 전달 및 그의 임의의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 전달 방법은 또한, 예를 들어, 문헌[Gori et al., Delivery and Specificity of CRISPR/Cas9 Genome Editing Technologies for Human Gene Therapy. Human Gene Therapy. July 2015, 26(7): 443-451. doi:10.1089/hum.2015.074]; 및 문헌[Zuris et al. Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient protein-based genome editing in vitro and in vivo. Nat Biotechnol. 2014 Oct 30;33(1):73-80]에 기술되어 있다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 약제학적 조성물은 네이키드 전달 제형로서 전달될 수 있다. 네이키드 전달 제형은 담체의 보조 없이, 그리고 원형 폴리리보뉴클레오티드의 공유적 변형 또는 부분적인 또는 완전한 캡슐화 없이, 본원에 개시된 바와 같은 원형 폴리리보뉴클레오티드를 세포로 전달한다.
네이키드 전달 제형은 담체가 없는 제형이며, 본원에 기재된 바와 같은 원형 폴리리보뉴클레오티드는 세포로의 전달을 돕는 모이어티에 결합하는 공유적 변형 없이 존재하며, 또는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 부분적 또는 완전 캡슐화 없이 존재한다. 일부 실시형태에서, 세포로의 전달을 돕는 모이어티에 결합하는 공유적 변형이 없는 원형 폴리리보뉴클레오티드는 세포로의 전달을 돕는 단백질, 소분자, 입자, 폴리머 또는 생체고분자에 공유적으로 결합되지 않는다.
일부 실시형태에서, 네이키드 전달 제형에는 하기 중 임의의 것 또는 그의 전부가 없을 수 있다: 트랜스펙션 시약, 양이온성 담체, 탄수화물 담체, 나노입자 담체 또는 단백질 담체. 예를 들어, 네이키드 전달 제형에는 피토글리코겐 옥테닐 숙시네이트, 피토글리코겐 베타-덱스트린, 무수물-변형된 피토글리코겐 베타-덱스트린, 리포펙타민, 폴리에틸렌이민, 폴리(트리메틸렌이민), 폴리(테트라메틸렌이민), 폴리프로필렌이민, 아미노글리코시드-폴리아민, 디데옥시-디아미노-b-사이클로덱스트린, 스페르민, 스페르미딘, 폴리(2-디메틸아미노)에틸 메타크릴레이트, 폴리(라이신), 폴리(히스티딘), 폴리(아르기닌), 양이온화된 젤라틴, 덴드리머, 키토산, l,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP), N-[1-(2,3-디올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTMA), l-[2-(올레오일옥시)에틸]-2-올레일-3-(2-하이드록시에틸)이미다졸리늄 클로라이드(DOTIM), 2,3-디올레일옥시-N-[2(스페르민카복사미도)에틸]-N,N-디메틸-l-프로판아미늄 트리플루오로아세테이트(DOSPA), 3B-[N―(N＼N'-디메틸아미노에탄)-카바모일]콜레스테롤 하이드로클로라이드(DC-콜레스테롤 HCl), 디헵타데실아미도글리실 스페르미딘(DOGS), N,N-디스테아릴-N,N-디메틸암모늄 브로마이드(DDAB), N-(l,2-디미리스틸옥시프로프-3-일)-N,N-디메틸-N-하이드록시에틸 암모늄 브로마이드(DMRIE), N,N-디올레일-N,N-디메틸암모늄 클로라이드(DODAC), 인간 혈청 알부민(HSA), 저밀도 지질단백질(LDL), 고밀도 지질단백질(HDL) 또는 글로불린이 없을 수 있다.
네이키드 전달 제형은 비-담체 부형제를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 비-담체 부형제는 비활성 성분을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 비-담체 부형제는 완충제, 예를 들어, PBS를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 비-담체 부형제는 용매, 비-수성 용매, 희석제(예를 들어, 비경구 투여가 가능한 희석제), 현탁 조제, 계면 활성제, 등장화제, 농후제, 유화제, 보존제, 폴리머, 펩티드, 단백질, 세포, 히알루로니다제, 분산제, 과립화제, 붕해제, 결합제, 완충제, 윤활제 또는 오일일 수 있다.
일부 실시형태에서, 네이키드 전달 제형은 희석제(예를 들어, 비경구 투여가 가능한 희석제)를 포함할 수 있다. 희석제는 액체 희석제 또는 고체 희석제일 수 있다. 일부 실시형태에서, 희석제는 RNA 가용화제, 완충제 또는 등장화제일 수 있다. RNA 가용화제의 예에는 물, 에탄올, 메탄올, 아세톤, 포름아미드 및 2-프로판올을 포함한다. 완충제의 예에는 2-(N-모르폴리노)에탄술폰산(MES), 비스(Bis)-트리스(Tris), 2-[(2-아미노-2-옥소에틸)-(카복시메틸)아미노]아세트산(ADA), N-(2-아세트아미도)-2-아미노에탄술폰산(ACES), 피페라진-N,N'-비스(2-에탄술폰산)(PIPES), 2-[[1,3-디하이드록시-2-(하이드록시메틸)프로판-2-일]아미노]에탄술폰산(TES), 3-(N-모르폴리노)프로판술폰산(MOPS), 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산(HEPES), 트리스(Tris), 트리신(Tricine), Gly-Gly, 비신(Bicine) 또는 포스페이트가 포함된다. 등장화제의 예에는 글리세린, 만니톨, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 트레할로스 또는 수크로스가 포함된다.
본 발명은 추가로 본원에 기술된 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 숙주 또는 숙주 세포에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 숙주 또는 숙주 세포는 식물, 곤충, 박테리아, 진균, 척추동물, 포유동물(예를 들어, 인간) 또는 다른 유기체 또는 세포이다.
일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 숙주에서 비-면역원성이다. 일부 실시형태에서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 참조 화합물, 예를 들어, 기술된 원형 폴리리보뉴클레오티드에 상응하는 선형 폴리뉴클레오티드, 또는 엔크립토겐을 결여한 원형 폴리리보뉴클레오티드에 의해 촉발되는 반응에 비하여, 숙주의 면역계에 의한 반응이 감소되거나, 반응을 생성하지 못한다. 일부 면역 반응은 체액성 면역 반응(예를 들어, 항원-특이적 항체의 생성) 및 세포-매개의 면역 반응(예를 들어, 림프구 증식)을 포함하지만, 이들에 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 숙주 또는 숙주 세포는 원형 폴리리보뉴클레오티드와 접촉된다(예를 들어, 그로 전달되거나, 그에 투여된다). 일부 실시형태에서, 숙주는 포유동물, 예컨대 인간이다. 숙주 내의 원형 폴리리보뉴클레오티드, 발현 생성물 또는 둘 모두의 양은 투여 이후 임의의 시간에 측정될 수 있다.
세포
본 발명의 방법에서 세포는 진핵 세포일 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포는 동물 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 포유동물 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 인간 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 수산양식 동물(어류, 게류, 새우, 굴 등) 유래의 세포, 포유동물, 예를 들어, 애완동물 또는 동물원 동물(고양이, 개, 도마뱀, 조류, 사자, 호랑이 및 곰 등) 유래, 농장 또는 일하는 동물(말, 소, 돼지, 닭 등) 유래, 인간, 배양된 세포, 일차 세포 또는 세포주, 줄기 세포, 전구 세포, 분화된 세포, 생식 세포, 암 세포(예를 들어, 종양형성, 전이성), 비-종양형성 세포(정상 세포), 태아 세포, 배아 세포, 성인 세포, 유사분열 세포, 비-유사분열 세포 또는 그의 임의의 조합이다.
일부 실시형태에서, 세포는 기관, 조직 또는 유기체 유래의 것이다. 세포는 본원에 개시된 방법에서 사용하기 이전에 대상체로부터 제거될 수 있으며, 예를 들어, 정맥천자 등에 의해 외과적으로 절제될 수 있다. 세포는 세포 배양물 유래의 것일 수 있다. 본원에 개시된 방법은 대상체 내의 세포 상에서 사용될 수 있으며, 예를 들어, 본원에 개시된 바와 같은 조성물은 세포를 포함하는 대상체에게 투여된다. 세포를 포함하는 대상체는 수산양식 동물(어류, 게류, 새우, 굴 등), 포유동물, 예를 들어, 애완동물 또는 동물원 동물(고양이, 개, 도마뱀, 조류, 사자, 호랑이 및 곰 등), 농장 또는 일하는 동물(말, 소, 돼지, 닭 등), 또는 인간일 수 있다. 일부 실시형태에서, 대상체는 그를 필요로 하는 대상체이며, 본원에 개시된 방법의 원형 폴리리보뉴클레오티드에 의해 생성되는 단백질은 대상체를 치료한다.
일부 실시형태에서, 세포는 복수의 세포이다. 본 발명의 방법에서 복수의 세포는 복수의 진핵 세포일 수 있다. 일부 실시형태에서, 복수의 세포는 복수의 동물 세포이다. 일부 실시형태에서, 복수의 세포는 복수의 포유동물 세포이다. 일부 실시형태에서, 복수의 세포는 복수의 인간 세포이다. 일부 실시형태에서, 복수의 세포는 수산양식 동물(어류, 게류, 새우, 굴 등) 유래, 포유동물, 예를 들어, 애완동물 또는 동물원 동물(고양이, 개, 도마뱀, 조류, 사자, 호랑이 및 곰 등) 유래, 농장 또는 일하는 동물(말, 소, 돼지, 닭 등) 유래 복수의 세포, 인간, 배양된 세포, 일차 세포 또는 세포주, 줄기 세포, 전구 세포, 분화된 세포, 생식 세포, 암 세포(예를 들어, 종양형성, 전이성), 비-종양형성 세포(정상 세포), 태아 세포, 배아 세포, 성인 세포, 유사분열 세포, 비-유사분열 세포 또는 그의 임의의 조합이다. 세포는 대상체 내의 복수의 세포일 수 있다. 대상체는 동물일 수 있다. 대상체는 포유동물일 수 있다. 대상체는 인간일 수 있다.
일부 실시형태에서, 복수의 세포는 기관, 조직 또는 유기체 유래의 세포이다. 복수의 세포는 본원에 개시된 방법에서 사용하기 이전에 대상체로부터 제거될 수 있으며, 예를 들어, 정맥천자 등에 의해 외과적으로 절제될 수 있다. 복수의 세포는 세포 배양물 유래의 것일 수 있다. 본원에 개시된 방법은 대상체 내의 복수의 세포 상에서 사용될 수 있으며, 예를 들어, 본원에 개시된 바와 같은 용량은 복수의 세포를 포함하는 대상체에게 투여된다. 복수의 세포를 포함하는 대상체는 수산양식 동물(어류, 게류, 새우, 굴 등), 포유동물, 예를 들어, 애완동물 또는 동물원 동물(고양이, 개, 도마뱀, 조류, 사자, 호랑이 및 곰 등), 농장 또는 일하는 동물(말, 소, 돼지, 닭 등), 또는 인간일 수 있다. 일부 실시형태에서, 대상체는 그를 필요로 하는 대상체이며, 본원에 개시된 방법의 원형 폴리리보뉴클레오티드에 의해 생성되는 단백질은 대상체를 치료한다.
대상체
본 발명의 방법에서 대상체는 동물일 수 있다. 일부 실시형태에서, 대상체는 동물 세포이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 포유동물이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 인간이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 수산양식 동물(어류, 게류, 새우, 굴 등), 포유동물, 예를 들어, 애완동물 또는 동물원 동물(고양이, 개, 도마뱀, 조류(예를 들어, 앵무새), 사자, 호랑이 및 곰 등), 농장 또는 일하는 동물(말, 소(예를 들어, 젖소 및 육우), 돼지, 닭, 칠면조, 암탉 또는 수탉, 염소, 양 등), 또는 인간일 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 바와 같은 세포는 본원에 개시된 바와 같은 대상체에 존재한다.
일부 실시형태에서, 대상체는 그를 필요로 하는 대상체이며, 본원에 개시된 방법의 원형 폴리리보뉴클레오티드에 의해 생성되는 단백질은 대상체를 치료한다.
넘버링된 실시형태 #1
[1] 세포에서의 단백질의 발현 방법으로서,
단백질을 인코딩하는 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제1 조성물을 세포에게 제공하는 단계로서, 세포가 제1 수준의 단백질을 발현하는 단계; 및
원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제2 조성물을 세포에게 제공하는 단계로서, 세포가 제2 수준의 단백질을 발현하며, 제2 수준이 적어도 제1 수준만큼인 단계를 포함하며,
그럼으로써 세포 내의 단백질의 발현을 적어도 단백질의 제1 수준으로 유지하는, 방법.
[2] 세포에서의 단백질의 발현 방법으로서,
단백질을 인코딩하는 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제1 조성물을 세포에게 제공하는 단계로서, 세포가 제1 수준의 단백질을 발현하는 단계; 및
원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제2 조성물을 세포에게 제공하는 단계로서, 세포가 제2 수준의 단백질을 발현하며, 제2 수준이 제1 수준의 20%를 넘게 차이나지 않는 단계를 포함하며,
그럼으로써 세포 내의 단백질의 발현을 적어도 단백질의 제1 수준으로 유지하는, 방법.
[3] 세포에서의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 생산 방법으로서:
원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제1 조성물을 세포에 제공하는 단계로서, 세포는 제1 조성물을 제공한 이후의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 수준을 포함하는 단계; 및
원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 세포에 제공하는 단계로서, 세포는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 수준을 포함하며, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 수준은 적어도 제1 수준만큼인 단계를 포함하며,
그럼으로써 세포 내의 원형 폴리리보뉴클레오티드를 적어도 제1 수준으로 유지하는, 방법.
[4] 세포에서의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 생산 방법으로서:
원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제1 조성물을 세포에 제공하는 단계로서, 세포는 제1 조성물을 제공한 이후의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 수준을 포함하는 단계; 및
원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 세포에게 제공하는 단계로서, 세포가 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 수준을 포함하며, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 수준이 제2 조성물을 제공한 이후 제1 수준의 20%를 넘게 차이나지 않는 단계를 포함하며,
그럼으로써 세포 내의 원형 폴리리보뉴클레오티드를 적어도 제1 수준으로 유지하는, 방법.
[5] 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후의 세포 내의 단백질의 수준과 비교하여 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 세포에 제공한 이후의 세포 내의 단백질의 수준을 발현하는 방법으로서:
단백질을 인코딩하는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물을 세포에게 제공하는 단계로서, 세포가 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물을 제공한 후에 소정의 수준의 단백질을 포함하는 단계; 및
원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 제1 조성물 이후에 세포에게 제공하는 단계로서, 세포가 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 제공한 후에 적어도 소정의 수준의 단백질을 포함하는 단계를 포함하며,
그럼으로써 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후의 세포 내의 단백질의 수준과 비교하여 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후의 세포 내의 단백질의 발현 수준을 유지하는, 방법.
[6] 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후의 세포 내의 단백질의 수준과 비교하여 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 세포에 제공한 이후의 세포 내의 단백질의 수준을 발현하는 방법으로서:
단백질을 인코딩하는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물을 세포에게 제공하는 단계로서, 세포가 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물을 제공한 후에 소정의 수준의 단백질을 포함하는 단계; 및
원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 제1 조성물 이후에 세포에게 제공하는 단계로서, 세포가 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 제공한 후에 소정의 수준의 20%를 넘게 차이나지 않는 수준의 단백질을 포함하는 단계를 포함하며,
그럼으로써 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후의 세포 내의 단백질의 수준과 비교하여 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후의 세포 내의 단백질의 발현 수준을 유지하는, 방법.
[7] 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 후의 세포에서의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 수준과 비교하여 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 세포에게 제공한 후의 세포에서의 소정의 수준의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 생성 방법으로서,
원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물을 세포에 제공하는 단계로서, 세포가 제1 조성물을 제공한 이후의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준을 포함하는 단계; 및
원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 세포에 제공하는 단계로서, 세포가 적어도 제2 조성물을 제공한 이후의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준을 포함하는 단계를 포함하며,
그럼으로써 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후의 세포 내의 선형 대응물의 수준과 비교하여 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후의 세포 내의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준을 유지하는, 방법.
[8] 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 후의 세포에서의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 수준과 비교하여 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 세포에게 제공한 후의 세포에서의 소정의 수준의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 생성 방법으로서,
원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물을 세포에 제공하는 단계로서, 세포가 제1 조성물을 제공한 이후의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준을 포함하는 단계; 및
원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 세포에 제공하는 단계로서, 세포가 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준의 20%를 넘게 차이나지 않는 제2 조성물을 제공한 이후의 단백질의 수준을 포함하는 단계를 포함하며;
그럼으로써 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후의 세포 내의 선형 대응물의 수준과 비교하여 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후의 세포 내의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준을 유지하는, 방법.
[9] 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태에 있어서, 제2 조성물을 제공하는 단계는 제1 조성물을 제공한 후에, 그리고 제1 조성물에 의해 발현되는 단백질의 제1 수준이 세포에서 실질적으로 검출 불가능하게 되기 전에 발생하는, 방법.
[10] 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태에 있어서, 제2 조성물을 제공하는 단계는 제1 조성물을 제공한 후에, 그리고 제1 조성물에 의해 발현되는 단백질의 제1 수준이 세포에서 50% 초과로 감소하기 전에 발생하는, 방법.
[11] 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태에 있어서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제3 조성물을 제2 조성물 이후에 세포에게 제공함으로써, 세포에서 단백질의 발현을 적어도 제1 수준의 단백질로 유지하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
[12] 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태에 있어서, 제3 조성물을 제공하는 단계는 제2 조성물을 제공한 후에, 그리고 제1 및 제2 조성물에 의해 발현되는 단백질의 제2 수준이 세포에서 실질적으로 검출 불가능하게 되기 전에 발생하는, 방법.
[13] 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태에 있어서, 제3 조성물을 제공하는 단계는 제2 조성물을 제공한 후에, 그리고 세포에서 제1 및 제2 조성물에 의해 발현되는 단백질의 제2 수준이 50% 넘게 감소하기 전에 발생하는, 방법.
[14] 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태에 있어서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9 또는 제10 조성물을 제공하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
[15] 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태에 있어서, 제2 조성물을 제공하는 단계는 제1 조성물을 제공한 후에, 그리고 제1 조성물을 제공함으로써 생성되는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준이 세포에서 실질적으로 검출 불가능하게 되기 전에 발생하는, 방법.
[16] 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태에 있어서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제3 조성물을 제2 조성물 이후에 세포에게 제공함으로써, 제3 조성물을 제공한 후에 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준을 적어도 제1 수준으로 유지하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
[17] 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태에 있어서, 제3 조성물을 제공하는 단계는 제2 조성물을 제공한 후에, 그리고 세포에서 제1 및 제2 조성물에 의해 생성되는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준이 세포에서 실질적으로 검출 불가능하게 되기 전에 발생하는, 방법.
[18] 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태에 있어서, 제3 조성물을 제공하는 단계는 제2 조성물을 제공한 후에, 그리고 세포에서 제1 및 제2 조성물에 의해 생성되는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준이 50% 초과로 감소하기 전에 발생하는, 방법.
[19] 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태에 있어서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9 또는 제10 조성물을 세포에게 제공하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
[20] 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태에 있어서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 제공하는 단계는 제1 조성물 이후에, 그리고 제1 조성물에 의해 발현되는 세포 내의 단백질의 수준이 실질적으로 검출 불가능하게 된 후에 발생하는, 방법.
[21] 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태에 있어서, 제2 조성물은 제1 조성물에 의해 발현된 세포 내의 단백질의 수준이 실질적으로 검출 불가능하게 된 지 적어도 1분, 1시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 7일, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 8개월, 10개월, 또는 1년 후에 세포에 제공되는, 방법.
[22] 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태에 있어서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 제공하는 단계는 제1 조성물 이후에, 그리고 제1 조성물에 의해 생성되는 세포 내의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준이 실질적으로 검출 불가능하게 된 후에 발생하는, 방법.
[23] 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태에 있어서, 제2 조성물은 제1 조성물에 의해 생성된 복수의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준이 실질적으로 검출 불가능하게 된 지 적어도 1분, 1시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 7일, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 8개월, 10개월, 또는 1년 후에 세포에 제공되는, 방법.
[24] 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태에 있어서, 제1 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 추가로 포함하는, 방법.
[25] 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태에 있어서, 제2 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 추가로 포함하는, 방법.
[26] 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태에 있어서, 제3 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 추가로 포함하는, 방법.
[27] 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태에 있어서, 제1 조성물 및 제2 조성물은 거의 동일한 양의 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는, 방법.
[28] 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태에 있어서, 제1 조성물은 제2 조성물보다 많은 양의 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는, 방법.
[29] 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태에 있어서, 제1 조성물은 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 또는 제10 조성물보다 많은 양의 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는, 방법.
[30] 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태에 있어서, 제2 조성물의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 양이 제1 조성물의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 양의 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 또는 25%를 넘게 차이나지 않는, 방법.
[31] 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태에 있어서, 제2 조성물의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 양이 제1 조성물의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 양보다 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 또는 25% 이하로 적은, 방법.
[32] 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태에 있어서, 단백질의 제1 수준이 제1 조성물을 제공한 지 하루 후의 단백질의 최고 수준인, 방법.
[33] 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태에 있어서, 단백질의 제1 수준이 제1 조성물을 제공한 지 하루 후의 단백질의 최고 수준의 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%인, 방법.
[34] 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태에 있어서, 단백질의 제2 수준이 제2 조성물의 제공 이후 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 또는 40 일 동안 제1 조성물을 제공한 지 하루 후의 단백질의 최고 수준의 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 또는 130%인, 방법.
[35] 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태에 있어서, 단백질의 제3 수준이 제3 조성물의 제공 이후 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 또는 40 일 동안 제1 조성물을 제공한 지 하루 후의 단백질의 최고 수준의 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 또는 130%인, 방법.
[36] 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태에 있어서, 제1 조성물의 제공 이후의 후속 조성물 각각에 대해, 각각의 후속 조성물 이후 발현된 단백질의 후속 수준이 각각의 후속 조성물의 제공 이후 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 또는 40 일 동안 제1 조성물을 제공한 지 하루 후의 단백질의 최고 수준의 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 또는 130%인, 방법.
[37] 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태에 있어서, 제2 조성물을 제공한 후의 단백질의 평균 수준이 제1 수준의 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%이며, 단백질의 평균 수준이 제2 조성물을 제공한 후 1일째부터 단백질이 실질적으로 검출 불가능한 날까지 측정되는, 방법.
[38] 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태에 있어서, 제1 조성물 이후에 각각의 후속 조성물을 제공한 후의 단백질의 평균 수준이 제1 수준의 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%이며, 단백질의 평균 수준이 각각의 후속 조성물을 제공한 후 1일째부터 단백질이 실질적으로 검출 불가능한 날까지 측정되는, 방법.
[39] 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태에 있어서, 단백질의 제1 수준은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후 제1 조성물의 제공 이후 적어도 6시간, 1일, 2일, 3일, 5일, 7일, 14일, 21일, 28일, 또는 35일 동안 유지되는, 방법.
[40] 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태에 있어서, 단백질의 제1 수준은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물, 제2 조성물, 및 제3 조성물을 제공한 이후 제1 조성물의 제공 이후 적어도 6시간, 1일, 2일, 3일, 5일, 7일, 14일, 21일, 28일, 또는 35일 동안 유지되는, 방법.
[41] 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태에 있어서, 제2 조성물을 제공한 이후의 세포 내의 단백질의 제2 수준은 제1 조성물을 제공한 이후 세포 내의 단백질의 제1 수준보다 적어도 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 60% 높은, 방법.
[42] 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태에 있어서, 제3 조성물을 제공한 이후의 세포 내의 단백질의 제3 수준은 제1 조성물을 제공한 이후 복수의 단백질의 제1 수준보다 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 60% 높은, 방법.
[43] 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태에 있어서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 제공한 지 1시간, 12시간, 18시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 15일, 20일, 25일, 30일, 40일, 또는 45일 이후의 단백질의 제2 수준은 제1 조성물을 제공한 이후의 단백질의 제1 수준보다 적어도 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 60% 높은, 방법.
[44] 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태에 있어서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제3 조성물을 제공한 지 1시간, 12시간, 18시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 15일, 20일, 25일, 30일, 40일, 또는 45일 이후의 단백질의 제3 수준은 제1 조성물을 제공한 이후의 단백질의 제1 수준보다 적어도 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 60% 높은, 방법.
[45] 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태에 있어서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 수준이 제1 조성물을 제공한 지 하루 후의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 최고 수준인, 방법.
[46] 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태에 있어서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 수준이 제1 조성물을 제공한 지 하루 후의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 최고 수준의 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%인, 방법.
[47] 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태에 있어서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 수준이 제2 조성물의 제공 이후 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 또는 40 일 동안 제1 조성물을 제공한 지 하루 후의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 최고 수준의 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 또는 130%인, 방법.
[48] 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태에 있어서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제3 수준이 제3 조성물의 제공 이후 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 또는 40 일 동안 제1 조성물을 제공한 지 하루 후의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 최고 수준의 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 또는 130%인, 방법.
[49] 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태에 있어서, 제1 조성물의 제공 이후의 후속 조성물 각각에 대해, 각각의 후속 조성물 이후 발현된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 후속 수준이 각각의 후속 조성물의 제공 이후 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 또는 40 일 동안 제1 조성물을 제공한 지 하루 후의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 최고 수준의 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 또는 130%인, 방법.
[50] 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태에 있어서, 제2 조성물을 제공한 후의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 평균 수준이 제1 수준의 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%이며, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 평균 수준이 제2 조성물을 제공한 후 1일째부터 원형 폴리리보뉴클레오티드가 실질적으로 검출 불가능한 날까지 측정되는, 방법.
[51] 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태에 있어서, 제1 조성물 이후 각각의 후속 조성물을 제공한 후의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 평균 수준이 제1 수준의 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%이며, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 평균 수준이 각각의 후속 조성물을 제공한 후 1일째부터 원형 폴리리보뉴클레오티드가 실질적으로 검출 불가능한 날까지 측정되는, 방법.
[52] 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태에 있어서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 수준은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물이 제공된 후 적어도 6시간, 1일, 2일, 3일, 5일, 7일, 14일, 21일, 28일, 또는 35일 동안 유지되는, 방법.
[53] 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태에 있어서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 수준은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제3 조성물이 제공된 후 적어도 6시간, 1일, 2일, 3일, 5일, 7일, 14일, 21일, 28일, 또는 35일 동안 유지되는, 방법.
[54] 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태에 있어서, 제2 조성물을 제공한 이후의 세포 내의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 수준은 제1 조성물을 제공한 이후 세포 내의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 수준보다 적어도 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 60% 높은, 방법.
[55] 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태에 있어서, 제3 조성물을 제공한 이후의 세포 내의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제3 수준은 제1 조성물을 제공한 이후 복수의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 수준보다 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 60% 높은, 방법.
[56] 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태에 있어서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 제공한 지 1시간, 12시간, 18시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 15일, 20일, 25일, 30일, 40일, 또는 45일 이후의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 수준은 제1 조성물을 제공한 이후의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 수준보다 적어도 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 60% 높은, 방법.
[57] 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태에 있어서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제3 조성물을 제공한 지 1시간, 12시간, 18시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 15일, 20일, 25일, 30일, 40일, 또는 45일 이후의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제3 수준은 제1 조성물을 제공한 이후의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 수준보다 적어도 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 60% 높은, 방법.
[58] 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태에 있어서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물이 제공된 후의 세포 내의 단백질의 수준은 적어도 1시간, 12시간, 18시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 15일, 20일, 25일, 또는 30일 동안 유지되는, 방법.
[59] 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태에 있어서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 후의 세포에서의 단백질의 수준이 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 후의 세포에서의 단백질의 수준보다 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50% 또는 60% 더 높은, 방법.
[60] 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태에 있어서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후의 세포 내의 단백질의 수준은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 제공한 이후 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 15일, 20일, 25일, 30일, 40일, 또는 45일 동안 원형의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후의 세포 내의 단백질의 수준보다 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 60% 높은, 방법.
[61] 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태에 있어서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물이 제공된 후의 세포 내의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준은 적어도 1시간, 12시간, 18시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 15일, 20일, 25일, 또는 30일 동안 유지되는, 방법.
[62] 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태에 있어서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 후의 세포에서의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준이 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 후의 세포에서의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 수준보다 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50% 또는 60% 더 높은, 방법.
[63] 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태에 있어서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후의 복수의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 제공한 이후 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 15일, 20일, 25일, 30일, 40일, 또는 45일 동안 원형의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후의 복수의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 수준보다 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 60% 높은, 방법.
[64] 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태에 있어서, 단백질은 치료적 단백질인, 방법.
[65] 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태에 있어서, 단백질이 세포내 단백질, 막 단백질, 또는 분비 단백질인, 방법.
[66] 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태에 있어서, 치료적 단백질은 항산화 활성, 결합, 카르고 수용체 활성, 촉매적 활성, 분자 운반체 활성, 분자 기능 조절제, 분자 전달제 활성, 영양소 저장소 활성, 단백질 태그, 구조적 분자 활성, 독소 활성, 전사 조절제 활성, 번역 조절제 활성 또는 수송체 활성을 갖는, 방법.
[67] 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태에 있어서, 치료적 단백질이 인간 인자 VIII, 인간 인자 IX, REP1, 아데노신 데아미나제, 인간 NGF, 핵-인코딩된 ND4, SECRA2a, SUMO1, VEGF, PDE6A, p53, PBFD, ARSA, ABCD1, APOE4, RPGR, DCLRE1C, VEGF 165, PDGF-B, 감마-사르코글리칸, 디스트로핀, LAMP2B, CNGB3, 망막색소변성증 GTPase 조절제 또는 CLN6인, 방법.
[68] 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태에 있어서, 세포는 진핵 세포인, 방법.
[69] 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태에 있어서, 세포는 동물 세포인, 방법.
[70] 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태에 있어서, 세포는 포유동물 세포인, 방법.
[71] 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태에 있어서, 세포는 인간 세포인, 방법.
[72] 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태에 있어서, 세포는 대상체 내의 복수의 세포인, 방법.
[73] 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태에 있어서, 대상체는 동물인, 방법.
[74] 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태에 있어서, 대상체는 포유동물인, 방법.
[75] 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태에 있어서, 대상체는 인간인, 방법.
[76] 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태에 있어서, 원형 폴리리보뉴클레오티드가 발현 서열의 3' 말단에 스태거 요소를 추가로 포함하며, 종결 요소를 결여하는, 방법.
[77] 실시형태 [76]에 있어서, 스태거 요소는 상기 원형 폴리리보뉴클레오티드의 회전환 번역 동안 리보솜을 고착시키는, 방법.
[78] 실시형태 [76] 또는 [77]에 있어서, 상기 스태거 요소는 D(V/I)ExNPGP인 C-말단 공통 서열을 갖는 서열을 인코딩하며, x는 임의의 아미노산인, 방법.
[79] 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태에 있어서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 내부 리보솜 진입 부위를 결여하는, 방법.
[80] 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태에 있어서, 하나 이상의 발현 서열은 코작 개시 서열을 포함하는, 방법.
[81] 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태에 있어서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는
a) 엔크립토겐;
b) 스태거 요소;
c) 조절 요소;
d) 복제 요소; 및 f) 준-이중-가닥 이차 구조. 로부터 선택되는 적어도 하나의 구조적 요소를 추가로 포함하는, 방법.
[82] 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태에 있어서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는
(i) 선형 대응물보다 더 큰 번역 효율;
(ii) 다수의 번역 생성물의 화학량론적 번역 효율;
(iii) 엔크립토겐을 결여한 대응물보다 더 적은 면역원성;
(iv) 선형 대응물에 비하여 증가된 반감기; 및
(v) 세포 분열 동안의 지속성으로부터 선택되는 적어도 하나의 기능적 특징을 포함하는, 방법.
[83] 실시형태 [76]에 있어서, 종결 요소는 정지 코돈을 포함하는, 방법.
[84] 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태에 있어서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 상기 원형 폴리리보뉴클레오티드의 자가-복제를 매개하도록 구성된 복제 도메인을 추가로 포함하는, 방법.
[85] 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태에 있어서, 상기 원형 폴리리보뉴클레오티드는 세포 분열 동안 지속되는, 방법.
넘버링된 실시형태 #2
[1] 세포에서의 단백질의 발현 방법으로서,
단백질을 인코딩하는 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제1 조성물을 세포에게 제공하는 단계로서, 세포가 제1 수준의 단백질을 발현하는 단계; 및
원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제2 조성물을 세포에게 제공하는 단계로서, 세포가 제2 수준의 단백질을 발현하며, 제2 수준이 적어도 제1 수준만큼인 단계를 포함하며,
그럼으로써 세포 내의 단백질의 발현을 적어도 단백질의 제1 수준으로 유지하는, 방법.
[2] 세포에서의 단백질의 발현 방법으로서,
단백질을 인코딩하는 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제1 조성물을 세포에게 제공하는 단계로서, 세포가 제1 수준의 단백질을 발현하는 단계; 및
원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제2 조성물을 세포에게 제공하는 단계로서, 세포가 제2 수준의 단백질을 발현하며, 제2 수준이 제1 수준의 20%를 넘게 차이나지 않는 단계를 포함하며,
그럼으로써 세포 내의 단백질의 발현을 적어도 단백질의 제1 수준으로 유지하는, 방법.
[3] 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 후의 세포에서의 단백질의 수준과 비교하여 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 세포에게 제공한 후의 세포에서의 소정의 수준의 단백질의 발현 방법으로서,
단백질을 인코딩하는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물을 세포에게 제공하는 단계로서, 세포가 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물을 제공한 후에 소정의 수준의 단백질을 포함하는 단계; 및
원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 제1 조성물 이후에 세포에게 제공하는 단계로서, 세포가 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 제공한 후에 적어도 소정의 수준의 단백질을 포함하는 단계를 포함하며,
그럼으로써 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후의 세포 내의 단백질의 수준과 비교하여 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후의 세포 내의 단백질의 발현 수준을 유지하는, 방법.
[4] 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 후의 세포에서의 단백질의 수준과 비교하여 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 세포에게 제공한 후의 세포에서의 소정의 수준의 단백질의 발현 방법으로서,
단백질을 인코딩하는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물을 세포에게 제공하는 단계로서, 세포가 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물을 제공한 후에 소정의 수준의 단백질을 포함하는 단계; 및
원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 제1 조성물 이후에 세포에게 제공하는 단계로서, 세포가 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 제공한 후에 소정의 수준의 20%를 넘게 차이나지 않는 수준의 단백질을 포함하는 단계를 포함하며,
그럼으로써 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후의 세포 내의 단백질의 수준과 비교하여 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후의 세포 내의 단백질의 발현 수준을 유지하는, 방법.
[5] 실시형태 [1] 또는 [2]에 있어서, 제2 조성물을 제공하는 단계가 제1 조성물을 제공한 후에, 그리고 제1 조성물에 의해 발현되는 단백질의 제1 수준이 세포에서 실질적으로 검출 불가능하게 되기 전에 발생하는, 방법.
[6] 실시형태 [1] 또는 [2]에 있어서, 제2 조성물을 제공하는 단계가 제1 조성물을 제공한 후에, 그리고 제1 조성물에 의해 발현되는 단백질의 제1 수준이 세포에서 50% 초과로 감소하기 전에 발생하는, 방법.
[7] 실시형태 [1] 내지 [2] 및 [5] 내지 [6] 중 어느 한 실시형태에 있어서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제3 조성물을 제2 조성물 이후에 세포에게 제공함으로써, 세포에서의 단백질의 발현을 적어도 제1 수준의 단백질로 유지하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
[8] 실시형태 [7]에 있어서, 제3 조성물을 제공하는 단계가 제2 조성물을 제공한 후에, 그리고 제1 및 제2 조성물에 의해 발현되는 단백질의 제2 수준이 세포에서 실질적으로 검출 불가능하게 되기 전에 발생하는, 방법.
[9] 실시형태 [7]에 있어서, 제3 조성물을 제공하는 단계가 제2 조성물을 제공한 후에, 그리고 세포에서 제1 및 제2 조성물에 의해 발현되는 단백질의 제2 수준이 50% 초과로 감소하기 전에 발생하는, 방법.
[10] 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태에 있어서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9 또는 제10 조성물을 제공하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
[11] 실시형태 [3] 또는 [4]에 있어서, 제2 조성물은 제1 조성물에 의해 발현된 세포 내 단백질의 수준이 실질적으로 검출 불가능하게 된 지 적어도 1분, 1시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 7일, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 12개월, 13개월, 14개월, 15개월, 16개월, 17개월, 18개월, 19개월, 20개월, 21개월, 또는 22개월 후에 세포에 제공되는, 방법.
[12] 실시형태 [1], [2], 또는 [5] 내지 [10] 중 어느 한 실시형태에 있어서, 단백질의 제1 수준이 제1 조성물을 제공한 후 1일째의 단백질의 가장 높은 수준인, 방법.
[13] 실시형태 [1], [2], 또는 [5] 내지 [10] 중 어느 한 실시형태에 있어서, 단백질의 제1 수준이 제1 조성물을 제공한 지 하루 후의 단백질의 최고 수준의 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%인, 방법.
[14] 실시형태 [13]에 있어서, 단백질의 제2 수준이 제2 조성물의 제공 이후 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 또는 40 일 동안 제1 조성물을 제공한 지 하루 후의 단백질의 최고 수준의 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 또는 130%인, 방법.
[15] 실시형태 [13] 또는 [14]에 있어서, 단백질의 제3 수준이 제3 조성물의 제공 이후 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 또는 40 일 동안 제1 조성물을 제공한 지 하루 후의 단백질의 최고 수준의 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 또는 130%인, 방법.
[16] 실시형태 [15]에 있어서, 제1 조성물의 제공 이후의 후속 조성물 각각에 대해, 각각의 후속 조성물 이후 발현된 단백질의 후속 수준은 각각의 후속 조성물의 제공 이후 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 또는 40 일 동안 제1 조성물을 제공한 지 하루 후의 단백질의 최고 수준의 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 또는 130%인, 방법.
[17] 실시형태 [1], [2], 또는 [5] 내지 [10] 중 어느 한 실시형태에 있어서, 제2 조성물을 제공한 후의 단백질의 평균 수준이 제1 수준의 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%이며, 단백질의 평균 수준이 제2 조성물을 제공한 후 1일째부터 단백질이 실질적으로 검출 불가능한 날까지 측정되는, 방법.
[18] 실시형태 [1], [2], 또는 [5] 내지 [10] 중 어느 한 실시형태에 있어서, 제1 조성물 이후에 각각의 후속 조성물을 제공한 후의 단백질의 평균 수준이 제1 수준의 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%이며, 단백질의 평균 수준이 각각의 후속 조성물을 제공한 후 1일째부터 단백질이 실질적으로 검출 불가능한 날까지 측정되는, 방법.
[19] 실시형태 [1], [2], [5], [7] 또는 [10] 중 어느 한 실시형태에 있어서, 단백질의 제1 수준은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물, 및 제2 조성물을 제공한 이후 제1 조성물의 제공 이후 적어도 6시간, 1일, 2일, 3일, 5일, 7일, 14일, 21일, 28일, 또는 35일 동안 유지되는, 방법.
[20] 실시형태 [7], [8], 또는 [10] 중 어느 한 실시형태에 있어서, 단백질의 제1 수준은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물, 제2 조성물, 및 제3 조성물을 제공한 이후 제1 조성물의 제공 이후 적어도 6시간, 1일, 2일, 3일, 5일, 7일, 14일, 21일, 28일, 또는 35일 동안 유지되는, 방법.
[21] 실시형태 [1], [2], [5], [7], [8], 또는 [10] 중 어느 한 실시형태에 있어서, 제2 조성물을 제공한 이후의 세포 내의 단백질의 제2 수준은 제1 조성물을 제공한 이후 세포 내의 단백질의 제1 수준보다 적어도 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 60% 높은, 방법.
[22] 실시형태 [7], [8] 또는 [10] 중 어느 한 실시형태에 있어서, 제3 조성물을 제공한 이후의 세포 내에서 생성된 단백질의 제3 수준은 제1 조성물을 제공한 이후 복수의 단백질의 제1 수준보다 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 60% 높은, 방법.
[23] 실시형태 [1], [2], [5], [7], [8], 또는 [10] 중 어느 한 실시형태에 있어서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 제공한 지 1시간, 12시간, 18시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 15일, 20일, 25일, 30일, 40일, 또는 45일 이후의 단백질의 제2 수준은 제1 조성물을 제공한 이후의 단백질의 제1 수준보다 적어도 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 60% 높은, 방법.
[24] 실시형태 [7], [8], 또는 [10] 중 어느 한 실시형태에 있어서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제3 조성물을 제공한 지 1시간, 12시간, 18시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 15일, 20일, 25일, 30일, 40일, 또는 45일 이후의 단백질의 제3 수준은 제1 조성물을 제공한 이후의 단백질의 제1 수준보다 적어도 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 60% 높은, 방법.
[25] 실시형태 [3], [4], [10], 또는 [11] 중 어느 한 실시형태에 있어서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물이 제공된 후의 세포 내의 단백질의 수준은 적어도 1시간, 12시간, 18시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 15일, 20일, 25일, 또는 30일 동안 유지되는, 방법.
[26] 실시형태 [3], [4], [10] 또는 [11] 중 어느 한 실시형태에 있어서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 후의 세포에서의 단백질의 수준은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 후의 세포에서의 단백질의 수준보다 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50% 또는 60% 더 높은, 방법.
[27] 실시형태 [3], [4], [10], 또는 [11] 중 어느 한 실시형태에 있어서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후의 세포 내의 단백질의 수준은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 제공한 이후 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 15일, 20일, 25일, 30일, 40일, 또는 45일 동안 원형의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후의 세포 내의 단백질의 수준보다 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 60% 높은, 방법.
[28] 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태에 있어서, 단백질은 치료적 단백질인, 방법.
[29] 상기 실시형태들 중 어느 한 실시형태에 있어서, 단백질이 세포내 단백질, 막 단백질, 또는 분비 단백질인, 방법.
[30] 실시형태 [28] 또는 [29] 중 어느 한 실시형태에 있어서, 치료적 단백질은 a) 항산화 활성, 결합, 카르고 수용체 활성, 촉매적 활성, 분자 운반체 활성, 분자 전달제 활성, 영양소 저장소 활성, 구조적 분자 활성, 독소 활성, 전사 조절제 활성, 번역 조절제 활성 또는 수송체 활성; b) 분자 기능 조절제; 또는 c) 단백질 태그로서의 기능을 갖는, 방법.
[31] 실시형태 [28] 내지 [30] 중 어느 한 실시형태에 있어서, 치료적 단백질은 인간 인자 VIII, 인간 인자 IX, REP1, 아데노신 데아미나제, 인간 NGF, 핵-인코딩된 ND4, SECRA2a, SUMO1, VEGF, PDE6A, p53, PBFD, ARSA, ABCD1, APOE4, RPGR, DCLRE1C, VEGF 165, PDGF-B, 감마-사르코글리칸, 디스트로핀, LAMP2B, CNGB3, 망막색소변성증 GTPase 조절제 또는 CLN6인, 방법.
[32] 세포에서의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 생산 방법으로서:
원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제1 조성물을 세포에 제공하는 단계로서, 세포는 제1 조성물을 제공한 이후의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 수준을 포함하는 단계; 및
원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 세포에 제공하는 단계로서, 세포는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 수준을 포함하며, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 수준은 적어도 제1 수준만큼인 단계를 포함하며,
그럼으로써 세포 내의 원형 폴리리보뉴클레오티드를 적어도 제1 수준으로 유지하는, 방법.
[33] 세포에서의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 생산 방법으로서:
원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제1 조성물을 세포에 제공하는 단계로서, 세포는 제1 조성물을 제공한 이후의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 수준을 포함하는 단계; 및
원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 세포에게 제공하는 단계로서, 세포가 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 수준을 포함하며, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 수준이 제2 조성물을 제공한 이후 제1 수준의 20%를 넘게 차이나지 않는 단계를 포함하며,
그럼으로써 세포 내의 원형 폴리리보뉴클레오티드를 적어도 제1 수준으로 유지하는, 방법.
[34] 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 후의 세포에서의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 수준과 비교하여 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 세포에게 제공한 후의 세포에서의 소정의 수준의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 생성 방법으로서:
원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물을 세포에 제공하는 단계로서, 세포가 제1 조성물을 제공한 이후의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준을 포함하는 단계; 및
원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 세포에 제공하는 단계로서, 세포가 적어도 제2 조성물을 제공한 이후의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준을 포함하는 단계를 포함하며,
그럼으로써 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후의 세포 내의 선형 대응물의 수준과 비교하여 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후의 세포 내의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준을 유지하는, 방법.
[35] 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 후의 세포에서의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 수준과 비교하여 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 세포에게 제공한 후의 세포에서의 소정의 수준의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 생성 방법으로서:
원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물을 세포에 제공하는 단계로서, 세포가 제1 조성물을 제공한 이후의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준을 포함하는 단계; 및
원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 세포에 제공하는 단계로서, 세포가 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준의 20%를 넘게 차이나지 않는 제2 조성물을 제공한 이후의 단백질의 수준을 포함하는 단계를 포함하며;
그럼으로써 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후의 세포 내의 선형 대응물의 수준과 비교하여 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후의 세포 내의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준을 유지하는, 방법.
[36] 실시형태 [32] 또는 [33]에 있어서, 제2 조성물을 제공하는 단계는 제1 조성물을 제공한 후에, 그리고 제1 조성물을 제공함으로써 생성되는 소정의 수준의 원형 폴리리보뉴클레오티드가 세포에서 실질적으로 검출 불가능하게 되기 전에 발생하는, 방법.
[37] 실시형태 [32], [33] 또는 [36]에 있어서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 제공하는 단계는 제1 조성물 이후에, 그리고 제1 조성물에 의해 생성되는 세포 내의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준이 실질적으로 검출 불가능하게 된 후에 발생하는, 방법.
[38] 실시형태 [32], [33], [36] 또는 [37] 중 어느 한 실시형태에 있어서, 제2 조성물은 제1 조성물에 의해 생성된 복수의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준이 실질적으로 검출 불가능하게 된 지 적어도 1분, 1시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 7일, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 12개월, 13개월, 14개월, 15개월, 16개월, 17개월, 18개월, 19개월, 20개월, 21개월, 또는 22개월 후에 세포에 제공되는, 방법.
[39] 실시형태 [32], [33], 또는 [36] 내지 [38] 중 어느 한 실시형태에 있어서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제3 조성물을 제2 조성물 이후에 세포에게 제공함으로써, 제3 조성물을 제공한 후에 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준을 적어도 제1 수준으로 유지하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
[40] 실시형태 [32], [33], 또는 [36] 내지 [39] 중 어느 한 실시형태에 있어서, 제3 조성물을 제공하는 단계는 제2 조성물을 제공한 후에, 그리고 세포에서 제1 및 제2 조성물에 의해 생성되는 소정의 수준의 원형 폴리리보뉴클레오티드가 세포에서 실질적으로 검출 불가능하게 되기 전에 발생하는, 방법.
[41] 실시형태 [32], [33] 및 [36] 내지 [40] 중 어느 한 실시형태에 있어서, 제3 조성물을 제공하는 단계는 제2 조성물을 제공한 후에 그리고 세포에서 제1 및 제2 조성물에 의해 생성되는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준이 50% 초과로 감소하기 전에 발생하는, 방법.
[42] 실시형태 [32] 내지 [41] 중 어느 한 실시형태에 있어서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9 또는 제10 조성물을 세포에게 제공하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
[43] 실시형태 [34] 또는 [35]에 있어서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 제공하는 단계는 제1 조성물 이후에, 그리고 제1 조성물에 의해 발현되는 세포 내의 소정의 수준의 단백질이 실질적으로 검출 불가능하게 된 후에 발생하는, 방법.
[44] 실시형태 [32], [33], 또는 [36] 내지 [42] 중 어느 한 실시형태에 있어서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 수준은 제1 조성물을 제공한 지 하루 후의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 최고 수준인, 방법.
[45] 실시형태 [32], [33], 또는 [36] 내지 [42] 중 어느 한 실시형태에 있어서, 제1 조성물에 의해 생산된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준은 제1 조성물을 제공한 지 하루 후의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 최고 수준의 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%인, 방법.
[46] 실시형태 [32], [33], 또는 [36] 내지 [42] 중 어느 한 실시형태에 있어서, 제2 조성물에 의해 생성된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준이 제2 조성물의 제공 이후 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 또는 40 일 동안 제1 조성물을 제공한 지 하루 후의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 최고 수준의 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 또는 130%인, 방법.
[47] 실시형태 [39] 내지 [42] 중 어느 한 실시형태에 있어서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제3 수준이 제3 조성물의 제공 이후 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 또는 40 일 동안 제1 조성물을 제공한 지 하루 후의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 최고 수준의 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 또는 130%인, 방법.
[48] 실시형태 [32], [33], 또는 [36] 내지 [42] 중 어느 한 실시형태에 있어서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 수준이 제2 조성물의 제공 이후 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 또는 40 일 동안 제1 조성물을 제공한 지 하루 후의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 최고 수준의 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 또는 130%인, 방법.
[49] 실시형태 [32], [33], 또는 [36] 내지 [42] 중 어느 한 실시형태에 있어서, 제2 조성물을 제공한 후의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 평균 수준은 제1 수준의 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%이며, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 평균 수준은 제2 조성물을 제공한 후 1일째부터 원형 폴리리보뉴클레오티드가 실질적으로 검출 불가능한 날까지 측정되는, 방법.
[50] 실시형태 [32], [33], 또는 [36] 내지 [42] 중 어느 한 실시형태에 있어서, 제1 조성물 이후 각각의 후속 조성물을 제공한 후의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 평균 수준은 제1 수준의 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%이며, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 평균 수준이 각각의 후속 조성물을 제공한 후 1일째부터 원형 폴리리보뉴클레오티드가 실질적으로 검출 불가능한 날까지 측정되는, 방법.
[51] 실시형태 [32], [33], 또는 [36] 내지 [42] 중 어느 한 실시형태에 있어서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 수준은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물이 제공된 후 적어도 6시간, 1일, 2일, 3일, 5일, 7일, 14일, 21일, 28일, 또는 35일 동안 유지되는, 방법.
[52] 실시형태 [39] 내지 [42] 중 어느 한 실시형태에 있어서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 수준은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제3 조성물이 제공된 후 적어도 6시간, 1일, 2일, 3일, 5일, 7일, 14일, 21일, 28일, 또는 35일 동안 유지되는, 방법.
[53] 실시형태 [32], [33], 또는 [36] 내지 [42] 중 어느 한 실시형태에 있어서, 제2 조성물을 제공한 이후의 세포 내의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 수준은 제1 조성물을 제공한 이후 세포 내의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 수준보다 적어도 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 60% 높은, 방법.
[54] 실시형태 [39] 내지 [42] 중 어느 한 실시형태에 있어서, 제3 조성물을 제공한 이후의 세포 내의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제3 수준은 제1 조성물을 제공한 이후 복수의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 수준보다 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 60% 높은, 방법.
[55] 실시형태 [32], [33], 또는 [36] 내지 [42] 중 어느 한 실시형태에 있어서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 제공한 지 1시간, 12시간, 18시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 15일, 20일, 25일, 30일, 40일, 또는 45일 이후의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 수준은 제1 조성물을 제공한 이후의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 수준보다 적어도 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 60% 높은, 방법.
[56] 실시형태 [39] 내지 [42] 중 어느 한 실시형태에 있어서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제3 조성물을 제공한 지 1시간, 12시간, 18시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 15일, 20일, 25일, 30일, 40일, 또는 45일 이후의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제3 수준은 제1 조성물을 제공한 이후의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 수준보다 적어도 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 60% 높은, 방법.
[57] 실시형태 [34], [35], 또는 [43] 중 어느 한 실시형태에 있어서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물이 제공된 후의 세포 내의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준은 적어도 1시간, 12시간, 18시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 15일, 20일, 25일, 또는 30일 동안 유지되는, 방법.
[58] 실시형태 [34], [35] 또는 [43]에 있어서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 후의 세포에서의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 후의 세포에서의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 수준보다 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50% 또는 60% 더 높은, 방법.
[59] 실시형태 [34], [35], 또는 [43] 중 어느 한 실시형태에 있어서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후의 복수의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 제공한 이후 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 15일, 20일, 25일, 30일, 40일, 또는 45일 동안 원형의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후의 복수의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 수준보다 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 60% 높은, 방법.
[60] 실시형태 [32] 내지 [59] 중 어느 한 실시형태에 있어서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 표적에 대한 결합 부위를 포함하거나, 단백질을 인코딩하거나, 둘 모두인, 방법.
[61] 세포 내의 표적의 결합 방법으로서,
결합 부위를 포함하는 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제1 조성물을 세포에게 제공하는 단계로서, 표적이 제1 수준으로 결합 부위에 결합하는 단계; 및
원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제2 조성물을 세포에게 제공하는 단계로서, 표적이 제2 수준으로 결합 부위에 결합하고, 제2 수준이 적어도 제1 수준만큼인 단계를 포함하며,
그럼으로써 세포 내의 표적의 결합을 적어도 결합의 제1 수준으로 유지하는, 방법.
[62] 세포 내의 표적의 결합 방법으로서,
결합 부위를 포함하는 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제1 조성물을 세포에게 제공하는 단계로서, 표적이 제1 수준으로 결합 부위에 결합하는 단계; 및
원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제2 조성물을 세포에게 제공하는 단계로서, 표적이 제2 수준으로 결합 부위에 결합하며, 제2 수준이 제1 수준의 20%를 넘게 차이나지 않는 단계를 포함하며;
그럼으로써 세포 내의 표적의 결합을 적어도 결합의 제1 수준으로 유지하는, 방법.
[63] 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 후의 세포 내의 표적으로의 결합의 수준과 비교하여 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 세포에게 제공한 후의 세포 내의 표적의 결합 방법으로서,
결합 부위를 포함하는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물을 세포에게 제공하는 단계로서, 상기 세포가 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물을 제공한 후에 소정의 수준의 표적으로의 결합을 포함하는 단계; 및
원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 제1 조성물 이후에 세포에게 제공하는 단계로서, 세포가 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 제공한 후에 적어도 소정의 수준의 표적으로의 결합을 포함하는 단계를 포함하며;
그럼으로써 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후의 세포 내의 표적에 대한 결합 수준과 비교하여 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후의 세포 내의 표적에 대한 결합 수준을 유지하는, 방법.
[64] 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 후의 세포 내의 표적으로의 결합의 수준과 비교하여 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 세포에게 제공한 후의 세포 내의 표적의 결합 방법으로서,
결합 부위를 포함하는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물을 세포에게 제공하는 단계로서, 상기 세포가 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물을 제공한 후에 소정의 수준의 표적으로의 결합을 포함하는 단계; 및
원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 제1 조성물 이후에 세포에게 제공하는 단계로서, 세포가 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 제공한 후에 소정의 수준의 20%를 넘게 차이나지 않는 수준의 표적으로의 결합을 포함하는 단계를 포함하며;
그럼으로써 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후의 세포 내의 표적에 대한 결합 수준과 비교하여 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후의 세포 내의 표적에 대한 결합 수준을 유지하는, 방법.
[65] 실시형태 [61] 또는 [62]에 있어서, 제2 조성물을 제공하는 단계는 제1 조성물을 제공한 후에 그리고 제1 조성물에 의한 제1 수준의 결합이 세포에서 실질적으로 검출 불가능하게 되기 전에 발생하는, 방법.
[66] 실시형태 [61], [62] 또는 [65]에 있어서, 제2 조성물을 제공하는 단계는 제1 조성물을 제공한 후에, 그리고 제1 조성물에 의한 제1 수준의 결합이 세포에서 50% 초과로 감소하기 전에 발생하는, 방법.
[67] 실시형태 [61], [62], [65] 또는 [66]에 있어서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제3 조성물을 제2 조성물 이후에 세포에게 제공함으로써, 세포 내의 표적의 결합을 적어도 제1 수준의 결합으로 유지하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
[68] 실시형태 [67]에 있어서, 제3 조성물을 제공하는 단계가 제2 조성물을 제공한 후에, 그리고 제1 및 제2 조성물에 의한 세포 내의 표적의 제2 수준의 결합은 세포에서 실질적으로 검출 불가능하게 되기 전에 발생하는, 방법.
[69] 실시형태 [67] 또는 [68]에 있어서, 제3 조성물을 제공하는 단계는 제2 조성물을 제공한 후에, 그리고 세포에서 제1 및 제2 조성물에 의한 제2 수준의 결합이 50% 초과로 감소하기 전에 발생하는, 방법.
[70] 실시형태 [61] 내지 [69] 중 어느 한 실시형태에 있어서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9 또는 제10 조성물을 제공하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
[71] 실시형태 [63], [64] 또는 [70]에 있어서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 제공하는 단계는 제1 조성물 이후에, 그리고 제1 조성물에 의한 소정의 수준의 결합이 실질적으로 검출 불가능하게 된 후에 발생하는, 방법.
[72] 실시형태 [63], [64], [70], 또는 [71]에 있어서, 제2 조성물은 제1 조성물에 의한 결합의 수준이 실질적으로 검출 불가능하게 된 지 적어도 1분, 1시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 7일, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 12개월, 13개월, 14개월, 15개월, 16개월, 17개월, 18개월, 19개월, 20개월, 21개월, 또는 22개월 후에 세포에 제공되는, 방법.
[73] 실시형태 [61], [62], 또는 [65] 내지 [70] 중 어느 한 실시형태에 있어서, 제1 수준의 결합은 제1 조성물을 제공한 후 1일째의 가장 높은 수준의 결합인, 방법.
[74] 실시형태 [61], [62], 또는 [65] 내지 [70] 중 어느 한 실시형태에 있어서, 결합의 제1 수준이 제1 조성물을 제공한 지 하루 후의 결합의 최고 수준의 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%인, 방법.
[75] 실시형태 [61], [62], 또는 [65] 내지 [70] 중 어느 한 실시형태에 있어서, 결합의 제2 수준이 제2 조성물의 제공 이후 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 또는 40 일 동안 제1 조성물을 제공한 지 하루 후의 결합의 최고 수준의 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 또는 130%인, 방법.
[76] 실시형태 [67] 내지 [70] 중 어느 한 실시형태에 있어서, 결합의 제3 수준이 제3 조성물의 제공 이후 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 또는 40 일 동안 제1 조성물을 제공한 지 하루 후의 결합의 최고 수준의 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 또는 130%인, 방법.
[77] 실시형태 [61], [62], 또는 [65] 내지 [70] 중 어느 한 실시형태에 있어서, 제1 조성물의 제공 이후의 후속 조성물 각각에 대해, 각각의 후속 조성물 이후 결합의 후속 수준이 각각의 후속 조성물의 제공 이후 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 또는 40일 동안 제1 조성물을 제공한 지 하루 후의 결합의 최고 수준의 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 또는 130%인, 방법.
[78] 실시형태 [61], [62], 또는 [65] 내지 [70] 중 어느 한 실시형태에 있어서, 제2 조성물을 제공한 후의 결합의 평균 수준은 제1 수준의 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%이며, 결합의 평균 수준이 제2 조성물을 제공한 후 1일째부터 결합이 실질적으로 검출 불가능한 날까지 측정되는, 방법.
[79] 실시형태 [61], [62], 또는 [65] 내지 [70] 중 어느 한 실시형태에 있어서, 제1 조성물 이후에 각각의 후속 조성물을 제공한 후의 결합의 평균 수준은 제1 수준의 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%이며, 결합의 평균 수준이 각각의 후속 조성물을 제공한 후 1일째부터 결합이 실질적으로 검출 불가능한 날까지 측정되는, 방법.
[80] 실시형태 [61], [62], 또는 [65] 내지 [70] 중 어느 한 실시형태에 있어서, 결합의 제1 수준은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후 제1 조성물의 제공 이후 적어도 6시간, 1일, 2일, 3일, 5일, 7일, 14일, 21일, 28일, 또는 35일 동안 유지되는, 방법.
[81] 실시형태 [67] 내지 [70] 중 어느 한 실시형태에 있어서, 결합의 제1 수준은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물, 제2 조성물, 및 제3 조성물을 제공한 이후 제1 조성물의 제공 이후 적어도 6시간, 1일, 2일, 3일, 5일, 7일, 14일, 21일, 28일, 또는 35일 동안 유지되는, 방법.
[82] 실시형태 [61], [62], 또는 [65] 내지 [70] 중 어느 한 실시형태에 있어서, 제2 조성물을 제공한 이후의 세포 내의 결합의 제2 수준은 제1 조성물을 제공한 이후 세포 내의 결합의 제1 수준보다 적어도 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 60% 높은, 방법.
[83] 실시형태 [67] 내지 [70] 중 어느 한 실시형태에 있어서, 제3 조성물을 제공한 이후의 세포 내의 결합의 제3 수준은 제1 조성물을 제공한 이후 복수의 결합의 제1 수준보다 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 60% 높은, 방법.
[84] 실시형태 [61], [62], 또는 [65] 내지 [70] 중 어느 한 실시형태에 있어서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 제공한 지 1시간, 12시간, 18시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 15일, 20일, 25일, 30일, 40일, 또는 45일 이후의 결합의 제2 수준은 제1 조성물을 제공한 이후의 결합의 제1 수준보다 적어도 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 60% 높은, 방법.
[85] 실시형태 [67] 내지 [70] 중 어느 한 실시형태에 있어서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제3 조성물을 제공한 지 1시간, 12시간, 18시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 15일, 20일, 25일, 30일, 40일, 또는 45일 이후의 결합의 제3 수준은 제1 조성물을 제공한 이후의 결합의 제1 수준보다 적어도 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 60% 높은, 방법.
[86] 실시형태 [63], [64], 또는 [70] 내지 [72] 중 어느 한 실시형태에 있어서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물이 제공된 후의 세포 내의 결합의 수준은 적어도 1시간, 12시간, 18시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 15일, 20일, 25일, 또는 30일 동안 유지되는, 방법.
[87] 실시형태 [63], [64] 및 [70] 내지 [72] 중 어느 한 실시형태에 있어서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 후의 세포에서의 결합의 수준은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 후의 세포에서의 결합의 수준보다 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50% 또는 60% 더 높은, 방법.
[88] 실시형태 [63], [64], 또는 [70] 내지 [72] 중 어느 한 실시형태에 있어서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후의 세포 내의 결합의 수준은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 제공한 이후 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 15일, 20일, 25일, 30일, 40일, 또는 45일 동안 원형의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후의 세포 내의 결합의 수준보다 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 60% 높은, 방법.
[89] 실시형태 [1] 내지 [88] 중 어느 한 실시형태에 있어서, 제1 조성물 및 제2 조성물은 대략적으로 동일한 양의 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는, 방법.
[90] 실시형태 [1] 내지 [89] 중 어느 한 실시형태에 있어서, 제1 조성물은 제2 조성물보다 많은 양의 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는, 방법.
[91] 실시형태 [1] 내지 [90] 중 어느 한 실시형태에 있어서, 제1 조성물은 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9 또는 제10 조성물보다 더 많은 양의 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는, 방법.
[92] 실시형태 [1] 내지 [91] 중 어느 한 실시형태에 있어서, 제2 조성물의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 양이 제1 조성물의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 양의 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 또는 25%를 넘게 차이나지 않는, 방법.
[93] 실시형태 [1] 내지 [92] 중 어느 한 실시형태에 있어서, 제2 조성물의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 양이 제1 조성물의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 양보다 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 또는 25% 이하만큼 적은, 방법.
[94] 실시형태 [1] 내지 [93] 중 어느 한 실시형태에 있어서, 제1 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 추가로 포함하는, 방법.
[95] 실시형태 [1] 내지 [94] 중 어느 한 실시형태에 있어서, 제2 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 추가로 포함하는, 방법.
[96] 실시형태 [1] 내지 [95] 중 어느 한 실시형태에 있어서, 제3 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 추가로 포함하는, 방법.
[97] 실시형태 [1] 내지 [96] 중 어느 한 실시형태에 있어서, 세포는 진핵 세포인, 방법.
[98] 실시형태 [1] 내지 [97] 중 어느 한 실시형태에 있어서, 세포는 동물 세포인, 방법.
[99] 실시형태 [1] 내지 [98] 중 어느 한 실시형태에 있어서, 세포는 포유동물 세포인, 방법.
[100] 실시형태 [1] 내지 [99] 중 어느 한 실시형태에 있어서, 세포는 인간 세포인, 방법.
[101] 실시형태 [1] 내지 [100] 중 어느 한 실시형태에 있어서, 세포는 대상체 내의 복수의 세포인, 방법.
[102] 실시형태 [1] 내지 [101] 중 어느 한 실시형태에 있어서, 대상체는 동물인, 방법.
[103] 실시형태 [1] 내지 [102] 중 어느 한 실시형태에 있어서, 대상체는 포유동물인, 방법.
[104] 실시형태 [1] 내지 [103] 중 어느 한 실시형태에 있어서, 대상체는 인간인, 방법.
[105] 실시형태 [1] 내지 [104] 중 어느 한 실시형태에 있어서, 원형 폴리리보뉴클레오티드가 발현 서열의 3' 말단에 스태거 요소를 추가로 포함하며, 종결 요소를 결여하는, 방법.
[106] 실시형태 [105]에 있어서, 스태거 요소는 상기 원형 폴리리보뉴클레오티드의 회전환 번역 동안 리보솜을 고착시키는, 방법.
[107] 실시형태 [105] 또는 [106]에 있어서, 상기 스태거 요소는 D(V/I)ExNPGP인 C-말단 공통 서열을 갖는 서열을 인코딩하며, x는 임의의 아미노산인, 방법.
[108] 실시형태 [1] 내지 [107] 중 어느 한 실시형태에 있어서, 원형 폴리리보뉴클레오티드가 내부 리보솜 유입 부위, 폴리-A 테일, 복제 요소 또는 그의 임의의 조합을 결여한 방법.
[109] 실시형태 [1] 내지 [108] 중 어느 한 실시형태에 있어서, 하나 이상의 발현 서열은 코작 개시 서열을 포함하는, 조성물.
[110] 실시형태 [1] 내지 [109] 중 어느 한 실시형태에 있어서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는
a) 엔크립토겐;
b) 스태거 요소;
c) 조절 요소;
d) 복제 요소; 및
f) 준-이중-가닥 이차 구조. 로부터 선택되는 적어도 하나의 구조적 요소를 추가로 포함하는, 방법.
[111] 실시형태 [1] 내지 [110] 중 어느 한 실시형태에 있어서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는
(i) 선형 대응물보다 더 큰 번역 효율;
(ii) 다수의 번역 생성물의 화학량론적 번역 효율;
(iii) 엔크립토겐을 결여한 대응물보다 더 적은 면역원성;
(iv) 선형 대응물에 비하여 증가된 반감기; 및
(v) 세포 분열 동안의 지속성으로부터 선택되는 적어도 하나의 기능적 특징을 포함하는, 방법.
[112] 실시형태 [105]에 있어서, 종결 요소는 정지 코돈을 포함하는, 방법.
[113] 실시형태 [1] 내지 [112] 중 어느 한 실시형태에 있어서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 상기 원형 폴리리보뉴클레오티드의 자가-복제를 매개하도록 구성된 복제 도메인을 추가로 포함하는, 방법.
[114] 실시형태 [1] 내지 [113] 중 어느 한 실시형태에 있어서, 상기 원형 폴리리보뉴클레오티드는 세포 분열 동안 지속되는, 방법.
[115] 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 후의 대상체에서의 반응 수준과 비교하여 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 대상체에게 제공한 후의 대상체에서의 소정의 반응 수준의 유도 방법으로서,
소정의 반응 수준을 유도하는, 단백질을 인코딩하는 및/또는 결합 부위를 포함하는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물을 대상체에게 제공하는 단계로서, 대상체가 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물을 제공한 후에 소정의 반응 수준을 포함하는 단계; 및
단백질을 인코딩하는 및/또는 결합 부위를 포함하는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 제1 조성물 이후에 대상체에게 제공하는 단계로서, 대상체가 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 제공한 후에 최소한의 반응 수준을 포함하는 단계를 포함하며,
그럼으로써 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 후의 대상체에서의 반응 수준과 비교하여 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 후에 대상체에서 소정의 반응 수준의 발현을 유지하는, 방법.[116] 대상체에서의 소정의 반응 수준의 유도 방법으로서,
(a) 반응을 유도하는, 단백질을 인코딩하는 및/또는 결합 부위를 포함하는 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제1 조성물을 대상체에게 제공하는 단계; 및
(b) 단계 (a) 이후 6시간째 내지 90일째에, 단백질을 인코딩하는 및/또는 결합 부위를 포함하는 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제2 조성물을 대상체에게 제공하는 단계를 포함하며,
그럼으로써 제1 조성물을 제공한 후에, 그리고 제2 조성물을 제공한 후에 대상체에서 반응을 유도하는, 방법.
[117] 대상체에서의 소정의 반응 수준의 유도 방법으로서,
(a) 반응을 유도하는, 단백질을 인코딩하는 및/또는 결합 부위를 포함하는 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제1 조성물을 대상체에게 제공하는 단계로서, 반응이 제1 수준으로 존재하는 단계; 및
(b) 단계 (a) 이후 6시간째 내지 90일째에, 반응을 유도하는, 단백질을 인코딩하는 및/또는 결합 부위를 포함하는 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제2 조성물을 대상체에게 제공하는 단계를 포함하는, 방법.
[118] 실시형태 [115] 내지 [117] 중 어느 한 실시형태에 있어서, 단백질이 에리트로포이에틴인 방법.
[119] 실시형태 [115] 내지 [118] 중 어느 한 실시형태에 있어서, 반응이 적혈구를 생성하는 것이거나, 반응 수준이 생성되는 적혈구의 수준인 방법.
실시예
하기의 실시예는 본 발명의 일부 실시형태를 추가로 예시하기 위해 제공되지만, 본 발명의 범주를 제한하고자 하지 않으며; 당업자에게 알려져 있는 다른 절차, 방법 또는 기법이 대안적으로 사용될 수 있다는 것이 그들의 예시적인 성질에 의해 이해될 것이다.
실시예 1: 생체내에서 투여되고, 더 긴 반감기/증가된 안정성을 나타내는 원형 RNA
이 실시예는 원형 RNA를 전달하는 능력 및 생체내에서 선형 RNA에 비하여 원형 RNA의 증가된 안정성을 보여준다.
이 실시예에 있어서, 나노루시퍼라제(Nluc)를 인코딩하는 ORF 및 스태거 서열과 함께 EMCV IRES를 포함하도록 원형 RNA를 설계하였다(EMCV 2A 3XFLAG Nluc 2A no stop 및 EMCV 2A 3XFLAG Nluc 2A stop). 원형 RNA를 시험관내에서 생성하였다.
Balb/c 마우스에 Nluc ORF를 갖는 원형 RNA 또는 대조군으로서 선형 RNA를 정맥내(IV) 꼬리 정맥 투여를 통해 주사하였다. 제조업체의 설명에 따라 지질-기반의 트랜스펙션 시약(미루스) 중에 제형화된 단회 용량의 5 ㎍의 RNA를 동물에게 제공하였다.
마우스를 희생시키고, 투여 후 3일째, 4일째 및 7일째에 간을 수집하였다(n = 2마리 마우스/시점). 간을 수집하고, RNA 안정화 시약(인비트로겐)에서 보관하였다. 조직을 마이크로 튜브 균질화기(피셔 사이언티픽)를 사용하여 RIPA 완충제 중에 균질화시키고, RNA를 cDNA 합성을 위한 페놀-기반의 RNA 추출 시약을 사용하여 추출하였다. qPCR을 사용하여 간 내의 선형 및 원형 RNA 둘 모두의 존재를 측정하였다.
조직 내의 RNA 검출을 qPCR에 의해 수행하였다. 선형 및 원형 RNA를 검출하기 위해, Nluc ORF를 증폭시키는 프라이머를 사용하였다. (F: AGATTTCGTTGGGGACTGGC, R: CACCGCTCAGGACAATCCTT). 오직 원형 RNA만을 검출하기 위해, 5'-3' 연접부를 증폭시키는 프라이머는 원형 RNA 구축물의 검출을 가능하게 하였지만, 선형 RNA 구축물의 검출을 가능하게 하지 않았다(F: CTGGAGACGTGGAGGAGAAC, R: CCAAAAGACGGCAATATGGT).
원형 RNA는 주사 후 3일째, 4일째 및 7일째에 마우스의 간에서 선형 RNA보다 더 높은 수준으로 검출되었다(도 1). 따라서, 원형 RNA를 투여하였으며, 투여 후 적어도 7일 동안 생체내에서 검출 가능하였다.
실시예 2: 원형 RNA의 생체내 발현, 반감기 및 비-면역원성
이 실시예는 생체내에서 원형 RNA로부터의 발현을 유도하는 능력을 보여준다. 그것은 선형 RNA에 비하여 원형 RNA의 증가된 반감기를 보여준다. 마지막으로, 이는 원형 RNA가 생체내에서 비-면역원성이도록 조작되었음을 보여준다.
이 실시예에 있어서, 원형 RNA는 CVB3 IRES, 가우시아 루시퍼라제(GLuc)를 인코딩하는 ORF, 및 IRES-ORF에 측접한 2개의 스페이서 요소를 포함하였다.
원형 RNA를 시험관내에서 생성하였다. 전사를 유도하기 위한 T7 RNA 폴리머라제 프로모터뿐만 아니라, 상기 열거된 모든 모티프를 포함하는 DNA 주형으로부터 미변형된 선형 RNA를 시험관내 전사하였다. 전사된 RNA를 제조업체의 설명에 따라 RNA 클린업 키트(뉴 잉글랜드 바이오랩스, T2050)로 정제하고, RNA 5'-포스포하이드롤라제(RppH)(뉴 잉글랜드 바이오랩스, M0356)로 처리하고, RNA 정제 컬럼으로 다시 정제하였다. RppH 처리된 RNA를 스플린트 DNA(GTCAACGGATTTTCCCAAGTCCGTAGCGTCTC) 및 T4 RNA 리가제 2(뉴 잉글랜드 바이오랩스, M0239)를 사용하여 원형화시켰다. 원형 RNA를 우레아-PAGE 정제하고, 완충제(0.5 M 아세트산나트륨, 0.1% SDS, 1 mM EDTA) 중에 용리시키고, 에탄올 침전시키고, RNase 부재의 물 중에 재현탁시켰다.
마우스에 가우시아 루시퍼라제 ORF를 갖는 원형 RNA 또는 대조군으로서 선형 RNA 2.5 ㎍의 단일의 꼬리 정맥 주사 용량을 제공하였으며, 둘 모두 담체로서 지질-기반의 트랜스펙션 시약(미루스) 중에 제형화하였다.
혈액 시료(50 ㎕)를 투여 후 1일째, 2일째, 7일째, 11일째, 16일째 및 23일째에 각 마우스의 꼬리-정맥으로부터 EDTA 튜브 내로 수집하였다. 혈장을 1300 g, 4℃에서 25분 동안의 원심분리에 의해 단리하고, 분비 효소인 가우시아 루시퍼라제의 활성을 가우시아 루시퍼라제 활성 검정(써모 사이언티픽 피어스)을 사용하여 시험하였다. 50 ㎕의 1X GLuc 기질을 5 ㎕의 혈장에 첨가하여, GLuc 루시퍼라제 활성 검정을 수행하였다. 혼합한 직후에 발광계 기기(프로메가)에서 플레이트를 판독하였다.
가우시아 루시퍼라제 활성은 원형 RNA의 투여 후 1일째, 2일째, 7일째, 11일째, 16일째 및 23일째에 혈장에서 검출되었다(도 2a 및 도 2b).
대조적으로, 가우시아 루시퍼라제 활성은 오직 변형된 선형 RNA의 투여 후 1일째 및 2일째에만 혈장에서 검출되었다. 선형 RNA 유래 단백질로부터의 효소 활성은 6일째 또는 그 이후에 백그라운드 수준을 초과하여 검출되지 않았다(도 2a 및 도 2b).
16일째에, 간을 3마리의 동물로부터 절제하고, 전체 RNA를 페놀-기반의 추출 시약(인비트로겐)을 사용하여 세포로부터 단리하였다. 전체 RNA(500 ng)를 역전사 처리하여, cDNA를 생성하였다. qRT-PCR 분석을 염료-기반의 정량적 PCR 믹스(바이오라드)를 사용하여 수행하였다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 원형 RNA의 qRT-PCR 수준이 제16일째에 간 및 비장 둘 모두에서 검출되었지만, 선형 RNA는 그렇지 않았다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 제16일째에 담체 트랜스펙션된 동물에 비하여 선형 RNA로 트랜스펙션된 간으로부터의 면역 관련 유전자는 RIG-I, MDA5, IFN-B 및 OAS의 발현 증가를 보였지만, 원형 RNA로 트랜스펙션된 간은 이들 마커의 발현 증가 RIG-I, MDA5, PKR 및 IFN-베타를 보이지 않았다. 따라서, 수여자 세포 내의 면역원성 관련 유전자의 유도는 트랜스펙션된 간으로부터 원형 RNA에 존재하지 않았다.
이 실시예는 주사 후 다수의 날에서의 혈장 중 단백질 활성의 수준을 사용하여, 연장된 기간 동안 생체내에서 원형 RNA가 단백질을 발현하였음을 보여주었다. 마우스 혈장에서의 가우시안 루시퍼라제(Gaussian Luciferase)의 반감기가 약 20분인 것을 고려해볼 때(문헌[Tannous, Nat Protoc., 2009, 4(4):582-591] 참조), 유사한 수준의 활성은 원형 RNA로부터의 연속 발현을 나타낸다. 추가로, 원형 RNA는 면역 관련 유전자를 유도하지 않고, 그의 변형된 선형 RNA 대응물보다 더 긴 발현 프로파일을 나타내었다.
실시예 3: 원형 RNA의 생체내 재투여
본 실시예는 원형 RNA의 2회 투여량을 사용하여 생체내에서 원형 RNA로부터의 발현을 유도하는 능력을 보여준다.
이 실시예에 있어서, 원형 RNA는 EMCV IRES, 가우시아 루시퍼라제(GLuc)를 인코딩하는 ORF, 및 IRES-ORF에 측접한 2개의 스페이서 요소를 포함하였다.
원형 RNA를 시험관내에서 생성하였다. 전사를 유도하기 위한 T7 RNA 폴리머라제 프로모터뿐만 아니라, 상기 열거된 모든 모티프를 포함하는 DNA 주형으로부터 미변형된 선형 RNA를 시험관내 전사하였다. 전사된 RNA를 제조업체의 설명에 따라 모나크 RNA 클린업 키트(뉴 잉글랜드 바이오랩스, T2050)로 정제하고, RNA 5'-포스포하이드롤라제(RppH)(뉴 잉글랜드 바이오랩스, M0356)로 처리하고, 모나크 RNA 클린업 시스템으로 다시 정제하였다. RppH 처리된 RNA를 스플린트 DNA(GTTTTTCGGCTATTCCCAATAGCCGTTTTG) 및 T4 RNA 리가제 2(뉴 잉글랜드 바이오랩스, M0239)를 사용하여 원형화시켰다. 원형 RNA를 우레아-PAGE 정제하고, 완충제(0.5 M 아세트산나트륨, 0.1% SDS, 1 mM EDTA) 중에 용리시키고, 에탄올 침전하고, RNA 보관 용액(써모피셔 사이언티픽, 카탈로그 번호 AM7000) 중에 재현탁화시켰다.
마우스에 가우시아 루시퍼라제 ORF를 갖는 원형 RNA 또는 대조군으로서 선형 RNA 0.25 ㎍의 단일의 꼬리 정맥 주사 용량을 제공하였으며, 0일째에 둘 모두 담체로서 지질-기반의 트랜스펙션 시약(미루스) 중에 제형화하였고, 투여 후 56일째에 2차 투약을 실시했다.
혈액 시료(50 ㎕)를 투여 후 1일째, 2일째, 7일째, 11일째, 16일째 및 23일째에 각 마우스의 꼬리-정맥으로부터 EDTA 튜브 내로 수집하였다. 혈장을 1300 g, 4℃에서 25분 동안의 원심분리에 의해 단리하고, 분비 효소인 가우시아 루시퍼라제의 활성을 가우시아 루시퍼라제 활성 검정(써모 사이언티픽 피어스)을 사용하여 시험하였다. 50 ㎕의 1X GLuc 기질을 5 ㎕의 혈장에 첨가하여, GLuc 루시퍼라제 활성 검정을 수행하였다. 혼합한 직후에 발광측정 기기(프로메가)에서 플레이트를 판독하였다.
가우시아 루시퍼라제 활성은 원형 RNA의 제1 용량의 투약 후 1일째, 2일째, 7일째, 11일째, 16일째, 및 23일째에 혈장에서 다시 검출되었다(도 5).
대조적으로, 가우시아 루시퍼라제 활성은 오직 변형된 선형 RNA(도 5)의 투여 후 1일째 및 2일째에만 혈장에서 검출되었다.
가우시아 루시퍼라제 활성은 원형 RNA의 제2 투여 후 6시간째 및 2일째, 3일째, 8일째 및 15일째에 혈장에서 다시 검출되었다(도 5).
대조적으로, 가우시아 루시퍼라제 활성은 오직 변형된 선형 RNA의 투여 후 1일째, 2일째, 3일째에만 혈장에서 검출되었다.
이 실시예는 주사 후 다수의 날에서의 혈장 중 단백질 활성의 수준을 사용하여, 연장된 기간 동안 생체내에서 원형 RNA가 단백질을 발현하였음을 보여주었다. 또한, 이는 원형 RNA의 투여가 유사한 발현 프로파일을 초래하는 것을 보여준다.
실시예 4: 원형 RNA의 생체내 시차 투약
본 실시예는 원형 RNA의 연속적 시차 투약을 사용하여 생체내에서 원형 RNA로부터 더 높은 발현을 유도하는 능력을 보여준다.
이 실시예에 있어서, 원형 RNA는 EMCV IRES, 가우시아 루시퍼라제(GLuc)를 인코딩하는 ORF, 및 IRES-ORF에 측접한 2개의 스페이서 요소를 포함하였다.
원형 RNA를 시험관내에서 생성하였다. 전사를 유도하기 위한 T7 RNA 폴리머라제 프로모터뿐만 아니라, 상기 열거된 모든 모티프를 포함하는 DNA 주형으로부터 미변형된 선형 RNA를 시험관내 전사하였다. 전사된 RNA를 제조업체의 설명에 따라 RNA 클린업 키트(뉴 잉글랜드 바이오랩스, T2050)로 정제하고, RNA 5'-포스포하이드롤라제(RppH)(뉴 잉글랜드 바이오랩스, M0356)로 처리하고, RNA 정제 컬럼으로 다시 정제하였다. RppH 처리된 RNA를 스플린트 DNA(GTCAACGGATTTTCCCAAGTCCGTAGCGTCTC) 및 T4 RNA 리가제 2(뉴 잉글랜드 바이오랩스, M0239)를 사용하여 원형화시켰다. 원형 RNA를 우레아-PAGE 정제하고, 완충제(0.5 M 아세트산나트륨, 0.1% SDS, 1 mM EDTA) 중에 용리시키고, 에탄올 침전시키고, RNase 부재의 물 중에 재현탁시켰다.
마우스에 가우시아 루시퍼라제 ORF를 갖는 원형 RNA 또는 대조군으로서 선형 RNA 0.25 pmol의 꼬리 정맥 주사 용량을 제공하였으며, 0일째, 2일째, 그리고 5일째에 둘 모두 담체로서 지질-기반의 트랜스펙션 시약(미루스) 중에 제형화하였다.
혈액 시료(50 ㎕)를 투여 후 6시간째, 1일째, 2일째, 3일째, 5일째, 7일째, 14일째, 21일째, 28일째, 35일째, 42일째에 각 마우스의 꼬리-정맥으로부터 EDTA 튜브 내로 수집하였다. 혈장을 1300 g, 4℃에서 25분 동안의 원심분리에 의해 단리하고, 가우시아 루시퍼라제, 분비된 효소의 활성을 가우시아 루시퍼라제 활성 검정(써모 사이언티픽 피어스)을 사용하여 시험하였다. 50 ㎕의 1X GLuc 기질을 5 ㎕의 혈장에 첨가하여, GLuc 루시퍼라제 활성 검정을 수행하였다. 혼합한 직후에 발광계 기기(프로메가)에서 플레이트를 판독하였다.
가우시아 루시퍼라제 활성은 원형 RNA의 단일 용량의 투약 후 6시간, 1, 2, 3, 5, 7, 14, 21, 28일째에 혈장에서 다시 검출되었다(도 6 및 도 7). 가우시아 루시퍼라제 활성은 원형 RNA의 제1 용량(3회 용량으로 투약한 경우)의 투약 후 6시간, 1, 2, 3, 5, 7, 14, 21, 28, 35일째에 혈장에서 다시 검출되었다(도 6 및 도 7).
대조적으로, 가우시아 루시퍼라제 활성은 오직 변형된 선형 RNA의 투여 후 6시간째, 1일째, 2일째, 3일째에만 혈장에서 검출되었으며 발현 수준은 초기 투여때보다 증가되지 않았다. 선형 RNA 유래 단백질로부터의 효소 활성은 추가의 선형 RNA가 투여되었음에도 불구하고 x일째 또는 그 이후에 백그라운드 수준을 초과하여 검출되지 않았다(도 6 및 도 7).
이 실시예는 다회 주사 후 혈장 중 단백질 활성의 증가된 수준을 사용하여, 연장된 기간 동안 생체내에서 원형 RNA가 단백질을 발현하였음을 보여주었다. 또한, 이는 원형 RNA의 반복 투여가 발현을 초래하지만, 선형 RNA는 그렇지 않음을 보여준다.
실시예 5: 정맥내 전달을 통한 원형 RNA의 네이키드(naked) 및 담체 투여 및 재투여
본 실시예는 정맥내 투여된 원형의 2회 투여량을 사용하여 생체내에서 원형 RNA로부터의 발현을 유도하는 능력을 보여준다.
이 실시예에 있어서, 원형 RNA는 EMCV IRES, 가우시아 루시퍼라제(GLuc)를 인코딩하는 ORF, 및 IRES-ORF에 측접한 2개의 스페이서 요소를 포함하였다.
원형 RNA를 시험관내에서 생성하였다. 전사를 유도하기 위한 T7 RNA 폴리머라제 프로모터뿐만 아니라, 상기 열거된 모든 모티프를 포함하는 DNA 주형으로부터 미변형된 선형 RNA를 시험관내 전사하였다. 전사된 RNA를 제조업체의 설명에 따라 모나크 RNA 클린업 키트(뉴 잉글랜드 바이오랩스, T2050)로 정제하고, RNA 5'-포스포하이드롤라제(RppH)(뉴 잉글랜드 바이오랩스, M0356)로 처리하고, 모나크 RNA 클린업 시스템으로 다시 정제하였다. RppH-처리된 RNA를 스플린트 DNA(GTTTTTCGGCTATTCCCAATAGCCGTTTTG) 및 T4 RNA 리가제 2(뉴 잉글랜드 바이오랩스, M0239)를 사용하여 원형화시켰다. 원형 RNA를 우레아-PAGE 정제하고, 완충제(0.5 M 아세트산나트륨, 0.1% SDS, 1 mM EDTA) 중에 용리시키고, 에탄올 침전하고, RNA 보관 용액(써모피셔 사이언티픽, 카탈로그 번호 AM7000) 중에 재현탁화시켰다.
본 실시예에서, 변형된 mRNA를 트릴링크 바이오테크놀로지즈(Trilink Biotechnologies)에 의해 맞춤 합성하였으며, 상기 열거된 모든 모티프를 포함하였다. 본 실시예에서, RNA를 슈도-우리딘 및 5-메틸-C로 완전히 치환하고, 클린캡™ AG를 사용하여 캡핑하고, 폴리아데닐화한다(120A).
비제형화된 RNA를 생성하기 위하여, 원형 RNA 및 mRNA를 이어서 100 μL의 PBS 중에 0.25 피코몰의 최종 농도로 희석하였다.
원형 RNA 및 mRNA를 또한 양이온성 지질 담체를 사용하여 제형화하였다. 본 실시예에서, 15% TransIT(미루스 바이오(Mirus Bio)) 및 7.5% 부스트(Boost)를 제조처의 설명에 따라 RNA와 복합체화하였다.
각각의 제형에서 0.25 피코몰의 용량의 가우시아 루시퍼라제 ORF를 갖는 원형 RNA의 단일의 꼬리 정맥 주사를 마우스에 제공하였다. 주사를 제0일에 수행하였으며, 제2 용량을 제49일에 투여하였다. 비히클은 대조군으로서만 쓰였다.
혈액 시료(50 ㎕)를 투여 후 1일째, 2일째, 7일째, 11일째, 16일째 및 23일째에 EDTA 튜브 내로 턱밑 천자에 의해 수집하였다. 혈장을 1300 g, 4℃에서 25분 동안의 원심분리에 의해 단리하고, 분비 효소인 가우시아 루시퍼라제의 활성을 가우시아 루시퍼라제 활성 검정(써모 사이언티픽 피어스)을 사용하여 시험하였다. 50 ㎕의 1X GLuc 기질을 5 ㎕의 혈장에 첨가하여, GLuc 루시퍼라제 활성 검정을 수행하였다. 혼합한 직후에 발광측정 기기(프로메가)에서 플레이트를 판독하였다.
가우시아 루시퍼라제 활성은 제1 용량의 미제형화된 및 TransIT-제형화된 원형 RNA 둘 모두의 투여 후 1일째, 2일째, 7일째, 11일째, 16일째 및 23일째에 혈장에서 검출되었다(도 8).
대조적으로, 가우시아 루시퍼라제 활성은 미제형화된 및 TransIT-제형화된 변형 mRNA 둘 모두의 투여 후 1일째, 그리고 2일째에만 혈장에서 검출되었다(도 8).
가우시아 루시퍼라제 활성은 제2 용량의 미제형화된 및 TransIT-제형화된 원형 RNA 둘 모두의 투여 후 1일째, 2일째, 3일째, 8일째, 14일째 및 21일째에 혈장에서 검출되었다(도 8).
대조적으로, 가우시아 루시퍼라제 활성은 미제형화된 및 TransIT-제형화된 변형 mRNA 둘 모두의 투여 후 1일째, 2일째, 3일째에만 혈장에서 검출되었다(도 8).
각각의 경우에, 가우시아 루시퍼라제 활성은 비히클 단독 대조군보다 더 컸다.
본 실시예는 주사 후 다수의 날에 혈장 중 단백질 활성의 수준을 사용하여, 담체 사용 및 미사용으로 정맥내 투여된 원형 RNA가 연장된 기간 동안 생체내에서 단백질을 발현하였음을 보여주었다. 또한, 이는 원형 RNA의 투여가 유사한 발현 프로파일을 초래하는 것을 보여준다.
실시예 6: 근육내 주사를 통한 원형 RNA의 네이키드 투여 및 재투여
본 실시예는 근육내 투여된 원형의 2회 투여량을 사용하여 생체내에서 원형 RNA로부터의 발현을 유도하는 능력을 보여준다.
이 실시예에 있어서, 원형 RNA는 EMCV IRES, 가우시아 루시퍼라제(GLuc)를 인코딩하는 ORF, 및 IRES-ORF에 측접한 2개의 스페이서 요소를 포함하였다.
실시예 5에 기재된 바와 같이 원형 RNA 및 mRNA를 생성한다.
미제형화된 RNA를 생성하기 위하여, 원형 RNA 및 mRNA를 이어서 100 μL의 PBS 중에 2.5 피코몰의 최종 농도로 희석하였다.
마우스에는 2.5 피코몰 용량의 가우시아 루시퍼라제 ORF를 갖는 원형 RNA의 뒷다리로의 단일의 근육내 주사를 제공하였다. 주사를 제0일에 수행하였으며, 제2 용량을 제49일에 투여하였다. 비히클은 대조군으로서만 쓰였다.
혈액 시료(50 ㎕)를 투여 후 1일째, 2일째, 7일째, 11일째, 16일째 및 23일째에 EDTA 튜브 내로 턱밑 천자에 의해 수집하였다. 혈장을 1300 g, 4℃에서 25분 동안의 원심분리에 의해 단리하고, 분비 효소인 가우시아 루시퍼라제의 활성을 가우시아 루시퍼라제 활성 검정(써모 사이언티픽 피어스)을 사용하여 시험하였다. 50 ㎕의 1X GLuc 기질을 5 ㎕의 혈장에 첨가하여, GLuc 루시퍼라제 활성 검정을 수행하였다. 혼합한 직후에 발광측정 기기(프로메가)에서 플레이트를 판독하였다.
가우시아 루시퍼라제 활성은 미제형화된 원형 RNA의 제1 용량의 투약 후 1일째, 2일째, 7일째, 11일째, 16일째, 및 23일째에 혈장에서 다시 검출되었다. (도 9)
대조적으로, 가우시아 루시퍼라제 활성은 오직 미제형화된 mRNA의 투여 후 1일째 및 2일째에만 혈장에서 검출되었다. (도 9)
가우시아 루시퍼라제 활성은 미제형화된 원형 RNA의 제2 투여 후 6시간째 및 2일째, 3일째, 8일째 및 15일째에 혈장에서 다시 검출되었다. (도 9)
대조적으로, 가우시아 루시퍼라제 활성은 오직 미제형화된 변형된 mRNA의 투여 후 1일째, 2일째, 3일째에만 혈장에서 검출되었다. (도 9)
각각의 경우에, 가우시아 루시퍼라제 활성은 비히클 단독 대조군보다 더 컸다.
이 실시예는 주사 후 다수의 날에서의 혈장 중 단백질 활성의 수준을 사용하여, 담체 없이 근육내 투여된 원형 RNA가 연장된 기간 동안 생체내에서 단백질을 발현하였음을 보여주었다. 또한, 이는 원형 RNA의 투여가 유사한 발현 프로파일을 초래하는 것을 보여준다.
실시예 7: 5회 반복된 정맥내 주사를 통한 원형 RNA의 담체 재투여는 작용성 단백질의 발현을 초래한다
본 실시예는 정맥내 투여된 원형 RNA의 5회 투여량을 사용하여 생체내에서 원형 RNA로부터의 발현을 유도하는 능력을 보여준다.
이 실시예에 있어서, 원형 RNA는 EMCV IRES, 가우시아 루시퍼라제(GLuc)를 인코딩하는 ORF, 및 IRES-ORF에 측접한 2개의 스페이서 요소를 포함하였다.
실시예 5에 기재된 바와 같이 원형 RNA 및 mRNA를 생성한다.
원형 RNA 및 mRNA를 양이온성 지질 담체를 사용하여 제형화하였다. 본 실시예에서, 10% TransIT(미루스 바이오) 및 5% 부스트를 제조처의 설명에 따라 RNA와 복합체화하였다.
마우스에 가우시아 루시퍼라제 ORF를 포함하는 원형 RNA의 0.25 피코몰의 단일의 꼬리 정맥 주사 용량을 제공하였다. 주사를 제0일, 제71일, 제120일, 제196일 및 제359일에 수행하였다. 비히클은 대조군으로서만 쓰였다.
혈액 시료(50 ㎕)를 투여 후 0.25일째, 1일째, 2일째, 3일째, 7일째, 14일째, 21일째, 28일째 및 35일째에 EDTA 튜브 내로 턱밑 천자에 의해 수집하였다. 혈장을 1300 g, 4℃에서 25분 동안의 원심분리에 의해 단리하고, 분비 효소인 가우시아 루시퍼라제의 활성을 가우시아 루시퍼라제 활성 검정(써모 사이언티픽 피어스)을 사용하여 시험하였다. 50 ㎕의 1X GLuc 기질을 5 ㎕의 혈장에 첨가하여, GLuc 루시퍼라제 활성 검정을 수행하였다. 혼합한 직후에 발광측정 기기(프로메가)에서 플레이트를 판독하였다.
Trans-IT 제형화된 원형 RNA를 투여하는 경우, 가우시아 루시퍼라제 활성은 제1 용량의 투여 후 1일째, 2일째, 3일째, 7일째, 14일째, 21일째 및 28일째; 제2 용량의 투여 후 1일째, 2일째, 3일째, 7일째, 14일째 및 21일째; 제3 용량의 투여 후 1일째, 2일째, 3일째, 7일째, 14일째 및 21일째; 제4 용량의 투여 후 1일째, 2일째, 3일째, 7일째, 14일째, 21일째 및 28일째; 및 제5 용량의 투여 후 1일째, 2일째, 3일째, 7일째, 14일째 및 21일째에 혈장에서 검출되었다. (도 10)
대조적으로, Trans-IT 제형화돤 변형 mRNA를 투여하는 경우, 가우시아 루시퍼라제 활성은 제1 용량의 투여 후 0.25일째, 1일째 및 2일째; 제2 용량의 투여 후 0.25일째, 1일째 및 2일째; 제3 용량의 투여 후 0.25일째, 1일째 및 2일째; 제4 용량의 투여 후 0.25일째, 1일째 및 2일째; 및 제5 용량의 투여 후 0.25일째, 1일째 및 2일째에 혈장에서 검출되었다. (도 10)
각각의 경우에, 가우시아 루시퍼라제 활성 및 이에 따라, 발현은 mRNA에 대해서보다는 원형 RNA에 대하여 더 컸다.
본 실시예는, 정맥내 투여된 원형 RNA가, 주사 후 다수의 날에서의 혈장 중 단백질 활성의 수준을 사용하여, 연장된 기간 동안 생체내에서 단백질을 발현하였으며, 적어도 5회 재투여될 수 있음을 보여주었다. 또한, 그것은 원형 RNA의 연장된 재투여가 유사한 발현 프로파일을 초래하는 것을 보여준다.
실시예 8: 담체 재투여(5X) 정맥내 - 독성
본 실시예는 1년 초과의 시간에 걸친 원형 RNA의 5회의 정맥내 투여의 비독성 효과를 보여준다.
이 실시예에 있어서, 원형 RNA는 EMCV IRES, 가우시아 루시퍼라제(GLuc)를 인코딩하는 ORF, 및 IRES-ORF에 측접한 2개의 스페이서 요소를 포함하였다.
실시예 5에 기재된 바와 같이 원형 RNA 및 mRNA를 생성한다.
원형 RNA 및 mRNA를 양이온성 지질 담체를 사용하여 제형화하였다. 본 실시예에서, 10% TransIT(미루스 바이오) 및 5% 부스트를 제조처의 설명에 따라 RNA와 복합체화하였다.
각각의 제형에서 0.25 피코몰의 용량의 가우시아 루시퍼라제를 인코딩하는 원형 RNA의 단일의 꼬리 정맥 주사를 마우스에 제공하였다. 주사를 제0일, 제71일, 제120일, 제196일 및 제359일에 수행하였다. 비히클은 대조군으로서만 쓰였다.
마우스를 제399일에 희생시켰으며, 간, 비장, 폐 및 담낭을 포르말린에서 고정하였다. 블록당 하나의 슬라이드를 절편화시키고, 헤마톡실린 및 에오신(H&E)을 사용하여 염색하였다. 유리 슬라이드를 광학 현미경을 사용하여 ACVP 위원회-인증된 수의병리학자가 평가하였다. 각각의 조직에서의 조직학적 관찰을 중증도 0 내지 5로 등급화하였으며, 여기서, 0=부재, 1=최소, 2=경도, 3=중등도, 4=현저함, 5=심각함이다.
Trans-IT 제형화된 원형 RNA를 5회 투여하는 경우, 최소의 내지 경도의 조직학적 변화가 간, 비장, 폐 및 담낭에서 관찰되었다. 거의 모든 조직병리학적 관찰(표 1)이 둘 모두의 대조군(담체 대조군 및/또는 비처리 대조군), 원형 RNA 및 mRNA 주사된 동물에 대하여 존재하였다. 모든 관찰은 시험된 RNA 독성과 관련되지 않은 백그라운드, 사후 또는 비특이적 변화와 일치하였다.
본 실시예는 원형 RNA가 조직병리학적 독성의 징후 없이 1년 넘게 반복적으로 투여될 수 있는 것을 보여주었다.
[표 1] - Trans-IT 제형화된 원형 RNA를 5회 투여하는 경우, 최소 내지 경도의 조직학적 변화가 간, 비장, 폐 및 담낭에서 관찰되었다
Figure pct00001
실시예 9: 담체 시간차 재투여(X2) - GLuc 활성
본 실시예는 연속 시간차 용량의 원형 RNA를 재투여함으로써 원형 RNA로부터 발현을 유도하는 능력을 보여준다.
이 실시예에 있어서, 원형 RNA는 EMCV IRES, 가우시아 루시퍼라제(GLuc)를 인코딩하는 ORF, 및 IRES-ORF에 측접한 2개의 스페이서 요소를 포함하였다.
실시예 5에 기재된 바와 같이 원형 RNA 및 mRNA를 생성한다.
원형 RNA 및 mRNA를 또한 양이온성 지질 담체를 사용하여 제형화하였다. 본 실시예에서, 10% TransIT(미루스 바이오) 및 5% 부스트를 제조처의 설명에 따라 RNA와 복합체화하였다.
마우스에는 0.25 피코몰의 용량의 가우시아 루시퍼라제 ORF를 갖는 제형화된 원형 RNA 및 변형된 mRNA의 단일의 꼬리 정맥 주사를 제공하였다. 주사를 뱃치(batch) 식으로 수행하였다: 제0일, 제2일 및 제5일에 제1 뱃치; 및 제71일, 제73일 및 제76일에 제2 뱃치. 비히클은 대조군으로서만 쓰였다.
혈액 시료(50 ㎕)를 투여 후 0.25일째, 1일째, 2일째, 3일째, 7일째, 14일째, 21일째, 28일째 및 35일째에 EDTA 튜브 내로 턱밑 천자에 의해 수집하였다. 혈장을 1300 g, 4℃에서 25분 동안의 원심분리에 의해 단리하고, 분비 효소인 가우시아 루시퍼라제의 활성을 가우시아 루시퍼라제 활성 검정(써모 사이언티픽 피어스)을 사용하여 시험하였다. 50 ㎕의 1X GLuc 기질을 5 ㎕의 혈장에 첨가하여, GLuc 루시퍼라제 활성 검정을 수행하였다. 혼합한 직후에 발광측정 기기(프로메가)에서 플레이트를 판독하였다.
Trans-IT 제형화된 원형 RNA를 투여하는 경우, 가우시아 루시퍼라제 활성은 뱃치 1의 제1 용량의 투여 후 1일째, 2일째, 3일째, 7일째, 14일째, 21일째, 28일째 및 35일째; 및 이어서 뱃치 2의 제1 용량의 투여 후 1일째, 2일째, 3일째, 7일째, 14일째, 21일째, 28일째 및 35일째에 혈장에서 검출되었다(도 11).
대조적으로, Trans-IT 제형화된 변형 mRNA를 투여하는 경우, 가우시아 루시퍼라제 활성은 뱃치 1의 제1 용량의 투여 후 0.25일째, 1일째, 2일째 및 3일째; 및 이어서 뱃치 2의 제1 용량의 투여 후 0.25일째, 1일째 및 2일째에 검출되었다(도 11).
가우시아 루시퍼라제 활성은 mRNA 대응물과 비교하여 원형 RNA로부터 발현되는 경우에 더 컸다.
이 실시예는 다회 연속 주사 후 혈장 중 단백질 활성의 증가된 수준을 사용하여, 연장된 기간 동안 생체내에서 원형 RNA가 단백질을 발현하였음을 보여주었다. 그것은 원형 RNA의 반복 투여가 발현을 초래하지만, 선형 RNA는 그렇지 않음을 보여준다. 또한, 그것은 원형 RNA의 연장된 재투여가 유사한 발현 프로파일을 초래하는 것을 보여준다.
실시예 10: 정맥내 투여되는 치료적으로 관련이 있는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 TransIT 투여 및 재투여
본 실시예는 정맥내 투여되는 치료적으로 관련이 있는 2회 용량의 원형 RNA를 사용하여, 생체내에서 원형 RNA로부터 발현을 유도하는 능력을 보여준다.
이 실시예에 있어서, 원형 RNA는 EMCV IRES, 에리트로포이에틴(EPO)를 인코딩하는 ORF, 및 IRES-ORF에 측접한 2개의 스페이서 요소를 포함하였다.
원형 RNA를 시험관내에서 생성하였다. 전사를 유도하기 위한 T7 RNA 폴리머라제 프로모터뿐만 아니라, 상기 열거된 모든 모티프를 포함하는 DNA 주형으로부터 미변형된 선형 RNA를 시험관내 전사하였다. 전사된 RNA를 제조업체의 설명에 따라 모나크 RNA 클린업 키트(뉴 잉글랜드 바이오랩스, T2050)로 정제하고, RNA 5'-포스포하이드롤라제(RppH)(뉴 잉글랜드 바이오랩스, M0356)로 처리하고, 모나크 RNA 클린업 시스템으로 다시 정제하였다. RppH 처리된 RNA를 스플린트 DNA(5’-GTTTTTCGGCTATTCCCAATAGCCGTTTTG-3’) 및 T4 RNA 리가제 2(뉴 잉글랜드 바이오랩스, M0239)를 사용하여 원형화시켰다. 원형 RNA를 우레아-PAGE 정제하고, 완충제(0.5 M 아세트산나트륨, 0.1% SDS, 1 mM EDTA) 중에 용리시키고, 에탄올 침전하고, RNA 보관 용액(써모피셔 사이언티픽, 카탈로그 번호 AM7000) 중에 재현탁화시켰다.
본 실시예에서, 변형된 mRNA는 원형 RNA에 인코딩된 동일한 EPO ORF 뉴클레오티드 서열에 측접한 5’ 및 3’ 글로빈 UTR을 포함하였다. mRNA 뉴클레오티드를 슈도-우리딘 및 5-메틸-C로 완전히 치환하고, 클린캡™ AG를 사용하여 캡핑하고, 폴리아데닐화시켰다(90A).
하나의 제형에서, 원형 RNA 및 mRNA를 양이온성 지질 담체를 사용하여 제형화시켰다. 본 실시예에서, 15% TransIT(미루스 바이오) 및 7.5% 부스트를 제조처의 설명에 따라 100 uL 최종 주입 부피 중에서 25 pmol RNA와 복합체화시켰다.
미제형화된 원형 RNA 및 mRNA도 또한 시험하였다. 본 실시예에서, 25 pmol의 각각의 RNA를 PBS를 사용하여 100 uL의 최종 부피로 희석시켰다.
마우스에는 제0일에 25 피코몰의 단일의 꼬리 정맥 주사 용량을 제공하였으며, 제2 용량을 제79일에 투여하였다. 비히클은 대조군으로서만 쓰였다.
혈액 시료(40 uL)를 제1 투여 후 1일째, 2일째, 3일째, 5일째, 7일째, 21일째, 28일째 및 35일째 및 제2 투여 후 1일째, 2일째, 3일째, 5일째 및 7일째에, 마우스 꼬리로부터 EDTA 튜브 내로 수집하였다. 전혈을 레틱-카운트(Retic-Count) 시약(BD)을 사용하여 30분 동안 염색하고, 유세포측정기 상에서 획득하였다. 분석은 50000개의 이벤트가 획득된 전방 산란(FSC) 대 측면 산란(SSC) 게이트 내에 속하는 적혈구(RBC) 집단으로 제한되었다. 망상적혈구는 전체 RBC 집단에서 양으로 염색된 세포의 백분율로서 기록된다.
증가된 수의 망상적혈구가 제1 용량의 투여 후 3일째, 5일째, 7일째, 14일째, 21일째 및 28일째에 전혈에서 검출되었으며, 이후에 망상적혈구 계수는 본 발명자들의 마우스 집단에서 다시 3 내지 5%의 정상 범위로 되었다(미제형화에 대해서는 도 12, 및 TransIT-제형화에 대해서는 도 13).
비히클 단독 대조군과 비교하여 TransIT로 제형화되는 경우, 제2 용량의 투여 후에 망상적혈구 계수의 증가가 원형 RNA 투여 및 mRNA 투여에 대하여 검출되었다. 이 증가는 치료적으로 관련이 있는 EPOGEN 용량과 비교하여 mRNA 및 원형 RNA 둘 모두에 대하여 더 크고 더욱 지속적이었으며; 상기 증가는 mRNA 투여에 대해서보다는 원형 RNA에 대하여 더 크고 더욱 지속적이었다(도 14).
또한, 제2 용량의 투여 후에, 비히클 단독 대조군과 비교하여 미제형화되는 경우에 망상적혈구 계수의 증가가 원형 RNA 투여 및 mRNA 투여에 대하여 검출되었다. 제5일 및 제7일에, 원형 RNA 및 mRNA에 의해 유도되는 망상적혈구 계수는 치료적으로 관련이 있는 EPOGEN 용량보다 더 컸으며, 이는 더욱 지속적인 치료적 효과를 보여준다(도 15). 원형 RNA에 의해 유도되는 치료적 효과는 mRNA의 치료적 효과보다 더 크다.
본 실시예는 hEPO를 코딩하는 원형 RNA가 등가의 용량의 mRNA에 대하여 관찰되는 상기 생물학적 효과를 유도하는 것을 보여준다. 각각의 처리에 대한 반응의 세기는 제1 용량과 제2 용량 간에 매우 유사하며, 원형 RNA에 있어서 대략 25%이며, mRNA에 있어서 18 내지 20%이다.
본 실시예는 담체와 함께 정맥내 투여된 치료적으로 관련이 있는 ORF를 인코딩하는 원형 RNA가 연장된 기간 동안 생체 내에서 단백질을 발현하여, 주사 후 다수의 일 동안 생리학적 효과가 관찰되게 하는 것을 입증한다. 또한, 이는 원형 RNA의 투여가 유사한 발현 프로파일을 초래하는 것을 보여준다.
실시예 11: 시험관내 원형 RNA 생성
본 실시예는 원형 RNA의 시험관내 생성을 기술한다.
도 16에 나타낸 출발-코돈(SEQ ID NO: 1), ORF(들)(SEQ ID NO: 2), 스태거 요소(들)(SEQ ID NO: 3), 엔크립토겐(들)(SEQ ID NO: 4) 및 IRES(SEQ ID NO: 5)를 갖는 원형 RNA를 설계한다. 원형화는 회전환 번역을 가능하게 하며, 다수의 오픈 리딩 프레임(ORF)은 불연속 ORF 발현 및 제어된 단백질 화학량론을 위해 대안적인 스태거 요소를 가지며, 엔크립토겐(들)은 RNA 면역원성을 약화시키거나 완화시키기 위한 것이며, RNA를 표적화하는 선택적인 IRES는 폴리-A 서열이 없는 리보솜 진입을 위한 것이다.
본 실시예에서, 원형 RNA를 하기와 같이 생성한다. 미변형된 선형 RNA를 5'- 및 3'- ZKSCAN1 인트론, 및 2A 서열에 연결된 GFP를 인코딩하는 ORF를 갖는 DNA 세그먼트로부터 T7 RNA 폴리머라제를 사용하여 시험관내 전사에 의해 합성한다. 전사된 RNA를 RNA 정제 시스템(퀴아젠(QIAGEN))으로 정제하고, 제조처의 지침에 따라 알칼리성 포스파타제(써모피셔 사이언티픽(ThermoFisher Scientific), EF0652)로 처리하고, RNA 정제 시스템으로 다시 정제한다.
스플린트 라이게이션 원형 RNA를 T4 DNA 리가제(뉴 잉글랜드 바이오, 인코포레이티드(New England Bio, Inc.), M0202M)를 사용한 전사된 선형 RNA 및 DNA 스플린트의 처리에 의해 생성하고, RNase R 처리로 농축한 후에 원형 RNA를 단리한다. RNA 품질을 아가로스 겔에 의해 또는 자동화 전기영동(아질런트(Agilent))을 통해 평가한다.
실시예 12: 생체내 원형 RNA 생성, 세포 배양
본 실시예는 원형 RNA의 생체내 생성을 기술한다.
GFP(SEQ ID NO: 2)를 발현 벡터, 예를 들어, pcDNA3.1(+)(애드진(Addgene))(SEQ ID NO: 6) 내로 클로닝한다. 이러한 벡터를 돌연변이유발하여 세포에서 원형 RNA 생성을 유도하며(SEQ ID NO: 6 및 문헌[Kramer et al 2015]에 기술됨), 도 17에 나타나 있다.
HeLa 세포를 페니실린-스트렙토마이신 및 10% 우태아혈청이 보충된 고 글루코스를 갖는 둘베코 변형 이글스 배지(DMEM)(라이프 테크놀로지즈)에서 37℃ 및 5% CO2에서 성장시킨다. 1 마이크로그램의 상기 기술된 발현 플라스미드를 지질 트랜스펙션 시약(라이프 테크놀로지즈)을 사용하여 트랜스펙션시키고, 트랜스펙션된 세포로부터의 전체 RNA를 트랜스펙션 후 1시간 내지 20일에 제조처의 지침에 따라 페놀-기반의 RNA 단리 시약(라이프 테크놀로지즈)을 사용하여 단리한다.
GFP 원형 RNA 및 mRNA 수준을 측정하기 위해, 무작위 헥사머를 사용한 qPCR 역전사를 수행한다. 약술하면, RT-qPCR을 위해, Hela 세포의 전체 RNA 및 동일한 공급원으로부터의 RNase R-분해된 RNA를 RT-PCR을 위한 주형으로서 사용한다. GFP mRNA 및 원형 GFP RNA의 cDNA를 제조하기 위해, 역전사 반응을 제조처의 지침에 따라 역전사효소(슈퍼-스크립트(Super-Script) II : RNase H ; 인비트로겐(Invitrogen)) 및 무작위 헥사머를 사용하여 수행한다. 증폭된 PCR 생성물을 6% PAGE를 사용하여 분석하고, 브롬화에티듐 염색에 의해 가시화시킨다. 농축 계수를 추산하기 위해, PCR 생성물을 농도계(ImageQuant; 몰레큘라 다이나믹스(Molecular Dynamics))에 의해 정량화하고, 전체 RNA 시료의 농도를 UV 흡광도에 의해 측정한다.
추가의 RNA 측정을 노던 블롯 분석을 사용하여 수행한다. 약술하면, 전체 세포 추출물을 페놀계 시약(TRIzol)을 사용하여 수득하거나, 핵 및 세포질 단백질 추출물을 상용의 키트(CelLytic NuCLEAR 추출 키트, 시그마(Sigma))를 사용한 세포의 분획화에 의해 수득한다. RNA 폴리머라제 II 전사를 저해하기 위해, 세포를 37℃에서 0시간 내지 6시간 동안 플라보피리돌(1 mM 최종 농도; 시그마)로 처리한다. RNase R 처리를 위해, 10 mg의 전체 RNA를 37℃에서 1시간 동안 20 U의 RNase R(에피센터(Epicentre))로 처리한다.
올리고뉴클레오티드 프로브를 사용한 노던 블롯을 하기와 같이 수행한다. 올리고뉴클레오티드 프로브, PCR 프라이머를 표준 프라이머 설계 툴을 사용하여 설계한다. T7 프로모터 서열을 역방향 프라이머에 부가하여, 시험관내 전사 반응에서 안티센스 프로브를 수득한다. 시험관내 전사를 제조처의 지침에 따라 DIG-RNA 표지화 믹스와 함께 T7 RNA 폴리머라제를 사용하여 수행한다. DNA 주형을 DNAs I 분해에 의해 제거하고, RNA 프로브를 페놀 클로로포름 추출 및 후속 침전에 의해 정제한다. 프로브를 50 ng/㎖로 사용한다. 전체 RNA(2 ㎍ 내지 10 ㎍)를 글리옥살 로드 염료(Glyoxal load dye)(앰비온(Ambion))를 사용하여 변성시키고, MOPS 완충제 중에 1.2% 아가로스 겔에서 분리한다. 겔을 1×TBE에서 20분 동안 침지시키고, 반-건조 블롯팅 시스템(바이오-라드(Bio-Rad))을 사용하여 1시간(15 V) 동안 하이본드(Hybond)-N+ 멤브레인(지이 헬쓰케어(GE Healthcare))으로 전달한다. 멤브레인을 건조시키고, 120,000 μJ cm-2에서 (265 nm에서) 1회 UV-가교시킨다. 사전-혼성화를 68℃에서 1시간 동안 행하고, DIG-표지된 시험관내 전사된 RNA 프로브를 밤새 혼성화시킨다. 멤브레인을 68℃에서 30분 동안 2×SSC, 0.1% SDS에서 3회 세척한 후에, 68℃에서 0.2×SSC, 0.1% SDS에서의 3회의 30분 세척으로 이어졌다. 면역검출을 알칼리성 포스파타제 항체와 직접-컨쥬게이트된 항-DIG로 수행한다. 면역반응성 밴드를 화학발광 알칼리성 포스파타제 기질(CDP 스타(star) 시약) 및 이미지 검출 및 정량화 시스템(LAS-4000 검출 시스템)을 사용하여 가시화시킨다.
실시예 13: 원형 RNA의 제조 및 시험관내 번역
본 실시예는 원형 RNA로부터의 유전자 생성물의 유전자 발현 및 검출을 기술한다.
본 실시예에서, 출발-코돈(SEQ ID NO: 1), GFP ORF(SEQ ID NO: 2), 스태거 요소(들)(SEQ ID NO: 3), 인간-유래된 엔크립토겐(들)(SEQ ID NO: 4)을 갖는, 그리고 IRES(SEQ ID NO: 5)를 갖거나 이것이 없는 원형 RNA를 설계하며, 도 18을 참조한다. 본 실시예에서, 실시예 10 및 11에 기술된 바와 같이 원형 RNA를 시험관내 또는 세포 내에서 생성한다.
원형 RNA를 30℃에서 토끼 망상적혈구 용해물(프로메가(Promega), 미국 위스콘신주 피츠버그 소재)에서 5시간 또는 밤새 인큐베이션시킨다. 반응 혼합물의 최종 조성은 70% 토끼 망상적혈구 용해물, 10 μM 메티오닌 및 류신, 메티오닌 및 류신 이외의 20 μM 아미노산 및 0.8 U/㎕ RNase 저해제(일본 오사카 소재의 토요보(Toyobo))를 포함한다. 분취물을 혼합물로부터 취하고, 10% 내지 20% 기울기 폴리아크릴아미드/황산도데실나트륨(SDS) 겔(일본 도쿄 소재의 아토(Atto))에서 분리한다. 상청액을 제거하고, 펠렛을 70℃에서 15분 동안 2×SDS 시료 완충제(0.125 M Tris-HCl, pH 6.8, 4% SDS, 30% 글리세롤, 5% 2-머캅토에탄올, 0.01% 브로모페놀 블루) 중에 용해시킨다. 헤모글로빈 단백질은 이러한 과정 동안 제거하는 반면, 헤모글로빈 이외의 단백질은 농축시킨다.
1,400×g에서 5분 동안 원심분리한 후에, 상청액을 10% 내지 20% 기울기 폴리아크릴아미드/SDS 겔에서 분석한다. 상업적으로 이용 가능한 표준물질(바이오라드(BioRad))을 크기 마커로서 사용한다. 반-건조 방법을 사용하여 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 멤브레인(밀리포어(Millipore))으로 전기전달한 후에, 블롯을 화학발광 키트(로클랜드(Rockland))를 사용하여 가시화시킨다.
GFP 단백질이 세포 용해물에서 가시화되고, 회전환 번역의 결과로서 선형 RNA보다 원형 RNA에서 더 많은 양으로 검출되는 것으로 예상된다.
실시예 14: 원형 RNA로부터의 화학량론적 단백질 발현
본 실시예는 단백질을 화학량론적으로 발현하는 원형 RNA의 능력을 기술한다.
본 실시예에서, 하나의 원형 RNA가 엔크립토겐(SEQ ID NO:4) 및 GFP를 인코딩하는 ORF(SEQ ID NO: 2) 및 RFP를 인코딩하는 ORF(SEQ ID NO:7)와 함께 GFP 및 RFP ORF에 측접한 스태거 요소(SEQ ID NO: 3)를 포함하도록 설계하며, 도 19a를 참조한다. 또 다른 원형 RNA를 유사하게 설계하지만, 측접하는 2A 서열 대신에 그것은 GFP와 RFP ORF 사이에 정지 및 출발 코돈을 가질 것이며, 도 19b를 참조한다. 실시예 11 및 12에 기술된 바와 같이 원형 RNA를 시험관내에서 또는 세포 내에서 생성한다.
원형 RNA를 30℃에서 토끼 망상적혈구 용해물(프로메가, 미국 위스콘신주 피츠버그 소재)에서 5시간 또는 밤새 인큐베이션시킨다. 반응 혼합물의 최종 조성은 70% 토끼 망상적혈구 용해물, 10 μM 메티오닌 및 류신, 메티오닌 및 류신 이외의 20 μM 아미노산 및 0.8 U/㎕ RNase 저해제(일본 오사카 소재의 토요보)를 포함한다. 분취물을 혼합물로부터 취하고, 10% 내지 20% 기울기 폴리아크릴아미드/황산도데실나트륨(SDS) 겔(일본 도쿄 소재의 아토(Atto))에서 분리한다. 상청액을 제거하고, 펠렛을 70℃에서 15분 동안 2×SDS 시료 완충제(0.125 M Tris-HCl, pH 6.8, 4% SDS, 30% 글리세롤, 5% 2-머캅토에탄올, 0.01% 브로모페놀 블루) 중에 용해시킨다. 헤모글로빈 단백질은 이러한 과정 동안 제거하는 반면, 헤모글로빈 이외의 단백질은 농축시킨다.
1,400×g에서 5분 동안 원심분리한 후에, 상청액을 10% 내지 20% 기울기 폴리아크릴아미드/SDS 겔에서 분석한다. 상업적으로 이용 가능한 표준물질(바이오라드(BioRad))을 크기 마커로서 사용한다. 반-건조 방법을 사용하여 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 멤브레인(밀리포어)으로 전기전달한 후에, 블롯을 화학발광 키트(로클랜드)를 사용하여 가시화시킨다.
정지 및 출발 코돈에 의해 분리되지 않은 GFP 및 RFP ORF를 갖는 원형 RNA는 동일한 양의 어느 하나의 단백질을 가지는 한편, ORF 사이에 출발 및 정지 코돈을 포함하는 원형 RNA로 처리된 세포는 상이한 양의 어느 하나의 단백질을 가질 것으로 예상된다.
실시예 15: 합성 원형 RNA는 세포에서 감소된 면역원성 유전자 발현을 보여준다
본 실시예는 선형 RNA에 비하여 감소된 면역원성을 갖도록 조작된 원형 RNA를 보여준다.
치료적 단백질을 인코딩하는 원형 RNA는 선형 RNA와 비교하여, 수여자 세포에서 면역원성 관련 유전자(RIG-I, MDA5, PKA 및 IFN-베타)의 유도 감소를 제공하였다. RIG-I는 짧은 5' 트리포스페이트 비캡핑된 이중 가닥 또는 단일 가닥 RNA를 인식할 수 있는 한편, MDA5는 더 긴 dsRNA를 인식할 수 있다. RIG-I 및 MDA5는 둘 모두 MAVS의 활성화 및 항바이러스 반응의 촉발에 관여할 수 있다. PKR은 dsRNA에 의해 활성화되고, 인터페론, 예컨대 IFN-베타에 의해 유도될 수 있다. 하기의 실시예에 나타낸 바와 같이, q-PCR에 의한 RIG-I, MDA5, PKR 및 IFN-베타의 발현에 의해 평가하여, 원형 RNA는 293T 세포에서 유사한 선형 RNA보다 면역 관련 유전자의 활성화를 감소시킨 것으로 나타났다.
원형 RNA 및 선형 RNA가 (1) 종결 요소 없이 코작, 3xFLAG-EGF 서열; (2) 코작, 종결 요소(정지 코돈)에 측접한 3xFLAG-EGF; (3) 코작, 2A 서열에 측접한 3xFLAG-EGF; 또는 (4) 코작, 2A 서열에 측접한 3xFLAG-EGF 서열에 이어서 종결 요소(정지 코돈)를 인코딩하도록 설계하였다.
이 실시예에서, 0.1x106개 세포를 12 웰 플레이트의 각 웰 내로 플레이팅함으로써 선천적 면역 반응 유전자의 수준을 세포에서 모니터링하였다. 1일 후에, 1 ㎍의 선형 또는 원형 RNA를 지질-기반의 트랜스펙션 시약(인비트로겐)을 사용하여 각 웰 내로 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션 후 24시간째에, 전체 RNA를 페놀-기반의 추출 시약(인비트로겐)을 사용하여 세포로부터 단리하였다. 전체 RNA(500 ng)를 역전사 처리하여, cDNA를 생성하였다. qRT-PCR 분석을 염료-기반의 정량적 PCR 믹스(바이오라드)를 사용하여 수행하였다.
사용되는 프라이머 서열: GAPDH를 위한 프라이머, F: AGGGCTGCTTTTAACTCTGGT, R: CCCCACTTGATTTTGGAGGGA; RIG-I, F: TGTGGGCAATGTCATCAAAA, R: GAAGCACTTGCTACCTCTTGC; MDA5, F: GGCACCATGGGAAGTGATT, R: ATTTGGTAAGGCCTGAGCTG; PKR, F: TCGCTGGTATCACTCGTCTG, R: GATTCTGAAGACCGCCAGAG; IFN-베타, F: CTCTCCTGTTGTGCTTCTCC, R: GTCAAAGTTCATCCTGTCCTTG.
도 20에 나타낸 바와 같이, 원형 RNA로 트랜스펙션시킨 293T 세포로부터의 면역 관련 유전자의 qRT-PCR 수준은 선형 RNA 트랜스펙션된 세포에 비하여 RIG-I, MDA5, PKR 및 IFN-베타의 감소를 보였다. 따라서, 수여자 세포 내의 면역원성 관련 유전자의 유도는 선형 RNA 트랜스펙션된 세포에 비하여 원형 RNA 트랜스펙션된 세포에서 감소하였다.
실시예 16: 생체내 발현
본 실시예는 생체내에서 원형 RNA로부터 단백질을 발현하는 능력을 기술한다.
본 실시예를 위해, 엔크립토겐(들)(SEQ ID NO: 4) 및 GFP(SEQ ID NO: 2) 또는 RFP(SEQ ID NO: 7) 또는 루시퍼라제(SEQ ID NO: 8)를 인코딩하는 ORF와 함께 GFP, RFP 또는 루시퍼라제 ORF의 측부 배치된 스태거 요소(SEQ ID NO: 3)를 포함하도록 원형 RNA를 설계하며, 도 21을 참조한다. 실시예 11 및 실시예 12에 기술된 바와 같이 원형 RNA를 시험관내 또는 세포 내에서 생성한다.
6 내지 8주령 수컷 BALB/c 마우스에, 본원에 기술된 바와 같은 GFP, RFP 또는 루시퍼라제 ORF를 갖는 300 mg/kg(6 mg)의 원형 RNA(50 ㎕ 부피), 또는 대조군으로서 선형 RNA를 피내(ID), 근육내(IM), 경구(PO), 복강내(IP) 또는 정맥내(IV) 투여를 통해 제공한다. 동물에 단회 용량 또는 3회 주사(제1일, 제3일, 제5일)를 제공한다.
혈액, 심장, 폐, 비장, 신장, 간 및 피부 주사 부위를 비-투여된 대조군 마우스로부터, 그리고 투여 후 2시간째, 4시간째, 8시간째, 24시간째, 48시간째, 72시간째, 96시간째 120시간째, 168시간째 및 264시간째에 수집한다(n = 4마리 마우스/시점). 혈액 시료를 연구 종료시에 경정맥 천자로부터 수집한다.
혈청 및 조직 둘 모두에 대한 원형 RNA 정량화를 분지형 DNA(bDNA)의 정량화(패노믹스(Panomics)/아피메트릭스(Affymetrix))를 사용하여 수행한다. (비처리된 조직 시료에 첨가되는) 알려져 있는 양의 RNA의 각 플레이트에 대한 표준 곡선을 사용하여, 처리된 조직에서 RNA를 정량화한다. 피코그램(pg)의 계산된 양을 플레이트에 적용되는 용해물 중 칭량된 조직의 양에 대해 정규화시킨다. 단백질 발현(RFP 또는 GFP)을 이전의 실시예에 기술된 바와 같이 각 조직에서 FACS 또는 웨스턴 블롯에 의해 평가한다.
루시퍼라제 원형 RNA를 투여받은 마우스의 개별 군에는, 투여 후 6, 24, 48, 72시간 및 96시간째에 3 mg의 루시페린을 주사하고, 동물을 생체내 영상화 시스템(IVIS Spectrum, 퍼킨엘머(PerkinElmer))에서 영상화한다. 투여 후 6시간째에, 3마리의 동물을 희생시키고, 해부하고, 근육, 피부, 배액 림프절, 간 및 비장을 생체외에서 영상화한다.
마우스는 처리된 조직에서 GFP, RFP 또는 루시퍼라제를 발현하는 것으로 예상된다.
실시예 17: 생체내 생체분포
본 실시예는 생체내에서 원형 RNA의 생체분포를 제어하고 측정하는 능력을 기술한다.
본 실시예에서, 마우스를 실시예 8에 기술된 바와 같이 루시퍼라제를 인코딩하는 원형 RNA로 처리한다. 약술하면, 엔크립토겐(들)(SEQ ID NO: 4) 및 루시퍼라제를 인코딩하는 ORF(SEQ ID NO: 8)와 함께 루시퍼라제 ORF의 측부 배치된 스태거 요소(SEQ ID NO: 3)를 포함하도록 원형 RNA를 설계하며, 도 22를 참조한다. 실시예 11 및 12에 기술된 바와 같이 원형 RNA를 시험관내 또는 세포 내에서 생성한다.
마우스에, 투여 후 6시간째, 24시간째, 48시간째, 72시간째 및 96시간째에 3 mg의 루시페린을 주사함으로써 루시퍼라제 원형 RNA를 투여하고, 동물을 생체내 영상화 시스템(IVIS Spectrum, 퍼킨엘머)에서 영상화시킨다. 투여 후 6시간째에, 3마리의 동물을 희생시키고, 해부하고, 근육, 피부, 배액 림프절, 간 및 비장을 생체외에서 영상화한다.
혈청 및 조직 둘 모두에 대한 원형 RNA 정량화를 분지형 DNA(bDNA)의 정량화(패노믹스/아피메트릭스)를 사용함으로써 수행한다. (비처리된 조직 시료에 첨가되는) 알려져 있는 양의 RNA의 각 플레이트에 대한 표준 곡선을 사용하여, 처리된 조직에서 RNA를 정량화한다. 피코그램(pg)의 계산된 양을 플레이트에 적용되는 용해물 중 칭량된 조직의 양에 대해 정규화시킨다.
6 내지 8주령 수컷 BALB/c 마우스의 개별군에 근육내 또는 피내 투여를 통해 루시퍼라제 원형 RNA를 다음의 4가지 용량 수준으로 투여한다: 10, 2, 0.4 및 0.08 mg(그룹당 n=6). 투여 후 6시간째, 24시간째, 48시간째, 72시간째 및 96시간째에, 동물에게 3 mg의 루시페린을 주사하고, 생체내 영상화 시스템(IVIS Spectrum, 퍼킨엘머)에서 영상화한다. 투여 후 6시간째에, 3마리의 동물을 희생시키고, 해부하고, 근육, 피부, 배액 림프절, 간 및 비장을 생체외에서 영상화한다. 마우스로부터의 조직을 또한 실시예 8에 기술된 바와 같이 루시퍼라제 발현에 대해 평가하고, 이러한 발현의 조직 분포를 분석한다.
마우스는 처리된 조직에서 루시퍼라제의 발현을 보이는 것으로 예상된다.
실시예 18: 생체내에서의 비-면역원성
본 실시예는 세포 감염 후의 원형 RNA의 면역원성의 생체내 평가를 기술한다.
본 실시예에는 엔크립토겐을 보유한 원형 RNA의 투여 후의 면역 반응의 정량화 및 비교가 기술되며, 도 23을 참조한다. 일 실시형태에서, 엔크립토겐을 갖는 원형 RNA 중 임의의 것은 원형 RNA의 1회 이상의 투여 후에 대조군에 비하여 감소된(예를 들어, 대조군 RNA의 투여에 비하여 감소된) 면역원성 반응을 가질 것이다.
원형 RNA에 대한 면역원성의 척도는 혈청 중 사이토카인 수준이다.
이 실시예에서, 사이토카인 혈청 수준을 원형 RNA의 1회 이상의 투여 후에 시험한다. 이전의 실시예 중 어느 하나로부터의 원형 RNA를 피내(ID), 근육내(IM), 경구(PO), 복강내(IP) 또는 정맥내(IV)를 통해 6 내지 8주령 BALB/c 마우스 내로 투여한다. 혈청을 다음의 상이한 코호트로부터 얻는다: 엔크립토겐을 보유한 원형 RNA 및 엔크립토겐이 없는 원형 RNA의 주사(들)를 전신으로 및/또는 국소로 주사한 마우스.
수집된 혈청 시료를 PBS 중에 1 내지 10배 희석하고, 효소-연결 면역흡착 검정(PBL 바이오메디컬 랩스(PBL Biomedical Labs), 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재)에 의해 마우스 IFN-α 및 TNF-α(알앤디(R&D), 미국 미네소타주 미네아폴리스 소재)에 대해 분석한다.
혈청 중 사이토카인 수준에 더하여, 염증성 마커의 발현은 면역원성의 또 다른 척도이다. 이 실시예에서, 비히클(원형 RNA 부재), 선형 RNA 또는 원형 RNA로 처리된 마우스 유래의 비장 조직을 투여 후 1시간, 4시간 및 24시간째에 수집할 것이다. 시료를 하기의 기법 qRT-PCR 분석, 노던 블롯 또는 FACS 분석을 사용하여 분석할 것이다.
qRT-PCR 분석을 위해, RIG-I, MDA5, OAS, OASL, TNF-알파 및 PKR에 대한 mRNA 수준을 이전에 기술된 바와 같이 정량화한다.
노던 블롯 분석을 위해. 시료를 상기 기술된 바와 같이 처리하고 IFN-알파 13, IFN-베타(오픈 바이오시스템즈), TNF-알파 또는 GAPDH(ATCC)에 대해 분석한다.
FACS 분석을 위해, 세포를 CD83(리서치 다이아그노스틱스 인코포레이티드(Research Diagnostics Inc)), HLA-DR, CD80 또는 CD86에 대한 직접 컨쥬게이트된 항체로 염색하고, 유세포분석기에서 분석한다.
일 실시형태에서, 엔크립토겐을 갖는 원형 RNA는 (ELISA, 노던 블롯, FACS 및/또는 qRT-PCR에 의해 결정하여) 대조군 RNA에 비하여, 1회 또는 다수의 투여 후에 감소된 사이토카인 수준을 가질 것이다.
실시예 19: 원형 RNA의 단리 및 정제
본 실시예는 원형 RNA 정제를 보여준다.
특정 실시형태에서, 이전의 실시예에 기술된 바와 같이, 인코딩된 단백질 생성물의 발현 이전에 원형 RNA를 단리하고 정제할 수 있다. 본 실시예에는 UREA 겔 분리를 사용한 단리가 기술된다. 하기의 실시예에 나타낸 바와 같이, 원형 RNA를 단리하고 정제하였다.
circRNA1을 정지 코돈 없이 삼중 FLAG 태깅된 EGF를 인코딩하도록 설계하였다(264개 뉴클레오티드). 이는 번역 개시를 위한 출발 코돈에 코작 서열을 갖는다(SEQ ID NO: 10). cirRNA2는 그것이 종결 요소(삼중 정지 코돈)를 갖는 것을 제외하고 원형 RNA1과 동일한 서열을 갖는다(273개 뉴클레오티드, SEQ ID NO: 11). 원형 RNA3을 종결 요소(정지 코돈) 없이 스태거 요소(2A 서열)에 측접한 삼중 FLAG 태깅된 EGF를 인코딩하도록 설계하였다(330개 뉴클레오티드, SEQ ID NO: 9). circRNA4는 그것이 종결 요소(삼중 정지 코돈)를 갖는 것을 제외하고, 원형 RNA3과 동일한 서열을 갖는다(339개 뉴클레오티드). CircRNA5를 2A 서열에 측접한 FLAG 태깅된 EGF에 이어서 FLAG 태깅된 나노 루시퍼라제를 인코딩하도록 설계하였다(873개 뉴클레오티드, SEQ ID NO: 12). CircRNA6은 그것이 EGF와 나노 루시퍼라제 유전자 사이에 종결 요소(삼중 정지 코돈)를 포함하고, 나노 루시퍼라제 서열의 말단에 종결 요소(삼중 정지 코돈)를 포함한 것을 제외하고 원형 RNA5와 동일한 서열을 갖는다(762개 뉴클레오티드, SEQ ID NO: 13). CircRNA1, CircRNA2, CircRNA3, CircRNA4, CircRNA5 및 CircRNA6을 본원에 기술된 바와 같이 단리하였다. CircRNA1, CircRNA2, CircRNA3, CircRNA4, CircRNA5 및 CircRNA6을 본원에 기술된 바와 같이 단리하였다.
이 실시예에서, 선형 및 원형 RNA를 기술된 바와 같이 생성하였다. 원형 RNA를 정제하기 위해, 라이게이션 혼합물을 6% 변성 PAGE에서 분리하고, 원형 RNA의 각각에 상응하는 RNA 밴드를 절개하였다. 절개된 RNA 겔 단편을 분쇄하고, RNA를 800 ㎕의 300 mM NaCl을 사용하여 밤새 용리시켰다. 겔 잔해를 원심분리 필터에 의해 제거하였으며, RNA를 0.3 M 아세트산나트륨의 존재 하에 에탄올을 사용하여 침전시켰다. 용리된 원형 RNA를 6% 변성 PAGE에 의해 분석하였으며, 도 24를 참조한다.
단일의 밴드를 다양한 크기를 갖는 원형 RNA에 대하여 PAGE에 의해 가시화시켰다.
실시예 20: 단백질 발현의 검출
이 실시예는 원형 RNA로부터의 시험관내 단백질 발현을 보여준다.
단백질 발현은 mRNA로부터 특정 단백질을 생성하는 과정이다. 이러한 과정은 메신저 RNA(mRNA)로의 DNA의 전사에 이어서, 폴리펩티드 쇄로의 mRNA의 번역을 포함하며, 이 폴리펩티드 쇄는 궁극적으로 기능성 단백질로 폴딩되며, 특정 하위세포 또는 세포외 위치에 표적화될 수 있다.
하기의 실시예에 나타낸 바와 같이, 단백질을 시험관내에서 원형 RNA 서열로부터 발현하였다.
원형 RNA를 종결 요소(정지 코돈) 없이 2A 서열에 측접한 삼중 FLAG 태깅된 EGF를 인코딩하도록 설계하였다(330개 뉴클레오티드, SEQ ID NO: 9).
선형 또는 원형 RNA를 25 ㎕의 부피에서 30℃에서 토끼 망상적혈구 용해물 중에 5시간 동안 인큐베이션시켰다. 반응 혼합물의 최종 조성은 70% 토끼 망상적혈구 용해물, 20 μM 아미노산, 0.8 U/㎕ RNase 저해제 및 1 ㎍의 선형 또는 원형 RNA를 함유하였다. 인큐베이션 후에, 아세트산(0.32 ㎕) 및 물(300 ㎕)을 반응 혼합물(16 ㎕)에 첨가하고 15℃에서 10분 동안 20,817 xg에서 원심분리시킴으로써 헤모글로빈 단백질을 제거하였다. 상청액을 제거하고, 펠렛을 30°l의 2x SDS 시료 완충제 중에 용해시키고, 70℃에서 15분 동안 인큐베이션시켰다. 1400 xg에서 5분 동안 원심분리한 후에, 상청액을 10% 내지 20% 기울기 폴리아크릴아미드/SDS 겔에서 분석하였다.
건식 전달 방법을 사용하여 니트로셀룰로스 멤브레인으로 전기전달한 후에, 블롯을 항-FLAG 항체 및 항-마우스 IgG 퍼옥시다제와 인큐베이션시켰다. 블롯을 ECL 키트로 가시화시켰으며(도 25 참조), 웨스턴 블롯 밴드 세기를 ImageJ에 의해 측정하였다.
형광이 검출되었으며, 이는 발현 생성물이 존재하였음을 나타낸다. 따라서, 원형 RNA는 단백질의 발현을 유도하는 것으로 나타났다.
서열 목록
SEQ ID NO: 1(출발 코돈)
AUG
SEQ ID NO: 2 (GFP)
EGFP: atggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaag
SEQ ID NO: 3(스태거 요소)
P2A: gctactaacttcagcctgctgaagcaggctggcgacgtggaggagaaccctggacct
T2A: gagggcaggggaagtctactaacatgcggggacgtggaggaaaatcccggccca
E2A: cagtgtactaattatgctctcttgaaattggctggagatgttgagagcaacccaggtccc
기타: F2A, BmCPV2A, BmIFV2A
SEQ ID NO: 4 ZKSCAN 인트론
GTAAAAAGAGGTGAAACCTATTATGTGTGAGCAGGGCACAGACGTTGAAACTGGAGCCAGGAGAAGTATTGGCAGGCTTTAGGTTATTAGGTGGTTACTCTGTCTTAAAAATGTTCTGGCTTTCTTCCTGCATCCACTGGCATACTCATGGTCTGTTTTTAAATATTTTAATTCCCATTTACAAAGTGATTTACCCACAAGCCCAACCTGTCTGTCTTCAG
또는
GTAAGAAGCAAGGTTTCATTTAGGGGAAGGGAAATGATTCAGGACGAGAGTCTTTGTGCTGCTGAGTGCCTGTGATGAAGAAGCATGTTAGTcctgggcaacgtagcgagaccccatctctacaaaaaatagaaaaattagccaggtatagtggcgcacacctgtgattccagctacgcaggaggctgaggtgggaggattgcttgagcccaggaggttgaggctgcagtgagctgtaatcatgccactactccaacctgggcaacacagcaaggaccctgtctcaaaaGCTACTTACAGAAAAGAATTAggctcggcacggtagctcacacctgtaatcccagcactttgggaggctgaggcgggcagatcacttgaggtcaggagtttgagaccagcctggccaacatggtgaaaccttgtctctactaaaaatatgaaaattagccaggcatggtggcacattcctgtaatcccagctactcgggaggctgaggcaggagaatcacttgaacccaggaggtggaggttgcagtaagccgagatcgtaccactgtgctctagccttggtgacagagcgagactgtcttaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaagaattaattaaaaatttaaaaaaaaatgaaaaaaaGCTGCATGCTTGTTTTTTGTTTTTAGTTATTCTACATTGTTGTCATTATTACCAAATATTGGGGAAAATACAACTTACAGACCAATCTCAGGAGTTAAATGTTACTACGAAGGCAAATGAACTATGCGTAATGAACCTGGTAGGCATTA
SEQ ID NO: 5 (IRES)
IRES (EMCV): Acgttactggccgaagccgcttggaataaggccggtgtgcgtttgtctatatgttattttccaccatattgccgtcttttggcaatgtgagggcccggaaacctggccctgtcttcttgacgagcattcctaggggtctttcccctctcgccaaaggaatgcaaggtctgttgaatgtcgtgaaggaagcagttcctctggaagcttcttgaagacaaacaacgtctgtagcgaccctttgcaggcagcggaaccccccacctggcgacaggtgcctctgcggccaaaagccacgtgtataagatacacctgcaaaggcggcacaaccccagtgccacgttgtgagttggatagttgtggaaagagtcaaatggctctcctcaagcgtattcaacaaggggctgaaggatgcccagaaggtaccccattgtatgggatctgatctggggcctcggtgcacatgctttacatgtgtttagtcgaggttaaaaaacgtctaggccccccgaaccacggggacgtggttttcctttgaaaaacacgatgataata
SEQ ID NO: 6(애드진 p3.1 락카제(laccase))
pcDNA3.1(+) 락카제2 MCS 엑손 벡터 서열 6926개 염기쌍
GACGGATCGGGAGATCTCCCGATCCCCTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGTATCTGCTCCCTGCTTGTGTGTTGGAGGTCGCTGAGTAGTGCGCGAGCAAAATTTAAGCTACAACAAGGCAAGGCTTGACCGACAATTGCATGAAGAATCTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGATGTACGGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCGTTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACTAGTCCAGTGTGGTGGAATTCCATTGAGAAATGACTGAGTTCCGGTGCTCTCAAGTCATTGATCTTTGTCGACTTTTATTTGGTCTCTGTAATAACGACTTCAAAAACATTAAATTCTGTTGCGAAGCCAGTAAGCTACAAAAAGAAAaaacaagagagaatgctatagtcgtatagtatagtttcccgactatctgatacccattacttatctagggggaatgcgaacccaaaattttatcagttttctcggatatcgatagatattggggaataaatttaaataaataaattttgggcgggtttagggcgtggcaaaaagttttttggcaaatcgctagaaatttacaagacttataaaattatgaaaaaatacaacaaaattttaaacacgtgggcgtgacagttttggGcggttttagggcgttagagtaggcgaggacagggttacatcgactaggctttgatcctgatcaagaatatatatactttataccgcttccttctacatgttacctatttttcaacgaatctagtatacctttttactgtacgatttatgggtataaTAATAAGCTAAATCGAGACTAAGttttattgttatatatattttttttattttatGCAGAAATTAATTAAACCGGTCCTGCAGGTGATCAGGCGCGCCGGTTACCGGCCGGCCCCGCGGAGCGTAAGTATTCAAAATTCCAAAATTTTTTACTAGAAATATTCGATTTTTTAATAGGCAGTTTCTATACTATTGTATACTATTGtagattcgttgaaaagtatgtaacaggaagaataaagcatttccgaccatgtaaagtatatatattcttaataaggatcaatagccgagtcgatctcgccatgtccgtctgtcttattGttttattaccgccgagacatcaggaactataaaagctagaaggatgagttttagcatacagattctagagacaaggacgcagagcaagtttgttgatccatgctgccacgctttaactttctcaaattgcccaaaactgccatgcccacatttttgaactattttcgaaattttttcataattgtattactcgtgtaaatttccatcaatttgccaaaaaactttttgtcacgcgttaacgccctaaagccgccaatttggtcacgcccacactattgaGcaattatcaaattttttctcattttattccccaatatctatcgatatccccgattatgaaattattaaatttcgcgttcgcattcacactagctgagtaacgagtatctgatagttggggaaatcgactTATTTTTTATATACAATGAAAATGAATTTAATCATATGAATATCGATTATAGCTTTTTATTTAATATGAATATTTATTTGGGCTTAAGGTGTAACCTcctcgacataagactcacatggcgcaggcacattgaagacaaaaatactcaTTGTCGGGTCTCGCACCCTCCAGCAGCACCTAAAATTATGTCTTCAATTATTGCCAACATTGGAGACACAATTAGTCTGTGGCACCTCAGGCGGCCGCTCGAGTCTAGAGGGCCCGTTTAAACCCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGGGCTCTAGGGGGTATCCCCACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTAATTCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCTGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTCCCGGGAGCTTGTATATCCATTTTCGGATCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAGGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGCGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGAGCGGGACTCTGGGGTTCGAAATGACCGACCAAGCGACGCCCAACCTGCCATCACGAGATTTCGATTCCACCGCCGCCTTCTATGAAAGGTTGGGCTTCGGAATCGTTTTCCGGGACGCCGGCTGGATGATCCTCCAGCGCGGGGATCTCATGCTGGAGTTCTTCGCCCACCCCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGTATACCGTCGACCTCTAGCTAGAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTC
SEQ ID NO: 7 (RFP)
mCherry: atggtgagcaagggcgaggaggataacatggccatcatcaaggagttcatgcgcttcaaggtgcacatggagggctccgtgaacggccacgagttcgagatcgagggcgagggcgagggccgcccctacgagggcacccagaccgccaagctgaaggtgaccaagggtggccccctgcccttcgcctgggacatcctgtcccctcagttcatgtacggctccaaggcctacgtgaagcaccccgccgacatccccgactacttgaagctgtccttccccgagggcttcaagtgggagcgcgtgatgaacttcgaggacggcggcgtggtgaccgtgacccaggactcctccctgcaggacggcgagttcatctacaaggtgaagctgcgcggcaccaacttcccctccgacggccccgtaatgcagaagaagaccatgggctgggaggcctcctccgagcggatgtaccccgaggacggcgccctgaagggcgagatcaagcagaggctgaagctgaaggacggcggccactacgacgctgaggtcaagaccacctacaaggccaagaagcccgtgcagctgcccggcgcctacaacgtcaacatcaagttggacatcacctcccacaacgaggactacaccatcgtggaacagtacgaacgcgccgagggccgccactccaccggcggcatggacgagctgtacaag
SEQ ID NO: 8(루시퍼라제)
nLuc: ATGGTCTTCACACTCGAAGATTTCGTTGGGGACTGGCGACAGACAGCCGGCTACAACCTGGACCAAGTCCTTGAACAGGGAGGTGTGTCCAGTTTGTTTCAGAATCTCGGGGTGTCCGTAACTCCGATCCAAAGGATTGTCCTGAGCGGTGAAAATGGGCTGAAGATCGACATCCATGTCATCATCCCGTATGAAGGTCTGAGCGGCGACCAAATGGGCCAGATCGAAAAAATTTTTAAGGTGGTGTACCCTGTGGATGATCATCACTTTAAGGTGATCCTGCACTATGGCACACTGGTAATCGACGGGGTTACGCCGAACATGATCGACTATTTCGGACGGCCGTATGAAGGCATCGCCGTGTTCGACGGCAAAAAGATCACTGTAACAGGGACCCTGTGGAACGGCAACAAAATTATCGACGAGCGCCTGATCAACCCCGACGGCTCCCTGCTGTTCCGAGTAACCATCAACGGAGTGACCGGCTGGCGGCTGTGCGAACGCATTCTGGCGTAA
SEQ ID NO: 9
코작 3XFLAG-EGF P2A nostop(330개 염기쌍)
GGGAGCCACCATGGACTACAAGGACGACGACGACAAGATCATCGACTATAAAGACGACGACGATAAAGGTGGCGACTATAAGGACGACGACGACAAAGCCATTAATAGTGACTCTGAGTGTCCCCTGTCCCACGACGGGTACTGCCTCCACGACGGTGTGTGCATGTATATTGAAGCATTGGACAAGTACGCCTGCAACTGTGTTGTTGGCTACATCGGGGAGCGCTGTCAGTACCGAGACCTGAAGTGGTGGGAACTGCGCGGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCTCT
5-13: 코작 서열
14-262: 3XFLAG-EGF
263-328: P2A
SEQ ID NO: 10
코작 3XFLAG-EGF nostop(264개 염기쌍)
GGGAGCCACCATGGACTACAAGGACGACGACGACAAGATCATCGACTATAAAGACGACGACGATAAAGGTGGCGACTATAAGGACGACGACGACAAAGCCATTAATAGTGACTCTGAGTGTCCCCTGTCCCACGACGGGTACTGCCTCCACGACGGTGTGTGCATGTATATTGAAGCATTGGACAAGTACGCCTGCAACTGTGTTGTTGGCTACATCGGGGAGCGCTGTCAGTACCGAGACCTGAAGTGGTGGGAACTGCGCCT
5-13: 코작 서열
14-262: 3XFLAG-EGF
SEQ ID NO: 11
코작 3XFLAG-EGF stop(273개 염기쌍)
GGGAGCCACCATGGACTACAAGGACGACGACGACAAGATCATCGACTATAAAGACGACGACGATAAAGGTGGCGACTATAAGGACGACGACGACAAAGCCATTAATAGTGACTCTGAGTGTCCCCTGTCCCACGACGGGTACTGCCTCCACGACGGTGTGTGCATGTATATTGAAGCATTGGACAAGTACGCCTGCAACTGTGTTGTTGGCTACATCGGGGAGCGCTGTCAGTACCGAGACCTGAAGTGGTGGGAACTGCGCTGATAGTAACT
5-13: 코작 서열
14-262: 3XFLAG-EGF
263-271: 삼중 정지 코돈
SEQ ID NO: 12
코작 1XFLAG-EGF T2A 1XFLAG-Nluc P2A nostop(873개 염기쌍)
GGGAGCCACCATGGACTACAAGGACGACGACGACAAGATCATCAATAGTGACTCTGAGTGTCCCCTGTCCCACGACGGGTACTGCCTCCACGACGGTGTGTGCATGTATATTGAAGCATTGGACAAGTACGCCTGCAACTGTGTTGTTGGCTACATCGGGGAGCGCTGTCAGTACCGAGACCTGAAGTGGTGGGAACTGCGCGGCTCCGGCGAGGGCAGGGGAAGTCTTCTAACATGCGGGGACGTGGAGGAAAATCCCGGCCCAGACTATAAGGACGACGACGACAAAATCATCGTCTTCACACTCGAAGATTTCGTTGGGGACTGGCGACAGACAGCCGGCTACAACCTGGACCAAGTCCTTGAACAGGGAGGTGTGTCCAGTTTGTTTCAGAATCTCGGGGTGTCCGTAACTCCGATCCAAAGGATTGTCCTGAGCGGTGAAAATGGGCTGAAGATCGACATCCATGTCATCATCCCGTATGAAGGTCTGAGCGGCGACCAAATGGGCCAGATCGAAAAAATTTTTAAGGTGGTGTACCCTGTGGATGATCATCACTTTAAGGTGATCCTGCACTATGGCACACTGGTAATCGACGGGGTTACGCCGAACATGATCGACTATTTCGGACGGCCGTATGAAGGCATCGCCGTGTTCGACGGCAAAAAGATCACTGTAACAGGGACCCTGTGGAACGGCAACAAAATTATCGACGAGCGCCTGATCAACCCCGACGGCTCCCTGCTGTTCCGAGTAACCATCAACGGAGTGACCGGCTGGCGGCTGTGCGAACGCATTCTGGCGGGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCTCT
5-13: 코작 서열
14-202: 1XFLAG-EGF
203-265: T2A
266-805: 1XFLAG-Nluc
806-871: P2A
SEQ ID NO: 13
코작 1XFLAG-EGF stop 1XFLAG-Nluc stop(762개 염기쌍)
GGGAGCCACCATGGACTACAAGGACGACGACGACAAGATCATCAATAGTGACTCTGAGTGTCCCCTGTCCCACGACGGGTACTGCCTCCACGACGGTGTGTGCATGTATATTGAAGCATTGGACAAGTACGCCTGCAACTGTGTTGTTGGCTACATCGGGGAGCGCTGTCAGTACCGAGACCTGAAGTGGTGGGAACTGCGCTGATAGTAAGACTATAAGGACGACGACGACAAAATCATCGTCTTCACACTCGAAGATTTCGTTGGGGACTGGCGACAGACAGCCGGCTACAACCTGGACCAAGTCCTTGAACAGGGAGGTGTGTCCAGTTTGTTTCAGAATCTCGGGGTGTCCGTAACTCCGATCCAAAGGATTGTCCTGAGCGGTGAAAATGGGCTGAAGATCGACATCCATGTCATCATCCCGTATGAAGGTCTGAGCGGCGACCAAATGGGCCAGATCGAAAAAATTTTTAAGGTGGTGTACCCTGTGGATGATCATCACTTTAAGGTGATCCTGCACTATGGCACACTGGTAATCGACGGGGTTACGCCGAACATGATCGACTATTTCGGACGGCCGTATGAAGGCATCGCCGTGTTCGACGGCAAAAAGATCACTGTAACAGGGACCCTGTGGAACGGCAACAAAATTATCGACGAGCGCCTGATCAACCCCGACGGCTCCCTGCTGTTCCGAGTAACCATCAACGGAGTGACCGGCTGGCGGCTGTGCGAACGCATTCTGGCGTGATAGTAACT
5-13: 코작 서열
14-202: 1XFLAG-EGF
203-211: 삼중 정지 코돈
212-751: 1XFLAG-Nluc
752-760: 삼중 정지 코돈
hEPO ORF
ATGGGAGTGCACGAGTGTCCCGCGTGGTTGTGGTTGCTGCTGTCGCTCTTGAGCCTCCCACTGGGACTGCCTGTGCTGGGGGCACCACCCAGATTGATCTGCGACTCACGGGTACTTGAGAGGTACCTTCTTGAAGCCAAAGAAGCCGAAAACATCACAACCGGATGCGCCGAGCACTGCTCCCTCAATGAGAACATTACTGTACCGGATACAAAGGTCAATTTCTATGCATGGAAGAGAATGGAAGTAGGACAGCAGGCCGTCGAAGTGTGGCAGGGGCTCGCGCTTTTGTCGGAGGCGGTGTTGCGGGGTCAGGCCCTCCTCGTCAACTCATCACAGCCGTGGGAGCCCCTCCAACTTCATGTCGATAAAGCGGTGTCGGGGCTCCGCAGCTTGACGACGTTGCTTCGGGCTCTGGGCGCACAAAAGGAGGCTATTTCGCCGCCTGACGCGGCCTCCGCGGCACCCCTCCGAACGATCACCGCGGACACGTTTAGGAAGCTTTTTAGAGTGTACAGCAATTTCCTCCGCGGAAAGCTGAAATTGTATACTGGTGAAGCGTGTAGGACAGGGGATCGCTAA
SEQUENCE LISTING <110> FLAGSHIP PIONEERING INNOVATIONS VI, LLC <120> METHODS OF DOSING CIRCULAR POLYRIBONUCLEOTIDES <130> 55503-710.601 <140> PCT/US2020/038835 <141> 2020-06-19 <150> 62/863,725 <151> 2019-06-19 <160> 54 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 3 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1 aug 3 <210> 2 <211> 717 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 2 atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60 ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120 ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180 ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240 cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300 ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360 gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420 aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480 ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540 gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600 tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660 ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaag 717 <210> 3 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 3 gctactaact tcagcctgct gaagcaggct ggcgacgtgg aggagaaccc tggacct 57 <210> 4 <211> 221 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 4 gtaaaaagag gtgaaaccta ttatgtgtga gcagggcaca gacgttgaaa ctggagccag 60 gagaagtatt ggcaggcttt aggttattag gtggttactc tgtcttaaaa atgttctggc 120 tttcttcctg catccactgg catactcatg gtctgttttt aaatatttta attcccattt 180 acaaagtgat ttacccacaa gcccaacctg tctgtcttca g 221 <210> 5 <211> 552 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 5 acgttactgg ccgaagccgc ttggaataag gccggtgtgc gtttgtctat atgttatttt 60 ccaccatatt gccgtctttt ggcaatgtga gggcccggaa acctggccct gtcttcttga 120 cgagcattcc taggggtctt tcccctctcg ccaaaggaat gcaaggtctg ttgaatgtcg 180 tgaaggaagc agttcctctg gaagcttctt gaagacaaac aacgtctgta gcgacccttt 240 gcaggcagcg gaacccccca cctggcgaca ggtgcctctg cggccaaaag ccacgtgtat 300 aagatacacc tgcaaaggcg gcacaacccc agtgccacgt tgtgagttgg atagttgtgg 360 aaagagtcaa atggctctcc tcaagcgtat tcaacaaggg gctgaaggat gcccagaagg 420 taccccattg tatgggatct gatctggggc ctcggtgcac atgctttaca tgtgtttagt 480 cgaggttaaa aaacgtctag gccccccgaa ccacggggac gtggttttcc tttgaaaaac 540 acgatgataa ta 552 <210> 6 <211> 6926 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 6 gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg 60 ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120 cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180 ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt 240 gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata 300 tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 360 cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 420 attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 480 atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 540 atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 600 tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg 660 actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc 720 aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg 780 gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca 840 ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagacccaa gctggctagc 900 gtttaaactt aagcttggta ccgagctcgg atccactagt ccagtgtggt ggaattccat 960 tgagaaatga ctgagttccg gtgctctcaa gtcattgatc tttgtcgact tttatttggt 1020 ctctgtaata acgacttcaa aaacattaaa ttctgttgcg aagccagtaa gctacaaaaa 1080 gaaaaaacaa gagagaatgc tatagtcgta tagtatagtt tcccgactat ctgataccca 1140 ttacttatct agggggaatg cgaacccaaa attttatcag ttttctcgga tatcgataga 1200 tattggggaa taaatttaaa taaataaatt ttgggcgggt ttagggcgtg gcaaaaagtt 1260 ttttggcaaa tcgctagaaa tttacaagac ttataaaatt atgaaaaaat acaacaaaat 1320 tttaaacacg tgggcgtgac agttttgggc ggttttaggg cgttagagta ggcgaggaca 1380 gggttacatc gactaggctt tgatcctgat caagaatata tatactttat accgcttcct 1440 tctacatgtt acctattttt caacgaatct agtatacctt tttactgtac gatttatggg 1500 tataataata agctaaatcg agactaagtt ttattgttat atatattttt tttattttat 1560 gcagaaatta attaaaccgg tcctgcaggt gatcaggcgc gccggttacc ggccggcccc 1620 gcggagcgta agtattcaaa attccaaaat tttttactag aaatattcga ttttttaata 1680 ggcagtttct atactattgt atactattgt agattcgttg aaaagtatgt aacaggaaga 1740 ataaagcatt tccgaccatg taaagtatat atattcttaa taaggatcaa tagccgagtc 1800 gatctcgcca tgtccgtctg tcttattgtt ttattaccgc cgagacatca ggaactataa 1860 aagctagaag gatgagtttt agcatacaga ttctagagac aaggacgcag agcaagtttg 1920 ttgatccatg ctgccacgct ttaactttct caaattgccc aaaactgcca tgcccacatt 1980 tttgaactat tttcgaaatt ttttcataat tgtattactc gtgtaaattt ccatcaattt 2040 gccaaaaaac tttttgtcac gcgttaacgc cctaaagccg ccaatttggt cacgcccaca 2100 ctattgagca attatcaaat tttttctcat tttattcccc aatatctatc gatatccccg 2160 attatgaaat tattaaattt cgcgttcgca ttcacactag ctgagtaacg agtatctgat 2220 agttggggaa atcgacttat tttttatata caatgaaaat gaatttaatc atatgaatat 2280 cgattatagc tttttattta atatgaatat ttatttgggc ttaaggtgta acctcctcga 2340 cataagactc acatggcgca ggcacattga agacaaaaat actcattgtc gggtctcgca 2400 ccctccagca gcacctaaaa ttatgtcttc aattattgcc aacattggag acacaattag 2460 tctgtggcac ctcaggcggc cgctcgagtc tagagggccc gtttaaaccc gctgatcagc 2520 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Claims (49)

  1. 포유동물에서 단백질의 발현을 유지하는 방법으로서:
    (a) 단백질을 인코딩하는 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제1 조성물을 포유동물에게 제공하는 단계; 및
    (b) 단계 (a) 이후 6시간 내지 90일째에 단백질을 인코딩하는 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제2 조성물을 포유동물에게 제공하는 단계를 포함하며,
    그럼으로써 포유동물 내의 단백질의 발현을 유지하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제2 조성물을 제공하는 단계가 제1 조성물을 제공한 후에, 그리고
    (i) 제1 조성물에 의해 발현되는 단백질의 제1 수준이 상기 포유동물에서 실질적으로 검출 불가능하게 되기 전에; 또는
    (ii) 제1 조성물에 의해 발현되는 단백질의 제1 수준이 상기 포유동물에서 실질적으로 검출 불가능하게 된 후에; 또는
    (iii) 제1 조성물에 의해 발현되는 단백질의 제1 수준이 상기 포유동물에서 50% 초과로 감소하기 전에 발생하는, 방법.
  3. 제1항 내지 제2항 중 어느 한 항에 있어서, 원형 폴리리보뉴클레오티드는 (i) 외인성 합성 원형 폴리리보뉴클레오티드이고/이거나; (ii) 폴리-A 서열, 복제 요소, 또는 둘 모두를 결여하는, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 조성물은 제1 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하고 제2 조성물은 제2 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하며:
    (i) 제1 원형 폴리리보뉴클레오티드와 제2 원형 폴리리보뉴클레오티드는 동일하거나; 또는
    (ii) 제1 원형 폴리리보뉴클레오티드와 제2 원형 폴리리보뉴클레오티드는 상이한, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제3 조성물을 제2 조성물 이후에 상기 포유동물에게 제공함으로써, 상기 포유동물에서 단백질의 발현을 유지시키는 단계; 또는
    (ii) 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제3 조성물을 제2 조성물 이후에 상기 포유동물에게 제공함으로써, 상기 포유동물에서 단백질의 발현을 회복시키는 단계;
    및 선택적으로 제3 조성물을 제공하는 단계가 제2 조성물을 제공한 후에, 그리고 (a) 제1 및 제2 조성물에 의해 발현되는 단백질의 제2 수준이 상기 포유동물에서 실질적으로 검출 불가능하게 되기 전에; 또는 (b) 상기 포유동물에서 제1 및 제2 조성물에 의해 발현되는 단백질의 제2 수준이 50% 초과로 감소하기 전에 발생하는 단계; 및/또는
    (iii) 상기 단백질을 인코딩하는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9 또는 제10 조성물을 제공하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 제1 조성물에 의해 발현되는 단백질의 제1 수준은 제1 조성물을 제공한 후 1일째 내지 2일째의 가장 높은 단백질의 수준임; 또는
    (ii) 제1 조성물에 의해 발현된 단백질의 제1 수준은 제1 조성물을 제공한 지 하루 후의 단백질의 최고 수준의 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%임; 및 선택적으로,
    (iii) 단백질의 제2 수준은 제2 조성물의 제공 이후 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 또는 30 일 동안 제1 조성물을 제공한 지 하루 후의 단백질의 최고 수준의 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 또는 130%임; 및 선택적으로,
    (iv) 단백질의 제3 수준은 제3 조성물의 제공 이후 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 또는 30 일 동안 제1 조성물을 제공한 지 하루 후의 단백질의 최고 수준의 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 또는 130%임; 및/또는
    (v) 제1 조성물의 제공 이후의 후속 조성물 각각에 대해, 각각의 후속 조성물 이후 발현된 단백질의 후속 수준은 각각의 후속 조성물의 제공 이후 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 또는 30 일 동안 제1 조성물을 제공한 지 하루 후의 단백질의 최고 수준의 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 또는 130%인, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 조성물을 제공한 후에 상기 단백질의 평균 수준은 제1 조성물로부터의 단백질의 제1 수준의 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 또는 110%이며, 상기 단백질의 평균 수준이 (i) 제2 조성물을 제공한 후 1일째부터 상기 단백질이 실질적으로 검출 불가능한 날까지; 또는 (ii) 각각의 후속 조성물을 제공한 이후 상기 단백질이 실질적으로 검출 불가능한 날까지 측정되는 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 단백질의 제1 수준은 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 후에 제1 조성물을 제공한 후 6시간 내지 90일 동안 유지됨; 및/또는
    (ii) 단백질의 제1 수준은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물, 제2 조성물, 및 제3 조성물을 제공한 이후 제1 조성물의 제공 이후 6시간 내지 270일 동안 유지됨; 및/또는
    (iii) 단백질의 제1 수준은 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 후에 제1 조성물을 제공한 후 6시간 내지 35일 동안 실질적으로 검출 불가능한, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 제2 조성물을 제공한 이후의 포유동물 내의 단백질의 제2 수준은 제1 조성물을 제공한 이후 포유동물 내의 단백질의 제1 수준보다 적어도 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 60% 높음; 및/또는
    (ii) 제3 조성물을 제공한 이후의 포유동물 내에서 생성된 단백질의 제3 수준은 제1 조성물을 제공한 이후 단백질의 제1 수준보다 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 60% 높음; 및/또는
    (iii) 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 제공한 지 1시간, 12시간, 18시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 15일, 20일, 25일, 또는 30일 이후의 단백질의 제2 수준은 제1 조성물을 제공한 이후의 단백질의 제1 수준보다 적어도 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 60% 높음; 및/또는
    (iv) 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제3 조성물을 제공한 지 1시간, 12시간, 18시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 15일, 20일, 25일, 또는 30일 이후의 단백질의 제3 수준은 제1 조성물을 제공한 이후의 단백질의 제1 수준보다 적어도 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 60% 높은, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질이 치료적 단백질, 예를 들어, 에리트로포이에틴이고/이거나;
    상기 단백질(예를 들어, 에리트로포이에틴)의 발현이 상기 포유동물에서 반응(예를 들어, 망상적혈구 생성)을 유도하는, 방법.
  11. 세포 또는 대상체에서 단백질의 발현을 유지하는 방법으로서:
    (a) 단백질을 인코딩하는 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제1 조성물을 세포 또는 대상체에게 제공하는 단계; 및
    (b) 단계 (a) 이후 6시간 내지 90일째에 단백질을 인코딩하는 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제2 조성물을 세포 또는 대상체에게 제공하는 단계를 포함하며,
    그럼으로써 세포 또는 대상체에서 단백질의 발현을 유지하며; 선택적으로 제1 조성물을 제공하는 단계는 대상체 내의 제1 세포에 대해 이루어지고, 제2 조성물을 제공하는 단계는 대상체 내의 제2 세포에 대하여 이루어지며, 제1 세포 및 제2 세포는 동일한 세포이거나 상이한 세포인, 방법.
  12. 세포 또는 대상체에서 단백질을 발현시키는 방법으로서:
    (a) 단백질을 인코딩하는 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제1 조성물을 세포 또는 대상체에게 제공하는 단계로서, 세포 또는 대상체는 제1 수준의 인코딩된 단백질을 발현하는 단계; 및
    (b) 단백질을 인코딩하는 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제2 조성물을 세포 또는 대상체에게 제공하는 단계로서, 세포 또는 대상체는 제2 수준의 인코딩된 단백질을 발현하는 단계를 포함하며
    (i) 제2 수준이 적어도 제1 수준만큼이거나,
    (ii) 제2 수준이 제1 수준의 20%를 넘게 차이나지 않으며;
    그럼으로써 세포 또는 대상체에서 인코딩된 단백질의 발현을 적어도 단백질의 제1 수준에서 유지하며; 선택적으로 제1 조성물을 제공하는 단계는 대상체 내의 제1 세포에 대해 이루어지고, 제2 조성물을 제공하는 단계는 대상체 내의 제2 세포에 대하여 이루어지며, 제1 세포 및 제2 세포는 동일한 세포이거나 상이한 세포인, 방법.
  13. 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 후의 세포 또는 대상체에서의 단백질의 수준과 비교하여 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 세포 또는 대상체에게 제공한 후의 세포 또는 대상체에서의 소정의 수준의 단백질의 발현 방법으로서,
    (a) 단백질을 인코딩하는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물을 세포 또는 대상체에게 제공하는 단계로서, 세포 또는 대상체가 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물을 제공한 후에 소정의 수준의 단백질을 포함하는 단계; 및
    (b) 제1 조성물 이후에 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 세포 또는 대상체에게 제공하는 단계로서, 세포 또는 대상체가
    (i) 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 제공한 후에 적어도 소정의 수준의 단백질을 포함하거나,
    (ii) 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 제공한 후에 소정의 수준의 20%를 넘게 차이나지 않는 수준의 단백질을 포함하는 단계를 포함하며,
    그럼으로써 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후의 세포 또는 대상체 내의 단백질의 수준과 비교하여 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후의 세포 또는 대상체 내의 단백질의 발현 수준을 유지하며; 선택적으로 제1 조성물을 제공하는 단계는 대상체 내의 제1 세포에 대해 이루어지고, 제2 조성물을 제공하는 단계는 대상체 내의 제2 세포에 대하여 이루어지며, 제1 세포 및 제2 세포는 동일한 세포이거나 상이한 세포인, 방법.
  14. 제11항 또는 제12항에 있어서, 제2 조성물을 제공하는 단계가 제1 조성물을 제공한 후에, 그리고
    (i) 제1 조성물에 의해 발현되는 단백질의 제1 수준이 상기 세포 또는 대상체에서 실질적으로 검출 불가능하게 되기 전에; 및/또는
    (ii) 제1 조성물에 의해 발현되는 단백질의 제1 수준이 상기 세포 또는 대상체에서 50% 초과로 감소하기 전에; 및/또는
    (iii) 제1 조성물에 의해 발현되는 단백질의 제1 수준이 상기 세포 또는 대상체에서 25% 내지 75% 감소하기 전에 발생하는 방법.
  15. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제3 조성물을 제2 조성물 이후에 세포 또는 대상체에게 제공함으로써, 세포 또는 대상체에서 단백질의 발현을 적어도 제1 수준의 단백질로 유지하는 단계를 추가로 포함하며, 그리고 선택적으로 제3 조성물을 제공하는 단계는 제2 조성물을 제공한 후에, 그리고 (i) 제1 및 제2 조성물에 의해 발현되는 단백질의 제2 수준이 세포 또는 대상체에서 실질적으로 검출 불가능하게 되기 전에, 또는 (ii) 세포 또는 대상체에서 제1 및 제2 조성물에 의해 발현되는 단백질의 제2 수준이 50% 초과로 감소하기 전에 발생하는, 방법.
  16. 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9 또는 제10 조성물을 제공하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  17. 제13항, 제15항, 또는 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 조성물은
    (i) 제1 조성물에 의해 발현된 세포 또는 대상체 내의 단백질의 수준이 실질적으로 검출 불가능하게 된 지 적어도 1분, 1시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 7일, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 12개월, 13개월, 14개월, 15개월, 16개월, 17개월, 18개월, 19개월, 20개월, 21개월, 또는 22개월 후에, 또는
    (ii) 제1 조성물의 적어도 14일 이후 그리고 제1 조성물의 90일 이하 이후에 세포 또는 대상체에게 제공되는, 방법.
  18. 제12항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 수준의 단백질은
    (i) 제1 조성물을 제공한 후 1일째의 단백질의 가장 높은 수준, 및/또는
    (ii) 단백질의 제1 수준이 제1 조성물을 제공한 지 하루 후의 단백질의 최고 수준의 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%인, 방법.
  19. 제18항에 있어서,
    (i) 단백질의 제2 수준은 제2 조성물의 제공 이후 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 또는 30 일 동안 제1 조성물을 제공한 지 하루 후의 단백질의 최고 수준의 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 또는 130%임; 및/또는,
    (ii) 단백질의 제3 수준은 제3 조성물의 제공 이후 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 또는 30 일 동안 제1 조성물을 제공한 지 하루 후의 단백질의 최고 수준의 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 또는 130%임; 및/또는
    (iii) 제1 조성물의 제공 이후의 후속 조성물 각각에 대해, 각각의 후속 조성물 이후 발현된 단백질의 후속 수준은 각각의 후속 조성물의 제공 이후 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 또는 30 일 동안 제1 조성물을 제공한 지 하루 후의 단백질의 최고 수준의 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 또는 130%임; 및/또는
    (iv) 제2 조성물을 제공한 후의 단백질의 평균 수준은 제1 수준의 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 또는 110%이며, 단백질의 평균 수준은 제2 조성물을 제공한 후 1일째부터 단백질이 실질적으로 검출 불가능한 날까지 측정됨; 및/또는
    (v) 제1 조성물 이후 각각의 후속 조성물을 제공한 후의 단백질의 평균 수준은 제1 수준의 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 또는 110%이며, 단백질의 평균 수준은 각각의 후속 조성물을 제공한 후 1일째부터 단백질이 실질적으로 검출 불가능한 날까지 측정됨; 및/또는
    (vi) 단백질의 제1 수준은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후 제1 조성물의 제공 이후 적어도 6시간, 1일, 2일, 3일, 5일, 7일, 14일, 21일, 28일, 또는 30일 동안 유지됨; 및/또는
    (vii) 단백질의 제1 수준은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물, 제2 조성물, 및 제3 조성물을 제공한 이후 제1 조성물의 제공 이후 적어도 6시간, 1일, 2일, 3일, 5일, 7일, 14일, 21일, 28일, 또는 30일 동안 유지됨; 및/또는
    (viii) 제2 조성물을 제공한 이후의 세포 또는 대상체 내의 단백질의 제2 수준은 제1 조성물을 제공한 이후 세포 또는 대상체 내의 단백질의 제1 수준보다 적어도 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 60% 높음; 및/또는
    (ix) 제3 조성물을 제공한 이후의 세포 또는 대상체 내에서 생성된 단백질의 제3 수준은 제1 조성물을 제공한 이후 복수의 단백질의 제1 수준보다 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 60% 높음; 및/또는
    (x) 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 제공한 지 1시간, 12시간, 18시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 15일, 20일, 25일, 30일, 40일, 또는 45일 이후의 단백질의 제2 수준은 제1 조성물을 제공한 이후의 단백질의 제1 수준보다 적어도 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 60% 높음; 및/또는
    (xi) 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제3 조성물을 제공한 지 1시간, 12시간, 18시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 15일, 20일, 25일, 또는 30일 이후의 단백질의 제3 수준은 제1 조성물을 제공한 이후의 단백질의 제1 수준보다 적어도 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 60% 높은, 방법.
  20. 제13항 또는 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물이 제공된 후의 세포 또는 대상체 내의 단백질의 수준은 적어도 1시간, 12시간, 18시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 15일, 20일, 25일, 또는 30일 동안 유지됨; 및/또는
    (ii) 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후의 세포 또는 대상체 내의 단백질의 수준은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후 세포 또는 대상체 내의 단백질의 수준보다 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 60% 높음; 및/또는
    (iii) 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후의 세포 또는 대상체 내의 단백질의 수준은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 제공한 이후 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 15일, 20일, 25일, 또는 30일 동안 원형의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후의 세포 또는 대상체 내의 단백질의 수준보다 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 60% 높은, 방법.
  21. 제11항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질은 치료적 단백질, 예를 들어, 에리트로포이에틴이며, 그리고/또는 단백질(예를 들어, 에리트로포이에틴)의 발현은 세포 또는 대상체에서 반응(예를 들어, 망상적혈구 생성)을 유도하는, 방법.
  22. 세포 또는 대상체에서의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 생산 방법으로서:
    (a) 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제1 조성물을 세포 또는 대상체에 제공하는 단계로서, 세포 또는 대상체는 제1 조성물을 제공한 이후의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 수준을 포함하는 단계; 및
    (b) 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 세포 또는 대상체에게 제공하는 단계로서, 세포 또는 대상체가 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 수준을 포함하며
    (i) 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 수준이 적어도 제1 수준만큼이거나,
    (ii) 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 수준이 제2 조성물을 제공한 이후 제1 수준의 20%를 넘게 차이나지 않는 단계를 포함하며;
    그럼으로써 세포 또는 대상체 내의 원형 폴리리보뉴클레오티드를 적어도 제1 수준으로 유지하며; 선택적으로, 제1 조성물은 제1 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하고 제2 조성물은 제2 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하며:
    (i) 제1 원형 폴리리보뉴클레오티드와 제2 원형 폴리리보뉴클레오티드는 동일하거나; 또는
    (ii) 제1 원형 폴리리보뉴클레오티드와 제2 원형 폴리리보뉴클레오티드는 상이하며;
    선택적으로, 제1 원형 폴리리보뉴클레오티드는 제1 결합 부위를 포함하고/하거나 제1 단백질을 인코딩하며, 제2 원형 폴리리보뉴클레오티드는 제2 결합 부위를 포함하고/하거나 제2 단백질을 인코딩하며, 제1 결합 부위 및 제2 결합 부위는 동일하거나 상이한 결합 부위이고/이거나 제1 단백질 및 제2 단백질은 동일한 단백질 또는 상이한 단백질을 인코딩하는, 방법.
  23. 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 후의 세포 또는 대상체에서의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 수준과 비교하여 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 세포 또는 대상체에게 제공한 후의 세포 또는 대상체에서의 소정의 수준의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 생성 방법으로서:
    (a) 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물을 세포 또는 대상체에 제공하는 단계로서, 세포 또는 대상체가 제1 조성물을 제공한 이후의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준을 포함하는 단계; 및
    (b) 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 세포 또는 대상체에게 제공하는 단계로서, 세포 또는 대상체가 (i) 적어도 제2 조성물을 제공한 이후의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준, 또는 (ii) 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준의 20%를 넘게 차이나지 않는 제2 조성물을 제공한 이후의 단백질의 수준을 포함하는 단계를 포함하며;
    그럼으로써 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후의 세포 또는 대상체 내의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준과 비교하여 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후의 세포 또는 대상체 내의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준을 유지하는, 방법.
  24. 제22항에 있어서, 제2 조성물을 제공하는 단계는 제1 조성물을 제공한 후에, 그리고 제1 조성물을 제공함으로써 생성되는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준이 상기 세포 또는 대상체에서 실질적으로 검출 불가능하게 되기 전에 발생하는, 방법.
  25. 제24항에 있어서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 제공하는 단계는 제1 조성물 이후에, 그리고 제1 조성물에 의해 생성되는 세포 또는 대상체에서의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준이 실질적으로 검출 불가능하게 된 후에 발생하는, 방법.
  26. 제23항 또는 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 조성물은
    (i) 제1 조성물에 의해 생성된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준이 실질적으로 검출 불가능하게 된 지 적어도 1분, 1시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 7일, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 12개월, 13개월, 14개월, 15개월, 16개월, 17개월, 18개월, 19개월, 20개월, 21개월, 또는 22개월 후에, 또는
    (ii) 제1 조성물의 적어도 14일 이후 그리고 제1 조성물의 90일 이하 이후에 세포 또는 대상체에게 제공되는, 방법.
  27. 제22항 또는 제24항에 있어서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제3 조성물을 제2 조성물 이후에 상기 세포 또는 대상체에게 제공함으로써, 제3 조성물을 제공한 후에 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준을 적어도 제1 수준으로 유지하는 단계를 추가로 포함하며, 선택적으로, 제3 조성물을 제공하는 단계가 제2 조성물을 제공한 후에, 그리고
    (i) 상기 세포 또는 대상체에서 제1 및 제2 조성물에 의해 생성되는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준이 상기 세포 또는 대상체에서 실질적으로 검출 불가능하게 되기 전에, 또는
    (ii) 상기 세포 또는 대상체에서 제1 및 제2 조성물에 의해 생성되는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준이 50% 넘게 감소하기 전에; 또는
    (iii) 상기 세포 또는 대상체에서 제1 및 제2 조성물에 의해 생성되는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준이 상기 세포 또는 대상체에서 25% 내지 75% 감소하기 전에 발생하는, 방법.
  28. 제22항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9 또는 제10 조성물을 세포 또는 대상체에게 제공하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  29. 제22항, 제24항, 제27항, 또는 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 수준은 제1 조성물을 제공한 후 1일째의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 가장 높은 수준임; 및/또는
    (ii) 제1 조성물의 제공 이후의 후속 조성물 각각에 대해, 각각의 후속 조성물 이후 발현된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 후속 수준은 각각의 후속 조성물의 제공 이후 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 또는 30 일 동안 제1 조성물을 제공한 지 하루 후의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 최고 수준의 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 또는 130%임; 및/또는
    (ii) 제2 조성물을 제공한 후의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 평균 수준은 제1 수준의 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%이며, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 평균 수준은 제2 조성물을 제공한 후 1일째부터 원형 폴리리보뉴클레오티드가 실질적으로 검출 불가능한 날까지 측정됨; 및/또는
    (iii) 제1 조성물 이후 각각의 후속 조성물을 제공한 후의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 평균 수준은 제1 수준의 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%이며, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 평균 수준은 각각의 후속 조성물을 제공한 후 1일째부터 원형 폴리리보뉴클레오티드가 실질적으로 검출 불가능한 날까지 측정됨; 및/또는
    (iv) 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 수준은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물이 제공된 후 적어도 6시간, 1일, 2일, 3일, 5일, 7일, 14일, 21일, 28일, 또는 30일 동안 유지됨; 및/또는
    (v) 제2 조성물을 제공한 이후의 세포 또는 대상체 내의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 수준은 제1 조성물을 제공한 이후 세포 또는 대상체 내의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 수준보다 적어도 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 60% 높음; 및/또는
    (vi) 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 제공한 지 1시간, 12시간, 18시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 15일, 20일, 25일, 또는 30일 이후의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 수준은 제1 조성물을 제공한 이후의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 수준보다 적어도 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 60% 높은, 방법.
  30. 제27항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제3 조성물을 제공한 지 1시간, 12시간, 18시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 15일, 20일, 25일, 또는 30일 이후의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제3 수준은 제1 조성물을 제공한 이후의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 수준보다 적어도 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 60% 높은, 방법.
  31. 제23항, 제25항, 제26항, 또는 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물이 제공된 후의 세포 또는 대상체 내의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준은 적어도 1시간, 12시간, 18시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 15일, 20일, 25일, 또는 30일 동안 유지됨; 및/또는
    (ii) 제1 조성물에 의해 생산된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준은 제1 조성물을 제공한 지 하루 후의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 최고 수준의 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%임; 및/또는
    (iii) 제2 조성물에 의해 생성된 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준이 제2 조성물의 제공 이후 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 또는 30일 동안 제1 조성물을 제공한 지 하루 후의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 최고 수준의 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 또는 130%임; 및/또는
    (iv) 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후의 세포 또는 대상체 내의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후 세포 또는 대상체 내의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 수준보다 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 60% 높음; 및/또는
    (v) 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 수준은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 제공한 이후 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 15일, 20일, 25일, 또는 30일 동안 원형의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 수준보다 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 60% 높은, 방법.
  32. 제27항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제3 수준이 제3 조성물의 제공 이후 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 또는 30 일 동안 제1 조성물을 제공한 지 하루 후의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 최고 수준의 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 또는 130%인, 방법.
  33. 제27항 내지 제29항, 또는 제32항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 수준은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제3 조성물이 제공된 후 적어도 6시간, 1일, 2일, 3일, 5일, 7일, 14일, 21일, 28일, 또는 30일 동안 유지됨; 및/또는
    (ii) 제3 조성물을 제공한 이후의 세포 또는 대상체 내의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제3 수준은 제1 조성물을 제공한 이후 복수의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 수준보다 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 60% 높음; 및/또는
    (iii) 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제3 조성물을 제공한 지 1시간, 12시간, 18시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 15일, 20일, 25일, 또는 30일 이후의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제3 수준은 제1 조성물을 제공한 이후의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 수준보다 적어도 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 60% 높은, 방법.
  34. 제22항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질(예를 들어, 에리트로포이에틴)은 대상체에서 반응(예를 들어, 망상적혈구의 생성)을 유도하는, 방법.
  35. 세포 또는 대상체 내의 표적의 결합 방법으로서,
    (a) 표적에 대한 결합 부위를 포함하는 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제1 조성물을 세포 또는 대상체에게 제공하는 단계로서, 상기 표적이 제1 수준으로 상기 결합 부위에 결합하는 단계; 및
    (b) 표적에 대한 결합 부위를 포함하는 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 제2 조성물을 세포 또는 대상체에게 제공하는 단계로서, 상기 표적이 제2 수준으로 상기 결합 부위에 결합하며, (i) 제2 수준이 적어도 제1 수준만큼이거나, (ii) 제2 수준이 제1 수준의 20%를 넘게 차이나지 않는 단계를 포함하며;
    그럼으로써 세포 또는 대상체 내의 표적의 결합을 적어도 결합의 제1 수준으로 유지하는, 방법.
  36. 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 후의 세포 또는 대상체에서의 표적으로의 결합의 수준과 비교하여 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 세포 또는 대상체에게 제공한 후의 세포 또는 대상체에서의 표적의 결합 방법으로서,
    (a) 결합 부위를 포함하는 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물을 세포 또는 대상체에게 제공하는 단계로서, 상기 세포 또는 대상체가 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물을 제공한 후에 소정의 수준의 표적으로의 결합을 포함하는 단계; 및
    (b) 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 제1 조성물 이후에 세포 또는 대상체에게 제공하는 단계로서, 상기 세포 또는 대상체가 (i) 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 제공한 후에 적어도 상기 수준의 표적으로의 결합, 또는 (ii) 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 제공한 후에 상기 수준의 20%를 넘게 차이나지 않는 수준의 표적으로의 결합을 포함하는 단계를 포함하며;
    그럼으로써 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후의 세포 또는 대상체 내의 표적에 대한 결합 수준과 비교하여 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후의 세포 또는 대상체 내의 표적에 대한 결합 수준을 유지하는, 방법.
  37. 제35항에 있어서, 제2 조성물을 제공하는 단계는 제1 조성물을 제공한 후에, 그리고 (i) 제1 조성물에 의한 결합의 제1 수준이 상기 세포 또는 대상체에서 실질적으로 검출 불가능하게 되기 전에, 또는 (ii) 제1 조성물에 의한 결합의 제1 수준이 세포 또는 대상체에서 50% 초과로 감소하기 전에, 또는 (iii) 제1 조성물에 의한 결합의 제1 수준이 세포 또는 대상체에서 25% 내지 75% 감소하기 전에 발생하는, 방법.
  38. 제35항 또는 제37항에 있어서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제3 조성물을 제2 조성물 이후에 세포 또는 대상체에게 제공함으로써, 상기 세포 또는 대상체에서 상기 표적의 결합을 적어도 제1 수준의 결합으로 유지하는 단계를 추가로 포함하며, 제3 조성물을 제공하는 단계가 제2 조성물을 제공한 후에, 그리고 제1 및 제2 조성물에 의한 상기 세포 또는 대상체에서의 표적의 결합의 제2 수준이 상기 세포 또는 대상체에서 실질적으로 검출 불가능하게 되기 전에 발생하는, 방법.
  39. 제38항에 있어서, 제3 조성물을 제공하는 단계는 제2 조성물을 제공한 후에, 그리고 상기 세포 또는 대상체에서의 제1 및 제2 조성물에 의한 결합의 제2 수준이 50% 초과로 감소하기 전에 발생하는, 방법.
  40. 제35항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9 또는 제10 조성물을 제공하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  41. 제36항 또는 제38항에 있어서,
    (i) 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 제공하는 단계가 제1 조성물 이후에, 그리고 제1 조성물에 의한 상기 결합의 수준이 실질적으로 검출 불가능하게 된 후에 발생함; 및/또는
    (ii) 제2 조성물은 제1 조성물에 의한 결합의 수준이 실질적으로 검출 불가능하게 된 지 적어도 6시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 7일, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 12개월, 13개월, 14개월, 15개월, 16개월, 17개월, 18개월, 19개월, 20개월, 21개월, 또는 22개월 후에 세포 또는 대상체에 제공됨; 및/또는
    (iii) 제2 조성물은 제1 조성물 이후 14일째에, 그리고 제1 조성물 이후 90일 이내에 상기 세포 또는 대상체에게 제공되는, 방법.
  42. 제35항 또는 제37항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 결합의 제1 수준은 제1 조성물을 제공한 후 1일째의 결합의 가장 높은 수준임; 및/또는
    (ii) 결합의 제1 수준은 제1 조성물을 제공한 지 하루 후의 결합의 최고 수준의 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%임; 및/또는
    (iii) 결합의 제2 수준은 제2 조성물의 제공 이후 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 또는 45 일 동안 제1 조성물을 제공한 지 하루 후의 결합의 최고 수준의 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 또는 130%임; 및/또는
    (iv) 결합의 제3 수준은 제3 조성물의 제공 이후 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 또는 30 일 동안 제1 조성물을 제공한 지 하루 후의 결합의 최고 수준의 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 또는 130%임; 및/또는
    (v) 제1 조성물의 제공 이후의 후속 조성물 각각에 대해, 각각의 후속 조성물 이후 결합의 후속 수준이 각각의 후속 조성물의 제공 이후 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 또는 30 일 동안 제1 조성물을 제공한 지 하루 후의 결합의 최고 수준의 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 또는 130%임; 및/또는
    (vi) 제2 조성물을 제공한 후의 결합의 평균 수준은 제1 수준의 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 또는 110%이며, 결합의 평균 수준은 제2 조성물을 제공한 후 1일째부터 결합이 실질적으로 검출 불가능한 날까지 측정됨; 및/또는
    (vii) 제1 조성물 이후 각각의 후속 조성물을 제공한 후의 결합의 평균 수준은 제1 수준의 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 또는 110%이며, 결합의 평균 수준은 각각의 후속 조성물을 제공한 후 1일째부터 결합이 실질적으로 검출 불가능한 날까지 측정됨; 및/또는
    (viii) 결합의 제1 수준은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후 제1 조성물의 제공 이후 적어도 6시간, 1일, 2일, 3일, 5일, 7일, 14일, 21일, 28일, 또는 30일 동안 유지됨; 및/또는
    (ix) 제2 조성물을 제공한 이후의 세포 또는 대상체 내의 결합의 제2 수준은 제1 조성물을 제공한 이후 세포 또는 대상체 내의 결합의 제1 수준보다 적어도 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 60% 높음;
    (x) 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 제공한 지 1시간, 12시간, 18시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 15일, 20일, 25일, 또는 30일 이후의 결합의 제2 수준은 제1 조성물을 제공한 이후의 결합의 제1 수준보다 적어도 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 60% 높은, 방법.
  43. 제36항 또는 제41항에 있어서,
    (i) 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물이 제공된 후의 세포 또는 대상체 내의 결합의 수준은 적어도 1시간, 12시간, 18시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 15일, 20일, 25일, 또는 30일 동안 유지됨; 및/또는
    (ii) 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후의 세포 또는 대상체 내의 결합의 수준은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후 세포 또는 대상체 내의 결합의 수준보다 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 60% 높음; 및/또는
    (iii) 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후의 세포 또는 대상체 내의 결합의 수준은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제2 조성물을 제공한 이후 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 15일, 20일, 25일, 또는 30일 동안 원형의 선형 대응물의 제1 조성물 및 제2 조성물을 제공한 이후의 세포 또는 대상체 내의 결합의 수준보다 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 60% 높은, 방법.
  44. 제38항 내지 제40항, 또는 제42항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 결합의 제1 수준은 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제1 조성물, 제2 조성물, 및 제3 조성물을 제공한 이후 제1 조성물의 제공 이후 적어도 6시간, 1일, 2일, 3일, 5일, 7일, 14일, 21일, 28일, 또는 30일 동안 유지됨; 및/또는
    (ii) 제3 조성물을 제공한 이후의 세포 또는 대상체 내의 결합의 제3 수준은 제1 조성물을 제공한 이후 결합의 제1 수준보다 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 60% 높음;
    (iii) 원형 폴리리보뉴클레오티드의 제3 조성물을 제공한 지 1시간, 12시간, 18시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 15일, 20일, 25일, 또는 30일 이후의 결합의 제3 수준은 제1 조성물을 제공한 이후의 결합의 제1 수준보다 적어도 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 60% 높은, 방법.
  45. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 제1 조성물의 원형 폴리리보뉴클레오티드와 제2 조성물의 원형 폴리리보뉴클레오티드는 동일하거나; 또는
    (ii) 제1 조성물의 원형 폴리리보뉴클레오티드와 제2 조성물의 원형 폴리리보뉴클레오티드는 상이한, 방법.
  46. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 제1 조성물 및 제2 조성물은 거의 동일한 양의 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함함; 또는
    (ii) 제1 조성물은 제2 조성물보다 많은 양의 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함함; 및/또는
    (iii) 제1 조성물은 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9 또는 제10 조성물보다 더 많은 양의 원형 폴리리보뉴클레오티드를 포함함; 및/또는
    (iv) 제2 조성물의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 양이 제1 조성물의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 양의 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 또는 25%를 넘게 차이나지 않음.
    (v) 제2 조성물의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 양이 제1 조성물의 원형 폴리리보뉴클레오티드의 양보다 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 또는 25% 이하로 적음; 및/또는
    (vi) 제1 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 추가로 포함함; 및/또는
    (vii) 제2 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 추가로 포함함; 및/또는
    (viii) 제3 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 추가로 포함함; 및/또는
    (x) 세포는 동물 세포(예를 들어, 포유동물 세포, 예를 들어, 인간 세포)임; 및/또는
    (xi) 세포는 대상체 내의 복수의 세포임
    (xii) 제1 조성물 및/또는 제2 조성물은 1 ng/㎖, 5 ng/㎖, 10 ng/㎖, 15 ng/㎖, 20 ng/㎖, 25 ng/㎖, 30 ng/㎖, 35 ng/㎖, 40 ng/㎖, 50 ng/㎖, 60 ng/㎖, 70 ng/㎖, 80 ng/㎖, 90 ng/㎖, 100 ng/㎖, 200 ng/㎖, 300 ng/㎖, 400 ng/㎖, 500 ng/㎖, 600 ng/㎖, 1 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖, 200 g/㎖, 300 ㎍/㎖, 400 ㎍/㎖, 500 ㎍/㎖, 600 ㎍/㎖, 700 ㎍/㎖, 800 ㎍/㎖, 900 ㎍/㎖, 1 ㎎/㎖, 1.5 ㎎/㎖ 또는 2 ㎎/㎖ 이하의 선형 폴리리보뉴클레오티드 분자를 포함함;
    (xiii) 제1 조성물 및/또는 제2 조성물은, 제1 조성물 및/또는 제2 조성물 내의 총 리보뉴클레오티드 분자에 비해 적어도 30%(w/w), 40%(w/w), 50%(w/w), 60%(w/w), 70%(w/w), 80%(w/w), 85%(w/w), 90%(w/w), 91%(w/w), 92%(w/w), 93%(w/w), 94%(w/w), 95%(w/w), 96%(w/w), 97%(w/w), 98%(w/w) 또는 99%(w/w)의 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자를 포함함; 및/또는
    (xiv) 제1 조성물 및/또는 제2 조성물 내의 총 리보뉴클레오티드 분자의 적어도 30%(w/w), 40%(w/w), 50%(w/w), 60%(w/w), 70%(w/w), 80%(w/w), 85%(w/w), 90%(w/w), 91%(w/w), 92%(w/w), 93%(w/w), 94%(w/w), 95%(w/w), 96%(w/w), 97%(w/w), 98%(w/w) 또는 99%(w/w)가 원형 폴리리보뉴클레오티드 분자인, 방법.
  47. 제11항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 동물(예를 들어, 포유동물)인, 방법.
  48. 제11항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 인간인, 방법.
  49. 제1항, 제11항, 제12항, 및 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질은 항원(예를 들어, 종양 항원, 박테리아 항원, 바이러스 항원)인, 방법.

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