CN110437334B

CN110437334B - 全人源抗金黄色葡萄球菌α-溶血素重组抗体

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Publication number: CN110437334B
Application number: CN201910681843.5A
Authority: CN
Inventors: 袁青; 年四季; 李春; 于红; 叶迎春
Original assignee: Southwest Medical University
Current assignee: Southwest Medical University
Priority date: 2019-07-26
Filing date: 2019-07-26
Publication date: 2020-12-01
Anticipated expiration: 2039-07-26
Also published as: CN110437334A

Abstract

本发明公开了一种抗金黄色葡萄球菌α‑溶血素单链抗体scFv2或scFv46；还公开了一种抗金黄色葡萄球菌α‑溶血素重组抗体scFv2‑Fc或scFv46‑Fc，包含前述的scFv2或scFv46和人抗体恒定区Fc段氨基酸序列；还公开了一种全人源抗金黄色葡萄球菌α‑溶血素重组抗体的通用表达载体sp‑Fc/pcDNA3.1，其编码基因的核酸序列如SEQ ID No:13所示；还公开了一种全人源抗金黄色葡萄球菌α‑溶血素重组抗体的真核表达载体，是将前述的单链抗体插入sp‑Fc/pcDNA3.1中得到；还公开了重组表达载体sp‑scFv2‑Fc/pMH3或sp‑scFv46‑Fc/pMH3。

Description

全人源抗金黄色葡萄球菌α-溶血素重组抗体

技术领域

本发明涉及抗体工程技术领域，具体涉及一种全人源抗金黄色葡萄球菌α-溶血素重组抗体。

背景技术

金黄色葡萄球菌是一种主要的革兰氏阳性致病菌，其感染可造成危及生命的严重疾病，如肺炎、菌血症、心内膜炎等。抗生素是长期以来治疗金黄色葡萄球菌感染的主要有效方式。但随着世界范围内抗生素、消毒剂滥用以及抗生素残留向环境释放的情况越来越严重，致病性强、传播途径广的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)已成为全球院内感染的首要病原菌。万古霉素中间体金黄色葡萄球菌(VISA)菌株和高度耐万古霉素的金黄色葡萄球菌(VRSA)菌株的出现为临床控制金葡菌感染带来更严峻的考验。因此，研发新的抗金黄色葡萄球菌的药物迫在眉睫，发现新的有效药物靶点已经成为了当前研发的新热点。

α-溶血素(α-Hemolysin,α-HL)是金黄色葡萄球菌分泌的主要毒力因子之一，是一种细胞外毒素。α-HL的前体由319个氨基酸组成，其前体能够在宿主细胞膜上结合并寡聚形成一个相对分子质量为2.32×10⁵的七聚体，再通过折叠形成一个β桶状的跨模区域，此区域允许分子量小于2kDa的分子通过，如K⁺、Na⁺等，最终引起靶细胞的坏死。同时，α-HL引起的细胞信号通路改变也发挥着重要作用。敲除α-HL基因的金黄色葡萄球菌菌株感染的肺炎小鼠表现出致死率显著降低。

近年来，生物医药彻底改变了医药工业，为那些传统治疗失败或以前没有治疗选择的患者带来了新希望。单克隆抗体药物的发展经历了鼠源性单克隆抗体、嵌合型单克隆抗体、人源化单克隆抗体和全人源单克隆抗体的四个阶段。虽然单克隆抗体具有纯度高、效价高、特异性强、结构均一、血清交叉反应少、制备成本低等多种优点，但以小鼠为细胞来源的抗体可使人体产生人抗鼠抗体反应(HAMA)，从而会削弱单克隆抗体的治疗作用，甚至导致机体的免疫病理损伤。因此，高亲和力、高特异性、毒副作用小的全人源基因工程抗体是当前重组抗体技术研发的趋势所在。

人源化抗体是在嵌合抗体的基础上减少鼠源成分，保留鼠抗体CDR区，其余全部替换成人抗体相应部分，经过改型抗体，人源成分达90％即为所指的人源化抗体。在疾病治疗中，人源化抗体优于鼠源抗体，不仅因为抗体中鼠源性成分的减少降低了机体的免疫排斥反应，还在于人源化抗体中Fc段能够诱发机体的效应技能募集效应因子或效应细胞，后者对靶细胞具有杀伤作用。还有一个优点在于人源化抗体在体内的半衰期可达数天，而鼠源抗体的半衰期则不到20h。单链抗体(single chainantibodyfragment，scFv)，是由抗体重链可变区和轻链可变区通过15～20个氨基酸的短肽(linker)连接而成的抗体。scFv能较好地保留其对抗原的亲和活性,并具有分子量小、穿透力强和抗原性弱等特点。重组抗体药物是生物医药领域的研发热点，代表了药物治疗领域的最新发展方向。高亲和力、高特异性、毒副作用小的全人源基因工程抗体是当前重组抗体技术研发的趋势所在。

scFv抗体比完整抗体具有更好的细胞穿透性。然而，单价结合的单链抗体体积太小，亲和力低，限制了单链抗体的快速清除效果。因此，科学家们用重组抗体技术开发了不同形式的小抗体。Fc片段与Fc受体的相互作用可以延长含Fc蛋白的半衰期。此外，Fc片段还参与了抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)作用。Fc相关的生物特性(FcRn结合能力、ADCC和CDC)可以通过对Fc残基的定点突变进行调整。因此，scFv-Fc抗体不仅可以作为诊断的工具，也可以作为治疗的手段。

噬菌体展示技术在药用单克隆抗体研究上运用得最为成熟和高效。噬菌体展示技术是从脾细胞、外周血淋巴细胞等提取mRNA，逆转录成cDNA，利用PCR技术分别扩增出抗体的重链及轻链基因，按一定的方式将两者连接克隆到表达载体上，并在适当的宿主细胞中表达成有功能的抗体分子，从而利用抗原-抗体特异性结合进行筛选、扩增，再用亲和层析等手段纯化抗体片段。使用噬菌体展示技术制备的抗金黄色葡萄球菌α-HL全人源重组抗体药物作为一个全新的治疗方式，具有极大临床应用潜能。

近几年，美国食品和药物管理局(FDA)批准应用于临床的抗体药物也多为人源化单克隆抗体和全人源单克隆抗体。并且，在没有针对金黄色葡萄球菌α-HL抗体药物被成功研发的情形之下，研发的多种多个抗体可能对应不同的适应症。目前，阿斯利康旗下的MedImmune生物制药公司研发的抗金黄色葡萄球菌α-HL单克隆抗体MED14893于2018年12月完成二期临床试验。但至今没有成功上市的该领域抗体。目前，国内该领域依然缺乏自主研发的抗金黄色葡萄球菌α-HL的全人源抗体。

发明内容

本发明的目的是针对上述问题提供一种全人源抗金黄色葡萄球菌α-溶血素重组抗体及其通用表达载体、真核表达载体和重组表达载体。

本发明解决其技术问题采用的技术方案：

一种抗金黄色葡萄球菌α-溶血素单链抗体，所述单链抗体为scFv2或scFv46，所述scFv2的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID No:4所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID No:5所示；所述scFv46的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID No:6所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID No:7所示。

所述scFv2或scFv46的重链可变区与轻链可变区由连接肽linker连接，所述连接肽linker的氨基酸序列为(Gly₄Ser)₃。

一种抗金黄色葡萄球菌α-溶血素重组抗体，所述全人源抗体为scFv2-Fc或scFv46-Fc，所述scFv2-Fc的氨基酸序列包含权利要求2所述的scFv2和人抗体恒定区Fc段氨基酸序列；所述scFv46-Fc的氨基酸序列包含权利要求2所述的scFv46和人抗体恒定区Fc段氨基酸序列；所述人抗体恒定区Fc段氨基酸序列如SEQ ID No:26所示。

一种全人源抗金黄色葡萄球菌α-溶血素重组抗体的通用表达载体，所述载体为sp-Fc/pcDNA3.1，其编码基因的核酸序列如SEQ ID No:13所示。

一种全人源抗金黄色葡萄球菌α-溶血素重组抗体的真核表达载体，所述真核表达载体由将上述的抗金黄色葡萄球菌α-溶血素单链抗体的序列插入通用表达载体sp-Fc/pcDNA3.1中得到，得到的真核表达载体为sp-scFv2-Fc/pcDNA3.1或sp-scFv46-Fc/pcDNA3.1。

一种全人源抗金黄色葡萄球菌α-溶血素重组抗体的重组表达载体，所述重组载体为sp-scFv2-Fc/pMH3或sp-scFv46-Fc/pMH3，是通过以下方法构建得到：以权利要求5所述的sp-scFv2-Fc/pcDNA3.1或sp-scFv46-Fc/pcDNA3.1为模板，采用sp-scFv-Fc片段扩增引物扩增sp-scFv2-Fc片段或sp-scFv46-Fc片段，将得到的扩增片段插入pMH3载体即得。

所述sp-scFv-Fc片段扩增引物为sp-EcoRI-F、Fc-NotI-R，sp-EcoRI-F的序列如SEQ ID No:22所示，Fc-NotI-R的序列如SEQ ID No:23所示。

所述扩增片段插入pMH3载体的方法为先将以sp-scFv2-Fc/pcDNA3.1或sp-scFv46-Fc/pcDNA3.1模板扩增得到的sp-scFv2-Fc或sp-scFv46-Fc片段和pMH3载体采用EcoRI和NotI双酶切后进行连接。

本发明的有益效果是：

(1)制备的抗金黄色葡萄球菌α-溶血素全人源单链抗体具有穿透性强，分子量小，便于操作，且最大程度地降低甚至消除人抗鼠抗体反应的特点，同时保留了天然抗体的主要生物学活性和特异性，去除或减少了无关结构。

(2)为了构建scFv-Fc，一些研究人员利用重叠PCR技术将编码这两个片段的DNA序列连接起来，然后将scFv-Fc融合片段插入到表达载体中。然而，本申请通过包含sp和Fc片段的通用重组载体，在sp和Fc之间带有多克隆位点，可以将不同的scFv插入到sp-Fc/pcDNA3.1载体中，从而避免了重复重叠PCRs生成新的结构。以sp-scFv-Fc/pcDNA3.1模板扩增sp-scFv-Fc，并插入到高效表达载体pMH3中，构建了sp-scFv-Fc/pMH3重组表达载体，将所插入的scFv-Fcs抗体表达，验证其折叠的正确性和生物活性，证实本申请成功构建了高效表达scFv-Fcs的重组载体。载体pMH3具有来自鸡β-actin基因inrton-1的高GC含量，可显著提高蛋白的表达水平。两种重组载体的比较也验证了sp-scFv-Fc/pMH3重组载体可在真核系统中高效表达scFv-Fc重组抗体。细胞增殖与活性检测实验结果表明本申请得到的scFv-Fc 2，scFv-Fc 46重组抗体中和毒素能力显著，同时抗兔红细胞溶血实验表明sp-scFv2-Fc/pMH3重组载体表达的抗体可提供有效抗溶血保护。

附图说明

图1为随机从从天然全人源scFv抗体文库中挑取的部分克隆子小量表达后ELISA筛选阳性单链抗体。

图2为对筛选的15株阳性单链抗体进行初步鉴定，其中，A和B为Westernblot验证表达的15株单链抗体；C为ELISA检测筛选的单链抗体与金黄色葡萄球菌α-溶血素的结合活性；D为ELISA检测筛选的单链抗体与金黄色葡萄球菌结合的特异性。

图3为构建的重组载体的结构示意图，其中，A为sp-Fc/pcDNA3.1通用表达载体的结构示意图，B为sp-scFv-Fc/pcDNA3.1真核表达载体的结构示意图，C为sp-scFv-Fc/pMH3重组表达载体的结构示意图。

图4为表达、纯化和鉴定scFv-Fc结果，其中，A和B为荧光质粒PIRES2-EGFP转染HEK293F细胞对比结果；C和D为Westernblot检测表达的scFv2-Fc、scFv10-Fc、scFv46-Fc；E和F为分别以购买和自制的α-溶血素作为抗原ELISA检测scFv-Fc与抗原的结合活性；G为Westernblot鉴定表达具有中和活性的scFv2-Fc、scFv46-Fc；H为SDS-PAGE鉴定纯化的scFv2-Fc、scFv46-Fc。

图5为重组抗体功能验证结果，其中，A为细胞增殖与活性检测实验结果，B为抗体介导的抗兔红细胞溶血实验结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，但并不因此而限制本发明。

实施例1金黄色葡萄球菌重组蛋白抗原的制备

制备抗金黄色葡萄球菌α-HL的全人源抗体过程中需要大量抗原蛋白。为促进抗原蛋白的可溶性表达，利用p-ColdTF融合表达载体进行表达，该载体携带TF分子伴侣(48KD)，有利于新表达的多肽的共翻译折叠。此外，载体携带有多聚组氨酸标签(His-Tag)，有利于纯化蛋白。

煮沸法提取金黄色葡萄球菌总RNA，以总RNA为模板，Oliga dT₁₅为引物反转录得到cDNA。获取NCBI基因数据库中金黄色葡萄球菌α-HL基因序列，根据基因序列设计引物，采用巢氏PCR扩增α-HL。利用常规的分子生物学技术将合成的重组蛋白基因克隆至p-Cold TF融合表达载体中，在大肠杆菌表达体系中进行低温诱导表达24小时，然后通过离心收集细菌沉淀。超声裂解细菌，离心后收集上清，westernblot验证α-HL/p-Cold TF融合蛋白表达,金属螯合亲和层析柱对上清中的重组蛋白进行纯化。采用p-Cold TF表达系统表达的α-HL产量高，可达到2mg/100ml，可满足后续全人源抗α-HL抗体的筛选。

本实施例所用引物及具体实验步骤见文献：吴桐等，金黄色葡萄球菌α-溶血素的克隆及可溶性融合表达[J]，中国免疫学杂志，2016，32(4)：532-535。

实施例2利用噬菌体展示抗体库技术筛选抗金黄色葡萄球菌α-HL单链抗体

本实验室前期已构建了天然全人源scFv抗体文库，文库容量达到2.5×10⁸，多样性好。用α-HL生物素化蛋白作为抗原，采用免疫磁珠法对天然全人源scFv抗体文库进行噬菌体展示富集，从富集后的scFv抗体文库中随机挑选克隆子，进行单克隆子噬菌体扩增表达，对表达的scFv以抗M13-HRP单克隆抗体进行噬菌体ELISA检测。本实施例的具体实验步骤见：硕士学位论文“吴桐.金黄色葡萄球菌α-溶血素的克隆表达及抗HLA-α全人源单链抗体的筛选[D].四川：四川医科大学，2016”。

结果显示：经4轮噬菌体展示筛选后，特异性单链抗体得到富集。随机挑取的1000余个克隆子进行ELISA初筛，取2个不包被抗原的酶标孔作为阴性对照。结果显示，阴性对照OD450值约为0.05，部分克隆子与抗原有结合反应，其中OD450>0.8的阳性单链抗体占34％左右，图1为采用ELISA筛选出的部分克隆子。ELISA筛选出的抗α-HL单链抗体阳性克隆子进行大量表达后，提取质粒送测序，测序结果表明：15株单链抗体测序序列为开放阅读框，为连接肽linker(Gly₄Ser)₃(SEQ ID No:1)连接的VH和VL，说明从天然全人源单链抗体文库中成功筛选到抗金黄色葡萄球菌α-HL全人源单链抗体；后期实验验证有9个单链抗体表达良好具有生物学活性，其中3个的编号为scFv2、scFv10、scFv46。

实施例3抗α-HL单链抗体的初步鉴定

将实施例2中从天然全人源scFv抗体文库得到的OD₄₅₀值最高的单链抗体进行大量表达后按说明书提取质粒测序，测序结果正确的15株抗α-HL单链抗体插入原核表达载体pLZ16中进行可溶性表达验证。pLZ16载体为本实验室根据pUC质粒构建，含有FLAG和His-tag标签，在本实验室公开的一些文献中有报道，例如“王栩,袁青,叶迎春,等.抗IL-33全人源scFv-Fc抗体的可溶性表达与鉴定[J]现代免疫学,2016；36(6):462-465”。

一、PCR扩增scFv目的基因及验证

(1)反应液的配制(20μl体系)：Prime STAR GXL DNA Polymerase 0.4μl，dNTPMixture(2.5mM)1.6μl(终浓度为200μM)，5×GXL Buffer 4μl，10μm F(PKM167)1μl，10μm R(PKM180)1μl，scFv DNA(20ng/μl)1μl，加ddH₂O至20μl。引物PKM167、PKM180的序列为：PKM167：5’GGCTCGTATGTTGTGTGGA 3’(SEQ ID No:2)，PKM180:5’TAGCCCCCTTATTAGCGTTTG3’(SEQ ID No:3)。

(2)PCR反应程序：94℃2min；98℃10sec、55℃15sec、68℃1min，30个循环；68℃10min。

(3)1.5％的琼脂糖凝胶电泳。

二、scFv和pLZ16载体的双酶切

将成功扩增的PCR产物用QIAquick PCRpurification Kit试剂盒回收，用于双酶切。

(1)NotI酶切反应体系：NotI 1μl、10×H buffer 2μl、0.1％BSA 2μl、0.1％Tritonx-1002μl、scFv或pLZ16载体质粒≤1μg，加ddH₂O至20μl。

37℃水浴酶切2h，乙醇沉淀纯化后加入1×TE溶解。

(2)NcoI酶切反应体系：NcoI 1μl、10×Kbuffer 2μl、0.1％BSA2μl、scFv或pLZ16载体质粒≤1μg(用1×TE溶解的经NotI酶切后的DNA)，加ddH₂O至20μl。

37℃水浴酶切2h，最后半小时，加1.5μl CIP在pLZ16载体酶切反应体系中避免质粒环化；酶切完成后用QIA quick PCR purification Kit试剂盒直接回收并测定浓度，保存于-20℃。

三、scFv和pLZ16载体的连接转化及PCR鉴定

(1)scFv和pLZ16载体的T4连接：

酶切后的载体质粒50ng、酶切后的scFv片段(需符合摩尔比(质粒：抗体＝1:3)的量)、10×T4Ligase buffer 1μl、T4DNALigase 0.5μl，加ddH₂O至20μl，16℃连接反应16h。

(2)转化感受态E.coli DH5α

连接产物10μl与制备的感受态菌50μl轻柔混合，冰上放置30min；42℃水浴热击90sec，快速放置于冰上静置2min；每管加入900μl LB液体培养基，混匀后于37℃，180r/min震荡培养1h；5000rpm离心5min，移去大部分上清，重悬后涂布于LBA固体培养基，于37℃培养过夜。PCR验证scFv/pLZ16重组载体构建结果：随机挑取固体培养基中克隆子，将其溶于10μl ddH₂O中，取1μl用于用pLZ16载体引物PCR验证重组载体构建结果，即得到scFv/pLZ16重组载体。

四、scFv在pLZ16原核表达系统中的可溶性表达及验证

(1)将构建成功的scFv/pLZ16重组载体成功转化到E.coli DH5α的菌液接种到50ml LBAG液体培养基中，37℃，180r/min震荡培养至OD₆₀₀＝0.5；

(2)8000rpm离心15min收集细菌沉淀，用50ml LBA重悬并加入终浓度为1mmol/lIPTG于32℃诱导表达5h；

(3)8000rpm离心15min收集细菌沉淀，加入2ml 1×PBS重悬后冰上超声破碎；

(4)4℃，12000rpm离心15min，收集上清(表达粗提液)；

(5)Western blot验证scFv/pLZ16重组载体表达：将表达粗提液SDS-PAGE电泳后转印至PVDF膜上，封闭后加入抗Flag-HRP标记抗体，最后于凝胶成像系统扫描分析结果。

五、ELISA检测单链抗体的特异性

(1)抗原抗体结合活性检测

酶标板包被购买的α-HL，一抗为表达的scFvs粗提液，二抗使用抗Flag-HRP标记抗体，最后加入TMB显色液显色，于450nm处读取吸光值(A)。

(2)金黄色葡萄球菌特异性检测

包被金黄色葡萄球菌和白色葡萄球菌全菌，一抗为表达的scFvs粗提液，二抗为抗Flag-HRP标记抗体，最后加入TMB显色液显色，于450nm处读取吸光值(A)。

六、结果

噬菌体筛选载体表达蛋白量低，所以本申请将测序成功的15株单链抗体经NotI、NcoI双酶切后插入pLZ16载体质粒中，PCR验证scFvs插入正确。抗体经IPTG诱导表达后采用免疫印迹法进行验证，结果显示(图2)：15株单链抗体成功表达，目的蛋白大小约为30kDa(图2A和图2B)。Phage-ELISA大量筛选阳性单链抗体需大量抗原，申请人自行制备α-HL蛋白，进行phage-ELISA从天然全人源scFv抗体文库中筛选阳性单链抗体。进一步检测筛选出的单链抗体与α-HL的结合活性结果显示：筛选出的克隆子与购买的(sigma)的α-HL也具有高结合活性，差异具有统计学意义(P<0.05)，表明筛选出的阳性抗体为针对α-HL的单链抗体，即为抗α-HL全人源单链抗体(图2C)。ELISA检测抗α-HL单链抗体的特异性结果显示：15株抗α-HL单链抗体与金黄色葡萄球菌均具有高结合活性，差异具有统计学意义(P<0.05)；相反，单链抗体几乎不与白色葡萄球菌相结合，说明通过富集筛选出的抗α-HL全人源单链抗体具有良好的特异性(图2D)。scFv2的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID No:4所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID No:5所示。scFv46的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID No:6所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID No:7所示。

实施例4scFv-Fc重组抗体的真核表达和纯化

一、构建表达scFv-Fc重组抗体的真核表达载体

1、由于scFv分子量小，结构不够稳定在体内半衰期短，并且不具有抗体Fc段功能，所以需构建结构稳定、体内半衰期长，具备抗体Fc段功能的IgG like scFv-Fc抗体。本发明构建带了多克隆酶切位点的通用表达载体sp-Fc/pcDNA3.1，可以任意插入scFv，构建的sp-scFv-Fc/pcDNA3.1重组载体转染HEK293F细胞，可在细胞中正确折叠，表达具有功能的scFv-Fc抗体。前期发表文章的pcDNA3.1/sp-Fc载体(见“叶迎春等，全人源scFv-Fc真核表达载体的构建与鉴定[J]，中国免疫学杂志，2014，30(2)：226-229)为单一酶切位点，不能满足任意scFv的插入；在前期工作的基础上，构建了在sp-Fc之间插入了多个酶切位点，保证了任意scFv的插入，构建的sp-Fc/pcDNA3.1具备通用性，其结构如图3A所示。

(1)合成信号肽SP序列：MDWTWRILFLVAAATGTHA(SEQ ID No:8)，合成的序列包含起始密码子和真核表达元件(Kozak序列)的重链信号肽序列，以合成的SP为模板，采用SPF-HindIII和SP R-KpnI引物PCR扩增得到引入酶切位点HindIII和KpnI的SP DNA。PCR反应液的配制(20μl体系)Takara Ex DNAPolymerase 0.2μl，dNTP Mixture(2.5mM)1.6μl(终浓度为200μM)，10×Ex Buffer 2μl，10μm F(SPF-HindIII)1μl，10μm R(SP R-KpnI)1μl，scFvDNA(20ng/μl)1μl，加ddH₂O至20μl。引物SP F-HindIII、SP R-KpnI的序列为：SP F-HindIII：5‘CCCAAGCTTGCCGCCGCCGCCACCATGGACTGGACCCTGGAGAAT 3’(SEQ ID No:9)，SP R-KpnI:5’GGGGTACCGGCGTGGGTGCCTGTAGCT 3’(SEQ ID No:10)。PCR反应程序：94℃2min；98℃10sec、55℃15sec、68℃30min，30个循环；68℃10min。HindIII和KpnI双酶切pcDNA3.1(该质粒购自Invitrogen公司)和PCR扩增的带酶切位点的SP DNA，采用T4DNA连接酶插入SP序列，构建sp-pcDNA 3.1重组载体。

(2)从健康志愿者外周血中分离单个核细胞(PBMC)，提取PBMC总RNA，采用PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kits(Takara)反转录cDNA，PCR对cDNA进行扩增(引物对：pcDNA3.1-KpnI-Fc-F，pcDNA3.1-XbaI-Fc-R)得到Fc扩增片段，在扩增Fc的上游引物引入了多个酶切位点(KpnI+ClaI+AgeI+AscI+XhoI)，以便于后期插入任意scFv序列。扩增的Fc段包括Hinge+CH2+CH3，保证了Fc段的功能区。：PCR扩增反应体系(20μl)为Prime STAR GXLDNAPolymerase 0.4μl，dNTP Mixture(2.5mM)，1.6μl(终浓度为200μM)，5×GXL Buffer 4μl，10m F(pcDNA3.1-KpnI-Fc)1μl，10μm R(pcDNA3.1-XbaI-Fc-R)1μl，cDNA(2μl)，加ddH₂O至20μl。引物pcDNA3.1-KpnI-Fc-F的序列为：5’CGGGGTACCATCGATACCGGTGGCGCGCCTCTCGAGGAGCCCAAATCTTGTGAC 3’(SEQ ID No:11)，引物pcDNA3.1-XbaI-Fc-R的序列为：5’CTAGTCTAGAGCGGCCGCTCATTTACCCGGAGACAGGGAG 3’(SEQ ID No:12)。PCR反应程序：94℃2min；98℃10sec、55℃15sec、68℃1min，30个循环；68℃10min。KpnI和XbaI双酶切Fc和SP-pcDNA 3.1重组载体，T4DNA连接酶，构建在SP和Fc之间带有多个酶切位点的可以任意插入scFv的sp-Fc/pcDNA3.1的通用表达载体。

(3)Fc扩增片段和sp-pcDNA3.1载体均进行KpnI、XbaI双酶切：

FastDigestKpnI酶切反应体系：FastDigest enzyme 1μl、10×FastDigestbuffer 2μl、Fc扩增片段或sp-pcDNA3.1载体质粒≤1μg，加ddH₂O至20μl。37℃温育2h，然后用乙醇沉淀法回收酶切后片段。

XbaI酶切反应体系：XbaI 1μl、10×M buffer 2μl、0.1％BSA 2μl、Fc扩增片段或sp-pcDNA3.1载体质粒≤1μg，加ddH₂O至20μl。37℃水浴酶切2h；最后半小时，加1.5μl CIP在sp-pcDNA3.1载体酶切反应体系中；酶切完成后，Fc片段用QIA quick PCRpurificationKit试剂盒直接回收，sp-pcDNA3.1载体酶切后产物直接上样0.8％的琼脂糖凝胶进行电泳，切下目的条带的凝胶使用快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收产物sp-pcDNA3.1片段，测定浓度，保存于-20℃。

(4)Fc和sp-pcDNA3.1片段的连接转化及验证

Fc和sp-pcDNA3.1双酶切后的片段经T4连接酶连接转化入感受态TOP10，克隆得到sp-Fc/pcDNA3.1通用载体；使用载体引物(T7-F和BGH-R)经PCR验证sp-Fc/pcDNA3.1通用载体构建结果；将PCR验证正确的菌株用LBA液体培养基扩大培养，提取质粒后送测序验证，通用载体sp-Fc/pcDNA3.1的编码基因核酸序列如SEQ ID No:13所示。引物T7-F序列为：5’TAATACGACTCACTATAGGG 3’(SEQ ID No:14)，引物BGH-R序列为：5’TAGAAGGCACAGTCGAGG 3’(SEQ ID No:15)。

2、构建sp-scFv-Fc/pcDNA3.1真核表达载体

(1)scFvs和sp-Fc/pcDNA3.1载体双酶切

使用表1中的scFv引物对扩增scFvs，扩增20μl体系为:EmeraldAMP PCR MasterMix酶(Takara公司)10ul、10μm F引物1ul、10μm R引物1ul、scFv DNA(20ng/ul)1ul、ddH₂O7ul。PCR反应程序：94℃2min；94℃30sec、55℃30sec、72℃1min，30个循环；72℃10min；琼脂糖凝胶电泳验证正确后回收PCR产物。

表1用于扩增插入sp-Fc/pcDNA3.1载体的scFv引物对

scFvs扩增片段和sp-Fc/pcDNA3.1通用载体均进行ClaI、XhoI双酶切；最后半小时，在sp-Fc/pcDNA3.1载体酶切反应体系中加入1.5μl CIP；酶切完成后用QIA quick PCRpurification Kit试剂盒直接回收产物并测定浓度，保存于-20℃。

Quick Cut^TMClaI酶切反应体系：Quick Cut ClaI 1μl、10×QuickCut Buffer 2μl、scFvs扩增片段或sp-Fc/pcDNA3.1通用载体DNA≤1μg、加ddH₂O至20μl。

FastDigestXhoI酶切反应体系：FastDigest enzyme 1μl、10×FastDigestBuffer 2μl、scFvs扩增片段或sp-Fc/pcDNA3.1通用载体DNA≤1μg、加ddH₂O至20μl，37℃水浴酶切2h。

(2)scFvs和sp-Fc/pcDNA3.1载体双酶切后的连接转化及PCR验证

scFvs和sp-Fc/pcDNA3.1载体双酶切后的片段经T4连接酶连接转化入感受态TOP10；使用载体引物(T7-F和BGH-R)经PCR验证sp-scFv-Fc/pcDNA3.1重组载体构建结果，将条带正确的菌株用LBA液体培养基扩大培养，提取质粒后送测序验证。成功构建sp-scFv-Fc/pcDNA3.1真核表达载体(结构如图3B所示)。

3、构建sp-scFv-Fc/pMH3重组表达载体

sp-scFv-Fc/pMH3重组表达载体的构建是基于sp-scFv-Fc/pcDNA3.1真核表达载体的基础上，扩增sp-scFv-Fc片段，插入pMH3载体(购自杭州安普生物科技有限公司)。sp-scFv-Fc扩增片段大小约为1500bp，扩增体系和PCR反应条件如下：PrimeSTARGXLDNAPolymerase酶(Takara公司)0.4μl、dNTP Mixture(2.5mM)1.6μl(终浓度为200μM)、5×GXL Buffer4μl、10μm引物sp-EcoRI-F 1ul、10μm引物Fc-NotI-R 1ul、sp-scFv-Fc/pcDNA3.1载体DNA(20ng/ul)1μl、ddH₂O至20μl。PCR反应程序：94℃2min；98℃10sec、55℃15sec、68℃1min，30个循环；68℃10min。引物序列为：sp-EcoRI-F：5’CCGGAATTCGCCGCCGCCGCCACCATG3’(SEQ ID No:22)，Fc-NotI-R：5’CTAGTCTAGAGCGGCCGCTCATTTACCCGGAGACAGGGAG 3’(SEQ ID No:23)。

扩增片段经EcoRI和NotI酶切后插入pMH3载体中，最后测序验证结果。

EcoRI酶切反应体系：FastDigest enzyme 1μl、10×FastDigest Buffer 2μl、sp-scFv-Fc扩增片段或pMH3载体DNA≤1μg、加ddH₂O至20μl。37℃水浴酶切2h；然后用乙醇沉淀法回收酶切后片段。

NotI酶切反应体系：

NotI 1μl、10×H buffer 2μl、0.1％BSA 2μl、0.1％Tritonx-1002μl、sp-scFv-Fc扩增片段或pMH3载体DNA≤1μg，加ddH₂O至20μl。37℃水浴酶切2h。

双酶切后的片段经T4连接酶连接转化入感受态TOP10，经验证成功构建sp-scFv-Fc/pMH3重组表达载体(结构如图3C所示)。

二、HEK 293F悬浮细胞表达重组蛋白及验证

1、HEK 293F悬浮细胞复苏、传代、冻存、转染，均采用现有技术进行。

2、Western blot验证重组蛋白表达

重组载体(sp-scFv-Fc/pcDNA3.1真核表达载体和sp-scFv-Fc/pMH3重组表达载体分别进行)转染3ml HEK 293F悬浮细胞，48h后1000rpm离心10min收集细胞，使用200μl细胞裂解液裂解细胞；裂解完成后，于4℃，12000rpm离心20min，收集上清用于Western blot验证：收集上清直接上样SDS-PAGE凝胶，一抗为山羊抗人IgG-HRP标记抗体。

图4A和图4B展示荧光质粒PIRES2-EGFP转染HEK293F细胞对比图，目的是摸索最佳转染方案，转染效率约60％。经Western blot验证结果表明：sp-scFv-Fc/pcDNA3.1真核表达载体和sp-scFv-Fc/pMH3重组表达载体均成功表达抗体蛋白，蛋白大小约为55kDa(图4C和图4D)。

3、ELISA检测重组蛋白表达

重组载体(sp-scFv-Fc/pcDNA3.1真核表达载体和sp-scFv-Fc/pMH3重组表达载体分别进行)转染10ml HEK 293F悬浮细胞，48h后1000rpm离心10min收集细胞，使用2ml1×PBS重悬后，加入4μl 0.2mM的蛋白酶抑制剂PMSF混匀，冰上超声破碎细胞；裂解完成后，于4℃，12000rpm离心20min，收集上清用于ELISA验证：使用购买α-HL和自制α-HL分别包被于酶标板，一抗为收集的上清，二抗为山羊抗人IgG-HRP标记抗体。

图4E和图4F为ELISA检测scFv-Fcs抗体与抗原结合活性结果。图4E所示：HLA-SIGMA为购买抗原包被酶标板，HLA-EX为自制抗原包被酶标板，sp-scFv-Fc/pcDNA3.1真核表达载体表达的抗体蛋白为一抗，检测结果表明scFv2-Fc(氨基酸序列如SEQ ID No:24所示)、scFv10-Fc、scFv46-Fc(氨基酸序列如SEQ ID No:25所示)重组抗体与购买抗原均具有结合活性，差异具有统计学意义(P<0.05)，进而验证了sp-scFv-Fc/pcDNA3.1真核表达载体成功构建并成功表达有生物活性的scFv-Fcs。人抗体恒定区Fc段氨基酸序列如SEQ ID No:26所示。图4F所示：scFv2-Fc、scFv10-Fc、scFv46-Fc重组抗体与购买抗原均具有高结合活性，差异具有统计学意义(P<0.05)，sp-scFv-Fc/pMH3重组表达载体表达结果也表明sp-scFv-Fc/pMH3重组表达载体成功构建并成功表达有生物活性的scFv-Fc抗体。并且，sp-scFv-Fc/pMH3重组载体表达重组蛋白量(图4F)显著高于sp-scFv-Fc/pcDNA3.1重组载体(图4E)，差异具有统计学意义(P<0.05)，说明在同等条件下sp-scFv-Fc/pMH3重组载体可以提供显著高效的重组蛋白表达。

三、抗体纯化

按照proteinA亲和层析柱(上海生工)说明书进行。

Western blot(图4G)和SDS-PAGE(图4H)验证抗体蛋白经proteinA亲和层析柱纯化后结果，结果证实成功纯化出抗体蛋白。

实施例5单克隆抗体功能验证

一、细胞增殖与活性检测实验

1、对A549人肺腺癌细胞复苏、传代、冻存备用。

2、细胞增殖与活性检测实验

(1)将生长对数期的A549细胞以5000个/孔接种96孔板；同时设立对照孔(含细胞、培养基)、空白孔1(只含完全培养基)和空白孔2(含完全培养基和α-HL)，每组样品设立6个重复孔；

(2)接种完成后，放回37℃、5％CO₂和95％相对湿度的细胞培养箱中培养24h；

(3)终浓度10nM的α-HL蛋白与scFv-Fc 10μl于37℃孵育20min，而后加入实验孔中，放回37℃、5％CO₂和95％相对湿度的培养箱中孵育24h；

(4)加入10μl CCK8试剂，放回37℃、5％CO₂和95％相对湿度的培养箱中避光孵育1h，酶标仪测量在450nm时的吸光度值(A)。

(5)计算细胞存活率：(实验孔As-空白孔Ab)/(对照孔Ac-空白孔Ab)×100％细胞增殖与活性检测试剂盒(CCK8)检测sp-scFv-Fc/pMH3重组载体表达的抗体蛋白对α-溶血素裂

解A549人肺腺癌细胞的抑制作用(中和毒素能力)。图5A为细胞增殖与活性检测。

实验结果：实验组As-scFv2-Fc、As-scFv10-Fc、As-scFv46-Fc分别为sp-scFv2-Fc/pMH3、sp-scFv10-Fc/pMH3、sp-scFv46-Fc/pMH3重组载体表达蛋白的中和毒素结果；实验组As-pMH3为pMH3载体表达蛋白的作用结果；Ac为对照孔，含有细胞、培养基和CCK8溶液；Ab1为空白孔1，只含有培养基和CCK8溶液；Ab2为空白孔2，含有α-溶血素、培养基和CCK8溶液。结果表明：scFv2-F和scFv46能提供显著中和毒素作用(^***P<0.001)。

二、抗体介导的抗兔红细胞溶血实验

(1)1.25ng/μlα-溶血素50μl与50μl scFv-Fc分别混匀，37℃中和孵育20min，每组样品设立3个复孔；

(2)样品加入到含50μl 1％兔红细胞的96孔板中，轻轻混匀，37℃条件下孵育30min；

(3)配平后，将平板以2400rpm离心5min以沉淀兔红细胞；

(4)取上清液100μl依次加入新微孔板中，酶标仪在405nm处读取吸光度值(A)。

图5B展示的是sp-scFv-Fc/pMH3重组表达载体表达的scFv2-Fc、scFv10-Fc、scFv46-Fc介导的抗兔红细胞溶血实验结果，其中设置了空质粒pMH3对照。结果表明：与空质粒(pMH3)相比，scFv2-Fc重组抗体可提供有效抗溶血保护，且差异具有统计学意义(scFv2-Fc vs pMH3:P＝0.0003，^***P<0.001)。

序列表

<110> 西南医科大学

<120> 全人源抗金黄色葡萄球菌α-溶血素重组抗体

<160> 26

<210> 1

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<223> 连接肽

<400> 1

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> PKM167

<400> 2

ggctcgtatg ttgtgtgga 19

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> PKM180

<400> 3

tagccccctt attagcgttt g 21

<210> 4

<211> 129

<212> PRT

<213> 人工序列

<223> scFv2的重链可变区

<400> 4

Pro Gly Ala Ala Ala Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Arg Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Lys Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Asp Tyr Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Val Lys Asn Ser Pro Tyr

65 70 75 80

Leu His Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Trp Asp Thr Asp Gly Tyr Asn Gly Leu Ile Arg Asn Phe Tyr

100 105 110

Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser

115 120 125

Ser

<210> 5

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<223> scFv2的轻链可变区

<400> 5

Asp Ile Arg Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Ile Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn His

20 25 30

Leu Ala Trp Asn Gln Gln Lys Pro Gly Lys Gly Pro Lys Val Leu Ile

35 40 45

Asn Ala Ala Ser Ile Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Asn Ser Phe Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 6

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<223> scFv46的重链可变区

<400> 6

Pro Gly Ala Ala Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Ser Met Ser Trp Ala Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Ser Tyr Ile Thr Ser Gly Gly Asn Tyr Ala Asn Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Gly Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Pro Gln Ser Arg Ser Ser Ala Val Asp Val Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 7

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<223> scFv46的轻链可变区

<400> 7

Gln Ser Val Leu Ile Gln Pro Ala Ser Met Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr

20 25 30

Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Tyr Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Met Ile Tyr Asp Val Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Cys Ser Tyr Thr Ser Asn

85 90 95

His Thr Tyr Val Leu Gly Thr Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Arg

100 105 110

<210> 8

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<223> 信号肽SP

<400> 8

Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly

1 5 10 15

Thr His Ala

<210> 9

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> SP F-HindIII

<400> 9

cccaagcttg ccgccgccgc caccatggac tggaccctgg agaat 45

<210> 10

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> SP R-KpnI

<400> 10

ggggtaccgg cgtgggtgcc tgtagct 27

<210> 11

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> pcDNA3.1-KpnI-Fc-F

<400> 11

cggggtacca tcgataccgg tggcgcgcct ctcgaggagc ccaaatcttg tgac 54

<210> 12

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> pcDNA3.1-XbaI-Fc-R

<400> 12

ctagtctaga gcggccgctc atttacccgg agacagggag 40

<210> 13

<211> 6166

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> 载体sp-Fc/pcDNA3.1

<400> 13

gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg 60

ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120

cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180

ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt 240

gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata 300

tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 360

cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 420

attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 480

atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 540

atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 600

tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg 660

actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc 720

aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg 780

gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca 840

ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagacccaa gctggctagc 900

gtttaaactt aagcttgccg ccgccgccac catggactgg acctggagaa tcctcttctt 960

ggtggcagca gctacaggca cccacgccgg taccatcgat accggtggcg cgcctctcga 1020

ggagcccaaa tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcctagcac ctgaactcct 1080

ggggggaccg tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg 1140

gacccctgag gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt 1200

caactggtac gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca 1260

gtacaacagc acgtaccgtg tggtcagcgt ccgcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa 1320

tggcaaggag tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac 1380

catctccaaa gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg 1440

ggatgagctg accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag 1500

cgacatcgcc gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc 1560

tcccgtgctg gactccgacg gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaagag 1620

caggtggcag caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca 1680

ctacacgcag aagagcctct ccctgtctcc gggtaaatga gcggccgctc tagagggccc 1740

gtttaaaccc gctgatcagc ctcgactgtg ccttctagtt gccagccatc tgttgtttgc 1800

ccctcccccg tgccttcctt gaccctggaa ggtgccactc ccactgtcct ttcctaataa 1860

aatgaggaaa ttgcatcgca ttgtctgagt aggtgtcatt ctattctggg gggtggggtg 1920

gggcaggaca gcaaggggga ggattgggaa gacaatagca ggcatgctgg ggatgcggtg 1980

ggctctatgg cttctgaggc ggaaagaacc agctggggct ctagggggta tccccacgcg 2040

ccctgtagcg gcgcattaag cgcggcgggt gtggtggtta cgcgcagcgt gaccgctaca 2100

cttgccagcg ccctagcgcc cgctcctttc gctttcttcc cttcctttct cgccacgttc 2160

gccggctttc cccgtcaagc tctaaatcgg gggctccctt tagggttccg atttagtgct 2220

ttacggcacc tcgaccccaa aaaacttgat tagggtgatg gttcacgtag tgggccatcg 2280

ccctgataga cggtttttcg ccctttgacg ttggagtcca cgttctttaa tagtggactc 2340

ttgttccaaa ctggaacaac actcaaccct atctcggtct attcttttga tttataaggg 2400

attttgccga tttcggccta ttggttaaaa aatgagctga tttaacaaaa atttaacgcg 2460

aattaattct gtggaatgtg tgtcagttag ggtgtggaaa gtccccaggc tccccagcag 2520

gcagaagtat gcaaagcatg catctcaatt agtcagcaac caggtgtgga aagtccccag 2580

gctccccagc aggcagaagt atgcaaagca tgcatctcaa ttagtcagca accatagtcc 2640

cgcccctaac tccgcccatc ccgcccctaa ctccgcccag ttccgcccat tctccgcccc 2700

atggctgact aatttttttt atttatgcag aggccgaggc cgcctctgcc tctgagctat 2760

tccagaagta gtgaggaggc ttttttggag gcctaggctt ttgcaaaaag ctcccgggag 2820

cttgtatatc cattttcgga tctgatcaag agacaggatg aggatcgttt cgcatgattg 2880

aacaagatgg attgcacgca ggttctccgg ccgcttgggt ggagaggcta ttcggctatg 2940

actgggcaca acagacaatc ggctgctctg atgccgccgt gttccggctg tcagcgcagg 3000

ggcgcccggt tctttttgtc aagaccgacc tgtccggtgc cctgaatgaa ctgcaggacg 3060

aggcagcgcg gctatcgtgg ctggccacga cgggcgttcc ttgcgcagct gtgctcgacg 3120

ttgtcactga agcgggaagg gactggctgc tattgggcga agtgccgggg caggatctcc 3180

tgtcatctca ccttgctcct gccgagaaag tatccatcat ggctgatgca atgcggcggc 3240

tgcatacgct tgatccggct acctgcccat tcgaccacca agcgaaacat cgcatcgagc 3300

gagcacgtac tcggatggaa gccggtcttg tcgatcagga tgatctggac gaagagcatc 3360

aggggctcgc gccagccgaa ctgttcgcca ggctcaaggc gcgcatgccc gacggcgagg 3420

atctcgtcgt gacccatggc gatgcctgct tgccgaatat catggtggaa aatggccgct 3480

tttctggatt catcgactgt ggccggctgg gtgtggcgga ccgctatcag gacatagcgt 3540

tggctacccg tgatattgct gaagagcttg gcggcgaatg ggctgaccgc ttcctcgtgc 3600

tttacggtat cgccgctccc gattcgcagc gcatcgcctt ctatcgcctt cttgacgagt 3660

tcttctgagc gggactctgg ggttcgaaat gaccgaccaa gcgacgccca acctgccatc 3720

acgagatttc gattccaccg ccgccttcta tgaaaggttg ggcttcggaa tcgttttccg 3780

ggacgccggc tggatgatcc tccagcgcgg ggatctcatg ctggagttct tcgcccaccc 3840

caacttgttt attgcagctt ataatggtta caaataaagc aatagcatca caaatttcac 3900

aaataaagca tttttttcac tgcattctag ttgtggtttg tccaaactca tcaatgtatc 3960

ttatcatgtc tgtataccgt cgacctctag ctagagcttg gcgtaatcat ggtcatagct 4020

gtttcctgtg tgaaattgtt atccgctcac aattccacac aacatacgag ccggaagcat 4080

aaagtgtaaa gcctggggtg cctaatgagt gagctaactc acattaattg cgttgcgctc 4140

actgcccgct ttccagtcgg gaaacctgtc gtgccagctg cattaatgaa tcggccaacg 4200

cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct 4260

gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt 4320

atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc 4380

caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga 4440

gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata 4500

ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac 4560

cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg 4620

taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc 4680

cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag 4740

acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt 4800

aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaagaacagt 4860

atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg 4920

atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg 4980

cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg 5040

gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta 5100

gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg 5160

gtctgacagt taccaatgct taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg 5220

ttcatccata gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact acgatacggg agggcttacc 5280

atctggcccc agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc cagatttatc 5340

agcaataaac cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc 5400

ctccatccag tctattaatt gttgccggga agctagagta agtagttcgc cagttaatag 5460

tttgcgcaac gttgttgcca ttgctacagg catcgtggtg tcacgctcgt cgtttggtat 5520

ggcttcattc agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc ccatgttgtg 5580

caaaaaagcg gttagctcct tcggtcctcc gatcgttgtc agaagtaagt tggccgcagt 5640

gttatcactc atggttatgg cagcactgca taattctctt actgtcatgc catccgtaag 5700

atgcttttct gtgactggtg agtactcaac caagtcattc tgagaatagt gtatgcggcg 5760

accgagttgc tcttgcccgg cgtcaatacg ggataatacc gcgccacata gcagaacttt 5820

aaaagtgctc atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga tcttaccgct 5880

gttgagatcc agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag catcttttac 5940

tttcaccagc gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat 6000

aagggcgaca cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt tttcaatatt attgaagcat 6060

ttatcagggt tattgtctca tgagcggata catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca 6120

aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct gacgtc 6166

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> T7-F

<400> 14

taatacgact cactataggg 20

<210> 15

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> BGH-R

<400> 15

tagaaggcac agtcgagg 18

<210> 16

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> scFv 2-F- Cla I

<400> 16

ccatcgatat gcatggccca ggtgcagct 29

<210> 17

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> scFv 2-R- XhoI

<400> 17

ccgctcgaga cgtttgattt ccaccttggt c 31

<210> 18

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> scFv 10-F- Cla I

<400> 18

ccatcgatat gcatggcggc ccagc 25

<210> 19

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> scFv 10- R- XhoI

<400> 19

ccgctcgaga cgtaggacgg tga 23

<210> 20

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> scFv 46-F- Cla I

<400> 20

ccatcgatat gcatggcggc ccagc 25

<210> 21

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> scFv 46-R-Xho I

<400> 21

ccgctcgaga cgtaggacgg tga 23

<210> 22

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> sp-EcoRI-F

<400> 22

ccggaattcg ccgccgccgc caccatg 27

<210> 23

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> Fc-NotI-R

<400> 23

ctagtctaga gcggccgctc atttacccgg agacagggag 40

<210> 24

<211> 486

<212> PRT

<213> 人工序列

<223> scFv2-Fc

<400> 24

Pro Gly Ala Ala Ala Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Arg Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Lys Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Asp Tyr Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Val Lys Asn Ser Pro Tyr

65 70 75 80

Leu His Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Trp Asp Thr Asp Gly Tyr Asn Gly Leu Ile Arg Asn Phe Tyr

100 105 110

Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

130 135 140

Asp Ile Arg Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Ile Gly

145 150 155 160

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn His

165 170 175

Leu Ala Trp Asn Gln Gln Lys Pro Gly Lys Gly Pro Lys Val Leu Ile

180 185 190

Asn Ala Ala Ser Ile Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

195 200 205

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

210 215 220

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Asn Ser Phe Pro Leu

225 230 235 240

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Leu Glu Glu Pro

245 250 255

Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Leu Ala Pro Glu

260 265 270

Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

275 280 285

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

290 295 300

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

305 310 315 320

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn

325 330 335

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Arg Thr Val Leu His Gln Asp Trp

340 345 350

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro

355 360 365

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

370 375 380

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn

385 390 395 400

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

405 410 415

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

420 425 430

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

435 440 445

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

450 455 460

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

465 470 475 480

Ser Leu Ser Pro Gly Lys

485

<210> 25

<211> 479

<212> PRT

<213> 人工序列

<223> scFv46-Fc

<400> 25

Pro Gly Ala Ala Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Ser Met Ser Trp Ala Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Ser Tyr Ile Thr Ser Gly Gly Asn Tyr Ala Asn Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Gly Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Pro Gln Ser Arg Ser Ser Ala Val Asp Val Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Val Leu Ile Gln Pro Ala Ser Met

130 135 140

Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser

145 150 155 160

Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Tyr Pro

165 170 175

Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met Ile Tyr Asp Val Ser Lys Arg Pro Ser

180 185 190

Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser

195 200 205

Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys

210 215 220

Cys Ser Tyr Thr Ser Asn His Thr Tyr Val Leu Gly Thr Gly Thr Lys

225 230 235 240

Leu Thr Val Leu Arg Leu Glu Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

245 250 255

Thr Cys Pro Pro Cys Leu Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val

260 265 270

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

275 280 285

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

290 295 300

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

305 310 315 320

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

325 330 335

Val Arg Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

340 345 350

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

355 360 365

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

370 375 380

Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

385 390 395 400

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

405 410 415

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

420 425 430

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

435 440 445

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

450 455 460

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

465 470 475

<210> 26

<211> 232

<212> PRT

<213> 人工序列

<223> 人抗体恒定区Fc段

<400> 26

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Leu Ala

1 5 10 15

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

35 40 45

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

50 55 60

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

65 70 75 80

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Arg Thr Val Leu His Gln

85 90 95

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

100 105 110

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

115 120 125

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr

130 135 140

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

145 150 155 160

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

165 170 175

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

180 185 190

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

195 200 205

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

210 215 220

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

225 230

Claims

1.一种抗金黄色葡萄球菌α-溶血素单链抗体，其特征在于：所述单链抗体为scFv2或scFv46，所述scFv2的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID No:4所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID No:5所示；所述scFv46的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID No:6所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID No:7所示。

2.如权利要求1所述的抗金黄色葡萄球菌α-溶血素单链抗体，其特征在于：所述scFv2或scFv46的重链可变区与轻链可变区由连接肽linker连接，所述连接肽linker的氨基酸序列为(Gly₄Ser)₃。

3.一种抗金黄色葡萄球菌α-溶血素重组抗体，其特征在于：所述重组抗体为scFv2-Fc或scFv46-Fc，所述scFv2-Fc的氨基酸序列包含权利要求2所述的scFv2和人抗体恒定区Fc段氨基酸序列；所述scFv46-Fc的氨基酸序列包含权利要求2所述的scFv46和人抗体恒定区Fc段氨基酸序列；所述人抗体恒定区Fc段氨基酸序列如SEQ ID No:26所示。

4.一种全人源抗金黄色葡萄球菌α-溶血素重组抗体的真核表达载体，其特征在于：所述真核表达载体由将权利要求2所述的抗金黄色葡萄球菌α-溶血素单链抗体的序列插入通用表达载体sp-Fc/pcDNA3.1中得到，得到的真核表达载体为sp-scFv2-Fc/pcDNA3.1或sp-scFv46-Fc/pcDNA3.1，编码所述通用表达载体sp-Fc/pcDNA3.1的核酸序列如SEQ ID No:13所示。

5.一种全人源抗金黄色葡萄球菌α-溶血素重组抗体的重组表达载体，其特征在于：所述重组载体为sp-scFv2-Fc/pMH3或sp-scFv46-Fc/pMH3，是通过以下方法构建得到：以权利要求4所述的sp-scFv2-Fc/pcDNA3.1或sp-scFv46-Fc/pcDNA3.1为模板，采用sp-scFv-Fc片段扩增引物扩增sp-scFv2-Fc片段或sp-scFv46-Fc片段，将得到的扩增片段插入pMH3载体即得。

6.如权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于：所述sp-scFv-Fc片段扩增引物为sp-EcoRI-F、Fc-NotI-R，sp-EcoRI-F的序列如SEQ ID No:22所示，Fc-NotI-R的序列如SEQID No:23所示。

7.如权利要求5或6所述的重组表达载体，其特征在于：所述扩增片段插入pMH3载体的方法为先将以sp-scFv2-Fc/pcDNA3.1或sp-scFv46-Fc/pcDNA3.1模板扩增得到的sp-scFv2-Fc或sp-scFv46-Fc片段和pMH3载体采用EcoRI和NotI双酶切后进行连接。