CN110514628A - 一种快速检测O-GlcNAc修饰的生物感应器/方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及能快速检测O‑GlcNAc修饰的方法及应用，属于生物工程技术领域。发明的方法包括采用分子克隆的方法通过在一对能发生荧光能量共振转移的“荧光蛋白对”之间连接GlcNAc结合蛋白和目的蛋白或肽段，构建出生物感应器及GafD突变的阴性对照；再将生物感应器与O‑GlcNAc糖基转移酶OGT在大肠杆菌中共表达，利用生物感应器内GlcNAc结合蛋白与O‑GlcNAc的结合能使“荧光对”距离缩短导致发生荧光共振能量转移，通过检测生物感应器的荧光能量共振转移来检测目的蛋白或肽段是否有O‑GlcNAc修饰。该检测方法具有快速、微量、灵敏、准确的检测特点，可用于蛋白及肽段是否有O‑GlcNAc修饰的确定及修饰位点的确定。

Description

一种快速检测O-GlcNAc修饰的生物感应器/方法及应用

技术领域

本发明涉及能发生荧光共振能量转移的“荧光蛋白对”生物感应器的构建及应用。该感应器适用于快速检测目的蛋白或肽段上是否有O-GlcNAc修饰。

背景技术

O-连接的N-乙酰葡萄糖胺（O-GlcNAc）修饰是广泛存在于细胞质和细胞核中的蛋白丝氨酸和苏氨酸上的一种动态、可逆的翻译后修饰。己糖胺生物合成途径合成的UDP-GlcNAc通过O-GlcNAc糖基转移酶OGT（哺乳动物细胞中催化合成O-GlcNAc糖基化修饰的唯一酶）催化添加到蛋白质的丝氨酸和苏氨酸上；O-GlcNAc修饰基团也可以由糖苷酶（O-GlcNAcase）催化去除。

到目前为止，已发现超过1000种蛋白质被O-GlcNAc糖基化修饰。O-GlcNAc修饰作为一种重要的蛋白质功能调节机制，参与了蛋白质活性、蛋白质定位、蛋白间相互作用和蛋白质的降解等多种蛋白质功能的调节，在细胞信号转导、转录、细胞生存、代谢、凋亡和衰老许多重要的生理过程中发挥调节作用。

随着对糖基化研究的深入，目前已建立了多种O-GlcNAc修饰的检测方法。例如植物凝集素法，通过结合末端GlcNAc基团来检测O-GlcNAc修饰。但是由于它的亲和力非常弱，同时可以非特异的识别氧聚糖和氮聚糖中的GlcNAc，所以灵敏度和特异性都受到很大限制，只能作为检测的辅助手段。还有作为检测O-GlcNAc修饰金标准的半乳糖基转移酶标记法，可通过放射性强度来检测O-GlcNAc修饰。但是此方法的最大缺陷是是任何末端的GlcNAc都能被检测到，而不能特异性的识别蛋白质的O-GlcNAc修饰，所以具有N聚糖修饰的蛋白需要消化后才能确定O-GlcNAc水平。另外，最常用的糖基化检测方法是抗体法，但大部分抗体对O-GlcNAc的亲和力非常弱，大大降低了检测的灵敏度，只有存在大量O-GlcNAc修饰的蛋白才可以被检测到。此外，抗体法的通病即存在非特异性结合，导致出现假阳性的结果，需要多种方法同时进行印证。综上所述，延缓O-GlcNAc修饰功能研究的主要原因是缺少高特异性、灵敏、快速的检测O-GlcNAc的方法。

本发明中的生物感应器是基于荧光能量共振转移原理建立的检测技术。首先通过基因克隆、转化和共表达，在原核中实现目的蛋白或肽段专一性的O-GlcNAc修饰，避免其他翻译后修饰的干扰。接着通过与阴性对照的比较，快速准确检测目的蛋白或肽段是否有O-GlcNAc修饰，并确定O-GlcNAc修饰位点，促进O-GlcNAc修饰生理和病理作用的研究及其在疾病诊断和治疗中的应用。

发明内容

针对目前存在的缺少高特异性、灵敏、快速检测O-GlcNAc的方法，本发明是依据荧光能量共振转移（FRET）原理，将能发生FRET的荧光蛋白对中连接可结合O-GlcNAc的蛋白GafD和检测的目的蛋白或肽段，从而实现O-GlcNAc修饰变化转化为光学信号。通过与连有GafD突变体（GafD*）的阴性对照感应器相比，生物感应器中荧光对距离改变导致的FRET效率变化，推测目的蛋白或肽段是否有O-GlcNAc修饰。

所谓荧光共振能量转移（FRET），是指两种荧光蛋白（供体和受体）相距很近时（10nm内），供体发射荧光与受体发色基团的吸收光谱重叠时，用适当频率的光谱激发供体产生振荡偶极子，进而与受体偶极子发生共振，最终导致能量从供体非放射性向受体转移的现象。

具有较高 FRET 效率的荧光蛋白对有：蓝色（eBFP2）和绿色（eGFP）、黄色（venus）和红色（mcherry）、青色（eCFP）和黄色（eYFP）。

采用基因克隆技术，构建由柔性Linker连接的荧光蛋白对阳性对照CFP-YFP.。同时通过分子克隆技术得到可结合O-GlcNAc的蛋白GafD和检测的目的蛋白（或肽段）的基因片段。采用双酶切连接的方式，将GafD和检测的目的蛋白（或肽段）的基因片段连接在荧光蛋白对中间获得特定的生物感应器。该生物感应器的具体基因克隆模式为： –青色荧光蛋白（eCFP）-GafD-Linker-目的蛋白或肽段-Linker-黄色荧光蛋白（Venus）（图1）。

将O-GlcNAc糖基转移酶（OGT）的原核表达质粒pBAD-MBP-OGT转化入大肠杆菌BL21(DE3)中，制备成感受态细胞。

用质粒（pET30a+）作为载体，将生物感应器基因克隆到制备的含有表达OGT质粒的感受态细胞中（图2）。诱导该感应器与OGT在BL21(DE3)中共表达，当生物感应器中的目的蛋白（或肽段）发生O-GlcNAc修饰时，，凝集素GafD与O-GlcNAc结合使得生物感应器内的“荧光对”距离至10nm内，导致其荧光共振能量转移效率的变化（图3）。

为寻找能简便调整蛋白含量的方法，在得到与OGT共表达的蛋白“目的肽段是CKⅡ的生物感应器（OS2）”后，测量经过梯度稀释后的蛋白含量。并采用受体（Venus）激发光激发，检测受体（Venus）发射荧光值。将蛋白含量和荧光发射光数据作标准曲线（图4），可得蛋白含量和受体荧光强度线性正相关，这表明可通过测量该荧光强度来进行蛋白含量调整和数据校正。

采用供体激发荧光照射，测定两种荧光蛋白的发射光数值。将阴性对照当作未发生FRET的原始值，再依据特定的计算公式 ( 如FRET/ I_(供体) )，测定生物感应器的FRET效率。

本发明一方面可以检测目的蛋白是否有O-GlcNAc修饰，另一方面可以检测小肽段是否有O-GlcNAc修饰。

在本发明第一方面的实施例中，分别构建了检测组蛋白的H2B（图5）、蛋白TAB1（图6）、蛋白CKⅡ（图7）以及蛋白Snai1（图8）的生物感应器及阴性对照，通过FRET的检测，可以得到这些蛋白有O-GlcNAc修饰，与已知的文献报道一致。

在本发明第二方面的实施例中，分别构建了检测蛋白Human c-Myc的肽段FELLPTPPLSP、蛋白Human serum response factor 的肽段PGTTSTIQTAP、蛋白CKⅡ的肽段PGGSTPVSSANM以及蛋白Human FoxO1的肽段VKTTTHSWVSG的生物感应器及阴性对照，通过FRET的检测，可以得到这些肽段有O-GlcNAc修饰，与已知的文献报道一致（图9）。

本发明的优点有：

1.本发明采用荧光共振能量转移原理构建的生物感应器，能将目的蛋白（或肽段）的O-GlcNAc修饰情况转化为光学信号。而光学信号本身的高灵敏性使本方法具有较之其他方法灵敏对高的优点。

2. 本发明的这种检测生物感应器，主要用于各种蛋白或长短不限的肽段的研究。这使得该方法不仅能检测蛋白是否能被O-GlcNAc修饰，并且通过肽段的检测来确定O-GlcNAc修饰位点。这将有效促进蛋白O-GlcNAc修饰的研究进展，具有显著发明意义。

3.将生物感应器与OGT在原核大肠杆菌中共表达，这就避免了真核生物才有的其他翻译后修饰的干扰，使检测结果更可靠。所以本发明具有结果可靠性高的优点。

4. 采用多功能酶标仪的荧光检测功能进行荧光强度的检测，检测快速方便简单，比起传统方法解约了大量时间。所以，本方法具有快速方便，操作简单的优点。

本发明通过以下附图和实施作进一步阐述，但不限制本发明的范围。

附图说明

图1 生物感应器、阴性对照及阳性对照的具体基因克隆示意图

图中第一个示意图是生物感应器的基因克隆图，依次是–青色荧光蛋白（eCFP）-GafD-Linker-目的蛋白或肽段-Linker-黄色荧光蛋白（Venus）。第二个示意图是GafD突变（即GafD*）的阴性对照生物感应器的基因克隆图，依次是-青色荧光蛋白（eCFP）-GafD*-Linker-目的蛋白或肽段-Linker-黄色荧光蛋白（Venus）。第三个示意图是阳性对照CFP-YFP，为-（eCFP）-Linker-黄色荧光蛋白（Venus）。

图2 生物感应器与糖基转移酶（OGT）在大肠杆菌中共表达的示意图。

图3 生物感应器经所含目的蛋白（或肽段）的O-GlcNAc修饰而发生荧光共振转移现象的示意图。

图4 蛋白含量和I_(受体)数据的标准曲线。纵坐标表示受体（Venus）的荧光强度，横坐标表示目的肽段是CKⅡ的生物感应器（CKⅡ-OS2）的蛋白含量。

图5 采用发明的方法测定的H2B目的蛋白的FRET效率示意图。图中柱形图表示阳性对照CFP-YFP、检测特定蛋白的生物感应器较阴性对照感应器得出的FRET值。柱形图下依次表示用免疫沉淀后Western bloting检测糖链O-GlcNAc、生物感应器及阴性对照表达水平，以及在Input中OGT表达水平。

图6 采用发明的方法测定的TAB1目的蛋白的FRET效率示意图。图中柱形图表示阳性对照CFP-YFP、检测特定蛋白的生物感应器较阴性对照感应器得出的FRET值。柱形图下依次表示用免疫沉淀后Western bloting检测糖链O-GlcNAc、生物感应器及阴性对照表达水平，以及在Input中OGT表达水平。

图7 采用发明的方法测定的Snail1目的蛋白的FRET效率示意图。图中柱形图表示阳性对照CFP-YFP、检测特定蛋白的生物感应器较阴性对照感应器得出的FRET值。柱形图下依次表示用免疫沉淀后Western bloting检测糖链O-GlcNAc、生物感应器及阴性对照表达水平，以及在Input中OGT表达水平。

图8 采用发明的方法测定的CKII目的蛋白的FRET效率示意图。图中柱形图表示阳性对照CFP-YFP、检测特定蛋白的生物感应器较阴性对照感应器得出的FRET值。柱形图下依次表示用免疫沉淀后Western bloting检测糖链O-GlcNAc、生物感应器及阴性对照表达水平，以及在Input中OGT表达水平。

图9 采用发明的方法测定的几种目的肽段的FRET效率示意图。图中柱形图表示阳性对照CFP-YFP、检测特定肽段的生物感应器较阴性对照感应器得出的FRET值。柱形图下依次表示用免疫沉淀后Western bloting检测糖链O-GlcNAc、生物感应器及阴性对照的表达水平，以及在Input中检测OGT的表达水平。 A. 生物感应器检测蛋白Human c-Myc的肽段FELLPTPPLSP；B. 生物感应器检测蛋白Human serum response factor的肽段PGTTSTIQTAP；C. 生物感应器检测蛋白Human FoxO1的肽段VKTTTHSWVSG。

具体实施方法

1.商业合成基因序列(L1)及基因序列(L2)

L1基因序列为：

TCTAGA(XbaI)GGATCC(BamHI)GGTGGCGAATTC(EcoRI)GGTGGTTCAGGTGGTGGTGGTTCAGGTGGTGGTGGTTCAGGTGGAGGAGGATCAGGAGGAGGAGGATCAGGAGGAGGAGGATCAGGAGGAATCGAT(ClaI)GTTAAC(HpaI)GCGGCCGC(NotI)GGCGGCAAGCTT(HindIII)。

L2基因序列为：

GGATCC(BamHI)GGTGGCGAATTC(EcoRI)GGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCCGC(NotI)GGCGGCAAGCTT(HindIII)。

2.阳性对照CFP-YFP表达载体的构建

（1）以pcDNA3.1-CFP为模板，通过PCR得到带克隆位点的荧光蛋白eCFP的基因片段；以pcDNA3.1-Venus为模板，通过PCR得到带克隆位点的荧光蛋白Venus的基因片段；具体如下。

荧光蛋白eCFP 长度：690bp

上游引物 TGCTGGATATCTGCAGAATTCCA；下游引物 GAATTC(EcoRⅠ)GAGCTC(SacⅠ)GATCCCGGCGGCGGTCACGA。

荧光蛋白Venus 长度：720bp

上游引物 GGCCGCGGCCGC(NotⅠ)GGCGGCAGCGGCGGCATGGTGA；下游引物 GGGAAGCTT (HindⅢ)TTACTTGTACAGCTCGTCCATGC。

（2）将步骤1的基因片段L2通过限制性内切酶BamHⅠ、HindⅢ克隆到载体pcDNA3.1A(-his/myc)上。

（3）将带克隆位点的荧光蛋白eCFP的基因片段通过限制性内切酶BamHⅠ、EcoRⅠ克隆到步骤（2）得到的质粒上。

（4）并将带克隆位点的荧光蛋白Venus的基因片段通过酶切限制性内切酶NotⅠ、HindⅢ克隆到步骤（3）得到的质粒上。将该克隆载体上的-CFP-Linker-YFP基因片段通过限制性内切酶BamHⅠ、HindⅢ克隆到载体pET30a+上。得到的生物感应器的阳性对照具体基因克隆模式为：原核启动子 –青色荧光蛋白（eCFP）-Linker-黄色荧光蛋白（Venus）-。

3.生物感应器及阴性对照的表达载体的构建

（1）以赠送质粒pLKM6为模板，通过PCR获得带克隆位点的GafD的基因片段；以赠送质粒pLDC17为模板，通过PCR得带克隆位点的GafD*的基因片段。具体如下。

凝集素GafD及GafD*长度：531bp

上游引物 GAGCTC(SacⅠ)TGCTGGATATCTGCAGAATTCCA；下游引物 CGGAATTC(EcoRⅠ)TGTTACTGTGTCATTCAGCGTAA。

荧光蛋白Venus长度：720bp

上游引物 GGCCGCGGCCGC(NotⅠ)GGCGGCAGCGGCGGCATGGTGA；下游引物 GGGAAGCTT (HindⅢ)TTACTTGTACAGCTCGTCCATGC。

（2）将步骤1的基因片段L2通过限制性内切酶XbaⅠ、HindⅢ克隆到载体pcDNA3.1A(-his/myc)上。

（3）同时，将带克隆位点的荧光蛋白eCFP的基因片段与GafD*的基因片段连接在T载体pEASY^®-Blunt Cloning Vector上。通过限制性内切酶BamHⅠ、EcoRⅠ将T载体上的eCFP-GafD*片段克隆到上一步得到的质粒上。

（4）将带克隆位点的荧光蛋白Venus的基因片段通过酶切限制性内切酶NotⅠ、HindⅢ克隆到上一步得到的质粒上。

（5）商业获取目的蛋白H2B、TAB1、CKⅡ的基因序列并通过PCR技术得到带克隆位点的基因片段。将带克隆位点的蛋白H2B、TAB1、CKⅡ、Snail1的基因片段通过限制性内切酶NotⅠ、ClaⅠ分别克隆到上一步得到的质粒上。将这些克隆载体上的生物感应器基因片段通过限制性内切酶BamHⅠ、HindⅢ分别克隆到载体pET30a+上，可分别得到生物感应器H2B-OS2、Snail1-OS2、TAB1-OS2、qCKⅡ-OS2。PCR克隆基因具体如下。

目的蛋白TAB1 长度：1515bp

上游引物 CCATCGAT (ClaⅠ)ATGGCGGCGCAGAGGAGG；

下游引物 GGCCGCGGCCGC(NotⅠ)CCGGTGCTGTCACCACG。

目的蛋白CKII 长度：768bp

上游引物 CCATCGAT (ClaⅠ)ATGTATGAGATTCTGAAGGCCCT ；

下游引物 GGCCGCGGCCGC(NotⅠ)CCTGCTGAGCGCCAGCGGC。

目的蛋白Snai1长度：795bp

上游引物 CCATCGAT (ClaⅠ)ATGCCGCGCTCTTTCCTCGT；

下游引物 GGCCGCGGCCGC(NotⅠ)CGCGGGGACATCCTGAGC。

目的蛋白H2B 长度：381bp

上游引物 CCATCGAT (ClaⅠ)ATGCCTGAACCGGCAAAATCC；

下游引物 AAGGAAAAAAGCGGCCGC(NotⅠ)CCTTGGAGCTGGTGTACTTGG。

（6）通过引物合成及退火得到检测的目的肽段：蛋白Human c-Myc的肽段FELLPTPPLSP、 蛋白Human serum response factor的肽段PGTTSTIQTAP、蛋白CKⅡ的肽段PGGSTPVSSANM以及蛋白 Human FoxO1的肽段VKTTTHSWVSG。将带克隆位点的肽段基因片段通过限制性内切酶NotⅠ、ClaⅠ分别克隆到步骤3（4）得到的质粒上。将这些克隆载体上的生物感应器基因片段通过限制性内切酶BamHⅠ、HindⅢ分别克隆到载体pET30a+上，可分别得到生物感应器Myc-OS2、SRF-OS2、FoxO1-OS2以及CKⅡ-OS2。PCR克隆基因具体如下。

蛋白Human c-Myc的肽段FELLPTPPLSP 长度：33bp

上游引物 CGATTTCGAGCTGCTGCCCACCCCGCCCCTGTCCCCTGGC；

下游引物 GGCCGCCAGGGGACAGGGGCGGGGTGGGCAGCAGCTCGAAAT。

蛋白Human serum response factor的肽段PGTTSTIQTAP 长度：33bp

上游引物 CGATCCGGGTACAACCTCCACCATCCAAACAGCACCTGGC；

下游引物 GGCCGCCAGGTGCTGTTTGGATGGTGGAGGTTGTACCCGGAT。

蛋白CKⅡ的肽段PGGSTPVSSANM长度：36bp

上游引物 CGATCCAGGGGGCAGTACGCCCGTCAGCAGCGCCAATATGGGC；

下游引物 GGCCGCC CATATTGGCGCTGCTGACGGGCGTACTGCCCCCTGGAT。

蛋白 Human FoxO1的肽段VKTTTHSWVSG 长度：33bp

上游引物 CGATGTCAAGACAACGACACATAGCTGGGTGTCAGGCGGC；

下游引物 GGCCGCCGCCTGACACCCAGCTATGTGTCGTTGTCTTGACAT。

（7）以上各种生物感应器的构建方法同样适用于GafD突变（即GafD*）的阴性对照生物感应器的构建。

（8）上述步骤的PCR产物及采用限制性内切酶切割产物均是通过电泳分离切割片段，割胶分离片段，采用“胶回收试剂盒”提取纯化目的片段。

（9）上述步骤通过限制性内切酶切割回收片段后均是采用T4 DNA连接酶进行过夜连接，连接后转化入大肠杆菌DH5α中扩增，平板培养，并采用抗生素抗性筛选获得阳性克隆。之后通过“质粒提取试剂盒”获得克隆质粒DNA。

4.建立生物感应器与糖基转移酶（OGT）在大肠杆菌BL21(DE3)中共表达系统（图3）。

（1）将表达糖基转移酶（OGT）的原核表达质粒pBAD-MBP-OGT转化入大肠杆菌BL21(DE3)中，平板过夜培养后挑取阳性克隆培养。转接至100ml培养基生长至OD值为0.4时，制备成感受态细胞。

（2）将检测不同目的蛋白（或肽段）的生物感应器的克隆质粒DNA分别转化入含有质粒pBAD-MBP-OGT的大肠杆菌BL21(DE3)中，37℃培养箱内平板培养过夜，并采用双抗生素Kana，Amp抗性筛选获得各种生物感应器及阳性、阴性对照的阳性克隆。挑取阳性克隆，转接培养至OD值为0.4时，加入0.5%阿拉伯糖及IPTG作为诱导剂进行过夜诱导。

5.使用FRET荧光蛋白对中的受体（Venus）荧光强度作为蛋白含量调整和数据校正的参照值：经缓冲液PBS洗涤两次，超声破碎后使用His标签预装柱纯化得到与OGT共表达的蛋白“目的肽段是CKⅡ的生物感应器（OS2）”后，以该感应器为例，测量经过梯度稀释后的蛋白含量。并采用受体（Venus）激发荧光激发，检测受体（Venus）发射荧光值。将蛋白含量和荧光发射光数据作标准曲线，可得蛋白含量和受体荧光强度线性正相关（图4）。所以，将其荧光强度作为蛋白含量调整和数据校正的参照值。

6. FRET测定前的样品制备：将过夜诱导的菌液使用PBS洗涤重悬，先测定生物感应器及其阳性、阴性对照样品的OD值，将它们的OD值调整到1，设置3个复孔，取体积200ul的各样品加入96孔黑板中，使用多功能酶标仪检测其荧光蛋白Venus的荧光强度，根据荧光强度将样品浓度进行调整，调整至其荧光蛋白Venus的荧光强度一致。

7. FRET效率的测定：采用供体激发荧光照射，测定两种荧光蛋白的发射光数值。将GafD突变后的阴性对照生物感应器当作未发生FRET的原始值，再依据特定的计算公式( 如FRET/ I_(供体) )，测定生物感应器的FRET效率（图5-9）。

8.验证使用本发明推测目的蛋白（或肽段）是否有O-GlcNAc修饰的准确性：将过夜诱导的菌液使用PBS洗涤两次，浓缩5倍重悬，经超声破碎后用镍珠免疫沉淀使得蛋白得到纯化富集，染后采用Western bloting的方法特异性的检测糖链O-GlcNAc的信号、生物感应器及阴性对照的蛋白表达信号，并在Input中检测O-GlcNAc糖基转移酶OGT蛋白表达信号。

序列表

<110> 中国海洋大学

<120> 一种快速检测O-GlcNAc修饰的生物感应器/方法及应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 8316

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg 60

ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120

cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180

ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt 240

gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata 300

tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 360

cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 420

attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 480

atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 540

atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 600

tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg 660

actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc 720

aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg 780

gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca 840

ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagacccaa gctggctagc 900

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ccggcgaggg cgagggcgat gccacctacg gcaagctgac cctgaagttc atctgcacca 1080

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gcttcagccg ctaccccgac cacatgaagc agcacgactt cttcaagtcc gccatgcccg 1200

aaggctacgt ccaggagcgc accatcttct tcaaggacga cggcaactac aagacccgcg 1260

ccgaggtgaa gttcgagggc gacaccctgg tgaaccgcat cgagctgaag ggcatcgact 1320

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acggccccgt gctgctgccc gacaaccact acctgagcac ccagtccgcc ctgagcaaag 1560

accccaacga gaagcgcgat cacatggtcc tgctggagtt cgtgaccgcc gccgggatcg 1620

tttcatttat tggcagtacg gagaatgatg ttggaccgtc tcagggctct tattccagca 1680

ctcatgcaat ggataacctg ccatttgtct ataataccgg ttacaacatt ggatatcaga 1740

atgcaaatgt ctggcgtatt agtggcgggt tttgtgttgg tctggacggg aaagtggatt 1800

tacccgtggt tggcagtctt gacgggcaga gtatttatgg gctgacggag gaggtgggac 1860

tccttatatg gatgggggac acgaattatt ccaggggtac cgcgatgagt ggaaactcat 1920

gggagaatgt cttttccgga tggtgcgtgg gaaattatgt atcaacgcag ggactgtctg 1980

ttcacgtaag accggtaatt ttaaaaagaa attcctctgc gcaatacagt gtacagaaaa 2040

ccagtatcgg gagtatcaga atgaggccct ataacggttc atctgcaggc agtgttcaga 2100

ccacagtgaa tttcagcctg aatccattta cgctgaatga cacagtaaca gaattcggtg 2160

gttcaggtgg tggtggttca ggtggtggtg gttcaggtgg aggaggatca ggaggaggag 2220

gatcaggagg aggaggatca ggaggaatcg atatgccgcg ctctttcctc gtcaggaagc 2280

cctccgaccc caatcggaag cctaactaca gcgagctgca ggactctaat ccagagttta 2340

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agccaattgc ctgggcctcc cttcggctcc aggagagtcc cagggtggca gagctgacct 2520

ccctgtcaga tgaggacagt gggaaaggct cccagccccc cagcccaccc tcaccggctc 2580

cttcgtcctt ctcctctact tcagtctctt ccttggaggc cgaggcctat gctgccttcc 2640

caggcttggg ccaagtgccc aagcagctgg cccagctctc tgaggccaag gatctccagg 2700

ctcgaaaggc cttcaactgc aaatactgca acaaggaata cctcagcctg ggtgccctca 2760

agatgcacat ccgaagccac acgctgccct gcgtctgcgg aacctgcggg aaggccttct 2820

ctaggccctg gctgctacaa ggccatgtcc ggacccacac tggcgagaag cccttctcct 2880

gtccccactg cagccgtgcc ttcgctgacc gctccaacct gcgggcccac ctccagaccc 2940

actcagatgt caagaagtac cagtgccagg cgtgtgctcg gaccttctcc cgaatgtccc 3000

tgctccacaa gcaccaagag tccggctgct caggatgtcc ccgcggcggc cgcggcggca 3060

gcggcggcat ggtgagcaag ggcgaggagc tgttcaccgg ggtggtgccc atcctggtcg 3120

agctggacgg cgacgtaaac ggccacaagt tcagcgtgtc cggcgagggc gagggcgatg 3180

ccacctacgg caagctgacc ctgaagctca tctgcaccac cggcaagctg cccgtgccct 3240

ggcccaccct cgtgaccacc ctcggctacg gcctgcagtg cttcgcccgc taccccgacc 3300

acatgaagca gcacgacttc ttcaagtccg ccatgcccga aggctacgtc caggagcgca 3360

ccatcttctt caaggacgac ggcaactaca agacccgcgc cgaggtgaag ttcgagggcg 3420

acaccctggt gaaccgcatc gagctgaagg gcatcgactt caaggaggac ggcaacatcc 3480

tggggcacaa gctggagtac aactacaaca gccacaacgt ctatatcacg gccgacaagc 3540

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aaggctacgt ccaggagcgc accatcttct tcaaggacga cggcaactac aagacccgcg 1260

ccgaggtgaa gttcgagggc gacaccctgg tgaaccgcat cgagctgaag ggcatcgact 1320

tcaaggagga cggcaacatc ctggggcaca agctggagta caactacatc agccacaacg 1380

tctatatcac cgccgacaag cagaagaacg gcatcaaggc caacttcaag atccgccaca 1440

acatcgagga cggcagcgtg cagctcgccg accactacca gcagaacacc cccatcggcg 1500

acggccccgt gctgctgccc gacaaccact acctgagcac ccagtccgcc ctgagcaaag 1560

accccaacga gaagcgcgat cacatggtcc tgctggagtt cgtgaccgcc gccgggatcg 1620

tttcatttat tggcagtacg gagaatgatg ttggaccgtc tcagggctct tattccagca 1680

ctcatgcaat ggataacctg ccatttgtct ataataccgg ttacaacatt ggatatcaga 1740

atgcaaatgt ctggcgtatt agtggcgggt tttgtgttgg tctggacggg aaagtggatt 1800

tacccgtggt tggcagtctt gacgggcaga gtatttatgg gctgacggag gaggtgggac 1860

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gggagaatgt cttttccgga tggtgcgtgg gaaattatgt atcaacgcag ggactgtctg 1980

ttcacgtaag accggtaatt ttaaaaagaa attcctctgc gcaatacagt gtacagaaaa 2040

ccagtatcgg gagtatcaga atgaggccct ataacggttc atctgcaggc agtgttcaga 2100

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gctatgatgg caaccgagtg accaacttcg tggcccagcg gctgtccgca gagctcctgc 2520

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agaacgagga tgagctcttc cgtctttcgc agctgggctt ggatgctgga aagatcaagc 2940

aggtggggat catctgtggg caggagagca cccggcggat cggggattac aaggttaaat 3000

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cagaaatcca tggggcacag ccgctggatg gggtgacggg cttcttggtg ctgatgtcgg 3120

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ctgcgatgat tgacactgag tttgccaagc agacctccct ggacgcagtg gcccaggccg 3240

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gcgaaatgag ccagcccaca ccgagcccag ccccagctgc aggaggacga gtgtaccctg 3420

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acatgaagca gcacgacttc ttcaagtccg ccatgcccga aggctacgtc caggagcgca 4080

ccatcttctt caaggacgac ggcaactaca agacccgcgc cgaggtgaag ttcgagggcg 4140

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agaagaacgg catcaaggcg aacttcaaga tccgccacaa catcgaggac ggcggcgtgc 4320

agctcgccga ccactaccag cagaacaccc ccatcggcga cggccccgtg ctgctgcccg 4380

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catcgcattg tctgagtagg tgtcattcta ttctgggggg tggggtgggg caggacagca 4800

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ctgaggcgga aagaaccagc tggggctcta gggggtatcc ccacgcgccc tgtagcggcg 4920

cattaagcgc ggcgggtgtg gtggttacgc gcagcgtgac cgctacactt gccagcgccc 4980

tagcgcccgc tcctttcgct ttcttccctt cctttctcgc cacgttcgcc ggctttcccc 5040

gtcaagctct aaatcggggg ctccctttag ggttccgatt tagtgcttta cggcacctcg 5100

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tttttcgccc tttgacgttg gagtccacgt tctttaatag tggactcttg ttccaaactg 5220

gaacaacact caaccctatc tcggtctatt cttttgattt ataagggatt ttgccgattt 5280

cggcctattg gttaaaaaat gagctgattt aacaaaaatt taacgcgaat taattctgtg 5340

gaatgtgtgt cagttagggt gtggaaagtc cccaggctcc ccagcaggca gaagtatgca 5400

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cagaagtatg caaagcatgc atctcaatta gtcagcaacc atagtcccgc ccctaactcc 5520

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gacaatcggc tgctctgatg ccgccgtgtt ccggctgtca gcgcaggggc gcccggttct 5880

ttttgtcaag accgacctgt ccggtgccct gaatgaactg caggacgagg cagcgcggct 5940

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cgactgtggc cggctgggtg tggcggaccg ctatcaggac atagcgttgg ctacccgtga 6420

tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc tgaccgcttc ctcgtgcttt acggtatcgc 6480

cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt gacgagttct tctgagcggg 6540

actctggggt tcgaaatgac cgaccaagcg acgcccaacc tgccatcacg agatttcgat 6600

tccaccgccg ccttctatga aaggttgggc ttcggaatcg ttttccggga cgccggctgg 6660

atgatcctcc agcgcgggga tctcatgctg gagttcttcg cccaccccaa cttgtttatt 6720

gcagcttata atggttacaa ataaagcaat agcatcacaa atttcacaaa taaagcattt 6780

ttttcactgc attctagttg tggtttgtcc aaactcatca atgtatctta tcatgtctgt 6840

ataccgtcga cctctagcta gagcttggcg taatcatggt catagctgtt tcctgtgtga 6900

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tggggtgcct aatgagtgag ctaactcaca ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc 7020

cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc 7080

ggtttgcgta ttgggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt 7140

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gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt 7500

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ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca 7680

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tcacgttaag ggattttggt catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta 7980

aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt 8040

taccaatgct taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata 8100

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agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc cagatttatc agcaataaac 8220

cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag 8280

tctattaatt gttgccggga agctagagta agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac 8340

gttgttgcca ttgctacagg catcgtggtg tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc 8400

agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg 8460

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agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag catcttttac tttcaccagc 8820

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ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct gacgtc 9036

<210> 4

<211> 8289

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 4

gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg 60

ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120

cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180

ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt 240

gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata 300

tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 360

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atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 600

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ccggcaagct gcccgtgccc tggcccaccc tcgtgaccac cctgacctgg ggcgtgcagt 1140

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agggcatcga cttcaaggag gacggcaaca tcctggggca caagctggag tacaactaca 3480

acagccacaa cgtctatatc acggccgaca agcagaagaa cggcatcaag gcgaacttca 3540

agatccgcca caacatcgag gacggcggcg tgcagctcgc cgaccactac cagcagaaca 3600

cccccatcgg cgacggcccc gtgctgctgc ccgacaacca ctacctgagc taccagtccg 3660

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ccgccgggat cactctcggc atggacgagc tgtacaagta aaagcttggg cccgaacaaa 3780

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gccagccatc tgttgtttgc ccctcccccg tgccttcctt gaccctggaa ggtgccactc 3960

ccactgtcct ttcctaataa aatgaggaaa ttgcatcgca ttgtctgagt aggtgtcatt 4020

ctattctggg gggtggggtg gggcaggaca gcaaggggga ggattgggaa gacaatagca 4080

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cttcctttct cgccacgttc gccggctttc cccgtcaagc tctaaatcgg gggctccctt 4320

tagggttccg atttagtgct ttacggcacc tcgaccccaa aaaacttgat tagggtgatg 4380

gttcacgtag tgggccatcg ccctgataga cggtttttcg ccctttgacg ttggagtcca 4440

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gcgcatgccc gacggcgagg atctcgtcgt gacccatggc gatgcctgct tgccgaatat 5580

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ccgctatcag gacatagcgt tggctacccg tgatattgct gaagagcttg gcggcgaatg 5700

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gcgacgccca acctgccatc acgagatttc gattccaccg ccgccttcta tgaaaggttg 5880

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ctggagttct tcgcccaccc caacttgttt attgcagctt ataatggtta caaataaagc 6000

aatagcatca caaatttcac aaataaagca tttttttcac tgcattctag ttgtggtttg 6060

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<213> Homo sapiens

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ccgcccctaa ctccgcccag ttccgcccat tctccgcccc atggctgact aatttttttt 4080

atttatgcag aggccgaggc cgcctctgcc tctgagctat tccagaagta gtgaggaggc 4140

ttttttggag gcctaggctt ttgcaaaaag ctcccgggag cttgtatatc cattttcgga 4200

tctgatcaag agacaggatg aggatcgttt cgcatgattg aacaagatgg attgcacgca 4260

ggttctccgg ccgcttgggt ggagaggcta ttcggctatg actgggcaca acagacaatc 4320

ggctgctctg atgccgccgt gttccggctg tcagcgcagg ggcgcccggt tctttttgtc 4380

aagaccgacc tgtccggtgc cctgaatgaa ctgcaggacg aggcagcgcg gctatcgtgg 4440

ctggccacga cgggcgttcc ttgcgcagct gtgctcgacg ttgtcactga agcgggaagg 4500

gactggctgc tattgggcga agtgccgggg caggatctcc tgtcatctca ccttgctcct 4560

gccgagaaag tatccatcat ggctgatgca atgcggcggc tgcatacgct tgatccggct 4620

acctgcccat tcgaccacca agcgaaacat cgcatcgagc gagcacgtac tcggatggaa 4680

gccggtcttg tcgatcagga tgatctggac gaagagcatc aggggctcgc gccagccgaa 4740

ctgttcgcca ggctcaaggc gcgcatgccc gacggcgagg atctcgtcgt gacccatggc 4800

gatgcctgct tgccgaatat catggtggaa aatggccgct tttctggatt catcgactgt 4860

ggccggctgg gtgtggcgga ccgctatcag gacatagcgt tggctacccg tgatattgct 4920

gaagagcttg gcggcgaatg ggctgaccgc ttcctcgtgc tttacggtat cgccgctccc 4980

gattcgcagc gcatcgcctt ctatcgcctt cttgacgagt tcttctgagc gggactctgg 5040

ggttcgaaat gaccgaccaa gcgacgccca acctgccatc acgagatttc gattccaccg 5100

ccgccttcta tgaaaggttg ggcttcggaa tcgttttccg ggacgccggc tggatgatcc 5160

tccagcgcgg ggatctcatg ctggagttct tcgcccaccc caacttgttt attgcagctt 5220

ataatggtta caaataaagc aatagcatca caaatttcac aaataaagca tttttttcac 5280

tgcattctag ttgtggtttg tccaaactca tcaatgtatc ttatcatgtc tgtataccgt 5340

cgacctctag ctagagcttg gcgtaatcat ggtcatagct gtttcctgtg tgaaattgtt 5400

atccgctcac aattccacac aacatacgag ccggaagcat aaagtgtaaa gcctggggtg 5460

cctaatgagt gagctaactc acattaattg cgttgcgctc actgcccgct ttccagtcgg 5520

gaaacctgtc gtgccagctg cattaatgaa tcggccaacg cgcggggaga ggcggtttgc 5580

gtattgggcg ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc 5640

ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata 5700

acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg 5760

cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct 5820

caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa 5880

gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc 5940

tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt 6000

aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg 6060

ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg 6120

cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct 6180

tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaagaacagt atttggtatc tgcgctctgc 6240

tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg 6300

ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc 6360

aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt 6420

aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa 6480

aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat 6540

gcttaatcag tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct 6600

gactccccgt cgtgtagata actacgatac gggagggctt accatctggc cccagtgctg 6660

caatgatacc gcgagaccca cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata aaccagccag 6720

ccggaagggc cgagcgcaga agtggtcctg caactttatc cgcctccatc cagtctatta 6780

attgttgccg ggaagctaga gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg 6840

ccattgctac aggcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg 6900

gttcccaacg atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct 6960

ccttcggtcc tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc agtgttatca ctcatggtta 7020

tggcagcact gcataattct cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg 7080

gtgagtactc aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc 7140

cggcgtcaat acgggataat accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg 7200

gaaaacgttc ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga 7260

tgtaacccac tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg 7320

ggtgagcaaa aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat 7380

gttgaatact catactcttc ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc 7440

tcatgagcgg atacatattt gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca 7500

catttccccg aaaagtgcca cctgacgtc 7529

<210> 7

<211> 30

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 7

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

1 5 10 15

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

20 25 30

Claims (2)

1.一种荧光能量共振转移（FRET）的生物感应器检测蛋白及肽段O-GlcNAc修饰及修饰位点的方法，其特征在于，采用基因克隆技术选择并获得能发生“荧光能量共振转移”的荧光蛋白对（eCFP 与Venus）的基因序列，并通过将凝集素GafD与目的蛋白（或肽段）依次连接在这对荧光蛋白中间，获得检测目标特定的生物感应器；通过在大肠杆菌与O-GlcNAc糖基转移酶构建共表达系统，诱导表达后当生物感应器内的目的蛋白或肽段发生O-GlcNAc修饰，凝集素GafD与O-GlcNAc结合使得“荧光对”距离至10nm内，导致其荧光共振能量转移效率的变化，据此推测目的蛋白或肽段是否有O-GlcNAc修饰。

2.根据权利要求1所述的生物感应器检测蛋白及肽段O-GlcNAc修饰及修饰位点的方法，其特征为；

（1）发生荧光共振转移“荧光蛋白对”是：增强型青色荧光蛋白（eCFP）和黄色荧光蛋白（Venus）；

（2）GlcNAc结合蛋白：能够与GlcNAc结合的凝集素和单链抗体等，例如文献中报道的凝集素GafD；

（3）检测O-GlcNAc修饰的生物感应器的设计和构建：在荧光蛋白对之间插入凝集素GafD，在该凝集素一边通过柔性Linker连接目的蛋白或肽段，其基本结构是“-FP₁（eCFP）-GafD-Linker-目的蛋白或肽段-Linker-FP₂（Venus）-”；

（4）生物感应器的阳性对照的设计和构建：通过一段柔性Linker将发生荧光共振转移的“荧光蛋白对（eCFP和Venus）”连接起来，其本结构是“-FP₁（eCFP）-Linker-FP₂（Venus）-”；

（5）在大肠杆菌BL21(DE3)中建立生物感应器与糖基转移酶的共表达系统：以质粒为载体，将上述序列克隆到原核表达载体启动子后，转入含有糖基转移酶基因的表达质粒的大肠杆菌BL21(DE3)中，使用诱导剂IPTG及阿拉伯糖诱导生物感应器及糖基转移酶OGT共表达；

（6）生物感应器荧光共振能量转移效率评价目的蛋白或肽段的是否有O-GlcNAc修饰：当生物感应器内的目的蛋白或肽段发生O-GlcNAc修饰，凝集素GafD与O-GlcNAc结合使得“荧光对”距离至10nm内，导致其荧光共振能量转移效率（E）升高；采用多功能酶标仪通过观察生物感应器较阴性对照的FRET 效率（E 值）变化，推测目的蛋白或肽段是否有O-GlcNAc修饰。