KR20180100028A - 형질전환시킨 중국햄스터난소 세포를 활용하여 시시엔5 단백질을 제조하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 시시엔5 단백질(이하, CCN5라고 약칭함, WISP-2, The human Wnt-1-induced signalling pathway protein-2) 유전자를 사용하여 형질 전환시킨 CHO(Chinese hamster ovary)세포와, 이를 활용하여 CCN5 재조합 단백질을 제조하는 방법, 그리고 이렇게 제조되는 CCN5 재조합 단백질과 그의 단편에 대한 것이다.

Description

형질전환시킨 중국햄스터난소 세포를 활용하여 시시엔5 단백질을 제조하는 방법{Preparation Process for CCN5 protein by using transfected CHO}

본 발명은 시시엔5 단백질(이하, CCN5라고 약칭함, WISP-2, The human Wnt-1-induced signalling pathway protein-2) 유전자를 사용하여 형질 전환시킨 CHO(Chinese hamster ovary)세포와, 이를 활용하여 CCN5 재조합 단백질을 제조하는 방법, 그리고 이렇게 제조되는 CCN5 재조합 단백질과 그의 단편에 대한 것이다.

1957년, 테오도르 티. 퍼크(Theodore T. Puck)가 최초로 중국 햄스터 난소 세포주(CHO cell line)를 확립한 이후, CHO 세포주는, 배양 속도가 빠르고 단백질 생산 효율이 높다는 점 때문에 재조합 단백질 생산용 세포주로서 가정 널리 선택되고 있다.

CHO 세포는 배양액 1리터 당 약 3 내지 10 그램의 재조합 단백질을 대량 생산할 수 있는 동물 유래의 세포주로 알려지고 있다.

한편 본 발명의 재조합 단백질 CCN5는, 섬유증식성 질환의 원인 세포인 근섬유모세포 (myofibroblast)를 선택적으로 사멸시키는 물질이며, CCN족에 속하는 기질 세포 단백질이다.

CCN족 단백질로는 6가지의 단백질이 공지되어 있으며, 이들은 혈관계 질환, 혈관신생, 종양생성, 섬유증식성 질환 유발, 세포 분화 및 생존과 같은 세포기능 조절에 다양한 역할을 한다는 사실이 공지되어 있다.

그 중, 본 발명의 재조합 단백질 CCN5는, 다른 CCN족 단백질과는 달리 C-말단 도메인이 없고, 250개의 아미노산 서열의 단일 폴리펩타이드 사슬로 구성되어 있다. 본 발명의 CCN5는, WISP-2, HICP, Cop1, CTGF-L 등 다른 이름으로도 알려지고 있다.

한편, 섬유증식성 질병의 원인이 되고 있는 콜라젠 등 세포외 기질의 과도한 조직 내 축적은, 장기 기능의 파괴와 염증성 면역 세포 및 주변 세포들과의 신호 전달체계의 구축에 따라 질환의 진행을 가속시키는 등, 인체 조직 기능의 손실을 지속적으로 유발한다.

섬유 형성 세포인 근섬유모세포(myofibroblast)의 병리적 증식으로 인하여 발생하는 섬유증식성 질병은, 심장, 신장, 간, 폐, 췌장, 대장, 눈 등을 포함하는 신체 장기들과, 중추 신경계, 피부, 근육, 혈관계, 섬유 종 및 종양의 증식과 전이에 영향을 주는 종양 간질 조직들에서 발생하는 심각한 만성질환이다.

따라서, 근섬유모세포의 이상 증식은 대부분의 섬유증식성 질병의 발생과 이로 인한 사망의 주요 원인이 된다. 근섬유모세포의 이상 증식을 일으키는 직접적인 원인에는, 조직 손상, 감염, 자가 면역 질환, 장기이식 및 이물질 반응, 종양 등이 있다.

최근에는 섬유증식성 질환을 일으키는 또 다른 원인으로서, 노화, 비만, 당뇨, 심혈관계 질환, 고혈압, 혈중 콜레스테롤 등도 중요한 원인으로 지목되고 있다.

섬유증식성 질병을 일으키는 원인과 발현되는 질환의 형태들도 매우 다양하지만, 각각의 조직들에서 진행되는 섬유증식성 질병의 진행 기전에는 획일적이고 일관된 형태의 경로가 존재하는 것으로 알려지고 있다.

비정상적으로 활성화된 섬유아세포(activated fibroblast)인 근섬유모세포(myofibroblast)가 모든 섬유 증식성 질환의 진행을 지배하는 원인 세포로서 지목되고 있다.

섬유증식성 질병의 핵심 진행자인 근섬유모세포는, 섬유성 1,3형 콜라젠으로 이루어진 세포 외 기질의 조직 내 축적을 야기한다. 이러한 근섬유모세포 세포 내에는 알파 평활근 액틴(α-SMA)이 발현되고, 세포외 기질을 분해하는 효소 유전자들이 비활성화되는 특징을 나타낸다.

근섬유모세포(myofibroblast)는 건강한 조직에는 거의 존재하지 아니하지만, 상처 부위 조직에 상주하는 섬유아세포(resident fibroblast)와 혈관의 원주 상피세포(pericyte)의 중간엽 세포들이 전구 세포로부터 분화되면서 활성화된다.

이러한 근섬유모세포(myofibroblast)의 활성화에는, 손상된 상피, 내피, 골수 유래 섬유소 세포, 면역세포 등에서 분비되는 TGF-β1, TNF-α, IL-1, IL-6, PDGF, IL-17A와 IL-13등의 성장인자와 싸이토카인 등이 관여한다.

이러한 근섬유모세포(myofibroblast)의 전구 세포들의 분화와 증식이 지속화되는 과정이 섬유증식성 질병의 근본 원인이다.

따라서, 이러한 섬유증식성 질환을 악화시키는 성장인자와 싸이토카인의 활성화 및 신호전달을 차단하는 것이 섬유증식성 질병을 치료하는 출발점이 될 수 있다

세포외 기질의 과잉 생산으로 경화된 조직의 기계적 자극이 근섬유모세포의 증식과 활성화를 자극하는 잠재성 TGF-β1의 자가분비를 촉진하여, 근섬유모세포가 더욱 증가되는 악순환이 나타나기도 한다.

근섬유모세포(myofibroblast)의 지속적인 활성은 세포 분화와 증식, 사멸 방지를 위한 유전자 전사와 마이크로 RNA들의 발현을 재 프로그램밍함으로써 만성 질환을 유발한다는 사실이 널리 공지되어 있다.

한편, 당 업계에서는 이러한 섬유증식성 질환 치료를 위해 TGF-β1, IL-13, LPA, CTGF, PDGF, αvβ6 인테그린, 갈렉틴-3, LOXL2, 트랜스글루타미네이즈-2,, NOX4와 JNK신호 억제제를 표적으로 하는 약물들이 개발 중이다.

그러나 근섬유모세포(myofibroblast)의 분화와 증식에 관련된 신호 억제를 통하여 섬유증식성 질환의 진행을 방지하는 효과가 기대되지만, 임상적으로 그러한 효과가 검증된 약물은 아직까지 개발되지 아니하고 있다.

섬유증식성 질병은 질병의 진행이 상당히 진행된 후에야 임상적으로 진단되는 만성 질병이기 때문에, 일차적인 치료 목표는 과잉 축적된 섬유의 제거와 손상된 조직 기능의 회복과 질병 상태의 가역적 복귀를 촉진하는 것이다.

따라서, 효과적인 섬유증식성 질병 치료제를 개발하기 위해서는 과잉 축적된 섬유의 제거와 손상된 조직 기능의 회복 그리고 섬유증식 상태의 가역적 복귀를 촉진을 위한 수단을 찾아내야 하는 것이 당업계의 현안 문제이다.

섬유증식성 질병 치료를 위한 근본적인 수단이 될 수 있는 근섬유모세포 (myofibroblast)의 세포사멸 기전이, 간 섬유증 실험동물 모델의 유도물질 투여 중단으로 인한 간 경화 증상이나, 항 바이러스 치료를 받은 환자의 간경화 증상이 가역적 회복을 일으킬 수 있다고 알려지고 있다.

따라서, 본 발명자들은, CCN5 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 유전자를 사용하여 형질전환시킨 CHO 세포를 활용하여 CCN5 재조합 단백질 또는 이의 단편을 제조함으로써, 인체에서 근섬유모세포(myofibroblast)의 세포사멸 기전을 유도할 수 있음에 착안하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

따라서, 기본적으로 본 발명은, CCN5 재조합 단백질 또는 이것의 단편을 암호화하는 유전자를 이용하여 형질전환시킨 CHO 세포를 제공하는 것을 1차적인 목적으로 한다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 CHO 세포의 형질변경에 사용되는 재조합 플라스미드 벡터를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 또 다른 목적은 CHO 세포의 형질변경에 사용된 재조합 플라스미드 벡터의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 또 다른 목적은 형질변경된 CHO 세포주가 분비하는 섬유증식성 질환의 치료 또는 예방 효과를 나타내는 CCN5 재조합 단백질 또는 이것의 단편을 제공하는 것을 목적으로 한다.

이상의 본 발명의 목적들은, 기본적으로 CCN5 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터(서열목록 (1)) 또는 CCN5 단백질을 암호화하는 유전자와 링커 도메인을 포함하는 재조합 벡터(서열목록 (2))를 제공함으로써 달성될 수 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 CCN5 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터(서열목록 (1))를 사용하여 형질 변환시킨 CHO 세포주(수탁번호 KCTC 13189BP 의 세포주)를 제공함으로써 달성될 수 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 CCN5 단백질을 암호화하는 유전자와 링커 도메인을 포함하는 재조합 벡터(서열목록 (2))를 사용하여 형질 변환시킨 CHO 세포주(수탁번호 KCTC 13080BP의 세포주)를 제공함으로써 달성될 수 있다.

본 발명의 또 다른 목적들은, CCN5의 분비 유도 영역이 제거된 서열을 가지면서 근섬유모세포의 세포사멸 활성을 나타내는 재조합 단백질을 제공함으로써 달성될 수 있다.

또한, 본 발명은 CCN5의 아미노 말단으로부터 23번째까지의 아미노산이 제거된 아미노산 서열을 포함하는 재조합 단백질을 제공함으로써 달성될 수 있다.

본 발명의 CCN5 단백질 또는 이의 단편은, 섬유증식성 질환의 공통기전인 근섬유모세포의 지속적인 병리적 활성을 억제하고, 근섬유모세포의 선택적 사멸을 촉진하여, 다양한 부위의 섬유증식성 질환을 치료할 수 있는 효과를 나타낸다.

본 발명의 CCN5 단백질 또는 이의 단편은, 섬유증식성 질환이 이미 발병하여 상당히 진행된 후에도, 섬유질의 분해와 정상적 조직 구조로의 회귀를 촉진하여, 난치병인 섬유증식성 질환에 새로운 치료법을 제공한다.

본 발명의 CCN5 단백질 또는 이의 단편은, 비정상적으로 증가된 세포외 기질의 분해가 진행되는 인체 내의 자연스런 치료 기전을 모방하여 이를 재현함으로써, 조직 이식 수술 등으로 인한 섬유화 반응으로 일어나는 부작용을 치료할 수 있는 효과가 있다.

도 1a는 수탁번호 KCTC 13189BP의 CHO 세포에서 분비형 CCN5 단백질의 발현을 웨스턴 블롯으로 나타낸 그림이다. M은 단백질 분자량 마커를 나타낸 것이고, 1레인은 pCMV-hCCN5 벡터로 형질도입된 CHO 세포로부터 세포 내 시료를 나타낸 것이고, 2레인은 pCMV-hCCN5 벡터로 형질도입된 CHO 세포로부터 세포 외로 분비된 시료를 나타낸 것이다. CCN5 단백질은 red arrowhead로 표시하였다.
도 1b는 분비형 CCN5 단백질을 대량생산하는 단일 세포주 형성 및 분리를 웨스턴 블롯으로 확인한 그림이다. 각 클론들은 4C, 6C, 7C, 8C, 9C로 표시되었으며 CCN5 단백질은 red arrowhead로 표시하였다.
도 2a는 수탁번호 KCTC 13080BP의 CHO에서 발현된 분비형 CCN5 융합단백질을 웨스턴 블롯으로 나타낸 그림이다.
M은 단백질 분자량 마커를 나타낸 것이고, 1레인은 공벡터로 형질도입된 CHO 세포로부터 세포 외로 분비된 시료를 나타낸 것이고, 2레인은 공벡터로 형질도입된 CHO 세포 내 시료를 나타낸 것이며, 3레인은 pCMV-hCCN5-myc-His 벡터로 형질도입된 CHO 세포로부터 세포 외로 분비된 시료를 나타낸 것이고, 4레인은 pCMV-hCCN5-myc-His 벡터로 형질도입된 CHO 세포 내 시료를 나타낸 것이다. CCN5 융합단백질은 red arrowhead로 표시하였다.
도 2b는 분비형 CCN5융합단백질을 대량생산하는 단일 세포주 형성 및 분리를 웨스턴 블롯으로 확인한 그림이다. 각 클론들은 C1~C28 로 표시되었으며 CCN5 융합단백질은 red arrowhead로 표시하였다.
도 2c는 컬럼 크로마토그래피로 정제한 후의 분비형 CCN5 단백질의 순도를 SDS-PAGE로 나타낸 그림이다. M은 단백질 분자량 마커를 나타낸 것이고, 1레인은 비환원 조건에서, 2레인은 환원 조건에서 분비형 CCN5 단백질을 보여주는 그림이다. 정제된 분비형 CCN5 단백질은 red arrowhead로 표시하였다.
도 3은 인간유래 진피 섬유아세포 (dermal fibroblast)에 TGF-β를 10ng/ml로 48시간 처리한 후 CCN5 단백질을 각 농도별로 처리하여 근섬유모세포 (myofibroblast)의 특정 마커 유전자인 α-SMA 유전자의 발현 억제 여부를 정량적 중합연쇄 반응 (quantitative RT-PCR)을 통해 비교한 그림이다.
도 4는 블레오마이신으로 폐섬유화증이 유도된 실험동물로의 CCN5 투여 시험의 결과이다.

이하, 다음의 실시 예를 들어 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 그러나 다음의 실시예들은 본 발명을 구체적인 실시 태양을 특정하여 설명하고자 하는 것일 뿐이며, 본 발명의 권리 범위를 이들에 기재된 내용으로 한정하거나 제한해석 하고자 의도하는 것은 아니다.

본 발명은 CCN5 단백질이 활성화된 근섬유모세포만을 선택적으로 사멸시키는 효과를 이용하여, 섬유증식성 질환이 이미 진행된 조직에서도 근섬유모세포의 수명과 기능을 조절하고, 섬유질의 분해와 정상 조직으로의 회귀를 가능케 하는 가역적 치료제로서, CCN5 단백질 또는 이의 단편이나 이를 암호화하는 유전자를 함유하는 약학 조성물을 제공할 수 있도록 하여 준다.

1) 신장 섬유증식성 질환

지속적인 증식과 활성화 상태인 병원성 근섬유모세포의 전구세포들은, 신장 조직 상주 섬유 아세포, 혈관주위 상피세포, 혈관 내피세포의 교차분화, 조골 유래 섬유소 세포 등이 염증성 면역세포들이 분비하는 섬유화 유발 인자들인 TGF-β, PDGF-B 등 여러 성장인자들에 의해 분화되고 증식된 것이다.

특히 상주 섬유아세포와 혈관 원주 상피세포의 근섬유모세포로의 분화는, 조혈 모세포 성장인자인 EPO의 생성과 분비의 감소, 상피세포의 박리외 모세혈관벽의 파괴, 염증물질 유출, 혈관소실로 기인한 저 산소화 환경 유발로 인한 만성 신장 질환 상태에서, 섬유증식성 질환을 가속시킨다.

병원성 근섬유모세포의 지속적 활성은 세포외 기질의 과잉 축적이 일으키는 기계적 조직 손상 이외에도, 염증성 싸이토카인과 케모카인의 분비로 인한 면역세포의 유입과 활성화의 염증환경의 유발에 따라 신장에서의 독소 물질의 배출, 영양분의 재흡수 등의 신장 기능 상실로 인한 만성 질환 상태가 계속 진행된다.

따라서 병원성 근섬유모세포를 표적으로 하여 신장 섬유증식성 질환을 치료하려는 것은 적절한 방법이며, 근섬유모세포의 분화와 증식에 관여하는 신호 전달계 억제, 나노 운반체를 활용한 선택적 약물전달과 활성 조절 등 다양한 약물 개발이 이루어지고 있다.

본 발명의 CCN5 단백질 또는 이것의 단편을 함유하는 약물은, 신장 섬유증식성 질환에서 세포외 축적 기질의 분해와 병원성 근섬유모세포들의 노화와 사멸유도를 통해 근섬유모세포의 활성억제 및 신장 기능의 회복 효과를 나타낸다.

2) 아토피와 건선을 포함한 피부섬유증

정상적인 상처 치유과정에서 근섬유모세포는 생리적으로 정교하게 조직 수복을 하고 피부 조직의 항상성을 유지시키는데 핵심적 역할을 한다.

상처 치유 초기에 호중구, 거식 세포와 비만 세포들이 분비하는 TGF-β, PDGF, IL-1, 트립타아제, 히스타민 등의 여러 인자는, 진피 섬유아세포, 원주 상피세포, 골수유래 섬유소 세포를 근섬유모세포로 분화시킨다.

활성화된 근섬유모세포는 세포외 기질의 분비를 통해 외부로부터의 감염 방지와 조직 리모델링이 정상적으로 진행되도록 하는 환경을 제공한다.

정상적인 상처 치유의 경우에는 근섬유모세포는 일시적이고 제한적 범위에서만 활성화되고, 상처치유 단계에 따라 외부 신호들에 의해 근섬유모세포는 분화, 증식, 사멸의 과정으로 상처 조직에서 사라진다.

또한, 근섬유모세포의 노화와 사멸과정에서 분비되는 메탈 의존적 단백질 분해효소들은 치유 과정에서 형성된 섬유화된 세포외 기질들을 분해하여, 반흔이 없는 정상적인 조직으로 상처부위를 되돌리게 된다.

병리적 상처, 화상, 피부조직 이식, 외과적 수술 후 상처, 자가 면역 질환 등에서 지속적으로 나타나는 근섬유모세포의 활성화는, 피부조직의 경직, 과도한 반흔의 섬유증식성 질환을 일으킨다.

따라서, 피부 섬유증은 피부의 과도한 흉터로 나타나며, 병리학적 상처 치유 반응의 결과이다. 근섬유모세포의 비정상적인 출현과 지속적 활성은 비대화된 상흔, 화상경직, 켈로이드, 피부경화증 현상의 공통적 원인이다.

또한, 피부 섬유증에서는 과도한 세포외 섬유성 기질의 축적과 경직을 통해 생긴 섬유성 병변이 근섬유모세포의 증식과 활성을 더욱더 촉진하여 심화시키는 악순환의 과정이 나타난다.

따라서 본 발명의 CCN5 단백질 또는 이의 단은, 근섬유모세포의 노화와 사멸을 유도하는 약리 작용을 통해, 기존에 존재하는 병리성 반흔과 섬유성 병변을 회복하는 치료 효과를 나타낸다.

단백질 분해효소가 섬유성 세포외 기질을 분해하여, 경직된 외부 환경의 자극을 통한 TGF-β의 유전자 전사와 자가분비, 자기 활성화를 억제시킴으로써 근섬유모세포의 증식과 세포외 기질의 축적을 억제할 수 있다.

그러므로, 근섬유모세포를 사멸시키는 기전을 자극하는 본 발명의 CCN5 단백질 또는 이의 단편을 함유하는 약학 조성물을 사용하여, 부작용을 최소화하면서 피부 섬유증식성 질병을 근본적으로 치료할 수 있다.

3) 폐 섬유화증(pulmonary fibrosis) 또는 특발성 폐 섬유화증(idiopathic pulmonary fibrosis, IPF)

폐 섬유화증 또는 특발성 폐 섬유화증은 만성적으로 진행되는 폐 간질의 섬유화를 특징으로 한다. 이 질병은 인구 10만 명 중 30-70명의 유병률을 가지는 것으로 알려지고 있으며, 한국에서는 희귀 난치성 질환으로 지정되어 있다.

현재까지 폐 섬유화증의 발병 과정이나 원인에 대해서는 명확하게 알려지지 않고 있다. 주로 환경 오염물질이나 미세 먼지에 장기간 노출되어 있거나, 바이러스의 감염 등에 의하여 활성화된 산소가 많이 생성되고, 이러한 활성 산소가 폐에 염증을 일으키고, 이로 인해 폐 섬유화증이 일어나는 것으로 추정되고 있다.

이러한 염증반응으로 인하여 근섬유모세포(myofibroblasts)가 비정상적으로 활성화되면서 과도한 세포외 기질(extracellular matrix)생성을 초래하여 폐 간질의 섬유화를 초래하게 된다고 보고되고 있다.

폐 간질 섬유화증은 주로 폐에서 한정 지어 나타나며, 조직학적으로는 통상형 간질성 폐렴(usual interstitial pneumonia, UIP)으로 분류된다.

특발성 폐 섬유화증은 서서히 진행되는 폐 기능의 저하로 인하여, 호흡곤란, 기침, 흉통과 객혈 등으로 진행된다. 특발성 폐 섬유화증은, 진단 이후 평균 생존 기간이 3년 내지 5년 이내의 치명적인 질환으로 알려지고 있고, 일단 병이 진행이 되어 섬유화되어 굳어진 이후에는, 어떠한 치료로도 병세가 호전이 되지 아니하는 것으로 보고되고 있다.

현재 특발성 폐섬유화증에 대한 원인 치료제는 없으며, 증상 완화를 위한 일시적인 치료에 한정되고 있는 실정이다.

이에 따라, 폐 섬유화증의 증상인 섬유화를 직접적으로 억제할 수 있는 물질을 사용하여 발병된 폐섬유화증을 개선시키려는 연구가 진행되고 있다.

예를 들어, 항 섬유화 약물인 피르페니돈(pirfenidone), 아세틸시스테인, 항응고제/스테로이드 병합요법 등을 통하여 특발성 폐섬유화증의 치료효과를 검증하고자 하였으나, 긍정적인 치료 효과를 얻지 못하고 있는 실정이다.

본 발명의 CCN5 단백질 또는 이의 단편은, 특발성 폐 섬유화증 질환에서 세포 외에 축적된 기질의 분해와 α-SMA 유전자 발현을 특징으로 하는 근섬유모세포들의 노화와 사멸을 통하여, 특발성 폐 섬유화증 치료 효과를 나타낸다.

4) 간섬유화 (Hepatic fibrosis or liver cirrhosis)

간 섬유화는 반복적인 간 손상에 대한 상처 회복 과정의 결과로서 나타나며, 간 세포는 콜라겐과 피브로넥틴과 같은 세포외 기질을 정상 조직 보다 약 6~8 배 많이 함유하게 된다.

간 성상 세포(hepatic stellate cell, HSC)는 손상된 간에서 세포외기질을 분비하는 주된 세포로서, 간 섬유화 증세에 핵심적인 역할을 담당하는 것으로 알려지고 있다.

간 성상 세포는 간이 손상을 받게 되면 활성화되어 alpha-smooth muscle actin (α-SMA) 양성인 근섬유모세포(myofibroblast)처럼 형태가 변한다.

활성화된 간 성상 세포는 다양한 염증성 사이토카인을 분비하며, 콜라겐(주로 I, III형)을 합성하여 세포외로 분비한다.

최근에는 마우스 간세 포(hepatocyte)가 TGF-β에 의하여 섬유모세포(fibroblast)로 바뀌는 과정(epithelial to mesenchymal transition, EMT)도, 간 섬유화 기전의 하나로서 지적되고 있다.

TGF-β는 간 섬유화 과정의 핵심적인 물질로서 간 성상 세포를 활성화 시키며 세포외기질의 합성을 유발하고 분해는 억제하여 간 섬유화를 유발한다.

간 섬유화의 또 다른 원인으로서, 환경오염 물질, 알코올, 바이러스 등 간 손상의 원인에 따라 차이를 보이지만, 간 손상에 의하여 먼저 간 세포가 손상 받고 손상된 간 세포에서 활성 산소와 염증과 관련된 물질들이 분비된다.

이에 따라 쿠퍼세포(Kupffer cell)와 염증세포들이 활성화되고, 이어서 간 성상 세포가 활성화되는 과정이 나타난다.

현재까지 간 섬유화의 치료를 위해 사용되는 약물들은 뚜렷한 치료 효과를 보이지 못하는 것으로 알려지고 있다.

본 발명의 CCN5 단백질 또는 이의 단편를 함유하는 약물은 근섬유모세포를 노화와 선택적 사멸을 촉진하여 간 섬유증식성 질환을 치료한다.

본 발명의 CCN5 유전자 발현 시스템을 제조하기 위해, CCN5단백질을 암호화하는 유전자는 적합한 발현 컨스트럭트 (expression construct) 내에 존재하는 것이 바람직하며, CCN5 단백질 유전자는 프로모터에 작동적으로 연결되는 것이 바람직하다.

본 명세서에서, 용어 "작동적으로 연결된"은 핵산 발현 조절 서열 (예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합위치의 어레이)과 다른 핵산 서열 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.

본 발명에 있어서, CCN5 단백질 유전자 서열에 결합된 프로모터는, 바람직하게는 대장균, 효모, 동물세포에서 작동하여 CCN5 단백질 유전자의 전사를 조절할 수 있는 것이다.

본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명은 (a) CCN5 단백질의 유전자를 포함하는 세포에 특정 시험 물질을 처리하는 단계 및 (b) 상기 CCN5 단백질 유전자의 발현을 분석하는 단계를 포함하며, 상기 특정 시험 물질이 CCN5 단백질 유전자의 발현을 증가시키면 섬유증식성 질환 예방 또는 치료제로 판단하는 것을 특징으로 하는 근 섬유아세포의 선택적 사멸의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 방법에 따르면, 우선 CCN5 단백질 유전자를 포함하는 세포에 분석 하고자하는 특정 시험 물질을 접촉시킨다. 바람직하게는, 이때 사용하는 CCN5 단백질 유전자를 포함하는 세포는 심장으로부터 유래한 세포이다.

본 발명의 스크리닝 방법에 있어서 사용되는 "시험물질"이란, CCN5 단백질 유전자의 발현량 또는 CCN5 단백질의 양에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 물질을 의미한다.

상기 시험물질은, 화학물질, 뉴클레오타이드, 안티-센스RNA, siRNA (small interference RNA) 및 천연물 추출물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이어, 특정 시험 물질이 처리된 세포에서 CCN5 단백질 유전자의 발현량 또는 CCN5 단백질의 양을 측정한다.

측정 결과, CCN5 단백질 유전자의 발현량 또는 CCN5 단백질의 양이 증가-조절(up-regulation)되는 것이 측정되면, 상기 시험 물질은 근섬유모세포 활성화에 의한 심부전 예방 또는 치료제로 예비 판정될 수 있다.

또한 본 발명은, (i) CCN5 유전자를 포함하는 벡터를 제조하는 단계; (ii) 상기 벡터를 CHO 세포에 형질전환 시키는 단계; (iii) 상기 형질전환체 또는 형질감염체로부터 생산된 CCN5 단백질을 정제하여 회수하는 단계를 포함하는 CCN5 단백질 또는 이의 단편을 제조하는 방법에 대한 것이다.

본 발명에서 "벡터"란 적당한 숙주 세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 발현 벡터를 의미하는 것으로서, 삽입된 유전자가 발현되도록 하는 유전자 제작물을 의미한다.

본 발명에서는 CCN5 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제조할 수 있는데, 상기 제조된 재조합 벡터를 CHO 세포에 형질전환 또는 형질감염시킴으로써, 본 발명의 CCN5를 생성하는 CHO 세포로부터 재조합 단백질의 형태로 수득하였다.

또한 전체 CCN5 유전자를 pCDNA3.1 myc/his에 도입하여, 플라스미드 벡터를 제조 (이하 pCMV-CCN5-m/h)하고, 상기 벡터를 CHO (Chinese Hamster Ovary)세포에 형질 감염시켜 배양함으로써, 분비형 CCN5 단백질을 배양액으로부터 회수하였다.

본 발명의 재조합 벡터는 본 발명의 CCN5유전자를 CHO세포에 적합한 프로모터를 함유한 벡터에 연결하여 제조된다.

본 발명의 유전자가 삽입될 벡터는 그것이 숙주 세포 안에서 복제될 수 있는 것이라면 특별히 제한되지는 아니한다.

아울러, 본 발명에서의 벡터는 유전자 발현 활성화 단백질이 연결된 융합 플라스미드가 사용될 수 있으며, 이러한 융합 플라스미드에는 ubiquitin, GST, MBP, GFP, His-tag, Myc-tag 등이 공지되어 있으나, 상기 예들만으로 본 발명에서 사용가능한 융합 플라스미드가 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 유전자를 벡터에 삽입하기 위해, 정제된 CCN5 유전자를 적당한 제한효소로 절단하여 적당한 벡터 DNA의 제한 부위 또는 클로닝 부위에 삽입하는 방법이 사용될 수 있다.

본 발명의 유전자는, 벡터에 작동 가능하게 연결되어 있어야 한다. 작동 가능한 연결을 위해서, 본 발명의 벡터는 프로모터 및 본 발명의 유전자 이외에 인핸서 (enhancer)와 같은 시스 요소 (cis element), 스플라이싱 시그널 (splicing signal), 폴리 A 추가 시그널 (poly A addition signal), 선택 마커 (selection marker), 라이보좀 결합 서열 (ribosome binding sequence, SD sequence) 등을 추가로 포함할 수 있다.

선택 마커의 예를 들면, 클로람페니콜 저항 유전자, 암피실린 저항 유전자, 디하이드로폴레이트 환원효소(dihydrofolate reductase), 네오마이신 저항 유전자 등이 사용될 수 있으나, 본 발명의 벡터에 작동 가능하도록 연결되는 추가적 구성요소가 상기 예들만으로 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 사용되는 용어, "형질전환 (transformation) 또는 "형질감염 (transfection)"이란 유전자를 숙주 세포에 도입하여 유전자가 숙주 세포의 염색체의 인자로서 또는 염색체 통합 완성에 의해 복제 가능하게 되는 것으로서, 외부의 유전자를 숙주 세포 내로 도입하여 인위적으로 유전적인 변화를 일으키는 현상을 의미한다.

본 발명의 형질전환 방법은, 일반적으로 알려진 형질전환 방법이 사용될 수 있으며, 당업계의 통상적인 방법에 따라 수행할 수 있다.

일반적으로 형질전환 방법에는 CaCl₂ 침전법, CaCl₂ 방법에 DMSO (dimethyl sulfoxide)라는 환원물질을 사용함으로써 효율을 높인 하나한(Hanahan) 방법, 전기천공법 (electroporation), 인산칼슘 침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로 박테리아 매개된 형질전환법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 있다.

상기 예시들에 의하여 본 발명의 형질감염 또는 형질전환 방법이 제한되는 것은 아니며, 업계에서 통상적으로 사용되는 형질전환 또는 형질감염 방법이 제한없이 사용될 수 있다.

필요로 하는 유전자가 발현되도록, 본 발명의 재조합 벡터를 CHO 세포 도입함으로써, 본 발명의 형질전환체(transformant) 또는 형질감염체를 획득할 수 있었다. 숙주 세포는 본 발명의 유전자를 발현하도록 하는 한 특별히 제한되지는 않는다.

본 발명에서 사용되는 프로모터는, 본 발명의 유전자를 CHO세포 발현하도록 하는 한 공지된 어떠한 프로모터도 사용될 수 있다.

효모를 숙주 세포로 사용하는 경우에는, GAP 프로모터, GAL 프로모터, ADH2 프로모터, CYC 프로모터, 그리고 TEF 프로모터가 사용될 수 있다.

포유동물 세포를 숙주 세포로 사용하는 경우에는, 바이러스로부터 유래된 프로모터 및 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터를 포함한다.

예를 들면, 본 발명에서 사용될 수 있는 프로모터에는 CMV(cytomegalo virus)프로모터, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, HSV의 tk 프로모터, RSV 프로모터, EF1 알파 프로모터, 메탈로티오닌 프로모터, 베타-액틴 프로모터, 인간 IL-2 유전자의 프로모터, 인간 IFN 유전자의 프로모터, 인간 IL-4 유전자의 프로모터, 인간 림포톡신 유전자의 프로모터 및 인간 GM-CSF 유전자의 프로모터가 포함되나, 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 회수되는 목적 단백질의 정제를 용이하게 하기 위하여, 플라스미드 벡터의 제조에, 필요에 따라, 또다른 유전자 서열을 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 추가적으로 포함될 수 있는 서열은 단백질 정제용 태그 서열일 수 있다.

예를 들면, 글루타티온 S-트랜스퍼라제 (Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질 (NEB, USA), FLAG (IBI, USA) 및 6x His (hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 있고, 가장 바람직하게는 6x His (hexa histidine)일 수 있으나, 상기 예들만으로 목적 단백질의 정제를 위하여 추가될 수 있는 유전자 서열이 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 CCN5 단백질을 포함하는 조성물을 제조하는 방법은 숙주 세포로부터 생산된 CCN5 단백질을 정제하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.

이와 같은 단백질 정제 방법은 바람직하게는 상기 단백질 정제용 태그를 이용하거나 또는 친화성 크로마토그래피를 이용하여 정제할 수 있게 된다.

이하, 본 발명의 내용을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예를 들어 설명하기 위한 것으로서 본 발명의 권리 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 인간 유래 CCN5의 cDNA 유전자 클로닝

인간 유래 CCN5를 재조합 단백질로 발현시키기 위하여, 인간 유래 상피세포로부터 total RNA를 추출하여 이로부터 cDNA를 합성하였다.

인간 유래 진피 섬유아세포(human dermal fibroblast cell)를 10% 혈청 배지에서 5% 이산화탄소 37℃ 조건하에서 배양한 후(1x106 cell)에, 배양액을 제거하고 세포에 PBS완충액을 첨가하여 2회 세척하고 0.5ml의 RNA 추출액(Trizol reagent, Thermo Fisher Scientific)을 직접 가하였다.

RNA 추출물이 가해진 혼합물을 10분간 상온에서 방치한 후 0.1ml의 클로로포름을 첨가하여 15초간 교반한 뒤, 약 12,000G로 10분간 원심분리 한 다음, 분리된 상층액을 취하여 동일 부피의 이소프로필알콜을 첨가하고, 12,000G로 10분간 원심분리한 뒤, 액체를 제거한 후, 75% 에탄올로 1회 세척을 하고 상온에서 RNA를 건조시켰다.

RNAase가 없는 정제 증류수를 약 50ul를 가하여 분광광도계를 이용하여 RNA의 정량 및 순도를 측정하였다. cDNA를 합성하기 위해 정제된 total RNA 2ug에 oligo dT와 결합 반응을 70C에서 5분간 진행시킨 후, 10X 역전사반응 완충용액, 10mM dNTP, RNAse 저해제, 및 M-MLV 역전사효소 (Enzynomics, Korea)를 가하여 cDNA 합성반응을 42℃에서 60분간 수행하였다.

cDNA 합성반응 후, 72℃에서 5분간 가열하여 역전사효소를 불활성화시킨 다음, RNase H를 첨가하여 단일가닥의 RNA를 제거하고, 이를 CCN5 유전자의 중합효소 연쇄반응의 주형으로 사용하였다.

전체 CCN5 유전자를 얻기 위하여 아미노 말단을 암호화하는 프라이머 (RCCN5) 5’-GGATCCGAATTCATGAGAGGCACACCGAAGACCCACC-3’ 와(서열목록(3)) 카르복실 말단을 암호화하는 프라이머 (XCCN5) 5‘-AAAAAACTCGAGCTAGAAGGCACTGTTTTGTGGACTGCG-3’를 (서열목록(4)) 합성한 다음, 상기에서 제조된 cDNA를 주형으로 하여 중합효소연쇄반응을 수행하였다.

0.2pmol 프라이머 (RCCN5)와 0.2pmol 프라이머 (XCCN5)를 dNTP 0.2nM, 1x AccuPrime Taq DNA 중합효소 반응 완충용액 (Invitrogen, USA) 및 1 unit의 AccuPrime Taq DNA 중합효소를 섞은 후, 중합효소 연쇄 반응 장치에서 95℃ 40초 58℃ 30초, 72℃ 1분의 40주기로 증폭 반응을 수행하였다.

반응 후에 증폭된 약 0.7kbp의 DNA절편을 1% 아가로스겔에서 전기 영동하여 분리 한 다음, pGEMT easy (Promega, USA) 벡터에 T4DNA 연결효소를 이용하여 삽입하고, 이렇게 얻어진 DNA들을 염기서열 분석한 결과, 인간 유래 CCN5의 전체 단백질을 암호화하는 cDNA를 얻었음을 확인할 수 있었다.

실시예 2: 세포 외 분비형 CCN5 유전자의 포유동물 세포용 발현벡터 제조

포유동물 세포인 CHO(Chinese Hamster Ovary) 세포에서 CCN5 유전자를 재조합 단백질 형태로 세포 외 분비로 유도 발현시키기 위하여, 포유동물 세포용 단백질 발현 벡터인 pCDNA3.1 myc/his(Invitrogen)에 분비 유도서열이 포함된 CCN5 전체 유전자를 삽입하였다.

실시예 1에서 얻어진 CCN5 유전자 pTA-hCCN5를 제한효소 EcoRI 과 XhoI으로 절편하여 얻어진 CCN5 유전자 절편을 pCDNA3.1 myc/his의 EcoRI 과 XhoI 부위로 삽입하였다.

이 과정을 통하여 완성된 서열목록(1)의 재조합 벡터를 pCMV-hCCN5 라고 명명하였다.

CCN5 단백질의 정제를 용이하게 하기 위해서 CC5 유전자의 카보시 말단에 myc peptide와 6개의 Histidine 이 융합된 CCN5 융합단백질을 만들기 위하여 전체 CCN5 유전자 아미노 말단을 암호화하는 프라이머 (RCCN5) 5‘-GGATCCGAATTCATGAGAGGCACACCGAAGACCCACC-3’와 (서열목록(3)) CCN5 유전자의 카르복실 말단을 암호화하면서 종결코돈이 없는 프라이머 (XCCN5-NoT) 5‘-AAAAAACTCGAGGAAGGCACTGTTTTGTGGACTGCG-3’를 (서열목록(5)) 합성한 다음, 상기에서 제조된 pTA-hCCN5를 주형으로 하여 중합효소연쇄반응을 수행하였다.

0.2pmol 프라이머 (RCCN5)와 0.2pmol 프라이머 (XCCN5-NoT)를 dNTP 0.2nM, 1x AccuPrime Taq DNA 중합효소 반응 완충용액 (Invitrogen, USA) 및 1 unit의 AccuPrime Taq DNA 중합효소를 섞은 후, 중합효소 연쇄 반응 장치에서 95℃ 40초 58℃ 30초, 72℃ 1분의 25주기로 증폭 반응을 수행하였다.

반응 후에 증폭된 약 0.7kbp의 DNA절편을 제한효소 제한효소 EcoRI 과 XhoI으로 절편하여 얻어진 CCN5 유전자 절편을 1% 아가로스겔에서 전기 영동하여 분리 한 다음, pCDNA3.1 myc/his의 EcoRI 과 XhoI 부위로 삽입하였다. 이 과정을 통하여 완성된 서열목록 (2)의 재조합 벡터를 pCMV-hCCN5-myc-His 라고 명명하였다.

실시예 3: CHO세포에서 세포 외 분비형 CCN5 유전자의 발현

CHO-K1 세포주는 10% FBS (Fetal bovine serum, Gibco)를 포함한 DMEM (Gibco) 배지에서 배양하였으며, 발현벡터 pCMV-hCCN5 및 pCMV-hCCN5-myc-His 유전자의 형질도입은 Lipofectamine 2000(Invitrogen)을 이용하여 수행하였다.

CHO-K1 세포주에 형질 도입 24시간 후에 PBS 완충용액으로 1회 세척한 다음, FBS가 제거된 DMEM으로 치환하여 형질 도입된 CHO-K1 세포주를 24시간 더 배양하였다. 24시간 후에 얻어진 DMEM 배지에 최종 농도 10%가 되게 TCA (Trichloroacetic acid, Sigma)를 넣어 단백질을 침전시킨 뒤, 그 침전물을 100% 아세톤으로 2회 세척하고 상온에서 침전물을 건조한 뒤 50mM Tris 완충용액에 녹여 SDS-폴리아크릴아마이드 전기영동을 실시하였다.

단백질 전기영동 젤을 웨스턴 블롯을 실시하여 CCN5 단백질에 대한 항체를 반응시켜 단백질의 발현 여부를 재확인하였다. (도면 1의 A)

실시예 4: 분비형 CCN5를 대량 생산하는 단일 세포주 형성 및 분리

CCN5 단백질을 발현하는 세포들을 단일 세포주로 분리하기 위하여, 상기 실시예 2에서 얻어진 포유동물 세포 발현 벡터로 형질도입 된 CHO 세포주들을, 10% FBS를 첨가한 DMEM 배지에서 37℃, 5% CO2 조건하에서 48시간 동안 배양한 다음, 세포를 1:10의 부피로 계대 배양하고 선택배지에서 2주 동안 콜로니를 형성시켰으며, 생성된 각각의 콜로니들을 분리하여 마이크로플레이트에서 세포를 성장시켰다.

이들 콜로니들 중에서 세포 외로 분비되는 CCN5 단백질을 발현하는 재조합 세포주 들을 선별하기 위하여 단백질 발현 여부를 웨스턴 블롯을 실시하여 확인 하였다. (도면 1의 B)

이와 같이 세포 외로 분비되는 CCN5 단백질 및 링커가 결합된 CCN5 융합단백질을 발현하는 재조합 세포주를 한국생명공학연구원 전북분원 생물자원 센터에 2017년 1월 24일 수탁번호(KCTC 13189BP)와 2016년 8월 18일 수탁번호(KCTC 13080BP)로 각각 기탁하였다.

실시예 5: CHO 세포 유래 분비형 CCN5 단백질 분리 및 정제

CCN5 단백질을 생산하는 단일 CHO 세포주를 10% FBS가 포함된 DMEM 배지에 1x10⁵cells/mL의 농도로 조정한 다음, 5% CO₂, 37℃ 배양기에서 3일 동안 배양하였다. 3일 후에 배지를 제거하고 PBS를 이용하여 세척한 후 FBS를 포함하지 않는 DMEM 배지로 교환 하고 1일 동안 추가 배양하였다.

1일 경과 후에 DMEM 배양액을 수확하여 13,000rpm에서 10분 동안 원심분리하여 상등액을 회수하였다. 상등액은 0.45um 실린지 필터를 통해 여과하였고, 정제 컬럼은 결합 완충액(50mM Tris, 0.5M NaCl, pH 8.0)으로 평형화된 1mL HisTrap^TMFFcolumn(GEHealthcare)을 사용하였다.

모든 컬럼 작업은 AKTA starter(GE Healthcare)상에서 수행하였고, 미결합된 단백질은 10 컬럼 볼륨(Column Volume; CV)의 결합 완충액으로 세척하여 제거하였다. 비특이적인 결합 단백질은 세척버퍼(50mm Tris, 0.5M NaCl, 2.5mM Imidazole, pH 8.0)를 이용하여 5CV 동안 세척하고, 용출버퍼(50mM Tris, 0.5M NaCl, 15mM Imidazole, pH 8.0)를 이용하여 단백질을 용출하였다.

CCN5 단백질을 포함하는 분획을 모으고, PBS 완충용액을 이용하여 분자량 컷-오프 10KDa 원심분리 필터를 이용하여 이미다졸과 NaCl을 제거 및 농축을 실시하였다.

최종적으로 분리된 CCN5 단백질은 12% SDS-PAGE를 이용하여 분석하였고, 단백질의 농도는 표준방법으로서 BSA를 이용하는 Bradford assay을 이용하였다. (도면 2의 C)

실시예 6: 재조합 CCN5 단백질의 활성 및 역가 분석

실시예 5에서 얻어진 CCN5 단백질의 활성을 비교 분석하기 위하여 다음과 같이 세포기반 분석 실험을 진행하였다. 인간 진피 섬유아세포 (human dermal fibroblast)를 10% FBS를 포함하는 DMEM 배지에서 배양하였다.

약 4x10⁴ 세포를 6well plate에 배양을 하여 24시간 후에 10ng/ml의 농도로 TGFb를 처리한 다음 48시간동안 추가로 배양하였다. 48시간 후 실시예 5에서 얻어진 정제된 CCN5 단백질 농도별로 처리한 뒤 48시간을 더 배양하였다.

배양액을 제거하고 세포에 PBS 완충용액을 첨가하여 2회 세척하고, 0.5ml의 RNA 추출액 (Trizol reagent, Thermo Fisher Scientific)액을 직접 가한다. 10분간 상온에서 방치한 후 0.1ml의 클로로포름 을 첨가하여 15초간 교반한 다음, 약 12,000G로 10분간 원심분리 하였다.

분리된 상층액을 취하여 동일 부피의 이소프로필알콜을 첨가하고, 12,000G로 10분간 원심분리한 다음, 액체를 제거한 후 75% 에탄올로 1회 세척을 하고 상온에서 건조를 시켰다. RNAase가 없는 정제 증류수를 약 50ul를 가하여 분광광도계를 이용하여 수득된 RNA의 정량 및 순도를 측정하였다.

cDNA를 합성하기 위해, 정제된 total RNA 2ug에 oligo dT와 결합 반응을 70℃에서 5분간 진행시킨 후, 10X 역전사반응 완충용액, 10mM dNTP, RNAse 저해제, 및 M-MLV 역전사효소 (Enzynomics, Korea)를 가하여, cDNA 합성반응을 42℃에서 60분간 수행하였다.

cDNA 합성 반응 후 72℃에서 5분간 가열하여 역전사효소를 불활성화시킨 다음, RNase H를 첨가하여 단일가닥의 RNA를 제거하여 cDNA를 얻었다. 근섬유모세포의 특징 유전자인 α-SMA의 발현 변화 여부를, 정량적 중합연쇄반응 (Quantitative RT-PCR)을 통해 관찰하였다.

이때 보정을 위한 유전자로서, beta-actin 유전자와 18S 유전자를 함께 정량화 하여 발현의 차이를 보정하였다. 사용된 유전자들의 염기 서열은 다음과 같다. alpha-SMA 유전자를 위해서는 5‘-GCCCAGCCAAGCACTGTCAGGA-3’ (서열목록(6))와 5’-TCCCACCATCACCCCCTGATGTC-3' 올리고뉴클레오타이드 프라이머(서열목록(7))를 사용하였고, beta-actin 유전자를 위해서는 5‘-CTGGCACCACACCTTCTACAATG-3’(서열목록(8))과 5‘-AATGTCACGCACGATTTCCCGC-3’ 올리고뉴클레오타이드 프라이머(서열목록(9))를 사용하였으며, 18S 유전자를 위해서는 5‘-TAACGAACGAGACTCTGGCAT-3’ (서열목록(10))과 5‘-CGGACATCTAAGGGCATCACAG-3’ 올리고뉴클레오타이드 프라이머(서열목록(11))를 사용하였다.

실시예 7: 블레오마이신으로 폐섬유화증이 유도된 실험동물에 대한 CCN5 단백질의 치료효과 시험

in vivo 조건에서 블레오마이신(Bleomycin)의 투여에 의해 유도된 폐 섬유화증에 대해, 정제된 CCN5 단백질 제제의 치료효과를 확인하고자, 20~25g의 몸무게를 가진 8주령 C57BL/6 마우스를 구입하였다.

블레오마이신으로 유도된 폐 섬유화증 마우스 모델을 이용하여 CCN5 단백질이 폐 섬유화를 억제하는지 평가하기 위해 폐 섬유화증 마우스들을 4개의 그룹으로 나누어서 실험을 하였다.

각 군의 투여 방법과 약물은 아래 표와 도4에서 나타내었다.

	마리(n)	투여물질	투여횟수
제1군	5	0.9% saline	주 4 회
제2군	5	CCN5 단백질	주 4 회
제3군	5	Bleomycin+0.9% saline	주 4 회
제4군	5	Bleomycin+CCN5 단백질	주 4 회

블레오마이신 투여하고 일주일 경과한 다음 CCN5 단백질을 약 0.5mpk 농도로 IP 방법으로 주사한 다음, 7,14,21일 경과 후 이들 동물모델로부터 폐조직을 적출하였다. 적출된 폐를 고정시키고, H&E 염색법과 Masson-trichrome 염색법을 각각 적용하여 고정된 폐 조직을 염색하고, 염색된 폐 조직을 Image J assay로 평가하여 폐 손상과 폐 섬유화를 평가하고 비교하였다.

한국생명공학연구원 KCTC13189BP 20170124 한국생명공학연구원 KCTC13080BP 20160818

<110> Paean Biotechnology Inc. <120> Preparation Process for CCN5 protein by using transfected CHO <130> PBPA1603.KR <160> 11 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 6216 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p3.1-full CCN5(noT) <400> 1 gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg 60 ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120 cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180 ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt 240 gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata 300 tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 360 cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 420 attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 480 atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 540 atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 600 tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga 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tttcgccctt tgacgttgga gtccacgttc tttaatagtg gactcttgtt ccaaactgga 2400 acaacactca accctatctc ggtctattct tttgatttat aagggatttt gccgatttcg 2460 gcctattggt taaaaaatga gctgatttaa caaaaattta acgcgaatta attctgtgga 2520 atgtgtgtca gttagggtgt ggaaagtccc caggctcccc agcaggcaga agtatgcaaa 2580 gcatgcatct caattagtca gcaaccaggt gtggaaagtc cccaggctcc ccagcaggca 2640 gaagtatgca aagcatgcat ctcaattagt cagcaaccat agtcccgccc ctaactccgc 2700 ccatcccgcc cctaactccg cccagttccg cccattctcc gccccatggc tgactaattt 2760 tttttattta tgcagaggcc gaggccgcct ctgcctctga gctattccag aagtagtgag 2820 gaggcttttt tggaggccta ggcttttgca aaaagctccc gggagcttgt atatccattt 2880 tcggatctga tcaagagaca ggatgaggat cgtttcgcat gattgaacaa gatggattgc 2940 acgcaggttc tccggccgct tgggtggaga ggctattcgg ctatgactgg gcacaacaga 3000 caatcggctg ctctgatgcc gccgtgttcc ggctgtcagc gcaggggcgc ccggttcttt 3060 ttgtcaagac cgacctgtcc ggtgccctga atgaactgca ggacgaggca gcgcggctat 3120 cgtggctggc cacgacgggc gttccttgcg cagctgtgct cgacgttgtc actgaagcgg 3180 gaagggactg gctgctattg ggcgaagtgc cggggcagga tctcctgtca tctcaccttg 3240 ctcctgccga gaaagtatcc atcatggctg atgcaatgcg gcggctgcat acgcttgatc 3300 cggctacctg cccattcgac caccaagcga aacatcgcat cgagcgagca cgtactcgga 3360 tggaagccgg tcttgtcgat caggatgatc tggacgaaga gcatcagggg ctcgcgccag 3420 ccgaactgtt cgccaggctc aaggcgcgca tgcccgacgg cgaggatctc gtcgtgaccc 3480 atggcgatgc ctgcttgccg aatatcatgg tggaaaatgg ccgcttttct ggattcatcg 3540 actgtggccg gctgggtgtg gcggaccgct atcaggacat agcgttggct acccgtgata 3600 ttgctgaaga gcttggcggc gaatgggctg accgcttcct cgtgctttac ggtatcgccg 3660 ctcccgattc gcagcgcatc gccttctatc gccttcttga cgagttcttc tgagcgggac 3720 tctggggttc gcgaaatgac cgaccaagcg acgcccaacc tgccatcacg agatttcgat 3780 tccaccgccg ccttctatga aaggttgggc ttcggaatcg ttttccggga cgccggctgg 3840 atgatcctcc agcgcgggga tctcatgctg gagttcttcg cccaccccaa cttgtttatt 3900 gcagcttata atggttacaa ataaagcaat agcatcacaa atttcacaaa taaagcattt 3960 ttttcactgc attctagttg tggtttgtcc aaactcatca atgtatctta tcatgtctgt 4020 ataccgtcga cctctagcta gagcttggcg taatcatggt catagctgtt tcctgtgtga 4080 aattgttatc cgctcacaat tccacacaac atacgagccg gaagcataaa gtgtaaagcc 4140 tggggtgcct aatgagtgag ctaactcaca ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc 4200 cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc 4260 ggtttgcgta ttgggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt 4320 cggctgcggc gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca 4380 ggggataacg caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa 4440 aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat 4500 cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc 4560 cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc 4620 gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt 4680 tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac 4740 cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg 4800 ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca 4860 gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa gaacagtatt tggtatctgc 4920 gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa 4980 accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa 5040 ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac 5100 tcacgttaag ggattttggt catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta 5160 aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt 5220 taccaatgct taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata 5280 gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact acgatacggg agggcttacc atctggcccc 5340 agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc cagatttatc agcaataaac 5400 cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag 5460 tctattaatt gttgccggga agctagagta agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac 5520 gttgttgcca ttgctacagg catcgtggtg tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc 5580 agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg 5640 gttagctcct tcggtcctcc gatcgttgtc agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc 5700 atggttatgg cagcactgca taattctctt actgtcatgc catccgtaag atgcttttct 5760 gtgactggtg agtactcaac caagtcattc tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc 5820 tcttgcccgg cgtcaatacg ggataatacc gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc 5880 atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc 5940 agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag catcttttac tttcaccagc 6000 gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca 6060 cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt 6120 tattgtctca tgagcggata catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt 6180 ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct gacgtc 6216 <210> 2 <211> 6219 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p3.1-full CCN5(T) <400> 2 gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg 60 ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120 cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180 ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt 240 gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata 300 tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 360 cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 420 attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 480 atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 540 atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 600 tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg 660 actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc 720 aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg 780 gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca 840 ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagacccaa gctggctagt 900 taagcttggt accgagctcg gatccactag tccagtgtgg tggaattcat gagaggcaca 960 ccgaagaccc acctcctggc cttctccctc ctctgcctcc tctcaaaggt gcgtacccag 1020 ctgtgcccga caccatgtac ctgcccctgg ccacctcccc gatgcccgct gggagtaccc 1080 ctggtgctgg atggctgtgg ctgctgccgg gtatgtgcac ggcggctggg ggagccctgc 1140 gaccaactcc acgtctgcga cgccagccag ggcctggtct gccagcccgg ggcaggaccc 1200 ggtggccggg gggccctgtg cctcttggca gaggacgaca gcagctgtga ggtgaacggc 1260 cgcctgtatc gggaagggga gaccttccag ccccactgca gcatccgctg ccgctgcgag 1320 gacggcggct tcacctgcgt gccgctgtgc agcgaggatg tgcggctgcc cagctgggac 1380 tgcccccacc ccaggagggt cgaggtcctg ggcaagtgct gccctgagtg ggtgtgcggc 1440 caaggagggg gactggggac ccagcccctt ccagcccaag gaccccagtt ttctggcctt 1500 gtctcttccc tgccccctgg tgtcccctgc ccagaatgga gcacggcctg gggaccctgc 1560 tcgaccacct gtgggctggg catggccacc cgggtgtcca accagaaccg cttctgccga 1620 ctggagaccc agcgccgcct gtgcctgtcc aggccctgcc caccctccag gggtcgcagt 1680 ccacaaaaca gtgccttcta gctcgagtct agagggccct tcgaacaaaa actcatctca 1740 gaagaggatc tgaatatgca taccggtcat catcaccatc accattgagt ttaaacccgc 1800 tgatcagcct cgactgtgcc ttctagttgc cagccatctg ttgtttgccc ctcccccgtg 1860 ccttccttga ccctggaagg tgccactccc actgtccttt cctaataaaa tgaggaaatt 1920 gcatcgcatt gtctgagtag gtgtcattct attctggggg gtggggtggg gcaggacagc 1980 aagggggagg attgggaaga caatagcagg catgctgggg atgcggtggg ctctatggct 2040 tctgaggcgg aaagaaccag ctggggctct agggggtatc cccacgcgcc ctgtagcggc 2100 gcattaagcg cggcgggtgt ggtggttacg cgcagcgtga ccgctacact tgccagcgcc 2160 ctagcgcccg ctcctttcgc tttcttccct tcctttctcg ccacgttcgc cggctttccc 2220 cgtcaagctc taaatcgggg gctcccttta gggttccgat ttagtgcttt acggcacctc 2280 gaccccaaaa aacttgatta gggtgatggt tcacgtagtg ggccatcgcc ctgatagacg 2340 gtttttcgcc ctttgacgtt ggagtccacg ttctttaata gtggactctt gttccaaact 2400 ggaacaacac tcaaccctat ctcggtctat tcttttgatt tataagggat tttgccgatt 2460 tcggcctatt ggttaaaaaa tgagctgatt taacaaaaat ttaacgcgaa ttaattctgt 2520 ggaatgtgtg tcagttaggg tgtggaaagt ccccaggctc cccagcaggc agaagtatgc 2580 aaagcatgca tctcaattag tcagcaacca ggtgtggaaa gtccccaggc tccccagcag 2640 gcagaagtat gcaaagcatg catctcaatt agtcagcaac catagtcccg cccctaactc 2700 cgcccatccc gcccctaact ccgcccagtt ccgcccattc tccgccccat ggctgactaa 2760 ttttttttat ttatgcagag gccgaggccg cctctgcctc tgagctattc cagaagtagt 2820 gaggaggctt ttttggaggc ctaggctttt gcaaaaagct cccgggagct tgtatatcca 2880 ttttcggatc tgatcaagag acaggatgag gatcgtttcg catgattgaa caagatggat 2940 tgcacgcagg ttctccggcc gcttgggtgg agaggctatt cggctatgac tgggcacaac 3000 agacaatcgg ctgctctgat gccgccgtgt tccggctgtc agcgcagggg cgcccggttc 3060 tttttgtcaa gaccgacctg tccggtgccc tgaatgaact gcaggacgag gcagcgcggc 3120 tatcgtggct ggccacgacg ggcgttcctt gcgcagctgt gctcgacgtt gtcactgaag 3180 cgggaaggga ctggctgcta ttgggcgaag tgccggggca ggatctcctg tcatctcacc 3240 ttgctcctgc cgagaaagta tccatcatgg ctgatgcaat gcggcggctg catacgcttg 3300 atccggctac ctgcccattc gaccaccaag cgaaacatcg catcgagcga gcacgtactc 3360 ggatggaagc cggtcttgtc gatcaggatg atctggacga agagcatcag gggctcgcgc 3420 cagccgaact gttcgccagg ctcaaggcgc gcatgcccga cggcgaggat ctcgtcgtga 3480 cccatggcga tgcctgcttg ccgaatatca tggtggaaaa tggccgcttt tctggattca 3540 tcgactgtgg ccggctgggt gtggcggacc gctatcagga catagcgttg gctacccgtg 3600 atattgctga agagcttggc ggcgaatggg ctgaccgctt cctcgtgctt tacggtatcg 3660 ccgctcccga ttcgcagcgc atcgccttct atcgccttct tgacgagttc ttctgagcgg 3720 gactctgggg ttcgcgaaat gaccgaccaa gcgacgccca acctgccatc acgagatttc 3780 gattccaccg ccgccttcta tgaaaggttg ggcttcggaa tcgttttccg ggacgccggc 3840 tggatgatcc tccagcgcgg ggatctcatg ctggagttct tcgcccaccc caacttgttt 3900 attgcagctt ataatggtta caaataaagc aatagcatca caaatttcac aaataaagca 3960 tttttttcac tgcattctag ttgtggtttg tccaaactca tcaatgtatc ttatcatgtc 4020 tgtataccgt cgacctctag ctagagcttg gcgtaatcat ggtcatagct gtttcctgtg 4080 tgaaattgtt atccgctcac aattccacac aacatacgag ccggaagcat aaagtgtaaa 4140 gcctggggtg cctaatgagt gagctaactc acattaattg cgttgcgctc actgcccgct 4200 ttccagtcgg gaaacctgtc gtgccagctg cattaatgaa tcggccaacg cgcggggaga 4260 ggcggtttgc gtattgggcg ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc 4320 gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa 4380 tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt 4440 aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa 4500 aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt 4560 ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg 4620 tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg taggtatctc 4680 agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc 4740 gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta 4800 tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct 4860 acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaagaacagt atttggtatc 4920 tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa 4980 caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa 5040 aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa 5100 aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt 5160 ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac 5220 agttaccaat gcttaatcag tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc 5280 atagttgcct gactccccgt cgtgtagata actacgatac gggagggctt accatctggc 5340 cccagtgctg caatgatacc gcgagaccca cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata 5400 aaccagccag ccggaagggc cgagcgcaga agtggtcctg caactttatc cgcctccatc 5460 cagtctatta attgttgccg ggaagctaga gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc 5520 aacgttgttg ccattgctac aggcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca 5580 ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa 5640 gcggttagct ccttcggtcc tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc agtgttatca 5700 ctcatggtta tggcagcact gcataattct cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt 5760 tctgtgactg gtgagtactc aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt 5820 tgctcttgcc cggcgtcaat acgggataat accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg 5880 ctcatcattg gaaaacgttc ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga 5940 tccagttcga tgtaacccac tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt tactttcacc 6000 agcgtttctg ggtgagcaaa aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg 6060 acacggaaat gttgaatact catactcttc ctttttcaat attattgaag catttatcag 6120 ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg 6180 gttccgcgca catttccccg aaaagtgcca cctgacgtc 6219 <210> 3 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RCCN5 <400> 3 ggatccgaat tcatgagagg cacaccgaag acccacc 37 <210> 4 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> XCCN5 <400> 4 aaaaaactcg agctagaagg cactgttttg tggactgcg 39 <210> 5 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> XCCN5-NoT <400> 5 aaaaaactcg aggaaggcac tgttttgtgg actgcg 36 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 6 gcccagccaa gcactgtcag ga 22 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 7 tcccaccatc accccctgat gtc 23 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 8 ctggcaccac accttctaca atg 23 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 9 aatgtcacgc acgatttccc gc 22 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 10 taacgaacga gactctggca t 21 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 11 cggacatcta agggcatcac ag 22

Claims (6)

1. 수탁번호 KCTC 13189BP의 형질전환된 CHO세포.
2. 수탁번호 KCTC 13189BP의 CHO세포 형질전환에 사용되는 서열목록 1의 재조합 플라스미드 벡터.
3. 서열목록 1의 재조합 플라스미드 벡터로 형질전환시킨 수탁번호 KCTC 13189BP의 CHO세포에 의하여 제조되는 재조합 CCN5 단백질.
4. 수탁번호 KCTC 13080BP의 형질전환된 CHO세포.
5. 수탁번호 KCTC 13080BP의 CHO세포 형질전환에 사용되는 서열목록 2의 재조합 플라스미드 벡터.
6. 서열목록 2의 재조합 플라스미드 벡터로 형질전환시킨 수탁번호 KCTC 13080BP의 CHO세포에 의하여 제조되는 재조합 CCN5 단백질.

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