CN113652412A

CN113652412A - 一种制备限制性内切酶类产品的方法

Info

Publication number: CN113652412A
Application number: CN202111067406.8A
Authority: CN
Inventors: 朱化星; 邹媛华; 汤玉洁; 徐志豪; 颜怀肖
Original assignee: Suzhou Inshore Protein Technology Co ltd
Current assignee: Suzhou Inshore Protein Technology Co ltd
Priority date: 2021-09-13
Filing date: 2021-09-13
Publication date: 2021-11-16

Abstract

本发明公开了一种制备限制性内切酶类产品的方法，涉及生物技术领域。本发明公开的制备限制性内切酶的方法采用表达载体改造实现真核表达细胞作为宿主细胞表达生产限制性内切酶。本发明提供的制备方法通过采用真核表达细胞共转甲基转移酶保护表达生产限制性内切酶，省略了原核表达系统生产限制性内切酶过程中甲基化保护菌株的筛选制备过程，本发明真核细胞培养产物经过简单的纯化工艺即可获得高产的限制性内切酶。本发明为限制性内切酶在mRNA等大量需求的技术领域应用提供了便利，克服了传统制备方法中表达菌株筛选过程复杂等问题。

Description

一种制备限制性内切酶类产品的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种制备限制性内切酶类的方法。

背景技术

限制性内切酶是可以识别双链DNA序列特异性序列并进行切割的核酸酶，根据限制性内切酶亚基结构的差别，可将限制性内切酶大致分I、II、III和IV型。其中II型限制性内切酶的亚基结构相对于I型、III型和IV型酶更为简单，大多数用于重组DNA的限制性内切酶工具都属于此大类。限制性内切酶的发现促使DNA重组技术诞生从而极大推动现代分子生物学和基因工程的发展，是当代基因工程研究不可或缺的基础工具，且近些年随着生物医药行业的兴起，限制性内切酶尤其是识别任意碱基切割位点的IIs型限制性内切酶迎来了更广阔且更大量的应用，如mRNA疫苗转录模板DNA的制备。

细菌体内存在“限制-修饰”现象，即通过自身基因组的DNA被甲基化酶修饰，从而避免限制性内切酶对自身基因组片段的切割，以此抵御外来噬菌体侵染。因此如使用原核表达系统单独表达重组限制性内切酶，会使宿主因基因组DNA被切割而死亡。目前现有的限制性内切酶重组制备多采用修饰型原核大肠杆菌表达系统；以限制性内切酶BsaI制备为例，专利US6723546B2主要方法为先构建BsaI对应的甲基转移酶重组表达质粒；质粒转化至大肠杆菌ER2566菌株，筛选得到甲基化保护菌株；制备甲基化保护菌感受态细胞；构建BsaI限制性内切酶重组表达质粒，转化至甲基化保护菌中，再经过一轮筛选从而得到BsaI表达菌株。现有方法所用的常规原核表达载体和克隆菌株难以生长，所用的大肠杆菌ER2566菌株难以获得来源明确的商业化产品，且现有方法步骤繁琐，需分步进行质粒构建，后分步筛选表达菌株，研发周期较长，造成了限制性内切酶研发和生产过程复杂等问题；另外由于大肠杆菌胞内蛋白种类复杂，加之大肠杆菌本身破裂后有内毒素释放等原因，而限制性内切酶在mRNA疫苗等领域的使用又对其纯度和内毒素残留要求高，因此原核表达系统制备限制性内切酶具有工艺繁琐的问题。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种采用真核表达系统制备限制性内切酶类产品的方法；特别地，本发明在采用真核表达系统制备限制性内切酶的过程中发现，常规真核表达载体无法获得构建正确的克隆，分析或因其在大肠杆菌泄露表达造成“限制-修饰”现象，本发明创新地通过表达载体改造即删除原核表达调控元件实现真核表达细胞作为宿主细胞表达生产限制性内切酶，纯化工艺简单，得到的限制性内切酶表达量和酶活产量较高，限制性内切酶的折叠和修饰也更为充分；本发明为限制性内切酶在mRNA等高质量要求和大量要求的技术领域应用提供了可能，克服了传统生产方法中表达菌株筛选过程复杂等问题。

本发明是这样实现的：

一方面，本发明提供一种制备限制性内切酶类的方法，其包括以下步骤(a)或(b)：

(a)：将甲基转移酶基因设计在第一真核表达载体上；将表达限制性内切酶基因设计在第二真核表达载体上；将所述第一真核表达载体和所述第二真核表达载体共同转染真核表达细胞进行表达，从所述真核表达细胞的培养产物中分离纯化得到所述限制性内切酶；

(b)：将所述甲基转移酶基因与所述限制性内切酶基因共同表达在同一真核表达载体上，再将该真核表达载体转染真核表达细胞进行表达，从所述真核表达细胞的培养产物中分离纯化得到所述限制性内切；

其中，甲基转移酶能够对限制性内切酶的特异性识别序列中的一个或多个碱基进行甲基化修饰以阻碍限制性内切酶对特异性识别序列的切割；通过甲基转移酶的功能，使得宿主真核表达细胞内表达的限制性内切酶不会对宿主细胞DNA切割，宿主细胞能够得到有效保护；上述真核表达载体均不含原核表达调控元件即步骤(a)中的第一真核表达载体和第二真核表达载体均不含原核表达调控元件，步骤(b)中的真核表达载体也不含原核表达调控元件。

该制备方法，采用真核表达细胞作为宿主细胞，控制表达甲基转移酶的基因和表达限制性内切酶的基因在不同的表达载体上或在同一表达载体上，并创新地通过表达载体改造即删除原核表达调控元件实现真核表达细胞作为宿主细胞表达生产限制性内切酶，提高限制性内切酶在真核表达细胞中的表达水平，转染后，从重组真核表达细胞的培养产物中分离纯化即可获得限制性内切酶；该方法的步骤少，工艺简单；得到的限制性内切酶表达量和酶活产量较高，且由于是在真核表达系统中表达，所得的限制性内切酶折叠和修饰更为充分，且由于真核细胞本身无内毒素的释放，所得的限制性内切酶内毒素含量低，生物活性好，该方法简化原核生产过程中限制性保护菌株的筛选制备，通过简单工艺即可获得低内毒素的限制性内切酶，为其在mRNA等高质量要求和大量要求的技术领域应用提供了可能，本发明提供的方法同时克服了传统生产方法中工艺复杂及内毒素含量高等问题。

其中，甲基转移酶能够对限制性内切酶的特异性识别序列中的一个或多个碱基进行甲基化修饰以阻碍限制性内切酶对特异性识别序列的切割；通过甲基转移酶的功能，使得宿主真核表达细胞内表达的限制性内切酶不会对宿主细胞DNA切割，宿主细胞能够得到有效保护。

可选地，在本发明的一些实施方案中，所述第一真核表达载体与所述第二真核表达共同转染时的质量比为(1-9):(9-1)，例如可以是1:9、2:8、3:7、4:6、5:5、6:4、7:3、8:2、或9:1。

可选地，在本发明的一些实施方案中，所述第一真核表达载体与所述第二真核表达共同转染时的质量比为(4-6):(6-4)。

另外，第一真核表达载体与第二真核表达载体的转染质量比是影响限制性内切酶表达量的一个重要因素。当表达甲基转移酶的第一真核表达载体与表达限制性内切酶的第二真核表达共同转染时以质量比为(4-6):(6-4)的比例(例如4:6、5:5、或6:4)转染时，能够有效地提高限制性内切酶的表达量和酶活产量。

可选地，在本发明的一些实施方案中，所述限制性内切酶包括但不限于I型限制性内切酶、II型限制性内切酶、III型限制性内切酶。本发明提供的制备方法可适用于多种类型的限制性内切酶的表达。本领域技术人员可以根据实际需要，选择感兴趣的限制性内切酶类型，无论选用何种限制性内切酶，均属于本发明的保护范围。

可选地，在本发明的一些实施方案中，所述I型限制性内切酶包括但不限于EcoAI、EcoBI、EcoDI、EcoEI、EcoKI、EcoprrI、EcoR124II、StySPI和StySJI。

可选地，在本发明的一些实施方案中，所述II型限制性内切酶包括但不限于AbrI、AccI、AgeI、AluI、ApaLI、AquI、AvaI、BamHI、BamHII、BanI、BanIII、BbvI、BepI、BglI、BglII、BsaI、BseCI、BslI、BsoBI、Bsp6I、BspRI、BstVI、BsuBI、BsuFI、BsuRI、CeqI、Cfr9I、Cfr10I、CfrBI、CviAII、CviBI、CviJI、CviRI、DdeI、DpnI、DpnII、DsaV、EcaI、Eco47I、Eco47II、Eco57I、EcoRI、EcoRII、EcoRV、FnuDI、FokI、HaeII、HaeIII、HgaI、HgiBI、HgiCI、HgiCII、HgiDI、HgiDII、HgiEI、HgiGI、HhaI、HhaII、HincII、HindII、HindIII、HindV、HinfI、HpaI、HpaII、HphI、KpnI、LlaDCHI、MamI、MboI、MboII、MjaI、MjaII、MjaIII、MjaIV、MjaV、MjaVI、MspI、MthTI、MthZI、MunI、MvaI、MwoI、NaeI、NgoBI、NgoBV、NgoFVII、NgoMIV、NgoPII、NlaIII、NlaIV、NmeDI、NspV、PaeR7I、PspPI、PstI、PvuI、PvuII、RsrI、SacI、SalI、Sau3AI、Sau96I、ScaI、ScrFI、SfiI、SinI、SmaI、SsoII、StsI、TaqI、TthHB8I、VspI、XamI、XbaI、XcyI、XhoI和XorII。

可选地，在本发明的一些实施方案中，所述III型限制性内切酶包括但不限于EcoPI、EcoP15I、HinfIII和StyLTI。

可选地，在本发明的一些实施方案中，所述甲基转移酶为C5甲基胞嘧啶甲基转移酶、N4甲基胞嘧啶甲基转移酶或N6甲基腺嘌呤甲基转移酶。

可选地，在本发明的一些实施方案中，所述C5甲基胞嘧啶甲基转移酶包括但不限于AgeIM、AluIM、ApaLIM、AquIMA、BanIM、BbvIM、BepIM、BsaIM、BseCIM、Bsp6IM、BspRIM、HsdFM、HsdRM、CVIJIM、DdeIM、DsaVM、Eco47IIM、EcoRIIM、FnuDIM、HaeIIM、HaeIIIM、HgaIAM、HgiBIM、HgiCIM、HgiCIIM、HgiDIM、HgiDIIM、HgiEIM、HgiGIM、HhaIM、HindVM、HpaIIM、HphIAM、MspIM、MthTIM、NaeIM、NgoBIM、NgoBVM、NgoFVIIM、NgoMIVM、NgoPIIM、NlaIVM、NmeDIMP、PspPIM、SacIM、Sau3AIM、Sau96IM、ScrFIAM、SinIM、SsoIIM和XorIIM；

可选地，在本发明的一些实施方案中，所述N4甲基胞嘧啶甲基转移酶包括但不限于AvaIM、BamHIM、BamHIIM、BglIM、BglIIM、BslIM、BsoBIM、Cfr9IM、CfrBIM、MjaIM、MjaIIM、MjaVM、MjaVIM、MthZIM、MvaIM、MwoIM、PvuIIM、ScaIM、SfiIM、SmaIM和XcyIM中的任意一种；

可选地，在本发明的一些实施方案中，所述N6甲基腺嘌呤甲基转移酶包括但不限于AbrIM、AccIM、BanIIIM、BsaIM、BstVIM、HsdBM、CeqIM、CVIAIIM、CVIBIM、CVIRIM、DpnM、EcaIM、Eco57IBM、EcoRIM、EcoRVM、FokIM、HhaIIM、HincIIM、HindIIM、HinfIM、HpaIM、KpnIM、LlaDCHIA、MamIM、MboIAM、MboIIM、MjaIIIM、MunIM、NlaIIIM、PaeR7IM、PstIM、RsrIM、SalIM、StsIM、TaqIM、TthHB8IM、VspIM、XamIM和XhoIM。

需要说明的是，当确定感兴趣的限制性内切酶后，本领域技术人员根据本领域的常规知识，可以很容易地确定与之相匹配的甲基转移酶类型，以保护宿主细胞DNA不被限制性内切酶切割，例如下表1所示：

表1

可选地，在本发明的一些实施方案中，所述真核表达细胞为哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞或酵母细胞。

可选地，在本发明的一些实施方案中，所述真核表达细胞包括但不限于哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞和酵母细胞。本领域技术人员可以选择合适的真核表达系统进行表达，其均属于本发明的保护范围。

可选地，在本发明的一些实施方案中，所述第一真核表达载体和所述第二真核表达载体选自单读码框蛋白表达载体或多读码框蛋白表达载体。

可选地，在本发明的一些实施方案中，当所述真核表达细胞为哺乳动物细胞时，所述第一真核表达和第二真核表达载体的骨架包括但不限于pcDNA3.1(-)、PTT5、PCMV-Tag、pTet-on/off和pEF4/V5。

当所述真核表达细胞为昆虫细胞时，所述第一真核表达和第二真核表达载体的骨架包括但不限于pfastbac1、pAcGHLT C或pVL1393；

当所述真核表达细胞为植物细胞，所述第一真核表达和第二真核表达载体的骨架均包括但不限于pKANNIBAL和pBI121；

当所述真核表达细胞为酵母细胞，所述第一真核表达和第二真核表达载体的骨架均包括但不限于pPIC9K、pPIC3.5、pPIC Zα、pGAPZ A、pYC119、pYES2-CT和pAUR123。

可选地，在本发明的一些实施方案中，所述哺乳动物细胞为CHO细胞、Hek293细胞或由Hek293经过驯化得到的Expi293细胞。

可选地，在本发明的一些实施方案中，所述哺乳动物细胞为HEK293细胞。

可选地，在本发明的一些实施方案中，所述第一真核表达和第二真核表达载体的骨架均为pcDNA3.1(-)。

可选地，在本发明的一些实施方案中，在所述第二真核表达载体中，所述限制性内切酶的编码序列上游连接有信号肽编码序列、所述限制性内切酶的编码序列下游连接有蛋白纯化标签编码序列。

可选地，在本发明的一些实施方案中，所述信号肽为CD33信号肽、Ig Kappa信号肽或IL-2信号肽。

通过加入信号肽可以使表达的限制性内切酶分泌到胞外，这样得到的限制性内切酶经纯化后，终产品中的宿主蛋白残留，核酸，核酸酶残留低；另外由于本发明采用真核细胞表达限制性内切酶，真核细胞本身无内毒素的释放，因此本发明制备得到的限制性内切酶内毒素残留低，更易于达到GMP标准。

可选地，在本发明的一些实施方案中，所述蛋白纯化标签为His标签、Flag标签、Avi标签、Strep标签、HA标签、Myc标签、V5标签、Sumo标签、GST标签、NusA标签、eGFP标签、eCFP标签、eYF标签或mCharry标签。

可选地，在本发明的一些实施方案中，所述限制性内切酶为BsaI，所述甲基转移酶为BsaIM，所述第一真核表达和第二真核表达载体的骨架均为pcDNA3.1(-)，所述甲基转移酶的编码序列位于所述第一真核表达载体的EcoRI和HindIII酶切位点之间，所述信号肽编码序列、所述限制性内切酶的编码序列和所述蛋白纯化标签编码序列位于所述第二真核表达载体的EcoRI和HindIII酶切位点之间；所述真核表达细胞为哺乳动物细胞；

所述信号肽为CD33信号肽，所述蛋白纯化标签为His标签。

可选地，在本发明的一些实施方案中，所述限制性内切酶的编码序列如SEQ IDNO.14所示，所述信号肽编码序列如SEQ ID NO.12所示，所述蛋白纯化标签编码序列如SEQID NO.16所示，所述甲基转移酶的编码序列如SEQ ID NO.8所示；所述哺乳动物细胞为HEK293细胞。

SEQ ID NO.12的限制性内切酶基因是经过了哺乳细胞密码子优化后的序列，优化后的序列CAI值由原始的0.65提高到0.95；GC含量由原始的32.6％调整为54％；CFD值由原始的7％降低到0％；优化限制性内切酶基因可有效提高限制性内切酶在真核哺乳动物细胞中的表达水平。

SEQ ID NO.8所示的甲基转移酶基因，为经过哺乳细胞密码子优化后的序列，优化后的序列CAI值由原始的0.61提高到0.96；GC含量由原始的31.4％调整为55.7％；CFD值由原始的9％降低到0％；优化后序列提高了甲基转移酶的表达水平，能够对更好地保护宿主DNA。

可选地，在本发明的一些实施方案中，所述原核表达调控元件可包括原核启动子、增强子等元件。

另一方面，本发明提供一种限制性内切酶制品，其由如上任一项所述的方法制得。

本发明提供的限制性内切酶制品，通过上述方法制备，该限制性内切酶制品的宿主蛋白残留、核酸、核酸酶残留以及内毒素残留低，限制性内切酶的折叠和修饰充分，具有生物活性好的特点。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为原始载体pcDNA3.1(-)图谱。

图2为删除原核原核表达调控相关元件后的pcDNA3.1(-)-RM图谱。

图3为实施例1中的细胞培养产物镍柱纯化洗脱组分SDS-PAGE图；图中所示组分A-F分别代表：镍柱上样组分、镍柱流出组分、20mM咪唑洗脱组分、50mM咪唑洗脱组分、500mM咪唑洗脱组分以及6M盐酸胍洗脱组分。

图4为实施例1中镍柱洗脱组分合并透析后过肝素柱纯化，肝素柱洗脱组分的DS-PAGE图；图中所示组分A-H分别代表：肝素柱上样组分、肝素柱流出组分、100mMNaCl洗脱组分、200mM NaCl洗脱组分、300mM NaCl洗脱组分、500mM NaCl洗脱组分、1M NaCl洗脱组分以及0.1M NaOH洗脱组分。

图5为实施例1中的重组BsaI限制性内切酶成品的SDS-PAGE图，表观分子大小约为62KDa。

图6为重组BsaI限制性内切酶成品的反向色谱结果图，其中，图A为重组BsaI限制性内切酶成品样品图；图B为洗脱后透析的终体系buffer图，具体包括：10mM Tris-HCl，300mM NaCl，1mM DTT，0.1mM EDTA，以及50％Glycerol，pH 7.4；图中所示箭头1代表BsaI蛋白峰图(保留时间7.693)，箭头2代表蛋白buffer成分。

图7为BsaI蛋白活性测定结果，其中，图A为实施例1的重组制备的BsaI样品测活图；图B为其他公司原核表达系统的BsaI样品测活图。

图8为根据不同质粒比例转染培养后蛋白表达情况，对表达最低和表达最好的比例培养上清进行粗步定活验证；图中：(a)代表1:9；(b)代表6:4。

图9为采用原始载体pcDNA3.1(-)作为真核表达载体转染宿主细胞后，对重组克隆的测序后的核酸序列比对结果；A为目的基因核酸序列，序列B为克隆测序拼接得到核酸序列。

图10为图9中的核酸序列对应的氨基酸序列比对结果；A为目的蛋白氨基酸序列，序列B为克隆测序结果对应的氨基酸序列。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例以限制性内切酶BsaI为例，对本发明生产限制性内切酶的方法进行具体说明，具体步骤如下：

步骤一：真核表达载体的构建

以商业化的哺乳动物细胞真核表达载体pcDNA3.1(-)作为出发载体(见图1)，通过PCR环形扩增删除启动子后原核表达调控相关的元件，得到改造载体pcDNA3.1(-)-RM(如图2所示)。由于限制性内切酶大多数来源于原核生物，原核生物具有比较完善的外源基因防御系统，且在质粒构建过程中需要转化原核的DH5α菌株去制备重组质粒，为了防止限制性内切酶表达质粒在转化过程中发生泄露表达从而引起对DH5α宿主的伤害以及基因突变等，删除了目标基因插入位点上游的原核表达系统中可应用到的启动子等原核表达调控元件。针对pcDNA3.1(-)载体，本实施例删除的元件具体为T7噬菌体启动子以及T7噬菌体启动子与载体MCS之间的序列。PCR环形扩增所用引物p3.1RM-F和p3.1RM-R，序列见表2。

表2

引物名称	序列(5’-3’)	序列标识符
			p3.1RM-F	ctgcttactggcttatcgaaatgaattccaccacactggactag	SEQ ID NO.1
p3.1RM-R	ggaattcatttcgataagccagtaagcag	SEQ ID NO.2
			p3.1-BsaIM-F	ctgtgctggatatctgcagaattcgccgccaccatgagcaatgctaagtccttc	SEQ ID NO.3
p3.1-BsaIM-R	cgtcgtcatccttatagtcgatgatagccagggagctcag	SEQ ID NO.4
			p3.1-flag-R	ctgatcagcggtttaaacttaagcttacttatcgtcgtcatccttatagtcgatgatag	SEQ ID NO.5
p3.1-BsaI-F	gcttactggcttatcgaaatgaattcgccaccatgccgctgctgctactgc	SEQ ID NO.6
			p3.1-BsaI-R	ctgatcagcggtttaaacttaagcttttagtgatggtggtggtggtggtc	SEQ ID NO.7

步骤二：甲基转移酶真核表达载体的构建

使用引物p3.1-BsaIM-F和p3.1-BsaIM-R，以及模板基因扩增出BsaIM基因(核酸序列为SEQ ID NO.8，其编码BsaIM蛋白，氨基酸序列为SEQ ID NO.9，即甲基转移酶，BsaIM由M1.BsaI和M2.BsaI两个亚基组成，其中M1.BsaI为N6型甲基化酶，M2.BsaI为C5型甲基化酶)，再以p3.1-BsaIM-F和p3.1-flag-R在BsaIM基因C端融合Flag标签基因(核酸序列为SEQID NO.10，氨基酸序列为SEQ ID NO.11)。扩增完毕后，利用

PCR一步定向克隆试剂盒(novoprotein)，将BsaIM+Flag tag基因片段无缝克隆至经EcoRI和HindIII线性化处理的pcDNA3.1(-)-RM表达载体上以构建甲基转移酶真核表达载体，转化大肠杆菌DH5α，利用菌落PCR进行阳性克隆鉴定，鉴定为阳性的重组子进行测序鉴定，甲基转移酶真核表达载体(命名为质粒A)的基因序列正确，与预期相符。将含质粒A的DH5α菌种进行培养后，抽提一定量的质粒A备用。

步骤三：限制性内切酶真核表达载体的构建

使用引物p3.1-BsaI-F和p3.1-BsaI-R扩增出含CD33信号肽基因(核酸序列为SEQID NO.12，蛋白氨基酸序列为SEQ ID NO.13)、BsaI基因(核酸序列为SEQ ID NO.14，蛋白氨基酸序列为SEQ ID NO.15)和6His tag序列(核酸序列为SEQ ID NO.16，氨基酸序列为SEQID NO.17)，扩增完毕后，利用

PCR一步定向克隆试剂盒(novoprotein)，将CD33信号肽+BsaI+6His tag基因片段无缝克隆至经EcoRI和HindIII线性化处理的pcDNA3.1(-)-RM表达载体上以得到限制性内切酶真核表达载体，转化大肠杆菌DH5α，利用菌落PCR进行阳性克隆鉴定，鉴定为阳性的重组子进行测序鉴定。经测序获知，限制性内切酶真核表达载体(命名为质粒B)的基因序列正确，与预期相符。将含质粒B的DH5α进行培养后，抽提一定量的质粒B备用。

步骤四：限制性内切酶的表达

将上述质粒A和质粒B按质量比为6:4的比例共同转染真核哺乳动物表达细胞HEK293细胞(购自Gibco)，每1L细胞(细胞密度1.8×10⁶个/ml)，质粒加入总质量为1mg，在37℃，5％CO₂，转速120rpm条件培养转染5天后，离心收集细胞上清进行纯化。

步骤五：限制性内切酶的纯化

对步骤四中收集的细胞上清补加500mM NaCl后通过镍柱和肝素柱纯化以获得限制性内切酶BsaI蛋白。

其中镍柱纯化过程，具体包括以下步骤：

第一步平衡：用平衡缓冲液平衡镍柱，直至紫外检测读数稳定，检测调零后上样；平衡缓冲液为20mM PB，300mM NaCl，pH7.4混合液；

第二步上样：样品应保持澄清，以不高于4ml/min流速上样；

第三步平衡：上样结束，用平衡缓冲液平衡层析柱，直到紫外检测读数回到基线或相对稳定；

第四步预洗：用预洗缓冲液冲洗层析柱，收集洗脱组分；此步洗脱液为20mM PB，300mM NaCl，20mM咪唑，pH7.4混合液；

第五步洗脱：用洗脱液冲洗层析柱，收集洗脱组分；此步洗脱液为20mM PB，300mMNaCl，50mM咪唑，pH7.4混合液；

第六步洗脱：用洗脱液冲洗层析柱，收集洗脱组分；此步洗脱液为20mM PB,300mMNaCl，500mM咪唑，pH7.4混合液。

第七步洗柱：用6M盐酸胍溶液冲洗层析柱，直到紫外检测读数回到基线或相对稳定；

分步洗脱所收集的各个洗脱组分进行SDS-PAGE检测，其中SDS-PAGE检测结果如图3所示。根据检测结果确定第四、五、六步洗脱组分含有目标蛋白，将三个组分合并透析至肝素柱平衡缓冲液备用，肝素柱平衡缓冲液为20mM PB，pH7.0混合液。

肝素柱纯化过程，具体包括如下步骤：

第一步平衡：用平衡缓冲液平衡镍柱，直至紫外检测读数稳定，检测调零后上样；平衡缓冲液为20mM PB，pH7.0混合液；

第二步上样：样品应保持澄清，以不高于4ml/min流速上样；

第四步洗脱：用洗脱液冲洗层析柱，收集洗脱组分；此步洗脱液为20mM PB，100mMNaCl，pH7.0混合液；

第五步洗脱：用洗脱液冲洗层析柱，收集洗脱组分；此步洗脱液为20mM PB，200mMNaCl，pH7.0混合液；

第六步洗脱：用洗脱液冲洗层析柱，收集洗脱组分；此步洗脱液为20mM PB，300mMNaCl，pH7.0混合液；

第七步洗脱：用洗脱液冲洗层析柱，收集洗脱组分；此步洗脱液为20mM PB，500mMNaCl，pH7.0混合液；

第八步洗脱：用洗脱液冲洗层析柱，收集洗脱组分；此步洗脱液为20mM PB，1MNaCl，pH7.0混合液；

第九步洗柱：用0.1M NaOH溶液冲洗层析柱，直到紫外检测读数回到基线或相对稳定；

分步洗脱所收集的各个洗脱组分进行SDS-PAGE检测，其中SDS-PAGE检测结果如图4所示。

根据检测结果，将第四、五步洗脱组分合并透析至最终体系含：10mM Tris-HCl，300mM NaCl，1mM DTT，0.1mM EDTA，以及50％Glycerol，pH7.4，得到重组BsaI限制性内切酶成品。重组BsaI限制性内切酶成品的SDS-PAGE结果如图5所示，SDS-PAGE检测结果显示其纯度≧95％。

以反向色谱表征本实施例制备的重组BsaI限制性内切酶成品纯度，反向色谱柱分析结果如图6，根据反向色谱结果，本实施例制备的重组BsaI限制性内切酶成品纯度高，形态均一。

实施例2

限制性内切酶的活性测定

活性测定方法是采用以含有相应的限制性内切酶识别序列的质粒/DNA片段为底物，将纯化得到的酶与一定量的底物在一定的反应buffer中作用一定时间后，将反应体系进行琼脂糖凝胶电泳，观察底物质粒/DNA片段消化情况来对酶活性进行定性和定量。

以实施例1制备的重组BsaI限制性内切酶为例，其活性测定方法以含有2个BsaI识别序列的质粒pcDNA3.1(-)-EGFP(Novoprotein)为底物(核酸序列为SEQ ID NO.18)，将重组BsaI限制性内切酶成品与底物质粒混合后置于37℃孵育，底物质粒被切割后理论上会形成分子量4381bp和1738bp的两个条带。

活性测定反应20μl体系如下：

以实施例1制备的重组BsaI限制性内切酶成品样品稀释不同梯度后作用于底物，同时以其他公司的来源于原核表达系统的BsaI样品稀释相同倍数后作用于底物，得到反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果即为活性测定结果，如图7所示。

本实施例中采用的酶活定活方法为2倍梯度稀释法，即对重组BsaI蛋白样品和对照样品进行2倍梯度稀释后，分别以稀释后的1μl加入到相同体积相同底物量的反应体系中；将重组BsaI样品对底物完全消化的梯度视作稀释倍数为N，稀释倍数为N+2的梯度底物未完全消化，将对照样品对底物完全消化的梯度视作稀释倍数为M，稀释倍数为M+2的梯度底物未完全消化；将对照样品酶活单位视作X(U/ul)，那么重组BsaI样品酶活单位＝(N*X)/M(U/ul)。本实施例提供的图7表示实施例1方法制备的限制性内切酶BsaI样品定活后与对照样品，稀释至相同的活性单位后分别对底物进行消化的结果。通过对两者对底物的消化情况的比较，可以看出实施例1方法制备的限制性内切酶BsaI样品定活后与对照产品进行相同梯度稀释，梯度结果一致。

且以完全切割对比计算酶活，采用实施例1的方法，每L细胞表达产物的酶活(即BsaI蛋白)总产量可以达到250万U/L(即培养结束后，每L培养液含有的BsaI蛋白的酶活产量为250万U)。

本实施例中采用的内毒素含量测定方法参照中国药典2020版第四部细菌内毒素检查法第一法凝胶法(通则1143)；采用上述的表达纯化方法得到的最终样品内毒素含量小于0.02EU/KU。

实施例3

本对比例的限制性内切酶BsaI的制备方法与实施例1基本相同，不同的是在步骤四中，质粒A和质粒B的质量比为1:9。

实施例4

本对比例的限制性内切酶BsaI的制备方法与实施例1基本相同，不同的是在步骤四中，质粒A和质粒B的质量比为2:8。

实施例5

本对比例的限制性内切酶BsaI的制备方法与实施例1基本相同，不同的是在步骤四中，质粒A和质粒B的质量比为3:7。

实施例6

本对比例的限制性内切酶BsaI的制备方法与实施例1基本相同，不同的是在步骤四中，质粒A和质粒B的质量比为4:6。

实施例7

本对比例的限制性内切酶BsaI的制备方法与实施例1基本相同，不同的是在步骤四中，质粒A和质粒B的质量比为5:5。

实施例8

本对比例的限制性内切酶BsaI的制备方法与实施例1基本相同，不同的是在步骤四中，质粒A和质粒B的质量比为7:3。

实施例9

本对比例的限制性内切酶BsaI的制备方法与实施例1基本相同，不同的是在步骤四中，质粒A和质粒B的质量比为8:2。

实施例10

本对比例的限制性内切酶BsaI的制备方法与实施例1基本相同，不同的是在步骤四中，质粒A和质粒B的质量比为9:1。

实施例11

取实施例1和2-10步骤四的培养产物进行亲和层析纯化，不同质粒比例的条件下得到目标蛋白表达量差异见表3。从表3中BsaI蛋白表达产量情况可以看出，质粒A与质粒B按质量比为1:9或9:1时，BsaI蛋白表达量较低；随着质粒A比例增加，BsaI蛋白表达水平出现明显差异，其中当质粒A与质粒B比例为6:4时，BsaI蛋白的表达量最高，表达效果最好，每升培养产物纯化BsaI蛋白得率10.2mg，远高于其他质量比的BsaI蛋白表达量(见表3，不同质粒比的BsaI蛋白产量结果)。

表3

另外，取表达最低和表达最高两个质粒比例的培养上清做2倍梯度稀释后对底物酶切后跑胶结果见图8，图8的切割活性倍数结果与蛋白表达量基本能够对应。进一步说明在当质粒A与质粒B比例为6:4时，BsaI蛋白的表达量最高，酶活产量高。

对比例1

本对比例的限制性内切酶BsaI的制备方法与实施例1基本相同，不同的是在步骤三中，采用pcDNA3.1(-)原始载体作为表达载体(即未删除原核表达调控相关元件)。

结果显示当真核表达载体上存在原核表达调控元件时，转化原核细胞(DH5α菌株)后，会发生泄漏导致碱基突变，转化平板很难长出克隆。所长出的少量克隆，抽提到的质粒，经测序确认在构建过程中BsaI蛋白的核苷酸序列均出现随机突变或者缺失(图9中箭头所示)，这些突变和缺失引起BsaI限制性内切酶的翻译提前终止和氨基酸序列突变(图10所示)。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 苏州近岸蛋白质科技股份有限公司

<120> 一种制备限制性内切酶类产品的方法

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ctgcttactg gcttatcgaa atgaattcca ccacactgga ctag 44

<210> 2

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggaattcatt tcgataagcc agtaagcag 29

<210> 3

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctgtgctgga tatctgcaga attcgccgcc accatgagca atgctaagtc cttc 54

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cgtcgtcatc cttatagtcg atgatagcca gggagctcag 40

<210> 5

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ctgatcagcg gtttaaactt aagcttactt atcgtcgtca tccttatagt cgatgatag 59

<210> 6

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gcttactggc ttatcgaaat gaattcgcca ccatgccgct gctgctactg c 51

<210> 7

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ctgatcagcg gtttaaactt aagcttttag tgatggtggt ggtggtggtc 50

<210> 8

<211> 2847

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atgagcaatg ctaagtcctt cagcctgaac gagaagaccg aggccaacgc cctgatcgac 60

ttcatcatcg agaagtccaa ccagtccaag gacctgggct actggctgca gaagagcaag 120

ggccagttct acacccacaa tttcatcggc gagaagctgg tgaccgagat cgtggagaat 180

atcaagttta atgacgattc cgaggtcatt aagatcatcg accccttttg tggcgatggc 240

aggctgatct gtatcctgct ggataagttc aatgctatca acaagttccg gaacaccctg 300

ctggagatcg agttttggga catcgaccct gaggctgtgg aggtggctta caccaacatc 360

aaggagaagg ctaatgctct ggagttcaat gtgcagctga agggcagggt gtgtgatacc 420

tttctgttcg cccaggacta cttcggcagc tacgacatct gcatcaccaa ccccccctgg 480

gtcattatca agcctgataa gaaggagaag gagaggctgt ccaaggagga ggagatcgag 540

tacatcgaga tcctgaagaa tttcgatgat ttcctgtccc ggtattaccc caccagcctg 600

cctaccaaga agtacggcgg ctggggcacc aacctggctc ggtgtggcac cgaggtggcc 660

ctgaggctga tctccaaggt gggcatctgc ggcatcgtga gccccgccag cctgctggga 720

gaccaggtga gcgacaacct gcgggtgtgg atgtttaaca actacgaggt gtatagcatc 780

tcctactttg tggctgaggc taagctgttc ggcaaggtgg accaggctgt gatcaccctg 840

accctgagcc ctaagtgcga cgattccagc ggcgacatca tcccccacct gttctattat 900

gatcgggagc tgtttgagaa gaggtactac atggacgagt atgattggcg gatcatcaag 960

tccctgaatt atgtgatccc tatccagttc ggcctggaga tcatcaagat gaacaggctg 1020

tttaagagcc tgcctacact gggcgacctg gagaatgaga aggagggcat ctggctgggc 1080

agggagctgg acgagaccgg catcaaggag aaactggcca acaagggcca gtacaggttt 1140

atcaagggca agatggtggg ccggtataac ctgatcgagg agtccaatca gtacatcgac 1200

gtgaggaaga tcgacaagat ccctaagtcc gtggagttct accggctggt gtggcgggac 1260

gtgtccagga ccacccagaa gcggaggctg atctctacca tcatccctcc taagtatatc 1320

accggcaata gcctgaacgt ggcctacttc aaggataaca acctgaagaa gctgaaggct 1380

ctgctggcta tcatgaacag ctttgtgttt gaggctcagg tgagggctaa tctgtccacc 1440

aaccacatct ccctgggcat catccggcgg gcccacatcc ccaagctgga gggaagggtg 1500

gtggatgagc tgagccagct ggtggataac tatgtgaacg aggagagcga gctgctgctg 1560

gaggtgaagg tggctaaggc ctatggcctg agcttcgagg atttcagcag catcctgtcc 1620

ctgttcgaca agatcggcaa ggacgagaag gagaagatcc tgcaggtggc caagaagtac 1680

ctgaagggcg gcatcaagaa tgattccctg atcatcaagc acgtgccccc tggcggcaat 1740

tggaaggaca tccctgagtg ggtgccttcc aagcggctgg agcagatccg gaagagctac 1800

gctgagggca agggcagccg gtccacctac tatggcaggc tgctgcctga tatgccttcc 1860

tacaccatca atacctactt taatcggcct ggcaacggct gccacatcca ctacgagcag 1920

gaccggaccc tgagccagag ggaggctgct cggctgcagt ccttccctga tgatttcatc 1980

ttttacggca gcaagaccgc tatcaacaac cagatcggca atgctgtgcc tcccctgctg 2040

gcctatcaga tcgctaaggc tttccctttc aagggccagt ttgtggacct gttcagcggc 2100

gctggcggcc tgagcctggg attcctgtgg gctggctgga agcccatcat cgccaatgat 2160

atcgataagt gggctctgac cacctacatg aataacatcc acaatgaggt ggtgctgggc 2220

gatatcaggg acgagaaggt gtccgagacc atcatccaga agtgcctgat cgctaagaag 2280

agcaaccctg accggcctct gttcgtgctg ggcggcccac cttgccaggg cttcagcacc 2340

gccggcaaga agaggtccat cgtggacgag aggaactggc tgtttgagtc ctatgtgtcc 2400

atcctgaagg aggtgaagcc tgacggcttt atctttgaga acgtgaccgg cctgctgagc 2460

atggagaagg gcgccttctt cgagatggtg aagtccgagc tgagcaagac cgtgagcaac 2520

ctgttcgtgt acaagctgaa ctccgtggat tatggcgtgc cccagaggcg gaacagggtg 2580

gtcattatcg gcgatagcac cggcaccaag aatagcgagc ctcccatccc catcacctcc 2640

ctgaagggcg agaagaccct gttcgacgcc ctgtcctccg ccatcagcgt gaaggaggct 2700

ctgagcgacc tgcctctgct gtcccccaat gaggacggca gctggaagaa ctatgtgtgt 2760

gagccccaga acatctatca gagcttcatg cggaagaaga tcaccgccca gcagtatatc 2820

gagatgctga gctccctggc tatcatc 2847

<210> 9

<211> 949

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Met Ser Asn Ala Lys Ser Phe Ser Leu Asn Glu Lys Thr Glu Ala Asn

1 5 10 15

Ala Leu Ile Asp Phe Ile Ile Glu Lys Ser Asn Gln Ser Lys Asp Leu

20 25 30

Gly Tyr Trp Leu Gln Lys Ser Lys Gly Gln Phe Tyr Thr His Asn Phe

35 40 45

Ile Gly Glu Lys Leu Val Thr Glu Ile Val Glu Asn Ile Lys Phe Asn

50 55 60

Asp Asp Ser Glu Val Ile Lys Ile Ile Asp Pro Phe Cys Gly Asp Gly

65 70 75 80

Arg Leu Ile Cys Ile Leu Leu Asp Lys Phe Asn Ala Ile Asn Lys Phe

85 90 95

Arg Asn Thr Leu Leu Glu Ile Glu Phe Trp Asp Ile Asp Pro Glu Ala

100 105 110

Val Glu Val Ala Tyr Thr Asn Ile Lys Glu Lys Ala Asn Ala Leu Glu

115 120 125

Phe Asn Val Gln Leu Lys Gly Arg Val Cys Asp Thr Phe Leu Phe Ala

130 135 140

Gln Asp Tyr Phe Gly Ser Tyr Asp Ile Cys Ile Thr Asn Pro Pro Trp

145 150 155 160

Val Ile Ile Lys Pro Asp Lys Lys Glu Lys Glu Arg Leu Ser Lys Glu

165 170 175

Glu Glu Ile Glu Tyr Ile Glu Ile Leu Lys Asn Phe Asp Asp Phe Leu

180 185 190

Ser Arg Tyr Tyr Pro Thr Ser Leu Pro Thr Lys Lys Tyr Gly Gly Trp

195 200 205

Gly Thr Asn Leu Ala Arg Cys Gly Thr Glu Val Ala Leu Arg Leu Ile

210 215 220

Ser Lys Val Gly Ile Cys Gly Ile Val Ser Pro Ala Ser Leu Leu Gly

225 230 235 240

Asp Gln Val Ser Asp Asn Leu Arg Val Trp Met Phe Asn Asn Tyr Glu

245 250 255

Val Tyr Ser Ile Ser Tyr Phe Val Ala Glu Ala Lys Leu Phe Gly Lys

260 265 270

Val Asp Gln Ala Val Ile Thr Leu Thr Leu Ser Pro Lys Cys Asp Asp

275 280 285

Ser Ser Gly Asp Ile Ile Pro His Leu Phe Tyr Tyr Asp Arg Glu Leu

290 295 300

Phe Glu Lys Arg Tyr Tyr Met Asp Glu Tyr Asp Trp Arg Ile Ile Lys

305 310 315 320

Ser Leu Asn Tyr Val Ile Pro Ile Gln Phe Gly Leu Glu Ile Ile Lys

325 330 335

Met Asn Arg Leu Phe Lys Ser Leu Pro Thr Leu Gly Asp Leu Glu Asn

340 345 350

Glu Lys Glu Gly Ile Trp Leu Gly Arg Glu Leu Asp Glu Thr Gly Ile

355 360 365

Lys Glu Lys Leu Ala Asn Lys Gly Gln Tyr Arg Phe Ile Lys Gly Lys

370 375 380

Met Val Gly Arg Tyr Asn Leu Ile Glu Glu Ser Asn Gln Tyr Ile Asp

385 390 395 400

Val Arg Lys Ile Asp Lys Ile Pro Lys Ser Val Glu Phe Tyr Arg Leu

405 410 415

Val Trp Arg Asp Val Ser Arg Thr Thr Gln Lys Arg Arg Leu Ile Ser

420 425 430

Thr Ile Ile Pro Pro Lys Tyr Ile Thr Gly Asn Ser Leu Asn Val Ala

435 440 445

Tyr Phe Lys Asp Asn Asn Leu Lys Lys Leu Lys Ala Leu Leu Ala Ile

450 455 460

Met Asn Ser Phe Val Phe Glu Ala Gln Val Arg Ala Asn Leu Ser Thr

465 470 475 480

Asn His Ile Ser Leu Gly Ile Ile Arg Arg Ala His Ile Pro Lys Leu

485 490 495

Glu Gly Arg Val Val Asp Glu Leu Ser Gln Leu Val Asp Asn Tyr Val

500 505 510

Asn Glu Glu Ser Glu Leu Leu Leu Glu Val Lys Val Ala Lys Ala Tyr

515 520 525

Gly Leu Ser Phe Glu Asp Phe Ser Ser Ile Leu Ser Leu Phe Asp Lys

530 535 540

Ile Gly Lys Asp Glu Lys Glu Lys Ile Leu Gln Val Ala Lys Lys Tyr

545 550 555 560

Leu Lys Gly Gly Ile Lys Asn Asp Ser Leu Ile Ile Lys His Val Pro

565 570 575

Pro Gly Gly Asn Trp Lys Asp Ile Pro Glu Trp Val Pro Ser Lys Arg

580 585 590

Leu Glu Gln Ile Arg Lys Ser Tyr Ala Glu Gly Lys Gly Ser Arg Ser

595 600 605

Thr Tyr Tyr Gly Arg Leu Leu Pro Asp Met Pro Ser Tyr Thr Ile Asn

610 615 620

Thr Tyr Phe Asn Arg Pro Gly Asn Gly Cys His Ile His Tyr Glu Gln

625 630 635 640

Asp Arg Thr Leu Ser Gln Arg Glu Ala Ala Arg Leu Gln Ser Phe Pro

645 650 655

Asp Asp Phe Ile Phe Tyr Gly Ser Lys Thr Ala Ile Asn Asn Gln Ile

660 665 670

Gly Asn Ala Val Pro Pro Leu Leu Ala Tyr Gln Ile Ala Lys Ala Phe

675 680 685

Pro Phe Lys Gly Gln Phe Val Asp Leu Phe Ser Gly Ala Gly Gly Leu

690 695 700

Ser Leu Gly Phe Leu Trp Ala Gly Trp Lys Pro Ile Ile Ala Asn Asp

705 710 715 720

Ile Asp Lys Trp Ala Leu Thr Thr Tyr Met Asn Asn Ile His Asn Glu

725 730 735

Val Val Leu Gly Asp Ile Arg Asp Glu Lys Val Ser Glu Thr Ile Ile

740 745 750

Gln Lys Cys Leu Ile Ala Lys Lys Ser Asn Pro Asp Arg Pro Leu Phe

755 760 765

Val Leu Gly Gly Pro Pro Cys Gln Gly Phe Ser Thr Ala Gly Lys Lys

770 775 780

Arg Ser Ile Val Asp Glu Arg Asn Trp Leu Phe Glu Ser Tyr Val Ser

785 790 795 800

Ile Leu Lys Glu Val Lys Pro Asp Gly Phe Ile Phe Glu Asn Val Thr

805 810 815

Gly Leu Leu Ser Met Glu Lys Gly Ala Phe Phe Glu Met Val Lys Ser

820 825 830

Glu Leu Ser Lys Thr Val Ser Asn Leu Phe Val Tyr Lys Leu Asn Ser

835 840 845

Val Asp Tyr Gly Val Pro Gln Arg Arg Asn Arg Val Val Ile Ile Gly

850 855 860

Asp Ser Thr Gly Thr Lys Asn Ser Glu Pro Pro Ile Pro Ile Thr Ser

865 870 875 880

Leu Lys Gly Glu Lys Thr Leu Phe Asp Ala Leu Ser Ser Ala Ile Ser

885 890 895

Val Lys Glu Ala Leu Ser Asp Leu Pro Leu Leu Ser Pro Asn Glu Asp

900 905 910

Gly Ser Trp Lys Asn Tyr Val Cys Glu Pro Gln Asn Ile Tyr Gln Ser

915 920 925

Phe Met Arg Lys Lys Ile Thr Ala Gln Gln Tyr Ile Glu Met Leu Ser

930 935 940

Ser Leu Ala Ile Ile

945

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gactataagg atgacgacga taag 24

<210> 11

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

1 5

<210> 12

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

atgcccctgc tgctgctgct gcccctgctg tgggccggcg ccctggccat g 51

<210> 13

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Met Pro Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Trp Ala Gly Ala Leu Ala

1 5 10 15

Met

<210> 14

<211> 1632

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

atgggcaaaa aggccgaata cggccagggc caccccatct tcctggagta cgccgagcag 60

atcatccagc acaaagagta ccagggcatg cccgacctga gataccccga cggcagaatc 120

caatgggagg ccccaagcaa cagaaaaagc ggcatcttca aagacaccaa catcaaaaga 180

cgcaaatggt gggagcagaa agctatcagc atcggcatcg accccagcag caaccagtgg 240

atcagtaaga ccgccaaact gatccaccca accatgagaa agccctgcaa aaagtgcggc 300

agaatcatgg acctgagata tagctacccc accaaaaacc tgatcaaaag aatcagaaag 360

ctgccctacg tggacgaatc ctttgagatc gacagcctgg agcacatcct gaagctgatc 420

aagagactgg tgctgcagta cggcgacaaa gtgtacgacg acctgccaaa actgctgacc 480

tgcaaggctg tgaagaacat cccccggctg ggcaacgacc tggacacctg gctgaactgg 540

atcgactccg tgtacatccc cagcgagccc agcatgctga gccccggagc catggccaac 600

ccccctgata gactggacgg cttccacagc ctgaacgaat gctgcagaag ccacgccgac 660

agaggcagat gggagaaaaa cctgagaagc tacaccacag acagaagagc ctttgagtac 720

tgggtggacg gcgactgggt ggccgccgat aagctgatgg gcctgatcag aactaacgag 780

cagatcaaga aggagacatg cctgaacgac aaccaccccg gaccctgtag cgccgaccac 840

atcggaccca ttagcctggg atttgtgcac agacccgagt tccagctgct gtgcaacagc 900

tgcaacagcg ccaaaaacaa cagaatgacc ttcagcgacg tgcagcacct gatcaacgcc 960

gagaacaacg gagaggaggt ggctagctgg tactgtaagc acatctggga cctgagaaag 1020

cacgacgtga aaaacaacga gaacgccctg agactgagta aaatcctgag agacaataga 1080

cacacagcca tgtttatcct gtcagagctg ctgaaggaca accactacct gttcctgagc 1140

accttcctgg gcctgcagta cgccgaaaga tccgtgagct tcagcaacat caaaatcgag 1200

aaccacatca tcaccggcca gatctccgaa cagccccgcg acaccaaata caccgaggag 1260

cagaaagcca gaagaatgag aatcggcttc gaagccctga aaagctacat cgagaaggaa 1320

aacagaaacg ccctgctggt gatcaacgac aaaatcatcg acaagatcaa cgagatcaaa 1380

aacatcctgc aggacatccc cgacgagtac aaactgctga acgagaagat tagcgagcag 1440

ttcaactccg aagaagtgag cgacgagctg ctgagagact tggtgacaca cctgccaaca 1500

aaagaaagcg agcccgccaa cttcaagctg gccagaaagt acctgcagga gatcatggag 1560

atcgtggggg acgagctgag caagatgtgg gaggacgaga gatacgtgag acagaccttc 1620

gccgacctgg ac 1632

<210> 15

<211> 544

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

Met Gly Lys Lys Ala Glu Tyr Gly Gln Gly His Pro Ile Phe Leu Glu

1 5 10 15

Tyr Ala Glu Gln Ile Ile Gln His Lys Glu Tyr Gln Gly Met Pro Asp

20 25 30

Leu Arg Tyr Pro Asp Gly Arg Ile Gln Trp Glu Ala Pro Ser Asn Arg

35 40 45

Lys Ser Gly Ile Phe Lys Asp Thr Asn Ile Lys Arg Arg Lys Trp Trp

50 55 60

Glu Gln Lys Ala Ile Ser Ile Gly Ile Asp Pro Ser Ser Asn Gln Trp

65 70 75 80

Ile Ser Lys Thr Ala Lys Leu Ile His Pro Thr Met Arg Lys Pro Cys

85 90 95

Lys Lys Cys Gly Arg Ile Met Asp Leu Arg Tyr Ser Tyr Pro Thr Lys

100 105 110

Asn Leu Ile Lys Arg Ile Arg Lys Leu Pro Tyr Val Asp Glu Ser Phe

115 120 125

Glu Ile Asp Ser Leu Glu His Ile Leu Lys Leu Ile Lys Arg Leu Val

130 135 140

Leu Gln Tyr Gly Asp Lys Val Tyr Asp Asp Leu Pro Lys Leu Leu Thr

145 150 155 160

Cys Lys Ala Val Lys Asn Ile Pro Arg Leu Gly Asn Asp Leu Asp Thr

165 170 175

Trp Leu Asn Trp Ile Asp Ser Val Tyr Ile Pro Ser Glu Pro Ser Met

180 185 190

Leu Ser Pro Gly Ala Met Ala Asn Pro Pro Asp Arg Leu Asp Gly Phe

195 200 205

His Ser Leu Asn Glu Cys Cys Arg Ser His Ala Asp Arg Gly Arg Trp

210 215 220

Glu Lys Asn Leu Arg Ser Tyr Thr Thr Asp Arg Arg Ala Phe Glu Tyr

225 230 235 240

Trp Val Asp Gly Asp Trp Val Ala Ala Asp Lys Leu Met Gly Leu Ile

245 250 255

Arg Thr Asn Glu Gln Ile Lys Lys Glu Thr Cys Leu Asn Asp Asn His

260 265 270

Pro Gly Pro Cys Ser Ala Asp His Ile Gly Pro Ile Ser Leu Gly Phe

275 280 285

Val His Arg Pro Glu Phe Gln Leu Leu Cys Asn Ser Cys Asn Ser Ala

290 295 300

Lys Asn Asn Arg Met Thr Phe Ser Asp Val Gln His Leu Ile Asn Ala

305 310 315 320

Glu Asn Asn Gly Glu Glu Val Ala Ser Trp Tyr Cys Lys His Ile Trp

325 330 335

Asp Leu Arg Lys His Asp Val Lys Asn Asn Glu Asn Ala Leu Arg Leu

340 345 350

Ser Lys Ile Leu Arg Asp Asn Arg His Thr Ala Met Phe Ile Leu Ser

355 360 365

Glu Leu Leu Lys Asp Asn His Tyr Leu Phe Leu Ser Thr Phe Leu Gly

370 375 380

Leu Gln Tyr Ala Glu Arg Ser Val Ser Phe Ser Asn Ile Lys Ile Glu

385 390 395 400

Asn His Ile Ile Thr Gly Gln Ile Ser Glu Gln Pro Arg Asp Thr Lys

405 410 415

Tyr Thr Glu Glu Gln Lys Ala Arg Arg Met Arg Ile Gly Phe Glu Ala

420 425 430

Leu Lys Ser Tyr Ile Glu Lys Glu Asn Arg Asn Ala Leu Leu Val Ile

435 440 445

Asn Asp Lys Ile Ile Asp Lys Ile Asn Glu Ile Lys Asn Ile Leu Gln

450 455 460

Asp Ile Pro Asp Glu Tyr Lys Leu Leu Asn Glu Lys Ile Ser Glu Gln

465 470 475 480

Phe Asn Ser Glu Glu Val Ser Asp Glu Leu Leu Arg Asp Leu Val Thr

485 490 495

His Leu Pro Thr Lys Glu Ser Glu Pro Ala Asn Phe Lys Leu Ala Arg

500 505 510

Lys Tyr Leu Gln Glu Ile Met Glu Ile Val Gly Asp Glu Leu Ser Lys

515 520 525

Met Trp Glu Asp Glu Arg Tyr Val Arg Gln Thr Phe Ala Asp Leu Asp

530 535 540

<210> 16

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

caccaccacc accatcac 18

<210> 17

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

His His His His His His

1 5

<210> 18

<211> 6119

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg 60

ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120

cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180

ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt 240

gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata 300

tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 360

cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 420

attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 480

atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 540

atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 600

tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg 660

actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc 720

aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg 780

gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca 840

ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagacccaa gctggctagc 900

gtttaaacgg gccctctaga ctcgagcggc cgccactgtg ctggatatct gcagaattcg 960

ccgccaccat ggtgagcaag ggcgaggagc tgttcaccgg ggtggtgccc atcctggtcg 1020

agctggacgg cgacgtaaac ggccacaagt tcagcgtgtc cggcgagggc gagggcgatg 1080

ccacctacgg caagctgacc ctgaagttca tctgcaccac cggcaagctg cccgtgccct 1140

ggcccaccct cgtgaccacc ctgacctacg gcgtgcagtg cttcagccgc taccccgacc 1200

acatgaagca gcacgacttc ttcaagtccg ccatgcccga aggctacgtc caggagcgca 1260

ccatcttctt caaggacgac ggcaactaca agacccgcgc cgaggtgaag ttcgagggcg 1320

acaccctggt gaaccgcatc gagctgaagg gcatcgactt caaggaggac ggcaacatcc 1380

tggggcacaa gctggagtac aactacaaca gccacaacgt ctatatcatg gccgacaagc 1440

agaagaacgg catcaaggtg aacttcaaga tccgccacaa catcgaggac ggcagcgtgc 1500

agctcgccga ccactaccag cagaacaccc ccatcggcga cggccccgtg ctgctgcccg 1560

acaaccacta cctgagcacc cagtccgccc tgagcaaaga ccccaacgag aagcgcgatc 1620

acatggtcct gctggagttc gtgaccgccg ccgggatcac tctcggcatg gacgagctgt 1680

acaagtaggc ttaagtttaa accgctgatc agcctcgact gtgccttcta gttgccagcc 1740

atctgttgtt tgcccctccc ccgtgccttc cttgaccctg gaaggtgcca ctcccactgt 1800

cctttcctaa taaaatgagg aaattgcatc gcattgtctg agtaggtgtc attctattct 1860

ggggggtggg gtggggcagg acagcaaggg ggaggattgg gaagacaata gcaggcatgc 1920

tggggatgcg gtgggctcta tggcttctga ggcggaaaga accagctggg gctctagggg 1980

gtatccccac gcgccctgta gcggcgcatt aagcgcggcg ggtgtggtgg ttacgcgcag 2040

cgtgaccgct acacttgcca gcgccctagc gcccgctcct ttcgctttct tcccttcctt 2100

tctcgccacg ttcgccggct ttccccgtca agctctaaat cgggggctcc ctttagggtt 2160

ccgatttagt gctttacggc acctcgaccc caaaaaactt gattagggtg atggttcacg 2220

tagtgggcca tcgccctgat agacggtttt tcgccctttg acgttggagt ccacgttctt 2280

taatagtgga ctcttgttcc aaactggaac aacactcaac cctatctcgg tctattcttt 2340

tgatttataa gggattttgc cgatttcggc ctattggtta aaaaatgagc tgatttaaca 2400

aaaatttaac gcgaattaat tctgtggaat gtgtgtcagt tagggtgtgg aaagtcccca 2460

ggctccccag caggcagaag tatgcaaagc atgcatctca attagtcagc aaccaggtgt 2520

ggaaagtccc caggctcccc agcaggcaga agtatgcaaa gcatgcatct caattagtca 2580

gcaaccatag tcccgcccct aactccgccc atcccgcccc taactccgcc cagttccgcc 2640

cattctccgc cccatggctg actaattttt tttatttatg cagaggccga ggccgcctct 2700

gcctctgagc tattccagaa gtagtgagga ggcttttttg gaggcctagg cttttgcaaa 2760

aagctcccgg gagcttgtat atccattttc ggatctgatc aagagacagg atgaggatcg 2820

tttcgcatga ttgaacaaga tggattgcac gcaggttctc cggccgcttg ggtggagagg 2880

ctattcggct atgactgggc acaacagaca atcggctgct ctgatgccgc cgtgttccgg 2940

ctgtcagcgc aggggcgccc ggttcttttt gtcaagaccg acctgtccgg tgccctgaat 3000

gaactgcagg acgaggcagc gcggctatcg tggctggcca cgacgggcgt tccttgcgca 3060

gctgtgctcg acgttgtcac tgaagcggga agggactggc tgctattggg cgaagtgccg 3120

gggcaggatc tcctgtcatc tcaccttgct cctgccgaga aagtatccat catggctgat 3180

gcaatgcggc ggctgcatac gcttgatccg gctacctgcc cattcgacca ccaagcgaaa 3240

catcgcatcg agcgagcacg tactcggatg gaagccggtc ttgtcgatca ggatgatctg 3300

gacgaagagc atcaggggct cgcgccagcc gaactgttcg ccaggctcaa ggcgcgcatg 3360

cccgacggcg aggatctcgt cgtgacccat ggcgatgcct gcttgccgaa tatcatggtg 3420

gaaaatggcc gcttttctgg attcatcgac tgtggccggc tgggtgtggc ggaccgctat 3480

caggacatag cgttggctac ccgtgatatt gctgaagagc ttggcggcga atgggctgac 3540

cgcttcctcg tgctttacgg tatcgccgct cccgattcgc agcgcatcgc cttctatcgc 3600

cttcttgacg agttcttctg agcgggactc tggggttcga aatgaccgac caagcgacgc 3660

ccaacctgcc atcacgagat ttcgattcca ccgccgcctt ctatgaaagg ttgggcttcg 3720

gaatcgtttt ccgggacgcc ggctggatga tcctccagcg cggggatctc atgctggagt 3780

tcttcgccca ccccaacttg tttattgcag cttataatgg ttacaaataa agcaatagca 3840

tcacaaattt cacaaataaa gcattttttt cactgcattc tagttgtggt ttgtccaaac 3900

tcatcaatgt atcttatcat gtctgtatac cgtcgacctc tagctagagc ttggcgtaat 3960

catggtcata gctgtttcct gtgtgaaatt gttatccgct cacaattcca cacaacatac 4020

gagccggaag cataaagtgt aaagcctggg gtgcctaatg agtgagctaa ctcacattaa 4080

ttgcgttgcg ctcactgccc gctttccagt cgggaaacct gtcgtgccag ctgcattaat 4140

gaatcggcca acgcgcgggg agaggcggtt tgcgtattgg gcgctcttcc gcttcctcgc 4200

tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg 4260

cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag 4320

gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc 4380

gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag 4440

gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga 4500

ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc 4560

atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg 4620

tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt 4680

ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca 4740

gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca 4800

ctagaagaac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag 4860

ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggttttttt gtttgcaagc 4920

agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt 4980

ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa 5040

ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat 5100

atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag tgaggcacct atctcagcga 5160

tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct gactccccgt cgtgtagata actacgatac 5220

gggagggctt accatctggc cccagtgctg caatgatacc gcgagaccca cgctcaccgg 5280

ctccagattt atcagcaata aaccagccag ccggaagggc cgagcgcaga agtggtcctg 5340

caactttatc cgcctccatc cagtctatta attgttgccg ggaagctaga gtaagtagtt 5400

cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg ccattgctac aggcatcgtg gtgtcacgct 5460

cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga gttacatgat 5520

cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc tccgatcgtt gtcagaagta 5580

agttggccgc agtgttatca ctcatggtta tggcagcact gcataattct cttactgtca 5640

tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg gtgagtactc aaccaagtca ttctgagaat 5700

agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaat acgggataat accgcgccac 5760

atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc ttcggggcga aaactctcaa 5820

ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac tcgtgcaccc aactgatctt 5880

cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa aacaggaagg caaaatgccg 5940

caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat gttgaatact catactcttc ctttttcaat 6000

attattgaag catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt gaatgtattt 6060

agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca catttccccg aaaagtgcca cctgacgtc 6119

Claims

1.一种制备限制性内切酶类的方法，其特征在于，其包括以下步骤(a)或(b)：

(b)：将所述甲基转移酶基因与所述限制性内切酶基因共同表达在同一真核表达载体上，将该真核表达载体转染所述真核表达细胞进行表达，从所述真核表达细胞的培养产物中分离纯化得到所述限制性内切酶；

其中，所述甲基转移酶能够对所述限制性内切酶的特异性识别序列中的一个或多个碱基进行甲基化修饰以阻碍所述限制性内切酶对所述特异性识别序列的切割；步骤(a)和步骤(b)中的真核表达载体均不含原核表达调控元件。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一真核表达载体与所述第二真核表达共同转染时的质量比为(1-9)到(9-1)；

优选的，所述第一真核表达载体与所述第二真核表达共同转染时的质量比为(4-6):(6-4)。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述限制性内切酶为I型限制性内切酶、II型限制性内切酶或III型限制性内切酶；

所述I型限制性内切酶选自EcoAI、EcoBI、EcoDI、EcoEI、EcoKI、EcoprrI、EcoR124II、StySPI和StySJI中的任意一种；

所述II型限制性内切酶选自AbrI、AccI、AgeI、AluI、ApaLI、AquI、AvaI、BamHI、BamHII、BanI、BanIII、BbvI、BepI、BglI、BglII、BsaI、BseCI、BslI、BsoBI、Bsp6I、BspRI、BstVI、BsuBI、BsuFI、BsuRI、CeqI、Cfr9I、Cfr10I、CfrBI、CviAII、CviBI、CviJI、CviRI、DdeI、DpnI、DpnII、DsaV、EcaI、Eco47I、Eco47II、Eco57I、EcoRI、EcoRII、EcoRV、FnuDI、FokI、HaeII、HaeIII、HgaI、HgiBI、HgiCI、HgiCII、HgiDI、HgiDII、HgiEI、HgiGI、HhaI、HhaII、HincII、HindII、HindIII、HindV、HinfI、HpaI、HpaII、HphI、KpnI、LlaDCHI、MamI、MboI、MboII、MjaI、MjaII、MjaIII、MjaIV、MjaV、MjaVI、MspI、MthTI、MthZI、MunI、MvaI、MwoI、NaeI、NgoBI、NgoBV、NgoFVII、NgoMIV、NgoPII、NlaIII、NlaIV、NmeDI、NspV、PaeR7I、PspPI、PstI、PvuI、PvuII、RsrI、SacI、SalI、Sau3AI、Sau96I、ScaI、ScrFI、SfiI、SinI、SmaI、SsoII、StsI、TaqI、TthHB8I、VspI、XamI、XbaI、XcyI、XhoI和XorII中的任意一种；

所述III型限制性内切酶选自EcoPI、EcoP15I、HinfIII和StyLTI中的任意一种。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述甲基转移酶为C5甲基胞嘧啶甲基转移酶、N4甲基胞嘧啶甲基转移酶或N6甲基腺嘌呤甲基转移酶；

所述C5甲基胞嘧啶甲基转移酶选自AgeIM、AluIM、ApaLIM、AquIMA、BanIM、BbvIM、BepIM、BsaIM、BseCIM、Bsp6IM、BspRIM、HsdFM、HsdRM、CVIJIM、DdeIM、DsaVM、Eco47IIM、EcoRIIM、FnuDIM、HaeIIM、HaeIIIM、HgaIAM、HgiBIM、HgiCIM、HgiCIIM、HgiDIM、HgiDIIM、HgiEIM、HgiGIM、HhaIM、HindVM、HpaIIM、HphIAM、MspIM、MthTIM、NaeIM、NgoBIM、NgoBVM、NgoFVIIM、NgoMIVM、NgoPIIM、NlaIVM、NmeDIMP、PspPIM、SacIM、Sau3AIM、Sau96IM、ScrFIAM、SinIM、SsoIIM和XorIIM中的任意一种；

所述N4甲基胞嘧啶甲基转移酶选自AvaIM、BamHIM、BamHIIM、BglIM、BglIIM、BslIM、BsoBIM、Cfr9IM、CfrBIM、MjaIM、MjaIIM、MjaVM、MjaVIM、MthZIM、MvaIM、MwoIM、PvuIIM、ScaIM、SfiIM、SmaIM和XcyIM中的任意一种；

所述N6甲基腺嘌呤甲基转移酶选自AbrIM、AccIM、BanIIIM、BsaIM、BstVIM、HsdBM、CeqIM、CVIAIIM、CVIBIM、CVIRIM、DpnM、EcaIM、Eco57IBM、EcoRIM、EcoRVM、FokIM、HhaIIM、HincIIM、HindIIM、HinfIM、HpaIM、KpnIM、LlaDCHIA、MamIM、MboIAM、MboIIM、MjaIIIM、MunIM、NlaIIIM、PaeR7IM、PstIM、RsrIM、SalIM、StsIM、TaqIM、TthHB8IM、VspIM、XamIM和XhoIM中的任意一种。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述真核表达细胞为哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞或酵母细胞。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，当所述真核表达细胞为哺乳动物细胞时，所述第一真核表达和第二真核表达载体的骨架均为pcDNA3.1(-)、PTT5、PCMV-Tag、pTet-on/off或pEF4/V5；

当所述真核表达细胞为昆虫细胞时，所述第一真核表达和第二真核表达载体的骨架均为pfastbac1、pAcGHLT C或pVL1393；

当所述真核表达细胞为植物细胞时，所述第一真核表达和第二真核表达载体的骨架均为pKANNIBAL或pBI121；

当所述真核表达细胞为酵母细胞时，所述第一真核表达和第二真核表达载体的骨架均为pPIC9K、pPIC3.5、pPIC Zα、pGAPZ A、pYC119、pYES2-CT或pAUR123。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在所述第二真核表达载体中，所述限制性内切酶的编码序列上游连接有信号肽编码序列、所述限制性内切酶的编码序列下游连接有蛋白纯化标签编码序列；

所述信号肽为CD33信号肽、Ig Kappa信号肽或IL-2信号肽；

所述蛋白纯化标签为His标签、Flag标签、Avi标签、Strep标签、HA标签、Myc标签、V5标签、Sumo标签、GST标签、NusA标签、eGFP标签、eCFP标签、eYF标签或mCharry标签。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述限制性内切酶为BsaI，所述甲基转移酶为BsaIM，所述第一真核表达和第二真核表达载体的骨架均为pcDNA3.1(-)，所述甲基转移酶的编码序列位于所述第一真核表达载体的EcoRI和HindIII酶切位点之间，所述信号肽编码序列、所述限制性内切酶的编码序列和所述蛋白纯化标签编码序列位于所述第二真核表达载体的EcoRI和HindIII酶切位点之间；所述真核表达细胞为哺乳动物细胞；

所述信号肽为CD33信号肽，所述蛋白纯化标签为His标签。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述限制性内切酶的编码序列如SEQ IDNO.14所示，所述信号肽编码序列如SEQ ID NO.12所示，所述蛋白纯化标签编码序列如SEQID NO.16所示，所述甲基转移酶的编码序列如SEQ ID NO.8所示；所述哺乳动物细胞为HEK293细胞。

10.一种限制性内切酶产品，其特征在于，其由权利要求1-9任一项所述的方法制得。