CN116769811A - 分泌trail的工程化巨噬细胞及其应用 - Google Patents

分泌trail的工程化巨噬细胞及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及涉及分泌TRAIL的工程化巨噬细胞及其在抗肿瘤中的应用。本发明构建了修饰巨噬细胞的融合基因、载体、工程化巨噬细胞及其应用。构建了TRAIL‑cM、Tri‑TRAIL‑cM和Arg1‑trimTRAIL‑cM三种质粒，被该质粒转染的巨噬细胞能够表达并外泌具有穿膜功能的TRAIL‑TAT蛋白通过发挥巨噬细胞的分泌功能，并结合巨噬细胞的肿瘤趋化性和浸润性，将药物蛋白递送到实体瘤内部，达到肿瘤治疗的作用。

Description

分泌TRAIL的工程化巨噬细胞及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术、免疫细胞治疗技术和抗肿瘤技术领域，具体涉及一种分泌TRAIL的工程化巨噬细胞及其在抗肿瘤中的应用。
技术背景
巨噬细胞（Macrophages，缩写为mø）是一种位于组织内的白血球，源自单核细胞，而单核细胞又来源于骨髓中的前体细胞。巨噬细胞和单核细胞皆为吞噬细胞，在脊椎动物体内参与非特异性防卫（先天性免疫）和特异性防卫（细胞免疫）。它们的主要功能是以固定细胞或游离细胞的形式对细胞残片及病原体进行噬菌作用（即吞噬以及消化），并激活淋巴球或其他免疫细胞，令其对病原体作出反应。巨噬细胞属免疫细胞是研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。巨噬细胞容易获得，便于培养，并可进行纯化。巨噬细胞属不繁殖细胞群，在条件适宜下可生活2-3周，多用做原代培养，难以长期生存。
巨噬细胞具有多种的生物学功能，参与机体抗感染、抗肿瘤、免疫应答和免疫调节等过程，是机体非特异性免疫防御的关键环节，同时还是特异性免疫应答过程中的重要参与者。在抗肿瘤免疫中，巨噬细胞不仅是抗原呈递细胞（antigenpresenting cells, APC），也是参与杀伤肿瘤的效应细胞。巨噬细胞杀伤肿瘤细胞的机制有：第一，活化的巨噬细胞，通过溶解酶途径，直接杀伤肿瘤细胞；第二，巨噬细胞通过处理肿瘤抗原并将呈递肿瘤抗原呈递给T 细胞，进而诱导产生特异性的免疫应答抗肿瘤；第三，巨噬细胞通过抗体介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（antibody dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC）实现对肿瘤细胞的杀伤；第四，活化的巨噬细胞，分泌TNF-α 等细胞毒性因子间接杀伤肿瘤细胞，TNF-α是具有最强的抗癌活性的细胞因子，不仅能增强宿主免疫力还能诱导肿瘤细胞凋亡；第五，巨噬细胞能产生细胞毒作用的 NO，且 NO 介导对肿瘤细胞的间接杀伤。巨噬细胞可分泌肿瘤坏死因子-α （tumor necrosis factor-α，TNF-α）、NO 等抗瘤效应因子参与特异性免疫应答过程。
肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)相关凋亡诱导配体TRAIL （TNF-related apoptosis inducing-ligand）是继TNF、FasL 之后发现的肿瘤坏死家族中第三个凋亡分子，其与细胞膜上的 TRAIL受体DR4/5 结合从而发挥生物学作用。在免疫系统中，免疫细胞的凋亡是重要的免疫调节，是机体维持自身的稳定，避免自身免疫疾病的重要机制。TRAIL蛋白单体分子具有高度的寡聚化倾向，可形成分子量为48KDa的二聚体和分子量为66KDa的三聚体，其中，三聚体可进一步聚集为六聚体。蛋白的构型稳定性及聚集形式与其肿瘤杀伤活性、受体亲和性以及稳定性等有着密切的关系，当TRAIL在空间上形成三聚体结构时，其抗肿瘤活性最佳而稳定性最高。
很多研究报道，TRAIL 在自然杀伤（NK）细胞、中性粒细胞、T 淋巴细胞，单核巨噬细胞和树突状细胞（DC）中表达，参与其对机体的免疫监视，可能在促进免疫细胞凋亡，调节免疫耐受等方面有重要作用，是一种良好的抗肿瘤蛋白类药物，然而蛋白类生物大分子由于自身分子量较大及不稳定性，在静脉给药过程中主要面临血液和肿瘤基质两大屏障，首先是血液屏障，在血液循环中，蛋白类药物易受网状内皮系统(RES)的吞噬、清除以及血浆中各种酶的降解，其次是肿瘤微环境中的基质屏障，肿瘤细胞的快速增殖及上皮间质转化作用形成了致密的肿瘤基质，同时肿瘤组织缺氧、偏酸及一系列慢性炎症反应形成了间质高压，致密的基质及高压极大地阻碍了大分子药物渗透进入肿瘤深层，这种不均匀的瘤内药物分布是造成肿瘤复发及转移的重要原因之一，也为肿瘤的治愈增加了难度，因此，对TRAIL 蛋白非功能结构域进行改造，以改善其体内及瘤内分布是亟需解决的问题。
发明内容
鉴于现有技术的问题，本发明的目的在于提供一种工程化改造巨噬细胞及其在抗肿瘤中的应用。所述的工程化改造巨噬细胞基于应用基因工程的方法对巨噬细胞进行功能化构建与修饰，使其分泌TRAIL，可针对不同肿瘤的特异性靶点，来实现更精准的高效定位肿瘤、靶向治疗癌症。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案。
一种修饰巨噬细胞的TRAIL融合蛋白基因，所述TRAIL融合蛋白基因的核酸序列如SEQID NO:5和SEQID NO:9所示。
一种质粒，所述质粒具有所述的修饰巨噬细胞的TRAIL融合基因。
一种载体，所述载体具有所述的修饰巨噬细胞的TRAIL融合基因。
进一步地，所述的载体的核酸序列如SEQID NO:1- SEQID NO:3所示。
优选的，所述载体为慢病毒载体，例如pCDH。
一种哺乳动物细胞，其基因组上整合了所述的TRAIL融合蛋白基因或所述的质粒或任意所述的载体，并且可表达和分泌所述TRAIL蛋白或其片段。
进一步地，所述的哺乳动物细胞为人、小鼠、大鼠、猪或猴的巨噬细胞。
一种分泌TRAIL的工程化巨噬细胞的制备方法，所述的制备方法包括如下步骤。
步骤1、获取如SEQID NO:5和SEQID NO:9所示的TRAIL融合蛋白。
步骤2、将步骤1中的所述TRAIL融合蛋白与辅助质粒混合培养，转染细胞。
步骤3、将转染的细胞转染至巨噬细胞中获取可表达TRAIL蛋白的巨噬细胞。
进一步地，所述的转染选自如下方式：病毒转染、脂质体转染、电转移转染、基因编辑转染和mRNA转染。
优选地，所述转染为病毒转染。
进一步地，所述辅助质粒包括：pCDH、 pMD2.G和psPAX2。
进一步地，所述的巨噬细胞为RAW264.7。
一种组合物，所述组合物含有所述的TRAIL融合蛋白基因或所述的质粒、任意所述的载体、所述的哺乳动物细胞、所述制备方法制得的分泌TRAIL的工程化巨噬细胞。
所述的TRAIL融合蛋白基因、所述的质粒、任意所述的载体、所述的哺乳动物细胞、所述的制备方法制得的分泌TRAIL的工程化巨噬细胞或所述的组合物在制备治疗肿瘤或者癌症产品中的应用。
进一步地，所述的肿瘤或者癌症为乳腺癌、黑色素瘤、结肠癌。
进一步地，所述产品为药物。
进一步地，所述药物为细胞治疗药物。
进一步地，所述药物包括有效量的巨噬细胞。
进一步地，所述药物含有药学上可用的载体或赋形剂。
进一步地，所述药物为注射剂。
本发明所述的工程化改造巨噬细胞可以被包括在用于治疗对象的组合物中。一方面，该组合物包含工程化改造巨噬细胞，该组合物可以包括药物组合物，并且进一步包括药学上可接受的载体。治疗有效量的包含工程化改造巨噬细胞的药物组合物可被给予。
一方面，本发明包括治疗对象的与肿瘤或癌症相关的疾病或状况的方法，包括向对象给予治疗有效量的包含本发明所述工程化改造巨噬细胞的药物组合物。另一方面，本发明包括治疗对象的实体肿瘤的方法，包括向对象给予治疗有效量的包含本发明所述工程化改造巨噬细胞的药物组合物。另一方面，本发明包括刺激对象对靶肿瘤细胞或肿瘤组织的免疫应答的方法，包括向对象给予治疗有效量的包含本发明所述工程化改造巨噬细胞的药物组合物。再另一方面，本发明包括本发明所述的工程化改造巨噬细胞在制备用于治疗对其有需要的对象的免疫应答的药物中的用途。在又一方面，本发明包括所述的工程化改造巨噬细胞在制备用于治疗对其有需要的对象中的肿瘤或癌症的药物中的用途。
本发明所述生成的工程化改造巨噬细胞具有目标效应活性。在实施例中，工程化改造巨噬细胞具有针对靶细胞上的抗原的目标效应活性，目标效应活性包括但不限于吞噬、目标的细胞的细胞毒性、抗原呈递和细胞因子分泌。
在实施方式例中，本发明所述的工程化改造巨噬细胞可作为制剂、生物剂或治疗剂，递送至靶标的能力。巨噬细胞可被修饰或改造以将用剂递送至靶标，其中该用剂选自核酸、抗生素、抗炎剂、抗体或其抗体片段、生长因子、细胞因子、酶、蛋白质、肽、融合蛋白、合成分子、有机分子、碳水化合物或类似物、脂质、激素、微粒体、其衍生物或变体、和其任意组合。作为非限制性实例，用靶向肿瘤抗原的工程化改造的巨噬细胞能够分泌诸如细胞因子或抗体的用剂，以协助巨噬细胞功能。
本发明的工程化改造巨噬细胞可以用于治疗癌症。癌症包括没有血管化或尚未实质上血管化的肿瘤以及血管化的肿瘤。癌症可以包括非实体肿瘤(如血液肿瘤，例如白血病和淋巴瘤)，或可以包括实体肿瘤。用本发明的细胞治疗的癌症类型包括但不限于癌、胚细胞瘤和肉瘤、以及某些白血病或淋巴恶性病、良性和恶性肿瘤、和恶性病(malignancy)，例如肉瘤、癌和黑素瘤。还包括成年人肿瘤/癌症和儿童肿瘤/癌症也被包括在内。
实体肿瘤是通常不包含囊肿或液体区域的异常组织块。实体肿瘤可以是良性或恶性的。不同类型的实体肿瘤以形成其的细胞类型命名(如肉瘤、癌和淋巴瘤)。实体肿瘤(如肉瘤和癌)的实例包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤和其它肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、淋巴恶性病、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝细胞癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髓样癌、甲状腺乳头状癌、嗜铬细胞瘤、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝瘤、胆管癌、绒毛膜癌、Wilms肿瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、精原细胞瘤、膀胱癌、黑素瘤和CNS肿瘤(如神经胶质瘤(如脑干神经胶质瘤和混合神经胶质瘤)、成胶质细胞瘤(也称为多形性成胶质细胞瘤)、星形细胞瘤、CNS淋巴瘤、生殖细胞瘤、成神经管细胞瘤、神经鞘瘤(Schwannoma)、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、menangioma、成神经细胞瘤、视网膜母细胞瘤和脑转移)。
血液癌症是血液或骨髓的癌症。血液(或血原性)癌症的实例包括白血病——包括急性白血病(如急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、急性髓原性白血病和成髓细胞性、前髓细胞性、髓单核细胞性、单核细胞性白血病和红白血病)、慢性白血病(如慢性髓细胞性(粒细胞性)白血病、慢性髓原性白血病和慢性淋巴细胞性白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤(无痛和高等级形式)、多发性骨髓瘤、Waldenstrom巨球蛋白血症、重链病、骨髓增生异常综合征、毛细胞白血病和骨髓发育不良。
本发明的工程化改造巨噬细胞可以以在适当临床前和临床实验和试验中确定的剂量和途径以及次数给予。细胞组合物可以以这些范围内的剂量多次给予。本发明工程化改造巨噬细胞的给予可以与本领域技术人员所确定的可用于治疗期望疾病或状况的其它方法组合。
待给予的本发明工程化改造巨噬细胞可以相对于治疗进行的对象是自体的、同种异体的或异种的。
本发明细胞的给予可以以本领域技术人员已知的任何便利方式进行。本发明的细胞可以通过气雾吸入、注射、摄入、转输、植入或移植被给予对象。本文所述的组合物可经动脉、皮下、皮内、瘤内、结节内、髓内、肌内、静脉内(i.v.)注射或腹膜内来给予。在其它情况下，本发明的细胞被直接注射到对象的炎症部位、对象的局部疾病部位、淋巴结、器官、肿瘤和类似位置中。
本发明的药物组合物可以包含所述的工程化改造巨噬细胞-与一种或多种药学上或生理学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂组合。这样的组合物可以包含缓冲剂，如中性缓冲盐水、磷酸缓冲盐水和类似物；碳水化合物，如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露糖醇；蛋白质；多肽或氨基酸，如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的组合物优选被配制用于静脉内给予。
本发明的药物组合物可以以适于待治疗(或预防)疾病的方式被给予。给药的数量和频率将通过诸如患者状况和患者疾病类型和严重程度的因素确定，尽管适当的剂量可通过临床试验确定。
与现有技术比，本发明的有益效果如下。
本发明成功构建了TRAIL-cM、Tri-TRAIL-cM和Arg1- trimTRAIL-cM质粒，被该质粒转染的巨噬细胞能够表达并外泌具有穿膜功能的TRAIL-TAT蛋白，在到达肿瘤组织后借助富正电的TAT结构域，协助TRAIL结构域穿透肿瘤微环境的基质屏障，抵达肿瘤深部，激活肿瘤细胞凋亡通路，发挥抗肿瘤作用；同时，快速凋亡的肿瘤细胞碎片能够为免疫系统提供丰富的抗原，进一步激活效应T细胞，促进树突状细胞的成熟，通过激活固有免疫进一步增强抗肿瘤作用。
分泌TRAIL的工程化巨噬细胞抗肿瘤的原理是通过发挥巨噬细胞的分泌功能，并结合巨噬细胞的肿瘤趋化性和浸润性，将药物蛋白递送到实体瘤内部，达到肿瘤治疗的作用。分泌TRAIL的工程化巨噬细胞最大优势是不需要靶向肿瘤特异性标志物，选择适当的抗肿瘤蛋白，就可以发挥治疗作用。
体外通过病毒或其他转染方式将响应免疫微环境（TME）启动分泌肿瘤细胞杀伤因子的人工合成蛋白序列（Arg1-TRAIL）构建到巨噬细胞中。然后将构建好的巨噬细胞回输给肿瘤患者。构建好的分泌TRAIL的工程化巨噬细胞会向肿瘤募集并持续释放杀伤因子，延缓肿瘤进展。分泌TRAIL的工程化巨噬细胞发挥的抗肿瘤作用：肿瘤患者分泌IL-10等炎症因子，分泌TRAIL的工程化巨噬细胞响应这些炎症因子并向肿瘤部位趋化并通过释放肿瘤杀伤蛋白延缓肿瘤进展。分泌TRAIL的工程化巨噬细胞可以弥补CAR-M靶点单一的问题，对异质性较强的非特异膜蛋白表达的肿瘤进行有效杀伤，单独发挥抗肿瘤作用。
分泌TRAIL的工程化巨噬细胞还可以结合CAR-M，即将CAR序列的启动子转换为TME响应的启动子，并同时分泌促免疫激活的因子。增强CAR-M对肿瘤部位的聚集和免疫治疗的效果。可以减少CAR-M治疗的细胞量同时增加全体免疫细胞的抗瘤活性。
附图说明
图1是TRAIL-cM质粒结构图。
图2是Tri-TRAIL-cM的质粒结构图。
图3是Arg1- Tri-TRAIL-cM的质粒结构图。
图4A是分泌天然TRAIL和三聚体TRAIL(TRAIL-cM和Tri-TRAIL-cM)的RAW264.7细胞的质粒结构示意图。
图4B是Western blot对TRAIL-cM和Tri-TRAIL-cM的RAW264.7细胞系进行TRAIL蛋白分泌的鉴定结果图。
图5A是用CCK8检测TRAIL-cM/ tril -TRAIL-cM和empty-cM对4T1的抗肿瘤作用的结果图。
图5B是用活细胞染色检测TRAIL-cM/ tril -TRAIL-cM和empty-cM对4T1的抗肿瘤作用的结果图。
图6A是将组成型表达 Tri-TRAIL-cM的CMV 启动子替换为Arg1启动子Arg1- Tri-TRAIL-cM的质粒结构示意图。
图6B-6C是Tri -TRAIL-iM与4T1共培养后TRAIL蛋白检测分析结果图。
图7A-7E是评估Tri-TRAIL-iM在皮下荷瘤小鼠中的抗肿瘤作用结果图。
图8A-8B是TRAIL-cM和Tri-TRAIL-iM免疫荧光图。
具体实施方式
为了更清楚地理解本发明，参照下述实施例及附图进一步描述本发明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。实施例中，各原始试剂材料均可商购获得，未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照仪器制造商所建议的条件。
Raw264.7细胞最初取自美国型培养标本(ATCC, Manassas, VA, USA)，在DMEM培养基(优质10%胎牛血清（FBS)中培养；0.05 mM β-Mercaptoethanol （β巯基乙醇）；1%青霉素/链霉素。小鼠乳腺癌细胞株(4T1)培养于添加10%胎牛血清、1%青霉素链霉素和1%真菌菌群(Invitrogen)的改良培养基DMEM中，在5% CO2/5%空气的潮湿环境中37°C生长，直到70-80%混合。
实施例 1分泌TRAIL的巨噬细胞药物载体构建。
将表达小鼠TRAIL的慢病毒载体克隆到pCDH载体(SBI)中。TRAIL cDNA从美国国家生物技术信息中心获得。将trail cDNA的C末端与含有11个甘氨酸重复三重化学区域的人α1 (I)胶原必需的C前肽进行比较，以分泌蛋白(Tri-trail-cM)的形式表达，并将肿瘤微环境诱导的trail 三聚体标记为Tri-trail-iM。用填充质粒将慢病毒载体转染293T细胞2天后，用病毒颗粒感染RAW264.7细胞。在含2 μg/mL嘌呤霉素的培养基中培养2天后进行筛选，含有TRAIL的raw264.7细胞分别标记为TRAIL - cM和Tri-trail-cM。对于Tri-trail-cMW为应用Arg1启动子，不含有Trail细胞标记为empty-cM。
1、monomTRAIL载体构建。
步骤1、设计并分别基因合成SP(hCD8)、mTRAIL、Myc等基因序列。
SP(hCD8)基因序列如SEQID NO:4所示。
mTRAIL的基因序列如SEQID NO:5所示。
Myc的基因序列如SEQID NO:6所示。
步骤2、利用分子生物学方法将SP(hCD8)、mTRAIL、Myc等序列依次连接为XbaI-SP(hCD8)-EcoR-mTRAIL- Pac I-Myc-NotI。
步骤3、利用分子克隆技术将上述序列装载到慢病毒载体系统中，构建monomTRAIL融合蛋白慢病毒表达质粒，序列如SEQID NO:1所示，质粒结构如图1所示。
2、trimTRAIL载体构建。
步骤1、设计并分别基因合成SP(hCD8)、mTRAIL、CP1、Myc等基因序列。
CP1基因序列如SEQID NO:7所示。
步骤2、利用分子生物学方法将SP(hCD8)、mTRAIL、CP1、Myc等序列依次连接为XbaⅠ-SP(hCD8)-EcoR-mTRAIL- Pac I-CP1-Myc-NotI。
步骤3、利用分子克隆技术将上述序列装载到慢病毒载体系统中，构建Arg1- trimTRAIL融合蛋白慢病毒表达质粒，序列如SEQID NO:2所示，质粒结构如图2所示。
3、Arg1- Tri-TRAIL载体构建。
步骤1、设计并分别基因合成mArg1、Tri-TRAIL等基因序列。
mArg1promoter的基因序列如SEQID NO:8所示。
trimTRAIL的基因序列如SEQID NO:9所示。
步骤2、利用分子生物学方法将mArg1、mTRAIL等序列依次连接为XbaⅠ-PG-mArg1-mTRAIL- Pac I-CP1-Myc-NotI。
步骤3、利用分子克隆技术将上述序列装载到慢病毒载体系统中，构建mArg1-mTRAIL融合蛋白慢病毒表达质粒。pCDH-PG-mArg1-mTRAIL核酸序列如3所示。
实施例2 分泌TRAIL的工程化巨噬细胞的制备方法。
一种分泌TRAIL的工程化巨噬细胞的方法，包括如下步骤。
步骤1、获取TRAIL融合蛋白（monoTRAIL 、trimTRAIL、Arg1-trimTRAIL）；其中，TRAIL融合蛋白的制备方法与实施例1相同。
步骤2、所述融合蛋白与辅助质粒混合培养，转染巨噬细胞；其中，转染的方式包括病毒转染、脂质体转染、电转移转染、基因编辑转染和mRNA转染。
慢病毒具体步骤如下：步骤1、293T细胞密度接近90%左右时进行传代，加入37℃预热的胰酶进行消化，将消化离心混匀后的细胞种于六孔板中。将细胞置于含5％CO2的37℃温箱中孵育24h，当细胞贴壁后所占面积达到六孔板总面积的50％以上时转染慢病毒质粒。步骤2、取两个无菌1.5ml EP管，分别加入150µl OPTI-MEM reduced serum medium（Thermo公司，货号：31985062）或无血清DMEM（corning公司，货号：10-013-CVRC），其中A管内加入病毒载体表达质粒pCDH（2µg）和病毒包装质粒pMD2.G（0.5µg）和psPAX2（1.5µg）；B管中加入10µl lipo2000转染试剂（Thermo公司，货号：11668019）。步骤3、然后将A管加入到B管中充分混匀，静置5-10min。步骤4、将静置好的转染复合物（A+B）缓缓滴加到293T细胞中。步骤5、做好标记，记好转染时间、转染质粒。步骤6、转染后的第24h，收集细胞上清并暂存-80℃冰箱，给细胞更换新的含10% FBS 的DMEM完全培养基。步骤7、转染后的第48h，再次收集细胞上清。步骤8、将24h和48h收集的上清离心（5000g，离心5min，4℃），去除细胞碎片和杂质，在注射器内混合，过0.45µm滤网。收集后的病毒上清可以用来进行感染和分装储存。步骤9、慢病毒滴度测定：第一天，以1×105 /mL接种293T细胞于96孔培养板，100μL/孔，37℃，5％CO2培养， 培养液为含10％胎牛血清的DMEM。第二天，弃50μL/孔培养上清，补加50μL/孔新鲜上述培养液，并含终浓度为6μg/mL的polybrene，37℃，5％CO2孵育30min。加10μL/孔的病毒原液或1μ L/孔的病毒浓缩液，5倍稀释，4个梯度，两个复孔，37℃，5％CO2培养。感染48h后，流式细胞仪检测eGFP，以阳性率为5～20％的细胞数为宜，计算滴度(U/mL)＝阳性率×稀释倍数× 100×104。
具体的，将获取的慢病毒颗粒转染至巨噬细胞RAW264.7，24h后加入Puro筛选被病毒转染的巨噬细胞，该巨噬细胞细胞可以表达TRAIL蛋白。ELISA检测基因修饰巨噬细胞表达TRAIL。采用TRAIL ELISA检测试剂盒检测实施例2得到的细胞上清液中TRAIL的含量。通过ELISA检测试剂盒检测融合蛋白中TRAIL的表达情况，结果发现：三种基因修饰MSC均可以高表达TRAIL蛋白，表达量无显著差异(P>0.05)。
收集6、12、24 h后的细胞培养基，在4℃下3000 rpm离心10 min，得到Raw264.7条件培养基(CM)。为了分析不同条件下巨噬细胞对4T1细胞的影响，将4T1细胞洗净，用新鲜培养基或CM培养24 h。进行如下分析实验。
1、细胞计数Kit-8分析(CCK-8)。
将4T1细胞与含不同TRAIL版本的巨噬细胞及对照细胞不同条件培养基共培养24h，将4T1 (2×103)接种到96孔板(康宁)。然后，每孔按指定时间加入CCK-8 (Beyotime,Jiangsu, China)溶液10 μl。37°C孵育1小时后，使用多功能酶标仪Synergy4;BioTek,Winooski, VT，USA)。
2、免疫印迹(WB)。
根据试剂盒说明书(Sigma Aldrich, R0278,St.)提取组织蛋白。使用BCA试剂盒(Beyotime Biotechnology, P0010S, Beijing, China)对蛋白浓度进行常规定量。每个样品在30 μg SDS-PAGE下进行分析，然后半干转移到PVDF膜上。用TBST制备的5% 脱脂乳在室温下封闭1小时后，在4℃与预稀释的一抗孵育过夜。然后洗膜，室温下二抗孵育1小时。所有抗体的稀释比例如下：Myc-Tag(1:500, CST, #2276, Boston, USA), GAPDH(1:500, CST,#97166, Boston, USA)。
3、酶联免疫吸附试验(ELISA)。
根据制造商说明书(R&D Systems,Emoriville, California, USA)，采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定细胞中小鼠TRAIL/TNFSF10 (DY1121)的水平。OD值由MicroplateReader (Multiskan Spectrum, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA)测量。
4、流式细胞术。
流式细胞术检测受刺激细胞的表面标志物。简单地说，THP-1RAW264.7细胞在刺激24小时后从6孔板上收集，用PBS洗涤三次。将分别含有1×106 M1极化或M2极化细胞的细胞悬液分成1.5 ml EP管，用以下抗体(PE抗人鼠CD86和APC抗人鼠CD206，Biolegend)在冰上黑暗中孵育30分钟。洗涤两次后，细胞悬浮于含3%胎牛血清的500 μl PBS中，流式细胞仪检测(BD Biosciences, San Diego, CA, USA)。
5、Annexin V/PI双染色检测细胞凋亡。
根据试剂盒说明书，使用Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒(560931，BD，UnitedStates)检测细胞凋亡率。将raw264.7细胞接种于6孔板(5×105/well)中，收集并重悬于结合缓冲液中，室温下与5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI共孵育20 min。1小时内用流式细胞仪(BD Biosciences, San Diego, CA, USA)对细胞进行分析，并用FlowJo 10.4.2软件(BDBiosciences)对数据进行分析。
6、组织病理学分析。
采用苏木精和伊红(H&E)染色法观察肿瘤组织的组织化学变化。小鼠组织置于10%多聚甲醛缓冲液中固定24h，梯度酒精脱水，石蜡包埋。石蜡切片切成5μm厚切片，37℃培养箱干燥。在二甲苯脱蜡后，根据制造商的说明对载玻片进行H&E染色试剂盒。
7、免疫组化(IHC)和免疫荧光(IF)染色。
组织切片厚度为5μm。连续切片置于载玻片上，37℃培养箱中干燥。切片用二甲苯脱蜡后，分别在50%、70%和80%乙醇中浸泡2min，在伊红中浸泡5s。然后对标本进行常规脱水、透明化和固定。切片用水冲洗，然后进行抗原热修复，用TRAIL (1:500, Abcam,ab231063)孵育，然后用二次免疫球蛋白G偶联适当的生物素(1:10 00，Affinity，#S0001)孵育。苏木精染色5min，自来水冲洗3min，1%盐酸冲洗2s，自来水冲洗2min，梯度脱水密封。如果染色，标本覆盖荧光标记抗体(iNOS, 1:500, Abcam, ab178945;F4/80, 1:500,Abcam, ab60343)，置于湿盒中保存30min。二级荧光免疫球蛋白G取自Abmart (1:1000，M21014S，shanghai，China）。对共染色切片进行检查，用Nikon Nikon Eclipse90i荧光显微镜拍摄图像。
7、TUNEL分析。
采用TUNEL (转移酶dUTP缺口末端标记法)对DNA片段进行分析。脱蜡后，样品用分级乙醇复水，在含4%甲醛的PBS中浸泡20分钟。采用原位凋亡检测、TUNEL分析和Alexafluor 488 (c10617; Thermo Fisher)染色。细胞核染色，用向量机安装培养基(h-1400;vector laboratories, California, USA)。Ki-67作为红色荧光增殖标记物。TUNEL阳性细胞产生绿色荧光。免疫荧光图像使用荧光显微镜(Olympus)获得。
8、统计分析。
所有统计分析均使用GraphPad Prism 8.0 (GraphPad Inc, La Jolla, CA,USA)进行。对于可测数据，连续变量用均数±标准差(x±s)表示，组间比较采用单因素方差分析。两两比较采用Tukey检验。各组间数据比较采用方差分析和Mann Whitney U检验。对于所有检验，双尾P值小于0.05被认为具有统计学意义。
9、实验结果。
（1）TRAIL-cM和Tri-TRAIL-cM的特征。
为了增强TRAIL的功能，使用人类α1(I)胶原C前肽(Trimer-Tag)与成熟的人类TRAIL的C端进行融合，生成二硫键连接的同三聚体。与monoTRAIL相比，Tri-trail在体内表现出更有利的药代动力学和药效学特征，同时保持良性的安全性特征。
分别构建了分泌天然TRAIL和三聚体TRAIL(TRAIL-cM和Tri-TRAIL-cM)的RAW264.7细胞，如图4A所示。通过Western blot对这两株细胞系进行TRAIL蛋白分泌的鉴定，如图4B所示。进一步定量分泌的TRAIL蛋白，ELISA结果显示细胞上清中TRAIL的浓度与培养时间呈正相关。流式细胞术检测分泌TRAIL对raw264.7的自体毒性，未观察到对药物载体细胞的杀伤作用。研究了工程巨噬细胞的极化，很明显与非工程巨噬细胞相比用流式细胞仪检测构建细胞的极化表型。
（2）TRAIL-cM和Tri-TRAIL-cM的体外抗肿瘤作用。
分别于6、12、24h用CCK8和活细胞染色检测TRAIL-cM/ tril -TRAIL-cM和empty-cM对4T1的抗肿瘤作用如图5A和5B所示。在共培养实验中收集上清液，与empty-cM组相比，工程巨噬细胞具有更好的抗肿瘤活性。其中，Tri-TRAIL-cM的抗肿瘤作用最强。收集共培养的4T1，分别用Western blot和Annexin V/PI双染色法检测caspase 3/caspase9蛋白水平。在Tri-TRAIL-cM上清的作用下，4T1的凋亡信号最为明显。结果三聚体TRAIL-cM上清具有较强的体外杀伤肿瘤细胞的能力。
（3）Tri-TRAIL-iM的特征。
为了避免非特异性杀伤和增强Tri-TRAIL-M的抗肿瘤特异性，利用受体内肿瘤微环境调控的诱导型启动子。Arg1能够对肿瘤环境中高表达的IL-10和IL-4产生高表达。将组成型表达 Tri-TRAIL-cM的CMV 启动子替换为Arg1启动子，并产生了肿瘤环境诱导的巨噬细胞Tri-TRAIL-iM的分泌，如图6A所示。在正常条件下，Tri -TRAIL-iM只分泌低剂量的TRAIL，而Tri -TRAIL-iM与4T1共培养后分泌了大量TRAIL蛋白如图6B所示，说明4T1存在时，Arg1启动子对致癌刺激有良好的反应。然后观察TRAIL的诱导分泌，与4T1共培养，发现只有在4T1细胞的刺激下，RAW264.7细胞才能高表达TRAIL蛋白，如图6C所示。进一步验证了Tri-TRAIL-iM在体内的诱导表达。
（4）Tri-TRAIL-iM在小鼠肿瘤模型中的体内抗肿瘤作用。
评估了Tri-TRAIL-iM在皮下荷瘤小鼠中的抗肿瘤作用，如图7A所示。PBS组、empty-cM组、TRAIL-cM组和Tri-TRAIL-iM组的肿瘤体积分别为PBS组的96.77%、87.5%和74.23%。PBS组与empty-cM组的肿瘤体积无显著差异，说明RAW 264.7的抗肿瘤作用有限。TRAIL-cM对肿瘤的杀伤作用较弱，Tri-TRAIL-iM能够显著减小肿瘤体积如图7B和7C所示。各组小鼠的体重均无明显变化，如图7D所示。在Tri-TRAIL-iM组中TRAIL表达更多，如图7E所示。与PBS、empty-cM组相比，肿瘤细胞凋亡更强，增殖能力更弱，如图8A所示， TRAIL-cM组和Tri-TRAIL-iM组分别有更多的促炎巨噬细胞如图8B所示。
由于巨噬细胞或单核细胞对缺氧的趋向性和向实体瘤内迁移和渗透的能力，巨噬细胞或单核细胞已被探索为抗癌药物和显像剂的潜在载体。纳米凝胶包裹的光敏剂对小鼠RAW264.7和人THP-1巨噬细胞的光毒性以及在抗原诱导的小鼠关节炎模型中的关节滞留作用优于游离剂。在此基础上，设计了能够分泌TRAIL的巨噬细胞的药物载体，同时比较了分泌天然单、三聚TRAIL的细胞药物的抗肿瘤活性以及对自身巨噬细胞表型分化的影响，发现分泌Tri-TRAIL-cM的三聚TRAIL更有利。
巨噬细胞是大多数实体瘤的主要免疫细胞。在小鼠中，肿瘤相关的M2极化的特点是，涉及培养免疫抑制微环境的基因上调。肿瘤微环境(TME)的特征是酸中毒、缺氧、IL-4和IL-13浓度升高以及肿瘤来源的细胞因子。M2标记Ym1、FIZZ1、Mrc1和Arg1的表达随时间的增加已在被报道。在暴露于肿瘤条件培养基(TCM)后，BMDM和RAW264.7巨噬细胞也上调Arg1至的600倍。这种作用可能是由肿瘤来源的细胞因子和代谢中间体，包括乳酸介导的。在此基础上，构建了Tri-Trail-iM，Arg1启动子启动了Tri-Trail的分泌。Tri-TRAIL-iM的TRAIL分泌量与培养时间成正比，在非诱导条件下，TRAIL分泌量保持在非常低的基线水平，如图6B-6C所示。
在小鼠中，Tri-TRAIL-iM检测到的TRAIL主要是在肿瘤部位分泌的，而在健康小鼠中几乎检测不到TRAIL的分泌。同时，在荷瘤小鼠中，Tri-TRAIL-iM表现出较好的抗肿瘤作用。这些结果表明Tri-TRAIL-iM有更好的安全性，同时对抗肿瘤如图7A-7E所示。此外由于TRAIL在肿瘤局部的高表达，进一步将TAMs转化为炎性细胞，可以拮抗自然发生的肿瘤浸润细胞类型的促肿瘤活性，如图8 B所示。
当巨噬细胞局部注入肿瘤组织时，Tri-TRAIL具有促进凋亡的作用，以控制实体肿瘤的生长。因此，这种肿瘤环境诱导药物分泌细胞，这可能值得进一步的研究，作为细胞治疗的潜在候选人，可以结合治疗，如CAR -工程细胞，提供更好的安全性和有效性。
序列表
<110> 鲲石生物科技（深圳）有限公司
<120> 分泌TRAIL的工程化巨噬细胞及其应用
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 8930
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg 60
tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg taggtatctc 120
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gtacagtgca ggggaaagaa tagtagacat aatagcaaca gacatacaaa ctaaagaatt 4020
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agccagcttc tttggagcct ttttaataaa cttaattaag agcagaaact tatatcagag 5100
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caacgggttt gccgccagaa cacagctgaa gcttcgaggg gctcgcatct ctccttcacg 5400
cgcccgccgc cctacctgag gccgccatcc acgccggttg agtcgcgttc tgccgcctcc 5460
cgcctgtggt gcctcctgaa ctgcgtccgc cgtctaggta agtttaaagc tcaggtcgag 5520
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ttgcctgacc ctgcttgctc aactctacgt ctttgtttcg ttttctgttc tgcgccgtta 5640
cagatccaag ctgtgaccgg cgcctacgct agacgccacc atggagagcg acgagagcgg 5700
cctgcccgcc atggagatcg agtgccgcat caccggcacc ctgaacggcg tggagttcga 5760
gctggtgggc ggcggagagg gcacccccaa gcagggccgc atgaccaaca agatgaagag 5820
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cggcggctac accaacaccc gcatcgagaa gtacgaggac ggcggcgtgc tgcacgtgag 6000
cttcagctac cgctacgagg ccggccgcgt gatcggcgac ttcaaggtgg tgggcaccgg 6060
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gcacctgcac cccatgggcg ataacgtgct ggtgggcagc ttcgcccgca ccttcagcct 6180
gcgcgacggc ggctactaca gcttcgtggt ggacagccac atgcacttca agagcgccat 6240
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gcacagcaac accgagctgg gcatcgtgga gtaccagcac gccttcaaga cccccatcgc 6360
cttcgccaga tcccgcgctc agtcgtccaa ttctgccgtg gacggcaccg ccggacccgg 6420
ctccaccgga tctcgcgagg gcagaggaag tcttctaaca tgcggtgacg tggaggagaa 6480
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cacgccggag agcgtcgaag cgggggcggt gttcgccgag atcggcccgc gcatggccga 6780
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cgtcaccgcc gacgtcgagg tgcccgaagg accgcgcacc tggtgcatga cccgcaagcc 7080
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agtgtggaaa atctctagca gtggcgcccg aacagggact tgaaagcgaa agggaaacca 2580
gaggagctct ctcgacgcag gactcggctt gctgaagcgc gcacggcaag aggcgagggg 2640
cggcgactgg tgagtacgcc aaaaattttg actagcggag gctagaagga gagagatggg 2700
tgcgagagcg tcagtattaa gcgggggaga attagatcgc gatgggaaaa aattcggtta 2760
aggccagggg gaaagaaaaa atataaatta aaacatatag tatgggcaag cagggagcta 2820
gaacgattcg cagttaatcc tggcctgtta gaaacatcag aaggctgtag acaaatactg 2880
ggacagctac aaccatccct tcagacagga tcagaagaac ttagatcatt atataataca 2940
gtagcaaccc tctattgtgt gcatcaaagg atagagataa aagacaccaa ggaagcttta 3000
gacaagatag aggaagagca aaacaaaagt aagaccaccg cacagcaagc ggccactgat 3060
cttcagacct ggaggaggag atatgaggga caattggaga agtgaattat ataaatataa 3120
agtagtaaaa attgaaccat taggagtagc acccaccaag gcaaagagaa gagtggtgca 3180
gagagaaaaa agagcagtgg gaataggagc tttgttcctt gggttcttgg gagcagcagg 3240
aagcactatg ggcgcagcgt caatgacgct gacggtacag gccagacaat tattgtctgg 3300
tatagtgcag cagcagaaca atttgctgag ggctattgag gcgcaacagc atctgttgca 3360
actcacagtc tggggcatca agcagctcca ggcaagaatc ctggctgtgg aaagatacct 3420
aaaggatcaa cagctcctgg ggatttgggg ttgctctgga aaactcattt gcaccactgc 3480
tgtgccttgg aatgctagtt ggagtaataa atctctggaa cagatttgga atcacacgac 3540
ctggatggag tgggacagag aaattaacaa ttacacaagc ttaatacact ccttaattga 3600
agaatcgcaa aaccagcaag aaaagaatga acaagaatta ttggaattag ataaatgggc 3660
aagtttgtgg aattggttta acataacaaa ttggctgtgg tatataaaat tattcataat 3720
gatagtagga ggcttggtag gtttaagaat agtttttgct gtactttcta tagtgaatag 3780
agttaggcag ggatattcac cattatcgtt tcagacccac ctcccaaccc cgaggggacc 3840
cgacaggccc gaaggaatag aagaagaagg tggagagaga gacagagaca gatccattcg 3900
attagtgaac ggatctcgac ggtatcggtt aacttttaaa agaaaagggg ggattggggg 3960
gtacagtgca ggggaaagaa tagtagacat aatagcaaca gacatacaaa ctaaagaatt 4020
acaaaaacaa attacaaaat tcaaaatttt atcgatacta gttgaaagac cccacctgta 4080
gacgcgtaga ttgccaggaa tataccagac actggagcta ggtaaaggcc tcctgtacac 4140
ccatacaagg agcgcttctc tgccttcaaa tatcaacaag ttttaaatcc ccagtgtgta 4200
gtacagagca ggctgggtgg atttgaggtc tgtgttctta ggaattgaac ctttaaagcg 4260
cagtatacat tctctacgct aaggaaagac ttgggctggg aaaagtgggc tctgccaaga 4320
ctcaggccga tgacctcgtc ccctccagag cagtgggtct caagcttcct aactctccaa 4380
ccttttaata cagttcttat gttgcagtgg ccccaatcat caaattgttt tgttgttaca 4440
gcataactat aattttccta gttataaagc atactgtaaa caactgtgtt ttctgatggt 4500
tttagggtaa ccgctgtgaa aggatctatc agccccaaaa ggaattggga tccacaggtt 4560
aagaaccagt gccttagatg ttctgaggcc acagctttgg agattgaaaa gacagtcctt 4620
tgtgaagact agaatcttag gccaaggtgc ttgctgccaa gcctgacacc ccagtctgac 4680
tctcagaacc catacagcaa ggagaacctc ctcagggcca tggtatgtgt ttcccaacac 4740
ggacacacac acaatcacac agagtaaagg gttttttaat taagcaagaa atacagttta 4800
cacatatgtc tgcataaggt cacggagggt ggtagccgac gagagaccag ctcatcttca 4860
ataaggaagt cagagagcag aaggctttgt cagcagggca agactatact ttgttaggaa 4920
gtgaggcatt gttcagactt ccttatgctt tcttatgaac aggctgtatt agccaacagt 4980
cctgtctgta cgtgagttgt gccactttgg gttgagggtg ctgggctaac acagatctta 5040
gttaagcatt tccttgtcct ttgattcctc aatgacccag aacaggcaaa caatacgata 5100
cttatgtttg atgaattaga tgactgcatc tacaactgaa cttgtgcact gagttctgga 5160
tggtcgcctg aaggagaacg cagggaggca ggcgatactt taataggact gactgtgagg 5220
gtaaatcggt gtcatacatg gaaccgtcgt gtgtatggag atacccagaa caataaagac 5280
ccaagaaaaa cagatagtca agaaatcatg agttttactt aatcagggcg ttttgatcag 5340
tcagtccaat gatgccaatg atgaaaagtc accctcaaac tgcccgaggg aagactttca 5400
ggaaaagccc tggtgataaa gtttaacagc aaatacctat gaatgaatgt ataaagctag 5460
taacggccgt agcactgttt tcaaaacgta gtcaccggct cactctacat ttgcgagacc 5520
ccgacagaag taaatgtaag gtcaagcgat tttgaaaaag aggagcacca gttcctttcc 5580
tgcagctcta acgtcctacc aatggggctg catggactgg tgcagccaca ggtgatgagc 5640
ccagagcata gaggaaactg gaagatggag cagcgtatcg tttataacag caacttggca 5700
tctgatggag atagctcagt ggtaacgtgg ggagtctgtc catttggtgc tggtggggaa 5760
actgggagag acaaagggga aatggaggat ttaaacaaaa tacaaaaaaa aaaaatggac 5820
gcaacagtca gcaatcactg tgaatagcaa attcttcatg catccaagac ttaagcccag 5880
catctttcag gcaggaaaac aatctacccc tgaatggcat ttttcttctt ttctttttac 5940
ctttggggca ggttctgtgt tgacctttga actaacccta taaccccagc aggtgttgaa 6000
cctataatcc ccctgcctca tcctctcaaa tagctggaat ttgtgggcca gcaccaagag 6060
gcccaaagaa agagaaagtt taaattaaat agaagaaaat gtagaggtat tgataggtgg 6120
tggtatcaca cacctttaat cccagcactc aggaggcagt gacagattgc tatctgtgag 6180
ttcaaggtta ggctggtcta tagggctagt tctagggtag ccagagccac acaaagaaaa 6240
catgtctcca aaaagcaaac aaaaatgtag aggtgcacat ttgggatctg ggagcaggta 6300
aaacttaaat tcctagctag cttcaaatat ataggaaaat tctatcttac ataaatcaat 6360
tttttaaaaa aatctataac cgtatatcag aaaaacatag taagatgaaa aatatatttg 6420
aaaaggaggt accaaaatgg tcctgaggga ctttggcttc ttgatttatt cattcaataa 6480
atgcaataca tttattcagt caataagtca atgtttattt tgtattgaac gattctatgt 6540
actgatggta gagggaacag aatctttctt gaggtattaa aattctgggt gctttttgtc 6600
ctcacaaggt taaagaaatt tacttctgac atgtgggttt tctttttaaa attataatca 6660
tgtaactttg taactgggag aatacttggt tgtgtttctt ctaaattaat acttttaaaa 6720
atatttcttt agtgttgggg gtggctttac acagggaccg gaccacatca cccacgtgga 6780
ggtcagagat caacttggag gagttgactc tttccttgca ccaaatgggt tctgcgggtc 6840
aaactcgggt catcgggctt ggtgttaccg gctggcctct ctcatctgcc ctagatctca 6900
gggggccctg ctgacactct gctggtgtgt agattagaat cgcggcagct cggcgggtgc 6960
agaatgccca ttgctccgtt ttgattcttc tgcaacctgt atgtgactag caacctcacc 7020
aagctgcagt ctcttcctcg gcaaaacagc ataagaatga ttctcagtct gaagttagtt 7080
taaagaggaa acaggaaacg aaagaacatt aactagaata gcacttggca cacgacagac 7140
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gccttcctga aataataata ataataacaa caacaacaac aacaacaata taaaacaaaa 7320
accagcccca tgctttccta gacagtgtaa cctggtgaca catgaaatgt gtctcacttt 7380
ccccagaact tgaagccttg actcaggatg ctcaacagga gggaagtaag agacaccacc 7440
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ttatgaaatc acacataatt gtcaattgtc tgaggagaga ttaatgtcat ccagctggct 7620
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tctgatgggg aggttctgtt gactctgtca ttcttccatt cggtgggcgg agccagttgt 7740
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tgaattcccc agaggtggaa gacctcagaa agtggcagct cacattactg ggatcactcg 7980
gagaagcaac tcagctttaa ttccaatctc caaggatgga aagaccttag gccagaagat 8040
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tggagagctg gtcatcgagc aggagggcct gtattacatc tattcccaaa catacttccg 8160
atttcaggaa gctgaagacg cttccaagat ggtctcaaag gacaaggtga gaaccaaaca 8220
gctggtgcag tacatctaca agtacaccag ctatccggat cccatagtgc tcatgaagag 8280
cgccagaaac agctgttggt ccagagatgc cgagtacgga ctgtactcca tctatcaggg 8340
aggattgttc gagctaaaaa aaaatgacag gatttttgtt tctgtgacaa atgaacattt 8400
gatggacctg gatcaagaag ccagcttctt tggagccttt ttaataaact taattaacga 8460
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ccagcagatc gagaacatcc ggagcccaga gggcagccgc aagaaccccg cccgcacctg 8580
ccgtgacctc aagatgtgcc actctgactg gaagagtgga gagtactgga ttgaccccaa 8640
ccaaggctgc aacctggatg ccatcaaagt cttctgcaac atggagactg gtgagacctg 8700
cgtgtacccc actcagccca gtgtggccca gaagaactgg tacatcagca agaaccccaa 8760
ggacaagagg catgtctggt tcggcgagag catgaccgat ggattccagt tcgagtatgg 8820
cggccagggc tccgaccctg ccgatgtggc catccagctg accttcctgc gcctgatgtc 8880
caccgaggcc tcccagaaca tcacctacca ctgcaagaac agcgtggcct acatggacca 8940
gcagactggc aacctcaaga aggccctgct cctccagggc tccaacgaga tcgagatccg 9000
cgccgagggc aacagccgct tcacctacag cgtcactgtc gatggctgca cgagtcacac 9060
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cttggagcct acctagactc agccggctct ccacgctttg cctgaccctg cttgctcaac 9720
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attacaaaat ttgtgaaaga ttgactggta ttcttaacta tgttgctcct tttacgctat 11280
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tctcctcctt gtataaatcc tggttgctgt ctctttatga ggagttgtgg cccgttgtca 11400
ggcaacgtgg cgtggtgtgc actgtgtttg ctgacgcaac ccccactggt tggggcattg 11460
ccaccacctg tcagctcctt tccgggactt tcgctttccc cctccctatt gccacggcgg 11520
amctcatcgc sgcctgcctt gcccgctgct ggacaggggc tcggctgttg ggcactgaca 11580
attccgtggt gttgtcgggr awatcatcgt cctttcctkg gctgctcgcc tgtgttgcca 11640
cctggattct gcgcgggacg tccttctgct acgtcccttc ggccctcawt ccagcggacc 11700
ttccttcccg cggcctgctg ccggctctgc ggcctcttcc gcgtctccgc cttcgccctc 11760
agacgagtcg gatctccctt tgggccgcct ccccgcctgg tacctttaag accaatgact 11820
tacaaggcag ctgtagatct tagccacttt ttaaaagaaa aggggggact ggaagggcta 11880
attcactccc aacgaagata agatctgctt tttgcttgta ctgggtctct ctggttagac 11940
cagatctgag cctgggagct ctctggctaa ctagggaacc cactgcttaa gcctcaataa 12000
agcttgcctt gagtgcttca agtagtgtgt gcccgtctgt tgtgtgactc tggtaactag 12060
agatccctca gaccctttta gtcagtgtgg aaaatctcta gcagtagtag ttcatgtcat 12120
cttattattc agtatttata acttgcaaag aaatgaatat cagagagtga gaggaacttg 12180
tttattgcag cttataatgg ttacaaataa agcaatagca tcacaaattt cacaaataaa 12240
gcattttttt cactgcattc tagttgtggt ttgtccaaac tcatcaatgt atcttatcat 12300
gtctggctct agctatcccg cccctaactc cgcccatccc gcccctaact ccgcccagtt 12360
ccgcccattc tccgccccat ggctgactaa ttttttttat ttatgcagag gccgaggccg 12420
cctcggcctc tgagctattc cagaagtagt gaggaggctt ttttggaggc ctagactttt 12480
gcagagacca aattcgtaat catgtcatag ctgtttcctg tgtgaaattg ttatccgctc 12540
acaattccac acaacatacg agccggaagc ataaagtgta aagcctgggg tgcctaatga 12600
gtgagctaac tcacattaat tgcgttgcgc tcactgcccg ctttccagtc gggaaacctg 12660
tcgtgccagc tgcattaatg aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt gcgtattggg 12720
cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg 12780
gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga taacgcagga 12840
aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg 12900
gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag 12960
aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc 13020
gtgcgctctc ctgttccgac cctgccg 13047
<210> 4
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atggccctgc ctgttaccgc cctgttgctc cctcttgccc tgctgcttca cgccgctcgc 60
cct 63
<210> 5
<211> 522
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cccagaggtg gaagacctca gaaagtggca gctcacatta ctgggatcac tcggagaagc 60
aactcagctt taattccaat ctccaaggat ggaaagacct taggccagaa gattgaatcc 120
tgggagtcct ctcggaaagg gcattcattt ctcaaccacg tgctctttag gaatggagag 180
ctggtcatcg agcaggaggg cctgtattac atctattccc aaacatactt ccgatttcag 240
gaagctgaag acgcttccaa gatggtctca aaggacaagg tgagaaccaa acagctggtg 300
cagtacatct acaagtacac cagctatccg gatcccatag tgctcatgaa gagcgccaga 360
aacagctgtt ggtccagaga tgccgagtac ggactgtact ccatctatca gggaggattg 420
ttcgagctaa aaaaaaatga caggattttt gtttctgtga caaatgaaca tttgatggac 480
ctggatcaag aagccagctt ctttggagcc tttttaataa ac 522
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gagcagaaac ttatatcaga ggaagatctg 30
<210> 7
<211> 738
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gatgatgcca atgtggttcg tgaccgtgac ctcgaggtgg acaccaccct caagagcctg 60
agccagcaga tcgagaacat ccggagccca gagggcagcc gcaagaaccc cgcccgcacc 120
tgccgtgacc tcaagatgtg ccactctgac tggaagagtg gagagtactg gattgacccc 180
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tgcgtgtacc ccactcagcc cagtgtggcc cagaagaact ggtacatcag caagaacccc 300
aaggacaaga ggcatgtctg gttcggcgag agcatgaccg atggattcca gttcgagtat 360
ggcggccagg gctccgaccc tgccgatgtg gccatccagc tgaccttcct gcgcctgatg 420
tccaccgagg cctcccagaa catcacctac cactgcaaga acagcgtggc ctacatggac 480
cagcagactg gcaacctcaa gaaggccctg ctcctccagg gctccaacga gatcgagatc 540
cgcgccgagg gcaacagccg cttcacctac agcgtcactg tcgatggctg cacgagtcac 600
accggagcct ggggcaagac agtgattgaa tacaaaacca ccaagacctc ccgcctgccc 660
atcatcgatg tggccccctt ggacgttggt gccccagacc aggaatttgg cttcgacgtt 720
ggccctgtct gcttcctg 738
<210> 8
<211> 3698
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
agattgccag gaatatacca gacactggag ctaggtaaag gcctcctgta cacccataca 60
aggagcgctt ctctgccttc aaatatcaac aagttttaaa tccccagtgt gtagtacaga 120
gcaggctggg tggatttgag gtctgtgttc ttaggaattg aacctttaaa gcgcagtata 180
cattctctac gctaaggaaa gacttgggct gggaaaagtg ggctctgcca agactcaggc 240
cgatgacctc gtcccctcca gagcagtggg tctcaagctt cctaactctc caacctttta 300
atacagttct tatgttgcag tggccccaat catcaaattg ttttgttgtt acagcataac 360
tataattttc ctagttataa agcatactgt aaacaactgt gttttctgat ggttttaggg 420
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acccatacag caaggagaac ctcctcaggg ccatggtatg tgtttcccaa cacggacaca 600
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tcagcaatca ctgtgaatag caaattcttc atgcatccaa gacttaagcc cagcatcttt 1740
caggcaggaa aacaatctac ccctgaatgg catttttctt cttttctttt tacctttggg 1800
gcaggttctg tgttgacctt tgaactaacc ctataacccc agcaggtgtt gaacctataa 1860
tccccctgcc tcatcctctc aaatagctgg aatttgtggg ccagcaccaa gaggcccaaa 1920
gaaagagaaa gtttaaatta aatagaagaa aatgtagagg tattgatagg tggtggtatc 1980
acacaccttt aatcccagca ctcaggaggc agtgacagat tgctatctgt gagttcaagg 2040
ttaggctggt ctatagggct agttctaggg tagccagagc cacacaaaga aaacatgtct 2100
ccaaaaagca aacaaaaatg tagaggtgca catttgggat ctgggagcag gtaaaactta 2160
aattcctagc tagcttcaaa tatataggaa aattctatct tacataaatc aattttttaa 2220
aaaaatctat aaccgtatat cagaaaaaca tagtaagatg aaaaatatat ttgaaaagga 2280
ggtaccaaaa tggtcctgag ggactttggc ttcttgattt attcattcaa taaatgcaat 2340
acatttattc agtcaataag tcaatgttta ttttgtattg aacgattcta tgtactgatg 2400
gtagagggaa cagaatcttt cttgaggtat taaaattctg ggtgcttttt gtcctcacaa 2460
ggttaaagaa atttacttct gacatgtggg ttttcttttt aaaattataa tcatgtaact 2520
ttgtaactgg gagaatactt ggttgtgttt cttctaaatt aatactttta aaaatatttc 2580
tttagtgttg ggggtggctt tacacaggga ccggaccaca tcacccacgt ggaggtcaga 2640
gatcaacttg gaggagttga ctctttcctt gcaccaaatg ggttctgcgg gtcaaactcg 2700
ggtcatcggg cttggtgtta ccggctggcc tctctcatct gccctagatc tcagggggcc 2760
ctgctgacac tctgctggtg tgtagattag aatcgcggca gctcggcggg tgcagaatgc 2820
ccattgctcc gttttgattc ttctgcaacc tgtatgtgac tagcaacctc accaagctgc 2880
agtctcttcc tcggcaaaaa gcataagaat gattctcagt ctgaagttag tttaaagagg 2940
aaacaggaaa cgaaagaaca ttaactagaa tagcacttgg cacacgacag acaactcata 3000
ttagctagtt tgctttccct atcttgggat atcatgattc caaaaatgag attttcccgg 3060
agactgtatt tcaaaaatag aactgctttg ggttgtcagg gaaataaatg atgccttcct 3120
gaaataataa taataataac aacaacaaca acaacaacaa tataaaacaa aaaccagccc 3180
catgctttcc tagacagtgt aacctggtga cacatgaaat gtgtctcact ttccccagaa 3240
cttgaagcct tgactcagga tgctcaacag gagggaagta agagacacca ccccccaccc 3300
ccgcttgctg ttttagcctc accttgcaag tccccagtgg acttaaatct tggaaaaggt 3360
gagcaccctg ccctgaggtg cccaggccgg aagcctagca cttcacatga ggttatgaaa 3420
tcacacataa ttgtcaattg tctgaggaga gattaatgtc atccagctgg ctttttcaaa 3480
agggtgtgaa ctggacggat gaataatgct cagagggaag aatggtagtt cctctgatgg 3540
ggaggttctg ttgactctgt cattcttcca ttcggtgggc ggagccagtt gttggataaa 3600
cagatccaac ctgattataa ggggggaaaa agatgtgccc tctgtctttt agggttacgg 3660
ccggtggaga ggagctggac agcccgagca catgcagc 3698
<210> 9
<211> 1371
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
atggccctgc ctgttaccgc cctgttgctc cctcttgccc tgctgcttca cgccgctcgc 60
cctgaattcc ccagaggtgg aagacctcag aaagtggcag ctcacattac tgggatcact 120
cggagaagca actcagcttt aattccaatc tccaaggatg gaaagacctt aggccagaag 180
attgaatcct gggagtcctc tcggaaaggg cattcatttc tcaaccacgt gctctttagg 240
aatggagagc tggtcatcga gcaggagggc ctgtattaca tctattccca aacatacttc 300
cgatttcagg aagctgaaga cgcttccaag atggtctcaa aggacaaggt gagaaccaaa 360
cagctggtgc agtacatcta caagtacacc agctatccgg atcccatagt gctcatgaag 420
agcgccagaa acagctgttg gtccagagat gccgagtacg gactgtactc catctatcag 480
ggaggattgt tcgagctaaa aaaaaatgac aggatttttg tttctgtgac aaatgaacat 540
ttgatggacc tggatcaaga agccagcttc tttggagcct ttttaataaa cttaattaac 600
gatgatgcca atgtggttcg tgaccgtgac ctcgaggtgg acaccaccct caagagcctg 660
agccagcaga tcgagaacat ccggagccca gagggcagcc gcaagaaccc cgcccgcacc 720
tgccgtgacc tcaagatgtg ccactctgac tggaagagtg gagagtactg gattgacccc 780
aaccaaggct gcaacctgga tgccatcaaa gtcttctgca acatggagac tggtgagacc 840
tgcgtgtacc ccactcagcc cagtgtggcc cagaagaact ggtacatcag caagaacccc 900
aaggacaaga ggcatgtctg gttcggcgag agcatgaccg atggattcca gttcgagtat 960
ggcggccagg gctccgaccc tgccgatgtg gccatccagc tgaccttcct gcgcctgatg 1020
tccaccgagg cctcccagaa catcacctac cactgcaaga acagcgtggc ctacatggac 1080
cagcagactg gcaacctcaa gaaggccctg ctcctccagg gctccaacga gatcgagatc 1140
cgcgccgagg gcaacagccg cttcacctac agcgtcactg tcgatggctg cacgagtcac 1200
accggagcct ggggcaagac agtgattgaa tacaaaacca ccaagacctc ccgcctgccc 1260
atcatcgatg tggccccctt ggacgttggt gccccagacc aggaatttgg cttcgacgtt 1320
ggccctgtct gcttcctgga gcagaaactt atatcagagg aagatctgtg a 1371

Claims (15)

1.一种修饰巨噬细胞的TRAIL融合蛋白基因，其特征在于，所述TRAIL融合蛋白基因的核酸序列如SEQID NO:5和SEQID NO:9所示。
2.一种质粒，其特征在于，所述质粒具有如权利要求1所述的修饰巨噬细胞的TRAIL融合基因。
3.一种载体，其特征在于，所述载体具有如权利要求1所述的修饰巨噬细胞的TRAIL融合基因。
4.如权利要求3所述的载体，其特征在于，其核酸序列如SEQID NO:1- SEQID NO:3所示。
5.如权利要求3所述的载体，其特征在于，所述载体为慢病毒载体。
6.一种哺乳动物细胞，其特征在于，其基因组上整合了权利要求1所述的TRAIL融合蛋白基因或权利要求2所述的质粒或权利要求3-5任意所述的载体，并且可表达和分泌所述TRAIL蛋白或其片段。
7.如权利要求6所述的哺乳动物细胞，其特征在于，所述细胞为人、小鼠、大鼠、猪或猴的巨噬细胞。
8.一种分泌TRAIL的工程化巨噬细胞的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括如下步骤：
步骤1、获取如SEQID NO:5和SEQID NO:9所示的TRAIL融合蛋白；
步骤2、将步骤1中的所述TRAIL融合蛋白与辅助质粒混合培养，转染细胞；
步骤3、将转染的细胞转染至巨噬细胞中获取可表达TRAIL蛋白的巨噬细胞。
9.如所述利要求8所述的工程化巨噬细胞的制备方法，其特征在于，所述转染选自如下方式：病毒转染、脂质体转染、电转移转染、基因编辑转染和mRNA转染。
10.一种组合物，其特征在于，所述组合物含有权利要求1所述的TRAIL融合蛋白基因或权利要求2所述的质粒、权利要求3-5任意所述的载体、权利要求6或7所述的哺乳动物细胞、权利8或9制备方法制得的分泌TRAIL的工程化巨噬细胞。
11.权利要求1所述的TRAIL融合蛋白基因或权利要求2所述的质粒、权利要求3-5任意所述的载体、权利要求6或7所述的哺乳动物细胞、权利8或9制备方法制得的分泌TRAIL的工程化巨噬细胞或权利10所述的组合物在制备治疗肿瘤或者癌症产品中的应用。
12.如权利11所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤或者癌症为乳腺癌、黑色素瘤、结肠癌。
13.如权利11所述的应用，其特征在于，所述产品为药物。
14.如权利13所述的应用，其特征在于，所述药物含有药学上可用的载体或赋形剂。
15.如权利13所述的应用，其特征在于，所述药物为注射剂。
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