KR20230085912A - Cd14 프로모터를 갖는 재조합 아데노 관련 바이러스 벡터 및 이의 용도 - Google Patents

Cd14 프로모터를 갖는 재조합 아데노 관련 바이러스 벡터 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 개시내용은 CD14+ 세포에서 외인성 핵산 서열을 특이적으로 발현하는 rAAV 벡터 및 rAAV 비리온을 제공한다. rAAV 벡터 또는 비리온은, 예를 들어, 단핵구 및 수지상 세포에서 암 항원, 바이러스 항원, 및/또는 박테리아 항원을 인코딩하는 외인성 핵산 서열을 특이적으로 발현하는 데 유용하다. rAAV 형질도입된 CD14+ 세포는 항원 특이적 T 세포 반응을 유도하는 항원 제시 세포로서 사용될 수 있다. 본 개시내용은 rAAV 비리온을 생산하는 방법 및 면역요법의 방법을 추가로 제공한다.

Description

CD14 프로모터를 갖는 재조합 아데노 관련 바이러스 벡터 및 이의 용도
서열 목록에 관한 설명
이 출원과 연관된 서열 목록은 종이 사본 대신에 텍스트 형식으로 제공되며, 본 명세서에 참조로 포함된다. 서열 목록을 함유하는 텍스트 파일의 이름은 100239_401WO_SEQUENCE_LISTING.txt이다. 텍스트 파일은 7.6KB이며, 2021년 9월 15일 생성되었으며, EFS-Web을 통해 전자적으로 제출되고 있다.
배경
기술분야
본 발명은 분자 생물학, 면역학, 면역요법, 및 유전자 치료 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 CD14 프로모터 영역을 갖는 재조합 아데노 관련 바이러스 벡터 및 이의 실제 적용에 관한 것이다.
관련 기술의 설명
아데노-연관 바이러스(AAV) 유형 2 게놈은 길이가 약 4.7킬로베이스인 단일 가닥 데옥시리보핵산(ssDNA)으로 구성된다. AAV 게놈은 AAV DNA 가닥의 양 말단에서 역전된 말단 반복(inverted terminal repeat; ITR) 서열(145 염기), 및 2개의 개방 판독 프레임(ORF): rep 및 cap 유전자를 포함한다. AAV 게놈의 좌측에 p5, p19 및 p40 프로모터가 있고, 이로부터 길이가 상이한 2개의 중첩 mRNA가 생산될 수 있다.
AAV는 비-병원성 바이러스이므로, 유전자 치료 및 면역요법을 위한 바이러스 벡터로서 활용된다. AAV와 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV)는 체세포, 신경 세포, 혈구 등과 같은 다양한 인간 세포를 넓게 감염(형질도입)시키는 능력을 갖는다. rAAV는 폴리펩티드로 번역될 수 있는 외인성 RNA를 발현할 수 있다. rAAV의 이러한 감염성은 많은 질환에 대한 유전자 치료에서 이점을 갖는다. 그러나, rAAV 벡터는 일반적으로 AAV 프로모터, CMV 프로모터, SV40 조기 프로모터 및 기타와 같은 구성적 프로모터를 함유하고, 이는 모든 또는 많은 조직에서 유전자의 발현을 용이하게 할 수 있다. 구성적 프로모터를 갖는 rAAV는 비표적 세포를 감염시키고 비표적 세포에서 외인성 유전자의 생성물을 발현시킴으로써 바람직하지 않은 표적외 효과를 생산할 수 있다. 따라서, 임상 치료에서, 구성적 프로모터를 갖는 rAAV는 독성 효과의 잠재적 위험을 포함하여 치료 목적과 관련되지 않는 불리한 반응 또는 부작용을 초래할 수 있다. 따라서, 당업계에서는 안전성, 정확성 및 치료 효능이 개선된 rAAV 벡터가 필요하다.
간략한 요약
본 개시내용은 2개의 역전된 말단 반복(ITR) 서열을 인코딩(encoding)하는 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 벡터 및 외인성 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 CD14 프로모터를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공하고, 여기서 CD14 프로모터는 CD14-발현 세포에서 특이적으로 외인성 핵산의 발현을 유도한다. 일부 구현예에서, CD14 프로모터는 인간 CD14 프로모터 서열이다. 일부 구현예에서, CD14 프로모터는 서열번호 1을 포함한다. 일부 구현예에서, CD14 프로모터는 서열번호 1의 위치 378-386, 위치 404-410 및 위치 533-538에 적어도 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, CD14-발현 세포는 단핵구, 대식세포, 또는 수지상 세포(dendritic cell)이다. 일부 구현예에서, rAAV 벡터는 5' 내지 3' 방향으로 제1 ITR, 외인성 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 CD14 프로모터, 폴리아데닐화 신호 서열, 및 제2 ITR을 포함한다. 일부 구현예에서, 외인성 핵산 서열은 다중 클로닝 부위(multiple cloning site; MCS), 제한 효소 표적 서열, 및/또는 폴리펩티드를 인코딩하는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드를 인코딩하는 서열은 종양 항원, 종양 관련 항원, 종양 유전자 생성물, 바이러스 항원, 박테리아 항원, 사이토카인, 또는 이들의 임의의 조합 모두 또는 일부를 인코딩한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 2개의 ITR 서열 및 외인성 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 CD14 프로모터를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 rAAV 비리온(virion)을 제공하고, 여기서 CD14 프로모터는 CD14-발현 세포에서 특이적으로 외인성 핵산의 발현을 유도한다. 일부 구현예에서, rAAV 비리온은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, 또는 이들의 임의의 조합의 캡시드 단백질을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 rAAV 벡터를 패키징 세포(packaging cell)에 도입하는 단계를 포함하는, rAAV 비리온을 생산하는 방법을 제공하고, 여기서 패키징 세포는 헬퍼 유전자(helper gene)를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 헬퍼 유전자는 AAV Rep 및 Cap 유전자와 아데노바이러스 VA, E2A, E3 및 E4 유전자를 포함한다. 일부 구현예에서, rAAV 비리온을 생산하는 방법은 본원에 개시된 rAAV 벡터와 함께 패키징 세포로 헬퍼 유전자를 공동 형질감염(co-transfecting)시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 패키징 세포는 HEK 293, HeLa 또는 HT1080 세포이다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 rAAV 벡터 중 어느 하나를 포함하는 단리된 세포의 집단(population)을 제공한다. 일부 구현예에서, 세포는 CD14를 발현한다. 일부 구현예에서, 세포는 단핵구, 수지상 세포, 또는 대식세포이다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 단리된 rAAV 형질도입된 CD14+ 세포를 포함하는 약제학적 조성물을 제공하고, 여기서 세포는 외인성 핵산 서열에 의해 인코딩된 폴리펩티드에 대한 항원 특이적 면역 반응을 생성하기 위해 T 세포를 활성화하는 데 효과적이다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 종양 항원, 종양 관련 항원, 종양 유전자 생성물, 바이러스 항원, 또는 박테리아 항원이다. 일부 구현예에서, 세포는 단핵구, 수지상 세포, 또는 대식세포이다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 외인성 핵산 서열에 의해 인코딩된 폴리펩티드를 발현하는 세포를 표적화하는 항원 특이적 T 세포를 포함하는 약제학적 조성물을 제공하고, 여기서 T 세포는 본원에 개시된 rAAV 형질도입된 CD14+ 세포 중 어느 하나의 세포에 의해 활성화되어 있다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 포함하는 약제학적 조성물을 제공하고, 여기서 PBMC는 본원에 개시된 rAAV 형질도입된 CD14+ 세포에 의해 활성화되어 있는 항원 특이적 T 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 단리된 세포의 집단 또는 본원에 개시된 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체(subject)에게 투여하여 면역 반응을 자극하는 단계를 포함하는 면역요법의 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 대상체는 인간이다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 a. 대상체의 PBMC를 본원에 개시된 rAAV 비리온으로 감염시켜 감염된 PBMC를 생성하는 단계, b. 감염된 PBMC의 단핵구를 수지상 세포(DC)로 분화(differentiating)시키기 위한 분화성 사이토카인을 첨가하는 단계, c. 감염된 PBMC의 세포독성 T 림프구(CTL)를 활성화시키는 활성화 사이토카인을 첨가하여 활성화된 CTL을 생성하는 단계, d. 임의로, 감염된 PBMC로부터 활성화된 CTL을 단리시키는 단계, 및 e. 활성화된 CTL 또는 단리되고 활성화된 CTL을 포함하는 감염된 PMBC의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 면역요법의 방법을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 i) CD14+ 세포를 제공하는 단계; ii) 폴리펩티드를 인코딩하는 서열을 발현하기에 충분한 본원에 개시된 rAAV 비리온과 CD14+ 세포를 접촉시키는 단계; 및 iii) 단계 ii)의 CD14+ 세포를 폴리펩티드를 발현시키기에 충분한 시간 동안 배양하는 단계를 포함하는, 변형된 항원 제시 세포(APC)를 생산하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, CD14+ 세포는 단핵구 또는 수지상 세포이다. 일부 구현예에서, 단핵구는 PBMC의 집단에 존재한다. 일부 구현예에서, 단핵구는 단리된 단핵구이다. 일부 구현예에서, 단핵구는 수지상 세포로 추가로 분화된다. 일부 구현예에서, 단핵구는 단핵구와 외인성 사이토카인을 접촉시킴으로써 수지상 세포로 분화된다. 일부 구현예에서, 외인성 사이토카인은 GM-CSF, IL-4, TNF-α, 또는 이들의 임의의 조합이다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 i) 나이브(
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) T 세포를 제공하는 단계; ii) 나이브 T 세포를 본원에 개시된 생성된 변형된 APC와 접촉시키는 단계; 및 iii) 단계 ii)의 T 세포를 활성화 사이토카인을 접촉시키는 단계를 포함하는, 항원 특이적 T 세포를 생산하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 활성화 사이토카인은 IL-2, IL-7, 또는 이들 둘 모두이다. 일부 구현예에서, 항원 특이적 T 세포는 CD4- T 세포 또는 CD8+ T 세포이다.
본 개시내용의 일부 구현예는 예로서 예시되고, 첨부된 도면에 의해 제한되지 않는다:
도 1은 외인성 유전자를 발현하기 위한 예시적인 AAV/인간 CD14 프로모터 벡터(예시적인 pAAV-CD14p)의 개략도를 도시한다.
도 2는 인간 CD14 프로모터 DNA가 고충실도 PCR에 의해 증폭된 후의 겔 전기영동 결과를 도시한다.
도 3은 SV40 후기 폴리-A DNA가 고충실도 PCR에 의해 증폭된 후의 겔 전기 영동 결과를 도시한다.
도 4는 예시적인 pAAV-CD14p 플라스미드가 제한 엔도뉴클레아제로 소화된 후의 겔 전기영동 결과를 도시한다.
도 5는 참조 야생형 서열(GenBank 수탁 번호 HQ199230.1)과 비교하여 예시적인 pAAV-CD14p 플라스미드에서 인간 CD14 프로모터 DNA(서열번호 1)의 서열의 정렬을 도시한다.
도 6은 감염성 바이러스 입자를 제조하는 예시적인 방법의 개략도를 도시한다.
도 7a는 전립선 특이적 항원(PSA)또는 전립선 특이적 막 항원(PSMA)을 발현하는 rAAV-CD14p/외인성 유전자 바이러스의 rAAV 바이러스 역가(카피/ml)를 도시한다. 도 7b는 IL-4 또는 IL-12를 발현하는 rAAV-CD14p/외인성 유전자 바이러스의 rAAV 바이러스 역가를 도시한다.
도 8a는 말초 혈액 림프구, 단핵구, 및 수지상 세포에서 CD14 프로모터 구동 발현 강화된 녹색 형광 단백질(eGFP)을 도시한다. 도 8b는 HEK 293 세포에서 CD14 프로모터 구동 eGFP 발현의 결여를 도시한다.
도 9는 세포 배양 3일째에 rAAV-CD14p/항원 rAAV에 의해 형질도입된 단핵구 및 수지상 세포(DC)에서 발현된 항원의 유세포 분석 검출 결과를 도시한다. PAP: 전립선 산 포스파타제 항원; CEA: 암배아 항원, CK19: 사이토케라틴 19 항원; MAGE-A3: 흑색종 항원 패밀리 A3 항원; Muc-1: 뮤신 1 항원.
도 10은 세포 배양 5일째에 각각의 rAAV-CD14p/사이토카인 rAAV에 의해 형질도입된 DC에서 유세포 분석 검출 사이토카인의 결과를 도시한다. GM-CSF: 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자.
도 11은 rAAV-CD14p/항원 rAAV로 형질도입된 DC 세포의 CD1a, CD40, CD80 및 CD86 마커의 유세포 분석 검출 결과를 도시한다. SP17: 정자 단백질 17.
도 12는 rAAV-형질도입된 DC의 IL-12 및 IL-10 발현 수준의 유세포 분석 검출의 비교를 도시한다. PSCA: 전립선 줄기 세포 항원; HPV 16 E6-E7: 인간 유두종 바이러스 유형 16 E6 및 E7 항원.
도 13은 DC 배양 6일째에 잔류하는 단핵구 수의 유세포 분석 검출 결과를 도시한다. SCC: 편평 세포 암종 항원; NY-ESO-1: 뉴욕 식도 편평 세포 암종-1 항원.
도 14는 각각 rAAV-CMVp/항원 rAAV-형질도입된 DC와 비교하여 rAAV-CD14p/항원 rAAV-형질도입된 DC에 의해 프라이밍된 T 림프구의 IFN-γ 발현 수준을 도시한다. HPV18 E6-E7: 인간 유두종 바이러스 유형 18 E6 및 E7 항원; MAGE-C2: 흑색종 항원 패밀리 C2 항원.
도 15는 각각 rAAV-CD14p/항원 rAAV-형질도입된 DC, rAAV-p5/항원 rAAV-형질도입된 DC 또는 rAAV-CMVp/항원 rAAV-형질도입된 DC에 의해 프라이밍된 CD69+/CD8+ T 림프구의 수를 도시한다. BA46: 유방 상피 항원 46(락타데린).
도 16은 항-MHC 클래스 I 항체로 처리된 rAAV-CD14p/항원 rAAV-형질도입된 DC 또는 rAAV-형질도입된 DC에 의해 유도된 세포독성 T 림프구(CTL)의 사멸 활성을 도시한다. K562, Hela, THP-1, 또는 HEK 293 세포의 사멸 백분율은 3개의 상이한 rAAV-CD14p/항원 rAAV-형질도입된 DC에 노출된 CTL에 의해 사멸된 이들 세포의 평균값이다.
도 17은 rAAV-CD14p/항원 rAAV-형질도입된 DC 및 rAAV-CMVp/항원 rAAV-형질도입된 DC에 의해 유도된 CTL의 사멸 활성의 비교를 도시한다.
도 18은 rAAV 형질도입 전 및 각각 rAAV-CD14p/CK19, rAAV-p5/CK19, rAAV-CD14p/muc-l, rAAV-CMVp/muc-1로 형질도입 후 14일째에 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에서 CD3+ T 림프구의 백분율을 도시한다.
CD14+ 세포, 예를 들어, 단핵구 또는 수지상 세포(DC)에서 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드의 표적화 및/또는 특이적 발현을 촉진할 수 있는 분화 항원 14(CD14) 프로모터의 클러스터를 포함하는 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 벡터가 본원에서 제공된다. 외인성 유전자 및/또는 코딩 서열은 rAAV 벡터에 삽입될 수 있다. CD14+ 세포를 감염시키고 CD14 프로모터에 작동 가능하게 연결된 외인성 유전자 및/또는 코딩 서열을 도입하여 CD14+ 세포에서 외인성 유전자 및/또는 코딩 서열의 표적화 및/또는 특이적 발현을 촉진시킬 수 있는 rAAV 비리온(예: rAAV-CD14p)이 또한 제공된다. 외인성 유전자 및/또는 코딩 서열의 예는 야생형을 인코딩하는 서열, 절단된 또는 돌연변이체 종양 항원 유전자, 종양 관련 항원, 바이러스 항원, 박테리아 항원, 사이토카인 및 기타 관심 폴리펩티드를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 본원에 개시된 rAAV 벡터 및 비리온은 악성 종양, 바이러스 또는 박테리아 감염성 질환, 및 다른 질환을 치료하거나 예방하기 위해 사용될 수 있는 면역 반응을 유도하기 위해 단핵구 및 DC를 형질도입하는데 유용하다. 조직- 또는 세포 특이적 CD14 프로모터를 사용하여, 본원에 개시된 rAAV 벡터, 조성물, 및 방법은 CD14+ 세포에서 관심 있는 폴리뉴클레오티드 서열의 표적화 및/또는 특이적 발현의 이점을 제공하는 한편, 비표적 세포에서 발현으로부터 발생할 수 있는 합병증을 감소시킨다.
정의
본 설명에서, 임의의 농도 범위, 백분율 범위, 비율 범위 또는 정수 범위는 달리 지시되지 않는 한 인용된 범위 내의 임의의 값 또는 하위범위를 포함하는 것으로 이해된다. 본원에서 사용된 용어 "약"은 달리 지시되지 않는 한 지시된 범위 또는 값의 ± 20%를 의미한다.
또한, 용어 "또는"은 내용이 달리 지시하지 않는 한, 일반적으로 "및/또는"(즉, 대안의 어느 하나, 둘 다 또는 이들의 임의의 조합을 의미함)을 포함하는 이의 의미로 사용된다는 것을 주목해야 한다.
또한, 본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 내용이 달리 지시하지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다.
용어 "포함하다(include)", "가지다(have)", "포함하다(comprise)" 및 그들의 변이체는 동의어로 사용되며, 비제한적인 것으로 해석되어야 한다.
본원에 사용된 용어 "이의 조합"은 그 용어에 선행하는 열거된 항목의 모든 가능한 조합을 지칭한다. 예를 들어, "A, B, C, 또는 이의 조합"은 A, B, C, AB, AC, BC, 또는 ABC 중 어느 하나를 지칭하는 것으로 의도된다. 유사하게, 본원에 사용된 용어 "이의 조합"은 그 용어에 선행하는 열거된 항목의 모든 가능한 조합을 지칭한다. 예를 들어, "A, B, C 및 이의 조합"은 A, B, C, AB, AC, BC 및 ABC 모두를 지칭하는 것으로 의도된다.
본원에 사용된 용어 "폴리뉴클레오티드", "뉴클레오티드", "뉴클레오티드 서열", "핵산" 및 "올리고뉴클레오티드"는 상호교환 가능하게 사용되며, 선형 또는 원형 형태, 및 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 중합체를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드의 예는 유전자 또는 유전자 단편의 코딩 또는 비코딩 영역, 연결 분석으로부터 정의된 유전자좌(유전자좌), 엑손, 인트론, 메신저 RNA(mRNA), 전달 RNA, 리보솜 RNA, 짧은 간섭성 RNA(siRNA), 짧은-헤어핀 RNA(shRNA), 마이크로-RNA(miRNA), 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 분지형 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 임의의 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브, 및 프라이머를 포함한다. 본 개시내용의 목적을 위해, 이들 용어는 중합체의 길이와 관련하여 제한적인 것으로 해석되어서는 안 된다. 용어는 천연 뉴클레오티드의 공지된 유사체뿐만 아니라 염기, 당 및/또는 포스페이트 모이어티(예: 포스포로티오에이트 백본)에서 변형되는 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일반적으로, 특정 뉴클레오티드의 유사체는 동일한 염기쌍 특이성을 갖는다; 즉, A의 유사체는 T와 염기쌍을 이룰 것이다.
본원에 사용된 용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하기 위해 상호교환 가능하게 사용된다. 용어는 또한 하나 이상의 아미노산이 화학적 유사체 또는 상응하는 천연 아미노산의 변형된 유도체인 아미노산 중합체에 적용된다.
일반적으로, 그리고 본원에 사용된 용어 "벡터"는 이에 연결되어 있는 다른 폴리뉴클레오티드를 운반할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 벡터는 단일 가닥, 이중 가닥 또는 부분적으로 이중 가닥인 폴리뉴클레오티드 분자; 하나 이상의 유리 말단을 포함하고, 유리 말단이 없는(예: 원형) 폴리뉴클레오티드 분자; DNA, RNA, 또는 둘 다를 포함하는 폴리뉴클레오티드 분자; 및 당업계에 공지된 폴리뉴클레오티드의 다른 품종을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 벡터의 한 유형은 "플라스미드"이며, 이는 추가의 DNA 세그먼트가, 예를 들어, 표준 분자 클로닝 기술에 의해 삽입될 수 있는 원형의 이중 가닥 DNA 루프를 지칭한다. 다른 유형의 벡터는 바이러스 벡터이며, 여기서 바이러스-유래 DNA 또는 RNA 서열은 바이러스(예: 아데노 관련 바이러스) 내로 패키징하기 위해 벡터 내에 존재한다. 바이러스 벡터는 또한 숙주 세포로의 형질도입을 위해 바이러스에 의해 운반되는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
용어 "형질감염" 및 "형질도입"은 상호교환 가능하며, 외인성 DNA 서열이 진핵 세포로 도입되는 과정을 지칭한다. 형질감염은 전기 천공, 미세 주입, 유전자 총 전달, 리포펙션, 슈퍼펙션 등을 포함하는 다수의 방법 중 어느 하나에 의해 달성될 수 있다. 형질도입은 일반적으로 바이러스 벡터, 예를 들어, AAV, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 또는 아데노바이러스 벡터에 의해 달성되는 진핵 세포로의 외인성 DNA 서열의 도입을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "유전자"는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA 서열을 포함한다. 따라서, 유전자는 cDNA 서열, 게놈 서열, 및 단백질, 폴리펩티드, 도메인, 펩티드, 융합 단백질, 및/또는 돌연변이체를 발현하거나 발현하도록 적응되는 더 작은 조작된 유전자 세그먼트를 포함할 수 있지만, 반드시 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, "발현"은 폴리뉴클레오티드가 DNA 주형으로부터(예를 들어, mRNA 또는 다른 mRNA 전사체로) 전사되는 과정 및/또는 전사된 mRNA가 후속적으로 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질로 번역되는 과정을 지칭한다. 전사체 및 인코딩된 폴리펩티드는 집합적으로 "발현 생성물"이라고 지칭될 수 있다
본원에 사용된 바와 같이, "특이적 발현", "표적화 발현" 및 "특이적으로 발현한다"는 상호교환 가능하게 사용되고, 특정 표적 조직 또는 표적 세포 유형에서 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 발현을 지칭하지만, 비표적 조직 또는 비표적 세포 유형에서 발현의 결여 또는 검출 불가능한 발현을 지칭한다. 특이적 발현은 일반적으로 "조직 특이적 프로모터" 또는 "세포 특이적 프로모터"에 의해 구동된다. "조직 특이적 프로모터"는 하나 또는 몇 개의 표적 조직에서 이의 조절하에 있는 유전자를 발현하지만, 다른 조직에서는 그렇지 않다. "세포 특이적 프로모터"는 하나 또는 몇 개의 특정 세포 유형에서 이의 조절하에 있는 유전자를 발현하지만, 다른 세포 유형에서는 그렇지 않다. 조직 특이적 프로모터 및 세포 특이적 프로모터는 둘 모두 본원에서 사용되는 바와 같이 "특이적 프로모터"로 지칭될 수 있다. 특이적 프로모터는 전사의 활성화제 및/또는 억제인자로서 작용할 수 있는 하나 이상의 특정 전사 인자와 상호 작용하는 특정 DNA 서열을 함유한다. 특이적 프로모터는 특정 세포 유형 및/또는 조직에서만 폴리뉴클레오티드의 발현을 유도한다. 예를 들어, 특이적 프로모터는 단핵구 및/또는 DC에서 폴리뉴클레오티드의 특이적 발현을 유도할 수 있지만, T 세포 또는 상피 세포에서는 그렇지 않다. 특이적 프로모터의 예는 CD14 프로모터이다.
본원에 사용된 바와 같이, "작동 가능하게 연결된"은 벡터가 숙주 세포에 도입될 때, 예를 들어, 숙주 세포에서 뉴클레오티드 서열의 발현을 허용하는 방식으로 관심 있는 뉴클레오티드 서열이 조절 요소(들), 예를 들어, 프로모터에 연결된다는 것을 의미하는 것으로 의도된다.
용어 "조절 요소"는 프로모터, 인핸서, 내부 리보솜 진입 부위(IRES), 및 다른 발현 제어 요소(예: 전사 종결 신호, 예를 들어, 폴리아데닐화 신호 및 폴리-U 서열)를 포함하는 것으로 의도된다. 이러한 조절 요소는, 예를 들어, 문헌[참조: Goeddel (1990) Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif.]에 기재되어 있다. 조절 요소는 조직 특이적 발현을 지시하는 것들을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "rAAV 비리온" 또는 "rAAV 입자"는 본원에 기재된 바와 같은 rAAV 벡터를 캡시드화하는 적어도 하나의 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 캡시드를 포함하는 감염성 바이러스 입자를 지칭한다. 바람직하게는, 벡터는 rAAV 비리온이 표적 세포를 감염(형질도입)시킨 후 발현되는 외인성 및/또는 이종성 핵산 서열을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "외인성"은 세포 또는 바이러스에 정상적으로 존재하지 않지만, 하나 이상의 유전적, 생화학적 또는 다른 방법에 의해 세포 또는 바이러스에 도입될 수 있는 핵산 서열 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 예를 들어, 외인성 핵산 서열은 세포에 도입된 감염성 바이러스 벡터, 플라스미드, 또는 에피솜의 일부일 수 있다. 추가의 예는 외인성 핵산 서열로서 바이러스 폴리뉴클레오티드 서열로 도입된 포유류 폴리뉴클레오티드이다. 외인성 핵산 서열 또는 폴리펩티드의 다른 예는 비교 가능한 세포에서 검출 가능한 수준에서 정상적으로 발현되지 않는 세포에 도입된 핵산 서열 또는 폴리펩티드이거나, 야생형 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 돌연변이체 및/또는 절단된 형태이다.
본원에 사용된 용어 "항원"은 하나 이상의 MHC 수용체, 항체, 또는 다른 항원 결합 잔기에 의해 결합될 수 있는 하나 이상의 에피토프를 함유하는 분자를 지칭한다. 예를 들어, 항원은 항원이 제시될 때 세포 항원 특이적 면역 반응을 만들기 위해 숙주의 면역계를 자극할 수 있다. 항원은 또한 그 자체로 또는 다른 분자와 조합하여 존재하는 경우, 세포 면역 반응을 유도하는 능력을 가질 수 있다. 예를 들어, 종양 세포 항원은 T 세포 수용체(TCR)에 의해 인식될 수 있다. 항원은 단백질의 야생형, 돌연변이체 또는 절단된 버전일 수 있다. 더욱이, 항원은 재조합 또는 게놈 DNA로부터 유래될 수 있다. 당업계에서는 병원성 유기체의 게놈의 뉴클레오티드 서열 또는 부분 뉴클레오티드 서열 또는 면역 반응을 유도하는 단백질에 대한 유전자 또는 유전자의 단편을 함유하는 발현된 DNA가 항원의 합성을 유도하는 것으로 인식되고 있다. 더욱이, 본 개시내용은 유전자 또는 cDNA의 전체 핵산 서열의 사용에 제한되지 않는다. 따라서, 하나 이상의 유전자 또는 cDNA의 부분 핵산 서열의 사용이 본원에서 고려되고, 이들 핵산 서열은 목적하는 면역 반응을 유도하기 위해 다양한 조합으로 배열된다.
용어 "항원 제시 세포" 또는 "APC"는 이의 세포 표면 상에 (또는 에서) 적어도 하나의 항원 또는 항원성 단편을 표시, 획득 또는 제시할 수 있는 다양한 세포 중 임의의 것이다. 이러한 세포는 본원에 개시되고 당업계에 공지된 방법을 사용하여 식별될 수 있다. 당업자에 의해 이해되고 본원 특정 구현예에 사용된 바와 같이, 예를 들어, 클래스 II 주요 조직 적합성 분자 또는 복합체(MHCII)와 함께 항원을 면역 세포에 표시하거나 제공하는 세포는 항원 제시 세포이다.
본원에 사용된 바와 같이, "CD14 양성" 또는 "CD14+" 세포는 CD14 유전자를 자연적으로 발현하는 세포를 지칭한다. CD14+ 세포의 예는 단핵구, DC 및 대식세포를 포함한다. 당업계에 공지된 유전자 발현의 검출을 위한 임의의 방법, 예를 들어, 유세포 분석, 면역조직화학적 염색, 형광 현미경법, 웨스턴 블롯, 노던 블롯, 및 역전사 PCR이 CD14 발현을 검출하는데 사용될 수 있다. 유세포 분석에 의해 검출되는 바와 같이, 마커에 대한 세포 집단 "양성"은 이소타입 대조군으로의 염색에 대해 발견된 수준 이상의 세포 집단의 균일한 모노클로날 항체 염색을 지칭한다. 일부 구현예에서, 참조 집단에 비해 MFI의 적어도 2배 증가는 세포가 마커의 발현에 대해 양성임을 나타낸다. 예를 들어, 마커에 대해 양성인 세포 집단은 이소타입 대조군과 비교하여 2배 내지 4배, 4배 내지 10배, 10배 내지 100배, 100배 내지 1,000배, 1,000배 내지 10,000배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 15배, 20배, 25배, 30배, 35배, 40배, 50배, 100배, 200배, 300배, 400배, 500배, 600배, 700배, 800배, 900배, 1,000배, 5,000배, 10,000배 또는 그 이상의 MFI를 입증할 수 있다.
"단핵구"는 마커 CD14를 발현하고, 수지상 세포 또는 대식세포로 분화할 수 있는 면역 세포이다. CD14 이외에, 단핵구는 CD11b, CCR2 및 CD16 중 적어도 하나를 발현한다.
"수지상 세포" 또는 "DC"는 생체내, 시험관내, 생체외, 또는 숙주 또는 대상체에 존재하거나, 또는 단핵구 또는 조혈 줄기 세포로부터 유래될 수 있는 항원 제시 세포이다. 수지상 세포 및 그들의 전구체는 말초 혈액 및 골수뿐만 아니라 다양한 림프 기관, 예를 들어, 비장, 림프절로부터 단리될 수 있다. DC는 수지상 세포체로부터 멀어지는 다수의 방향으로 연장되는 얇은 시트(라멜리포디아(lamelliphodia))를 갖는 특징적인 형태를 갖는다. DC는 MHC 클래스 II 뿐만 아니라 MHC 클래스 I 제한 시스템 둘 모두에 대한 강력한 전문 항원 제시 세포이다(참조: Santambrogio et al., PNAS 96(26):15050-55, 1999). 전형적으로, 수지상 세포는 높은 수준의 MHC 및 공동자극(예: B7-1 및 B7-2) 분자를 발현한다. 수지상 세포는 T 세포의 항원 특이적 분화를 유도할 수 있고, 시험관내 및 생체내에서 세포독성 T 림프구 반응을 개시할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "분화성 사이토카인"은 단핵구의 수지상 세포로의 분화를 촉진할 수 있는 사이토카인을 지칭한다. 분화성 사이토카인의 예는 GM-CSF, Il-4 및 TNF-α를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 용어 "활성화 사이토카인"은 항원 특이적 T 림프구, 예를 들어, 세포독성 T 림프구의 활성화를 촉진할 수 있는 사이토카인을 지칭한다. 활성화 사이토카인의 예는 IL-2 및 IL-7을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
용어 "암" 및 "종양"은 본원에서 상호교환 가능하게 사용되며, 조절되지 않은 성장, 분화 결여, 국소 조직 침입 및/또는 전이를 초래하는 세포의 과증식을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "치료", "치료하다", "치료된" 또는 "치료하는"은 이러한 용어가 적용되는 질환, 장애 또는 상태를 역전시키고, 완화하고, 이의 진행을 억제하고, 이의 가능성을 예방하거나 감소시킴을 포함할 수 있다. 암과 관련하여 사용될 때, 예를 들어, 용어는 일반적으로 질환 및/또는 증상을 역전시키고, 완화하고, 이의 진행을 억제하는 것을 지칭한다. 감염성 질환과 관련하여 사용되는 경우, 예를 들어, 용어는 대상체가 감염된 후 감염과 싸우기 위해, 예를 들어, 감염을 감소시키거나 제거하거나 악화되는 것을 방지하는 치료뿐만 아니라, 병원체에 의한 감염에 대한 대상체의 내성을 증가시키거나, 즉 감염으로 인한 질병의 징후를 나타낼 가능성을 감소시키는 예방적 치료를 지칭할 수 있다.
"유효량" 또는 "치료적 유효량"은 대상체(예: 인간)에게 투여될 때 질환을 치료하는 데 도움이 되기에 충분한 본원에 기재된 조성물의 양을 지칭한다. "치료적 유효량"을 구성하는 조성물의 양은 세포 및/또는 rAAV 제제, 상태 및 이의 중증도, 투여 방식, 및 치료될 대상체의 체중 및 연령에 따라 달라질 것이지만, 자신의 지식과 본 개시내용과 관련하여 당업자에 의해 통상적으로 결정될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "면역 반응을 유도한다"는 항원 특이적 세포 매개 면역 반응을 활성화하고/하거나 촉진하는 능력을 지칭한다. 예를 들어, 본 개시내용의 조성물은 면역 반응을 증강시키고/시키거나 활성화할 수 있다. 면역 반응은 생체외 및/또는 생체내에서 유도될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "대상체" 또는 "환자"는 본원에 개시된 치료, 요법, 세포 조성물, 및/또는 rAAV 조성물을 투여받을 필요가 있는 하나 이상의 개체를 지칭한다. 본 개시내용에 따라 치료될 수 있는 대상체는 일반적으로 인간이다. 그러나, 추가의 대상체는 비인간 영장류, 소, 말, 양, 염소, 돼지, 개, 고양이, 마우스, 토끼, 래트, 또는 기니 피그를 포함한다. 대상체는 남성 또는 여성일 수 있고 유아, 청소년, 청년, 성인 및 노인 대상체를 포함하여 임의의 적합한 연령일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "약제학적으로 또는 약리학적으로 허용 가능한"은 동물 또는 인간에게 투여될 때 부작용, 알레르기, 또는 다른 바람직하지 않은 반응을 생성하지 않는 분자 실체 및 조성물을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, "약제학적으로 허용되는 담체"는 임의의 및 모든 용매, 분산 배지, 코팅, 항균제 및 항진균제, 등장성 제제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 약제학적 활성 물질에 대한 이러한 배지 및 제제의 사용은 당업계에 익히 공지되어 있다. 임의의 통상적인 배지 또는 제제가 본 발명의 벡터 또는 세포와 양립할 수 없는 경우를 제외하고, 치료 조성물에서 그것의 사용이 고려된다. 보충 활성 성분이 또한 조성물에 혼입될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, "샘플"은 세포의 집단이 단리, 농축 또는 고갈될 수 있는 세포 공급원(예: 생물학적 조직)을 지칭한다. 일부 구현예에서, 샘플은 일반적으로 이전에 처리되지 않았거나 최소로 처리되어 있다. 예를 들어, 샘플은 비동원 혈액, 비동원 성분채집술 생성물, 동원 말초 혈액, 동원 성분채집술 생성물, 골수, 제대혈, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC), 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 일부 구현예에서, 샘플은 밀도 구배, 피콜, 퍼콜, 적혈구 저장성 용해, 암모늄-클로라이드-칼륨(ACK) 완충액으로 처리함으로써 제조되거나 최소로 처리되고, pH 균형 등장성 완충액으로 세척되거나, 또는 이들의 임의의 조합이다. 일부 구현예에서, 샘플은 단일 조직 수확에 의해 제공된다. 일부 구현예에서, 샘플은 하나 이상의 조직 수확에 의해 제공된다.
재조합 AAV 벡터
본원에 제공된 AAV 벡터는 내부 Cap 및 Rep 유전자와 다른 내인성 DNA 섹션을 결실시키고 ITR 사이에 외인성 핵산 서열을 삽입함으로써 AAV 게놈의 내부 비 반복 부분을 결실시킴으로써 관심 유전자를 전달하도록 조작되어 있다. 외인성 유전자는 CD14-발현(CD14+) 표적 세포에서 특이적 발현을 유도할 수 있는 CD14 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 따라서, 본 개시내용은 2개의 ITR 서열을 인코딩하는 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 벡터 및 외인성 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 CD14 프로모터를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공하고, 여기서 CD14 프로모터는 CD14+ 세포에서 외인성 핵산의 특이적 발현을 유도한다. CD14 프로모터는 CD14 양성 세포에서 외인성 핵산 서열의 발현을 특이적으로 유도하는 임의의 포유류 CD14 프로모터일 수 있다. 일부 구현예에서, CD14 프로모터는 인간 CD14 프로모터 서열이다. 인간 CD14 프로모터는 서열번호 1을 포함하거나 서열번호 1과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 반면, CD14+ 세포에서 특이적 발현을 유도할 수 있다. 서열번호 1에서 위치를 참조하면, CD14 프로모터는 TATA 박스(위치 481-486), C/EBP 부위(위치 378-386), Spl 결합 부위(위치 404-410 및 위치 533-538), Myb 부위(위치 42-47 및 위치 457-463), AP-1 부위(위치 113-121, 위치 127-133, 및 위치 288-293), AP-2 부위(위치 276-283 및 356-364), 및 CDP(CCATT 변위 단백질) 부위(위치 164-168)를 포함한다. 특정 구현예에서, CD14 프로모터는 C/EBP 부위 및 CD14의 조직 특이적 발현을 조절하는 Spl 부위를 포함한다. 일부 구현예에서, CD14 프로모터는 서열번호 1의 위치 378-386, 위치 404-410 및 위치 533-538에 적어도 뉴클레오티드를 포함한다. CD14 발현 세포의 예는 단핵구, 수지상 세포, 및 대식세포를 포함한다.
일부 구현예에서, rAAV 벡터는 5' 내지 3' 방향으로 제1 ITR, 외인성 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 CD14 프로모터, 폴리아데닐화 신호 서열, 및 제2 ITR을 포함한다. 일부 구현예에서, ITR 서열은 AAV-2 ITR 서열이거나 AAV-2 ITR 서열로부터 유도된다. 일부 구현예에서, 제1 ITR 서열 및 제2 ITR 서열은 AAV-2 ITR이거나 AAV-2 ITR로부터 유도된다. 일부 구현예에서, ITR 서열은 임의의 다른 AAV 혈청형, 예를 들어, AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9 및 AAVrh.10으로부터 유래된다. 이론에 결부시키지 않고, ITR 서열은 제1 및 제2 ITR에 의해 측면화된 서열의 효율적인 증식을 위해 대칭적이어야 한다고 생각된다. 폴리아데닐화 신호 서열의 예는 SV40 후기 폴리아데닐화 신호, 인간 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호, 및 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호를 포함한다. 일부 구현예에서, rAAV 벡터는 인핸서 서열을 추가로 포함한다. 인핸서는 당업계에 익히 공지되어 있고, 프로모터로부터 전사를 증가시키는 유전적 요소이다. 인핸서 서열은 CD14 프로모터에 의해 구동되는 발현의 특이성에 상당히 영향을 미치지 않는다. 인핸서의 예는 시미안 바이러스 40(SV40) 인핸서, 사이토메갈로바이러스(CMV) 즉시-초기 인핸서 및 HACNS1 (CENTG2) 인핸서를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, rAAV 벡터는 "pAAV-CD14p"로서도 지칭되는 플라스미드 벡터(즉, AAV ITR 서열 및 CD14 프로모터를 함유하는 플라스미드)이다. 일부 구현예에서, 플라스미드 벡터는 인간 CD14 전사 프로모터, AAV 유형 2 역전된 말단 반복(ITR) 서열, 다중 클로닝 부위 서열(MCS), SV40 후기 폴리-A 서열(late poly-A sequence), 항생제 내성 유전자, 예를 들어, 베타 락타마제 유전자(암피실린 내성 유전자, Ampr), 및 플라스미드가 이. 콜리(E. coli)에서 복제할 수 있게 하는 유전자 요소(gene element)(예: DH5α)를 포함한다. 예시적인 플라스미드 벡터는 도 l에 도시되어 있다. 일부 구현예에서, 플라스미드는 서열번호 2의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, rAAV 벡터는 AAV 비리온에서 캡시드화된다.
특정 구현예에서, 외인성 핵산 서열은 다중 클로닝 부위(MCS)를 포함한다. MCS 서열은 당업계에 익히 공지되어 있으며, 때때로 폴리링커로서도 지칭된다. MCS 서열은 일반적으로 제한 엔도뉴클레아제(또한 제한 효소로서 공지됨)에 의해 표적화될 수 있는 제한 부위로서 공지된 여러 고유 서열을 함유하는 DNA의 짧은 세그먼트이다. MCS는 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 이상의 고유 제한 부위를 함유할 수 있다. 당업계에 공지된 임의의 제한 부위가 사용될 수 있다. 제한 부위의 예는 AbsI, AscI, AvrII, BclI, BstZ17I, BstBI, Bst98I, BmgBI, BglII, ClaI, FseI, MluI, MreI, NdeI, NheI, NsiI, SnaBI, EcoRI, EcoRII, BamHI, HindIII, TaqI, NotI, HinFI, Sau3AI, PvuII, SmaI, HaeIII, Hgal, Alul, EcoRV, EcoP15I, KpnI, PstI, PmeI, RsrII, SacI, SalI, ScaI, SpeI, SphI, StuI, SgrDI, SrfI, XhoI, 및 XbaI를 포함한다. 추가 제한 부위 및 제한 효소가 REBASE 데이터베이스에 나열되어 있으며, 이는 전체가 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, 외인성 핵산 서열은 RNA 및/또는 폴리펩티드를 인코딩하는 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, RNA 및/또는 폴리펩티드를 인코딩하는 서열은 MCS에 삽입된다. RNA의 예로는 mRNA, 짧은 간섭성 RNA(siRNA), 짧은-헤어핀 RNA(shRNA), 마이크로-RNA(miRNA) 및 리보자임을 포함한다. 일부 구현예에서, 외인성 핵산 서열은 항원성 폴리펩티드를 인코딩한다. 항원성 폴리펩티드의 예는 종양 항원, 종양 관련 항원, 종양 유전자 생성물, 바이러스 항원, 박테리아 항원, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 특정 구현예에서, 항원성 폴리펩티드는 전장 단백질, 단백질의 항원성 단편, 절단된 단백질, 및/또는 단백질의 돌연변이체 형태일 수 있다.
수지상 세포를 포함하는 세포는 본질적으로 임의의 세포 번역 생성물(예: 단백질)로부터 펩티드의 레퍼토리를 자연적으로 생성하고, 펩티드/MHC 복합체를 통해 세포의 표면에 펩티드를 제공한다. 내인성 및/또는 외인성 단백질의 단백질 분해는 MHC 분자에 결합되어 펩티드/MHC 복합체를 형성할 수 있는 더 작은 펩티드를 생성한다. 그런 다음, 펩티드/MHC 복합체는 세포 표면에 트래피킹된다. 순환성 세포독성 T 세포의 표면 상의 T 세포 수용체(TCR)는 T 세포 지시된 면역 반응을 유발하는 종양 항원 또는 바이러스 단백질과 같은 펩티드의 존재에 대해 펩티드/MHC 복합체를 프로빙한다. 세포의 표면에서 펩티드의 생산 및 제시를 위한 세포 과정은, 예를 들어, 문헌(참조: "Janeway's Immunobiology" 9th Ed. (2016))에 요약되어 있다.
일부 구현예에서, 종양 항원, 종양 관련 항원, 또는 종양 유전자 생성물은 당업계에 공지된 임의의 이러한 항원성 폴리펩티드 또는 이의 단편일 수 있다. 종양 항원, 종양 관련 항원, 또는 종양 유전자 생성물의 예는 알파 태아단백질(alpha fetoprotein; AFP), B 흑색종 항원(BAGE/CT2.1), 분화 20의 클러스터(CD20), CD269, G250(탄산 탈수효소 IX/CA IX), HM1.24, CD 154, 전립선암 관련 항원(예: 전립선 특이적 항원(PSA), 전립선 특이적 막 항원(PSMA), 전립선 줄기 세포 항원(PSCA) 및 전립선 산 포스파타제(PAP) 항원), 유방암 관련 종양 관련 항원(예: 유방 상피 항원 46(BA46, 락타데린)), 암-고환 항원(CT) 패밀리(예: 뉴욕 식도 편평 세포 암종-1(NY-ESO-1)(CT6.1), ADAM2(CT15), SPA17(SP17, CT22), SPANX, 예를 들어, Spanx-A1(CT11.1)), 인간 흑색종 관련 항원(MAGE) 패밀리(예: MAGE-A1/CT1.1, MAGE-A2/CT 1.2, MAGE-A3/CT1.3, MAGE-A4/CT1.4, MAGE-B1/CT3.1, MAGE-C1/CT7.1, MAGE-C2/CT10, MAGE-C3/CT7.2, MAGE-E1), MART 1, SAGE 1, 암배아 항원(CEA), HER-2/neu, 사이토케라틴 19(CK19, K19, cyfra21-l), 서바이빈, 뮤신-1(MUC-1, CA15-3), 편평 세포 암종(SCC) 항원, 또는 이들의 임의의 항원성 단편 및/또는 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 바이러스 항원은 당업계에 공지된 임의의 바이러스 항원일 수 있다. 바이러스 항원의 예는 B형 간염 바이러스(HBV) 항원, C형 간염 바이러스(HCV) 항원, 인간 유두종 바이러스(HPV) 항원, 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 항원, 사이토메갈로 바이러스(CMV), 엡스타인-바 바이러스(EBV), 인플루엔자 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스(RSV), 단순 포진 바이러스(HSV), 유두종 바이러스, 홍역 바이러스, 로타바이러스, 또는 이들의 임의의 항원성 단편 및/또는 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, HPV 항원은 E6 폴리펩티드, E7 폴리펩티드, 또는 이들의 임의의 항원성 단편이다. 특정 구현예에서, 외인성 핵산 서열은 E6 폴리펩티드 및 E7 폴리펩티드, 또는 이들의 항원성 단편을 인코딩하는 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, E6 또는 E7 항원은 HPV 혈청형 16, 18, 30, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 61, 또는 이들의 임의의 항원성 단편 및/또는 조합으로부터 유도된다. 일부 구현예에서, HBV 항원은 HBsAg, HBeAg, HBcAg 및/또는 HBxAg이다. 일부 구현예에서, HCV 항원은 C, E1, E2, NS1, NS2, NS3, NS4 및/또는 NS5 항원이다. 일부 구현예에서, HIV 항원은 gag 항원, pol 항원 및/또는 env 항원이다. 일부 구현예에서, CMV 항원은 pp65 항원, pp150 항원, 및/또는 gB 항원이다. 일부 구현예에서, EBV 항원은 LMP-1 항원, LMP-2A 항원, LMP-2B 항원, EAR 항원, EAD 항원, VCA 항원, MA 항원, EBNA1 항원, EBNA2 항원, EBNA3 항원, EBNA3B 항원, 및/또는 EBNA3C 항원이다.
일부 구현예에서, 박테리아 항원은 당업계에 공지된 임의의 박테리아 항원일 수 있다. 박테리아 항원이 유도될 수 있는 박테리아의 예는 미코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 헬리코박터(Helicobacters), 캄필로박터(Campylobacters), 클로스트리디아(Clostridia), 코리네박테리움 디프테리아에(Corynebacterium diphtheriae), 보르데텔라 퍼투시스(Bordetella pertussis),　보렐리아 부르그도르페이(Borrelia burgdorfei), 플라스모듐(Plasmodium), 비브리오 콜레라(Vibrio cholera), 에쉐리키아 콜리(Escherichia coli), 시겔라(Shigella),　살모넬라 티피(Salmonella typhi) 및 나이세리아 고노레아(Neisseria gonorrhea)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 특정 구현예에서, 미코박테리움 투베르쿨로시스 항원은 MPT44 항원, MPT45 항원, MPT59 항원, MPT64 항원, Ag85B 항원, Rv3117 항원 및/또는 ESAT-6 항원이다.
표 1은 출원시 이용 가능한 대표적인 항원의 목록 및 UniProtUK 수탁 번호를 제공한다. 버전 번호는 데이터베이스에 제공된 서열의 버전을 지칭한다. 공지된 및 예측된 이소폼에 대한 UniProtUK 수탁 번호도 또한 제공된다.
[표 1]
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일부 구현예에서, 외인성 핵산 서열은 사이토카인을 인코딩한다. 사이토카인은 인터루킨, 인터페론, 종양 괴사 인자, 과립구 대식세포 콜로니-자극 인자(GM-CSF), 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 사이토카인의 예는 GM-CSF, TNF-α, IL-4, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18, TGF-β, 당업계에 공지된 다른 Thl 사이토카인, 예를 들어, IFNγ, IL-2, IL-10, IL-18, 및 IL-27, 당업계에 공지된 다른 Th2 사이토카인, 예를 들어, IL-5, IL-9, IL-10, IL-13, IL-25, 및 암피레굴린, 및/또는 이들의 임의의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
특정 구현예에서, rAAV 벡터는 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 서열을 추가로 포함한다. IRES 서열은 다중 유전자 또는 폴리시스트론성 메시지를 생성하는 데 사용될 수 있다. IRES 서열은 RNA 및/또는 폴리펩티드를 인코딩하는 외인성 핵산 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 다중 외인성 핵산 서열은 함께 전사될 수 있으며, 각각 IRES에 의해 분리되어 폴리시스트론성 메시지를 생성한다. IRES 서열에 의해, 각 개방 판독 프레임은 효율적인 번역을 위해 리보솜에 접근 가능하다. 다중 유전자는 적어도 2개의 RNA 및/또는 폴리펩티드를 인코딩하는 단일 메시지를 전사하기 위해 단일 프로모터를 사용하여 효율적으로 발현될 수 있다(참조: 미국 특허 번호 5,925,565 및 5,935,819, 각각 본원에 참조로 포함됨).
본 개시내용에 따라서, rAAV 플라스미드 벡터는 화학식 "pAAV-[프로모터]/[페이로드]"에 따라 명명된다. 따라서, "pAAV-CD14p/외인성 유전자"는 외인성 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 CD14 프로모터를 포함하는 rAAV 플라스미드 벡터를 지칭하고, 여기서 CD14 프로모터 및 외인성 핵산 서열은 서열의 5' 및 3' 영역에 위치된 ITR 서열에 의해 측면화된다. 추가 예는 rAAV 플라스미드 벡터를 지칭하는 pAAV-CD14p/항원 및 pAAV-CD14p/사이토카인을 포함하며, 여기서 CD14 프로모터는 각각 항원 또는 사이토카인을 인코딩하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된다. 또한, 특정 폴리펩티드를 인코딩하는 외인성 서열을 포함하는 rAAV 플라스미드 벡터는 외인성 서열의 명칭을 포함한다. 예를 들어, PSA를 인코딩하는 외인성 핵산에 작동 가능하게 연결된 CD14 프로모터를 포함하는 rAAV 플라스미드 벡터는 "pAAV-CD14p/PSA"로 지칭된다. rAAV 플라스미드 벡터의 예는 pAAV-CD14p/AFP, pAAV-CD14p/BA46, pAAV-CD14p/CT2.1, pAAV-CD14p/CEA, pAAV-CD14p/CD20, pAAV-CD14p/CD269, pAAV-CD14p/CK19, pAAV-CD14p/G250, pAAV-CD14p/HPV16-E6, pAAV-CD14p/HPV16-E7, pAAV-CD14p/HPV16-E6-E7, pAAV-CD14p/HPV18-E6, pAAV-CD14p/HPV18-E7, pAAV-CD14p/HPV18-E6-E7, pAAV-CD14p/HER2, pAAV-CD14p/HM1.24, pAAV-CD14p/LMP-1, pAAV-CD14p/MAGE-A1, pAAV-CD14p/MAGE-A2, pAAV-CD14p/MAGE-A4, pAAV-CD14p/MAGE-B1, pAAV-CD14p/MAGE-C1, pAAV-CD14p/MAGE-E1, pAAV-CD14p/MART1, pAAV-CD14p/MUC-1, pAAV-CD14p/CT6.1, pAAV-CD14p/PSA, pAAV-CD14p/PAP, pAAV-CD14p/PSMA, pAAV-CD14p/PSCA, pAAV-CD14p/SAGE1, pAAV-CD14p/SCC, pAAV-CD14p/SPANX, pAAV-CD14p/SPA17, 및 pAAV-CD14p/서바이빈을 포함한다.
rAAV 비리온
특정 구현예에서, 외인성 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 CD14 프로모터를 포함하는 rAAV 비리온이 본원에 개시되고, 여기서 CD14 프로모터는 CD14+ 세포에서 특이적으로 외인성 핵산의 발현을 유도한다. rAAV 비리온은 본원에 제공된 구현예 및 실시예에 개시된 임의의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, rAAV 비리온은 항원성 폴리펩티드, 예를 들어, 임의의 종양 항원, 종양 관련 항원, 종양 유전자 생성물, 바이러스 항원, 박테리아 항원, 또는 본원에 개시된 바와 같은 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, rAAV 비리온은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAVrh.10, AAV11 또는 이들의 임의의 조합의 캡시드 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, rAAV 비리온은 AAV2, AAV3, AAV5, AAV6, 또는 이들의 임의의 조합의 캡시드 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, rAAV 비리온은 AAV2의 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, rAAV 벡터의 ITR 서열의 바이러스 기원이 캡시드 서열의 바이러스 기원에 이종성인 키메라 rAAV 비리온이 사용된다. 예는 AAV2로부터 유도된 ITR과 AAV5, AAV6, AAV8 또는 AAV9로부터 유도된 캡시드를 갖는 키메라 바이러스(즉, 각각 AAV2/5, AAV2/6, AAV2/8 및 AAV2/9)를 포함한다. 특정 구현예에서, rAAV 비리온은 CD14 프로모터 이외의 프로모터를 포함하지 않는다. 특정 구현예에서, rAAV 비리온은 AAV 구조 유전자, 즉 Rep 및/또는 Cap 유전자를 포함하지 않는다. 본 개시내용에 따라, rAAV 비리온은 화학식 "rAAV-[프로모터]/[페이로드]"에 따라 명명된다. rAAV 비리온의 예는 rAAV-CD14p/AFP, rAAV-CD14p/BA46, rAAV-CD14p/CT2.1, rAAV-CD14p/CEA, rAAV-CD14p/CD20, rAAV-CD14p/CD269, rAAV-CD14p/CK19, rAAV-CD14p/G250, rAAV-CD14p/HPV16-E6, rAAV-CD14p/HPV16-E7, rAAV-CD14p/HPV16-E6-E7, rAAV-CD14p/HPV18-E6, rAAV-CD14p/HPV18-E7, rAAV-CD14p/HPV18-E6-E7, rAAV-CD14p/HER2, rAAV-CD14p/HM1.24, rAAV-CD14p/LMP-1, rAAV-CD14p/MAGE-A1, rAAV-CD14p/MAGE-A2, rAAV-CD14p/MAGE-A4, rAAV-CD14p/MAGE-B1, rAAV-CD14p/MAGE-C1, rAAV-CD14p/MAGE-E1, rAAV-CD14p/MART1, rAAV-CD14p/MUC-1, rAAV-CD14p/CT6.1, rAAV-CD14p/PSA, rAAV-CD14p/PAP, rAAV-CD14p/PSMA, rAAV-CD14p/PSCA, rAAV-CD14p/SAGE1, rAAV-CD14p/SCC, rAAV-CD14p/SPANX, rAAV-CD14p/SPA17, 및 rAAV-CD14p/서바이빈을 포함한다.
본원에 개시된 하나의 측면에서, pAAV-CD14p/외인성 플라스미드를 패키징 세포에 도입하는 단계를 포함하는, rAAV 비리온을 생산하는 방법이 있으며, 여기서 패키징 세포는 헬퍼 유전자를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함한다. 감염성 rAAV 비리온을 생산하기 위해, 적합한 패키징 세포주는 본원에 개시된 구현예 및 실시예에 개시된 임의의 rAAV 벡터를 포함하는 플라스미드로 형질감염될 수 있다. 패키징 세포주는 다른 AAV 유전자, 즉 Rep 및 Cap를 인코딩하는 헬퍼 플라스미드를 함유하지만, ITR 서열은 결여되어 있다. 패키징 세포주는 또한 헬퍼 바이러스 유전자, 예를 들어, 감염성 비리온의 생산에 필요한 아데노바이러스 유전자를 인코딩하는 플라스미드를 함유한다. 예를 들어, 헬퍼 플라스미드는 아데노 바이러스, 예를 들어, 아데노바이러스 유형 5의 VA, E2A, E3 및 E4 유전자를 포함할 수 있다. 헬퍼 바이러스 유전자는 rAAV 벡터의 복제 및 헬퍼 플라스미드로부터의 AAV 유전자의 발현을 촉진한다. 헬퍼 플라스미드는 ITR 서열의 결여로 인해 상당량으로 패키징되지 않는다. 특정 구현예에서, 헬퍼 유전자는 단일 플라스미드 상에 포함된다. 다른 구현예에서, 헬퍼 유전자는 하나 이상의 플라스미드(예: 2개의 플라스미드) 상에 포함된다. 일부 구현예에서, pAAV-CD14p/외인성 플라스미드는 헬퍼 유전자를 포함하는 하나 이상의 플라스미드와 함께 패키징 세포로 공동 형질감염된다. 대안적으로, 패키징 세포주는 또한 헬퍼로서 아데노바이러스로 감염될 수 있다. 일부 구현예에서, pAAV-CD14p/외인성 플라스미드는 Rep 및 Cap 유전자를 포함하는 플라스미드와 함께 패키징 세포로 공동 형질감염되고, 세포는 아데노바이러스로 감염된다. 아데노바이러스에 의한 오염은, 예를 들어, 아데노바이러스가 AAV보다 더 민감한 열 처리에 의해 감소될 수 있다. 일부 구현예에서, 패키징 세포는 포유류 세포이다. rAAV 비리온을 생산하는 데 사용될 수 있는 패키징 세포의 예는 HEK 293, HeLa 및 HT1080 세포를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 패키징 세포는 HEK 293T 세포이다. 패키징 세포주는 또한 AAV Rep 및 Cap 유전자와 아데노바이러스 VA, E2A, E3 및 E4 유전자를 포함하는 하나 이상의 벡터로 안정적으로 형질감염되거나 형질도입될 수 있다. 폴리뉴클레오티드를 세포에 전달하기 위한 추가 방법은 당업계에 공지되어 있다. 본원에 개시된 rAAV 비리온은 표적 세포에 Rep 및 Cap 유전자와 아데노바이러스 헬퍼 유전자가 결여되어 있기 때문에 표적 세포(예: 단핵구 및 DC)에서 자손 감염성 비리온을 형성하기 위해 복제할 수 없다.
변형된 항원 제시 세포를 생산하고 항원 특이적 T 세포를 생산하는 방법
CD14+ 표적 세포에서 외인성 핵산 서열을 특이적으로 발현시키기 위해 본원에 제공된 rAAV 벡터를 사용하는 방법이 본원에 개시된다. 일부 구현예에서, i) CD14+ 세포를 제공하는 단계; ii) CD14+ 세포와 본원에 개시된 임의의 rAAV 벡터를 폴리펩티드를 인코딩하는 외인성 핵산 서열을 발현하기에 충분한 양으로 접촉시키는 단계; 및 iii) 단계 ii)의 CD14+ 세포를 폴리펩티드를 발현시키기에 충분한 시간 동안 배양하는 단계를 포함하는, 변형된 APC를 생산하는 방법이 있다. CD14+ 세포는 단핵구 또는 수지상 세포일 수 있다. rAAV 벡터는 본원의 임의의 구현예에서 개시된 rAAV 비리온 또는 rAAV 플라스미드일 수 있다. CD14+ 세포는 rAAV 비리온이 CD14+ 세포를 형질도입하기에 충분한 시간 동안 CD14+ 세포를 rAAV 비리온과 공동 배양함으로써 rAAV 비리온과 접촉될 수 있다. 대안적으로, CD14+ 세포는 rAAV 플라스미드로 형질감염될 수 있다.
일부 구현예에서, 단핵구는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 집단에 존재한다. 일부 구현예에서, 단핵구는 단리된 단핵구이다. 일부 구현예에서, 단리된 단핵구는 샘플로부터 단리된다. 일부 구현예에서, 단리된 단핵구는 PBMC의 집단으로부터 단리된다. 단핵구는 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 PBMC의 집단으로부터 단리될 수 있다. 예를 들어, PBMC는 밀도 구배 원심분리에 의해 혈액 샘플로부터 수득될 수 있다. 이어서, 단핵구는 태그, 표지 또는 비드에 연결된 항-CD14 항체 (및/또는 다른 적합한 단핵구 마커)를 사용하여 정렬될 수 있다. 이어서, 단핵구는, 예를 들어, 형광 활성화 세포 정렬(FACS) 또는 자기 비드 분리를 사용하여 정렬되거나 단리된다. 대안적으로, 단핵구는 항-CD3 항체를 사용하여 PBMC로부터 분리되어 PBMC 샘플로부터 비단핵구를 정렬 및 제거할 수 있다. 단핵구는 또한 당업계에 공지된 부착성 배양 분리 기술을 사용하여 CD3+ 림프구로부터 분리될 수 있다.
일부 구현예에서, 단계 ii)는 단핵구를 수지상 세포로 분화시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 단핵구는 단핵구를 수지상 세포로 분화시키기에 충분한 시간 동안 단핵구와 사이토카인을 접촉시킴으로써 수지상 세포로 분화된다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 세포 배양물에 첨가된다. 일부 구현예에서, 단핵구는 외인성 사이토카인을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 단핵구에 도입하여 단핵구가 외인성 사이토카인을 발현하도록 유발함으로써 수지상 세포로 분화된다. 외인성 사이토카인을 인코딩하는 핵산은 플라스미드 또는 rAAV 비리온일 수 있다. 일부 구현예에서, 외인성 사이토카인을 인코딩하는 핵산은 CD14 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 배지에 첨가되거나 핵산 서열에서 인코딩된 사이토카인은 GM-CSF, IL-4, TNF-α, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 단핵구를 수지상 세포로 분화시키기에 충분한 시간은 당업자가 용이하게 결정할 수 있다. 일부 구현예에서, 단핵구를 수지상 세포로 분화시키기에 충분한 시간은 1 내지 8일 사이, 2 내지 7일 사이, 또는 3 내지 6일 사이이다. 일부 구현예에서, 단핵구를 수지상 세포로 분화시키기에 충분한 시간은 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일 또는 8일이다. 또한, 당업계에 공지된 단핵구를 수지상 세포로 분화시키는 임의의 방법이 사용될 수 있다.
또한, 항원 특이적 T 세포를 생산하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 항원 특이적 T 세포를 생산하는 방법은 i) 나이브 T 세포를 제공하는 단계; ii) 나이브 T 세포를 본원의 구현예 및 실시예에 기재된 임의의 변형된 APC와 접촉시키는 단계; 및 iii) 단계 ii)의 T 세포를 활성화 사이토카인과 접촉시키는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 변형된 APC는 항원성 폴리펩티드를 인코딩하는 외인성 핵산을 특이적으로 발현하는 변형된 수지상 세포이다. 활성화 사이토카인은 배양 배지 중의 T 세포에 첨가될 수 있다. 활성화 사이토카인은 IL-2, IL-7, 또는 둘 모두일 수 있다. 일부 구현예에서, 항원 특이적 T 세포는 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 또는 이의 혼합물이다. 일부 구현예에서, 변형된 수지상 세포는 IL-12를 인코딩하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 CD14 프로모터를 포함하는 rAAV 벡터를 추가로 포함하고, IL-12 폴리펩티드를 발현하여 CD8+ T 세포 증식을 향상시킨다.
일부 구현예에서, 항원 특이적 T 세포를 생산하는 방법은 i) CD14+ 단핵구 및 CD3+ T 세포를 포함하는 PBMC의 집단을 제공하는 단계; ii) 폴리펩티드를 인코딩하는 외인성 핵산 서열을 발현하기에 충분한 양으로 PBMC의 집단을 본원 구현예 및 실시예에서 개시된 임의의 rAAV 벡터와 접촉시키는 단계; iii) 단핵구와 사이토카인을 접촉시키고, 단핵구를 수지상 세포로 분화시키기에 충분한 시간 동안 배양함으로써 PBMC에서 단핵구를 수지상 세포로 분화시키는 단계; 및 iv) 분화된 수지상 세포와 CD3+ T 세포를 활성화 사이토카인과 접촉시키고, 분화된 수지상 세포 및 CD3+ T 세포를 항원 특이적 T 세포를 생산하기에 충분한 시간 동안 배양하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단핵구는 단핵구를 사이토카인과 접촉시킴으로써 수지상 세포로 분화된다. 사이토카인은 GM-CSF, IL-4, TNF-α, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 일부 구현예에서, 단핵구를 수지상 세포로 분화시키기에 충분한 시간은 1 내지 8일 사이, 2 내지 7일 사이, 또는 3 내지 6일 사이이다. 일부 구현예에서, 단핵구를 수지상 세포로 분화시키기에 충분한 시간은 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일 또는 8일이다. 활성화 사이토카인은 IL-2, IL-7, 또는 둘 모두일 수 있다. 일부 구현예에서, 분화된 수지상 세포 및 CD3+ T 세포를 배양하여 항원 특이적 T 세포를 생산하기에 충분한 시간은 1 내지 12일 사이, 2 내지 10일 사이, 또는 3 내지 6일 사이이다. 일부 구현예에서, 분화된 수지상 세포 및 CD3+ T 세포를 배양하여 항원 특이적 T 세포를 생산하기에 충분한 시간은 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일 또는 12일이다. 항원 특이적 T 세포는 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포 또는 이들의 혼합물일 수 있다.
약제학적 조성물 및 치료 방법
또한, 약제학적 조성물 및 질환의 치료 방법이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 변형된 APC의 집단 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이 본원에 제공되며, 여기서 변형된 APC는 본원의 구현예 및 실시예에 개시된 임의의 변형된 APC이고, CD14 프로모터에 작동 가능하게 연결된 외인성 핵산 서열에 의해 인코딩된 폴리펩티드에 대해 항원 특이적 면역 반응을 생성하기 위해 T 세포를 활성화시키는 데 효과적이다. 변형된 APC는 단핵구, 수지상 세포, 또는 이들의 조합일 수 있다. 일부 구현예에서, 변형된 APC는 단핵구로부터 분화되는 수지상 세포이다. 일부 구현예에서, 변형된 APC는 단리된 단핵구이다. 일부 구현예에서, 변형된 APC는 단리된 수지상 세포이다. 일부 구현예에서, 변형된 APC는 PBMC의 혼합물에 존재한다. 일부 구현예에서, 변형된 APC는 CD3+ T 세포와의 혼합물에 존재한다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 변형된 APC와 항원-특이적 T 세포의 혼합물을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 특이적 T 세포는 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포 또는 이들의 혼합물이다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물의 변형된 APC는 종양 항원, 종양 관련 항원, 종양 유전자 생성물, 바이러스 항원, 또는 박테리아 항원을 특이적으로 발현한다.
일부 구현예에서, 종양 항원, 종양 관련 항원, 또는 종양 유전자 생성물은 당업계에 공지된 임의의 이러한 항원성 폴리펩티드 또는 이의 단편일 수 있다. 종양 항원, 종양 관련 항원, 또는 종양 유전자 생성물의 예는 알파 태아단백질(AFP), B 흑색종 항원(BAGE/CT2.1), 분화 20의 클러스터(CD20), CD269, G250(탄산 탈수효소 IX/CA IX), HM1.24, CD 154, 전립선암 관련 항원(예: 전립선 특이적 항원(PSA), 전립선 특이적 막 항원(PSMA), 전립선 줄기 세포 항원(PSCA) 및 전립선 산 포스파타제(PAP) 항원), 유방암 관련 종양 관련 항원(예: 유방 상피 항원 46(BA46, 락타데린)), 암-고환 항원(CT) 패밀리(예: 뉴욕 식도 편평 세포 암종-1(NY-ESO-1)(CT6.1), ADAM2(CT15), SPA17(SP17, CT22), SPANX, 예를 들어, Spanx-Al(CT11.1)), 인간 흑색종 관련 항원(MAGE) 패밀리(예: MAGE-A1/CT1.1, MAGE-A2/CT1.2, MAGE-A3/CT1.3, MAGE-A4/CT1.4, MAGE-B1/CT3.1, MAGE-C1/CT7.1, MAGE-C2/CT10, MAGE-C3/CT7.2, MAGE-E1), MART 1, SAGE 1, 암배아 항원(CEA), HER-2/neu, 사이토케라틴 19 (CK19, KI 9, cyfra21-l), 서바이빈, 뮤신-1(MUC-1, CA15-3), 편평 세포 암종(SCC) 항원, 또는 이들의 임의의 항원성 단편 및/또는 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 바이러스 항원은 당업계에 공지된 임의의 바이러스 항원일 수 있다. 바이러스 항원의 예는 B형 간염 바이러스(HBV) 항원, C형 간염 바이러스(HCV) 항원, 인간 유두종 바이러스(HPV) 항원, 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 항원, 인플루엔자 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스(RSV), 사이토메갈로 바이러스(CMV), 엡스타인-바 바이러스(EBV), 단순 포진 바이러스(HSV), 유두종 바이러스, 홍역 바이러스, 로타바이러스, 또는 이들의 임의의 항원성 단편 및/또는 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, HPV 항원은 E6 폴리펩티드, E7 폴리펩티드, 또는 이들의 임의의 항원성 단편이다. 특정 구현예에서, 외인성 핵산 서열은 E6 폴리펩티드 및 E7 폴리펩티드, 또는 이들의 항원성 단편을 인코딩하는 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, E6 또는 E7 항원은 HPV 혈청형 16, 18, 30, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 61, 또는 이들의 임의의 항원성 단편 및/또는 조합으로부터 유래된다. 일부 구현예에서, HBV 항원은 HBsAg, HBeAg, HBcAg 및/또는 HBxAg이다. 일부 구현예에서, HCV 항원은 C, E1, E2, NS1, NS2, NS3, NS4 및/또는 NS5 항원이다. 일부 구현예에서, HIV 항원은 gag 항원, pol 항원 및/또는 env 항원이다. 일부 구현예에서, CMV 항원은 pp65 항원, pp150 항원, 및/또는 gB 항원이다. 일부 구현예에서, EBV 항원은 LMP-1 항원, LMP-2A 항원, LMP-2B 항원, EAR 항원, EAD 항원, VCA 항원, MA 항원, EBNA1 항원, EBNA2 항원, EBNA3 항원, EBNA3B 항원, 및/또는 EBNA3C 항원이다.
일부 구현예에서, 박테리아 항원은 당업계에 공지된 임의의 박테리아 항원일 수 있다. 박테리아 항원이 유도될 수 있는 박테리아의 예는 미코박테리움 투베르쿨로시스, 헬리코박터, 캄필로박터, 클로스트리디아, 코리네박테리움 디프테리아에, 보르데텔라 퍼투시스, 보렐리아 부르그도르페이, 플라스모듐, 비브리오 콜레라, 에쉐리키아 콜리, 시겔라, 살모넬라 티피 및 나이세리아 고노레아를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 특정 구현예에서, 미코박테리움 투베르쿨로시스 항원은 MPT44 항원, MPT45 항원, MPT59 항원, MPT64 항원, Ag85B 항원, Rv3117 항원 및/또는 ESAT-6 항원이다.
일부 구현예에서, 외인성 핵산 서열은 사이토카인을 인코딩한다. 사이토카인은 인터류킨, 인터페론, 종양 괴사 인자, 과립구 대식세포 콜로니-자극 인자(GM-CSF), 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 사이토카인의 예는 GM-CSF, TNF-α, IL-12, IL-4, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18, TGF-β, 당업계에 공지된 다른 Th1 사이토카인, 예를 들어, IFNγ, IL-2, IL-10, IL-18, 및 IL-27, 당업계에 공지된 다른 Th2 사이토카인, 예를 들어, IL-5, IL-9, IL-10, IL-13, IL-25 및 암피레굴린, 및/또는 이들의 임의의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본원에 개시된 rAAV 비리온, 변형된 APC, 및 활성화된 T 세포는 질환 및 장애를 치료하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 임의의 rAAV 비리온의 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하여 면역 반응을 자극하는 단계를 포함하는, 면역요법의 방법이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 임의의 rAAV 벡터를 포함하는 임의의 세포(예: 단리된 세포) 및/또는 본원에 개시된 임의의 약제학적 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하여 면역 반응을 자극하는 단계를 포함하는, 면역요법의 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 임의의 변형된 APC에 의해 활성화된 항원 특이적 T 세포 집단 및 본원에 기재된 임의의 rAAV 벡터에 의해 인코딩된 항원을 발현하는 표적 세포의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 면역요법의 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 집단 PBMC의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 면역요법의 방법이 제공되며, 여기서 PBMC는 본원에 기재된 임의의 변형된 APC에 의해 활성화된 항원 특이적 T 세포 및 본원에 기재된 임의의 rAAV 벡터에 의해 인코딩된 항원을 발현하는 표적 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 대상체는 인간이다. 일부 구현예에서, 단리된 세포의 집단은 치료될 또는 치료 중인 대상체로부터 수득된 샘플로부터 유래되었다.
일부 구현예에서, 말초 정맥혈은 치료될 환자(예: 암 환자)로부터 수집되고, 말초 혈액 단핵 세포를 단리시키는 데 사용될 수 있다. 단리된 말초 혈액 단핵 세포는 시험관내(예: 세포 배양 플레이트 또는 페트리 접시)에서 배양될 수 있고, 이어서 말초 혈액 단핵 세포에서 단핵구는 말초 혈액 림프구로부터 분리될 수 있다. 이어서, 단핵구는 본원에 제공된 rAAV 비리온에 의해 감염된 다음, 사이토카인(들)의 존재하에서 DC로 분화될 수 있다. 성숙 후(예를 들어, 6일 동안 배양됨), DC를 수집하고 기재된 바와 같이 제조된 말초 혈액 림프구의 배양물에 첨가하여 혼합 배양물을 생성할 수 있다. 혼합 배양물이 충분한 시간 동안 배양된 후(예: 6 내지 12일), 혼합 배양물 중 세포독성 T 림프구(CTL)를 수확하고 환자에게 투여할 수 있다(예: 정맥내 투여를 통해).
일부 관련 구현예에서, 말초 정맥혈은 치료될 환자(예: 암 환자)로부터 수집되고, 말초 혈액 단핵 세포를 단리시키는 데 사용될 수 있다. 단리된 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)는 본원에 제공된 rAAV 비리온에 의해 감염될 수 있고, 감염된 PBMC의 단핵구는 사이토카인(예: GM-CSF, IL-4 및 TNF-α)의 존재하에 DC로 후속적으로 분화될 수 있다. 또한, 사이토카인(예: IL-2 및 IL7)을 배양된 PBMC에 첨가하여 CTL을 활성화시킬 수 있다. 이어서, PBMC로부터 수확된 활성화된 CTL 또는 활성화된 CTL을 포함하는 생성되는 PBMC는 환자에게 투여될 수 있다(예: 정맥내 투여를 통해).
일부 구현예에서, 본 개시내용은 다음을 포함하는, 면역요법의 방법을 제공한다:
a. 대상체의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 본원에 제공된 rAAV 비리온으로 감염시켜 감염된 PBMC를 생성하는 단계,
b. 감염된 PBMC의 단핵구를 수지상 세포(DC)로 분화시키기 위한 분화성 사이토카인(예: GM-CSF, IL-4 및 TNF-α)을 첨가하는 단계,
c. 감염된 PBMC의 세포독성 T 림프구(CTL)를 활성화시키는 활성화 사이토카인(예: IL-2 및 IL7)을 첨가하여 활성화된 CTL을 생성하는 단계,
d. 임의로 감염된 PBMC로부터 활성화된 CTL을 단리시키는 단계, 및
e. 활성화된 CTL 또는 단리되고 활성화된 CTL을 포함하는 감염된 PMBC의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계.
일부 구현예에서, 이를 필요로 하는 대상체는 암, 종양, 바이러스 감염, 또는 박테리아 감염으로 진단되어 있다.
일부 구현예에서, 암은 급성 림프구성 암(acute lymphocytic cancer), 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia), 폐포 횡문근육종(alveolar rhabdomyosarcoma), 방광암(bladder cancer), 골암(bone cancer), 뇌암(brain cancer), 유방암(breast cancer), 항문, 항문관, 직장의 암(cancer of the anus, anal canal, rectum), 눈의 암(cancer of the eye), 간내 담관의 암(cancer of the intrahepatic bile duct), 관절의 암(cancer of the joints), 목, 담낭, 또는 흉막의 암(cancer of the neck, gallbladder, or pleura), 코, 비강, 중이의 암(cancer of the nose, nasal cavity, or middle ear), 구강의 암(cancer of the oral cavity), 외음부의 암(cancer of the vulva), 만성 림프구성 백혈병(chronic lymphocytic leukemia), 만성 골수성 암(chronic myeloid cancer), 결장암(colon cancer), 식도암(esophageal cancer), 자궁경부암(cervical cancer), 섬유육종(fibrosarcoma), 위장관 카르시노이드 종양(gastrointestinal carcinoid tumor), 호지킨 림프종(Hodgkin lymphoma), 하인두암(hypopharynx cancer), 신장암(kidney cancer), 후두암(larynx cancer), 백혈병(leukemia), 액체 종양(liquid tumors), 간암(liver cancer), 폐암(lung cancer), 림프종(lymphoma), 악성 중피종(malignant mesothelioma), 비만세포종(mastocytoma), 흑색종(melanoma), 다발성 골수종(multiple myeloma), 비인두암(nasopharynx cancer), 비호지킨 림프종(non-Hodgkin lymphoma), 난소암(ovarian cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 복막, 장막, 장간막 암(peritoneum, omentum, and mesentery cancer), 인두암(pharynx cancer), 전립선암(prostate cancer), 직장암(rectal cancer), 신장암(renal cancer), 피부암(skin cancer), 소장암(small intestine cancer), 연조직암(soft tissue cancer), 고형 종양(solid tumors), 위암(stomach cancer), 고환암(testicular cancer), 갑상선암(thyroid cancer), 요관암(ureter cancer) 및/또는 요로 방광암(urinary bladder cancer)이다. 일부 구현예에서, 암은 AFP-양성 간암; BA46-양성 유방암; CT2.1-양성 악성 흑색종 폐암, 위암, 또는 기타 CT2.1-양성 악성 암; CEA-양성 폐암, 결장암, 유방암, 또는 기타 CEA-양성 암; CD20-양성 악성 흉선종, 림프종, 골수종 및 기타 CD20-양성 육종; CD269-양성 간암, CK19-양성 폐암, 결장암, 유방암 및 기타 CK19-양성 암; G250-양성 악성 위장관 종양, 신장암, 흑색종 및 기타 G250-양성 암; HPV-16 E6-양성 자궁경부암 및 기타 HPV-16 E6-양성 악성 종양; HPV-16 E7-양성 자궁경부암 및 기타 HPV-16 E7-양성 악성 종양; HPV-16 E6 및 E7-양성 자궁경부암 및 기타 HPV-16 E6 및 E7-양성 악성 종양; HPV-18 E6-양성 자궁경부암 및 기타 HPV-18 E6-양성 악성 종양; HPV-18 E7-양성 자궁경부암 및 기타 HPV-18 E7-양성 악성 종양; HPV-18 E6 및 E7-양성 자궁경부암 및 기타 HPV-18 E6 및 E7-양성 악성 종양; HER2/neu-양성 유방암, 폐암, 위장관 종양, 신장암, 흑색종 및 기타 HER2/neu-양성 악성 종양; HM1.24-양성 다발성 골수종, 골수종, 및 림프종; LMP-1-양성 비인두 암종 및 림프종; MAGE-A1-양성 폐암, 위장관 종양, 신장암, 흑색종 및 기타 MAGE-A1-양성 악성 종양; MAGE-A2-양성 폐암, 위장관 종양, 신장암, 흑색종 및 기타 MAGE-A2-양성 악성 종양; MAGE-A4-양성 폐암, 위장관 종양, 신장암, 흑색종 및 기타 MAGE-A4-양성 악성 종양; MAGE-B1-양성 폐암, 위장관 종양, 신장암, 흑색종 및 기타 MAGE-B1-양성 악성 종양; MAGE-C1-양성 폐암, 위장관 종양, 신장암, 흑색종 및 기타 MAGE-C1-양성 악성 종양; MAGE-C1-양성 폐암, 위장관 종양, 신장암, 흑색종 및 기타 MAGE-C1-양성 악성 종양; MART 1-양성 흑색종 및 기타 MART 1-양성 악성 종양; MUC-1-양성 악성 종양; NY-ESO-1-양성 악성 종양; PSA-양성 전립선암; PAP-양성 전립선암; PSMA-양성 전립선암, 폐암, 유방암, 신장암 및 기타 PSMA-양성 악성 종양; PSCA-양성 전립선암; SAGE 1-양성 육종, 흑색종 및 기타 SAGE 1 악성 종양; SCC-양성 편평 세포 암종; SPAX-A1-양성 선암종, 육종 및 흑색종; SPA 17-양성 선암종, 육종 및 흑색종; 및 서바이빈-양성 악성 종양이다.
일부 구현예에서, 바이러스 감염은 B형 간염 바이러스(HBV), C형 간염 바이러스(HCV), 인간 유두종 바이러스(HPV), 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 인플루엔자 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스(RSV), 사이토메갈로 바이러스(CMV), 엡스타인-바 바이러스(EBV), 단순 포진 바이러스(HSV), 유두종 바이러스, 홍역 바이러스, 또는 로타바이러스에 의한 감염이다.
일부 구현예에서, 박테리아 감염은 미코박테리움 투베르쿨로시스, 헬리코박터, 캄필로박터, 클로스트리디아, 코리네박테리움 디프테리아에, 보르데텔라 퍼투시스, 보렐리아 부르그도르페이, 플라스모듐, 비브리오 콜레라, 에쉐리키아 콜리, 시겔라, 살모넬라 티피, 및 나이세리아 고노레아에 의한 감염이다.
실시예
실시예 1
예시적인 pAAV-CD14p의 생산
본 개시내용 이전에 대부분의 재조합 아데노 관련 바이러스 벡터의 공통적인 특징은 프로모터가 구성적 프로모터, 예를 들어, CMV 프로모터, SV40 조기 프로모터, AAV p5 프로모터 및 기타라는 것이었다. 이전의 rAAV 벡터에 의해 도입된 외인성 유전자는 다양한 인간 세포에서 발현될 수 있다. 그러나, 본 개시내용에서 기재된 예시적인 pAAV-CD14p 벡터는 이러한 프로모터를 갖지 않는다. 오히려, 현재 개시된 rAAV 벡터는 조직 특이적 또는 세포 특이적인 CD14 프로모터를 갖는다. 본원에 제공된 rAAV 벡터에 의해 운반된 외인성 유전자는 CD14+ 세포, 예를 들어, 단핵구 및 DC에서 특이적으로 발현되는 한편, CD14-음성(CD14-) 세포에서 유의한 및/또는 검출 가능한 발현을 갖지 않는다.
도 1은 예시적인 AAV/인간 CD14 프로모터 벡터 (예시적인 pAAV-CD14p)의 개략도를 제공한다. 이 rAAV 벡터는 인간 CD14 전사 프로모터(614bp), AAV 유형 2 역전된 말단 반복(ITR) 서열(각각 145 염기), 다중 클로닝 부위 서열(MCS), SV40 후기 폴리-A 서열(256bp), 베타 락타마아제 유전자(암피실린 내성 유전자, Ampr), 및 플라스미드가 이. 콜리에서 복제할 수 있도록 하는 유전자 요소(예: DH5α)로 구성된다.
예시적인 rAAV 벡터는 다음과 같이 제조하였다: 완전한 AAV-2 게놈을 함유하는 pCAAV-2 플라스미드를 제조하고 출발점으로서 사용하였다. AAV-2 게놈 서열(GenBank: J01901.1)을 참조로서 사용하여, pCAAV-2 플라스미드를 2개의 제한 엔도뉴클레아제(BmgB I 및 SnaB I)로 소화하여 nt 165에서 nt 4493까지 AAV-2의 프로모터 및 구조적 유전자(Rep 및 Cap)를 모두 결실시켜 바이러스 ITR 서열만이 유지되도록 하였다(nt 1-164 및 nt 4494-4675).
인간 CD14 게놈 서열(GenBank: HQ199230.1)은 CD14 프로모터를 표적으로 하는 PCR 프라이머를 적제하기 위한 참조로서 사용하였다. 프라이머 서열은 아래에 제공된다:
상류 프라이머: 5'- atgacgtg gtgccaacagatgaggttc-3'(서열번호 4; nt 2986-3004; BmgB I 링커);
하류 프라이머: 5'- attacgtagcagatctagtctctaga ggtcgataagtcttccgaac-3'(서열번호 3; nt 3599-3580; MCS(SnaB I, Bgl II, Xba I) 링커).
총 DNA를 인간 단핵구로부터 단리시키고, CD14 프로모터 DNA를 고충실도 PCR로 증폭시켰다(도 2). 정제된 CD14 프로모터 DNA를 제한 엔도뉴클레아제 BmgB I 및 SnaB I로 소화한 다음, 제한 엔도뉴클레아제-소화된 pCAAV-2 플라스미드로 결찰시켰다. 다음으로, SV40 후기 폴리A DNA 서열을 플라스미드(도 3)에 삽입하여 예시적인 pAAV-CD14p 벡터를 생성하였다.
예시적인 pAAV-CD14p 플라스미드에 CD14 프로모터의 삽입을 제한 효소 소화 분석에 의해 확인하였다. 구체적으로, 예시적인 pAAV-CD14p를 BmgB I 및 SnaB I로 소화하고, 겔 전기영동을 수행하였다. 도 4는 CD14 프로모터 DNA에 대한 정확한 크기의 밴드를 나타낸다. 또한, 예시적인 pAAV-CD14p가 서열분석되어 인간 CD14 프로모터가 정확하게 위치되었고, 돌연변이가 도입되지 않았음을 확인하였다(참조: 도 5에서 벡터의 CD14 프로모터 서열과 GenBank: (HQ199230.1)의 DNA 서열 사이의 정렬). 본원에 제공된 예시적인 pAAV-CD14p 플라스미드는 편리하게 변형되어 MCS (예: pAAV-CD14p/외인성 유전자)에 외인성 유전자를 삽입할 수 있다.
실시예 2
감염성 비리온의 생산
아데노 관련 바이러스는 본질적으로 헬퍼 바이러스(예: 아데노바이러스)가 감염성 비리온으로 조립될 필요가 있는 복제-결함 바이러스이다. 도 6은 야생형 헬퍼 바이러스 없이 복제 적격 AAV-2의 오염 없이 감염성 rAAV(rAAV-CD14p/외인성 유전자) 비리온을 제조하는 개략도를 도시한다. p헬퍼 플라스미드를 작제하고, AAV 비리온 조립에 필요한 아데노바이러스 유형 5의 VA, E2A, E3 및 E4 유전자 및 AAV 유형 2의 Rep 및 Cap 유전자를 함유한다. pAAV-CD14/외인성 유전자 플라스미드는 p헬퍼 플라스미드와 함께 HEK 293 세포로 공동-형질감염시켰다. 감염성 rAAV 비리온은 형질감염된 세포의 배양 72시간 내지 96시간 후에 생성되었다. rAAV 비리온의 역가를 도트 블롯 혼성화 검정을 사용하여 검출하였다. 인간 CD14 프로모터를 표적으로 하는 디곡시게닌(DIG)-표지된 DNA 프로브를 사용하여 rAAV 비리온을 검출하고 로딩 표준과 비교하였다. 도 7은 감염성 rAAV 비리온의 높은 역가를 나타낸다. 따라서, 본 데이터는 예시적인 pAAV-CD14p 및 p헬퍼 플라스미드 시스템이 세포 배양에서 rAAV 비리온을 효과적으로 생성했음을 입증한다.
실시예 3
단핵구의 단리 및 수지상 세포로의 분화
말초 정맥혈은 대상체로부터 채취하였다. PBMC를 피콜을 이용하여 말초 정맥혈로부터 분리하였다. 일부 실험에서, 단핵구는 비-부착성 세포(림프구)로부터 부착성 세포(단핵구)를 분리하기 위한 배양 방법을 사용하여 PBMC로부터 분리시켰다. 간략하게, PBMC를 세포 배양 배지(AIM-V 배지 GIBCO)에 현탁시키고 조직 배양 플라스크에 첨가하였다. 그 후, 단핵구가 플라스크의 바닥에 부착될 때까지 PBMC를 37℃, 5% CO2에서 2 내지 4시간 동안 배양하였다. 비-부착성 세포(림프구)를 제거하고 추가 실험을 위해 저장하였다. 부착성 세포(단핵구)는 배양물에 유지시켰다. 대안으로서, 일부 실험에서 단핵구를 멸균 항-CD14 항체-표지된 자성 비드를 사용하여 PBMC로부터 분리하였다. 이러한 과정은 단핵구를 함유하는 분획 및 PBMC로부터의 림프구를 함유하는 분획을 초래하였다.
다음으로, 단핵구를 GM-CSF, IL-4 및 TNF-α를 포함하는 사이토카인을 첨가하여 DC로 분화시켜 단핵구가 DC로 분화하도록 연속적으로 유도하였다. 0일째에, GM-CSF(800 IU/mL) 및 IL-4(1000 IU/mL)를 배양 배지에 첨가하였다. 배지를 2일 마다 신선한 배지와 사이토카인으로 교체하였다. 5일째에, TNF-α(100 IU/mL)를 배지에 첨가하였다. 분화 배양은 세포 배양 6일째에 성숙한 DC를 초래하였다.
실시예 4
CD14 프로모터는 CD14 발현 세포에서 외인성 유전자 발현을 특이적으로 유도한다
다음으로, 외인성 유전자의 발현을 위한 CD14 프로모터의 특이성을 시험하였다. 먼저, eGFP를 실시예 1에 기재된 바와 같은 예시적인 pAAV-CD14p 플라스미드로 클로닝하여 pAAV-CD14p/eGFP를 생성하였다. 다음으로, 감염성 비리온은 pAAV-CD14p/eGFP 및 p헬퍼를 기재된 바와 같은 HEK 293 세포로 공동 형질감염시킴으로써 생성시키고, rAAV-CD14p/eGFP 비리온을 수집하였다.
다음으로, CD14+ 단핵구 및 DC를 AAV-CD14p/eGFP 바이러스로 형질도입하였다. C14- 말초 혈액 림프구 및 HEK 293 세포를 대조군으로서 rAAV-CD14p/eGFP 바이러스로 형질도입하였다. eGFP의 발현은 형광 현미경법으로 평가하였다. 세포가 rAAV-CD14p/eGFP 바이러스로 감염된 지 72시간 후, eGFP는 CD14+ 단핵구 및 수지상 세포에서 특이적으로 발현되었고, CD14- 림프구 및 HEK 293 세포에서는 발현되지 않았다(도 8). 따라서, 데이터는 CD14 프로모터가 CD14+ 세포에서 외인성 유전자 생성물의 발현을 특이적으로 유도했음을 입증한다.
실시예 5
rAAV-CD14p/항원 비리온에 의해 형질도입된 단핵구 및 수지상 세포에서 항원의 발현
암 항원의 발현을 시험하기 위해, rAAV-CD14p/항원 비리온은 각각 PSA, PSMA, PAP, CEA, CK19, MAGE-A3, 서바이빈, 또는 Muc-1을 인코딩하는 DNA 서열을 기재된 방법을 사용하여 실시예 1에 기재된 바와 같은 예시적인 pAAV-CD14p 플라스미드로 클로닝함으로써 생성하였다. 이러한 비리온은 각각 rAAV-CD14p/PSA, rAAV-CD14p/PSMA, rAAV-CD14p/PAP, rAAV-CD14p/CEA, rAAV-CD14p/CK19, rAAV-CD14p/MAGE-A3, rAAV-CD14p/서바이빈 및 rAAV-CD14p/Muc-1로서 지칭된다.
단핵구 및 DC에서 항원 페이로드의 CD14 프로모터(CD14p) 매개 발현을 평가하기 위해 단핵구를 rAAV-CD14p/항원 비리온으로 형질도입하고 배양물 중 DC로 분화시켰다. 먼저, PBMC를 인간 대상체의 말초 정맥혈로부터 수득하였다. 단핵구를 실시예 3에 기재된 바와 같이 PBMC로부터 분리하고, 세포 배양 배지에서 배양하였다. 단핵구를 분리한 후, 상이한 rAAV-CD14p/항원 바이러스를 즉시 첨가하여 MOI 50에서 단핵구 배양물을 분리하고, 사이토카인을 실시예 3에 기재된 바와 같이 배양 배지에 첨가하여 단핵구가 DC로 분화하도록 유도하였다.
상이한 rAAV-CD14p/항원 비리온에 의해 형질도입된 단핵구 및 DC에서 항원의 발현은 유세포 분석법을 사용하여 형질도입 세포 배양 후 3일째에 평가하였다. 유세포 분석법의 결과는 세포의 항원의 발현률이 79.6% 내지 91.7% 범위임을 보여준다(도 9). 데이터는 항원 발현 속도가 높았고, rAAV-CD14p/항원 비리온의 형질도입 효율도 또한 높았음을 나타낸다.
실시예 6
rAAV-CD14p/사이토카인 비리온에 의해 형질도입된 수지상 세포에서 사이토카인의 발현
사이토카인의 발현을 시험하기 위해, rAAV-CD14p/사이토카인 비리온은 각각 GM-CSF 또는 IL-4를 인코딩하는 DNA 서열을 기재된 방법을 사용하여 예시적인 pAAV-CD14p 플라스미드로 클로닝하여 생성하였다. 이러한 비리온은 각각 rAAV-CD14p/GM-CSF 및 rAAV-CD14p/IL-4로서 지칭된다. CD14 프로모터가 아닌 구성적 p5 프로모터 또는 CMV 프로모터, 즉 rAAV-p5/GM-CSF 및 rAAV-CMVp/IL-4를 포함하는 대조군 벡터도 또한 생산하였다.
단핵구를 PBMC로부터 분리하고, rAAV-CD14p/사이토카인 비리온으로 형질도입시키고, 기재된 바와 같이 GM-CSF, IL-4 및 TNF-α와 함께 DC 분화 배양에서 배양하였다. 형질도입 후 5일째에, 일상적인 유세포 분석법을 사용하여 DC에서 사이토카인 유전자의 발현을 검출하였다(도 10). rAAV-CD14p/사이토카인 바이러스-형질도입된 DC에서 사이토카인 발현 수준은 형질도입되지 않은 대조군보다 상당히 더 높았다(p <0.05). 유세포 분석 결과는 또한 rAAV-CD14p/사이토카인 유전자 바이러스의 형질감염 효율이 높았다는 것을 입증한다. 놀랍게도, 구성적 p5 프로모터 또는 CMV 프로모터를 갖는 rAAV 비리온의 형질도입 효율은 rAAV-CD14p/사이토카인 유전자 바이러스보다 현저히 더 낮았다(p=0.02 내지 0.04).
실시예 7
rAAV-CD14p/항원-형질도입된 세포 상에서 수지상 세포 마커의 발현
항원 특이적 CTL의 DC 활성화에 중요한 마커의 발현을 유세포 분석법에 의해 평가하였다. 인간 CD1a, CD40, CD80 및 CD86은 DC의 마커이다. CD1a는 분화 초기에 발현된 DC 마커이다. CD1a+ DC는 자극시 상당량의 IL-12 p70을 생산하고, IFN-γ-생산 CD4+ T 세포를 생성한다. CD40, CD80 및 CD86 분자는 T 세포의 DC 자극을 위한 중요한 공자극성 분자의 역할을 한다. CD80, CD86 및 CD40의 증가된 발현은 견고한 CTL 반응을 생성하는데 기여한다. CD40-CD40L은 한 쌍의 공자극성 분자이고, 그들의 상호 작용은 성공적인 적응성 면역 반응, 특히 CD8+ CTL의 개발에 중요하다. CD80은 DC 기능 및 CTL 활성화에서 중요한 구성 요소이다. DC 상의 MHC 클래스 II-펩티드 복합체가 T 헬퍼 세포 상의 수용체와 상호 작용할 때, CD80은 CD28을 통해 DC 및 CD8+ T 림프구 사이의 상호작용을 허용한다. CD28을 통한 상호작용은 T 림프구 분화를 CTL로 신호화하는 것을 돕는다. CD86은 T 림프구 활성화 및 생존에 중요한 공자극성 신호를 제공한다.
도 11은 rAAV-CD14p/항원 비리온에 의해 형질도입된 DC의 CD1a, CD40, CD80 및 CD86 수준이 매우 높았음을 보여준다. rAAV-형질도입된 DC의 CD 마커의 높은 발현 수준은 DC가 면역 반응, 특히 항원 특이적 CTL 반응을 자극하는 기능을 할 수 있음을 나타낸다.
실시예 8
rAAV-형질도입된 DC에서 IL-12 및 IL-10 발현
IL-12 및 IL-10의 발현은 rAAV-CD14p/항원 비리온으로 형질도입된 DC에서 측정하였다. IL-12 및 IL-10은 DC 매개 면역 반응에서 대조적인 역할을 하는 것으로 생각된다. DC에서 IL-12의 높은 발현은 Thl 반응을 향상시키고 CTL 증식을 증가시키는 것으로 생각된다. 대조적으로, IL-10의 발현은 Th2 반응을 향상시키는 것으로 생각된다. rAAV-CD14p/HPV16 E6-E7 또는 rAAV-CD14p/PSCA 비리온으로 형질도입된 DC는 AAV 유형 p5 프로모터 또는 CMV 프로모터를 갖는 비리온, 즉 rAAV-p5/HPV16 E6-E7 또는 rAAV-CMVp/PSCA로 형질도입된 DC와 비교하였다. P5 프로모터 또는 CMV 프로모터는 CD14-음성 세포를 포함하는 다양한 인간 세포에서 외인성 유전자를 발현할 수 있다. 단핵구를 PBMC로부터 분리하고, rAAV 비리온으로 형질도입하고, 기재된 바와 같이 DC로 분화시켰다. 도 12에 도시된 바와 같이, rAAV-CD14p/항원 비리온 형질도입된 DC에 의해 발현된 IL-12의 수준은 대조군보다 상당히 더 높았다(p <0.05).
데이터는 단핵구 및 DC가 rAAV-CD14p/항원 유전자 바이러스에 의해 형질감염된 후 IL-12의 발현 수준은 상향 조절되었고, IL-10의 발현 수준은 하향 조절되었음을 나타낸다. rAAV-CD14p/항원 비리온-형질도입된 DC는 AAV 유형 p5 프로모터 또는 CMV 프로모터를 갖는 rAAV에 의해 형질감염된 DC보다 항원 특이적 CTL의 사멸 능력을 향상시키는데 더 효율적이었다.
실시예 9
단핵구의 DC로의 분화 효율
인간 CD14+ 단핵구를 기재된 바와 같이 GM-CSF, IL-4 및 TNF-α의 존재하에 배양하여 세포를 DC로 분화시켰다. 세포 배양 6일째에, 많은 수의 DC가 검출되었다. 분화 효율을 평가하기 위해, 배양물에 잔류하는 단핵구의 수를 유세포 분석법으로 검출하였다. 결과는 rAAV-CD14p/항원 비리온에 의해 형질도입된 잔류하는 단핵구의 수가 rAAV-p5/항원 비리온 또는 rAAV-CMVp/항원 비리온에 의해 형질도입된 잔류하는 단핵구의 수보다 상당히 더 낮았음(p <0.05)을 보여주었다(도 13). 이러한 결과는 예기치 않게 인간 CD14+ 단핵구를 rAAV-CD14p/항원 비리온으로 형질도입시킴으로써, 더 많은 DC가 수득될 수 있음을 나타낸다.
실시예 10
림프구에서 IFN-γ 발현의 DC 유도
Thl 반응을 활성화하는 rAAV 형질도입된 DC의 능력을 DC 세포를 림프구와 공동 배양하고 IFN-γ 발현을 측정함으로써 평가하였다. IFN-γ는 중요한 Thl 사이토카인이다. T 림프구에 의한 IFN-γ의 발현은 항원-양성 표적 세포를 사멸시키는 항원 특이적 CTL의 능력과 양성적으로 상관관계가 있다.
단핵구를 rAAV-CD14p/항원 비리온 또는 rAAV-CMVp/항원 비리온으로 형질도입하고, 6일 동안 기재된 바와 같이 분화 배양에서 배양하였다. 단핵구는 rAAV-CD14p/HPV18 E6-E7, rAAV-CD14p/CEA, rAAV-CD14p/MAGE-C2, rAAV-CMVp/HPV18 E6-E7, rAAV-CMVp/CEA 또는 rAAV-CMVp/MAGE-C2로 형질감염시켰다. 세포 배양 6일째에, DC를 수확하고, 단핵구와 동일한 공여체로부터 수확된 림프구와 혼합하였다. DC 및 림프구를 IL-7(80 IU/mL) 및 IL-2(100 IU/mL)의 존재하에서 공동 배양하였다. 배지 및 사이토카인은 2일마다 교체하였다. 세포 배양 14일째에, 림프구를 수확하고, IFN-γ의 발현 수준을 유세포 분석법으로 측정하였다.
결과는 rAAV-CD14p/항원 유전자 바이러스-형질감염된 DC에 의해 활성화된 T 림프구에 의해 발현된 IFN-γ 수준이 rAAV-CMVp/항원 유전자 바이러스-형질감염된 DC에 의해 활성화된 T 림프구에 의해 발현된 IFN-γ 수준보다 상당히 더 높았음을 나타낸다(도 14; p<0.05). 이는 rAAV-CMVp/항원 DC의 수와 비교하여 rAAV-CD14p/항원 형질도입된 DC의 수가 더 많아 CTL의 생성이 증가하기 때문일 수 있다. 즉, CD14 프로모터를 갖는 rAAV는 놀랍게도 림프구가 IFN-γ를 발현하도록 유도하는 데 더 효율적이다.
실시예 11
CD69 및 CD8의 림프구 발현
CD69 및 CD8의 발현 수준은 rAAV-CD14/항원 비리온 형질도입된 DC와 공동 배양된 T 림프구에서 평가하였다. CD69는 CTL(CD8+ T 림프구)의 조기 활성화의 마커이다. 단핵구를 rAAV-CD14p/항원 비리온, rAAV-CMVp/항원 비리온 또는 rAAV-p5/항원 비리온으로 형질도입하고, 6일 동안 기재된 바와 같이 분화 배양에서 배양하였다. 보다 구체적으로, 단핵구는 rAAV-CD14p/HPV16 E6-E7, rAAV-CD14p/CK19, rAAV-CD14p/BA46, rAAV-CMVp/HPV16 E6-E7, rAAV-p5/CL19, 또는 rAAV-CMVp/BA46으로 형질도입시켰다. 세포 배양 6일째에, DC를 수확하고, 단핵구와 동일한 공여체로부터 수확된 림프구와 혼합하였다. DC 및 림프구를 기재된 바와 같이 IL-7 및 IL-2의 존재하에서 공동 배양하였다. DC 및 T 림프구 공동 배양 14일째에, 유세포 분석법을 사용하여 T 세포 집단에서 CD69+/CD8+ T 림프구의 수를 검출하였다.
결과는 rAAV-CD14p/항원 유전자 바이러스-형질감염된 DC에 의해 활성화된 CD69+/CD8+ T 림프구의 수가 rAAV-p5/항원 유전자 바이러스 또는 rAAV-CMVp/항원 유전자 바이러스-형질감염된 DC에 의해 활성화된 CD69+/CD8+ T 림프구의 수보다 훨씬 더 많다는 것을 보여주었다(도 15). 데이터는 rAAV-CD14p/항원 비리온이 표적 세포에 대해 강력한 사멸 활성을 갖는 T 림프구를 생성하는 데 있어서 p5 또는 CMV 구동 비리온보다 더 효율적임을 나타낸다.
실시예 12
표적 세포의 세포독성 T 림프구 사멸
단핵구를 rAAV 비리온에 의해 형질도입하고 기재된 바와 같이 DC로 분화시켰다. DC를 기재된 바와 같은 공여체 림프구와 함께 공동 배양하였다. 단핵구는 rAAV-CD14p/HPV16 E6-E7, rAAV-CD14p/PSMA 또는 rAAV-CD14p/MAGE-A3으로 형질도입하였다. DC 및 T 림프구 공동 배양 14일째에, 세포를 수확하였다. CTL은 각각의 바이러스 또는 종양 항원을 발현하는 종양 조직으로부터 단리된 세포, 즉 HPV-16 E6 및 E7 항원 양성 자궁경부암 세포, PSMA 양성 전립선암 세포, 및 MAGE-A3 양성 비소세포 폐 선암종 세포와 공동 배양하였다. 일상적인 크롬(51Cr) 방출 검정을 사용하여 rAAV-CD14p/항원 형질도입된 DC에 의해 프라이밍된 CTL의 사멸 활성을 분석하였다.
도 16은 rAAV-CD14p/항원 형질도입된 DC에 의해 프라이밍된 CTL의 종양 항원양성 및 바이러스 항원 양성 표적 세포의 1시간 사멸의 백분율이 약 50.2% 내지 67.2%였음을 보여준다. 대조군 실험에서, CTL과의 공동 배양 6시간 전에 세포배양물에 항-인간 MHC 클래스 I 항체를 첨가하고, 종양 항원 양성 및 바이러스 항원-양성 표적 세포의 1시간 사멸의 백분율은 약 12.3 내지 16.6이었다. 따라서, 항-MHC-I 항체는 항원-양성 세포의 사멸을 극적으로 감소시켰다(도 16). 또한, 일련의 항원-음성 대조군 세포는 사멸되지 않았다(도 16). 결과는 rAAV-CD14p/항원 형질도입된 DC 세포가 MHC-I-제한 방식으로 표적 세포의 항원 특이적 CTL 사멸을 활성화할 수 있었음을 입증한다.
다음으로, rAAV-CD14p/HPV18 E6-E7, rAAV-CD14p/CEA, rAAV-CD14p/PSA, rAAV-CMVp/HPV18 E6-E7, rAAV-CMVp/CEA 또는 rAAV-CMVp/PSA로 형질도입된 DC에 의해 활성화된 CTL 사멸을 비교하였다. 변형된 DC를 생성하고, 기재된 바와 같이 공여체 림프구와 함께 공동 배양하였다. CTL은 각각의 바이러스 또는 종양 항원을 발현하는 종양 조직으로부터 단리된 세포, 즉 HPV-18 E6 및 E7 항원 양성 자궁경부암 세포, PSA 양성 전립선암 세포, 및 CEA 양성 비소세포 폐 선암종 세포와 함께 공동 배양하였다. 사멸 활성은 항원 발현 표적 세포와 CTL의 공동 배양 및 51Cr 방출 검정에 의해 평가하였다. rAAV-CD14p/항원-형질도입된 DC에 의해 유도된 CTL에 의해 사멸된 표적 세포의 백분율은 rAAV-CMVp/항원-형질도입된 DC에 의해 유도된 CTL에 의해 사멸된 표적 세포의 백분율보다 상당히 더 높았다(p <0.05)(도 17). 결과는 놀랍게도 rAAV-CMVp/항원 형질도입된 DC에 의해 활성화된 CTL보다 rAAV-CD14p/항원 형질도입된 DC에 의해 활성화된 CTL의 보다 견고한 항원 특이적 사멸 활성을 입증한다.
실시예 13
표적 세포의 세포독성 T 림프구 사멸
실험을 수행하여 PBMC의 혼합 배양물에서 rAAV-CD14p/항원 특이성을 평가하였다. 인간 PBMC는 주로 림프구와 적은 수의 단핵구로 구성된다. CD3은 T 림프구의 마커이다. 본 연구에서, 인간 PBMC는 rAAV로 직접 감염시켰다. rAAV는 rAAV-CD14p/항원 바이러스, rAAV-CMVp/항원 바이러스 또는 rAAV-p5/항원 바이러스였다. 보다 구체적으로, rAAV-CD14p/CK19, rAAV-CD14p/muc-l, rAAV-p5/CK19 또는 rAAV-p5/muc-1이다. GM-CSF, IL-4 및 TNF-α를 PBMC 배양물에 첨가하여 단핵구의 DC로의 분화를 촉진하였다. 배양 6일째에, IL-2 및 IL7을 기재된 바와 같이 첨가하였다. 세포 배양 배지 및 사이토카인은 2일마다 교체하였다. 14일째에, PBMC를 수확하고, CD3+ T 림프구의 수를 유세포 분석법으로 분석하였다.
결과(도 18)는 rAAV-CD14p/항원-형질도입된 PBMC 내의 CD3+ T 림프구의 수가 0일째에 형질도입 전 CD3+ 세포의 수와 비교하여 14일까지 증가했음을 입증한다. 대조적으로, rAAV-p5/항원- 및 rAAV-CMVp/항원-형질도입된 PBMC에서의 CD3+ 세포의 수는 상당히 감소되었다. rAAV-p5/항원 또는 rAAV-CMVp/항원-형질도입된 PBMC에서 감소된 CD3+ 세포의 수는 활성화된 CTL에 의한 표적 상, 조직외 사멸의 결과인 것으로 생각된다. p5 프로모터와 CMV 프로모터는 구성적 프로모터이고, 따라서 rAAV-p5/항원 또는 rAAV-CMVp/항원 비리온에 의해 형질도입된 CD3+ 세포는 또한 항원을 발현하고, 항원 특이적 CTL에 의해 표적화된다. 대조적으로, CD14 프로모터는 DC에서 항원의 발현을 특이적으로 유도한다. 따라서, rAAV-CD14p/항원 비리온이 CD3+ T 림프구를 감염시킬 수 있는 반면, CD3+ 세포는 항원을 발현하지 않고 배양물에서 항원 특이적 CTL에 의해 사멸되지 않는다.
따라서, 이 연구는 세포 면역요법에서 rAAV-CD14p/항원 비리온의 적용이 보다 안전하다는 것을 시사할 뿐만 아니라, CTL을 제조하기 위한 새롭고 신속한 방법을 제공한다. 연구 결과에 따라, PBMC는 PBMC로부터 단핵구를 먼저 분리하지 않고 CTL을 제조하기 위해 rAAV-CD14p/항원 유전자 바이러스에 의해 직접 감염될 수 있다. 대조적으로, DC에 의해 활성화된 CTL을 제조하는 이전의 방법은 PBMC로부터 단핵구를 분리하는 제1 단계를 필요로 하였다.
기재된 다양한 구현예를 결합하여 추가의 구현예를 제공할 수 있다. 본 명세서에서 지칭되고/되거나 2020년 10월 15일에 출원된 미국 가특허 출원 제63/092,239호를 포함하여 출원 데이터 시트에 나열된 미국 특허, 미국 특허 출원 간행물, 미국 특허 출원, 외국 특허, 외국 특허 출원 및 비특허 간행물은 모두 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. 구현예의 측면은 필요한 경우 또 다른 추가의 구현예를 제공하기 위해 다양한 특허, 출원 및 간행물의 개념을 사용하도록 변형될 수 있다.
이들 및 다른 변경이 상세한 설명에 비추어 구현예에 이루어질 수 있다. 일반적으로, 이하의 청구범위에서, 사용된 용어는 청구범위를 명세서 및 청구범위에 개시된 특정 구현예로 제한하는 것으로 해석되어서는 안 되지만, 이러한 청구범위가 허여되는 등가물의 전체 범위와 함께 모든 가능한 구현예를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 따라서, 청구범위는 본 개시내용에 의해 제한되지 않는다.
SEQUENCE LISTING <110> Aavocyte, Inc. <120> RECOMBINANT ADENO-ASSOCIATED VIRUS VECTORS WITH CD14 PROMOTER AND USE THEREOF <130> 100239.401WO <140> PCT <141> 2021-10-14 <150> US 63/092,239 <151> 2020-10-15 <160> 6 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 614 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD14 Promoter <400> 1 gtgccaacag atgaggttca caatctcttc cacaaaacat gcagttaaat atctgaggat 60 attcagggac ttggatttgg tggcaggaga tcaacataaa ccaagacaag gaagaagtca 120 aagaaatgaa tcaagtagat tctctgggat ataaggtagg gggattgggg ggttggatag 180 tgcagagtat ggtactggcc taaggcactg aggatcatcc ttttcccaca cccaccagag 240 aaggcttagg ctcccgagtc aacagggcat tcaccgcctg gggcgcctga gtcatcagga 300 cactgccagg agacacagaa ccctagatgc cctgcagaat ccttcctgtt acggcccccc 360 tccctgaaac atccttcatt gcaatatttc caggaaagga agggggctgg ctcggaggaa 420 gagaggtggg gaggtgatca gggttcacag aggagggaac tgaatgacat cccaggatta 480 cataaactgt cagaggcagc cgaagagttc acaagtgtga agcctggaag ccggcgggtg 540 ccgctgtgta ggaaagaagc taaagcactt ccagagcctg tccggagctc agaggttcgg 600 aagacttatc gacc 614 <210> 2 <211> 4151 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Exemplary pAAV-CD14p vector DNA sequence <400> 2 ggtaccgcta gcctgcaggg ggggggggcc cccttggcca ctccctctct gcgcgctcgc 60 tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggctttgc ccgggcggcc 120 tcagtgagcg agcgagcgcg cagagaggga gtggccaact ccatcactag gggttcctgg 180 aggggtggag tcgtgacatc agatccatgc ggccgcaccg tattaccgcc atgcatgtgc 240 caacagatga ggttcacaat ctcttccaca aaacatgcag ttaaatatct gaggatattc 300 agggacttgg atttggtggc aggagatcaa cataaaccaa gacaaggaag aagtcaaaga 360 aatgaatcaa gtagattctc tgggatataa ggtaggggga ttggggggtt ggatagtgca 420 gagtatggta ctggcctaag gcactgagga tcatcctttt cccacaccca ccagagaagg 480 cttaggctcc cgagtcaaca gggcattcac cgcctggggc gcctgagtca tcaggacact 540 gccaggagac acagaaccct agatgccctg cagaatcctt cctgttacgg cccccctccc 600 tgaaacatcc ttcattgcaa tatttccagg aaaggaaggg ggctggctcg gaggaagaga 660 ggtggggagg tgatcagggt tcacagagga gggaactgaa tgacatccca ggattacata 720 aactgtcaga ggcagccgaa gagttcacaa gtgtgaagcc tggaagccgg cgggtgccgc 780 tgtgtaggaa agaagctaaa gcacttccag agcctgtccg gagctcagag gttcggaaga 840 cttatcgacc agatctacga tctcgaggtc gagctgtcta gacgagcaga catgataaga 900 tacattgatg agtttggaca aaccacaact agaatgcagt gaaaaaaatg ctttatttgt 960 gaaatttgtg atgctattgc tttatttgta accattataa gctgcaataa acaagttaac 1020 aacaacaatt gcattcattt tatgtttcag gttcaggggg aggtgtggga ggttttttaa 1080 agcaagtaaa acctctacaa atgtggtact taaggatgta gataagtagc atggcgggtt 1140 aatcattaac tacaaggaac ccctagtgat ggagttggcc actccctctc tgcgcgctcg 1200 ctcgctcact gaggccgggc gaccaaaggt cgcccgacgc ccgggctttg cccgggcggc 1260 ctcagtgagc gagcgagcgc gcagagaggg agtggccaag gggggggggg gggggggggc 1320 ccccctgcag gaattcggat ccgtcgaccg atgcccttga gagccttcaa cccagtcagc 1380 tccttccggt gggcgcgggg catgactatc gtcgccgcac ttatgactgt cttctttatc 1440 atgcaactcg taggacaggt gccggcagcg ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct 1500 gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt 1560 atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc 1620 caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga 1680 gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata 1740 ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac 1800 cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg 1860 taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc 1920 cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag 1980 acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt 2040 aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaagaacagt 2100 atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg 2160 atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac 2220 gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca 2280 gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac 2340 ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac 2400 ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt 2460 tcgttcatcc atagttgcct gactccccgt cgtgtagata actacgatac gggagggctt 2520 accatctggc cccagtgctg caatgatacc gcgagaccca cgctcaccgg ctccagattt 2580 atcagcaata aaccagccag ccggaagggc cgagcgcaga agtggtcctg caactttatc 2640 cgcctccatc cagtctatta attgttgccg ggaagctaga gtaagtagtt cgccagttaa 2700 tagtttgcgc aacgttgttg ccattgctac aggcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg 2760 tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt 2820 gtgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc 2880 agtgttatca ctcatggtta tggcagcact gcataattct cttactgtca tgccatccgt 2940 aagatgcttt tctgtgactg gtgagtactc aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg 3000 gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaat acgggataat accgcgccac atagcagaac 3060 tttaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc 3120 gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt 3180 tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg 3240 aataagggcg acacggaaat gttgaatact catactcttc ctttttcaat attattgaag 3300 catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt gaatgtattt agaaaaataa 3360 acaaataggg gttccgcgca catttccccg aaaagtgcca cctgacgcgc cctgtagcgg 3420 cgcattaagc gcggcgggtg tggtggttac gcgcagcgtg accgctacac ttgccagcgc 3480 cctagcgccc gctcctttcg ctttcttccc ttcctttctc gccacgttcg ccggctttcc 3540 ccgtcaagct ctaaatcggg ggctcccttt agggttccga tttagtgctt tacggcacct 3600 cgaccccaaa aaacttgatt agggtgatgg ttcacgtagt gggccatcgc cctgatagac 3660 ggtttttcgc cctttgacgt tggagtccac gttctttaat agtggactct tgttccaaac 3720 tggaacaaca ctcaacccta tctcggtcta ttcttttgat ttataaggga ttttgccgat 3780 ttcggcctat tggttaaaaa atgagctgat ttaacaaaaa tttaacgcga attttaacaa 3840 aatattaacg cttacaattt gccattcgcc attcaggctg cgcaactgtt gggaagggcg 3900 atcggtgcgg gcctcttcgc tattacgcca gcccaagcta ccatgataag taagtaatat 3960 taaggtacgg gaggtacttg gagcggccgc aataaaatat ctttattttc attacatctg 4020 tgtgttggtt ttttgtgtga atcgatagta ctaacatacg ctctccatca aaacaaaacg 4080 aaacaaaaca aactagcaaa ataggctgtc cccagtgcaa gtgcaggtgc cagaacattt 4140 ctctatcgat a 4151 <210> 3 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Downstream primer with MCS linker (SnaB I, Bgl II, Xba I) <400> 3 attacgtagc agatctagtc tctagaggtc gataagtctt ccgaac 46 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Upstream primer with BmgBI linker <400> 4 atgacgtggt gccaacagat gaggttc 27 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Downstream primer for human CD14 promoter sequence <400> 5 ggtcgataag tcttccgaac 20 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Upstream primer for human CD14 promoter sequence <400> 6 gtgccaacag atgaggttc 19

Claims (76)

  1. 2개의 역전된 말단 반복(inverted terminal repeat; ITR) 서열을 인코딩(encoding)하는 재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV) 벡터 및 외인성 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 CD14 프로모터를 포함하는 폴리뉴클레오티드로서, CD14 프로모터가 CD14-발현 세포에서 특이적으로 외인성 핵산의 발현을 유도하는, 폴리뉴클레오티드.
  2. 제1항에 있어서, CD14 프로모터가 인간 CD14 프로모터 서열인, 폴리뉴클레오티드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, CD14 프로모터가 서열번호 1을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, CD14 프로모터가 서열번호 1의 위치 378-386, 위치 404-410, 및 위치 533-538에 적어도 뉴클레오티드를 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, CD14-발현 세포가 단핵구, 대식세포 또는 수지상 세포(dendritic cell)인, 폴리뉴클레오티드.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 벡터가 5' 내지 3' 방향으로 제1 ITR, 외인성 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 CD14 프로모터, 폴리아데닐화 신호 서열, 및 제2 ITR을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, ITR 서열이 AAV-2 ITR인, 폴리뉴클레오티드.
  8. 제6항에 있어서, 제1 ITR 서열 및 제2 ITR 서열이 AAV-2 ITR인, 폴리뉴클레오티드.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 벡터가 플라스미드인, 폴리뉴클레오티드.
  10. 제9항에 있어서, 플라스미드가 인간 CD14 전사 프로모터, AAV 유형 2 역전된 말단 반복(ITR) 서열, 다중 클로닝 부위(multiple cloning site) 서열(MCS), SV40 후기 폴리-A 서열(late poly-A sequence), 항생제 내성 유전자, 및 플라스미드가 숙주 세포에서 복제할 수 있게 하는 유전자 요소(gene element)를 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 벡터가 인핸서 영역(enhancer region)을 추가로 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 핵산 서열이 다중 클로닝 부위(MCS), 제한 효소 표적 서열, 및/또는 폴리펩티드를 인코딩하는 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  13. 제12항에 있어서, 외인성 핵산 서열이 폴리펩티드를 인코딩하는 서열을 포함하고, 폴리펩티드가 종양 항원, 종양 관련 항원, 종양 유전자 생성물, 바이러스 항원, 박테리아 항원, 사이토카인, 또는 이들의 임의의 조합의 전부 또는 일부를 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  14. 제13항에 있어서, 외인성 핵산 서열이 종양 항원, 종양 관련 항원, 또는 종양 유전자 생성물을 인코딩하는 서열을 포함하며, 종양 항원, 종양 관련 항원, 또는 종양 유전자 생성물이 알파 태아단백질(AFP), B 흑색종 항원(BAGE/CT2.1), 분화(Differentiation) 20의 클러스터(CD20), C269, G250(탄산 탈수효소 IX/CA IX), HM1.24, CD 154, 전립선암 관련 항원, 유방암 관련 종양 관련 항원, 암-고환 항원(CT) 패밀리의 구성원, 인간 흑색종 관련 항원(MAGE) 패밀리의 구성원, MART 1, SAGE 1, 암배아 항원(CEA), HER-2/neu, 사이토케라틴 19(CK19, K19, cyfra21-l), 서바이빈, 뮤신-1(MUC-1, CA15-3), 편평 세포 암종(SCC) 항원, 또는 이들의 임의의 항원성 단편 및/또는 조합인, 폴리뉴클레오티드.
  15. 제14항에서,
    (a) 전립선암 관련 항원이 전립선 특이적 항원(PSA), 전립선 특이적 막 항원(PSMA), 전립선 줄기 세포 항원(PSCA) 또는 전립선 산 포스파타제(PAP) 항원, 또는 이들의 임의의 항원성 단편 및/또는 조합이고;
    (b) 유방암 관련 종양 관련 항원이 유방 상피 항원 46(BA46, 락타데린) 또는 이들의 임의의 항원성 단편이고;
    (c) 암-고환 항원(CT) 패밀리의 구성원이 뉴욕 식도 편평 세포 암종-1(NY-ESO-1)(CT6.1), ADAM2(CT15), SPA17(CT22), 또는 SPANX-A1(CT11.1), 또는 이들의 임의의 항원성 단편 및/또는 조합이고; 또는
    (d) 인간 흑색종 관련 항원(MAGE) 패밀리의 구성원이 MAGE-A1/CT1.1, MAGE-A2/CT1.2, MAGE-A3/CT1.3, MAGE-A4/CT1.4, MAGE-B1/CT3.1, MAGE-C1/CT7.1, MAGE-C2/CT10, MAGE-C3/CT7.2, 또는 MAGE-E1 또는 이들의 임의의 항원성 단편 및/또는 조합인, 폴리뉴클레오티드.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 종양 항원, 종양 관련 항원, 또는 종양 유전자 생성물이 PSA, PSMA, PAP, PSCA, BA46, CEA, HER-2/neu, CK19, 서바이빈, MUC-1, SCC, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-C2, NY-ESO-1, ADAM2, SPA17, 또는 SPANX-A1 또는 이들의 임의의 항원성 단편 및/또는 조합인, 폴리뉴클레오티드.
  17. 제13항에 있어서, 외인성 핵산 서열이 바이러스 항원을 인코딩하는 서열을 포함하고, 바이러스 항원이 B형 간염 바이러스(HBV) 항원, C형 간염 바이러스(HCV) 항원, 인간 유두종 바이러스(HPV) 항원, 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 항원, 또는 이들의 임의의 조합인, 폴리뉴클레오티드.
  18. 제17항에 있어서, HPV 항원이 E6 항원 또는 E7 항원인, 폴리뉴클레오티드.
  19. 제18항에 있어서, E6 또는 E7 항원이 HPV 혈청형 16, 18, 30, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 61, 또는 이들의 임의의 조합으로부터 유래되는, 폴리뉴클레오티드.
  20. 제13항에 있어서, 외인성 핵산 서열이 사이토카인을 인코딩하는 서열을 포함하며, 사이토카인이 GM-CSF, TNF-α, TNF-β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-7, IL-9, TGF-β, IFNγ, IL-10, IL-13, IL-15, IL-18, IL-25, IL-27, 및 암피레굴린 또는 이들의 임의의 조합인, 폴리뉴클레오티드.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV) 비리온(virion).
  22. 제21항에 있어서, 비리온이 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, 또는 이들의 임의의 조합의 캡시드 단백질을 포함하는, rAAV 비리온.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서, 비리온이 AAV2의 캡시드 단백질을 포함하는, rAAV 비리온.
  24. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 비리온이 CD14 프로모터 이외의 프로모터 및 AAV 구조 유전자 중 하나 이상을 포함하지 않는, rAAV 비리온.
  25. 제24항에 있어서, AAV 구조 유전자가 AAV2의 Rep 및 Cap 유전자를 포함하는, rAAV 비리온.
  26. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 패키징 세포(packaging cell)에 도입하는 단계를 포함하는, rAAV 비리온을 생산하는 방법으로서, 패키징 세포가 헬퍼 유전자(helper gene)를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는, 방법.
  27. 제26항에 있어서, 헬퍼 유전자가 AAV Rep 및 Cap 유전자와 아데노바이러스 VA, E2A, E3 및 E4 유전자를 포함하는, 방법.
  28. 제26항 또는 제27항에 있어서, 패키징 세포가 헬퍼 유전자를 안정적으로 발현하는, 방법.
  29. 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 헬퍼 유전자는 단일 플라스미드 상에 인코딩되는, 방법.
  30. 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 헬퍼 유전자가 하나 이상의 플라스미드 상에 포함되는, 방법.
  31. 제28항에 있어서, Rep 및 Cap 유전자가 제1 헬퍼 플라스미드 상에 인코딩되고, VA, E2A, E3 및 E4 유전자가 제2 헬퍼 플라스미드 상에 인코딩되는, 방법.
  32. 제29항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 헬퍼 유전자가 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 갖는 패키징 세포로 공동 형질감염(co-transfecting)되는, 방법.
  33. 제26항에 있어서, rAAV 벡터가 Rep 및 Cap 유전자를 포함하는 플라스미드로 공동-형질감염되고, 패키징 세포가 아데노바이러스로 감염되는, 방법.
  34. 제26항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 패키징 세포가 HEK 293, HeLa 또는 HT1080 세포인, 방법.
  35. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 세포의 집단(population).
  36. 제35항에서, 세포가 CD14를 발현하는, 단리된 세포의 집단.
  37. 제35항 또는 제36항에 있어서, 세포가 폴리펩티드를 인코딩하는 외인성 핵산 서열을 발현하는, 단리된 세포의 집단.
  38. 제35 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 단핵구, 수지상 세포 또는 대식세포인, 단리된 세포의 집단.
  39. 제35항에 있어서, 세포가 패키징 세포인, 단리된 세포의 집단.
  40. 제35항 또는 제39항에 있어서, 세포가 HEK293 세포인, 단리된 세포의 집단.
  41. 제35항 내지 제38항 중 어느 한 항의 단리된 세포를 포함하는 약제학적 조성물로서, 세포가 T 세포를 활성화시켜 외인성 핵산 서열에 의해 인코딩된 폴리펩티드에 대한 항원 특이적 면역 반응을 생성하는데 효과적인, 약제학적 조성물.
  42. 제41항에 있어서, 폴리펩티드가 종양 항원, 종양 관련 항원, 종양 유전자 생성물, 바이러스 항원, 또는 박테리아 항원인, 약제학적 조성물.
  43. 제42항에 있어서, 폴리펩티드가 종양 항원, 종양 관련 항원, 또는 종양 유전자 생성물이고, 종양 항원, 종양 관련 항원, 또는 종양 유전자 생성물이 알파 태아단백질(alpha fetoprotein; AFP), B 흑색종 항원(BAGE/CT2.1), 분화 20의 클러스터(CD20), C269, G250(탄산 탈수효소 IX/CA IX), HM1.24, CD 154, 전립선암 관련 항원, 유방암 관련 종양 관련 항원, 암-고환 항원(CT) 패밀리의 구성원, 인간 흑색종 관련 항원(MAGE) 패밀리의 구성원, MART 1, SAGE 1, 암배아 항원(CEA), HER-2/neu, 사이토케라틴 19(CK19, K19, cyfra21-l), 서바이빈, 뮤신-1(MUC-1, CA15-3), 편평 세포 암종(SCC) 항원, 또는 이들의 임의의 항원성 단편 및/또는 조합인, 약제학적 조성물.
  44. 제43항에 있어서,
    (a) 전립선암 관련 항원이 전립선 특이적 항원(PSA), 전립선 특이적 막 항원(PSMA), 전립선 줄기 세포 항원(PSCA) 또는 전립선 산 포스파타제(PAP) 항원, 또는 이들의 임의의 항원성 단편 및/또는 조합이고;
    (b) 유방암 관련 종양 관련 항원이 유방 상피 항원 46(BA46, 락타데린) 또는 이들의 임의의 항원성 단편이고;
    (c) 암-고환 항원(CT) 패밀리의 구성원이 뉴욕 식도 편평 세포 암종-1(NY-ESO-1)(CT6.1), ADAM2(CT15), SPA17(CT22), 또는 SPANX-A1(CT11.1), 또는 이들의 임의의 항원성 단편 및/또는 조합이고; 또는
    (d) 인간 흑색종 관련 항원(MAGE) 패밀리의 구성원이 MAGE-A1/CT1.1, MAGE-A2/CT1.2, MAGE-A3/CT1.3, MAGE-A4/CT1.4, MAGE-B1/CT3.1, MAGE-C1/CT7.1, MAGE-C2/CT10, MAGE-C3/CT7.2, 또는 MAGE-E1 또는 이들의 임의의 항원성 단편 및/또는 조합인, 약제학적 조성물.
  45. 제43항 또는 제44항에 있어서, 종양 항원, 종양 관련 항원, 또는 종양 유전자 생성물이 PSA, PSMA, PAP, PSCA, BA46, CEA, HER-2/neu, CK19, 서바이빈, MUC-1, SCC, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-C2, NY-ESO-1, ADAM2, SPA17, 또는 SPANX-A1 또는 이들의 임의의 항원성 단편 및/또는 조합인, 약제학적 조성물.
  46. 제42항에 있어서, 폴리펩티드가 바이러스 항원이고, 바이러스 항원이 B형 간염 바이러스(HBV) 항원, C형 간염 바이러스(HCV) 항원, 인간 유두종 바이러스(HPV) 항원, 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 항원, 또는 이들의 임의의 조합인, 약제학적 조성물.
  47. 제46항에 있어서, HPV 항원이 E6 항원 또는 E7 항원인, 약제학적 조성물.
  48. 제47항에 있어서, E6 또는 E7 항원이 HPV 혈청형 16, 18, 30, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 61, 또는 이들의 임의의 조합으로부터 유래되는, 약제학적 조성물.
  49. 제41항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 단핵구, 수지상 세포 또는 이들의 조합인, 약제학적 조성물.
  50. 제35 내지 제38항 중 어느 한 항의 단리된 세포의 집단 또는 제41항 내지 제49항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체(subject)에게 투여하여 면역 반응을 자극하는 단계를 포함하는, 면역요법의 방법.
  51. 제50항에 있어서, 대상체가 인간인, 면역요법의 방법.
  52. 제50항 또는 제51항에 있어서, 단리된 세포의 집단이 대상체로부터 유래된, 면역요법의 방법.
  53. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 외인성 핵산 서열에 의해 활성화된 폴리펩티드를 발현하는 세포를 표적으로 하는 항원 특이적 T 세포를 포함하는 약제학적 조성물로서, T 세포가 제35항 내지 제38항 중 어느 한 항의 세포에 의해 활성화되어 있는, 약제학적 조성물.
  54. 제53항의 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 면역요법의 방법.
  55. 제54항에 있어서, 대상체가 인간인, 면역요법의 방법.
  56. 제54항 또는 제55항에 있어서, 항원 특이적 T 세포가 대상체로부터 유래된, 면역요법의 방법.
  57. 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 포함하는 약제학적 조성물로서, PBMC가 제35항 내지 제38항 중 어느 한 항의 세포에 의해 활성화되어 있는 항원 특이적 T 세포를 포함하는, 약제학적 조성물.
  58. 제57항의 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 면역요법의 방법.
  59. 제58항에 있어서, 대상체가 인간인, 면역요법의 방법.
  60. 제58항 또는 제59항에 있어서, PBMC가 대상체로부터 유래된, 면역요법의 방법.
  61. 면역요법의 방법으로서,
    a. 대상체의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 제21항 내지 제25항 중 어느 한 항의 rAAV 비리온으로 감염시켜 감염된 PBMC를 생성하는 단계,
    b. 감염된 PBMC의 단핵구를 수지상 세포(DC)로 분화시키기 위한 분화성 사이토카인을 첨가하는 단계,
    c. 감염된 PBMC의 세포독성 T 림프구(CTL)를 활성화시키는 활성화 사이토카인을 첨가하여 활성화된 CTL을 생성하는 단계,
    d. 임의로 감염된 PBMC로부터 활성화된 CTL을 단리시키는 단계,
    e. 활성화된 CTL 또는 단리되고 활성화된 CTL을 포함하는 감염된 PMBC의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  62. 변형된 항원 제시 세포(APC)를 생산하는 방법으로서,
    i) CD14+ 세포를 제공하는 단계;
    ii) CD14+ 세포를 폴리펩티드를 인코딩하는 서열을 발현하기에 충분한 제21 항 내지 제25항 중 어느 한 항의 rAAV와 접촉시키는 단계; 및
    iii) 단계 ii)의 CD14+ 세포를 폴리펩티드를 발현하기에 충분한 시간 동안 배양하는 단계를 포함하는, 방법.
  63. 제62항에 있어서, CD14+ 세포가 단핵구 또는 수지상 세포인, 방법.
  64. 제63항에 있어서, 단핵구가 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 집단에 존재하는, 방법.
  65. 제63항에 있어서, 단핵구가 단리된 단핵구인, 방법.
  66. 제63항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 단핵구가 추가로 수지상 세포로 분화되는, 방법.
  67. 제66항에 있어서, 단핵구를 외인성 사이토카인과 접촉시킴으로써 단핵구가 수지상 세포로 분화되는, 방법.
  68. 제67항에 있어서, 외인성 사이토카인을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 단핵구에 도입함으로써 단핵구가 수지상 세포로 분화되어 단핵구가 외인성 사이토카인을 발현하도록 하는, 방법.
  69. 제68항에 있어서, 외인성 사이토카인을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 플라스미드 또는 rAAV 비리온인, 방법.
  70. 제69항에 있어서, rAAV 비리온이 제21항 내지 제25항 중 어느 한 항의 rAAV 비리온인, 방법.
  71. 제67항에 있어서, 외인성 사이토카인이 세포 배양물에 첨가되는, 방법.
  72. 제67항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 사이토카인이 GM-CSF, IL-4, TNF-α 또는 이들의 임의의 조합인, 방법.
  73. 제63항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 사이토카인이 GM-CSF, IL-4 및 TNF-α인, 방법.
  74. 항원 특이적 T 세포를 생산하는 방법으로서,
    i) 나이브(
    Figure pct00004
    ) T 세포를 제공하는 단계;
    ii) 나이브 T 세포를 제62항 내지 제73항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생성된 변형된 APC와 접촉시키는 단계; 및
    iii) 단계 ii)의 T 세포를 활성화 사이토카인과 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  75. 제74항에 있어서, 활성화 사이토카인이 IL-2, IL-7, 또는 이들 둘 모두인, 방법.
  76. 제74항 또는 제75항에 있어서, 항원 특이적 T 세포가 CD4+ T 세포 또는 CD8- T 세포인, 방법.
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