CN112105389A - 用于转染抵抗细胞类型的组合物 - Google Patents

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Abstract

提供了用于将核酸治疗剂递送至细胞的试剂组合物。试剂包含可电离的脂质、结构脂质和稳定剂，所述稳定剂提高核酸的转染效率并使转染的细胞存活。5转染试剂在质粒和mRNA递送以及在神经元和祖细胞样细胞中是有效的。它可以用于离体细胞治疗。

Description

用于转染抵抗细胞类型的组合物
发明背景
发明领域
本发明的领域是将活性核酸转移到细胞中。
相关技术
多核苷酸或寡核苷酸形式的核酸可以通过干扰特定基因靶标的表达，或者通过恢复或增强特定基因靶标的表达，或者通过编辑基因而用于将治疗集中在所述特定基因靶标上。
因为核酸相对较大，是带负电的亲水性化合物，其不能被动地扩散穿过细胞膜并且也易受核酸酶的攻击，所以将核酸递送到细胞或组织中面临着挑战。(Akhtar,Basu SFau–Wickstrom等人,1991)。
将这些核酸递送穿过细胞膜的现有方法包括将病毒如腺相关病毒作为基因恢复的载体，但这些可以在治疗的个体中引起免疫应答(Mingozzi和High 2013)。可电离的脂质和聚合物也已经用于实验中，但每一种都具有转染效率、稳定性和毒性的问题(Lv,Zhang等人,2006)。为了提高核酸的治疗活性，本领域的重大努力集中于包含可电离的脂质的脂质纳米颗粒(LNP)(所述可电离的脂质包括可电离的阳离子脂质(也称为“可电离的脂质”或“阳离子脂质”)和聚乙二醇化脂质)，用于将核酸有效地封装和递送到细胞中(Tam,Chen等人,2013,Kauffman,Webber等人,2015)。
已经工程化脂质颗粒以获得不同的药代动力学、组织中不同的生物分布、生物降解性或改变的毒性，从而有利于核酸的治疗活性。
iPSC或iPSC样细胞的产生涉及将关键的重编程因子引入供体或患者的体细胞中。一旦成功地建立稳定的iPSC克隆，它们就有可能分化成大多数细胞类型，用于研究或临床应用。作为一种通用的、生理学相关的体外系统，iPSC创新的出现为疾病建模、药物发现和基于细胞的治疗领域提供了前所未有的可能性。iPSC技术的优势在神经科学领域是特别相关的，其中使用基本组织的实验模型是不可行的，并且小动物模型不能充分反映复杂的人神经解剖结构。
iPSC衍生的神经元与原代神经元显示出许多形态、生化和功能的相似性。然而，包括但不限于神经元细胞的终末分化细胞通常由于其敏感性和不能增殖而难以转染，同时保持其活力。尽管事实是已经发现转染和重编程的细胞是临床相关的，并且在神经变性病症、CNS病症和干细胞移植中具有应用，但目前的方法，如电穿孔、磷酸钙共沉淀、脂质转染和核转染通常导致高比例的细胞死亡率。为此，研究人员和对基因治疗感兴趣的人们发现将核酸递送到细胞中的合适替代选择。
发明概述
根据本发明，提供了转染试剂组合物，其包含Mol％的可电离的脂质或其药学上可接受的盐；15至25Mol％的结构脂质；35至41Mol％的固醇；和0.5至约10Mol％的稳定剂。在一些实施方案中，可电离的脂质是氨基脂质或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，稳定剂包含一种以上的表面活性剂。在一些实施方案中，稳定剂是聚山梨醇酯，如聚山梨醇酯(80)或聚山梨醇酯的混合物。在一些实施方案中，稳定剂是麦芽糖苷。在一些实施方案中，稳定剂是聚山梨醇酯和麦芽糖苷的混合物。在优选的实施方案中，稳定剂是聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯20和十三烷基-D-麦芽糖苷的混合物。在一个实施方案中，三种组分的比例是相等的(1:1:1)。在实施方案中，可电离的脂质占所述组合物的约40Mol％。在实施方案中，稳定剂为所述组合物的约0.5至5Mol％。在一些实施方案中，固醇是胆固醇。
根据本发明，提供了以上所述的组合物，其包含核酸或肽。在实施方案中，核酸是DNA、RNA或能够表达RNA的质粒。在一些实施方案中，可电离的脂质选自BOCHD-C3-DMA、KC2、MC3、α-D-生育酚琥珀酰基和DODMA，在实施方案中，可电离的脂质呈其药学上可接受的盐的形式。在实施方案中，结构脂质是1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)，并且在其它实施方案中，是DSPE或DSPC。在一些实施方案中，所述组合物呈直径为约15nm至约300nm的脂质纳米颗粒的形式。
根据本发明的实施方案，提供了用核酸治疗剂转染iPSC或iPSC样细胞同时保持核酸的活性和细胞的活力的方法，其通过使所述细胞与以上所述的组合物接触进行。
根据本发明的另一实施方案，提供了用核酸治疗剂转染神经元细胞同时保持核酸的活性和细胞的活力的方法，其通过使所述细胞与以上所述的组合物接触进行。在实施方案中，所述细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，所述细胞是人或获自人。
在结合附图阅读了本发明的具体实施方案的以下描述之后，本发明的其它方面和特征对于本领域的普通技术人员将变得显而易见。
附图简述
在说明了本发明的实施方案的附图中，
图1A-1F是衍生自人神经祖细胞并且已经用使用脂质混合物A(图1A)、脂质混合物TBD(图1B)、脂质混合物T20(图1C)、脂质混合物T80(图1D)、脂质混合物K(图1E)和脂质混合物L(图1F)制备的质粒GFP-LNP转染的DIV14成熟神经元的“GFP掩模(GFP mask)”相衬图像的黑白底片再现。转染后72小时对质粒-GFP脂质颗粒(脂质(N)：核酸(P)，比例为4)成像。长的线状突起是神经突(轴突和树突)，并且球状元素是细胞体(体细胞)；
图2是用IncucyteTMS3仪器拍摄的DIV14成熟神经元的黑白底片相差显微镜图像，并且成熟神经元代表了在研究中使用的那些；
图3A-3C是未处理的(3A)和在用使用脂质混合物A(3B)制备的质粒GFP-LNP或使用脂质混合物L(3C)制备的质粒GFP-LNP处理后48小时在DIV14时用IncucyteTM仪器拍摄的iPSC衍生的神经元的代表性相衬黑白色阴像；
图4A-4D是未处理的(4A)和用脂质颗粒处理后48小时，在第4天用IncucyteTMS3仪器拍摄的iPSC衍生的神经祖细胞的黑白底片相衬图像，所述脂质颗粒由N/P 6的脂质混合物A(4B)、N/P 6的脂质混合物L(4C)或LipofectamineTM(4D)组成，含有编码GFP的质粒；
图5是在用使用脂质混合物A、脂质混合物T20、脂质混合物T80、脂质混合物K或脂质混合物L制备的质粒GFP-LNP(N/P4)处理后0至144小时捕获的图像中DIV 14时表达GFP的iPSC衍生的神经元的百分比的图；
图6是显示在用使用脂质混合物A、脂质混合物T20、脂质混合物T80、脂质混合物K或脂质混合物L制备的质粒GFP-LNP(N/P4)处理后0至144小时，在DIV14时的iPSC衍生的神经元中每mm2捕获的图像中表达GFP的神经突的长度的图；
图7是显示未处理和使用脂质混合物A和脂质混合物L制备的浓度等于250ng/mL的mRNA-LNP(N/P 4)处理后表达GFP的iPSC的百分比的条形图；
图8A是显示使用具有单独的表面活性剂吐温20和吐温80以及吐温20和吐温80的表面活性剂组合的LNP组合物，质粒介导的GFP在神经祖细胞中表达效果的条形图；
图8B是显示使用具有单独的表面活性剂Myrj52(脂质混合物A)、吐温20和吐温80的LNP组合物，质粒介导的GFP在神经祖细胞中表达效果的条形图；
图9A是显示使用两种相似的但包含两种不同可电离脂质的LNP组合物，mRNA介导的GFP(平均荧光强度)在神经祖细胞中表达的条形图；以及
图9B是显示使用包含两种不同的可电离脂质的两种相似的LNP组合物，mRNA介导的GFP(平均荧光强度)在神经祖细胞中表达的条形图；
图10是比较未处理的对照、脂质混合物L、脂质混合物K和LipofectamineTM处理的NPC历经144小时的LNP处理的NPC增殖(在皿中汇合)的线形图；以及
图11是显示通过流式细胞术测量的NPC中GFP水平的条形图。
详述
本发明提供了脂质混合物组合物，它们在产生核酸治疗剂和其它寡聚物(如肽)的基于脂质的制剂中的用途，以及使用这些脂质混合物和所得的制剂克服转染-抵抗细胞类型的方法。
在另一个方面，提供本发明的脂质混合物组合物用于与核酸治疗剂混合以产生脂质核酸颗粒，其增强核酸向靶细胞或组织中的递送，并且与较为传统的脂质混合物组合物或脂质核酸颗粒(如由市售的脂质混合物(如LipofectamineTM转染剂)制备的那些)相比具有更低的毒性。
在另一个方面，本发明提供了脂质混合物组合物，其包含可电离的脂质、一种或多种结构脂质、胆固醇和洗涤剂的特定稳定混合物的。
在另一个方面，提供根据本发明的脂质混合物组合物用于配制核酸和肽治疗剂，以用于治疗中枢神经系统的疾病，或用于细胞重编程，或用于患者细胞的离体转化。
“脂质”是指结构上不同的有机化合物组，其是脂肪酸衍生物或固醇或者可以是如在类脂质(lipidoid)中的脂质样材料(实例C12-200)，并且特征在于不溶于水但可溶于许多有机溶剂。
“脂质颗粒”。本发明提供了由以上所述的脂质混合物组合物制备的脂质颗粒。在一些实施方案中，脂质颗粒含有治疗剂。脂质颗粒是脂质、核酸、胆固醇和稳定剂的集合体。正负电荷、比例以及亲水性和疏水性决定了脂质颗粒在组分的尺寸和取向方面的物理结构。这些脂质颗粒的结构组织可以导致具有如在脂质体中的最小双层的水性内部，或者它可以含有如在固体核酸脂质纳米颗粒中的固体内部。
“可电离的脂质”。脂质颗粒包含可电离的脂质。如本文所用，术语“可电离的脂质”是指这样的脂质，其在pH降低至脂质的可电离基团的pK以下时是阳离子的或变得可电离的(质子化)，但在较高pH值下逐渐更中性。在低于pK的pH值处，脂质然后能够与带负电的核酸(例如寡核苷酸)缔合。如本文所用，术语“可电离的脂质”包括在pH降低时呈现正电荷的两性离子脂质，以及在选择性pH(如生理pH)下带有净正电荷的多种脂质物质中的任一种。这样的脂质包括但不限于N,N-二油烯基-N,N-二甲基氯化铵(DODAC)、1,2-二油酰基-3-二甲基氨基丙烷(DODAP)、N-(2,3-二油烯基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)、N,N-二硬脂酰基-N,N-二甲基溴化铵(DDAB)、N-(2,3-二油酰基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTAP)、3-(N-(N′,N′-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基)胆固醇(DC-Chol)和N-(1,2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羟乙基溴化铵(DMRIE)。
当提及体外细胞时，“活力”意指像细胞类型或组织培养菌株正常的那样，继续生长、分裂以及继续生长和分裂的能力。细胞活力受到恶劣条件或处理的影响。细胞活力在非临床环境中并不总是重要的，但在离体治疗或肠胃外施用中是关键的。
在优选的实施方案中，可电离的脂质是氨基脂质。可用于本发明的合适的氨基脂质包括WO2009/096558中所述的那些，将其通过引用以其整体并入本文。代表性氨基脂质包括1,2-二亚油烯基氧基(dilinoleyoxy)-3-(二甲基氨基)乙酰氧基丙烷(DLin-DAC)、1,2-二亚油烯基氧基-3-吗啉代丙烷(DLin-MA)、1,2-二亚油酰基(dilinoleoyl)-3-二甲基氨基丙烷(DLinDAP)、1,2-亚油烯基硫基(dilinoleylthio)-3-二甲基氨基丙烷(DLin-S-DMA)、1-亚油酰基-2-亚油烯基氧基-3-二甲基氨基丙烷(DLin-2-DMAP)、1,2-亚油烯基氧基-3-三甲基氨基丙烷氯化物盐(DLin-TMA·Cl)、1,2-二亚油酰基-3-三甲基氨基丙烷氯化物盐(DLin-TAP·Cl)、1,2-亚油烯基氧基-3-(N-甲基哌嗪基)丙烷(DLin-MPZ)、3-(N,N-亚油烯基氨基)-l,2-丙烷二醇(DLinAP)、3-(N,N-二油烯基氨基)-l,2-丙烷二醇(DOAP)、1,2-亚油烯基氧代-3-(2-N,N-二甲基氨基)乙氧基丙烷(DLin-EG-DMA),2,2-亚油烯基-4-二甲基氨基甲基-[l,3]-二噁茂烷(DLin-K-DMA)、1,2-亚油烯基氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DLin-DMA)、三十八-6,9,28,31-四烯-19-基4-(二甲基氨基)丁酸酯(DLin-MC3-DMA)、2,2-亚油烯基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1,3]-二噁茂烷(DLin-KC2-DMA)和1,2-二油烯基氧基-3-二甲基氨基丙烷(DODMA)。
在其它实施方案中，使用了Almarsson,Orn和Lawlor,Ciaran Patrick的US20180000953中提及的较新的可电离脂质，如3-(双十二烷基氨基)-N1,N1,4-三(十二烷基)-1-哌嗪乙胺(KL10)、14,25-双十三烷基-15,18,21,24-四氮杂-三十八烷(KL25)、2-({8-[(3.β.)-胆甾-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,2Z)-十八-9,12-二烯-1-基氧基]丙-1-胺(辛基-CLin DMA)、(2R)-2-({8-[(3.β.)-胆甾-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z-,12Z)-十八-9,12-二烯-1-基氧基]丙-1-胺(辛基-CLinDMA(2R))和(2S)-2-({8-[.β.)-胆甾-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,1-2Z)-十八-9,12-二烯-1-基氧基]丙-1-胺(辛基-CLinDMA(2S))。
在其它实施方案中，可电离的脂质样材料是如Kaufmann和他的同事所述的C12-200(Kaufmann k 2015)：
Figure BDA0002748184420000071
在本发明的优选实施方案中，可电离的脂质是1,17-双(2-辛基环丙基)十七烷-9-基4-(二甲基氨基)丁酸酯盐酸盐(BOCHD-C3-DMA)。该化合物公开于美国公开申请2013323269中。在其它优选的实施方案中，可电离的脂质是COATSOME SS-E-P4C2.目录号SS-EC或“α-D-生育酚琥珀酰基”。
可电离的脂质存在于组合物的实施方案中，并且本发明的脂质颗粒优选占约35至约45Mol％的量，或者最优选40Mol％的量(“Mol％”意指特定组分占总摩尔数的百分比)。
结构脂质。本发明的组合物和脂质颗粒包含组合物的约20Mol％的一种或多种结构脂质。合适的结构脂质支持制造过程中颗粒的形成。结构脂质是指在生理pH下以阴离子、不带电或中性两性离子形式存在的多种脂质种类中的任一种。代表性的结构脂质包括二酰基磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰乙醇胺、二酰基磷脂酰甘油、神经酰胺、鞘磷脂、二氢鞘磷脂、脑磷脂和脑苷脂。
示例性的结构脂质包括两性离子脂质，例如二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰基-磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰基油酰基磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰基油酰基-磷脂酰乙醇胺(POPE)和二油酰基-磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-羧酸盐(酯)(DOPE-mal)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰基磷酸乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰基-磷脂酰乙醇胺(DSPE)、16-O-单甲基PE、16-O-二甲基PE、18-1-反式PE、1-硬脂酰基-2-油酰基-磷脂酰乙醇胺(SOPE)和1,2-二反油酰基(dielaidoyl)-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(反式DOPE)。在一个优选的实施方案中，结构脂质是1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)。
在另一个实施方案中，结构脂质是在生理pH下带负电的任何脂质。这些脂质包括磷脂酰甘油，如二油酰基磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰基磷脂酰甘油(DPPG)、棕榈酰基油酰基磷脂酰甘油(POPG)、心磷脂、磷脂酰肌醇、二酰基磷脂酰丝氨酸、二酰基磷脂酸和连接到中性脂质上的其它阴离子修饰基团。
其它合适的结构脂质包括糖脂(例如，单唾液神经节苷酯GM1)。
稳定剂包括在脂质混合物组合物和脂质核酸实施方案中以确保混合物的完整性以及其它作用。在本发明的优选实施方案中，稳定剂是洗涤剂。洗涤剂是破坏或帮助形成分子之间的疏水性-亲水性相互作用的一类分子。合适的洗涤剂包括聚山梨醇酯20(也称为吐温20；聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯；聚氧乙烯(20)山梨醇酐单月桂酸酯或IUPAC名称2-[2-[3,4-双(2-羟基乙氧基)氧杂环戊-2-基]-2-(2-羟基乙氧基)乙氧基]乙基十二酸盐(酯))；聚山梨醇酯80(也称为吐温80，IUPAC名称2-[2-[3,4-双(2-羟基乙氧基)氧杂环戊-2-基]-2-(2-羟基乙氧基)乙氧基]乙基十八烷-9-烯酸酯)和麦芽糖苷，如正癸基-β-D-麦芽糖苷、正十二烷基-β-D-麦芽糖苷和6-环己基-1-己基-β-D-麦芽糖苷。
在优选的实施方案中，稳定剂是组合的聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80和十三烷基β-D-麦芽糖苷。在一些实施方案中，这三种组分以1:1:1的重量比组合。在一些实施方案中，三种洗涤剂的组合一起占总脂质混合物的5至10Mol％。
在一些实施方案中，三种洗涤剂的组合一起占总脂质混合物的1至3Mol％。在一些实施方案中，三种洗涤剂的组合一起占总脂质混合物的0.5至2.5mol％。
固醇包含在优选的脂质混合物组合物中，并且由其制备的脂质颗粒包括固醇，如胆固醇和植物固醇。在本发明的脂质混合物中，在一些实施方案中，胆固醇以最终脂质混合物的30至50Mol％存在。可选地，胆固醇以最终脂质混合物的35至41Mol％存在。在各种优选的实施方案中，胆固醇以35.9、37.5、38、39和39.4Mol％存在。
肽。本发明的脂质混合物组合物和脂质颗粒可用于肽的全身递送或局部递送。如本文所用，术语“治疗性肽”意在包括递送到细胞中引起期望效果的任何氨基酸链。肽是短链氨基酸，长度为2-50个氨基酸，与具有较长链(50个氨基酸或更多)，通常具有三级和/或四级结构的蛋白质相反。肽中的氨基酸通过称为肽键的键在序列中彼此连接。
核酸。本发明的脂质混合物组合物和脂质颗粒可用于核酸的全身递送或局部递送。如本文所用，术语“核酸治疗剂(NAT)”意在包括递送到细胞中引起期望效果的任何寡核苷酸或多核苷酸。含有多达50个核苷酸的片段通常被称为寡核苷酸，而较长的片段被称为多核苷酸。在特定的实施方案中，本发明的寡核苷酸的长度为20-50个核苷酸。在本发明的实施方案中，寡核苷酸的长度为996-4500个核苷酸，如信使RNA的情况。
当前，在越来越多的临床前和临床研究中正积极地寻求NAT。这些NAT包括脱氧核糖核酸、互补脱氧核糖核酸、完整基因、核糖核酸、寡核苷酸和核酶，用于靶向多种疾病(如癌症、感染性疾病、遗传病症和神经变性疾病)的基因治疗。如本文所述，核酸治疗剂(NAT)在其形成过程中被掺入到脂质颗粒中。
根据本发明存在于脂质颗粒中的核酸包括已知的任何形式的核酸。本文使用的核酸可以是单链DNA或RNA、或者双链DNA或RNA、或者DNA-RNA杂交物。双链DNA的实例包括结构基因、包括控制区和终止区的基因、以及诸如病毒或质粒DNA的自我复制系统。双链RNA的实例包括siRNA和其它RNA干扰试剂。单链核酸包括反义寡核苷酸、核酶、微小RNA、mRNA和形成三链体的寡核苷酸。
质粒DNA是本发明的实施方案中配制的优选核酸。质粒是与细胞中的染色体DNA分离并且可以独立复制的DNA分子。质粒的大小范围为小于1000个核苷酸至数万个核苷酸。最常见的形式是小的环状双链DNA。可以合成质粒并将其递送到哺乳动物细胞用于治疗目的。合成质粒用作分子克隆中的载体，用于驱动重组DNA序列在宿主有机体内复制。可以使用物理方法，如电穿孔，或化学手段，如本发明中经由脂质颗粒增强的转染，经由转化将质粒导入细胞。与物理技术相比，这些基于脂质的载体系统具有一些优势，其包括：i)在细胞和组织系统中的高生物相容性和低毒性；ii)相对容易制造；iii)亲脂性基质不易受到在聚合物系统中观察到的腐蚀现象的影响；iv)由于它们不能从免疫系统中观察到而增加的体内循环半衰期。
因此，在一个实施方案中，核酸治疗剂(NAT)是质粒或环状核酸构建体。在另一个实施方案中，NAT是复制子。在一个实施方案中，NAT是mRNA。
术语“核酸”还指核糖核苷酸、脱氧核苷酸、修饰的核糖核苷酸、修饰的脱氧核糖核苷酸、修饰的磷酸-糖-骨架寡核苷酸、其它核苷酸、核苷酸类似物、以及它们的组合，并且可以是单链的、双链的，或者含有双链和单链序列的部分，视情况而定。
如本文所用，术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”可互换使用，并且意指核苷酸单体的单链和双链聚合物，包括通过核苷酸间磷酸二酯键连键，例如，3'-5'和2'-5'反向连键连接的2'-脱氧核糖核苷酸(DNA)和核糖核苷酸(RNA)，例如，3'-3'和5'-5'分支结构或核苷酸间类似物。多核苷酸具有相关的抗衡离子，如H+、NH4+、三烷基铵、Mg2+、Na+等。多核苷酸可以完全由脱氧核糖核苷酸、完全由核糖核苷酸或其嵌合混合物组成。多核苷酸可以包含核苷酸间、核碱基和/或糖类似物。
如本文所用，“核酸”是具有由核苷酸或其类似物形成的主链的含核碱基序列的聚合物或聚合物区段。
如本文所用，“N/P”是可电离脂质的胺基的摩尔与mRNA/DNA的磷酸基团的摩尔的比例。在本发明的实施方案中，N/P比为N/P3至N/P7，并且最优选的比例为N/P4至N/P 6。
根据本发明的一些实施方案的脂质颗粒可以通过电子显微镜表征。如通过电子显微镜所看到的，具有基本上实心核的本发明的颗粒具有电子致密核。Cullis等人的美国专利第9,758,795号中公开了一种这样的结构。定义电子密度使得实心核颗粒的内部50％的投影面积的面积平均电子密度(如在2-D低温EM图像中所看到的)不小于颗粒外围处的最大电子致密的x％(x＝20％、40％、60％)。电子密度被计算为在不包含纳米颗粒的区域中感兴趣区域的图像强度与背景强度之差的绝对值。
可以使用在溶液中确定颗粒尺寸的装置(如MalvernTMZetasizerTM)来评估本发明的脂质颗粒的尺寸。颗粒具有约15nm至约300nm的平均粒径。脂质颗粒的另一术语是“LNP”，其代表“脂质纳米颗粒”。在一些实施方案中，平均粒径大于300nm。在一些实施方案中，脂质颗粒的直径为约300nm或更小、250nm或更小、200nm或更小、150nm或更小、100nm或更小、或者50nm或更小。在一个实施方案中，脂质颗粒的直径为约50nm至约150nm。与较大的颗粒相比，较小的颗粒通常在体内表现出增加的循环寿命。在一个实施方案中，脂质颗粒的直径为约15nm至约50nm。
混合。可以通过标准T管混合技术、湍流混合、研磨混合、促进搅拌顺序自组装，或将所有元素与元素自组装成纳米颗粒的被动混合来制备根据本发明的实施方案的脂质颗粒。已经开发了多种方法来配制含有基因药物的脂质纳米颗粒(LNP)。合适的方法公开在例如Ansell,Mui和Hope的美国专利第5,753,613号和Saravolac等人的美国专利第6,734,171号中。这些方法包括在乙醇存在下将预先形成的脂质颗粒与核酸治疗剂(NAT)混合，或者将溶解在乙醇中的脂质与含有NAT的水性介质混合，得到NAT封装效率为65-95％的脂质颗粒。这两种方法都依赖于存在可电离脂质以实现NAT的包封以及稳定剂以抑制大结构的聚集和形成。产生的脂质颗粒系统的性能(包括大小和NAT封装效率)对多种配制参数敏感，如离子强度、脂质和乙醇浓度、pH、NAT浓度和混合速率。J Drug Target.2016Nov；24(9):821-835。
微流体两相液滴技术已经被应用于生产用于药物递送的单分散聚合物微粒或生产用于封装细胞、蛋白质或其它生物分子的大囊泡。已经证明使用流体动力学流动聚焦(一种提供试剂的快速混合的常见微流体技术)产生具有受控尺寸的单分散脂质体。
通常，使用当前的配制程序难以控制混合时的诸如相对脂质和NAT浓度，以及混合速率的参数，导致制剂内和制剂间产生的NAT特性变化。自动微混合仪器如NanoAssemblrTM仪器(Precision NanoSystems Inc,Vancouver,Canada)使纳米药物(脂质体、脂质纳米颗粒和聚合物纳米颗粒)能够快速和受控地制造。NanoAssemblrTM仪器经由微流体混合筒实现纳米颗粒的受控分子自组装，所述微流体混合筒允许在定制或平行化的情况下以纳升、微升或更大规模毫秒混合纳米颗粒组分。小规模的快速混合允许对颗粒合成和质量的可再现性控制，这在较大的仪器中是不可能的。
优选的方法掺入诸如NanoAssemblrTMSparkTM、IngniteTM、BenchtopTM和BlazeTM的微流体混合装置的仪器，以便在一个步骤中将形成过程中使用的几乎100％的核酸封装在颗粒中。在一个实施方案中，通过将形成过程中使用的约90％至约95％的核酸封装在颗粒中的方法制备脂质颗粒。
Cullis等人的美国专利第9,758,795号和第9,943,846号描述了使用小体积混合技术的方法和由此衍生的新型制剂。Ramsay等人的美国申请公开号20160022580描述了使用小体积混合技术和产物来配制不同材料的更先进的方法。Walsh等人的美国申请公开号2016235688公开了具有到要混合的元素的不同路径和孔的微流体混合器。Wild,Leaver和Taylor的PCT公开WO2017117647公开了具有一次性无菌路径的微流体混合器。Wild,Leaver和Taylor的PCT公开号WO201711764公开了分叉环形微量混合几何体及其在微量混合中的应用。Chang,Klaassen,Leaver等人的PCT公开号WO2018006166公开了可编程的自动微混合器及其混合芯片。Wild和Weaver的美国外观设计号D771834、D771833、D772427和D803416以及Chang等人的D800335、D800336和D812242公开了用于由Precision NanoSystems Inc销售的混合器仪器的具有微通道和混合几何体的混合筒。
在本发明的实施方案中，用于生物微流体混合的装置用于制备本发明的脂质颗粒和治疗制剂。该装置包括第一试剂流和第二试剂流，其供给到微流体混合器中，并且脂质颗粒从出口收集，或者在其它实施例中，进入无菌环境中。
第一流包括在第一溶剂中的治疗剂。合适的第一溶剂包括治疗剂可溶于其中且可与第二溶剂混溶的溶剂。合适的第一溶剂包括水性缓冲液。代表性的第一溶剂包括柠檬酸盐和乙酸盐缓冲液。
第二流包括在第二溶剂中的脂质混合材料。合适的第二溶剂包括可电离的脂质可溶于其中且可与第一溶剂混溶的溶剂。合适的第二溶剂包括1,4-二噁烷、四氢呋喃、丙酮、乙腈、二甲亚砜、二甲基甲酰胺、酸和醇。代表性的第二溶剂包括90％的水性乙醇或无水乙醇。
在本发明的一个实施方案中，合适的装置包括一个或多个微通道(即，最大尺寸小于1毫米的通道)。在一个实例中，微通道的直径为约20μm至约300μm。在实例中，微通道的至少一个区域具有主流动方向和一个或多个表面，所述表面具有限定在其中的至少一个凹槽或突起，所述凹槽或突起具有如美国专利公开号20040262223中所述的与主方向形成角度的取向(例如交错的人字形混合器)，或者如美国专利公开号2018093232中所述的分叉环形流。为了实现最大的混合速率，有利的是在混合区域之前避免不适当的流体阻力。因此，装置的一个实例具有尺寸大于1000微米的非微流体通道，以将流体递送到单个混合通道。
自动化较低的微混合方法和仪器，如在Zhang,S.,等人；Chem.Eng.J.；144；2008；324-328和Strook A.等人；Science 295；2002；647-651中公开的那些也可用于产生本发明的制剂。涉及T管混合的较为原始的系统公开于Jeffs L B等人,A scalable,extrusion-free method for efficient liposomal encapsulation of plasmid DNA.PharmRes.2005；22(3):362-72中。
本发明的脂质颗粒可以用于在体外或体内将治疗剂递送到细胞中。在特定的实施方案中，治疗剂是核酸，使用本发明的核酸-脂质颗粒将其递送到细胞中。核酸可以是siRNA、miRNA、LNA、质粒或复制子、mRNA、单一基因。在其它实施方案中，治疗剂是肽，使用本发明的肽-脂质颗粒将其递送到细胞中。所述方法和脂质混合物组合物可以容易地适于递送用于治疗将受益于这种治疗的任何疾病或病症的任何合适的治疗剂。
在某些实施方案中，本发明提供了将核酸导入细胞的方法(即转染)。转染是分子生物学中常用的一种技术，用于将核酸治疗剂(或NAT)从细胞外导入细胞内空间中，目的是转录、翻译和表达所递送的基因。转染效率通常被定义为：i)总处理群体中显示所递送基因的阳性表达的细胞的百分比，如通过蛋白质定量方法如活细胞成像(用于检测荧光蛋白质)、流式细胞术或ELISA所测量的，或者ii)处理的细胞表达的蛋白质的强度或量。可以通过使本发明的颗粒或脂质混合物组合物与细胞接触足以发生细胞内递送的一段时间来实施这些方法。
典型的应用包括使用众所周知的程序来提供siRNA的细胞内递送以敲除或沉默特定细胞靶标。可选地，应用包括编码治疗上有用的多肽的DNA或mRNA序列的递送。以这种方式，通过提供缺陷型或缺失型基因产物来提供基因疾病的治疗。本发明的方法可以在体外、离体或体内实施。例如，使用本领域技术人员已知的方法，本发明的脂质混合物组合物也可以用于在体内将核酸递送至细胞。在另一个实例中，本发明的脂质混合物组合物可以用于将核酸递送到离体的患者细胞样品，然后返回患者。
以下描述了通过本发明的脂质颗粒递送核酸治疗剂。
对于体内施用，优选肠胃外(例如，关节内、静脉内、腹腔内、皮下、鞘内、真皮内、气管内、骨内或肌内)施用药物组合物。在特定实施方案中，通过弹丸注射静脉内、鞘内或腹腔内施用药物组合物。其它施用途径包括局部(皮肤、眼睛、粘膜)，口服，肺部，鼻内，舌下，直肠和阴道。
对于离体应用，优选将药物组合物施用于已经从有机体中取出的生物样品，然后将细胞洗涤并恢复到有机体中。有机体可以是哺乳动物，特别地可以是人。该方法用于例如细胞重编程、基因修复、免疫治疗。
在一个实施方案中，本发明提供了调节靶多核苷酸或多肽表达的方法。这些方法通常包括使细胞与本发明的脂质颗粒接触，所述脂质颗粒与能够调节靶多核苷酸或多肽表达的核酸结合。如本文所用，术语“调节”是指改变靶多核苷酸或多肽的表达。调节可以意指增加或增强，或者它可以意指减少或降低。
在相关的实施方案中，本发明提供了治疗对象中以多肽过表达为特征的疾病或病症的方法，其包括向对象提供本发明的药物组合物，其中治疗剂选自siRNA，微小RNA，反义寡核苷酸和能够表达siRNA、微小RNA或反义寡核苷酸的质粒，并且其中所述siRNA、微小RNA、或反义RNA包含特异性结合编码多肽的多核苷酸或其互补物的多核苷酸。
在相关的实施方案中，本发明提供了治疗对象中以多肽表达不足为特征的疾病或病症的方法，其包括向对象提供本发明的药物组合物，其中所述治疗剂选自mRNA、自扩增RNA(SAM)、自我复制的DNA或质粒，包含特异性编码或表达表达不足的多肽或其互补物的核酸治疗剂。
在实施方案中，本文所述的药物组合物的制剂可以通过药理学领域中已知的或以后开发的任何方法制备。通常，这种制备方法包括将活性成分与赋形剂和/或一种或多种其它辅助成分结合的步骤。
根据本公开内容的药物组合物可以作为单一单位剂量和/或作为多个单一单位剂量批量制备、包装和/或销售。如本文所用，“单位剂量”是指包含预定量的活性成分的离散量的药物组合物。活性成分的量通常可以等于将施用于对象的活性成分的剂量和/或这种剂量的方便分数，包括但不限于这种剂量的一半或三分之一。
根据本公开内容的药物组合物中的活性成分、药学上可接受的赋形剂和/或任何另外的成分的相对量可以根据所治疗的对象的特性、身材和/或状况而变化，并且进一步根据组合物的施用途径而变化。例如，该组合物可以包含0.1％至99％(w/w)的活性成分。
药物制剂可以另外包含药学上可接受的赋形剂，如本文所用，其包括但不限于适于期望的特定剂型的任何和所有溶剂、分散介质、稀释剂、或其它液体媒介物、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂等。用于配制药物组合物的各种赋形剂和用于制备该组合物的技术是本领域已知的(参见Remington:The Science and Practiceof Pharmacy,第21版,A.R.Gennaro,Lippincott,Williams和Wilkins,Baltimore,MD,2006；通过引用以其整体并入本文)。除了任何常规赋形剂介质可能与物质或其衍生物不相容之外，如通过产生任何不期望的生物效应或以有害方式在其它方面与药物组合物的任何其它组分相互作用，本文考虑了常规赋形剂介质的使用。
在一些实施方案中，可以增加和/或减小脂质颗粒的颗粒尺寸。颗粒尺寸的变化可能能够帮助对抗诸如但不限于炎症的生物反应，或者可以通过改变生物分布来增加递送到哺乳动物的NAT的生物效应。
在药物组合物的制备中使用的药学上可接受的赋形剂包括但不限于惰性稀释剂、表面活性剂和/或乳化剂、防腐剂、缓冲剂、润滑剂和/或油。这样的赋形剂可以任选地包含在本发明的药物制剂中。
在一些实施方案中，示例性质粒或其它NAT编码蛋白质或酶，其选自人生长激素、红细胞生成素、1-抗胰蛋白酶、酸性α葡糖苷酶、芳基硫酸酯酶A、羧肽酶N、a-半乳糖苷酶A、α-L-艾杜糖醛酸酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、艾杜糖醛酸硫酸酯酶、N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶、N-乙酰葡糖胺糖苷酶、α-氨基葡萄糖苷乙酰转移酶、N-乙酰葡萄糖胺6-硫酸酯酶、N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶、β-葡糖苷酶、半乳糖-6-硫酸盐硫酸酯酶、β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸酶、葡糖脑苷脂酶、乙酰肝素磺酰胺酶、肝素-N-硫酸酯酶、溶酶体酸脂肪酶、透明质酸酶、半乳糖脑苷脂酶、鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)、氨基甲酰基-磷酸合成酶1(CPS 1)、精氨琥珀酸合成酶(ASS 1)、精氨琥珀酸裂解酶(ASL)、精氨酸酶1(ARGl)、囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)、运动神经元生存(SMN)、因子VIII、因子IX、兆核酸酶(meganucleases)如TALENS、Cas9和自我复制的RNA和低密度脂蛋白受体(LDLR)。
在研究或筛查平台的背景下，可以使用本发明将其它质粒或核酸应用于基于细胞的系统。这些包括为了诱导细胞中特定的生理或功能变化的目的，如在用于产生诱导的多能干细胞的重编程过程中，导入遗传物质。在这种情况下，将特定基因(被称为Yamanaka因子)导入患者来源的体细胞中，其触发细胞向干细胞样状态的逆转。这些使得细胞能够无限地分裂并变成多能的(能够分化成许多其它下游细胞类型)，其可以用于研究和临床应用。通过本发明的脂质颗粒可以增强这些和类似的遗传操作步骤，以提高在与诱导的干细胞一起工作时通常使用的过程的效率。
以下是用核酸制备的代表性脂质颗粒(LNP)的描述，它们是如何制备的，它们的优势的证据，以及使用它们实现治疗益处的方法。
通过在微流体混合器内快速混合脂质-乙醇溶液与水性缓冲液来进行脂质颗粒的配制，所述微流体混合器被设计成诱导混沌对流并在中等雷诺数(24<Re<1000)下提供受控的混合环境。微流体通道具有人字形特征或以PCT公开WO2017117647中所示的方式配置。在其它实施方案中，微流体通道如美国专利第10,076,730中构造。
通过动态光散射(DLS)测量脂质颗粒的颗粒尺寸和“多分散性指数”(PDI)。PDI表示颗粒分布的宽度。假定单个颗粒尺寸模式和单个指数拟合自相关函数，这是由(DLS)测量的强度自相关函数的累积分析计算的参数。从生物物理学的观点来看，低于0.1的PDI表示样品是单分散的。假定所有其它变量是中性的，由机械微混合器如NanoAssemblrTM Spark和Benchtop产生的颗粒在尺寸上基本上是均匀的。较低的PDI表示脂质颗粒的更均匀的群体。
在某些实施方案中，稳定剂以约5至约10Mol％的量存在于颗粒中。在一些实施方案中，稳定剂是洗涤剂，如聚山梨醇酯和麦芽糖苷的混合物。
在实施方案中，稳定剂以约2.5Mol％存在于基于脂质的制剂中。
在优选的实施方案中，稳定剂是聚山梨醇酯20(聚山梨醇酯20或聚氧乙烯(20)山梨醇酐单月桂酸酯)、聚山梨醇酯80(聚山梨醇酯80或聚氧乙烯(20)山梨醇酐单月桂酸酯和十三烷基β-D-麦芽糖苷的混合物。在优选的实施方案中，这三种组分以基本上1:1:1wt/wt比存在，或者为清楚起见，每种组分为约33.33％。
在优选的实施方案中，核酸是由双链脱氧核糖核酸组成的质粒。质粒是存在于细胞的细胞质中的基因结构(与传统细胞遗传学所存在的核相对)，其可以独立于染色体复制，通常是小的环状DNA链。这不是正常的哺乳动物基因构建体，而是用作操纵细胞中基因功能的治疗选择。质粒也可以用于建立用于医学研究的新的细胞或动物模型。质粒是分子生物学中的重要工具，并且是新兴的治疗剂，因为它们i)易于操作和分离；ii)能够自我复制以扩大生产；iii)长期稳定性；iv)在一系列有机体和应用中的功能性。除了具有复制起点(或不具有复制起点，取决于预期用途)外，工程质粒还具有限制酶识别位点以允许断裂环以导入新的遗传物质，以及选择性标志物，如抗生素抗性基因。质粒可以是约1000个碱基对至约20千碱基对。
术语
如本文所用，术语“约”被定义为意指所述数值加或减10％。它用于表示期望的靶浓度可以是例如40Mol％，但通过混合不一致，实际百分比可能相差+/-5Mol％。
如本文所用，术语“基本上”被定义为所述数值加或减5％。它用于表示期望的靶浓度可以是例如40Mol％，但通过混合不一致，实际百分比可能相差+/-5Mol％。
如本文所用，术语“核酸”被定义为旨在在疾病的诊断、治愈、缓解、治疗或预防中具有直接效果，或者在恢复、校正或改变生理功能中具有直接效果，或者充当研究试剂的物质。在优选的实施方案中，核酸是寡核苷酸。在优选的实施方案中，治疗剂是核酸治疗剂，如RNA多核苷酸。在优选的实施方案中，治疗剂是双链环状DNA(质粒)。
如本文所用，术语“试剂”由其对细胞、组织或器官的生物效应具有直接影响的事实来定义。试剂包括但不限于多核苷酸、蛋白质、肽、多糖、无机离子和放射性核素。核酸试剂的实例包括但不限于反义寡核苷酸、核酶、微小RNA、mRNA、核酶、tRNA、tracrRNA、sgRNA、snRNA、siRNA、shRNA、ncRNA、miRNA、mRNA、预浓缩的DNA、pDNA或适配子。核酸试剂用于沉默基因(用例如siRNA)、表达基因(用例如mRNA)、编辑基因组(用例如CRISPR/Cas9)以及重编程细胞以返回到原始有机体(例如离体细胞治疗以重编程免疫细胞用于癌症治疗)。“试剂”包括细胞治疗应用中的辅助试剂和药物。
在本公开内容中，词语“包含(comprising)”在非限制性意义上用于意指包括该词语之后的项，但不排除没有具体提及的项。应理解，在包含或可以包含指定特征或变量或参数的实施方案中，替代实施方案可以由这些特征或变量或参数组成或者基本上由这些特征或变量或参数组成。通过不定冠词“一个/一种(a)”对要素的引用不排除存在多于一个要素的可能性，除非上下文明确要求存在一个且仅一个要素。
在本公开内容中，“转染试剂”意指为了诱导感兴趣的特定基因表达的目的增强核酸转移到细胞中的组合物。它通常包括与核酸结合的可电离脂质和结构脂质。LIPOFECTINTM和LIPOFECTAMINETM是由ThermoFisher Scientific销售的已建立的商业转染试剂。
在本公开内容中，通过端点表述的数值范围包括归入该范围内的所有数值，包括所有非负整数(whole number)、所有整数(integer)和所有分数中间数(例如，1至5包括1、1.5、2、2.75、3、3.80、4和5等)。在本公开内容中，单数形式“一个/一种(an)”和“该”包括复数指代物，除非内容另外明确规定。因此，例如，提及含有“化合物”的组合物包括两种或更多种化合物的混合物。在本公开内容中，术语“或”通常以其包括“和/或”的意义使用，除非内容另外明确规定。
提供以下实施例是为了说明而不是限制本发明的目的。
实施例
材料和方法
一些脂质混合物用1,17-双(2-辛基环丙基)十七烷-9-基4-(二甲基氨基)丁酸酯(BOCHD-C3-DMA)形成，其通过Avanti Polar Lipids(Alabaster,AL,USA)合成。其它脂质混合物用DODMA(也为Avanti Polar Lipids)或COATSOMETMSS-E-P4C2.目录号SS-33/4PE-15(NOF America Corporation,Irvine,CA)形成。
结构脂质1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)也获自Avanti Lipids。Kc2和Dlin-MC3-DMA内部合成。没有关于来源另外描述的盐和试剂获自Fisher Scientific(Fair Lawn,NJ)。对照和LipofectamineTM对照是例外。根据维基百科，LipofectamineTM试剂描述于Yongliang,Chu等人的美国专利第7,479,573号中，并且组成为3:1w/w DOSPA:DOPE。
RNase A获自Applied Biosystems/Ambion(Austin,TX)。
稳定剂(TW20:TW80:TBD)意在意指1:1:1wt/wt比的聚山梨醇酯20(也称为聚氧乙烯(20)山梨醇酐单月桂酸酯或吐温TM20)、聚山梨醇酯(80)(也称为聚氧乙烯(80)山梨醇酐单月桂酸酯或吐温TM80)和十三烷基β-D-麦芽糖苷(均来自Millipore Sigma,Burlington,MA)的混合物。在其它实施方案中，聚山梨醇酯80或聚山梨醇酯20或麦芽糖苷各自作为单独的稳定剂存在。在其它实施方案中，它们以不同的比例但仍一起存在。在其它实施方案中，仅聚山梨醇酯80和麦芽糖苷包含稳定剂。
DiD意指'DiD'；DiIC18(5)油(1,1'-双十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚二羰花青高氯酸盐(酯))(Invitrogen D-307)，并且是用于研究的脂质标签(与脂质保持在一起)。其它这样的脂质染料是丹酰DOPE和荧光素DHPE。
在pH4.0的25mM-100mM乙酸缓冲液中制备寡核苷酸或多核苷酸(质粒或信使RNA，在下文称为“核酸”或“核酸治疗剂”)溶液。取决于期望的寡核苷酸与脂质的比例和配制浓度，制备靶浓度为2.3mg/ml至4mg/ml总脂质的溶液。在乙醇中制备含有1,17-双(2-辛基环丙基)十七烷-9-基4-(二甲基氨基)丁酸酯盐酸盐、DOPE、胆固醇、2.5Mol％稳定剂和0-10％,DiD标签的脂质溶液，并且将其与核酸混合以实现25％(v/v)的乙醇浓度。对于某些实例，使用三十八-6,9,28,31-四烯-19-基4-(二甲基氨基)丁酸酯(DLin-MC3-DMA)、DODMA或2,2-亚油烯基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1,3]-二噁茂烷(DLin-KC2-DMA)代替1,17-双(2-辛基环丙基)十七烷-9-基4-(二甲基氨基)丁酸酯盐酸盐(BOCHD-C3-DMA)。
核酸与制剂的比例是N/P 4至N/P 6，其中“N”是脂质胺的摩尔数，“P”是核苷酸磷酸的摩尔数(每个核苷酸磷酸单元被认为是1摩尔单元)，并且“4”和“6”是它们的比例。
通过上述“混合”下的标准微流体方法，通过使用NanoAssemblrTMBenchtop或NanoAssemblrTMSpark制备脂质颗粒。以这种方式，通过混沌对流发生混合，导致层压流的分离变得越来越小，从而促进快速扩散。这种混合发生在毫秒时间尺度上，并导致脂质被转移到逐渐增加的水性环境中，降低它们的溶解度并导致脂质纳米颗粒(LNP)的自发形成。通过带正电荷的脂质头部基团和带负电荷的寡核苷酸的结合获得质粒的包埋。
诱导的多能干细胞或iPSC
使用非整合oriP/EBNA1质粒从重编程供体来源的成纤维细胞产生诱导的多能干细胞(iPSC)。将细胞维持在
Figure BDA0002748184420000211
生长因子减少(GFR)基底膜基质(
Figure BDA0002748184420000212
GrowthFactor Reduced(GFR)Basement Membrane Matrix)(#354230)上，并维持在完全mTESR培养基(具有补充物的基础培养基)(StemCell Technologies,#05850)中。将来自三个单独供体的三种iPSC克隆用250ng/mL GFP mRNA脂质颗粒和100ng/mL ApoE处理48小时。
人神经祖细胞(NPC)和培养
NPC是衍生自诱导的多能干细胞的未成熟神经元细胞类型，其可以使用促进分化的特定培养条件、试剂和细胞培养基分化成成熟的皮质神经元。从iPSC克隆到功能和生理学上定义的成熟皮质神经元的分化过程是耗时的且技术上具有挑战性的过程。可商购获得的NPC加速神经元培养的过程，因为这些细胞类型进一步在分化途径中。在这些研究中，良好表征的NPC购自StemCell Technologies(Vancouver,Canada,雌性细胞系Cat#70902,雄性系：StemCell Technologies Cat#70901.)，并且进行培养以获得成熟的皮质神经元。本发明的脂质颗粒制剂可以应用于沿该分化途径的多个点，从祖细胞阶段开始到神经元成熟的点。这也表明基于脂质颗粒的核酸载体可能应用于iPSC自身的遗传操作，或NPC阶段上游的神经元细胞类型。
通过将NPC接种在具有神经祖细胞培养基2(StemCell Technologies Cat.#08560)的MatrigelTM包被的细胞培养瓶中来维持NPC。每隔一天进行完全培养基的更换，直至大约每隔4天，细胞汇合，此时将细胞传代。在接种到MatrigelTM包被的24孔板上后24小时，用1μg/mL ApoE和100ng/mL质粒脂质颗粒制剂处理NPC。
NPC的分化在BrainPhysTM神经元培养基N2-A&SM1试剂盒cat#05793中完成。使用修改版本的StemCell BrainPhystm方案进行分化，简而言之：在分化第0天，将NPC接种在含神经祖细胞培养基2的聚-L-鸟氨酸和层粘连蛋白包被的T25组织培养瓶上。24小时后，将培养基切换为神经元分化培养基(STEMdiffTM神经元分化试剂盒Cat.#08500,StemCell)，并且此后每隔一天进行完全培养基的更换。
在分化的第6天，将细胞传代到具有正常量的STEMdifftm培养基的一半的聚-L-鸟氨酸和层粘连蛋白包被的24孔培养皿中。这成为神经元成熟的第0天。24小时后，在神经元成熟的第1天，添加正常量的BrainPhysTM神经元培养基的一半，并且在实验期间每隔一天用BrainPhysTM神经元培养基进行1/2培养基更换。
神经元的处理和使用IncuCyteTMS3活细胞范围(IncuCyteTMS3Live Cells Scope)的评估
当神经元成熟到所需的天数(第1天、第7天、第10天、第14天等)时，向每个孔中添加1μg/mL ApoE，随后添加600ng/mL脂质混合物制剂中的核酸治疗剂。然后使用位于细胞培养箱内的IncuCyteTMS3活细胞分析系统(Essen Biosciences,Ann Arbor,Michigan,USA)实时分析处理的板。将IncuCyteTMS3编程为在实验期间每6小时在每个孔内的6个场位置以10X放大率拍摄图像。在数据采集之后，使用IncuCyteTMS3软件创建算法以鉴定相衬和绿色荧光蛋白(“GFP”)图像两者的细胞体和％汇合。
提供以下实施例是为了说明而不是限制本发明的目的。
实施例1
核酸治疗剂(NAT)微流体混合至脂质纳米颗粒(LNP)
通过将来自各个脂质储液的规定量的脂质(参见表1)在乙醇中组合来制备脂质混合物溶液。对于NanoAssemblrTMSPARK方法，使用50mM的脂质混合物溶液浓度，并且对于NanoAssemblrTMSPARK，通常使用12.5mM的脂质混合物溶液。
使用乙酸钠缓冲液将信使RNA(mRNA)或质粒NAT稀释到所需浓度。然后通过使用NanoAssemblrTMSpark仪器运行两种流体来制备脂质颗粒样品。简而言之，按照N/P比例(4或6)的需要，将总体积为36μL的在100mM乙酸钠缓冲液中的10-20μg核酸与12μL的50mM脂质混合物溶液混合。将微流体混合的纳米颗粒立即用在水输出孔中的48μL无Ca和Mg的1XPBS(pH7.4)中稀释。将这些核酸脂质颗粒立即收集到含有96μL无Ca和Mg的1XPBS(pH7.4)的微量离心管中。通过改良的Ribogreen/PicogreenTM测定测量封装效率。对于质粒，所观察到的颗粒属性通常为140-300nm，这取决于脂质组成。
也由NanoAssemblrTMBenchtop制备基于脂质的制剂用于测试。简而言之，根据N/P比为6或4，使用100mM乙酸钠缓冲液将350μL mRNA/质粒稀释到0.2至0.3mg/mL的所需浓度。然后通过以3:1的流速比和12ml/分钟的总流速运行两种流体，即在水性溶剂中的核酸和在乙醇中的脂质混合物，制备脂质颗粒样品。在微流体装置中混合后，将筒后脂质颗粒样品稀释到含有3-40体积的磷酸盐缓冲盐水(PBS)缓冲液(pH7.4)的无RNA酶的管中。最后通过在PBS(pH7)中透析或使用AmiconTM离心过滤器(Millipore,USA)在3000RPM下或使用TFF系统去除乙醇。一旦达到所需浓度，在无菌条件下使用200μm过滤器对颗粒进行过滤灭菌。通过Ribogreen测定测量最终的NAT封装效率。
脂质混合物的组分
可电离的脂质1,17-双(2-辛基环丙基)十七烷-9-基4-(二甲基氨基)丁酸酯盐酸盐、中性脂质DOPE和稳定剂Myrj52(聚氧乙烯(40)硬脂酸酯)是脂质混合物A的组分。对于脂质混合物A DODMA，使用DODMA代替1,17-双(2-辛基环丙基)十七烷-9-基4-(二甲基氨基)丁酸酯盐酸盐，并且在脂质混合物A-COATSOME中使用CoatsomeTM。首先用单一表面活性剂，然后两种表面活性剂，然后三种表面活性剂替代稳定剂Myrj。
(脂质混合物T20，即聚氧乙烯(20)山梨醇酐单月桂酸酯)、脂质混合物T80(聚氧乙烯(80)山梨醇酐单月桂酸酯)和脂质混合物TDM(仅十三烷基β-D-麦芽糖苷或“TBD”)。在脂质混合物K和L中，稳定剂是1:1:1wt/wt比的聚氧乙烯(20)山梨醇酐单月桂酸酯：聚氧乙烯(80)山梨醇酐单月桂酸酯：十三烷基β-D-麦芽糖苷的组合。在所有制剂中，存在0-0.1Mol％的DiD标签。脂质混合物中组分比例的列表显示在表1中。
表1：脂质混合物的组分和比例
Figure BDA0002748184420000241
Figure BDA0002748184420000251
*IL是：可电离的脂质。BOCHD-C3-DMA、DODMA和CoatsomeTM是在多种实例中的IL。在脂质混合物A或脂质混合物K后的后缀DODMA或COATSOME用于表示使用这些脂质的位置。在所有其它情况下，IL是BOCHD-C3-DMA。
**也称为聚山梨醇酯20或吐温20
***也称为聚山梨醇酯80或吐温80
实施例2
脂质颗粒或“LNP”的表征和封装
使用ZetaSizer Nano ZSTM,Malvern Instruments,UK)通过动态光散射(DLS)测定颗粒尺寸(颗粒的流体动力学直径)。将633nm波长的He/Ne激光器用作光源。从以反向散射检测模式(测量角度173)进行的散射强度数据测量数据。测量是每个样品各自两个循环的平均10次运行。Z-平均尺寸被报道为脂质颗粒尺寸，并且被定义为谐波强度平均粒径。
本申请中描述的各种脂质混合物的质粒和mRNA封装的结果显示在表2中。在所有制剂中都存在良好的包封，其中多分散性低于0.3。
表2A：使用NanoAssemblrTMSPARK微混合器产生的质粒LNP颗粒：物理-化学参数
Figure BDA0002748184420000261
表2B：使用NanoAssemblrTMBenchtop微混合器产生的mRNA LNP和质粒LNP颗粒：物理-化学参数
Figure BDA0002748184420000262
Figure BDA0002748184420000271
实施例3
用质粒LNP处理神经元并使用IncuCyteTMS3评估–GFP表达
将在ddH2O中的质粒制备物pCX-EGFP(质粒大小5514nt,SEQ ID NO.1，由GenScript USA Inc,Piscataway,NJ定制，包括氨苄青霉素抗性、限制酶HINDIII)用于该评估。所述质粒包括GFP表达组分，其仅在所述质粒在细胞内表达时才产生靶蛋白。
现在转到使用脂质颗粒进行细胞处理：当准备好纯的神经元群体时，通常在神经分化的第8天左右，将1μg/mL的ApoE和600ng/mL的质粒脂质颗粒与Neural Maintenance-XFTM培养基(Axol Bioscience)一起添加。然后将处理的板置于位于细胞培养箱内的IncuCyteTMS3仪器中。IncuCyteTMS3在实验期间每6小时在每个孔内的6个位置处拍摄10X图像。在数据采集后，使用IncuCyteTMS3软件创建算法以鉴定相位图像和GFP图像中的神经元细胞体和神经突。
为了创建图1A-1F，我们使用GFP掩模(一种用于标记细胞内对GFP荧光信号呈阳性的区域的图像分析工具)，然后我们使用阴像用于更好的黑白再现。在DIV14时，处理后72小时拍摄图像。清楚地看到GFP阳性细胞体和神经炎。
测试的制剂是：图1A脂质混合物A、图1B脂质混合物D、图1C脂质混合物T20、图1D脂质混合物T80、图1E脂质混合物K、图1F脂质混合物L。氨基脂质与核苷酸磷酸的摩尔比是N/P4。很明显，虽然单独的表面活性剂聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80和麦芽糖苷对转染或细胞活力没有产生大的积极影响，但所有三者的组合对转染或细胞活力产生了大的积极影响。
实施例4
制剂对细胞健康的影响
作为参考，图2是在神经元成熟的第14天(DIV14)时未处理的成熟神经元的相衬图像。图3A、3B和3C是在DIV 14时，未处理的和用脂质颗粒处理后48小时的iPSC衍生的神经元的相衬图像，所述脂质颗粒由含有编码GFP的质粒的脂质混合物A或脂质混合物L组成，氨基脂质与核苷酸磷酸摩尔比是N/P 6。显示的数据来自IncucyteTM实时成像仪器。观察结果：相衬图像中的白色圆形细胞显示死细胞/垂死细胞；脂质混合物A的图像显示该制剂对人iPSC衍生的神经元有毒；并且脂质混合物L与未处理的细胞非常相似(即无毒性)。
图4A-D是未处理的和用脂质颗粒处理后48小时，在DIV 3时用IncucyteTM仪器拍摄的iPSC衍生的神经祖细胞的相衬图像，所述脂质颗粒由未处理(图4A)、脂质混合物A GFP质粒(图4B)、脂质混合物L GFP质粒(图4C)或LipofectamineTM质粒(图4D)组成，DNA:脂质比均为N/P 6。相衬图像中的白色圆形细胞是死细胞或垂死细胞。脂质混合物A试验的图像显示该制剂对人iPSC衍生的神经祖细胞(NPC)有毒。脂质混合物L看上去对细胞毒性较小；以及LipofectamineTM是有毒的。毒性由活细胞的数量表示，较少的细胞意指较高的毒性。
实施例5
用流式细胞术确认了iPSC衍生的成熟神经元
在处理和温育神经元后，收集来自每个孔的培养基，使用利用PBS中的3％FBS灭活的0.25％胰蛋白酶收获细胞，并在其相应的培养基中沉淀。离心后，用PBS洗涤细胞一次并再次沉淀。然后将细胞重悬于结合缓冲液TM(BD Biosciences)中，并且加入碘化丙锭以染色具有完全破裂的膜的细胞(死细胞)。然后使用BD Biosciences CantoTMII流式细胞仪评估细胞。
标志物组由以下组成：βIII微管蛋白(TUJ1)，其为存在于分化(成熟)神经元中的神经元谱系标志物；双皮质素(DCX)，其在神经元分化的早期阶段表达；和Sox 1，其在神经祖细胞(未分化的神经元)中表达。
表3.在DIV14时神经元的流式细胞术表征
Figure BDA0002748184420000291
流式细胞术数据显示，大多数分化的神经元群体(74％)在处理前表达对成熟神经元特异的标志物，确认了测试的神经元基本上是成熟的。
实施例6
神经元的处理和神经元活力的评估
细胞活力和神经突生长是神经细胞健康和功能的最常见的测量指标。经受细胞毒性处理的神经细胞通常通过缩短其神经突来响应。此外，神经突生长是存活的神经元培养物的金标准标志。神经突长度的测量单位是mm/mm2。查看每mm2的神经突长度，“平均神经突长度”由来自孔的所有图像的数据得到。
“细胞体簇”是细胞体数量的量度。处理的细胞应具有与未处理的细胞相似的细胞体数量，以显示没有毒性作用。测量单位是1/mm2。通过查看每mm2鉴定的细胞体数量计算孔的所有图像中的细胞体的平均数量。
用于显示不同脂质混合物的转染和NAT表达的测量是“％的GFP阳性细胞体簇”。该测量将GFP细胞簇值归一化为图像中总细胞体的数量，并给出图像中GFP阳性神经元的数量的总体估计。
在成熟的DIV 14时处理成熟神经元细胞。将脂质混合物A、脂质混合物TBD、脂质混合物T20、脂质混合物T80、脂质混合物K和脂质混合物L与GFP质粒以核酸与脂质的4X重量比混合。
测量GFP-阳性细胞体的数量和GFP-阳性神经突的总长度。来自这两个图的数据显示在图5和图6中。脂质混合物K&脂质混合物L制剂显示出最高数量的GFP-阳性细胞体和神经突，导致相对于脂质混合物A/未处理的成熟iPSC衍生的神经元中的最高％的GFP-阳性。来自细胞体计数和相位神经突长度的结果(图5)确认了GFP％结果的那些结果(图6)。
实施例7
mRNA转染
使用非整合oriP/EBNA1{Yu,2009,Human induced pluripotent stem cellsfree of vector and transgene sequences}质粒由重编程供体来源的成纤维细胞产生诱导的多能干细胞(iPSC)。将细胞维持在
Figure BDA0002748184420000301
生长因子减少(GFR)基底膜基质(#354230)中，并且维持在完全mTeSR培养基(具有补充物的基础培养基)(StemCellTechnologies,#05850)中。将来自三个单独供体的三种iPSC克隆用250ng/mL GFP mRNA(
Figure BDA0002748184420000302
EGFP mRNA
Figure BDA0002748184420000303
增强的绿色荧光蛋白mRNA(TrilinkBiotechnologies,San Diego,CA))脂质颗粒和100ng/mL ApoE处理48小时。996bp mRNA表示为Seq Id No.2。使用DAPI核标签测定细胞的总数，然后计算表达GFP的细胞相对于每孔细胞总数的百分比。如图7所示，与未处理的和脂质混合物A组相比，由脂质混合物L制备的脂质颗粒显示出最高的表达GFP的iPSC的比例(40.4％对比8.36％)。该图代表每个处理组的GFP阳性细胞的平均百分比。该实验说明了mRNA以及质粒转染有利地通过本发明的脂质混合物完成，并且可以成功地转染iPSC。
实施例8
体外质粒转染，GFP表达
质粒和脂质颗粒的制备如上所述。在该实验中，不同比例的可电离脂质、中性脂质、胆固醇和表面活性剂的与质粒封装一起使用。有关所述制剂的详细信息，请参见表1。LNP吐温20和LNP吐温80的胆固醇和稳定剂的比例略微不同于用于mRNA脂质混合物T20和T80的胆固醇和稳定剂的比例。实验的目的是研究质粒介导的GFP在体外神经祖细胞(NPC)中的表达的影响，其使用具有单独的表面活性剂对比组合的脂质颗粒组合物，并且在第二部分中，使用不同的表面活性剂作为单一试剂对比标准表面活性剂Myrj52进行。在脂质颗粒中包含1mol％吐温20、1mol％吐温80和1mol％吐温20与吐温80的一对一组合的制剂介导的转染活性显示在图8A中。两种吐温的组合比每种单独的吐温更好地发挥作用，以在细胞中建立GFP蛋白表达。
对于实验的第二部分，在脂质颗粒中包含2.5mol％Myrj52(脂质混合物A)、2.5mol％聚山梨醇酯20(吐温20在脂质混合物T20中)和2.5mol％聚山梨醇酯80(吐温80在脂质混合物T80中)的制剂介导的转染活性显示在图8B中。聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80都比Myrj52更好地发挥作用，以在细胞中建立GFP蛋白表达。
实施例9
无论可电离脂质的特性如何，表面活性剂组合的效果都存在
将NPC暴露于含有脂质混合物A和脂质混合物K封装的mRNA形式的交替可电离脂质中以鉴定任何可电离脂质的特异性作用。图9A显示了与脂质混合物K和脂质混合物K DODMA相比，脂质混合物A和脂质混合物A DODMA的作为GFP百分比的mRNA表达。对于用1,17-双(2-辛基环丙基)十七烷-9-基4-(二甲基氨基)丁酸酯HCl制备的脂质混合物，观察到类似的结果，这与DODMA相反。
图9B显示了使用相似的测试模式，但用COATSOMETM作为可电离的脂质，mRNA介导的GFP在神经祖细胞中的表达(平均荧光强度)。此外，具有1,17-双(2-辛基环丙基)十七烷-9-基4-(二甲基氨基)丁酸酯HCl或CoatsomeTM的脂质混合物K优于脂质混合物A或脂质混合物ACoatsomeTM。
无论可电离的脂质是1,17-双(2-辛基环丙基)十七烷-9-基4-(二甲基氨基)丁酸酯HCl、DODMA或CoatsomeTM，都维持了脂质混合物K中组合表面活性剂的益处。
实施例10
在NPC中，将TransfectamineTM转染剂(Life Technologies Inc.)与脂质混合物K和脂质混合物L(1,17-双(2-辛基环丙基)十七烷-9-基4-(二甲基氨基)丁酸酯HCl)对于其对细胞健康的作用进行比较。结果显示在图10中。在144小时的正常细胞培养(包括传代)后，用LipofectamineTM处理的细胞不能存活，而用脂质混合物K和L处理的那些几乎100％汇合。
实施例11
将两种常用的可电离脂质，即KC2和DLin-MC3-DMA，代替脂质混合物A和K的可电离脂质组分。如上所述转染NPC，并且经由流式细胞术在48H时GFP中值荧光强度的结果显示在图11中。为了参考，脂质颗粒尺寸、PDI和封装效率列在表4中。与对照脂质混合物A相比，KC2和DLin-MC3-DMA(在图中为MC3)在脂质混合物K中有效增强GFP表达。PNI-IL-1是1,17-双(2-辛基环丙基)十七烷-9-基4-(二甲基氨基)丁酸酯HCl)。
Figure BDA0002748184420000321
虽然已经描述和说明了本发明的具体实施方案，但这些实施方案应被认为仅仅是对本发明的说明，而不应被视为限制根据所附权利要求所解释的本发明。
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ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag 180
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accaccctga cctacggcgt gcagtgcttc agccgctacc ccgaccacat gaagcagcac 1980
gacttcttca agtccgccat gcccgaaggc tacgtccagg agcgcaccat cttcttcaag 2040
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cgcatcgagc tgaagggcat cgacttcaag gaggacggca acatcctggg gcacaagctg 2160
gagtacaact acaacagcca caacgtctat atcatggccg acaagcagaa gaacggcatc 2220
aaggtgaact tcaagatccg ccacaacatc gaggacggca gcgtgcagct cgccgaccac 2280
taccagcaga acacccccat cggcgacggc cccgtgctgc tgcccgacaa ccactacctg 2340
agcacccagt ccgccctgag caaagacccc aacgagaagc gcgatcacat ggtcctgctg 2400
gagttcgtga ccgccgccgg gatcactcac ggcatggacg agctgtacaa gtaagaattc 2460
actcctcagg tgcaggctgc ctatcagaag gtggtggctg gtgtggccaa tgccctggct 2520
cacaaatacc actgagatct ttttccctct gccaaaaatt atggggacat catgaagccc 2580
cttgagcatc tgacttctgg ctaataaagg aaatttattt tcattgcaat agtgtgttgg 2640
aattttttgt gtctctcact cggaaggaca tatgggaggg caaatcattt aaaacatcag 2700
aatgagtatt tggtttagag tttggcaaca tatgccatat gctggctgcc atgaacaaag 2760
gtggctataa agaggtcatc agtatatgaa acagccccct gctgtccatt ccttattcca 2820
tagaaaagcc ttgacttgag gttagatttt ttttatattt tgttttgtgt tatttttttc 2880
tttaacatcc ctaaaatttt ccttacatgt tttactagcc agatttttcc tcctctcctg 2940
actactccca gtcatagctg tccctcttct cttatgaaga tccctcgacc tgcagcccaa 3000
gcttggcgta atcatggtca tagctgtttc ctgtgtgaaa ttgttatccg ctcacaattc 3060
cacacaacat acgagccgga agcataaagt gtaaagcctg gggtgcctaa tgagtgagct 3120
aactcacatt aattgcgttg cgctcactgc ccgctttcca gtcgggaaac ctgtcgtgcc 3180
agcggatccg catctcaatt agtcagcaac catagtcccg cccctaactc cgcccatccc 3240
gcccctaact ccgcccagtt ccgcccattc tccgccccat ggctgactaa ttttttttat 3300
ttatgcagag gccgaggccg cctcggcctc tgagctattc cagaagtagt gaggaggctt 3360
ttttggaggc ctaggctttt gcaaaaagct aacttgttta ttgcagctta taatggttac 3420
aaataaagca atagcatcac aaatttcaca aataaagcat ttttttcact gcattctagt 3480
tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct tatcatgtct ggatccgctg cattaatgaa 3540
tcggccaacg cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg ctcttccgct tcctcgctca 3600
ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg 3660
taatacggtt atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc 3720
agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc 3780
cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac 3840
tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc 3900
tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcaat 3960
gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc 4020
acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca 4080
acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag 4140
cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta 4200
gaaggacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg 4260
gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc 4320
agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt 4380
ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa 4440
ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat 4500
atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag tgaggcacct atctcagcga 4560
tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct gactccccgt cgtgtagata actacgatac 4620
gggagggctt accatctggc cccagtgctg caatgatacc gcgagaccca cgctcaccgg 4680
ctccagattt atcagcaata aaccagccag ccggaagggc cgagcgcaga agtggtcctg 4740
caactttatc cgcctccatc cagtctatta attgttgccg ggaagctaga gtaagtagtt 4800
cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg ccattgctac aggcatcgtg gtgtcacgct 4860
cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga gttacatgat 4920
cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc tccgatcgtt gtcagaagta 4980
agttggccgc agtgttatca ctcatggtta tggcagcact gcataattct cttactgtca 5040
tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg gtgagtactc aaccaagtca ttctgagaat 5100
agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaat acgggataat accgcgccac 5160
atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc ttcggggcga aaactctcaa 5220
ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac tcgtgcaccc aactgatctt 5280
cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa aacaggaagg caaaatgccg 5340
caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat gttgaatact catactcttc ctttttcaat 5400
attattgaag catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt gaatgtattt 5460
agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca catttccccg aaaagtgcca cctg 5514
<210> 2
<211> 966
<212> DNA
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> mRNA eGFP ORF
<220>
<221> misc_feature
<222> (721)..(846)
<223> n是a、c、g、t或u
<400> 2
atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60
ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120
ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180
ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240
cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300
ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360
gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420
aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480
ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540
gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600
tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660
ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa 720
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 780
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 840
nnnnnnaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 900
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 960
aaaaaa 966

Claims (22)

1.转染试剂组合物，其包含：
35至50Mol％的可电离的脂质或其药学上可接受的盐；
15至25Mol％的结构脂质；
35至41Mol％的固醇；和
0.5至约10Mol％的稳定剂。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述可电离的脂质是氨基脂质或其药学上可接受的盐.
3.如权利要求1或2所述的组合物，其中所述稳定剂包含一种以上的表面活性剂。
4.如权利要求1-2中任一项所述的组合物，其中所述稳定剂是聚山梨醇酯。
5.如权利要求1-2中任一项所述的组合物，其中所述稳定剂是聚山梨醇酯(80)。
6.如权利要求1-2中任一项所述的组合物，其中所述稳定剂是麦芽糖苷。
7.如权利要求1-2中任一项所述的组合物，其中所述稳定剂是聚山梨醇酯的混合物。
8.如权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中所述稳定剂是聚山梨醇酯和麦芽糖苷的混合物。
9.如权利要求8所述的组合物，其中所述稳定剂是聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯20和十三烷基-D-麦芽糖苷的混合物。
10.如权利要求9所述的组合物，其中所述混合物是等比例的聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯20和十三烷基-D-麦芽糖苷。
11.如权利要求1-10中任一项所述的组合物，其中所述可电离的脂质占所述组合物的约40Mol％。
12.如权利要求1-10中任一项所述的组合物，其中所述稳定剂占所述组合物的约0.5至5Mol％。
13.如权利要求1-12中任一项所述的组合物，其中所述固醇是胆固醇。
14.如权利要求1-13中任一项所述的组合物，其还包含核酸或肽。
15.如权利要求14所述的组合物，其中所述核酸是DNA、RNA或能够表达RNA的质粒。
16.如权利要求1-15中任一项所述的组合物，其中所述可电离的脂质选自BOCHD-C3-DMA、KC2、MC3、α-D-生育酚琥珀酰基和DODMA、或它们的药学上可接受的盐。
17.如权利要求1-16中任一项所述的组合物，其中所述结构脂质是1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)或DSPE或DSPC。
18.如权利要求1-17中任一项所述的组合物，其中所述组合物以直径为约15nm至约300nm的脂质纳米颗粒的形式存在。
19.用核酸治疗剂转染iPSC或iPSC样细胞同时保持核酸的活性和所述细胞的活力的方法，其包括使所述细胞与权利要求1-18中任一项所述的组合物接触。
20.用核酸治疗剂转染神经元细胞同时保持核酸的活性和所述细胞的活力的方法，其包括使所述细胞与权利要求1-18中任一项所述的组合物接触。
21.如权利要求19或20所述的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
22.如权利要求19或20所述的方法，其中所述细胞是人源细胞类型。
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