JP2024514939A - ヒトミトコンドリアゲノムを標的化する遺伝子操作メガヌクレアーゼ - Google Patents

ヒトミトコンドリアゲノムを標的化する遺伝子操作メガヌクレアーゼ Download PDF

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Abstract

本開示は、式（ＩＩ）の化合物を提供し、式中、Ｒ１は、少なくとも１個の窒素原子を含む、任意選択的に置換された単環式又は二環式飽和、部分的に不飽和又は芳香族のヘテロシクリルであり、他の可変要素は、本明細書で定義される通りである。化合物は、コロナウイルスメインプロテアーゼ（ＭＰＲＯ）の阻害剤である。化合物の調製のための方法、及び化合物の使用、例えば、ＣＯＶＩＤ－１９などのコロナウイルス疾患の治療及び／又は予防における使用も、開示される。【化１】TIFF2024514939000027.tif26170【選択図】なし

Description

本開示は、分子生物学および組換え核酸技術の分野に関する。特に、本開示は、ヒトミトコンドリアゲノムに見出される認識配列を認識および切断するように遺伝子操作された組換えメガヌクレアーゼに関する。本開示はさらに、遺伝子修飾真核細胞を産生するための方法におけるそのような組換えメガヌクレアーゼの使用、およびミトコンドリアＤＮＡが修飾されている遺伝子修飾真核細胞の集団に関する。
ＥＦＳ－ＷＥＢを介してテキストファイルとして提出された配列表の参照
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩ形式で提出され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０２２年４月２１日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーの名称はＰ８９３３９＿０１３９＿５＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿４－２１－２２．ｔｘｔであり、サイズは８０．６ｋｂである。
すべての生物において、ミトコンドリアは、正常な成長および発達の下で、ならびにストレスに応答して細胞のエネルギーおよび代謝を調節する。これらの役割で機能するタンパク質の多くは、ミトコンドリアゲノムにコードされている。したがって、ミトコンドリアゲノムの編集は、動物と植物の両方において多様な用途を有する。ヒトにおいて、有害なミトコンドリア変異は、遺伝子編集療法を適用することができるいくつかの障害の原因である。
病原性ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）変異には、タンパク質コード、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）またはリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）遺伝子における大規模な再編成および点変異が含まれる。ｍｔＤＮＡ関連疾患診断の有病率は５，０００人に約１人であるが、１０の最も一般的な病原性ｍｔＤＮＡ変異の集団頻度ははるかに高く、２００人に１人に近づき、多くの「正常な」個体が低レベルの変異型ゲノムを保有していることを意味する（非特許文献１）。
変異型ｍｔＤＮＡは、ほとんどの場合、患者の細胞において野生型ｍｔＤＮＡと共存する（ｍｔＤＮＡヘテロプラスミー）。いくつかの研究は、野生型ｍｔＤＮＡが強い保護効果を有することを示し、変異型ｍｔＤＮＡのレベルが８０～９０％より高い場合にのみ生化学的異常が観察された（非特許文献２）。変異負荷が８０％を超える場合にのみ、筋線維がＯＸＰＨＯＳ欠損を発症することが示されている（非特許文献３）。したがって、このバランスを野生型に向かってわずかなパーセンテージでもシフトさせることができる任意のアプローチは、強い治療可能性を有する。
しかし、ｍｔＤＮＡ操作は、ｍｔＤＮＡを高効率で標的化し、正確な編集を生成することができないため、依然として科学の未開拓領域である。ミトコンドリアゲノムは、予測可能な修復機構およびこの細胞小器官への編集技術の送達を必要とするため、編集が困難である。ミトコンドリアゲノム編集に関連する困難および予測不可能性を考慮すると、生命科学における調査および機会の分野全体を切り開く、ｍｔＤＮＡの正確な編集に対する満たされていない必要性が存在する。ミトコンドリアゲノムの規定された領域（好ましくはただ１つの遺伝子に限定される）をより予測可能な様式で標的化および編集する能力は、現在利用可能なシステムを超える明らかな利点である。
Ｓｃｈｏｎら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎ １３：８７８－８９０（２０１２） Ｓｃｈｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １３：８７８－８９０（２０１２） Ｓｃｉａｃｃｏら、Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ、３：１３－１９（１９９４）
ミトコンドリアゲノムの正確な編集のための組成物および方法が本明細書で提供される。これまで、ミトコンドリアゲノム編集の試みは、大規模かつ予測不可能な欠失／再編成をもたらしてきた。本発明は、遺伝子操作メガヌクレアーゼがミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）の正確な編集をもたらし、それにより生命科学における調査および機会の分野全体を切り開くことができることを実証する。本明細書で提供される組成物および方法は、周囲領域に影響を与えることなく、１つの特定のミトコンドリア遺伝子を編集するために使用することができる。
一態様では、本発明は、真核細胞のミトコンドリアゲノム中の配列番号１を含む認識配列に結合して切断するミトコンドリア標的化遺伝子操作メガヌクレアーゼ（ＭＴＥＭ）であって、ＭＴＥＭがミトコンドリア移行ペプチド（ＭＴＰ）に結合した遺伝子操作メガヌクレアーゼを含み、遺伝子操作メガヌクレアーゼが第１のサブユニットおよび第２のサブユニットを含み、第１のサブユニットが認識配列の第１の認識半部位に結合し、第１の超可変（ＨＶＲ１）領域を含み、第２のサブユニットが認識配列の第２の認識半部位に結合し、第２の超可変（ＨＶＲ２）領域を含む、ＭＴＥＭを提供する。
いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号３～１２のいずれか１つの残基２４～７９に対応するアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号３～１２のいずれか１つの残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、および７７に対応する１つ以上の残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号３～１２のいずれか１つの残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、および７７に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号３～１２のいずれか１つの残基６６に対応する残基にＹ、Ｒ、ＫまたはＤを含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１個のアミノ酸置換を有する配列番号３～１２のいずれか１つの残基２４～７９を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号３～１２のいずれか１つの残基２４～７９を含む。
いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号３～１２のいずれか１つの残基７～１５３に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号３～１２のいずれか１つの残基１９に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号３、５、７、９、１１または１２のいずれか１つの残基８０に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号３～１２のいずれか１つの残基１９に対応する残基にＧ、ＳまたはＡを含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号３～１２のいずれか１つの残基８０に対応する残基にＥ、ＱまたはＫを含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個のアミノ酸置換を有する配列番号３～１２のいずれか１つの残基７～１５３を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号３～１２のいずれか１つの残基７～１５３を含む。
いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号３～１２のいずれか１つの残基２１５～２７０に対応するアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号３～１２のいずれか１つの残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６および２６８に対応する１つ以上の残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号３～１２のいずれか１つの残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６および２６８に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号３～１２のいずれか１つの残基２４１に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号３または５～１２のいずれか１つの残基２６３に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号３～６または８～１２のいずれか１つの残基２６４に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号６の残基２６５に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号３～１２のいずれか１つの残基２５７に対応する残基にＹ、Ｒ、ＫまたはＤを含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１個のアミノ酸置換を有する配列番号３～１２のいずれか１つの残基２１５～２７０を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号３～１２のいずれか１つの残基２１５～２７０を含む。
いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号３～１２のいずれか１つの残基１９８～３４４に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号４のいずれか１つの残基２７６に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号３～１２のいずれか１つの残基３３０に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号３～１２のいずれか１つの残基２１０に対応する残基にＧ、ＳまたはＡを含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号３～１２のいずれか１つの残基２７１に対応する残基にＥ、ＱまたはＫを含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０個のアミノ酸置換を有する配列番号３～１２のいずれか１つの残基１９８～３４４を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号３～１２のいずれか１つの残基１９８～３４４を含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作メガヌクレアーゼは、リンカーを含む一本鎖メガヌクレアーゼであり、リンカーは第１のサブユニットと第２のサブユニットとを共有結合する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作メガヌクレアーゼは、配列番号３～１２のいずれか１つに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作メガヌクレアーゼは、配列番号３～１２のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作メガヌクレアーゼは、配列番号３３～４２のいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作メガヌクレアーゼは、配列番号３３～４２のいずれか１つの核酸配列によってコードされる。
いくつかの実施形態では、ＭＴＰは、配列番号４３～４５のいずれか１つに記載の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＭＴＰは、配列番号４３～４５のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＭＴＰは、遺伝子操作メガヌクレアーゼのＣ末端に結合される。いくつかの実施形態では、ＭＴＰは、遺伝子操作メガヌクレアーゼのＮ末端に結合される。いくつかの実施形態では、ＭＴＰは、遺伝子操作メガヌクレアーゼに融合される。いくつかの実施形態では、ＭＴＰは、ポリペプチドリンカーによって遺伝子操作メガヌクレアーゼに結合される。いくつかの実施形態では、遺伝子操作メガヌクレアーゼは、第１のＭＴＰおよび第２のＭＴＰに結合される。いくつかの実施形態では、第１のＭＴＰおよび／または第２のＭＴＰは、配列番号４３～４５のいずれか１つに記載の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のＭＴＰおよび／または第２のＭＴＰは、配列番号４３～４５のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のＭＴＰおよび第２のＭＴＰは同一である。いくつかの実施形態では、第１のＭＴＰおよび第２のＭＴＰは同一ではない。いくつかの実施形態では、第１のＭＴＰおよび／または第２のＭＴＰは、遺伝子操作メガヌクレアーゼに融合される。いくつかの実施形態では、第１のＭＴＰおよび／または第２のＭＴＰは、ポリペプチドリンカーによって遺伝子操作メガヌクレアーゼに結合される。
いくつかの実施形態では、ＭＴＥＭは、核外搬出配列（ＮＥＳ）に結合される。いくつかの実施形態では、ＮＥＳは、配列番号４６または４７に示される配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＮＥＳは、配列番号４６または４７に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＮＥＳは、ＭＴＥＭのＮ末端に結合される。いくつかの実施形態では、ＮＥＳは、ＭＴＥＭのＣ末端に結合される。いくつかの実施形態では、ＮＥＳはＭＴＥＭに融合される。いくつかの実施形態では、ＮＥＳは、ポリペプチドリンカーによってＭＴＥＭに結合される。いくつかの実施形態では、ＭＴＥＭは、第１のＮＥＳおよび第２のＮＥＳに結合される。いくつかの実施形態では、第１のＮＥＳはＭＴＥＭのＮ末端に結合され、第２のＮＥＳはＭＴＥＭのＣ末端に結合される。いくつかの実施形態では、第１のＮＥＳおよび／または第２のＮＥＳは、配列番号４６または４７に示される配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のＮＥＳおよび／または第２のＮＥＳは、配列番号４６または４７に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のＮＥＳおよび第２のＮＥＳは同一である。いくつかの実施形態では、第１のＮＥＳおよび第２のＮＥＳは同一ではない。いくつかの実施形態では、第１のＮＥＳおよび／または第２のＮＥＳは、ＭＴＥＭに融合される。いくつかの実施形態では、第１のＮＥＳおよび／または第２のＮＥＳは、ポリペプチドリンカーによってＭＴＥＭに結合される。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載のＭＴＥＭをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドはｍＲＮＡである。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載のＭＴＥＭをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡ構築物を提供する。いくつかの実施形態では、組換えＤＮＡ構築物は、ポリヌクレオチドを含む組換えウイルスをコードする。いくつかの実施形態では、組換えウイルスは、組換えアデノウイルス、組換えレンチウイルス、組換えレトロウイルス、または組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。いくつかの実施形態では、組換えウイルスは組換えＡＡＶである。いくつかの実施形態では、組換えＡＡＶはＡＡＶ９キャプシドを有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＭＴＥＭをコードする核酸配列に作動可能に連結されたプロモータを含む。いくつかの実施形態では、プロモータは構成的プロモータであるか、またはプロモータは、筋細胞特異的プロモータ、骨格筋特異的プロモータ、筋管特異的プロモータ、筋サテライト細胞特異的プロモータ、ニューロン特異的プロモータ、アストロサイト特異的プロモータ、ミクログリア特異的プロモータ、眼細胞特異的プロモータ、網膜細胞特異的プロモータ、網膜神経節細胞特異的プロモータ、網膜色素上皮特異的プロモータ、膵臓細胞特異的プロモータ、または膵臓ベータ細胞特異的プロモータである。いくつかの実施形態では、構成的プロモータは、ＣＭＶプロモータ、ＣＡＧプロモータ、ＥＦ１アルファプロモータ、またはＵｂＣプロモータである。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の任意の組換えＤＮＡ構築物を含むプラスミドを提供する。別の態様では、本発明は、本明細書に記載のＭＴＥＭをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む組換えウイルスを提供する。いくつかの実施形態では、組換えウイルスは、組換えアデノウイルス、組換えレンチウイルス、組換えレトロウイルス、または組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。いくつかの実施形態では、組換えウイルスは組換えＡＡＶである。いくつかの実施形態では、組換えＡＡＶはＡＡＶ９キャプシドを有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＭＴＥＭをコードする核酸配列に作動可能に連結されたプロモータを含む。いくつかの実施形態では、プロモータは構成的プロモータであるか、またはプロモータは、筋細胞特異的プロモータ、骨格筋特異的プロモータ、筋管特異的プロモータ、筋サテライト細胞特異的プロモータ、ニューロン特異的プロモータ、アストロサイト特異的プロモータ、ミクログリア特異的プロモータ、眼細胞特異的プロモータ、網膜細胞特異的プロモータ、網膜神経節細胞特異的プロモータ、網膜色素上皮特異的プロモータ、膵臓細胞特異的プロモータ、または膵臓ベータ細胞特異的プロモータである。いくつかの実施形態では、構成的プロモータは、ＣＭＶプロモータ、ＣＡＧプロモータ、ＥＦ１アルファプロモータ、またはＵｂＣプロモータである。
別の態様では、本発明は、ポリヌクレオチドを含む脂質ナノ粒子を含む脂質ナノ粒子組成物であって、ポリヌクレオチドが本明細書に記載のＭＴＥＭをコードする核酸配列を含む、脂質ナノ粒子組成物を提供する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドはｍＲＮＡである。
別の態様では、本発明は、薬学的に許容される担体および本明細書に記載のＭＴＥＭを含む医薬組成物を提供する。
別の態様では、本発明は、薬学的に許容される担体、本明細書に記載のポリヌクレオチドを含む医薬組成物を提供する。
別の態様では、本発明は、薬学的に許容される担体および本明細書に記載の組換えＤＮＡ構築物を含む医薬組成物を提供する。
別の態様では、本発明は、薬学的に許容される担体および本明細書に記載の組換えウイルスを含む医薬組成物を提供する。
別の態様では、本発明は、薬学的に許容される担体、および本明細書に記載の脂質ナノ粒子組成物を含む医薬組成物を提供する。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の任意のポリヌクレオチドを含む遺伝子修飾真核細胞を提供する。いくつかの実施形態では、遺伝子修飾真核細胞は、遺伝子修飾哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、遺伝子修飾真核細胞は、遺伝子修飾ヒト細胞である。
別の態様では、本発明は、遺伝子修飾真核細胞を産生するための方法であって、方法が、真核細胞に、（ａ）本明細書に記載のＭＴＥＭをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドであり、ＭＴＥＭが真核細胞で発現される、ポリヌクレオチド、または（ｂ）本明細書に記載のＭＴＥＭを導入することを含み、ＭＴＥＭが、真核細胞の変異型ミトコンドリアゲノム中の配列番号１を含む認識配列に切断部位を作り出す、方法を提供する。いくつかの実施形態では、切断部位は、認識配列が挿入または欠失を含むように、非相同末端結合によって修復される。いくつかの実施形態では、認識配列を含む変異型ミトコンドリアゲノムは、遺伝子修飾真核細胞で分解される。いくつかの実施形態では、認識配列を含む変異型ミトコンドリアゲノムの約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％が遺伝子修飾真核細胞で分解される。いくつかの実施形態では、認識配列を含む変異型ミトコンドリアゲノムに対する野生型ミトコンドリアゲノムの比は、遺伝子修飾真核細胞で増加する。いくつかの実施形態では、比は、約５：９５、約１０：９０、約１５：８５、約２０：８０、約２５：７５、約３０：７０、約３５：６５、約４０：６０、約４５：５５、約５０：５０、約５５：４５、約６０：４０、約６５：３５、約７０：３０、約７５：２５、約８０：２０、約８５：１５、約９０：１０、約９５：５、約２０：１、約５０：１、約１００：１、約１５０：１、約２００：１、約２５０：１、約３００：１、約３５０：１、約４００：１、約４５０：１、約５００：１、約５５０：１、約６００：１、約６５０：１、約７００：１、約７５０：１、約８００：１、約８５０：１、約９００：１、約９５０：１、約１０００：１、またはそれ以上まで増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子修飾真核細胞中の野生型ミトコンドリアゲノムのパーセンテージは、遺伝子修飾真核細胞中の全ミトコンドリアゲノムの約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、またはそれ以上である。いくつかの実施形態では、遺伝子修飾真核細胞中の認識配列を含む変異型ミトコンドリアゲノムのパーセンテージは、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、またはそれ以上減少する。いくつかの実施形態では、遺伝子修飾真核細胞の細胞呼吸は、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約１００％またはそれ以上増加する。いくつかの実施形態では、遺伝子修飾真核細胞の細胞呼吸は、約３０～４０％、約４０～５０％、約５０～６０％、約６０～７０％、約７０～８０％、約８０～９０％、約９０～１００％、またはそれ以上増加する。
別の態様では、本発明は、複数の遺伝子修飾細胞を含む真核細胞の集団を産生するための方法であって、方法が、集団中の複数の真核細胞に、（ａ）本明細書に記載のＭＴＥＭをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドであり、ＭＴＥＭが複数の真核細胞で発現される、ポリヌクレオチド、または（ｂ）本明細書に記載のＭＴＥＭを導入することを含み、ＭＴＥＭが、複数の真核細胞の変異型ミトコンドリアゲノム中の配列番号１を含む認識配列に切断部位を作り出す、方法を提供する。いくつかの実施形態では、切断部位は、認識配列が挿入または欠失を含むように、非相同末端結合によって修復される。いくつかの実施形態では、認識配列を含む変異型ミトコンドリアゲノムは、複数の遺伝子修飾真核細胞で分解される。いくつかの実施形態では、認識配列を含む変異型ミトコンドリアゲノムの約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％が、複数の遺伝子修飾真核細胞で分解される。いくつかの実施形態では、認識配列を含む変異型ミトコンドリアゲノムに対する野生型ミトコンドリアゲノムの比は、複数の遺伝子修飾真核細胞で増加する。いくつかの実施形態では、認識配列を含む変異型ミトコンドリアゲノムに対する野生型ミトコンドリアゲノムの比は、真核細胞の集団で増加する。いくつかの実施形態では、比は、約５：９５、約１０：９０、約１５：８５、約２０：８０、約２５：７５、約３０：７０、約３５：６５、約４０：６０、約４５：５５、約５０：５０、約５５：４５、約６０：４０、約６５：３５、約７０：３０、約７５：２５、約８０：２０、約８５：１５、約９０：１０、約９５：５、約２０：１、約５０：１、約１００：１、約１５０：１、約２００：１、約２５０：１、約３００：１、約３５０：１、約４００：１、約４５０：１、約５００：１、約５５０：１、約６００：１、約６５０：１、約７００：１、約７５０：１、約８００：１、約８５０：１、約９００：１、約９５０：１、約１０００：１、またはそれ以上まで増加する。いくつかの実施形態では、複数の遺伝子修飾真核細胞中の野生型ミトコンドリアゲノムのパーセンテージは、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、またはそれ以上増加する。いくつかの実施形態では、真核細胞の集団中の野生型ミトコンドリアゲノムのパーセンテージは、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％またはそれ以上増加する。いくつかの実施形態では、複数の遺伝子修飾真核細胞中の認識配列を含む変異型ミトコンドリアゲノムのパーセンテージは、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、またはそれ以上減少する。いくつかの実施形態では、真核細胞の集団中の認識配列を含む変異型ミトコンドリアゲノムのパーセンテージは、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、またはそれ以上減少する。いくつかの実施形態では、複数の遺伝子修飾真核細胞における細胞呼吸は、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約１００％またはそれ以上増加する。いくつかの実施形態では、複数の遺伝子修飾真核細胞における細胞呼吸は、約３０～４０％、約４０～５０％、約５０～６０％、約６０～７０％、約７０～８０％、約８０～９０％、約９０～１００％、またはそれ以上増加する。いくつかの実施形態では、真核細胞の集団における細胞呼吸は、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約１００％またはそれ以上増加する。いくつかの実施形態では、真核細胞の集団における細胞呼吸は、約３０～４０％、約４０～５０％、約５０～６０％、約６０～７０％、約７０～８０％、約８０～９０％、約９０～１００％、またはそれ以上増加する。
いくつかの実施形態では、認識配列は、ミトコンドリア障害に関連する変異型ミトコンドリアゲノムの領域内にある。いくつかの実施形態では、ミトコンドリア障害は、ミトコンドリア脳筋症、乳酸アシドーシスおよび脳卒中様エピソード（ＭＥＬＡＳ）である。いくつかの実施形態では、認識配列は、野生型ミトコンドリアゲノムのヌクレオチド位置３０００～３５００に対応する変異型ミトコンドリアゲノムの領域に位置する。いくつかの実施形態では、ＭＴＥＭは、変異型ミトコンドリアゲノムのＡ３２４３Ｇ変異を標的化する。いくつかの実施形態では、方法はインビボで行われる。いくつかの実施形態では、方法はインビトロで行われる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドはｍＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載される任意のｍＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは組換えＤＮＡ構築物である。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載の任意の組換えＤＮＡ構築物である。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、脂質ナノ粒子によって真核細胞に導入される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、組換えウイルスによって真核細胞に導入される。いくつかの実施形態では、組換えウイルスは、本明細書に記載の任意の組換えウイルスである。いくつかの実施形態では、組換えウイルスは組換えＡＡＶである。いくつかの実施形態では、組換えＡＡＶはＡＡＶ９キャプシドを有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＭＴＥＭをコードする核酸配列に作動可能に連結されたプロモータを含む。いくつかの実施形態では、プロモータは、筋細胞特異的プロモータ、骨格筋特異的プロモータ、筋管特異的プロモータ、筋サテライト細胞特異的プロモータ、ニューロン特異的プロモータ、アストロサイト特異的プロモータ、ミクログリア特異的プロモータ、眼細胞特異的プロモータ、網膜細胞特異的プロモータ、網膜神経節細胞特異的プロモータ、網膜色素上皮特異的プロモータ、膵臓細胞特異的プロモータ、または膵臓ベータ細胞特異的プロモータである。いくつかの実施形態では、構成的プロモータは、ＣＭＶプロモータ、ＣＡＧプロモータ、ＥＦ１アルファプロモータ、またはＵｂＣプロモータである。いくつかの実施形態では、真核細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、真核細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態では、真核細胞は、筋細胞、骨格筋細胞、筋管細胞、筋サテライト細胞、ニューロン、アストロサイト、ミクログリア細胞、眼細胞、網膜細胞、網膜神経節細胞、網膜色素上皮細胞、膵臓細胞、または膵臓ベータ細胞である。
別の態様では、本発明は、遺伝子修飾真核細胞を産生するための任意の方法、または複数の遺伝子修飾細胞を含む真核細胞の集団を産生するための任意の方法によって産生される遺伝子修飾真核細胞または遺伝子修飾真核細胞の集団を提供する。
別の態様では、本発明は、対象の標的細胞または対象の標的細胞の集団で変異型ミトコンドリアゲノムを分解するための方法であって、方法が、標的細胞または標的細胞の集団に：（ａ）本明細書に記載のＭＴＥＭをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドであり、ＭＴＥＭが標的細胞または標的細胞の集団で発現される、ポリヌクレオチド、または（ｂ）本明細書に記載のＭＴＥＭを送達することを含み、ＭＴＥＭが、配列番号１を含む認識配列において変異型ミトコンドリアゲノムに切断部位を作り出し、変異型ミトコンドリアゲノムが分解される、方法を提供する。いくつかの実施形態では、認識配列は、野生型ミトコンドリアゲノムのヌクレオチド位置３０００～３５００に対応する変異型ミトコンドリアゲノムの領域に位置する。いくつかの実施形態では、ＭＴＥＭは、変異型ミトコンドリアゲノムのＡ３２４３Ｇ変異を標的化する。いくつかの実施形態では、対象は哺乳動物である。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。いくつかの実施形態では、標的細胞は、筋細胞、骨格筋細胞、筋管細胞、筋サテライト細胞、ニューロン、アストロサイト、ミクログリア細胞、眼細胞、網膜細胞、網膜神経節細胞、網膜色素上皮細胞、膵臓細胞、もしくは膵臓ベータ細胞であるか、または前記標的細胞の集団は、筋細胞、骨格筋細胞、筋管細胞、筋サテライト細胞、ニューロン、アストロサイト、ミクログリア細胞、眼細胞、網膜細胞、網膜神経節細胞、網膜色素上皮細胞、膵臓細胞、もしくは膵臓ベータ細胞の集団であるか、または標的細胞の集団は、筋細胞、骨格筋細胞、筋管細胞、筋サテライト細胞、ニューロン、アストロサイト、ミクログリア細胞、眼細胞、網膜細胞、網膜神経節細胞、網膜色素上皮細胞、膵臓細胞もしくは膵臓ベータ細胞の集団であるか、または前記標的細胞の集団は、筋細胞、骨格筋細胞、筋管細胞、筋サテライト細胞、ニューロン、アストロサイト、ミクログリア細胞、眼細胞、網膜細胞、網膜神経節細胞、網膜色素上皮細胞、膵臓細胞もしくは膵臓ベータ細胞の集団である。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドはｍＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載される任意のｍＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは組換えＤＮＡ構築物である。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載の任意の組換えＤＮＡ構築物である。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、脂質ナノ粒子によって標的細胞または標的細胞の集団に送達される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、組換えウイルスによって標的細胞または標的細胞の集団に送達される。いくつかの実施形態では、組換えウイルスは、本明細書に記載の任意の組換えウイルスである。いくつかの実施形態では、組換えウイルスは組換えＡＡＶである。いくつかの実施形態では、組換えＡＡＶはＡＡＶ９キャプシドを有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＭＴＥＭをコードする核酸配列に作動可能に連結されたプロモータを含む。いくつかの実施形態では、プロモータは構成的プロモータであるか、または前記プロモータは、筋細胞特異的プロモータ、骨格筋特異的プロモータ、筋管特異的プロモータ、筋サテライト細胞特異的プロモータ、ニューロン特異的プロモータ、アストロサイト特異的プロモータ、ミクログリア特異的プロモータ、眼細胞特異的プロモータ、網膜細胞特異的プロモータ、網膜神経節細胞特異的プロモータ、網膜色素上皮特異的プロモータ、膵臓細胞特異的プロモータ、もしくは膵臓ベータ細胞特異的プロモータである。いくつかの実施形態では、構成的プロモータは、ＣＭＶプロモータ、ＣＡＧプロモータ、ＥＦ１アルファプロモータ、またはＵｂＣプロモータである。いくつかの実施形態では、認識配列を含む変異型ミトコンドリアゲノムの約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％が、標的細胞または標的細胞の集団で分解される。いくつかの実施形態では、認識配列を含む変異型ミトコンドリアゲノムに対する野生型ミトコンドリアゲノムの比は、標的細胞または標的細胞の集団で増加する。いくつかの実施形態では、比は、約５：９５、約１０：９０、約１５：８５、約２０：８０、約２５：７５、約３０：７０、約３５：６５、約４０：６０、約４５：５５、約５０：５０、約５５：４５、約６０：４０、約６５：３５、約７０：３０、約７５：２５、約８０：２０、約８５：１５、約９０：１０、約９５：５、約２０：１、約５０：１、約１００：１、約１５０：１、約２００：１、約２５０：１、約３００：１、約３５０：１、約４００：１、約４５０：１、約５００：１、約５５０：１、約６００：１、約６５０：１、約７００：１、約７５０：１、約８００：１、約８５０：１、約９００：１、約９５０：１、約１０００：１、またはそれ以上まで増加する。いくつかの実施形態では、標的細胞または標的細胞の集団中の野生型ミトコンドリアゲノムのパーセンテージは、標的細胞または標的細胞の集団中の全ミトコンドリアゲノムの約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、またはそれ以上である。いくつかの実施形態では、遺伝子修飾真核細胞中の認識配列を含む変異型ミトコンドリアゲノムのパーセンテージは、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、またはそれ以上減少する。いくつかの実施形態では、標的細胞または標的細胞の集団における細胞呼吸は、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約１００％またはそれ以上増加する。いくつかの実施形態では、標的細胞または標的細胞の集団における細胞呼吸は、約３０～４０％、約４０～５０％、約５０～６０％、約６０～７０％、約７０～８０％、約８０～９０％、約９０～１００％、またはそれ以上増加する。
別の態様では、本発明は、対象のＭＥＬＡＳに関連する状態を処置するための方法であって、方法が、対象に、（ａ）治療有効量の本明細書に記載のＭＴＥＭをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドであり、ポリヌクレオチドが対象の標的細胞または標的細胞の集団に送達され、ＭＴＥＭが標的細胞または標的細胞の集団で発現される、ポリヌクレオチド、または（ｂ）治療有効量の本明細書に記載のＭＴＥＭであり、ＭＴＥＭが対象の標的細胞または標的細胞の集団に送達される、ＭＴＥＭを投与することを含み、ＭＴＥＭが、配列番号１を含む認識配列において変異型ミトコンドリアゲノムに切断部位を作り出し、変異型ミトコンドリアゲノムが分解される、方法を提供する。いくつかの実施形態では、認識配列は、野生型ミトコンドリアゲノムのヌクレオチド位置３０００～３５００に対応する変異型ミトコンドリアゲノムの領域に位置する。いくつかの実施形態では、ＭＴＥＭは、変異型ミトコンドリアゲノムのＡ３２４３Ｇ変異を標的化する。いくつかの実施形態では、方法は、ＭＥＬＡＳに関連する１つ以上の症状を低減または改善する。いくつかの実施形態では、方法は、本明細書に記載の任意の医薬組成物を投与することを含む。いくつかの実施形態では、対象は哺乳動物である。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。いくつかの実施形態では、標的細胞は、筋細胞、骨格筋細胞、筋管細胞、筋サテライト細胞、ニューロン、アストロサイト、ミクログリア細胞、眼細胞、網膜細胞、網膜神経節細胞、網膜色素上皮細胞、膵臓細胞、もしくは膵臓ベータ細胞であるか、または前記標的細胞の集団は、筋細胞、骨格筋細胞、筋管細胞、筋サテライト細胞、ニューロン、アストロサイト、ミクログリア細胞、眼細胞、網膜細胞、網膜神経節細胞、網膜色素上皮細胞、膵臓細胞、もしくは膵臓ベータ細胞の集団であるか、または標的細胞の集団は、筋細胞、骨格筋細胞、筋管細胞、筋サテライト細胞、ニューロン、アストロサイト、ミクログリア細胞、眼細胞、網膜細胞、網膜神経節細胞、網膜色素上皮細胞、膵臓細胞もしくは膵臓ベータ細胞であるか、または前記標的細胞の集団は、筋細胞、骨格筋細胞、筋管細胞、筋サテライト細胞、ニューロン、アストロサイト、ミクログリア細胞、眼細胞、網膜細胞、網膜神経節細胞、網膜色素上皮細胞、膵臓細胞もしくは膵臓ベータ細胞の集団である。いくつかの実施形態では、症状は、筋肉、脳、中枢神経系、膵臓、または網膜の状態である。いくつかの実施形態では、状態は、ミトコンドリア脳筋症、乳酸アシドーシス、および脳卒中様エピソード（ＭＥＬＡＳ）、進行性外眼筋麻痺、母性遺伝性糖尿病、片頭痛、または眼筋ミオパチーである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドはｍＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載される任意のｍＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは組換えＤＮＡ構築物である。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載の任意の組換えＤＮＡ構築物である。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、脂質ナノ粒子によって標的細胞または標的細胞の集団に送達される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、組換えウイルスによって標的細胞または標的細胞の集団に送達される。いくつかの実施形態では、組換えウイルスは、本明細書に記載の任意の組換えウイルスである。いくつかの実施形態では、組換えウイルスは組換えＡＡＶである。いくつかの実施形態では、組換えＡＡＶはＡＡＶ９キャプシドを有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＭＴＥＭをコードする核酸配列に作動可能に連結されたプロモータを含む。いくつかの実施形態では、プロモータは構成的プロモータであるか、またはプロモータは、筋細胞特異的プロモータ、骨格筋特異的プロモータ、筋管特異的プロモータ、筋サテライト細胞特異的プロモータ、ニューロン特異的プロモータ、アストロサイト特異的プロモータ、ミクログリア特異的プロモータ、眼細胞特異的プロモータ、網膜細胞特異的プロモータ、網膜神経節細胞特異的プロモータ、網膜色素上皮特異的プロモータ、膵臓細胞特異的プロモータ、または膵臓ベータ細胞特異的プロモータである。いくつかの実施形態では、構成的プロモータは、ＣＭＶプロモータ、ＣＡＧプロモータ、ＥＦ１アルファプロモータ、またはＵｂＣプロモータである。いくつかの実施形態では、認識配列を含む変異型ミトコンドリアゲノムの約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％が、標的細胞または標的細胞の集団で分解される。いくつかの実施形態では、認識配列を含む変異型ミトコンドリアゲノムに対する野生型ミトコンドリアゲノムの比は、標的細胞または標的細胞の集団で増加する。いくつかの実施形態では、比は、約５：９５、約１０：９０、約１５：８５、約２０：８０、約２５：７５、約３０：７０、約３５：６５、約４０：６０、約４５：５５、約５０：５０、約５５：４５、約６０：４０、約６５：３５、約７０：３０、約７５：２５、約８０：２０、約８５：１５、約９０：１０、約９５：５、約２０：１、約５０：１、約１００：１、約１５０：１、約２００：１、約２５０：１、約３００：１、約３５０：１、約４００：１、約４５０：１、約５００：１、約５５０：１、約６００：１、約６５０：１、約７００：１、約７５０：１、約８００：１、約８５０：１、約９００：１、約９５０：１、約１０００：１、またはそれ以上まで増加する。いくつかの実施形態では、標的細胞または標的細胞の集団中の野生型ミトコンドリアゲノムのパーセンテージは、標的細胞または標的細胞の集団中の全ミトコンドリアゲノムの約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、またはそれ以上である。いくつかの実施形態では、遺伝子修飾真核細胞中の認識配列を含む変異型ミトコンドリアゲノムのパーセンテージは、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、またはそれ以上減少する。いくつかの実施形態では、標的細胞または標的細胞の集団における細胞呼吸は、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約１００％またはそれ以上増加する。いくつかの実施形態では、標的細胞または標的細胞の集団における細胞呼吸は、約３０～４０％、約４０～５０％、約５０～６０％、約６０～７０％、約７０～８０％、約８０～９０％、約９０～１００％、またはそれ以上増加する。
一態様では、本発明は、配列番号１を含む認識配列に結合して切断する遺伝子操作メガヌクレアーゼであって、遺伝子操作メガヌクレアーゼが第１のサブユニットおよび第２のサブユニットを含み、第１のサブユニットが認識配列の第１の認識半部位に結合し、第１の超可変（ＨＶＲ１）領域を含み、第２のサブユニットが認識配列の第２の認識半部位に結合し、第２の超可変（ＨＶＲ２）領域を含み、ＨＶＲ１領域が、配列番号３～１２のいずれか１つの残基２４～７９に対応するアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、８０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＨＶＲ２領域が、配列番号３～１２のいずれか１つの残基２１５～２７０に対応するアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、遺伝子操作メガヌクレアーゼを提供する。
いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号３～１２のいずれか１つの残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、および７７に対応する１つ以上の残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号３～１２のいずれか１つの残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、および７７に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号３～１２のいずれか１つの残基６６に対応する残基にＹ、Ｒ、ＫまたはＤを含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１個のアミノ酸置換を有する配列番号３～１２のいずれか１つの残基２４～７９を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号３～１２のいずれか１つの残基２４～７９を含む。
いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号３～１２のいずれか１つの残基７～１５３に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号３～１２のいずれか１つの残基１９に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号３～１２のいずれか１つの残基８０に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号３～１２のいずれか１つの残基１９に対応する残基にＧ、ＳまたはＡを含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号３～１２のいずれか１つの残基８０に対応する残基にＥ、ＱまたはＫを含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個のアミノ酸置換を有する配列番号３～１２のいずれか１つの残基７～１５３を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号３～１２のいずれか１つの残基７～１５３を含む。
いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号３～１２のいずれか１つの残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６および２６８に対応する１つ以上の残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号３～１２のいずれか１つの残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６および２６８に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号３～１２のいずれか１つの残基２４１に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号３または５～１２のいずれか１つの残基２６３に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号３または８～１２のいずれか１つの残基２６４に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号６の残基２６５に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号３～１２のいずれか１つの残基２５７に対応する残基にＹ、Ｒ、ＫまたはＤを含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１個のアミノ酸置換を有する配列番号３～１２のいずれか１つの残基２１５～２７０を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号３～１２のいずれか１つの残基２１５～２７０を含む。
いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号３～１２のいずれか１つの残基１９８～３４４に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号４のいずれか１つの残基２７６に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号３～１２のいずれか１つの残基３３０に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号３～１２のいずれか１つの残基２１０に対応する残基にＧ、ＳまたはＡを含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号３～１２のいずれか１つの残基２７１に対応する残基にＥ、ＱまたはＫを含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０個のアミノ酸置換を有する配列番号３～１２のいずれか１つの残基１９８～３４４を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号３～１２のいずれか１つの残基１９８～３４４を含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作メガヌクレアーゼは、リンカーを含む一本鎖メガヌクレアーゼであり、リンカーは第１のサブユニットと第２のサブユニットとを共有結合する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作メガヌクレアーゼは、配列番号３～１２のいずれか１つに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作メガヌクレアーゼは、配列番号３～１２のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作メガヌクレアーゼは、配列番号３３～４２のいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作メガヌクレアーゼは、配列番号３３～４２のいずれか１つの核酸配列によってコードされる。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作メガヌクレアーゼは、核外搬出配列（ＮＥＳ）に結合される。いくつかの実施形態では、ＮＥＳは、配列番号４６または４７に示される配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＮＥＳは、配列番号４６または４７に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＮＥＳは、遺伝子操作メガヌクレアーゼのＮ末端に結合される。いくつかの実施形態では、ＮＥＳは、遺伝子操作メガヌクレアーゼのＣ末端に結合される。いくつかの実施形態では、ＮＥＳは、遺伝子操作メガヌクレアーゼに融合される。いくつかの実施形態では、ＮＥＳは、ポリペプチドリンカーによって遺伝子操作メガヌクレアーゼに結合される。いくつかの実施形態では、遺伝子操作メガヌクレアーゼは、第１のＮＥＳおよび第２のＮＥＳを含む。いくつかの実施形態では、第１のＮＥＳは遺伝子操作メガヌクレアーゼのＮ末端に結合され、第２のＮＥＳは遺伝子操作メガヌクレアーゼのＣ末端に結合される。いくつかの実施形態では、第１のＮＥＳおよび／または第２のＮＥＳは、配列番号４６または４７に示される配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のＮＥＳおよび／または第２のＮＥＳは、配列番号４６または４７に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のＮＥＳおよび第２のＮＥＳは同一である。いくつかの実施形態では、第１のＮＥＳおよび第２のＮＥＳは同一ではない。いくつかの実施形態では、第１のＮＥＳおよび／または第２のＮＥＳは、遺伝子操作メガヌクレアーゼに融合される。いくつかの実施形態では、第１のＮＥＳおよび／または第２のＮＥＳは、ポリペプチドリンカーによって遺伝子操作メガヌクレアーゼに結合される。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の遺伝子操作メガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドはｍＲＮＡである。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の遺伝子操作メガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡ構築物を提供する。いくつかの実施形態では、組換えＤＮＡ構築物は、ポリヌクレオチドを含む組換えウイルスをコードする。いくつかの実施形態では、組換えウイルスは、組換えアデノウイルス、組換えレンチウイルス、組換えレトロウイルス、または組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。いくつかの実施形態では、組換えウイルスは組換えＡＡＶである。いくつかの実施形態では、組換えＡＡＶはＡＡＶ９キャプシドを有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、遺伝子操作メガヌクレアーゼをコードする核酸配列に作動可能に連結されたプロモータを含む。いくつかの実施形態では、プロモータは構成的プロモータであるか、またはプロモータは、筋細胞特異的プロモータ、骨格筋特異的プロモータ、筋管特異的プロモータ、筋サテライト細胞特異的プロモータ、ニューロン特異的プロモータ、アストロサイト特異的プロモータ、ミクログリア特異的プロモータ、眼細胞特異的プロモータ、網膜細胞特異的プロモータ、網膜神経節細胞特異的プロモータ、網膜色素上皮特異的プロモータ、膵臓細胞特異的プロモータ、または膵臓ベータ細胞特異的プロモータである。いくつかの実施形態では、構成的プロモータは、ＣＭＶプロモータ、ＣＡＧプロモータ、ＥＦ１アルファプロモータ、またはＵｂＣプロモータである。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の遺伝子操作メガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む組換えウイルスを提供する。いくつかの実施形態では、組換えウイルスは、組換えアデノウイルス、組換えレンチウイルス、組換えレトロウイルス、または組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。いくつかの実施形態では、組換えウイルスは組換えＡＡＶである。いくつかの実施形態では、組換えＡＡＶはＡＡＶ９キャプシドを有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、遺伝子操作メガヌクレアーゼをコードする核酸配列に作動可能に連結されたプロモータを含む。いくつかの実施形態では、プロモータは構成的プロモータであるか、またはプロモータは、筋細胞特異的プロモータ、骨格筋特異的プロモータ、筋管特異的プロモータ、筋サテライト細胞特異的プロモータ、ニューロン特異的プロモータ、アストロサイト特異的プロモータ、ミクログリア特異的プロモータ、眼細胞特異的プロモータ、網膜細胞特異的プロモータ、網膜神経節細胞特異的プロモータ、網膜色素上皮特異的プロモータ、膵臓細胞特異的プロモータ、もしくは膵臓ベータ細胞特異的プロモータである。いくつかの実施形態では、構成的プロモータは、ＣＭＶプロモータ、ＣＡＧプロモータ、ＥＦ１アルファプロモータ、またはＵｂＣプロモータである。
別の態様では、本発明は、ポリヌクレオチドを含む脂質ナノ粒子を含む脂質ナノ粒子組成物であって、ポリヌクレオチドが本明細書に記載の遺伝子操作メガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含む、脂質ナノ粒子組成物を提供する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドはｍＲＮＡである。
別の態様では、本発明は、薬学的に許容される担体、および本明細書に記載の遺伝子操作メガヌクレアーゼを含む医薬組成物を提供する。
別の態様では、本発明は、薬学的に許容される担体、本明細書に記載の任意のポリヌクレオチドを含む医薬組成物を提供する。
別の態様では、本発明は、薬学的に許容される担体および本明細書に記載の任意の組換えＤＮＡ構築物を含む医薬組成物を提供する。
別の態様では、本発明は、薬学的に許容される担体、本明細書に記載の任意の組換えウイルスを含む医薬組成物を提供する。
別の態様では、本発明は、薬学的に許容される担体および本明細書に記載の任意の脂質ナノ粒子組成物を含む医薬組成物を提供する。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の任意のポリヌクレオチドを含む遺伝子修飾真核細胞を提供する。いくつかの実施形態では、遺伝子修飾真核細胞は、遺伝子修飾哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、遺伝子修飾真核細胞は、遺伝子修飾ヒト細胞である。
別の態様では、本発明は、遺伝子修飾真核細胞を産生するための方法であって、方法が、本明細書に記載の遺伝子操作メガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを真核細胞に導入することを含み、遺伝子操作メガヌクレアーゼが真核細胞で発現され、遺伝子操作メガヌクレアーゼが配列番号１を含む認識配列に切断部位を作り出す、方法を提供する。いくつかの実施形態では、切断部位は、認識配列が挿入または欠失を含むように、非相同末端結合によって修復される。いくつかの実施形態では、真核細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドはｍＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、脂質ナノ粒子または組換えウイルスによって真核細胞に導入される。いくつかの実施形態では、組換えウイルスは組換えＡＡＶである。
別の態様では、本発明は、遺伝子修飾真核細胞を産生するための方法であって、方法が、真核細胞に本明細書に記載の遺伝子操作メガヌクレアーゼを導入することを含み、遺伝子操作メガヌクレアーゼが真核細胞で発現され、遺伝子操作メガヌクレアーゼが配列番号１を含む認識配列に切断部位を作り出す、方法を提供する。いくつかの実施形態では、切断部位は、認識配列が挿入または欠失を含むように、非相同末端結合によって修復される。いくつかの実施形態では、真核細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞はヒト細胞である。
別の態様では、本発明は、そのゲノムに挿入された目的の外因性配列を含む遺伝子修飾真核細胞を産生するための方法であって、方法が、真核細胞に、本明細書に記載の遺伝子操作メガヌクレアーゼをコードする第１の核酸配列であり、遺伝子操作メガヌクレアーゼが真核細胞で発現される第１の核酸配列、および目的の配列を含む第２の核酸配列を含む１つ以上のポリヌクレオチドを導入することを含み、遺伝子操作メガヌクレアーゼが配列番号１を含む認識配列に切断部位を作り出し、目的の配列が切断部位でゲノムに挿入される、方法を提供する。いくつかの実施形態では、第２の核酸配列は、切断部位に隣接する核酸配列に相同な核酸配列をさらに含み、目的の配列は、相同組換えによって切断部位に挿入される。いくつかの実施形態では、真核細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態では、第１の核酸配列は、ｍＲＮＡとして真核細胞に導入される。いくつかの実施形態では、第２の核酸配列は、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）として真核細胞に導入される。いくつかの実施形態では、第１の核酸配列は、組換えウイルスによって真核細胞に導入される。いくつかの実施形態では、第２の核酸配列は、組換えウイルスによって真核細胞に導入される。いくつかの実施形態では、組換えウイルスは組換えＡＡＶである。
別の態様では、本発明は、そのゲノムに挿入された目的の外因性配列を含む遺伝子修飾真核細胞を産生するための方法であって、方法が、真核細胞に、本明細書に記載の遺伝子操作メガヌクレアーゼ、および目的の配列を含む核酸配列を含むポリヌクレオチドを導入することを含み、遺伝子操作メガヌクレアーゼが配列番号１を含む認識配列に切断部位を作り出し、目的の配列が切断部位でゲノムに挿入される、方法を提供する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、切断部位に隣接する核酸配列に相同な核酸配列をさらに含み、目的の配列は、相同組換えによって切断部位に挿入される。いくつかの実施形態では、真核細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）として真核細胞に導入される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、組換えウイルスによって真核細胞に導入される。いくつかの実施形態では、組換えウイルスは組換えＡＡＶである。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の方法によって作製された遺伝子修飾真核細胞を提供する。
本開示の前述および他の態様ならびに実施形態は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲を参照することによってより完全に理解することができる。明確にするために別個の実施形態の文脈で説明される本開示の特定の特徴は、単一の実施形態で組み合わせて提供することもできる。実施形態のすべての組合せは、本開示によって具体的に包含され、あたかもそれぞれのおよびすべての組合せが個別に明示的に開示されているかのように本明細書に開示される。逆に、簡潔にするために単一の実施形態の文脈で説明される本開示の様々な特徴はまた、別個にまたは任意の適切な部分組合せで提供されてもよい。実施形態に列挙された特徴のすべての部分組合せもまた、本開示によって具体的に包含され、あたかもそのような部分組合せのそれぞれおよびすべてが本明細書に個別に明示的に開示されているかのように本明細書に開示される。本明細書に開示される本開示の各態様の実施形態は、必要な変更を加えて本開示の他の各態様に適用される。
様々なＭＩＴ ２５－２６遺伝子操作メガヌクレアーゼ、またはＣＨＯ ２３－２４メガヌクレアーゼ（対照）をコードするｍＲＮＡでトランスフェクトし、トランスフェクションの４８時間後にＧＦＰ＋細胞のパーセンテージについてアッセイしたＣＨＯレポーター細胞のフローサイトメトリー結果を示す図である。データを活性指数、活性スコアと毒性スコアの和として示す。 野生型配列に対するＭＩＴ ２５－２６Ｌ．３５遺伝子操作メガヌクレアーゼの識別を実証する図である。ＭＩＴ ２５－２６ｘ．９１もしくはＭＩＴ ２５－２６Ｌ．３５遺伝子操作メガヌクレアーゼ、またはＣＨＯ ２３－２４メガヌクレアーゼ（対照）をコードするｍＲＮＡでトランスフェクトし、トランスフェクションの４８時間後にＧＦＰ＋細胞のパーセンテージについてアッセイしたＣＨＯレポーター細胞のフローサイトメトリー結果を示す。データを活性指数、活性スコアと毒性スコアの和として示す。 野生型または変異型ＭＩＴ ２５－２６結合部位のいずれかが核染色体上に組み込まれたヒトミトコンドリアゲノムの一部を含むＦｌｐＩｎ ＣＨＯ細胞における様々なＭＩＴ ２５－２６遺伝子操作メガヌクレアーゼのインデル形成を示す図である。ＦｌｐＩｎ ＣＨＯ細胞をＭＩＴ ２５－２６遺伝子操作メガヌクレアーゼでヌクレオフェクトし、２日後に細胞をＭＩＴ ２５－２６変異型部位と野生型部位の両方におけるインデル頻度について分析した。 野生型または変異型ＭＩＴ ２５－２６結合部位のいずれかが核染色体上に組み込まれたヒトミトコンドリアゲノムの一部を含むＦｌｐＩｎ ＣＨＯ細胞における、ＭＩＴ ２５－２６ｘ．９１遺伝子操作メガヌクレアーゼと比較した最適化されたＭＩＴ ２５－２６Ｌ．３５遺伝子操作メガヌクレアーゼのインデル形成を示す図である。ＦｌｐＩｎ ＣＨＯ細胞をＭＩＴ ２５－２６遺伝子操作メガヌクレアーゼでヌクレオフェクトし、２日後に細胞をＭＩＴ ２５－２６変異型部位と野生型部位の両方におけるインデル頻度について分析した。 遺伝子操作メガヌクレアーゼの核標的化を実証する図である。ＭＲＣ－５細胞を、核局在化配列を有する遺伝子操作メガヌクレアーゼをコードするプラスミドでトランスフェクトした。免疫細胞学的染色は、ＤＡＰＩおよびモノクローナル遺伝子操作メガヌクレアーゼ抗体、ならびにミトコンドリアを染色するＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄを用いて達成した。細胞を、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ７１０共焦点顕微鏡を用いて２０ｘの倍率で観察した。左上の写真は、すべての染色の重ね合わせである。右上の写真は、遺伝子操作メガヌクレアーゼの位置を示す。左下の写真はＤＡＰＩによる核染色を示し、右下の写真はミトコンドリアを示す。 遺伝子操作メガヌクレアーゼのミトコンドリア標的化を実証する図である。ＭＲＣ－５細胞を、ミトコンドリア移行ペプチド（ＭＴＰ）を有する遺伝子操作メガヌクレアーゼをコードするプラスミドでトランスフェクトした。免疫細胞学的染色は、ＤＡＰＩおよびモノクローナル遺伝子操作メガヌクレアーゼ抗体、ならびにミトコンドリアを染色するＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄを用いて達成した。細胞を、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ７１０共焦点顕微鏡を用いて２０ｘの倍率で観察した。左上の写真は、すべての染色の重ね合わせである。右上の写真は、遺伝子操作メガヌクレアーゼの位置を示す。左下の写真はＤＡＰＩによる核染色を示し、右下の写真はミトコンドリアを示す。 核局在化シグナル（ＮＬＳ）またはミトコンドリア移行ペプチド（ＭＴＰ）に融合した遺伝子操作メガヌクレアーゼによるインデル形成を示す図である。ＭＲＣ－５細胞を遺伝子操作メガヌクレアーゼ構築物でヌクレオフェクトし、ＡＰＣ １１－１２結合部位でのインデル形成を２日後に分析した。 核局在化シグナル（ＮＬＳ）、ミトコンドリア移行ペプチド（ＭＴＰ）またはＭＴＰおよび配列番号４７の核外搬出配列（ＮＥＳ）に融合した遺伝子操作メガヌクレアーゼによるインデル形成を示す図である。ＭＲＣ－５細胞を遺伝子操作メガヌクレアーゼ構築物でヌクレオフェクトし、ＡＰＣ １１－１２結合部位でのインデル形成を２日後に分析した。 核局在化シグナル（ＮＬＳ）、ミトコンドリア移行ペプチド（ＭＴＰ）またはＭＴＰおよび配列番号４６のＭＶＭｐ ＮＳ２核外搬出配列（ＮＥＳ）に融合した遺伝子操作メガヌクレアーゼによるインデル形成を示す図である。ＭＲＣ－５細胞を遺伝子操作メガヌクレアーゼ構築物でヌクレオフェクトし、ＡＰＣ １１－１２結合部位でのインデル形成を２日後に分析した。 核局在化シグナル（ＮＬＳ）、ミトコンドリア移行ペプチド（ＭＴＰ）またはＭＴＰおよび配列番号４６のＭＶＭｐ ＮＳ２核外搬出配列（ＮＥＳ）に融合した遺伝子操作ＭＩＴ ２５－２６ｘ．９１メガヌクレアーゼによるインデル形成を示す図である。ＭＲＣ－５細胞を遺伝子操作メガヌクレアーゼ構築物でヌクレオフェクトし、３つのＭＩＴ ２５－２６ｘ．９１結合部位のそれぞれにおけるインデル形成を２日後に分析した。 ヌクレオフェクション後１日目のヘテロプラズミックＭＥＬＡＳ変異を有するサイブリッド細胞株におけるミトコンドリア標的化遺伝子操作メガヌクレアーゼ（ＭＴＥＭ）ＭＩＴ ２５－２６ｘ．９１の有効性を示す図である。これらのデータは、ＭＴＳ－ＧＦＰ細胞と比較したｍｔＤＮＡ損失として表される。 ヌクレオフェクション後４日目のヘテロプラズミックＭＥＬＡＳ変異を有するサイブリッド細胞株におけるミトコンドリア標的化遺伝子操作メガヌクレアーゼ（ＭＴＥＭ）ＭＩＴ ２５－２６ｘ．９１の有効性を示す図である。これらのデータは、ＭＴＳ－ＧＦＰ細胞と比較したｍｔＤＮＡ損失として表される。 ヌクレオフェクション後７日目のヘテロプラズミックＭＥＬＡＳ変異を有するサイブリッド細胞株におけるミトコンドリア標的化遺伝子操作メガヌクレアーゼ（ＭＴＥＭ）ＭＩＴ ２５－２６ｘ．９１の有効性を示す図である。これらのデータは、ＭＴＳ－ＧＦＰ細胞と比較したｍｔＤＮＡ損失として表される。 ヌクレオフェクション後１１日目のヘテロプラズミックＭＥＬＡＳ変異を有するサイブリッド細胞株におけるミトコンドリア標的化遺伝子操作メガヌクレアーゼ（ＭＴＥＭ）ＭＩＴ ２５－２６ｘ．９１の有効性を示す図である。これらのデータは、ＭＴＳ－ＧＦＰ細胞と比較したｍｔＤＮＡ損失として表される。 ミトコンドリア標的化遺伝子操作メガヌクレアーゼ（ＭＴＥＭ）ＭＩＴ ２５－２６ｘ．９１によるトランスフェクションの１１日後のＭＥＬＡＳサイブリッド細胞のミトコンドリアストレス試験を示す図である。 ミトコンドリア標的化遺伝子操作メガヌクレアーゼ（ＭＴＥＭ）ＭＩＴ ２５－２６ｘ．９１によるトランスフェクションの１１日後のＭＥＬＳＡサイブリッド細胞のＡＴＰ産生を示す図である。 ミトコンドリア標的化遺伝子操作メガヌクレアーゼ（ＭＴＥＭ）ＭＩＴ ２５－２６ｘ．９１によるトランスフェクションの１１日後のＭＥＬＳＡサイブリッド細胞のＡＴＰ産生を示す図である。 ミトコンドリア標的化遺伝子操作メガヌクレアーゼ（ＭＴＥＭ）ＭＩＴ ２５－２６ｘ．９１によるトランスフェクションの１１日後のＭＥＬＡＳサイブリッド細胞のエネルギーマップを示す図であり、ＡＴＰ産生に対する解糖およびＯＸＰＨＯＳの相対的寄与を示す。 細胞内標的化配列を欠く遺伝子操作メガヌクレアーゼの細胞局在化を示す免疫蛍光染色である。細胞を、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）ペプチド配列と融合された遺伝子操作メガヌクレアーゼをコードするプラスミドでトランスフェクトした。免疫細胞学的染色を、ＤＡＰＩおよびミトコンドリアを染色するＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄを用いて達成した。細胞を、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ７１０共焦点顕微鏡を用いて６３ｘの倍率で観察した。左上の写真は、すべての染色の重ね合わせである。右上の写真は、遺伝子操作メガヌクレアーゼの位置を示す。左下の写真は核のＤＡＰＩによる核染色を示し、右下の写真はミトコンドリアの染色を示す。 ミトコンドリア標的化ペプチド（ＭＴＰ）を含有する遺伝子操作メガヌクレアーゼの細胞局在化を示す免疫蛍光染色である。細胞を、Ｎ末端上のミトコンドリア標的化ペプチド配列（ＭＴＳ）およびＣ末端上の緑色蛍光タンパク質ペプチド（ＧＦＰ）配列と融合した遺伝子操作メガヌクレアーゼをコードするプラスミドでトランスフェクトした。免疫細胞学的染色を、ＤＡＰＩおよびミトコンドリアを染色するＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄを用いて達成した。細胞を、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ７１０共焦点顕微鏡を用いて６３ｘの倍率で観察した。左上の写真は、すべての染色の重ね合わせである。右上の写真は、遺伝子操作メガヌクレアーゼの位置を示す。左下の写真は核のＤＡＰＩによる核染色を示し、右下の写真はミトコンドリアの染色を示す。 トランスフェクションの０、６、２４、４８および７２時間後の、示された対照（モック、ＭＴＳ－ＧＦＰ、ＭＴＳ－ＡＰＣ １１－１２Ｌ．３３０、およびＭＴＳ－ＭＩＴ ２５－２６ｘ．９１ ＫＯ）ならびに試験遺伝子操作メガヌクレアーゼでトランスフェクトされた細胞の、１００％変異型ｍｔＤＮＡ（ｍ．３２４３Ｇ）を含有するミトコンドリアにおける全ｍｔＤＮＡに対する環状ｍｔＤＮＡの比を示すグラフを提供する。 トランスフェクションの０、６、２４、４８、および７２時間後の、示された対照（モック、ＭＴＳ－ＧＦＰ、ＭＴＳ－ＡＰＣ １１－１２Ｌ．３３０、およびＭＴＳ－ＭＩＴ ２５－２６ｘ．９１ ＫＯ）ならびに試験遺伝子操作メガヌクレアーゼでトランスフェクトされた細胞の、１００％変異型ｍｔＤＮＡ（ｍ．３２４３Ｇ）を含有するミトコンドリアにおけるリボソーム１８ｓ ＤＮＡに対する全ｍｔＤＮＡの比を示すグラフを提供する。 トランスフェクションの０、６、２４、４８および７２時間後の、示された対照（モック、ＭＴＳ－ＧＦＰ、ＭＴＳ－ＡＰＣ １１－１２Ｌ．３３０、およびＭＴＳ－ＭＩＴ ２５－２６ｘ．９１ ＫＯ）ならびに試験遺伝子操作メガヌクレアーゼでトランスフェクトされた細胞の、野生型ｍｔＤＮＡを含有するミトコンドリアにおける全ｍｔＤＮＡに対する環状ｍｔＤＮＡの比を示すグラフを提供する。 トランスフェクションの０、６、２４、４８および７２時間後の、示された対照（モック、ＭＴＳ－ＧＦＰ、ＭＴＳ－ＡＰＣ １１－１２Ｌ．３３０、およびＭＴＳ－ＭＩＴ ２５－２６ｘ．９１ ＫＯ）ならびに試験遺伝子操作メガヌクレアーゼでトランスフェクトされた細胞の、野生型ｍｔＤＮＡを含有するミトコンドリアにおけるリボソーム１８ｓ ＤＮＡに対する全ｍｔＤＮＡの比を示すグラフを提供する。 トランスフェクションの０、３、６、１２、２４、４８および７２時間後の、示された対照（モック、ＭＴＳ－ＧＦＰ、ＭＴＳ－ＡＰＣ １１－１２Ｌ．３３０、およびＭＴＳ－ＭＩＴ ２５－２６ｘ．９１ ＫＯ）ならびに試験遺伝子操作メガヌクレアーゼでトランスフェクトされた細胞の、野生型ｍｔＤＮＡを含有するミトコンドリアにおけるリボソーム１８ｓ ＤＮＡに対する全ｍｔＤＮＡの比を示すグラフを提供する。 トランスフェクションの０、３、６、１２、２４、４８および７２時間後の、示された対照（モック、ＭＴＳ－ＧＦＰ、ＭＴＳ－ＡＰＣ １１－１２Ｌ．３３０、およびＭＴＳ－ＭＩＴ ２５－２６ｘ．９１ ＫＯ）ならびに試験遺伝子操作メガヌクレアーゼでトランスフェクトされた細胞の、野生型ｍｔＤＮＡを含有するミトコンドリアにおける全ｍｔＤＮＡに対する環状ｍｔＤＮＡの比を示すグラフを提供する。 トランスフェクション１日後の、示された対照（モック、ＭＴＳ－ＧＦＰ）または４つの異なる濃度のＭＩＴ ２５－２６ｘ．９１メガヌクレアーゼでトランスフェクトされたＭＥＬＡＳ細胞の、９６％変異型ｍｔＤＮＡ（ｍ．３２４３Ｇ）を含有するミトコンドリアにおけるリボソーム１８ｓ ＤＮＡに対する全ｍｔＤＮＡの比を示すグラフを提供する。バーの高さは、ＭＴＳ－ＧＦＰトランスフェクト細胞に対して正規化されたｍｔＤＮＡの損失を示す。バー内で、灰色の相対的パーセンテージは、存在する野生型ｍｔＤＮＡの相対的パーセンテージに対応し、黒色の相対的パーセンテージは、存在する変異型ｍｔＤＮＡの相対的パーセンテージに対応する。 トランスフェクション４日後の、示された対照（モック、ＭＴＳ－ＧＦＰ）または４つの異なる濃度のＭＩＴ ２５－２６ｘ．９１メガヌクレアーゼでトランスフェクトされたＭＥＬＡＳ細胞の、９６％変異型ｍｔＤＮＡ（ｍ．３２４３Ｇ）を含有するミトコンドリアにおけるリボソーム１８ｓ ＤＮＡに対する全ｍｔＤＮＡの比を示すグラフを提供する。バーの高さは、ＭＴＳ－ＧＦＰトランスフェクト細胞に対して正規化されたｍｔＤＮＡの損失を示す。バー内で、灰色の相対的パーセンテージは、存在する野生型ｍｔＤＮＡの相対的パーセンテージに対応し、黒色の相対的パーセンテージは、存在する変異型ｍｔＤＮＡの相対的パーセンテージに対応する。 トランスフェクション７日後の、示された対照（モック、ＭＴＳ－ＧＦＰ）または４つの異なる濃度のＭＩＴ ２５－２６ｘ．９１メガヌクレアーゼでトランスフェクトされたＭＥＬＡＳ細胞の、９６％変異型ｍｔＤＮＡ（ｍ．３２４３Ｇ）を含有するミトコンドリアにおけるリボソーム１８ｓ ＤＮＡに対する全ｍｔＤＮＡの比を示すグラフを提供する。バーの高さは、ＭＴＳ－ＧＦＰトランスフェクト細胞に対して正規化されたｍｔＤＮＡの損失を示す。バー内で、灰色の相対的パーセンテージは、存在する野生型ｍｔＤＮＡの相対的パーセンテージに対応し、黒色の相対的パーセンテージは、存在する変異型ｍｔＤＮＡの相対的パーセンテージに対応する。 ミトコンドリア標的化遺伝子操作メガヌクレアーゼ（ＭＴＥＭ）ＭＩＴ ２５－２６ｘ．９１によるトランスフェクションの１１日後のＭＥＬＡＳサイブリッド細胞のミトコンドリアストレス試験を示すグラフである。 ミトコンドリア標的化遺伝子操作メガヌクレアーゼ（ＭＴＥＭ）ＭＩＴ ２５－２６ｘ．９１によるトランスフェクションの１１日後のＭＥＬＡＳサイブリッド細胞のエネルギーマップを示す図であり、ＡＴＰ産生に対する解糖およびＯＸＰＨＯＳの相対的寄与を示す。 ミトコンドリア標的化遺伝子操作メガヌクレアーゼ（ＭＴＥＭ）ＭＩＴ ２５－２６ｘ．９１によるトランスフェクションの１１日後のＭＥＬＳＡサイブリッド細胞の基礎呼吸速度を示す。 ミトコンドリア標的化遺伝子操作メガヌクレアーゼ（ＭＴＥＭ）ＭＩＴ ２５－２６ｘ．９１によるトランスフェクションの１１日後のＭＥＬＳＡサイブリッド細胞の最大呼吸速度を示す。 ミトコンドリア標的化遺伝子操作メガヌクレアーゼ（ＭＴＥＭ）ＭＩＴ ２５－２６ｘ．９１によるトランスフェクションの１１日後のＭＥＬＳＡサイブリッド細胞のミトコンドリアＡＴＰ産生速度を示す。 トランスフェクション１日後の、示された対照（モック、ＭＴＳ－ＧＦＰ）または４つの異なる濃度のＭＩＴ ２５－２６ｘ．９１ ２５９ Ｈ＞ＱメガヌクレアーゼでトランスフェクトされたＭＥＬＡＳ細胞の、９６％変異型ｍｔＤＮＡ（ｍ．３２４３Ｇ）を含有するミトコンドリアにおけるリボソーム１８ｓ ＤＮＡに対する全ｍｔＤＮＡの比を示すグラフを提供する。バーの高さは、ＭＴＳ－ＧＦＰトランスフェクト細胞に対して正規化されたｍｔＤＮＡの損失を示す。バー内で、灰色の相対的パーセンテージは、存在する野生型ｍｔＤＮＡの相対的パーセンテージに対応し、黒色の相対的パーセンテージは、存在する変異型ｍｔＤＮＡの相対的パーセンテージに対応する。 ミトコンドリア標的化遺伝子操作メガヌクレアーゼ（ＭＴＥＭ）ＭＩＴ ２５－２６ｘ．９１ ２５９ Ｈ＞Ｑによるトランスフェクションの１日後のＭＥＬＡＳサイブリッド細胞のミトコンドリアストレス試験を示すグラフである。 トランスフェクション３日後の、示された対照（モック、ＭＴＳ－ＧＦＰ）または４つの異なる濃度のＭＩＴ ２５－２６ｘ．９１ ２５９ Ｈ＞ＱメガヌクレアーゼでトランスフェクトされたＭＥＬＡＳ細胞の、９６％変異型ｍｔＤＮＡ（ｍ．３２４３Ｇ）を含有するミトコンドリアにおけるリボソーム１８ｓ ＤＮＡに対する全ｍｔＤＮＡの比を示すグラフを提供する。バーの高さは、ＭＴＳ－ＧＦＰトランスフェクト細胞に対して正規化されたｍｔＤＮＡの損失を示す。バー内で、灰色の相対的パーセンテージは、存在する野生型ｍｔＤＮＡの相対的パーセンテージに対応し、黒色の相対的パーセンテージは、存在する変異型ｍｔＤＮＡの相対的パーセンテージに対応する。 ミトコンドリア標的化遺伝子操作メガヌクレアーゼ（ＭＴＥＭ）ＭＩＴ ２５－２６ｘ．９１ ２５９ Ｈ＞Ｑによるトランスフェクションの３日後のＭＥＬＡＳサイブリッド細胞のミトコンドリアストレス試験を示すグラフである。 トランスフェクション７日後の、示された対照（モック、ＭＴＳ－ＧＦＰ）または４つの異なる濃度のＭＩＴ ２５－２６ｘ．９１ ２５９ Ｈ＞ＱメガヌクレアーゼでトランスフェクトされたＭＥＬＡＳ細胞の、９６％変異型ｍｔＤＮＡ（ｍ．３２４３Ｇ）を含有するミトコンドリアにおけるリボソーム１８ｓ ＤＮＡに対する全ｍｔＤＮＡの比を示すグラフを提供する。バーの高さは、ＭＴＳ－ＧＦＰトランスフェクト細胞に対して正規化されたｍｔＤＮＡの損失を示す。バー内で、灰色の相対的パーセンテージは、存在する野生型ｍｔＤＮＡの相対的パーセンテージに対応し、黒色の相対的パーセンテージは、存在する変異型ｍｔＤＮＡの相対的パーセンテージに対応する。 ミトコンドリア標的化遺伝子操作メガヌクレアーゼ（ＭＴＥＭ）ＭＩＴ ２５－２６ｘ．９１ ２５９Ｈ＞Ｑによるトランスフェクションの７日後のＭＥＬＡＳサイブリッド細胞のミトコンドリアストレス試験を示すグラフである。 Ｆｌｐ－Ｉｎ ２９３レポーター細胞株においてトランスフェクトされたＭＩＴ ２５－２６Ｌ．３５ １９ Ａ＞ＳおよびＭＩＴ ２５－２６ｘ．９１ ２５９ Ｈ＞Ｑメガヌクレアーゼによって誘導されたオフターゲット切断を同定するためのオリゴ捕捉アッセイの結果を示すグラフである。丸で囲んだ点は、オンターゲット部位を示す。ＭＴ－オリゴのみは陰性対照を表す。 未処理、１ｅ５ ＲＮＡコピー／細胞の用量のＭＩＴ ２５－２６ｘ．９１ ２５９Ｈ＞ＱメガヌクレアーゼでトランスフェクトされたＭＥＬＡＳ細胞の９６％変異型ｍｔＤＮＡ（ｍ．３２４３Ｇ）を含有するミトコンドリア、または未処理の０％変異型（ＷＴ細胞）のいずれかの経時的な細胞増殖を示すグラフである。 未処理、１ｅ５ ＲＮＡコピー／細胞の用量のＭＩＴ ２５－２６ｘ．９１ ２５９Ｈ＞ＱメガヌクレアーゼでトランスフェクトされたＭＥＬＡＳ細胞の９６％変異型ｍｔＤＮＡ（ｍ．３２４３Ｇ）を含有するミトコンドリア、または未処理の０％変異型（ＷＴ細胞）のいずれかの処理後Ｄ２、Ｄ３およびＤ４の経時的な細胞倍加を示す棒グラフである。 マウス異種移植腫瘍モデルにおけるミトコンドリアヘテロプラスミーに対する遺伝子操作ＭＴＥＭメガヌクレアーゼ編集の効果を示す研究の実験概略図を提供する。 ３つの異なる用量のＭＩＴ ２５－２６ｘ．９１遺伝子操作メガヌクレアーゼをキャプシド化するＡＡＶ９ベクターの投与時（サイブリッド導入後のＤ１８）の腫瘍体積を示すグラフを提供する。 サイブリッド細胞導入後３５日目およびメガヌクレアーゼ投与後１７日目における、３つの異なる用量のＭＩＴ ２５－２６ｘ．９１遺伝子操作メガヌクレアーゼをキャプシド化するＡＡＶ９ベクターの投与後のＷＴ ｍｔＤＮＡのパーセンテージを示すグラフを提供する。 サイブリッド細胞導入後３５日目およびメガヌクレアーゼ投与後１７日目における、３つの異なる用量のＭＩＴ ２５－２６ｘ．９１遺伝子操作メガヌクレアーゼをキャプシド化するＡＡＶ９ベクターの投与後のＷＴ ｍｔＤＮＡのパーセンテージを示すグラフを提供する。ＮＳは、群間の統計学的に有意でない差を示す。 トランスフェクション後１日目の、示された対照（モック、ＭＴＳ－ＧＦＰ）または４つの異なる濃度のＭＩＴ ２５－２６ｘ．９１ ２５９ Ｈ＞ＱメガヌクレアーゼでトランスフェクトされたＭＥＬＡＳ細胞の、８５％変異型ｍｔＤＮＡ（ｍ．３２４３Ｇ）を含有するミトコンドリアにおけるリボソーム１８ｓ ＤＮＡに対する全ｍｔＤＮＡの比を示すグラフを提供する。バーの高さは、ＭＴＳ－ＧＦＰトランスフェクト細胞に対して正規化されたｍｔＤＮＡの損失を示す。バー内で、灰色の相対的パーセンテージは、存在する野生型ｍｔＤＮＡの相対的パーセンテージに対応し、黒色の相対的パーセンテージは、存在する変異型ｍｔＤＮＡの相対的パーセンテージに対応する。 ミトコンドリア標的化遺伝子操作メガヌクレアーゼ（ＭＴＥＭ）ＭＩＴ ２５－２６ｘ．９１ ２５９Ｈ＞Ｑによるトランスフェクションの１日後のＭＥＬＡＳサイブリッド細胞のミトコンドリアストレス試験を示すグラフである。 トランスフェクション後３日目の、示された対照（モック、ＭＴＳ－ＧＦＰ）または４つの異なる濃度のＭＩＴ ２５－２６ｘ．９１ ２５９ Ｈ＞ＱメガヌクレアーゼでトランスフェクトされたＭＥＬＡＳ細胞の、８５％変異型ｍｔＤＮＡ（ｍ．３２４３Ｇ）を含有するミトコンドリアにおけるリボソーム１８ｓ ＤＮＡに対する全ｍｔＤＮＡの比を示すグラフを提供する。バーの高さは、ＭＴＳ－ＧＦＰトランスフェクト細胞に対して正規化されたｍｔＤＮＡの損失を示す。バー内で、灰色の相対的パーセンテージは、存在する野生型ｍｔＤＮＡの相対的パーセンテージに対応し、黒色の相対的パーセンテージは、存在する変異型ｍｔＤＮＡの相対的パーセンテージに対応する。 ミトコンドリア標的化遺伝子操作メガヌクレアーゼ（ＭＴＥＭ）ＭＩＴ ２５－２６ｘ．９１ ２５９ Ｈ＞Ｑによるトランスフェクションの３日後のＭＥＬＡＳサイブリッド細胞のミトコンドリアストレス試験を示すグラフである。 トランスフェクション後１日目の、ＭＥＬＡＳ細胞の９６％変異型ｍｔＤＮＡ（ｍ．３２４３Ｇ）を含有するミトコンドリア、または０％変異型ｍｔＤＮＡを含有するＷＴ細胞におけるリボソーム１８ｓ ＤＮＡに対する全ｍｔＤＮＡの比を示すグラフを提供する。変異型細胞は未処理であるか、またはＭＩＴ ２５－２６ｘ．９１ ２５９ Ｈ＞Ｑメガヌクレアーゼの１ｅ５ ＲＮＡコピー／細胞で処理した。０％変異型細胞は未処理であった。バーの高さは、変異型ｍｔＤＮＡ細胞に対して正規化されたｍｔＤＮＡの損失を示す。バー内で、灰色の相対的パーセンテージは、存在する野生型ｍｔＤＮＡの相対的パーセンテージに対応し、黒色の相対的パーセンテージは、存在する変異型ｍｔＤＮＡの相対的パーセンテージに対応する。 ミトコンドリア標的化遺伝子操作メガヌクレアーゼ（ＭＴＥＭ）ＭＩＴ ２５－２６ｘ．９１ ２５９ Ｈ＞Ｑによるトランスフェクションの１日後のＷＴまたはＭＥＬＡＳサイブリッド細胞のミトコンドリアストレス試験を示すグラフである。
配列の簡単な説明
配列番号１は、ＭＩＴ ２５－２６認識配列（センス）の核酸配列を示す。
配列番号２は、ＭＩＴ ２５－２６認識配列（アンチセンス）の核酸配列を示す。
配列番号３は、ＭＩＴ ２５－２６ｘ．９１遺伝子操作メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号４は、ＭＩＴ ２５－２６ｘ．４８遺伝子操作メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号５は、ＭＩＴ ２５－２６ｘ．７３遺伝子操作メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号６は、ＭＩＴ ２５－２６ｘ．２９遺伝子操作メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号７は、ＭＩＴ ２５－２６ｘ．３７遺伝子操作メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号８は、ＭＩＴ ２５－２６Ｌ．３５遺伝子操作メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号９は、ＭＩＴ ２５－２６ｘ．９１ ２５９ Ｈ＞Ｑと呼ばれる、アミノ酸位置２５９にＨからＱへの置換を有するＭＩＴ ２５－２６ｘ．９１遺伝子操作メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号１０は、ＭＩＴ ２５－２６Ｌ．３５ １９ Ａ＞Ｓと呼ばれる、アミノ酸位置１９にＡからＳへの置換を有するＭＩＴ ２５－２６Ｌ．３５遺伝子操作メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号１１は、ＭＩＴ ２５－２６ｘ．９１ ２６３ Ｔ＞Ｒと呼ばれる、アミノ酸位置２６３にＴからＲへの置換を有するＭＩＴ ２５－２６ｘ．９１遺伝子操作メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号１２は、ＭＩＴ ２５－２６ｘ．９１ ４６ Ｈ＞Ｗと呼ばれる、アミノ酸位置４６にＨからＷへの置換を有するＭＩＴ ２５－２６ｘ．９１遺伝子操作メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号１３は、ＭＩＴ ２５－２６ｘ．９１メガヌクレアーゼ２５結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
配列番号１４は、ＭＩＴ ２５－２６ｘ．４８メガヌクレアーゼ２５結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
配列番号１５は、ＭＩＴ ２５－２６ｘ．７３メガヌクレアーゼ２５結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
配列番号１６は、ＭＩＴ ２５－２６ｘ．２９メガヌクレアーゼ２５結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
配列番号１７は、ＭＩＴ ２５－２６ｘ．３７メガヌクレアーゼ２５結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
配列番号１８は、ＭＩＴ ２５－２６Ｌ．３５メガヌクレアーゼ２５結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
配列番号１９は、ＭＩＴ ２５－２６ｘ．９１ ２５９ Ｈ＞Ｑメガヌクレアーゼ２５結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
配列番号２０は、ＭＩＴ ２５－２６Ｌ．３５ １９ Ａ＞Ｓメガヌクレアーゼ２５結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
配列番号２１は、ＭＩＴ ２５－２６ｘ．９１ ２６３ Ｔ＞Ｒメガヌクレアーゼ２５結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
配列番号２２は、ＭＩＴ ２５－２６ｘ．９１ ４６ Ｈ＞Ｗメガヌクレアーゼ２５結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
配列番号２３は、ＭＩＴ ２５－２６ｘ．９１メガヌクレアーゼ２６結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
配列番号２４は、ＭＩＴ ２５－２６ｘ．４８メガヌクレアーゼ２６結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
配列番号２５は、ＭＩＴ ２５－２６ｘ．７３メガヌクレアーゼ２６結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
配列番号２６は、ＭＩＴ ２５－２６ｘ．２９メガヌクレアーゼ２６結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
配列番号２７は、ＭＩＴ ２５－２６ｘ．３７メガヌクレアーゼ２６結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
配列番号２８は、ＭＩＴ ２５－２６Ｌ．３５メガヌクレアーゼ２６結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
配列番号２９は、ＭＩＴ ２５－２６ｘ．９１ ２５９ Ｈ＞Ｑメガヌクレアーゼ２６結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
配列番号３０は、ＭＩＴ ２５－２６Ｌ．３５ １９ Ａ＞Ｓメガヌクレアーゼ２６結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
配列番号３１は、ＭＩＴ ２５－２６ｘ．９１ ２６３ Ｔ＞Ｒメガヌクレアーゼ２６結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
配列番号３２は、ＭＩＴ ２５－２６ｘ．９１ ４６ Ｈ＞Ｗメガヌクレアーゼ２６結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
配列番号３３は、ＭＩＴ ２５－２６ｘ．９１メガヌクレアーゼの核酸配列を示す。
配列番号３４は、ＭＩＴ ２５－２６ｘ．４８メガヌクレアーゼの核酸配列を示す。
配列番号３５は、ＭＩＴ ２５－２６ｘ．７３メガヌクレアーゼの核酸配列を示す。
配列番号３６は、ＭＩＴ ２５－２６ｘ．２９メガヌクレアーゼの核酸配列を示す。
配列番号３７は、ＭＩＴ ２５－２６ｘ．３７メガヌクレアーゼの核酸配列を示す。
配列番号３８は、ＭＩＴ ２５－２６Ｌ．３５メガヌクレアーゼの核酸配列を示す。
配列番号３９は、ＭＩＴ ２５－２６ｘ．９１ ２５９ Ｈ＞Ｑメガヌクレアーゼの核酸配列を示す。
配列番号４０は、ＭＩＴ ２５－２６Ｌ．３５ １９Ａ＞Ｓメガヌクレアーゼの核酸配列を示す。
配列番号４１は、ＭＩＴ ２５－２６ｘ．９１ ２６３ Ｔ＞Ｒメガヌクレアーゼの核酸配列を示す。
配列番号４２は、ＭＩＴ ２５－２６ｘ．９１ ４６ Ｈ＞Ｗメガヌクレアーゼの核酸配列を示す。
配列番号４３は、ＣＯＸ ＶＩＩＩ ＭＴＰのアミノ酸配列を示す。
配列番号４４は、ＳＵ９ ＭＴＰのアミノ酸配列を示す。
配列番号４５は、ＣＯＸ ＶＩＩＩ－ＳＵ９ ＭＴＰのアミノ酸配列を示す。
配列番号４６は、ＭＶＭｐ ＮＳ２ ＮＥＳ配列のアミノ酸配列を示す。
配列番号４７は、ＮＥＳ配列のアミノ酸配列を示す。
配列番号４８は、野生型Ｉ－ＣｒｅＩ配列のアミノ酸配列を示す。
配列番号４９は、ＡＰＣ １１－１２結合部位でのインデル頻度を決定するために使用されるデジタル液滴ＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）プライマーＰ１の核酸配列を示す。
配列番号５０は、ＡＰＣ １１－１２結合部位でのインデル頻度を決定するために使用されるｄｄＰＣＲプライマーＦ１の核酸配列を示す。
配列番号５１は、ＡＰＣ １１－１２結合部位におけるインデル頻度を決定するために使用されるｄｄＰＣＲプライマーＲ１の核酸配列を示す。
配列番号５２は、ＡＰＣ １１－１２結合部位におけるインデル頻度を決定するために使用されるｄｄＰＣＲプライマーＰ２の核酸配列を示し、ｄｄＰＣＲプライマーＰ３は、ｍｔＤＮＡのヘテロプラスミーレベルおよび核ＤＮＡに対するｍｔＤＮＡコピー数を決定するために利用される。
配列番号５３は、ＡＰＣ １１－１２結合部位におけるインデル頻度を決定するために使用されるｄｄＰＣＲプライマーＦ２の核酸配列を示す。ｄｄＰＣＲプライマーＦ３は、ｍｔＤＮＡのヘテロプラスミーレベルおよび核ＤＮＡに対するｍｔＤＮＡコピー数を決定するために利用される。
配列番号５４は、ＡＰＣ １１－１２結合部位におけるインデル頻度を決定するために使用されるｄｄＰＣＲプライマーＲ２の核酸配列を示す。ｄｄＰＣＲプライマーＲ３は、ｍｔＤＮＡのヘテロプラスミーレベルおよび核ＤＮＡに対するｍｔＤＮＡコピー数を決定するために利用される。
配列番号５５は、ＭＩＴ ２５－２６ｘ．９１ヌクレアーゼによって誘導される潜在的な核オフターゲット部位編集を同定するために使用されるｄｄＰＣＲプライマーＦ１の核酸配列を示す。
配列番号５６は、ＭＩＴ ２５－２６ｘ．９１ヌクレアーゼによって誘導される潜在的な核オフターゲット部位編集を同定するために使用されるｄｄＰＣＲプライマーＲ１の核酸配列を示す。
配列番号５７は、ＭＩＴ ２５－２６ｘ．９１ヌクレアーゼによって誘導される潜在的な核オフターゲット部位編集を同定するために使用されるｄｄＰＣＲプライマーＦ２の核酸配列を示す。
配列番号５８は、ＭＩＴ ２５－２６ｘ．９１ヌクレアーゼによって誘導される潜在的な核オフターゲット部位編集を同定するために使用されるｄｄＰＣＲプライマーＲ２の核酸配列を示す。
配列番号５９は、ＭＩＴ ２５－２６ｘ．９１ヌクレアーゼによって誘導される潜在的な核オフターゲット部位編集を同定するために使用されるｄｄＰＣＲプライマーＦ３の核酸配列を示す。
配列番号６０は、ＭＩＴ ２５－２６ｘ．９１ヌクレアーゼによって誘導される潜在的な核オフターゲット部位編集を同定するために使用されるｄｄＰＣＲプライマーＲ３の核酸配列を示す。
配列番号６１は、ＭＩＴ ２５－２６ｘ．９１ヌクレアーゼによって誘導される潜在的な核オフターゲット部位編集を同定するために使用されるｄｄＰＣＲプライマーＦ４の核酸配列を示す。
配列番号６２は、ＭＩＴ ２５－２６ｘ．９１ヌクレアーゼによって誘導される潜在的な核オフターゲット部位編集を同定するために使用されるｄｄＰＣＲプライマーＲ４の核酸配列を示す。
配列番号６３は、ｍｔＤＮＡのヘテロプラスミーレベル、ならびに核ＤＮＡに対するｍｔＤＮＡコピー数を決定するために利用されるｄｄＰＣＲプライマーＰ１の核酸配列を示す（変異型対立遺伝子）。
配列番号６４は、ｍｔＤＮＡのヘテロプラスミーレベル、ならびに核ＤＮＡに対するｍｔＤＮＡコピー数を決定するために利用されるｄｄＰＣＲプライマーＦ１の核酸配列を示す。
配列番号６５は、ｍｔＤＮＡのヘテロプラスミーレベル、ならびに核ＤＮＡに対するｍｔＤＮＡコピー数を決定するために利用されるｄｄＰＣＲプライマーＲ１の核酸配列を示す。
配列番号６６は、ｍｔＤＮＡのヘテロプラスミーレベル、ならびに核ＤＮＡに対するｍｔＤＮＡコピー数を決定するために利用されるｄｄＰＣＲプライマーＰ２の核酸配列を示す。
配列番号６７は、ｍｔＤＮＡのヘテロプラスミーレベル、ならびに核ＤＮＡに対するｍｔＤＮＡコピー数を決定するために利用されるｄｄＰＣＲプライマーＦ２の核酸配列を示す。
配列番号６８は、ｍｔＤＮＡのヘテロプラスミーレベル、ならびに核ＤＮＡに対するｍｔＤＮＡコピー数を決定するために利用されるｄｄＰＣＲプライマーＲ２の核酸配列を示す。
配列番号６９は、ｍｔＤＮＡのヘテロプラスミーレベル、ならびに核ＤＮＡに対するｍｔＤＮＡコピー数を決定するために利用されるｄｄＰＣＲプライマーＰ４の核酸配列を示す。
配列番号７０は、ｍｔＤＮＡのヘテロプラスミーレベル、ならびに核ＤＮＡに対するｍｔＤＮＡコピー数を決定するために利用されるｄｄＰＣＲプライマーＦ４の核酸配列を示す。
配列番号７１は、ｍｔＤＮＡのヘテロプラスミーレベル、ならびに核ＤＮＡに対するｍｔＤＮＡコピー数を決定するために利用されるｄｄＰＣＲプライマーＲ４の核酸配列を示す。
配列番号７２は、ｍｔＤＮＡのヘテロプラスミーレベル、ならびに核ＤＮＡに対するｍｔＤＮＡコピー数を決定するために利用されるｄｄＰＣＲプライマーＰ１の核酸配列を示す（ＷＴ対立遺伝子）。
発明の詳細な説明
１．１ 参照および定義
本明細書で言及される特許および科学文献は、当業者に利用可能な知識を確立する。本明細書に引用される発行された米国特許、許可された出願、公開された外国出願、およびＧｅｎＢａｎｋデータベース配列を含む参考文献は、それぞれが参照により組み込まれることが具体的かつ個々に示されているのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、異なる形態で具体化することができ、本明細書に記載の実施形態に限定されると解釈されるべきではない。むしろ、これらの実施形態は、本開示が徹底的かつ完全であり、本発明の範囲を当業者に十分に伝えるように提供される。例えば、一実施形態に関して示された特徴は、他の実施形態に組み込むことができ、特定の実施形態に関して示された特徴は、その実施形態から削除することができる。さらに、本明細書で提案される実施形態に対する多数の変形および追加は、本開示に照らして当業者に明らかであり、これらは本発明から逸脱しない。
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書における本発明の説明で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明するためのものであり、本発明を限定することを意図しない。
本明細書で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用される場合、「ａ」、「ａｎ」、または「ｔｈｅ」は、１つまたは１つより多くを意味してもよい。例えば、「ａ」細胞は、単一の細胞または複数の細胞を意味してもよい。
本明細書で使用される場合、「５’キャップ」（ＲＮＡキャップ、ＲＮＡ ７－メチルグアノシンキャップまたはＲＮＡ ｍ７Ｇキャップとも呼ばれる）という用語は、転写開始直後に真核メッセンジャーＲＮＡの「前部」または５´末端に付加された修飾グアニンヌクレオチドである。５’キャップは、最初に転写されるヌクレオチドに連結された末端基からなる。その存在は、リボソームによる認識およびＲＮａｓｅからの保護にとって重要である。キャップ付加は転写と共役しており、それぞれが他方に影響を及ぼすように共転写的に起こる。転写の開始直後に、合成されているｍＲＮＡの５’末端は、ＲＮＡポリメラーゼと結合したキャップ合成複合体によって結合される。この酵素複合体は、ｍＲＮＡキャッピングに必要な化学反応を触媒する。合成は多段階生化学反応として進行する。キャッピング部分は、その安定性または翻訳の効率などのｍＲＮＡの機能性をモジュレートするように修飾することができる。
本明細書で使用される場合、「対立遺伝子」という用語は、遺伝子の２つ以上のバリアント形態のうちの１つを指す。
本明細書で使用される場合、「同種異系（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ）」または代替的に「同種異系（ａｌｌｏｇｅｎｉｃ）」という用語は、物質が導入される個体と同じ種の異なる動物または異なる患者に由来する任意の物質を指す。２つ以上の個体は、１つ以上の遺伝子座における遺伝子が同一でない場合、互いに同種異系であると言われる。いくつかの態様では、同じ種の個体からの同種異系物質は、抗原的に相互作用するために遺伝的に十分に異なり得る。
本明細書で使用される場合、「構成的プロモータ」という用語は、遺伝子産物をコードまたは指定するポリヌクレオチドと作動可能に連結されると、細胞のほとんどまたはすべての生理学的条件下で細胞内で遺伝子産物を産生させるヌクレオチド配列を指す。
本明細書で使用される場合、「対照」または「対照細胞」という用語は、遺伝子修飾細胞の遺伝子型または表現型の変化を測定するための参照点を提供する細胞を指す。対照細胞は、例えば、（ａ）野生型細胞、すなわち、遺伝子修飾細胞をもたらした遺伝子改変のための出発物質と同じ遺伝子型の野生型細胞、（ｂ）遺伝子修飾細胞と同じ遺伝子型であるが、ヌル構築物で（すなわち、目的の形質に既知の影響を及ぼさない構築物で）形質転換された細胞、または（ｃ）遺伝子修飾細胞と遺伝的に同一であるが、改変された遺伝子型または表現型の発現を誘導する条件もしくは刺激またはさらなる遺伝子修飾に曝露されていない細胞を含み得る。例えば、本発明の対照または対照細胞は、本明細書に記載のＭＴＥＭもしくは遺伝子操作メガヌクレアーゼ、または本明細書に記載のＭＴＥＭもしくは遺伝子操作メガヌクレアーゼをコードするアミノ酸配列を有するポリヌクレオチドを含まない細胞または細胞集団であり得る。
本明細書で使用される場合、２つのタンパク質またはアミノ酸配列の修飾に関する「に対応する」という用語は、第１のタンパク質の特定の修飾が第２のタンパク質の修飾と同じアミノ酸残基の置換であること、および２つのタンパク質が標準的な配列アラインメント（例えば、ＢＬＡＳＴｐプログラムを使用して）に供される場合、第１のタンパク質の修飾のアミノ酸位置が第２のタンパク質の修飾のアミノ酸位置に対応するまたはそれとアラインメントすることを示すために使用される。したがって、第１のタンパク質における残基「Ｘ」のアミノ酸「Ａ」への修飾は、残基ＸおよびＹが配列アラインメントにおいて互いに対応する場合、ＸおよびＹが異なる数であり得るという事実にもかかわらず、第２のタンパク質における残基「Ｙ」のアミノ酸「Ａ」への修飾に対応する。
本明細書で使用される場合、用語「破壊された」または「破壊する」または「発現を破壊する」または「標的配列を破壊する」は、遺伝子機能を妨害し、それによってコードされるポリペプチド／発現産物の発現および／または機能を妨げる変異（例えばフレームシフト変異）の導入を指す。例えば、遺伝子のヌクレアーゼ媒介破壊は、切断型タンパク質の発現および／またはその野生型機能を保持しないタンパク質の発現をもたらし得る。さらに、遺伝子へのドナー鋳型の導入は、コードされたタンパク質の発現、切断型タンパク質の発現、および／またはその野生型機能を保持しないタンパク質の発現をもたらさない可能性がある。
本明細書で使用される場合、「コードする」という用語は、定義されたヌクレオチドの配列（例えば、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびｍＲＮＡ）または定義されたアミノ酸の配列のいずれかを有する生物学的プロセスにおける他のポリマーおよび巨大分子の合成のための鋳型として機能する遺伝子、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡなどのポリヌクレオチド中のヌクレオチドの特定の配列の固有の特性、およびそれから生じる生物学的特性を指す。したがって、その遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写および翻訳により、細胞または他の生物系でタンパク質が産生される場合、遺伝子、ｃＤＮＡまたはＲＮＡはタンパク質をコードする。そのヌクレオチド配列がｍＲＮＡ配列と同一であり、通常は配列表に提供されるコード鎖と、遺伝子またはｃＤＮＡの転写のための鋳型として使用される非コード鎖の両方を、その遺伝子またはｃＤＮＡのタンパク質または他の産物をコードすると呼ぶことができる。
本明細書で使用される場合、ヌクレオチド配列またはタンパク質に関する「内因性」という用語は、細胞内に天然に含まれるかまたは細胞によって発現される配列またはタンパク質を意味することを意図する。
本明細書で使用される場合、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列に関する「外因性」または「異種」という用語は、純粋に合成されている、外来種に由来する、または同じ種に由来する場合、意図的なヒトの介入によって組成および／またはゲノム遺伝子座においてその天然の形態から実質的に修飾されている配列を意味することを意図する。
本明細書で使用される場合、「発現」という用語は、プロモータによって駆動される特定のヌクレオチド配列の転写および／または翻訳を指す。
本明細書で使用される場合、「発現ベクター」という用語は、発現されるヌクレオチド配列に作動可能に連結された発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むベクターを指す。発現ベクターは、発現に十分なシス作用性要素を含み、発現のための他の要素は、宿主細胞によって、またはインビトロ発現系で供給され得る。発現ベクターには、組換えポリヌクレオチドを組み込むコスミド、プラスミド（例えば、裸の、またはリポソームに含まれる）およびウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）を含む当技術分野で公知のすべてのものが含まれる。
本明細書で使用される場合、「遺伝子修飾」という用語は、ゲノムＤＮＡ配列が組換え技術によって意図的に修飾されている、またはその祖先においてそうである細胞または生物を指す。本明細書で使用される場合、「遺伝子修飾」という用語は、「トランスジェニック」という用語を包含する。例えば、本明細書で使用される場合、「遺伝子修飾」細胞は、ミトコンドリアＤＮＡが組換え技術によって意図的に修飾されている細胞を指し得る。
本明細書で使用される場合、「相同組換え」または「ＨＲ」という用語は、修復鋳型として相同ＤＮＡ配列を使用して二本鎖ＤＮＡ切断が修復される天然の細胞プロセスを指す（例えば、Ｃａｈｉｌｌら（２００６），Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１１：１９５８－１９７６を参照されたい）。相同ＤＮＡ配列は、細胞に送達された内因性染色体配列または外因性核酸であり得る。
本明細書で使用される場合、「相同性アーム」または「ヌクレアーゼ切断部位に隣接する配列に相同な配列」という用語は、ヌクレアーゼによって生成された切断部位への核酸分子の挿入を促進する、核酸分子の５´および３´末端に隣接する配列を指す。一般に、相同性アームは、少なくとも５０塩基対、好ましくは少なくとも１００塩基対、最大２０００塩基対またはそれ以上の長さを有することができ、ゲノム中のそれらの対応する配列に対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％またはそれ以上の配列相同性を有することができる。いくつかの実施形態では、相同性アームは約５００塩基対である。
本明細書で使用される場合、「インビトロ転写ＲＮＡ」という用語は、インビトロで合成されたＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡを指す。一般に、インビトロ転写ＲＮＡは、インビトロ転写ベクターから生成される。インビトロ転写ベクターは、インビトロ転写ＲＮＡを生成するために使用される鋳型を含む。
本明細書で使用される場合、「単離された」という用語は、天然の状態から改変または除去されたことを意味する。例えば、生きている動物に天然に存在する核酸またはペプチドは「単離され」ていないが、その天然の状態の共存物質から部分的または完全に分離された同じ核酸またはペプチドは「単離され」ている。単離された核酸またはタンパク質は、実質的に精製された形態で存在し得るか、または例えば宿主細胞などの非天然環境に存在し得る。
本明細書で使用される場合、「レンチウイルス」という用語は、レトロウイルス科の属を指す。レンチウイルスは、非分裂細胞に感染することができるという点でレトロウイルスの中で独特である。レンチウイルスは、宿主細胞のＤＮＡに顕著な量の遺伝情報を送達することができるため、遺伝子送達ベクターの最も効率的な方法の１つである。ＨＩＶ、ＳＩＶ、およびＦＩＶはすべてレンチウイルスの例である。
本明細書で使用される場合、「脂質ナノ粒子」という用語は、典型的に平均直径１０～１０００ナノメートルの球形構造を有する脂質組成物を指す。いくつかの製剤では、脂質ナノ粒子は、少なくとも１種のカチオン性脂質、少なくとも１種の非カチオン性脂質、および少なくとも１種のコンジュゲート脂質を含むことができる。ｍＲＮＡなどの核酸を封入するのに適した当技術分野で公知の脂質ナノ粒子が、本発明における使用のために企図される。
本明細書で使用される場合、組換えタンパク質に関する「修飾」という用語は、参照配列（例えば、野生型または天然配列）に対する組換え配列内のアミノ酸残基の任意の挿入、欠失、または置換を意味する。
本明細書で使用される場合、「非相同末端結合」または「ＮＨＥＪ」という用語は、２本鎖ＤＮＡ切断が２つの非相同ＤＮＡセグメントの直接結合によって修復される天然の細胞プロセスを指す（例えば、Ｃａｈｉｌｌら（２００６）、Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１１：１９５８－１９７６を参照されたい）。非相同末端結合によるＤＮＡ修復は誤りがちであり、修復部位でのＤＮＡ配列の鋳型のない付加または欠失を頻繁にもたらす。いくつかの例では、標的認識配列での切断は、標的認識部位にＮＨＥＪをもたらす。遺伝子のコード配列中の標的部位のヌクレアーゼ誘導切断とそれに続くＮＨＥＪによるＤＮＡ修復は、遺伝子機能を破壊するフレームシフト変異などの変異をコード配列に導入することができる。したがって、遺伝子操作ヌクレアーゼを使用して、細胞の集団中の遺伝子を効果的にノックアウトすることができる。
本明細書で使用される場合、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」という用語は、互いの縮重バージョンであり、同じアミノ酸配列をコードするすべてのヌクレオチド配列を含む。タンパク質またはＲＮＡをコードするヌクレオチド配列という語句はまた、タンパク質をコードするヌクレオチド配列が、あるバージョンで１つ以上のイントロンを含み得る程度にイントロンを含むことができる。
本明細書で使用される場合、「作動可能に連結された」という用語は、２つ以上の要素間の機能的連結を意味することを意図する。例えば、本明細書に記載のヌクレアーゼをコードする核酸配列と調節配列（例えば、プロモータ）との間の作動可能な連結は、ヌクレアーゼをコードする核酸配列の発現を可能にする機能的連結である。作動可能に連結された要素は、連続していても不連続であってもよい。２つのタンパク質コード領域の結合を指すために使用される場合、作動可能に連結されることは、コード領域が同じリーディングフレーム内にあることを意図する。
本明細書で使用される場合、特に明記しない限り、「または」という単語は、「および／または」の包括的な意味で使用され、「いずれか／または」の排他的な意味では使用されない。
本明細書で使用される場合、「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」という用語は、互換的に使用され、ペプチド結合によって共有結合したアミノ酸残基から構成される化合物を指す。タンパク質またはペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸を含有しなければならず、タンパク質またはペプチドの配列を含むことができるアミノ酸の最大数に制限はない。ポリペプチドは、ペプチド結合によって互いに結合した２つ以上のアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質を含む。本明細書で使用される場合、用語は、例えば、当技術分野で一般にペプチド、オリゴペプチド、およびオリゴマーとも呼ばれる短鎖と、当技術分野で一般にタンパク質と呼ばれる長鎖の両方を指し、その多くの種類がある。「ポリペプチド」には、例えば、とりわけ、生物学的活性断片、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドのバリアント、修飾ポリペプチド、誘導体、アナログ、融合タンパク質が含まれる。ポリペプチドは、天然ペプチド、組換えペプチド、またはそれらの組合せを含む。
本明細書で使用される場合、「低減した」または「減少した」という用語は、対照細胞の集団と比較した場合の、ＭＥＬＡＳ変異を有する変異型ミトコンドリアゲノムを含む細胞の集団における細胞のパーセンテージまたは細胞の比の低減を指す。いくつかの実施形態では、「低減した」または「減少した」は、単一細胞または細胞集団における変異型ミトコンドリアゲノムのパーセンテージまたは野生型ミトコンドリアゲノムに対する変異型ミトコンドリアゲノムの比の低減を指す。このような低減は、最大５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または最大１００％である。したがって、「低減された」という用語は、変異型ｍｔＤＮＡの部分的な低減と完全な低減の両方を包含する。
本明細書で使用される場合、アミノ酸配列と核酸配列の両方に関する用語である「同一性パーセント」、「配列同一性」、「類似性パーセンテージ」、「配列類似性」などの用語は、アラインメントしたアミノ酸残基またはヌクレオチド間の類似性を最大にし、同一または類似の残基またはヌクレオチドの数、全体の残基またはヌクレオチドの数、ならびに配列アラインメントにおけるギャップの存在および長さの関数である、配列のアラインメントに基づく２つの配列の類似性の程度の尺度を指す。標準的なパラメータを使用して配列類似性を決定するために、様々なアルゴリズムおよびコンピュータプログラムが利用可能である。本明細書で使用される場合、配列類似性は、アミノ酸配列についてのＢＬＡＳＴｐプログラムおよび核酸配列についてのＢＬＡＳＴｎプログラムを使用して測定され、これらは両方ともアメリカ国立生物工学情報センター（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）から入手可能であり、かつ例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０、ＧｉｓｈおよびＳｔａｔｅｓ（１９９３）、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．３：２６６－２７２、Ｍａｄｄｅｎら（１９９６）、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１－１４１、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３ ８９－３４０２）、Ｚｈａｎｇら（２０００）、Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｂｉｏｌ．７（１－２）：２０３－１４に記載されている。本明細書で使用される場合、２つのアミノ酸配列の類似性パーセントは、ＢＬＡＳＴｐアルゴリズムについての以下のパラメータに基づくスコアである：ワードサイズ＝３、ギャップ開始ペナルティ＝－１１、ギャップ伸長ペナルティ＝－１、およびスコア行列＝ＢＬＯＳＵＭ ６２。本明細書で使用される場合、２つの核酸配列の類似性パーセントは、ＢＬＡＳＴｎアルゴリズムについての以下のパラメータに基づくスコアである：ワードサイズ＝１１、ギャップ開始ペナルティ＝－５、ギャップ伸長ペナルティ＝－２、マッチリワード＝１、ミスマッチペナルティ＝－３。
本明細書で使用される場合、「ポリ（Ａ）」という用語は、ポリアデニル化によってｍＲＮＡに結合された一連のアデノシンである。一過性発現のための構築物の好ましい実施形態では、ポリＡは、５０～５０００、好ましくは６４超、より好ましくは１００超、最も好ましくは３００または４００超である。ポリ（Ａ）配列を化学的または酵素的に修飾して、ｍＲＮＡの機能性、例えば局在化、安定性または翻訳の効率をモジュレートすることができる。
本明細書で使用される場合、「ポリアデニル化」という用語は、ポリアデニリル部分またはその修飾バリアントのメッセンジャーＲＮＡ分子への共有結合を指す。真核生物では、ほとんどのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子が３´末端でポリアデニル化されている。３’ポリ（Ａ）尾部は、酵素ポリアデニル酸ポリメラーゼの作用によってプレ－ｍＲＮＡに付加されたアデニンヌクレオチド（多くの場合数百）の長い配列である。高等真核生物では、ポリ（Ａ）尾部は、特定の配列、ポリアデニル化シグナルを含む転写物に付加される。ポリ（Ａ）尾部およびそれに結合したタンパク質は、エキソヌクレアーゼによる分解からｍＲＮＡを保護するのを助ける。ポリアデニル化は、転写終結、核からのｍＲＮＡの搬出、および翻訳にとっても重要である。ポリアデニル化は、ＤＮＡがＲＮＡに転写された直後に核内で起こるが、さらに細胞質内で後に起こる場合もある。転写が終結した後、ｍＲＮＡ鎖は、ＲＮＡポリメラーゼと結合したエンドヌクレアーゼ複合体の作用によって切断される。切断部位は、通常、切断部位付近の塩基配列ＡＡＵＡＡＡの存在を特徴とする。ｍＲＮＡが切断された後、切断部位の遊離３’末端にアデノシン残基が付加される。
本明細書で使用される場合、「プロモータ」または「調節配列」という用語は、プロモータ／調節配列に作動可能に連結された遺伝子産物の発現に必要な核酸配列を指す。いくつかの例では、この配列はコアプロモータ配列であり得、他の例では、この配列はまた、遺伝子産物の発現に必要なエンハンサー配列および他の調節要素を含み得る。プロモータ／調節配列は、例えば、組織特異的様式で遺伝子産物を発現するものであり得る。
本明細書で使用される場合、タンパク質に関する「組換え」または「遺伝子操作」という用語は、タンパク質をコードする核酸およびタンパク質を発現する細胞または生物への遺伝子工学技術の適用の結果として改変されたアミノ酸配列を有することを意味する。核酸に関して、「組換え」または「遺伝子操作」という用語は、遺伝子工学技術の適用の結果として改変された核酸配列を有することを意味する。遺伝子工学技術には、ＰＣＲおよびＤＮＡクローニング技術、トランスフェクション、形質転換および他の遺伝子転移技術、相同組換え、部位特異的変異誘発、ならびに遺伝子融合が含まれるが、これらに限定されない。この定義によれば、天然に存在するタンパク質と同一のアミノ酸配列を有するが、異種宿主でのクローニングおよび発現によって産生されるタンパク質は、組換えまたは遺伝子操作されているとみなされない。
本明細書で使用される場合、「組換えＤＮＡ構築物」、「組換え構築物」、「発現カセット」、「発現構築物」、「キメラ構築物」、「構築物」、および「組換えＤＮＡ断片」という用語は、本明細書で互換的に使用され、一本鎖または二本鎖ポリヌクレオチドである。組換え構築物は、天然には一緒に見出されない調節配列およびコード配列を含むがこれらに限定されない核酸断片の人工的な組合せを含む。例えば、組換えＤＮＡ構築物は、異なる供給源に由来する調節配列およびコード配列、または同じ供給源に由来し、天然に見出されるものとは異なる様式で配置された調節配列およびコード配列を含み得る。そのような構築物は、単独で使用されてもよく、またはベクターと組み合わせて使用されてもよい。
本明細書で使用される場合、「組織特異的プロモータ」という用語は、遺伝子をコードするかまたは遺伝子によって指定されるポリヌクレオチドと作動可能に連結された場合、細胞がプロモータに対応する組織型の細胞である場合にのみ、実質的に細胞内で遺伝子産物を産生させるヌクレオチド配列を指す。
本明細書で使用される場合、「トランスフェクトされた」または「形質転換された」または「形質導入された」または「ヌクレオフェクトされた」という用語は、外因性核酸が宿主細胞に転移または導入されるプロセスを指す。「トランスフェクトされた」または「形質転換された」または「形質導入された」細胞は、外因性核酸でトランスフェクト、形質転換または形質導入された細胞である。細胞は、初代対象細胞およびその子孫を含む。
本明細書で使用される場合、「転移ベクター」という用語は、単離された核酸を含み、単離された核酸を細胞の内部に送達するために使用することができる物質の組成物を指す。線状ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性化合物に関連するポリヌクレオチド、プラスミドおよびウイルスを含むがこれらに限定されない多数のベクターが当技術分野で公知である。したがって、「転移ベクター」という用語は、自律複製プラスミドまたはウイルスを含む。用語はまた、例えば、ポリリジン化合物、リポソームなどの、細胞への核酸の転移を促進する非プラスミドおよび非ウイルス化合物をさらに含むと解釈されるべきである。ウイルス転移ベクターの例としては、これらに限定されないが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどが挙げられる。
本明細書で使用される場合、「一過性」という用語は、数時間、数日または数週間の期間にわたる非組み込み導入遺伝子の発現を指し、発現期間は、ゲノムに組み込まれているか、または宿主細胞中の安定なプラスミドレプリコン内に含まれている場合、遺伝子の発現期間よりも短い。
本明細書で使用される場合、「ベクター」または「組換えＤＮＡベクター」という用語は、所与の宿主細胞においてポリペプチドをコードする配列の転写および翻訳が可能な複製系および配列を含む構築物であり得る。ベクターが使用される場合、ベクターの選択は、当業者に周知のように、宿主細胞を形質転換するために使用される方法に依存する。ベクターとしては、限定されないが、プラスミドベクターおよび組換えＡＡＶベクター、または遺伝子を標的細胞に送達するのに適した当技術分野で公知の任意の他のベクターが挙げられ得る。当業者は、本明細書に記載される単離されたヌクレオチドまたは核酸配列のいずれかを含む宿主細胞を首尾よく形質転換し、選択し、増殖させるためにベクター上に存在しなければならない遺伝子要素を十分に認識している。いくつかの実施形態では、「ベクター」はウイルスベクターも指す。ウイルスベクターには、限定されないが、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）が含まれ得る。
本明細書で使用される場合、「野生型」という用語は、野生型対立遺伝子によってコードされるポリペプチドがその元の機能を有する、同じ種類の遺伝子の対立遺伝子集団における最も一般的な天然に存在する対立遺伝子（すなわち、ポリヌクレオチド配列）を指す。「野生型」という用語はまた、野生型対立遺伝子によってコードされるポリペプチドを指す。野生型対立遺伝子（すなわち、ポリヌクレオチド）およびポリペプチドは、野生型配列に対して１つ以上の変異および／または置換を含む変異型またはバリアント対立遺伝子およびポリペプチドと区別可能である。野生型対立遺伝子またはポリペプチドは、生物において正常な表現型を付与することができるが、変異型もしくはバリアント対立遺伝子またはポリペプチドは、場合によっては改変された表現型を付与することができる。野生型ヌクレアーゼは、組換えヌクレアーゼまたは天然に存在しないヌクレアーゼと区別可能である。「野生型」という用語はまた、特定の遺伝子の野生型対立遺伝子を有する細胞、生物および／もしくは対象、または比較目的で使用される細胞、生物および／もしくは対象を指すことができる。
本明細書で使用される場合、ヌクレアーゼに言及する場合の「改変された特異性」という用語は、ヌクレアーゼが、生理学的条件下で参照ヌクレアーゼ（例えば、野生型）に結合せず、参照ヌクレアーゼによって切断されない認識配列に結合して切断すること、または認識配列の切断速度が、参照ヌクレアーゼと比較して生物学的に有意な量（例えば、少なくとも２×、または２×－１０×）だけ増加または減少することを意味する。
本明細書で使用される場合、「中心配列」という用語は、メガヌクレアーゼ認識配列の半部位を分離する４つの塩基対を指す。これらの塩基は、＋１～＋４の番号が付されている。中心配列は、メガヌクレアーゼ切断後に３´一本鎖オーバーハングになる４つの塩基を含む。「中心配列」は、センス鎖またはアンチセンス（反対）鎖の配列を指すことができる。メガヌクレアーゼは対称性であり、中心配列のセンス鎖とアンチセンス鎖の両方で等しく塩基を認識する。例えば、センス鎖上の配列Ａ＋１Ａ＋２Ａ＋３Ａ＋４は、メガヌクレアーゼによってアンチセンス鎖上のＴ＋１Ｔ＋２Ｔ＋３Ｔ＋４として認識され、したがってＡ＋１Ａ＋２Ａ＋３Ａ＋４およびＴ＋１Ｔ＋２Ｔ＋３Ｔ＋４は機能的に等価である（例えば、両方が所与のメガヌクレアーゼによって切断され得る）。したがって、配列Ｃ＋１Ｔ＋２Ｇ＋３Ｃ＋４は、メガヌクレアーゼがその認識配列に対称ホモ二量体として結合するという事実に起因して、その反対鎖配列Ｇ＋１Ｃ＋２Ａ＋３Ｇ＋４と等価である。
本明細書で使用される場合、「切断する」または「切断」という用語は、本明細書で「切断部位」と呼ばれる、標的配列内の二本鎖切断をもたらす標的配列内の認識配列の骨格内のホスホジエステル結合の加水分解を指す。
本明細書で使用される場合、「ＤＮＡ結合親和性」または「結合親和性」という用語は、ヌクレアーゼが参照ＤＮＡ分子（例えば、認識配列または任意の配列）と非共有結合する傾向を意味する。結合親和性は、解離定数Ｋｄによって測定される。本明細書で使用される場合、参照認識配列に対するヌクレアーゼのＫｄが、参照ヌクレアーゼに対して統計的に有意な変化パーセントだけ増加または減少する場合、ヌクレアーゼは「改変された」結合親和性を有する。
本明細書で使用される場合、「超可変領域」という用語は、比較的高い可変性を有するアミノ酸を含むメガヌクレアーゼモノマーまたはサブユニット内の局在化配列を指す。超可変領域は、約５０～６０個の連続残基、約５３～５７個の連続残基、または好ましくは約５６個の残基を含むことができる。いくつかの実施形態では、超可変領域の残基は、配列番号３～１２のいずれか１つの２４～７９位または２１５～２７０位に対応し得る。超可変領域は、認識配列中のＤＮＡ塩基と接触する１つ以上の残基を含むことができ、モノマーまたはサブユニットの塩基選択性を改変するように修飾することができる。超可変領域はまた、メガヌクレアーゼが二本鎖ＤＮＡ認識配列と結合する場合にＤＮＡ骨格に結合する１つ以上の残基を含むことができる。そのような残基は、ＤＮＡ骨格および標的認識配列に対するメガヌクレアーゼの結合親和性を改変するように修飾することができる。本明細書に記載の異なる実施形態では、超可変領域は、可変性を示し、塩基選択性および／またはＤＮＡ結合親和性に影響を及ぼすように修飾することができる１～２０残基を含み得る。特定の実施形態では、超可変領域は、可変性を示し、塩基選択性および／またはＤＮＡ結合親和性に影響を及ぼすように修飾することができる約１５～２０残基を含む。いくつかの実施形態では、超可変領域内の可変残基は、配列番号３～１２のいずれか１つの位置２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５および７７のうちの１つ以上に対応する。他の実施形態では、超可変領域内の可変残基は、配列番号３～１２のいずれか１つの位置２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６および２６８のうちの１つ以上に対応する。
本明細書で使用される場合、「リンカー」という用語は、２つのヌクレアーゼサブユニットを単一のポリペプチドに結合するために使用される外因性ペプチド配列を指す。リンカーは、天然のタンパク質に見出される配列を有していてもよく、または天然のタンパク質には見出されない人工配列であってもよい。リンカーは、可撓性であり、二次構造を欠いていてもよく、または生理学的条件下で特定の三次元構造を形成する傾向を有していてもよい。リンカーは、限定されないが、米国特許第８，４４５，２５１号、第９，３４０，７７７号、第９，４３４，９３１号および第１０，０４１，０５３号によって包含されるものを含むことができ、これらの各々は参照によりその全体が組み込まれる。いくつかの実施形態では、リンカーは、配列番号３～１２のいずれか１つの残基１５４～１９５を示すアミノ酸配列を有し得る。
本明細書で使用される場合、「メガヌクレアーゼ」という用語は、１２塩基対を超える認識配列で二本鎖ＤＮＡに結合するエンドヌクレアーゼを指す。いくつかの実施形態では、本開示のメガヌクレアーゼの認識配列は、２２塩基対である。メガヌクレアーゼは、Ｉ－ＣｒｅＩ（配列番号４８）に由来するエンドヌクレアーゼであり得、例えば、ＤＮＡ結合特異性、ＤＮＡ切断活性、ＤＮＡ結合親和性、または二量体化特性に関して天然のＩ－ＣｒｅＩに対して修飾されたＩ－ＣｒｅＩの遺伝子操作バリアントを指し得る。Ｉ－ＣｒｅＩのそのような修飾されたバリアントを産生するための方法は、当技術分野で公知である（例えば、参照によりその全体が組み込まれる国際公開第２００７／０４７８５９号）。本明細書で使用されるメガヌクレアーゼは、ヘテロ二量体として二本鎖ＤＮＡに結合する。メガヌクレアーゼはまた、一対のＤＮＡ結合ドメインがペプチドリンカーを使用して単一のポリペプチドに結合されている「一本鎖メガヌクレアーゼ」であり得る。「ホーミングエンドヌクレアーゼ」という用語は、「メガヌクレアーゼ」という用語と同義である。本開示のメガヌクレアーゼは、本明細書に記載の方法を使用して測定した場合、細胞生存率への有害な影響またはメガヌクレアーゼ切断活性の有意な低減を観察することなく、細胞をトランスフェクトし、３７℃で維持できるように、本明細書に記載の標的細胞で発現した場合に実質的に非毒性である。
本明細書で使用される場合、「ヌクレアーゼ」および「エンドヌクレアーゼ」という用語は、ポリヌクレオチド鎖内のホスホジエステル結合を切断する、天然に存在するまたは遺伝子操作された酵素を指すために互換的に使用される。
本明細書で使用される場合、「ミトコンドリア標的化遺伝子操作メガヌクレアーゼ」または「ＭＴＥＭ」という用語は、遺伝子操作メガヌクレアーゼがミトコンドリア細胞小器官内のミトコンドリアＤＮＡに結合して切断することができるように、遺伝子操作メガヌクレアーゼをミトコンドリアに向けることができるペプチドまたは他の分子に結合した遺伝子操作メガヌクレアーゼを指す。
本明細書で使用される場合、「ミトコンドリア移行ペプチド」または「ＭＴＰ」という用語は、ミトコンドリア内で分子を運搬するために別個の分子に結合することができるペプチドまたはアミノ酸の断片を指す。例えば、ＭＴＰは、遺伝子操作メガヌクレアーゼをミトコンドリアに運搬するために、遺伝子操作メガヌクレアーゼなどのヌクレアーゼに結合することができる。ＭＴＰは、疎水性アミノ酸と正に帯電したアミノ酸の交互パターンからなり、いわゆる両親媒性ヘリックスを形成することができる。
本明細書で使用される場合、「認識半部位」、「認識配列半部位」または単に「半部位」という用語は、ホモ二量体もしくはヘテロ二量体メガヌクレアーゼのモノマーによって、または一本鎖メガヌクレアーゼの１つのサブユニットによって、または一本鎖メガヌクレアーゼの１つのサブユニットによって認識および結合される二本鎖ＤＮＡ分子内の核酸配列を意味する。
本明細書で使用される場合、「認識配列」または「認識部位」という用語は、ヌクレアーゼによって結合および切断されるＤＮＡ配列を指す。メガヌクレアーゼの場合、認識配列は、４塩基対によって分離された逆位９塩基対「半部位」の対を含む。一本鎖メガヌクレアーゼの場合、タンパク質のＮ末端ドメインは第１の半部位と接触し、タンパク質のＣ末端ドメインは第２の半部位と接触する。メガヌクレアーゼによる切断は、４塩基対の３´オーバーハングを作り出す。「オーバーハング」または「粘着末端」は、二本鎖ＤＮＡ配列のエンドヌクレアーゼ切断によって作り出すことができる短い一本鎖ＤＮＡセグメントである。Ｉ－ＣｒｅＩに由来するメガヌクレアーゼおよび一本鎖メガヌクレアーゼの場合、オーバーハングは、２２塩基対の認識配列の塩基１０～１３を含む。本明細書で使用される場合、「一本鎖メガヌクレアーゼ」という用語は、リンカーによって結合された一対のヌクレアーゼサブユニットを含むポリペプチドを指す。一本鎖メガヌクレアーゼは、以下の構成：Ｎ末端サブユニット－リンカー－Ｃ末端サブユニットを有する。２つのメガヌクレアーゼサブユニットは、一般に、アミノ酸配列が同一ではなく、同一ではないＤＮＡ配列に結合する。したがって、一本鎖メガヌクレアーゼは、典型的に偽パリンドロームまたは非パリンドローム認識配列を切断する。一本鎖メガヌクレアーゼは、実際には二量体ではないが、「一本鎖ヘテロ二量体」または「一本鎖ヘテロ二量体メガヌクレアーゼ」と呼ばれることがある。明確にするために、特に明記しない限り、「メガヌクレアーゼ」という用語は、二量体または一本鎖メガヌクレアーゼを指すことができる。
本明細書で使用される場合、「特異性」という用語は、ヌクレアーゼが認識配列と呼ばれる塩基対の特定の配列でのみ、または認識配列の特定のセットでのみ二本鎖ＤＮＡ分子に結合して切断する能力を意味する。認識配列のセットは、特定の保存された位置または配列モチーフを共有するが、１つ以上の位置で縮重することができる。高度に特異的なヌクレアーゼは、１つのみまたはごく少数の認識配列を切断することができる。特異性は、当技術分野で公知の任意の方法によって決定することができる。
本明細書で使用される場合、「標的部位」または「標的配列」という用語は、ヌクレアーゼの認識配列を含む細胞の染色体ＤＮＡの領域を指す。
本明細書で使用される場合、「ベクター」は、ウイルスベクター（すなわち、組換えウイルス）を指すこともできる。ウイルスベクターには、限定されないが、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）が含まれ得る。
本明細書で使用される場合、「血清型」または「キャプシド」という用語は、ウイルス細胞表面抗原に基づいて決定されるウイルスの種内の別個のバリアントを指す。ＡＡＶの既知の血清型としては、とりわけ、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１およびＡＡＶＨＳＣ（Ｓｎｙｄｅｒ ａｎｄ Ｍｏｕｌｌｉｅｒ Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ：Ｈｕｍａｎａ ＰｒｅｓｓにおけるＷｅｉｔｚｍａｎ ａｎｄ Ｌｉｎｄｅｎ（２０１１））が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「対照」または「対照細胞」は、遺伝子修飾細胞の遺伝子型または表現型の変化を測定するための参照点を提供する細胞を指す。対照細胞は、例えば、（ａ）野生型細胞、すなわち、遺伝子修飾細胞をもたらした遺伝子改変のための出発物質と同じ遺伝子型の野生型細胞、（ｂ）遺伝子修飾細胞と同じ遺伝子型であるが、ヌル構築物で（すなわち、目的の形質に既知の影響を及ぼさない構築物で）形質転換された細胞、または（ｃ）遺伝子修飾細胞と遺伝的に同一であるが、改変された遺伝子型または表現型の発現を誘導する条件、刺激もしくはさらなる遺伝子修飾に曝露されていない細胞を含み得る。
本明細書で使用される場合、「有効量」または「治療有効量」という用語は、有益もしくは望ましい生物学的および／または臨床的結果をもたらすのに十分な量を指す。治療有効量は、使用される製剤または組成物、疾患およびその重症度、ならびに処置される対象の年齢、体重、身体状態および応答性に応じて変化する。いくつかの具体的な実施形態では、有効量の本明細書に記載のＭＴＥＭまたは遺伝子操作メガヌクレアーゼは、約１ｘ１０１０ｇｃ／ｋｇ～約１ｘ１０１４ｇｃ／ｋｇ（例えば、１ｘ１０１０ｇｃ／ｋｇ、１ｘ１０１１ｇｃ／ｋｇ、１ｘ１０１２ｇｃ／ｋｇ、１ｘ１０１３ｇｃ／ｋｇ、または１ｘ１０１４ｇｃ／ｋｇ）の、本明細書に記載のＭＴＥＭまたは遺伝子操作メガヌクレアーゼをコードする核酸または鋳型核酸を含む。特定の実施形態では、有効量の本明細書に記載のＭＴＥＭもしくは遺伝子操作メガヌクレアーゼをコードする核酸および／もしくは鋳型核酸、または本明細書に記載のＭＴＥＭもしくは遺伝子操作メガヌクレアーゼをコードする核酸および／もしくは本明細書に記載の鋳型核酸を含む医薬組成物は、対象における疾患の少なくとも１つの症状を低減する。
本明細書で使用される場合、本明細書で使用される「有効用量」、「有効量」、「治療有効用量」、または「治療有効量」という用語は、有益もしくは望ましい生物学的および／または臨床的結果をもたらすのに十分な量を指す。
本明細書で使用される場合、「ｇｃ／ｋｇ」または「遺伝子コピー／キログラム」という用語は、本明細書に記載のＭＴＥＭもしくは遺伝子操作メガヌクレアーゼをコードする核酸および／または鋳型核酸を投与される対象のキログラム単位の体重当たりの、本明細書に記載のＭＴＥＭもしくは遺伝子操作メガヌクレアーゼをコードする核酸のコピー数、または本明細書に記載の鋳型核酸のコピー数を指す。
本明細書で使用される場合、「防止する」という用語は、患者の疾患または状態の防止を指す。
本明細書で使用される場合、「予防」という用語は、疾患または疾患状態の防止または保護的処置を意味する。
本明細書で使用される場合、「低減した」という用語は、疾患の症状または重症度の任意の低減を指す。そのような低減は、最大５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または最大１００％であり得る。したがって、「低減された」という用語は、疾患状態の部分的な低減と完全な低減の両方を包含する。
本明細書で使用される場合、変数の数値範囲の列挙は、その範囲内の値のいずれかに等しい変数で本開示が実施され得ることを伝えることを意図する。したがって、本質的に離散的な変数の場合、変数は、範囲の終点を含む数値範囲内の任意の整数値に等しくなり得る。同様に、本質的に連続的な変数の場合、変数は、範囲の終点を含む数値範囲内の任意の実数値に等しくなり得る。一例として、限定ではないが、０と２との間の値を有すると記載されている変数は、変数が本質的に離散的である場合、０、１または２の値をとることができ、変数が本質的に連続的である場合、０．０、０．１、０．０１、０．００１の値、または≧０かつ≦２の任意の他の実数値をとることができる。
２．１ 発明の原理
ミトコンドリアは、正常な成長および発達の下で、ならびにストレスに応答して細胞エネルギーおよび代謝を調節する。したがって、ミトコンドリアゲノムの編集は、動物と植物の両方において多様な用途を有する。ヒトにおいて、有害なミトコンドリア変異は、遺伝子編集療法を適用することができるいくつかの障害の原因である。しかし、治療用途のためにミトコンドリアゲノム編集を使用する可能性を考慮しても、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）を効率的に標的化し、正確な編集を生成することができないため、これは依然として科学の未開拓領域である。ミトコンドリアゲノムは、編集技術をこの細胞小器官に送達する必要があるため、編集が困難である。さらに、ミトコンドリアは、予測可能な修復機構を欠いている。ミトコンドリアゲノムを編集する以前の試みは、大規模かつ予測不可能な欠失／再編成をもたらした。したがって、ミトコンドリアゲノムの所定の領域（好ましくは、ただ１つの遺伝子に限定される）をより予測可能な様式で標的化および編集することを可能にする組成物および方法が所望される。
本開示は、ミトコンドリアゲノム内の周囲領域に影響を与えることなく、ミトコンドリアゲノム上の認識配列に結合して切断するための組成物および方法を提供する。本明細書には、ｍｔＤＮＡにおいてＤＳＢが生成され得るように、ＭＴＰに結合した遺伝子操作メガヌクレアーゼが開示される。本発明は、遺伝子操作メガヌクレアーゼがミトコンドリア細胞小器官に向けられ、ｍｔＤＮＡの正確な編集を促進することができ、したがって生命科学における展望および機会の分野全体を開くことを実証する。
２．２ 遺伝子操作メガヌクレアーゼならびにヒトミトコンドリアＤＮＡ内の認識配列を認識および切断するためのミトコンドリア標的化遺伝子操作メガヌクレアーゼ
部位特異的ヌクレアーゼを使用して生細胞のゲノム内でＤＮＡ切断を行うことが可能であり、そのようなＤＮＡ切断は、トランスジェニックＤＮＡ配列との相同組換えを介してゲノムの永久的な修飾をもたらし得ることが当技術分野で公知である。標的遺伝子座において二本鎖切断を誘導するためのヌクレアーゼの使用は、特にゲノム標的に相同な配列に隣接するトランスジェニックＤＮＡ配列の相同組換えを刺激することが公知である。このようにして、外因性核酸配列を標的遺伝子座に挿入することができる。
ミトコンドリア移行ペプチド（ＭＴＰ）に結合した遺伝子操作メガヌクレアーゼから構築されたミトコンドリア標的化遺伝子操作メガヌクレアーゼ（ＭＴＥＭ）は、真核細胞の細胞質からミトコンドリアに効果的に輸送することができる。ミトコンドリア細胞小器官内に入ると、ＭＴＥＭは、ミトコンドリアゲノム内の認識配列に結合して切断することができる。部位特異的ヌクレアーゼを使用して生細胞のゲノム内でＤＮＡ切断を行うことが可能であり、そのようなＤＮＡ切断は、変異原性ＮＨＥＪ修復を介して、またはトランスジェニックＤＮＡ配列との相同組換えを介してゲノムの永久的な修飾をもたらし得ることが当技術分野で公知である。ＮＨＥＪは、切断部位で変異誘発を生じさせ、対立遺伝子の不活性化をもたらすことができる。ＮＨＥＪ関連変異誘発は、早期終止コドンの生成、異常な非機能性タンパク質を産生するフレームシフト変異を介して対立遺伝子を不活性化し得るか、またはナンセンス変異媒介ｍＲＮＡ分解などの機構を誘因し得る。ＮＨＥＪを介して変異誘発を誘導するヌクレアーゼの使用は、野生型対立遺伝子に存在する特定の変異または配列を標的化するために使用することができる。さらに、標的遺伝子座において二本鎖切断を誘導するためのヌクレアーゼの使用は、特にゲノム標的に相同な配列に隣接するトランスジェニックＤＮＡ配列の相同組換えを刺激することが公知である。このようにして、外因性核酸配列を標的遺伝子座に挿入することができる。そのような外因性核酸は、目的の任意の配列またはポリペプチドをコードすることができる。いくつかの実施形態では、部位特異的ヌクレアーゼは、ミトコンドリアゲノム内の認識配列を切断することができ、その結果、部位特異的ヌクレアーゼによって作成された切断末端からミトコンドリアゲノムが分解される。
本発明を実施するために使用されるヌクレアーゼはメガヌクレアーゼである。特定の実施形態では、本発明を実施するために使用されるメガヌクレアーゼは、一本鎖メガヌクレアーゼである。一本鎖メガヌクレアーゼは、リンカーペプチドによって結合されたＮ末端サブユニットおよびＣ末端サブユニットを含む。２つのドメインの各々は、認識配列の半分（すなわち、認識半部位）を認識して結合し、ＤＮＡ切断の部位は、２つのサブユニットの界面付近の認識配列の中央にある。ＤＮＡ鎖切断は、メガヌクレアーゼによるＤＮＡ切断が一対の４塩基対の３’一本鎖オーバーハングを生成するように、４塩基対によって相殺される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の遺伝子操作メガヌクレアーゼは、ＭＩＴ ２５－２６認識配列（配列番号１）に結合して切断するように遺伝子操作されている。そのような遺伝子操作メガヌクレアーゼは、本明細書で「ＭＩＴ ２５－２６メガヌクレアーゼ」または「ＭＩＴ ２５－２６ヌクレアーゼ」と呼ばれる。特定の実施形態では、ＭＩＴ ２５－２６メガヌクレアーゼは、配列番号１のＭＩＴ ２５－２６認識配列を切断するＭＴＥＭのために、ＭＴＰに結合される。
本明細書に記載の遺伝子操作メガヌクレアーゼは、第１の超可変（ＨＶＲ１）領域を含む第１のサブユニット、および第２の超可変（ＨＶＲ２）領域を含む第２のサブユニットを含み得る。さらに、第１のサブユニットは、認識配列中の第１の認識半部位（例えば、ＭＩＴ ２５半部位）に結合することができ、第２のサブユニットは、認識配列中の第２の認識半部位（例えば、ＭＩＴ ２６半部位）に結合することができる。遺伝子操作メガヌクレアーゼが一本鎖メガヌクレアーゼである実施形態では、第１および第２のサブユニットは、ＨＶＲ１領域を含み、第１の半部位に結合する第１のサブユニットがＮ末端サブユニットとして位置し、ＨＶＲ２領域を含み、第２の半部位に結合する第２のサブユニットがＣ末端サブユニットとして位置するように配向され得る。代替的な実施形態では、第１および第２のサブユニットは、ＨＶＲ１領域を含み、第１の半部位に結合する第１のサブユニットがＣ末端サブユニットとして位置し、ＨＶＲ２領域を含み、第２の半部位に結合する第２のサブユニットがＮ末端サブユニットとして位置するように配向され得る。
本明細書に記載の例示的なＭＩＴ ２５－２６メガヌクレアーゼを表１に提供し、以下にさらに説明する。
Figure 2024514939000001
＊「ＭＩＴ２５サブユニット％」および「ＭＩＴ２６サブユニット％」は、各メガヌクレアーゼのＭＩＴ２５結合サブユニット領域およびＭＩＴ２６結合サブユニット領域と、ＭＩＴ２５－２６ｘ．９１メガヌクレアーゼのＭＩＴ２５結合サブユニット領域およびＭＩＴ２６結合サブユニット領域との間のアミノ酸配列同一性をそれぞれ表す。
本明細書に記載される特定の実施形態では、遺伝子操作メガヌクレアーゼは、ミトコンドリアゲノム内の配列番号１を含む認識配列に結合して切断し、遺伝子操作メガヌクレアーゼは、第１のサブユニットおよび第２のサブユニットを含み、第１のサブユニットは認識配列の第１の認識半部位に結合し、第１の超可変（ＨＶＲ１）領域を含み、第２のサブユニットは認識配列の第２の認識半部位に結合し、第２の超可変（ＨＶＲ２）領域を含む。
いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号３～１２のいずれか１つの残基２４～７９に対応するアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかのこのような実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号３～１２のいずれか１つの残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、および７７に対応する１つ以上の残基を含む。いくつかのこのような実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号３～１２のいずれか１つの残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５および７７に対応する残基を含む。いくつかのこのような実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号３～１２のいずれか１つの残基６６に対応する残基にＹ、Ｒ、ＫまたはＤを含む。いくつかのこのような実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号３～１２のいずれか１つの残基２４～７９を含む。いくつかのこのような実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号３～１２のいずれか１つの残基２１５～２７０に対応するアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかのこのような実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号３～１２のいずれか１つの残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６および２６８に対応する１つ以上の残基を含む。いくつかのこのような実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号３～１２のいずれか１つの残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６および２６８に対応する残基を含む。いくつかのこのような実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号３～１２のいずれか１つの残基２５７に対応する残基にＹ、Ｒ、ＫまたはＤを含む。いくつかのこのような実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号３～１２のいずれか１つの残基２１５～２７０を含む。いくつかのこのような実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号３～１２のいずれか１つの残基７～１５３に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、第２のサブユニットは、配列番号３～１２のいずれか１つの残基１９８～３４４に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかのこのような実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号３～１２のいずれか１つの残基１９に対応する残基にＧ、ＳまたはＡを含む。いくつかのこのような実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号３～１２のいずれか１つの残基８０に対応する残基にＥ、ＱまたはＫを含む。いくつかのこのような実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号３～１２のいずれか１つの残基２１０に対応する残基にＧ、ＳまたはＡを含む。いくつかのこのような実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号３～１２のいずれか１つの残基２７１に対応する残基にＥ、ＱまたはＫを含む。いくつかのこのような実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号３～１２のいずれか１つの残基８０に対応する残基を含む。いくつかのこのような実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号３～１２のいずれか１つの残基２７１に対応する残基を含む。いくつかのそのような実施形態では、遺伝子操作メガヌクレアーゼは、リンカーを含む一本鎖メガヌクレアーゼであり、リンカーは第１のサブユニットと第２のサブユニットとを共有結合する。いくつかのこのような実施形態では、遺伝子操作メガヌクレアーゼは、配列番号３～１２のいずれか１つに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかのこのような実施形態では、遺伝子操作メガヌクレアーゼは、配列番号３～１２のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作メガヌクレアーゼは、配列番号３３～４２のいずれか１つに示される核酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる。いくつかのそのような実施形態では、遺伝子操作メガヌクレアーゼは、配列番号３３～４２のいずれか１つに示される核酸配列によってコードされる。
ＭＩＴ ２５－２６ｘ．９１（配列番号３）
いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号３の残基２４～７９に対応するアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号３の残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、および７７に対応する１つ以上の残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号３の残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、および７７に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号３の残基６６に対応する残基にＹ、Ｒ、ＫまたはＤを含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１個のアミノ酸置換を有する配列番号３の残基２４～７９を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号３の残基２４～７９を含む。
いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号３の残基７～１５３に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号３の残基１９に対応する残基にＧ、ＳまたはＡを含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号３の残基１９に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号３の残基８０に対応する残基にＥ、ＱまたはＫを含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個のアミノ酸置換を有する配列番号３の残基７～１５３を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号３の残基７～１５３を含む。
いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号３の残基２１５～２７０に対応するアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号３の残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６および２６８に対応する１つ以上の残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号３の残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６および２６８に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号３の残基２５７に対応する残基にＹ、Ｒ、ＫまたはＤを含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号３の残基２４１に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号３の残基２６２に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号３の残基２６３に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号３の残基２６４に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１個のアミノ酸置換を有する配列番号３の残基２１５～２７０を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号３の残基２１５～２７０を含む。
いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号３の残基１９８～３４４に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号３の残基２１０に対応する残基にＧ、ＳまたはＡを含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号３の残基２７１に対応する残基にＥ、ＱまたはＫを含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号３の残基３３０に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個のアミノ酸置換を有する配列番号３の残基１９８～３４４を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号３の残基１９８～３４４を含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作メガヌクレアーゼは、リンカーを含む一本鎖メガヌクレアーゼであり、リンカーは前記第１のサブユニットと前記第２のサブユニットを共有結合する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作メガヌクレアーゼは、配列番号３に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作メガヌクレアーゼは、配列番号３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作メガヌクレアーゼは、配列番号３３に示される核酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作メガヌクレアーゼは、配列番号３３に示される核酸配列によってコードされる。
ＭＩＴ ２５－２６ｘ．４８（配列番号４）
いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号４の残基２４～７９に対応するアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号４の残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５および７７に対応する１つ以上の残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号４の残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、および７７に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号４の残基６６に対応する残基にＹ、Ｒ、ＫまたはＤを含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１個のアミノ酸置換を有する配列番号４の残基２４～７９を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号４の残基２４～７９を含む。
いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号４の残基７～１５３に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号４の残基１９に対応する残基にＧ、ＳまたはＡを含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号４の残基１９に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号４の残基８０に対応する残基にＥ、ＱまたはＫを含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個のアミノ酸置換を有する配列番号４の残基７～１５３を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号４の残基７～１５３を含む。
いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号４の残基２１５～２７０に対応するアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号４の残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６および２６８に対応する１つ以上の残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号４の残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６および２６８に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号４の残基２５７に対応する残基にＹ、Ｒ、ＫまたはＤを含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号４の残基２４１に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１個のアミノ酸置換を有する配列番号４の残基２１５～２７０を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号４の残基２１５～２７０を含む。
いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号４の残基１９８～３４４に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号４の残基２１０に対応する残基にＧ、ＳまたはＡを含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号４の残基２７１に対応する残基にＥ、ＱまたはＫを含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号４の残基２７６に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号４の残基３３０に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個のアミノ酸置換を有する配列番号４の残基１９８～３４４を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号４の残基１９８～３４４を含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作メガヌクレアーゼは、リンカーを含む一本鎖メガヌクレアーゼであり、リンカーは前記第１のサブユニットと前記第２のサブユニットを共有結合する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作メガヌクレアーゼは、配列番号４に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作メガヌクレアーゼは、配列番号４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作メガヌクレアーゼは、配列番号３４に示される核酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作メガヌクレアーゼは、配列番号３４に示される核酸配列によってコードされる。
ＭＩＴ ２５－２６ｘ．７３（配列番号５）
いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号５の残基２４～７９に対応するアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号５の残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、および７７に対応する１つ以上の残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号５の残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、および７７に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号５の残基６６に対応する残基にＹ、Ｒ、ＫまたはＤを含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１個のアミノ酸置換を有する配列番号５の残基２４～７９を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号５の残基２４～７９を含む。
いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号５の残基７～１５３に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号５の残基１９に対応する残基にＧ、ＳまたはＡを含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号５の残基１９に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号５の残基８０に対応する残基にＥ、ＱまたはＫを含む。いくつかの実施形態では、残基は、配列番号５の残基８０に対応する残基である。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個のアミノ酸置換を有する配列番号５の残基７～１５３を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号５の残基７～１５３を含む。
いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号５の残基２１５～２７０に対応するアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号５の残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６および２６８に対応する１つ以上の残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号５の残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６および２６８に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号５の残基２５７に対応する残基にＹ、Ｒ、ＫまたはＤを含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号５の残基２４１に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号５の残基２６３に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号５の残基２６４に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１個のアミノ酸置換を有する配列番号５の残基２１５～２７０を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号５の残基２１５～２７０を含む。
いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号５の残基１９８～３４４に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号５の残基２１０に対応する残基にＧ、ＳまたはＡを含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号５の残基２７１に対応する残基にＥ、ＱまたはＫを含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号５の残基３３０に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個のアミノ酸置換を有する配列番号５の残基１９８～３４４を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号５の残基１９８～３４４を含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作メガヌクレアーゼは、リンカーを含む一本鎖メガヌクレアーゼであり、リンカーは前記第１のサブユニットと前記第２のサブユニットを共有結合する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作メガヌクレアーゼは、配列番号５に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作メガヌクレアーゼは、配列番号５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作メガヌクレアーゼは、配列番号３５に示される核酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作メガヌクレアーゼは、配列番号３５に示される核酸配列によってコードされる。
ＭＩＴ ２５－２６ｘ．２９（配列番号６）
いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号６の残基２４～７９に対応するアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号６の残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５および７７に対応する１つ以上の残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号６の残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、および７７に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号６の残基６６に対応する残基にＹ、Ｒ、ＫまたはＤを含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１個のアミノ酸置換を有する配列番号６の残基２４～７９を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号６の残基２４～７９を含む。
いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号６の残基７～１５３に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号６の残基１９に対応する残基にＧ、ＳまたはＡを含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号６の残基１９に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号６の残基８０に対応する残基にＥ、ＱまたはＫを含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個のアミノ酸置換を有する配列番号６の残基７～１５３を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号６の残基７～１５３を含む。
いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号６の残基２１５～２７０に対応するアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号６の残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６および２６８に対応する１つ以上の残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号６の残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６および２６８に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号６の残基２５７に対応する残基にＹ、Ｒ、ＫまたはＤを含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号６の残基２４１に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号６の残基２６３に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号６の残基２６４に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号６の残基２６５に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１個のアミノ酸置換を有する配列番号６の残基２１５～２７０を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号６の残基２１５～２７０を含む。
いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号６の残基１９８～３４４に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号６の残基２１０に対応する残基にＧ、ＳまたはＡを含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号６の残基２７１に対応する残基にＥ、ＱまたはＫを含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号６の残基３３０に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個のアミノ酸置換を有する配列番号６の残基１９８～３４４を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号６の残基１９８～３４４を含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作メガヌクレアーゼは、リンカーを含む一本鎖メガヌクレアーゼであり、リンカーは前記第１のサブユニットと前記第２のサブユニットを共有結合する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作メガヌクレアーゼは、配列番号６に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作メガヌクレアーゼは、配列番号６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作メガヌクレアーゼは、配列番号３６に示される核酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作メガヌクレアーゼは、配列番号３６に示される核酸配列によってコードされる。
ＭＩＴ ２５－２６ｘ．３７（配列番号７）
いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号７の残基２４～７９に対応するアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号７の残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、および７７に対応する１つ以上の残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号７の残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、および７７に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号７の残基６６に対応する残基にＹ、Ｒ、ＫまたはＤを含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１個のアミノ酸置換を有する配列番号７の残基２４～７９を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号７の残基２４～７９を含む。
いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号７の残基７～１５３に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号７の残基１９に対応する残基にＧ、ＳまたはＡを含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号７の残基１９に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号７の残基８０に対応する残基にＥ、ＱまたはＫを含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号７の残基８０に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個のアミノ酸置換を有する配列番号７の残基７～１５３を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号７の残基７～１５３を含む。
いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号７の残基２１５～２７０に対応するアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号７の残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６および２６８に対応する１つ以上の残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号７の残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６および２６８に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号７の残基２５７に対応する残基にＹ、Ｒ、ＫまたはＤを含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号７の残基２４１に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号７の残基２６３に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１個のアミノ酸置換を有する配列番号７の残基２１５～２７０を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号７の残基２１５～２７０を含む。
いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号７の残基１９８～３４４に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号７の残基２１０に対応する残基にＧ、ＳまたはＡを含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号７の残基２７１に対応する残基にＥ、ＱまたはＫを含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号７の残基３３０に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個のアミノ酸置換を有する配列番号７の残基１９８～３４４を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号７の残基１９８～３４４を含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作メガヌクレアーゼは、リンカーを含む一本鎖メガヌクレアーゼであり、リンカーは前記第１のサブユニットと前記第２のサブユニットを共有結合する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作メガヌクレアーゼは、配列番号７に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作メガヌクレアーゼは、配列番号７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作メガヌクレアーゼは、配列番号３７に示される核酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作メガヌクレアーゼは、配列番号３７に示される核酸配列によってコードされる。
ＭＩＴ ２５－２６Ｌ．３５（配列番号８）
いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号８の残基２４～７９に対応するアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号８の残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５および７７に対応する１つ以上の残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号８の残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、および７７に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号８の残基６６に対応する残基にＹ、Ｒ、ＫまたはＤを含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１個のアミノ酸置換を有する配列番号８の残基２４～７９を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号８の残基２４～７９を含む。
いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号８の残基７～１５３に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号８の残基１９に対応する残基にＧ、ＳまたはＡを含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号８の残基１９に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号８の残基８０に対応する残基にＥ、ＱまたはＫを含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個のアミノ酸置換を有する配列番号８の残基７～１５３を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号８の残基７～１５３を含む。
いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号８の残基２１５～２７０に対応するアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号８の残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６および２６８に対応する１つ以上の残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号８の残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６および２６８に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号８の残基２５７に対応する残基にＹ、Ｒ、ＫまたはＤを含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号８の残基２４１に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号８の残基２６３に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号８の残基２６４に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１個のアミノ酸置換を有する配列番号８の残基２１５～２７０を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号８の残基２１５～２７０を含む。
いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号８の残基１９８～３４４に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号８の残基２１０に対応する残基にＧ、ＳまたはＡを含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号８の残基２７１に対応する残基にＥ、ＱまたはＫを含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号８の残基３３０に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個のアミノ酸置換を有する配列番号８の残基１９８～３４４を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号８の残基１９８～３４４を含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作メガヌクレアーゼは、リンカーを含む一本鎖メガヌクレアーゼであり、リンカーは前記第１のサブユニットと前記第２のサブユニットを共有結合する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作メガヌクレアーゼは、配列番号８に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作メガヌクレアーゼは、配列番号８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作メガヌクレアーゼは、配列番号３８に示される核酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作メガヌクレアーゼは、配列番号３８に示される核酸配列によってコードされる。
ＭＩＴ ２５－２６ｘ．９１ ２５９Ｈ＞Ｑ（配列番号９）
いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号９の残基２４～７９に対応するアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号９の残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５および７７に対応する１つ以上の残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号９の残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、および７７に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号９の残基６６に対応する残基にＹ、Ｒ、ＫまたはＤを含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１個のアミノ酸置換を有する配列番号９の残基２４～７９を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号９の残基２４～７９を含む。
いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号９の残基７～１５３に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号９の残基１９に対応する残基にＧ、ＳまたはＡを含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号９の残基１９に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号９の残基８０に対応する残基にＥ、ＱまたはＫを含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号９の残基８０に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個のアミノ酸置換を有する配列番号９の残基７～１５３を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号９の残基７～１５３を含む。
いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号９の残基２１５～２７０に対応するアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号９の残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６および２６８に対応する１つ以上の残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号９の残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６および２６８に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号９の残基２５７に対応する残基にＹ、Ｒ、ＫまたはＤを含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号９の残基２４１に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号９の残基２６３に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号９の残基２６４に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１個のアミノ酸置換を有する配列番号９の残基２１５～２７０を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号９の残基２１５～２７０を含む。
いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号９の残基１９８～３４４に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号９の残基２１０に対応する残基にＧ、ＳまたはＡを含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号９の残基２７１に対応する残基にＥ、ＱまたはＫを含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号９の残基３３０に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個のアミノ酸置換を有する配列番号９の残基１９８～３４４を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号９の残基１９８～３４４を含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作メガヌクレアーゼは、リンカーを含む一本鎖メガヌクレアーゼであり、リンカーは前記第１のサブユニットと前記第２のサブユニットを共有結合する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作メガヌクレアーゼは、配列番号９に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作メガヌクレアーゼは、配列番号９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作メガヌクレアーゼは、配列番号３９に示される核酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作メガヌクレアーゼは、配列番号３９に示される核酸配列によってコードされる。
ＭＩＴ ２５－２６Ｌ．３５ １９Ａ＞Ｓ（配列番号１０）
いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号１０の残基２４～７９に対応するアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号１０の残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、および７７に対応する１つ以上の残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号１０の残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、および７７に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号１０の残基６６に対応する残基にＹ、Ｒ、ＫまたはＤを含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１個のアミノ酸置換を有する配列番号１０の残基２４～７９を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号１０の残基２４～７９を含む。
いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号１０の残基７～１５３に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号１０の残基１９に対応する残基にＧ、ＳまたはＡを含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号１０の残基１９に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号１０の残基８０に対応する残基にＥ、ＱまたはＫを含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個のアミノ酸置換を有する配列番号１０の残基７～１５３を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号１０の残基７～１５３を含む。
いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号１０の残基２１５～２７０に対応するアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号１０の残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６および２６８に対応する１つ以上の残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号１０の残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６および２６８に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号１０の残基２５７に対応する残基にＹ、Ｒ、ＫまたはＤを含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号１０の残基２４１に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号１０の残基２６３に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号１０の残基２６４に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１個のアミノ酸置換を有する配列番号１０の残基２１５～２７０を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号１０の残基２１５～２７０を含む。
いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号１０の残基１９８～３４４に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号１０の残基２１０に対応する残基にＧ、ＳまたはＡを含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号１０の残基２７１に対応する残基にＥ、ＱまたはＫを含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号１０の残基３３０に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個のアミノ酸置換を有する配列番号１０の残基１９８～３４４を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号１０の残基１９８～３４４を含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作メガヌクレアーゼは、リンカーを含む一本鎖メガヌクレアーゼであり、リンカーは前記第１のサブユニットと前記第２のサブユニットを共有結合する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作メガヌクレアーゼは、配列番号１０に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作メガヌクレアーゼは、配列番号１０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作メガヌクレアーゼは、配列番号４０に示される核酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作メガヌクレアーゼは、配列番号４０に示される核酸配列によってコードされる。
ＭＩＴ ２５－２６ｘ．９１ ２６３Ｔ＞Ｒ（配列番号１１）
いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号１１の残基２４～７９に対応するアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号１１の残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、および７７に対応する１つ以上の残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号１１の残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、および７７に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号１１の残基６６に対応する残基にＹ、Ｒ、ＫまたはＤを含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１個のアミノ酸置換を有する配列番号１１の残基２４～７９を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号１１の残基２４～７９を含む。
いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号１１の残基７～１５３に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号１１の残基１９に対応する残基にＧ、ＳまたはＡを含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号１１の残基１９に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号１１の残基８０に対応する残基にＥ、ＱまたはＫを含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号１１の残基８０に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個のアミノ酸置換を有する配列番号１１の残基７～１５３を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号１１の残基７～１５３を含む。
いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号１１の残基２１５～２７０に対応するアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号１１の残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６および２６８に対応する１つ以上の残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号１１の残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６および２６８に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号１１の残基２５７に対応する残基にＹ、Ｒ、ＫまたはＤを含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号１１の残基２４１に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号１１の残基２６３に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号１１の残基２６４に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１個のアミノ酸置換を有する配列番号１１の残基２１５～２７０を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号１１の残基２１５～２７０を含む。
いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号１１の残基１９８～３４４に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号１１の残基２１０に対応する残基にＧ、ＳまたはＡを含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号１１の残基２７１に対応する残基にＥ、ＱまたはＫを含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号１１の残基３３０に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個のアミノ酸置換を有する配列番号１１の残基１９８～３４４を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号１１の残基１９８～３４４を含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作メガヌクレアーゼは、リンカーを含む一本鎖メガヌクレアーゼであり、リンカーは前記第１のサブユニットと前記第２のサブユニットを共有結合する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作メガヌクレアーゼは、配列番号１１に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作メガヌクレアーゼは、配列番号１１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作メガヌクレアーゼは、配列番号４１に示される核酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作メガヌクレアーゼは、配列番号４１に示される核酸配列によってコードされる。
ＭＩＴ ２５－２６ｘ．９１ ４６Ｈ＞Ｗ（配列番号１２）
いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号１２の残基２４～７９に対応するアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号１２の残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、および７７に対応する１つ以上の残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号１２の残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、および７７に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号１２の残基６６に対応する残基にＹ、Ｒ、ＫまたはＤを含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１個のアミノ酸置換を有する配列番号１２の残基２４～７９を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ１領域は、配列番号１２の残基２４～７９を含む。
いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号１２の残基７～１５３に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号１２の残基１９に対応する残基にＧ、ＳまたはＡを含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号１２の残基１９に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号１２の残基８０に対応する残基にＥ、ＱまたはＫを含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号１２の残基８０に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個のアミノ酸置換を有する配列番号１２の残基７～１５３を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号１２の残基７～１５３を含む。
いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号１２の残基２１５～２７０に対応するアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号１２の残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６および２６８に対応する１つ以上の残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号１２の残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６および２６８に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号１２の残基２５７に対応する残基にＹ、Ｒ、ＫまたはＤを含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号１２の残基２４１に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号１２の残基２６３に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号１２の残基２６４に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１個のアミノ酸置換を有する配列番号１２の残基２１５～２７０を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ２領域は、配列番号１２の残基２１５～２７０を含む。
いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号１２の残基１９８～３４４に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号１２の残基２１０に対応する残基にＧ、ＳまたはＡを含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号１２の残基２７１に対応する残基にＥ、ＱまたはＫを含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号１２の残基３３０に対応する残基を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個のアミノ酸置換を有する配列番号１２の残基１９８～３４４を含む。いくつかの実施形態では、第２のサブユニットは、配列番号１２の残基１９８～３４４を含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作メガヌクレアーゼは、リンカーを含む一本鎖メガヌクレアーゼであり、リンカーは前記第１のサブユニットと前記第２のサブユニットを共有結合する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作メガヌクレアーゼは、配列番号１２に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作メガヌクレアーゼは、配列番号１２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作メガヌクレアーゼは、配列番号４２に示される核酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作メガヌクレアーゼは、配列番号４２に示される核酸配列によってコードされる。遺伝子操作メガヌクレアーゼをミトコンドリアに向けるためのＭＴＰは、１０～１００アミノ酸長であり得る。特定の実施形態では、ＭＴＰは、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約９５、約１００、またはそれ以上のアミノ酸長である。ＭＴＰは、続いてミトコンドリアマトリックスなどのミトコンドリアの異なる領域にタンパク質を標的化する追加のシグナルを含み得る。本明細書に開示される組成物および方法で使用するためのＭＴＰの非限定的な例としては、アカゲザルＦ０ ＡＴＰアーゼサブユニット９（ＳＵ９）ＭＴＰ、ヒトチトクロムｃオキシダーゼサブユニットＶＩＩＩ（ＣｏｘＶＩＩＩまたはＣｏｘ８）ＭＴＰ、ヒトＡＴＰシンターゼＭＴＰのサブユニットｃのＰ１アイソフォーム、アルデヒドデヒドロゲナーゼ標的化配列ＭＴＰ、グルタレドキシン５ ＭＴＰ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼＭＴＰ、ペプチジル－プロリルイソメラーゼＭＴＰ、アセチルトランスフェラーゼＭＴＰ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼＭＴＰ、チトクロムオキシダーゼＭＴＰ、およびＡＴＰシンターゼＭＴＰのＦＡ部分のサブユニット、ＣＰＮ６０／Ｎｏ ＧＧリンカーＭＴＰ、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）ＭＴＰ、スーパーオキシドジスムターゼ二重（２ ＳＯＤ）ＭＴＰ、スーパーオキシドジスムターゼ修飾（ＳＯＤｍｏｄ）ＭＴＰ、スーパーオキシドジスムターゼ修飾（２ ＳＯＤｍｏｄ）二重ＭＴＰ、Ｌ２９ ＭＴＰ、ｇＡＴＰアーゼガンマサブユニット（ＦＡγ５１）ＭＴＰ、ＣｏｘＩＶ ｔｗｉｎ ｓｔｒｅｐ（ＡＢＭ９７４８３）ＭＴＰおよびＣｏｘＩＶ １０ｘＨｉｓ ＭＴＰが挙げられる。
特定の実施形態では、ＭＴＰは、少なくとも２つのＭＴＰの組合せを含む。ＭＴＰの組合せは、同一のＭＴＰの組合せであってもよく、異なるＭＴＰの組合せであってもよい。特定の実施形態では、ＭＴＰは、Ｃｏｘ ＶＩＩＩ ＭＴＰ（配列番号４３）およびＳＵ９ ＭＴＰ（配列番号４４）を、配列番号４５によって表される単一のＭＴＰ中に含む。
ＭＴＥＭを形成するために、ＭＴＰは、任意の適切な手段によって本明細書に記載の遺伝子操作メガヌクレアーゼに結合され得る。特定の実施形態では、ＭＴＰは、遺伝子操作メガヌクレアーゼのＮ末端に結合され得る。他の実施形態では、ＭＴＰは、遺伝子操作メガヌクレアーゼのＣ末端に結合され得る。いくつかの実施形態では、複数のＭＴＰを単一の遺伝子操作メガヌクレアーゼに結合させてＭＴＥＭを形成することができる。例えば、第１のＭＴＰを遺伝子操作メガヌクレアーゼのＮ末端に結合させることができ、第２のＭＴＰを遺伝子操作メガヌクレアーゼのＣ末端に結合させることができる。いくつかの実施形態では、第１および第２のＭＴＰは同一であり、他の実施形態では、第１および第２のＭＴＰは同一ではない。ＭＴＰは、遺伝子操作メガヌクレアーゼの細胞のミトコンドリアへの運搬を可能にする任意の手段によって結合され得る。特定の実施形態では、ＭＴＰは、ＭＴＰを遺伝子操作メガヌクレアーゼのＮ末端またはＣ末端に融合することによって結合される。ＭＴＰはまた、ペプチドリンカーによって遺伝子操作メガヌクレアーゼに結合され得る。リンカーは、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１５または２０個のアミノ酸であり得る。特定の実施形態では、ＭＴＰは、遺伝子操作メガヌクレアーゼのＮ末端またはＣ末端でペプチドリンカーに結合される。
いくつかの実施形態では、本開示の組成物および方法で使用するための本明細書に記載のＭＴＥＭまたは遺伝子操作メガヌクレアーゼは、遺伝子操作メガヌクレアーゼが核ゲノムを切断するのを防止するのを助けるために、核外搬出配列（ＮＥＳ）に結合される。いくつかのこのような実施形態では、ＮＥＳは、配列番号４６または４７のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、ＮＥＳは、配列番号４６または４７のアミノ酸配列を含み得る。特定の実施形態では、ＮＥＳは、遺伝子操作メガヌクレアーゼのＮ末端に結合される。他の実施形態では、ＮＥＳは、遺伝子操作メガヌクレアーゼのＣ末端に結合される。特定の実施形態では、ＮＥＳは遺伝子操作メガヌクレアーゼに融合される。特定の実施形態では、ＮＥＳは、ポリペプチドリンカーによって遺伝子操作メガヌクレアーゼに結合される。
特定の実施形態では、本明細書に記載のＭＴＥＭまたは遺伝子操作メガヌクレアーゼは、複数のＮＥＳに結合される。例えば、本明細書に記載の遺伝子操作メガヌクレアーゼは、第１のＮＥＳおよび第２のＮＥＳを含むことができる。いくつかのそのような実施形態では、第１のＮＥＳは、本明細書に記載のＭＴＥＭまたは遺伝子操作メガヌクレアーゼのＮ末端に結合し、第２のＮＥＳは、本明細書に記載のＭＴＥＭまたは遺伝子操作メガヌクレアーゼのＣ末端に結合する。いくつかのそのような実施形態では、第１のＮＥＳおよび／または第２のＮＥＳは、配列番号４６または４７に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、第１のＮＥＳおよび／または第２のＮＥＳは、配列番号４６または４７に示されるアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、第１のＮＥＳおよび第２のＮＥＳは同一である。他の実施形態では、第１のＮＥＳおよび第２のＮＥＳは同一ではない。ＮＥＳは、当技術分野で公知の任意の適切な手段によって本明細書に記載のＭＴＥＭまたは遺伝子操作メガヌクレアーゼに結合され得る。例えば、第１のＮＥＳおよび／または第２のＮＥＳは、本明細書に記載のＭＴＥＭまたは遺伝子操作メガヌクレアーゼに融合することができる。いくつかの実施形態では、第１のＮＥＳおよび／または第２のＮＥＳは、ポリペプチドリンカーによって本明細書に記載のＭＴＥＭまたは遺伝子操作メガヌクレアーゼに結合される。
ＮＥＳを含む本明細書に記載のＭＴＥＭまたは遺伝子操作メガヌクレアーゼは、ＮＥＳを含まない遺伝子操作メガヌクレアーゼと比較して、標的細胞または標的細胞集団（例えば、真核細胞または真核細胞集団）の核への運搬が低減または減少し得る。例えば、ＮＥＳを含む本明細書に記載のＭＴＥＭまたは遺伝子操作メガヌクレアーゼの核運搬は、ＮＥＳを含まない本明細書に記載のＭＴＥＭまたは遺伝子操作メガヌクレアーゼの核運搬よりも約５～１０％、１０～２０％、２０～３０％、３０～４０％、４０～５０％、５０～６０％、６０～７０％、７０～８０％、８０～９０％、９０～１００％、またはそれ以上（例えば、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、またはそれ以上）少なくてもよい。いくつかの実施形態では、ＮＥＳを含む遺伝子操作メガヌクレアーゼは、ＮＥＳを含まない本明細書に記載のＭＴＥＭまたは遺伝子操作メガヌクレアーゼと比較して、より少ない核インデル（すなわち、標的細胞または標的細胞集団の核ゲノムにおけるより少ない切断および結果として生じる欠失）を誘導し得る。例えば、ＮＥＳを含む本明細書に記載のＭＴＥＭまたは遺伝子操作メガヌクレアーゼによって誘導される核インデルは、ＮＥＳを含まない本明細書に記載のＭＴＥＭまたは遺伝子操作メガヌクレアーゼによって誘導される核インデルよりも約５～１０％、１０～２０％、２０～３０％、３０～４０％、４０～５０％、５０～６０％、６０～７０％、７０～８０％、８０～９０％、９０～１００％、またはそれ以上少なくてもよい。
２．３ 医薬組成物
いくつかの実施形態では、本発明は、薬学的に許容される担体、および本明細書に記載のＭＴＥＭもしくは遺伝子操作メガヌクレアーゼ、または薬学的に許容される担体、および本明細書に記載のＭＴＥＭもしくは遺伝子操作メガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチドを含む医薬組成物を提供する。特に、医薬的に許容される担体、および治療有効量の本明細書に記載のＭＴＥＭもしくは遺伝子操作メガヌクレアーゼをコードする核酸、または本明細書に記載のＭＴＥＭもしくは遺伝子操作メガヌクレアーゼを含む医薬組成物が提供され、本明細書に記載のＭＴＥＭの遺伝子操作メガヌクレアーゼまたは遺伝子操作メガヌクレアーゼは、ヒトｍｔＤＮＡ（例えば、配列番号１のＭＩＴ ２５－２６認識配列）などのｍｔＤＮＡ内の認識配列に対して特異性を有する。
他の実施形態では、本発明は、薬学的に許容される担体および本明細書に記載の遺伝子修飾細胞を含む医薬組成物を提供する。
そのような医薬組成物は、公知の技術に従って調製することができる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（２１ｓｔ ｅｄ．、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ、２００５）を参照されたい。本発明による医薬製剤の製造では、ヌクレアーゼポリペプチド（またはそれをコードするＤＮＡ／ＲＮＡもしくはそれを発現する細胞）を、典型的に薬学的に許容される担体と混合し、得られた組成物を対象に投与する。担体は、製剤中の任意の他の成分と適合性であるという意味で許容されなければならず、対象に有害であってはならない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、対象の疾患の処置に有用な１種以上の追加の薬剤または生物学的分子をさらに含むことができる。同様に、追加の薬剤および／または生物学的分子は、別個の組成物として同時投与することができる。
本明細書に記載の特定の実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載のＭＴＥＭまたは遺伝子操作メガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド（例えば、ウイルスゲノム）を含む組換えウイルス（すなわち、ウイルスベクター）を含む。そのような組換えウイルスは当技術分野で公知であり、組換えレトロウイルス、組換えレンチウイルス、組換えアデノウイルス、および組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）が含まれる（２０１３ Ｎｅｗ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３６：１－２２）。本発明に有用な組換えＡＡＶは、標的細胞型へのウイルスの形質導入、および標的細胞による本明細書に記載のＭＴＥＭまたは遺伝子操作メガヌクレアーゼの発現を可能にする任意のキャプシドまたは血清型を有することができる。例えば、いくつかの実施形態では、組換えＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、またはＡＡＶＨＳＣの血清型を有する。いくつかの実施形態では、組換えウイルスは標的組織に直接注入される。代替的な実施形態では、組換えウイルスは、循環系を介して全身送達される。異なるＡＡＶが異なる組織に局在化する傾向があり、特定の組織への優先的送達のために適切なＡＡＶキャプシド／血清型を選択することができることは当技術分野で公知である。したがって、いくつかの実施形態では、ＡＡＶ血清型はＡＡＶ９である。ＡＡＶはまた、宿主細胞において第２鎖ＤＮＡ合成を必要としないように、自己相補的であり得る（ＭｃＣａｒｔｙら（２００１）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．８：１２４８－５４）。組換えＡＡＶによって送達される核酸は、左（５’）および右（３’）逆方向末端反復を含み得る。
本明細書に記載の特定の実施形態では、医薬組成物は、脂質ナノ粒子内に製剤化された本明細書に記載の１つ以上のｍＲＮＡ（例えば、本明細書に記載のＭＴＥＭまたは遺伝子操作メガヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ）を含む。
脂質ナノ粒子を含むカチオン性脂質、非カチオン性脂質および／または脂質コンジュゲート、ならびにそのような脂質の互いに対する相対モル比の選択は、選択された脂質の特徴、意図された標的細胞の性質、および送達されるｍＲＮＡの特徴に基づく。さらなる考慮事項には、例えば、アルキル鎖の飽和、ならびに選択された脂質のサイズ、電荷、ｐＨ、ｐＫａ、融合性および毒性が含まれる。したがって、個々の成分のモル比はそれに応じて調整することができる。
本明細書に記載の方法で使用するための脂質ナノ粒子は、当技術分野で現在公知の様々な技術によって調製することができる。核酸－脂質粒子およびそれらの調製方法は、例えば、米国特許公開第２００４０１４２０２５号および第２００７００４２０３１号に開示されており、その開示は、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
脂質ナノ粒子の適切なサイズの選択は、標的細胞の部位および脂質ナノ粒子が作製されている用途を考慮しなければならない。一般に、脂質ナノ粒子は、約２５～約５００ｎｍの範囲内のサイズを有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、約５０ｎｍ～約３００ｎｍまたは約６０ｎｍ～約１２０ｎｍのサイズを有する。脂質ナノ粒子のサイズは、参照により本明細書に組み込まれるＢｌｏｏｍｆｉｅｌｄ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．，１０：４２１＾１５０（１９８１）に記載されるように、準電気光散乱（ＱＥＬＳ）によって決定することができる。特定のサイズ範囲の脂質ナノ粒子の集団を産生するための様々な方法、例えば超音波処理または均質化が当技術分野で公知である。そのような方法の１つは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，７３７，３２３号に記載されている。
本発明での使用が企図されるいくつかの脂質ナノ粒子は、少なくとも１種のカチオン性脂質、少なくとも１種の非カチオン性脂質、および少なくとも１種のコンジュゲート脂質を含む。より特定の例では、脂質ナノ粒子は、約５０ｍｏｌ％～約８５ｍｏｌ％のカチオン性脂質、約１３ｍｏｌ％～約４９．５ｍｏｌ％の非カチオン性脂質、および約０．５ｍｏｌ％～約１０ｍｏｌ％の脂質コンジュゲートを含むことができ、非ラメラ（すなわち、非二重層）形態を有するような方法で産生される。他の特定の例では、脂質ナノ粒子は、約４０ｍｏｌ％～約８５ｍｏｌ％のカチオン性脂質、約１３ｍｏｌ％～約４９．５ｍｏｌ％の非カチオン性脂質、および約０．５ｍｏｌ％～約１０ｍｏｌ％の脂質コンジュゲートを含むことができ、非ラメラ（すなわち、非二重層）形態を有するような方法で産生される。
カチオン性脂質は、例えば、以下の１種以上を含むことができる：パルミトイル－オレオイル－ノル－アルギニン（ＰＯＮＡ）、ＭＰＤＡＣＡ、ＧＵＡＤＡＣＡ、（（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル４－（ジメチルアミノ）ブタノエート）（ＭＣ３）、ＬｅｎＭＣ３、ＣＰ－ＬｅｎＭＣ３、γ－ＬｅｎＭＣ３、ＣＰ－γ－ＬｅｎＭＣ３、ＭＣ３ＭＣ、ＭＣ２ＭＣ、ＭＣ３エーテル、ＭＣ４エーテル、ＭＣ３アミド、Ｐａｎ－ＭＣ３、Ｐａｎ－ＭＣ４およびＰａｎ ＭＣ５、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－（２－ジメチルアミノエチル）－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ２－ＤＭＡ；「ＸＴＣ２」）、２，２－ジリノレイル－４－（３－ジメチルアミノプロピル）－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ３－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－（４－ジメチルアミノブチル）－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ４－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－５－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキサン（ＤＬｉｎ－Ｋ６－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－Ｎ－メチルペピアジノ－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＭＰＺ）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ）、１，２－ジリノレイルカルバモイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－Ｃ－ＤＡＰ）、１，２－ジリノレイオキシ－３－（ジメチルアミノ）アセトキシプロパン（ＤＬｉｎ－ＤＡＣ）、１，２－ジリノレイオキシ－３－モルホリノプロパン（ＤＬｉｎ－ＭＡ）、１，２－ジリノレオイル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２－ジリノレイルチオ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－Ｓ－ＤＭＡ）、１－リノレオイル－２－リノレイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－２－ＤＭＡＰ）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＬｉｎ－ＴＭＡ．Ｃｌ）、１，２－ジリノレオイル－３－トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＬｉｎ－ＴＡＰ．Ｃｌ）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－（Ｎ－メチルピペラジノ）プロパン（ＤＬｉｎ－ＭＰＺ）、３－（Ｎ，Ｎ－ジリノレイルアミノ）－１，２－プロパンジオール（ＤＬｉｎＡＰ）、３－（Ｎ，Ｎ－ジオレイルアミノ）－１，２－プロパンジオ（ＤＯＡＰ）、１，２－ジリノレイルキソ－３－（２－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノ）エトキシプロパン（ＤＬｉｎ－ＥＧ－ＤＭＡ）、Ｎ，Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、１，２－ジオレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）、１，２－ジステアリルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＳＤＭＡ）、Ｎ－（１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ－ジステアリル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ－（１－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）、３－（Ｎ－（Ｎ’，Ｎ’－ジメチルアミノエタン）－カルバモイル）コレステロール（ＤＣ－Ｃｈｏｌ）、Ｎ－（１，２－ジミリスチルオキシプロパ－３－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、２，３－ジオレイルオキシ－Ｎ－［２（スペルミン－カルボキサミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－プロパンアミニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）、３－ジメチルアミノ－２－（コレスタ－５－エン－３－ベータ－オキシブタン－４－オキシ）－１－（シス，シス－９，１２－オクタデカジエノキシ）プロパン（ＣＬｉｎＤＭＡ）、２－［５’－（コレスタ－５－エン－３－ベータ－オキシ）－３´－オキサペントキシ）－３－ジメチル－１－（シス，シス－９’，１－２’－オクタデカジエノキシ）プロパン（ＣｐＬｉｎＤＭＡ）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－３，４－ジオレイルオキシベンジルアミン（ＤＭＯＢＡ）、１，２－Ｎ，Ｎ’－ジオレイルカルバミル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＯｃａｒｂＤＡＰ）、１，２－Ｎ，Ｎ’－ジリノレイルカルバミル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ）、またはそれらの混合物。カチオン性脂質はまた、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ２－ＤＭＡ（「ＸＴＣ２」）、ＭＣ３、ＬｅｎＭＣ３、ＣＰ－ＬｅｎＭＣ３、γ－ＬｅｎＭＣ３、ＣＰ－γ－ＬｅｎＭＣ３、ＭＣ３ＭＣ、ＭＣ２ＭＣ、ＭＣ３エーテル、ＭＣ４エーテル、ＭＣ３アミド、Ｐａｎ－ＭＣ３、Ｐａｎ－ＭＣ４、Ｐａｎ ＭＣ５、またはそれらの混合物であり得る。
様々な実施形態では、カチオン性脂質は、粒子に存在する全脂質の約５０ｍｏｌ％～約９０ｍｏｌ％、約５０ｍｏｌ％～約８５ｍｏｌ％、約５０ｍｏｌ％～約８０ｍｏｌ％、約５０ｍｏｌ％～約７５ｍｏｌ％、約５０ｍｏｌ％～約７０ｍｏｌ％、約５０ｍｏｌ％～約６５ｍｏｌ％、または約５０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％を構成する。
他の実施形態では、カチオン性脂質は、粒子に存在する全脂質の約４０ｍｏｌ％～約９０ｍｏｌ％、約４０ｍｏｌ％～約８５ｍｏｌ％、約４０ｍｏｌ％～約８０ｍｏｌ％、約４０ｍｏｌ％～約７５ｍｏｌ％、約４０ｍｏｌ％～約７０ｍｏｌ％、約４０ｍｏｌ％～約６５ｍｏｌ％、または約４０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％を構成する。
非カチオン性脂質は、例えば、１種以上のアニオン性脂質および／または中性脂質を含み得る。特定の実施形態では、非カチオン性脂質は、以下の中性脂質成分のうちの１種を含む：（１）コレステロールまたはその誘導体；（２）リン脂質；または（３）リン脂質とコレステロールもしくはその誘導体との混合物。コレステロール誘導体の例としては、コレスタノール、コレスタノン、コレステノン、コプロスタノール、コレステリル－２’－ヒドロキシエチルエーテル、コレステリル－４’－ヒドロキシブチルエーテル、およびそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。リン脂質は、これらに限定されないが、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイル－ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、パルミトイルオレイル－ホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）、ジパルミトイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、モノメチル－ホスファチジルエタノールアミン、ジメチル－ホスファチジルエタノールアミン、ジエライドイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＥＰＥ）、ステアロイルオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、およびそれらの混合物を含む中性脂質であってもよい。特定の具体的な実施形態では、リン脂質は、ＤＰＰＣ、ＤＳＰＣ、またはそれらの混合物である。
いくつかの実施形態では、非カチオン性脂質（例えば、１種以上のリン脂質および／またはコレステロール）は、粒子に存在する全脂質の約１０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％、約１５ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％、約２０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％、約２５ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％、約１０ｍｏｌ％～約５５ｍｏｌ％、約１５ｍｏｌ％～約５５ｍｏｌ％、約２０ｍｏｌ％～約５５ｍｏｌ％、約２５ｍｏｌ％～約５５ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％～約５５ｍｏｌ％、約１３ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％、約１５ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％または約２０ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％を構成する。非カチオン性脂質がリン脂質とコレステロールまたはコレステロール誘導体との混合物である場合、混合物は、粒子に存在する全脂質の最大約４０、５０または６０ｍｏｌ％を構成し得る。
粒子の凝集を阻害するコンジュゲート脂質は、例えば、以下：ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質コンジュゲート、ポリアミド（ＡＴＴＡ）－脂質コンジュゲート、カチオン性ポリマー－脂質コンジュゲート（ＣＰＬ）、またはそれらの混合物の１種以上を含み得る。１つの特定の実施形態では、核酸－脂質粒子は、ＰＥＧ－脂質コンジュゲートまたはＡＴＴＡ－脂質コンジュゲートのいずれかを含む。特定の実施形態では、ＰＥＧ－脂質コンジュゲートまたはＡＴＴＡ－脂質コンジュゲートは、ＣＰＬと一緒に使用される。粒子の凝集を阻害するコンジュゲート脂質は、例えば、ＰＥＧ－ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、ＰＥＧジアルキルオキシプロピル（ＤＡＡ）、ＰＥＧ－リン脂質、ＰＥＧ－セラミド（Ｃｅｒ）、またはそれらの混合物を含むＰＥＧ－脂質を含み得る。ＰＥＧ－ＤＡＡコンジュゲートは、ＰＥＧ－ジラウリルオキシプロピル（Ｃ１２）、ＰＥＧ－ジミリスチルオキシプロピル（Ｃ１４）、ＰＥＧ－ジパルミチルオキシプロピル（Ｃ１６）、ＰＥＧ－ジステアリルオキシプロピル（Ｃ１８）、またはそれらの混合物であり得る。
本発明での使用に適したさらなるＰＥＧ－脂質コンジュゲートには、ｍＰＥＧ２０００－１，２－ジ－Ｏ－アルキル－ｓｎ３－カルボモイルグリセリド（ＰＥＧ－Ｃ－ＤＯＭＧ）が含まれるが、これらに限定されない。ＰＥＧ－Ｃ－ＤＯＭＧの合成は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ０８／８８６７６号に記載されている。本発明での使用に適したなおさらなるＰＥＧ－脂質コンジュゲートには、限定されないが、１－［８’－（１，２－ジミリストイル－３－プロパノキシ）－カルボキサミド－３’，６’－ジオキサオクタニル］カルバモイル－ω－メチル－ポリ（エチレングリコール）（２ＫＰＥＧ－ＤＭＧ）が含まれる。２ＫＰＥＧ－ＤＭＧの合成は、米国特許第７，４０４，９６９号に記載されている。
いくつかの場合、粒子の凝集を阻害するコンジュゲート脂質（例えば、ＰＥＧ－脂質コンジュゲート）は、粒子に存在する全脂質の約０．１ｍｏｌ％～約２ｍｏｌ％、約０．５ｍｏｌ％～約２ｍｏｌ％、約１ｍｏｌ％～約２ｍｏｌ％、約０．６ｍｏｌ％～約１．９ｍｏｌ％、約０．７ｍｏｌ％～約１．８ｍｏｌ％、約０．８ｍｏｌ％～約１．７ｍｏｌ％、約１ｍｏｌ％～約１．８ｍｏｌ％、約１．２ｍｏｌ％～約１．８ｍｏｌ％、約１．２ｍｏｌ％～約１．７ｍｏｌ％、約１．３ｍｏｌ％～約１．６ｍｏｌ％、約１．４ｍｏｌ％～約１．５ｍｏｌ％、または約１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９もしくは２ｍｏｌ％（またはその任意の分率もしくは範囲）を構成し得る。典型的には、そのような場合、ＰＥＧ部分は約２，０００ダルトンの平均分子量を有する。他の場合では、粒子の凝集を阻害するコンジュゲート脂質（例えば、ＰＥＧ－脂質コンジュゲート）は、粒子に存在する全脂質の約５．０ｍｏｌ％～約１０ｍｏｌ％、約５ｍｏｌ％～約９ｍｏｌ％、約５ｍｏｌ％～約８ｍｏｌ％、約６ｍｏｌ％～約９ｍｏｌ％、約６ｍｏｌ％～約８ｍｏｌ％、または約５ｍｏｌ％、６ｍｏｌ％、７ｍｏｌ％、８ｍｏｌ％、９ｍｏｌ％、もしくは１０ｍｏｌ％（またはその任意の分率もしくは範囲）を構成し得る。典型的には、そのような場合、ＰＥＧ部分は約７５０ダルトンの平均分子量を有する。
他の実施形態では、組成物は、少なくとも１種の正電荷担体、および正電荷担体とは異なる少なくとも１種の負電荷担体を含有する両性リポソームを含み、リポソームの等電点は４～８である。この目的は、リポソームが、ｐＨ依存性の変化する電荷を用いて調製されるという事実によって達成される。
所望の特性を有するリポソーム構造は、例えば、膜形成または膜ベースのカチオン性電荷担体の量が、低ｐＨではアニオン性電荷担体の量を超え、より高いｐＨでは比が逆転する場合に形成される。これは、イオン化可能な成分が４～９のｐＫａ値を有する場合に常に当てはまる。媒体のｐＨが低下すると、すべてのカチオン性電荷担体がより多く帯電し、すべてのアニオン性電荷担体が電荷を失う。
両性リポソームに有用なカチオン性化合物としては、本明細書上記に以前に記載されたカチオン性化合物が挙げられる。限定されないが、強カチオン性化合物は、例えば、以下を含み得る：ＤＣ－Ｃｈｏｌ ３－β－［Ｎ－（Ｎ’，Ｎ’－ジメチルメタン）カルバモイル］コレステロール、ＴＣ－Ｃｈｏｌ ３－β－［Ｎ－（Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’－トリメチルアミノエタン）カルバモイルコレステロール、ＢＧＳＣビスグアニジニウム－スペルミジン－コレステロール、ＢＧＴＣビス－グアニジウム－トレン－コレステロール、ＤＯＴＡＰ（１，２－ジオレオイルオキシプロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド、ＤＯＳＰＥＲ（１，３－ジオレオイルオキシ－２－（６－カルボキシ－スペルミル）－プロピルアルニド、ＤＯＴＭＡ（１，２－ジオレオイルオキシプロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド）（ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標））、ＤＯＲＩＥ １，２－ジオレオイルオキシプロピル）－３－ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド、ＤＯＳＣ（１，２－ジオレオイル－３－スクシニル－ｓｎ－グリセリルコリンエステル）、ＤＯＧＳＤＳＯ（１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－スクシニル－２－ヒドロキシエチルジスルフィドオミチン）、ＤＤＡＢジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド、ＤＯＧＳ（（Ｃ１８）２ＧｌｙＳｐｅｒ３＋）Ｎ，Ｎ－ジオクタデシルアミド－グリコール－スペルミン（ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（登録商標））（Ｃ１８）２Ｇｌｙ＋Ｎ，Ｎ－ジオクタデシルアミド－グリシン、ＣＴＡＢセチルトリメチルアンモニウムブロミド、ＣｐｙＣセチルピリジニウムクロリド、ＤＯＥＰＣ １，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリンまたは他のＯ－アルキル－ホスファチジルコリンまたはエタノールアミン、リジン、アルギニンまたはオルニチンからのアミド、およびホスファチジルエタノールアミン。
弱カチオン性化合物の例としては、限定されないが、以下が挙げられる：Ｈｉｓ－Ｃｈｏｌ（ヒスタミニル－コレステロールヘミスクシネート）、Ｍｏ－Ｃｈｏｌ（モルホリン－Ｎ－エチルアミノ－コレステロールヘミスクシネート）、またはヒスチジニル－ＰＥ。
中性化合物の例としては、限定されないが、コレステロール、セラミド、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、テトラエーテル脂質、またはジアシルグリセロールが挙げられる。
両性リポソームに有用なアニオン性化合物には、本明細書に以前に記載された非カチオン性化合物が含まれる。限定されないが、弱アニオン性化合物の例としては、以下を挙げることができる：ＣＨＥＭＳ（コレステロールヘミスクシネート）、８～２５個の炭素原子を有するアルキルカルボン酸、またはジアシルグリセロールヘミスクシネート。さらなる弱アニオン性化合物は、アスパラギン酸またはグルタミン酸のアミド、ならびにＰＥおよびＰＳ、ならびにグリシン、アラニン、グルタミン、アスパラギン、セリン、システイン、トレオニン、チロシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、または他のアミノ酸もしくはアミノジカルボン酸とのそのアミドを含むことができる。同様の原理により、ヒドロキシカルボン酸またはヒドロキシジカルボン酸とＰＳとのエステルも弱アニオン性化合物である。
いくつかの実施形態では、両性リポソームは、本明細書に上記で記載されたものなどのコンジュゲート脂質を含有する。有用なコンジュゲート脂質の特定の例には、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミンおよびホスファチジン酸、ＰＥＧ－セラミドコンジュゲート（例えば、ＰＥＧ－ＣｅｒＣ１４またはＰＥＧ－ＣｅｒＣ２０）、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミンおよびＰＥＧ修飾１，２－ジアシルオキシプロパン－３－アミンが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの特定の例は、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロールおよびジアルキルグリセロールである。
いくつかの実施形態では、中性脂質は、粒子に存在する全脂質の約１０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％、約１５ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％、約２０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％、約２５ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％、約１０ｍｏｌ％～約５５ｍｏｌ％、約１５ｍｏｌ％～約５５ｍｏｌ％、約２０ｍｏｌ％～約５５ｍｏｌ％、約２５ｍｏｌ％～約５５ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％～約５５ｍｏｌ％、約１３ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％、約１５ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％または約２０ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％を構成する。
いくつかの場合では、粒子の凝集を阻害するコンジュゲート脂質（例えば、ＰＥＧ－脂質コンジュゲート）は、粒子に存在する全脂質の約０．１ｍｏｌ％～約２ｍｏｌ％、約０．５ｍｏｌ％～約２ｍｏｌ％、約１ｍｏｌ％～約２ｍｏｌ％、約０．６ｍｏｌ％～約１．９ｍｏｌ％、約０．７ｍｏｌ％～約１．８ｍｏｌ％、約０．８ｍｏｌ％～約１．７ｍｏｌ％、約１ｍｏｌ％～約１．８ｍｏｌ％、約１．２ｍｏｌ％～約１．８ｍｏｌ％、約１．２ｍｏｌ％～約１．７ｍｏｌ％、約１．３ｍｏｌ％～約１．６ｍｏｌ％、約１．４ｍｏｌ％～約１．５ｍｏｌ％、または約１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９もしくは２ｍｏｌ％（またはその任意の分率もしくは範囲）を構成する。典型的には、そのような場合、ＰＥＧ部分は約２，０００ダルトンの平均分子量を有する。他の場合では、粒子の凝集を阻害するコンジュゲート脂質（例えば、ＰＥＧ－脂質コンジュゲート）は、粒子に存在する全脂質の約５．０ｍｏｌ％～約１０ｍｏｌ％、約５ｍｏｌ％～約９ｍｏｌ％、約５ｍｏｌ％～約８ｍｏｌ％、約６ｍｏｌ％～約９ｍｏｌ％、約６ｍｏｌ％～約８ｍｏｌ％、または約５ｍｏｌ％、６ｍｏｌ％、７ｍｏｌ％、８ｍｏｌ％、９ｍｏｌ％、もしくは１０ｍｏｌ％（またはその任意の分率もしくは範囲）を構成し得る。典型的には、そのような場合、ＰＥＧ部分は約７５０ダルトンの平均分子量を有する。
中性脂質およびコンジュゲート脂質の総量を考慮すると、両性リポソームの残りの残部は、様々な比で製剤化されたカチオン性化合物とアニオン性化合物の混合物を含むことができる。カチオン性脂質のアニオン性脂質に対する比は、核酸封入、ゼータ電位、ｐＫａ、または荷電脂質成分の存在に少なくとも部分的に依存する他の物理化学的特性の所望の特性を達成するために選択され得る。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）などの真核細胞における送達および取り込みを特異的に増強する組成物を有する。特定の実施形態では、脂質ナノ粒子は、肝臓または特に肝細胞内での送達および取り込みを特異的に増強する組成物を有する。特定の実施形態では、脂質ナノ粒子は、神経細胞における送達および取り込みを特異的に増強する組成物を有する。
２．４ 組換えウイルスを産生するための方法
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載の方法で使用するための組換えウイルス（例えば、組換えＡＡＶ）を提供する。組換えＡＡＶは、典型的に、ＨＥＫ－２９３などの哺乳動物細胞株で産生される。ウイルスのｃａｐ遺伝子およびｒｅｐ遺伝子は、その自己複製を防止して送達される治療遺伝子（例えば、ヌクレアーゼ遺伝子）のための余地を作るためにベクターから除去されるので、これらをトランスでパッケージング細胞株に提供する必要がある。さらに、複製を支持するのに必要な「ヘルパー」（例えば、アデノウイルス）成分を提供する必要がある（Ｃｏｔｓら（２０１３）、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１３（５）：３７０－８１）。多くの場合、組換えＡＡＶは、「ヘルパー」成分をコードする第１のプラスミド、ｃａｐ遺伝子およびｒｅｐ遺伝子を含む第２のプラスミド、ならびにウイルスにパッケージングされる介在ＤＮＡ配列を含むウイルスＩＴＲを含む第３のプラスミドで細胞株をトランスフェクトするトリプルトランスフェクションを使用して産生される。次いで、キャプシドに包まれたゲノム（目的のＩＴＲおよび介在遺伝子）を含むウイルス粒子を、凍結融解サイクル、超音波処理、界面活性剤、または当技術分野で公知の他の手段によって細胞から単離する。次いで、粒子を塩化セシウム密度勾配遠心分離またはアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製し、続いて細胞、組織またはヒト患者などの生物に対する目的の遺伝子に送達する。
組換えＡＡＶは、典型的に細胞内で産生される（製造される）ため、本明細書に記載のＭＴＥＭまたは遺伝子操作メガヌクレアーゼがパッケージング細胞内で発現されないことを確実にするために、本発明を実施する際に注意を払わなければならない。本明細書に記載のウイルスゲノムはヌクレアーゼの認識配列を含み得るため、パッケージング細胞株で発現される任意のヌクレアーゼは、ウイルス粒子にパッケージングされ得る前にウイルスゲノムを切断することが可能であり得る。これは、パッケージング効率の低減および／または断片化ゲノムのパッケージングをもたらす。パッケージング細胞におけるヌクレアーゼ発現を防止するために、いくつかのアプローチを使用することができる。
本明細書に記載のＭＴＥＭまたは遺伝子操作メガヌクレアーゼは、本明細書に記載のＭＴＥＭまたは遺伝子操作メガヌクレアーゼの発現に適した任意のプロモータの制御下に置くことができる。いくつかの実施形態では、プロモータは構成的プロモータであるか、またはプロモータは、組織特異的プロモータ、例えば、例えば幹細胞特異的プロモータ、ＣＤ３４＋ＨＳＣ特異的プロモータ、筋肉特異的プロモータ、骨格筋特異的プロモータ、筋管特異的プロモータ、筋サテライト細胞特異的プロモータ、ニューロン特異的プロモータ、アストロサイト特異的プロモータ、ミクログリア特異的プロモータ、眼細胞特異的プロモータ、網膜細胞特異的プロモータ、網膜神経節細胞特異的プロモータ、網膜色素上皮特異的プロモータ、膵細胞特異的プロモータ、膵ベータ細胞特異的プロモータ、腎細胞特異的プロモータ、骨髄細胞特異的プロモータ、または耳有毛細胞特異的プロモータである。いくつかの実施形態では、遍在性プロモータは、ＣＭＶプロモータ、ＣＡＧプロモータ、ＥＦ１アルファプロモータまたはＵｂＣプロモータである。
特定の実施形態では、本明細書に記載のＭＴＥＭまたは遺伝子操作メガヌクレアーゼは、パッケージング細胞において活性ではない組織特異的プロモータの制御下に置くことができる。例えば、筋肉組織へのヌクレアーゼ遺伝子の送達のためにウイルスベクターを開発する場合、筋肉特異的プロモータを使用することができる。筋肉特異的プロモータの例には、Ｃ５－１２（Ｌｉｕら（２００４）Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１５：７８３－９２）、筋肉特異的クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモータ（Ｙｕａｓａら（２００２）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．９：１５７６－８８）、または平滑筋２２（ＳＭ２２）プロモータ（Ｈａａｓｅら（２０１３）ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３：４９－５４）が含まれる。ＣＮＳ（ニューロン）特異的プロモータの例としては、ＮＳＥ、シナプシンおよびＭｅＣＰ２プロモータ（Ｌｅｎｔｚら（２０１２）Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ Ｄｉｓ．４８：１７９－８８）が挙げられる。肝臓特異的プロモータの例としては、アルブミンプロモータ（Ｐａｌｂなど）、ヒトα１－アンチトリプシン（Ｐａ１ＡＴなど）、およびヘモペキシン（Ｐｈｐｘなど）（Ｋｒａｍｅｒら、（２００３）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ ７：３７５－８５）、ハイブリッド肝臓特異的プロモータ（ＡｐｏＥ遺伝子由来の肝臓遺伝子座制御領域（ＡｐｏＥ－ＨＣＲ）、および肝臓特異的アルファ１－アンチトリプシンプロモータ）、ヒトチロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモータおよびアポリポタンパク質Ａ－ＩＩプロモータが挙げられる。眼特異的プロモータの例としては、オプシン、および角膜上皮特異的Ｋ１２プロモータ（Ｍａｒｔｉｎら（２００２）Ｍｅｔｈｏｄｓ（２８）：２６７－７５）（Ｔｏｎｇら、（２００７）Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ、９：９５６－６６）が挙げられる。これらのプロモータ、または当技術分野で公知の他の組織特異的プロモータは、ＨＥＫ－２９３細胞において高度に活性ではなく、したがって本発明のウイルスベクターに組み込まれた場合、パッケージング細胞において有意なレベルのヌクレアーゼ遺伝子発現を生じることは予想されない。同様に、本発明のウイルスベクターは、適合しない組織特異的プロモータの使用を伴う他の細胞株の使用（すなわち、周知のＨｅＬａ細胞株（ヒト上皮細胞）および肝臓特異的ヘモペキシンプロモータの使用）を企図する。組織特異的プロモータの他の例としては、滑膜肉腫ＰＤＺＤ４（小脳）、Ｃ６（肝臓）、ＡＳＢ５（筋肉）、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｂ（心臓）、ＳＬＣ５Ａ１２（腎臓）、コレステロール調節ＡＰＯＭ（肝臓）、ＡＤＰＲＨＬ１（心臓）、および一遺伝子性奇形症候群ＴＰ７３Ｌ（筋肉）が挙げられる。（Ｊａｃｏｘら（２０１０）、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ｖ．５（８）：ｅ１２２７４）。
あるいは、組換えウイルスは、ヌクレアーゼが発現される可能性が低い異なる種由来の細胞にパッケージングすることができる。例えば、ウイルス粒子は、非哺乳動物パッケージング細胞では活性ではない周知のサイトメガロウイルスまたはＳＶ４０ウイルス初期プロモータなどの哺乳動物プロモータを使用して、微生物、昆虫または植物細胞で産生され得る。特定の実施形態では、ウイルス粒子は、Ｇａｏら（Ｇａｏら（２００７）、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３１（２）：１３８－４３）によって記載されているバキュロウイルス系を使用して昆虫細胞中で産生される。哺乳動物プロモータの制御下にあるヌクレアーゼは、これらの細胞で発現される可能性は低い（Ａｉｒｅｎｎｅら（２０１３）、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２１（４）：７３９－４９）。さらに、昆虫細胞は、哺乳動物細胞とは異なるｍＲＮＡスプライシングモチーフを利用する。したがって、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）イントロンまたはＳＶ４０ラージＴ抗原イントロンなどの哺乳動物イントロンをヌクレアーゼのコード配列に組み込むことが可能である。これらのイントロンは、昆虫細胞内のプレｍＲＮＡ転写物から効率的にスプライシングされないため、昆虫細胞は機能的ヌクレアーゼを発現せず、全長ゲノムをパッケージングする。対照的に、得られた組換えＡＡＶ粒子が送達される哺乳動物細胞は、プレｍＲＮＡを適切にスプライシングし、機能的ヌクレアーゼタンパク質を発現する。Ｈａｉｆｅｎｇ Ｃｈｅｎは、昆虫パッケージング細胞における毒性タンパク質バルナーゼおよびジフテリア毒素フラグメントＡの発現を減弱させるためのＨＧＨおよびＳＶ４０ラージＴ抗原イントロンの使用を報告しており、これらの毒素遺伝子を有する組換えＡＡＶベクターの産生を可能にしている（Ｃｈｅｎ，Ｈ（２０１２）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．１（１１）：ｅ５７）。
本明細書に記載のＭＴＥＭまたは遺伝子操作メガヌクレアーゼ遺伝子は、小分子誘導物質がヌクレアーゼ発現に必要とされるように、誘導可能なプロモータに作動可能に連結され得る。誘導性プロモータの例としては、Ｔｅｔ－Ｏｎシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ；Ｃｈｅｎら（２０１５）、ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５（１）：４））およびＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈシステム（Ｉｎｔｒｅｘｏｎ；Ｓｏｗａら（２０１１）、Ｓｐｉｎｅ、３６（１０）：Ｅ６２３－８）が挙げられる。両方のシステム、ならびに当技術分野で公知の同様のシステムは、小分子活性化因子（それぞれドキシサイクリンまたはエクジソン）に応答して転写を活性化するリガンド誘導性転写因子（それぞれＴｅｔリプレッサーおよびエクジソン受容体のバリアント）に依存する。そのようなリガンド誘導性転写活性化因子を使用して本発明を実施することには、以下が含まれる：１）ヌクレアーゼ遺伝子を対応する転写因子に応答するプロモータの制御下に置くことであって、ヌクレアーゼ遺伝子が（ａ）転写因子に対する結合部位を有する、制御下に置くこと、および２）転写因子をコードする遺伝子をパッケージングされたウイルスゲノムに含めること。転写活性化因子も同じ細胞に提供されない場合、組換えＡＡＶ送達後にヌクレアーゼが標的細胞または組織で発現されないため、後者の工程が必要である。次いで、転写活性化因子は、同族小分子活性化因子で処理された細胞または組織においてのみヌクレアーゼ遺伝子発現を誘導する。このアプローチは、小分子誘導物質がいつどの組織に送達されるかを選択することにより、ヌクレアーゼ遺伝子発現を空間時間的に調節することを可能にするため、有利である。しかし、運搬能力が著しく制限されているウイルスゲノムに誘導物質を含める必要性は、このアプローチに欠点をもたらす。
別の特定の実施形態では、組換えＡＡＶは、ヌクレアーゼの発現を妨げる転写リプレッサーを発現する哺乳動物細胞株で産生される。転写リプレッサーは当技術分野で公知であり、Ｔｅｔリプレッサー、Ｌａｃリプレッサー、Ｃｒｏリプレッサーおよびラムダリプレッサーが挙げられる。エクジソン受容体などの多くの核ホルモン受容体は、それらの同族ホルモンリガンドの非存在下で転写リプレッサーとしても作用する。本発明を実施するために、パッケージング細胞は、転写リプレッサーをコードするベクターでトランスフェクト／形質導入され、ウイルスゲノム中のヌクレアーゼ遺伝子（パッケージングベクター）は、リプレッサーがプロモータをサイレンシングするように、リプレッサーに対する結合部位を含むように修飾されたプロモータに作動可能に連結される。転写リプレッサーをコードする遺伝子は、様々な位置に配置することができる。これは、別個のベクトル上でコードすることができるか、ＩＴＲ配列の外側のパッケージングベクターに組み込むことができるか、ｃａｐ／ｒｅｐベクターまたはアデノウイルスヘルパーベクターに組み込むことができるか、または構成的に発現されるようにパッケージング細胞のゲノムに安定に組み込むことができる。転写リプレッサー部位を組み込むように一般的な哺乳動物プロモータを修飾する方法は、当技術分野で公知である。例えば、ＣｈａｎｇおよびＲｏｎｉｎｓｏｎは、強力な構成的ＣＭＶおよびＲＳＶプロモータを、Ｌａｃリプレッサーのオペレーターを含むように修飾し、修飾されたプロモータからの遺伝子発現がリプレッサーを発現する細胞において大きく減弱したことを示した（ＣｈａｎｇおよびＲｏｎｉｎｓｏｎ（１９９６）、Ｇｅｎｅ １８３：１３７－４２）。非ヒト転写リプレッサーの使用は、ヌクレアーゼ遺伝子の転写が、リプレッサーを発現するパッケージング細胞においてのみ抑制され、得られた組換えＡＡＶで形質導入された標的細胞または組織では抑制されないことを確実にする。
２．５ 遺伝子修飾細胞を産生するための方法
本発明は、ヒトｍｔＤＮＡなどのｍｔＤＮＡ内に見出される認識配列に結合して切断する、本明細書に記載のＭＴＥＭまたは遺伝子操作メガヌクレアーゼを使用して、インビトロとインビボの両方で遺伝子修飾細胞を産生するための方法を提供する。そのような認識配列での切断は、切断部位でのＮＨＥＪ、相同組換えによる外因性配列の挿入、またはｍｔＤＮＡの分解を可能にし得る。
本発明は、本明細書に記載のＭＴＥＭもしくは遺伝子操作メガヌクレアーゼ、または本明細書に記載のＭＴＥＭもしくは遺伝子操作メガヌクレアーゼをコードする核酸を、真核細胞（例えば、ヒト細胞）などの細胞に送達（すなわち、導入）することができることを含む。
本明細書に記載のＭＴＥＭもしくは遺伝子操作メガヌクレアーゼは、タンパク質の形態で、または好ましくは本明細書に記載のＭＴＥＭもしくは遺伝子操作メガヌクレアーゼをコードする核酸として細胞に送達され得る。そのような核酸は、ＤＮＡ（例えば、環状もしくは線状化プラスミドＤＮＡまたはＰＣＲ産物）あるいはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）であり得る。したがって、本明細書に記載のＭＴＥＭまたは遺伝子操作メガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドが本明細書で提供される。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドはｍＲＮＡである。本明細書に記載のＭＴＥＭまたは遺伝子操作メガヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドは、プロモータに作動可能に連結することができる。特定の実施形態では、本明細書に記載のＭＴＥＭまたは遺伝子操作メガヌクレアーゼをコードする核酸配列を有するポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモータを含む発現カセットが提供される。
ＭＴＥＭまたは遺伝子操作メガヌクレアーゼをコードする配列がＤＮＡ形態で送達される実施形態の場合、ＭＴＥＭまたは遺伝子操作メガヌクレアーゼをコードする配列の転写を促進するためにプロモータに作動可能に連結されるべきである。本発明に適した哺乳動物プロモータには、サイトメガロウイルス初期（ＣＭＶ）プロモータ（Ｔｈｏｍｓｅｎら（１９８４）、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、８１（３）：６５９－６３）、ＳＶ４０初期プロモータ（ＢｅｎｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ（１９８１）、Ｎａｔｕｒｅ．２９０（５８０４）：３０４－１０）、ＣＡＧプロモータ、ＥＦ１アルファプロモータ、またはＵｂＣプロモータなどの構成的プロモータ、ならびにテトラサイクリン誘導性プロモータ（Ｄｉｎｇｅｒｍａｎｎら（１９９２）、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２（９）：４０３８－４５）などの誘導性プロモータが含まれる。本明細書に記載のＭＴＥＭまたは遺伝子操作メガヌクレアーゼはまた、合成プロモータに作動可能に連結され得る。合成プロモータとしては、限定されないが、ＪｅＴプロモータ（国際公開第２００２／０１２５１４号）を挙げることができる。特定の実施形態では、本明細書に記載のＭＴＥＭまたは遺伝子操作メガヌクレアーゼをコードする核酸配列は、筋細胞特異的プロモータ、骨格筋特異的プロモータ、筋管特異的プロモータ、筋サテライト細胞特異的プロモータ、ニューロン特異的プロモータ、アストロサイト特異的プロモータ、ミクログリア特異的プロモータ、眼細胞特異的プロモータ、網膜細胞特異的プロモータ、網膜神経節細胞特異的プロモータ、網膜色素上皮特異的プロモータ、膵細胞特異的プロモータ、または膵ベータ細胞特異的プロモータなどの組織特異的プロモータに作動可能に連結される。
特定の実施形態では、ＭＴＥＭまたは遺伝子操作メガヌクレアーゼをコードする核酸配列は、組換えＤＮＡ構築物または発現カセット上に送達される。例えば、組換えＤＮＡ構築物は、プロモータおよび本明細書に記載のＭＴＥＭまたは遺伝子操作メガヌクレアーゼをコードする核酸配列を有するポリヌクレオチドを含む発現カセット（すなわち、「カセット」）を含むことができる。本明細書で提供されるポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡまたはＤＮＡであり得る。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、選択可能マーカーをコードする配列をさらに含む。選択可能マーカーは、本明細書に記載のポリヌクレオチドを含有する細胞または生物（例えば、細菌、真核細胞、哺乳動物細胞、植物細胞、植物および／または植物部分）の選択を可能にする任意のマーカーであり得る。特定の実施形態では、選択可能マーカーは抗生物質耐性遺伝子である。
いくつかの実施形態では、ＭＥＴＭをコードするｍＲＮＡが細胞に送達されるが、これは、これにより本明細書に記載のＭＴＥＭまたは遺伝子操作メガヌクレアーゼをコードする遺伝子が細胞のゲノムに組み込まれる可能性が低減するためである。
ＭＥＴＭをコードするそのようなｍＲＮＡは、インビトロ転写などの当技術分野で公知の方法を使用して産生され得る。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、７－メチル－グアノシン、アンチリバースキャップアナログ（ＡＲＣＡ）（米国特許第７，０７４，５９６号）、ＣＬＥＡＮＣＡＰ（登録商標）アナログ、例えばＣａｐ １アナログ（Ｔｒｉｌｉｎｋ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して５´キャップされるか、またはワクシニアキャッピング酵素などを使用して酵素的にキャップされる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡはポリアデニル化され得る。ｍＲＮＡは、本明細書に記載のコードされたＭＴＥＭもしくは遺伝子操作メガヌクレアーゼの発現および／またはｍＲＮＡ自体の安定性を増強するために、様々な５´および３´非翻訳配列要素を含み得る。そのような要素には、例えば、ウッドチャック肝炎ウイルス翻訳後調節要素などの翻訳後調節要素が含まれ得る。ｍＲＮＡは、シュードウリジン、５－メチルシチジン、Ｎ６－メチルアデノシン、５－メチルウリジンまたは２－チオウリジンなどのヌクレオシドアナログまたは天然に存在するヌクレオシドを含み得る。さらなるヌクレオシドアナログとしては、例えば、米国特許第８，２７８，０３６号に記載されているものが挙げられる。
本明細書に記載される精製ＭＴＥＭまたは遺伝子操作メガヌクレアーゼは、本明細書でさらに詳述されるものを含む、当技術分野で公知の様々な異なる機構によって細胞に送達されてミトコンドリアＤＮＡを切断することができる。
別の特定の実施形態では、本明細書に記載のＭＴＥＭまたは遺伝子操作メガヌクレアーゼをコードする核酸は、一本鎖ＤＮＡ鋳型を使用して細胞に導入される。一本鎖ＤＮＡは、本明細書に記載のＭＴＥＭまたは遺伝子操作メガヌクレアーゼをコードする配列の上流および／または下流に５’および／または３’ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）をさらに含むことができる。一本鎖ＤＮＡは、本明細書に記載のＭＴＥＭまたは遺伝子操作メガヌクレアーゼをコードする配列の上流および／または下流に５’および／または３’相同性アームをさらに含むことができる。
別の特定の実施形態では、本明細書に記載のＭＴＥＭまたは遺伝子操作メガヌクレアーゼをコードする遺伝子は、線状化ＤＮＡ鋳型を使用して細胞に導入される。そのような線状化ＤＮＡ鋳型は、当技術分野で公知の方法によって産生することができる。例えば、ヌクレアーゼをコードするプラスミドＤＮＡは、環状プラスミドＤＮＡが細胞に導入される前に線状化されるように、１つ以上の制限酵素によって消化することができる。
本明細書に記載の精製ＭＴＥＭもしくは遺伝子操作メガヌクレアーゼ、または本明細書に記載のＭＴＥＭもしくは遺伝子操作メガヌクレアーゼをコードする核酸は、本明細書で以下にさらに詳述するものを含む、当技術分野で公知の様々な異なる機構によって細胞に送達されてミトコンドリアＤＮＡを切断することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＭＴＥＭもしくは遺伝子操作メガヌクレアーゼ、本明細書に記載のＭＴＥＭもしくは遺伝子操作メガヌクレアーゼをコードするＤＮＡ／ｍＲＮＡ、または本明細書に記載のＭＴＥＭもしくは遺伝子操作メガヌクレアーゼを発現する細胞は、公知の技術に従い、薬学的に許容される担体中で全身投与または標的組織への投与のために製剤化される。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（２１ｓｔ ｅｄ．、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ、２００５）を参照されたい。本発明による医薬製剤の製造において、タンパク質／ＲＮＡ／ｍＲＮＡ／細胞は、典型的に薬学的に許容される担体と混和される。担体は、当然ながら、製剤中の任意の他の成分と適合性であるという意味で許容されなければならず、患者に有害であってはならない。担体は、固体もしくは液体、またはその両方であり得、単位用量製剤として化合物と共に製剤化され得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＭＴＥＭもしくは遺伝子操作メガヌクレアーゼ、または本明細書に記載のＭＴＥＭもしくは遺伝子操作メガヌクレアーゼをコードするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、細胞取り込みを促進するために、細胞透過性ペプチドまたは標的化リガンドに結合される。当技術分野で公知の細胞透過性ペプチドの例としては、ポリアルギニン（Ｊｅａｒａｗｉｒｉｙａｐａｉｓａｒｎら（２００８）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．１６：１６２４－９）、ＨＩＶウイルス由来のＴＡＴペプチド（Ｈｕｄｅｃｚら（２００５）、Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．２５：６７９－７３６）、ＭＰＧ（Ｓｉｍｅｏｎｉら（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：２７１７－２７２４）、Ｐｅｐ－１（Ｄｅｓｈａｙｅｓら（２００４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４３：７６９８－７７０６、およびＨＳＶ－１ ＶＰ－２２（Ｄｅｓｈａｙｅｓら（２００５）Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．６２：１８３９－４９が挙げられる。代替的な実施形態では、本明細書に記載のＭＴＥＭもしくは遺伝子操作メガヌクレアーゼ、または本明細書に記載のＭＴＥＭもしくは遺伝子操作メガヌクレアーゼをコードするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、ＭＴＥＭタンパク質／ＤＮＡ／ｍＲＮＡが標的細胞に結合してそれによって内在化されるように、標的細胞上に発現される特定の細胞表面受容体を認識する抗体に共有結合または非共有結合される。あるいは、ＭＴＥＭタンパク質／ＤＮＡ／ｍＲＮＡは、そのような細胞表面受容体の天然リガンド（または天然リガンドの一部）に共有結合または非共有結合され得る（ＭｃＣａｌｌら（２０１４）Ｔｉｓｓｕｅ Ｂａｒｒｉｅｒｓ．２（４）：ｅ９４４４４９；Ｄｉｎｄａら（２０１３）Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：１２６４－７４；Ｋａｎｇら（２０１４）Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５（３）：２２０－３０；Ｑｉａｎら（２０１４）Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ Ｔｏｘｉｃｏｌ．１０（１１）：１４９１－５０８）。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＭＴＥＭもしくは遺伝子操作メガヌクレアーゼ、または本明細書に記載のＭＴＥＭもしくは遺伝子操作メガヌクレアーゼをコードするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、生分解性ヒドロゲル内に封入される。ヒドロゲルは、頻繁な注射を必要とせずに標的組織の所望の領域への治療ペイロードの持続的かつ調整可能な放出を提供することができ、刺激応答性物質（例えば、温度およびｐＨ応答性ヒドロゲル）は、環境的または外部から加えられた合図に応答してペイロードを放出するように設計することができる（Ｋａｎｇ Ｄｅｒｗｅｎｔら（２００８）Ｔｒａｎｓ Ａｍ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｓｏｃ．１０６：２０６－２１４）。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＭＴＥＭもしくは遺伝子操作メガヌクレアーゼ、または本明細書に記載のＭＴＥＭもしくは遺伝子操作メガヌクレアーゼをコードするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、当技術分野で公知の方法を使用してナノ粒子に共有結合もしくは好ましくは非共有結合されるか、またはそのようなナノ粒子内に封入される（Ｓｈａｒｍａら（２０１４）Ｂｉｏｍｅｄ Ｒｅｓ Ｉｎｔ．２０１４）。ナノ粒子は、長さスケールが＜１μｍ、好ましくは＜１００ｎｍであるナノスケール送達系である。そのようなナノ粒子は、金属、脂質、ポリマー、または生物学的高分子から構成されたコアを使用して設計することができ、複数コピーのヌクレアーゼタンパク質、ｍＲＮＡ、またはＤＮＡをナノ粒子コアに付着させるか、またはそれによって封入することができる。これは、各細胞に送達されるタンパク質／ｍＲＮＡ／ＤＮＡのコピー数を増加させ、したがって標的認識配列が切断される可能性を最大にするために、本明細書に記載の各ＭＴＥＭまたは遺伝子操作メガヌクレアーゼの細胞内発現を増加させる。そのようなナノ粒子の表面は、ポリマーまたは脂質（例えば、キトサン、カチオン性ポリマーまたはカチオン性脂質）でさらに修飾されて、その表面が細胞送達およびペイロードの取り込みを増強するための追加の機能性を付与するコア－シェルナノ粒子を形成し得る（Ｊｉａｎら（２０１２）Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．３３（３０）：７６２１－３０）。ナノ粒子はさらに、ナノ粒子を適切な細胞型に向けるためにおよび／または細胞取り込みの可能性を高めるために、標的化分子に有利に結合され得る。そのような標的化分子の例としては、細胞表面受容体に特異的な抗体および細胞表面受容体の天然リガンド（または天然リガンドの一部）が挙げられる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＭＴＥＭもしくは遺伝子操作メガヌクレアーゼ、または本明細書に記載のＭＴＥＭもしくは遺伝子操作メガヌクレアーゼをコードするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、リポソーム内に封入されるか、またはカチオン性脂質（例えば、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ；Ｚｕｒｉｓら（２０１５）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３３：７３－８０；Ｍｉｓｈｒａら（２０１１）Ｊ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．２０１１：８６３７３４を参照されたい）を使用して複合体化される。リポソームおよびリポプレックス製剤は、ペイロードを分解から保護し、標的部位での蓄積および保持を増強し、標的細胞の細胞膜との融合および／またはその破壊を通じて細胞取り込みおよび送達効率を促進することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＭＴＥＭもしくは遺伝子操作メガヌクレアーゼ、または本明細書に記載のＭＴＥＭもしくは遺伝子操作メガヌクレアーゼをコードするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、ポリマースキャフォールド（例えば、ＰＬＧＡ）内に封入されるか、またはカチオン性ポリマー（例えば、ＰＥＩ、ＰＬＬ）を使用して複合体化される（Ｔａｍｂｏｌｉら（２０１１）Ｔｈｅｒ Ｄｅｌｉｖ．２（４）：５２３－５３６）。ポリマー担体は、ポリマー侵食および薬物拡散の制御によって調整可能な薬物放出速度を提供するように設計することができ、高い薬物封入効率は、所望の標的細胞集団への細胞内送達まで治療ペイロードの保護を提供することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＭＴＥＭもしくは遺伝子操作メガヌクレアーゼ、または本明細書に記載のｎＭＴＥＭもしくは遺伝子操作メガヌクレアーゼをコードするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、ミセルに自己集合する両親媒性分子（Ｔｏｎｇら（２００７）Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．９（１１）：９５６－６６）と組み合わされる。ポリマーミセルは、凝集を防止し、電荷相互作用をマスクし、非特異的相互作用を低減することができる親水性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール）で形成されたミセルシェルを含み得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＭＴＥＭもしくは遺伝子操作メガヌクレアーゼ、または本明細書に記載のＭＴＥＭもしくは遺伝子操作メガヌクレアーゼをコードするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、標的細胞への投与および／または送達のために、エマルジョンまたはナノエマルジョン（すなわち、＜１ｎｍの平均粒径を有する）に製剤化される。「エマルジョン」という用語は、限定されないが、水非混和性相が水相と混合された場合に、無極性残基（例えば、長い炭化水素鎖）を水から遠ざけ、極性頭部基を水に向ける疎水力の結果として形成することができる脂質構造を含む、任意の水中油型、油中水型、水中油中水型、または油中水中油型の分散液または液滴を指す。これらの他の脂質構造には、単層、少層、および多層の脂質小胞、ミセル、およびラメラ相が含まれるが、これらに限定されない。エマルジョンは、水相および親油性相（典型的に油および有機溶媒を含有する）から構成される。エマルジョンはまた、１種以上の界面活性剤を含むことが多い。ナノエマルジョン製剤は、例えば、米国特許第６，０１５，８３２号、同第６，５０６，８０３号、同第６，６３５，６７６号、同第６，５５９，１８９号および同第７，７６７，２１６号に記載されるように周知であり、これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＭＴＥＭもしくは遺伝子操作メガヌクレアーゼ、または本明細書に記載のＭＴＥＭもしくは遺伝子操作メガヌクレアーゼをコードするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、多官能性ポリマーコンジュゲート、ＤＮＡデンドリマー、およびポリマーデンドリマーに共有結合または非共有結合される（Ｍａｓｔｏｒａｋｏｓら（２０１５）Ｎａｎｏｓｃａｌｅ．７（９）：３８４５－５６；Ｃｈｅｎｇら（２００８）Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．９７（１）：１２３－４３）。デンドリマー生成により、ペイロード容量およびサイズを制御することができ、高いペイロード容量を提供することができる。さらに、複数の表面基の提示を利用して安定性を改善し、非特異的相互作用を低減させ、細胞特異的標的化および薬物放出を増強することができる。
いくつかの実施形態では、ＭＴＥＭをコードする核酸配列を有するポリヌクレオチドは、組換えウイルスを使用して細胞に導入される。そのような組換えウイルスは当技術分野で公知であり、組換えレトロウイルス、組換えレンチウイルス、組換えアデノウイルスおよび組換えＡＡＶが含まれる（Ｖａｎｎｕｃｃｉら（２０１３ Ｎｅｗ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３６：１－２２で考察されている）。本発明で有用な組換えＡＡＶは、標的細胞型へのウイルスの形質導入および標的細胞によるＭＴＥＭの発現を可能にする任意のキャプシドまたは血清型を有することができる。例えば、いくつかの実施形態では、組換えＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、またはＡＡＶＨＳＣの血清型を有する。いくつかの実施形態では、組換えウイルスは標的組織に直接注入される。代替的な実施形態では、組換えウイルスは、循環系を介して全身送達される。異なるＡＡＶが異なる組織に局在化する傾向があり、特定の組織への優先的送達のために適切なＡＡＶキャプシド／血清型を選択することができることは当技術分野で公知である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ血清型はＡＡＶ９である。ＡＡＶはまた、宿主細胞において第２鎖ＤＮＡ合成を必要としないように、自己相補的であり得る（ＭｃＣａｒｔｙら（２００１）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．８：１２４８－５４）。組換えＡＡＶによって送達される核酸は、左（５’）および右（３’）逆方向末端反復を含み得る。
一実施形態では、本明細書に記載のＭＴＥＭまたは遺伝子操作メガヌクレアーゼをコードする核酸配列を有するポリヌクレオチドの送達に使用される組換えウイルスは、自己制限組換えウイルスである。自己制限組換えウイルスは、ベクター内に遺伝子操作メガヌクレアーゼの認識配列が存在するため、細胞または生物において限られた持続時間を有することができる。したがって、自己制限組換えウイルスは、プロモータ、本明細書に記載のＭＴＥＭまたは遺伝子操作メガヌクレアーゼ、およびＩＴＲ内のメガヌクレアーゼ認識部位をコードするように遺伝子操作することができる。自己制限組換えウイルスは、本明細書に記載のＭＴＥＭまたは遺伝子操作メガヌクレアーゼが発現され、ゲノム内の内因性認識配列で細胞のゲノムを切断することができるように、メガヌクレアーゼ遺伝子を細胞、組織、または生物に送達する。送達されたメガヌクレアーゼはまた、自己制限組換えウイルス自体の中にその標的部位を見出し、この標的部位でベクターを切断する。切断されると、ウイルスゲノムの５´および３´末端が露出され、エキソヌクレアーゼによって分解され、したがってウイルスを死滅させ、本明細書に記載のＭＴＥＭまたは遺伝子操作メガヌクレアーゼの産生を停止させる。
本明細書に記載のＭＴＥＭまたは遺伝子操作メガヌクレアーゼをコードする核酸配列を有するポリヌクレオチドがＤＮＡ形態（例えば、プラスミド）で、および／またはウイルスベクター（例えばＡＡＶ）を介して送達される場合、それらはプロモータに作動可能に連結されなければならない。いくつかの実施形態では、これは、ウイルスベクター由来の内因性プロモータ（例えば、レンチウイルスベクターのＬＴＲ）、または本明細書の他の箇所に記載されている構成的もしくは組織特異的プロモータなどのウイルスプロモータであり得る。特定の実施形態では、本明細書に記載のＭＴＥＭまたは遺伝子操作メガヌクレアーゼをコードする核酸配列を有するポリヌクレオチドは、ニューロン、グリア細胞（例えば、アストロサイトまたはオリゴデンドロサイト）、筋細胞（例えば、骨格筋細胞、心筋細胞または平滑筋細胞）などの標的細胞において遺伝子発現を優先的に駆動するプロモータに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、標的細胞は、筋細胞、骨格筋細胞、筋管細胞、筋サテライト細胞、ニューロン、アストロサイト、ミクログリア細胞、眼細胞、網膜細胞、網膜神経節細胞、網膜色素上皮細胞、膵臓細胞、もしくは膵臓ベータ細胞であるか、または前記標的細胞の集団は、筋細胞、骨格筋細胞、筋管細胞、筋サテライト細胞、ニューロン、アストロサイト、ミクログリア細胞、眼細胞、網膜細胞、網膜神経節細胞、網膜色素上皮細胞、膵臓細胞、もしくは膵臓ベータ細胞の集団であるか、または標的細胞の集団は、筋細胞、骨格筋細胞、筋管細胞、筋サテライト細胞、ニューロン、アストロサイト、ミクログリア細胞、眼細胞、網膜細胞、網膜神経節細胞、網膜色素上皮細胞、膵臓細胞もしくは膵臓ベータ細胞の集団であるか、または前記標的細胞の集団は、筋細胞、骨格筋細胞、筋管細胞、筋サテライト細胞、ニューロン、アストロサイト、ミクログリア細胞、眼細胞、網膜細胞、網膜神経節細胞、網膜色素上皮細胞、膵臓細胞もしくは膵臓ベータ細胞の集団である。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチド、例えば本明細書で上述された遺伝子操作メガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを真核細胞または真核細胞集団に導入することにより、遺伝子修飾真核細胞または遺伝子修飾真核細胞集団を産生するための方法が本明細書で提供される。真核細胞または真核細胞集団で発現すると、遺伝子操作メガヌクレアーゼはミトコンドリアに局在化し、ミトコンドリアゲノム内の認識配列に結合し、切断部位を生成する。遺伝子操作メガヌクレアーゼによって生成された切断部位は、切断部位での核酸の挿入または欠失をもたらし得るＮＨＥＪ修復経路によって修復され得る。追加的または代替的に、真核細胞または真核細胞集団のミトコンドリアゲノム内の遺伝子操作メガヌクレアーゼによって生成された切断部位は、代替非相同末端結合（Ａｌｔ－ＮＨＥＪ）またはマイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）によって修復され得る。ＮＨＥＪまたはＡｌｔ－ＮＨＥＪ／ＭＭＥＪは、切断部位での核酸の挿入および／または欠失をもたらし得る。特に、ＮＨＥＪまたはＡｌｔ－ＮＨＥＪ／ＭＭＥＪは、切断部位に１～１０００（例えば、１～１０、１０～１００、１００～２００、２００～３００、３００～４００、４００～５００、５００～６００、６００～７００、７００～８０、８００～９００または９００～１０００）ヌクレオチド、例えば約１、５、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、６７５、７００、７２５、７５０、７７５、８００、８２５、８５０、８７５、９００、９２５、９５０、９７５または１０００ヌクレオチドの挿入および／または欠失をもたらし得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の遺伝子修飾真核細胞または本明細書に記載の遺伝子修飾真核細胞集団でミトコンドリアゲノムを分解することができる。いくつかのこのような実施形態では、認識配列を含むミトコンドリアゲノムのパーセンテージは、対照細胞と比較して約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％減少するか、または約３０～４０％、４０～５０％、５０～６０％、６０～７０％、７０～８０％、８０～９０％、９０～１００％もしくはそれ以上減少してもよい。
特定の実施形態では、配列番号１の認識配列を含む変異型ミトコンドリアゲノムが分解される。配列番号１の認識配列を有する変異型ミトコンドリアゲノムを分解することにより、野生型ミトコンドリアゲノムの変異型ミトコンドリアゲノムに対する全体的な比は、本明細書に記載のＭＴＥＭまたは遺伝子操作メガヌクレアーゼの投与または発現後に増加する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の単一の遺伝子修飾真核細胞または遺伝子修飾真核細胞の集団における野生型の変異型ミトコンドリアゲノムに対する比は、約５：９５、約１０：９０、約１５：８５、約２０：８０、約２５：７５、約３０：７０、約３５：６５、約４０：６０、約４５：５５、約５０：５０、約５５：４５、約６０：４０、約６５：３５、約７０：３０、約７５：２５、約８０：２０、約８５：１５、約９０：１０、約９５：５、約２０：１、約５０：１、約１００：１、約１５０：１、約２００：１、約２５０：１、約３００：１、約３５０：１、約４００：１、約４５０：１、約５００：１、約５５０：１、約６００：１、約６５０：１、約７００：１、約７５０：１、約８００：１、約８５０：１、約９００：１、約９５０：１、約１０００：１またはそれ以上まで増加する。
特定の実施形態では、本明細書に記載の単一の遺伝子修飾真核細胞または本明細書に記載の遺伝子修飾真核細胞の集団における野生型ゲノムのパーセンテージは、配列番号１を含む変異型ミトコンドリアゲノムが本明細書に記載のＭＴＥＭまたは遺伝子操作メガヌクレアーゼによって認識され、切断され、分解されるにつれて増加し得る。本明細書に記載の遺伝子修飾真核細胞または遺伝子修飾細胞集団における野生型ミトコンドリアゲノムのパーセンテージは、本明細書に記載のＭＴＥＭまたは遺伝子操作メガヌクレアーゼを発現しない真核細胞または真核細胞集団と比較した場合、遺伝子修飾真核細胞または遺伝子修飾細胞集団における全ミトコンドリアゲノムの約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、またはそれ以上であり得る。同様に、遺伝子修飾真核細胞または遺伝子修飾細胞集団における配列番号１の認識配列を含む変異型ミトコンドリアゲノムのパーセンテージは、本明細書に記載のＭＴＥＭまたは遺伝子操作メガヌクレアーゼを発現しない真核細胞または真核細胞集団と比較した場合、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％またはそれ以上減少し得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の遺伝子修飾真核細胞または遺伝子修飾真核細胞集団におけるミトコンドリア呼吸は、本明細書に記載のＭＴＥＭまたは遺伝子操作メガヌクレアーゼを発現しない真核細胞と比較した場合、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約１００％、またはそれ以上増加し得る。本明細書に記載の遺伝子修飾真核細胞または遺伝子修飾真核細胞集団におけるミトコンドリア呼吸は、本明細書に記載のＭＴＥＭまたは遺伝子操作メガヌクレアーゼを発現しない真核細胞または真核細胞集団と比較した場合、約３０～４０％、４０～５０％、５０～６０％、６０～７０％、７０～８０％、８０～９０％、９０～１００％、またはそれ以上増加し得る。
ある特定の場合では、認識配列は、ミトコンドリア障害に関連するミトコンドリアゲノムの領域内にある。例えば、認識配列は、ミトコンドリア脳筋症、乳酸アシドーシス、および脳卒中様エピソード（ＭＥＬＡＳ））に関連するミトコンドリアゲノムの領域内であり得る ｍｔＤＮＡ遺伝子ＭＴ－ＴＬ１における変異は、症例の約８０％においてＭＥＬＡＳに関連する。ＭＥＬＡＳ症例の８０％超が、ｔＲＮＡ－ＬｅｕにおけるＡ３２４３Ｇ点変異によって引き起こされる。ＭＴ－ＴＱ、ＭＴ－ＴＨ、ＭＴ－ＴＫ、ＭＴ－ＴＳ１、ＭＴ－ＮＤ１、ＭＴ－ＮＤ５、ＭＴ－ＮＤ６、およびＭＴ－ＴＳ２の変異もＭＥＬＡＳ症候群に関連している。ＭＥＬＡＳ症候群のいくつかの症例は、ミトコンドリア遺伝子における新たな自然変異の結果として起こるように思われ、遺伝しない（Ｓｕｅら、Ｊ Ｐｅｄｉａｔｒ １３４：６９６－７００（１９９９）；Ｓｉｎｇｈら、Ｉｎｄｉａｎ Ｊ Ｐｅｄｉａｔｒ ６６：６２１－６２５（１９９９）；Ｄｅｓｃｈａｕｅｒら、Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ Ｄｉｓｏｒｄ、９：３０５－３０７（１９９９））。ＭＥＬＡＳは、小児期、通常は２歳～１５歳で始まり、主に神経系および筋肉に影響を及ぼす。最も一般的な初期症状は、発作、反復性頭痛、食欲不振および反復性嘔吐である。身体の片側に一時的な筋力低下を伴う脳卒中様エピソード（半身麻痺）も起こり得、これは意識の変化、視力および聴力損失、運動技能の損失および知的障害をもたらし得る。ＭＥＬＡＳはｍｔＤＮＡの変異によって引き起こされる。
正常ｍｔＤＮＡと変異型ｍｔＤＮＡの両方が同じ細胞に存在してもよく、これはヘテロプラスミーとして公知の状況である。欠損ミトコンドリアの数は、正常ミトコンドリアの数よりも多くてもよい。変異がｍｔＤＮＡの有意な割合に影響を及ぼすまで、症状は所与の世代では現れない可能性がある。異なる組織における正常および変異型ｍｔＤＮＡの不均一な分布は、同じ家族のメンバーにおける異なる器官に影響を及ぼし得る。これは、罹患した家族のメンバーに様々な症状をもたらし得る。
特定の実施形態では、真核細胞または真核細胞集団のミトコンドリアゲノムにおける本明細書に記載の認識配列は、ミトコンドリアゲノムのヌクレオチド３０００～３５００に位置する。特定の実施形態では、本明細書に記載のＭＴＥＭまたは遺伝子操作メガヌクレアーゼは、ミトコンドリアゲノムのＡ３２４３Ｇ変異を標的化する。本明細書で使用される「ＭＥＬＡＳ変異」は、野生型ゲノムのＡが位置３２４３の変異型ミトコンドリアゲノムにおけるＧで置き換えられている、ミトコンドリアゲノムのＡ３２４３Ｇ変異を指す。特定の実施形態では、配列番号１の認識配列は、変異型ミトコンドリアゲノム上にのみ位置する。遺伝子修飾真核細胞または遺伝子修飾真核細胞集団で発現すると、ＭＴＥＭまたは遺伝子操作メガヌクレアーゼはミトコンドリアに局在化し、ミトコンドリアゲノム内の認識配列に結合し、切断部位を生成することができる。したがって、変異型ゲノム上にのみ位置する認識配列を標的化することにより、ゲノムを切断し、続いて分解することができる。変異型ミトコンドリアゲノムのこの特異的分解は、ＭＥＬＡＳの症状の処置または緩和を助けるために使用することができる。
したがって、本明細書に記載のＭＴＥＭもしくは遺伝子操作メガヌクレアーゼをコードする核酸配列またはＭＴＥＭもしくは遺伝子操作メガヌクレアーゼを含むポリヌクレオチドを標的細胞または集団に送達することにより、標的細胞または標的細胞の集団で変異型ミトコンドリアゲノムを分解するための方法が本明細書に提供される。特定の実施形態では、標的細胞または標的細胞の集団は、ＭＥＬＡＳ変異（すなわち、Ａ３２４３Ｇ変異）を有する変異型ミトコンドリアゲノムを含み、ＭＴＥＭまたは遺伝子操作メガヌクレアーゼは、配列番号１の認識配列を認識して切断する。標的細胞または標的細胞集団は、ヒト対象などの哺乳動物対象中にあってもよい。いくつかの実施形態では、標的細胞は、筋細胞、骨格筋細胞、筋管細胞、筋サテライト細胞、ニューロン、アストロサイト、ミクログリア細胞、眼細胞、網膜細胞、網膜神経節細胞、網膜色素上皮細胞、膵臓細胞、もしくは膵臓ベータ細胞であるか、または前記標的細胞の集団は、筋細胞、骨格筋細胞、筋管細胞、筋サテライト細胞、ニューロン、アストロサイト、ミクログリア細胞、眼細胞、網膜細胞、網膜神経節細胞、網膜色素上皮細胞、膵臓細胞、もしくは膵臓ベータ細胞の集団であるか、または標的細胞の集団は、筋細胞、骨格筋細胞、筋管細胞、筋サテライト細胞、ニューロン、アストロサイト、ミクログリア細胞、眼細胞、網膜細胞、網膜神経節細胞、網膜色素上皮細胞、膵臓細胞もしくは膵臓ベータ細胞の集団であるか、または前記標的細胞の集団は、筋細胞、骨格筋細胞、筋管細胞、筋サテライト細胞、ニューロン、アストロサイト、ミクログリア細胞、眼細胞、網膜細胞、網膜神経節細胞、網膜色素上皮細胞、膵臓細胞もしくは膵臓ベータ細胞の集団である。
対象のＭＥＬＡＳ障害に関連する状態を処置する方法は、本明細書に記載されている。そのような方法は、治療有効量のＭＴＥＭもしくは遺伝子操作メガヌクレアーゼをコードする核酸配列を有するポリヌクレオチド、または治療有効量の本明細書に記載のＭＴＥＭもしくは遺伝子操作メガヌクレアーゼを対象に投与することを含み、ＭＴＥＭもしくは遺伝子操作メガヌクレアーゼは、ＭＥＬＡＳ変異を有する変異型ミトコンドリアゲノム中の配列番号１の認識配列の切断部位を作り出す。変異型ミトコンドリアゲノムで作り出された切断部位は、変異型ミトコンドリアゲノムの分解をもたらし得る。特定の実施形態では、処置することは、ＭＥＬＡＳの少なくとも１つの症状を低減または緩和することを含む。ＭＥＬＡＳの症状には、発作、反復性頭痛、食欲不振、反復性嘔吐、身体の片側に一時的な筋力低下を伴う脳卒中様エピソード（半身麻痺）、意識の変化、視力および聴力損失、運動技能の損失、ならびに知的障害が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、対象のＭＥＬＡＳに関連する状態を処置する方法は、本明細書に記載の医薬組成物の投与を含む。
いくつかの実施形態では、対象は、ＭＴＥＭまたは遺伝子操作メガヌクレアーゼをコードする核酸の約１ｘ１０１０ｇｃ／ｋｇ～約１ｘ１０１４ｇｃ／ｋｇ（例えば、１ｘ１０１０ｇｃ／ｋｇ、１ｘ１０１１ｇｃ／ｋｇ、１ｘ１０１２ｇｃ／ｋｇ、１ｘ１０１３ｇｃ／ｋｇ、または１ｘ１０１４ｇｃ／ｋｇ）の用量で本明細書に記載の医薬組成物を投与される。いくつかの実施形態では、対象は、ＭＴＥＭまたは遺伝子操作メガヌクレアーゼをコードする核酸の少なくとも約１×１０１０ｇｃ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１１ｇｃ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１２ｇｃ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１３ｇｃ／ｋｇ、または少なくとも約１×１０１４ｇｃ／ｋｇの用量で医薬組成物を投与される。いくつかの実施形態では、対象は、ＭＴＥＭまたは遺伝子操作メガヌクレアーゼをコードする核酸の約１×１０１０ｇｃ／ｋｇ～約１×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約１×１０１１ｇｃ／ｋｇ～約１×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約１×１０１２ｇｃ／ｋｇ～約１×１０１３ｇｃ／ｋｇ、または約１×１０１３ｇｃ／ｋｇ～約１×１０１４ｇｃ／ｋｇの用量で医薬組成物を投与される。特定の実施形態では、対象は、ＭＴＥＭまたは遺伝子操作メガヌクレアーゼをコードする核酸の約１ｘ１０１２ｇｃ／ｋｇ～約９ｘ１０１３ｇｃ／ｋｇ（例えば、約１ｘ１０１２ｇｃ／ｋｇ、約２ｘ１０１２ｇｃ／ｋｇ、約３ｘ１０１２ｇｃ／ｋｇ、約４ｘ１０１２ｇｃ／ｋｇ、約５ｘ１０１２ｇｃ／ｋｇ、約６ｘ１０１２ｇｃ／ｋｇ、約７ｘ１０１２ｇｃ／ｋｇ、約８ｘ１０１２ｇｃ／ｋｇ、約９ｘ１０１２ｇｃ／ｋｇ、約１ｘ１０１３ｇｃ／ｋｇ、約２ｘ１０１３ｇｃ／ｋｇ、約３ｘ１０１３ｇｃ／ｋｇ、約４ｘ１０１３ｇｃ／ｋｇ、約５ｘ１０１３ｇｃ／ｋｇ、約６ｘ１０１３ｇｃ／ｋｇ、約７ｘ１０１３ｇｃ／ｋｇ、約８ｘ１０１３ｇｃ／ｋｇ、または約９ｘ１０１３ｇｃ／ｋｇ）の用量で医薬組成物を投与される。
いくつかの実施形態では、対象は、ＭＴＥＭまたは遺伝子操作メガヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡの約０．１ｍｇ／ｋｇ～約３ｍｇ／ｋｇの用量で脂質ナノ粒子製剤を投与される。いくつかの実施実施形態では、対象は、ＭＴＥＭまたは遺伝子操作メガヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡの少なくとも約０．１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．２５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．７５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１．０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１．５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約２．０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約２．５ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも約３．０ｍｇ／ｋｇの用量で脂質ナノ粒子製剤を投与される。いくつかの実施形態では、対象は、ＭＴＥＭまたは遺伝子操作メガヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡの約０．１ｍｇ／ｋｇ～約０．２５ｍｇ／ｋｇ、約０．２５ｍｇ／ｋｇ～約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ～約０．７５ｍｇ／ｋｇ、約０．７５ｍｇ／ｋｇ～約１．０ｍｇ／ｋｇ、約１．０ｍｇ／ｋｇ～約１．５ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ～約２．０ｍｇ／ｋｇ、約２．０ｍｇ／ｋｇ～約２．５ｍｇ／ｋｇ、または約２．５ｍｇ／ｋｇ～約３．０ｍｇ／ｋｇの用量で脂質ナノ粒子製剤を投与される。
本明細書に記載のＭＴＥＭもしくは遺伝子操作メガヌクレアーゼ、または本明細書に記載のＭＴＥＭもしくは遺伝子操作メガヌクレアーゼをコードする核酸の送達のための標的組織には、限定されないが、筋肉組織、脳組織、中枢神経系組織、膵臓組織、または眼／網膜組織が含まれる。いくつかの実施形態では、送達のための標的細胞は、筋細胞、骨格筋細胞、筋管細胞、筋サテライト細胞、ニューロン、アストロサイト、ミクログリア細胞、眼細胞、網膜細胞、網膜神経節細胞、網膜色素上皮細胞、膵臓細胞もしくは膵臓ベータ細胞であるか、または前記標的細胞の集団は、筋細胞、骨格筋細胞、筋管細胞、筋サテライト細胞、ニューロン、アストロサイト、ミクログリア細胞、眼細胞、網膜細胞、網膜神経節細胞、網膜色素上皮細胞、膵臓細胞もしくは膵臓ベータ細胞の集団であるか、または標的細胞の集団は、筋細胞、骨格筋細胞、筋管細胞、筋サテライト細胞、ニューロン、アストロサイト、ミクログリア細胞、眼細胞、網膜細胞、網膜神経節細胞、網膜色素上皮細胞、膵臓細胞もしくは膵臓ベータ細胞の集団であるか、または前記標的細胞の集団は、筋細胞、骨格筋細胞、筋管細胞、筋サテライト細胞、ニューロン、アストロサイト、ミクログリア細胞、眼細胞、網膜細胞、網膜神経節細胞、網膜色素上皮細胞、膵臓細胞もしくは膵臓ベータ細胞の集団である。
本明細書に記載の方法の様々な実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のＭＴＥＭまたは遺伝子操作メガヌクレアーゼ、本明細書に記載のそのようなＭＴＥＭまたは遺伝子操作メガヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、または本明細書に記載のそのようなＭＴＥＭまたは遺伝子操作メガヌクレアーゼをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含む組換えウイルスは、本明細書に記載のように、当技術分野で公知の任意の適切な投与経路を介して投与することができる。したがって、本明細書に記載の１つ以上のＭＴＥＭまたは遺伝子操作メガヌクレアーゼ、本明細書に記載のそのようなＭＴＥＭまたは遺伝子操作メガヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、または本明細書に記載のそのようなＭＴＥＭまたは遺伝子操作メガヌクレアーゼをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含む組換えウイルスは、本明細書に記載のように、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、肝臓内、経粘膜、経皮、動脈内、および舌下を含む投与経路によって投与され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＭＴＥＭもしくは遺伝子操作メガヌクレアーゼ、または本明細書に記載のｍＲＮＡもしくはＤＮＡベクターＭＴＥＭもしくは遺伝子操作メガヌクレアーゼは、標的組織への直接注射を介して標的細胞（例えば、神経細胞、筋細胞、膵臓細胞、眼球細胞など）に供給される。いくつかの実施形態では、真核細胞は、幹細胞、ＣＤ３４＋ＨＳＣ、筋細胞、骨格筋細胞、筋管細胞、筋サテライト細胞、ニューロン、アストロサイト、ミクログリア細胞、眼細胞、網膜細胞、網膜神経節細胞、網膜色素上皮細胞、膵臓細胞、膵臓ベータ細胞、腎臓細胞、骨髄細胞、または耳有毛細胞である。いくつかの実施形態では、症状は、筋肉、脳、中枢神経系、膵臓、または網膜の状態である。いくつかの実施形態では、状態は、ミトコンドリア脳筋症、乳酸アシドーシス、および脳卒中様エピソード（ＭＥＬＡＳ）、進行性外眼筋麻痺、母性遺伝性糖尿病、片頭痛、または眼筋ミオパチーである。
本明細書に記載のＭＴＥＭもしくは遺伝子操作メガヌクレアーゼ、本明細書に記載のそのようなＭＴＥＭもしくは遺伝子操作メガヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、またはそのような遺伝子操作ヌクレアーゼをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含む組換えウイルスの他の適切な投与経路は、必要に応じて処置医によって容易に決定され得る。
いくつかの実施形態では、治療有効量の本明細書に記載のＭＴＥＭまたは遺伝子操作メガヌクレアーゼは、それを必要とする対象に投与される。必要に応じて、ＭＴＥＭまたは遺伝子操作メガヌクレアーゼの投与量または投薬頻度は、投与する医師の判断に基づき、処置の過程にわたって調整され得る。適切な用量は、他の要因の中でも、選択される任意のＡＡＶの詳細（例えば、血清型など）、投与経路、処置される対象（すなわち、対象の年齢、体重、性別および全身状態）、ならびに投与様式に依存する。したがって、適切な投与量は患者によって異なり得る。適切な有効量は、当業者によって容易に決定され得る。投薬処置は、単回用量スケジュールまたは複数回用量スケジュールであり得る。さらに、対象は、適切なだけ多くの用量を投与されてもよい。当業者は、適切な用量数を容易に決定することができる。投与量は、代替的な投与経路を考慮に入れるか、または任意の副作用に対する治療上の利益のバランスをとるように調整する必要があり得る。
本明細書に記載の外因性核酸分子は、以前に考察された手段のいずれかによって細胞に導入および／または対象に送達され得る。特定の実施形態では、外因性核酸分子は、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、または組換えＡＡＶなどの組換えウイルスによって導入される。外因性核酸分子を導入するのに有用な組換えＡＡＶは、本明細書で前述した血清型／キャプシドを含む、ウイルスの細胞への形質導入、および外因性核酸分子配列の細胞ゲノムへの挿入を可能にする任意の血清型を有することができる。組換えＡＡＶはまた、宿主細胞において第２鎖ＤＮＡ合成を必要としないように自己相補的であり得る。組換えＡＡＶを使用して導入された外因性核酸分子は、５’（左）および３’（右）逆方向末端反復に隣接することができる。
別の特定の実施形態では、外因性核酸分子は、一本鎖ＤＮＡ鋳型を使用して細胞に導入することができる。一本鎖ＤＮＡは、外因性核酸分子を含むことができ、特定の実施形態では、相同組換えによってヌクレアーゼ切断部位への核酸配列の挿入を促進するために５’および３’相同性アームを含むことができる。一本鎖ＤＮＡは、５’相同性アームの５’上流に５’ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列、および３’相同性アームの３’下流に３’ＡＡＶ ＩＴＲ配列をさらに含むことができる。
別の特定の実施形態では、本明細書に記載のＭＴＥＭまたは遺伝子操作メガヌクレアーゼおよび／または本明細書に記載の外因性核酸分子をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドは、線状化ＤＮＡ鋳型によるトランスフェクションによって細胞に導入することができる。本明細書に記載のＭＴＥＭまたは遺伝子操作メガヌクレアーゼおよび／または外因性核酸分子をコードするプラスミドＤＮＡは、例えば、環状プラスミドＤＮＡが細胞へのトランスフェクションの前に線状化されるように、１種以上の制限酵素によって消化することができる。
細胞に送達される場合、本明細書に記載の外因性核酸は、以前に考察された哺乳動物プロモータおよび誘導性プロモータを含む、細胞におけるコードされたポリペプチドの発現に適した任意のプロモータに作動可能に連結され得る。本明細書に記載の外因性核酸はまた、合成プロモータに作動可能に連結され得る。合成プロモータとしては、限定されないが、ＪｅＴプロモータ（国際公開第２００２／０１２５１４号）を挙げることができる。
２．６ バリアント
本発明は、本明細書に記載のポリペプチドおよびポリヌクレオチド配列のバリアントを包含する。
本明細書で使用される場合、「バリアント」は、実質的に類似の配列を意味することを意図する。「バリアント」ポリペプチドは、天然タンパク質の１つ以上の内部部位での１つ以上のアミノ酸の欠失もしくは付加、および／または天然ポリペプチドの１つ以上の部位での１つ以上のアミノ酸の置換によって「天然」ポリペプチドに由来するポリペプチドを意味することを意図する。本明細書で使用される場合、「天然」ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、バリアントが由来する親配列を含む。実施形態によって包含されるバリアントポリペプチドは、生物学的に活性である。すなわち、それらは天然タンパク質の所望の生物学的活性、例えば、ＭＩＴ ２５－２６認識配列（配列番号１）などのｍｔＤＮＡ（例えば、ヒトｍｔＤＮＡ）に見出される認識配列に結合して切断する能力を保持し続ける。そのようなバリアントは、例えば、ヒトの操作から生じ得る。いくつかの実施形態では、実施形態の天然ポリペプチドの生物学的に活性なバリアント（例えば、配列番号３～１２のいずれか１つ）、または本明細書に記載の認識半部位結合サブユニットの生物学的に活性なバリアントは、本明細書の他の箇所に記載されている配列アラインメントプログラムおよびパラメータによって決定される天然ポリペプチド、天然サブユニット、天然ＨＶＲ１、または天然ＨＶＲ２のアミノ酸配列に対して少なくとも約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。実施形態のポリペプチドまたはサブユニットの生物学的に活性なバリアントは、わずか約１～４０アミノ酸残基、わずか約１～２０、わずか約１～１０、わずか約５、わずか４、３、２、またはさらには１アミノ酸残基だけ、そのポリペプチドまたはサブユニットと異なり得る。
実施形態のポリペプチドは、アミノ酸の置換、欠失、切断および挿入を含む様々な方法で改変され得る。そのような操作のための方法は、当技術分野で一般に公知である。例えば、アミノ酸配列バリアントは、ＤＮＡ中の変異によって調製することができる。変異誘発およびポリヌクレオチド改変のための方法は、当技術分野で周知である。例えば、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：４８８－４９２；Ｋｕｎｋｅｌら（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７－３８２；米国特許第４，８７３，１９２号；ＷａｌｋｅｒおよびＧａａｓｔｒａ編．（１９８３）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｃＭｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）およびそこに引用されている参考文献を参照されたい。目的のタンパク質の生物学的活性に影響を及ぼさない適切なアミノ酸置換に関する指針は、参照により本明細書に組み込まれるＤａｙｈｏｆｆら（１９７８）Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）のモデルに見出すことができる。１つのアミノ酸を類似の特性を有する別のアミノ酸と交換するなどの保存的置換が最適であり得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の遺伝子操作メガヌクレアーゼは、本明細書に記載のＨＶＲ１およびＨＶＲ２領域のバリアントを含み得る。親ＨＶＲ領域は、例えば、例示される遺伝子操作メガヌクレアーゼの残基２４～７９または残基２１５～２７０を含み得る。したがって、バリアントＨＶＲは、バリアントＨＶＲ領域が遺伝子操作メガヌクレアーゼの生物学的活性（すなわち、認識配列への結合および切断）を維持するように、本明細書に例示される遺伝子操作メガヌクレアーゼの残基２４～７９または残基２１５～２７０に対応するアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。さらに、本明細書に記載のいくつかの実施形態では、バリアントＨＶＲ１領域またはバリアントＨＶＲ２領域は、親ＨＶＲ内の特定の位置に見出されるアミノ酸残基に対応する残基を含むことができる。この文脈において、「に対応する」は、バリアントＨＶＲ中のアミノ酸残基が、同じ相対位置において（すなわち、親配列中の残りのアミノ酸に関して）において親ＨＶＲ配列中に存在する同じアミノ酸残基（すなわち、別個の同一の残基）であることを意味する。例として、親ＨＶＲ配列が位置２６にセリン残基を含む場合、残基２６に「対応する残基を含む」バリアントＨＶＲも、親位置２６に対して相対的な（すなわち、対応する）位置にセリンを含む。
特定の実施形態では、本明細書に記載の遺伝子操作メガヌクレアーゼは、配列番号３～１２のいずれか１つの残基２１５～２７０に対応するアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するＨＶＲ１を含む。
特定の実施形態では、本明細書に記載の遺伝子操作メガヌクレアーゼは、配列番号３～１２のいずれか１つの残基２４～７９に対応するアミノ酸配列に対して８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するＨＶＲ２を含む。
野生型Ｉ－ＣｒｅＩメガヌクレアーゼのＤＮＡ認識ドメインに対する実質的な数のアミノ酸修飾が以前に同定されており（例えば、米国特許第８，０２１，８６７号）、これは単独でまたは組み合わせて、得られる合理的に設計されたメガヌクレアーゼが野生型酵素とは異なる半部位特異性を有するように、ＤＮＡ認識配列半部位内の個々の塩基で特異性が改変された遺伝子操作メガヌクレアーゼをもたらす。表２は、認識半部位の各半部位位置（－１から－９）に存在する塩基に基づいて特異性を増強するために、遺伝子操作メガヌクレアーゼモノマーまたはサブユニットにおいて行われ得る潜在的置換を提供する。そのような置換は、本明細書に記載のメガヌクレアーゼのバリアントに組み込まれる。
Figure 2024514939000002
太字の項目は野生型接触残基であり、本明細書で使用される「修飾」を構成しない。アスタリスクは、残基がアンチセンス鎖上の塩基と接触することを示す。
ＤＮＡ結合親和性および／または活性をモジュレートするために、遺伝子操作メガヌクレアーゼモノマーまたはサブユニットにおいて特定の修飾を行うことができる。例えば、本明細書に記載の遺伝子操作メガヌクレアーゼモノマーまたはサブユニットは、Ｉ－ＣｒｅＩもしくは配列番号３～１２のいずれか１つの１９位に対応する残基にＧ、Ｓ、もしくはＡ（国際公開第２００９００１１５９号）、Ｉ－ＣｒｅＩもしくは配列番号３～１２のいずれか１つの６６位に対応する残基にＹ、Ｒ、Ｋ、もしくはＤ、および／またはＩ－ＣｒｅＩもしくは配列番号３～１２のいずれか１つの８０位に対応する残基にＥ、Ｑ、もしくはＫ（米国特許第８０２１８６７号）を含み得る。
ポリヌクレオチドの場合、「バリアント」は、天然ポリヌクレオチド内の１つ以上の部位における１つ以上のヌクレオチドの欠失および／または付加を含む。当業者は、実施形態の核酸のバリアントが、オープンリーディングフレームが維持されるように構築されることを認識する。ポリヌクレオチドの場合、保存的バリアントは、遺伝暗号の縮重のために、実施形態のポリペプチドの１つのアミノ酸配列をコードする配列を含む。バリアントポリヌクレオチドには、例えば部位特異的変異誘発を使用することによって生成されるが、依然として遺伝子操作メガヌクレアーゼまたは外因性核酸分子または実施形態の鋳型核酸をコードするものなどの合成由来ポリヌクレオチドが含まれる。一般に、実施形態の特定のポリヌクレオチドのバリアントは、本明細書の他の箇所に記載される配列アラインメントプログラムおよびパラメータによって決定される場合、その特定のポリヌクレオチドに対して少なくとも約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％またはそれ以上の配列同一性を有する。実施形態の特定のポリヌクレオチド（すなわち、参照ポリヌクレオチド）のバリアントもまた、バリアントポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと参照ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドとの間のパーセント配列同一性の比較によって評価することができる。
本明細書に包含されるタンパク質配列の欠失、挿入および置換は、ポリペプチドの特徴に根本的な変化をもたらすとは予想されない。しかし、そうする前に置換、欠失または挿入の正確な効果を予測することが困難である場合、当業者は、ＭＩＴ ２５－２６認識配列（配列番号１）などのヒトｍｔＤＮＡ内に見出される認識配列に優先的に結合して切断するその能力についてポリペプチドをスクリーニングすることにより、効果が評価されることを理解する。
表３は、本明細書に開示される配列の概要である。
Figure 2024514939000003
Figure 2024514939000004
Figure 2024514939000005
Figure 2024514939000006
Figure 2024514939000007
Figure 2024514939000008
Figure 2024514939000009
Figure 2024514939000010
Figure 2024514939000011
Figure 2024514939000012
Figure 2024514939000013
本開示は、以下の実施例によってさらに説明されるが、これらは限定として解釈されるべきではない。当業者は、日常的な実験のみを使用して、本明細書に記載の特定の物質および手順に対する多数の等価物を認識するか、または確認することができる。そのような等価物は、以下の実施例に続く特許請求の範囲に包含されることが意図される。
実施例１．ＭＩＴ ２５－２６ヌクレアーゼ活性のレポーターアッセイ
この実験の目的は、様々なＭＩＴ ２５－２６メガヌクレアーゼが哺乳動物細胞中のヒトＭＩＴ ２５－２６認識配列に結合して切断することができるかどうかを決定し、様々なＭＩＴ ２５－２６メガヌクレアーゼが野生型対立遺伝子を識別することができるかどうかを決定することであった。これを行うために、遺伝子操作メガヌクレアーゼを、以前に記載されたＣＨＯ細胞レポーターアッセイ（国際公開第２０１２／１６７１９２号を参照されたい）を使用して評価した。アッセイを行うために、細胞のゲノムに組み込まれた非機能性緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子発現カセットを有する２つのＣＨＯ細胞レポーター株を産生した。各細胞株のＧＦＰ遺伝子は、遺伝子操作メガヌクレアーゼによるいずれかの認識配列の細胞内切断が相同組換え事象を刺激して機能的ＧＦＰ遺伝子をもたらすように、一対の認識配列によって分離された直接配列重複を含む。
この研究のために開発されたＣＨＯレポーター細胞株では、２つの認識配列をＧＦＰ遺伝子に挿入した。１つの認識配列は、ヒトＭＩＴ ２５－２６認識配列（１塩基のみ異なる変異型配列または野生型配列のいずれか）に対するものであった。細胞株番号１（変異型）は変異型対立遺伝子を含有し、細胞株番号２（野生型）は野生型対立遺伝子を含有した。両方の株に挿入された第２の認識配列はＣＨＯ－２３／２４認識配列であり、これは「ＣＨＯ－２３／２４」と呼ばれる対照遺伝子操作メガヌクレアーゼによって認識および切断される。ＣＨＯ－２３／２４認識配列は、陽性対照および標準的な活性尺度として使用される。
上に詳述したＣＨＯレポーター細胞に、様々なＭＩＴ ２５－２６ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡをトランスフェクトした。ＣＨＯレポーター細胞の対照試料を、ＣＨＯ－２３／２４メガヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡでトランスフェクトした。各アッセイにおいて、５ｅ４ ＣＨＯレポーター細胞を、製造者の説明書に従ってＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）ＭＥＳＳＥＮＧＥＲＭＡＸ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して、９６ウェルプレートにおいて２．５ｎｇ（低用量）のｍＲＮＡでトランスフェクトした。トランスフェクトされたＣＨＯ細胞をトランスフェクションの２日後にイメージサイトメトリーによって評価して、トランスフェクトされていない陰性対照と比較したＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージを決定した。変異レポーター細胞株で低用量のｍＲＮＡをトランスフェクトした細胞も、５日目および７日目にイメージサイトメトリーによって評価した。各時点で得られたデータを、ＣＨＯ－２３／２４メガヌクレアーゼを使用して観察されたＧＦＰ陽性細胞％に対して正規化して「活性スコア」を決定し、最も早い時点からの正規化データを最も遅い時点のものから差し引いて「毒性スコア」を決定した。次いで、活性および毒性スコアを一緒に加算して「活性指数」を決定し、次いでこれをＣＨＯ－２３／２４メガヌクレアーゼの活性指数に対して正規化して細胞株間のデータを比較した（「正規化活性指数」）。これを野生型細胞株と変異型細胞株の両方について行い、変異型配列に対するヌクレアーゼの特異性を決定した。
ヌクレアーゼ最適化の後、同じレポーター細胞株にＭＩＴ ２５－２６遺伝子操作メガヌクレアーゼをトランスフェクトした。以下を除いて同じトランスフェクションおよび評価プロトコルに従った：変異型細胞株に９０ｎｇ（高用量）または２．５ｎｇ（低用量）のｍＲＮＡをトランスフェクトし、野生型細胞株に９０ｎｇの用量のみをトランスフェクトした。
試験した様々なＭＩＴ ２５－２６操作メガヌクレアーゼは、変異レポーター株のＭＩＴ ２５－２６認識配列に結合して切断することができた（図１）。さらに、遺伝子操作メガヌクレアーゼのいずれも野生型レポーター株に結合して切断することができず、変異型配列に対する高レベルの特異性を示した。さらに、最適化されたＭＩＴ ２５－２６ヌクレアーゼ（ＭＩＴ ２５－２６Ｌ．３５）は、特により高いｍＲＮＡ用量で野生型配列に対するさらなる識別を示す（図２）。
これらの研究は、本明細書に記載の遺伝子操作ＭＩＴ ２５－２６メガヌクレアーゼが、細胞内のそれらのヒト認識配列（例えば、ＭＩＴ ２５－２６）に効率的かつ選択的に結合して切断することができることを実証した。
実施例２．ＦｌｐＩｎ ＣＨＯ細胞株におけるＭＩＴ ２５－２６メガヌクレアーゼの評価
この実験の目的は、インビトロモデルにおいて、（１）変異型標的部位に対する活性、および（２）対応する野生型配列に対する特異性について、いくつかのＭＩＴ ２５－２６メガヌクレアーゼを評価することであった。これは、核染色体上に組み込まれたヒトミトコンドリアゲノムの一部を含む２つのＦｌｐＩｎ ＣＨＯ細胞株を使用して行った。組み込まれた配列は、野生型または変異型ＭＩＴ ２５－２６結合部位のいずれか、および周囲のｍｔＤＮＡ配列を含む。目的は、野生型配列を切断せずに高効率で変異型配列を切断することができる遺伝子操作メガヌクレアーゼを生成することであるため、変異型結合部位と野生型結合部位は１つのヌクレオチドのみが異なり、したがってメガヌクレアーゼ特異性が最も重要である。特異性および効力を、各部位での挿入／欠失（インデル）形成を計算することによって液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）によって評価した。
図３に示される実験において比較された遺伝子操作メガヌクレアーゼは、以下の通りであった：ＭＩＴ ２５－２６ｘ．２９、ＭＩＴ ２５－２６ｘ．３７、ＭＩＴ ２５－２６ｘ．４８、ＭＩＴ ２５－２６ｘ．７３、およびＭＩＴ ２５－２６ｘ．９１。図４に示される実験において比較された遺伝子操作メガヌクレアーゼは、ＭＩＴ ２５－２６ｘ．９１およびＭＩＴ ２５－２６Ｌ．３５メガヌクレアーゼであった。
ＦｌｐＩｎ ＣＨＯ株は、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＦｌｐ－Ｉｎ（商標）システムを使用して作製した。組み込みカセットは、ＭＩＴ ２５－２６変異型配列または野生型配列のいずれか、および周囲のｍｔＤＮＡ配列を含んでいた。様々なＭＩＴ ２５－２６メガヌクレアーゼの特異性および効力を比較するために、６ｅ５ ＦｌｐＩｎ ＣＨＯ細胞を、５００ｎｇまたは５ｎｇのいずれかのＭＩＴ ２５－２６メガヌクレアーゼｍＲＮＡ用量のＬｏｎｚａ ４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）（ＳＦ緩衝液、条件ＥＮ－１３８）を使用してヌクレオフェクトした。ｇＤＮＡ抽出のためにヌクレオフェクションの２日後に細胞を収集し、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＣｙｔｏＦｌｅｘ Ｓサイトメーターを使用してトランスフェクション効率について評価した。トランスフェクション効率は、両方の細胞株で９５％を超えた。Ｍａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｂｌｏｏｄ ＱｕｉｃｋＰｕｒｅキットを使用してｇＤＮＡを単離した。
液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を利用して、結合部位を取り囲むアンプリコンを生成するためにＰ１／Ｐ２、Ｆ１およびＲ１を使用し、さらにゲノムカウンターとして作用する参照アンプリコンを生成するためにＰ３、Ｆ２、Ｒ２を使用して、ＭＩＴ ２５－２６変異型部位と野生型部位の両方におけるインデル頻度を決定した。２つのアンプリコンの比は、未処理集団で等しく、処理試料の結合部位でのインデル形成に対して低下するはずである。増幅を、１×ｄｄＰＣＲ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ ｆｏｒ Ｐｒｏｂｅｓ（ｄＵＴＰなし、ＢｉｏＲａｄ）、２５０ｎＭの各プローブ、９００ｎＭの各プライマー、２０Ｕ／μＬのＫｐｎ－Ｉ ＨＦ（ＮＥＢ）および１５０ｎｇの細胞ｇＤＮＡを含有する２４μＬの反応液中で多重化した。ＱＸ１００液滴生成器（ＢｉｏＲａｄ）を使用して液滴を生成した。サイクル条件は以下の通りであった：９５℃（２℃／ｓランプ）１０分を１サイクル、９４℃（２℃／ｓランプ）１０秒を４５サイクル、５９．２℃（２℃／ｓランプ）３０秒、７２Ｃ（０．２℃／ｓランプ）１分３０秒、９８℃１０分１サイクル、４℃保持。液滴をＱＸ２００液滴リーダー（ＢｉｏＲａｄ）を使用して分析し、ＱｕａｎｔａＳｏｆｔ分析ソフトウェア（ＢｉｏＲａｄ）を使用してデータを取得および分析した。
Ｐ１（変異型対立遺伝子）：ＴＧＧＣＡＧＧＧＣＣＣＧＧＴ（配列番号６３）
Ｐ２（野生型対立遺伝子）：ＡＣＣＧＧＧＣＴＣＴＧＣＣＡＴ（配列番号７２）
Ｆ１：ＣＣＣＡＡＧＡＡＣＡＧＧＧＴＴＴＧＴＴＡＡＧ（配列番号６４）
Ｒ１：ＧＧＡＡＴＧＣＣＡＴＴＧＣＧＡＴＴＡＧ（配列番号６５）
Ｐ３：ＡＧＣＡＧＴＴＣＴＡＣＣＧＴＡＣＡＡＣＣＣＴＡＡＣＡ（配列番号６６）
Ｆ２：ＧＧＣＡＧＴＴＧＡＧＧＴＧＧＡＴＴＡ（配列番号６７）
Ｒ２：ＧＧＡＡＴＧＣＧＧＴＡＧＴＡＧＴＴＡＧＧ（配列番号６８）
遺伝子操作メガヌクレアーゼをＭＩＴ ２５－２６変異型配列に対して設計し、２つのｍＲＮＡ用量で変異型配列と野生型配列の両方におけるインデル形成について評価した。試験した遺伝子操作メガヌクレアーゼの５つすべてが、非常に高いｍＲＮＡ用量（５００ｎｇ）で、野生型部位で活性を示した（図３）。ＭＩＴ ２５－２６ｘ．９１は２０％で最も少ない野生型インデルを生成したが、ＭＩＴ ２５－２６ｘ．４８は４４％で最も多い野生型インデルを生成した。変異型認識部位切断に関して、ＭＩＴ ２５－２６ｘ．２９とＭＩＴ ２５－２６ｘ．３７の両方は、低ｍＲＮＡ用量（５ｎｇ）で非常に活性であり、両方とも７４％のインデルを生成した。ここで評価されたセットから、ＭＩＴ ２５－２６ｘ．９１が最も特異的であると思われる。
最適化されたメガヌクレアーゼをＭＩＴ ２５－２６変異型配列に対して設計し、２つのｍＲＮＡ用量でＭＩＴ ２５－２６ｘ．９１と共に変異型配列と野生型配列の両方におけるインデル形成について評価した。変異型配列に対する有効性はＭＩＴ ２５－２６ｘ．９１とＭＩＴ ２５－２６Ｌ．３５の間で比較的変化しないようであり、野生型配列に対する特異性はＭＩＴ ２５－２６Ｌ．３５で大幅に改善された。ＭＩＴ ２５－２６ｘ．９１は、５００ｎｇのＭＩＴ ２５－２６ｘ．９１ ｍＲＮＡで１６％の野生型インデルを示したが、ＭＩＴ ２５－２６Ｌ．３５は２％のインデルしか示さなかった（図４）。
まとめると、これらのデータは、ＭＩＴ ２５－２６メガヌクレアーゼの一群が変異型ＭＩＴ ２５－２６部位に対して非常に活性かつ特異的であることを示す。さらに、それらは、残りのオフターゲット（野生型）編集を低減させるように最適化することができる。
実施例３：ミトコンドリア局在化
この実験の目的は、タンパク質上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）がミトコンドリア移行ペプチド（ＭＴＰ）で置き換えられた場合の遺伝子操作メガヌクレアーゼ局在化を可視化することであった。
６ｅ５ ＭＲＣ－５細胞を、Ｌｏｎｚａ ４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）（ＳＥ緩衝液、条件ＣＭ－１５０）を使用して６００ｎｇの遺伝子操作メガヌクレアーゼｍＲＮＡでヌクレオフェクトした。２つの遺伝子操作メガヌクレアーゼ構築物を比較した：いずれもタンパク質のＮ末端に、１つはＮＬＳを有し、１つはＭＴＰを有する。ヌクレオフェクション後２４時間で、細胞を５０ｎＭ ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ（商標）Ｄｅｅｐ Ｒｅｄ ＦＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｍ２２４２６）で３０分間染色し、次いでＰＢＳで洗浄した。次いで、細胞をＨＩＥＲによって４％ ＰＦＡで１５分間固定し、ＤＡＰＩおよびモノクローナル遺伝子操作メガヌクレアーゼ抗体（Ｖ３４ Ｈｕ）を使用して染色した。２０×Ｚスタック画像を使用して、Ｚｅｉｓｓ顕微鏡を使用して細胞を画像化した。
核局在化配列と融合すると、遺伝子操作メガヌクレアーゼ染色は、細胞質および核全体に拡散して見える（図５）。しかし、ミトコンドリア移行ペプチドと融合した場合、遺伝子操作メガヌクレアーゼ染色は点状に見え、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ染色と重なる（図６）。ＭＴＰに結合した場合、遺伝子操作メガヌクレアーゼの核局在化はないように思われる。
ＮＬＳをＭＴＰと交換すると、遺伝子操作メガヌクレアーゼは、核からミトコンドリアに効果的に局在化する。
実施例４：ミトコンドリア局在化データを用いたヌクレアーゼ活性
この実験の目的は、ミトコンドリア標的化遺伝子操作メガヌクレアーゼ（ＭＴＥＭ）タンパク質が核に到達し、ｍＲＮＡヌクレオフェクション後に二本鎖切断（ＤＳＢ）を引き起こしているかどうかを決定することであった。実施例１の染色および画像化データにより、これは生じていないはずであることが示唆されたが、この実験では、インデルが生成されているかどうかを決定するために分子レベルをより深く調べた。
この実験で使用した遺伝子操作メガヌクレアーゼは、核標的部位（すなわち、ＡＰＣ １１－１２）を有するＡＰＣ １１－１２Ｌ．３３０であった。
６ｅ５ ＭＲＣ－５細胞を、Ｌｏｎｚａ ４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）（ＳＥ緩衝液、条件ＣＭ－１５０）を使用して同数の遺伝子操作メガヌクレアーゼｍＲＮＡコピーでヌクレオフェクトした。３つの遺伝子操作メガヌクレアーゼ構築物を比較した：１つはＮＬＳを有し、１つは標的化配列を有さず、１つはミトコンドリア移行ペプチド（ＭＴＰ）を有する。これらの異なる構築物は異なる長さのｍＲＮＡを生じるため、ｍＲＮＡコピー数はトランスフェクション間で一貫して維持された（５．８ｅ１１コピー）。ｇＤＮＡ抽出のためにヌクレオフェクションの２日後に細胞を収集し、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＣｙｔｏＦｌｅｘ Ｓサイトメーターを使用してトランスフェクション効率について評価した。トランスフェクション効率は９５％を超えた。Ｍａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｂｌｏｏｄ ＱｕｉｃｋＰｕｒｅキットを使用してｇＤＮＡを単離した。
デジタル液滴ＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を利用して、結合部位を取り囲むアンプリコンを生成するためにＰ１、Ｆ１およびＲ１を使用し、さらにゲノムカウンターとして作用する参照アンプリコンを生成するためにＰ２、Ｆ２、Ｒ２を使用して、ＡＰＣ １１－１２結合部位におけるインデル頻度を決定した。２つのアンプリコンの比は、未処理集団で等しく、処理試料の結合部位でのインデル形成に対して低下するはずである。増幅を、１×ｄｄＰＣＲ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ ｆｏｒ Ｐｒｏｂｅｓ（ｄＵＴＰなし、ＢｉｏＲａｄ）、２５０ｎＭの各プローブ、９００ｎＭの各プライマー、２０Ｕ／ｕＬのＨｉｎｄ－ＩＩＩ ＨＦ（ＮＥＢ）および１２０ｎｇの細胞ｇＤＮＡを含有する２４ｕＬ反応液中で多重化した。ＱＸ１００液滴生成器（ＢｉｏＲａｄ）を使用して液滴を生成した。サイクル条件は以下の通りであった：９５℃（２℃／ｓランプ）１０分を１サイクル、９４℃（２℃／ｓランプ）１０秒を４５サイクル、５７．５℃（２℃／ｓランプ）３０秒、７２Ｃ（２℃／ｓランプ）１分、９８℃１０分を１サイクル、４℃保持。ＱＸ２００液滴リーダー（ＢｉｏＲａｄ）を使用して液滴を分析し、ＱｕａｎｔａＳｏｆｔ分析ソフトウェア（ＢｉｏＲａｄ）を使用してデータを取得および分析した。
Ｐ１：ＡＧＣＣＣＣＧＧＧＴＡＣＴＣＣＴＴＧＴＴ（配列番号４９）
Ｆ１：ＴＴＣＣＴＴＧＣＡＧＧＡＡＣＡＧＡＧ（配列番号５０）
Ｒ１：ＣＴＧＣＴＴＧＡＣＣＡＣＣＣＡＴＴ（配列番号５１）
Ｐ２：ＣＣＡＧＣＡＧＧＣＣＡＧＧＴＡＣＡＣＣ（配列番号５２）
Ｆ２：ＡＣＣＧＣＣＡＡＧＧＡＴＧＣＡＣ（配列番号５３）
Ｒ２：ＧＣＧＧＧＴＧＧＧＡＡＴＧＧＡＧ（配列番号５４）
図７に示されるように、Ｎ末端に融合されたＮＬＳにより、ＡＰＣ １１－１２Ｌ．３３０は、その意図された（核）標的部位で５９％のインデルを生成することができる。標的化配列が全く存在しない場合、その意図された標的部位で４２％のインデルを生成することができる。遺伝子操作メガヌクレアーゼに融合されたＭＴＰでは、依然としてその意図された標的部位で２３％のインデルを生成することができる。
遺伝子操作メガヌクレアーゼは、核内および核外に拡散することができ得る小さなタンパク質であり、タンパク質上にＮＬＳが存在しなくてもインデル形成をもたらす。この効果は、細胞のヌクレオフェクションおよび細胞膜の透過化によって悪化し得るが、核外搬出シグナル（ＮＥＳ）の付加によって潜在的に緩和され得る。
実施例５：ミトコンドリア局在化および核外搬出配列の付加によるヌクレアーゼ活性
この実験の目的は、遺伝子操作メガヌクレアーゼへの核外搬出シグナル（ＮＥＳ）の付加が核インデルを排除するかどうかを決定することであった。
図８で使用されるＮＥＳは、Ｋｏｓｕｇｉら２００８ Ｔｒａｆｆｉｃ １２：２０５３－６２からのデータに基づいて合理的に設計した。遺伝子操作メガヌクレアーゼのＣ末端に融合したＮＥＳアミノ酸配列は、ＬＧＡＧＬＧＡＬＧＬ（配列番号４７）であった。図９および図１０で使用されるＮＥＳは、Ｍｉｎｃｚｕｋら ２００６ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０３（５２）：１９６８９－１９６９４から得た。遺伝子操作メガヌクレアーゼのＣ末端に融合したＮＥＳアミノ酸配列は、ＶＤＥＭＴＫＫＦＧＴＬＴＩＨＤＴＥＫ（配列番号４６）であった。
図８および図９で使用された遺伝子操作メガヌクレアーゼは、核標的部位を有するＡＰＣ １１－１２Ｌ．３３０であった。図１０で使用された遺伝子操作メガヌクレアーゼはＭＩＴ ２５－２６ｘ．９１であり、これは内因性核標的部位を有さない。しかし、結合部位を含むミトコンドリア配列をＦｌｐＩｎ ２９３細胞の核染色体上に導入し、これらが図１０で評価されている細胞である（部位０はヌクレアーゼ結合部位）。
ＡＰＣ １１－１２Ｌ．３３０を含む実験のために、Ｌｏｎｚａ ４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）（ＳＥ緩衝液、条件ＣＭ－１５０）を使用して、６ｅ５ ＭＲＣ－５細胞を同数の遺伝子操作メガヌクレアーゼｍＲＮＡコピーでヌクレオフェクトした。図８では、４つのメガヌクレアーゼ構築物を比較した：１つはＮＬＳを有し、１つは標的化配列を有さず、１つはミトコンドリア移行ペプチド（ＭＴＰ）を有し、１つはＭＴＰおよびＮＥＳを有する。図９では、４つの遺伝子操作メガヌクレアーゼ構築物を比較した：１つはＮＬＳを有し、１つはＭＴＰを有し、１つはＭＴＰおよびＮＥＳを有し、１つはＭＴＰおよびＭＶＭｐ ＮＳ２ ＮＥＳを有する。ＮＬＳおよびＭＴＰは、両方ともそれらのそれぞれのタンパク質のＮ末端に融合され、ＮＥＳはＣ末端に融合された。これらの異なる構築物は異なる長さのｍＲＮＡを生じるため、ｍＲＮＡコピー数はトランスフェクション間で一定に保たれた（図８のデータの５．８ｅ１１コピー、図９のデータの２．８８ｅ１１コピー）。ｇＤＮＡ抽出のためにヌクレオフェクションの２日後に細胞を収集し、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＣｙｔｏＦｌｅｘ Ｓサイトメーターを使用してトランスフェクション効率について評価した。トランスフェクション効率は９５％を超えた。Ｍａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｂｌｏｏｄ ＱｕｉｃｋＰｕｒｅキットを使用してｇＤＮＡを単離した。
デジタル液滴ＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を利用して、結合部位を取り囲むアンプリコンを生成するためにＰ１、Ｆ１およびＲ１を使用し、さらにゲノムカウンターとして作用する参照アンプリコンを生成するためにＰ２、Ｆ２、Ｒ２を使用して、ＡＰＣ １１－１２結合部位におけるインデル頻度を決定した。２つのアンプリコンの比は、未処理集団で等しく、処理試料の結合部位でのインデル形成に対して低下するはずである。増幅を、１×ｄｄＰＣＲ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ ｆｏｒ Ｐｒｏｂｅｓ（ｄＵＴＰなし、ＢｉｏＲａｄ）、２５０ｎＭの各プローブ、９００ｎＭの各プライマー、２０Ｕ／μＬのＨｉｎｄ－ＩＩＩ ＨＦ（ＮＥＢ）および１２０ｎｇの細胞ｇＤＮＡを含有する２４μＬの反応液中で多重化した。ＱＸ１００液滴生成器（ＢｉｏＲａｄ）を使用して液滴を生成した。サイクル条件は以下の通りであった：９５℃（２℃／ｓランプ）１０分を１サイクル、９４℃（２℃／ｓランプ）１０秒を４５サイクル、５７．５℃（２℃／ｓランプ）３０秒、７２Ｃ（２℃／ｓランプ）１分、９８℃１０分を１サイクル、４℃保持。ＱＸ２００液滴リーダー（ＢｉｏＲａｄ）を使用して液滴を分析し、ＱｕａｎｔａＳｏｆｔ分析ソフトウェア（ＢｉｏＲａｄ）を使用してデータを取得および分析した。
Ｐ１：ＡＧＣＣＣＣＧＧＧＴＡＣＴＣＣＴＴＧＴＴ（配列番号４９）
Ｆ１：ＴＴＣＣＴＴＧＣＡＧＧＡＡＣＡＧＡＧ（配列番号５０）
Ｒ１：ＣＴＧＣＴＴＧＡＣＣＡＣＣＣＡＴＴ（配列番号５１）
Ｐ２：ＣＣＡＧＣＡＧＧＣＣＡＧＧＴＡＣＡＣＣ（配列番号５２）
Ｆ２：ＡＣＣＧＣＣＡＡＧＧＡＴＧＣＡＣ（配列番号５３）
Ｒ２：ＧＣＧＧＧＴＧＧＧＡＡＴＧＧＡＧ（配列番号５４）
ＭＩＴ ２５－２６ｘ．９１を含む実験では、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＦｌｐ－Ｉｎ（商標）システムを使用してＦｌｐＩｎ ２９３株を作製した。組み込みカセットは、ＭＩＴ ２５－２６変異型結合部位および周囲のｍｔＤＮＡ配列を含んでいた。Ｎｅｏｎエレクトロポレーターを使用して、１．５ｅ６ ＦｌｐＩｎ ２９３細胞に１．８ｅ１２コピーの遺伝子操作メガヌクレアーゼｍＲＮＡをエレクトロポレーションした（Ｎｅｏｎ条件＃１１、１００ｕＬチップ）。ｇＤＮＡ抽出のために、エレクトロポレーションの２日後に細胞を収集し、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＣｙｔｏＦｌｅｘ Ｓサイトメーターを使用してトランスフェクション効率について評価した。トランスフェクション効率は９５％を超えた。Ｍａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｂｌｏｏｄ ＱｕｉｃｋＰｕｒｅキットを使用してｇＤＮＡを単離した。
ＭＩＴ ２５－２６ｘ．９１ヌクレアーゼによって誘導される潜在的な核オフターゲット部位編集を同定するために、インビトロでゲノムワイドの偏りのないオフターゲティングアッセイから同定した、選択された部位で標的化アンプリコン配列決定を行った。３つの核ゲノム配列が、このヌクレアーゼの推定オフターゲット部位として同定された（部位１、部位２、および部位３）。ＮＬＳ－ＭＩＴ ２５－２６ｘ．９１、ＭＴＰ－ＭＩＴ ２５－２６ｘ．９１、またはＭＴＰ－ＭＩＴ ２５－２６ｘ．９１－ＭＶＭｐＮＳ２ ＮＥＳのいずれかで処理した細胞から収集されたｇＤＮＡを、プライマーＦ１＞＜Ｒ１、Ｆ２＞＜Ｒ２、Ｆ３＞＜Ｒ３およびＦ４＞＜Ｒ４を使用して、導入された核オンターゲット部位（部位０）ならびに３つの内因性推定オフターゲット部位（部位１、２および３）での標的化アンプリコン配列決定によって評価した。
Ｆ１：ＧＣＴＧＧＣＴＡＧＣＧＴＴＴＡＡＡＣＴＴＡＡＧＣＴＴＧ（配列番号５５）
Ｒ１：ＧＧＧＴＡＴＧＴＴＧＴＴＡＡＧＡＡＧＡＧＧＡＡＴＴＧＡＡＣＣＴＣＴＣＴＧ（配列番号５６）
Ｆ２：ＴＧＴＧＡＧＴＧＣＡＴＡＴＡＡＴＧＡＡＡＴＧＧＧＡＴＧＡＣＡＧ（配列番号５７）
Ｒ２：ＣＡＧＴＣＣＣＣＡＣＣＴＣＴＴＡＡＧＴＴＴＣＡＡＡＴＧＡＣ（配列番号５８）
Ｆ３：ＣＣＧＣＡＡＧＣＣＣＣＴＴＧＧＴＡＣＴＧ（配列番号５９）
Ｒ３：ＧＴＣＴＧＣＡＣＴＣＡＡＧＧＡＡＧＧＡＧＣＴＣ（配列番号６０）
Ｆ４：ＧＡＣＣＴＴＡＴＧＣＴＧＡＧＧＡＡＡＡＧＣＴＧＴＣＡＴＴＣＴＡＧ（配列番号６１）
Ｒ４：ＧＧＣＣＡＴＴＴＡＴＴＴＣＡＧＡＧＴＴＴＡＧＡＴＣＧＣＴＡＴＧＣ（配列番号６２）
増幅は、１×緩衝液Ｑ５、１×エンハンサーＱ５、２００μＭ ｄＮＴＰ、０．５μＭの各プライマー、１．０ｕのＱ５ポリメラーゼ、および３００ｎｇの細胞ｇＤＮＡを含有する５０μＬ反応液中で生成した。サイクル条件は以下の通りであった：９８℃４分を１サイクル、９８℃３０秒を３５サイクル、６８℃２０秒、７２℃１５秒、７２℃２分を１サイクル、４℃保持。
生のＰＣＲ産物を、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐ７５８９）を使用して増幅し、次いで各試料にわたってプールした。次いで、プールされたＰＣＲ産物をＮＧＳによってインデルについて分析した。
ＡＰＣ １１－１２Ｌ．３３０へのＮＥＳの付加は、核インデルの保有率をわずかに減少させるようであり（図８）、ＭＶＭｐ ＮＳ２ ＮＥＳの付加は、核インデルを完全に排除するようであった（図９）。
核染色体上のｍｔＤＮＡ配列のセグメントを含むヒトゲノムに関連して、ＭＩＴ ２５－２６ｘ．９１ヌクレアーゼのオンターゲット（核）インデル有効性は、ＮＬＳでは３４．１％、ＭＴＰでは０．５％、ＭＴＰおよびＭＶＭｐ ＮＳ２ ＮＥＳでは０．１％である（図１０）。核オフターゲット編集は、ＮＬＳでのみ検出された（＜１％）。ＭＴＰまたはＭＴＰおよびＭＶＭｐ ＮＳ２ ＮＥＳのいずれかで検出可能なレベルのオフターゲット編集はなかった。
ＭＶＭｐ ＮＳ２ ＮＥＳは、潜在的に問題となる核オフターゲット編集を軽減する、ミトコンドリア標的化遺伝子操作メガヌクレアーゼへの非常に効果的な付加である。
実施例６：サイブリッド細胞におけるヌクレアーゼ有効性および機能
この実験の目的は、ヘテロプラズミックＭＥＬＡＳ変異（ｍ．３２４３Ａ＞Ｇ）を有する細胞株におけるＭＩＴ ２５－２６ｘ．９１ヌクレアーゼの有効性を示すことであった。使用される細胞株は、野生型ｍｔＤＮＡと変異型ｍｔＤＮＡの両方を含有するサイブリッド（細胞質ハイブリッド）である。特に、細胞株は９１％変異型であり、すなわち、ｍｔＤＮＡ集団の９１％が変異型対立遺伝子を含有し、９％が野生型対立遺伝子を含有する。
Ｌｏｎｚａ ４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）（ＳＦ緩衝液、条件ＣＡ－１３７）を使用して、８ｅ５ ＭＥＬＡＳサイブリッド細胞に用量滴定にわたって遺伝子操作メガヌクレアーゼｍＲＮＡをヌクレオフェクトした。遺伝子操作メガヌクレアーゼｍＲＮＡ用量は、１ｅ５ ＲＮＡコピー／細胞で開始した。これは、合計８ｅ１０ ＲＮＡコピー、または９４．８ｎｇのＲＮＡに変換される。次いで、ｍＲＮＡを１ｅ２ ＲＮＡコピー／細胞に至るまで１：１０で段階希釈した。ｇＤＮＡ抽出のために、ヌクレオフェクションの１日後に細胞を収集し、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＣｙｔｏＦｌｅｘ Ｓサイトメーターを使用してトランスフェクション効率について評価した。トランスフェクション効率は９５％を超えた。Ｍａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｂｌｏｏｄ ＱｕｉｃｋＰｕｒｅキットを使用してｇＤＮＡを単離した。細胞を、ｇＤＮＡ抽出および機能分析のためのさらなる時点（４日目、７日目および１１日目）のために保持した。
液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を利用して、ｍｔＤＮＡのヘテロプラスミーレベル、ならびに核ＤＮＡ（ｎｕＤＮＡ）に対するｍｔＤＮＡコピー数を決定した。これは、結合部位を取り囲むアンプリコンを生成するためにＰ１、Ｆ１およびＲ１を使用し（アッセイ１）、ｍｔＤＮＡカウンターとして作用する参照アンプリコンを生成するためにＰ２、Ｆ２およびＲ２を使用し（アッセイ２）、ｎｕＤＮＡカウンターとして作用する核参照アンプリコンを生成するためにＰ３、Ｆ３およびＲ３を使用して達成された（アッセイ３）。アッセイ２の陽性液滴の数に対するアッセイ１の陽性液滴の数を使用して、細胞中のヘテロプラスミーのレベルを決定した。アッセイ３の陽性液滴の数に対するアッセイ２の陽性液滴の数を使用して、細胞中のｍｔＤＮＡコピー数を決定した。次いで、この比をＭＴＳ－ＧＦＰ（対照）条件に基づいて正規化し、得られた正規化されたコピー数にヘテロプラスミーレベルを乗算して、図１１～図１４に示されるデータを生成した。これらのグラフにおいて、バーの高さは、ＭＴＳ－ＧＦＰ細胞に対するｍｔＤＮＡ損失を示す。バー内で、灰色の相対的パーセンテージは、存在する野生型ｍｔＤＮＡの相対的パーセンテージに対応し、黒色の相対的パーセンテージは、存在する変異型ｍｔＤＮＡの相対的パーセンテージに対応する。
Ｐ１：ＴＧＧＣＡＧＧＧＣＣＣＧＧＴ（配列番号６３）
Ｆ１：ＣＣＣＡＡＧＡＡＣＡＧＧＧＴＴＴＧＴＴＡＡＧ（配列番号６４）
Ｒ１：ＧＧＡＡＴＧＣＣＡＴＴＧＣＧＡＴＴＡＧ（配列番号６５）
Ｐ２：ＡＧＣＡＧＴＴＣＴＡＣＣＧＴＡＣＡＡＣＣＣＴＡＡＣＡ（配列番号６６）
Ｆ２：ＧＧＣＡＧＴＴＧＡＧＧＴＧＧＡＴＴＡ（配列番号６７）
Ｒ２：ＧＧＡＡＴＧＣＧＧＴＡＧＴＡＧＴＴＡＧＧ（配列番号６８）
Ｐ３：ＣＣＡＧＣＡＧＧＣＣＡＧＧＴＡＣＡＣＣ（配列番号５２）
Ｆ３：ＡＣＣＧＣＣＡＡＧＧＡＴＧＣＡＣ（配列番号５３）
Ｒ３：ＧＣＧＧＧＴＧＧＧＡＡＴＧＧＡＧ（配列番号５４）
アッセイ１および２を、１×ｄｄＰＣＲ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ ｆｏｒ Ｐｒｏｂｅｓ（ｄＵＴＰなし、ＢｉｏＲａｄ）、２５０ｎＭの各プローブ、９００ｎＭの各プライマー、２０Ｕ／μＬのＨｉｎｄ－ＩＩＩ ＨＦ（ＮＥＢ）および０．２２５ｎｇの細胞ｇＤＮＡを含有する２４μＬの反応液中で多重化した。ＱＸ１００液滴生成器（ＢｉｏＲａｄ）を使用して液滴を生成した。サイクル条件は以下の通りであった：９５℃（２℃／ｓランプ）１０分を１サイクル、９４℃（２℃／ｓランプ）１０秒を４５サイクル、５９．２℃（２℃／ｓランプ）３０秒、７２Ｃ（０．２℃／ｓランプ）１分、９８℃１０分を１サイクル、４℃保持。ＱＸ２００液滴リーダー（ＢｉｏＲａｄ）を使用して液滴を分析し、ＱｕａｎｔａＳｏｆｔ分析ソフトウェア（ＢｉｏＲａｄ）を使用してデータを取得および分析した。
アッセイ３を、１×ｄｄＰＣＲ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ ｆｏｒ Ｐｒｏｂｅｓ（ｄＵＴＰなし、ＢｉｏＲａｄ）、２５０ｎＭの各プローブ、９００ｎＭの各プライマー、２０Ｕ／μＬのＨｉｎｄ－ＩＩＩ ＨＦ（ＮＥＢ）および９０ｎｇの細胞ｇＤＮＡを含有する２４μＬの反応液中でシングルプレックスとして実行した。ＱＸ１００液滴生成器（ＢｉｏＲａｄ）を使用して液滴を生成した。サイクル条件は以下の通りであった：９５℃（２℃／ｓランプ）１０分を１サイクル、９４℃（２℃／ｓランプ）１０秒を４５サイクル、５９．２℃（２℃／ｓランプ）３０秒、７２Ｃ（０．２℃／ｓランプ）１分、９８℃１０分を１サイクル、４℃保持。ＱＸ２００液滴リーダー（ＢｉｏＲａｄ）を使用して液滴を分析し、ＱｕａｎｔａＳｏｆｔ分析ソフトウェア（ＢｉｏＲａｄ）を使用してデータを取得および分析した。
トランスフェクション後１１日目に、Ｓｅａｈｏｒｓｅ ＸＦｅ９６ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）での分析のために、５ｅ３細胞を９６ウェルＳｅａｈｏｒｓｅ細胞培養マイクロプレートに蒔いた。また、ＸＦセンサーカートリッジを、非ＣＯ２インキュベーター中で一晩、２００μＬ／ウェルのＳｅａｈｏｒｓｅ ＸＦ Ｃａｌｉｂｒａｎｔで水和させた。次の日（１２日目）、９７ｍＬのＳｅａｈｏｒｓｅアッセイ培地（ＤＭＥＭ）を、１ｍＬの１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１ｍＬの２ｍＭグルタミンおよび１ｍＬの１０ｍＭグルコースと合わせた。細胞を調製した培地で２回洗浄し、次いで非ＣＯ２インキュベーターに１時間入れた。１つのＣｅｌｌ Ｍｉｔｏ Ｓｔｒｅｓｓ Ｔｅｓｔ Ｋｉｔを製造者の指示に従って再構成した。溶液は、オリゴマイシン（１５ｕＭ）、ＦＣＣＰ（５ｕＭ）、およびロテノン／アンチマイシンＡ（５ｕＭ）から構成されていた。Ｃｅｌｌ Ｍｉｔｏ Ｓｔｒｅｓｓ Ｔｅｓｔでは、水和カートリッジのすべてのポートＡに２０μＬのオリゴマイシン溶液を添加し、すべてのポートＢに２２μＬのＦＣＣＰ溶液を添加し、すべてのポートＣに２４μＬのロテノン／アンチマイシンＡを添加した。ＡＴＰ速度アッセイのために、同じストック溶液を使用した。このアッセイのために、２０μＬのオリゴマイシン溶液をすべてのポートＡに添加し、２２μＬのロテノン／アンチマイシンＡ溶液をすべてのポートＢに添加し、２４μＬのＳｅａｈｏｒｓｅアッセイ培地をすべてのポートＣに添加した。ベースライン、オリゴマイシン、ＦＣＣＰ、およびロテノン／アンチマイシンＡについて４回の測定サイクル（０３：００混合、００：００待機、０３：００測定）でアッセイを実行した。ＯＣＲおよびＰＥＲ値は、Ｗａｖｅソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して分析した。Ｃｅｌｌ Ｍｉｔｏ Ｓｔｒｅｓｓ ＴｅｓｔおよびＡＴＰ Ｒａｔｅ Ａｓｓａｙ Ｒｅｐｏｒｔｓは、Ｗａｖｅソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して作成した。
アッセイ完了後、細胞をＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｈ３５７０）で標準培地中１：５０００希釈で染色した。細胞を３７Ｃで２０分間インキュベートし、次いでＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ Ｐｉｃｏ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用してイメージサイトメトリーによって分析した。次いで、ＯＣＲおよびＰＥＲ値を、Ｗａｖｅソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して細胞数に対して正規化した。
図１１に示すように、より高用量のミトコンドリア標的化遺伝子操作メガヌクレアーゼ（ＭＴＥＭ）は、ｍｔＤＮＡコピーのより大きな損失をもたらした。ヘテロプラスミーは、トランスフェクション後１日目という早い時期に既にシフトし始めた。４日目に、細胞は、特に高用量（１ｅ５ ＲＮＡコピー／細胞）で、最初のｍｔＤＮＡ低減から依然として回復している（図１２）。ヘテロプラスミーは、１ｅ４ ＲＮＡコピー／細胞条件で完全にシフトしている（細胞は１００％野生型である）。７日目に、細胞は、それらのｍｔＤＮＡコピー数がすべての条件にわたって対照レベルまで回復した（図１３）。ヘテロプラスミーは、２つの最も高い用量（１ｅ５ ＲＮＡコピー／細胞および１ｅ４ ＲＮＡコピー／細胞）で１００％シフトしている。ヘテロプラスミーは、１ｅ３ ＲＮＡコピー／細胞の用量で約５５％変異型にシフトしている。１ｅ２ ＲＮＡコピー／細胞はヘテロプラスミーをシフトさせなかった。１１日目に、細胞は、それらのｍｔＤＮＡコピー数がすべての条件にわたって対照レベルまで回復した（図１４）。ヘテロプラスミーは、２つの最も高い用量（１ｅ５ ＲＮＡコピー／細胞および１ｅ４ ＲＮＡコピー／細胞）で１００％シフトしている。ヘテロプラスミーは、１ｅ３ ＲＮＡコピー／細胞の用量で約５５％変異型にシフトしている。１ｅ２ ＲＮＡコピー／細胞はヘテロプラスミーをシフトさせなかった。
Ｃｅｌｌ Ｍｉｔｏ Ｓｔｒｅｓｓ Ｔｅｓｔでは、ヘテロプラスミーの完全なシフトを示したＭＴＥＭ処理細胞（１ｅ５ ＲＮＡコピー／細胞）は、未処理細胞（モック）よりも基礎呼吸が５３％増加し、最大呼吸が４６％増加した（図１５）。
ＡＴＰ速度アッセイでは、ヘテロプラスミーの完全なシフトを示したＭＴＥＭ処理細胞（１ｅ５ ＲＮＡコピー／細胞）は、未処理細胞（モック）よりも総ＡＴＰ産生が１７％増加した（図１６）。
ＡＴＰ速度アッセイでは、ヘテロプラスミーの完全なシフトを示したＭＴＥＭ処理細胞（１ｅ５ ＲＮＡコピー／細胞）は、未処理細胞（モック）よりもｍｉｔｏＡＴＰ産生が８８％増加した（図１７）。
ＡＴＰ産生に対する解糖およびＯＸＰＨＯＳの相対的寄与を、図１８のエネルギーマップにおいて可視化することができる。ヘテロプラスミーの完全なシフトを示したＭＴＥＭ処理細胞（１ｅ５ ＲＮＡコピー／細胞）は、未処理細胞（モック）よりも大きなＯＸＰＨＯＳからのＡＴＰ寄与を示した。
ヘテロプラスミーは、本明細書に記載されるＭＩＴ ２５－２６メガヌクレアーゼを使用して、異常サイブリッド細胞において非常に効果的にシフトした。このシフトは、酸素消費、ＡＴＰ産生、およびＯＸＰＨＯＳ ＡＴＰ産生の有意な機能的改善をもたらした。ミトコンドリア標的化遺伝子操作メガヌクレアーゼで処理された細胞は、酸素を使用して未処理細胞よりも容易にＯＸＰＨＯＳを介してＡＴＰを産生することができる。
実施例７：ミトコンドリア局在化
この実験の目的は、タンパク質上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）がミトコンドリア移行ペプチド（ＭＴＰ）で置き換えられた場合の遺伝子操作メガヌクレアーゼ局在化を可視化することであった。
Ｌｏｎｚａ ４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）（ＳＦ緩衝液、条件ＣＡ－１３７）を使用して、８ｅ５ ＭＥＬＡＳサイブリッド細胞を１ｅ６ ＲＮＡコピー／細胞の遺伝子操作メガヌクレアーゼｍＲＮＡでヌクレオフェクトした。２つの遺伝子操作メガヌクレアーゼ構築物を比較した：１つは標的配列を有さず、１つはタンパク質のＮ末端にＭＴＰを有する。ヌクレオフェクション後２４時間で、細胞を５０ｎＭ ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ（商標）Ｄｅｅｐ Ｒｅｄ ＦＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｍ２２４２６）およびＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（１：５０００希釈）で３０分間染色した。細胞を、６３ｘ Ｚスタック画像を使用してＺｅｉｓｓ顕微鏡を使用して画像化した。
標的化配列がない場合、遺伝子操作メガヌクレアーゼ染色は、細胞質および核全体に拡散して見える（図１９）。しかし、ミトコンドリア移行ペプチドと融合した場合、遺伝子操作メガヌクレアーゼ染色は点状に見え、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ染色と重なる（図２０）。ＭＴＰに結合した場合、遺伝子操作メガヌクレアーゼの核局在化はないように思われる。
Ｎ末端ＭＴＰの付加により、遺伝子操作メガヌクレアーゼはミトコンドリアに効果的に局在化する。
実施例８：ミトコンドリア標的化メガヌクレアーゼ活性および特異性評価
この実験の目的は、ミトコンドリア環状ＤＮＡにｍ．３２４３Ａ＞Ｇ変異を有するＭＥＬＡＳ細胞におけるオンターゲット（変異型ｍ．３２４３Ｇ編集）のための様々なＭＩＴ ２５－２６ヌクレアーゼを評価し、ＷＴミトコンドリア環状ＤＮＡに対するヌクレアーゼの潜在的なオフターゲット編集（ｍ．３２４３Ａ活性）を評価することであった。したがって、この実験で使用した細胞株は、１００％変異型ｍｔＤＮＡ（ｍ．３２４３Ａ＞Ｇ変異）または１００％野生型ｍｔＤＮＡ（ｍ．３２４３Ａ）のいずれかを含有していた。ミトコンドリアゲノムは環状であり、線状ＤＮＡは迅速に除去される。したがって、ヌクレアーゼがその意図されたオンターゲット認識配列を切断する場合、環状ｍｔＤＮＡは線状化され、ミトコンドリアによって排除される。ヌクレアーゼの特異性は、ヌクレアーゼトランスフェクション後の残りの環状野生型ｍｔＤＮＡ配列の量を決定することによって評価することができる。ＷＴおよび変異型ＤＮＡは単一の塩基対のみが異なるため、ＷＴ ＤＮＡ配列の非特異的切断の量はオフターゲット活性を示す。変異型ｍｔＤＮＡ配列とＷＴ ｍｔＤＮＡ配列とは単一のヌクレオチドのみが異なるため、ＷＴ ｍｔＤＮＡを破壊することなく変異型ｍｔＤＮＡを確実に切断して排除することができる酵素を同定する必要がある。この分析には２つの細胞株を使用した：１つはホモプラズミック変異型（１００％変異型）であり、１つはホモプラズミックＷＴ（０％変異型）である。４つの対照構築物：モック、ＭＴＳ－ＧＦＰ、ミトコンドリアゲノムに認識配列を有さないメガヌクレアーゼＭＴＳ－ＡＰＣ １１－１２Ｌ．３３０、およびヌクレアーゼ活性死メガヌクレアーゼＭＴＳ－ＭＩＴ ２５－２６ｘ．９１ ＫＯを使用した。実験では、以下の１０個のＭＴＳ－ＭＩＴ ２５－２６ヌクレアーゼ：ＭＴＳ－ＭＩＴ ２５－２６ｘ．２９（配列番号６）、ＭＴＳ－ＭＩＴ ２５－２６ｘ．３７（配列番号７）、ＭＴＳ－ＭＩＴ ２５－２６ｘ．７３（配列番号５）、ＭＴＳ－ＭＩＴ ２５－２６ｘ．９１（配列番号３）、ＭＴＳ－ＭＩＴ ２５－２６ｘ．８４、ＭＴＳ－ＭＩＴ ２５－２６Ｌ．３５（配列番号８）、ＭＴＳ－ＭＩＴ ２５－２６Ｌ．３５ １９Ａ＞Ｓ（配列番号１０）、ＭＴＳ－ＭＩＴ ２５－２６ｘ．９１ ４６Ｈ＞Ｗ（配列番号１２）、ＭＴＳ－ＭＩＴ ２５－２６ｘ．９１ ２５９Ｈ＞Ｑ（配列番号９）、およびＭＴＳ－ＭＩＴ ２５－２６ｘ．９１ ２６３Ｔ＞Ｒ（配列番号１１）を比較し、８ｅ５ ＭＥＬＡＳサイブリッド細胞（１００％変異型または０％変異型のいずれか）に、Ｌｏｎｚａ ４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）（ＳＦ緩衝液、条件ＣＡ－１３７）を使用して１．５ｅ５ ＲＮＡコピー／細胞（１４２ｎｇ）の遺伝子操作メガヌクレアーゼｍＲＮＡをヌクレオフェクトした。
ｇＤＮＡ抽出のために、時間経過（６、２４、４８および７２時間）に沿って細胞を収集した。Ｍａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｂｌｏｏｄ ＱｕｉｃｋＰｕｒｅキットを使用してｇＤＮＡを単離した。Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＣｙｔｏＦｌｅｘ Ｓサイトメーターを使用してトランスフェクション効率を評価するために、ヌクレオフェクションの１日後に細胞を収集した。トランスフェクション効率は９５％を超えた。
液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を利用して、ｍｔＤＮＡ切断（ＭＩＴ ２５－２６結合部位における線状化ｍｔＤＮＡ）および核ＤＮＡ（ｎｕＤＮＡ）に対するｍｔＤＮＡコピー数を決定した。これは、結合部位を取り囲むアンプリコンを生成するためにＰ１、Ｆ１およびＲ１を使用し（アッセイ１）、ｍｔＤＮＡカウンターとして作用する参照アンプリコンを生成するためにＰ２、Ｆ２およびＲ２を使用し（アッセイ２）、ｎｕＤＮＡカウンターとして作用する核参照アンプリコンを生成するためにＰ４、Ｆ４およびＲ４を使用して達成された（アッセイ３）。アッセイ２の陽性液滴の数に対するアッセイ１の陽性液滴の数を使用して、環状ｍｔＤＮＡ分子に対する線状化ｍｔＤＮＡ分子の比を決定した。アッセイ３の陽性液滴の数に対するアッセイ２の陽性液滴の数を使用して、細胞中のｍｔＤＮＡコピー数を決定した。
Ｐ１：ＴＧＧＣＡＧＧＧＣＣＣＧＧＴ（配列番号６３）
Ｆ１：ＣＣＣＡＡＧＡＡＣＡＧＧＧＴＴＴＧＴＴＡＡＧ（配列番号６４）
Ｒ１：ＧＧＡＡＴＧＣＣＡＴＴＧＣＧＡＴＴＡＧ（配列番号６５）
Ｐ２：ＡＧＣＡＧＴＴＣＴＡＣＣＧＴＡＣＡＡＣＣＣＴＡＡＣＡ（配列番号６６）
Ｆ２：ＧＧＣＡＧＴＴＧＡＧＧＴＧＧＡＴＴＡ（配列番号６７）
Ｒ２：ＧＧＡＡＴＧＣＧＧＴＡＧＴＡＧＴＴＡＧＧ（配列番号６８）
Ｐ４：ＡＡＣＣＡＧＡＣＡＡＡＴＣＧＣＴＣＣＡＣＣＡＡＣ（配列番号６９）
Ｆ４：ＣＧＧＡＣＡＧＧＡＴＴＧＡＣＡＧＡＴＴ（配列番号７０）
Ｒ４：ＣＣＡＧＡＧＴＣＴＣＧＴＴＣＧＴＴＡＴＣ（配列番号７１）
アッセイ１および２を、１×ｄｄＰＣＲ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ ｆｏｒ Ｐｒｏｂｅｓ（ｄＵＴＰなし、ＢｉｏＲａｄ）、２５０ｎＭの各プローブ、９００ｎＭの各プライマー、２０Ｕ／μＬのＨｉｎｄ－ＩＩＩ ＨＦ（ＮＥＢ）および０．２２５ｎｇの細胞ｇＤＮＡを含有する２４μＬの反応液中で多重化した。ＱＸ１００液滴生成器（ＢｉｏＲａｄ）を使用して液滴を生成した。サイクル条件は以下の通りであった：９５℃（２℃／ｓランプ）１０分を１サイクル、９４℃（２℃／ｓランプ）１０秒を４５サイクル、５９．２℃（２℃／ｓランプ）３０秒、７２Ｃ（０．２℃／ｓランプ）１分、９８℃１０分を１サイクル、４℃保持。ＱＸ２００液滴リーダー（ＢｉｏＲａｄ）を使用して液滴を分析し、ＱｕａｎｔａＳｏｆｔ分析ソフトウェア（ＢｉｏＲａｄ）を使用してデータを取得および分析した。
アッセイ２および３を、１×ｄｄＰＣＲ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ ｆｏｒ Ｐｒｏｂｅｓ（ｄＵＴＰなし、ＢｉｏＲａｄ）、２５０ｎＭの各プローブ、９００ｎＭの各プライマー、２０Ｕ／μＬのＨｉｎｄ－ＩＩＩ ＨＦ（ＮＥＢ）および０．２２５ｎｇの細胞ｇＤＮＡを含有する２４μＬの反応液中で多重化した。ＱＸ１００液滴生成器（ＢｉｏＲａｄ）を使用して液滴を生成した。サイクル条件は以下の通りであった：９５℃（２℃／ｓランプ）１０分を１サイクル、９４℃（２℃／ｓランプ）１０秒を４５サイクル、５９．２℃（２℃／ｓランプ）３０秒、７２Ｃ（０．２℃／ｓランプ）１分、９８℃１０分を１サイクル、４℃保持。ＱＸ２００液滴リーダー（ＢｉｏＲａｄ）を使用して液滴を分析し、ＱｕａｎｔａＳｏｆｔ分析ソフトウェア（ＢｉｏＲａｄ）を使用してデータを取得および分析した。
図２１は、６時間での全ｍｔＤＮＡ（線状化および環状化）に対する環状ｍｔＤＮＡの比の顕著な低減を示し、変異型ｍ．３２４３Ｇ ｍｔＤＮＡ配列について試験したすべてのヌクレアーゼの堅牢な切断活性を示している。環状ＤＮＡの切断直後に、ＤＮＡは線状化され、ミトコンドリアによって除去され、６時間後の環状ｍｔＤＮＡの漸進的な増加によって示されるように、残りの未切断または複製環状ｍｔＤＮＡのみが検出される。変異型ｍｔＤＮＡのこの低減はまた、全ｍｔＤＮＡのリボソーム１８ｓ ＤＮＡ配列に対する比によって可視化することができ、これは、各ヌクレアーゼがトランスフェクション後２４時間までにほぼ完全にすべての変異型ｍｔＤＮＡを排除することができることを示す（図２２）。しかし、図２３および図２４に示されるように、異なるヌクレアーゼは、変異型ｍｔＤＮＡとＷＴ ｍｔＤＮＡとの間で特異性が異なっていた。この特異性の差は、切断され、その後排除されたＷＴ ｍｔＤＮＡの量によって示され、異なるヌクレアーゼがＷＴ ｍ．３２４３Ａ配列を区別する能力が異なることを示している。特に、ＭＩＴ ２５－２６Ｌ．３５ １９Ａ＞ＳメガヌクレアーゼおよびＭＩＴ ２５－２６ｘ．９１．２５９ Ｈ＞Ｑヌクレアーゼは、ＷＴ ｍｔＤＮＡを線状化する能力と枯渇させる能力の両方において４つの対照から統計的に有意でないオンターゲット活性を示し、高度の特異性を示した。対照的に、ＭＴＳ ２６－２６ｘ．８４ヌクレアーゼは、ｍｔＤＮＡのほぼすべてがトランスフェクション後４８時間までに除去されるため、変異型ｍｔＤＮＡとＷＴ ｍｔＤＮＡとを十分に識別することができなかった（図２４）。追加のデータセットは、ＭＩＴ ＭＴＳ ２５－２６ｘ．９１ ２５９Ｈ＞Ｑが、すべての時点でｍｔＤＮＡコピー数とｍｔＤＮＡ線状化の両方に関して４つの対照と比較して統計的に有意でないため、最も特異的なヌクレアーゼであることを示す（図２５および２６ならびに表７および８）。
図２２～図２６の各時点での統計的有意性をそれぞれ表４～表８に示す。
Figure 2024514939000014
アスタリスク（＊）は、同じ数のアスタリスクを有する細胞間における統計学的有意性を示す。Ｎ／Ａ－統計および２４時間は、２回の反復のために計算することができなかった
Figure 2024514939000015
アスタリスク（＊）は、同じ数のアスタリスクを有する細胞間における統計学的有意性を示す。ｎｓの表記は、他の条件のいずれとの間にも統計的な差がないことを示す。
Figure 2024514939000016
アスタリスク（＊）は、同じ数のアスタリスクを有する細胞間における統計学的有意性を示す。ｎｓの表記は、他の条件のいずれとの間にも統計的な差がないことを示す。
Figure 2024514939000017
アスタリスク（＊）は、同じ数のアスタリスクを有する細胞間における統計学的有意性を示す。ｎｓの表記は、他の条件のいずれとの間にも統計的な差がないことを示す。
Figure 2024514939000018
アスタリスク（＊）は、同じ数のアスタリスクを有する細胞間における統計学的有意性を示す。ｎｓの表記は、他の条件のいずれとの間にも統計的な差がないことを示す。
実施例９：ミトコンドリア標的化メガヌクレアーゼｍＲＮＡトランスフェクション後のｍ．３２４３Ｇ変異型細胞における分子変化
この実験の目的は、ヘテロプラズミックＭＥＬＡＳ変異（ｍ．３２４３Ａ＞Ｇ）を有する細胞株におけるＭＩＴ ２５－２６ｘ．９１ヌクレアーゼの有効性を示すことであった。使用される細胞株は、野生型ｍｔＤＮＡと変異型ｍｔＤＮＡの両方を含有するサイブリッド（細胞質ハイブリッド）である。特に、細胞株は９６％変異型であり、すなわち、ｍｔＤＮＡ集団の９６％が変異型対立遺伝子を含有し、６％が野生型対立遺伝子を含有する。
Ｌｏｎｚａ ４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）（ＳＦ緩衝液、条件ＣＡ－１３７）を使用して、８ｅ５ ＭＥＬＡＳサイブリッド細胞に用量滴定にわたって遺伝子操作メガヌクレアーゼｍＲＮＡをヌクレオフェクトした。遺伝子操作メガヌクレアーゼｍＲＮＡ用量は、１ｅ５ ＲＮＡコピー／細胞で開始した。これは、合計８ｅ１０ ＲＮＡコピー、または９４．８ｎｇのＲＮＡに変換される。次いで、ｍＲＮＡを１ｅ２ ＲＮＡコピー／細胞に至るまで１：１０で段階希釈した。ｇＤＮＡ抽出のために、ヌクレオフェクションの１日後に細胞を収集し、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＣｙｔｏＦｌｅｘ Ｓサイトメーターを使用してトランスフェクション効率について評価した。トランスフェクション効率は９５％を超えた。Ｍａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｂｌｏｏｄ ＱｕｉｃｋＰｕｒｅキットを使用してｇＤＮＡを単離した。細胞を、ｇＤＮＡ抽出および機能分析のためのさらなる時点（４日目および７日目）のために保持した。
液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を利用して、ｍｔＤＮＡのヘテロプラスミーレベル、ならびに核ＤＮＡ（ｎｕＤＮＡ）に対するｍｔＤＮＡコピー数を決定した。これは、結合部位を取り囲むアンプリコンを生成するためにＰ１、Ｆ１およびＲ１を使用し（アッセイ１）、ｍｔＤＮＡカウンターとして作用する参照アンプリコンを生成するためにＰ２、Ｆ２およびＲ２を使用し（アッセイ２）、ｎｕＤＮＡカウンターとして作用する核参照アンプリコンを生成するためにＰ４、Ｆ４およびＲ４を使用して達成された（アッセイ３）。アッセイ２の陽性液滴の数に対するアッセイ１の陽性液滴の数を使用して、細胞中のヘテロプラスミーのレベルを決定した。アッセイ３の陽性液滴の数に対するアッセイ２の陽性液滴の数を使用して、細胞中のｍｔＤＮＡコピー数を決定した。次いで、この比をＭＴＳ－ＧＦＰ（対照）条件に基づいて正規化し、得られた正規化されたコピー数にヘテロプラスミーレベルを乗算して、図２７～図２９に示されるデータを生成した。これらのグラフにおいて、バーの高さは、ＭＴＳ－ＧＦＰ細胞に対するｍｔＤＮＡ損失を示す。バー内で、灰色の相対的パーセンテージは、存在する野生型ｍｔＤＮＡの相対的パーセンテージに対応し、黒色の相対的パーセンテージは、存在する変異型ｍｔＤＮＡの相対的パーセンテージに対応する。
Ｐ１：ＴＧＧＣＡＧＧＧＣＣＣＧＧＴ（配列番号６３）
Ｆ１：ＣＣＣＡＡＧＡＡＣＡＧＧＧＴＴＴＧＴＴＡＡＧ（配列番号６４）
Ｒ１：ＧＧＡＡＴＧＣＣＡＴＴＧＣＧＡＴＴＡＧ（配列番号６５）
Ｐ２：ＡＧＣＡＧＴＴＣＴＡＣＣＧＴＡＣＡＡＣＣＣＴＡＡＣＡ（配列番号６６）
Ｆ２：ＧＧＣＡＧＴＴＧＡＧＧＴＧＧＡＴＴＡ（配列番号６７）
Ｒ２：ＧＧＡＡＴＧＣＧＧＴＡＧＴＡＧＴＴＡＧＧ（配列番号６８）
Ｐ４：ＡＡＣＣＡＧＡＣＡＡＡＴＣＧＣＴＣＣＡＣＣＡＡＣ（配列番号６９）
Ｆ４：ＣＧＧＡＣＡＧＧＡＴＴＧＡＣＡＧＡＴＴ（配列番号７０）
Ｒ４：ＣＣＡＧＡＧＴＣＴＣＧＴＴＣＧＴＴＡＴＣ（配列番号７１）
アッセイ１および２を、１×ｄｄＰＣＲ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ ｆｏｒ Ｐｒｏｂｅｓ（ｄＵＴＰなし、ＢｉｏＲａｄ）、２５０ｎＭの各プローブ、９００ｎＭの各プライマー、２０Ｕ／μＬのＨｉｎｄ－ＩＩＩ ＨＦ（ＮＥＢ）および０．２２５ｎｇの細胞ｇＤＮＡを含有する２４μＬの反応液中で多重化した。ＱＸ１００液滴生成器（ＢｉｏＲａｄ）を使用して液滴を生成した。サイクル条件は以下の通りであった：９５℃（２℃／ｓランプ）１０分を１サイクル、９４℃（２℃／ｓランプ）１０秒を４５サイクル、５９．２℃（２℃／ｓランプ）３０秒、７２Ｃ（０．２℃／ｓランプ）１分、９８℃１０分を１サイクル、４℃保持。ＱＸ２００液滴リーダー（ＢｉｏＲａｄ）を使用して液滴を分析し、ＱｕａｎｔａＳｏｆｔ分析ソフトウェア（ＢｉｏＲａｄ）を使用してデータを取得および分析した。
アッセイ２および３を、１×ｄｄＰＣＲ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ ｆｏｒ Ｐｒｏｂｅｓ（ｄＵＴＰなし、ＢｉｏＲａｄ）、２５０ｎＭの各プローブ、９００ｎＭの各プライマー、２０Ｕ／μＬのＨｉｎｄ－ＩＩＩ ＨＦ（ＮＥＢ）および０．２２５ｎｇの細胞ｇＤＮＡを含有する２４μＬの反応液中で多重化した。ＱＸ１００液滴生成器（ＢｉｏＲａｄ）を使用して液滴を生成した。サイクル条件は以下の通りであった：９５℃（２℃／ｓランプ）１０分を１サイクル、９４℃（２℃／ｓランプ）１０秒を４５サイクル、５９．２℃（２℃／ｓランプ）３０秒、７２Ｃ（０．２℃／ｓランプ）１分、９８℃１０分を１サイクル、４℃保持。ＱＸ２００液滴リーダー（ＢｉｏＲａｄ）を使用して液滴を分析し、ＱｕａｎｔａＳｏｆｔ分析ソフトウェア（ＢｉｏＲａｄ）を使用してデータを取得および分析した。
トランスフェクション後７日目に、Ｓｅａｈｏｒｓｅ ＸＦｅ９６ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）での分析のために、４ｅ３細胞を９６ウェルＳｅａｈｏｒｓｅ細胞培養マイクロプレートに蒔いた。また、ＸＦセンサーカートリッジを、非ＣＯ２インキュベーター中で一晩、２００μＬ／ウェルのＳｅａｈｏｒｓｅ ＸＦ Ｃａｌｉｂｒａｎｔで水和させた。次の日（８日目）、９７ｍＬのＳｅａｈｏｒｓｅアッセイ培地（ＤＭＥＭ）を１ｍＬの１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１ｍＬの２ｍＭグルタミンおよび１ｍＬの１０ｍＭグルコースと合わせた。細胞を調製した培地で２回洗浄し、次いで非ＣＯ２インキュベーターに１時間入れた。１つのＣｅｌｌ Ｍｉｔｏ Ｓｔｒｅｓｓ Ｔｅｓｔ Ｋｉｔを製造者の指示に従って再構成した。溶液は、オリゴマイシン（１５ｕＭ）、ＦＣＣＰ（５ｕＭ）、およびロテノン／アンチマイシンＡ（５ｕＭ）から構成されていた。Ｃｅｌｌ Ｍｉｔｏ Ｓｔｒｅｓｓ Ｔｅｓｔでは、水和カートリッジのすべてのポートＡに２０μＬのオリゴマイシン溶液を添加し、すべてのポートＢに２２μＬのＦＣＣＰ溶液を添加し、すべてのポートＣに２４μＬのロテノン／アンチマイシンＡを添加した。ＡＴＰ速度アッセイのために、同じストック溶液を使用した。このアッセイのために、２０μＬのオリゴマイシン溶液をすべてのポートＡに添加し、２２μＬのロテノン／アンチマイシンＡ溶液をすべてのポートＢに添加し、２４μＬのＳｅａｈｏｒｓｅアッセイ培地をすべてのポートＣに添加した。ベースライン、オリゴマイシン、ＦＣＣＰ、およびロテノン／アンチマイシンＡについて４回の測定サイクル（０３：００混合、００：００待機、０３：００測定）でアッセイを実行した。ＯＣＲおよびＰＥＲ値は、Ｗａｖｅソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して分析した。Ｃｅｌｌ Ｍｉｔｏ Ｓｔｒｅｓｓ ＴｅｓｔおよびＡＴＰ Ｒａｔｅ Ａｓｓａｙ Ｒｅｐｏｒｔｓは、Ｗａｖｅソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して作成した。
アッセイ完了後、細胞をＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｈ３５７０）で標準培地中１：５０００希釈で染色した。細胞を３７Ｃで２０分間インキュベートし、次いでＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ Ｐｉｃｏ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用してイメージサイトメトリーによって分析した。次いで、ＯＣＲおよびＰＥＲ値を、Ｗａｖｅソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して細胞数に対して正規化した。
図２７に示すように、より高用量のミトコンドリア標的化遺伝子操作メガヌクレアーゼ（ＭＴＥＭ）は、ｍｔＤＮＡコピーのより大きな損失をもたらした。このｍｔＤＮＡ低減は、１日目にのみ２つの最高ｍＲＮＡ用量で統計的に有意であった（表９）。観察されたｍｔＤＮＡ枯渇は、変異型ｍｔＤＮＡの選択的切断に対応した。３つの最高ｍＲＮＡ用量で処理した細胞は、すべての時点で変異型ｍｔＤＮＡの有意な損失を示した（表９、表１０、表１１）。変異型ｍｔＤＮＡの排除後、残りのＷＴ ｍｔＤＮＡは細胞を再増殖させることが見出された（図２８および図２９）。７日目までに、最高ｍＲＮＡ用量で処理した細胞には０．５％の変異型ｍｔＤＮＡしか残っていなかった（図２９）。すべての時点で２つの最高ｍＲＮＡ用量で、ならびに４日目および７日目に１ｅ３ ＲＮＡコピー／細胞用量で処理した細胞中に存在するＷＴ ｍｔＤＮＡの量に有意な増加があった（表９、表１０、表１１）。
Figure 2024514939000019
Figure 2024514939000020
Figure 2024514939000021
Ｃｅｌｌ Ｍｉｔｏ Ｓｔｒｅｓｓ Ｔｅｓｔでは、ヘテロプラスミーの完全なシフトを示したＭＴＥＭ処理細胞（１ｅ５ ＲＮＡコピー／細胞）は、ＧＦＰ処理細胞よりも基礎呼吸が２．１５ｘ増加し、最大呼吸が２．０３ｘ増加した（図３０）。
ＡＴＰ速度アッセイでは、ヘテロプラスミーの完全なシフトを示したＭＴＥＭ処理細胞（１ｅ５ ＲＮＡコピー／細胞）は、ＧＦＰ処理細胞よりもｍｉｔｏＡＴＰ産生が２．２３ｘ増加した（図３１）。
ヘテロプラスミーは、本明細書に記載されるＭＩＴ ２５－２６メガヌクレアーゼを使用して、高パーセンテージの変異型異常サイブリッド細胞で非常に効果的にシフトした。このシフトは、基礎呼吸速度（図３２）、最大呼吸速度（図３３）、およびミトコンドリアＡＴＰ産生（図３４）の有意な機能的改善をもたらした。ミトコンドリア標的化遺伝子操作メガヌクレアーゼで処理された細胞は、酸素を使用して未処理細胞よりも容易に酸化的リン酸化を介してＡＴＰを生成することができる。
実施例１０：ミトコンドリア標的化メガヌクレアーゼｍＲＮＡトランスフェクション後の９６％ ｍ．３２４３Ｇ変異型細胞における分子変化
この実験の目的は、ヘテロプラズミックＭＥＬＡＳ変異（ｍ．３２４３Ａ＞Ｇ）を有する細胞株におけるＭＩＴ ２５－２６ｘ．９１ ２５９ Ｈ＞Ｑメガヌクレアーゼの有効性を示すこと、およびメガヌクレアーゼによって誘導された一過性のｍｔＤＮＡ枯渇が細胞呼吸に負の影響を及ぼしたかどうかを判定することであった。使用される細胞株は、野生型ｍｔＤＮＡと変異型ｍｔＤＮＡの両方を含むサイブリッド（細胞質ハイブリッド）である。特に、細胞株は９６％変異型であり、すなわち、ｍｔＤＮＡ集団の９６％が変異型対立遺伝子を含有し、６％が野生型対立遺伝子を含有する。
Ｌｏｎｚａ ４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）（ＳＦ緩衝液、条件ＣＡ－１３７）を使用して、８ｅ５ ＭＥＬＡＳサイブリッド細胞に用量滴定にわたって遺伝子操作メガヌクレアーゼｍＲＮＡをヌクレオフェクトした。遺伝子操作メガヌクレアーゼｍＲＮＡ用量は、１ｅ５ ＲＮＡコピー／細胞で開始した。これは、合計８ｅ１０ ＲＮＡコピー、または９４．８ｎｇのＲＮＡに変換される。次いで、ｍＲＮＡを１ｅ２ ＲＮＡコピー／細胞に至るまで１：１０で段階希釈した。ｇＤＮＡ抽出およびＳｅａｈｏｒｓｅ Ｃｅｌｌ Ｍｉｔｏ Ｓｔｒｅｓｓ Ｔｅｓｔ評価のために、ヌクレオフェクション後１、３および７日目に細胞を収集した。Ｍａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｂｌｏｏｄ ＱｕｉｃｋＰｕｒｅキットを使用してｇＤＮＡを単離した。
液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を利用して、ｍｔＤＮＡのヘテロプラスミーレベル、ならびに核ＤＮＡ（ｎｕＤＮＡ）に対するｍｔＤＮＡコピー数を決定した。これは、結合部位を取り囲むアンプリコンを生成するためにＰ１、Ｆ１およびＲ１を使用し（アッセイ１）、ｍｔＤＮＡカウンターとして作用する参照アンプリコンを生成するためにＰ２、Ｆ２およびＲ２を使用し（アッセイ２）、ｎｕＤＮＡカウンターとして作用する核参照アンプリコンを生成するためにＰ４、Ｆ４およびＲ４を使用して達成された（アッセイ３）。アッセイ２の陽性液滴の数に対するアッセイ１の陽性液滴の数を使用して、細胞中のヘテロプラスミーのレベルを決定した。アッセイ３の陽性液滴の数に対するアッセイ２の陽性液滴の数を使用して、細胞中のｍｔＤＮＡコピー数を決定した。次いで、この比をＭＴＳ－ＧＦＰ（対照）条件に基づいて正規化し、得られた正規化されたコピー数にヘテロプラスミーレベルを乗算して、図３５、図３７および図３９に示されるデータを生成した。これらのグラフにおいて、バーの高さは、ＭＴＳ－ＧＦＰ細胞に対するｍｔＤＮＡ損失を示す。バー内で、灰色の相対的パーセンテージは、存在する野生型ｍｔＤＮＡの相対的パーセンテージに対応し、黒色の相対的パーセンテージは、存在する変異型ｍｔＤＮＡの相対的パーセンテージに対応する。
Ｐ１：ＴＧＧＣＡＧＧＧＣＣＣＧＧＴ（配列番号６３）
Ｆ１：ＣＣＣＡＡＧＡＡＣＡＧＧＧＴＴＴＧＴＴＡＡＧ（配列番号６４）
Ｒ１：ＧＧＡＡＴＧＣＣＡＴＴＧＣＧＡＴＴＡＧ（配列番号６５）
Ｐ２：ＡＧＣＡＧＴＴＣＴＡＣＣＧＴＡＣＡＡＣＣＣＴＡＡＣＡ（配列番号６６）
Ｆ２：ＧＧＣＡＧＴＴＧＡＧＧＴＧＧＡＴＴＡ（配列番号６７）
Ｒ２：ＧＧＡＡＴＧＣＧＧＴＡＧＴＡＧＴＴＡＧＧ（配列番号６８）
Ｐ４：ＡＡＣＣＡＧＡＣＡＡＡＴＣＧＣＴＣＣＡＣＣＡＡＣ（配列番号６９）
Ｆ４：ＣＧＧＡＣＡＧＧＡＴＴＧＡＣＡＧＡＴＴ（配列番号７０）
Ｒ４：ＣＣＡＧＡＧＴＣＴＣＧＴＴＣＧＴＴＡＴＣ（配列番号７１）
アッセイ１および２を、１×ｄｄＰＣＲ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ ｆｏｒ Ｐｒｏｂｅｓ（ｄＵＴＰなし、ＢｉｏＲａｄ）、２５０ｎＭの各プローブ、９００ｎＭの各プライマー、２０Ｕ／μＬのＨｉｎｄ－ＩＩＩ ＨＦ（ＮＥＢ）および０．２２５ｎｇの細胞ｇＤＮＡを含有する２４μＬの反応液中で多重化した。ＱＸ１００液滴生成器（ＢｉｏＲａｄ）を使用して液滴を生成した。サイクル条件は以下の通りであった：９５℃（２℃／ｓランプ）１０分を１サイクル、９４℃（２℃／ｓランプ）１０秒を４５サイクル、５９．２℃（２℃／ｓランプ）３０秒、７２Ｃ（０．２℃／ｓランプ）１分、９８℃１０分を１サイクル、４℃保持。ＱＸ２００液滴リーダー（ＢｉｏＲａｄ）を使用して液滴を分析し、ＱｕａｎｔａＳｏｆｔ分析ソフトウェア（ＢｉｏＲａｄ）を使用してデータを取得および分析した。
アッセイ２および３を、１×ｄｄＰＣＲ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ ｆｏｒ Ｐｒｏｂｅｓ（ｄＵＴＰなし、ＢｉｏＲａｄ）、２５０ｎＭの各プローブ、９００ｎＭの各プライマー、２０Ｕ／μＬのＨｉｎｄ－ＩＩＩ ＨＦ（ＮＥＢ）および０．２２５ｎｇの細胞ｇＤＮＡを含有する２４μＬの反応液中で多重化した。ＱＸ１００液滴生成器（ＢｉｏＲａｄ）を使用して液滴を生成した。サイクル条件は以下の通りであった：９５℃（２℃／ｓランプ）１０分を１サイクル、９４℃（２℃／ｓランプ）１０秒を４５サイクル、５９．２℃（２℃／ｓランプ）３０秒、７２Ｃ（０．２℃／ｓランプ）１分、９８℃１０分を１サイクル、４℃保持。ＱＸ２００液滴リーダー（ＢｉｏＲａｄ）を使用して液滴を分析し、ＱｕａｎｔａＳｏｆｔ分析ソフトウェア（ＢｉｏＲａｄ）を使用してデータを取得および分析した。
トランスフェクション後０、２および６日目に、４ｅ３細胞を、Ｓｅａｈｏｒｓｅ ＸＦｅ９６ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）での分析のために９６ウェルＳｅａｈｏｒｓｅ細胞培養マイクロプレートに蒔いた。また、ＸＦセンサーカートリッジを、非ＣＯ２インキュベーター中で一晩、２００μＬ／ウェルのＳｅａｈｏｒｓｅ ＸＦ Ｃａｌｉｂｒａｎｔで水和させた。次の日（１、３および７日目）、９７ｍＬのＳｅａｈｏｒｓｅアッセイ培地（ＤＭＥＭ）を１ｍＬの１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１ｍＬの２ｍＭグルタミンおよび１ｍＬの１０ｍＭグルコースと合わせた。細胞を調製した培地で２回洗浄し、次いで非ＣＯ２インキュベーターに１時間入れた。１つのＣｅｌｌ Ｍｉｔｏ Ｓｔｒｅｓｓ Ｔｅｓｔ Ｋｉｔを製造者の指示に従って再構成した。溶液は、オリゴマイシン（１５ｕＭ）、ＦＣＣＰ（５ｕＭ）、およびロテノン／アンチマイシンＡ（５ｕＭ）から構成されていた。Ｃｅｌｌ Ｍｉｔｏ Ｓｔｒｅｓｓ Ｔｅｓｔでは、水和カートリッジのすべてのポートＡに２０μＬのオリゴマイシン溶液を添加し、すべてのポートＢに２２μＬのＦＣＣＰ溶液を添加し、すべてのポートＣに２４μＬのロテノン／アンチマイシンＡを添加した。ベースライン、オリゴマイシン、ＦＣＣＰ、およびロテノン／アンチマイシンＡについて４回の測定サイクル（０３：００混合、００：００待機、０３：００測定）でアッセイを実行した。ＯＣＲ値は、Ｗａｖｅソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して分析した。Ｃｅｌｌ Ｍｉｔｏ Ｓｔｒｅｓｓ Ｔｅｓｔ Ｒｅｐｏｒｔは、Ｗａｖｅソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して作成した。
アッセイ完了後、標準培地中１：５０００希釈で、細胞をＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｈ３５７０）で染色した。細胞を３７Ｃで２０分間インキュベートし、次いでＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ Ｐｉｃｏ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用してイメージサイトメトリーによって分析した。次いで、ＯＣＲ値を、Ｗａｖｅソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して細胞数に対して正規化した。
図３５に示すように、より高用量のミトコンドリア標的化遺伝子操作メガヌクレアーゼ（ＭＴＥＭ）は、ｍｔＤＮＡコピーのより大きな損失をもたらした。このｍｔＤＮＡ低減は、１日目にのみ２つの最高ｍＲＮＡ用量で統計的に有意であった（表１２）。観察されたｍｔＤＮＡ枯渇は、変異型ｍｔＤＮＡの選択的切断に対応した。３つの最高ｍＲＮＡ用量で処理した細胞は、すべての時点で変異型ｍｔＤＮＡの有意な損失を示した（表１２、表１３、表１４）。変異型ｍｔＤＮＡの排除後、残りのＷＴ ｍｔＤＮＡは細胞を再増殖させることが見出された（図３７および図３９）。７日目までに、最高ｍＲＮＡ用量で処理した細胞には０．３％の変異型ｍｔＤＮＡしか残っていなかった（図３９）。すべての時点で、３つの最高ｍＲＮＡ用量で処理した細胞中に存在するＷＴ ｍｔＤＮＡの量の有意な増加があった（表１２、表１３、表１４）。
１日目のＣｅｌｌ Ｍｉｔｏ Ｓｔｒｅｓｓ Ｔｅｓｔでは、ＭＴＥＭ処理細胞は、基礎ＯＣＲまたは最大ＯＣＲのいずれにおいても統計学的に有意な減少を示さなかった（表１２）。３日目までに、呼吸は、３つの最高ｍＲＮＡ用量で処理した細胞で有意に改善した（表１３）。７日目までに、すべての細胞集団が呼吸の統計学的に有意な改善を示した（図３６、図３８、および図４０、表１２、表１３、および表１４）。
ヘテロプラスミーは、本明細書に記載のＭＩＴ ２５－２６メガヌクレアーゼを使用して、高パーセンテージの変異型サイブリッド細胞で効果的にシフトした。誘導されたシフトは、呼吸に負の影響を及ぼさない一過性のｍｔＤＮＡ枯渇をもたらした（図３６、図３８および図４０）。３日目までに、処理細胞において基礎呼吸および最大呼吸の改善が観察された（図３８）。ミトコンドリア標的化遺伝子操作メガヌクレアーゼで処理された細胞は、酸素を使用して未処理細胞よりも容易に酸化的リン酸化を介してＡＴＰを生成することができ、このプロセスは一過性のｍｔＤＮＡ枯渇中に影響を受けない。
Figure 2024514939000022
Figure 2024514939000023
Figure 2024514939000024
実施例１１：オリゴ捕捉アッセイによるメガヌクレアーゼオフターゲティング分析
この実験の目的は、２つの異なるＭＩＴ ２５－２６ヌクレアーゼによって切断され得る潜在的な核オフターゲット部位を決定することであった。ＭＩＴ ２５－２６ｘ．９１ ２５９ Ｈ＞ＱおよびＭＩＴ ２５－２６Ｌ３５ １９Ａ＞Ｓ。以前のデータは、タンパク質のＮ末端に含まれるＭＴＰがミトコンドリア局在化を達成するのに非常に効果的であることを示唆しているが、本発明者らは、試験された遺伝子操作メガヌクレアーゼが核ＤＮＡ内にオフターゲットＤＳＢを導入しないことを実験的に証明することに関心がある。
ヌクレアーゼに対する核オフターゲット編集を正確に決定するためには、陽性対照としてオンターゲット配列を有する必要がある。ＭＩＴ ２５－２６結合部位はｍｔＤＮＡにあるため、核ＤＮＡに内因性オンターゲット部位は存在しない。したがって、Ｆｌｐ－Ｉｎ ２９３レポーター細胞株を使用して、ＭＩＴ ２５－２６結合部位をヒト細胞株の核染色体上に導入した。１．５ｅ６のこれらのＦｌｐ－Ｉｎ ２９３レポーター細胞に、Ｎｅｏｎトランスフェクションシステム（１００ｕＬチップ、条件１１）を使用して、１．５ｕｇの遺伝子操作メガヌクレアーゼｍＲＮＡおよび０．７５ｕｇのｄｓＤＮＡオリゴをエレクトロポレーションした。この場合、使用したメガヌクレアーゼ構築物は、タンパク質のＮ末端にＮＬＳを含有していた。２つの異なるメガヌクレアーゼ：ＭＩＴ ２５－２６ｘ．９１ ２５９Ｈ＞ＱおよびＭＩＴ ２５－２５６Ｌ．３５ １９Ａ＞Ｓを使用した。メガヌクレアーゼを含まない対照試料をｄｓＤＮＡオリゴのみでトランスフェクトした。すべての条件を二連でアッセイした。メガヌクレアーゼｍＲＮＡとｄｓＤＮＡオリゴとの同時トランスフェクションは、オリゴの挿入によって核ＤＳＢを修復することを可能にする。トランスフェクトした細胞を、ｇＤＮＡ抽出およびオリゴ捕捉分析のためにエレクトロポレーションの２日後に収集した。次いで、切断された部位を、以下に記載されるオリゴ捕捉アッセイを使用して同定することができる。
ＧＵＩＤＥ－ｓｅｑと同様に、オリゴ捕捉アッセイは、細胞のゲノムＤＮＡ内の切断部位でオリゴヌクレオチドを捕捉することにより、ＭＩＴ ２５－２６メガヌクレアーゼによって作り出される潜在的なオフターゲット部位を同定する。ＧＵＩＤＥ－ｓｅｑは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９によって生成されたＤＮＡ切断のために開発され、この技術を本発明のヌクレアーゼに適用するために、化学および分析に対するいくつかの重要な変更が存在する。ＣＲＩＳＰＲ－ｃａｓ９とは異なり、本明細書に記載の遺伝子操作メガヌクレアーゼは、４塩基対３´オーバーハングを生成する。この違いに対応するために、オリゴ捕捉に使用されるオリゴヌクレオチドは、ＭＩＴ ２５－２６メガヌクレアーゼで生成されたオーバーハングと適合し得るランダム化された４塩基対のオーバーハングを有する。平滑末端よりもむしろ粘着末端をライゲーションする効率が高いため、より高い挿入頻度が観察される。上記のように、ヌクレアーゼおよび二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドをコードするｍＲＮＡを細胞にトランスフェクトした。２日後、これらの細胞からゲノムＤＮＡを単離し、超音波処理してＤＮＡをより小さいサイズにせん断した。オリゴヌクレオチドアダプターをせん断されたＤＮＡにライゲーションし、ＰＣＲを使用して、一端にアダプターを含み、他端に捕捉されたオリゴヌクレオチドを含む任意のＤＮＡ片を増幅した。増幅したＤＮＡを精製し、標準的な市販キットを使用して配列決定ライブラリーを調製した。
配列決定ライブラリーを、Ｖ２ ２×１５０キットを使用してＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑで実行した。データをフィルタリングし、オリゴヌクレオチドを捕捉した有効な部位について分析し、潜在的なオフターゲット部位を予測する。ここでも、プロトコルは、ＣＲＩＳＰＲ－ｃａｓ９に使用されるＰＡＭ検索からＭＩＴ ２５－２６メガヌクレアーゼ検索に調整する必要があった。開発されたソフトウェアは、各配列をチェックして、その配列に隣接するアダプターおよび捕捉されたオリゴが存在することを確認して、それが有効なリードであることを検証する。ソフトウェアはまた、ＰＣＲの重複をチェックし、ＰＣＲバイアスの低減を助けるために同一であるリードを除去する。配列リードを参照ゲノムにアラインメントし、１０００塩基対ウィンドウ内のグループ化された配列を潜在的なＭＩＴ ２５－２６メガヌクレアーゼ部位についてスキャンする。
各ＭＩＴ ２５－２６メガヌクレアーゼは、連結された二量体である。各モノマーは、２つの半部位の間の中央に４塩基対のスペーサーを有する９塩基対の半部位を認識する。ソフトウェアは、許容されるギャップのない各半部位について最も近い配列一致を探す。ＭＩＴ ２５－２６メガヌクレアーゼは、一般に標的部位のこれらの位置でより大量の縮重を許容することができるため、中間の４つの塩基対はオフターゲット選択では考慮されない。ソフトウェアは、組み合わされた半部位における塩基ミスマッチの数を含む潜在的なオフターゲット部位のリストを出力するが、中央の４つの塩基対ミスマッチをカウントしない。ソフトウェアは、６つを超える塩基対がミスマッチであると同定されたオフターゲットを排除するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９とは異なり、任意のミスマッチフィルタに基づいてオフターゲットを排除しない。代わりに、ゲノム内の脆弱なスポットまたはホットスポットでのオリゴのランダムな捕捉から生成されるバックグラウンドノイズは、２つの方法で低減され得る。第一に、未処理のモック試料もオリゴ捕捉に供され、ヌクレアーゼが存在しない組込み部位のウィンドウがヌクレアーゼ含有試料から差し引かれ得る。本発明者らはまた、アッセイを三連で実行し、３回の反復のうちの少なくとも２回で反復しない部位を排除することが、ランダムな組み込みノイズを経験的に除去するための良好な方法であることを見出した。
リードカウントは特定の部位での切断頻度と直接相関しないが、一般に、より頻繁に発生することから潜在的により懸念されるまたはより有効であるオフターゲットを強調することができる。潜在的に有効なオフターゲット部位の数の尺度として、オリゴ捕捉データをグラフによって視覚化する１つの方法を図４１に示す。特定のヌクレアーゼによって生成された各オフターゲットは、その部位にアラインメントされた固有の配列リードの数に基づいてプロットされる。推定オフターゲット部位と意図された部位との間の塩基対ミスマッチの数は、意図された標的部位（丸）により類似する部位を示すより濃い色のカラースケールによって示される。高い特異性を有するヌクレアーゼの場合、意図された部位は、最高のリードカウントを有するべきである。より良好なヌクレアーゼは、より高いカウント部位（グラフの右側）と高い類似性を有する部位（より濃い色の点）の両方を除去する。
実施例１２：成長速度に対するグルコース対ガラクトースでの培養の効果
この実験の目的は、グルコース含有培地ではなくガラクトース中で細胞を成長させる場合に、遺伝子操作メガヌクレアーゼのトランスフェクションが細胞増殖にどのように影響するかを決定することであった。グルコースの存在下では、培養中のほとんどの細胞は、酸素および機能的ミトコンドリアが豊富であるにもかかわらず、ＡＴＰ産生に関してほぼ排他的に解糖に依存する。したがって、一過性のｍｔＤＮＡ枯渇の機能的転帰は、細胞がＡＴＰ産生に関してミトコンドリア機能に依存しなければならないような細胞培養環境の変化なしでは、培養細胞中で明確に評価することができない。これを行うために、細胞をグルコース含有培地からガラクトース含有培地に移行させなければならない。ガラクトースのピルビン酸への酸化はグルコースよりも遅く、ＡＴＰの正味の増加をもたらさない。したがって、ガラクトースで成長した細胞は、ＡＴＰ産生のためにＯＸＰＨＯＳに頼らざるを得ない。
９６％変異型ｍ．３２４３Ａ＞Ｇ ｍｔＤＮＡを含む８ｅ５ＭＥＬＡＳサイブリッド細胞を、Ｌｏｎｚａ ４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）（ＳＦ緩衝液、条件ＣＡ－１３７）を使用して遺伝子操作メガヌクレアーゼｍＲＮＡでヌクレオフェクトした。使用した遺伝子操作メガヌクレアーゼは、１ｅ５ ＲＮＡコピー／細胞（９４．８ｎｇ ｍＲＮＡ）の用量のＭＩＴ ２５－２６ｘ．９１ ２５９Ｈ＞Ｑであった。トランスフェクトされていない対照、ならびにトランスフェクトされていない０％変異型細胞株を使用した。トランスフェクションの直後に、すべての細胞を、５ｍＭガラクトースを含有する培地に蒔いた。合計２ｅ３細胞／ウェルを４つの９６ウェル平底プレートに播種した。
トランスフェクション後１、２、３および４日目に、１プレートの細胞を、ガラクトース含有培地中１：１０，０００希釈でＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｈ３５７０）で染色した。細胞を３７Ｃで１０分間インキュベートし、次いでＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ Ｐｉｃｏ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用してイメージサイトメトリーによって分析して、細胞数を決定した（図４２）。４日目までに、９６％変異型未処理コホートに合計５，６６４±４２９個の細胞、９６％変異型処理コホートに１０，４３８±９６８個の細胞、および０％変異型未処理コホートに２０，８９１±２，３２０個の細胞が存在した。細胞数データを使用して、各細胞集団の倍加時間を決定した（図４３）。２日目に、倍加時間は、１．７５日（９６％変異型未処理）、２．４４日（９６％変異型処理）および１．００日（０％変異型処理）であった。４日目までに、倍加時間は、３．５５日（９６％変異型未処理）、１．３７日（９６％変異型処理）および１．６０（０％変異型未処理）であった。
ガラクトースの存在下では、未処理の９６％変異型サイブリッド細胞は、０％変異型（ＷＴ）細胞と比較して成長速度の障害を示す。この効果は、ミトコンドリア標的化遺伝子操作メガヌクレアーゼでの処理によって部分的に救済される（図４２）。
実施例１３：マウス異種移植腫瘍モデルにおけるヘテロプラスミーに対するメガヌクレアーゼ編集の効果
この実験の目的は、インビボでｍ．３２４３Ａ＞Ｇヘテロプラスミーをシフトさせる有効性を決定することであった。残念ながら、この特定の変異に現在利用可能な動物モデルはない。インビトロで変異を研究するために利用される細胞はがん細胞株に由来するため、本発明者らは、異種移植マウスモデルを生成するために細胞を使用することができると仮定した。異種移植片を生成し、次いで遺伝子操作メガヌクレアーゼをキャプシド化したＡＡＶ９でマウスを全身的に処置することにより、本発明者らは、腫瘍におけるヘテロプラスミーシフトが可能であるかどうかを確認しようとした。
５ｅ４の９６％ ｍ．３２４３Ａ＞Ｇ変異型サイブリッド細胞をマトリゲルと１：１で混合し、ヌードマウスの右側腹部に総容量２００ｕＬで皮下注射した。合計３２匹の動物に注射した。カリパス測定によって腫瘍成長の進行を隔週で監視した。１８日目に、＜約２００ｍｍ３の腫瘍サイズに基づいて、合計１６匹の動物をＡＡＶ９注射のために選択した（図４５）。使用したメガヌクレアーゼはＭＩＴ ２５－２６ｘ．９１であった。マウスを、ＰＢＳ（ｎ＝４）、５ｅ１２ ＶＧ／ｋｇ（ｎ＝４）、１ｅ１３ ＶＧ／ｋｇ（ｎ＝４）、または５ｅ１３ ＶＧ／ｋｇ（ｎ＝４）のいずれかを注射するための４つのコホートにランダムに割り当てた。マウスの右眼に後眼窩注射した。研究の残りを通して腫瘍成長を監視し、すべての動物を３５日目に屠殺した。腫瘍の４つの小さな切片（約３ｍｍ）をｇＤＮＡ単離のために採取した。研究設計の図を図４４に示す。
液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を利用して、ｍｔＤＮＡのヘテロプラスミーレベル、ならびに核ＤＮＡ（ｎｕＤＮＡ）に対するｍｔＤＮＡコピー数を決定した。これは、結合部位を取り囲むアンプリコンを生成するためにＰ１、Ｆ１およびＲ１を使用し（アッセイ１）、ｍｔＤＮＡカウンターとして作用する参照アンプリコンを生成するためにＰ２、Ｆ２およびＲ２を使用し（アッセイ２）、ｎｕＤＮＡカウンターとして作用する核参照アンプリコンを生成するためにＰ４、Ｆ４およびＲ４を使用して達成された（アッセイ３）。アッセイ２の陽性液滴の数に対するアッセイ１の陽性液滴の数を使用して、細胞中のヘテロプラスミーのレベルを決定した。アッセイ３の陽性液滴の数に対するアッセイ２の陽性液滴の数を使用して、細胞中のｍｔＤＮＡコピー数を決定した。
Ｐ１：ＴＧＧＣＡＧＧＧＣＣＣＧＧＴ（配列番号６３）
Ｆ１：ＣＣＣＡＡＧＡＡＣＡＧＧＧＴＴＴＧＴＴＡＡＧ（配列番号６４）
Ｒ１：ＧＧＡＡＴＧＣＣＡＴＴＧＣＧＡＴＴＡＧ（配列番号６５）
Ｐ２：ＡＧＣＡＧＴＴＣＴＡＣＣＧＴＡＣＡＡＣＣＣＴＡＡＣＡ（配列番号６６）
Ｆ２：ＧＧＣＡＧＴＴＧＡＧＧＴＧＧＡＴＴＡ（配列番号６７）
Ｒ２：ＧＧＡＡＴＧＣＧＧＴＡＧＴＡＧＴＴＡＧＧ（配列番号６８）
Ｐ４：ＡＡＣＣＡＧＡＣＡＡＡＴＣＧＣＴＣＣＡＣＣＡＡＣ（配列番号６９）
Ｆ４：ＣＧＧＡＣＡＧＧＡＴＴＧＡＣＡＧＡＴＴ（配列番号７０）
Ｒ４：ＣＣＡＧＡＧＴＣＴＣＧＴＴＣＧＴＴＡＴＣ（配列番号７１）
アッセイ１および２を、１ｘ ｄｄＰＣＲ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ ｆｏｒ Ｐｒｏｂｅｓ（ｄＵＴＰなし、ＢｉｏＲａｄ）、２５０ｎＭの各プローブ、９００ｎＭの各プライマー、２０Ｕ／μＬのＨｉｎｄ－ＩＩＩ ＨＦ（ＮＥＢ）および０．２２５ｎｇの細胞ｇＤＮＡを含有する２４μＬの反応液中で多重化した。ＱＸ１００液滴生成器（ＢｉｏＲａｄ）を使用して液滴を生成した。サイクル条件は以下の通りであった：９５℃（２℃／ｓランプ）１０分を１サイクル、９４℃（２℃／ｓランプ）１０秒を４５サイクル、５９．２℃（２℃／ｓランプ）３０秒、７２Ｃ（０．２℃／ｓランプ）１分、９８℃１０分を１サイクル、４℃保持。液滴をＱＸ２００液滴リーダー（ＢｉｏＲａｄ）を使用して分析し、ＱｕａｎｔａＳｏｆｔ分析ソフトウェア（ＢｉｏＲａｄ）を使用してデータを取得および分析した。
アッセイ２および３を、１ｘ ｄｄＰＣＲ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ ｆｏｒ Ｐｒｏｂｅｓ（ｄＵＴＰなし、ＢｉｏＲａｄ）、２５０ｎＭの各プローブ、９００ｎＭの各プライマー、２０Ｕ／μＬのＨｉｎｄ－ＩＩＩ ＨＦ（ＮＥＢ）および０．２２５ｎｇの細胞ｇＤＮＡを含有する２４μＬの反応液中で多重化した。ＱＸ１００液滴生成器（ＢｉｏＲａｄ）を使用して液滴を生成した。サイクル条件は以下の通りであった：９５℃（２℃／ｓランプ）１０分を１サイクル、９４℃（２℃／ｓランプ）１０秒を４５サイクル、５９．２℃（２℃／ｓランプ）３０秒、７２Ｃ（０．２℃／ｓランプ）１分、９８℃１０分を１サイクル、４℃保持。ＱＸ２００液滴リーダー（ＢｉｏＲａｄ）を使用して液滴を分析し、ＱｕａｎｔａＳｏｆｔ分析ソフトウェア（ＢｉｏＲａｄ）を使用してデータを取得および分析した。
ＡＡＶ注射の時点で、注射した動物の腫瘍体積は４７～２１７ｍｍ３であった（図４５）。図４６に示すように、単離された腫瘍試料中に存在するＷＴ ｍｔＤＮＡの平均パーセンテージは、６．４７％（ＰＢＳ）、７．８５％（５ｅ１２ ＶＧ／ｋｇ）、７．９２％（１ｅ１３ ＶＧ／ｋｇ）、および１３．８９％（５ｅ１３ ＶＧ／ｋｇ）であった。図４６に示すように、５ｅ１３ ＶＧ／ｋｇコホートにおけるＷＴ ｍｔＤＮＡのパーセンテージは、ＰＢＳ処置マウスと比較して統計学的に有意であった。図４７に示すように、１８Ｓ ｒＤＮＡに対する平均ｍｔＤＮＡコピー数は、６．６１（ＰＢＳ）、７．７８（５ｅ１２ ＶＧ／ｋｇ）、６．１０（１ｅ１３ ＶＧ／ｋｇ）、および７．４１（５ｅ１３ ＶＧ／ｋｇ）であった。ＡＡＶ処置コホートのいずれもｍｔＤＮＡコピー数の有意な変化を示さなかった。
異種移植マウスモデルを使用すると、遺伝子操作メガヌクレアーゼをキャプシド化したＡＡＶ９は、インビボでｍ．３２４３Ａ＞Ｇヘテロプラスミーをシフトさせることができる。
実施例１４ ミトコンドリア標的化メガヌクレアーゼｍＲＮＡトランスフェクション後の８５％変異型ｍ．３２４３Ｇ変異型細胞における分子変化
この実験の目的は、ヘテロプラズミックＭＥＬＡＳ変異（ｍ．３２４３Ａ＞Ｇ）を有する細胞株におけるＭＩＴ ２５－２６ｘ．９１ ２５９ Ｈ＞Ｑメガヌクレアーゼの有効性を示すこと、およびメガヌクレアーゼによって誘導された一過性のｍｔＤＮＡ枯渇が細胞呼吸に負の影響を及ぼしたかどうかを判定することであった。使用される細胞株は、野生型ｍｔＤＮＡと変異型ｍｔＤＮＡの両方を含むサイブリッド（細胞質ハイブリッド）である。細胞株は特に８５％変異型であり、すなわち、ｍｔＤＮＡ集団の８５％が変異型対立遺伝子を含有し、１５％が野生型対立遺伝子を含有する。この細胞株は、実施例１０に記載されているよりもわずかに低いパーセンテージの変異型ｍｔＤＮＡに基づいて選択され、これはよりＷＴ様の呼吸レベルをもたらし、したがってメガヌクレアーゼによって誘導される負の影響が検出可能であり得る。
Ｌｏｎｚａ ４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）（ＳＦ緩衝液、条件ＣＡ－１３７）を使用して、８ｅ５ ＭＥＬＡＳサイブリッド細胞に用量滴定にわたって遺伝子操作メガヌクレアーゼｍＲＮＡをヌクレオフェクトした。遺伝子操作メガヌクレアーゼｍＲＮＡ用量は、１ｅ５ ＲＮＡコピー／細胞で開始した。これは、合計８ｅ１０ ＲＮＡコピー、または９４．８ｎｇのＲＮＡに変換される。次いで、ｍＲＮＡを１ｅ２ ＲＮＡコピー／細胞に至るまで１：１０で段階希釈した。ｇＤＮＡ抽出およびＳｅａｈｏｒｓｅ Ｃｅｌｌ Ｍｉｔｏ Ｓｔｒｅｓｓ Ｔｅｓｔ評価のために、ヌクレオフェクション後１および３日目に細胞を収集した。Ｍａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｂｌｏｏｄ ＱｕｉｃｋＰｕｒｅキットを使用してｇＤＮＡを単離した。
液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を利用して、ｍｔＤＮＡのヘテロプラスミーレベル、ならびに核ＤＮＡ（ｎｕＤＮＡ）に対するｍｔＤＮＡコピー数を決定した。これは、結合部位を取り囲むアンプリコンを生成するためにＰ１、Ｆ１およびＲ１を使用し（アッセイ１）、ｍｔＤＮＡカウンターとして作用する参照アンプリコンを生成するためにＰ２、Ｆ２およびＲ２を使用し（アッセイ２）、ｎｕＤＮＡカウンターとして作用する核参照アンプリコンを生成するためにＰ４、Ｆ４およびＲ４を使用して達成された（アッセイ３）。アッセイ２の陽性液滴の数に対するアッセイ１の陽性液滴の数を使用して、細胞中のヘテロプラスミーのレベルを決定した。アッセイ３の陽性液滴の数に対するアッセイ２の陽性液滴の数を使用して、細胞中のｍｔＤＮＡコピー数を決定した。次いで、この比をＭＴＳ－ＧＦＰ（対照）条件に基づいて正規化し、得られた正規化されたコピー数にヘテロプラスミーレベルを乗算して、図３５、図３７および図３９に示されるデータを生成した。これらのグラフにおいて、バーの高さは、ＭＴＳ－ＧＦＰ細胞に対するｍｔＤＮＡ損失を示す。バー内で、灰色の相対的パーセンテージは、存在する野生型ｍｔＤＮＡの相対的パーセンテージに対応し、黒色の相対的パーセンテージは、存在する変異型ｍｔＤＮＡの相対的パーセンテージに対応する。
Ｐ１：ＴＧＧＣＡＧＧＧＣＣＣＧＧＴ（配列番号６３）
Ｆ１：ＣＣＣＡＡＧＡＡＣＡＧＧＧＴＴＴＧＴＴＡＡＧ（配列番号６４）
Ｒ１：ＧＧＡＡＴＧＣＣＡＴＴＧＣＧＡＴＴＡＧ（配列番号６５）
Ｐ２：ＡＧＣＡＧＴＴＣＴＡＣＣＧＴＡＣＡＡＣＣＣＴＡＡＣＡ（配列番号６６）
Ｆ２：ＧＧＣＡＧＴＴＧＡＧＧＴＧＧＡＴＴＡ（配列番号６７）
Ｒ２：ＧＧＡＡＴＧＣＧＧＴＡＧＴＡＧＴＴＡＧＧ（配列番号６８）
Ｐ４：ＡＡＣＣＡＧＡＣＡＡＡＴＣＧＣＴＣＣＡＣＣＡＡＣ（配列番号６９）
Ｆ４：ＣＧＧＡＣＡＧＧＡＴＴＧＡＣＡＧＡＴＴ（配列番号７０）
Ｒ４：ＣＣＡＧＡＧＴＣＴＣＧＴＴＣＧＴＴＡＴＣ（配列番号７１）
アッセイ１および２を、１ｘ ｄｄＰＣＲ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ ｆｏｒ Ｐｒｏｂｅｓ（ｄＵＴＰなし、ＢｉｏＲａｄ）、２５０ｎＭの各プローブ、９００ｎＭの各プライマー、２０Ｕ／μＬのＨｉｎｄ－ＩＩＩ ＨＦ（ＮＥＢ）および０．２２５ｎｇの細胞ｇＤＮＡを含有する２４μＬの反応液中で多重化した。ＱＸ１００液滴生成器（ＢｉｏＲａｄ）を使用して液滴を生成した。サイクル条件は以下の通りであった：９５℃（２℃／ｓランプ）１０分を１サイクル、９４℃（２℃／ｓランプ）１０秒を４５サイクル、５９．２℃（２℃／ｓランプ）３０秒、７２Ｃ（０．２℃／ｓランプ）１分、９８℃１０分を１サイクル、４℃保持。ＱＸ２００液滴リーダー（ＢｉｏＲａｄ）を使用して液滴を分析し、ＱｕａｎｔａＳｏｆｔ分析ソフトウェア（ＢｉｏＲａｄ）を使用してデータを取得および分析した。
アッセイ２および３を、１ｘ ｄｄＰＣＲ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ ｆｏｒ Ｐｒｏｂｅｓ（ｄＵＴＰなし、ＢｉｏＲａｄ）、２５０ｎＭの各プローブ、９００ｎＭの各プライマー、２０Ｕ／μＬのＨｉｎｄ－ＩＩＩ ＨＦ（ＮＥＢ）および０．２２５ｎｇの細胞ｇＤＮＡを含有する２４μＬの反応液中で多重化した。ＱＸ１００液滴生成器（ＢｉｏＲａｄ）を使用して液滴を生成した。サイクル条件は以下の通りであった：９５℃（２℃／ｓランプ）１０分を１サイクル、９４℃（２℃／ｓランプ）１０秒を４５サイクル、５９．２℃（２℃／ｓランプ）３０秒、７２Ｃ（０．２℃／ｓランプ）１分、９８℃１０分を１サイクル、４℃保持。ＱＸ２００液滴リーダー（ＢｉｏＲａｄ）を使用して液滴を分析し、ＱｕａｎｔａＳｏｆｔ分析ソフトウェア（ＢｉｏＲａｄ）を使用してデータを取得および分析した。
トランスフェクション後０日目に、Ｓｅａｈｏｒｓｅ ＸＦｅ９６ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）での分析のために、９．６ｅ３細胞を９６ウェルＳｅａｈｏｒｓｅ細胞培養マイクロプレートに蒔いた。また、ＸＦセンサーカートリッジを、非ＣＯ２インキュベーター中で一晩、２００μＬ／ウェルのＳｅａｈｏｒｓｅ ＸＦ Ｃａｌｉｂｒａｎｔで水和させた。トランスフェクション後２日目に、Ｓｅａｈｏｒｓｅ ＸＦｅ９６ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）での分析のために、５ｅ３細胞を９６ウェルＳｅａｈｏｒｓｅ細胞培養マイクロプレートに蒔いた。また、ＸＦセンサーカートリッジを、非ＣＯ２インキュベーター中で一晩、２００μＬ／ウェルのＳｅａｈｏｒｓｅ ＸＦ Ｃａｌｉｂｒａｎｔで水和させた。次の日（１および３日目）、９７ｍＬのＳｅａｈｏｒｓｅアッセイ培地（ＤＭＥＭ）を、１ｍＬの１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１ｍＬの２ｍＭグルタミンおよび１ｍＬの１０ｍＭグルコースと合わせた。細胞を調製した培地で２回洗浄し、次いで非ＣＯ２インキュベーターに１時間入れた。１つのＣｅｌｌ Ｍｉｔｏ Ｓｔｒｅｓｓ Ｔｅｓｔ Ｋｉｔを製造者の指示に従って再構成した。溶液は、オリゴマイシン（１５ｕＭ）、ＦＣＣＰ（５ｕＭ）、およびロテノン／アンチマイシンＡ（５ｕＭ）から構成されていた。Ｃｅｌｌ Ｍｉｔｏ Ｓｔｒｅｓｓ Ｔｅｓｔでは、水和カートリッジのすべてのポートＡに２０μＬのオリゴマイシン溶液を添加し、すべてのポートＢに２２μＬのＦＣＣＰ溶液を添加し、すべてのポートＣに２４μＬのロテノン／アンチマイシンＡを添加した。ベースライン、オリゴマイシン、ＦＣＣＰ、およびロテノン／アンチマイシンＡについて４回の測定サイクル（０３：００混合、００：００待機、０３：００測定）でアッセイを実行した。ＯＣＲ値は、Ｗａｖｅソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して分析した。Ｃｅｌｌ Ｍｉｔｏ Ｓｔｒｅｓｓ Ｔｅｓｔ Ｒｅｐｏｒｔは、Ｗａｖｅソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して作成した。
アッセイ完了後、標準培地中１：５０００希釈で、細胞をＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｈ３５７０）で染色した。細胞を３７Ｃで２０分間インキュベートし、次いでＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ Ｐｉｃｏ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用してイメージサイトメトリーによって分析した。次いで、ＯＣＲ値を、Ｗａｖｅソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して細胞数に対して正規化した。
図４８に示すように、より高用量のミトコンドリア標的化遺伝子操作メガヌクレアーゼ（ＭＴＥＭ）は、ｍｔＤＮＡコピーのより大きな損失をもたらした。このｍｔＤＮＡ低減は、１日目においてのみ最高ｍＲＮＡ用量で統計学的に有意であった（表１５）。観察されたｍｔＤＮＡ枯渇は、変異型ｍｔＤＮＡの選択的切断に対応した。３つの最高ｍＲＮＡ用量で処理した細胞は、すべての時点で変異型ｍｔＤＮＡの有意な損失を示した（表１５および表１６）。変異型ｍｔＤＮＡの排除後、残りのＷＴ ｍｔＤＮＡは細胞を再増殖させることが見出された（図４８および図５０）。３日目までに、最高ｍＲＮＡ用量で処理した細胞には０．２％の変異型ｍｔＤＮＡしか残っていなかった（図５０）。両方の時点で、３つの最高ｍＲＮＡ用量で処理した細胞中に存在するＷＴ ｍｔＤＮＡの量の有意な増加があった（表１５および表１６）。
１日目のＣｅｌｌ Ｍｉｔｏ Ｓｔｒｅｓｓ Ｔｅｓｔでは、ＭＴＥＭ処理細胞は、ＧＦＰ処理対照と比較して基礎ＯＣＲまたは最大ＯＣＲのいずれかに有意な変化を示さなかった（表１５）。３日目も同様である（表１６）。３日目に高用量処理細胞で観察されたヘテロプラスミーの完全なシフトにもかかわらず、呼吸に統計学的に有意な変化はなく、これは、ここで利用される細胞がＷＴ様呼吸を示し、ヘテロプラスミーのさらなるシフトがミトコンドリア機能に大きな変化を与えないことを示す。
ヘテロプラスミーは、本明細書に記載のＭＩＴ ２５－２６メガヌクレアーゼを使用して、８５％変異型サイブリッド細胞で効果的にシフトした。誘導されたシフトは、これらの細胞にＷＴ様呼吸が存在するにもかかわらず、呼吸に負の影響を及ぼさない一過性のｍｔＤＮＡ枯渇をもたらした（図４８および図５０）。これは、一過性のｍｔＤＮＡ枯渇が細胞呼吸に負の影響を及ぼさないことを示唆する。
Figure 2024514939000025
Figure 2024514939000026
実施例１５ 細胞呼吸に対するグルコース対ガラクトースでの培養の効果
この実験の目的は、グルコース含有培地ではなくガラクトース中で細胞を成長させた場合に、遺伝子操作メガヌクレアーゼのトランスフェクションが細胞呼吸にどのように影響するかを決定することであった。グルコースの存在下では、培養中のほとんどの細胞は、酸素および機能的ミトコンドリアが豊富であるにもかかわらず、ＡＴＰ産生に関してほぼ排他的に解糖に依存する。したがって、一過性のｍｔＤＮＡ枯渇の機能的転帰は、細胞がＡＴＰ産生に関してミトコンドリア機能に依存しなければならないような細胞培養環境の変化なしでは、培養細胞中で明確に評価することができない。これを行うために、細胞をグルコース含有培地からガラクトース含有培地に移行させなければならない。ガラクトースのピルビン酸への酸化はグルコースよりも遅く、ＡＴＰの正味の増加をもたらさない。したがって、ガラクトースで成長した細胞は、ＡＴＰ産生のためにＯＸＰＨＯＳに頼らざるを得ない。
９６％変異型ｍ．３２４３Ａ＞Ｇ ｍｔＤＮＡを含む８ｅ５ＭＥＬＡＳサイブリッド細胞を、Ｌｏｎｚａ ４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）（ＳＦ緩衝液、条件ＣＡ－１３７）を使用して遺伝子操作メガヌクレアーゼｍＲＮＡでヌクレオフェクトした。使用した遺伝子操作メガヌクレアーゼは、１ｅ５ ＲＮＡコピー／細胞（９４．８ｎｇ ｍＲＮＡ）の用量のＭＩＴ ２５－２６ｘ．９１ ２５９Ｈ＞Ｑであった。トランスフェクトされていない対照、ならびにトランスフェクトされていない０％変異型細胞株を使用した。トランスフェクションの直後に、すべての細胞を、５ｍＭガラクトースを含有する培地に蒔いた。ｇＤＮＡ抽出およびＳｅａｈｏｒｓｅ Ｃｅｌｌ Ｍｉｔｏ Ｓｔｒｅｓｓ Ｔｅｓｔ評価のために、ヌクレオフェクション後１日目に細胞を収集した。Ｍａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｂｌｏｏｄ ＱｕｉｃｋＰｕｒｅキットを使用してｇＤＮＡを単離した。
液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を利用して、ｍｔＤＮＡのヘテロプラスミーレベル、ならびに核ＤＮＡ（ｎｕＤＮＡ）に対するｍｔＤＮＡコピー数を決定した。これは、結合部位を取り囲むアンプリコンを生成するためにＰ１、Ｆ１およびＲ１を使用し（アッセイ１）、ｍｔＤＮＡカウンターとして作用する参照アンプリコンを生成するためにＰ２、Ｆ２およびＲ２を使用し（アッセイ２）、ｎｕＤＮＡカウンターとして作用する核参照アンプリコンを生成するためにＰ４、Ｆ４およびＲ４を使用して達成された（アッセイ３）。アッセイ２の陽性液滴の数に対するアッセイ１の陽性液滴の数を使用して、細胞中のヘテロプラスミーのレベルを決定した。アッセイ３の陽性液滴の数に対するアッセイ２の陽性液滴の数を使用して、細胞中のｍｔＤＮＡコピー数を決定した。次いで、この比を９６％変異型未処理対照条件に基づいて正規化し、得られた正規化されたコピー数にヘテロプラスミーレベルを乗算して、図５２に示されるデータを生成した。これらのグラフにおいて、バーの高さは、ＭＴＳ－ＧＦＰ細胞に対するｍｔＤＮＡ損失を示す。バー内で、灰色の相対的パーセンテージは、存在する野生型ｍｔＤＮＡの相対的パーセンテージに対応し、黒色の相対的パーセンテージは、存在する変異型ｍｔＤＮＡの相対的パーセンテージに対応する。
Ｐ１：ＴＧＧＣＡＧＧＧＣＣＣＧＧＴ（配列番号６３）
Ｆ１：ＣＣＣＡＡＧＡＡＣＡＧＧＧＴＴＴＧＴＴＡＡＧ（配列番号６４）
Ｒ１：ＧＧＡＡＴＧＣＣＡＴＴＧＣＧＡＴＴＡＧ（配列番号６５）
Ｐ２：ＡＧＣＡＧＴＴＣＴＡＣＣＧＴＡＣＡＡＣＣＣＴＡＡＣＡ（配列番号６６）
Ｆ２：ＧＧＣＡＧＴＴＧＡＧＧＴＧＧＡＴＴＡ（配列番号６７）
Ｒ２：ＧＧＡＡＴＧＣＧＧＴＡＧＴＡＧＴＴＡＧＧ（配列番号６８）
Ｐ４：ＡＡＣＣＡＧＡＣＡＡＡＴＣＧＣＴＣＣＡＣＣＡＡＣ（配列番号６９）
Ｆ４：ＣＧＧＡＣＡＧＧＡＴＴＧＡＣＡＧＡＴＴ（配列番号７０）
Ｒ４：ＣＣＡＧＡＧＴＣＴＣＧＴＴＣＧＴＴＡＴＣ（配列番号７１）
アッセイ１および２を、１ｘ ｄｄＰＣＲ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ ｆｏｒ Ｐｒｏｂｅｓ（ｄＵＴＰなし、ＢｉｏＲａｄ）、２５０ｎＭの各プローブ、９００ｎＭの各プライマー、２０Ｕ／μＬのＨｉｎｄ－ＩＩＩ ＨＦ（ＮＥＢ）および０．２２５ｎｇの細胞ｇＤＮＡを含有する２４μＬの反応液中で多重化した。ＱＸ１００液滴生成器（ＢｉｏＲａｄ）を使用して液滴を生成した。サイクル条件は以下の通りであった：９５℃（２℃／ｓランプ）１０分を１サイクル、９４℃（２℃／ｓランプ）１０秒を４５サイクル、５９．２℃（２℃／ｓランプ）３０秒、７２Ｃ（０．２℃／ｓランプ）１分、９８℃１０分を１サイクル、４℃保持。ＱＸ２００液滴リーダー（ＢｉｏＲａｄ）を使用して液滴を分析し、ＱｕａｎｔａＳｏｆｔ分析ソフトウェア（ＢｉｏＲａｄ）を使用してデータを取得および分析した。
アッセイ２および３を、１ｘ ｄｄＰＣＲ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ ｆｏｒ Ｐｒｏｂｅｓ（ｄＵＴＰなし、ＢｉｏＲａｄ）、２５０ｎＭの各プローブ、９００ｎＭの各プライマー、２０Ｕ／μＬのＨｉｎｄ－ＩＩＩ ＨＦ（ＮＥＢ）および０．２２５ｎｇの細胞ｇＤＮＡを含有する２４μＬの反応液中で多重化した。ＱＸ１００液滴生成器（ＢｉｏＲａｄ）を使用して液滴を生成した。サイクル条件は以下の通りであった：９５℃（２℃／ｓランプ）１０分を１サイクル、９４℃（２℃／ｓランプ）１０秒を４５サイクル、５９．２℃（２℃／ｓランプ）３０秒、７２Ｃ（０．２℃／ｓランプ）１分、９８℃１０分を１サイクル、４℃保持。ＱＸ２００液滴リーダー（ＢｉｏＲａｄ）を使用して液滴を分析し、ＱｕａｎｔａＳｏｆｔ分析ソフトウェア（ＢｉｏＲａｄ）を使用してデータを取得および分析した。
トランスフェクション後０日目に、Ｓｅａｈｏｒｓｅ ＸＦｅ９６ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）での分析のために、２ｅ３細胞／ウェルを９６ウェルＳｅａｈｏｒｓｅ細胞培養マイクロプレートに蒔いた。また、ＸＦセンサーカートリッジを、非ＣＯ２インキュベーター中で一晩、２００μＬ／ウェルのＳｅａｈｏｒｓｅ ＸＦ Ｃａｌｉｂｒａｎｔで水和させた。次の日（１日目）、９７ｍＬのＳｅａｈｏｒｓｅアッセイ培地（ＤＭＥＭ）を１ｍＬの１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１ｍＬの２ｍＭグルタミンおよび１０ｍＭガラクトースと合わせた。得られた培地を滅菌濾過した。細胞を調製した培地で２回洗浄し、次いで非ＣＯ２インキュベーターに１時間入れた。１つのＣｅｌｌ Ｍｉｔｏ Ｓｔｒｅｓｓ Ｔｅｓｔ Ｋｉｔを製造者の指示に従って再構成した。溶液は、オリゴマイシン（１５ｕＭ）、ＦＣＣＰ（２０ｕＭ）、およびロテノン／アンチマイシンＡ（５ｕＭ）から構成されていた。Ｃｅｌｌ Ｍｉｔｏ Ｓｔｒｅｓｓ Ｔｅｓｔでは、水和カートリッジのすべてのポートＡに２０μＬのオリゴマイシン溶液を添加し、すべてのポートＢに２２μＬのＦＣＣＰ溶液を添加し、すべてのポートＣに２４μＬのロテノン／アンチマイシンＡを添加した。ベースライン、オリゴマイシン、ＦＣＣＰ、およびロテノン／アンチマイシンＡについて４回の測定サイクル（０３：００混合、００：００待機、０３：００測定）でアッセイを実行した。ＯＣＲ値は、Ｗａｖｅソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して分析した。Ｃｅｌｌ Ｍｉｔｏ Ｓｔｒｅｓｓ Ｔｅｓｔ Ｒｅｐｏｒｔは、Ｗａｖｅソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して作成した。
アッセイ完了後、標準培地中１：５０００希釈で、細胞をＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｈ３５７０）で染色した。細胞を３７Ｃで２０分間インキュベートし、次いでＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ Ｐｉｃｏ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用してイメージサイトメトリーによって分析した。次いで、ＯＣＲ値を、Ｗａｖｅソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して細胞数に対して正規化した。
図５２に示すように、使用した高用量のミトコンドリア標的化遺伝子操作メガヌクレアーゼ（ＭＴＥＭ）は、未処理対照と比較して一過性のｍｔＤＮＡ枯渇をもたらした。ＭＴＥＭ処理細胞は、未処理の９６％変異型細胞に存在する全ｍｔＤＮＡの２７％のみを含有していた。観察されたｍｔＤＮＡ枯渇は、変異型ｍｔＤＮＡの選択的切断に対応した。１日目に、ＭＴＥＭ処理細胞に存在するｍｔＤＮＡの４４％が、未処理細胞における９２．８％とは対照的に変異型であった。
１日目のＣｅｌｌ Ｍｉｔｏ Ｓｔｒｅｓｓ Ｔｅｓｔでは、未処理の０％変異型（ＷＴ）細胞は、高レベルの基礎呼吸（７．５ｐｍｏｌ Ｏ２／分／１，０００細胞）および最大呼吸（１０．０ｐｍｏｌ Ｏ２／分／１，０００細胞）を示した。未処理の９６％変異型細胞は、はるかに低いレベルの呼吸を示し、基礎呼吸は４．２ｐｍｏｌ Ｏ２／分／１，０００細胞、最大呼吸は４．８ｐｍｏｌ Ｏ２／分／１，０００細胞であった。ＭＴＥＭ処理細胞は、未処理の９６％変異型細胞（基礎呼吸は３．９ｐｍｏｌ Ｏ２／分／１，０００細胞、最大呼吸は４．４ｐｍｏｌ Ｏ２／分／１，０００細胞）と同様の呼吸レベルを有し、これらの細胞がＡＴＰ生成に関してＯＸＰＨＯＳに依存し、この時点でｍｔＤＮＡ枯渇が存在するにも関わらず、細胞呼吸は負の影響を受けなかったことを示している（図５３）。

Claims (195)

  1. 真核細胞のミトコンドリアゲノム中の配列番号１を含む認識配列に結合して切断するミトコンドリア標的化遺伝子操作メガヌクレアーゼ（ＭＴＥＭ）であって、前記ＭＴＥＭが、ミトコンドリア移行ペプチド（ＭＴＰ）に結合した遺伝子操作メガヌクレアーゼを含み、前記遺伝子操作メガヌクレアーゼが第１のサブユニットおよび第２のサブユニットを含み、前記第１のサブユニットが前記認識配列の第１の認識半部位に結合し、第１の超可変（ＨＶＲ１）領域を含み、前記第２のサブユニットが前記認識配列の第２の認識半部位に結合し、第２の超可変（ＨＶＲ２）領域を含む、ＭＴＥＭ。
  2. 前記ＨＶＲ１領域が、配列番号３～１２のいずれか１つの残基２４～７９に対応するアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のＭＴＥＭ。
  3. 前記ＨＶＲ１領域が、配列番号３～１２のいずれか１つの残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、および７７に対応する１つ以上の残基を含む、請求項１または請求項２に記載のＭＴＥＭ。
  4. 前記ＨＶＲ１領域が、配列番号３～１２のいずれか１つの残基２４～７９を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のＭＴＥＭ。
  5. 前記第１のサブユニットが、配列番号３～１２のいずれか１つの残基７～１５３に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のＭＴＥＭ。
  6. 前記第１のサブユニットが、配列番号３～１２のいずれか１つの残基１９に対応する残基を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のＭＴＥＭ。
  7. 前記第１のサブユニットが、配列番号３、５、７、９、１１、または１２のいずれか１つの残基８０に対応する残基を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載のＭＴＥＭ。
  8. 前記第１のサブユニットが、配列番号３～１２のいずれか１つの残基７～１５３を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載のＭＴＥＭ。
  9. 前記ＨＶＲ２領域が、配列番号３～１２のいずれか１つの残基２１５～２７０に対応するアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載のＭＴＥＭ。
  10. 前記ＨＶＲ２領域が、配列番号３～１２のいずれか１つの残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６、および２６８に対応する１つ以上の残基を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載のＭＴＥＭ。
  11. 前記ＨＶＲ２領域が、配列番号３～１２のいずれか１つの残基２４１に対応する残基を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載のＭＴＥＭ。
  12. 前記ＨＶＲ２領域が、配列番号３または５～１２のいずれか１つの残基２６３に対応する残基を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載のＭＴＥＭ。
  13. 前記ＨＶＲ２領域が、配列番号３～６または８～１２のいずれか１つの残基２６４に対応する残基を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載のＭＴＥＭ。
  14. 前記ＨＶＲ２領域が、配列番号６の残基２６５に対応する残基を含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載のＭＴＥＭ。
  15. 前記ＨＶＲ２領域が、配列番号３～１２のいずれか１つの残基２１５～２７０を含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載のＭＴＥＭ。
  16. 前記第２のサブユニットが、配列番号３～１２のいずれか１つの残基１９８～３４４に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載のＭＴＥＭ。
  17. 前記第２のサブユニットが、配列番号４の残基２７６に対応する残基を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載のＭＴＥＭ。
  18. 前記第２のサブユニットが、配列番号３～１２のいずれか１つの残基３３０に対応する残基を含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載のＭＴＥＭ。
  19. 前記第２のサブユニットが、配列番号３～１２のいずれか１つの残基１９８～３４４を含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載のＭＴＥＭ。
  20. 前記遺伝子操作メガヌクレアーゼがリンカーを含む一本鎖メガヌクレアーゼであり、前記リンカーが前記第１のサブユニットと前記第２のサブユニットとを共有結合する、請求項１～１９のいずれか一項に記載のＭＴＥＭ。
  21. 前記遺伝子操作メガヌクレアーゼが、配列番号３～１２のいずれか１つに対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載のＭＴＥＭ。
  22. 前記遺伝子操作メガヌクレアーゼが、配列番号３～１２のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項１～２１のいずれか一項に記載のＭＴＥＭ。
  23. 前記遺伝子操作メガヌクレアーゼが、配列番号３３～４２のいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる、請求項１～２２のいずれか一項に記載のＭＴＥＭ。
  24. 前記遺伝子操作メガヌクレアーゼが、配列番号３３～４２のいずれか１つの核酸配列によってコードされる、請求項１～２３のいずれか一項に記載のＭＴＥＭ。
  25. 前記ＭＴＰが、配列番号４３～４５のいずれか１つに記載の配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～２４のいずれか一項に記載のＭＴＥＭ。
  26. 前記ＭＴＰが、配列番号４３～４５のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む、請求項１～２５のいずれか一項に記載のＭＴＥＭ。
  27. 前記ＭＴＰが前記遺伝子操作メガヌクレアーゼのＣ末端に結合される、請求項１～２６のいずれか一項に記載のＭＴＥＭ。
  28. 前記ＭＴＰが前記遺伝子操作メガヌクレアーゼのＮ末端に結合される、請求項１～２７のいずれか一項に記載のＭＴＥＭ。
  29. 前記ＭＴＰが前記遺伝子操作メガヌクレアーゼに融合される、請求項１～２８のいずれか一項に記載のＭＴＥＭ。
  30. 前記ＭＴＰがポリペプチドリンカーによって前記遺伝子操作メガヌクレアーゼに結合される、請求項１～２８のいずれか一項に記載のＭＴＥＭ。
  31. 前記遺伝子操作メガヌクレアーゼが第１のＭＴＰおよび第２のＭＴＰに結合される、請求項１～２４のいずれか一項に記載のＭＴＥＭ。
  32. 前記第１のＭＴＰおよび／または前記第２のＭＴＰが、配列番号４３～４５のいずれか１つに記載の配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３１に記載のＭＴＥＭ。
  33. 前記第１のＭＴＰおよび／または前記第２のＭＴＰが、配列番号４３～４５のいずれか一項に記載のアミノ酸配列を含む、請求項３１または請求項３２に記載のＭＴＥＭ。
  34. 前記第１のＭＴＰおよび前記第２のＭＴＰが同一である、請求項３１～３３のいずれか一項に記載のＭＴＥＭ。
  35. 前記第１のＭＴＰおよび前記第２のＭＴＰが同一ではない、請求項３１～３３のいずれか一項に記載のＭＴＥＭ。
  36. 前記第１のＭＴＰおよび／または前記第２のＭＴＰが前記遺伝子操作メガヌクレアーゼに融合される、請求項３１～３５のいずれか一項に記載のＭＴＥＭ。
  37. 前記第１のＭＴＰおよび／または前記第２のＭＴＰが、ポリペプチドリンカーによって前記遺伝子操作メガヌクレアーゼに結合される、請求項３１～３５のいずれか一項に記載のＭＴＥＭ。
  38. 前記ＭＴＥＭが核外搬出配列（ＮＥＳ）に結合される、請求項１～３７のいずれか一項に記載のＭＴＥＭ。
  39. 前記ＮＥＳが、配列番号４６または４７に示される配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３８に記載のＭＴＥＭ。
  40. 前記ＮＥＳが、配列番号４６または４７に示されるアミノ酸配列を含む、請求項３８または請求項３９に記載のＭＴＥＭ。
  41. 前記ＮＥＳが前記ＭＴＥＭのＮ末端に結合される、請求項３８～４０のいずれか一項に記載のＭＴＥＭ。
  42. 前記ＮＥＳが前記ＭＴＥＭのＣ末端に結合される、請求項３８～４０のいずれか一項に記載のＭＴＥＭ。
  43. 前記ＮＥＳが前記ＭＴＥＭに融合される、請求項３８～４２のいずれか一項に記載のＭＴＥＭ。
  44. 前記ＮＥＳがポリペプチドリンカーによって前記ＭＴＥＭに結合される、請求項３８～４２のいずれか一項に記載のＭＴＥＭ。
  45. 第１のＮＥＳおよび第２のＮＥＳに結合される、請求項１～３７のいずれか一項に記載のＭＴＥＭ。
  46. 前記第１のＮＥＳが前記ＭＴＥＭのＮ末端に結合され、前記第２のＮＥＳが前記ＭＴＥＭのＣ末端に結合される、請求項４５に記載のＭＴＥＭ。
  47. 前記第１のＮＥＳおよび／または前記第２のＮＥＳが、配列番号４６または４７に示される配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項４５または請求項４６に記載のＭＴＥＭ。
  48. 前記第１のＮＥＳおよび／または前記第２のＮＥＳが、配列番号４６または４７に示されるアミノ酸配列を含む、請求項４５～４７のいずれか一項に記載のＭＴＥＭ。
  49. 前記第１のＮＥＳおよび前記第２のＮＥＳが同一である、請求項４５～４８のいずれか一項に記載のＭＴＥＭ。
  50. 前記第１のＮＥＳおよび前記第２のＮＥＳが同一ではない、請求項４５～４８のいずれか一項に記載のＭＴＥＭ。
  51. 前記第１のＮＥＳおよび／または前記第２のＮＥＳが前記ＭＴＥＭに融合される、請求項４５～５０のいずれか一項に記載のＭＴＥＭ。
  52. 前記第１のＮＥＳおよび／または前記第２のＮＥＳがポリペプチドリンカーによって前記ＭＴＥＭに結合される、請求項４５～５０のいずれか一項に記載のＭＴＥＭ。
  53. 請求項１～５２のいずれか一項に記載の前記ＭＴＥＭをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド。
  54. ｍＲＮＡである、請求項５３に記載のポリヌクレオチド。
  55. 請求項１～５２のいずれか一項に記載の前記ＭＴＥＭをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む、組換えＤＮＡ構築物。
  56. 前記ポリヌクレオチドを含む組換えウイルスをコードする、請求項５５に記載の組換えＤＮＡ構築物。
  57. 前記組換えウイルスが、組換えアデノウイルス、組換えレンチウイルス、組換えレトロウイルス、または組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である、請求項５６に記載の組換えＤＮＡ構築物。
  58. 前記組換えウイルスが組換えＡＡＶである、請求項５６または請求項５７に記載の組換えＤＮＡ構築物。
  59. 前記組換えＡＡＶがＡＡＶ９キャプシドを有する、請求項５８に記載の組換えＤＮＡ構築物。
  60. 前記ポリヌクレオチドが、前記ＭＴＥＭをコードする前記核酸配列に作動可能に連結されたプロモータを含む、請求項５５～５９のいずれか一項に記載の組換えＤＮＡ構築物。
  61. 前記プロモータが遍在性プロモータであるか、または前記プロモータが、筋細胞特異的プロモータ、骨格筋特異的プロモータ、筋管特異的プロモータ、筋サテライト細胞特異的プロモータ、ニューロン特異的プロモータ、アストロサイト特異的プロモータ、ミクログリア特異的プロモータ、眼細胞特異的プロモータ、網膜細胞特異的プロモータ、網膜神経節細胞特異的プロモータ、網膜色素上皮特異的プロモータ、膵臓細胞特異的プロモータ、または膵臓ベータ細胞特異的プロモータである、請求項６０に記載の組換えＤＮＡ構築物。
  62. 前記遍在性プロモータがＣＭＶプロモータ、ＣＡＧプロモータ、ＥＦ１アルファプロモータまたはＵｂＣプロモータである、請求項６１に記載の組換えＤＮＡ構築物。
  63. 請求項１～５２のいずれか一項に記載の前記ＭＴＥＭをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む、組換えウイルス。
  64. 組換えアデノウイルス、組換えレンチウイルス、組換えレトロウイルス、または組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である、請求項６３に記載の組換えウイルス。
  65. 組換えＡＡＶである、請求項６３または請求項６４に記載の組換えウイルス。
  66. 前記組換えＡＡＶがＡＡＶ９キャプシドを有する、請求項６５に記載の組換えウイルス。
  67. 前記ポリヌクレオチドが、前記ＭＴＥＭをコードする前記核酸配列に作動可能に連結されたプロモータを含む、請求項６３～６６のいずれか一項に記載の組換えウイルス。
  68. 前記プロモータが遍在性プロモータであるか、または前記プロモータが、筋細胞特異的プロモータ、骨格筋特異的プロモータ、筋管特異的プロモータ、筋サテライト細胞特異的プロモータ、ニューロン特異的プロモータ、アストロサイト特異的プロモータ、ミクログリア特異的プロモータ、眼細胞特異的プロモータ、網膜細胞特異的プロモータ、網膜神経節細胞特異的プロモータ、網膜色素上皮特異的プロモータ、膵臓細胞特異的プロモータ、または膵臓ベータ細胞特異的プロモータである、請求項６７に記載の組換えウイルス。
  69. 前記遍在性プロモータがＣＭＶプロモータ、ＣＡＧプロモータ、ＥＦ１アルファプロモータまたはＵｂＣプロモータである、請求項６８に記載の組換えウイルス。
  70. ポリヌクレオチドを含む脂質ナノ粒子を含む脂質ナノ粒子組成物であって、前記ポリヌクレオチドが、請求項１～５２のいずれか一項に記載の前記ＭＴＥＭをコードする核酸配列を含む、脂質ナノ粒子組成物。
  71. 前記ポリヌクレオチドがｍＲＮＡである、請求項７０に記載の脂質ナノ粒子組成物。
  72. 薬学的に許容される担体、および請求項１～５２のいずれか一項に記載の前記ＭＴＥＭを含む医薬組成物。
  73. 薬学的に許容される担体、および請求項５３または請求項５４に記載の前記ポリヌクレオチドを含む医薬組成物。
  74. 薬学的に許容される担体、および請求項５５～６２のいずれか一項に記載の前記組換えＤＮＡ構築物を含む医薬組成物。
  75. 薬学的に許容される担体、および請求項６３～６９のいずれか一項に記載の前記組換えウイルスを含む医薬組成物。
  76. 薬学的に許容される担体、および請求項７０または請求項７１に記載の前記脂質ナノ粒子組成物を含む医薬組成物。
  77. 請求項１～５２のいずれか一項に記載の前記ポリヌクレオチドを含む、遺伝子修飾真核細胞。
  78. 遺伝子修飾哺乳動物細胞である、請求項７７に記載の遺伝子修飾真核細胞。
  79. 遺伝子修飾ヒト細胞である、請求項７７または請求項７８に記載の遺伝子修飾真核細胞。
  80. 遺伝子修飾真核細胞を産生するための方法であって、前記方法が、真核細胞に、
    （ａ）請求項１～５２のいずれか一項に記載の前記ＭＴＥＭをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドであり、前記ＭＴＥＭが前記真核細胞で発現される、ポリヌクレオチド、または
    （ｂ）請求項１～５２のいずれか一項に記載の前記ＭＴＥＭ
    を導入することを含み、前記ＭＴＥＭが、前記真核細胞の変異型ミトコンドリアゲノム中の配列番号１を含む前記認識配列に切断部位を作り出す、方法。
  81. 前記切断部位が、前記認識配列が挿入または欠失を含むように非相同末端結合によって修復される、請求項８０に記載の方法。
  82. 前記認識配列を含む前記変異型ミトコンドリアゲノムが、前記遺伝子修飾真核細胞で分解される、請求項８０に記載の方法。
  83. 前記認識配列を含む変異型ミトコンドリアゲノムの約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％が前記遺伝子修飾真核細胞で分解される、請求項８２に記載の方法。
  84. 前記認識配列を含む変異型ミトコンドリアゲノムに対する野生型ミトコンドリアゲノムの比が前記遺伝子修飾真核細胞で増加する、請求項８２または請求項８３のいずれか一項に記載の方法。
  85. 前記比が、約５：９５、約１０：９０、約１５：８５、約２０：８０、約２５：７５、約３０：７０、約３５：６５、約４０：６０、約４５：５５、約５０：５０、約５５：４５、約６０：４０、約６５：３５、約７０：３０、約７５：２５、約８０：２０、約８５：１５、約９０：１０、約９５：５、約２０：１、約５０：１、約１００：１、約１５０：１、約２００：１、約２５０：１、約３００：１、約３５０：１、約４００：１、約４５０：１、約５００：１、約５５０：１、約６００：１、約６５０：１、約７００：１、約７５０：１、約８００：１、約８５０：１、約９００：１、約９５０：１、約１０００：１、またはそれ以上まで増加する、請求項８２～８４のいずれか一項に記載の方法。
  86. 前記遺伝子修飾真核細胞中の野生型ミトコンドリアゲノムのパーセンテージが、前記遺伝子修飾真核細胞中の全ミトコンドリアゲノムの約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％またはそれ以上である、請求項８２～８５のいずれか一項に記載の方法。
  87. 前記遺伝子修飾真核細胞における前記認識配列を含む変異型ミトコンドリアゲノムのパーセンテージが、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％またはそれ以上減少する、請求項８２～８６のいずれか一項に記載の方法。
  88. 前記遺伝子修飾真核細胞の細胞呼吸が、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約１００％またはそれ以上増加する、請求項８２～８７のいずれか一項に記載の方法。
  89. 前記遺伝子修飾真核細胞の細胞呼吸が、約３０～４０％、約４０～５０％、約５０～６０％、約６０～７０％、約７０～８０％、約８０～９０％、約９０～１００％またはそれ以上増加する、請求項８２～８８のいずれか一項に記載の方法。
  90. 複数の遺伝子修飾細胞を含む真核細胞の集団を産生するための方法であって、前記方法が、前記集団中の複数の真核細胞に、
    （ａ）請求項１～５２のいずれか一項に記載の前記ＭＴＥＭをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドであり、前記ＭＴＥＭが前記複数の真核細胞で発現される、ポリヌクレオチド、または
    （ｂ）請求項１～５２のいずれか一項に記載の前記ＭＴＥＭ
    を導入することを含み、前記ＭＴＥＭが、前記複数の真核細胞の変異型ミトコンドリアゲノム中の配列番号１を含む認識配列に切断部位を作り出す、方法。
  91. 前記切断部位が、前記認識配列が挿入または欠失を含むように非相同末端結合によって修復される、請求項９０に記載の方法。
  92. 前記認識配列を含む前記変異型ミトコンドリアゲノムが、前記複数の遺伝子修飾真核細胞で分解される、請求項９０に記載の方法。
  93. 前記認識配列を含む変異型ミトコンドリアゲノムの約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％が前記複数の遺伝子修飾真核細胞で分解される、請求項９２に記載の方法。
  94. 前記認識配列を含む変異型ミトコンドリアゲノムに対する野生型ミトコンドリアゲノムの比が前記複数の遺伝子修飾真核細胞で増加する、請求項９２または請求項９３に記載の方法。
  95. 前記認識配列を含む変異型ミトコンドリアゲノムに対する野生型ミトコンドリアゲノムの比が前記真核細胞の集団で増加する、請求項９２～９４のいずれか一項に記載の方法。
  96. 前記比が、約５：９５、約１０：９０、約１５：８５、約２０：８０、約２５：７５、約３０：７０、約３５：６５、約４０：６０、約４５：５５、約５０：５０、約５５：４５、約６０：４０、約６５：３５、約７０：３０、約７５：２５、約８０：２０、約８５：１５、約９０：１０、約９５：５、約２０：１、約５０：１、約１００：１、約１５０：１、約２００：１、約２５０：１、約３００：１、約３５０：１、約４００：１、約４５０：１、約５００：１、約５５０：１、約６００：１、約６５０：１、約７００：１、約７５０：１、約８００：１、約８５０：１、約９００：１、約９５０：１、約１０００：１、またはそれ以上まで増加する、請求項９２～９５のいずれか一項に記載の方法。
  97. 前記複数の遺伝子修飾真核細胞における野生型ミトコンドリアゲノムのパーセンテージが、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％またはそれ以上増加する、請求項９２～９６のいずれか一項に記載の方法。
  98. 前記真核細胞の集団中の野生型ミトコンドリアゲノムのパーセンテージが、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％またはそれ以上増加する、請求項９２～９７のいずれか一項に記載の方法。
  99. 前記複数の遺伝子修飾真核細胞における前記認識配列を含む変異型ミトコンドリアゲノムのパーセンテージが、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％またはそれ以上減少する、請求項９２～９８のいずれか一項に記載の方法。
  100. 前記真核細胞の集団中の前記認識配列を含む変異型ミトコンドリアゲノムのパーセンテージが、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、またはそれ以上減少する、請求項９２～９９のいずれか一項に記載の方法。
  101. 前記複数の遺伝子修飾真核細胞における細胞呼吸が、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約１００％またはそれ以上増加する、請求項９２～１００のいずれか一項に記載の方法。
  102. 前記複数の遺伝子修飾真核細胞における細胞呼吸が、約３０～４０％、約４０～５０％、約５０～６０％、約６０～７０％、約７０～８０％、約８０～９０％、約９０～１００％またはそれ以上増加する、請求項９２～１０１のいずれか一項に記載の方法。
  103. 前記真核細胞の集団の細胞呼吸が、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約１００％またはそれ以上増加する、請求項９２～１０２のいずれか一項に記載の方法。
  104. 前記真核細胞の集団における細胞呼吸が、約３０～４０％、約４０～５０％、約５０～６０％、約６０～７０％、約７０～８０％、約８０～９０％、約９０～１００％、またはそれ以上増加する、請求項９２～１０３のいずれか一項に記載の方法。
  105. 前記認識配列が、ミトコンドリア障害に関連する前記変異型ミトコンドリアゲノムの領域内にある、請求項８０～１０４のいずれか一項に記載の方法。
  106. 前記ミトコンドリア障害が、ミトコンドリア脳筋症、乳酸アシドーシス、および脳卒中様エピソード（ＭＥＬＡＳ）である、請求項１０５に記載の方法。
  107. 前記認識配列が、野生型ミトコンドリアゲノムのヌクレオチド位置３０００～３５００に対応する変異型ミトコンドリアゲノムの領域に位置する、請求項１０５または請求項１０６に記載の方法。
  108. 前記ＭＴＥＭが変異型ミトコンドリアゲノムのＡ３２４３Ｇ変異を標的化する、請求項１０５～１０７のいずれか一項に記載の方法。
  109. インビボで実施される、請求項８０～１０８のいずれか一項に記載の方法。
  110. インビトロで実施される、請求項８０～１０８のいずれか一項に記載の方法。
  111. 前記ポリヌクレオチドがｍＲＮＡである、請求項８０～１１０のいずれか一項に記載の方法。
  112. 前記ポリヌクレオチドが請求項５３に記載の前記ｍＲＮＡである、請求項１１１に記載の方法。
  113. 前記ポリヌクレオチドが組換えＤＮＡ構築物である、請求項８０～１１０のいずれか一項に記載の方法。
  114. 前記ポリヌクレオチドが請求項５５～６２のいずれか一項に記載の前記組換えＤＮＡ構築物である、請求項１１３に記載の方法。
  115. 前記ポリヌクレオチドが脂質ナノ粒子によって前記真核細胞に導入される、請求項８０～１１０のいずれか一項に記載の方法。
  116. 前記ポリヌクレオチドが組換えウイルスによって前記真核細胞に導入される、請求項８０～１１０のいずれか一項に記載の方法。
  117. 前記組換えウイルスが、請求項６３～６９のいずれか一項に記載の前記組換えウイルスである、請求項１１６に記載の方法。
  118. 前記組換えウイルスが組換えＡＡＶである、請求項１１６または請求項１１７に記載の方法。
  119. 前記組換えＡＡＶがＡＡＶ９キャプシドを有する、請求項１１８に記載の方法。
  120. 前記ポリヌクレオチドが、前記ＭＴＥＭをコードする前記核酸配列に作動可能に連結されたプロモータを含む、請求項８０～１１９のいずれか一項に記載の方法。
  121. 前記プロモータが遍在性プロモータであるか、または前記プロモータが、筋細胞特異的プロモータ、骨格筋特異的プロモータ、筋管特異的プロモータ、筋サテライト細胞特異的プロモータ、ニューロン特異的プロモータ、アストロサイト特異的プロモータ、ミクログリア特異的プロモータ、眼細胞特異的プロモータ、網膜細胞特異的プロモータ、網膜神経節細胞特異的プロモータ、網膜色素上皮特異的プロモータ、膵臓細胞特異的プロモータ、または膵臓ベータ細胞特異的プロモータである、請求項１２０に記載の方法。
  122. 前記遍在性プロモータが、ＣＭＶプロモータ、ＣＡＧプロモータ、ＥＦ１アルファプロモータまたはＵｂＣプロモータである、請求項１２１に記載の方法。
  123. 前記真核細胞が哺乳動物細胞である、請求項８０～１２２のいずれか一項に記載の方法。
  124. 前記真核細胞がヒト細胞である、請求項８０～１２３のいずれか一項に記載の方法。
  125. 前記真核細胞が、筋細胞、骨格筋細胞、筋管細胞、筋サテライト細胞、ニューロン、アストロサイト、ミクログリア細胞、眼細胞、網膜細胞、網膜神経節細胞、網膜色素上皮細胞、膵臓細胞、または膵臓ベータ細胞である、請求項８０～１２４のいずれか一項に記載の方法。
  126. 請求項８０～１２５のいずれか一項に記載の方法によって産生される遺伝子修飾真核細胞または遺伝子修飾真核細胞の集団。
  127. 対象の標的細胞または対象の標的細胞の集団で変異型ミトコンドリアゲノムを分解するための方法であって、前記方法が、前記標的細胞または前記標的細胞の集団に、
    （ａ）請求項１～５２のいずれか一項に記載のＭＴＥＭをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドであり、前記ＭＴＥＭが前記標的細胞または前記標的細胞の集団で発現される、ポリヌクレオチド、または
    （ｂ）請求項１～５２のいずれか一項に記載の前記ＭＴＥＭ
    を送達することを含み、前記ＭＴＥＭが、配列番号１を含む認識配列において前記変異型ミトコンドリアゲノムに切断部位を作り出し、前記変異型ミトコンドリアゲノムが分解される、方法。
  128. 前記認識配列が、野生型ミトコンドリアゲノムのヌクレオチド位置３０００～３５００に対応する変異型ミトコンドリアゲノムの領域に位置する、請求項１２７に記載の方法。
  129. 前記ＭＴＥＭが変異型ミトコンドリアゲノムのＡ３２４３Ｇ変異を標的化する、請求項１２７または請求項１２８に記載の方法。
  130. 前記対象が哺乳動物である、請求項１２７～１２９のいずれか一項に記載の方法。
  131. 前記対象がヒトである、請求項１２７～１３０のいずれか一項に記載の方法。
  132. 前記標的細胞が、筋細胞、骨格筋細胞、筋管細胞、筋サテライト細胞、ニューロン、アストロサイト、ミクログリア細胞、眼細胞、網膜細胞、網膜神経節細胞、網膜色素上皮細胞、膵臓細胞、もしくは膵臓ベータ細胞であるか、または前記標的細胞の集団が、筋細胞、骨格筋細胞、筋管細胞、筋サテライト細胞、ニューロン、アストロサイト、ミクログリア細胞、眼細胞、網膜細胞、網膜神経節細胞、網膜色素上皮細胞、膵臓細胞、もしくは膵臓ベータ細胞の集団である、請求項１２７～１３１のいずれか一項に記載の方法。
  133. 前記ポリヌクレオチドがｍＲＮＡである、請求項１２７～１３２のいずれか一項に記載の方法。
  134. 前記ポリヌクレオチドが請求項５４に記載の前記ｍＲＮＡである、請求項１３３に記載の方法。
  135. 前記ポリヌクレオチドが組換えＤＮＡ構築物である、請求項１２７～１３２のいずれか一項に記載の方法。
  136. 前記ポリヌクレオチドが請求項５５～６２のいずれか一項に記載の前記組換えＤＮＡ構築物である、請求項１３５に記載の方法。
  137. 前記ポリヌクレオチドが、脂質ナノ粒子によって前記標的細胞または前記標的細胞の集団に送達される、請求項１２７～１３２のいずれか一項に記載の方法。
  138. 前記ポリヌクレオチドが、組換えウイルスによって前記標的細胞または前記標的細胞の集団に送達される、請求項１２７～１３２のいずれか一項に記載の方法。
  139. 前記組換えウイルスが、請求項６３～６９のいずれか一項に記載の前記組換えウイルスである、請求項１３８に記載の方法。
  140. 前記組換えウイルスが組換えＡＡＶである、請求項１３８または請求項１３９に記載の方法。
  141. 前記組換えＡＡＶがＡＡＶ９キャプシドを有する、請求項１４０に記載の方法。
  142. 前記ポリヌクレオチドが、前記ＭＴＥＭをコードする前記核酸配列に作動可能に連結されたプロモータを含む、請求項１２７～１４１のいずれか一項に記載の方法。
  143. 前記プロモータが遍在性プロモータであるか、または前記プロモータが、筋細胞特異的プロモータ、骨格筋特異的プロモータ、筋管特異的プロモータ、筋サテライト細胞特異的プロモータ、ニューロン特異的プロモータ、アストロサイト特異的プロモータ、ミクログリア特異的プロモータ、眼細胞特異的プロモータ、網膜細胞特異的プロモータ、網膜神経節細胞特異的プロモータ、網膜色素上皮特異的プロモータ、膵臓細胞特異的プロモータ、または膵臓ベータ細胞特異的プロモータである、請求項１４２に記載の方法。
  144. 前記遍在性プロモータが、ＣＭＶプロモータ、ＣＡＧプロモータ、ＥＦ１アルファプロモータまたはＵｂＣプロモータである、請求項１４３に記載の方法。
  145. 前記認識配列を含む変異型ミトコンドリアゲノムの約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％が、前記標的細胞または前記標的細胞の前記集団で分解される、請求項１２７～１４４のいずれか一項に記載の方法。
  146. 前記認識配列を含む変異型ミトコンドリアゲノムに対する野生型ミトコンドリアゲノムの比が、前記標的細胞または前記標的細胞の集団で増加する、請求項１２７～１４５のいずれか一項に記載の方法。
  147. 前記比が、約５：９５、約１０：９０、約１５：８５、約２０：８０、約２５：７５、約３０：７０、約３５：６５、約４０：６０、約４５：５５、約５０：５０、約５５：４５、約６０：４０、約６５：３５、約７０：３０、約７５：２５、約８０：２０、約８５：１５、約９０：１０、約９５：５、約２０：１、約５０：１、約１００：１、約１５０：１、約２００：１、約２５０：１、約３００：１、約３５０：１、約４００：１、約４５０：１、約５００：１、約５５０：１、約６００：１、約６５０：１、約７００：１、約７５０：１、約８００：１、約８５０：１、約９００：１、約９５０：１、約１０００：１、またはそれ以上まで増加する、請求項１２７～１４６のいずれか一項に記載の方法。
  148. 前記標的細胞または前記標的細胞の集団における野生型ミトコンドリアゲノムのパーセンテージが、前記標的細胞または前記標的細胞の集団における全ミトコンドリアゲノムの約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％またはそれ以上である、請求項１２７～１４７のいずれか一項に記載の方法。
  149. 前記遺伝子修飾真核細胞における前記認識配列を含む変異型ミトコンドリアゲノムのパーセンテージが、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％またはそれ以上減少する、請求項１２７～１４８のいずれか一項に記載の方法。
  150. 前記標的細胞または前記標的細胞の集団の細胞呼吸が、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約１００％、またはそれ以上増加する、請求項１２７～１４９のいずれか一項に記載の方法。
  151. 前記標的細胞または前記標的細胞の集団の細胞呼吸が、約３０～４０％、約４０～５０％、約５０～６０％、約６０～７０％、約７０～８０％、約８０～９０％、約９０～１００％、またはそれ以上増加する、請求項１２７～１５０のいずれか一項に記載の方法。
  152. 対象のミトコンドリア障害に関連する状態を処置するための方法であって、前記方法が、前記対象に、
    （ａ）治療有効量の請求項１～５２のいずれか一項に記載のＭＴＥＭをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドであり、前記ポリヌクレオチドが前記対象における標的細胞または標的細胞の集団に送達され、前記ＭＴＥＭが前記標的細胞または前記標的細胞の集団で発現される、ポリヌクレオチド、または
    （ｂ）治療有効量の請求項１～５２のいずれか一項に記載の前記ＭＴＥＭであり、前記ＭＴＥＭが前記対象における標的細胞または標的細胞の集団に送達される、前記ＭＴＥＭ
    を投与することを含み、前記ＭＴＥＭが、配列番号１を含む認識配列において変異型ミトコンドリアゲノムに切断部位を作り出し、前記変異型ミトコンドリアゲノムが分解される、方法。
  153. 前記認識配列が、野生型ミトコンドリアゲノムのヌクレオチド位置３０００～３５００に対応する変異型ミトコンドリアゲノムの領域に位置する、請求項１５２に記載の方法。
  154. 前記ＭＴＥＭが変異型ミトコンドリアゲノムのＡ３２４３Ｇ変異を標的化する、請求項１５２または請求項１５３に記載の方法。
  155. 前記ミトコンドリア障害がＭＥＬＡＳであり、前記方法がＭＥＬＡＳに関連する１つ以上の症状を低減または改善する、請求項１５２～１５４のいずれか一項に記載の方法。
  156. 請求項７２～７６のいずれか一項に記載の前記医薬組成物を投与することを含む、請求項１５２～１５５のいずれか一項に記載の方法。
  157. 前記対象が哺乳動物である、請求項１５２～１５６のいずれか一項に記載の方法。
  158. 前記対象がヒトである、請求項１５２～１５７のいずれか一項に記載の方法。
  159. 前記標的細胞が、筋細胞、骨格筋細胞、筋管細胞、筋サテライト細胞、ニューロン、アストロサイト、ミクログリア細胞、眼細胞、網膜細胞、網膜神経節細胞、網膜色素上皮細胞、膵臓細胞、もしくは膵臓ベータ細胞であるか、または前記標的細胞の集団が、筋細胞、骨格筋細胞、筋管細胞、筋サテライト細胞、ニューロン、アストロサイト、ミクログリア細胞、眼細胞、網膜細胞、網膜神経節細胞、網膜色素上皮細胞、膵臓細胞、もしくは膵臓ベータ細胞の集団である、請求項１５２～１５８のいずれか一項に記載の方法。
  160. 前記状態が、筋肉、脳、中枢神経系、膵臓、または網膜の状態である、請求項１５２～１５９のいずれか一項に記載の方法。
  161. 前記状態が、ミトコンドリア脳筋症、乳酸アシドーシス、および脳卒中様エピソード（ＭＥＬＡＳ）、進行性外眼筋麻痺、母性遺伝性糖尿病、片頭痛、または眼筋ミオパチーである、請求項１５２～１６０のいずれか一項に記載の方法。
  162. 前記ポリヌクレオチドがｍＲＮＡである、請求項１５２～１６１のいずれか一項に記載の方法。
  163. 前記ポリヌクレオチドが請求項５３に記載の前記ｍＲＮＡである、請求項１６２に記載の方法。
  164. 前記ポリヌクレオチドが組換えＤＮＡ構築物である、請求項１５２～１６１のいずれか一項に記載の方法。
  165. 前記ポリヌクレオチドが請求項５５～６２のいずれか一項に記載の前記組換えＤＮＡ構築物である、請求項１６４に記載の方法。
  166. 前記ポリヌクレオチドが、脂質ナノ粒子によって前記標的細胞または前記標的細胞の集団に送達される、請求項１５２～１６１のいずれか一項に記載の方法。
  167. 前記ポリヌクレオチドが、組換えウイルスによって前記標的細胞または前記標的細胞の集団に送達される、請求項１５２～１６１のいずれか一項に記載の方法。
  168. 前記組換えウイルスが、請求項６３～６９のいずれか一項に記載の前記組換えウイルスである、請求項１６７に記載の方法。
  169. 前記組換えウイルスが組換えＡＡＶである、請求項１６７または請求項１６８に記載の方法。
  170. 前記組換えＡＡＶがＡＡＶ９キャプシドを有する、請求項１６９に記載の方法。
  171. 前記ポリヌクレオチドが、前記ＭＴＥＭをコードする前記核酸配列に作動可能に連結されたプロモータを含む、請求項１５２～１７０のいずれか一項に記載の方法。
  172. 前記プロモータが遍在性プロモータであるか、または前記プロモータが、筋細胞特異的プロモータ、骨格筋特異的プロモータ、筋管特異的プロモータ、筋サテライト細胞特異的プロモータ、ニューロン特異的プロモータ、アストロサイト特異的プロモータ、ミクログリア特異的プロモータ、眼細胞特異的プロモータ、網膜細胞特異的プロモータ、網膜神経節細胞特異的プロモータ、網膜色素上皮特異的プロモータ、膵臓細胞特異的プロモータ、または膵臓ベータ細胞特異的プロモータである、請求項１７１に記載の方法。
  173. 前記遍在性プロモータが、ＣＭＶプロモータ、ＣＡＧプロモータ、ＥＦ１アルファプロモータまたはＵｂＣプロモータである、請求項１７２に記載の方法。
  174. 前記認識配列を含む変異型ミトコンドリアゲノムの約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％が、前記標的細胞または前記標的細胞の前記集団で分解される、請求項１５２～１７３のいずれか一項に記載の方法。
  175. 前記認識配列を含む変異型ミトコンドリアゲノムに対する野生型ミトコンドリアゲノムの比が、前記標的細胞または前記標的細胞の集団で増加する、請求項１５２～１７４のいずれか一項に記載の方法。
  176. 前記比が、約５：９５、約１０：９０、約１５：８５、約２０：８０、約２５：７５、約３０：７０、約３５：６５、約４０：６０、約４５：５５、約５０：５０、約５５：４５、約６０：４０、約６５：３５、約７０：３０、約７５：２５、約８０：２０、約８５：１５、約９０：１０、約９５：５、約２０：１、約５０：１、約１００：１、約１５０：１、約２００：１、約２５０：１、約３００：１、約３５０：１、約４００：１、約４５０：１、約５００：１、約５５０：１、約６００：１、約６５０：１、約７００：１、約７５０：１、約８００：１、約８５０：１、約９００：１、約９５０：１、約１０００：１、またはそれ以上まで増加する、請求項１５２～１７５のいずれか一項に記載の方法。
  177. 前記標的細胞または前記標的細胞の集団における野生型ミトコンドリアゲノムのパーセンテージが、前記標的細胞または前記標的細胞の集団における全ミトコンドリアゲノムの約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％またはそれ以上である、請求項１５２～１７６のいずれか一項に記載の方法。
  178. 前記遺伝子修飾真核細胞における前記認識配列を含む変異型ミトコンドリアゲノムのパーセンテージが、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％またはそれ以上減少する、請求項１５２～１７７のいずれか一項に記載の方法。
  179. 前記標的細胞または前記標的細胞の集団における細胞呼吸が、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約１００％、またはそれ以上増加する、請求項１５２～１７８のいずれか一項に記載の方法。
  180. 前記標的細胞または前記標的細胞の集団の細胞呼吸が、約３０～４０％、約４０～５０％、約５０～６０％、約６０～７０％、約７０～８０％、約８０～９０％、約９０～１００％、またはそれ以上増加する、請求項１５２～１７９のいずれか一項に記載の方法。
  181. 配列番号１を含む認識配列に結合して切断する遺伝子操作メガヌクレアーゼであって、前記遺伝子操作メガヌクレアーゼが第１のサブユニットおよび第２のサブユニットを含み、前記第１のサブユニットが、前記認識配列の第１の認識半部位に結合し、第１の超可変（ＨＶＲ１）領域を含み、前記第２のサブユニットが、前記認識配列の第２の認識半部位に結合し、第２の超可変（ＨＶＲ２）領域を含み、前記ＨＶＲ１領域が、配列番号３～１２のいずれか１つの残基２４～７９に対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＨＶＲ２領域が、配列番号３～１２のいずれか１つの残基２１５～２７０に対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、遺伝子操作メガヌクレアーゼ。
  182. 請求項１８１に記載の前記遺伝子操作メガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含む、ポリヌクレオチド。
  183. 請求項１８１に記載の前記遺伝子操作メガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む、組換えＤＮＡ構築物。
  184. 請求項１８１に記載の前記遺伝子操作メガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む、組換えウイルス。
  185. ポリヌクレオチドを含む脂質ナノ粒子を含む脂質ナノ粒子組成物であって、前記ポリヌクレオチドが、請求項１８１に記載の前記遺伝子操作メガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含む、脂質ナノ粒子組成物。
  186. 薬学的に許容される担体、および請求項１８１に記載の前記遺伝子操作メガヌクレアーゼを含む、医薬組成物。
  187. 薬学的に許容される担体、および請求項１８２に記載の前記ポリヌクレオチドを含む、医薬組成物。
  188. 薬学的に許容される担体、および請求項１８３に記載の前記組換えＤＮＡ構築物を含む、医薬組成物。
  189. 薬学的に許容される担体、および請求項１８４に記載の前記組換えウイルスを含む、医薬組成物。
  190. 薬学的に許容される担体、および請求項１８５に記載の前記脂質ナノ粒子組成物を含む、医薬組成物。
  191. 請求項１８２に記載の前記ポリヌクレオチドを含む、遺伝子修飾真核細胞。
  192. 遺伝子修飾真核細胞を産生するための方法であって、前記方法が、請求項１８１に記載の前記遺伝子操作メガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを真核細胞に導入することを含み、前記遺伝子操作メガヌクレアーゼが前記真核細胞で発現され、前記遺伝子操作メガヌクレアーゼが配列番号１を含む前記認識配列に切断部位を作り出す、方法。
  193. 遺伝子修飾真核細胞を産生するための方法であって、前記方法が請求項１８１に記載の前記遺伝子操作メガヌクレアーゼを真核細胞に導入することを含み、前記遺伝子操作メガヌクレアーゼが前記真核細胞で発現され、前記遺伝子操作メガヌクレアーゼが配列番号１を含む認識配列に切断部位を作り出す、方法。
  194. 細胞のゲノムに挿入された目的の外因性配列を含む遺伝子修飾真核細胞を産生するための方法であって、前記方法が、請求項１８１に記載の前記遺伝子操作メガヌクレアーゼをコードする第１の核酸配列であり、前記遺伝子操作メガヌクレアーゼが前記真核細胞で発現される第１の核酸配列、および前記目的の配列を含む第２の核酸配列であり、前記遺伝子操作メガヌクレアーゼが配列番号１を含む認識配列に切断部位を作り出し、前記目的の配列が前記切断部位でゲノムに挿入される第２の核酸配列を含む１つ以上のポリヌクレオチドを真核細胞に導入することを含む、方法。
  195. 細胞のゲノムに挿入された目的の外因性配列を含む遺伝子修飾真核細胞を産生するための方法であって、前記方法が、請求項１８１に記載の前記遺伝子操作メガヌクレアーゼ、および前記目的の配列を含む核酸配列を含むポリヌクレオチドを真核細胞に導入することを含み、前記遺伝子操作メガヌクレアーゼが配列番号１を含む認識配列に切断部位を作り出し、前記目的の配列が前記切断部位でゲノムに挿入される、方法。
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