CN117693584A - 靶向人线粒体基因组的工程化大范围核酸酶 - Google Patents

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CN117693584A CN202280044085.6A CN202280044085A CN117693584A CN 117693584 A CN117693584 A CN 117693584A CN 202280044085 A CN202280044085 A CN 202280044085A CN 117693584 A CN117693584 A CN 117693584A
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J·J·史密斯
G·汤姆贝林
J·莫里斯
W·舒普
C·T·莫赖斯
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University of Miami
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Abstract

本文公开了工程化的重组大范围核酸酶以识别和切割存在于人线粒体DNA(mtDNA)中的识别序列。本公开内容还涉及这种重组大范围核酸酶在产生遗传修饰的真核细胞的方法中的用途，以及涉及遗传修饰的真核细胞群，其中所述mtDNA已被修饰或编辑。

Description

靶向人线粒体基因组的工程化大范围核酸酶
技术领域
本公开内容涉及分子生物学和重组核酸技术领域。特别地，本公开内容涉及被工程化以识别和切割在人类线粒体基因组中发现的识别序列的重组大范围核酸酶。本公开内容还涉及这种重组大范围核酸酶在生产遗传修饰的真核细胞的方法中的用途，以及涉及遗传修饰的真核细胞群，其中线粒体DNA已被修饰。
通过EFS-WEB作为文本文件提交的序列表的引用
本申请包含序列表，其已经通过EFS-Web以ASCII格式提交，并且将其整体通过引用并入本文。所述ASCII副本，于2022年4月21日创建，名为P89339_0139_5_SeqList_4-21-22.txt，并且大小为80.6kb。
背景技术
在所有生物体中，线粒体在正常生长和发育下以及应激反应中调节细胞能量和代谢。很多起这些作用的蛋白都是在线粒体基因组中编码的。因此，线粒体基因组的编辑在动物和植物中都有不同的应用。在人类中，有害的线粒体突变是很多疾病的来源，可以将基因编辑疗法应用于这些疾病。
致病性线粒体DNA(mtDNA)突变包括蛋白编码、转移RNA(tRNA)或核糖体RNA(rRNA)基因的大规模重排和点突变。尽管mtDNA相关疾病诊断的患病率约为1/5,000，但十种最常见的致病性mtDNA突变的群体频率要高得多，接近1/200，这意味着很多“正常”个体携带低水平的突变基因组(Schon等，Nat Rev Gen 13:878-890(2012))。
在大多数情况下，突变的mtDNA与患者细胞中的野生型mtDNA共存(mtDNA异质性)。几项研究表明，野生型mtDNA具有很强的保护作用，只有当突变的mtDNA水平高于80-90％时，才能观察到生化异常(Schon等，Nature Reviews Genetics 13:878-890(2012))。已经表明，只有当突变负荷超过80％时，肌肉纤维才会产生OXPHOS缺陷(Sciacco等，Hum MolGenet 3:13-19(1994))。因此，任何能够将这种平衡向野生型转变哪怕只是一小部分的方法都将具有强大的治疗潜力。
然而，mtDNA操作仍然是一个未被探索的科学领域，因为无法高效地靶向mtDNA并产生精确的编辑。线粒体基因组很难编辑，因为其需要可预测的修复机制和向该细胞器递送编辑技术。鉴于线粒体基因组编辑相关的困难和不可预测性，存在对线粒体DNA精确编辑的尚未得到满足的需求，这将在生命科学中开辟一个完整的等待探索和充满机会的领域。以更可预测的方式靶向和编辑线粒体基因组的限定区域(优选仅限于一个基因)的能力将明显优于目前可用的系统。
发明内容
本文提供了用于精确编辑线粒体基因组的组合物和方法。到目前为止，线粒体基因组编辑的尝试已经导致了大量不可预测的缺失/重排。本发明证明，工程化的大范围核酸酶可以导致线粒体DNA(mtDNA)的精确编辑，从而在生命科学中开辟了一个完整的等待探索和充满机会的领域。本文提供的组合物和方法可用于编辑一个特定的线粒体基因而不影响周围区域。
在一个方面中，本发明提供了一种线粒体靶向的工程化大范围核酸酶(MTEM)，其结合和切割在真核细胞的线粒体基因组中包含SEQ ID NO:1的识别序列，其中所述MTEM包含附接至线粒体转运肽(MTP)的工程化大范围核酸酶，其中所述工程化大范围核酸酶包含第一亚基和第二亚基，其中第一亚基结合至识别序列的第一识别半位点并包含第一高变(HVR1)区，并且其中第二亚基结合至识别序列的第二识别半位点并包含第二高变(HVR2)区。
在一些实施方式中，所述HVR1区包含与对应于SEQ ID NO:3-12的任一个的残基24-79的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述HVR1区包含对应于SEQ ID NO:3-12的任一个的残基24、26、28、30、32、33、38、40、42、44、46、68、70、75和77的一个或多个残基。在一些实施方式中，所述HVR1区包含对应于SEQ ID NO:3-12的任一个的残基24、26、28、30、32、33、38、40、42、44、46、68、70、75和77的残基。在一些实施方式中，所述HVR1区在对应于SEQ ID NO:3-12的任一个的残基66的残基处包含Y、R、K或D。在一些实施方式中，所述HVR1区包含具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个氨基酸取代的SEQ ID NO:3-12的任一个的残基24-79。在一些实施方式中，所述HVR1区包含SEQ ID NO:3-12的任一个的残基24-79。
在一些实施方式中，所述第一亚基包含与SEQ ID NO:3-12的任一个的残基7-153具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述第一亚基包含对应于SEQ ID NO:3-12的任一个的残基19的残基。在一些实施方式中，所述第一亚基包含对应于SEQ ID NO:3、5、7、9、11或12的任一个的残基80的残基。在一些实施方式中，所述第一亚基在对应于SEQ ID NO:3-12的任一个的残基19的残基处包含G、S或A。在一些实施方式中，所述第一亚基在对应于SEQ ID NO:3-12的任一个的残基80的残基处包含E、Q或K。在一些实施方式中，所述第一亚基包含具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸取代的SEQ ID NO:3-12的任一个的残基7-153。在一些实施方式中，所述第一亚基包含SEQ ID NO:3-12的任一个的残基7-153。
在一些实施方式中，所述HVR2区包含与对应于SEQ ID NO:3-12的残基215-270的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述HVR2区包含对应于SEQ ID NO:3-12的任一个的残基215、217、219、221、223、224、229、231、233、235、237、259、261、266和268的一个或多个残基。在一些实施方式中，所述HVR2区包含对应于SEQ ID NO:3-12的任一个的残基215、217、219、221、223、224、229、231、233、235、237、259、261、266和268的残基。在一些实施方式中，所述HVR2区包含对应于SEQ ID NO:3-12的任一个的残基241的残基。在一些实施方式中，所述HVR2区包含对应于SEQ ID NO:3或5-12的任一个的残基263的残基。在一些实施方式中，所述HVR2区包含对应于SEQ ID NO:3-6或8-12的任一个的残基264的残基。在一些实施方式中，所述HVR2区包含对应于SEQ ID NO:6的残基265的残基。在一些实施方式中，所述HVR2区在对应于SEQ ID NO:3-12的任一个的残基257的残基处包含Y、R、K或D。在一些实施方式中，所述HVR2区包含具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个氨基酸取代的SEQ ID NO:3-12的任一个的残基215-270。在一些实施方式中，所述HVR2区包含SEQ ID NO:3-12的任一个的残基215-270。
在一些实施方式中，所述第二亚基包含与SEQ ID NO:3-12的任一个的残基198-344具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述第二亚基包含对应于SEQ ID NO:4的任一个的残基276的残基。在一些实施方式中，所述第二亚基包含对应于SEQ ID NO:3-12的任一个的残基330的残基。在一些实施方式中，所述第二亚基在对应于SEQ ID NO:3-12的任一个的残基210的残基处包含G、S或A。在一些实施方式中，所述第二亚基在对应于SEQ ID NO:3-12的任一个的残基271的残基处包含E、Q或K。在一些实施方式中，所述第二亚基包含具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸取代的SEQ ID NO:3-12任一个的残基198-344。在一些实施方式中，所述第二亚基包含SEQ ID NO:3-12的任一个的残基198-344。
在一些实施方式中，所述工程化大范围核酸酶是包含接头的单链大范围核酸酶，所述接头共价连接第一亚基和第二亚基。在一些实施方式中，所述工程化大范围核酸酶包含与SEQ ID NO:3-12的任一个具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述工程化大范围核酸酶包含SEQ ID NO:3-12的任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述工程化大范围核酸酶由与SEQ ID NO:33-42的任一个的核酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的核酸序列编码。在一些实施方式中，所述工程化大范围核酸酶由SEQ ID NO:33-42的任一个的核酸序列编码。
在一些实施方式中，所述MTP包含与SEQ ID NO:43-45的任一个中所示的序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述MTP包含SEQ ID NO:43-45的任一个中所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述MTP附接至工程化大范围核酸酶的C末端。在一些实施方式中，所述MTP附接至工程化大范围核酸酶的N末端。在一些实施方式中，所述MTP与工程化大范围核酸酶融合。在一些实施方式中，所述MTP通过多肽接头附接至工程化大范围核酸酶。在一些实施方式中，所述工程化大范围核酸酶附接至第一MTP和第二MTP。在一些实施方式中，第一MTP和/或第二MTP包含与SEQ ID NO:43-45的任一个中所示的序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，第一MTP和/或第二MTP包含SEQ ID NO:43-45的任一个中所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，第一MTP和第二MTP是相同的。在一些实施方式中，第一MTP和第二MTP是不同的。在一些实施方式中，第一MTP和第二MTP与工程化大范围核酸酶融合。在一些实施方式中，第一MTP和第二MTP通过多肽接头附接至工程化大范围核酸酶。
在一些实施方式中，MTEM附接至核输出序列(NES)。在一些实施方式中，所述NES包含与SEQ ID NO:46或47中所示的序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述NES包含SEQ ID NO:46或47中所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述NES附接在MTEM的N末端处。在一些实施方式中，所述NES附接在MTEM的C末端处。在一些实施方式中，所述NES与MTEM融合。在一些实施方式中，所述NES通过多肽接头附接至MTEM。在一些实施方式中，所述MTEM附接至第一NES和第二NES。在一些实施方式中，第一NES附接在MTEM的N末端处和第二NES附接在MTEM的C末端处。在一些实施方式中，第一NES和/或第二NES包含与SEQ ID NO:46或47中所示的序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，第一NES和/或第二NES包含SEQ ID NO:46或47中所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，第一MTP和第二MTP是相同的。在一些实施方式中，第一MTP和第二MTP是不同的。在一些实施方式中，第一NES和/或第二NES与MTEM融合。在一些实施方式中，第一NES和/或第二NES通过多肽接头附接至MTEM。
在另一个方面中，本发明提供了一种多核苷酸，其包含编码本文所述的MTEM的核酸序列。在一些实施方式中，所述多核苷酸是mRNA。
在另一个方面中，本发明提供了一种重组DNA构建体，其包含多核苷酸，所述多核苷酸包含编码本文所述的MTEM的核酸序列。在一些实施方式中，所述重组DNA构建体编码包含所述多核苷酸的重组病毒。在一些实施方式中，所述重组病毒是重组腺病毒、重组慢病毒、重组逆转录病毒或重组腺相关病毒(AAV)。在一些实施方式中，所述重组病毒是重组AAV。在一些实施方式中，所述重组AAV具有AAV9衣壳。在一些实施方式中，其中所述多核苷酸包含可操作地连接至编码所述MTEM的所述核酸序列的启动子。在一些实施方式中，所述启动子是组成型启动子，或者所述启动子是肌肉细胞特异性启动子、骨骼肌特异性启动子、肌管特异性启动子、肌肉卫星细胞特异性启动子、神经元特异性启动子、星形胶质细胞特异性启动子、小胶质细胞特异性启动子、眼细胞特异性启动子、视网膜细胞特异性启动子、视网膜神经节细胞特异性启动子、视网膜色素上皮特异性启动子、胰腺细胞特异性启动子或胰腺β细胞特异性启动子。在一些实施方式中，所述组成型启动子是CMV启动子、CAG启动子、EF1α启动子或UbC启动子。
在另一个方面中，本发明提供了一种质粒，其包含本文所述的任何重组DNA构建体。在另一个方面中，本发明提供了一种重组病毒，其包含多核苷酸，所述多核苷酸包含编码本文所述的MTEM的核酸序列。在一些实施方式中，所述重组病毒是重组腺病毒、重组慢病毒、重组逆转录病毒或重组腺相关病毒(AAV)。在一些实施方式中，所述重组病毒是重组AAV。在一些实施方式中，所述重组AAV具有AAV9衣壳。在一些实施方式中，其中所述多核苷酸包含可操作地连接至编码所述MTEM的所述核酸序列的启动子。在一些实施方式中，所述启动子是组成型启动子，或者所述启动子是肌肉细胞特异性启动子、骨骼肌特异性启动子、肌管特异性启动子、肌肉卫星细胞特异性启动子、神经元特异性启动子、星形胶质细胞特异性启动子、小胶质细胞特异性启动子、眼细胞特异性启动子、视网膜细胞特异性启动子、视网膜神经节细胞特异性启动子、视网膜色素上皮特异性启动子、胰腺细胞特异性启动子或胰腺β细胞特异性启动子。在一些实施方式中，所述组成型启动子是CMV启动子、CAG启动子、EF1α启动子或UbC启动子。
在另一个方面中，本发明提供了一种脂质纳米颗粒组合物，其包含脂质纳米颗粒，所述脂质纳米颗粒包含多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码本文所述的MTEM的核酸序列。在一些实施方式中，所述多核苷酸是mRNA。
在另一个方面中，本发明提供了一种药物组合物，其包含药学上可接受的载体和本文所述的MTEM。
在另一个方面中，本发明提供了一种药物组合物，其包含药学上可接受的载体和本文所述的多核苷酸。
在另一个方面中，本发明提供了一种药物组合物，其包含药学上可接受的载体和本文所述的重组DNA构建体。
在另一个方面中，本发明提供了一种药物组合物，其包含药学上可接受的载体和本文所述的重组病毒。
在另一个方面中，本发明提供了一种药物组合物，其包含药学上可接受的载体和本文所述的脂质纳米颗粒组合物。
在另一个方面中，本发明提供了一种遗传修饰的真核细胞，其包含本文所述的任何多核苷酸。在一些实施方式中，所述遗传修饰的真核细胞是遗传修饰的哺乳动物细胞。在一些实施方式中，所述遗传修饰的真核细胞是遗传修饰的人细胞。
在另一个方面中，本发明提供了一种用于产生遗传修饰的真核细胞的方法，所述方法包括向真核细胞中引入：(a)多核苷酸，其包含编码本文所述MTEM的核酸序列，其中MTEM在真核细胞中表达；或(b)本文所述的MTEM；其中MTEM在真核细胞的突变线粒体基因组中在包含SEQ ID NO:1的识别序列处产生切割位点。在一些实施方式中，切割位点通过非同源末端连接修复，以使得识别序列包含插入或缺失。在一些实施方式中，包含识别序列的突变线粒体基因组在遗传修饰的真核细胞中被降解。在一些实施方式中，在遗传修饰的真核细胞中，约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的包含识别序列的突变线粒体基因组被降解。在一些实施方式中，在遗传修饰的真核细胞中，野生型线粒体基因组与包含识别序列的突变线粒体基因组的比率增加。在一些实施方式中，比率增加至约5:95、约10:90、约15:85、约20:80、约25:75、约30:70、约35:65、约40:60、约45:55、约50:50、约55:45、约60:40、约65:35、约70:30、约75:25、约80:20、约85:15、约90:10、约95:5、约20:1、约50:1、约100:1、约150:1、约200:1、约250:1、约300:1、约350:1、约400:1、约450:1、约500:1、约550:1、约600:1、约650:1、约700:1、约750:1、约800:1、约850:1、约900:1、约950:1、约1000:1或更高。在一些实施方式中，在遗传修饰的真核细胞中野生型线粒体基因组的百分比是在遗传修饰的真核细胞中总线粒体基因组的约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或更高。在一些实施方式中，在遗传修饰的真核细胞中，包含识别序列的突变线粒体基因组的百分比降低约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或更高。在一些实施方式中，在遗传修饰的真核细胞中细胞呼吸增加约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约100％或更高。在一些实施方式中，在遗传修饰的真核细胞中细胞呼吸增加约30-40％、约40-50％、约50-60％、约60-70％、约70-80％、约80-90％、约90-100％或更高。
在另一个方面中，本发明提供了一种用于产生包含多个遗传修饰的细胞的真核细胞群的方法，所述方法包括向在所述群中的多个真核细胞中引入：(a)多核苷酸，其包含编码本文所述的MTEM的核酸序列，其中MTEM在多个真核细胞中表达；或(b)本文所述的MTEM；其中MTEM在多个真核细胞的突变线粒体基因组中，在包含SEQ ID NO:1的识别序列处产生切割位点。在一些实施方式中，切割位点通过非同源末端连接修复，以使得识别序列包含插入或缺失。在一些实施方式中，包含识别序列的突变线粒体基因组在多个遗传修饰的真核细胞中被降解。在一些实施方式中，在多个遗传修饰的真核细胞中，约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的包含识别序列的突变线粒体基因组被降解。在一些实施方式中，在多个遗传修饰的真核细胞中，野生型线粒体基因组与包含识别序列的突变线粒体基因组的比率增加。在一些实施方式中，在真核细胞群中，野生型线粒体基因组与包含识别序列的突变线粒体基因组的比率增加。在一些实施方式中，比率增加至约5:95、约10:90、约15:85、约20:80、约25:75、约30:70、约35:65、约40:60、约45:55、约50:50、约55:45、约60:40、约65:35、约70:30、约75:25、约80:20、约85:15、约90:10、约95:5、约20:1、约50:1、约100:1、约150:1、约200:1、约250:1、约300:1、约350:1、约400:1、约450:1、约500:1、约550:1、约600:1、约650:1、约700:1、约750:1、约800:1、约850:1、约900:1、约950:1、约1000:1或更高。在一些实施方式中，在多个遗传修饰的真核细胞中，野生型线粒体基因组的百分比增加约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或更高。在一些实施方式中，在真核细胞群中，野生型线粒体基因组的百分比增加约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或更高。在一些实施方式中，在多个遗传修饰的真核细胞中，包含识别序列的突变线粒体基因组的百分比降低约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或更高。在一些实施方式中，在真核细胞群中，包含识别序列的突变线粒体基因组的百分比降低约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或更高。在一些实施方式中，在多个遗传修饰的真核细胞中细胞呼吸增加约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约100％或更高。在一些实施方式中，在多个遗传修饰的真核细胞中细胞呼吸增加约30-40％、约40-50％、约50-60％、约60-70％、约70-80％、约80-90％、约90-100％或更高。在一些实施方式中，在真核细胞群中细胞呼吸增加约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约100％或更高。在一些实施方式中，在真核细胞群中细胞呼吸增加约30-40％、约40-50％、约50-60％、约60-70％、约70-80％、约80-90％、约90-100％或更高。
在一些实施方式中，识别序列在与线粒体病症相关的突变线粒体基因组的区域内。在一些实施方式中，线粒体病症是线粒体脑肌病、乳酸酸中毒和卒中样发作(MELAS)。在一些实施方式中，识别序列位于对应于野生型线粒体基因组核苷酸位置3000-3500的突变线粒体基因组的区域中。在一些实施方式中，MTEM靶向突变线粒体基因组的A3243G突变。在一些实施方式中，所述方法在体内进行。在一些实施方式中，所述方法在体外进行。在一些实施方式中，所述多核苷酸是mRNA。在一些实施方式中，所述多核苷酸是本文所述的任何mRNA。在一些实施方式中，所述多核苷酸是重组DNA构建体。在一些实施方式中，所述多核苷酸是本文所述的任何重组DNA构建体。在一些实施方式中，通过脂质纳米颗粒将多核苷酸引入真核细胞。在一些实施方式中，通过重组病毒将多核苷酸引入真核细胞。在一些实施方式中，所述重组病毒是本文所述的任何重组病毒。在一些实施方式中，所述重组病毒是重组AAV。在一些实施方式中，所述重组AAV具有AAV9衣壳。在一些实施方式中，其中所述多核苷酸包含可操作地连接至编码所述MTEM的所述核酸序列的启动子。在一些实施方式中，所述启动子是肌肉细胞特异性启动子、骨骼肌特异性启动子、肌管特异性启动子、肌肉卫星细胞特异性启动子、神经元特异性启动子、星形胶质细胞特异性启动子、小胶质细胞特异性启动子、眼细胞特异性启动子、视网膜细胞特异性启动子、视网膜神经节细胞特异性启动子、视网膜色素上皮特异性启动子、胰腺细胞特异性启动子或胰腺β细胞特异性启动子。在一些实施方式中，所述组成型启动子是CMV启动子、CAG启动子、EF1α启动子或UbC启动子。在一些实施方式中，所述真核细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方式中，所述真核细胞是人细胞。在一些实施方式中，所述真核细胞是肌肉细胞、骨骼肌细胞、肌管细胞、肌肉卫星细胞、神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞、眼细胞、视网膜细胞、视网膜神经节细胞、视网膜色素上皮细胞、胰腺细胞或胰腺β细胞。
在另一个方面中，本发明提供了一种遗传修饰的真核细胞或遗传修饰的真核细胞群，其通过用于产生遗传修饰的真核细胞的任何方法或者用于产生包含多个遗传修饰的细胞的真核细胞群的任何方法产生。
在另一个方面中，本发明提供了一种用于在受试者的靶细胞中或者在受试者的靶细胞群中降解突变线粒体基因组的方法，所述方法包括向靶细胞或靶细胞群递送：(a)多核苷酸，其包含编码本文所述的MTEM的核酸序列，其中MTEM在靶细胞或靶细胞群中表达；或(b)本文所述的MTEM；其中MTEM在突变线粒体基因组中在包含SEQ ID NO:1的识别序列处产生切割位点，以及其中突变线粒体基因组被降解。在一些实施方式中，识别序列位于对应于野生型线粒体基因组核苷酸位置3000-3500的突变线粒体基因组的区域。在一些实施方式中，MTEM靶向突变线粒体基因组的A3243G突变。在一些实施方式中，受试者是哺乳动物。在一些实施方式中，受试者是人。在一些实施方式中，所述靶细胞是肌肉细胞、骨骼肌细胞、肌管细胞、肌肉卫星细胞、神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞、眼细胞、视网膜细胞、视网膜神经节细胞、视网膜色素上皮细胞、胰腺细胞或胰腺β细胞，或者其中所述靶细胞群是肌肉细胞、骨骼肌细胞、肌管细胞、肌肉卫星细胞、神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞、眼细胞、视网膜细胞、视网膜神经节细胞、视网膜色素上皮细胞、胰腺细胞或胰腺β细胞的群，或者所述靶细胞群是肌肉细胞、骨骼肌细胞、肌管细胞、肌肉卫星细胞、神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞、眼细胞、视网膜细胞、视网膜神经节细胞、视网膜色素上皮细胞、胰腺细胞或胰腺β细胞的群，或者其中所述靶细胞群是肌肉细胞、骨骼肌细胞、肌管细胞、肌肉卫星细胞、神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞、眼细胞、视网膜细胞、视网膜神经节细胞、视网膜色素上皮细胞、胰腺细胞或胰腺β细胞的群。在一些实施方式中，所述多核苷酸是mRNA。在一些实施方式中，多核苷酸是本文所述的任何mRNA。在一些实施方式中，多核苷酸是重组DNA构建体。在一些实施方式中，多核苷酸是本文所述的任何重组DNA构建体。在一些实施方式中，通过脂质纳米颗粒将多核苷酸递送至靶细胞或靶细胞群。在一些实施方式中，通过重组病毒将多核苷酸递送至靶细胞或靶细胞群。在一些实施方式中，重组病毒是本文所述的任何重组病毒。在一些实施方式中，所述重组病毒是重组AAV。在一些实施方式中，所述重组AAV具有AAV9衣壳。在一些实施方式中，其中所述多核苷酸包含可操作地连接至编码所述MTEM的所述核酸序列的启动子。在一些实施方式中，启动子是组成型启动子，或者其中所述启动子是肌肉细胞特异性启动子、骨骼肌特异性启动子、肌管特异性启动子、肌肉卫星细胞特异性启动子、神经元特异性启动子、星形胶质细胞特异性启动子、小胶质细胞特异性启动子、眼细胞特异性启动子、视网膜细胞特异性启动子、视网膜神经节细胞特异性启动子、视网膜色素上皮特异性启动子、胰腺细胞特异性启动子或胰腺β细胞特异性启动子。在一些实施方式中，所述组成型启动子是CMV启动子、CAG启动子、EF1α启动子或UbC启动子。在一些实施方式中，在靶细胞或靶细胞群中约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的包含识别序列的突变线粒体基因组被降解。在一些实施方式中，在靶细胞或靶细胞群中野生型线粒体基因组与包含识别序列的突变线粒体基因组的比率增加。在一些实施方式中，比率增加至约5:95、约10:90、约15:85、约20:80、约25:75、约30:70、约35:65、约40:60、约45:55、约50:50、约55:45、约60:40、约65:35、约70:30、约75:25、约80:20、约85:15、约90:10、约95:5、约20:1、约50:1、约100:1、约150:1、约200:1、约250:1、约300:1、约350:1、约400:1、约450:1、约500:1、约550:1、约600:1、约650:1、约700:1、约750:1、约800:1、约850:1、约900:1、约950:1、约1000:1或更高。在一些实施方式中，在靶细胞或靶细胞群中野生型线粒体基因组的百分比是在靶细胞或靶细胞群中总线粒体基因组的约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或更高。在一些实施方式中，在遗传修饰的真核细胞中，包含识别序列的突变线粒体基因组的百分比降低约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或更高。在一些实施方式中，在靶细胞或靶细胞群中细胞呼吸增加约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约100％或更高。在一些实施方式中，在靶细胞或靶细胞群中细胞呼吸增加约30-40％、约40-50％、约50-60％、约60-70％、约70-80％、约80-90％、约90-100％或更高。
在另一个方面中，本发明提供了一种用于在受试者中治疗与MELAS相关的病况的方法，所述方法包括向所述受试者施用：(a)治疗有效量的包含编码本文所述的MTEM的核酸序列的多核苷酸，其中将多核苷酸递送至在受试者中的靶细胞或靶细胞群，其中MTEM在靶细胞或靶细胞群中表达；或(b)治疗有效量的本文所述的MTEM，其中将MTEM递送至在受试者中的靶细胞或靶细胞群；其中MTEM在突变线粒体基因组中在包含SEQ ID NO:1的识别序列处产生切割位点，以及其中突变线粒体基因组被降解。在一些实施方式中，识别序列位于对应于野生型线粒体基因组的核苷酸位置3000-3500的突变线粒体基因组的区域中。在一些实施方式中，MTEM靶向突变线粒体基因组的A3243G突变。在一些实施方式中，所述方法减少或改善与MELAS相关的一种或多种症状。在一些实施方式中，所述方法包括施用本文所述的任何药物组合物。在一些实施方式中，受试者是哺乳动物。在一些实施方式中，受试者是人。在一些实施方式中，所述靶细胞是肌肉细胞、骨骼肌细胞、肌管细胞、肌肉卫星细胞、神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞、眼细胞、视网膜细胞、视网膜神经节细胞、视网膜色素上皮细胞、胰腺细胞或胰腺β细胞，或者其中所述靶细胞群是肌肉细胞、骨骼肌细胞、肌管细胞、肌肉卫星细胞、神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞、眼细胞、视网膜细胞、视网膜神经节细胞、视网膜色素上皮细胞、胰腺细胞或胰腺β细胞的群，或者所述靶细胞群是肌肉细胞、骨骼肌细胞、肌管细胞、肌肉卫星细胞、神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞、眼细胞、视网膜细胞、视网膜神经节细胞、视网膜色素上皮细胞、胰腺细胞或胰腺β细胞的群，或者其中所述靶细胞群是肌肉细胞、骨骼肌细胞、肌管细胞、肌肉卫星细胞、神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞、眼细胞、视网膜细胞、视网膜神经节细胞、视网膜色素上皮细胞、胰腺细胞或胰腺β细胞的群。在一些实施方式中，病况是肌肉、脑、中枢神经系统、胰腺或视网膜的病况。在一些实施方式中，所述病况是线粒体脑肌病、乳酸酸中毒和卒中样发作(MELAS)、进行性外眼肌麻痹、母系遗传性糖尿病、偏头痛或眼肌病。在一些实施方式中，所述多核苷酸是mRNA。在一些实施方式中，多核苷酸是本文所述的任何mRNA。在一些实施方式中，多核苷酸是重组DNA构建体。在一些实施方式中，多核苷酸是本文所述的任何重组DNA构建体。在一些实施方式中，通过脂质纳米颗粒将多核苷酸递送至靶细胞或靶细胞群。在一些实施方式中，通过重组病毒将多核苷酸递送至靶细胞或靶细胞群。在一些实施方式中，重组病毒是本文所述的任何重组病毒。在一些实施方式中，所述重组病毒是重组AAV。在一些实施方式中，所述重组AAV具有AAV9衣壳。在一些实施方式中，其中所述多核苷酸包含可操作地连接至编码所述MTEM的所述核酸序列的启动子。在一些实施方式中，启动子是组成型启动子，或者所述启动子是肌肉细胞特异性启动子、骨骼肌特异性启动子、肌管特异性启动子、肌肉卫星细胞特异性启动子、神经元特异性启动子、星形胶质细胞特异性启动子、小胶质细胞特异性启动子、眼细胞特异性启动子、视网膜细胞特异性启动子、视网膜神经节细胞特异性启动子、视网膜色素上皮特异性启动子、胰腺细胞特异性启动子或胰腺β细胞特异性启动子。在一些实施方式中，所述组成型启动子是CMV启动子、CAG启动子、EF1α启动子或UbC启动子。在一些实施方式中，约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的包含识别序列的突变线粒体基因组在靶细胞或靶细胞群中被降解。在一些实施方式中，在靶细胞或靶细胞群中野生型线粒体基因组与包含识别序列的突变线粒体基因组的比率增加。在一些实施方式中，比率增加至约5:95、约10:90、约15:85、约20:80、约25:75、约30:70、约35:65、约40:60、约45:55、约50:50、约55:45、约60:40、约65:35、约70:30、约75:25、约80:20、约85:15、约90:10、约95:5、约20:1、约50:1、约100:1、约150:1、约200:1、约250:1、约300:1、约350:1、约400:1、约450:1、约500:1、约550:1、约600:1、约650:1、约700:1、约750:1、约800:1、约850:1、约900:1、约950:1、约1000:1或更高。在一些实施方式中，在靶细胞或靶细胞群中野生型线粒体基因组的百分比是在靶细胞或靶细胞群中总线粒体基因组的约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或更高。在一些实施方式中，在遗传修饰的真核细胞中包含识别序列的突变线粒体基因组的百分比降低约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或更高。在一些实施方式中，在靶细胞或靶细胞群中细胞呼吸增加约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约100％或更高。在一些实施方式中，在靶细胞或靶细胞群中细胞呼吸增加约30-40％、约40-50％、约50-60％、约60-70％、约70-80％、约80-90％、约90-100％或更高。
在一个方面中，本发明提供了一种工程化大范围核酸酶，其结合并切割包含SEQID NO:1的识别序列，其中所述工程化大范围核酸酶包含第一亚基和第二亚基，其中所述第一亚基结合至识别序列的第一识别半位点并包含第一高变(HVR1)区，其中所述第二亚基结合至识别序列的第二识别半位点并包含第二高变(HVR2)区，其中所述HVR1区包含与对应于SEQ ID NO:3-12的任一个的残基24-79的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列，以及其中所述HVR2区包含与对应于SEQ ID NO:3-12的任一个的残基215-270的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述HVR1区包含对应于SEQ ID NO:3-12的任一个的残基24、26、28、30、32、33、38、40、42、44、46、68、70、75和77的一个或多个残基。在一些实施方式中，所述HVR1区包含对应于SEQ ID NO:3-12的任一个的残基24、26、28、30、32、33、38、40、42、44、46、68、70、75和77的残基。在一些实施方式中，所述HVR1区在对应于SEQ ID NO:3-12的任一个的残基66的残基处包含Y、R、K或D。在一些实施方式中，所述HVR1区包含具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个氨基酸取代的SEQ ID NO:3-12的任一个的残基24-79。在一些实施方式中，所述HVR1区包含SEQ ID NO:3-12的任一个的残基24-79。
在一些实施方式中，所述第一亚基包含与SEQ ID NO:3-12的任一个的残基7-153具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述第一亚基包含对应于SEQ ID NO:3-12的任一个的残基19的残基。在一些实施方式中，所述第一亚基包含对应于SEQ ID NO:3-12的任一个的残基80的残基。在一些实施方式中，所述第一亚基在对应于SEQ ID NO:3-12的任一个的残基19的残基处包含G、S或A。在一些实施方式中，所述第一亚基在对应于SEQ ID NO:3-12的任一个的残基80的残基处包含E、Q或K。在一些实施方式中，所述第一亚基包含具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸取代的SEQ ID NO:3-12的任一个的残基7-153。在一些实施方式中，所述第一亚基包含SEQ ID NO:3-12的任一个的残基7-153。
在一些实施方式中，所述HVR2区包含对应于SEQ ID NO:3-12的任一个的残基215、217、219、221、223、224、229、231、233、235、237、259、261、266和268的一个或多个残基。在一些实施方式中，所述HVR2区包含对应于SEQ ID NO:3-12的任一个的残基215、217、219、221、223、224、229、231、233、235、237、259、261、266和268的残基。在一些实施方式中，所述HVR2区包含对应于SEQ ID NO:3-12的任一个的残基241的残基。在一些实施方式中，所述HVR2区包含对应于SEQ ID NO:3或5-12的任一个的残基263的残基。在一些实施方式中，所述HVR2区包含对应于SEQ ID NO:3或8-12的任一个的残基264的残基。在一些实施方式中，所述HVR2区包含对应于SEQ ID NO:6的残基265的残基。在一些实施方式中，所述HVR2区在对应于SEQ ID NO:3-12的任一个的残基257的残基处包含Y、R、K或D。在一些实施方式中，所述HVR2区包含具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个氨基酸取代的SEQ ID NO:3-12的任一个的残基215-270。在一些实施方式中，所述HVR2区包含SEQ ID NO:3-12的任一个的残基215-27。
在一些实施方式中，所述第二亚基包含与SEQ ID NO:3-12的任一个的残基198-344具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述第二亚基包含对应于SEQ ID NO:4的任一个的残基276的残基。在一些实施方式中，所述第二亚基包含对应于SEQ ID NO:3-12的任一个的残基330的残基。在一些实施方式中，所述第二亚基在对应于SEQ ID NO:3-12的任一个的残基210的残基处包含G、S或A。在一些实施方式中，所述第二亚基在对应于SEQ ID NO:3-12的任一个的残基271的残基处包含E、Q或K。在一些实施方式中，所述第二亚基包含具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸取代的SEQ ID NO:3-12的任一个的残基198-344。在一些实施方式中，所述第二亚基包含SEQ ID NO:3-12的任一个的残基198-344。
在一些实施方式中，所述工程化大范围核酸酶是包含接头的单链大范围核酸酶，所述接头共价连接第一亚基和第二亚基。在一些实施方式中，所述工程化大范围核酸酶包含与SEQ ID NO:3-12的任一个具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述工程化大范围核酸酶包含SEQ ID NO:3-12的任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述工程化大范围核酸酶由与SEQ ID NO:33-42的任一个的核酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的核酸序列编码。在一些实施方式中，所述工程化大范围核酸酶由SEQ ID NO:33-42的任一个的核酸序列编码。
在一些实施方式中，所述工程化大范围核酸酶附接至核输出序列(NES)。在一些实施方式中，所述NES包含与SEQ ID NO:46或47中所示的序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述NES包含SEQ ID NO:46或47中所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述NES附接在工程化大范围核酸酶的N末端。在一些实施方式中，所述NES附接在工程化大范围核酸酶的C末端。在一些实施方式中，所述NES与工程化大范围核酸酶融合。在一些实施方式中，所述NES通过多肽接头附接至工程化大范围核酸酶。在一些实施方式中，所述工程化大范围核酸酶包含第一NES和第二NES。在一些实施方式中，第一NES附接在工程化大范围核酸酶的N末端，和第二NES附接在工程化大范围核酸酶的C末端。在一些实施方式中，第一NES和/或第二NES包含与SEQ ID NO:46或47中所示的序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，第一NES和/或第二NES包含SEQ ID NO:46或47中所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，第一NES和第二NES是相同的。在一些实施方式中，第一NES和第二NES是不同的。在一些实施方式中，第一NES和/或第二NES与工程化大范围核酸酶融合。在一些实施方式中，第一NES和/或第二NES通过多肽接头附接至工程化大范围核酸酶。
在另一个方面中，本发明提供了一种多核苷酸，其包含编码本文所述的工程化大范围核酸酶的核酸序列。在一些实施方式中，所述多核苷酸是mRNA。
在另一个方面中，本发明提供了一种重组DNA构建体，其包含多核苷酸，所述多核苷酸包含编码本文所述的工程化大范围核酸酶的核酸序列。在一些实施方式中，重组DNA构建体编码包含多核苷酸的重组病毒。在一些实施方式中，所述重组病毒是重组腺病毒、重组慢病毒、重组逆转录病毒或重组腺相关病毒(AAV)。在一些实施方式中，所述重组病毒是重组AAV。在一些实施方式中，所述重组AAV具有AAV9衣壳。在一些实施方式中，所述多核苷酸包含可操作地连接至编码工程化大范围核酸酶的核酸序列的启动子。在一些实施方式中，启动子是组成型启动子，或者所述启动子是肌肉细胞特异性启动子、骨骼肌特异性启动子、肌管特异性启动子、肌肉卫星细胞特异性启动子、神经元特异性启动子、星形胶质细胞特异性启动子、小胶质细胞特异性启动子、眼细胞特异性启动子、视网膜细胞特异性启动子、视网膜神经节细胞特异性启动子、视网膜色素上皮特异性启动子、胰腺细胞特异性启动子或胰腺β细胞特异性启动子。在一些实施方式中，所述组成型启动子是CMV启动子、CAG启动子、EF1α启动子或UbC启动子。
在另一个方面中，本发明提供了一种重组病毒，其包含多核苷酸，所述多核苷酸包含编码本文所述的工程化大范围核酸酶的核酸序列。在一些实施方式中，所述重组病毒是重组腺病毒、重组慢病毒、重组逆转录病毒或重组腺相关病毒(AAV)。在一些实施方式中，所述重组病毒是重组AAV。在一些实施方式中，所述重组AAV具有AAV9衣壳。在一些实施方式中，所述多核苷酸包含可操作地连接至编码工程化大范围核酸酶的核酸序列的启动子。在一些实施方式中，启动子是组成型启动子，或者所述启动子是肌肉细胞特异性启动子、骨骼肌特异性启动子、肌管特异性启动子、肌肉卫星细胞特异性启动子、神经元特异性启动子、星形胶质细胞特异性启动子、小胶质细胞特异性启动子、眼细胞特异性启动子、视网膜细胞特异性启动子、视网膜神经节细胞特异性启动子、视网膜色素上皮特异性启动子、胰腺细胞特异性启动子或胰腺β细胞特异性启动子。在一些实施方式中，所述组成型启动子是CMV启动子、CAG启动子、EF1α启动子或UbC启动子。
在另一个方面中，本发明提供了一种脂质纳米颗粒组合物，其包含脂质纳米颗粒，所述脂质纳米颗粒包含多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码本文所述的工程化大范围核酸酶的核酸序列。在一些实施方式中，所述多核苷酸是mRNA。
在另一个方面中，本发明提供了一种药物组合物，其包含药学上可接受的载体和本文所述的工程化大范围核酸酶。
在另一个方面中，本发明提供了一种药物组合物，其包含药学上可接受的载体和本文所述的任何多核苷酸。
在另一个方面中，本发明提供了一种药物组合物，其包含药学上可接受的载体和本文所述的任何重组DNA构建体。
在另一个方面中，本发明提供了一种药物组合物，其包含药学上可接受的载体和本文所述的任何重组病毒。
在另一个方面中，本发明提供了一种药物组合物，其包含药学上可接受的载体和本文所述的任何脂质纳米颗粒组合物。
在另一个方面中，本发明提供了一种遗传修饰的真核细胞，其包含本文所述的任何多核苷酸。在一些实施方式中，所述遗传修饰的真核细胞是遗传修饰的哺乳动物细胞。在一些实施方式中，所述遗传修饰的真核细胞是遗传修饰的人细胞。
在另一个方面中，本发明提供了一种用于产生遗传修饰的真核细胞的方法，所述方法包括向真核细胞中引入包含编码本文所述的工程化大范围核酸酶的核酸序列的多核苷酸，其中工程化大范围核酸酶在真核细胞中表达，以及其中工程化大范围核酸酶在包含SEQ ID NO:1的识别序列处产生切割位点。在一些实施方式中，切割位点通过非同源末端连接修复，以使得识别序列包含插入或缺失。在一些实施方式中，真核细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方式中，哺乳动物细胞是人细胞。在一些实施方式中，所述多核苷酸是mRNA。在一些实施方式中，通过脂质纳米颗粒或通过重组病毒将多核苷酸引入真核细胞。在一些实施方式中，所述重组病毒是重组AAV。
在另一个方面中，本发明提供了一种用于产生遗传修饰的真核细胞的方法，所述方法包括向真核细胞中引入本文所述的工程化大范围核酸酶，其中工程化大范围核酸酶在真核细胞中表达，以及其中所述工程化大范围核酸酶在包含SEQ ID NO:1的识别序列处产生切割位点。在一些实施方式中，切割位点通过非同源末端连接修复，以使得识别序列包含插入或缺失。在一些实施方式中，真核细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方式中，哺乳动物细胞是人细胞。
在另一个方面中，本发明提供了一种用于产生包含插入其基因组中的外源性目标序列的遗传修饰的真核细胞的方法，所述方法包括向真核细胞中引入一个或多个包含以下的多核苷酸：编码本文所述的工程化大范围核酸酶的第一核酸序列，其中工程化大范围核酸酶在真核细胞中表达，和包含目标序列的第二核酸序列，其中所述工程化大范围核酸酶在包含SEQ ID NO:1的识别序列处产生切割位点，以及其中目标序列在切割位点处插入基因组中。在一些实施方式中，第二核酸序列还包含与切割位点侧翼的核酸序列同源的核酸序列，以及通过同源重组在切割位点处插入目标序列。在一些实施方式中，真核细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方式中，哺乳动物细胞是人细胞。在一些实施方式中，将第一核酸序列作为mRNA引入真核细胞。在一些实施方式中，将第二核酸作为双链DNA(dsDNA)引入真核细胞。在一些实施方式中，通过重组病毒将第一核酸序列引入真核细胞。在一些实施方式中，通过重组病毒将第二核酸序列引入真核细胞。在一些实施方式中，所述重组病毒是重组AAV。
在另一个方面中，本发明提供了一种用于产生包含插入其基因组中的外源性目标序列的遗传修饰的真核细胞的方法，所述方法包括向真核细胞中引入本文所述工程化大范围核酸酶和包含含有目标序列的核酸序列的多核苷酸，其中所述工程化大范围核酸酶在包含SEQ ID NO:1的识别序列处产生切割位点，以及其中目标序列在切割位点处插入基因组。在一些实施方式中，所述多核苷酸序列还包含与切割位点侧翼的核酸序列同源的核酸序列，以及通过同源重组在切割位点处插入目标序列。在一些实施方式中，真核细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方式中，哺乳动物细胞是人细胞。在一些实施方式中，将多核苷酸作为双链DNA(dsDNA)引入真核细胞。在一些实施方式中，通过重组病毒将多核苷酸引入真核细胞。在一些实施方式中，所述重组病毒是重组AAV。
在另一个方面中，本发明提供了由本文所述的方法制备的遗传修饰的真核细胞。
通过参考以下详细描述和权利要求，可以更充分地理解本公开内容的前述和其他方面以及实施方式。为了清楚起见，在单独实施方式的上下文中描述的本公开内容的某些特征也可以在单个实施方式中组合提供。实施方式的所有组合都被本公开内容具体地包含并且在本文中被公开，就好像每个组合都被单独且明确地公开一样。相反，为了简洁起见，在单个实施方式的上下文中描述的本公开内容的各种特征也可以单独提供或以任何合适的子组合提供。在实施方式中列出的特征的所有子组合也被本公开内容具体地包含并且在本文内容中被公开，就好像每个这样的子组合在本文中单独且明确地被公开一样。本文公开的本公开内容的每个方面的实施方式经必要的修改后适用于本公开内容的每个其他方面。
附图说明
图1显示了用编码各种MIT 25-26工程化大范围核酸酶或CHO 23-24大范围核酸酶(对照)的mRNA转染CHO报告细胞，并在转染后48小时测定GFP+细胞的百分比的流式细胞术结果。数据以活性指数(活性和毒性评分的总和)显示。
图2展示了MIT 25-26L.35工程化大范围核酸酶与野生型序列的区别。显示了用编码MIT 25-26x.91或MIT 25-26L.35工程化大范围核酸酶或CHO 23-24大范围核酸酶(对照)的mRNA转染CHO报告细胞，并在转染后48小时测定GFP+细胞的百分比的流式细胞术结果。数据以活性指数(活性和毒性评分的总和)显示。
图3显示了在FlpIn CHO细胞中各种MIT 25-26工程化大范围核酸酶的indel形成，所述FlpIn CHO细胞包含具有整合到核染色体上的野生型或突变MIT 25-26结合位点的人线粒体基因组的一部分。FlpIn-CHO细胞用MIT 25-26工程化大范围核酸酶进行核转染，2天后分析细胞在MIT 25-26突变体和野生型位点的indel频率。
图4显示了在FlpIn CHO细胞中与MIT 25-26x.91工程化大范围核酸酶相比优化的MIT 25-26L.35工程化大范围核酸酶的indel形成，所述FlpIn CHO细胞包含具有整合到核染色体上的野生型或突变MIT 25-26结合位点的人线粒体基因组的一部分。FlpIn-CHO细胞用MIT 25-26工程化大范围核酸酶进行核转染，2天后分析细胞在MIT 25-26突变体和野生型位点的indel频率。
图5展示了工程化大范围核酸酶的核靶向性。用编码具有核定位序列的工程化大核酸酶的质粒转染MRC-5细胞。免疫细胞学染色是用DAPI和单克隆工程化大范围核酸酶抗体以及染色线粒体的Mitotracker Red实现的。用Zeiss LSM710共聚焦显微镜在20倍放大倍数下观察细胞。左上图是所有染色的叠加。右上图显示了工程化大范围核酸酶的位置。左下图显示了用DAPI核染色，右下图显示了线粒体。
图6展示了工程化大范围核酸酶的线粒体靶向性。用编码具有线粒体转运肽(MTP)的工程化大范围核酸酶的质粒转染MRC-5细胞。免疫细胞学染色是用DAPI和单克隆工程化大范围核酸酶抗体以及染色线粒体的Mitotracker Red实现的。用Zeiss LSM710共聚焦显微镜在20倍放大倍数下观察细胞。左上图是所有染色的叠加。右上图显示了工程化大范围核酸酶的位置。左下图显示了用DAPI核染色，右下图显示了线粒体。
图7显示了通过与核定位信号(NLS)或线粒体转运肽(MTP)融合的工程化大范围核酸酶的indel形成。用工程化大范围核酸酶构建体对MRC-5细胞进行核转染，2天后分析在APC 11-12结合位点的indel形成。
图8显示了通过与核定位信号(NLS)、线粒体转运肽(MTP)或MTP和SEQ ID NO:47的核输出序列(NES)融合的工程化大范围核酸酶的indel形成。用工程化大范围核酸酶构建体对MRC-5细胞进行核转染，2天后分析在APC 11-12结合位点的indel形成。
图9显示了通过与核定位信号(NLS)、线粒体转运肽(MTP)或MTP和SEQ ID NO:46的MVMp NS2核输出序列(NES)融合的工程化大范围核酸酶的indel形成。用工程化大范围核酸酶构建体对MRC-5细胞进行核转染，2天后分析在APC 11-12结合位点的indel形成。
图10显示了通过与核定位信号(NLS)、线粒体转运肽(MTP)或MTP和SEQ ID NO:46的MVMp NS2核输出序列(NES)融合的工程化MIT 25-26x.91大范围核酸酶的indel形成。用工程化大范围核酸酶构建体对MRC-5细胞进行核转染，2天后分析在三个MIT 25-26x.91结合位点的每一个的indel形成。
图11显示了线粒体靶向的工程化大范围核酸酶(MTEM)MIT 25-26x.91在核转染后第1天携带异质MELAS突变的cybrid细胞系中的效力。这些数据表示为相对于MTS-GFP细胞的mtDNA损失。
图12显示了线粒体靶向的工程化大范围核酸酶(MTEM)MIT 25-26x.91在核转染后第4天携带异质MELAS突变的cybrid细胞系中的效力。这些数据表示为相对于MTS-GFP细胞的mtDNA损失。
图13显示了线粒体靶向的工程化大范围核酸酶(MTEM)MIT 25-26x.91在核转染后第7天携带异质MELAS突变的cybrid细胞系中的效力。这些数据表示为相对于MTS-GFP细胞的mtDNA损失。
图14显示了线粒体靶向的工程化大范围核酸酶(MTEM)MIT 25-26x.91在核转染后第11天携带异质MELAS突变的cybrid细胞系中的效力。这些数据表示为相对于MTS-GFP细胞的mtDNA损失。
图15显示了用线粒体靶向的工程化大范围核酸酶(MTEM)MIT 25-26x.91转染后11天MELAS cybrid细胞的线粒体应激测试。
图16显示了用线粒体靶向的工程化大范围核酸酶(MTEM)MIT 25-26x.91转染后11天MELAS cybrid细胞的ATP产量。
图17显示了用线粒体靶向的工程化大范围核酸酶(MTEM)MIT 25-26x.91转染后11天MELAS cybrid细胞的ATP产量。
图18显示了用线粒体靶向工程化大范围核酸酶(MTEM)MIT 25-26x.91转染后11天MELAS cybrid细胞的能量图，显示了糖酵解和OXPHOS对ATP产量的相对贡献。
图19为免疫荧光染色，显示缺乏亚细胞靶向序列的工程化大范围核酸酶的细胞定位。用编码与绿色荧光蛋白(GFP)肽序列融合的工程化大范围核酸酶的质粒转染细胞。免疫细胞学染色是用DAPI和染色线粒体的Mitotracker Red实现的。用Zeiss LSM710共聚焦显微镜在63倍放大倍数下观察细胞。左上图是所有染色的叠加。右上图显示了工程化大范围核酸酶的位置。左下图显示了用DAPI对细胞核进行核染色，右下图显示了对线粒体进行染色。
图20为免疫荧光染色，显示含有线粒体靶向肽(MTP)的工程化大范围核酸酶的细胞定位。用编码与线粒体靶向的肽序列(MTS)在N末端融合并且与绿色荧光蛋白肽(GFP)序列在C末端融合的工程化大范围核酸酶的质粒转染细胞。免疫细胞学染色是用DAPI和染色线粒体的Mitotracker Red实现的。用Zeiss LSM710共聚焦显微镜在63倍放大倍数下观察细胞。左上图是所有染色的叠加。右上图显示了工程化大范围核酸酶的位置。左下图显示了用DAPI对细胞核进行核染色，右下图显示了对线粒体进行染色。
图21提供了显示在转染后0、6、24、48和72小时，用指定对照(模拟物、MTS-GFP、MTS-APC 11-12L.330和MTS-MIT 25-26x.91KO)和测试工程化大范围核酸酶转染的细胞的含100％突变mtDNA(m.3243G)线粒体中环状mtDNA与总mtDNA的比率的图。
图22提供了显示在转染后0、6、24、48和72小时，用指定对照(模拟物、MTS-GFP、MTS-APC 11-12L.330和MTS-MIT 25-26x.91KO)和测试工程化大范围核酸酶转染的细胞的含100％突变mtDNA(m.3243G)线粒体中总mtDNA与核糖体18s DNA的比率的图。
图23提供了显示在转染后0、6、24、48和72小时，用指定对照(模拟物、MTS-GFP、MTS-APC 11-12L.330和MTS-MIT 25-26x.91KO)和测试工程化大范围核酸酶转染的细胞的含野生型mtDNA线粒体中环状mtDNA与总mtDNA的比率的图。
图24提供了显示在转染后0、6、24、48和72小时，用指定对照(模拟物、MTS-GFP、MTS-APC 11-12L.330和MTS-MIT 25-26x.91KO)和测试工程化大范围核酸酶转染的细胞的含野生型mtDNA线粒体中总mtDNA与核糖体18s DNA的比率的图。
图25提供了显示在转染后0、3、6、12、24、48和72小时，用指定对照(模拟物、MTS-GFP、MTS-APC 11-12L.330和MTS-MIT 25-26x.91KO)和测试工程化大范围核酸酶转染的细胞的含野生型mtDNA线粒体中总mtDNA与核糖体18s DNA的比率的图。
图26提供了显示在转染后0、3、6、12、24、48和72小时，用指定对照(模拟物、MTS-GFP、MTS-APC 11-12L.330和MTS-MIT 25-26x.91KO)和测试工程化大范围核酸酶转染的细胞的含野生型mtDNA线粒体中环状mtDNA与总mtDNA的比率的图。
图27提供了显示在转染后第1天，用指定对照(模拟物、MTS-GFP)或四种不同浓度的MIT 25-26x.91大范围核酸酶转染的MELAS细胞的含96％突变mtDNA(m.3243G)线粒体的总mtDNA与核糖体18s DNA的比率的图。柱子高度指示mtDNA的损失，归一化为MTS-GFP转染的细胞。在柱子内，灰色的相对百分比对应于存在的野生型mtDNA的相对百分比，黑色的相对百分比对应于存在的突变mtDNA的相对百分比。
图28提供了显示在转染后第4天，用指定对照(模拟物、MTS-GFP)或四种不同浓度的MIT 25-26x.91大范围核酸酶转染的MELAS细胞的含96％突变mtDNA(m.3243G)线粒体的总mtDNA与核糖体18s DNA的比率的图。柱子高度指示mtDNA的损失，归一化为MTS-GFP转染的细胞。在柱子内，灰色的相对百分比对应于存在的野生型mtDNA的相对百分比，黑色的相对百分比对应于存在的突变mtDNA的相对百分比。
图29提供了显示在转染后第7天，用指定对照(模拟、MTS-GFP)或四种不同浓度的MIT 25-26x.91大范围核酸酶转染的MELAS细胞的含96％突变mtDNA(m.3243G)线粒体的总mtDNA与核糖体18sDNA的比率的图。柱子高度指示mtDNA的损失，归一化为MTS-GFP转染的细胞。在柱子内，灰色的相对百分比对应于存在的野生型mtDNA的相对百分比，黑色的相对百分比对应于存在的突变mtDNA的相对百分比。
图30是显示用线粒体靶向的工程化大范围核酸酶(MTEM)MIT 25-26x.91转染后11天MELAS cybrid细胞的线粒体应激测试的图。
图31显示了用线粒体靶向的工程化大范围核酸酶(MTEM)MIT 25-26x.91转染后11天的MELAS cybrid细胞的能量图，显示了糖酵解和OXPHOS对ATP产量的相对贡献。
图32显示了用线粒体靶向的工程化大范围核酸酶(MTEM)MIT 25-26x.91转染后11天MELSA cybrid细胞的基础呼吸速率。
图33显示了用线粒体靶向的工程化大范围核酸酶(MTEM)MIT 25-26x.91转染后11天MELSA cybrid细胞的最大呼吸速率。
图34显示了用线粒体靶向的工程化大范围核酸酶(MTEM)MIT 25-26x.91转染后11天MELSA cybrid细胞的线粒体ATP产量速率。
图35提供了显示在转染后第1天，用指定对照(模拟物、MTS-GFP)或四种不同浓度的MIT 25-26x.91259H>Q大范围核酸酶转染的MELAS细胞的含96％突变mtDNA(m.3243G)线粒体的总mtDNA与核糖体18s DNA的比率的图。柱子高度指示mtDNA的损失，归一化为MTS-GFP转染的细胞。在柱子内，灰色的相对百分比对应于存在的野生型mtDNA的相对百分比，黑色的相对百分比对应于存在的突变mtDNA的相对百分比。
图36是显示用线粒体靶向的工程化大范围核酸酶(MTEM)MIT 25-26x.91 259H>Q转染后1天MELAS cybrid细胞的线粒体应激测试的图。
图37提供了显示在转染后第3天，用指定对照(模拟物、MTS-GFP)或四种不同浓度的MIT 25-26x.91259H>Q大范围核酸酶转染的MELAS细胞的含96％突变mtDNA(m.3243G)线粒体的总mtDNA与核糖体18s DNA的比率的图。柱子高度指示mtDNA的损失，归一化为MTS-GFP转染的细胞。在柱子内，灰色的相对百分比对应于存在的野生型mtDNA的相对百分比，黑色的相对百分比对应于存在的突变mtDNA的相对百分比。
图38是显示用线粒体靶向的工程化大范围核酸酶(MTEM)MIT 25-26x.91 259H>Q转染后3天MELAS cybrid细胞的线粒体应激测试的图。
图39提供了显示在转染后第7天，用指定对照(模拟物、MTS-GFP)或四种不同浓度的MIT 25-26x.91259H>Q大范围核酸酶转染的MELAS细胞的含96％突变mtDNA(m.3243G)线粒体的总mtDNA与核糖体18s DNA的比率的图。柱子高度指示mtDNA的损失，归一化为MTS-GFP转染的细胞。在柱子内，灰色的相对百分比对应于存在的野生型mtDNA的相对百分比，黑色的相对百分比对应于存在的突变mtDNA的相对百分比。
图40是显示用线粒体靶向的工程化大范围核酸酶(MTEM)MIT 25-26x.91 259H>Q转染后7天MELAS cybrid细胞的线粒体应激测试的图。
图41是描绘用于鉴定在Flp-In293报告细胞系中转染的MIT 25-26L.35 19A>S和MIT 25-26x.91 259H>Q大范围核酸酶诱导的脱靶切割的寡聚物捕获测定的结果的图。圈出的点指示中靶位点。MT-Oligo-Only代表阴性对照。
图42是显示未处理的、以1e5 RNA拷贝/细胞的剂量用MIT 25-26x.91 259H>Q大范围核酸酶转染的含有96％突变mtDNA(m.3243G)的线粒体的MELAS细胞或未处理的0％突变(WT细胞)随着时间推移的细胞增殖的图。
图43是显示未处理的、以1e5 RNA拷贝/细胞的剂量用MIT 25-26x.91 259H>Q大范围核酸酶转染的含有96％突变mtDNA(m.3243G)的线粒体的MELAS细胞或未处理的0％突变(WT细胞)处理后D2、D3和D4的细胞倍增时间的柱状图。
图44提供了显示工程化MTEM大范围核酸酶编辑对小鼠异种移植肿瘤模型中线粒体异质性的影响的研究的实验示意图。
图45提供了显示在三种不同剂量下包封MIT 25-26x.91工程化大范围核酸酶的AAV9载体施用时(cybrid引入后D18)的肿瘤体积的图。
图46提供了显示在cybrid细胞引入后第35天和大范围核酸酶施用后第17天以三种不同剂量施用包封MIT 25-26x.91工程化大范围核酸酶的AAV9载体后WT mtDNA的百分比的图。
图47提供了显示在cybrid细胞引入后第35天和大范围核酸酶施用后第17天以三种不同剂量施用包封MIT 25-26x.91工程化大范围核酸酶的AAV9载体后WT mtDNA的百分比的图。NS指示组间无统计学显著差异。
图48提供了显示在转染后第1天，用指定对照(模拟物、MTS-GFP)或四种不同浓度的MIT 25-26x.91259H>Q大范围核酸酶转染的MELAS细胞的含85％突变mtDNA(m.3243G)线粒体中总mtDNA与核糖体18s DNA的比率的图。柱子高度指示mtDNA的损失，归一化为MTS-GFP转染的细胞。在柱子内，灰色的相对百分比对应于存在的野生型mtDNA的相对百分比，黑色的相对百分比对应于存在的突变mtDNA的相对百分比。
图49是显示用线粒体靶向的工程化大范围核酸酶(MTEM)MIT 25-26x.91 259H>Q转染后1天MELAS cybrid细胞的线粒体应激测试的图。
图50提供了显示在转染后第3天，用指定对照(模拟物、MTS-GFP)或四种不同浓度的MIT 25-26x.91259H>Q大范围核酸酶转染的MELAS细胞的含85％突变mtDNA(m.3243G)线粒体中总mtDNA与核糖体18s DNA的比率的图。柱子高度指示mtDNA的损失，归一化为MTS-GFP转染的细胞。在柱子内，灰色的相对百分比对应于存在的野生型mtDNA的相对百分比，黑色的相对百分比对应于存在的突变mtDNA的相对百分比。
图51是显示用线粒体靶向的工程化大范围核酸酶(MTEM)MIT 25-26x.91 259H>Q转染后3天MELAS cybrid细胞的线粒体应激测试的图。
图52提供了显示转染后第1天在含有96％突变mtDNA(m.3243G)线粒体的MELAS细胞中或含有0％突变mtDNA的WT细胞中总mtDNA与与核糖体18s DNA的比率的图。突变细胞未经处理或用1e5个RNA拷贝/细胞的MIT 25-26x.91 259H>Q大范围核酸酶处理。0％突变细胞未经处理。柱子高度指示mtDNA的损失，归一化为MTS-GFP转染的细胞。在柱子内，灰色的相对百分比对应于存在的野生型mtDNA的相对百分比，黑色的相对百分比对应于存在的突变mtDNA的相对百分比。
图53是显示用线粒体靶向的工程化大范围核酸酶(MTEM)MIT 25-26x.91 259H>Q转染1天后WT或MELAS cybrid细胞的线粒体应激测试的图。
序列的简要描述
SEQ ID NO:1列出了MIT 25-26识别序列(正义)的核酸序列。
SEQ ID NO:2列出了MIT 25-26识别序列(反义)的核酸序列。
SEQ ID NO:3列出了MIT 25-26x.91工程化大范围核酸酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO:4列出了MIT 25-26x.48工程化大范围核酸酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO:5列出了MIT 25-26x.73工程化大范围核酸酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO:6列出了MIT 25-26x.29工程化大范围核酸酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO:7列出了MIT 25-26x.37工程化大范围核酸酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO:8列出了MIT 25-26L.35工程化大范围核酸酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO:9列出了在氨基酸位置259处具有H至Q取代的称为MIT 25-26x.91259H>Q的MIT 25-26x.91工程化大范围核酸酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO:10列出了在氨基酸位置19处具有A至S取代的称为MIT 25-26L.35 19A>S的MIT 25-26L.35工程化大范围核酸酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO:11列出了在氨基酸位置263处具有T至R取代的称为MIT 25-26x.91263T>R的MIT 25-26x.91工程化大范围核酸酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO:12列出了在氨基酸位置46处具有H至W取代的称为MIT 25-26x.91 46H>W的MIT 25-26x.91工程化大范围核酸酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO:13列出了MIT 25-26x.91大范围核酸酶25结合亚基的氨基酸序列。
SEQ ID NO:14列出了MIT 25-26x.48大范围核酸酶25结合亚基的氨基酸序列。
SEQ ID NO:15列出了MIT 25-26x.73大范围核酸酶25结合亚基的氨基酸序列。
SEQ ID NO:16列出了MIT 25-26x.29大范围核酸酶25结合亚基的氨基酸序列。
SEQ ID NO:17列出了MIT 25-26x.37大范围核酸酶25结合亚基的氨基酸序列。
SEQ ID NO:18列出了MIT 25-26L.35大范围核酸酶25结合亚基的氨基酸序列。
SEQ ID NO:19列出了MIT 25-26x.91 259H>Q大范围核酸酶25结合亚基的氨基酸序列。
SEQ ID NO:20列出了MIT 25-26L.35 19A>S大范围核酸酶25结合亚基的氨基酸序列。
SEQ ID NO:21列出了MIT 25-26x.91 263T>R大范围核酸酶25结合亚基的氨基酸序列。
SEQ ID NO:22列出了MIT 25-26x.91 46H>W大范围核酸酶25结合亚基的氨基酸序列。
SEQ ID NO:23列出了MIT 25-26x.91大范围核酸酶26结合亚基的氨基酸序列。
SEQ ID NO:24列出了MIT 25-26x.48大范围核酸酶26结合亚基的氨基酸序列。
SEQ ID NO:25列出了MIT 25-26x.73大范围核酸酶26结合亚基的氨基酸序列。
SEQ ID NO:26列出了MIT 25-26x.29大范围核酸酶26结合亚基的氨基酸序列。
SEQ ID NO:27列出了MIT 25-26x.37大范围核酸酶26结合亚基的氨基酸序列。
SEQ ID NO:28列出了MIT 25-26L.35大范围核酸酶26结合亚基的氨基酸序列。
SEQ ID NO:29列出了MIT 25-26x.91 259H>Q大范围核酸酶26结合亚基的氨基酸序列。
SEQ ID NO:30列出了MIT 25-26L.35 19A>S大范围核酸酶26结合亚基的氨基酸序列。
SEQ ID NO:31列出了MIT 25-26x.91 263T>R大范围核酸酶26结合亚基的氨基酸序列。
SEQ ID NO:32列出了MIT 25-26x.91 46H>W大范围核酸酶26结合亚基的氨基酸序列。
SEQ ID NO:33列出了MIT 25-26x.91大范围核酸酶的核酸序列。
SEQ ID NO:34列出了MIT 25-26x.48大范围核酸酶的核酸序列。
SEQ ID NO:35列出了MIT 25-26x.73大范围核酸酶的核酸序列。
SEQ ID NO:36列出了MIT 25-26x.29大范围核酸酶的核酸序列。
SEQ ID NO:37列出了MIT 25-26x.37大范围核酸酶的核酸序列。
SEQ ID NO:38列出了MIT 25-26L.35大范围核酸酶的核酸序列。
SEQ ID NO:39列出了MIT 25-26x.91 259H>Q大范围核酸酶的核酸序列。
SEQ ID NO:40列出了MIT 25-26L.35 19A>S大范围核酸酶的核酸序列。
SEQ ID NO:41列出了MIT 25-26x.91 263T>R大范围核酸酶的核酸序列。
SEQ ID NO:42列出了MIT 25-26x.91 46H>W大范围核酸酶的核酸序列。
SEQ ID NO:43列出了COX VIII MTP的氨基酸序列。
SEQ ID NO:44列出了SU9 MTP的氨基酸序列。
SEQ ID NO:45列出了COX VIII-SU9 MTP的氨基酸序列。
SEQ ID NO:46列出了MVMp NS2 NES序列的氨基酸序列。
SEQ ID NO:47列出了NES序列的氨基酸序列。
SEQ ID NO:48列出了野生型I-CreI序列的氨基酸序列。
SEQ ID NO:49列出了用于确定在APC 11-12结合位点处的indel频率的数字液滴PCR(ddPCR)引物P1的核酸序列。
SEQ ID NO:50列出了用于确定在APC 11-12结合位点处的indel频率的ddPCR引物F1的核酸序列。
SEQ ID NO:51列出了用于确定在APC 11-12结合位点处的indel频率的ddPCR引物R1的核酸序列。
SEQ ID NO:52列出了用于确定在APC 11-12结合位点处的indel频率的ddPCR引物P2的核酸序列；ddPCR引物P3用于确定mtDNA的异质性水平和相对于核DNA的mtDNA拷贝数。
SEQ ID NO:53列出了用于确定在APC 11-12结合位点处的indel频率的ddPCR引物F2的核酸序列；ddPCR引物F3用于确定mtDNA的异质性水平和相对于核DNA的mtDNA拷贝数。
SEQ ID NO:54列出了用于确定在APC 11-12结合位点处的indel频率的ddPCR引物R2的核酸序列；ddPCR引物R3用于确定mtDNA的异质性水平和相对于核DNA的mtDNA拷贝数。
SEQ ID NO:55列出了用于鉴定由MIT 25-26x.91核酸酶诱导的潜在核脱靶位点编辑的ddPCR引物F1的核酸序列。
SEQ ID NO:56列出了用于鉴定由MIT 25-26x.91核酸酶诱导的潜在核脱靶位点编辑的ddPCR引物R1的核酸序列。
SEQ ID NO:57列出了用于鉴定由MIT 25-26x.91核酸酶诱导的潜在核脱靶位点编辑的ddPCR引物F2的核酸序列。
SEQ ID NO:58列出了用于鉴定由MIT 25-26x.91核酸酶诱导的潜在核脱靶位点编辑的ddPCR引物R2的核酸序列。
SEQ ID NO:59列出了用于鉴定由MIT 25-26x.91核酸酶诱导的潜在核脱靶位点编辑的ddPCR引物F3的核酸序列。
SEQ ID NO:60列出了用于鉴定由MIT 25-26x.91核酸酶诱导的潜在核脱靶位点编辑的ddPCR引物R3的核酸序列。
SEQ ID NO:61列出了用于鉴定由MIT 25-26x.91核酸酶诱导的潜在核脱靶位点编辑的ddPCR引物F4的核酸序列。
SEQ ID NO:62列出了用于鉴定由MIT 25-26x.91核酸酶诱导的潜在核脱靶位点编辑的ddPCR引物R4的核酸序列。
SEQ ID NO:63列出了用于确定mtDNA的异质性水平以及相对于核DNA(突变等位基因)的mtDNA拷贝数的ddPCR引物P1的核酸序列。
SEQ ID NO:64列出了用于确定mtDNA的异质性水平以及相对于核DNA的mtDNA拷贝数的ddPCR引物F1的核酸序列。
SEQ ID NO:65列出了用于确定mtDNA的异质性水平以及相对于核DNA的mtDNA拷贝数的ddPCR引物R1的核酸序列。
SEQ ID NO:66列出了用于确定mtDNA的异质性水平以及相对于核DNA的mtDNA拷贝数的ddPCR引物P2的核酸序列。
SEQ ID NO:67列出了用于确定mtDNA的异质性水平以及相对于核DNA的mtDNA拷贝数的ddPCR引物F2的核酸序列。
SEQ ID NO:68列出了用于确定mtDNA的异质性水平以及相对于核DNA的mtDNA拷贝数的ddPCR引物R2的核酸序列。
SEQ ID NO:69列出了用于确定mtDNA的异质性水平以及相对于核DNA的mtDNA拷贝数的ddPCR引物P4的核酸序列。
SEQ ID NO:70列出了用于确定mtDNA的异质性水平以及相对于核DNA的mtDNA拷贝数的ddPCR引物F4的核酸序列。
SEQ ID NO:71列出了用于确定mtDNA的异质性水平以及相对于核DNA的mtDNA拷贝数的ddPCR引物R4的核酸序列。
SEQ ID NO:72列出了用于确定mtDNA的异质性水平以及相对于核DNA(WT等位基因)的mtDNA拷贝数的ddPCR引物P1的核酸序列。
具体实施方式
1.1引用和定义
本文引用的专利和科学文献建立了本领域技术人员可用的知识。本文引用的公布的美国专利、允许的申请、公开的外国申请和包括GenBank数据库序列的参考文献通过引用并入本文，其程度如同每一个都被具体且单独地表明通过引用并入一样。
本发明可以以不同的形式实施，并且不应该被解释为限于本文列出的实施方式。相反，提供这些实施方式使得本公开内容将会是彻底和完整的，并将本发明的范围充分传达给本领域技术人员。例如，关于一个实施方式示出的特征可以被并入其他实施方式中，并且关于特定实施方式示出的特征可以从该实施方式中删除。此外，根据本公开内容，对本文提出的实施方式的许多变化和添加对于本领域技术人员将是显而易见的，其不脱离本发明。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。本文中在本发明的说明书中使用的术语仅用于描述特定实施方式的目的，而不旨在限制本发明。
本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用整体并入本文。
如本文所用，“一”、“一个”或“该”可以指一个或多于一个。例如，“一个”细胞可以指单个细胞或多个细胞。
如本文所用，术语“5’帽(也称为RNA帽、RNA 7-甲基鸟苷帽或RNA m7G帽)”是一种修饰的鸟嘌呤核苷酸，其在转录开始后不久添加到真核信使RNA的“前端”或5’端。5’帽由与第一个转录的核苷酸连接的末端基团组成。其存在对于核糖体的识别和对RNases的防护至关重要。帽的添加与转录相偶联，并以共转录的方式发生，从而相互影响。转录开始后不久，正在合成的信使核糖核酸的5’端被与RNA聚合酶相关的帽合成复合物结合。这种酶复合物催化mRNA加帽所需的化学反应。合成以多步骤的生化反应进行。帽部分可以被修饰以调节mRNA的功能，如其稳定性或翻译效率。
如本文所用，术语“等位基因”指一个基因的两种或更多种变体形式中的一种。
如本文所用，术语“同种异体的”或替代地，“异基因的”指来源于同一物种的不同动物或与被引入材料的个体不同的患者的任何材料。当一个或多个基因座上的基因不相同时，两个或更多个个体被称为是彼此同种异体的。在一些方面中，来自相同物种的个体的同种异体材料可能在遗传上足够不同以致于抗原性相互作用。
如本文所用，术语“组成型启动子”是指当与编码或指定基因产物的多核苷酸可操作地连接时导致基因产物在细胞的大多数或所有生理条件下在细胞中产生的核苷酸序列。
如本文所用，术语“对照”或“对照细胞”是指提供用于测定遗传修饰的细胞的基因型或表型变化的参考点的细胞。对照细胞可以包括例如：(a)野生型细胞，即与用于产生遗传修饰的细胞的遗传改变的起始材料基因型相同的细胞；(b)与遗传修饰的细胞基因型相同但已用无效构建体(即，用对目标性状没有已知影响的构建体)转化的细胞；或(c)与遗传修饰的细胞遗传上相同但不暴露于将诱导改变的基因型或表型的表达的条件或刺激或进一步遗传修饰的细胞。例如，本发明的对照或对照细胞可以是不包含本文所述的MTEM或工程化大范围核酸酶或具有编码本文所述MTEM或工程化大范围核酸内切酶的氨基酸序列的多核苷酸的细胞或细胞群。
如本文所用，关于两种蛋白或氨基酸序列的修饰的术语“对应于”用于表示第一蛋白中的特定修饰是与第二蛋白中修饰相同的氨基酸残基的取代，并且当对两种蛋白进行标准序列比对(例如，使用BLASTp程序)时，第一蛋白中修饰的氨基酸位置与第二蛋白中修饰的氨基酸位置相对应于或对齐。因此，如果残基X和Y在序列比对中彼此对应，则第一蛋白中残基“X”修饰为氨基酸“A”将对应于第二蛋白中残基“Y”修饰为氨基酸“A”，尽管X和Y可能是不同的数字。
如本文所用，术语“破坏的”或“破坏”或“破坏表达”或“破坏靶序列”指引入干扰基因功能以及阻止表达和/或由此编码的多肽/表达产物的功能的突变(例如，移码突变)。例如，核酸酶介导的基因破坏可导致截短蛋白的表达和/或不保留其野生型功能的蛋白的表达。此外，将供体模板引入基因中可能导致编码蛋白的不表达、截短蛋白的表达和/或不保留其野生型功能的蛋白的表达。
如本文所用，术语“编码”指多核苷酸中特定核苷酸序列的固有性质，如基因、cDNA或mRNA，以在具有定义的核苷酸序列(例如，rRNA、tRNA和mRNA)或定义的氨基酸序列的生物过程中用作合成其他聚合物和大分子的模板以及由此产生的生物性质。因此，如果对应于基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生蛋白，则基因、cDNA或RNA编码蛋白。其核苷酸序列与mRNA序列相同并且通常在序列表中提供的编码链和用作基因或cDNA转录模板的非编码链都可以称为编码该基因或cDNA的蛋白或其他产物。
如本文所用，提及核酸序列或蛋白时，术语“内源性”意指天然包含在细胞内或由细胞表达的序列或蛋白。
如本文所用，提及核苷酸序列或氨基酸序列时，术语“外源性”或“异源性”意指纯合成的、源自外来物种的序列，或者，如果来自同一物种，则指通过有意的人为干预在组成和/或基因组基因座上对其天然形式进行实质性修饰的序列。
如本文所用，术语“表达”指由启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。
如本文所用，术语“表达载体”指包含重组多核苷酸的载体，所述重组多核苷酸包含可操作地连接至待表达的核苷酸序列的表达控制序列。表达载体包含用于表达的足够的顺式作用元件；其他用于表达的元件可以由宿主细胞提供或在体外表达系统中提供。表达载体包括本领域公知的所有载体，包括引入重组多核苷酸的粘粒、质粒(例如，裸的或包含在脂质体中)和病毒(例如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
如本文所用，术语“遗传修饰的”指细胞或生物体，其中或其祖先中的基因组DNA序列已通过重组技术被有意修饰。如本文所用，术语“遗传修饰的”涵盖术语“转基因”。例如，如本文所用，“遗传修饰的”细胞可以指其中线粒体DNA已通过重组技术被有意地修饰的细胞。
如本文所用，术语“同源重组”或“HR”是指其中使用同源DNA序列作为修复模板修复双链DNA断裂的天然细胞过程(参见，例如，Cahill等，(2006),Front.Biosci.11:1958-1976)。同源DNA序列可以是内源染色体序列或递送至细胞的外源核酸。
如本文所用，术语“同源臂”或“与核酸酶切割位点侧翼序列同源的序列”是指核酸分子的5’和3’端侧翼的序列，其促进将核酸分子插入至由核酸酶产生的切割位点中。一般而言，同源臂的长度可以是至少50个碱基对，优选至少100个碱基对，且至多2000个碱基对或更多，并且可以与其在基因组中对应的序列具有至少90％、优选至少95％或更高的序列同源性。在一些实施方式中，同源臂为约500个碱基对。
如本文所用，术语“体外转录的RNA”指在体外合成的RNA，优选mRNA。通常，体外转录的RNA由体外转录载体产生。体外转录载体包括用于产生体外转录的RNA的模板。
如本文所用，术语“分离的”指改变或脱离自然状态。例如，在活体动物中天然存在的核酸或肽不是“分离的”，但从其自然状态的共存物质中部分或完全分离的相同核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白可以以基本纯化的形式存在，或者可以存在于非天然环境中，比如例如宿主细胞中。
如本文所用，术语“慢病毒”指逆转录病毒科的一个属。慢病毒是逆转录病毒中唯一能够感染非分裂细胞的病毒；其可以将大量的遗传信息传递到宿主细胞的DNA中，因此其是基因递送载体最有效的方法之一。HIV、SIV和FIV均是慢病毒的实例。
如本文所用，术语“脂质纳米颗粒”是指具有平均直径在10至1000纳米之间的典型球形结构的脂质组合物。在一些制剂中，脂质纳米颗粒可以包含至少一种阳离子脂质、至少一种非阳离子脂质和至少一种缀合的脂质。本领域公知的适用于包封核酸(如mRNA)的脂质纳米颗粒预期用于本发明。
如本文所用，关于重组蛋白的术语“修饰”指重组序列中氨基酸残基相对于参考序列(例如，野生型或天然序列)的任何插入、缺失或取代。
如本文所用，术语“非同源末端连接”或“NHEJ”指通过两个非同源DNA片段的直接连接修复双链DNA断裂的自然细胞过程(参见，例如，Cahill等，(2006),Front.Biosci.11:1958-1976)。通过非同源末端连接的DNA修复是容易出错的，并且经常导致在修复位点DNA序列的非模板添加或缺失。在一些情况下，在靶识别序列上的切割导致在靶识别位点上的NHEJ。核酸酶诱导的基因编码序列中靶位点的切割，然后通过NHEJ进行DNA修复，可以将突变引入编码序列，如移码突变，从而破坏基因功能。因此，工程化核酸酶可以用来有效地敲除细胞群中的基因。
如本文所用，术语“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此为简并形式并且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白或RNA的短语核苷酸序列还可以包括内含子，以使得编码蛋白的核苷酸序列在一些形式中可以包含一个或多个内含子。
如本文所用，术语“可操作地连接”意指两个或更多个元件之间的功能性连接。例如，编码本文所述核酸酶的核酸序列与调控序列(例如，启动子)之间的可操作连接是允许编码核酸酶的核苷酸序列表达的功能性连接。可操作地连接的元件可以是连续的或不连续的。当用来指两个蛋白编码区的连接时，通过可操作地连接意指编码区在相同的阅读框架中。
如本文所用，除非另有特别说明，否则词语“或”以“和/或”的包容性含义使用，而非以“非此即彼”的排他性含义使用。
如本文所用，术语“肽”、“多肽”和“蛋白”可以互换使用，并且指由肽键共价连接的氨基酸残基组成的化合物。蛋白或肽必需包含至少两个氨基酸，并且对可以构成蛋白或肽序列的氨基酸的最大数量没有限制。多肽包括包含通过肽键相互连接的两个或更多个氨基酸的任何肽或蛋白。如本文所用，例如，术语指短链，其在本领域中也通常称为肽、寡肽和寡聚物，以及指长链，其通常在本领域称为蛋白，其有很多类型。“多肽”包括例如生物活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同二聚体、异二聚体，多肽的变体、修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等。多肽包括天然肽、重组肽或其组合。
如本文所用，术语“降低的”或“减少的”指与对照细胞群相比时，包括具有MELAS突变的突变线粒体基因组的细胞群中的细胞百分比或细胞比率的减少。在一些实施方式中，“降低的”或“减少的”指单个细胞或细胞群中突变线粒体基因组的百分比或突变线粒体基因组的比率与野生型线粒体基因组相比的减少。此类降低是至多5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或至多100％。因此，术语“降低的”涵盖突变mtDNA的部分降低或完全降低。
如本文所用，关于氨基酸序列和核酸序列两者的术语，术语“百分比同一性”、“序列同一性”、“百分比相似性”、“序列相似性”等指基于使比对的氨基酸残基或核苷酸之间的相似性最大化的序列比对的两个序列的相似性程度的度量，并且其为相同或相似残基或核苷酸的数目、总残基或核苷酸的数目、以及序列比对中缺口的存在和长度的函数。多种算法和计算机程序可用于使用标准参数确定序列相似性。如本文所使用的，序列相似性是使用用于氨基酸序列的BLASTp程序和用于核酸序列的BLASTn程序测量的，两者均可通过国家生物技术信息中心(www.ncbi.nlm.nih.gov/)获得，并且描述于：例如，Altschul等，(1990),J.Mol.Biol.215:403-410；Gish和States(1993),Nature Genet.3:266-272；Madden等，(1996),Meth.Enzymol.266:131-141；Altschul等，(1997),Nucleic Acids Res.25:33 89-3402；Zhang等，(2000),J.Comput.Biol.7(1-2):203-14。如本文所用，两个氨基酸序列的百分比相似性是基于BLASTp算法的以下参数的得分：字长＝3；缺口空位罚分＝-11；缺口延伸罚分＝-1；和评分矩阵＝BLOSUM62。如本文所用的，两个核酸序列的百分比相似性是基于BLASTn算法的以下参数的得分：字长＝11；缺口空位罚分＝-5；缺口延伸罚分＝-2；匹配奖励＝1；和错配罚分＝-3。
如本文所用，术语“poly(A)”是通过多聚腺苷酸化连接到mRNA上的一系列腺苷。在用于瞬时表达的构建体的优选实施方式中polyA在50和5000之间，优选大于64，更优选大于100，最优选大于300或400。可以对Poly(A)序列进行化学或酶促修饰，以调节mRNA功能，如定位、稳定性或翻译效率。
如本文所用，术语“多聚腺苷酸化”指多聚腺苷部分或其修饰变体与信使RAN分子的共价连接。在真核生物中，大多数信使RNA(mRNA)分子在3’端被多聚腺苷酸化。3’poly(A)尾是一个腺嘌呤核苷酸的长序列(通常是几百个)，通过酶聚腺苷酸聚合酶的作用添加到pre-mRNA中。在高等真核生物中，将poly(A)尾添加到包含特定序列的转录物上，即多聚腺苷酸化信号。Poly(A)尾和与其结合的蛋白有助于保护mRNA不被核酸外切酶降解。多聚腺苷酸化对于转录终止、从细胞核输出mRNA并翻译也很重要。DNA转录成RNA后，在细胞核中立即发生多聚腺苷酸化，但也可以稍后发生在胞质中。转录终止后，通过与RNA聚合酶相关的核酸内切酶复合物的作用，mRNA链被切割。切割位点的特征通常是在切割位点附近存在碱基序列AAUAAA。在mRNA被切割后，将腺苷残基添加到切割位点处的游离3’端。
如本文所用，术语“启动子”或“调控序列”指表达与启动子/调控序列可操作连接的基因产物所需的核酸序列。在一些情况下，该序列可以是核心启动子序列，而在其他情况下，该序列还可以包括增强子序列和基因产物表达所需的其他调控元件。启动子/调控序列例如可以是以组织特异性方式表达基因产物的序列。
如本文所用，针对蛋白，术语“重组”或“工程化的”指由于将基因工程技术应用于编码蛋白的核酸和表达蛋白的细胞或生物体而具有改变的氨基酸序列。针对核酸，术语“重组”或“工程化的”指由于基因工程技术的应用而具有改变的核酸序列。基因工程技术包括但不限于PCR和DNA克隆技术；转染、转化和其他基因转移技术；同源重组；定点诱变；以及基因融合。根据该定义，具有与天然存在的蛋白相同的氨基酸序列但通过在异源宿主中克隆和表达产生的蛋白不认为是重组或工程化的。
如本文所用，术语“重组DNA构建体”、“重组构建体”、“表达盒”、“表达构建体”、“嵌合构建体”、“构建体”和“重组DNA片段”在本文中可以互换使用，并且是单链或双链多核苷酸。重组构建体包含核酸片段的人工组合，包括但不限于自然界中未一起发现的调控和编码序列。例如，重组DNA构建体可以包括源自不同来源的调控序列和编码序列，或者源自同一来源并以不同于自然界中发现的方式排列的调控序列或编码序列。此类构建体可以单独使用，也可以与载体结合使用。
如本文所用，术语“组织特异性启动子”是指当与编码基因或由基因指定的多核苷酸可操作地连接时，基本上只有当细胞是与启动子对应的组织类型的细胞时，才会导致基因产物在细胞中产生的核苷酸序列。
如本文所用，术语“转染的”或“转化的”或“转导的”或“核转染的”是指外源核酸转移或引入宿主细胞的过程。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是指已经用外源核酸转染、转化或转导的细胞。细胞包括原代受试者细胞及其子代。
如本文所用，术语“转移载体”指包含分离的核酸的物质组合物，其可用于将分离的核酸递送到细胞内部。本领域公知很多载体，包括但不限于线性多核苷酸、与离子或两性化合物结合的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“转移载体”包括自主复制的质粒或病毒。还应将该术语解释为进一步包括促进核酸转移到细胞中的非质粒和非病毒化合物，比如例如聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒转移载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体等。
如本文所用，术语“瞬时”指非整合转基因的表达持续几小时、几天或几周的时间段，其中表达时间段小于如果整合到基因组中或包含在宿主细胞中稳定的质粒复制子中的基因表达时间段。
如本文所用，术语，“载体”或“重组DNA载体”可以是包括复制系统和能够在给定宿主细胞中转录和翻译多肽编码序列的序列的构建体。如果使用载体，则载体的选择取决于本领域技术人员熟知的用于转化宿主细胞的方法。载体可包括但不限于质粒载体和重组AAV载体，或本领域已知的适用于将基因递送至靶细胞的任何其他载体。本领域技术人员熟知必须存在于载体上的遗传元件，以成功转化、选择和扩增包含本文描述的任何分离的核苷酸或核酸序列的宿主细胞。在一些实施方式中，“载体”也指病毒载体。病毒载体可包括但不限于逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体和腺相关病毒载体(AAV)。
如本文所用，术语“野生型”是指相同类型基因的等位基因群体中最常见的天然存在的等位基因(即，多核苷酸序列)，其中由野生型等位基因编码的多肽具有其原始功能。术语“野生型”也指由野生型等位基因编码的多肽。野生型等位基因(即，多核苷酸)和多肽与突变体或变体等位基因和多肽是可区分的，所述突变体或变体等位基因和多肽相对于野生型序列包含一个或多个突变和/或取代。尽管野生型等位基因或多肽可在生物体中赋予正常表型，但是在一些情况下，突变体或变体等位基因或多肽可赋予改变的表型。野生型核酸酶与重组或非天然存在的核酸酶是可区分的。术语“野生型”还可以指具有特定基因的野生型等位基因的细胞、生物体和/或受试者，或用于比较目的的细胞、生物体和/或受试者。
如本文所用，当提及核酸酶时，术语“改变的特异性”指核酸酶结合并切割识别序列，所述识别序列在生理条件下不结合参考核酸酶(例如，野生型)并被其切割，或相对于参考核酸酶，识别序列的切割速率增加或降低生物学显著量(例如，至少2×或2×-10×)。
如本文所用，术语“中心序列”是指在大范围核酸酶识别序列中分隔半位点的四个碱基对。这些碱基编号为+1至+4。中心序列包含在大范围核酸酶切割后变成3’单链突出端的四个碱基。“中心序列”可指正义链或反义(相反)链的序列。大范围核酸酶是对称的并且同等地识别中心序列的正义和反义链上的碱基。例如，正义链上的序列A+1A+2A+3A+4被大范围核酸酶识别为反义链上的T+1T+2T+3T+4，因此，A+1A+2A+3A+4和T+1T+2T+3T+4在功能上等同(例如，两者都可被给定的大范围核酸酶切割)。因此，序列C+1T+2G+3C+4相当于其相反链序列G+1C+2A+3G+4，因为大范围核酸酶作为对称的同二聚体结合其识别序列。
如本文所用，术语“切割(cleave或cleavage)”指靶序列内识别序列骨架内磷酸二酯键的水解，导致靶序列内的双链断裂，本文中称为“切割位点”。
如本文所用，术语“DNA结合亲和性”或“结合亲和性”是指核酸酶与参考DNA分子(例如，识别序列或任意序列)非共价结合的趋势。结合亲和性是通过解离常数，Kd衡量的。如本文所用，如果核酸酶针对参考识别序列的Kd相对于参考核酸酶增加或减少统计学上显著的百分比变化，则核酸酶具有“改变的”结合亲和性。
如本文所用，术语“高变区”是指大范围核酸酶单体或亚基内的局部序列，其包含具有相对高可变性的氨基酸。高变区可以包含约50-60个连续的残基、约53-57个连续的残基或者优选地约56个残基。在一些实施方式中，高变区的残基可以对应于SEQ ID NO:3-12的任一个的位置24-79或位置215-270。高变区可以包含一个或多个与识别序列中的DNA碱基接触的残基，并且可以被修饰以改变单体或亚基的碱基偏好。当大范围核酸酶与双链DNA识别序列缔合时，高变区还可以包含一个或多个与DNA骨架结合的残基。可以修饰此类残基以改变大范围核酸酶对DNA骨架和靶识别序列的结合亲和性。在本文描述的不同实施方式中，高变区可以包含1-20个残基，其表现出可变性并且可以被修饰以影响碱基偏好和/或DNA结合亲和性。在特定实施方式中，高变区可以包含约15-20个的残基，其表现出可变性并且可以被修饰以影响碱基偏好和/或DNA结合亲和性。在一些实施方式中，高变区内的可变残基对应于SEQ ID NO:3-12的任一个的位置24、26、28、30、32、33、38、40、42、44、46、68、70、75和77的一个或多个。在其他实施方式中，高变区内的可变残基对应于SEQ ID NO:3-12的任一个的位置215、217、219、221、223、224、229、231、233、235、237、259、261、266和268的一个或多个。
如本文所用，术语“接头”指用于将两个核酸酶亚基连接成单个多肽的外源肽序列。接头可具有在天然蛋白质中发现的序列，或者可以是在任何天然蛋白质中未发现的人工序列。接头可以是柔性的并且缺乏二级结构或者可能具有在生理条件下形成特定三维结构的倾向。接头可以包括但不限于美国专利号8,445,251、9,340,777、9,434,931和10,041,053所涵盖的那些，其每一个均通过引用整体并入。在一些实施方式中，接头可以具有SEQID NO:3-12的任一个的残基154-195所示的氨基酸序列。
如本文所用，术语“大范围核酸酶”指在大于12个碱基对的识别序列处结合双链DNA的核酸内切酶。在一些实施方式中，针对本公开内容的大范围核酸酶的识别序列是22个碱基对。大范围核酸酶可以是来源于I-CreI(SEQ ID NO:48)的核酸内切酶，并且可以指相对于天然I-CreI已被修饰的I-CreI的工程化变体，例如，针对DNA结合特异性、DNA切割活性、DNA结合亲和性或二聚化性质。产生此类修饰的I-CreI变体的方法是本领域公知的(例如，WO2007/047859，通过引用整体并入)。如本文所用的大范围核酸酶作为异二聚体结合至双链DNA。大范围核酸酶也可以是“单链大范围核酸酶”，其中一对DNA结合结构域使用肽接头连接成单个多肽。术语“归巢核酸内切酶”与术语“大范围核酸酶”同义。当在如本文描述的靶细胞中表达时，本公开内容的大范围核酸酶基本上是无毒的，使得当使用本文所述的方法测量时，细胞可以被转染并维持在37℃而不会观察到对细胞活力的有害影响或大范围酶切割活性的显著降低。
如本文所用，术语“核酸酶”和“核酸内切酶”可互换使用，指切割多核苷酸链内的磷酸二酯键的天然存在的或工程化的酶。
如本文所用，术语“线粒体靶向的工程化大范围核酸酶”或“MTEM”是指附接到肽或其他分子上的工程化大范围核酸酶，其能够将工程化大范围核酸酶引导到线粒体，以使得工程化大范围核酸酶能够结合和切割线粒体细胞器内的线粒体DNA。如本文所用，术语“线粒体转运肽”或“MTP”指可以附接到单独分子以在线粒体中转运分子的肽或氨基酸片段。例如，可以将MTP附接到核酸酶，如工程化大范围核酸酶，以便将工程化大范围核酸酶转运到线粒体。MTP可以由疏水性的和带正电荷的氨基酸交替组成，形成所谓的两亲性螺旋。
如本文所用，术语“识别半位点”、“识别序列半位点”或简单地“半位点”指双链DNA分子中的核酸序列，该核酸序列被同二聚体或异二聚体大范围核酸酶的单体或单链大范围核酸酶一个亚基或单链大范围核酸酶一个亚基识别和结合。
如本文所用，术语“识别序列”或“识别位点”指由核酸酶结合和切割的DNA序列。在大范围核酸酶的情况下，识别序列包括一对反向的9个碱基对的“半位点”，其被四个碱基对分开。在单链大范围核酸酶的情况下，蛋白的N末端结构域接触第一半位点，蛋白的C末端结构域接触第二半位点。由大范围核酸酶的切割产生四个碱基对3’突出端。“突出端”或“粘性末端”是指可以通过核酸内切酶切割双链DNA序列产生的短单链DNA片段。在来源于I-CreI的大范围核酸酶和单链大范围核酸酶的情况下，突出端包含22个碱基对识别序列的碱基10-13。如本文所用，术语“单链大范围核酸酶”指包含通过接头连接的核酸酶亚基对的多肽。单链大范围核酸酶具有以下组织：N-末端亚基-接头-C-末端亚基。两个大范围核酸酶亚基在氨基酸序列上通常将是不同的，并且将结合不同DNA序列。因此，单链大范围核酸酶通常切割伪回文或非回文识别序列。可以将单链大范围核酸酶称为“单链异二聚体”或“单链异二聚体大范围核酸酶”，尽管其实际上不是二聚体。为清楚起见，除非另有说明，否则术语“大范围核酸酶”可以指二聚体或单链大范围核酸酶。
如本文所用，术语“特异性”是指核酸酶仅在被称为识别序列的特定碱基对序列上或仅在特定的一组识别序列上结合和切割双链DNA分子的能力。该组识别序列将共享某些保守位置或序列基序，但可在一个或多个位置简并。高度特异性的核酸酶只能切割一个或极少数识别序列。可以通过本领域已知的任何方法确定特异性。
如本文所用，术语“靶位点”或“靶序列”指含有核酸酶识别序列的细胞的染色体DNA的区域。
如本文所用，“载体”还可以指病毒载体(即，重组病毒)。病毒载体可以包括但不限于逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体和腺相关病毒载体(AAV)。
如本文所用，术语“血清型”或“衣壳”指基于病毒细胞表面抗原确定的病毒种内的独特变体。除了其他以外，AAV的已知血清型包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11和AAVHSC(Weitzman和Linden(2011)In Snyder andMoullier Adeno-associated virus methods and protocols.Totowa,NJ:HumanaPress)。
如本文所用，“对照”或“对照细胞”指为衡量遗传修饰细胞的基因型或表型变化提供参考点的细胞。对照细胞可以包括，例如：(a)野生型细胞，即与导致遗传修饰细胞的遗传改变的初始材料具有相同基因型的；(b)与遗传修饰的细胞具有相同基因型但已用无效构建体(即，用对目标性状没有已知影响的构建体)转化的细胞；或者，(c)与遗传修饰的细胞在遗传上相同的细胞，但不暴露于会诱导改变的基因型或表型表达的条件、刺激或进一步的遗传修饰。
如本文所用，术语“有效量”或“治疗有效量”是指足以实现有益或期望的生物学和/或临床结果的量。治疗有效量将根据所使用的制剂或组合物、疾病及其严重程度以及待治疗受试者的年龄、体重、身体状况和反应性而变化。在一些特定实施方式中，本文所述的有效量的MTEM或工程化大范围核酸酶包含约1x1010 gc/kg至约1x1014gc/kg(例如，1x1010gc/kg、1x1011 gc/kg、1x1012 gc/kg、1x1013 gc/kg或1x1014 gc/kg)的编码本文所述的MTEM或工程化大范围核酸酶的核酸或模板核酸。在特定实施方式中，有效量的编码本文所述的MTEM或工程化大范围核酸酶的核酸和/或模板核酸，或者包含编码本文所述的MTEM或工程化大范围核酸酶的核酸和/或本文所述的模板核酸的药物组合物降低受试者中的疾病的至少一种症状。
如本文所用，术语“有效剂量”、“有效量”、“治疗有效剂量”或“治疗有效量”，如本文所用，指足以产生有益或期望的生物学和/或临床结果的量。
如本文所用，术语“gc/kg”或“基因拷贝/千克”是指施用编码本文所述MTEM或工程化大范围核酸酶的核酸和/或模板核酸的受试者每千克重量的编码本文所描述的MTEM或工程化大范围核酸内切酶的核酸拷贝数或本文所述的模板核酸拷贝数。
如本文所用，术语“防止”指在防止患者的疾病或病况。
如本文所用，术语“预防”指疾病或疾病状态的防止或保护性治疗。
如本文所用，术语“降低的”指疾病症状或严重程度的任何降低。此类降低可以是至多5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或至多100％。因此，术语“降低的”涵盖疾病状态的部分降低和完全降低。
如本文所用，变量的数值范围的叙述旨在传达可以用等于该范围内的任何值的变量来实践本公开。因此，对于固有离散的变量，变量可以等于该数值范围内的任何整数值，包括范围的端点。类似地，对于固有连续的变量，变量可以等于数值范围内的任何实数值，包括范围的端点。作为示例而非限制，如果变量是固有离散的，则被描述为具有在0和2之间的值的变量可以取值0、1或2，以及如果变量是固有连续的，则可以取值0.0、0.1、0.01、0.001或≥0且≤2的任何其他实数值。
2.1发明原理
线粒体在正常生长和发育以及应激反应下调节细胞能量和代谢。因此，线粒体基因组的编辑在动物和植物中都有不同的应用。在人类中，有害的线粒体突变是很多疾病的来源，基因编辑疗法可以应用于这些疾病。然而，即使考虑到将线粒体基因组编辑用于治疗应用的潜力，由于无法有效靶向线粒体DNA(mtDNA)并产生精确的编辑，其仍然是一个未被充分探索的科学领域。线粒体基因组很难编辑，因为编辑技术需要递送到这个细胞器。而且，线粒体缺乏可预测的修复机制。此前编辑线粒体基因组的尝试已经导致了大量且不可预测的缺失/重排。因此，需要能够以更加可预测的方式靶向和编辑线粒体基因组的定义区域(优选仅限于一个基因)的组合物和方法。
本公开内容提供了用于结合和切割线粒体基因组上的识别序列而不影响线粒体基因组中的周围区域的组合物和方法。本文公开了附接至MTP的工程化大范围核酸酶，以使得可以在mtDNA中产生DSB。本发明证明，可以将工程化大范围核酸酶引导到线粒体细胞器中，并促进mtDNA的精确编辑，从而开辟了生命科学中具有前景和机遇的整个领域。
2.2工程化大范围核酸酶与用于识别和切割人线粒体DNA内的识别序列的线粒体 靶向的工程化大范围核酸酶
本领域已知，可以使用位点特异性核酸酶在活细胞的基因组中产生DNA断裂，并且这种DNA断裂可以通过与转基因DNA序列的同源重组导致基因组的永久修饰。已知使用核酸酶在靶基因座中诱导双链断裂可刺激同源重组，特别是侧翼为与基因组靶标同源的序列的转基因DNA序列的同源重组。以这种方式，可以将外源性核酸序列插入靶基因座中。
由附接在线粒体转运肽(MTP)上的工程化大范围核酸酶构建的线粒体靶向的工程化大范围核苷酸酶(MTEM)可以有效地从真核细胞的胞质运输至线粒体。一旦进入线粒体细胞器，MTEM就可以结合并切割线粒体基因组中的识别序列。本领域已知，可以使用位点特异性核酸酶在活细胞的基因组中产生DNA断裂，并且这种DNA断裂可以通过诱变性NHEJ修复或通过与转基因DNA序列的同源重组导致基因组的永久修饰。NHEJ可以在切割位点产生突变，导致等位基因失活。NHEJ相关诱变可通过产生早期终止密码子、产生异常非功能蛋白的移码突变使等位基因失活，或者可触发诸如无义介导的mRNA衰变的机制。使用核酸酶通过NHEJ诱导诱变可用于靶向野生型等位基因中存在的特定突变或序列。此外，已知使用核酸酶在靶基因座中诱导双链断裂会刺激同源重组，特别是侧翼为与基因组靶标同源的序列的转基因DNA序列的同源重组。以这种方式，可以将外源性核酸序列插入靶基因座中。此类外源性核酸可以编码任何目标序列或多肽。在一些实施方式中，位点特异性核酸酶可以切割线粒体基因组中的识别序列，这导致线粒体基因组从位点特异性核苷酸酶产生的切割末端降解。
用于实施本发明的核酸酶是大范围核酸酶。在特定实施方式中，用于实施本发明的大范围核酸酶是单链大范围核酸酶。单链大范围核酸酶包含通过接头肽连接的N末端亚基和C末端亚基。两个结构域中的每一个都识别并结合识别序列的一半(即，识别半位点)，并且DNA切割位点位于靠近两个亚基的界面的识别序列的中间。DNA链断裂被四个碱基对抵消，使得DNA被大范围核酸酶切割产生一对四碱基对3’单链突出端。
在一些实施方式中，本文所述的工程化大范围核酸酶已被工程化以结合并切割MIT 25-26识别序列(SEQ ID NO:1)。在本文中将此类工程化大范围核酸酶称为“MIT 25-26大范围核酸酶”或“MIT 25-26核酸酶”。在特定实施方式中，将MIT 25-26大范围核酸酶附接到MTP以用于切割SEQ ID NO:1的MIT 25-26识别序列的MTEM。
本文所述的工程化大范围核酸酶可以包含第一亚基，其包含第一高变(HVR1)区，和第二亚基，其包含第二高变(HVR2)区。此外，第一亚基可以结合至识别序列中的第一识别半位点(例如，MIT 25半位点)，以及第二亚基可以结合至识别序列中的第二识别半位点(例如，MIT 26半位点)。在其中工程化大范围核酸酶是单链大范围核酸酶的实施方式中，第一和第二亚基可以被定向，以使得包含HVR1区并结合第一半位点的第一亚基被定位为N末端亚基，以及包含HVR2区并结合第二半位点的第二亚基被定位为C末端亚基。在替代性实施方式中，第一和第二亚基可以被定向，以使得包含HVR1区并结合第一半位点的第一亚基被定位为C末端亚基，以及包含HVR2区并结合第二半位点的第二亚基被定位为N末端亚基。
在表1中提供了本文所述的示例性MIT 25-26大范围核酸酶，并且在下文中进一步描述。
表1：
*“MIT25亚基％”和“MIT26亚基％”代表每种大范围核酸酶的MIT25结合和MIT26结合亚基区域分别与MIT225-6x91大范围核酸酶的MIT25结合和MIT26结合亚基区域之间的氨基酸序列同一性。
在本文所述的某些实施方式中，工程化大范围核酸酶结合并切割线粒体基因组内包含SEQ ID NO:1的识别序列，其中所述工程化大范围核酸酶包含第一亚基和第二亚基，其中第一亚基结合至识别序列的第一识别半位点并包含第一高变(HVR1)区，和其中第二亚基结合至识别序列的第二识别半位点并包含第二高变(HVR2)区。
在一些实施方式中，HVR1区包含与对应于SEQ ID NO:3-12的任一个的残基24-79的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些此类实施方式中，HVR1区包含对应于SEQ ID NO:3-12的任一个的残基24、26、28、30、32、33、38、40、42、44、46、68、70、75和77的一个或多个残基。在一些此类实施方式中，HVR1区包含对应于SEQ ID NO:3-12的任一个的残基24、26、28、30、32、33、38、40、42、44、46、68、70、75和77的残基。在一些此类实施方式中，HVR1区在对应于SEQ ID NO:3-12的任一个的残基66的残基处包含Y、R、K或D。在一些此类实施方式中，HVR1区包含SEQ ID NO:3-12的任一个的残基24-79。在一些此类实施方式中，HVR2区包含与对应于SEQ ID NO:3-12的任一个的残基215-270的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些此类实施方式中，HVR2区包含对应于SEQ ID NO:3-12的任一个的残基215、217、219、221、223、224、229、231、233、235、237、259、261、266和268的一个或多个残基。在一些此类实施方式中，HVR2区包含对应于SEQ ID NO:3-12的任一个的残基215、217、219、221、223、224、229、231、233、235、237、259、261、266和268的残基。在一些此类实施方式中，HVR2区在对应于SEQ ID NO:3-12的任一个的残基257处的包含Y、R、K或D。在一些此类实施方式中，HVR2区包含SEQ ID NO:3-12的任一个的残基215-270。在一些此类实施方式中，第一亚基包含与SEQ ID NO:3-12的任一个的残基7-153具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列，和其中第二亚基包含与SEQ ID NO:3-12的任一个的残基198-344具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些此类实施方式中，第一亚基在对应于SEQ ID NO:3-12的任一个的残基19的残基处包含G、S或A。在一些此类实施方式中，第一亚基在对应于SEQ ID NO:3-12的任一个的残基80的残基处包含E、Q或K。在一些此类实施方式中，第二亚基在对应于SEQ ID NO:3-12的任一个的残基210的残基处包含G、S或A。在一些此类实施方式中，第二亚基在对应于SEQ ID NO:3-12的任一个的残基271的残基处包含E、Q或K。在一些此类实施方式中，第一亚基包含对应于SEQ ID NO:3-12的任一个的残基80的残基。在一些此类实施方式中，第二亚基包含对应于SEQ ID NO:3-12的任一个的残基271的残基。在一些此类实施方式中，工程化大范围核酸酶是包含接头的单链大范围核酸酶，其中接头共价连接第一亚基和第二亚基。在一些此类实施方式中，工程化大范围核酸酶包含与SEQ ID NO:3-12的任一个具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些此类实施方式中，工程化大范围核酸酶包含SEQ ID NO:3-12的任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，工程化大范围核酸酶由与SEQ ID NO:33-42的任一个中所示的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的核酸序列编码。在一些此类实施方式中，工程化大范围核酸酶由SEQ ID NO:33-42的任一个中所示的核酸序列编码。
MIT 25-26x.91(SEQ ID NO:3)
在一些实施方式中，HVR1区包含与对应于SEQ ID NO:3的残基24-79的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，HVR1区包含对应于SEQ ID NO:3的残基24、26、28、30、32、33、38、40、42、44、46、68、70、75和77的一个或多个残基。在一些实施方式中，HVR1区包含对应于SEQ ID NO:3的残基24、26、28、30、32、33、38、40、42、44、46、68、70、75和77的残基。在一些实施方式中，HVR1区在对应于SEQ ID NO:3的残基66的残基处包含Y、R、K或D。在一些实施方式中，HVR1区包含具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个氨基酸取代的SEQID NO:3的残基24-79。在一些实施方式中，HVR1区包含SEQ ID NO:3的残基24-79。
在一些实施方式中，第一亚基包含与SEQ ID NO:3的残基7-153具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，第一亚基在对应于SEQ ID NO:3的残基19的残基处包含G、S或A。在一些实施方式中，第一亚基包含对应于SEQ ID NO:3的残基19的残基。在一些实施方式中，第一亚基在对应于SEQ ID NO:3的残基80的残基处包含E、Q或K。在一些实施方式中，第一亚基包含具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸取代的SEQ ID NO:3的残基7-153。在一些实施方式中，第一亚基包含SEQ ID NO:3的残基7-153。
在一些实施方式中，HVR2区包含与对应于SEQ ID NO:3的残基215-270的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，HVR2区包含对应于SEQ ID NO:3的残基215、217、219、221、223、224、229、231、233、235、237、259、261、266和268的一个或多个残基。在一些实施方式中，HVR2区包含对应于SEQ ID NO:3的残基215、217、219、221、223、224、229、231、233、235、237、259、261、266和268的残基。在一些实施方式中，HVR2区在对应于SEQ IDNO:3的残基257的残基处包含Y、R、K或D。在一些实施方式中，HVR2区包含对应于SEQ ID NO:3的残基241的残基。在一些实施方式中，HVR2区包含对应于SEQ ID NO:3的残基262的残基。在一些实施方式中，HVR2区包含对应于SEQ ID NO:3的残基263的残基。在一些实施方式中，HVR2区包含对应于SEQ ID NO:3的残基264的残基。在一些实施方式中，HVR2区包含具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个氨基酸取代的SEQ ID NO:3的残基215-270。在一些实施方式中，HVR2区包含SEQ ID NO:3的残基215-270。
在一些实施方式中，第二亚基包含与SEQ ID NO:3的残基198-344具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，第二亚基在对应于SEQ ID NO:3的残基210的残基处包含G、S或A。在一些实施方式中，第二亚基在对应于SEQ ID NO:3的残基271的残基处包含E、Q或K。在一些实施方式中，第二亚基包含对应于SEQ ID NO:3的残基330的残基。在一些实施方式中，第二亚基包含具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸取代的SEQ ID NO:3的残基198-344。在一些实施方式中，第二亚基包含SEQ ID NO:3的残基198-344。
在一些实施方式中，工程化大范围核酸酶是包含接头的单链大范围核酸酶，其中接头共价连接所述第一亚基和所述第二亚基。在一些实施方式中，工程化大范围核酸酶包含与SEQ ID NO:3具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，工程化大范围核酸酶包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列。在一些实施方式中，工程化大范围核酸酶由与SEQ ID NO:33中所示的核酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的核酸序列编码。在一些实施方式中，工程化大范围核酸酶由SEQID NO:33中所示的核酸序列编码。
MIT 25-26x.48(SEQ ID NO:4)
在一些实施方式中，HVR1区包含与对应于SEQ ID NO:4的残基24-49的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，HVR1区包含对应于SEQ ID NO:4的残基24、26、28、30、32、33、38、40、42、44、46、68、70、75和77的一个或多个残基。在一些实施方式中，HVR1区包含对应于SEQ ID NO:4的残基24、26、28、30、32、33、38、40、42、44、46、68、70、75和77的残基。在一些实施方式中，HVR1区在对应于SEQ ID NO:4的残基66的残基处包含Y、R、K或D。在一些实施方式中，HVR1区包含具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个氨基酸取代的SEQID NO:4的残基24-79。在一些实施方式中，HVR1区包含SEQ ID NO:4的残基24-79。
在一些实施方式中，第一亚基包含与SEQ ID NO:4的残基7-153具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，第一亚基在对应于SEQ ID NO:4的残基19的残基处包含G、S或A。在一些实施方式中，第一亚基包含对应于SEQ ID NO:4的残基19的残基。在一些实施方式中，第一亚基在对应于SEQ ID NO:4的残基80的残基处包含E、Q或K。在一些实施方式中，第一亚基包含具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸取代的SEQ ID NO:4的残基7-153。在一些实施方式中，第一亚基包含SEQ ID NO:4的残基7-153。
在一些实施方式中，HVR2区包含与对应于SEQ ID NO:4的残基215-270的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，HVR2区包含对应于SEQ ID NO:4的残基215、217、219、221、223、224、229、231、233、235、237、259、261、266和268的一个或多个残基。在一些实施方式中，HVR2区包含对应于SEQ ID NO:4的残基215、217、219、221、223、224、229、231、233、235、237、259、261、266和268的残基。在一些实施方式中，HVR2区在对应于SEQ IDNO:4的残基257的残基处包含Y、R、K或D。在一些实施方式中，HVR2区包含对应于SEQ ID NO:4的残基241的残基。在一些实施方式中，HVR2区包含具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个氨基酸取代的SEQ ID NO:4的残基215-270。在一些实施方式中，HVR2区包含SEQ ID NO:4的残基215-270。
在一些实施方式中，第二亚基包含与SEQ ID NO:4的残基198-344具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，第二亚基在对应于SEQ ID NO:4的残基210的残基处包含G、S或A。在一些实施方式中，第二亚基在对应于SEQ ID NO:4的残基271的残基处包含E、Q或K。在一些实施方式中，第二亚基包含对应于SEQ ID NO:4的残基276的残基。在一些实施方式中，第二亚基包含对应于SEQ ID NO:4的残基330的残基。在一些实施方式中，第二亚基包含具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸取代的SEQ ID NO:4的残基198-344。在一些实施方式中，第二亚基包含SEQ ID NO:4的残基198-344。
在一些实施方式中，工程化大范围核酸酶是包含接头的单链大范围核酸酶，其中接头共价连接所述第一亚基和所述第二亚基。在一些实施方式中，工程化大范围核酸酶包含与SEQ ID NO:4具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，工程化大范围核酸酶包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。在一些实施方式中，工程化大范围核酸酶由与SEQ ID NO:34中所示的核酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的核酸序列编码。在一些实施方式中，工程化大范围核酸酶由SEQID NO:34中所示的核酸序列编码。
MIT 25-26x.73(SEQ ID NO:5)
在一些实施方式中，HVR1区包含与对应于SEQ ID NO:5的残基24-79的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，HVR1区包含对应于SEQ ID NO:5的残基24、26、28、30、32、33、38、40、42、44、46、68、70、75和77的一个或多个残基。在一些实施方式中，HVR1区包含对应于SEQ ID NO:5的残基24、26、28、30、32、33、38、40、42、44、46、68、70、75和77的残基。在一些实施方式中，HVR1区在对应于SEQ ID NO:5的残基66的残基处包含Y、R、K或D。在一些实施方式中，HVR1区包含具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个氨基酸取代的SEQID NO:5的残基24-79。在一些实施方式中，HVR1区包含SEQ ID NO:5的残基24-79。
在一些实施方式中，第一亚基包含与SEQ ID NO:5的残基7-153具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，第一亚基在对应于SEQ ID NO:5的残基19的残基处包含G、S或A。在一些实施方式中，第一亚基包含对应于SEQ ID NO:5的残基19的残基。在一些实施方式中，第一亚基在对应于SEQ ID NO:5的残基80的残基处包含E、Q或K。在一些实施方式中，残基对应于SEQ ID NO:5的残基80。在一些实施方式中，第一亚基包含具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸取代的SEQ ID NO:5的残基7-153。在一些实施方式中，第一亚基包含SEQ ID NO:5的残基7-153。
在一些实施方式中，HVR2区包含与对应于SEQ ID NO:5的残基215-270的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，HVR2区包含对应于SEQ ID NO:5的残基215、217、219、221、223、224、229、231、233、235、237、259、261、266和268的一个或多个残基。在一些实施方式中，HVR2区包含对应于SEQ ID NO:5的残基215、217、219、221、223、224、229、231、233、235、237、259、261、266和268的残基。在一些实施方式中，HVR2区在对应于SEQ IDNO:5的残基257的残基处包含Y、R、K或D。在一些实施方式中，HVR2区包含对应于SEQ ID NO:5的残基241的残基。在一些实施方式中，HVR2区包含对应于SEQ ID NO:5的残基263的残基。在一些实施方式中，HVR2区包含对应于SEQ ID NO:5的残基264的残基。在一些实施方式中，HVR2区包含具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个氨基酸取代的SEQ ID NO:5的残基215-270。在一些实施方式中，HVR2区包含SEQ ID NO:5的残基215-270。
在一些实施方式中，第二亚基包含与SEQ ID NO:5的残基198-344具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，第二亚基在对应于SEQ ID NO:5的残基210的残基处包含G、S或A。在一些实施方式中，第二亚基在对应于SEQ ID NO:5的残基271的残基处包含E、Q或K。在一些实施方式中，第二亚基包含对应于SEQ ID NO:5的残基330的残基。在一些实施方式中，第二亚基包含具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸取代的SEQ ID NO:5的残基198-344。在一些实施方式中，第二亚基包含SEQ ID NO:5的残基198-344。
在一些实施方式中，工程化大范围核酸酶是包含接头的单链大范围核酸酶，其中接头共价连接所述第一亚基和所述第二亚基。在一些实施方式中，工程化大范围核酸酶包含与SEQ ID NO:5具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，工程化大范围核酸酶包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。在一些实施方式中，工程化大范围核酸酶由与SEQ ID NO:35中所示的核酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的核酸序列编码。在一些实施方式中，工程化大范围核酸酶由SEQID NO:35中所示的核酸序列编码。
MIT 25-26x.29(SEQ ID NO:6)
在一些实施方式中，HVR1区包含与对应于SEQ ID NO:6的残基24-79的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，HVR1区包含对应于SEQ ID NO:6的残基24、26、28、30、32、33、38、40、42、44、46、68、70、75和77的一个或多个残基。在一些实施方式中，HVR1区包含对应于SEQ ID NO:6的残基24、26、28、30、32、33、38、40、42、44、46、68、70、75和77的残基。在一些实施方式中，HVR1区在对应于SEQ ID NO:6的残基66的残基处包含Y、R、K或D。在一些实施方式中，HVR1区包含具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个氨基酸取代的SEQID NO:6的残基24-79。在一些实施方式中，HVR1区包含SEQ ID NO:6的残基24-79。
在一些实施方式中，第一亚基包含与SEQ ID NO:6的残基7-153具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，第一亚基在对应于SEQ ID NO:6的残基19的残基处包含G、S或A。在一些实施方式中，第一亚基包含对应于SEQ ID NO:6的残基19的残基。在一些实施方式中，第一亚基在对应于SEQ ID NO:6的残基80的残基处包含E、Q或K。在一些实施方式中，第一亚基包含具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸取代的SEQ ID NO:6的残基7-153。在一些实施方式中，第一亚基包含SEQ ID NO:6的残基7-153。
在一些实施方式中，HVR2区包含与对应于SEQ ID NO:6的残基215-270的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，HVR2区包含对应于SEQ ID NO:6的残基215、217、219、221、223、224、229、231、233、235、237、259、261、266和268的一个或多个残基。在一些实施方式中，HVR2区包含对应于SEQ ID NO:6的残基215、217、219、221、223、224、229、231、233、235、237、259、261、266和268的残基。在一些实施方式中，HVR2区在对应于SEQ IDNO:6的残基257的残基处包含Y、R、K或D。在一些实施方式中，HVR2区包含对应于SEQ ID NO:6的残基241的残基。在一些实施方式中，HVR2区包含对应于SEQ ID NO:6的残基263的残基。在一些实施方式中，HVR2区包含对应于SEQ IDNO:6的残基264的残基。在一些实施方式中，HVR2区包含对应于SEQ ID NO:6的残基265的残基。在一些实施方式中，HVR2区包含具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个氨基酸取代的SEQ ID NO:6的残基215-270。在一些实施方式中，HVR2区包含SEQ ID NO:6的残基215-270。
在一些实施方式中，第二亚基包含与SEQ ID NO:6的残基198-344具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，第二亚基在对应于SEQ ID NO:6的残基210的残基处包含G、S或A。在一些实施方式中，第二亚基在对应于SEQ ID NO:6的残基271的残基处包含E、Q或K。在一些实施方式中，第二亚基包含对应于SEQ ID NO:6的残基330的残基。在一些实施方式中，第二亚基包含具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸取代的SEQ ID NO:6的残基198-344。在一些实施方式中，第二亚基包含SEQ ID NO:6的残基198-344。
在一些实施方式中，工程化大范围核酸酶是包含接头的单链大范围核酸酶，其中接头共价连接所述第一亚基和所述第二亚基。在一些实施方式中，工程化大范围核酸酶包含与SEQ ID NO:6具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，工程化大范围核酸酶包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。在一些实施方式中，工程化大范围核酸酶由与SEQ ID NO:36中所示的核酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的核酸序列编码。在一些实施方式中，工程化大范围核酸酶由SEQID NO:36中所示的核酸序列编码。
MIT 25-26x.37(SEQ ID NO:7)
在一些实施方式中，HVR1区包含与对应于SEQ ID NO:7的残基24-79的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，HVR1区包含对应于SEQ ID NO:7的残基24、26、28、30、32、33、38、40、42、44、46、68、70、75和77的一个或多个残基。在一些实施方式中，HVR1区包含对应于SEQ ID NO:7的残基24、26、28、30、32、33、38、40、42、44、46、68、70、75和77的残基。在一些实施方式中，HVR1区在对应于SEQ ID NO:7的残基66的残基处包含Y、R、K或D。在一些实施方式中，HVR1区包含具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个氨基酸取代的SEQID NO:7的残基24-79。在一些实施方式中，HVR1区包含SEQ ID NO:7的残基24-79。
在一些实施方式中，第一亚基包含与SEQ ID NO:7的残基7-153具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，第一亚基在对应于SEQ ID NO:7的残疾19的残基处包含G、S或A。在一些实施方式中，第一亚基包含对应于SEQ ID NO:7的残基19的残基。在一些实施方式中，第一亚基在对应于SEQ ID NO:7的残基80的残基处包含E、Q或K。在一些实施方式中，第一亚基包含对应于SEQ ID NO:7的残基80的残基。在一些实施方式中，第一亚基包含具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸取代的SEQ ID NO:7的残基7-153。在一些实施方式中，第一亚基包含SEQID NO:7的残基7-153。
在一些实施方式中，HVR2区包含与对应于SEQ ID NO:7的残基215-270的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，HVR2区包含对应于SEQ ID NO:7的残基215、217、219、221、223、224、229、231、233、235、237、259、261、266和268的一个或多个残基。在一些实施方式中，HVR2区包含对应于SEQ ID NO:7的残基215、217、219、221、223、224、229、231、233、235、237、259、261、266和268的残基。在一些实施方式中，HVR2区在对应于SEQ IDNO:7的残基257的残基处包含Y、R、K或D。在一些实施方式中，HVR2区包含对应于SEQ ID NO:7的残基241的残基。在一些实施方式中，HVR2区包含对应于SEQ ID NO:7的残基263的残基。在一些实施方式中，HVR2区包含具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个氨基酸取代的SEQID NO:7的残基215-270。在一些实施方式中，HVR2区包含SEQ ID NO:7的残基215-270。
在一些实施方式中，第二亚基包含与SEQ ID NO:7的残基198-344具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，第二亚基在对应于SEQ ID NO:7的残基210的残基处包含G、S或A。在一些实施方式中，第二亚基在对应于SEQ ID NO:7的残基271的残基处包含E、Q或K。在一些实施方式中，第二亚基包含对应于SEQ ID NO:7的残基330的残基。在一些实施方式中，第二亚基包含具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸取代的SEQ ID NO:7的残基198-344。在一些实施方式中，第二亚基包含SEQ ID NO:7的残基198-344。
在一些实施方式中，工程化大范围核酸酶是包含接头的单链大范围核酸酶，其中接头共价连接所述第一亚基和所述第二亚基。在一些实施方式中，工程化大范围核酸酶包含与SEQ ID NO:7具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，工程化大范围核酸酶包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列。在一些实施方式中，工程化大范围核酸酶由与SEQ ID NO:37中所示的核酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的核酸序列编码。在一些实施方式中，工程化大范围核酸酶由SEQID NO:37中所示的核酸序列编码。
MIT 25-26L.35(SEQ ID NO:8)
在一些实施方式中，HVR1区包含与对应于SEQ ID NO:8的残基24-79的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，HVR1区包含对应于SEQ ID NO:8的残基24、26、28、30、32、33、38、40、42、44、46、68、70、75和77的一个或多个残基。在一些实施方式中，HVR1区包含对应于SEQ ID NO:8的残基24、26、28、30、32、33、38、40、42、44、46、68、70、75和77的残基。在一些实施方式中，HVR1区在对应于SEQ ID NO:8的残基66的残基处包含Y、R、K或D。在一些实施方式中，HVR1区包含具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个氨基酸取代的SEQID NO:8的残基24-79。在一些实施方式中，HVR1区包含SEQ ID NO:8的残基24-79。
在一些实施方式中，第一亚基包含与SEQ ID NO:8的残基7-153具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，第一亚基在对应于SEQ ID NO:8的残基19的残基处包含G、S或A。在一些实施方式中，第一亚基包含对应于SEQ ID NO:8的残基19的残基。在一些实施方式中，第一亚基在对应于SEQ ID NO:8的残基80的残基处包含E、Q或K。在一些实施方式中，第一亚基包含具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸取代的SEQ ID NO:8的残基7-153。在一些实施方式中，第一亚基包含SEQ ID NO:8的残基7-153。
在一些实施方式中，HVR2区包含与对应于SEQ ID NO:8的残基215-270的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，HVR2区包含对应于SEQ ID NO:8的残基215、217、219、221、223、224、229、231、233、235、237、259、261、266和268的一个或多个残基。在一些实施方式中，HVR2区包含对应于SEQ ID NO:8的残基215、217、219、221、223、224、229、231、233、235、237、259、261、266和268的残基。在一些实施方式中，HVR2区在对应于SEQ IDNO:8的残基257的残基处包含Y、R、K或D。在一些实施方式中，HVR2区包含对应于SEQ ID NO:8的残基241的残基。在一些实施方式中，HVR2区包含对应于SEQ ID NO:8的残基263的残基。在一些实施方式中，HVR2区包含对应于SEQ ID NO:8的残基264的残基。在一些实施方式中，HVR2区包含具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个氨基酸取代的SEQ ID NO:8的残基215-270。在一些实施方式中，HVR2区包含SEQ ID NO:8的残基215-270。
在一些实施方式中，第二亚基包含与SEQ ID NO:8的残基198-344具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，第二亚基在对应于SEQ ID NO:8的残基210的残基处包含G、S或A。在一些实施方式中，第二亚基在对应于SEQ ID NO:8的残基271的残基处包含E、Q或K。在一些实施方式中，第二亚基包含对应于SEQ ID NO:8的残基330的残基。在一些实施方式中，第二亚基包含具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸取代的SEQ ID NO:8的残基198-344。在一些实施方式中，第二亚基包含SEQ ID NO:8的残基198-344。
在一些实施方式中，工程化大范围核酸酶是包含接头的单链大范围核酸酶，其中接头共价连接所述第一亚基和所述第二亚基。在一些实施方式中，工程化大范围核酸酶包含与SEQ ID NO:8具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，工程化大范围核酸酶包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在一些实施方式中，工程化大范围核酸酶由与SEQ ID NO:38中所示的核酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的核酸序列编码。在一些实施方式中，工程化大范围核酸酶由SEQID NO:38中所示的核酸序列编码。
MIT 25-26x.91 259H>Q(SEQ ID NO:9)
在一些实施方式中，HVR1区包含与对应于SEQ ID NO:9的残基24-79的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，HVR1区包含对应于SEQ ID NO:9的残基24、26、28、30、32、33、38、40、42、44、46、68、70、75和77的一个或多个残基。在一些实施方式中，HVR1区包含对应于SEQ ID NO:9的残基24、26、28、30、32、33、38、40、42、44、46、68、70、75和77的残基。在一些实施方式中，HVR1区在对应于SEQ ID NO:9的残基66的残基处包含Y、R、K或D。在一些实施方式中，HVR1区包含具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个氨基酸取代的SEQID NO:9的残基24-79。在一些实施方式中，HVR1区包含SEQ ID NO:9的残基24-79。
在一些实施方式中，第一亚基包含与SEQ ID NO:9的残基7-153具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，第一亚基在对应于SEQ ID NO:9的残基19的残基处包含G、S或A。在一些实施方式中，第一亚基包含对应于SEQ ID NO:9的残基19的残基。在一些实施方式中，第一亚基在对应于SEQ ID NO:9的残基80的残基处包含E、Q或K。在一些实施方式中，第一亚基包含对应于SEQ ID NO:9的残基80的残基。在一些实施方式中，第一亚基包含具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸取代的SEQ ID NO:9的残基7-153。在一些实施方式中，第一亚基包含SEQID NO:9的残基7-153。
在一些实施方式中，HVR2区包含与对应于SEQ ID NO:9的残基215-270的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，HVR2区包含对应于SEQ ID NO:9的残基215、217、219、221、223、224、229、231、233、235、237、259、261、266和268的一个或多个残基。在一些实施方式中，HVR2区包含对应于SEQ ID NO:9的残基215、217、219、221、223、224、229、231、233、235、237、259、261、266和268的残基。在一些实施方式中，HVR2区在对应于SEQ IDNO:9的残基257的残基处包含Y、R、K或D。在一些实施方式中，HVR2区包含对应于SEQ ID NO:9的残基241的残基。在一些实施方式中，HVR2区包含对应于SEQ ID NO:9的残基263的残基。在一些实施方式中，HVR2区包含对应于SEQ ID NO:9的残基264的残基。在一些实施方式中，HVR2区包含具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个氨基酸取代的SEQ ID NO:9的残基215-270。在一些实施方式中，HVR2区包含SEQ ID NO:9的残基215-270。
在一些实施方式中，第二亚基包含与SEQ ID NO:9的残基198-344具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，第二亚基在对应于SEQ ID NO:9的残基210的残基处包含G、S或A。在一些实施方式中，第二亚基在对应于SEQ ID NO:9的残基271的残基处包含E、Q或K。在一些实施方式中，第二亚基包含对应于SEQ ID NO:9的残基330的残基。在一些实施方式中，第二亚基包含具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸取代的SEQ ID NO:9的残基198-344。在一些实施方式中，第二亚基包含SEQ ID NO:9的残基198-344。
在一些实施方式中，工程化大范围核酸酶是包含接头的单链大范围核酸酶，其中接头共价连接所述第一亚基和所述第二亚基。在一些实施方式中，工程化大范围核酸酶包含与SEQ ID NO:9具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，工程化大范围核酸酶包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列。在一些实施方式中，工程化大范围核酸酶由与SEQ ID NO:39中所示的核酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的核酸序列编码。在一些实施方式中，工程化大范围核酸酶由SEQID NO:39中所示的核酸序列编码。
MIT 25-26L.35 19A>S(SEQ ID NO:10)
在一些实施方式中，HVR1区包含与对应于SEQ ID NO:10的残基24-79的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，HVR1区包含对应于SEQ ID NO:10的残基24、26、28、30、32、33、38、40、42、44、46、68、70、75和77的一个或多个残基。在一些实施方式中，HVR1区包含对应于SEQ ID NO:10的残基24、26、28、30、32、33、38、40、42、44、46、68、70、75和77的残基。在一些实施方式中，HVR1区在对应于SEQ ID NO:10的残基66的残基处包含Y、R、K或D。在一些实施方式中，HVR1区包含具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个氨基酸取代的SEQ ID NO:10的残基24-79。在一些实施方式中，HVR1区包含SEQ ID NO:10的残基24-79。
在一些实施方式中，第一亚基包含与SEQ ID NO:10的残基7-153具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，第一亚基在对应于SEQ ID NO:10的残基19的残基处包含G、S或A。在一些实施方式中，第一亚基包含对应于SEQ ID NO:10的残基19的残基。在一些实施方式中，第一亚基在对应于SEQ ID NO:10的残基80的残基处包含E、Q或K。在一些实施方式中，第一亚基包含具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸取代的SEQ ID NO:10的残基7-153。在一些实施方式中，第一亚基包含SEQ ID NO:10的残基7-153。
在一些实施方式中，HVR2区包含与对应于SEQ ID NO:10的残基215-270的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，HVR2区包含对应于SEQ ID NO:10的残基215、217、219、221、223、224、229、231、233、235、237、259、261、266和268的一个或多个残基。在一些实施方式中，HVR2区包含对应于SEQ ID NO:10的残基215、217、219、221、223、224、229、231、233、235、237、259、261、266和268的残基。在一些实施方式中，HVR2区在对应于SEQID NO:10的残基257的残基处包含Y、R、K或D。在一些实施方式中，HVR2区包含SEQ ID NO:10的残基241的残基。在一些实施方式中，HVR2区包含对应于SEQ ID NO:10的残基263的残基。在一些实施方式中，HVR2区包含对应于SEQ ID NO:10的残基264的残基。在一些实施方式中，HVR2区包含具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个氨基酸取代的SEQ ID NO:10的残基215-270。在一些实施方式中，HVR2区包含SEQ ID NO:10的残基215-270。
在一些实施方式中，第二亚基包含与SEQ ID NO:10的残基198-344具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，第二亚基在对应于SEQ ID NO:10的残基210的残基处包含G、S或A。在一些实施方式中，第二亚基在对应于SEQ ID NO:10的残基271的残基处包含E、Q或K。在一些实施方式中，第二亚基包含对应于SEQ ID NO:10的残基330的残基。在一些实施方式中，第二亚基包含具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸取代的SEQ ID NO:10的残基198-344。在一些实施方式中，第二亚基包含SEQ ID NO:10的残基198-344。
在一些实施方式中，工程化大范围核酸酶是包含接头的单链大范围核酸酶，其中接头共价连接所述第一亚基和所述第二亚基。在一些实施方式中，工程化大范围核酸酶包含与SEQ ID NO:10具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，工程化大范围核酸酶包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。在一些实施方式中，工程化大范围核酸酶由与SEQ ID NO:40中所示的核酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的核酸序列编码。在一些实施方式中，工程化大范围核酸酶由SEQ ID NO:40中所示的核酸序列编码。
MIT 25-26x.91 263T>R(SEQ ID NO:11)
在一些实施方式中，HVR1区包含与对应于SEQ ID NO:11的残基24-79的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，HVR1区包含对应于SEQ ID NO:11的残基24、26、28、30、32、33、38、40、42、44、46、68、70、75和77的一个或多个残基。在一些实施方式中，HVR1区包含对应于SEQ ID NO:11的残基24、26、28、30、32、33、38、40、42、44、46、68、70、75和77的残基。在一些实施方式中，HVR1区在对应于SEQ ID NO:11的残基66的残基处包含Y、R、K或D。在一些实施方式中，HVR1区包含具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个氨基酸取代的SEQ ID NO:11的残基24-79。在一些实施方式中，HVR1区包含SEQ ID NO:11的残基24-79。
在一些实施方式中，第一亚基包含与SEQ ID NO:11的残基7-153具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，第一亚基在对应于SEQ ID NO:11的残基19的残基处包含G、S或A。在一些实施方式中，第一亚基包含对应于SEQ ID NO:11的残基19的残基。在一些实施方式中，第一亚基在对应于SEQ ID NO:11的残基80的残基处包含E、Q或K。在一些实施方式中，第一亚基包含对应于SEQ ID NO:11的残基80的残基。在一些实施方式中，第一亚基包含具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸取代的SEQ ID NO:11的残基7-153。在一些实施方式中，第一亚基包含SEQ ID NO:11的残基7-153。
在一些实施方式中，HVR2区包含与对应于SEQ ID NO:11的残基215-270的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，HVR2区包含对应于SEQ ID NO:11的残基215、217、219、221、223、224、229、231、233、235、237、259、261、266和268的一个或多个残基。在一些实施方式中，HVR2区包含对应于SEQ ID NO:11的残基215、217、219、221、223、224、229、231、233、235、237、259、261、266和268的残基。在一些实施方式中，HVR2区在对应于SEQID NO:11的残基257的残基处包含Y、R、K或D。在一些实施方式中，HVR2区包含对应于SEQ IDNO:11的残基241的残基。在一些实施方式中，HVR2区包含对应于SEQ ID NO:11的残基263的残基。在一些实施方式中，HVR2区包含对应于SEQ ID NO:11的残基264的残基。在一些实施方式中，HVR2区包含具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个氨基酸取代的SEQ ID NO:11的残基215-270。在一些实施方式中，HVR2区包含SEQ ID NO:11的残基215-270。
在一些实施方式中，第二亚基包含与SEQ ID NO:11的残基198-344具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，第二亚基在对应于SEQ ID NO:11的残基210的残基处包含G、S或A。在一些实施方式中，第二亚基在对应于SEQ ID NO:11的残基271的残基处包含E、Q或K。在一些实施方式中，第二亚基包含SEQ ID NO:11的残基330的残基。在一些实施方式中，第二亚基包含具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸取代的SEQ ID NO:11的残基198-344。在一些实施方式中，第二亚基包含SEQ ID NO:11的残基198-344。
在一些实施方式中，工程化大范围核酸酶是包含接头的单链大范围核酸酶，其中接头共价连接所述第一亚基和所述第二亚基。在一些实施方式中，工程化大范围核酸酶包含与SEQ ID NO:11具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，工程化大范围核酸酶包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列。在一些实施方式中，工程化大范围核酸酶由与SEQ ID NO:41中所示的核酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的核酸序列编码。在一些实施方式中，工程化大范围核酸酶由SEQ ID NO:41中所示的核酸序列编码。
MIT 25-26x.91 46H>W(SEQ ID NO:12)
在一些实施方式中，HVR1区包含与对应于SEQ ID NO:12的残基24-79的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，HVR1区包含对应于SEQ ID NO:12的残基24、26、28、30、32、33、38、40、42、44、46、68、70、75和77的一个或多个残基。在一些实施方式中，HVR1区包含对应于SEQ ID NO:12的残基24、26、28、30、32、33、38、40、42、44、46、68、70、75和77的残基。在一些实施方式中，HVR1区在对应于SEQ ID NO:12的残基66的残基处包含Y、R、K或D。在一些实施方式中，HVR1区包含具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个氨基酸取代的SEQ ID NO:12的残基24-79。在一些实施方式中，HVR1区包含SEQ ID NO:12的残基24-79。
在一些实施方式中，第一亚基包含与SEQ ID NO:12的残基7-153具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，第一亚基在对应于SEQ ID NO:12的残基19的残基处包含G、S或A。在一些实施方式中，第一亚基包含对应于SEQ ID NO:12的残基19的残基。在一些实施方式中，第一亚基在对应于SEQ ID NO:12的残基80的残基处包含E、Q或K。在一些实施方式中，第一亚基包含对应于SEQ ID NO:12的残基80的残基。在一些实施方式中，第一亚基包含具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸取代的SEQ ID NO:12的残基7-153。在一些实施方式中，第一亚基包含SEQ ID NO:12的残基7-153。
在一些实施方式中，HVR2区包含与对应于SEQ ID NO:12的残基215-270的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，HVR2区包含对应于SEQ ID NO:12的残基215、217、219、221、223、224、229、231、233、235、237、259、261、266和268的一个或多个残基。在一些实施方式中，HVR2区包含对应于SEQ ID NO:12的残基215、217、219、221、223、224、229、231、233、235、237、259、261、266和268的残基。在一些实施方式中，HVR2区在对应于SEQID NO:12的残基257的残基处包含Y、R、K或D。在一些实施方式中，HVR2区包含对应于SEQ IDNO:12的残基241的残基。在一些实施方式中，HVR2区包含对应于SEQ ID NO:12的残基263的残基。在一些实施方式中，HVR2区包含对应于SEQ ID NO:12的残基264的残基。在一些实施方式中，HVR2区包含具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个氨基酸取代的SEQ ID NO:12的残基215-270。在一些实施方式中，HVR2区包含SEQ ID NO:12的残基215-270。
在一些实施方式中，第二亚基包含与SEQ ID NO:12的残基198-344具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，第二亚基在对应于SEQ ID NO:12的残基210的残基处包含G、S或A。在一些实施方式中，第二亚基在对应于SEQ ID NO:12的残基271的残基处包含E、Q或K。在一些实施方式中，第二亚基包含对应于SEQ ID NO:12的残基330的残基。在一些实施方式中，第二亚基包含具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸取代的SEQ ID NO:12的残基198-344。在一些实施方式中，第二亚基包含SEQ ID NO:12的残基198-344。
在一些实施方式中，工程化大范围核酸酶是包含接头的单链大范围核酸酶，其中接头共价连接所述第一亚基和所述第二亚基。在一些实施方式中，工程化大范围核酸酶包含与SEQ ID NO:12具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，工程化大范围核酸酶包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列。在一些实施方式中，工程化大范围核酸酶由与SEQ ID NO:42中所示的核酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的核酸序列编码。在一些实施方式中，工程化大范围核酸酶由SEQ ID NO:42中所示的核酸序列编码。用于将工程化大范围核酸酶定向至线粒体中的MTP的长度可以是10-100个氨基酸。在特定实施方式中，MTP是约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30、约35、约40、约45、约50、约55、约60、约65、约70、约75、约80、约85、约90、约95、约100或更多个氨基酸的长度。MTP可以包含其他信号，其随后将蛋白靶向线粒体的不同区域，如线粒体基质。用于本文公开的组合物和方法的MTP的非限制性实例包括粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)F0 ATP酶亚基9(SU9)MTP、人细胞色素c氧化酶亚基VIII(CoxVIII或Cox8)MTP、人ATP合酶MTP的亚基c的P1亚型、乙醛脱氢酶靶向的序列MTP、谷氧还蛋白5MTP、丙酮酸脱氢酶MTP、肽基脯氨酰异构酶MTP、乙酰基转移酶MTP和异柠檬酸脱氢酶MTP、细胞色素氧化酶MTP和ATP合酶的FA部分的亚基MTP、CPN60/无GG接头MTP、超氧化物歧化酶(SOD)MTP、超氧化物歧化酶双倍的(2SOD)MTP、超氧化物歧化酶修饰的(SODmod)MTP、超氧化物歧化酶修饰的(2SODmod)双倍的MTP、L29 MTP、gATP酶γ亚基(FAγ51)MTP、CoxIV twin strep(ABM77483)MTP和CoxIV 10xHis MTP。
在特定实施方式中，MTP包含至少两种MTP的组合。MTP的组合可以是相同MTP的组合或者不同MTP的组合。在特定实施方式中，MTP包含Cox VIII MTP(SEQ ID NO:43)和SU9MTP(SEQ ID NO:44)，将其形成由SEQ ID NO:45表示的单一MTP。
为了形成MTEM，MTP可以通过任何适宜的方式附接到本文所述的工程化大范围核酸酶上。在特定实施方式中，MTP可以附接到工程化大范围核酸酶的N末端。在其他实施方式中，MTP可以附接到工程化大范围核酸酶的C末端。在一些实施方式中，多个MTP可以附接到单一工程化大范围核酸酶以形成MTEM。例如，第一MTP可以附接到工程化大范围核酸酶的N末端和第二MTP可以附接到工程化大范围核酸酶的C末端。在一些实施方式中，第一和第二MTP是相同的，在其他实施方式中，第一和第二MTP是不同的。可以通过允许将工程化大范围核酸酶转运到细胞线粒体中的任何方式附接一个或多个MTP。在特定实施方式中，通过将MTP融合到工程化大范围核酸酶N末端或C末端附接MTP。还可以通过肽接头将MTP附接到工程化大范围核酸酶。例如，接头可以是约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、15或20个氨基酸。在特定实施方式中，在工程化大范围核酸酶的N或C末端将MTP附接至肽接头。
在一些实施方式中，将用于本公开内容的组合物和方法中的本文所述的MTEM或工程化大范围核酸酶附接至核输出序列(NES)，以帮助防止工程化大范围核酸酶切割核基因组。在一些此类实施方式中，NES包含与SEQ ID NO:46或47的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。例如，NES可以包含SEQ ID NO:46或47的氨基酸序列。在某些实施方式中，NES附接在工程化大范围核酸酶的N末端。在其他实施方式中，NES附接在工程化大范围核酸酶的C末端。在某些实施方式中，NES与工程化大范围核酸酶融合。在某些实施方式中，NES通过多肽接头附接至工程化大范围核酸酶。
在特定实施方式中，本文所述的MTEM或工程化大范围核酸酶附接至多个NES。例如，本文所述的工程化大范围核酸酶可以包含第一NES和第二NES。在一些此类实施方式中，第一NES附接在本文所述的MTEM或工程化大范围核酸酶的N末端，第二附接NES在本文所述的MTEM或工程化大范围核酸酶的C末端。在一些此类实施方式中，第一NES和/或第二NES包含与SEQ ID NO:46或47中所示的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。例如，第一NES和/或第二NES可以包含SEQ ID NO:46或47中所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，第一NES和第二NES是相同的。在其他实施方式中，第一NES和第二NES是不同的。NES可以通过本领域已知的任何适宜方法附接至本文所述的MTEM或工程化大范围核酸酶。例如，第一NES和/或第二NES可以与本文所述的MTEM或工程化大范围核酸酶融合。在一些实施方式中，第一NES和/或第二NES通过多肽接头附接至本文所述的MTEM或工程化大范围核酸酶。
与没有NES的工程化大范围核酸酶相比，具有NES的本文所述的MTEM或工程化大范围核酸酶可以具有减少或降低的向靶细胞或靶细胞群(例如，真核细胞或真核细胞群)细胞核的转运。例如，具有NES的本文所述的MTEM或工程化大范围核酸酶的细胞核转运可以比没有NES的本文所述的MTEM或工程化大范围核酸酶少约5-10％、10-20％、20-30％、30-40％、40-50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-90％、90-100％或更多(例如，约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或更多)。在一些实施方式中，与没有NES的本文所述的MTEM或工程化大范围核酸酶相比，具有NES的工程化大范围核酸酶可诱导更少的核indel(即，在靶细胞或靶细胞群的核基因组中更少的切割和导致的缺失)。例如，具有NES的本文所述的MTEM或工程化大范围核酸酶诱导的核indel比没有NES的本文所述的MTEM或工程化大范围核酸酶诱导的低约5-10％、10-20％、20-30％、30-40％、40-50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-90％、90-100％或更多。
2.3药物组合物
在一些实施方式中，本发明提供了一种药物组合物，其包含药学上可接受的载体和本文所述的MTEM或工程化大范围核酸酶，或者药学上可接受的载体和包含编码本文所述的MTEM或工程化大范围核酸酶的核酸序列的分离的多核苷酸。特别是，提供了药物组合物，其包含药学上可接受的载体和治疗有效量的编码本文所述的MTEM或工程化大范围核酸酶的核酸或本文所述的MTEM或工程化大范围核酸酶，其中MTEM的工程化大范围核酸酶或本文所述的工程化大范围核酸酶针对mtDNA内的识别序列具有特异性，如人mtDNA(例如，SEQ IDNO:1的MIT 25-26识别序列)。
在其他实施方式中，本发明提供了一种药物组合物，其包含药学上可接受的载体和本文所述的遗传修饰的细胞。
此类药物组合物可以根据已知技术制备。参见，例如，Remington,The ScienceAnd Practice of Pharmacy(第21版，Philadelphia,Lippincott,Williams&Wilkins,2005)。在根据本发明的药物制剂的制备中，核酸酶多肽(或编码其的DNA/RNA或表达其的细胞)通常与药学上可接受的载体混合，并且将得到的组合物向受试者施用。在与制剂中的任何其他成分相容的意义上，载体必需是可接受的，并且不得对受试者有害。在一些实施方式中，本文所述的药物组合物还可以包含一种或多种可用于治疗受试者疾病的另外的药剂或生物分子。同样地，另外的药剂和/或生物分子可以作为单独的组合物共同施用。
在本文所述的特定实施方式中，药物组合物包含重组病毒(即，病毒载体)，其包含含有编码本文所述的MTEM或工程化大范围核酸酶的核酸序列的多核苷酸(例如，病毒基因组)。此类重组病毒是本领域已知的，并且包括重组逆转录病毒、重组慢病毒、重组腺病毒和重组腺相关病毒(AAV)(在Vannucci等，(2013New Microbiol.36:1-22)中综述)。可用于本发明的重组AAV可以具有任何衣壳或血清型，其允许将病毒转导到靶细胞类型中并通过靶细胞表达本文所述的MTEM或工程化大范围核酸酶。例如，在一些实施方式中，重组AAV具有血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11或AAVHSC。在一些实施方式中，将重组病毒直接注射到靶组织中。在替代性实施方式中，重组病毒通过循环系统全身递送。本领域已知，不同的AAV倾向于定位到不同的组织，并且可以选择适当的AAV衣壳/血清型以优先递送到特定组织。因此，在一些实施方式中，AAV血清型是AAV9。AAV也可以是自互补的，使得其不需要在宿主细胞中合成第二链DNA(McCarty等，(2001)Gene Ther.8:1248-54)。通过重组AAV递送的核酸可以包括左(5’)和右(3’)反向末端重复序列。
在本文所述的特定实施方式中，药物组合物包含配制在脂质纳米颗粒内的本文所述的一种或多种mRNA(例如，编码本文所述的MTEM或工程化核酸酶的mRNA)。
包含脂质纳米颗粒的阳离子脂质、非阳离子脂质和/或脂质缀合物以及此类脂质彼此之间的相对摩尔比的选择基于所选脂质的特性，预期靶细胞的性质和待递送的mRNA的特性。其他考虑因素包括，例如，烷基链的饱和度，以及所选脂质的尺寸、电荷、pH、pKa、融合性和毒性。因此，可以相应地调节每种单独组分的摩尔比。
用于本文所述方法的脂质纳米颗粒可通过本领域目前已知的各种技术制备。核酸-脂质颗粒及其制备方法公开于例如美国专利公开号20040142025和20070042031中，其公开内容出于所有目的通过引用整体并入本文。
脂质纳米颗粒的适当尺寸的选择必须考虑靶细胞的位点和制造脂质纳米颗粒的应用。通常，脂质纳米颗粒将具有在约25至约500nm的范围内的尺寸。在一些实施方式中，脂质纳米颗粒具有约50nm至约300nm或约60nm至约120nm的尺寸。脂质纳米颗粒的尺寸可以通过准电光散射(QELS)确定，如在Bloomfield,Ann.Rev.Biophys.Bioeng.,10:421^150(1981)中所描述的，其通过引用并入本文。本领域已知多种用于产生特定尺寸范围的脂质纳米颗粒群体的方法，例如，超声处理或均质化。一种此类方法描述在美国专利号4,737,323中，其通过引用并入本文。
预期用于本发明的一些脂质纳米颗粒包含至少一种阳离子脂质、至少一种非阳离子脂质和至少一种缀合脂质。在更具体的实例中，脂质纳米颗粒可包含约50mol％至约85mol％的阳离子脂质、约13mol％至约49.5mol％的非阳离子脂质和约0.5mol％至约10mol％的脂质缀合物，并且以具有非层状(即，非双层)形态的方式产生。在其他具体实例中，脂质纳米颗粒可包含约40mol％至约85mol％的阳离子脂质、约13mol％至约49.5mol％的非阳离子脂质和约0.5mol％至约10mol％的脂质缀合物，并且以具有非层状(即，非双层)形态的方式产生。
阳离子脂质可以包括，例如，以下的一种或多种：棕榈酰基-油酰基-去甲精氨酸(PONA)、MPDACA、GUADACA、((6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七-6,9,28,31-四烯-19-基4-(二甲基氨基)丁酸酯)(MC3)、LenMC3、CP-LenMC3、γ-LenMC3、CP-γ-LenMC3、MC3MC、MC2MC、MC3醚、MC4醚、MC3酰胺、Pan-MC3、Pan-MC4和Pan MC5、1,2-二亚油酰氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)、1,2-二亚油烯基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLenDMA)、2,2-二亚油基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1,3]-二氧戊环(DLin-K-C2-DMA；“XTC2”)、2,2-二亚油基-4-(3-二甲基氨基丙基)-[1,3]-二氧戊环(DLin-K-C3-DMA)、2,2-二亚油基-4-(4-二甲基氨基丁基)-[1,3]-二氧戊环(DLin-K-C4-DMA)、2,2-二亚油基-5-二甲基氨基甲基-[1,3]-二恶烷(DLin-K6-DMA)、2,2-二亚油基-4-N-甲基哌嗪并-[1,3]-二氧戊环(DLin-K-MPZ)、2,2-二亚油基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]-二氧戊环(DLin-K-DMA)、1,2-二亚油基氨基甲酰氧基-3-二甲基氨基丙烷(DLin-C-DAP)、1,2-二亚油酰氧基-3-(二甲基氨基)乙酰氧基丙烷(DLin-DAC)、1,2-二亚油酰氧基-3-吗啉代丙烷(DLin-MA)、1,2-二亚油酰基-3-二甲基氨基丙烷(DLinDAP)、1,2-二亚油烯基硫代-3-二甲基氨基丙烷(DLin-S-DMA)、1-亚油酰基-2-亚油酰氧基-3-二甲基氨基丙烷(DLin-2-DMAP)、1,2-二亚油酰氧基-3-三甲基氨基丙烷盐酸盐(DLin-TMA.Cl)、1,2-二亚油酰基-3-三甲基氨基丙烷盐酸盐(DLin-TAP.Cl)、1,2-二亚油酰氧基-3-(N-甲基哌嗪基)丙烷(DLin-MPZ)、3-(N,N-二亚油基氨基)-1,2-丙二醇(DLinAP)、3-(N,N-二油烯基氨基)-1,2-丙二醇(DOAP)、1,2-二亚油基氧代-3-(2-N,N-二甲基氨基)乙氧基丙烷(DLin-EG-DMA)、N,N-二油基-N,N-二甲基氯化铵(DODAC)、1,2-二油烯基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DODMA)、1,2-二硬脂基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DSDMA)、N-(1-(2,3-二油烯基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)、N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化铵(DDAB)、N-(1-(2,3-二油酰氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTAP)、3-(N-(N’,N’-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基)胆固醇(DC-Chol)、N-(1,2-二肉豆蔻酰氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羟乙基溴化铵(DMRIE)、2,3-二油烯基氧基-N-[2(精胺-甲酰胺基)乙基]-N,N-二甲基-1-丙胺三氟乙酸盐(DOSPA)、二-十八烷基酰胺基甘氨酰基精胺(DOGS)、3-二甲氨基-2-(胆甾-5-烯-3-β-氧基丁-4-氧基)-1-(顺,顺-9,12)-十八碳二烯氧基)丙烷(CLinDMA)、2-[5’-(胆甾-5-烯-3-β-氧基)-3’-氧杂戊氧基]-3-二甲基-1-(顺,顺-9’,1-2’-十八碳二烯氧基)丙烷(CpLinDMA)、N,N-二甲基-3,4-二油酰氧基苄胺(DMOBA)、1,2-N,N’-二油烯基氨基甲酰基-3-二甲基氨基丙烷(DOcarbDAP)、1,2-N,N’-二亚油基氨基甲酰基-3-二甲基氨基丙烷(DLincarbDAP)或其混合物。阳离子脂质也可以是DLinDMA、DLin-K-C2-DMA(“XTC2”)、MC3、LenMC3、CP-LenMC3、γ-LenMC3，CP-γ-LenMC3、MC3MC、MC2MC、MC3醚、MC4醚、MC3酰胺、Pan-MC3、Pan-MC4、PanMC5或其混合物。
在各种实施方式中，阳离子脂质构成颗粒中存在的总脂质的约50mol％至约90mol％、约50mol％至约85mol％、约50mol％至约80mol％、约50mol％至约75mol％、约50mol％至约70mol％、约50mol％至约65mol％或约50mol％至约60mol％。
在其他实施方式中，阳离子脂质构成颗粒中存在的总脂质的约40mol％至约90mol％、约40mol％至约85mol％、约40mol％至约80mol％、约40mol％至约75mol％、约40mol％至约70mol％、约40mol％至约65mol％或约40mol％至约60mol％。
非阳离子脂质可以包含例如一种或多种阴离子脂质和/或中性脂质。在特定实施方式中，非阳离子脂质包含以下中性脂质组分之一：(1)胆固醇或其衍生物；(2)磷脂；或(3)磷脂和胆固醇或其衍生物的混合物。胆固醇衍生物的实例包括，但不限于，胆甾烷醇、胆甾烷酮、胆甾烯酮、粪固醇、胆固醇基-2’-羟乙基醚、胆固醇基-4’-羟基丁基醚及其混合物。磷脂可以是中性脂质，包括但不限于，二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰油酰基-磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰油酰基-磷脂酰乙醇胺(POPE)、棕榈酰油酰基-磷脂酰甘油(POPG)、二棕榈酰基-磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰基-磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰基-磷脂酰乙醇胺(DSPE)、单甲基-磷脂酰乙醇胺、二甲基-磷脂酰乙醇胺、二反油酰基-磷脂酰乙醇胺(DEPE)、硬脂酰油酰基-磷脂酰乙醇胺(SOPE)、卵磷脂酰胆碱(EPC)及其混合物。在某些优选的实施方式中，磷脂是DPPC、DSPC或其混合物。
在一些实施方式中，非阳离子脂质(例如，一种或多种磷脂和/或胆固醇)构成颗粒中存在的总脂质的约10mol％至约60mol％、约15mol％至约60mol％、约20mol％至约60mol％、约25mol％至约60mol％、约30mol％至约60mol％、约10mol％至约55mol％、约15mol％至约55mol％、约20mol％至约55mol％、约25mol％至约55mol％、约30mol％至约55mol％、约13mol％至约50mol％、约15mol％至约50mol％或约20mol％至约50mol％。当非阳离子脂质是磷脂和胆固醇或胆固醇衍生物的混合物时，混合物可以构成颗粒中存在的总脂质的高达约40、50或60mol％。
抑制颗粒聚集的缀合脂质可以包括例如以下的一种或多种：聚乙二醇(PEG)-脂质缀合物、聚酰胺(ATTA)-脂质缀合物、阳离子聚合物-脂质缀合物(CPL)或其混合物。在某些实施方式中，核酸-脂质颗粒包含PEG-脂质缀合物或ATTA-脂质缀合物。在某些实施方式中，PEG-脂质缀合物或ATTA-脂质缀合物与CPL一起使用。抑制颗粒聚集的缀合脂质可以包含PEG-脂质，包括例如，PEG-二酰基甘油(DAG)、PEG二烷氧基丙基(DAA)、PEG-磷脂、PEG-神经酰胺(Cer)或其混合物。PEG-DAA缀合物可以是PEG-二月桂酰氧基丙基(C12)、PEG-二肉豆蔻酰氧基丙基(C14)、PEG-二棕榈酰氧基丙基(C16)、PEG-二硬脂酰氧基丙基(C18)或其混合物。
适用于本发明的另外的PEG-脂质缀合物包括，但不限于，mPEG2000-1,2-二-O-烷基-sn3-氨基甲酰基甘油酯(PEG-C-DOMG)。PCT申请号PCT/US08/88676中描述了PEG-C-DOMG的合成。适用于本发明的其他的PEG-脂质缀合物包括，但不限于1-[8’-(1,2-二肉豆蔻酰基-3-丙氧基)-甲酰胺基-3’,6’-二氧杂辛烷基]氨基甲酰基-ω-甲基-聚(乙二醇)(2KPEG-DMG)。2KPEG-DMG的合成描述于美国专利号7,404,969中。
在一些情况中，抑制颗粒聚集的缀合脂质(例如，PEG-脂质缀合物)可以构成颗粒中存在的总脂质的约0.1mol％至约2mol％，约0.5mol％至约2mol％，约1mol％至约2mol％，约0.6mol％至约1.9mol％，约0.7mol％至约1.8mol％，约0.8mol％至约1.7mol％，约1mol％至约1.8mol％，约1.2mol％至约1.8mol％，约1.2mol％至约1.7mol％，约1.3mol％至约1.6mol％，约1.4mol％至约1.5mol％，或约1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2mol％(或其任何分数或其中的范围)。通常，在这样的情况中，PEG部分具有约2,000道尔顿的平均分子量。在其他情况中，抑制颗粒聚集的缀合脂质(例如，PEG-脂质缀合物)可以构成颗粒中存在的总脂质的约5.0mol％至约10mol％，约5mol％至约9mol％，约5mol％至约8mol％，约6mol％至约9mol％，约6mol％至约8mol％，或约5mol％、6mol％、7mol％、8mol％、9mol％或10mol％(或其任何分数或其中的范围)。通常，在这样的情况中，PEG部分具有约750道尔顿的平均分子量。
在其他实施方式中，组合物包含两性脂质体，其包含至少一种正电荷载体和至少一种不同于所述正电荷载体的负电荷载体，所述脂质体的等电点为4-8。该目的是由于以下事实实现的：脂质体是用pH依赖性、变化的电荷制备的。
例如，当成膜或基于膜的阳离子电荷载体的量在低pH下超过阴离子电荷载体的量并且该比率在较高pH下反转时，形成具有所需性质的脂质体结构。当可电离组分具有在4和9之间的pKa值时总是如此。当介质的pH下降时，所有阳离子电荷载体带电更多并且所有阴离子电荷载体失去它们的电荷。
可用于两性脂质体的阳离子化合物包括上文先前所述的那些阳离子化合物。非限制性地，强阳离子化合物可以包括例如：DC-Chol3-β-[N-(N′,N′-二甲基甲烷)氨甲酰基]胆固醇、TC-Chol3-β-[N-(N′,N′,N′-三甲基氨基乙基)氨甲酰基胆固醇、BGSC二胍-亚精胺-胆固醇、BGTC二胍-tren-胆固醇、DOTAP(1,2-二油酰氧基丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵、DOSPER(1,3-二油酰氧基-2-(6-羧基-精胺基)-丙酰胺、DOTMA(1,2-二油酰氧基丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵)DORIE溴化(1,2-二油酰氧基丙基)-3-二甲羟乙铵、DOSC(1,2-二油酰基-3-琥珀酰-sn-甘油胆碱酯)、DOGSDSO(1,2-二油酰基-sn-甘油-3-琥珀酰-2-羟乙基二硫化鸟氨酸)、DDAB溴化二甲基二-十八铵、DOGS((C18)2GlySper3+)N,N-二-十八氨基-乙二醇-精胺/>(C18)2Gly+N,N-二-十八氨基甘氨酸、CTAB溴化鲸蜡基三甲铵、CpyC氯化鲸蜡基吡啶盐、DOEPC 1,2-二油酰基-顺-甘油-3-乙基磷酸胆碱或其他O-烷基-磷脂酰胆碱或乙醇胺，赖氨酰胺、精氨酰胺或鸟氨酰胺和磷脂酰乙醇胺。
弱阳离子化合物的实例包括但不限于：His-Chol(组胺酰-胆固醇半琥珀酸酯)、Mo-Chol(吗啉-N-乙氨基-胆固醇半琥珀酸酯)或组胺酰-PE。
中性化合物的实例包括但不限于：胆固醇、神经酰胺、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、四醚脂质或二酰基甘油。
可用于两性脂质体的阴离子化合物包括本文前面所述的那些非阳离子化合物。非限制性地，弱阴离子化合物的实例可以包括：CHEMS(胆固醇半琥珀酸酯)，具有8至25个碳原子的烷基羧酸，或二酰基甘油半琥珀酸酯。其他弱阴离子化合物可包括天冬氨酸或谷氨酸和PE的酰胺以及PS及其与甘氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、丝氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、酪氨酸、谷氨酸、天冬氨酸或其他氨基酸或氨基二羧酸的酰胺。根据相同的原理，羟基羧酸或羟基二羧酸和PS的酯也是弱阴离子化合物。
在一些实施方式中，两性脂质体包含缀合的脂质，例如上文所述的那些。有用的缀合脂质的具体实例包括但不限于PEG修饰的磷脂乙醇胺和磷脂酸，PEG-神经酰胺缀合物(例如，PEG-CerC14或PEG-CerC20)，PEG修饰的二烷基胺和PEG修饰的1,2-二酰氧基丙烷-3-胺。一些具体实例是PEG修饰的二酰基甘油和二烷基甘油。
在一些实施方式中，中性脂质构成颗粒中存在的总脂质的约10mol％至约60mol％、约15mol％至约60mol％、约20mol％至约60mol％、约25mol％至约60mol％、约30mol％至约60mol％、约10mol％至约55mol％、约15mol％至约55mol％、约20mol％至约55mol％、约25mol％至约55mol％、约30mol％至约55mol％、约13mol％至约50mol％、约15mol％至约50mol％或约20mol％至约50mol％。
在一些情况下，抑制颗粒聚集的缀合脂质(例如，PEG-脂质缀合物)构成颗粒中存在的总脂质的约0.1mol％至约2mol％、约0.5mol％至约2mol％、约1mol％至约2mol％、约0.6mol％至约1.9mol％、约0.7mol％至约1.8mol％、约0.8mol％至约1.7mol％、约1mol％至约1.8mol％、约1.2mol％至约1.8mol％、约1.2mol％至约1.7mol％、约1.3mol％至约1.6mol％、约1.4mol％至约1.5mol％，或约1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2mol％(或其任何分数或其中的范围)。通常，在这种情况下，PEG部分具有约2,000道尔顿的平均分子量。在其他情况下，抑制颗粒聚集的缀合脂质(例如，PEG-脂质缀合物)可构成颗粒中存在的总脂质的约5.0mol％至约10mol％、约5mol％至约9mol％、约5mol％至约8mol％、约6mol％至约9mol％、约6mol％至约8mol％，或约5mol％、6mol％、7mol％、8mol％、9mol％或10mol％(或其任何分数或其中的范围)。通常，在这种情况下，PEG部分具有约750道尔顿的平均分子量。
考虑到中性和缀合脂质的总量，两性脂质体的剩余平衡可以包含以各种比率配制的阳离子化合物和阴离子化合物的混合物。可选择阳离子与阴离子脂质的比率以实现所需的核酸包封性质、ζ电位、pKa或至少部分取决于带电脂质组分的存在的其他物理化学性质。
在一些实施方式中，脂质纳米颗粒具有特异性增强真核细胞(如哺乳动物细胞(例如，人细胞))中的递送和摄取的组合物。在某些实施方式中，脂质纳米颗粒具有特异性增强肝脏中或特异性地肝细胞内的递送和摄取的组合物。在某些实施方式中，脂质纳米颗粒具有特异性增强神经细胞中的递送和摄取的组合物。
2.4用于产生重组病毒的方法
在一些实施方式中，本发明提供了用于本文所述的方法中的重组病毒(例如，重组AAV)。重组AAV通常在哺乳动物细胞系如HEK-293中产生。因为病毒帽和rep基因从载体中被除去以防止其自身复制从而为待递送的治疗性基因(例如，核酸酶基因)腾出空间，所以有必要在包装细胞系中以反式提供这些。此外，有必要提供支持复制所必需的“辅助”(例如，腺病毒)组分(Cots等，(2013),Curr.Gene Ther.13(5):370-81)。通常，使用三重转染产生重组AAV载体，其中细胞系用编码“辅助”组分的第一质粒、包含帽和rep基因的第二质粒和包含含有待包装至病毒中的插入DNA序列的病毒ITR的第三质粒转染。然后通过冻-融循环、超声处理、去污剂或本领域已知的其他方法从细胞中分离包含包裹在衣壳中的基因组(ITR和目的插入基因)的病毒颗粒。然后使用氯化铯密度梯度离心或亲和色谱法纯化颗粒，并随后将其递送至细胞、组织或生物体(例如，人类患者)的目的基因。
因为重组AAV颗粒通常在细胞中产生(制造)，所以在实施本发明时必须采取预防措施以确保本文所述的MTEM或工程化大范围核酸酶不在包装细胞中表达。因为本文所述的病毒基因组可包含核酸酶的识别序列，所以在包装细胞系中表达的任何核酸酶在其可被包装到病毒颗粒中之前可能能够切割病毒基因组。这将导致降低的包装效率和/或片段化基因组的包装。可以使用几种方法来防止核酸酶在包装细胞中表达。
可以将本文所述的MTEM或工程化大范围核酸酶置于适于本文所述的MTEM或工程化大范围核酸酶表达的任何启动子的控制下。在一些实施方式中，启动子是组成型启动子，或者启动子是组织特异性启动子，比如，例如，干细胞特异性启动子、CD34+HSC-特异性启动子、肌肉特异性启动子、骨骼肌特异性启动子、肌管特异性启动子、肌肉卫星细胞特异性启动子、神经元特异性启动子、星形胶质细胞特异性启动子、小胶质细胞特异性启动子、眼细胞特异性启动子、视网膜细胞特异性启动子、视网膜神经节细胞特异性启动子、视网膜色素上皮特异性启动子、胰腺细胞特异性启动子、胰腺β细胞特异性启动子、肾细胞特异性启动子、骨髓细胞特异性启动子或耳毛细胞特异性启动子。在一些实施方式中，泛在启动子是CMV启动子、CAG启动子、EF1α启动子或UbC启动子。
在特定实施方式中，可以将本文所述的MTEM或工程化大范围核酸酶置于在包装细胞中无活性的组织特异性启动子的控制下。例如，如果病毒载体开发用于将核酸酶基因递送至肌肉组织，则可以使用肌肉特异性启动子。肌肉特异性启动子的实例包括C5-12(Liu等，(2004)Hum Gene Ther.15:783-92)、肌肉特异性肌酸激酶(MCK)启动子(Yuasa等，(2002)Gene Ther.9:1576-88)或平滑肌22(SM22)启动子(Haase等，(2013)BMCBiotechnol.13:49-54)。CNS(神经元)特异性启动子的实例包括NSE、突触蛋白和MeCP2启动子(Lentz等，(2012)Neurobiol Dis.48:179-88)。肝特异性启动子的实例包括白蛋白启动子(如Palb)、人α1-抗胰蛋白酶(如Pa1AT)和血红素结合蛋白(如Phpx)(Kramer等，(2003)Mol.Therapy 7:375-85)、杂合肝特异性启动子(来自ApoE基因的肝基因座控制区(ApoE-HCR)和肝特异性α1抗胰蛋白酶启动子)、人甲状腺素结合球蛋白(TBG)启动子和载脂蛋白A-II启动子。眼特异性启动子的实例包括视蛋白和角膜上皮特异性K12启动子(Martin等，(2002)Methods(28):267-75)(Tong等，(2007)J Gene Med,9:956-66)。这些启动子或本领域已知的其他组织特异性启动子在HEK-293细胞中不具有高活性，因此在整合至本发明的病毒载体中时，不会预期在包装细胞中产生显著水平的核酸酶基因表达。类似地，本发明的病毒载体考虑使用其他细胞系并使用不相容的组织特异性启动子(即，公知的HeLa细胞系(人上皮细胞)和使用肝特异性血红素结合蛋白启动子)。组织特异性启动子的其他实例包括：滑膜肉瘤PDZD4(小脑)、C6(肝)、ASB5(肌肉)、PPP1R12B(心脏)、SLC5A12(肾)、胆固醇调节APOM(肝脏)、ADPRHL1(心脏)和单基因畸形综合征TP73L(肌肉)。(Jacox等，(2010),PLoSOne v.5(8):e12274)。
或者，重组病毒可以包装在来自不同物种的在其中不可能表达核酸酶的细胞中。例如，可以使用哺乳动物启动子在微生物、昆虫或植物细胞中产生病毒颗粒，如众所周知的巨细胞病毒或SV40病毒早期启动子，其在非哺乳动物包装细胞中没有活性。在特定实施方式中，使用杆状病毒系统在昆虫细胞中产生病毒颗粒，如Gao等所描述的(Gao等，(2007),J.Biotechnol.131(2):138-43)。在哺乳动物启动子控制下的核酸酶不太可能在这些细胞中表达(Airenne等，(2013),Mol.Ther.21(4):739-49)。此外，昆虫细胞利用不同于哺乳动物细胞的mRNA剪接基序。因此，有可能将哺乳动物内含子(如人生长激素(HGH)内含子或SV40大T抗原内含子)整合至核酸酶的编码序列中。因为这些内含子在昆虫细胞中不能有效地从前mRNA转录产物剪接，所以昆虫细胞将不表达功能性核酸酶，并且将包装全长基因组。相反，所得重组AAV颗粒被递送到的哺乳动物细胞将正确地剪接前mRNA并表达功能性核酸酶蛋白。Haifeng Chen已报道了使用HGH和SV40大T抗原内含子来减弱昆虫包装细胞中毒性蛋白芽孢杆菌RNA酶(barnase)和白喉毒素片段A的表达，从而使得能够产生携带这些毒素基因的重组AAV载体(Chen,H(2012)Mol Ther Nucleic Acids.1(11):e57)。
本文所述的MTEM或工程化大范围核酸酶基因可以与诱导型启动子可操作地连接，使得核酸酶的表达需要小分子诱导物。诱导型启动子的实例包括Tet-On系统(Clontech；Chen等，(2015),BMC Biotechnol.15(1):4)和RheoSwitch系统(Intrexon；Sowa等，(2011),Spine,36(10):E623-8)。两种系统以及本领域中已知的类似系统依赖于配体诱导的转录因子(分别为Tet阻遏物和蜕皮激素受体的变体)，其响应于小分子激活剂(分别为强力霉素或蜕皮激素)而激活转录。使用这种配体诱导的转录激活剂实施本发明包括：1)将核酸酶基因置于响应相应转录因子的启动子的控制下，该核酸酶基因具有转录因子的结合位点；和2)在包装的病毒基因组中包括编码转录因子的基因。后一步骤是必要的，因为如果转录激活剂也未提供给相同的细胞，则在重组AAV递送后核酸酶将不会在靶细胞或组织中表达。然后转录激活剂仅在用同源小分子激活剂处理的细胞或组织中诱导核酸酶基因表达。该方法是有利的，因为它使得核酸酶基因表达能够通过选择何时和对何种组织递送小分子诱导剂而以时空方式进行调节。然而，要求将诱导物包括在病毒基因组中(这显著地限制承载能力)形成了该方法的缺点。
在另一个特定实施方式中，重组AAV颗粒在表达防止核酸酶表达的转录阻遏物的哺乳动物细胞系中产生。转录阻遏物是本领域已知的，并且包括Tet-阻遏物、Lac-阻遏物、Cro阻遏物和Lambda阻遏物。许多核激素受体(如蜕皮激素受体)在缺乏其同源激素配体的情况下也充当转录阻遏物。为了实施本发明，用编码转录阻遏物的载体转染/转导包装细胞，并将病毒基因组(包装载体)中的核酸酶基因与经修饰以包含阻遏物的结合位点的启动子可操作地连接，使得阻遏物使启动子沉默。编码转录阻遏物的基因可以置于多个位置。它可以在单独的载体上编码；它可以在ITR序列外被整合至包装载体中；它可以被整合至帽/rep载体或腺病毒辅助载体中；或者它可以稳定地整合到包装细胞的基因组中使其组成型地表达。修饰常见哺乳动物启动子以整合转录阻遏物位点的方法是本领域已知的。例如，Chang和Roninson修饰强组成型CMV和RSV启动子以包含Lac阻遏物的操纵子，并且表明修饰启动子的基因表达在表达阻遏物的细胞中大大减弱(Chang和Roninson(1996),Gene 183:137-42)。非人转录阻遏物的使用确保核酸酶基因的转录仅在表达阻遏物的包装细胞中被阻遏，而在用所得重组AAV载体转导的靶细胞或组织中不被阻遏。
2.5用于产生遗传修饰的细胞的方法
本发明提供了用于在体外和体内产生遗传修饰的细胞的方法，其使用结合并切割mtDNA(如人mtDNA)内发现的识别序列的本文所述的MTEM或工程化大范围核酸酶。在这样的识别序列上的切割可以允许在切割位点处的NHEJ、通过同源重组插入外源序列或mtDNA的降解。
本发明包括可以将本文所述的MTEM或工程化大范围核酸酶，或者编码本文所述的MTEM或工程化大范围核酸酶的核酸递送(即，引入)至细胞，如真核细胞(例如，人细胞)。
可以以蛋白或优选地作为编码本文所述的MTEM或工程化大范围核酸酶的核酸的形式将本文所述的MTEM或工程化大范围核酸酶递送至细胞。此类核酸可以是DNA(例如，环状或线性质粒DNA或PCR产物)或RNA(例如，mRNA)。因此，本文提供的多核苷酸包含编码本文所述的MTEM或工程化大范围核酸酶的核酸序列。在特定实施方式中，多核苷酸是mRNA。编码本文所述的MTEM或工程化大范围核酸酶的多核苷酸可以可操作地连接至启动子。在特定实施方式中，提供的表达盒包含可操作地连接至具有编码本文所述的MTEM或工程化大范围核酸酶的核酸序列的多核苷酸的启动子。
对于其中MTEM或工程化大范围核酸酶编码序列以DNA形式递送的实施方式，其应与启动子可操作地连接以促进MTEM或工程化大范围核酸酶编码序列的转录。适用于本发明的哺乳动物启动子包括组成型启动子，如巨细胞病毒早期(CMV)启动子(Thomsen等，(1984),Proc Natl Acad Sci USA.81(3):659-63)、SV40早期启动子(Benoist和Chambon(1981),Nature.290(5804):304-10)、CAG启动子、EF1α启动子或UbC启动子，以及诱导型启动子，如四环素诱导型启动子(Dingermann等，(1992),Mol Cell Biol.12(9):4038-45)。本文所述的MTEM或工程化大范围核酸酶还可以可操作地连接至合成的启动子。合成的启动子可以包括但不限于JeT启动子(WO 2002/012514)。在特定实施方式中，编码本文所述的MTEM或工程化大范围核酸酶的核酸序列可操作地连接至组织特异性启动子，如肌细胞特异性启动子、骨骼肌特异性启动子、肌管特异性启动子、肌肉卫星细胞特异性启动子、神经元特异性启动子、星形胶质细胞特异性启动子、小胶质细胞特异性启动子、眼细胞特异性启动子、视网膜细胞特异性启动子、视网膜神经节细胞特异性启动子、视网膜色素上皮特异性启动子、胰腺细胞特异性启动子或胰腺β细胞特异性启动子。
在特定实施方式中，编码MTEM或工程化大范围核酸酶的核酸序列在重组DNA构建体或表达盒上递送。例如，重组DNA构建体可以包含表达盒(即，“盒”)，其包含启动子和具有编码本文所述的MTEM或工程化大范围核酸酶的核酸序列的多核苷酸。本文提供的多核苷酸可以是mRNA或DNA。在特定实施方式中，多核苷酸还包含编码选择性标志物的序列。选择性标志物可以是允许选择包含本文所述的多核苷酸的细胞或生物体(例如，细菌、真核细胞、哺乳动物细胞、植物细胞、植物和/或植物部分)的任何标志物。在特定实施方式中，选择性标志物是抗生素抗性基因。
在一些实施方式中，将编码MTEM的mRNA递送至细胞，因为这降低了编码本文所述的MTEM或工程化大范围核酸酶的基因将整合到细胞基因组中的可能性。
可以使用本领域已知的方法(如体外转录)产生编码MTEM的此类mRNA。在一些实施方式中，mRNA用7-甲基-鸟苷、抗反向帽类似物(ARCA)(US7,074,596)、类似物例如Cap 1类似物(Trilink,San Diego,CA)进行5’加帽，或用牛痘加帽酶或类似物酶促加帽。在一些实施方式中，mRNA可以是多聚腺苷酸化的。mRNA可以包含各种5’和3’非翻译序列元件以增强编码的本文所述的MTEM或工程化大范围核酸酶的表达和/或mRNA自身的稳定性。这些元件可以包括，例如，翻译后调控元件，如土拨鼠肝炎病毒翻译后调控元件。mRNA可以包含核苷类似物或天然存在的核苷，如假尿苷、5-甲基胞苷、N6-甲基腺苷、5-甲基尿苷或2-硫尿苷。其他核苷类似物包括例如US8,278,036中描述的那些。
本文所述的纯化MTEM或工程化大范围核酸酶可以被递送至细胞以通过本领域已知的各种不同机制切割线粒体DNA，包括本文中进一步详述的那些。
在另一个特定实施方式中，使用单链DNA模板将编码本文所述的MTEM或工程化大范围核酸酶的核酸引入细胞。单链DNA可进一步包含编码本文所述的MTEM或工程化大范围核酸酶的序列上游和/或下游的5’和/或3’AAV反向末端重复序列(ITR)。单链DNA可进一步包含编码本文所述的MTEM或工程化大范围核酸酶的序列上游和/或下游的5’和/或3’同源臂。
在另一个特定实施方式中，使用线性DNA片段将编码本文所述的MTEM或工程化大范围核酸酶的基因引入细胞。此类线性DNA模板可以由本领域已知的方法产生。例如，编码核酸酶的质粒DNA可以被一种或多种限制性酶消化，使得环状质粒DNA在引入细胞之前被线性化。
本文所述的纯化的MTEM或工程化大范围核酸酶，或者编码本文所述的MTEM或工程化大范围核酸酶的核酸可以被递送至细胞以通过本领域已知的各种不同机制切割线粒体DNA，包括本文中进一步详述的那些。
在一些实施方式中，根据已知技术，将本文所述的MTEM或工程化大范围核酸酶、编码本文所述MTEM或工程化大范围核酸酶的DNA/mRNA、或表达本文所述MTEM或工程化大范围核酸酶的细胞配制成用于在药学上可接受的载体中全身施用或施用至靶组织。参见，例如，Remington,The Science And Practice of Pharmacy(第21版，Philadelphia,Lippincott,Williams&Wilkins,2005)。在根据本发明的药物制剂的制备中，蛋白/RNA/mRNA/细胞通常与药学上可接受的载体混合。当然，载体必须在与制剂中的任何其他成分兼容的意义上是可接受的，并且不得对患者有害。载体可以是固体或液体，或者两者兼有，并且可以与化合物一起配制为单位剂量制剂。
在一些实施方式中，本文所述的MTEM或工程化大范围核酸酶，或者编码本文所述的MTEM或工程化大范围核酸酶的DNA/mRNA被偶联至细胞穿透肽或靶向配体以促进细胞摄取。本领域内已知的细胞穿透肽的实例包括聚精氨酸(Jearawiriyapaisarn等，(2008)MolTher.16:1624-9)、来自HIV病毒的TAT肽(Hudecz等，(2005),Med.Res.Rev.25:679-736)、MPG(Simeoni等，(2003)Nucleic Acids Res.31:2717–2724)、Pep-1(Deshayes等，(2004)Biochemistry 43:7698–7706)和HSV-1VP-22(Deshayes等，(2005)Cell Mol Life Sci.62:1839-49)。在一个替代性实施方式中，本文所述的MTEM或工程化大范围核酸酶，或者编码本文所述的MTEM或工程化大范围核酸酶的DNA/mRNA被共价或非共价偶联至识别靶细胞上表达的特异性细胞表面受体的抗体，使得MTEM蛋白/DNA/mRNA与靶细胞结合并被靶细胞内化。或者，MTEM蛋白/DNA/mRNA可以被共价或非共价偶联至这种细胞表面受体的天然配体(或天然配体的一部分)。(McCall等，(2014)Tissue Barriers.2(4):e944449；Dinda等，(2013)Curr Pharm Biotechnol.14:1264-74；Kang等，(2014)Curr Pharm Biotechnol.15(3):220-30；Qian等，(2014)Expert Opin Drug Metab Toxicol.10(11):1491-508)。
在一些实施方式中，本文所述的MTEM或工程化大范围核酸酶，或者编码本文所述的MTEM或工程化大范围核酸酶的DNA/mRNA被包封在生物可降解水凝胶内。水凝胶可以在不需要频繁注射的情况下向靶组织的期望区域提供治疗有效负载的持续且可调的释放，并且刺激响应性材料(例如，温度和pH响应性水凝胶)可以被设计为响应环境或外部施加的线索而释放有效负载(Kang Derwent等，(2008)Trans Am Ophthalmol Soc.106:206-214)。
在一些实施方式中，使用本领域已知的方法将本文所述的MTEM或工程化大范围核酸酶，或者编码本文所述的MTEM或工程化大范围核酸酶的DNA/mRNA共价地或优选非共价地偶联至纳米颗粒或包封在这种纳米颗粒内(Sharma等，(2014)Biomed Res Int.2014)。纳米颗粒是纳米级递送系统，其长度尺度<1μm，优选<100nm。可以使用由金属、脂质、聚合物或生物大分子组成的核来设计这种纳米颗粒，并且核酸酶蛋白、mRNA或DNA的多个拷贝可以附接于纳米颗粒核或用纳米颗粒核包封。这增加了递送至每个细胞的蛋白/mRNA/DNA的拷贝数，并因此增加了每个本文所述的MTEM或工程化大范围核酸酶的细胞内表达，以最大化靶识别序列将被切割的可能性。这种纳米颗粒的表面可以进一步用聚合物或脂质(例如，壳聚糖、阳离子聚合物或阳离子脂质)修饰，以形成其表面赋予另外的功能的核-壳纳米颗粒，从而增强有效负载的细胞递送和摄取(Jian等，(2012)Biomaterials.33(30):7621-30)。纳米颗粒可另外有利地偶联至靶向分子以将纳米颗粒引导至合适的细胞类型和/或增加细胞摄取的可能性。这种靶向分子的实例包括对于细胞表面受体和细胞表面受体的天然配体(或天然配体的部分)特异性的抗体。
在一些实施方式中，本文所述的MTEM或工程化大范围核酸酶，或者编码本文所述的MTEM或工程化大范围核酸酶的DNA/mRNA被使用阳离子脂质包封在脂质体内或复合(参见，例如，LIPOFECTAMINETM,Life Technologies Corp.,Carlsbad,CA；Zuris等，(2015)NatBiotechnol.33:73-80；Mishra等，(2011)J Drug Deliv.2011:863734)。脂质体和脂质复合物制剂可以保护有效载荷免于降解，增强靶位点处的累积和保留，并通过与靶细胞的细胞膜融合和/或破坏靶细胞的细胞膜促进细胞摄取和递送效率。
在一些实施方式中，本文所述的MTEM或工程化大范围核酸酶，或者编码本文所述的MTEM或工程化大范围核酸酶的DNA/mRNA被使用阳离子聚合物包封在聚合物支架(例如，PLGA)内或复合(例如，PEI、PLL)(Tamboli等，(2011)Ther Deliv.2(4):523-536)。可以设计聚合物载体以通过控制聚合物侵蚀和药物扩散提供可调的药物释放速率，并且高的药物包封效率可以提供对治疗有效负载的保护，直到细胞内递送至期望的靶细胞群体。
在一些实施方式中，本文所述的MTEM或工程化大范围核酸酶，或者编码本文所述的MTEM或工程化大范围核酸酶的DNA/mRNA与自组装成胶束的两亲性分子组合(Tong等，(2007)J Gene Med.9(11):956-66)。聚合物胶束可以包括由亲水性聚合物(例如，聚乙二醇)形成的胶束壳，其可以防止聚集、掩蔽电荷相互作用和减少非特异性相互作用。
在一些实施方式中，本文所述的MTEM或工程化大范围核酸酶，或者编码本文所述的MTEM或工程化大范围核酸酶的DNA/mRNA被配制成乳液或纳米乳液(即，具有<1nm的平均粒径)以用于施用和/或递送至靶细胞。术语“乳液”是指(但不限于)任何水包油、油包水、水包油包水或油包水包油分散体或液滴，包括当水不混溶相与水相混合时，可作为驱动非极性残基(例如，长烃链)远离水和极性头基团朝向水的疏水力的结果形成的脂质结构。这些其他脂质结构包括但不限于单层的、少层的(paucilamellar)和多层的脂质囊泡、胶束和层状相。乳液由水相和亲脂相(通常包含油和有机溶剂)组成。乳液还经常包含一种或多种表面活性剂。纳米乳液制剂是众所周知的，例如，如美国专利号6,015,832、6,506,803、6,635,676、6,559,189和7,767,216中所描述的，其每一个通过引用整体并入本文。
在一些实施方式中，本文所述的MTEM或工程化大范围核酸酶，或者编码本文所述的MTEM或工程化大范围核酸酶的DNA/mRNA与多功能聚合物缀合物、DNA树状物和聚合树状物共价附接或非共价缔合(Mastorakos等(2015)Nanoscale.7(9):3845-56；Cheng等，(2008)J Pharm Sci.97(1):123-43)。树状物的产生可以控制有效负载容量和大小，并且可以提供高的药物有效负载能力。此外，可以利用多个表面基团的展示来改善稳定性、减少非特异性相互作用以及增强细胞特异性靶向和药物释放。
在一些实施方式中，使用重组病毒将具有编码MTEM的核酸序列的多核苷酸引入细胞中。这种重组病毒是本领域已知的，并且包括重组逆转录病毒、重组慢病毒、重组腺病毒和重组AAV(综述于Vannucci等，(2013New Microbiol.36:1-22))。可用于本发明的重组AAV可具有允许将病毒转导入靶细胞类型并由靶细胞表达MTEM的任何衣壳或血清型。例如，在一些实施方式中，重组AAV具有血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11或AAVHSC。在一些实施方式中，将重组病毒直接注射至靶组织。在替代性实施方式中，通过循环系统将重组病毒全身递送。本领域已知，不同的AAV倾向于定位于不同的组织，并且可以选择适当的AAV衣壳/血清型以优先递送到特定组织。在一些实施方式中，AAV血清型是AAV9。AAV也可以是自身互补的，使得其不需要宿主细胞中的第二链DNA合成(McCarty等，(2001)Gene Ther.8:1248-54)。通过重组AAV递送的核酸可以包括左(5’)和右(3’)反向末端重复序列。
在一个实施方式中，用于递送具有编码本文所述的MTEM或工程化大范围核酸酶的核酸序列的多核苷酸的重组病毒是自限性重组病毒。由于载体内存在工程化大范围核酸酶的识别序列，自限性重组病毒在细胞或生物体中可具有有限的持续时间。因此，自限性重组病毒可被工程化以提供启动子、本文所述MTEM或工程化大范围核酸酶和ITR内大范围核酸酶识别位点的编码。自限性重组病毒将大范围核酸酶基因递送至细胞、组织或生物体，使得本文所述的MTEM或工程化大范围核酸酶被表达并且能够在基因组内的内源识别序列处切割细胞的基因组。递送的大范围核酸酶还将在自限性重组病毒本身中发现其靶位点，并在该靶位点处切割载体。一旦切割，病毒基因组的5’和3’端将暴露并被核酸外切酶降解，从而杀死病毒并停止本文所述的MTEM或工程化大范围核酸酶的产生。
如果具有编码本文所述的MTEM或工程化大范围核酸酶的核酸序列的多核苷酸以DNA形式(例如，质粒)和/或通过病毒载体(例如，AAV)被递送，则其必须可操作地连接至启动子。在一些实施方式中，这可以是病毒启动子，如来自病毒载体(例如，慢病毒载体LTR)的内源性启动子，或者本文其他地方所述的组成型或组织特异性启动子。在特定实施方式中，具有编码本文所述的MTEM或工程化大范围核酸酶的核酸序列的多核苷酸可操作地连接到优选驱动靶细胞中的基因表达的启动子，所述靶细胞例如是神经元、神经胶质细胞(例如，星形胶质细胞或少突胶质细胞)、肌肉细胞(例如，骨骼肌细胞、心肌细胞或平滑肌细胞)等。在一些实施方式中，靶细胞是肌肉细胞、骨骼肌细胞、肌管细胞、肌肉卫星细胞、神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞、眼细胞、视网膜细胞、视网膜神经节细胞、视网膜色素上皮细胞、胰腺细胞或胰腺β细胞，或者其中所述靶细胞群是肌肉细胞、骨骼肌细胞、肌管细胞、肌肉卫星细胞、神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞、眼细胞、视网膜细胞、视网膜神经节细胞、视网膜色素上皮细胞、胰腺细胞或胰腺β细胞的群，或者靶细胞群是肌肉细胞、骨骼肌细胞、肌管细胞、肌肉卫星细胞、神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞、眼细胞、视网膜细胞、视网膜神经节细胞、视网膜色素上皮细胞、胰腺细胞或胰腺β细胞的群，或者其中所述靶细胞群是肌肉细胞、骨骼肌细胞、肌管细胞、肌肉卫星细胞、神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞、眼细胞、视网膜细胞、视网膜神经节细胞、视网膜色素上皮细胞、胰腺细胞或胰腺β细胞的群。
在一些实施方式中，本文提供了用于通过向真核细胞或真核细胞群引入本公开内容的多核苷酸(如含有编码上文所述的工程化大范围核酸酶的核酸序列的多核苷酸)产生遗传修饰的真核细胞或遗传修饰的真核细胞群的方法。在真核细胞或真核细胞群中表达后，工程化大范围核酸酶定位于线粒体，结合线粒体基因组中的识别序列，并产生切割位点。工程化大范围核酸酶产生的切割位点可以通过NHEJ修复途径修复，这可能导致切割位点的核酸插入或缺失。附加地或替代地，由真核细胞或真核细胞群的线粒体基因组中的工程化大范围核酸酶产生的切割位点可以通过替代非同源末端连接(Alt-NHEJ)或微同源介导的末端连接(MMEJ)来修复。NHEJ或Alt-NHEJ/MMEJ可导致核酸在切割位点的插入和/或缺失。特别地，NHEJ或Alt-NHEJ/MMEJ可以导致在切割位点处1-1000(例如，1-10、10-100、100-200、200-300、300-400、400-500、500-600、600-700、700-80、800-900或900-1000)个核苷酸的插入和/或缺失，如约1、5、10、15、20、25、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900、925、950、975或1000个核苷酸。在一些实施方式中，在本文所述的遗传修饰的真核细胞中或本文所述的遗传修饰的真核细胞群中的线粒体基因组可以被降解。在一些此类实施方式中，与对照细胞相比，包含识别序列的线粒体基因组的百分比降低约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％，或者可以被降解约30-40％、40-50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-90％、90-100％或更多。
在特定实施方式中，包含SEQ ID NO:1的识别序列的突变线粒体基因组被降解。通过降解具有SEQ ID NO:1的识别序列的突变线粒体基因组，在施用或表达本文所述的MTEM或工程化大范围核酸酶后，野生型线粒体基因组与突变线粒体基因组的总比率将增加。在一些实施方式中，在单个本文所述的遗传修饰的真核细胞或遗传修饰的真核细胞群中野生型与突变线粒体基因组的比率增加至约5:95、约10:90、约15:85、约20:80、约25:75、约30:70、约35:65、约40:60、约45:55、约50:50、约55:45、约60:40、约65:35、约70:30、约75:25、约80:20、约85:15、约90:10、约95:5、约20:1、约50:1、约100:1、约150:1、约200:1、约250:1、约300:1、约350:1、约400:1、约450:1、约500:1、约550:1、约600:1、约650:1、约700:1、约750:1、约800:1、约850:1、约900:1、约950:1、约1000:1或更高。
在特定实施方式中，当包含SEQ ID NO:1的突变线粒体基因组被本文所述的MTEM或工程化大范围核酸酶识别、切割和降解时，单个本文所述遗传修饰的真核细胞或本文所述遗传修饰的真核细胞群中野生型基因组的百分比可以增加。当与不表达本文所述的MTEM或工程化大范围核酸酶的真核细胞或真核细胞群比较时，在本文所述的遗传修饰的真核细胞或遗传修饰的细胞群中野生型线粒体基因组的百分比可以是在遗传修饰的真核细胞或遗传修饰的细胞群中总线粒体基因组的约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或更高。同样地，当与不表达本文所述的MTEM或工程化大范围核酸酶的真核细胞或真核细胞群比较时，在遗传修饰的真核细胞或遗传修饰的细胞群中包含SEQ ID NO:1的识别序列的突变线粒体基因组的百分比可以降低约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或更高。
在一些实施方式中，当与不表达本文所述的MTEM或工程化大范围核酸酶的真核细胞比较时，在本文所述的遗传修饰的真核细胞或遗传修饰的真核细胞群中线粒体呼吸可以增加约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约100％或更高。当与不表达本文所述的MTEM或工程化大范围核酸酶的真核细胞真核细胞群比较时，在本文所述的遗传修饰的真核细胞或遗传修饰的真核细胞群中线粒体呼吸可以被增加约30-40％、40-50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-90％、90-100％或更高。
在某些情况下，识别序列在与线粒体病症相关的线粒体基因组的区域内。例如，识别序列可以在线粒体基因组中与线粒体脑肌病、乳酸酸中毒和卒中样发作(MELAS)相关的区域内。在大约80％的病例中，mtDNA基因MT-TL1中的突变与MELAS相关。超过80％的MELAS病例是由在tRNA-Leu中的A3243G点突变引起的。在MT-TQ、MT-TH、MT-TK、MT-TS1、MT-ND1、MT-ND5、MT-ND6和MT-TS2中的突变也与MELAS综合征相关。MELAS综合征的一些病例似乎是线粒体基因新的自发突变的结果，并且不是遗传性的(Sue等，J Pediatr 134:696-700(1999)；Singh等，Indian J Pediatr66:621-625(1999)；Deschauer等，NeuromusculDisord 9:305-307(1999))。MELAS始于儿童时期，通常在2至15岁之间，主要影响神经系统和肌肉。最常见的早期症状是癫痫发作、反复头痛、食欲不振和反复呕吐。也可能发生身体一侧暂时性肌肉无力的中风样发作(偏瘫)，这可能导致意识改变、视力和听力丧失、运动技能丧失和智力障碍。MELAS是由在mtDNA中的突变引起的。
正常和突变的mtDNA都可以存在于同一细胞中，这种情况被称为异质性。缺陷线粒体的数量可能会超过正常线粒体的数量。症状可能不会出现在任何给定的世代中直至突变影响相当大比例的mtDNA。正常和突变mtDNA在不同组织中的不均匀分布会影响同一家族成员的不同器官。这可能会导致受影响家族成员中的各种症状。
在特定实施方式中，在真核细胞或真核细胞群的线粒体基因组中本文所述的识别序列位于线粒体基因组的核苷酸3000至3500之间。在特定实施方式中，本文所述的MTEM或工程化大范围核酸酶靶向线粒体基因组的A3243G突变。如本文所用，“MELAS突变”指线粒体基因组的A3243G突变，其中在位置3243处野生型基因组的A被突变线粒体基因组中的G取代。在特定实施方式中，SEQ ID NO:1的识别序列仅位于突变线粒体基因组上。在遗传修饰的真核细胞或遗传修饰的真核细胞群中表达后，MTEM或工程化大范围核酸酶能够定位于线粒体，结合线粒体基因组中的识别序列并产生切割位点。通过靶向仅位于突变基因组上的识别序列，基因组可以被切割并且随后被降解。突变线粒体基因组的这种特异性降解可以用于辅助治疗或减轻MELAS的症状。
因此，本文提供的方法用于通过向靶细胞或群递送包含编码MTEM或工程化大范围核酸酶的核酸序列的多核苷酸或本文所述的MTEM或工程化大范围核酸酶在靶细胞或靶细胞群中降解突变线粒体基因组。在特定实施方式中，靶细胞或靶细胞群包含具有MELAS突变(即，A3243G突变)的突变线粒体基因组，并且MTEM或工程化大范围核酸酶识别并切割SEQID NO:1的识别序列。靶细胞或靶细胞群可以在哺乳动物受试者中，如人受试者。在一些实施方式中，靶细胞是肌肉细胞、骨骼肌细胞、肌管细胞、肌肉卫星细胞、神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞、眼细胞、视网膜细胞、视网膜神经节细胞、视网膜色素上皮细胞、胰腺细胞或胰腺β细胞，或者其中所述靶细胞群是肌肉细胞、骨骼肌细胞、肌管细胞、肌肉卫星细胞、神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞、眼细胞、视网膜细胞、视网膜神经节细胞、视网膜色素上皮细胞、胰腺细胞或胰腺β细胞的群，或者靶细胞群是肌肉细胞、骨骼肌细胞、肌管细胞、肌肉卫星细胞、神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞、眼细胞、视网膜细胞、视网膜神经节细胞、视网膜色素上皮细胞、胰腺细胞或胰腺β细胞的群，或者其中所述靶细胞群是肌肉细胞、骨骼肌细胞、肌管细胞、肌肉卫星细胞、神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞、眼细胞、视网膜细胞、视网膜神经节细胞、视网膜色素上皮细胞、胰腺细胞或胰腺β细胞的群。
本文描述了在受试者中治疗与MELAS病症相关的病况的方法。此类方法包括向受试者施用治疗有效量的具有编码MTEM或工程化大范围核酸酶的核酸序列的多核苷酸，或者治疗有效量的本文所述的MTEM或工程化大范围核酸酶，其中在具有MELAS突变的突变线粒体基因组中MTEM或工程化大范围核酸酶产生SEQ ID NO:1的识别序列的切割位点。在突变线粒体基因组中产生的切割位点能够导致突变线粒体基因组的降解。在特定实施方式中，治疗包括降低或减轻MELAS的至少一种症状。MELAS的症状包括但不限于癫痫发作、反复头痛、食欲不振、反复呕吐、身体一侧暂时肌肉无力的中风样发作(偏瘫)、意识改变、视力和听力丧失、运动技能丧失和智力障碍。在特定实施方式中，在受试者中治疗与MELAS相关的病况的方法涉及施用本文所述的药物组合物。
在一些实施方式中，以约1x1010 gc/kg至约1x1014 gc/kg(例如，1x1010 gc/kg、1x1011 gc/kg、1x1012 gc/kg、1x1013 gc/kg或1x1014 gc/kg)的编码MTEM或工程化大范围核酸酶的核酸的剂量向受试者施用本文所述的药物组合物。在一些实施方式中，以至少约1x1010 gc/kg、至少约1x1011 gc/kg、至少约1x1012 gc/kg、至少约1x1013 gc/kg或至少约1x1014 gc/kg的编码MTEM或工程化大范围核酸酶的核酸的剂量向受试者施用药物组合物。在一些实施方式中，以约1x1010 gc/kg至约1x1011 gc/kg、约1x1011 gc/kg至约1x1012 gc/kg、约1x1012 gc/kg至约1x1013 gc/kg或约1x1013 gc/kg至约1x1014 gc/kg的编码MTEM或工程化大范围核酸酶的核酸的剂量向受试者施用药物组合物。在某些实施方式中，以约1x1012gc/kg至约9x1013 gc/kg(例如，约1x1012gc/kg、约2x1012 gc/kg、约3x1012 gc/kg、约4x1012gc/kg、约5x1012 gc/kg、约6x1012 gc/kg、约7x1012 gc/kg、约8x1012 gc/kg、约9x1012 gc/kg、约1x1013 gc/kg、约2x1013 gc/kg、约3x1013 gc/kg、约4x1013 gc/kg、约5x1013 gc/kg、约6x1013 gc/kg、约7x1013 gc/kg、约8x1013 gc/kg或约9x1013 gc/kg)的编码MTEM或工程化大范围核酸酶的核酸的剂量向受试者施用药物组合物。
在一些实施方式中，以约0.1mg/kg至约3mg/kg的编码MTEM或工程化大范围核酸酶的mRNA的剂量向受试者施用脂质纳米颗粒制剂。在一些实施方式中，以至少约0.1mg/kg、至少约0.25mg/kg、至少约0.5mg/kg、至少约0.75mg/kg、至少约1.0mg/kg、至少约1.5mg/kg、至少约2.0mg/kg、至少约2.5mg/kg或至少约3.0mg/kg的编码MTEM或工程化大范围核酸酶的mRNA的剂量向受试者施用脂质纳米颗粒制剂。在一些实施方式中，以约0.1mg/kg至约0.25mg/kg、约0.25mg/kg至约0.5mg/kg、约0.5mg/kg至约0.75mg/kg、约0.75mg/kg至约1.0mg/kg、约1.0mg/kg至约1.5mg/kg、约1.5mg/kg至约2.0mg/kg、约2.0mg/kg至约2.5mg/kg或约2.5mg/kg至约3.0mg/kg的编码MTEM或工程化大范围核酸酶的mRNA的剂量向受试者施用脂质纳米颗粒制剂。
用于递送本文所述的MTEM或工程化大范围核酸酶或者编码本文所述的MTEM或工程化大范围核酸酶的核酸的靶组织包括但不限于肌肉组织、脑组织、中枢神经系统组织、胰腺组织或眼/视网膜组织。在一些实施方式中，用于递送的靶细胞是肌肉细胞、骨骼肌细胞、肌管细胞、肌肉卫星细胞、神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞、眼细胞、视网膜细胞、视网膜神经节细胞、视网膜色素上皮细胞、胰腺细胞或胰腺β细胞，或者其中所述靶细胞群是肌肉细胞、骨骼肌细胞、肌管细胞、肌肉卫星细胞、神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞、眼细胞、视网膜细胞、视网膜神经节细胞、视网膜色素上皮细胞、胰腺细胞或胰腺β细胞的群，或者靶细胞群是肌肉细胞、骨骼肌细胞、肌管细胞、肌肉卫星细胞、神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞、眼细胞、视网膜细胞、视网膜神经节细胞、视网膜色素上皮细胞、胰腺细胞或胰腺β细胞的群，或者其中所述靶细胞群是肌肉细胞、骨骼肌细胞、肌管细胞、肌肉卫星细胞、神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞、眼细胞、视网膜细胞、视网膜神经节细胞、视网膜色素上皮细胞、胰腺细胞或胰腺β细胞的群。
在本文所述方法的各种实施方式中，如本文所描述的，一种或多种本文所述的MTEM或工程化大范围核酸酶、编码此类本文所述的MTEM或工程化大范围核酸酶的多核苷酸或者包含编码此类本文所述的MTEM或工程化大范围核酸酶的一个或多个多核苷酸的重组病毒可以通过本领域已知的任何合适的施用途径施用。因此，如本文所描述的，一种或多种本文所述的MTEM或工程化大范围核酸酶、编码此类本文所述的MTEM或工程化大范围核酸酶的多核苷酸或者包含编码此类本文所述的MTEM或工程化大范围核酸酶的一个或多个多核苷酸的重组病毒可以通过包括静脉内、肌内、腹膜内、皮下、肝内、经粘膜、经皮、动脉内和舌下的施用途径施用。在一些实施方式中，通过直接向靶组织注射将本文所述的MTEM或工程化大范围核酸酶或者本文所述的MTEM或工程化大范围核酸酶的mRNA或DNA载体供应至靶细胞(例如，神经细胞、肌肉细胞、胰腺细胞、眼细胞等)。在一些实施方式中，真核细胞是干细胞、CD34+HSC、肌肉细胞、骨骼肌细胞、肌管细胞、肌肉卫星细胞、神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞、眼细胞、视网膜细胞、视网膜神经节细胞、视网膜色素上皮细胞、胰腺细胞、胰腺β细胞、肾细胞、骨髓细胞或耳毛细胞。在一些实施方式中，病况是肌肉、脑、中枢神经系统、胰腺或视网膜的病况。在一些实施方式中，所述病况是线粒体脑肌病、乳酸酸中毒和卒中样发作(MELAS)、进行性外眼肌麻痹、母系遗传性糖尿病、偏头痛或眼肌病。
本文所述的MTEM或工程化大范围核酸酶、编码此类本文所述的MTEM或工程化大范围核酸酶的多核苷酸或者包含编码此类本文所述的MTEM或工程化大范围核酸酶的一个或多个多核苷酸的重组病毒的其他合适的施用施用途径可由治疗医师根据需要容易地确定。
在一些实施方式中，向有需要的受试者施用治疗有效量的本文所述的MTEM或工程化大范围核酸酶。适当时，MTEM或工程化大范围核酸酶的剂量或给药频率可以在治疗过程中根据施用医师的判断进行调整。除其他因素外，适当的剂量将取决于所选择的任何AAV的具体情况(例如，血清型等)、施用途径、接受治疗的受试者(即，受试者的年龄、体重、性别和一般状况)以及施用方式。因此，适当的剂量可能因患者而异。适当的有效量可以由本领域技术人员容易地确定。剂量治疗可以是单剂量计划或多剂量计划。此外，受试者可以被施用适当多的剂量。本领域技术人员能够容易地确定适当的剂量数。可能需要调整剂量，以考虑替代施用途径或平衡治疗获益与任何副作用。
本文所述的外源核酸分子可以通过此前讨论的任何方式引入细胞和/或递送至受试者。在特定的实施方式中，外源核酸分子通过重组病毒如慢病毒、逆转录病毒、腺病毒或重组AAV引入。可用于引入外源核酸分子的重组AAV可以具有允许将病毒转导到细胞中并将外源核酸分子序列插入到细胞基因组中的任何血清型，包括本文此前描述的那些血清型/衣壳。重组AAV也可以是自互补的，使得其不需要在宿主细胞中合成第二链DNA。使用重组AAV引入的外源核酸分子的两侧翼可以是5’(左)和3’(右)反向末端重复序列。
在另一个特定实施方式中，可以使用单链DNA模板将外源核酸分子引入细胞。单链DNA可以包含外源核酸分子，并且在特定实施方式中，可以包含5’和3’同源臂，以通过同源重组促进核酸序列插入核酸酶切割位点。单链DNA可进一步包含5’同源臂5’上游的5’AAV反向末端重复序列(ITR)序列和3’同源臂3’下游的3’AAV-ITR序列。
在另一个特定实施方式中，可以通过用线性DNA模板的转染将包含编码本文所述的MTEM或工程化大范围核酸酶的核酸和/或本文所述的外源性核酸分子的多核苷酸引入细胞。编码本文所述的MTEM或工程化大范围核酸酶和/或外源核酸分子的质粒DNA可以，例如，通过一种或多种限制性内切酶消化，使得环状质粒DNA在转染到细胞中之前线性化。
当向细胞递送时，本文所述的外源性核酸可以可操作地连接至适用于在细胞中表达编码的多肽的任何启动子，包括此前讨论的那些哺乳动物启动子和诱导型启动子。本文所述的外源性核酸还可以可操作地连接至合成启动子。合成启动子可以包括但不限于JeT启动子(WO 2002/012514)。
2.6变体
本发明涵盖本文所述的多肽和多核苷酸序列的变体。
如本文所用，“变体”旨在指基本上相似的序列。“变体”多肽旨在指通过在天然蛋白的一个或多个内部位点上缺失或添加一个或多个氨基酸和/或在天然多肽的一个或多个位点上取代一个或多个氨基酸而衍生自“天然”多肽的多肽。如本文所用，“天然”多核苷酸或多肽包含衍生变体的亲本序列。实施方式涵盖的变体多肽具有生物活性。也就是说，其继续具有天然蛋白的期望的生物活性；例如，结合并切割在mtDNA(例如，人mtDNA)中发现的识别序列(如MIT 25-26识别序列(SEQ ID NO:1))的能力。此类变体可能是例如人操纵的结果。在一些实施方式中，实施方式的天然多肽(例如，SEQ ID NO:3-12的任一个)的生物活性变体，或者本文所述的识别半位点结合亚基的生物活性变体将与天然多肽、天然亚基、天然HVR1或天然HVR2的氨基酸序列具有至少约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的序列同一性，如通过本文其他地方描述的序列比对程序和参数确定的。实施方式的多肽或亚基的生物活性变体可以与该多肽或亚基相差少至约1-40个氨基酸残基、少至约1-20个、少至约1-10个、少至约5个、少至4个、3个、2个或甚至1个氨基酸残基。
实施方式的多肽可以以各种方式改变，包括氨基酸取代、缺失、截短和插入。这种操作的方法通常是本领域已知的。例如，氨基酸序列变体可通过DNA中的突变制备。诱变和多核苷酸改变的方法是本领域熟知的。参见，例如，Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:488-492；Kunkel等，(1987)Methods in Enzymol.154:367-382；U.S.Pat.No.4,873,192；Walker和Gaastra编著，(1983)Techniques in Molecular Biology(MacMillanPublishing Company,New York)和其中引用的参考文献。在Dayhoff等，(1978)Atlas ofProtein Sequence and Structure(Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,D.C.)的模型中可以找到关于不影响目标蛋白的生物活性的适当氨基酸取代的指导，其通过引用并入本文。保守取代(如将一个氨基酸与另一个具有相似性质的氨基酸交换)可能是最佳的。
在一些实施方式中，本文所述的工程化大范围核酸酶可以包含本文所述的HVR1和HVR2区的变体。亲本HVR区可以包含，例如，示例性工程化大范围核酸酶的残基24-79或残基215-270。因此，变体HVR可以包含与对应于本文示例性工程化大范围核酸酶的残基24-79或残基215-270的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更高序列同一性的氨基酸序列，以使得变体HVR区保持工程化大范围核酸酶的生物活性(即，结合至并切割识别序列)。此外，在本文所述的一些实施方式中，变体HVR1区域或变体HVR2区域可包含对应于在亲本HVR内的特定位置发现的氨基酸残基的残基。在本文中，“对应于”指变体HVR中的氨基酸残基是存在于亲本HVR序列中相同相对位置(即，相对于亲本序列中的其余氨基酸)的相同氨基酸残基(即，分开的相同残基)。例如，如果亲本HVR序列在位置26包含丝氨酸残基，则“包含对应于”残基26的残基的变体HVR也将在相对于(即，对应于)亲本位置26的位置包含丝氨酸。
在特定实施方式中，本文所述的工程化大范围核酸酶包含HVR1，其与对应于SEQID NO:3-12的任一个的残基215-270的氨基酸序列具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更高序列同一性。
在某些实施方式中，本文所述的工程化大范围核酸酶包含HVR2，其与对应于SEQID NO:3-12的任一个的残基24-79的氨基酸序列具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更高序列同一性。
此前已经鉴定了野生型I-CreI大范围核酸酶的DNA识别结构域的大量氨基酸修饰(例如，U.S.8,021,867)，其单独或组合地导致工程化大范围核酸酶在DNA识别序列半位点内的单个碱基处具有改变的特异性，使得所得合理设计的大范围核酸酶具有不同于野生型酶的半位点特异性。表2提供了可以在工程化大范围核酸酶单体或亚单位中进行的潜在取代，以基于识别半位点的每个半位点位置(-1至-9)处存在的碱基来增强特异性。此类取代整合入本文所述的大范围核酸酶的变体中。
表2：在工程化大范围核酸酶变体中的潜在取代
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粗体条目是野生型接触残基并且不构成本文所用的“修饰”。星号表示该残基与反义链上的碱基接触。
可以在工程化大范围核酸酶单体或亚基中进行某些修饰以调节DNA结合亲和性和/或活性。例如，本文所述的工程化大范围核酸酶单体或亚基可以在对应于I-CreI或SEQID NO:3-12的任一个的位置19的残基处包含G、S或A(WO 2009001159)，在对应于I-CreI或SEQ ID NO:3-12的任一个的位置66的残基处包含Y、R、K或D和/或在对应于I-CreI或SEQ IDNO:3-12的任一个的位置80的残基处包含E、Q或K(US 8021867)。
对于多核苷酸，“变体”包括在天然多核苷酸内的一个或多个位点缺失和/或添加一个或多个核苷酸。本领域技术人员将认识到，将构建实施方式的核酸变体以维持开放阅读框。对于多核苷酸，保守变体包括由于遗传密码的简并性而编码实施方式的多肽之一的氨基酸序列的那些序列。变体多核苷酸包括合成来源的多核苷酸，例如，通过使用定点诱变产生但仍编码工程化大范围核酸酶的那些，或外源核酸分子，或实施方式的模板核酸。一般而言，实施方式的特定多核苷酸的变体与该特定多核苷酸具有至少约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更高序列同一性，如通过本文其他地方所述的序列比对程序和参数所确定的。实施方式的特定多核苷酸(即，参考多核苷酸)的变体也可以通过变体多核苷酸编码的多肽与参考多核苷酸编码的多肽之间的序列同一性百分比的比较来评估。
预期本文涵盖的蛋白序列的缺失、插入和取代不会产生多肽特征的根本改变。然而，当在这样做之前之前难以预测取代、缺失或插入的确切效果时，本领域技术人员将理解，将通过筛选多肽优先结合和切割在人mtDNA内发现的识别序列(如MIT 25-26识别序列(SEQ ID NO:1))的能力来评估该效果。
表3是本文公开的序列的总结。
表3：
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实施例
以下实施例进一步说明了本公开内容，这些实施例不应被解释为限制性的。本领域技术人员将认识到或能够使用不多于常规实验来确定本文所述的特定物质和程序的很多等效物。此类等效物旨在包含在以下实施例之后的权利要求的范围内。
实施例1：MIT 25-26核酸酶活性的报告基因测定
本实验的目的是确定各种MIT 25-26大范围核酸酶是否能够在哺乳动物细胞中结合并切割人MIT 25-26识别序列，并且确定各种MIT 25-26大范围核酸酶是否能够区分野生型等位基因。为此，使用此前描述的CHO细胞报告基因测定(参见WO/2012/167192)来评价工程化的大范围核酸酶。为进行该测定，产生两个CHO细胞报告系，其携带整合到细胞基因组中的非功能性绿色荧光蛋白(GFP)基因表达盒。每个细胞系中的GFP基因包含由一对识别序列分开的直接序列重复，使得工程化大范围核酸酶对任一识别序列的细胞内切割将刺激同源重组事件，从而产生功能性GFP基因。
在为本研究开发的CHO报告细胞系中，将两个识别序列插入GFP基因中。一个识别序列用于人MIT 25-26识别序列(突变体或野生型序列，其仅相差一个碱基)。1号细胞系(突变体)含有突变体等位基因，而2号细胞系(野生型)含有野生型等位基因。插入两个细胞系中的第二识别序列是CHO-23/24识别序列，其被称为“CHO-23/24”的对照工程化大范围核酸酶识别并切割。将CHO-23/24识别序列用作阳性对照和活性的标准衡量。
用编码各种MIT 25-26核酸酶的mRNA转染上文详述的CHO报告细胞。用编码CHO-23/24大范围核酸酶的mRNA转染CHO报告细胞的对照样品。在每项测定中，根据制造商的说明书，用MESSENGERMAX(ThermoFisher)在96孔板中使用2.5ng(低剂量)mRNA转染5e4个CHO报告细胞。转染后2天通过图像细胞计数评价转染的CHO细胞，以确定与未转染的阴性对照相比GFP阳性细胞的百分比。在突变报告细胞系中用低剂量mRNA转染的细胞也在第5天和第7天通过图像细胞计数进行评价。将每个时间点获得的数据归一化为使用CHO-23/24大范围核酸酶观察到的GFP阳性细胞％，以确定“活性评分”，并将最早时间点的归一化数据从最新时间点的标准化数据中减去，以确定“毒性评分”。然后，将活性评分和毒性评分加在一起以确定“活性指数”，然后将其归一化为CHO-23/24大范围核酸酶的活性指数，以比较细胞系之间的数据(“归一化活性指数”)。对野生型和突变细胞系均进行了此操作，以确定核酸酶对突变序列的特异性。
在核酸酶优化后，用MIT 25-26工程化大范围核酸酶转染相同的报告细胞系。遵循相同的转染和评价方案，但以下除外：用90ng(高剂量)或2.5ng(低剂量)的mRNA转染突变细胞系，而仅用90ng剂量转染野生型细胞系。
测试的各种MIT 25-26工程化大范围核酸酶能够结合并切割突变报告系中的MIT25-26识别序列(图1)。此外，没有工程化大范围核酸酶能够结合并切割野生型报告系，表明对突变序列具有高水平的特异性。而且，优化的MIT 25-26核酸酶(MIT 25-26L.35)显示出对野生型序列的额外区分，特别是在较高的mRNA剂量下(图2)。
这些研究表明，本文所述的工程化MIT 25-26大范围核酸酶能够在细胞中有效和选择性地结合并切割其人识别序列(例如，MIT 25-26)。
实施例2：在FlpIn CHO细胞系中评价MIT 25-26大范围核酸酶
本实验的目的是在体外模型中评价各种MIT 25-26大范围核酸酶(1)针对突变靶位点的活性和(2)针对相应野生型序列的特异性。这是使用包含整合至核染色体上的一部分人线粒体基因组的两个FlpIn CHO细胞系进行的。整合的序列含有野生型或突变MIT 25-26结合位点，以及周围mtDNA序列。突变体和野生型结合位点仅相差一个核苷酸，因此大范围核酸酶的特异性是至关重要的，因为目的是产生一种工程化大范围核酸酶，其可以高效切割突变体序列，而不切割野生型序列。通过液滴数字PCR(ddPCR)计算每个位点处的插入/缺失(indel)形成来评价特异性和效力。
图3中所示的实验中比较的工程化大范围核酸酶如下所示：MIT 25-26x.29、MIT25-26x.37、MIT 25-26x.48、MIT 25-26x.73和MIT 25-26x.91。图4中所示的实验中比较的工程化大范围核酸酶是MIT 25-26x.91和MIT 25-26L.35大范围核酸酶。
使用来自ThermoFisher Scientific的Flp-InTM系统制备FlpIn CHO细胞系。整合盒包含MIT 25-26突变体或野生型序列，以及周围的mtDNA序列。为比较各种MIT 25-26大范围核酸酶的特异性和效力，6e5个FlpIn-CHO细胞使用Lonza 4D NucleofectorTM以500ng或5ng的MIT 25-26大范围核酸酶mRNA剂量(SF缓冲液，条件EN-138)进行核转染。在核转染后两天收集细胞用于gDNA提取，并使用Beckman Coulter CytoFlex S细胞仪评价转染效率。两种细胞系的转染效率均超过95％。使用Macherey Nagel NucleoSpin Blood QuickPure试剂盒分离gDNA。
液滴数字PCR(ddPCR)用于确定MIT 25-26突变体和野生型位点的indel频率，使用P1/P2、F1和R1产生结合位点周围的扩增子，以及P3、F2和R2产生用作基因组计数器的参考扩增子。在未处理的群中，两个扩增子的比率应该相等，并且相对于处理的样品中结合位点的indel形成而言下降。在含有1x ddPCR Supermix for Probes(无dUTP,BioRad)、250nM每种探针、900nM每种引物、20U/μL Kpn-IHF(NEB)和150ng细胞gDNA的24μL反应物中进行多重扩增。使用QX100液滴发生器(BioRad)产生液滴。循环条件如下所示：95℃(2℃/s变温)持续10分钟，1个循环，94℃(2℃/s变温)持续10秒、59.2℃(2℃/s变温)持续30秒、72C(0.2℃/s变温)持续1分30秒，45个循环，98℃持续10分钟，1个循环，4℃保持。使用QX200液滴读取器(BioRad)分析液滴，并使用QuantaSoft分析软件(BioRad)获取和分析数据。
P1(突变等位基因)：TGGCAGGGCCCGGT(SEQ ID NO:63)
P2(野生型等位基因)：ACCGGGCTCTGCCAT(SEQ ID NO:72)
F1：CCCAAGAACAGGGTTTGTTAAG(SEQ ID NO:64)
R1：GGAATGCCATTGCGATTAG(SEQ ID NO:65)
P3：AGCAGTTCTACCGTACAACCCTAACA(SEQ ID NO:66)
F2：GGCAGTTGAGGTGGATTA(SEQ ID NO:67)
R2：GGAATGCGGTAGTAGTTAGG(SEQ ID NO:68)
针对MIT 25-26突变序列设计了工程化大范围核酸酶，并评价了在两个mRNA剂量下突变体和野生型序列中indel的形成。在非常高的mRNA剂量(500ng)下，测试的全部5个工程化大范围核酸酶在野生型位点都表现出活性(图3)。MIT 25-26x.91产生的野生型indel最少，为20％，而MIT 25-26x.48产生的野生型indel最多，为44％。在突变识别位点切割方面，MIT 25-26x.29和MIT 25-26x.37两者在低mRNA剂量(5ng)下均具有较高活性，两者均产生74％indel。从这里评价的集合来看，MIT 25-26x.91似乎是最特异性的。
针对MIT 25-26突变体序列设计了一种优化的大范围核酸酶，并在两种mRNA剂量下评价突变体和野生型序列以及MIT 25-26x.91中indel的形成。虽然在MIT 25-26x.91和MIT 25-26L.35之间对突变序列的效力似乎相对不变，但使用MIT 25-26L.35对野生型序列的特异性大大提高。使用500ng MIT 25-26x.91mRNA，MIT 25-26x.91显示出16％野生型indel，而MIT 25-26L.35仅显示出2％indel(图4)。
这些数据一起表明，MIT 25-26大范围核酸酶的集合对突变的MIT 25-26位点具有高度活性和特异性。此外，能够对其进行优化，以减少任何剩余的脱靶(野生型)编辑。
实施例3：线粒体定位
本实验的目的是当蛋白上的核定位信号(NLS)被线粒体转运肽(MTP)取代时，可视化工程化大范围核酸酶定位。
使用Lonza 4D-NucleofectorTM(SE缓冲液，条件CM-150)，用600ng工程化大范围核酸酶mRNA核转染6e5个MRC-5细胞。比较了两种工程化大范围核酸酶构建体：一种具有NLS，一种具有MTP，均位于蛋白的N末端。核转染后24小时，使用50nM MitoTrackerTM DeepRed FM(ThermoFisher Scientific,M22426)染色细胞30分钟，然后用PBS洗涤。然后，用含HIER的4％ PFA固定细胞15分钟，并使用DAPI和单克隆工程化大范围核酸酶抗体(V34 Hu)染色。使用Zeiss显微镜对细胞进行成像，使用20x Z堆栈图像。
当与核定位序列融合时，工程化大范围核酸酶染色似乎弥漫在整个细胞质和细胞核中(图5)。然而，当与线粒体转运肽融合时，工程化大范围核酸酶染色呈点状，并与MitoTracker染色重叠(图6)。当附接到MTP时，工程化大范围核酸酶似乎没有任何核定位。
当NLS被MTP取代时，工程化大范围核酸酶有效地远离细胞核定位到线粒体。
实施例4：具有线粒体定位数据的核酸酶活性
本实验的目的是确定是否有任何线粒体靶向的工程化大范围核酸酶(MTEM)蛋白进入细胞核，并在mRNA核转染后引起双链断裂(DSB)。实施例1中的染色和成像数据表明这不应该发生，但对该实验在分子水平上进行了更深入的研究，以确定是否正在生成任何indel。
在本实验中使用的工程化大范围核酸酶是APC 11-12L.330，其具有核靶位点(即，APC 11-12)。
使用Lonza 4D-NucleofectorTM(SE缓冲液，条件CM-150)，用相等的工程化大范围核酸酶mRNA拷贝数核转染6e5个MRC-5细胞。比较了三种工程化大范围核酸酶构建体：一种具有NLS，一种不具有靶向序列以及一种具有线粒体转运肽(MTP)。由于这些不同的构建体产生不同长度的mRNA，因而在转染中mRNA拷贝数保持一致(5.8e11个拷贝)。在核转染后两天收集细胞用于gDNA提取，并使用Beckman Coulter CytoFlex S细胞仪评价转染效率。转染效率超过95％。使用Macherey Nagel NucleoSpin Blood QuickPure试剂盒分离gDNA。
使用数字液滴PCR(ddPCR)测定APC 11-12结合位点的indel频率，使用P1、F1和R1产生结合位点周围的扩增子，以及使用P2、F2和R2产生用作基因组计数器的参考扩增子。在未处理的群中，两个扩增子的比例应该相等，并且相对于处理的样品中结合位点的indel形成而言下降。在含有1x ddPCR Supermix for Probes(无dUTP,BioRad)、250nM每种探针、900nM每种引物、20U/μL Hind-III HF(NEB)和120ng细胞gDNA的24μL反应物中进行多重扩增。使用QX100液滴发生器(BioRad)产生液滴。循环条件如下所示：95℃(2℃/s变温)持续10分钟，1个循环，94℃(2℃/s变温)持续10秒、57.5℃(2℃/s变温)持续30秒、72C(0.2℃/s变温)持续1分钟，45个循环，98℃持续10分钟，1个循环，4℃保持。使用QX200液滴读取器(BioRad)分析液滴，并使用QuantaSoft分析软件(BioRad)获取和分析数据。
P1：AGCCCCGGGTACTCCTTGTT(SEQ ID NO:49)
F1：TTCCTTGCAGGAACAGAG(SEQ ID NO:50)
R1：CTGCTTGACCACCCATT(SEQ ID NO:51)
P2：CCAGCAGGCCAGGTACACC(SEQ ID NO:52)
F2：ACCGCCAAGGATGCAC(SEQ ID NO:53)
R2：GCGGGTGGGAATGGAG(SEQ ID NO:54)
如图7中所示，通过与N末端融合的NLS，APC 11-12L.330能够在其预期(核)靶位点产生59％的indel。在完全不存在靶向序列的情况下，其能够在其预期靶位点产生42％的indel。通过将MTP与工程化大范围核酸酶融合，其仍然能够在其预期的靶位点产生23％的indel。
工程化大范围核酸酶是小蛋白，即使在蛋白上不存在NLS，也可以扩散进出细胞核，从而形成indel。这种作用可能通过细胞的核转染和细胞膜的透化而加剧，但可能通过添加核输出信号(NES)而潜在地减轻。
实施例5：具有线粒体定位和添加核输出序列的核酸酶活性
本实验的目的是确定在工程化大范围核酸酶上添加核输出信号(NES)是否会消除核indel。
在图8中使用的NES是基于来自Kosugi等，2008Traffic12:2053-62的数据合理设计的。与工程化大范围核酸酶的C末端融合的NES氨基酸序列是：LGAGLGALGL(SEQ ID NO:47)。在图9和图10中使用的NES取自Minczuk等，2006Proc Natl Acad Sci USA 103(52):19689-19694。与工程化大范围核酸酶的C末端融合的NES氨基酸序列是：VDEMTKKFGTLTIHDTEK(SEQ ID NO:46)。
在图8和图9中使用的工程化大范围核酸酶是APC 11-12L.330，其具有核靶位点。在图10中使用的工程化大范围核酸酶是MIT 25-26x.91，其不具有内源性核靶位点。然而，将包含结合位点的线粒体序列引入FlpIn 293细胞的核染色体上，并且那些是在图10中评价的细胞(位点0是核酸酶结合位点)。
对于涉及APC 11-12L.330的实验，使用Lonza4D-NucleofectorTM(SE缓冲液，条件CM-150)，用相等的工程化大范围核酸酶mRNA拷贝数核转染6e5个MRC-5细胞。在图8中比较了四种大范围核酸酶构建体：一种具有NLS，一种不具有靶向序列，一种具有线粒体转运肽(MTP)和一种具有MTP和NES。在图9中比较了四种工程化大范围核酸酶构建体：一种具有NLS，一种具有MTP，一种具有MTP和NES以及一种具有MTP和MVMp NS2 NES。将NLS和MTP均融合至其各自蛋白的N末端，将NES融合至C末端。由于这些不同的构建体产生不同长度的mRNA，因而在转染中mRNA拷贝数保持一致(针对图8中的数据5.8e11个拷贝，针对图9中的数据2.88e11个拷贝)。在核转染后两天收集细胞用于gDNA提取，并使用Beckman CoulterCytoFlex S细胞仪评价转染效率。转染效率超过95％。使用Macherey Nagel NucleoSpinBlood QuickPure试剂盒分离gDNA。
使用数字液滴PCR(ddPCR)测定APC 11-12结合位点的indel频率，使用P1、F1和R1产生结合位点周围的扩增子，以及使用P2、F2和R2产生用作基因组计数器的参考扩增子。在未处理的群中，两个扩增子的比例应该相等，并且相对于处理的样品中结合位点的indel形成而言下降。在含有1x ddPCR Supermix for Probes(无dUTP,BioRad)、250nM每种探针、900nM每种引物、20U/μL Hind-III HF(NEB)和120ng细胞gDNA的反应物中进行多重扩增。使用QX100液滴发生器(BioRad)产生液滴。循环条件如下所示：95℃(2℃/s变温)持续10分钟，1个循环，94℃(2℃/s变温)持续10秒、57.5℃(2℃/s变温)持续30秒、72C(0.2℃/s变温)持续1分钟，45个循环，98℃持续10分钟，1个循环，4℃保持。使用QX200液滴读取器(BioRad)分析液滴，并使用QuantaSoft分析软件(BioRad)获取和分析数据。
P1：AGCCCCGGGTACTCCTTGTT(SEQ ID NO:49)
F1：TTCCTTGCAGGAACAGAG(SEQ ID NO:50)
R1：CTGCTTGACCACCCATT(SEQ ID NO:51)
P2:CCAGCAGGCCAGGTACACC(SEQ ID NO:52)
F2:ACCGCCAAGGATGCAC(SEQ ID NO:53)
R2:GCGGGTGGGAATGGAG(SEQ ID NO:54)
对于涉及MIT 25-26x.91的实验，使用来自ThermoFisher Scientific的Flp-InTM系统制备FlpIn 293系。整合盒包含MIT 25-26突变结合位点和周围的mtDNA序列。用1.8e12个拷贝的工程化大范围核酸酶mRNA使用Neon电穿孔仪对1.5e6个FlpIn 293细胞进行电穿孔(Neon条件#11，100uL吸头)。在电穿孔后两天收集细胞用于gDNA提取，并使用BeckmanCoulter CytoFlex S细胞仪评价转染效率。转染效率超过95％。使用Macherey NagelNucleoSpin Blood QuickPure试剂盒分离gDNA。
为了鉴定由MIT 25-26x.91核酸酶诱导的潜在核脱靶位点编辑，对从体外、全基因组、无偏脱靶测定中鉴定的选定位点进行靶向扩增子测序。三个核基因组序列被鉴定为该核酸酶的推定脱靶位点(位点1、位点2和位点3)。使用引物F1><R1、F2><R2、F3><R3和F4><R4在引入的核中靶位点(位点0)以及三个内源性推定脱靶位点(位点1、位点2和位点3)通过靶向扩增子测序评价从使用NLS-MIT 25-26x.91、MTP-MIT 25-26x.91或MTP-MIT 25-26x.91-MVMpNS2NES处理的细胞收集的gDNA。
F1：GCTGGCTAGCGTTTAAACTTAAGCTTG(SEQ ID NO:55)
R1：GGGTATGTTGTTAAGAAGAGGAATTGAACCTCTG(SEQ ID NO:56)
F2：TGTGAGTGCATATAATGAAATGGGATGACAG(SEQ ID NO:57)
R2：CAGTCCCCACCTCTTAAGTTTCAAATGAC(SEQ ID NO:58)
F3：CCGCAAGCCCCTTGGTACTG(SEQ ID NO:59)
R3：GTCTGCACTCAAGGAAGGAGCTC(SEQ ID NO:60)
F4：GACCTTATGCTGAGGAAAAGCTGTCATTCTAG(SEQ ID NO:61)
R4：GGCCATTTATTTCAGAGTTTAGATCGCTATGC(SEQ ID NO:62)
在含有1x缓冲液Q5、1x增强子Q5、200μM dNTP、0.5μM每种引物、1.0μQ5聚合酶和300ng细胞gDNA的反应物中产生扩增。循环条件如下所示：98℃持续4分钟，1个循环，98℃持续30秒、68℃持续20秒、72℃持续15秒，35个循环，72℃持续2分钟，1个循环，4℃保持。
使用PicoGreen(ThermoFisher Scientific，P7589)扩增原始PCR产物，然后合并每个样品。然后通过NGS分析合并的PCR产物的indel。
在APC 11-12L.330中添加NES似乎略微降低了核indels的发生率(图8)，并且添加MVMp NS2 NES似乎完全消除了核inde(图9)。
在包含核染色体上mtDNA序列片段的人类基因组的背景下，MIT 25-26x.91核酸酶的中靶(核)indel效率是，具有NLS的34.1％、具有MTP的0.5％以及具有MTP和MVMp NS2 NES的0.1％(图10)。仅具有NLS的检测到核脱靶编辑(<1％)，具有MTP或者MTP和MVMp NS2 NES无可检测水平的脱靶编辑。
MVMp NS2 NES是线粒体靶向的工程化大范围核酸酶的高效补充，可缓解潜在的核脱靶编辑问题。
实施例6：在Cybrid细胞中的核酸酶功效和功能
本实验的目的是在携带异质MELAS突变(m.3243A>G)的细胞系中显示MIT 25-26x.91核酸酶的功效。使用的细胞系是cybrid(细胞质杂合体)，其含有野生型和突变mtDNA。特别是，细胞系是91％的突变体——也就是说，91％的mtDNA群含有突变等位基因，9％含有野生型等位基因。
使用Lonza 4D-NucleofectorTM(SF缓冲液，条件CA-137)，在剂量滴定范围内，使用工程化大范围核酸酶mRNA核转染8e5个MELAS cybrid细胞。工程化大范围核酸酶mRNA剂量初始为1e5个RNA拷贝/细胞；这相当于共计8e10 RNA拷贝或94.8ng RNA。然后，将mRNA按照1:10系列稀释至1e2个RNA拷贝/细胞。在核转染后一天收集细胞用于gDNA提取，并使用Beckman Coulter CytoFlex S细胞仪评估转染效率。转染效率超过95％。使用MachereyNagel NucleoSpin Blood QuickPure试剂盒分离gDNA。将细胞保持到其他时间点(第4天、第7天和第11天)用于gDNA提取和功能分析。
数字液滴PCR(ddPCR)用于确定mtDNA的异质性水平，以及相对于核DNA(nuDNA)的mtDNA拷贝数。这是使用P1、F1和R1产生结合位点周围的扩增子(测定1)，P2、F2和R2产生用作mtDNA计数器的参考扩增子(测定2)，以及P3、F3和R3产生用作nuDNA计数器的核参考扩增子(测定3)来实现的。测定1中阳性液滴的数量相对于测定2中阳性液滴的数量用于确定细胞中的异质性水平。测定2中阳性液滴的数量相对于测定3中阳性液滴的数量用于测定细胞中的mtDNA拷贝数。然后基于MTS-GFP(对照)条件对该比率进行归一化，并将所得的归一化拷贝数乘以异质性水平，以产生图11-14所示的数据。在这些图中，柱子的高度指示相对于MTS-GFP细胞的mtDNA损失。在柱子内，灰色的相对百分比对应于存在的野生型mtDNA的相对百分比，而黑色的相对百分比对应于存在的突变mtDNA的相对百分比。
P1：TGGCAGGGCCCGGT(SEQ ID NO:63)
F1：CCCAAGAACAGGGTTTGTTAAG(SEQ ID NO:64)
R1：GGAATGCCATTGCGATTAG(SEQ ID NO:65)
P2：AGCAGTTCTACCGTACAACCCTAACA(SEQ ID NO:66)
F2：GGCAGTTGAGGTGGATTA(SEQ ID NO:67)
R2:GGAATGCGGTAGTAGTTAGG(SEQ ID NO:68)
P3：CCAGCAGGCCAGGTACACC(SEQ ID NO:52)
F3：ACCGCCAAGGATGCAC(SEQ ID NO:53)
R3：GCGGGTGGGAATGGAG(SEQ ID NO:54)
测定1和测定2在含有1x ddPCR Supermix for Probes(无dUTP,BioRad)、250nM每种探针、900nM每种引物、20U/μL Hind-III HF(NEB)和0.225ng细胞gDNA的反应物中多重测定。使用QX100液滴发生器(BioRad)产生液滴。循环条件如下所示：95℃(2℃/s变温)持续10分钟，1个循环，94℃(2℃/s变温)持续10秒、59.2℃(2℃/s变温)持续30秒、72C(0.2℃/s变温)持续1分钟，45个循环，98℃持续10分钟，1个循环，4℃保持。使用QX200液滴读取器(BioRad)分析液滴，并使用QuantaSoft分析软件(BioRad)获取和分析数据。
测定3在24μL反应物中单路运行，该反应物包含1x ddPCR Supermix for Probes(无dUTP,BioRad)、250nM每种探针、900nM每种引物、20U/μL Hind-III HF(NEB)和90ng细胞gDNA。使用QX100液滴发生器(BioRad)产生液滴。循环条件如下所示：95℃(2℃/s变温)持续10分钟，1个循环，94℃(2℃/s变温)持续10秒、59.2℃(2℃/s变温)持续30秒、72C(0.2℃/s变温)持续1分钟，45个循环，98℃持续10分钟，1个循环，4℃保持。使用QX200液滴读取器(BioRad)分析液滴，并使用QuantaSoft分析软件(BioRad)获取和分析数据。
在转染后第11天，将5e3个细胞接种到96孔Seahorse细胞培养微孔板中，用于在Seahorse XFe96分析仪(Agilent)上进行分析。XF传感器盒也在非CO2培养箱中用200μL/孔Seahorse XF Calibrant水合过夜。次日(第12天)，将97mL Seahorse测定培养基(DMEM)与1mL 1mM丙酮酸钠、1mL 2mM谷氨酰胺和1mL 10mM葡萄糖混合。用制备的培养基洗涤细胞两次，然后将其置于非CO2培养箱中1小时。根据制造商说明重构一个细胞线粒体压力测试试剂盒。溶液由寡霉素(15μM)、FCCP(5μM)和鱼藤酮/抗霉素A(5μM)组成。对于细胞线粒体压力测试，将20μL寡霉素溶液添加到水合盒的所有端口A，将22μL FCCP溶液添加到所有端口B，将24μL鱼藤酮/抗霉素A添加到所有端口C。对于ATP速率测定，使用相同的储备溶液。对于该测定，将20μL寡霉素溶液添加到所有端口A，将22μL鱼藤酮/抗霉素A添加到所有端口B，将24μL Seahorse测定培养基添加到所有端口C。对基线、寡霉素、FCCP和鱼藤酮/抗霉素A进行4个测量循环(03:00混合、00:00等待、03:00测量)的测定。使用Wave软件(Agilent)分析OCR和PER值。使用Wave软件(Agilent)生成细胞线粒体压力测试和ATP速率测定报告。
测定完成后，用标准培养基中1:5000稀释的Hoechst 33342溶液(ThermoFisher，H3570)对细胞进行染色。将细胞在37℃下孵育20分钟，然后使用ImageXpress Pico自动细胞成像系统(Molecular Devices)通过图像细胞计数进行分析。然后使用Wave软件(Agilent)将OCR和PER值归一化为细胞计数。
如图11中所示，线粒体靶向的工程化大范围核酸酶(MTEM)的更高剂量导致mtDNA拷贝的更大损失。早在转染后的第1天，异质性就已经开始改变。在第4天，细胞仍在从最初的mtDNA减少中恢复，特别是在高剂量下(1e5个RNA拷贝/细胞)(图12)。在1e4个RNA拷贝/细胞条件下，异质性已经完全改变(细胞是100％野生型)。在第7天，在所有条件下，细胞的mtDNA拷贝数都恢复到对照水平(图13)。在两个最高剂量(1e5个RNA拷贝/细胞和1e4个RNA拷贝/细胞)下，异质性发生了100％的改变。在1e3个RNA拷贝/细胞的剂量下，异质性已经转变为约55％的突变体。1e2个RNA拷贝/细胞不改变异质性。在第11天，细胞在所有条件下都恢复了mtDNA拷贝数至对照水平(图14)。在两个最高剂量(1e5个RNA拷贝/细胞和1e4个RNA拷贝/细胞)下，异质性发生了100％的改变。在1e3个RNA拷贝/细胞的剂量下，异质性已经转变为约55％的突变体。1e2个RNA拷贝/细胞不改变异质性。
在细胞线粒体压力测试中，MTEM处理的细胞表现出异质性的完全转变(1e5个RNA拷贝/细胞)，与未处理的细胞(模拟)相比，基础呼吸增加了53％，最大呼吸增加了46％(图15)。
在ATP速率测定中，MTEM处理的细胞表现出异质性的完全转变(1e5个RNA拷贝/细胞)，其总ATP产量比未处理细胞(模拟)增加17％(图16)。
在ATP速率测定中，MTEM处理的细胞表现出异质性的完全转变(1e5个RNA拷贝/细胞)，其线粒体ATP产量比未处理细胞(模拟)增加88％(图17)。
糖酵解和OXPHOS对ATP产量的相对贡献可以在图18的能量图中可视化。MTEM处理的细胞表现出异质性的完全转变(1e5 RNA拷贝/细胞)，与未处理细胞(模拟)相比，展示出OXPHOS对ATP的贡献更大。
使用本文所述的MIT 25-26大范围核酸酶在患病的Cybrid细胞中非常有效地转变了异质性。这种转变导致氧消耗、ATP产量和OXPHOS ATP产量的显著功能性改善。与未处理细胞相比，用线粒体靶向的工程化大范围核酸酶处理的细胞能够更容易地利用氧气通过OXPHOS产生ATP。
实施例7：线粒体定位
本实验的目的是当蛋白上的核定位信号(NLS)被线粒体转运肽(MTP)取代时可视化工程化大范围核酸酶的定位。
使用Lonza 4D-NucleofectorTM(SF缓冲液，条件CA-137)用1e6个RNA拷贝/细胞工程化大范围核酸酶mRNA核转染8e5个MELAS cybrid细胞。比较了两种工程化大范围核酸酶构建体：一种没有靶向序列，一种在蛋白的N末端有MTP。在核转染后24小时，用50nMMitoTrackerTM Deep Red FM(ThermoFisher Scientific,M22426)和Hoechst 33342(1:5000稀释)对细胞进行30分钟的染色。使用Zeiss显微镜使用63x Z堆栈图像对细胞进行成像。
在没有靶向序列的情况下，工程化大范围核酸酶染色似乎弥散在整个细胞质和细胞核中(图19)。然而，当与线粒体转运肽融合时，工程化大范围核酸酶染色呈现点状，并与MitoTracker染色重叠(图20)。当附接到MTP时，工程化大范围核酸酶似乎没有任何核定位。
通过添加N末端MTP，工程化大范围核酸酶有效地定位于线粒体。
实施例8：线粒体靶向的大范围核酸酶活性和特异性评价
本实验的目的是评价在线粒体环状DNA中携带m.3243A>G突变的MELAS细胞中用于中靶(突变m.3243G编辑)的各种MIT 25-26核酸酶，并评价用于WT线粒体环状DNA的核酸酶的潜在脱靶编辑(m.3243A活性)。因此，在本实验中使用的细胞系含有100％突变mtDNA(m.3243A＞G突变)或100％野生型mtDNA(m.3243A)。线粒体基因组是环形的，线性DNA被迅速清除。因此，如果核酸酶切割其预期的中靶识别序列，环状mtDNA将线性化并被线粒体消除。核酸酶的特异性可以通过测定核酸酶转染后剩余的环状野生型mtDNA序列的量来评估。WT DNA序列的非特异性切割量指示脱靶活性，因为WT和突变DNA仅相差单个碱基对。由于突变和野生型mtDNA序列仅相差单个核苷酸，因而有必要鉴定一种能够在不破坏WT mtDNA的情况下强力切割和消除突变mtDNA的酶。将两种细胞系用于该分析：一种是同质突变体(100％突变体)，一种是同质WT(0％突变体)。使用四种对照构建体：模拟、MTS-GFP，在线粒体基因组MTS-APC 11-12L.330中没有识别序列的大范围核酸酶以及核酸酶活性死亡的大范围核酸酶MTS-MIT 25-26x.91KO。在实验中比较了以下十种MTS-MIT 25-26核酸酶：MTS-MIT 25-26x.29(SEQ ID NO:6)、MTS-MIT 25-26x.37(SEQ ID NO:7)、MTS-MIT 25-26x.73(SEQ ID NO:5)、MTS-MIT 25-26x.91(SEQ ID NO:3)、MTS-MIT 25-26x.84、MTS-MIT 25-26L.35(SEQ ID NO:8)、MTS-MIT 25-26L.35 19A>S(SEQ ID NO:10)、MTS-MIT 25-26x.9146H>W(SEQ ID NO:12)、MTS-MIT 25-26x.91 259H>Q(SEQ ID NO:9)和MTS-MIT 25-26x.91263T>R(SEQ ID NO:11)。
使用Lonza 4D-NucleofectorTM(SF缓冲液，条件CA-137)用1.5e5个RNA拷贝/细胞(142ng)的工程化大范围核酸酶mRNA核转染8e5个MELAS cybrid细胞(100％突变或0％突变)。沿时间进程(第6、24、48和72小时)收集细胞用于gDNA提取。使用Macherey NagelNucleoSpin Blood QuickPure试剂盒分离gDNA。在核转染后一天收集细胞，使用Beckman-Colter CytoFlex S细胞仪评估转染效率。转染效率超过95％。
数字液滴PCR(ddPCR)用于确定mtDNA切割(在MIT 25-26结合位点的线性化mtDNA)，以及相对于核DNA(nuDNA)的mtDNA拷贝数。这是使用P1、F1和R1产生结合位点周围的扩增子(测定1)，P2、F2和R2产生用作mtDNA计数器的参考扩增子(测定2)，以及P4、F4和R4产生用作nuDNA计数器的核参考扩增子(测定3)实现的。测定1中阳性液滴的数量相对于测定2中阳性液滴的数量用于确定线性化mtDNA分子与环形mtDNA分子的比率。测定2中阳性液滴的数量相对于测定3中阳性液滴的数量用于确定细胞中的mtDNA拷贝数。
P1：TGGCAGGGCCCGGT(SEQ ID NO:63)
F1：CCCAAGAACAGGGTTTGTTAAG(SEQ ID NO:64)
R1：GGAATGCCATTGCGATTAG(SEQ ID NO:65)
P2：AGCAGTTCTACCGTACAACCCTAACA(SEQ ID NO:66)
F2：GGCAGTTGAGGTGGATTA(SEQ ID NO:67)
R2：GGAATGCGGTAGTAGTTAGG(SEQ ID NO:68)
P4：AACCAGACAAATCGCTCCACCAAC(SEQ ID NO:69)
F4：CGGACAGGATTGACAGATT(SEQ ID NO:70)
R4：CCAGAGTCTCGTTCGTTATC(SEQ ID NO:71)
测定1和测定2在含有1x ddPCR Supermix for Probes(无dUTP,BioRad)、250nM每种探针、900nM每种引物、20U/μL Hind-III HF(NEB)和0.225ng细胞gDNA的24μL反应物中多重测定。使用QX100液滴发生器(BioRad)产生液滴。循环条件如下所示：95℃(2℃/s变温)持续10分钟，1个循环，94℃(2℃/s变温)持续10秒、59.2℃(2℃/s变温)持续30秒、72C(0.2℃/s变温)持续1分钟，45个循环，98℃持续10分钟，1个循环，4℃保持。使用QX200液滴读取器(BioRad)分析液滴，并使用QuantaSoft分析软件(BioRad)获取和分析数据。
测定2和测定3在含有1x ddPCR Supermix for Probes(无dUTP,BioRad)、250nM每种探针、900nM每种引物、20U/μL Hind-III HF(NEB)和0.225ng细胞gDNA的24μL反应物中多重测定。使用QX100液滴发生器(BioRad)产生液滴。循环条件如下所示：95℃(2℃/s变温)持续10分钟，1个循环，94℃(2℃/s变温)持续10秒、59.2℃(2℃/s变温)持续30秒、72C(0.2℃/s变温)持续1分钟，45个循环，98℃持续10分钟，1个循环，4℃保持。使用QX200液滴读取器(BioRad)分析液滴，并使用QuantaSoft分析软件(BioRad)获取和分析数据。
图21显示，在6小时时，环状mtDNA与总mtDNA(线性和环状)的比率显著降低，表明所有测试的核酸酶对突变体m.3243GmtDNA序列的强大的切割活性。在环状DNA切割后，DNA立即线性化并被线粒体清除，并且只有剩余的未切割或复制的环状mtDNA被检测到，如6小时后环状mtDNA的逐渐增加所示。突变mtDNA的这种减少也可以通过总mtDNA与核糖体18sDNA序列的比率来可视化，这表明每种核酸酶都能够在转染后24小时几乎完全消除所有突变mtDNA(图22)。然而，如图23和图24所示，不同的核酸酶在突变体mtDNA和野生型mtDNA之间的特异性不同。这种特异性的差异通过被切割并随后消除的WT mtDNA的量来显示，这表明不同的核酸酶具有不同的区分WT m.3243A序列的能力。特别是，MIT 25-26L.35 19A>S大范围核酸酶和MIT 25-26x.91 259H>Q核酸酶表现出中靶活性与四个对照组相比在其线性化和耗竭WT mtDNA的能力方面在统计学上不显著，表明高度的特异性。而相反的是，MTS26-26x.84核酸酶不能充分区分突变mtDNA和野生型mtDNA，因为转染后48小时几乎所有的mtDNA都被清除(图24)。其他数据集表明，MIT MTS 25-26x.91 259H>Q是最具特异性的核酸酶，因为在所有时间点，就mtDNA拷贝数和mtDNA线性化而言，其相对于四个对照组在统计学上不显著(图25和图26以及表7和表8)。
针对图22-26的每个时间点的统计学显著性分别如表4-8所示。
表4：在100％突变-mtDNA拷贝数细胞中总mtDNA与核糖体18s DNA序列的比率的统计学显著性
核酸酶 第6小时 第24小时 第48小时 第72小时
MTS MIT 25-26x.29 ** N/A **** ****
MTS MIT 25-26x.37 * N/A **** ****
MTS MIT 25-26x.73 ** N/A **** ****
MTS MIT 25-26x.91 *** N/A **** ****
MTS MIT 25-26L.35 *** N/A **** ****
MTS MIT 25-26x.84 *** N/A **** ****
MTS MIT 25-26L.35 19A＞S **** N/A **** ****
MTS MIT 25-26x.91 46H＞W * N/A **** ****
MTS MIT 25-26x.91 259H＞Q ** N/A **** ****
MTS MIT 25-26x.91 263T＞R ** N/A **** ****
星号(*)表示具有相同星号数量的细胞之间的统计学显著性。N/A-由于有两个重复因而无法计算24小时的统计数据
表5：在0％突变-mtDNA拷贝数细胞中完整环状mtDNA与总mtDNA的比率的统计学显著性
核酸酶 第6小时 第24小时 第48小时 第72小时
MTS MIT 25-26x.29 **** *** * ns
MTS MIT 25-26x.37 **** ns ns ns
MTS MIT 25-26x.73 **** *** ns ns
MTS MIT 25-26x.91 **** ns ns ns
MTS MIT 25-26L.35 ns ns ** ns
MTS MIT 25-26x.84 **** **** **** ****
MTS MIT 25-26L.35 19A＞S ns ns ns ns
MTS MIT 25-26x.91 46H＞W **** ns ns ns
MTS MIT 25-26x.91 259H＞Q ns ns ns ns
MTS MIT 25-26x.91 263T＞R **** ns ns ns
星号(*)表示具有相同星号数量的细胞之间的统计学显著性。ns符号表示任何其他条件之间没有统计学差异。
表6：在0％突变-mtDNA拷贝数细胞中总mtDNA与核糖体18s DNA序列的比率的统计学显著性
星号(*)表示具有相同星号数量的细胞之间的统计学显著性。ns符号表示任何其他条件之间没有统计学差异。
表7：在0％突变-mtDNA拷贝数细胞中总mtDNA与核糖体18s DNA序列的比率的统计学显著性
/>
星号(*)表示具有相同星号数量的细胞之间的统计学显著性。ns符号表示任何其他条件之间没有统计学差异。
表8：在0％突变-mtDNA拷贝数细胞中完整环状mtDNA与总mtDNA的比率的统计学显著性
星号(*)表示具有相同星号数量的细胞之间的统计学显著性。ns符号表示任何其他条件之间没有统计学差异。
实施例9：线粒体靶向的核酸酶mRNA转染后在m.3243G突变细胞中的分子改变
本实验的目的是在携带异质MELAS突变(m.3243A＞G)的细胞系中显示MIT 25-26x.91核酸酶的功效。使用的细胞系是cybrid(细胞质杂合体)，其含有野生型和突变mtDNA。特别是，细胞系是96％的突变体——也就是说，96％的mtDNA群含有突变等位基因，6％含有野生型等位基因。
使用Lonza 4D-NucleofectorTM(SF缓冲液，条件CA-137)，在剂量滴定范围内，使用工程化大范围核酸酶mRNA核转染8e5个MELAS cybrid细胞。工程化大范围核酸酶mRNA剂量初始为1e5个RNA拷贝/细胞；这相当于共计8e10个RNA拷贝或94.8ng RNA。然后，将mRNA按照1:10系列稀释至1e2个RNA拷贝/细胞。在核转染后一天收集细胞用于gDNA提取，并使用Beckman Coulter CytoFlex S细胞仪评估转染效率。转染效率超过95％。使用MachereyNagel NucleoSpin Blood QuickPure试剂盒分离gDNA。将细胞保持到其他时间点(第4天和第7天)用于gDNA提取和功能分析。
数字液滴PCR(ddPCR)用于确定mtDNA的异质性水平，以及相对于核DNA(nuDNA)的mtDNA拷贝数。这是使用P1、F1和R1产生结合位点周围的扩增子(测定1)，P2、F2和R2产生用作mtDNA计数器的参考扩增子(测定2)，以及P4、F4和R4产生用作nuDNA计数器的核参考扩增子(测定3)来实现的。测定1中阳性液滴的数量相对于测定2中阳性液滴的数量用于确定细胞中的异质性水平。测定2中阳性液滴的数量相对于测定3中阳性液滴的数量用于测定细胞中的mtDNA拷贝数。然后基于MTS-GFP(对照)条件对该比率进行归一化，并将所得的归一化拷贝数乘以异质性水平，以产生图27-29所示的数据。在这些图中，柱子的高度指示相对于MTS-GFP细胞的mtDNA损失。在柱子内，灰色的相对百分比对应于存在的野生型mtDNA的相对百分比，而黑色的相对百分比对应于存在的突变mtDNA的相对百分比。
P1：TGGCAGGGCCCGGT(SEQ ID NO:63)
F1：CCCAAGAACAGGGTTTGTTAAG(SEQ ID NO:64)
R1：GGAATGCCATTGCGATTAG(SEQ ID NO:65)
P2：AGCAGTTCTACCGTACAACCCTAACA(SEQ ID NO:66)
F2：GGCAGTTGAGGTGGATTA(SEQ ID NO:67)
R2：GGAATGCGGTAGTAGTTAGG(SEQ ID NO:68)
P4：AACCAGACAAATCGCTCCACCAAC(SEQ ID NO:69)
F4：CGGACAGGATTGACAGATT(SEQ ID NO:70)
R4：CCAGAGTCTCGTTCGTTATC(SEQ ID NO:71)
测定1和测定2在含有1x ddPCR Supermix for Probes(无dUTP,BioRad)、250nM每种探针、900nM每种引物、20U/μL Hind-III HF(NEB)和0.225ng细胞gDNA的24μL反应物中多重测定。使用QX100液滴发生器(BioRad)产生液滴。循环条件如下所示：95℃(2℃/s变温)持续10分钟，1个循环，94℃(2℃/s变温)持续10秒、59.2℃(2℃/s变温)持续30秒、72C(0.2℃/s变温)持续1分钟，45个循环，98℃持续10分钟，1个循环，4℃保持。使用QX200液滴读取器(BioRad)分析液滴，并使用QuantaSoft分析软件(BioRad)获取和分析数据。
测定2和测定3在含有1x ddPCR Supermix for Probes(无dUTP,BioRad)、250nM每种探针、900nM每种引物、20U/μL Hind-III HF(NEB)和0.225ng细胞gDNA的24μL反应物中多重测定。使用QX100液滴发生器(BioRad)产生液滴。循环条件如下所示：95℃(2℃/s变温)持续10分钟，1个循环，94℃(2℃/s变温)持续10秒、59.2℃(2℃/s变温)持续30秒、72C(0.2℃/s变温)持续1分钟，45个循环，98℃持续10分钟，1个循环，4℃保持。使用QX200液滴读取器(BioRad)分析液滴，并使用QuantaSoft分析软件(BioRad)获取和分析数据。
在转染后第7天，将4e3个细胞接种到96孔Seahorse细胞培养微孔板中，用于在Seahorse XFe96分析仪(Agilent)上进行分析。XF传感器盒也在非CO2培养箱中用200μL/孔Seahorse XF Calibrant水合过夜。次日(第8天)，将97mL Seahorse测定培养基(DMEM)与1mL 1mM丙酮酸钠、1mL 2mM谷氨酰胺和1mL 10mM葡萄糖混合。用制备的培养基洗涤细胞两次，然后将其置于非CO2培养箱中1小时。根据制造商的说明重构一个细胞线粒体压力测试试剂盒。溶液由寡霉素(15μM)、FCCP(5μM)和鱼藤酮/抗霉素A(5μM)组成。对于细胞线粒体压力测试，将20μL寡霉素溶液添加到水合盒的所有端口A，将22μL FCCP溶液添加到所有端口B，将24μL鱼藤酮/抗霉素A添加到所有端口C。对于ATP速率测定，使用相同的储备溶液。对于该测定，将20μL寡霉素溶液添加到所有端口A，将22μL鱼藤酮/抗霉素A添加到所有端口B，将24μL Seahorse测定培养基添加到所有端口C。对基线、寡霉素、FCCP和鱼藤酮/抗霉素A进行4个测量循环(03:00混合、00:00等待、03:00测量)的测定。使用Wave软件(Agilent)分析OCR和PER值。使用Wave软件(Agilent)生成细胞线粒体压力测试和ATP速率测定报告。
测定完成后，用标准培养基中1∶5000稀释的Hoechst 33342溶液(ThermoFisher，H3570)对细胞进行染色。将细胞在37℃下孵育20分钟，然后使用ImageXpress Pico自动细胞成像系统(Molecular Devices)通过图像细胞计数进行分析。然后使用Wave软件(Agilent)将OCR和PER值归一化为细胞计数。
如图27中所示，线粒体靶向的工程化大范围核酸酶(MTEM)的更高剂量导致mtDNA拷贝的更大损失。仅在第1天的两个最高mRNA剂量下，这种mtDNA减少具有统计学意义(表9)。观察到的mtDNA耗竭对应于突变mtDNA的选择性切割。用三种最高mRNA剂量处理的细胞在所有时间点都表现出突变mtDNA的显著损失(表9、表10、表11)。在消除突变mtDNA后，发现剩余的WT mtDNA重新填充细胞(图28和图29)。到第7天，用最高mRNA剂量处理的细胞中只剩下0.5％的突变mtDNA(图29)。在所有时间点用两种最高mRNA剂量以及在第4天和第7天用1e3个RNA拷贝/细胞剂量处理的细胞中存在的WT mtDNA的量显著增加(表9、表10、表11)。
表9：在第1天不同剂量的大范围核酸酶mRNA剂量下WT DNA量的统计学显著性
ns：P＞0.05，*：P≤0.05，**：P≤0.01，***：P≤0.001，****：P≤0.0001.
表10：在第4天不同剂量的大范围核酸酶mRNA剂量下WT DNA量的统计学显著性
条件 mtDNA拷贝数 突变mtDNA百分比 WT mtDNA百分比
模拟 ns ns ns
1x105个RNA拷贝/细胞 ns **** ****
1x104个RNA拷贝/细胞 ns **** ****
1x103个RNA拷贝/细胞 ns *** ***
1x102个RNA拷贝/细胞 ns ns ns
ns：P＞0.05，*：P≤0.05，**：P≤0.01，***：P≤0.001，****：P≤0.0001.
表11：在第7天不同剂量的大范围核酸酶mRNA剂量下WT DNA量的统计学显著性
条件 mtDNA拷贝数 突变mtDNA百分比 WT mtDNA百分比
模拟 ns ns ns
1x105个RNA拷贝/细胞 ns **** ****
1x104个RNA拷贝/细胞 ns **** ****
1x103个RNA拷贝/细胞 ns *** ***
1x102个RNA拷贝/细胞 ns ns ns
ns：P＞0.05，*：P≤0.05，**：P≤0.01，***：P≤0.001，****：P≤0.0001.
在细胞线粒体压力测试中，MTEM处理的细胞表现出异质性的完全转变(1e5个RNA拷贝/细胞)，与GFP处理细胞相比，基础呼吸增加2.15x，最大呼吸增加2.03x(图30)。
在ATP速率测定中，MTEM处理的细胞表现出异质性的完全转变(1e5个RNA拷贝/细胞)，其线粒体ATP产量比GFP处理细胞增加2.23x(图31)。
使用本文所述的MIT 25-26大范围核酸酶在高百分比突变患病的cybrid细胞中非常有效地转变了异质性。这种变化导致基础呼吸速率(图32)、最大呼吸速率(见图33)和线粒体ATP产量(图34)的显著功能性改善。与未处理的细胞相比，用线粒体靶向的工程化大范围核酸酶处理的细胞能够更容易地利用氧气通过氧化磷酸化产生ATP。
实施例10：线粒体靶向的核酸酶mRNA转染后在96％m.3243G突变细胞中的分子改变
本实验的目的是在携带异质性MELAS突变(m.3243A>G)的细胞系中显示MIT 25-26x.91 259H>Q大范围核酸酶的效力，并确定大范围核酸酶诱导的瞬时mtDNA耗竭是否对细胞呼吸产生负面影响。使用的细胞系是cybrid(细胞质杂合体)，其含有野生型和突变mtDNA。特别是，细胞系是96％的突变体——也就是说，96％的mtDNA群含有突变等位基因，6％含有野生型等位基因。
使用Lonza 4D-NucleofectorTM(SF缓冲液，条件CA-137)，在剂量滴定范围内，使用工程化大范围核酸酶mRNA核转染8e5个MELAS cybrid细胞。工程化大范围核酸酶mRNA剂量初始为1e5个RNA拷贝/细胞；这相当于共计8e10个RNA拷贝或94.8ng RNA。然后，将mRNA按照1:10系列稀释至1e2个RNA拷贝/细胞。在核转染后一天、三天和七天收集细胞用于gDNA提取和Seahorse细胞线粒体压力测试评价。使用Macherey Nagel NucleoSpin BloodQuickPure试剂盒分离gDNA。
数字液滴PCR(ddPCR)用于确定mtDNA的异质性水平，以及相对于核DNA(nuDNA)的mtDNA拷贝数。这是使用P1、F1和R1产生结合位点周围的扩增子(测定1)，P2、F2和R2产生用作mtDNA计数器的参考扩增子(测定2)，以及P4、F4和R4产生用作nuDNA计数器的核参考扩增子(测定3)来实现的。测定1中阳性液滴的数量相对于测定2中阳性液滴的数量用于确定细胞中的异质性水平。测定2中阳性液滴的数量相对于测定3中阳性液滴的数量用于测定细胞中的mtDNA拷贝数。然后基于MTS-GFP(对照)条件对该比率进行归一化，并将所得的归一化拷贝数乘以异质性水平，以产生图35、图37和图39所示的数据。在这些图中，柱子的高度指示相对于MTS-GFP细胞的mtDNA损失。在柱子内，灰色的相对百分比对应于存在的野生型mtDNA的相对百分比，而黑色的相对百分比对应于存在的突变mtDNA的相对百分比。
P1：TGGCAGGGCCCGGT(SEQ ID NO:63)
F1：CCCAAGAACAGGGTTTGTTAAG(SEQ ID NO:64)
R1：GGAATGCCATTGCGATTAG(SEQ ID NO:65)
P2：AGCAGTTCTACCGTACAACCCTAACA(SEQ ID NO:66)
F2：GGCAGTTGAGGTGGATTA(SEQ ID NO:67)
R2：GGAATGCGGTAGTAGTTAGG(SEQ ID NO:68)
P4：AACCAGACAAATCGCTCCACCAAC(SEQ ID NO:69)
F4：CGGACAGGATTGACAGATT(SEQ ID NO:70)
R4：CCAGAGTCTCGTTCGTTATC(SEQ ID NO:71)
测定1和测定2在含有1x ddPCR Supermix for Probes(无dUTP,BioRad)、250nM每种探针、900nM每种引物、20U/μL Hind-III HF(NEB)和0.225ng细胞gDNA的24μL反应物中多重测定。使用QX100液滴发生器(BioRad)产生液滴。循环条件如下所示：95℃(2℃/s变温)持续10分钟，1个循环，94℃(2℃/s变温)持续10秒、59.2℃(2℃/s变温)持续30秒、72C(0.2℃/s变温)持续1分钟，45个循环，98℃持续10分钟，1个循环，4℃保持。使用QX200液滴读取器(BioRad)分析液滴，并使用QuantaSoft分析软件(BioRad)获取和分析数据。
测定2和测定3在含有1x ddPCR Supermix for Probes(无dUTP,BioRad)、250nM每种探针、900nM每种引物、20U/μL Hind-III HF(NEB)和0.225ng细胞gDNA的24μL反应物中多重测定。使用QX100液滴发生器(BioRad)产生液滴。循环条件如下所示：95℃(2℃/s变温)持续10分钟，1个循环，94℃(2℃/s变温)持续10秒、59.2℃(2℃/s变温)持续30秒、72C(0.2℃/s变温)持续1分钟，45个循环，98℃持续10分钟，1个循环，4℃保持。使用QX200液滴读取器(BioRad)分析液滴，并使用QuantaSoft分析软件(BioRad)获取和分析数据。
在转染后第0、2和6天，将4e3个细胞接种到96孔Seahorse细胞培养微孔板中，用于在Seahorse XFe96分析仪(Agilent)上进行分析。XF传感器盒也在非CO2培养箱中用200μL/孔Seahorse XF Calibrant水合过夜。次日(第1、3和7天)，将97mL Seahorse测定培养基(DMEM)与1mL 1mM丙酮酸钠、1mL 2mM谷氨酰胺和1mL 10mM葡萄糖混合。用制备的培养基洗涤细胞两次，然后将其置于非CO2培养箱中1小时。根据制造商的说明重构一个细胞线粒体压力测试试剂盒。溶液由寡霉素(15μM)、FCCP(5μM)和鱼藤酮/抗霉素A(5μM)组成。对于细胞线粒体压力测试，将20μL寡霉素溶液添加到水合盒的所有端口A，将22μL FCCP溶液添加到所有端口B，将24μL鱼藤酮/抗霉素A添加到所有端口C。对基线、寡霉素、FCCP和鱼藤酮/抗霉素A进行4个测量循环(03:00混合、00:00等待、03:00测量)的测定。使用Wave软件(Agilent)分析OCR值。使用Wave软件(Agilent)生成细胞线粒体压力测试报告。
测定完成后，用标准培养基中1:5000稀释的Hoechst 33342溶液(ThermoFisher，H3570)对细胞进行染色。将细胞在37℃下孵育20分钟，然后使用ImageXpress Pico自动细胞成像系统(Molecular Devices)通过图像细胞术进行分析。然后使用Wave软件(Agilent)将OCR值归一化为细胞计数。
如图35中所示，线粒体靶向的工程化大范围核酸酶(MTEM)的更高剂量导致mtDNA拷贝的更大损失。仅在第1天的两个最高mRNA剂量下，这种mtDNA减少具有统计学意义(表12)。观察到的mtDNA耗竭对应于突变mtDNA的选择性切割。用三种最高mRNA剂量处理的细胞在所有时间点都表现出突变mtDNA的显著损失(表12、表13、表14)。在消除突变mtDNA后，发现剩余的WT mtDNA重新填充细胞(图37和图39)。到第7天，用最高mRNA剂量处理的细胞中只剩下0.3％的突变mtDNA(图39)。在所有时间点，用三种最高mRNA剂量处理的细胞中存在的WT mtDNA的量显著增加(表12、表13、表14)。
在细胞线粒体压力测试中，在第1天，MTEM处理细胞在基础OCR或最大OCR中都没有表现出统计学上显著的降低(表12)。到第3天，用三种最高mRNA剂量处理细胞的呼吸显著改善(表13)。到第7天，所有细胞群都显示出呼吸的统计学上的显著改善(图36、图38和图40，表12、表13和表14)。
使用本文所述的MIT 25-26大范围核酸酶在高百分比突变的cybrid细胞中有效地转变了异质性。诱导的转变导致短暂的mtDNA耗竭，不会对呼吸产生负面影响(图36、图38和图40)。到第3天，在处理的细胞中观察到基础呼吸和最大呼吸的改善(图38)。与未处理的细胞相比，用线粒体靶向的工程化大范围核酸酶处理的细胞能够更容易地利用氧气通过氧化磷酸化产生ATP，并且在瞬时mtDNA耗竭期间，这一过程不受影响。
表12：在第1天不同剂量的大范围核酸酶mRNA剂量下，WT DNA量、基础OCR和最大OCR的统计学导著性
ns：P＞0.05，*：P≤0.05，**：P≤0.01，***：P≤0.001，****：P≤0.0001.
表13：在第3天不同剂量的大范围核酸酶mRNA剂量下，WT DNA量、基础OCR和最大OCR的统计学显著性
ns：P＞0.05，*：P≤0.05，**：P≤0.01，***：P≤0.001，****：P≤0.0001.
表14：在第7天不同剂量的大范围核酸酶mRNA剂量下，WT DNA量、基础OCR和最大OCR的统计学显著性
ns：P＞0.05，*：P≤0.05，**：P≤0.01，***：P≤0.001，****：P≤0.0001.
实施例11：通过寡聚物捕获测定的大范围核酸酶脱靶分析
本实验的目的是确定可以被两种不同的MIT 25-26核酸酶切割的任何潜在的核脱靶位点：MIT 25-26x.91 259H＞Q和MIT 25-26L35 19A＞S。此前的数据表明，包含在蛋白N末端的MTP在实现线粒体定位方面非常有效，但我们有兴趣通过实验证明测试的工程化大范围核酸酶不会在细胞核DNA中引入任何脱靶DSB。
为了准确地确定核酸酶的核脱靶编辑，有必要将中靶序列作为阳性对照。由于MIT25-26结合位点在mtDNA中，因而在核DNA中不存在内源性中靶位点。因此，使用Flp-In293报告细胞系将MIT 25-26结合位点引入人细胞系的核染色体上。使用Neon转染系统(100μL吸头，条件11)，用1.5μg工程化大范围核酸酶mRNA和0.75μg的dsDNA寡核苷酸电穿孔1.5e6个这些Flp-In293报告细胞。在这种情况下，所使用的大范围核酸酶构建体在蛋白的N末端含有NLS。使用两种不同的大范围核酸酶：MIT 25-26x.91 259H>Q和MIT 25-256L.35 19A>S。没有大范围核酸酶的对照样品仅用dsDNA寡核苷酸转染。所有条件均一式两份测定。大范围核酸酶mRNA与dsDNA寡核苷酸的共转染允许通过插入寡核苷酸修复任何核DSB。在电穿孔后两天收集转染的细胞用于gDNA提取和寡核苷酸捕获分析。然后可以使用下面描述的寡核苷酸捕获测定来鉴定被切割的位点。
与GUIDE-seq类似，寡核苷酸捕获测定通过在细胞基因组DNA内的断裂位点捕获寡核苷酸来识别MIT 25-26大范围核酸酶产生的潜在脱靶位点。GUIDE-seq是为CRISPR-Cas9产生的DNA断裂而开发的，为了将该技术应用于目前的核酸酶，对化学和分析进行了一些关键的修改。与CRISPR-cas9不同，本文所述的工程化大范围核酸酶产生四个碱基对的3’突出端。为了适应这种差异，用于寡核苷酸捕获的寡核苷酸具有随机化的四个碱基对突出端，其可以与MIT 25-26大范围核酸酶产生的突出端兼容。由于连接粘性末端而不是平末端的效率更高，因此观察到更高的插入频率。如上所述，用编码核酸酶和双链DNA寡核苷酸的mRNA转染细胞。两天后，分离来自这些细胞的基因组DNA并进行超声处理以将DNA剪切成更小的尺寸。将寡核苷酸接头连接到剪切的DNA上，并使用PCR扩增一端含有接头而另一端含有捕获的寡核苷酸的任何DNA片段。将扩增的DNA纯化并且使用标准商业试剂盒制备测序文库。
使用V2 2x150试剂盒在Illumina MiSeq上运行测序文库。过滤数据并分析捕获寡核苷酸的有效位点，并预测潜在的脱靶位点。同样，需要将方案从用于CRISPR-cas9的PAM检索调整为MIT 25-26大范围核酸酶检索。用开发的软件检查每个序列以确保序列侧翼有接头和捕获的寡核苷酸，以验证其是有效的读长。该软件还检查PCR重复，并移除相同的读长，以帮助减少PCR偏倚。将序列读长与参考基因组比对，并扫描千碱基对窗口内的分组序列以寻找潜在的MIT 25-26大范围核酸酶位点。
每个MIT 25-26大范围核酸酶都是连接的二聚体。每个单体识别一个九碱基对半位点，在两个半位点之间的中心有一个四碱基对间隔序列。该软件在没有允许间隙的情况下为每个半位点寻找最接近的序列匹配。在脱靶选择中不考虑中间的四个碱基对，因为MIT25-26大范围核酸酶通常可以在靶位点的这些位置容忍更高量的简并量。该软件输出潜在脱靶位点的列表，具有组合的半位点中的碱基错配数量，但不计算中间的四个碱基对错配。该软件不会基于任何错配过滤消除任何脱靶，不像CRISPR-Cas9那样消除任何被识别为超过六个碱基对错配的脱靶。相反，在基因组内的脆弱点或热点随机捕获寡核苷酸产生的背景噪声可以通过两种方式减少。首先，还运行未处理的模拟样品，虽然可以从含有核酸酶的样品中减去寡核苷酸捕获和不存在核酸酶的整合位点的窗口。我们还发现，一式三份进行测定，并消除三次重复中至少两次不重复的任何位点，是从经验上消除随机积分噪音的好方法。
尽管读长计数与特定位点的切割频率不直接相关，但其通常可以突出显示可能更令人担忧或更有效的脱靶，因为其发生得更频繁。图41显示了一种以图形方式可视化寡聚物捕获数据作为潜在有效脱靶位点数量计量的方法。由特定核酸酶产生的每个脱靶都是基于在该位点排列的独特序列读长的数量绘制的。假定的脱靶位点和预期位点之间的碱基对错配的数量由色标表示，较深的颜色表示与预期靶位点更相似的位点(圈出)。对于具有高特异性的核酸酶，预期位点应该具有最高的读长计数。更好的核酸酶同时去除计数较高的位点(在图的右侧)和具有高相似性的位点(颜色较深的点)。
实施例12：在葡萄糖与半乳糖中培养对生长速率的影响
本实验的目的是确定当细胞在含半乳糖而不是含葡萄糖的培养基中生长时，工程化大范围核酸酶转染如何影响细胞增殖。在葡萄糖存在的情况下，尽管有丰富的氧气和功能性线粒体，但培养中的大多数细胞几乎完全依赖糖酵解来产生ATP。因此，在不改变细胞培养环境的情况下，不能在培养细胞中清楚地评价瞬时mtDNA缺失的功能性结局，从而使细胞必须依赖线粒体功能来产生ATP。为了做到这一点，细胞必须从含葡萄糖的培养基过渡到含半乳糖的培养基。半乳糖氧化为丙酮酸比葡萄糖慢，并且不会产生ATP的净增加。因此，在半乳糖中生长的细胞被迫依赖OXPHOS来产生ATP。
使用Lonza 4D-NucleofectorTM(SF缓冲液，条件CA-137)，利用工程化大范围核酸酶mRNA核转染8e5个含有96％突变m.3243A>G mtDNA的MELAS cybrid细胞。在1e5个RNA拷贝/细胞(94.8ng mRNA)的剂量下，使用的工程化大范围核酸酶是MIT 25-26x.91 259H>Q。使用未转染的对照，以及未转染的0％突变细胞系。转染后，立即将所有细胞接种到含有5mM半乳糖的培养基中。将总计2e3个细胞/孔接种在四个96孔的平底培养板上。
在转染后第1、2、3和4天，用Hoechst 33342溶液(ThermoFisher，H3570)在含半乳糖的培养基中以1:10000稀释对一板细胞进行染色。将细胞在37℃下孵育10分钟，然后使用ImageXpress Pico自动细胞成像系统(Molecular Devices)通过图像细胞计数进行分析，以确定细胞计数(图42)。到第4天，96％的突变未处理组中共有5,664±429个细胞，96％的突变处理组中有10,438±968个细胞，0％的突变未处理组中有20,891±2,320个细胞。细胞计数数据用于确定每个细胞群的倍增时间(图43)。在第2天，倍增时间为1.75天(96％突变未处理)、2.44天(96％突变处理)和1.00天(0％突变处理)。到第4天，倍增时间为3.55天(96％突变未处理)、1.37天(96％突变处理)和1.60天(0％突变未处理)。
在半乳糖存在的情况下，与0％的突变(WT)细胞相比，未处理的96％的突变cybrid细胞表现出受损的生长速率。通过用线粒体靶向的工程化大范围核酸酶处理，这种作用得到了部分挽救(图42)。
实施例13：大范围核酸酶编辑对小鼠异种移植物肿瘤模型中的异质性的影响
本实验的目的是确定在体内转变m.3243A>G异质性的效力。不幸的是，目前还没有这种特殊突变的动物模型。由于用于体外研究突变的细胞来源于癌细胞系，我们假设我们可以使用这些细胞产生异种移植小鼠模型。通过产生异种移植物，然后用AAV9包封的工程化大范围核酸酶系统治疗小鼠，我们试图观察肿瘤中的异质性转变是否可能。
将5e4个96％m.3243A>G突变cybrid细胞与Matrigel 1:1混合，并以总体积200uL皮下注射到裸鼠的右侧胁腹。总共注射了32只动物。通过卡尺测量每两周监测肿瘤生长进展。在第18天，根据肿瘤尺寸<～200mm3，共选择16只动物进行AAV9注射(图45)。所使用的大范围核酸酶是MIT 25-26x.91。将小鼠随机分配到四个组中，注射PBS(n＝4)、5e12个VG/kg(n＝4)、1e13个VG/kg(n＝4)或5e13个VG/kg(n＝4)。将小鼠经眶后注射到右眼。在整个研究的剩余时间里监测肿瘤生长，并在第35天处死所有动物。采集肿瘤的四个小切片(～3mm)进行gDNA分离。研究设计图如图44所示。
数字液滴PCR(ddPCR)用于确定mtDNA的异质性水平，以及相对于核DNA(nuDNA)的mtDNA拷贝数。这是使用P1、F1和R1产生结合位点周围的扩增子(测定1)，P2、F2和R2产生用作mtDNA计数器的参考扩增子(测定2)，以及P4、F4和R4产生用作nuDNA计数器的核参考扩增子(测定3)来实现的。测定1中阳性液滴的数量相对于测定2中阳性液滴的数量用于确定细胞中的异质性水平。测定2中阳性液滴的数量相对于测定3中阳性液滴的数量用于测定细胞中的mtDNA拷贝数。
P1：TGGCAGGGCCCGGT(SEQ ID NO:63)
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R4：CCAGAGTCTCGTTCGTTATC(SEQ ID NO:71)
测定1和测定2在含有1x ddPCR Supermix for Probes(无dUTP,BioRad)、250nM每种探针、900nM每种引物、20U/μL Hind-III HF(NEB)和0.225ng细胞gDNA的24μL反应物中多重测定。使用QX100液滴发生器(BioRad)产生液滴。循环条件如下所示：95℃(2℃/s变温)持续10分钟，1个循环，94℃(2℃/s变温)持续10秒、59.2℃(2℃/s变温)持续30秒、72C(0.2℃/s变温)持续1分钟，45个循环，98℃持续10分钟，1个循环，4℃保持。使用QX200液滴读取器(BioRad)分析液滴，并使用QuantaSoft分析软件(BioRad)获取和分析数据。
测定2和测定3在含有1x ddPCR Supermix for Probes(无dUTP,BioRad)、250nM每种探针、900nM每种引物、20U/μL Hind-III HF(NEB)和0.225ng细胞gDNA的24μL反应物中多重测定。使用QX100液滴发生器(BioRad)产生液滴。循环条件如下所示：95℃(2℃/s变温)持续10分钟，1个循环，94℃(2℃/s变温)持续10秒、59.2℃(2℃/s变温)持续30秒、72C(0.2℃/s变温)持续1分钟，45个循环，98℃持续10分钟，1个循环，4℃保持。使用QX200液滴读取器(BioRad)分析液滴，并使用QuantaSoft分析软件(BioRad)获取和分析数据。
注射AAV时，注射动物的肿瘤体积在47至217mm3之间(图45)。如图46中所示，在分离的肿瘤样品中存在的WT mtDNA的平均百分比为6.47％(PBS)、7.85％(5e12个VG/kg)、7.92％(1e13个VG/kg)和13.89％(5e13个VG/kg)。如图46中所示，5e13个VG/kg组中WTmtDNA的百分比相对于PBS处理的小鼠具有统计学意义。如图47中所示，相对于18S rDNA的平均mtDNA拷贝数为6.61(PBS)、7.78(5e12个VG/kg)、6.10(1e13个VG/kg)和7.41(5e13个VGg/kg)。AAV处理的组均未显示出mtDNA拷贝数的显著变化。
使用异种移植物小鼠模型，AAV9(包封的工程化大范围核酸酶)能够在体内转变m.3243A>G异质性。
实施例14：线粒体靶向的核酸酶mRNA转染后在85％突变m.3243G突变细胞中的分子改变
本实验的目的是在携带异质性MELAS突变(m.3243A>G)的细胞系中显示MIT 25-26x.91 259H>Q大范围核酸酶的效力，并确定大范围核酸酶诱导的瞬时mtDNA耗竭是否对细胞呼吸产生负面影响。使用的细胞系是cybrid(细胞质杂合体)，其含有野生型和突变mtDNA。特别是，细胞系是85％的突变体——也就是说，85％的mtDNA群含有突变等位基因，15％含有野生型等位基因。选择该细胞系是基于比实施例10中所述的突变mtDNA的百分比略低，其产生更类似WT的呼吸水平，因此由大范围核酸酶诱导的任何负面影响都可以检测到。
使用Lonza 4D-NucleofectorTM(SF缓冲液，条件CA-137)，在剂量滴定范围内，使用工程化大范围核酸酶mRNA核转染8e5个MELAS cybrid细胞。工程化大范围核酸酶mRNA剂量初始为1e5个RNA拷贝/细胞；这相当于共计8e10个RNA拷贝或94.8ng RNA。然后，将mRNA按照1:10系列稀释至1e2个RNA拷贝/细胞。在核转染后一天和三天收集细胞用于gDNA提取和Seahorse细胞线粒体压力测试评价。使用Macherey Nagel NucleoSpin Blood QuickPure试剂盒分离gDNA。
数字液滴PCR(ddPCR)用于确定mtDNA的异质性水平，以及相对于核DNA(nuDNA)的mtDNA拷贝数。这是使用P1、F1和R1产生结合位点周围的扩增子(测定1)，P2、F2和R2产生用作mtDNA计数器的参考扩增子(测定2)，以及P4、F4和R4产生用作nuDNA计数器的核参考扩增子(测定3)来实现的。测定1中阳性液滴的数量相对于测定2中阳性液滴的数量用于确定细胞中的异质性水平。测定2中阳性液滴的数量相对于测定3中阳性液滴的数量用于测定细胞中的mtDNA拷贝数。然后基于MTS-GFP(对照)条件对该比率进行归一化，并将所得的归一化拷贝数乘以异质性水平，以产生图35、图37和图39所示的数据。在这些图中，柱子的高度指示相对于MTS-GFP细胞的mtDNA损失。在柱子内，灰色的相对百分比对应于存在的野生型mtDNA的相对百分比，而黑色的相对百分比对应于存在的突变mtDNA的相对百分比。
P1：TGGCAGGGCCCGGT(SEQ ID NO:63)
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测定1和测定2在含有1x ddPCR Supermix for Probes(无dUTP,BioRad)、250nM每种探针、900nM每种引物、20U/μL Hind-III HF(NEB)和0.225ng细胞gDNA的24μL反应物中多重测定。使用QX100液滴发生器(BioRad)产生液滴。循环条件如下所示：95℃(2℃/s变温)持续10分钟，1个循环，94℃(2℃/s变温)持续10秒、59.2℃(2℃/s变温)持续30秒、72C(0.2℃/s变温)持续1分钟，45个循环，98℃持续10分钟，1个循环，4℃保持。使用QX200液滴读取器(BioRad)分析液滴，并使用QuantaSoft分析软件(BioRad)获取和分析数据。
测定2和测定3在含有1x ddPCR Supermix for Probes(无dUTP,BioRad)、250nM每种探针、900nM每种引物、20U/μL Hind-III HF(NEB)和0.225ng细胞gDNA的24μL反应物中多重测定。使用QX100液滴发生器(BioRad)产生液滴。循环条件如下所示：95℃(2℃/s变温)持续10分钟，1个循环，94℃(2℃/s变温)持续10秒、59.2℃(2℃/s变温)持续30秒、72C(0.2℃/s变温)持续1分钟，45个循环，98℃持续10分钟，1个循环，4℃保持。使用QX200液滴读取器(BioRad)分析液滴，并使用QuantaSoft分析软件(BioRad)获取和分析数据。
在转染后第0天，将9.6e3个细胞接种到96孔Seahorse细胞培养微孔板中，用于在Seahorse XFe96分析仪(Agilent)上进行分析。XF传感器盒也在非CO2培养箱中用200μL/孔Seahorse XF Calibrant水合过夜。在转染后第2天，将5e3个细胞接种到96孔Seahorse细胞培养微孔板中，用于在Seahorse XFe96分析仪(Agilent)上进行分析。XF传感器盒也在非CO2培养箱中用200μL/孔Seahorse XF Calibrant水合过夜。次日(第1天和第3天)，将97mLSeahorse测定培养基(DMEM)与1mL 1mM丙酮酸钠、1mL 2mM谷氨酰胺和1mL 10mM葡萄糖混合。用制备的培养基洗涤细胞两次，然后将其置于非CO2培养箱中1小时。根据制造商的说明重构一个细胞线粒体压力测试试剂盒。溶液由寡霉素(15μM)、FCCP(5μM)和鱼藤酮/抗霉素A(5μM)组成。对于细胞线粒体压力测试，将20μL寡霉素溶液添加到水合盒的所有端口A，将22μL FCCP溶液添加到所有端口B，将24μL鱼藤酮/抗霉素A添加到所有端口C。对基线、寡霉素、FCCP和鱼藤酮/抗霉素A进行4个测量循环(03:00混合、00:00等待、03:00测量)的测定。使用Wave软件(Agilent)分析OCR值。使用Wave软件(Agilent)生成细胞线粒体压力测试报告。
测定完成后，用标准培养基中1:5000稀释的Hoechst 33342溶液(ThermoFisher，H3570)对细胞进行染色。将细胞在37℃下孵育20分钟，然后使用ImageXpress Pico自动细胞成像系统(Molecular Devices)通过图像细胞计数进行分析。然后使用Wave软件(Agilent)将OCR值归一化为细胞计数。
如图48中所示，线粒体靶向的工程化大范围核酸酶(MTEM)的更高剂量导致mtDNA拷贝的更大损失。仅在第1天的最高mRNA剂量下，这种mtDNA减少具有统计学意义(表15)。观察到的mtDNA耗竭对应于突变mtDNA的选择性切割。用三种最高mRNA剂量处理的细胞在所有时间点都表现出突变mtDNA的显著损失(表15和表16)。在消除突变mtDNA后，发现剩余的WTmtDNA重新填充细胞(图48和图50)。到第3天，用最高mRNA剂量处理的细胞中只剩下0.2％的突变mtDNA(图50)。在这两个时间点，用三种最高mRNA剂量处理的细胞中存在的WT mtDNA的量显著增加(表15和表16)。
在第1天的细胞线粒体压力测试中，相对于GFP处理的对照，MTEM处理的细胞在基础或最大OCR方面没有表现出显著变化(表15)。第3天也是如此(表16)。尽管在第3天在高剂量处理的细胞中观察到异质性的完全转变，但呼吸没有统计学上的显著变化，这表明这里使用的细胞存在WT样呼吸，并且异质性的进一步转变不会导致线粒体功能的大变化。
使用本文所述的MIT 25-26大范围核酸酶在85％的突变cybrid细胞中有效地转变了异质性。诱导的转变导致短暂的mtDNA耗竭，不会对呼吸产生负面影响(图48和图50)，尽管这些细胞中存在WT样呼吸。这表明短暂的线粒体DNA耗竭不会对细胞呼吸产生负面影响。
表15：在第1天不同剂量的大范围核酸酶mRNA剂量下，WT DNA量、基础OCR和最大OCR的统计学显著性
ns：P＞0.05，*：P≤0.05，**：P≤0.01，***：P≤0.001，****：P≤0.0001.
表16：在第3天不同剂量的大范围核酸酶mRNA剂量下，WT DNA量、基础OCR和最大OCR的统计学显著性
ns：P＞0.05，*：P≤0.05，**：P≤0.01，***：P≤0.001，****：P≤0.0001.
实施例15：在葡萄糖与半乳糖中培养对细胞呼吸的影响
本实验的目的是确定当细胞在含半乳糖而不是含葡萄糖的培养基中生长时，工程化大范围核酸酶转染如何影响细胞呼吸。在葡萄糖存在的情况下，尽管有丰富的氧气和功能性线粒体，但培养中的大多数细胞几乎完全依赖糖酵解来产生ATP。因此，在不改变细胞培养环境的情况下，不能在培养细胞中清楚地评价瞬时mtDNA缺失的功能性结局，从而使细胞必须依赖线粒体功能来产生ATP。为了做到这一点，细胞必须从含葡萄糖的培养基过渡到含半乳糖的培养基。半乳糖氧化为丙酮酸比葡萄糖慢，并且不会产生ATP的净增加。因此，在半乳糖中生长的细胞被迫依赖OXPHOS来产生ATP。
使用Lonza 4D-NucleofectorTM(SF缓冲液，条件CA-137)，利用工程化大范围核酸酶mRNA核转染8e5个含有96％突变m.3243A>G mtDNA的MELAS cybrid细胞。在1e5个RNA拷贝/细胞(94.8ng mRNA)的剂量下，使用的工程化大范围核酸酶是MIT 25-26x.91 259H>Q。使用未转染的对照，以及未转染的0％突变细胞系。转染后，立即将所有细胞接种到含有5mM半乳糖的培养基中。在核转染后的第一天收集细胞，用于gDNA提取和Seahorse细胞线粒体压力测试评价。使用Macherey-Nagel NucleoSpin Blood QuickPure试剂盒分离gDNA。
数字液滴PCR(ddPCR)用于确定mtDNA的异质性水平，以及相对于核DNA(nuDNA)的mtDNA拷贝数。这是使用P1、F1和R1产生结合位点周围的扩增子(测定1)，P2、F2和R2产生用作mtDNA计数器的参考扩增子(测定2)，以及P4、F4和R4产生用作nuDNA计数器的核参考扩增子(测定3)来实现的。测定1中阳性液滴的数量相对于测定2中阳性液滴的数量用于确定细胞中的异质性水平。测定2中阳性液滴的数量相对于测定3中阳性液滴的数量用于测定细胞中的mtDNA拷贝数。然后，基于96％突变未经处理的对照条件对该比率进行归一化，并将所得的归一化拷贝数乘以异质性水平，以生成图52所示的数据。在这些图中，柱子的高度指示相对于MTS-GFP细胞的mtDNA损失。在柱子内，灰色的相对百分比对应于存在的野生型mtDNA的相对百分比，而黑色的相对百分比对应于存在的突变mtDNA的相对百分比。
P1：TGGCAGGGCCCGGT(SEQ ID NO:63)
F1：CCCAAGAACAGGGTTTGTTAAG(SEQ ID NO:64)
R1：GGAATGCCATTGCGATTAG(SEQ ID NO:65)
P2：AGCAGTTCTACCGTACAACCCTAACA(SEQ ID NO:66)
F2：GGCAGTTGAGGTGGATTA(SEQ ID NO:67)
R2：GGAATGCGGTAGTAGTTAGG(SEQ ID NO:68)
P4：AACCAGACAAATCGCTCCACCAAC(SEQ ID NO:69)
F4：CGGACAGGATTGACAGATT(SEQ ID NO:70)
R4：CCAGAGTCTCGTTCGTTATC(SEQ ID NO:71)
测定1和测定2在含有1x ddPCR Supermix for Probes(无dUTP,BioRad)、250nM每种探针、900nM每种引物、20U/μL Hind-III HF(NEB)和0.225ng细胞gDNA的24μL反应物中多重测定。使用QX100液滴发生器(BioRad)产生液滴。循环条件如下所示：95℃(2℃/s变温)持续10分钟，1个循环，94℃(2℃/s变温)持续10秒、59.2℃(2℃/s变温)持续30秒、72C(0.2℃/s变温)持续1分钟，45个循环，98℃持续10分钟，1个循环，4℃保持。使用QX200液滴读取器(BioRad)分析液滴，并使用QuantaSoft分析软件(BioRad)获取和分析数据。
测定2和测定3在含有1x ddPCR Supermix for Probes(无dUTP,BioRad)、250nM每种探针、900nM每种引物、20U/μL Hind-III HF(NEB)和0.225ng细胞gDNA的24μL反应物中多重测定。使用QX100液滴发生器(BioRad)产生液滴。循环条件如下所示：95℃(2℃/s变温)持续10分钟，1个循环，94℃(2℃/s变温)持续10秒、59.2℃(2℃/s变温)持续30秒、72C(0.2℃/s变温)持续1分钟，45个循环，98℃持续10分钟，1个循环，4℃保持。使用QX200液滴读取器(BioRad)分析液滴，并使用QuantaSoft分析软件(BioRad)获取和分析数据。
在转染后第0天，将2e3个细胞接种到96孔Seahorse细胞培养微孔板中，用于在Seahorse XFe96分析仪(Agilent)上进行分析。XF传感器盒也在非CO2培养箱中用200μL/孔Seahorse XF Calibrant水合过夜。次日(第1天)，将97mL Seahorse测定培养基(DMEM)与1mL 1mM丙酮酸钠、1mL 2mM谷氨酰胺和1mL 10mM葡萄糖混合。所得培养基无菌过滤。用制备的培养基洗涤细胞两次，然后将其置于非CO2培养箱中1小时。根据制造商的说明重构一个细胞线粒体压力测试试剂盒。溶液由寡霉素(15μM)、FCCP(20μM)和鱼藤酮/抗霉素A(5μM)组成。对于细胞线粒体压力测试，将20μL寡霉素溶液添加到水合盒的所有端口A，将22μL FCCP溶液添加到所有端口B，将24μL鱼藤酮/抗霉素A添加到所有端口C。对基线、寡霉素、FCCP和鱼藤酮/抗霉素A进行4个测量循环(03:00混合、00:00等待、03:00测量)的测定。使用Wave软件(Agilent)分析OCR值。使用Wave软件(Agilent)生成Cell Mito Stress Test报告。
测定完成后，用标准培养基中1:5000稀释的Hoechst 33342溶液(ThermoFisher，H3570)对细胞进行染色。将细胞在37℃下孵育20分钟，然后使用ImageXpress Pico自动细胞成像系统(Molecular Devices)通过图像细胞计数进行分析。然后使用Wave软件(Agilent)将OCR值归一化为细胞计数。
如图52中所示，相对于未处理的对照，使用高剂量的线粒体靶向的工程化大范围核酸酶(MTEM)导致瞬时mtDNA耗竭。MTEM处理的细胞仅包含未处理的96％突变细胞中存在的总mtDNA的27％。观察到的mtDNA耗竭对应于突变mtDNA的选择性切割。在第1天，存在于MTEM处理的细胞中的44％mtDNA是突变的，而在未处理的细胞内为92.8％。
在第1天的细胞线粒体压力测试中，未处理的0％突变体(WT)细胞表现出高水平的基础呼吸(7.5pmol O2/min/1,000个细胞)和最大呼吸(10.0pmol O2/min/1,000个细胞)。未处理的96％突变细胞表现出低得多的呼吸水平——基础呼吸为4.2pmol O2/min/1,000个细胞，最大呼吸为4.8pmol O2/min/1,000个细胞。MTEM处理的细胞与未处理的96％突变细胞具有相似的呼吸水平(基础呼吸为3.9pmol O2/min/1,000个细胞，最大呼吸为4.4pmolO2/min/1,000个细胞)，这表明尽管这些细胞依赖OXPHOS产生ATP，并且此时存在mtDNA耗竭，但细胞呼吸没有受到负面影响(图53)。

Claims (195)

1.一种线粒体靶向的工程化大范围核酸酶(MTEM)，其结合和切割在真核细胞的线粒体基因组中包含SEQ ID NO:1的识别序列，其中所述MTEM包含附接至线粒体转运肽(MTP)的工程化大范围核酸酶，其中所述工程化大范围核酸酶包含第一亚基和第二亚基，其中所述第一亚基结合至所述识别序列的第一识别半位点，并包含第一高变(HVR1)区，并且其中所述第二亚基结合至所述识别序列的第二识别半位点，并包含第二高变(HVR2)区。
2.根据权利要求1所述的MTEM，其中所述HVR1区包含与对应于SEQ ID NO:3-12的任一个的残基24-79的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的MTEM，其中所述HVR1区包含对应于SEQ ID NO:3-12的任一个的残基24、26、28、30、32、33、38、40、42、44、46、68、70、75和77的一个或多个残基。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的MTEM，其中所述HVR1区包含SEQ ID NO:3-12的任一个的残基24-79。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的MTEM，其中所述第一亚基包含与SEQ ID NO:3-12的任一个的残基7-153具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的MTEM，其中所述第一亚基包含对应于SEQ ID NO:3-12的任一个的残基19的残基。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的MTEM，其中所述第一亚基包含对应于SEQ ID NO:3、5、7、9、11或12的任一个的残基80的残基。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的MTEM，其中所述第一亚基包含SEQ ID NO:3-12的任一个的残基7-153。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的MTEM，其中所述HVR2区包含与对应于SEQ ID NO:3-12的任一个的残基215-270的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的MTEM，其中所述HVR2区包含对应于SEQ ID NO:3-12的任一个的残基215、217、219、221、223、224、229、231、233、235、237、259、261、266和268的一个或多个残基。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的MTEM，其中所述HVR2区包含对应于SEQ ID NO:3-12的任一个的残基241的残基。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的MTEM，其中所述HVR2区包含对应于SEQ ID NO:3或5-12的任一个的残基263的残基。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的MTEM，其中所述HVR2区包含对应于SEQ ID NO:3-6或8-12的任一个的残基264的残基。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的MTEM，其中所述HVR2区包含对应于SEQ ID NO:6的残基265的残基。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的MTEM，其中所述HVR2区包含SEQ ID NO:3-12的任一个的残基215-270。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的MTEM，其中所述第二亚基包含与SEQ ID NO:3-12的任一个的残基198-344具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的MTEM，其中所述第二亚基包含对应于SEQ IDNO:4的残基276的残基。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的MTEM，其中所述第二亚基包含对应于SEQ IDNO:3-12的任一个的残基330的残基。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的MTEM，其中所述第二亚基包含SEQ ID NO:3-12的任一个的残基198-344。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的MTEM，其中所述工程化大范围核酸酶是包含接头的单链大范围核酸酶，其中所述接头共价连接所述第一亚基和所述第二亚基。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的MTEM，其中所述工程化大范围核酸酶包含与SEQID NO:3-12的任一个具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
22.根据权利要求1-21中任一项所述的MTEM，其中所述工程化大范围核酸酶包含SEQID NO:3-12的任一个的氨基酸序列。
23.根据权利要求1-22中任一项所述的MTEM，其中所述工程化大范围核酸酶由与SEQID NO:33-42的任一个的核酸序列具有至少80％序列同一性的核酸序列编码。
24.根据权利要求1-23中任一项所述的MTEM，其中所述工程化大范围核酸酶由SEQ IDNO:33-42的任一个的核酸序列编码。
25.根据权利要求1-24中任一项所述的MTEM，其中所述MTP包含与SEQ ID NO:43-45的任一个中所示的序列具有至少80％序列同一性的核酸序列。
26.根据权利要求1-25中任一项所述的MTEM，其中所述MTP包含SEQ ID NO:43-45的任一个中所示的氨基酸序列。
27.根据权利要求1-26中任一项所述的MTEM，其中所述MTP附接至所述工程化大范围核酸酶的C末端。
28.根据权利要求1-27中任一项所述的MTEM，其中所述MTP附接至所述工程化大范围核酸酶的N末端。
29.根据权利要求1-28中任一项所述的MTEM，其中所述MTP与所述工程化大范围核酸酶融合。
30.根据权利要求1-28中任一项所述的MTEM，其中所述MTP通过多肽接头附接至所述工程化大范围核酸酶。
31.根据权利要求1-24中任一项所述的MTEM，其中所述工程化大范围核酸酶附接至第一MTP和第二MTP。
32.根据权利要求31所述的MTEM，其中所述第一MTP和/或所述第二MTP包含与SEQ IDNO:43-45的任一个中所示的序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
33.根据权利要求31或权利要求32所述的MTEM，其中所述第一MTP和/或所述第二MTP包含SEQ ID NO:43-45的任一个中所示的氨基酸序列。
34.根据权利要求31-33中任一项所述的MTEM，其中所述第一MTP和所述第二MTP是相同的。
35.根据权利要求31-33中任一项所述的MTEM，其中所述第一MTP和所述第二MTP是不同的。
36.根据权利要求31-35中任一项所述的MTEM，其中所述第一MTP和/或所述第二MTP与所述工程化大范围核酸酶融合。
37.根据权利要求31-35中任一项所述的MTEM，其中所述第一MTP和/或所述第二MTP通过多肽接头附接至所述工程化大范围核酸酶。
38.根据权利要求1-37中任一项所述的MTEM，其中所述MTEM附接至核输出序列(NES)。
39.根据权利要求38所述的MTEM，其中所述NES包含与SEQ ID NO:46或47中所示的序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
40.根据权利要求38或权利要求39所述的MTEM，其中所述NES包含SEQ ID NO:46或47中所示的氨基酸序列。
41.根据权利要求38-40中任一项所述的MTEM，其中所述NES附接在所述MTEM的N末端处。
42.根据权利要求38-40中任一项所述的MTEM，其中所述NES附接在所述MTEM的C末端处。
43.根据权利要求38-42中任一项所述的MTEM，其中所述NES与所述MTEM融合。
44.根据权利要求38-42中任一项所述的MTEM，其中所述NES通过多肽接头附接至所述MTEM。
45.根据权利要求1-37中任一项所述的MTEM，其中所述MTEM附接至第一NES和第二NES。
46.根据权利要求45所述的MTEM，其中所述第一NES附接在所述MTEM的N末端处，和其中所述第二NES附接在所述METM的C末端处。
47.根据权利要求45或权利要求46所述的MTEM，其中所述第一NES和/或所述第二NES包含与SEQ ID NO:46或47中所示的序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
48.根据权利要求45-47中任一项所述的MTEM，其中所述第一NES和/或所述第二NES包含SEQ ID NO:46或47中所示的氨基酸序列。
49.根据权利要求45-48中任一项所述的MTEM，其中所述第一NES和所述第二NES是相同的。
50.根据权利要求45-48中任一项所述的MTEM，其中所述第一NES和所述第二NES是不同的。
51.根据权利要求45-50中任一项所述的MTEM，其中所述第一NES和/或所述第二NES与所述MTEM融合。
52.根据权利要求45-50中任一项所述的MTEM，其中所述第一NES和/或所述第二NES通过多肽接头附接至所述MTEM。
53.一种多核苷酸，其包含编码权利要求1-52中任一项的所述MTEM的核酸序列。
54.根据权利要求53所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸是mRNA。
55.一种重组DNA构建体，其包含多核苷酸，所述多核苷酸包含编码权利要求1-52中任一项的所述MTEM的核酸序列。
56.根据权利要求55所述的重组DNA构建体，其中所述重组DNA构建体编码包含所述多核苷酸的重组病毒。
57.根据权利要求56所述的重组DNA构建体，其中所述重组病毒是重组腺病毒、重组慢病毒、重组逆转录病毒或重组腺相关病毒(AAV)。
58.根据权利要求56或权利要求57所述的重组DNA构建体，其中所述重组病毒是重组AAV。
59.根据权利要求58所述的重组DNA构建体，其中所述重组AAV具有AAV9衣壳。
60.根据权利要求55-59中任一项所述的重组DNA构建体，其中所述多核苷酸包含可操作地连接至编码所述MTEM的所述核酸序列的启动子。
61.根据权利要求60所述的重组DNA构建体，其中所述启动子是泛在启动子，或者其中所述启动子是肌肉细胞特异性启动子、骨骼肌特异性启动子、肌管特异性启动子、肌肉卫星细胞特异性启动子、神经元特异性启动子、星形胶质细胞特异性启动子、小胶质细胞特异性启动子、眼细胞特异性启动子、视网膜细胞特异性启动子、视网膜神经节细胞特异性启动子、视网膜色素上皮特异性启动子、胰腺细胞特异性启动子或胰腺β细胞特异性启动子。
62.根据权利要求61所述的重组DNA构建体，其中所述泛在启动子是CMV启动子、CAG启动子、EF1α启动子或UbC启动子。
63.一种重组病毒，其包含多核苷酸，所述多核苷酸包含编码权利要求1-52中任一项的所述MTEM的核酸序列。
64.根据权利要求63所述的重组病毒，其中所述重组病毒是重组腺病毒、重组慢病毒、重组逆转录病毒或重组腺相关病毒(AAV)。
65.根据权利要求63或权利要求64所述的重组病毒，其中所述重组病毒是重组AAV。
66.根据权利要求65所述的重组病毒，其中所述重组AAV具有AAV9衣壳。
67.根据权利要求63-66中任一项所述的重组病毒，其中所述多核苷酸包含可操作地连接至编码所述MTEM的所述核酸序列的启动子。
68.根据权利要求67所述的重组病毒，其中所述启动子是泛在启动子，或者其中所述启动子是肌肉细胞特异性启动子、骨骼肌特异性启动子、肌管特异性启动子、肌肉卫星细胞特异性启动子、神经元特异性启动子、星形胶质细胞特异性启动子、小胶质细胞特异性启动子、眼细胞特异性启动子、视网膜细胞特异性启动子、视网膜神经节细胞特异性启动子、视网膜色素上皮特异性启动子、胰腺细胞特异性启动子或胰腺β细胞特异性启动子。
69.根据权利要求68所述的重组病毒，其中所述泛在启动子是CMV启动子、CAG启动子、EF1α启动子或UbC启动子。
70.一种脂质纳米颗粒组合物，其包含脂质纳米颗粒，所述脂质纳米颗粒包含多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码权利要求1-52中任一项的所述MTEM的核酸序列。
71.根据权利要求70所述的脂质纳米颗粒组合物，其中所述多核苷酸是mRNA。
72.一种药物组合物，其包含药学上可接受的载体和权利要求1-52中任一项的所述MTEM。
73.一种药物组合物，其包含药学上可接受的载体和权利要求53或权利要求54的所述多核苷酸。
74.一种药物组合物，其包含药学上可接受的载体和权利要求55-62中任一项的所述重组DNA构建体。
75.一种药物组合物，其包含药学上可接受的载体和权利要求63-69中任一项的所述重组病毒。
76.一种药物组合物，其包含药学上可接受的载体和权利要求70或权利要求71的所述脂质纳米颗粒组合物。
77.一种遗传修饰的真核细胞，其包含权利要求1-52中任一项的所述多核苷酸。
78.根据权利要求77所述的遗传修饰的真核细胞，其中所述遗传修饰的真核细胞是遗传修饰的哺乳动物细胞。
79.根据权利要求77或权利要求78所述的遗传修饰的真核细胞，其中所述遗传修饰的真核细胞是遗传修饰的人细胞。
80.一种用于产生遗传修饰的真核细胞的方法，所述方法包括向真核细胞中引入：
(a)多核苷酸，其包含编码权利要求1-52中任一项的所述MTEM的核酸序列，其中所述MTEM在所述真核细胞中表达；或
(b)权利要求1-52中任一项的所述MTEM；
其中所述MTEM在所述真核细胞的突变线粒体基因组中在包含SEQ ID NO:1的所述识别序列处产生切割位点。
81.根据权利要求80所述的方法，其中所述切割位点通过非同源末端连接修复，以使得所述识别序列包含插入或缺失。
82.根据权利要求80所述的方法，其中包含所述识别序列的所述突变线粒体基因组在所述遗传修饰的真核细胞中被降解。
83.根据权利要求82所述的方法，其中约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的包含所述识别序列的突变线粒体基因组在所述遗传修饰的真核细胞中被降解。
84.根据权利要求82或权利要求83中任一项所述的方法，其中在所述遗传修饰的真核细胞中野生型线粒体基因组与包含所述识别序列的突变线粒体基因组的比率增加。
85.根据权利要求82-84中任一项所述的方法，其中所述比率增加至约5:95、约10:90、约15:85、约20:80、约25:75、约30:70、约35:65、约40:60、约45:55、约50:50、约55:45、约60:40、约65:35、约70:30、约75:25、约80:20、约85:15、约90:10、约95:5、约20:1、约50:1、约100:1、约150:1、约200:1、约250:1、约300:1、约350:1、约400:1、约450:1、约500:1、约550:1、约600:1、约650:1、约700:1、约750:1、约800:1、约850:1、约900:1、约950:1、约1000:1或更高。
86.根据权利要求82-85中任一项所述的方法，其中在所述遗传修饰的真核细胞中野生型线粒体基因组的百分比是在所述遗传修饰的真核细胞中总线粒体基因组的约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或更高。
87.根据权利要求82-86中任一项所述的方法，其中在所述遗传修饰的真核细胞中包含所述识别序列的突变线粒体基因组的百分比降低约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或更高。
88.根据权利要求82-87中任一项所述的方法，其中在所述遗传修饰的真核细胞中细胞呼吸增加约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约100％或更高。
89.根据权利要求82-88中任一项所述的方法，其中在所述遗传修饰的真核细胞中细胞呼吸增加约30-40％、约40-50％、约50-60％、约60-70％、约70-80％、约80-90％、约90-100％或更高。
90.一种用于产生包含多个遗传修饰的细胞的真核细胞群的方法，所述方法包括向在所述群中的多个真核细胞中引入：
(a)多核苷酸，其包含编码权利要求1-52中任一项的所述MTEM的核酸序列，其中所述MTEM在所述多个真核细胞中表达；或
(b)权利要求1-52中任一项的所述MTEM；
其中所述MTEM在所述多个真核细胞的突变线粒体基因组中在包含SEQ ID NO:1的识别序列处产生切割位点。
91.根据权利要求90所述的方法，其中所述切割位点通过非同源末端连接修复，以使得所述识别序列包含插入或缺失。
92.根据权利要求90所述的方法，其中包含所述识别序列的所述突变线粒体基因组在所述多个遗传修饰的真核细胞中被降解。
93.根据权利要求92所述的方法，其中约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的包含所述识别序列的突变线粒体基因组在所述多个遗传修饰的真核细胞中被降解。
94.根据权利要求92或权利要求93所述的方法，其中在所述多个遗传修饰的真核细胞中野生型线粒体基因组与包含所述识别序列的突变线粒体基因组的比率增加。
95.根据权利要求92-94中任一项所述的方法，其中在所述真核细胞群中野生型线粒体基因组与包含所述识别序列的突变线粒体基因组的比率增加。
96.根据权利要求92-95中任一项所述的方法，其中所述比率增加至约5:95、约10:90、约15:85、约20:80、约25:75、约30:70、约35:65、约40:60、约45:55、约50:50、约55:45、约60:40、约65:35、约70:30、约75:25、约80:20、约85:15、约90:10、约95:5、约20:1、约50:1、约100:1、约150:1、约200:1、约250:1、约300:1、约350:1、约400:1、约450:1、约500:1、约550:1、约600:1、约650:1、约700:1、约750:1、约800:1、约850:1、约900:1、约950:1、约1000:1或更高。
97.根据权利要求92-96中任一项所述的方法，其中在所述多个遗传修饰的真核细胞中野生型线粒体基因组的百分比增加约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或更高。
98.根据权利要求92-97中任一项所述的方法，其中在所述真核细胞群中野生型线粒体基因组的百分比增加约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或更高。
99.根据权利要求92-98中任一项所述的方法，其中在所述多个遗传修饰的真核细胞中包含所述识别序列的突变线粒体基因组的百分比降低约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或更高。
100.根据权利要求92-99中任一项所述的方法，其中在所述真核细胞群中包含所述识别序列的突变线粒体基因组的百分比降低约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或更高。
101.根据权利要求92-100中任一项所述的方法，其中在所述多个遗传修饰的真核细胞中细胞呼吸增加约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约100％或更高。
102.根据权利要求92-101中任一项所述的方法，其中在所述多个遗传修饰的真核细胞中细胞呼吸增加约30-40％、约40-50％、约50-60％、约60-70％、约70-80％、约80-90％、约90-100％或更高。
103.根据权利要求92-102中任一项所述的方法，其中在所述真核细胞群中细胞呼吸增加约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约100％或更高。
104.根据权利要求92-103中任一项所述的方法，其中在所述真核细胞群中细胞呼吸增加约30-40％、约40-50％、约50-60％、约60-70％、约70-80％、约80-90％、约90-100％或更高。
105.根据权利要求80-104中任一项所述的方法，其中所述识别序列在与线粒体病症相关的所述突变线粒体基因组的区域内。
106.根据权利要求105所述的方法，其中所述线粒体病症是线粒体脑肌病、乳酸酸中毒和卒中样发作(MELAS)。
107.根据权利要求105或权利要求106所述的方法，其中所述识别序列位于对应于野生型线粒体基因组的核苷酸位置3000-3500的所述突变线粒体基因组的区域中。
108.根据权利要求105-107中任一项所述的方法，其中所述MTEM靶向所述突变线粒体基因组的A3243G突变。
109.根据权利要求80-108中任一项所述的方法，其中所述方法在体内进行。
110.根据权利要求80-108中任一项所述的方法，其中所述方法在体外进行。
111.根据权利要求80-110中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸是mRNA。
112.根据权利要求111所述的方法，其中所述多核苷酸是权利要求53的所述mRNA。
113.根据权利要求80-110中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸是重组DNA构建体。
114.根据权利要求113所述的方法，其中所述多核苷酸是权利要求55-62中任一项的所述重组DNA构建体。
115.根据权利要求80-110中任一项所述的方法，其中通过脂质纳米颗粒将所述多核苷酸引入所述真核细胞。
116.根据权利要求80-110中任一项所述的方法，其中通过重组病毒将所述多核苷酸引入所述真核细胞。
117.根据权利要求116所述的方法，其中所述重组病毒是权利要求63-69中任一项的所述重组病毒。
118.根据权利要求116或权利要求117所述的方法，其中所述重组病毒是重组AAV。
119.根据权利要求118所述的方法，其中所述重组AAV具有AAV9衣壳。
120.根据权利要求80-119中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸包含可操作地连接至编码所述MTEM的所述核酸序列的启动子。
121.根据权利要求120所述的方法，其中所述启动子是泛在启动子，或者其中所述启动子是肌肉细胞特异性启动子、骨骼肌特异性启动子、肌管特异性启动子、肌肉卫星细胞特异性启动子、神经元特异性启动子、星形胶质细胞特异性启动子、小胶质细胞特异性启动子、眼细胞特异性启动子、视网膜细胞特异性启动子、视网膜神经节细胞特异性启动子、视网膜色素上皮特异性启动子、胰腺细胞特异性启动子或胰腺β细胞特异性启动子。
122.根据权利要求121所述的方法，其中所述泛在启动子是CMV启动子、CAG启动子、EF1α启动子或UbC启动子。
123.根据权利要求80-122中任一项所述的方法，其中所述真核细胞是哺乳动物细胞。
124.根据权利要求80-123中任一项所述的方法，其中所述真核细胞是人细胞。
125.根据权利要求80-124中任一项所述的方法，其中所述真核细胞是肌肉细胞、骨骼肌细胞、肌管细胞、肌肉卫星细胞、神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞、眼细胞、视网膜细胞、视网膜神经节细胞、视网膜色素上皮细胞、胰腺细胞或胰腺β细胞。
126.一种遗传修饰的真核细胞或遗传修饰的真核细胞群，其由权利要求80-125中任一项所述的方法产生。
127.一种用于在受试者的靶细胞中或者在受试者的靶细胞群中降解突变线粒体基因组的方法，所述方法包括向所述靶细胞或所述靶细胞群递送：
(a)多核苷酸，其包含编码权利要求1-52中任一项的MTEM的核酸序列，其中所述MTEM在所述靶细胞或所述靶细胞群中表达；或
(b)权利要求1-52中任一项的所述MTEM；
其中所述MTEM在所述突变线粒体基因组中在包含SEQ ID NO:1的识别序列处产生切割位点，以及其中所述突变线粒体基因组被降解。
128.根据权利要求127所述的方法，其中所述识别序列位于对应于野生型线粒体基因组的核苷酸位置3000-3500的所述突变线粒体基因组的区域中。
129.根据权利要求127或权利要求128所述的方法，其中所述MTEM靶向所述线粒体基因组的A3243G突变。
130.根据权利要求127-129中任一项所述的方法，其中所述受试者是哺乳动物。
131.根据权利要求127-130中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
132.根据权利要求127-131中任一项所述的方法，其中所述靶细胞是肌肉细胞、骨骼肌细胞、肌管细胞、肌肉卫星细胞、神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞、眼细胞、视网膜细胞、视网膜神经节细胞、视网膜色素上皮细胞、胰腺细胞或胰腺β细胞，或其中所述靶细胞群是肌肉细胞、骨骼肌细胞、肌管细胞、肌肉卫星细胞、神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞、眼细胞、视网膜细胞、视网膜神经节细胞、视网膜色素上皮细胞、胰腺细胞或胰腺β细胞的群。
133.根据权利要求127-132中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸是mRNA。
134.根据权利要求133所述的方法，其中所述多核苷酸是权利要求54的所述mRNA。
135.根据权利要求127-132中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸是重组DNA构建体。
136.根据权利要求135所述的方法，其中所述多核苷酸是权利要求55-62中任一项的所述重组DNA构建体。
137.根据权利要求127-132中任一项所述的方法，其中通过脂质纳米颗粒将所述多核苷酸递送至所述靶细胞或所述靶细胞群。
138.根据权利要求127-132中任一项所述的方法，其中通过重组病毒将所述多核苷酸递送至所述靶细胞或所述靶细胞群。
139.根据权利要求138所述的方法，其中所述重组病毒是权利要求63-69中任一项的所述重组病毒。
140.根据权利要求138或权利要求139所述的方法，其中所述重组病毒是重组AAV。
141.根据权利要求140所述的方法，其中所述重组AAV具有AAV9衣壳。
142.根据权利要求127-141中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸包含可操作地连接至编码所述MTEM的所述核酸序列的启动子。
143.根据权利要求142所述的方法，其中所述启动子是泛在启动子，或者其中所述启动子是肌肉细胞特异性启动子、骨骼肌特异性启动子、肌管特异性启动子、肌肉卫星细胞特异性启动子、神经元特异性启动子、星形胶质细胞特异性启动子、小胶质细胞特异性启动子、眼细胞特异性启动子、视网膜细胞特异性启动子、视网膜神经节细胞特异性启动子、视网膜色素上皮特异性启动子、胰腺细胞特异性启动子或胰腺β细胞特异性启动子。
144.根据权利要求143所述的方法，其中所述泛在启动子是CMV启动子、CAG启动子、EF1α启动子或UbC启动子。
145.根据权利要求127-144中任一项所述的方法，其中在所述靶细胞或所述靶细胞群中约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的包含所述识别序列的突变线粒体基因组被降解。
146.根据权利要求127-145中任一项所述的方法，其中在所述靶细胞或所述靶细胞群中野生型线粒体基因组与包含所述识别序列的突变线粒体基因组的比率增加。
147.根据权利要求127-146中任一项所述的方法，其中所述比率增加至约5:95、约10:90、约15:85、约20:80、约25:75、约30:70、约35:65、约40:60、约45:55、约50:50、约55:45、约60:40、约65:35、约70:30、约75:25、约80:20、约85:15、约90:10、约95:5、约20:1、约50:1、约100:1、约150:1、约200:1、约250:1、约300:1、约350:1、约400:1、约450:1、约500:1、约550:1、约600:1、约650:1、约700:1、约750:1、约800:1、约850:1、约900:1、约950:1、约1000:1或更高。
148.根据权利要求127-147中任一项所述的方法，其中在所述靶细胞中或所述靶细胞群中野生型线粒体基因组的百分比是在所述靶细胞或所述靶细胞群中总线粒体基因组的约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或更高。
149.根据权利要求127-148中任一项所述的方法，其中在所述遗传修饰的真核细胞中包含所述识别序列的突变线粒体基因组的百分比降低约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或更高。
150.根据权利要求127-149中任一项所述的方法，其中在所述靶细胞或所述靶细胞群中细胞呼吸增加约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约100％或更高。
151.根据权利要求127-150中任一项所述的方法，其中在所述靶细胞或所述靶细胞群中细胞呼吸增加约30-40％、约40-50％、约50-60％、约60-70％、约70-80％、约80-90％、约90-100％或更高。
152.一种用于在受试者中治疗与线粒体病症相关的病况的方法，所述方法包括向所述受试者施用：
(a)治疗有效量的包含编码权利要求1-52中任一项的MTEM的核酸序列的多核苷酸，其中将所述多核苷酸递送至在所述受试者中的靶细胞或靶细胞群，其中所述MTEM在所述靶细胞或所述靶细胞群中表达；或
(b)治疗有效量的权利要求1-52中任一项的所述MTEM，其中将所述MTEM递送至在所述受试者中的靶细胞或靶细胞群；
其中所述MTEM在突变线粒体基因组中在包含SEQ ID NO:1的识别序列处产生切割位点，以及其中所述突变线粒体基因组被降解。
153.根据权利要求152所述的方法，其中所述识别序列位于对应于野生型线粒体基因组的核苷酸位置3000-3500的所述突变线粒体基因组的区域中。
154.根据权利要求152或权利要求153所述的方法，其中所述MTEM靶向所述突变线粒体基因组的A3243G突变。
155.根据权利要求152-154中任一项所述的方法，其中所述线粒体病症是MELAS，以及其中所述方法减少或改善与MELAS相关的一种或多种症状。
156.根据权利要求152-155中任一项所述的方法，其中所述方法包括施用权利要求72-76中任一项的所述药物组合物。
157.根据权利要求152-156中任一项所述的方法，其中所述受试者是哺乳动物。
158.根据权利要求152-157中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
159.根据权利要求152-158中任一项所述的方法，其中所述靶细胞是肌肉细胞、骨骼肌细胞、肌管细胞、肌肉卫星细胞、神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞、眼细胞、视网膜细胞、视网膜神经节细胞、视网膜色素上皮细胞、胰腺细胞或胰腺β细胞，或其中所述靶细胞群是肌肉细胞、骨骼肌细胞、肌管细胞、肌肉卫星细胞、神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞、眼细胞、视网膜细胞、视网膜神经节细胞、视网膜色素上皮细胞、胰腺细胞或胰腺β细胞的群。
160.根据权利要求152-159中任一项所述的方法，其中所述病况是肌肉、脑、中枢神经系统、胰腺或视网膜的病况。
161.根据权利要求152-160中任一项所述的方法，其中所述病况是线粒体脑肌病、乳酸酸中毒和卒中样发作(MELAS)、进行性外眼肌麻痹、母系遗传性糖尿病、偏头痛或眼肌病。
162.根据权利要求152-161中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸是mRNA。
163.根据权利要求162所述的方法，其中所述多核苷酸是权利要求53的所述mRNA。
164.根据权利要求152-161中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸是重组DNA构建体。
165.根据权利要求164所述的方法，其中所述多核苷酸是权利要求55-62中任一项的所述重组DNA构建体。
166.根据权利要求152-161中任一项所述的方法，其中通过脂质纳米颗粒将所述多核苷酸递送至所述靶细胞或所述靶细胞群。
167.根据权利要求152-161中任一项所述的方法，其中通过重组病毒将所述多核苷酸递送至所述靶细胞或所述靶细胞群。
168.根据权利要求167所述的方法，其中所述重组病毒是权利要求63-69中任一项的所述重组病毒。
169.根据权利要求167或权利要求168所述的方法，其中所述重组病毒是重组AAV。
170.根据权利要求169所述的方法，其中所述重组AAV具有AAV9衣壳。
171.根据权利要求152-170中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸包含可操作地连接至编码所述MTEM的所述核酸序列的启动子。
172.根据权利要求171所述的方法，其中所述启动子是泛在启动子，或者其中所述启动子是肌肉细胞特异性启动子、骨骼肌特异性启动子、肌管特异性启动子、肌肉卫星细胞特异性启动子、神经元特异性启动子、星形胶质细胞特异性启动子、小胶质细胞特异性启动子、眼细胞特异性启动子、视网膜细胞特异性启动子、视网膜神经节细胞特异性启动子、视网膜色素上皮特异性启动子、胰腺细胞特异性启动子或胰腺β细胞特异性启动子。
173.根据权利要求172所述的方法，其中所述泛在启动子是CMV启动子、CAG启动子、EF1α启动子或UbC启动子。
174.根据权利要求152-173中任一项所述的方法，其中约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的包含所述识别序列的突变线粒体基因组在所述靶细胞或所述靶细胞的所述群中被降解。
175.根据权利要求152-174中任一项所述的方法，其中在所述靶细胞或所述靶细胞群中野生型线粒体基因组与包含所述识别序列的突变线粒体基因组的比率增加。
176.根据权利要求152-175中任一项所述的方法，其中所述比率增加至约5:95、约10:90、约15:85、约20:80、约25:75、约30:70、约35:65、约40:60、约45:55、约50:50、约55:45、约60:40、约65:35、约70:30、约75:25、约80:20、约85:15、约90:10、约95:5、约20:1、约50:1、约100:1、约150:1、约200:1、约250:1、约300:1、约350:1、约400:1、约450:1、约500:1、约550:1、约600:1、约650:1、约700:1、约750:1、约800:1、约850:1、约900:1、约950:1、约1000:1或更高。
177.根据权利要求152-176中任一项所述的方法，其中在所述靶细胞或所述靶细胞群中野生型线粒体基因组的百分比是在所述靶细胞或所述靶细胞群中总线粒体基因组的约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或更高。
178.根据权利要求152-177中任一项所述的方法，其中在所述遗传修饰的真核细胞中包含所述识别序列的突变线粒体基因组的百分比降低约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或更高。
179.根据权利要求152-178中任一项所述的方法，其中在所述靶细胞或所述靶细胞群中细胞呼吸增加约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约100％或更高。
180.根据权利要求152-179中任一项所述的方法，其中在所述靶细胞或所述靶细胞群中细胞呼吸增加约30-40％、约40-50％、约50-60％、约60-70％、约70-80％、约80-90％、约90-100％或更高。
181.一种工程化大范围核酸酶，其结合并切割包含SEQ ID NO:1的识别序列，其中所述工程化大范围核酸酶包含第一亚基和第二亚基，其中所述第一亚基结合至所述识别序列的第一识别半位点并包含第一高变(HVR1)区，其中所述第二亚基结合至所述识别序列的第二识别半位点并包含第二高变(HVR2)区，其中所述HVR1区包含与对应于SEQ ID NO:3-12的任一个的残基24-79的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列，以及其中所述HVR2区包含与SEQ ID NO:3-12的任一个的残基215-270的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
182.一种多核苷酸，其包含编码权利要求181的所述工程化大范围核酸酶的核酸序列。
183.一种重组DNA构建体，其包含多核苷酸，所述多核苷酸包含编码权利要求181的所述工程化大范围核酸酶的核酸序列。
184.一种重组病毒，其包含多核苷酸，所述多核苷酸包含编码权利要求181的所述工程化大范围核酸酶的核酸序列。
185.一种脂质纳米颗粒组合物，其包含脂质纳米颗粒，所述脂质纳米颗粒包含多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码权利要求181的所述工程化大范围核酸酶的核酸序列。
186.一种药物组合物，其包含药学上可接受的载体和权利要求181的所述工程化大范围核酸酶。
187.一种药物组合物，其包含药学上可接受的载体和权利要求182的所述多核苷酸。
188.一种药物组合物，其包含药学上可接受的载体和权利要求183的所述重组DNA构建体。
189.一种药物组合物，其包含药学上可接受的载体和权利要求184的所述重组病毒。
190.一种药物组合物，其包含药学上可接受的载体和权利要求185的所述脂质纳米颗粒组合物。
191.一种遗传修饰的真核细胞，其包含权利要求182的所述多核苷酸。
192.一种用于产生遗传修饰的真核细胞的方法，所述方法包括向真核细胞引入包含编码权利要求181的所述工程化大范围核酸酶的核酸序列的多核苷酸，其中所述工程化大范围核酸酶在所述真核细胞中表达，以及其中所述工程化大范围核酸酶在包含SEQ ID NO:1的所述识别序列处产生切割位点。
193.一种用于产生遗传修饰的真核细胞的方法，所述方法包括向真核细胞引入权利要求181的所述工程化大范围核酸酶，其中所述工程化大范围核酸酶在所述真核细胞中表达，以及其中所述工程化大范围核酸酶在包含SEQ ID NO:1的识别序列处产生切割位点。
194.一种用于产生包含插入其基因组中的外源性目标序列的遗传修饰的真核细胞的方法，所述方法包括向真核细胞引入一个或多个包含以下的多核苷酸：编码权利要求181的所述工程化大范围核酸酶的第一核酸序列，其中所述工程化大范围核酸酶所述真核细胞中表达，和包含所述目标序列的第二核酸序列，其中所述工程化大范围核酸酶在包含SEQ IDNO:1的识别序列处产生切割位点以及其中所述目标序列在所述切割位点处插入所述基因组中。
195.一种用于产生包含插入其基因组中的外源性目标序列的遗传修饰的真核细胞的方法，所述方法包括向真核细胞引入权利要求181的所述工程化大范围核酸酶和包含含有所述目标序列的核酸序列的多核苷酸，其中所述工程化大范围核酸酶在包含SEQ ID NO:1的识别序列处产生切割位点，以及其中所述目标序列在所述切割位点处插入所述基因组中。
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