ES2575412T3 - Meganucleasas monocatenarias diseñadas racionalmente con secuencias de reconocimiento no palindrómicas - Google Patents

Meganucleasas monocatenarias diseñadas racionalmente con secuencias de reconocimiento no palindrómicas Download PDF

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Abstract

Una meganucleasa monocatenaria recombinante que comprende: una primera subunidad LAGLIDADG que comprende una secuencia polipeptídica que tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia con los restos 9-151 de una meganucleasa I-CreI de tipo silvestre de SEQ ID NO: 1 y que tiene un primer semi-sitio de reconocimiento; una segunda subunidad LAGLIDADG que comprende una secuencia polipeptídica que tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia con los restos 9-151 de una meganucleasa I-CreI de tipo silvestre de SEQ ID NO: 1 y que tiene un segundo semi-sitio de reconocimiento; en la que dichas primera y segunda subunidades LAGLIDADG están unidas covalentemente mediante un engarce polipeptídico, en donde dicho engarce es un engarce flexible y comprende más de 25 y menos de 31 restos; estando dicha primera subunidad unida covalentemente a dicho engarce polipeptídico en un resto correspondiente a una posición seleccionada del grupo que consiste en las posiciones 151-153 de SEQ ID NO: 1; estando dicha segunda subunidad unida covalentemente a dicho engarce polipeptídico en un resto correspondiente a una posición seleccionada del grupo que consiste en las posiciones 7-9 de SEQ ID NO: 1; y en donde dichas primera y segunda subunidades LAGLIDADG son capaces de actuar juntas para reconocer y escindir una secuencia de ADN no palindrómica que es un híbrido de dicho primer semi-sitio de reconocimiento y dicho segundo semi-sitio de reconocimiento.

Description

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también se evaluaron por SDSPAGE para determinar el grado en que la región de engarce se proteolizaba durante la expresión o purificación para liberar las dos subunidades.
TABLA 3
Meganucleasas ICreI Monocatenarias con Engarces GlySer
Número de engarce
Parte de fusión N terminal Parte de fusión C terminal Secuencia de engarce Actividad Proteólisis del engarce
1
Val151 Phe9 (GSS)7G
2
Val151 Phe9 (GSS)8G
3
Val151 Phe9 (GSS)9G + +
4
Val151 Phe9 (GSS)10G ND +++
5
Val151 Phe9 (GSS)11G ND +++
6
Val151 Phe9 (GSS)9GG + +
7
Val151 Phe9 (GSS)9GSG + +
8
Asp153 Phe9 (GSS)9G + +
5 Los resultados indicaron que los engarces flexibles, tales como los engarces GlySer en la Tabla 3, son adecuados para producción de meganucleasas monocatenarias siempre que la longitud sea apropiada (véase también Ejemplo 2). Por ejemplo, haciendo referencia a la Tabla 3, las meganucleasas monocatenarias que incluían engarces 1 y 2, que comprendían 22 y 25 aminoácidos totales, respectivamente, no mostraban ninguna actividad de escisión
10 detectable con los puntos de fusión ensayados. SDSPAGE indicó que estas meganucleasas estaban intactas y no se degradaron por proteasas, lo que condujo a la conclusión de que estas meganucleasas monocatenarias eran estructuralmente estables pero estaban restringidas funcionalmente por engarces que eran demasiado cortos para permitir que las subunidades LAGLIDADG individuales adoptaran la conformación necesaria para unión y/o catálisis de ADN. Los engarces 3, 6, 7 y 8, que comprendían 28, 29, 30 y 28 aminoácidos, respectivamente, mostraron todos
15 niveles bajos de actividad de escisión. SDSPAGE indicó que una cantidad pequeña (5 %10 %) de cada uno se proteolizó en subunidades individuales mientras que la mayoría tenía un peso molecular correspondiente a las meganucleasas monocatenarias de longitud completa (∼40 kilodalton). Los números 3 y 8 tienen la misma secuencia de engarce pero puntos de fusión N terminales en Val151 y Asp153, respectivamente. Ambas meganucleasas monocatenarias mostraron niveles comparables de actividad, lo que indica que el punto de fusión preciso no es
20 crítico en este caso. Finalmente, los engarces 4 y 5, que comprendían 31 y 34 aminoácidos, respectivamente, no produjeron meganucleasa monocatenaria detectable cuando se purificaron de E. coli. Estos engarces se proteolizaron completamente en las subunidades LAM1 y/o LAM2 individuales como se detecta por SDSPAGE y, por lo tanto, la actividad de escisión de estas meganucleasas no se investigó adicionalmente.
25 Estos resultados condujeron a los inventores a concluir que los engarces GlySer son aceptables para la producción de meganucleasas monocatenarias basándose en la subunidad LAGLIDADG de la meganucleasa monoLAGLIDADG ICreI y los puntos de fusión particulares empleados, siempre que los engarces fueran mayores de 25 y menores de 31 aminoácidos de longitud. Para meganucleasas monocatenarias basadas en ICreI con estos puntos de fusión, los engarces más cortos evitan la catálisis mientras que los engarces más largos son inestables y 
30 propensos a corte por proteasas.
Los efectos de variar los puntos de fusión en las longitudes de engarce aceptables pueden determinarse empíricamente por experimentación rutinaria y/o predecirse basándose en la realización de modelos tridimensionales de las estructuras proteicas. Significativamente, a medida que un punto de fusión se mueve en 35 dirección N terminal o C terminal, puede moverse más cerca o más lejos del otro punto de fusión dependiendo de la estructura secundaria y terciaria de la proteína cerca del punto de fusión. Por lo tanto, por ejemplo, mover el punto de fusión N terminal en dirección C terminal (por ejemplo, del resto 150 al resto 155 para una subunidad N terminal) no da como resultado necesariamente que el punto de fusión N terminal esté físicamente más cerca del punto de fusión C terminal debido a que, por ejemplo, los restos N terminales en esa región pueden ser parte de una 40 estructura secundaria/terciaria que apunta en el sentido o el sentido contrario del punto de fusión C terminal. Por lo tanto, mover un punto de fusión N terminal en dirección N terminal o C terminal, o mover un punto de fusión C terminal en dirección N terminal a C terminal, puede dar como resultado un desplazamiento en el intervalo de longitudes de engarce aceptables hacia engarces más largos o más cortos. Ese desplazamiento, sin embargo, se determina fácilmente, como se muestra por los experimentos presentados en el presente documento, por
45 experimentación rutinaria y/o realización de modelos tridimensionales.
Por lo tanto, en algunas realizaciones, los engarces flexibles útiles tienen longitudes de más de 25 restos y menos de 31 restos (incluyendo todos los valores entre medias), como se muestra en la Tabla 3 para una meganucleasa
13
imagen12
imagen13
cuatro puntos: actividad no detectable; + actividad mínima; ++ actividad media; +++ actividad comparable al heterodímero LAM1/LAM2 producido por coexpresión de los dos monómeros en E. coli antes de la purificación de endonucleasa. Inmediatamente después de la purificación, las meganucleasas monocatenarias se centrifugaron (2100 g durante 10 minutos) para sedimentar proteína precipitada (indicativa de inestabilidad estructural) y la
5 cantidad de precipitado (ppt) observado se puntuó: no precipitado; + poco precipitado; ++ precipitado significativo. Las muestras proteicas que precipitaron en un grado significativo no pudieron ensayarse con respecto a actividad de escisión.
TABLA 6
Engarces para ICreI monocatenaria
Nº
CFP Secuencia de Engarce Actividad ppt
9
K7 SLPGSVGGLSPSQASSAASSASSSPGSGISEALRAGATKS +++
10
K7 SLPGSVGGLSPSQASSAASSASSSPGSGISEALRAGGATKS +++
11
K7 SLPGSVGGLSPSQASSAASSASSSPGSGISEALRAAGGATKS ND ++
12
K7 SLPGSVGGLSPSQASSAASSASSSPGSGISEALRAASGGATKS ND ++
13
K7 SLPGSVGGLSPSQASSAASSASSSPGSGISEALRAASSGGATKS ND ++
14
K7 SLPGSVGGLSPSQASSAASSASSSPGSGISEALRAASSAGGATKS +++
15
E8 SLPGSVGGLSPSQASSAASSASSSPGSGISEALRAGATKEF ++ +
16
E8 SLPGSVGGISPSQASSAASSASSSPGSGTSEAPRAGATKEF ++
17
E8 SLPGSVGGLSPSQASSAASSASSSPGSGTSEATRAGATKEF ++ +
18
E8 SLPGSLGGLSPSQASSAASSASSSPGSGPSEALRAGATKEF ++ +
19
E8 SLPGSVGGVSPSQASSAASSASSSPGSGVSEASRAGATKEF ++ +
20
E8 SLPGSVGGLSPSQASSAASSASSSPGSGLSEALRAGATKEF ++ +
21
E8 SLPGSLGGISPSQASSAASSASSSPGSGSSEASRAGATKEF ++
22
E8 SPGSVGGVSPSQASSAASSASSSPGSGISEATRAGATKEF ++
23
E8 SLPGSLGGVSPSQASSAASSPGSGTSEAPRAGATKEF ND ++
24
E8 SLPGSVGGLSPSQASSAASSPGSGISEAIRAGATKEF ++
25
E8 SLPGSLGGVSPSQASSAASSASSAASSPGSGASEASRAGATKEF ++
10 Las meganucleasas monocatenarias de cada uno de estos engarces excepto para 1113 y 23 (que no se investigaron) corrieron como una banda única del peso molecular deseado (∼40 kilodalton) en un gel de SDSPAGE, lo que indica resistencia a escisión proteolítica de la secuencia de engarce. En al menos un caso (Engarce 9), la meganucleasa LAM monocatenaria pudo almacenarse a 4 ºC durante más de 4 semanas sin ninguna prueba de
15 degradación o pérdida de actividad de escisión. Además, varias endonucleasas LAM monocatenarias (9, 10 y 14) escindieron la secuencia de reconocimiento LAM1/LAM2 híbrida con eficacia comparable al heterodímero LAM1/LAM2 purificado, lo que indica que la fusión de subunidades ICreI usando estos engarces no altera significativamente la actividad endonucleasa (véase Ejemplo 2).
20 En claro contraste con el heterodímero LAM1/LAM2 purificado (que es, de hecho, una mezcla de homo y heterodímeros), las meganucleasas LAM monocatenarias que incorporan los engarces en la Tabla 6 escinden el sitio híbrido mucho más eficazmente que una de las secuencias palindrómicas (véase Ejemplo 2). Las secuencias palindrómicas normalmente se cortan con eficacia <5 % en relación con el sitio híbrido. Esta escisión no pretendida de los sitios de ADN palindrómicos podrían deberse a (1) homodimerización de subunidades LAM 1 o LAM2 de un
25 par de proteínas monocatenarias diferentes, (2) cortes secuencial de ambas cadenas de la secuencia palindrómica por una única subunidad (LAM1 o LAM2) dentro de la meganucleasa monocatenaria o (3) cantidades pequeñas de LAM 1 o LAM2 homodiméricas que se forman después de la escisión proteolítica de la meganucleasa monocatenaria en sus subunidades individuales (aunque los resultados de SDSPAGE hacen esta última explicación improbable). Aunque las meganucleasas monocatenarias ICreI mantienen cierta actividad hacia los sitios de ADN
30 palindrómicos, la actividad está tan desproporcionadamente sesgada a favor del sitio híbrido que este enfoque representa una mejora muy significativa sobre los procedimientos existentes.
16
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aparente de ∼40 kilodalton, coherente con que sea un par de subunidades IMsoI unidas covalentemente, y no fueron evidentes productos de degradación proteica. Estos resultados indican que la invención es adecuada para la producción de meganucleasas monocatenarias de alta actividad, estables, derivadas de IMsoI.
TABLA 11
Modificaciones de ICreI del documento WO 2007/047859
Base de Cadena Sentido Favorecida
Posn.
A C G T A/T A/C A/G C/T G/T A/G/T A/C/G/T
1
Y75 L75* C75* Y139* C46* A46* R70* H75* R75* H46* K46* R46* K70 E70* E75* E46* D46* Q70* C70 L70 Y75* Q75* H75* H139 Q46* H46* T46* G70 A70 S70 G46*
2
Q70 T44* A44* V44* I44* L44* N44* E70 D70 K44* R44* H70 D44* E44* Q44* C44*
3
Q68 C24* I24* E68 F68 K24* R24* R68 M68 C68 L68 F68 H68 Y68 K68
4
A26* Q77 E77 K26* R77 E26* S77 Q26* S26*
5
E42 R42 K28* C28* Q42 M66 K66
6
Q40 C28* E40 R28* R40 C40 I40 V40 C79 I79 V79 Q28* A40 A79 A28* H28* S40 S28*
7
N30* Q38 E38 K30* R30* K38 R38 E30* I38 L38 C38 H38 N38 Q30*
8
F33 Y33 E33 D33 F33 H33 L33 V33 I33 F33 C33 R32* R33
9
E32 R32 K32 L32 V32 A32 C32 D32 I32 S32 N32 H32 Q32 T32
Las entradas en negrita son restos de contacto naturales y no constituyen “modificaciones” como se usa en el presente documento.
Un asterisco indica que el resto entra en contacto con la base en la cadena antisentido.
27
TABLA 12
Modificaciones de IMsoI del documento WO 2007/047859
Base de Cadena Sentido Favorecida
Posición
A C G T
1
K75* Q77 A49* C49* K79* D77 E77 K49* R75* K75* R79* K79* K77 R77 E49* E79* C77 L77 Q79*
2
Q75 K81 C47* I47* L47* E75 D75 R47* K47* K81* R81* K75 E47* E81* A75 C75 V75 I75 T75 Q47* Q81*
3
Q72 C26* L26* V26* A26* I26* E72 Y72 H26* K26* R26* R72 K72 Y26* F26* K72 Y72 H26*
4
K28 Q83 K28* R28* E83 R83 K83 K28 K83 Q28*
5
K28 C28* L28* I28* K28* R28* R45 E28* Q28*
6
I30* V30* S30* L30* Q43 E43 E85 K30* R30* R43 K43 K85 R85 E30* D30* K43 I85 V85 L85 Q30*
7
Q41 E32 E41 R32 R41 K41 K32 M41 L41 I41
8
Y35 K35 E32 R32 K32 K35 R35 K32 K35
9
N34 H34 D34 E34 S34 K34 R34 H34 S34 C34 V34 T34 A34
Las entradas en negrita representan restos de contacto naturales y no constituyen “modificaciones” como se usa en el presente documento. Un asterisco indica que el resto entra en contacto con la base en la cadena antisentido.
TABLA 13
Modificaciones de ICeU del documento WO 2007/047859
Base de Cadena Sentido Favorecida
Posición
A C G T
1
C92* A92* V92* K116* R116* D116* K92* E116* E92* Q116* Q92*
28
2
Q117 E117 K117 C117
C90*
D117 R124 V117
L90*
R174* K124 T117
V90*
K124* E124* Q90*
K90*
E90*
R90*
D90*
K68*
3
C70* K70* E70* Q70*
V70*
E88*
T70*
L70*
K70*
4
Q126 E126 R126 K126
N126
D126 K126 L126
K88*
R88* E88* Q88*
L88*
K88* D88*
C88*
K72*
C72*
L72*
V72*
5
C74* K74* E74* C128
L74*
K128 L128
V74*
R128 V128
T74*
E128 T128
6
Q86 D86 K128 K86
E86
R128 C86
R84*
R86 L86
K84*
K86
E84*
7
L76* C76* K76* R76* K76* H76* E76* R84 H76* Q76*
8
Y79 D79 R79 C79
R79
E79 K79 L79
Q76
D76 K76 V79
E76
R76 L76
9
Q78 D78 R78 K78
N78
E78 K78 V78
H78
H78
L78
K78
C78
T78
Las entradas en negrita son restos de contacto naturales y no constituyen “modificaciones” como se usa en el presente documento.
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TABLA 14
Modificaciones de ISceI del documento WO 2007/047859
Base de Cadena Sentido Favorecida
Posición
A C G T
4
K50 R50* K50* E57 E50* R57 K57 K57 M57 Q50*
5
K48 Q102 R48* K48* E102 E59 E48* K102 R102 Q48* C102 L102 V102
6
K59 R59* K59* K84 E59* Q59* Y46
7
C46* L46* V46* R46* K46* E86 K86 R86 E46* K68 C86 L86 Q46*
29
8
K61* S61* V61* A61* L61* E88 R61* H61* E61* R88 K88 K88 Q61* H61*
9
T98* C98* V98* L98* R98* K98* E98* D98* Q98*
10
V96* C96* A96* K96* R96* D96* E96* Q96*
11
C90* L90* K90* R90* E90* Q90*
12
Q193 E165 E193 D193 K165 R165 C165 L165 C193 V193 A193 T193 S193
13
C193* L193* K193* R193* D192 E193* D193* K163 R192 Q193* C163 L163
14
L192* C192* E161 R192* K192* K147 K161 R161 R197 D192* E192* K161 Q192*
15
E151 K151 C151 L151 K151
17
N152* S152* C150* L150* V150* T150* K152* K150* N152* S152* D152* D150* E150* Q152* Q150*
18
K155* C155* R155* K155* E155* H155* Y155*
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“modificaciones”
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5 Se desvelan los siguientes artículos:
1. Una meganucleasa monocatenaria recombinante que comprende:
una primera subunidad LAGLIDADG derivada de una primera meganucleasa monoLAGLIDADG, teniendo
10 dicha primera subunidad LAGLIDADG un primer semisitio de reconocimiento; una segunda subunidad LAGLIDADG derivada de una segunda meganucleasa monoLAGLIDADG o una meganucleasa diLAGLIDADG, teniendo dicha segunda subunidad LAGLIDADG un segundo semisitio de reconocimiento; en la que dichas primera y segunda subunidades LAGLIDADG se unen covalentemente por un engarce
15 polipeptídico de modo que dicho primer dominio LAGLIDADG está en sentido Nterminal con respecto a dicho engarce y dicho segundo dominio LAGLIDADG está en sentido Cterminal con respecto a dicho engarce; y en la que dichas primera y segunda subunidades LAGLIDADG son capaces de actuar juntos para reconocer y escindir una secuencia de ADN no palindrómica que es un híbrido de dicho primer semisitio de reconocimiento y dicho segundo semisitio de reconocimiento.
20 2. La meganucleasa monocatenaria recombinante del artículo 1 en la que:
30
imagen24
imagen25
imagen26
imagen27

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  1. imagen1
    imagen2
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