BR112012012588B1

BR112012012588B1 - Endonuclease, método para recombinação homóloga de polinucleotídeos e método para mutação direcionada de polinucleotídeos

Info

Publication number: BR112012012588B1
Application number: BR112012012588-5A
Authority: BR
Inventors: Andrea Hlubek; Christian Biesgen
Original assignee: Basf Plant Science Company Gmbh
Priority date: 2009-11-27
Filing date: 2010-11-25
Publication date: 2019-03-26
Also published as: CA2782014A1; BR112012012588A2; CA2782014C; CN102725412A; EP2504439A1; US9404099B2; EP2504439A4; WO2011064736A1; CN102725412B; JP2013511977A; DE112010004582T5; AU2010325549B2; EP2504439B1; JP5944320B2; ZA201204700B; US20120246764A1; AU2010325549A1

Abstract

endonuclease, método para recombinação homóloga de polinucleotídeos e método para mutação direcionada de polinucleotídeos. trata-se de endonucleases otimizadas, assim como métodos de integração direcionada, exclusão direcionada ou mutação direcionada de polinucleotídeos que utilizam endonucleases otimizadas.

Description

“ENDONUCLEASE, MÉTODO PARA RECOMBINAÇÃO HOMÓLOGA DE POLINUCLEOTÍDEOS E MÉTODO PARA MUTAÇÃO DIRECIONADA DE POLINUCLEOTÍDEOS”

Campo da Invenção [001 ] A presente invenção refere-se a endonucleases otimizadas, assim como a métodos de integração direcionada, exclusão direcionada ou mutação direcionada de polinucleotídeos que utilizam endonucleases otimizadas.

Antecedentes da Invenção [002] A engenharia genômica é um termo para resumir as diferentes técnicas para inserir, excluir, substituir ou, de outro modo, manipular as sequências genéticas específicas em um genoma e tem várias aplicações terapêuticas e biotecnológicas. Quase todas as técnicas de engenharia genômica usam recombinases, integrases ou endonucleases para criar quebras de fita dupla de DNA em sítios predeterminados com a finalidade de promover a recombinação homóloga.

[003] Apesar do fato de que vários métodos tenham sido empregados para criar quebras de fita dupla de DNA, o desenvolvimento de meios efetivos para criar quebras de fita dupla de DNA em sítios altamente específicos em um genoma permanece sendo um objetivo principal na terapia genética, agrotecnologia, e biologia sintética.

[004] Uma abordagem para atingir este objetivo consiste em usar nucleases com especificidade por uma sequência que seja suficientemente grande para que esteja presente apenas em um único sítio em um genoma. As nucleases que reconhecem tais sequências de DNA grandes de cerca de 15 a 30 nucleotídeos e, portanto, denominadas como “meganucleases” ou “endonucleases de endereçamento” e são frequentemente associadas a elementos de DNA parasíticos ou redundantes, como os íntrons e inteínas de

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2/71 auXo-splicing do grupo 1 comumente encontrados nos genomas de plantas e fungos. As meganucleases são comumente agrupadas em quatro famílias: a família LAGLIDADG, a família GIY-YIG, a família His-Cys box e a família HNH. Estas famílias são caracterizadas por motivos estruturais, que afetam a atividade catalítica e a sequência de suas sequências de reconhecimento de DNA.

[005] As meganucleases naturais da família LAGLIDADG foram usadas para promover efetivamente modificações genômicas sítio-específicas em culturas celulares de insetos e mamíferos, assim como em muitos organismos, tais como plantas, levedura ou camundongos, porém, esta abordagem se limita à modificação de seus genes homólogos que conservam a sequência de reconhecimento de DNA ou a genomas pré-modificados por engenharia genética nos quais se introduziu uma sequência de reconhecimento. Com a finalidade de evitar estas limitações e promover a modificação genética estimulada por quebra de fita dupla de DNA, criaram-se novos tipos de nucleases.

[006] Um tipo de novas nucleases consiste em combinações artificiais de nucleases não-específicas a um domínio de ligação de DNA altamente específico. A efetividade desta estratégia foi demonstrada em uma variedade de organismos que utilizam fusões quiméricas entre um domínio de ligação de DNA de dedo de zinco (zinc finger) modificado por engenharia genética e o domínio de nuclease não-específica da enzima de restrição de Fokl (por exemplo, WO03/089452), sendo que uma variação desta abordagem consiste em usar uma variante inativa de uma meganuclease como um domínio de ligação de DNA fundido a uma nuclease não-específica tipo Fokl conforme descrito em Lippow et al., “Creation ofa type IIS restriction endonuclease with a longrecognition sequence”, Nucleic Acid Research (2009), Vol.37, No.9, páginas 3061 a 3073.

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3/71 [007] Uma abordagem alternativa consiste em modificar por engenharia genética as meganucleases naturais com a finalidade de customizar suas regiões de ligação de DNA para ligar sítios existentes em um genoma, criando, assim, meganucleases modificadas por engenharia genética que possui novas especificidades (por exemplo, W007093918, W02008/093249, WO09114321). No entanto, muitas meganucleases que foram modificadas por engenharia genética em relação à especificidade de divagem de DNA diminuíram a atividade de divagem em relação às meganucleases de ocorrência natural a partir das quais estas foram derivadas (US2010/0071083). A maioria das meganucleases também age sobre sequências similares a seu sítio de ligação ótimo, que pode levar a efeitos fora do alvo não-pretendidos ou mesmo prejudiciais. Diversas abordagens já foram adotadas para aumentar a eficiência da recombinação homóloga induzida por meganuclease, por exemplo, fundindose as nucleases ao domínio de ligação por ligantes do Receptor de Glicocorticóides em ratos com a finalidade de promover ou mesmo induzir o transporte desta nuclease modificada ao núcleo celular e, portanto, seus sítiosalvo através da adição de dexametasona ou compostos similares (W02007/135022). Apesar deste fato, ainda há uma necessidade na técnica em desenvolver meganucleases que possuem altas taxas de indução de recombinação homóloga e/ou uma alta especificidade a seu sítio de ligação, limitando, assim, o risco de efeitos fora do alvo.

Descrição Resumida da Invenção [008] A invenção proporciona versões otimizadas de endonucleases da família de endonuclease LAGLIDADG. Em particular, as endonucleases otimizadas compreendem uma sequência de aminoácido que possui pelo menos 80% de identidade de sequência de aminoácido a um polipeptídeo descrito por SEQ ID NO: 1, 15, 16, 17 ou 19. Em uma modalidade da invenção, as endonucleases otimizadas são versões do tipo selvagem ou

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4/71 modificadas por engenharia genética de l-Scel, conforme descrito por SEQ ID NO: 1 ou um de seus homólogos que possui pelo menos 55%, 58%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência em nível de aminoácido, que possui uma ou mais mutações selecionadas a partir dos grupos de:

a) l-Scel -1, l-Scel -2, l-Scel -3, l-Scel -4, l-Scel -5, l-Scel -6, IScel -7, l-Scel -8 e l-Scel -9;

b) S229K, S229A, S229P, S229G, S229E, S229Q, S229D, S229N, S229C, S229Y, S229T, M203K, M203H, M203R, Q77K, Q77H, Q77R, E130K, E130H, E130R, Y199K, Y199H e Y199R;

c) uma metionina, valina, glicina, treonina, serina, alanina, cisteína, ácido glutâmico, glutamina, ácido aspártico, asparagina, isoleucina ou histidina após a metionina de partida de sua sequência de aminoácido; ou

d) uma combinação de uma ou mais mutações selecionadas a partir de a) e b), a) e c), b) e c) ou a) b) e c) acima.

[009] Em uma modalidade da invenção, a endonuclease otimizada compreende uma sequência de aminoácido descrita por SEQ ID NO 2, 3 ou 5.

[010] Em uma modalidade adicional da invenção, as endonucleases otimizadas são uma versão modificada por engenharia genética de uma endonuclease que compreende uma sequência de aminoácido que possui pelo menos 80% de identidade de sequência de aminoácido a um polipeptídeo descrito por SEQ ID NO: 1, 15, 16, 17 ou 19.

[011] Em outra modalidade, a invenção proporciona uma endonuclease que possui pelo menos 80% de identidade de sequência de aminoácido a um polipeptídeo descrito por SEQ ID NO: 1, ou uma versão modificada por engenharia genética de uma endonuclease que possui pelo menos 80% de identidade de sequência de aminoácido a um polipeptídeo

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5/71 descrito por SEQ ID NO: 1, sendo que a sequência de aminoácido TISSETFLK é removida por exclusão ou mutação de qualquer um dos aminoácidos da sequência de aminoácido TISSETFLK. Outra modalidade preferencial da invenção consiste em uma endonuclease otimizada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, que compreende uma sequência de aminoácido que possui pelo menos 80% de identidade de sequência de aminoácido a um polipeptídeo descrito por SEQ ID NO: 1 ou 2 e compreende uma mutação de serina Nr 229 de SEQ ID NO: 1. Em uma modalidade adicional da invenção, a endonuclease otimizada é fundida a pelo menos um domínio de dedo de zinco (zinc finger), ou a pelo menos uma unidade de repetição derivada a partir de um efetor tipo ativador de transcrição (TAL), ou pelo menos domínio de dedo de zinco (zinc finger) e pelo menos uma unidade de repetição derivada a partir de um efetor tipo ativador de transcrição (TAL). De preferência, as endonucleases otimizadas compreendem um sinal de secreção Seclll ou SecIV. A invenção também proporciona polinucleotídeos isolados compreendendo uma sequência de polinucleotídeo, que codifica para uma endonuclease otimizada.

[012] De preferência, este polinucleotídeo é códon otimizado ou tem um baixo teor de motivos de instabilidade de RNA ou tem um baixo teor de repetições de códon, ou tem um baixo teor de sítios de splicing críptico, ou tem um baixo teor de códons de iniciação alternativas, tem um baixo teor de sítios de restrição, ou tem um baixo teor de estrutura secundárias de RNA ou tem qualquer combinação das características descritas anteriormente. Outra modalidade da invenção consiste em um cassete de expressão que compreende um polinucleotídeo isolado conforme descrito em combinação funcional com um promotor e uma sequência terminadora. Outras modalidades da invenção são vetores, células hospedeiras ou organismos não-humanos compreendendo um polinucleotídeo que codifica para uma endonuclease otimizada, ou um polinucleotídeo isolado que codifica para uma endonuclease otimizada, ou um

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6/71 cassete de expressão que compreende um polinucleotídeo que codifica para uma endonuclease otimizada, e vetores, células hospedeiras ou organismos não-humanos compreendendo uma combinação das endonucleases, polinucleotídeos e cassetes de expressão descritos anteriormente. De preferência, o organismo não-humano consiste em uma planta.

[013] A invenção proporciona métodos de utilização das endonucleases aqui descritas para induzir uma recombinação homóloga ou eventos de união terminal, de preferência, em métodos para integração direcionada de excisão de sequências. De preferência, as sequências senso excisadas são genes marcadores. A invenção proporciona, ainda, um método para recombinação homóloga de polinucleotídeos que compreende as etapas a seguir: a) fornecer uma célula competente para recombinação homóloga, b) fornecer um polinucleotídeo que compreende um sítio de reconhecimento de DNA de uma endonuclease otimizada flanqueada por uma sequência A e por uma sequência B, c) fornecer um polinucleotídeo que compreende as sequências A' e B', que são suficientemente longas e homólogas à sequência A e à sequência B, para permitir uma recombinação homóloga na dita célula e d) fornecer uma endonuclease otimizada conforme descrita no presente documento ou um cassete de expressão conforme descrito no presente documento, e) combinar b), c) e d) na dita célula e f) detectar os polinucleotídeos recombinados de b) e c), ou selecionar ou cultivar células compreendendo polinucleotídeos recombinados de b) e c). De preferência, o método para recombinação homóloga de polinucleotídeos leva a uma recombinação homóloga, sendo que uma sequência de polinucleotídeo compreendida na célula competente da etapa a) é excluída do genoma das células em cultivo da etapa f). Um método adicional da invenção consiste em um método para mutação direcionada que compreende as seguintes etapas:

a) fornecer uma célula que compreende um polinucleotídeo que compreende

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7/71 um sítio de reconhecimento de DNA de uma endonuclease otimizada, b) fornecer uma endonuclease otimizada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7 ou um cassete de expressão de acordo com a reivindicação 10 e que seja capaz de clivar o sítio de reconhecimento de DNA da etapa a), c) combinar a) e b) na dita célula e d) detectar polinucleotídeos mutados, ou selecionar ou cultivar células compreendendo polinucleotídeos mutados.

[014] Em outra modalidade preferencial da invenção, os métodos descritos anteriormente compreendem uma etapa, onde a endonuclease otimizada e o sítio de reconhecimento de DNA são combinados em pelo menos uma célula através de cruzamento de organismos, através de transformação ou através de um transporte mediado via um peptídeo Sec III ou SeclV fundido à endonuclease otimizada.

Breve Descrição das Figuras [015] A Figura 1 mostra uma comparação da frequência de recombinação homóloga, medida pela restauração da atividade beta glucuronidase (% de mudas azuis), após a recombinação induzida por três variantes l-Scel diferentes. Cada variante l-Scel foi testada em cinco linhagens plantas diferentes, conduzindo-se a construção de teste. Para cada combinação, 96 mudas da geração T2 foram analisadas para determinação da atividade beta glucuronidase (“l-Scel”, que possui a sequência de aminoácido descrita por SEQ ID NO: 1; “l-Scel c-term mod” que possui a sequência de aminoácido descrita por SEQ ID NO: 3; “NLS IScel c-term mod”, que possui a sequência de aminoácido descrito por SEQ ID NO: 5), vide também o Exemplo 10b. A Figura 2 descreve um alinhamento de sequência de homólogos l-Scel diferentes, onde 1 é SEQ ID NO: 1, 2 é SEQ ID NO: 15, 3 é SEQ ID NO: 16, 4 é SEQ ID NO: 17, 5 é SEQ ID NO:

18.

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Descrição Detalhada da Invenção [016] A invenção proporciona endonucleases otimizadas, que podem ser usadas como enzimas alternativas de indução de quebra de fita dupla de DNA. A invenção também proporciona métodos de utilização de três endonucleases otimizadas.

[017] As endonucleases otimizadas são variantes de ISce-l (descrito por SEQ ID NO: 1) e dos homólogos de ISce-l que possui pelo menos 55%, 58%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência em nível de aminoácido. As versões otimizadas de l-Scel também são denominadas como ISce-l otimizada.

[018] Os homólogos de endonucleases ISce-l podem ser clonados a partir de outros organismos ou podem ser criados mutando-se as endonucleases LAGLIDADG, por exemplo, substituindo-se, adicionando-se ou excluindo-se aminoácidos da sequência de aminoácido de uma determinada endonuclease LAGLIDADG.

[019] Por exemplo, é possível adicionar sinais de localização nuclear à sequência de aminoácido de uma endonuclease LAGLIDADG e/ou alterar um ou mais aminoácidos e/ou excluir partes de sua sequência, por exemplo, partes do N-terminal ou partes de seu C-terminal.

Tabela 1: Homólogos exemplificadores de I-SceI, que podem ser clonados a

PARTIR DE OUTROS ORGANISMOS DESCRITOS NA TABELA 1;

No. de Acessão Uni-Prot	Organismo	SEQ ID NO	Identidade de sequência de aminoácido a 1
A7LCP1	S. cerevisiae	1	100
Q36760	S. cerevisiae	15	98
063264	Z. bisporus	16	72
Q34839	K. thermotolerans	17	71
Q34807	P. canadensis	18	58

[020] As endonucleases LAGLIDADG úteis na invenção podem ser encontradas nos genomas de algas, fungos, leveduras, protozoários,

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9/71 cloroplastos, mitocôndrias, bactérias e arqueias. As endonucleases LAGLIDADG compreendem pelo menos um motivo LAGLIDADG conservado. O nome do motivo LAGLIDADG se baseia em uma sequência de aminoácido característica que aparece em todas as endonucleases LAGLIDADG. O termo LAGLIDADG é um acrônimo desta sequência de aminoácido de acordo com o código de uma letra conforme descrito no STANDARD ST.25, isto é, o padrão adotado pelo Comitê de Coordenação Executivo PCIPI para a apresentação de listagens de sequências de nucleotídeos e aminoácidos em pedidos de patente.

[021] No entanto, o motivo LAGLIDADG não é completamente conservado em todas as endonucleases LAGLIDADG, (vide, por exemplo, Chevalier et al. (2001), NucleicAcids Res. 29(18): 3757 a 3774, ou Dalgaard et al. (1997), Nucleic Acids Res. 25(22): 4626 a 4638), de tal modo que algumas endonucleases LAGLIDADG compreendam alguma ou várias alterações de aminoácido em seu motivo LAGLIDADG. As endonucleases LAGLIDADG compreendendo apenas um motivo LAGLIDADG agem geralmente como homodímeros ou heterodímeros. As endonucleases LAGLIDADG compreendendo dois motivos LAGLIDADG agem como monômeros e geralmente compreendem uma estrutura pseudo-dimérica.

[022] As endonucleases LAGLIDADG podem ser isoladas dos polinucleotídeos de organismos mencionados como exemplos na Tabela 1, ou novamente sintetizadas por técnicas conhecidas na arte, por exemplo, que utilizam informações de sequência disponíveis em bancos de dados públicos conhecidos por indivíduos versados na técnica, por exemplo, Genbank (Benson (2010)), NucleicAcids Res38:D46-51 ou Swissprot (Boeckmann (2003), Nucleic Acids Res 31 :365-70). Pode-se encontrar uma coleção de endonucleases LAGLIDADG no Banco de Dados PFAM para famílias de proteínas. O número de acessão do Banco de Dados PFAM PF00961 descreve a família de proteína LAGLIDADG 1, que compreende cerca de 800 sequências de proteínas. O

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10/71 número de acessão do Banco de Dados PFAM PF03161 descreve membros da família de proteína LAGLIDADG 2, que compreende cerca de 150 sequências de proteínas. Pode-se encontrar uma coleção alternativa de endonucleases LAGLIDADG no banco de dados InterPro, por exemplo, número de acessão InterPro IPR004860.

[023] Outra forma de criar homólogos de endonucleases LAGLIDADG consiste em mutar a sequência de aminoácido de uma endonuclease LAGLIDADG com a finalidade de modificar sua afinidade de ligação ao DNA, sua afinidade de formação de dímero ou alterar sua sequência de reconhecimento de DNA. A determinação da estrutura, assim como dos alinhamentos de sequência de homólogos de endonucleases LAGLIDADG permitem escolhas racionais referentes a aminoácidos que podem ser alterados para afetar sua afinidade de ligação ao DNA, sua atividade enzimática, ou alterar sua sequência de reconhecimento de DNA.

[024] Conforme o uso em questão, o termo “afinidade de ligação ao DNA” significa a tendência de uma meganuclease ou endonuclease LAGLIDADG de se associar não-covalentemente a uma molécula de DNA de referência (por exemplo, uma sequência de reconhecimento de DNA ou uma sequência arbitrária). A afinidade de ligação é medida por uma constante de dissociação, KD (por exemplo, a KD de l-Scel para a sequência de reconhecimento de WT DNA é aproximadamente igual a 0,1 nM). Conforme o uso em questão, uma meganuclease “alterou” a afinidade de ligação se a KD da meganuclease recombinante para uma sequência de reconhecimento de DNA de referência foi aumentada ou reduzida por uma quantidade estatisticamente significativa (p < 0,05) em relação a uma meganuclease de referência ou a uma endonuclease LAGLIDADG.

[025] Conforme o uso em questão, o termo “atividade enzimática” se refere à taxa na qual uma meganuclease, por exemplo, uma endonuclease

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LAGLIDADG cliva uma sequência de reconhecimento de DNA particular. Essa atividade é uma reação enzimática mensurável, que envolve a hidrólise de ligações fosfodiéster de DNA de fita dupla. A atividade de uma meganuclease que age em um substrato de DNA particular é afetada pela afinidade ou avidez da meganuclease por tal substrato de DNA particular que, sucessivamente, é afetado tanto por interações específicas à sequência como por interações nãoespecíficas à sequência com o DNA.

[026] As nucleases podem ser adicionalmente otimizadas excluindo-se 50, 40, 30, 20, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, ou 1 aminoácidos de sua sequência de aminoácido, sem destruir sua atividade de endonuclease. Por exemplo, no caso de partes da sequência de aminoácido de uma endonuclease LAGLIDADG serem excluídas, é importante reter o motivo de endonuclease LAGLIDADG descrito anteriormente.

[027] Prefere-se excluir sequências PEST ou outros motivos de desestabilização como KEN-box, D-box e A-box. Estes motivos também podem ser destruídos pela introdução de trocas únicas de aminoácido, por exemplo, introdução de um aminoácido positivamente carregado (arginina, histidina e lisina) na sequência PEST. As endonucleases LAGLIDADG, que foram mutadas com a finalidade de modificar sua afinidade de ligação ao DNA, ou alterar seus sítios de reconhecimento de DNA são denominadas como endonucleases modificadas por engenharia genética. I-Scel, assim como homólogos de l-Sce I que possui pelo menos 55%, 58%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência em nível de aminoácido podem ser geneticamente modificados como outras endonucleases LAGLIDADG com a finalidade de alterar sua afinidade de ligação ao DNA, sua atividade enzimática, ou alterar sua sequência de reconhecimento de DNA. As versões modificadas por engenharia genética de l-Scel e homólogos de l-Sce I que possui pelo menos 55%, 58%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 93%, 94%,

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95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência em nível de aminoácido.

[028] De modo correspondente, em uma modalidade da invenção, as endonucleases otimizadas são versões modificadas por engenharia genética de l-Scel ou seus homólogos que possui pelo menos 55%, 58%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência em nível de aminoácido e que possui uma afinidade de ligação ao DNA alterada, uma atividade enzimática alterada, ou uma sequência de reconhecimento de DNA alterada, quando comparada a sua forma não modificada por engenharia genética, significando a respectiva endonuclease LAGLIDADG como ela ocorre na natureza.

[029] Em outra modalidade da invenção, as endonucleases otimizadas são variantes de l-Scel conforme descrito por SEQ ID NO: 1 ou seus homólogos que possui pelo menos 55%, 58%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência em nível de aminoácido como elas ocorrem na natureza.

[030] Os homólogos, que não ocorrem na natureza, mas têm pelo menos uma das mutações A36G, L40M, L40V, 141 S, 141 N, L43A, H91A e I123L, que têm um pequeno efeito sobre a afinidade de ligação ao DNA de IScel, ou alterará sua sequência de reconhecimento de DNA também serão considerados como sendo homólogos que ocorrem na natureza, desde que não compreendam outras mutações, que alterem sua afinidade de ligação ao DNA, sua atividade enzimática, ou sua sequência de reconhecimento de DNA, quando comparados a l-Scel conforme descrito por SEQ ID NO: 1 ou ao respectivo homólogo que possui pelo menos 55%, 58%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência em nível de aminoácido como ocorre na natureza. As versões modificadas por engenharia genética de l-Scel, que possui uma afinidade de ligação ao DNA aumentada ou

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13/71 reduzida são, por exemplo, descritas em WO07/047859 e WO09/076292 aqui incluídos a título de referência.

[031] Caso não seja explicitamente mencionado em contrário, todos os mutantes serão nomeados de acordo com os números de aminoácido das sequências de aminoácido do tipo selvagem da respectiva endonuclease, por exemplo, o mutante L19 de l-Scel terá uma troca de aminoácido de leucina na posição 19 da sequência de aminoácido l-Scel tipo selvagem, conforme descrito por SEQ ID NO: 1. O mutante L19H de l-Scel terá uma substituição da leucina de aminoácido na posição 19 da sequência de aminoácido l-Scel tipo selvagem com histidina.

[032] Por exemplo, a afinidade de ligação ao DNA de l-Scel pode ser aumentada por ao menos uma modificação correspondente a uma substituição selecionada a partir do grupo que consiste em:

(a) substituição de D201, L19, L80, L92, Y151, Y188, 1191, Y199 ou Y222 por Η, N, Q, S, T, K ou

R; ou (b) substituição de N 15, N 17, S81, H84, N94, N 120, T156, N 157, S159, N163, Q165, S166, N194 ou S202 por K ou R;

a afinidade de ligação ao DNA de l-Scel pode ser reduzida por ao menos uma mutação correspondente a uma substituição selecionada a partir do grupo que consiste em:

(a) substituição de K20, K23, K63, K122, K148, K153, K190, K193, K195 ou K223 por Η, N, Q, S, T, D ou E; ou (b) substituição de L19, L80, L92, Y151, Y188, 1191, Y199, Y222, N15, N 17, S81, H84, N94, N120, T156, N157, S159, N163, Q165, S166, N 194 ou S202 por D ou E.

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14/71 [033] As versões modificadas por engenharia genética de l-Scel, l-Crel, l-Msol e l-Ceul que possui uma sequência de reconhecimento de DNA alterada são descritas, por exemplo, em WO07/047859 e WO09/076292.

[034] Por exemplo, um importante sítio de reconhecimento de DNA de l-Scel tem a sequência a seguir:

sentido: 5’-TTACCCTGTTATCCCTAG-3' posição de base: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 anti-sentido: 3'-A AT G G G A C A AT AG G G AT C-5'.

[035] As mutações a seguir de l-Scel alterarão a preferência por C na posição 4 para A: K50.

[036] As mutações a seguir de l-Scel manterão a preferência por C na posição 4: K50, CE57.

[037] As mutações a seguir de l-Scel alterarão a preferência por C na posição 4 para G: E50, R57, K57.

[038] As mutações a seguir de l-Scel alterarão a preferência por C na posição 4 para T:K57, M57, Q50.

[039] As mutações a seguir de l-Scel alterarão a preferência por C na posição 5 para A: K48, Q102.

[040] As mutações a seguir de l-Scel manterão a preferência por C na posição 5: R48, K48, E102, E59.

[041] As mutações a seguir de l-Scel alterarão a preferência por C na posição 5 para G: E48, K102, R102.

[042] As mutações a seguir de l-Scel alterarão a preferência por C na posição 5 para T: Q48, C102, L102, V102.

[043] As mutações a seguir de l-Scel alterarão a preferência por C na posição 6 para A: K59.

[044] As mutações a seguir de l-Scel manterão a preferência por

C na posição 6: R59, K59.

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15/71 [045] As mutações a seguir de l-Scel alterarão a preferência por C na posição 6 para G: K84, E59.

[046] As mutações a seguir de l-Scel alterarão a preferência por C na posição 6 para T: Q59, Y46.

[047] As mutações a seguir de l-Scel alterarão a preferência por T na posição 7 para A: C46, L46, V46.

[048] As mutações a seguir de l-Scel alterarão a preferência por T na posição 7 para C: R46, K46, E86.

[049] As mutações a seguir de l-Scel alterarão a preferência por T na posição 7 para G: K86, R86, E46.

[050] As mutações a seguir de l-Scel manterão a preferência por T na posição 7: K68, C86, L86, Q46*.

[051] As mutações a seguir de l-Scel alterarão a preferência por G na posição 8 para A: K61, S61, V61, A61, L61.

[052] As mutações a seguir de l-Scel alterarão a preferência por G na posição 8: E88, R61, H61.

[053] As mutações a seguir de l-Scel manterão a preferência por G na posição 8: E61, R88, K88.

[054] As mutações a seguir de l-Scel alterarão a preferência por G na posição 8 para ο Τ: K88, Q61, H61.

[055] As mutações a seguir de l-Scel alterarão a preferência por T na posição 9 para A: T98, C98, V98, L9B.

[056] As mutações a seguir de l-Scel alterarão a preferência por T na posição 9 para C: R98, K98.

[057] As mutações a seguir de l-Scel alterarão a preferência por T na posição 9 para G: E98, D98.

[058] As mutações a seguir de l-Scel manterão a preferência por

T na posição 9: Q98.

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16/71 [059] As mutações a seguir de l-Scel alterarão a preferência por T na posição 10 para A: V96, C96, A96.

[060] As mutações a seguir de l-Scel alterarão a preferência por T na posição 10 para C: K96, R96.

[061] As mutações a seguir de l-Scel alterarão a preferência por T na posição 10 para G: D96, E96.

[062] As mutações a seguir de l-Scel manterão a preferência por T na posição 10: Q96.

[063] As mutações a seguir de l-Scel manterão a preferência por A na posição 11: C90, L90.

[064] As mutações a seguir de l-Scel alterarão a preferência por A na posição 11 para C: K90, R90.

[065] As mutações a seguir de l-Scel alterarão a preferência por A na posição 11 para G: E90.

[066] As mutações a seguir de l-Scel alterarão a preferência por A na posição 11 para T: Q90.

[067] As mutações a seguir de l-Scel alterarão a preferência por T na posição 12 para A: Q193.

[068] As mutações a seguir de l-Scel alterarão a preferência por T na posição 12 para C: E165, E193, D193.

[069] As mutações a seguir de l-Scel alterarão a preferência por T na posição 12 para G: K165, R165.

[070] As mutações a seguir de l-Scel manterão a preferência por T na posição 12: C165, L165, C193, V193, A193, T193, S193.

[071] As mutações a seguir de l-Scel alterarão a preferência por C na posição 13 para A: C193, L193.

[072] As mutações a seguir de l-Scel manterão a preferência por

C na posição 13: K193, R193, D192.

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17/71 [073] As mutações a seguir de l-Scel alterarão a preferência por C na posição 13 para G: E193, D193, K163, R192.

[074] As mutações a seguir de l-Scel alterarão a preferência por C na posição 13 para T: Q193, C163, L163.

[075] As mutações a seguir de l-Scel alterarão a preferência por C na posição 14 para A: L192, C192.

[076] As mutações a seguir de l-Scel manterão a preferência por C na posição 14: E161, R192, K192.

[077] As mutações a seguir de l-Scel alterarão a preferência por C na posição 14 para G: K147, K161, R161, R197, D192, E192.

[078] As mutações a seguir de l-Scel alterarão a preferência por C na posição 14 para T: K161, Q192.

[079] As mutações a seguir de l-Scel manterão a preferência por C na posição 15: E151.

[080] As mutações a seguir de l-Scel alterarão a preferência por C na posição 15 para G: K151.

[081] As mutações a seguir de l-Scel alterarão a preferência por C na posição 15 para T: C151, L151. K151.

[082] As mutações a seguir de l-Scel manterão a preferência por A na posição 17: N152, S152, C150, L150, V150, T150.

[083] As mutações a seguir de l-Scel alterarão a preferência por A na posição 17 para C: K152, K150.

[084] As mutações a seguir de l-Scel alterarão a preferência por A na posição 17 para G: N152, S152, D152, D150, E150.

[085] As mutações a seguir de l-Scel alterarão a preferência por A na posição 17 para T: Q152, Q150.

[086] As mutações a seguir de l-Scel alterarão a preferência por

G na posição 18 para A: K155, C155.

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18/71 [087] As mutações a seguir de l-Scel alterarão a preferência por G na posição 18: R155, K155.

[088] As mutações a seguir de l-Scel manterão a preferência por G na posição 18: E155.

[089] As mutações a seguir de l-Scel alterarão a preferência por G na posição 18 para T: H155, Y155.

[090] As combinações de várias mutações podem aumentar o efeito. Um exemplo é o mutante triplo W149G, D150C e N152K, que alterará a preferência de l-Scel por A na posição 17 para G.

[091] Com a finalidade de preservar a atividade enzimática, as mutações I38S, I38N, G39D, G39R, L40Q, L42R, D44E, D44G, D44H, D44S, A45E, A45D, Y46D, I47R, I47N, D144E, D145E, D145N e G146E de l-Scel ou seu homólogo que possui pelo menos 55%, 58%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência em nível de aminoácido, devem ser evitadas.

[092] As mutações que alteram a atividade enzimática, a afinidade de ligação ao DNA, a sequência de reconhecimento de DNA de l-Scel ou seu homólogo que possui pelo menos 55%, 58%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência em nível de aminoácido podem ser combinadas para criar uma endonuclease modificada por engenharia genética, por exemplo, uma endonuclease modificada por engenharia genética com base em l-Scel e que possui uma afinidade de ligação ao DNA alterada e/ou uma sequência de reconhecimento de DNA alterada, quando comparadas a l-Scel conforme descrito por SEQ ID NO: 1.

[093] Além da engenharia racional de l-Scel, também é possível alterar a atividade enzimática, a afinidade de ligação ao DNA, a sequência de reconhecimento de DNA de l-Scel ou seu homólogo que possui pelo menos 55%,

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58%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência em nível de aminoácido, empregando-se evolução molecular. Os polinucleotídeos que codificam uma enzima de endonuclease candidata podem, por exemplo, ser moduladas com protocolos de embaralhamento de DNA. O embaralhamento de DNA é um processo de recombinação e mutação recursiva, realizado por fragmentação aleatória de um pool de genes relacionados, seguido pela remontagem dos fragmentos através de um processo de reação em cadeia de polimerase. Vide, por exemplo, Stemmer (1994) Proc Natl Acad Sei USA 91 :10747-10751; Stemmer (1994) Nature 370:389-391; e US 5.605.793, US 5.837.458, US 5.830.721 e US 5.811.238. As endonucleases modificadas por engenharia genética também podem ser criadas utilizando-se desenho racional, com base em um conhecimento adicional da estrutura cristalina de uma determinada endonuclease, vide, por exemplo, Fajardo-Sanchez et al., Computer design of obligate heterodimer meganucleases allows efficient cutting of custom DNA sequences, Nucleic Acids Research, 2008, Vol. 36, No. 7 2163-2173. Vários exemplos de endonucleases modificadas por engenharia genética, assim como seus respectivos sítios de reconhecimento de DNA são conhecidos na técnica e descritos, por exemplo, em: WO 2005/105989, WO 2007/034262, WO 2007/047859, WO 2007/093918, WO 2008/093249, WO 2008/102198, WO 2008/152524, WO 2009/001159, WO 2009/059195, WO 2009/076292, WO 2009/114321, ou WO 2009/134714, WO 10/001189, aqui incluídos a título de referência.

[094] As mutações e alterações para criar nucleases otimizadas podem ser combinadas com as mutações usadas para criar endonucleases modificadas por engenharia genética, por exemplo, um homólogo de l-Scel pode ser uma nuclease otimizada conforme descrito no presente documento, mas

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20/71 também pode compreender mutações usadas para alterar sua afinidade de ligação ao DNA e/ou alterar sua sequência de reconhecimento de DNA.

[095] A sequência de aminoácido de l-Scel ou seus homólogos que possui pelo menos 55%, 58%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência em nível de aminoácido, assim como os polinucleotídeos que codificam para l-Scel ou seus homólogos que possui pelo menos 55%, 58%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência em nível de aminoácido, pode ser aperfeiçoada adaptando-se a sequência de polinucleotídeo à utilização de códon do organismo, onde l-Scel ou seus homólogos que possui pelo menos 55%, 58%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência em nível de aminoácido é destinado a ser expresso, ou excluindo-se códons de iniciação alternativa, ou excluindo-se sinais de poliadenilação críptica a partir da sequência de polinucleotídeo que codifica para o endonuclease.

Mutações Usadas para Criar Nucleases Otimizadas:

[096] As nucleases otimizadas como versões otimizadas de l-Scel ou seus homólogos que possui pelo menos 55%, 58%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência em nível de aminoácido podem ser otimizadas alterando-se a sequência de aminoácido da respectiva endonuclease LAGLIDADG para aprimorar a estabilidade de proteína. De modo correspondente, as nucleases otimizadas não compreendem ou têm um número reduzido comparado à sequência de aminoácido da nuclease não-otimizada de:

a) Sequências PEST,

b) KEN-boxes

c) A-boxes,

d) D-boxes, ou

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e) compreendem uma terminação N-terminal otimizada para estabilidade de acordo com a regra N-terminal,

f) compreendem uma glicina como o segundo aminoácido Nterminal, ou

g) qualquer combinação de a), b), c) d), e) e f).

[097] As sequências PEST são sequências de cerca de 12 aminoácidos, compreendendo pelo menos uma prolina, um glutamato ou aspartato e pelo menos uma serina ou treonina. As sequências PEST são, por exemplo, descritas em Rechsteiner M, Rogers SW. “PEST sequences and regulation byproteolysis.” Trends Biochem. Sci. 1996; 21 (7), páginas 267 a 271.

[098] A sequência de consenso de aminoácido de um KEN-box é: KENXXX(N/D).

[099] A sequência de consenso de aminoácido de um A-box é: AQRXLXXSXXXQRVL.

[0100] A sequência de consenso de aminoácido de um D-box é: RXXL.

[0101] Uma forma adicional para estabilizar as nucleases contra a degradação consiste em otimizar a sequência de aminoácido do N-terminal da respectiva endonuclease de acordo com a regra N-terminal. As nucleases que são otimizadas para a expressão em eucariotas compreendem metionina, valina, glicina, treonina, serina, alanina ou cisteína após a metionina de partida de sua sequência de aminoácido. As nucleases que são otimizadas para a expressão em procariotas compreendem metionina, valina, glicina, treonina, serina, alanina, cisteína, ácido glutâmico, glutamina, ácido aspártico, asparagina, isoleucina ou histidina após a metionina de partida de sua sequência de aminoácido. As nucleases podem ser adicionalmente otimizadas excluindo-se 50, 40,30, 20,10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, ou 1 aminoácidos de sua sequência de aminoácido, sem destruir sua atividade de endonuclease. Por exemplo, em um caso onde partes

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22/71 da sequência de aminoácido de uma endonuclease LAGLIDADG são excluídas, é importante reter o motivo de endonuclease LAGLIDADG descrito anteriormente.

[0102] Outra forma de otimizar as nucleases consiste em adicionar sinais de localização nuclear à sequência de aminoácido da nuclease. Por exemplo, um sinal de localização nuclear conforme descrito por SEQ ID NO: 4. As nucleases otimizadas podem compreender uma combinação dos métodos e recursos descritos anteriormente, por exemplo, podem compreender um sinal de localização nuclear, compreender uma glicina como o segundo aminoácido Nterminal ou uma exclusão no C-terminal ou uma combinação desses recursos. Exemplos de nucleases otimizadas que possui uma combinação dos métodos e recursos descritos anteriormente são, por exemplo, descritos por SEQ ID NOs: 2, 3 e 5.

[0103] As nucleases otimizadas não compreendem uma sequência de aminoácido descrita pela sequência: HVCLLYDQWVLSPPH, LAYWFMDDGGK, KTIPNNLVENYLTPMSLAYWFMDDGGK, KPIIYIDSMSYLIFYNLIK, KLPNTISSETFLK, ou TISSETFLK, ou que não compreendem uma sequência de aminoácido descrita pela sequência: HVCLLYDQWVLSPPH, LAYWFMDDGGK,

KPIIYIDSMSYLIFYNLIK, KLPNTISSETFLK ou TISSETFLK, ou que não compreendem uma sequência de aminoácido descrita pela sequência: HVCLLYDQWVLSPPH, LAYWFMDDGGK, KLPNTISSETFLK ou TISSETFLK, ou que não compreendem uma sequência de aminoácido descrita pela sequência: LAYWFMDDGGK, KLPNTISSETFLK ou TISSETFLK, ou que não compreendem uma sequência de aminoácido descrita pela sequência: KLPNTISSETFLK ou TISSETFLK.

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23/71 [0104] Em uma modalidade, a nuclease otimizada é l-Scel, ou seus homólogos que possui pelo menos 55%, 58%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência em nível de aminoácido onde a sequência de aminoácido TISSETFLK no C-terminal de IScel tipo selvagem ou seus homólogos que possui pelo menos 55%, 58%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência em nível de aminoácido e que possui uma sequência de aminoácido TISSETFLK no C-terminal é excluída ou mutada.

[0105] A sequência de aminoácido TISSETFLK pode ser excluída ou mutada, excluindo-se ou mutando-se pelo menos 1,2,3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9 aminoácidos do C-terminal de l-Scel tipo selvagem ou seus homólogos que possui pelo menos 55%, 58%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência em nível de aminoácido e que possui uma sequência de aminoácido TISSETFLK no Cterminal.

Tabela 2: Diferentes exemplos para exclusões da sequência de aminoácido

TISSETFLK em I- Scel tipo selvagem:

l-Scel tipo selvagem e otimizada	Sequência de aminoácido em C-terminal
l-Scel tipo selvagem	TISSETFLK
l-Scel -1	TISSETFL
l-Scel -2	TISSETF
l-Scel -3	TISSET
l-Scel -4	TISSE
l-Scel -5	TISS
l-Scel -6	TIS
l-Scel -7	TI
l-Scel -8	T
l-Scel -9	Exclusão completa

[0106] Em uma modalidade da invenção, as nucleases otimizadas ou versões otimizadas de l-Scel e seus homólogos que possui pelo menos 55%,

58%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou

99% de identidade de sequência em nível de aminoácido compreendem pelo

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24/71 menos uma das mutações a seguir: L74K, Y75H, Q77K, E130K, T134H, Y199H, M203K, Y205H.

[0107] Igualmente, prefere-se mutar a serina na posição 229 da sequência de aminoácido de l-Scel tipo selvagem conforme descrito em SEQ ID NO: 1 para Lys, Ala, Pro, Gly, Glu, Gin, Asp, Asn, Cys, Tyr ou Thr. Criando, assim, os l-Scel mutantes S229K, S229A, S229P, S229G, S229E, S229Q, S229D, S229N, S229C, S229Y, ou S229T. O aminoácido No. 229 de l-Scel tipo selvagem é o aminoácido Nr. 230 em SEQ ID NO: 2.

[0108] Em outra modalidade da invenção, o aminoácido metionina na posição 202 da sequência de aminoácido de l-Scel tipo selvagem conforme descrito em SEQ ID No. 1 (sendo o aminoácido 203 caso seja referenciado a SEQ ID No. 2), é mutado para Lys, His ou Arg. Criando, assim, o l-Scel mutante M202K, M202H e M202R.

[0109] Alternativamente, a sequência de aminoácido TISSETFLK pode ser mutada, por exemplo, à sequência de aminoácido: TIKSETFLK, ou AIANQAFLK.

[0110] As versões otimizadas preferenciais de l-Scel são as exclusões l-Scel -1, l-Scel -2, l-Scel -3, l-Scel - 4, l-Scel -5, l-Scel -6, l-Scel -7,1Scel -8, l-Scel -9 e os mutantes S229K e S229A, com mais preferência, são as exclusões l-Scel -1, l-Scel -2, l-Scel -3, l-Scel -4, l-Scel -5, l-Scel -6 e o mutante S229K. Com a máxima preferência, são a exclusão de l-Scel -5 (SEQ ID O 30) e o mutante S229K.

[0111] Também é possível combinar as exclusões e as mutações descritas anteriormente, por exemplo, combinando-se a exclusão de l-Scel -1 com o mutante S229A, criando, assim, a sequência de aminoácido TIASETFL no C-terminal.

[0112] Versões otimizadas mais preferências de l-Scel são as exclusões l-Scel -1, l-Scel -2, l-Scel -3, 1- Scel -4, l-Scel -5, l-Scel -6, l-Scel -7,1

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Scel -8, l-Scel -9 ou os mutantes de S229K e S229A, em combinação com a mutação M202K.

[0113] Com ainda mais preferência, são as exclusões l-Scel -1, IScel -2, l-Scel -3, l-Scel -4, l-Scel -5, l-Scel - 6 ou o mutante S229K em combinação com a mutação M202K. Em outra modalidade da invenção, os aminoácidos glutamina na posição 76, ácido glutâmico na posição 129, ou tirosina na posição 198 da sequência de aminoácido de l-Scel tipo selvagem conforme descrito em SEQ ID No. 1 (sendo aminoácidos 77, 130 e 199 caso sejam referenciados a SEQ ID No. 2), são mutados para Lys, His ou Arg. Criando, assim, os l-Scel mutantes Q76K, Q76H, Q76R, E129K, E129H, E129R, Y198K, Y198HeY198R.

[0114] As exclusões e mutações descritas anteriormente também serão aplicáveis a seus homólogos de l-Scel que possui pelo menos 55%, 58%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência em nível de aminoácido e que possui uma sequência de aminoácido TISSETFLK no C-terminal.

[0115] Consequentemente, em uma modalidade da invenção, a endonuclease otimizada é uma versão otimizada de l-Scel ou de um de seus homólogos que possui pelo menos 55%, 58%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência em nível de aminoácido, e que possui uma ou mais mutações ou exclusões selecionadas a partir do grupo de: l-Scel -1, l-Scel -2, I- Scel -3, l-Scel -4, l-Scel -5, l-Scel -6,1Scel -7, l-Scel -8, l-Scel -9, S229K, S229A, S229P, S229G, S229E, S229Q, S229D, S229N, S229C, S229Y, S229T, M202K, M202H, M202R, Q76K, Q76H, Q76R, E129K, E129H, E129R, Y198K, Y198H e Y198R, sendo que os números de aminoácido são referenciados à sequência de aminoácido conforme descrito por SEQ ID NO: 1. Em uma modalidade adicional da invenção, a endonuclease otimizada é uma versão otimizada de l-Scel ou de um de seus homólogos que

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26/71 possui pelo menos 55%, 58%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência em nível de aminoácido, e que possui uma ou mais mutações ou exclusões selecionadas a partir do grupo de: l-Scel -1, l-Scel -2, l-Scel -3, l-Scel -4, l-Scel -5, l-Scel -6, S229K e M202K, sendo que os números de aminoácido são referenciados à sequência de aminoácido conforme descrito por SEQ ID NO: 1.

[0116] Uma endonuclease otimizada particular preferencial é um tipo selvagem ou versão modificada por engenharia genética de l-Scel, conforme descrito por SEQ ID NO: 1 ou um de seus homólogos que possui pelo menos 55%, 58%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência em nível de aminoácido e que possui uma ou mais mutações selecionadas a partir dos grupos de:

b) S229K, S229A, S229P, S229G, S229E, S229Q, S229D, S229N, S229C, S229Y, S229T, M203K, M203H, M203R, Q77K, Q77H, Q77R, E 130K, E130H, E130R, Y199K, Y199H e Y199R;

c) metionina, valina, glicina, treonina, serina, alanina, cisteína, ácido glutâmico, glutamina, ácido aspártico, asparagina, isoleucina ou histidina após a metionina de partida de sua sequência de aminoácido; ou

d) uma combinação de uma ou mais mutações selecionadas a partir de a) e b), a) e c), b) e c) ou a) b) e c) anteriores.

[0117] A endonuclease otimizada é, de preferência, expressa como uma proteína de fusão com uma sequência de localização nuclear (NLS). Esta sequência NLS permite um transporte facilitado ao núcleo e aumenta a eficácia do sistema de recombinação. Uma variedade de sequências NLS é conhecida pelos indivíduos versados e descrita, dentre outros, por Jicks G e Raikhel NV (1995) Annu. Rev. Cell Biol. 1 1 :155-188. Por exemplo, a sequência

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NLS do antígeno SV40 grande é preferencial para organismos vegetais. Proporcionam-se exemplos no documento WO 03/060133. A NLS pode ser heteróloga à endonuclease e/ou ao domínio de ligação ao DNA ou pode ser naturalmente compreendida na endonuclease e/ou no domínio de ligação ao DNA.

[0118] Outra modalidade da invenção consiste em fusões translacionais que compreende endonucleases otimizadas e domínios de ligação ao DNA heterólogos. As endonucleases otimizadas compreendem mutações conforme descrito anteriormente e podem compreender ou não mutações adicionais conforme descrito anteriormente, por exemplo, as mutações usadas para criar endonucleases modificadas por engenharia genética.

[0119] Os domínios de ligação ao DNA heterólogos preferenciais são dedo de zinco (zinc fingef ou unidades de repetição derivadas a partir de um efetor tipo ativador de transcrição (TAL) (também denominado como repetição TAL).

[0120] Consequentemente, em uma modalidade da invenção, a endonuclease otimizada é fundida a pelo menos um domínio de dedo de zinco (zinc fingeh, ou a pelo menos uma das unidades de repetição derivadas a partir de um efetor tipo ativador de transcrição (TAL), ou pelo menos um domínio de dedo de zinco (zinc fingef e pelo menos uma das unidades de repetição derivadas de um efetor tipo ativador de transcrição (TAL).

[0121] Aquelas fusões podem ser N-terminal ou C-terminal ou N- e C-terminal à endonulease otimizada.

[0122] Por exemplo, é possível fundir pelo menos um domínio de dedo de zinco (zinc fingerj ao N-terminal e pelo menos um domínio de dedo de zinco (zinc finger) ao C-terminal da endonuclease otimizada, ou fundir pelo menos um domínio de dedo de zinco (zinc finger) ao N-terminal e pelo menos uma unidade de repetição derivada a partir de um efetor tipo ativador de

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28/71 transcrição (TAL) ao C-terminal da endonuclease otimizada. Alternativamente, também é possível fundir uma combinação de pelo menos um domínio de dedo de zinco (zinc finger) e pelo menos uma unidade de repetição derivada a partir de um efetor tipo ativador de transcrição (TAL) ao N- ou C-terminal ou ao N- e C-terminal de uma endonuclease otimizada. Basicamente toda permutação desses elementos é possível. Os domínios de dedo de zinco (zinc finger) têm resíduos conservados de cisteína e histidina que coordenam de modo tetraédrico o único átomo de zinco em cada domínio de dedo. Em particular, a maioria dos ZFPs é caracterizada por componentes de dedo da sequência geral:

-Cys-(X)2-4-Cys-(X)i2-His-(X)3-5-His-, onde X representa qualquer aminoácido (os ZFPs C2H2). Os domínios de dedo de zinco (zinc finger) desta classe mais abrangentemente representada contêm duas cisteínas e duas histidinas com espaçamentos particulares. A estrutura dobrada de cada domínio de dado contém uma betavolta antiparalela, uma região de ponta de dedo e uma hélice alfa 10 antipática curta. Os ligantes metálicos de coordenação se ligam ao íon de zinco e, no caso de dedo de zinco tipo zif268, a a-hélice antipática curta se liga na ranhura principal de DNA. Ademais, a estrutura dos dedo de zinco (zinc finger) é estabilizada por determinados resíduos de aminoácido hidrofóbico conservado (por exemplo, o resíduo diretamente anterior ao primeiro Cys conservado e o resíduo na posição +4 do segmento helicoidal do dedo) e por coordenação de zinco 15 através dos resíduos conservados de cisteína e histidina. Descreveramse os ZFPs C2H2 canônicos que possui alterações nas posições que fazem contatos de base diretos, 'suportam’ ou 'sustentam' resíduos imediatamente adjacentes às posições de contato de base, e às posições capazes de entrarem em contato com a espinha dorsal de fosfato do DNA. Vide, por exemplo, as Patentes U.S. Nos. 6.007.988; 6.013.453; 6.140.081; 6.866.997; 6.746.838; 6.140.081; 6.610.512; 7.101.972; 6.453.242; 6.785.613; 7.013.219; PCT WO

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98/53059; Choo et al. (2000) Curro Opin. Struct. Biol.10:411-416; Segai et al. (2000) Curro Opin. Chern. Biol.4:34-39.

[0123] Ademais, as proteínas de dedo de zinco (zinc finge/ conque possui os dedo de zinco com resíduos de coordenação de zinco modificados também foram descritas (vide, por exemplo, Os Pedidos de Patente U.S. Nos. 25 20030108880, 20060246567 e 20060246588; estando as descrições destes aqui incorporadas a título de referência).

[0124] Os termos “unidade de repetição derivada a partir de um efetor tipo ativador de transcrição (TAL)”, “unidade de repetição” e “repetição TAL” são usados de modo intercambiável e são usados para descrever a porção modular de um domínio de repetição a partir de um efetor TAL, ou uma versão artificial deste, que contém dois aminoácidos nas posições 12 e 13 da sequência de aminoácido de uma unidade de repetição que determina o reconhecimento deu um par de base em uma sequência de DNA alvo de tal modo que os aminoácidos confiram reconhecimento de: HD para reconhecimento de C/G; NI para reconhecimento de AT; NG para reconhecimento de T/A; NS para reconhecimento de C/G ou AT ou T/A ou G/C; NN para reconhecimento de G/C ou A/T; IG para reconhecimento de T/A; N para reconhecimento de C/G; HG para reconhecimento de C/G ou T/A; H para reconhecimento de T/A; e NK para reconhecimento de G/C, (os aminoácidos H, D, I, G, S, K são descritos por códigos de uma letra, desse modo, A, T, C, G se referem aos pares de base de DNA reconhecidos pelos aminoácidos).

[0125] O número de unidades de repetição a ser usado em um domínio de repetição pode ser averiguado por um indivíduo versado na técnica através de experimentação de rotina. Em geral, pelo menos 1,5 unidades de repetição são consideradas como um mínimo, embora, tipicamente, pelo menos cerca de 8 unidades de repetição sejam usadas. As unidades de repetição não

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30/71 precisam ser unidades de repetição completas, visto que se podem utilizar unidades de repetição com a metade do tamanho. Um domínio de ligação ao DNA hetetólogo da invenção pode compreender, por exemplo, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 19,5, 20, 20,5, 21,21,5, 22,

22.5, 23, 23,5, 24, 24,5, 25, 25,5, 26, 26,5, 27, 27,5, 28, 28,5, 29, 29,5, 30, 30,5,

31.31.5, 32, 32,5, 33, 33,5, 34, 34,5, 35, 35,5, 36, 36,5, 37, 37,5, 38, 38,5, 39,

39.5, 40, 40,5, 41,41,5, 42, 42,5, 43, 43,5, 44, 44,5, 46, 46,5, 47, 47,5, 48, 48,5, 49, 49,5, 50, 50,5 ou mais unidades de repetição.

[0126] Uma sequência de consenso típica de uma repetição com 34 aminoácidos (em código de uma letra) é mostrada abaixo:

LTPEQWAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHG (SEQ ID NO: 19).

[0127] Uma sequência de consenso adicional para uma unidade de repetição com 35 aminoácidos (em código de uma letra) é a seguinte: LTPEQWAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAPHD (SEQ ID NO: 20).

[0128] As unidades de repetição que podem ser usadas em uma modalidade da invenção têm uma identidade com as sequências de consenso descritas anteriormente de pelo menos 35%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95%.

[0129] Os domínios de dedo de zinco (zinc fingeh, assim como as repetições TAL podem ser mutados para se ligarem a qualquer sequência de polinucleotídeo determinada. Os métodos de como selecionar as mutações apropriadas são descritos em W00027878, WO03062455, W008076290, W008076290, W09945132 e WO2010/079430, aqui incluídos a título de referência. Portanto, é possível selecionar uma sequência de polinucleotídeo próxima a uma sequência de reconhecimento de DNA de uma endonuclease otimizada, e mutar os domínios de dedo de zinco (zinc finger) ou as repetições TAL para se ligarem àquela sequência de polinucleotídeo vizinha. Os domínios

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31/71 de dedo de zinco (zinc finger) ou repetições TAL podem, então, ser usados para fusões translacionais com a respectiva endonuclease otimizada, que possui a sequência de reconhecimento de DNA próxima.

[0130] Também é possível escolher uma sequência de polinucleotídeo similar a uma sequência de reconhecimento de DNA de uma endonuclease otimizada, porém, sendo reconhecida de forma ineficaz e/ou cortada pela endonuclease otimizada. É possível criar fusões translacionais de endonucleases otimizadas com pelo menos um dedo de zinco (zinc finger) ou repetição TAL, ligar a uma sequência de polinucleotídeo próxima a este sítio de reconhecimento de DNA não-ótimo, que reconhecerá e cortará o dito sítio de reconhecimento de DNA não-ótimo de modo mais eficiente.

[0131] É possível gerar fusões de nucleases LAGLIDADG otimizadas com uma combinação de repetição TAL e domínios de dedo de zinco (zinc finger). Visto que os efetores TAL são capazes de reconhecerem regiões ricas em AT, isto pode compensar a limitação dos domínios de dedo de zinco (zinc finger), que preferencialmente se ligam às regiões ricas em GC.

[0132] A repetição TAL e os domínios de dedo de zinco (zinc finger) podem ser usados para criar fusões N-terminal ou C-terminal ou N-terminal e Cterminal às nucleases LAGLIDADG otimizadas, sendo que várias repetições TAL e/ou domínios de dedo de zinco (zinc finger), assim como combinações destes, podem ser fundidos na extremidade N- terminal ou C-terminal das nucleases LAGLIDADG otimizadas.

[0133] As estruturas exemplificadoras dessas fusões são:

N-term-l-Scel- repetição TAL (x)-C-term;

N-term- repetição TAL(x) l-Scel- -C-term;

N-term- repetição TAL(x) l-Scel- repetição TAL-C-term;

N-term-l-Scel- domínio de dedo de zinco (zinc finger) (x)-C-term;

N-term- domínio de dedo de zinco (zinc finger) (x) l-Scel- -C-term;

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N-term- domínio de dedo de zinco (zinc finger) (x) l-Scel- domínio de dedo de zinco (zinc finger) (x) -C-term;

N-term- repetição TAL(x)-l-Scel- domínio de dedo de zinco (zinc finger) (x)-C-term;

N-term- domínio de dedo de zinco (zinc finger) (x) l-Scel- repetição TAL-C-term;

N-term- domínio de dedo de zinco (zinc finger) (x)-repetição TAL(x)-l-Scel- domínio de dedo de zinco (zinc finger) (x)-C-term;

N-term- domínio de dedo de zinco (zinc finger) (x) l-Scel- repetição TAL(x) -domínio de dedo de zinco (zinc finger) (x)-C-term, sendo que (x) significa uma ou várias repetições TAL ou domínios de dedo de zinco (zinc finger).

[0134] Em uma modalidade preferencial, as sequências que codificam as endonucleases otimizadas são modificadas pela inserção de uma sequência de íntron. Isto evita a expressão de uma enzima funcional em organismos hospedeiros procarióticos e, desse modo, facilita procedimentos de clonagem e transformações (por exemplo, com base em E.coli ou Agrobacterium). Em organismos eucarióticos, por exemplo, organismos plantas, a expressão de uma enzima funcional é realizada, visto que as plantas são capazes de reconhecer os íntrons e “realizar splicing” nos mesmos. De preferência, os íntrons são inseridos nas endonucleases otimizadas mencionadas como preferenciais acima.

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33/71 [0135] Em outra modalidade preferencial, as sequências de aminoácidos da endonuclease otimizada podem ser modificadas adicionando-se um sinal de secreção Sec IV ao N-, ou C-terminal da endonuclease otimizada.

[0136] Em uma modalidade preferencial, o sinal de secreção SeclV é um sinal de secreção SeclV compreendido em proteínas Vir de Agrobacteríum. Exemplos desses sinais de secreção Sec IV, assim como os métodos de como aplicar estes são descritos em WO 01 89283, em Vergunst et al, A carga positiva é um recurso importante do sinal de transporte C-terminal das proteínas translocadas VirB/D4 de Agrobacteríum, PNAS 2005, 102, 03, páginas 832 a 837.

[0137] Um sinal de secreção Sec IV também pode ser adicionado, adicionando-se fragmentos de uma proteína Vir ou até mesmo uma proteína Vir completa, por exemplo, uma proteína VirE2 completa a uma endonuclease otimizada, de maneira similar conforme descrito na descrição de WO01/38504, que descreve uma proteína de fusão RecA/VirE2.

[0138] Em outra modalidade preferencial, as sequências de aminoácidos da endonuclease otimizada podem ser modificadas adicionando-se um sinal de secreção Sec III ao N-, ou C-terminal da endonuclease otimizada. Os sinais de secreção Seclll adequados são, por exemplo, descritos em WO 00/02996.

[0139] No caso de um sinal de secreção Sec III ser adicionado, pode ser vantajoso expressar a endonuclease otimizada em uma célula, que também compreenda uma construção recombinante que codifica partes ou todo um sistema de secreção funcional tipo III, com a finalidade de super-expressar ou complementar partes ou todo um sistema de secreção funcional tipo III em tal célula.

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34/71 [0140] As construções recombinantes que codificam partes ou todo um sistema de secreção funcional tipo III são, por exemplo, descritas em WO 00/02996.

[0141] Se um sinal de secreção SeclV for adicionado à endonuclease otimizada e se a endonuclease otimizada for destinada a ser expressa, por exemplo, em Agrobacterium rhizogenes ou em Agrobacterium tumefaciens, é vantajoso adaptar a sequência de DNA que codifica para a endonuclease otimizada à utilização de códon do organismo de expressão. De preferência, a endonuclease otimizada não tem, ou tem apenas algumas sequências de reconhecimento de DNA no genoma do organismo de expressão. Isto é ainda mais vantajoso, se a endonuclease otimizada não tiver uma sequência de reconhecimento de DNA ou uma sequência de reconhecimento de DNA menos preferencial no genoma de Agrobacterium. No caso de se pretender que a endonuclease otimizada seja expressa em um organismo procariótico, a sequência que codifica endonuclease otimizada não deve ter um íntron.

Polinucleotídeos:

[0142] A invenção também compreende polinucleotídeos isolados que codificam as endonucleases otimizadas descritas anteriormente.

[0143] Exemplos desses polinucleotídeos isolados são polinucleotídeos isolados que codificam sequências de aminoácidos descritas por SEQ ID NO: 3, 5, ou sequências de aminoácidos que possui pelo menos 70%, 80%, 90% 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de similaridade de sequência de aminoácido, de preferência, que possui pelo menos 70%, 80%, 90% 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência de aminoácido a qualquer uma das sequências de aminoácidos descritas por SEQ ID NO:2, 3, 5.

[0144] De preferência, o polinucleotídeo isolado tem uma utilização de códon otimizada para expressão em um organismo hospedeiro particular, ou

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35/71 tem um baixo teor de motivos de instabilidade NA, ou tem um baixo teor de repetições de códon, ou tem um baixo teor de sítios de splicing críptico, ou tem um baixo teor de códons de partida alternativos, ou tem um baixo teor de sítios de restrição, ou tem um baixo teor de estruturas secundárias de RNA ou tem qualquer combinação desses recursos.

[0145] A utilização de códon do polipeptídeo isolado pode ser otimizada, por exemplo, para a expressão em plantas, de preferência, em um vegetal selecionado a partir do grupo que compreende: arroz, milho, trigo, canoa, cana de açúcar, girassol, beterraba, batata ou tabaco.

[0146] De preferência, o polinucleotídeo isolado é combinado com uma sequência promotora e como uma sequência terminadora adequadas para formar um cassete de expressão funcional para expressão da endonuclease otimizada em um organismo hospedeiro particular.

[0147] Os promotores adequados são, por exemplo, promotores específicos constitutivos, induzíveis por calor ou patógenos de sementes, pólen, flores ou frutas.

[0148] Os indivíduos versados na técnica conheceM vários promotores que possuem estes recursos.

[0149] Por exemplo, diversos promotores constitutivos em plantas são conhecidos. A maioria deles deriva de fontes virais ou bacterianas, como promotor desintase nopalina (nos) (Shawetal. (1984) NucleicAcids Res. 12 (20): 7831 -7846), o promotor sintase manopina (mas) (Cornai et al. (1990) PlantMolBiol 15(3):373-381 ), ou o promotor sintase octopina (ocs) (Leisner e Gelvin (1988) Proc NatlAcad Sei USA 85 (5) :2553-2557) da Agrobacterium tumefaciens ou o promotor CaMV35S do Vírus do Mosaico da Couve-Flor (US 5.352.605). O último era mais frequentemente usado na expressão constitutiva de transgenes em plantas (Odell et al. (1985) Nature 313:810-812; Battraw e Hall (1990) Plant Mol Biol 15:527-538; Benfey et al. (1990) EMBO J 9(69):1677-1684; US 5.612.472). No entanto, o promotor CaMV 35S

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36/71 demonstra variabilidade não apenas em diferentes espécies vegetais, mas também em diferentes tecidos vegetais (Atanassova et al. (1998) Plant Mol Biol 37:275-85; Battraw e Hall (1990) Plant Mol Biol 15:527-538; Holtorf et al. (1995) Plant Mol Biol 29:637-646 ; Jefferson et al. (1987) EMBO J 6 :3901-3907). Uma desvantagem adicional é uma interferência da atividade regulatória de transcrição do promotor 35S com o vírus CaMV tipo selvagem (Al-Kaff et al. (2000) Nature Biotechnology 18 :99599). Outro promotor viral para expressão constitutiva é o promotor Sugarcane bacilliform badnavirus (ScBV) (Schenketal. (1999) PlantMolBiol39 (6) :1221 -1230).

[0150] Descrevem-se vários promotores constitutivos vegetais, como o promotor de ubiquitina da Arabidopsis thaliana (Callis et al. (1990) J Biol Chem 265:12486-12493; Holtorf S et al. (1995) Plant Mol Biol29-.637-747), que - no entanto - é reportado como sendo incapaz de regular a expressão de marcadores de seleção (W003102198), ou dois promotores de ubiquitina de milho (Ubi-1 e U bi-2; US 5.510.474; US 6.020.190; US 6.054.574), que além de um perfil de expressão constitutiva demonstra uma indução de choque térmico (Christensen et al. (1992) Plant. Mol. Biol. 18(4):675-689). Uma comparação do nível de especificidade e expressão do CaMV 35S, o promotor de tionina de cevada, e o promotor de ubiquitina de Arabidopsis com base em plantas de Arabidopsis estavelmente transformados demonstram uma alta taxa de expressão para o promotor CaMV 35S, enquanto o promotor de tionina estava inativo na maioria das linhagens e o promotor da Arabisopsis resultou apenas em uma atividade de expressão moderada (Holtorf et al. (1995) Plant Mol Biol29 (4):637-6469).

Vetores:

[0151] Os polinucleotídeos descritos anteriormente podem ser compreendidos em um vetor de DNA adequado para transformação, transfecção, clonagem ou super-expressão.

[0152] Em um exemplo, os polinucleotídeos descritos anteriormente são compreendidos em um vetor para transformação de

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37/71 organismos não-humanos ou células, de preferência, os organismos nãohumanos são plantas ou células vegetais.

[0153] Em geral, os vetores da invenção compreendem elementos funcionais adicionais, que podem incluir, mas não se limitam a:

i) Origens de replicação que garantam a replicação dos cassetes de expressão ou vetores de acordo com a invenção, por exemplo, em E. coli. Exemplos que podem ser mencionados são ORI (origem de replicação de DNA), o pBR322 ori ou ο P15A ori (Sam-brook et al.: Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2- ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989);

ii) Múltiplos sítios de clonagem (MCS) para permitir e facilitar a inserção de uma ou mais sequências de ácido nucleico;

iii) Sequências que tornem possível uma recombinação homóloga ou inserção no genoma de um organismo hospedeiro;

iv) Elementos, por exemplo, sequências delimitadoras, que tornem possível a transferência mediada por Agrobacterium em células vegetais para a transferência e a integração no genoma vegetal, tal como, por exemplo, o limite direito ou esquerdo do T-DNA ou da região vir.

A Sequência Marcadora [0154] Deve-se compreender, no sentido amplo, que o termo “sequência marcadora” inclui todas as sequências nucleotídicas (e/ou sequências de polipeptídeo transladadas a partir das mesmas) que facilitem a detecção, identificação, ou seleção de células, tecidos ou organismos transformados (por exemplo, plantas). Os termos “sequência que permite a seleção de um material vegetal transformado”, “marcador de seleção” ou “gene marcador de seleção” ou “proteína marcadora de seleção” ou “marcador” têm essencialmente o mesmo significado.

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38/71 [0155] Os marcadores podem incluir (mas não se limitam a) um marcador selecionável e um marcador passível de triagem. Um marcador selecionável confere à célula ou ao organismo um fenótipo que resulta em uma diferença de crescimento ou viabilidade. O marcador selecionável pode interagir com um agente de seleção (tal como um herbicida ou antibiótico ou pró-fármaco) para produzir este fenótipo. Um marcador passível de triagem confere à célula ou ao organismo um fenótipo prontamente detectável, de preferência, um fenótipo visivelmente detectável como uma cor ou coloração. O marcador passível de triagem pode interagir com um agente de triagem (como um corante) para produzir este fenótipo.

[0156] O marcador selecionável (ou sequências marcadoras selecionáveis) compreende, mas não se limita a

a) marcador de seleção negativa, que confere resistência contra um ou mais agentes tóxicos (no caso de plantas fitotóxicas) como antibióticos, herbicidas ou outros biocidas,

b) marcador de contra-seleção, que confere uma sensibilidade contra determinados compostos químicos (por exemplo, convertendo-se um composto não-tóxico em um composto tóxico), e

c) marcador de seleção positiva, que confere uma vantagem de crescimento (por exemplo, através de expressão de elementos chave da citocina ou biossíntese de hormônio que leva à produção de um hormônio vegetal, por exemplo, auxina, guiberelinas, citocinas, ácido abscísico e etileno; Ebinuma H et al. (2000) Proc Natl Acad Sei USA 94:21 17-2121).

[0157] Ao se utilizar marcadores de seleção negativa, selecionamse apenas células ou plantas compreendendo o dito marcador de seleção negativa. Ao se utilizar um marcador de contra-seleção, selecionam-se apenas células ou plantas que sejam desprovidas do dito marcador de contra-seleção. O marcador de contra-seleção podem ser empregados para verificar a excisão

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39/71 bem sucedida de uma sequência (que compreende o dito marcador de contraseleção) a partir de um genoma. As sequências marcadoras passíveis de triagem incluem, mas não se limitam a, genes repórteres (por exemplo, luciferase, glucuronidase, cloranfenicol acetil transferase (CAT, etc.). As sequências marcadoras preferenciais incluem, mas não se limitam a:

i) Marcador de seleção negativa [0158] Normalmente, os marcadores de seleção negativa são úteis para selecionar células que tenham sido submetidas com sucesso à transformação. O marcador de seleção negativa, que foi introduzido com a construção de DNA da invenção, pode conferir resistência a um biocida ou agente fitotóxico (por exemplo, um herbicida como fosfinotricina, glifosato ou bromoxinil), um inibidor de metabolismo como 2-deoxiglucose-6-fosfato (WO 98/45456) ou um antibiótico como, por exemplo, tetraciclina, ampicilina, canamicina, G 418, neomicina, bleomicina ou higromicina às células que foram submetidas com sucesso à transformação. O marcador de seleção negativa permite a seleção das células transformadas a partir de células nãotransformadas (McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5:81 -84). O marcador de seleção negativa em um vetor da invenção pode ser empregado para conferir resistência em mais de um organismo. Por exemplo, um vetor da invenção pode compreender um marcador de seleção para amplificação em bactérias (como E.coli ou Agrobacterium) e plantas. Exemplos de marcadores selecionáveis para E. coli incluem: genes que especificam resistência a antibióticos, isto é, ampicilina, tetraciclina, canamicina, eritromicina, ou genes que conferem outros tipos de atividades enzimáticas selecionáveis como galactosidase, ou o operon lactose. Os marcadores selecionáveis adequados para uso em células de mamíferos incluem, por exemplo, o gene diidrofolato reductase (DHFR), o gene timidina quinase (TK), ou genes procarióticos que conferem resistência a fármacos, gpt (xantina-guaninafosforibosiltransferase, que pode ser selecionado

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40/71 com o ácido micofenólico; neo (neomicina fosfotransferase), que pode ser selecionado com G418, higromicina, ou puromicina; e DHFR (diidrofolato reductase), que pode ser selecionado com metotrexato (Mulligan & Berg (1981) Proc NatlAcad Sei USA 78:2072; Southern & Berg (1982) J Mol Appl Genet 1 : 327). Geralmente, os marcadores de seleção para células vegetais conferem resistência a um biocida ou a um antibiótico, tal como, por exemplo, canamicina, G 418, bleomicina, higromicina, ou cloranfenicol, ou resistência a herbicida, como resistência a clorsulfurona ou Basta.

[0159] Os marcadores de seleção negativa especialmente preferenciais são aqueles que conferem resistência a herbicidas. Exemplos de marcadores de seleção negativa são:

as sequências de DNA que codificam fosfinotricina acetiltransferases (PAT), que acetila o grupo amino livre do inibidor glutamina sintase fosfinotricina (PPT) e, portanto, produz a detoxificação de PPT (de Block et al. (1987) EMBO J 6:2513-2518) (também referido como gene bar resistente a Bialophos; EP 242236), genes sintase 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato (genes sintase EPSP), que conferem resistência a Glifosato- (N-(fosfonometil)glicina), o gene gox, que codifica a enzima de degradação de glifosato oxi-doreduetase, o gene deh (que codifica uma dealogenase que inativa o Dalapon-), acetolactato sintases que conferem resistência a sulfonilureia e imidazolinona, genes bxn que codificam enzimas nitrilase de degradação de bromoxinil, a canamicina, ou G418, gene de resistência (NPTII). O gene NPTII codifica uma neomicina fosfotransferase que reduz o efeito inibitório de

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41/71 canamicina, neomicina, G418 e paromomicina devido a uma reação de fosforilação (Becket al (1982) Gene 19: 327), o gene DOGR1. O gene DOGR1 foi isolado da levedura Saccharomyces cerevisiae (EP 0 807 836). Este codifica um 2-deoxiglicose-6fosfato fosfatase que confere resistência a 2-DOG (Randez-Gil et al. (1995) Yeasí11 :1233-1240).

o gene hyg, que codifica a enzima higromicina fosfotransferase e confere resistência ao antibiótico higromicina (Gritz e Davies (1983) Gene 25: 179);

especialmente preferenciais são os marcadores de seleção negativa que conferem resistência contra os efeitos tóxicos impostos por aminoácidos tipo D, por exemplo, D-alanina e D-serina (WO 03/060133; Erikson 2004). Especialmente preferenciais como marcador de seleção negativa neste contexto são genes daol (EC: 1 .4. 3.3 : GenBank Acc.-No.: U60066) da levedura Rhodotorula gracilis (Rhodosporidium toruloides) e gene E. coli dsdA (D-serina deidratase (Dserina deaminase) (EC: 4.3.1.18; GenBank Acc.-No.: J01603).

ii) Marcador de seleção positiva [0160] O marcador de seleção positiva compreende, mas não se limita a, genes marcadores de seleção de estímulo de crescimento como isopentenil transferase de Agrobacteríum tumefaciens (cepa:P022; Genbank Acc.-No.: AB025109) pode-como uma enzima chave da biossíntese de citocina - facilitar a regeneração de plantas transformados (por exemplo, pela seleção em um meio isento de citocina). Os métodos de seleção correspondentes são descritos (Ebinuma H et al. (2000) Proc Natl Acad Sei USA 94:21 17-2121; Ebinuma H et al. (2000) Selection of Marker-free transgenic plants using the oncogenes (ipt, rol A, B, C) of Agrobacteríum as selectable markers, ln Molecular Biology of Woody Plants. Kluwer Academic Publishers). Os marcadores de seleção positivos adicionais, que conferem uma vantagem de crescimento a um

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42/71 vegetal transformado em comparação com um não-transformado, são descritos, por exemplo, em EP-A 0 601 092. Os marcadores de seleção de estímulo de crescimento podem incluir (mas não se limitam a) beta-Glucuronidase (em combinação com, por exemplo, uma citocinina glucuronida), manose-6-fosfato isomerase (em combinação com manose), UDP-galactose-4-epimerase (em combinação com, por exemplo, galactose), sendo que o manose-6-fosfato isomerase em combinação com manose PE especialmente preferencial.

ui) Marcadores de contra-seleção [0161] O marcador de contra-seleção permite a seleção de organismos com sequências excluídas com sucesso (KoprekT et al. (1999) Plant J 19(6):719-726). Fragmento de TKtimidina quinase (TK) e difteria toxina A (DTA), gene codA que codifica uma citosina deaminase (Gleve AP et al. (1999) Plant Mol Biol 40(2):223-35; Pereat RI et al. (1993) Plant Mol Biol 23(4)793-799; Stougaard J (1993) Plant J 3:755-761 ), o gene citocromo P450 (Koprek et al. (1999) Plant J 16:719- 726), genes que codificam um haloalcano dealogenase (Naested H (1999) Plant J 18:571 -576), o gene iaaH (Sundaresan V et al. (1995) Genes & Development 9:1797-1810), o gene tms2 (Fedoroff NV & Smith DL (1993) Plant J 3:273- 289), e as ácido D-amino oxidases que causam efeitos tóxicos pela conversão de D-aminoácidos (WO 03/ 060133).

[0162] Em uma modalidade preferencial, o cassete de excisão inclui pelo menos um dos ditos marcadores de contra-seleção para distinguir células vegetais ou plantas com sequências excisadas com sucesso a partir do vegetal que ainda contém estes. Em uma modalidade mais preferencial, o cassete de excisão da invenção compreende um marcador de função dupla, isto é, um marcador que pode ser empregado como um marcador de seleção negativa ou como um marcador de contra-seleção dependendo do substrato empregado no esquema de seleção. Um exemplo para um marcador de função dupla é o gene daol (EC: 1 .4. 3.3 : GenBank Acc.-No.: U60066) da levedura

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Rhodotorula gracilis, que pode ser empregado como marcador de seleção negativa com D-aminoácidos como D-alanina e D-serina, e como um marcador de contra-seleção com D-aminoácidos como D-isoleucina e D-valina (vide o Pedido de Patente Europeu No.: 04006358.8 )

IV) MARCADOR PASSÍVEL DE TRIAGEM (GENES REPÓRTERES) [0163] O marcador passível de triagem (como genes repórteres) codificam proteínas prontamente quantificáveis ou detectáveis e que, através de uma cor intrínseca ou atividade enzimática, garante a avaliação da eficácia de transformação ou do local ou temporização de expressão. Especialmente preferenciais são os genes que codificam as proteínas repórteres (vide também Schenborn E, Groskreutz D. (1999) MolBiotechnol 13(1 ):29-44) como “proteína verde fluorescente” (GFP) (Chui WL et al. (1996) Curr Biol6:325-330; Lef-fel SM et al. (1997) Biotechniques23(5):912-8; Sheen et al. (1995) Plant J 8(5):777-784; Haseloff et al. (1997) Proc Natl Acad Sei USA 94(6):2122-2127; Reichel et al. (1996) Proc Natl Acad Sei USA 93(12):5888-5893; Tian et al. (1997) Plant Cell Rep 16:267-271 ; WO 97/41228);

- Cloranfenicol transferase,

- luciferase (Millar et al . (1992) Plant Mol Biol Rep 1 0:324-414 ; Ow et al . (1986) Science 234:856-859) permite a seleção por detecção de bioluminescência,

- beta-galactosidase, codifica uma enzima para a qual uma variedade de substratos cromogênicos estão disponíveis,

- beta-glucuronidase (GUS) (Jefferson et al. (1987) EMBO J 6:3901-3907) ou o gene uidA, que codifica uma enzima para uma variedade de substratos cromogênicos,

- produto de gene R locus: proteína que regula a produção de pigmentos de antocianina (coloração vermelha) em tecido vegetal e, portanto, torna possível a análise direta da atividade promotora sem a adição de

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44/71 adjuvantes ou substratos cromogênicos adicionais (Dellaporta et al. (1988) In: Chromosome Structure and Function: Impact of New Concepts, 18th Stadler Genetics Symposium, 1 1 :263-282,),

- beta-lactamase (Sutcliffe (1978) Proc Natl Acad Sci USA 75:3737-3741), enzima para uma variedade de substratos cromogênicos (por exemplo PADAC, um cefa-losporina cromogênico),

- produto de gene xylE (Zukowsky et al. (1983) Proc Natl Acad Sci USA 80:1 101-1 105), catecol dioxigenase capaz de converter catecóis cromogênicos,

- alfa-amilase (Ikuta et al. (1990) Bio/technol. 8:241-242),

- tirosinase (Katz et al.(1983) J Gene Microbiol 129:2703-2714), enzima que oxida tirosina para proporcionar DOPA e dopaquinona que subsequentemente forma melanina, que é prontamente detectável,

-aequorina (Prasher et al.(1985) Biochem Biophys Res Commun 126(3):1259-1268), pode ser usada na detecção de bioluminescência sensível a cálcio.

Organismos Alvo [0164] Qualquer organismo adequado para transformação ou distribuição de uma endonuclease otimizada pode ser usado como organismo alvo. Isto inclui procariotas, eucariotas, e arqueias, em particular, células humanas ou animais, animais, plantas, fungos ou leveduras, de preferências, plantas, fungos ou leveduras.

[0165] Em uma modalidade, o organismo alvo é um vegetal.

[0166] O termo “planta” inclui plantas completas, órgãos/estruturas vegetativas de ramos (por exemplo, folhas, caules e bulbos), raízes, flores e órgãos/estruturas florais (por exemplo, brácteas, sépalas, pétalas, estames, carpelos, anteras e óvulos), sementes (inclusive, embriões, endospermas, e tegumentos) e frutas (o ovário maduro), tecidos vegetais (por exemplo, tecido

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45/71 vascular, tecido primário, e similares) e células (por exemplo, células de guarda, células-ovo, tricomas e similares), e proles dos mesmos. Em geral, a classe de plantas que pode ser usada no método da invenção é tão ampla quanto a classe de plantas superiores e inferiores receptivos a técnicas de transformação, incluindo angiospermas (plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas), gimnospermas, fetos, e algas multicelulares. Inclui plantas de uma variedade de níveis de ploidia, incluindo aneuplóide, poliplóide, diplóide, haplóide e hemizigoto.

[0167] Todos os gêneros e espécies de plantas superiores e inferiores do reio vegetal se encontram incluídos no escopo da invenção. Além disso, estão incluídas plantas maduras, sementes, ramos e mudas, e partes, material de propagação (por exemplo, sementes e frutas) e culturas, por exemplo, culturas celulares, derivadas a partir destes.

[0168] Preferem-se plantas e materiais vegetais das seguintes famílias plantas: Amaranthaceae, Brassicaceae, Carophyllaceae, Chenopodiaceae, Compositae, Cucurbitaceae, Labiatae, Leguminosae, Papilionoideae, Liliaceae, Linaceae, Malvaceae, osaceae, Saxifragaceae, Scrophulariaceae, Solanaceae, Tetragoniaceae.

[0169] Plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas perenes anuais são os organismos hospedeiros preferenciais para a geração de plantas transgênicas. O uso do sistema de recombinação, ou método de acordo com a invenção é adicionalmente vantajoso em todas as plantas ornamentais, árvores úteis ou ornamentais, flores, flores de corte, arbustos ou turfa. O dito vegetal pode incluir - mas não se limita a - briófitas como, por exemplo, Hepaticae (hepáticas) e Musci (musgos); pteridófitos como samambaias, rabo-de-cavalo e Lycopodiophyta; gimnospermas como coníferas, cicádeas, ginkgo e Gnetaeae; algas como Chlorophyceae, Phaeophpyceae, Rhodophyceae, Myxophyceae, Xanthophyceae, Bacillariophyceae (diátomos) e Euglenophyceae.

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46/71 [0170] As plantas para os propósitos da invenção podem compreender as famílias das Rosaceae como rosas, Ericaceae como rododendros e azaléias, Euphorbiaceae como copo-de-leite e cróton, Caryophyllaceae como cravos, Solanaceae como petúnias, Gesneriaceae como violeta Africana, Balsaminaceae como balsamina, Orchidaceae como orquídeas, Iridaceae como gladioli, íris, freesia e açafrão, Compositae como calêndula, Geraniaceae como gerânio, Liliaceae como dracaena, Moraceae como fícus, Araceae como filodendro e muitos outros.

[0171] As plantas transgênicas de acordo com a invenção são adicionalmente selecionadas em particular a partir de plantas de colheita dicotiledôneas como, por exemplo, provenientes das famílias das Leguminosae como ervilha, alfafa e soja; Solanaceae como tabaco e muitos outros; a família das Umbelliferae, particularmente o gênero Daucus (particularmente a espécie carota (cenoura)) e Apium (particularmente a espécie graveolens dulce (aipo)) e muitos outros; a família das Solanaceae, particularmente o gênero Lycopersicon, particularmente a espécie esculentum (tomate) e o gênero Solanum, particularmente a espécie tuberosum (batata) e melongena (berinjela) e muitos outros; e o gênero Capsicum, particularmente a espécie annum (pimenta) e muitos outros; a família das Leguminosae, particularmente o gênero Glicine, particularmente a espécime max (soja) e muitos outros; e a família das Cruciferae, particularmente o gênero Brassica, particularmente a espécie napus (colza), campestris (beterraba), oleracea cv Tastie (repolho), oleracea cv Snowball Y (couve-flor) e oleraceacv Emperor (brócolis); e o gênero Arabidopsis, particularmente a espécie thaliana e muitos outros; a família das Compositae, particularmente o gênero Lactuca, particularmente a espécie sativa (alface) e muitos outros.

[0172] As plantas transgênicas de acordo com a invenção são selecionadas em particular dentre as plantas de colheita monocotiledôneas,

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47/71 como, por exemplo, cereais como trigo, cevada, sorgo e mileto, centeio, triticalo, maize, arroz ou aveia, e cana de açúcar. Especialmente preferenciais são Arabidopsis thaliana, Nicotiana tabacum, colza, soja, milho (maize), trigo, semente de linho, batata e tagetes.

[0173] Adicionalmente, os organismos vegetais, para o propósito da invenção, são outros organismos que sejam capazes de atividade fotossintética, como, por exemplo, algas ou cianobactérias, e, também, musgos. As algas preferenciais são as algas verdes, como, por exemplo, as algas do gênero Haematococcus, Phaedactylum tricornatum, Volvox ou Dunaliella.

[0174] As plantas geneticamente modificadas de acordo com a invenção que podem ser consumidas por seres humanos ou animais também podem ser usadas como alimento ou comida para animais, por exemplo, diretamente ou seguindo o processamento conhecido na técnica.

Construção de Construções de Polinucleotídeo [0175] Tipicamente, as construções de polinucleotídeo (por exemplo, para um cassete de expressão) a serem introduzidas em um organismo não-humano ou células, por exemplo, plantas ou células vegetais são preparadas utilizando-se técnicas de expressão transgênica. As técnicas de expressão recombinante envolvem a construção de ácidos nucleicos recombinantes e a expressão de genes em células transfectadas. As técnicas de clonagem molecular para alcançar essas finalidades são conhecidas na técnica. Uma ampla variedade de métodos de clonagem e amplificação in vitro adequados para a construção de ácidos nucleicos recombinantes são bem conhecidos pelos indivíduos versados na técnica. Exemplos dessas técnicas e instruções suficientes para instruir indivíduos versados na técnica através de muitos exercícios de clonagem são encontrados em Berger e Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, hie, San Diego, CA (Berger); Current Protocols in Molecular Biology, F.

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M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, um empreendimento conjunto entre Greene Publishing Associates, Inc. e John Wiley & Sons, Inc., (1998 Supplement), T. Maniatis, E.F. Fritsch e J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manua\, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989), em T.J. Silhavy, M.L. Berman e L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984). De preferência, as construções de DNA empregadas na invenção são geradas unindo-se os constituintes essenciais supramencionados da construção de DNA juntos na sequência supramencionada utilizando-se a técnicas de recombinação e clonagem com as quais os indivíduos versados na técnica são familiarizados.

[0176] A construção de construções de polinucleotídeo geralmente requer o uso de vetores capazes de se replicarem em bactérias. Uma pletora de kits encontra-se comercialmente disponível para a purificação de plasmídeos das bactérias. Os plasmídeos isolados e purificados podem, então, ser adicionalmente manipulados para produzir outros plasmídeos, usados para transfectar células ou incorporados em Agrobacterium tumefaciens ou Agrobacterium rhizogenes para infectar e transformar plantas. Quando a Agrobacterium for o meio de transformação, os vetores de embaralhamento são construídos.

Métodos para Introdução de Construções em Células Alvo [0177] Uma construção de DNA empregada na invenção pode ser vantajosamente introduzida em células utilizando-se vetores onde a dita construção de DNA é inserida. Exemplos de vetores podem ser plasmídeos, cosmídeos, fagos, vírus, retrovírus ou agrobactérias. Em uma modalidade vantajosa, o cassete de expressão é introduzido por meio de vetores de plasmídeo. Os vetores preferenciais são aqueles que permitem a integração estável do cassete de expressão no genoma hospedeiro.

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49/71 [0178] Uma construção de DNA pode ser introduzida em células vegetais alvo e/ou organismos através de qualquer um dos vários meios conhecidos pelos indivíduos versados na técnica, um procedimento que é denominado transformação (vide também Keown et al. (1990) Meth Enzymol 185:527-537). Por exemplo, as construções de DNA podem ser introduzidas em células, seja em cultura ou em órgãos de um vegetal através de uma variedade de técnicas convencionais. Por exemplo, as construções de DNA podem ser introduzidas diretamente em células vegetais utilizando-se métodos balísticos, como bombardeamento de partículas de DNA, ou a construção de DNA pode ser introduzida utilizando-se técnicas como eletroporação e microinjeção de células. As técnicas de transformação mediadas por partículas (também conhecidas como “biolística”) são descritas, por exemplo, em Klein et al. (1987) Nature 327:70-73; Vasil V et al. (1993) BiolTechnol 11 :1553-1558; e Becker D et al. (1994) PlantJ 5:299-307. Estes métodos envolvem a penetração de células por pequenas partículas com ácido nucleico na matriz de pequenas microesferas ou partículas, ou sobre a superfície. A Pistola Gênica PDS- 1000 Biolística (Biorad, Hercules, CA) usa pressão de hélio para acelerar micro-carreadores de DNA revestidos com ouro ou tungstênio DNA em direção às células alvo. O processo é aplicável a uma ampla faixa de tecidos e células dos organismos, incluindo plantas. Outros métodos de transformação também são conhecidos pelos indivíduos versados na técnica.

[0179] As técnicas de microinjeção são usadas na técnica e descritas na literatura cientifica e na literatura de patente. Da mesma forma, a célula pode ser quimicamente permeabilizada, por exemplo, utilizando-se polietileno glicol, de tal modo que o DNA possa entrar na célula por difusão. O DNA também pode ser introduzido por fusão de protoplastos com outras unidades contendo DNA como minicélulas, células, lisossomos ou lipossomos. A introdução de construções de DNA utilizando-se precipitação de polietileno

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50/71 glicol (PEG) é descrita em Paszkowski et al. (1984) EMBO J 3:2717. A distribuição de genes à base de lipossomos é, por exemplo, descrita no documento WO 93/24640; Mannino e Gould-Fogerite (1988) BioTechniques 6(7):682-691 ; US 5,279,833; WO 91/06309; e Feigner et al. (1987) Proc Natl Acad Sci USA 84:7413-7414).

[0180] Outro método adequado de introduzir DNA é a eletroporação, onde as células são permeabilizadas de modo reversível por um pulso elétrico. As técnicas de eletroporação são descritas em Fromm et al. (1985) Proc Natl Acad Sci USA 82:5824. A transformação e a eletroporação mediadas por PEG de protoplastos vegetais também são discutidas em Lazzeri P (1995) Methods Mol Biol 49:95-106. Os métodos gerais preferenciais que podem ser mencionados são: a transfecção mediada por fosfato de cálcio, a transfecção mediada por DEAE-dextrano, a transfecção mediada por lipídio catiônico, eletroporação, transdução e infecção. Esses métodos são conhecidos pelos indivíduos versados na técnica e descritos, por exemplo, em Davis et al., Basic Methods In Molecular Biology (1986). Para uma revisão de métodos de transferência genética para plantas e culturas celulares, vide, Fisk et al. (1993) Scientia Horticulturae 55:5-36 e Potrykus (1990) Cl BA Found Symp 154:198.

[0181] Os métodos são conhecidos pela introdução e expressão de genes heterólogos em plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas. Vide, por exemplo, US 5.633.446, US 5.317.096, US 5.689.052, US 5.159.135, e US 5.679.558; Weising et al. (1988) Ann. Rev. Genet. 22:421 -477. A transformação de monocotiledôneas em particular pode usar várias técnicas, inclusive a eletroporação (por exemplo, Shimamoto et al. (1992) Nature 338:274-276; biolística (por exemplo, EP-A1 270,356); e Agrobacterium(por exemplo, Bytebier et al. (1987) Proc Natl Acad Sci USA 84:5345-5349).

[0182] Em plantas, os métodos para transformação e regeneração de plantas a partir de tecidos vegetais ou células vegetais com os quais os

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51/71 indivíduos versados na técnica estão familiarizados são utilizados para transformação transiente ou estável. Os métodos adequados são especialmente uma transformação de protoplasto por meio de uma absorção de DNA induzida por polietileno glicol, métodos biolísticos como a pistola gênica (método de “bombardeamento de partículas”), eletroporação, a incubação de embriões secos em uma solução contendo DNA, sonicação e microinjeção, e a transformação de células ou tecidos intactos por micro- ou macroinjeção em tecidos ou embriões, eletroporação de tecidos, ou infiltração a vácuo de sementes. No caso de injeção ou eletroporação de DNA em células vegetais, o plasmídeo usado não precisa satisfazer nenhuma exigência particular. Os plasmídeos simples como aqueles da série pUC podem ser usados. Se plantas intactas precisarem ser regeneradas a partir das células transformadas, a presença de um gene marcador selecionável adicional no plasmídeo será útil.

[0183] Além dessas técnicas “diretas” de transformação, a transformação também pode ser realizada por infecção bacteriana por meio de Agrobacteríum tumefaciens ou Agrobacteríum rhizogenes. Estas cepas contêm um plasmídeo (plasmídeo Ti ou Ri). Parte deste plasmídeo, denominada como T-DNA (DNA transferido), é transferida ao vegetal segundo a infecção de Agrobacteríum e integrada no genoma da célula vegetal.

[0184] Para transformação mediada por Agrobacteríum de plantas, uma construção de DNA da invenção pode ser combinada com regiões de flanqueamento de T-DNA adequadas e introduzida em um vetor hospedeiro convencional de Agrobacteríum tumefaciens. As funções de virulência do hospedeiro A. tumefaciens irão direcionar a inserção de um transgene e gene(s) marcador(es) adjacente(s) (caso presente(s)) no DNA da célula vegetal quando a célula for infectada pela bactéria. As técnicas de transformação mediadas por Agrobacteríum tumefaciens são bem descritas na literatura científica. Vide, por exemplo, Horsch et al. (1984) Science 233:496-498, Fraley et al. (1983) Proc

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Natl Acad Sci USA 80:4803-4807, Hooykaas (1989) Plant Mol Biol 13:327-336, Horsch RB (1986) Proc Natl Acad Sci USA 83(8):2571-2575), Bevans et al. (1983) Nature 304:184-187, Bechtold et al. (1993) Comptes Rendus De LAcademie Des Sciences Serie lll-Sciences De La Vie-Life Sciences 316:1 1941 199, Valve- kens et al. (1988) Proc Natl Acad Sci USA 85:5536-5540.

[0185] De preferência, uma construção de DNA da invenção é integrada em plasmídeos específicos, seja em um vetor condutor, ou intermediário, ou em um vetor binário. Se, por exemplo, um plasmídeo Ti ou Ri precisar ser usado para a transformação, pelo menos o limite direito, mas na maioria dos casos o limite direito e o limite esquerdo, do T-DNA de plasmídeo Ti ou Ri é ligado ao cassete de expressão a ser introduzido como uma região de flanqueamento. Os vetores binários são preferencialmente usados. Os vetores binários são capazes de replicação tanto em E. coli como em Agrobacterium. Normalmente, eles contêm um gene marcador de seleção e um ligador ou poliligador flanqueado pela sequência de flanqueamento de T-DNA direita e esquerda. Podem ser diretamente transformados em Agrobacterium (Holsters et al. (1978) Mol Gen Genet 163:181 -187). O gene marcador de seleção permite a seleção de agrobactérias transformadas e, por exemplo, o gene nptll, que confere resistência à canamicina. A Agrobacterium, que age como um organismo hospedeiro neste caso, deve conter um plasmídeo com a região vir. Requer-se que a última transfira o T-DNA à célula vegetal. Uma Agrobacterium assim transformada pode ser usada para transformar células vegetais.

[0186] Muitas cepas de Agrobacterium tumefaciens são capazes de transferir material genético - por exemplo, uma construção de DNA de acordo com a invenção como, por exemplo, as cepas EHA101 (pEHA101 ) (Hood EE et al. (1996) J Bacteriol 168(3): 1291 -1301 ), EHA105(pEHA105) (Hood et al. 1 993, Transgenic Research 2, 208-218), LBA4404(pAL4404) (Hoekema et al. (1983) Nature 303:179-181 ), C58C1 (pMP90) (Koncz e Schell (1 986) Mol Gen

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Genet 204,383-396) e C58C1 (pGV2260) (Deblaere et al. (1985) NuclAcids Res. 13, 4777-4788).

[0187] A cepa agrobacteriana empregada para a transformação compreende, além de seu plasmídeo Ti desarmado, um plasmídeo binário com o T-DNA a ser transferido, que, normalmente, compreende um gene para a seleção das células transformadas e um gene a ser transferido. Ambos os genes devem ser equipados com sinais de iniciação e terminação transcripcionais e translacionais. O plasmídeo binário pode ser transferido na cepa agrobacteriana, por exemplo, através de eletroporação ou outros métodos de transformação (Mozo & Hooykaas (1991) Plant Mol Biol 16:917-918). Geralmente, realiza-se uma co-cultura dos explantes vegetais com a cepa agrobacteriana durante dois a três dias.

[0188] Uma variedade de vetores poderia, ou pode, ser usada. Em princípio, estes se diferenciam entre aqueles vetores que podem ser empregados para a transformação ou agroinfecção mediada por Agrobacteríum, isto é, que compreende uma construção de DNA da invenção em um T-DNA, que, de fato, permite uma integração estável do T-DNA no genoma vegetal. Ademais, podem-se empregar vetores isentos de sequência limítrofe, que podem se transformados em células vegetais, por exemplo, através de bombardeamento de partículas, onde eles podem levar tanto à expressão transiente como à expressão estável.

[0189] O uso de T-DNA para a transformação de células vegetais foi estudado e descrito intensivamente (EP-A1 120 516; Hoekema, ln: The Binary Plant Vector System, Offset-drukkerij Kanters Β. V., Alblasserdam, capítulo V; Fraley et al. (1985) Crít Rev Plant Sei 4: 1-45 e An et al. (1985) EMBO J 4:277287). Vários vetores binários são conhecidos, alguns desses se encontram comercialmente disponíveis como, por exemplo, pBIN19 (Clontech Laboratories, Inc. USA).

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54/71 [0190] Para transferir o DNA à célula vegetal, os explantes vegetais são co-culturados com Agrobacterium tumefaciens ou Agrobacterium rhizogenes. Iniciando-se a partir de material vegetal infectado (por exemplo, folhas, raízes ou seções de caule, mas também protoplastos ou suspensões de células vegetais), plantas intactas podem ser regeneradas utilizando-se um meio adequado que pode conter, por exemplo, antibióticos ou biocidas para selecionar células transformadas. As plantas obtidas podem, então, ser submetidas à triagem quanto à presença do DNA introduzido, neste caso uma construção de DNA de acordo com a invenção. Assim que o DNA tiver se integrado no genoma hospedeiro, o genótipo em questão é, normalmente, estável e a inserção em questão também é encontrada nas gerações subsequentes. Normalmente, o cassete de expressão integrado contém um marcador de seleção que confere uma resistência a um biocida (por exemplo, um herbicida) ou um antibiótico como canamicina, G 418, bleomicina, higromicina ou fosfinotricina e similares ao vegetal transformado. O marcador de seleção permite a seleção de células transformadas (McCormicket al., Plant CellReports5 (1986), 81-84). As plantas obtidas podem ser culturadas e hibridizadas de maneira convencional. Duas ou mais gerações devem ser cultivadas com a finalidade de garantir que a integração genômica seja estável e hereditária.

[0191 ] Os métodos supramencionados são descritos, por exemplo, em B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, editado por SD Kung e R Wu, Academic Press (1993), 128-143 e em Potrykus (1991) Annu Rev Plant Physiol Plant Molec Biol 42:205-225). A construção a ser expressa é preferencialmente clonada em um vetor que seja adequado para a transformação de Agrobacterium tumefaciens, por exemplo, pBin 19 (Bevan et al. (1984) NuclAcids Res 12:871 1).

[0192] A construção de DNA da invenção pode ser usada para conferir características desejadas em essencialmente qualquer vegetal. Um

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55/71 indivíduo versado na técnica reconhecerá que após a construção de DNA ser estavelmente incorporada em plantas transgênicas e confirmada como sendo operável, esta pode ser introduzida em outras plantas por cruzamento sexual. Pode-se utilizar qualquer número de técnicas de procriação padrão, dependendo da espécie a ser cruzada.

[0193] Alternativamente, as endonucleases otimizadas podem ser expressas de modo transiente. A endonuclease quimérica pode ser transientemente expressada como um DNA ou RNA distribuído na célula alvo e/ou pode ser distribuída como uma proteína. A distribuição como uma proteína pode ser alcançada com a ajuda de peptídeos de penetração de células ou por fusão com peptídeos de sinal SEciV fundidos a nucleases ou endonucleases quiméricas, que mediam a secreção a partir de um organismo de distribuição em um célula de um organismo alvo, por exemplo, a partir de Agrobacterium rhizogenes ou Agrobacterium tumefaciens a uma célula vegetal.

Regeneração de Plantas Transgênicas [0194] As células transformadas, isto é, aquelas compreendendo o DNA integrado no DNA da célula hospedeira, podem ser selecionadas a partir de células não-transformadas se um marcador selecionável fizer parte do DNA introduzido. Um marcador pode, por exemplo, ser qualquer gene que seja capaz de conferir uma resistência a antibióticos ou herbicidas (para exemplos vide acima). As células transformadas que expressam tal gene marcador são capazes de sobreviver na presença de concentrações de um antibiótico ou herbicida adequado que mata um tipo selvagem não-transformado. Assim que a célula vegetal transformada tiver sido gerada, um vegetal intacto pode ser obtido utilizando-se métodos conhecidos pelos indivíduos versados. Por exemplo, utilizam-se culturas de calos como material de partida. A formação de ramos e raízes pode ser induzida nesta biomassa celular ainda não-diferenciada na maneira conhecida. Os ramos obtidos podem ser plantados e culturados.

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56/71 [0195] As células vegetais transformadas, derivadas por qualquer uma das técnicas de transformação anterior, podem ser culturadas para regenerar um vegetal completo que possua o genótipo transformado e, portanto, o fenótipo desejado. Essas técnicas de regeneração dependem da manipulação de determinados fito-hormônios em um meio de cultura de tecido, dependendo tipicamente de um marcador biocida e/ou herbicida que tenha sido introduzido junto às sequências nucleotídicas desejadas. A regeneração vegetal a partir de protoplastos culturados é descrita em Evans et al., Protoplasts Isolation and Culture, Handbook of Plant Cell Culture, pp. 124176, Macmillian Publishing Company, New York (1983); e em Binding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, pp. 21-73, CRC Press, Boca Raton, (1985). A regeneração também pode ser obtida a partir do calo vegetal, explantes, embriões somáticos (Dandekar et al. (1989) J Tissue Cult Meth 12:145; McGranahan et al. (1990) Plant Cell Rep 8:512), órgãos, ou partes do mesmo. Essas técnicas de regeneração são genericamente descritas em Klee et al. (1987) Ann Rev Plant Physiol 38:467-486.

Combinação com outras técnicas de aprimoramento de recombinação [0196] Em uma modalidade preferencial adicional, a eficácia do sistema de recombinação é aumentada pela combinação com sistemas que promovam uma recombinação homóloga. Esses sistemas são descritos e abrangem, por exemplo, a expressão de proteínas como RecA ou o tratamento com inibidores PARP. Demonstrou-se que a recombinação homóloga intracromossômica em plantas de tabaco pode ser aumentada utilizando-se inibidores PARP (Puchta H et al. (1995) Plant J. 7:203-210). A utilização destes inibidores, a taxa de recombinação homóloga no cassete de recombinação após a indução da quebra de DNA de fita dupla de sequência específica, e, portanto, a eficácia da exclusão das sequências de transgene, podem ser adicionalmente aumentadas. Vários inibidores PARP podem ser empregados para este

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57/71 propósito. De preferência, abrangem-se inibidores como 3- aminobenzamida, 8hidróxi-2-metilquinazolin-4-ona (NU1025), 1,11 b-diidro- (2H)benzopirano(4,3,2de)isoquinolin-3-ona (GPI 6150), 5-aminoisoquino-linona, 3,4-diidro- 5-(4-(1piperidinil)butóxi)-1 (2H)-isoquinolinona, ou os compostos descritos em WO 00/26192, WO 00/29384, WO 00/32579, WO 00/64878, WO 00/68206, WO 00/67734, WO 01/23386 e WO 01/23390.

[0197] Ademais, foi possível aumentar a frequência de várias reações de recombinação homóloga em plantas expressando-se o gene E. coli RecA (Reiss B et al. (1996) Proc Natl Acad Sei USA 93(7):3094-3098). Da mesma forma, a presença da proteína desloca a razão entre reparos DSB homólogos e ilegítimos em favor de reparo homólogo (Reiss B et al. (2000) Proc Natl Acad Sei USA 97(7):3358-3363). Pode-se fazer referência também aos métodos descritos em WO 97/08331 para aumentar a recombinação homóloga em plantas. Um aumento adicional na eficácia do sistema de recombinação pode ser alcançado pela expressão simultânea do gene RecA ou outros genes que aumentam a eficácia de recombinação homóloga (Shalev G et al. (1999) Proc Natl Acad Sei USA 96(13):7398-402). Os sistemas descritos acima para promover uma recombinação homóloga também podem ser vantajosamente empregados em casos onde a construção de recombinação deve ser introduzida de modo sítio-direcionado no genoma de um organismo eucariótico por meio de recombinação homóloga.

Métodos para Recombinação Homóloga e Mutação Direcionada UtilizandoSe Endonucleases Otimizadas.

[0198] A presente invenção proporciona um método para recombinação homóloga de polinucleotídeos que compreende:

a. proporcionar uma célula competente para recombinação homóloga,

b. proporcionar um polinucleotídeo que compreende um

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58/71 polinucleotídeo recombinante flanqueado por uma sequência A e por uma sequência B,

c. proporcionar um polinucleotídeo que compreende sequências A' e B', que sejam suficientemente longas e homólogas à sequência A e à sequência B, de modo a permitir uma recombinação homóloga na dita célula, e

d. proporcionar uma endonuclease otimizada ou um cassete de expressão que codifica uma endonuclease otimizada,

e. combinar b), c) e d) na dita célula, e

f. detectar os polinucleotídeos recombinados de b) e c), ou selecionar ou cultivar células compreendendo polinucleotídeos recombinados de

b) e c).

[0199] Em uma modalidade da invenção, a etapa e) leva à exclusão de um polinucleotídeo compreendido no polinucleotídeo proporcionado na etapa c).

[0200] Em uma modalidade da invenção, o polinucleotídeo excluído compreendido no polinucleotídeo proporcionado na etapa c) codifica um gene marcador ou partes de um gene marcador.

[0201] Em uma modalidade da invenção, o polinucleotídeo proporcionado na etapa b) compreende pelo menos um cassete de expressão.

[0202] Em uma modalidade da invenção, o polinucleotídeo proporcionado na etapa b) compreende pelo menos um cassete de expressão, levando à expressão de um gene marcador de seleção ou um gene repórter.

[0203] Em uma modalidade da invenção, o polinucleotídeo proporcionado na etapa b) compreende pelo menos um cassete de expressão, levando à expressão de um gene marcador de seleção ou um gene repórter e compreende pelo menos um sítio de reconhecimento de DNA ou pelo menos um sítio de reconhecimento quimérico.

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59/71 [0204] Uma modalidade adicional da invenção proporciona um método para mutação direcionada de polinucleotídeos que compreende:

a. proporcionar uma célula que compreende um polinucleotídeo que compreende um sítio de reconhecimento l-Scel,

b. proporcionar uma endonuclease otimizada, sendo capaz de clivar o sítio de reconhecimento quimérico da etapa a),

c. combinar a) e b) na dita célula e

d. detectar os polinucleotídeos mutados, ou selecionar as células cultivadas compreendendo polinucleotídeos mutados.

[0205] A invenção proporciona em outra modalidade um método para recombinação homóloga conforme descrito anteriormente ou um método para mutação direcionada de polinucleotídeos conforme descrito anteriormente, que compreende:

combinar a endonuclease otimizada e o sítio de reconhecimento Scel através do cruzamento de organismos, através da transformação de células ou através de um peptídeo SeclV fundido à endonuclease otimizada e colocar a célula que compreende o sítio de reconhecimento Scel em contato com um organismo que expressa a endonuclease otimizada e expressa um complexo de transporte SeclV capaz de reconhecer o peptídeo SeclV fundido à endonuclease quimérica.

Exemplos

Métodos Gerais:

[0206] A síntese química de oligonucleotídeos pode ser realizada, por exemplo, de maneira conhecida utilizando-se o método de fosfoamidita (Voet, Voet, 2^ã edição, Wiley Press New York, páginas 896- 897). As etapas de clonagem realizadas para os propósitos da presente invenção, como, por exemplo, clivagens de restrição, eletroforese em gel de agarose, purificação de fragmentos de DNA, a transferência de ácidos nucleicos à nitrocelulose e membranas de náilon, a ligação

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60/71 de fragmentos de DNA, a transformação de células E. coli, culturas bacterianas, a propagação de fagos e a análise de sequência de DNA recombinante são realizados conforme descrito por Sambrook et al. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press; ISBN 0-87969-309-6. As moléculas de DNA recombinante foram sequenciadas utilizando-se um sequenciador de DNA fluorescente a laser ALF Express (Pharmacia, Upsala [sic], Suécia) seguindo o método de Sanger (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74 (1977), 5463-5467).

Exemplo 1: Construções que Incluem Cassetes de Expressão de Endonuclease de DNA de Sequência Específica para Expressão em E.cou

Exemplo 1 a: Construção Básica [0207] Neste exemplo, apresenta-se um esboço geral de um vetor, denominado “Construção I” adequado para transformação em E. coli. Este esboço geral do vetor compreende um gene resistente à ampicilina para seleção, uma origem de replicação para E. coli e o gene araC, que codifica um regulador de transcrição induzível por Arabinose. SEQ ID NO: 7 mostra uma expansão de sequência de “NNNNNNNNNN”. Isto significa um marcador de posição para genes que codificam as diferentes versões da endonuclease de DNA de sequência específica. Os diferentes genes podem ser expressos a partir do promotor de pBAD induzível por Arabinose (Guzman et al., J Bacteriol \TT. 4121-4130(1995)), as sequências dos genes que codificam as diferentes versões de nuclease são dadas nos exemplos a seguir.

[0208] A construção de controle, na qual o marcador de posição é substituído pela sequência de l-Scel (SEQ ID NO: 8), era denominada como VCSAH40-4.

Exemplo 2: Plasmídeos de E. coli que Codificam Versões Estabilizadas da Nuclease [0209] As diferentes sequências desestabilizantes podem ser identificadas na sequência de aminoácido de l-Scel. Dentre estas, uma

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61/71 sequência PEST fraca no C-terminal, que compreende resíduos de aminoácido 228 a 236 e uma sequência N-terminal que mostra similaridade a um motivo KEN (Pflegere Kirschner, Genes andDev. 14:655-665 (2000)). De acordo com a regra N-terminal, o segundo resíduo de aminoácido de l-Scel confere instabilidade à proteína.

[0210] Para testar o efeito dessas sequências na estabilidade da nuclease, diferentes versões de l-Scel foram geradas por PCR, que carece de aminoácidos do N-terminal, 9 aminoácidos do C-terminal ou ambos. Estas construções foram expressas a partir da “Construção I”, descrita no Exemplo 1

a). Portanto, o marcador de posição foi substituído por várias sequências, codificando as versões da nuclease (mostrada em SEQ ID NO: 2, 3, 5). Os plasmídeos foram denominados como VC-SAH43-8 (l-Scel encurtado Cterminal) e VC-SAH42-13 (l-Scel encurtado NLS-C terminal), VC-SAH44- 32 (IScel encurtado N-terminal, SEQ ID NO: 21) e VC-SAH45-3 (l-Sce encurtado Ne C-terminal, SEQ ID NO: 22).

[0211] De acordo com a regra N-terminal, todas essas construções conduzem a estabilização do segundo resíduo de aminoácido G. Para testar o efeito do segundo aminoácido sobre a estabilidade de proteína, também são geradas versões com o resíduo desestabilizante nativo de l-Scel. Os plasmídeos resultantes foram denominados como VC-SAH105 e VC-SAH106.

[0212] Geraram-se exclusões adicionais do C-terminal:

os resíduos de aminoácidos únicos foram sucessivamente removidos do C-terminal. Estas variantes estão resumidas na Tabela 3) e foram testadas para determinação da sua atividade em E.coli.

[0213] Ademais, sequências PEST potenciais foram descobertas em l-Scel e analisadas pela introdução de trocas de aminoácidos únicos. Estas variantes estão resumidas na Tabela 3) e foram testadas para determinação da sua atividade em E.coli.

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Tabela 3

Nome do vetor	Variante de nuclease
VC-SAH 151-2	NLS l-Scel -1
VC-SAH 152-6	NLS l-Scel -2
VC-SAH 153-6	NLS l-Scel -3
VC-SAH 154-1	NLS l-Scel -4
VC-SAH 155-1	NLS l-Scel -5
VC-SAH 156-3	NLS l-Scel -6
VC-SAH 157-1	NLS l-Scel -7
VC-SAH 158-2	NLS l-Scel -8
VC-SAH 159-3	NLS l-Scel -10
VC-SAH 160-1	NLS l-Scel -11
VC-SAH 161-1	NLS l-Scel -12
VC-SAH 162-2	NLS l-Scel -13
VC-SAH 163-1	NLS l-Scel 1-218
VC-SAH 164-2	NLS l-Scel 1 -202
VC-SAH 165-3	NLS l-Scel 1 -187
VC-SAH 166-1	NLS l-Scel 1 -169
VC-SAH 167-1	NLS l-Scel 1 -155
VC-SAH 190-4	l-Scel L74K
VC-SAH 191 -3	l-Scel Y75H
VC-SAH 192-3	l-Scel Q77K
VC-SAH 193-3	-Scel E130K
VC-SAH 194-1	l-Scel T134H
VC-SAH 195-2	l-Scel Y199H
VC-SAH 196-2	l-Scel M203K
VC-SAH 197-2	l-Scel Y205H
VC-SAH 198-1	l-Scel S230K

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Exemplo 3: Co-Transformação de Construções que Codificam DNA Endonuclease e Construções que Abrangem Sequências de Reconhecimento de Nuclease em E. coli [0214] Os plasmídeos VC-SAH44-32, VC-SAH43-8, VCSAH42-13, VC-SAH45-3 e VC-SAH40-4 (descritos no Exemplo 2) foram individualmente co-transformados com o vetor alvo VC-SAH6-1 ou com o vetor de controle VC-SAH7-1 em E. coli. O mesmo é realizado com VC-SAH 105 e VC-SAH 106 e com os vetores resumidos na Tabela 3.

Exemplo 4: Demonstração da Atividade de Endonuclease em E. coli [0215] As versões de l-Scel descritas no Exemplo 2 foram testadas para determinação da sua atividade.

[0216] Os co-transformantes que conduzem a combinação de dois plasmídeos, um codificando uma nuclease e o outro incluindo o sítio alvo de nuclease foram cultivados de um dia para o outro em LB com Ampicilina, Canamicina e Glicose para reprimir o promotor pBAD. As culturas foram diluídas 1:100 e cultivadas até que alcançassem OD6oo=0,5. A expressão da nuclease foi induzida pela adição de Arabinose durante 3 a 4 horas. O promotor pBAD é descrito como sendo dose dependente (Guzman 1995), portanto, a cultura foi dividida em diferentes alíquotas e a expressão de proteína foi induzida com concentrações de Arabinose variando de 0,2% a 0,0002%. 5 pm de cada alíquota foram colocados em placas em um meio sólido de LB, suplementados com Ampicilina e Canamicina. As placas foram incubadas de um dia para o outro a 37 ^SC e o crescimento celular foi analisado de modo semi-quantitativo. As fusões de nuclease ativa não cortaram as construções, que abrangem o sítio alvo. Isto leva à perda de resistência à Canamicina. Portanto, a atividade da proteína de fusão foi observada devido à capacidade de perda dos co-transformantes para cultivo em um meio contendo Canamicina.

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Resultados [0217] VC-SAH43-8 (l-Scel encurtado C-terminal) e VC-SAH42-13 (l-Scel encurtado NLS-C terminal) foram bastante ativos, cortaram o sítio alvo mesmo na ausência do indutor Arabinose. O cultivo celular desses cotransformantes foi observado somente na presença de Glicose, que reprime adicionalmente o promotor pBAD. Logo, nos casos de VC-SAH43-8 e VCSAH42-13, a baixa quantidade de proteína l-Scel produzida devido à expressão basal a partir do promotor pBAD foi suficiente para cortar o plasmídeo alvo.

[0218] Os resultados são simplificados e resumidos na Tabela 4 ++ e + representam um crescimento muito forte e forte, que indica pouca ou nenhuma atividade da nuclease expressada em direção ao respectivo sítio alvo. - e - - representam um crescimento reduzido ou nenhum crescimento, que indica uma atividade alta ou muito alta da nuclease em direção ao respectivo sítio alvo.

Tabela 4: Variantes l-Scel: O Ensaio de Crescimento de E. col/Indica a Atividade de Endonuclease em Relação aos Respectivos Sítios Alvo

Variante de nuclease	VC-SAH6-1 (sítio l-Scel)	VC-SAH7-1 (controle)
VC-SAH40-4	l-Scel	+	++
VC-SAH43-8	l-Scel curto C-term (-9) l-Scel curto NLS -C term	-	+
VC-SAH42-13	(-9)	-	+
VC-SAH151-2	NLS l-Scel -1		++
VC-SAH 152-6	NLS l-Scel -2		++
VC-SAH 153-6	NLS l-Scel -3		++
VC-SAH 154-1	NLS l-Scel -4		++
VC-SAH 155-1	NLS l-Scel -5		++
C-SAH 156-3	V NLS l-Scel -6		++
VC-SAH 157-1	NLS l-Scel -7		+
VC-SAH 158-2	NLS l-Scel -8		+
VC-SAH 159-3	NLS l-Scel-10		+
VC-SAH 160-1	NLS l-Scel -11	++	++
VC-SAH 161-1	NLS l-Scel-12	++	++
VC-SAH 162-2	NLS l-Scel-13	++	++
VC-SAH 163-1	NLS l-Scel 1-218	++	++
VC-SAH 164-2	NLS l-Scel 1-202	++	++
VC-SAH 165-3	NLS l-Scel 1-187	++	++

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Variante de nuclease	VC-SAH6-1 (sítio l-Scel)	VC-SAH7-1 (controle)
VC-SAH 166-1	NLS l-Scel 1-169	++	++
VC-SAH 167-1	NLS l-Scel 1-155	++	++

Exemplo 5: Transformação de S. cerevisiae [0219] As células de S. cerevisiae são cultivadas em 10 ml de YEPS de um dia para o outro e, então, diluídas 1:10. Esta cultura é, então, cultivada até que alcance OD6oo=0,5. As células são peletizadas e ressuspensas em 15 ml de água esterilizada duas vezes, novamente peletizadas e ressuspensas em 1 ml de água esterilizada. Esta suspensão celular é aliquotada em 100 μΙ e novamente peletizada. Em gelo, adicionaram-se 240 μΙ de 50% de PEG4000, 36 μΙ de 1 M de LiAc, 20 μΙ de DNA de esperma de salmão (5 mg/ml) (5 minutos a 100 ^SC, então, 10 minutos em gelo) e 6 pg de plasmídeo em 64 μΙ de água. A suspensão é incubada a 42 ^SC durante 45 minutos e colocada em gelo durante 30 segundos. As células são peletizadas e ressuspensas em 500 μΙ de água, destas 200 μΙ são colocadas em placas em um meio seletivo desprovido de metionina. As placas são incubadas a 30 ^SC durante 3 a 4 dias. Podem-se escolher colônias únicas para análise futura.

Exemplo 6: Construções que Abrangem Versões Estabilizadas da Nuclease para Expressão em S. cerevisiae [0220] As sequências descritas no Exemplo 2 são clonadas no vetor pGBT9-3H/B (Tirode et al 1997, J Biol Chem 272:22995-22999) sob o controle do promotor MET25, que é representado na presença e ativo na ausência de metionina.

Exemplo 7: Demonstração da Estabilidade de Endonuclease em S. CEREVISIAE [0221] A expressão de proteína é induzida pelo crescimento dos transformantes em um meio desprovido de metionina. O extrato de proteína completo dos diferentes transformantes é gerado e testado para determinação

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66/70 da abundância e da quantidade de l-Scel por análise Western blot. Realizaramse experimentos de pulso-procura (do inglês “pulse-chase”) com o uso de Cicloeximida e MG132, para determinar a meia vida in vivo das diferentes versões.

Exemplo 8: Construções que Codificam Versões Estabilizadas da Nuclease para Expressão em A. thaliana

Exemplo 8 a: Construções para a Demonstração da Atividade de Endonuclease Cruzando-Se Plantas que Expressam a Nuclease com Plantas que Conduzem um T-DNA com o Respectivo Sítio Alvo [0222] Todas as construções que mostram a atividade na Tabela 4 são avaliadas por teste, os Exemplos a seguir se concentrarão na versão encurtada C-terminal de l-Scel. Geraram-se diferentes plasmídeos, onde o marcador de posição da “Construção IV” (SEQ ID No: 13) é substituído por diferentes sequências, codificando a versão encurtada C-terminal de l-Scel, em combinações com ou sem G estabilizante como o segundo resíduo de aminoácido, e com ou sem NLS. As variantes de nuclease são mais favoráveis entre as construções VC-SAH151 -2, VC-SAH152-6, VC-SAH153-6, VC- SAH 154-1, VC-SAH 155-1, VC-SAH 156-3.

Exemplo 8 b: Construções para Demonstração da Atividade de Endonuclease Transformando-Se Estas Construções em Plantas que já Conduzem um T-DNA com o Respectivo Sítio Alvo [0223] Neste exemplo, apresenta-se o esboço geral de um vetor binário, denominado como “Construção VI” (VC-SCB697) adequado para transformação de vegetal. Este esboço geral do vetor binário compreende um TDNA com um cassete nos-promotor::nptll::nos-terminador, que permite a seleção em canamicina, quando integrada no genoma vegetal. SEQ ID NO: 23 (VCSCB697) mostra uma extensão de sequência de “NNNNNNNNNN”. Isto significa um marcador de posição para genes que codificam versões de l-Scel.

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67/70 [0224] Geraram-se diferentes plasmídeos, onde o marcador de posição é substituído por diferentes construções, que consistem em uma versão encurtada C-terminal de l-Scel: VC-SAH124-3 (N LS-l-Scel encurtado C term, G) (SEQ I D NO:5), VC-SAH125-2 (l-Scel encurtado C term, G ), (SEQ ID NO:3), VC-SAH122-7 (l-Scel, G) (SEQ I D NO:2) e VC-SAH123-3 (NLS- l-Scel, G), vide o Exemplo 2 (Utilizado como um controle l-Scel sem o G estabilizante como o segundo resíduo de aminoácido: VC-SCB697-3). Todas as construções que mostram atividade na Tabela 4 são avaliadas por teste, as variantes de nuclease codificadas pelas construções VC-SAH151 -2, VC-SAH 152-6, VC-SAH 153-6, VC-SAH 154-1, VC-SAH 155-1, VC-SAH 156-3 são as mais favoráveis.

[0225] Geram-se plasmídeos idênticos sem o G estabilizante como o segundo resíduo de aminoácido.

Exemplo 9: Transformação de Construções que Codificam Versões Estabilizadas da Nuclease em A. thaliana [0226] Os plasmídeos descritos no Exemplo 8b foram transformados em linhagens de A. thaliana que conduzem o T-DNA de VCSCB583-40 (SEQ ID NO: 24).

[0227] As construções descritas no Exemplo 8a) são transformadas em plantas tipo selvagem.

Exemplo 10: Monitoramento da Atividade das Nucleases Estabilizadas Exemplo 10a: por Cruzamento [0228] A atividade das diferentes versões de l-Scel é monitorada cruzando-se as linhagens de expressão de endonuclease de DNA de sequência específica e as linhagens que abrangem construções com sequências de reconhecimento. As sequências de reconhecimento são circundadas por um gene uidA (GUS) parcial (denominado como “GU”) e por outro gene uidA parcial (denominado como “US”). As metades parcialmente sobrepostas do gene GUS (GU e US) são não-funcionais, porém, como resultado da atividade de l-Scel no

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68/70 sítio alvo, um gene GUS funcional será restaurado por recombinação intracromossômica homóloga (ICHR). Isto pode ser monitorado por um ensaio histoquímico de colocação de GUS por Jefferson et al. (1987) EMBO J 6:3901 3907).

[0229] Para visualizar a atividade de l-Scel, as linhagens transgênicas de Arabidopsis que abrangem o T-DNA dos plasmídeos descritos no Exemplo 9a) são cruzadas com as linhagens de Arabidopsis que abrangem o T-DNA de construção VC-SCB734-4. As sementes F1 dos cruzamentos são colhidas. As sementes têm suas superfícies esterilizadas e cultivadas em um meio A suplementado com os respectivos antibióticos e/ou herbicidas. As mudas com 3-4 dias de idade são colhidas e usadas para o ensaio histoquímico de coloração de GUS. A quantidade de áreas azuis é um indicador de tecidos / partes de tecidos onde ocorreram ICHR nos cruzamentos e, portanto, para atividade de l-Scel.

Exemplo 10b: por Supertransformação [0230] A atividade das diferentes versões de l-Scel foi monitorada transformando-se as linhagens que abrangem as construções com sequências de reconhecimento com plasmídeos que abrangem um cassete de expressão com diferentes versões do l-Scel estabilizado. As sequências de reconhecimento são circundadas por um gene uidA (GUS) parcial (denominado como “GU”) e outro gene uidA parcial (denominado como “US”). As metades parcialmente sobrepostas do gene GUS (GU e US) são não-funcionais, porém, como resultado da atividade de l-Scel no sítio alvo, um gene GUS funcional será restaurado por recombinação intracromossômica homóloga (ICHR). Isto pode ser monitorado por um ensaio histoquímico de colocação de GUS por Jefferson et al. (1987) EMBO J 6:3901 -3907).

[0231] Para visualizar a atividade de l-Scel, as linhagens transgênicas de Arabidopsis que abrangem o T-DNA de construção pCB583-40

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69/70 foram transformadas com plasmídeos descritos no Exemplo 8b). As sementes F1 foram colhidas, têm suas superfícies esterilizadas e cultivadas em um meio A suplementado com os respectivos antibióticos e/ou herbicidas. As plantas F1 foram analisadas para integração de cópia única da construção de nuclease e auto-reproduzidos. As plantas F2 foram cultivadas no meio A sem pressão de seleção. O T-DNA que codifica a nuclease também codifica dsRed. Devido à segregação isenta de dsRed e, portanto, as plantas isentas de nuclease foram selecionadas sob luz UV. As mudas com 4 folhas foram colhidas e usadas para o ensaio histoquímico de coloração de GUS. As mudas azuis representam um evento de recombinação homóloga, que ocorreu na geração anterior. Para cada construção, analisaram-se 3 a 5 linhagens independentes, até 96 mudas foram coloradas. O número de mudas azuis é um indicador para atividade de l-Scel.

Resultados [0232] Em resumo, l-Scel, l-Scel +G e N LS-l-Scel+G resultaram entre 30%-41 % de plantas azuis. Enquanto a expressão das versões encurtadas C-terminal codificadas por VC-SAH124-3 e VC-SAH 125-2 resultou em aproximadamente 60% de mudas azuis.

[0233] Um sinal de GUS positivo representa um evento ICHR, devido à atividade de l-Scel. A nuclease também pode produzir um corte, que pode não ser reparado por ICHR, mas por recombinação ilegítima. Este evento levará à destruição da sequência de reconhecimento de l-Scel e a um gene GUS não-funcional. Neste caso, a atividade de l-Scel pode não ser monitorada pela coloração azul. Para analisar adicionalmente as mudas brancas obtidas neste ensaio, realizou-se uma reação de PCR que amplifica as metades do gene GUS (GU e US). Os amplicons foram submetidos à digestão de l-Scel para detectar a presença ou a ausência da sequência alvo. A ausência do sítio alvo representa a atividade de l-Scel na geração anterior. Em resumo, as variantes de l-Scel encurtado C terminal resultaram em 1 entre 88 plantas T2 testadas com um sítio

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70/70 l-Scel intacto. Em contraste, o l-Scel codificado pela construção VC-SCB697-3 resultou em 14 entre 48 plantas testadas que ainda abrangiam um sítio de l-Scel não-cortado.

[0234] As versões encurtadas C-terminal codificadas por VC-SAH 124-3 e VC-SAH 125-2 resultaram em uma geração T2 na qual quase todos os indivíduos mostraram o resultado da atividade de l-Scel.

Claims

Reivindicações

1. ENDONUCLEASE, caracterizada por consistir em uma sequência de aminoácidos descrita por SEQ ID NO: 3 ou 5.
2. ENDONUCLEASE, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por ser uma endonuclease produzida por engenharia genética.
3. MÉTODO PARA RECOMBINAÇÃO HOMÓLOGA DE POLINUCLEOTÍDEOS, caracterizado por compreender:

a) fornecer uma célula competente para recombinação homóloga,

b) fornecer um polinucleotídeo que compreende um sítio de reconhecimento de DNA de uma endonuclease flanqueada por uma sequência A e uma sequência B,

c) fornecer um polinucleotídeo que compreende as sequências A' e B', possuindo comprimento de 15 a 30 nucleotídeos e que são homólogas à sequência A e sequência B, e

d) fornecer uma endonuclease, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 2,

e) combinar b), c) e d) na dita célula, e

f) detectar polinucleotídeos recombinados de b) e c), ou selecionar ou cultivar células compreendendo polinucleotídeos recombinados de b) e c).
4. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por através de recombinação homóloga uma sequência de polinucleotídeo compreendida na célula competente da etapa a) ser excluída do genoma das células de cultivo da etapa f).
5. MÉTODO PARA MUTAÇÃO DIRECIONADA DE POLINUCLEOTÍDEOS, caracterizado por compreender:

a) fornecer uma célula que compreende um polinucleotídeo

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2/2 que compreende um sítio de reconhecimento de DNA de uma endonuclease, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 2,

b) fornecer uma endonuclease, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 2, e que seja capaz de clivar o sítio de reconhecimento de DNA da etapa a),

c) combinar a) e b) na dita célula, e

d) detectar polinucleotídeos mutados, ou selecionar ou cultivar células compreendendo polinucleotídeos mutados.