JP5922029B2 - キメラエンドヌクレアーゼおよびその使用 - Google Patents
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Description
a) 少なくとも1つのエンドヌクレアーゼコード領域を提供するステップ、
b) 少なくとも1つの異種DNA結合ドメインコード領域を提供するステップ、
c) ステップa)の1つもしくは複数のエンドヌクレアーゼの、1つもしくは複数の潜在的DNA認識配列を有し、かつ、ステップb)の1つもしくは複数の異種DNA結合ドメインの、1つもしくは複数の潜在的認識配列を有する、ポリヌクレオチドを提供するステップ、
d) ステップa)のすべてのエンドヌクレアーゼのコード領域、およびステップb)のすべての異種DNA結合ドメインの翻訳融合物を作製するステップ、
e) ステップd)で作製された翻訳融合物からキメラエンドヌクレアーゼを発現させるステップ、
f) ステップc)のポリヌクレオチドの切断について、ステップe)で発現されたキメラエンドヌクレアーゼをテストするステップ。
a) 相同組み換えに適したコンピテント細胞を提供するステップ、
b) 配列Aおよび配列Bが両側に配置されたキメラ認識部位を含んでなるポリヌクレオチドを提供するステップ、
c) 配列A'およびB'を含んでなるポリヌクレオチドであって、配列Aおよび配列Bに対して十分長くて相同的であり、前記細胞における相同組み換えを可能にする前記ポリヌクレオチドを提供するステップ、
d) 本明細書に記載のキメラエンドヌクレアーゼ、または本明細書に記載の発現カセットを提供するステップ、
e) 前記細胞においてb)、c)、およびd)を組み合わせるステップ、ならびに
f) b)とc)の組み換えられたポリヌクレオチドを検出する、またはb)とc)の組み換えられたポリヌクレオチドを有する細胞を選択し、または増殖させるステップ。
好ましくは、ポリヌクレオチドの相同組み換えのための方法は、ステップa)のコンピテント細胞に含まれるポリヌクレオチド配列がステップf)の増殖細胞のゲノムから欠失しているような、相同組み換えをもたらす。本発明のもう1つの方法は、下記のステップを含んでなる標的変異のための方法である:
a) キメラエンドヌクレアーゼのキメラ認識部位を含んでなるポリヌクレオチドを有する、細胞を提供するステップ、
b) ステップa)のキメラ認識部位を切断することができるキメラエンドヌクレアーゼを提供するステップ、
c) 前記細胞においてa)とb)を組み合わせるステップ、ならびに
d) 変異したポリヌクレオチドを検出する、または変異したポリヌクレオチドを有する増殖細胞を選択するステップ。
本発明の別の好ましい実施形態において、上記の方法は、生物の交雑によって、形質転換によって、または最適化されたエンドヌクレアーゼと融合されたSec IIIもしくはSecIVペプチドを介した輸送によって、キメラエンドヌクレアーゼおよびキメラ認識部位を少なくとも1つの細胞内で組み合わせるステップを含んでなる。
本発明は、キメラLAGLIDADGエンドヌクレアーゼを提供するが、これは少なくとも1つのLAGLIDADGエンドヌクレアーゼ、および少なくとも1つの異種DNA結合ドメインを含んでなり、このDNA結合ドメインは1つもしくは複数のZn2C6ジンクフィンガーを含んでいる。
本発明に有用なLAGLIDADGエンドヌクレアーゼは、藻類、菌類、酵母、原生動物、葉緑体、ミトコンドリア、細菌、および古細菌のゲノムに見いだすことができる。LAGLIDADGエンドヌクレアーゼは、少なくとも1つの保存されたLAGLIDADGモチーフを含有する。LAGLIDADGモチーフという名称は、すべてのLAGLIDADGエンドヌクレアーゼに見られる特徴的なアミノ酸配列に基づく。LAGLIDADGという用語は、特許出願におけるヌクレオチドおよびアミノ酸配列リストの発表に関するPCIPI執行調整委員会(Executive Coordination Committee)によって採用された標準、すなわちSTANDARD ST.25に記載の一文字記号によるこのアミノ酸配列の頭字語である。
センス 5'- T T A C C C T G T T A T C C C T A G -3’
塩基位置: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
アンチセンス 3'- A A T G G G A C A A T A G G G A T C -5'
I-SceIの次の変異は、4位でのCの優先をAに変える:K50。
、V150、T150。
I-SceIについて:I38S、I38N、G39D、G39R、L40Q、L42R、D44E、D44G、D44H、D44S、A45E、A45D、Y46D、I47R、I47N、D144E、D145E、D145NおよびG146E。
I-CreIについて:Q47E、
I-CeuIについて:E66Q、
I-MsoIについて:D22N、
PI-SceIについて:D218、D229、D326またはT341における変異。
ヌクレアーゼは、たとえば、そのDNA結合特異性を変化させる(たとえばそのDNA認識部位の特異性を高める、もしくは低下させる)変異を挿入することによって、またはヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列を、エンドヌクレアーゼを発現させる予定の生物のコドン使用頻度に適合させることによって、または別の開始コドンを欠失させることによって、または潜在的ポリアデニル化シグナルもしくは潜在的スプライス部位もしくは潜在的miRNA標的を、エンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列から欠失させることによって、最適化することができる。
a) PEST配列、
b) KENボックス、
c) Aボックス、
d) Dボックスを含まないか、もしくはその数が減少している、または
e) N末端則にしたがって、安定性のために最適化されたN末端を有する、
f) 2番目のN末端アミノ酸としてグリシンを含有する、または
g) a)、b)、c)、d)、e) およびf)の任意の組み合わせである。
KENボックスのアミノ酸コンセンサス配列は、KENXXX(N/D)である
Aボックスのアミノ酸コンセンサス配列は、AGRXLXXSXXXQRVLである
Dボックスのアミノ酸コンセンサス配列は、RXXLである。
または、配列:HVCLLYDQWVLSPPH、LAYWFMDDGGK、KPIIYIDSMSYLIFYNLIK、KLPNTISSETFLKもしくはTISSETFLKで表されるアミノ酸配列を含有しない、
または、配列:HVCLLYDQWVLSPPH、LAYWFMDDGGK、KLPNTISSETFLKもしくはTISSETFLKで表されるアミノ酸配列を含有しない、
または、配列:LAYWFMDDGGK、KLPNTISSETFLKもしくはTISSETFLKで表されるアミノ酸配列を含有しない、
または、配列:KLPNTISSETFLKもしくはTISSETFLKで表されるアミノ酸配列を含有しない。
a) I-SceI -1、I-SceI -2、I-SceI -3、I-SceI -4、I-SceI -5、I-SceI -6、I-SceI -7、I-SceI -8、およびI-SceI -9;
b) S229K、S229A、S229P、S229G、S229E、S229Q、S229D、S229N、S229C、S229Y、S229T、M203K、M203H、M203R、Q77K、Q77H、Q77R、E130K、E130H、E130R、Y199K、Y199HおよびY199R;
c) アミノ酸配列の開始メチオニンの後のメチオニン、バリン、グリシン、スレオニン、セリン、アラニン、システイン、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン酸、アスパラギン、イソロイシン、もしくはヒスチジン;または
d) 上記a)およびb)、a)およびc)、b)およびc)、またはa)、b)およびc)から選択される1つもしくは複数の変異の組み合わせ。
本発明のキメラエンドヌクレアーゼは、少なくとも1つの異種DNA結合ドメインを含んでおり、これは1つもしくは複数のZn2C6ジンクフィンガーを含有する。
-Cys-(X)2-Cys-(X)6-Cys-(X)5-41-Cys-(X)2-Cys-(X)6-8-Cys-
[式中、Cysはシステインを表し、Xは任意のアミノ酸を表す]
で表されるアミノ酸モチーフによって複合体を形成する共通構造を特徴とする。
LAGLIDADGエンドヌクレアーゼおよび異種DNA結合ドメインは、多くの別法で組み合わせることができる。
a) PEST配列、
b) KENボックス、
c) A-ボックス、
d) D-ボックス、もしくは
e) N末端則にしたがって安定性に最適なN末端を含んでいること、
f) 2番目のN末端アミノ酸としてグリシンを含んでいること、または
g) キメラエンドヌクレアーゼの完全なアミノ酸配列についてa)、b)、c)、d)、e)、およびf)の任意の組み合わせ、
によって可能となる。
I-SceIおよびAlcR、またはI-SceIおよびAlcR (1 - 60)、またはI-CreIおよびAlcR、またはI-CreIおよびAlcR (1 - 60)、またはI-MsoIおよびAlcR、またはI-MsoIおよびAlcR (1 - 60)の組み合わせであるが、このAlcRもしくはAlcR(1 - 60)はNもしくはC末端でI-SceI、I-CreIまたはI-MsoIに融合されており、このI-SceI、I-CreI、I-MsoI、AlcR、AlcR (1 - 60)は、アミノ酸レベルで少なくとも50%、60%、70%、80%、85%、90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、もしくは 99%の配列同一性を有するそれらのホモログを含む。
N末端- LAGLIDADGエンドヌクレアーゼ- Zn2C6 ジンクフィンガー - C末端、
N末端- Zn2C6 ジンクフィンガー - LAGLIDADGエンドヌクレアーゼ - C末端、
N末端- Zn2C6 ジンクフィンガー - LAGLIDADGエンドヌクレアーゼ - Zn2C6 ジンクフィンガー - C末端、
が挙げられるが、
他の組み合わせも可能であり、この場合1つのエンドヌクレアーゼは、1つもしくは複数のZn2C6ジンクフィンガーをNもしくはC末端に有する可能性がある。
N末端-I-SceI - AlcR - C末端、または
N末端-I-SceI - AlcR (1 - 60) - C末端、または
N末端-I-CreI - AlcR - C末端、または
N末端-I-CreI - AlcR (1 - 60) - C末端、または
N末端-I-MsoI - AlcR - C末端、または
N末端-I-MsoI - AlcR (1 - 60) - C末端、または
N末端- AlcR - I-SceI- C末端、または
N末端- AlcR (1 - 60)-I-SceI - C末端、または
N末端- AlcR - I-CreI - C末端、または
N末端- AlcR (1 - 60)-I-CreI - C末端、または
N末端- AlcR - I-MsoI - C末端、または
N末端- AlcR (1 - 60)-I-MsoI - C末端。
キメラエンドヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼのDNA認識配列と異種DNA結合ドメインの認識配列とを組み合わせたDNA配列と結合している。キメラエンドヌクレアーゼがそのDNA内に2つ以上のエンドヌクレアーゼもしくは2つ以上の異種DNA結合ドメインを含有している場合、キメラエンドヌクレアーゼは、使用されたエンドヌクレアーゼのDNA認識配列と、使用された異種DNA結合ドメインのDNA結合配列との組み合わせである、DNA配列と結合していると考えられる。キメラエンドヌクレアーゼと結合したDNAの配列が、エンドヌクレアーゼと異種DNA結合ドメインを組み合わせた順序を反映していることは明白である。
I-SceI - AlcRまたはI-SceI AlcR (1 - 60)の構造を有する、好ましくは配列番号7、8、9、10、50、51、52および53で表されるアミノ酸配列を有するキメラエンドヌクレアーゼ。
I-SceI AlcR または
I-SceI AlcR (1 - 60) 標的部位1 cgtgcggatctagggataacagggtaat (配列番号13)
I-SceI AlcR または
I-SceI AlcR (1 - 60) 標的部位2 cgtgcggatcctagggataacagggtaat (配列番号14)
I-SceI AlcR または
I-SceI AlcR (1 - 60) 標的部位3 cgtgcggatcgctagggataacagggtaat (配列番号15)
I-SceI AlcR または
I-SceI AlcR (1 - 60) 標的部位4 cgtgcggatccgctagggataacagggtaat (配列番号16)
AlcR(1 - 60)-I-SceIの構造を有する、好ましくは配列番号54、55および56で表されるアミノ酸配列を有するキメラエンドヌクレアーゼ
AlcR (1-60) I-SceI または
AlcR-I-SceI 標的部位1 cgtgcggatcattaccctgttatcccta (配列番号43)
AlcR (1-60) I-SceI または
AlcR-I-SceI 標的部位2 cgtgcggatcnattaccctgttatcccta (配列番号44)
AlcR (1-60) I-SceI または
AlcR-I-SceI 標的部位3 cgtgcggatcnnattaccctgttatcccta (配列番号45)
AlcR (1-60) I-SceI または
AlcR-I-SceI 標的部位4 cgtgcggatcnnnattaccctgttatcccta (配列番号46)。
AlcRおよびAlcR (1-60) 5'- WGCGG-3'
AflR 5'-TCGNNNNNCGA-3' (配列番号164)
Hap1 5'-CGGNNNTA-3'
Leu3 5'-RGCCG-3'であって、
このAはアデニンを、Gはグアニンを、Cはシトシンを、Tはチミンを、Wはアデニンもしくはチミンを、Rはグアニンもしくはアデニンを、ならびにNはアデニンもしくはグアニンもしくはシトシンもしくはチミンを表す。
本発明は、上記キメラエンドヌクレアーゼをコードする単離されたポリヌクレオチドも含んでいる。
本発明には、キメラ認識配列を含有する単離されたポリヌクレオチドも含まれるが、このキメラ認識配列は約15から約300、または約20から約200、または約25から約100ヌクレオチドの長さであって、エンドヌクレアーゼの認識配列、および異種DNA結合ドメインの認識配列を含む。
上記ポリヌクレオチドは、形質転換、トランスフェクション、クローニングもしくは過剰発現に適したDNAベクターに含まれていてもよい。
i) たとえば大腸菌(E. coli)において、本発明の発現カセットもしくはベクターの複製を保証する、複製開始点。例として挙げられるのは、ORI(DNA複製開始点)、pBR322 ori、またはP15A oriである。(Sam-brook et al.: Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)。
ii) 1つもしくは複数の核酸配列の挿入が可能であって、その挿入を促進する、多重クローニング部位(MCS)。
iii) 宿主生物のゲノム内への相同組み換えもしくは挿入を可能にする配列。
iv)植物ゲノム内への移動および組み込みのために、植物細胞内でアグロバクテリウムを介した伝達を可能にする、たとえば、T-DNAのライトボーダーもしくはレフトボーダーまたはvir領域といった、ボーダー配列などのエレメント。
「マーカー配列」という用語は、広義では、形質転換された細胞、組織、または生物(たとえば、植物)の検出、同定、または選択を容易にする、すべてのヌクレオチド配列(および/またはそれから翻訳されたポリペプチド配列)を含むものと理解されるべきである。「形質転換された植物材料の選択を可能にする配列」、「選択マーカー」または「選択マーカー遺伝子」または「選択マーカータンパク質」または「マーカー」という表現は、基本的に同じ意味を持つ。
a) ネガティブ選択マーカー、これは1つもしくは複数の毒物(植物の場合、植物に有害な物質)、たとえば抗生物質、除草剤、もしくは他の殺生物剤に対する抵抗性を与えるものである、
b) 対抗選択マーカー、これは(たとえば、毒性のない化合物を有毒な化合物に変換することによって)特定の化合物に対する感受性を与えるものである、ならびに
c) ポジティブ選択マーカー、これは(たとえば、オーキシン、ジベレリン、サイトカイニン、アブシジン酸およびエチレンなどの植物ホルモンの生産をもたらす、サイトカイニンもしくはホルモン生合成の重要成分の発現によって;Ebinuma H et al. (2000) Proc Natl Acad Sci USA 94:2117-2121)増殖優位性を与えるものである。
通例、ネガティブ選択マーカーは、形質転換に成功した細胞を選択するのに有用である。ネガティブ選択マーカーは、本発明のDNA構築物を用いて導入されているが、殺生物剤もしくは植物に有害な物質(たとえば、ホスフィノトリシン、グリホサートもしくはブロモキシニルなどの除草剤)、2-デオキシグルコース-6-リン酸(WO 98/45456)などの代謝阻害剤、または抗生物質、たとえば、テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、G418、ネオマイシン、ブレオマイシンもしくはハイグロマイシンに対する抵抗性を、形質転換に成功した細胞に、与えることができる。ネガティブ選択マーカーは、形質転換されない細胞から形質転換された細胞を選択することを可能にする(McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5:81-84)。本発明のベクター中のネガティブ選択マーカーを、2つ以上の生物において抵抗性を与えるために使用することができる。たとえば、本発明のベクターは、細菌(大腸菌もしくはアグロバクテリウム(Agrobacterium))および植物での増幅のための選択マーカーを含有することができる。大腸菌のための択可能なマーカーの例としては、抗生物質、すなわちアンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシン、エリスロマイシンに対する耐性を特定する遺伝子、または他のタイプの選択可能な酵素活性、たとえばガラクトシダーゼを与える遺伝子、またはラクトースオペロンがある。哺乳動物細胞に使用するのに適した、選択可能なマーカーとしては、たとえば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子(DHFR)、チミジンキナーゼ遺伝子(TK)、または薬剤耐性を与える原核細胞遺伝子、gpt(キサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ)、これはミコフェノール酸を用いて選択することができる; neo(ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ)、これはG418、ハイグロマイシン、もしくはピューロマイシンを用いて選択することができる;ならびにDHFR(ジヒドロ葉酸還元酵素)、これはメトトレキサートを用いて選択することができる:が挙げられる。植物細胞のための選択マーカーは、殺生物剤もしくは抗生物質、たとえば、カナマイシン、G418、ブレオマイシン、ハイグロマイシン、もしくはクロラムフェニコールに対する耐性、または除草剤抵抗性、たとえばクロルスルフロンもしくはバスタに対する抵抗性を与えることが多い。
ポジティブ選択マーカーには、サイトカイニン生合成の重要な酵素として、形質転換された植物の再生を促進することができる、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens) (菌株:PO22; Genbank Acc.-No.: AB025109)由来のイソペンテニルトランスフェラーゼのような増殖刺激選択マーカー(たとえば、サイトカイニンを含まない培地上で選択)があるがこれらに限定されない。対応する選択方法が記載されている(Ebinuma H et al. (2000) Proc Natl Acad Sci USA 94:2117-2121; Ebinuma H et al. (2000) Selection of Marker-free transgenic plants using the oncogenes (ipt, rol A, B, C) of Agrobacterium as selectable markers, In Molecular Biology of Woody Plants. Kluwer Academic Publishers)。形質転換されないものと比べて形質転換された植物に増殖優位性を与える、他のポジティブ選択マーカーは、たとえば、EP-A 0 601 092に記載されている。増殖刺激選択マーカーにはβグルクロニダーゼ(たとえばサイトカイニングルクロニドと組み合わせ)、マンノース-6-リン酸イソメラーゼ(マンノースと組み合わせ)、UDP-ガラクトース-4-エピメラーゼ(たとえばガラクトースと組み合わせ)を含めることができる(がそれに限定すべきではない)。マンノースと組み合わせたマンノース-6-リン酸イソメラーゼが特に好ましい。
対抗選択マーカーは、正しく欠失させた配列による生物の選択を可能にする(Koprek T et al. (1999) Plant J 19(6):719-726)。チミジンキナーゼ(TK)およびジフテリア毒素A断片(DT-A)、シトシンデアミナーゼをコードするcodA遺伝子(Gleve AP et al. (1999) Plant Mol Biol 40(2):223-35; Pereat RI et al. (1993) Plant Mol Biol 23(4):793-799; Stougaard J (1993) Plant J 3:755-761)、シトクロムP450遺伝子(Koprek et al. (1999) Plant J 16:719-726)、ハロアルカン脱ハロゲン酵素をコードする遺伝子(Naested H (1999) Plant J 18:571-576)、iaaH遺伝子(Sundaresan V et al. (1995) Genes & Development 9:1797-1810)、tms2遺伝子(Fedoroff NV & Smith DL (1993) Plant J 3:273- 289)、およびD-アミノ酸の変換により有毒作用を引き起こすD-アミノ酸オキシダーゼ(WO 03/ 060133)。
スクリーニング可能なマーカー(レポーター遺伝子など)は、簡単に数値化できる、もしくは検出できるタンパク質をコードしており、これは、内色素もしくは酵素活性によって、形質転換効率、または発現の位置もしくはタイミングを確実に評価する。特に好ましいのは、次のようなレポータータンパク質をコードする遺伝子である(Schenborn E, Groskreutz D. (1999) Mol Biotechnol 13(1):29-44も参照されたい):
- 「緑色蛍光タンパク質」(GFP)(Chui WL et al. (1996) Curr Biol 6:325-330; Lef-fel SM et al. (1997) Biotechniques 23(5):912-8; Sheen et al. (1995) Plant J 8(5):777-784; Haseloff et al. (1997) Proc Natl Acad Sci USA 94(6):2122-2127; Reichel et al. (1996) Proc Natl Acad Sci USA 93(12):5888-5893; Tian et al. (1997) Plant Cell Rep 16:267-271; WO 97/41228)、
- クロラムフェニコールトランスフェラーゼ、
- ルシフェラーゼ(Millar et al. (1992) Plant Mol Biol Rep 10:324-414; Ow et al. (1986) Science 234:856-859)、これは生物発光の検出により選択が可能となる、
- βガラクトシダーゼ、これはさまざまな発色基質が利用できる酵素をコードする、
- βグルクロニダーゼ(GUS)(Jefferson et al. (1987) EMBO J 6:3901-3907)またはuidA遺伝子、これはさまざまな発色基質に対する酵素をコードする、
- R遺伝子座遺伝子産物:植物組織においてアントシアニン色素(赤色着色)の生成を制御し、そうすることで追加の補助剤もしくは発色基質を加えることなく、プロモーター活性の直接的な分析を可能にするタンパク質(Dellaporta et al. (1988) In: Chromosome Structure and Function: Impact of New Concepts, 18th Stadler Genetics Symposium, 11:263-282)、
- βラクタマーゼ(Sutcliffe (1978) Proc Natl Acad Sci USA 75:3737-3741)、さまざまな発色基質(たとえばPADAC、発色性セファロスポリン)に対する酵素、
- xylE遺伝子産物(Zukowsky et al. (1983) Proc Natl Acad Sci USA 80:1101-1105)、発色するカテコール類を変換することができるカテコールジオキシゲナーゼ、
- αアミラーゼ(Ikuta et al. (1990) Bio/technol. 8:241-242)、
- チロシナーゼ(Katz et al.(1983) J Gene Microbiol 129:2703-2714)、チロシンを酸化してDOPAおよびドーパキノンを与える酵素であって、これらは次にメラニンを形成し、これは容易に検出できる、
- エクオリン(Prasher et al.(1985) Biochem Biophys Res Commun 126(3):1259-1268)、これはカルシウム感受性生物発光検出に使用できる。
形質転換またはキメラエンドヌクレアーゼの導入に適した任意の生物を標的生物として使用することができる。これには、原核生物、真核生物、および古細菌が含まれ、特に非ヒト生物、植物、真菌もしくは酵母であるが、ヒトもしくは動物細胞も含まれる。
典型的には、非ヒト生物もしくは細胞、たとえば植物もしくは植物細胞に導入されるべきポリヌクレオチド構築物(たとえば発現カセットのための)は、導入遺伝子発現法を用いて調製される。組み換え発現法は、組み換え核酸の構築およびトランスフェクト細胞での遺伝子発現を含んでいる。こうした目的を達成する分子クローニング技術は当技術分野で知られている。組み換え核酸の構築に適した、さまざまなクローニングおよびin vitro増幅法は、当業者によく知られている。多くのクローニングの実習を通じて、当業者に十分指示することができる、上記の技術および教示の例は、Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Vol.152, Academic Press, hic., San Diego, CA (Berger) ; Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publish-ing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (1998 Supplement), T. Maniatis, E.F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989), T.J. Silhavy, M.L. Berman and L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984)に見いだされる。本発明で使用されるDNA構築物は、当業者によく知られた組み換え、およびクローニング技術を用いて、前記配列内で、DNA構築物の前記必須成分を結合することによって作製されることが好ましい。
本発明で使用されるDNA構築物は、このDNA構築物が挿入されているベクターを用いて、細胞内に有利に導入することができる。ベクターの例は、プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス、レトロウイルス、またはアグロバクテリアとすることができる。有利な実施形態において、発現カセットは、プラスミドベクターを用いて導入される。好ましいベクターは、発現カセットを宿主ゲノム内に安定して組み込むことができるベクターである。
形質転換された細胞、すなわ宿主細胞のDNAに組み込まれたDNAを含有する細胞は、選択可能なマーカーが導入されたDNAの一部を占めているならば、形質転換されていない細胞から選別することができる。マーカーはたとえば、抗生物質もしくは除草剤に対する耐性を与えることができる任意の遺伝子とすることができる(たとえば上記を参照されたい)。こうしたマーカー遺伝子を発現する形質転換細胞は、形質転換されていない野生型を死滅させる、適当な抗生物質もしくは除草剤の濃度のもとで生存することができる。形質転換された植物細胞が作製されたならば、当業者に公知の方法を用いて、完全な植物体を得ることができる。たとえば、カルス培養を出発材料として使用する。芽および根の形成は、この未だ分化していない細胞生物体において既知の方法で誘導することができる。得られた芽を植えて栽培することができる。
さらに好ましい実施形態において、形質転換系の効率は、相同組み換えを促進する系の併用によって高められる。こうした系は報告されており、たとえば、RecAなどのタンパク質の発現、またはPARP阻害剤による処理が含まれる。タバコ植物における染色体内相同組み換えは、PARP阻害剤を使用することによって高めることができることが示された(Puchta H et al. (1995) Plant J. 7:203-210)。こうした阻害剤を用いて、配列特異的DNA二本鎖切断の誘導後の、組み換えカセットにおける相同組み換え率、およびそれによる導入遺伝子配列の欠失の有効性を、さらに増加させることができる。さまざまなPARP阻害剤をこの目的に使用することができる。好ましくは、3-アミノベンズアミド、8-ヒドロキシ-2-メチルキナゾリン-4-オン(NU1025)、1,11b-ジヒドロ-(2H)ベンゾピラノ(4,3,2-デ)イソキノリン-3-オン(GPI 6150)、5-アミノイソキノリノン、3,4-ジヒドロ-5-(4-(1-ピペリジニル)ブトキシ)-1(2H)-イソキノリノン、またはWO 00/26192, WO 00/29384, WO 00/32579, WO 00/64878, WO 00/68206, WO 00/67734, WO 01/23386およびWO 01/23390に記載の化合物などの阻害剤が含まれる。
本発明は、上記のようなキメラLAGLIDADGエンドヌクレアーゼを提供する方法を提供する。
a. 少なくとも1つのLAGLIDADGエンドヌクレアーゼコード領域を提供するステップ、
b. 少なくとも1つの異種DNA結合ドメインコード領域を提供するステップ、
c. ステップa)の1つもしくは複数のLAGLIDADGエンドヌクレアーゼの、1つもしくは複数の潜在的DNA認識配列を有し、かつ、ステップb)の1つもしくは複数の異種DNA結合ドメインの、1つもしくは複数の潜在的認識配列を有する、ポリヌクレオチドを提供するステップ、
d. ステップa)のすべてのLAGLIDADGエンドヌクレアーゼコード領域、およびステップb)のすべての異種DNA結合ドメインの翻訳融合物を作製するステップ、
e. ステップd)で作製された翻訳融合物からキメラLAGLIDADGエンドヌクレアーゼを発現させるステップ、
f. ステップe)で発現されたキメラLAGLIDADGエンドヌクレアーゼの、ステップc)のポリヌクレオチドの切断について調べるステップ。
本発明はポリヌクレオチドの相同組み換え方法を提供するが、その方法は下記を含んでなる:
a. 相同組み換えに適した細胞を提供すること、
b. 両端に配列Aおよび配列Bが配置された組み換えポリヌクレオチドを含んでなる、ポリヌクレオチドを提供すること、
c. 配列Aおよび配列Bに対して相同で、十分長い、配列A'およびB'を含んでなるポリヌクレオチドであって、前記細胞において相同組み換えを可能にする前記ポリヌクレオチドを提供すること、および
d. キメラLAGLIDADGエンドヌクレアーゼ、またはキメラLAGLIDADGエンドヌクレアーゼをコードする発現カセットを提供すること、
e. 前記細胞内で、b)、c)、およびd)を組み合わせること、ならびに
f. b)およびc)の組み換えられたポリヌクレオチドを検出すること、またはb)およびc)の組み換えられたポリヌクレオチドを含有する細胞を選択し、または増殖させること。
a. 好ましくは、配列番号13、14、15、16、26、27、28、29、43、44、45または46で表される配列の一群から選択される、キメラ認識部位を含んでなるポリヌクレオチドを含有する細胞を提供すること、
b. キメラエンドヌクレアーゼ、たとえば、配列番号2, 3, 5, 7, 8, 9, 10, 50, 51, 52, 53, 54, 55, および56で表される配列の一群から選択される、配列を有するエンドヌクレアーゼを含んでなり、ステップa)のキメラ認識部位を切断する能力を有する、キメラエンドヌクレアーゼを提供すること、
c. 前記細胞においてa)およびb)を組み合わせること、ならびに
d. 変異したポリヌクレオチドを検出する、または変異したポリヌクレオチドを含有する増殖細胞を選択すること。
キメラエンドヌクレアーゼとキメラ認識部位を、生物の交雑により、細胞の形質転換により、またはキメラエンドヌクレアーゼと融合したSecIVペプチドによって、組み合わせること、ならびにキメラ認識部位を含有する細胞を、キメラエンドヌクレアーゼを発現する生物と接触させること、ならびにキメラエンドヌクレアーゼと融合したSecIVペプチドを認識することができるSecIV輸送複合体を発現させること。
一般的方法
オリゴヌクレオチドの化学合成は、たとえば、ホスホアミダイト法を用いた既知の方法で、実行することができる(Voet, Voet, 2nd edition, Wiley Press New York, pages 896-897)。本発明の目的のために実行されるクローニングステップ、たとえば、制限酵素切断、アガロースゲル電気泳動、DNA断片の精製、ニトロセルロースおよびナイロン膜への核酸の転写、DNA断片の結合、大腸菌細胞の形質転換、細菌培養、ファージの増殖、および組み換えDNAの配列分析は、Sambrook et al. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press; ISBN 0-87969-309-6により記載されたように行われる。組み換えDNA分子は、Sangerの方法(Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 5463-5467)にしたがって、ALF Expressレーザー蛍光DNAシークエンサー(Pharmacia, Upsala [sic], Sweden)を用いて配列決定した。
(実施例1a):基本構築物
この実施例において、大腸菌での形質転換に適した「構築物I」と称される、ベクターの概要を提示する。このベクターの概要は、選択のためのアンピシリン耐性遺伝子、大腸菌のための複製開始点、およびアラビノース誘導性転写調節因子をコードするaraC遺伝子を含んでなる。シークエンスプロトコールの配列中の"NNNNNNNNNN"の配列範囲は、さまざまなタイプの配列特異的DNAエンドヌクレアーゼをコードする遺伝子のためのプレースホルダーとなるよう意図されたものである。さまざまな遺伝子は、アラビノース誘導性pBADプロモーターから発現することができ(Guzman et al., J Bacteriol 177: 4121-4130 (1995))、さまざまなヌクレアーゼ型をコードする遺伝子の配列は、次の実施例で与えられる。
Gene 73 (2), 385-396 (1988)において、Felenbokらは、A. nidulansの転写活性化因子としてAlcRタンパク質を記載した。AlcRコード配列は、リジン1つをリンカーとして用いて、I-SceI配列のC末端に融合させた。リンカーは、結果として得られる融合タンパク質が、I-SceIおよびAlcRの結合部位の組み合わせに相当する、同系の結合部位を認識するように設計した。AlcRの機能は、エタノールの添加によって制御することができる。このことから、融合タンパク質の活性もしくはDNA結合親和性を同様に制御できる可能性がある。結果として得られたプラスミドをVC-SAH51-40と称した。構築物の配列は、構築物Iの配列と同一であるが、配列"NNNNNNNNNN"は、配列番号19で表される配列で置き換えられた。
(実施例2a):基本構築物
この実施例において、大腸菌での形質転換に適した「構築物II」と称される、ベクターの概要を提示する。このベクターの概要は、選択のためのカナマイシン耐性遺伝子、大腸菌のための複製開始点を含んでなるが、これは構築物Iのoriに対応する。配列番号23は”NNNNNNNNNN"の配列範囲を示す。これは、配列特異的DNAエンドヌクレアーゼのさまざまなタイプおよびタンパク質融合物について、さまざまな認識/標的部位のためのプレースホルダーとなるよう意図されたものである。コントロール構築物において、プレースホルダーは、I-SceIの天然の標的配列を含む配列範囲(配列番号24)で置き換えられており、この構築物はVC-SAH6-1と命名された。標的部位を持たないコントロールプラスミドは、VC-SAH7-1と称することとした(配列番号25)。
Structure 9, 827-36 (2001)において、Cahuzacらは、同系の認識配列と複合したAlcRのDNA結合ドメインを記載した。この情報に基づいて、組み合わせた標的部位を作製したが、それはヌクレアーゼI-SceIおよびAlcRの標的部位からなる。それぞれの部位がさまざまな距離をとる、種々の組み合わせの標的部位を作製した。同系のI-SceI融合タンパク質によってもっともよく認識される標的部位を特定することを目標とした。結果として得られたプラスミドは、VC-SAH56-1、VC-SAH57-2、VC-SAH58-2、VC-SAH59-1と称することとした。構築物の配列は、構築物IIの配列と同一であるが、配列"NNNNNNNNNN"は、それぞれ配列番号26、27、28、29で表される配列で置き換えられた。
異なる選択マーカーを有する同一濃度の2つのプラスミドを、メーカーの説明書にしたがって化学的にコンピテントにした大腸菌Top10細胞に形質転換した。それぞれの選択用の抗生物質を含むLB上に細胞を蒔き、37℃にて一晩増殖させた。
一方はヌクレアーゼもしくはヌクレアーゼ融合物(構築物I)をコードし、他方は適合する標的部位(構築物II)を保有する、二つのプラスミドを組み合わせて保持する同時形質転換体を、アンピシリンおよびカナマイシン含有LB中で一晩増殖させた。培養物を1:100に希釈し、OD600=0.5に達するまで増殖させた。構築物Iからの融合タンパク質の発現は、3〜4時間アラビノースを添加することにより誘導された。pBADプロモーターは用量依存性であると報告されている(Guzman 1995)ので、培養物をさまざまな量に分割し、タンパク質の発現を0.2%から0.0002%までさまざまの濃度のアラビノースで誘導した。それぞれの分割量から5μlを、アンピシリンおよびカナマイシンを添加したLB固形培地上に蒔いた。プレートは、37℃にで一晩インキュベートし、細胞増殖は半定量的に分析した。活性ヌクレアーゼ融合物は、標的部位を保有する構築物を切断した。このことは、カナマイシン耐性を与える、構築物IIまたは構築物IIIの損失を招いた。したがって、融合タンパク質の活性は、同時形質転換体がカナマイシン含有培地上で増殖する能力を失ったことにより、観察された。
シロイヌナズナ(A. thaliana)の植物体を、開花するまで土壌で生育させた。当該の構築物で形質転換されたアグロバクテリウム・ツメファシエンス(菌株C58C1 [pMP90])を、培養液がOD600 0.8-1.0に達するまで、500 mL液体YEB培地(5 g/L 牛肉エキス、1 g/L 酵母エキス (Duchefa)、5 g/L ペプトン (Duchefa)、5 g/L ショ糖 (Duchefa)、0,49 g/L MgSO4 (Merck))中で増殖させた。細菌の細胞を遠心分離(15分、5000 rpm)によって集め、500 mL浸透溶液(5% ショ糖、0.05% SILWET L-77 [発売Lehle seeds、カタログ番号VIS-02])中に再懸濁した。開花した植物をアグロバクテリウム溶液中に10-20秒間浸漬した。その後、植物を1日暗下に置いた後、種子が収穫できるまで温室内で維持した。表面を滅菌した種子を、nptII耐性マーカー遺伝子を保有する植物用には50 mg/Lカナマイシン、ならびにpat遺伝子を保有する植物用には10 mg/Lホスフィノトリシンをそれぞれ添加した増殖培地A(4.4g/L MS塩類 [Sigma-Aldrich]、0.5g/L MES [Duchefa]; 8g/L Plant Agar [Duchefa])上に蒔くことによって、トランスジェニック種子を選択した。生存する植物を土壌に移し、温室内で生育させた。
(実施例6a):基本構築物
この実施例において、植物の形質転換に適した「構築物IV」と称される、バイナリーベクターの概要を提示する。このバイナリーベクターの概要は、p-Mas1del100::cBAR:: t-Ocs1カセットを有するT-DNAを含んでなるが、これは、植物ゲノムに組み込まれたとき、ホスフィノトリシンによる選択を可能にするものである。配列番号31は”NNNNNNNNNN"の配列範囲を示す。これは、さまざまなタイプの配列特異的DNAエンドヌクレアーゼをコードする遺伝子ためのプレースホルダーとなるよう意図されたものである。後者の配列は、次の実施例で与えられる。
「構築物IV」の”NNNNNNNNNN"の配列範囲を、実施例1bに記載の3つの異なる型のI-SceI-AlcR融合物をコードする遺伝子で別々に置き換えた。その結果得られたプラスミドは、VC-SAH91-1 (NLS - I-SceI - AlcR(1-60))、VC-SAH92-1 (I-SceI - AlcR(1-60))、VC-SAH103-3 (NLS - I-SceI - AlcR) および VC-SAH104-22 (I-SceI - AlcR)と称することとした。
(実施例7a):基本構築物
この実施形態において、シロイヌナズナの形質転換に適した「構築物V」と称される、バイナリーベクターの概要を提示する。このバイナリーベクターの概要は、nos-プロモーター::nptII::nos-ターミネーターカセットを有するT-DNAを含んでなるが、これは、植物ゲノムに組み込まれたとき、カナマイシン耐性を与えるものである。
ヌクレアーゼI-SceIおよびAlcRの標的部位からなる、組み合わせた標的部位を作製した。それぞれの部位がさまざまな距離をとる、さまざまな組み合わせの標的部位を作製した。同系のI-SceI融合タンパク質によってもっともよく認識される標的部位を特定することを目標とした。結果として得られたプラスミドは、VC-SAH52-21、VC-SAH111、VC-SAH112、VC-SAH55-22と称することとした/呼ばれている。構築物の配列は、構築物Vの配列と同一であるが、配列"NNNNNNNNNN"は、それぞれ配列番号33、34、35、36で表される配列で置き換えられた。
プラスミドVC-SAH87-4、VC-SAH91-1、VC-SAH92-1、VC-SAH103-3、VC-SAH105、VC-SAH140、VC-SAH139-20、VC-SAH89-10、VC-SAH90を用いて、実施例5に記載のプロトコールにしたがって、シロイヌナズナを形質転換した/する。選択されたトランスジェニック系(T1世代)を温室内で生長させ、花を用いて交雑させた/させる(下記を参照されたい)。
プラスミドVC-SAH52-21, VC-SAH111, VC-SAH112, VC-SAH55-22, VC-SAH113, VC-SAH114, VC-SAH115, VC-SAH16-4, VC-SAH17-8, VC-SAH18-7およびVC-SAH19-15を用いて、実施例5に記載のプロトコールにしたがってシロイヌナズナを形質転換した/する。選択されたトランスジェニック系(T1世代)を温室内で生長させ、花を用いて交雑させた/させる(実施例10を参照されたい)。
配列特異的DNAエンドヌクレアーゼをコードするT-DNAを保持するシロイヌナズナのトランスジェニック系を、対応する組み合わされた標的部位を有するGU-USレポーター構築物を有するT-DNAを保持するシロイヌナズナの系と交雑させた/させる。標的部位に対するI-SceI活性の結果として、染色体内相同組み換え(ICHR)により機能的GUSが回復されることになる。組織化学的GUS染色によってこれをモニターすることができる(Jefferson et al. (1987) EMBO J 6:3901-3907)。
ヌクレアーゼをコードする構築物VC-SAH91-1 ( NLS-I-SceI - AlcR(1-60) )のT-DNAを保有する3つの独立した系統を、ヌクレアーゼをコードする構築物VC-SAH743-4 ( 天然型I-SceI部位)のT-DNAを保有する3つの独立した系統、ならびにヌクレアーゼをコードする構築物VC-SAH55-22 (標的部位I-SceI - AlcR)のT-DNAを保有する3つの独立した系統と、交雑させた。
(実施例20)
(実施例20a):大腸菌で発現するために、AlcRと融合したI-SceIのC末端短縮型をコードする、配列特異的DNAエンドヌクレアーゼ発現カセットを保有する構築物
特異性および安定性の高まったI-SceIバリアントを作製するために、AlcRと、提示されたC末端PEST配列(アミノ酸228-236)が変化したタイプのI-SceIとの間で融合タンパク質を作製した。二つの異なるC末端の変更が選択されたが、第1のC末端(C term mod #1)では、C末端は配列番号37で置き換えら、第2のC末端(C term mod #2)では、C末端は配列番号38で置き換えられた。
VC-SAH181-1 (CGTGCGGATCATTACCCTGTTATCCCTA) (配列番号43)
VC-SAH182-2 (CGTGCGGATCNATTACCCTGTTATCCCTA) (配列番号44)
VC-SAH183-3 (CGTGCGGATCNNATTACCCTGTTATCCCTA) (配列番号45)
VC-SAH184-2 (CGTGCGGATCNNNATTACCCTGTTATCCCTA) (配列番号46)
(実施例20b):大腸菌におけるエンドヌクレアーゼ活性の実証
実施例20aに記載のプラスミドによりコードされる、AlcRのC末端融合を有するタイプのヌクレアーゼを、大腸菌において、複合標的部位をコードするベクターVC-SAH56-1, VC-SAH57-2, VC-SAH58-2, VC-SAH59-1とともに同時形質転換した。これらのタイプのI-SceIの活性および特異性を実施例3および4に記載のように分析した。
大腸菌において、実施例20aに記載のC末端I-SceI - AlcR融合物は、実施例4、表1に示すVC-SAH48〜VC-SAH51と同様に機能した。
実施例20aに記載のそれぞれのタイプのI-SceI-AlcR融合物を構築物IVに入れてクローニングした。VC-SAH126-1と称するプラスミドにおいて、プレースホルダーはNLS - I-SceI C term mod #1 AlcR (1-60) (配列番号39)で置き換えられた。VC-SAH127-1と称するプラスミドにおいて、NNNNNNはNLS - I-SceI C term mod #2 AlcR (1-60) (配列番号40)で置き換えられた。
実施例5に記載のように、プラスミドSAH126-1およびVC-SAH127-1でシロイヌナズナを形質転換した。植物は、実施例7bに記載のように、同系の標的部位を含むレポーター構築物を有するT-DNAを保有する系統と交雑させた。同様に、VC-SAH137-1およびVC-SAH138-2を用いてシロイヌナズナを形質転換した。植物は、実施例7bに記載のように、同系の標的部位を含むレポーター構築物を有するT-DNAを保有する系統と交雑させた。これらのタイプのヌクレアーゼの活性および特異性を、実施例10に記載のように分析する。
ヌクレアーゼをコードする構築物VC-SAH126-1(NLS-I-SceI C term mod #1 AlcR(1-60))のT-DNAを保有する3つの独立した系統、ならびにヌクレアーゼをコードする構築物VC-SAH127-1(NLS-I-SceI C term mod #2 AlcR(1-60))のT-DNAを保有する3つの独立した系統を、ヌクレアーゼをコードする構築物VC-SAH743-4 ( 天然型I-SceI部位)のT-DNAを保有する3つの独立した系統、ならびにヌクレアーゼをコードする構築物VC-SAH55-22 (標的部位I-SceI - AlcR)のT-DNAを保有する3つの独立した系統と、交雑させた。
Claims (27)
- I-SceIの酵素活性を有するLAGLIDADGエンドヌクレアーゼ、およびAlcRまたはそのDNA結合ドメイン断片からなる異種DNA結合ドメインを含んでなる、キメラエンドヌクレアーゼ。
- LAGLIDADGエンドヌクレアーゼが、配列番号1、2、3、122、123、124または125で表されるポリペプチドに対して少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含有する、請求項1に記載のキメラエンドヌクレアーゼ。
- LAGLIDADGエンドヌクレアーゼが、遺伝子操作された、もしくは最適化されたエンドヌクレアーゼである、または最適化型の遺伝子操作されたエンドヌクレアーゼである、請求項1または2に記載のキメラエンドヌクレアーゼ。
- AlcRまたはそのDNA結合ドメイン断片からなる異種DNA結合ドメインが転写因子由来である、請求項1〜3のいずれか1つに記載のキメラエンドヌクレアーゼ。
- 異種DNA結合ドメインが、配列番号6、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、または94のいずれか1つに記載のポリペプチドに対して少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有する、少なくとも1つのポリペプチドを含んでいる、請求項1〜4のいずれか1つに記載のキメラエンドヌクレアーゼ。
- 異種DNA結合ドメインが、図10に示されるコンセンサス配列を有する、請求項5に記載のキメラエンドヌクレアーゼ。
- キメラエンドヌクレアーゼが最適化されたエンドヌクレアーゼを含んでいる、請求項1〜6のいずれか1つに記載のキメラエンドヌクレアーゼ。
- DNA二本鎖切断を引き起こす活性を有するエンドヌクレアーゼ、および異種DNA結合ドメインがリンカーポリペプチドを介して連結されている、請求項1〜7のいずれか1つに記載のキメラエンドヌクレアーゼ。
- リンカーポリペプチドが少なくとも3つのアミノ酸からなり、このリンカーポリペプチドのアミノ酸配列中のアミノ酸の少なくとも3分の1が、グリシン、もしくはセリン、もしくはアラニン、またはグリシン、セリン、およびアラニンの組み合わせである、請求項1〜8のいずれか1つに記載のキメラエンドヌクレアーゼ。
- 少なくとも1つのNLS配列を含有する、請求項1〜9のいずれか1つに記載のキメラエンドヌクレアーゼ。
- 異種DNA結合ドメインのDNA結合活性が誘導することができるものである、請求項1〜10のいずれか1つに記載のキメラエンドヌクレアーゼ。
- エンドヌクレアーゼの、DNA二本鎖切断を引き起こす活性が、二量体もしくはヘテロ二量体LAGLIDADGエンドヌクレアーゼの第2のモノマーの発現により誘導可能である、請求項1〜11のいずれか1つに記載のキメラエンドヌクレアーゼ。
- 少なくとも1つのSecIIIまたはSecIV分泌シグナルをさらに含有する、請求項1〜12のいずれか1つに記載のキメラエンドヌクレアーゼ。
- 配列番号7、8、9、10、50、51、52、53、54、55または56により表されるポリペプチドに対して少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1〜13のいずれか1つに記載のキメラエンドヌクレアーゼ。
- 請求項1〜14のいずれか1つに記載のキメラエンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
- 請求項15に記載のヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドであって、その単離されたポリヌクレオチドの配列はコドン最適化されている、前記単離されたポリヌクレオチド。
- 請求項15または16に記載の単離されたポリヌクレオチドを、プロモーターおよび転写終結配列とともに機能的に組み合わせて含む、発現カセット。
- 直接連結された、または1から10ヌクレオチドの配列によって連結された、
a. I-SceIの酵素活性を有するLAGLIDADGエンドヌクレアーゼの認識配列、および
b. AlcRまたはそのDNA結合ドメイン断片からなる異種DNA結合ドメインの認識配列、
を含有するキメラ認識配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。 - 前記異種DNA結合ドメインの認識配列が、配列番号6、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94のいずれか1つに記載のアミノ酸配列を含む少なくとも1つのDNA結合ドメインにより結合され得るものである、請求項18に記載のキメラ認識配列を含む単離されたポリヌクレオチド。
- 配列番号13、14、15、16、43、44、45、または46のいずれか1つに記載のポリヌクレオチド配列を含有する、請求項18または19に記載のキメラ認識配列を含む単離されたポリヌクレオチド。
- a. 請求項1〜14のいずれかに記載のキメラエンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、または
b. 請求項15もしくは16に記載の単離されたポリヌクレオチド、または
c. 請求項17に記載の発現カセット、または
d. 請求項18〜20のいずれか1つに記載のキメラ認識配列を含む単離されたポリヌクレオチド、または
e. a)、b)、c)、およびd)の任意の組み合わせ
を含有する、ベクター、宿主細胞、または非ヒト生物。 - 非ヒト生物が植物である、請求項21に記載の非ヒト生物。
- 改善された組換え効率を有するキメラエンドヌクレアーゼを提供するための方法であって、
a. 少なくとも1つのエンドヌクレアーゼコード領域を提供するステップであって、エンドヌクレアーゼがI-SceIの酵素活性を有するLAGLIDADGエンドヌクレアーゼである、ステップ、
b. 少なくとも1つの異種DNA結合ドメインコード領域を提供するステップであって、異種DNA結合ドメインがAlcRまたはそのDNA結合ドメイン断片からなる、ステップ、
c. 請求項18〜20のいずれか1つに記載の単離されたポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを提供するステップ、
d. ステップa)のすべてのエンドヌクレアーゼのコード領域、およびステップb)のすべての異種DNA結合ドメインの翻訳融合物を作製するステップ、
e. ステップd)で作製された翻訳融合物からキメラエンドヌクレアーゼを発現させるステップ、
f. ステップc)のポリヌクレオチドの切断について、ステップe)で発現されたキメラエンドヌクレアーゼをテストするステップ、
を含む、前記方法。 - ポリヌクレオチドの相同組み換えのための方法であって、
a. 相同組み換えに適した細胞を提供すること、
b. 配列Aおよび配列Bが両側に配置された、請求項18〜20のいずれか1つに記載の単離されたポリヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドを提供すること、
c. 配列A'およびB'を含んでなるポリヌクレオチドであって、配列Aおよび配列Bに対して十分長くて相同的であり、前記細胞における相同組み換えを可能にする前記ポリヌクレオチドを提供すること、
d. 請求項1〜14のいずれか1つに記載のキメラエンドヌクレアーゼ、または請求項17に記載の発現カセットを提供すること、
e. 前記細胞においてb)、c)のポリヌクレオチドと、d)のキメラエンドヌクレアーゼを組み合わせること、ならびに
f. b)とc)の組み換えられたポリヌクレオチドを検出する、またはb)とc)の組み換えられたポリヌクレオチドを有する細胞を選択する、および/もしくは増殖させること
を含む、前記方法。 - 請求項24に記載のポリヌクレオチドの相同組み換えのための方法であって、相同組み換えの際に、ステップa)のコンピテント細胞に含まれるポリヌクレオチド配列がステップf)の増殖細胞のゲノムから欠失する、前記方法。
- ポリヌクレオチドの標的変異のための方法であって、
a. 請求項18〜20のいずれか1つに記載のキメラ認識配列を含有するポリヌクレオチドを含んでいる細胞を提供すること、
b. ステップa)のキメラ認識配列を切断することができる、請求項1〜14のいずれか1つに記載のキメラエンドヌクレアーゼを提供すること、
c. 前記細胞においてa)のポリヌクレオチドとb)のキメラエンドヌクレアーゼを組み合わせること、ならびに
d. 変異したポリヌクレオチドを検出する、または変異したポリヌクレオチドを含有する増殖細胞を選択すること、
を含む、前記方法。 - 請求項24〜26のいずれか1つに記載の相同組み換え、または標的変異のための方法であって、キメラエンドヌクレアーゼと融合されたSec IIIもしくはSecIVペプチドを介した輸送により、形質転換により、または生物の交雑により、キメラエンドヌクレアーゼおよびキメラ認識配列を少なくとも1つの細胞内で組み合わせる、前記方法。
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