BR112015009967B1 - Método para a produção de um polipeptídeo terapêutico - Google Patents

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Abstract

PLANTAS PARA PRODUÇÃO DE PROTEÍNAS TERAPÊUTICAS. A presente invenção refere-se a materiais e métodos que são proporcionados para produzir plantas (por exemplo, variedades de Nicotiana) que são adequadas para a produção de polipeptídeos terapêuticos adequados para administração a seres humanos e animais, particularmente fazendo mutações induzidas por endonucleases efetoras TAL em genes codificando xilosiltransferases e fucosiltransferases.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS DE PATENTE RELACIONADOS
[0001] Este pedido de patente reivindica benefício de prioridade do Pedido de Patente Provisória U.S. No. de Série 61/790.850, depositado em 15 de março de 2013, e Pedido de Patente Provisória U.S. No. de Série 61/721.194, depositado em 1°. de novembro de 2012.
CAMPO TÉCNICO
[0002] Este documento se refere a materiais e métodos para produzir plantas que são adequadas para produção de proteínas terapêuticas para administração a seres humanos e animais, particularmente fazendo nocautes (knockouts) direcionados em genes codificando xilosiltransferases e fucosiltransferases. Este documento também se refere a variedades de Nicotiana que carecem de atividade de xilosiltransferase e fucosiltransferase, ou que têm atividade reduzida de xilosiltransferase e fucosiltransferase.
ANTECEDENTES
[0003] Diferentemente das glicoproteínas de animais, as glicoproteínas de plantas têm resíduos beta(1,2) xilosil e núcleo- alfa(1,3) fucosil, e carecem de resíduo terminais beta(1,4) galactosil e ácido siálico. Beta-1,2-xilosiltransferase ("XylT") catalisa a transferência de xilose a partir de UDP-xilose para a manose núcleo β-ligada de N- glicanos ligados à proteína. Esta enzima é única para plantas e algumas espécies de animais não vertebrados, e não ocorre em seres humanos ou em outros vertebrados. A α-1,3-fucosiltransferase ("FucT") catalisa a transferência de fucose a partir de GDP-fucose para a N-acetil glucosamina núcleo β-ligada (GlcNAc) de N-glicanos ligados à proteína. Esta enzima é encontrada em espécies de plantas e animais, incluindo seres humanos.
SUMÁRIO
[0004] Este documento proporciona materiais e métodos para produzir plantas que são particularmente úteis para produção de proteínas terapêuticas adequadas para administração a seres humanos e animais, particularmente fazendo nocautes direcionados em genes codificando xilosiltransferases e fucosiltransferases. Este documento também proporciona variedades de Nicotiana que carecem de atividade de xilosiltransferase e de fucosiltransferase, ou que têm atividade reduzida de xilosiltransferase e de fucosiltransferase em comparação com variedades de Nicotiana de controle correspondentes.
[0005] Esta descrição se baseia no mínimo em parte na descoberta de que plantas adequadas para a produção de proteínas para administração a seres humanos e animais podem ser produzidas por nocaute de todas as cópias dos genes codificando xilosiltransferases e fucosiltransferases. Esta descrição também se baseia no mínimo em parte no desenvolvimento de variedades de Nicotiana benthamiana que carecem de atividades de xilosiltransferase e de fucosiltransferase. Ter a capacidade de produzir plantas viáveis que carecem de atividades de xilosiltransferase e de fucosiltransferase pode facilitar a produção de proteínas terapêuticas para administração a seres humanos e animais, com uma menor incidência de reações imunogênicas ou alérgicas em comparação com proteínas produzidas em plantas com atividade de xilosiltransferase e de fucosiltransferase.
[0006] Além disso, esta descrição se baseia no mínimo em parte na descoberta de que plantas adequadas para a produção de proteínas para administração a seres humanos e animais podem ser produzidas por nocaute ou de modo diverso por mutação de uma ou mais cópias dos genes codificando xilosiltransferases e fucosiltransferases tal como transcrição dos genes e/ou translação do polipeptídeo codificado são reduzidas em comparação com uma planta selvagem correspondente ou célula da planta selvagem correspondente, e no desenvolvimeno de variedades de Nicotiana benthamiana que têm atividades reduzidas de xilosiltransferase e de fucosiltransferase. A capacidade de produzir plantas viáveis que têm atividades reduzidas de xilosiltransferase e de fucosiltransferase também pode facilitar a produção de proteínas terapêuticas para administração a seres humanos e animais. A redução dos níveis de glicanos em proteínas produzidas em plantas pode remover algumas das características planta- específicas das proteínas. As proteínas referidas podem ter uma menor incidência de reações imunogênicas ou alérgicas em comparação com proteínas produzidas em plantas que não têm atividade reduzida de xilosiltransferase e de fucosiltransferase. As proteínas referidas também podem ter atividade funcional aprimorada em comparação com proteínas que não têm níveis reduzidos de glicanos.
[0007] Em um aspecto, este documento caracteriza planta de Nicotiana ou célula da planta tendo uma mutação em cada um de uma pluralidade de alelos de XylT e uma mutação em cada um de uma pluralidade de alelos de FucT, em que a planta ou célula da planta não produz níveis detectáveis de beta-1,2-xilosil-açúcares ou alfa-1,3- fucosil-açúcares de núcleo sobre estruturas de N-glicano de glicoproteínas produzidas na planta ou célula da planta. As mutações podem estar em uma ou mais sequências conforme estipulado nas SEQ ID NOS: 1, 2, ou 3. As mutações podem ter sido induzidas por uma ou mais endonucleases de corte raras. A uma ou mais endonucleases de corte raras podem ser endonucleases efetoras semelhantes a ativadores de transcrição (TAL). Cada uma das endonucleases efetoras TAL pode ligar a uma sequência conforme estipulado em qualquer uma das SEQ ID NOS: 45 a 63. A planta ou célula da planta pode incluir um ácido nucleico codificando um polipeptídeo heterólogo. Cada uma das mutações pode ser uma eliminação de mais de um nucleotídeo. Cada um entre a pluralidade de alelos de XylT e a pluralidade de alelos de FucT pode ter uma eliminação de uma sequência de ácidos nucleicos endógena e não inclui qualquer ácido nucleico exógeno. A planta ou célula da planta pode ser uma planta de N. benthamiana ou célula da planta.
[0008] Em outro aspecto, este documento caracteriza um método para a produção de um polipeptídeo. O método pode incluir (a) proporcionar uma planta de Nicotiana ou célula da planta tendo uma mutação em cada um de uma pluralidade de alelos de XylT e uma mutação em cada um de uma pluralidade de alelos de FucT, em que a planta ou célula da planta não produz níveis detectáveis de beta-1,2- xilosil-açúcares ou alfa-1,3-fucosil-açúcares de núcleo sobre estruturas de N-glicano de glicoproteínas produzidas na planta ou célula da planta, e em que a planta ou célula da planta contém um ácido nucleico compreendendo (i) uma sequência de nucleotídeos codificando um polipeptídeo ligada operacionalmente a (ii) um promotor expressível em planta e (iii) uma sequência envolvida em terminação de transcrição e poliadenilação, em que o polipeptídeo é heterólogo à planta; e (b) cultivar a planta ou célula da planta sob condições e por um tempo suficiente de modo a que o polipeptídeo heterólogo seja produzido. O método pode adicionalmente incluir isolar o polipeptídeo heterólogo a partir da planta ou célula da planta. As mutações podem ter sido induzidas por uma ou mais endonucleases de corte raras. A uma ou mais endonucleases de corte raras podem ser endonucleases efetoras TAL. Cada uma das endonucleases efetoras TAL pode ligar a uma sequência conforme estipulado em qualquer uma das SEQ ID NOS: 45 a 63.
[0009] Em outro aspecto, este documento caracteriza um método para produzir uma planta de Nicotiana que tem uma mutação em cada um de uma pluralidade de alelos de XylT e uma mutação em cada um de uma pluralidade de alelos de FucT. O método pode incluir (a) contactar uma população de células de planta de Nicotiana tendo alelos de XylT funcionais e alelos de FucT funcionais com uma ou mais endonucleases de corte raras direcionadas para sequências de XylT endógenas, e uma ou mais endonucleases de corte raras direcionadas para sequências de FucT endógenas, (b) selecionar, entre a população, uma célula na qual uma pluralidade de alelos de XylT e uma pluralidade de alelos de FucT foram inativados, e (c) regenerar a célula da planta selecionada em uma planta de Nicotiana, em que a planta de Nicotiana contém mutações em uma pluralidade de alelos de XylT e mutações em uma pluralidade de alelos de FucT, e não produz níveis detectáveis de beta-1,2-xilosil-açúcares ou alfa-1,3-fucosil-açúcares de núcleo sobre estruturas de N-glicano de glicoproteínas produzidas na planta. As células de planta de Nicotiana podem ser protoplastos. O método pode incluir transformar os protoplastos com um ou mais vetores codificando uma ou mais endonucleases de corte raras. A uma ou mais endonucleases de corte raras podem ser endonucleases efetoras TAL. Cada uma das endonucleases efetoras TAL podem ser direcionadas para uma sequência conforme estipulado em qualquer uma das SEQ ID NOS: 45 a 63. O método pode incluir introduzir nos protoplastos uma proteína endonuclease efetora TAL. O método pode adicionalmente incluir cultivar os protoplastos para gerar linhagens de plantas. O método pode incluir isolar DNA genômico compreendendo no mínimo uma porção de um locus XylT ou no mínimo uma porção de um locus FucT dos protoplastos. As células de planta de Nicotiana podem ser células de planta de N. benthamiana.
[00010] Em ainda outro aspecto, este documento caracteriza um método para gerar uma planta de Nicotiana tendo uma mutação em cada um de uma pluralidade de alelos de XylT e uma mutação em cada um de uma pluralidade de alelos de FucT. O método pode incluir (a) cruzar uma primeira planta de Nicotiana tendo uma mutação em no mínimo um alelo de XylT e uma mutação em no mínimo um alelo de FucT com uma segunda planta de Nicotiana tendo uma mutação em no mínimo um alelo de XylT e uma mutação em no mínimo um alelo de FucT, para obter a progênie; e (b) selecionar entre a progênie uma planta de Nicotiana que tem mutações em uma pluralidade de alelos de XylT e mutações em uma pluralidade de alelos de FucT. As mutações podem ter sido induzidas por uma ou mais endonucleases de corte raras. A uma ou mais endonucleases de corte raras podem ser endonucleases efetoras TAL. Cada uma das endonucleases efetoras TAL pode ligar a uma sequência conforme estipulado em qualquer uma das SEQ ID NOS: 45 a 63. Cada uma das mutações pode ser uma eliminação de mais de um nucleotídeo. A progênie pode ser homozigoto para as mutações em cada um dos alelos.
[00011] Este documento também caracteriza planta de Nicotiana ou célula da planta tendo uma mutação em um ou mais alelos de XylT e uma mutação em um ou mais alelos de FucT, em que os níveis de beta- 1,2-xilosil-açúcares ou alfa-1,3-fucosil-açúcares de núcleo sobre estruturas de N-glicano de glicoproteínas produzidas na planta ou célula da planta são reduzidos em comparação com uma planta ou célula da planta correspondente que não contém as mutações. As mutações podem estar em uma ou mais sequências conforme estipulado nas SEQ ID NOS: 1, 2, ou 3. As mutações podem ter sido induzidas por uma ou mais endonucleases de corte raras. A uma ou mais endonucleases de corte raras podem ser endonucleases efetoras semelhantes a ativadores de transcrição (TAL). Cada uma das endonucleases efetoras TAL pode ligar a uma sequência conforme estipulado em qualquer uma das SEQ ID NOS: 45 a 63. A planta ou célula da planta pode conter um ácido nucleico codificando um polipeptídeo heterólogo (por exemplo, um polipeptídeo recombinante). Cada uma das mutações pode ser uma eliminação de mais de um nucleotídeo. Cada um dos um ou mais alelos de XylT e o um ou mais alelos de FucT podem ter uma eliminação de uma sequência de ácidos nucleicos endógena e não inclui qualquer ácido nucleico exógeno. A planta ou célula da planta pode ser uma planta de N. benthamiana ou célula da planta.
[00012] Em outro aspecto, este documento caracteriza um método para a produção de um polipeptídeo. O método pode incluir (a) proporcionar uma planta de Nicotiana ou célula da planta contendo uma mutação em um ou mais alelos de XylT e uma mutação em um ou mais alelos de FucT, em que os níveis de beta-1,2-xilosil-açúcares ou alfa- 1,3-fucosil-açúcares de núcleo sobre estruturas de N-glicano de glicoproteínas produzidas na planta ou célula da planta são reduzidos em comparação com uma planta ou célula da planta correspondente que não contém as mutações, e em que a planta ou célula da planta compreende um ácido nucleico recombinante que inclui (i) uma sequência de nucleotídeos codificando um polipeptídeo ligada operacionalmente a (ii) um promotor expressível em planta e (iii) uma sequência envolvida em terminação de transcrição e poliadenilação, em que o polipeptídeo é heterólogo à planta; e (b) cultivar a planta ou célula da planta sob condições e por um tempo suficiente de modo a que o polipeptídeo heterólogo seja produzido. O método pode adicionalmente incluir isolar o polipeptídeo heterólogo a partir da planta ou célula da planta. As mutações podem ter sido induzidas por uma ou mais endonucleases de corte raras. A uma ou mais endonucleases de corte raras podem ser endonucleases efetoras TAL. Cada uma das endonucleases efetoras TAL pode ligar a uma sequência conforme estipulado em qualquer uma das SEQ ID NOS: 45 a 63.
[00013] Em ainda outro aspecto, este documento caracteriza um método para produzir uma planta de Nicotiana que tem uma mutação em um ou mais alelos de XylT e uma mutação em um ou mais alelos de FucT. O método pode incluir (a) contactar uma população de células de planta de Nicotiana células da planta tendo alelos de XylT funcionais e alelos de FucT funcionais com uma ou mais endonucleases de corte raras direcionadas para sequências de XylT endógenas, e uma ou mais endonucleases de corte raras direcionadas para sequências de FucT endógenas, (b) selecionar, entre a população, uma célula na qual um ou mais alelos de XylT e um ou mais alelos de FucT foram inativados, e (c) regenerar a célula da planta selecionada em uma planta de Nicotiana, em que a planta de Nicotiana contém mutações em um ou mais alelos de XylT e mutações em um ou mais alelos de FucT, e tem níveis reduzidos de beta-1,2-xilosil-açúcares ou alfa-1,3-fucosil- açúcares de núcleo sobre estruturas de N-glicano de glicoproteínas produzidas na planta, em comparação com uma planta que não contém as mutações. As células da planta de Nicotiana podem ser protoplastos. O método pode incluir transformar os protoplastos com um ou mais vetores codificando uma ou mais endonucleases de corte raras. A uma ou mais endonucleases de corte raras podem ser endonucleases efetoras TAL. Cada uma das endonucleases efetoras TAL podem ser direcionadas para uma sequência conforme estipulado em qualquer uma das SEQ ID NOS: 45 a 63. O método pode incluir introduzir nos protoplastos uma proteína endonuclease efetora TAL. O método pode adicionalmente incluir cultivar os protoplastos para gerar linhagens de plantas. O método pode incluir isolar DNA genômico compreendendo no mínimo uma porção de um locus XylT ou no mínimo uma porção de um locus FucT a partir dos protoplastos. As células de planta de Nicotiana podem ser células de planta de N. benthamiana.
[00014] Em outro aspecto, este documento caracteriza um método para gerar uma planta de Nicotiana tendo uma mutação em um ou mais alelos de XylT e uma mutação em um ou mais alelos de FucT. O método pode incluir (a) cruzar uma primeira planta de Nicotiana contendo uma mutação em no mínimo um alelo de XylT e uma mutação em no mínimo um alelo de FucT com uma segunda planta de Nicotiana contendo uma mutação em no mínimo um alelo de XylT e uma mutação em no mínimo um alelo de FucT, para obter a progênie; e (b) selecionar entre a progênie uma planta de Nicotiana que contém mutações em um ou mais alelos de XylT e mutações em um ou mais alelos de FucT. As mutações podem ter sido induzidas por uma ou mais endonucleases de corte raras. A uma ou mais endonucleases de corte raras podem ser endonucleases efetoras TAL. Cada uma das endonucleases efetoras TAL pode ligar a uma sequência conforme estipulado em qualquer uma das SEQ ID NOS: 45 a 63. Cada uma das mutações pode ser uma eliminação de mais de um nucleotídeo. A progênie pode ser homozigoto para as mutações em cada um dos alelos.
[00015] A menos que definido de modo diverso, todos os termos técnicos e científicos usados aqui, neste pedido de patente, têm o mesmo significado conforme comumente entendido por uma pessoa com conhecimento regular na arte à qual diz respeito esta invenção. Embora métodos e materiais similares ou equivalentes aos descritos aqui, neste pedido de patente, possam ser usados para praticar a invenção, métodos e materiais adequados são descritos abaixo. Todas as publicações, pedidos de patente, patentes, e outras referências mencionados aqui, neste pedido de patente, são incorporados por meio de referência em sua totalidade. Em caso de conflito, o presente relatório descritivo, incluindo definições, controlará. Além disso, os materiais, métodos, e exemplos são somente ilustrativos e não se destinam a ser limitantes.
[00016] Os detalhes de uma ou mais modalidades da invenção são estipulados nos desenhos em anexo e na descrição abaixo. Outras catacterísticas, objetos, e vantagens da invenção serão evidentes a partir da descrição e dos desenhos, e das reivindicações.
DESCRIÇÃO DE DESENHOS
[00017] A figura 1 mostra sítios alvo para endonucleases efetoras TAL de XylT. É mostrada a sequência de DNA para ambos os genes XylT (XylT1 e XylT2) (SEQ ID NO: 1; as sequências de DNA para os dois genes XylT são as mesmas nesta região), iniciando com o códon de partida (ATG). As sequências sublinhadas representam sítios alvo para as endonucleases efetoras TAL que reconhecem os genes XylT.
[00018] A figura 2 mostra sítios alvo para endonucleases efetoras TAL de FucT. São mostradas as sequências de DNA para os dois genes FucT (FucT1, SEQ ID NO: 2; FucT2, SEQ ID NO: 3), iniciando com o códon de partida (ATG). As sequências sublinhadas representam sítios alvo para endonucleases efetoras TAL que reconhecem os genes FucT. As diferenças de sequências entre FucT1 e FucT2 estão indicadas em negrito.
[00019] A figura 3 mostra exemplos de mutações induzidas por endonucleases efetoras TAL em os genes XylT. A linha superior de cada painel mostra a sequência de DNA do sítio de reconhecimento para as endonucleases efetoras TAL XylT_T04 (sublinhada e em letras maiúsculas) ou no gene XylT1 (painel superior) ou XylT2 (painel inferior). As outras sequências mostram mutações típicas que foram induzidas por união de extremidades não homólogas imprecisas (NHEJ), com os tamanhos das eliminações dados à direita.
[00020] A figura 4 mostra exemplos de mutações induzidas por endonucleases efetoras TAL nos genes FucT. A linha superior de cada painel mostra a sequência de DNA do sítio de reconhecimento para as endonucleases efetoras TAL FucT2_T02 (sublinhada e em letras maiúsculas) ou no gene FucT1 (painel superior) ou FucT2 (painel inferior). As outras sequências mostram mutações típicas que foram induzidas por NHEJ imprecisas, com os tamanhos das eliminações dados à direita.
[00021] A figura 5 mostra perfis de mutações FucT1 e FucT2 nas linhagens de plantas NB13-105a e NB13-213a. Para cada alinhamento, as sequências superiores são de N. benthamiana selvagem, e as sequências menores são de plantas mutantes NB13-105a ou NB13- 213a. O sítio de reconhecimento para a endonuclease efetora TAL FucT2_T02 está sublinhado em cada alinhamento.
[00022] A figura 6 mostra perfis de mutações XylT1 e XylT2 nas linhagens de plantas NB15-11d e NB12-113c. Para cada alinhamento, as sequências superiores são de N. benthamiana selvagem, e as sequências menores são de plantas mutantes NB15-11d ou NB12-113c. O sítio de reconhecimento para a endonuclease efetora TAL XylT_T04 está sublinhado em cada alinhamento.
[00023] A figura 7 mostra perfis de mutações FucT1 e FucT2 na linhagem de planta NB14-29a. Para cada alinhamento, as sequências superiores são de N. benthamiana selvagem, e as sequências menores são de NB14-29a. O sítio de reconhecimento para a endonuclease efetora TAL FucT2_T02 está sublinhado em cada alinhamento.
[00024] A figura 8 mostra perfis de mutações XylT1 e XylT2 na linhagem de planta NB14-29a. Para cada alinhamento, as sequências superiores são de N. benthamiana selvagem, e as sequências menores são de NB14-29a. O sítio de reconhecimento para a endonuclease efetora TAL XylT_T04 está sublinhado em cada alinhamento.
[00025] A figura 9 compara as intensidades relatives de N-glicanos com fucose em NB13-105a, NB13-213a e N. benthamiana selvagem. Os dados de N-glicano foram gerados a partir de proteínas endógenas de N. benthamiana através de MALDI TOF MS (Espectrometria de massa por tempo de voo com dessorção/ionização de matriz assistida por laser).
[00026] A figura 10 compara as intensidades relatives de N-glicanos com xilose em NB12-113c, NB15-11d e N. benthamiana selvagem. Os dados de N-glicano foram gerados a partir de proteínas endógenas de N. benthamiana através de MALDI TOF MS.
[00027] A figura 11 compara as intensidades relatives de N-glicanos com fucose e xilose em NB14-29a e N. benthamiana selvagem. Os dados de N-glicano foram gerados a partir de proteínas endógenas de N. benthamiana através de MALDI TOF MS.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[00028] Este documento proporciona plantas do gênero Nicotiana que carecem de atividade de xilosiltransferase e de fucosiltransferase, bem como métodos para gerar as referidas plantas, e métodos para usar as referidas plantas para a produção de polipeptídeos adequados para administração a seres humanos e animais. Membros do gênero Nicotiana incluem, por exemplo, as espécies benthamiana, tabacum, sylvestris, acaulis, acuminate, africana, alata, ameghinoi, amplexicaulis, arentsii, attenuate, azambujae, benavidesii, bonariensis, burbidgeae, cavicola, clevelandii, cordifolia, corymbosa, cutleri, debneyi, excelsior, exigua, forgetiana, fragrans, glauca, glutinosa, goodspeedii, gossei, hesperis, heterantha, ingulba, kawakamii, knightiana, langsdorffii, linearis, longibracteata, longiflora, maritime, megalosiphon, miersii, mutabilis, nesophila, noctiflora, nudicaulis, occidentalis, obtusifolia, otophora, paa, palmeri, paniculata, pauciflora, petuniodes, plumbaginifolia, quadrivalvis, raimondii, repanda, rosulata, rotundifolia, rustica, setchellii, simulans, solanifolia, spegazzinii, stenocarpa, stocktonii, suaveolens, thrysiflora, tomentosa, tomentosiformis, truncata, umbratica, undulate, velutina, wigandioides, e wuttkei.
[00029] Em N. benthamiana, existem no mínimo dois membros (XylT1 e XylT2) na família de genes xilosiltransferase (XylT) e no mínimo dois membros (FucT1 e FucT2) na família de genes fucosiltransferase (FucT). Exemplos típicos de sequências de nucleotídeos XylT e FucT de Nicotiana que ocorrem naturalmente são mostrados na Tabela 4. As plantas de Nicotiana, células, partes das plantas, sementes, e progênie das mesmas proporcionadas aqui, neste pedido de patente, podem ter uma mutação em cada um de uma pluralidade dos alelos endógenos XylT e FucT, de tal modo que a expressão de cada gene é reduzida ou completamente inibida. As plantas, células, partes, semente, e progênie não apresentam níveis detectáveis de beta-1,2-xilosil-açúcares ou alfa- 1,3-fucosil-açúcares de núcleo sobre estruturas de N-glicano de glicoproteínas produzidas nos mesmos.
[00030] Em algumas modalidades, as plantas de Nicotiana, células, partes das plantas, sementes, e progênie das mesmas proporcionadas aqui, neste pedido de patente, podem ter uma mutação em um ou mais alelos endógenos XylT e um ou mais alelos endógenos FucT, de tal modo que a expressão de cada gene é reduzida (por exemplo, parcialmente ou completamente reduzida). O nível de expressão reduzido pode ser suficiente para produzir plantas, células, partes, sementes, e progênie que apresentam níveis reduzidos de beta-1,2- xilosil-açúcares ou alfa-1,3-fucosil-açúcares de núcleo sobre estruturas de N-glicano de glicoproteínas produzidas nas mesmas, em comparação com os níveis de beta-1,2-xilosil-açúcares ou alfa-1,3- fucosil-açúcares de núcleo sobre estruturas de N-glicano de glicoproteínas produzidas em plantas de controle correspondentes, células, partes, sementes, e progênie de controle correspondentes que não incluem as mutações XylT e FucT.
[00031] As plantas, células da planta, partes da planta, sementes, e progênie das plantas proporcionadas aqui, neste pedido de patente, podem ser geradas usando uma endonuclease de corte rara, tal como um sistema de endonuclease efetora TAL, para fazer nocautes direcionados nos genes XylT e FucT. Portanto, esta descrição proporciona materiais e métodos para usar endonucleases efetoras TAL para gerar plantas e produtos relacionados (por exemplo, sementes e partes da planta) que são particularmente adequados para produção de proteínas terapêuticas humanas e de animais devido a nocautes direcionados em todos os alelos dos genes XylT e FucT. Outras nucleases específicas de sequências de corte raras, a serem usadas para gerar o material das plantas desejadas, incluindo endonucleases de homing manipuladas ou nucleases de dedo de zinco.
[00032] "Plantas" e "partes da planta" se referem a células, tecidos, órgãos, sementes, e partes cortadas (por exemplo, raízes, folhas, e flores) que conservam as características de diferenciação da planta de origem (parental). "Semente" se refere a qualquer estrutura da planta que é formada por diferenciação continuada do óvulo da planta, depois de seu ponto de maturação normal na abertura da flor, independente de se é formada na presença ou na ausência de fertilização e independente de se ou não a estrutura da semente é fértil ou infértil.
[00033] O termo "alelo(s)" significa qualquer uma de uma ou mais formas alternativas de um gene em um lócus particular. Em uma célula diploide (ou anfidiploide) de um organismo, alelos de um determinado gene são localizados em uma localização específica ou lócus sobre um cromossoma. Um alelo está presente sobre cada cromossoma do par de cromossomas homólogos. Alelos "heterozigotos" são dois alelos diferentes situados em um lócus específico, posicionados individualmente sobre pares correspondentes de cromossomas homólogos. Alelos "homozigotos" são dois alelos idênticos situados em um lócus específico, posicionados individualmente sobre pares correspondentes de cromossomas homólogos na célula.
[00034] "Tipo selvagem" conforme usado aqui, neste pedido de patente, se refere a uma forma típica de uma planta ou de um gene conforme ocorre o mais comumente na natureza. Um "alelo de XylT selvagem" é um alelo de XylT que ocorre naturalmente (por exemplo, conforme é encontrado dentro de plantas de Nicotiana que ocorrem naturalmente) que codifica uma proteína XylT funcional, ao passo que um "alelo de XylT mutante" é um alelo de XylT que não codifica uma proteína XylT funcional. Um "alelo de XylT mutante" semelhante pode incluir uma ou mais mutações em sua sequência de ácido nucleico, onde a uma ou mais mutações resultam em nenhuma quantidade detectável de proteína XylT funcional na planta ou célula da planta in vivo. De modo similar, um "alelo de FucT selvagem" é um alelo de FucT que ocorre naturalmente que codifica uma proteína FucT funcional, ao passo que um "alelo de FucT mutante" é um alelo de FucT que não codifica uma proteína FucT funcional. Um "alelo de FucT mutante" semelhante pode incluir uma ou mais mutações em sua sequência de ácido nucleico, onde a uma ou mais mutações resultam em nenhuma quantidade detectável de proteína FucT funcional na planta ou célula da planta in vivo.
[00035] O termo "endonucleases de corte raras" aqui, neste pedido de patente, se referem a proteínas naturais ou manipuladas tendo atividade de endonuclease direcionada para sequências de ácido nucleico tendo uma sequência de reconhecimento (sequência alvo) de cerca de 12 a 40 bp de comprimento (por exemplo, 14 a 40 bp de comprimento). Endonucleases de corte raras típicas provocam clivagem dentro de seu sítio de reconhecimento, deixando corte escalonado de 4 nt com ressaltos de 3‘OH ou 5’OH. Estas endonucleases de corte raras podem ser meganucleases, tais como proteínas selvagens ou variantes de endonucleases de homing, mais particularmente pertencentes à família de dodecapeptídeos (LAGLIDADG (SEQ ID NO: 79); vide a patente internacional No. WO 2004/067736) ou podem resultar de proteínas de fusão que associam um domínio de ligação de DNA e um domínio catalítico com atividade de clivagem. Endonucleases efetoras TAL e nucleases de dedo de zinco (ZFN) são exemplos de fusões de domínios de ligação de DNA com o domínio catalítico da endonuclease FokI. Endonucleases efetoras TAL customizadas estão disponíveis comercialmente sob o nome comercial TALENTM (Cellectis, Paris, França). Para uma revisão de endonucleases de corte raras, vide Baker, Nature Métodos 9:23-26, 2012.
[00036] "Mutagênese" conforme usado aqui, neste pedido de patente, se refere a processos nos quais são introduzidas mutações em uma sequência de DNA selecionada. Nos métodos descritos aqui, neste pedido de patente, por exemplo, ocorre mutagênese através de algumas quebras de DNA de filamento duplo feitas por endonucleases efetoras TAL direcionadas para sequências de DNA selecionadas em uma célula de planta. A mutagênese referida resulta em "mutações induzidas por endonucleases efetoras TAL" e expressão reduzida do gene alvo. Depois da mutagênese, as plantas podem ser regeneradas a partir das células tratadas usando técnicas conhecidas (por exemplo, plantando sementes de acordo com procedimentos de cultura convencionais, seguidos por autopolinização).
[00037] Em alguns casos, um ácido nucleico pode ter uma sequência de nucleotídeos com no mínimo cerca de 75 por cento de identidade de sequência com uma sequência de nucleotídeos XylT ou FucT típica. Por exemplo, uma sequência de nucleotídeos pode ter no mínimo 75, no mínimo 80, no mínimo 85, no mínimo 90, no mínimo 91, no mínimo 92, no mínimo 93, no mínimo 94, no mínimo 95, no mínimo 96, no mínimo 97, no mínimo 98, ou no mínimo 99 por cento de identidade de sequência com uma sequência de nucleotídeos XylT ou FucT tíica que ocorre naturalmente.
[00038] A percentagem de identidade de sequência entre uma sequência de ácido nucleico ou de aminoácido em particular e uma sequência referida por um número de identificação de sequência em particular é determinada como se segue. Primeiro, uma sequência de ácido nucleico ou de aminoácido é comparada com a sequência estipulada em um número de identificação de sequência em particular usando o programa BLAST 2 Sequences (Bl2seq) da versão independente de BLASTZ contendo o BLASTN versão 2.0.14 e o BLASTP versão 2.0.14. Esta versão independente de BLASTZ pode ser obtida online em fr.com/blast ou em ncbi.nlm.nih.gov. Instruções explicando como usar o programa Bl2seq podem ser encontradas no arquivo readme que acompanha BLASTZ. Bl2seq realiza uma comparação entre duas sequências usando ou o algoritmo BLASTN ou BLASTP. BLASTN é usado para comparar sequências de ácido nucleico, ao passo que BLASTP é usado para comparar sequências de aminoácido. De modo a comparar duas sequências de ácido nucleico, as opções são como se segue: -i é definido como um arquivo contendo a primeira sequência de ácido nucleico a ser comparada (por exemplo, C:\seq1.txt); -j é definido como um arquivo contendo a segunda sequência de ácido nucleico a ser comparada (por exemplo, C:\seq2.txt); -p é definido como blastn; -o é definido como qualquer nome de arquivo desejado (por exemplo, C:\output.txt); -q é definido como -1; -r é definido como 2; e todas as outras opções são deixadas em sua configuração padrão. Por exemplo, o comando que se segue pode ser usado para gerar um arquivo de saída contendo uma comparação entre duas sequências: C:\Bl2seq -i c:\seq1.txt -j c:\seq2.txt -p blastn -o c:\output.txt -q -1 -r 2. De modo a comparar duas sequências de aminoácido, as opções de Bl2seq são definidas como se segue: -i é definido como um arquivo contendo a primeira sequência de aminoácido a ser comparada (por exemplo, C:\seq1.txt); -j é definido como um arquivo contendo a segunda sequência de aminoácido a ser comparada (por exemplo, C:\seq2.txt); -p é definido como blastp; -o é definido como qualquer nome de arquivo desejado (por exemplo, C:\output.txt); e todas as outras opções são deixadas em sua configuração padrão. Por exemplo, o comando que se segue pode ser usado para gerar um arquivo de saída contendo uma comparação entre duas sequências de aminoácido: C:\Bl2seq -i c:\seq1.txt -j c:\seq2.txt -p blastp -o c:\output.txt. Se as duas sequências comparadas compartilharem homologia, então o arquivo de saída designado vai apresentar estas regiões de homologia como sequências alinhadas. Se as duas sequências comparadas não compartilharem homologia, então o arquivo de saída designado não vai apresentar sequências alinhadas.
[00039] Uma vez alinhadas, o número de correspondências é determinado contando o número de posições onde um resíduo aminoácido ou nucleotídeo idêntico está presente em ambas as sequências. A percentagem de identidade de sequência é determinada dividindo o número de correspondências ou pelo comprimento da sequência definida na sequência identificada (por exemplo, SEQ ID NO: 1), ou por um comprimento articulado (por exemplo, 100 resíduos aminoácido ou nucleotídeos consecutivos de uma sequência definida em uma sequência identificada), seguido por multiplicação do valor resultante por 100. Por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que tem 80 correspondências quando alinhada com a sequência definida na SEQ ID NO: 1 é 88,9 por cento idêntica à sequência definida na SEQ ID NO: 1 (isto é, 80 + 90 x 100 = 88,9). Deve ser observado que o valor da percentagem de identidade de sequência é arredondado até o décimo mais próximo. Por exemplo, 75,11, 75,12, 75,13, e 75,14 é arredondado para baixo até 75,1, ao passo que 75,15, 75,16, 75,17, 75,18, e 75,19 é arredondado para cima até 75,2. Também deve ser observado que o valor do comprimento será sempre um inteiro.
[00040] Métodos para selecionar sequências alvo endógenas e gerar endonucleases efetoras TAL direcionadas para as referidas sequências podem ser realizados conforme descrito em outras partes. Vide, por exemplo, a Publicação de Patente Internacional PCT No. WO 2011/072246, a qual é incorporada aqui, neste pedido de patente, por meio de referência em sua totalidade. Efetoras TAL são encontradas em bactérias patogênicas de plantas no gênero Xanthomonas. Estas proteínas desempenham funções importantes em doença, ou acionam defesa, por ligação de DNA do hospedeiro e ativação de genes do hospedeiro efetor-específicos (vide, por exemplo, Gu et al., Nature 435:1122-1125, 2005; Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:10503-10508, 2006; Kay et al. Science 318:648-651, 2007; Sugio et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104:10720-10725, 2007; e Romer et al. Science 318:645-648, 2007). A especificidade depende de um número efetor-variável de imperfeitos, tipicamente 34 repetições de aminoácidos (Schornack et al., J. Plant Physiol. 163:256-272, 2006; e patente internacional No. WO 2011/072246). Polimorfismos estão presentes essencialmente nas posições de repetições 12 e 13, as quais são referidas aqui, neste pedido de patente, como o di-resíduo de repetição variável (RVD).
[00041] Os RVDs de efetores TAL correspondem aos nucleotídeos em seus sítios alvo em um modo direto e linear, um RVD para um nucleotídeo, com alguma degeneração e sem dependência do contexto aparente. Este mecanismo para reconhecimento de proteína-DNA possibilita previsão de sítios alvo para novos efetores TAL alvo específicos, bem como seleção de sítios alvo e manipulação de novos efetores TAL com especificidade de ligação para os sítios selecionados.
[00042] Domínios de ligação de DNA efetores TAL podem ser fundidos a outras sequências, tais como sequências de endonucleases, resultando em endonucleases quiméricas direcionadas para sequências de DNA selecionadas específicas, e levando a corte subsequente do DNA na ou próximo às sequências alvo. Os cortes referidos (isto é, quebras de filamento duplo) em DNA podem induzir mutações na sequência de DNA selvagem através de recombinação homóloga ou NHEJ, por exemplo. Em alguns casos, endonucleases efetoras TAL podem ser usadas para facilitar mutagênese sítio direcionada em genomas complexos, inativando (knocking out) ou alterando de modo diverso a função genética com grande precisão e alta eficiência. Conforme descrito nos Exemplos abaixo, endonucleases efetoras TAL direcionadas para cada um dos alelos de XylT e FucT de N. benthamiana podem ser usadas para mutagenizar os genes endógenos, resultando em plantas sem expressão detectável destes genes. O fato de que algumas endonucleases (por exemplo, FokI) funcionam como dímeros podem ser usadas para reforçar a especificidade alvo da endonuclease efetora TAL. Por exemplo, em alguns casos um par de monômeros de endonucleases efetoras TAL direcionadas para diferentes sequências de DNA (por exemplo, as sequências alvo sublinhadas mostradas nas figuras 1 e 2) podem ser usados. Quando os dois sítios de reconhecimento de endonucleases efetoras TAL estão em íntima proximidade, conforme representado nas figuras 1 e 2, os monômeros inativos podem se unir para criar uma enzima funcional que cliva o DNA. Ao exigir ligação de DNA para ativar a nuclease, pode ser criada uma enzima de restrição altamente sítio- específica.
[00043] O termo "expressão" conforme usado aqui, neste pedido de patente, se refere à transcrição de uma sequência de ácido nucleico em particular para produzir mRNA senso ou antissenso, e/ou a translação de uma molécula de mRNA senso para produzir um polipeptídeo (por exemplo, uma proteína terapêutica), com ou sem eventos pós- translacionais subsequentes.
[00044] "Redução da expressão" de um gene ou polipeptídeo em uma planta ou uma célula de planta inclui inibição, interrupção, inativação (knocking-out), ou supressão (knocking-down) do gene ou polipeptídeo, de tal modo que transcrição do gene e/ou translação do polipeptídeo codificado são reduzidas em comparação com uma planta selvagem correspondente ou célula da planta. Os níveis de expressão podem ser medidos usando métodos tais como, por exemplo, reação de cadeia polimerase-transcrição reversa (RT-PCR), Northern blotting, hibridização de dot-blot, hibridização in situ, run-on nuclear e/ou run-off nuclear, proteção de RNase, ou métodos imunológicos e enzimáticos tais como ELISA, radioimunoensaio, e Western blotting.
[00045] Métodos para usar endonucleases efetoras TAL para gerar plantas, células da planta, ou partes da planta tendo mutações em genes endógenos incluem, por exemplo, os descritos nos Exemplos aqui, neste pedido de patente. Por exemplo, ácidos nucleicos codificando endonucleases efetoras TAL direcionadas para sequências XylT ou FucT selecionadas (por exemplo, as sequências XylT mostradas na figura 1 ou as sequências FucT mostradas na figura 2) podem ser transformados centro de células da planta (por exemplo, protoplastos), onde podem ser expressados. As células em seguida podem ser analisadas para determinar se mutações foram introduzidas no um ou mais sítios alvos, através de testes à base de ácido nucleico ou testes à base de proteína para detectar níveis de expressão conforme descrito acima, por exemplo, ou usando testes à base de ácido nucleico (por exemplo, PCR e sequenciamento de DNA, ou PCR seguido por um teste T7E1; Mussolino et al., Nucleic Acids Res. 39:9283-9293, 2011) para detectar mutações nos loci genômicos.
[00046] A população mutagenizada, ou uma geração subsequente daquela população, pode ser triada para um ou mais traços desejados (por exemplo, uma falta de atividades de xilosiltransferase e de fucosiltransferase, ou atividades reduzidas de xilosiltransferase e de fucosiltransferase) resultante das mutações. Alternativamente, a população mutagenizada, ou uma geração subsequente daquela população, podem se triada para uma mutação em um gene XylT ou FucT. Por exemplo, a geração M2 da progênie de plantas M1 pode ser avaliada para a presença de uma mutação em um gene XylT ou FucT. Uma "população" é qualquer grupo de indivíduos que partilham um conjunto genético comum. Conforme usado aqui, neste pedido de patente, "M0" se refere a células da planta (e plantas cultivadas a partir da mesma) expostas a uma nuclease efetora TAL, enquanto que "M1" se refere a sementes produzidas por plantas M0 autopolinizadas, e plantas cultivadas a partir de semelhantes sementes. "M2" é a progênie (sementes e plantas) de plantas M1 autopolinizadas, "M3" é a progênie de plantas M2 autopolinizadas, e "M4" é a progênie de plantas M3 autopolinizadas. "M5" é a progênie de plantas M4 autopolinizadas. "M6", "M7", etc. são cada uma a progênie de plantas autopolinizadas da geração anterior. O termo "autofecundadas (selfed)" conforme usado aqui, neste pedido de patente, significa autopolinizadas.
[00047] Uma ou mais plantas de tabaco M1 podem ser obtidas a partir de células da planta individuais mutagenizadas (M0) (e plantas cultivadas a partir das mesmas), e no mínimo uma das plantas podem ser identificadas como contendo uma mutação em um gene XylT ou FucT. Uma planta de tabaco M1 pode ser heterozigota para um alelo mutante em um locus XylT e/ou um locus FucT e, devido à presença do alelo selvagem, apresentar atividade de xilosil- ou fucosiltransferase. Alternativamente, uma planta de tabaco M1 pode ter um alelo mutante em um locus XylT ou FucT e apresentar o fenótipo de falta de atividade de xilosil- ou fucosiltransferase. As plantas referidas podem ser heterozigotas e carecer de atividade de xilosil- ou fucosiltransferase devido a fenômenos tais como uma supressão negativa dominante, apesar da presença do alelo selvagem, ou podem ser homozigotas devido a mutações induzidas de modo independente em ambos os alelos no locus XylT ou FucT.
[00048] Uma planta de tabaco carregando alelos de XylT e FucT mutantes pode ser usada em um programa de melhoramento de plantas para criar linhagens, variedades e híbridos novos e úteis. Deste modo, em algumas modalidades, uma planta de tabaco M1, M2, M3, ou de geração posterior contendo no mínimo uma mutação em um gene XylT e no mínimo uma mutação em um gene FucT é cruzada com uma segunda planta de Nicotiana, e são identificadas as progênies do cruzamento nas quais estão presentes mutações dos genes XylT e FucT. Será reconhecido que a segunda planta de Nicotiana pode ser uma das espécies e variedades descritas aqui, neste pedido de patente. Também será reconhecido que a segunda planta de Nicotiana pode conter as mesmas mutações XylT e FucT que a planta à qual é cruzada, diferentes mutações XylT e FucT, ou ser selvagem nos loci XylT e/ou FucT.
[00049] O melhoramento pode ser realizado através de procedimentos conehcidos. Impressão digital de DNA, SNP ou tecnologias similares podem ser usadas em um programa de melhoramento por seleção assistida por marcador (MAS) para transferir ou reproduzir alelos de XylT e FucT mutantes para outros tabacos. Por exemplo, um melhorista pode criar populações segregantes a partir de hibridizações de um genótipo contendo um alelo mutante com um genótipo agronomicamente desejávels. Plantas nas gerações F2 ou de retro cruzamento podem ser triadas usando marcadores desenvolvidos a partir de algumas sequências XylT e FucT ou fragmentos das mesmas. Plantas identificadas como possuindo o alelo mutante podem ser retrocruzadas ou autopolinizadas para criar uma segunda população a ser triada. Dependendo do padrão de herança esperado ou da tecnologia MAS usada, pode ser necessário autopolinizar as plantas selecionadas antes de cada ciclo de retrocruzamento de modo a ajudar na identificação das plantas individuais desejadas. Retrocruzamento ou outro procedimento de melhoramento pode ser repetido até ser recuperado o fenótipo desejado do parental recorrente.
[00050] Cruzamentos com sucesso produzem plantas F1 que são férteis e que podem ser retrocruzadas com um dos parentais caso desejado. Em algumas modalidades, uma população de plantas na geração F2 é triada paa expressão de genes XylT e FucT, por exemplo, é identificada uma planta que não consegue expressar XylT e FucT devido à ausência de alguns genes XylT e FucT de acordo com métodos de rotina, por exemplo, usando um método de PCR com iniciadores com base nas informações de sequências de nucleotídeos para XylT e FucT descritas aqui, neste pedido de patente. Plantas selecionadas são em seguida cruzadas com um dos parentais e as plantas da primeira geração de retrocruzamento (BC1) são autopolinizadas para produzir uma população BC1F2 que é novamente triada para expressão de genes XylT e FucT variantes (por exemplo, versões nulas dos genes XylT e FucT). O processo de retrocruzamento, autopolinização, e triagem é repetido, por exemplo, no mínimo 4 vezes até a triagem final produzir uma planta que é fértil e razoavelmente similar à planta de origem (parental) recorrente. Esta planta, caso desejado, pode ser autopolinizada, e a progênie em seguida pode ser triada de novo para confirmar que a planta carece de expressão dos genes XylT e FucT. Análises citogenéticas das plantas selecionadas opcionalmente podem ser realizadas para confirmar as relações de pareamento de cromossoma e complemento de cromossoma. Sementes de melhorista da planta selecionada podem ser produzidas usando métodos de rotina incluindo, por exemplo, teste de campo, confirmação da condição nula para XylT e FucT, e/ou análises de folha curada para determinar o nível de atividade de xilosiltransferase e de fucosiltransferase.
[00051] Em situações onde o híbrido F1 original resultante do cruzamento entre um primeiro parental de tabaco mutante e um segundo parental de tabaco selvagem, é hibridizado ou retrocruzado com o parental de tabaco mutante, a progênie do retrocruzamento pode ser autopolinizada para criar uma geração BC1F2 que é triada para os alelos mutantes XylT e FucT.
[00052] O resultado de um programa de melhoramento de plantas usando as plantas de tabaco mutantes descritas aqui, neste pedido de patente, pode ser linhagens, híbridos e variedades novos e úteis. Conforme usado aqui, neste pedido de patente, o termo "variedade" se refere a uma população de plantas que partilham características constantes as quais as separam de outras plantas da mesma espécie. Uma variedade é frequentemente, embora não sempre, vendida comercialmente. Embora possuindo um ou mais traços distintivos, uma variedade pode ser adicionalmente caracterizada por uma variação total muito pequena entre indivíduos dentro daquela variedade. Uma variedade de "linhagem pura" pode ser criada por várias gerações de autopolinização e seleção, ou por propagação vegetativa de um único parental usando técnicas de cultura de tecido ou células. Uma variedade pode ser essencialmente derivada a partir de outra linhagem ou variedade. Conforme definido pela International Convention for the Protection of New Varieties of Plants (N.T.: Convenção Internacional para a Proteção de Novas Variedades de Plantas) (2 de dezembro de 1961, conforme revisto em Genebra em 10 de novembro de 1972, em 23 de outubro de 1978, e em 19 de março de 1991), uma variedade é "essencialmente derivada" a partir de uma variedade inicial se: a) for predominantemente derivada a partir da variedade inicial, ou a partir de uma variedade que é predominantemente derivada a partir da variedade inicial, enquanto conservando a expressão das características essenciais que resultam do genótipo ou da combinação de genótipos da variedade inicial; b) for claramente distinguível da variedade inicial; e c) com exceção das diferenças as quais resultam da ação de derivação, está em conformidade com a variedade inicial na expressão das características essenciais que resultam do genótipo ou da combinação de genótipos da variedade inicial. Variedades essencialmente derivadas podem ser obtidas, por exemplo, por meio da seleção de um mutante natural or induzido, uma variante somaclonal, um indivíduo variante de plantas da variedade inicial, retrocruzamento, ou transformação. Uma "linhagem" conforme distinguida de uma variedade o mais frequentemente denota um grupo de plantas usadas não comercialmente, por exemplo em pesquisa de plantas. Uma linhagem tipicamente apresenta pouca variaçãõ global entre indivíduos para um ou mais traços de interesse, embora possa haver alguma variação entre indivíduos para outros traços.
[00053] Variedades de tabacos híbridos podem ser produzidas evitando autopolinização de plantas parentais femininas (isto é, parentais de sementes) de uma primeira variedade, permitindo que o pólen de plantas parentais masculinas de uma segunda variedade fertilize as plantas parentais femininas, e permitindo que sementes de híbridos F1 formem sobre as plantas femininas. A autopolinização de plantas femininas pode ser prevenida emasculando as flores em um estágio inicial do desenvolvimento das flores. Alternativamente, a formação de pólen pode ser prevenida sobre as plantas parentais femininas usando uma forma de esterilidade masculina. Por exemplo, esterilidade masculina pode ser produzida por esterilidade masculina citoplasmática (CMS), ou esterilidade masculina transgênica em que um transgene inibe microsporogênese e/ou formação de pólen, ou auto- incompatibilidade. Plantas parentais femininas contendo CMS são particularmente úteis. Em modalidades nas quais as plantas parentais femininas são CMS, é colhido pólen de plantas férteis masculinas e aplicado manualmente aos estigmas de plantas parentais femininas CMS, e as sementes F1 resultantes são colhidas.
[00054] Variedades e linhagens descritas aqui, neste pedido de patente, podem ser usadas para formar híbridos F1 de tabaco de cruzamento único. Em semelhantes modalidades, as plantas das variedades parentais podem ser cultivadas como populações adjacentes substancialmente homogêneas de modo a facilitar polinização cruzada natural das plantas parentais masculinas com as plantas parentais femininas. A semente F1 formada sobre as plantas parentais femininas é seletivamente colhida por meios convencionais. Também é possível cultivar as duas variedades de plantas parentais em grandes quantidades e colher uma mistura de sementes de híbridos F1 formadas sobre o parental feminino e sementes formadas sobre o parental masculino em consequência da autopolinização. Alternativamente, podem ser realizados cruzamentos de três vias em que um híbrido F1 de cruzamento único é usado como um um parental feminino e é cruzado com um parental masculino diferente. Como outra alternativa, podem ser criados híbridos de duplo cruzamento em que as progênies F1 de dois diferentes cruzamentos únicos são as mesmas cruzadas. Auto-incompatibilidade pode ser usada para beneficiamento em particular de modo a prevenir autopolinização de parentais femininos ao formar um híbrido de duplo cruzamento.
[00055] Esta descrição também proporciona métodos para a produção de polipeptídeos (por exemplo, terapêutico glicoproteínas). Em alguns casos, as plantas, células, partes da planta, sementes, e progênie proporcionadas aqui, neste pedido de patente, podem conter uma molécula de ácido nucleico codificando um polipeptídeo heterólogo (por exemplo, um polipeptídeo recombinante). Em alguns casos, os métodos proporcionados aqui, neste pedido de patente, podem incluir proporcionar uma planta de Nicotiana, célula da planta, ou parte da planta tendo uma mutação induzida por endonuclease efetora TAL em cada um de uma pluralidade dos alelos endógenos XylT e FucT (por exemplo, em dois ou mais dos alelos endógenos XylT e em dois ou mais dos alelos endógenos FucT), onde a planta, célula da planta, ou parte da planta adicionalmente contém um ácido nucleico codificando um polipeptídeo heterólogo (por exemplo, um polipeptídeo recombinante). Em alguns casos, os métodos proporcionados aqui, neste pedido de patente, podem incluir proporcionar uma planta de Nicotiana, célula da planta, ou parte da planta tendo uma mutação induzida por endonuclease efetora TAL em um ou mais dos alelos endógenos XylT e FucT (por exemplo, em um ou mais dos alelos endógenos XylT e em um ou mais dos alelos endógenos FucT), onde a planta, célula da planta, ou parte da planta adicionalmente contém um ácido nucleico codificando um polipeptídeo heterólogo (por exemplo, um polipeptídeo recombinante). A sequência codificante para o polipeptídeo heterólogo pode ser ligada operacionalmente a um promotor expressível em planta, e também a uma sequência envolvida em terminação de transcrição e poliadenilação. Em alguns casos, o métodos também pode incluir manter a planta ou célula da planta sob condições (por exemplo, temperatura, umidade, luz / escuridão, fluxo de ar, e condições nutricionais adequados, em uma estufa e/ou em condições aquosas) e por um tempo (por exemplo, 6 a 12 horas, 12 a 24 horas, 24 a 48 horas, 48 horas a 7 dias, 7 dias a 30 dias, ou mais de 30 dias) suficiente para o polipeptídeo ser produzidos. Em alguns casos, os métodos para a produção de um polipeptídeo podem adicionalmente incluir isolar o polipeptídeo expressado a partir da planta ou célula da planta. Técnicas para isolar os referidos polipeptídeos podem incluir, por exemplo, técnicas convencionais tais como extração, precipitação, cromatografia, cromatografia por afinidade, e eletroforese.
[00056] Um "promotor expressível em planta" é uma sequência de DNA que é capaz de controlar a (iniciação) transcrição em uma célula de planta. Isto inclui qualquer promotor de origem vegetal, bem como qualquer promotor de origem não vegetal que é capaz de direcionar a transcrição em uma célula de planta [por exemplo, promotores de origem viral ou bacteriana tais como o promotor CaMV35S, promotores de genes de T-DNA, promotores específicos teciduais ou promotores específicos de órgãos tais como promotores específicos de semente, promotores específicos de órgãos (por exemplo, promotores específicos de caule, de folha, de raiz, ou de mesófilo)].
[00057] Em alguns casos, uma planta de Nicotiana, célula da planta, parte da planta, semente, ou progênie proporcionada aqui, neste pedido de patente, pode conter um ácido nucleico codificando um polipeptídeo heterólogo. Um "polipeptídeo heterólogo" é um polipeptídeo que não ocorre naturalmente na planta ou células da planta. Isto está em contraste com polipeptídeos homólogos, os quais são polipeptídeos expressados naturalmente pela planta ou células da planta. Polipeptídeos heterólogos e homólogos que sofrem N-glicosilação pós- translacional são referidos aqui, neste pedido de patente, como glicoproteínas heterólogas ou homólogas, respectivamente.
[00058] Exemplos de polipeptídeos heterólogos que podem ser produzidos usando as plantas e métodos descritos aqui, neste pedido de patente, para administração a seres humanos ou animais incluem, sem limitação, citocinas, receptores de citocinas, fatores de crescimento, receptores de fatores de crescimento, hormônios de crescimento, insulina, pró-insulina, eritropoietina, fatores estimulantes de colônias, interleucinas, interferons, fator de necrose tumoral, receptor do fator de necrose tumoral, trombopoietina, trombina, peptídeos natriuréticos, fatores de coagulação, fatores anticoagulantes, ativador do plasminogênio tecidual, uroquinase, hormônio folículo estimulante, hormônio luteinizante, calcitonina, proteínas CD, proteínas CTLA, proteínas receptoras de células T e de células B, proteínas morfogênicas ósseas, fatores neurotróficos, fator reumatoide, RANTES, albumina, relaxina, proteína inibidora de macrófagos, proteínas ou antígenos virais, proteínas de membrana superficiais, enzimas, proteínas reguladoras, proteínas imunomoduladoras, receptores de homing, proteínas de transporte, superóxido dismutase, proteínas receptoras acopladas à proteína G, proteínas neuromoduladoras, antígenos (por exemplo, antígenos bacterianos ou virais), e anticorpos ou fragmentos dos mesmos. Em alguns casos, os polipeptídeos produzidos por plantas podem ser usados como vacinas.
[00059] "Anticorpos" incluem anticorpos das classes IgD, IgG, IgA, IgM, IgE, bem como anticorpos recombinantes tais como anticorpos de cadeia única, anticorpos quiméricos e humanizados, e anticorpos multiespecíficos. O termo "anticorpo" também se refere a fragmentos e derivados de todos os precedentes, e podem incluir adicionalmente quaisquer variantes modificadas ou derivadas dos mesmos que conservam a capacidade de ligar especificamente um epitopo. Anticorpos incluem anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, anticorpos humanizados ou quiméricos, anticorpos camelizados, anticorpos de camelídeos, anticorpos de cadeia única (scFvs), fragmentos Fab, fragmentos F(ab')2, fragmentos Fvs ligados por dissulfeto (sdFv), anticorpos anti-idiotípicos, intracorpos, anticorpos sintéticos, e fragmentos de ligação de epitopos de qualquer um dos acima. O termo "anticorpo" também se refere a proteínas de fusão que incluem uma região equivalente à região Fc de uma imunoglobulina.
[00060] A invenção será adicionalmente descrita nos exemplos que se seguem, os quais não limitam o âmbito da invenção descrita nas reivindicações.
EXEMPLOS Exemplo 1 - Manipulação de nucleases sequência-específicas para mutagenizar as famílias de genes FucT e XylT
[00061] Em N. benthamiana, foram pesquisadas mutações em dois genes FucT (FucT1 e FucT2) e em dois genes XylT (XylT1 e XylT2). Como cada gene tem dois alelos, a inativação destes genes precisou da introdução de mutações em oito sítios alvo.
[00062] De modo a completamente inativar ou nocautear (knock-out) os membros da família de genes XylT em N. benthamiana, foram designadas nucleases sequência-específicas que têm por alvo a região codificante de proteína na vizinhança do códon de partida. Os primeiros 90 bp das sequências codificantes são idênticos entre os genes XylT1 e XylT2 (figura 1). Quatro pares de endonucleases efetoras TAL foram designados para ter por alvo a família de genes XylT dentro dos primeiros 90 bp usando software que identifica especificamente sítios de reconhecimento de endonucleases efetoras TAL, tais como TALENT 2.0 (Doyle et al., Nucleic Acids Res. 40:W117-122, 2012). Os sítios de reconhecimento de endonucleases efetoras TAL para os genes XylT estão sublinhados na figura 1 e são listados na Tabela 1. Endonucleases efetoras TAL foram sintetizadas usando métodos similares aos descritos em outras partes (Cermak et al., Nucleic Acids Res. 39:e82, 2011; Reyon et al., Nat. Biotechnol. 30:460-465, 2012; e Zhang et al., Nat. Biotechnol. 29:149-153, 2011).
[00063] Os primeiros 130 bp das sequências codificantes para os genes FucT1 e FucT2 são conservados mas não idênticos (figura 2). Endonucleases efetoras TAL tendo por alvo a família de genes FucT foram manipuladas usando uma estratégia similar conforme descrito acima, mas como as sequências de genes FucT são mais divergentes do que XylT1 e XylT2, variações de sequências estão presentes em todos os quatro sítios alvo de endonucleases efetoras TAL (em negrito na figura 2). Os sítios de reconhecimento de endonucleases efetoras TAL para genes FucT estão sublinhados na figura 2 e são listados na Tabela 1. Os sítios alvo 1 e 2 contêm polimorfismos de nucleotídeo nos sítios de reconhecimento de endonucleases efetoras TAL, e portanto dois pares de endonucleases efetoras TAL foram gerados para cada região alvo de modo a aumentar a probabilidade de que as endonucleases efetoras TAL venham a reconhecer seu alvo. Para os sítios alvo 3 e 4, variações de sequências ocorrem nas regiões de espaçador entre os sítios de reconhecimento de DNA de endonucleases efetoras TAL, e portanto um único par de endonucleases efetoras TAL liga à mesma sequência alvo em ambos os genes.
Exemplo 2 - Atividade de endonucleases efetoras TAL para FucT e XylT em levedura
[00064] De modo a avaliar a atividade das endonucleases efetoras TAL tendo por alvo os genes XylT e FucT, foram realizados testes de atividade em levedura por métodos similares aos descritos em outras partes (Christian et al., Genetics 186:757-761, 2010). Para estes testes, um plasmídeo alvo foi construído com o sítio de reconhecimento de endonucleases efetoras TAL clonado em um gene repórter de β- galactosidase não funcional. O sítio alvo foi flanqueado por uma repetição direta de sequência codificante para β-galactosidase de tal modo que se o gene repórter tivesse sido clivado pela endonuclease efetora TAL, teria ocorrido recombinação entre as repetições diretas e a função teria sido restaurada para o gene de β-galactosidase. Portanto, a própria atividade de β-galactosidase serviu como uma medida da atividade de clivagem de endonucleases efetoras TAL.
[00065] No teste de levedura, dois dos pares de endonucleases efetoras TAL de XylT (XYL_T03 e XYL_T04) apresentaram alta atividade de clivagem sob duas condições distintas de temperaturas (isto é, 37°C e 30°C). Cinco dos pares de endonucleases efetoras TAL de FucT (dois para o sítio alvo 1, dois para o sítio alvo 2, e um para o sítio alvo 4) apresentaram alta atividades de clivagem tanto a 37°C quanto a 30°C. As atividades de clivagem foram normalizadas para a nuclease de referência, I-SceI. Os resultados estão resumidos na Tabela 2.
Exemplo 3 - Atividade das endonucleases efetoras TAL de FucT e XylT em seus sítios alvo endógenos em N. benthamiana
[00066] A atividade de endonucleases efetoras TAL em sítios alvo endógenos em N. benthamiana foi medida por expressão das endonucleases efetoras TAL em protoplastos e exame os sítios alvo de endonucleases efetoras TAL para mutações introduzidas por NHEJ. Os métodos para preparação de protoplastos foram realizados conforme descrito em outra parte (Wright et al., Plant J. 44:693-705, 2005). Em resumo, as sementes foram esterilizadas sendo lavadas sucessivamente com 100% de etanol, 50% de alvejante e em seguida água destilada estéril. As sementes esterilizadas foram plantadas sobre meio agarose MS suplementado com ferro. Os protoplastos foram isolados a partir de folhas expandidas jovens usando o protocolo descrito por Wright et al. (supra).
[00067] Plasmídeos codificando endonucleases efetoras TAL junto com um plasmídeo codificando YFP foram introduzidos em protoplastos de N. benthamiana por transformação mediada por PEG conforme descrito em outra parte (Yoo et al., Nature Protocols 2:1565-1572, 2007). Vinte e quatro horas depois do tratamento, a eficiência da transformação foi medida avaliando uma alíquota dos protoplastos transformados usando um citômetro de fluxo para monitorar a fluorescência de YFP. O restante dos protoplastos transformados foi colhido, e foi preparado DNA genômico por um método à base de CTAB. Usando o DNA genômico preparado a partir dos protoplastos como um modelo, um fragmento de aproximadamente 300 bp englobando o sítio de reconhecimento de endonucleases efetoras TAL foi amplificado por PCR. O produto de PCR foi em seguida submetido a 454 piro- sequenciamento. Leituras de sequenciamento com mutações de inserção / eliminação (indel) na região do espaçador foram consideradas como tendo sido derivadas de reparo impreciso de um sítio de reconhecimento de endonucleases efetoras TAL clivado por NHEJ. A frequência da mutagênese foi calculada como o número de leituras de sequenciamento com mutações NHEJ fora das leituras de sequenciamento total. Os valores foram em seguida normalizados pela eficiência da transformação.
[00068] A atividade dos pares de endonucleases efetoras TAL, XylT03 e XylT04, contra seus genes alvo está resumida na Tabela 3. Ambos os pares de endonucleases efetoras TAL induziram frequências muito elevadas de mutações induzidas por NHEJ tanto em XylT1 quanto em XylT2, variando de 28,2% a 73,8%. Exemplos de mutações induzidas por endonucleases efetoras TAL em XylT1 e XylT2 são mostrados na figura 3. Para os pares de endonucleases efetoras TAL FucT1_T02 e FucT2_T02, o sítio de reconhecimento de cada par de endonucleases efetoras TAL foi conservado tanto em ambos os genes FucT1 e FucT2 com a exceção de um polimorfismo de 1 bp em uma das duas endonucleases efetoras TAL compreendendo cada par. Conforme resumido na Tabela 3, estes pares de endonucleases efetoras TAL geraram altas frequências de mutações induzidas por NHEJ em ambos os genes, variando de 24,7% a 46,5%. Exemplos de mutações induzidas por endonucleases efetoras TAL sobre loci FucT1 e FucT2 são mostrados na figura 4.
Exemplo 4 - Linhagens de N. benthamiana com mutações induzidas por endonucleases efetoras TAL em XylT ou FucT
[00069] Linhagens de N. benthamiana foram criadas com mutações nos genes XylT ou FucT. Com base nos dados de 454 piro- sequenciamento, os pares de endonucleases efetoras TAL com a maior atividade de clivagem (XylT_T04 e FucT2_T02), foram escolhidos para mutagenizar os genes XylT e FucT. Os protoplastos foram isolados a partir de folhas estéreis, e transformados com plasmídeos codificando um dos seguintes: (i) endonuclease efetora TAL XylT_T04; (ii) endonuclease efetora TAL FucT2_T02; ou (iii) YFP. As eficiências das transformações foram monitoradas pela liberação do plasmídeo YFP, a qual foi visualizada usando um microscópio fluorescente ou por citometria de fluxo conforme descrito acima.
[00070] Depois da transformação, foram gerados calos derivados de protoplastos (Van den Elzen et al., Plant Mol. Biol. 5:299-302, 1985). Imediatamente depois da transformação mediada por PEG, os protoplastos foram ressuspendidos em meio K3G1 na densidade celular de 1x105/ml em uma pequena placa de Petri, e armazenados a 25°C no escuro. No dia 4 depois da transformação, quando a maioria dos protoplastos estavam iniciando sua primeira divisão celular, a cultura de protoplastos foi diluída quatro vezes em meio Media C (Van den Elzen et al., acima). No dia 7 e no dia 10, as culturas de protoplastos foram diluídas duas vezes em meio MS. No dia 18 depois da transformação, os calos foram identificados sob o microscópio ótico, e um mês depois da transformação, os calos derivados de protoplastos estavam visíveis a olho nu. Estes calos visíveis foram transferidos para meio de indução de rebento. Depois de terem emergido rebentos de uns poucos cm de comprimento, foram cortados na base e transferidos para meio de indução de raiz. Assim que as raízes se formaram, foram transferidos para o solo.
[00071] Um pequeno pedaço de tecido de folha foi usado para preparar DNA genômico das plantas regeneradas. As amostras de DNA foram avaliadas por amplificação por PCR do locus alvo e sequenciamento de DNA para identificar as plantas com mutações em XylT ou FucT. Conforme mostrado na figura 5, a linhagem de plantas NB13-105a manteve eliminações de 13 bp idênticas em ambos os alelos do gene FucT1, e eliminações de 14 bp idênticas em ambos os alelos do gene FucT2. A linhagem de plantas NB13-213a manteve eliminações de 20 bp e 12 bp nos dois alelos de FucT1. NB12-213a também manteve eliminações de 13 bp e 2 bp nos dois alelos de FucT2. Portanto, a linhagem de plantas NB12-213a tem mutações em todos os alvos FucT - os dois alelos de FucTI e os dois alelos de FucT2. Conforme mostrado na figura 6, a linhagem de plantas NB15-11d teve eliminações de 7 bp diferentes em cada alelo de XylT1 e uma eliminação de 8 bp em um alelo de XylT2. A linhagem de plantas NB12-113c tem uma eliminação de 7 bp em um alelo de XylT1 e eliminações de 35 bp e 5 bp em cada um dos dois alelos de XylT2. Foram colhidas sementes das plantas modificadas, e a herança das mutações foi monitorada na progênie, confirmando transmissão hereditária e estável dos loci modificados.
Exemplo 5 - Linhagens de N. benthamiana com mutações induzidas por endonucleases efetoras TAL em XylT e FucT
[00072] De modo a criar linhagens de N. benthamiana com mutações em todos os alelos de todos os quatro genes XylT e FucT, protoplastos foram transformados com ambas as endonucleases efetoras TAL, XylT_T04 e FucT2_T02 (Yoo et al., Nature Protocols 2:1565-1572, 2007; e Zhang et al., Plant Physiol. 161:20-27, 2012). Conforme descrito acima (Van den Elzen et al., Plant Mol. Biol. 5:299-302, 1985), plântulas foram regeneradas e triadas para mutações nos genes XylT e FucT. Foi realizada triagem por amplificação por PCR do alvo e análise de sequência de DNA dos produtos de amplificação.
[00073] Usando esta abordagem, a linhagem de planta NB14-29a foi identificada como tendo mutações de eliminação em todos os oito alelos de quatro loci. Esta linhagem de planta é homozigoto para uma eliminação de 44 bp em FucT1 e heterozigoto para eliminações de 2 bp e 40 bp em FucT2 (figura 7). Esta mesma linhagem de planta, NB14- 29a, é homozigoto para uma eliminação de 5 bp em XylT1 e é heterozigoto para eliminações de 6 bp e 549 bp em XylT2 (figura 8). A transmissão das mutações foi monitorada na progênie de NB14-29a, demonstrando que as mutações foram transmissíveis por hereditariedade.
[00074] Em estudos alternativos, linhagens de N. benthamiana com mutações em um ou mais alelos de XylT são cruzadas com as linhagens de N. benthamiana tendo mutações em um ou mais alelos de FucT. Nas gerações subsequentes, as progênies resultantes são triadas para os indivíduos que são homozigoto para todas as mutações presentes nas linhagens parentais. Podem ser realizados cruzamentos adicional com outras linhagens que têm mutações em outros genes FucT ou XylT. Um cruzamento iterativo semelhante é usado para gerar plantas que são homozigoto para alelos mutantes de XylT e FucT. Triagem para mutações é realizada por amplificação por PCR e sequenciamento de DNA direto dos produtos de PCR de plantas individuais.
Exemplo 6 - Linhagens de N. benthamiana mutantes com níveis reduzidos de α1,3-fucose e carecendo de β1,2-xilose detectável
[00075] A presença de α1,3-fucose e β1,2-xilose sobre proteínas endógenas nas linhagens de N. benthamiana mutantes foi avaliada por espectrometria de massa (North et al., Curr. Opin. Struct. Biol. 19:498506, 2009). Usando uma abordagem similar (Strasser et al., Plant Biotechnol. J. 6:392-402, 2008), proteínas solúveis foram isoladas a partir de folhas verdes de NB13-105a, NB13-213a, NB15-11d, NB12- 113c, e N. benthamiana selvagem. N-glicanos foram liberados a partir de proteínas por digestão com peptídeo-N-glicosidase A e F. N-glicanos liberados foram purificados usando colunas Ultra Clean SPE Carbograph (Alltech) e metilados in vitro. N-glicanos permetilados foram analisados através de MALDI TOF MS (Espectrometria de massa por tempo de voo com dessorção/ionização de matriz assistida por laser) (Karas and Hillenkamp, Anal. Chem. 60:259-280, 1988).
[00076] Análise de N-glicosilação mostrou níveis reduzidos (mais de 60%) de fucosilação em NB13-105a e NB13-213a em comparação com N. benthamiana selvagem (figura 9). Mutações de XylT1 e XylT2 em NB15-11d e NB12-113c levou a níveis indetectáveis de xilosilação sobre proteínas das folhas (figura 10).
[00077] Análise de N-glicosilação também foi realizada sobre proteínas endógenas purificadas a partir da linhagem NB14-29a, a qual tem mutações em todos os oito alelos dos genes FucT e XylT (figuras 7 e 8). Como nas linhagens NB13-105a e NB13-213a, a fucosilação foi significativamente reduzida em NB14-29a (FIG 11). A presença de β1,2-xilose sobre proteínas endógenas também foi reduzida em NB14- 29a (FIG 11), mas não em uma extensão tão grande quanto a observada para NB15-11d e NB12-113c (FIG 10). Isto provavelmente foi porque a linhagem NB14-29a tem uma mutação in-frame em um alelo de XylT2 (especificamente, tem uma eliminação de 6 bp, FIG 8), e este alelo provavelmente pode produzir uma proteína funcional com atividade de xilosil transferase.
Exemplo 7 - Linhagens de N. benthamiana mutantes têm níveis reduzidos de α1,3-fucose e β1,2-xilose sobre polipeptídeos expressados
[00078] A presença de α1,3-fucose e β1,2-xilose em polipeptídeos heterólogos expressados nas linhagens de N. benthamiana mutantes é avaliada por espectrometria de massa (Strasser et al., Plant Biotechnol. J. 6:392-402, 2008). Um polipeptídeo heterólogo, tal como uma imunoglobulina humana (por exemplo, IgG), é expressado por introdução, nas linhagens de N. benthamiana mutantes, da sequência codificante para o polipeptídeo por, por exemplo, infiltração por agrobactérias (Yang et al., Plant J. 22:543-551, 2000) ou eletroporação de protoplastos derivados a partir de linhagens mutantes. Nove dias depois da infiltração por agrobactérias ou 48 horas depois da eletroporação, os polipeptídeos totais são extraídos a partir de plantas mutantes, e a IgG é purificada usando proteína G. A cadeia pesada do anticorpo purificado é isolada por corte da banda correspondente de um gel SDS-PAGE reduzido. A proteína de cadeia pesada nesta banda é usada para análise de glicanos por LC-MS conforme descrito por Strasser et al. (supra). Tabela 1 Sequências alvo de endonucleases efetoras TAL
Figure img0001
Tabela 2 Atividade de endonucleases efetoras TAL XylT e FucT em levedura
Figure img0002
*Sublinhado indica variações **Normalizada para I-SceI (máx. = 1,0) Tabela 3 454 Dados de Piro-Sequenciamento para endonucleases efetoras TAL XylT e FucT
Figure img0003
* Freq. de mutagênese NHEJ foi obtida po normalização da percentagem de 454 leituras com mutações transformação de protoplastos. O número total de 454 leituras de sequenciamento usadas para esta análise foi in NHEJ para a eficiência de dicado entre parênteses. ** Controles negativos foram obtidos a partir de protoplastos transformados somente pelo plasmídeo codificante de YFP. Tabela 4 Sequências XylT e FucT Típicas
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OUTRAS MODALIDADES
[00079] Deve ser entendido que apesar da invenção ter sido descrita em conjunto com a descrição detalhada da mesma, a descrição precedente se destina a ilustrar e não a limitar o âmbito da invenção, a qual é definida pelo âmbito das reivindicações anexadas. Outros aspectos, vantagens, e modificações estão dentro do âmbito das reivindicações que se seguem.

Claims (8)

1. Método para a produção de um polipeptídeo, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) proporcionar uma planta de Nicotiana benthamiana ou célula da planta compreendendo deleções em um ou mais alelos XylT e um ou mais alelos FucT, em que as referidas deleções foram induzidas por um primeiro par de endonucleases efetoras TAL (TALEN) que se liga a sequências de ácido nucleico selecionadas do grupo que consiste em: SEQ ID NOs: 47 e 48; SEQ ID NOs: 49 e 50; e SEQ ID NOs: 51 e 52, e um segundo par de endonucleases efetoras TAL (TALEN) que se liga a sequências de ácido nucleico selecionadas do grupo que consiste em: SEQ ID NOs: 53 e 54; SEQ ID NOs: 55 e 56; SEQ ID NOs: 57 e 58; SEQ ID NOs: 58 e 59; e SEQ ID NOs: 62 e 63, em que os níveis de beta-1,2-xilosil-açúcares ou alfa-1,3- fucosil-açúcares de núcleo sobre estruturas de N-glicano de glicoproteínas produzidas na referida planta ou célula da planta são reduzidos em comparação com uma planta ou célula da planta correspondente que não contém as referidas deleções, e em que a referida planta ou célula da planta compreende um ácido nucleico recombinante compreendendo (i) uma sequência de nucleotídeos codificando um polipeptídeo ligada operacionalmente a (ii) um promotor expressível em planta e (iii) uma sequência envolvida em terminação de transcrição e poliadenilação, em que o referido polipeptídeo é heterólogo à referida planta; e (b) cultivar a referida planta ou célula da planta sob condições e por um tempo suficiente de modo a que o referido polipeptídeo heterólogo seja produzido.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda isolar o referido polipeptídeo heterólogo a partir da referida planta ou célula da planta.
3. Método para produzir uma planta de Nicotiana benthamiana que compreende deleções em um ou mais alelos XylT e um ou mais alelos FucT, o referido método caracterizado pelo fato de que compreende: (a) introduzir em uma população de células de planta de Nicotiana benthamiana compreendendo alelos XylT funcionais e alelos FucT funcionais um primeiro par de endonucleases efetoras TAL (TALEN) que se liga a sequências de ácido nucleico selecionadas do grupo que consiste em: SEQ ID NOs: 47 e 48; SEQ ID NOs: 49 e 50; e SEQ ID NOs: 51 e 52, e um segundo par de endonucleases efetoras TAL (TALEN) que se liga a sequências de ácido nucleico selecionadas do grupo que consiste em: SEQ ID NOs: 53 e 54; SEQ ID NOs: 55 e 56; SEQ ID NOs: 57 e 58; SEQ ID NOs: 58 e 59; e SEQ ID NOs: 62 e 63, (b) selecionar, entre a referida população, uma célula na qual um ou mais alelos XylT e um ou mais alelos FucT foram inativados, e em que os níveis de beta-1,2-xilosil-açúcares ou alfa-1,3- fucosil-açúcares de núcleo sobre estruturas de N-glicano de glicoproteínas produzidas na referida célula de planta Nicotiana benthamiana são reduzidos em comparação com uma célula de planta Nicotiana benthamiana correspondente que não contém as referidas deleções.
4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que as referidas células da planta de Nicotiana benthamiana são protoplastos.
5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que compreende transformar os referidos protoplastos com um ou mais vetores codificando a referida primeira endonuclease efetora TAL (TALEN) e a referida segunda endonuclease efetora TAL (TALEN).
6. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que compreende introduzir nos referidos protoplastos a referida primeira endonuclease efetora TAL (TALEN) e a referida segunda endonuclease efetora TAL (TALEN).
7. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que compreende ainda cultivar os referidos protoplastos para gerar linhagens de plantas.
8. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que compreende isolar DNA genômico compreendendo no mínimo uma porção de um locus XylT ou no mínimo uma porção de um locus FucT dos referidos protoplastos.
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK3194583T3 (da) * 2014-07-30 2021-12-20 Zumutor Biologics Inc Ikke-fucosyleret protein og fremgangsmåder dermed
WO2016079739A2 (en) * 2014-11-20 2016-05-26 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. Compositions and methods for producing polypeptides with a modified glycosylation pattern in plant cells
WO2021101351A2 (ko) * 2019-11-21 2021-05-27 (주)지플러스 생명과학 비푸코실화된 담배를 이용하여 생산한 항체 및 이의 용도

Family Cites Families (86)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US562628A (en) * 1896-06-23 Faucet
US562629A (en) * 1896-06-23 Sprocket drive-chain
US562630A (en) * 1896-06-23 John lines
US562631A (en) * 1896-06-23 littlefield
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4535060A (en) 1983-01-05 1985-08-13 Calgene, Inc. Inhibition resistant 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthetase, production and use
US4761373A (en) 1984-03-06 1988-08-02 Molecular Genetics, Inc. Herbicide resistance in plants
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4940835A (en) 1985-10-29 1990-07-10 Monsanto Company Glyphosate-resistant plants
CA1293460C (en) 1985-10-07 1991-12-24 Brian Lee Sauer Site-specific recombination of dna in yeast
US4810648A (en) 1986-01-08 1989-03-07 Rhone Poulenc Agrochimie Haloarylnitrile degrading gene, its use, and cells containing the gene
ES2018274T5 (es) 1986-03-11 1996-12-16 Plant Genetic Systems Nv Celulas vegetales resistentes a los inhibidores de glutamina sintetasa, preparadas por ingenieria genetica.
US4975374A (en) 1986-03-18 1990-12-04 The General Hospital Corporation Expression of wild type and mutant glutamine synthetase in foreign hosts
US5273894A (en) 1986-08-23 1993-12-28 Hoechst Aktiengesellschaft Phosphinothricin-resistance gene, and its use
US5276268A (en) 1986-08-23 1994-01-04 Hoechst Aktiengesellschaft Phosphinothricin-resistance gene, and its use
US5013659A (en) 1987-07-27 1991-05-07 E. I. Du Pont De Nemours And Company Nucleic acid fragment encoding herbicide resistant plant acetolactate synthase
US5006333A (en) 1987-08-03 1991-04-09 Ddi Pharmaceuticals, Inc. Conjugates of superoxide dismutase coupled to high molecular weight polyalkylene glycols
US5162602A (en) 1988-11-10 1992-11-10 Regents Of The University Of Minnesota Corn plants tolerant to sethoxydim and haloxyfop herbicides
US5501967A (en) 1989-07-26 1996-03-26 Mogen International, N.V./Rijksuniversiteit Te Leiden Process for the site-directed integration of DNA into the genome of plants
US5484956A (en) 1990-01-22 1996-01-16 Dekalb Genetics Corporation Fertile transgenic Zea mays plant comprising heterologous DNA encoding Bacillus thuringiensis endotoxin
US5204253A (en) 1990-05-29 1993-04-20 E. I. Du Pont De Nemours And Company Method and apparatus for introducing biological substances into living cells
US5767366A (en) 1991-02-19 1998-06-16 Louisiana State University Board Of Supervisors, A Governing Body Of Louisiana State University Agricultural And Mechanical College Mutant acetolactate synthase gene from Ararbidopsis thaliana for conferring imidazolinone resistance to crop plants
US5487994A (en) 1992-04-03 1996-01-30 The Johns Hopkins University Insertion and deletion mutants of FokI restriction endonuclease
US5792640A (en) 1992-04-03 1998-08-11 The Johns Hopkins University General method to clone hybrid restriction endonucleases using lig gene
US5436150A (en) 1992-04-03 1995-07-25 The Johns Hopkins University Functional domains in flavobacterium okeanokoities (foki) restriction endonuclease
US5356802A (en) 1992-04-03 1994-10-18 The Johns Hopkins University Functional domains in flavobacterium okeanokoites (FokI) restriction endonuclease
ATE398679T1 (de) 1992-07-07 2008-07-15 Japan Tobacco Inc Verfahren zur transformation einer monokotyledon pflanze
AU6234594A (en) 1993-02-12 1994-08-29 Johns Hopkins University, The Functional domains in (flavobacterium okeanokoites) (foki) restriction endonuclease
US6808904B2 (en) 1994-06-16 2004-10-26 Syngenta Participations Ag Herbicide-tolerant protox genes produced by DNA shuffling
US7285416B2 (en) 2000-01-24 2007-10-23 Gendaq Limited Regulated gene expression in plants
US6326166B1 (en) 1995-12-29 2001-12-04 Massachusetts Institute Of Technology Chimeric DNA-binding proteins
US5853973A (en) 1995-04-20 1998-12-29 American Cyanamid Company Structure based designed herbicide resistant products
US6084155A (en) 1995-06-06 2000-07-04 Novartis Ag Herbicide-tolerant protoporphyrinogen oxidase ("protox") genes
JPH10117776A (ja) 1996-10-22 1998-05-12 Japan Tobacco Inc インディカイネの形質転換方法
GB9819693D0 (en) 1998-09-10 1998-11-04 Zeneca Ltd Glyphosate formulation
US7070934B2 (en) 1999-01-12 2006-07-04 Sangamo Biosciences, Inc. Ligand-controlled regulation of endogenous gene expression
US7013219B2 (en) 1999-01-12 2006-03-14 Sangamo Biosciences, Inc. Regulation of endogenous gene expression in cells using zinc finger proteins
US6534261B1 (en) 1999-01-12 2003-03-18 Sangamo Biosciences, Inc. Regulation of endogenous gene expression in cells using zinc finger proteins
AU2982900A (en) 1999-02-03 2000-08-25 Children's Medical Center Corporation Gene repair involving the induction of double-stranded dna cleavage at a chromosomal target site
US6451732B1 (en) 1999-06-04 2002-09-17 Syngenta, Limited Herbicidal compositions of glyphosate trimesium
US7067722B2 (en) 1999-08-26 2006-06-27 Monsanto Technology Llc Nucleic acid sequences and methods of use for the production of plants with modified polyunsaturated fatty acids
US7001768B2 (en) 2000-04-28 2006-02-21 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted modification of chromatin structure
US6368227B1 (en) 2000-11-17 2002-04-09 Steven Olson Method of swinging on a swing
ES2409080T3 (es) 2001-01-22 2013-06-24 Sangamo Biosciences Inc. Proteínas de unión con dedos de zinc modificadas
US7262054B2 (en) 2002-01-22 2007-08-28 Sangamo Biosciences, Inc. Zinc finger proteins for DNA binding and gene regulation in plants
WO2009095742A1 (en) 2008-01-31 2009-08-06 Cellectis New i-crei derived single-chain meganuclease and uses thereof
ATE531796T1 (de) 2002-03-21 2011-11-15 Sangamo Biosciences Inc Verfahren und zusammensetzungen zur verwendung von zinkfinger-endonukleasen zur verbesserung der homologen rekombination
US7361635B2 (en) 2002-08-29 2008-04-22 Sangamo Biosciences, Inc. Simultaneous modulation of multiple genes
WO2004067753A2 (en) 2003-01-28 2004-08-12 Cellectis Use of meganucleases for inducing homologous recombination ex vivo and in toto in vertebrate somatic tissues and application thereof.
US7888121B2 (en) 2003-08-08 2011-02-15 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for targeted cleavage and recombination
US7189691B2 (en) 2004-04-01 2007-03-13 The Administrators Of The Tulane Educational Fund Methods and compositions for treating leukemia
WO2007060495A1 (en) 2005-10-25 2007-05-31 Cellectis I-crei homing endonuclease variants having novel cleavage specificity and use thereof
NZ598048A (en) 2006-01-17 2013-05-31 Synthon Biopharmaceuticals Bv Compositions and methods for humanization and optimization of n-glycans in plants
US20090060921A1 (en) * 2006-01-17 2009-03-05 Biolex Therapeutics, Inc. Glycan-optimized anti-cd20 antibodies
CA2988226C (en) 2006-03-10 2022-04-26 Monsanto Technology Llc Soybean seed and oil compositions and methods of making same
WO2008010009A1 (en) 2006-07-18 2008-01-24 Cellectis Meganuclease variants cleaving a dna target sequence from a rag gene and uses thereof
EP2152884A1 (en) * 2007-05-21 2010-02-17 Bayer BioScience N.V. Methods and means for producing glycoproteins with altered glycosylation pattern in higher plants
US8563314B2 (en) 2007-09-27 2013-10-22 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for modulating PD1
CN101815722B (zh) 2007-09-28 2015-11-25 双刃基金会 Bs3抗性基因和使用方法
CA2704108A1 (en) * 2007-10-31 2009-05-07 Bayer Bioscience N.V. Method to produce modified plants with altered n-glycosylation pattern
BRPI0921909A2 (pt) 2008-11-10 2017-06-13 Two Blades Found métodos para fabricar um promotor indutível por patógeno, e um gene r, para intensificar a resistência de uma planta, e para identificar uma caixa upa, promotor indutível por patógeno, cassete de expressão, molécula de ácido nucléico, planta transformada, semente da planta transformada, célula hospedeira.
US20110239315A1 (en) 2009-01-12 2011-09-29 Ulla Bonas Modular dna-binding domains and methods of use
EP2206723A1 (en) 2009-01-12 2010-07-14 Bonas, Ulla Modular DNA-binding domains
DE112010000876T5 (de) 2009-02-03 2012-09-13 Wisconsin Alumni Research Foundation Steuerung Kälte-induzierten Süßens und Verringerung von Acrylamid-Niveaus in Kartoffeln oder Süßkartoffeln
US8772008B2 (en) 2009-05-18 2014-07-08 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for increasing nuclease activity
CA2765287C (en) * 2009-06-15 2018-12-11 Bayer Bioscience N.V. Nicotiana benthamiana plants deficient in xylosyltransferase activity
US20120178647A1 (en) 2009-08-03 2012-07-12 The General Hospital Corporation Engineering of zinc finger arrays by context-dependent assembly
EP2464750A4 (en) 2009-08-11 2013-10-02 Sangamo Biosciences Inc HOMOZYGOT ORGANIZATIONS INTENDED FOR TARGETED CHANGES
ES2657067T3 (es) 2009-10-22 2018-03-01 Dow Agrosciences Llc Proteínas con dedos de zinc modificadas genéticamente que se dirigen a genes vegetales implicados en la biosíntesis de ácidos grasos
US8956828B2 (en) 2009-11-10 2015-02-17 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted disruption of T cell receptor genes using engineered zinc finger protein nucleases
US20110117249A1 (en) * 2009-11-19 2011-05-19 Karla Ward Bite sized burrito systems
CN102762726A (zh) 2009-11-27 2012-10-31 巴斯夫植物科学有限公司 嵌合内切核酸酶及其用途
CN105384827A (zh) 2009-11-27 2016-03-09 巴斯夫植物科学有限公司 嵌合内切核酸酶及其用途
EP2504439B1 (en) 2009-11-27 2016-03-02 BASF Plant Science Company GmbH Optimized endonucleases and uses thereof
AU2010327998B2 (en) 2009-12-10 2015-11-12 Iowa State University Research Foundation, Inc. TAL effector-mediated DNA modification
US20110203012A1 (en) 2010-01-21 2011-08-18 Dotson Stanton B Methods and compositions for use of directed recombination in plant breeding
JP6137596B2 (ja) 2010-02-08 2017-05-31 サンガモ セラピューティクス， インコーポレイテッド 遺伝子操作された切断ハーフドメイン
CA2788850C (en) 2010-02-09 2019-06-25 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted genomic modification with partially single-stranded donor molecules
US20130198897A1 (en) * 2010-03-22 2013-08-01 Philip Morris Products S.A. Modifying enzyme activity in plants
CA2796600C (en) 2010-04-26 2019-08-13 Sangamo Biosciences, Inc. Genome editing of a rosa locus using zinc-finger nucleases
JP6208580B2 (ja) 2010-05-17 2017-10-04 サンガモ セラピューティクス， インコーポレイテッド 新規のｄｎａ結合タンパク質及びその使用
EP2392208B1 (en) 2010-06-07 2016-05-04 Helmholtz Zentrum München Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt (GmbH) Fusion proteins comprising a DNA-binding domain of a Tal effector protein and a non-specific cleavage domain of a restriction nuclease and their use
EP2580331A4 (en) 2010-06-14 2013-11-27 Univ Iowa State Res Found Inc NUCLEASE ACTIVITY OF THE TAL EFFECTOR AND FUSION PROTEIN FOKI
JP6104252B2 (ja) 2011-10-04 2017-03-29 アイコン・ジェネティクス・ゲーエムベーハー フコシルトランスフェラーゼ活性が欠損したニコチアナ・ベンサミアナ植物
UA118090C2 (uk) 2012-09-07 2018-11-26 ДАУ АГРОСАЙЄНСІЗ ЕлЕлСі Спосіб інтегрування послідовності нуклеїнової кислоти, що представляє інтерес, у ген fad2 у клітині сої та специфічний для локусу fad2 білок, що зв'язується, здатний індукувати спрямований розрив
WO2015057393A1 (en) 2013-10-01 2015-04-23 University Of Wyoming Compositions and methods for reducing fucosylation of glycoproteins in insect cells and methods of use thereof for production recombinant glycoproteins

Also Published As

Publication number Publication date
NZ707560A (en) 2019-10-25
AU2013337832A1 (en) 2015-05-21
MX367031B (es) 2019-08-02
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IL238545A0 (en) 2015-06-30
US20210059142A1 (en) 2021-03-04
CA2890281A1 (en) 2014-05-08

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