ES2894832T3 - Plantas para la producción de proteínas terapéuticas - Google Patents

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Feng Zhang
Thomas Stoddard
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Abstract

Un método para fabricar una planta de Nicotiana o una línea celular vegetal de Nicotiana que comprende una deleción en cada uno de una pluralidad de alelos XylT 1 y XylT2 y una deleción en cada uno de una pluralidad de alelos FucTI y FucT2, dicho método comprende: (a) Poner en contacto a una población de células vegetales de Nicotiana que comprenden alelos funcionales XylT1 y XylT2 y alelos funcionales FucT1 y FucT2 con un primer par de endonucleasas efectoras TAL (TALEN) que se une a secuencias de ácido nucleico seleccionadas del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 47 y 48; SEQ ID NO: 49 y 50; y SEQ ID NO: 51 y 52, y un segundo par de endonucleasas efectoras TAL (TALEN) que se une a secuencias de ácido nucleico seleccionadas del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 53 y 54; SEQ ID NO: 55 y 56; SEQ ID NO: 57 y 58; SEQ ID NO: 58 y 59; y SEQ ID NO: 62 y 63, (b) seleccionar, de dicha población, una célula en la cual cada uno de dicha pluralidad de alelos XylT1 y XylT2 y cada uno de dicha pluralidad de alelos FucT1 y FucT2 se han inactivado, y (c) regenerar dicha célula vegetal seleccionada en dicha planta de Nicotiana o línea celular vegetal de Nicotiana, en donde dicha planta de Nicotiana o línea celular vegetal de Nicotiana comprende dicha deleción en cada una de dicha pluralidad de alelos XylT1 y XylT2 y dicha deleción en cada una de dicha pluralidad de alelos FucT1 y FucT2, y en donde los niveles de beta-1,2-xilosil- y estructura central-alfa- 1,3-fucosil-azúcares en las estructuras de N-glicano de las glicoproteínas producidas en dicha planta o línea celular vegetal están disminuidos en comparación con una planta o línea celular vegetal correspondiente que no contiene dichas deleciones.

Description

DESCRIPCIÓN
Plantas para la producción de proteínas terapéuticas
Referencia cruzada a solicitudes relacionadas
Esta solicitud reivindica el beneficio de la prioridad de la solicitud provisional de los Estados Unidos con núm. de serie 61/790,850, presentada el 15 de marzo de 2013, y la solicitud provisional de los Estados Unidos con núm. de serie 61/721,194, presentada el 1 de noviembre de 2012.
Campo técnico
Este documento se refiere a materiales y métodos para fabricar plantas que sean adecuadas para la producción de proteínas terapéuticas para la administración a humanos y animales, particularmente mediante la realización de desactivaciones génicas dirigidas a genes que codifican xilosiltransferasas y fucosiltransferasas. Este documento también se relaciona con variedades de Nicotiana que carecen de actividad xilosiltransferasa y fucosiltransferasa, o que tienen actividad xilosiltransferasa y fucosiltransferasa reducida.
Antecedentes
A diferencia de las glicoproteínas animales, las glicoproteínas vegetales tienen residuos beta(1,2) xilosilo y residuos estructura central-alfa(1,3) fucosilo, y carecen de residuos beta(1,4) galactosilo terminales y de ácido siálico. La beta-1,2-xilosiltransferasa ("XylT") cataliza la transferencia de xilosa desde UDP-xilosa a la manosa con enlace p a la estructura central de N-glicanos unidos a proteínas. Esta enzima es exclusiva de las plantas y algunas especies de animales no vertebrados, y no se encuentra en seres humanos ni en otros vertebrados. La a-1,3-fucosil-transferasa ("FucT") cataliza la transferencia de fucosa de la GDP-fucosa a la N-acetilglucosamina (GlcNAc) con enlace p a la estructura central de N-glicanos unidos a proteínas. Esta enzima se encuentra en especies vegetales y animales, incluidos los humanos.
Resumen
Este documento proporciona materiales y métodos para fabricar plantas que son particularmente útiles para la producción de proteínas terapéuticas adecuadas para la administración a seres humanos y animales, particularmente mediante la realización de desactivaciones génicas dirigidas a genes que codifican xilosiltransferasas y fucosiltransferasas. Este documento también proporciona variedades de Nicotiana que carecen de actividad xilosiltransferasa y fucosiltransferasa, o que tienen una actividad xilosiltransferasa y fucosiltransferasa reducida en comparación con el control correspondiente de variedades de Nicotiana.
Esta descripción se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de que pueden fabricarse plantas adecuadas para producir proteínas para la administración a seres humanos y animales mediante la desactivación de todas las copias de los genes que codifican xilosiltransferasas y fucosiltransferasas. Esta descripción también se basa, al menos en parte, en el desarrollo de variedades de Nicotiana benthamiana que carecen de actividades xilosiltransferasa y fucosiltransferasa. Tener la capacidad de producir plantas viables que carecen de actividades xilosiltransferasa y fucosiltransferasa puede facilitar la producción de proteínas terapéuticas para la administración a humanos y animales, con una menor incidencia de reacciones inmunogénicas o alérgicas en comparación con las proteínas producidas en plantas con actividad xilosiltransferasa y fucosiltransferasa.
Además, esta descripción se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de que pueden fabricarse plantas adecuadas para producir proteínas para la administración a humanos y animales mediante la desactivación o mutación de una o más copias de los genes que codifican xilosiltransferasas y fucosiltransferasas de manera que la transcripción de los genes y/o la traducción del polipéptido codificado se reducen en comparación con una planta o célula vegetal de tipo silvestre correspondiente, y en el desarrollo de variedades de Nicotiana benthamiana que tienen actividades reducidas de xilosiltransferasa y fucosiltransferasa. La capacidad de fabricar plantas viables que tienen actividades reducidas de xilosiltransferasa y fucosiltransferasa también puede facilitar la producción de proteínas terapéuticas para su administración a humanos y animales. La reducción de los niveles de glicanos en proteínas producidas por plantas puede eliminar en las proteínas algunas de las características específicas de las plantas. Tales proteínas pueden tener una menor incidencia de reacciones inmunogénicas o alérgicas en comparación con las proteínas producidas en plantas que no tienen una actividad reducida de xilosiltransferasa y fucosiltransferasa. Dichas proteínas también pueden tener una actividad funcional mejorada en comparación con las proteínas que no tienen niveles reducidos de glicanos.
Este documento presenta una planta o célula vegetal de Nicotiana que tiene una mutación en cada uno de una pluralidad de alelos XylT y una mutación en cada uno de una pluralidad de alelos FucT, en donde la planta o célula vegetal no produce niveles detectables de beta-1,2-xilosil- o estructura central-alfa-1,3-fucosil-azúcares en estructuras de N-glicano de glicoproteínas producidas en la planta o célula vegetal. Las mutaciones pueden estar en una o más secuencias como se establece en SEQ ID NO: 1, 2 o 3. Las mutaciones pueden haber sido inducidas por una o más endonucleasas de corte raro. Las una o más endonucleasas de corte raro pueden ser endonucleasas efectoras de tipo activador de la transcripción (TAL). Cada una de las endonucleasas efectoras TAL puede unirse a una secuencia como se establece en cualquiera de las SEQ ID NO: 45-63. La planta o célula vegetal puede incluir un ácido nucleico que codifica un polipéptido heterólogo. Cada una de las mutaciones puede ser una deleción de más de un nucleótido. Cada uno de la pluralidad de alelos XylT y la pluralidad de alelos FucT puede tener una deleción de una secuencia de ácido nucleico endógeno y no incluir ningún ácido nucleico exógeno. La planta o célula vegetal puede ser una planta o célula vegetal N. benthamiana.
Este documento también presenta un método para producir un polipéptido. El método puede incluir (a) proporcionar una planta o célula vegetal Nicotiana que tiene una mutación en cada uno de una pluralidad de alelos XylT y una mutación en cada uno de una pluralidad de alelos FucT, en donde la planta o célula vegetal no produce niveles detectables de beta-1,2-xilosil- o estructura central-alfa-1,3-fucosil-azúcares en estructuras de N-glicano de glicoproteínas producidas en la planta o célula vegetal, y en donde la planta o célula vegetal contiene un ácido nucleico que comprende (i) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido operativamente unido a (ii) un promotor expresable en plantas y (iii) una secuencia implicada en la terminación de la transcripción y la poliadenilación, en donde el polipéptido es heterólogo a la planta; y (b) cultivar la planta o la célula vegetal en condiciones y durante un tiempo suficiente para que se produzca el polipéptido heterólogo. El método puede incluir, además, aislar el polipéptido heterólogo de la planta o célula vegetal. Las mutaciones pueden haber sido inducidas por una o más endonucleasas de corte raro. Las una o más endonucleasas de corte raro pueden ser endonucleasas efectoras TAL. Cada una de las endonucleasas efectoras TAL puede unirse a una secuencia como se establece en cualquiera de las SEQ ID NO: 45-63.
Este documento también incluye un método para fabricar una planta de Nicotiana que tiene una mutación en cada uno de una pluralidad de alelos XylT y una mutación en cada uno de una pluralidad de alelos FucT. El método puede incluir (a) poner en contacto una población de células vegetales de Nicotiana que tienen alelos XylT funcionales y alelos FucT funcionales con una o más endonucleasas de corte raro dirigidas a secuencias XylT endógenas, y una o más endonucleasas de corte raro dirigidas a secuencias FucT endógenas, (b) seleccionar, de la población, una célula en cual una pluralidad de alelos XylT y una pluralidad de alelos FucT se han inactivado, y (c) regenerar la célula vegetal seleccionada en una planta de Nicotiana en donde la planta de Nicotiana contiene mutaciones en una pluralidad de alelos XylT y mutaciones en una pluralidad de alelos FucT, y no produce niveles detectables de beta-1,2-xilosil- o estructura central-alfa-1,3-fucosil-azúcares en estructuras de N-glicano de las glicoproteínas producidas en la planta. Las células vegetales de Nicotiana pueden ser protoplastos. El método puede incluir transformar los protoplastos con uno o más vectores que codifican una o más endonucleasas de corte raro. Las una o más endonucleasas de corte raro pueden ser endonucleasas efectoras TAL. Cada una de las endonucleasas efectoras TAL puede dirigirse a una secuencia como se establece en cualquiera de las SEQ ID NO: 45-63. El método puede incluir la introducción en los protoplastos de una proteína endonucleasa efectora TAL. El método puede incluir, además, el cultivo de protoplastos para generar líneas de plantas. El método puede incluir aislar ADN genómico que comprende al menos una parte de un locus XylT o al menos una parte de un locus FucT de los protoplastos. Las células vegetales de Nicotiana pueden ser células vegetales de N benthamiana.
Este documento también incluye un método para generar una planta de Nicotiana que tiene una mutación en cada uno de una pluralidad de alelos XylT y una mutación en cada uno de una pluralidad de alelos FucT. El método puede incluir (a) cruzar una primera planta de Nicotiana que tiene una mutación en al menos un alelo XylT y una mutación en al menos un alelo FucT con una segunda planta de Nicotiana que tiene una mutación en al menos un alelo XylT y una mutación en al menos un alelo FucT, para obtener la progenie; y (b) seleccionar de la progenie una planta de Nicotiana que tiene mutaciones en una pluralidad de alelos XylT y mutaciones en una pluralidad de alelos FucT. Las mutaciones pueden haber sido inducidas por una o más endonucleasas de corte raro. Las una o más endonucleasas de corte raro pueden ser endonucleasas efectoras TAL. Cada una de las endonucleasas efectoras TAL puede unirse a una secuencia como se establece en cualquiera de las SEQ ID NO: 45-63. Cada una de las mutaciones puede ser una deleción de más de un nucleótido. La progenie puede ser homocigótica para las mutaciones en cada uno de los alelos.
Este documento también incluye una planta o célula vegetal de Nicotiana que tiene una mutación en uno o más alelos XylT y una mutación en uno o más alelos FucT, en donde los niveles de beta-1,2-xilosil- o estructura centralalfa-1,3-fucosil-azúcares en las estructuras N-glicano de las glicoproteínas producidas en la planta o célula vegetal se reducen en comparación con una planta o célula vegetal correspondiente que no contiene las mutaciones. Las mutaciones pueden estar en una o más secuencias como se establece en SEQ ID NO: 1, 2 o 3. Las mutaciones pueden haber sido inducidas por una o más endonucleasas de corte raro. Las una o más endonucleasas de corte raro pueden ser endonucleasas efectoras de tipo activador de la transcripción (TAL). Cada una de las endonucleasas efectoras TAL puede unirse a una secuencia como se establece en cualquiera de las SEQ ID NO: 45-63. La planta o célula vegetal puede contener un ácido nucleico que codifica un polipéptido heterólogo (por ejemplo, un polipéptido recombinante). Cada una de las mutaciones puede ser una deleción de más de un nucleótido. Cada uno de los uno o más alelos XylT y el uno o más alelos FucT pueden tener una deleción de una secuencia de ácido nucleico endógeno y no incluir ningún ácido nucleico exógeno. La planta o célula vegetal puede ser N. Benthamiana.
Este documento también presenta un método para producir un polipéptido. El método puede incluir (a) proporcionar una planta o célula vegetal Nicotiana que contiene una mutación en uno o más alelos XylT y una mutación en uno o más alelos FucT, en donde los niveles de beta-1,2-xilosil- o estructura central-alfa-1,3-fucosil-azúcares en estructuras N-glicano de glicoproteínas producidas en la planta o célula vegetal están disminuidos en comparación con una planta o célula vegetal correspondiente que no contiene las mutaciones, y en donde la planta o célula vegetal comprende un ácido nucleico recombinante que incluye (i) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido unido operativamente a (ii) un promotor expresable en plantas y (iii) una secuencia implicada en la terminación de la transcripción y la poliadenilación, en donde el polipéptido es heterólogo a la planta; y (b) hacer crecer la planta o la célula vegetal en condiciones y durante un tiempo suficiente para que se produzca el polipéptido heterólogo. El método puede incluir, además, aislar el polipéptido heterólogo de la planta o célula vegetal. Las mutaciones pueden haber sido inducidas por una o más endonucleasas de corte raro. Las una o más endonucleasas de corte raro pueden ser endonucleasas efectoras TAL. Cada una de las endonucleasas efectoras TAL puede unirse a una secuencia como se establece en cualquiera de las SEQ ID NO: 45-63.
Este documento también incluye un método para fabricar una planta de Nicotiana que tiene una mutación en uno o más alelos XylT y una mutación en uno o más alelos FucT. El método puede incluir (a) poner en contacto una población de células vegetales de Nicotiana que tienen alelos XylT funcionales y alelos FucT funcionales con una o más endonucleasas de corte raro dirigidas a secuencias XylT endógenas, y una o más endonucleasas de corte raro dirigidas a secuencias FucT endógenas, (b) seleccionar, de la población, una célula en la cual uno o más alelos XylT y uno o más alelos FucT se han inactivado, y (c) regenerar la célula vegetal seleccionada en una planta de Nicotiana en donde la planta de Nicotiana contiene mutaciones en uno o más alelos XylT y mutaciones en uno o más alelos FucT, y tiene niveles reducidos de beta-1,2-xilosil- o estructura central-alfa-1,3-fucosil-azúcares en estructuras de N-glicano de glucoproteínas producidas en la planta, en comparación con una planta que no contiene las mutaciones. Las células vegetales de Nicotiana pueden ser protoplastos. El método puede incluir transformar los protoplastos con uno o más vectores que codifican una o más endonucleasas de corte raro. Las una o más endonucleasas de corte raro pueden ser endonucleasas efectoras TAL. Cada una de las endonucleasas efectoras TAL puede dirigirse a una secuencia como se establece en cualquiera de las SEQ ID NO: 45-63. El método puede incluir la introducción en los protoplastos de una proteína endonucleasa efectora TAL. El método puede incluir, además, el cultivo de protoplastos para generar líneas de plantas. El método puede incluir aislar ADN genómico que comprende al menos una parte de un locus XylT o al menos una parte de un locus FucT de los protoplastos. Las células vegetales de Nicotiana pueden ser células vegetales de N. benthamiana.
Este documento también incluye un método para generar una planta de Nicotiana que tiene una mutación en uno o más alelos XylT y una mutación en uno o más alelos FucT. El método puede incluir (a) cruzar una primera planta de Nicotiana que contiene una mutación en al menos un alelo XylT y una mutación en al menos un alelo FucT con una segunda planta de Nicotiana que contiene una mutación en al menos un alelo XylT y una mutación en al menos un alelo FucT, para obtener progenie; y (b) seleccionar de la progenie una planta Nicotiana que contiene mutaciones en uno o más alelos XylT y mutaciones en uno o más alelos FucT. Las mutaciones pueden haber sido inducidas por una o más endonucleasas de corte raro. Las una o más endonucleasas de corte raro pueden ser endonucleasas efectoras TAL. Cada una de las endonucleasas efectoras TAL puede unirse a una secuencia como se establece en cualquiera de las SEQ ID NO: 45-63. Cada una de las mutaciones puede ser una deleción de más de un nucleótido. La progenie puede ser homocigótica para las mutaciones en cada uno de los alelos.
La presente invención es como se define en las reivindicaciones adjuntas.
A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente descripción tienen el mismo significado que el que entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque pueden usarse métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente descripción para practicar la invención, más abajo se describen métodos y materiales adecuados. En caso de conflicto, prevalecerá la presente especificación, incluidas las definiciones. Además, los materiales, métodos y ejemplos son solo ilustrativos y no pretenden ser limitantes.
Los detalles de una o más modalidades de la invención se exponen más abajo en los dibujos adjuntos y la descripción. Otras características, objetos y ventajas de la invención resultarán evidentes a partir de la descripción y los dibujos, y de las reivindicaciones.
Descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra los sitios diana para las endonucleasas efectoras XylT TAL. Se muestra la secuencia de ADN para ambos genes XylT (XylT1 y XylT2) (SEQ ID NO: 1; las secuencias de ADN para los dos genes XylT son las mismas en esta región), comenzando con el codón de inicio (ATG). Las secuencias subrayadas representan sitios diana de las endonucleasas efectoras TAL que reconocen los genes XylT.
La Figura 2 muestra los sitios diana para las endonucleasas efectoras FucT TAL. Se muestran las secuencias de ADN para los dos genes FucT (FucT1, SEQ ID NO: 2; FucT2, SEQ ID NO: 3), comenzando con el codón de inicio (ATG). Las secuencias subrayadas representan sitios diana para endonucleasas efectoras TAL que reconocen los genes FucT. Las diferencias de secuencia entre FucT1 y FucT2 se indican en negrita.
La Figura 3 muestra ejemplos de mutaciones inducidas por endonucleasas efectoras TAL en los genes XylT. La línea superior de cada panel muestra la secuencia de ADN del sitio de reconocimiento para las endonucleasas efectoras XylT_T04 TAL (subrayadas y en mayúsculas) en el gen XylT1 (panel superior) o XylT2 (panel inferior). Las otras secuencias muestran mutaciones representativas que fueron inducidas por unión de extremos no homólogos (NHEJ) imprecisa, con los tamaños de las deleciones dados a la derecha.
La Figura 4 muestra ejemplos de mutaciones inducidas por endonucleasas efectoras TAL en los genes FucT. La línea superior de cada panel muestra la secuencia de ADN del sitio de reconocimiento para las endonucleasas efectoras FucT2_T02 TAL (subrayadas y en mayúsculas) en el gen FucT1 (panel superior) o FucT2 (panel inferior). Las otras secuencias muestran mutaciones representativas que fueron inducidas por NHEJ imprecisa, con los tamaños de las deleciones dados a la derecha.
La Figura 5 muestra los perfiles de mutación FucT1 y FucT2 en las líneas de plantas NB13-105a y NB13-213a. Para cada alineación, las secuencias superiores son del tipo silvestre de N. benthamiana, y las secuencias inferiores son de plantas mutantes NB13-105a o NB13-213a. El sitio de reconocimiento para la endonucleasa efectora FucT2_T02 TAL está subrayado en cada alineación. La Figura 6 muestra perfiles de mutación XylT1 y XylT2 en las líneas de plantas NB15-11d y NB12-113c. Para cada alineación, las
secuencias superiores son de tipo silvestre N. benthamiana, y las secuencias inferiores son de plantas mutantes NB15-11d o NB12-113c. El sitio de reconocimiento para la endonucleasa efectora XylT_T04 TAL está subrayado en cada alineación. La Figura 7 muestra los perfiles de mutación FucT1 y FucT2 en la línea de plantas NB14-29a. Para cada alineación, las secuencias superiores son de N. benthamiana, tipo silvestre y las secuencias inferiores son de NB14-29a. El sitio de reconocimiento para la endonucleasa efectora FucT2_T02 TAL está subrayado en cada alineación.
La Figura 8 muestra los perfiles de mutación de XylT1 y XylT2 en la línea de plantas NB14-29a. Para cada alineación, las secuencias superiores son de N. benthamiana, tipo silvestre y las secuencias inferiores son de NB14-29a. El sitio de reconocimiento para la endonucleasa efectora XylT_T04 TAL está subrayado en cada alineación.
La Figura 9 compara las intensidades relativas de N-glicanos con fucosa en NB13-105a, NB13-213a y N. benthamiana tipo silvestre. Los datos de N-glicanos se generaron a partir de proteínas endógenas de N. benthamiana a través de MALDI TOF MS (espectrometría de masas de tiempo de vuelo de desorción-ionización láser asistida por matriz).
La Figura 10 compara las intensidades relativas de N-glicanos con xilosa en NB12-113c, NB15-11d y el tipo silvestre de N. benthamiana. Los datos de N-glicanos se generaron a partir de proteínas endógenas de N. benthamiana a través de MALDI TOF MS.
La Figura 11 compara las intensidades relativas de N-glicanos con fucosa y xilosa en NB14-29a y el tipo silvestre de N. benthamiana. Los datos de N-glicanos se generaron a partir de proteínas endógenas de N. benthamiana a través de MALDI TOF MS.
Descripción detallada
Este documento proporciona plantas del género Nicotiana que carecen de actividad xilosiltransferasa y fucosiltransferasa, así como métodos para generar tales plantas, y métodos para usar tales plantas para producir polipéptidos adecuados para la administración a humanos y animales. Los miembros del género Nicotiana incluyen, por ejemplo, la especie benthamiana, tabacum, sylvestris, acaulis, acuminate, africana, alata, ameghinoi, amplexicaulis, arentsii, attenuate, azambujae, benavidesii, bonariensis, burbidgeae, cavicola, clevelandii, cordifolia, corymbosa, cutleri, debneyi, excelsior, exigua, forgetiana, fragrans, glauca, glutinosa, goodspeedii, gossei, hesperis, heterantha, ingulba, kawakamii, knight-iana, langsdorffii, linearis, longibracteata, longiflora, maritime, megalosiphon, miersii, mutabilis, nesophila, noctiflora, nudicaulis, occidentalis, obtusifolia, otophora, paa, palmeri, paniculata, pauciflora, petuniodes, plumbaginifolia, quadri-valvis, raimondii, repanda, rosulata, rotundifolia, rustica, setchellii, simulans, solanifolia, spegazzinii, stenocarpa, stock- tonii, suaveolens, thrysiflora, tomentosa, tomentosiformis, truncata, umbratica, undulate, velutina, wigandioides, y wuttkei.
En N. benthamiana, hay al menos dos miembros (XylT1 y XylT2) en la familia de genes de xilosiltransferasa (XylT) y al menos dos miembros (FucT1 y FucT2) en la familia de genes de fucosiltransferasa (FucT). Ejemplos representativos de ocurrencia natural de las secuencias de nucleótidos XylT y FucT de Nicotiana se muestran en la Tabla 4. Las plantas de Nicotiana, células, partes de plantas, semillas y progenie de las mismas proporcionadas en la presente descripción pueden tener una mutación en cada uno de una pluralidad de alelos XylT y FucT endógenos, de manera que la expresión de cada gen se reduce o se inhibe completamente. Las plantas, células, partes, semillas y progenie no exhiben niveles detectables de beta-1,2-xilosil- o estructura central-alfa-1,3-fucosil-azúcares en las estructuras de N-glicano de las glicoproteínas producidas en las mismas.
Las plantas de Nicotiana, células, partes de plantas, semillas y progenie de las mismas proporcionadas en la presente descripción pueden tener una mutación en uno o más alelos XylT endógenos y uno o más alelos FucT endógenos, de manera que la expresión de cada gen se reduce (por ejemplo, se reduce parcial o completamente). El nivel reducido de expresión puede ser suficiente para producir plantas, células, partes, semillas y progenie que exhiben niveles reducidos de beta-1,2-xilosil- o estructura central-alfa-1,3-fucosil-azúcares en estructuras de N-glicano de glicoproteínas producidas allí, en comparación con los niveles de beta-1,2-xilosil- o estructura central-alfa-1,3-fucosil-azúcares en las estructuras de N-glicano de las glicoproteínas producidas en las correspondientes plantas, células, partes, semillas y progenie de control que no incluyen las mutaciones XylT y FucT.
Las plantas, células vegetales, partes de plantas, semillas y progenie de plantas proporcionadas en la presente descripción pueden generarse mediante el uso de una endonucleasa de corte raro, tal como un sistema de endonucleasa efectora TAL, para hacer desactivaciones génicas dirigidas a los genes XylT y FucT. Por lo tanto, esta descripción proporciona materiales y métodos para usar endonucleasas efectoras TAL para generar plantas y productos relacionados (por ejemplo, semillas y partes de plantas) que son particularmente adecuados para la producción de proteínas terapéuticas humanas y animales debido a las desactivaciones génicas dirigidas a todos los alelos de XylT y Genes FucT. Otras nucleasas de corte raro de secuencias específicas que se usarán para generar el material vegetal deseado, incluidas endonucleasas de direccionamiento o nucleasas con dedos de zinc manipuladas por ingeniería genética.
"Plantas" y "partes de plantas" se refieren a células, tejidos, órganos, semillas y partes cortadas (por ejemplo, raíces, hojas y flores) que conservan las características distintivas de la planta parental. "Semilla" se refiere a cualquier estructura de la planta que se forma por la diferenciación continua del óvulo de la planta, siguiendo su punto de maduración normal en la apertura de la flor, independientemente de si se forma en presencia o ausencia de fertilización e independientemente de si la estructura de la semilla es fértil o infértil.
El término "alelo(s)" significa cualquiera de una o más formas alternativas de un gen en un locus particular. En una célula diploide (o anfidiploide) de un organismo, los alelos de un gen determinado se encuentran en una ubicación o locus específicos en un cromosoma. Un alelo está presente en cada cromosoma del par de cromosomas homólogos. Los alelos "heterocigotos" son dos alelos diferentes que residen en un locus específico, colocados individualmente en los pares correspondientes de cromosomas homólogos. Los alelos "homocigotos" son dos alelos idénticos que residen en un locus específico, colocados individualmente en los pares correspondientes de cromosomas homólogos en la célula.
"Tipo silvestre", como se usa en la presente descripción, se refiere a la forma típica de una planta o un gen que ocurre más comúnmente en la naturaleza. Un "alelo XylT de tipo silvestre" es un alelo XylT de origen natural (por ejemplo, como se encuentra en plantas de Nicotiana de origen natural) que codifica una proteína XylT funcional, mientras que un "alelo XylT mutante" es un alelo XylT que no codifica una proteína XylT funcional. Dicho "alelo XylT mutante" puede incluir una o más mutaciones en su secuencia de ácido nucleico, donde las mutaciones no dan como resultado una cantidad detectable de proteína XylT funcional en la planta o célula vegetal in vivo. De manera similar, un "alelo FucT de tipo silvestre" es un alelo FucT de origen natural que codifica una proteína FucT funcional, mientras que un "alelo FucT mutante" es un alelo FucT que no codifica una proteína FucT funcional. Dicho "alelo FucT mutante" puede incluir una o más mutaciones en su secuencia de ácido nucleico, donde las mutaciones no dan como resultado una cantidad detectable de proteína FucT funcional en la planta o célula vegetal in vivo.
El término "endonucleasas de corte raro" en la presente descripción se refiere a proteínas naturales o modificadas genéticamente que tienen actividad endonucleasa dirigida a secuencias de ácido nucleico que tienen una secuencia de reconocimiento (secuencia diana) de aproximadamente 12-40 pb de longitud (por ejemplo, 14-40 pb de longitud). Las endonucleasas de corte raro típicas causan escisión dentro de su sitio de reconocimiento, dejando un corte escalonado de 4 nt con salientes 3'OH o 5'OH. Estas endonucleasas de corte raro pueden ser meganucleasas, tales como proteínas de tipo silvestre o variantes de endonucleasas de direccionamiento, más particularmente pertenecientes a la familia de los dodecapéptidos (LAGLIDADG (SEQ ID NO: 79); ver, WO 2004/067736) o pueden resultar de proteínas de fusión que asocian un dominio de unión a ADN y un dominio catalítico con actividad de escisión. Las endonucleasas efectoras TAL y las nucleasas con dedos de zinc (ZFN) son ejemplos de fusiones de dominios de unión al ADN con el dominio catalítico de la endonucleasa FokI. Las endonucleasas efectoras TAL personalizadas están disponibles comercialmente con el nombre comercial TALEN™ (Cellectis, París, Francia). Para una revisión de las endonucleasas de corte raro, ver Baker, Nature Methods 9: 23-26, 2012.
"Mutagénesis", como se usa en la presente descripción, se refiere a procesos en los que se introducen mutaciones en una secuencia de ADN seleccionada. En los métodos descritos en la presente descripción, por ejemplo, la mutagénesis se produce a través de roturas de ADN de doble cadena hechas por endonucleasas efectoras de TAL dirigidas a secuencias de ADN seleccionadas en una célula vegetal. Dicha mutagénesis da como resultado "mutaciones inducidas por endonucleasa efectora de TAL" y expresión reducida del gen diana. Después de la mutagénesis, las plantas pueden regenerarse a partir de las células tratadas mediante el uso de técnicas conocidas (por ejemplo, al plantar semillas de acuerdo con procedimientos de cultivo convencionales, seguido de autopolinización).
En algunos casos, un ácido nucleico puede tener una secuencia de nucleótidos con al menos aproximadamente un 75 por ciento de identidad de secuencia con una secuencia de nucleótidos XylT o FucT representativa. Por ejemplo, una secuencia de nucleótidos puede tener al menos 75, al menos 80, al menos 85, al menos 90, al menos 91, al menos 92, al menos 93, al menos 94, al menos 95, al menos 96, al menos 97, al menos 98, o al menos 99 por ciento de identidad de secuencia con una secuencia de nucleótidos XylT o FucT representativa y de origen natural El porcentaje de identidad de secuencia entre una secuencia de ácido nucleico o de aminoácidos particular y una secuencia referenciada por un número de identificación de secuencia particular se determina como sigue. Primero, se compara una secuencia de ácido nucleico o de aminoácido con la secuencia establecida en un número de identificación de secuencia particular mediante el uso del programa BLAST 2 Sequences (B12seq) de la versión independiente de BLASTZ que contiene la versión 2.0.14 de BLASTN y la versión 2.0.14 de BLASTP. Esta versión independiente de BLASTZ puede obtenerse en línea en fr.com/blast o en ncbi.nlm.nih.gov. Las instrucciones que explican cómo usar el programa B12seq pueden encontrarse en el archivo Léame que acompaña a BLASTz . B12seq realiza una comparación entre dos secuencias mediante el uso del algoritmo BLASTN o BLASTP. BLASTN se usa para comparar secuencias de ácidos nucleicos, mientras que BLASTP se usa para comparar secuencias de aminoácidos. Para comparar dos secuencias de ácido nucleico, las opciones se establecen como sigue: -i se configura en un archivo que contiene la primera secuencia de ácido nucleico que se va a comparar (por ejemplo, C:\seq1.txt); -j se configura en un archivo que contiene la segunda secuencia de ácido nucleico que se va a comparar (por ejemplo, C:\seq2.txt); -p se configura para blastn; -o se configura en cualquier nombre de archivo deseado (por ejemplo, C:\output.txt); -q se configura en -1; -r se configura en 2; y todas las demás opciones se dejan en su configuración predeterminada. Por ejemplo, el siguiente comando puede usarse para generar un archivo de salida que contenga una comparación entre dos secuencias: C:\Bl2seq -i c:\seq1.txt -j c:\seq2.txt -p blastn -o c:\output.txt -q -1 -r 2. Para comparar dos secuencias de aminoácidos, las opciones de Bl2seq se configuran de la siguiente manera: -i se configura en un archivo que contiene la primera secuencia de aminoácidos que se va a comparar (por ejemplo, C:\seq1.txt); -j se configura en un archivo que contiene la segunda secuencia de aminoácidos que se va a comparar (por ejemplo, C:\seq2.txt); -p se configura para blastp; -o se configura en cualquier nombre de archivo deseado (por ejemplo, C:\output.txt); y todas las demás opciones se dejan en su configuración predeterminada. Por ejemplo, el siguiente comando puede usarse para generar un archivo de salida que contenga una comparación entre dos secuencias de aminoácidos: C:\Bl2seq -i c:\seq1.txt -j c:\seq2.txt-p blastp -o c:\output.txt. Si las dos secuencias comparadas comparten homología, entonces el archivo de salida designado presentará esas regiones de homología como secuencias alineadas. Si las dos secuencias comparadas no comparten homología, entonces el archivo de salida designado no presentará secuencias alineadas.
Una vez alineados, el número de coincidencias se determina al contar el número de posiciones donde se presenta un residuo de nucleótido o aminoácido idéntico en ambas secuencias. El porcentaje de identidad de secuencia se determina al dividir el número de coincidencias por la longitud de la secuencia establecida en la secuencia identificada (por ejemplo, SEQ ID NO: 1), o por una longitud articulada (por ejemplo, 100 nucleótidos consecutivos o residuos de aminoácidos de una secuencia establecida en una secuencia identificada), seguido por la multiplicación del valor resultante por 100. Por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico que tiene 80 coincidencias cuando se alinea con la secuencia establecida en SEQ ID NO: 1 es 88,9 por ciento idéntica a la secuencia establecida en SEQ ID NO: 1 (es decir, 80 90 x 100 = 88,9). Se observa que el valor de identidad de secuencia porcentual se redondea al décimo más cercano. Por ejemplo, 75,11, 75,12, 75,13 y 75,14 se redondean a 75,1, mientras que 75,15, 75,16, 75,17, 75,18 y 75,19 se redondean a 75,2. También se observa que el valor de la longitud siempre será un número entero.
Los métodos para seleccionar secuencias diana endógenas y generar endonucleasas efectoras TAL dirigidas a tales secuencias pueden realizarse como se describe en otras partes. Ver, por ejemplo, Publicación PCT núm. WO 2011/072246. Los efectores TAL se encuentran en bacterias patógenas de plantas del género Xanthomonas. Estas proteínas juegan un papel importante en la enfermedad, o activan la defensa, al unirse al ADN del hospedador y activar genes del hospedero específicos de los efectores. (ver, por ejemplo, Gu y otros, Nature 435: 1122-1125, 2005; Yang y otros Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103: 10503-10508, 2006; Kay y otros Science 318: 648-651, 2007; Sugio y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104: 10720-10725, 2007; y Romer y otros Science 318: 645-648, 2007). La especificidad depende de un número efector-variable de repeticiones imperfectas, típicamente 34 aminoácidos (Schomack y otros, J. Plant Physiol. 163: 256-272, 2006; y WO 2011/072246). Los polimorfismos están presentes en primer lugar en las posiciones de repetición 12 y 13, que se denominan en la presente descripción como el dirresiduo variable repetitivo (RVD).
Los RVD de los efectores TAL corresponden a los nucleótidos en sus sitios diana de una manera lineal directa, un RVD a un nucleótido, con cierta degeneración y sin dependencia aparente del contexto. Este mecanismo para el reconocimiento de proteína-ADN permite la predicción del sitio diana para nuevos efectores TAL específicos de la diana, así como la selección del sitio diana y la ingeniería de nuevos efectores TAL con especificidad de unión para los sitios seleccionados.
Los dominios de unión al ADN del efector TAL pueden fusionarse con otras secuencias, tales como secuencias de endonucleasas, lo que da como resultado endonucleasas quiméricas dirigidas a secuencias de ADN seleccionadas específicas y que conducen al corte posterior del ADN en las secuencias diana o cerca de ellas. Dichos cortes (es decir, roturas de doble cadena) en el ADN pueden inducir mutaciones en la secuencia de ADN de tipo silvestre mediante NHEJ o recombinación homóloga, por ejemplo. En algunos casos, las endonucleasas efectoras TAL pueden usarse para facilitar la mutagénesis dirigida al sitio en genomas complejos, por desactivación génica o por alteración de la función del gen con gran precisión y alta eficiencia. Como se describe en los ejemplos más abajo, las endonucleasas efectoras TAL dirigidas a cada uno de los alelos XylT y FucT de N. benthamiana pueden usarse para mutagenizar los genes endógenos, lo que da como resultado plantas sin expresión detectable de estos genes. El hecho de que algunas endonucleasas (por ejemplo, Fokl) funcionen como dímeros puede usarse para mejorar la especificidad de diana de la endonucleasa efectora TAL. Por ejemplo, en algunos casos puede usarse un par de monómeros de endonucleasa efectora de TAL dirigidos a diferentes secuencias de ADN (por ejemplo, las secuencias diana subrayadas mostradas en las Figuras 1 y 2). Cuando los dos sitios de reconocimiento de endonucleasas efectoras TAL están muy próximos, como se muestra en las Figuras 1 y 2, los monómeros inactivos pueden unirse para crear una enzima funcional que escinde el ADN. Al requerir la unión del ADN para activar la nucleasa, puede crearse una enzima de restricción altamente específica del sitio.
El término "expresión" como se usa en la presente descripción se refiere a la transcripción de una secuencia de ácido nucleico particular para producir ARNm sentido o antisentido, y/o la traducción de una molécula de ARNm sentido para producir un polipéptido (por ejemplo, una proteína terapéutica), con o sin sucesos postraduccionales. "Reducir la expresión" de un gen o polipéptido en una planta o una célula vegetal incluye inhibir, interrumpir, desactivar o atenuar el gen o polipéptido, de manera que la transcripción del gen y/o la traducción del polipéptido codificado se reducen en comparación con una planta o célula vegetal correspondiente de tipo silvestre. Los niveles de expresión pueden medirse mediante el uso de métodos como, por ejemplo, la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR), transferencia de Northern, hibridación de transferencia puntual, hibridación in situ, transcripción nuclear activa y/o transcripción nuclear inactiva, protección de ARNasa o métodos inmunológicos y enzimáticos como ELISA, radioinmunoensayo y transferencia de Western.
Los métodos para usar endonucleasas efectoras TAL para generar plantas, células vegetales o partes de plantas que tienen mutaciones en genes endógenos incluyen, por ejemplo, los descritos en los Ejemplos de la presente descripción. Por ejemplo, los ácidos nucleicos que codifican las endonucleasas efectoras TAL dirigidas a secuencias XylT o FucT seleccionadas (por ejemplo, las secuencias XylT mostradas en la Figura 1 o las secuencias FucT mostradas en la Figura 2) pueden transformarse en células vegetales (por ejemplo, protoplastos), donde ellas pueden expresarse. Posteriormente, las células pueden analizarse para determinar si se han introducido mutaciones en el sitio o sitios diana, a través de ensayos basados en ácidos nucleicos o ensayos basados en proteínas para detectar niveles de expresión como se describió anteriormente, por ejemplo, o mediante el uso de ensayos basados en ácidos nucleicos (por ejemplo, PCR y secuenciación de ADN, o PCR seguida de un ensayo T7E1; Mussolino y otros, Nucleic Acids Res. 39: 9283-9293, 2011) para detectar mutaciones en los loci genómicos.
La población mutagenizada, o una generación posterior de esa población, puede cribarse para un rasgo o rasgos deseados (por ejemplo, una falta de actividades xilosiltransferasa y fucosiltransferasa, o actividades reducidas xilosiltransferasa y fucosiltransferasa) resultantes de las mutaciones. Alternativamente, la población mutagenizada, o una generación posterior de esa población, puede cribarse en busca de una mutación en un gen XylT o FucT. Por ejemplo, la progenie M2 de la generación de plantas M1 pueden evaluarse para determinar la presencia de una mutación en un gen XylT o FucT. Una "población" es cualquier grupo de individuos que comparten un acervo genético común. Como se usa en la presente descripción, "M0" se refiere a células vegetales (y plantas que crecen a partir de ellas) expuestas a una nucleasa efectora TAL, mientras que "M1" se refiere a semillas producidas por plantas M0 autopolinizadas y plantas que crecen a partir de tales semillas. "M2" es la progenie (semillas y plantas) de plantas Mi autopolinizadas, "M3" es la progenie de plantas M2 autopolinizadas y "M4" es la progenie de plantas M3 autopolinizadas. "M5" es la progenie de plantas M4 autopolinizadas. "Me", "M7", etc. son cada uno la progenie de plantas autopolinizadas de la generación anterior. El término "auto" como se usa en la presente descripción significa autopolinizado.
Una o más plantas de tabaco M1 pueden obtenerse a partir de células individuales de la planta, mutagenizada (Mo) (y las plantas cultivadas de la misma), y al menos una de las plantas pueden identificarse como que contiene una mutación en un gen XylT o FucT. Una planta de tabaco M1 puede ser heterocigótica para un alelo mutante en un locus XylT y/o FucT y, debido a la presencia del alelo de tipo silvestre, exhibe actividad xilosil- o fucosiltransferasa. Alternativamente, una planta de tabaco M1 puede tener un alelo mutante en un locus XylT o FucT y exhibir el fenotipo de falta de actividad xilosil- o fucosiltransferasa. Tales plantas pueden ser heterocigóticas y carecer de actividad xilosil- o fucosiltransferasa debido a fenómenos tales como una supresión negativa dominante, a pesar de la presencia del alelo de tipo silvestre, o pueden ser homocigóticas debido a mutaciones inducidas independientemente en ambos alelos en el locus XylT o FucT.
Una planta de tabaco que porta alelos XylT y FucT mutantes puede usarse en un programa de reproducción de plantas para crear líneas, variedades e híbridos novedosos y útiles. Por lo tanto, una planta de tabaco M1, M 2, M 3 o de generación posterior que contenga al menos una mutación en un XylT y al menos una mutación en un gen FucT puede cruzarse con una segunda planta de Nicotiana, y la progenie del cruce se identifica por la presencia de las mutaciones de los genes XylT y FucT. Se apreciará que la segunda planta de Nicotiana puede ser una de las especies y variedades descritas en la presente descripción. También se apreciará que la segunda planta de Nicotiana puede contener las mismas mutaciones XylT y FucT que la planta con la que se cruza, diferentes mutaciones XylT y FucT, o ser de tipo silvestre en los loci XylT y/o FucT.
La reproducción puede llevarse a cabo mediante procedimientos conocidos. Pueden usarse huellas dactilares de ADN, SNP o tecnologías similares en un programa de reproducción de selección asistida por marcadores (MAS) para transferir o reproducir alelos mutantes XylT y FucT en otros tabacos. Por ejemplo, un reproductor puede crear poblaciones segregantes a partir de hibridaciones de un genotipo que contiene un alelo mutante con un genotipo deseable agronómicamente. Las plantas en las generaciones F2 o retrocruzadas pueden seleccionarse mediante el uso de marcadores desarrollados a partir de secuencias XylT y FucT o fragmentos de las mismas. Las plantas identificadas como que poseen el alelo mutante pueden retrocruzarse o autopolinizarse para crear una segunda población que se cribará. En dependencia del patrón de herencia esperado o de la tecnología MAS usada, puede ser necesario autopolinizar las plantas seleccionadas antes de cada ciclo de retrocruzamiento para ayudar a identificar las plantas individuales deseadas. El retrocruzamiento u otro procedimiento de reproducción puede repetirse hasta que se recupere el fenotipo deseado del parental recurrente.
Los cruces exitosos producen plantas F1 que son fértiles y que pueden retrocruzarse con uno de los parentales si se desea. Una población de plantas en la generación F2 puede cribarse para la expresión de genes XylT y FucT, por ejemplo, se identifica una planta que no expresa XylT y FucT debido a la ausencia de genes XylT y FucT de acuerdo con métodos estándar, por ejemplo, mediante el uso de un método de PCR con cebadores basados en la información de la secuencia de nucleótidos para XylT y FucT descrito en la presente descripción. Luego, las plantas seleccionadas se cruzan con uno de los parentales y las plantas de la primera generación de retrocruzamiento (BC1) se autopolinizan para producir una población BC1F2 que se criba de nuevo para la expresión de genes variantes XylT y FucT (por ejemplo, versiones nulas de los genes XylT y FucT). El proceso de retrocruzamiento, autopolinización y cribado se repite, por ejemplo, al menos 4 veces hasta que el cribado final produce una planta que es fértil y razonablemente similar al parental recurrente. Esta planta, si se desea, puede autopolinizarse y la progenie posteriormente puede cribarse nuevamente para confirmar que la planta carece de expresión de los genes XylT y FucT. Opcionalmente, pueden realizarse análisis citogenéticos de las plantas seleccionadas para confirmar el complemento cromosómico y las relaciones de apareamiento cromosómico. La semilla del reproductor de la planta seleccionada puede producirse mediante el uso de métodos estándar que incluyen, por ejemplo, pruebas de campo, confirmación de la condición nula para XylT y FucT, y/o análisis de hojas curadas para determinar el nivel de actividad de xilosil- y fucosiltransferasa.
En situaciones donde el híbrido original F1 resultante del cruce entre un primer parental de tabaco mutante y un segundo parental de tabaco de tipo silvestre, se hibrida o retrocruza con el parental de tabaco mutante, la progenie del retrocruzamiento puede autopolinizarse para crear una generación BC1F2 que se criba para los alelos mutantes XylT y FucT.
El resultado de un programa de reproducción de plantas que usa las plantas de tabaco mutantes descritas en la presente descripción puede ser líneas, híbridos y variedades novedosos y útiles. Como se usa en la presente descripción, el término "variedad" se refiere a una población de plantas que comparten características constantes que las separan de otras plantas de la misma especie. A menudo, aunque no siempre, una variedad se vende comercialmente. Si bien posee uno o más rasgos distintivos, una variedad puede caracterizarse además por una variación general muy pequeña entre los individuos dentro de esa variedad. Puede crearse una variedad de "línea pura" mediante varias generaciones de autopolinización y selección, o propagación vegetativa a partir de un solo parental mediante el uso de técnicas de cultivo de tejidos o de células. Una variedad puede derivarse esencialmente de otra línea o variedad. Según la definición del Convenio Internacional para la Protección de las Nuevas Variedades de Plantas (2 de diciembre de 1961, revisado en Ginebra el 10 de noviembre de 1972, el 23 de octubre de 1978 y el 19 de marzo de 1991), una variedad es "esencialmente derivada "a partir de una variedad inicial si: a) se deriva predominantemente de la variedad inicial, o de una variedad que se deriva predominantemente de la variedad inicial, que conserva la expresión de los caracteres esenciales que resultan del genotipo o combinación de genotipos de la variedad inicial; b) se distingue claramente de la variedad inicial; y c) salvo las diferencias que resulten del acto de derivación, se ajusta a la variedad inicial en la expresión de los caracteres esenciales que resultan del genotipo o combinación de genotipos de la variedad inicial. Las variedades esencialmente derivadas pueden obtenerse, por ejemplo, mediante la selección de un mutante natural o inducido, una variante somaclonal, un individuo variante a partir de plantas de la variedad inicial, retrocruzamiento o transformación. Una "línea", a diferencia de una variedad, suele indicar un grupo de plantas que se utilizan de forma no comercial, por ejemplo, en la investigación de plantas. Por lo general, una línea muestra poca variación general entre individuos para uno o más rasgos de interés, aunque puede haber alguna variación entre individuos para otros rasgos.
Las variedades híbridas de tabaco pueden producirse al evitar la autopolinización de las plantas parentales femeninas (es decir, las parentales de semillas) de una primera variedad, y permitir que el polen de las plantas parentales masculinas de una segunda variedad fertilice las plantas parentales femeninas y permitir que se formen semillas híbridas Fi en las plantas femeninas. La autopolinización de las plantas femeninas puede prevenirse al castrar las flores en una etapa temprana del desarrollo de las flores. Alternativamente, puede prevenirse la formación de polen en las plantas parentales femeninas mediante el uso de una forma de esterilidad masculina. Por ejemplo, la esterilidad masculina puede producirse mediante esterilidad masculina citoplasmática (CMS) o esterilidad masculina transgénica en donde un transgén inhibe la microsporogénesis y/o la formación de polen, o la autoincompatibilidad. Las plantas parentales femeninas que contienen CMS son particularmente útiles. Para las plantas en las cuales las plantas parentales femeninas son CMS, puede recolectarse polen de plantas fértiles masculinas y aplicarse manualmente a los estigmas de las plantas progenitoras femeninas CMS, y se cosecha la semilla Fi resultante.
Las variedades y líneas descritas en la presente descripción pueden usarse para formar híbridos Fi de tabaco de un solo cruzamiento. Las plantas de las variedades parentales pueden cultivarse como poblaciones contiguas sustancialmente homogéneas para facilitar la polinización cruzada natural de las plantas parentales masculinas a las plantas parentales femeninas. La semilla F1 que se formó en las plantas parentales femeninas se cosecha selectivamente por medios convencionales. Uno también puede cultivar las dos variedades de plantas parentales en cantidad y cosechar una mezcla de la semilla híbrida F1 formada en el parental femenino y la semilla formada en el parental masculino como resultado de la autopolinización. Alternativamente, los cruces de tres vías pueden llevarse a cabo en donde un híbrido F1 de un solo cruce se usa como parental femenino y se cruza con un parental masculino diferente. Como otra alternativa, pueden crearse otros híbridos de doble cruce en donde la progenie F1 de dos cruces únicos diferentes se cruzan entre sí. La autoincompatibilidad puede usarse con una ventaja particular para prevenir la autopolinización de las parentales femeninas cuando se forma un híbrido de doble cruzamiento.
Esta descripción también proporciona métodos para producir polipéptidos (por ejemplo, glicoproteínas terapéuticas). En algunos casos, las plantas, células, partes de plantas, semillas y progenie proporcionadas en la presente descripción pueden contener una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido heterólogo (por ejemplo, un polipéptido recombinante). En algunos casos, los métodos proporcionados en la presente descripción pueden incluir proporcionar una planta, célula vegetal o parte de la planta de Nicotiana que tiene una mutación inducida por endonucleasa efectora TAL en cada uno de una pluralidad de alelos XylT y FucT endógenos (por ejemplo, en dos o más de los alelos XylT endógenos y en dos o más de los alelos FucT endógenos), donde la planta, célula vegetal o parte de la planta contiene además un ácido nucleico que codifica un polipéptido heterólogo (por ejemplo, un polipéptido recombinante). En algunos casos, los métodos proporcionados en la presente descripción pueden incluir proporcionar una planta, célula vegetal o parte de la planta de Nicotiana que tiene una mutación inducida por endonucleasa efectora TAL en uno o más de los alelos XylT y FucT endógenos (por ejemplo, en uno o más de los alelos XylT endógenos y en uno o más de los alelos FucT endógenos), donde la planta, célula vegetal o parte de la planta contiene además un ácido nucleico que codifica un polipéptido heterólogo (por ejemplo, un polipéptido recombinante). La secuencia codificante del polipéptido heterólogo puede unirse operativamente a un promotor expresable en plantas y también a una secuencia implicada en la terminación de la transcripción y la poliadenilación. En algunos casos, los métodos también pueden incluir mantener la planta o célula vegetal en condiciones (por ejemplo, temperatura, humedad, luz/oscuridad, flujo de aire y condiciones nutricionales adecuadas, en un invernadero y/o en condiciones acuosas) y durante un tiempo (por ejemplo, de 6 a 12 horas, de 12 a 24 horas, de 24 a 48 horas, de 48 horas a 7 días, de 7 días a 30 días o más de 30 días) suficiente para que se produzca el polipéptido. En algunos casos, los métodos para producir un polipéptido pueden incluir además aislar el polipéptido expresado de la planta o célula vegetal. Las técnicas para aislar tales polipéptidos pueden incluir, por ejemplo, técnicas convencionales tales como extracción, precipitación, cromatografía, cromatografía de afinidad y electroforesis.
Un "promotor expresable en plantas" es una secuencia de ADN que es capaz de controlar (iniciar) la transcripción en una célula vegetal. Esto incluye cualquier promotor de origen vegetal, así como cualquier promotor de origen no vegetal que sea capaz de dirigir la transcripción en una célula vegetal [por ejemplo, Promotores de origen viral o bacteriano como el promotor CaMV35S, promotores del gen T-DNA, promotores específicos de tejidos o específicos de órganos tales como promotores específicos de semillas, promotores específicos de órganos (por ejemplo, promotores específicos de tallo, hoja, raíz o mesófilo)].
En algunos casos, una planta, célula vegetal, parte de la planta, semilla o progenie de Nicotiana proporcionada en la presente descripción puede contener un ácido nucleico que codifica un polipéptido heterólogo. Un "polipéptido heterólogo" es un polipéptido que no se encuentra de forma natural en la planta o en las células vegetales. Esto contrasta con los polipéptidos homólogos, que son polipéptidos expresados naturalmente por la planta o las células vegetales. Los polipéptidos heterólogos y homólogos que experimentan N-glicosilación postraduccional en la presente descripción se denominan glicoproteínas heterólogas u homólogas, respectivamente.
Ejemplos de polipéptidos heterólogos que pueden producirse mediante el uso de las plantas y métodos descritos en la presente descripción para la administración a humanos o animales incluyen, sin limitación, citocinas, receptores de citocinas, factores de crecimiento, receptores de factores de crecimiento, hormonas de crecimiento, insulina, proinsulina, eritropoyetina, factores estimulantes de colonia, interleucinas, interferones, factor de necrosis tumoral, receptor del factor de necrosis tumoral, trombopoyetina, trombina, péptidos natriuréticos, factores de coagulación, factores anticoagulantes, activador del plasminógeno tisular, uroquinasa, hormona estimulante del folículo, hormona luteinizante, calcitonina, proteínas CD, proteínas CTLA, proteínas receptoras de células T y células B, proteínas morfogénicas óseas, factores neurotróficos, factor reumatoide, RANTES, albúmina, relaxina, proteína inhibidora de macrófagos, proteínas virales o antígenos, proteínas de superficie de la membrana, enzimas, proteínas reguladoras, proteínas inmunomoduladoras, receptores de direccionamiento, proteínas de transporte, superóxido dismutasa, proteína receptora acoplada a la proteína G, proteínas neuromoduladoras, antígenos (por ejemplo, antígenos bacterianos o virales) y anticuerpos o fragmentos de los mismos. En algunos casos, los polipéptidos producidos por plantas pueden usarse como vacunas.
Los "anticuerpos" incluyen anticuerpos de las clases IgD, IgG, IgA, IgM, IgE, así como anticuerpos recombinantes tales como anticuerpos monocatenarios, anticuerpos quiméricos y humanizados y anticuerpos multiespecíficos. El término "anticuerpo" también se refiere a fragmentos y derivados de todo lo anterior, y puede incluir además cualquier modificación o variantes derivatizadas de los mismos que conservan la capacidad de unirse específicamente a un epítopo. Los anticuerpos incluyen anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos humanizados o quiméricos, anticuerpos camelizados, anticuerpos camélidos, anticuerpos monocatenarios (scFv), fragmentos Fab, fragmentos F(ab')2 , fragmentos de Fvs unidos por disulfuro (sdFv), anticuerpos antiidiotípicos, intracuerpos, anticuerpos sintéticos y fragmentos de unión a epítopo de cualquiera de los anteriores. El término "anticuerpo" también se refiere a proteínas de fusión que incluyen una región equivalente a la región Fc de una inmunoglobulina.
La invención se describirá adicionalmente en los siguientes ejemplos, que no limitan el alcance de la invención descrita en las reivindicaciones.
Ejemplos
Ejemplo 1: Ingeniería de nucleasas de secuencias específicas para mutagenizar las familias de genes FucT y XylT En N. benthamiana, Se buscaron mutaciones en dos genes FucT (FucTI y FucT2) y dos genes XylT (XylTI y XylT2). Dado que cada gen tiene dos alelos, la inactivación de estos genes requirió la introducción de mutaciones en ocho sitios diana.
Para desactivar o desactivar completamente a los miembros de la familia de genes XylT en N. benthamiana, se diseñaron nucleasas específicas de secuencia que se dirigen a la región codificante de la proteína en la vecindad del codón de inicio. Los primeros 90 pb de las secuencias codificantes son idénticos entre los genes XylTI y XylT2 (Figura 1). Se diseñaron cuatro pares de endonucleasas efectoras TAL para dirigirse a la familia de genes XylT dentro de los primeros 90 pb mediante el uso de un software que identifica específicamente los sitios de reconocimiento de endonucleasas efectoras TAL, como TALENT 2.0 (Doyle y otros, Nucleic Acids Res. 40: W117-122, 2012). Los sitios de reconocimiento de endonucleasas efectoras TAL para los genes XylT están subrayados en la FIG. 1 y se enumeran en la Tabla 1. Las endonucleasas efectoras TAL se sintetizaron mediante el uso de métodos similares a los descritos en otros lugares (Cermak y otros, Nucleic Acids Res. 39: e82, 2011; Reyon y otros, Nat. Biotechnol. 30: 460-465, 2012; y Zhang y otros, Nat. Biotechnol. 29: 149-153, 2011).
Los primeros 130 pb de las secuencias codificantes de los genes FucT1 y FucT2 se conservan pero no son idénticos (Figura 2). Las endonucleasas efectoras TAL que se dirigen a la familia de genes FucT se diseñaron por ingeniería genética mediante el uso de una estrategia similar a la descrita anteriormente, pero debido a que las secuencias del gen FucT son más divergentes que XylT1 y XylT2, las variaciones de secuencia están presentes en los cuatro sitios diana de endonucleasas efectoras tAl (en negrita en la Figura 2). Los sitios de reconocimiento de endonucleasas efectoras TAL para genes FucT están subrayados en la Figura 2 y se enumeran en la Tabla 1. Los sitios diana 1 y 2 contienen polimorfismos de nucleótidos en los sitios de reconocimiento de endonucleasas efectoras TAL, por lo que se generaron dos pares de endonucleasas efectoras TAL para cada región diana para aumentar la probabilidad de que las endonucleasas efectoras TAL reconocieran su diana. Para los sitios diana 3 y 4, se producen variaciones de secuencia en las regiones espaciadoras entre los sitios de reconocimiento del ADN de la endonucleasa efectora TAL y, por tanto, un solo par de endonucleasa efectora TAL se une a la misma secuencia diana en ambos genes.
Ejemplo 2 - Actividad endonucleasa efectora FucT y XylT TAL en levadura
Para evaluar la actividad de las endonucleasas efectoras TAL que se dirigen a los genes XylT y FucT, se realizaron ensayos de actividad en levadura mediante métodos similares a los descritos en otra parte (Christian y otros, Genetics 186: 757-761,2010). Para estos ensayos, se construyó un plásmido diana con el sitio de reconocimiento de endonucleasa efectora TAL clonado en un gen indicador de 13-galactosidasa no funcional. El sitio diana estaba flanqueado por una repetición directa de la secuencia codificante de la p-galactosidasa de manera que si el gen reportero fuera escindido por la endonucleasa efectora TAL, se produciría la recombinación entre las repeticiones directas y la función se restablecería en el gen de la p-galactosidasa. La actividad de la p-galactosidasa, por lo tanto, sirvió como una medida de la actividad de escisión de la endonucleasa efectora TAL.
En el ensayo de levadura, dos de los pares de endonucleasas efectoras XylT TAL (XYL_T03 y XYL_T04) exhibieron una alta actividad de escisión en dos condiciones de temperatura distintas (es decir, 37 °C y 30 °C). Cinco de los pares de endonucleasas efectoras FucT TAL (dos para el sitio diana 1, dos para el sitio diana 2 y uno para el sitio diana 4) exhibieron altas actividades de escisión tanto a 37 °C como a 30 °C. Las actividades de escisión se normalizaron con respecto a la nucleasa de referencia, I-SceI. Los resultados se resumen en la Tabla 2.
Ejemplo 3 - Actividad de las endonucleasas efectoras FucT y XylT TAL en sus sitios diana endógenos en N. benthamiana
La actividad de la endonucleasa efectora TAL en sitios diana endógenos en N. benthamiana se midió al expresar las endonucleasas efectoras TAL en protoplastos y examinar los sitios diana de las endonucleasas efectoras TAL en busca de mutaciones introducidas por NHEJ. Los métodos para la preparación de protoplastos se realizaron como se describe en otra parte (Wright y otros, Plant J. 44: 693 - 705, 2005). Brevemente, las semillas se esterilizaron al lavarlas sucesivamente con etanol al 100%, lejía al 50% y luego con agua destilada estéril. Las semillas esterilizadas se sembraron en medio de agarosa MS suplementado con hierro. Los protoplastos se aislaron de hojas jóvenes expandidas mediante el uso del protocolo descrito por Wright y otros, (supra).
Los plásmidos que codifican la endonucleasa efectora TAL junto con un plásmido que codifica YFP se introdujeron en protoplastos de N. benthamiana por transformación mediada por PEG como se describe en otra parte (Yoo y otros, Nature Protocols 2: 1565-1572, 2007). Veinticuatro horas después del tratamiento, se midió la eficiencia de la transformación al evaluar una alícuota de los protoplastos transformados mediante el uso de un citómetro de flujo para controlar la fluorescencia de YFP. Se cosechó el resto de los protoplastos transformados y se preparó el ADN genómico mediante un método basado en CTAB. Mediante el uso del ADN genómico preparado a partir de los protoplastos como molde, se amplificó mediante PCR un fragmento de aproximadamente 300 pb que abarcaba el sitio de reconocimiento de la endonucleasa efectora TAL. A continuación, el producto del PCR se sometió a pirosecuenciación 454. Se consideró que las lecturas de secuenciación con mutaciones de inserción/deleción (indel) en la región espaciadora se habían derivado de la reparación imprecisa de un sitio de reconocimiento de endonucleasa efectora TAL escindido por NHEJ. La frecuencia de mutagénesis se calculó como el número de lecturas de secuenciación con mutaciones NHEJ del total de lecturas de secuenciación. A continuación, los valores se normalizaron mediante la eficiencia de transformación.
La actividad de los pares de endonucleasas efectoras de TAL, XylT03 y XylT04, contra sus genes diana se resume en la Tabla 3. Ambos pares de endonucleasas efectoras de TAL indujeron frecuencias muy altas de mutaciones de NHEJ tanto en XylT1 como en XylT2, que oscilan entre el 28,2 % y el 73,8 %. En la Figura 3 se muestran ejemplos de mutaciones inducidas por endonucleasas efectoras de TAL en XylT1 y XylT2. Para los pares de endonucleasas efectoras FucT 1_T02 y FucT2_T02 TAL, el sitio de reconocimiento de cada par de endonucleasas efectoras TAL se conservó en los genes FucT1 y FucT2 con la excepción de un polimorfismo de 1 pb en una de las dos endonucleasas efectoras TAL que comprenden cada par. Como se resume en la Tabla 3, estos pares de endonucleasas efectoras de TAL generaron altas frecuencias de mutaciones inducidas por NHEJ en ambos genes, que oscilan entre el 24,7 % y el 46,5 %. En la Figura 4 se muestran ejemplos de mutaciones inducidas por endonucleasas efectoras de TAL en los loci FucT1 y FucT2.
Ejemplo 4 - Líneas de N. benthamiana con mutaciones inducidas por endonucleasas efectoras TAL en XylT o FucT Se crearon líneas de N. benthamiana con mutaciones en los genes XylT o FucT. Con base en los datos de 454 pirosecuenciaciones, se eligieron los pares de endonucleasas efectoras TAL con la más alta actividad de escisión (XylT_T04 y FucT2_T02) para mutagenizar los genes XylT y FucT. Los protoplastos se aislaron de hojas estériles y se transformaron con plásmidos que codifican uno de los siguientes: (i) endonucleasa efectora TAL XylT_T04; (ii) endonucleasa efectora de TAL FucT2_T02; o (iii) YFP. Las eficiencias de transformación se controlaron mediante la administración del plásmido YFP, que se visualizó mediante el uso de un microscopio fluorescente o mediante citometría de flujo como se describió anteriormente.
Después de la transformación, se generaron callos derivados de protoplastos (Van den Elzen y otros, Plant Mol. Biol.
5: 299-302, 1985). Inmediatamente después de la transformación mediada por PEG, los protoplastos se resuspendieron en medios K3G1 a la densidad celular de 1x105/ml en una pequeña placa de petri, y se almacenaron a 25 °C en la oscuridad. El día 4 después de la transformación, cuando la mayoría de los protoplastos comenzaban su primera división celular, el cultivo de protoplastos se diluyó cuatro veces en Medio C (Van den Elzen y otros, supra). El día 7 y el día 10, los cultivos de protoplastos se diluyeron dos veces en medio MS. El día 18 después de la transformación, los callos se identificaron bajo el microscopio óptico y un mes después de la transformación, los callos derivados de protoplastos eran visibles a simple vista. Estos callos visibles se transfirieron a un medio inductor de brotes. Después de que emergieron brotes de unos pocos cm de longitud, se cortaron en la base y se transfirieron a un medio inductor de raíces. Una vez que se formaron las raíces, se transfirieron al suelo.
Se usó un pequeño trozo de tejido foliar para preparar ADN genómico de las plantas regeneradas. Las muestras de ADN se evaluaron mediante amplificación por PCR del locus diana y secuenciación de ADN para identificar aquellas plantas con mutaciones en XylT o FucT. Como se muestra en la Figura 5, la línea de plantas NB13-105a ha tenido deleciones idénticas de 13 pb en ambos alelos del gen FucT1 y deleciones idénticas de 14 pb en ambos alelos del gen FucT2. La línea de plantas NB13-213a tuvo deleciones de 20 pb y 12 pb en los dos alelos de FucT1. NB12-213a también tuvo deleciones de 13 pb y 2 pb en los dos alelos de FucT2. La línea de plantas NB12-213a, por lo tanto, tiene mutaciones en todas las dianas de FucT: los dos alelos de FucT1 y los dos alelos de FucT2. Como se muestra en la Figura 6, la línea de plantas NB15-11d tiene diferentes deleciones de 7 pb en cada alelo XylT1 y una deleción de 8 pb en un alelo de XylT2. La línea de plantas NB12-113c tiene una deleción de 7 pb en un alelo de XylT1 y deleciones de 35 pb y 5 pb en cada uno de los dos alelos de XylT2. Se recolectaron semillas de las plantas modificadas y se controló la herencia de las mutaciones en la progenie, y se confirmó la transmisión hereditaria estable de los loci modificados.
Ejemplo 5 - Líneas de N. Benthamiana con mutaciones inducidas por endonucleasas efectoras TAL en XylT y FucT Para crear líneas de Benthamiana con mutaciones en todos los alelos de los cuatro genes XylT y FucT, los protoplastos se transformaron con endonucleasas efectoras TAL, XylT_T04 y FucT2_T02 (Yoo y otros, Nature Protocols 2: 1565-1572, 2007; y Zhang et al., Plant Physiol. 161: 20-27, 2012). Como se describió anteriormente (Van den Elzen y otros, Plant Mol. Biol. 5: 299-302, 1985), las plántulas se regeneraron y se cribaron en busca de mutaciones en los genes XylT y FucT. El cribado se realizó mediante amplificación por PCR de la diana y análisis de la secuencia de ADN de los productos de amplificación.
Mediante el uso de este enfoque, se identificó que la línea de plantas NB14-29a tenía mutaciones por deleción en los ocho alelos de los cuatro loci. Esta línea de plantas es homocigótica para una deleción de 44 pb en FucT1 y heterocigótica para deleciones de 2 pb y 40 pb en FucT2 (Figura 7). Esta misma línea de plantas, NB14-29a, es homocigótica para una deleción de 5 pb en XylT 1 y es heterocigótica para deleciones de 6 pb y 549 pb en XylT2 (Figura 8). La transmisión de las mutaciones se controló en la progenie de NB14-29a, lo que demostró que las mutaciones eran hereditarias.
En estudios alternativos, líneas de N. benthamiana con mutaciones en uno o más alelos XylT se cruzan con líneas de N. benthamiana que tienen mutaciones en uno o más alelos FucT. En las generaciones posteriores, la progenie resultante se criba para aquellos individuos que son homocigóticos para todas las mutaciones presentes en las líneas parentales. Pueden realizarse cruces adicionales con otras líneas que tienen mutaciones en otros genes FucT o XylT. Dicho cruce iterativo se usa para generar plantas que son homocigóticas para los alelos mutantes de XylT y FucT. El cribado para mutaciones se realiza mediante amplificación por PCR y secuenciación directa del ADN de los productos de PCR de plantas individuales.
Ejemplo 6 - Líneas mutantes de N. benthamiana con niveles reducidos de a1,3-fucosa y que carecen de p1,2-xilosa detectable
La presencia de a1,3-fucosa y p1,2-xilosa en proteínas endógenas en líneas mutantes de N. benthamiana se evaluó mediante espectrometría de masas (North y otros, Curr. Opin. Struct. Biol. 19: 498-506, 2009). Mediante el uso de un enfoque similar (Strasser y otros, Plant Biotechnol. J. 6: 392-402, 2008), se aislaron proteínas solubles de hojas verdes de NB13-105a, NB13-213a, NB15-11d, NB12-113c y de tipo silvestre de N. benthamiana. Los N-glicanos se liberaron de las proteínas mediante digestión con péptido-N-glicosidasa A y F. Los N-glicanos liberados se purificaron mediante el uso de columnas Ultra Clean s Pe Carbograph (Alltech) y se metilaron in vitro. Los N-glicanos permetilados se analizaron mediante MALDI TOF MS (espectrometría de masas de tiempo de vuelo de desorciónionización por láser asistida por matriz) (Karas y Hillenkamp, Anal. Chem. 60: 259-280, 1988).
El análisis de N-glicosilación mostró niveles reducidos (más del 60 %) de fucosilación en NB13-105a y NB13-213a en comparación con el tipo silvestre de N. benthamiana (Figura 9). Las mutaciones de XylT1 y XylT2 en NB15-11d y NB12-113c condujeron a niveles indetectables de xilosilación en las proteínas de las hojas (Figura 10).
El análisis de N-glicosilación también se realizó en proteínas endógenas purificadas de la línea NB14-29a, que tiene mutaciones en los ocho alelos de los genes FucT y XylT (Figuras 7 y 8). Como en las líneas NB13-105a y NB13-213a, la fucosilación se redujo significativamente en NB14-29a (Figura 11). La presencia de 131,2-xilosa en proteínas endógenas también se redujo en NB 14-29a (Figura 11), pero no tanto como se observó para NB15-11d y NB12-113c (Figura 10). Esto probablemente se debió a que la línea NB14-29a tiene una mutación en marco en un alelo de XylT2 (específicamente, tiene una deleción de 6 pb, Figura 8), y este alelo probablemente puede producir una proteína funcional con actividad xilosil transferasa.
Ejemplo 7: Las líneas mutantes de N. benthamiana tienen niveles reducidos de a1,3-fucosa y p1,2-xilosa en los polipéptidos expresados
La presencia de a1,3-fucosa y p1,2-xilosa en polipéptidos heterólogos expresados en las líneas mutantes de N. benthamiana se evalúan mediante espectrometría de masas (Strasser y otros, Plant Biotechnol. J. 6: 392-402, 2008). Un polipéptido heterólogo, como una inmunoglobulina humana (por ejemplo, IgG), se expresa al introducir en las líneas mutantes de N. Benthamiana la secuencia codificante del polipéptido mediante, por ejemplo, infiltración de agrobacterias (Yang y otros, Plant J. 22: 543-551, 2000) o electroporación de protoplastos derivados de líneas mutantes. Nueve días después de la infiltración de agrobacterium o 48 horas después de la electroporación, los polipéptidos totales se extraen de plantas mutantes y la IgG se purifica mediante el uso de proteína G. La cadena pesada del anticuerpo purificado se aísla al cortar la banda correspondiente de un gel SDS-PAGE reducido. La proteína de cadena pesada en esta banda se usa para el análisis de glicanos por LC-MS como describen Strasser y otros, (supra).
Tabla 1
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Tabla 3
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Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES
    Un método para fabricar una planta de Nicotiana o una línea celular vegetal de Nicotiana que comprende una deleción en cada uno de una pluralidad de alelos XylT 1 y XylT2 y una deleción en cada uno de una pluralidad de alelos FucTI y FucT2, dicho método comprende:
    (a) Poner en contacto a una población de células vegetales de Nicotiana que comprenden alelos funcionales XylT1 y XylT2 y alelos funcionales FucT1 y FucT2 con un primer par de endonucleasas efectoras TAL (TALEN) que se une a secuencias de ácido nucleico seleccionadas del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 47 y 4 8 ; SEQ ID NO: 49 y 50; y SEQ ID NO: 51 y 52, y un segundo par de endonucleasas efectoras TAL (TALEN) que se une a secuencias de ácido nucleico seleccionadas del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 53 y 54; SEQ ID NO: 55 y 56; SEQ ID NO: 57 y 58; SEQ ID NO: 58 y 59; y SEQ ID NO: 62 y 63,
    (b) seleccionar, de dicha población, una célula en la cual cada uno de dicha pluralidad de alelos XylT1 y XylT2 y cada uno de dicha pluralidad de alelos FucT1 y FucT2 se han inactivado, y
    (c) regenerar dicha célula vegetal seleccionada en dicha planta de Nicotiana o línea celular vegetal de Nicotiana, en donde dicha planta de Nicotiana o línea celular vegetal de Nicotiana comprende dicha deleción en cada una de dicha pluralidad de alelos XylT1 y XylT2 y dicha deleción en cada una de dicha pluralidad de alelos FucT1 y FucT2, y en donde los niveles de beta-1,2-xilosil- y estructura central-alfa-1,3-fucosil-azúcares en las estructuras de N-glicano de las glicoproteínas producidas en dicha planta o línea celular vegetal están disminuidos en comparación con una planta o línea celular vegetal correspondiente que no contiene dichas deleciones.
    El método de la reivindicación 1, en donde dichas células vegetales de Nicotiana son protoplastos.
    El método de la reivindicación 2, que comprende transformar dichos protoplastos con uno o más vectores que codifican una o más endonucleasas efectoras TAL.
    El método de la reivindicación 2 o la reivindicación 3, que comprende, además, cultivar dichos protoplastos para generar una línea celular vegetal de Nicotiana.
    El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dichas células vegetales de Nicotiana son células vegetales de N. benthamiana.
    El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde dicho primer par de TALEN se une a las secuencias de ácidos nucleicos SEQ ID NO: 51 y 52, y dicho segundo par de TALEN se une a las secuencias de ácido nucleico SEQ ID NO: 58 y 59.
    Un método para producir un polipéptido heterólogo en una planta de Nicotiana o célula vegetal de Nicotiana, dicho método comprende:
    (a) fabricar dicha planta de Nicotiana o línea celular vegetal de Nicotiana de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde dicha planta o línea celular vegetal comprende un ácido nucleico recombinante que comprende (i) una secuencia de nucleótidos que codifica dicho polipéptido heterólogo unido operativamente a (ii) un promotor expresable en plantas y (iii) una secuencia implicada en la terminación de la transcripción y la poliadenilación; y
    (b) cultivar dicha planta de Nicotiana o línea celular vegetal de Nicotiana en condiciones y durante un tiempo suficiente para que se produzca dicho polipéptido heterólogo.
    El método de la reivindicación 7, que comprende, además, aislar dicho polipéptido heterólogo de dicha planta o línea celular vegetal.
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