CN104968193A - 用于生成治疗性蛋白质的植物 - Google Patents

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Abstract

提供了材料和方法以制备植物(例如烟草品种)，该植物适用于生成适用于给予人和动物的治疗性多肽，具体而言是通过在编码木糖基转移酶和岩藻糖基转移酶的基因中产生TAL效应子核酸内切酶诱导的突变。

Description

用于生成治疗性蛋白质的植物
相关申请的交叉参考
本申请要求2013年3月15日提交的美国临时申请序列号61/790,850和2012年11月1日提交的美国临时申请序列号61/721,194的优先权。
技术领域
本文涉及用于制备植物的材料和方法，所述植物适用于生成用于给予人和动物的治疗性蛋白质，具体而言是通过在编码木糖基转移酶和岩藻糖基转移酶的基因中进行靶向敲除。本文还涉及缺失木糖基转移酶和岩藻糖基转移酶活性或者具有降低的木糖基转移酶和岩藻糖基转移酶活性的烟草(Nicotiana)品种。
背景技术
与动物糖蛋白不同，植物糖蛋白具有β(1,2)木糖基和核心-α(1,3)岩藻糖基残基，且缺少末端β(1,4)半乳糖基残基和唾液酸。β-1,2-木糖基转移酶(“XylT”)催化木糖从UDP-木糖转移至蛋白质连接的N-聚糖的核心β-连接的甘露糖。该酶是植物和一些非脊椎动物物种特有的，且不存在于人或其他脊椎动物中。α-1.3-岩藻糖基转移酶(“FucT”)催化岩藻糖从GDP-岩藻糖转移至蛋白质连接的N-聚糖的核心β-连接的N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)。该酶发现于植物和动物物种(包括人)中。
发明内容
本文提供了用于制备植物的材料和方法，所述植物特别用于生成适用于给予人和动物的治疗性蛋白质，具体而言是通过在编码木糖基转移酶和岩藻糖基转移酶的基因中进行靶向敲除。本文还提供了烟草(Nicotiana)品种，其与对照烟草品种相比缺失木糖基转移酶和岩藻糖基转移酶活性或者具有降低的木糖基转移酶和岩藻糖基转移酶活性。
本发明至少部分基于以下发现，即可通过敲除编码木糖基转移酶和岩藻糖基转移酶的基因的所有拷贝来制备适用于生成用于给予人和动物的蛋白质的植物。本发明还至少部分基于缺失木糖基转移酶和岩藻糖基转移酶活性的本赛姆氏烟草(Nicotiana benthamiana)品种的开发。能够制备缺失木糖基转移酶和岩藻糖基转移酶活性的可存活植物可促进用于给予人和动物的治疗性蛋白质的生成，其与具有木糖基转移酶和岩藻糖基转移酶活性的植物中生成的蛋白质相比免疫原性或过敏性反应的发生率较低。
此外，本发明还至少部分基于：可通过使编码木糖基转移酶和岩藻糖基转移酶的基因的一个或多个拷贝敲除或突变来制备适用于生成用于给予人和动物的蛋白质的植物，从而使基因的转录和/或所编码多肽的翻译与相应野生型植物或植物细胞相比下降的发现，并且至少部分基于具有下降的木糖基转移酶和岩藻糖基转移酶活性的本赛姆氏烟草品种的开发。能够制备具有下降的木糖基转移酶和岩藻糖基转移酶活性的可存活植物也可促进用于给予人和动物的治疗性蛋白质的生成。植物生成的蛋白质中聚糖水平的降低可从该蛋白质去除一些植物特有的特性。与不具有下降的木糖基转移酶和岩藻糖基转移酶活性的植物所生成的蛋白质相比，这类蛋白质具有较低的免疫原性或过敏性反应发生率。与不具有降低的聚糖水平的蛋白质相比，这类蛋白质还具有改善的功能活性。
在一个方面，本文涉及一种烟草植物或植物细胞，其在多个XylT等位基因的每一个中都具有突变且在多个FucT等位基因的每一个中都具有突变，其中该植物或植物细胞在该植物或植物细胞所生成的糖蛋白的N-聚糖结构上不生成可检测水平的β-1,2-木糖基-糖或核心α-1,3-岩藻糖基-糖。该突变可以位于SEQ ID NO:1、2或3中所列的一条或多条序列处。该突变可以由一种或多种稀切核酸内切酶(rare-cutting endonuclease)诱导。该一种或多种稀切核酸内切酶可以是转录激活因子样(TAL)效应子核酸内切酶。该TAL效应子核酸内切酶各自可结合SEQ ID NO:45-63中任一项所列序列。该植物或植物细胞可包含编码异源多肽的核酸。该突变各自可以是多于一个的核苷酸的缺失。多个XylT等位基因和多个FucT等位基因中的每一个都可以具有内源核酸序列的缺失且不包含任何外源核酸。该植物或植物细胞可以是本赛姆氏烟草植物或植物细胞。
在另一个方面，本发明涉及一种生成多肽的方法。该方法可包括(a)提供烟草植物或植物细胞，其在多个XylT等位基因的每一个中都具有突变且在多个FucT等位基因的每一个中都具有突变，该植物或植物细胞在该植物或植物细胞所生成的糖蛋白的N-聚糖结构上不生成可检测水平的β-1,2-木糖基-糖和核心α-1,3-岩藻糖基-糖，且该植物或植物细胞含有核酸，该核酸包含(i)编码多肽的核苷酸序列，所述核苷酸序列可操作地连接于(ii)植物可表达启动子，和(iii)涉及转录终止和聚腺苷酸化的序列，其中所述多肽对所述植物是异源的；以及(b)在足以生成异源多肽的条件下使该植物或植物细胞生长足以生成异源多肽的时间。该方法还可包括从所述植物或植物细胞中分离该异源多肽。该突变可已被一种或多种稀切核酸内切酶诱导。该一种或多种稀切核酸内切酶可以是TAL效应子核酸内切酶。该TAL效应子核酸内切酶各自可结合SEQ ID NO:45-63中任一项所列序列。
在另一个方面，本文涉及一种制备烟草植物的方法，该烟草植物在多个XylT等位基因的每一个中都具有突变且在多个FucT等位基因的每一个中都具有突变。该方法可包括(a)使具有功能性XylT等位基因和功能性FucT等位基因的烟草植物细胞群体与靶向内源性XylT序列的一种或多种稀切核酸内切酶和靶向内源性FucT序列的一种或多种稀切核酸内切酶接触，(b)从该群体中选择特定细胞，其中多个XylT等位基因和多个FucT等位基因已失活，以及(c)将所选植物细胞再生为烟草植物，其中该烟草植物在多个XylT等位基因中含有突变且在多个FucT等位基因含有突变，且在该植物所生成的糖蛋白的N-聚糖结构上不生成可检测水平的β-1,2-木糖基-糖或核心α-1,3-岩藻糖基-糖。该烟草植物细胞可以是原生质体。该方法可包括使用编码一种或多种稀切核酸内切酶的一种或多种载体转化原生质体。所述一种或多种稀切核酸内切酶可以是TAL效应子核酸内切酶。该TAL效应子核酸内切酶各自可靶向SEQ ID NO:45-63中任一项所列序列。该方法可包括向原生质体内导入TAL效应子核酸内切酶蛋白。该方法还可包括培养原生质体以生成植物株系。该方法可包括从原生质体中分离包含XylT基因座的至少部分或FucT基因座的至少部分的基因组DNA。该烟草植物细胞可以是本赛姆氏烟草植物细胞。
在另一个方面，本文涉及一种生成烟草植物的方法，该烟草植物在多个XylT等位基因的每一个中都具有突变且在多个FucT等位基因的每一个中都具有突变。该方法可包括(a)将在至少一个XylT等位基因中具有突变且在至少一个FucT等位基因中具有突变的第一烟草植物与在至少一个XylT等位基因中具有突变且在至少一个FucT等位基因中具有突变的第二烟草植物杂交以获得后代，以及(b)从后代中选择在多个XylT等位基因中具有突变且在多个FucT等位基因中具有突变的烟草植物。该突变可以由一种或多种稀切核酸内切酶诱导。所述一种或多种稀切核酸内切酶可以是TAL效应子核酸内切酶。所述TAL效应子核酸内切酶各自可结合SEQID NO:45-63中任一项所列序列。该突变各自可以是多于一个核苷酸的缺失。该后代可以是各所述等位基因上突变的纯合子。
本文还涉及一种烟草植物或植物细胞，其在一个或多个XylT等位基因上具有突变且在一个或多个FucT等位基因上具有突变，其中，与不含有所述突变的相应植物或植物细胞相比，该植物或植物细胞中生成的糖蛋白的N-聚糖结构上生成的β-1,2-木糖基-糖和核心α-1,3-岩藻糖基-糖的水平降低。该突变可位于SEQ ID NO:1、2或3中所列的一条或多条序列处。该突变可以由一种或多种稀切核酸内切酶诱导。该一种或多种稀切核酸内切酶可以是转录激活因子样(TAL)效应子核酸内切酶。该TAL效应子核酸内切酶各自可结合SEQ ID NO:45-63中任一项所列序列。该植物或植物细胞可含有编码异源多肽(如重组多肽)的核酸。该突变各自可以是多于一个核苷酸的缺失。一个或多个XylT等位基因和一个或多个FucT等位基因中的每一个都可以具有内源核酸序列的缺失且不包含任何外源核酸。该植物或植物细胞可以是本赛姆氏烟草植物或植物细胞。
在另一个方面，本文涉及一种生成多肽的方法。该方法可包括(a)提供烟草植物或植物细胞，其在一个或多个XylT等位基因中具有突变且在一个或多个FucT等位基因中具有突变，其中，与不含有所述突变的相应植物或植物细胞相比，该植物或植物细胞中生成的糖蛋白的N-聚糖结构上生成的β-1,2-木糖基-糖和核心α-1,3-岩藻糖基-糖的水平降低，且该植物或植物细胞含有重组核酸，该重组核酸包含(i)编码多肽的核苷酸序列，所述核苷酸序列可操作地连接于(ii)植物可表达启动子，和(iii)涉及转录终止和聚腺苷酸化的序列，其中所述多肽对所述植物是异源的；以及(b)在足以生成异源多肽的条件下使该植物或植物细胞生长足以生成异源多肽的时间。该方法还可包括从所述植物或植物细胞中分离该异源多肽。该突变可已被一种或多种稀切核酸内切酶诱导。该一种或多种稀切核酸内切酶可以是TAL效应子核酸内切酶。该TAL效应子核酸内切酶各自可结合SEQ ID NO:45-63中任一项所列序列。
在另一个方面，本文涉及一种制备烟草植物的方法，该烟草植物在一个或多个XylT等位基因中具有突变且在一个或多个FucT等位基因中具有突变。该方法可包括(a)使具有功能性XylT等位基因和功能性FucT等位基因的烟草植物细胞群体与靶向内源性XylT序列的一种或多种稀切核酸内切酶和靶向内源性FucT序列的一种或多种稀切核酸内切酶接触，(b)从该群体中选择特定细胞，其中一个或多个XylT等位基因和一个或多个FucT等位基因已失活，以及(c)将所选植物细胞再生为烟草植物，其中该烟草植物在一个或多个XylT等位基因中含有突变且在一个或多个FucT等位基因中含有突变，且与不含有所述突变的植物相比，该烟草植物所生成的糖蛋白的N-聚糖结构上生成的β-1,2-木糖基-糖和核心α-1,3-岩藻糖基-糖水平降低。该烟草植物细胞可以是原生质体。该方法可包括使用编码一种或多种稀切核酸内切酶的一种或多种载体转化原生质体。该一种或多种稀切核酸内切酶可以是TAL效应子核酸内切酶。该TAL效应子核酸内切酶各自可靶向SEQ ID NO:45-63中任一项所列序列。该方法可包括向所述原生质体内导入TAL效应子核酸内切酶。该方法还可包括培养所述原生质体以生成植物株系。该方法可包括从原生质体中分离包含XylT基因座的至少部分或FucT基因座的至少部分的基因组DNA。该烟草植物细胞可以是本赛姆氏烟草植物细胞。
在另一个方面，本文涉及一种生成烟草植物的方法，该烟草植物在一个或多个XylT等位基因中具有突变且在一个或多个FucT等位基因中具有突变。该方法可包括(a)将在至少一个XylT等位基因中含有突变且在至少一个FucT等位基因中含有突变的第一烟草植物与在至少一个XylT等位基因中含有突变且在至少一个FucT等位基因中含有突变的第二烟草植物杂交以获得后代，以及(b)从后代中选择在一个或多个XylT等位基因中含有突变且在一个或多个FucT等位基因中含有突变的烟草植物。该突变可以由一种或多种稀切核酸内切酶诱导。该一种或多种稀切核酸内切酶可以是TAL效应子核酸内切酶。该TAL效应子核酸内切酶各自可结合SEQID NO:45-63中任一项所列序列。该突变各自可以是多于一个核苷酸的缺失。该后代可以是各所述等位基因上突变的纯合子。
除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语的意义与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的相同。虽然与本文所述类似或等同的方法和材料可用来实施本发明，但在下文描述合适的方法和材料。本文中述及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献都通过引用全文纳入本文。在抵触的情况下，以本说明书(包括定义在内)为准。此外，材料、方法和实施例都仅是说明性的，并不意在构成限制。
在附图和以下描述中详细说明了本发明的一种或多种实施方式。本发明的其他特征、目的和优势通过描述、附图以及权利要求书将是显而易见的。
附图说明
图1显示XylT TAL效应子核酸内切酶的靶位点。显示了全部两种XylT基因(XylT1和XylT2)的DNA序列(SEQ ID NO:1；两种XylT基因的DNA序列在该区域中是相同的)，从起始密码子(ATG)开始。带下划线的序列代表识别XylT基因的TAL效应子核酸内切酶的靶位点。
图2显示FucT TAL效应子核酸内切酶的靶位点。显示了两种FucT基因(FucT1，SEQ ID NO:2；FucT2，SEQ ID NO:3)的DNA序列，从起始密码子(ATG)开始。带下划线的序列代表识别FucT基因的TAL效应子核酸内切酶的靶位点。以粗体形式显示FucT1与FucT2之间的序列差异。
图3显示XylT基因中TAL效应子核酸内切酶诱导的突变的示例。各组图的顶部行显示XylT1(上图)或XylT2(下图)基因中XylT_T04TAL效应子核酸内切酶的识别位点的DNA序列(带下划线且大写字母)。其他序列显示由不精确的非同源末端连接(NHEJ)诱导的代表性突变，右侧显示缺失的大小。
图4显示FucT基因中TAL效应子核酸内切酶诱导的突变的示例。各组图的顶部行显示FucT1(上图)或FucT2(下图)基因中FucT2_T02TAL效应子核酸内切酶的识别位点的DNA序列(带下划线且大写字母)。其他序列显示由不精确的NHEJ诱导的代表性突变，右侧显示缺失的大小。
图5显示NB13-105a和NB13-213a植物株系中的FucT1和FucT2突变概况。对于各比对，顶部序列来自野生型本赛姆氏烟草，较下方的序列来自突变体植物NB13-105a或NB13-213a。各比对中FucT2_T02TAL效应子核酸内切酶的识别位点带下划线。
图6显示NB15-11d和NB12-113c植物株系中的XylT1和XylT2突变概况。对于各比对，顶部序列来自野生型本赛姆氏烟草，较下方的序列来自突变体植物NB15-11d或NB12-113c。各比对中XylT_T04TAL效应子核酸内切酶的识别位点带下划线。
图7显示NB14-29a植物株系中的FucT1和FucT2突变概况。对于各比对，顶部序列来自野生型本赛姆氏烟草，较下方的序列来自NB14-29a。各比对中FucT2_T02TAL效应子核酸内切酶的识别位点带下划线。
图8显示NB14-29a植物株系中的XylT1和XylT2突变概况。对于各比对，顶部序列来自野生型本赛姆氏烟草，较下方的序列来自突变体植物NB14-29a。各比对中XylT_T04TAL效应子核酸内切酶的识别位点带下划线。
图9比较NB13-105a、NB13-213a和野生型本赛姆氏烟草中含有岩藻糖的N-聚糖的相对强度。通过MALDI TOF MS(基体辅助激光解吸/电离飞行时间质谱)从内源性本赛姆氏烟草蛋白中生成N-聚糖数据。
图10比较NB12-113c、NB15-11d和野生型本赛姆氏烟草中含有木糖的N-聚糖的相对强度。通过MALDI TOF MS从内源性本赛姆氏烟草蛋白生成N-聚糖数据。
图11比较NB14-29a和野生型本赛姆氏烟草中含有岩藻糖和木糖的N-聚糖的相对强度。通过MALDI TOF MS从内源性本赛姆氏烟草蛋白生成N-聚糖数据。
发明详述
本文提供了缺失木糖基转移酶和岩藻糖基转移酶活性的烟草属植物，以及制备这类植物的方法，和使用这类植物生成适用于给予人和动物的多肽的方法。烟草属的成员包括，例如，本赛姆氏烟草(benthamiana)、普通烟草(tabacum)、林烟草(sylvestris)、无茎烟草(acaulis)、渐尖叶烟草(acuminata)、非洲烟草(africana)、花烟草(alata)、阿米基诺氏烟草(ameghinoi)、抱茎烟草(amplexicaulis)、阿伦兹氏烟草(arentsii)、渐狭叶烟草(attenuata)、阿姆布吉烟草(azambujae)、贝纳莫特氏烟草(benavidesii)、博内里烟草(bonariensis)、巴比德烟草(burbidgeae)、洞生烟草(cavicola)、克利夫兰氏烟草(clevelandii)、心叶烟草(cordifolia)、伞床烟草(corymbosa)、卡特勒烟草(cutleri)、迪伯纳氏烟草(debneyi)、木丝烟草(excelsior)、稀少烟草(exigua)、福尔吉特氏烟草(forgetiana)、香烟草(fragrans)、粉蓝烟草(glauca)、粘烟草(glutinosa)、古特斯比氏烟草(goodspeedii)、哥西氏烟草(gossei)、赫斯珀瑞斯烟草(hesperis)、赫特阮斯烟草(heterantha)、因古儿巴烟草(ingulba)、卡瓦卡米氏烟草(kawakamii)、耐特氏烟草(knightiana)、朗氏烟草(langsdorffi)、狭叶烟草(linearis)、长苞烟草(longibracteata)、长苞烟草(longiflora)、海滨烟草(maritina)、特大管烟草(megalosiphon)、摩西氏烟草(miersii)、姆特毕理斯烟草(mutabilis)、岛生烟草(nesophila)、夜花烟草(noctiflora)、裸茎烟草(nudicaulis)、西方烟草(occidentalis)、欧不特斯烟草(obtusifolia)、耳状烟草(otophora)、皮阿烟草(paa)、帕欧姆烟草(palmeri)、圆锥烟草(paniculata)、少花烟草(pauciflora)、矮牵牛状烟草(petunioides)、蓝茉莉叶烟草(plumbaginifolia)、夸德瑞伍氏烟草(quadrivalvis)、雷蒙德氏烟草(raimondii)、残波烟草(repanda)、莲坐叶烟草I(rosulata)、圆叶烟草(rotundifolia)、黄花烟草(rustica)、赛特氏烟草(setchelli)、拟似烟草(simulans)、茄叶烟草(solanifolia)、斯佩格茨氏烟草(spegazzinii)、莲坐叶烟草II(stenocarpa)、斯托克通氏烟草(stocktonii)、香甜烟草(suaveolens)、拟穗状烟草(thrysiflora)、绒毛烟草(tomentosa)、绒毛状烟草(tomentosiformis)、楚喀特烟草(truncata)、荫生烟草(umbratica)、波叶烟草(undulata)、颤毛烟草(velutina)、芹叶烟草(wigandioides)和伍开烟草(wuttkei)。
在本赛姆氏烟草中，存在木糖基转移酶(XylT)基因家族的至少两个成员(XylT1和XylT2)和岩藻糖基转移酶(FucT)基因家族的至少两个成员(FucT1和FucT2)。天然产生的烟草XylT和FucT核苷酸序列的代表性示例示于表4。本文提供的烟草植物、细胞、植物部分、种子及其后代可在多个内源性XylT和FucT等位基因的每一个中具有突变，使得各基因的表达下降或被完全抑制。该植物、细胞、部分、种子和后代在其中生成的糖蛋白的N-聚糖结构上不具有可检测水平的β-1,2-木糖基-糖或核心α-1,3-岩藻糖基-糖。
在一些实施方式中，本文提供的烟草植物、细胞、植物部分、种子及其后代可在一个或多个内源性XylT等位基因和一个或多个内源性FucT等位基因上具有突变，使得各基因的表达下降(如部分或完全下降)。降低的表达水平足以生成特定的植物、细胞、部分、种子和后代，与不包含XylT和FucT突变的相应对照植物、细胞、部分、种子和后代中产生的糖蛋白的N-聚糖结构上的β-1,2-木糖基-糖和核心α-1,3-岩藻糖基-糖的水平相比，上述特定的植物、细胞、部分、种子和后代中生成的糖蛋白的N-聚糖结构上的β-1,2-木糖基-糖和核心α-1,3-岩藻糖基-糖的水平降低。
本文提供的烟草植物、植物细胞、植物部分、种子和植物后代可使用稀切核酸内切酶(如TAL效应子核酸内切酶系统)制备，以在XylT和FucT基因中进行靶向敲除。因此，本发明提供了用于使用TAL效应子核酸内切酶以制备植物和相关产品(如种子和植物部分)的材料和方法，所述植物和相关产品因XylT和FucT基因的所有等位基因中的靶向敲除而特别适用于生成人和动物治疗性蛋白质。使用其他稀切、序列特异性核酸酶以制备所需植物材料，包括工程改造的寻靶核酸内切酶或锌指核酸酶。
“植物”和“植物部分”指保留亲本植物的区别特征的细胞、组织、器官、种子和切断的部分(如根、叶和花)。“种子”指在开花时的正常成熟时间点之后由植物胚珠的连续分化形成的任何植物结构，不考虑其在受精还是未受精的情况下形成，也不考虑种子结构是可育的还是不可育的。
术语“等位基因”指特定基因座处基因的一种或多种可选形式中的任一种。在生物体的二倍体(或双二倍体)细胞中，给定基因的等位基因位于染色体上的特定位置或基因座。一个等位基因存在于同源染色体对的各条染色体上。“杂合”等位基因是位于特定基因座的两个不同的等位基因，其单独地位于相应同源染色体对上。“纯合”等位基因是位于特定基因座的两个相同的等位基因，其单独地位于细胞中相应同源染色体对上。
“野生型”在本文中指植物或基因在自然中最常见的典型形式。“野生型XylT等位基因”是编码功能性XylT蛋白的天然产生的XylT等位基因(例如发现于天然产生的烟草植物内)，而“突变体XylT等位基因”是不编码功能性XylT蛋白的XylT等位基因。这类“突变体XylT等位基因”可在其核酸序列中包含一个或多个突变，其中该突变导致植物或植物细胞体内没有可检测量的功能性XylT蛋白。类似的，“野生型FucT等位基因”是编码功能性FucT蛋白的天然产生的FucT等位基因，而“突变体FucT等位基因”是不编码功能性FucT蛋白的FucT等位基因。这类“突变体FucT等位基因”可在其核酸序列中包含一个或多个突变，其中该突变导致植物或植物细胞体内没有可检测量的功能性FucT蛋白。
本文中术语“稀切核酸内切酶”指天然或工程改造的蛋白质，其具有针对含有长度为约12-40bp(如长度为14-40bp)的识别序列(目标序列)的核酸序列的核酸内切酶活性。典型的稀切核酸内切酶在其识别位点内部产生切割，形成具有3′OH或5’OH突出端的4nt交错切口。这些稀切核酸内切酶可以是大范围核酸酶，如野生型寻靶核酸内切酶或其变体蛋白质，更具体地属于十二肽家族(LAGLIDADG(SEQ ID NO:79)；参见WO2004/067736)或可以是来自关联DNA结合结构域与具有切割活性的催化结构域的融合蛋白。TAL效应子核酸内切酶和锌指核酸酶(ZFN)是DNA结合结构域与核酸内切酶FokI的催化结构域融合的示例。自定义的TAL效应子核酸内切酶可以商品名TALENTM(法国巴黎的赛勒柯蒂斯公司(Cellectis))购得。关于稀切核酸内切酶的综述，参见Baker,Nature Methods9:23-26,2012。
“诱变”在本文中指将突变导入所选DNA序列的过程。例如，在本文所述方法中，诱变经由靶向植物细胞中所选DNA序列的TAL效应子核酸内切酶生成的双链DNA断裂发生。这类诱变导致“TAL效应子核酸内切酶诱导的突变”并降低靶基因的表达。诱变后，可使用已知技术(例如根据自花受粉后的常规生长步骤种植种子)由经处理的细胞再生植物。
在一些情况下，核酸可含有与代表性XylT和FucT核苷酸序列具有约75％序列相同性的核苷酸序列。例如，核苷酸序列可与代表性、天然产生的XylT或FucT核苷酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列相同性。
如下所述测定特定核酸或氨基酸序列与特定序列识别号所指示的序列之间的序列相同性百分比。首先，使用来自含有BLASTN版本2.0.14和BLASTP版本2.0.14的BLASTZ独立版本的BLAST 2序列(Bl2seq)程序比较核酸或氨基酸序列与特定序列识别号所指示的序列。该BLASTZ独立版本可在fr.com/blast或ncbi.nlm.nih.gov在线获取。解释如何使用Bl2seq程序的说明书可参见BLASTZ附带的自述文件。Bl2seq使用BLASTN或BLASTP算法在两种序列之间进行比较。BLASTN用于比较核酸序列，而BLASTP用于比较氨基酸序列。为比较两种核酸序列，如下所述设置选项：-i设为含有待比较的第一核酸序列的文件(如C:\seq1.txt)；-j设为含有待比较的第二核酸序列的文件(如C:\seq2.txt)；-p设为blastn；-o设为任何需要的文件名(如C:\output.txt)；-q设为-1；-r设为2；且所有其他选项都设为其默认设置。例如，以下命令可用于生成含有两种序列之间比较的输出文件：C:\Bl2seq-i c:\seq1.txt-j c:\seq2.txt-p blastn-oc:\output.txt-q-1-r 2。为比较两种氨基酸序列，如下所述设置Bl2seq的选项：-i设为含有待比较的第一氨基酸序列的文件(如C:\seq1.txt)；-j设为含有待比较的第二氨基酸序列的文件(如C:\seq2.txt)；-p设为blastp；-o设为任何需要的文件名(如C:\output.txt)；且所有其他选项都设为其默认设置。例如，以下命令可用于生成含有两种氨基酸序列之间比较的输出文件：C:\Bl2seq-i c:\seq1.txt-j c:\seq2.txt-p blastp-o c:\output.txt。如果两种比较的序列具有同源性，则指定的输出文件会以经比对序列的形式显示那些同源区域。如果比较的两种序列不具有同源性，则指定的输出文件不会显示经比对的序列。
一旦进行比对，即通过对两种序列中存在相同核苷酸或氨基酸的位置的数目进行计数来测定匹配的数目。将匹配的数目除以鉴定的序列(如SEQ ID NO:1)中所列序列长度或连接的长度(如来自鉴定的序列中所列序列的100个连续核苷酸或氨基酸残基)，随后将结果值乘以100，从而测定序列相同性百分比。例如，与SEQ ID NO:1中所列序列比对时具有80个匹配的核酸序列与SEQ ID NO:1中所列序列具有88.9％相同性(即80÷90x100＝88.9)。应注意序列相同性百分比值四舍五入至小数点后第一位。例如，75.11、75.12、75.13和75.14向下四舍五入至75.1，而75.15、75.16、75.17、75.18和75.19向上四舍五入至75.2。还应注意，长度值始终是整数。
可如他处所述进行用于选择内源性目标序列和生成靶向这类序列的TAL效应子核酸内切酶的方法。参见例如，PCT公开号WO 2011/072246，其通过引用全文纳入本文。TAL效应子发现于黄单胞菌属(Xanthomonas)中的植物病原性细菌中。这些蛋白质通过结合宿主DNA并激活效应器特异性宿主基因在疾病或触发防卫方面起重要作用(参见例如，Gu等，Nature435:1122-1125,2005；Yang等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103:10503-10508,2006；Kay等，Science 318:648-651,2007；Sugio等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 104:10720-10725,2007；和等，Science 318:645-648,2007)。特异性取决于效应子-可变不完善数目(effector-variable number ofimperfect)，通常是34个氨基酸重复(Schornack等，J.Plant Physiol.163:256-272,2006；和WO 2011/072246)。多态性主要发生在重复位置12和13，本文将其称为重复可变双残基(RVD)。
TAL效应子的RVD以直接、线性形式对应于其靶位点的核苷酸，一种RVD对应于一种核苷酸，有一些简并性且没有明显的环境依赖性。该蛋白质-DNA识别机制能针对新的靶标特异性TAL效应子进行靶位点预测，以及靶位点选择和对与所选位点具有结合特异性的新TAL效应子进行工程改造。
TAL效应子DNA结合结构域可与其他序列(如核酸内切酶序列)融合，生成靶向特定、经选择的DNA序列的嵌合核酸内切酶并导致在被靶向的序列处或附近的后续DNA切割。DNA中的这类切割(即双链断裂)可通过例如NHEJ或同源重组在野生型DNA序列中诱导突变。在一些情况下，TAL效应子核酸内切酶可用于促进复杂基因组中的定点诱变，高度准确且高效地敲除或改变基因功能。如下文实施例所述，靶向本赛姆氏烟草XylT和FucT等位基因中每一个的TAL效应子核酸内切酶可用于诱变内源性基因，生成不具有这些基因的可检测表达的植物。可使用一些内切核酸酶(如FokI)以二聚物形式起作用的现象来提高TAL效应子核酸内切酶的靶标特异性。例如，在一些情况下，可使用靶向不同DNA序列的一对TAL效应子核酸内切酶单体(如图1和2中所示带下划线的靶序列)。当两个TAL效应子核酸内切酶识别位点紧邻时，如图1和2所示，无活性的单体可聚集在一起以生成切割DNA的功能性酶。通过需要DNA结合来激活核酸酶，可建立高度位点特异性的限制性酶。
术语“表达”在本文中指转录特定核酸序列以生成正义或反义mRNA，和/或翻译正义RNA分子以生成多肽(如治疗性蛋白质)，伴随或不伴随后续的翻译后事件。
对于植物或植物细胞中的基因或多肽，“降低表达”包括抑制、中断、敲除或敲减基因或多肽，使得基因的转录和/或所编码多肽的翻译与相应野生型植物或植物细胞相比降低。可使用例如以下方法测量表达水平：反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、Northern印迹、点印迹杂交、原位杂交、核连缀(nuclear run-on)和/或核失控(nuclear run-off)、RNA酶保护或免疫和酶方法(如ELISA、放射性免疫试验和western印迹)。
使用TAL效应子核酸内切酶来生成在内源性基因中具有突变的植物、植物细胞或植物部分的方法包括，例如，本文实施例中所述的那些。例如，可将编码靶向所选XylT或FucT序列(如图1所示的XylT序列或图2所示的FucT序列)的TAL效应子核酸内切酶的核酸转化至植物细胞(如原生质体)中，该核酸在其中表达。随后可以例如如上文所述通过基于核酸的试验或基于蛋白质的试验检测表达水平，或者使用基于核酸的试验(例如PCR和DNA测序，或PCR之后的T7E1试验；Mussolino等，Nucleic AcidsRes.39:9283-9293,2011)检测基因组基因座处的突变，从而对细胞进行后续分析以确定是否已将突变导入靶位点。
可以筛选诱变的群体或该群体的后代中由突变导致的所需特性(例如缺失木糖基转移酶和岩藻糖基转移酶活性或木糖基转移酶和岩藻糖基转移酶活性降低)。或者，可以筛选诱变的群体或该群体的后代的XylT或FucT基因中的突变。例如，可以评价M1植物的后代M2代中是否存在XylT或FucT基因中的突变。“群体”是具有共同的基因池的个体的任何组。如本文所使用，“M0”指与TAL效应子核酸酶接触的植物细胞(和由此长成的植物)，而“M1”指由M0植物自花授粉产生的种子和由该种子长成的植物。“M2”是自花授粉的M1植物的子代(种子和植物)，“M3”是自花授粉的M2植物的子代，且“M4”是自花授粉的M3植物的子代。“M5”是自花授粉的M4植物的子代。“M6”、“M7”等各自是前一代自花授粉植物的子代。术语“自交”在本文中指自花授粉。
一种或多种M1烟草植物可获自单个、诱变的(M0)植物细胞(和由其长成的植物)，且至少一种所述植物可以被鉴定为含有XylT或FucT基因中的突变。M1烟草植物可以是XylT和/或FucT基因座处突变体等位基因的杂合子，并由于存在野生型等位基因而表现出木糖基转移酶或岩藻糖基转移酶活性。或者，M1烟草植物可以在XylT和/或FucT基因座处具有突变体等位基因并表现出缺失木糖基转移酶或岩藻糖基转移酶活性的表型。这类植物可以是杂合子并且由于诸如显性负抑制(dominantnegative suppression)的现象而缺失木糖基转移酶或岩藻糖基转移酶活性(即便存在野生型等位基因也是如此)，或者可以由于XylT或FucT基因座处全部两个等位基因中的独立诱导的突变而成为纯合子。
携带突变的XylT和FucT等位基因的烟草植物可用于植物育种项目以创建新型且有用的株、品种和杂交体。因此，在一些实施方式中，将在XylT基因中含有至少一个突变且在FucT基因中含有至少一个突变的M1、M2、M3或后代烟草植物与第二烟草植物杂交，并鉴定其中存在XylT和FucT基因突变的杂交后代。应理解，该第二烟草植物可以是上文所述物种和品种之一。还应理解，该第二烟草植物可含有与其杂交的植物相同的XylT和FucT突变，不同的XylT和FucT突变或者在XylT和/或FucT基因座处为野生型。
可通过已知方法进行育种。DNA指纹图谱、SNP或类似技术可用于标志物辅助选择(MAS)育种项目以将突变体XylT和FucT等位基因转移或培育至其他烟草内。例如，培育者可从含有突变体等位基因的基因型与农学上需要的基因型的杂交中创建分离群。可使用由XylT和FucT序列或其片段开发的标志物筛选F2或回交代的植物。经鉴定为具有突变体等位基因的植物可回交或自花授粉以创建待筛选的第二群体。取决于预期的遗传模式或使用的MAS技术，需要在各回交循环前对所选植物进行自花授粉以辅助鉴定所需单个植物。可重复回交或其他育种过程直至恢复所需回归亲本的表型。
成功的杂交生成可育且能够在需要时与亲本之一回交的F1植物。在一些实施方式中，筛选F2代中植物群体的XylT和FucT基因表达，例如由于根据标准方法不存在XylT和FucT基因而将植物鉴定为无法表达XylT和FucT，例如使用PCR方法，其中使用基于本文所述XylT和FucT的核苷酸序列信息的引物。随后将选定的植物与亲本之一回交并使第一回交(BC1)代植物自花授粉以生成BC1F2群体，再次筛选其中变体XylT和FucT基因表达(例如沉默类型的XylT和FucT基因)。重复回交、自花授粉和筛选过程，例如重复至少4次直至最终的筛选生成可育且与回归亲本合理类似的植物。需要时，该植物可以自花授粉并且可随后再次筛选后代以确认植物缺失XylT和FucT基因表达。可任选地对所选植物进行细胞遗传分析以确认染色体互补和染色体配对关系。可使用标准方法生成培育者的所选植物的种子，包括例如田间试验、缺失XylT和FucT的沉默状态和/或分析干燥的叶片以测定木糖基转移酶和岩藻糖基转移酶活性的水平。
在将由第一、突变体烟草亲本与第二、野生型烟草亲本之间杂交得到的最初的F1杂交体杂交或回交至突变体烟草亲本的情况下，回交的后代可以自花授粉以建立BC1F2代，对其筛选突变体XylT和FucT等位基因。
使用本文所述突变体烟草植物进行的植物育种项目可获得新颖且有用的株系、杂交体和品种。本文所用术语“品种”指共有恒定特性的植物群体，该特性将其与相同种的其他植物区分开来。品种通常(但不是始终)在市场上有售。虽然具有一种或多种不同特征，但可通过品种内个体之间非常小的总体差异对该品种进行表征。“纯系”品种可通过若干代自花授粉和选择来创建，或使用组织或细胞培养技术由单一亲本无性繁殖。某一品种可基本来源于另一株系或品种。根据《保护植物新品种国际公约》(1961年12月2日，于1972年11月10日、1978年10月23日和1991年3月19日在日内瓦修订)的定义，某一品种“基本来源”于某一初始品种的前提是：a)其主要来源于该初始品种，或者来源于主要源自该初始品种的品种，同时保留该初始品种的基因型或基因型组合所导致的基本特性的表达；b)其与该初始品种明显不同；以及c)除了衍生作用导致的差异外，其在该初始品种的基因型或基因型组合所导致的基本特性的表达方面与该初始品种一致。基本衍生的品种可通过例如选择天然或诱导的突变体、体细胞克隆变体、来自初始品种、回交或转化的植物的变体个体来获得。不同于某一品种的某一“株系”通常指非商业使用(例如在植物研究中使用)的一组植物。某一株系通常显示一种或多种感兴趣特征在个体之间的微小总体差异，但对于其他特征而言个体之间可能存在一些差异。
可通过以下方法生成杂交体烟草品种：阻止第一品种的雌性亲本植物(即种子亲本)的自花授粉，允许来自第二品种的雄性亲本植物的花粉使该雌性亲本植物受精，并允许F1杂交体种子在该雌性植物上形成。可通过在花发育早期阶段对花进行去雄来阻止雌性植物的自花授粉。或者，可使用雄性不育的方式避免在雌性亲本植物上形成花粉。例如，可通过胞质雄性不育(CMS)或转基因雄性不育(其中转基因抑制小孢子发生和/或花粉形成)或自交不亲和来产生雄性不育。含有CMS的雌性亲本植物特别有用。在雌性亲本植物是CMS的实施方式中，从雄性能育植物中收获花粉并人工施涂在CMS雌性亲本植物的柱头上，随后收获得到的F1种子。
本文所述品种和株系可用于形成单交烟草F1杂交体。在这类实施方式中，可以基本均匀间隔群体的形式种植亲本品种的植物以促进从雄性亲本植物至雌性亲本植物的天然交叉授粉。通过常规方法选择性地收获雌性亲本植物上形成的F1种子。也可整体种植两种亲本植物品种并收获通过自花授粉产生的雄性亲本上形成的种子和雌性亲本上形成的F1杂交种子的掺混物。或者，可进行三方杂交(three-way crosses)，其中单交F1杂交体用作雌性亲本并与一种不同的雄性亲本杂交。作为另一种选择，可创建双重杂交(double-cross)的杂交体，其中使两种不同单交的F1后代相互杂交。自交不亲和性可特别有利于阻止在形成双重交杂的杂交体时雌性亲本的自花授粉。
本发明还提供了生成多肽(如治疗性糖蛋白)的方法。在一些情况下，本文提供的植物、细胞、植物部分、种子和后代可含有编码异源多肽(如重组多肽)的核酸分子。在一些情况下，本文提供的方法可包括提供在多个内源性XylT和FucT等位基因(例如在两个或更多个内源性XylT等位基因中和两个或更多个内源性FucT等位基因中)的每一个中都具有TAL效应子内切核酸酶诱导的突变的烟草植物、植物细胞或植物部分，其中该植物、植物细胞或植物部分还含有编码异源多肽(如重组多肽)的核酸。在一些情况下，本文提供的方法可包括提供在一个或多个内源性XylT和FucT等位基因中(例如在一个或多个内源性XylT等位基因中和一个或多个内源性FucT等位基因中)具有TAL效应子内切核酸酶诱导的突变的烟草植物、植物细胞或植物部分，其中该植物、植物细胞或植物部分还含有编码异源多肽(如重组多肽)的核酸。异源多肽的编码序列可被可操作地连接至植物可表达的启动子，且还可被连接至涉及转录终止和聚腺苷酸化的序列。在一些情况下，该方法还可包括使植物或植物细胞在足以生成多肽的条件下(例如合适的温度、湿度、明/暗、气流和营养条件，在温室中和/或在水性条件下)保持足以生成多肽的时间(例如6至12小时、12至24小时、24至48小时、48小时至7天、7天至30天，或超过30天)。在一些情况下，用于生成多肽的方法还可包括从植物或植物细胞分离表达的多肽。用于分离这类多肽的技术可包括例如常规技术，如提取、沉淀、色谱、亲和色谱和电泳。
“植物可表达启动子”是能够在植物细胞中控制(起始)转录的DNA序列。其包括任何植物来源的启动子以及能够在植物细胞中指导转录的任何非植物来源的启动子[例如，病毒或细菌来源的启动子(如CaMV35S启动子)、T-DNA基因启动子、组织特异性或器官特异性启动子(如种子特异性启动子)、器官特异性启动子(如茎、叶、根或叶肉特异性启动子)]。
在一些情况下，本文提供的烟草植物、植物细胞、植物部分、种子或后代可含有编码异源多肽的核酸。“异源多肽”是：不在植物或植物细胞中天然产生的多肽。这与同源多肽相反，其是由植物或植物细胞天然表达的多肽。经历翻译后N-糖基化的异源和同源多肽在本文中分别称作异源或同源糖蛋白。
可使用本文所述植物和方法生成的用于给予人或动物的异源多肽的示例包括但不限于：细胞因子、细胞因子受体、生长因子、生长因子受体、生长激素、胰岛素、胰岛素原、红细胞生成素、集落刺激因子、白介素、干扰素、肿瘤坏死因子、肿瘤坏死因子受体、促血小板生成素、凝血酶、利钠肽、凝血因子、抗凝血因子、组织纤溶酶原激活物、尿激酶、卵泡刺激素、黄体化激素、降钙素、CD蛋白、CTLA蛋白、T细胞和B细胞受体蛋白、骨形态发生蛋白、神经营养因子、类风湿因子、RANTES、白蛋白、松弛素、巨噬细胞抑制蛋白、病毒蛋白质或抗原、表面膜蛋白、酶、调节蛋白、免疫调节蛋白、寻靶受体、转运蛋白、超氧化物歧化酶、G-蛋白偶联受体蛋白、神经调节蛋白、抗原(例如细菌或病毒抗原)和抗体或其片段。在一些情况下，植物生成的多肽可用作疫苗。
“抗体”包括抗体类型IgD、IgG、IgA、IgM、IgE以及重组抗体(如单链抗体、嵌合和人源化抗体以及多特异性抗体)。术语“抗体”还指前述所有物质的片段和衍生物，且还可包括保留特异性结合表位能力的其任何修饰或衍生的变体。抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体、人源化或嵌合抗体、骆驼科动物化抗体(camelized antibody)、骆驼科动物抗体(camelidantibody)、单链抗体(scFv)、Fab片段、F(ab')2片段、二硫键连接的Fvs(sdFv)片段、抗独特型抗体、胞内抗体(intra-body)、合成的抗体和上述任一种的表位结合片段。术语“抗体”还指包含相对于免疫球蛋白Fc区的区域的融合蛋白。
以下实施例进一步描述了本发明，这些实施例并不限制权利要求书所述的本发明范围。
实施例
实施例1–工程改造序列特异性核酸酶以诱变FucT和XylT基因家族
在本赛姆氏烟草中，在两种FucT基因(FucT1和FucT2)和两种XylT基因(XylT1和XylT2)中寻求突变。由于各基因具有两个等位基因，这些基因的失活需要在八个靶位点导入突变。
为使本赛姆氏烟草中XylT基因家族的成员完全失活或敲除，设计了序列特异性核酸酶，其靶向起始密码子附近的蛋白质编码区。XylT1和XylT2基因的最初90-bp编码序列相同(图1)。使用特异性鉴定TAL效应子核酸内切酶识别位点的软件(如TALE-NT 2.0(Doyle等，Nucleic AcidsRes.40:W117-122,2012))设计了四对TAL效应子核酸内切酶对，以在最初的90bp内靶向XylT基因家族。XylT基因的TAL效应子核酸内切酶识别位点在图1中带下划线并列于表1。使用与他处所述的那些方法类似的方法合成TAL效应子核酸内切酶(Cermak等，Nucleic Acids Res.39:e82,2011；Reyon等，Nat.Biotechnol.30:460-465,2012；和Zhang等，Nat.Biotechnol.29:149-153,2011)。
FucT1和FucT2基因的最初130-bp编码序列保守但不相同(图2)。使用与上文所述策略类似的策略工程改造靶向FucT基因家族的TAL效应子核酸内切酶，但因为FucT基因序列比XylT1和XylT2差异更大，在全部四个TAL效应子核酸内切酶识别位点中都存在序列变异(图2中粗体)。FucT基因的TAL效应子核酸内切酶识别位点在图2中带下划线并列于表1。靶位点1和2在TAL效应子核酸内切酶识别位点中包含核苷酸多态性，因此针对各靶区域生成了两个TAL效应子核酸内切酶对，以增加TAL效应子核酸内切酶识别其靶标的可能性。对于靶位点3和4，序列变异出现在TAL效应子核酸内切酶DNA识别位点之间的间隔子区域中，因此单个TAL效应子核酸内切酶对结合两种基因中相同的靶序列。
实施例2–酵母中的FucT和XylTTAL效应子核酸内切酶活性
为评估靶向XylT和FucT基因的TAL效应子核酸内切酶的活性，通过与他处所述方法(Christian等，Genetics 186:757-761,2010)类似的方法在酵母中进行活性试验。对于这些试验，构建目的质粒，其中将TAL效应子核酸内切酶识别位点克隆至非功能性β-半乳糖苷酶报告基因中。靶位点侧接β-半乳糖苷酶编码序列的直接重复，从而如果报告基因被TAL效应子核酸内切酶切割，则在直接重复之间会发生重组并修复β-半乳糖苷酶基因的功能。因此，β-半乳糖苷酶活性被用作TAL效应子核酸内切酶切割活性的度量。
在酵母试验中，两个XylT TAL效应子核酸内切酶对(XYL_T03和XYL_T04)在两种不同温度条件(即37℃和30℃)下具有高切割活性。五个FucT TAL效应子核酸内切酶对(两个针对靶位点1、两个针对靶位点2且一个针对靶位点4)在37℃和30℃下都表现出高切割活性。将切割活性对基准核酸酶I-SceI进行标准化。结果总结在表2中。
实施例3–本赛姆氏烟草中FucT和XylT TAL效应子核酸内切酶在其内 源性靶位点处的活性
通过在原生质体中表达TAL效应子核酸内切酶并研究TAL效应子核酸内切酶靶位点的通过NHEJ导入的突变，来测量本赛姆氏烟草中内源性靶位点处TAL效应子核酸内切酶活性。如他处所述进行用于原生质体制备的方法(Wright等，Plant J.44:693-705,2005)。简言之，通过依次使用100％乙醇、50％漂白剂和无菌蒸馏水清洗种子来进行灭菌。将灭菌的种子置于补充有铁的MS琼脂糖培养基上。使用Wright等(同上)所述实验方案从年幼的展开的叶片中分离原生质体。
如他处所述通过PEG介导的转化将编码TAL效应子核酸内切酶的质粒与编码YFP的质粒导入本赛姆氏烟草原生质体(Yoo等，NatureProtocols 2:1565-1572,2007)。处理后24小时，通过使用流式细胞仪监测YFP荧光来评价转化的原生质体的等分试样，从而检测转化效率。收获剩余的转化的原生质体，并通过基于CTAB的方法制备基因组DNA。使用从原生质体制备的基因组DNA作为模板，通过PCR扩增包含TAL效应子核酸内切酶识别位点的约300-bp片段。随后对PCR产物进行454焦磷酸测序。认为间隔子区域中具有插入/缺失(indel)突变的测序读数来源于通过NHEJ进行的经切割TAL效应子核酸内切酶识别位点的不精确修复。诱变频率计算为具有NHEJ突变的测序读数数目除以总测序读数。随后通过转化效率对数值进行标准化。
表3中总结了TAL效应子核酸内切酶对XylT03和XylT04针对其靶基因的活性。两种TAL效应子核酸内切酶对在XylT1和XylT2中都诱导非常高频率的NHEJ突变，范围为28.2％至73.8％。XylT1和XylT2中TAL效应子核酸内切酶诱导的突变的示例示于图3。对于FucT1_T02和FucT2_T02TAL效应子核酸内切酶对，各TAL效应子核酸内切酶对的识别位点在FucT1和FucT2基因中都是保守的，例外是包含各对的两种TAL效应子核酸内切酶之一中的1-bp多态性。如表3总结的那样，这些TAL效应子核酸内切酶对在两种基因中都生成高频率的NHEJ诱导的突变，范围为24.7％至46.5％。FucT1和FucT2基因座上TAL效应子核酸内切酶诱导的突变的示例示于图4。
实施例4–在XylT或FucT中具有TAL效应子核酸内切酶诱导的突变的 本赛姆氏烟草株系
创建在XylT或FucT基因中具有突变的本赛姆氏烟草株系。基于454焦磷酸测序数据，选择具有最高切割活性的TAL效应子核酸内切酶对(XylT_T04和FucT2_T02)来诱变XylT和FucT基因。从无菌叶中分离原生质体，并使用编码以下物质之一的质粒转化：(i)TAL效应子核酸内切酶XylT_T04；(ii)TAL效应子核酸内切酶FucT2_T02；或(iii)YFP。通过递送YFP质粒监测转化效率，其使用荧光显微镜或通过前文所述流式细胞术来观察。
转化后，产生原生质体衍生的愈伤组织(Van den Elzen等，Plant Mol.Biol.5:299-302,1985)。PEG介导的转化后，立即在小培养皿中以1x105个/ml的细胞密度将原生质体重悬于K3G1培养基中，并在黑暗中在25℃下储存。在转化后第4天，当大部分原生质体开始其第一次细胞分裂时，将原生质体培养物在培养基C中稀释四倍(Van den Elzen等，同上)。在第7天和第10天，将原生质体培养物在MS培养基中稀释两倍。在转化后第18天，在光学显微镜下鉴定愈伤细胞，在转化后一个月，原生质体衍生的愈伤组织肉眼可见。将这些可见的愈伤组织转移至生芽培养基。出现数厘米的芽后，在基部将其切割并转移至生根培养基中。一旦形成根，即将其转移至土壤中。
使用小片叶组织来从再生植物制备基因组DNA。通过靶基因座的PCR扩增和DNA测序来评估DNA样品以鉴定在XylT或FucT中具有突变的那些植物。如图5所示，植物株系NB13-105a在FucT1基因的两个等位基因中都维持相同的13bp缺失，其在FucT2基因的两个等位基因中都维持相同的14bp缺失。植物株系NB13-213a在FucT1的两个等位基因中维持20bp和12bp缺失。NB12-213a在FucT2的两个等位基因中也维持13bp和2bp缺失。因此，植物株系NB12-213a在所有FucT靶标(FucT1的两个等位基因和FucT2的两个等位基因)中都具有突变。如图6所示，植物株系NB15-11d在各XylT1等位基因中都具有不同的7bp缺失且在XylT2的一个等位基因中具有8bp缺失。植物株系NB12-113c在XylT1的一个等位基因中都具有7bp缺失且在XylT2的两个等位基因中的每一个中都具有35bp和5bp缺失。从经修饰的植物收集种子，并在后代中监测突变的遗传，确认经修饰基因座的稳定、可遗传传递。
实施例5–在XylT和FucT中具有TAL效应子核酸内切酶诱导的突变的 本赛姆氏烟草株系
为创建在全部四个XylT和FucT具有的所有等位基因中都具有突变的本赛姆氏烟草株系，同时使用TAL效应子核酸内切酶XylT_T04和FucT2_T02转化原生质体(Yoo等，Nature Protocols 2:1565-1572,2007；和Zhang等，Plant Physiol.161:20-27,2012)。如上文所述(Van den Elzen等，Plant Mol.Biol.5:299-302,1985)，再生小植株并筛选XylT和FucT基因中的突变。通过靶标的PCR扩增和扩增产物的DNA序列分析来进行筛选。
使用该方法，鉴定了植物株系NB14-29a，其在四个基因座的所有八个等位基因中都具有缺失突变。该植物株系对于FucT1处的44bp缺失而言是纯合子且对于FucT2处的2bp和40bp缺失而言是杂合子(图7)。同一植物株系NB14-29a对于XylT1处的5bp缺失而言是纯合子且对于XylT2处的6bp和549bp缺失而言是杂合子(图8)。在NB14-29a的后代中监测突变的传递，显示突变是可遗传的。
在替代性研究中，将在一个或多个XylT等位基因中具有突变的本赛姆氏烟草株系与在一个或多个FucT等位基因中具有突变的本赛姆氏烟草株系杂交。在随后各代中，筛选所得后代中对于全部株系中存在的所有突变都是纯合子的那些个体。可与在其他FucT或XylT基因中具有突变的其他株系进行额外的杂交。这些迭代杂交用于生成对于XylT和FucT的突变等位基因而言是纯合子的植物。从单个植物中通过PCR扩增和对PCR产物的直接DNA测序来筛选突变。
实施例6–具有降低的α1,3-岩藻糖水平且缺失可检测的β1,2-木糖的突变 体本赛姆氏烟草株系
通过质谱评估突变体本赛姆氏烟草株系中的内源性蛋白质上的α1,3-岩藻糖和β1,2-木糖的存在(North等，Opin.Struct.Biol.19:498-506,2009)。使用类似的方法(Strasser等，Plant Biotechnol.J.6:392-402,2008)，从NB13-105a、NB13-213a、NB15-11d、NB12-113c和野生型本赛姆氏烟草的绿叶分离可溶性蛋白质。通过使用肽-N-糖苷酶A和F消化，以从蛋白质释放N-聚糖。使用超净SPE Carbograph柱(奥泰克公司(Alltech))纯化释放的N-聚糖并在体外甲基化。通过MALDI TOF MS(基体辅助激光解吸电离飞行时间质谱)分析全甲基化的N-糖链(Karas和Hillenkamp,Anal.Chem.60:259-280,1988)。
N-糖基化分析显示，与野生型本赛姆氏烟草相比，NB13-105a和NB13-213a中的岩藻糖基化水平降低(超过60％)(图9)。NB15-11d和NB12-113c中XylT1和XylT2的突变导致叶蛋白上不可检测的木糖基化水平(图10)。
还在从株系NB14-29a中纯化的内源性蛋白质上进行N-糖基化分析，该株系在FucT和XylT基因的所有八个等位基因上都具有突变(图7和8)。如图在株系NB13-105a和NB13-213a中那样，NB14-29a中岩藻糖基化显著降低(图11)。NB14-29a中内源性蛋白质上存在的β1,2-木糖也显著降低(图11)，但程度不及NB15-11d和NB12-113c中所观察到的程度(图10)。这可能是因为株系NB14-29a在XylT2的一个等位基因中具有框内突变(具体而言，其具有6bp缺失，图8)，且该等位基因可能能够生成具有木糖基转移酶活性的功能性蛋白。
实施例7–突变体本赛姆氏烟草株系降低了表达的多肽上的α1,3-岩藻糖 和β1,2-木糖水平
通过质谱评估突变体本赛姆氏烟草株系中表达的多肽上的α1,3-岩藻糖和β1,2-木糖的存在(Strasser等，Plant Biotechnol.J.6:392-402,2008)。通过将异源多肽(如人免疫球蛋白(如IgG))的编码序列导入突变体本赛姆氏烟草株系中(例如通过突变体株系衍生的原生质体的电穿孔和农杆菌浸润(Yang等，Plant J.22:543-551,2000))来表达该异源多肽。农杆菌浸润后九天或电穿孔后48小时，从突变体植物中提取总多肽，并使用蛋白G纯化IgG。通过从还原型SDS-PAGE凝胶中切割相应条带来分离纯化的抗体的重链。将该条带中的重链蛋白用于通过LC-MS进行的聚糖分析，如Strasser等所述(同上)。
其他实施方式
应理解虽然本发明已结合其详述进行描述，但以上描述意在说明而不是限制本发明的范围，该范围由所附权利要求的范围限定。其他方面、优点和修改在以下权利要求的范围内。

Claims (58)

1.一种烟草(Nicotiana)植物或植物细胞，其在多个XylT等位基因的每一个中包含突变且在多个FucT等位基因的每一个中都包含突变，所述植物或植物细胞在所述植物或植物细胞所生成的糖蛋白的N-聚糖结构上不生成可检测水平的β-1,2-木糖基-糖或核心α-1,3-岩藻糖基-糖。
2.如权利要求1所述的植物或植物细胞，所述突变位于SEQ ID NO:1、2或3中所列的一条或多条序列处。
3.如权利要求1所述的植物或植物细胞，所述突变由一种或多种稀切核酸内切酶诱导。
4.如权利要求3所述的植物或植物细胞，所述一种或多种稀切核酸内切酶是转录激活因子样(TAL)效应子核酸内切酶。
5.如权利要求4所述的植物或植物细胞，所述TAL效应子核酸内切酶各自结合SEQ ID NO:45-63中任一项所示的序列。
6.如权利要求1所述的植物或植物细胞，所述植物或植物细胞包含编码异源多肽的核酸。
7.如权利要求1所述的植物或植物细胞，所述突变各自是多于一个核苷酸的缺失。
8.如权利要求1所述的植物或植物细胞，所述多个XylT等位基因和所述多个FucT等位基因各自具有内源性核酸序列的缺失且不包含任何外源性核酸。
9.如权利要求1所述的植物或植物细胞，所述植物或植物细胞是本赛姆氏(N. benthamiana)烟草植物或植物细胞。
10.一种生成多肽的方法，所述方法包括：
(a)提供烟草植物或植物细胞，其在多个XylT等位基因的每一个中包含突变且在多个FucT等位基因的每一个中包含突变，所述植物或植物细胞在所述植物或植物细胞所生成的糖蛋白的N-聚糖结构上不生成可检测水平的β-1,2-木糖基-糖和核心α-1,3-岩藻糖基-糖，且所述植物或植物细胞包含如下核酸，所述核酸包含(i)编码多肽的核苷酸序列，所述核苷酸序列可操作地连接于(ii)植物可表达启动子和(iii)涉及转录终止和聚腺苷酸化的序列，其中所述多肽对所述植物是异源的；以及
(b)在足以生成所述异源多肽的条件下使所述植物或植物细胞生长足以生成所述异源多肽的时间。
11.如权利要求10所述的方法，所述方法还包括从所述植物或植物细胞分离所述异源多肽。
12.如权利要求10所述的方法，所述突变由一种或多种稀切核酸内切酶诱导。
13.如权利要求12所述的方法，所述一种或多种稀切核酸内切酶是TAL效应子核酸内切酶。
14.如权利要求13所述的方法，所述TAL效应子核酸内切酶各自结合SEQ ID NO:45-63中任一项所示的序列。
15.一种制备烟草植物的方法，所述烟草植物在多个XylT等位基因的每一个中包含突变且在多个FucT等位基因的每一个中包含突变，所述方法包括：
(a)使包含功能性XylT等位基因和功能性FucT等位基因的烟草植物细胞群体与一种或多种靶向内源性XylT序列的稀切核酸内切酶和一种或多种靶向内源性FucT序列的稀切核酸内切酶接触，
(b)从所述群体中选择特定细胞，所述细胞中多个XylT等位基因和多个FucT等位基因已失活，以及
(c)使所述选定的植物细胞再生为烟草植物，所述烟草植物在多个XylT等位基因中包含突变且在多个FucT等位基因中包含突变，且不在所述植物中生成的糖蛋白的N-聚糖结构上生成可检测水平的β-1,2-木糖基-糖或核心α-1,3-岩藻糖基-糖。
16.如权利要求15所述的方法，所述烟草植物细胞是原生质体。
17.如权利要求16所述的方法，所述方法包括使用编码一种或多种稀切核酸内切酶的一种或多种载体转化所述原生质体。
18.如权利要求17所述的方法，所述一种或多种稀切核酸内切酶是TAL效应子核酸内切酶。
19.如权利要求18所述的方法，所述TAL效应子核酸内切酶各自靶向SEQ ID NO:45-63中任一项所示的序列。
20.如权利要求16所述的方法，所述方法包括将TAL效应子核酸内切酶蛋白导入所述原生质体。
21.如权利要求16所述的方法，所述方法还包括培养所述原生质体以生成植物株系。
22.如权利要求16所述的方法，所述方法包括从所述原生质体分离包含XylT基因座的至少部分或FucT基因座的至少部分的基因组DNA。
23.如权利要求15所述的方法，所述烟草植物细胞是本赛姆氏烟草植物细胞。
24.一种生成烟草植物的方法，所述烟草植物在多个XylT等位基因的每一个中包含突变且在多个FucT等位基因的每一个中包含突变，所述方法包括：
(a)将在至少一个XylT等位基因中包含突变且在至少一个FucT等位基因中包含突变的第一烟草植物与在至少一个XylT等位基因中包含突变且在至少一个FucT等位基因中包含突变的第二烟草植物杂交以获得后代；以及
(b)从所述后代选择在多个XylT等位基因中包含突变且在多个FucT等位基因中包含突变的烟草植物。
25.如权利要求24所述的方法，所述突变由一种或多种稀切核酸内切酶诱导。
26.如权利要求25所述的方法，所述一种或多种稀切核酸内切酶是TAL效应子核酸内切酶。
27.如权利要求26所述的方法，所述TAL效应子核酸内切酶各自结合SEQ ID NO:45-63中任一项所示的序列。
28.如权利要求24所述的方法，所述突变各自是多于一个核苷酸的缺失。
29.如权利要求24所述的方法，所述后代就各所述等位基因处的所述突变而言是纯合子。
30.一种烟草植物或植物细胞，其在一个或多个XylT等位基因中包含突变且在一个或多个FucT等位基因中包含突变，其中，与不含所述突变的相应植物或植物细胞相比，所述植物或植物细胞中生成的糖蛋白的N-聚糖结构上的β-1,2-木糖基-糖和核心α-1,3-岩藻糖基-糖的水平降低。
31.如权利要求30所述的植物或植物细胞，所述突变位于SEQ ID NO:1、2或3中所列的一条或多条序列处。
32.如权利要求30所述的植物或植物细胞，所述突变由一种或多种稀切核酸内切酶诱导。
33.如权利要求32所述的植物或植物细胞，所述一种或多种稀切核酸内切酶是转录激活因子样(TAL)效应子核酸内切酶。
34.如权利要求33所述的植物或植物细胞，所述TAL效应子核酸内切酶各自结合SEQ ID NO:45-63中任一项所示的序列。
35.如权利要求30所述的植物或植物细胞，所述植物或植物细胞包含编码重组多肽的核酸。
36.如权利要求30所述的植物或植物细胞，所述突变各自是多于一个核苷酸的缺失。
37.如权利要求30所述的植物或植物细胞，所述一个或多个XylT等位基因和所述一个或多个FucT等位基因各自具有内源性核酸序列的缺失且不包含任何外源性核酸。
38.如权利要求30所述的植物或植物细胞，所述植物或植物细胞是本赛姆氏烟草植物或植物细胞。
39.一种生成多肽的方法，所述方法包括：
(a)提供烟草植物或植物细胞，其在一个或多个XylT等位基因中包含突变且在一个或多个FucT等位基因中包含突变，其中，所述植物或植物细胞中生成的糖蛋白的N-聚糖结构上的β-1,2-木糖基-糖和核心α-1,3-岩藻糖基-糖的水平与不含有所述突变的相应植物或植物细胞相比降低，且所述植物或植物细胞含有如下重组核酸，所述重组核酸包含(i)编码多肽的核苷酸序列，所述核苷酸序列可操作地连接于(ii)植物可表达启动子，和(iii)涉及转录终止和聚腺苷酸化的序列，其中所述多肽对所述植物是异源的；以及
(b)在足以生成所述异源多肽的条件下使所述植物或植物细胞生长足以生成所述异源多肽的时间。
40.如权利要求39所述的方法，所述方法还包括从所述植物或植物细胞分离所述异源多肽。
41.如权利要求39所述的方法，所述突变由一种或多种稀切核酸内切酶诱导。
42.如权利要求41所述的方法，所述一种或多种稀切核酸内切酶是TAL效应子核酸内切酶。
43.如权利要求42所述的方法，所述TAL效应子核酸内切酶各自结合SEQ ID NO:45-63中任一项所示的序列。
44.一种制备烟草植物的方法，所述烟草植物在一个或多个XylT等位基因中包含突变且在一个或多个FucT等位基因中包含突变，所述方法包括：
(a)使包含功能性XylT等位基因和功能性FucT等位基因的烟草植物细胞群体与一种或多种靶向内源性XylT序列的稀切核酸内切酶和一种或多种靶向内源性FucT序列的稀切核酸内切酶接触，
(b)从所述群体选择特定细胞，所述特定细胞中一个或多个XylT等位基因和一个或多个FucT等位基因已失活，以及
(c)使所述选定的植物细胞再生为烟草植物，所述烟草植物在一个或多个XylT等位基因中包含突变且在一个或多个FucT等位基因中包含突变，且所述植物中生成的糖蛋白的N-聚糖结构上的β-1,2-木糖基-糖和核心α-1,3-岩藻糖基-糖的水平与不含有所述突变的相应植物相比降低。
45.如权利要求44所述的方法，所述烟草植物细胞是原生质体。
46.如权利要求45所述的方法，所述方法包括使用编码一种或多种稀切核酸内切酶的一种或多种载体转化所述原生质体。
47.如权利要求46所述的方法，所述一种或多种稀切核酸内切酶是TAL效应子核酸内切酶。
48.如权利要求47所述的方法，所述TAL效应子核酸内切酶各自靶向SEQ ID NO:45-63中任一项所示的序列。
49.如权利要求45所述的方法，所述方法包括将TAL效应子核酸内切酶蛋白导入所述原生质体。
50.如权利要求45所述的方法，所述方法还包括培养所述原生质体以生成植物株系。
51.如权利要求45所述的方法，所述方法包括从所述原生质体分离包含XylT基因座的至少部分或FucT基因座的至少部分的基因组DNA。
52.如权利要求44所述的方法，所述烟草植物细胞是本赛姆氏烟草植物细胞。
53.一种生成烟草植物的方法，所述烟草植物在一个或多个XylT等位基因中包含突变且在一个或多个FucT等位基因中包含突变，所述方法包括：
(a)将在至少一个XylT等位基因中具有突变且在至少一个FucT等位基因中具有突变的第一烟草植物与在至少一个XylT等位基因中具有突变且在至少一个FucT等位基因中具有突变的第二烟草植物杂交以获得后代；以及
(b)从所述后代选择在一个或多个XylT等位基因中包含突变且在一个或多个FucT等位基因中包含突变的烟草植物。
54.如权利要求53所述的方法，所述突变由一种或多种稀切核酸内切酶诱导。
55.如权利要求54所述的方法，所述一种或多种稀切核酸内切酶是TAL效应子核酸内切酶。
56.如权利要求55所述的方法，所述TAL效应子核酸内切酶各自结合SEQ ID NO:45-63中任一项所示的序列。
57.如权利要求53所述的方法，所述突变各自是多于一个核苷酸的缺失。
58.如权利要求53所述的方法，所述后代就各所述等位基因处的所述突变而言是纯合子。
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