DE112010000876T5

DE112010000876T5 - Steuerung Kälte-induzierten Süßens und Verringerung von Acrylamid-Niveaus in Kartoffeln oder Süßkartoffeln

Info

Publication number: DE112010000876T5
Application number: DE112010000876T
Authority: DE
Inventors: Pudota Bala Bhaskar; Jiming Jiang
Original assignee: Wisconsin Alumni Research Foundation
Current assignee: Wisconsin Alumni Research Foundation
Priority date: 2009-02-03
Filing date: 2010-02-02
Publication date: 2012-09-13
Also published as: CA2748767A1; US20160194648A1; US20100199386A1; WO2010091018A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren und Zusammensetzungen zum Beseitigen von durch Kühllagerung induziertem Süßen von Kartoffel oder Süßkartoffel. Die Erfindung wird teilweise durch Abschalten des Gens der vakuolären sauren Invertase mittels RNAi-Technologie ausgeführt. Die resultierenden Kartoffeln widerstehen Kühllagerung ohne signifikante Hexose-Bildung, und stellen Kartoffeln oder Süßkartoffeln her, die verringerte Maillard-Reaktionen beim Ausbacken in heißem Öl aufweisen. Die ausgebackenen Produkte reichern, im Vergleich mit Kontrollen, signifikant niedrigere Acrylamid-Niveaus an.

Description

INFORMATIONEN ÜBER VERWANDTE ANMELDUNGEN
Diese Anmeldung nimmt die Priorität der US Serial No. 61/149,397, angemeldet am 3. Februar 2009, und US Serial No. 61/241,876 , angemeldet am 12. September 2009, in Anspruch, wobei der Inhalt jeder dieser Anmeldungen hierin durch Bezugnahme aufgenommen wird.
GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein die Hemmung der Umwandlung von Zucker in Kartoffeln oder Süßkartoffeln während der Kühllagerung (2–12°C, insbesondere 2–4°C). Die Erfindung betrifft im Speziellen ein Abschalten (engl. silencing) des Gens der vakuolären sauren Invertase mittels RNAi, um die Umwandlung von Saccharose zu Fructose und Glukose in Kartoffelknollen zu hemmen und um die Acrylamid-Niveaus in ausgebackenen essbaren Kartoffelprodukten oder Süßkartoffelprodukten zu verringern.
SEQUENZ-PROTOKOLL
Die vorliegende Erfindung enthält ein Sequenzprotokoll, welches via EFS-Web übermittelt wurde und welches hiermit durch Bezugnahme vollständig aufgenommen wird. Die am 1. Februar 2010 erstellte ASCII-Kopie wurde als WARFPOTA.txt benannt und hat eine Größe von 20397 Bytes.
STAATLICHE UNTERSTÜTZUNG
Diese Erfindung wurde mit Unterstützung der National Science Foundation, Zuwendungs-Nr. DBI-0218166 und USDA/CSREES 08-CRHF-0-6055 gemacht. An dieser Erfindung können bestimmte Rechte der US-Regierung bestehen.
DISKETTE FÜR SEQUENZ-PROTOKOLL UND TABELLEN
Entfällt.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Durch Kühllagerung induziertes Süßen
Kartoffelknollen (Solanum tuberosum) werden bei niedrigen Temperaturen gelagert ((47–50°F (8–10°C)), um ein Keimen zu verhindern, Resipiration zu verringern und krankheitsbedingte Verluste zu minimieren (Rausch und Greiner, 2004). Diese Temperaturen sind jedoch nicht ideal; kälterere Lagerungstemperaturen sind bevorzugter (2–4°C), da kältere Temperaturen, (1) den Bedarf der Verwendung an Fungiziden und Bakteriziden bei der Lagerung; (2) den Verlust fester Bestandteile durch Respiration; (3) den Bedarf an chemischen Keimunterdrückern verringern würden; und (4) helfen würden, das Vermarktungsfenster zu erhöhen (Sowokinos, 2007). In der Kälte wird jedoch Stärke, ein Polysaccharid, in die einfachen reduzierenden Zucker Glukose und Fructose umgewandelt; ein Phänomen das als Kälte-induziertes Süßen (engl. cold-induced sweetening; CIS) bekannt ist (Dale und Bradshaw, 2003; Keijbets, 2008; Rausch und Greiner, 2004; Sowokinos, 2001; Sowokinos, 2007). Die Carbonyl-Gruppen dieser Zucker reagieren mit der Aminogruppe freier Aminosäuren (eine Reaktion vom Maillard-Typ), wenn rohe Kartoffeln bei hohen Temperaturen in Öl ausgebacken werden, was zu nicht akzeptabel dunklen und bitterschmeckenden Chips und Fritten führt (Sowokinos, 2007).
Bei dieser Reaktion entsteht zudem Acrylamid, ein Toxin und potentielles Karzinogen (Keijbets, 2008). Im Jahre 2002 berichtete die schwedische Lebensmittelbehörde (engl. Swedish National Food Administration) von alarmierend hohen Acrylamid-Niveaus in kohlenhydratreichen erhitzten Nahrungsmitteln (Produkten aus Kartoffelknollen, Weizenmehl und Kaffeebohnen) (Tareke et al. 2002). Während die mögliche Karzinogenität niedriger Acrylamid-Niveaus im Menschen immer noch erforscht wird (Pelucchi et al. 2003; Granath und Tomqvist, 2003), konzentrierte sich ein großer Teil der Forschung darauf, den Mechanismus/die Mechanismen der Acrylamidbildung in Nahrungsmitteln zu verstehen, sowie auch auf Beseitigungs-/Verringerung-Strategien, um mögliche Risiken für die menschliche Gesundheit zu minimieren. Im Jahr 2005 (Food Navigator Report) wurden vom Staat Kalifornien mehrere Klagen, die Acrylamid-Niveaus in zu Nahrungsmitteln verarbeiteten Kartoffeln betreffen, gegen große Lebensmittelfirmen eingereicht. Dies führte dazu, dass mehrere Lebensmittelfirmen zustimmten, die Acrylamid-Niveaus in ausgebackenen Kartoffelprodukten in den folgenden 3–5 Jahren wesentlich zu verringern (San Francisco Chronicle Artikel, 2008). Die Mechanismen, nach denen die Zuckeranreicherung in der Kälte reguliert wird, bleiben jedoch schlecht verstanden (Keijbets, 2008; Sowokinos, 2007), und ein Bedarf für Verfahren zur Verringerung von Acrylamid-Niveaus in ausgebackenen Kartoffelprodukten bleibt weiterhin bestehen.
Kartoffel-Kohlenhydratstoffwechsel
Der Kohlenhydratstoffwechsel in der Kartoffel ist komplex (Sowokinos, 2007) und gilt als ein quantitatives genetisches Merkmal (Menendez et al., 2002). Die tatsächliche Konzentration an freiem Zucker in Kartoffeln beinhaltet die Interaktion mehrerer Kohlenhydratstoffwechselwege, einschließlich der/des Stärke-Synthese/-Abbaus, Glykolyse, Respiration und Süßens. Diese Stoffwechselwege werden auf vielen Ebenen gesteuert, einschließlich Hormonen, Membranstruktur und -Funktion, Kompartimentierung und Konzentration von Enzymen, Schlüsselionen und Substraten; und natürlich Enzym-Expressionsniveaus und -Aktivität (Sowokinos, 2007).
Saccharose wird aus von Chloroplasten stammendem Triosephosphat in einem Quellen-Blatt (engl. source leaf) synthetisiert. Nach dem Eindringen in den apoplastischen Raum, der das Phloem umgibt, transportiert ein Saccherose-Protonensymporter die Saccharose aktiv in das Phloem. In einem Senken-Gewebe (engl. sink tissue), wie bspw. einer Knolle, wird Saccharose symplastisch entladen und/oder in den Apoplast freigesetzt. Von dort kann sie entweder durch einen Saccherose-Protonensymporter aufgenommen oder durch Zellwandinvertase in Glukose und Fructose hydrolysiert werden. Innerhalb der Senken-Zellen kann Saccharose entweder (1) durch Saccharose-Synthase in Uridin-Diphosphoglukose (UDPG) und Fructose umgewandelt oder (2) durch eine zytosolische Invertase hydrolysiert werden. Nach dem Eindringen in die Vakuolen kann Saccharose auch durch vakuoläre Invertase in Fructose und Glukose gespalten werden. Hexokinasen phosphorylieren die Einfachzucker, was zu Hexosen führt, die in die Respiration eintreten können. Im Senken-Gewebe können Zellwand-Invertase und vakuoläre Invertase durch Inhibitoren der beta-Fructosidase posttranslational reguliert werden (Rausch und Greiner, 2004).
Ein heiliger Gral in der industriellen Landwirtschaft betreffend Kartoffeln, insbesondere betreffend jene, die zu Crisps, Chips und Pommes frites verarbeitet werden sollen, war es, Kühllagerungs-induziertes Süßen von Kartoffeln zu steuern, ein lang gehegte Bedürfnis der Kartoffel-verarbeitenden Industrie (Keijbets, 2008). Das Problem Kühllagerungs-induzierten Süßens zu lösen ist insbesondere deshalb schwierig, weil der Zuckergehalt durch eine Vielzahl von Faktoren, einschließlich der (1) Stärkesynthese, (2) des Stärkeabbaus, (3) der Glykolyse, (4) der mitochondrialen Respiration (die in der Knolle reichlich ist) und (5) der Hexose-Bildung beeinträchtigt ist (Dale und Bradshaw, 2003). Die Bedeutung dieses Ziels wird einfacher verstanden, wenn die Statistiken über die Kartoffel-Verarbeitung verstanden werden. Etwa 30 Million Tonnen Kartoffeln werden in Konsumgüter (Crips, Chips, Pommes frites, etc.) umgewandelt (Keijbets, 2008). Verarbeitete Kartoffelprodukte, die 10% der weltweiten Feldfrüchte darstellen, verbrauchen 1–2 von 3 in den entwickelten Ländern der Welt erzeugten Kartoffeln (Keijbets, 2008). Kartoffeln beginnen selbst in China wichtige Faktoren zu werden, das nun zwei moderne Pommes frites-Pflanzen, zwanzig Kartoffelchip-Pflanzen und drei Kartoffelflocken-Pflanzen beheimatet (Keijbets, 2008). Einschließlich der Kartoffelstärke-Verarbeitung verbrauchte China im Jahre 2006 1,26 Millionen Tonnen Kartoffeln (Keijbets, 2008). Auch Indien stockt auf (Keijbets, 2008). Insgesamt wurden im Jahr 2006 in verarbeiteten Kartoffelprodukten etwa 30 Millionen Tonnen Kartoffeln verwendet (Keijbets, 2008).
Obgleich 2001–2002 eine Karte molekularer Funktionen für Kohlenhydrat-Stoffwechsel und -Transport der Kartoffel veröffentlicht wurde (Chen et al., 2001; Menendez et al., 2002), wurde sich dem Problem des Kühllagerungs-induzierten Süßens unzureichend zugewandt. Verschiedene Anstrengungen zeigen die Resistenz der Knolle gegenüber Manipulation betreffend die Hemmung Kühllagerungs-induzierten Süßens und verdeutlichen die Herausforderung.
Zrenner et al. (1996) transformierten Kartoffeln mit cDNA Kälte-induzierbarer, löslicher saurer Invertase in der Antisense-Orientierung und unter Kontrolle des konstitutiven 35S-Blumenkohlmosaikvirus-Promotors (Zrenner et al., 1996). Die Analyse der geernteten und kühlgelagerten Knollen zeigte, dass verglichen mit Kontrollen eine Hemmung der Aktivität löslicher saurer Invertase zu verringertem Hexose- und erhöhtem Saccharose-Gehalt führte. Das Hexose/Saccharose-Verhältnis verringerte sich mit sich verringernden Invertaseaktivitäten, Zrenner et al. beobachteten jedoch, dass sich die Gesamtmenge löslicher Zucker nicht signifikant änderte. Aus diesen Daten leiteten Zrenner et al. ab, dass Invertasen nicht die Gesamtmenge löslicher Zucker in kühl-gelagerten Kartoffelknollen steuern, jedoch an der Regulation des Verhältnisses von Hexose zu Saccharose beteiligt sind (Zrenner et al., 1996).
Auch Greiner et al. (1999) erzielten gemischte Ergebnisse (Greiner et al., 1999). Greiner et al. transformierten Kartoffeln mit cDNA, die für ein putatives vakuoläres Homolog eines Tabakzellwand-Invertaseinhibitors kodiert und die funktionell mit einem CaMV-35S-Promotor verbunden ist. In transgenen Knallen war die Kälte-induzierte Hexose-Anreicherung, ohne jeglichen Einfluss auf den Ertrag an Kartoffelknollen, um bis zu 75% verringert. Die Verarbeitungsqualität von Knollen wurde verbessert, ohne die Stärke-Quantität oder -Qualität zu verändern (Greiner et al., 1999), Greiner et al. konnten die Invertase-Aktivität jedoch nur teilweise unterdrücken.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
In einem ersten Aspekt betrifft die Erfindung ein isoliertes Polynukleotid, das eine Nukleinsäure-Sequenz mit wenigstens 90%–99% Nukleinsäure-Sequenzidentität zu einer Sequenz umfasst, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 5, 6, 9, 10, 11, 23 und 24.
In einem damit in Zusammenhang stehenden Aspekt betrifft die Erfindung ein Fragment aus wenigstens 20 aufeinanderfolgenden Nukleotiden einer Sequenz mit wenigstens 90% Sequenzidentität zu SEQ ID NO: 4. Die Erfindung betrifft auch RNAi-Vektoren, die diese Polynukleotide umfassen, und transgene Pflanzen, die diese Polynukleotide und Vektoren enthalten. Transgene Pflanzen umfassen jene der Gattung Solanum, wie bspw. Kartoffel (Solanum tuberosum) sowie Süßkartoffel, Jamswurzel und Maniok.
In einem zweiten Aspekt betrifft die Erfindung ein isoliertes Polynukleotid, das eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 5, 6, 9, 10, 11, 23 und 24.
In den ersten zwei Aspekten betrifft die Erfindung auch RNAi-Vektoren, die die Polynukleotide dieser ersten zwei Aspekte umfassen. Die Erfindung betrifft auch RNAi-Vektoren, die diese Polynukleotide umfassen, und transgene Pflanzen, die diese Polynukleotide und Vektoren beinhalten. Transgene Pflanzen umfassen jene der Gattung Solanum, wie bspw. Kartoffel (Solanum tuberosum) sowie Süßkartoffel, Jamswurzel und Maniok. Die Erfindung umfasst auch essbare Produkte von derartigen transgenen Pflanzen, wie bspw. Kartoffeln, sowie deren verarbeitete Form, einschließlich Kartoffelcrisps, Kartoffelchips, Pommes frites, Kartoffelstäbchen und Julienne-geschnittene Kartoffeln (engl. shoestring potatoes). Für Süßkartoffeln umfassen derartige verarbeiteten Formen Süßkartoffeln, Crisps, Chips und Fritten. Die Expression eines vakuolären Invertase(VI)-Gens ist im Vergleich zu nicht-transformierten Pflanzen oder einer anderen Kontrolle in transgenen Pflanzen wenigstens um 65%, wenigstens um 66%, wenigstens um 67%, wenigstens um 68%, wenigstens um 69%, wenigstens um 70%, wenigstens um 71%, wenigstens um 72%, wenigstens um 73%, wenigstens um 74%, wenigstens um 75%, wenigstens um 76%, wenigstens um 77%, wenigstens um 78%, wenigstens um 79%, wenigstens um 80%, wenigstens um 81%, wenigstens um 82%, wenigstens um 83%, wenigstens um 84%, wenigstens um 85%, wenigstens um 86%, wenigstens um 87%, wenigstens um 88%, wenigstens um 89%, wenigstens um 90%, wenigstens um 91%, wenigstens um 92%, wenigstens um 93%, wenigstens um 94%, wenigstens um 95%, wenigstens um 96%, wenigstens um 97%, wenigstens um 98%, wenigstens um 99% oder mehr verringert.
In einem dritten Aspekt betrifft die Erfindung Verfahren zum Abschalten vakuolärer Invertase in einer transgenen Kartoffelpflanze oder transgenen Süßkartoffelpflanze, die das Verringern des Niveaus an VI-Aktivität, verglichen mit dessen Niveau in einer nicht-transgenen Kontroll-Kartoffelpflanze oder nicht-transgenen Kontroll-Süßkartoffelpflanze, umfassen, durch Verringern des Niveaus einer mRNA in der transgenen Kartoffelpflanze oder transgenen Süßkartoffelpflanze, wobei die mRNA durch ein Polynukleotid mit wenigstens 90% Sequenzidentität zu einer Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 4 kodiert ist und durch Expression eines RNAi-Konstrukts, das ein Fragment aus wenigstens 20 aufeinanderfolgenden Nukleotiden einer Sequenz mit wenigstens 90% Sequenzidentität zu SEQ ID NO: 4 umfasst.
In einem vierten Aspekt betrifft die Erfindung Verfahren zum Abschalten vakuolärer Invertase in einer transgenen Kartoffelpflanze oder transgenen Süßkartoffelpflanze, die das Verringern des Niveaus an VI-Aktivität, verglichen mit dessen Niveau in einer Kontroll-, nicht-transgenen Kartoffel- oder Süßkartoffel-Pflanze umfassen, mittels Verringern des Niveaus einer mRNA in der transgenen Kartoffelpflanze oder transgenen Süßkartoffelpflanze, wobei die mRNA durch ein Polynukleotid mit wenigstens 90% Sequenzidentität zu einer Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 4 kodiert ist, und mittels Expression eines RNAi-Konstrukts, das ein Polynukleotid mit wenigstens 90%–99% Sequenzidentität zu einem Polynukleotid umfasst, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 5, 6, 9, 10, 11, 23 und 24. Das RNAi-Konstrukt kann auch ein Polynukleotid umfassen, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 5, 6, 9, 10, 11, 23 und 24.
Im dritten und vierten Aspekt kann die Erfindung weiter einen Schritt des Screenens der transgenen Pflanzen hinsichtlich einer Verringerung der VI-Aktivität durch Vergleichen der VI-Aktivität in der transgenen Pflanze mit einer Kontrollpflanze, wie bspw. einer nicht-transgenen Pflanze oder einer transgenen Pflanze mit einem Leervektor, umfassen. Diese Verfahren können weiter auch einen Schritt des Screenens von aus transgenen Pflanzen hergestellten Kartoffeln oder Süßkartoffeln auf durch Kühllagerung-induziertes Süßen durch Vergleichen der transgenen Kartoffel oder transgenen Süßkartoffel mit einer Kontrollkartoffel oder Kontrollsüßkartoffel umfassen. Derartiges Screenen kann ein Testen der Chipfarbe nach Ausbacken beinhalten. Beispiele für Tests, die verwendet werden können, umfassen eine optische Farbbewertung, wie bspw. diejenige, welche hierin in Tabelle 6 bereitgestellt ist. Die Chipfarbe kann unter Verwendung der Kartoffelchip-Farbreferenz-Standards, die vom Potato Chip Institute International, Cleveland, Ohio entwickelt wurden, optisch bestimmt werden. (Douches und Freyer, 1994; Reeves, 1982).
Ebenso kann im dritten und vierten Aspekt der RNAi-Vektor in Pflanzen mittels Agrobacterium tumefaciens eingebracht werden. Der RNAi-Vektor kann zum Beispiel einen pHELLSGATE-Vektor, wie bspw. pHELLSGATE2 oder pHELLSGATE8, umfassen. Pflanzen, die den erfindungsgemäßen Verfahren zugänglich, sind umfassen jene der Gattung Solanum, wie bspw. Kartoffel (Solanum tuberosum), sowie Süßkartoffel, Jamswurzel und Maniok.
In einem fünften Aspekt betrifft die Erfindung Kits, die ein RNAi-Konstrukt umfassen, das ein Fragment aus wenigstens 20 aufeinanderfolgenden Nukleotiden einer Sequenz mit wenigstens 90% Sequenzidentität zu SEQ ID NO: 4 umfasst, und Anleitungen zu deren Verwendung. Zum Beispiel kann das RNAi-Konstrukt ein Polynukleotid mit wenigstens 90%–99% Sequenzidentität zu einem Polynukleotid umfassen, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehen aus SEQ ID NOs: 5, 6, 9, 10, 11, 23 und 24. Das RNAi-Konstrukt kann auch ein Polynukleotid umfassen, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 5, 6, 9, 10, 11, 23 und 24.
In einem sechsten Aspekt betrifft die Erfindung Verfahren zum Steuern der Anreicherung von reduzierenden Zuckern in einer Kartoffelpflanze oder Süßkartoffelpflanze während einer Kühllagerung. Das Verfahren umfasst die Schritte Verringern eines Niveaus vakuolärer Invertase-Aktivität in der Kartoffelpflanze oder Süßkartoffelpflanze relativ zu einer Kontroll-Kartoffelpflanze oder -Süßkartoffelpflanze durch Einbringen in die Kartoffelpflanze eines RNAi-Konstrukts, das ein Fragment aus wenigstens 20 aufeinanderfolgenden Nukleotiden einer Sequenz mit wenigstens 90% Sequenzidentität zu SEQ ID NO: 4 umfasst, und Halten der Pflanze unter Bedingungen, die zur Expression des RNAi-Konstrukts ausreichen, wodurch sich das Niveau einer mRNA verringert, die durch ein Polynukleotid mit wenigstens 90% Sequenzidentität zu einer Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 4 kodiert wird. Dieses Verfahren kann weiter Testen der Farbe eines Kartoffelprodukts oder Süßkartoffelprodukts aus einer Kartoffel oder Süßkartoffel der Pflanze, nach einer Wärmebehandlung der Kartoffel oder Süßkartoffel, umfassen. Das Verfahren kann alternativ Testen der Farbe des Kartoffelprodukts oder Süßkartoffelprodukts durch Vergleichen der Produktfarbe mit der Farbe eines Kontroll-Kartoffelprodukts oder Kontroll-Süßkartoffelprodukts von einer Kartoffelpflanze umfassen. Das obige Verfahren kann weiter eine Wärmebehandlung der Kartoffel zu einem Crisp, Chip, Pommes frites, Kartoffelstäbchen, einer Julienne-geschnittenen Kartoffel oder einem anderen essbaren Kartoffelprodukt oder Süßkartoffel zu einem Crisp, Chip, einer Fritte oder einem anderen Süßkartoffelprodukt umfassen.
In dem obigen Verfahren umfasst das RNAi-Konstrukt ein Polynukleotid mit wenigstens 90% Sequenzidentität zu einem Polynukleotid, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 5, 6, 9, 10, 11, 23 und 24. Das RNAi-Konstrukt umfasst alternativ ein Polynukleotid mit wenigstens 95% Sequenzidentität zu einem Polynukleotid, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 5, 6, 9, 10, 11, 23 und 24. Das RNAi-Konstrukt umfasst noch weiter alternativ ein Polynukleotid mit wenigstens 98% Sequenzidentität zu einem Polynukleotid, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 5, 6, 9, 10, 11, 23 und 24.
Das RNAi-Konstrukt umfasst weiter alternativ ein Polynukleotid, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 5, 6, 9, 10, 11, 23 und 24.
In diesem Verfahren kann der RNAi-Vektor mittels Agrobacterium tumefaciens in Pflanzen eingebracht werden. Der RNAi-Vektor kann zum Beispiel einen pHELLSGATE-Vektor, wie bspw. pHELLSGATE2 oder pHELLSGATE8, umfassen. Pflanzen, die den erfindungsgemäßen Verfahren zugänglich sind, umfassen jene der Gattung Solanum, wie bspw. Kartoffel (Solanum tuberosum), sowie Süßkartoffel, Jamswurzel und Maniok.
In einem siebten Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Steuern der Acrylamidbildung während Wärmebehandlung einer Kartoffel oder Süßkartoffel von einer Kartoffelpflanze oder Süßkartoffelpflanze. Das Verfahren umfasst die Schritte Verringern eines Niveaus an vakuolärer Invertase-Aktivität in der Kartoffelpflanze oder Süßkartoffelpflanze relativ zu einer Kontroll-Kartoffelpflanze oder –Süßkartoffelpflanze, durch Einbringen eines RNAi-Konstrukts in die Kartoffelpflanze oder Süßkartoffelpflanze, das ein Fragment aus wenigstens 20 aufeinanderfolgenden Nukleotiden einer Sequenz mit wenigstens 90% Sequenzidentität zu SEQ ID NO: 4 umfasst, und Halten der Pflanze unter Bedingungen, die zur Expression des RNAi-Konstrukts ausreichen, wodurch sich das Niveau einer mRNA verringert, die durch ein Polynukleotid mit wenigstens 90% Sequenzidentität zu einer Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 4 kodiert wird.
Dieses Verfahren kann weiter Testen des Acrylamid-Niveaus in einem wärmebehandelten Kartoffelprodukt oder Süßkartoffelprodukt einer Kartoffel von einer Kartoffelpflanze oder Süßkartoffel von einem Süßkartoffelprodukt, das mittels des zuvor beschriebenen Verfahrens hergestellt wurde, umfassen.
Das Testen des Acrylamid-Niveaus in dem Kartoffelprodukt oder Süßkartoffelprodukt kann weiter umfassen Vergleichen des Acrylamid-Niveaus eines mittels des obigen Verfahrens hergestellten Kartoffelprodukts oder Süßkartoffelprodukts, das von einer Kartoffel von einer Kartoffelpflanze oder Süßkartoffel von einem Süßkartoffelprodukt stammt, mit einem Acrylamid-Niveau in einem Kontroll-Kartoffelprodukt von einer Kontroll-Kartoffelpflanze oder einem Kontroll-Süßkartoffelprodukt von einer Kontroll-Süßkartoffelpflanze. Beim Testen können Kartoffelprodukte oder Süßkartoffelprodukte, die von einer Kartoffel von einer Kartoffelpflanze oder von einer Süßkartoffel von einer Süßkartoffelpflanze, die mittels des obigen Verfahrens hergestellt wurden, und wobei die Kartoffel oder Süßkartoffel für einen Zeitraum von wenigstens 2 Stunden einer Kühllagerung unterworfen wurde, wenigstens eine 5-fache Verringerung, wenigstens eine 6-fache Verringerung, wenigstens eine 7-fache Verringerung, wenigstens eine 8-fache Verringerung, wenigstens eine 9-fache Verringerung, wenigstens eine 10-fache Verringerung, wenigstens eine 11-fache Verringerung, wenigstens eine 12-fache Verringerung, wenigstens eine 13-fache Verringerung, wenigstens eine 14-fache Verringerung, wenigstens eine 15-fache Verringerung, wenigstens eine 20-fache Verringerung, wenigstens eine 25-fache Verringerung, wenigstens eine 30-fache Verringerung, wenigstens eine 35-fache Verringerung, wenigstens eine 40-fache Verringerung, wenigstens eine 45-fache Verringerung, wenigstens eine 50-fache Verringerung, wenigstens eine 55-fache Verringerung, wenigstens eine 60-fache Verringerung, wenigstens eine 65-fache Verringerung, wenigstens eine 70-fache Verringerung, wenigstens eine 75-fache Verringerung, wenigstens eine 80-fache Verringerung, wenigstens eine 85-fache Verringerung, wenigstens eine 90-fache Verringerung, wenigstens eine 95-fache Verringerung, wenigstens eine 100-fache Verringerung, wenigstens eine 150-fache Verringerung, wenigstens eine 200-fache Verringerung, wenigstens eine 250-fache Verringerung, wenigstens eine 300-fache Verringerung, wenigstens eine 350-fache Verringerung, wenigstens eine 400-fache Verringerung, wenigstens eine 450-fache Verringerung oder wenigstens eine 500-fache Verringerung des Acrylamid-Niveaus im Vergleich zu einem Kartoffelprodukt von einer Kontroll-Kartoffelpflanze aufweisen. Genauer wurde die Kartoffel oder Süßkartoffel einer Kühllagerung für einen Zeitraum von wenigstens drei Stunden, wenigstens vier Stunden, wenigstens fünf Stunden, wenigstens sechs Stunden, wenigstens acht Stunden, wenigstens zehn Stunden, wenigstens 12 Stunden, wenigstens 18 Stunden, wenigstens 24 Stunden, wenigstens 30 Stunden, wenigstens 36 Stunden oder länger unterworfen. Beim Testen können alternativ mittels des obigen Verfahrens hergestellte Kartoffelprodukte oder Süßkartoffelprodukte, die von einer Kartoffel von einer Kartoffelpflanze oder einer Süßkartoffel von einer Süßkartoffelpflanze stammen, und wobei die Kartoffel oder Süßkartoffel Raumtemperatur-Bedingungen unterworfen wurde, oder bei diesen gelagert wurde (19,5° bis 25,5°C/67,1°F bis 77,9°F) wenigstens eine 1-fache Verringerung, wenigstens eine 2-fache Verringerung, wenigstens eine 3-fache Verringerung, wenigstens eine 4-fache Verringerung, wenigstens eine 5-fache Verringerung, wenigstens eine 6-fache Verringerung, wenigstens eine 7-fache Verringerung, wenigstens eine 8-fache Verringerung, wenigstens eine 9-fache Verringerung, wenigstens eine 10-fache Verringerung, wenigstens eine 11-fache Verringerung, wenigstens eine 12-fache Verringerung, wenigstens eine 13-fache Verringerung, wenigstens eine 14-fache Verringerung oder wenigstens eine 15-fache Verringerung des Acrylamid-Niveaus im Vergleich zu einem Kartoffelprodukt von einer Kontroll-Kartoffelpflanze aufweisen.
Die Kartoffelprodukte, die von einer Kartoffel von einer Kartoffelpflanze stammen, oder die Süßkartoffelprodukte, die von einer Süßkartoffel von einer Süßkartoffelpflanze stammen, die mittels des obigen Verfahrens hergestellt wurden, und wobei die Kartoffel oder Süßkartoffel einer Kühllagerung für einen Zeitraum von wenigstens 2 Stunden unterworfen wurden, weisen alternativ beim Testen eine 5- bis 500-fache Verringerung, eine 5- bis 450-fache Verringerung, eine 5- bis 400-fache Verringerung, eine 5- bis 400-fache Verringerung, eine 5-bis 350-fache Verringerung, eine 5- bis 300-fache Verringerung, eine 5- bis 250-fache Verringerung, eine 5- bis 200-fache Verringerung, eine 5- bis 150-fache Verringerung, eine 5- bis 100-fache Verringerung, eine 5- bis 95-fache Verringerung, eine 5- bis 90-fache Verringerung, eine 5- bis 85-fache Verringerung, eine 5- bis 80-fache Verringerung, eine 5- bis 75-fache Verringerung, eine 5- bis 70-fache Verringerung, eine 5- bis 65-fache Verringerung, eine 5- bis 60-fache Verringerung, eine 5- bis 55-fache Verringerung, eine 5- bis 50-fache Verringerung, eine 5- bis 45-fache Verringerung, eine 5- bis 40-fache Verringerung, eine 5- bis 35-fache Verringerung, eine 5- bis 30-fache Verringerung, eine 5- bis 25-fache Verringerung, eine 5- bis 20-fache Verringerung, eine 5- bis 15-fache Verringerung, eine 5- bis 10-fache Verringerung, eine 10- bis 500-fache Verringerung, eine 10- bis 450-fache Verringerung, eine 10- bis 400-fache Verringerung, eine 10- bis 400-fache Verringerung, eine 10- bis 350-fache Verringerung, eine 10- bis 300-fache Verringerung, eine 10- bis 250-fache Verringerung, eine 10- bis 200-fache Verringerung, eine 10- bis 150-fache Verringerung, eine 10- bis 100-fache Verringerung, eine 10- bis 95-fache Verringerung, eine 10- bis 90-fache Verringerung, eine 10- bis 85-fache Verringerung, eine 10- bis 80-fache Verringerung, eine 10- bis 75-fache Verringerung, eine 10- bis 70-fache Verringerung, eine 10- bis 65-fache Verringerung, eine 10- bis 60-fache Verringerung, eine 10- bis 55-fache Verringerung, eine 10- bis 50-fache Verringerung, eine 10- bis 45-fache Verringerung, eine 10- bis 40-fache Verringerung, eine 10- bis 35-fache Verringerung, eine 10- bis 30-fache Verringerung, eine 10- bis 25-fache Verringerung, eine 10- bis 20-fache Verringerung oder eine 10- bis 15-fache Verringerung des Acrylamid-Niveaus im Vergleich zu einem Kartoffelprodukt von einer Kontroll-Kartoffelpflanze oder einem Süßkartoffelprodukt von einer Kontroll-Süßkartoffelpflanze auf. Die Kartoffel oder Süßkartoffel wurde genauer einer Kühllagerung für einen Zeitraum von wenigstens drei Stunden, wenigstens vier Stunden, wenigstens fünf Stunden, wenigstens sechs Stunden, wenigstens acht Stunden, wenigstens zehn Stunden, wenigstens 12 Stunden, wenigstens 18 Stunden, wenigstens 24 Stunden, wenigstens 30 Stunden, wenigstens 36 Stunden oder länger unterworfen. Beim Testen können alternativ Kartoffelprodukte oder Süßkartoffelprodukte, die von einer Kartoffel von einer Kartoffelpflanze oder von einer Süßkartoffel von einer Süßkartoffelpflanze stammen, die mittels des obigen Verfahrens hergestellt wurden, und wobei die Kartoffel oder Süßkartoffel Raumtemperatur-Bedingungen unterworfen wurden oder bei den selben gelagert wurden, eine Verringerung von wenigstens einer 1- bis 15-fachen Verringerung, einer 2- bis 15-fachen, einer 3- bis 15-fachen, einer 4- bis 15-fachen, einer 5- bis 15-fachen, einer 1- bis 14-fachen, einer 2- bis 14-fachen, einer 3- bis 14-fachen, einer 4- bis 14-fachen einer 5- bis 14-fachen, einer 1- bis 13-fachen, einer 2- bis 13-fachen, einer 3- bis 13-fachen, einer 4- bis 13-fachen einer 5- bis 15-fachen, einer 1- bis 12-fachen, einer 2- bis 12-fachen, einer 3- bis 12-fachen, einer 4- bis 12-fachen, einer 5- bis 12-fachen, einer 1- bis 11-fachen, einer 2- bis 11-fachen, einer 3- bis 11-fachen, einer 4- bis 11-fachen, einer 5- bis 11-fachen, einer 1- bis 10-fachen, einer 2- bis 10-fachen, einer 3- bis 10-fachen, einer 4- bis 10-fachen oder einer 5- bis 10-fachen Verringerung des Acrylamid-Niveaus im Vergleich zu einem Kartoffelprodukt von einer Kontroll-Kartoffelpflanze aufweisen.
Die Kartoffelprodukte, die von einer Kartoffel von einer Kartoffelpflanze stammen, oder die Süßkartoffelprodukte, die von einer Süßkartoffel von einer Süßkartoffelpflanze stammen, die mittels des obigen Verfahrens hergestellt wurde, und wobei die Kartoffel oder Süßkartoffel einer Kühllagerung für einen Zeitraum von wenigstens 2 Stunden unterworfen wurde, können beim Testen noch weiter alternativ, im Vergleich zu einem Kartoffelprodukt von einer Kontroll-Kartoffelpflanze oder einem Süßkartoffelprodukt von einer Kontroll-Süßkartoffelpflanze, Acrylamid-Niveaus von 25% bis 75% weniger, 25% bis 70% weniger, 25% bis 65% weniger, 25% bis 60% weniger, 25% bis 55% weniger, 25% bis 55% weniger, 25% bis 50% weniger, 25% bis 45% weniger, 25% bis 40% weniger, 25 bis 35% weniger, 30% bis 75% weniger, 30% bis 70% weniger, 30% bis 65% weniger, 30% bis 60% weniger, 30% bis 55% weniger, 30% bis 55% weniger, 30% bis 50% weniger, 30% bis 45% weniger, 25% bis 40% weniger, 30% bis 35% weniger, 35% bis 75% weniger, 35% bis 70% weniger, 35% bis 65% weniger, 35% bis 60% weniger, 35% bis 55% weniger, 35% bis 55% weniger, 35% bis 50% weniger, 35% bis 45% weniger, 35% bis 40% weniger, 40% bis 75% weniger, 40% bis 70% weniger, 40% bis 65% weniger, 40% bis 60% weniger, 40% bis 55% weniger, 40% bis 55% weniger, 40% bis 50% weniger, 40% bis 45% weniger, 45% bis 75% weniger, 45% bis 70% weniger, 45% bis 65% weniger, 45% bis 60% weniger, 45% bis 55% weniger, 45% bis 55% weniger, 45% bis 50%, 50% bis 75% weniger, 50% bis 70% weniger, 50% bis 65% weniger, 50% bis 60% weniger oder 50% bis 55% weniger aufweisen. Die Kartoffel oder Süßkartoffel wurde genauer einer Kühllagerung für einen Zeitraum von wenigstens drei Stunden, wenigstens vier Stunden, wenigstens fünf Stunden, wenigstens sechs Stunden, wenigstens acht Stunden, wenigstens zehn Stunden, wenigstens 12 Stunden, wenigstens 18 Stunden, wenigstens 24 Stunden, wenigstens 30 Stunden, wenigstens 36 Stunden oder länger unterworfen. Beim Testen können Kartoffelprodukte oder Süßkartoffelprodukte, die von einer Kartoffel von einer Kartoffelpflanze oder von einer Süßkartoffel von einer Süßkartoffelpflanze stammen, die mittels des obigen Verfahrens hergestellt wurde, und wobei die Kartoffel oder Süßkartoffel Raumtemperatur-Bedingungen unterworfen wurde oder bei diesen gelagert wurde, alternativ, im Vergleich zu einem Kartoffelprodukt von einer Kontroll-Kartoffelpflanze oder einem Süßkartoffelprodukt von einer Kontroll-Süßkartoffelpflanze, Acrylamid-Niveaus von 25% bis 75% weniger, 25% bis 70% weniger, 25% bis 65% weniger, 25% bis 60% weniger, 25% bis 55% weniger, 25% bis 55% weniger, 25% bis 50% weniger, 25% bis 45% weniger, 25% bis 40% weniger, 25 bis 35% weniger, 30% bis 75% weniger, 30% bis 70% weniger, 30% bis 65% weniger, 30% bis 60% weniger, 30% bis 55% weniger, 30% bis 55% weniger, 30% bis 50% weniger, 30% bis 45% weniger, 25% bis 40% weniger, 30% bis 35% weniger, 35% bis 75% weniger, 35% bis 70% weniger, 35% bis 65% weniger, 35% bis 60% weniger, 35% bis 55% weniger, 35% bis 55% weniger, 35% bis 50% weniger, 35% bis 45% weniger, 35% bis 40% weniger, 40% bis 75% weniger, 40% bis 70% weniger, 40% bis 65% weniger, 40% bis 60% weniger, 40% bis 55% weniger, 40% bis 55% weniger, 40% bis 50% weniger, 40% bis 45% weniger, 45% bis 75% weniger, 45% bis 70% weniger, 45% bis 65% weniger, 45% bis 60% weniger, 45% bis 55% weniger, 45% bis 55% weniger, 45% bis 50%, 50% bis 75% weniger, 50% bis 70% weniger, 50% bis 65% weniger, 50% bis 60% weniger oder 50% bis 55% weniger aufweisen.
Zusätzlich wird auch vermutet, dass bei wie oben beschriebenem Testen Kartoffelprodukte, die von einer Kartoffel von einer Kartoffelpflanze stammen, oder Süßkartoffelprodukte, die von einer Süßkartoffel von einer Süßkartoffelpflanze stammen, die nach dem obigen Verfahren hergestellt wurde, und wobei die Kartoffel oder Süßkartoffel einer Kühllagerung für einen Zeitraum von wenigstens 2 Stunden unterworfen wurde, Acrlyamid-Niveaus von weniger als 500 ppb (mg/Kg), weniger als 400 ppb (mg/Kg), weniger als 300 ppb (mg/Kg), weniger als 200 ppb (mg/Kg) oder weniger als 100 ppb (mg/Kg) aufweisen werden. Alternativ werden beim Testen die Kartoffelprodukte, die von einer Kartoffel von einer Kartoffelpflanze stammen, die mittels des obigen Verfahrens hergestellt wurde, Acrylamid-Niveaus zwischen etwa 90 ppb (mg/Kg) bis etwa 500 ppb (mg/Kg), etwa 100 ppb (mg/Kg) bis etwa 500 ppb (mg/Kg), etwa 200 ppb (mg/Kg) bis etwa 500 ppb (mg/Kg), etwa 250 ppb (mg/Kg) bis etwa 500 ppb (mg/Kg), etwa 100 ppb (mg/Kg) bis etwa 300 ppb (mg/Kg), etwa 100 ppb (mg/Kg) bis etwa 250 ppb (mg/Kg), etwa 200 ppb (mg/Kg) bis etwa 300 ppb (mg/Kg), etwa 250 ppb (mg/Kg) bis etwa 300 ppb (mg/Kg), etwa 300 ppb (mg/Kg) bis etwa 500 ppb (mg/Kg), oder etwa 400 ppb (mg/Kg) bis etwa 500 ppb (mg/Kg) aufweisen. Genauer wurde die Kartoffel oder Süßkartoffel für einen Zeitraum von wenigstens drei Stunden, wenigstens vier Stunden, wenigstens fünf Stunden, wenigstens sechs Stunden, wenigstens acht Stunden, wenigstens zehn Stunden, wenigstens 12 Stunden, wenigstens 18 Stunden, wenigstens 24 Stunden, wenigstens 30 Stunden, wenigstens 36 Stunden oder länger einer Kühllagerung ausgesetzt. Zusätzlich wird auch vermutet, dass bei wie oben beschriebenem Testen Kartoffelprodukte, die von einer Kartoffel von einer Kartoffelpflanze stammen, oder Süßkartoffelprodukte, die von einer Süßkartoffel von einer Süßkartoffelpflanze stammen, die nach dem obigen Verfahren hergestellt wurde, und wobei die Kartoffel oder Süßkartoffel Raumtemperatur-Bedingungen unterworfen wurde oder bei diesen gelagert wurde, Acrylarnid-Niveaus von weniger als 1100 ppb (mg/Kg), 1000 ppb (mg/Kg), weniger als 900 ppb (mg/Kg), weniger als 800 ppb (mg/Kg), weniger als 700 ppb (mg/Kg), weniger als 600 ppb (mg/Kg) oder weniger als 500 ppb (mg/Kg) aufweisen können. Beim Testen werden alternativ Kartoffelprodukte, die von einer Kartoffel von einer Kartoffelpflanze stammen, die mittels des obigen Verfahrens hergestellt wurde, Acrylamid-Niveaus zwischen etwa 400 ppb (mg/Kg) bis etwa 1100 ppb (mg/Kg), etwa 400 ppb (mg/Kg) bis etwa 1000 ppb (mg/Kg), etwa 400 ppb (mg/Kg) bis etwa 900 ppb (mg/Kg), etwa 400 ppb (mg/Kg) bis etwa 800 ppb (mg/Kg), etwa 400 ppb (mg/Kg) bis etwa 700 ppb (mg/Kg), etwa 500 ppb (mg/Kg) bis etwa 1100 ppb (mg/Kg), etwa 500 ppb (mg/Kg) bis etwa 1000 ppb (mg/Kg), etwa 500 ppb (mg/Kg) bis etwa 900 ppb (mg/Kg), etwa 500 ppb (mg/Kg) bis etwa 800 ppb (mg/Kg) oder etwa 500 ppb (mg/Kg) bis etwa 750 ppb (mg/Kg) aufweisen.
Das obige Verfahren kann weiter eine Wärmebehandlung der Kartoffel zu einem Crisp, Chip, Pommes frites, Kartoffelstäbchen, einer Julienne-geschnittenen Kartoffel oder einem anderen essbaren Kartoffelprodukt, oder der Süßkartoffel zu einen Crisp, Chip, Pommes frites oder einem anderen Süßkartoffelprodukt umfassen.
In dem obigen Verfahren umfasst das RNAi-Konstrukt ein Polynukleotid mit wenigstens 90% Sequenzidentität zu einem Polynukleotid, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 5, 6, 9, 10, 11, 23 und 24. Das RNAi-Konstrukt umfasst alternativ ein Polynukleotid mit wenigstens 95% Sequenzidentität zu einem Polynukleotid, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 5, 6, 9, 10, 11, 23 und 24. In einer noch weiteren Alternative umfasst das RNAi-Konstrukt ein Polynukleotid mit wenigstens 98% Sequenzidentität zu einem Polynukleotid, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 5, 6, 9, 10, 11, 23 und 24.
Das RNAi-Konstrukt umfasst als noch weitere Alternative ein Polynukleotid, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 5, 6, 9, 10, 11, 23 und 24.
In diesem Verfahren kann der RNAi-Vektor mittels Agrobacterium tumefaciens in Pflanzen eingebracht werden. Der RNAi-Vektor kann zum Beispiel einen pHELLSGATE-Vektor, wie bspw. pHELLSGATE2 oder pHELLSGATE8, umfassen. Pflanzen, die den erfindungsgemäßen Verfahren zugänglich sind, umfassen jene der Gattung Solanum, wie bspw. Kartoffel (Solanum tuberosum), sowie Süßkartoffel, Jamswurzel und Maniok.
KURZE BESCHREIBUNG VERSCHIEDENER ANSICHTEN DER ZEICHNUNG
1 zeigt einen Northern-Blot, der verschiedene transgene Kartoffellinien analysiert, die ein RNAi-Konstrukt enthalten, das VI targetiert. (A) Ein Northern-Blot, der die mRNA-Expressionsmuster des VI-Gens zwischen Kartoffellinien zeigt. C = Nicht-transformierte Kartoffelpflanze (Kontrolle), Spuren 1–15 stellen Proben von 15 unabhängigen VI-RNAi-transgenen Pflanzen dar. In den Proben 1, 2, 5 und 13 waren die VI-mRNA-Niveaus um so viel wie 95–99% verringert, wohingegen in den verbleibenden RNAi-Linien verschiedene Niveaus an Abschaltungs-Mustern festgestellt wurden. (B) Eine Gel-Ladekontrolle von RNA-Proben, die die Belademuster und die Integrität der RNA bestätigt. Das Gel-Bild wurde nach Färbung mit Ethidiumbromid unter UV für 10 Minuten aufgenommen.
2 zeigt eine phänotypische Analyse beispielhafter transgener Kartoffellinien, die ein RNAi-Konstrukt enthalten, das VI targetiert. (A) Während Gewächshaus-Experimenten wurden bei den VI-abgeschalteten transgenen Katahdin-Pflanzen im Vergleich zu nicht-transgenen Katahdin (Kontrolle), keine anormalen Phänotypen beobachtet. Die Bilder wurden von 50 Tage alten Pflanzen aufgenommen. (B) Knollen, geerntet von jeder dieser Linien. Es wurden keine anomalen Knollenphänotypen beobachtet und es wurden keine signifikanten Unterschiede (P < 0,05) im Knollenertrag zwischen VI-abgeschalteten Linien und Kontrollen beobachtet.
3 zeigt Raspel-Experimente zum Testen der Maillard-Raktion mittels Chip-Farbe. Der obere Teil zeigt Chips, die von Knollen-Proben erhalten wurden, die von einer repräsentativen VI-abgeschalteten RNAi-Linie (#1) (~99% abgeschaltet) genommen wurden, die für 60 Tage bei Raumtemperatur (20°C) und für einen Zeitraum von 14 Tage, 60 Tage, 90 und 180 Tage bei Kühllagerung (4°C) gelagert wurden. Der unterer Teil zeigt Chips, die von Knollen-Proben erhalten wurden, die von nichttransformierten (Katandin-Kontroll) Knollen genommen wurden, die für 60 Tage bei Raumtemperatur (20°C) und für einen Zeitraum von 14, 60, 90 und 180 Tage bei Kühllagerung (4°C) gelagert wurden. Mit einer optischen Kartoffelchip-Farbbewertung von 3,0 wurden Chips bewertet, die als Proben von Knollen von einer bei Raumtemperatur gelagerten Linie, sowohl von Kontroll- als auch von RNAi-Linie, genommen wurden. Bemerkenswerterweise wurden mit einer Chip-Bewertung von 3,0 Chips bewertet, die als Proben von 14, 60, 90 und 180 Tagen kühlgelagerten Knollen der RNAi-Line genommen wurden. Mit einer Chip-Bewertung von 6,0 wurden jedoch Chips bewertet, die nach 14 Tage von der kühl-gelagerten Kontroll-Line als Proben genommen wurden und von 8,0 für alle Chips, die direkt nach 60, 90 und 180 Tagen Kühllagerung als Proben genommen wurden. Die Chip-Skala wird durch 1 (hell) bis 10 (dunkel) dargestellt. Eine optische Kartoffelchip-Farbbewertung ist in Tabelle 6 bereitgestellt.
4 zeigt die Korrelation der Chip-Farbe mit der Menge an VInv-Transkript. Alle Chips wurden von Knollenproben erhalten, die nach 60 Tagen Lagerung bei entweder 20°C oder bei 4°C (direktes Raspeln nach der Kühllagerung) genommen wurden. Repräsentative Knollen-Proben wurden von VI-RNAi-Linien gesammelt, die wie in Tabelle 6 beschrieben verschiedene Niveaus von Transkripten darstellen. RNAi-Line #10 zeigte keine Verringerung an VI-Transkript und erzeugte bei Raspeln an Tag 60, bei Lagerung bei 4°C, eine schlechte Chip-Bewertung von 8,0. RNAi-Line #1 zeigte eine 99%ige VI-Transkript-Verringerung und erzeugte bei Raspeln an Tag 60 eine gute Chip-Bewertung von 3,0 (Knollen gelagert bei 4°C). RNAi-Linie #3 zeigte eine ~90%ige Verringerung des VI-Transkripts und erzeugte eine mittlere Chip-Bewertung von 5,5 bei Raspeln an Tag 60 (Knollen gelagert bei 4°C). RNAi-Linie #5 zeigte eine 80%ige VI-Transkript-Verringerung und erzeugte eine mittlere Chip-Bewertung von 5,0 bei Raspeln an Tag 60 (Knollen gelagert bei 4°C). RNAi-Linien #6, 8 zeigten eine 60%ige bzw. 20%ige Transkript-Verringerung. Diese beiden Linien erzeugten schlechte Chip-Bewertungen von 7,0 bei Raspeln an Tag 60 (Knollen gelagert bei 4°C).
5 ist ein Balkendiagramm von Acrylamid-Niveaus in Kartoffelchips, die von VI-abgeschalteten Linien stammen. Die Acrylamid-Analyse wurde mit Chips durchgeführt, die von bei 4°C für 14 Tage kühlgelagerten Knollen-Proben von drei repräsentative VI-abgeschalteten RNAi-Linien (unter Verwendung von RNAi # 1, 2, 3) und Katahdin (Kontrolle) erhalten wurden. Acrylamid-Niveaus sind als ppb (mg/kg) dargestellt und stellen den Mittelwert von zwei unabhängigen Messungen, einschließlich der Standardabweichung, dar. Sterne zeigen signifikante Unterschiede zwischen RNAi-Linien und der Katahdin Kontroll-Linie (P < 0,05).
6 ist ein Balkendiagramm von Acrylamid-Niveaus in Kartoffelchips, die von VI-abschaltenden Linien stammen. Die Acrylamidanalyse wurde an Chips durchgeführt, die von bei 4°C für 180 Tage kühlgelagerten Knollenproben von drei repräsentativen VI-abgeschalteten RNAi-Linien (RNAi # 1, 2, 3) und Katahdin (Kontrolle) erhalten wurden. Acrylamid-Niveaus sind als ppb (mg/kg) dargestellt und stellen den Mittelwert von zwei unabhängigen Messungen, einschließlich Standardabweichung, dar. Sterne zeigen signifikante Unterschiede zwischen RNAi-Linien und der Katahdin Kontroll-Linie (P < 0,05).
7 zeigt einen Vergleich von Acrylamid-Mustern zwischen Knollen, die bei RT oder bei 4°C für 14 Tage und für 180 Tage gelagert wurden. Acrylamid-Niveaus bei RNAi-Linien (#1, 2, 3) zeigten, verglichen mit den Kontrollen, zwischen Lagerung bei RT und 4°C für 14 Tage und 180 Tage nur leichte Veränderungen. Die Acrylamid-Niveaus erhöhten sich jedoch bei Lagerung bei 4°C für 14 Tage oder 180 Tage bei Knollen, die von der Katahdin Kontrolllinien erhalten wurden, um ein Vielfaches. Acrylamid-Niveaus sind als ppb (mg/Kg) dargestellt.
8 zeigt die Feld-Bewertungen von VI-RNAi-Linien der vorliegenden Erfindung, die an zwei Standorten in Wisconsin angebaut wurden, wobei Kontroll- (engt control, C) und Leer-Vektor-Linien (engl. empty vector, EV), wie in Beispiel 9 beschrieben, verglichen wurden. Genauer Vergleiche des Knollenertrages zwischen auf Feldern angebauter Kontroll- und VI-RNAi-Linien. Der mittlere Gesamtertrag (g) pro Pflanze (n = 9) bei Kontroll- und Leer-Vektor transformierten Pflanzen betrug 2123 ± 253 bzw. 2120 ± 392. Der mittlere Gesamtertrag (g) bei drei unabhängigen VI-RNAi-Linien #2, #3 und #1 betrug 1963 ± 233, 1961 ± 329 bzw. 1767 ± 166. Ein Fisher-LSD-Test (LSD; engl. Fisher's Least Significant Difference), als ein Vergleich der mittleren Gesamterträge, zeigte keine signifikanten Unterschiede (alpha von 0,05) zwischen Kontrollen (Kontroll- und Leer-Vektor) und #2 und #3. Bei einem alpha von 0,05 zeigte der LSD-Test jedoch einen signifikanten Unterschied zwischen Kontrollen und Linie #1. Signifikante Unterschiede von Kontrollen (P < 0,05) sind durch einen Stern angegeben.
9 zeigt Messungen der spezifischen Dichte geernteter Knollen von auf Feldern angebauten VI-RNAi-Linien (#2, #3, #1) der vorliegenden Erfindung, die an zwei Standorten in Wisconsin angebaut wurden, wobei Kontroll- (C) und Leer-Vektor-Linien (EV), wie in Beispiel 9 beschrieben, verglichen wurden. Diese Abbildung zeigt, dass die VI-RNAi-Linien (#2, #3, #1) im Vergleich zu den Kontroll- und Leer-Vektor-Linien übereinstimmende (p < 0,05) Messungen der spezifischen Dichte zeigten.
10 zeigt die Ergebnisse von Raspel-Experimenten zum Testen der Maillard-Reaktion mittels der Chip-Farbe an auf Feldern angebauten Knollen, die von erfindungsgemäßen VI-RNAi-Linien erhalten wurden, die an zwei Standorten in Wisconsin angebaut wurden. Der obere Teil zeigt Chips, die von auf Feldern angebauten Knollenproben erhalten wurden, die von zehn repräsentativen VI-abgeschalteten RNAi-Linien #1, #2, #3 (~99% abgeschaltet) und Kontrollen genommen wurden, die bei Kühllagerung (4°C) für einen Zeitraum von 14 Tagen gelagert wurden. Der untere Teil zeigt Chips, die von auf Feldern angebauten Knollenproben erhalten wurden, die von zehn repräsentativen VI-abgeschalteten RNAi-Linien #1, #2, #3 (~99% abgeschaltet) und Kontrollen erhalten wurden, die bei Raumtemperatur (RT) für einen Zeitraum von 14 Tagen gelagert wurden.
11 zeigt weitere Ergebnisse von Raspel-Experimenten an Knollen, die von auf Feldern angebauten VI-RNAi-Linien der vorliegenden Erfindung erhalten wurden, die an zwei Standorten in Wisconsin angebaut wurden. Diese Abbildung zeigt insbesondere die Chip-Farbe von auf Feldern angebauten Knollen, die entweder einer Kühllagerung für 14 Tage bei 4°C unterworfen wurden oder bei Raumtemperatur (RT) für 14 Tage gelagert wurden. 50 unabhängige Chips wurden in Scheiben von 10 verschiedenen Knollen von jeder dieser Linien (#1, #2, #3 und Kontrolle) abgeschnitten und die Hunter-Werte-Messungen wurden durchgeführt. Der horizontale Strich-Balken stellt die untere Grenze eines kommerziell annehmbaren Hunter-Farbwerts dar. Hunter-Werte von ≥ 50 sind im Allgemeinen annehmbare Ergebnisse.
12 Diese Abbildung zeigt Acrylamid-Niveaus in Kartoffelchips, die von auf Feldern angebauten VI-abgeschalteten Linien stammen. Eine Acrylamid-Analyse wurde an Chips durchgeführt, die von auf Feldern angebauten, bei 4°C für 14 Tage gelagerten, Knollenproben von drei repräsentativen VI-abgeschalteten RNAi-Linien (RNAi #1, 2, 3) und Katahdin (Kontrolle) erhalten wurden. Acrylamid-Niveaus sind als ppb (mg/kg) dargestellt und stellen den Mittelwert von drei unabhängigen Messungen, einschließlich Standardabweichung, dar. Sterne geben signifikante Unterschiede zwischen RNAi-Linien und der Katahdin-Kontroll-Linie an (P < 0,05). Chips, die aus Knollen, die bei 4°C gelagert wurden, hergestellt wurden, zeigten bei zwei von drei Linien niedrigere Acrylamid-Niveaus als Chips von Knollen, die bei 20°C gelagert wurden.
13 zeigt Acrylamid-Niveaus in Kartoffelchips, die von im Gewächshaus angebauten VI-abgeschalteten Linien stammen. Eine Acrylamidanalyse wurde an Chips durchgeführt, die von im Gewächshaus angebauten, bei 4°C für 14 Tage kühl gelagerten Knollenproben von drei repräsentativen VI-abgeschalteten RNAi-Linien (RNAi #1, 2, 3) und der Katahdin (Kontrolle) stammen. Acrylamid-Niveaus sind als ppb (mg/kg) dargestellt und stellen den Mittelwert von drei unabhängigen Messungen, einschließlich Standardabweichung, dar. Sterne stellen signifikante Unterschiede zwischen RNAi-Linien und der Katandin-Kontroll-Linie dar (P < 0,05). Chips, die von Knollen verarbeitet wurden, die bei 4°C gelagert wurden, zeigten bei allen drei Linien niedrigere Acrylamid-Niveaus als Chips von Knollen, die bei 20°C gelagert wurden.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG
Die vorliegende Erfindung löst schlüssig, überraschend und einfach das Kühllagerungs-induzierte Süßen in Kartoffeln und stellt dadurch schließlich eine endgültige, befriedigende Lösung für das lang gehegte Bedürfnis, die Komplikationen bei Lagerung bei niedrigen Temperaturen (2–12°C) zu lösen, bereit.
Die Erfinder waren überrascht, dass ein Abschalten des vakuolären Invertase (VI) Gens unter Verwendung eines RNA-Interferenz(RNAi)-Ansatzes alleine, insbesondere im Lichte der komplexen Natur des Kohlenhydrat-Stoffwechsels in Kartoffeln (Menendez et al., 2002; Sowokinos, 2007), ausreichend war. Die Erfinder haben verschiedene Kartoffel-Linien entwickelt, in denen das VI-Gen in der gesamten Kartoffelpflanze teilweise oder vollständig abgeschaltet ist. Diese Linien zeigten verglichen mit den Kontroll-Pflanzen unterschiedliche Invertase-RNA-Niveaus. Es war nicht nur überraschend, das Problem des Kühllagerungs-induzierten Süßens so einfach zu lösen, die Erfinder beobachteten auch keine nachteiligen Nebenwirkungen: es wurden keine phänotypischen Anomalien oder andere negative Effekte, einschließlich Knollengröße, -form und -Durchschnittsgewicht (Knollenertrag) beobachtet. An den am stärksten abgeschalteten Linien, die bei 39°F (4°C) für zwei Monate, 3 Monate und verlängert 6 Monate gelagert wurden, durchgeführte Raspel-Experimente erzeugten dramatische, hellfarbige, industriell annehmbare Kartoffelchips. Derartige Raspel-Experimente umfassen Testen der Chipfarbe (auf die Maillard-Reaktion) nach dem Ausbacken. Beispiele für Tests, die verwendet werden können, umfassen optische Farbbewertung, wie bspw. diejenige, die hierin in Tabelle 6 bereitgestellt ist. Die Chipfarbe kann unter Verwendung der Kartoffelchip-Farbreferenz-Standards, die vom Potato Chip Institute International, Cleveland, Ohio (Douches und Freyer, 1994; Reeves, 1982) entwickelt wurden, optisch bestimmt werden. Diese Ergebnisse zeigen deshalb nicht nur, dass Kühllagerungs-induziertes Süßen überraschend einfach gelöst werden kann, sondern verursachen auch einen Paradigmenwechsel hinsichtlich des Kartoffel-Kohlenhydrat-Stoffwechsels und Kühllagerungs-induzierten Süßens in der Kartoffel. CIS kann in der Kartoffel nicht länger als eine komplexe, quantitative Eigenschaft angesehen werden (Menendez et al., 2002), sondern als eine einfache Eigenschaft, die mittels eines einzigen Gens, dem Gen der vakuolären sauren Invertase, manipuliert werden kann.
Die Erfindung wird durch ein Verringern des Niveaus an VI Aktivität im Vergleich zu dessen Niveau in einer nicht-transgenen Kontroll-Kartoffelpflanze mittels Verringern des Niveaus einer mRNA in der transgenen Kartoffelpflanze erreicht, wobei die mRNA durch ein Polynukleotid mit wenigstens 90% Sequenzidentität zu einer Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO: 4 kodiert ist, und mittels Expression eines RNAi-Konstrukts, das ein Fragment aus wenigstens 20 aufeinanderfolgenden Nukleotiden einer Sequenz mit wenigstens 90% Sequenzidentität zu SEQ ID NO: 4 umfasst. Zum Beispiel kann die Erfindung mittels Expression eines RNAi-Konstrukts in einer Pflanze, wie bspw. einer Kartoffelpflanze, ausgeführt werden, wobei das RNAi-Konstrukt ein Polynukleotid mit wenigstens 90%–99% Sequenzidentität zu einem Polynukleotid umfasst, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 5, 6, 9, 10, 11, 23 und 24. Das RNAi-Konstrukt kann auch ein Polynukleotid umfassen, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 5, 6, 9, 10, 11, 23 und 24.
Die erfindungsgemäßen Verfahren können mittels herkömmlicher transgener Techniken und rekombinanter DNA-Technologien einfach ausgeführt werden.
DEFINITIONEN
”Etwa” bezeichnet ein Plus oder Minus von etwa zehn Prozent (10%) eines genannten Wertes.
”Kühllagerung” wie hierin verwendet bezeichnet die Lagerung einer Kartoffel oder Süßkartoffel bei einer Temperatur von 12°C oder weniger. ”Kühllagerung” bezeichnet alternativ einen Bereich einer Temperatur von 2°C bis 12°C. Beispiele für ”Kühllagerungs”-Temperaturen für Kartoffeln und Süßkartoffeln sind Temperaturen von 2°C bis 4°C oder 8°C bis 10°C. Eine Kühllagerung kann für einen Zeitraum von wenigstens 2 Stunden erfolgen. Genauer kann eine Kühllagerung für einen Zeitraum von wenigstens drei Stunden, wenigstens vier Stunden, wenigstens fünf Stunden, wenigstens sechs Stunden, wenigstens acht Stunden, wenigstens zehn Stunden, wenigstens 12 Stunden, wenigstens 18 Stunden, wenigstens 24 Stunden, wenigstens 30 Stunden, wenigstens 36 Stunden oder langer erfolgen.
”Raumtemperatur-Bedingungen” oder ”Raumtemperatur” wie hierin miteinander austauschbar verwendet, meint eine Temperatur von zwischen 18° bis 26°C. Genauer kann Raumtemperatur-Bedingungen oder Raumtemperatur eine Temperatur von 19,5°C bis 25,5°C sein.
”Kartoffelprodukt” oder ”essbares Kartoffelprodukt” wie hierin miteinander austauschbar verwendet, bezeichnet zum Verzehr bestimmte Lebensmittel, die von Kartoffeln stammen, wie bspw., jedoch ohne darauf beschränkt zu sein, Crisps, Kartoffelchips, Julienne-Schnitten (auch bekannt als Kartoffelstäbchen), Pommes frites, Kartoffelstäbchen und Julienne-geschnittene Kartoffeln (Julienne-geschnittene Kartoffeln (engl. shoestring potatoes) sind extrem dünne (nämlich 2–3 mm) Versionen normaler Pommes frites, die jedoch in der Art normaler gesalzener Kartoffelchips ausgebacken werden).
”Wärmebehandlung” wie hierin verwendet, bezeichnet ein Erhitzen eines Kartoffelprodukts oder Süßkartoffelprodukts in Öl (wie bspw. Getreideöl, Olivenöl, Gemüseöl, Erdnussöl, Rapsöl) oder Fett bei einer Temperatur von 160°F bis etwa 375°F mittels den Fachleuten bekannten Routinetechniken (wie bspw. traditionelles Ausbacken in schwimmendem Fett, Vakuum-Ausbacken, Ausbacken im Ofen, Ausbacken im Kessel, etc.).
”Kartoffel” wie hierin verwendet, bezeichnet eine jegliche Sorte von Solanum tuberosum. Beispiele für Sorten von Solanum tuberosum, die innerhalb der vorliegenden Erfindung liegen können, sind Allegany, Atlantic, CalWhite, Cascade, Castile, Chipeta, Gemchip, Irish Cobbler, Freedom Russet, Itasca, Kanona, Katahdin, Kennebec, La Chipper, MegaChip, Millennium Russet, Monona, Norchip, Norwis, Onaway, Ontario, Pike, Sebago, Shepody, Snowden, Superior, White Rose, Yukon Gold, Red Rounds, Chieftain, La Rouge, NorDonna, Norland, Red La Soda, Red Pontiac, Red Ruby, Sangre, Viking, Russets, BelRus, Centennial Russet, Century Russet, Frontier Russet, Goldrush, Hilite Russet, Krantz, Lemhi Russet, Nooksack, Norgold Russet, Norking Russet, Dakota Pearl, Ranger Russet, Ranger Russet Mews Release, Russet Burbank, Russet Norkotah, Russet Nugget Villetta Rose und White Pearl.
”Spezifisch hybridisieren” bezeichnet die Fähigkeit einer Nukleinsäure, nachweisbar und spezifisch an eine zweite Nukleinsäure zu binden. Polynukleotide hybridisieren spezifisch mit Ziel-Nukleinsäuresträngen unter Hybridisierungs- und Wasch-Bedingungen, die nennenswerte Mengen nachweisbaren Bindens nicht-spezifischer Nukleinsäuren minimieren.
Eine ”targetierende” Sequenz bedeutet, dass eine Nukleinsäuresequenz von Solanum tuberosum VI-Sequenz oder Komplementäre davon ein VI-Gen abschalten können. Beispielhafte targetierende Sequenzen umfassen SEQ ID NOs: 9–11 und 23–24. Es kann eine Ziel-Sequenz ausgewählt sein, die für eine bestimmte Kultursorte von Solanum tuberosum mehr oder weniger spezifisch ist. Zum Beispiel kann die targetierende Sequenz spezifisch für VI-Gene aus den Kartoffel-Sorten von, zum Beispiel, Allegany, Atlantic, CalWhite, Cascade, Castile, Chipeta, Gemchip, Irish Cobbler, Freedom Russet, Itasca, Kanona, Katahdin, Kennebec, La Chipper, MegaChip, Millennium Russet, Monona, Norchip, Norwis, Onaway, Ontario, Pike, Sebago, Shepody, Snowden, Superior, White Rose, Yukon Gold, Red Rounds, Chieftain, La Rouge, NorDonna, Norland, Red La Soda, Red Pontiac, Red Ruby, Sangre, Viking, Russets, BelRus, Centennial Russet, Century Russet, Frontier Russet, Goldrush, Hilite Russet, Krantz, Lemhi Russet, Nooksack, Norgold Russet, Norking Russet, Dakota Pearl, Ranger Russet, *Ranger Russet Mews Release, Russet Burbank, Russet Norkotah, Russet Nugget Villetta Rose und White Pearl sein.
Ein ”Polynukleotid” ist ein Nukleinsäure-Polymer aus Ribonukleinsäure (RNA), Desoxyribonukleinsäure (DNA), modifizierter RNA oder DNA, oder RNA- oder DNA-Mimetika (wie bspw. PNAs) und Derivate davon und Homologe davon. Somit umfassen Polynukleotide Polymere, die aus natürlich vorkommenden Nukleobasen, Zuckern und kovalenter Internukleosid-(Rückgrat-)Bindungen, sowie Polymeren mit nicht natürlich vorkommenden Teilen, die ähnlich funktionieren, zusammengesetzt sind. Derartige in der Technik und für die Zwecke der vorliegenden Erfindung wohl bekannte modifizierte oder subsituierte Nukleinsäure-Polymere werden als ”Analoge” bezeichnet. Oligonukleotide sind im Allgemeinen kurze Polynukleotide von etwa 10 bis zu etwa 160 oder 200 Nukleotiden.
”Solanum tuberosum VI (Sequenz variantes Polynukleotid” oder ”Solanum tuberosum VI-Sequenz variante Nukleinsäuresequenz” bezeichnet ein Solanum tuberosum VI-Sequenz variantes Polynukleotid mit wenigstens etwa 60% Nukleinsäure-Sequenzidentität, bevorzugtererweise wenigstens etwa 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% Nukleinsäure-Sequenzidentität und noch bevorzugtererweise wenigstens etwa 99% Nukleinsäure-Sequenzidentität zu der Nukleinsäuresequenz von. Varianten umfassen nicht die native Nukleotidsequenz.
Normalerweise sind Solanum tuberosum VI-Sequenz variante Polynukleotide wenigstens etwa 8 Nukleotide lang, häufig wenigstens etwa 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 Nukleotiden lang, oder sogar etwa 75–200 Nukleotide oder mehr lang.
”Prozent (%) Nukleinsäure-Sequenzidentität” hinsichtlich Solanum tuberosum VI Sequenz-Nukleinsäuresequenzen ist als der prozentuale Anteil an Nukleotiden in einer Kandidatensequenz definiert, die identisch mit den Nukleotiden in der interessierenden Solanum tuberosum VI-Sequenz sind, nachdem die Sequenzen aneinander ausgerichtet wurden (engl. aligned) und, sofern notwendig, Lücken eingefügt wurden, um die maximale prozentuale Sequenzidentität zu erhalten. Ein Aneinanderausrichten (engl. Alignment) zu Zwecken des Bestimmens der prozentualen Nukleinsäure-Sequenzidentität kann auf verschiedenen Wegen, die innerhalb der Fachkenntnisse liegen, erreicht werden, beispielsweise unter Verwendung öffentlich verfügbarer Computer-Software wie bspw. BLAST, BLAST-2, ALIGN oder Megalign (DNASTAR) Software. Fachleute können angemessene Parameter zur Messung eines Aneinanderausrichtens bestimmen, einschließlich denjenigen, die zum Erreichen des maximalen Aneinanderausrichtens über die volle Länge der Sequenzen, die verglichen werden, benötigt werden.
Beim Aneinanderausrichten von Nukleotidsequenzen kann die prozentuale Nukleinsäure-Sequenzidentität einer gegebenen Nukleinsäuresequenz C zu, mit, oder gegen eine gegebene Nukleinsäuresequenz D (die alternativ ausgedrückt werden kann, als eine gegebene Nukleinsäuresequenz C, die eine bestimmte % Nukleinsäure-Sequenzidentität zu, mit oder gegen eine gegebene Nukleinsäuresequenz D hat oder umfasst) wie folgt berechnet werden:
% Nukleinsäure-Sequenzidentität = W/Z·100,
wobei
W die Anzahl an Nukleotiden ist, die als identische Gegenstücke mittels des Sequenz-Aneinanderausrichtungsprogramms oder des Aneinanderausrichtungs-Algorithmus von C und D bestimmt ist
und
Z die Gesamtzahl an Nukleotiden in D ist.
Wenn die Länge von Nukleinsäuresequenz C nicht gleich der Länge von Nukleinsäuresequenz D ist, wird die % Nukleinsäure-Sequenzidentität von C zu D nicht gleich der % Nukleinsäure-Sequenzidentität von D zu C sein.
”Im Wesentlichen bestehend aus einem Polynukleotid mit einer % Sequenzidentität” bedeutet, dass das Polynukleotid sich nicht wesentlich in der Länge, jedoch in der Sequenz, unterscheidet. Somit meint, dass ein Polynukleotid ”A” im Wesentlichen aus einem Polynukleotid mit 80% Sequenzidentität zu einer bekannten Sequenz ”B” mit 100 Nukleotiden besteht, dass Polynukleotid ”A” etwa 100 nts lang ist, jedoch in bis zu 20 nts von der Sequenz ”B” abweichen kann. Die fragliche Polynukleotidsequenz kann aufgrund von Modifikation der Enden länger oder kürzer sein, wie zum Beispiel dem Hinzufügen von 1–15 Nukleotiden, um spezifische Probenarten, Primer und andere molekularen Werkzeuge, etc., herzustellen wie dies bspw. der Fall ist, wenn im Wesentlichen nicht-identische Sequenzen hinzugefügt werden, um beabsichtigte Sekundärstrukturen zu erzeugen. Derartige nicht-identischen Nukleotide werden nicht in der Berechnung der Sequenzidentität berücksichtigt, wenn die Sequenz durch ”bestehend im Wesentlichen aus” modifiziert ist.
Die Spezifität einzelsträngiger DNA komplementäre Fragmente zu hybridisieren, wird durch die Stringenz der Reaktionsbedingungen bestimmt. Die Hybridisierungs-Stringenz wird erhöht, wenn sich der Hang, DNA-Duplexe zu bilden, verringert. In Nukleinsäure-Hybridisierungsreaktionen kann die Stringenz so gewählt werden, dass sie entweder spezifische Hybridisierungen (hohe Stringenz) begünstigt. Weniger spezifische Hybridisierungen (niedrige Stringenz) kann verwendet werden, um verwandte, jedoch nicht exakte DNA-Moleküle (homolog, jedoch nicht identisch) oder Segmente, zu identifizieren.
DNA-Duplexe werden stabilisiert durch: (1) die Anzahl komplementärer Basenpaare, (2) die Art der Basenpaare, (3) Salzkonzentration (ionische Stärke) des Reaktionsgemischs, (4) die Temperatur der Reaktion und (5) die Gegenwart bestimmter organischer Lösungsmittel, wie bspw. Formamid, das die DNA-Duplex-Stabilität verringert. Ein üblicher Ansatz besteht darin, die Temperatur zu variieren: höhere Temperaturen erzielen stringentere Reaktionsbedingungen. Ausubel et al. (1987) stellen eine hervorragende Erklärung für die Stringenz von Hybridisierungs-Reaktionen bereit (Ausubel, 1987).
Unter ”stringenten Bedingungen” zu hybridisieren beschreibt Hybridisierungsprotokolle, in denen Nukleotidsequenzen, die wenigstens 60% homolog zueinander sind, hybridisiert bleiben. ”Small interfering RNA” (”siRNA”) (oder ”short interfering RNAs”) bezeichnen eine RNA (oder ein RNA-Analog), die zwischen etwa 10–50 Nukleotiden (oder Nukleotid-Analoge) umfasst und die in der Lage ist, RNA-Interferenz zu steuern oder zu vermitteln. Eine wirksame siRNA kann zwischen etwa 15–30 Nukleotiden oder Nukleotidanaloge, zwischen etwa 16–25 Nukleotide, zwischen etwa 18–23 Nukleotide und sogar etwa 19–22 Nukleotide umfassen.
”Nukleotidanalog” oder ”verändertes Nukleotid” oder ”modifiziertes Nukleotid” bezeichnet ein Nicht-Standard-Nukleotid, einschließlich nicht natürlich vorkommender Ribonukleotide oder Deoxyribonukleotide. Bevorzugte Nukleotidanaloge sind an irgendeiner Position modifiziert, so dass bestimmte chemische Eigenschaften des Nukleotids verändert sind, die Fähigkeit des Nukleotidanalogs dessen angedachte Funktion auszuführen jedoch beibehalten sind. Beispiele für Positionen des Nukleotids, die derivatisiert sein können, umfassen die Position 5, z. B. 5-(2-Amino)propyluridin, 5-Bromuridin, 5-Propinuridin, 5-Propenyluridin, etc.; die Position 6, z. B. 6-(2-Amino)Propyluridin; die Position 8 für Adenosin und/oder Guanosine, z. B. 8-Bromguanosin, 8-Chlorguanosin, 8-Fluorguanosin, etc. Nukleotidanaloge umfassen auch Deaza-Nukleotide, z. B. 7-Deaza-Adenosin; O- und N-modifizierte (z. B. alkylierte, z. B. N6-Methyladenosin oder wie anderweitig in der Technik bekannt) Nukleotide; und andere heterozyklisch modifizierte Nukleotidanaloge (Herdewijn, 2000).
”RNA-Analog” bezeichnet ein Polynukleotid (z. B. ein chemisch synthetisiertes Polynukleotid) mit wenigstens einem verglichen mit einer entsprechenden unveränderten oder nicht modifizierten RNA veränderten oder modifizierten Nukleotid, das jedoch die gleiche oder ähnliche Natur oder Funktion wie die entsprechende unveränderte oder nicht modifizierte RNA beibehält. Oligonukleotide können mit Bindungen verbunden sein, die im Vergleich zu einem RNA-Molekül mit Phosphodiester-Bindungen, zu einem geringeren Ausmaß an Hydrolyse des RNA-Analogs führen. Zum Beispiel können die Nukleotide des Analogs Methylendiol-, Ethylendiol-, Oxymethylthio-, Oxyethylthio-, Oxycarbonyloxy-, Phosphordiamidat-, Phophoramidat- und/oder Phosphorthioat-Bindungen umfassen. RNA-Analoge umfassen Zucker- und/oder Rückgrat-modifizierte Ribonukleotide und/oder Deoxyribonukleotide. Derartige Veränderungen oder Modifikationen können weiter Hinzufügen von nicht-Nukleotidmaterial umfassen, wie bspw. an dem/den Ende(n) oder innerhalb (an einem oder mehreren Nukleotiden der RNA) der RNA. Ein RNA-Analog muss nur ausreichend ähnlich zur natürlichen RNA sein, so dass es die Fähigkeit hat, RNA-Interferenz zu vermitteln (vermittelt).
”RNA-Interferenz” (”RNAi”) bezeichnet einen ausgewählten intrazellulären Abbau von RNA. RNAi kommt natürlicherweise in Zellen vor, um fremde RNAs (z. B. virale RNAs) zu entfernen. Natürliche RNAi verläuft über Fragmente, die aus freier dsRNA, die den Abbaumechanismus zu anderen ähnlichen RNA-Sequenzen lenkt, abgespalten werden. Alternativ kann RNAi, zum Beispiel um die Expression von Zielgenen abzuschalten, durch die menschliche Hand initiiert werden. Ein RNAi-Mittel mit einem Strang, dessen ”Sequenz ausreichend komplementär ist zu einer Ziel-mRNA-Sequenz, um Ziel-spezifische RNA-Interferenz (RNAi) zu steuern” meint, dass der Strang eine Sequenz hat, die ausreicht, um die Zerstörung der Ziel-mRNA durch die RNAi-Maschinerie oder den RNAi-Prozess auszulösen.
Ein ”isoliertes” Molekül (z. B. ”isolierte siRNA” oder ”isolierter siRNA-Präkursor”) bezeichnet ein Molekül, das im Wesentlichen frei ist von anderem zellulärem Material, oder Kulturmittel, wenn es mittels rekombinanter Techniken hergestellt ist, oder im Wesentlichen frei von chemischen Präkursoren oder anderen Chemikalien ist, wenn es chemisch synthetisiert ist.
”Transgen” bezeichnet ein jegliches Nukleinsäuremolekül, das durch Kunstgriff in eine Zelle eingeführt ist und Teil des Genoms des Organismus wird, der sich aus der Zelle entwickelt. Solch ein Transgen kann ein Gen umfassen, das zum Teil oder vollständig heterolog (d. h. fremd) zu dem transgenen Organismus ist oder kann ein Gen darstellen, das homolog zu einem endogenen Gen des Organismus ist. ”Transgen” meint auch ein Nukleinsäuremolekül, das ein oder mehrere ausgewählte Nukleinsäuresequenzen, z. B. DNAs, die ein oder mehrere konstruierte RNA-Präkursoren kodieren umfasst, die in einem transgenen Organismus, z. B. einer Pflanze exprimiert werden sollen, der zum Teil oder vollständig heterolog, d. h. fremd, zu der transgenen Pflanze, oder homolog zu einem endogenen Gen der transgenen Pflanze ist, der jedoch angelegt wurde, um in das Pflanzengenom an einer Stelle eingeführt zu werden, die sich von der des natürlichen Gens unterscheidet. Ein Transgen umfasst einen oder mehrere Promotoren und eine jegliche andere DNA, wie bspw. Introns, die zur Expression der ausgewählten Nukleinsäuresequenz notwendig sind und die funktionell mit der ausgewählten Sequenz verbunden sind, und kann eine Enhancer-Sequenz umfassen.
Vergleichen eines Werts, Niveaus, Merkmals, einer Eigenschaft, Fähigkeit, etc. mit einer geeigneten Kontrolle meint Vergleichen des Wertes, Niveaus, Merkmals, der Eigenschaft oder Fähigkeit mit einer jeden Kontrolle oder einem jeden Standard, die/der einem Durchschnittsfachmann vertraut und für Vergleichszwecke nützlich ist. Eine geeignete Kontrolle kann ein Wert, Niveau, Merkmal, eine Eigenschaft, Fähigkeit, etc. sein, die bestimmt wurde, bevor eine RNAi-Methodik durchgeführt wird. Zum Beispiel kann eine Transkriptionsrate, ein mRNA-Niveau, eine Translationsrate, ein Proteinniveau, eine biologische Aktivität, eine zelluläre Eigenschaft oder Fähigkeit, ein Genotyp, Phänotyp, etc. bestimmt werden, bevor ein erfindungsgemäßes RNAi-Mittel in eine Zelle oder einen Organismus eingebracht wird. Eine geeignete Kontrolle kann ein Wert, Niveau, Merkmal, eine Eigenschaft, Fähigkeit, etc. sein, der/die in einer Zelle oder einem Organismus bestimmt wird, z. B. einer/einem Kontroll- oder normalen Zelle oder -Organismus, der zum Beispiel normale Eigenschaften aufweist. Eine Kontrolle kann auch ein vordefinierter Wert, ein vordefiniertes, Merkmal, eine vordefinierte Eigenschaft, Fähigkeit, etc. sein.
DURCHFÜHRUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung umfasst Verfahren zum Abschalten von Solanum tuberosum- oder Süßkartoffel-VI-Genen, wobei eine Solanum tuberosum- oder Süßkartoffelpflanze mit Nukleinsäuren transformiert wird, die in der Lage sind, die VI-Gene abzuschalten. Abschalten der VI-Gene kann bequem durch Sub-Klonieren der Polyunkleotide gemäß SEQ ID NOs: 5, 6, 9–11 und 23–24 in RNAi-Vektoren durchgeführt werden. Die hierin beschriebenen Verfahren können verwendet werden, um (1) Kälte-induziertes Süßen in Kartoffel oder Süßkartoffel zu steuern; und (2) Acrylamid-Niveaus in verarbeiteten Produkten aus Kartoffel oder Süßkartoffel zu verringern.
RNA-Interferenz (RNAi) in Pflanzen (d. h. post-transriptionelles Gen-Abschalten (PTGS, engl. post-transcriptional gene silencing)) ist ein Beispiel für eine umfassende Familie an Phänomenen, die zusammenfassen als RNA-Abschalten (engl. RNA silencing) bezeichnet wird (Hannon, 2002). Die vereinheitlichenden Merkmale von Phänomenen des RNA-Abschaltens sind die Herstellung kleiner (21–26 nt) RNAs, die als Spezifitäts-Faktoren zum Herunterregulieren von Genexpression agieren (Hamilton und Baulcombe 1999; Hammond et al. 2000; Parrish et al. 2000; Zamore et al. 2000; Ojikeng et al. 2001; Parrish und Fire 2001; Tijsterman et al. 2002) und das Erfordernis eines oder mehrerer Mitglieder der Argonaute-Proteinfamilie (oder PPO-Proteine, benannt nach deren charakteristischen PAZ- und Piwi-Domänen) (Tabara et al. 1999; Fagard et al. 2000; Hammond et al. 2001; Hutvagner und Zamore 2002; Kennerdell et al. 2002; Martinez et al. 2002a; Pal-Bhadra et al. 2002; Williams und Rubin 2002). Kleine RNAs werden in Tieren durch Mitglieder der Dicer-Familie doppelsträngiger RNA(dsRNA)-spezifischer Endonukleasen erzeugt (Bernstein et al. 2001; Billy et al. 2001; Grishok et al. 2001; Ketting et al. 2001). Mitglieder der Dicer-Familie sind große, multi-Domänenproteine, die putative RNA-Helikase, PAZ, zwei Tandem-Ribonuklease III (RNase III) und ein oder zwei dsRNA-bindende Domänen enthalten. Die Tandem-RNase III-Domänen vermitteln vermutlich endonukleolytisches Spalten von dsRNA in kurze interferierende RNAs (engl. small interfering RNAs; siRNAs), den Vermittlern von RNAi. In Drosophila und Säugern bilden siRNAs zusammen mit einem oder mehrerer Argonaut-Proteinen einen Protein-RNA-Komplex, den RNA-induzierten Abschaltungs-Komplex (RISC, engl. RNA-induced silencing complex), der die Spaltung von Ziel-RNAs an Sequenzen mit ausgedehnter Komplementarität zu der siRNA vermittelt (Zamore et al., 2000).
Zusätzlich zu Dicer- und Argonauten-Proteinen werden RNA-abhängige RNA-Polymerase(RdRP)-Gene zum RNA-Abschalten in PTGS benötigt, welches durch Transgene initiiert wird, die eine endogene mRNA in Pflanzen überexprimieren (Zamore et al., 2000), obwohl Transgene, die angelegt wurden, um dsRNA zu erzeugen, dieses Erfordernis umgehen (Beclin et al., 2002). Dicer in Tieren und CARPEL FACTORY (CAF, ein Dicer-Homolog) in Pflanzen erzeugen auch microRNAs (miRNAs), 20–24-nt lange, einzelsträngige nicht-kodierende RNAs, von denen angenommen wird, dass sie endogene mRNA-Expression regulieren (Park et al., 2002). miRNAs werden durch Dicer-Spaltung von Stamm-Schleifen-Vorläufer-RNA-Transkripten (pre-miRNAs) erzeugt; die miRNA kann entweder an der 5'- oder 3'-Seite des doppelstränigen Sammes liegen. Im Allgemeinen haben Pflanzen-miRNAs bei weitem größere Komplementarität zu zellulären mRNAs, als dies in Tieren der Fall ist, und es wurde vorgeschlagen, dass diese Spaltung von Ziel-RNA mittels einem RNAi-ähnlichen Mechanismus vermitteln (Llave et al., 2002; Rhoades et al., 2002).
In Pflanzen kann RNAi durch ein Transgen erreicht werden, das Haarnadel-RNA (engl. hairpin RNA; hpRNA) mit einer dsRNA-Region erzeugt (Waterhouse und Helliwell, 2003). Obwohl Gegenstrang-vermitteltes Gen-Abschalten ein RNAi-verbundenes Phänomenen ist (Di Serio et al., 2001), ist hpRNA-induzierte RNAi effizienter (Chuang und Meyerowitz, 2000). In einem hpRNA-erzeugenden Vektor ist das Zielgen als ein Inverted Repeat kloniert, das mit einer nicht verwandten Sequenz als ein Abstandhalter (engl. spacer) in Zwischenräumen angeordnet ist und durch einen starken Promotor, wie bspw. den 35S CaMV-Promotor für Zweikeimblättrige oder den Mais-Ubiquitin 1-Promotor für Einkeimblättrige, getrieben wird. Wenn ein Intron als der Abstandhalter verwendet wird, was essentiell für die Stabilität des Inverted Repeats in Escherichia coli ist, wird die Effizienz hoch: beinahe 100% der transgenen Pflanzen zeigen Gen-Abschaltung (Smith et al., 2000; Wesley et al., 2001). RNAi kann gegen eine große Bandbreite an Zielen verwendet werden; 30 und 50 untranslatierte Regionen (UTRs), so kurz wie 100 nt, können effiziente Ziele von RNAi sein (Kusaba, 2004).
Zur genomweiten Genfunktions-Analyse ist eine Vektor zum Hochdurchsatz-Klonieren von Zielgenen als Inverted Repeats nützlich, der auf einer LR-Clonase-Reaktion beruht (Wesley et al., 2001). Ein weiterer Hochdurchsatz-RNAi-Vektor beruht auf dem ”Ausbreiten des RNA-Targetierens” (transitive RNAi) aus einem Inverted Repeat einer heterologen 30 UTR (Brummell et al., 2003). Ebenso wurde ein chemisch reguliertes RNAi-System entwickelt (Guo et al., 2003).
Virus-induziertes Gen-Abschalten (VIGS, engl. virus-induced gene silencing) ist ein weiterer Ansatz, der häufig verwendet wird, um die Genfunktion in Pflanzen zu untersuchen (Waterhouse und Helliwell, 2003). RNA-Viren erzeugen während ihres Lebenszykluses dsRNA durch die Wirkung virus-kodierter RdRP. Wenn das Virusgenom ein Wirtspflanzengen enthält, kann eine Inokulation mit dem Virus RNAi gegen das Pfanzengen auslösen. Dieser Ansatz ist insbesondere zum Abschalten essentieller Gene nützlich, was ansonsten bei Einbringen in das Keimplasma zu letalen Phänotypen führt. Amplicon ist eine VIGS betreffende Technik (Waterhouse und Helliwell, 2003). Sie verwendet einen Satz Transgene, der Virusgene, die für die Virusreplikation notwendig sind und ein Zielgen umfasst. Wie VIGS löst Amplicon RNAi aus, kann jedoch auch die Probleme der Wirtsspezifität von Viren überwinden (Kusaba, 2004).
Zusätzlich können siRNAs und hpRNAs synthetisiert und anschließend in Wirtszellen eingebracht werden. Die Polynukleotide gemäß SEQ ID NOs: 5, 6, 9–11 und 23–24 können durch herkömmliche Techniken hergestellt werden, wie bspw. Festphasensynthese unter einer Verwendung kommerziell verfügbaren Ausrüstung, wie bspw. derjenigen, die von Applied Biosystems USA Inc. (Foster City, CA; USA), DuPont, (Wilmington, DE; USA) oder Milligen (Bedford, MA; USA) bezogen werden kann. Modifizierte Polynukleotide, wie bspw. Phosphorothioate und alkylierte Derivate können auch leicht durch ähnliche, in der Technik bekannte Verfahren hergestellt werden (Ruth, 1990).
I. RNAi-Vektoren
Eine hervorragende Anleitung bezüglich RNAi-Vektoren kann in Preuss und Pikaard gefunden werden (Preuss und Pikaard, 2004). Verschiedene RNAi-Vektorenfamilien, die Agrobacterium tumefaciens-vermittelte Abgabe in Pflanzen verwenden, sind weit verbreitet. Alle teilen denselben Gesamtaufbau, unterscheiden sich jedoch hinsichtlich auswählbarer Marker, Klonierungsstrategien und anderer Elemente (Tabelle 1). Ein typischer Aufbau für ein RNAi-induzierendes Transgen umfasst einen starken Promotor (wie jene, die den Fachleuten wohl bekannt sind, wie bspw. Blumenkohl-Mosaikvirus 35S-Promotor), der die Expression von Sequenzen antreibt, die der/den targetierten mRNA(s) entspricht. Diese targetierenden Sequenzen werden in beiden Orientierungen kloniert und flankieren einen dazwischenliegenden Abstandhalter, der ein Intron sein kann oder eine Abstandhalter-Sequenz, die nicht gespleißt werden wird. Zur stabilen Transformation ist ein auswählbares Markergen, wie bspw. Herbizid-Resistenz oder Antibiotika-Resistenz, getrieben durch einen Pflanzen-Promotor, an das RNAi-induzierenden Transgen grenzend umfasst. Der auswählbare Marker spielt in RNAi keine Rolle, erlaubt jedoch, dass Transformanten durch Behandeln der Samen, ganzer Pflanzen oder kultivierter Zellen mit Herbizid oder Antibiotika identifiziert werden. Für transiente Expressionsexperimente wäre kein auswählbares Markergen notwendig. In Konstrukten zur Verwendung in A. tumefaciens-vermittelter Abgabe wird die T-DNA durch eine linke Rand-(LB, engl. left border) und eine rechte Rand-(RB, engl. right border)Sequenz flankiert, die das DNA-Segment abgrenzt, das transferriert werden soll. Zur stabilen Transformation, die durch andere Mittel als A. tumefaciens vermittelt wird, sind LB- und RB-Sequenzen unerheblich (Preuss und Pikaard, 2004).

TABELLE 1 Beispielhafte Vektoren zur stabilen Transformation zur hpRNA-Herstellung
	pFGC5941	pMCG161	pHannibal	pHELLSGATE
Organisms	Zweikeimblättrige	Einkeimblättrige	Zweikeimblättrige	Zweikeimblättrige
Klonierverfahren	Restriktionsverdau/Ligation	Restriktionsverdau/Ligation	Restriktionsverdau/Ligation	GATEWAY@ Rekombination (Invitrogen)
Bakterielle Selektion	Kanamycin	Chloramphenicol	Spectinomycin	Spectinomycin
Pflanzen Selektion	Basta	Basta	Chloramphenicol	Kanamycin
dsRNA Promotor	CaMV 35S	CaMV 355	CaMV 355	CaMV 35S
Inverted Repeat Abstandhalter	ChsA Intron	Waxy Intron	Pdk Intron	Pdk Intron

Zwei Vektoren sind insbesondere nützlich, pHANNIBAL und pHELLSGATE (Helliwell et al., 2005; Wesley et al., 2001). pHELLSGATE-Vektoren sind auch in U.S. Patent No. 6,933,146 und der US Patent-Veröffentlichung 2005/0164394 beschrieben. Der pHANNIBAL-Vektor weist T-DNA auf (der Teil des Plasmids, der mittels Agrobacterium-vermittelter Transformation zum Pflanzengenom transferiert wird), die ein auswählbares Markergen und einen starken Promotor stromaufwärts von einem Paar, ein Intron flankierender multipler Klonierungsstellen umfasst. Diese Struktur erlaubt das Klonieren von Sinn- und Gegensinn-Kopien von Zielsequenzen, die durch das Intron getrennt sind. Ein Derivat des pHANNIBAL-Vektors, pHELLSGATE2, erleichtert ein Hochdurchsatzklonieren von targetierenden Sequenzen. Die Effizienz von pHELLSGATE-Vektoren stellen einen potentiellen Vorteil für großdimensionierte Projekte bereit, die zum Ziel haben, ganze Gen-Kategorien auszuschalten. In diesem Vektor wurde der pHANNIBAL-Vektor modifiziert, indem die Polylinker mit aatB-Stellen-spezifischen Rekombinationssequenzen ersetzt wurden. pHELLSGATE8 ist identisch mit pHELLSGATE2, enthält jedoch die effizienteren aatP-Rekombinationsstellen.
Ein weiterer Satz RNAi-Vektoren, der ursprünglich für Arabidopsis und Mais angelegt wurde, ist vom Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC, Ohio State University, Columbus, OH) frei erhältlich und wurde vom Functional Genomics of Plant Chromatin Consortium (Gendler et al., 2008) gestiftet. Die Vektoren pFGC5941 und pMCG161 umfassen innerhalb der T-DNA ein auswählbares Markergen, Phosphinothricin-Acetyl-Transferase, das Resistenz gegen das Herbizid Basta vermittelt, und einen starken Promotor (der 35S Promotor des Blumenkohl-Mosaik-Virus), der die Expression der RNAi-induzierenden dsRNA antreibt. Die Einbringung von Zielsequenzen in den Vektor benötigt zwei Klonierschritte, die von Polylinkern, die ein Petunien-Chalconsynthaseintron flankieren, Gebrauch machen, ein Gesamtaufbau ähnlich zu pHANNIBAL. Andere ChromDB RNAi-Vektoren, wie bspw. pGSA1131, pGSA1165, pGSA1204, pGSA1276 und pGSA1252, pGSA1285, bieten eine Kanamycin- oder Hygromycin-Resistenz als auswählbaren Pflanzenmarker anstelle von Basta-Resistenz, und eine nicht-intronische Abstandhalter-Sequenz anstelle des Chalcon-Synthaseintrons. Die ChromDB-Vektoren beruhen auf pCAMB1A-Plasmiden, die durch das Center for Application of Molecular Biology to International Agriculture (CAMBIA; Canberra, Australia) entwickelt wurden. Diese Plasmide haben zwei Replikationsursprünge, einen zur Replikation in Agrobacterium tumefaciens und einen weiteren zur Replikation in E. coli. Somit können alle Klonierschritte in E. coli vor der Transformation unternommen werden (Preuss und Pikaard, 2004).
II. Aufbau targetierender Sequenzen (Preuss und Pikaard, 2004)
RNAi-Vektoren sind üblicherweise so angelegt, dass die targetierende Sequenz, die jedem der Inverted Repeats entspricht, 300–700 Nukleotide lang ist; ein Stück perfekter Komplementarität größer als 14 Nukleotide erscheint jedoch als absolut notwendig; 20 Nukleotide ist ein praktisches Minimum. Es wird leichter ein Erfolg erreicht, wenn die dsRNA targetierende Sequenz 300–700 Nukleotide aufweist. Beispielhafte erfindungsgemäße targetierende Sequenzen umfassen jene gemäß SEQ ID NOs: 5, 6, 9–11, und 23–24, und jene mit wenigstens 90%–99% Sequenzidentität zu denselben (z. B. 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%) (Tabelle 2), ebenso wie jegliche 20 aufeinanderfolgenden Nukleotide gemäß SEQ ID NO: 4 (Tabelle 3) oder jenen mit wenigstens 90%–99% Sequenzidentität zu denselben (z. B. 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%).
Natürlich vorkommende miRNA-Vorläufer (pre-miRNA) weisen einen Einzelstrang auf, der einen Duplex-Stamm bildet, der zwei Teile, die im Allgemeinen komplementär sind, und eine Schleife (engl. loop), der die zwei Teile des Stammes verbindet, umfasst. In typischen pre-miRNAs umfasst der Stamm ein oder mehrere Wölbungen, z. B. Extra-Nukleotide, die eine ”Schleife” aus einem einzelnen Nukleotid in einem Teil des Stammes erzeugen und/oder ein oder mehrere ungepaarte Nukleotide, die eine Lücke in der Hybridisierung der zwei Teile des Stammes zu einander erzeugen.
In hpRNAs ist ein Teil des Duplexstammes eine Nukleinsäuresequenz, die zu der Ziel-mRNA komplementär ist. Somit umfassen konstruierte RNA-Vorläufer einen Duplex-Stamm mit zwei Teilen und einer Schleife, die die zwei Teile verbindet. Die zwei Stamm-Teile haben eine Länge von etwa 18 oder 19 bis etwa 25, 30, 35, 37, 38, 39, oder 40 oder mehr Nukleotide. In Pflanzenzellen kann der Stamm länger als 30 Nukleotide sein. Der Stamm kann viel größerer Abschnitte umfassen, die zu der Ziel-mRNA komplementär sind (bis zur und einschließlich der gesamten mRNA). Die zwei Teile des Duplexstammes müssen ausreichend komplementär sein, um zu hybridisieren, um den Duplex-Stamm zu bilden. Somit können die zwei Teile vollständig oder perfekt komplementär sein, müssen dies jedoch nicht sein. Zudem können die zwei Stammteile gleich lang sein, oder ein Teil kann einen Überhang von 1, 2, 3, oder 4 Nukleotiden umfassen.
Erfindungsgemäße hpRNAs umfassen die Sequenzen des erwünschten siRNA-Duplex. Der erwünschte siRNA-Duplex und somit beide der zwei Stammteile in dem konstruierten RNA-Vorläufer sind durch in der Technik bekannte Verfahren ausgewählt. Diese umfassen, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Auswählen einer 18, 19, 20, 21 Nukleotide langen oder längeren Sequenz aus der Zielgen-mRNASequenz aus einer Region 100 bis 200 oder 300 Nukleotide auf der 3'-Seite des Translationsstarts. Im Allgemeinen kann die Sequenz aus einem jeden Teil der mRNA des Zielgens ausgewählt werden (wie bspw. dasjenige gemäß SEQ ID NO: 4; Tabelle 3).
III. Verfahren zur Abgabe von Polynukleotiden an Pflanzen und Pflanzenzellen
Geeignete Verfahren umfassen ein jegliches Verfahren, durch welches DNA in eine Zelle eingebracht werden kann, wie bspw. durch Agrobacterium oder virale Infektion, direkte DNA-Abgabe wie zum Beispiel durch PEG-vermittelte Transformation von Protoplasten (Omirulleh et al., 1993), durch Austrocknungs-/Hemmungs-vermittelte DNA-Aufnahme, durch Elektroporation, durch Schütteln mit Siliziumcarbidfasern, durch Beschleunigung DNA-beschichteter Partikel, etc. In bestimmten Ausführungsformen sind Beschleunigungs-Verfahren bevorzugt und umfassen zum Beispiel Mikroprojektilbeschuß.
Techniken zur Einbringung von DNA in Zellen sind den Fachleuten wohl bekannt. Vier allgemeine Verfahren zur Abgabe eines Gens in Zellen wurden beschrieben: (1) chemische Verfahren (Graham und van der Eb, 1973; Zatloukal et al., 1992); (2) physikalische Verfahren wie bspw. Mikroinjektion (Capecchi, 1980), Elektroporation (Fromm et al., 1985; Wong und Neumann, 1982) und die Gen-Kanone (Fynan et al., 1993; Johnston und Tang, 1994); (3) virale Vektoren (Clapp, 1993; Eglitis und Anderson, 1988; Eglitis et al., 1988; Lu et al., 1993); und (4) Rezeptor-vermittelte Mechanismen (Curiel et al. 1991; Curiel et al., 1992; Wagner et al., 1992).
Elektroporation kann extreme effizient sein und kann zur transienten Expression klonierter Gene und zur Etablierung von Zelllinien, die integrierte Kopien des interessierenden Genes tragen, verwendet werden. Das Einbringen von DNA durch Elektroporation ist den Fachleuten wohl bekannt. Bei diesem Verfahren werden bestimmte die Zellwand abbauende Enzyme, wie bspw. Pectin-abbauende Enzyme, eingesetzt, um die Ziel-Empfängerzellen für eine Transformation durch Elektroporation empfindlicher als unbehandelte Zellen zu machen. Empfängerzellen werden alternativ für die Transformation durch mechanisches Verletzen empfindlicher gemacht. Um die Transformation durch Elektroporation zu beeinflussen, kann man entweder brüchige Gewebe, wie bspw. eine Suspensionskultur von Zellen oder embryogenem Kallus verwenden oder man kann alternativ unreife Embryonen oder andere organisierte Gewebe direkt transformieren. Zellwände werden teilweise von den ausgewählten Zellen durch deren Aussetzen gegenüber Pektin-abbauenden Enzymen (Pectolyasen) abgebaut oder mechanisch auf eine gesteuerte Art und Weise verletzt.
Mikroprojektilbeschuß, eine Technik brachialer Kraft, schießt Partikel, die mit der interessierenden DNA beschichtet sind, in Pflanzenzellen. Beispielhafte Partikel umfassen Wolfram, Gold und Platin. Ein Vorteil des Mikroprojektilbeschusses zusätzlich dazu, dass dieser ein wirksames Mittel zum reproduzierbaren Erhalten eines stabilen Transformierens Einkeimblättriger ist, ist, dass die Protoplastisolation nicht erforderlich ist und ein Erfordernis für die Empfindlichkeit gegenüber Agrobacterium-Infektion nicht benötigt wird. Zum Beschuss werden bevorzugterweise Zellen in Suspension auf Filtern oder festen Kulturmedien konzentriert. Unreife Embryonen oder andere Zielzellen können alternativ auf festem Kulturmittel aufgebracht werden. Die Zellen werden unter einer Makroprojektil-Stoppplatte angeordnet. Sofern erwünscht werden auch ein oder mehrere Schirme zwischen der Beschleunigungsvorrichtung und den zu beschießenden Zellen angeordnet.
Agrobacterium-vermittelter Transfer ist ein universell einsetzbares System zum Einbringen von Genen in Pflanzenzellen, da die DNA in ganze Pflanzengewebe eingebracht werden kann, womit der Bedarf der Regeneration einer intakten Pflanze aus einem Protoplasten umgangen wird. Dafny-Yelin et al. stellen einen Überblick der Agrobacterium-Transformation bereit (Dafny-Yelin und Tzfira, 2007). Integrierende Agrobacterium-Pflanzen-Vektoren zum Einbringen von DNA in Pflanzenzellen sind in der Technik wohl bekannt, wie bspw. die oben Beschriebenen, wie auch weitere (Rogers et al., 1987). Weiter ist die Integration der Ti-DNA ein relativ präziser Prozess, der zu wenigen Umordnungen führt. Die zu transferierende DNA-Region wird durch die Randsequenzen definiert (Jorgensen et al., 1987; Spielmann und Simpson, 1986).
Agrobacterium-vermittelte Transformation ist in zweikeimblättrigen Pflanzen am effizientesten. Eine transgene Pflanze, die mittels Agrobacteriums-Transformationsverfahren gebildet wird, enthält üblicherweise ein einziges Gen auf einem Chromosom. Homozygote transgene Pflanzen können durch sexuelles Verpaaren (Vermehren mit sich selbst, engl. selfing) einer unabhängigen segregierten transgenen Pflanze, die ein einziges hinzugefügtes Gen enthält, Keimen einiger der erzeugten Samen und Untersuchen der resultierenden Pflanzen auf die targetierte Eigenschaft oder Insertion hin, erhalten werden.
In einigen Verfahren kann Agrobacterium, das das interessierende Gen trägt, auf die Zielpflanzen angewendet werden, wenn die Pflanzen blühen. Die Bakterien können mittels Vakuuminfiltrations-Protokallen in angemessenen Medien angewendet oder sogar einfach auf die Blüten gesprüht werden.
Zur RNA-vermittelten Hemmung in einer Zelllinie oder einem gesamten Organismus kann Genexpression bequem durch Verwendung eines Reporter- oder Arznei-Resistenz-Gens getestet werden, dessen Proteinprodukt einfach zu testen ist. Derartige Reportergene umfassen Acetohydroxysäure-Synthase (AHAS), alkalischen Phosphatase (AP), beta-Galactosidase (LacZ), beta-Glucoronidase (GUS), Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT), Grün-Fluoreszierendes-Protein (GFP), Meerrettichperoxidase (HRP), Luziferase (Luc), Nopalinsynthase (NOS), Octopinsynthase (OCS) und Derivate davon. Mehrere auswählbare Marker sind verfügbar, die Resistenz gegenüber Ampicillin, Bleomycin, Chloramphenicol, Gentarnycin, Hygromycin, Kanamycin, Lincomycin, Methotrexat, Phosphinothricin, Puromycin, Basta und Tetracyclin vermitteln. Abhängig vom Test erlaubt die Quantifizierung der Menge an Genexpression, einen Grad an Hemmung zu bestimmen, der im Vergleich zu einer nicht behandelten Zelle größer ist als 10%, 33%, 50%, 90%, 95% oder 99%. Niedrigere Dosen injizierten Materials und längere Zeiten nach Verabreichung von RNAi-Mittel können zu Hemmung in einer kleineren Zellfraktion führen (z. B. wenigstens 10%, 20%, 50%, 75%, 90% oder 95% der targetierten Zellen). Eine Quantifizierung der Genexpression in einer Zelle kann ähnliche Mengen an Hemmung auf dem Niveau einer Akkumulation an Ziel-mRNA oder Translation von Zielprotein zeigen. Als ein Beispiel kann die Effizienz der Hemmung durch Bestimmen der Menge an Genprodukt in der Zelle bestimmt werden; mRNA kann mit einer Hybridisierungs-Sonde mit einer Nukleotidsequenz außerhalb der Region, die für die hemmende doppelsträngige RNA verwendet wird, nachgewiesen werden, oder translatiertes Polypeptid kann mit einem gegen die Polypeptidsequenz dieser Region gerichteten Antikörper nachgewiesen werden. Quantitative PCR-Techniken können ebenso verwendet werden.
Feld-Bewertung von VI-RNAi Kartoffel-Pflanzen
Kartoffellinien mit dem vakuolären Invertase-(VI)-Gen, das unter Verwendung des wie hierin beschriebenen RNA-Interferenz-(RNAi)Verfahrens abgeschaltet wurde, wurden auf Feldern in Wisconsin, USA bewertet. Bei Kartoffellinien, die unter Verwendung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung hergestellt wurden, wurden keine Wachstumsanomalien beobachtet, wenn diese mit Kontroll- und Leer-Vektor-Linien verglichen wurden. Darüber hinaus wiesen die RNAi-Linien, die unter Verwendung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung hergestellt wurden, verglichen mit Kontroll- und Leer-Vektor-Linien keine signifikanten Unterschiede im Ertrag auf (p < 0,05). Darüber hinaus hatten Knollen, die von den RNAi-Linien geerntet wurden, mit denen von Kontroll- und Leer-Vektor-Linien übereinstimmende Messungen bzgl. der spezifischen Dichte (p < 0,05). Es ist den Fachleuten wohl bekannt, dass die spezifische Dichte von Knollen (Kartoffeln) ein wichtiger Faktor der Erntequalität ist. Tatsächlich wird die spezifische Dichte in der Industrie als eine Referenz verwendet, um Ausbackqualität, Backeigenschaften und Lagerfähigkeit einer Knolle (Kartoffel) zu beurteilen.
Steuerung Kälte-induzierten Süßens in Kartoffeln
Das hierin beschriebene Verfahren zum Abschalten des vakuolären Invertase(VI)-Gens unter Verwendung einer RNA-Interferenz (RNAi), um das Niveau an VI-Aktivität in einer Kartoffelpflanze im Vergleich zu dessen Niveau in einer Kontrolle zu verringern, kann verwendet werden, um die Anreicherung oder Menge an reduzierenden Zuckern (wie beispielsweise Glukose und Fructose) in einer Kartoffelpflanze während einer Kühllagerung für eine jegliche Zeitspanne (wie bspw. einen Tag, zwei Tage, drei Tage, vier Tage, fünf Tage, sechs Tage, sieben Tage, acht Tage, neun Tage, zehn Tage, elf Tage, zwölf Tage, dreizehn Tage, vierzehn Tage, fünfzehn Tage, sechszehn Tage, siebzehn Tage, achtzehn Tage, neunzehn Tage, zwanzig Tage, einundzwanzig Tage, etc.) zu steuern.
Verfahren zum Steuern der Anreicherung oder der Menge an reduzierenden Zuckern während einer Kühllagerung in einer Kartoffel umfassen die Schritte Verringern eines Niveaus an vakuolärer Invertase-Aktivität in der Kartoffelpflanze relativ zu einer Kontroll-Kartoffelpflanze unter Verwendung des hierin beschriebenen Verfahrens, nämlich durch Einbringen eines RNAi-Konstrukts, das ein Fragment aus wenigstens 20 aufeinanderfolgenden Nukleotiden einer Sequenz mit wenigstens 90% Sequenzidentität zu SEQ ID NO: 4 umfasst, in die Kartoffelpflanze, und Halten der Pflanze unter Bedingungen, die zur Expression des RNAi-Konstrukts ausreichend sind, wobei das Niveau einer mRNA, die durch ein Polynukleotid mit wenigstens 90% Sequenzidentität zu einer Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 4 kodiert wird, verringert wird. Dieses Verfahren kann weiter umfassen Testen der Farbe eines Kartoffelprodukts von einer Kartoffel der Pflanze nach einer Wärmebehandlung der Kartoffel (wie beispielsweise zu einem Crisp, Chip, Pommes frites, Kartoffelstäbchen, zu einer Julienne-geschnittener Kartoffel oder zu einem anderen essbaren Kartoffelprodukt). Das Verfahren kann alternativ umfassen Testen der Farbe des Kartoffelprodukts durch Vergleichen der Produktfarbe mit der Farbe eines Kontroll-Kartoffelprodukts von einer Kontroll-Kartoffelpflanze. Beispiele für Tests, die verwendet werden können, umfassen optische Farbbewertung, wie bspw. die hierin in Tabelle 6 Vorgesehene. Die Chipfarbe kann optisch unter Verwendung der Kartoffelchip-Farbreferenz-Standards bestimmt werden, die durch das Potato Chip Institute International, Cleveland, Ohio (Douches und Freyer, 1994; Reeves, 1982) entwickelt wurden. Ein Spektrophotometer, wie bspw. das Hunterlab Colorflex Kalorimetrie-Spektrophotometer kann ebenso verwendet werden, um die tatsächliche Farbe zu bestimmen (www.hunterlab.com). In dem zuvor beschriebenen Verfahren umfasst das RNAi-Konstrukt ein Polynukleotid mit wenigstens 90% Sequenzidentität zu einem Polynukleotid, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 5, 6, 9, 10, 11,23 und 24. Das RNAi-Konstrukt umfasst alternativ ein Polynukleotid mit wenigstens 95% Sequenzidentität zu einem Polynukleotid, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 5, 6, 9, 10, 11, 23 und 24. Das RNAi-Konstrukt umfasst noch weiter alternativ ein Polynukleotid mit wenigstens 98% Sequenzidentität zu einem Polynukleotid, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 5, 6, 9, 10, 11, 23 und 24.
Das RNAi-Konstrukt umfasst in einer weiteren Alternative ein Polynukleotid, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 5, 6, 9, 10, 11, 23 und 24.
In diesem Verfahren kann der RNAi-Vektor mittels Agrobacterium tumefaciens in Pflanzen eingebracht werden. Der RNAi-Vektor kann zum Beispiel einen pHELLSGATE-Vektor, wie bspw. pHELLSGATE2 oder pHELLSGATE8, umfassen. Pflanzen, die dem Verfahren der Erfindung zugänglich sind, umfassen jene der Gattung Solanum, wie bspw. Kartoffel (Solanum tuberosum).
Kartoffeln, die von einer Pflanze geerntet wurden, deren Niveau an vakuolärer Invertase-Aktivität gemäß dem hierin beschriebenen Verfahren verringert ist, weisen eine Verringerung in der Anreicherung oder Menge an reduzierenden Zuckern während einer Kühllagerung für einen Zeitraum von wenigstens 2 Stunden auf, die verglichen mit einer Kartoffel, die von einer Kontroll-Pflanze geerntet wurde, in einer Menge von etwa 5% bis etwa 99%, genauer, von etwa 5% bis etwa 95%, etwa 5% bis etwa 90%, etwa 5% bis etwa 85%, etwa 5% bis etwa 80%, etwa 5% bis etwa 75% etwa 5% bis etwa 70%, etwa 5% bis etwa 65%, etwa 5% bis etwa 60%, etwa 5% bis etwa 55%, etwa 5% bis etwa 50%, etwa 5% bis etwa 45%, etwa 5% bis etwa 40%, etwa 5% bis etwa 35%, etwa 5% bis etwa 30%, etwa 5% bis etwa 25% oder etwa 5% bis etwa 20% ist. Eine Kühllagerung kann genauer für einen Zeitraum von wenigstens drei Stunden, wenigstens vier Stunden, wenigstens fünf Stunden, wenigstens sechs Stunden, wenigstens acht Stunden, wenigstens zehn Stunden, wenigstens 12 Stunden, wenigstens 18 Stunden, wenigstens 24 Stunden, wenigstens 30 Stunden, wenigstens 36 Stunden oder länger erfolgen. Alternativ weisen Kartoffeln, die von einer Pflanze geerntet wurden, deren Niveau an vakuoläre Invertase-Aktivität gemäß dem hierin beschriebenen Verfahren verringert ist, eine Verringerung in der Anreicherung oder Menge an reduzierenden Zuckern während einer Kühllagerung für einen Zeitraum von wenigstens 2 Stunden auf, die verglichen mit einer Kartoffel, die von einer Kontroll-Pflanze geerntet wurde, in einer Menge von etwa 5%, etwa 6%, etwa 7%, etwa 8%, etwa 9%, etwa 10%, etwa 11%, etwa 12%, etwa 13%, etwa 14%, etwa 15%, etwa 16%, etwa 17%, etwa 18%, etwa 19%, etwa 20%, etwa 21%, etwa 22%, etwa 23%, etwa 24%, etwa 25%, etwa 26%, etwa 27%, etwa 28%, etwa 29%, etwa 30%, etwa 31%, etwa 32%, etwa 33%, etwa 34%, etwa 35%, etwa 36%, etwa 37%, etwa 38%, etwa 39%, etwa 40%, etwa 41%, etwa 42%, etwa 43%, etwa 44%, etwa 45%, etwa 46%, etwa 47%, etwa 48%, etwa 49%, etwa 50%, etwa 51%, etwa 52%, etwa 53%, etwa 54%, etwa 55%, etwa 56%, etwa 57%, etwa 58%, etwa 59%, etwa 60%, etwa 61%, etwa 62%, etwa 63%, etwa 64%, etwa 65%, etwa 66%, etwa 67%, etwa 68%, etwa 69%, etwa 70%, etwa 71%, etwa 72%, etwa 73%, etwa 74%, etwa 75%, etwa 76%, etwa 77%, etwa 78%, etwa 79%, etwa 80%, etwa 81%, etwa 82%, etwa 83%, etwa 84%, etwa 85%, etwa 86%, etwa 87%, etwa 88%, etwa 89%, etwa 90%, etwa 91%, etwa 92%, etwa 93%, etwa 94%, etwa 95%, etwa 96%, etwa 97%, etwa 98% oder etwa 99% ist. Eine Kühllagerung kann genauer für einen Zeitraum von wenigstens drei Stunden, wenigstens vier Stunden, wenigstens fünf Stunden, wenigstens sechs Stunden, wenigstens acht Stunden, wenigstens zehn Stunden, wenigstens 12 Stunden, wenigstens 18 Stunden, wenigstens 24 Stunden, wenigstens 30 Stunden, wenigstens 36 Stunden oder länger erfolgen.
Verringerung von Acrylamid-Niveaus
In einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Steuern der Acrylamidbildung während einer Wärmebehandlung einer Kartoffel (wie bspw. in einen Crisp, Chip, Pommes frittes, Kartoffelstäbchen, einer Julienne-geschnittene Kartoffel oder einem anderen essbaren Kartoffelprodukt) von einer Kartoffelpflanze. Steuern der Acrylamidbildung während einer Wärmebehandlung einer Kartoffel ist insbesondere wichtig, wenn die Kartoffel einer Kühllagerung für einen jeglichen Zeitraum (wie bspw. für einen Tag, zwei Tage, drei Tage, vier Tage, fünf Tage, sechs Tage, sieben Tage, acht Tage, neun Tage, zehn Tage, elf Tage, zwölf Tage, dreizehn Tage, vierzehn Tage, fünfzehn Tage, sechszehn Tage, siebzehn Tage, achtzehn Tage, neunzehn Tage, zwanzig Tage, einundzwanzig Tage, etc.) ausgesetzt wurde.
In diesem Aspekt umfasst das Verfahren die Schritte Verringern eines Niveau an vakuolärer Invertase-Aktivität in der Kartoffelpflanze relativ zu einer Kontroll-Kartoffelpflanze unter Verwendung des wie hierin beschriebenen Verfahrens, nämlich durch Einbringen eines RNAi-Konstrukts, das ein Fragment aus wenigstens 20 aufeinanderfolgenden Nukleotiden einer Sequenz mit wenigstens 90% Sequenzidentität zu SEQ ID NO: 4 umfasst, in die Kartoffelpflanze, und Halten der Pflanze unter Bedingungen, die zur Expression des RNAi-Konstrukts ausreichend sind, wodurch das Niveau einer mRNA verringert wird, die durch ein Polynukleotid mit wenigstens 90% Sequenzidentität zu einer Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 4 kodiert wird.
Dieses Verfahren kann weiter umfassen Testen des Niveaus an Acrylamid in einem wärmebehandelten Kartoffelprodukt aus einer Kartoffel von einer Kartoffelpflanze, die durch das vorgenannte Verfahren hergestellt wurde. Es ist bevorzugt, dass die zu testende Kartoffel einer Kühllagerung für einen Zeitraum von wenigstens 2 Stunden ausgesetzt wurde. Genauer kann eine Kühllagerung für einen Zeitraum von für einen Zeitraum von wenigstens drei Stunden, wenigstens vier Stunden, wenigstens fünf Stunden, wenigstens sechs Stunden, wenigstens acht Stunden, wenigstens zehn Stunden, wenigstens 12 Stunden, wenigstens 18 Stunden, wenigstens 24 Stunden, wenigstens 30 Stunden, wenigstens 36 Stunden oder länger sein. Zum Beispiel können Chips, die von der Kartoffel von einer Kartoffelpflanze stammen, die durch das zuvor beschriebene Verfahren hergestellt wurde, in Gemüseöl bei 183°C/362°F oder 188°C/370°F oder 190°C/190°F oder bei 191°C/375°F für 2 Minuten, 30 Sekunden oder 2 Minuten oder 2 Minuten 15 Sekunden ausgebacken werden. Ausgebackene Chips können dann abkühlen und zu Pulver zermahlen werden und das Pulver kann zur Acrylamidanalyse verwendet werden. Um die Acrylamidniveaus zu bestimmen, können in der Technik bekannte Routineverfahren verwendet werden. Zum Beispiel kann eine Kombination aus Massenspektrometrie und Flüßigkeitschromatographie verwendet werden, um Acrylamid nachzuweisen.
Das Testen des Acrylamidniveaus in dem Kartoffelprodukt kann weiter umfassen Vergleichen des Acrylamidniveaus eines Kartoffelprodukts, das von einer Kartoffel von einer Kartoffelpflanze stammt, die durch das zuvor beschriebene Verfahren hergestellt wurde, und wobei die Kartoffel einer Kühllagerung für einen Zeitraum von wenigstens zwei Stunden ausgesetzt wurde mit einem Acrylamidniveau in einem Kontroll-Kartoffelprodukt von einer Kontroll-Kartoffelpflanze (nämlich einer nicht-RNAi Pflanze). Beim Testen werden Kartoffelprodukte, die von einer Kartoffel von einer Kartoffelpflanze stammen, die durch das zuvor beschriebene Verfahren hergestellt wurden, wenigstens eine 5-fache Verringerung, wenigstens eine 6-fache Verringerung, wenigstens eine 7-fache Verringerung, wenigstens eine 8-fache Verringerung, wenigstens eine 9-fache Verringerung, wenigstens eine 10-fache Verringerung, wenigstens eine 11-fache Verringerung, wenigstens eine 12-fache Verringerung, wenigstens eine 13-fache Verringerung, wenigstens eine 14-fache Verringerung, wenigstens eine 15-fache Verringerung, wenigstens eine 20-fache Verringerung, wenigstens eine 25-fache Verringerung, wenigstens eine 30-fache Verringerung, wenigstens eine 35-fache Verringerung, wenigstens eine 40-fache Verringerung, wenigstens eine 45-fache Verringerung, wenigstens eine 50-fache Verringerung, wenigstens eine 55-fache Verringerung, wenigstens eine 60-fache Verringerung, wenigstens eine 65-fache Verringerung, wenigstens eine 70-fache Verringerung, wenigstens eine 75-fache Verringerung, wenigstens eine 80-fache Verringerung, wenigstens eine 85-fache Verringerung, wenigstens eine 90-fache Verringerung, wenigstens eine 95-fache Verringerung, wenigstens eine 100-fache Verringerung, wenigstens eine 150-fache Verringerung, wenigstens eine 200-fache Verringerung, wenigstens eine 250-fache Verringerung, wenigstens eine 300-fache Verringerung, wenigstens eine 350-fache Verringerung, wenigstens eine 400-fache Verringerung, wenigstens eine 450-fache Verringerung oder wenigstens eine 500-fache Verringerung des Niveaus an Acrylamid im Vergleich zu einem Kartoffelprodukt von einer Kontroll-Kartoffelpflanze zeigen. Eine Kühllagerung kann genauer für einen Zeitraum von wenigstens drei Stunden, wenigstens vier Stunden, wenigstens fünf Stunden, wenigstens sechs Stunden, wenigstens acht Stunden, wenigstens zehn Stunden, wenigstens 12 Stunden, wenigstens 18 Stunden, wenigstens 24 Stunden, wenigstens 30 Stunden, wenigstens 36 Stunden oder länger sein. Die Kartoffelprodukte, die von einer Kartoffel von einer Kartoffelpflanze stammen, die durch das zuvor beschriebene Verfahren hergestellt wurden, und wobei die Kartoffel einer Kühllagerung für einen Zeitraum von wenigstens zwei Stunden ausgesetzt wurde, zeigen beim Testen genauer eine 5- bis 500-fache Verringerung, eine 5- bis 450-fache Verringerung, eine 5- bis 400-fache Verringerung, eine 5- bis 400-fache Verringerung, eine 5- bis 350-fache Verringerung, eine 5- bis 300-fache Verringerung, eine 5- bis 250-fache Verringerung, eine 5- bis 200-fache Verringerung, eine 5- bis 150-fache Verringerung, eine 5- bis 100-fache Verringerung, eine 5- bis 95-fache Verringerung, eine 5- bis 90-fache Verringerung, eine 5- bis 85-fache Verringerung, eine 5- bis 80-fache Verringerung, eine 5- bis 75-fache Verringerung, eine 5- bis 70-fache Verringerung, eine 5- bis 65-fache Verringerung, eine 5- bis 60-fache Verringerung, eine 5- bis 55-fache Verringerung, eine 5- bis 50-fache Verringerung, eine 5- bis 45-fache Verringerung, eine 5- bis 40-fache Verringerung, eine 5- bis 35-fache Verringerung, eine 5- bis 30-fache Verringerung, eine 5- bis 25-fache Verringerung, eine 5- bis 20-fache Verringerung, eine 5- bis 15-fache Verringerung, eine 5- bis 10-fache Verringerung, eine 10- bis 500-fache Verringerung, eine 10- bis 450-fache Verringerung, eine 10- bis 400-fache Verringerung, eine 10- bis 400-fache Verringerung, eine 10- bis 350-fache Verringerung, eine 10- bis 300-fache Verringerung, eine 10- bis 250-fache Verringerung, eine 10- bis 200-fache Verringerung, eine 10- bis 150-fache Verringerung, eine 10- bis 100-fache Verringerung, eine 10- bis 95-fache Verringerung, eine 10- bis 90-fache Verringerung, eine 10- bis 85-fache Verringerung, eine 10- bis 80-fache Verringerung, eine 10- bis 75-fache Verringerung, eine 10- bis 70-fache Verringerung, eine 10- bis 65-fache Verringerung, eine 10- bis 60-fache Verringerung, eine 10- bis 55-fache Verringerung, eine 10- bis 50-fache Verringerung, eine 10- bis 45-fache Verringerung, eine 10- bis 40-fache Verringerung, eine 10- bis 35-fache Verringerung, eine 10- bis 30-fache Verringerung, eine 10- bis 25-fache Verringerung, eine 10- bis 20-fache Verringerung oder eine 10- bis 15-fache Verringerung des Acrylamidniveaus im Vergleich zu einem Kartoffelprodukt von einer Kontroll-Kartoffelpflanze. Eine Kühllagerung kann genauer für einen für einen Zeitraum von wenigstens drei Stunden, wenigstens vier Stunden, wenigstens fünf Stunden, wenigstens sechs Stunden, wenigstens acht Stunden, wenigstens zehn Stunden, wenigstens 12 Stunden, wenigstens 18 Stunden, wenigstens 24 Stunden, wenigstens 30 Stunden, wenigstens 36 Stunden oder länger sein. Noch weiter alternativ zeigen die Kartoffelprodukte, die von einer Kartoffel von einer Kartoffelpflanze stammen, die durch das zuvor beschriebene Verfahren hergestellt wurde, und wobei die Kartoffel einer Kühllagerung für einen Zeitraum von wenigstens zwei Stunden ausgesetzt wurde, beim Testen 25% bis 75% niedrigere, 25% bis 70% niedrigere, 25% bis 65% niedrigere, 25% bis 60% niedrigere, 25% bis 55% niedrigere, 25% bis 55% niedrigere, 25% bis 50% niedrigere, 25% bis 45% niedrigere, 25% bis 40% niedrigere, 25 bis 35% niedrigere, 30% bis 75% niedrigere, 30% bis 70% niedrigere, 30% bis 65% niedrigere, 30% bis 60% niedrigere, 30% bis 55% niedrigere, 30% bis 55% niedrigere, 30% bis 50% niedrigere, 30% bis 45% niedrigere, 25% bis 40% niedrigere, 30% bis 35% niedrigere, 35% bis 75% niedrigere, 35% bis 70% niedrigere, 35% bis 65% niedrigere, 35% bis 60% niedrigere, 35% bis 55% niedrigere, 35% bis 55% niedrigere, 35% bis 50% niedrigere, 35% bis 45% niedrigere, 35% bis 40% niedrigere, 40% bis 75% niedrigere, 40% bis 70% niedrigere, 40% bis 65% niedrigere, 40% bis 60% niedrigere, 40% bis 55% niedrigere, 40% bis 55% niedrigere, 40% bis 50% niedrigere, 40% bis 45% niedrigere, 45% bis 75% niedrigere, 45% bis 70% niedrigere, 45% bis 65% niedrigere, 45% bis 60% niedrigere, 45% bis 55% niedrigere, 45% bis 55% niedrigere, 45% bis 50%, 50% bis 75% niedrigere, 50% bis 70% niedrigere, 50% bis 65% niedrigere, 50% bis 60% niedrigere oder 50% bis 55% niedrigere Acrylamid-Niveaus im Vergleich zu einem Kartoffelprodukt von einer Kontroll-Kartoffelpflanze. Genauer kann eine Kühllagerung für einen Zeitraum von wenigstens drei Stunden, wenigstens vier Stunden, wenigstens fünf Stunden, wenigstens sechs Stunden, wenigstens acht Stunden, wenigstens zehn Stunden, wenigstens 12 Stunden, wenigstens 18 Stunden, wenigstens 24 Stunden, wenigstens 30 Stunden, wenigstens 36 Stunden oder länger sein.
Zusätzlich wird auch angenommen, dass bei dem wie oben beschriebenen Testen Kartoffelprodukte, die von einer Kartoffel von einer Kartoffelpflanze stammen, die durch das zuvor beschriebene Verfahren hergestellt wurden, und wobei die Kartoffel einer Kühllagerung für einen Zeitraum von wenigstens zwei Stunden ausgesetzt wurde Acrylamid-Niveaus von weniger als 500 ppb (mg/Kg), weniger als 400 ppb (mg/Kg), weniger als 300 ppb (mg/Kg), weniger als 200 ppb (mg/Kg) oder weniger als 100 ppb (mg/Kg) zeigen werden. Die Kartoffelprodukte, die von einer Kartoffel von einer Kartoffelpflanze stammen, die durch das zuvor beschriebene Verfahren hergestellt wurde, werden alternativ beim Testen Acrylamid-Niveaus zwischen etwa 90 ppb (mg/Kg) bis etwa 500 ppb (mg/Kg), etwa 100 ppb (mg/Kg) bis etwa 500 ppb (mg/Kg), etwa 200 ppb (mg/Kg) bis etwa 500 ppb (mg/Kg), etwa 250 ppb (mg/Kg) bis etwa 500 ppb (mg/Kg), etwa 100 ppb (mg/Kg) bis etwa 300 ppb (mg/Kg), etwa 100 ppb (mg/Kg) bis etwa 250 ppb (mg/Kg), etwa 200 ppb (mg/Kg) bis etwa 300 ppb (mg/Kg), etwa 250 ppb (mg/Kg) bis etwa 300 ppb (mg/Kg), etwa 300 ppb (mg/Kg) bis etwa 500 ppb (mg/Kg), oder etwa 400 ppb (mg/Kg) bis etwa 500 ppb (mg/Kg) zeigen. Genauer kann eine Kühllagerung für einen Zeitraum von wenigstens drei Stunden, wenigstens vier Stunden, wenigstens fünf Stunden, wenigstens sechs Stunden, wenigstens acht Stunden, wenigstens zehn Stunden, wenigstens 12 Stunden, wenigstens 18 Stunden, wenigstens 24 Stunden, wenigstens 30 Stunden, wenigstens 36 Stunden oder länger sein. Zusätzlich wird auch angenommen, dass beim wie zuvor beschriebenen Testen Kartoffelprodukte, die von einer Kartoffel von einer Kartoffelpflanze stammen, oder Süßkartoffelprodukte, die von einer Süßkartoffel von einer Süßkartoffelpflanze stammen, die nach dem zuvor beschriebenen Verfahren hergestellt wurde, und wobei die Kartoffel oder Süßkartoffel Raumtemperatur-Bedingungen unterworfen wurde oder bei diesen gelagert wurde, Acrylamid-Niveaus von weniger als 1100 ppb (mg/Kg), 1000 ppb (mg/Kg), weniger als 900 ppb (mg/Kg), weniger als 800 ppb (mg/Kg), weniger als 700 ppb (mg/Kg), weniger als 600 ppb (mg/Kg), oder weniger als 500 ppb (mg/Kg) aufweisen. Die Kartoffelprodukte, die von einer Kartoffel von einer Kartoffelpflanze stammen, die durch das zuvor beschriebene Verfahren hergestellt wurde, werden alternativ beim Testen Acrylamid-Niveaus zwischen etwa 400 ppb (mg/Kg) bis etwa 1100 ppb (mg/Kg), etwa 400 ppb (mg/Kg) bis etwa 1000 ppb (mg/Kg), etwa 400 ppb (mg/Kg) bis etwa 900 ppb (mg/Kg), etwa 400 ppb (mg/Kg) bis etwa 800 ppb (mg/Kg), etwa 400 ppb (mg/Kg) bis etwa 700 ppb (mg/Kg), etwa 500 ppb (mg/Kg) bis etwa 1100 ppb (mg/Kg), etwa 500 ppb (mg/Kg) bis etwa 1000 ppb (mg/Kg), etwa 500 ppb (mg/Kg) bis etwa 900 ppb (mg/Kg), etwa 500 ppb (mg/Kg) bis etwa 800 ppb (mg/Kg) oder etwa 500 ppb (mg/Kg) bis etwa 750 ppb (mg/Kg) aufweisen.
Das Testen des Acrlyamidniveaus in dem Kartoffelprodukt kann weiter umfassen Vergleichen des Acrylamidniveaus eines Kartoffelprodukts, das von einer Kartoffel von einer Kartoffelpflanze stammt, die durch das obige Verfahren hergestellt wurde, und wobei die Kartoffel bei Raumemperaturbedingungen gelagert wurde oder Raumemperaturbedingungen ausgesetzt wurde, mit einem Acrylamidniveau in einem Kontroll-Kartoffelprodukt von einer Kontroll-Kartoffelpflanze (nämlich einer nicht-RNAi Pflanze). Kartoffelprodukte, die von einer Kartoffel von einer Kartoffelpflanze stammen, die durch das zuvor beschriebene Verfahren hergestellt wurde, werden beim Testen wenigstens eine 1-fache Verringerung, wenigstens eine 2-fache Verringerung, wenigstens eine 3-fache Verringerung, wenigstens eine 4-fache Verringerung, wenigstens eine 5-fache Verringerung, wenigstens eine 6-fache Verringerung, wenigstens eine 7-fache Verringerung, wenigstens eine 8-fache Verringerung, wenigstens eine 9-fache Verringerung, wenigstens eine 10-fache Verringerung, wenigstens eine 11-fache Verringerung, wenigstens eine 12-fache Verringerung, wenigstens eine 13-fache Verringerung, wenigstens eine 14-fache Verringerung oder wenigstens eine 15-fache Verringerung des Acrylamidniveaus, verglichen mit einem Kartoffelprodukt von einer Kontroll-Kartoffelpflanze zeigen.
Die Kartoffelprodukte, die von einer Kartoffel von einer Kartoffelpflanze stammen, oder die Süßkartoffelprodukte, die von einer Süßkartoffel von einer Süßkartoffelpflanze stammen, die durch das wie oben beschriebene Verfahren hergestellt wurde, und wobei die Kartoffel oder Süßkartoffel bei Raumemperaturbedingungen gelagert wurde, können alternativ eine Verringerung von wenigstens einer 1- bis 15-fachen Verringerung, einer 2- bis 15-fachen, einer 3- bis 15-fachen, einer 4- bis 15-fachen, einer 5- bis 15-fachen, einer 1- bis 14-fachen, einer 2- bis 14-fachen, einer 3- bis 14-fachen, einer 4- bis 14-fachen, einer 5- bis 14-fachen, einer 1- bis 13-fachen, einer 2- bis 13-fachen, einer 3- bis 13-fachen, einer 4- bis 13-fachen einer 5- bis 15-fachen, einer 1- bis 12-fachen, einer 2- bis 12-fachen, einer 3- bis 12-fachen, einer 4- bis 12-fachen, einer 5- bis 12-fachen, einer 1- bis 11-fachen, einer 2- bis 11-fachen, einer 3- bis 11-fachen, einer 4- bis 11-fachen, einer 5- bis 11-fachen, einer 1- bis 10-fachen, einer 2- bis 10-fachen, einer 3- bis 10-fachen, einer 4- bis 10-fachen oder einer 5- bis 10-fachen des Acrylamidniveaus verglichen mit einem Kartoffelprodukt von einer Kontroll-Kartoffelpflanze zeigen.
Noch weiter alternativ können die Kartoffelprodukte, die von einer Kartoffel von einer Kartoffelpflanze stammen, oder die Süßkartoffelprodukte, die von einer Süßkartoffel von einer Süßkartoffelpflanze stammen, die durch das obige Verfahren hergestellt wurde, und wobei die Kartoffel oder Süßkartoffel bei Raumtemperaturbedingungen gelagert wurde oder Raumtemperaturbedingungen ausgesetzt wurde, 25% bis 75% niedrigere, 25% bis 70% niedrigere, 25% bis 65% niedrigere, 25% bis 60% niedrigere, 25% bis 55% niedrigere, 25% bis 55% niedrigere, 25% bis 50% niedrigere, 25% bis 45% niedrigere, 25% bis 40% niedrigere, 25 bis 35% niedrigere, 30% bis 75% niedrigere, 30% bis 70% niedrigere, 30% bis 65% niedrigere, 30% bis 60% niedrigere, 30% bis 55% niedrigere, 30% bis 55% niedrigere, 30% bis 50% niedrigere, 30% bis 45% niedrigere, 25% bis 40% niedrigere, 30% bis 35% niedrigere, 35% bis 75% niedrigere, 35% bis 70% niedrigere, 35% bis 65% niedrigere, 35% bis 60% niedrigere, 35% bis 55% niedrigere, 35% bis 55% niedrigere, 35% bis 50% niedrigere, 35% bis 45% niedrigere, 35% bis 40% niedrigere, 40% bis 75% niedrigere, 40% bis 70% niedrigere, 40% bis 65% niedrigere, 40% bis 60% niedrigere, 40% bis 55% niedrigere, 40% bis 55% niedrigere, 40% bis 50% niedrigere, 40% bis 45% niedrigere, 45% bis 75% niedrigere, 45% bis 70% niedrigere, 45% bis 65% niedrigere, 45% bis 60% niedrigere, 45% bis 55% niedrigere, 45% bis 55% niedrigere, 45% bis 50%, 50% bis 75% niedrigere, 50% bis 70% niedrigere, 50% bis 65% niedrigere, 50% bis 60% niedrigere oder 50% bis 55% niedrigere Acrylamid-Niveaus verglichen mit einem Kartoffelprodukt von einer Kontroll-Kartoffelpflanze oder einem Süßkartoffelprodukt von einer Kontroll-Süßkartoffelpflanze zeigen.
Das oben genannte Verfahren (sowohl bei der Kühllagerung als auch bei Raumtemperatur) kann weiter umfassen Wärmebehandlung der Kartoffel zu einem Crisp, Chip, Pommes frites, Kartoffelstäbchen oder einer Julienne-geschnittenen Kartoffel oder einem anderen essbaren Kartoffelprodukt.
In dem oben genannten Verfahren umfasst das RNAi-Konstrukt ein Polynukleotid mit wenigstens 90% Sequenzidentität zu einem Polynukleotid, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 5, 6, 9, 10, 11,23 und 24. Das RNAi-Konstrukt umfasst alternativ ein Polynukleotid mit wenigstens 95% Sequenzidentität zu einem Polynukleotid, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 5, 6, 9, 10, 11, 23 und 24. In einer noch weiteren Alternative umfasst das RNAi-Konstrukt ein Polynukleotid mit wenigstens 98% Sequenzidentität zu einem Polynukleotid, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 5, 6, 9, 10, 11, 23 und 24.
In einer weiteren Alternative umfasst das RNAi-Konstrukt ein Polynukleotid, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 5, 6, 9, 10, 11, 23 und 24.
In diesem Verfahren kann der RNAi-Vektor mittels Agrobacterium tumefaciens in Pflanzen eingebracht werden. Der RNAi-Vektor kann zum Beispiel einen pHELLSGATE-Vektor, wie bspw. pHELLSGATE2 oder pHELLSGATE8, umfassen. Pflanzen, die dem erfindungsgemäßen Verfahren zugänglich sind, umfassen jene der Gattung Solanum, wie bspw. Kartoffel (Solanum tuberosum).
Anwendbarkeit des hierin beschriebenen Verfahrens auf andere Feldfrüchte
Die hierin beschriebenen Verfahren sind auch auf andere Feldfrüchte, wie bspw. Süßkartoffel (Ipomoea batatas), Jamswurzel (Familie Dioscoreaceae) und Maniok (Manihot esculenta) anwendbar, ebenso wie auf Lebensmittel, die von zum Verzehr bestimmten Süßkartoffeln und Jamswurzel stammen, wie beispielsweise jedoch nicht beschränkt auf Crisps, Chips (zum Beispiel ist eine Anzahl an frittierten Chips kommerziell erhältlich von Süßkartoffeln (wie beispielsweise Blue Mesa Grilled Sweetpotato Chips, Route II Sweetpotato Chips, National Food Mariquitas Sweetpotato Chips und Zapp's regular Sweetpotato chips) und Maniok (wie beispielsweise Tropical Del Campo Iselitas Maniok Chips und Yu-qui-tas Maniok Chips), Julienne-Schnitten (auch als Stäbchen bezeichnet) und Fritten. Kälte-induziertes Süßen und hohe Acrylamidniveaus nach einer Zeit der Kühllagerung sind auch im Zusammenhang mit Süßkartoffeln als ein Problem bekannt. Wie hierin verwendet bezeichnet der Ausdruck ”Süßkartoffelprodukt” hierin Lebensmittel, die von zum Verzehr bestimmten Süßkartoffeln stammen, wie beispielsweise, jedoch nicht beschränkt auf, Crisps, Süßkartoffelchips, Julienne-Schnitten (auch bekannt als Süßkartoffelstäbchen) und Fritten. Die zuvor beschriebenen Bereiche und Werte für die Verringerung reduzierender Zucker in Kälteinduzierten Kartoffeln und Verringerung von Acrylamidniveaus wie oben hinsichtlich Kartoffeln beschrieben, sind auch auf die Verringerung dieser Niveaus in Süßkartoffel, Jamswurzel und Maniok anwendbar. Darüber hinaus sind alle der zuvor im Zusammenhang mit deren Verwendung mit einer Kartoffel beschriebenen Tests für die Verwendung bezogen auf Süßkartoffeln anwendbar.
Kits
Die Polynukleotide gemäß SEQ ID NOs: 5, 6, 9–11 und 23–24 können als Teile in Kits umfasst sein. Derartige Kits umfassen ein oder mehrere der erfindungsgemäßen Polynukleotide. In einer Ausführungsform sind die Polynukleotide gemäß SEQ ID NOs: 5, 6, 9–11 und 23–24 in RNAi-Vektoren vorgesehen und werden verwendet, um VI-Gene abzuschalten, wie bspw. in Solanum tuberosum und anderen Pflanzen, wie bspw. Süßkartoffel, Jamswurzel und Maniok, die VI-Gene mit wenigstens 90% Sequenzidentität zu einer Polynukleotidsequenz aufweisen, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 5, 6, 9–11, und 23–24 oder einem anderen Fragment aus SEQ ID NO: 4.
Kits können auch eine Kontroll-Nukleinsäure, wie bspw. einen leeren RNAi-Vektor oder einen Vektor mit einem Reporter, der mit einem Pflanzenpromotor funktionell verbunden ist, umfassen. Kits können auch Primer und Sonden zum Nachweisen von Inserts und mRNA der Transgene, wie bspw. jene gemäß SEQ ID NOs: 12–22, umfassen.
Kits können auch Amplifikations-Mittel, Reaktionsbestandteile und/oder Reaktionsgefäße umfassen. Eine oder mehrere der Bestandteile des Kits können lyophilisiert sein und das Kit kann weiter Mittel umfassen, die geeignet sind zum Rekonstituieren der lyophilisierten Produkte. Das Kit kann zusätzlich Anleitungen zur Verwendung enthalten.
Wenn ein Kit zur Verfügung gestellt wird, können die verschiedenen Bestandteile der Zusammensetzung in einzelnen Behältern verpackt sein und unmittelbar vor der Verwendung zusammengemischt werden. Derartiges einzelnes Verpacken der Bestandteile kann eine Langzeitlagerung der aktiven Bestandteile erlauben.
Die Mittel, die in den Kits enthalten sind, können in einer jeglichen Art von Behälter zur Verfügung gestellt werden, so dass die verschiedenen Bestandteile erhalten bleiben und nicht durch die Materialien des Behälters adsorbiert oder verändert werden. Versiegelte Glasampullen können zum Beispiel ein oder mehrere der Mittel oder Puffer enthalten, die unter einem neutralen, nicht-reaktiven Gas, wie bspw. Stickstoff verpackt wurden. Ampullen bestehen aus einem jeglichen geeigneten Material, wie bspw. Glas, organischen Polymeren, wie bspw. Polykarbonat, Polystyrol, etc.; Keramik, Metall oder einem jeglichen anderen Material, das üblicherweise verwendet wird, um ähnliche Mittel zu beinhalten. Andere Beispiele für geeignete Behälter umfassen einfache Flaschen, die aus ähnlichen Substanzen wie Ampullen hergestellt werden können und Umschläge, die Folien-kaschierte Innenräume aufweisen können, wie bspw. Aluminium oder eine Legierung. Andere Behälter umfassen Teströhrchen, -Fläschchen, -Kolben, -Flaschen, -Spritzen, etc.
Kits können auch mit Anleitungsmaterialien zur Verfügung gestellt werden. Anleitungen können auf Papier oder anderen Trägermaterialien gedruckt sein und/oder können als ein elektronisch lesbares Mittel, wie beispielsweise eine Diskette, CD-ROM, DVD-ROM, Zip-Diskette, ein Videoband, Audioband, etc. zur Verfügung gestellt werden.
BEISPIELE
Die folgenden Beispiele dienen lediglich zu Zwecken der Veranschaulichung und sollten nicht zu Beschränkung der beanspruchten Erfindung ausgelegt werden. Es gibt eine Vielzahl alternativer Methoden und Verfahren, die dem Fachmann zur Verfügung stehen, die ein erfolgreiches Durchführen der vorliegenden Erfindung in ähnlicher Weise erlauben würden.
Beispiel 1: Entwicklung von Konstrukten zum Abschalten des vakuoläre saure Invertase-Gens der Kartoffel
Eine Suche nach der Kartoffel-cDNA des vakuolären säurelöslichen Invertasegens (VI) im Institute for Genomic Research (TIGR) (jetzt DFCI-Solanum tuberosum Gen-Index) (Quackenbush et al, 2000) und NCBI's GenBank (Benson et al, 1994) führte zu drei VI-Sequenzen, die 99% Nukleotid-Identität teilen (TC132799; The Gene Index Databases, Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA 02115; (Quackenbush et al, 2000) (SEQ ID NO: 1), L29099 (SEQ ID NO: 2) und AY341425 (SEQ ID NO: 3); Tabelle 4). Beruhend auf diesen Sequenzen wurde eine 2351 bp volle Länge (engl. full-length) VI-cDNA der Kartoffel erhalten (Tabelle 4; SEQ ID NO: 4). Die aus den Datenbanken entnommene cDNA-Sequenz wurde durch Re-Sequenzierung der cDNA-Sequenzen bestätigt, die aus der Kartoffel-Kultursorte Katahdin, unter Verwendung der folgenden Primersätze amplifiziert wurden: Satz 1 (amplifiziert eine 810 bp-Region, die 293–1102 bp gemäß SEQ ID NO: 4 entspricht)
Satz 2 (amplifiziert eine 866 bp-Region, die 1058–1923 bp gemäß SEQ ID NO: 4 entspricht)
Satz 3 (amplifiziert eine 830 bp-Region, die 1438–2267 bp gemäß SEQ ID NO: 4 entspricht)
Drei verschiedene Sequenzen, 506 bp (SEQ ID NO: 9, Nukleotide 1845–2351 gemäß SEQ ID NO: 4, in Tabelle 4 einfach unterstrichen), 495 bp (SEQ ID NO: 10; Nukleotide 673–1168 gemäß SEQ ID NO: 4, in Tabelle 4 doppelt-unterstrichen) bzw. 508 bp (SEQ ID NO: 11; Nukleotide 1310–1818 gemäß SEQ ID NO: 4, Fettdruck in Tabelle 4) wurden zum Aufbau von abschaltenden Konstrukten ausgewählt. Alle cDNA-Fragmente wurden aus Katahdin mittels Platinum Taq DNA Polymerase (Invitrogen, Carlsbad, CA) amplifiziert mit 35 Zyklen Hitze-Denaturierung bei 95°C für 30 Sekunden, Glühen (engl. annealing) bei 60°C für 30 Sekunden und Extension bei 72°C für 1 Minute, nach einer anfänglichen Hitze-Denaturierung bei 95°C für 40 Sekunden. SEQ ID NO: 9 (ein 506-bp cDNA-Fragment) wurde unter Verwendung des Primersatzes 4 (SEQ ID NOs: 12–13) amplifiziert:
Gleichermaßen wurde SEQ ID NO: 10 (ein 495 bp cDNA-Fragment) unter Verwendung des Primersatzes 5 (SEQ ID NOs: 14–15) amplifiziert:
SEQ ID NO: 11 (ein 508 bp cDNA-Fragment) wurde unter Verwendung des Primersatzes 6 (SEQ ID NOs: 16–17) amplifiziert:
Die amplifizierten PCR-Produkte wurden mittels QIAQUICK^® PCR purification kit (Qiagen, Valencia, CA) aufgereinigt, auf einem Gel überprüft und in den pENTRID directional TOPO-Kloniervektor (Invitrogen) einkloniert. Das gerichtete Klonieren in den pENTR-Vektor wurde durch Sequenzieren überprüft und die LR-Rekombinationsreaktion wurde mittels dem pHellsGate8-Plasmid durchgeführt (dieses Plasmid ist abgesehen von dessen Verwendung von attR-Stellen anstelle von attP-Stellen identisch zu pHellsGate2, wie beschrieben in (Wesley et al, 2001)). Rekombinationsreaktionsprodukte wurden durch Restriktionsverdaue (XhoI und XbaI) analysiert und sequenziert, um zu sichern, dass die VI-Sequenzen in Sinn- und Antisinn-Orientierungen rekombinert haben. Das Agrobacterium GV3101:pMP90 (Hellens et al., 2000) wurde mit pHellsGate8-VI-Plasmiden durch das Einfrier- und Auftau-Verfahren (Sambrook und Russell, 2001) transformiert und positive Klone wurden auf YEP-Medium, das Gentamycin-(30 mg/ml) und Spectinomycin-Resistenz-(50 mg/ml) Antibiotika enthält, selektioniert. Agrobacterium-Transformanten wurden durch Kolonie-PCR mittels den Primersätzen 4–6 für jede gemäß SEQ ID NOs: 9, 10 und 11 unabhängige Transformation des VI-Gens bestätigt. Einzelkolonien wurden ausgewählt, auf flüssigem YEP-Medium mit geeigneten Antibiotika (GenR und SpecR) angezogen und verwendet, um Kartoffeln zu infizieren. Kartoffel-Stamminternodium-Explantate aus 5–6 Wochen alten in vitro Pflanzen der Kartoffelsorte Katahdin wurden bei der Kartoffeltransformation (Bhaskar et al, 2008; Song et al, 2003; Zeigelhoffer et al, 1999) verwendet. Kanamyzin-Antibiotikum wurde als ein transgene Pflanzen-Selektionsmarker verwendet.
Beispiel 2: Bestätigen transgener Pflanzen
Transgene Katahdin-Linien, die aus den drei Konstrukten erhalten wurden, wurden zuerst auf die Gegenwart des Kanamycin-Resistenz Selektionsmarkers hin gescreent. Auf genomischer DNA, die aus den transgenen Linien wie auch aus nicht-transformierten Kontrollen isoliert wurde, wurde eine PCR mittels der Kanamycin-Marker-spezifischen Primer (Primersatz 7; SEQ ID NOs: 18 und 19) durchgeführt:
Die Gegenwart oder Abwesenheit eines einzelnen 531 bp langen PCR-Produktes wurde in einer transgenen Pflanze bestätigt. Eine PCR wurde mit 40 Zyklen Hitze-Denaturierung bei 95°C für 20 Sekunden, Anlagern bei 53°C für 30 Sekunden und Extension bei 72°C für 1 Minute, nach einer anfänglichen Hitze-Denaturierung bei 95°C für 1 Minute, durchgeführt. Das PCR Reaktionsgemisch (25 μl) bestand aus 1 × PCR-Puffer, 0,1 mM dNTPs, 0,2 μM Primer, 1,5 mM MgCl₂, 1 U Platinum Taq Polymerase (Invitrogen) und 1,5 ng genomischer DNA.
Beispiel 3: Bestätigen von VI-Gen-Abschaltung
Alle transgenen Katahdin-Pflanzen, die aus drei unabhängigen Transformationen erhalten wurden, wurden auf die Abschaltung der VI-Gene hin mittels Northern-Blot-Hybridisierungen gescreent. Gesamt-RNA wurde aus Kartoffelblättern mittels des QIAQUICK^® RNA Isolation Kit (Qiagen) isoliert. Ungefähr 15 μg RNA wurde in jede Spur geladen und auf einem denaturierenden 1% Agarosegel aufgelöst und dann auf eine HYBOND^TM+ Nylonmembran (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) transferiert. SEQ ID NO: 20 der VI-cDNA-Sequenz (Tabelle 5) wurde mit Primersatz 8 (SEQ ID NOs: 21 und 22) PCR-amplifiziert:
Die Sonde wurde mit 3000 Ci/mmol [³²P] dATP (Amersham) mittels des STRIP-EZ^® DNA Kit (Ambion, Austin, Texas) gemäß den Instruktionen des Herstellers radioaktiv markiert. Die Gel-Blot-Membran wurde in 65°C Church-Puffer (7% SDS, 0,5M Na₂HPO₄, 1 mM EDTA, pH 7,2) für wenigstens 1 Stunde vorgewaschen. Die radioaktiven Sonden wurden denaturiert und dann über Nacht bei 65°C auf die Membran hybridisiert. Nach der Hybridisierung wurden die Membranen zweimal in 2 × SSC und 0,1% SDS für 15 min und zweimal in 0,2 × SSC und 0,1% SDS für 15 min gewaschen. Signale wurden mittels eines Phosphor-Imagers und/oder durch Exposition gegenüber einem Röntgenfilm und Entwickeln nachgewiesen.
Beispiel 4: Kartoffelknollen-Lagerung und Chip-Herstellung
Zwei Replikationen 70 unabhängiger VI-RNAi Katahdin-Linien wurden zusammen mit Kontrollen aus der Zellkultur in Gewächshaustöpfe übertragen. Diese Pflanzen wurden in zwei separaten Zuchtkammern gezüchtet; jede enthielt alle Pflanzen aus einer Replikation. Die Wachstumsbedingungen bestanden aus 70% Luftfeuchtigkeit, einem 16-Std. Tag/8-Std. Nacht-System, 19°C/15°C, 500 μmol m^–2s^–1 Licht wurde angewendet. Knollen wurden von den Pflanzen geerntet, nachdem sie volle Seneszenz entwickelt hatten. Das Gewicht frischer Knollen wurde unter Verwendung aller geernteter Knollen ermittelt. Alle Knollen wurden eine Woche in Dunkelheit bei Raumtemperatur gelagert. Aus jeder Linie wurden 3–6 Knollen ausgewählt und in Luftfeuchtigkeit-gesteuerten Kammern bei 4°C für bis zu 180 Tage (6 Monate) gelagert und die verbleibenden Knollen wurden in Dunkelheit bei Raumtemperatur (20°C) gelagert. Um Kartoffelchips herzustellen, wurden Proben durch das Schneiden von Scheiben (vom apikalen zum basalen Ende der Knolle, 0,65 cm Durchmesser, 1,5 mm dick) aus Knollen, die sowohl bei 20°C als auch bei 4°C gelagert wurden, genommen. Die verbleibenden Knollenproben wurden unmittelbar in flüssigem Stickstoff zur späteren Bestimmung der Invertase-Enzymaktivität und des Zuckerprofils eingefroren. Knollenscheiben wurden für 2 Minuten bei 191°C zur Beobachtung der Chipfarbe ausgebacken. Die Chipfarbe wurde optisch anhand einer 10-Chip-Probe jeder Pflanzenlinie unter Verwendung des Kartoffelchip-Farbreferenz-Standards, der vom Potato Chip Institute International, Cleveland, Ohio (Douches und Freyer, 1994; Reeves, 1982) entwickelt wurde, bestimmt.
Beispiel 5: Acrylamid-Analyse
Raspel-Experimente wurden an Knollen durchgeführt, die bei 4°C für 180 Tage (6 Monate) ohne Durchführung eines Aufarbeitungsprozesses gelagert wurden. Kartoffelknollen wurden um Scheiben zu erhalten, der Länge nach geschnitten und in Gemüseöl bei 184°C/362°F oder bei 191°C/375°F für 2 Minuten, 30 Sekunden ausgebacken. Ausgebackene Chips konnten abkühlen und wurden gründlich zerrieben und das Pulver wurde zur Acrylamid-Analyse verwendet. Proben wurden an Covance Inc., Madison, WI und an das Labor von Mike Pariza an der Universität von Wisconsin, Madison, WI versendet. Bei Covance, Inc. wurde eine Kombination aus Massenspektrometrie und Flüssigkeitschromatographie verwendet, um Acrylamid nach dem Verfahren nachzuweisen, das durch die Food und Drug Administration der Vereinigten Staaten (http://www.cfsan.fda,gov/~dms/acrylami.html) aus einem früheren Verfahren (Schuster, 1988) übernommen wurde. In Mike Pariza's Labor wurden die Proben durch ein zuvor beschriebenes (Park et al. 2005) modifiziertes EPA-Verfahren analysiert. Der t-Test wurde verwendet, um zu untersuchen, ob die Mittelwerte zweier Gruppen sich statistisch signifikant voneinander unterschieden.
Beispiel 6: Ergebnisse-Charakterisierung von VI-RNAi-Linien
Insgesamt 110 gesunde transgene Linien, die aus drei unabhängigen Transformationen mit drei unterschiedlichen Konstrukten erzeugt wurden, wurden zur Analyse ausgewählt (63, 40 und 7 Pflanzen ergaben sich aus Konstrukt #2, #1 bzw. #3 (SEQ ID NOs: 11, 10 und 9)). Mit diesen Linien wurde parallel zu nicht-transformierten Pflanzen und mit Leervektor transformierten Pflanzen eine Northern-Blot-Analyse der Transkription des VI-Gens durchgeführt (1). In 23 Linien wurde ein 95–99% Verlust an VI-Transkript nachgewiesen, eine Verringerung von 10–90% an VI-Gentranskription wurde in 49 Linien nachgewiesen. Die VI Gentranskription in den verbleibenden 38 transgenen Linien zeigte verglichen mit Kontrollen keinen Unterschied. Sechs transgene Linien zeigten jedoch nach langer Exposition für 4 Wochen mittels Verstärkerschirmen fast keine nachweisbaren Transkripte (~99%). Insgesamt 70 repräsentative RNAi-Linien wurden zur weiteren Analyse ausgewählt (6, 12, 45 und 7 Linien, die eine ~99%ige, 95–99%ige bzw. 10–90%ige Abschaltung bzw. keine Abschaltung darstellen). Die Gegenwart eines Kanamycin-Resistenz-Selektionsmarkergens wurde durch PCR-Analyse bestätigt. Zwei in vitro-Kopien einer jeden der 70 oben genannten repräsentativen RNAi-Linien wurden gepflanzt, jeweils eine in zwei verschiedenen Gewächshäusern. Exakt identische Wachstumsbedingungen wurden in den beiden Gewächshauszimmern vom Pflanzen bis zur Ernte der Knollen aufrechterhalten. Die Erfinder beobachteten in diesen transgenen Linien im Vergleich zu Kontrollen weder unterscheidbare morphologische Merkmale noch irgendeinen Knollenphänotyp nach dem Ernten, der mit RNAi-Abschalten des VI-Gens einhergeht (2). Einige wenige transgene Linien (insgesamt 6) zeigten verkümmerte Phänotypen mit anomalen Blatt- und Blütenstrukturen. Diese Phänotypen zeigten jedoch keinerlei Korrelation mit VI-Transkriptniveaus und deren Auftreten wurde daher während der in vitra-Vermehrung erhaltenen somaklonalen Variationen zugeschrieben. Knollen wurden nachdem sie volle Seneszenz entwickelt hatten von den Pflanzen geerntet. Unter den VI-RNAi-Linien wurden im Vergleich zu Kontrollen keine Knollen-Phänotypen beobachtet. Das Gewicht frischer Knollen wurde mittels aller geernteten Knollen ermittelt. Es wurden verglichen mit Kontrollen keine signifikanten Unterschiede bei den Frisch-Knollengewichten und der Gesamtanzahl an Knollen pro Pflanze bei den transgenen Linien festgestellt.
Beispiel 7: Ergebnisse -experimentelle Ergebnisse beim Raspein
Raspel-Experimente wurden an Knollen durchgeführt, die bei 20°C gelagert wurden, und an Knollen, die direkt aus der Kühllagerung (nämlich 4°C) genommen wurden. Alle diese Raspel-Experimente wurden an Knollen ohne Durchführung eines Aufarbeitungsprozesses durchgeführt. Die Raspelleistung von Knollen, die bei 20°C gelagert wurden, war zwischen den RNAi-Linien und den Kontrollen nicht unterschiedlich. Übereinstimmende Chip-Werte von 3,0 auf einer Chip-Skala von 1 (hell) bis 10 (dunkel) wurden für alle Linien erhalten. Chip-Werte von 6,0–7,0 und 7,0–8,0 wurden für Kontroll-Knollen beobachtet, die nach 14 Tagen und 60 Tagen direkt aus einer 4°C Lagerung verarbeitet wurden (3). Auffallenderweise wurden für Knollen der besten RNAi-Linien, die direkt nach Kühllagerung für sowohl 14 als auch 60 Tage hergestellt wurden, Chip-Werte von 3,0 erhalten. Die helle Farbe der Chips korrelierte mit der Menge des VI-Transkripts in den RNAi-Linien (Tabelle 6, 4). Aus ~99% VI-abgeschalteten Linien (RNAi #1, 2 & 4) hergestellte Chips ergaben durchweg hellere Werte. Interessanterweise erzeugten wenige der von uns analysierten Linien mit ~90% VI-Abschaltung (RNAi #3) hell- bis mittel-farbene Chips mit Werten von 4,0–6,0. Die Raspelleistung von RNAi-Linien (#7, 8) war jedoch auch wenn diese Linien eine VI-Transkript-Verringerung von 50% bzw. 20% zeigten schlecht. Auf der Grundlage dieses Ergebnisses schließen die Erfinder, dass die Niveaus an VI-Transkript in den RNAi-Linien die Menge an reduzierenden Zuckern in Knollen steuern, die die Farbe der Kartoffelchips bestimmt. Die Raspelleistung von RNAi-Linie #7 ähnelte fast jener der Kontroll-Linien, wobei keine Verringerung an VI-Transkript in dieser Linie nachgewiesen wurde. Diese Ergebnisse zeigen, dass das vollständige Abschalten des VI-Gens in Kartoffelpflanzen die Anreicherung an reduzierenden Zuckern bei Kühllagerung steuern kann und hellfarbige Chips erzeugt, die geltenden Industriestandards entsprechen.

* Die Raspelleistung wurde in gut (Chip-Wert ≤ 4,5), mittel (5–6) und schlecht (≥ 7,5) eingeteilt.
** Ein halber Wert wurde Chips zugewiesen, wenn ihre Farbe zwischen 2 der 10 Farbindikatoren nicht zu unterscheiden war.
Weitere Raspel-Experimente an Knollen, die nach 3 Monaten (90 Tage) und nach 6 Monaten (180 Tage) direkt aus 4°C Lagerung entnommen wurden, erzeugten für Knollen der besten VI-RNAi-Linien Chip-Werte von 3,0 bis 4,0. Chips, die aus ~99% VI-abgeschalteten Linien (RNAi # 1, 2 und 4) hergestellt wurden, erzeugten immer noch durchweg hellere Werte. RNAi #3 mit ~90% VI-Abschaltung erzeugte jedoch mittel-farbige Chips mit Werten im Bereich von 5,0 bis 6,0. Wie aus vorherigen Raspel-Ergebnissen bei 14 und 60 Tagen erwartet, war die Raspelleistung von RNAi-Linien #7, 8 und 9 schlecht und erzeugte Werte von 8,0. Interessanterweise war die Raspelleistung von RNAi-Linie #5 bei Raspel-Experimenten bei 14 und 60 Tagen mittel, erzeugte jedoch schlechte Raspel-Werte bei 90 und 180-Tagen Analyse (Tabelle 6). Auf der Grundlage dieser Ergebnisse schließen die Erfinder, dass die Niveaus an VI-Transkript in den RNAi-Linien die Menge an reduzierenden Zuckern in den Knollen steuert, die die Farbe der Kartoffelchips bestimmen.
Diese Ergebnisse stützen die vorherigen Schlussfolgerungen der Erfinder, dass die Niveaus an VI-Transkript in den RNAi-Linien die Menge an reduzierenden Zuckern in den Knollen steuert, die die Farbe der Kartoffelchips bestimmen. Die Ergebnisse geben auch an, dass ein vollständiges Abschalten des VI-Gens in Kartoffelpflanzen das Problem des Kälte-induzierten Süßens steuern kann und hell-farbige Chips erzeugt, die gemäß derzeitigen Industriestandards annehmbar sind.
Beispiel 8: Niedrige Acrylamid-Niveaus bei VI-RNAi-Linien im Vergleich zu Kontrollen
In der Kartoffel wird Acrylamid vorwiegend durch eine Maillard-artige Reaktion bei Aminosäuren (Asparagin) und reduzierenden Zuckern bei hohen Ausbacktemperaturen gebildet (Mottram et al. 2002). Da reduzierende Zucker (Glukose und Fructose) unter den zwei größten limitierenden Faktoren während Acrylamidbildung in aus Kartoffeln hergestellten Produkten sind, nahmen wir an, dass VI-abgeschaltete RNAi-Linien im Vergleich zu Kontrollen sehr niedrige Acrylamid-Niveaus anreichern würden. Die Erfinder wählten kühl-gelagerte Knollen (4°C für 14 Tage und 180 Tage – keine Aufarbeitung) aus drei VI-abgeschalteten RNAi-Linien (RNAi #1, 2, 3) und einer Katandin-Kontrolllinie (Tabelle 8) zum Vergleichen von Acrylamidniveaus mittels den in Beispiel 5 beschriebenen Verfahren. Ausgebackene Chips wurden abgekühlt, sorgfältig zerrieben und das sich daraus ergebende Pulver wurde zur Acrylamid-Analyse verwendet. Proben wurden an Covance Inc., Madison, WI und auch an das Labor von Mike Pariza an der Universität von Wisconsin, Madison versendet. Bei Covance, Inc., wurde eine Kombination an Massenspektrometrie und Flüssigkeitschromatographie verwendet, um Acrylamid nach dem Verfahren nachzuweisen, das durch die Food und Drug Administration der Vereinigten Staaten (http://www.cfsan.fda.go/~dms/acrylami.html) aus einem früheren Verfahren (Schuster, 1988) entwickelt wurde. Im Pariza-Labor, Universität von Wisconsin-Madison wurden die Proben durch ein zuvor in Park et al. 2005 beschriebenes modifiziertes EPA-Verfahren analysiert. Ein t-Test wurde verwendet, um zu untersuchen, ob die Mittelwerte zweier Gruppen sich statistisch signifikant voneinander unterschieden.
Bemerkenswerterweise waren Acrylamidniveaus bei den Kartoffelchip-Proben, die aus VI-abgeschalteten RNAi-Linien erhalten wurden, im Vergleich zu Kontrollen signifikant verringert. Aufgrund der beschränkten Verfügbarkeit von Knollenproben, wurden Acrylamidniveaus nach höheren Ausbackzeiten (2 Minuten, 30 Sekunden) und Temperaturen (375°F) gemessen. Chips ausgebacken von RNAi-Linien zeigten eine 9- bis l0-fache Verringerung von Acrylamidniveaus im Vergleich zu Kontrollen (5 und 6). Insbesondere war Acrylamid-Niveau in RNAi #1 so niedrig wie 750 ppb verglichen zu nicht-transformierter Katahdin-Kontrolle (5160 ppb) bei 14 Tage Kühllagerung (4°C). Die ähnliche Linie (RNAi #1) erzeugte verringerte Acrylamidniveaus von 1130 ppb nach 6 Monaten Kühllagerung verglichen mit der Kontrolllinie (10420 ppb). Die Erfinder haben eine ähnliche 8- bis 12-fache Verringerung des Acrylamidniveaus bei anderen VI-abgeschalteten Linien (#2 und 3) im Vergleich zu Kontrollen beobachtet (5 und 6). Interessanterweise wurde für RNAi-Linie #1 keine Änderung des Acrylamidniveaus unter RT und 14-Tagen Kühllagerung im Vergleich zu erhöhten Acrylamidniveaus bei Kontrollen während diesen Zeitpunkten festgestellt (7).
Diese Studie zeigte, dass VI-RNAi-Linien, die bei 39°F für mehrere Monate kühlgelagert wurden, noch immer Kartoffelchips mit relativ niedrigen Acrylamid-Niveaus (7) im Vergleich zu den Kontrollen ergaben. Es gab in wenigstens einer RNAi-Linie (#1) keine Änderung im Acrylamid-Niveau nach 14-tägiger Kühllagerung verglichen mit nicht-transformierter Kontrolle und nur eine leichte Zunahme von 0,5-fach nach einer verlängerten 6-monatigen Kühllagerung bei 39°F. Dieser Befund weist darauf hin, dass dramatische Verringerungen der VI-Transkriptniveaus ausreichend genug sind, um ein niedrig-Acrylamid Produkt zu garantieren. Derzeit erzeugt keine der kommerziellen aus 39°F-Lagerung entnommenen Kultursorten annehmbare Chips, da überschüssige reduzierende Zucker eine dunkle Farbe und Acrylamid in Maillard-Reaktion bilden werden.
Beispiel 9: Feld-Evaluierungen von VI-RNAi Kartoffellinien
Insgesamt 60 transgene Linien, die aus zwei unabhängigen Transformationen mit zwei verschiedene Konstrukten erzeugt wurden, wurden zur Analyse ausgewählt (nämlich 20 Pflanzen (RNAi #1), die aus SEQ ID NO: 11 erzeugt wurden, 20 Pflanzen (RNAi #2), die aus SEQ ID NO: 11 erzeugt wurden bzw. 20 Pflanzen (RNAi #3), die aus SEQ ID NO: #10 erzeugt wurden). Kontroll-Pflanzen umfassten insgesamt 20 Transgene, die sich aus Leervektor-Konstrukten (Agrobacterium GV3101:pHellsGate8) und 20 transformierten Katahdin-Pflanzen ergaben. 60 andere Kontroll-Pflanzen der Sorten Snowden, Russett Burbank, Megachip und Red Norland wurden auch bei Feldanalysen einbezogen.
Alle diese oben genannten Kartoffellinien wurden während der ersten und zweiten Juni-Wochen 2009 auf beiden Feld-Standorten, im Standort Hancock, Wisconsin (2. Juni 2009) bzw. Standort Rhinelander, Wisconsin (9. Juni 2009), verpflanzt. Am Standort Hancock, Wisconsin wurden 10 RNAi #1-Pflanzen, 10 RNAi #2-Pflanzen und 10 RNAi #3-Pflanzen, 10 Leervektor-Pflanzen, 10 nicht-transformierte Kontroll-Pflanzen und 80 Kontroll-Pflanzen anderer Kartoffelsorten gepflanzt. Ähnlich wurde am Standort Rhinelander Wisconsin 10 RNAi #1-Pflanzen, 10 RNAi #2-Pflanzen und 10 RNAi #3-Pflanzen, 10 Leervektor-Pflanzen, 10 nicht-transformierte Kontroll-Pflanzen und 100 Kontroll-Pflanzen anderer Kartoffelsorten gepflanzt.
Alle diese Pflanzen wurden von Hand an beiden Feld-Standorten mit 3 Fuß Abstand zwischen den Reihen und 2 Fuß Abstand zwischen den Pflanzen innerhalb einer Reihe gepflanzt. Es wurde auf beiden Feld-Standorten ein vollständig zufälliger Aufbau (engl. Completely Randomized Aufbau, CRD) verfolgt. Die vollständige bepflanzte Agrarfläche am Standort Hancock, Wisconsin umfasste 30 × 51 Fuß (etwa 0,14 Acre) und am Standort Rhinelander, Wisconsin umfasste sie 22 × 63 Fuß (etwa 0,20 Acre). Sobald alle Pflanzenmaterialien verpflanzt waren, wurden auf beiden Feld-Standorten Routine-Kultivierungs- und Managementpraktiken wie im Folgenden beschrieben befolgt.
Die an den Standorten Hancock, Wisconsin und Rhinelander, Wisconsin befolgten Routine-Kultivierungs- und Managementpraktiken waren wie folgt:
Düngemittel: 1. April, N-P-K-S-Ca in Form von 0-0-0-17S-21Ca (Kalziumsulfat) 70 lb/0,14 Acre und N-P-K in Form von 0-0-60 (Pottasche) 52,5 lb/0,14 Acre
Düngemittel: 16. Juni, N-P-K-S in Form von 21-0-0-24S (Ammoniumsulfat) 49 lb/0,14 Acre
Fungizid: 18. Juni, EQUUS ZN Fungizid 0,21 Pinten/0,14 Acre
Fungizid: 26. Juni, BRAVO ZN Fungizid 0,21 Pinten/0,14 Acre
Fungizid: 02. Juli, EQUUS ZN Fungizid 0,21 Pinten/0,14 Acre, Headline EC Fungizid 0,84 Flüssigunzen/0,14 Acre
Düngemittel: 09. Juli, N-P-K in Form von 46-0-0 (Harnstoff) 31,5 lb/0,14 Acre
Fungizid: 10. Juli, ECHO Zn Fungizid, 0,21 Pinten/0,14 Acre
Fungizid: 17. Juli, BRAVO Zn 0,21 Pinten/0,14 Acre, ENDURA Fungizid 0,35 Trockenunzen/0,14 Acre
Fungizid: 23. Juli, ECHO Zn 0,21 Pinten/0,14 Acre
Fungizid: 30. Juli, ECHO Zn 0,21 Pinten/0,14 Acre und Headline Fungizid 0,84 Flüssigunzen/0,14 Acre
Insektizide: 31. Juli, Coragen 0,7 Flüssigunzen/0,14 Acre
Fungizid: 07. August, ECHO Zn 0,42 Pinten/0,14 Acre, Tanos Fungizid 1,12 Trockenunzen/0,14 Acre
Insecticide: 11. August, Coragen 0,49 Flüssigunzen/0,14 Acre
Fungizid: 13. August, ECHO Zn 0,42 Pinten/0,14 Acre, Manzate Pro Stick Fungizid 0,03 lb/0,14 Acre
Fungizid: 20. August, Echo Zn 0,3 Pinten, Tanos Fungizid 1,12 Trockenunzen/0,14 Acre
Fungizid: 27. August, Manzate Pro Stick Fungizid Echo Zn/0,14 Acre 23. September 2009 -Ernte
Bewässerungsplan und -Menge: 4/20/2009 (Menge in Inch: 0,25 Inch), 5/4/2009 (0,5), 5/18/2009 (0,5), 5/22/2009 (0,5), 6/1/2009 (0,3), 6/2/2009 (0,25), 6/5/2009 (0,5), 6/11/2009 (0,25), 6/15/2009 (0,5), 6/19/2009 (0,5), 6/21/2009 (0,5), 6/23/2009 (0,5), 6/25/2009 (0,5), 6/27/2009 (0,5). Bewässerungsplan wurde an jedem dritten Tag @ mit 0,5 Inch weitergeführt bis zum Erntetag am 23. September 2009.
Feldevaluationen von VI-RNAi-Kartoffellinien
Feldevaluationen der VI-RNAi-Linien wurden in Wisconsin während des Sommers 2009 an den Pflanzen-Standorten Hancock und Rhinelander durchgeführt. Bei transgenen VI-RNAi-Pflanzen wurden im Vergleich zu Konrollpflanzen keine Wachstumsanomalien festgestellt. RNAi-Linien zeigten keine signifikanten Ertragsunterschiede (p < 0,05) im Vergleich zu Kontroll- und Leervektor-Linien (Siehe 8). Messungen der spezifischen Dichte wurden bei auf Feldern angebaute transgenen und Kontroll-Knollen durchgeführt. Die spezifische Dichte von Kartoffeln ist ein wichtiger Faktor der Erntequalität. In der Praxis verwendet die Kartoffelindustrie die spezifische Dichte als eine Referenz, um die Ausbackqualität, Back-Eigenschaften und Lagerfähigkeit zu beurteilen. Die Messungen der spezifischen Dichte wurden wie folgt bestimmt. Eine Knollenprobengröße im Bereich von 10 bis 15 lbs (4,5–6,8 kg) wurde als eine angemessene Probengröße für Messungen der spezifischen Dichte verwendet. Ausgewählte Probeneinheiten werden als erstes an der Luft gewogen und dann wird dieselbe Einheit in Wasser suspendiert nachgewogen. Die spezifische Dichte wurde mittels der folgenden Formel berechnet: Spezifische Dichte = Gewicht an Luft/(Gewicht an Luft – Gewicht in Wasser).
Die wie oben beschrieben durchgeführten Messungen der spezifischen Dichte waren bei transgenen VI-RNAi-Knollen verglichen mit den Kontrollen übereinstimmend (p < 0,05) (siehe 9).
Raspelleistung von Knollen aus VI-RNAi-Kartoffellinien
Wie oben beschriebene Raspel-Experimente an auf Feldern angebauten VI-RNAi-Knollen bei 14-tägiger Kühllagerung nebst Kontrollen. Die Raspel-Experimente wurden wie in Beispiel 4 beschrieben durchgeführt. Gute Chip-Werte (≥ 4,5) wurden für 14-Tage kühl gelagerte VI-RNAi-Knollenproben erhalten (siehe 10), wohingegen kühl gelagerte Kontroll-Knollen schlechte Chip-Werte (≥ 8,0) erzeugten. Die Farbe von Kartoffelchips wurde mittels eines Hunterlab Colorflex kalorimetrischen Spektrophotometers überprüft. Dieses Gerät misst die Echtfarbe von Kartoffelchips (im Durchschnitt 40 Chips) mittels voreingestellten dreidimensionalen Farbskalen. Ein Hunter-Wert von ≥ 50 oder höher stellt in der Kartoffelverarbeitenden Industrie einen weithin akzeptierten Chip-Farbwert dar. Hunter-Werte von > 60 wurden für alle die 14-Tage kühl gelagerten VI-RNAi-Knollen erhalten im Vergleich zu einem Wert von 36,01 ± 0,35 für Kontroll-Knollen (siehe 11). Gleichermaßen wurden Hunter-Werte von > 58 für alle diese 60-Tage kühl-gelagerten VI-RNAi Knollen erhalten, im Vergleich zu dem Wert 27,77 ± 0,28 für Kontroll-Knollen (siehe 11).
Acrylamid-Analyse für auf Feldern angebaute Knollen
Acrylamideanalysen wurden an Kartoffelchips durchgeführt, die aus Raumtemperatur (RT) und 14-Tage kühl gelagerten Feld-geernteten Knollen, wie oben beschrieben, mittels der wie in Beispiel 5 beschriebenen Techniken erzeugt wurden. Wesentliche Acrylamid-Verringerungen von etwa 100-fach wurden bei kühl-gelagerten RNAi-Knollen im Vergleich zu kühl gelagerten Kontroll-Knollen beobachtet. Acrylamidwerte für Knollen von Linie #2 und #1 waren 180 und 650 ppb im Vergleich zu 29550 ppb bei den Kontrollen signifikant (p < 0,05) (siehe 13).
Acrylamidniveaus bei beiden auf Feldern und im Gewächshaus angebauten (siehe 12 und 13) transgenen Knollen nach 14-tägiger Kühllagerung erzeugten durchweg sehr niedrige Acrylamidniveaus.
Ein Fachmann würde ohne weiteres zu schätzen wissen, dass die vorliegende Offenbarung gut geeignet ist, die Absichten und Zwecke zu erfüllen und die genannten, ebenso wie die denen innewohnenden Ziele und Vorteile zu erhalten. Die molekularen Komplexe und die hierin beschriebenen Verfahren, Abläufe, Behandlungen, Moleküle, spezifischen Verbindungen sind gegenwärtig stellvertretend für bevorzugte Ausführungsformen, sind beispielhaft und nicht als den Umfang der Erfindung einschränkend vorgesehen. Es ist für einen Fachmann leicht ersichtlich, dass verschiedene Substitutionen und Modifikationen an der hierin offenbarten Erfindung vorgenommen werden können, ohne von dem Umfang und Geist der Erfindung abzuweichen.
Alle in der Beschreibung erwähnten Patente und Veröffentlichungen sind für das Niveau des Fachmanns bezeichnend, zu dessen Gebiet die Erfindung gehört. Alle Patente und Veröffentlichungen sind durch Bezugnahme im gleichen Umfang hierin aufgenommen, als wenn für jede einzelne Veröffentlichung im Besonderen und einzeln angegeben wäre, dass diese durch Bezugnahme mit aufgenommen sei.
Die hierin anschaulich beschriebene Erfindung kann in geeigneter Weise bei Fehlen eines jeglichen Element oder jeglicher Elemente, Begrenzung oder Einschränkungen, die hierin nicht im Besonderen offenbart sind, praktiziert werden. So kann hierin zum Beispiel in jedem Fall ein jeglicher der Begriffe ”umfassen”, ”im Wesentlichen bestehen aus” und ”bestehen aus” durch einen jeden der beiden anderen Begriffe ersetzt werden. Die Begriffe und Ausdrücke, die eingesetzt wurden, werden als beschreibende Begriffe verwendet und nicht als Einschränkungen und es gibt keine Absicht eines Ausschließens eines jeglichen Äquivalents der gezeigten und beschriebenen Merkmale oder Teilen davon in der Verwendung derartiger Begriffe und Ausdrücke. Es wird jedoch anerkannt, dass verschiedene Modifikationen innerhalb des beanspruchten Bereichs der Erfindung möglich sind. Somit sollte verstanden werden, dass, obwohl die vorliegende Offenbarung durch bevorzugte Ausführungsformen und wahlweise Merkmale konkret offenbart wurde, durch Fachleute auf Modifikation und Variation der hierin offenbarten Konzepte zurückgegriffen werden kann und dass derartige Modifikationen und Variationen als im Umfang der durch die anhängigen Ansprüche definierten Erfindung enthalten betrachtet werden.
LITERATURVERZEICHNIS
Die Offenbarungen alter Literaturstellen werden hierin durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit aufgenommen.

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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

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Claims

Isoliertes Polynukleotid, das eine Nukleinsäuresequenz mit wenigstens 90% Nukleinsäure-Sequenzidentität zu einer Sequenz umfasst, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 5, 6, 9, 10, 11, 23 und 24.
Polynukleotid nach Anspruch 1, wobei die Sequenz wenigstens 95% Nukleinsäure-Sequenzidentität aufweist.
Isoliertes Polynukleotid nach Anspruch 1, das eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 5, 6, 9, 10, 11, 23 und 24.
RNAi-Vektor, der ein Polynukleotid nach Anspruch 1 umfasst.
Transgene Pflanze, die den Vektor nach Anspruch 4 umfasst.
Transgene Pflanze nach Anspruch 5, wobei die Pflanze Solanum sp. ist.
Transgene Pflanze nach Anspruch 6, wobei die Pflanze Solanum tuberosum ist.
Transgene Pflanze nach Anspruch 7, wobei die Expression eines vakuolären Invertasegens verglichen mit einer nicht-transformierten Pflanze um wenigstens 90% verringert ist.
Transgene Pflanze nach Anspruch 7, wobei die Pflanze eine Knolle umfasst.
Transgene Pflanze nach Anspruch 9, wobei die Knolle zu einem Crisp, Chip, Pommes frites, Kartoffelstäbchen, Julienne-geschnittene Kartoffel oder anderen Kartoffelprodukt verarbeitet worden ist.
Verfahren zum Abschalten vakuolärer Invertase in einer transgenen Pflanze, wobei die Pflanze eine Kartoffelpflanze, eine Süßkartoffelpflanze, eine Jamswurzel oder ein Maniok ist und das Verfahren das Verringern des Niveaus an VI-Aktivität verglichen mit dessen Niveau in einer Kontroll-, nicht-transgenen Kartoffel-, Süßkartoffel-, Yamswurzel- oder Maniokpflanze umfasst, mittels Verringern des Niveaus einer mRNA in der transgenen Kartoffelpflanze, wobei die mRNA durch ein Polynukleotid mit wenigstens 90% Sequenzidentität zu einer Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO: 4 kodiert ist, und mittels Expression eines RNAi-Konstrukts, das ein Fragment aus wenigstens 20 aufeinanderfolgenden Nukleotiden einer Sequenz mit wenigstens 90% Sequenzidentität zu SEQ ID NO: 4 umfasst.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei das RNAi-Konstrukt ein Polynukleotid mit wenigstens 90% Sequenzidentität zu einem Polynukleotid umfasst, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 5, 6, 9, 10, 11, 23 und 24.
Verfahren nach Anspruch 11, das weiter den Schritt des Screenens der transgenen Pflanzen hinsichtlich einer Verringerung von VI-Aktivität mittels Vergleichen der VI-Aktivität in der transgenen Pflanze mit einer Kontrollpflanze umfasst.
Verfahren nach Anspruch 11, das weiter den Schritt des Screenens von aus den transgenen Pflanzen hergestellten Kartoffeln oder Süßkartoffeln mittels Vergleichen einer transgenen Kartoffel oder Süßkartoffel mit einer Kontroll-Kartoffel oder -Süßkartoffel nach durch Kühllagerung induziertem Süßen umfasst.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei das Screenen Untersuchen der Chip-Farbe nach dem Ausbacken umfasst.
Verfahren zum Steuern der Anreicherung von reduzierenden Zuckern in einer Kartoffel- oder Süßkartoffel-Pflanze während Kühllagerung, wobei das Verfahren umfasst: Verringern eines Niveaus vakuolärer Invertase-Aktivität in der Kartoffel- oder Süßkartoffel-Pflanze relativ zu einer Kontroll-Kartoffel- oder -Süßkartoffel-Pflanze mittels Einbringen in die Kartoffelpflanze eines RNAi-Konstrukts, das ein Fragment aus wenigstens 20 aufeinanderfolgenden Nukleotiden einer Sequenz mit wenigstens 90% Sequenzidentität zu SEQ ID NO: 4 umfasst, und Halten der Pflanze unter Bedingungen, die zur Expression des RNAi-Konstrukts ausreichen, wodurch sich das Niveau einer mRNA verringert, die durch ein Polynukleotid mit wenigstens 90% Sequenzidentität zu einer Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 4 kodiert wird.
Verfahren nach Anspruch 16, das weiter Testen der Farbe eines Kartoffelprodukts von einer Kartoffel der Pflanze nach Wärmebehandlung der Kartoffel umfasst.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei Testen der Farbe des Kartoffel- oder Süßkartoffel-Produkts Vergleichen der Produktfarbe mit der Farbe eines Kontroll-Kartoffel- oder -Süßkartoffelprodukts von einer Kontroll-Kartoffel- oder -Süßkartoffelpflanze umfasst.
Verfahren nach Anspruch 16, das weiter Wärmebehandlung der Kartoffel in ein(en) Crisp, Chip, Pommes frites, Kartoffelstäbchen, Julienne-geschnittene Kartoffel oder anderes Kartoffelprodukt oder Süßkartoffelprodukt umfasst.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei das RNAi-Konstrukt ein Polynukleotid mit wenigstens 90% Sequenzidentität zu einem Polynukleotid umfasst, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 5, 6, 9, 10, 11, 23 und 24.
Verfahren zum Steuern von Acrylamidbildung während Wärmebehandlung einer Kartoffel oder Süßkartoffel von einer Kartoffel- oder Süßkartoffel-Pflanze, wobei das Verfahren umfasst: Verringern eines Niveaus an vakuolärer Invertaseaktivität in der Kartoffel- oder Süßkartoffel-Pflanze relativ zu einer Kontroll-Kartoffel- oder -Süßkartoffel-Pflanze mittels Einbringen eines RNAi-Konstrukts in die Kartoffel-Pflanze, das ein Fragment aus wenigstens 20 aufeinanderfolgenden Nukleotiden einer Sequenz mit wenigstens 90% Sequenzidentität zu SEQ ID NO: 4 umfasst, und Halten der Pflanze unter Bedingungen, die zur Expression des RNAi-Konstrukts ausreichen, wodurch sich das Niveau einer mRNA verringert, die durch ein Polynukleotid mit wenigstens 90% Sequenzidentität zu einer Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 4 kodiert wird.
Verfahren nach Anspruch 21, das weiter Testen des Acrylamid-Niveaus in einem wärmebehandelten Kartoffelprodukt der Kartoffel oder Süßkartoffelprodukt der Süßkartoffel umfasst.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei Testen des Acrylamid-Niveaus in dem Kartoffelprodukt oder Süßkartoffelprodukt Vergleichen des Acrylamid-Niveaus mit einem Acrylamid-Niveau in einem Kontroll-Kartoffelprodukt von einer Kontroll-Kartoffelpflanze oder einem Kontroll-Süßkartoffelprodukt von einem Kontroll-Süßkartoffelprodukt umfasst.
Verfahren nach Anspruch 22, das weiter Wärmebehandlung der Kartoffel in ein(en) Crisp, Chip, Pommes frites, Kartoffelstäbchen, Julienne-geschnittene Kartoffel oder anderes Kartoffelprodukt oder Süßkartoffel in ein Süßkartoffelprodukt umfasst.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei das RNAi-Konstrukt ein Polynukleotid mit wenigstens 90% Sequenzidentität zu einem Polynukleotid umfasst, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 5, 6, 9, 10, 11, 23 und 24.