JP4558711B2 - 短いdsRNA配列を用いた植物中での効率的遺伝子サイレンシング - Google Patents
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Description
本発明は、植物細胞中での目的遺伝子の発現を減少させるための方法を提供し、該方法は以下のステップを含む:
(a)植物細胞に対してキメラ遺伝子を供給すること、ただし、該キメラ遺伝子は機能しうるように連結された以下のDNA断片を含むものであること、
i) 植物細胞のDNA依存性RNAポリメラーゼIIIによって認識されるプロモーターであって、DNA依存性RNAポリメラーゼIIIと相互作用する全てのシス作用プロモーターエレメントを含むIII型のプロモーターであることを特徴とするプロモーター、
好ましくは、U6snRNAをコードする遺伝子のプロモーター、U3snRNAをコードする遺伝子のプロモーター、7SL RNAをコードする遺伝子のプロモーターより選択される3型POLIIIプロモーター、
より好ましくは、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7または配列番号8のヌクレオチド配列より選択されるプロモーターのヌクレオチド配列を含むプロモーター;
ii)転写された際にはRNA分子をもたらすDNA断片、ただし、該RNA分子は以下のセンスおよびアンチセンスヌクレオチド配列を含むものであること、
(1) 目的遺伝子から転写されたRNAに由来する約19個連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列に対して約90〜約100%の配列同一性を有する約19個連続したヌクレオチドを含むセンスヌクレオチド配列、
(2) 該センス配列の約19個連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列の相補体に対して約90〜100%の配列同一性を有する約19個連続したヌクレオチドを含むアンチセンスヌクレオチド配列、
ここで、センスおよびアンチセンスヌクレオチド配列は、約19〜約200ヌクレオチド長の二本鎖RNAを形成できるものであること、
iii)少なくとも4個連続したT残基を含むオリゴdTストレッチ、
(b)該キメラ遺伝子を含まない植物細胞中での目的遺伝子の発現と比較したときに、目的遺伝子の発現が減少している植物細胞を同定すること。
i) 植物細胞のDNA依存性RNAポリメラーゼIIIによって認識されるプロモーターであって、DNA依存性RNAポリメラーゼIIIと相互作用する全てのシス作用プロモーターエレメントを含むIII型のプロモーターであることを特徴とするプロモーター、
好ましくは、U6snRNAをコードする遺伝子のプロモーター、U3snRNAをコードする遺伝子のプロモーター、7SL RNAをコードする遺伝子のプロモーターより選択される3型POLIIIプロモーター、
より好ましくは、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7または配列番号8のヌクレオチド配列より選択されるプロモーターのヌクレオチド配列を含むプロモーター;
ii)転写された際にはRNA分子をもたらすDNA断片、ただし、該RNA分子は以下のセンスおよびアンチセンスヌクレオチド配列を含むものであること、
(1) 植物細胞中で目的遺伝子から転写されたRNAに由来する約19個連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列に対して約90〜約100%の配列同一性を有する約19個連続したヌクレオチドを含むセンスヌクレオチド配列、
(2) 該センス配列の約19個連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列の相補体に対して約90〜100%の配列同一性を有する約19個連続したヌクレオチドを含むアンチセンスヌクレオチド配列、
ここで、センスおよびアンチセンスヌクレオチド配列は、約19〜約200ヌクレオチド長の二本鎖RNAを形成できるものであること、
iii)少なくとも4個連続したT残基を含むオリゴdTストレッチ。
本発明は、RNAポリメラーゼIIIにより認識される3型プロモーターの制御下にある短いdsRNA分子(好ましくは約20塩基対(bp)から約100bpの範囲)をコードするキメラ遺伝子が、強力な構成的RNAポリメラーゼIIプロモーターCaMV 35Sにより駆動される同様の構築物よりも効率のよい遺伝子サイレンシングをもたらした、という観察に基づいている。
(a)植物細胞に対してキメラ遺伝子を供給すること、ただし、該キメラ遺伝子は機能しうるように連結された以下のDNA断片を含むものであること、
i) 植物細胞のDNA依存性RNAポリメラーゼIIIによって認識されるプロモーターであって、該DNA依存性RNAポリメラーゼIIIと相互作用する全てのシス作用プロモーターエレメントを含むIII型のプロモーターであることを特徴とするプロモーター、
ii)転写された際にはRNA分子をもたらすDNA断片、ただし、該RNA分子は以下のセンスおよびアンチセンスヌクレオチド配列を含むものであること、
(1) 目的遺伝子から転写されたRNAに由来する約19個連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列に対して約90〜約100%の配列同一性を有する約19個連続したヌクレオチドを含むセンスヌクレオチド配列、
(2) 該センス配列の約19個連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列の相補体に対して約90〜100%の配列同一性を有する約19個連続したヌクレオチドを含むアンチセンスヌクレオチド配列、
ここで、センスおよびアンチセンスヌクレオチド配列は、約19〜約200ヌクレオチド長の二本鎖RNAを形成できるものであること、
iii)少なくとも4個連続したT残基を含むオリゴdTストレッチ、
(b)該キメラ遺伝子を含まない植物細胞中での前記目的遺伝子の発現と比較したときに、前記目的遺伝子の発現が減少している植物細胞を同定すること。
配列番号1: シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)変種Landsberg erectaの7SL-2遺伝子のプロモーターの配列、それに続くユニーク制限酵素認識部位、その後のオリゴdTストレッチ。
3型Pol IIIプロモーターは、シロイヌナズナ、イネもしくはトマトの7SL、U3snRNAもしくはU6snRNA遺伝子からPCR増幅を用いて単離した。そのPCR増幅は以下のように設計した:
a)得られる断片が、増幅された断片中には存在しない制限酵素認識部位によって挟まれており、
b)プロモーター断片の後にユニーク制限酵素認識部位(SalI、XhoIまたはPvuI)が続き、その後に、
c)Pol IIIターミネーターとしてポリ(T)配列(7〜9個のT残基を有する)が続く。
これらのPolIIIプロモーターをサイレンシングについて調べるために、GUS逆方向反復配列(配列番号9)を合成したが、これは、GUSの186bpセンス配列(GUSコード配列のヌクレオチド690-875)を、その3’末端で、該186bp断片の最初の94bpのアンチセンス配列(GUSコード配列のヌクレオチド690-783)と融合させたものから成る。このi/r(inverted-repeat;逆方向反復)配列は、2つのSalIサイトおよび2つのPvuIサイトによって挟まれており、従ってSalIもしくはPvuI断片としてPolIIIプロモーターベクター中にクローニングすることができる。i/r GUS配列(GUShp94)を用いて、表1中に記載された全てのPolIIIプロモーターを含む構築物を作製した(表2参照)。GUShp94配列に加えて、GUShp41a(9bpの非GUS配列により隔てられたステム中の41bp;配列番号10)およびGUShp21(6bpの非GUS配列により隔てられたステム中の21bp;配列番号11)のような、より小さなi/r GUS配列を用いて、AtU3B+136プロモーター(配列番号4)およびCaMV35Sプロモーターを含む構築物も作製した(表2)。
実施例2と同様の構築物を作製し、pWBVec4aにクローニングし(表4参照)、CaMV35S-GUS遺伝子を発現するトランスジェニックシロイヌナズナ系統を形質転換するのに用いた。
構築物pMBW479、pMBW481、pMBW485、pMBW486およびpLMW62(表4参照)を、Ubil-GUS-nos遺伝子を発現するイネに超迅速形質転換した。GUS染色は、pMBW485(OsU3-GUShp94)およびpMBW479(35S-GUShp94)のみが、内在するGUS遺伝子に対して顕著なサイレンシングをもたらしたことを示した。これらの結果は、双子葉植物3型PolIIIプロモーターが単子葉植物では機能していないことを示している。
シロイヌナズナU6-26構築物は、-446から+3bpまでのプロモーター(配列番号5)およびPCRによって付加された追加の配列を含み、断片の両端にXhoIサイトが形成される。これらをpGEM由来のプラスミドのSalIサイトにPCR産物をクローニングするのに用いた。NotIでインサートを切り出し、植物形質転換用のpART27バイナリーベクターに挿入した。また、このPCRは、オリゴヌクレオチド配列の挿入のためのSalIサイトをプロモーターと終止配列(T8)の間に組み込んだ。
1. 3型Pol IIIプロモーターは植物細胞中でdsRNA分子の発現を効果的に駆動するのに用いることができる;
2. At U6プロモーターは、試験したうちでは最も有効なプロモーターであるようである;
3. 単子葉植物PolIIIプロモーターは単子葉植物と双子葉植物の両者において機能的だが、双子葉植物プロモーターは単子葉植物において機能的でないようである;
4. III型Pol IIIプロモーターは、比較的短いヘアピン配列を用いた遺伝子サイレンシングに関してはCaMV35Sプロモーターよりも有効であるようである。
図1に概略を示したクローニング戦略を用いることにより、20の新しい小ヘアピン構築物(表8にまとめてある)を作製した。これら構築物の全てに由来する推定上の小hpRNAは、42bpのdsRNAステム(標的遺伝子配列に対応する)および9-ntループ(非標的配列)を含む。EIN2(配列番号31〜33に表してある)またはGUS(配列番号28〜30に表してある)の異なる領域に対応する3つの標的配列を選択した。これらの構築物を用いてタバコを形質転換し、対応する内在性(EIN2)またはレポーター(GUS)遺伝子のサイレンシングを誘導するそれらの効力を評価した。
1)小GUSヘアピン構築物のほとんどは良好なGUSサイレンシングをもたらした;
2)PolIIIプロモーター駆動構築物pLMW164およびpLMW165は、35Sプロモーター駆動構築物pLMW155よりも安定したGUSサイレンシングをもたらした。
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Claims (12)
- 植物細胞中での目的遺伝子の発現を減少させるための方法であって、以下のステップ:
(a)前記植物細胞に対してキメラ遺伝子を供給すること、ただし、該キメラ遺伝子は機能しうるように連結された以下のDNA断片を含むものであること、
i) 前記植物細胞のDNA依存性RNAポリメラーゼIIIによって認識されるプロモーターであって、該DNA依存性RNAポリメラーゼIIIと相互作用する全てのシス作用プロモーターエレメントを含むIII型のプロモーターであることを特徴とするプロモーター、
ii)転写された際にはRNA分子をもたらすDNA断片、ただし、該RNA分子は以下のセンスおよびアンチセンスヌクレオチド配列を含むものであること、
(1) 前記目的遺伝子から転写されたRNAに由来する19個連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列に対して90〜100%の配列同一性を有する19個連続したヌクレオチドを含むセンスヌクレオチド配列、
(2) 該センス配列の19個連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列の相補体に対して90〜100%の配列同一性を有する19個連続したヌクレオチドを含むアンチセンスヌクレオチド配列、
ここで、センスおよびアンチセンスヌクレオチド配列は、19〜200ヌクレオチド長の二本鎖RNAを形成できるものであること、
iii)少なくとも4個連続したT残基を含むオリゴdTストレッチ、
(b)該キメラ遺伝子を含まない植物細胞中での前記目的遺伝子の発現と比較したときに、前記目的遺伝子の発現が減少している植物細胞を同定すること、
を含む、前記方法。 - 前記プロモーターが、U6snRNAをコードする植物遺伝子のプロモーター、U3snRNAをコードする植物遺伝子のプロモーター、または7SL RNAをコードする植物遺伝子のプロモーターから選択される3型POLIIIプロモーターである、請求項1に記載の方法。
- 前記プロモーターが、
配列番号1の7位のヌクレオチドから322位のヌクレオチドまで、
配列番号2の7位のヌクレオチドから408位のヌクレオチドまで、
配列番号3の7位のヌクレオチドから313位のヌクレオチドまで、
配列番号4の7位のヌクレオチドから446位のヌクレオチドまで、
配列番号5の7位のヌクレオチドから436位のヌクレオチドまで、
配列番号6の7位のヌクレオチドから468位のヌクレオチドまで、
配列番号7の7位のヌクレオチドから384位のヌクレオチドまで、および
配列番号8の7位のヌクレオチドから421位のヌクレオチドまで、
のヌクレオチド配列より選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項1または2に記載の方法。 - 前記植物細胞が双子葉植物細胞であり、前記プロモーターが双子葉もしくは単子葉の植物または植物細胞に由来するものである、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記植物細胞が単子葉植物細胞であり、前記プロモーターが単子葉植物もしくは植物細胞に由来するものである、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記プロモーターが、前記植物細胞にとって内在性のものである、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記目的遺伝子がトランスジーンである、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記目的遺伝子が内在性遺伝子である、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記植物細胞が植物内に含まれる、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1〜9のいずれか1項に記載のキメラ遺伝子。
- 請求項10に記載のキメラ遺伝子を含む植物細胞。
- 請求項10に記載のキメラ遺伝子をその植物細胞中に含む植物。
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