CN106222197A - 植物基因组定点修饰方法 - Google Patents

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朱健康
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张波涛
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Abstract

本发明提供了植物基因组定点修饰方法。具体地，本发明提供了一种RNA引导的植物基因组定点修饰方法。通过使用特定结构的核酸构建物，本发明方法可在预定的植物基因组位点，高效地进行定点修饰。本发明方法有助于高效地筛选具有改良性状的植物。

Description

植物基因组定点修饰方法
本申请是申请日为2014年7月14日、申请号为201410334460.8、发明名称为“植物基因组定点修饰方法”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及RNA引导的植物基因组定点修饰方法。
背景技术
过去十多年里，序列特异性核酸酶的发明和改进已经在创建定点突变方面展现出了强大威力。锌指核酸酶(Zinc finger nucleases，ZFNs)和类转录激活因子效应物核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease，TALENs)即是其中的主要代表(Carroll et al.,2006；Christian et al.,2010)。它们是识别一段特定核酸序列的结合结构域阵列与一种非特异性核酸酶Fok1组成的融合蛋白。这些蛋白切割核酸序列产生双链断裂以后，生物体会通过非同源末端连接或者同源重组两种机制进行修复，从而引入定点改变或修饰。上述技术已经在多个物种里获得成功应用，包括线虫，人细胞，老鼠，斑马鱼，玉米，水稻，短柄草等(Beumer et al.,2006；Meng et al.,2008；Shukla et al.,2009；Meyer et al.,2010；Cui et al.,2011；Mahfouz et al.,2011；Li et al.,2012；Meyer etal.,2012；Shan et al.,2013；Weinthal et al.,2013)。然而，这些技术的最大缺陷是通过蛋白元件来识别特定核酸序列，构建比较麻烦，识别特异性有待提高。
2012年人们发现并改进了一种突破性的新技术，CRISPR/Cas。CRISPR(clusteredregulatory interspaced short palindromic repeats)，是一段被一种短重复序列分隔的核酸序列，它们转录形成的CRISPR RNA(crRNAs)与另一种反式作用型crRNA(trans-activating crRNA，tracrRNA)部分区域配对形成二元复合体。然后，该二元复合体一起引导具有非特异核酸酶活性的Cas蛋白，切割与crRNAs匹配的DNA序列，从而形成双链断裂。
此外，人们进一步将crRNAs与tracrRNA融合在一起，形成单一的chimeric RNA(chiRNA)分子，并发现chiRNA同样能介导Cas9蛋白切割目的序列(Jinek et al.,2012)。这种可编辑型CRISPR/Cas系统很快在多个物种里面取得成功应用，包括人细胞系，斑马鱼，大肠杆菌和老鼠等(Jinek et al.,2012；Hwang et al.,2013；Jiang et al.,2013；Jinek etal.,2013；Mali et al.,2013；Shen et al.,2013；Wang et al.,2013)。这项技术的最大优势是构建简易，而且可以同时对多个目标位点基因修饰。对于动物，可将chiRNA和Cas9的体外转录产物直接施用(如通过注射)于动物，从而引起基因突变。在老鼠中，已有同时对多达5个目标位点基因突变的成功报道。然而，由于种种未知的原因，目前尚未在植物中成功开发和应用类似的技术。
综上所述，为了植物基因工程的需要，本领域迫切需要开发简便高效的植物基因组的定点修饰方法。
发明内容
本发明的目的就是简便高效的植物基因组的定点修饰方法。
本发明的另一目的是提供适用于植物的CRISPR/Cas技术，并在稳定植株中实现特异DNA序列的切割。
在本发明的第一方面，提供了一种植物基因组定点修饰方法，包括步骤：
(a)将一表达嵌合RNA和Cas蛋白的核酸构建物导入植物细胞，获得转化的植物细胞，其中所述嵌合RNA是由特异性识别待定点修饰(或待切割位点)的CRISPR RNA(crRNAs)和反式作用型crRNA(trans-activating crRNA，tracrRNA)所构成的嵌合体(chimera)；和
(b)在合适的条件下，使转化的植物细胞中的所述核酸构建物转录形成嵌合RNA(chiRNA)，并且使所述转化的植物细胞表达所述的Cas蛋白，从而使得在所述嵌合RNA的引导下，在所述转化的植物细胞中，通过所述Cas蛋白对基因组DNA进行定点切割，从而进行基因组定点修饰。
在另一优选例中，所述的定点修饰包括定点随机修饰和定点非随机修饰(定点精确修饰)。
在另一优选例中，在嵌合RNA和Cas蛋白对基因组DNA进行定点切割之前，向植物细胞中导入供体DNA，从而进行基因组定点精确修饰，所述供体DNA为单链或双链DNA，并包含待插入或待替换的DNA序列，所述DNA序列可以为单个核苷酸、或多个核苷酸(包括DNA片段或者编码基因)。
在另一优选例中，所述核酸构建物包括第一亚核酸构建物和第二亚核酸构建物，其中第一亚核酸构建物和第二亚核酸构建物是相互独立的，或是一体的；
其中，第一亚核酸构建物包括从5'至3'的以下元件：
第一植物启动子；
与所述第一植物启动子操作性相连的嵌合RNA的编码序列，所述嵌合RNA的编码序列的结构如式I所示：
A-B (I)
式中，
A为编码CRISPR RNA(crRNAs)的DNA序列；
B为编码反式作用型crRNA(trans-activating crRNA，tracrRNA)的DNA序列；
“-”表示A和B之间的连接键或连接序列；其中，由所述嵌合RNA的编码序列转录形成一个完整的RNA分子，即嵌合RNA(chiRNA)；和
RNA转录终止子；
第二亚核酸构建物包括5'至3'的以下元件:
第二植物启动子；
与所述第二植物启动子操作性相连的Cas蛋白的编码序列，并且所述Cas蛋白 的是N端、C端或两侧与核定位序列(NLS序列)融合的融合蛋白；和
植物转录终止子。
在另一优选例中，所述第一亚核酸构建物的数量为一个或者多个(针对多个待切割位点)，并与第二亚核酸构建物是相互独立的，或是一体的。
在另一优选例中，各第一亚核酸构建物与第二亚核酸构建物的相对位置是任意的。
在另一优选例中，所述的第二植物启动子和与所述所述Cas蛋白的编码序列之间5'至3'还操作性相连有：
第三亚核酸构建物，较佳地，所述的第三亚核酸构建物为来源于番茄矮壮病毒(TBSV)的p19蛋白编码序列；和
自剪切序列，较佳地，所述的自剪切序列为2A多肽编码序列(SEQ ID NO.:98)。
在另一优选例中，所述的p19蛋白编码序列包括p19基因的全长序列或cDNA序列。
在另一优选例中，所述的2A多肽序列如SEQ ID NO.:99所示
在另一优选例中，所述的p19蛋白编码序列如SEQ ID NO.:100所示。
在另一优选例中，所述的p19蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.:101所示。
在另一优选例中，所述定点修饰包括：
(i)在没有供体DNA的情况下，对植物基因组特定位点进行随机插入和缺失；和
(ii)在存在供体DNA的情况下，以供体DNA为模板，对植物基因组特定位点进行精确插入、缺失或者替换DNA序列；
较佳地，所述定点修饰包括对植物基因组的基因敲除，基因敲入(转基因)以及调控(上调或下调)內源基因的表达水平。
在另一优选例中，所述的RNA转录终止子为U6转录终止子,为至少连续的7个T(TTTTTTT)。
在另一优选例中，第一植物启动子为来自于待改造植物的内源启动子。
在另一优选例中，第一植物启动子为来自于待改造植物的RNA聚合酶III依赖的启动子。
在另一优选例中，所述RNA聚合酶III依赖的启动子包括AtU6-26、OsU6-2、AtU6-1、AtU3-B、At7SL或其组合。
在另一优选例中，所述的植物转录终止子为Nos。
在另一优选例中，所述的第二植物启动子为RNA聚合酶II依赖的启动子，较佳地，包括组成型表达的启动子或拟南芥生殖细胞特异性表达的sporocyteless(SPL)启动子。
在另一优选例中，所述第二亚核酸构建物中，在所述Cas蛋白的编码序列后，自5'至3'还依次操作性连接有SPL基因的表达框架。
在另一优选例中，所述的SPL基因表达框架包括SPL基因的内含子、外显子、非翻译区、和终止子。
在另一优选例中，所述的SPL基因表达框架自5'至3'依次操作性连接有一个或多个选自SEQ ID NO.:103(内含子1)、104(外显子2)、105(内含子2)、106(外显子3)、107(3'非翻译区)、108(终止子)所示的序列。
在另一优选例中，所述的第二亚核酸构建物中的植物转录终止子序列如SEQ IDNO.:108所示。
在另一优选例中，所述的核酸构建物是一个同时表达嵌合RNA和Cas蛋白的质粒。
在另一优选例中，所述的植物包括单子叶植物、双子叶植物和裸子植物；
较佳地，所述的植物包括林业植物、农用植物、经济作物、观赏植物。
在另一优选例中，所述的植物包括以下科的植物：十字花科、禾本科。
在另一优选例中，所述的植物包括但不限于拟南芥、水稻、小麦、大麦、玉米、高粱、燕麦、黑麦、甘蔗、油菜、白菜、棉花、大豆、苜蓿、烟草、番茄、辣椒、南瓜、西瓜、黄瓜、苹果，桃、李、海棠、甜菜、向日葵、莴苣、莴笋、青蒿、菊芋、甜叶菊、杨树、柳树、桉树、丁子香、橡胶树、木薯、蓖麻、花生、豌豆、黄芪、烟草，番茄，辣椒等。
在另一优选例中，所述的cas蛋白包括cas9蛋白。
在另一优选例中，所述的第二植物启动子为RNA聚合酶II依赖的启动子。
在另一优选例中，所述的RNA聚合酶II依赖的启动子包括组成型启动子和拟南芥生殖细胞特异性表达的sporocyteless(SPL)启动子。
在另一优选例中，所述的第一植物启动子包括AtU6-26、OsU6-2、AtU6-1、AtU3-B、At7SL或其组合。
在另一优选例中，所述的第二植物启动子包括35s、UBQ、SPL启动子或其组合。
在另一优选例中，所述方法还包括：在步骤(b)之前或之后，将所述的转化的植物细胞再生成植株。
在另一优选例中，所述方法还包括：检测所述转化的植物细胞中基因组的突变或修饰情况。
在另一优选例中，所述植物细胞包括来自培养物、愈伤组织、或植株的植物细胞。
在本发明的第二方面，提供了一种用于植物基因组定点修饰的核酸构建物，所述核酸构建物包括第一亚核酸构建物和第二亚核酸构建物，其中第一亚核酸构建物和第二亚核酸构建物是相互独立的，或是一体的；
其中，第一亚核酸构建物包括从5'至3'的以下元件：
第一植物启动子；
与所述第一植物启动子操作性相连的嵌合RNA的编码序列，所述嵌合RNA的编码序列的结构如式I所示：
A-B (I)
式中，
A为编码CRISPR RNA(crRNAs)的DNA序列；
B为编码反式作用型crRNA(trans-activating crRNA，tracrRNA)的DNA序列；
“-”表示A和B之间的连接键或连接序列；其中，由所述嵌合RNA的编码序列转录形成一个完整的RNA分子，即嵌合RNA(chiRNA)；和
RNA转录终止子；
第二亚核酸构建物包括5'至3'的以下元件:
第二植物启动子；
与所述第二植物启动子操作性相连的Cas蛋白的编码序列，并且所述Cas蛋白 的是N端、C端或两侧与核定位序列(NLS序列)融合的融合蛋白；和
植物转录终止子。
在另一优选例中，所述的第二植物启动子和与所述所述Cas蛋白的编码序列之间5'至3'还操作性相连有：
第三亚核酸构建物，较佳地，所述的第三亚核酸构建物为来源于番茄矮壮病毒(TBSV)的p19蛋白编码序列；和
2A序列。
在另一优选例中，所述的p19蛋白编码序列包括p19基因的全长序列或cDNA序列。
在另一优选例中，所述的p19蛋白编码序列如SEQ ID NO.:98所示。
在另一优选例中，所述的RNA转录终止子为U6转录终止子,为至少连续的7个T(TTTTTTT)。
在另一优选例中，所述的植物转录终止子为Nos。
在另一优选例中，所述的核酸构建物为DNA构建物。
在另一优选例中，所述的第一亚核酸构建物和第二亚核酸构建物是一体的。
在另一优选例中，所述的第一亚核酸构建物的数量为一个或者多个(针对多个待切割位点)。
在另一优选例中，第一亚核酸构建物和第二亚核酸构建物位于同一个质粒中。
在另一优选例中，第一亚核酸构建物位于第二亚核酸构建物的上游或下游。
在另一优选例中，所述的第一植物启动子和/或第二植物启动子是组成型或诱导型启动子。
在另一优选例中，所述的Cas蛋白的编码序列还包括位于ORF两侧的NLS序列。
在另一优选例中，所述第二亚核酸构建物还包括：位于Cas蛋白编码序列下游的Nos终止子。
在另一优选例中，所述的Cas蛋白还带有标签序列。
在另一优选例中，所述第二亚核酸构建物还包括：位于第二植物启动子与位于Cas蛋白编码序列之间的标签序列(如3×Flag序列)。
在另一优选例中，位于N端的NLS序列位于所述的标签序列的下游。
在本发明的第三方面，提供了一种载体，所述载体携带本发明第二方面所述的核酸构建物；
本发明还提供一种载体组合，所述载体组合包括第一载体和第二载体，其中第一载体携带本发明第二方面所述的核酸构建物的第一亚核酸构建物，而第二载体携带本发明第二方面所述的核酸构建物的第二亚核酸构建物。
在另一优选例中，所述的第一亚核酸构建物的数量为一个或者多个。
在另一优选例中，所述的第一载体可以为一个或者多个，并携带一个或者多个本发明第二方面所述的核酸构建物的第一亚核酸构建物。
在本发明的第四方面，提供了一种基因工程的细胞，所述细胞含有本发明第三方面中所述的载体或载体组合。
在本发明的第五方面，提供了一种植物细胞，所述的植物细胞的基因组中整合有本发明第二方面所述的核酸构建物。
在本发明的第六方面，提供了一种制备植物的方法，包括步骤：将本发明第五方面所述的植物细胞再生成形成植株。
在本发明的第七方面，提供了一种植物，所述植物的植物细胞的基因组中整合有本发明第二方面所述的核酸构建物。
在本发明的第八方面，提供了一种植物，所述植物是第六方面所述的方法制备的。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示来自酿脓链球菌SF370的SpCas9可以在拟南芥原生质体中造成DNA的定点双链断裂。(A)SpCas9的表达由2×35S启动子驱动，而引导RNA(chiRNA)则由拟南芥中的AtU6-26启动子驱动。NLS，核定位序列；Flag，Flag标签序列；Nos，Nos终止子。(B)基于同源重组的YF-FP报告系统。图中显示了设计的chiRNA目标位点。PAM序列标记为紫红色，20个碱基的目的序列标记为蓝绿色。(C)YF-FP报告系统检测的CRISPR/Cas活性。YFP阳性细胞由流式细胞仪检测。
图2显示稳定转化载体和目的基因chiRNA设计位点示意图。(A)用于农杆菌介导稳定转化水稻和拟南芥的双元载体示意图，其同时带有chiRNA和Cas9表达框。SpCas9的表达由2×35S启动子驱动，拟南芥chiRNA由AtU6-26启动子驱动，水稻chiRNA为OsU6-2启动子驱动。(B)Cas9/chiRNA目标位点示意图。PAM序列标记为紫红色，chiRNA目标位点标记为蓝绿色。限制性内切酶位点由方框标注。用于RFLP检测的酶切位点用黑框标注。
图3显示SpCas9可以在拟南芥和水稻植株中多个基因位点进行DNA的定点切割。(A)和(B)BRI1位点1的代表性T1代转基因植株。左边显示的是生长正常的植株，右边的是显示与bri1突变体类似表型的植株。植株在MS培养基上筛选5天后移栽到培养土中生长1周(A)或3周(B)后拍照。(C)GAI位点1的代表性T1代转基因植株。左边显示的是生长正常的植株，右边的是显示与gai突变体类似表型的植株。植株在MS培养基上筛选5天后移栽到培养土中生长4周后拍照。(D)处于生根期的ROC5位点1的代表性T1转基因植株。(E)BRI1位点1的12株T1代转基因苗的限制性酶切分析。PCR产物由EcoRV进行酶切。M，DNA分子量标准。(F)ROC5位点1的14株T1代转基因苗的限制性酶切分析。PCR产物由AhdI进行酶切。M，DNA分子量标准。(G)和(H)从BRI1位点1(G)和ROC5位点1(H)的一株T1代转基因苗中检测到的目标位点区域突变代表类型。野生型对照序列在顶部，PAM序列标记为紫红色，目标位点标记为蓝绿色。红线表示缺失的碱基，红色字母表示插入或者突变的碱基。序列的完整变化情况标注在右侧，+表示插入，D表示缺失。(I)水稻和拟南芥的T1代转基因苗观察到表型和突变情况鉴定统计。标尺长度为1cm(A,B,C,D)。
图4显示在拟南芥中BRI1基因位点1上由工程化的chiRNA：Cas9诱导产生的靶向位点缺失突变。所示突变类型是来自于12个独立T1代转基因植株的基因组DNA 扩增并克隆到载体后进行测序得到。最上面显示的是野生型对照的序列，PAM序列标记为紫红色，目标位点标记为蓝绿色。红线表示缺失的碱基，红色字母表示插入或者突变的碱基。序列的完整变化情况标注在右侧，+表示插入，D表示缺失。值得注意的是有的序列既有插入又有缺失。98个克隆中检测到了75个突变。
图5显示在拟南芥中BRI1基因位点2上由工程化的chiRNA：Cas9诱导产生的靶向位点缺失突变。所示突变类型是来自于3个独立T1代转基因植株的基因组DNA扩增并克隆到载体后进行测序得到。野生型序列如顶部所示，PAM序列标记为紫红色，目标位点标记为蓝绿色。红线表示缺失的碱基，红色字母表示插入或者突变的碱基。序列的完整变化情况标注在右侧，+表示插入，D表示缺失。检测到的次数标记在括号中。71个克隆中检测到了28个突变。
图6显示在拟南芥中BRI1基因位点3上由工程化的chiRNA：Cas9诱导产生的靶向位点缺失突变。所示突变类型是来自于4个独立T1代转基因植株的基因组DNA扩增并克隆到载体后进行测序得到。野生型序列如顶部所示，PAM序列标记为紫红色，目标位点标记为蓝绿色。红线表示缺失的碱基，红色字母表示插入或者突变的碱基。序列的完整变化情况标注在右侧，+表示插入，D表示缺失。检测到的次数标记在括号中。34个克隆中检测到了22个突变。
图7显示在拟南芥中GAI基因位点1上由工程化的chiRNA：Cas9诱导产生的靶向位点缺失突变。所示突变类型是来自于3个独立T1代转基因植株的基因组DNA扩增并克隆到载体后进行测序得到。野生型序列如顶部所示，PAM序列标记为紫红色，目标位点标记为蓝绿色。红线表示缺失的碱基，红色字母表示插入或者突变的碱基。序列的完整变化情况标注在右侧，+表示插入，D表示缺失。检测到的次数标记在括号中。53个克隆中检测到了17个突变。
图8显示在水稻中ROC5基因位点1上由工程化的chiRNA：Cas9诱导产生的靶向位点缺失突变。所示突变类型是来自于5个独立T1代转基因植株的基因组DNA扩增并克隆到载体后进行测序得到。野生型序列如顶部所示，PAM序列标记为紫红色，目标位点标记为蓝绿色。红线表示缺失的碱基，红色字母表示插入或者突变的碱基。序列的完整变化情况标注在右侧，+表示插入，D表示缺失。检测到的次数标记在括号中。165个克隆中检测到了136个突变。
图9显示了Pa7-YFP的载体图谱。
图10显示了AtU6-26chiRNA序列(未插入目的位点识别序列SEQ ID NO.:1)。其中，灰色标注的为AtU6-26启动子，下划线标注的为插入目的位点oligo的两个BbsI酶切位点，方框标注的为与目的位点融合的反式作用型crRNA区域。
图11显示了AtU6-26chiRNA序列(已插入目的位点识别序列SEQ ID NO.:2)。
图12显示了OsU6-2chiRNA序列(未插入目的位点识别序列SEQ ID NO.:3)：其中，灰色标注的为OsU6-2启动子，下划线标注的为插入目的位点oligo的两个BbsI酶切位点，方框标注的为与目的位点融合的反式作用型crRNA区域。
图13显示了OsU6-2chiRNA序列(已插入目的位点识别序列SEQ ID NO.:4)。
图14显示了2×35S-Cas9-Nos序列(SEQ ID NO.:39)。
图15A-B显示了CRISPR-Cas同时在T1代拟南芥转基因植株中同时造成CHLI1和CHLI2基因定点突变。所示突变类型是来自于3个独立T1代转基因植株的基因组DNA扩增并克隆到载体后进行测序得到。最上面显示的是野生型对照的序列，目标位点用下划线标记。序列的完整变化情况标注在右侧，+表示插入，-表示缺失。
图16显示了CRISPR-Cas在T1代拟南芥转基因植株中同时造成TT4基因内两个位点的定点突变及位点之间大片度序列缺失。所示突变类型是来自于11个独立T1代转基因植株的基因组DNA扩增并克隆到载体后进行测序得到。最上面显示的是野生型对照的序列，目标位点用下划线标记。两个目的位点的序列完整变化情况及检测到的比例标注在右侧，用“；”分隔，+表示插入，-表示缺失。
图17显示了植物基因打靶载体构建示意图。pSPL-Cas9-sgR:生殖系特异表达的植物基因打靶载体。pUBQ-Cas9-sgR:组成型表达的植物基因打靶载体。pAtU6:拟南芥U6基因的启动子；sgRNA:单链引导RNA；pAtSPL:拟南芥SPL基因的启动子；pAtUBQ:拟南芥UBQ基因的启动子；HspCas9：人源化的链霉菌Cas9基因；SPL intron:SPL基因的内含子；SPL exon:SPL基因的外显子；tSPL:SPL基因的终止子；tUBQ:UBQ基因的终止子。
图18显示了Cas9基因的原位杂交。A,B,C:pSPL-Cas9-sgR的T1代转基因植物；D,E,F:pUBQ-Cas9-sgR的T1代转基因植物。A,D:花药发育的V期；B,E:花药发育的VII期；C,F:胚珠发育的II期。标尺＝20μM。
图19显示了生殖系专一性基因打靶系统的效率统计。A:测序结果比对发现，pSPL-Cas9-sgR-AP1-27/194的T1代转基因植物没有检测到突变，但在相应的T2代植物中却可以检测到突变。B:组成型基因敲除系统和生殖细胞专一性基因敲除系统在不同组织和不同世代中敲除效率的比较。
图20显示了不同植物打靶系统T2代转化子的突变类型统计。对于转化不同的载体构建的T2代群体，随机选取8个发生突变的株系，分别检测12个单株用于突变类型的统计。
图21显示了高效植物基因打靶载体示意图。A:常规拟南芥基因打靶载体psgR-Cas9。B:共表达植物转录后基因沉默抑制蛋白的基因打靶载体psgR-Cas9-p19。pAtU6:拟南芥U6基因启动子；sgRNA:单链引导RNA；pUBQ:拟南芥UBQ基因启动子；hSpCas9:人源化的链霉菌Cas9基因；tUBQ:拟南芥UBQ基因的终止子；TBSV-p19:番茄矮壮病毒(TBSV)的p19蛋白编码基因；2A肽:蛋白顺式切割元件；BbsI:BbsI内切酶识别位点。
图22显示了利用原生质体瞬时表达系统，检测p19共表达载体的基因打靶效率。A:p19的作用机制以及检测原理示意图。p19蛋白在植物细胞中以二聚体形式存在，可以起到抑制sgRNA的降解，提高sgRNA与Cas9的结合活性的功能。sgRNA-Cas9复合体能够结合YFFP报道基因上的识别序列并剪切，产生双链DNA的断裂(DSB)。部分重复的YFP序列会发生单链退火，从而被DNA损伤修复系统切除并修复正确。B:YFFP瞬时表达系统地荧光检测。a,c,e,g,I,k:YFP荧光通道下的阳性细胞信号。b,d,f,h,j,l:RFP荧光通道下的叶绿体自发荧光信号。左下方的数值代表YFP阳性细胞在整个细胞群体中所占的比例。
图23显示了sgR-Cas9-p19转基因植物的基因表达分析。A:在sgR-Cas9-p19的 转基因群体中出现三种不同程度的发育表型：1/-:叶片平展，2/+:叶片卷曲，3/++:叶片锯齿。B:Northern结果表明，在叶片出现锯齿的转基因植物总，sgRNA和miRNAme168的表达水平都有明显的提高。C,D:Realtime PCR的结果显示，叶发育表型与p19的表达水平正相关，但是Cas9基因的表达量相对稳定。
图24显示了sgR-Cas9-p19转基因T1代植物的表型分析。在sgR-Cas9-p19-AP1和sgR-Cas9-p19-TT4这两个转基因群体中，根据叶发育表型的严重程度，共分为三类，没有表型(p19/-)，叶卷曲(p19/+)和叶锯齿(p19/++)。同时根据靶基因突变的程度，也分为三类，野生型(WT)，嵌合体(chimera)和突变体(mutant)。分类统计相应的植株数目，计入表格。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，采用特定结构的核酸构建物，从而首次在植物中成功实现了RNA引导的基因组定点修饰。本发明方法不仅可进行定点切割和修饰，而且可以在特定位点高效引入各种不同类型的突变，从而有利于筛选具有经改造的新植物，而采用了生殖细胞中特异性表达的启动子还能提高从子代中的获得基因定点修饰植物的比例，此外，本发明人还发现，当本发明核酸构建物中引入特定的序列后，能够有效地改善植物打靶的效率并影响植物的发育表型。在此基础上完成了本发明。
实验表明，本发明特别适用于植物，可在稳定植株中对基因组实现特异的定点DNA序列的切割和基因修饰。
定义
如本文所用，术语“crRNA”指负责识别目标位点的CRISPR RNA。
如本文所用，术语“tracrRNA”指与crRNA配对的反式激活crRNA。
如本文所用，术语“植物启动子”指能够在植物细胞中启动核酸转录的核酸序列。该植物启动子可以是来源于植物、微生物(如细菌、病毒)或动物等，或者是人工合成或改造过的启动子。
如本文所用，术语“植物转录终止子”指能够在植物细胞中可使转录停止的终止子。该植物转录终止子可以是来源于植物、微生物(如细菌、病毒)或动物等，或者是人工合成或改造过的终止子。代表性的例子包括(但并不限于)：Nos终止子。
如本文所用，术语“Cas蛋白”指一种核酸酶。一种优选的Cas蛋白是Cas9蛋白。典型的Cas9蛋白包括(但并不限于)：来源于酿脓链球菌SF370的Cas9。
如本文所用，术语“Cas蛋白的编码序列”指编码具有切割活性的Cas蛋白的核苷酸序列。在插入的多聚核苷酸序列被转录和翻译从而产生功能性Cas蛋白的情况下，技术人员会认识到，因为密码子的简并性，有大量多聚核苷酸序列可以编码相同的多肽。另外，技术人员也会认识到不同物种对于密码子具有一定的偏好性，可能会根据在不同物种中表达的需要，会对Cas蛋白的密码子进行优化，这些变异体都被术语“Cas蛋白的编码序列”所具体涵盖。此外，术语特定地包括了全长的、与Cas基因序列基本相同的序列，以及编码出保留Das蛋白功能的蛋白质的序列。
如本文所用，术语“植物”包括全植株、植物器官(如叶、茎、根等)、种子和植物细胞以及它们的子代。可用于本发明方法的植物的种类没有特别限制，一般包括任何可进行转化技术的高等植物类型，包括单子叶、双子叶植物和裸子植物。
如本文所用，术语“异源序列”是来自不同种的序列，或者如果来自同一种则是对其最初形式经过充分修饰的序列。例如，可操作地连于启动子的异源结构基因可以是来自不同于获得该结构基因的种，或者，如果来自同一种，则其中之一或两者都对它们的最初形式进行了充分的修饰。
如本文所用，“可操作地连于”或“操作性相连”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。
如本文所用，术语“2A多肽编码序列”、“自剪切序列”、“2A序列”指的是是发现于病毒中的一段不依赖于蛋白酶的自剪切氨基酸序列，类似于IRES，利用2A可以实现单一启动子同时表达两个基因。它也广泛存在于各类真核细胞。与IRES不同的是，下游蛋白表达量不会减少。但剪切后2A多肽残基与上游蛋白连为一体，可在上游蛋白和2A多肽间加入一种Furin蛋白酶剪切点(4个碱性氨基酸残基，如Arg-Lys-Arg-Arg)以从上游蛋白末端完全切除2A多肽残基。
如本文所用，术语“嵌合RNA(chiRNA)”、“单链引导RNA(sgRNA)”可互换使用，均指由具有式I所示结构编码序列的并能够转录形成一个完整的RNA分子的RNA序列。
核酸构建物
本发明提供了一种核酸构建物，所述核酸构建物包括第一亚核酸构建物和第二亚核酸构建物，其中第一亚核酸构建物和第二亚核酸构建物是相互独立的，或一体的；
其中，第一亚核酸构建物包括从5'至3'的以下元件：
第一植物启动子；
与所述第一植物启动子操作性相连的嵌合RNA的编码序列，所述嵌合RNA的编码序列的结构如式I所示：
A-B (I)
式中，
A为编码CRISPR RNA(crRNAs)的DNA序列；
B为编码反式作用型crRNA(trans-activating crRNA，tracrRNA)的DNA序列；
“-”表示A和B之间的连接键或连接序列；其中，由所述嵌合RNA的编码序列转录形成一个完整的RNA分子，即嵌合RNA(chiRNA)；和
RNA转录终止子(包括但并不限于：U6转录终止子,为至少连续的7个T)；
第二亚核酸构建物包括5'至3'的以下元件:
第二植物启动子；
与所述第二植物启动子操作性相连的Cas蛋白的编码序列，并且所述Cas蛋白的是N端、C端或两侧与核定位序列(NLS序列)融合的融合蛋白；
植物转录终止子(包括但并不限于Nos等终止子)。
在本发明中，第一植物启动子和第二植物启动子的强度分别能够启动产生有效量的chiRNA和Cas蛋白，以实现对植物基因组的定点修饰。
应理解，在本发明中，第一亚核酸构建物和第二亚核酸构建物可以位于同一或不同的多核苷酸上，也可以位于同一或不同的载体上。
将本发明构建好的上述核酸构建物，通过常规的植物重组技术(例如农杆菌转让技术)，可以导入植物细胞，从而获得携带所述核酸构建物(或带有所述核酸构建物的载体)的植物细胞，或获得基因组中整合有所述核酸构建物的植物细胞。
在所述植物细胞中，本发明核酸构建物所转录形成的chiRNA以及所表达形成Cas蛋白，可以配合对基因组进行定点切割，进而引入各种不同的突变。
此外，为了获得更多含有突变基因的种子，并进一步提高CRISPR/Cas9系统在生殖细胞中的活性，减小基因打靶技术对植物发育过程可能产生的不良影响，本发明采用了拟南芥SPOROCYTELESS(SPL)基因的表达框架来驱动Cas9基因的表达。
SPL基因在拟南芥的生殖细胞系，包括大孢子母细胞和小孢子母细胞中都有特异的表达。原位杂交实验的结果表明，SPL基因的表达框架能有效地启动Cas9在生殖细胞系中的转录。同时，突变体检测的结果也证明，由SPL启动子驱动的Cas9表达系统，并不影响T1代转基因植物的基因功能和生长发育，但在T2代的转基因群体中却可以获得大量靶向基因发生突变的杂合子，这说明目的基因的突变是在生殖细胞中发生的。
为了进一步提高sgRNA在植物中的稳定性，以及CRISPR/Cas9系统的基因打靶效率，构建了TBSV-p19蛋白与Cas9蛋白共表达的基因打靶载体psgR-Cas9-p19。通过在拟南芥的瞬时表达系统中检测重组正确的YFFP基因的蛋白活性，实验证明，p19蛋白可以显著提高CRISPR/Cas9系统的基因打靶效率。
此外，同时构建了以拟南芥内源基因为靶点的p19共表达载体，在得到的T1代植物中，约1/3出现了明显的叶发育表型，提示p19对受miRNA调控的植物发育过程有抑制作用。Northern检测及基因表达定量分析的结果表明，p19蛋白的表达水平与miR168和sgRNA的累积量呈正相关性。同时，对靶向位点的表型和基因型分析也说明，p19表达量高的转基因植物，靶基因发生突变的概率也更高，这为进一步改进基于CRISPR/Cas9的植物基因打靶系统提供了重要的依据和手段。
定点切割的方法
本发明还提供了一种对植物的基因组进行定点切割或定点修饰的方法。
(a)将表达嵌合RNA和表达Cas蛋白的核酸构建物导入植物细胞，获得转化的植物细胞；和
(b)在合适的条件下，使转化的植物细胞中的所述核酸构建物转录形成嵌合RNA(chiRNA)，并且使所述转化的植物细胞表达所述的Cas蛋白，从而使得在所述嵌合 RNA的引导下，在所述转化的植物细胞中通过所述Cas蛋白进行基因组定点切割，从而进行基因组定点修饰。
在本发明方法中，步骤(a)中的表达嵌合RNA和表达Cas蛋白的核酸构建物可以是同一核酸构建物，也可以是不同的核酸构建物。
另外，如果待处理的植物或植物细胞中已经含有了Cas蛋白表达盒，那么可以仅导入表达嵌合RNA的核酸构建物。
此外，如果需要同时在多个特定位点进行定点切割或定点修饰，那么可以将表达多个不同chiRNA的核酸构建物(可以是同一或不同的核酸构建物)导入植物细胞。
在定点切割后，植物细胞会通过多种机制进行修复，并常常会在修复过程中引入各种不同的突变。基于此，人们可以筛选出具有所需突变或所需表现的植物或植物细胞，以便用于后续研究或生产。
定点精确修饰的方法
如果需要在植物基因组中进行定点精确插入、缺失或者替换DNA序列，那么可以在嵌合RNA和Cas蛋白对基因组进行定点切割之前，导入供体DNA，所述供体DNA可以为单链或双链DNA，并包含待插入或待替换的DNA序列，所述DNA序列可以为单个核苷酸、或多个核苷酸(包括DNA片段或者编码基因)。在定点切割后，植物细胞可以通过同源重组介导的DNA修复系统，以供体DNA为模板，对植物基因组进行定点精确插入、缺失或者替换修饰。所述供体DNA可以用于在植物基因组特定位置插入或置换特定DNA序列；也可以用于替换启动子，插入增强子等DNA顺式调控元件，以调控植物内源基因的表达水平；还可以用于插入编码完整蛋白的多核苷酸序列。导入供体DNA的方法包括但不限于：显微注射，农杆菌介导转染，基因枪法，电击法，超声波法，脂质体介导法，聚乙二醇(PEG)介导法，激光微束穿刺孔法，供体DNA经化学修饰(添加亲脂性基团)后直接导入等。
应用
本发明可应用于植物基因工程领域，用于改造各种不同的植物，尤其是具有经济价值的农作物和林业植物。
本发明的主要优点包括：
(a)可特异性地在植物基因组的特定位置，进行定点切割和修饰。
(b)可高效地在特定位置引入各种不同形式的修饰。
(c)可高效地在特定位置引入新的基因。
(d)可高效地敲除植物基因组的特定基因。
(e)可有效地调控植物內源基因的表达水平。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
通用材料和方法
拟南芥和水稻植物生长
试验中采用拟南芥野生型Col-0(购自美国ABRC中心)。种子播种到MS培养基上先在4℃春化3天，然后放入22℃长光照生长室(16h光照/8h黑夜),5-10天后移苗到营养土。
实验中采用的水稻为Kasalath品种(购自中国水稻所)，植株移栽到土中后生长于温室中(16h光照，30度/8h黑夜，22度)。
目的位点的设计
合适的chiRNA目的位点为N1-20NGG的形式，其中N1-20为chiRNA载体构建物所需要提供的识别序列，NGG为CRISPR/Cas9复合体与DNA目的位点结合所需要的识别序列，称为PAM序列。
因为U6型小RNA的转录以G作为起始信号，因此，选用对GN19NGG这种形式的序列作为目的位点。此外，因为研究表明CRISPR/Cas系统可以容忍目的位点远离PAM序列一侧多达5个碱基的错配，因此如果N1-20的第一个核苷酸是G，则合成目的位点oligo引物为接头加N1-20；如果N1-20的第一个核苷酸不是G，则本实施例中也将之当做为G，合成目的位点oligo引物为接头加GN2-20。
载体构建
从载体pX260中，用引物Cas9-F和Cas9-R，通过PCR扩增SpCas9的编码序列，亚克隆到pA7-GFP载体的XhoI和BamHI位点之间替换掉其原来的GFP基因，这样就分别在N端和C端获得了2x 35S启动子和Nos终止子。pX260和A7-GFP载体的详细构建方法见文献(Voelkeret al.,2006；Cong et al.,2013)。随后用HindIII/EcoRI酶切位点将2x 35S启动子到Nos终止子这段完整的Cas9表达盒亚克隆到pBluescript SK+载体(购自Stratagene Inc.,SanDiego,CA)，命名为35S-Cas9-SK。
以拟南芥野生型Col-0基因组DNA为模板，用AtU6-26F和AtU6-26R引物通过PCR扩增获得AtU6-26启动子，然后亚克隆到pEasy-Blunt载体(购自全式金生物，北京)中，挑选KpnI在启动子前端的克隆。随后利用KpnI/XhoI酶切位点亚克隆到pBluescript SK+(购自Stratagene Inc.,San Diego,CA)载体中。用AtU6-26-85F和AtU6-26-85R引物通过PCR扩增的方法从载体pX330中获得85bp的chiRNA诱导序列并与AtU6-26启动子融合，从而获得完整的chiRNA表达载体(见图10)，获得的载体命名为At6-26SK。根据设计的目标位点合成上下游寡聚核苷酸链(见表1)，退火形成的带有接头的双链小片段通过连接反应克隆到BbsI酶切后的At6-26SK的两个BbsI位点之间。
随后用KpnI/EcoRI酶切将chiRNA表达盒亚克隆到35S-Cas9-SK中用于瞬时表达分析，或者用KpnI/SalI酶切后与带有完整Cas9表达框的SaII/EcoRI片段一起亚克隆到pCambia1300载体的KpnI/EcoRI区域(Cambia,Canberra,Australia)以用于拟南芥转基因。
以水稻野生型Nipponbare基因组DNA为模板用OsU6-2F和OsU6-2R引物通过PCR扩增获得OsU6-2启动子，然后亚克隆到pEasy-Blunt载体(全式金生物，北京)中。
随后用TPCR-OsU6F和TPCR-OsU6R引物通过Transfer PCR的方法将OsU6-2转移到At6-26SK载体中替换AtU6-26启动子，获得载体OsU6-2SK(见图12)。根据设计的目标位点合成上下游寡聚核苷酸链，退火形成的带有接头的双链小片段通过连接反应克隆到BbsI酶切后的OsU6-2SK的两个BbsI位点之间。随后用KpnI/EcoRI酶切将chiRNA表达盒亚克隆到35S-Cas9-SK中用于瞬时表达分析，或者用KpnI/HindIII酶切后与带有完整Cas9表达框的HindIII/EcoRI片段一起亚克隆到pCambia1300载体的KpnI/EcoRI区域(Cambia,Canberra,Australia)以用于水稻转基因。
以拟南芥野生型Col-0基因组为模板，用pAtU6-F-HindIII和pAtU6-R引物通过PCR扩增得到AtU6-26启动子片段pAtU6-26。以pX330载体为模板，用sgR-F-U6和sgR-R-SmaI引物通过PCR扩增得到chiRNA(即sgRNA)片段。随后以chiRNA和pAtU6的PCR产物的混合物为模板，用pAtU6-F-HindIII和sgR-R-SmaI引物进行重叠PCR获得pAtU6-chiRNA片段(SEQ IDNO.:40)，经过HindIII和XmaI酶切后插入pMD18T载体相应位置得到psgR-At载体。
以拟南芥野生型Col-0基因组为模板，分别用pAtUBQ1-F-SmaI和pAtUBQ1-R-Cas与tUBQ1-F-BamHI和tUBQ-R-KpnI为引物通过PCR扩增获得AtUBQ1的启动子pAtUBQ1和终止子。以pX330载体为模板，以Cas9-F-pUBQ和Cas9-R-BamHI为引物通过PCR扩增获得Cas9基因片段。将上述pAtUBQ1，Cas9基因和AtUBQ1的终止子片段分别用XmaI和NcoI，NcoI和BamHI以及BamHI和KpnI酶切后共同连入用XmaI和KpnI双切的psgR-At载体，最终得到插入片段为pAtUBQ-Cas9-tUBQ(SEQ ID NO.:41)的psgR-Cas9-At骨架载体。
选择符合5’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGG-3’的序列作为靶标。对于psgR-Cas9-At载体，分别合成正义链5’-GATTGNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’和反义链5’-AAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNC-3’。随后将两条合成的寡核苷酸链变性退火形成带接头的双链DNA小片段，插入psgR-Cas9-At的两个BbsI酶切位点之间，获得针对特定目标位点的psgR-Cas9-At载体。从已插入有靶标基因片段的psgR-At载体上，用pAtU6-F-KpnI和sgR-EcoRI引物，扩增得到完整的pAtU6-chiRNA元件，并用KpnI和EcoRI酶切后插入已经带有针对另一个靶标基因的pAtU6-chiRNA元件的psgR-Cas9-At载体，得到p2×sgR-Cas9-At载体。随后用HindIII和EcoRI酶切，将完整的2×sgR-Cas9-At亚克隆到pCambia1300(Cambia,Canberra,Australia)载体得到双元载体p2×1300-sgR-Cas9用于拟南芥转基因。
pUBQ-Cas9-sgR系列载体的构建
合成引物sgR-BsaⅠ-F/R，用PNK激酶将引物加磷，缓慢退火，连入psgR-Cas9-At的BbsⅠ位点。将所得到的psgR-Cas9-Bsa载体用EcoRⅠ和HindⅢ酶切连入pBin19载体。即得pUBQ-Cas9-sgR载体。将合成的引物sgR-AP1-S27/A27和sgR-AP1-S194/A194也按照上述方法连入pUBQ-Cas9-sgR载体的BsaⅠ位点，即得pUBQ-Cas9-sgR-AP1-27和pUBQ-Cas9-sgR-AP1-194。
pSPL-Cas9-sgR系列载体的构建
合成引物SPL5’-F-XmaⅠ和SPL5’-R-BsaⅠ，从拟南芥基因组上扩增SPL基因的5’端启动子序列。该片段用XmaⅠ和BsaⅠ酶切后，连入psgR-Cas9-Bsa的XmaⅠ和NcoⅠ位点，得到pSPL-Cas9-5’。合成引物SPL3’-F-BamHⅠ和SPL3’-R-KpnⅠ，从拟南芥基因组上扩增SPL基因的3’端序列，该序列包括SPL基因的后个外显子(SEQ ID NO.:104、106)和两个内含子(SEQID NO.:103、105)以及终止子(SEQ ID NO.:108)，用BamHⅠ和KpnⅠ酶切后连入pSPL-Cas9-5’,得到pSPL-Cas9-53’。所得质粒用XmaⅠ和KpnⅠ酶切后，连入pUBQ-Cas9-sgR，即得pSPL-Cas9-sgR载体。将合成的引物sgR-AP1-S27/A27和sgR-AP1-S194/A194也按照上述方法连入pSPL-Cas9-sgR载体的BsaⅠ位点，即得pSPL-Cas9-sgR-AP1-27和pSPL-Cas9-sgR-AP1-194。
psgR-Cas9-p19载体的构建
含有NcoⅠ位点的TBSV-p19-2A基因由金唯智公司合成。将该基因片段用NcoI酶切后插入psgR-Cas9载体的NcoI位点，用p19-F和Cas9-378R引物鉴定片段的插入方向，即得psgR-Cas9-p19载体。
psgR-Cas9-MRS1/2载体的构建
分别合成引物sgR-MRS1-S/A和sgR-MRS2-S/A。连入psgR-Cas9-At的BbsⅠ位点，即得psgR-Cas9-MRS1和psgR-Cas9-MRS2载体
psgR-Cas9-MRS1/2-p19载体的构建
分别合成引物sgR-MRS1-S/A和sgR-MRS2-S/A。连入psgR-Cas9-p19的BbsⅠ位点，即得psgR-Cas9-MRS1-p19和psgR-Cas9-MRS2-p19载体
1300-psgR-Cas9-p19-AP1/TT4载体的构建
分别合成引物sgR-AP1-S27/A27，sgR-AP1-S194/A194，sgR-TT4-S65/A65和sgR-TT4-S296/A296。用PNK激酶将引物加磷，退火，连入psgR-Cas9-p19的BbsⅠ位点，即得psgR-Cas9-p19-AP1-27，psgR-Cas9-p19-AP1-194，psgR-Cas9-p19-TT4-65和psgR-Cas9-p19-TT4-296。用AtU6-F-KpnI和sgR-R-EcoRI引物分别扩增psgR-Cas9-AP1-194-p19和psgR-Cas9-p19-TT4-296，所得片段用KpnⅠ和EcoRⅠ酶切连入psgR-Cas9-p19-AP1-27和psgR-Cas9-p19-TT4-65，即得psgR-Cas9-p19-AP1和psgR-Cas9-p19-TT4。将这两个质粒用HindⅢ和EcoRⅠ酶切，回收，连入pCAMBIA1300载体，即得1300-psgR-Cas9-p19-AP1和1300-psgR-Cas9-p19-TT4载体。
基于同源重组的瞬时YF-FP报告系统分析
在pA7-YFP的基础上构建了一个基于同源重组的瞬时YF-FP报告系统。pA7-YFP载体图谱见图9，它以pUC18载体为骨架，在多克隆位点处插入了一个2×35S启动子-EYFP-NOS终止子的完整表达盒。以pA7-YFP载体为模板，分别用表1中的两对引物YF-FP 1F和YF-FP1R与YF-FP 2F和YF-FP 2R通过PCR扩增的方法分别获得YFP基因的1-510bp和229-720bp这两段编码序列，然后通过一个18bp的酶切接头(GGATCC ACTAGT GTCGAC)(SEQ ID NO.:103)或一个55bp的多重识别序列(MRS：ACTAGTTCCCTTTATCTCTTAGGGATAACAGGGTAATAGAGATAAAGGGAGGCCT)(SEQ ID NO.:104)连接起来，并利用XhoI/SacI放回到pA-YFP载体上以替换原来的YFP编码区。该载体的YFP编码区域在酶切接头两侧有282bp的重叠区域。根据已经报道的方法制备 拟南芥叶肉细胞原生质体和PEG转化转化(Yoo et al.,2007)。转化后室温暗培养16-24小时的样品用流式细胞仪进行荧光检测。
创建拟南芥和水稻稳定转基因植株
将带有SpCas9完整表达盒和chiRNA完整表达盒的pCambia1300载体转化到农杆菌GV3101中。选取正在盛花期的健壮野生型Col-0植株用浸花法进行转基因(Clough andBent,1998)。正常护理转基因植株至收获种子，收到的T1代种子，用5％次氯酸钠消毒后10分钟后，无菌水漂洗4次，播撒在含20μg/L潮霉素或50μM卡那霉素的MS0培养基上筛选。4℃放置2天后，移入12小时光照的培养箱中培养10天后，移栽到16小时光照的温室中，继续培养。。通过农杆菌介导转化水稻愈伤组织获得转基因植株(Hiei et al.,1994)。
基因组修饰的酶切和测序分析
提取潮霉素筛选获得阳性转化子的基因组DNA。用目标位点对应的引物进行PCR扩增并回收。每个样品取大约400ng PCR回收产物用相应的限制性内切酶酶切过夜。酶切反应用琼脂糖凝胶电泳(1.2-2％)进行分析。对酶切后残留的未被切割的条带进行割胶回收，连接到pZeroBack/blunt载体(天根生物，北京)中，对单克隆摇菌制备质粒后用M13F引物进行桑格法测序分析。
生殖细胞打靶的突变体鉴定
对四种不同的转基因T1代群体，随机选取32个株系，分别在生长2周后和开花后各选取1枚叶片和一个花序，用CTAB法提取DNA基因组。以AP1-F133/271R为引物，PCR扩增目的基因片段并测序，突变体会从剪切位点起出生套峰。对于T2代的转基因群体，随机选取8个发生突变的株系，各检测12个单株。将测序结果为套峰的PCR产物，进行TA克隆，并挑取10个单克隆测序以确定突变基因的类型。
含p19蛋白的突变体鉴定
对T1代的1300-psgR-Cas9-p19-AP1/TT4转基因植物群体，各随机选取60个株系，在生长2周后取1枚叶片，用CTAB法提取DNA基因组。分别以AP1-F133/271R和TT4-F159/407R为引物，PCR扩增目的基因片段，电泳检测PCR的条带，统计发生片段确实植物株系和相关的发育表型。
原位杂交
1.材料包埋：选用抽薹后的转基因植物的花序为材料，用4％的多聚甲醛固定12小时，梯度酒精脱水，二甲苯透明后石蜡包埋。
2.探针制备：Cas9基因以引物dCas9-F3-F/R扩增后，所得片段用PstI和BamHI酶切连入pTA2载体。所得载体用SalⅠ线性化后，作为DNA模板，分别用T7和SP6RNA聚合酶在体外转录出反义和正义的Biotin标记RNA探针(Roche,11175025910)。产物经过DNaseⅠ消化，碱裂和纯化后溶解于甲酰胺中保存。
3.原位杂交按照文献报道的方法操作。(Brewer PB,Heisler MG,Hejatko J,Friml J,Benkova E(2006)In situ hybridization for mRNA detection inArabidopsistissue sections.Nat Protoc 1:1462-1467.)
Northern杂交
取开花期植物的花序，用Trizol法提取总RNA(Invitrogen)。每个样品上样50μg，用15％的PAGE胶分离目的RNA条带并用湿转法转移到硝酸纤维素膜上(Hybond,Amersham)。紫外交联2分钟后，在杂交液(DIG EASY Hyb,Roche)中预杂交1小时，加入20μM地高辛标记的寡核苷酸探针(Invitrogen)，42℃杂交过夜。2×SSC，0.1％的SDS洗膜两次，每次10分钟，0.1×SSC，0.1％的SDS洗膜两次，每次10分钟。用地高辛检测试剂盒(Thermo Fisher)检测目的条带，压片15分钟后，用X光片显影。
Realtime PCR
将提取的植物总RNA用DNaseⅠ(Takara)处理30分钟,酚氯仿纯化后，取5μg做反转录(Takara)。产物稀释1倍后，取1μl做模板，配置Realtime-PCR反应体系(Biorad)。每个样品做三个重复，以ACTIN基因为内参，Col野生型为对照，用2-ΔΔCt法计算基因表达的相对变化。
序列信息
表1序列信息
实施例1
使用酿脓链球菌SF370的CRISPR/Cas9在拟南芥原生质体中造成定点DNA双链断裂。
结果如图1所示。构建YFP1目标位点chiRNA的oligo为表1中的YF-FP F和YF-FP R。结果表明，当将YF-FP报告基因和CRISPR/Cas载体共转拟南芥原生质体后，可以获得很强的YFP信号，基于同源重组的基因修复效率高达18.8％[(4.76％-0.78％)/21.23％]。这说明构建的CRISPR/Cas系统发挥功能，能够实现在植物细胞中高效地对DNA序列进行双链切割产生双链断裂。
实施例2
构建用于农杆菌介导的拟南芥和水稻的转化的单一二元载体中表达chiRNA和hSpCas9，并选取2个拟南芥基因BRI1和GAI与1个水稻基因ROC5设计目标位点。
结果如图2所示。载体的Cas9表达盒完全相同。对于chiRNA表达盒，用于拟南芥转化的采用AtU6-26启动子，用水稻转化的采用OsU6-2启动子。BRI1位点1,2，3的chiRNA构建所对应oligos分别为表1中的BRI1 chiRNA1 F和BRI1 chiRNA1 R，BRI1 chiRNA2 F和BRI1chiRNA2 R,BRI1 chiRNA3 F和BRI1 chiRNA3 R。GAI位点1的chiRNA构建所对应的oligos为表1中的GAI chiRNA1 F和GAI chiRNA1 R。ROC5位点1的chiRNA构建所对应的oligos为表1中的ROC5 chiRNA1 F和ROC5 chiRNA1 R。
实施例3
通过目标位点在拟南芥和水稻中产生稳定转基因植物。
结果如图3所示。RFLP鉴定BRI1位点1和3的转基因植株的PCR引物为表1中的BRI11F和BRI 1 1R，RFLP鉴定BRI1位点2的转基因植株的PCR引物为表1中的BRI1 2F和BRI1 2R。RFLP鉴定GAI位点1的转基因植株的PCR引物为表1中的GAI F和GAI R。RFLP鉴定ROC5位点1的转基因植株的PCR引物为表1中的ROC5F和ROC5R。
结果表明，很大比例的拟南芥转基因T1代植株在生长早期显现出与目的基因位点纯合突变相似的表型。RFLP酶切分析显示有些转基因植株的目的位点位置的PCR产物有明显的不能被酶切的片段残留，说明这些植株中部分细胞的目的位点位置的天 然酶切位点已经丢失。进一步测序结果显示，所有选定的拟南芥和水稻目的基因的T1代转基因植株在目的基因位点都有多种类型的DNA突变，包括短的删除，插入或替换。这说明CRISPR/Cas系统可以高效地在拟南芥和水稻的转基因植株中高效地对基因组的多个位点进行定点的切割，从而获得对特定基因的修饰。
实施例4
使用工程化的chiRNA：Cas9在多个拟南芥植株中BRI1基因位点1上诱导产生靶向位点插入和缺失突变(图11、图13)。
结果如图4所示。对12株T1代独立转基因植株进行测序鉴定，从98个克隆中检测到了75个突变，总共获得37种不同类型的突变类型。值得注意的是有的序列既有插入又有缺失。结果表明CRISPR/Cas系统可以高效地在拟南芥目的基因位点进行定点的切割，从而获得对特定基因的修饰。
实施例5
使用工程化的chiRNA：Cas9在多个拟南芥植株中BRI1基因位点2上诱导产生靶向位点插入和缺失突变。
结果如图5所示。对3株T1代独立转基因植株进行测序鉴定，从71个克隆中检测到了28个突变，每个植株都有2种或两种以上的突变类型。结果表明CRISPR/Cas系统可以高效地在拟南芥目的基因位点进行定点的切割，从而获得对特定基因的修饰。
实施例6
使用工程化的chiRNA：Cas9在多个拟南芥植株中BRI1基因位点3上诱导产生靶向位点插入和缺失突变。
结果如图6所示。对4株T1代独立转基因植株进行测序鉴定，从34个克隆中检测到了22个突变，每个植株都有2种或两种以上的突变类型。结果表明CRISPR/Cas系统可以高效地在拟南芥目的基因位点进行定点的切割，从而获得对特定基因的修饰。
实施例7
使用工程化的chiRNA：Cas9在拟南芥中GAI基因位点1上诱导产生靶向位点插入和缺失突变。
结果如图7所示。对3株T1代独立转基因植株进行测序鉴定，从53个克隆中检测到了17个突变，每个植株都有1种或以上的突变类型。结果表明CRISPR/Cas系统可以高效地在拟南芥目的基因位点进行定点的切割，从而获得对特定基因的修饰。
实施例8
使用工程化的chiRNA：Cas9在水稻中ROC5基因位点1上诱导产生靶向位点插入和缺失突变。
结果如图8所示。对15株T1代独立水稻转基因植株进行测序鉴定，从165个克隆中检测到了136个突变，每个植株都有1种或多达5种的突变类型。结果表明CRISPR/Cas系统可以高效地在水稻目的基因位点进行定点的切割，从而获得对特定基因的修饰。
上述实施例的部分试验的汇总结果如表2所示：
表2.拟南芥和水稻T1代转基因植株中检测到的目的位点突变统计表
实施例9
重复实施例4，不同点在于，用启动子AtU6-1替换AtU6-26。同样使用工程化的chiRNA：Cas9在多个拟南芥植株中BRI1基因位点1上诱导产生靶向位点插入和缺失突变。
对10株T1代独立转基因植株进行测序鉴定，结果表明，采用AtU6-1同样可以在基因组特定位点引入突变，但引入突变的频率较低，不足AtU6-26的约10％。这提示，AtU6-26是特别优选的第一植物启动子。
实施例10
通过目标位点对拟南芥中2个不同基因同时进行突变。
使用p2×1300-sgR-Cas9载体在多个拟南芥植株中同时对CHLI1和CHLI2基因位点诱导产生靶向位点插入和缺失突变，结果如图15、表4和表5所示。对3株T1代独立转基因植株进行测序鉴定，各植株在CHLI1和CHLI2基因位点都有多种突变类型。结果表明CRISPR/Cas系统可以高效地实现在拟南芥多个目的基因位点同时进行定点的切割，从而同时获得对多个特定基因的修饰。
构建载体所使用的chiRNA oligos为表3中的sgCHLI1-S101和sgCHLI1-A101与sgCHLI2-S280和sgCHLI2-A280。SURVEYOR分析检测转基因植株的PCR引物为表3中的CHLI1-3-F和CHLI1-262-R与CHLI2-3-F和CHLI2-463-R。
实施例11
通过目标位点在拟南芥中同一个基因的2个位点同时进行突变及实现大片段删除
使用p2×1300-sgR-Cas9载体在多个拟南芥植株中同时对TT4基因中的2个位点诱导产生靶向位点插入和缺失突变，以及造成2个位点间序列的大片段缺失，结果如图16、表4和表5所示。对11株T1代独立转基因植株进行测序鉴定，每个植株在TT4基因的2个位点都有多种突变类型，而且在多个植株中检测到目的位点之间序列的整体缺失。结果表明CRISPR/Cas系统可以高效地实现在拟南芥同时对同一基因内多位点进行定点切割修饰，并能够实现大片段序列整体删除。
构建载体所使用的chiRNA oligos为表3中的sgTT4-S65和sgTT4-A65与sgTT4-S296和sgTT4-A296。SURVEYOR分析检测转基因植株的PCR引物为表3中的TT4-1-F和TT4-362-R与TT4-F-159和TT4-407-R。
表3引物列表
表4 CRISPR-Cas在T1代拟南芥转基因植株中诱导基因修饰统计
表5拟南芥T1代转基因植株中检测到的目的位点突变统计表
实施例12植物生殖系基因打靶载体的构建
为了实现Cas9基因在拟南芥生殖细胞系中的特异表达，克隆了SPL基因上游3.7K的序列作为启动子以及下游1.5K的片段作为终止子。并用人源化的链霉菌Cas9基因取代SPL基因第一个外显子，保留SPL基因所有的内含子以及第二和第三个外显子(图17,A)。同时，克隆了组成型表达的UBQ基因的启动子和终止子，用于构建组成型表达的基因打靶载体作为实验对照(图17,B)。
实施例13 Cas9基因的表达模式检测
原位杂交的结果表明，SPL基因启动子能驱动Cas9基因在花粉发育早期的绒毡层细胞(图18,A)和小孢子母细胞(图18,B)中特异表达，而UBQ启动子驱动的Cas9基因在同一时期的花药中几乎不表达(图18,D,E)。此外，SPL启动子驱动的Cas9基因在胚珠发育早期的卵母细胞中也能检测到表达信号(图18,C)，与之相比，UBQ启动子在胚珠中的表达是泛在的(图18,F)。这一结果表明，SPL基因的表达框架确实能在生殖细胞系中特异诱导Cas9基因的转录。
实施例14不同植物基因打靶系统的突变效率检测
为了比较pSPL-Cas9-sgR载体和pUBQ-Cas9-sgR载体的基因打靶效率，我们分别构建了识别拟南芥APETALA(AP1)编码基因第27号核苷酸位点和第194号核苷酸位点的基因打靶载体，并转化拟南芥。通过PCR扩增目的基因的序列以和测序结果比对发现，pUBQ-Cas9-sgR系列载体可以同时在T1和T2代植物中检测到基因突变，而pSPL-Cas9-sgR系列载体只能在T2代的转基因群体中检测到突变(图19，A)，这同时也说明这该载体的DNA切割活性具有生殖细胞特异性。
通过统计这两种打靶载体在植物不同发育时期和不同世代的基因打靶活性，我们发现，首先，不同靶向位点的剪切效率不同。对于pUBQ-Cas9-sgR载体而言，不论是在叶片中还是在花序中，AP1-27的效率均高于AP1-194。其次，有些在叶片中能检测到突变的株系，在花序中却没有产生突变。再者，AP1-194位点的突变效率在pSPL-Cas9-sgR的T2代转化子中不但高于AP1-27，而且比同期的pUBQ-Cas9-sgR转化子提高了近1倍(图19，B)。说明生殖细胞专一性打靶载体很好的DNA切割活性。
实施例15 T2代转化子中的基因突变类型的统计
为了由比较不同基因打靶系统产生的基因突变类型，我们从4个转基因群体中，各随机选取了8个发生基因突变的T2代转基因株系，每个株系分别检测了12个单株。实验结果表明，组成型表达的基因打靶系统虽然能产生一定比例的纯合子(2-4％)和杂合子(11-12％)，但是其中绝大多是基因型不明确的嵌合体或野生型(73％-84％)。而生殖系专一性的打靶系统能较稳定地产生30％左右的杂合子，却未得到纯合的植株(图20)。推测SPL启动子虽然在雌雄配子体中都表达，但在其中一方造成目的基因突变频率较低。当然，这并不影响杂合的T2代植株在T3代中分离出纯合的株系。
实施例16高效植物基因打靶载体的构建
在已有的拟南芥基因打靶载体的基础上(图21，A)，为了实现CRISPR/Cas9系统在植物中稳定和高效的表达，克隆了番茄矮壮病毒(TBSV)的p19蛋白序列并将其与人源化的链霉菌Cas9蛋白通过蛋白顺式切割元件2A肽融合在UBQ基因的框架下进行基因转录和翻译(图21，B)。由于2A肽的蛋白自剪切作用，这个融合的阅读框会表达出两个独立的蛋白来各自行使功能。
实施例17高效植物打靶系统的活性检测
在拟南芥的瞬时表达系统中，分别将含有p19和不含p19的CRISPR/Cas9载体与YFFP报道基因共同转化原生质体。YFFP报道基因是一个有部分序列重复的黄色荧光蛋白(YFP)编码基因，正常情况下无法正确表达和翻译。但在CRISPR/Cas9系统地识别和剪切作用下，会发生双链DNA的断裂(DSB)并激活植物内源的DNA修复机制来去除重复的基因片段，从而产生正常的有功能的YFP蛋白(图22，A)。通过统计两组不同的转染群体中YFP阳性细胞的比例，实验证明，p19能显著提高CRISPR/Cas9的基因打靶效率(图22，B)。
实施例18高效植物基因打靶系统在转基因植物中的表达分析
为了在稳定转化系统中验证p19蛋白提高植物基因打靶效率的作用，本实施例选取了两个拟南芥内源基因AP1和TT4作为靶向位点，分别构建了两组含有p19和不含有p19蛋白的CRISPR/Cas9基因敲除载体并转化拟南芥。在得到的四种T1代转基因群体中，均出现不同程度的叶发育表型。根据表型的严重程度，可以将它们分成3种类型：平展型(1/-)，卷曲型(2/+)和锯齿型(3/++)，并由此推测p19蛋白也可能干扰受miRNA调控的植物叶发育过程(图23，A)。
为了验证，分别检测了不同表型的植物中sgRNA和miR168的表达水平，结果发现在有严重叶发育表型的植物中sgRNA和miRNA的累积水平均最高(图23，B)。同时，p19基因的表达水平也与叶发育表型的严重程度成正比，但对Cas9的表达影响不大(图23，C,D)。由此可见，p19蛋白确实可以提高植物内源sgRNA的稳定性。
实施例19高效植物基因打靶系统在转基因植物中的功能分析
为了解p19蛋白在稳定sgRNA的同时是否能提高CRISPR/Cas9系统的打靶活性，在两个不同1300-psgR-Cas9-p19转基因群体中，分别统计了叶发育表型和基因突变的情况。
结果表明，在这两个群体中，均有约1/3的植株出现严重发育表型，有约1/5的植株有轻微的叶发育表型，且无论在哪一个群体中，有叶发育表型的植株出现靶基因突变的概率都要明显高于没有叶发育表型的植株(图24)，说明p19也能在稳定转化植株中提高CRISPR/Cas9系统地基因打靶效率。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求 书所限定的范围。
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Claims (11)

1.一种植物基因组定点修饰方法，其特征在于，包括步骤：
(a)将一表达嵌合RNA和Cas蛋白的核酸构建物导入植物细胞，获得转化的植物细胞，其中所述嵌合RNA是由特异性识别待定点修饰(或待切割位点)的CRISPR RNA(crRNAs)和反式作用型crRNA(trans-activating crRNA，tracrRNA)所构成的嵌合体(chimera)；和
(b)在合适的条件下，使转化的植物细胞中的所述核酸构建物转录形成嵌合RNA(chiRNA)，并且使所述转化的植物细胞表达所述的Cas蛋白，从而使得在所述嵌合RNA的引导下，在所述转化的植物细胞中，通过所述Cas蛋白对基因组DNA进行定点切割，从而进行基因组定点修饰；其中所述核酸构建物包括第一亚核酸构建物和第二亚核酸构建物，其中第一亚核酸构建物和第二亚核酸构建物是相互独立的，或是一体的；
其中，第一亚核酸构建物包括从5'至3'的以下元件：
第一植物启动子；
与所述第一植物启动子操作性相连的嵌合RNA的编码序列，所述嵌合RNA的编码序列的结构如式I所示：
A-B (I)
式中，
A为编码CRISPR RNA(crRNAs)的DNA序列；
B为编码反式作用型crRNA(trans-activating crRNA，tracrRNA)的DNA序列；
“-”表示A和B之间的连接键或连接序列；其中，由所述嵌合RNA的编码序列转录形成一个完整的RNA分子，即嵌合RNA(chiRNA)；和
RNA转录终止子；
第二亚核酸构建物包括5'至3'的以下元件:
第二植物启动子；
与所述第二植物启动子操作性相连的Cas蛋白的编码序列，并且所述Cas蛋白的是N端、C端或两侧与核定位序列(NLS序列)融合的融合蛋白；和
植物转录终止子，并且所述第二植物启动子为生殖细胞中特异性表达的启动子。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一亚核酸构建物的数量为一个或者多个(针对多个待切割位点)，并与第二亚核酸构建物是相互独立的，或是一体的。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的第二植物启动子和与所述所述Cas蛋白的编码序列之间5'至3'还操作性相连有：
第三亚核酸构建物，较佳地，所述的第三亚核酸构建物为来源于番茄矮壮病毒(TBSV)的p19蛋白编码序列；和
自剪切序列，较佳地，所述的自剪切序列为2A多肽编码序列(SEQ ID NO.:98)。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述定点修饰包括：
(i)在没有供体DNA的情况下，对植物基因组特定位点进行随机插入和缺失；和
(ii)在存在供体DNA的情况下，以供体DNA为模板，对植物基因组特定位点进行精确插入、缺失或者替换DNA序列；
较佳地，所述定点修饰包括对植物基因组的基因敲除，基因敲入(转基因)以及调控(上调或下调)內源基因的表达水平。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的第一植物启动子为RNA聚合酶III依赖的启动子。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：检测所述转化的植物细胞中基因组的突变或修饰情况。
7.一种用于植物基因组定点修饰的核酸构建物，其特征在于，所述核酸构建物包括第一亚核酸构建物和第二亚核酸构建物，其中第一亚核酸构建物和第二亚核酸构建物是相互独立的，或是一体的；
其中，第一亚核酸构建物包括从5'至3'的以下元件：
第一植物启动子；
与所述第一植物启动子操作性相连的嵌合RNA的编码序列，所述嵌合RNA的编码序列的结构如式I所示：
A-B (I)
式中，
A为编码CRISPR RNA(crRNAs)的DNA序列；
B为编码反式作用型crRNA(trans-activating crRNA，tracrRNA)的DNA序列；
“-”表示A和B之间的连接键或连接序列；其中，由所述嵌合RNA的编码序列转录形成一个完整的RNA分子，即嵌合RNA(chiRNA)；和
RNA转录终止子；
第二亚核酸构建物包括5'至3'的以下元件:
第二植物启动子；
与所述第二植物启动子操作性相连的Cas蛋白的编码序列，并且所述Cas蛋白的是N端、C端或两侧与核定位序列(NLS序列)融合的融合蛋白；和
植物转录终止子，并且所述第二植物启动子为生殖细胞中特异性表达的启动子。
8.一种载体，其特征在于，所述载体携带权利要求7所述的核酸构建物；
或一种载体组合，其特征在于，所述载体组合包括第一载体和第二载体，其中第一载体携带权利要求7所述的核酸构建物的第一亚核酸构建物，而第二载体携带权利要求7所述的核酸构建物的第二亚核酸构建物。
9.一种基因工程的细胞，其特征在于，所述细胞含有权利要求8中所述的载体或载体组合；或所述的植物细胞的基因组中整合有权利要求7所述的核酸构建物。
10.一种制备植物的方法，其特征在于，包括步骤：
将权利要求9所述的植物细胞再生成形成植株。
11.一种植物基因组定点修饰方法，其特征在于，包括步骤：
(a)将一表达嵌合RNA和Cas蛋白的核酸构建物导入植物细胞，获得转化的植物细胞，其中所述嵌合RNA是由特异性识别待定点修饰(或待切割位点)的CRISPR RNA(crRNAs)和反式作用型crRNA(trans-activating crRNA，tracrRNA)所构成的嵌合体(chimera)；和
(b)在合适的条件下，使转化的植物细胞中的所述核酸构建物转录形成嵌合RNA(chiRNA)，并且使所述转化的植物细胞表达所述的Cas蛋白，从而使得在所述嵌合RNA的引导下，在所述转化的植物细胞中，通过所述Cas蛋白对基因组DNA进行定点切割，从而进行基因组定点修饰。
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