CN107254485A - 一种能够快速构建植物基因定点敲除载体的新反应体系 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种能够快速构建植物基因定点敲除载体的新反应体系，包括：(1)基于CRISPR‑Cas系统的载体，所述载体具有如下特征的DNA分子：在农杆菌侵染法转化到植物后，能够同时实现OsU3启动子驱动SgRNA的转录和Ubiquitin启动子驱动Cas9蛋白表达的载体；(2)限制性内切酶AarⅠ；(3)限制性内切酶AarⅠ反应所需的buffer和Oligo；(4)靶基因位点特异性的DNA双链；(5)T4DNA连接酶及该酶反应所需的ATP。本发明所述体系只需5‑10个反应循环就能快速高效完成质粒的构建过程，极大简化了操作流程，满足快速、高通量构建植物基因定点敲除质粒的需求。

Description

一种能够快速构建植物基因定点敲除载体的新反应体系

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种能够快速构建植物基因定点敲除载体的新反应体系。

背景技术

CRISPR-Cas系统是细菌的一种获得性免疫系统，当细菌被噬菌体侵染后，可以获得噬菌体的DNA片段，并整合进基因组。当该类噬菌体再次入侵细菌时，通过对入侵噬菌体核酸的特异性识别，利用CAS蛋白进行切割，从而使得该类噬菌体发生降解，从而形成免疫。

CRISPR全称为Clustered regularly interspaced short palindromicrepeats，即成簇的，规律间隔的，短回文重复序列。日本大阪大学在对一种细菌编码的碱性磷酸酶基因进行研究时，首先发现了这种不寻常的DNA片段。这些片段是由简单的重复序列组成，而且在重复片段之间还存在一些特有的间隔序列。西班牙学者Mojica在地中海噬盐菌中发现了类似的序列，并在20种不同的微生物中均鉴定了这种重复现象，2002年，这种重复序列被正式命名为CRISPR，但功能未知。

随着测序技术和生物信息学的发展，2005年，先后有3个研究小组发现间隔序列和侵染细菌的病毒或Phage高度同源，从而推测该系统可能类似siRNA，是细菌抵抗噬菌体的一种机制。随后，很多研究支持了这一推测。一旦Phage上同间隔序列同源的序列发生突变后，Phage又恢复了侵染细菌的功能。这一侵染功能依赖于一类CAS蛋白功能参与，由于该类蛋白存在于CRISPR序列附近，参与CRISPR序列的识别和切割，因此被命名为CRISPRassociated protein，简称CAS蛋白。CAS蛋白能够在guide RNA的引导下对靶位点进行切割。有些CAS蛋白突变后，细菌还可以获得入侵的DNA片段并整合进基因组，但不能降解外源DNA片段，这证明CAS系统中存在一些蛋白是负责获取并整合外源DNA片段的，而另一些CAS蛋白则负责再次入侵时降解外源DNA。Cas9是CAS蛋白中比较重要的一员，它属于核酸酶，它编码基因上的某些点突变可以导致整个系统无法正常运转。以Cas9蛋白以及guide RNA为核心组成的II型CRISPR/CAS系统是目前研究最为深入的类型。

在II型CRISPR/CAS系统中，CRISPR序列首先转录成pre-crRNA，在pre-crRNA转录的同时，与其重复序列互补的反式激活crRNA(Trans-activating crRNA，tracrRNA)也转录出来，并且激发Cas9和双链RNA特异性RNase III核酸酶对pre-crRNA进行加工。加工成熟后，crRNA、tracrRNA和Cas9组成复合体，识别并结合于crRNA互补的序列，然后解开DNA双链，形成R-loop，使crRNA与互补链杂交，另一条链保持游离的单链状态，然后由Cas9中的HNH活性位点剪切crRNA的互补DNA链，RuvC活性位点剪切非互补链，最终引入DNA双链断裂(DSB)。CRISPR/Cas9的剪切位点位于crRNA互补序列下游邻近的PAM区(ProtospacerAdjacent Motif)的5'-GG-N₁₈-NGG-3'特征区域中的NGG位点。在体内，形成的双链断裂末端可通过非同源末端连接(Non-homologous end joining,NHEJ)的机制进行修复，由于切割时产生的少量碱基的变异或缺失，修复后的片段较原始序列出现变异。根据这一原理，CRISPR/Cas9系统被认为可用于基因组DNA的定点编辑。

根据CRISPR/Cas9的作用原理可知，细菌体内形成的靶向并切割外源DNA的复合物包括两个关键组分，Cas9和gRNA(guide RNA)。

2012年Science发表文章证实只要Cas9和一条定制的RNA就可以编辑DNA。研究人员将经密码子优化的Cas9和tracRNA、crRNA两部分融合表达形成的SgRNA(small guideRNA)分别构建到两个载体上进行细胞转染，结果发现在Cas9的作用下，SgRNA也能很好地行使guide RNA的功能，这一成果极大地简化了利用CRISPR/Cas9系统进行基因组编辑的程序。2013年，这一系统在作物的基因组改良上得以实现。Nature Biotechnology杂志上发表了中国科学院遗传所高彩霞老师课题组的研究进展^[1]。该研究小组将水稻密码子优化的Cas9构建在载体pJIT163上，形成Cas9的表达载体pJIT163-2NLSCas9。此外，合成水稻U3启动子和sgRNA骨架融合的片段并克隆到pUC-T载体上，构成gRNA表达载体pOsU3-gRNA。通过AarⅠ酶切位点可将靶基因的序列与sgRNA骨架进行融合。将Cas9与gRNA的表达载体同时转染水稻和小麦的原生质体，原生质体培养一段时间后即可检测到靶基因上存在一定的突变频率。为了检测sgRNA:Cas9系统是否可以在水稻植株水平上产生基因敲除，研究人员将两类质粒通过基因枪轰击水稻愈伤组织的方法进行转化，并将阳性的愈伤组织再生出植株，从再生的植株中均检测到了一定比例的靶基因突变的植株，说明利用sgRNA:Cas9系统可以实现水稻和小麦基因组的定点编辑。虽然利用pJIT163-2NLSCas9和pUC-T-gRNA两类载体可以实现对水稻进行不同基因的定点突变，但该系统采用的是两类载体同步基因枪转化水稻愈伤组织的方法，并不适合常规的农杆菌介导的水稻转化体系。同年，北京大学瞿礼嘉教授课题组在Cell research上发表的研究成果解决了这一问题^[2]。为了将CRISPR/Cas系统适用于农杆菌介导的植物转化体系，研究人员将SgRNA序列和Cas9基因分别克隆到Gateway体系的Entry质粒和目标质粒上。构建质粒时需要首先将靶位点序列克隆到Entry质粒上，实现guide RNA的构建；然后在位点特异性重组酶的作用下将SgRNA整合进目标质粒，构建完成的质粒可直接用于农杆菌介导的植物转基因体系，目前这一系统被广泛用于农杆菌介导的植物基因的定点敲除。

基于前期的研究进展，能用于农杆菌介导的植物转基因载体的构建往往需要分两步走：首先设计引物将靶基因序列与中间载体上的RNA骨架进行融合，构建guide RNA；然后再利用酶切连接或Gateway技术等方法，将SgRNA连接到表达Cas9蛋白的植物表达载体上，形成一个完整的转基因载体。这一过程不仅步骤相对繁琐，耗时长，而且依赖于一些进口试剂盒和酶类，构建成本高。最重要的是这样两步法的构建体系极大地限制了载体构建的通量，不利于快速且高通量基因定点敲除载体的构建。

主要参考文献：

[1]Shan Q,Wang Y,Li J,et al.Targeted genome modification of cropplants using a CRISPR-Cas system[J].Nature biotechnology,2013,31(8):686-688.

[2]Miao J,Guo D,Zhang J,et al.Targeted mutagenesis in rice usingCRISPR-Cas system[J].Cell research,2013,23(10):1233.

发明内容

针对上述现有技术存在的问题，本发明目的在于提供一种能够快速构建植物基因定点敲除载体的新反应体系，该反应体系经5-10个反应循环就可以实现载体的构建，极大加快了植物基因定点敲除载体构建的速度和效率，满足高通量构建载体的需求。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

本发明提供一种能够快速构建植物基因定点敲除载体的新反应体系，包括：

(1)基于CRISPR-Cas系统的载体，所述载体具有如下特征的DNA分子：在农杆菌侵染法转化到植物后，能够同时实现OsU3启动子驱动SgRNA的转录和Ubiquitin启动子驱动Cas9蛋白表达的载体；

(2)限制性内切酶AarⅠ；

(3)限制性内切酶AarⅠ反应所需的buffer和Oligo；

(4)靶基因位点特异性的DNA双链；

(5)T4DNA连接酶及该酶反应所需的ATP。

优选的，所述反应体系包括：①基于CRISPR-Cas系统的载体50-120ng；②限制性内切酶AarⅠ的10X buffer 0.5-1.5μL；③限制性内切酶AarⅠ的50XOligo0.1-0.3μL；④靶位点双链DNA 0.5-1.5μL；⑤限制性内切酶AarⅠ0.1-0.3μL；⑥T4DNA连接酶0.05-0.15μL；⑦ATP0.5-1.5μL。

一种更为具体的优选反应体系包括：①基于CRISPR-Cas系统的载体100ng；②限制性内切酶AarⅠ的10X buffer 1μL；③限制性内切酶AarⅠ的50XOligo0.2μL；④靶位点双链DNA 1μL；⑤限制性内切酶AarⅠ0.2μL；⑥T4DNA连接酶0.1μL；⑦ATP 1μL,加水至总体积10μL。

本发明所述的基于CRISPR-Cas系统的载体，包含有OsU3启动子序列、编码SgRNA序列、Ubiquitin启动子序列和编码Cas9蛋白的序列，其中：OsU3启动子序列，位于编码SgRNA序列的上游，同时包含Ubiquitin启动子序列，位于编码Cas9蛋白的序列上游。

优选的，本发明所述的基于CRISPR-Cas系统的载体，骨架载体为植物表达载体pCAMBIA1305.1，在所述载体pCAMBIA1305.1上整合OsU3启动子序列、编码SgRNA序列、Ubiquitin启动子序列和编码Cas9蛋白的序列，其中：OsU3启动子序列位于编码SgRNA序列的上游，Ubiquitin启动子序列，位于编码Cas9蛋白序列的上游。所构建的载体命名为pCAMBIA1305.1-SgRNA-Ubi-Cas9，简称1305CRISPR，大小18293bp，具体如SEQ ID NO：1所示。

本发明还提供一种扩增OsU3-sgRNA序列的引物：

GgRNAqz-F：CCATGATTACGAATTCAAGGAATCTTTAAACATACGAA(如SEQ ID NO：2所示)；

GgRNAqz-R：

CTAGAGGATCCCCGGGTACCAAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACT(如SEQ ID NO：3所示)。

本发明还提供一种扩增编码Cas9蛋白序列的引物：

GCAS9-F：CCGGGGATCCTCTAGAATGGCCCCTAAGAAGAAGAGAAAGG(如SEQ IDNO：4所示)；

GCAS9-R：GGCCAGTGCCAAGCTTTTTGATCTTGAAAGATCTTTTATCT(如SEQ ID NO：5所示)。

本发明还提供一种扩增Ubiquitin启动子序列的引物：

UBIqz1：TGGTACCCGGGGATCCGGGCTGCAGTGCAGCGTGACCCGGT(如SEQ ID NO：6所示)；

UBIqz2：TAGGGGCCATTCTAGACTGCAGAAGTAACACCAAACAACAG(如SEQ ID NO：7所示)。

本发明还提供本发明所述反应体系在构建植物基因定点敲除载体或在植物基因敲除或在构建基因定点敲除转基因植物中的应用。

本发明还提供所述反应体系在在构建单子叶植物基因定点敲除载体或在单子叶植物基因敲除或在构建基因定点敲除转基因单子叶植物中的应用。

本发明还提供本发明所述反应体系在在构建水稻基因定点敲除载体或在水稻基因敲除或在构建基因定点敲除转基因水稻中的应用。

本发明还提供一种快速构建植物基因定点敲除载体的方法，将本发明所述的反应体系置于35-38℃反应4-6分钟，15-17℃反应4-6分钟，经过5-10个循环后反应产物直接用于转化感受态细胞。

一种优选的更为具体的快速构建植物基因定点敲除载体的方法，将本发明所述的反应体系置于37℃反应5分钟，16℃反应5分钟，经5-10个循环后反应产物直接用于转化感受态细胞。

本发明所建立的快速高效且满足高通量的载体构建体系，旨在实现一步法构建植物基因敲除的载体。优选以本实验室现有的植物表达载体pCAMBIA1305.1为骨架，将OsU3启动子驱动转录SgRNA的基因序列OsU3-sgRNA和Ubiquitin启动子驱动表达Cas9蛋白的基因序列Ubi-Cas9先后整合到pCAMBIA1305.1的多克隆位点，获得一个能够同时表达Cas9蛋白和转录SgRNA的植物转化载体。随后在新质粒的基础上，优化了构建植物基因敲除质粒的反应条件，采取同步酶切和连接的方式，避开质粒的割胶回收等环节，建立一个快速、高效、高通量构建基因定点敲除质粒载体的新方法。本发明相对于现有技术的优势：

1)本发明所述的反应体系，可以实现一步法构建载体，减少实验操作步骤和实验损耗，仅需一个反应体系和5-10个反应循环就可以实现质粒的构建，极大加快了植物基因定点敲除载体构建的速度和效率。

2)本发明将Cas9和OsU3-SgRNA构建到同一载体上，提供了一个同时携带有CRISPR/Cas9和CRISPR/SgRNA序列的重组质粒1305CRISPR，首先本发明中构建的1305CRISPR质粒有19232bp大小，属于低拷贝质粒，因此在质粒提取时往往浓度较低，酶切后回收效率更低，质粒提取、酶切和回收过程繁琐，从摇菌到回收整个过程至少需要3天时间，而得到的量(按10μg计算)往往只能用于少量载体的构建，如此周而复始，严重限制了载体构建的速度；此外，AarⅠ酶是稀有酶，价格昂贵，由于大量酶切后回收效率低下，至少一半以上的AarⅠ酶实际上是被浪费的。本发明在1305CRISPR质粒的基础上建立一步法反应体系，人力、物力成本均下降，构建时间缩短，通量显著增加，一次质粒DNA的大量提取(按10μg量计算)可保证500个质粒的构建，即避免了反复提取质粒DNA、免去了1305CRISPR质粒大量酶切并回收的步骤、减少了琼脂糖凝胶和回收试剂盒的使用、优化了AarⅠ酶的使用效率。经优化后的反应体系不仅免去了中间质粒的克隆过程，同时省去了大分子量质粒1305CRISPR酶切、电泳、割胶回收等多个繁琐且效率低下的环节，只需一个反应体系、5-10个反应循环就能快速高效完成质粒的构建过程，极大简化了操作流程，满足快速、高通量构建植物基因定点敲除质粒的需求。

3)基于1305CRISPR质粒的基因定点敲除载体构建的新方法已经非常成熟，2016年以来本实验室利用该方法已成功构建了针对不同基因位点的基因敲除载体总计102个，所有质粒都快速构建成功，极大地减少人力和物力的投入。不仅如此，该系统不受样品数量的限制，可实现高通量基因定点敲除载体的构建，能够满足生物公司等服务机构对于高通量的需求。

附图说明

图1是植物表达载体pCAMBIA1305.1结构示意图；

图2是本发明1305CRISPR载体结构示意图；

图3GIP7基因位点上产生的不同变异类型；

图4GIP8基因位点上产生的不同变异类型。

具体实施方式

实施例1基于CRISPR-Cas系统的载体的构建方法

1)以pOsU3-gRNA质粒为模板，采用sgRNA重组引物(表1)扩增OsU3-SgRNA序列，并同源整合到EcoRⅠ和KpnⅠ双酶切后的pCAMBIA 1305.1线性载体上

(图1)。连接产物转化DH5a,挑选阳性克隆进行测序。经测序获得含OsU3-SgRNA正确序列的新质粒载体，命名为pCAMBIA 1305.1-SgRNA；

2)以pJIT163-2NLSCas9质粒为模板，采用Cas9重组引物(表1)扩增编码Cas9的基因组序列，并利用同源重组的方法整合到XbaⅠ和HindⅢ双酶切的pCAMBIA 1305.1-SgRNA载体上。连接产物转化DH5a,挑选阳性克隆进行测序。经测序获得含有Cas9基因正确序列的新质粒，命名为pCAMBIA1305.1-SgRNA-Cas9；

3)以本实验室的常用质粒p1390为模板，采用Ubi启动子重组引物(表1)扩增Ubi启动子序列，并将其同源重组到KpnⅠ和XbaⅠ双酶切的pCAMBIA1305.1-SgRNA-Cas9载体上。连接产物转化DH5a,挑选阳性克隆进行测序。经测序获得含有正确Ubi启动子序列的最终质粒，命名为pCAMBIA1305.1-SgRNA-Ubi-Cas9，简称1305CRISPR，大小19232bp(图2)。

表1本实施例中所用到的引物

实施例2能够快速构建水稻基因定点敲除载体的反应体系

①适量实施1中制备的1305CRISPR质粒DNA100ng；②限制性内切酶AarⅠ的10Xbuffer 1μL；③限制性内切酶AarⅠ的50XOligo 0.2μL；④靶位点双链DNA1μL；⑤限制性内切酶AarⅠ0.2μL；⑥T4DNA连接酶0.1μL；⑦ATP 1μL,加水至总体积10μL。

实施例3快速构建水稻基因定点敲除载体的方法

将实施例2所述的反应体系置于37℃反应5分钟，16℃反应5分钟，经5-10个循环后反应产物直接用于转化DH5a。平板上生长的菌落经37℃培养过夜后随机挑选1-3个菌落送公司进行测序确认。凡克隆位点上含有靶基因序列的质粒即为构建完成的正确质粒。

实施例4

为了研究细胞分选相关基因的功能，我们选取了与细胞分选可能相关的13个水稻基因位点。利用实施例2中建立的体系和实施例3中建立的方法，分别构建相应基因的定点敲除载体，后续通过农杆菌介导转化，获得转基因水稻。在对阳性的转基因苗进行靶位点检测时发现，不同基因的转基因苗均获得不同比例的变异家系，敲除成功率由27.0％至94.6％不等(表2)。在敲除成功的基因位点上均产生了多种类型的等位基因变异型(图3，图4)，这些说明本发明中快速构建载体的体系是切实可行的，且由本发明获得的转化质粒能够如期获得目标基因的不同等位基因型，为后续基因功能的研究创造了良好的材料。

表2转基因植株中不同基因位点的敲除成功率

<110>南京农业大学

<120>一种能够快速构建植物基因定点敲除载体的新反应体系

<130>7

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>19232

<212>DNA

<213>人工合成

<400>1

catggtagat ctgagggtaa atttctagtt tttctccttc attttcttgg ttaggaccct 60

tttctctttt tatttttttg agctttgatc tttctttaaa ctgatctatt ttttaattga 120

ttggttatgg tgtaaatatt acatagcttt aactgataat ctgattactt tatttcgtgt 180

gtctatgatg atgatgatag ttacagaacc gacgaactag tctgtacccg atcaacaccg 240

agacccgtgg cgtcttcgac ctcaatggcg tctggaactt caagctggac tacgggaaag 300

gactggaaga gaagtggtac gaaagcaagc tgaccgacac tattagtatg gccgtcccaa 360

gcagttacaa tgacattggc gtgaccaagg aaatccgcaa ccatatcgga tatgtctggt 420

acgaacgtga gttcacggtg ccggcctatc tgaaggatca gcgtatcgtg ctccgcttcg 480

gctctgcaac tcacaaagca attgtctatg tcaatggtga gctggtcgtg gagcacaagg 540

gcggattcct gccattcgaa gcggaaatca acaactcgct gcgtgatggc atgaatcgcg 600

tcaccgtcgc cgtggacaac atcctcgacg atagcaccct cccggtgggg ctgtacagcg 660

agcgccacga agagggcctc ggaaaagtca ttcgtaacaa gccgaacttc gacttcttca 720

actatgcagg cctgcaccgt ccggtgaaaa tctacacgac cccgtttacg tacgtcgagg 780

acatctcggt tgtgaccgac ttcaatggcc caaccgggac tgtgacctat acggtggact 840

ttcaaggcaa agccgagacc gtgaaagtgt cggtcgtgga tgaggaaggc aaagtggtcg 900

caagcaccga gggcctgagc ggtaacgtgg agattccgaa tgtcatcctc tgggaaccac 960

tgaacacgta tctctaccag atcaaagtgg aactggtgaa cgacggactg accatcgatg 1020

tctatgaaga gccgttcggc gtgcggaccg tggaagtcaa cgacggcaag ttcctcatca 1080

acaacaaacc gttctacttc aagggctttg gcaaacatga ggacactcct atcaacggcc 1140

gtggctttaa cgaagcgagc aatgtgatgg atttcaatat cctcaaatgg atcggcgcca 1200

acagcttccg gaccgcacac tatccgtact ctgaagagtt gatgcgtctt gcggatcgcg 1260

agggtctggt cgtgatcgac gagactccgg cagttggcgt gcacctcaac ttcatggcca 1320

ccacgggact cggcgaaggc agcgagcgcg tcagtacctg ggagaagatt cggacgtttg 1380

agcaccatca agacgttctc cgtgaactgg tgtctcgtga caagaaccat ccaagcgtcg 1440

tgatgtggag catcgccaac gaggcggcga ctgaggaaga gggcgcgtac gagtacttca 1500

agccgttggt ggagctgacc aaggaactcg acccacagaa gcgtccggtc acgatcgtgc 1560

tgtttgtgat ggctaccccg gagacggaca aagtcgccga actgattgac gtcatcgcgc 1620

tcaatcgcta taacggatgg tacttcgatg gcggtgatct cgaagcggcc aaagtccatc 1680

tccgccagga atttcacgcg tggaacaagc gttgcccagg aaagccgatc atgatcactg 1740

agtacggcgc agacaccgtt gcgggctttc acgacattga tccagtgatg ttcaccgagg 1800

aatatcaagt cgagtactac caggcgaacc acgtcgtgtt cgatgagttt gagaacttcg 1860

tgggtgagca agcgtggaac ttcgcggact tcgcgacctc tcagggcgtg atgcgcgtcc 1920

aaggaaacaa gaagggcgtg ttcactcgtg accgcaagcc gaagctcgcc gcgcacgtct 1980

ttcgcgagcg ctggaccaac attccagatt tcggctacaa gaacgctagc catcaccatc 2040

accatcacgt gtgaattggt gaccagctcg aatttccccg atcgttcaaa catttggcaa 2100

taaagtttct taagattgaa tcctgttgcc ggtcttgcga tgattatcat ataatttctg 2160

ttgaattacg ttaagcatgt aataattaac atgtaatgca tgacgttatt tatgagatgg 2220

gtttttatga ttagagtccc gcaattatac atttaatacg cgatagaaaa caaaatatag 2280

cgcgcaaact aggataaatt atcgcgcgcg gtgtcatcta tgttactaga tcgggaatta 2340

aactatcagt gtttgacagg atatattggc gggtaaacct aagagaaaag agcgtttatt 2400

agaataacgg atatttaaaa gggcgtgaaa aggtttatcc gttcgtccat ttgtatgtgc 2460

atgccaacca cagggttccc ctcgggatca aagtactttg atccaacccc tccgctgcta 2520

tagtgcagtc ggcttctgac gttcagtgca gccgtcttct gaaaacgaca tgtcgcacaa 2580

gtcctaagtt acgcgacagg ctgccgccct gcccttttcc tggcgttttc ttgtcgcgtg 2640

ttttagtcgc ataaagtaga atacttgcga ctagaaccgg agacattacg ccatgaacaa 2700

gagcgccgcc gctggcctgc tgggctatgc ccgcgtcagc accgacgacc aggacttgac 2760

caaccaacgg gccgaactgc acgcggccgg ctgcaccaag ctgttttccg agaagatcac 2820

cggcaccagg cgcgaccgcc cggagctggc caggatgctt gaccacctac gccctggcga 2880

cgttgtgaca gtgaccaggc tagaccgcct ggcccgcagc acccgcgacc tactggacat 2940

tgccgagcgc atccaggagg ccggcgcggg cctgcgtagc ctggcagagc cgtgggccga 3000

caccaccacg ccggccggcc gcatggtgtt gaccgtgttc gccggcattg ccgagttcga 3060

gcgttcccta atcatcgacc gcacccggag cgggcgcgag gccgccaagg cccgaggcgt 3120

gaagtttggc ccccgcccta ccctcacccc ggcacagatc gcgcacgccc gcgagctgat 3180

cgaccaggaa ggccgcaccg tgaaagaggc ggctgcactg cttggcgtgc atcgctcgac 3240

cctgtaccgc gcacttgagc gcagcgagga agtgacgccc accgaggcca ggcggcgcgg 3300

tgccttccgt gaggacgcat tgaccgaggc cgacgccctg gcggccgccg agaatgaacg 3360

ccaagaggaa caagcatgaa accgcaccag gacggccagg acgaaccgtt tttcattacc 3420

gaagagatcg aggcggagat gatcgcggcc gggtacgtgt tcgagccgcc cgcgcacgtc 3480

tcaaccgtgc ggctgcatga aatcctggcc ggtttgtctg atgccaagct ggcggcctgg 3540

ccggccagct tggccgctga agaaaccgag cgccgccgtc taaaaaggtg atgtgtattt 3600

gagtaaaaca gcttgcgtca tgcggtcgct gcgtatatga tgcgatgagt aaataaacaa 3660

atacgcaagg ggaacgcatg aaggttatcg ctgtacttaa ccagaaaggc gggtcaggca 3720

agacgaccat cgcaacccat ctagcccgcg ccctgcaact cgccggggcc gatgttctgt 3780

tagtcgattc cgatccccag ggcagtgccc gcgattgggc ggccgtgcgg gaagatcaac 3840

cgctaaccgt tgtcggcatc gaccgcccga cgattgaccg cgacgtgaag gccatcggcc 3900

ggcgcgactt cgtagtgatc gacggagcgc cccaggcggc ggacttggct gtgtccgcga 3960

tcaaggcagc cgacttcgtg ctgattccgg tgcagccaag cccttacgac atatgggcca 4020

ccgccgacct ggtggagctg gttaagcagc gcattgaggt cacggatgga aggctacaag 4080

cggcctttgt cgtgtcgcgg gcgatcaaag gcacgcgcat cggcggtgag gttgccgagg 4140

cgctggccgg gtacgagctg cccattcttg agtcccgtat cacgcagcgc gtgagctacc 4200

caggcactgc cgccgccggc acaaccgttc ttgaatcaga acccgagggc gacgctgccc 4260

gcgaggtcca ggcgctggcc gctgaaatta aatcaaaact catttgagtt aatgaggtaa 4320

agagaaaatg agcaaaagca caaacacgct aagtgccggc cgtccgagcg cacgcagcag 4380

caaggctgca acgttggcca gcctggcaga cacgccagcc atgaagcggg tcaactttca 4440

gttgccggcg gaggatcaca ccaagctgaa gatgtacgcg gtacgccaag gcaagaccat 4500

taccgagctg ctatctgaat acatcgcgca gctaccagag taaatgagca aatgaataaa 4560

tgagtagatg aattttagcg gctaaaggag gcggcatgga aaatcaagaa caaccaggca 4620

ccgacgccgt ggaatgcccc atgtgtggag gaacgggcgg ttggccaggc gtaagcggct 4680

gggttgtctg ccggccctgc aatggcactg gaacccccaa gcccgaggaa tcggcgtgac 4740

ggtcgcaaac catccggccc ggtacaaatc ggcgcggcgc tgggtgatga cctggtggag 4800

aagttgaagg ccgcgcaggc cgcccagcgg caacgcatcg aggcagaagc acgccccggt 4860

gaatcgtggc aagcggccgc tgatcgaatc cgcaaagaat cccggcaacc gccggcagcc 4920

ggtgcgccgt cgattaggaa gccgcccaag ggcgacgagc aaccagattt tttcgttccg 4980

atgctctatg acgtgggcac ccgcgatagt cgcagcatca tggacgtggc cgttttccgt 5040

ctgtcgaagc gtgaccgacg agctggcgag gtgatccgct acgagcttcc agacgggcac 5100

gtagaggttt ccgcagggcc ggccggcatg gccagtgtgt gggattacga cctggtactg 5160

atggcggttt cccatctaac cgaatccatg aaccgatacc gggaagggaa gggagacaag 5220

cccggccgcg tgttccgtcc acacgttgcg gacgtactca agttctgccg gcgagccgat 5280

ggcggaaagc agaaagacga cctggtagaa acctgcattc ggttaaacac cacgcacgtt 5340

gccatgcagc gtacgaagaa ggccaagaac ggccgcctgg tgacggtatc cgagggtgaa 5400

gccttgatta gccgctacaa gatcgtaaag agcgaaaccg ggcggccgga gtacatcgag 5460

atcgagctag ctgattggat gtaccgcgag atcacagaag gcaagaaccc ggacgtgctg 5520

acggttcacc ccgattactt tttgatcgat cccggcatcg gccgttttct ctaccgcctg 5580

gcacgccgcg ccgcaggcaa ggcagaagcc agatggttgt tcaagacgat ctacgaacgc 5640

agtggcagcg ccggagagtt caagaagttc tgtttcaccg tgcgcaagct gatcgggtca 5700

aatgacctgc cggagtacga tttgaaggag gaggcggggc aggctggccc gatcctagtc 5760

atgcgctacc gcaacctgat cgagggcgaa gcatccgccg gttcctaatg tacggagcag 5820

atgctagggc aaattgccct agcaggggaa aaaggtcgaa aaggtctctt tcctgtggat 5880

agcacgtaca ttgggaaccc aaagccgtac attgggaacc ggaacccgta cattgggaac 5940

ccaaagccgt acattgggaa ccggtcacac atgtaagtga ctgatataaa agagaaaaaa 6000

ggcgattttt ccgcctaaaa ctctttaaaa cttattaaaa ctcttaaaac ccgcctggcc 6060

tgtgcataac tgtctggcca gcgcacagcc gaagagctgc aaaaagcgcc tacccttcgg 6120

tcgctgcgct ccctacgccc cgccgcttcg cgtcggccta tcgcggccgc tggccgctca 6180

aaaatggctg gcctacggcc aggcaatcta ccagggcgcg gacaagccgc gccgtcgcca 6240

ctcgaccgcc ggcgcccaca tcaaggcacc ctgcctcgcg cgtttcggtg atgacggtga 6300

aaacctctga cacatgcagc tcccggagac ggtcacagct tgtctgtaag cggatgccgg 6360

gagcagacaa gcccgtcagg gcgcgtcagc gggtgttggc gggtgtcggg gcgcagccat 6420

gacccagtca cgtagcgata gcggagtgta tactggctta actatgcggc atcagagcag 6480

attgtactga gagtgcacca tatgcggtgt gaaataccgc acagatgcgt aaggagaaaa 6540

taccgcatca ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg 6600

ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg 6660

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cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct 6840

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gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc 7020

tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca 7080

ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag 7140

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ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc 7260

accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga 7320

tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca 7380

cgttaaggga ttttggtcat gcattctagg tactaaaaca attcatccag taaaatataa 7440

tattttattt tctcccaatc aggcttgatc cccagtaagt caaaaaatag ctcgacatac 7500

tgttcttccc cgatatcctc cctgatcgac cggacgcaga aggcaatgtc ataccacttg 7560

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atgttgctgt ctcccaggtc gccgtgggaa aagacaagtt cctcttcggg cttttccgtc 7680

tttaaaaaat catacagctc gcgcggatct ttaaatggag tgtcttcttc ccagttttcg 7740

caatccacat cggccagatc gttattcagt aagtaatcca attcggctaa gcggctgtct 7800

aagctattcg tatagggaca atccgatatg tcgatggagt gaaagagcct gatgcactcc 7860

gcatacagct cgataatctt ttcagggctt tgttcatctt catactcttc cgagcaaagg 7920

acgccatcgg cctcactcat gagcagattg ctccagccat catgccgttc aaagtgcagg 7980

acctttggaa caggcagctt tccttccagc catagcatca tgtccttttc ccgttccaca 8040

tcataggtgg tccctttata ccggctgtcc gtcattttta aatataggtt ttcattttct 8100

cccaccagct tatatacctt agcaggagac attccttccg tatcttttac gcagcggtat 8160

ttttcgatca gttttttcaa ttccggtgat attctcattt tagccattta ttatttcctt 8220

cctcttttct acagtattta aagatacccc aagaagctaa ttataacaag acgaactcca 8280

attcactgtt ccttgcattc taaaacctta aataccagaa aacagctttt tcaaagttgt 8340

tttcaaagtt ggcgtataac atagtatcga cggagccgat tttgaaaccg cggtgatcac 8400

aggcagcaac gctctgtcat cgttacaatc aacatgctac cctccgcgag atcatccgtg 8460

tttcaaaccc ggcagcttag ttgccgttct tccgaatagc atcggtaaca tgagcaaagt 8520

ctgccgcctt acaacggctc tcccgctgac gccgtcccgg actgatgggc tgcctgtatc 8580

gagtggtgat tttgtgccga gctgccggtc ggggagctgt tggctggctg gtggcaggat 8640

atattgtggt gtaaacaaat tgacgcttag acaacttaat aacacattgc ggacgttttt 8700

aatgtactga attaacgccg aattaattcg ggggatctgg attttagtac tggattttgg 8760

ttttaggaat tagaaatttt attgatagaa gtattttaca aatacaaata catactaagg 8820

gtttcttata tgctcaacac atgagcgaaa ccctatagga accctaattc ccttatctgg 8880

gaactactca cacattatta tggagaaact cgagcttgtc gatcgacaga tccggtcggc 8940

atctactcta tttctttgcc ctcggacgag tgctggggcg tcggtttcca ctatcggcga 9000

gtacttctac acagccatcg gtccagacgg ccgcgcttct gcgggcgatt tgtgtacgcc 9060

cgacagtccc ggctccggat cggacgattg cgtcgcatcg accctgcgcc caagctgcat 9120

catcgaaatt gccgtcaacc aagctctgat agagttggtc aagaccaatg cggagcatat 9180

acgcccggag tcgtggcgat cctgcaagct ccggatgcct ccgctcgaag tagcgcgtct 9240

gctgctccat acaagccaac cacggcctcc agaagaagat gttggcgacc tcgtattggg 9300

aatccccgaa catcgcctcg ctccagtcaa tgaccgctgt tatgcggcca ttgtccgtca 9360

ggacattgtt ggagccgaaa tccgcgtgca cgaggtgccg gacttcgggg cagtcctcgg 9420

cccaaagcat cagctcatcg agagcctgcg cgacggacgc actgacggtg tcgtccatca 9480

cagtttgcca gtgatacaca tggggatcag caatcgcgca tatgaaatca cgccatgtag 9540

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ccgcagcgat cgcatccata gcctccgcga ccggttgtag aacagcgggc agttcggttt 9660

caggcaggtc ttgcaacgtg acaccctgtg cacggcggga gatgcaatag gtcaggctct 9720

cgctaaactc cccaatgtca agcacttccg gaatcgggag cgcggccgat gcaaagtgcc 9780

gataaacata acgatctttg tagaaaccat cggcgcagct atttacccgc aggacatatc 9840

cacgccctcc tacatcgaag ctgaaagcac gagattcttc gccctccgag agctgcatca 9900

ggtcggagac gctgtcgaac ttttcgatca gaaacttctc gacagacgtc gcggtgagtt 9960

caggcttttt catatctcat tgccccccgg gatctgcgaa agctcgagag agatagattt 10020

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gaggaaggtc ttgcgaagga tagtgggatt gtgcgtcatc ccttacgtca gtggagatat 10140

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tcgtgggtgg gggtccatct ttgggaccac tgtcggcaga ggcatcttga acgatagcct 10260

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tgaagtgaca gatagctggg caatggaatc cgaggaggtt tcccgatatt accctttgtt 10380

gaaaagtctc aatagccctt tggtcttctg agactgtatc tttgatattc ttggagtaga 10440

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cggcagaggc atcttgaacg atagcctttc ctttatcgca atgatggcat ttgtaggtgc 10620

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ctgtatcttt gatattcttg gagtagacga gagtgtcgtg ctccaccatg ttggcaagct 10800

gctctagcca atacgcaaac cgcctctccc cgcgcgttgg ccgattcatt aatgcagctg 10860

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aattgtgagc ggataacaat ttcacacagg aaacagctat gaccatgatt acgaattcaa 11040

ggaatcttta aacatacgaa cagatcactt aaagttcttc tgaagcaact taaagttatc 11100

aggcatgcat ggatcttgga ggaatcagat gtgcagtcag ggaccatagc acaagacagg 11160

cgtcttctac tggtgctacc agcaaatgct ggaagccggg aacactgggt acgtcggaaa 11220

ccacgtgatg tgaagaagta agataaactg taggagaaaa gcatttcgta gtgggccatg 11280

aagcctttca ggacatgtat tgcagtatgg gccggcccat tacgcaattg gacgacaaca 11340

aagactagta ttagtaccac ctcggctatc cacatagatc aaagctgatt taaaagagtt 11400

gtgcagatga tccgtggcag ctcgcaggtg aacacaacac ctgcacacgt tttagagcta 11460

gaaatagcaa gttaaaataa ggctagtccg ttatcaactt gaaaaagtgg caccgagtcg 11520

gtgctttttt tggtacccgg ggatccgggc tgcagtgcag cgtgacccgg tcgtgcccct 11580

ctctagagat aatgagcatt gcatgtctaa gttataaaaa attaccacat attttttttg 11640

tcacacttgt ttgaagtgca gtttatctat ctttatacat atatttaaac tttactctac 11700

gaataatata atctatagta ctacaataat atcagtgttt tagagaatca tataaatgaa 11760

cagttagaca tggtctaaag gacaattgag tattttgaca acaggactct acagttttat 11820

ctttttagtg tgcatgtgtt ctcctttttt tttgcaaata gcttcaccta tataatactt 11880

catccatttt attagtacat ccatttaggg tttagggtta atggttttta tagactaatt 11940

tttttagtac atctatttta ttctatttta gcctctaaat taagaaaact aaaactctat 12000

tttagttttt ttatttaata atttagatat aaaatagaat aaaataaagt gactaaaaat 12060

taaacaaata ccctttaaga aattaaaaaa actaaggaaa catttttctt gtttcgagta 12120

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tggtggattt attaattttg gatctgtatg tgtgtgccat acatattcat agttacgaat 13020

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ggtcgttcat tcgttctaga tcggagtaga atactgtttc aaactacctg gtgtatttat 13200

taattttgga actgtatgtg tgtgtcatac atcttcatag ttacgagttt aagatggatg 13260

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atggcatatg cagcatctat tcatatgctc taaccttgag tacctatcta ttataataaa 13380

caagtatgtt ttataattat tttgatcttg atatacttgg atgatggcat atgcagcagc 13440

tatatgtgga tttttttagc cctgccttca tacgctattt atttgcttgg tactgtttct 13500

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atggcattag agacaagcaa tcagggaaga caatccttga ctttttgaag tctgatggct 15660

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aggatttcca attttataag gtgcgcgaga tcaacaatta tcaccatgct catgacgcat 16560

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ctatgcctca agtgaatatt gtcaagaaga ctgaagtcca gacgggcggg ttctcaaagg 16920

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gcccagagga taacgaacag aagcaactgt ttgtggagca acacaagcat tatcttgacg 17400

agatcattga acagatttcg gagttcagta agcgcgtcat cctcgccgac gcgaatttgg 17460

ataaggttct ctcagcctac aacaagcacc gggacaagcc tatcagagag caggcggaaa 17520

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acactacgat tgatcggaag agatacactt ctacgaagga ggtgctggat gcaaccctta 17640

tccaccaatc gattactggc ctctacgaga cgcggatcga cttgagtcag ctcggggggg 17700

ataagagacc agcggcaacc aagaaggcag gacaagcgaa gaagaagaag tagcaattcg 17760

gtacgctgaa atcaccagtc tctctctaca aatctatctc tctctatttt ctccataaat 17820

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ttgagcatat aagaaaccct tagtatgtat ttgtatttgt aaaatacttc tatcaataaa 17940

atttctaatt cctaaaacca aaatccagta ctaaaatcca gatctcctaa agtccctata 18000

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tcgaagctag aagtaccgct taggcaggag gccgttaggg aaaagatgct aaggcagggt 18120

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accccctaat aaccccttat caatttaaga aataatccgc ataagccccc gcttaaaaat 18360

tggtatcaga gccatgaata ggtctatgac caaaactcaa gaggataaaa cctcaccaaa 18420

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cttcccaaca gttgcgcagc ctgaatggcg aatgctagag cagcttgagc ttggatcaga 18660

ttgtcgtttc ccgccttcag tttagcttca tggagtcaaa gattcaaata gaggacctaa 18720

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aagatacagt ctcagaagac caaagggcaa ttgagacttt tcaacaaagg gtaatatccg 18900

gaaacctcct cggattccat tgcccagcta tctgtcactt tattgtgaag atagtggaaa 18960

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gggatgacgc acaatcccac tatccttcgc aagacccttc ctctatataa ggaagttcat 19200

ttcatttgga gagaacacgg gggactcttg ac 19232

<210>2

<211>38

<212>DNA

<213>人工合成

<400>2

ccatgattac gaattcaagg aatctttaaa catacgaa 38

<210>3

<211>46

<212>DNA

<213>人工合成

<400>3

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<210>4

<211>41

<212>DNA

<213>人工合成

<400>4

ccggggatcc tctagaatgg cccctaagaa gaagagaaag g 41

<210>5

<211>41

<212>DNA

<213>人工合成

<400>5

ggccagtgcc aagctttttg atcttgaaag atcttttatc t 41

<210>6

<211>41

<212>DNA

<213>人工合成

<400>6

tggtacccgg ggatccgggc tgcagtgcag cgtgacccgg t 41

<210>7

<211>41

<212>DNA

<213>人工合成

<400>7

taggggccat tctagactgc agaagtaaca ccaaacaaca g 41

Claims (10)

1.一种能够快速构建植物基因定点敲除载体的新反应体系，其特征在于，包括：

(1)基于CRISPR-Cas系统的载体，所述载体具有如下特征的DNA分子：在农杆菌侵染法转化到植物后，能够同时实现OsU3启动子驱动SgRNA的转录和Ubiquitin启动子驱动Cas9蛋白表达的载体；

(2)限制性内切酶Aar Ⅰ；

(3)限制性内切酶Aar Ⅰ反应所需的buffer和Oligo；

(4)靶基因位点特异性的DNA双链；

(5)T4DNA连接酶及该酶反应所需的ATP。

2.根据权利要求1所述的反应体系，其特征在于，包括：①基于CRISPR-Cas系统的载体50-120ng；②限制性内切酶Aar Ⅰ的10X buffer 0.5-1.5μL；③限制性内切酶Aar Ⅰ的50XOligo 0.1-0.3μL；④靶位点双链DNA 0.5-1.5μL；⑤限制性内切酶Aar Ⅰ0.1-0.3μL；⑥T4DNA连接酶0.05-0.15μL；⑦ATP0.5-1.5μL。

3.根据权利要求1所述的反应体系，其特征在于，包括：①基于CRISPR-Cas系统的载体100ng；②限制性内切酶Aar Ⅰ的10X buffer 1μL；③限制性内切酶Aar Ⅰ的50X Oligo 0.2μL；④靶位点双链DNA 1μL；⑤限制性内切酶Aar Ⅰ0.2μL；⑥T4DNA连接酶0.1μL；⑦ATP 1μL,加水至总体积10μL。

4.根据权利要求1所述的反应体系，其特征在于，所述的基于CRISPR-Cas系统的载体，包含有OsU3启动子序列、编码SgRNA序列、Ubiquitin启动子序列和编码Cas9蛋白的序列，其中：OsU3启动子序列，位于编码SgRNA序列的上游，同时包含Ubiquitin启动子序列，位于编码Cas9蛋白的序列上游。

5.根据权利要求1所述的反应体系，其特征在于，所述的基于CRISPR-Cas系统的载体，骨架载体为植物表达载体pCAMBIA1305.1，在所述载体pCAMBIA1305.1上整合OsU3启动子序列、编码SgRNA序列、Ubiquitin启动子序列和编码Cas9蛋白的序列，其中：OsU3启动子序列位于编码SgRNA序列的上游，Ubiquitin启动子序列，位于编码Cas9蛋白序列的上游。

6.根据权利要求1所述的反应体系，其特征在于，所述的基于CRISPR-Cas系统的载体，具体如SEQ ID NO：1所示。

7.权利要求1-6任一项所述的反应体系在构建植物基因定点敲除载体或在植物基因敲除或在构建基因定点敲除转基因植物中的应用。

8.权利要求1-6任一项所述的反应体系在构建单子叶植物基因定点敲除载体或在单子叶植物基因敲除或在构建基因定点敲除转基因单子叶植物中的应用。

9.权利要求1-6任一项所述的反应体系在构建水稻基因定点敲除载体或在水稻基因敲除或在构建基因定点敲除转基因水稻中的应用。

10.一种快速构建植物基因定点敲除载体的方法，其特征在于，将权利要求1-6任一项所述的反应体系置于35-38℃反应4-6分钟，15-17℃反应4-6分钟，经过5-10个循环后反应产物直接用于转化感受态细胞。