CN110423772B - 一种用于鲍曼不动杆菌胞嘧啶碱基编辑质粒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于鲍曼不动杆菌胞嘧啶碱基编辑的质粒，其特征在于，所述质粒命名为pBECAb，其序列为SEQ ID NO：1。本发明能够快速且高效地对各种鲍曼不动杆菌株进行碱基编辑，无需使用同源修复模板，便可实现胞嘧啶碱基向胸腺嘧啶碱基的定向转变。当编辑位点含有密码子对应的CAA、CAG、CGA、TGG(反义链)序列时，能够将其转变为终止密码子对应的TAA、TAG、TGA序列，实现基因失活。所述的技术对于鲍曼不动杆菌耐药机制、感染治疗、药物靶标发现及生理功能研究等方面具有广阔的应用前景。

Description

一种用于鲍曼不动杆菌胞嘧啶碱基编辑质粒及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种用于鲍曼不动杆菌胞嘧啶碱基编辑的质粒及其应用。
背景技术
鲍曼不动杆菌是一种革兰氏阴性人类病原菌，能够引发多种的医院获得性感染疾病，危害性极为严重。鲍曼不动杆菌具有很强的耐药能力，并且还能从外界环境中不断摄取耐药基因，获得对包括碳青霉烯和多粘菌素类抗生素在内的多种、甚至所有种类抗生素的抵抗能力。随着近几十年来抗生素的广泛使用，多重耐药性甚至全耐药性鲍曼不动杆菌造成的临床感染病例正快速增加，对人类健康造成了严重威胁。目前，世界卫生组织(WHO)已将鲍曼不动杆菌列为世界上最具耐药性的、最能威胁人类健康的十二大"超级细菌"之首，强调了鲍曼不动杆菌感染的严重性，以及开发鲍曼不动杆菌新型治疗方法的重要性和迫切性。
鲍曼不动杆菌新型治疗方法的开发，离不开DNA分子水平的基因功能解析和耐药机理研究。然而，利用传统遗传操作工具对鲍曼不动杆菌的基因功能进行研究，具有速度慢、效率低和工作量大等缺点，严重制约了研究进度。目前，基于CRISPR-Cas9技术的新一代基因组编辑工具已成功应用于鲍曼不动杆菌的基因组编辑，该工具通过切割鲍曼不动杆菌的基因组DNA，产生致死性的基因组DNA双链断裂，同时导入人工修饰的同源片段，利用重组酶系统的同源重组修复功能，达到菌株筛选和定向编辑的目的。但该方法只适用于对鲍曼不动杆菌基因组上的基因进行编辑，而难以对质粒上的基因进行编辑，因为质粒DNA的双链断裂不会影响到细菌的存活，极易造成质粒的丢失而非基因编辑。然而，鲍曼不动杆菌中很多与抗生素耐药相关的基因都定位于内源质粒上，基于DNA双链断裂的CRISPR-Cas9基因组编辑技术难以对其进行编辑。
最近发展起来的碱基编辑技术，不依赖于基因组DNA双链断裂和同源重组，直接催化DNA碱基的定向转变，为鲍曼不动杆菌的基因功能研究提供了新的思路。该方法在原有Cas9核酸酶的基础上，将可切割DNA双链的Cas9核酸酶突变为只能切割DNA单链的Cas9缺刻酶(Cas9(D10A))或丧失DNA切割功能的dCas9(Cas9(D10A，H840A))，并融合胞嘧啶脱氨酶或腺嘌呤脱氨酶，分别实现胞嘧啶碱基向胸腺嘧啶碱基(C→T)的转变或腺嘌呤碱基向鸟嘌呤碱基(A→G)的转变。该方法在编辑过程中不会产生DNA双链断裂，因而可以对包括位于质粒上的基因在内的所有基因进行定向碱基编辑。其中，胞嘧啶碱基编辑器可以将密码子对应的CAA、CAG、CGA、TGG(反义链)序列转变为终止密码子对应的TAA、TAG、TGA序列。在基因中引入提前出现的终止密码子时，会提前终止基因的蛋白翻译，达到与基因敲除相同的功能，实现基因失活。
目前已报道的胞嘧啶碱基编辑系统具有较大的局限性，不能直接用于鲍曼不动杆菌的胞嘧啶碱基编辑。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于鲍曼不动杆菌胞嘧啶碱基编辑的质粒及其应用。
为了达到上述目的，本发明提供了一种用于鲍曼不动杆菌胞嘧啶碱基编辑的质粒，其特征在于，所述质粒能够表达APOBEC1-XTEN-Cas9(D10A)融合蛋白和sgRNA。
优选地，所述质粒能够在大肠杆菌和鲍曼不动杆菌中复制传代。
优选地，所述质粒具有阿布拉霉素抗性。
优选地，所述质粒包含用于鲍曼不动杆菌中表达APOBEC1-XTEN-Cas9(D10A)融合蛋白基因的启动子、用于表达sgRNA的启动子、Cas9(D10A)、APOBEC1、XTEN。
优选地，所述质粒包含阿布拉霉素抗性基因片段。
优选地，所述质粒包含WH1266质粒复制子DNA片段。
优选地，所述质粒包含ColE1质粒复制子DNA片段。
一种用于鲍曼不动杆菌胞嘧啶碱基编辑的质粒，其特征在于，所述质粒命名为pBECAb，其序列为SEQ ID NO：1。
本发明还提供上述的pBECAb质粒在实现鲍曼不动杆菌中碱基编辑的应用，其特征在于，将胞嘧啶碱基向胸腺嘧啶碱基转变。
优选地，所述的基因为tynA基因。
本发明还提供上述的pBECAb质粒在鲍曼不动杆菌中实现基因失活的应用。
优选地，所述的基因为blaTEM-1D基因。
优选地，所述的鲍曼不动杆菌株为鲍曼不动杆菌ATCC17978或XH386菌株。
本发明还提供了含有上述的pBECAb质粒的大肠杆菌DH5alpha菌株，其分类命名是：大肠埃希氏菌；拉丁文学名：Escherichia coli；保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏编号为：CCTCC M 2019466。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明涉及在鲍曼不动杆菌中基于CRISPR-Cas9系统与APOBEC1胞嘧啶脱氨酶形成的pBECAb质粒以及相关应用。本发明的质粒能够在不使用同源修复模板的情况下，直接将胞嘧啶碱基(C)转变为胸腺嘧啶碱基(T)，实现碱基编辑。当编辑位点存在密码子对应的CAA、CAG、CGA或TGG(反义链)序列时，pBECAb质粒通过将其转变为终止密码子对应的TAA、TAG或TGA序列，还可以实现高效的基因失活。
pBECAb单质粒碱基编辑系统的开发，能够显著简化鲍曼不动杆菌的基因编辑流程、扩大可编辑基因范围，加速鲍曼不动杆菌的基因功能研究，对于针对鲍曼不动杆菌的新型治疗方法等方面具有重要意义。该系统在鲍曼不动杆菌的基因功能解析、药物靶点筛选和新型治疗方法开发等方面具有广阔的应用前景。
含有pBECAb质粒的大肠杆菌DH5alpha菌株，分类命名是：大肠埃希氏菌；拉丁文学名：Escherichia coli；保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)；地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山；保藏日期：2019.06.19，保藏号为：CCTCC M 2019466。
附图说明
附图1：质粒pBECAb质粒图谱；
ColE1：质粒在大肠杆菌中的复制子；aprR：大肠杆菌和鲍曼不动杆菌中阿布拉霉素抗性基因；WH1266：质粒在鲍曼不动杆菌中的复制子；sacB：蔗糖敏感基因，用于质粒消除；rpsLSA：用于鲍曼不动杆菌中表达APOBEC1-XTEN-Cas9(D10A)融合蛋白基因的启动子；APOBEC1：胞嘧啶脱氨酶基因；XTEN：柔性蛋白linker；Cas9(D10A)：Cas9缺刻酶基因；J23119：用于表达sgRNA的启动子；spacer：插入的20bp靶点序列，可针对不同的靶点更换序列；bom：控制质粒在大肠杆菌中的拷贝数；
附图2：pBECAb质粒在鲍曼不动杆菌中实现高效碱基编辑；
图A.利用pBECAb质粒在鲍曼不动杆菌中进行胞嘧啶碱基向胸腺嘧啶碱基转变的示意图；
图B.采用pBECAb质粒对鲍曼不动杆菌ATCC17978菌株中富含胞嘧啶碱基的tynA靶点的编辑结果；
附图3：鉴定pBECAb质粒在鲍曼不动杆菌中的碱基编辑活性窗口；
附图4：pBECAb质粒在鲍曼不动杆菌中实现高效基因失活。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
各实施例中使用的生物材料来源如下：
pBECKP-km质粒(购自美国addgene公司，货号：117235)；
pCasKP-apr质粒(购自美国addgene公司，货号：117231)；
pWH1266质粒(购自美国ATCC公司，货号：ATCC77092)；
鲍曼不动杆菌ATCC17978菌株(购自美国ATCC公司，货号：ATCC17978)；
鲍曼不动杆菌XH386菌株(分离自杭州市儿童医院某患者)；
大肠杆菌DH5alpha菌株感受态细胞(购自上海唯地生物技术有限公司，货号：DL1001)。
含有pBECAb质粒的大肠杆菌DH5alpha菌株，分类命名是：大肠埃希氏菌；拉丁文学名：Escherichia coli；保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)；地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山；保藏日期：2019.06.19，保藏号为：CCTCC M 2019466。
各实施例中使用的LB液体培养基购自生工生物工程(上海)股份有限公司，货号：A507002-0250；LB固体培养基购自生工生物工程(上海)股份有限公司，货号：A507003-0250；阿布拉霉素购自生工生物工程(上海)股份有限公司，货号：A600090-0001。
实施例一：pBECAb质粒构建
pBECAb质粒的组成如附图1所示，其序列为SEQ ID NO：1。
pBECAb质粒的具体构建方法如下：
(1)通过聚合酶链式反应(PCR)，从pCasKP-apr质粒中扩增得到阿布拉霉素抗性基因片段aprR。
用于PCR扩增的引物序列为：
aprR-F：5’-TATCTGCGCTCTGCTGAAGCC-3’(SEQ ID NO：2)
aprR-R：5’-GGCCTCGTGATACGCCTATTT-3’(SEQ ID NO：3)
使用Takara公司的PrimerSTAR HS DNA Polymerase对上述aprR片段进行扩增，反应体系为：32μL ddH2O，4μL dNTP Mixture(2.5mM each)，10μL5×Primestar Buffer，1.5μL aprR-F(10μM)，1.5μL aprR-R(10μM)，1μL pCasKP-apr质粒DNA模板(1ng/μL)，0.5μLPrimerSTAR HS DNA Polymerase。体系配置完成后进行PCR扩增，扩增参数为：98℃预变性30s；之后98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸40s，共28个循环；接着72℃完全延伸5min；最后16℃保温。
完成PCR扩增后，使用TAKARA公司的DpnI限制性内切酶消除PCR反应体系中的pCasKP-apr质粒模板，具体操作为：在完成扩增的上一步PCR反应液中加入1μL DpnI酶，使用移液枪吹吸混匀后置于37℃恒温培养箱中温育1h。
(2)通过PCR，从pWH1266质粒中扩增得到WH1266质粒复制子DNA片段。
用于PCR扩增的引物序列为：
WH1266-F：5’-GCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTCGCGCGTTTCG-3’(SEQ ID NO：4)
WH1266-R：5’-CAGGAGGCGCAACTCAAGC-3’(SEQ ID NO：5)
使用Takara公司的PrimerSTAR HS DNA Polymerase对上述WH1266片段进行扩增，反应体系为：32μL ddH2O，4μL dNTP Mixture(2.5mM each)，10μL 5×Primestar Buffer，1.5μL WH1266-F(10μM)，1.5μL WH1266-R(10μM)，1μL pWH1266质粒DNA模板(1ng/μL)，0.5μL PrimerSTAR HS DNA Polymerase。体系配置完成后进行PCR，循环如下：98℃预变性30s；之后98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸1min，共28个循环；接着72℃完全延伸5min；最后16℃保温。
(3)通过PCR，从pBECKP-km质粒中扩增得到除卡那霉素抗性基因片段kmR之外的其他DNA片段。
用于PCR扩增的引物序列为：
BED10A-F：5’-TTGAGTTGCGCCTCCTGCCA-3’(SEQ ID NO：6)
BED10A-R：5’-AGCAGAGCGCAGATACCAAATAC-3’(SEQ ID NO：7)
使用Takara公司的PrimerSTAR HS DNA Polymerase对上述DNA片段进行扩增，反应体系为：32μL ddH2O，4μL dNTP Mixture(2.5mM each)，10μL 5×Primestar Buffer，1.5μL BED10A-F(10μM)，1.5μL BED10A-R(10μM)，1μL pBECKP-km质粒DNA模板(1ng/μL)，0.5μLPrimerSTAR HS DNA Polymerase。体系配置完成后进行PCR，循环如下：98℃预变性30s；之后98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸5min，共28个循环；接着72℃完全延伸5min；最后16℃保温。
(4)使用康宁生物科学(吴江)有限公司产生的AxyPrep PCR清洁试剂盒对上述三管PCR产物分别进行纯化回收。PCR产物纯化的操作步骤按照试剂盒提供的操作说明书进行。然后使用TAKARA公司的In-Fusion HD Cloning Kit试剂盒将上述三种纯化的DNA片段组装成完整的pBECAb质粒，具体的反应体系为：1μL aprR基因片段(50ng/μL)，2μL WH1266片段(60ng/μL)，3μL pBECKP-km质粒片段(30ng/μL)，2μL ddH2O，2μL In-Fusion HDenzyme premix。体系配制完成后进行In-fusion克隆反应，反应条件为：50℃温育15min，然后冰浴至少2min。
将上述10μL In-Fusion反应产物转化到100μL大肠杆菌DH5apha感受态细胞中(上海唯地生物技术有限公司)，转化方法参照附带的说明书进行。接着，取100μL复苏菌液涂布在含有100μg/mL阿布拉霉素的LB固体培养基平板上，待复苏液被固体培养基完全吸收后，将固体培养基平板倒置于37℃恒温培养箱培养约16h至细菌转化子长出。随机挑取几个转化子，经液体扩增培养后抽提质粒DNA并送至金唯智生物科技有限公司进行测序。质粒抽提使用生工生物工程(上海)股份有限公司的SanPrep柱式质粒DNA小量提取试剂盒，抽提步骤参照附带的说明书进行。经测序正确的pBECAb质粒用于下游实验，对应的大肠杆菌DH5apha细菌转化子进行保藏。本发明中，含有正确pBECAb质粒的大肠杆菌DH5alpha菌株已由发明人保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为：CCTCC M 2019466。
该pBECAb质粒的特征在于是一种穿梭质粒，能够在大肠杆菌和鲍曼不动杆菌中复制传代；在于该质粒在大肠杆菌和鲍曼不动杆菌中都具有阿布拉霉素抗性，能够用于菌株筛选；在于该质粒能够在鲍曼不动杆菌中表达APOBEC1-XTEN-Cas9(D10A)融合蛋白和sgRNA，实现胞嘧啶碱基向胸腺嘧啶碱基的转变，并进行基因失活；在于含有两个BsaI酶切位点，能够通过golden gate反应无缝插入spacer序列；在于拥有蔗糖敏感基因sacB，能够在完成碱基编辑后消除鲍曼不动杆菌株中的pBECAb质粒。
实施例二：将spacer片段插入pBECAb质粒
为了使pBECAb质粒能够对鲍曼不动杆菌基因组DNA的特定靶点进行碱基编辑，需要将靶点的spacer序列插入到pBECAb质粒的sgRNA表达基因中，其插入方法如下：
(1)首先在编辑位点处选择一NGG序列(N代表A/T/G/C任意碱基)，NGG序列前的20个碱基即为spacer序列。应注意，spacer序列的GC含量比例应控制在20％-80％，NGG不包含在spacer序列中。为获得更高的编辑效率，编辑位点建议位于spacer序列的3-8位。本步骤的特征在于：为使spacer片段能够无缝插入到pBECAb质粒的sgRNA表达基因中，需要在spacer序列正义链5’端加上tagt接头，以及在需要在spacer序列反义链5’端加上aaac接头，其具体的引物设计模板如下：
正义链引物：5’-tagtNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’
反义链引物：3’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNcaaa-5’
按上述模板设计好的spacer正义链引物和反义链引物送至金唯智生物科技有限公司进行引物合成。
(2)将上述两条合成的spacer引物进行磷酸化，然后通过缓慢退火，以碱基互补配对的方式形成双链DNA片段。具体的磷酸化反应体系为：1μL spacer正义链引物(100μM)，1μL spacer反义链引物(100μM),1μL T4PNK polynucleotide kinase(TAKARA公司)，5μL 10×T4DNA ligase Buffer，42μL ddH2O。应注意，磷酸化反应体系中添加的是含有10mM ATP的T4DNA ligase Buffer。反应条件为：37℃温育30-60min。磷酸化反应结束后，向反应产物中加入0.5μL 5M NaCl溶液，混合均匀后，在PCR仪中进行缓慢退火反应。具体的退火反应条件为：95℃温育5min，然后以每10s降低1℃的速率缓慢降温至25℃，共执行70个循环。反应结束后，使用ddH2O对反应产物进行十倍稀释，用于后续实验。
(3)通过golden gate反应，将上述退火得到的spacer双链DNA片段插入到pBECAb质粒的sgRNA表达基因中。反应体系为：1μL稀释后的spacer双链DNA片段，1μL pBECAb质粒，1μL 10×T4DNA ligase Buffer，0.5μL T4DNA ligase(NEB公司)，0.5μL BsaI-HF(NEB公司)，6μL ddH2O，总体积共10μL。反应条件为：37℃温育3min，16℃温育4min，共25个循环；然后50℃温育5min，最后80℃温育15min。该反应过程在PCR仪中进行。
(4)将golden gate反应产物转化大肠杆菌DH5alpha感受态细胞(上海唯地生物技术有限公司)。转化步骤参照感受态细胞附带的说明书进行，具体为：将10μL反应产物与刚刚融化的100μL大肠杆菌DH5alpha感受态细胞混匀后冰浴30min，然后42℃水浴热激60s，继续冰浴2min后加入800μL不含抗生素的LB液体培养基，置于37℃摇床中复苏40-60min，最后取适量复苏菌液在含有100μg/mL阿布拉霉素的LB固体培养基平板上涂布，倒置于37℃恒温培养箱培养过夜，直至转化子长出。随机挑取一些转化子，经LB液体扩增后使用生工生物工程(上海)股份有限公司的SanPrep柱式质粒DNA小量提取试剂盒提取质粒，并取部分质粒溶液送至金唯智生物科技有限公司进行DNA测序，以验证插入spacer片段的正确性。所使用的测序引物为M13R，序列为：5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’(SEQ ID NO：8)。
实施例三：鲍曼不动杆菌电转感受态细胞制备
用接种环沾取甘油管保藏的鲍曼不动杆菌ATCC17978菌株或XH386菌株，在LB固体培养基平板上划线活化，倒置于37℃恒温培养箱中培养过夜。在平板上挑取一个新鲜的单菌落，接种至5mL不含抗生素的LB液体试管中，在37℃摇床中振荡培养过夜至菌液浑浊。接种1mL菌液至100mL不含抗生素的LB液体中，继续振荡培养至菌液的OD600吸光系数值达到0.5左右时，将菌液置于冰上预冷20min。将预冷的菌液转置到无菌离心管中，在4℃离心机中以3200g离心力离心5min，倒去培养液上清，收集菌体沉淀。接着在离心管中加入40mL预冷的10％无菌甘油，并用无菌枪头轻轻吹吸重悬菌体，然后以相同离心参数再次离心收集菌体沉淀。重复甘油洗涤步骤一次。收集的菌体沉淀重悬于1-2mL预冷的10％无菌甘油中，即为制备完成的鲍曼不动杆菌电转感受态细胞。感受态细胞以50μL等份分装到无菌EP管中，液氮速冻后放入-80℃冰箱保存。
本实施例的特征在于，可以制备任意品种的鲍曼不动杆菌电转感受态细胞，此处仅以鲍曼不动杆菌ATCC17978菌株和XH386菌株为例。
实施例四：将质粒通过电转化转入鲍曼不动杆菌中
从-80℃冰箱中取一管实施例三制备的鲍曼不动杆菌电转感受态细胞，在冰上放置几分钟至细胞溶液融化，然后加入约200ng插入了spacer片段的pBECAb质粒(体积不超过5μL)，使用移液器轻轻吹吸混匀后转移至提前预冷的2mm电转杯(Bio-Rad公司)。擦净电转杯外侧冷凝水后，使用GenePulser Xcell电穿孔仪(Bio-Rad公司)进行电转化。电转化参数为：2.5kV，200Ω，25μF，正常的电击时间为4.8-5.3ms之间。电击后，立即用1mL不含抗生素的LB液体重悬细胞，置于37℃摇床中振荡复苏培养1.5h。取100μL复苏后的菌液涂布在含有100μg/mL阿布拉霉素的LB固体培养基平板上，待菌液被吸收后，于37℃培养箱中倒置培养过夜至转化子长出。
实施例五：pBECAb质粒在鲍曼不动杆菌中实现碱基编辑
通过使用pBECAb质粒，可以在多种鲍曼不动杆菌株中实现对不同基因的高效率胞嘧啶碱基向胸腺嘧啶碱基转变，其转变示意图见附图2A。本实施例以鲍曼不动杆菌ATCC17978菌株为例，对其tynA基因进行碱基编辑。
(1)在tynA基因中选取某一含有多个胞嘧啶碱基的spacer位点，此处选取的spacer位点序列为：5’-ATCGCTACTCCGCTAACTGT-3’(SEQ ID NO：9)。按照实施例二步骤(1)的方法设计tynA_spacer引物序列，具体序列为：tynA-spacer-F：5’-tagtATCGCTACTCCGCTAACTGT-3’(SEQ ID NO：10)tynA-spacer-R：5’-aaacACAGTTAGCGGAGTAGCGAT-3’(SEQ ID NO：11)
在金唯智生物科技有限公司合成上述两条引物，并通过实施例二的步骤将tynA_spacer插入到pBECAb质粒中，得到pBECAb-tynA质粒。
(2)将测序正确的pBECAb-tynA质粒通过实施例四的电转化方法转入到实施例三方法制备的鲍曼不动杆菌ATCC17978电转感受态细胞中，复苏后涂布含有100μg/mL阿布拉霉素的LB固体培养基平板，倒置于37℃恒温培养箱中过夜培养至转化子长出。
(3)随机挑取10个转化子单菌落，通过菌落PCR扩增出含有tynA靶点的DNA片段。此处用于菌落PCR扩增的引物序列为：
tynA-seq-F：5’-ACCTTTCACCCGCTCAATAG-3’(SEQ ID NO：12)
tynA-seq-R：5’-TAGTCTGCAATCACGGCATC-3’(SEQ ID NO：13)
菌落PCR的反应体系为：10μL 2×Estaq Mastermix(康为世纪公司)，0.5μL tynA-seq-F(10μM)，0.5μL tynA-seq-R(10μM)，9μL ddH2O，然后用无菌牙签沾取少量鲍曼不动杆菌转化子菌体至反应体系中作为扩增模板。扩增条件参数为：95℃预变性10min；95℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸40s，共28个循环；然后72℃完全延伸5min，最后进行16℃保温。
(4)随机挑取10个菌落PCR产物送至金唯智生物科技有限公司进行DNA测序，使用tynA-seq-F作为测序引物，检测编辑结果。从附图2B可以看出，鲍曼不动杆菌ATCC17978菌株在tynA基因spacer位点处的原始DNA序列为：5’-AAGTGATCGCTACTCCGCTAACTGTTGGTGGATA-3’(SEQ ID NO：14)，而10个转化子菌落的对应DNA序列分别为：
5’-AAGTGATTGTTATTCCGCTAACTGTTGGTGGATA-3’(SEQ ID NO：15)
5’-AAGTGATCGTTACTTCGCTAACTGTTGGTGGATA-3’(SEQ ID NO：16)
5’-AAGTGATTGTTATTCCGCTAACTGTTGGTGGATA-3’(SEQ ID NO：17)
5’-AAGTGATTGTTATTCCGCTAACTGTTGGTGGATA-3’(SEQ ID NO：18)
5’-AAGTGATCGTTACTCCGCTAACTGTTGGTGGATA-3’(SEQ ID NO：19)
5’-AAGTGATCGTTACTTCGCTAACTGTTGGTGGATA-3’(SEQ ID NO：20)
5’-AAGTGATTGTTACTCCGCTAACTGTTGGTGGATA-3’(SEQ ID NO：21)
5’-AAGTGATTGTTACTTCGCTAACTGTTGGTGGATA-3’(SEQ ID NO：22)
5’-AAGTGATTGTTATTCCGCTAACTGTTGGTGGATA-3’(SEQ ID NO：23)
5’-AAGTGATTGCTACTTTGCTAACTGTTGGTGGATA-3’(SEQ ID NO：24)
通过DNA序列比对可以看出，tynA基因的spacer位点序列中出现了各种碱基编辑结果，其中的多个位置的胞嘧啶碱基均转变为了胸腺嘧啶碱基，表明pBECAb质粒可以在鲍曼不动杆菌中成功实现碱基编辑。
实施例六：pBECAb质粒在鲍曼不动杆菌中活性窗口的鉴定
从附图2B可以看出，pBECAb质粒对tynA靶点编辑后，产生了多种编辑结果，且成功编辑的胞嘧啶碱基位点主要位于tynA靶点的前半部分，表明靶点中不同位置的胞嘧啶碱基编辑效率不同。为了检测pBECAb质粒在鲍曼不动杆菌中对靶点中不同位置的胞嘧啶碱基编辑效率，鉴定其活性窗口，我们系统地设计了8个含有不同胞嘧啶碱基位点的靶点序列，检测pBECAb质粒对这8个靶点中各种位点胞嘧啶碱基的编辑效率。
(1)8个靶点的信息如下：
其中，aceI靶点的序列为：5’-CGACCACCAGTTGCAGCAAA-3’(SEQ ID NO：25)，对应的spacer引物序列为：
aceI-spacer-F：5’-tagtCGACCACCAGTTGCAGCAAA-3’(SEQ ID NO：26)
aceI-spacer-R：5’-aaacTTTGCTGCAACTGGTGGTCG-3’(SEQ ID NO：27)
其中，adeB靶点的序列为：5’-ACTATTCCGTTGTCTGCTCA-3’(SEQ ID NO：28)，对应的spacer引物序列为：
adeB-spacer-F：5’-tagtACTATTCCGTTGTCTGCTCA-3’(SEQ ID NO：29)
adeB-spacer-R：5’-aaacTGAGCAGACAACGGAATAGT-3’(SEQ ID NO：30)
其中，cpdA-1靶点的序列为：5’-CATCAACAACCTGTAGTTGT-3’(SEQ ID NO：31)，对应的spacer引物序列为：
cpdA1-spacer-F：5’-tagtCATCAACAACCTGTAGTTGT-3’(SEQ ID NO：32)cpdA1-spacer-R：5’-aaacACAACTACAGGTTGTTGATG-3’(SEQ ID NO：33)
其中，cpdA-2靶点的序列为：5’-GATTCCCTTAATATCTGGCA-3’(SEQ ID NO：34)，对应的spacer引物序列为：
cpdA2-spacer-F：5’-tagtGATTCCCTTAATATCTGGCA-3’(SEQ ID NO：35)
cpdA2-spacer-R：5’-aaacTGCCAGATATTAAGGGAATC-3’(SEQ ID NO：36)
其中，entE靶点的序列为：5’-GCTTTCTTTCAGTTGTCAGG-3’(SEQ ID NO：37)，对应的spacer引物序列为：
entE-spacer-F：5’-tagtGCTTTCTTTCAGTTGTCAGG-3’(SEQ ID NO：38)
entE-spacer-R：5’-aaacCCTGACAACTGAAAGAAAGC-3’(SEQ ID NO：39)
其中，oxyR-1靶点的序列为：5’-CGTCTCATTTTGCTTGAAGA-3’(SEQ ID NO：40)，对应的spacer引物序列为：
oxyR1-spacer-F：5’-tagtCGTCTCATTTTGCTTGAAGA-3’(SEQ ID NO：41)
oxyR1-spacer-R：5’-aaacTCTTCAAGCAAAATGAGACG-3’(SEQ ID NO：42)
其中，oxyR-2靶点的序列为：5’-TCTACCAACATTGGTTGAGA-3’(SEQ ID NO：43)，对应的spacer引物序列为：
oxyR2-spacer-F：5’-tagtTCTACCAACATTGGTTGAGA-3’(SEQ ID NO：44)
oxyR2-spacer-R：5’-aaacTCTCAACCAATGTTGGTAGA-3’(SEQ ID NO：45)
其中，tynA靶点的序列及spacer引物序列与实施例五步骤(1)中相同。
在金唯智生物科技有限公司合成上述16条引物，并通过实施例二中的步骤分别将各spacer片段插入到pBECAb质粒中，得到相应的各个质粒。
(2)上一步骤的各个质粒经DNA测序验证正确后，使用实施例四中的电转化步骤电转到实施例三方法制备的鲍曼不动杆菌ATCC17978电转感受态细胞中，复苏后涂布含有100μg/mL阿布拉霉素的LB固体培养基平板，倒置于37℃恒温培养箱中过夜培养至转化子长出。为确保实验结果具有统计学意义，每个靶点的编辑实验重复三次。
(3)在固体培养基转化平板中加入1mL无菌水，然后用无菌刮棒刮下平板上生长的所有转化子单菌落，制成菌悬液。使用生工生物工程(上海)股份有限公司生产的Ezup柱式细菌基因组DNA提取试剂盒提取这些菌悬液的基因组DNA，用作PCR扩增模板。
设计并合成用于扩增各个靶点的PCR引物，并且针对每个样品需在一侧引物的5’端添加6个碱基的barcode序列，用于后续的高通量测序结果分析。具体的含barcode扩增引物序列如下：
用于扩增aceI靶点的引物序列为：
aceI-seq-F1：5’-CATTCAAGATCGAGATTAATGCGCGG-3’(SEQ ID NO：46)
aceI-seq-F2：5’-CATTCGAGATCGAGATTAATGCGCGG-3’(SEQ ID NO：47)
aceI-seq-F3：5’-CATTCCAGATCGAGATTAATGCGCGG-3’(SEQ ID NO：48)
aceI-seq-R：5’-CCATGAAGCATTTGCATCCC-3’(SEQ ID NO：49)
用于扩增adeB靶点的引物序列为：
adeB-seq-F1：5’-ATTGGAAATGTCGAAATTGCACCCG-3’(SEQ ID NO：50)
adeB-seq-F2：5’-ATTGGGAATGTCGAAATTGCACCCG-3’(SEQ ID NO：51)
adeB-seq-F3：5’-ATTGGCAATGTCGAAATTGCACCCG-3’(SEQ ID NO：52)
asdeB-seq-R：5’-TTTCACGGCGTTAGCACCC-3’(SEQ ID NO：53)
用于扩增cpdA-1靶点的引物序列为：
cpdA1-seq-F1：5’-CCAATATTTCCAGACCCTCGGTAATC-3’(SEQ ID NO：54)
cpdA1-seq-F2：5’-CCAATGTTTCCAGACCCTCGGTAATC-3’(SEQ ID NO：55)
cpdA1-seq-F3：5’-CCAATCTTTCCAGACCCTCGGTAATC-3’(SEQ ID NO：56)
cpdA1-seq-R：5’-TGGCAAATGGATGGTGATG-3’(SEQ ID NO：57)
用于扩增cpdA-2靶点的引物序列为：
cpdA2-seq-F1：5’-CACATACCATTTCAAAACGTGAAGGC-3’(SEQ ID NO：58
cpdA2-seq-F2：5’-CACATGCCATTTCAAAACGTGAAGGC-3’(SEQ ID NO：59)
cpdA2-seq-F3：5’-CACATCCCATTTCAAAACGTGAAGGC-3’(SEQ ID NO：60)
cpdA2-seq-R：5’-GTAACGATAACCCGGTGCA-3’(SEQ ID NO：61)
用于扩增entE靶点的引物序列为：
entE-seq-F1：5’-AGATTATGCTCAATCATCAAGCTACCG-3’(SEQ ID NO：62)
entE-seq-F2：5’-AGATTGTGCTCAATCATCAAGCTACCG-3’(SEQ ID NO：63)
entE-seq-F3：5’-AGATTCTGCTCAATCATCAAGCTACCG-3’(SEQ ID NO：64)
entE-seq-R：5’-AAACCGCAAATCTCGGCAC-3’(SEQ ID NO：65)
用于扩增oxyR-1靶点的引物序列为：
oxyR1-seq-F1：5’-GTTCAAGCAAATTCACTTGATGATCTCG-3’(SEQ ID NO：66)
oxyR1-seq-F2：5’-GTTCAGGCAAATTCACTTGATGATCTCG-3’(SEQ ID NO：67)
oxyR1-seq-F3：5’-GTTCACGCAAATTCACTTGATGATCTCG-3’(SEQ ID NO：68)
oxyR1-seq-R：5’-CGTCTTCAATTGGTTTTGCAGT-3’(SEQ ID NO：69)
用于扩增oxyR-2靶点的引物序列为：
oxyR2-seq-F1：5’-GCATCACTCATTTTGCTTGAAGAAGGC-3’(SEQ ID NO：70)
oxyR2-seq-F2：5’-GCATCGCTCATTTTGCTTGAAGAAGGC-3’(SEQ ID NO：71)
oxyR2-seq-F3：5’-GCATCCCTCATTTTGCTTGAAGAAGGC-3’(SEQ ID NO：72)
oxyR2-seq-R：5’-TGCTAAAGTACGGCTAGGTGC-3’(SEQ ID NO：73)
用于扩增tynA靶点的引物序列为：
tynA-seq-F1：5’-AGCAGACGCGTAATTGAGACGAGTAAA-3’(SEQ ID NO：74)
tynA-seq-F2：5’-AGCAGGCGCGTAATTGAGACGAGTAAA-3’(SEQ ID NO：75)
tynA-seq-F3：5’-AGCAGCCGCGTAATTGAGACGAGTAAA-3’(SEQ ID NO：76)
tynA-seq-2R：5’-CATCCCCAACATCGAGGTAA-3’(SEQ ID NO：77)
PCR反应体系为：10μL 2×Estaq Mastermix(康为世纪公司)，0.5μL正义链引物(10μM)，0.5μL反义链引物(10μM)，8.5μL ddH2O，0.5μL基因组DNA(50-100ng/μL)。扩增条件参数为：95℃预变性3min；95℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，共28个循环；然后72℃完全延伸5min，最后进行16℃保温。
PCR产物使用Axygen公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒进行纯化，纯化步骤参照试剂盒附带的说明书进行。纯化后的PCR产物等摩尔比混合后，送至金唯智生物科技有限公司进行扩增子高通量测序。
(4)收到高通量测序数据后，首先使用linux系统下的FastQC软件进行测序质量分析，删除质量值低于Q30的序列数据，以保证后续数据分析的准确性。然后使用linux系统下的sabre软件根据预设的barcode序列对各个样品的测序结果进行筛选拆分，对含有相同barcode序列的测序数据进行分组输出，并随机选取5万条测序序列进行统计。本实施例中的所有高通量测序序列已上传至NCBISequence Read Archive(SRA)数据库，登录号为PRJNA522943。
汇总针对8个靶点的24个样品的编辑结果见附图3，通过分析和汇总pBECAb质粒对8个基因靶点碱基编辑的高通量测序结果，鉴定出pBECAb质粒在鲍曼不动杆菌中对位于spacer 3-8位的胞嘧啶碱基具有更高的编辑活性，可以看出pBECAb质粒在鲍曼不动杆菌中对位于靶点3-8位的胞嘧啶具有更高的编辑效率，表明3-8位是pBECAb质粒的编辑活性窗口。
实施例七：pBECAb质粒在鲍曼不动杆菌中实现基因失活
pBECAb质粒介导的碱基编辑，可以在鲍曼不动杆菌中通过产生过早出现的终止密码子，实现对不同基因的高效失活。本实施例以鲍曼不动杆菌XH386菌株为例，将其blaTEM-1D基因第37位谷氨酰胺对应的DNA序列CAG转变为终止密码子对应的DNA序列TAG，实现blaTEM-1D基因失活。
(1)为实现pBECAb质粒介导的基因失活，选取spacer序列时应满足以下要求：①满足实施例二步骤(1)中的spacer选取要求；②3-8位编辑活性窗口内含有的胞嘧啶碱基转变为胸腺嘧啶碱基后可形成不移码的终止密码子对应的TAA、TAG、TGA序列。
按照上述要求，本实验选取的blaTEM-1D基因spacer位点序列为：5’-AGATCAGTTGGGTGCACGAG-3’(SEQ ID NO：78)，对应的引物序列为：blaTEM-1D-spacer-F：5’-tagtAGATCAGTTGGGTGCACGAG-3’(SEQ ID NO：79)blaTEM-1D-spacer-R：5’-aaacCTCGTGCACCCAACTGATCT-3’(SEQ ID NO：80)
在金唯智生物科技有限公司合成上述两条引物，并通过实施例二的步骤将tynA_spacer插入到pBECAb质粒中，得到pBECAb-TEM质粒。
(2)测序验证正确的pBECAb-TEM质粒通过实施例四的电转化方法转入到实施例三中的方法制备的鲍曼不动杆菌XH386电转感受态细胞中，复苏后涂布含有100μg/mL阿布拉霉素的LB固体培养基平板，倒置于37℃恒温培养箱中过夜培养至转化子长出。
(3)随机挑取一个转化子单菌落，通过菌落PCR扩增出含有blaTEM-1D靶点的基因组DNA片段。此处用于菌落PCR扩增的引物序列为：
blaTEM-1D-seq-F：5’-TGGCACTTTTCGGGGAAATG-3’(SEQ ID NO：81)
blaTEM-1D-seq-R：5’-CACGCTCGTCGTTTGGTATG-3’(SEQ ID NO：82)
菌落PCR的反应体系为：10μL 2×Estaq Mastermix(康为世纪公司)，0.5μLblaTEM-1D-seq-F(10μM)，0.5μL blaTEM-1D-seq-R(10μM)，9μL ddH2O，然后用无菌牙签沾取少量鲍曼不动杆菌转化子菌体至反应体系中作为扩增模板。扩增条件参数为：95℃预变性10min；95℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸40s，共28个循环；然后72℃完全延伸5min，最后进行16℃保温。
(4)菌落PCR产物送至金唯智生物科技有限公司进行DNA测序，使用blaTEM-1D-seq-F作为测序引物，检测编辑结果。从附图4可以看出，鲍曼不动杆菌XH386菌株在blaTEM-1D基因spacer位点处的原始DNA序列为：5’-GCTGAAGATCAGTTGGGTGCA-3’(SEQ ID NO：83)，而转化子菌落的对应DNA序列为：5’-GCTGAAGATTAGTTGGGTGCA-3’(SEQ ID NO：84)。通过DNA序列比对可以看出，pBECAb质粒通过将鲍曼不动杆菌XH386菌株的blaTEM-1D基因中第37位谷氨酰胺对应的CAG序列转变为终止密码子对应的TAG序列，实现了blaTEM-1D基因失活。
实施例八：鲍曼不动杆菌中pBECAb质粒的消除
挑取一个已经完成碱基编辑的鲍曼不动杆菌单克隆菌落，接种到不含抗生素的5mL LB液体培养基试管，在37℃摇床中振荡培养过夜。第二天，用无菌接种环沾取过夜培养的菌液，在含5％蔗糖(w/v)的LB固体培养基平板上进行划线接种，然后倒置于37℃恒温培养箱中培养至细菌单菌落长出。因pBECAb质粒中含有蔗糖敏感基因sacB，它表达的分泌型蔗糖果聚糖酶能催化蔗糖水解成葡萄糖和果糖，并且将果糖聚合成有毒的高分子量的果聚糖，造成细菌死亡，因而只有pBECAb质粒发生消除的鲍曼不动杆菌株才能生长。
为进一步确认pBECAb质粒的消除，可随机挑取含5％蔗糖(w/v)的LB固体培养基平板上长出的鲍曼不动杆菌单克隆菌落，依次分别在含有100μg/mL阿布拉霉素和不含抗生素的LB固体培养基平板划线，并倒置于37℃恒温培养箱中培养过夜。若鲍曼不动杆菌株在含有100μg/mL阿布拉霉素的LB固体培养基平板上不能生长，而在不含抗生素的LB固体培养基平板可生长，则确认这些细胞中pBECAb质粒已消除成功，可对这些细胞进行保藏或用于其他实验。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海科技大学
<120> 一种用于鲍曼不动杆菌胞嘧啶碱基编辑质粒及其应用
<130> PCN1191765
<160> 84
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 12095
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pBECAb质粒
<400> 1
ttatttgtta actgttaatt gtccttgttc aaggatgctg tctttgacaa cagatgtttt 60
cttgcctttg atgttcagca ggaagctagg cgcaaacgtt gattgtttgt ctgcgtagaa 120
tcctctgttt gtcatatagc ttgtaatcac gacattgttt cctttcgctt gaggtacagc 180
gaagtgtgag taagtaaagg ttacatcgtt aggatcaaga tccattttta acacaaggcc 240
agttttgttc agcggcttgt atgggccagt taaagaatta gaaacataac caagcatgta 300
aatatcgtta gacgtaatgc cgtcaatcgt catttttgat ccgcgggagt cagtgaacag 360
ataccatttg ccgttcattt taaagacgtt cgcgcgttca atttcatctg ttactgtgtt 420
agatgcaatc agcggtttca tcactttttt cagtgtgtaa tcatcgttta gctcaatcat 480
accgagagcg ccgtttgcta actcagccgt gcgtttttta tcgctttgca gaagtttttg 540
actttcttga cggaagaatg atgtgctttt gccatagtat gctttgttaa ataaagattc 600
ttcgccttgg tagccatctt cagttccagt gtttgcttca aatactaagt atttgtggcc 660
tttatcttct acgtagtgag gatctctcag cgtatggttg tcgcctgagc tgtagttgcc 720
ttcatcgatg aactgctgta cattttgata cgtttttccg tcaccgtcaa agattgattt 780
ataatcctct acaccgttga tgttcaaaga gctgtctgat gctgatacgt taacttgtgc 840
agttgtcagt gtttgtttgc cgtaatgttt accggagaaa tcagtgtaga ataaacggat 900
ttttccgtca gatgtaaatg tggctgaacc tgaccattct tgtgtttggt cttttaggat 960
agaatcattt gcatcgaatt tgtcgctgtc tttaaagacg cggccagcgt ttttccagct 1020
gtcaatagaa gtttcgccga ctttttgata gaacatgtaa atcgatgtgt catccgcatt 1080
tttaggatct ccggctaatg caaagacgat gtggtagccg tgatagtttg cgacagtgcc 1140
gtcagcgttt tgtaatggcc agctgtccca aacgtccagg ccttttgcag aagagatatt 1200
tttaattgtg gacgaatcga actcaggaac ttgatatttt tcattttttt gctgttcagg 1260
gatttgcagc atatcatggc gtgtaatatg ggaaatgccg tatgtttcct tatatggctt 1320
ttggttcgtt tctttcgcaa acgcttgagt tgcgcctcct gccagcagtg cggtagtaaa 1380
ggttaatact gttgcttgtt ttgcaaactt tttgatgttc atcgttcatg tctccttttt 1440
tatgtactgt gttagcggtc tgcttcttcc agccctcctg tttgaagatg gcaagttagt 1500
tacgcacaat aaaaaaagac ctaaaatatg taaggggtga cgccaaagta tacactttgc 1560
cctttacaca ttttaggtct tgcctgcttt atcagtaaca aacccgcgcg atttactttt 1620
cgacctcatt ctattagact ctcgtttgga ttgcaactgg tctattttcc tcttttgttt 1680
gatagaaaat cataaaagga tttgcagact acgggcctaa agaactaaaa aatctatctg 1740
tttcttttca ttctctgtat tttttatagt ttctgttgca tgggcataaa gttgcaagct 1800
tgcaaacatg ctttgggtaa acatgtaggt attaacgtca atgcgacaat agtagcattg 1860
attaaatgag aattagtaag tgttttactt actaaatttt atttaaccta aaaatgaacc 1920
acctggatgt gtgggattaa aaagtgaaga gaggaggaca tatcacatga gtagcgaaac 1980
cggtccggtt gcagtggatc cgaccctgcg ccgtcgcatt gaaccgcacg agtttgaagt 2040
gttctttgat ccgcgcgagc tgcgcaaaga aacttgcctg ctgtacgaga ttaactgggg 2100
tggccgccat agcatctggc gccataccag ccagaacacc aataagcacg tggaagtgaa 2160
ttttattgaa aaatttacca ccgagcgcta cttctgccct aatacccgct gcagcatcac 2220
ctggtttctg agctggagcc cgtgcggcga atgtagtcgc gccattaccg agttcctgag 2280
ccgctatccg catgtgaccc tgttcatcta catcgcccgt ctgtaccatc acgccgatcc 2340
gcgcaatcgc caaggtctgc gtgatctgat tagcagcggt gtgaccatcc agatcatgac 2400
cgaacaagag agcggctatt gctggcgcaa cttcgtgaac tattctccga gcaacgaagc 2460
ccactggccg cgttatccgc atctgtgggt gcgcctgtat gtgctggagc tgtactgcat 2520
catcctgggc ctgccgcctt gcctgaatat tctgcgccgt aaacagccgc aactgacatt 2580
cttcaccatc gcactgcaga gctgccatta tcagcgcctg ccgccgcaca ttttatgggc 2640
caccggtctg aaaagcggta gtgaaactcc gggcacaagc gaaagcgcaa ccccggaaag 2700
tgataagaaa tactcaatag gcttagctat cggcacaaat agcgtcggat gggcggtgat 2760
cactgatgaa tataaggttc cgtctaaaaa gttcaaggtt ctgggaaata cagaccgcca 2820
cagtatcaaa aaaaatctta taggggctct tttatttgac agtggagaga cagcggaagc 2880
gactcgtctc aaacggacag ctcgtagaag gtatacacgt cggaagaatc gtatttgtta 2940
tctacaggag attttttcaa atgagatggc gaaagtagat gatagtttct ttcatcgact 3000
tgaagagtct tttttggtgg aagaagacaa gaagcatgaa cgtcatccta tttttggaaa 3060
tatagtagat gaagttgctt atcatgagaa atatccaact atctatcatc tgcgaaaaaa 3120
attggtagat tctactgata aagcggattt gcgcttaatc tatttggcct tagcgcatat 3180
gattaagttt cgtggtcatt ttttgattga gggagattta aatcctgata atagtgatgt 3240
ggacaaacta tttatccagt tggtacaaac ctacaatcaa ttatttgaag aaaaccctat 3300
taacgcaagt ggagtagatg ctaaagcgat tctttctgca cgattgagta aatcaagacg 3360
attagaaaat ctcattgctc agctccccgg tgagaagaaa aatggcttat ttgggaatct 3420
cattgctttg tcattgggtt tgacccctaa ttttaaatca aattttgatt tggcagaaga 3480
tgctaaatta cagctttcaa aagatactta cgatgatgat ttagataatt tattggcgca 3540
aattggagat caatatgctg atttgttttt ggcagctaag aatttatcag atgctatttt 3600
actttcagat atcctaagag taaatactga aataactaag gctcccctat cagcttcaat 3660
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ttatattgat gggggagcta gccaagaaga attttataaa tttatcaaac caattttaga 3840
aaaaatggat ggtactgagg aattattggt gaaactaaat cgtgaagatt tgctgcgcaa 3900
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ttttgcatgg atgactcgga agtctgaaga aacaattacc ccatggaatt ttgaagaagt 4140
tgtcgataaa ggtgcttcag ctcaatcatt tattgaacgc atgacaaact ttgataaaaa 4200
tcttccaaat gaaaaagtac taccaaaaca tagtttgctt tatgagtatt ttacggttta 4260
taacgaattg acaaaggtca aatatgttac tgaaggaatg cgaaaaccag catttctttc 4320
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taagcaatta aaagaagatt atttcaaaaa aatagaatgt tttgatagtg ttgaaatttc 4440
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taaagataaa gattttttgg ataatgaaga aaatgaagat atcttagagg atattgtttt 4560
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aaaagttgtt gatgaattgg tcaaagtaat ggggcggcat aagccagaaa atatcgttat 4980
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gaaacgaatc gaagaaggta tcaaagaatt aggaagtcag attcttaaag agcatcctgt 5100
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tgttccacaa agtttcctta aagacgattc aatagacaat aaggtcttaa cgcgttctga 5280
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taaatacgat gaaaatgata aacttattcg agaggttaaa gtgattacct taaaatctaa 5580
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ttcagtccta gtggttgcta aggtggaaaa agggaaatcg aagaagttaa aatccgttaa 6180
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tttagaagct aaaggatata aggaagttaa aaaagactta atcattaaac tacctaaata 6300
tagtcttttt gagttagaaa acggtcgtaa acggatgctg gctagtgccg gagaattaca 6360
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gcataagcat tatttagatg agattattga gcaaatcagt gaattttcta agcgtgttat 6540
tttagcagat gccaatttag ataaagttct tagtgcatat aacaaacata gagacaaacc 6600
aatacgtgaa caagcagaaa atattattca tttatttacg ttgacgaatc ttggagctcc 6660
cgctgctttt aaatattttg atacaacaat tgatcgtaaa cgatatacgt ctacaaaaga 6720
agttttagat gccactctta tccatcaatc catcactggt ctttatgaaa cacgcattga 6780
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<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> aprR-R
<400> 3
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<212> DNA
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<220>
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<213> Artificial Sequence
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<223> WH1266-R
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<220>
<223> BED10A-R
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
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<220>
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<211> 24
<212> DNA
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<212> DNA
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<220>
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<220>
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<212> DNA
<213> Acinetobacter baumannii
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aagtgatcgc tactccgcta actgttggtg gata 34
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<211> 34
<212> DNA
<213> Acinetobacter baumannii
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aagtgattgt tattccgcta actgttggtg gata 34
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<211> 34
<212> DNA
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<400> 16
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<211> 34
<212> DNA
<213> Acinetobacter baumannii
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aagtgattgt tattccgcta actgttggtg gata 34
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<212> DNA
<213> Acinetobacter baumannii
<400> 19
aagtgatcgt tactccgcta actgttggtg gata 34
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<212> DNA
<213> Acinetobacter baumannii
<400> 20
aagtgatcgt tacttcgcta actgttggtg gata 34
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<212> DNA
<213> Acinetobacter baumannii
<400> 21
aagtgattgt tactccgcta actgttggtg gata 34
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<212> DNA
<213> Acinetobacter baumannii
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<212> DNA
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<211> 34
<212> DNA
<213> Acinetobacter baumannii
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
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<212> DNA
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<223> adeB-spacer-R
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aaactgagca gacaacggaa tagt 24
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cpdA-1靶点的序列
<400> 31
catcaacaac ctgtagttgt 20
<210> 32
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cpdA1-spacer-F
<400> 32
tagtcatcaa caacctgtag ttgt 24
<210> 33
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cpdA1-spacer-R
<400> 33
aaacacaact acaggttgtt gatg 24
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cpdA-2靶点的序列
<400> 34
gattccctta atatctggca 20
<210> 35
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cpdA2-spacer-F
<400> 35
tagtgattcc cttaatatct ggca 24
<210> 36
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cpdA2-spacer-R
<400> 36
aaactgccag atattaaggg aatc 24
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> entE靶点的序列
<400> 37
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<210> 38
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> entE-spacer-F
<400> 38
tagtgctttc tttcagttgt cagg 24
<210> 39
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> entE-spacer-R
<400> 39
aaaccctgac aactgaaaga aagc 24
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> oxyR-1靶点的序列
<400> 40
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<210> 41
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> oxyR1-spacer-F
<400> 41
tagtcgtctc attttgcttg aaga 24
<210> 42
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> oxyR1-spacer-R
<400> 42
aaactcttca agcaaaatga gacg 24
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> oxyR-2靶点的序列
<400> 43
tctaccaaca ttggttgaga 20
<210> 44
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> oxyR2-spacer-F
<400> 44
tagttctacc aacattggtt gaga 24
<210> 45
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> oxyR2-spacer-R
<400> 45
aaactctcaa ccaatgttgg taga 24
<210> 46
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> aceI-seq-F1
<400> 46
cattcaagat cgagattaat gcgcgg 26
<210> 47
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> aceI-seq-F2
<400> 47
cattcgagat cgagattaat gcgcgg 26
<210> 48
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> aceI-seq-F3
<400> 48
cattccagat cgagattaat gcgcgg 26
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> aceI-seq-R
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ccatgaagca tttgcatccc 20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> adeB-seq-F1
<400> 50
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> adeB-seq-F2
<400> 51
attgggaatg tcgaaattgc acccg 25
<210> 52
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> adeB-seq-F3
<400> 52
attggcaatg tcgaaattgc acccg 25
<210> 53
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> asdeB-seq-R
<400> 53
tttcacggcg ttagcaccc 19
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cpdA1-seq-F1
<400> 54
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<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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ccaatgtttc cagaccctcg gtaatc 26
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<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cpdA1-seq-F3
<400> 56
ccaatctttc cagaccctcg gtaatc 26
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<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cpdA1-seq-R
<400> 57
tggcaaatgg atggtgatg 19
<210> 58
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cpdA2-seq-F1
<400> 58
cacataccat ttcaaaacgt gaaggc 26
<210> 59
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cpdA2-seq-F2
<400> 59
cacatgccat ttcaaaacgt gaaggc 26
<210> 60
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cpdA2-seq-F3
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cacatcccat ttcaaaacgt gaaggc 26
<210> 61
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cpdA2-seq-R
<400> 61
gtaacgataa cccggtgca 19
<210> 62
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> entE-seq-F1
<400> 62
agattatgct caatcatcaa gctaccg 27
<210> 63
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> entE-seq-F2
<400> 63
agattgtgct caatcatcaa gctaccg 27
<210> 64
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> entE-seq-F3
<400> 64
agattctgct caatcatcaa gctaccg 27
<210> 65
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> entE-seq-R
<400> 65
aaaccgcaaa tctcggcac 19
<210> 66
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> oxyR1-seq-F1
<400> 66
gttcaagcaa attcacttga tgatctcg 28
<210> 67
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> oxyR1-seq-F2
<400> 67
gttcaggcaa attcacttga tgatctcg 28
<210> 68
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> oxyR1-seq-F3
<400> 68
gttcacgcaa attcacttga tgatctcg 28
<210> 69
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> oxyR1-seq-R
<400> 69
cgtcttcaat tggttttgca gt 22
<210> 70
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> oxyR2-seq-F1
<400> 70
gcatcactca ttttgcttga agaaggc 27
<210> 71
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> oxyR2-seq-F2
<400> 71
gcatcgctca ttttgcttga agaaggc 27
<210> 72
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> oxyR2-seq-F3
<400> 72
gcatccctca ttttgcttga agaaggc 27
<210> 73
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> oxyR2-seq-R
<400> 73
tgctaaagta cggctaggtg c 21
<210> 74
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tynA-seq-F1
<400> 74
agcagacgcg taattgagac gagtaaa 27
<210> 75
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tynA -seq-F2
<400> 75
agcaggcgcg taattgagac gagtaaa 27
<210> 76
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tynA -seq-F3
<400> 76
agcagccgcg taattgagac gagtaaa 27
<210> 77
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tynA -seq-2R
<400> 77
catccccaac atcgaggtaa 20
<210> 78
<211> 20
<212> DNA
<213> Acinetobacter baumannii
<400> 78
agatcagttg ggtgcacgag 20
<210> 79
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> blaTEM-1D-spacer-F
<400> 79
tagtagatca gttgggtgca cgag 24
<210> 80
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> blaTEM-1D-spacer-R
<400> 80
aaacctcgtg cacccaactg atct 24
<210> 81
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> blaTEM-1D-seq-F
<400> 81
tggcactttt cggggaaatg 20
<210> 82
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> blaTEM-1D-seq-R
<400> 82
cacgctcgtc gtttggtatg 20
<210> 83
<211> 21
<212> DNA
<213> Acinetobacter baumannii
<400> 83
gctgaagatc agttgggtgc a 21
<210> 84
<211> 21
<212> DNA
<213> Acinetobacter baumannii
<400> 84
gctgaagatt agttgggtgc a 21

Claims (7)

1.一种用于鲍曼不动杆菌胞嘧啶碱基编辑的质粒，其特征在于，所述质粒能够表达APOBEC1-XTEN-Cas9融合蛋白和sgRNA；所述质粒命名为pBECAb，其序列为SEQ ID NO：1；所述质粒能够在大肠杆菌和鲍曼不动杆菌中复制传代；所述质粒具有阿布拉霉素抗性；所述质粒包含阿布拉霉素抗性基因片段、WH1266质粒复制子DNA片段以及ColE1质粒复制子DNA片段。
2.如权利要求1所述的用于鲍曼不动杆菌胞嘧啶碱基编辑的质粒，其特征在于，所述质粒包含用于鲍曼不动杆菌中表达APOBEC1-XTEN-Cas9融合蛋白基因的启动子、用于表达sgRNA的启动子、Cas9、APOBEC1、XTEN。
3.权利要求1-2中任一项所述的质粒在实现鲍曼不动杆菌中胞嘧啶碱基编辑的应用，其特征在于，将胞嘧啶碱基向胸腺嘧啶碱基转变。
4.如权利要求3所述的质粒在实现鲍曼不动杆菌中胞嘧啶碱基编辑的应用，其特征在于，在所述鲍曼不动杆菌中胞嘧啶碱基向胸腺嘧啶碱基转变的活性窗口为spacer的3-8位。
5.权利要求1-2中任一项所述的质粒在实现鲍曼不动杆菌中基因失活的应用。
6.如权利要求5所述的质粒在实现鲍曼不动杆菌中基因失活的应用，其特征在于，当编辑位点存在密码子对应的CAG序列时，所述质粒通过将其转变为终止密码子对应的TAG序列，通过蛋白质翻译的提前终止而失活目的基因。
7.含有权利要求1-2中任一项所述的质粒的菌株。
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