KR20170068303A - 프로모터 영역을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오티드, 그를 포함하는 숙주 세포 및 상기 숙주 세포를 이용하여 목적 유전자를 발현시키는 방법 - Google Patents

프로모터 영역을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오티드, 그를 포함하는 숙주 세포 및 상기 숙주 세포를 이용하여 목적 유전자를 발현시키는 방법 Download PDF

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Abstract

초산 생산 박테리아 유래 프로모터 영역을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오티드, 그를 포함하는 숙주 세포 및 상기 숙주 세포를 이용하여 목적 유전자를 발현시키는 방법을 제공한다.

Description

프로모터 영역을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오티드, 그를 포함하는 숙주 세포 및 상기 숙주 세포를 이용하여 목적 유전자를 발현시키는 방법{Isolated polynucleotide comprising promoter region, host cell comprising the same and Method of expressing a target gene using the host cell}
초산 생산 박테리아 유래 프로모터 영역을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오티드, 그를 포함하는 숙주 세포 및 상기 숙주 세포를 이용하여 목적 유전자를 발현시키는 방법에 관한 것이다.
미생물에서 원하는 유전자를 발현시키기 위해서는 발현 프로모터가 필요하다. 프로모터는 DNA가 mRNA로 전사되는 과정에서 RNA 중합효소가 결합하는 부위로, 프로모터의 DNA 염기 서열 및 길이에 따라 RNA 중합효소나 다른 전사인자의 결합 여부 및 강도가 결정된다. 즉, 프로모터는 유전자의 발현 세기 및 조건을 결정하게 된다. 따라서 미생물을 원하는 방향으로 개량하기 위해서는, 우선 원하는 유전자를 원하는 세기로 발현시킬 수 있는 적합한 프로모터가 필요하다.
초산균은 식초의 발효 과정에서 초산을 만드는 박테리아를 통칭한다. 초산 등 여러 유기산을 만들어 내는 능력이 있어 전통적으로 식음료 산업 등에 활용되고 있다. 특히 초산균이 식초 발효 과정에서 만드는 초막이 셀룰로스 성분임이 밝혀졌는데, 이러한 미생물 유래의 셀룰로스는 산업적으로 이용 가치가 크지만, 낮은 생산 속도를 개선하는 것이 관건이다. 이를 개선하기 위해 균주 조작을 통해 초산균을 개량하는 방법을 생각할 수 있지만, 실제 미생물 셀룰로스 생산을 위해 적용한 예는 드물다.
일 양상은 서열번호 1의 421번 내지 450번 뉴클레오티드 서열, 서열번호 2의 248번 내지 273번 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로모터 영역을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
다른 양상은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
다른 양상은 상기 숙주 세포를 이용하여 목적 유전자를 발현시키는 방법을 제공한다.
일 양상은 서열번호 1의 421번 내지 450번 뉴클레오티드 서열, 서열번호 2의 248번 내지 273번 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로모터 영역을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
용어 "프로모터"는 RNA 폴리머라제가 결합하여 이와 작동가능하게 연결되어 있는 유전자의 전사를 개시하도록 하는 DNA 영역을 의미한다. 상기 프로모터 서열은 통상의 기술자에 의해 동일 또는 유사한 활성을 갖는 범위에서 변형될 수 있다. 따라서, 상기 서열번호 1의 421번 내지 450번 뉴클레오티드 서열, 서열번호 2의 248번 내지 273번 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열과 예를 들면, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 프로모터 및 서열번호 1의 421번 내지 450번 뉴클레오티드 서열, 서열번호 2의 248번 내지 273번 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열 중 프로모터 활성을 갖는 서열, 예를 들면, 예측된 전사 개시점 및 -10 영역의 서열을 포함하는 단편(이하 "변이체")이 일 양상의 발명의 범위 내에 포함된다.
상기 분리된 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1, 2, 또는 3의 뉴클레오티드 서열로 구성되는 것일 수 있다.
상기 분리된 폴리뉴클레오티드는 벡터일 수 있다. 상기 분리된 폴리뉴클레오티드는 목적 유전자가 상기 프로모터 영역에 작동가능하게 연결되어 있는 것일 수 있다. 상기 목적 유전자는 상기 프로모터 영역에 대하여 하류에서 연결된 것일 수 있다. 용어 "작동가능하게 연결되어 있는 (operably linked)"은 발현이 필요한 유전자와 이의 조절 서열이 서로 기능적으로 결합되어 유전자 발현을 가능케 하는 방식으로 연결되어 있는 것을 의미한다. 상기 벡터는 상기 프로모터 또는 그 변이체 및 목적 유전자 외에 복제기점, 프로모터 조절 부위, 리보솜 결합 부위, 전사 종결부위, 선별 마커, 또는 이들의 조합을 더 포함할 수 있다.
본 명세서에 있어서, 용어 "벡터(vector)"란 연결되어 있는 다른 핵산을 세포로 전달할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 특정한 유전자의 도입을 매개하는 핵산 서열이라는 관점에서, 본 명세서에서 벡터는, 핵산 구조체(nucleic acid construct), 및 카세트(cassette)와 상호 교환 가능하게 사용될 수 있는 것으로 해석된다. 벡터에는 예를 들면 플라스미드 또는 바이러스 유래 벡터 등이 포함된다. 플라스미드란 추가의 DNA가 연결될 수 있는 원형의 이중가닥 DNA 고리를 말한다. 본 명세서에서 사용되는 벡터에는 예를 들면, 플라스미드 발현벡터, 바이러스 발현벡터 및 이들과 동등한 기능을 수행할 수 있는 바이러스 벡터가 포함될 수 있다. 바이러스 벡터는 바이러스 게놈 내에 추가의 DNA가 연결되어질 수 있다. 어떤 벡터는 도입되는 숙주 세포 내에서 자가 복제 (autonomous replication) 될 수 있다 (예, 박테리아 복제원점을 갖는 박테리아 벡터). 다른 벡터는 숙주 세포에 도입되면 숙주 세포 게놈 내에 삽입되어, 숙주 게놈과 함께 복제된다. 더욱이, 어떤 벡터는 작동가능하게 연결되어 있는 (operatively linked) 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 본 명세서에서는 그러한 벡터를 "발현 벡터"라고도 한다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에 있어서 플라스미드 형태가 자주 발현 벡터로서 유용하게 사용된다. 본 발명에서 사용되는 벡터에는 예를 들면, 플라스미드 발현벡터, 바이러스 발현벡터 및 이들과 동등한 기능을 수행할 수 있는 바이러스 벡터가 포함된다.
상기 벡터, 예를 들면 발현 벡터는 발현에 사용될 숙주 세포에 근거하여 선택되어지는, 하나 이상의 조절 서열을 포함하고, 이들은 발현되어질 핵산 서열과 작동가능하게 연결되어 있다. "작동 가능하게 연결되어 있는"이란 목적으로 하는 뉴클레오티드 서열이 숙주 세포에서 그의 발현이 이루어질 수 있도록 하는 방식으로 상기 조절서열에 연결되어 있다는 것을 의미한다. "조절 서열"이란 용어는 프로모터, 인핸서 및 다른 조절 요소 (예, 폴리아데닐화 신호)를 포함하는 의미이다. 조절서열에는 많은 숙주 세포에서 목적으로 하는 핵산이 구성적으로 발현될 수 있도록 지시하는 것 및 특정한 숙주 세포에서만 목적으로 하는 핵산이 발현될 수 있도록 지시하는 것 (예, 조직특이적 조절 서열)이 포함된다. 발현벡터의 설계는 형질전환될 숙주 세포의 선택 및 원하는 단백질 발현의 수준 등과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다는 것은 당업자라면 이해할 수 있다. 본 발명의 발현 벡터는 숙주 세포에 도입되어 상기 단백질을 발현할 수 있다.
상기 플라스미드는 박테리아 클로닝 벡터(bacterial cloning vectors)일 수 있다. 이들 클로닝 벡터는 DNA가 삽입될 수 있도록 하는 부위, 예를 들면, DNA 조각이 연결되어질 여러 통상적으로 사용되는 제한 부위(restriction site)를 갖는 다중 클로닝 부위 (multiple cloning site) 또는 폴리링커(polylinker)를 포함할 수 있다. 원하는 유전자가 삽입된 후, 상기 플라스미드는 형질전환에 의하여 박테리아에 도입된다. 이들 플라스미드는 선택 마커(selectable marker), 일반적으로 특정 항생제를 포함한 선택 성장 배지에서 생존 및 증식할 수 있도록 하는 하는 능력을 박테리아에게 부여하는 항생제 내성 유전자(antibiotic resistance gene)를 포함할 수 있다. 형질전환 후 상기 세포는 선택 배지에 노출되고, 상기 플라스미드를 가진 세포만이 생존할 수 있다. 이러한 방식으로, 상기 항생제는 상기 플라스미드 DNA를 포함한 박테리아만 선택될 수 있도록 하는 필터로서 역할을 한다. 상기 벡터는 또한 클론된 삽입체를 가진 플라스미드의 선택을 촉진하기 위하여 다른 마커 유전자 또는 리포터 유전자를 포함할 수 있다. 그 후, 상기 플라스미드를 포함한 박테리아는 많은 양으로 생육되고, 회수되어, 플라스미드 준비의 다양한 방법에 의하여 분리될 수 있다. 플라스미드 클로닝 벡터는 약 15kbp 이하의 DNA 조각을 클론하는 것일 수 있다. 상기 벡터는 상업적으로 알려진 벡터, 예를 들면, pBR322,pUC, TOPO 클로닝 벡터 등일 수 있다.
상기 목적 유전자는 목적 단백질을 코딩하는 것일 수 있다. 상기 목적 유전자는 셀룰로스 생산에 관여하는 단백질을 코딩하는 것일 수 있다. 상기 목적 산물을 코딩하는 유전자는 페르메아제(permease), 글루코스 키나제(glucose kinase: GLK), 포스포글루코무타제(phosphoglucomutase: PGM), UDP-글루코스 피로포스포릴라제(UDP-glucose pyrophosphorylase: UGP), 또는 셀룰로스 효소(cellulose synthase: CS)를 코딩하는 유전자일 수 있다. 상기 목적 산물을 코딩하는 유전자는 대장균(Ec) glcP 유전자, Zymomonas mobilis(Zm) glk 유전자, Komagataeibacter xylinus(Kx) pgm 유전자, 대장균(Ec) galU 유전자, 또는 Xanthomonas campestris(Xc) UGP 또는 Komagataeibacter xylinus(Kx) bcsABCD 유전자일 수 있다.
상기 분리된 폴리뉴클레오티드는 재조합, 인공적으로 합성, 또는 인공적으로 반합성 된 것일 수 있다.
상기 분리된 폴리뉴클레오티드는 상기 프로모터 영역에 작동가능하게 연결되어 있는 목적 유전자를 예를 들면, tac 프로모터와 작동가능하게 연결된 경우보다 mRNA 양 또는 단백질을 기준으로 호기 조건에서 0.5배 이상, 예를 들면, 1.0배, 1.2배, 1.3배, 또는 1.4배 더 높게 발현되도록 하는 것일 수 있다.
다른 양상은 서열번호 1, 2, 또는 3의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로모터 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 외부로부터 도입된 것일 수 있다.
상기 숙주 세포는 아세트산 생산 박테리아 세포일 수 있다. 상기 숙주 세포는 Acetobacteraceae 패밀리의 세포일 수 있다. Acetobacteraceae 패밀리의 세포는 Komagataibacter 속, Gluconacetobacter 속, Acetobacter 속, 또는 Gluconobacter 속의 세포일 수 있다. 상기 숙주 세포는 Komagataibacter xylinus ("Acetobacter xylinum"라고도 함)세포일 수 있다.
상기 숙주 세포에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 벡터일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 목적 유전자가 상기 프로모터 영역에 작동가능하게 연결되어 있는 것일 수 있다. 상기 목적 유전자는 목적 단백질을 코딩하는 것일 수 있다. 상기 목적 유전자는 셀룰로스 생산에 관여하는 단백질을 코딩하는 것일 수 있다. 상기 목적 산물을 코딩하는 유전자는 페르메아제(permease), 글루코스 키나제(glucose kinase: GLK), 포스포글루코무타제(phosphoglucomutase: PGM), UDP-글루코스 피로포스포릴라제(UDP-glucose pyrophosphorylase: UGP), 또는 셀룰로스 효소(cellulose synthase: CS)를 코딩하는 유전자일 수 있다. 상기 목적 산물을 코딩하는 유전자는 대장균(Ec) glcP 유전자, Zymomonas mobilis(Zm) glk 유전자, Komagataeibacter xylinus(Kx) pgm 유전자, 대장균(Ec) galU 유전자, 또는 Xanthomonas campestris(Xc) UGP 또는 Komagataeibacter xylinus(Kx) bcsABCD 유전자일 수 있다.
상기 숙주세포는 예를 들면, 목적 유전자의 클로닝을 위해 상기 벡터가 도입된 것일 수 있다. 상기 숙주세포는 예를 들면, 상기 벡터가 도입되어 목적 유전자를 발현하는 것일 수 있다. 상기 벡터의 도입은 당해 분야에 공지된 바와 같이 숙주 세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행될 수 있다. 예를 들면, 전기천공법 (electroporation), 열 충격 (heat-shock), 인산칼슘 (CaPO4) 침전, 염화칼슘 (CaCl2) 침전, 미세주입법 (microinjection), 폴리에틸렌글리콜 (PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법, 초산 리튬-DMSO법, 또는 이들의 조합에 의해 수행될 수 있다.
상기 숙주세포에 도입된 상기 벡터는 예를 들면, 상기 프로모터 또는 그 변이체의 하류에 목적 단백질의 생산에 관여하는 유전자가 작동가능하게 연결되어 있는 것일 수 있다. 상기 벡터는 상기 프로모터 또는 그 변이체 및 목적 유전자 외에 복제기점, 프로모터 조절 부위, 리보솜 결합 부위, 전사 종결부위, 선별 마커, 또는 이들의 조합을 더 포함할 수 있다. 상기 숙주세포는 예를 들면, 상기 프로모터 또는 그 변이체와 작동가능하게 연결된 유전자를 혐기 조건에서 발현시킬 수 있다. 상기 유전자는 예를 들면, 호기 조건에서 매우 높게 발현되고, 혐기 조건에서도 비교적 높은 발현 수준을 유지하는 것일 수 있다. 상기 유전자의 발현량은 예를 들면, tac 프로모터와 작동가능하게 연결된 경우보다 mRNA 양 또는 단백질을 기준으로 호기 조건에서 0.5배 이상, 예를 들면, 1.0배, 1.2배, 1.3배, 또는 1.4배 더 높을 수 있다.
상기 숙주 세포는 재조합 균주일 수 있다.
다른 양상은 서열번호 1의 421번 내지 450번 뉴클레오티드 서열, 서열번호 2의 248번 내지 273번 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로모터 영역 및 상기 프로모터 영역에 작동가능하게 연결되어 있는 목적 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 배양하여, 상기 목적 유전자를 발현시키는 단계를 포함하는 목적 유전자를 발현시키는 방법을 제공한다.
상기 방법은 서열번호 1의 421번 내지 450번 뉴클레오티드 서열, 서열번호 2의 248번 내지 273번 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로모터 영역 및 상기 프로모터 영역에 작동가능하게 연결되어 있는 목적 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 배양하여, 상기 목적 유전자를 발현시키는 단계를 포함한다. 숙주 세포에 대하여는 상기한 바와 같다.
상기 방법에 있어서, 상기 숙주 세포는 Acetobacteraceae 패밀리의 세포일 수 있다. 상기 목적 유전자는 셀룰로스 생산에 관여하는 단백질을 코딩하는 것일 수 있다. 상기 목적 산물을 코딩하는 유전자는 페르메아제(permease), 글루코스 키나제(glucose kinase: GLK), 포스포글루코무타제(phosphoglucomutase: PGM), UDP-글루코스 피로포스포릴라제(UDP-glucose pyrophosphorylase: UGP), 또는 셀룰로스 효소(cellulose synthase: CS)를 코딩하는 유전자일 수 있다. 상기 목적 산물을 코딩하는 유전자는 대장균(Ec) glcP 유전자, Zymomonas mobilis(Zm) glk 유전자, Komagataeibacter xylinus(Kx) pgm 유전자, 대장균(Ec) galU 유전자, 또는 Xanthomonas campestris(Xc) UGP 또는 Komagataeibacter xylinus(Kx) bcsABCD 유전자일 수 있다.
상기 방법은 예를 들면, 상기 벡터가 도입된 숙주세포를 배양하여 상기 목적 유전자가 코딩하는 단백질이 관여하는 생합성 경로의 최종 산물을 생산하는 방법일 수 있다. 상기 목적 유전자는 예를 들면, 셀룰로스, L-아미노산, 젖산, 아세트산, 숙신산 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 산물의 생산에 관여하는 것일 수 있다. 따라서, 상기 방법은 상기 유전자의 최종 산물, 예를 들면, 셀룰로스, L-아미노산, 젖산, 아세트산, 숙신산 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 산물을 호기 조건 또는 혐기 조건에서 생산하는 것일 수 있다. 상기 방법에서 상기 산물은 예를 들면, 호기 조건에서 대량 생산되고, 혐기 조건에서도 비교적 높은 생산수준을 유지하는 것일 수 있다. 상기 숙주세포는 예를 들면, 서열번호 1, 2, 또는 3의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로모터 또는 그 변이체에 상기 산물의 생산에 관여하는 유전자가 작동가능하게 연결된 벡터가 도입된 K. xylinus KCCM 41431일 수 있다.
상기 숙주세포의 배양은 당해 분야에 공지된 통상적인 방법에 따라 수행될 수 있다. 상기 배양에 사용되는 배지는, 당원으로서 예를 들면, 글루코오스, 사카로오스, 락토오스, 프락토오스, 말토오스, 전분, 셀룰로스와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산을 개별적으로 또는 혼합물로서 포함할 수 있다. 상기 배지는 질소원으로서 예를 들면, 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두밀 및 요소 또는 무기 화합물, 예를 들면 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 또는 질산암모늄을 개별적으로 또는 혼합물로서 포함할 수 있다. 상기 배지는 인원으로서 예를 들면, 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염을 포함할 수 있다. 상기 배지는 예를 들면, 성장에 필요한 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 포함할 수 있다. 또한, 상기 배양에서 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질 또는 적절한 전구체가 배양물에 첨가될 수 있다. 상기 물질은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식으로 예를 들면, 회분식으로 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.
상기 배양은 호기 조건에서 수행하는 것일 수 있다.
일 양상에 따른 분리된 폴리뉴클레오티드에 의하면, 세포 내에서 유전자의 전사 개시를 효율적으로 진행시킬 수 있다.
다른 양상에 따른 숙주 세포에 의하면, 목적 유전자의 전사를 효율적으로 개시할 수 있다.
다른 양상에 따른 목적 유전자를 발현시키는 방법에 의하면, 목적 유전자를 효율적으로 발현시킬 수 있다.
도 1은 CAT assay 결과를 나타내는 도면이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예1 : 프로모터 탐색 및 P1 , P2 , 및 P3 의 동정
본 실시예에서는 초산균, 특히 미생물 셀룰로스를 생산하는 Komagataibacter 속의 박테리아에서 유전자 과발현에 활용할 수 있는 3종의 프로모터를 발굴하였다. 이 프로모터들은 모두 미생물 셀룰로스 자연 생산균인 Komagataibacter xylinus KCCM 41431의 유전체에서 유래하였으며, 유전자를 과발현시키는데 사용할 수 있는 세기를 갖추었다.
(1) 프로모터 탐색
K.xylinus KCCM 41431의 게놈 DNA를 추출한 후, Sau3AI으로 부분적으로 절단하였다. 절단 산물 중 0.5 내지 1.5 kb 크기의 DNA 절편을 1% 아가로스 겔에서 추출하였다. 추출한 DNA 절편을 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열을 갖는 BglII로 절단한 프로모터 탐색 벡터 pTSaP에 연결하였다. 이들 벡터를 대장균 Top10 균주 세포(Invitrogen)에 형질전환한 후, 10 ug/ml 테트라시클린 및 5 ug/ml 클로람페니콜 함유 LB (Luria Delbruck) 고체 배지 도말하였다. 풀링(pooling)한 콜로니로부터 플라스미드를 분리하고, K.xylinus KCCM 41431에 전기 천공법으로 형질전환한 후, 5 ug/ml 테트라시클린 함유 HS (Hestrin-Schramm: 20g/l 포도당, 5g/l 효모추출물(yeast extract), 5g/l 폴리펩톤(polypeptone), 2.7g/l Na2PO4 및 1.15g/l 시트르산) 고체 배지에 도말하여 콜로니를 얻었다. pTSaP는 삽입된 유전체 DNA와 리포터 유전자인 클로람페니콜 아세틸트란스퍼라제(chloramphenicol acetyltransferase) 유전자 cat가 작동가능하게 연결되어 있다. 상기 프로모터 탐색 벡터 pTSaP는 자체적으로 제작한 것이다. pTSaP는 Komagataibacter 속 세포에서 복제될 수 있도록 하는 복제 원점 pSa ori, 테트라시클린 저항성 유전자, 대장균 복제원점 pUC ori, 및 리포터 유전자 cat가 전사 터미네이터와 작동가능하게 연결된 것이다.
이렇게 얻은 K.xylinus KCCM 41431 콜로니를 5 ug/ml 테트라시클린 및 120 ug/ml 클로람페니콜 함유 HS 고체 배지에 각각 계대하였다. 30℃에서 48시간 이상 배양하여 계대가 성공한 K.xylinus KCCM 41431 콜로니에서 플라스미드를 분리한 후, 이를 주형으로 하고 서열번호 5 및 6의 폴리뉴클레오티드를 프라이머로 사용하여 시퀀싱을 수행하였다.
시퀀싱 결과 pTSaP 벡터의 BglII 부위에 클로닝된 DNA의 서열을 파악할 수 있었으며, 얻어진 프로모터를 P1, P2, 및 P3로 명명하였다. 프로모터 P1, P2, 및 P3는 각각 서열번호 1, 2, 및 3의 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 이들 서열을 프로모터 예측 프로그램 (http://server.molgenrug.nl/index.php/prokaryote- promoters)(de Jong et al. BMC Genomics 2012, 13: 299)을 통해 전사 시작점을 예측한 결과, 서열번호 1에서 예측된 프로모터 영역은 421 내지 450번째 염기서열인 'TATAATGCATTCTGATATTTTGTTGTTAT'(서열번호 8)이고 전사 개시점은 455번째 염기인 'T'이다. 서열번호 2의 경우 예측된 프로모터 영역은 248 내지 273번째 염기서열인 'TTAAATTTTTCATACTTATTAATGTAAAAT'(서열번호 9)이고 전사 개시점은 283번째 염기인 'T'이다.
(2) 프로모터 세기의 검증
삽입된 유전체 DNA의 프로모터 활성은 리포터 유전자인 cat 유전자 발현의 세기 즉, CAT 활성의 세기를 측정함으로써 결정되었다. 대조군으로서 유전체 DNA가 도입되지 않은 pTSaP를 음성 대조군으로, 종래에 사용하던 tac 프로모터 (서열번호 7)를 포함하고 있는 pTSaP를 양성 대조군으로 사용하였다.
CAT 활성은 클로람페니콜의 아세틸화 형태를 측정하는 CAT assay를 통하여 측정하였는데, 다음과 같이 진행된다. CAT 효소 및 5,5'-디티오-비스 (2-니크로벤조산)(5,5'-Dithio-bis (2-Nitrobenzoic Acid): DTNB)의 존재하에서 아세틸-CoA와 클로람페니콜을 반응시켜 아세틸-클로람페니콜과 CoA를 형성시킨다. 이때 CoA는 DTNB)와 반응하여 412nm 흡광도를 갖는 5-티오-2-니트로벤조에이트(5-thio-2-nitrobenzoate: TNB)로 전환된다. 즉, (1)절에서 얻어진 K. xylinus 콜로니 및 대조구를 테트라시클린 (5 ug/ml)과 셀룰로스 (0.5%, Sigma C2730)이 함유되어 있는 HS 액체 배지에서 30 ℃에서 24시간 동안 220 rpm로 교반하면서 배양하였다. 박테리아를 회수한 후 PBS 버퍼에 현탁시키고, 초음파(sonication)를 조사하여 세포를 파쇄시킨 후 원심분리하여, 상등액을 취하여 조단백질을 얻는다. 다음으로, 1ml 반응액 당 10 ug의 조단백질을 아세틸-CoA (200 ug/mL), 클로람페니콜 (100 ug/mL), 및 DTNB (50 mg/mL)와 혼합한 후 반응시키고 시간대 별로 412 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정된 흡광도를 아래 식에 대입하여 활성을 계산하였다.
활성(단위/ml 효소)(units/ml enzyme)=(△412nm/min 테스트-△412nm/min Blank)(df)/(0.0136) (df: 희석인자 (dilution factor))
도 1은 CAT assay 결과를 나타내는 도면이다. 도 1에서, 가로축의 vector (대조군), tac, P1, P2, 및 P3은 각각, 유전체 DNA가 도입되지 않은 pTSaP 벡터, tac 프로모터가 도입된 pTSaP 벡터, 서열번호 1, 2, 또는 3의 프로모터가 도입된 pTSaP 벡터를 나타낸다. 도 1에 나타낸 바와 같이, P1, 및 P2는 양성 대조군인 tac 프로모터에 비교하여 각각 1.41배, 1.31배, 및 0.46배의 세기를 보였다. 또한, 음성 대조군에 비하여도 현저한 발현 촉진 효과를 보였다.
<110> Samsung Electronics Co., Ltd. <120> Isolated polynucleotide comprising promoter region, host cell comprising the same and Method of expressing a target gene using the host cell <130> PN111720KR <160> 9 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1141 <212> DNA <213> Komagataibacter xylinus KCCM 41431 <400> 1 gatcgcgggc acgcgctgca ttgaccgcca gcgcggcggc agccgttttg gcgcccaccg 60 caccggactt gcgctggctg accgggtgag cgggcgcgca gccgccctgt ccagcacggg 120 gcagcagaag gcgctgctgc tgggcatcgt gctgtcgcat gcgcgcatac tcgcggcatg 180 ccgggggcag gtgcccatgc tcctgctcga tgagccgctg gtgcatctgg acgaagcccg 240 caggcaggcc ctgttccgcg ccgtgggccg catgcgcacg ggcgtgttcc tgaccggaac 300 ggacgccgaa cagttcgccc ccctgcgggg ccatgccgca ttcgaggcgc caggggcggg 360 taatcttgcc catgaggcct gatttgcgtg gggaatgctg gttccgacgg gcggttgggg 420 ctataatgca ttctgatatt ttgttgttat ccgctgtgga gcatctgccg gcatgtccga 480 tcaatccagt cccgatcaga aacacgatgc cgaggccaag ggcacagtag cgcccgcgcc 540 tgattatgat gaggcatcca tctcggtgct gcgggggctg gatgcggtgc gcaagcgccc 600 cggcatgtat attggcgata ccgatgacgg ctcgggcctg caccacatgg ccttcgaaat 660 cattgataac gcggtggatg aggcgcaggc cggtttcgcc accggctgcg tcgtcaccct 720 caatggcgat ggcagcgtga ccgtgcgcga tgacgggcgc ggcattccca ccggcatgca 780 ccatgaggaa ggggtgagtg cggcggaagt cgtgctgacc aagctgcatg cgggcggcaa 840 gttcaaccag aattcctaca aggtttccgg tggcctgcat ggcgtgggcg ctgcggtggt 900 caatgctttg tccgaatgga tggaagtgcg catctggcgc gatggcaagg agcatgtgat 960 ccgctttcag ggcggcgagc gtgatgaggc gctgcgcgtg gtgggcgaaa gtgctgagcc 1020 gcgcggcacg caggtcacat tcaagcccag tgccaagacc ttcgccaagg tggagttcga 1080 gttcccgatt ctcgagcgcc gcctgcgcga actggccttc ctcaattccg ggctcaggat 1140 c 1141 <210> 2 <211> 1058 <212> DNA <213> Komagataibacter xylinus KCCM 41431 <400> 2 gatcggtcca cgtatcaata aactgtgcgg actggtagag ggccatcccg ttctccattg 60 tttttcatcg gctggctggg ctgttaaata acctttagca tgcatcttat gtggcggcac 120 atccatcccc catgcagcat gctataatcc tgtgcttttt ccccacctgt gggtattgct 180 tcccatgcgg ggcaggtaga ttatttatga gggcatctgt cacaagccaa 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<213> Komagataibacter xylinus KCCM 41431 <400> 3 aacttcggcg gcgcccgagc gtgaacagca cgggctgacc aacctgtgcg cgcgcggcgg 60 ctacgtcctg gcggaagccg aagggacgcg gcaggtcacg ctggtcgcca cggggcacga 120 ggcgatactg gcgctggcgg cacgcaaact gttgaaggac gcaggggttg cggcggctgt 180 cgtatccctt ccatgctggg aactgttcgc cgcgcaaaaa atgacgtatc gtgccgccgt 240 gctgggaacg gcaccccgga tcggcattga agccgcgtca gggtttggat gggaacgctg 300 gcttgggaca gacgggctgt ttgttggcat tgacgggttc gggacggccg ccccggacca 360 gccggacagc gcgactgaca tcacgccgga acggatctgc cgcgacgcgc tgcgtctggt 420 ccgtcccctg tccgataccc tgactgaacc ggcgggagga aacggcgcgc cgcccgggat 480 gacatcggcc gatgtcagtg tgtgaaatgt cagaccttac ggagaaaata agaaa 535 <210> 4 <211> 4843 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pTSaP: promoter screening vector <400> 4 aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg 60 gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag 120 aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc 180 gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg 240 ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt 300 cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc 360 ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc 420 actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg 480 tggcctaact acggctacac tagaagaaca gcatttggta tctgcgctct gctgaagcca 540 gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc 600 ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat 660 cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaattctca 720 tgtttgacag cttatcatcg ataagcttta atgcggtagt ttatcacagt taaattgcta 780 acgcagtcag gcaccgtgta tgaaatctaa caatgcgctc atcgtcatcc tcggcaccgt 840 caccctggat gctgtaggca taggcttggt tatgccggta ctgccgggcc tcttgcggga 900 tatcgtccat tccgacagca tcgccagtca ctatggcgtg ctgctagcgc tatatgcgtt 960 gatgcaattt ctatgcgcac ccgttctcgg agcactgtcc gaccgctttg gccgccgccc 1020 agtcctgctc gcttcgctac 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cctcggcgag cacatggaac gggttggcat ggattgtagg 1920 cgccgcccta taccttgtct gcctccccgc gttgcgtcgc ggtgcatgga gccgggccac 1980 ctcgacctga atggaagccg gcggcacctc gctaacggat tcaccactcc aagaattgga 2040 gccaattttt aaggcagtta ttggtgccct taaacgcctg gttgctacgc ctgaataagt 2100 gataataagc ggatgaatgg cagaaattcg aattcagcca gcaagacagc gatagagggt 2160 agttatccac gtgaaaccgc taatgccccg caaagccttg attcacgggg ctttccggcc 2220 cgctccaaaa actatccacg tgaaatcgct aatcagggta cgtgaaatcg ctaatcggag 2280 tacgtgaaat cgctaataag gtcacgtgaa atcgctaatc aaaaaggcac gtgagaacgc 2340 taatagccct ttcagatcaa cagcttgcaa acacccctcg ctccggcaag tagttacagc 2400 aagtagtatg ttcaattagc ttttcaatta tgaatatata tatcaattat tggtcgccct 2460 tggcttgtgg acaatgcgct acgcgcaccg gctccgcccg tggacaaccg caagcggttg 2520 cccaccgtcg agcgccagcg cctttgccca caacccggcg gccggccgca acagatcgtt 2580 ttataaattt ttttttttga aaaagaaaaa gcccgaaagg cggcaacctc tcgggcttct 2640 ggatttccga tcacctgtaa agtgggacca catgctgaac tccctatcac tgcatgagta 2700 gggaactgcc aggcatcaaa 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atggcatcgt aaagaacatt ttgaggcatt tcagtcagtt 3600 gctcaatgta cctataacca gaccgttcag ctggatatta cggccttttt aaagaccgta 3660 aagaaaaata agcacaagtt ttatccggcc tttattcaca ttcttgcccg cctgatgaat 3720 gctcatccgg aattccgtat ggcaatgaaa gacggtgagc tggtgatatg ggatagtgtt 3780 cacccttgtt acaccgtttt ccatgagcaa actgaaacgt tttcatcgct ctggagtgaa 3840 taccacgacg atttccggca gtttctacac atatattcgc aagatgtggc gtgttacggt 3900 gaaaacctgg cctatttccc taaagggttt attgagaata tgtttttcgt ctcagccaat 3960 ccctgggtga gtttcaccag ttttgattta aacgtggcca atatggacaa cttcttcgcc 4020 cccgttttca ccatgggcaa atattatacg caaggcgaca aggtgctgat gccgctggcg 4080 attcaggttc atcatgccgt ttgtgatggc ttccatgtcg gcagaatgct taatgaatta 4140 caacagtact gcgatgagtg gcagggcggg gcgtaatttt tttaaggcag ttattggtgc 4200 ccttaaacgc ctggttgcta cgcctgaata agtgataata agcggatgaa tggcagaaat 4260 tcgtcgaggc ggcacctcgc taacggattc accactccaa gaattggagc caatcaattc 4320 ttgcggagaa ctgtgaatgc gcaaaccaac ccttggcaga acatatccat cgcgtccgcc 4380 atctccagca gccgcacgcg gcgcatctcg gctgttttgg cggatgagag aagattttca 4440 gcctgataca gattaaatca gaacgcagaa gcggtctgat aaaacagaat ttgcctggcg 4500 gcagtagcgc ggtggtccca cctgacccca tgccgaactc agaagtgaaa cgccgtagcg 4560 ccgatggtag tgtggggtct ccccatgcga gagtagggaa ctgccaggca tcaaataaaa 4620 cgaaaggctc agtcgaaaga ctgggccttt cgttttatct gttgtttgtc ggtgaacgct 4680 ctcctgagta ggacaaatcc gccgggagcg gatttgaacg ttgcgaagca acggcccgga 4740 gggtggcggg caggacgccc gccataaact gccaggcatc aaattaagca gaaggccatc 4800 ctgacggatg gcctttttgc gtttctacaa actcttcctg tcg 4843 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SeqF primer <400> 5 atgttcttta cgatgccatt ggga 24 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SeqR primer <400> 6 tctcctgagt aggacaaatc cg 22 <210> 7 <211> 188 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tac promoter <400> 7 ggctgtgcag gtcgtaaatc actgcataat tcgtgtcgct caaggcgcac tcccgttctg 60 gataatgttt tttgcgccga catcataacg gttctggcaa atattctgaa atgagctgtt 120 gacaattaat catcggctcg tataatgtgt ggaattgtga gcggataaca atttcacaca 180 ggaaacat 188 <210> 8 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P1 promoter <400> 8 tataatgcat tctgatattt tgttgttat 29 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P2 promoter <400> 9 ttaaattttt catacttatt aatgtaaaat 30

Claims (20)

  1. 서열번호 1의 421번 내지 450번 뉴클레오티드 서열, 서열번호 2의 248번 내지 273번 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로모터 영역을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
  2. 청구항 1에 있어서, 서열번호 1, 2, 또는 3의 뉴클레오티드 서열로 구성되는 분리된 폴리뉴클레오티드.
  3. 청구항 1에 있어서, 벡터인 것인 분리된 폴리뉴클레오티드.
  4. 청구항 1에 있어서, 목적 유전자가 상기 프로모터 영역에 작동가능하게 연결되어 있는 것인 분리된 폴리뉴클레오티드.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 목적 유전자는 목적 단백질을 코딩하는 것인 분리된 폴리뉴클레오티드.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 목적 유전자는 셀룰로스 생산에 관여하는 단백질을 코딩하는 것인 분리된 폴리뉴클레오티드.
  7. 서열번호 1의 421번 내지 450번 뉴클레오티드 서열, 서열번호 2의 248번 내지 273번 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로모터 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 외부로부터 도입된 것인 숙주 세포.
  9. 청구항 7에 있어서, 상기 숙주 세포는 아세트산 생산 박테리아 세포인 것인 숙주 세포.
  10. 청구항 7에 있어서, 상기 숙주 세포는 Acetobacteraceae 패밀리의 세포인 것인 숙주 세포.
  11. 청구항 10에 있어서, Acetobacteraceae 패밀리의 세포는 Komagataibacter 속, gluconacetobacter 속, acetobacter 속, 또는 gluconobacter 속의 세포인 것인 숙주 세포.
  12. 청구항 7에 있어서, 상기 숙주 세포는 Komagataibacter xylinus 세포인 것인 숙주 세포.
  13. 청구항 7에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 벡터인 것인 숙주 세포.
  14. 청구항 7에 있어서, 목적 유전자가 상기 프로모터 영역에 작동가능하게 연결되어 있는 것인 숙주 세포.
  15. 청구항 14에 있어서, 상기 목적 유전자는 목적 단백질을 코딩하는 것인 숙주 세포.
  16. 청구항 14에 있어서, 상기 목적 유전자는 셀룰로스 생산에 관여하는 단백질을 코딩하는 것인 숙주 세포.
  17. 서열번호 1의 421번 내지 450번 뉴클레오티드 서열, 서열번호 2의 248번 내지 273번 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로모터 영역 및 상기 프로모터 영역에 작동가능하게 연결되어 있는 목적 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 배양하여, 상기 목적 유전자를 발현시키는 단계를 포함하는 목적 유전자를 발현시키는 방법.
  18. 청구항 17에 있어서, 상기 숙주 세포는 Acetobacteraceae 패밀리의 세포인 것인 방법.
  19. 청구항 17에 있어서, 상기 목적 유전자는 셀룰로스 생산에 관여하는 단백질을 코딩하는 것인 방법.
  20. 청구항 17에 있어서, 상기 배양은 호기 조건에서 수행되는 것인 방법.
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