CN112921047A - 过表达细胞色素蛋白的产电希瓦氏菌菌株及构建方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了过表达细胞色素蛋白的产电希瓦氏菌菌株及构建方法及应用，方法为：1)将细胞色素蛋白编码基因MtrC与PHG12‑LIacO‑1连接得到质粒PHG12‑LIacO‑1‑MtrC；2)将质粒PHG13‑tet‑ribABCDE电转导入希瓦氏菌MR‑1中，得到菌株MR‑1/Ptet5；3)将1)获得的质粒导入菌株MR‑1/Ptet5中，得到过表达细胞色素蛋白的产电希瓦氏菌菌株；本发明的菌株，在0.5mM IPTG诱导下，48h的厌氧发酵，实现最大功率密度为1046mW/m²，是对照菌株MR‑1/Ptet5的1.47倍。不仅提高了EET能力，而且验证了核黄素更倾向与MtrC结合促进EET。

Description

过表达细胞色素蛋白的产电希瓦氏菌菌株及构建方法及应用

技术领域

本发明属于希瓦氏菌胞外电子转移的研究领域。具体地涉及一种过表达细胞色素蛋白的产电希瓦氏菌菌株及构建方法及应用

背景技术

异化金属还原细菌希瓦氏菌，具有利用固体、胞外金属氧化物作为终端电子受体取代氧的非凡能力。这种不寻常的呼吸能力受到科研工作者的广泛关注，并应用于微生物燃料电池、微生物电合成等领域。这种能力是由位于这些细菌外膜的多血红素c型细胞色素和金属氧化物之间的细胞外电子转移(EET)促进的。在希瓦氏菌中已经发现与EET相关的胞外电子转移机制，包括直接电子转移机制和间接电子转移机制两种。在直接电子转移中，C型细胞色素可以通过直接接触将电子转移到固体基质上。此外，可以通过微米长的导电附属物，通常被称为“细菌纳米线”将电子转移到胞外电子受体。在间接电子转移中，电子穿梭载体黄素类物质负责携带电子到达胞外电子受体。基于黄素类物质参与EET，提出了游离黄素和黄素结合两种机制。游离核黄素和黄素单核苷酸(FMN)介导双电子转移反应。核黄素和FMN作为辅助因子结合MtrC和OmcA介导两个单电子转移反应。OmcA和MtrC可能对核黄素和FMN有不同的结合亲和力和结合位点，OmcA可通过血红素5和7与RF和FMN相互作用、RF-OmcA复合物的结合亲和力略高于FMN-OmcA。RF和FMN在MtrC上靠近血红素1、9和7，并且在血红素4附近发现了一个附加的FMN结合位点。虽然黄素与细胞色素结合的许多方面已经建立，但结合相互作用的分子细节仍然不清楚。

目前，有研究通过共表达核黄素合成基因ribABCDE和金属还原管道基因MtrABC来促进EET能力。与野生型菌株相比，基因工程菌株的电功率有所提高，但仍然处于低的水平。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提高一种过表达细胞色素蛋白的产电希瓦氏菌菌株。

本发明的第二个目的是提供在一种过表达细胞色素蛋白的产电希瓦氏菌菌株的构建方法。

本发明的第三个目的是提供一种过表达细胞色素蛋白的产电希瓦氏菌菌株的应用。

本发明的技术方案概述如下：

过表达细胞色素蛋白的产电希瓦氏菌菌株的构建方法，包括如下步骤：

(1)将细胞色素蛋白编码基因MtrC与表达载体PHG12-LIacO-1连接得到质粒PHG12-LIacO-1-MtrC；

(2)将质粒PHG13-tet-ribABCDE电转导入希瓦氏菌MR-1中，得到菌株MR-1/Ptet5；

(3)将(1)获得的质粒电转导入菌株MR-1/Ptet5中，得到过表达细胞色素蛋白的产电希瓦氏菌菌株MR-1/Ptet5/PL-MtrC；

所述细胞色素蛋白编码基因MtrC的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述质粒PHG12-LIacO-1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述PHG13-tet-ribABCDE的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

上述方法构建的一种过表达细胞色素蛋白的产电希瓦氏菌菌株。

上述一种过表达细胞色素蛋白的产电希瓦氏菌菌株的应用。

有益效果

本发明所构建的过表达细胞色素蛋白的产电希瓦氏菌菌株，在0.5mM IPTG诱导下，48h的厌氧发酵，能够实现最大功率密度为1046mW/m²，是对照菌株MR-1/Ptet5(707mW/m²)的1.47倍。不仅提高了EET能力，而且验证了核黄素更倾向与MtrC结合促进EET。

附图说明

图1为PHG12-LIacO-1-MtrC载体的图谱。

图2为接种不同浓度诱导剂的MR-1/Ptet5/PL-MtrC菌的电功率密度图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明，下述实施例是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，但对本发明不作任何限制。

本发明所用到的原始菌株希瓦氏菌Shewanella oneidensis MR-1来源为ATCC保藏的典型菌株(ATCC 700550)，网址：https://www.atcc.org/products/all/700550.aspx#generalinformation，购买日期：2019年7月。

实施例1

一种过表达细胞色素蛋白编码基因的产电希瓦氏菌菌株构建方法，包括如下步骤：

(1)将细胞色素蛋白编码基因MtrC与表达载体PHG12-LIacO-1连接得到质粒PHG12-LIacO-1-MtrC，操作流程如下：

以Shewanella oneidensis MR-1基因组作为模板，以MtrC-1和MtrC-2为引物(见表1)进行PCR扩增，扩增MtrC基因片段(SEQ ID NO.1)，以PHG12-LIacO-1质粒(SEQ IDNO.2)为模板，以PHG12-1和PHG12-2(见表1)为引物，进行PCR扩增线性化载体。最后将线性化载体片段PHG12-LIacO-1和MtrC进行连接得到载体PHG12-LIacO-1-MtrC。测序检测无误。最终的质粒图谱如图1所示。

(2)将质粒PHG13-tet-ribABCDE电转导入希瓦氏菌MR-1中，得到菌株MR-1/Ptet5，操作流程如下：

将-80℃冻存的菌株MR-1在LB固体培养基上培养至长出单菌落，挑取单菌落接种到装有5ml LB液体培养基的试管中，在30℃、200rpm培养12h。以1％的接种量接种到装有100ml LB液体培养基的500ml三角瓶中，在30℃、200rpm培养大约2h，至OD₆₀₀为0.4-0.6。将三角瓶取出置冰上冷却10min，然后将菌液转移至预冷的100ml离心管中，4℃离心收集菌体，再用1M山梨醇水溶液洗三次，然后用1mL1M预冷的山梨醇水溶液重悬菌体，最后分装到预冷的1.5ml无菌EP管中，每管100μl，得到制备好MR-1的感受态。向MR-1感受态中加入PHG13-tet-ribABCDE(SEQ ID NO.3)，混匀后加入电击杯中，使用MicroPulser(Bio-Rad公司)电穿孔仪在1.2KV条件下电击4.5ms，电击后迅速加入800ml LB液体培养基，然后在30℃、200rpm复苏培养3h。复苏培养后，取100μL菌液涂布在含有终浓度为34μg/mL氯霉素抗性的LB固体培养基上，30℃培养至长出单菌落，用菌落PCR验证，得到质粒正确导入的菌株，命名为MR-1/Ptet5。

(3)将步骤(1)获得的质粒电转导入菌株MR-1/Ptet5中，得到过表达细胞色素蛋白的产电希瓦氏菌菌株MR-1/Ptet5/PL-MtrC，操作流程如下：

将-80℃冻存的MR-1/Ptet5在含34μg/mL氯霉素抗性LB固体培养基上培养至长出单菌落，挑取单菌落接种到装有含有34μg/mL氯霉素抗性5ml LB液体培养基的试管中，在30℃、200rpm培养12h。以1％的接种量分别接种到装有100ml LB和34μg/mL氯霉素抗性LB液体培养基的500ml三角瓶中，在30℃、200rpm培养大约2h，至OD₆₀₀为0.4-0.6。将三角瓶取出置冰上冷却10min，然后将菌液转移至预冷的100ml离心管中，4℃离心收集菌体，再用1M山梨醇水溶液洗三次，然后用1mL1M预冷的山梨醇水溶液重悬菌体，最后分装到预冷的1.5mL无菌EP管中，每管100μl，得到制备好MR-1/Ptet5的感受态。MR-1/Ptet5感受态中加入PHG12-LIacO-1-MtrC，混匀后加入电击杯中，使用MicroPulser(Bio-Rad公司)电穿孔仪在1.2KV条件下电击4.5ms，电击后迅速加入800mL LB液体培养基，然后在30℃、200rpm复苏培养3h。复苏培养后，取100μL菌液涂布在含有终浓度为50μg/mL卡那霉素和34μg/mL氯霉素抗性的LB平板上，30℃培养至长出单菌落，用菌落PCR验证，得到质粒正确导入的菌株，命名为MR-1/Ptet5/PL-MtrC。

本发明中的菌株代号等是为了方便描述，但不应理解为对本发明的限定。

表1菌株构建所用引物序列

实施例2生物电化学表征

1.生物燃料电池制备

1.1MFCs预处理

(1)碳布电极的预处理：根据实验要求裁剪碳布(阳极1cm×1cm，阴极2.5cm×3cm)，。用水冲洗三次，然后加入1M HCl水溶液，浸泡过夜，再用无菌水冲洗三次，然后向烧杯中加入纯丙酮，浸泡过夜(注意烧杯用塑料薄膜密封，防止丙酮挥发)。最后，用无菌水清洗碳布为除去丙酮，干燥后保存备用。

(2)Nafion 117质子交换膜的预处理：根据实验所需质子交换膜的大小，将质子交换膜切割成直径为5cm圆片，然后将切割好的质子交换膜放置在1M HCl水溶液中浸泡过夜，用无菌水冲洗三次，冲洗过程中应避免污染，再用无菌水浸泡，以防质子交换膜干燥，待用。

(3)阳极液的制备：先于1L蓝盖瓶中制备好5×M9母液(30g Na₂HPO₄和15gKH₂PO₄,，2.5g NaCl，5g NH₄Cl，加无菌水至1L)；取200mL 5×M9母液于另一干净的1L蓝盖瓶中，灭菌。在紫外线消毒过的超净工作台上，加入50ml LB培养基(酵母提取物5g/L、NaCl10g/L和胰蛋白胨10g/L)、10mL 20mM乳酸钠水溶液、1mL的0.1mM无菌CaCl₂水溶液、1mL的1M无菌MgSO₄水溶液、1ml的50mg/ml卡那霉素水溶液、1ml的34mg/ml氯霉素乙醇溶液、1ml的1mg/ml四环素水溶液和1ml的1M IPTG水溶液。最后用无菌水补至1L。摇匀，放置备用。

(4)电解液的制备：称取24.693g K₃[Fe(CN)₆]、13.063g K₂HPO₄和10.207g KH₂PO₄置于大烧杯中，加蒸馏水至1.5L，用干净的玻璃棒搅拌，摇匀，超声溶解完全，置于超净工作台上备用。

2.2菌株培养

将工程菌株MR-1/Ptet5取1mL加入100mL含有34μg/mL氯霉素抗性的LB液体中，置于30，℃200rpm摇床中培养12h，之后将细胞悬浮液浓度调节到同一水平(OD₆₀₀值等于0.7)并分装到制备好的微生物燃料电池的生物阳极(工作体积为140ml)，置于30℃培养箱中厌氧培养，48h进行生物电化学分析。

将工程菌株MR-1/Ptet5/PL-MtrC取1mL加入100mL含有50μg/mL卡那霉素和34μg/mL氯霉素抗性的LB液体中，在置于30，℃200rpm摇床中培养10h，然后加入不同浓度的IPTG诱导剂诱导2h，分别为0.25mM，0.5mM，0.75mM，1mM，之后将细胞悬浮液浓度调节到同一水平(OD₆₀₀值等于0.7)并分别分装到生物燃料电池的生物阳极(工作体积为140ml)平行，置于30℃培养箱中厌氧培养，48h左右进行生物电化学表征。

2.3生物电化学分析

线性伏安法(LSV)曲线的测定，操作步骤如下：

(1)当MFCs的输出电压达到峰值并进入稳定期时，将电阻器与导线分开，并保持30分钟以稳定开路电压。

(2)当开路电压稳定时，将电化学工作站的绿色线夹夹在阳极室外的导线上，红色线夹在阴极室外的导线上，白色线夹在Ag/AgCl电极的红色线夹前面。

(3)设定扫描参数如下：

初始电位(V)：-0.87

最终电位(V)：-0.1

初始扫描极化：Positive

扫描速率(V/s)：0.0001

采样时间(V)：0.001

静止时间(s)：30

灵敏度(A/V)：1.e-003

(4)LSV曲线扫描完成后，以.txt、.lsv格式文件保存到电脑中。

(5)上述菌株电化学分析结果如图2所示。

过表达细胞色素蛋白的产电希瓦氏菌菌株MR-1/Ptet5/PL-MtrC，在0.5mM IPTG诱导下，能够实现最大功率密度为1046mW/m²，是对照菌株MR-1/Ptet5(707mW/m²)的1.47倍。不仅提高了EET能力，而且验证了相比其他细胞色素蛋白，核黄素更倾向与MtrC结合促进EET。

序列表

<110> 天津大学

<120> 过表达细胞色素蛋白的产电希瓦氏菌菌株及构建方法及应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2208

<212> DNA

<213> 希瓦氏菌MR-1(Shewanella oneidensis )

<400> 1

atgatgaaac ggttcaattt caataccgca acaaaagcga tgttgggtgc cggtttactt 60

tcactccttc tcactggctg cggtggcagt gatggtaaag atggtgaaga cggtaaacca 120

ggcgttgttg gagttaatat caactcaacc tcaaccttaa aagcaaaatt cactaatgcc 180

actgttgatg caggtaaagt cactgtcaac ttcaccctag aaaatgccaa tggtgtagca 240

gtattaggct taaccaaaga tcacgatttg cgatttggta ttgcgcaatt aactcccgtt 300

aaagaaaaag tgggagaaac agaagctgac cgcggttatc aatggcaagc ttatatcaat 360

gccaagaaag aacccggtac cgttccatca ggcgttgata acctcaatcc atcgacccag 420

tttcaagcga acgttgagtc tgccaataaa tgcgacactt gtttagtaga ccatggcgat 480

ggtagctaca gttatacata ccaagttaac gttgccaatg tgactgagcc ggtaaaagtc 540

acttacagtg cagatgccac tcaacgtgcg accatggaac ttgagctacc gcaacttgcg 600

gcgaatgcgc atttcgattg gcaaccttca acaggtaaaa cagaaggcat tcaaactcgc 660

aatgtcgtct ctattcaagc atgttatacc tgtcaccaac cagaaagctt agcgctgcat 720

ggtggccgtc gtatcgatat tgaaaactgt gcatcttgcc acactgcaac ctctggtgat 780

ccagaatcag gcaatagcat tgaatttact tatatgatcc atgctatcca taaaggtggc 840

gagcgtcata ccttcgatgc taccggtgca caagtgcctg ccccatataa aattattggc 900

tatggcggta aggtaatcga ttatggcaaa gtgcattacc cccaaaaacc agccgcagat 960

tgtgcagcct gtcacgttga aggcgctggc gcacctgcta atgccgatct gttcaaagca 1020

gatttaagca atcaagcatg tattggctgt cacactgaaa aaccatctgc tcaccatagc 1080

agcactgatt gtatggcttg ccacaatgca accaagcctt acggcggtac gggaagtgca 1140

gctaaacgtc atggcgatgt aatgaaagct tataacgata gccttggtta taaagcgaaa 1200

ttcagcaaca ttggtattaa aaataatgcc ctaacattcg atgtacaaat tcttgataat 1260

aaagatcaac ctatcggcaa ggaatttatt tcggatccga gtgcatacac taaatcgagt 1320

atctatttct catggggaat agataaagat taccctgctt ataccgcagg tagcagatat 1380

agtgatcgtg gctttgcatt atcaaattcg aaggtttcaa cttacaacga agcaactaaa 1440

accttcacta ttgacagtac aaatagcaac ttaaagctgc cagctgatct aactggtatg 1500

aatgttgagt tgtatgctgg tgtagcaacc tgttttaaca aaggtggata cggcgttgaa 1560

gatgttgtag cgaccccatg ttctaccgat actcgctacg cttacatcca agaccaacca 1620

ttccgtttca aatggaatgg aacggatacc aattctgccg ctgaaaaacg tagagcgatt 1680

atcgatacag ctaagtgttc aggttgccat aacaaggaaa ttgttcatta tgacaacggc 1740

gttaactgtc aagcttgtca tactcctgat aagggtttaa aaactgacaa cacttaccca 1800

ggaactaaag ttccaacgag ctttgcgtgg aaagcccacg aaagtgaagg ccattatctg 1860

aaatatgcag gcgtacaatc tggcactgta ctaaaaaccg attgtgcaac atgtcatact 1920

gctgataaat ccaacgtagt aacgggtatc gctttaggca gatcgccaga gcgcgcatgg 1980

ctttacggcg atattaagaa caatggtgcc gtaatttggg tatcttccga tgctggcgca 2040

tgcttaagtt gccaccagaa gtatctgtct gatgcagcca agtctcatat tgaaactaac 2100

ggcggtatct taaatggtac tagtgctgca gatgttcaaa ctcgtgcatc tgaaagctgt 2160

gcaacgtgcc atactccatc gcaattgatg gaagcacacg gtaactaa 2208

<210> 2

<211> 4361

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ctacctgctt tctctttgcg cttgcgtttt cccttgtcca gatagcccag tagctgacat 60

tcatcccagg tggcactttt cggggaaatg tgcgcgcccg cgttcctgct ggcgctgggc 120

ctgtttctgg cgctggactt cccgctgttc cgtcagcagc ttttcgccca cggccttgat 180

gatcgcggcg gccttggcct gcatatcccg attcaacggc cccagggcgt ccagaacggg 240

cttcaggcgc tcccgaaggt cgcgggccgt ctcttgggct tgatcggcct tcttgcgcat 300

ctcacgcgct cctgcggcgg cctgtagggc aggctcatac ccctgccgaa ccgcttttgt 360

cagccggtcg gccacggctt ccggcgtctc aacgcgcttt gagattccca gcttttcggc 420

caatccctgc ggtgcatagg cgcgtggctc gaccgcttgc gggctgatgg tgacgtggcc 480

cactggtggc cgctccaggg cctcgtagaa cgcctgaatg cgcgtgtgac gtgccttgct 540

gccctcgatg ccccgttgca gccctagatc ggccacagcg gccgcaaacg tggtctggtc 600

gcgggtcatc tgcgctttgt tgccgatgaa ctccttggcc gacagcctgc cgtcctgcgt 660

cagcggcacc acgaacgcgg tcatgtgcgg gctggtttcg tcacggtgga tgctggccgt 720

cacgatgcga tccgccccgt acttgtccgc cagccacttg tgcgccttct cgaagaacgc 780

cgcctgctgt tcttggctgg ccgacttcca ccattccggg ctggccgtca tgacgtactc 840

gaccgccaac acagcgtcct tgcgccgctt ctctggcagc aactcgcgca gtcggcccat 900

cgcttcatcg gtgctgctgg ccgcccagtg ctcgttctct ggcgtcctgc tggcgtcagc 960

gttgggcgtc tcgcgctcgc ggtaggcgtg cttgagactg gccgccacgt tgcccatttt 1020

cgccagcttc ttgcatcgca tgatcgcgta tgccgccatg cctgcccctc ccttttggtg 1080

tccaaccggc tcgacggggg cagcgcaagg cggtgcctcc ggcgggccac tcaatgcttg 1140

agtatactca ctagactttg cttcgcaaag tcgtgaccgc ctacggcggc tgcggcgccc 1200

tacgggcttg ctctccgggc ttcgccctgc gcggtcgctg cgctcccttg ccagcccgtg 1260

gatatgtgga cgatggccgc gagcggccac cggctggctc gcttcgctcg gcccgtggac 1320

aaccctgctg gacaagctga tggacaggct gcgcctgccc acgagcttga ccacagggat 1380

tgcccaccgg ctacccagcc ttcgaccaca tacccaccgg ctccaactgc gcggcctgcg 1440

gccttgcccc atcaattttt ttaattttct ctggggaaaa gcctccggcc tgcggcctgc 1500

gcgcttcgct tgccggttgg acaccaagtg gaaggcgggt caaggctcgc gcagcgaccg 1560

cgcagcggct tggccttgac gcgcctggaa cgacccaagc ctatgcgagt gggggcagtc 1620

gaaggcgaag cccgcccgcc tgccccccga gcctcacggc ggcgagtgcg ggggttccaa 1680

gggggcagcg ccaccttggg caaggccgaa ggccgcgcag tcgatcaaca agccccggag 1740

gggccacttt ttgccggagg gggagccgcg ccgaaggcgt gggggaaccc cgcaggggtg 1800

cccttctttg ggcaccaaag aactagatat agggcgaaat gcgaaagact taaaaatcaa 1860

caacttaaaa aaggggggta cgcaacagct cattgcggca ccccccgcaa tagctcattg 1920

cgtaggttaa agaaaatctg taattgactg ccacttttac gcaacgcata attgttgtcg 1980

cgctgccgaa aagttgcagc tgattgcgca tggtgccgca accgtgcggc accctaccgc 2040

atggagataa gcatggccac gcagtccaga gaaatcggca ttcaagccaa gaacaagccc 2100

ggtcactggg tgcaaacgga acgcaaagcg catgaggcgt gggccgggct tattgcgagg 2160

aaacccacgg cggcaatgct gctgcatcac ctcgtggcgc agatgggcca ccagaacgcc 2220

gtggtggtca gccagaagac actttccaag ctcatcggac gttctttgcg gacggtccaa 2280

tacgcagtca aggacttggt ggccgagcgc tggatctccg tcgtgaagct caacggcccc 2340

ggcaccgtgt cggcctacgt ggtcaatgac cgcgtggcgt ggggccagcc ccgcgaccag 2400

ttgcgcctgt cggtgttcag tgccgccgtg gtggttgatc acgacgacca ggacgaatcg 2460

ctgttggggc atggcgacct gcgccgcatc ccgaccctgt atccgggcga gcagcaacta 2520

ccgaccggcc ccggcgagga gccgcccagc cagcccggca ttccgggcat ggaaccagac 2580

ctgccagcct tgaccgaaac ggaggaatgg gaacggcgcg ggcagcagcg cctgccgatg 2640

cccgatgagc cgtgttttct ggacgatggc gagccgttgg agccgccgac acgggtcacg 2700

ctgccgcgcc ggtagcactt gggttgcgca gcaacccgta agtgcgctgt tccagactat 2760

cggctgtagc cgcctcgccg ccctatacct tgtctgcctc cccgcgttgc gtcgcggtgc 2820

atggagccgg gccacctcga cctgaatgga agccggcggc acctcgctaa cggattcacc 2880

gtttttatca ggctctggga ggcagaataa atgatcatat cgtcaattat tacctccacg 2940

gggagagcct gagcaaactg gcctcaggca tttgagaagc acacggtcac actgcttccg 3000

gtagtcaata aaccggttga gctcagagaa ttcgcggccg cttctagaga attgtgagcg 3060

gataacaatt gacattgtga gcggataaca agatactgag cacacctagg aataattttg 3120

tttaacttta agaaggagat atacatatgt aagctagcag ctcgagcaaa taaaacgaaa 3180

ggctcagtcg aaagactggg cctttcgttt tatctgttgt ttgtcggtga acgctctcct 3240

gagtaggaca aattactagt agcggccgct gcagaccggt aaaccagcaa tagacataag 3300

cggctattta acgaccctgc cctgaaccga cgaccgggtc gaatttgctt tcgaacccca 3360

gagtcccgct cagaagaact cgtcaagaag gcgatagaag gcgatgcgct gcgaatcggg 3420

agcggcgata ccgtaaagca cgaggaagcg gtcagcccat tcgccgccaa gctcttcagc 3480

aatatcacgg gtagccaacg ctatgtcctg atagcggtcc gccacaccca gccggccaca 3540

gtcgatgaat ccagaaaagc ggccattttc caccatgata ttcggcaagc aggcatcgcc 3600

gtgggtcacg acgagatcct cgccgtcggg catgcgcgcc ttgagcctgg cgaacagttc 3660

ggctggcgcg agcccctgat gctcttcgtc cagatcatcc tgatcgacaa gaccggcttc 3720

catccgagta cgtgctcgct cgatgcgatg tttcgcttgg tggtcgaatg ggcaggtagc 3780

cggatcaagc gtatgcagcc gccgcattgc atcagccatg atggatactt tctcggcagg 3840

agcaaggtga gatgacagga gatcctgccc cggcacttcg cccaatagca gccagtccct 3900

tcccgcttca gtgacaacgt cgagcacagc tgcgcaagga acgcccgtcg tggccagcca 3960

cgatagccgc gctgcctcgt cttgcagttc attcagggca ccggacaggt cggtcttgac 4020

aaaaagaacc gggcgcccct gcgctgacag ccggaacacg gcggcatcag agcagccgat 4080

tgtctgttgt gcccagtcat agccgaatag cctctccacc caagcggccg gagaacctgc 4140

gtgcaatcca tcttgttcaa tcatgcgaaa cgatcctcat cctgtctctt gatcagatct 4200

tgatcccctg cgccatcaga tccttggcgg caagaaagcc atccagttta ctttgcaggg 4260

cttcccaacc ttaccagagg gcgccccagc tggcaattcc ggttcgcttg ctgtccataa 4320

aaccgcccag tctagctatc gccatgtaag cccactgcaa g 4361

<210> 3

<211> 6988

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag 60

aatcagggga taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc 120

gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca 180

aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt 240

ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc 300

tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc 360

tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc 420

ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact 480

tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg 540

ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaaggaca gtatttggta 600

tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca 660

aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa 720

aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg 780

aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga ggtacctttt ccgctgcata accctgcttc 840

ggggtcatta tagcgatttt ttcggtatat ccatcctttt tcgcacgata tacaggattt 900

tgccaaaggg ttcgtgtaga ctttccttgg tgtatccaac ggcgtcagcc gggcaggata 960

ggtgaagtag gcccacccgc gagcgggtgt tccttcttca ctgtccctta ttcgcacctg 1020

gcggtgctca acgggaatcc tgctctgcga ggctggccgg ctaccgccgg cgtaacagat 1080

gagggcaagc ggatggctga tgaaaccaag ccaaccagga agggcagccc acctatcaag 1140

gtgtactgcc ttccagacga acgaagagcg attgaggaaa aggcggcggc ggccggcatg 1200

agcctgtcgg cctacctgct ggccgtcggc cagggctaca aaatcacggg cgtcgtggac 1260

tatgagcacg tccgcgagct ggcccgcatc aatggcgacc tgggccgcct gggcggcctg 1320

ctgaaactct ggctcaccga cgacccgcgc acggcgcggt tcggtgatgc cacgatcctc 1380

gccctgctgg cgaagatcga agagaagcag gacgagcttg gcaaggtcat gatgggcgtg 1440

gtccgcccga gggcagagcc atgacttttt tagccgctaa aacggccggg gggtgcgcgt 1500

gattgccaag cacgtcccca tgcgctccat caagaagagc gacttcgcgg agctggtgaa 1560

gtacatcacc gacgagcaag gcaagaccga agcttgcttg gattctcacc aataaaaaac 1620

gcccggcggc aaccgagcgt tctgaacaaa tccagatgga gttctgaggt cattactgga 1680

tctatcaaca ggagtccaat aactgcctta aaaaaattac gccccgccct gccactcatc 1740

gcagtactgt tgtaattcat taagcattct gccgacatgg aagccatcac agacggcatg 1800

atgaacctga atcgccagcg gcatcagcac cttgtcgcct tgcgtataat atttgcccat 1860

agtgaaaacg ggggcgaaga agttgtccat attggccacg tttaaatcaa aactggtgaa 1920

actcacccag ggattggctg agacgaaaaa catattctca ataaaccctt tagggaaata 1980

ggccaggttt tcaccgtaac acgccacatc ttgcgaatat atgtgtagaa actgccggaa 2040

atcgtcgtgg tattcactcc agagcgatga aaacgtttca gtttgctcat ggaaaacggt 2100

gtaacaaggg tgaacactat cccatatcac cagctcaccg tctttcattg ccatacggaa 2160

ctccggatga gcattcatca ggcgggcaag aatgtgaata aaggccggat aaaacttgtg 2220

cttatttttc tttacggtct ttaaaaaggc cgtaatatcc agctgaacgg tctggttata 2280

ggtacattga gcaactgact gaaatgcctc aaaatgttct ttacgatgcc attgggatat 2340

atcaacggtg gtatatccag tgattttttt ctccatttta gcttccttag ctcctgaaaa 2400

tctcgataac tcaaaaaata cgcccggtag tgatcttatt tcattatggt gaaagttgga 2460

acctcttacg tgccgatcaa cgtctcattt tcgccagagc tcagagaatt cgcggccgct 2520

tctagagtct taagacccac tttcacattt aagttgtttt tctaatccgc aaatgatcaa 2580

ttcaaggccg aataagaagg ctggctctgc accttggtga tcaaataatt cgatagcttg 2640

tcgtaataat ggcggcatac tatcagtagt aggtgtttcc ctttcttctt tagcgacttg 2700

atgctcttga tcttccaata cgcaacctaa agtaaaatgc cccacagcgc tgagtgcata 2760

taatgcattc tctagtgaaa aaccttgttg gcataaaaag gctaattgat tttcgagagt 2820

ttcatactgt ttttctgtag gccgtgtacc taaatgtact tttgctccat cgcgatgact 2880

tagtaaagca catctaaaac ttttagcgtt attacgtaaa aaatcttgcc agctttcccc 2940

ttctaaaggg caaaagtgag tatggtgcct atctaacatc tcaatggcta aggcgtcgag 3000

caaagcccgc ttatttttta catgccaata caatgtaggc tgctctacac ctagcttctg 3060

ggcgagttta cgggttgtta aaccttcgat tccgacctca ttaagcagct ctaatgcgct 3120

gttaatcact ttacttttat ctaatctgct catcattaat tcctaatttt tgttgacact 3180

ctatcgttga tagagttatt ttaccactcc ctatcagtga tagagaaaag cctaggaata 3240

attttgttta actttaagaa ggagatatac acatatgcag cttaaacgtg tggcagaagc 3300

caaactgcca accccatggg gcgatttcct gatggtggga tttgaagaac tggcaaccgg 3360

acacgatcat gtcgcgctag tctatggcga tatttccggg cataccccgg tacttgcgcg 3420

cgtccattcc gaatgtctga ccggtgacgc cctgttcagc ttgcgctgcg attgtggctt 3480

ccagctcgaa gcggcattga cgcaaattgc cgaggaaggc cgtggtattt tgctgtatca 3540

ccgtcaggaa ggtcgtaaca ttggtctgct gaataaaatc cgcgcttacg cactgcagga 3600

tcaaggttac gataccgtag aggctaacca ccagttaggc ttcgccgctg atgagcgcga 3660

cttcactctt tgcgctgata tgttcaaact ccttggcgtc aatgaagtcc gcttgttaac 3720

caataacccg aaaaaagtcg aaattctgac cgaagcaggg attaatattg ttgaacgcgt 3780

accattgatt gtaggtcgta accccaataa cgaacattat ctcgatacca aagccgagaa 3840

aatgggccat ttgctgaaca aataaatcta taaaataagg gggccctaac ttaatgaatc 3900

agacgctact ttcctctttt ggtacgcctt tcgaacgtgt tgaaaatgca ctggctgcgc 3960

tgcgtgaagg acgcggtgta atggtgcttg atgatgaaga ccgtgaaaac gaaggtgata 4020

tgatcttccc ggcagaaacc atgactgttg agcagatggc gctgaccatt cgccacggta 4080

gcggtattgt ttgcctgtgc attactgaag atcgccgtaa acaactcgat ctgccaatga 4140

tggtagaaaa taacaccagc gcctatggca ccggttttac cgtgaccatt gaagcagctg 4200

aaggtgtgac taccggtgtt tctgccgctg accgtattac gaccgttcgc gcagcgattg 4260

ccgatggcgc aaaaccgtca gatctgaatc gtcctggcca cgttttccca cttcgcgctc 4320

aggcaggtgg tgtactgacg cgtggcggtc atactgaagc aactattgat ctgatgacgc 4380

tggcaggctt taaaccggct ggtgtactgt gtgagctgac taatgacgat ggcacgatgg 4440

cgcgtgcacc agagtgtatt gagtttgcca ataaacacaa tatggcgctc gtgactattg 4500

aagacctggt ggcataccgt caggcacatg agcgtaaagc cagctgagga tcccgtagat 4560

agacaaggag gaaaacacag tgcaggacga gtattacatg gcgcgggcgc taaagctggc 4620

gcaacgagga cgttttacca cgcatcccaa cccgaatgtc gggtgcgtca ttgtcaaaga 4680

tggcgaaatt gtcggtgaag gttaccacca acgtgcgggt gaaccacatg ccgaagtaca 4740

cgcgttgcgt atggcgggtg aaaaagccaa aggtgcgacc gcctatgtca cactcgaacc 4800

ctgtagccat catggtcgta cgccaccgtg ctgtgacgca ctcatcgccg ctggcgtagc 4860

gcgcgtggtt gcctcgatgc aagatcctaa cccgcaggtc gctgggcgtg gactttaccg 4920

tctgcaacag gctggcattg acgtcagcca cggcctgatg atgagtgaag ccgagcaatt 4980

gaataaaggc tttctcaagc ggatgcgcac cggctttcct tatattcagt taaaacttgg 5040

cgcatcgctt gatggtcgca cggcgatggc gagcggcgaa agccagtgga tcacttcgcc 5100

ccaggcgcgg cgtgatgtac aactactgcg cgcgcaaagt catgccattt taaccagcag 5160

cgccacggtg ctggcggatg atcctgcctt aacggtgcgt tggtctgaac tggatgaaca 5220

aactcaggcg ctctatccgc aacaaaatct ccgtcagccg atacgtattg tgattgatag 5280

ccaaaatcgc gtgacgccgg tacatcgcat tgtgcagcag cccggcgaaa cctggttcgc 5340

gcgtacgcag gaagattctc gtgagtggcc ggaaacggtg cgtaccttgc tgattccaga 5400

gcataaaggt catctggatc tggttgtact gatgatgcaa ctgggtaaac agcaaattaa 5460

cagcatctgg gtggaagcgg ggccaacgct cgctggcgca ttgctgcagg cgggtttagt 5520

cgatgagctg attgtctata tcgcacctaa actattaggc agcgacgccc gcggattatg 5580

cacgctgcca gggcttgaga aattagccga cgccccccaa tttaaattca aagagatacg 5640

tcatgtaggc ccggatgttt gcctgcattt agtgggtgca tgagtcgaca catacgtcaa 5700

acgcaggaag aggaggaaat acatgaacat tattgaagct aacgttgcta ccccggacgc 5760

tcgcgtcgcc atcaccatcg cgcgtttcaa caactttatc aatgacagcc tgctggaagg 5820

tgcaattgac gcactgaaac gtatcggtca ggtaaaagat gaaaacatta ccgttgtttg 5880

ggtgcctggt gcctatgagc tgccgctggc ggcgggtgca ctggctaaaa ccggtaaata 5940

cgacgcggtg attgcgctgg gtacggttat tcgtggtggc actgcccact ttgaatatgt 6000

cgctggtggt gcaagcaacg gcctggcgca tgttgcccag gacagcgaaa ttccggttgc 6060

ttttggggtt ctgaccactg aaagcattga acaagcgatc gaacgtgctg gcaccaaagc 6120

tggcaacaaa ggtgcagaag ctgcactgac cgcgcttgaa atgattaatg tattgaaagc 6180

catcaaggcc tgagaggacg cagacgcgcc tcttacagga ggagagagat gtttacgggg 6240

attgtacagg gcaccgcaaa actggtgtcg attgacgaga aaccaaattt tcgtacgcat 6300

gtggtggagt tacccgacca catgctggac ggcctggaaa ccggtgcttc cgtggcgcat 6360

aacggttgct gcctgaccgt gacggaaatt aacggcaacc atgtcagttt tgacctgatg 6420

aaagaaacgt tacgcattac caatcttggc gatttaaaag tgggggattg ggtaaacgtt 6480

gagcgtgcgg cgaaattcag tgatgaaatt ggcggacact taatgtcagg tcatattatg 6540

accactgctg aagtggcgaa aatattaacc tcagaaaata atcgccagat ctggtttaaa 6600

gtccaggata gtcagttgat gaaatatatt ctgtacaaag gatttattgg catcgacggt 6660

attagcctga ccgtcggcga agtcacgcca acgcgttttt gcgtccattt aattccggaa 6720

acactggaac gcacgactct tgggaagaaa aaacttggcg cacgcgtcaa cattgaaatc 6780

gatccacaaa ctcaggcagt ggtagatacg gtagaacgtg tgctggcggc acgagaaaat 6840

gccatgaatc aaccaggcac agaagcctga ctcgagtcga gcaaataaaa cgaaaggctc 6900

agtcgaaaga ctgggccttt cgttttatct gttgtttgtc ggtgaacgct ctcctgagta 6960

ggacaaatta ctagtagcgg ccgctgca 6988

<210> 4

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctttaagaag gagatataca tatgatgatg aacgcacaaa aatc 44

<210> 5

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

agcctttcgt tttatttgct cgagttacat tttcacttta gtgtga 46

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

catagttata tctccttctt aaagt 25

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

taagctagca gctcgagcaa at 22

Claims (3)

1.过表达细胞色素蛋白的产电希瓦氏菌菌株的构建方法，其特征是包括如下步骤：

(1)将细胞色素蛋白编码基因MtrC与表达载体PHG12-LIacO-1连接得到质粒PHG12-LIacO-1-MtrC；

(2)将质粒PHG13-tet-ribABCDE电转导入希瓦氏菌MR-1中，得到菌株MR-1/Ptet5；

(3)将(1)获得的质粒电转导入菌株MR-1/Ptet5中，得到过表达细胞色素蛋白的产电希瓦氏菌菌株MR-1/Ptet5/PL-MtrC；

所述细胞色素蛋白编码基因MtrC的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述质粒PHG12-LIacO-1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述PHG13-tet-ribABCDE的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

2.权利要求1的方法构建的一种过表达细胞色素蛋白的产电希瓦氏菌菌株。

3.权利要求3的一种过表达细胞色素蛋白的产电希瓦氏菌菌株的应用。

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