CN109609427A

CN109609427A - 一株高产血红素的洛伊希瓦氏菌基因工程菌及其构建方法

Info

Publication number: CN109609427A
Application number: CN201910072760.6A
Authority: CN
Inventors: 邱东茹; 戴景程; 周集中
Original assignee: Institute of Hydrobiology of CAS
Current assignee: Institute of Hydrobiology of CAS
Priority date: 2019-01-25
Filing date: 2019-01-25
Publication date: 2019-04-12
Anticipated expiration: 2039-01-25
Also published as: CN109609427B

Abstract

本发明公开了一种高产血红素的洛伊希瓦氏菌基因工程菌及其构建方法，通过转座子随机插入突变的方法获得一株深红色表型的洛伊希瓦氏菌（Shewanellaloihica）突变株，经基因鉴定和遗传互补实验证实ypiD基因被插入突变失活造成胞外红色物质的积累，经质谱鉴定该红色物质为血红素，随后又利用同源重组的方法敲除ypiD基因，从而得到高产血红素的洛伊希瓦氏菌工程菌PV‑4△ypjD，该菌株可在胞外分泌大量血红素，在摇瓶培养条件下，生物量（OD₆₀₀）达到2.4‑2.6时，血红素产量为90‑120mg/L，具有较大的应用价值。

Description

一株高产血红素的洛伊希瓦氏菌基因工程菌及其构建方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一株敲除基因ypjD的洛伊希瓦氏菌工程菌及其构建方法，所述的工程菌可用于生产血红素。

背景技术

血红素是含有二价铁离子的原卟啉IX，而原卟啉IX含有4个吡咯环结构，广泛的存在于自然界中，从微生物到人体细胞中都含有该分子，它参与了很多生物过程，包括氧分子的转运和储存(血红蛋白和肌红蛋白)、氧化磷酸化作用中的电子传递(b-型细胞色素和c-型细胞色素)、碳氢化合物的氧化作用(细胞色素P450和细胞色素氧化酶)。而在微生物中，原卟啉IX主要是细胞色素、维生素B12及细菌叶绿素等合成的主要成分，进而参与菌体呼吸、光合作用、气体转运、过氧化物的降解等重要生理活动。

在应用方面，根据血红素的分子结构和物理化学性质，我们可以知道它具有重要的生理功能和很高的使用价值。在医药领域，由于血红素中含有丰富的铁，易于被机体吸收利用，血红素铁有良好的促进骨髓造血和治疗动物溶血性和失血性贫血的作用，是人类迄今所知的最为理想的抗贫血药物。在食品方面，由于血红素是一类以卟啉环为结构的吡咯类色素，血红素在溶液中呈红色，是一种天然色素，可以作为肉制品工业中的着色剂，从而逐步取代现在使用的亚硝酸盐及人工色素。在医药行业中，血红素还可用于制备抗癌药物。在临床，血红素可用作补铁剂，治疗缺铁性贫血症，易被人体直接吸收，可取代目前常用的其它补铁剂。

目前市场上的血红素主要从动物血液中提取获得，有关血红素提取的国内的相关企业有中韩合资浙江海宁和田龙生物科技有限公司和天津生命科学应用研究所等。近年来，血红素越来越受到重视，人们研究并提出了多种提取方法。从目前文献的报道情况来看，血红素提取方法主要有冰醋酸法、酸性丙酮法(酸钠法、蒸馏法、鞣酸法等)、羧甲基纤维素(CMC)法和蛋白酶水解法等。每一种方法都有其优点，也有弊端。尽管提取的方法有所改进，但要真正应用于生产需要考虑以下几个问题：一、降低成本。现有的方法成本高、产品单一，没有做到联产其他产品；二、提取的过程中应尽量避免使用毒性较大、难以回收的有机溶剂，做到环保生产。以往的方法普遍的不足是产品纯度低、提取成本高、生产周期长、溶剂回收难等。又由于红血球的血红蛋白中血红素与珠蛋白相连，从血液中提取高纯度产品存在一定难度。而目前有关实验室在微生物发酵的方法改进上也取得一些成效。众所周知，在生物体内，血红素的合成途径是从5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid，ALA)开始的。ALA是血红素合成途径的关键前体物质。ALA在ALA脱水酶(HemB)的催化下生成胆色素原，然后胆色素原在羟甲基胆素合成酶(HemC)的作用下生成羟甲基胆素，又被尿卟啉原Ⅲ合成酶(HemD)催化生成含有四吡咯环的尿卟啉原Ⅲ，再经过尿卟啉原Ⅲ脱羧酶(HemE)和粪卟啉原Ⅲ氧化酶(HemF；无氧条件下为HemN)的脱羧氧化作用生成原卟啉原Ⅸ，又在偶联呼吸链辅酶Q的原卟啉原氧化酶(HemG)催化下生成原卟啉Ⅸ。原卟啉Ⅸ在亚铁螯合酶(HemH)作用下将铁离子螯合进原卟啉环生成血红素。江南大学康振实验室将血红素的整个合成途径用质粒连入后并转入大肠杆菌体内过表达，从而大量累积血红素，最终获得0.56μM/OD细胞。但是由于产量低，不适合应用于大量的生产，至今依然没有工程化应用。

洛伊希瓦氏菌(Shewanella loihica)多具有很高的呼吸途径多样性，拥有数十种c-型细胞色素，具有合成血红素的潜力，我们通过基因工程改造挖掘其合成血红素的潜能，可以在胞外分泌大量血红素。

发明内容

本发明的目的在于提供一株洛伊希瓦氏菌基因工程菌及其应用，通过无痕敲除基因ypjD的方式构建洛伊希瓦氏菌工程菌，所述工程菌具有高产血红素的生物特性。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一株高产血红素的洛伊希瓦氏菌基因工程菌，其构建方法包括以下步骤：

(1)利用同源重组的方法同时敲除洛伊希瓦氏菌PV-4染色体上编码具有限制性内切酶PstI和甲基化酶PstM活性的两个基因，序列如SEQ ID NO.6和7所示，使其不会对外源的DNA造成破坏，获得的菌株易于进行遗传操作；

(2)将基因ypjD的上、下游片段通过cross-over PCR连接后，与自杀质粒相连，构建自杀型敲除质粒p△ypjD；

(3)将含有自杀型敲除质粒的大肠杆菌营养缺陷菌株与步骤(1)获得的洛伊希瓦氏菌接合，进一步筛选出发生双交换的菌株，并经PCR扩增和测序证实框内缺失基因ypjD，从而获得基因ypjD敲除的洛伊希瓦氏菌工程菌。

在本发明的一个具体实施例中，将ypjD基因的上下游部分片段连接后分别引入重组整合型自杀质粒PDS3.0的多克隆位点，再将所得整合型自杀质粒转入营养缺陷菌株E.coli WM3064中，并与野生型菌株S.loihica PV-4接合，质粒p△ypjD会通过接合的方式进入宿主菌株S.loihica PV-4中，依次经过抗生素的筛选获得单交换菌株，再经过无抗性培养基和蔗糖培养基的筛选发生第二次同源重组的菌株，PCR鉴定并通过测序证实框内缺失基因ypjD，最终获得工程菌株PV-4ΔypjD。

上述洛伊希瓦氏菌工程菌可用于生产血红素，通过摇瓶培养42小时后，测定其生产血红素约为90-120mg/L，具有较大的应用价值。

与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：

1、选取的菌株洛伊希瓦氏菌工程菌S.loihica PV-4是从夏威夷罗利海底火山口旁(离海平面大概有1325米)的富含有铁元素的微生物垫中分离。该菌株无致病性，生物安全性高，富含数十种c-型细胞色素，具有大量合成血红素的潜力。

2、我们对该菌株采用了无痕基因敲除的方法进行基因工程改造，没有引入任何外源基因，不会产生其他附属物质，对人体和其他生物无害。

3、洛伊希瓦氏菌工程菌胞外分泌血红素，与传统的化学合成或者化学萃取的方法相比，更简单、更有效、更安全，实验室产量高达90-120mg/L。

附图说明

图1为转座子随机插入突变体的平板培养结果。图A中圆圈标记的突变体菌落表现为红色，图B为该突变体的划线扩大培养状态，也表现为红色。

图2为pMiniHimar RB1随机插入的基因位点。

图3为基因工程菌PV-4△ypjD的电泳检测图。

图4为ypjD基因回补菌株的电泳检测图。

图5为洛伊希瓦氏菌工程菌PV-4△ypjD、洛伊希瓦氏菌工程菌PV-4△ypjD的互补菌株和野生型菌株洛伊希瓦氏菌S.loihica PV-4加空载体在固体培养基静置培养生长的表型状况。同等条件下，洛伊希瓦氏菌工程菌PV-4△ypjD表现为深红的表型，而野生型S.loihica PV-4和洛伊希瓦氏菌工程菌PV-4△ypjD的互补菌株则表现为淡粉色表型。

图6为洛伊希瓦氏菌工程菌PV-4△ypjD胞外分泌物的紫外吸收光谱。在405nm左右出现最大峰值，因此判断洛伊希瓦氏菌工程菌PV-4△ypjD的胞外分泌物可能是血红素。

图7为洛伊希瓦氏菌工程菌PV-4△ypjD胞外分泌物的质谱检测图。图A为氯化血红素标样质谱峰值图，图B为洛伊希瓦氏菌工程菌PV-4△ypjD质谱峰值图。PV-4△ypjD分泌物的成分与标样的成分基本一致，可判断洛伊希瓦氏菌工程菌PV-4△ypjD分泌到胞外的红色物质为血红素。

具体实施方式

以下实施例中未注明具体条件的分子生物学实验方法，均按照常规条件，参照《分子克隆实验指南》(New York:Cold Spring Harbor)。

生物材料来源说明：

质粒pMiniHimar RB1由威斯康星大学米尔沃基分校的Daad Saffarini博士馈赠，也可参照文献《Identification of Genes Involved in Cytochrome c Biogenesis inShewanella oneidensis,Using a Modified mariner Transposon》构建；

洛伊希瓦氏菌(S.loihica)PV-4，最初是从夏威夷罗利海底火山口旁(离海平面大概有1325米)的富含有铁元素的微生物垫中分离(Shewanella loihica spnov.,isolatedfrom iron-rich microbial mats in the Pacific Ocean.)，是革兰氏阴性细菌，属于γ-变形菌门的亚群，具有兼性厌氧的特性；中国科学院水生生物研究所分子微生物与生物技术学科组保存有该菌株，并保证从申请日起二十年内向公众发放生物材料；

大肠杆菌营养缺陷菌株E.coli WM3064由伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校的W.Metcalf博士馈赠；

自杀质粒pDS3.0构建过程可参考文献《Transcriptomic and proteomiccharacterization of the fur modulon in the metal-reducing bacteriumShewanella oneidensis》；质粒pHERD30T由本实验室保存，构建过程可参考文献《P-BAD-Based Shuttle Vectors for Functional Analysis of Toxic and Highly RegulatedGenes in Pseudomonas and Burkholderia spp.and Other Bacteria》。

实施例1：转座子随机插入突变体的筛选

洛伊希瓦氏菌(S.loihica)PV-4最初是从夏威夷罗利海底火山口旁(离海平面大概有1325米)的富含有铁元素的微生物垫中分离，是革兰氏阴性细菌，属于γ-变形菌门的亚群，具有兼性厌氧的特性。周集中实验室已经对其全基因组进行测序和注释，并进行了微生物分类和生理生化分析，从而发现和其他的Shewanella菌不同，S.loihica PV-4在以乳酸盐作为电子供体时，却不能利用DMSO、硫代硫酸盐作为电子受体。

该菌株目前很难进行遗传操作，申请人对其进行了遗传改造，使其更易进行遗传操作，具体方法如下：

野生型洛伊希瓦氏菌(S.loihica)PV-4由于含有限制性内切酶PstI和甲基化酶PstM的系统，这个内切酶限制修饰系统会对自身的DNA进行甲基化保护而识别外源的DNA并进行切割，从而更好的保护自己。而我们利用同源重组的方法，破坏了PstI-PstM这个限制修饰系统，即同时敲除基因PstI(Shew_0992)(序列如SEQ ID NO.6所示)和PstM(Shew_0993)(序列如SEQ ID NO.7所示)，使其不会对外源的DNA造成破坏，更利于对其进行遗传操作。具体操作方法可参照文献《Differential Regulation of the Two FerrochelataseParalogues in Shewanella loihica PV-4in Response to Environmental Stresses》。

我们通过使用转座子插入突变系统pMiniHimar RB1对已经遗传改造的洛伊希瓦氏菌S.loihica PV-4进行随机插入突变，首先将pMiniHimar RB1转入大肠杆菌营养缺陷菌株E.coli WM3064，随后通过接合的方式进入改造后的S.loihicaPV-4中，该质粒在S.loihica PV-4不能独立复制，在编码的转座酶作用下，在基因组DNA上随机寻找TA位点将转座子插入到染色体上，转座子伴随基因组的DNA的复制进行复制。外源转座子DNA片段的插入足以破坏目的基因的功能。最后将接合后的菌株涂布到含有50μg/ml的Km的LB平板进行筛选，放入28℃温箱，16～28h后，观察克隆形态和颜色。

如图1所示，我们得到一株深红色表型的菌株，将其划线扩大培养同样表现为深红色表型。随后我们使用Bouhenni等的方法(Identification of genes involved incytochrome c biogenesis in Shewanella oneidensis,using a modified marinertransposon.)，对插入位点进行定位，从而确定被插入的TA位点和基因(如图2)。

通过分析鉴定发现转座子插入到了一个未知功能的基因上，该基因在大肠杆菌中被命名为ypjD，因此希瓦氏菌中的直系同源基因也被称为ypjD，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。通过遗传互补实验进一步证明ypiD基因被插入突变失活造成胞外血红素的积累。

实施例2：ypjD基因敲除自杀质粒的构建

将ypjD基因的上下游部分片段连接后分别引入重组整合型自杀质粒pDS3.0的多克隆位点，得到含有ypjD基因的自杀型敲除质粒p△ypjD。具体操作如下：

根据GenBank数据库中洛伊希瓦氏菌(S.loihica)PV-4的全基因组序列(GCA_000016065.1)，分别设计敲除ypjD的引物，引物序列如下：

ypjD-sacI-3o:AGAGCTCctgggctcaggctcttg

ypjD-sacI-3i:agagacgacctaagccagtcttcttgtggtcatcgacctg

ypjD-sacI-5i:gactggcttaggtcgtctctacgctaaattccgcacactt

ypjD-sacI-5o:AGAGCTCatccatgatagagagcagca

PCR体系：25μl的2×MIX、22μl的去离子水、1μl的F引物、1μl的R引物、1μl的DNA模板。

PCR反应条件：95℃5分钟；95℃30秒，50℃～60℃30秒，72℃30秒～60秒，循环数30～35个；72℃10分钟。

根据上述PCR反应体系及条件，利用引物对ypjD-sacI-3o/ypjD-sacI-3i进行PCR扩增，获得ypjD上游基因片段(475bp)，序列如SEQ ID NO.2所示，利用引物对ypjD-sacI-5i/ypjD-sacI-5o进行PCR扩增，获得ypjD下游基因片段(730bp)，序列如SEQ ID NO.3所示。并通过融合PCR(以PCR获得的上下游片段为模板，ypjD-sacI-3o和ypjD-sacI-5o为引物，进行二次PCR获取上下游连接的融合片段)获得融合片段(1205bp)，序列如SEQ ID NO.4所示。

融合片段经酶切连接进入整合型自杀质粒PDS3.0中，构建基因敲除自杀质粒p△ypjD，并使用PDS3.0通用引物进行扩增并测序验证。

sacI酶切体系：10×酶切buffer 5μl，DNA 10μl，sacI酶1～2μl，ddH₂O 34μl；37℃过夜酶切反应。

连接体系：10×连接buffer 1μl，连接酶1μl，sacI酶切的DNA片段4μl，sacI酶切的pDS3.0质粒1μl，去离子水3μl；16℃过夜连接。

实施例3：基因敲除工程菌株PV-4△ypjD的构建

首先，将构建好的基因敲除自杀质粒p△ypjD转入营养缺陷菌株E.coliWM3064，该自杀质粒含有R6K复制子，在含有t蛋白的细菌中可以进行复制，而在没有t蛋白的菌株中不能复制，因此当含有自杀型敲除质粒p△ypjD的营养缺陷菌株E.coli WM3064通过接合的方式进入宿主菌株S.loihica PV-4(已参照实施例1所述方法进行遗传改造)，则不能够在该菌株中进行复制，因此整合到该基因组中的同源序列上，由于发生整合的单交换菌株含有抗庆大霉素的基因和蔗糖敏感基因sacB，因此可以在含有15μg/ml的庆大霉素的LB培养基平板上生长，从而得到了自杀质粒p△ypjD整合进基因组的单交换转化子。

其次，将得到的单交换转化子转接于无抗性的基本培养基(10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，5g/L氯化钠)中试管培养6-8个小时，并涂布于含有10％蔗糖的LB培养基平板上进行第二轮筛选，并将长出的克隆分别对应点到LB培养基平板和含有15μg/ml庆大霉素的LB培养基平板，并对只在LB培养基平板上生长而不在庆大霉素的LB培养基平板生长的菌落进行PCR扩增，检测获得发生双交换的突变体菌株，得到小PCR片段(如图3)的是ypjD基因敲除株，命名为PV-4ΔypjD，经培养该菌株的菌落为深红色表型。

实施例4：基因YpjD的遗传功能回补验证

根据GenBank数据库中洛伊希瓦氏菌(S.loihica)PV-4的全基因组序列(GCA_000016065.1)，分别设计克隆ypjD基因的引物，引物序列如下：

PV4-ypjD-F:GgaattcAGGTCGATGACCACAAGAAAGC(EcoRI)

PV4-ypjD-R:GCtctagaCGGAATTTAGCGTGTCTGGC(XbaI)

PCR获取ypjD基因片段856bp，序列如SEQ ID NO.5所示，并分别克隆于pEASY载体上，经测序正确后，EcoRI和XbaI双酶切回收ypjD片段，并连接于诱导表达载体pHERD30T，构建质粒pHERD30T-ypjD。将pHERD30T及重组质粒pHERD30T-ypjD转化入营养缺陷菌株E.coliWM3064，并通过接合的方式进入宿主工程菌株PV-4ΔypjD中，空载pHERD30T转化入营养缺陷菌株E.coliWM3064后，通过结合方式进入宿主菌株S.loihica PV-4，经过PCR检测验证，电泳检测结果见图4。

结果发现(见图5)，基因敲除工程菌PV-4ΔypjD表型恢复到野生菌株表型，而基因敲除工程菌PV-4ΔypjD的表型为深红色，野生型和基因敲除工程菌PV-4ΔypjD的回补表型都表现为淡红色，说明基因敲除工程菌PV-4ΔypjD表面有深红色物质分泌，而野生型和回补表型都没有深红色物质分泌，ypjD是可以进行功能回补的。

实施例5：基因敲除工程菌株PV-4△ypjD产生的红色物质的化学分析

我们分别使用紫外分光光度法和质谱分析的方法对基因敲除工程菌株PV-4△ypjD产生的红色物质进行定性定量分析。

具体操作步骤如下：我们将购得的氯化血红素标样及其基因敲除工程菌株PV-4△ypjD产生的红色物质溶解在90％的酸性丙酮中或者1M的NaOH中，使用紫外分光光度计(Biowave II,WPA)，用石英比色杯在每隔10nm的波长范围内测量我们的待测样品的吸收峰，从而测得吸收峰曲线，读取其最大吸收峰值，并发现在405nm左右同时出现最大吸收峰(如图6)。而质谱分析的结果也表明分泌物样品与标品的质谱峰值图相似(如图7)，证明了基因敲除工程菌株PV-4△ypjD分泌物的成分与标样的成分基本一致，可判断洛伊希瓦氏菌工程菌PV-4△ypjD分泌到胞外的红色物质为血红素。

实施例6：基因敲除工程菌株PV-4△ypjD的摇瓶培养及血红素产量

目前部分实验室依靠大肠杆菌的工程改造去生产血红素，但是由于改造条件复杂(将整个血红素合成通路连接到载体上，在大肠杆菌中过表达，增强血红素的合成途径，以达到合成血红素的目的)，产量不高，收效甚微。而经遗传改造的洛伊希瓦氏菌(S.loihica)PV-4，仅仅在摇瓶中培养42小时(LB培养液，30℃，220转/分钟)，其生物量(OD₆₀₀)虽然只达到2.4-2.6，但血红素产量高达90-120mg/L，具有较大的应用价值。

序列表

<110> 中国科学院水生生物研究所

<120> 一株高产血红素的洛伊希瓦氏菌基因工程菌及其构建方法

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 789

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggtgattt tttcggcttc agccattttc ttctacagta tcgcactcgt cttggtcgtc 60

agccgactgt ttcatgccga tggccctaac cgtaaagccg tagccgcctt cgccgccgtg 120

gccgtggtgc ttcatgccgc cgccctgtct caggccatct tcaccggtga cggtcaaaac 180

ttcagtctga ccaatgtgat ctccatggtg aactggatca tcgccttcac cttcaccatc 240

ttgatgttcc gcctcaaggt aatcgtcgtc gtgcccgtgg tctatgcgtg ctctgtcatc 300

tcggtggcgc tgctgtggct attaccgcct aaatatatca cccacttcga gctttacccc 360

gaggtgttgg cccacgtggt gctgtcgctg atggcctata gtgccctaat gatcgccgcg 420

ctttatgcca tccaactggc gatgattcaa aacaagctga agaagaagca gctgatgctg 480

agcccggcga ttccaccgct gatgacggta gagaagcaac tttatcacct ggtgatcatc 540

ggcgtggtgc tgctgagtct gtcgctggcg actggcttta tcttcctcga tgatatgttt 600

gccgacggcc agggccataa ggcgatcctc tctatcattg cctggtttac ctatatcgcc 660

atgctggcgc agcagtactg ggtaggttgt aagatccgca ccgccgtggc ctatactctg 720

actggcgcaa ccctgctgtc actggcctac ttcggcgccc gcatcgtcaa agaactgatc 780

ctgcaatag 789

<210> 2

<211> 475

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

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acgtttcttt aatattgtct tctgtaaggc gaccacgacc gctaatattt ttcagggtgc 180

gtgataatct gtcggtgagg ttctcaaaca ttatcgcgtt ctttaccgtt tagaatttac 240

atgattgggg cagtattata gcgatgcaca gatattatgc taccgcgcag cgtaagttat 300

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cgatcaacta aggataaaaa ctcgaccgcc tcgcgcaggt cgatgaccac aagaa 475

<210> 3

<211> 730

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

acgctaaatt ccgcacactt cacctaggtc aagatggact aaagtgcgac ctaggtgaac 60

ttgactcaca gcccaaatcg ctgtatttac taaatcttaa cgctattctt actcatcaac 120

gccaaagtgg ggccactgat tggaagctat atccaccagc gtacttgtca tcatcctgtt 180

cgtactcatc atcatctccg cctatttctc cggctccgaa accgccatga tgtcgctcaa 240

tcgctatcgc ctgcgtcatc tggccaacaa tggtcataag ggcgcgaaac gcgccatcag 300

attgctagag cgcccagaca gactgatcgg cttgattctg atcggcaaca acctggtgaa 360

catcctcgcc tcggctatcg ccaccatatt ggggattcgc ttgtttggtg atgttggggt 420

ggccatcgcc acgggtgtgc tcactctggt ggtattagtc tttgccgagg tgacgccaaa 480

aactgtggcc gccctgcacc ctgagcgtat cgcctttcca tcgagcgtac tgctcaaagc 540

cctgttggtg ctgctctcgc ccttggtgaa gatagttaac tttatcacct ctaccttcct 600

gcgcctgctg ggcatccgct cggtgaaggc cgatgacgcc ttgagtcagg aggagctgcg 660

cacagttgtg cacgaggccg gcgccctgat cccccagcgc caccaggaga tgctgctctc 720

tatcatggat 730

<210> 4

<211> 1205

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

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aggcacgaac aacgggcaag gcgacgtcgg cttccagcag cgccatacgc acttcgcgta 120

acgtttcttt aatattgtct tctgtaaggc gaccacgacc gctaatattt ttcagggtgc 180

gtgataatct gtcggtgagg ttctcaaaca ttatcgcgtt ctttaccgtt tagaatttac 240

atgattgggg cagtattata gcgatgcaca gatattatgc taccgcgcag cgtaagttat 300

ggcttaggca agttatctgc tgtagggtaa aaatgtcaaa acttaggagt aacgctcaga 360

aagtgctaat ttttgtgtgt aaagcctctg cccaaaatag catccatcgt gttattctaa 420

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tcacagccca aatcgctgta tttactaaat cttaacgcta ttcttactca tcaacgccaa 600

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atcgcctgcg tcatctggcc aacaatggtc ataagggcgc gaaacgcgcc atcagattgc 780

tagagcgccc agacagactg atcggcttga ttctgatcgg caacaacctg gtgaacatcc 840

tcgcctcggc tatcgccacc atattgggga ttcgcttgtt tggtgatgtt ggggtggcca 900

tcgccacggg tgtgctcact ctggtggtat tagtctttgc cgaggtgacg ccaaaaactg 960

tggccgccct gcaccctgag cgtatcgcct ttccatcgag cgtactgctc aaagccctgt 1020

tggtgctgct ctcgcccttg gtgaagatag ttaactttat cacctctacc ttcctgcgcc 1080

tgctgggcat ccgctcggtg aaggccgatg acgccttgag tcaggaggag ctgcgcacag 1140

ttgtgcacga ggccggcgcc ctgatccccc agcgccacca ggagatgctg ctctctatca 1200

tggat 1205

<210> 5

<211> 856

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aggtcgatga ccacaagaaa gctcacataa cgataggtta attttcgatg gtgatttttt 60

cggcttcagc cattttcttc tacagtatcg cactcgtctt ggtcgtcagc cgactgtttc 120

atgccgatgg ccctaaccgt aaagccgtag ccgccttcgc cgccgtggcc gtggtgcttc 180

atgccgccgc cctgtctcag gccatcttca ccggtgacgg tcaaaacttc agtctgacca 240

atgtgatctc catggtgaac tggatcatcg ccttcacctt caccatcttg atgttccgcc 300

tcaaggtaat cgtcgtcgtg cccgtggtct atgcgtgctc tgtcatctcg gtggcgctgc 360

tgtggctatt accgcctaaa tatatcaccc acttcgagct ttaccccgag gtgttggccc 420

acgtggtgct gtcgctgatg gcctatagtg ccctaatgat cgccgcgctt tatgccatcc 480

aactggcgat gattcaaaac aagctgaaga agaagcagct gatgctgagc ccggcgattc 540

caccgctgat gacggtagag aagcaacttt atcacctggt gatcatcggc gtggtgctgc 600

tgagtctgtc gctggcgact ggctttatct tcctcgatga tatgtttgcc gacggccagg 660

gccataaggc gatcctctct atcattgcct ggtttaccta tatcgccatg ctggcgcagc 720

agtactgggt aggttgtaag atccgcaccg ccgtggccta tactctgact ggcgcaaccc 780

tgctgtcact ggcctacttc ggcgcccgca tcgtcaaaga actgatcctg caataggcca 840

gacacgctaa attccg 856

<210> 6

<211> 1098

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gtgacatttc cggaagtacc atcgttagca ttgatcgctg aaagactccc acaaattttc 60

ccagaaggca cagagcacag aaattatctt attcgagaaa tggcagctaa aaccatctat 120

gtgatgttct atgccggagc cattgaggga tcagatcgat gggttcgtcc aagccaggtc 180

acggatatga cggatgagca agcccaacta actgatgccg aaaacaggaa agcatgggta 240

aaaatgatgc tttccaataa gaaaaagaag cctgaaaacc cttggtatgc ggcgaacagt 300

cgggagcctg tacgggatga aaccatccga acagggctga ttccccttca agccgttgta 360

gttcgccaag gtatccccac cacttcatca aagcccactt acgccctaca aaaagaattt 420

tcagcactat tttctatcaa cctttacggt gatgatctcg atgccgcaat tgaaagctgg 480

cagaaaagac atctctcaaa agccgcaatt acacgcctga agttgatgaa ggactatggc 540

tcagaggact ccgaatctgt acagatcaag tttcctgatg gcgcaatacg caaacttgaa 600

ccggggccgt ctagccttat atccaaggct gttatagaag agttcgcacc gagattccta 660

aaaaagccaa aagtgctctg gttatcggaa tcgggaaaca aggtggtagc ccaggacgaa 720

gccttggcga aggcgctagg gcttcaaata gatccatcac gggcccttcc cgacattatc 780

ctggttgatc taggggacga cagcacggga cttgaaatgc tggttgtgtt cactgaggtt 840

gtcgcatctg acggccccat caaccgccaa aggaaagaga ttctgacgac tcttgcgaca 900

gaagccggct ttgatcccga acacctggct ttcctaactg catttcttga tcgaagctcg 960

caacccttca aaaaatctat ctctgagctg gcatggggct cctatgcctg gttctctact 1020

gagccggatt acattatcga tctgagagag catgacgaat ctgtcaagct gacgtccctt 1080

tccaaccgca acaagtga 1098

<210> 7

<211> 1788

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atgagaacgg cgcttgcctt acaggatgtt gcacagctca atgacccact cgtgcgctac 60

catgcctgca aagcgatggc gaggggcttt gcaaactcac gtaactctga tgagcaacgt 120

gttcaggatg cgcgggtatt ttgtgctgcc gtaatcgatg cgtactggca gaccctctgc 180

aaacgctaca agtcgagaat gaagcctaaa ggctctcaat acctggagca ggaaattgag 240

cctgatgccc ttcagttggc tgcagataca ggagagctga ttgctcagtt cccagtagaa 300

gatgctggtt atctgattgg ctcaatctac acggtaatgt tacccagctc cttgcgctca 360

agcctggggg cttattacac gccgccgccg ctggtatcca gactgctgga tctggccgaa 420

aaagctggct ttgatttcgg caagggtacg gcaattgacc ctgcatgtgg tggcggtgcc 480

ttcttggccc ctgttgccat gagaatgatt aagcgcatgc ccaaagcgtc cgctgaatgg 540

acgctcaaac gcattggcca aaggctgcgt ggtatcgaaa ttgacccctt tgctgcatgg 600

atgagcagcg tcatcctaga agcatctatt cttccgctat gtgttgaggc taaacggcga 660

ttgccgaatc tagtcaccgt tggagatgca cttaacgtgt ccaatatggg cacttttgac 720

ttggtaattg gcaaccctcc ctatgggcgt acaacacttt ctccggaaat gcgggacacc 780

tattctcggt cattgtacgg ccatgcgaat ctatatggtt tgtttacaga cttggcattg 840

cgacttgctg ctgacaatgg tgtggttgct tacctcactc ccacttcatt cctgggtggg 900

caatatttca aatcactgcg cgagctgctg accgccgaaa caacggtaaa aggtattgac 960

ttcatctctg atcgaaatgg cgtctttgat gacgtacttc aggaaacctt actgacagca 1020

tacaaaaaag agaaaagtaa tcagtctgcc aatatatcgc tgatcatgcc gcaagggcta 1080

aattccgcga aggttgaaaa gatcggtaag gttaaaattc ctaagtcggg tgagccttgg 1140

gtacttcctc gcagcacggc tgatgcgaaa tttatcgcca acctggaaaa gatgcccacg 1200

cgcctgatcg accttggcta tacagtctcg actggccaac tggtgtggaa ccgccacaaa 1260

gatcagctcc gctcgatgcc ttcaaaaagc actctgccat tgatctgggc agaatcagta 1320

acagccgacg gattcaagtt cagcgccact cgccggaatc atgttccgta tcttgcgctc 1380

tccgctaaac agcctcacct ggtaacacgg cattcttgtg ttctgctgca gcgtactact 1440

gcgaaagagc aggctcgccg cctaatccca gccttgttac cacaagactt cttagatgag 1500

catggcgggg ccgtagtgga aaaccacctc aacatgattt actgcgaagg cttagacatt 1560

gcagtagtca gcccgaaaac tgtttgcgcc ttactcagca ctgaagccgt ggacagggca 1620

tttcgtggta tcagtggcag cgttgctgta tctgcctatg aattgaatgc tttacctctg 1680

cccaccgttg accaaatttg cgaattagaa caattaatca gtagcggatg ccctaaagcg 1740

acgatagagc gcaaggtgtc agaattctat ggggaaaaaa caaagtga 1788

Claims

1.一株高产血红素的洛伊希瓦氏菌基因工程菌，其特征在于，所述工程菌是将洛伊希瓦氏菌(Shewanella loihica)PV-4的基因ypjD敲除后获得的，基因ypjD的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述洛伊希瓦氏菌基因工程菌在生产血红素中的应用。

3.权利要求1所述的高产血红素的洛伊希瓦氏菌基因工程菌的构建方法，包括以下步骤：

(1)敲除洛伊希瓦氏菌染色体上编码具有限制性内切酶PstI和甲基化酶PstM活性的两个基因，序列如SEQ ID NO.6和7所示，获得的菌株易于进行遗传操作；

4.根据权利要求3所述的洛伊希瓦氏菌基因工程菌的构建方法，其特征在于，所述的自杀质粒为pDS3.0，感受态细胞为大肠杆菌营养缺陷菌株E.coli WM3064。