CN1946844B

CN1946844B - 通过利用两个染色体外元件在原核细胞中产生重组基因

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Publication number: CN1946844B
Application number: CN2005800131740A
Authority: CN
Inventors: 阿纳·罗德里格斯-戈梅斯; 塔特贾纳·加利克; 玛丽-阿格尼丝·珀蒂; 伊凡·马蒂克; 米罗斯拉夫·拉德曼
Original assignee: Mixis France SA
Current assignee: Mixis France SA
Priority date: 2004-02-26
Filing date: 2005-02-26
Publication date: 2012-02-29
Anticipated expiration: 2025-02-26
Also published as: EA200601561A1; SI1718745T1; AU2005217093A1; AU2005217093B2; DE602005011106D1; JP2007523656A; AU2008264152A1; JP4777969B2; ATE414770T1; HK1097294A1; ES2315849T3; EP1718745B1; KR20060126570A; PT1718745E; ZA200606110B; EP1718745A1; CN1946844A; NZ548686A; US20070212692A1; WO2005083079A1

Abstract

本发明总体上涉及在真核细胞具体是细菌中产生和检测的重组DNA序列的方法，所述方法通过利用两个不同的染色体外元件以及具体是可用于进行本发明的方法的质粒的染色体外元件来进行。用于这些方法的DNA序列包括蛋白质编码型和非编码型序列。

Description

通过利用两个染色体外元件在原核细胞中产生重组基因

技术领域

本发明总体涉及在原核细胞具体是细菌中产生和检测重组DNA序列的体内方法，所述方法通过利用两个不同的染色体外元件以及用于进行本发明方法的染色体外元件具体是质粒来进行。这些方法涉及的DNA序列包括蛋白质编码型和非编码型序列。

背景技术

进化是遗传变异以及表型选择的连续过程。群体的遗传多样性可通过产生新的突变体组合来扩增，以改进群体内个体的表现。微生物的定向进化通过连续随机诱变和筛选经由经典菌株改进的过程常规实现。

定向进化目前几乎只被用作改造蛋白质的工具。通过突变技术诸如定点诱变，盒式诱变，随机诱变以及易错PCR已经产生蛋白质变体，并且已经筛选由此产生的文库中的蛋白质执行具体功能的能力。该方法的循环应用已经成功用于改造酶的物理和催化性质，诸如pH最佳值，耐热性，溶剂稳定性，等电点选择性，催化活性，底物特异性以及细菌中的毒性抗性机制以及病毒的宿主范围和稳定性。

产生出酶的新性质的常规诱变方法有很多限制。这些方法仅适用于已经被克隆并且在功能上定性且具有离散功能的基因或序列。此外，常规诱变方法仅开发出数量非常有限的改变(permutation)总数，甚至对于单个基因也如此。但是，在特定环境下可能需要不仅修饰一个基因，还要修饰其它基因，以表达具有新性质的蛋白质。所述其它基因可为例如协同赋予单个表型的基因或在一或多种细胞机制诸如转录、翻译、翻译后修饰、分泌或基因产物的蛋白水解降解中起作用的基因。意图通过常规诱变方法分别最优化所有具有所述功能的基因将是事实上不可能的任务。

大多数与常规诱变方法相关的问题可通过需要随机组合不同的功能基因序列的重组方法克服，从而在分子水平混合天然类似的或随机诱变的基因。与利用重组的常规诱变相比，获得具有改进的表型的突变体的可能性明显更高。重组方法相比于常规DNA操作技术的主要优势具体在于试验的简单性以及没有DNA序列导致的限制。

对于重组方法的许多认识来自对简单的单细胞生物体诸如细菌的研究。所述生物体中重组的研究的优势在于很容易操作DNA序列以及研究在大部分细胞中同步诱导的特异性重组事件的可能性。同样重要的是逐渐确信(growing conviction)在微生物中研究的过程在许多方面与哺乳动物细胞例如人细胞产生遗传多样性的途径是相同或相似的。此外，定义这些机制使得在哺乳动物细胞中开发更有效的基因靶向和基因置换机制的需要更为重要。

尽管存在在原核细胞中实施重组的多种不同系统，其中的大多数不允许方便且可信地检测新重组的DNA序列。因此，本领域仍然需要有效的原核检测系统，其具体允许快速并简便地检测重组体和/或在选择压力下选择重组体。

因此，本发明的技术问题是提供改进的方法和手段以简单并有效地在原核细胞中产生重组嵌合基因，具体用于筛选和检测所述重组序列。

本发明通过提供用于在原核生物中产生并检测重组DNA序列的方法解决该技术问题，包括以下步骤：

a)产生含有受体DNA分子以及供体DNA分子的第一原核细胞，所述受体DNA分子包含待重组的第一DNA序列并可在所述原核细胞中自主复制，所述供体DNA分子包含待重组的第二DNA序列以及编码基因产物的至少第一标记序列并不能在原核细胞中自主复制，

b)如果第一标记序列的基因产物被表达，在仅允许细胞的生长和增殖的选择性条件下培养第一原核细胞，和

c)分离第二原核细胞，其在选择性条件下生长和/或增殖，并且由于第一和第二DNA序列之间的重组，含有具有至少第一标记序列以及第一和第二重组的DNA序列的杂合DNA分子。

本发明提供用于在体内筛选至少两种趋异或异源的DNA序列或重组基质之间的重组事件的原核系统。通过涉及来自包含待重组的两个DNA序列的两个染色体外元件的DNA的体内交换的方法，本发明的系统允许以快速且有效的方式从至少两个趋异的DNA序列产生具有改进的性质的新的优势DNA序列。其核苷酸序列不显示同源性的两个染色体外元件以受体DNA 分子和供体DNA分子的形式导入原核宿主细胞。受体分子可在诉诸中自主复制，而供体分子没有复制能力。但是，供体分子含有至少一种独特的蛋白编码型标记序列，诸如抗生素抗性标记或营养标记，其既不存在宿主细胞的基因组中，也不存在受体分子中。将两种染色体外元件导入原核宿主细胞后，所述细胞在强制进行两种异源基因的重组的条件下培养。这些条件可包括例如在存在细胞通常对其敏感的抗生素的条件下进行培养和在缺乏必要营养的培养基中培养细胞，其中所述细胞自身不能合成所述必要营养素并且由此必需从外部添加。在所用的培养条件下，细胞仅可生长和繁殖，即分裂，条件是选择性标记序列的基因产物得以表达。但标记序列的表达的前提是非复制型供体分子和复制型受体分子形成共整合子，其可从受体分子的起点复制并由此保证保持标记序列。该共整合子的形成是两种重组基质之间的重组的结果，导致产生新的DNA分子，其序列与亲本DNA序列不同。该创造性方法由此提供简单和快速的选择系统来鉴定重组DNA序列。利用该创造性方法，重组的突变DNA序列可大文库可轻易产生，随后可利用适宜的选择或筛选系统鉴定具有获得的所需功能的变体。

在简单的单细胞生物体诸如原核生物中对重组过程的研究具有明显的优势，即DNA序列操作容易以及研究在大部分细胞中同步诱导的具体重组事件的可能性。此外，最近几十年来，在发酵技术以及原核生物体的基本遗传学中积累了大量专业知识。原核宿主细胞的另一主要优势涉及其非常短的倍增时间。由此，通过利用原核宿主细胞，可进行许多轮细胞分裂由此进行多轮重组并在短时间内产生多种新的重组DNA序列。

本发明的方法可在野生型或错配修复缺陷的原核细胞中进行。使得受损DNA得以修复的方法与遗传重组的机制紧密相关；并且已知错配修复机制对于不同序列之间的重组即部分同源重组的频率有抑制性效应。错配修复系统的突变由此大大促进原核细胞中重组事件的总体频率。另一方面，已知原核野生型细胞具有错配修复依赖性重组机制，其基于两种重组基质中间隔一段距离的错配。根据待重组的DNA序列，无论是野生型或错配修复缺陷原核细胞可用于获得重组的序列。

本发明用于产生并检测重组DNA序列的方法具有这样的优势，即差异很大的DNA序列可被重组。本发明人意外发现具有高总体差异程度并仅共享非常短的同源或相同片段的序列可被重组。对重组序列的分析揭示了其中出现重组的最长的同一性片段仅包括18-22个核苷酸。大多数重组事件出现在长度为10-15个核苷酸的同源片段中。一些情况中，重组出现在长度仅为4-5个核苷酸的片段中。

因此，本发明的方法允许源自不同原核物种或不同原核属的DNA序列的重组，以产生具有优势性质的重组DNA序列。

本发明产生和检测重组的DNA序列的方法的优势在于超过两种不同的序列可被重组，由此所述待重组的两种不同的序列可为预选出的或非选出的序列。

例如多种不同DNA序列直到整个基因文库可被插入受体以及供体DNA分子。随后，单独的不同DNA序列可彼此重组。还可能将第一套不同的DNA序列直到整个基因文库仅仅插入受体DNA分子中，并将第二套不同的DNA序列直到整个基因文库插入供体DNA分子中或反之，然后将这两组进行重组。在两种情况下，对于哪对不同的DNA序列将被重组没有选择。

然而，可能将多种，优选预选出的不同序列以逐步的方式进行重组，由此每个步骤中，对哪对应当重组的不同的DNA序列进行选择。如果，例如，三种待重组的不同的DNA序列应当被重组，而不是第一步中第一原核细胞被产生，由此例如，具有待重组的第一DNA序列的受体DNA分子以及具有待重组的第二DNA序列的供体DNA分子被导入给定物种的细菌种类。这些原核细胞在选择性条件下培养，使得只有这样的细胞生长并增殖，其中不同的受体和供体DNA分子形成杂合分子，使得能够表达供体分子的标记序列并且两种待重组的DNA序列能够重组。由此，获得含有由于重组具有第一和第二重组DNA序列的杂合分子的第二原核细胞。分离第一和第二重组序列并将其中之一插入例如受体分子，而待重组的第三DNA序列被插入供体分子。随后，在下一步中，包含重组序列之一的受体分子以及包含待重组的第三DNA序列的供体分子再次被导入原核宿主细胞并进行另一轮重组。

如果，例如，四种不同的DNA序列将进行重组，则在第一步中产生两组不同的第一原核细胞。例如，第一组的第一原核细胞可通过将具有待重组的第一DNA许兰列的受体DNA分子和具有待重组的第二DNA序列的供体DNA分子导入原核细胞来产生。同样，第二组第一原核细胞可通过将具有待重组的第三DNA序列的受体DNA分子以及具有待重组的第四DNA序列的供体DNA分子导入相同物种的细胞来产生。每组原核细胞在可实现重组的选择性条件下培养。由此，获得具有由于第一和第二待重组DNA序列之间的重组产生的具有第一和第二重组的DNA序列的杂合分子的第一组原核细胞。还获得另一组原核细胞，其含有由于待重组的第三和第四DNA序列之间的重组产生的具有第三和第四重组DNA序列的杂合分子。然后，由此获得的所述第一、第二、第三和第四重组DNA序列自其分别的宿主细胞分离。另一步骤中，所述第一或第二重组序列可被插入供体DNA分子，第三和第四重组序列可被插入受体DNA分子。由此获得的供体和受体DNA分子随后被引入原核宿主细胞，并接受另一轮重组。由此，第五、第六和更多的不同DNA序列也可被重组。

本发明优选的实施方案中，所述供体DNA分子和受体DNA分子是不同的线性或环状DNA结构。术语“DNA结构”指DNA分子，例如载体诸如质粒或噬菌体，其特征在于其在导入原核宿主细胞时呈现染色体外元件的形式。本发明中，“染色体外元件”是不整合入原核宿主细胞的染色体的DNA分子。

供体DNA分子必须能够与受体DNA分子杂交，由此可形成杂合分子。优选，供体DNA分子和受体DNA分子不共享同源性，除非待重组的DNA序列。

根据本发明，受体DNA分子必须能够在导入原核宿主细胞后在其中自主复制。由此受体DNA分子必须具有至少一个复制起点，使得受体DNA分子能够独立于宿主遗传物质而进行复制。本发明中，“复制起点”或“ori”是细胞酶用于启动DNA分子复制的DNA分子的区域。在起点，DNA的两条链被拉开形成复制泡(bubble)，在泡的每侧产生单链DNA区域。DNA聚合酶装置可随后移动进入其中，并开始合成新的DNA链，利用旧的链作为模板。包括细菌质粒或噬菌体的小的DNA通常具有单个起点。

本发明的实施方案中，受体DNA分子是质粒，具体是双链环状DNA分子。“质粒”是染色体外元件，其可独立于宿主遗传物质进行复制。本发明另一实施方案中，受体DNA分子是噬菌体，具体是以染色体外元件的形式存在原核细胞中的DNA的噬菌体。

本发明的优选实施方案中，受体DNA分子是质粒，其可在大肠杆菌宿主细胞中复制。优选，受体DNA分子是大肠杆菌质粒pACYC184或其衍生物，质粒pACYC184是Tet^R和Cam^R。

本发明中，供体DNA分子是不能在原核宿主细胞中复制但能够与受体DNA形成杂合分子的DNA分子。因此，制药含有至少标记序列并且不能在给定的原核宿主细胞中独立复制，任何DNA分子可用作供体分子。适宜供体分子包括，但不限于，线性双链DNA，其可环化，例如通过PCR产生并含有适宜标记序列，质粒和噬菌体。如果质粒和噬菌体用作供体DNA分子，该分子可根本不具有复制的功能起点或具有在所用的原核宿主细胞中没有功能即无活性的复制起点。

因此，本发明的一个实施方案中，供体DNA分子含有复制起点。这意味着，供体DNA分子不含有任何可在任何原核宿主细胞中作为复制起点起作用的序列，即参与复制起始的蛋白质因子可结合的序列。缺乏复制起点可由于缺失起起点作用的核酸序列。

本发明另一实施方案中，供体DNA分子的复制起点的功能被一或多种消除复制起点本身的功能或参与复制的蛋白质的功能的突变损害，具体是与起点的核酸序列结合的那些蛋白质，由此启动复制。例如已知大肠杆菌中，复制启动的关键蛋白DnaA在复制染色体起点结合特异性序列即所谓的DnaA-盒子并融化三种富含AT的13mer直接重复。DnaA蛋白还结合开放区中单链6mer盒子，这被认为可稳定所述开放复合物(参见Jiang etal，PNAS，100(2003)，8692-8697)。DnaA盒子以及富含AT的区域通常见于多种原核复制子的起点，DnaA蛋白质显示在这些起点处在复制启动中起重要作用。因此，DnaA盒子和/或AT富含区或复制起点的序列中的相应位点的一些突变诸如适宜碱基取代，缺失等可防止复制启动所需蛋白质的结合，由此抑制染色体外元件的功能。在本发明优选实施方案中，供体DNA分子的复制起点的功能可受到供体DNA分子的复制起点的核酸序列中一或多种突变的损害，具体是DnaA盒子中和/或起点的AT富含区域中。

此外，已知单独的DnaA蛋白不足以在质粒的起点形成开放复合体，所述质粒诸如RK2，P1，F，pSC101或R6K。在这些情况中，有效形成开发复合体需要质粒Rep蛋白的结合，尽管与宿主DnaA蛋白和HU或IHF(整合的宿主因子)蛋白一起。开放复合体形成的质粒特异性启动蛋白需要是质粒对其复制起点的启动事件的频率进行控制的关键(参见Jiang etal.，PNAS，100(2003)，8692-8697)。这意味着，编码在质粒复制中具有重要功能的蛋白质因子的质粒核酸序列的突变也可损害染色体外元件的复制起点的功能。本发明的另一优选实施方案中，供体DNA分子的复制起点可被编码在供体DNA分子的复制中具有重要功能的蛋白质因子的核酸序列中的一或多种突变损害。

本发明另一实施方案中，供体DNA分子含有这样的复制起点，其仅在一些原核宿主细胞中有活性，但在导入了所述供体DNA分子的原核细胞中无活性，从而实现待重组的两种DNA序列的重组。有许多报道称，在具体的细菌种类中有活性的复制起点不在另一种细菌种类中起作用。例如已知肺炎克雷伯氏菌的复制起点(oriC)在Caulobacter crescent、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)或Rhodobacter sphaeroides(O″Neill和Bender，J.Bacteriol.，170(1988)，3774-3777)中无活性。还已知枯草芽孢杆菌的质粒不能在大肠杆菌细胞中复制。优选实施方案中，供体DNA分子和/或其复制起点源自除其细胞中导入了该供体DNA分子的原核物种以外的原核生物。

具体的优选实施方案中，所述供体DNA分子是枯草芽孢杆菌质粒pMIX91，其为质粒pIL253的衍生物并可在大肠杆菌中复制，并包含spec^R 标记，phleo^R标记和限制位点ScaI，PpuMI和EcoO109I，用于插入外来DNA序列。另一具体优选实施方案中，供体DNA分子是枯草芽孢杆菌质粒pMIX101，其为质粒pIL253的衍生物并可在枯草芽孢杆菌中复制但不能在大肠杆菌中复制，并且包含spec^R标记，phleo^R标记以及限制位点XhoI以及PstI用于插入外来DNA序列。

本发明另一实施方案中，供体DNA分子的复制起点仅仅在具体的温度范围内起作用，例如在低于45℃。如果供体DNA分子含有所述温度敏感起点，其将不能在非容许性条件即高于45℃的温度下复制，但允许原核宿主细胞的生长。

本发明术语“标记序列”指在给定的原核细胞中独一无二避过那且位于供体DNA分子和受体DNA分子上的DNA序列，优选位于重组基质的上游或下游，或已经重组的DNA序列。标记序列在相同DNA分子杀过那存在，这是由于重组基质或已经重组的DNA序列，优选与另一标记序列组合，其可位于重组基质的另一侧，允许重组基质或已经重组的DNA序列被识别并选择，所述选择可通过分子或遗传学方法。

本发明的供体DNA分子包含第一标记序列，其允许选择参与重组基质的交叉。所述第一标记序列，优选与其它存在供体DNA分子或受体DNA分子上的其它标记序列组合，也允许其它轮的重组以重复的方式进行。

本发明的“第一标记序列”是编码蛋白质的DNA序列，其基因产物对于原核宿主细胞在所用选择性条件下的生长和繁殖是必要的。第一标记序列选自以下物质组成的组：营养标记，抗生物抗性标记，以及编码仅两个或多个亚基在相同细胞中表达的条件下起作用的酶的亚基的序列。

“营养标记”是编码可补偿生物体或细胞的营养缺陷型的基因产物并由此可赋予所述营养缺陷型生物体或细胞原营养的标记序列。本发明术语“营养缺陷型”意指有机体或细胞必须在含有不能由所述营养缺陷型生物体自身合成的必须营养的培养基中生长。营养标记基因的基因产物促进营养缺陷型细胞中缺乏的必须营养素的合成。因此，一旦营养标记基因得以表达，不需要将该必需营养素添加到所述生物体或细胞生长的培养基中，这是由于所述生物体或细胞已经获得了原营养。

“抗生素抗性标记”是标记基因，其中基因产物在表达时赋予所述抗生素标记基因在其中表达的细胞在存在给定浓度的给定抗生素的培养基中生长，而不具有所述抗生素抗性标记的细胞则不能。

“编码酶亚基的序列”可用作标记序列，条件是所述细胞不能合成完整酶结构的组装由此获得酶的完整活性所需的酶的所有亚基，并且如果存在或缺失酶活性可通过遗传和/或分子手段监控。如果，例如酶的活性是细胞的重要生化途径所需的，其使得细胞能在具体环境中生长和/或增殖，则细胞不能合成完整酶结构的所有组分，则细胞不能在所述环境中生存。用作标记序列的“编码酶亚基的序列”在表达时允许完整酶的组装以及细胞的存活。

优选，第一标记序列的基因产物赋予抗生素敏感性细胞以对抗生素的抗性。具体地，所述第一标记序列是spec^R，其基因产物赋予细胞对壮观霉素的抗性，phleo^R，其基因产物赋予对腐草霉素的抗性，或tc^R，其基因产物赋予对四环素的抗性。

本发明另一实施方案中，所述供体DNA分子含有第二标记序列。本发明另一实施方案中，所述受体DNA分子含有第三标记序列以及可选的第四标记序列。这意味着，本发明的实施方案中，供体DNA分子可包含至少第一和第二标记序列，可选甚至更多标记序列，其可被排列在例如重组基质的上游或下游。另一实施方案中，受体DNA序列可包含第三和第四标记序列，可选甚至更多标记序列，其可排列在例如重组基质的上游或下游。这些其它的标记允许增加对重组DNA序列进行选择的严谨度，这是由于在第二原核细胞中形成并包含两种不同重组DNA序列的杂合分子可包含总共至少四种不同的标记序列。

本发明“第二、第三和第四标记序列”是选自下组的蛋白质编码型或非编码型序列：营养标记、色素标记、抗生素抗性标记、抗生素敏感标记、引物识别位点、内含子/外显子边界、编码酶的具体亚基的序列、启动子序列，下游调控的基因序列和限制酶位点。

“色素标记”是其中基因产物参与色素合成的标记基因，所述色素在表达时将使该色素标记在其中表达的细胞被染色。不具有色素标记的细胞不能合成色素并且由此不能被染色。由此该色素标记允许快速检测含有该色素标记的细胞的表型。

“抗生素敏感标记”是其基因产物在表达时破坏细胞在存在给定浓度的给定抗生素下生长的能力的标记基因。

“引物识别标记”是位点特异性PCR引物的退火位点，其允许通过PCR快速鉴定不同的标记序列。

本发明优选实施方案中，供体DNA分子的第二标记序列以及受体DNA分子的第三和第四标记序列是蛋白质编码型序列，其基因产物赋予抗生素敏感型细胞对抗生素的抗性。优选，第三标记序列的基因产物赋予细胞对四环素的抗性，第四标记序列的基因产物赋予细胞对氯霉素的抗性。

本发明术语“待重组的DNA序列”和“重组基质”指任何两种可作为同源或非同源重组过程的结果而被重组的DNA序列。

多种类型的同源重组事件的特征在于破坏的DNA链与同源配偶体的碱基配对，其中反应的程度可涉及成百个几乎完全配对的碱基对。反之，illegitimate或非同源重组的特征在于不具有互补碱基对或仅具有少量互补碱基对的DNA的末端的连接。在原核细胞中，非同源修复和重组事件以比同源重组事件低得多的频率发生。

本发明优选实施方案中，两种重组基质，即待重组的第一和第二DNA序列是不同的序列，即其不相同但显示一定程度的同源性。术语“同源性”是指存在两种核酸分子序列之间的同一性程度。根据本发明，待重组的DNA序列就其整体比对而言在两个或更多个位置上不同。在本发明的实施方案中，两种重组基质之间的总体分歧度相对于其总体长度为超过0，1％，具体为超过5％，优选超过25％。这意味着，待重组的DNA序列的差异可为超过30％，超过40％或甚至超过50％。本发明具体优选的实施方案中，待重组的两个DNA序列共享至少一或多个同源或相同区域，但所述区域非常短。本发明的同源或相同区域可包括少于25个核苷酸，具体少于29个或少于15个核苷酸，甚至少于10个核苷酸，例如4，5，6，7，8或9个核苷酸。

重组基质或待重组的DNA序列可具有天然或合成来源。因此，本发明一个实施方案中，待重组的第一和第二DNA序列是天然存在的序列。天然存在的序列可通过适宜分离方法分离自任何天然来源，包括病毒，存活或死亡的原核生物体诸如细菌，存活或死亡的真核生物体诸如真菌、动物、植物和人，或其部分，或可通过化学手段合成。天然存在的序列也可包括在从天然来源分离后进行诱变的序列。本发明另一实施方案中，待重组的第一和第二DNA序列是不见于天然来源的人工序列。人工序列可通过任何已知化学方法合成。

本发明优选实施方案中，待重组的DNA序列是编码蛋白质的序列，例如编码可用于工业制备天然和非天然化合物的酶的序列。用于通过利用酶的辅助制备的化合物的酶可用于制备药物，化妆品，食品等。编码蛋白质的序列也可为编码可用于人和动物健康领域的治疗应用的蛋白质的序列。医学上重要的蛋白质的重要种类包括细胞因子和生长因子。蛋白质编码序列的重组允许产生编码具有改变的优选改进的功能和/或新获得的功能的新的突变序列的产生。由此，可能例如实现蛋白质热稳定性的提高，改变蛋白质的底物特异性，改善其活性，开发新的催化性位点和/或融合来自两种不同的酶的结构域。待重组的编码蛋白质的DNA序列可包括来自不同物种的序列，其编码在其天然背景中相似或相同的功能的相同或相似的蛋白质。待重组的蛋白质编码型DNA序列可包括来自相同蛋白或酶家族的序列。待重组的蛋白质编码序列也可为编码具有不同功能的蛋白质的序列-例如，编码催化给定代谢途径的不同步骤的酶的序列。本发明优选实施方案中，待重组的第一和第二DNA序列选自Beta-内酰胺酶的Oxa超家族的基因序列的组。

本发明另一优选实施方案中，待重组的DNA序列是非编码型序列，诸如例如参与其天然细胞背景中参与蛋白质编码型序列的表达的调节的序列。非编码型序列的实例包括，但不限于，启动子序列，含有核糖体结合位点的序列，内含自序列，多腺苷酸化序列等。通过重组所述非编码型序列，可能产生突变序列，其在细胞环境中在改变的细胞过程的调节-例如，基因的改变的表达。

本发明的重组基质或待重组的DNA序列可当然包括超过一种蛋白质编码序列和/或超过一种非编码型序列。例如，重组基质可包括一种蛋白质编码型序列加上一种非编码型序列以及不同的非编码型序列。本发明的另一实施方案中，待重组的DNA序列可由一或多个具有间插和/或侧接非编码序列的编码序列组成。这意味着，待重组的DNA序列可为例如在其5’-末端具有调节序列和/或未翻译的3’-区域的基因序列或具有外显子/内含子结构的哺乳动物基因序列。本发明另一实施方案中，待重组的DNA序列可由较大的连续DNA片段组成，所述片段含有超过一个编码序列，可选具有间插型非编码序列，诸如操作子。待重组的DNA序列可为已经经过一次或多次重组事件的序列，例如同源和/或非同源重组事件。

重组基质可包含非突变型野生型DNA序列和/或突变型DNA序列。优选实施方案中，可能将野生型序列与已经存在的突变序列重组以产生新的突变序列。

本发明中原核细胞用作宿主细胞以导入受体和供体DNA分子。术语“原核细胞”和“原核宿主细胞”包括任何细胞，其中的基因组在细胞浆中作为环状结构游离存在，即细胞，其中的基因组不被细胞核膜所围绕。原核细胞的特征还在于其不必需依赖于氧并且其核糖体小于真核细胞的核糖体。原核细胞包括古细菌和真细菌。与细胞壁组成无关，真细菌可分成革兰氏阳性细菌，革兰氏阴性细菌和蓝细菌。

因此，本发明的原核细胞是古细菌或真细菌的细胞，由此本发明的优选实施方案中，原核细胞是革兰氏阴性细菌，革兰氏阳性细菌或蓝细菌。优选，革兰氏阴性细菌是大肠杆菌，例如大肠杆菌AB1157或其MutS^-突变体，大肠杆菌MXP1。

本发明优选使用原核宿主细胞，用于具有功能修复系统的创造性方法。错配修复(MMR)系统是避免由于复制过程中DNA聚合酶错误造成的突变的最大的贡献因素之一。但是错配修复也通过保证遗传重组的忠诚度来促进遗传稳定性。虽然在细菌以及酵母和哺乳动物细胞中，含有一些错配(＜1％)的部分同源DNA底物出现的效率渊源低于相同序列的情况，重组的频率(基因转化和/或交叉)在MMR缺陷系中明显升高。这意味着，重组的高度忠诚度不仅是由于重组酶的内在性质造成的，也是由于通过错配修复系统对重组进行编辑造成的。因此，错配修复机制对于趋异序列之间的重组具有抑制效应。在大肠杆菌中，甲基指导的MMR系统的两种蛋白，即MutS和MutL，是这种强抗重组活性所需的，但是其它MMR系统蛋白MutH和UvrD的影响则低得多。除了它们在MMR和部分同源重组中的作用，MMR蛋白也在基因转化过程中非同源DNA的去除中起重要作用。

本发明另一优选实施方案中，使用错配修复系统缺陷的原核细胞。本发明中，术语“错配修复系统缺陷”意指原核细胞的MMR系统被暂时或永久性损害。细胞或生物体的MMR缺陷可通过任何暂时或永久损害MMR系统的策略实现，包括但不限于一或多种参与MMR的基因的突变，利用诸如UV光的因子进行处理，其导致MMR的整体损伤，利用诸如2-氨基嘌呤或含有过量错配的异源双链体的因子进行处理以部分包含并失活MMR系统，以及参与MMR的一或多种基因的可诱导表达或抑制，例如通过可调节的启动子，其允许瞬时失活。

本发明优选实施方案中，原核宿主细胞的错配修复系统是由于至少一种参与MMR的基因的突变造成的。优选实施方案中，原核细胞具有突变的mutS基因，突变的mutL基因，突变的mutH基因和/或突变的UvrD基因。

另一实施方案中，原核宿主细胞的一或多种主要重组蛋白受损或受阻。已经显示例如AddAB基因受损的细胞显示高频率同源和非同源重组。另一实施方案中，所述原核宿主细胞过表达主要重组蛋白之一诸如recA。该蛋白通过促进单链DNA的复性以形成重组事件所需的异源双链体分子并启动DNA链的交换而参与同源重组。

本发明中第一原核细胞通过将受体DNA分子和供体DNA分子同时或序贯导入原核宿主细胞来产生。本发明一个实施方案中，第一原核细胞可通过在第一步中将受体DNA分子引入具体的原核宿主细胞来产生。发现含有受体分子的原核宿主细胞之后，在第二步中将供体DNA分子引入含有受体DNA分子的细胞。本发明另一实施方案中，受体和供体DNA分子都可被同时引入原核宿主细胞。

根据本发明，将受体和供体DNA分子导入原核宿主细胞可通过任何已知适宜方法进行，例如转化，接合，转导，性导，感染和/或电穿孔。

本发明术语“转化”指通过细胞例如微生物细胞对环境中分离的优选纯化的核酸分子的摄取。一些原核物种的细胞诸如芽孢杆菌或双球菌(Diplococcus)是天然感受态的，但是其它原核物种诸如大肠杆菌的细胞必需经过特殊处理以使其变为感受态，即诱导核酸分子转移穿过细胞膜。已知几种细菌具有通过转化进行DNA交换的能力。

“接合(conjugation)”指通过细胞-细胞接触，质粒介导的细菌质粒从一种细菌细胞转移入另一种细菌细胞。有关的转移机制通常由质粒或偶联的转运子编码。所述质粒是结合质粒或辅助质粒。结合质粒是自身可传递的质粒，其携带促进细胞-细胞接触(动员(mobilization)基因)。它们含有产生接合桥的基因。一旦产生所述的桥，其它质粒以及甚至染色体DNA(结合转运子)也可被转移。可移动的质粒含有移动化基因，但需要接合质粒的“辅助”以在细胞间移动。接合是原核细胞的不同种系发生的组之间以及原核细胞和真核细胞之间的遗传交换的主要途径之一。

“性导”是这样的过程，经由该过程遗传物质从具有F因子和F质粒的原核细胞转移到不含有F因子的细胞(F-)。F因子通常存在细菌细胞的细胞质中，但有时可包含在细菌染色体不同位点，这导致形成Hfr-细胞。F因子的整合是可逆的，由此一旦所述质粒发生错误整合，就产生所谓的取代的F因子(F’)，其含有细菌染色体中与F因子的原始真核位点侧接的遗传物质。

“转导”意指核酸分子通过噬菌体从一种细菌细胞转移到另一种细菌细胞中，包括将噬菌体从一种细胞释放以及随后对另一种细胞的感染。存在两种形式的转导。专门的(specialized)转导可在温度细菌噬菌体的细胞裂解性细胞周期的过程中出现，由此细菌的遗传物质可取代部分细菌噬菌体基因组。该段细菌DNA作为噬菌体基因组的一部分复制并可通过噬菌体被转移入另一受体细胞。在通常的转导的情况中，裂解性噬菌体的整个基因组可被细菌DNA取代。当该噬菌体感染另一种细菌的时候，其将DNA注入受体，在受体中其与受体细胞的DNA片段进行交换。

“电穿孔”是这样的过程，其中细胞与核酸分子混合，并短时间暴露于高电压。由此使得宿主细胞的细胞膜可通透，允许外来核酸进入宿主细胞。

本发明具体优选的实施方案中，供体DNA分子在导入原核宿主细胞之前接受UV照射，这是由于已知辐照会导致重组频率增加。

根据本发明，含有受体和供体DNA分子的第一原核细胞在强迫受体和供体DNA分子的共整合子或杂合分子以及两种重组基质的重组优选非同源重组的条件下，即允许选择重组的DNA序列的条件。

如果供体DNA分子的第一标记序列是抗生素抗性标记，含有受体和供体DNA分子的第一原核细胞在存在所述原核宿主细胞敏感并且第一标记序列的基因产物赋予对其的抗性的抗生素的条件下培养。具有优选的实施方案中，所述第一原核细胞在存在放线壮观素的条件下培养，条件是供体DNA上存在的第一标记序列是spec^R，其基因产物赋予细胞对放线壮观素的抗性。另一具体优选的实施方案中，所述第一原核细胞在腐草霉素存在的条件下进行培养，条件是存在供体DNA分子上的第一标记序列是phleo^R，其基因产物赋予细胞对腐草霉素的抗性。另一具体优选的实施方案中，所述第一原核细胞在存在四环素的条件下培养，条件是存在供体DNA分子上的第一标记序列是tc^R，其基因产物赋予细胞对四环素的抗性。

如果供体DNA分子的第一标记序列是营养标记，含有受体和供体DNA分子的第一原核细胞在缺乏特定的必要营养素的培养基中培养，该营养素不能由宿主细胞自身合成，并且在导入供体分子并表达包含在供体分子中的第一标记基因时供给宿主细胞。一旦第一营养标记基因表达，不必要将该必需营养素添加到原核细胞生长的培养基中。

如果第二标记序列，第三标记序列和/或第四标记序列是抗生素标记，则在优选实施方案中，第一原核细胞可在另外存在第二、第三和/或第四抗生素的条件下培养，其中所述第二、第三和第四标记序列的基因产物分别赋予对所述抗生素的抗性。优选，第一原核细胞培养在不仅存在腐草霉素或壮观霉素或四环素，而且还存在氯霉素的条件下。最优选，所述第一原核细胞在存在腐草霉素，壮观霉素，氯霉素和四环素的条件下生长并增殖。

在选择性条件下培养原核细胞之后，分离含有受体和供体DNA分子形成的共整合子或杂合分子的第二原核细胞。该共整合子含有重组DNA序列。共整合子和/或重组DNA序列的存在可通过多种手段诸如限制图谱分析，PCR扩增和/或测序等得以确认和检测。如果，例如供体分子的第二标记许了和受体分子的第三或第四标记序列是独特的引物识别序列，则该共整合子的特异性片段可通过利用识别这些各自的标记组合的适当引物来进行PCR扩增。为了检测各种标记组合的存在，如果没有形成共整合子，即没有出现重组，这些片段则不能被检出。如果，例如供体分子的第二标记序列和受体分子的第三或第四标记序列是独特的限制酶切位点，那么所述共整合子可接受限制酶分子以检测具体的DNA片段。如果没有形成共整合子，即没有出现重组，这些片段则不能被检出。

根据本发明，第二原核细胞的杂合DNA分子中包含的第一和第二重组DNA序列可被分离和/或分析和/或选择。获得的第一和第二重组DNA序列可通过例如PCR扩增或利用适当的限制酶切割来分离。杂合DNA分子中所含的第一和第二重组DNA序列的分析可例如通过测序方法来进行。

根据本发明，分离的第一和第二重组DNA序列可分别再次插入供体DNA分子和受体DNA分子，并通过利用本发明的方法进行另一轮重组。

本发明的另一方面涉及产生具有新的或改进的功能和性质的新蛋白、酶和非编码序列的方法，由此已知的蛋白质编码型序列或已知的非编码型序列通过利用本发明的方法进行一或多轮重组，以产生并检测原核宿主细胞中的重组DNA序列。本发明还涉及通过本发明的任何一种方法产生的蛋白质、酶和非编码序列。

本发明还涉及枯草芽孢杆菌质粒pMIX91，其是质粒pIL253的衍生物并可在枯草芽孢杆菌中复制，但不能在大肠杆菌中复制，并且其包含spec^R 标记和phleo^R标记以及限制位点ScaI，PpuMI和EcoO109I，用于插入外来DNA序列。

本发明还涉及枯草芽孢杆菌质粒p-MIX101，其为质粒pIL253的衍生物并可在枯草芽孢杆菌中复制，但不能在大肠杆菌中复制，并且其包含tc^R标记序列和限制位点XhoI和PstI，用于插入DNA序列。

本发明还涉及枯草芽孢杆菌菌株DSM17158，其含有枯草芽孢杆菌质粒pMIX91(于2005年2月21日保藏在DSMZ，Deutsche Sammlung furMikroorganismen und Zellkulturen GmbH，Braunschweig，Germany，SB202pMIX91)，并涉及枯草芽孢杆菌菌株DSM 17159，其含有枯草芽孢杆菌质粒pMIX101(于2005年2月21日保藏在DSMZ，Deutsche Sammlung furMikroorganismen und Zellkulturen GmbH，Braunschweig，Germany，1A423pMIX101)。

本发明另一方面分别涉及枯草芽孢杆菌质粒pMIX91和pMIX101作为供体DNA分子在本发明方法中的用途，即质粒pMIX91或pMIX101用于在原核宿主细胞优选大肠杆菌细胞中产生和/或检测重组DNA序列的用途。

本发明另一方面涉及大肠杆菌质粒pACYC184或pMIX100或其衍生物作为本发明方法中的受体DNA分子的用途，即质粒pACYC184或pMIX100用于在原核宿主细胞优选大肠杆菌细胞中产生和/或检测重组DNA序列的用途。

本发明另一方面涉及试剂盒，其可用于进行本发明的方法以在原核宿主细胞中产生并检测的重组DNA序列。第一个实施方案中，所述试剂盒至少包含含有大肠杆菌AB1157的细胞作为原核宿主细胞的第一容器，含有大肠杆菌质粒pACYC184或大肠杆菌质粒pMIX100的大肠杆菌菌株AB1157的细胞作为受体DNA分子的第二容器，以及含有枯草芽孢杆菌质粒pMIX91的枯草芽孢杆菌菌株DSM17158的细胞或包含枯草芽孢杆菌质粒pMIX101的枯草芽孢杆菌菌株DSM17159的细胞作为供体DNA分子的第三容器。本发明的第二个实施方案中，所述试剂盒至少包含含有菌株AB1157的MutS-突变体即大肠杆菌菌株MXP1的细胞作为原核宿主细胞的第一试剂盒，含有质粒pACYC184或pMIX100的大肠杆菌菌株AB1157的细胞的第二容器，以及含有质粒pMIX91的枯草芽孢杆菌菌株DSM17158的细胞或含有质粒pMIX101的枯草芽孢杆菌菌株DSM17159的细胞的第三容器。另一实施方案中，所述试剂盒至少包含含有大肠杆菌菌株AB1157或大肠杆菌菌株MPX1的细胞的第一容器，含有大肠杆菌质粒pACYC184或pMIX100 的DNA的第二容器，以及含有枯草芽孢杆菌质粒pMIX91或枯草芽孢杆菌质粒pMIX101的DNA的第三容器。

本发明另一方面涉及在原核细胞中产生杂合基因和/或杂合基因编码的蛋白质的方法。用于产生杂合基因和/或杂合基因编码的蛋白质的方法包括进行本发明的方法以产生并检测重组DNA序列的步骤，由此在原核细胞中产生杂合基因和/或杂合基因编码的蛋白质。表达后，在原核细胞中选择和/或分离杂合基因和/或编码的蛋白质。

本发明还涉及可通过本发明用于产生杂和基因的方法或本发明用于产生并检测重组DNA序列的方法获得的杂合基因。

本发明还涉及蛋白质，其由杂合基因编码，所述杂合基因可通过本发明用于产生杂合基因的方法或本发明用于产生并检测重组DNA序列的方法获得，和/或可通过本发明用于产生杂合基因编码的蛋白质的方法获得。

本发明通过以下序列表，附图，以及实施例举例说明。

图1图示了本发明产生和/或检测两条DNA序列间的重组的方法。第一序列oxa7基因，存在于枯草芽孢杆菌质粒pTG2-phleo上作为供体DNA分子。pTG2-phleo携带spec^R和phleo^R标记，其赋予对壮观霉素和腐草霉素的抗性。通过电穿孔将TG2-phleo导入作为受体DNA分子的含有质粒pTG3的大肠杆菌宿主细胞。pTG3包含第二DNA序列，oxa11基因，以及赋予对氯霉素抗性的cm^R标记。导入TG2-phleo后，细胞在存在壮观霉素和腐草霉素的条件下培养，其强制两种质粒间的共整合形成以及两种基因之间同时进行重组。因此，培养后，获得含有二聚体质粒的大肠杆菌细胞，所述质粒含有新重组的DNA序列R1和R2。重组的DNA序列可通过对限制图谱分析、R1和R2重组基因的PCR扩增和/或R1和R2的测序来分析。

图2显示质粒spUC19-phleo，pic156，pACYC184和pIL253的物理图谱，其用于构建适合本发明所述方法的构建体。

图3显示被构建用于进行本发明方法的质粒的物理图谱。质粒pMIX96和pMIX 97没有显示，这是由于它们与pMIX95相似，但是分别具有oxa5和oxa1，而不是oxa11。pMIX99与PMIX98相似，但具有oxa1而不是oxa11。

图4显示通过本发明对趋异度22％的oxa基因进行体内重组的方法获得的基因的结构。详细描述了其中发生交换的序列同一性片段。

图5显示大肠杆菌质粒pMIX100的结构，其可在大肠杆菌宿主细胞中用作受体DNA分子。PMIX100携带来自质粒pACYC184的复制起点以及氯霉素抗性基因。PMIX100还携带来自pBluescript SK+的基因lacZ。

图6显示枯草芽孢杆菌质粒pMIX101的结构，其为枯草芽孢杆菌质粒pIL253的衍生物并可在大肠杆菌宿主细胞中用作供体DNA分子。pMIX101携带赋予对红霉素的抗性的标记Erm^R，以及赋予对四环素抗性的Tc^R。四环素抗性基因扩增自质粒pACYC184。

图7显示转化效率对照质粒pMIX102的结构。pMIX102是pBluescriptSK+的衍生物，含有自质粒pACYC184扩增的Tc^R基因。在pMIX102中，Tc^R基因由plac启动子驱动。

图8显示转化效率对照质粒pMIX103的结构。pMIX103是pBluescriptSK+的衍生物，含有自质粒pACYC184扩增的Tc^R基因。在pMIX103中，Tc^R基因以与plac相反的方向克隆。因此，该基因由其自身启动子驱动。

图9图示将oxa7，oxa11和oxa5基因克隆入大肠杆菌质粒pMIX100以及枯草芽孢杆菌质粒pMIX101的策略。为将oxa7，oxa11克隆入pM1X100，所述基因利用5’末端含有PstI或XhoI的引物进行扩增。利用这些酶进行消化之后，扩增的DNA片段与pMIX100独立连接，所述质粒已经用Pst1+XhoI切割。大肠杆菌DH810的感受态细胞利用连接混合物电穿孔，携带阳性克隆的集落利用氯霉素抗性、在含有Cm(30μg/rnl)+X-Gal(80μg/ml)+IPTG(0.5mM)的LB板上呈白色进行表型选择。质粒DNA通过限制作图获得并进行分析。结果证实，pMIX104携带oxa7，pMIX106携带oxa11，pMIX107携带oxa5。为了克隆入枯草芽孢杆菌质粒pMIX101，通过利用PstI和XhoI进行限制从pMIX104获得作为0.9kb片段的oxa7，并与已经用相同的酶切割的pMIX101连接。利用连接产物转化枯草芽孢杆菌DSM17159感受态细胞后，在含有0.5μg/ml红霉素(Erm)的LB上选择细胞。

SEQ ID No.1和2分别显示引物OLG1和OLG2的序列，所述引物用于扩增oxa7并分别在5’和3’末端导入ScaI和PpuMl限制位点。

SEQ ID No.3和4分别显示引物OLG3和OLG4的序列，所述引物用于扩增oxa11并分别在5’和3’末端导入BamHI和EcoO109I限制位点。

SEQ ID No.5和6分别显示引物OLG5和OLG6的序列，所述引物用于扩增oxa5并分别在5’和3’末端导入BamHI和EcoO109I限制位点。

SEQ ID No.7和8分别显示引物OLG7和OLG8的序列，所述引物用于扩增oxa1并分别在5’和3’末端导入BamHI和EcoO109I限制位点。

SEQ ID No.9和10分别显示引物OLG9和OLG10的序列，所述引物用于扩增oxa11并分别在5’和3’末端导入ScaI和EcoO109I限制位点。

SEQ ID No.11显示引物OLG11的序列，其与引物OLG8(SEQ ID No.8)一起使用，用于扩增oxa1并分别在5’和3’导入ScaI和EcoO109I限制位点。

SEQ ID No.12和13分别显示引物OLG12和OLG13的序列，所述引物用于扩增包含在杂合质粒pMIX93中的重组基因R1。

SEQ ID No.14显示引物OLG11的序列，其与引物OLG12(SEQ ID No.12)一起使用，用于扩增包含在杂合质粒pMIX95，pMIX96和pMIX97之一中的重组基因R1。

SEQ ID No.15显示引物OLG15的序列，其与引物OLG17(SEQ ID No.17)一起使用，用于扩增包含在杂合质粒pMIX93中包含的重组基因R2。

SEQ ID No.16显示引物OLG16的序列，其与引物OLG17(SEQ ID No.17)一起使用，用于扩增包含在杂合质粒pMIX95，pMIX96和pMIX97中的重组基因R2。

SEQ ID No.17显示引物OLG17的序列。

实施例

实施例1

利用双质粒系统(大肠杆菌/枯草芽孢杆菌)的体内异源基因重组，由此通过对壮观霉素和/或腐草霉素的抗性选择重组DNA序列

1.材料和方法

1.1细菌菌株和质粒

用于本实施例的细菌菌株和质粒分别显示于表1和表2。

表1：细菌菌株

菌株	基因型	参考文献或来源
			大肠杆菌AB1157Nal^R hsd^-	thr1 leu6 proA2 his4，thil argE3 lacY1galK2 ara14 xyl15mtl1 tsx33 str31supE44thr⁺ hsdR^-Bnal^R	M.Radman菌株保藏中心
大肠杆菌MIXP1	As AB1157 Nal^R R^- but mutS::Tn5(kan^R)	mutS等位基因，来自Radman菌株保藏中心
			大肠杆菌DH5α	SupE44 ΔlacU169 (φ80lacZ ΔM15)hsdR17 recA1 endA1gyrA96 thi-1 relA1	(8)
枯草芽孢杆菌DSM4393	aroB2 trpC2 his6	德国菌株保藏中心DSMZ(Deut-sche Sammlung vonMikroorgansimen undZellkulturen GmbH)

表2：质粒

质粒	选择	参考文献或来源
			pACYC184	Tet^RCam^R	New England Biolabs(1)
plL253	Erm^R	(6)
			pic156	Amp^R Spec^R	(7)
pUC19-Phleo	Amp^R Phleo^R	(2)

1.2生长条件和培养基

大肠杆菌和枯草芽孢菌株均于37℃培养在LB培养基(DifcoLaboratories，Detroit，USA)中。当在板(LBA)中应用培养基时，每升加入15g琼脂(Difco)。当向所需的培养基中补充抗生素时，终浓度如下：四环素(Sigma-Aldrich Chimie，St.QuentinFal-lavier，France)，12.5μg/ml；氯霉素(Sigma-Aldrich Chimie)，30μg/ml；氨苄西林(Sigma-Aldrich Chimie)，100μg/ml；红霉素(Sigma-Aldrich Chimie)，0.5μg/ml；壮观霉素(Sigma-AldrichChimie)，75μg/ml；腐草霉素(Euromedex，Strasbourg，France)，2μg/ml、当在LBA中加入壮观霉素和腐草霉素时，终浓度分别为60和1μg/ml。

1.3 DNA操作以及微生物

转导

大肠杆菌MIXPl菌株利用P1-介导的转导构建(3)。

转化

通过电穿孔转化、利用Eppendorf Electroporator 2510(Eppendorf AG，Hamburg，Germany)，根据生产商的说明将质粒导入大肠杆菌菌株。

制备枯草芽孢杆菌的感受态细胞并如Yasbin et al.(9)所述进行转化。

DNA操作

遵循分子生物学技术已确立的规则(4)。DNA操作用酶购自New Eng-land Biolabs(Beverly，MA，USA)，MBI Fermentas(Vilnius，Lithuania)，Promega(Madison，Wis.)或Stratagene(La Jolla，CA，USA)，并如生产商推荐那样使用。如需要，利用限制内切核酸酶消化的DNA用NucefbSpin ExtractKit(Machery-Nagel)自琼脂糖凝胶纯化。

质粒DNA利用NucleoSpin试剂盒(Machery-Nagel GmbH&Co.，Dren，Germany)根据生产商的说明自大肠杆菌分离。为了从枯草芽孢杆菌分离质粒DNA，使用相同的试剂盒，但第一个裂解步骤通过将细与2mg ml^-1溶菌酶于37℃保温30min来进行。

所用引物由Proligo France SAS(Paris，France)合成。

核苷酸序列通过Genome Express(Meylan，France)在两个方向确定。利用lnfobiogen package(Genopole d′Evry，Evry，France)分析序列。利用ClustalW程序进行序列比较。

PCR扩增

PCR反应利用Mastercycler Gradient(Ep-pendorfAG，Hamburg，Germany)进行。利用高保真度Herculase Enhanced DNA聚合酶(Strategene)在以下条件下于50μl体积中进行反应：96℃、3min，96℃、30s循环35次，退火温度30s，72℃、1min，最后的延长步骤在72℃进行10min。退火温度通过用所用引物的最低Tm减去5℃来确定(subtracting 5℃to the lowest Tm)。如需要，利用NucleonSpin Extract kit(Machery-Nagel)纯化PCR产物。利用电泳在0.7％琼脂糖凝胶中分析扩增产物。

2.常规策略

进行本试验是为了通过两种亲本基因的体内重组产生显示优势性质的新分子，所述基因共享不同程度的序列同一性。

所用策略如下：

将被重组的基因由核苷酸序列不显示同源性的两种不同的质粒携带。第一种是大肠杆菌复制型质粒，其赋予氯霉素(Cm)或四环素抗性(Tc)。其基于标准克隆载体pACYC184，其为获自New England Biolabs的低拷贝数质粒。

第二种是源自pIL253(Simon和Chopin，1988)的枯草芽孢杆菌质粒。其不能在大肠杆菌中复制，并且分别携带两种针对壮观霉素(Spc)和腐草霉素(Phleo)的抗生素抗性标记。

为了重组这两种载体携带的异源基因对，通过电穿孔将枯草芽孢杆菌质粒引入含有复制型质粒的大肠杆菌菌株。该过程显示于图1。所述菌株是错配修复系统(MMR)高效型(proficient)(+)或缺陷型(-)，其控制诱变以及重组。

电穿孔后，利用枯草芽孢杆菌赋予对其的抗性(Spc和Phleo)的抗生素选择转化体。这种选择压力强制异源基因之间的重组，这是由于仅仅携带枯草芽孢杆菌与大肠杆菌质粒之间的共整合子的细胞可在这些条件下生长。杂合质粒赋予对Spc和Phleo的抗性，并自大肠杆菌起点复制，这是由于枯草芽孢杆菌的起点无功能。此外，其携带两种重组基因R1和R2。

第一步骤是在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌载体中克隆最初被选为靶标以评价重组有效性的基因。

oxa基因之间的重组试验在野生型和错配修复缺陷菌株中进行。在相同或趋异的成对基因之间进行试验。

质粒DNA在接受电穿孔之前进行UV照射，这是由于显示所述照射导致重组频率增加10倍。

重组也在通过2-氨基嘌呤处理而成为暂时的增变株的菌株中进行。2-氨基嘌呤是腺苷酸类似物，其在细菌生长过程中掺入DNA并饱和MMR系统。因此，产生瞬时突变株表型，这是由于去除2-氨基嘌呤之后，可恢复野生状态。对错配修复活性的临时控制为菌株在重组中提供稳定的背景，避免突变在其基因组中的累积。

2.结果

构建枯草芽孢杆菌载体

为构建用于携带重组靶基因的枯草芽孢杆菌，两种赋予对抗生素壮观霉素(spec^R)和腐草霉素(phleo^R)抗性的基因标记分别根据两步克隆策略被克隆入质粒pIL253。

第一，spec^R基因作为长度1294bp的SacI片段自质粒pic156获得。所述片段经纯化连接于SacI-消化的pIL253。枯草芽孢杆菌DSM17158感受态细胞用连接混合物转化，转化体在含有75μg ml^-1壮观霉素的LBA板上选择。获自转化体的质粒DNA的限制分析证实了它们含有携带spec^R基因的pILF253-衍生物。

第二个步骤中，将phleo^R基因克隆入pIL253-spec。质粒pUC19-phleo利用EcoRI和SalI限制酶消化，对应phleo^R的长度574bp的片段利用凝胶纯化并与已经用相同的两种酶消化的pIL253-spec连接。枯草芽孢杆菌DSM17158的感受态细胞利用连接混合物转化，转化体在含有60μg ml^-1腐草霉素的LBA板上选择。获自转化体的质粒DNA的限制分析证实了它们含有携带spec^R和phleo^R基因的预期的6.69-kb质粒，所述质粒命名为pMIX91(见图3)。

构建转化效率对照载体

构建用作在壮观霉素和腐草霉素选择下在重组实验中大肠杆菌菌株的转化效率的对照载体。所述载体如下构建：在利用BamHI和EcoRI消化pic156后，作为1.25kb的片段获得壮观霉素抗性基因(spe)。其被克隆入pUC-phleo的相应位点，与腐草霉素抗性基因(phleo)相邻。用连接混合物对大肠杆菌DH10B感受态细胞(component cells)进行电穿孔以后，在含有终浓度分别为60μg/ml和1μg/ml的两种抗生素LBA板上选择壮观霉素和腐草霉素抗性集落。分离自转化体的质粒DNA的限制分析显示它们对应命名为pMIX92的长度4.46kb的预期构建体(见图3)。

将编码β-内酰胺酶的基因克隆入大肠杆菌和枯草芽孢杆菌载体

编码β-内酰胺酶的四种基因被选作为评价野生型和MutS突变体大肠杆菌菌株中的重组效率的靶标。所述基因诸如oxa7(GenBank保藏号X75562)，oxa11(GenBank保藏号Z22590)，oxa5(Gen-Bank保藏号X58272)和oxa1(GenBank保藏号J02967)显示其核苷酸序列有不同程度的趋异度。oxa1的序列与oxa5，oxa7和oxa11的序列的趋异度分别为40％。oxa5的序列与oxa7和oxa11的序列的趋异度分别为22％。oxa7的序列与oxa11的序列的趋异度为5％。

将四种oxa基因克隆入大肠杆菌质粒pACYC184，并将oxa7，oxa11和oxa1克隆入枯草芽孢杆菌质粒pMIX91。所述基因的克隆如下进行：利用设计为分别在扩增的DNA的5′和3′末端导入ScaI和PpuMl位点的引物通过PCR扩增oxa7(引物OLG1的具有序列SEQ ID No.1，OLG2具有序列SEQID No.2)。PCR产物利用这些限制酶消化，产生的991bps片段连接于已经用相同的酶切割的pMIX91。枯草芽孢杆菌DSM17158感受态细胞利用连接混合物转化，转化体在含有75μg ml^-1壮观霉素的LBA板上选择。获自转化体的质粒DNA的限制分析证实了它们含有携带oxa7的预期的6.89-kb质粒pMIX94(见图3)。

为将oxa7克隆入大肠杆菌载体pACYC184，上述PCR产物以及pACYC184，利用PpuMI和ScaI消化。平末端通过利用DNA聚合酶I的Klenow片段自消化的DNA产生，连接它们。用连接混合物对大肠杆菌DH10B感受态细胞进行电穿孔以后，在含有终浓度12.5μg ml四环素的 LBA板上选择转化体。分离自转化体的质粒DNA的限制分析显示它们对应命名为pMIX93的长度4.33kb的预期构建体(见图3)。

为将oxa11，oxa5和oxa1克隆入大肠杆菌载体pACYC184，利用设计为分别在扩增的DNA的5′和3′末端导入BamHI和EcoO109I位点的引物通过PCR扩增基因。分别使用OLG3(SEQ ID No.3)/OLG4(SEQ ID No.4)，OLG5(SEQ ID No.5)/OLG6(SEQ ID No.6)和OLG7(SEQ ID No.7)/OLG8(SEQID No.8)扩增oxa11，oxa5和oxa1。PCR产物用BamHI和EcoO109I消化，产生的997bps(oxa11)和830bps(oxa5)和936bps(oxa1)片段独立连接于已经用相同的酶切割的pACYC184。用连接混合物对大肠杆菌DH10B感受态细胞进行电穿孔以后，在含有终浓度30μg/ml氯霉素的LBA板上选择转化体。分离自转化体的质粒DNA的限制分析显示它们对应6.89kb质粒spMIX95(3.72kb)，pMIX96(3.55kb)和pMIX97(3.66kb)预期质粒(见图3)。

为将oxa11和oxa1克隆入大肠杆菌载体pMIX91，利用设计为分别在扩增的DNA的5′和3′末端导入ScaI和EcoO109I位点的引物通过PCR扩增基因。分别使用OLG9(SEQ ID No.9)/OLG10(SEQ ID No.10)和OL11(SEQ IID No.11)/OLG8扩增oxa11和oxa1。PCR产物用BamHI和EcoO109I消化，产生的995bps(oxa11)和934bps(oxa1)片段独立连接于已经用相同的酶切割的pMIX91。用连接混合物对枯草芽孢杆菌DSM17158感受态细胞进行电穿孔以后，在含有终浓度75μg/ml壮观霉素的LBA板上选择转化体。分离自转化体的质粒DNA的限制分析显示它们对应预期的质粒pMIX98(6.89kb)和pMIX99(6,83kb)(见图3)。

MutS^-的大肠杆菌相比oxa基因在wt中的体内重组

第一个步骤中，大肠杆菌AB1157及其MutS^-突变体大肠杆菌MXP1的感受态细胞通过用携带oxa基因的pACYC184-衍生质粒pMIX93，pMIX95，pMIX96或pMIX97进行电穿孔来独立转化。转化体基于它们对四环素或氯霉素的抗性来选择。适宜质粒的存在随后通过限制和/或PCR分析来证实。

第二步中，携带复制型质粒的野生型和MutS^-菌株自含有四环素或氯霉素的选择培养基上制备。随后，所述感受态细胞利用携带oxa基因的枯草芽孢杆菌质粒pMIX94，pMIX98或pMIX99电穿孔来独立转化。

电穿孔后，在含有枯草芽孢杆菌赋予针对其的抗性的抗生素即终浓度分别为60μg ml^-1和1μgml^-1的壮观霉素和腐草霉素的LBA板上选择转化体。所述转化压力使得oxa基因之间发生重组，这是由于仅仅含有枯草芽孢杆菌与大肠杆菌质粒之间形成的杂合质粒的细胞在所述条件下生长。37C过夜保温该板，然后通过利用限制酶消化分析转化体的质粒DNA以保证它们含有携带两种重组基因R1和R2的杂合质粒(长度大约10.5kb)。一些情况中，重组基因通过PCR扩增并经测序。如果居留的质粒是pMIX93，用OLG12(SEQ ID No.12)/OLG13(SEQ ID No.13)扩增R1，用OLG15(SEQIDNo.15)/OLG17(SEQ ID No.17)扩增R2；如果居留质粒是pMIX95，pMIX96 orpMIX97，用OLG12/OLG14(SEQ ID No.14)扩增R1，用OLG16 SEQ ID No.16)/OLG17扩增R2。

重组实验中，枯草芽孢杆菌质粒pMIX91用作阴性对照，而大肠杆菌质粒pMIX92用作在壮观霉素和腐草霉素存在下的转化效率对照。pMIX92可在含有pACYC184-衍生质粒的菌株中复制，这是由于它们的复制起点(分别为ColE1和p15)是相容的。质粒DNA在电穿孔前接受UV照射(200J/m²)这是由于显示所述照射导致重组频率增加10倍。

重组频率也通过用每个枯草芽孢杆菌质粒获得的转化效率除以对照载体pMIX92所得转化效率来计算。转化效率也可作为以前描述的条件下每μgDNA获得的集落形成单位(cfu)的数目计算。

所得结果总结于表3。野生型菌株中，在利用相同或具有5％趋异度的oxa基因的实验中获得转化体，而在MutS^-突变体中，重组也在经由22％趋异度的基因之间发生。

表3：野生型和MutS^-大肠杆菌菌株中oxa基因之间的体内重组频率

基因趋异度 (％)	重组频率
			wt菌株	MutS^-菌株
0	10^-4	10^-4
			5	10^-8	10^-5
22	----	10^-7
			40	----	----

与2-氨基嘌呤(2-AP)处理的大肠杆菌相比Oxa基因在野生型中的体内重组

第一步中，大肠杆菌AB1157的感受态细胞利用携带oxa11基因的pACYC184-衍生质粒pMIX95进行电穿孔来转化。转化体基于其抗性选择。适当质粒的存在通过限制和/和PCR分析证实。

第二步中，该菌株的感受态细胞在存在200μg/m1 2-AP的情况下制备，并利用携带oxa7的枯草芽孢杆菌pMIX94和携带oxa11的pMIX98独立电穿孔。

枯草芽孢杆菌质粒pMIX91用作阴性对照。而携带Spc^R和Phleo^R标记的大肠杆菌质粒用作转化效率对照。质粒DNA在电穿孔前进行UV照射，以增加重组效率。

结果总结于表4。野生型菌株中，重组体在利用相同的oxa基因的实验中获得，而在2-AP处理的菌株中，重组也在具有5％趋异度的基因之间发生。

表4：野生型和2-AP处理的大肠杆菌菌株中获得的oxa基因之间的体内重组频率

基因趋异度 (％)	重组频率
			wt菌株	2-AP处理的菌株
0	10^-4	10^-5
			5	---	10^-6

值得注意的是重组出现在具有22％趋异度的基因之间，其中序列同一性的最长片段分别为22个核苷酸(oxa5/oxa11)和18个核苷酸(oxa5/oxa7)(见图5和图6)。已经报道低于最小同源性长度已知为MEPS(最小有效加工片段)时重组无效。MEPS的长度根据重组途径不同，但据描述其范围为23到90个碱基对(5)。

对涉及5％和22％趋异度基因的实验中获得的54种杂合质粒携带的基因R1和R2的序列分析显示，所述杂合质粒中有46种相互不同。该结果表明它们对应不同重组事件，因此，高遗传多样程度通过体内重组产生。

在4-101个核苷酸的不同序列同一性片段中通过非交互单次交换产生大多数重组基因。一些情况中，观察到多重交换，其产生R1或R2嵌合基因。oxa7/oxa5与oxa11/oxa5之间的重组基因显示于图4。

重组基因的DNA以及推定的氨基酸序列的比较显示其中有53％对应新的oxa基因(见表5)。由于没有移码或终止密码子在重组过程中产生，推定它们编码38种新的有功能的β-内酰胺酶。

表5：通过体内重组获得的重组oxa基因的核苷酸序列以及推定的氨基酸序列的比较

序列比较	新基因	新蛋白质
			R1	33/54	21/54
R2	25/54	17/54
			总计	58/108(53％)	38/108(35％)

实施例2

用于异源基因的体内重组的双质粒系统(大肠杆菌/枯草芽孢杆菌)，由此通过对四环素的抗性选择重组DNA序列

设计另一种双质粒系统来验证实施例1中所得结果并促进基因的克隆和重组。该系统基于四环素抗性细胞的选择。

1.细菌菌株和质粒

用于该实施例的细菌菌株和质粒分别显示于表6和表7。

表6：细菌菌株

菌株	基因型	参考文献或来源
			大肠杆菌AB1157Nal^R hsd^-	thr1 leu6 proA2 his4， thil argE3 lacY1 galK2 ara14 xyl15 mil1 tsx33 str31 su- pE44thr⁺ hsdR^-B nalR	M.Radman菌株保藏中心
大肠杆菌MIXP1	As AB1157 Nal^R R^- but mutS::Tn5(kan^R)	mutS allele from M. Radman strain collec- tion
			大肠杆菌DH10B	F^- mcrA Δ(mrr^- hsdRMS-mcrBC)φ80 lacZΔm15 ΔlacX74 recA1 endA1 a raD139 Δ(ara， leu)7697 galU galK λ^- rpsL nupG	Invitrogene Life Technologies Cat 18290-015
枯草芽孢杆菌1A423	argGH15 leuB8 recA4 thr-5hsd_Rl R^-M^-	Bacillus Genetic stock center(Ohio State University，USA)

表7：质粒

质粒	选择
		大肠杆菌质粒pMIX100	Cm^R
枯草芽孢杆菌质粒pMIX101	Tc^R，Erm^R
		转化效率对照质粒pM1X102和pMIX 103	Amp^R，Tc^R

2.结果

2.1构建大肠杆菌质粒pMIX100

质粒pMIX100携带pACYC184的复制起点以及其氯霉素抗性基因。pMIX100也携带来自pBluescript SK+的基因lacZ，其促进克隆实验中的选择。lacZ编码β-半乳糖苷酶的片段，其提供在含有X-Gal和IPTG的培养基中对重组体进行蓝/白选择的α-补充(complementation)。因此，含有pMIX100的集落在该培养基中应当是蓝色的，携带具有插入多聚接头(MCS)的基因的质粒的那些应为白色。质粒pMIX100的物理图谱显示于图5。

2.2构建枯草芽孢杆菌质粒pMIX101

质粒pMIX101是枯草芽孢杆菌质粒pIL253的衍生物。由于赋予红霉素抗性的pIL253标记Erm^R不能用于大肠杆菌，导入允许在重组实验中选择杂合分子的四环素抗性标记。四环素抗性标记扩增自质粒pACYC184。因此pMIX101携带两种标记：Erm^R作为在枯草芽孢杆菌中克隆靶基因的选择标记，以及Tc^R用于在大肠杆菌中选择重组杂合分子。质粒pMIX101的物理图谱显示于图6。

2.3构建转化效率对照质粒pMIX102和pMIX103

由于枯草芽孢杆菌载体不能在大肠杆菌中复制，转化效率对照对于评估重组效率而言是必要的。由于重组体通过四环素抗性选择，在对照质粒中必需存在相同的标记。pBluescript SK+的衍生物质粒含有扩增自pACYC184的Tc^R基因。在pMIX102中，Tc^R基因通过plac启动子驱动。质粒pMIX102的物理图谱显示于图7。

在第二对照载体pMIX103中，Tc^R基因以与plac相反的方向克隆。因此其从其自身启动子表达。质粒pMIX103的物理图谱显示于图8。

2.4将oxa7，oxa19和oxa5克隆入大肠杆菌质粒pMIX100

为证实实施例1中获得的具有0％，5％和22％趋异度的oxa基因之间的重组试验的结果，将oxa7，oxa11和oxa5克隆入大肠杆菌质粒pMIX100。所述基因利用5’末端含有PstI或XhoI的引物扩增。利用所述的酶进行消化之后，扩增的DNA片段分别与已经用PstI+XhoI消化的pMIX100连接。，大肠杆菌DHB10的感受态细胞利用连接混合物进行电穿孔，含有阳性克隆的集落通过在含有Cm(30，μg/ml)+X-Gal(80g/ml)+IPTG(0.5mM)的LB板上通过氯霉素抗性/白色来进行表型选择。对于每种oxa的克隆，分析5种所述的转化体。

获得质粒DNA并通过限制作图分析。结果证实pMIX104携带oxa7，pMIX106携带oxa11，pMIX107携带oxa5。

为了克隆入枯草芽孢杆菌质粒pMIX101，通过用PstI和XhoI限制从pMIX104获得作为0.9kb的片段oxa7，并将其与已经用相同的酶切割的pMIX101连接。利用连接产物转化枯草芽孢杆菌DSM17159感受态细胞之后，在含有0.5μg红霉素(Erm)的LB上选择细胞。质粒DNA获自24种转化体，并通过限制分析。结果证实所有克隆均含有7-kb质粒pMIX105。

oxa7，oxa11和oxa5基因向大肠杆菌质粒pMIX100内以及枯草芽孢杆菌质粒pMIX101内克隆的策略显示于图9。

2.5与MutS^-突变体相比野生型中oxa基因的体内重组

大肠杆菌AB1157hsdR^-及其MMR^-突变体大肠杆菌AB1157hsdR^-CΔmutS，利用质粒spMIX104(oxa7)，pMIX106(oxa11)和pMIX107(oxa5)分别进行电穿孔来转化。

为重组oxa基因，含有这些质粒的大肠杆菌菌株利用pMIX105(oxa7)进行电穿孔。枯草芽孢杆菌质粒pMIX101用作阴性对照，而携带Tc^R标记的大肠杆菌质粒pMIX102用作在四环素选择下的转化效率的对照。所有DNA在进行电穿孔前都接受UV照射，以增加重组频率。

重组频率也通过用枯草芽孢杆菌质粒获得的转化效率除以对照载体pMIX92所得转化效率来计算。转化效率也可作为以前描述的条件下每μgDNA获得的集落形成单位(cfu)的数目计算。

所得结果总结于表8。野生型菌株中，在利用相同或具有5％趋异度的oxa基因的实验中获得转化体，而在MutS^-突变体中，重组也在经由22％趋异度的基因之间发生。

表8：野生型和MutS-大肠杆菌菌株中oxa基因之间的体内重组频率

Figure DEST_PATH_G16322868150138000D000091

重组频率与利用以前的双质粒系统所得的结果相一致。

为了证实重组，使pMIX105转化体生长于含有四环素(12,5μg/ml)的液体培养基。获自这些培养物的质粒DNA显示它们含有携带oxa重组基因的二聚体，以及居留质粒(pMIX104或pMIX106)的情况也如此(together withresident plasmids)。此外，利用特异性引物，重组基因R1和R2通过PCR从两种集落以及质粒DNA成功扩增。

结果证实利用第二双质粒系统以四环素抗性作为选择压力可产生重组体。

Claims

1.在原核细胞中产生并检测重组DNA序列的方法，包括以下步骤：

a)产生含有受体DNA分子以及供体DNA分子的第一原核细胞，所述受体DNA分子是大肠杆菌质粒pACYC184且所述受体DNA分子包含待重组的第一DNA序列并可在所述原核细胞中自主复制，所述供体DNA分子是包含spec^R标记和phleo^R标记的枯草芽孢杆菌质粒pMIX91或包含tc^R标记的枯草芽孢杆菌质粒pMIX101且所述供体DNA分子包含待重组的第二DNA序列以及编码基因产物的至少第一标记序列并不能在所述原核细胞中自主复制，

b)如果第一标记序列的基因产物被表达，在仅允许所述细胞的生长和/或增殖的选择性条件下培养第一原核细胞，和

2.权利要求1的方法，其中待重组的第一和第二DNA序列的至少两个核苷酸是趋异的。

3.权利要求1的方法，其中待重组的第一和第二DNA序列是天然存在的序列。

4.权利要求3的方法，其中待重组的第一和/或第二DNA序列源自病毒，细菌，植物，动物和/或人。

5.权利要求1的方法，其中待重组的第一和/或第二DNA序列是人工序列。

6.权利要求1的方法，其中待重组的第一和第二DNA序列各自包含一或多个蛋白质编码型序列和/或一或多个非编码型序列。

7.权利要求1的方法，其中所述第一原核细胞通过将受体DNA分子和供体DNA分子同时或序贯引入原核细胞来产生。

8.权利要求7的方法，其中所述受体和供体DNA分子通过转化、接合、转导、性导和/或电穿孔引入原核细胞。

9.权利要求1的方法，其中所述第一原核细胞培养在存在至少一种抗生素的条件下，其中第一标记序列的基因产物赋予对该抗生素的抗性。

10.权利要求9的方法，其中所述第一原核细胞还培养在存在第二、第三和/或第四抗生素的条件下，其中第二、第三和第四标记序列的基因产物分别赋予对所述抗生素的抗性。

11.权利要求1的方法，其中所述原核细胞是古细菌(archaebacterium)或真细菌(eubacterium)的细胞。

12.权利要求11的方法，其中所述真细菌是革兰氏阴性细菌，革兰氏阳性细菌或蓝细菌(cyanobacterium)。

13.权利要求12的方法，其中所述革兰氏阴性细菌是大肠杆菌。

14.权利要求1的方法，其中所述原核细胞具有有功能的错配修复系统。

15.权利要求1的方法，其中所述原核细胞的错配修复系统暂时性或永久性缺陷。

16.权利要求15的方法，其中所述错配修复系统的暂时性或永久性缺陷是由于参与错配修复系统的一或多个基因的突变、缺失和/或可诱导表达或阻抑，利用使得错配修复系统饱和的药剂进行处理和/或利用全面敲除错配修复的药剂进行处理造成的。

17.权利要求15或16的方法，其中所述原核细胞具有突变的mutS基因和/或突变的mutL基因。

18.权利要求1的方法，其中包含在第二原核细胞的杂合DNA分子中的第一和第二重组的DNA序列被选择和/或分离和/或分析。

19.权利要求18的方法，其中所述第一和第二重组DNA序列通过限制酶切割来分离。

20.权利要求18的方法，其中所述第一和第二重组DNA序列通过PCR扩增。

21.权利要求18-20之一的方法，其中所述分离的第一和第二重组DNA序列分别被插入供体DNA分子和受体DNA分子，进行另一轮重组。