JP2007523656A - 2種の染色体外エレメントを使用することによる原核細胞中での組換え遺伝子の生成 - Google Patents
2種の染色体外エレメントを使用することによる原核細胞中での組換え遺伝子の生成 Download PDFInfo
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Abstract
Description
本発明は全体として、2種の異なる染色体外エレメントを用いることにより、原核細胞中で、具体的には細菌中で、組換えDNA配列を生成し検出するin vivoの方法、および本発明の方法の実施に使用することができる染色体外エレメント、具体的にはプラスミドに関する。この方法が関係するDNA配列は、タンパク質コード配列および非コード配列を含む。
進化とは、遺伝的変異、および表現型の選択の連続的な過程である。集団内での個体の性能を改良する新たな変異体の組合せを作成することによって、集団の遺伝的多様性を増幅することができる。微生物の定方向進化は、連続したランダム変異導入およびスクリーニングによる古典的な株の改良の方法を介して従来より行われている。
したがって、本発明の根底にある技術的な問題は、原核細胞中で組換えモザイク遺伝子を単純にかつ効率よく生成し、具体的にはそのような組換え配列をスクリーニングし検出する改良された方法および手段を提供することである。
a)組換えられる第1のDNA配列を含み、原核細胞中で自発的に複製することができるレシピエントDNA分子、ならびに組換えられる第2のDNA配列、および遺伝子産物をコードする少なくとも第1のマーカー配列を含み、原核細胞中で自発的に複製することができないドナーDNA分子を含む第1の原核細胞を生成する工程と、
b)第1のマーカー配列の遺伝子産物が発現した場合にその細胞の増殖および/または繁殖だけを可能にする選択的な条件下で第1の原核細胞を培養する工程と、
c)選択的な条件下で増殖および/または繁殖し、少なくとも第1のマーカー配列、ならびに第1および第2のDNA配列間での組換えによる第1および第2の組み換えられたDNA配列を有するハイブリッドDNA分子を含む第2の原核細胞を単離する工程とを含む。
スペクチノマイシンおよび/またはフレオマイシンに対する耐性により組換えDNA配列を選択する二重プラスミド系(大腸菌/枯草菌)を使用する非相同遺伝子のin vivo組換え
1.材料および方法
1.1 細菌株およびプラスミド
この実施例中で使用する細菌株およびプラスミドをそれぞれ表1および表2に示す。
大腸菌と枯草菌はどちらもLB培地(Difco Laboratories、Detroit、米国)中で37℃で培養した。プレート中で培地を使用するとき(LBA)、1リットル当たりに寒天(Difco)を15g添加した。必要なとき、培地に抗生物質を補充し、その終濃度は以下の通りであった:テトラサイクリン(Sigma−Aldrich Chimie、St.Quentin Fallavier、フランス)、12.5μg/ml;クロラムフェニコール(Sigma−Aldrich Chimie)、30μg/ml;アンピシリン(Sigma−Aldrich Chimie)、100μg/ml;エリスロマイシン(Sigma−Aldrich Chimie)、0.5μg/ml;スペクチノマイシン(Sigma−Aldrich Chimie)、75μg/ml;フレオマイシン(Euromedex、Strasbourg、フランス)、2μg/ml。LBAにスペクチノマイシン+フレオマイシンを補充したとき、終濃度は、それぞれ60μg/mlおよび1μg/mlであった。
形質導入
P1を媒介する形質導入を用いて大腸菌MIXP1株を構築した(3)。
Eppendorfエレクトロポレーター2510(Eppendorf AG、Hamburg、ドイツ)を用いた電気的形質転換により、供給元の説明書に従って大腸菌株中にプラスミドを導入した。
分子生物学技術については確立されているプロトコールに従った(4)。DNA操作用の酵素は、New England Biolabs(Beverly、マサチューセッツ州、米国)、MBl Fermentas(Vilnius、リトアニア)、Promega(Madison、ウィスコンシン州)またはStratagene(La Jolla、カリフォルニア州、米国)から購入し、製造元による推奨の通りに使用した。必要なときに、NuceloSpin抽出キット(Machery−Nagel)を使用して、アガロースゲルから制限エンドヌクレアーゼで消化したDNAを精製した。
Mastercycler Gradient(Eppendorf AG、Hamburg、ドイツ)を使用してPCR反応を行った。容量50μlで反応を実施し、ハイフィデリティーHerculase Enhanced DNAポリメラーゼ(Strategene)を下記の条件下で使用した:96℃で3分間と、96℃で30秒間、アニーリング温度で30秒間、72℃で1分間を35サイクルと、72℃で10分間の最終伸長工程。アニーリング温度は、使用したプライマーの最も低いTmから5℃減じることによって決定した。必要なときに、NucleonSpin抽出キット(Machery−Nagel)を使用してPCR産物を精製した。0.7%アガロースゲル(Sigma)中での電気泳動によって増幅産物を分析した。
この実験は、異なる程度の配列同一性を有する2種の親遺伝子のin vivo組換えにより、有利な特性を示す新たな分子を生成するために行った。使用した戦略は下記の通りである。
枯草菌ベクターの構築
組換えの標的遺伝子を運搬する枯草菌ベクターを構築するために、抗生物質スペクチノマイシン(specR)およびフレオマイシン(phleoR)それぞれに対する耐性を付与する2種の遺伝子マーカーを、2工程のクローン化戦略に従ってプラスミドpIL253中にクローン化した。
組換え実験においてスペクチノマイシンおよびフレオマイシンの選択下で大腸菌株の形質転換効率対照として使用するベクターを構築した。ベクターを以下の通りに構築した:pic156をBamH1およびEcoRIで消化した後、1.25kbの断片としてスペクチノマイシン耐性遺伝子(specR)を得た。フレオマイシン耐性遺伝子(phleoR)の隣にあるpUC−phleoの対応する部位にそれをクローン化した。その連結混合物を用いた大腸菌DH10Bコンピテント細胞のエレクトロポレーションを行った後、スペクチノマイシンおよびフレオマイシンの耐性コロニーを、それぞれ終濃度60μg/mlおよび1μg/mlの両方の抗生物質を含むLBAプレート上で選択した。形質転換体から単離されたプラスミドDNAの制限分析により、それが長さ4.46kbの予想された構築物と一致していることが判明し、それをpMIX92と名付けた(図3を参照)。
野生型とMutS−変異型の両方の大腸菌株で組換え効率を評価するために、β−ラクタマーゼをコードする4種の遺伝子を標的として選択した。そのような遺伝子であるoxa7(GenBankアクセッション番号X75562)、oxa11(GenBankアクセッション番号Z22590)、oxa5(GenBankアクセッション番号X58272)およびoxa1(GenBankアクセッション番号J02967)は、そのヌクレオチド配列において異なる程度の相異性を示す。oxa1の配列と、oxa5、oxa7およびoxa11それぞれの配列は40%異なる。oxa5の配列と、oxa7およびoxa11それぞれの配列は22%異なる。oxa7の配列と、oxa11の配列は5%異なる。
第1の工程では、oxa遺伝子を運搬するpACYC184誘導体プラスミドであるpMIX93、pMIX95、pMIX96またはMIX97で、大腸菌AB1157およびそのMutS−変異体である大腸菌MXP1のコンピテント細胞をエレクトロポレーションによりそれぞれ独立に形質転換した。テトラサイクリンまたはクロラムフェニコールに対するその耐性に基づいて形質転換体を選択した。その後、適切なプラスミドが存在することを制限分析および/またはPCR分析によって確認した。
第1の工程では、oxa11遺伝子を運搬するpACYC184誘導体プラスミドであるpMIX95で、大腸菌AB1157のコンピテント細胞をエレクトロポレーションにより形質転換した。その耐性に基づいて形質転換体を選択した。適切なプラスミドが存在することを制限分析および/またはPCR分析によって確認した。
他の二重プラスミド系を設計して、実施例1で得られた結果を検証し、遺伝子のクローン化および組換えを促進した。この系は、テトラサイクリンに耐性である細胞の選択に基づくものである。
この実施例中で使用する細菌株およびプラスミドをそれぞれ表5および表6に示す。
2.1 大腸菌プラスミドpMIX100の構築
プラスミドpMIX100は、pACYC184の複製起点、並びにそのクロラムフェニコール耐性遺伝子を運搬する。pMIX100はまた、pBluescript SK+由来の遺伝子lacZをも運搬し、この遺伝子はクローン化実験での選択を促進する。lacZは、X−GalおよびIPTGを含む培地中での組換え体の青色/白色選択のα−相補性をもたらすβ−ガラクトシダーゼの断片をコードする。したがって、pMIX100を有するコロニーは、この培地中で青色であるはずであり、遺伝子がポリリンカー(MCS)中に挿入されたプラスミドを有するものは白色であるはずである。プラスミドpMIX100の物理的地図を図5に示す。
プラスミドpMIX101は、枯草菌プラスミドpIL253の誘導体である。pIL253のマーカーErmRはエリスロマイシンに対する耐性を付与するが、これは大腸菌に有用でないため、組換え実験でのハイブリッド分子の選択を可能にするテトラサイクリン耐性マーカーを導入した。プラスミドpACYC184からテトラサイクリン耐性遺伝子を増幅した。したがって、pMIX101は、2種のマーカー、すなわち標的遺伝子をクローン化するための枯草菌中での選択マーカーであるErmR、および大腸菌中で組換えハイブリッド分子を選択するTcRを運搬する。プラスミドpMIX101の物理的地図を図6に示す。
枯草菌ベクターが大腸菌で複製することができないので、組換え頻度の推定に形質転換効率対照が必要である。テトラサイクリン耐性によって組換え体が選択されるので、同じマーカーが対象ベクター中に存在しなければならない。pBluescript SK+の誘導体であるプラスミドpMIX102は、pACYC184から増幅されたTcR遺伝子を含む。pMIX102では、placプロモーターによってTcR遺伝子が駆動される。プラスミドpMIX102の物理的地図を図7に示す。
実施例1で得られた、0%、5%および22%異なるoxa遺伝子間での組換え実験の結果を検証するために、oxa7、oxa11およびoxa5を大腸菌プラスミドpMIX100中にクローン化した。5’末端にPstIまたはXhoIを含むプライマーを使用して、それらの遺伝子を増幅した。それらの酵素で消化した後、増幅したDNA断片を、PstI+XhoIで予め切断したpMIX100とそれぞれ独立に連結した。その連結混合物を用いて大腸菌DHB10のコンピテント細胞のエレクトロポレーションを行い、クロラムフェニコール耐性/Cm(30μg/ml)+X−Gal(80μg/ml)+IPTG(0.5mM)を含むLBプレート上での白色により、陽性クローンを有するコロニーを表現型上選択した。各oxaクローン化について、そのような形質転換体のうち5個を分析した。
大腸菌AB1157hsdR−およびそのMMR−変異体である大腸菌AB1157hsdR−CΔmutSのコンピテント細胞を、プラスミドpMIX104(oxa7)、pMIX106(oxa11)およびpMIX107(oxa5)を用いたエレクトロポレーションによりそれぞれ独立に形質転換した。
Claims (48)
- 原核生物中で組換えDNA配列を生成し検出する方法であって、
a)組換えられる第1のDNA配列を含み、原核細胞中で自発的に複製することができるレシピエントDNA分子、ならびに組換えられる第2のDNA配列、および遺伝子産物をコードする少なくとも第1のマーカー配列を含み、原核細胞中で自発的に複製することができないドナーDNA分子を含む第1の原核細胞を生成する工程と、
b)前記第1のマーカー配列の遺伝子産物が発現した場合に前記細胞の増殖および/または繁殖だけを可能にする選択的な条件下で前記第1の原核細胞を培養する工程と、
c)選択的な条件下で増殖および/または繁殖し、少なくとも第1のマーカー配列、ならびに第1および第2のDNA配列間での組換えによる第1および第2の組み換えられたDNA配列を有するハイブリッドDNA分子を含む第2の原核細胞を単離する工程と
を含む方法。 - 前記ドナーDNA分子およびレシピエントDNA分子が、特定の異なるプラスミドまたはバクテリオファージ中での異なる直鎖状または環状のDNA構造物である、請求項1に記載の方法。
- 前記レシピエントDNA分子が、大腸菌(Escherichia coli)中で複製することができるプラスミドである、請求項1または2に記載の方法。
- 前記レシピエントDNA分子が、大腸菌(E. coli)プラスミドpACYC184または大腸菌プラスミドpMIX100あるいはその誘導体である、請求項3に記載の方法。
- 前記ドナーDNA分子が複製起点を有さない、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ドナーDNA分子が機能的でない複製起点を有する、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ドナーDNA分子および/またはその複製起点が、その細胞中にドナーDNA分子が導入される原核生物種以外の原核生物種に由来する、請求項6に記載の方法。
- 前記ドナーDNA分子が、大腸菌中で複製することができない枯草菌(Bacillus subtilis)プラスミドである、請求項7に記載の方法。
- 前記ドナーDNA分子が、specRマーカーおよびphleoRマーカーを含む枯草菌(B. subtilis)プラスミドpMIX91、またはtcRマーカーを含む枯草菌プラスミドpMIX101である、請求項7または8に記載の方法。
- 前記ドナーDNAの複製起点の機能が変異によって損傷を受ける、請求項6に記載の方法。
- 前記ドナーDNA構造物の第1のマーカー配列が、栄養マーカー、抗生物質耐性マーカー、および酵素のサブユニットをコードする配列からなる群から選択される、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1のマーカー配列の遺伝子産物が、抗生物質に感受性の細胞に前記抗生物質に対する耐性を付与する、請求項11に記載の方法。
- 前記第1のマーカー配列が、その遺伝子産物がスペクチノマイシンに対する耐性を細胞に付与するspecR、その遺伝子産物がフレオマイシンに対する耐性を細胞に付与するphleoR、またはその遺伝子産物がテトラサイクリンに対する耐性を細胞に付与するtcRである、請求項11または12に記載の方法。
- 前記ドナーDNA分子が第2のマーカー配列を含む、請求項1から13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記レシピエントDNA分子が、第3のマーカー配列を、場合によっては第4のマーカー配列を含む、請求項1から14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第2、第3および第4のマーカー配列が、栄養マーカー、色素マーカー、抗生物質耐性マーカー、抗生物質感受性マーカー、制限酵素部位、プライマー認識部位、および酵素のサブユニットをコードする配列からなる群から選択されるタンパク質コードまたは非コード配列である、請求項14または15に記載の方法。
- 前記レシピエントDNA分子の第3および第4のマーカー配列の遺伝子産物が、抗生物質に感受性の細胞に前記抗生物質に対する耐性を付与する、請求項16に記載の方法。
- 前記第3のマーカー配列の遺伝子産物が、テトラサイクリンに対する耐性を細胞に付与する、請求項17に記載の方法。
- 前記第4のマーカー配列の遺伝子産物が、クロラムフェニコールに対する耐性を細胞に付与する、請求項17に記載の方法。
- 前記組換えられる第1および第2のDNA配列が、少なくとも2ヌクレオチド異なる、請求項1から19のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組換えられる第1および第2のDNA配列が、天然に存在する配列である、請求項1から20のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組換えられる第1および/または第2のDNA配列が、ウイルス、細菌、植物、動物および/またはヒトに由来する、請求項21に記載の方法。
- 前記組換えられる第1および/または第2のDNA配列が人工の配列である、請求項1から20のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組換えられる第1および第2のDNA配列のそれぞれが、1個または複数個のタンパク質コード配列および/あるいは1個または複数個の非コード配列を含む、請求項1から23のいずれか一項に記載の方法。
- 前記レシピエントDNA分子および前記ドナーDNA分子を原核細胞中に同時にまたは順次導入することにより、前記第1の原核細胞を生成する、請求項1から24のいずれか一項に記載の方法。
- 形質転換、接合、形質導入、伴性導入および/またはエレクトロポレーションを介して前記レシピエントDNA分子およびドナーDNA分子を前記原核細胞中に導入する、請求項25に記載の方法。
- 前記第1のマーカー配列の遺伝子産物が耐性を付与する少なくとも1種の抗生物質の存在下で前記第1の原核細胞を培養する、請求項1から26のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第2のマーカー配列、前記第3のマーカー、および前記第3のマーカー配列の遺伝子産物がそれぞれ耐性を付与する第2、第3および/または第4の抗生物質の存在下で前記第1の原核細胞をさらに培養する、請求項27に記載の方法。
- 前記原核細胞が、古細菌または真正細菌の細胞である、請求項1から28のいずれか一項に記載の方法。
- 前記真正細菌が、グラム陰性細菌、グラム陽性細菌またはラン藻類である、請求項29に記載の方法。
- 前記グラム陰性細菌が大腸菌である、請求項30に記載の方法。
- 前記原核細胞が機能的なミスマッチ修復系を有する、請求項1から31のいずれか一項に記載の方法。
- 前記原核細胞のミスマッチ修復系が一時的にまたは永久的に欠損している、請求項1から31のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ミスマッチ修復系の一時的または永久的な欠損が、ミスマッチ修復系に関与する1種もしくは複数種の遺伝子の変異、欠失および/または誘導性発現もしくは抑制、ミスマッチ修復系を飽和する作用因子での処理、ならびに/あるいはミスマッチ修復系を全体的にノックアウトする作用因子での処理に起因する、請求項33に記載の方法。
- 前記原核細胞が、変異mutS遺伝子および/または変異mutL遺伝子を有する、請求項33または34に記載の方法。
- 前記第2の原核細胞のハイブリッドDNA分子中に含まれる第1および第2の組み換えられたDNA配列を選択および/または単離および/または分析する、請求項1から35のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1および第2の組み換えられたDNA配列を制限酵素切断によって単離する、請求項36に記載の方法。
- 前記第1および第2の組み換えられたDNA配列をPCRによって増幅する、請求項36に記載の方法。
- 前記単離された第1および第2の組み換えられたDNA配列を、ドナーDNA分子およびレシピエントDNA分子にそれぞれ挿入し、それを別の回の組換えにかける、請求項36から38のいずれか一項に記載の方法。
- specRマーカー、phleoRマーカー、ならびに外来DNA配列を挿入するための制限部位ScaI、PpuMIおよびEcoO109Iを含む枯草菌プラスミドpMIX91。
- tcRマーカー配列、ならびに外来DNA配列を挿入するための制限部位XhoIおよびPstIを含む枯草菌プラスミドpMIX101。
- 原核宿主細胞中で、好ましくは大腸菌細胞中で組換えDNA配列を生成および/または検出するための請求項1から40のいずれか一項に記載の方法におけるドナーDNA分子としての枯草菌プラスミドpMIX91またはpMIX101の使用。
- 原核宿主細胞中で、好ましくは大腸菌細胞中で組換えDNA配列を生成および/または検出するための請求項1から40のいずれか一項に記載の方法におけるレシピエントDNA分子としての大腸菌プラスミドpACYC184またはpMIX100あるいはその誘導体の使用。
- 大腸菌株AB1157または大腸菌株MXP1または大腸菌株DHB10の細胞を含む第1の容器、プラスミドpACYC184を含む大腸菌株AB1157の細胞またはプラスミドpMIX100を含む大腸菌株DHB10の細胞を含む第2の容器、およびプラスミドpMIX91を含む枯草菌株DSM4393の細胞またはプラスミドpMIX101を含む枯草菌株1A423の細胞を含む第3の容器を少なくとも含むキット。
- 大腸菌株AB1157または大腸菌株MXP1または大腸菌株DHB10の細胞を含む第1の容器、プラスミドpACYC184またはプラスミドpMIX100のDNAを含む第2の容器、およびプラスミドpMIX91またはプラスミドpMIX101のDNAを含む第3の容器を少なくとも含むキット。
- 原核細胞中でハイブリッド遺伝子および/またはハイブリッド遺伝子によってコードされたタンパク質を生成する方法であって、請求項1から39のいずれか一項に記載の方法を実施し、前記ハイブリッド遺伝子および/または前記ハイブリッド遺伝子によってコードされたタンパク質を前記原核細胞中で生成し、発現後、前記ハイブリッド遺伝子および/またはそれにコードされたタンパク質を前記原核細胞中で選択し、かつ/またはそれから単離する方法。
- 請求項46に記載の方法によって得られるハイブリッド遺伝子。
- 請求項47に記載のハイブリッド遺伝子によってコードされ、請求項46に記載の方法によって得られるタンパク質。
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