JP2007523656A5

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Publication number: JP2007523656A5
Application number: JP2007500177A
Authority: JP
Filing date: 2005-02-26
Publication date: 2008-04-17
Anticipated expiration: 2025-02-26

Claims

原核生物中で組換えＤＮＡ配列を生成し検出する方法であって、
（ａ）組換えられる第１のＤＮＡ配列を含み、原核細胞中で自発的に複製することができる染色体外レシピエントＤＮＡ分子、ならびに組換えられる第２のＤＮＡ配列、および遺伝子産物をコードする少なくとも第１のマーカー配列を含み、原核細胞中で自発的に複製することができない染色体外ドナーＤＮＡ分子を含む第１の原核細胞を生成する工程、
（ｂ）レシピエントおよびドナーＤＮＡ分子間の共同組込み分子またはハイブリッド分子の形成ならびに組み換えられる２つのＤＮＡ配列の組換えを強行し、第１のマーカー配列の遺伝子産物が発現した場合に細胞の増殖および／または繁殖だけを可能にする選択的な条件下で第１の原核細胞を培養する工程、ならびに
（ｃ）選択的な条件下で増殖および／または繁殖し、少なくとも第１のマーカー配列、ならびに第１および第２のＤＮＡ配列間での組換えによる第１および第２の組換えＤＮＡ配列を有するハイブリッドＤＮＡ分子を含む第２の原核細胞を単離する工程を含み、ここで、原核細胞のミスマッチ修復系が一時的にまたは永久的に欠損しているところの方法。
ドナーＤＮＡ分子およびレシピエントＤＮＡ分子が、異なる直鎖状または環状ＤＮＡ構造物、特に、異なるプラスミドまたはバクテリオファージである、請求項１に記載の方法。
ドナーＤＮＡ分子が複製起点を有さない、請求項１記載の方法。
ドナーＤＮＡ分子が機能的でない複製起点を有する、請求項１記載の方法。
ドナーＤＮＡ分子が大腸菌で複製することができない、枯草菌プラスミドである、請求項１記載の方法。
ドナーＤＮＡ分子がｓｐｅｃ ^Ｒマーカーおよびｐｈｌｅｏ ^Ｒマーカーを含む枯草菌プラスミドｐＭＩＸ９１またはｔｃ ^Ｒマーカーを含む枯草菌ｐＭＩＸ１０１プラスミドである、請求項５記載の方法。
ドナーＤＮＡ構造物の第１のマーカー配列が、栄養マーカー、抗生物質耐性マーカー、および酵素のサブユニットをコードする配列からなる群より選択される、請求項１記載の方法。
第１のマーカー配列の遺伝子産物が、抗生物質に感受性がある細胞に抗生物質に対する耐性を付与する、請求項７に記載の方法。
第１のマーカー配列が、その遺伝子産物がスペクチノマイシンに対する耐性を細胞に付与するｓｐｅｃ ^Ｒ、その遺伝子産物がフレオマイシンに対する耐性を細胞に付与するｐｈｌｅｏ ^Ｒ、またはその遺伝子産物がテトラサイクリンに対する耐性を細胞に付与するｔｃ ^Ｒである、請求項７記載の方法。
原核生物中で組換えＤＮＡ配列を生成し検出する方法であって、
（ｄ）組換えられる第１のＤＮＡ配列を含み、原核細胞中で自発的に複製することができる染色体外レシピエントＤＮＡ分子、ならびに組換えられる第２のＤＮＡ配列および遺伝子産物をコードする少なくとも第１のマーカー配列を含み、原核細胞中で自発的に複製することができない染色体外ドナーＤＮＡ分子を含む第１の原核細胞を生成する工程、
（ｅ）レシピエントおよびドナーＤＮＡ分子間の共同組込み分子またはハイブリッド分子の形成ならびに組換えられる２つのＤＮＡ配列の組換えを強行し、第１のマーカー配列の遺伝子産物が発現した場合に細胞の増殖および／または繁殖だけを可能にする選択的な条件下で第１の原核細胞を培養する工程、ならびに
（ｆ）選択的な条件下で増殖および／または繁殖し、少なくとも第１のマーカー配列、ならびに第１および第２のＤＮＡ配列間での組換えによる第１および第２の組換えＤＮＡ配列を有するハイブリッドＤＮＡ分子を含む第２の原核細胞を単離する工程を含み、ここで、ドナーＤＮＡ分子がｓｐｅｃ ^Ｒマーカーおよびｐｈｌｅｏ ^Ｒマーカーを含む枯草菌プラスミドｐＭＩＸ９１またはｔｃ ^Ｒマーカーを含む枯草菌ｐＭＩＸ１０１プラスミドであるところの方法。
レシピエントＤＮＡ分子が、直鎖状または環状ＤＮＡ構造物、特に、プラスミドまたはバクテリオファージである、請求項１０記載の方法。
原核細胞が機能的なミスマッチ修復系を有する、請求項１０記載の方法。
原核細胞のミスマッチ修復系が一時的にまたは永久的に欠損している、請求項１０記載の方法。
レシピエントＤＮＡ分子が大腸菌で複製することができるプラスミドである、請求項１記載の方法。
レシピエントＤＮＡ分子が大腸菌プラスミドｐＡＣＹＣ１８４または大腸菌プラスミドｐＭＩＸ１００あるいはその誘導体である、請求項１４記載の方法。
ドナーＤＮＡ分子および／またはその複製起点が、その細胞中にドナーＤＮＡ分子が導入される原核生物種以外の原核生物種に由来する、請求項１記載の方法。
ドナーＤＮＡ分子の複製起点の機能が突然変異によって障害される、請求項１に記載の方法。
ドナーＤＮＡ分子が第２のマーカー配列を含む、請求項１記載の方法。
レシピエントＤＮＡ分子が第３のマーカー配列を含み、第４のマーカー配列を含んでいてもよい、請求項１記載の方法。
第２、第３および第４のマーカー配列が、栄養マーカー、色素マーカー、抗生物質耐性マーカー、抗生物質感受性マーカー、制限酵素部位、プライマー認識部位、および酵素のサブユニットをコードする配列からなる群より選択されるタンパク質コードまたは非コード配列である、請求項１８記載の方法。
レシピエントＤＮＡ分子の第３および第４のマーカー配列の遺伝子産物が、抗生物質に感受性である細胞に抗生物質に対する耐性を付与する、請求項２０記載の方法。
第３のマーカー配列の遺伝子産物が、テトラサイクリンに対する耐性を細胞に付与する、請求項２１記載の方法。
第４のマーカー配列の遺伝子産物が、クロラムフェニコールに対する耐性を細胞に付与する、請求項２１記載の方法。
組換えられる第１および第２のＤＮＡ配列が、少なくとも２ヌクレオチド異なる、請求項１記載の方法。
組換えられる第１および第２のＤＮＡ配列が、天然に存在する配列である、請求項１記載の方法。
組換えられる第１および／または第２のＤＮＡ配列が、ウイルス、細菌、植物、動物および／またはヒトに由来する、請求項２５記載の方法。
組換えられる第１および／または第２のＤＮＡ配列が人工の配列である、請求項１記載の方法。
組換えられる第１および第２のＤＮＡ配列のそれぞれが、１個または複数のタンパク質コード配列および／あるいは１個または複数の非コード配列を含む、請求項１記載の方法。
レシピエントＤＮＡ分子およびドナーＤＮＡ分子を原核細胞中に同時にまたは順次導入することにより、第１の原核細胞を生成する、請求項１記載の方法。
形質転換、接合、形質導入、伴性導入、および／またはエレクトロポレーションを介してレシピエントおよびドナーＤＮＡ分子を原核細胞中に導入する、請求項２９記載の方法。
第１のマーカー配列の遺伝子産物が耐性を付与する少なくとも１種の抗生物質の存在下で第１の原核細胞を培養する、請求項１記載の方法。
第２のマーカー配列、第３のマーカー配列および第４のマーカー配列の遺伝子産物がそれぞれ耐性を付与する第２、第３および／または第４の抗生物質の存在下で第１の原核細胞をさらに培養する、請求項３１記載の方法。
原核細胞が、古細菌または真正細菌の細胞である、請求項１記載の方法。
真正細菌が、グラム陰性細菌、グラム陽性細菌または藍色細菌である、請求項３３記載の方法。
グラム陰性細菌が大腸菌である、請求項３４記載の方法。
ミスマッチ修復系の一時的または永久的な欠損が、ミスマッチ修復系に関与する１種もしくは複数の遺伝子の突然変異、欠失および／または誘導性発現もしくは抑制、ミスマッチ修復系を飽和する作用因子での処理、ならびに／あるいはミスマッチ修復系を全体的にノックアウトする作用因子での処理に起因する、請求項１記載の方法。
原核細胞が、突然変異ｍｕｔＳ遺伝子および／または突然変異ｍｕｔＬ遺伝子を有する、請求項１記載の方法。
第２の原核細胞のハイブリッドＤＮＡ分子に含まれる第１および第２の組換えＤＮＡ配列を選択および／または単離および／または分析する、請求項１記載の方法。
第１および第２の組換えＤＮＡ配列を制限酵素切断によって単離する、請求項３８記載の方法。
第１および第２の組換えＤＮＡ配列をＰＣＲによって増幅する、請求項３８記載の方法。
単離された第１および第２の組換えＤＮＡ配列を、ドナーＤＮＡ分子およびレシピエントＤＮＡ分子にそれぞれ挿入し、再度組換えにかける、請求項３８記載の方法。
ｓｐｅｃ ^Ｒマーカーおよびｐｈｌｅｏ ^Ｒマーカー、ならびに外来ＤＮＡ配列を挿入するための制限部位ＳｃａＩ、ＰｐｕＭＩおよびＥｃｏＯ１０９Ｉを含む、枯草菌プラスミドｐＭＩＸ９１。
ｔｃ ^Ｒマーカー配列、ならびに外来ＤＮＡ配列を挿入するための制限部位ＸｈｏＩおよびＰｓｔＩを含む枯草菌プラスミドｐＭＩＸ１０１。
大腸菌株ＡＢ１１５７または大腸菌株ＭＸＰ１または大腸菌株ＤＨＢ１０の細胞を含む第１の容器、プラスミドｐＡＣＹＣ１８４を含む大腸菌株ＡＢ１１５７の細胞またはプラスミドｐＭＩＸ１００を含む大腸菌株ＤＨＢ１０の細胞を含む第２の容器、およびプラスミドｐＭＩＸ９１を含む枯草菌株ＤＳＭ４３９３の細胞またはプラスミドｐＭＩＸ１０１を含む枯草菌株１Ａ４２３の細胞を含む第３の容器を少なくとも含むキット。
大腸菌株ＡＢ１１５７または大腸菌株ＭＸＰ１または大腸菌株ＤＨＢ１０の細胞を含む第１の容器、プラスミドｐＡＣＹＣ１８４またはプラスミドｐＭＩＸ１００のＤＮＡを含む第２の容器、およびプラスミドｐＭＩＸ９１またはプラスミドｐＭＩＸ１０１のＤＮＡを含む第３の容器を少なくとも含むキット。
原核細胞中でハイブリッド遺伝子および／またはハイブリッド遺伝子によってコードされたタンパク質を生成する方法であって、請求項１記載の方法を実施し、ハイブリッド遺伝子および／またはハイブリッド遺伝子によってコードされたタンパク質を原核細胞中で生成し、発現後、ハイブリッド遺伝子および／またはコードされたタンパク質を原核細胞中で選択し、かつ／またはそれから単離する方法。