ES2259685T3

ES2259685T3 - Procedimiento para la inactivacion funcional reversible del sistema de reparacion del desapareamiento.

Info

Publication number: ES2259685T3
Application number: ES02002337T
Authority: ES
Inventors: Miroslav Radman; Ivan Matic
Original assignee: Mixis France SA
Current assignee: Mixis France SA
Priority date: 2002-01-31
Filing date: 2002-01-31
Publication date: 2006-10-16
Anticipated expiration: 2022-01-31
Also published as: HRP20040682A2; US20050176149A1; DK1333095T3; SI1333095T1; DE60209580T2; ATE319845T1; DE60209580D1; PT1333095E; JP4488742B2; US7883894B2; WO2003064667A1; JP2005538687A; EP1333095B1; WO2003064667A8; EP1333095A1

Abstract

Un procedimiento para incrementar la tasa de recombinación entre secuencias de DNA, no idénticas, presentes en un organismo procariótico, in vivo, el cual comprende: a) combinar, en una célula, una secuencia de DNA procedente de una primera especie o género, con una secuencia de DNA procedente de una segunda especie o género, en donde, la primera y segunda secuencias de DNA, tienen secuencias que son parcialmente homólogas y que tienen desapareamientos aptos para activar el sistema de reparación de desapareamiento enzimático de la célula, cuando el citado sistema es funcional, b) tratar el organismo, previamente o subsiguientemente a la etapa a), o previamente, simultáneamente y subsiguientemente a la etapa a) con un análogo de bases de la base nucleótida de origen natural, en una cantidad y durante un período de tiempo suficientes como para inhibir, de una forma reversible, el MRS de una célula, por lo menos parcialmente, y c) eliminar el análogo de bases, del organismo.

Description

Procedimiento para la inactivación funcional reversible del sistema de reparación del desapareamiento.

La presente invención, se refiere a un procedimiento para la inactivación funcional reversible del sistema funcional de reparación del desapareamiento en organismos precarióticos, y varias aplicaciones de éste. De una forma particular, la presente invención, se refiere a un procedimiento para la recombinación in vitro, de secuencias nucleótidas no idénticas. La presente invención, se refiere, también, a un procedimiento para la producción de organismos híbridos, procarióticos, producidos mediante la recombinación in vivo, de diferentes organismos, especies o géneros. La presente invención, se refiere, también a un procedimiento para la producción, en vivo, de genes híbridos, y proteínas codificados por éstas.

La evolución, es la selección de las variantes más idóneas, producidas mediante mutación y recombinación. La mutación al azahar, produce nuevos alelos, mientras que, la recombinación genética, produce nuevas combinaciones de alelos preexistentes. Esta propiedad de la recombinación genética, mejora la efectividad de la mutagénesis, debido al hecho de que, ésta, permite la asociación de múltiples mutaciones adaptables, así, como también su separación, de las mutaciones perjudiciales más frecuentes. La eficacia de la recombinación genética, depende de la identidad de la secuencia de DNA, compartida por las dos moléculas recombinantes y de los sistemas celulares enzimáticos, involucrados en la recombinación, y de sus ediciones (Redman and Wagner, 1993; Matic et al., 1996). La recombinación entre DNAs que difieren mediante mutaciones de puntos bien distanciados (polimorfismo de secuencia), se reduce o se inhibe. Los cruzamientos entre diferentes cepas y especies bacterianas, muestran el hecho de que, la frecuencia de recombinación, decrece exponencialmente, con el incremento de la divergencia de la secuencia genómica (Vulic et al., 1997). El apareamiento de secuencias de DNA no idénticas, tiene como resultado la generación de moléculas heterodúplex desapareadas. Los pares de bases desapareados, se reconocen por parte de los componentes del sistema de reparación del desapareamiento (MRS, -del inglés: mismatch repair system-), el cual actúa como un inhibidor de la recombinación entre secuencias de DNA, no idénticas (Rayssiguier et al., 1989; Shen and Huang, 1989; Worth Jr. et al., 1994); Zahrt et al., 1994; Matic et al., 1995).

Esta función de MRS, juega un importante rol interpretativo, en la integridad estructural de los cromosomas y del aislamiento genético, entre diferentes especies bacterianas. Así, por ejemplo, la inactivación de genes de MRS, incrementa en un valor de 10-15 veces, la frecuencia de duplicaciones cromosómicas, resultantes de la recombinación entre locus E. coli rhsA y rshB (únicamente divergentes en un 0,8%) (Petit et al., 1991) y en un valor de aproximadamente 10^{3} veces, la conversión de genes, entre los genes de S. enterica (serovariedad Typhimurium), tufA y tufB (divergentes en aproximadamente un 1%) (Abdulkarim and Hughes, 1996). El MRS, controla, también, la recombinación conjugacional y transductora entre cepas y especies divergentes (Rayssiguier et al., 1989; Shen and Huang, 1989; Worth Jr. et al., 1994); Zahrt et al., 1994; Matic et al., 1995); Vultic et al., 1997). Incluso una divergencia reducida, es suficiente como para dificultar o impedir la recombinación. Así, por ejemplo, la recombinación transductora entre dos serovariedades (Typhimurium y typhi) de S. enterica, cuyos genomas difieren únicamente en un 1-2%, al nivel de las secuencias de DNA, se incrementa en un valor de 10^{2}-10^{3} veces, en marcos de referencia genéticos deficientes de un MRS (Zhart et al., 1994).

Tres genes, han mostrado su requerimiento, de una forma específica, para el MRS, en E. coli: mutS, mutL y mutH (Friedeberg et al., 1995). La inactivación de diferentes genes del MRS, tiene un efecto distinto y característico en la recombinación de interespecies (Rayssiguier et al, 1989; Stambuk y Radman, 1998; Denamur et al., 2000). El efecto más fuerte de recombinación, se observa mediante la inactivación de genes mutS y mutL, tal y como se describe, por ejemplo, en las patentes estadounidenses US 4.956.415 y US 5.912.119. Por el contrario, la sobreproducción de proteínas, reduce, de una forma severa, la frecuencia de recombinación, incluso entre cepas bacterianas con divergencia genómica muy reducida (Vulic et al., 1997). Así, de esta forma, procediendo a modificar la actividad del MRS, es posible el interrumpir o establecer barreras genéticas, entre diferentes especies bacterianas.

Cuando se genera diversidad genómica, mediante recombinación, uno de los problemas mayores, con la recombinación, en un sistema de referencia proficiente, reside en el hecho de que, la divergencia de secuencia de DNA, restringe los acontecimientos de recombinación, en las regiones genómicas de mayor similitud de secuencia. Por consiguiente, la mayoría de los recombinantes, son merodiploides, altamente inestables, a menudo, generados por un cruzamiento desigual entre los operones de RNA ribosómico (rrn), los cuales son, usualmente, casi idénticos, entre especies bacterianas relacionadas. La inactivación del MRS, permite, no únicamente mayores rendimientos productivos de interespecies recombinantes, sino también, una mayor diversidad y una mayor estabilidad de los híbridos. Las aplicaciones potenciales de esta estrategia, la cual permite la creación de genomas interespecíficos de mosaicos, son múltiples, en la investigación fundamental, en la ingeniería genética y en medicina. Permitiendo la recombinación de genomas enteros, pueden obtenerse los genomas de mosaicos con nuevas recombinaciones de genes y operones (incluso con genes de mosaicos y operones).

No obstante, para la recombinación, cada vez que se utiliza una cepa o especie bacteriana nueva, los genes mutS y mutL, deben inactivarse. Esto puede realizarse de uno forma muy difícil, cuando estos gentes, no están identificados y cuando, las herramientas genéticas para la inactivación, no se han desarrollado para ciertas especies dadas. Además, la inactivación de los genes del MRS, incrementa las tasas de mutación en un valor de 10^{2}-10^{3} superior, las cuales pueden no desearse, una vez se ha obtenido una construcción deseada. La alternativa, puede ser la inhibición/saturación del MRS, utilizando algunos otros estudios o formas de enfocar el problema. Así, por ejemplo, (i) el MRS, puede saturarse mediante unos errores excesivos de replicación del DNA, en cepas de E. coli, que portan una gen dnaQ defectuoso, que codifica para la actividad de lectura de corrección de DNA-polimerasa de replicación (PolIII)(Shaaper and Radman, 1989). (ii) la eficacia del MRS, ha mostrado también, decrecer, como resultado de la titrimetría o titulación, de las proteínas de reparación del desapareamiento, en células que contienen desapareamientos de copias múltiples de DNA de hebra individual, codificadas mediante retornes (Maas et al., 1996). Las patentes estadounidenses US 5.965.415 y US 5.912.119, describen procedimientos para la recombinación intergenérica e interespecífica, en donde, el MSR, se inactiva transitoriamente, mediante mutaciones en los genes del MRS y subsiguientes restauración del MRS, utilizando una corrección mutante, o mediante mutación del MRS, mediante la introducción de secuencias nucleótidas, que comprenden un extenso número de desapareamientos. No obstante, en el último caso, el componente enzimático del MRS, aparentemente, se destruye y, la reactivación funcional del MRS, requiere una resíntesis de las enzimas reparación. (iii) La sobre-expresión de las proteínas del MRS, a partir de especies bacterianas no relacionadas, puede también inhibir el MRS del E. coli, y tiene como resultado una mutagénesis incrementada (Prudhomme et al., 1991). El documento de patente internacional WO 97/05 268, da a conocer un procedimiento para incrementar la tasa de recombinación entre secuencias de DNA parcialmente homólogas, procediendo a inactivar, de una forma transitoria, el MRS, con una molécula de DNA, que soporte muchos desapareamientos. No obstante, si bien la totalidad de los procedimientos anteriormente mencionados, arriba, para la inhibición/saturación de MRS, no requieren una inactivación de los genes del MRS, es necesaria un modificación adicional de las células, con objeto de reducir las tasas de mutación y recombinación, una vez se hayan obtenido los recombinantes requeridos.

Así, de este modo, el problema técnico subyacente, el cual representa la base de la presente invención, es el de proporcionar un procedimiento sencillo, para inactivar, o por lo menos reducir, de una forma considerable, la actividad del MRS de un organismo procariótico, con objeto de incrementar la tasa de recombinación entre secuencias nucleótidas parcialmente homólogas, es decir, secuencias nucleótidas no idénticas o divergentes, en el organismo, evitando con ello la modificación adicional subsiguiente de las células tratadas, con objeto de reducir las tasas de mutación y de recombinación.

La presente invención, soluciona el problema técnico en cuestión, procediendo a proporcionar un procedimiento para la inactivación funcional, reversible, es decir, transitoria, del sistema de reparación del desapareamiento (MRS), en un organismo procariótico, procedimiento éste, el cual comprende el proceder a someter el organismo a un agente, especialmente, a un análogo de bases, capaz de inhibir parcialmente o completamente, el sistema de reparación del desapareamiento del organismo, en una cantidad y durante un período de tiempo suficientes, como para incrementar de una forma reversible, la tasa de recombinación, entre secuencias nucleótidas no idénticas, de una forma particular, secuencias de DNA, presentes en el organismo y, en una forma de preferida de presentación, eliminar subsiguientemente el agente, especialmente, el análogo de bases, del organismo.

Así, de este modo, la presente invención, proporciona medios para inactivar de una forma reversible el MRS, los cuales, a su vez, permiten un número de aplicaciones de utilidad, tales como el incrementar la tasa de recombinación de secuencias nucleótidas, no idénticas. De este modo, la presente invención, proporciona también procedimientos para incrementar la tasa de recombinación, en un organismo procariótico, y procedimientos para mutagenizar un organismo, con lo cual, el MRS, se inactiva de una forma reversible, tal y como se describe aquí.

En un aspecto de la presente invención, el procedimiento de la presente invención, proporciona la ventaja de que, mediante la inactivación reversible del MRS, de un organismo procariótico, puede incrementarse de una forma reversible, la tasa de recombinación entre secuencias de DNA, no idénticas, presentes en el organismo, evitando la necesidad de manipulaciones subsiguientes de las células tratadas, y manteniendo el MRS, genéticamente y constantemente intacto.

En el contexto de la presente invención, nucleótidos no idénticos o divergentes, de una forma particular, secuencias de DNA, de una forma particularmente preferida, secuencias de DNA de doble hebra, presentes en un organismo precariótico, comprenden primeras secuencias, es decir, nucleótidos autólogos, de una forma particular, secuencias de DNA, presentes en el organismo, de una forma preferible, previamente a la toma de segundas secuencias, y dichas segundas secuencias, introducidas en este organismo, por ejemplo, mediante sexo natural, conjugación, transducción, fusión artificial de células, o cualesquiera otros medios conocidos en arte especializado de la técnica, tales como los tratamientos eléctricos, biolísticos, o físicos. Por supuesto, ambas, la primera y la segunda secuencia, pueden introducirse simultáneamente en el organismo procariótico. Estas segundas secuencias introducidas, no son idénticas, es decir que, debe entenderse que, éstas, no son completamente idénticas u homólogas a la segundas secuencias. De una forma particular, estas secuencias parcialmente homólogas, tienen una significante porción de bases desapareadas, por ejemplo, en una cantidad del hasta un 30%. Las secuencias parcialmente homólogas, son capaces de activar el MRS, si el MRS es funcional y no inactivado, inhibido o saturado. Se deja que, las secuencias introducidas, se recombinen con las secuencias autólogas de DNA, presentes en el organismo procariótico, debido al sistema de reparación del desapareamiento, reversiblemente inactivado. Una vez que la recombinación haya tenido lugar, el agente utilizado en concordancia con la presente invención, puede eliminarse, de tal forma que, el sistema de reparación del desapareamiento, pueda recuperar su funcionalidad original. Una ventaja de la inhibición o saturación transitorias del MRS, reside en el hecho de que, después de la recombinación, las células híbridas obtenidas, no tienen constitutivamente altas tasas de mutación, debido a la inactivación permanente de los genes del MRS.

En una forma de presentación particularmente preferida de la presente invención, las secuencias de DNA no idénticas, se encuentran presentes en forma de genes, operones, grupos de genes, cromosomas, plásmidos y/o genomas. Estas secuencias de DNA, pueden ser secuencias de DNA de origen natural, o secuencias de DNA genéticamente manipuladas.

La presente invención, permite a un incremento muy significativo de la eficacia de la recombinación entre secuencias de DNA no idénticas, que se inhibe, normalmente, mediante el sistema de reparación del desapareamiento. La presente invención, puede utilizarse, de una forma ventajosa, para facilitar la generación de nueva biodiversidad, al nivel de los genes individuales u operones, así como también de genomas enteros. La inhibición química del MRS, con objeto de incrementar la eficacia de la recombinación entre secuencias de DNA no idénticas, en concordancia con la presente invención, nunca se ha utilizado antes.

En una forma de presentación de la presente invención, el organismo procariótico que comprende las secuencias nucleótidas autólogas, pueden someterse a un análogo de bases, capaz de inhibir el sistema de reparación de desapareamientos del organismo, en una cantidad y durante un período de tiempo suficientes, como para incrementar, de una forma reversible, la tasa de recombinación, entre secuencias de DNA no idénticas, con dicho análogo de bases. Así, de este modo, las segundas secuencias nucleótidas que se introducen en el organismo que comprende las secuencias nucleótidas autólogas, se introducen después del tratamiento del organismo con el análogo de bases.

En otra forma de presentación particularmente preferida de la presente invención, el organismo procariótico, se trata con el análogo de bases, previamente, simultáneamente y subsiguientemente a la introducción de las segundas secuencias en el organismo, con el análogo de bases. Es también posible, el tratar el organismo, con el análogo de bases, solamente después de introducir las segundas secuencias en el organismo.

El período de tiempo suficiente para incrementar reversiblemente la tasa se recombinación es, de una forma preferible, inferior a 5 horas, de una forma particular, de 0,5 a 5 horas, de una forma preferible, de 1 a 4 horas y, de una forma particular, de 1 hora.

Para el procedimiento descrito, pueden utilizarse organismos eucarióticos, por ejemplo, un organismo anfibio, animal, mamífero, o mamífero no humano. En el contexto de la presente invención, el organismo, es un organismo procariótico, en donde, el organismo es, de una forma preferible, un organismo eubacteriano o arqueobacteriano. En una forma de presentación particularmente preferida, el organismo eubacteriano, es Escherichia coli, Streptococcus pneumoniae o Salmonella typhimurium.

En una forma preferida de presentación de la presente invención, el análogo de bases a ser utilizado en concordancia con la presente invención, es una 2-aminopurina. De una forma general, podría utilizarse una substancia química o una fuerza física.

En concordancia con la presente invención, el análogo de bases que se prefiere de una forma particular, es un análogo de bases de procedencia natural o un análogo de bases sintetizado de bases nucleótidas de procedencia natural, tales como la adenina, uridina, ciptosina, timidina o guanidina, como por ejemplo, la 2-aminopurina o compuestos que tienen las mismas características, tales como la 2-aminopurina, es decir, que son capaces de saturar el sistema de reparación del desapareamiento y/o de interactivar con enzimas y DNA o nucleótidos. En concordancia con la presente invención, una secuencia nucleótida, de una forma particular, un oligonucleótido, por ejemplo, un oligonucleótido que comprenda pares de bases desapareadas, o un heterodúplex, no se consideran como siendo agentes
químicos.

Así, de este modo, la actividad MSR, en concordancia con la presente invención, puede inhibirse en células tratadas con análogos de bases, de una forma particular, 2-aminopurina, un análogo de bases de adenina el cual se desaparea con citosina. La ventaja de la inhibición química, reside en el hecho de que, ésta, proporciona una inhibición transitoria y puede aplicarse fácilmente a diferentes especies de bacterias y células eucarióticas, por ejemplo, células de mamíferos humanos o no humanos.

En concordancia con una forma de presentación preferida de la presente invención, el tratamiento con células de Escherichia coli con 2-aminopurina (2-AP), reduce la eficacia de sistema de reparación del desapareamiento (MRS), procediendo a realizar una titulación o titración y/o inactivar la proteína MutL. La consecuencia de esta deficiencia transitoria del sistema de reparación del desapareamiento, es un significante incremento (de 10^{4} veces), en la frecuencia de recombinación entre secuencias de DNA no idénticas. Esta forma enfocar el problema, tiene la ventaja de su simplicidad, en comparación con todos los sistemas de inhibición/saturación del MRS, conocidos en el arte especializado de la técnica, debido al hecho de que, éste, no requiere ningún tipo de manipulación genética de las células utilizadas. La presente invención, por lo tanto, proporciona un procedimiento para una inactivación funcional, reversible, del sistema de reparación del desapareamiento.

En concordancia con una forma particularmente preferida de presentación de la presente invención, las altas concentraciones de 2-AP, provocan un efecto mutante que sugiere una saturación del MRS. En una forma preferida de presentación de la presente invención, se utilizan de 50 \mug/ml a 600 \mug/ml. En una forma de presentación adicional, de una forma particular, se utilizan, por lo menos, 50 \mug/ml, de una forma muy particular, por lo menos 75 \mug/ml, por menos 100 \mug/ml, por lo menos 200 \mug/ml, por lo menos 300 \mug/ml, por lo menos 400 \mug/ml, por lo menos 500 \mug/ml, o por lo menos 600 \mug/ml, de 2-AP.

La presente invención, resuelve el problema anteriormente expuesto, arriba, también, procediendo a proporcionar, en un aspecto adicional de la presente invención, un procedimiento para mutagenizar un organismo procariótico, procedimiento éste, el cual, comprende el proceder a someter al organismo, a unas condiciones que permitan la recombinación de homólogos, entre secuencias de DNA, divergentes o no idénticas, presentes en el organismo, someter el organismo a un agente capaz de saturar o de inactivar, de una forma reversible, el MRS del organismo, en una cantidad y durante un período de tiempo, suficientes como para incrementar, de una forma reversible, la tasa de recombinación entre secuencias no idénticas de DNA, en el organismo, tal y como se ha descrito anteriormente, arriba y, en una forma preferida de presentación, eliminando el agente, del organismo.

Así, de este modo, la presente invención, se refiere a un procedimiento para mutagenizar un organismo procariótico, el cual comprende el proceder a introducir secuencias de DNA parcialmente homólogas, en el organismo, someter el organismo a unas condiciones que permitan la recombinación de homólogos entre sus autólogos y las secuencias de DNA introducidas, con lo cual, el organismo, se somete a un análogo de bases, capaz de inhibir el sistema de reparación de desapareamientos del organismo, en una cantidad y durante un período de tiempo suficientes, como para incrementar de una forma reversible, la tasa de recombinación entre los autólogos y las secuencias de DNA introducidas en el organismo y, de una forma preferible, eliminando el análogo de bases, del organismo. Tal y como se ha expuesto anteriormente, arriba, las secuencias de DNA no idénticas, pueden ser genes, operones, grupos de genes, cromosomas, plásmidos o genomas.

El procedimiento descrito anteriormente, arriba, puede también utilizarse para incrementar la tasa de recombinación, en un organismo, tal y como se ha especificado anteriormente, arriba.

Así, de este modo, la presente invención, se refiere, también, a un procedimiento para la recombinación in vivo, el cual comprende el proceder a combinar, en una célula, una secuencia de DNA procedente de una primera especie o género, con un secuencia de DNA procedente de una segunda especie o género, en donde, la primera y segunda secuencias de DNA, tienen secuencias que son parcialmente homólogas y que tienen desapareamientos aptos para activar el sistema de reparación de desapareamiento enzimático de una célula, cuando el citado sistema es funcional, y en donde, el sistema de reparación del desapareamiento, enzimático, se ha desactivado de una forma reversible, en concordancia con la presente invención, para capacitar la recombinación estable entre la primera y segunda secuencias de DNA, produciendo con ello, en una forma preferida de presentación, genes híbridos, genomas híbridos, cromosomas híbridos, operones híbridos, plásmidos híbridos, o grupos de genes híbridos. En una forma preferida de presentación, las secuencias de DNA, pueden ser de doble hebra.

En una forma preferida de presentación del la presente invención, el procedimiento anteriormente descrito, arriba, de recombinación, las células del organismo procariótico de una primera especie o un primer género, se fusionan a células de un organismo procariótico de una segunda especie o un segundo género, para combinar, en una célula, el DNA procedente de la primera especie o género, con el DNA procedente de una segunda especie o género, y en donde, las células del organismo de la segunda especie o segundo género, comprenden un sistema de reparación del desapareamiento, reversiblemente inactivado, en concordancia con la presente invención.

En una forma de presentación adicionalmente preferida, de la presente invención, se procede a cruzar un organismo unicelular de una primera especie o de un primer género, con un organismo celular de una segunda especie o de un segundo género, para combinar, en una célula, una secuencia de DNA procedente de una primera especie o género, con una secuencia de DNA procedente de una segunda especie o género, y en donde, el sistema de reparación del desapareamiento, enzimático, de por lo menos uno de estos organismos, se ha inactivado de una forma reversible, en concordancia con la presente invención.

En una forma de presentación adicionalmente preferida de la presente invención, se procede a conjugar o transducir una bacteria recipientaria de una primera especie o género, con una bacteria donante de una segunda especie o género, para recombinar, en una célula, una secuencia de DNA procedente de una primera especie o género, con una segunda secuencia de DNA procedente de una segunda especie o género, en donde, la bacteria donante, tiene por lo menos una secuencia de DNA a ser transferida a la bacteria recipientaria, y en donde, el sistema de reparación del desapareamiento, enzimático, de por lo menos una de las bacterias donante o recipientaria, se inactiva de una forma reversible, en concordancia con la presente invención.

La invención, prefiere una forma adicional de presentación, en la cual, las dos secuencias de DNA, se emplazan en un organismo unicelular, para combinar, en una célula, una secuencia de DNA procedente de una primera especie o género, con una segunda secuencia de DNA procedente de una segunda especie o género, en donde, el organismo, se inactiva de una forma reversible, en su sistema de reparación del desapareamiento, enzimático, en concordancia con la presente invención, y en donde, las secuencias de DNA, son parcialmente homólogas, y derivan de dos organismos diferentes.

Se prefiere, de una forma particular, el proceder a utilizar uno de los procedimientos para la recombinación, anteriormente descritos, arriba, en donde, se produce un gen híbrido y/o su proteína codificada, mediante la selección de un gen híbrido y/o su proteína codificada, después de la expresión en el organismo procariótico.

En una forma preferida de presentación del procedimiento anteriormente descrito, arriba, para la recombinación, cada secuencia de DNA, se encuentra contenida en un plásmido separado, y en donde, cada plásmido, se introduce en el organismo procariótico.

En una forma de presentación particularmente preferida de la presente invención, el procedimiento anteriormente descrito, arriba, para la mutagenización de un organismo procariótico, o para incrementar la tasa de recombinación de un organismo procariótico, se prevé el hecho de que, las secuencias de DNA introducidas, derivan de un organismo de una especie diferente del organismo transformado con la secuencia de DNA introducida. Así, de este modo, en concordancia con la presente invención, las secuencias nucleótidas introducidas, pueden derivar de diferentes especies, o también, de la misma especie, o incluso organismo, si se compara con el organismo en el cual se ha introducido la secuencia nucleótida.

En una forma de presentación adicionalmente preferida de la presente invención, las secuencias nucleótidas introducidas, se introducen en el organismo procariótico, mediante transducción, cruzamientos conjugados, fusión artificial de células, absorción química, física, eléctrica o biolística de las secuencias nucleótidas.

En una forma de presentación adicionalmente preferida de la presente invención, la recombinación de homólogos entre los autólogos y las secuencias nucleótidas introducidas, involucran el reemplazo de genes y la adición de genes.

En una forma particularmente preferida de presentación de la presente invención, el sometimiento del organismo procariótico a un agente capaz de inactivar o saturar el MRS, tiene lugar previamente y/o simultáneamente y/o después de la introducción de las secuencias divergente nucleótidas divergentes, es decir, de las segundas secuencias nucleótidas, en el organismo.

La presente invención, proporciona, también, un procedimiento para la recombinación in vivo de secuencias de DNA, homólogas, pero con bases desapareadas, en donde, las citadas secuencias, se ponen conjuntamente en células o en un organismo procariótico, cuyo sistema de reparación de desapareamiento, enzimático, se ha activado de una forma reversible, es decir, de una forma transitoria, mediante la aplicación transitoria del agente definido anteriormente, arriba, durante un determinado transcurso de tiempo, para obtener la recombinación entre las citadas secuencias de DNA, por ejemplo, durante un transcurso de tiempo inferior a 5 horas, de una forma particular, durante un transcurso de tiempo inferior a 1 hora.

Así, de este modo, la presente invención, se refiere a un procedimiento de recombinación in vivo, es decir, a un procedimiento para la producción de organismos procarióticos recombinados, mediante cruzamiento, o cualquier otro medio, para poner conjuntamente DNA procedente de diferentes organismos procarióticos, o cualquier otro medio, y la recombinación in vivo de un organismo procariótico de diferentes especies y/o géneros, en donde, el cruzamiento, o el otro medio, y la recombinación in vivo, se realizan entre un organismo de la primera especie y/o de un primer género, y un organismo de una segunda especie y/o de un segundo género, en donde, por lo menos uno de estos dos organismos, comprenden un MRS reversiblemente inactivado, en concordancia con la presente invención.

En una forma de presentación particularmente preferida de la presente invención, la recombinación, es una recombinación entre diferentes especies, es decir, una recombinación interespecífica o una recombinación entre organismos de diferentes géneros, es decir, una recombinación intergenérica.

La secuencias de DNA concernidas para la recombinación, pueden ser cromosómicas o extra-cromosómicas, por ejemplo, plásmidos, los cuales permitan, en una forma particularmente preferida de presentación, la recombinación entre genes individuales clonados.

Mediante el procedimiento anteriormente identificado, arriba, es posible el producir, de una forma particular, células u organismos recombinados de bacterias en concordancia con la presente invención, pero, por supuesto, también, de levaduras, plantas o animales, organismo recombinados, éstos, concebidos mediante ingeniería genética o modificados mediante ingeniería genética.

En una forma particularmente preferida de presentación, la presente invención, se refiere a un procedimiento para la producción de bacterias, recombinadas mediante cruzamiento, y a la recombinación de bacterias de diferentes especies y/o géneros, en donde, se realiza una conjugación o transducción in vivo, entre una bacteria recipientaria de una primera especie y/o de un primer género, cuyo sistema de desapareamiento enzimático, se ha inactivado de una forma reversible, en concordancia con la presente invención, y bacterias donantes de una segunda especie y/o de un segundo género, el cual, en una forma preferida de presentación, comprende un rasgo o propiedad particular que se desea, a ser transferido en la bacteria recipientaria. Es posible, también, el inactivar de una forma reversible, el sistema de reparación del desapareamiento en concordancia con la presente invención, utilizando el procedimiento anteriormente identificado, arriba, y un análogo de bases.

En una forma preferida de presentación de la presente invención, las bacterias recipientarias, son también defectivas en los sistemas enzimáticos de restricción del DNA.

En una forma de presentación particularmente preferida del procedimiento de la presente invención, anteriormente descrito, arriba, ambas cepas, se cruzan en presencia del análogo de bases, inactivando, de una forma reversible, el sistema de reparación del desapareamiento y, a continuación, se elimina el análogo de bases.

En una forma particularmente preferida de la presente invención, se procede a cruzar la capa de E. coli y una cepa de Salmonella typhimurium, de las cuales, por lo menos una, de una forma preferible, ambas, se inactiva(n) en concordancia con la presente invención y, en su MRS enzimático. En una forma de presentación todavía más preferida, se procede a conjugar una bacteria donante del tipo Hrf, con una bacteria recipientaria F^{-}.

El procedimiento anteriormente identificado, arriba, para la producción de organismos procarióticos o células, recombinados, de una forma particular, bacterias, es ventajoso, en tanto que, ésta, crea nuevas cepas de bacterias que exhiben propiedades ventajosas, siendo, por ejemplo, no tóxicas, o convirtiéndose en apropiadas, para su uso en la producción de vacunas.

La presente invención, se refiere, asimismo, a un procedimiento para la producción de genes híbridos y sus proteínas codificadas in vivo, a partir de dos genes parcialmente homólogos, en donde, las células recombinadas, se preparan a partir de células de un primer organismo procariótico, el cual contiene un primer gen, y células de una segundo organismo procariótico, el cual contiene un segundo gen, parcialmente homólogo, y en donde, se procede a llevar a cabo un procedimiento para la mutagénesis en concordancia con la presente invención, en la célula recombinada y, el gen híbrido deseado, o su proteína codificada, se seleccionan entre éstos. Este procedimiento, prevé el hecho de que, en un organismo procariótico que comprende un MRS inactivado en concordancia con la presente invención, se emplazan conjuntamente dos secuencias de DNA, consistentes en genes parcialmente homólogos, que derivan de dos organismos diferentes y, después de la recombinación in vivo, el gen híbrido deseado y, si se desea, después de la síntesis de proteínas in vivo, se selecciona la proteína codificada. En concordancia con una forma preferida de presentación de la presente invención, por lo menos dos plásmidos que contienen por lo menos dos genes parcialmente homólogos, que codifican para la misma función, pero que tienen diferentes secuencias, se introducen en una célula que tiene un MRS reversiblemente inactivado, en concordancia con la presente invención, un gen híbrido, y, en una forma preferida de presentación, después de la expresión, bajo condiciones convencionales, la proteína híbrida, se selecciona, y, de una forma preferible, se aísla. Los plásmidos, pueden introducirse en el organismo procariótico, mediante procedimientos convencionales de transformación.

La presente invención, se refiere, también, a un procedimiento de mutagénesis inversa pretendida como objetivo, de un gen, en un organismo procariótico, en donde, el gen, comprende un base mutada, la cual se desea restablecer a como era, antes de la mutación, en donde, el sistema de reparación del apareamiento, del organismo, se inactiva de una forma reversible, en concordancia con la presente invención, y se introduce un oligonucleótido consistente en una secuencia de DNA, a ser restablecida, como era antes de la mutación y, el mutante restablecido, se selecciona de entre los mutantes.

Por supuesto, la presente invención, se refiere, también, a productos obtenidos en concordancia con los procedimientos de la presente invención, es decir, los organismos procarióticos recombinados y/o mutagenizados, células, productos genéticos, proteínas, genes, grupos de genes, operones, plásmidos, cromosomas y genomas.

Formas preferidas adicionales de presentación de la presente invención, vienen representadas por las sub-reivindicaciones, las cuales son el objeto de éstas.

La invención, se expondrá, ahora, por vía de ejemplos y de las figuras de acompañamiento.

Las figuras, muestran:

Figura 1

Influencia de la 2-aminopurina (2-AP), en la eficacia de la recombinación conjugada de las intraespecies E. coli Hfr x E. coli F^{-} e interespecies S. typhimurium Hfr x E. coli F^{-}. Las cepas recipientarias E. coli, eran, o bien mutS^{+} (A, C), o bien mutS^{-} (B, D). Las frecuencias de recombinación para el marcador seleccionado (Thr^{+}), se expresan por donante HFr, después de substraer los inversores desapareados. Cada número, representa la media (error standard +/-), de por lo menos tres experimentos independientes.

Figura 2

Identificación del componente del sistema de reparación del desapareamiento, el cual se satura o se inhibe mediante tratamiento con 2-aminopurina (2-AP). Las cepas recipientarias de E. coli, eran, o bien ya sea mutS^{-} (A, B), o bien ya sea mutL^{-} (C, D). La deficiencia de la reparación del desapareamiento, se complementó con plásmidos que portaban genes mutS^{+} (A, B), o mutL^{+} (C, D). La dosis utilizada de 2-AP, en estos experimentos, era, siempre, de 300 mg/ml. Las frecuencias de recombinación del marcador seleccionado (Thr^{+}), se expresan por donante Hfr, después de substraer los inversores desapareados. Cada número, representa la media (error standard +/-), de por lo menos tres experimentos independientes.

Ejemplo Cepas bacterianas, plásmidos, y condiciones de cultivo

Cepa donante	Genotipo	Referencia o fuente
S. typhimurium LT2 SA965	LeuBCD39 ara-7	(Sanderson et al., 1972)
E. coli K12 P4X	RelA1 spoT1 metB	(Kahn, 1968)
MX0	AsP4X, pero metB^{+}

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Cepa recipientaria	Genotipo	Referencia o fuente
AB1157	Thr1 \hskip0.4cm leu6 \hskip0.4cm proA2	(Bachmann, 1972)
	his4 \hskip0.5cm thi1 \hskip0.4cm argE3
	lacY1 \hskip0.3cm galK2 \hskip0.2cm ara14
	xyl5 \hskip0.4cm mtl1 \hskip0.4cm tsx33 \hskip0.4cm str31
	supE44
MX1	As AB11547, pero Na1R
MX2	As NX1, pero Thr-34::Tn10	Alelo thr, procedente del E. coli
		Genetic Stock Center, Yale
		University, New Haven, USA.
MX3	As NX1, pero Thr-3091::Tn10kan	Alelo thr, procedente del E. coli
		Genetic Stock Center, Yale
		University, New Haven, USA.
MX4	As NX2, pero _mutS::_ Sm-Sp	Alelo mutS, procedente de la
		colección de cepas de M. Radman
MX5	As NX3, pero mutL218::Tn10	Alelo mutL (Pang. et al., 1985).

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Plásmidos	Genotipo	Referencia o fuente
PMQ341	mutS^{+} CamR	(Wu y Marinus, 1994)
PMQ339	MutL^{+} CamR	(Wu y Marinus, 1994)

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Medio:

Todos los cultivos, se cultivaron a una temperatura de 37°C.

1.- Medio rico LB:

Bacto tryptona (DIFCO) 10 g; extracto de levadura Batco (DIFCO) 5 g; NaCl 10 g; H_{2}O desionizada 1 l. Valor pH ajustado a 7,0, con NaOH 1 M.

2.- Medio mínimo M63:

KH_{2}PO_{4} 13,6 g; (NH_{4})_{2}SO_{4} 2 g; FeSO_{4} 7H_{2}O 0,5 mg, H_{2}O desionizada 1 l. Valor pH ajustado a 7,0, con KOH. Después de sometimiento a autoclave se procedió a añadir 1 ml de MgSO_{4} 7 H_{2}O y 10 ml de una solución al 20% de una fuente de carbono. Se procedió a añadir aminoácidos y antibióticos, cuando era necesario.

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Cuando se utilizó el medio en las placas, se añadieron 15 g de agar (DIFCO) por litro. Todos los medios, se esterilizaron mediante sometimiento a autoclave durante un transcurso de tiempo de 30 minutos, a una temperatura de 120°C. Los antibióticos, se añadieron siempre después del sometimiento al autoclave. Las concentraciones finales en antibióticos, eran como sigue: ácido nalidíxico (Sigma), 40 \mug/ml; espectinomicina (Sigma), 100 \mug/ml; estreptomicina (Sigma), 75 \mug/ml; canamicina (Sigma), 50 \mug/ml; tetraciclina (Sigma), 12,5 \mug/ml; y cloranfenicol (Sigma), 30 \mug/ml.

Manipulación de DNA y microorganismos Electrotransformación

Los plásmidos que portaban genes mutS^{+} ó mutL^{+}, se introdujeron, mediante eletrotransformación (utilizando un aparato de microimpulsos del tipo BIO Rad micro pulser), en la cepas MX4 y MX5, respectivamente.

Transducción

Todas las cepas recipientarias, eran derivados de la cepa E. coli K12 F^{-} AB1157, los cuales se habían construido utilizando transducción mediatizada por P1 (Miller, 1972).

Cruzamientos de conjugación

Los experimentos de conjugación, se realizaron bajo las condiciones anteriormente descritas, arriba (Rayssiguier et al., 1989). Los cultivos realizados durante el transcurso de toda una noche, de cepas donantes (2-4 x 10^{9} células/ml) que comprendían la secuencia de DNA a ser introducida y las cepas recipientarias que comprendían las secuencias de autólogas de DNA, se diluyeron a un valor 50 veces, en medio fresco LB, con 2-aminopurina (Sigma), o sin ella, y se hicieron crecer mediante una cuidadosa agitación (de una velocidad angular de aproximadamente 150 revoluciones por minuto), con objeto de obtener 2-4 x 10^{6} células/ml. Con objeto de obtener la concentración de células requerida, se requiere un tiempo de incubación de aproximadamente 3 horas. Cuando las células se trataron con 2-AP, el crecimiento, era ligeramente inferior (la incubación, era de un tiempo aproximadamente 30 minutos más largo), en comparación con el crecimiento sin 2-AP. Se prefiere el tratamiento con 2-AP de las cepas donante y recipientaria, antes del apareamiento, puesto que, la 2-AP, debe incorporarse en el DNA, durante la replicación, con objeto de saturar la reparación del desapareamiento. Las dosis de 2-AP sometidas a test de ensayo, eran de: 25 \mug/ml, 50 \mug/ml, 75 \mug/ml, 100 \mug/ml, 300 \mug/ml, y 600 \mug/ml. El efecto del tratamiento con 2-AP, era ya significativo, cuando se utilizaba una dosis de 2-AP de 50 \mug/ml. El efecto máximo, se observó a 100 \mug/ml de 2-AP, mientras que, incrementos adicionales en la concentración de 2-AP, no incrementaban adicionalmente la eficacia de la recombinación. Se prepararon mezclas de apareamiento, procediendo a mezclar, conjuntamente, bacterias Hfr y F^{-}, en un factor de relación de 1:1. Esta mezcla se filtró a través de un filtro de microcelulosa, de un tamaño de poro de 0,45 \mum, (de un diámetro de 2,5 cm), utilizando un equipo de filtración mediante la acción de vacío (MILLIPORE). Los filtros con mezclas de apareamiento, es decir, mezclas con células que comprendían autólogos y secuencias nucleótidas introducidas, se incubaron en una placa de agar de LB fresco (con 2-aminopurina, o sin ella) precalentada a una temperatura de 37°C. Después de un transcurso de tiempo de 60 minutos, los pares de apareamiento, se resuspendieron en MgSO_{4} 10^{-2} M, y se separaron mediante una vigorosa acción de torbellino mediante vórtices y así, de este modo, diluyendo la 2-AP, a niveles inactivos. A continuación, las mezclas de apareamiento, se colocaron en placas, en un medio, el cual seleccionaba para los recombinantes deseados (fenotipo Thr^{+}), y contra-seleccionaba ambas cepas paternas, la donante (fenotipo Nal^{s}) y la recipientaria (fenotipo THr^{-}), las cuales no contenían 2-AP. Para este propósito, se procedió a utilizar el medio M9 (suplementado con arginina, histidina, leucina, prolina, y triptófano (100 \mug/ml, de cada una), tiamina (30 \mug/ml), glucosa (0,4%), y ácido nalidíxico (40 \mug/ml), para contra-seleccionar las células donantes Hfr). No se añadió treonina, al medio, con objeto de seleccionar los recombinantes Thr^{+}. Los recombinantes, se clasificaron mediante puntuación, después de un transcurso de tiempo de 48 horas, a una temperatura de 37°C.

El efecto del tratamiento con 2-AP, en la recombinación, se demostró, en el transcurso de la presente invención, utilizando el sistema bien estudiado de recombinación de conjugación, entre S. Typhimurium x E. coli (Stambuk y Radman, 1998); Rayssiguier et al., 1989; Matic et al., 1995; Denamur et al., 2000). La recombinación entre estas dos especies bacterianas, las cuales tienen aproximadamente un 16% de divergencia en sus secuencias genómicas, es muy reducida (10^{-8}-10^{-7}; figura 1A), en comparación con las recombinación intraespecies (aproximadamente 10^{-1}; figura 1C). La inactivación del gen mutS ó mutL, en células recipientarias en concordancia con la presente invención, utilizando 2-AP, incrementa en un valor de 10^{3}-10^{4} veces, la frecuencia de la recombinación interespecies (figura 1B, figura 2A y figura 2B).

La alta tasa de recombinación observada en los experimentos de conjugación interespecies, no se incrementa de una forma considerable, mediante el tratamiento con 2-AP, en el sistema de E. coli utilizado, en ambos fondos, en el fondo de base del mutS^{+} (tipo salvaje), o en el fondo de base del mutS^{-}. La figura 1B, muestra el hecho de que, en un fondo de base del recipientario mutS^{-}, el efecto de la 2-AP, no es tan pronunciado como en el fondo de base de un tipo salvaje (figura 1A), debido al hecho de que, las células mutS^{-}, exhiben ya unas altas tasas de recombinación, debido al MRS que se ha inactivado genéticamente (mtS^{-}). ^{}

Así, de este modo, cuando las células recipientarias del tipo salvaje, se habían tratado con 75, 100, 300 ó 600 \mug/ml de 2-AP (se ve un incremento de la frecuencia de recombinación, de 50 a 600 \mug/ml de 2-AP), de una forma particular, por encima de 75 \mug/ml), la frecuencia de recombinación interespecies, se incrementó en un valor de 10^{4} veces, mientras que, la de la recombinación intraespecies, no se modificó (figura 1). Mediante la introducción de plásmidos que portan genes que codifican para genes mutS ó mutL, la proteína muL, se identificó como el componente del MRS, el cual se somete a titulación o titración, o se inactiva mediante el tratamiento con 2-AP (figura 2B).

Así, por lo tanto, puede concluirse el hecho de que, el tratamiento de células de E. coli, con 2-AP, tiene como resultado un incremento transitorio de la eficacia de recombinación entre las secuencias divergentes de DNA, de una forma particular, mediante recombinación de homólogos, mediante la saturación o la inhibición de un sistema de reparación del desapareamiento, genéticamente intacto.

La presente invención, enseña cómo romper las barreras genéticas, de una forma particular, en bacterias del tipo salvaje, de una forma reversible. La rotura de las barreras genéticas, permite una eficiente recombinación inter-especies de genes, operones, o genomas, produciendo una nueva gran escala de biodiversidad, la cual puede ser una fuente útil de la innovación biotecnológica. El mecanismo del incremento transitorio, en la recombinación de interespecies, de hasta un valor de 10.000 veces, se muestra en el ejemplo anteriormente facilitado, arriba: la substancia química utilizada, la 2-aminopurina, produce un fenotipo reversible de la deficiencia de reparación del desapareamiento del DNA, mediante el agotamiento o reducción de la función MutL del citado sistema de reparación del DNA. La gran ventaja de este procedimiento, con respecto al uso de mutantes deficientes de reparación del desapareamiento, reside en el hecho de que, el estado genéticamente inestable, puede limitarse estrictamente, al tiempo de cruzamiento de las interespecies: el agotamiento o reducción de la 2-aminopurina, devuelve la estabilidad genética. Adicionalmente, el presente procedimiento, capacita para la activación de la recombinación de interespecies, también en organismos, en donde, los genes de reparación del desapareamiento, son desconocidos, o no pueden manipularse genética-
mente.

Referencias

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Claims

1. Un procedimiento para incrementar la tasa de recombinación entre secuencias de DNA, no idénticas, presentes en un organismo procariótico, in vivo, el cual comprende:

a): combinar, en una célula, una secuencia de DNA procedente de una primera especie o género, con una secuencia de DNA procedente de una segunda especie o género, en donde, la primera y segunda secuencias de DNA, tienen secuencias que son parcialmente homólogas y que tienen desapareamientos aptos para activar el sistema de reparación de desapareamiento enzimático de la célula, cuando el citado sistema es funcional,

b): tratar el organismo, previamente o subsiguientemente a la etapa a), o previamente, simultáneamente y subsiguientemente a la etapa a) con un análogo de bases de la base nucleótida de origen natural, en una cantidad y durante un período de tiempo suficientes como para inhibir, de una forma reversible, el MRS de una célula, por lo menos parcialmente, y

c): eliminar el análogo de bases, del organismo.

2. El procedimiento, según la reivindicación 1, en donde, el organismo procariótico, es un organismo eubacteriano o arqueobacteriano.

3. El procedimiento, según las reivindicaciones 1 ó 2, en donde, el organismo eubacteriano, es Escherichia coli.

4. El procedimiento, según las reivindicaciones 1 a 3, en donde, las secuencias de DNA no idénticas, son genes, operones, grupos de genes, cromosomas, plásmidos o genomas.

5. El procedimiento, según las reivindicaciones 1 a 4, en donde, las secuencias de DNA, son secuencias de DNA de origen natural, o secuencias de DNA manipuladas artificialmente.

6. El procedimiento, según las reivindicaciones 1 a 5, en donde, el análogo de bases, es 2-aminopurina.

7. El procedimiento, según las reivindicaciones 1 a 6, en donde, el período de tiempo suficiente para incrementar de una forma reversible la tasa de recombinación, es inferior a 5 horas, de una forma preferible, de 1 hora.

8. El procedimiento, según las reivindicaciones 1 a 7, en donde, la cantidad de análogo de bases, suficiente como para incrementar la tasa de recombinación de una forma irreversible, es de 50 \mug/ml a 600 \mug/ml.

9. Un procedimiento para mutagenizar un organismo procariótico, el cual comprende

la introducción de secuencias de DNA parcialmente homólogas, con una porción de bases desapareadas, hasta en un 30%, en el organismo, en el organismo,

el someter el organismo a unas condiciones que permitan la recombinación de homólogos entre sus autólogos y las secuencias de DNA introducidas.

con lo cual, el organismo, se somete a un análogo de bases, de una base de nucleótidos de origen natural, capaz de inhibir el sistema de reparación de desapareamiento del organismo, en una cantidad y durante un período de tiempo suficientes, como para incrementar de una forma reversible, la tasa de recombinación entre los autólogos y las secuencias de DNA introducidas en el organismo y,

10. El procedimiento, según la reivindicación 8, en donde, las secuencias de DNA introducidas, se introducen el organismo, mediante sexo natural, transducción, cruzamientos de conjugación, fusión artificial de células, tratamiento químico, físico, eléctrico o biolístico de las secuencias de DNA.

11. El procedimiento, según la reivindicación 9 ó 10, en donde, la recombinación de homólogos, entre los autólogos y las secuencias de DNA introducidas, involucra el reemplazo de genes y la adición de genes.

12. El procedimiento, según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en donde, las secuencias de DNA introducidas, derivan de un organismo o de una especie diferente a la especie del organismo transformado con la secuencia de DNA introducida.

13. El procedimiento, según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, en donde, el organismo procariótico, es un organismo eubacteriano o arqueobacteriano.

14. El procedimiento, según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, en donde, el organismo eubacteriano, es Escherichia coli.

15. El procedimiento, según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14, en donde, las secuencias de DNA no idénticas, son genes, operones, grupos de genes, cromosomas, plásmidos o genomas.

16. El procedimiento, según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 15, en donde, el análogo de bases, es 2-aminopurina.

17. El procedimiento, según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 8, en donde, las secuencias de DNA, son de doble hebra.

18. El procedimiento, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 ó 17, en donde, la recombinación, es una recombinación intergenérica y/o interespecífica.

19. El procedimiento, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 ó 17 ó 18, en donde, células de un organismo procariótico de una primera especie o un primer género, se fusionan a células de un organismo procariótico de una segunda especie o un segundo género, para combinar, en una célula, el DNA procedente de la primera especie o género, con el DNA procedente de una segunda especie o género, y en donde, las células del organismo de la segunda especie o segundo género, comprenden un sistema de reparación del desapareamiento, enzimático, reversiblemente inactivado.

20. El procedimiento, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 ó 17 ó 18, en donde se procede a cruzar un organismo unicelular de una primera especie o de un primer género, con un organismo celular de una segunda especie o de un segundo género, para combinar, en una célula, una secuencia de DNA procedente de una primera especie o género, con una secuencia de DNA procedente de una segunda especie o género, y en donde, el sistema de reparación del desapareamiento, enzimático, de por lo menos uno de estos organismos, se ha inactivado de una forma reversible.

21. El procedimiento, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 ó 17 ó 18, en donde, se procede a conjugar o transducir una bacteria recipientaria de una primera especie o género, con una bacteria donante de una segunda especie o género, para combinar, en una célula, una secuencia de DNA procedente de una primera especie o género, con una segunda secuencia de DNA procedente de una segunda especie o género, en donde, la bacteria donante, tiene por lo menos una secuencia de DNA a ser transferida a la bacteria recipientaria, y en donde, el sistema de reparación del desapareamiento, enzimático, de por lo menos una de las bacterias donante y recipientaria, se inactiva de una forma reversible.

22. El procedimiento, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 ó 17 ó 18, en donde, dos secuencias de DNA, se emplazan en un organismo unicelular, para combinar, en una célula, una secuencia de DNA procedente de una primera especie o género, con una segunda secuencia de DNA procedente de una segunda especie o género, en donde, el organismo, se inactiva de una forma reversible, en su sistema de reparación del desapareamiento, enzimático, y en donde, las secuencias de DNA, son parcialmente homólogas, y derivan de dos organismos diferentes.

23. El procedimiento, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 ó 17 ó 18, en donde, cada secuencia de DNA, se encuentra contenida en un plásmido separado, y en donde, cada plásmido, se introduce en el organismo.

24. Un procedimiento, pare la producción de un gen híbrido y/o su proteína codificada, en donde se procede llevar a cabo un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 ó 17 a 23 y, el gen híbrido y/o su proteína codificada, se produce mediante la selección de un gen híbrido y/o su proteína codificada, después de la expresión, en el organismo.