HRP20040682A2

HRP20040682A2 - Process for the reversible functional inactivation of the mismatch repair system

Info

Publication number: HRP20040682A2
Authority: HR
Inventors: Ivan Matic; Miroslav Radman
Original assignee: Mixis France Sa
Priority date: 2002-01-31
Filing date: 2004-07-23
Publication date: 2004-12-31
Also published as: WO2003064667A8; DK1333095T3; ATE319845T1; EP1333095A1; WO2003064667A1; JP2005538687A; US20050176149A1; US7883894B2; ES2259685T3; EP1333095B1; DE60209580D1; DE60209580T2; SI1333095T1; PT1333095E; JP4488742B2

Description

Ovaj izum odnosi se na postupak za reverzibilnu funkcionalnu inaktivaciju sustava popravka krivo sparenih baza u organizmu, te brojne primjene istoga. Posebice, ovaj izum se odnosi na postupak in vivo rekombinacije neidentičnih nukleotidnih slijedova. Ovaj izum također se odnosi na postupak proizvodnje hibridnih organizama in vivo rekombinacijom različitih organizama, vrsta ili rodova. Ovaj izum također se odnosi na postupak dobivanja hibridnih gena i njima kodiranih proteina in vivo.

Evolucija je odabir najsposobnijih varijanti dobivenih mutacijom i rekombinacijom. Nasumična mutacija daje nove alele, dok genetička rekombinacija daje nove kombinacije već postojećih alela. Ovo svojstvo genetičke rekombinacije poboljšava učinkovitost mutageneze, jer dopušta udruživanje višestrukih adaptivnih mutacija, kao i njihovo odvajanje od puno učestalijih štetnih mutacija. Učinkovitost genetičke rekombinacije ovisi o identičnosti slijeda DNA koji dijele dvije rekombinirajuće molekule, te o staničnom enzimatskom sustavu uključenom u rekombinaciju i njeno uređivanje (Radman i Wagner, 1993; Matic et al., 1996). Rekombinacija između molekula DNA koje se razlikuju u odvojenim točkastim mutacijama (polimorfizam slijeda) smanjena je ili inhibirana. Križanja između različitih bakterijskih sojeva i vrsta pokazuju da se učestalost rekombinacije eksponencijalno smanjuje s povećanjem divergentnosti genomskog slijeda (Vulic et al., 1997). Sparivanje neidentičnih slijedova DNA rezultira stvaranjem krivo sparenih heterodupleksnih molekula. Krivo sparene bazne parove prepoznaju komponente sustava popravka krivo sparenih baza (engl. mismatch repair system, MRS), koji djeluje kao inhibitor rekombinacije između neidentičnih slijedova DNA (Rayssiguier et al., 1989; Shen i Huang, 1989; Worth Jr. et al., 1994; Zahrt et al., 1994; Matic et al., 1995).

Ova funkcija MRS igra važnu ulogu u održavanju strukturalnog integriteta kromosoma i genetičke izolacije između različitih bakterijskih vrsta. Na primjer, inaktivacija gena iz sustava MRS 10-15 puta povećava učestalost kromosomskih duplikacija nastalih rekombinacijom između lokusa rhsA i rhsB E. coli (samo 0,9% divergencije) (Petit et al., 1991) te oko 103 puta učestalost genske konverzije između gena tufA i tufB S. enterica (serovar Typhimurium) (oko 1% divergencije) (Abdulkarim i Hughes, 1996). MRS također kontrolira konjugacijsku i transdukcijsku rekombinaciju između divergentnih sojeva i vrsta (Rayssiguier et al., 1989; Zahrt et al., 1994; Matic et al., 1995; Vulic et al., 1997). Čak je i niska divergencija dovoljna za sprečavanje rekombinacije. Na primjer, transdukcijska rekombinacija između dva serovara S. enterica (Typhimurium i Typhi), čiji se genomi na razini slijeda DNA razlikuju samo 1-2%, povećava se 102-103 puta u genetičkim okruženjima s nedostatkom MRS (Zahrt et al., 1994).

Pokazalo se da su tri gena osobito bitna za MRS u E. coli: mutS, mutL i mutH (Friedberg et al., 1995). Inaktivacija različitih gena iz sustava MRS ima različit i karakterističan učinak na međuvrsnu rekombinaciju (Rayssiguier et al., 1989; Stambuk i Radman, 1998; Denamur et al., 2000). Najjači hiperrekombinacijski učinak opažen je nakon inaktivacije gena mutS i mutL, kako je opisano u, na primjer, SAD 5,956,415 i SAD 5,912,119. Nasuprot tome, pretjerana produkcija proteina MutS i MutL ozbiljno smanjuje učestalost rekombinacije, čak i između bakterijskih sojeva s jako niskom genomskom divergencijom (Vulic et al., 1997). Tako je modifikacijom aktivnosti MRS moguće poremetiti ili uspostaviti genetičke barijere između različitih bakterijskih vrsta.

Kad se genetička raznovrsnost uspostavlja putem rekombinacije, jedan od glavnih problema rekombinacije u okruženju s učinkovitim MRS, je to što divergencija slijeda DNA ograničava rekombinacijske događaje na područja genoma s najvećom sličnosti sekvence. Kao posljedica toga, većina rekombinanata su jako nestabilni merodiploidi, koji su često nastali nejednakim prekrštenjem između operona ribosomalne RNA (engl. ribosomal RNA, rrn), koji su pak obično gotovo identični između srodnih bakterijskih vrsta. Inaktivacija MRS dopušta, ne samo veći udio međuvrsne rekombinacije, nego i veću raznolikost i veću stabilnost hibrida. Moguće primjene ove strategije, koja dopušta stvaranje međuvrsnih mozaičnih genoma, su višestruke primjene u bazičnom istraživanju, biotehnologiji, genetičkom inženjerstvu i medicini. Dopuštanjem rekombinacije cijelih genoma, mogu se dobiti mozaični genomi s novim kombinacijama gena i operona (čak i s mozaičnim genima i operonima).

Međutim, svaki put kad se novi bakterijski soj ili vrsta koriste za rekombinaciju, gen mutS ili mutL mora se inaktivirati. Ovo može biti jako teško kad ovi geni nisu inaktivirani i/ili kad u danoj vrsti nisu razvijeni genetički alati za inaktivaciju gena. Pored toga, inaktivacije gena iz sustava MRS povećavaju učestalost mutacije 102-103 puta, što može biti neželjeno nakon što je dobiven željeni konstrukt. Alternativa bi bila inhibicija/saturacija MRS pomoću nekog drugog pristupa. Na primjer, (i) MRS može biti zasićen pretjeranim greškama u replikaciji DNA u sojevima E. coli s defektnim genom dnaQ, koji kodira za lektorirajuću aktivnost replikacijske DNA polimeraze (PolIII) (Schaaper i Radman, 1989). (ii) Također je pokazano da se učinkovitost MRS smanjuje uslijed titracije proteina koji sudjeluju u popravku krivo sparenih baza, u stanicama koje imaju krivo sparene baze u višeponavljajućoj jednolančanoj DNA kodiranoj retronom (Maas et al., 1996). SAD 5,965,415 i SAD 5,912,119 opisuju postupak za međurodnu i međuvrsnu rekombinaciju, gdje je MRS prolazno inaktiviran mutacijama gena iz sustava MRS i naknadnim uspostavljanjem MRS uz upotrebu korekcijskog mutanta ili saturacijom MRS putem uvođenja nukleotidnih slijedova koje sadrže veliki broj krivo sparenih baza. Međutim, u posljednjem slučaju enzimatske komponente MRS se očito uništavaju i ponovna funkcionalna aktivacija MRS zahtijeva ponovnu sintezu enzima popravka. Prekomjerna ekspresija proteina sustava MRS iz nesrodnih bakterijskih vrsta također može inhibirati MRS u E. coli i rezultirati povećanom mutagenezom (Prudhomme et al., 1991). Međutim, iako sve gore navedene metode za inhibiciju/saturaciju MRS ne zahtijevaju inaktivaciju gena sustava MRS, dodatna modifikacija stanica nužna je kako bi se smanjila učestalost mutacija i rekombinacija nakon što se dobiju potrebne rekombinante.

Tako je tehnički problem u pozadini ovog izuma, osmisliti jednostavnu metodu za inaktivaciju ili barem značajno smanjenje aktivnosti MRS u organizmu, kako bi se povećala učestalost rekombinacije između djelomično homolognih, tj. neidentičnih ili divergentnih nukleotidnih slijedova u organizmu, uz izbjegavanje narednih dodatnih modifikacija obrađenih stanica, kako bi se smanjila učestalost mutacija i rekombinacija.

Ovaj izum rješava tehnički problem jer obznanjuje postupak za reverzibilnu, tj. prolaznu, funkcionalnu inaktivaciju sustava popravka krivo sparenih baza (MRS) u organizmu, a koji obuhvaća podvrgavanje organizma agensu sposobnom za djelomičnu ili potpunu inhibiciju sustava popravka krivo sparenih baza u organizmu, u obimu i vremenskom periodu dovoljnom za reverzibilno povećanje učestalosti rekombinacije između neidentičnih nukleotidnih slijedova, pogotovo slijedova DNA, prisutnih u organizmu i, u poželjnom ostvarenju, naknadnim uklanjanjem agensa iz organizma.

Tako ovaj izum obznanjuje način za reverzbilnu inaktivaciju MRS, koja zauzvrat omogućava brojne korisne primjene, poput povećanja učestalosti rekombinacije neidentičnih nukleotidnih slijedova. Dakle, ovaj izum također osigurava postupke za povećanje učestalosti rekombinacije u organizmu i postupke za mutagenezu organizma, pri čemu je MRS reverzibilno inaktiviran kako je ovdje opisano.

U jednom pogledu ovog izuma, postupak iz ovog izuma ima prednost, jer se reverzibilnom inaktivacijom MRS organizma, učestalost rekombinacije između neidentičnih slijedova DNA prisutnih u organizmu može reverzibilno povećati, pri čemu se izbjegava potreba za narednim manipulacijama tretiranih stanica, te MRS konstantno održava genetički intaktnim.

U kontekstu ovog izuma, neidentični ili divergentni nukleotidi, posebno slijedovi DNA, posebno poželjni dvolančani slijedovi DNA prisutni u organizmu, obuhvaćaju «prve» slijedove, tj. autologne nukleotide, posebno slijedove DNA, prisutne u organizmu, poželjno prije unosa «drugih» slijedova, i navedene «druge» slijedove ubačene u ovaj organizam, na primjer, prirodnim seksom, konjugacijom, transdukcijom, umjetnom staničnom fuzijom ili bilo kojim načinom poznatim u struci, poput kemijskih, električnih, biolističkih ili fizikalnih obrada. Naravno, i «prvi» i «drugi» slijedovi mogu se istovremeno unijeti u organizam. Ovi uneseni «drugi» slijedovi su neidentični, to jest nisu potpuno identični ili homologni «drugim» slijedovima. Napose, ovi djelomično homologni slijedovi imaju značajni udio krivo sparenih baza, na primjer, do 30%. Djelomično homologni slijedovi mogu aktivirati MRS, ako je MRS funkcionalan i nije inaktiviran, inhibiran ili zasićen. Uneseni slijedovi, zbog reverzibilne inaktivacije sustava popravka krivo sparenih baza, rekombiniraju s autolognim slijedovima DNA prisutnim u organizmu. Jednom nakon što se dogodila rekombinacija, agens, korišten prema postupku iz ovog izuma, može se ukloniti tako da sustav krivo sparenih baza uspije povratiti svoju prvobitnu funkciju. Jedna prednost prolazne inhibicije ili zasićenja MRS je to što, nakon rekombinacije, dobivene hibridne stanice nemaju konstitutivno visoku učestalost mutacija zbog trajne inaktivacije gena sustava MRS.

U posebno poželjnom ostvarenju ovog izuma, neidentični slijedovi DNA prisutni su u obliku gena, operona, skupina gena, kromosoma, plazmida i/ili genoma. Ovi slijedovi DNA mogu biti prirodnog porijekla ili artificijalno konstruirani slijedovi DNA.

Ovaj izum omogućava vrlo značajno povećanje učinkovitosti rekombinacije između neidentičnih DNA slijedova, koja je obično inhibirana sustavom popravka krivo sparnenih baza. Ovaj izum može se pogodno koristiti za dobivanje nove bioraznolikosti na razini pojedinačnih gena ili operona, kao i čitavih genoma. Kemijska inhibicija MRS prema postupku iz ovog izuma, nikad prije nije korištena za povećanje učinkovitosti rekombinacije između neidentičnih DNA slijedova.

U jednom ostvarenju ovog izuma, organizam koji sadržava autologne nukleotidne slijedove može biti podvrgnut agensu sposobnom za inhibiciju sustava popravka krivo sparenih baza organizma, u količini i vremenskom periodu dovoljnim za reverzibilno povećanje učestalosti rekombinacije između neidentičnih DNA slijedova s tim agensom. Tako su «drugi» nukleotidni slijedovi, koji su uneseni u organizam koji sadrži autologne nukleotidne slijedove, uneseni nakon obrade organizma agensom.

U drugom posebno poželjnom ostvarenju ovog izuma, organizam je obrađen agensom prije, istovremeno ili nakon unošenja «drugih» slijedova u organizam pomoću tog agensa. Također je moguće obraditi organizam agensom isključivo nakon unošenja «drugih» slijedova u organizam.

Poželjno je da vremenski period dovoljan za reverzibilno povećanje učestalosti rekombinacije bude manji od 5 sati, posebno od 0,5 do 5 sati, poželjno 1 do 4 sata, i posebno 1 sat.

U kontekstu ovog izuma, organizam je eukariot, na primjer, insekt, vodozemac, životinja, sisavac ili sisavac osim čovjeka, ili prokariotski organizam, pri čemu u slučaju kad je organizam prokariotski organizam, organizam je eubakterijski ili arhealni organizam. U posebno poželjnom ostvarenju eubakterijski organizam je Escherichia coli, Streptococcus pneumoniae ili Salmonella typhimurium.

U poželjnom ostvarenju ovog izuma, agens koji će se prema ovom izumu koristiti, je kemijska tvar ili fizikalna sila.

Prema ovom izumu, kemijska tvar koja je posebno poželjna je prirodni ili sintetizirani bazni analog nukleotidnih baza prirodnog porijekla, poput adenina, uridina, citozina, timidina ili gvanidina, na primjer, 2-aminopurin ili spojevi s istim karakteristikama kao 2-aminopurin, tj. da mogu saturirati sustav popravka krivo sparenih baza i/ili interagirati s enzimima i DNA ili nukleotidima. Prema ovom izumu, nukleotidni slijed, posebno oligonukleotid, na primjer oligonukleotid koji sadrži krivo sparene bazne parove, ili heterodupleks, ne smatraju se kemijskim agensima.

Tako se, prema poželjnom ostvarenju ovog izuma, aktivnost MRS može inhibirati u stanicama obrađenim kemijskim agensom, posebno 2-aminopurinom, baznim analogom adenina koji se krivo sparuje s citozinom. Prednost kemijske inhibicije je u tome što se ona može lako primijeniti na različite bakterijske vrste i eukariotske stanice, na primjer humane stanice ili stanice drugih sisavaca.

Prema posebno poželjnom ostvarenju ovog izuma, tretman stanica Escherichie coli 2-aminopurinom (2-AP) reverzibilno smanjuje učinkovitost sustava popravka krivo sparenih baza (MRS) titracijom i/ili inaktivacijom proteina MutL. Posljedica ove prolazne fenotipske deficijencije popravka krivo sparenih baza je značajno povećanje (104 puta) učestalosti rekombinacije između neidentičnih slijedova DNA. Ovaj postupak, u usporedbi sa svim u struci poznatim metodama inhibicije/zasićenja MRS, ima prednost u jednostavnosti, jer ne treba nikakve genetičke modifikacije korištenih stanica. Ovaj izum stoga osigurava metodu za reverzibilnu funkcionalnu inaktivaciju sustava popravka krivo sparenih baza.

Prema posebno poželjnom ostvarenju ovog izuma visoka koncentracija 2-AP uzrokuje mutatorski učinak, što upućuje na zasićenje MRS. U poželjnom ostvarenju ovog izuma korišteno je 500 µg/ml do 600 µg/ml 2-AP. U slijedećem ostvarenju korišteno je napose barem 50 µg/ml, napose barem 75µg/ml, barem 100 µg/ml, barem 200 µg/ml, barem 300 µg/ml, barem 400 µg/ml, barem 500 µg/ml ili barem 600 µg/ml 2-AP.

Ovaj izum gore navedeni problem također rješava i objavljivanjem postupka za mutagenezu organizma u širem pogledu, koji obuhvaća podvrgavanje organizma uvjetima koji dozvoljavaju homolognu rekombinaciju između divergentnih ili neidentičnih slijedova DNA, prisutnih u organizmu, podvrgavanje organizma agensu koji omogućava reverzibilno zasićenje ili inaktivaciju MRS organizma, u količini i vremenskom periodu dovoljnim za reverzibilno povećanje učestalosti rekombinacije između neidentičnih slijedova DNA u organizmu, kako je gore opisano, i u poželjnom ostvarenju, uklanjanje agensa iz organizma.

Tako se ovaj izum odnosi na postupak za mutagenezu organizma, koji obuhvaća unošenje djelomično homolognih slijedova DNA u organizam, podvrgavanje organizma uvjetima koji dozvoljavaju homolognu rekombinaciju između autolognih i unešenih slijedova, pri čemu je organizam podvrgnut agensu koji može inhibirati sustav popravka krivo sparenih baza u organizmu, u količini i vremenskom periodu dovoljnim za reverzibilno povećanje učestalosti rekombinacije između autolognih i unešenih slijedova DNA u organizmu i, poželjno, uklanjanje agensa iz organizma. Kako je gore objašnjeno, neidentični slijedovi DNA mogu biti geni, operoni, skupine gena, kromosomi, plazmidi ili genomi.

Gornji postupak također može biti korišten za povećanje učestalosti rekombinacije u organizmu, kako je gore pobliže označeno.

Tako se ovaj izum također odnosi na postupak za in vivo rekombinaciju, koja obuhvaća povezivanje slijeda DNA iz jedne vrste ili roda sa slijedom DNA iz druge vrste ili roda, u stanici, pri čemu «prvi» i «drugi» slijedovi DNA imaju slijedove koji su djelomično homologni, i imaju krivo sparene baze koje mogu aktivirati stanični enzimatski sustav popravka krivo sparenih baza, kad je navedeni sustav funkcionalan i gdje je enzimatski sustav popravka krivo sparenih baza reverzibilno inaktiviran prema postupku iz ovog izuma, kako bi se omogućila stabilna rekombinacija između «prvih» i «drugih» slijedova i pri tome, u poželjnom ostvarenju, dajući hibridne gene, hibridne genome, hibridne kromosome, hibridne operone, hibridne plazmide ili hibridne grupe gena. U poželjnom ostvarenju slijedovi DNA mogu biti dvolančani.

U poželjnom ostvarenju gore navedenog postupka rekombinacije, stanice organizma «prve» vrste ili «prvog» roda fuzionirane su sa stanicama organizma «druge» vrste ili «drugog» roda, kako bi se u stanici povezala DNA iz «prve» vrste ili roda s DNA iz «druge» vrste ili roda, i pri čemu je u stanicama organizma «druge» vrste ili «drugog» roda enzimatski sustav popravka krivo sparenih baza reverzibilno inaktiviran prema postupku iz ovog izuma.

U slijedećem poželjnom ostvarenju, jednostanični organizam «prve» vrste ili «prvog» roda križan je s jednostaničnim organizmom «druge» vrste ili «drugog» roda, kako bi se u stanici povezao slijed DNA iz «prve» vrste ili roda sa slijedom DNA iz «druge» vrste ili roda, i pri čemu je, u barem jednom od ovih organizama, enzimatski sustav popravka krivo sparenih baza reverzibilno inaktiviran prema postupku iz ovog izuma.

U slijedećem poželjnom ostvarenju recipijentna bakterija «prve» vrste ili roda konjugirana ili transducirana s donorskom bakterijom «druge» vrste ili roda kako bi se u stanici povezao slijed DNA iz «prve» vrste ili roda sa slijedom DNA iz «druge» vrste ili roda, pri čemu donorska bakterija ima barem jedan slijed DNA koji se treba prenijeti u recipijentnu bakterijui, i pri čemu je, u barem jednoj od donorskih i recipijentnih bakterija, enzimatski sustav popravka krivo sparenih baza reverzibilno inaktiviran prema postupku iz ovog izuma.

Za izum je poželjno slijedeće ostvarenje u kojem su dva slijeda DNA stavljena u jednostanični organizam kako bi se u stanici povezao slijed DNA iz «prve» vrste ili roda sa slijedom DNA iz «druge» vrste ili roda, pri čemu je u organizmu enzimatski sustav popravka krivo sparenih baza reverzibilno inaktiviran prema postupku iz ovog izuma, i pri čemu su dva slijeda DNA djelomično homologna i potječu iz dva različita organizma.

Naročito je poželjeno koristiti jedan od gore navedenih postupaka za rekombinaciju, pri čemu je hibridni gen i/ili njime kodirani protein dobiven odabirom hibridnog gena i/ili njime kodiranog proteina nakon ekspresije u organizmu.

U poželjnom ostvarenju gore navedenog postupka za rekombinaciju, svaki slijed DNA nalazi se na odvojenom plazmidu i pri tome je svaki plazmid unesen u organizam.

U posebno poželjnom ostvarenju ovog izuma, gore navedeni postupak za mutiranje organizma ili povećanje učestalosti rekombinacije podrazumijeva da uneseni slijed DNA potječe iz organizma različite vrste od vrste organizma transformirane s unesenim slijedom DNA. Stoga, prema ovom izumu uneseni nukleotidni slijedovi mogu potjecati iz različitih vrsta, ili također iz iste vrste, ili čak organizma, u odnosu na organizam u koji je nukleotidni slijed unesen.

U slijedećem poželjnom ostvarenju ovog izuma uneseni nukleotidni slijedovi su uneseni u organizam prirodnim seksom, transdukcijom, konjugacijskim križanjem, umjetnom staničnom fuzijom, kemijskim, fizikalnim, električnim ili biolističkim unosom nukleotidnih slijedova.

U slijedećem poželjnom ostvarenju ovog izuma homologna rekombinacija između autolognih i unesenih nukleotidnih slijedova uključuje zamjenu gena i adiciju gena.

U posebno poželjnom ostvarenju ovog izuma podvrgavanje organizma agnesu koji može inaktivirati ili saturirati MRS, događa se prije i/ili istovremeno i/ili nakon unošenja divergentnog slijeda, to jest «drugog» nukleotidnog slijeda u organizam.

Ovaj izum također donosi postupak za in vivo rekombinaciju homolognih slijedova DNA koji imaju krivo sparene baze, pri čemu su navedeni slijedovi povezani u stanicama ili organizmu čiji je enzimatski sustav krivo sparenih baza reverzibilno, to jest prolazno, inaktiviran prolaznom primjenom gore definiranog agensa, tijekom vremenskog perioda u kojem bi se postigla rekombinacija između navedenih slijedova DNA, na primjer tijekom manje od 5 sati, naročito tijekom 1 sata.

Tako se ovaj izum odnosi na postupak rekombinacije in vivo, to jest na postupak za dobivanje rekombiniranih organizama križanjem, ili bilo kojim drugim načinom povezivanja DNA iz različitih organizama, i in vivo rekombinacije organizama različitih vrsta i/ili rodova, pri čemu su križanje, ili neki drugi postupak, i in vivo rekombinacija, provedeni između organizma «prve» vrste i/ili «prvog» roda i organizma «druge» vrste i/ili «drugog» roda, pri čemu barem jedan od ova dva organizma sadržava MRS reverzibilno inaktiviran prema postupku iz ovog izuma.

U posebno poželjnom ostvarenju rekombinacija je rekombinacija između različitih vrsta, to jest međuvrsna rekombinacija, ili rekombinacija između organizama različitog roda, to jest međurodna rekombinacija.

Slijedovi DNA koji mogu sudjelovati u rekombinaciji mogu biti kromosomski ili nekromosomski, na primjer plazmidi, što u posebno poželjnom ostvarenju dozvoljava rekombinaciju između kloniranih pojedinačnih gena.

Pomoću gore definiranog postupka napose je moguće dobiti genetički proizvedene ili modificirane stanice, ili rekombinirane organizme, i to bakterije, kvasce, biljke ili životinje.

U posebno poželjnom ostvarenju, ovaj izum odnosi se na postupak dobivanja rekombinantnih bakterija križanjem, i rekombinaciju bakterija različitih vrsta i/ili rodova, pri čemu se konjugacija ili transdukcija izvode in vivo između recipijentne bakterije «prve» vrste i/ili «prvog» roda, čiji je enzimatski sustav popravka krivo sparenih baza revezibilno inaktiviran prema postupku iz ovog izuma, i donorske bakterije «druge» vrste i/ili «drugog» roda koja, u posebno poželjnom ostvarenju, posjeduje posebno obilježje ili svojstvo, koje je poželjno prenijeti u recipijentnu bakteriju. Moguće je također reverzibilno inaktivirati sustav popravka krivo sparenih baza donorske bakterije, prema ovom izumu koristeći gore definirani postupak i agens.

U poželjnom ostvarenju ovog izuma recipijentne bakterije također imaju nefunkcionalni sustav enzimatskog cijepanja DNA.

U posebno poželjnom ostvarenju gore navednog postupka, oba soja su križana u prisustvu agensa koji reverzibilno inaktivira sustav popravka krivo sparenih baza, nakon čega je agens uklonjen.

U posebno poželjnom ostvarenju ovog izuma, križani su soj E. coli i soj Salmonelle typhimurium, od čega je kod barem jednog, a poželjno i kod oba soja, inaktiviran enzimatski MRS. U još poželjnijem ostvarenju, donorska bakterija tipa Hfr konjugirana je s recipijentnom bakterijom tipa F-.

Gore naveden postupak ovog izuma za dobivanje rekombinantnih organizama ili stanica, posebno bakterija, pogodan je jer stvara nove bakterijske sojeve s korisnim svojstvima, na primjer, netoksičnosti i mogućnosti upotrebe u proizvodnji cjepiva.

Ovaj izum također se odnosi na postupak za in vivo dobivanje hibridnih gena i njima kodiranih proteina iz dva djelomično homologna gena, pri čemu su rekombinantne stanice pripremljene iz stanica «prvog» organizma koji sadrži «prvi» gen, i stanica «drugog» organizma, koji sadrži «drugi», djelomično homologni gen, i gdje se postupak mutageneze prema ovom izumu, izvodi u rekombinantnoj stanici iz koje je izabran željeni hibridni gen ili njime kodirani protein. Ovaj postupak predviđa da su u organizmu u kojem je MRS inaktiviran prema postupku iz ovog izuma, dva slijeda DNA koja obuhvaćaju djelomično homologne gene koji potječu iz dva različita organizma, međusobno spojena, te je nakon rekombinacije in vivo, izabran željeni hibridni gen i, ako je to poželjno, njime kodirani protein nakon proteinske sinteze in vivo. Prema poželjnom ostvarenju ovog izuma, barem dva plazmida, koja sadrže barem dva djelomično homologna gena koja kodiraju za istu funkciju, ali imaju različite slijedove, unesena su u stanicu s MRS reverzibilno inaktiviranim prema postupku iz ovog izuma i, nakon rekombinacije u skladu s ovim izumom, odabran je hibridni gen i, u poželjnom ostvarenju, nakon ekspresije pod uobičajenim uvjetima, hibridni protein, koji je po mogućnosti i izoliran. Plazmidi mogu biti uneseni u organizam uobičajenim metodama transformacije.

Ovaj izum također se odnosi na postupak ciljane povratne mutageneze gena u organizmu, pri čemu gen obuhvaća mutiranu bazu za koju je poželjno da povrati prvobitni oblik prije mutacije, i gdje je sustav popravka krivo sparenih baza reverzibilno inaktiviran u organizmu prema postupku iz ovog izuma, i gdje je unesen oligonukleotid, koji se sastoji od slijeda DNA za kojeg je poželjno povratiti prvobitni oblik prije mutacije, a ponovno uspostavljeni mutant odabran između transformanata.

Naravno, ovaj izum također se odnosi na produkte dobivene prema postupcima iz ovog izuma, to jest dobivene rekombinantne i/ili mutirane organizme, stanice, genske produkte, proteine, gene, nakupine gena, operone, plazmide, kromosome i genome.

Slijedeća poželjna ostvarenja ovog izuma predmet su podzahtjeva.

Izum će sad biti objašnjen putem primjera i pripadajućih slika.

Slike prikazuju:

Slika 1: Utjecaj 2-aminopurina (2-AP) na učinkovitost međuvrsne konjugacijske rekombinacije između E. coli Hfr i E. coli F ̄, te između S. typhimurium Hfr i E. coli F ̄. Recipijentni sojevi E. coli bili su ili mutS+ (A, C) ili mutS ̄ (B, D). Učestalosti rekombinacije za odabrani marker (Thr+) izražene su po Hfr-donorima, nakon oduzimanja nesparenih revertanata. Svaki broj predstavlja srednju vrijednost (+/- standardna pogreška) iz barem tri neovisna pokusa.

Slika 2: Identifikacija komponente sustava krivo sparenih baza, koja je zasićena ili inhibirana obradom 2-aminopurinom (2-AP). Recipijentni sojevi E. coli bili su ili mutS ̄ (A, B) ili mutL ̄ (C, D). Nedostatak sustava krivo sparenih baza komplementiran je plazmidima koji sadrže gene mutS+ (A, B) ili mutL+ (C, D). Korištena doza 2-AP u ovim pokusima uvijek je bila 300 mg/ml. Učestalosti rekombinacije za odabrani marker (Thr+) izražene su po Hfr-donorima, nakon oduzimanja nesparenih revertanata. Svaki broj predstavlja srednju vrijednost (+/- standardna pogreška) iz barem tri neovisna pokusa.

Primjer:

Bakterijski sojevi, plazmidi i uvjeti kulture

[image]

Mediji:

Svi sojevi uzgajani su pri 37 °C.

LB bogati medij: Bakto tripton (DIFCO) 10 g; Bakto kvaščev ekstrakt (DIFCO) 5 g; NaCl 10 g; deionizirana H2O 1 l. Podesi pH na 7,0 s 1 M NaOH.

M63 minimalni medij: KH2PO4 13,6 g; (NH4)2SO4 2 g; FeSO4x7H2O 0,5 mg; deionizirana H2O 1 l. Podesi pH na 7,0 s KOH. Nakon autoklaviranja, dodan je 1 ml 1 M MgSO4x7H2O i 10 ml 20%-tne otopine izvora ugljika. Kad je to potrebno, dodani su vitamini, aminokiseline i antibiotici.

Kad su mediji korišteni u pločama, dodano je 15 g agara (DIFCO) po litri. Svi mediji su sterilizirani autoklaviranjem na 120°C tijekom 30 minuta. Antibiotici su uvijek dodavani prije autoklaviranja. Konačne koncentracije antibiotika iznosile su kako slijedi: nalidiksična kiselina (Sigma), 40 µg/ml; spektinomicin (Sigma), 100 µg/ml; streptomicin (Sigma), 75 µg/ml; kanamicin (Sigma), 50 µg/ml; tetraciklin (Sigma), 12,5 µg/ml i kloramfenikol (Sigma), 30 µg/ml.

Manipulacija DNA i mikroorganizama

Elektrotransformacija:

Plazmidi s genima mutS+ odnosno mutL+ uneseni su elektrotransformacijom (koristeći BIO RAD mikropulsirajući aparat) u sojeve MX4 odnosno MX5.

Transdukcija:

Svi recipijentni sojevi bili su derivati soja E. coli K12 F ̄ AB1157, koji su konstruirani pomoću transdukcije posredovane s P1 (Miller, 1972).

Konjugacijska križanja:

Konjugacijski pokusi izvedeni su pod prethodno opisanim uvjetima (Rayssiguier et al., 1989). Prekonoćne kulture donorskih sojeva (2-4 x 109 stanica/ml), koje su sadržavale slijed DNA koji se trebao unijeti u recipijentne sojeve, koji su pak sadržavali autologne slijedove DNA, razrijeđene su 50 puta sa svježim LB medijem, sa ili bez 2-aminopurina (Sigma), i uzgajane uz blago miješanje (oko 150 okretaja/min) kako bi se dobilo 2-4 x 108 stanica/ml. Da bi se dobila potrebna koncentracija stanica, nužna su 3 sata inkubacije. Kad su stanice obrađene s 2-AP, rast je bio nešto slabiji (inkubacija je bila 30 minuta dulja) u usporedbi s rastom bez 2-AP. Poželjno je da su donorski i recipijentni sojevi obrađeni s 2-AP prije parenja, budući da se 2-AP, da bi saturirao sustav popravka krivo sparenih baza, mora ugraditi u DNA tijekom replikacije. Ispitane doze 2-AP bile su: 25 µg/ml, 50 µg/ml, 75 µg/ml, 100 µg/ml, 300 µg/ml i 600 µg/ml. Učinak obrade s 2-AP bio je značajan već kod 50 µg/ml 2-AP. Maksimalni učinak uočen je sa 100 µg/ml 2-AP, dok daljnje povećanje koncentracije 2-AP nije povećalo učinkovitost rekombinacije. Smjese za parenje pripremljene su miješanjem bakterija Hfr i F ̄ u omjeru 1:1. Ova smjesa filtrirana je kroz sterilne nitrocelulozne filtere veličine pora 0,45 µm (promjera 2,5 cm), koristeći opremu za filtriranje putem vakuuma (MILLIPORE). Filtri sa smjesama za parenje, tj. smjesama sa stanicama koje su sadržavale autologne i unesene nukleotidne slijedove, inkubirani su na svježe pripremljenim pločama s LB agarom (sa ili bez 2-aminopurina), prethodno ugrijanih na 37°C. Nakon 60 min, konjugacijski parovi su resuspendirani u 10-2 M MgSO4 te odvojeni snažnim miješanjem, i time razrijeđivanjem 2-AP do neaktivne razine. Potom su smjese za parenje nasađene na medij koji pozitivno selekcionira poželjne rekombinante (fenotip Thr+) i negativno selekcionira i donorske (fenotip Nals) i recipijentne (fenotip Thr ̄) roditeljske sojeve koji ne sadržavaju 2-AP. U ovu svrhu, korišten je medij M9 [obogaćen argininom, histidinom, leucinom, prolinom i triptofanom (svaki 100 µg/ml), tiaminom (30 µg/ml), glukozom (0,4 %) i nalidiksičnom kiselinom (40 µg/ml) kako bi se negativno selekcionirale donorske stanice Hfr]. Treonin nije dodan u medij kako bi se mogle selekcionirati rekombinante Thr+. Rekombinante su izbrojane nakon 48 sati inkubacije na 37°C.

Rezultati:

Učinak obrade s 2-AP na rekombinaciju prikazan je u toku ovog izuma koristeći dobro ispitani sustav konjugacijske rekombinacije između S. typhimurium i E. coli (Stambuk i Radman, 1998; Rayssiguier et al., 1989; Matic et al., 1995; Denamur et al., 2000). Rekombinacija između ove dvije bakterijske vrste, koje imaju otprilike 16% divergencije u svojim genomskim slijedovima, jako je niska (10-8-10-7; Sl. 1A) u odnosu na unutarvrsnu rekombinaciju (oko 10-1; Sl. 1C). Inaktivacija gena mutS ili mutL u recipijentnim stanicama, prema postupku iz ovog izuma koristeći 2-AP, oko 103-104 puta povećava učestalost međuvrsne rekombinacije (Sl. 1B, Sl. 2A i 2B).

Visoka učestalost rekombinacije opažena u pokusima unutarvrsne konjugacije na korištenom sustavu E. coli, nije se značajno povećala nakon obrade s 2-AP, niti u mutS+ (divlji tip) niti u mutS ̄ pozadini. Slika 1B prikazuje da učinak 2-AP nije toliko izražen u mutS ̄ recipijentnom tipu, kao u divljem tipu (Slika 1A), budući da stanice mutS ̄ već pokazuju visoku učestalost rekombinacije uslijed genetički inaktiviranog MRS (mutS ̄).

Tako, kad su primateljske stanice divljeg tipa obrađene sa 75, 100, 300 ili 600 µg/ml 2-AP (povećanje učestalosti rekombinacije uočeno je kod 50 do 600 µg/ml 2-AP, a posebice kod i iznad 75 µg/ml), učestalost međuvrsne rekombinacije povećana je 104 puta, dok nije promijenjena učestalost unutarvrsne rekombinacije (Sl. 1). Unosom plazmida koji nose gene mutS ili mutL, protein MutL identificiran je kao sastavni dio MRS koji se titrira ili inaktivira uslijed obrade 2-AP (Sl. 2B).

Stoga se može zaključiti da obrada stanica E. coli s 2-AP rezultira prolaznim povećanjem učestalosti rekombinacije između divergentnih slijedova DNA, i to naročito homologne rekombinacije, uslijed saturacije ili inhibicije genetički intaktnog sustava popravka krivo sparenih baza.

Ovaj izum poučava nas kako srušiti genetičke barijere, naročito na reverzibilni način kod bakterija divljeg tipa. Rušenje genetičkih barijera dopušta učinkovitu međuvrsnu rekombinaciju gena, operona ili genoma, što rezultira novom širokom biološkom raznolikošću, koja može biti koristan izvor biotehnoloških inovacija. Mehanizam prolaznog povećanja međuvrsne rekombinacije do 10 000 puta, prikazan je u gornjem primjeru: korištena kemijska tvar, 2-aminopurin, proizvodi reverzibilni fenotip, kojem nedostaje sustav popravka krivo sparenih baza u DNA, dokidanjem funkcije proteina MutL iz navedenog sustava popravka DNA. Velika prednost ove metode, u odnosu na korištenje mutanata s nedostatkom sustava popravka krivo sparenih baza, je u tome što se genetički nestabilno stanje može strogo ograničiti na vrijeme trajanja međuvrsnog križanja: izostanak 2-aminopurina vraća genetičku stabilnost. K tome, ova metoda također omogućava aktivaciju međuvrsne rekombinacije u organizmima u kojima su geni koji sudjeluju u popravku krivo sparenih baza nepoznati ili se ne mogu genetički mijenjati.

Literaturni navodi:

Abdulkarim, F. i Hughes, D. (1996). Homologous recombination between the tuf genes of Salmonella typhimurium, J Mol Biol 260, 506-522.

Bechmann, B. J. (1972). Pedigrees of some mutant strains of Echerichia coli K-12, Bacteriol Rev 36, 525-557.

Cupples, C. i Miller, J. H. (1989). A set of lacZ mutantions in Escherichia coli allows rapid dectection of each of the six base substitutions., Proc Natl Acad Sci USA 86, 5345-5349.

Cupples, C. G., Cabrera, M., Cruz, C. i Miller, J. H. (1990). A set of lacZ mutations in Escherichia coli that allow rapid detection of specific frameshift mutations, genetics 125, 275-280.

Denamur, E., Lecointre, G., Darlu, P., Tenaillon, O., Acquaviva, C., Sayada, C., Sunjevaric, I., Rothstein, R., Elion, J., Taddei, F., Radman, M. i Matic, I. (2000). Evolutionari implications of the frequent horizontal transfer of mismatch repair genes, Cell 103, 711-721.

Friedberg, E. C., Walker, G. C. i Siede, W. (1995). DNA repair and mutagenesis (Wasington, D. C., ASM Press).

Kahn, P. L. (1968). Isolation of high frequency recombining strains from Escherichia coli containing the V colicinogenic factor, J Bacteriol 96, 205-214.

Maas, W. K., Wang, C., Lima, T., Hach, A. i Lim, D. (1996). Multicopi single-stranded DNA of Escherichia coli enhences mutation and recombination frequencies by titrating MutS protein., Mol Microbiol 19, 505-509.

Matic, I., Rayssiguier, C. i Radman, M. (1995). Interspecies gene exchange in bacteria: The role of SOS and mismatch repair systems in evolution of species, Cell 80, 507-515.

Matic, I., Taddei, F. i Radman, M. (1996). Genetic barriers among bacteria, Trends Microbiol 4, 69-73.

Miller, J. H. (1972). Experiments in molecular genetics (Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor Laboratory).

Pang, P.P., Lundberg, A. S. i Walker, G. C. (1985). Identification and characterization of the mutL and mutS gene products of Salmonella typhimurium LT2, J Bacteriol 163, 1007-1015.

Petit, M. A., Dimpfl, J., Radman, M. i Echols, H. (1991). Control of chromosomal rearrangments in E. coli by the mismatch repair system, Genetics 129, 327-332.

Prudhomme, M., Méjean, V., Martin, B. i Claverys, J.-P. (1991). Mismatch repair genes of Streptococcus pneumoniae: HexA confers a mutator phenotipe in Escherichia coli by negative complementation, J Bacteriol 173, 7196-7203.

Radman, M. i Wagner, R. (1993). Mismatch recognition in chromosomal interactions and speciation, Chromosoma 102, 369-373.

Rayssiguier, C., Thaler, D. S. i Radman, M. (1989). The barrier to recombination between Escherichia coli and Salmonella typhimurium is disrupted in mismatch-repair mutants, Narure 342, 396-401.

Sanderson, K. E., Ross, H., Zeiger, L. i Mäkelä, P. H. (1972). F+, Hfr, and F' strains of Salmonella typhimurium and Salmonella abony, Bact Rev 36, 602-637.

Schaaper, R. M. i Radman, M. (1989). The extreme mutator effect Escherichia coli mutD5 results from saturation of mismatch repair by excessive DNA replication errors, EMBO J 8, 3511-3516.

Shen, P. i Huang, H. (1989). Effect of base pair mismatches on recombination via the RecBCD pathway, Mol Gen Genet 218, 358-360.

Stambuk, S. i Radman, M. (1998). Mechanism and control of interspecies recombination in Escherichia coli. I. Mismatch repair, methilation, recombination and replication functions, Genetics 150, 533-542.

Vulic, M., Dionisio, F., Taddei, F. i Radman, M. (1997). Molecular Keys to Speciation: DNA Polymorphism and the Control of Genetic Exchange in Enterobacteria, Proc Natl Acad Sci USA 94, 9763-9767.

Worth Jr., L., Clark, S., Radman, M. i Modrich, P. (1994). Mismatch repair proteins MutS and MutL inhibit RecA-catalyzed strand transfer between diverged DNAs, Proc Natl Acad Sci USA 91, 3238-3241.

Wu, T. -H. i Marinus, M. G. (1994). Dominant negative mutations in the mutS gene of Escherichia coli, J Bacteriol 176, 5393-5400.

Zahrt, T. C., Mora, G. C. i Maloli, S. (1994. Inactivation of mismatch repair overcomes the barrier to transduction between Salmonella typhimurium and Salmonella Typhi, J Bacteriol 176, 1527-1529.

Claims

1. Postupak za povećanje učestalosti rekombinacije u organizmu in vivo, naznačen time, da obuhvaća povezivanje slijeda DNA iz «prve» vrste ili roda sa slijedom DNA iz «druge» vrste ili roda, u stanici, pri čemu «prvi» i «drugi» slijedovi DNA imaju slijedove koji su djelomično homologni i imaju krivo sparene baze, koje mogu aktivirati stanični enzimatski sustav popravka krivo sparenih baza, kad je taj sustav funkcionalan i kad je enzimatski sustav krivo sparenih baza (MRS) bio? reverzibilno inaktiviran postupkom koji uključuje podvrgavanje organizma baznom analogu nukleotidne baze prirodnog porijekla, koji može barem djelomično inhibirati MRS organizma u obimu i vremenskom periodu dovoljnim za revrzibilno povećanje učestalosti rekombinacije između neidentičnih slijedova DNA prisutnih u organizmu, i uklanjanje baznog analoga nukleotida prirodnog porijekla iz organizma.

2. Postupak prema zahtjevu 1, naznačen time, da je organizam eukariotski ili prokariotski organizam.

3. Postupak prema zahtjevu 1 ili 2, naznačen time, da je prokariotski organizam eubakterijski ili arhealni organizam.

4. Organizam prema zahtjevima 1 do 3, naznačen time, da je eubakterijski organizam Escherichia coli.

5. Postupak prema bilo kojem od zahtjeva 1 do 4, naznačen time, da su neidentični slijedovi DNA geni, operoni, nakupine gena, kromosomi, plazmidi ili genomi.

6. Postupak prema bilo kojem od zahtjeva 1 do 5, naznačen time, da su slijedovi DNA prirodnog porijekla, ili su to artificijalno konstruirani slijedovi DNA.

7. Postupak prema bilo kojem od zahtjeva 1 do 6, naznačen time, da je bazni analog 2-aminopurin.

8. Postupak prema bilo kojem od zahtjeva 1 do 7, naznačen time, da vremenski period dovoljan za reverzibilno povećanje učestalosti rekombinacije iznosi manje od 5 sati, poželjno 1 sat.

9. Postupak prema bilo kojem od zahtjeva 1 do 8, naznačen time, da količina baznog analoga dovoljna za reverzibilno povećanje učestalosti rekombinacije iznosi 50 µg/ml do 600 µg/ml.

10. Postupak za mutagenezu organizma, naznačen time, da obuhvaća unos djelomično homolognih slijedova DNA, s udjelom krivo sparenih baza do 30%, u organizam, podvrgavanje organizma uvjetima koji dopuštaju homolognu rekombinaciju između njegovih autolognih i unesenih slijedova DNA, tijekom čega je organizam podvrgnut baznom analogu nukleotidne baze prirodnog porijekla, sposobne inhibirati sustav popravka krivo sparenih baza organizma u količini i vremenskom periodu dovoljnim za revrzibilno povećanje učestalosti rekombinacije između autolognih i unesenih slijedova DNA u organizam, i uklanjanje baznog analoga iz organizma.

11. Postupak prema zahtjevu 10, naznačen time, da su uneseni slijedovi DNA uneseni u organizam prirodnim seksom, transdukcijom, konjugacijskim križanjem, umjetnom staničnom fuzijom, te kemijskim, fizikalnim, električnim ili biolističkim unosom slijedova DNA.

12. Postupak prema zahtjevu 10 ili 11, naznačen time, da homologna rekombinacija između autolognih i unesenih slijedova DNA uključuje zamjenu gena i adiciju gena.

13. Postupak prema bilo kojem od zahtjeva 10 do 12, naznačen time, da uneseni slijedovi DNA potječu iz organizma različite vrste od vrste organizma transformiranog s unesenim slijedom DNA.

14. Postupak prema bilo kojem od zahtjeva 10 do 13, naznačen time, da je organizam eukariotski ili prokariotski organizam.

15. Postupak prema bilo kojem od zahtjeva 10 do 14, naznačen time, da je prokariotski organizam eubakterijski ili arhealni organizam.

16. Postupak prema bilo kojem od zahtjeva 10 do 15, naznačen time, da je eubakterijski organizam Escherichia coli.

17. Postupak prema bilo kojem od zahtjeva 10 do 16, naznačen time, da su neidentični slijedovi DNA geni, operoni, nakupine gena, kromosomi, plazmidi ili genomi.

18. Postupak prema bilo kojem od zahtjeva 10 do 17, naznačen time, da je bazni analog 2-aminopurin.

19. Postupak prema bilo kojem od zahtjeva 1 do 9, naznačen time, da su slijedovi DNA dvolančani.

20. Postupak prema bilo kojem od zahtjeva 1 do 9 ili 19, naznačen time, da je rekombinacija međurodna i/ili međuvrsna rekombinacija.

21. Postupak prema bilo kojem od zahtjeva 1 do 9, ili 19 ili 20, naznačen time, da su stanice organizma «prve» vrste ili «prvog» roda fuzionirane sa stanicama organizma «druge» vrste ili «drugog» roda, kako bi se u stanici povezala DNA iz «prve» vrste ili roda s DNA iz «druge» vrste ili roda, i gdje stanice organizma «druge» vrste ili «drugog» roda imaju reverzibilno inaktiviran enzimatski sustav popravka krivo sparenih baza.

22. Postupak prema bilo kojem od zahtjeva 1 do 9, 19 ili 20, naznačen time, da je jednostanični organizam «prve» vrste ili «prvog» roda križan s jednostaničnim organizmom «druge» vrste ili «drugog» roda, kako bi se u stanici povezao slijed DNA iz «prve» vrste ili roda sa slijedom DNA iz «druge» vrste ili roda, i gdje je enzimatski sustav popravka krivo sparenih baza reverzibilno inaktiviran u barem jednom od ovih organizama.

23. Postupak prema bilo kojem od zahtjeva 1 do 9, 19 ili 20, naznačen time, da je recipijentna bakterija «prve» vrste ili roda konjugirana ili transducirana s donorskom bakterijom «druge» vrste ili roda, kako bi se u stanici povezao slijed DNA iz «prve» vrste ili roda sa slijedom DNA iz «druge» vrste ili roda, i gdje donorska bakterija ima barem jedan slijed DNA koji se treba prenijeti u recipijentnu bakteriju, i gdje je enzimatski sustav popravka krivo sparenih baza reverzibilno inaktiviran u barem jednoj od donorskih i recipijentnih bakterija.

24. Postupak prema bilo kojem od zahtjeva 1 do 9, 19 ili 20, naznačen time, da su dva slijeda DNA «stavljena» u jednostanični organizam, kako bi se u stanici povezao slijed DNA iz «prve» vrste ili roda sa slijedom DNA iz «druge» vrste ili roda, i gdje je enzimatski sustav popravka krivo sparenih baza reverzibilno inaktiviran u organizmu, i gdje su dva slijeda DNA djelomično homologna i potječu iz dva različita organizma.

25. Postupak prema bilo kojem od zahtjeva 1 do 9, ili 19 do 24, naznačen time, da su hibridni gen i/ili njime kodirani protein dobiveni odabirom hibridnog gena i/ili njime kodiranog proteina nakon ekspresije u organizmu.

26. Postupak prema bilo kojem od zahtjeva 1 do 9, ili 19 do 24, naznačen time, da je svaki slijed DNA na odvojenom plazmidu i da je svaki plazmid unesen u organizam.

27. Postupak za dobivanje hibridnog gena i/ili njime kodiranog proteina, naznačen time, da je proveden postupak prema bilo kojem od zahtjeva 1 do 9, ili 19 do 26, i da je hibridni gen i/ili njime kodirani protein dobiven odabirom hibridnog gena i/ili njime kodiranog proteina nakon ekspresije u organizmu.