JP4488742B2

JP4488742B2 - ミスマッチ修復系の機能を可逆的に不活性化する方法

Info

Publication number: JP4488742B2
Application number: JP2003564258A
Authority: JP
Inventors: マティック，イワン; ラドマン，ミロスラフ
Original assignee: ミクシスフランスソシエテアノニム
Priority date: 2002-01-31
Filing date: 2002-12-19
Publication date: 2010-06-23
Anticipated expiration: 2022-12-19
Also published as: ES2259685T3; HRP20040682A2; JP2005538687A; US20050176149A1; DE60209580T2; WO2003064667A1; PT1333095E; DK1333095T3; WO2003064667A8; SI1333095T1; ATE319845T1; EP1333095A1; US7883894B2; DE60209580D1; EP1333095B1

Description

説明
本発明は、生物においてミスマッチ修復系の機能を可逆的に不活性化する方法およびその種々の用途に関する。特に本発明は、非同一ヌクレオチド配列間のin vivo組換えの方法に関する。また本発明は、異なる生物、種または属間のin vivo組換えにより作製される雑種生物を作製する方法に関する。さらに本発明は、雑種遺伝子およびそれによりコードされるタンパク質をin vivoで作製する方法に関する。

進化とは、突然変異および組換えにより生じた最適変異体の選択である。ランダム突然変異では新たな対立遺伝子が生じるが、遺伝子組換えでは既存の対立遺伝子からなる新たな組み合わせが生じる。遺伝子組換えが有するこの特性により、複数の適応変異同士が関連付けられるだけでなく、より頻繁に生じる有害な変異からのそれら適応変異の分離が可能となるため、突然変異誘発の有効性が改善される。遺伝子組換えの効率は、２つの組換える分子間で共有されたDNA配列の同一性、および組換えとその編集に関与する細胞酵素系に依存する(Radman and Wagner, 1993; Matic et al., 1996)。十分に間隔のあいた点突然変異において異なっている（配列多型）DNA間の組換えは、減少するかまたは阻害される。異なる細菌株間および種間の交雑では、ゲノム配列の分岐が大きくなるにつれて、その組換え頻度が指数関数的に低下することが示されている(Vulic et al., 1997)。非同一DNA配列同士の対合により、ミスマッチを含むヘテロ２本鎖分子が生成する。ミスマッチ塩基対は、非同一DNA配列間の組換えのインヒビターとして働くミスマッチ修復系（MRS）の成分により認識される (Rayssiguier et al., 1989; Shen and Huang, 1989; Worth Jr. et al., 1994; Zahrt et al., 1994; Matic et al., 1995)。

MRSのこの機能は、染色体の構造の完全性の維持および異なる細菌種間の遺伝的分離において重要な役割を果たしている。例えば、MRS遺伝子を不活性化すると、大腸菌（E.coli）のrhsAおよびrhsB遺伝子座（わずか0.9％の分岐）間の組換えで生じる染色体重複の頻度は10〜15倍高くなり(Petit et al., 1991)、またS.エンテリカ(S. enterica)（血清型名 Typhimurium）のtufAおよびtufB遺伝子（約１％の分岐）間の遺伝子変換は約10³倍高くなる(Abdulkarim and Hughes, 1996)。またMRSは、分岐した株間および種間における接合的および形質導入的組換えも制御している(Rayssiguier et al., 1989; Zahrt et al., 1994; Matic et al., 1995; Vulic et al., 1997)。わずかな分岐であっても、組換えを妨げるには十分である。例えば、互いのゲノムがDNA配列レベルでほんの1〜2％しか違わないS.エンテリカ(S. enterica)の２種の血清型（TyphimuriumおよびTyphi）の間の形質導入的組換えにより、MRS欠損型の遺伝的バックグラウンドが10²〜10³倍増大する (Zahrt et al., 1994)。

大腸菌（E.coli）のMRSは、特に3種の遺伝子、すなわちmutS、mutLおよびmutHを要することが証明されている(Friedberg et al., 1995)。異なるMRS遺伝子の不活性化は、種間組換えに相異なる特徴的な影響を及ぼす(Rays-siguier et al., 1989; Stambuk and Radman, 1998; De-namur et al., 2000)。mutSおよびmutL遺伝子の不活性化の際には、例えばUS 5,956,415やUS 5,912,119に記載されているような、最も強力な過剰組換え（hyperrecombination）作用が観察される。一方、MutSおよびMutLタンパク質が過剰に産生されると、ゲノム分岐が非常に小さい細菌株間でさえ、その組換え頻度が大幅に低下する(Vulic et al., 1997)。従って、MRSの活性を修飾することで、異なる細菌種間の遺伝的障壁を破壊または確立することができる。

組換えにより遺伝的多様性を作り出す場合、MRSが高機能のバックグラウンド(MRS proficient background)における組換えに伴う主な問題点の１つは、DNA配列の分岐のために、その組換え事象が最も高い配列類似性を有するゲノム領域に限定されてしまうということである。その結果、大部分の組換え体は、リボソームRNA(rrn)オペロン（通常、近縁な細菌種間ではほぼ同一である）間の不等交差により生成することが多い、非常に不安定な部分ニ倍体となる。MRSを不活性化することで、種間組換え体の生成率を上げるだけでなく、雑種の多様性および安定性を高めることができる。種間モザイクゲノムを作製することのできるこの方法の潜在的用途は、基礎研究、バイオテクノロジー、遺伝子工学および医学において多様に存在する。ゲノム全体の組換えを可能にすることにより、遺伝子とオペロンとの新たな組み合わせ（モザイク遺伝子とオペロンでも可）を有するモザイクゲノムを取得することができる。

しかし、新規な細菌株または種を組換えに使用する場合は、その都度mutSまたはmutL遺伝子をノックアウトしなければならない。それらの遺伝子が同定されていない場合および／または所与の種に対する遺伝子ノックアウト用の遺伝的ツールが開発されていない場合、これは非常に難しいだろう。その上、MRS遺伝子の不活性化により突然変異率が10²〜10³倍上昇するものの、これは一旦所望の構築物を取得した後は却って都合が悪くなる。別の手段としては、他の幾つかのアプローチを利用したMRSの阻害／飽和が考えられる。例えば、(i)複製DNAポリメラーゼ（PolIII）のプルーフリーディング活性をコードするdnaQ遺伝子欠損型を担持する大腸菌（E.coli）株において、過剰なDNA複製エラーによりMRSを飽和させることができる(Schaaper and Radman, 1989)。また、（ii）レトロンがコードする多コピー1本鎖DNA内にミスマッチを含有する細胞においてミスマッチ修復タンパク質を滴定すると、MRSの効率が低下することが証明されている(Maas et al., 1996)。US 5,965,415および US 5,912,119には属間および種間組換えのための方法が記載されており、この場合のMRSは、MRS遺伝子の突然変異とその後の修正変異を利用した該MRSの修復により、または多数のミスマッチを含むヌクレオチド配列の導入を利用したMRSの飽和により、一時的に不活性化される。しかし、後者の場合にはMRSの酵素成分は破壊されると思われ、MRS機能を再活性化する際には修復酵素を再合成する必要がある。また、（iii）非近縁細菌種からMRSタンパク質を過剰発現させると大腸菌（E.coli）のMRSを阻害することができ、その結果として突然変異誘発率が上昇する(Prudhomme et al., 1991)。しかし、前記のMRS阻害／飽和方法はいずれもMRS遺伝子の不活性化を必要としないものの、必要な組換え体を取得した後で細胞をさらに修飾して変異および組換え率を低下させる必要がある。

従って、本発明の基礎を成す技術的課題は、生物のMRS活性を不活性化するかまたは少なくとも大幅に低下させて、該生物において部分的に相同な（すなわち非同一の、もしくは分岐した）ヌクレオチド配列間の組換え率を高め、それにより、処理された細胞の追加的改変を回避してその後の変異および組換え率を低下させるための、簡便な方法を提供することである。

本発明は、生物においてミスマッチ修復系（MRS）の機能を可逆的に、すなわち一時的に不活性化する方法であって、生物を、該生物のミスマッチ修復系を部分的または完全に阻害しうる作用因子に、該生物中に存在する非同一ヌクレオチド配列（特にDNA配列）間の組換え率を可逆的に高めるのに十分な量と期間にて曝露することを含んでなり、さらに好適な実施形態では続いて該生物から該作用因子を取り除くことを含んでなる上記方法を提供することにより、前記技術的課題を解決する。

従って、本発明はMRSを可逆的に不活性化する手段を提供し、これはひいては非同一ヌクレオチド配列間の組換え率を高めるといった多くの有用な用途を可能にする。それ故、本発明はさらに、生物における組換え率を高める方法、および生物において突然変異を誘発することにより本明細書中に記載するようにMRSを可逆的に不活性化する方法、を提供する。

本発明の１態様では、本発明の方法は、生物のMRSを可逆的に不活性化することにより、該生物中に存在する非同一DNA配列間の組換え率を可逆的に高め、処理した細胞をその後操作する必要を無くし、さらにMRSを遺伝的かつ定常的に無傷なまま維持することができるという利点を提供する。

本発明に関しては、生物中に存在する非同一または分岐ヌクレオチド（特にDNA配列、特に好ましくは２本鎖DNA配列）が、第１の配列、すなわち該生物中に存在する自己ヌクレオチド（特にDNA配列）を、好ましくは第２の配列の取り込みに先立って含んでおり、そして第２の配列は、例えば自然な性交、接合、形質導入、人為的な細胞融合または当分野で公知の他の任意の手段（化学的、電気的、遺伝子銃もしくは物理的処理など）によって該生物内に導入される。無論、第１と第２の配列の両方を、同時に前記生物内に導入してもよい。この導入する第２の配列は同一ではない。つまり、第２の配列と完全には同一ではないかまたは相同ではない。特に、これらの部分的に相同な配列は、かなりの割合のミスマッチ塩基（例えば最大30％）を有する。これらの部分的に相同な配列は、MRSが機能的でかつ不活性化、阻害されていないかまたは飽和していない場合に該MRSを活性化することができる。導入された配列は、ミスマッチ修復系が可逆的に不活性化されているため、生物中に存在する自己DNA配列と組換わることができる。一旦組換えが生じたら、本発明に従って使用した作用因子を取り除くことによりミスマッチ修復系の本来の機能を回復させることができる。MRSの一時的な阻害または飽和により得られる利点の１つは、組換え後、得られる雑種細胞が、MRS遺伝子の永久不活性化に起因する恒常的な高変異率を示さないことである。

本発明の特に好適な実施形態では、非同一DNA配列は遺伝子、オペロン、遺伝子クラスター、染色体、プラスミドおよび／またはゲノムの形態で存在する。これらのDNA配列は、天然のDNA配列であっても、人為的に操作されたDNA配列であってもよい。

本発明により、通常であればミスマッチ修復系により阻害される非同一DNA配列間の組換えの効率をかなり高めることができる。都合の良いことに、本発明を使用することにより、個々の遺伝子またはオペロンのレベル、さらには全ゲノムのレベルで新たな生物多様性を容易に創出することができる。本発明の方法によって非同一DNA配列間の組換え効率を高めるためにMRSを化学的に阻害することは、これまで一度も用いられたことが無い。

本発明の１実施形態では、自己ヌクレオチド配列を含む生物を、該生物のミスマッチ修復系を阻害しうる作用因子に、該作用因子を用いて非同一DNA配列間の組換え率を可逆的に高めるのに十分な量と期間にて曝露してもよい。そして、該自己ヌクレオチド配列を含む生物内に導入される第２のヌクレオチド配列は、該生物を該作用因子で処理した後に導入される。

本発明の特に好適な別の実施形態では、前記作用因子を利用し生物内に第２の配列を導入する前に、導入すると同時に、および導入した後に、前記作用因子で該生物を処理する。また、生物内に第２の配列を導入した後にだけ、該生物を前記作用因子で処理することもできる。

組換え率を可逆的に高めるのに十分な期間とは、好ましくは5時間未満、特に0.5〜5時間、好ましくは1〜4時間、および特に1時間である。

本発明に関しては、生物とは真核生物、例えば昆虫、両生類、動物、哺乳類もしくは非ヒト哺乳類である生物であってもよいし、原核生物であってもよく、ここで生物が原核生物である場合、該生物は真正細菌もしくは古細菌生物である。特に好適な実施形態では、真正細菌生物は大腸菌（Escherichia coli）、肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）またはネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）である。

本発明の好適な実施形態では、本発明に従って使用する作用因子は化学物質または物理的な力である。

本発明において特に好適な化学物質は、天然の化学物質であるか、あるいは天然のヌクレオチド塩基（アデニン、ウリジン、シトシン、チミジンまたはグアニジンなど）の合成塩基類似体、例えば2-アミノプリンまたは2-アミノプリンと同等の特性を有する（すなわち、ミスマッチ修復を飽和させうる、かつ／または酵素およびDNAもしくはヌクレオチドと相互作用しうる）化合物である。ヌクレオチド配列、特にオリゴヌクレオチド（例えばミスマッチ塩基対を含むオリゴヌクレオチド）、またはヘテロ２本鎖は、本発明では化学物質として考えない。

従ってMRS活性は、本発明の好適な実施形態によれば、化学物質、特にアデニンの塩基類似体である2-アミノプリン（シトシンと誤対合する）で処理した細胞で阻害されうる。化学的阻害の利点は、一時的な阻害を提供すること、および異なる細菌種および真核細胞、例えばヒトや非ヒト哺乳動物細胞に、容易に適用しうることである。

本発明の特に好適な実施形態によれば、大腸菌（Escherichia coli）細胞を2-アミノプリン（2-AP）で処理すると、MutLタンパク質の滴定および／または不活性化によりミスマッチ修復系（MRS）の効率が可逆的に低下する。この一時的な表現型的ミスマッチ修復欠損の結果、非同一DNA配列間の組換え頻度が有意に高まる（10⁴倍）。このアプローチは、当分野で公知の全てのMRS阻害／飽和方法と比べて簡単であるという利点を有する。何故なら、該アプローチは、使用する細胞の遺伝的改変を何ら必要としないからである。従って、本発明は、ミスマッチ修復系の機能を可逆的に不活性化する方法を提供する。

本発明の特に好適な実施形態によれば、高濃度の2-APは突然変異誘発作用をもたらし、このことはMRSの飽和を示唆する。本発明の好適な実施形態では、50μg／mL〜600μg／mLの2-APを使用する。さらに別の実施形態では、特に少なくとも50μg／mL、特に少なくとも75μg／mL、少なくとも100μg／mL、少なくとも200μg／mL、少なくとも300μg／mL、少なくとも400μg／mL、少なくとも500μg／mLまたは少なくとも600μg／mLの2-APを使用する。

本発明は、さらに別の態様において、生物において突然変異を誘発する方法であって、該生物中に存在する分岐DNA配列または非同一DNA配列間の相同組換えが生じうる条件に該生物を曝露すること、および、該生物を、上記した通り該生物のMRSを可逆的に飽和または不活性化しうる作用因子に、該生物中の非同一DNA配列間の組換え率を可逆的に高めるのに十分な量と期間にて暴露することを含んでなり、好適な実施形態では、さらに該生物から該作用因子を取り除くことを含んでなる上記方法を提供することにより、前記課題を解決する。

従って本発明は、部分的に相同なDNA配列を生物内に導入すること、該生物をその自己DNA配列と導入されたDNA配列との間で相同組換えが生じうる条件に曝露すること、それにより該生物を、該生物のミスマッチ修復系を阻害しうる作用因子に、該生物内における自己DNA配列と導入されたDNA配列との間の組換え率を可逆的に高めるのに十分な量と期間にて曝露すること、さらに好ましくは該生物から該作用因子を取り除くこと、を含んでなる、生物において突然変異を誘発する方法に関する。既に説明したように、その非同一DNA配列は、遺伝子、オペロン、遺伝子クラスター、染色体、プラスミドまたはゲノムであってよい。

また、前記方法を使用して、上記で特定した生物における組換え率を高めることができる。

従って本発明は、第１の種または属に由来するDNA配列と第２の種または属に由来するDNA配列とを細胞内で組み合わせること（ここで第１と第２のDNA配列は、部分的に相同でかつ細胞の酵素によるミスマッチ修復系が機能的である場合にはその修復系を活性化しうるミスマッチを有する配列であり、また該酵素によるミスマッチ修復系は本発明に従って可逆的に不活性化されて第１と第２のDNA配列間の安定な組換えが可能となっている）を含んでなり、また好適な実施形態では、それによって雑種遺伝子、雑種ゲノム、雑種染色体、雑種オペロン、雑種プラスミド、または雑種遺伝子クラスターが生成されることを含んでなる、in vivo組換えの方法にも関する。好適な実施形態では、該DNA配列は２本鎖であってよい。

組換えのための上記方法の好適な実施形態では、第１の種または第１の属の生物の細胞を第２の種または第２の属の生物の細胞と融合させることにより、第１の種または属に由来するDNAと第２の種または属に由来するDNAとを細胞内で組み合わせる（ここで第２の種または第２の属の生物の細胞は、本発明に従って可逆的に不活性化された、酵素によるミスマッチ修復系を含む）。

さらに別の好適な実施形態では、第１の種または第１の属の単細胞生物を、第２の種または第２の属の単細胞生物と交雑することにより、第１の種または属に由来するDNA配列と第２の種または属に由来するDNA配列とを1細胞内で組み合わせる（ここでこれらの生物のうち少なくとも一方の、酵素によるミスマッチ修復系は、本発明に従って可逆的に不活性化されている）。

さらに別の好適な実施形態では、第１の種または属の受容細菌を第２の種または属の供与細菌と接合させるかまたは該供与細菌を用いて形質導入することにより、第１の種または属に由来するDNA配列と第２の種または属に由来するDNA配列とを細胞内で組み合わせる（ここで該供与細菌は該受容細菌に伝達しようとするDNA配列を少なくとも１つ有しており、また該供与細菌と該受容細菌のうちの少なくとも一方の酵素によるミスマッチ修復系は本発明に従って可逆的に不活性化されている）。

本発明は、２つのDNA配列を一の単細胞生物内に入れることにより第１の種または属に由来するDNA配列と第２の種または属に由来するDNA配列とを細胞内で組み合わせるものであって、ここで該生物ではその酵素によるミスマッチ修復系が本発明に従って可逆的に不活性化されており、また前記の２つのDNA配列は部分的に相同でかつ２つの異なる生物に由来するという、さらに別の実施形態を提案する。

前記組換え方法のうちの１つを使用し、但し、雑種遺伝子および／またはそのコードされたタンパク質を前記生物内で発現させた後に該雑種遺伝子および／またはそのコードされたタンパク質を選択することにより製造することが、特に好ましい。

前記組換え方法の好適な実施形態では、各DNA配列は別個のプラスミドに含有されており、また各プラスミドは前記生物中に導入されるものとする。

本発明の特に好適な実施形態において、生物において突然変異を誘発するかまたは生物の組換え率を高めるための前記方法は、導入されるDNA配列が、該導入されるDNA配列によって形質転換される生物種とは異なる種の生物に由来することを見越している。従って、本発明によれば、導入されるヌクレオチド配列は、該ヌクレオチド配列を導入する生物とは異なる種または同一種、さらには同一生物に由来するものであってもよい。

本発明のさらに好適な実施形態では、導入されるヌクレオチド配列は、自然な性交、形質導入、接合交雑、人為的な細胞融合、該ヌクレオチド配列の化学的、物理的、電気的取り込みもしくは遺伝子銃による取り込みによって生物内に導入される。

本発明のさらに好適な実施形態では、自己ヌクレオチド配列と導入されるヌクレオチド配列との間の相同組換えは、遺伝子置換および遺伝子付加を伴う。

本発明の特に好適な実施形態では、分岐体、つまり第２のヌクレオチド配列を生物に導入する前に、および／または同時に、および／またはその後に、MRSを不活性化しうるかまたは飽和させうる作用因子に該生物を曝露する。

本発明はさらに、相同であるがミスマッチの塩基を有するDNA配列間のin vivo組換えの方法であって、該配列が、酵素によるミスマッチ修復系が先に定義した作用因子の一時的適用により、該DNA配列間の組換えが生じうる期間（例えば5時間未満、特に1時間）可逆的に（つまり一時的に）不活性化されている細胞内または生物内に一緒に置かれている方法を、提供する。

従って本発明は、in vivo組換え方法、つまり交雑、または異なる生物に由来するDNAを一緒に存在させるための他の任意の手段、ならびに異なる種および／または属の生物のin vivo組換えにより、組換え生物を作製するための方法であって、交雑または他の手段ならびにin vivo組換えが第１の種および／または第１の属の生物と第２の種および／または第２の属の生物との間で生じ、かつこれら２つの生物のうち少なくとも一方は本発明に従って可逆的に不活性化されたMRSを含む方法、に関する。

特に好適な実施形態では、組換えは、異なる種の間での組換え（つまり種間組換え）または異なる属の生物間での組換え（つまり属間組換え）である。

組換えに関与するDNA配列は、染色体DNAであっても、または特に好適な実施形態においてはクローニングした個々の遺伝子間の組換えを可能にする染色体外DNA、例えばプラスミドであってもよい。

上記で特定した方法を用いれば、細菌、酵母、植物または動物の、特に遺伝子操作もしくは改変した細胞または組換え生物を作製することができる。

特に好適な実施形態では、本発明は、異なる種および／または属の細菌間の交雑ならびに組換えにより組換えられた細菌の作製方法であって、接合または形質導入が、第１の種および／または第１の属の受容細菌（その酵素によるミスマッチ系は本発明に従って可逆的に不活性化されている）と第２の種および／または第２の属の供与細菌（特に好適な実施形態では、受容細菌に伝達されることが望まれる特定の形質または性質を含んでいる）との間でin vivoにて生じる方法に関する。また、上記で特定した方法および作用因子を用いて、供与細菌のミスマッチ修復系を本発明に従って可逆的に不活性化することも可能である。

本発明の好適な実施形態では、受容細菌もまたそのDNAの酵素制限系が欠損している。

上記方法の特に好適な実施形態では、両菌株を、ミスマッチ修復系を可逆的に不活性化する作用因子の存在下で交雑した後、該作用因子を取り除く。

本発明の特に好適な実施形態では、大腸菌（E.coli）の菌株とネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）の菌株とを交雑するが、これらの菌株のうち少なくとも一方、好ましくは両菌株において、その酵素によるMRSが本発明に従って不活性化される。さらにより好適な実施形態では、Hfr型の供与細菌をF^-受容細菌と接合させる。

上記で特定した、組換え生物または細胞（特に細菌）を作製するための本発明の方法は、該方法により有利な特性（無毒である、またはワクチン製造時に使用するのに適している、など）を呈する新規細菌株が得られる場合に都合が良い。

また本発明は、2つの部分的に相同な遺伝子から雑種遺伝子およびそのコードされたタンパク質をin vivoで作製する方法であって、組換え細胞が、第１の遺伝子を含有する第１の生物の細胞と、部分的に相同な第２の遺伝子を含有する第２の生物の細胞とから調製され、また本発明の突然変異誘発方法を該組換え細胞において実施し、かつ所望の雑種遺伝子またはそのコードされたタンパク質をそこから選択する方法にも関する。この方法は、本発明に従って不活性化されたMRSを含む生物内に、2つの別個の生物に由来する部分的に相同な遺伝子からなる2つのDNA配列を一緒に入れて、in vivoで組換えた後に所望の雑種遺伝子を、また必要であればin vivoでタンパク質を合成させた後にそのコードされたタンパク質を選択すること、を見越している。本発明の好適な実施形態によれば、同一機能をコードするが異なる配列を有する少なくとも2つの部分的に相同な遺伝子を含有する少なくとも2つのプラスミドを、本発明に従って可逆的に不活性化されたMRSを有する細胞内に導入し、本発明に従って組換えを行った後に、雑種遺伝子を、また好適な実施形態では慣例的条件下で発現させた後に雑種タンパク質を選択し、好ましくは単離する。前記プラスミドを、従来の形質転換方法により生物内に導入してもよい。

本発明はさらに、生物内における遺伝子の標的化逆突然変異誘発方法であって、該遺伝子が変異前の状態に再構築されることが望まれる変異型塩基を含んでおり、該生物のミスマッチ修復系を本発明に従って可逆的に不活性化してから、変異前の状態として再構築されるDNA配列からなるオリゴヌクレオチドを導入し、さらに再構築された変異体を形質転換体から選択する方法にも関する。

勿論、本発明は、本発明の方法に従って取得した生成物、すなわち取得した組換え型および／または突然変異型の生物、細胞、遺伝子産物、タンパク質、遺伝子、遺伝子クラスター、オペロン、プラスミド、染色体およびゲノムにも関する。

本発明のさらに好適な実施形態は、本発明の特許請求の範囲において従属項の発明主題となっている。

本発明を、実施例および添付の図面を用いて以下に説明する。

図面には以下の事項が示されている：
図１：大腸菌（E.coli）Hfr×大腸菌（E.coli）F^-種内およびネズミチフス菌(S. typhimurium)Hfr×大腸菌（E.coli）F^-種間の接合組換えの効率に対して2-アミノプリン(2-AP)が及ぼす影響。受容大腸菌（E.coli）株はmutS^＋(A, C)またはmutS⁻(B, D)とした。選択マーカー(Thr^＋)についての組換え頻度を、非交雑復帰突然変異株を差し引いた後のHfr供与細菌1個当たりで表す。各数値は、少なくとも3回の独立した実験から得た平均値（＋/−標準誤差）を示す。

図２：2-アミノプリン(2-AP)処理により飽和するかまたは阻害されるミスマッチ修復系成分の同定。受容大腸菌（E.coli）株はmutS⁻(A, B)またはmutL⁻(C, D)とした。ミスマッチ修復の欠損は、mutS^＋(A, B)またはmutL^＋(C, D)遺伝子を担持するプラスミドにより相補された。これらの実験で使用した2-APの投与量は、常に300mg／mLとした。選択マーカー(Thr^＋)についての組換え頻度を、非交雑復帰突然変異株を差し引いた後のHfr供与細菌1個当たりで表す。各数値は、少なくとも3回の独立した実験から得た平均値（＋/−標準誤差）を示す。

細菌の菌株、プラスミド、および培養条件

培地：
全ての菌株を37℃で培養した。

１．LBリッチ培地：Bacto tryptone (DIFCO) 10 g; Bacto yeast extract (DIFCO) 5 g; NaCl 10 g; 脱イオン水1L。1M NaOHでpHを7.0に調整した。

２．M63最少培地：KH₂PO₄ 13.6 g; (NH₄)₂SO₄ 2 g; FeSO₄ 7H₂O 0.5 mg; 脱イオン水1L。KOHでpHを7.0に調整した。オートクレーブ処理した後、1 mLの1M MgSO₄ 7 H₂Oと10 mLの20%炭素源溶液を加えた。必要に応じて、ビタミン類、アミノ酸類および抗生物質を加えた。

培地をプレートで使用する場合には、1L当たり15gの寒天（DIFCO）を加えた。全ての培地を120℃で30分間オートクレーブ処理することにより滅菌した。抗生物質は必ずオートクレーブ処理の後で加えた。各抗生物質の最終濃度は以下の通りであった：ナリジクス酸（Sigma）、40μg／mL；スペクチノマイシン(Sigma)、100μg／mL；ストレプトマイシン(Sigma)、75μg／mL；カナマイシン(Sigma)、50μg／mL；テトラサイクリン(Sigma)、12.5μg／mL；およびクロラムフェニコール(Sigma)、30μg／mL。

DNAおよび微生物の操作
電気形質転換：
mutS^＋またはmutL^＋遺伝子を担持するプラスミドを、電気形質転換により（BIO RADマイクロパルサー装置を用いて）それぞれMX4およびMX5株に導入した。

形質導入：
全ての受容菌株は、P1介在型形質導入(Miller, 1972)を利用して構築した大腸菌（E.coli）K12 F^- AB1157株誘導体であった。

接合交雑：
以前に記載された条件(Rays-siguier et al., 1989)下で接合実験を実施した。導入しようとするDNA配列を含む供与菌株（2〜4×10⁹細胞／mL）と自己DNA配列を含む受容菌株とを一晩培養したものを、2-アミノプリン(Sigma)を含むかまたは含まない新鮮なLB培地で50倍希釈し、穏やかに振盪しながら（約150rpm）増殖させて2〜4×10⁸細胞／mLとした。所要濃度の細胞を取得するには、約3時間のインキュベーションを必要とする。細胞を2-APで処理した場合、その増殖は2-APで処理しない増殖と比べるとわずかに遅かった（インキュベーションを約30分長く行った）。ミスマッチ修復を飽和させるためには2-APが複製中のそのDNA内に取り込まれなければならないので、供与および受容菌株を接合前に2-APで処理することが好ましい。試験した2-APの用量は、次の通りであった：25μg／mL、50μg／mL、75μg／mL、100μg／mL、300μg／mLおよび600μg／mL。2-AP処理の効果は、50μg／mLの2-APを使用した場合に既に顕著に現れていた。最大効果は2-APが100μg／mLのときに観察され、2-AP濃度をそれ以上高くしても組換え率がさらに高まることは無かった。Hfr菌とF⁻菌を1:1の比で混合することにより、接合混合物を調製した。この混合物を、真空濾過装置(MILLIPORE)を用いて0.45μm孔径の無菌ニトロセルロースフィルター（直径2.5cm）に通して濾過した。接合混合物、すなわち自己ヌクレオチド配列および導入ヌクレオチド配列を含む細胞との混合物を保持したフィルターを、予め37℃で温めておいた新鮮なLB寒天プレート（2-アミノプリン含有または非含有）上でインキュベートした。60分後、接合対を10^-2M MgSO₄中に再懸濁し、激しくボルテックスすることによりそれらを分離して、2-APを不活性レベルまで希釈する。その後、この接合混合物を所望の組換え体（Thr^＋表現型）について選択した培地にプレーティングし、2-APを含有しない供与（Nal^s表現型）および受容（Thr⁻表現型）親株の両方を対抗選択した。この目的のため、M9培地［Hfr供与細胞を対抗選択するためにアルギニン、ヒスチジン、ロイシン、プロリンおよびトリプトファン（各100
μg／mL）、チアミン(30μg／mL)、グルコース(0.4％)、およびナリジクス酸(40μg／mL)が補充されている］を使用した。Thr^＋組換え体を選択するため、トレオニンは培地に加えなかった。37℃で48時間インキュベートした後、組換え体を計数した。

結果：
2-AP処理が組換えに及ぼす効果を、ネズミチフス菌(S. typhimurium)と大腸菌（E.coli）の間の接合組換えという良く研究された系(Stambuk and Radman, 1998; Rayssiguier et al., 1989; Matic et al., 1995; Denamur et al., 2000)を使用して、本発明の過程で実証した。ゲノム配列に約16％の分岐を有するこれら2つの細菌種間の組換えは、種内組換え（約10^-1、図1C）と比べると非常に低い（10^-8〜10^-7、図1A）。本発明に従い2-APを用いて受容細胞のmutSまたはmutL遺伝子を不活性化すると、種間組換え頻度が約10³〜10⁴倍上昇した（図1B、図2Aおよび2B）。

種内接合実験で観察される高い組換え率は、使用した大腸菌（E.coli）系において2-AP処理した場合、mutS^＋（野生型）またはmutS⁻バックグラウンドのいずれにおいても余り上昇しない。図1Bは、mutS⁻受容バックグラウンドにおいては、mutS⁻細胞はそのMRSが遺伝学的に不活性化されている（mutS⁻）ために最初から高い組換え率を示すことから、2-APの効果が野生型バックグラウンドの場合（図1A）ほど顕著には現れないことを示している。従って、野生型受容細胞を75、100、300または600μg／mLの2-APで処理した場合（組換え頻度の上昇は50〜600μg／mLの2-AP、特に75μg／mLを超える2-APで観察される）、種間組換え頻度は最大で10⁴倍上昇したが、種内組換え頻度は変化しなかった（図1）。mutSまたはmutL遺伝子をコードする遺伝子を担持するプラスミドを導入することにより、MutLタンパク質を、滴定されるかまたは2-AP処理により不活性化されるMRSの構成成分として同定した（図2B）。

従って、大腸菌（E.coli）細胞の2-AP処理は、遺伝学的に無傷のミスマッチ修復系を飽和させるかまたは阻害することにより、分岐DNA配列間の組換え率、特に相同組換えによる組換え率を一時的に高める、と結論付けることができる。

本発明は、特に野生型細菌の遺伝的障壁を可逆的な様式で打ち破る方法を教示するものである。遺伝的障壁を打ち破ることで遺伝子、オペロンまたはゲノムの効率的な種間組換えが可能となり、それによってバイオテクノロジーの革新にとって有用な供給源となりうる新規で大規模な生物多様性を生み出すことができる。種間組換えの一時的な増加（最大で10,000倍にも達する）の機構は上記実施例中に示されている。つまり、使用した化学物質（2-アミノプリン）が、DNA修復系のMutL機能を消耗させることにより、可逆的な表現型のDNAミスマッチ修復欠損をもたらす。ミスマッチ修復欠損変異体の使用を超える、この方法の大きな利点は、遺伝的に不安定な状態を種間交雑時に厳密に限定することができるということである。つまり、2-アミノプリンが枯渇することにより遺伝的安定性が回復する。さらに、本発明の方法により、ミスマッチ修復遺伝子が未知であるかまたは遺伝子操作できない生物において種間組換えを引き起こすことも可能となる。

参考文献:
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大腸菌（E.coli）Hfr×大腸菌（E.coli）F^-種内およびネズミチフス菌(S. typhimurium)Hfr×大腸菌（E.coli）F^-種間の接合組換えの効率に対して2-アミノプリン(2-AP)が及ぼす影響を示す。 2-アミノプリン(2-AP)処理により飽和するかまたは阻害されるミスマッチ修復系成分の同定を示す。

Claims

非ヒト生物においてin vivoでの組換え率を高める方法であって、第１の種または属に由来するDNA配列と第２の種または属に由来するDNA配列とを細胞内で対合させることを含み、ここで第１と第２のDNA配列は、部分的に相同であってかつ該細胞の酵素によるミスマッチ修復系（MRS）が不活性化、阻害または飽和がなされていない場合にその修復系を活性化しうるミスマッチを有する配列を有しており、さらに、該生物を、塩基類似体である2-アミノプリンに曝露すること、および該生物から該2-アミノプリンを取り除くことを含む方法によって、該酵素によるミスマッチ修復系が可逆的に不活性化されている、上記方法。
非ヒト生物が真核生物または原核生物である、請求項１記載の方法。
原核生物が真正細菌生物もしくは古細菌生物である、請求項２記載の方法。
真正細菌生物が大腸菌（Escherichia coli）である、請求項３に記載の方法。
前記非同一DNA配列が遺伝子、オペロン、遺伝子クラスター、染色体、プラスミドまたはゲノムである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
前記DNA配列が天然のDNA配列または人為的に操作されたDNA配列である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
前記生物の2-アミノプリンへの曝露が、前記生物を2-アミノプリンに、5時間未満、好ましくは1時間にわたり曝露することである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
前記生物の2-アミノプリンへの曝露が、前記生物を、50μg／mL〜600μg／mLの量の2-アミノプリンに曝露することである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
非ヒト生物において突然変異を誘発する方法であって、
ミスマッチ塩基を最大30％の割合で有する部分的に相同なDNA配列を該生物に導入すること、
該生物をその自己DNA配列と導入されるDNA配列との間で相同組換えが生じうる条件におくこと、
それにより、該生物を塩基類似体である2-アミノプリンに曝露すること、および
該生物から該2-アミノプリンを取り除くこと、
を含んでなる上記方法。
前記導入されるDNA配列が、自然な性交、形質導入、接合交雑、人為的な細胞融合、該DNA配列の化学的、物理的もしくは電気的な取り込み、または遺伝子銃による取り込みによって、前記生物内に導入される、請求項９記載の方法。
前記の自己DNA配列と導入されるDNA配列との間の相同組換えが遺伝子置換および遺伝子付加を伴う、請求項９または１０記載の方法。
前記導入されるDNA配列が、該導入されるDNA配列によって形質転換される生物種とは異なる種の生物に由来する、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の方法。
非ヒト生物が真核生物または原核生物である、請求項９〜１２のいずれか１項に記載の方法。
原核生物が真正細菌生物もしくは古細菌生物である、請求項１３に記載の方法。
真正細菌生物が大腸菌（Escherichia coli）である、請求項１４に記載の方法。
前記非同一DNA配列が遺伝子、オペロン、遺伝子クラスター、染色体、プラスミドまたはゲノムである、請求項９〜１５のいずれか１項に記載の方法。
前記生物の2-アミノプリンへの曝露が、前記生物を2-アミノプリンに、5時間未満、好ましくは1時間にわたり曝露することである、請求項９〜１６のいずれか１項に記載の方法。
前記生物の2-アミノプリンへの曝露が、前記生物を、50μg／mL〜600μg／mLの量の2-アミノプリンに曝露することである、請求項９〜１７のいずれか１項に記載の方法。
前記DNA配列が2本鎖である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
前記組換えが属間組換えおよび／または種間組換えである、請求項１〜８のいずれか１項または請求項１９に記載の方法。
第１の種または第１の属の生物の細胞を第２の種または第２の属の生物の細胞と融合させて第１の種または属に由来するDNAと第２の種または属に由来するDNAとを細胞内で対合させることを特徴とし、かつ第２の種または第２の属の生物の細胞が、可逆的に不活性化された、酵素によるミスマッチ修復系を含む、請求項１〜８のいずれか１項または請求項１９もしくは２０に記載の方法。
第１の種または第１の属の単細胞生物を第２の種または第２の属の単細胞生物と交雑して第１の種または属に由来するDNAと第２の種または属に由来するDNAとを細胞内で対合させることを特徴とし、かつこれらの生物のうち少なくとも一方の、酵素によるミスマッチ修復系が、可逆的に不活性化されている、請求項１〜８のいずれか１項または請求項１９もしくは２０に記載の方法。
第１の種または属の受容細菌を第２の種または属の供与細菌と接合させるかまたは該供与細菌を用いて形質導入して第１の種または属に由来するDNA配列と第２の種または属に由来するDNA配列とを細胞内で対合させることを特徴とし、かつ該供与細菌が該受容細菌に伝達しようとするDNA配列を少なくとも１つ有しており、さらに該供与細菌と該受容細菌のうちの少なくとも一方の、酵素によるミスマッチ修復系が、可逆的に不活性化されている、請求項１〜８のいずれか１項または請求項１９もしくは２０に記載の方法。
２つのDNA配列を単細胞生物内に入れて第１の種または属に由来するDNA配列と第２の種または属に由来するDNA配列とを細胞内で対合させることを特徴とし、かつ該生物ではその酵素によるミスマッチ修復系が可逆的に不活性化されており、さらに該２つのDNA配列が部分的に相同であってかつ2つの異なる生物に由来する、請求項１〜８のいずれか１項または請求項１９もしくは２０に記載の方法。
雑種遺伝子および／またはそのコードされたタンパク質が、前記生物内で発現された後に該雑種遺伝子および／またはそのコードされたタンパク質を選択することにより製造される、請求項１〜８、および１９〜２４のいずれか１項に記載の方法。
各DNA配列が別個のプラスミドに含有されており、また各プラスミドが前記生物内に導入される、請求項１〜８、および１９〜２４のいずれか１項に記載の方法。
雑種遺伝子および／またはそのコードされたタンパク質の製造方法であって、請求項１〜８、および１９〜２６のいずれか１項に記載の方法を実施し、さらに、該雑種遺伝子および／またはそのコードされたタンパク質を、前記生物内で発現させた後に該雑種遺伝子および／またはそのコードされたタンパク質を選択することにより製造することを特徴とする、上記方法。